(57)【要約】      （修正有）【課題】ケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium  globosum  species  group）を迅速かつ正確に検出する方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法。（ａ）特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。（ｂ）特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium globosum  species  group）の検出を行う、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在するInternal  Transcribed  Spacer領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・グロボーサム関連種群のInternal  Transcribed  Spacer領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記ケトミウム・グロボーサム関連種群に、ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）及びケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）が含まれる、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）及びケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）からなる群より選ばれる少なくとも１種を検出する、請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
前記ケトミウム・グロボーサム関連種群のInternal  Transcribed  Spacer領域の部分塩基配列が下記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかである、請求項１〜５のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のInternal  Transcribed  Spacer領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項７】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium globosum  species  group）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつつケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium globosum  species  group）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、請求項７記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項７又は８記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｃ）配列番号３に記載のInternal  Transcribed  Spacer領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項１０】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium globosum  species  group）検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケトミウム・グロボーサム関連種群（Chaetomium globosum  species  group）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌の一種であるケトミウム（Chaetomium）属の菌類は、自然界に広く分布し、食品や飲料の変敗に関与することが知られている。このうち、ケトミウム属菌類の１種であるケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）は飲食品事故の原因菌として知られている。また、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）は、ケトミウム・グロボーサムとは最低生育温度やコロニーの色調が異なるが、子のう胞子の形態を比較すると極めて類似性が高く、かつ分子系統的に単一の分岐を形成するため、容易に識別できないことが知られている。これら近縁性の極めて高い２種を含め、分子系統的にケトミウム・グロボーサムと非常に近縁にある種を纏めてケトミウム・グロボーサム関連種群と呼ばれることが知られている。
飲食品製造において、内容物（飲食品自体）やその原材料だけではなく、製造装置、製造環境、包装容器等に関しても殺菌処理が行われる。内容物やその原材料に関しては加熱殺菌を行うが、製造環境、製造設備、包装容器等に関しては薬剤による殺菌等種々の殺菌法が提案されている。その１つである無菌充填方式は、製造環境、製造設備、包装容器等を過酢酸等を用いて殺菌し、加熱殺菌を行った内容物を充填し製品の商業的無菌性を担保するものである。
ここで、ケトミウム・グロボーサムは、無菌充填方式で用いられる殺菌剤の１種である過酢酸に対し耐性を有することが知られており、過酢酸を用いて滅菌、殺菌を行う飲食品製造においてケトミウム・グロボーサムは最重要危害菌に位置付けられている。上記のように、ケトミウム・グロボーサム、及びケトミウム・グロボーサムの子のう胞子の形態との類似性が極めて高く分子系統的に極めて近縁なケトミウム・クルエンタムなど、ケトミウム・グロボーサム及びその近縁種（本明細書において、「ケトミウム・グロボーサム関連種群」ともいう）は遺伝的な類縁性が高く、かつ加工食品の重要な原料であるオオムギやコムギ、さらにはキュウリ、ヨモギなどの食用植物からの検出報告があるため、ケトミウム・グロボーサム関連種群の漏れのない検出が食品の微生物制御の観点では極めて重要である。
【０００３】
ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法、及び他の種との識別方法は、培養を用いた形態学的な分類が主となっている。この方法は形態学的な特徴が確認できるまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などにより損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出・識別結果の正確性に問題があった。
このように真菌の検出に長期間を要し、さらには他の種群との識別結果の正確性に問題がある形態学的な方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
【０００４】
特許文献１には、ケトミウム属の菌類のゲノムＤＮＡ中の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅することにより、ケトミウム属の菌類を検出する方法が記載されている。しかし、特許文献１記載の方法はケトミウム属の菌類を属レベルで検出することはできるが、ケトミウム・グロボーサム関連種群のみを検出することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲食品の無菌充填方式はホットパック充填方式と異なり、包装容器を加熱しないため、包装容器には耐熱性が求められない。したがって、過酢酸や過酸化水素を用いて製造環境、製造設備、包装容器等を殺菌する無菌充填方式を導入することにより、包装容器の肉薄化が可能になり、生産コストの減少や、包装容器運搬に係るコストの低減及びＣＯ2排出量の低下が実現できる。したがって、過酢酸耐性を有し、無菌充填方式における危害菌であるケトミウム・グロボーサム及びその近縁種の迅速かつ正確な検出が、特に飲食品業界において強く望まれている。
さらに、ケトミウム・グロボーサムを始めとする真菌の過酢酸耐性は、菌種により強さ、すなわち無菌充填方式における危害性が大きく異なる。したがって、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、ケトミウム・グロボーサム及びその近縁種を迅速かつ正確に検出することが重要となる。
【０００７】
本発明は、飲食品業界などにおいて危害菌とされているケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出する方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のようにケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法ではケトミウム・グロボーサム関連種群に対する特異性が低く、擬陽性や擬陰性の結果となる可能性が高い点が挙げられる。これは、ケトミウム・グロボーサム関連種群の遺伝子のデータベースが現在のところ脆弱であり、ケトミウム・グロボーサム関連種群に保存されている遺伝子領域が正確に解析されていないために、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることなどが原因であると考えた。
【０００９】
このような課題に鑑み、本発明者等は、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、ケトミウム・グロボーサム関連種群の１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在する内部転写スペーサー（Internal  Transcribed  Spacer、以下、本明細書において「ＩＴＳ」ともいう）領域の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【００１０】
