(57)【要約】【課題】  架橋ゼラチン担体およびそれを用いた生理活性物質徐放担体に関し、粒子状などからなる架橋ゼラチンの表面荷電が、−３〜−５０ｍＶである負荷電のゼータ電位を有する架橋ゼラチン担体、および該担体に生理活性物質を吸着、保持してなる生理活性物質徐放担体を提供するものである。【解決手段】  架橋ゼラチンの表面が負荷電しており、エタノール中でのゼータ電位が−３〜−５０ｍＶであることを特徴とする。加熱による架橋処理が好ましく、さらにγ線照射による分解処理を施すことがより好ましい。架橋ゼラチン担体は、中実構造の単一粒子もしくは粒子凝集体であることが好ましい。表面のゼータ電位を特定範囲で変動させることで、所望の治療効果を発揮する量の生理活性物質を吸着、保持することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ゼラチンの表面が負荷電しており、エタノール中でのゼータ電位が−３〜−５０ｍＶであることを特徴とする架橋ゼラチン担体。
【請求項２】
架橋ゼラチンが加熱架橋されている請求項１記載の架橋ゼラチン担体。
【請求項３】
架橋ゼラチンがさらに分解処理されている請求項２記載の架橋ゼラチン担体。
【請求項４】
分解処理がγ線照射処理である請求項３記載の架橋ゼラチン担体。
【請求項５】
架橋ゼラチン担体が、中実構造の単一粒子もしくは粒子凝集体である請求項１記載の架橋ゼラチン担体。
【請求項６】
請求項１記載の架橋ゼラチン担体に、生理活性物質が吸着、保持されてなる生理活性物質徐放担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋ゼラチン担体およびそれを用いた生理活性物質徐放担体に関し、詳しくは粒子状などからなる架橋ゼラチンの表面荷電が、−３〜−５０ｍＶである負荷電のゼータ電位を有する架橋ゼラチン担体、および該担体に生理活性物質を吸着、保持してなる生理活性物質徐放担体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゼラチンは動物由来コラーゲンを酸やアルカリで処理して抽出したタンパク質であって、ゲル化剤としてゼリーなどの食品分野や、医薬品分野などに用いられており、また、接着剤分野やフィルム分野などの工業用途にも用いられるなど様々な分野で利用されてきた身近な材料である。これらの各種用途のうち、医療品用途に使用されている精製度の高いゼラチンやコラーゲンは日本薬局方にも収載されており、注射製剤用の添加物として、また肝臓癌用の塞栓材料や止血用スポンジ材、経口投与用のカプセル材などの製品に幅広く利用されているものである。
【０００３】
上記したように、ゼラチンは生体組織を構成するコラーゲンより抽出されているために、生体適合性および生体内分解性に非常に優れた材料である。さらに、ゼラチンは通常、水や温水に対して比較的容易に溶解する性質を有しており、架橋処理を施して不溶化させ、その不溶化の程度を制御することによって、生体内へ投与された際のゼラチンの生分解時間を制御できるという性質を有する。従って、薬剤などの生理活性物質などを架橋して不溶化されたゼラチンに予め吸着させておけば、生体内へ投与した場合に、ゼラチンの生分解による溶解などと共に生理活性物質が徐々に放出することができるので、生理活性物質を一定期間にわたって徐放させるという作用効果を発揮するものである。
【０００４】
特許文献１には生体適合性物質としてのゼラチンを水不溶化して多孔性粒子にした発明が開示されており、塞栓治療用や医薬製剤用担体として有用であるとの記載がある。つまり、この水不溶化多孔性粒子は多孔部分に生理食塩水や医薬品などの溶液を含浸、保持させるものであるが、多孔部分に含浸保持させるので、例えば、孔径や多孔度が変動すると吸着量も大きく変動してしまい、生理活性物質を徐放する担体としては、吸着量のコントロールが難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８７９０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
