(57)【要約】【課題】非破壊的手段によって鶏卵中のコレステロール含有量を測定する手段を提供する。【解決手段】本発明は、鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法であって、以下の工程：鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射工程；前記光照射工程で照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出工程；前記光検出工程で検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得工程；前記スペクトル取得工程で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定工程；を含む前記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法であって、以下の工程：
鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射工程；
前記光照射工程で照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出工程；
前記光検出工程で検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得工程；
前記スペクトル取得工程で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定工程；
を含む前記方法。
【請求項２】
前記光照射工程において照射される光が600〜1100 nmの範囲の波長を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記光照射工程において照射される光が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に照射される光であり、
前記光検出工程において検出される光が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置であって、以下の手段：
鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射手段；
前記光照射手段によって照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出手段；
前記光検出手段によって検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得手段；
前記スペクトル取得手段で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定手段；
を含む前記装置。
【請求項５】
前記光照射手段によって照射される光が600〜1100 nmの範囲の波長を有する、請求項4に記載の装置。
【請求項６】
前記光照射手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、
前記光検出手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置される、請求項4又は5に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非破壊的手段による鶏卵中のコレステロール含有量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏卵は、アミノ酸組成がよく、脂質も含まれている優れた食品であることが知られている。また、鶏卵は、魚卵とともにコレステロール含有量の高い食品としても知られている。鶏卵中のコレステロール含有量は、卵黄100 gあたりで平均1300〜1400 mg、全卵(可食部)100 gあたりで平均450〜500 mgといわれている。前記平均値に基づけば、鶏卵1個には、約230 mgのコレステロールが含まれていることになる（非特許文献1）。
【０００３】
ヒトの体のコレステロールの大半（80％以上）は、食物由来ではなく、ヒトの体内で生合成されたものといわれている。通常、食事からのコレステロール摂取が増えると、体内での生合成を抑制する機構が働き、血液中レベルの恒常性が保たれる。それ故、健康な人の場合、鶏卵からのような食事由来のコレステロール摂取は、あまり気にする必要はないというのが主流の考えとなっている(非特許文献2)。
【０００４】
ただし、hyper-respondersと呼ばれる、食事からの摂取コレステロールを血液中コレステロール値に反映しやすいヒトと、そうでないヒト(hypo-responders)がいることが知られている（非特許文献3及び4）。また、高脂血症の治療において、1日に摂取してよいコレステロールの上限を、300 mg程度に設定される場合もある（非特許文献5）。それ故、鶏卵のような食品材料中のコレステロール含有量を知ることは、コレステロール摂取量を適切な範囲に管理するために重要である。
【０００５】
鶏卵中のコレステロールレベルを調節する方法は、鶏への乾燥納豆の給与による方法等が知られている（非特許文献6）。しかしながら、通常の鶏卵であっても、個別に測定すると卵黄100 gあたりで約1000 mgから1800 mgを越える場合まで、かなりの幅があることが知られている。それ故、鶏卵中のコレステロール含有量を簡便に測定する手段が求められている。
【０００６】
鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法として、例えば非特許文献7は、卵黄又は全卵から除タンパクした後、コレステロール含有画分を抽出して、該抽出物中のコレステロール含有量を高速液体クロマトグラフィー（以下、「HPLC」とも記載する）によって分析する方法を記載する。また、非特許文献8は、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを用いる酵素法によって、前記コレステロール含有抽出物中のコレステロール含有量を測定する方法を記載する。
