(57)【要約】【課題】前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤の提供。【解決手段】ＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）に存在し、ＡＲによる転写活性を調節するＯｃｔ１遺伝子結合配列の特異的な塩基配列を認識して結合する新規のＰＩポリアミドを得た。これにより、該ＰＩポリアミドを有効成分とするＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤や、前立腺癌の予防および／または治療剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部に結合するピロール−イミダゾールポリアミド。
【請求項２】
次の式１〜３のいずれかに示される、請求項１に記載のピロール−イミダゾールポリアミド。
［式１］
2014173032.tif 000016
［式２］
2014173032.tif 000017
［式３］
2014173032.tif 000018
【請求項３】
請求項１または２に記載のピロール−イミダゾールポリアミドを有効成分として含む、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のピロール−イミダゾールポリアミドを有効成分として含む前立腺癌の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のピロール−イミダゾール  ポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す場合がある）に関する。さらに詳しくは、アンドロゲン応答遺伝子であるＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）を認識して結合することにより、この遺伝子の発現を抑制する新規のＰＩポリアミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンのひとつであるアンドロゲンと、この受容体であるアンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ、以下、ＡＲと示す場合がある）は、前立腺細胞において、その増殖、さらには癌化に密接に関与していることが知られている。
そこで、前立腺癌の治療法のひとつとして、ＡＲの作用を抑制することにより、前立腺癌の進行を抑制させるアンドロゲン除去療法が行われてきた。しかし、治療が進むに従って、癌化した前立腺細胞の形質が変化するため効果がなくなり、その後の治療が困難であるという問題があった。
【０００３】
また、ＡＲを発現している前立腺癌細胞が、アンドロゲン応答遺伝子の発現を亢進していることから、アンドロゲン応答遺伝子に対し干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することによって前立腺癌を治療する方法や、癌化した細胞に細胞毒性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを投与することによって前立腺癌を治療する方法等も開示されている（特許文献１〜４）。
しかし、干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸は生体内で分解され易いため安定性が低く、生体内において細胞毒性遺伝子産物を発現させる方法も必ずしも安全とはいえないため、これらの治療方法は前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、前立腺癌の治療に有効であり、かつ、安定で安全な物質を得るために、ＤＮＡに配列特異的に結合し、生体内での安定性が高く、組織、細胞への移行性が高いＰＩポリアミドに着目した（非特許文献１）。ＰＩポリアミドは、芳香族アミノ酸であるＮ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｅ（Ｎ−メチルピロール、以下、Ｐｙと示す場合がある）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｎ−メチルイミダゾール、以下、Ｉｍと示す場合がある）で構成される物質である。
本発明者らは、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＰＲ２と、転写制御因子であるＥＴＳ  ｆａｍｉｌｙのＥＧＲ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するＰＩポリアミドを開発した（特願２０１２−１０６３８２）。本発明者らが開発したこのＰＩポリアミドは、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制し、この融合遺伝子の発現に伴って起こるＥＺＨ２遺伝子の発現も抑制できるＰＩポリアミドであることから、前立腺癌の予防、治療等に有用なものであった。
【０００５】
さらに、本発明者らは、網羅的な前立腺癌の予防、治療等を可能とすることを目的として、本発明においてアンドロゲン応答遺伝子の一つであるＡＣＳＬ３遺伝子に対し、有用なＰＩポリアミドの開発を試みた。ＡＣＳＬ３遺伝子は、長鎖脂肪酸の代謝に関連するアンドロゲン応答遺伝子で、前立腺癌に高発現することが知られているが、本発明者らは、さらに前立腺癌細胞の増殖と遊走能を亢進させることを見出している。
本発明者らは、ＡＣＳＬ３遺伝子の転写開始点上流６３Ｋｂに転写調節領域（ＡＲ応答領域）が存在し、ＡＲが遺伝子に結合する部位（ＡＲ応答配列、以下、ＡＲＥと示す場合がある）の近傍に転写因子としてＯｃｔ１遺伝子結合配列およびＧＡＴＡ遺伝子結合配列が存在していることを見出した。そして、このＯｃｔ１遺伝子結合配列がＡＲの転写活性を正に亢進させる、前立腺癌の予後不良因子であることを見出した（非特許文献２）。
そこで、本発明において、このＯｃｔ１遺伝子結合配列に特異的に結合するＰＩポリアミドを開発し、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現を抑制することにより、前立腺癌の予防、治療等に有用なＰＩポリアミドの開発を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５０５４４６号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１８５５２号公報
【特許文献３】特表２００９−５０７４９２号公報
【特許文献４】特表２０１０−５３２６６３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｍｌｉｎｓ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６４４−６４８，  ２００５