通常、架橋ゼラチンに薬剤などの生理活性物質を予め吸着させて、生理食塩水などで懸濁させたのち、生体内に投与して生理活性物質を徐放させる場合、生理活性物質の処方や治療目的に応じて、架橋ゼラチンへの生理活性物質の吸着量を制御、調整することが重要となる。
【０００７】
しかしながら、架橋ゼラチン担体が治療などに必要な生理活性物質の吸着量を有していないと、生体内に投与しても有効な治療効果を発揮できないと共に、生理活性物質を所望期間にわたって徐放することができないという問題が生じる。
【０００８】
本発明者らは、上記問題点を解決するために生体内での生分解時間を制御できる架橋ゼラチンを調製すると共に、生理活性物質の吸着量に影響を及ぼす要因について検討を行った結果、架橋ゼラチンの表面電荷が吸着量に大きく影響を及ぼしていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は架橋ゼラチンの表面が負荷電しており、エタノール中でのゼータ電位が−３〜−５０ｍＶであることを特徴とする架橋ゼラチン担体を提供するものである。
【００１０】
特に、架橋ゼラチンとしては一般的な化学架橋剤などによって化学的架橋処理を施されたものではなく、加熱処理によって物理的架橋されているものが好ましく、さらに架橋処理後にγ線照射処理を行うことによって分解処理を施したものが、より好ましいものである。
【００１１】
また、本発明は上記架橋ゼラチン担体に生理活性物質を吸着、保持させることによって、徐放性に優れた生理活性物質徐放担体を提供できるものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の架橋ゼラチン担体は、その表面電荷を負電荷、具体的にはエタノール中でのゼータ電位を−３〜−５０ｍＶの範囲内に調整することによって、生理活性物質の吸着、保持量を精度よく制御することができるという効果を発揮するものである。従って、架橋ゼラチン担体の表面荷電を特定のゼータ電位の範囲内で変動させることによって、所望する治療効果を発揮するように生理活性物質を徐放する徐放担体を得ることができるのである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例および比較例にて得た架橋ゼラチン担体の表面電荷（ゼータ電位）と、の生理活性物質としての成長因子の吸着率との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の架橋ゼラチン担体に用いるゼラチンは、その種類（由来）は特に限定されるものではない。例えば、牛骨由来、牛皮由来、豚骨由来、豚皮由来などの各種ゼラチンを用いることができる。
【００１５】
本発明の架橋ゼラチン担体は、ゼラチンを粒子状に成形したものを水系溶媒に対して不溶性にするために架橋処理してなるものであって、好ましくは一般的に用いられている架橋剤による化学的架橋処理ではなく、加熱処理による熱架橋を施したものが望ましい。即ち、架橋剤による化学的架橋処理を行った場合、架橋剤反応物や架橋剤の残渣がゼラチンに結合する可能性があり、このようにして得られた架橋ゼラチン担体を生体内に用いる場合には各種毒性などの検討も慎重に行わなければならず、使用できる架橋剤にも制限が生じることになる。
【００１６】
一方、加熱処理によって熱架橋した場合は、上記のような懸念はなく、また、架橋剤による架橋処理よりも穏和な条件下での架橋処理が行われるので、生分解性に影響するゼラチンの架橋度制御も比較的容易となる。従って、本発明のような架橋ゼラチン担体を熱架橋によって調製した場合には、架橋の程度を使用目的に応じて調整できるので、水溶液中や血管内で完全に溶解するまでの時間（生分解時間など）を容易に調整することができるのである。
