(57)【要約】【課題】方法及びキットの提供。【解決手段】本発明は、形質細胞性腫瘍への罹患が疑われる対象者の生物学的サンプルにおいて、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される１つのマーカーを検出することを特徴とする形質細胞性腫瘍の検出方法を提供する。本発明はまた、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される１つのマーカーに特異的に結合可能な試薬を含んでなることを特徴とする形質細胞性腫瘍検出用キットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質細胞性腫瘍への罹患が疑われる対象者の生物学的サンプルにおいて、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを検出することを特徴とする形質細胞性腫瘍の検出方法。
【請求項２】
マーカーがセントリオリンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形質細胞性腫瘍が多発性骨髄腫である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
マーカーの検出が該マーカーに特異的に結合可能な抗体を用いて行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生物学的サンプル中のマーカーの検出が、分子シャペロンHSP72に特異的に結合可能な試薬及びマーカーに特異的に結合可能な試薬を逐次又は同時に用いて行われる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される１つのマーカーに特異的に結合可能な試薬を含んでなることを特徴とする形質細胞性腫瘍検出用キット。
【請求項７】
分子シャペロンHSP72に特異的に結合可能な試薬を更に含んでなる請求項６に記載のキット。
【請求項８】
セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の形質細胞性腫瘍検出用マーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質細胞性腫瘍を検出するための方法、キット及びマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
形質細胞性腫瘍は、骨髄、骨、軟部組織、咽頭、扁桃腺、副鼻腔、口腔、鼻、喉や消化管において形質細胞が単クローン性に増殖するリンパ系腫瘍(Ｂ細胞腫瘍)である。
形質細胞性腫瘍では、増殖した形質細胞(骨髄腫細胞)や、そこから産生される単クローン性免疫グロブリン(Ｍタンパク)が骨病変(骨融解)、骨髄機能低下、腎機能障害、Ｍタンパク血症など様々な病態や症状が現れる。よって、形質細胞性腫瘍を早期に発見し、適切な治療を早期に開始することが必要である。
【０００３】
形質細胞性腫瘍の１種である多発性骨髄腫(Multiple Myeloma)は10万人に２〜３人が発症し、造血器悪性疾患の18％を占める疾患である。従来、多発性骨髄腫の病期分類は、血清アルブミンの値とβ２ミクログロブリンの値の２つだけで決められているので、臨床病期の正確な判定が困難であり、治療の開始時期の決定に支障をきたしている。
よって、多発性骨髄腫について、腫瘍特性を強く反映し、病期の正確な判定に有用なマーカーを臨床現場に導入することが求められている。
しかしながら、現在までに、多発性骨髄腫を含む形質細胞性腫瘍の検出に有用な腫瘍マーカーは同定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
よって、本発明の目的は、形質細胞性腫瘍についての新規な腫瘍マーカーを同定し、該マーカーを利用して形質細胞性腫瘍を検出する方法及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、形質細胞性腫瘍への罹患が疑われる対象者の生物学的サンプルにおいて、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択されるマーカーを検出することを特徴とする形質細胞性腫瘍の検出方法を提供する。
本発明はまた、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される１つのマーカーに特異的に結合可能な試薬を含んでなることを特徴とする形質細胞性腫瘍検出用キットを提供する。
本発明はまた、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の形質細胞性腫瘍検出用マーカーとしての使用を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、生物学的サンプルを用いて形質細胞性腫瘍を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】多発性骨髄腫患者及び健常人の血清中のHSP72及びHSP72結合分子の電気泳動写真である。
【図２】配列LSLHNDISAMQQQLQEKを有するペプチドのMS/MSスペクトルを示す。
【図３】多発性骨髄腫患者及び健常人の血清の、抗セントリオリン抗体を用いたウェスタンブロットの結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜形質細胞性腫瘍の検出方法＞
本発明の形質細胞性腫瘍の検出方法は、形質細胞性腫瘍への罹患が疑われる対象者の生物学的サンプルにおいて、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択されるマーカーを検出することを特徴とする。