【０００７】
前記文献に記載の方法のように、測定対象の鶏卵を割卵して測定試料を調製する場合、測定対象の鶏卵を食品材料として使用することができない。食品材料として使用する鶏卵中のコレステロール含有量を測定するためには、非破壊的手段による測定方法であることが必要となる。非破壊的手段によって鶏卵中の特性を調査する方法として、例えば特許文献1は、卵に光源からの光を照射する工程であって、前記光は可視波長域及び赤外波長域の波長を有する光であるような工程と、各卵を通過する光を各卵に隣接して配置された検出器によって受光する工程と、卵毎に前記複数の可視波長及び赤外波長における光強度を表すスペクトルを生成する工程と、卵毎の前記生成したスペクトルを生存卵に関連するスペクトルと比較し、生存卵を識別する工程とを含む、識別される特性を有する卵を処理する方法を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2010-273682号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】青山頼孝、卵の栄養、1998年、中村良編、「卵の科学」、pp.42-53、朝倉書店（東京）
【非特許文献２】八田一、卵の栄養機能と生理機能、2006年、Foods & Foods Ingredients Journal of Japan、第211巻、p. 908-917
【非特許文献３】Oh SY, Miller LT, 1985年, Effect of dietary egg on variability of plasma cholesterol levels and lipoprotein cholesterol., American Journal of Clinical Nutrition. 第42巻, p. 421-431
【非特許文献４】Herron KL, Vega-Lopes S, Conde K, Ramjiganesh T, Schchter NS, Fernandez ML, 2003年, Men classified as hypo- or hyper-responders to dietary cholesterol feeding exhibit differences in lipoprotein metabolism., Journal of Nutrition, 第133巻, p. 1036-1042
【非特許文献５】日本動脈硬化学会、2007年、「動脈硬化性疾患予防ガイドライン2007年版」、株式会社協和企画（東京）
【非特許文献６】Fujiwara K, Miyaguchi Y, Toyoda A, Nakamura Y, Yamazaki M, Nakashima K, Abe H, 2008年, Effect of fermented soybean “natto” supplement on egg production and qualities., Asian-Australasian Journal of Animal Science, 第21巻, p. 1610-1615
【非特許文献７】Official Methods of Analysis of AOAC, 第11版, Washington, 1970年
【非特許文献８】Shen CS, Chen IS, Sheppard AJ, 1982年, Enzymatic determination of cholesterol in egg yolk, Journal of Association of Official Analytical Chemists., 第65巻, p. 1222-1224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
店頭での販売時までに、非破壊的手段によって鶏卵中のコレステロール含有量を測定できれば、各鶏卵のコレステロール含有量の情報を、店頭での販売時に消費者に提供し得る。家庭での鶏卵の調理においては、主として生卵が食品材料として使用される。それ故、各鶏卵のコレステロール含有量の情報は、食事由来のコレステロール摂取量の管理に有用である。
【００１１】
通常、鶏卵は、GP（Grading and Packaging）センターにおいて、洗浄、検卵、規格毎の選別及び梱包が行われている。このため、GPセンターにおける前記作業時に、非破壊的手段によって短時間に鶏卵中のコレステロール含有量を測定すれば、各鶏卵のコレステロール含有量の特定及びそれに基づく鶏卵の選別を効率的に実施できる可能性がある。
【００１２】
非破壊的手段による鶏卵中の特性調査技術としては、特許文献1に記載の方法が知られている。しかしながら、当該文献には、鶏卵中のコレステロール含有量を測定する手段は記載されていない。
【００１３】
それ故、本発明は、非破壊的手段によって鶏卵中のコレステロール含有量を測定する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、特定の波長領域の近赤外線を鶏卵に照射して透過光を検出することにより、割卵することなく鶏卵中のコレステロール含有量を高精度で定量し得ることを見いだし、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（1）  鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法であって、以下の工程：
鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射工程；
前記光照射工程で照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出工程；
前記光検出工程で検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得工程；
