(57)【要約】【課題】本発明の目的は、サーマルサイクル処理に、特にポリメラーゼ連鎖反応にサンプルを従わせるサーモサイクルデバイスを提供することである。【解決手段】本発明は、少なくとも１つのサンプルホルダ１１と、少なくとも１つのサーマルリファレンス１２と、上記サンプルホルダと上記サーマルリファレンスとの間に構成される少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイス１３とを有する、サーモサイクルデバイス１０に関する。上記加熱及び／又は冷却デバイスは、上記サンプルホルダ及び上記サーマルリファレンスと熱伝導的に接触する。更に、このデバイスは、サイクルの間、上記サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに維持する少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイス１４と、上記リファレンス加熱及び／又は冷却デバイス１４と熱伝導的に接触するヒートシンク１５とを有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモサイクルデバイスであって、
ａ）少なくとも１つのサンプルホルダと、
ｂ）少なくとも１つのサーマルリファレンスと、
ｃ）前記サンプルホルダと前記サーマルリファレンスとの間に構成され、前記サンプルホルダ及び前記サーマルリファレンスと熱伝導的に接触する少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイスと、
ｄ）サイクルの間、前記サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに維持する少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスと、
ｅ）前記リファレンス加熱及び／又は冷却デバイスと熱伝導的に接触するヒートシンクとを有する、サーモサイクルデバイス。
【請求項２】
前記少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイス及び／又は前記少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスが、少なくとも１つの熱電デバイスを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記サーマルリファレンス、前記少なくとも１つのサンプルホルダ及び／又は前記ヒートシンクが、少なくとも１つの熱伝導性の高い材料を有する、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記デバイスが、核酸増幅に関するサーモサイクラである、請求項１乃至３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５】
核酸増幅のための請求項１乃至４のいずれかに記載のデバイスの使用。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載のデバイスを用いて、少なくとも１つのサンプルをサーマルサイクル処理に従わせる方法において、
前記サーマルリファレンスの温度レベルが、サイクルの間、所定の温度レベルへと調整及び／又は維持される、方法。
【請求項７】
前記サーマルリファレンスの温度レベルが、前記サーモサイクルプロトコルの少なくとも２つの異なる温度レベルの間にある値へと調整及び／又は維持される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サーモサイクルプロトコルが０℃〜１０℃の間の温度値を提供する場合、前記サーマルリファレンスの温度レベルが、環境温度に近い値へと調整及び／又は維持される、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーモサイクルデバイスに関し、特にサーモサイクルプロトコルに対象物を従わせるサーモサイクルデバイスに関する。特に、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルのようなサーモサイクルプロトコルに、核酸を有するサンプルを従わせるサーモサイクルデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
サーモサイクルデバイスは、サーモサイクルプロトコルに対象物を従わせる装置である。即ち、対象物が反復的な態様で異なる温度に従属されるサイクルに従わされる。もっとも一般には、これらのデバイスは、サーモサイクラとしても知られており、生命科学実験において用いられる。この場合、これらのデバイスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順に基づかれる核酸の増幅のために用いられる。サーモサイクラは、サンプルが配置されることができる設備を持つサーマルブロックを有する。更に、斯かるデバイスは、離散的かつ事前にプログラムされた階段状にブロックの温度を上下させる加熱及び冷却ユニットを有する。斯かるサーモサイクルデバイスの基本的な原理は例えば、米国特許第５，０３８，８５２号に開示される。
【０００３】
このデバイスは、発散させられなければならない正味の熱を生成する。さもなければ、デバイスの全体の性能は、損なわれることになる。即ち、冷却及び／又は加熱性能が低下することになる。
【０００４】