【００１７】
本発明の架橋ゼラチン担体を粒子形状として得るためには、まず、Ｗ／Ｏ分散法や、マイクロリアクター法、スプレードライ法、噴霧凍結乾燥法、粉砕法などの公知の造粒法によって粒子形状のゼラチン担体を作製することができる。
【００１８】
次いで、得られたゼラチン担体は、一旦、送風乾燥や自然乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの乾燥手段を用いて乾燥させ、その後、１００〜２００℃、好ましくは１２０〜１８０℃の温度範囲で、２〜４８時間、好ましくは２〜８時間、加熱乾燥することによって熱架橋を施して、本発明の架橋ゼラチン担体をすることができるのである。但し、静置での加熱乾燥ではなく、攪拌や回転条件下での加熱乾燥の場合には、１５０〜１７０℃±５℃の温度範囲で、３〜５時間程度の加熱処理を行うことが好ましい。このとき、常圧下で乾燥させてもよいが、本来水溶性であるゼラチンは、大気中の酸素や水分などに影響を受けやすいので、再現性よく均一な加熱架橋を行うためには、真空下での加熱処理が好ましい。なお、本発明における真空下とは、絶対真空を０ｋＰａとすると、一般的な真空乾燥機にて達成できる１０ｋＰａ以下の範囲の圧力状態を意味するものである。
【００１９】
また、本発明における架橋ゼラチン担体は、上記したような架橋処理を施したのち、分解処理を施すことによって得ることもできる。このように分解処理を施した架橋ゼラチン担体は、分解処理によって担体表面の負電荷をさらに増大させることができるので、生理活性物質の吸着に効果的な担体表面のゼータ電位を−３〜−５０ｍＶの範囲内で所望の値に調整することができて好ましいものである。本発明における分解処理とは、γ線をはじめとした放射線照射や電子線照射などによる分解処理が挙げられ、好ましくは、製品包装後において最終滅菌処理としても利用できるγ線を用いることが実用上望ましいものである。γ線の照射量としては、１０〜５０ＫＧｙ程度が好ましいが、滅菌操作としても充分に対応できる２５〜５０ｋＧｙの範囲の照射量とすることが、架橋ゼラチン担体の表面のゼータ電位の調整する上でさらに好ましいものである。
【００２０】
上記のようにして得られる本発明の架橋ゼラチン担体は、何れの内部構造であってもよいが、表面ゼータ電位の調整を容易にするためには多孔質構造ではなく、中実構造の粒子が好ましく、さらに好ましくは中実構造の単一粒子もしくはこれらの複数粒子が凝集してなる粒子凝集体が望ましい。
【００２１】
つまり、多孔質構造の粒子であると比表面積が大きくなって、粒子内部の多孔質部内の表面電荷も本発明の効果に影響を及ぼすようになり、架橋ゼラチン担体として所望の表面ゼータ電位を制御しがたくなり、生理活性物質の吸着量（保持量）を所望の値に設定しがたくなる傾向を示す。従って、本発明の効果を確実に発揮させるためには、中実構造のゼラチン粒子を用いることが好ましいのである。
【００２２】
また、得られる架橋ゼラチン担体は、乾燥時における架橋ゼラチンの単一粒子の平均粒径が、５〜５０μｍ、好ましくは５〜２５μｍとすることが、ゼータ電位を本発明の範囲に制御して生理活性物質の吸着量のコントロールを可能とする点から望ましいものである。平均粒径が５μｍに満たない場合は、粒子が微小すぎるために体内に導入した場合の生分解性が速くなって本発明の効果を充分に発揮しにくくなる。従って、さらなる架橋する行うために過酷な架橋条件にする必要が生じ、ゼータ電位が中和側に移行してしまい、本発明の効果を充分に得られない傾向を示す。一方、平均粒径が５０μｍを超える場合には、粒子内部の電荷も本発明の効果に及ぼすようになって、架橋ゼラチン担体として本発明の効果を発揮させるようなゼータ電位に制御しがたくなる傾向を示して好ましくない。