前記スペクトル取得工程で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定工程；
を含む前記方法。
【００１６】
（2）  前記光照射工程において照射される光が600〜1100 nmの範囲の波長を有する、前記（1）に記載の方法。
【００１７】
（3）  前記光照射工程において照射される光が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に照射される光であり、
前記光検出工程において検出される光が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光である、前記（1）又は（2）に記載の方法。
【００１８】
（4）  鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置であって、以下の手段：
鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射手段；
前記光照射手段によって照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出手段；
前記光検出手段によって検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得手段；
前記スペクトル取得手段で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定手段；
を含む前記装置。
【００１９】
（5）  前記光照射手段によって照射される光が600〜1100 nmの範囲の波長を有する、前記（4）に記載の装置。
【００２０】
（6）  前記光照射手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、
前記光検出手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置される、前記（4）又は（5）に記載の装置。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、非破壊的手段によって鶏卵中のコレステロール含有量を測定する手段を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1は、本発明の方法の一実施形態を示す工程図である。
【図２】図2は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置の一実施形態を示す構成図である。
【図３】図3は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置を使用するときの一実施形態を示す模式図である。
【図４】図4は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置を使用するときの別の実施形態を示す模式図である。
【図５】図5は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置を使用するときの別の実施形態を示す模式図である。
【図６】図6は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置を使用するときの別の実施形態を示す模式図である。
【図７】図7は、本発明の方法によって得られた鶏卵の近赤外スペクトルを示す図である。A：近赤外スペクトルの原スペクトル；B：原スペクトルを一次微分処理して得られた一次微分スペクトル。
【図８】図8は、従来法による卵黄100gあたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の方法によるコレステロール含有量の推定値との関係を示す図である。図中、実線は回帰直線を、点線は95％信頼区間を示す。
【図９】図9は、従来法による鶏卵1個あたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の近赤外分光分析法によるコレステロール含有量の推定値との関係を示す図である。図中、実線は回帰直線を、点線は95％信頼区間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
本明細書では、適宜図面を参照して本発明の特徴を説明する。図面では、明確化のために各部の寸法及び形状を誇張しており、実際の寸法及び形状を正確に描写してはいない。それ故、本発明の技術的範囲は、これら図面に表された各部の寸法及び形状に限定されるものではない。
【００２４】
＜1. 鶏卵中のコレステロール含有量測定方法＞
本発明は、鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法に関する。
特定の波長領域の近赤外線を試料に照射して透過光又は反射光を検出する近赤外分光法は、試料を破壊することなく試料内部の分析を行うことができる。このため、近赤外分光法は、鶏卵の特性調査（例えば特許文献1）、果実の糖度測定、米又は小麦のデンプン含有量測定、及び醤油の成分分析のように、食品材料又は加工食品の検査若しくは分析に利用されている。しかしながら、近赤外分光法を用いて鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法は知られていなかった。
【００２５】
本発明者らは、特定の波長領域の近赤外線を鶏卵に照射して透過光を検出することにより、鶏卵中のコレステロール含有量を高精度で定量し得ることを見いだした。本発明の方法は、卵殻の外部から近赤外線を照射することによって実施される。このため、本発明の方法を適用することにより、割卵することなく鶏卵中のコレステロール含有量を測定することが可能となる。
【００２６】
本発明の方法は、食品材料として使用される鶏卵に広く適用することができる。例えば、当該技術分野で通常使用される産卵鶏から採卵した鶏卵であれば、産卵鶏の品種及び／又は採卵時期に限定されず適用し得る。食品材料として提供される鶏卵は、通常、白色卵殻のものだけでなく、褐色又は赤褐色のような有色卵殻のものも存在する。本発明の方法は、白色卵殻及び有色卵殻のいずれの鶏卵にも適用し得る。