【非特許文献２】Ｄａｉｓｕｋｅ  Ｏｂｉｎａｔａ，ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １３０：１０２１−１０２８，２０１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）に存在し、ＡＲによる転写活性を調節するＯｃｔ１遺伝子結合配列の特異的な塩基配列を認識して結合する新規のＰＩポリアミドを得るに至った。
本発明者らは、本発明において、このＰＩポリアミドが、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現を抑制し、また、ＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性を抑制するとともに、前立腺癌の予防、治療等に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（４）のＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とするＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤、前立腺癌の予防または治療剤等に関する。
（１）配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部に結合するピロール−イミダゾールポリアミド。
（２）次の式１〜３のいずれかに示される、上記（１）に記載のピロール−イミダゾールポリアミド。
［式１］
2014173032.tif 000002
［式２］
2014173032.tif 000003
［式３］
2014173032.tif 000004
（３）上記（１）または（２）に記載のピロール−イミダゾールポリアミドを有効成分として含む、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤。
（４）上記（１）または（２）に記載のピロール−イミダゾールポリアミドを有効成分として含む前立腺癌の予防または治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。生体内での安定性が高く、組織、細胞への移行性も高い、本発明のＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤は、前立腺癌の予防、治療に効果的な薬剤となり得る。
また、本発明者らが開発している、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＰＲ２と、転写制御因子であるＥＴＳ  ｆａｍｉｌｙのＥＧＲ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するＰＩポリアミド（特願２０１２−１０６３８２）と組み合わせることにより、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＯｃｔ１遺伝子結合配列（ＯＣＴ１（Ｎｏ．１）、ＯＣＴ１（Ｎｏ．２））、ＡＲＥ（ＡＲＥ（Ｎｏ．１）、ＡＲＥ（Ｎｏ．２））、ＧＡＴＡ遺伝子結合配列（ＧＡＴＡ）の各塩基配列、およびＯｃｔ１遺伝子結合配列（ＯＣＴ１（Ｎｏ．２））の塩基配列の全部または一部に対するＰＩポリアミドの結合部位（Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）〜Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（３））を模式的に示した図である。
【図２】ＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の評価結果を示した図である（試験例１）。
【図３】ＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の評価結果を示した図である（試験例１）。
【図４】各ＰＩポリアミドを導入した細胞におけるＡＣＳＬ３遺伝子の発現の結果を示した図である（試験例２）。
【図５】ＰＩポリアミド（１）を１μＭまたは５μＭ導入した細胞におけるＡＣＳＬ３遺伝子の発現の結果を示した図である（試験例２）。
【図６】ＰＩポリアミドを導入した細胞についてのＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の結果を示した図である（試験例３）。
【図７】陽性コントロールであるＰＳＡプロモーター領域を組み込んだ細胞についてのＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の結果を示した図である（試験例３）。
【図８】ＰＩポリアミドを導入した細胞における細胞増殖能の評価結果を確認した図である（試験例４）。
【図９】ＰＩポリアミドを導入した細胞における細胞遊走能の評価結果を確認した図である（試験例５）。
【図１０】細胞遊走能の評価における各ＰＩポリアミドを導入した細胞の顕微鏡写真を示した図である（試験例５）。
【図１１】ＰＩポリアミドの腫瘍に対する効果を示した図である（試験例６）。
【図１２】ヌードマウスに注射したＬＮＣａＰ細胞由来のＡＣＳＬ３タンパク質に対するＰＩポリアミドの発現抑制効果を示した図である（試験例６）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の「ＰＩポリアミド」には、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであればいずれのものも含まれる。
ここで「一部」とは、配列表配列番号１に示される塩基配列において、少なくとも１つ以上の塩基、好ましくは２つ以上の塩基、さらに好ましくは３つ以上複数の塩基のことをいい、認識する塩基の数が多ければ多いほど好ましい。塩基が複数の塩基の場合、連続する塩基を認識してもよく、連続しない塩基を認識してもよい。
この配列表配列番号１に示される塩基配列は、図１に示したように、ＡＣＳＬ３遺伝子の転写調節領域（ＡＲ応答領域）において、ＡＲＥ（ＡＲＥ（Ｎｏ．１）とＡＲＥ（Ｎｏ．２））に囲まれたＯｃｔ１遺伝子結合配列（ＯＣＴ１（Ｎｏ．２））の塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のＰＩポリアミドは、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであればよいが、配列表配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであってもよい。
さらに、ＰＩポリアミドのうちＩｍ／ＰｙペアはＤＮＡにおけるＧ・Ｃを認識し、Ｐｙ／ＩｍペアはＧ・Ｃを認識し、Ｐｙ／ＰｙペアはＴ・ＡおよびＡ・Ｔを認識することから、本発明のＰＩポリアミドは、配列表配列番号１に示される塩基配列のうち、ＧとＣが１つ以上入れ替わった塩基配列や、ＴとＡが１つ以上入れ替わった塩基配列の全部または一部を認識して結合するものであってもよい。
【００１５】