【００２３】
なお、本発明における架橋ゼラチン担体は、上記のような架橋ゼラチンの単一粒子だけでなく、これらの複数粒子が凝集した粒子凝集体であってもよい。この場合の平均粒径は、２５〜５００μｍ、好ましくは５０〜２００μｍ程度の大きさであってもよい。
【００２４】
上記のようにして得られる本発明の架橋ゼラチン担体は、後述するように生理活性物質の吸着量の調整のためには、エタノール中にてゼータ電位を測定した場合の値が、−３〜−５０ｍＶとすることが重要であり、好ましくは−１０〜−４０ｍＶの範囲に調整することが好ましい。ゼータ電位が−３ｍＶを超えると、得られる架橋ゼラチン担体が電気的に中和状態に近くなり、生理活性物質を吸着する性能が弱まってしまい、充分な吸着性が得られない場合がある。一方、−５０ｍＶを下回ると、得られる架橋ゼラチン担体のゼータ電位の制御が不安定となって、安定な性能を有する架橋ゼラチン担体を得がたくなる傾向を示し、その結果、吸着保持している生理活性物質が有する目的とする効果を充分に発揮できない場合がある。
【００２５】
本発明におけるゼータ電位の測定は、次の通りである。乾燥させた粒子状の架橋ゼラチン担体を１ｍｇ/ｍｌとなるように秤量したのち、エタノール（試薬特級）１０ｍｌにて懸濁させ、これを試薬特級エタノールにて１００倍に希釈する。次に、得られた希釈懸濁液をゼータ電位測定装置を用いて２５℃にて測定した値を、本発明におけるゼータ電位とした。ゼータ電位測定装置としては、ゼータ電位・粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製、商品名：ＤｅｌｓａＮａｎｏ）や、ゼータ電位・粒径測定システム（大塚電子社製、商品名ＥＬＳＺ−１０００ＺＳ）、ゼータ電位測定装置（マルバーン社製、商品名：ゼータサイザーナノ）、超音波方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（日本ルフト社製、商品名：ＤＴ１２０２）、表面分析用ゼータ電位測定装置（アントンパール社製、商品名：ＳｕｒＰＡＳＳ）などの市販の装置を用いることができる。これらの装置の測定原理は、レーザードップラー多点検出方式電気泳動法や、レーザードップラー法（動的電気泳動光散乱法）、位相解析光散乱法、超音波振動電流法、流動電位・流動電流測定法などを採用しているが、何れの原理を用いてもよいものである。
【００２６】
本発明の架橋ゼラチン担体は、その表面の特定範囲のゼータ電位に調整された負荷電を利用して、生理活性物質を吸着、保持させて生理活性物質徐放担体を作製することができる。本発明において用いる生理活性物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、体内に投与することによって各種疾患を治療する目的で使用される各種薬剤や、インターフェロンやインターロイキンに代表されるサイトカイン類、各種成長因子（増殖因子）などを用いることができる。
【００２７】
上記の生理活性物質徐放担体は、その表面に生理活性物質を吸着させ、その表面もしくは内部に生理活性物質を保持させたものであり、生体に投与することで吸着保持した生理活性物質を生体内に徐放させて所望の効果を発揮するものである。生体への投与方法としては、例えば、生理食塩水などの溶媒に懸濁分散させたのち、これを生体の局所部位に筋肉注射して徐々に薬剤を徐放させる方法や、疾患患部近辺の血管を塞栓するように血管内に注入投与し、塞栓後に吸着している生理活性物質を患部に徐放させるなどの方法がある。これらの投与方法を行う場合には、注射用シリンジのほかカテーテルなどの公知の器具を用いることができる。
【００２８】