従って、この処理において生成される余分な熱は、ヒートシンクへと廃棄又は発散されなければならない。このヒートシンクから直接又は間接的に、周囲に熱が逃される。これは順に、ヒートシンクが周囲より実質的に暖かくなっていくことを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特定された環境において、特にデバイスの小型化の話になると、熱放散は現実的なチャレンジである。なぜなら、小型化は、高スループット実験室環境、ラボオンチップ環境、高集積デバイス等において必要とされるからである。
【０００６】
このため、サーモサイクラ、特にペルチェ具備サーモサイクラは、生成された熱が発散させられる大きなヒートシンクを有する。これらのヒートシンクは、しばしば、ある温度、例えば３０℃に調整される冷却水循環システムに接続される。しかしながら、これは、上記の特定された小型化ニーズとの互換性を持たない追加的な装置要件を生じさせる。これは、高い製造コストと動作の間の大きな保守労力とを意味する。
【０００７】
更に、サーモサイクル処理の速度を上げることが、多くの用途において望ましい。しかしながら、ＰＣＲプロトコルにおいて、例えば、所与の温度で行われる異なるステップ（例えばアニーリング、伸長及び変性）の持続時間を単純に短縮することはできない。なぜなら、これらのステップが処理の効率に関連付けられるからである。処理速度を上げる唯一のオプションは、デバイスが１つのステップから次のステップにスイッチするのに必要な時間を減らすことである。次のステップとは即ち、中にサンプルを含むサンプルホルダを次の温度レベルまでそれぞれ加熱又は冷却するステップである。ペルチェ要素を有するサーモサイクラは、同様にこの問題を持つ。これらのデバイスの加熱及び冷却性能は限界があるので、サンプルホルダを加熱又は冷却するのに必要な時間は、これらのサーモサイクラにおいてかなり長い。即ち、いわゆる「熱ランプ」は、あまり急峻でない。
【０００８】
この問題を解決するために、相当な労力が費やされてきた。１つの手法は、サンプルホルダの熱容量を減らす、サンプルホルダの熱伝導率を上げる、並びにサンプルホルダと冷却及び／又は加熱デバイスとの間の熱伝導率を上げることである。別の手法は、熱的に単離された蓋をサンプルホルダに提供することである。しかしながら、これらのすべての手法が、サーモサイクル処理の速度に関連付けられる要件を完全に満たすというわけではない。
【０００９】
国際公開第２００６／１０５９１９号は、サーマルブロックと、少なくとも１つのヒートポンプと、ヒートシンクと、制御ユニットと、上記ヒートシンク及び上記ヒートポンプと熱的に接触するサーマルベースとを有する複数のサンプルの同時的なサーモサイクルに関するデバイスを開示する。サーマルベースは、熱を輸送及び分散させる例えばヒートパイプといった蒸気チャンバデバイスである。ヒートシンクと組み合わせてサーマルベースを用いることは、熱放散を改良し、サーモサイクルプロトコルに含まれる冷却ステップに必要な時間を減少させるのに役立つ。
【００１０】
しかしながら、上記サーマルベースは、ヒートシンクによる熱放散だけを改善する。不利な点は、この効果が一方向性である点にあり、ヒートシンクに対する熱放散にだけ影響を及ぼすことにある。別の不利な点は、サーマルベースがスイッチ「オン」又は「オフ」されるという態様でのみ、サーマルベースが制御されることができる点にある。従って、このサーマルベースは、受動的に機能する発散デバイスに過ぎない。
【００１１】
本発明の目的は、サーマルサイクル処理に、特にポリメラーゼ連鎖反応にサンプルを従わせるサーモサイクルデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、独立請求項に記載のデバイスにより満たされる。従属項は、好ましい実施形態を提供する。
【００１３】
本発明が詳述される前に、本発明は、記載されるデバイス及び記載される方法の処理ステップの特定の要素部分に限定されるものではない点を理解されたい。なぜなら、斯かるデバイス及び方法は、変形されることができるからである。数値により区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、この範囲がこれらの制限値を含むとみなされる点も理解されたい。
【００１４】
本発明によれば、少なくとも１つのサンプルホルダ、少なくとも１つのサーマルリファレンス及び少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイスを有するサーモサイクルデバイスが提供される。後者は、上記サンプルホルダと上記サーマルリファレンスとの間に配置され、上記サンプルホルダと上記サーマルリファレンスと熱伝導的に接触する。更に、このデバイスは、サイクルの間上記サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに保つ少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスと、上記温度制御手段と熱伝導的に接触するヒートシンクとを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】サーモサイクルデバイスを示す図である。
【図２】異なる実施形態のサーモサイクルデバイスを示す図である。
【図３Ａ】ＰＣＲサーモサイクルプロトコルを例示的に示す図である。
【図３Ｂ】同じＰＣＲサーモサイクルプロトコルを示す図であるが、この場合、サーマルリファレンスの温度レベル（グレー水平棒）が、アニーリング温度と変性温度との間の算術平均以下だがアニーリング温度よりまだ高いある値へと調整される、図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本書で使用される用語「サンプルホルダ」は、例えば核酸を有する生体サンプルといったサンプルを受けることができるデバイスを指す。これらのサンプルは、マイクロ反応管又はマイクロタイタプレートのような専用の容器に含まれることができる。