【００２７】
図1は、本発明の鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法の一実施形態を示す工程図である。以下、図1に基づき、本発明の方法の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
［1-1. 光照射工程］
本発明の方法は、鶏卵に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射工程（工程S1）を含むことが必要である。
【００２９】
通常、「可視光線」は、400〜750 nmの波長領域に属する波長を有する光であり、「近赤外線」は、750〜2500 nmの波長領域に属する波長を有する光である。本明細書において、「可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光」は、400〜2500 nmの波長領域に属する波長を有する光を意味する。本工程において照射される光（以下、「照射光」とも記載する）は、400〜1100 nmの波長領域に属する波長を有することが好ましく、600〜1100 nmの波長領域に属する波長を有することがより好ましい。400〜1100 nmの波長領域に属する波長を有する光を照射することにより、波長掃引範囲を狭くし本工程の実施に要する時間を短縮することができる。また、600 nm以上の波長領域に属する波長を有する光を用いることにより、以下において説明する近赤外スペクトルに基づくコレステロール含有量の決定を高精度で行うことができる。
【００３０】
本工程において、照射光は、鶏卵に対して様々な方向から照射されることができる。例えば、照射光は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の上方から卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に照射することができる。しかしながら、照射光は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に照射されることが好ましい。通常、本工程は、鶏卵と照射光との配置を前記で説明した位置関係にするために、鶏卵を固定した状態で実施される。このため、本工程において、鶏卵を前記の配置にするために、鶏卵固定部材が使用されることが好ましい。鶏卵固定部材を使用する場合、鶏卵は、鶏卵固定部材の上面に載置される。鶏卵固定部材は鶏卵の下面と接触するように配置されているため、鶏卵固定部材と接触している部分と接触していない部分との間で、照射された光が鶏卵内で反射する際の反射率に差が生じ得る。それ故、鶏卵の鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む水平面と平行な面上において光を照射することにより、鶏卵固定部材による影響を抑制することができる。また、通常、鶏卵中のコレステロールは、主として卵黄に含有される。それ故、鶏卵の卵黄を通過するように前記長軸線と直交する方向に光を照射することにより、鶏卵中のコレステロール含有量をより高精度で測定することができる。
【００３１】
本明細書において、「平行」、「垂直」及び「直交」とは、直線及び／又は面が完全に又は略平行、垂直若しくは直交の位置関係にあることを意味する。
【００３２】
本明細書において、「卵黄を通過するように」とは、鶏卵内の卵黄の少なくとも一部分を光が通過することを意味する。それ故、卵黄を通過するような位置とは、例えば、鶏卵の鋭端部から20〜60 mmの範囲、典型的には27〜52 mmの範囲を意味する。
【００３３】
本工程は、鶏卵及び鶏卵固定部材を収容する収容部材の内部で光を照射することにより実施することが好ましい。前記収容部材は、暗箱のように外部の光を実質的に遮断できる部材であることが好ましい。収容部材の内部で本工程を実施することにより、外部の光の影響を実質的に抑制して鶏卵中のコレステロール含有量をより高精度で測定することができる。
【００３４】
［1-2. 光検出工程］
本発明の方法は、光照射工程（工程S1）で照射された光が前記鶏卵を透過するか又は鶏卵内で反射することにより、鶏卵外に放出される光を検出する光検出工程（工程S2）を含むことが必要である。
【００３５】
本工程において検出される光は、400〜1100 nmの波長領域に属する波長を有することが好ましく、600〜1100 nmの波長領域に属する波長を有することがより好ましい。400〜1100 nmの波長領域に属する波長を有する光を検出することにより、波長掃引範囲を狭くし本工程の実施に要する時間を短縮することができる。また、600 nm以上の波長領域に属する波長を有する光を用いることにより、以下において説明する近赤外スペクトルに基づくコレステロール含有量の決定を高精度で行うことができる。
【００３６】
本工程においては、鶏卵に対して様々な方向に放出される光を検出することができる。例えば、検出される光は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の側方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む水平面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光であることができる。或いは、検出される光は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵の内部で反射することにより該鶏卵の上方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光であってもよい。しかしながら、本工程において、検出される光は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光であることが好ましい。