このような本発明の「ＰＩポリアミド」として、例えば、次の式１に示されるＰＩポリアミド（１）、式２に示されるＰＩポリアミド（２）および式３に示されるＰＩポリアミド（３）を挙げることができる。これらの各ＰＩポリアミドにおけるＯｃｔ１遺伝子結合配列の塩基配列の全部または一部に対する結合部位を図１に模式的に示した。本発明の「ＰＩポリアミド」は、これらの式１〜式３に示されるＰＩポリアミドに限らず、上記のような特性を有する「ＰＩポリアミド」であればいずれのものであってもよく、従来知られている方法により、独自に設計して作製した「ＰＩポリアミド」も含まれる。
【００１６】
［式１］
2014173032.tif 000005
【００１７】
［式２］
2014173032.tif 000006
【００１８】
［式３］
2014173032.tif 000007
【００１９】
本発明の「ＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、Ｏｃｔ１遺伝子結合配列の全部または一部に結合することにより、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現を抑制する剤のことをいう。
ここで、「発現抑制」とは、例えば、前立腺癌細胞等の「ＡＣＳＬ３遺伝子の発現」が起こる細胞に本発明の該発現抑制剤を付与した場合に、本発明の該発現抑制剤を付与しない場合と比べて、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現の程度が低下する状態のことをいう。このＡＣＳＬ３遺伝子の発現の程度の低下には、ＡＣＳＬ３遺伝子がまったく発現しない場合も含まれる。
このような本発明の「ＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
【００２０】
本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、前立腺癌の予防、前立腺癌の治療、または前立腺癌の予防および治療に有用な剤のことをいう。
このような本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
このような本発明の剤は、前立腺癌を発症する可能性が高いヒトに発症前に投与したり、前立腺癌を発症した後に、癌の進行を抑制したり、癌を完寛させたりすることを目的として投与することができる。
【００２１】
さらに、本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」は、従来知られている前立腺癌の予防、治療等のための薬剤や、本発明者らが開発したアンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＰＲ２と、転写制御因子であるＥＴＳ  ｆａｍｉｌｙのＥＧＲ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するＰＩポリアミド（特願２０１２−１０６３８２）と組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合するように、次のＰＩポリアミド（１）、ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）をそれぞれ設計した。また、これらとの比較のために、Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）も設計した。
図１にＰＩポリアミド（１）、ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）の結合部位を示した。なお、図１においてＰＩポリアミド（１）の結合部位を２箇所示しているが、同じ遺伝子にポリアミドが結合する場合には、４塩基以上間が空いている必要があることから、ＰＩポリアミド（１）が同時に２箇所に結合することはない。
また、下式における各記号は次の意味を示す。
Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン。
【００２４】
ＰＩポリアミド（１）
図１に、ＰＩｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）として示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（１））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＰｙＩｍＰｙβＩｍＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式１）に示されるものであり、化学式はＣ77Ｈ96Ｎ29Ｏ15＋、分子量は１６６７．７７であった。
【００２５】
［式１］
2014173032.tif 000008
【００２６】
ＰＩポリアミド（２）
図１に、ＰＩｐｏｌｙａｍｉｄｅ（２）として示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（２））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＩｍＰｙβＰｙＰｙＰｙγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式２）に示されるものであり、化学式はＣ78Ｈ97Ｎ28Ｏ15＋、分子量は１６６６．７８であった。
【００２７】
［式２］
2014173032.tif 000009
【００２８】
ＰＩポリアミド（３）
図１に、ＰＩｐｏｌｙａｍｉｄｅ（３）として示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（３））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＰｙＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式３）に示されるものであり、化学式はＣ79Ｈ98Ｎ27Ｏ15＋、分子量は１６６５．７９であった。
【００２９】
［式３］
2014173032.tif 000010
【００３０】
ＰＩポリアミド（コントロール）
Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）として、表１、ＰＩポリアミド（コントロール）に示した塩基配列を標的塩基配列として認識するようにＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式４）に示されるものであり、化学式はＣ73Ｈ94Ｎ29Ｏ15、分子量は１６１７．７１であった。
【００３１】
［式４］
2014173032.tif 000011
【００３２】
【表１】
2014173032.tif 000012
【００３３】
２．ＰＩポリアミドの合成
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