本発明の形質細胞性腫瘍の検出方法は、形質細胞性腫瘍を診断するためのデータの採取方法でもある。
【０００９】
本発明において、「マーカー」とは、体液及び/又は組織中に存在する生体由来物質であって、その存在や濃度が当該生体内の生物学的変化(疾患の存在や進行度を含む)を反映する(したがって、当該生体内の生物学的変化の指標となる)物質である。
「形質細胞性腫瘍」は、多発性骨髄腫、形質細胞腫及び単クローン性ガンマグロブリン血症(MGUS)を含み、好ましくは多発性骨髄腫及び形質細胞腫から選択され、より好ましくは多発性骨髄腫である。
「対象者」は、ヒトを含む動物であり、好ましくはヒトを含む哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
「生物学的サンプル」は、例えば、血液(全血サンプル、血清サンプル又は血漿サンプルを含む)、リンパ液、髄液、腹水、組織滲出液又は分泌液、痰及び尿を含む体液；脳、脊髄、心臓、肝臓、粘膜などの組織(そのホモジネート、溶解物若しくは抽出物)；細胞(その溶解産物及び抽出物を含む)である。
【００１０】
本発明の形質細胞性腫瘍検出用マーカー(以下、「本発明のマーカー」という)は、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される。
「セントリオリン」(Centriolin)は、110 kDa中心体タンパク質、bA165P4.1、bA165P4.1 (マウスMa2a8のオーソログ)、bA165P4.2 (中心体タンパク質１)、中心小体関連タンパク質、中心体タンパク質1、中心体タンパク質110kDa、CEP1、CEP110、CP110、FANとも呼ばれ、細胞分裂時の中心体成熟に関与し、細胞増殖を調節するタンパク質として知られる。セントリオリンの代表的なアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NP_008949.4又はgi87298937として特定されるものである。
「ヒストンH4」は、DNAと結合する塩基性核タンパク質であるヒストンを構成する主要な５成分のうちの１つである。ヒストンH4の代表的なアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NP_001029249.1又はgi77539758として特定されるものである。
【００１１】
「神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１」は、神経細胞の分化に必要と考えられているタンパク質(「デスモヨキン」とも呼ばれる)の１つのアイソフォームであり、その代表的なアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NP_001611.1又はgi61743954として特定されるものである。
「タイチンアイソフォームN2-A」は、骨格筋及び心筋に存在する弾性タンパク質(「コネクチン」とも呼ばれる)の１つのアイソフォームであり、その代表的なアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NP_596869.4又はgi291045225として特定されるものである。
【００１２】
本発明のマーカーは、当該マーカータンパク質に特異的な(又は特有な)ペプチドフラグメント(以下、「特異的ペプチドフラグメント」という)として検出してもよい。或るペプチドフラグメントが当該マーカータンパク質に特異的であるか否かは、当該分野において公知の方法により容易に決定することができる。例えば、ペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、タンパク質データベース(例えば、NCBI、UniProt、NR-AAなど)のアミノ酸配列と(例えば、BLAST又はFASTAなどの配列比較ソフトウェアを用いて)比較をすることによって決定できる。
【００１３】
セントリオリンに関しては、例えば、配列LSLHNDISAMQQQLQEK(配列番号：１)、配列NELLKQKTIELTRACQK(配列番号：２)及び配列SLADLQKQFSEILARSK(配列番号：３)のうちの少なくとも１つを含むフラグメントであり得る。
ヒストンH4に関しては、例えば、配列TVTAMDVVYALKR(配列番号：４)、配列ISGLIYEETR(配列番号：５)及び配列VFLENVIR(配列番号：６)のうちの少なくとも１つを含むフラグメントである得る。
神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１に関しては、例えば、配列VEGDMQVPDLDIK(配列番号：７)及び配列VEGEMKVPDVDIK(配列番号：８)のうちの少なくとも１つを含むフラグメントであり得る。
タイチンアイソフォームN2-Aに関しては、例えば、配列QDTRKDTWGVVSSGSSKTKLK(配列番号：９)、配列VTKDPIHPYTK(配列番号：10)、配列VLDSPGPCGK(配列番号：11)、配列VGGGEYIELK(配列番号：12)、配列LEPSRIVKQDEFTR(配列番号：13)及び配列SSISLGWKPPAKDGGSPIK(配列番号：)のうちの少なくとも１つを含むフラグメントであり得る。
特異的ペプチドフラグメントは、例えば30kD以下、好ましくは10〜28kD程度のサイズであり得る。
【００１４】
生物学的サンプル中の本発明のマーカーは、イムノアッセイ、電気泳動法、クロマトグラフィー若しくは質量分析法又はこれらの任意の組合せなど種々の方法により検出することができる。