前記光照射工程で照射された光は、鶏卵を透過する（以下、「透過光」とも記載する）だけでなく、鶏卵内で反射する（以下、「反射光」とも記載する）。前記で説明したように、反射光は、鶏卵固定部材の影響を受ける可能性がある。また、鶏卵の側方に放出される透過光を検出する場合、照射光が鶏卵の外部で散乱した光（以下、「外部散乱光」とも記載する）の影響を受ける可能性がある。これに対し、鶏卵の下方に放出される透過光を検出する場合、前記の悪影響を実質的に抑制することができる。それ故、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵の該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、該鶏卵を透過することにより該鶏卵の下方に放出される光を検出することにより、反射光及び／又は外部散乱光に起因する影響を抑制することができる。また、前記のように配置された鶏卵の卵黄を通過するように前記長軸線と直交する方向に放出される光を検出することにより、鶏卵中のコレステロール含有量をより高精度で測定することができる。
【００３７】
本工程は、前記で説明した収容部材の内部で光を検出することにより実施することが好ましい。収容部材の内部で本工程を実施することにより、外部の光の影響を実質的に抑制して鶏卵中のコレステロール含有量をより高精度で測定することができる。
【００３８】
［1-3. スペクトル取得工程］
本発明の方法は、光検出工程（工程S2）で検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得工程（工程S3）を含むことが必要である。
【００３９】
本工程は、光検出工程で検出された光に基づき、近赤外スペクトルを生成することによって実施される。近赤外スペクトルを生成するための手段としては、当該技術分野で通常使用される近赤外分光装置が好ましい。近赤外分光装置を用いることにより、短時間で高精度の近赤外スペクトルを生成することができる。
【００４０】
［1-4. コレステロール含有量決定工程］
本発明の方法は、スペクトル取得工程（工程S3）で取得された近赤外スペクトルに基づき、前記鶏卵中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定工程（工程S4）を含むことが必要である。
【００４１】
本工程において、近赤外スペクトルに基づき、鶏卵中のコレステロール含有量を決定するための手段としては、例えば、当該技術分野で公知のケモメトリックス法を適用することができる。ケモメトリックス法を適用する場合、予め以下の手順で検量線を作成する。数個（好ましくは50以上）の検量線作成用の鶏卵を用いて前記スペクトル取得工程を実施し、近赤外スペクトルを取得する。次に、鶏卵を割卵して、当該技術分野で公知の手段によって鶏卵成分のコレステロール含有量を測定する。前記測定手段としては、例えば、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼのような酵素を用いる比色定量法、並びにHPLC、LC-MS又はGC-MSのようなクロマトグラフィー技術を用いる機器分析法を挙げることができる。簡便に測定できることから、酵素を用いる比色定量法が好ましい。その後、近赤外スペクトルから解析用データを取得し、前記で測定したコレステロール含有量を用いて検量線を作成する。検量線作成に用いる解析手段としては、Xの線形関数とYとの間の共分散が最大となるように複数の潜在因子を抽出するPLS（Partial least square）回帰分析法、及び重回帰分析法を挙げることができる。成分に由来する重みづけを反映するので推定精度が高く、且つ／又はオーバーフィッティングがなくなると考えられることから、PLS回帰分析法を用いることが好ましい。前記のような近赤外スペクトルデータの解析及び検量線の作成は、パーソナルコンピューターのような演算装置を用いて自ら行ってもよく、当該技術分野で通常使用される市販のケモメトリックス解析用ソフトを使用して行ってもよい。
【００４２】
前記の手順で検量線を作成した後、該検量線を用いて前記と同様の解析手段により、測定対象となる鶏卵のコレステロール含有量を決定することができる。検量線の作成は、本工程を実施する度に行ってもよい。しかしながら、検量線は、予め作成したデータを演算装置に蓄積しておき、測定時に演算装置から呼び出して使用することが好ましい。このようにすることで、コレステロール含有量の測定時間を短縮することができる。
【００４３】
前記の手順で作成された検量線は、以下の手順でその精度を評価することができる。数個（好ましくは50以上）の検量線評価用の鶏卵を用いて前記スペクトル取得工程を実施し、近赤外スペクトルを取得する。得られた近赤外スペクトルに基づき、前記の手順で作成した検量線からコレステロール含有量の推定値を得る。次に、鶏卵を割卵して、前記のような公知の手段によって鶏卵成分のコレステロール含有量を測定する。前記コレステロール含有量の推定値と実際の測定値とを比較して、検量線の精度を評価する。検量線の精度の評価手段としては、例えばPLS回帰分析法を用いて検量線を作成した場合、回帰推定からの標準誤差（SECV）に対する従来法による測定値の標準偏差の比であるRPD（Ratio of standard deviation of reference data in predicted sample set to SECV; SD/SECV）を指標とする方法（Williams, PC., 2001年, Implementation of near-infrared technology., “Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries”, 第2版. p. 145-169., Williams, PC及びNorris KH編, American Association of Cereal Chemist Press, St. Paul, Minnesota)を挙げることができる。通常、近赤外分光分析法におけるRPDは、2.5以下の場合は分析精度が不良であり、2.5〜3.0の場合はラフな分析に適用可能と判断される。また、RPDが3.0〜5.0の場合は、高精度なスクリーニングに適用可能と判断される。