ＨＣＴＵ（ペプチド研究所製）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（１）〜（３）（３種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ合成した。
【００３４】
１）試薬の調製
（１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，２０ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，４０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）およびＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）をそれぞれ、合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを２当量、それ以外を４当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに４５ｍｇ、それ以外のチューブには２２．５ｍｇをそれぞれ加えた。また、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックスおよび１時間静置し完全に溶解させた。
（２）合成用試薬
合成機による合成のために、表２に記載の試薬を調製して用いた。
【００３５】
【表２】
2014173032.tif 000013
【００３６】
３．レジンの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ  Ｌｉｂｒａ  Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットした。これにＮＭＰ１ｍＬを加え、２０分間膨潤させた。
【００３７】
４．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ−８；島津製作所製）にインストールした。また、先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ−８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ2ＮＡｃＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙγＰｙＩｍＰｙβＩｍＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ2ＮＡｃＩｍＰｙβＰｙＰｙＰｙγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ2ＮＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＰｙＰｙβＰｙＰｙβ−ＲｅｓｉｎまたはＨ2ＮＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβ−Ｒｅｓｉｎまで、次の（１）〜（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。
【００３８】
反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマーおよび活性化剤を除くため、１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
【００３９】
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移した。これにＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することにより、レジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ  Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬおよびメタノール１ｍＬで回収した。
溶媒を留去後、ＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ3ＣＮ＝１００：０〜０：１００，３０ｍｉｎ）で分取精製した。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ得た。
【００４０】
６．ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ
上記５において生成したＰＩポリアミド（１）〜（３）（３種）について、次の１）および２）の工程によるＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙにより、Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）への結合をそれぞれ確認した。また、ＰＩポリアミド（コントロール）についても同様に、Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）への結合の有無を調べた。
【００４１】
１）Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（配列表配列番号１）と同じ塩基配列を含むＯｃｔ１オリゴＤＮＡにＦＩＴＣをラベルした分子（５０ｂａｓｅ）を作成し、終濃度１μＭのオリゴをアニーリングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１００℃に熱し、その後２時間かけて段階的に３０℃まで冷却した。これにより、Ｏｃｔ１オリゴＤＮＡは自己アニーリングし、ヘアピン状の２本鎖を形成する。
２）上記１）のヘアピン状の２本鎖ＤＮＡを含む溶液１５μｌに０．２ｍＭのＰＩポリアミド（１）〜（３）またはＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ５μｌ混合し、３７℃で１時間インキュベートして混合液を得た。
３）上記（２）の混合液を５−２０％  アクリルアミドゲル（ＴＢＥ  バッファー）にて電気泳動しＬＡＳ  ４０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）にて泳動像を観察し、泳動度の違いから結合の有無を判定した。
４）その結果、Ｏｃｔ１オリゴＤＮＡに対し、本発明のＰＩ  ポリアミド（１）〜（３）はいずれも結合するが、ＰＩポリアミド（コントロール）やＰＩポリアミドを加えていない溶媒のみの場合では結合が見られないことが確認できた。
【００４２】
［試験例］
次の試験例１〜６により、本発明のＰＩポリアミドによる、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）や腫瘍に対する効果を確認した。なお、各試験例における共通の試料として、次の試料を同様に調製して使用した。
【００４３】
＜試料＞
１．ＰＩポリアミド
実施例と同様の方法によって合成したＰＩポリアミド（１）〜（３）（３種）およびＰＩポリアミド（コントロール）を使用した。