本発明において、本発明のマーカーに関して「検出」とは、存否の判定だけでなく定量も含む。
【００１５】
本発明のマーカーの検出は、少なくとも１種の「本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質」を用いて行うことができる。ここで、「本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質」は、本発明のマーカー又はその特異的ペプチドフラグメントに特異的に結合することができる物質である。本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質は、代表的には、抗体である。
【００１６】
例えば、本発明のマーカー(及び/又はその特異的ペプチドフラグメント)の検出はイムノアッセイにより行うことができる。
イムノアッセイでは、本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質として１種類又は複数種類(例えば２種類)の抗体を使用する。例えば、セントリオリンの検出には抗セントリオリン抗体を使用し、ヒストンH4の検出には抗ヒストンH4抗体を使用する。
本発明において、抗体とは、完全抗体及びその抗原結合部位を有するフラグメント(単鎖抗体(scFv)、Fab抗体、F(ab')2抗体、Fab'抗体を含む)をいう。抗体は、既知の抗体であってもよいし、新たに作製された抗体であってもよい。
イムノアッセイは、好ましくは２種類の抗体を用いるサンドイッチ法である。
【００１７】
抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、モノクローナルであることが好ましい。
ポリクローナル抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、そのような抗体は、マーカー又は該マーカーに特有のペプチドフラグメントを、単独で又は適切なキャリア(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ジフテリア毒素、破傷風毒素)に結合させて、必要に応じてアジュバント(例えば、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム又はリン酸化アルミニウム(ミョウバン))と共に、１回又はそれ以上(皮下、静脈内、腹腔内などに)投与した動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、ダチョウなど抗体産生に使用できる動物)の血清から、例えばアフィニティークロマトグラフィーのような精製法を用いて精製することにより(例えば、免疫グロブリン画分又は精製抗体として)取得することができる。精製することなく、全血清(抗血清)をそのまま用いてもよい。
【００１８】
モノクローナル抗体を作製する方法もまた当該分野において公知である(例えば、Kohler and Milstein(Nature, 256:495-497, 1975；Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。簡潔には、当該蛋白又はペプチドで免疫した動物の脾臓細胞(Ｂ細胞)を、細胞融合法により適切な骨髄腫細胞と融合して不死化細胞(ハイブリドーマ)を作製し、所望の結合能を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイブリドーマを、インビトロ又はインビボ(例えば、マウス腹腔内)で増殖させて産生抗体を取得してもよい。
【００１９】
抗体には検出可能な標識を付することができる。抗体の標識は、当該分野で公知であり、使用する検出手段に応じて適宜選択できる。例えば、標識には、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発色物質、発光物質などが使用できる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ(特にHRP)、β-ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ(特にアルカリホスファターゼ)、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼなどが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉが挙げられる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Cy2、Cy3などが挙げられる。発色物質としては、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェリンなどが挙げられる。
【００２０】
標識からのシグナルの測定は、分光光度計、蛍光光度計、CCDカメラ、CMOSカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などから適宜選択したものを、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に使用して行うことができる。
【００２１】
本発明のマーカー(及び/又はその特異的ペプチドフラグメント)は、分子シャペロンHSP72(熱ショックタンパク質72)との複合体として検出してもよい。本発明のマーカーは、下記実施例で示すように、分子シャペロンHSP72結合分子として見出され、生物学的サンプル中でHSP72-マーカー複合体を形成し得る。ここで、「HSP72」は、Hsp70-1a、Hsp70、Hsp70-1とも呼ばれ、遺伝子HSPA1Aによりコードされるタンパク質であり、その代表的なアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NM_005345として特定される。