【００１７】
本書で使用される用語「サーモサイクルプロトコル」は、少なくとも１つのサンプルホルダ及びそこに含まれるサンプルがそれぞれ、少なくとも２つの異なる温度レベルへと反復的に加熱及び／又は冷却されるプロトコルを指す。
【００１８】
この目的のために、加熱及び／又は冷却デバイスは、好ましい実施形態において、マイクロプロセッサ制御ユニット及びメモリを具備する。メモリには、サーモサイクルプロトコルが格納される。
【００１９】
好ましい実施形態において、加熱及び／又は冷却デバイスは、熱電デバイスである。これは、例えば熱イオン放出デバイスとすることができる。別の好ましい実施形態において、熱電デバイスは、サーモトンネル冷却デバイスである。別の好ましい実施形態において、熱電デバイスは、ヒートポンプである。
【００２０】
しかしながら、特に好ましい実施態様では、加熱及び／又は冷却デバイスは、ペルチェ要素である。同様に、サーマルリファレンスに対する少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスは好ましくは、少なくとも１つの熱電デバイスを有し、より好ましくは少なくとも１つのペルチェ要素を有することができる。
【００２１】
本発明のある実施形態によれば、このデバイスは、サンプルホルダとサーマルリファレンスとの間に配置される、少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイスを有することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、このデバイスは、サンプルホルダとサーマルリファレンスとの間に配置される、多数の加熱及び／又は冷却デバイスを有することができる。本実施形態において、加熱及び／又は冷却デバイスは好ましくは、多数の個別のペルチェ要素である。これは、サーモサイクル処理を更に最適化するため、サンプルホルダの単一のチャンバが独立して制御された温度とすることができる利点を提供することができる。
【００２２】
しばしば熱電ヒートポンプ又は温度電気冷却器と呼ばれるペルチェ要素は、デバイスの１つの側からその他の側へと熱を移す半導体アクティブヒートポンプである。好ましい実施形態において、斯かるデバイスは、Ａｌ２Ｏ３から作られる２つのセラミックプレートに含まれる。これらのプレートの間に、好ましくはＢｉ２Ｔｅ３、Ｓｂ２Ｔｅ３、Ｂｉ２Ｓｅ３等を有するグループから選ばれるｐ及びｎドープの半導体から作られる小さな立方体が配置される。これらは、その上部又は下部においてそれぞれ交互的な態様で金属ブリッジを用いて互いに接続される。
【００２３】
本発明によるデバイスは、サーマルリファレンスの温度を制御するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスを提供することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明によるデバイスは、サイクルの間、サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに維持するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスを提供する。こうして、加熱及び／又は冷却デバイスに関する一定の温度リファレンスが、サイクルの間、提供されることができる。
【００２４】
加熱及び／又は冷却デバイスがペルチェ要素である場合、この１つの側面は、サンプルホルダと隣接し、他の側面は、サーマルリファレンスと接触し、後者の側面は、サイクルの間、サーモサイクルの実際の状態に関係なく、即ちサンプルホルダが加熱又は冷却されるかに関係なく一定の温度を経験することになる。従って、本発明によるデバイスは、加熱及び／又は冷却デバイスのより良好な性能に関する状態を、特に後者がペルチェ要素である場合に提供する。
【００２５】
サンプルの貯蔵のためサンプルホルダが低温へと冷却されることになる場合、好ましくは０℃付近に、より好ましくは０℃〜１０℃の間に、又は４℃〜８℃の間に冷却されることになるとき、サーモサイクルプロトコルの終了段階において、サーマルリファレンスのリファレンス温度が減らされることができる。本発明によるデバイスは、貯蔵の間、サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに維持するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスを提供することができる。加熱及び／又は冷却デバイスに関する一定の温度リファレンスが、貯蔵の間、提供されることができる。好ましくは、貯蔵の間の一定の温度リファレンスは、サイクルの間の一定の温度リファレンスより低い。
【００２６】
こうして本発明によるデバイスは、サイクルの間、サーマルリファレンスの温度を所定の温度レベルに維持し、貯蔵の間、サーマルリファレンスの温度を好ましくは異なる所定の温度レベルに維持するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスを提供することができる。
【００２７】
こうして熱又は冷気が上記加熱及び／又は冷却デバイスから上記サーマルリファレンスへと発散させられる場合であっても、上述したリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスは、サーマルリファレンスの温度を所定のレベルに能動的に維持するデバイスを提供することができる。