これらの各ＰＩポリアミドを蒸留水に溶解したものを、細胞を培養している培地に添加することで細胞への導入を行った。
【００４４】
２．前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手したヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣナンバー：ＣＲＬ−１７４）を用いた。
【００４５】
３．培地
（１）フェノールレッド含有培地
フェノールレッド含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ７５０９）５００ｍＬに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を５０ｍｌ添加したものをフェノールレッド含有培地として用いた。
（２）フェノールレッド非含有培地
また、フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ８７５８）５００ｍに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を１２．５ｍｌ添加したものをフェノールレッド非含有培地として用いた。
【００４６】
４．ＤＨＴ（デヒドロテストステロン）（和光純薬）
エタノール（ＥｔＯＨ）で、１００ｎＭに溶解したＤＨＴをアンドロゲン刺激のために用いた。
【００４７】
［試験例１］
ＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の評価
ＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）における次の各塩基配列をそれぞれ変異または欠失させた場合におけるＡＲ活性への影響を調べた。
１）Ｏｃｔ１遺伝子結合配列（図１、ＯＣＴ１（Ｎｏ．１）、ＯＣＴ１（Ｎｏ．２））
２）ＡＲＥ（図１、ＡＲＥ（Ｎｏ．１）、ＡＲＥ（Ｎｏ．２））
３）ＧＡＴＡ遺伝子結合配列（図１、ＧＡＴＡ）
【００４８】
１．ＰＣＲ
ＡＣＳＬ３転写開始点上流６３ｋｂに存在する、ＡＲ結合部位（ＡＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ；ＡＲＢＳ）を約１ｋｂ抽出し（配列表配列番号１０）、これを鋳型ＤＮＡとして、次の（１）〜（５）の変異ＡＲＢＳをそれぞれＰＣＲによって増幅させた。
（１）ＯＣＴ１（Ｎｏ．１）を欠失させたもの（表３、Ｍｕｔ  Ｏｃｔ  ＃１プライマー使用）
（２）ＯＣＴ１（Ｎｏ．２）を欠失させたもの（表３、Ｍｕｔ  Ｏｃｔ  ＃２プライマー使用）
（３）ＧＡＴＡを欠失させたもの（表３、Ｍｕｔ  ＧＡＴＡプライマー使用）
（４）ＯＣＴ１（Ｎｏ．２）を欠失させ、ＡＲＥ（Ｎｏ．１）を変異させたもの（表３、Ｍｕｔ  Ｏｃｔ  ＃２プライマーとＭｕｔ  ＡＲＥ  １プライマー使用）
（５）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）を欠失させ、ＡＲＥ（Ｎｏ．１）とＡＲＥ（Ｎｏ．２）を変異させたもの（表３、Ｍｕｔ  Ｏｃｔ  ＃２プライマー、Ｍｕｔ  ＡＲＥ  １プライマーおよびＭｕｔ  ＡＲＥ  ２プライマー使用）
【００４９】
各変異ＡＲＢＳは、以下の手順によって得た。
（１）鋳型ＤＮＡ（配列表配列番号１０）に対し、変異または欠失させたい遺伝子に対するプライマーをフォワードプライマー、鋳型ＤＮＡの末端に対するプライマー（表３、ＡＣＳＬ３  ＡＲＢＳ  ｒｖプライマー）をリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたコンストラクトを得た。
（２）鋳型ＤＮＡ（配列表配列番号１０）に対し、鋳型ＤＮＡの先端に対するプライマー（表３、ＡＣＳＬ３  ＡＲＢＳ  ｆｗプライマー）をフォワードプライマーとし、変異または欠失させたい遺伝子に対するプライマーをリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたコンストラクトを得た。
（３）上記（１）および（２）で得たコンストラクトを混合したものを鋳型ＤＮＡとして、鋳型ＤＮＡの先端に対するプライマー（表３、ＡＣＳＬ３  ＡＲＢＳ  ｆｗプライマー）をフォワードプライマーとし、鋳型ＤＮＡの末端に対するプライマー（表３、ＡＣＳＬ３  ＡＲＢＳ  ｒｖプライマー）をリバースプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、変異ＡＲＢＳを得た。
【００５０】
【表３】
2014173032.tif 000014
【００５１】
２．ルシフェラーゼアッセイ
上記（１）〜（５）の変異ＡＲＢＳをそれぞれルシフェラーゼベクター（ｐＧＬ３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に挿入したものを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクション試薬とし、このプロトコールに従って上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地にて約６０時間培養した前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）にトランスフェクションした。
その約１２時間後、Ｒ１８８１（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアンドロゲン刺激を行い、さらに２４時間後ルシフェラーゼアッセイを行った。この試験において、ルシフェラーゼベクターの陽性コントロールとして、欠失または変異していないＡＲＢＳ（鋳型ＤＮＡ：配列表配列番号１０）を組み込んだ前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）を使用した。
【００５２】
その結果、図２に示したように、（１）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．１）を欠失させたもの（図２、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．１）ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と、（３）ＧＡＴＡを欠失させたもの（図２、ＧＡＴＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）は陽性コントロール（図２、ＡＣＳＬ３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ）と同様のＡＲ活性を示したが、（２）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）を欠失させたもの（図２、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）ｄｅｌｅｔｉｏｎ）はＡＲ活性が有意に低下することが確認できた。