【００２２】
複合体として検出する場合、その検出は、例えば、本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質とHSP72に特異的に結合可能な物質とを用いて行う。HSP72に特異的に結合可能な物質は、代表的には、HSP72に特異的に結合することができる抗体(抗HSP72抗体)である。抗HSP72抗体は既知の抗体であってもよいし、新たに作製された抗体であってもよい。抗HSP72抗体は、上記で説明した方法により作製することができる。抗HSP72抗体は１種類のみを用いてもよいし、複数種類(例えば、２〜10種類)を組み合わせて用いてもよい。
抗HSP72抗体の例としては、特開2013-32990号公報(特願2011-169552)に記載のモノクローナル抗体3G7、1F8B4、3A11D9、3B9C8、3H6F8、4G2G11、8A10G9、8H4C2、8H4D8が挙げられる。
【００２３】
例えば、HSP72に特異的に結合可能な物質は、複合体を支持体(例えばビーズ)上に固定するために使用する。HSP72に特異的に結合可能な物質を介して支持体上に固定されたHSP72は、所望の本発明のマーカーのみと複合体を形成するわけではないが、本発明のマーカーを支持体上に集めて濃縮することができる。支持体上に固定されたHSP72と本発明のマーカーとの複合体は、本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質を用いて検出することができる。
【００２４】
本発明のマーカーの検出の前に、生物学的サンプルを電気泳動やクロマトグラフィーに供することによって、予め、(存在すれば)当該マーカーを含む画分を取得してもよい。
例えば、１種類又は複数種類の抗HSP72抗体を担持させた固相/支持体(例えば、セファロースビーズ)を用いて、本発明のマーカー又はその特異的ペプチドフラグメントを分子シャペロンHSP72との複合体としてアフィニティー精製を行ない、その後溶出させてもよい(HSP72とHSP72結合性分子との複合体(HSP72複合体)画分)。
溶出は公知の方法を使用して行うことができる。例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムのような塩、グアニジンやグリシンのような変性剤を用いることができる。
【００２５】
本発明の形質細胞性腫瘍の検出方法は、より具体的には、例えば下記のように実施する。
本発明のマーカーに特異的に結合可能な第１の物質(例えば、第１の抗マーカー抗体)が固定された支持体を、生物学的サンプルと、該サンプル中のマーカー(存在する場合)がマーカーに特異的に結合可能な物質と結合するに適切な条件下で接触させる。
次いで、洗浄液(例えば、PBSのような公知の緩衝液)で、支持体を１回以上洗浄する。
マーカーに特異的に結合可能な物質と結合することで支持体上に固定されたマーカーは、マーカーに特異的に結合可能な第２の物質(例えば、第２の抗マーカー抗体)を用いて検出する。すなわち、支持体と、マーカーに特異的に結合可能な第２の物質とを、両者の結合に適切な条件下で接触させ、次いで支持体を洗浄液で１回以上洗浄する。
その後、マーカーに特異的に結合可能な第２の物質を、当該物質に付された標識に応じた方法により検出する。
【００２６】
或いは、HSP72に特異的に結合可能な物質(例えば、抗HSP72抗体)が固定された支持体を、生物学的サンプルと、該サンプル中のHSP72とHSP72に特異的に結合可能な物質との結合に適切な条件下で接触させる。このとき、HSP72と複合体を形成している本発明のマーカーは、HSP72に特異的に結合可能な物質を介して支持体に固定される。
次いで、洗浄液で、支持体を１回以上洗浄する。
支持体上に固定された複合体は、マーカーに特異的に結合可能な物質(例えば、抗マーカー抗体)を用いて検出する。すなわち、支持体と、マーカーに特異的に結合可能な物質とを、両者の結合に適切な条件下で接触させ、次いで支持体を洗浄液で１回以上洗浄することによって、結合しなかったマーカーに特異的に結合可能な物質を除去する。
その後、支持体上に捕捉された、マーカーに特異的に結合可能な物質を、当該物質に付された標識に応じた方法により検出する。
【００２７】
或いは、生物学的サンプルに、HSP72に特異的に結合可能な物質が(好ましくは複数種類)固定された固相を添加する。その後、洗浄液で固相を１回以上洗浄する。次いで、塩や変性剤、酸性溶液などを用いて、(存在する場合)固相からHSP72と本発明のマーカーとの複合体を溶出させる。得られた画分中の本発明のマーカー(又は複合体)は上記の方法で検出する。得られた画分は、血清アルブミンや免疫グロブリンなどの夾雑物が除去される一方、本発明のマーカー(又は複合体)は濃縮されているので、本発明のマーカー(又は複合体)の検出が容易となる。
【００２８】
＜形質細胞性腫瘍検出用キット＞
本発明の形質細胞性腫瘍検出用キットは、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される１つのマーカーに特異的に結合可能な試薬を含んでなることを特徴とする。
本キットは、上述した本発明の形質細胞性腫瘍検出方法の実施に適切である。
【００２９】