【００４４】
本発明の方法は、非常に高い精度で鶏卵中のコレステロール含有量を測定することができる。例えば、コレステロール含有量決定工程において、PLS回帰分析法を用いて検量線を作成した場合、本発明の方法のRPDは、3以上である。それ故、本発明の方法を用いることにより、高精度なスクリーニングに適用可能な精度で鶏卵中のコレステロール含有量を測定することが可能となる。
【００４５】
＜2. 鶏卵中のコレステロール含有量測定装置＞
本発明はまた、鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置に関する。
図2は、本発明の方法を実施するための鶏卵中のコレステロール含有量を測定する装置の一実施形態を示す構成図である。図2に示すように、本発明の装置100は、鶏卵1に可視光線領域から近赤外線領域に属する波長を有する光を照射する光照射手段3と、光照射手段3によって照射された光が鶏卵1を透過するか又は鶏卵1内で反射することにより、鶏卵1外に放出される光を検出する光検出手段4と、光検出手段4によって検出された光の近赤外スペクトルを取得するスペクトル取得手段と、スペクトル取得手段で取得された近赤外スペクトルに基づき、鶏卵1中のコレステロール含有量を決定するコレステロール含有量決定手段とを含むことが必要である。前記の構成を有する本装置を使用することにより、本発明の鶏卵中のコレステロール含有量を測定する方法を実施することができる。
【００４６】
本発明の装置100は、鶏卵固定部材2を含むことが好ましい。本発明の装置100において、鶏卵1は、その下面が鶏卵固定部材2と接触するように鶏卵固定部材2の上面に載置される。鶏卵1は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように鶏卵固定部材2の上面に載置されることが好ましい。鶏卵固定部材2を含むことにより、本発明の装置によって近赤外スペクトルを測定する間、鶏卵1を前記の好ましい配置にすることができる。これにより、本発明の装置によって測定される鶏卵中のコレステロール含有量の精度を向上させることができる。
【００４７】
本発明の装置100は、鶏卵1、鶏卵固定部材2、光照射手段3及び光検出手段4を収容する収容部材5を含むことが好ましい。収容部材5は、暗箱のように外部の光を実質的に遮断できる部材であることが好ましい。収容部材5の内部に前記部材及び手段を収容することにより、外部の光の影響を実質的に抑制して鶏卵中のコレステロール含有量をより高精度で測定することができる。
【００４８】
光照射手段3は、ハロゲンランプ、発光ダイオード（LED）及びEverGloセラミックからなる群から選択される光照射素子であることが好ましい。光照射手段3は、例えば、光ファイバーケーブル等によって光源6と接続される。光源6は、前記で説明した所望の波長領域の光を発振するために使用される。照射光は、光源6で分光してもよく、光照射手段3で分光してもよい。
【００４９】
光検出手段4は、シリコン、PbS（硫化鉛）、InGaAs（インジウム・ガリウム・ヒ素）及びアーセナイドからなる群から選択される光検出素子であることが好ましい。光検出手段4は、例えば、光ファイバーケーブル等によって検出器7と接続される。検出器7は、前記で説明した所望の波長領域の光を検出するために使用される。
【００５０】
スペクトル取得手段は、検出器7を含む機器であって、光検出手段4によって検出された光に基づき近赤外スペクトルを生成するために使用される。スペクトル取得手段は、検出器7に加えて、光源6を含む分光機器8、例えば当該技術分野で通常使用される近赤外分光分析装置であることが好ましい。
【００５１】
コレステロール含有量決定手段は、スペクトル取得手段によって得られたスペクトルデータを記憶する記憶部と、スペクトルデータに基づき前記で説明した解析を実施するための演算処理部とを有する演算装置9であることが好ましい。
【００５２】
本発明の装置を用いて鶏卵中のコレステロール含有量を測定するときには、光照射手段及び光検出手段を鶏卵に対して様々な位置関係となるように配置することができる。本発明の装置を使用するときの実施形態を示す模式図を図3〜6に示す。
【００５３】
図3に示すように、本発明の装置101は、光照射手段13が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵11に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、鶏卵11の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、光検出手段14が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵11を透過することにより鶏卵11の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵11の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置されることができる（以下、「第一の実施形態」とも記載する）。このとき、鶏卵11の下面と接触するように鶏卵固定部材12が配置され、光照射手段13及び光検出手段14は、それぞれ光ファイバーケーブル15及び16によって光源及び検出器に接続される。鶏卵固定部材12には、光検出手段14によって鶏卵11の下方に放出された光を検出するために貫通孔が配設されることが好ましい。
【００５４】