本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００１１】
また、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・グロボーサム関連種群検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法は、飲食品の汚染事故の原因菌の１種であるケトミウム・グロボーサム、及びケトミウム・グロボーサムとITS領域の塩基配列に基づき作成した系統樹では分子系統的に単一の分岐を形成するケトミウム・グロボーサムの関連種を漏れなく迅速かつ正確に検出することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ケトミウム属真菌のＩＴＳ領域の塩基配列に基づいて作成した、ケトミウム属真菌の分子系統樹を示す図である。
【図２】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図３】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ケトミウム・グロボーサム関連種群の１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在するＩＴＳ領域の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するケトミウム・グロボーサム関連種群に特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行い、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、ＩＴＳ領域の塩基配列中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。
【００１５】
本発明における「ケトミウム・グロボーサム関連種群」とは、ケトミウム・グロボーサムの他、ケトミウム・グロボーサムのタイプストレインと子のう胞子の形態や発芽孔の構造など、形態学的に多くの共通点を有し、分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹においてケトミウム・グロボーサムを含む単系統の分岐群を形成する菌種群を意味する。ケトミウム・グロボーサム関連種群は、子のう胞子が楕円形であり、発芽孔が片方に存在する、という構造的な共通点を有する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining  method）、最大節約法（Maximum  parsimony）、最尤法（Maximum  likelihood  estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted  Pair  Group  Method  with  Arithmetic  mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。また、本発明において、ケトミウム属真菌のＩＴＳ領域の塩基配列に基づいて分子系統樹を作成することが好ましい。
本発明において、「ケトミウム・グロボーサム関連種群」には、前記ケトミウム・グロボーサム及びケトミウム・クルエンタムの他、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）及びケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）が含まれる。
【００１６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１７】
本発明の検出方法は、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の塩基配列中の可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
発明者等は、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、ＩＴＳ領域の塩基配列中に同一のグループ内では保存性が高いが異なるグループ間で塩基配列の保存性が低く、グループによって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてケトミウム・グロボーサム関連種群はグループ固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
【００１８】
本発明の検出方法は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
前記オリゴヌクレオチド対を使用してケトミウム・グロボーサム関連種群を検出し、他の菌種群と識別することが可能となる。
【００１９】
ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の塩基配列中の可変部位を配列番号３に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号３に記載の塩基配列は、ケトミウム・グロボーサムNBRC6310株の１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在するＩＴＳ領域の部分塩基配列を示す。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Chae3Fともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Chae3Rともいう）はそれぞれ、配列番号３に記載の塩基配列のうち１９位〜３８位までの領域及び１５７位〜１７６位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はケトミウム・グロボーサム関連種群が固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればケトミウム・グロボーサム関連種群に特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりケトミウム・グロボーサム関連種群を検出することが可能となる。
【００２０】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｃ）配列番号３に記載のＩＴＳ領域の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００２１】
本発明の検出方法に用いる前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できれば、配列番号１又は２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１又は２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２２】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２３】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、ケトミウム・グロボーサム関連種群の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００２４】
前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２５】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。
【００２６】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでケトミウム・グロボーサム関連種群を検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００２７】
本発明の検出方法において、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するために、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
被検体中のケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に単分岐内の菌種を漏れなく検出することが出来る。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００２８】
本発明の検出方法において、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行うため、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００２９】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列（好ましくは、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行うのが好ましい。ここで、本発明における「ケトミウム・グロボーサム関連種群」は、分類学上の分類に関わらず、配列番号３に記載のＩＴＳ領域の部分塩基配列を有するものの他、配列番号３に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列、又は、配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をＩＴＳ領域に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸又はその一部を増幅でき、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をケトミウム・グロボーサム関連種群検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３０】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で１０秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃以上（好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上）６０℃以下（好ましくは５８℃以下、より好ましくは５６℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