本発明における生理活性物質徐放担体を調製する方法としては、例えば注射器内に生理活性物質と共に、架橋ゼラチン担体を分散、充填して吸着することができるほか、予め注射器内に架橋ゼラチン担体だけを充填しておき、使用時に生理食塩水を注射器内に吸入して架橋ゼラチン担体を分散させたり、バイヤル内に架橋ゼラチン担体を充填しておき、使用時に生理食塩水を投入してゼラチン粒子を分散させ、これを注射器内に吸入する場合などの態様、いわゆる用時調製することもできる。
【００２９】
なお、生体内に投与された架橋ゼラチン担体は、生体内で徐々に生分解しながら吸着保持している生理活性物質を徐放するが、架橋ゼラチン担体を得る際の架橋条件を調整することによって生分解時間を調整することができ、その結果として生理活性物質の徐放時間を調整することができる。具体的には、筋肉内にて２週間程度の徐放期間に設定する場合には、ゼラチンを架橋する工程での加熱条件としては、１００〜１８０℃で１〜２４時間とすることが好ましい。なお、架橋工程では加熱操作を行うので、架橋ゼラチン担体が酸化変性する恐れがある場合は、酸素の影響を抑制するために減圧下や不活性ガス雰囲気下で架橋工程を行うことが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。なお、本発明は実施例の記載によって限定されるものではなく、技術思想を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
【００３１】
＜実施例１＞
ゼラチン（豚皮由来、ゼリー強度１００ｇ（ＪＩＳ  Ｋ６５０３に準じる））５ｇを、４０℃の水１００ｍｌに溶解したのち、プラスチック容器に充填した。このゼラチン水溶液を２〜１０℃の温度下で１７時間放置してゲル化させたのち、−８０℃にて凍結させた。次いで、凍結乾燥機にて１０ｋＰａ以下の真空下で乾燥させてシート状物を得、これを粉砕用ミルにて粉砕し、２５μｍ、６３μｍおよび１７００μｍの篩を用いて粒子径を整えて、２５μｍ以下、および６３〜１７００μｍの平均粒径を有するゼラチン粉砕粒子を得た。
【００３２】
次に、各ゼラチン粉砕粒子を小型ドラム式真空乾燥機（愛知電機社製、商品名：ＢＨＲ−０．５型）にて、真空下（５ｋＰａ以下）で、１８回／分の速度で回転させた状態にして１５０℃（±５℃）で４時間加熱処理を施して、本発明の架橋ゼラチン担体を得た。
【００３３】
＜実施例２＞
実施例１において、加熱処理を１７０℃（±５℃）、４時間とした以外は、実施例１と同様にして架橋ゼラチン担体を得た。
【００３４】
＜実施例３＞
実施例１にて得られた架橋ゼラチン担体を、大気中で常圧下にてプラスチック容器に入れてアルミニウム包装したのち、γ線２５ｋＧｙを照射し、分解処理を施した架橋ゼラチン担体を得た。
【００３５】
＜比較例１＞
実施例１において、加熱処理温度を１７０℃（±５℃）とした以外は、実施例１と同様にしてγ線照射処理（分解処理）を施した架橋ゼラチン担体を得た。
【００３６】
上記実施例および比較例にて得られた架橋ゼラチン担体のうち、２５μｍ以下の平均粒径のものは、ゼータ電位測定用として用い、６３〜１７００μｍの平均粒径のものは生理活性物質の吸着量測定用に用い、測定結果を表１および図１に示した。なお、吸着量測定操作において、架橋ゼラチン担体に生理活性物質を含浸後、生理食塩水に懸濁させ、架橋ゼラチン担体に吸着されなかった分を上澄みとして回収し、それを測定液とした。測定液に微粉末が混入することを避けるために、６３〜１７００μｍの平均粒径の架橋ゼラチンを吸着量測定に用いた。
【００３７】
上記実施例品および比較例品の架橋ゼラチン担体のゼータ電位の測定、および生理活性物質吸着量の測定は、以下の方法にて測定した。
【００３８】
＜ゼータ電位測定＞