また、図4に示すように、本発明の装置102は、光照射手段23が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵21に対し、該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵21の上方から卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、光検出手段24が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵21を透過することにより鶏卵21の下方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵21の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置されることもできる（以下、「第二の実施形態」とも記載する）。このとき、鶏卵21の下面と接触するように鶏卵固定部材22が配置され、光照射手段23及び光検出手段24は、それぞれ光ファイバーケーブル25及び26によって光源及び検出器に接続される。鶏卵固定部材22には、光検出手段24によって鶏卵21の下方に放出された光を検出するために貫通孔が配設されることが好ましい。
【００５５】
さらに、図5に示すように、本発明の装置103は、光照射手段33が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵31に対し、該長軸線を含む水平面と平行な面上において、鶏卵31の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、光検出手段34が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵31を透過することにより鶏卵31の側方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む水平面と平行な面上において、鶏卵31の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置されることもできる（以下、「第三の実施形態」とも記載する）。このとき、鶏卵31の下面と接触するように鶏卵固定部材32が配置され、光照射手段33及び光検出手段34は、それぞれ光ファイバーケーブル35及び36によって光源及び検出器に接続される。
【００５６】
或いは、図6に示すように、本発明の装置104は、光照射手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵41に対し、該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵41の上方から鶏卵41の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置され、光検出手段が、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように配置された鶏卵41の内部で反射することにより鶏卵41の上方に放出される光であって、且つ該長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵41の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置されることもできる（以下、「第四の実施形態」とも記載する）。このとき、鶏卵41の下面と接触するように鶏卵固定部材42が配置される。光照射手段及び光検出手段は、別々の素子として配置されてもよいが、図6に示すように、単一の光照射及び検出手段47として配置されることが好ましい。このとき、光照射及び検出手段47は、光ファイバーケーブル45によって光源及び分光・検出部に接続される。
【００５７】
前記で説明したように、本発明の方法によって鶏卵中のコレステロール含有量を測定するときには、鶏卵に対する光照射手段及び光検出手段の位置関係によって測定精度が変動し得る。本発明者らは、前記で説明した4種類の実施形態のうち、第一の実施形態の本発明の装置を用いて鶏卵中のコレステロール含有量を測定した場合、高い精度でコレステロール含有量を測定できることを見出した。それ故、本発明の装置は、第一の実施形態であることが好ましい。
【００５８】
以上詳細に説明したように、本発明の方法及び装置により、割卵することなく鶏卵中のコレステロール含有量を高精度で定量することが可能となる。それ故、本発明を適用することにより、GPセンターにおいて各鶏卵のコレステロール含有量の特定及びそれに基づく鶏卵の選別を効率的に実施することが可能となる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６０】
［近赤外スペクトルの測定装置］
以下の実験では、近赤外分光分析装置（NIRSystems社、現Foss社 Model-6500）を用いた。前記装置を用いて鶏卵中のコレステロール含有量を測定するときの模式図を図3に示す。図3に示すように、本装置101において、鶏卵11は、鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む面が水平面と平行となるように、試料固定台12上に載置した。光照射素子13は、鶏卵11の鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む水平面と平行な面上において、鶏卵11の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に光を照射するように配置した。光検出素子14は、鶏卵11を透過することにより鶏卵11の下方に放出される光であって、且つ鶏卵11の鈍端部と鋭端部とを結ぶ長軸線を含む垂直面と平行な面上において、鶏卵11の卵黄を通過するように該長軸線と直交する方向に放出される光を検出するように配置した。試料固定台12には、光検出素子14によって鶏卵11の下方に放出された光を検出するために貫通孔を配設した。光照射素子13及び光検出素子14は、それぞれ光ファイバーケーブル15及び16によって、暗箱の外に配置した光源及び検出器に接続した。
【００６１】
［近赤外スペクトルの測定］