【００２８】
サーマルリファレンスの温度は、変化されることができる。一般に、サーマルリファレンスが、サイクルの間、所定の温度レベルに維持されることが好ましい。これは、サンプルホルダが加熱又は冷却されるかどうかという事実に関係なく、サーマルリファレンスが一定の温度を持つことを意味する。
【００２９】
サーマルリファレンスが、貯蔵の間、別の所定の温度レベルに維持されることが更に好ましい。貯蔵の間の温度レベルは好ましくは、サイクルの間の温度レベルより低い温度レベルである。
【００３０】
本発明によれば、いつでも制御された温度とすることができるサーマルリファレンスが提供される。本発明によるデバイスは、処理効率の改善を提供することができる。特にランプ速度における増加及び／又はエネルギー使用における減少が、処理の効率に貢献することができる。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様によれば、サーマルリファレンスは「サーマルバッファ」として機能することができる。このバッファには、そうでなければヒートシンクを介してデバイスから発散させられる熱が蓄積されることができる。加熱及び／又は冷却デバイス、特にペルチェが時間的変動を処理する必要がある事態を防止するため、蓄積された熱が、サーマル負荷の時間的変動を処理するのに用いられることが好ましい。その場合、サーマルリファレンス又はサーマルバッファは「時間的バッファ」として機能することができる。蓄積された熱が、別のサンプルホルダを加熱するのに用いられることができることが更に好ましい。例えば、サーマルリファレンスは、非同期で循環する加熱及び／又は冷却デバイス、特にペルチェ要素へと熱を分散させることにより、サーマル負荷の空間分布を平らにすることができる。その場合、サーマルリファレンス又はサーマルバッファは、「空間バッファ」として機能することができる。
【００３２】
本発明によるデバイスは、サンプルホルダ及びサンプルのより高速及び／又はより効率的な温度制御を提供することができる。特に有利には、デバイスの全体の熱放散が減らされることができる。
【００３３】
好ましい実施形態において、このデバイスは、上記リファレンス加熱及び／又は冷却デバイスと熱伝導的に接触するヒートシンクを有する。上記リファレンス加熱及び／又は冷却デバイスは、発散させられる熱をほとんど除去することになる。この目的のために、ヒートシンクが必要とされる。しかしながら、例えばすべてのサンプル及び／又はサンプルホルダが同時に加熱されるとき、リファレンス加熱及び／又は冷却デバイスは、ヒートシンクから熱を取ることもできる。
【００３４】
ヒートシンクは、例えば従来のヒートシンク、即ちひれのある（finned）冷却器とすることができる。後者はオプションで、ファンを具備することができる。別の実施形態では、上記ヒートシンクは、冷却水循環システムを有することができる。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、サーマルリファレンス、少なくとも１つのサンプルホルダ及び／又はヒートシンクは、少なくとも１つの熱導電性の高い材料を有する。この材料は好ましくは、銅、銀及び／又はアルミニウム、及び／又はセラミック、サーメット及び／又は前者を有する合金を有するグループから選択され、特に好ましくは、銅及び／又はアルミニウム、及び／又はセラミック、サーメット及び／又は前者を有する合金を有するグループから選択される。この特徴は、サンプルホルダ及びそこに含まれるサンプルの加熱及び／又は冷却の速度を上げるために有益である。
【００３６】
サーマルリファレンスのサーマル容量は、用途に依存する。更に、このデバイスは、サーモサイクルプロトコルの少なくとも２つの異なる温度レベル間の値へとサーマルリファレンスの温度レベルを調整する及び／又は維持する手段を有することが好ましい。これは、サンプルホルダが３つの異なる温度レベル（例えば６６、７０及び９４℃）へと反復的に従わされるサーモサイクルプロトコルが実行されると仮定するとき、サーマルリファレンスの温度レベルが例えば、上記プロトコルの２つの極値間のある値へと制御されることを意味する。加熱及び／又は冷却デバイスによりブリッジされることになるサンプルホルダとサーマルリファレンスとの間のサーマルギャップ又は温度差（ΔＴ）（即ち、この温度差を超えると加熱及び／又は冷却デバイスが熱を汲み上げなければならない温度差）が、最小にまで減らされる。これは、加熱及び／又は冷却デバイスのエネルギー消費の削減をもたらす。このことは、実験室用途において特に有益である。なぜなら、個別の電源の小型化を可能にし、電源の熱放散の削減をもたらすからである。
【００３７】
他の実施形態では、第１の温度は例えば、６６℃の代わりに５６℃を採用することができる。
【００３８】
更に、これは、加熱及び／又は冷却デバイスにより生成される熱の削減及び熱放散要求の減少をもたらす。これは順に、ヒートシンクの削減を可能にする。
【００３９】
このデバイスは、より少ないエネルギー使用を提供することができる。このことは、より少ない熱搬送を提供し、及び／又は電源を小型化する可能性を提供することができる。特に実験室において、デバイスに対して必要なスペースが少なくて済むことは、特に有益でありえる。更に、電源を小型化することは、熱搬送の減少を生じさせることができる。より低い温度であることは、ファンも必要でないという利点を提供することができる。
【００４０】
処理時間は減少されることができ、特に温度ランプ速度は増加されることができる。一般に、このデバイスは、増加された効率を提供することができる。