本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬は、上記で説明した「本発明のマーカーに特異的に結合可能な物質」であり、好ましくは、本発明のマーカーに特異的に結合することができる抗体である。
本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬は、溶液形態で提供されてもよいし、凍結乾燥形態で提供されてもよい。
本発明のキットにおいて、本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬はまた、必要であれば、本発明の方法について記載したような標識が付されていてもよい。或いは、本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬は、(ストレプト)アビジン-ビオチンのような結合対の一方のパートナー(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン)が付着されており、他方のパートナー(例えば、(ストレプト)アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体)が付着した標識と結合可能にされていてもよい。
【００３１】
本発明のキットは、分子シャペロンHSP72に特異的に結合可能な試薬を更に含んでいてもよい。本発明のキットにおいて、HSP72に特異的に結合可能な試薬は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。HSP72に特異的に結合可能な試薬は、好ましくは抗HSP72抗体である。
本発明のキットは、支持体を更に含んでいてもよい。支持体の形態は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、ビーズ、粒子、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップなどであり得る。
【００３２】
支持体の材料は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、アガロース(セファロースを含む)、ガラス、樹脂(例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン)、セルロース及びその誘導体(例えば、ニトロセルロース)などであり得る。
支持体には、本発明のマーカーに特異的に結合可能な試薬又はHSP72に特異的に結合可能な試薬が固定されていてもよい。本発明のマーカー又はHSP72に特異的に結合可能な試薬の支持体への固定は、物理的吸着、共有結合若しくは非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)のいずれであってもよい。
【００３３】
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用できる。
本発明のマーカー又はHSP72に結合可能な物質が固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル)又は非還元多糖類(例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース)などでコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上のタウ蛋白又はアルブミンに結合可能な物質を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
【００３４】
本発明のキットは、必要に応じて、標識シグナル生成剤(例えば発色剤)及び/又は反応停止液を更に含んでいてもよい。
標識シグナル生成剤は、標識に応じて公知のものから適宜選択できる。例えば、標識がペルオキシダーゼである場合には、TMB、DAB、o-フェニレンジアミン(OPD)、2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)などであり得、アルカリホスファターゼである場合には、p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)、4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)などであり得る。
反応停止液は、例えば、硫酸又は水酸化ナトリウムであり得る。
【００３５】
本発明のキットはまた、希釈剤や洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材(例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール)などを含んでいてもよい。
【実施例】
【００３６】
［実験１］
多発性骨髄腫患者の血液サンプルを用いたマーカーの同定
いずれもインフォームドコンセントが得られた13人の多発性骨髄腫(MM)患者及び５人の健常人(NR)からの血清を使用した。
血清100μLにNHq(９種類の抗HSP72モノクローナル抗体3G7、1F8B4、3A11D9、3B9C8、3H6F8、4G2G11、8A10G9、8H4C2、8H4D8をNHS-セファロース(GEヘルスケア・ジャパン)に結合させたもの)を25μL加え、PBS(-)で400μLとし、30分間転倒混和した後、PBSにて洗浄した。その後、0.1Ｍグリシン(pH2.0)にて溶出した。これらを５〜20％のグラジエントゲルでのSDS-PAGE電気泳動に供し、銀染色を行った。結果を図1B及びCに示す。
なお、図1Aは、血清100μLからNHqを用いてHSP72複合体を単離した後、抗HSP72抗体でウエスタンブロットを行い、各血清中のHSP72量を評価した結果である。