【００３１】
本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にケトミウム・グロボーサム関連種群が含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約150bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。
【００３２】
本発明において、前記オリゴヌクレオチド対を用いて被検体のＩＴＳ領域の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかに含まれるか否かを確認することで、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・グロボーサム関連種群を検出することもできる。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するＩＴＳ領域の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、その一致又は相違に基づいて前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行うものである。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をケトミウム・グロボーサム関連種群と同定することができる。このようにして、ケトミウム・グロボーサム関連種群を迅速かつ正確に検出することができる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００３３】
本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００３４】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００３５】
本発明のケトミウム・グロボーサム関連種群検出キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出反応が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
本発明の方法により、迅速かつ正確にケトミウム・グロボーサム関連種群を一括して検出することができる。前述の通り、ケトミウム・グロボーサム関連種群は形態学的に多くの共通点を有する。従って、分子系統的に安定した単系統の分岐群を形成する群に属する菌類を一括して検出できることは、系統分類学の分野において非常に有用である。
【００３７】
また、本発明の方法により、ケトミウム・グロボーサム、ケトミウム・クルエンタム、ケトミウム・アンデュラチュラム、ケトミウム・スバフィン、ケトミウム・レクタングラー、ケトミウム・エラタム、ケトミウム・インターラプタム、ケトミウム・メガロカルパム及びケトミウム・グランデからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出することもできる。
ケトミウム・グロボーサム関連種群のうち、ケトミウム・グロボーサムは、酸性食品、乳製品、甘味食品からの検出例の報告の多い過酢酸耐性菌類である。ここで、「過酢酸耐性菌類」とは、無菌充填飲食品の事故報告がある菌種又は無菌充填飲食品の事故を起こし得る菌種であり、かつ１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも生残する菌類を指す。具体的には、前記条件下の過酢酸殺菌によっても、日本の食品業界において広く用いられる、商業的無菌を意味する殺菌である６Ｄ殺菌（初発菌数を1／1000000に低減する殺菌）を確保することが出来ない菌類を指す。なお、ケトミウム・グロボーサム関連種群のうち、食品又は飲料の生産現場で危害菌として検出されたとの報告があるのはケトミウム・グロボーサムだけである。従って、例えば、製造環境の殺菌に過酢酸殺菌を用いる食品や飲料においてカビによる事故が起こった場合、本発明を実施することで、危害菌すなわちケトミウム・グロボーサムの検出を迅速かつ正確に行うことが可能となる。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、ケトミウム・グロボーサム関連種群検出キット、使用、並びに方法を開示する。
【００３９】
＜１＞下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００４０】
＜２＞検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・グロボーサム関連種群の１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在するＩＴＳ領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、前記＜１＞項記載の検出方法。
＜３＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞前記ケトミウム・グロボーサム関連種群に、ケトミウム・グロボーサム、ケトミウム・クルエンタム、ケトミウム・アンデュラチュラム、ケトミウム・スバフィン、ケトミウム・レクタングラー、ケトミウム・エラタム、ケトミウム・インターラプタム、ケトミウム・メガロカルパム及びケトミウム・グランデが含まれる、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の検出方法。
＜５＞ケトミウム・グロボーサム、ケトミウム・クルエンタム、ケトミウム・アンデュラチュラム、ケトミウム・スバフィン、ケトミウム・レクタングラー、ケトミウム・エラタム、ケトミウム・インターラプタム、ケトミウム・メガロカルパム及びケトミウム・グランデからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の検出方法。
＜６＞前記ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列が下記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかである、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のＩＴＳ領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・グロボーサム関連種群の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００４１】
＜７＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
【００４２】
＜８＞前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、前記＜７＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜９＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜７＞又は＜８＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１０＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・グロボーサム関連種群を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜９＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【００４３】
＜１１＞前記＜７＞〜＜１０＞のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・グロボーサム関連種群検出キット。
【００４４】
＜１２＞ケトミウム・グロボーサム関連種群検出用核酸プライマーとしての、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１３＞ケトミウム・グロボーサム関連種群検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１４＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをケトミウム・グロボーサム関連種群検出用核酸プライマーとして使用する方法。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
試験例１  ケトミウム属に属する菌類の分子系統樹の作成