【００４１】
好ましい実施形態において、サーマルリファレンスの温度レベルは、サーモサイクルプロトコルにおいて連続して採用される２つの異なる温度レベルの算術平均に近いある値へと調整及び／又は維持される。上記の例において、サーマルリファレンスの上記温度レベルは、約８０℃であるよう制御されることができる。他の例では、サーマルリファレンスの温度レベルが約７０℃であるよう制御されることも好ましい。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、サーマルリファレンスの温度レベルは、ある値へと調整及び／又は維持される。その値とは、サーモサイクルプロトコルにおいて連続して採用される２つの異なる温度レベルの算術平均以下であるが、上記２つの異なる温度レベルの低い方のレベル以上である値である。この好ましい実施形態は特に有益である。なぜなら、それが、デバイスの熱放散及びエネルギー消費を更に減らすことになるからである。これは、サンプルホルダとリファレンスとの間のポジティブな温度ギャップ（サンプルホルダからリファレンス温度を引いた差）を維持することが、ネガティブな温度ギャップを維持するより少ない熱を必要とするという事実によるものである。
【００４３】
サーマルリファレンスの上記温度レベルが約７０℃であるよう制御されるとすると、加熱及び／又は冷却デバイスは、６６℃の温度へとサンプルホルダを冷却するために、−４℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならない。それとは対照的に、９４℃の温度へとサンプルホルダを加熱するため、加熱及び／又は冷却デバイスは、＋２４℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならない。
【００４４】
第１の温度レベルとして５６℃が選択される場合、加熱及び／又は冷却デバイスが、サンプルホルダを冷却するため、−１４℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならない。
【００４５】
上記サーマルリファレンスがないと、サーマルギャップは、環境温度と加熱又は冷却処理そのものとに依存する。これは、実施形態によっては、ギャップを埋めることができない処理又は少なくとも非効率的なエネルギーを生じさせる。従って、１つの主要な利点は、サーマルギャップが選択されることができ、エネルギー、速度及び／又はサイズといった異なる基準に関して最適化されることができる点にある。
【００４６】
別の利点は、加熱及び冷却ステップの速度が、サーマルリファレンスを用いて速くされることができる点にある。このリファレンスは、好ましくはサーモサイクルプロトコルの少なくとも２つの異なる温度レベルの間の温度を持ち、より好ましくは温度サイクルの範囲の中心近くの温度を持つ。なぜなら、サーマルギャップ（ΔＴ）が減らされるからである。より大きな温度ギャップを維持することは、高温側から低温側へのより大きな熱「漏れ」を引き起こす。それゆえに、この熱漏れを補償するのにより大きな電流が必要とされる。更に、より高い電流は、例えばペルチェデバイスの内部の電気抵抗が原因で、より大きな電力の入力を必要とする。こうして、スペース及びコストの観点でスペックの高い、より多くの熱を発散する大きな電源を必要とする。こうしたことはすべて、上述した用途に対して斯かるデバイスを好ましくないものにしてしまう。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、サーマルリファレンスの温度レベルは、より低い値へと調整されて及び／又は維持される。この低い値とは、サーモサイクルプロトコルが、０℃から１０℃の間の温度値を提供する場合、特に増幅されたプロダクトの増幅後の貯蔵に関しては、例えば環境温度に近い値である。
【００４８】
本書で使用される用語「環境温度」は、デバイスのすぐ近くの周囲における温度を指す。水冷デバイスが約４０℃の温度で用いられるいくつかの場合には、こうして上記の意味における「環境温度」は、４０℃の値を採用することができる。室温での空冷が用いられる他の場合には、こうして上記の意味における「環境温度」は、例えば２５℃の値を採用することができる。
【００４９】
サーマルリファレンスの温度レベルが、貯蔵の間、約４０℃であるよう制御されることが好ましい。他の例において、サーマルリファレンスの温度レベルが、貯蔵の間、約２５℃であるよう制御されることも好ましい。
【００５０】
好ましくは、本発明によるサーモサイクルデバイスは、核酸増幅に関するサーモサイクラである。同様に、本発明は、核酸増幅のための本発明によるサーモサイクルデバイスの使用に関連付けられる。
【００５１】
本書で用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡを指す。好ましくは、この用語は、プラスミド、ゲノム、ウィルス性、ミトコンドリア及びｃＤＮＡだけでなく、ｍＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡを指す。
【００５２】
本発明の範囲内で、当業者に知られるすべての核酸増幅が適用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、ギャップＬＣＲ、リペア連鎖反応（ＲＣＲ）、ストランド・ディスプレイスメント・アンプリフィケーション（ＳＤＡ）、トランスクリプション・メディエイテッド・アンプリフィケーション（ＴＭＡ）、サイクリング・プローブ・テクノロジー反応（ＣＰＴ）又はＱβレプリカーゼ・アッセイがある。
【００５３】