畜産草地研究所で飼養されている白色レグホン種（58週齢）の産卵鶏が産卵した57個の鶏卵（卵重52 g〜60 g)を用いて、以下の実験を行った。
【００６２】
まず、それぞれの鶏卵の卵重を測定した。1個の鶏卵を、前記で説明した近赤外分光分析装置の暗箱の中に配置された試料固定台上に載置した。暗箱を閉鎖し、鶏卵の側方に配置した光照射素子から該鶏卵に対して可視光線領域から近赤外線領域（400〜1100 nm）に属する波長を有する光を照射した。試料固定台に配設された貫通孔の下方に配置された光検出素子によって、鶏卵の下方に放出された透過光を検出した。検出した透過光に基づき、可視光線領域から近赤外線領域（400〜1100 nm）の近赤外スペクトルを得た。前記測定後、鶏卵を、鈍端部と鋭端部とを結ぶ軸線を中心として90度回転させて、前記と同様の手順で近赤外スペクトルを得た。これにより、鶏卵1個あたり2個の近赤外スペクトルを得た。1回の近赤外スペクトルの測定時間は、約1.5分だった。得られた近赤外スペクトルの原スペクトルを図7Aに、原スペクトルを一次微分処理して得られた一次微分スペクトルを図7Bに、それぞれ示す。
【００６３】
［従来法によるコレステロール含有量の測定］
近赤外スペクトル測定後の鶏卵を割卵し、卵殻、卵白及び卵黄に分けた。それぞれの部分の重量を測定した。5 mlの1.0 M水酸化カリウムを含有するメタノール溶液と2.5 mlのイソプロピルアルコールとの混合溶液を用いて、0.25 mgの卵黄から脂溶性画分を抽出した。得られた脂溶性画分を70℃で30分間加熱して、脂肪酸をケン化した。ケン化後の画分を、メスフラスコを用いて定容した。従来法（非特許文献8）に基づき、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを用いてコレステロールを比色定量する分析キット（F-キット コレステロール、Roche社）を用いて、ケン化後の脂溶性画分に含まれるコレステロール含有量を測定した。用いた卵黄の重量から、卵黄100 gあたりのコレステロール含有量を算出した。また、卵黄100 gあたりのコレステロール含有量と卵黄の重量との積から、鶏卵1個あたりのコレステロール含有量を算出した。
【００６４】
［回帰分析によるコレステロール検量線の作成］
前記の手順で測定した2個の近赤外スペクトルのうち、波長614〜946 nm及び984〜1054 nmの領域の1次微分値を用いて検量線を作成した。検量線の作成には、Xの線形関数とYとの間の共分散が最大となるように複数の潜在因子を抽出するPLS（Partial least square）回帰分析法を用いた。得られた検量線について、クロスバリデーション法による推定を行った。前記の手順で得られた従来法によるコレステロール含有量の測定値と近赤外定量値との寄与率（RSQ=r2）、及び回帰推定からの標準誤差（SECV）を算出した。SECVに対する従来法による測定値の標準偏差の比であるRPD（Ratio of standard deviation of reference data in predicted sample set to SECV; SD/SECV）を指標として、得られた検量線に基づく定量分析の分析精度を判定した（Williams, PC., 2001年, Implementation of near-infrared technology., “Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries”, 第2版. p. 145-169., Williams, PC及びNorris KH編, American Association of Cereal Chemist Press, St. Paul, Minnesota)。従来法による卵黄100 gあたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の近赤外分光分析法によるコレステロール含有量の推定値との関係を図8に、従来法による鶏卵1個あたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の近赤外分光分析法によるコレステロール含有量の推定値との関係を図9に、それぞれ示す。図中、実線は回帰直線を、点線は95％信頼区間を示す。
【００６５】
図8に示すように、従来法による卵黄100 gあたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の近赤外分光分析法によるコレステロール含有量の推定値との間には高い相関が認められた。寄与率は0.885、検定による標準誤差は33、RPDは3.00となった。また、図9に示すように、従来法による鶏卵1個あたりのコレステロール含有量の測定値と本発明の近赤外分光分析法によるコレステロール含有量の推定値との間にも高い相関が認められた。この場合、寄与率は0.893、検定による標準誤差は7.117、RPDは3.08となった。
【００６６】
通常、近赤外分光分析法におけるRPDは、2.5以下の場合は分析精度が不良であり、2.5〜3.0の場合はラフな分析に適用可能と判断される。また、RPDが3.0〜5.0の場合は、高精度なスクリーニングに適用可能と判断される。前記のように、本発明の方法の場合、RPDは3.0〜5.0の範囲であった。それ故、本発明の方法は、高精度なスクリーニングに適用可能と判断される。
【符号の説明】
【００６７】
100, 101, 102, 103…鶏卵中のコレステロール含有量測定装置
1, 11, 21, 31, 41…鶏卵
2, 12, 22, 32, 42…鶏卵固定部材
3, 13, 23, 33…光照射手段
4, 14, 24, 34…光検出手段
5…収容部材
6…光源
7…検出器
8…分光機器
9…演算装置
15, 25, 35, 45, 16, 26, 36…光ファイバーケーブル
47…光照射及び検出手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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