【００３７】
多発性骨髄腫患者からの血清には、健常人からの血清では見られない患者特異的なバンドが幾つか見出される。特に、28kD以下の領域には、患者特異的なバンドが多数存在する(図1B及びC中「＊」で示す)。
そこで、28kD付近及び泳動先端部のバンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化後、LC/MS/MSにて質量分析を行った。質量分析の結果を、タンパク質同定ソフトProteinPilotを用い、NCBIヒトデータベースに対して検索した。ヒットしたペプチドフラグメントの一例として配列LSLHNDISAMQQQLQEKのもののMS/MSスペクトルを図２に示す。このようにして、トリプシン消化により得られたペプチド群について配列決定を行い、タンパク質を同定した。
【００３８】
同定したタンパク質中、健常人の血液サンプルでは同定されず、本来血液中に存在し得ない４つのタンパク質、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aをマーカー候補分子として見出した。
セントリオリンは、配列LSLHNDISAMQQQLQEKを有するペプチド、配列NELLKQKTIELTRACQKを有するペプチド及び配列SLADLQKQFSEILARSKを有するペプチドなどから同定された。
ヒストンH4は、配列TVTAMDVVYALKRを有するペプチド、配列ISGLIYEETRを有するペプチド及び配列VFLENVIRを有するペプチドなどから同定された。
神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１は、配列VEGDMQVPDLDIKを有するペプチド及び配列VEGEMKVPDVDIKを有するペプチドなどから同定された。
タイチンアイソフォームN2-Aは、配列QDTRKDTWGVVSSGSSKTKLKを有するペプチド、配列VTKDPIHPYTKを有するペプチド、配列VLDSPGPCGKを有するペプチド、配列VGGGEYIELKを有するペプチド、配列LEPSRIVKQDEFTRを有するペプチド及び配列SSISLGWKPPAKDGGSPIKを有するペプチドなどから同定された。
【００３９】
［実験２］
多発性骨髄腫細胞を用いた検証
多発性骨髄腫細胞株KMS-12-PE及びRPMI8226の培養上清並びにRPMI8226の細胞抽出液を材料としてNHqによるアフィニティー精製を行った。
培養上清又は細胞抽出液30mLを公称分子量3000のフィルターにて限外濾過して300μLに濃縮した後、NHqを25μL加え、PBS(-)で400μLとした。30分間の転倒混和後、PBSにて洗浄した。0.1Ｍグリシン(pH2.0)にて溶出した後、SDS-PAGEで展開せずにショットガン法にて質量分析を行った。質量分析の結果は、タンパク質同定ソフトProteinPilotを用い、NCBIヒトデータベースに対して検索した。その結果、実験１で見出した４つのマーカー候補分子がいずれも同定された。
よって、上記４つのタンパク質を多発性骨髄腫のマーカーとして同定した。
【００４０】
［実験３］
多発性骨髄腫患者の血液サンプルにおけるセントリオリンの検出
健常人３例、多発性骨髄腫患者９例の血清100μLにNHqを25μL加えてアフィニティー精製を行ない、SDSサンプルバッファーにて溶出した。これらを12.5％ゲルにてSDS-PAGEを行った後、Centriolinポリクローナル抗体(abcam、ab99338)にてウエスタンブロットを行った。染色後の結果を図３に示す。
陽性コントロールとして用いたKMS-12-PEの細胞抽出液では、全長セントリオリンに相当する110kD付近及びそれ以外にもCentriolinポリクローナル抗体と反応するバンドを見出した。
【００４１】
患者血清では、全長セントリオリンに相当する分子量にCentriolinポリクローナル抗体と反応したバンドは見出せないものの、反応性のバンドを複数見出した。このうち３つのバンド(フラグメント１、２及び３)は、ベイトであるHSP72のバンドと相関している。
一方、健常人の血清では、これらのバンドは存在しなかった。
よって、セントリオリンは、多発性骨髄腫患者の血清中で検出されるが、健常人の血清中では検出されず、したがって多発性骨髄腫についての血清中のマーカーとして使用できることが分かった。
これらバンドは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、慢性骨髄性白血病、急性リンパ白血病の各２例ずつの血清では見出されなかったので、多発性骨髄腫に特有なバンドと考えられた。
なお、セントリオリンは、多発性骨髄腫患者の血清中で、全長タンパク質としてよりも、そのフラグメントがHSP72と複合体を形成していることが示唆される。
【００４２】
以上の実験結果から、セントリオリン、ヒストンH4、神経芽細胞分化関連タンパク質AHNAKアイソフォーム１及びタイチンアイソフォームN2-Aからなる群より選択される本発明のマーカーは、多発性骨髄腫検出用マーカーとして使用することができ、多発性骨髄腫検出方法及びキットに有用であることが理解できる。
【００４３】
上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的形態及び例のみに限定されるものではない。本明細書に記載された具体的な構成、手段及び方法は、本発明の要旨を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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