また、図３に示したように、陽性コントロール（図３、ＡＣＳＬ３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ）に対し、（２）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）を欠失させたもの（図３、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、（４）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）を欠失させ、ＡＲＥ（Ｎｏ．１）を変異させたもの（図３、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）ｄｅｌ．ＡＲＥ（Ｎｏ．１）ｍｕｔ．）、（５）Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）を欠失させ、ＡＲＥ（Ｎｏ．１）とＡＲＥ（Ｎｏ．２）を変異させたもの（図３、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）ｄｅｌ．ＡＲＥ（Ｎｏ．１）ｍｕｔ．ＡＲＥ（Ｎｏ．２）ｍｕｔ．）はいずれもＡＲ活性が有意に低下することが確認できた。
従って、この結果よりＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性には、Ｏｃｔ１遺伝子結合配列のうち、Ｏｃｔ１（Ｎｏ．２）の作用が重要であることが示唆された。
【００５３】
［試験例２］
ＡＣＳＬ３遺伝子の発現の検討
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＩポリアミド（１）〜（３）をそれぞれ導入した細胞におけるＡＣＳＬ３遺伝子の発現を検討した。比較として、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においても同様に検討した。
１）ＰＩポリアミドの導入およびｃＤＮＡの調製
各ＰＩポリアミドを５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地でＬＮＣａＰ細胞を３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。
この細胞から、アイソゲン（ニッポンジーン製）を用いてマニュアルに従って、ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。
【００５４】
２）ＲＴ−ＰＣＲ
上記１）で調製したｃＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、表４に示したプライマーにより、各ＰＩポリアミドを導入した前立腺癌細胞における融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の有無を調べた。このＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。
【００５５】
【表４】
2014173032.tif 000015
【００５６】
その結果、図４に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）、ＰＩポリアミド（２）またはＰＩポリアミド（３）を導入した細胞においては（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（２）、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（３））、アンドロゲン刺激を与えても、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現が抑制されることが確認できた。一方、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においては、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現は抑制されなかった（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））。
また、図５にＰＩポリアミド（１）を１μＭまたは５μＭ導入した細胞における、ＡＣＳＬ３遺伝子の発現抑制の結果を示したが、アンドロゲン刺激を与えても、ＰＩポリアミド（１）を５μＭ導入した細胞は特にＡＣＳＬ３遺伝子の発現が抑制されることが確認できた。
【００５７】
［試験例３］
ＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性の評価
ＡＣＳＬ３転写開始点上流６３ｋｂに存在する、ＡＲ結合部位（ＡＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ；ＡＲＢＳ）を約１ｋｂ抽出し（配列表配列番号１０）、ルシフェラーゼベクター（ｐＧＬ３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に挿入したものを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクション試薬とし、このプロトコールに従って上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地にて約６０時間培養した前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）にトランスフェクションした。
その約１２時間後、ＤＨＴ１００ｎＭを用いたアンドロゲン刺激と、ＰＩポリアミド（１）またはＰＩポリアミド（コントロール）の導入（１μＭまたは５μＭ）を行い、ルシフェラーゼアッセイを行った。この試験において、ルシフェラーゼベクターの陽性コントロールとしてＡＲ応答活性が知られているＰＳＡプロモーター領域（配列表配列番号２２）を組み込んだ前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）を使用した。
【００５８】
その結果、図６に示したようにＰＩポリアミド（１）を導入したものは、同量のＰＩポリアミド（コントロール）を導入したものに対して、有意にＡＣＳＬ３の転写調節領域（ＡＲ応答領域）におけるＡＲ活性を低下させることが確認できた。ＰＩポリアミド（２）およびＰＩポリアミド（３）を用いた場合も同様であった。
また、図７に示したように、陽性コントロールであるＰＳＡプロモーター領域を組み込んだ前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）を使用した場合には、ＰＩポリアミド（１）を導入したものと同量のＰＩポリアミド（コントロール）を導入したものに有意な差がないことが確認できた。
【００５９】
［試験例４］
細胞増殖能の評価
ＰＩポリアミド（１）を導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、ＭＴＳアッセイによって各細胞の増殖能を検討した。