核酸増幅に関して最も好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法の基本概念は、その内容が参考として本書に内含される米国特許第４，６８３，２０２号に開示される。
【００５４】
ＰＣＲ処理において、例えば以下の温度レベルを有するサーモサイクルプロトコルが適用される。
【００５５】
Ａ）変性温度：９４〜９６℃。この温度において、二本鎖核酸分子（交雑されたプライマーを含む）の２つのストランド間の水素結合が解放される。これは、２つの一本鎖を生じさせる。基本的に、さらに温度を高くするとより高速な変性が生じることになる（「溶解」とも呼ばれ、本書において同義的に用いられる）。しかし、ポリメラーゼ酵素（「Ｔａｑポリメラーゼ」）は、より高い温度では分解することになる。
【００５６】
Ｂ）アニーリング温度：５０〜７０℃。この温度において、プライマーのアニーリング（即ち、シーケンス状の特定のハイブリダイゼーション）が起こる。最適温度は、プライマーのＡＴ／ＧＣ成分に依存する。ＡＴの豊富なプライマーは、低いアニーリング温度を必要とするが、ＧＣの豊富なプライマーは、高いアニーリング温度を必要とする。
【００５７】
Ｃ）伸長温度：６０〜７５℃。この温度において、伸長処理が起こる。選択された温度は、個別のポリメラーゼに最適な温度に依存する。
【００５８】
Ｄ）貯蔵温度：０〜１０℃。一旦増幅サイクルが終わると、増幅された核酸の崩壊を防止するため、サンプルは貯蔵のため１０℃以下の温度へと冷却される。
【００５９】
ＰＣＲに関するサーモサイクルプロトコルは例えば、以下のステップを有する。
【表１】
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【００６０】
増幅プロトコルに基づき繰り返される温度レベルＡ〜Ｃの過程において、サーマルリファレンスの温度は、アニーリング温度と変性温度との間のある温度に維持される。
【００６１】
好ましくは、サーマルリファレンスの温度は、ある温度に維持され、その温度は、アニーリング温度と変性温度との間の算術平均である。
【００６２】
更に、別の好ましい実施形態において、サーマルリファレンスの温度は、変性温度よりアニーリング温度に近い温度に維持される。これは、熱電が冷却ではなく加熱に使用される場合、それがより少ない熱放散を必要とするという事実によるものである。
【００６３】
ステップＤにおいて、サーマルリファレンスの温度は、伸長温度と貯蔵温度との間のある温度に維持される。好ましくは、サーマルリファレンスの温度は、この場合環境温度に維持される。
【００６４】
斯かるデバイスの他の可能性のある使用法は例えば、物質検査を有することができる。即ち、加速された経年劣化挙動を検査するため、所与の温度サイクルにテスト標本を従わせる。本発明によるデバイスの他の可能な使用は、培養器デバイス、細胞培養デバイス、発酵デバイス、バイオリアクタ等としての使用を含む。
【００６５】
更に、本発明は、上記発明によるデバイスを用いてサーマルサイクル処理に少なくとも１つのサンプルを従わせる方法を提供する。この場合、サーマルリファレンスの温度レベルは、サイクルの間、所定の温度レベルへと調整及び／又は維持される。上記サンプルは、好ましくは核酸を有する生体サンプルである。サーモサイクルプロトコルは好ましくは、ＰＣＲプロトコルである。この方法の詳細及び利点に関しては、明細書のこれまでの部分を参照されたい。
【００６６】
好ましい実施形態において、サーマルリファレンスの温度レベルは、サーモサイクルプロトコルの少なくとも２つの異なる温度レベルの間のある値へと調整及び／又は維持される。
【００６７】
更に、別の好ましい実施形態において、サーモサイクルプロトコルが、０℃〜１０℃の間の温度値を提供する場合、サーマルリファレンスの温度レベルは、環境温度に近い値へと調整及び／又は維持される。
【００６８】
本発明の目的の追加的な詳細、特徴、特性及び利点が、請求項、図及び個別の図及び例示についての以下の記載において開示される。これは、例示的な態様で、本発明による細胞溶解及び／又はミキシングデバイス又はミクロ液体デバイスの好ましい実施形態を示す。しかしながら、これらの図面は、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきでない。
【００６９】
図１は、サンプルホルダ１１と、サーマルリファレンス１２と、上記サンプルホルダ１１及び上記サーマルリファレンス１２の間に構成される加熱及び／又は冷却デバイス１３とを有するサーモサイクルデバイス１０を示す。加熱及び／又は冷却デバイス１３は、ペルチェ要素から成る。これは、サンプルホルダ１１及びサーマルリファレンス１２と熱伝導的に接触する。ペルチェ要素１３は、電源（図１にて図示省略）を具備する制御ユニットに有線接続される。少なくとも２つの異なる温度レベルを有するサーモサイクルプロトコルへとサンプルホルダを従わせることができるよう、ペルチェ要素は選択される。
【００７０】
更に、このデバイスは、サイクルの間、サーマルリファレンス１２の温度を所定の温度レベルに維持するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイス１４を有する。別のペルチェ要素から成るリファレンス加熱及び／又は冷却デバイス１４は、ヒートシンク１５と熱伝導的に接触する。後者は、２つの部品１６を介して水冷却サイクルに接続される。ペルチェ要素１４は、電源（図１にて図示省略）を具備する別の制御ユニットに有線接続される。サイクルの間、サーマルリファレンス１２の温度を所定の温度レベルに維持することができるよう、ペルチェ要素は選択される。
【００７１】