各実施例品および比較例品の架橋ゼラチン担体を乾燥状態にし、平均粒径２５μｍ以下のものを、１ｍｇ/ｍｌとなるように秤量したのち、これをエタノール（試薬特級）にて１００倍に希釈、懸濁させた。得られた懸濁液をゼータ電位・粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製、商品名：ＤｅｌｓａＮａｎｏ）を用いて２５℃にて測定した。
【００３９】
＜生理活性物質吸着量の測定＞
生理活性物質としての分子量約１７，０００の成長因子および分子量３１９．８５の色素（メチレンブルー）を用いて、以下のように架橋ゼラチン担体に対する吸着量を測定した。
【００４０】
成長因子の吸着量測定
生理活性物質としての各成長因子を生理食塩水中に０．１４ｍｇ／ｍｌ濃度になるように調製し、生理活性物質水溶液を調製した。検量線用に０．０２８ｍｇ／ｍｌ、０．０５６ｍｇ／ｍｌ、０．０８４ｍｇ／ｍｌ、０．１１ｍｇ／ｍｌおよび０．１４ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう生理活性物質水溶液を希釈した。
【００４１】
生理活性物質としての成長因子吸着量の測定のために、各実施例品および比較例品の架橋ゼラチン担体を０．０２５ｇずつ量りとった。次に、これらの架橋ゼラチン担体に、０．１４ｍｇ／ｍｌ濃度の生理活性物質水溶液をそれぞれ０．３５ｍｌずつ添加し、なるべく架橋ゼラチン担体全体に水溶液が行き渡るようにして、４０℃で１時間静置した。そののち、０．６５ｍｌの生理食塩水を添加し、上澄み液を濾紙にて濾過して、上澄み液を高速液体クロマトグラフィーにて吸光度を測定した。予め作成しておいた検量線グラフから、上澄み液中の生理活性物質の濃度を求め、初期の生理活性物質添加量を１００％として、吸着率を算出した。
【００４２】
色素（メチレンブルー）の吸着量測定
生理活性物質としての各色素（メチレンブルー）を精製水中に０．５重量％濃度になるように調製し、生理活性物質水溶液を調製した。検量線用に０．００００５重量％、０．０００２５重量％、０．０００５０重量％、および０．０００７５重量％の濃度になるよう生理活性物質水溶液を希釈した。
【００４３】
生理活性物質としての色素吸着量の測定のために、各実施例品および比較例品の架橋ゼラチン担体を０．０４ｇずつ量りとった。次に、これらの架橋ゼラチン担体に、０．０５重量％濃度の生理活性物質水溶液をそれぞれ０．５ｍｌずつ添加し、なるべく架橋ゼラチン担体全体に水溶液が行き渡るようにして、室温下１時間静置した。そののち、４．５ｍｌの精製水を添加し、上澄み液を濾紙にて濾過して、上澄み液を吸光度測定器にて吸光度を測定した。予め作成しておいた検量線グラフから、上澄み液中の生理活性物質の濃度を求め、初期の生理活性物質添加量を１００％として、吸着率を算出した。
【００４４】
【表１】
2014210757.tif 000003
【００４５】
表１および図１の結果から明らかなように、架橋ゼラチン担体表面のゼータ電位が−３〜−５０ｍＶの範囲内であると、ゼータ電位の増減に合わせて生理活性物質の吸着率（吸着量）が規則的に変動することが分かる。従って、架橋ゼラチン担体に吸着・保持させる生理活性物質の目的に応じて、架橋ゼラチン担体表面のデータ電位を変動させることで所望の効果を発揮できることが明らかである。
なお、エタノール中でのゼータ電位を−３ｍＶよりも大きくした架橋ゼラチン担体を得るために、ゼラチン担体を架橋する際に加熱温度を１８０℃以上にしたが、ゼラチン担体の黄変が激しくなり、本発明の用途としての塞栓用途や生理活性物質徐放用途には適しないものであった。一方、エタノール中のゼータ電位を−５０ｍＶよりも小さくした比較例１品では、生理活性物質の吸着量が低下してしまい、本発明の架橋ゼラチン担体の性能を充分に満たす架橋ゼラチン担体を得ることができなかった。
【図１】
2014210757.tif 000004