即ち、このＬＮＣａＰ細胞を全部で５×１０3細胞となるように９６ウェルプレートに播き、各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地で３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。刺激後、それぞれ２４時間、４８時間または９６時間培養した。
指定された刺激時間後、各細胞にＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を１０μｌ添加して１時間インキュベートした。その後、各細胞の吸光度（４９０ｎｍ）を測定し、培養後の細胞数を調べることで、細胞増殖能を評価した。
【００６０】
その結果、図８に示したように、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図８、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、５μＭ）に対し、本発明のＰＩポリアミド（１）を５μＭ導入した細胞（図８、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）、５μＭ）では、４８時間培養した段階で有意に増殖が抑制されることが確認でき、９６時間培養した場合には、さらに有意に増殖が抑制されることが確認できた。ＰＩポリアミド（２）およびＰＩポリアミド（３）を用いた場合も同様に、細胞の増殖が抑制された。
【００６１】
［試験例５］
細胞遊走能の評価
ＰＩポリアミド（１）を導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ＰＥＴ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  アッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
即ち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーに上記３．（１）のフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ  １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ＰＩポリアミドを５μＭとなるように添加した上記３．（１）のフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０4細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌの上記３．（１）のフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ‘ｓ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の顕微鏡で観察し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。
【００６２】
図９に各ＰＩポリアミドを添加した細胞における遊走した細胞数を示した。また、各ＰＩポリアミドを添加した細胞の顕微鏡写真を図１０に示した。
その結果、図９および図１０に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図９、１０、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１））、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図９、１０、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に比べて、細胞の遊走能（浸潤能）が顕著に抑制されることが確認できた。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）においても同様に、細胞の遊走能（浸潤能）が抑制された。
【００６３】
［試験例６］
本発明のＰＩポリアミドの腫瘍に対する効果を確認した。
前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）３×１０6個を７週齢の雄性ヌードマウス（ｎ＝１０）の右脇腹に皮下注射した。３日毎にキャリパー測定し、腫瘍の大きさをモニターした。腫瘍の大きさが１００ｃｍ2に達した段階で、ｄＨ2Ｏに溶解したＰＩポリアミド（１）またはＰＩポリアミド（コントロール）を６ｍｇ／ｋｇ体重となるように尾静脈から注射した（ＰＩポリアミド（１）：ｎ＝４、ＰＩポリアミド（コントロール）：ｎ＝６）。
週に１回の注射を４週間続け、腫瘍の大きさを毎週測定した。最後の注射から１週間経過後、ヌードマウスを解剖し、腫瘍を摘出した。
その結果、図１１に示したように、ＰＩポリアミド（１）を注射したヌードマウスでは、ＰＩポリアミド（コントロール）を注射したヌードマウスに比べ、顕著に腫瘍の形成が抑制されることが確認できた。
また、摘出した腫瘍から溶解バッファー（ＮＰ４０バッファー）を用いてタンパク質を抽出し、ＡＣＳＬ３抗体によりウエスタンブロットした結果（＃１、＃２の各２個体）を図１２に示した（図１２上段、下段はβアクチンタンパク質の発現を示す）。その結果、ＰＩポリアミド（コントロール）を注射したヌードマウスではＡＣＳＬ３タンパク質が発現しているのに対し、ＰＩポリアミド（１）を注射したヌードマウスではいずれもＡＣＳＬ３タンパク質の発現が顕著に抑制されることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。また、本発明者らが開発している、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＰＲ２と、転写制御因子であるＥＴＳ  ｆａｍｉｌｙのＥＧＲ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するＰＩポリアミド（特願２０１２−１０６３８２）と組み合わせることにより、前立腺癌の網羅的な治療等も可能となる。
【図１】
2014173032.tif 000019
【図２】
2014173032.tif 000020
【図３】
2014173032.tif 000021
【図４】
2014173032.tif 000022
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
2014173032.tif 000027
【図１０】
2014173032.tif 000028
【図１１】
2014173032.tif 000029
【図１２】
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【配列表】
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