下記の方法により、ケトミウム属に属する菌類各種（ケトミウム・グロボーサム、ケトミウム・クルエンタム、ケトミウム・アンデュラチュラム、ケトミウム・スバフィン、ケトミウム・レクタングラー、ケトミウム・エラタム、ケトミウム・インターラプタム、ケトミウム・メガロカルパム、ケトミウム・グランデ、ケトミウム・ヒスパリカム（Chaetomium hispanicum）、ケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）、ケトミウム・インディカム（Chaetomium indicum）、ケトミウム・アトロブランネウム（Chaetomium atrobrunneum）、ケトミウム・ニグリコーラ（Chaetomium nigricolor）、ケトミウム・ムロラム（Chaetomium murorum）、ケトミウム・クリスパタム（Chaetomium crispatum）、ケトミウム・サーモフィルス（Chaetomium thermophilum）など）のＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。
【００４７】
ポテトデキストロース（PDA培地、Difco社製）寒天斜面培地を用いて、The  Centraalbureau  voor  Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、及びThe  CABI  Bioscience  Fungal  Reference  Collectionが保管しIMIナンバーにより管理されている株などを２５℃で７日間暗所培養し、各種菌体から、Genとるくん（商品名、タカラバイオ社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。
目的とする部位のPCR増幅は、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD)を用いて、プライマーとして、ITS4（5'-tcctccgcttattgatatg-3'：配列番号４）、及びITS1（5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'：配列番号５）又はITS5（5'-ggaagtaaaagtaacaagg-3'：配列番号６）(White  T．J.，Bruns  T．D.，Lee  S．B.，Taylor  J．W.，Amplification  and  direct  sequencing  of  fungal  ribosomal  DNA  for  phylogenetics；Innis  M．A.，Gelfan  D．H.，Sninsky  J．J.，White  T．J.（eds），PCR  Protocols：A  Guide  to  the  Methods  and  Application，San  Diego：Academic  Press，p．315-322，1990）を使用した。増幅条件は、熱変性：９５℃１分、アニーリング５５℃１分、伸長反応７２℃１分、３５サイクルで実施した。PCR産物は、Auto  SegTM  G-50（Amersham  Pharmacia  Biotech社製）を使用し精製し、ラベル化は、BigDye  terminator  Ver．3.1（商品名、Applied  Biosystems社製）を使用し、ABI  PRISM  3130  Genetic  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエア‘ATGC  Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したケトミウム属菌類各種や、DNA  data  bank  of  Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）から入手した各種ケトミウム属菌類及び類縁菌（チーラビア・アウランティアカ（Thielavia aurantiaca）、チーラビア・アレナリア（Thielavia arenaria）、チーラビア・クワイテンシス（Thielavia kuwaitensis）、チーラビア・ミヌタ（Thielavia minuta）、チーラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、チーラビア・テリコラ（Thielavia terricola）及びチーラビア・トルトウス（Thielavia tortuosa）等）のＩＴＳ領域の部分塩基配列情報をもとに、Clustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、NJ-Protを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
【００４８】
図１に示すように、分子系統樹の各分岐の安定性やケトミウム・グロボーサムのＩＴＳ領域の塩基配列の相同性から、薬剤耐性の高いケトミウム・グロボーサムと、これと類縁性が極めて高いグループ（ケトミウム・グロボーサム関連種群）の菌種を特定した。その結果、ケトミウム・グロボーサム関連種群には、ケトミウム・グロボーサムだけではなく、ケトミウム・クルエンタム、ケトミウム・アンデュラチュラム、ケトミウム・スバフィン、ケトミウム・レクタングラー、ケトミウム・エラタム、ケトミウム・インターラプタム、ケトミウム・メガロカルパム、ケトミウム・グランデが含まれることが明らかとなった。
【００４９】
試験例２  ケトミウム・グロボーサム関連種群に特異的なＩＴＳ領域の部分塩基配列の解析
上記の方法により決定したケトミウム属真菌各種や、各種菌類の公知のＩＴＳ領域の塩基配列情報をもとに、Clustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、ケトミウム・グロボーサム関連種群に特異的な塩基配列（Chae3F：aaccagcggagggatcatta（配列番号１）、Chae3R：aattatcaagagtttggtga（配列番号２））を決定した。
【００５０】
実施例
（１）プライマーの設計
上記で決定したケトミウム・グロボーサム関連種群に特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Chae3Fプライマー）及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Chae3Rプライマー）を設計し、シグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
【００５１】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちケトミウム・グロボーサム関連種群とその他のケトミウム属菌類、並びに飲食品での事故事例で報告されている真菌等としては、表１及び２に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、及びThe  Centraalbureau  voor  Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて各菌の至適温度で７日間培養した。
【００５２】
【表１】
2014018092.tif 000002
【００５３】
【表２】
2014018092.tif 000003
【００５４】
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan  ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。
【００５５】
（３）ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre  Mix  Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Chae3Fプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びChae3Rプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５５℃、１分間のアニーリング反応、および(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。
【００５６】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic  Acid  sample  loading  buffer  ５×（BIO  RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２０分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図２及び３に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図２は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図３は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００５７】
その結果、ケトミウム・グロボーサム関連種群のゲノムＤＮＡを含む試料では、約150bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、ケトミウム・グロボーサム関連種群以外のケトミウム属真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、ケトミウム・グロボーサム関連種群を特異的に検出することができる。
【００５８】
上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ケトミウム・グロボーサム関連種群のＩＴＳ領域の部分塩基配列の存在を確認することができケトミウム・グロボーサム関連種群を特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、より迅速かつより正確にケトミウム・グロボーサム関連種群を一括して検出することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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