サンプルホルダ１１は、マイクロ反応管１７を受けることができるよう設計される。この管は、例えば、生体サンプルを有する。
【００７２】
図２は、熱的に絶縁された容器を備えるサンプルホルダ２１、サーマルリファレンス２２、及び、上記サンプルホルダ２１と上記サーマルリファレンス２２との間に構成される多数の加熱及び／又は冷却デバイス２３を有する異なる実施形態のサーモサイクルデバイス２０を示す。加熱及び／又は冷却デバイス２３は、個別のペルチェ要素から成る。これらは、サンプルホルダ２１の異なる熱的に絶縁された容器、及びサーマルリファレンス２２と熱伝導的に接触する。ペルチェ要素２３は、電源（図２にて図示省略）を具備する制御ユニットに有線接続される。少なくとも２つの異なる温度レベルを有する個別のサーモサイクルプロトコルへとサンプルホルダ２１の異なる熱的に絶縁された容器を従わせることができるよう、ペルチェ要素は選択される。
【００７３】
更に、このデバイスは、サイクルの間、サーマルリファレンス２２の温度を所定の温度レベルに維持するリファレンス加熱及び／又は冷却デバイス２４を有する。別のペルチェ要素から成るリファレンス加熱及び／又は冷却デバイス２４は、ヒートシンク２５と熱伝導的に接触する。後者は、２つの部品２６を介して水冷却サイクルに接続される。ペルチェ要素２４は、電源（図２にて図示省略）を具備する別の制御ユニットに有線接続される。サイクルの間、サーマルリファレンス２２の温度を所定の温度レベルに維持することができるよう、ペルチェ要素は選択される。
【００７４】
サンプルホルダ２１は、マイクロ反応管２７を受けることができるよう設計される。この管は、例えば、生体サンプルを有する。サンプルホルダ２１の異なる熱的に絶縁された容器を個別に加熱及び／又は冷却するオプションを提供することにより、個別のサーモサイクルプロトコルが、マイクロ反応管に含まれる異なるサンプルに対して提供されることができる。これは例えば、マルチプレクス化されたＰＣＲ手法に関して必要とされる。この場合、異なるＡＴ：ＧＣ成分を持つ、若しくは長さにおいて変化する異なるプライマーが用いられるか、又は、増幅された核酸の長さが変化する。こうしてこれらのマルチプレクス化されたＲＣＲ手法は、異なるアニーリング温度、異なるアニーリング時間並びに／又は異なる伸長及び／若しくは変性時間を必要とする。
【００７５】
図３Ａは、ＰＣＲサーモサイクルプロトコルを例示的に示す。明確さのため、３つの増幅サイクルだけが示される。通常、サーモサイクルの数は、１０から１００の間の範囲にある。サーモサイクルは、９４℃でのプライマリ変性ステップを有する。ここで、補完的なヌクレオチド間の水素結合が解放され、二本鎖核酸分子は２つの一本鎖分子へと変換される。その後、後続のアニーリング、伸長及び変性ステップを有する増幅サイクルが開始する。
【００７６】
アニーリングは、比較的低い温度で起こる（例えば６６℃又は５６℃）。この温度で、一本鎖核酸分子に対するプライマーのアニーリング（即ちシーケンス状の特定のハイブリダイゼーション）が起こる。しかしながら、最適温度は、プライマーのＡＴ／ＧＣ成分に依存する。ＡＴの豊富なプライマーは、低いアニーリング温度を必要とするが、ＧＣの豊富なプライマーは、高いアニーリング温度を必要とする。
【００７７】
本実施例では、７０℃の温度で伸長が起こる。このステップでは、熱耐性ポリメラーゼは、テンプレートとして一本鎖核酸分子を取り、開始点としてプライマーの３'末端を用いつつ、テンプレートの個別のヌクレオチドに対して補完的な対ヌクレオチドが、プライマーに結合される。しかしながら選択された温度は、個別のポリメラーゼに最適な温度に依存する。最も人気のあるポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼで、これは、７２℃の温度で最適に伸長する。このステップは、１，０００個のベースペア当たりおよそ１分かかる。その後、新しい変性ステップが適用される。
【００７８】
一旦選択されたサイクル数が実行されると、最終的な伸長ステップが起こる。このステップは、先行する伸長ステップより長く持続する。このステップは、任意の残りの一本鎖核酸が完全に伸長されることを確実にするのに役立つ。
【００７９】
その後、増幅された核酸の崩壊を防止するため、サンプルは、貯蔵のため１０℃以下の温度へと冷却される。
【００８０】
増幅処理の間、サーマルリファレンスの温度レベル（グレー水平棒）は、アニーリング温度（６６℃）と変性温度（９４℃）との間の算術平均に近い値、即ち８０℃へと調整される。これは、矢印により示されるように、アニーリングのためサンプルホルダを６６℃の温度へと冷却するのに、ペルチェデバイスが−１４℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならない一方で、サンプルホルダを９４℃の温度へと加熱するのに、加熱及び／又は冷却デバイスが＋１４℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならないことを意味する。
【００８１】
アニーリング温度が５６℃である場合、サーマルリファレンスの温度レベルをより低い値、例えば７５℃へと調整するだろう。この値はここでも、アニーリング温度と変性温度との間の算術平均値である。
【００８２】
図３Ｂは、同じＰＣＲサーモサイクルプロトコルを示す。しかしながら、この場合、サーマルリファレンスの温度レベル（グレー水平棒）は、アニーリング温度と変性温度との間の算術平均以下であるが、アニーリング温度よりまだ高い値へと調整される。この場合、サーマルリファレンスの温度レベルは、伸長温度に等しい値、即ち７２℃へと調整される。
【００８３】
デバイスの熱放散及びエネルギー消費を更に減らすという点で、この実施形態は有益である。これは、ペルチェデバイスの加熱性能が冷却性能より常に良いという事実によるものである。図３Ｂの例において、ペルチェデバイスは、アニーリングのためサンプルホルダを６６℃の温度へと冷却するのに、−６℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならない。それとは対照的に、サンプルホルダを９４℃の温度へと加熱するのに、加熱及び／又は冷却デバイスは、＋２２℃のサーマルギャップ（ΔＴ）を埋めなければならないであろう。サーマルギャップは、矢印により示される。
【００８４】
アニーリング温度が５６℃である場合、サーマルリファレンスの温度レベルをより低い値、例えば６６℃へと再び調整するだろう。この場合も、ペルチェ要素が、冷却より加熱において一層効率的であるという事実によるものである。
【００８５】
いずれの場合においても、冷却に関するサーマルギャップ（それぞれ−６℃又は−１０℃）は、加熱に関するサーマルギャップ（それぞれ＋２２℃又は＋２８℃）より小さい。従って、温度レベルについての上記構成は、ペルチェ要素が加熱より冷却において効率が下がるという事実を説明する。
【００８６】
図面、開示及び添付の特許請求の範囲の研究から、開示された実施形態に対する他の変形が、請求項に記載された発明を実施する当業者により理解され及び遂行されることができる。請求項において、単語「有する」は他の要素又はステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数性を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属項に記載されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示すものではない。請求項における任意の参照符号は、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００８７】
上記の詳細な実施形態における特定の要素及び特徴の組み合わせは、例示的なものにすぎない。本出願及び参照により含まれる特許／出願における他の教示を、これらの教示と交換すること及び代入することも、明白に想定される。当業者であれば理解されるであろうが、請求項に記載される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、変形、修正及び本願明細書に記載される以外の他の実現を当業者であれば思いつくことができる。従って、前述の説明は、例示に過ぎないものであり、限定として意図されるものではない。本発明の範囲は、以下の請求項及びその均等の範囲において規定される。更に、明細書及び請求項において使用される参照符号は、請求項に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
2014100145.tif 000004
【図２】
2014100145.tif 000005
【図３Ａ】
2014100145.tif 000006
【図３Ｂ】
2014100145.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月7日(2014.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのサンプルをサーモサイクルプロセスに従わせるサーモサイクルデバイスであって、
ａ）少なくとも１つのサンプルホルダと、
ｂ）少なくとも１つのサーマルリファレンスと、
ｃ）前記サンプルホルダと前記サーマルリファレンスとの間に構成され、前記サンプルホルダ及び前記サーマルリファレンスと熱伝導的に接触する少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイスと、
ｄ）少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスであって、前記サーマルリファレンスの温度レベルを、前記サーモサイクルプロセスの少なくとも２つの異なる温度レベルの間にある値へと調整及び／又は維持する、少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスとを有する、サーモサイクルデバイス。
【請求項２】
前記サーモサイクルプロセスが、アニーリング、伸長及び変性ステップを含む増幅サイクルを有し、前記サーマルリファレンスは、アニーリング温度と変性温度との間の算術平均に近い値へと調整及び／又は維持される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記サーマルリファレンスは、前記サーモサイクルプロセスにおいて連続して採用される２つの異なる温度レベルの算術平均以下であるが、前記２つの異なる温度レベルの低い方のレベル以上である値へと調整及び／又は維持される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記少なくとも１つの加熱及び／又は冷却デバイス及び／又は前記少なくとも１つのリファレンス加熱及び／又は冷却デバイスが、少なくとも１つの熱電デバイスを有する、請求項１乃至３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５】
前記サーマルリファレンス、及び／又は前記少なくとも１つのサンプルホルダが、少なくとも１つの熱伝導性の高い材料を有する、請求項１乃至４のいずれかに記載のデバイス。
【外国語明細書】
2014100145000001.pdf