(57)【要約】【課題】従来から知られている蛍光標識ペプチド基質を用いたネプリライシンの活性の評価方法では、感度が十分ではなかった。検体を提供する哺乳動物における神経病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡ等の開発が切望されていた。【解決手段】神経細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法であって、（ａ）神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第一工程と、（ｂ）第一工程により染色されたネプリライシンを定量する第二工程と、（ｃ）第二工程により定量されたネプリライシン量を対照値と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有するネプリライシンの活性の有無若しくはその程度を評価する第三工程と、を含むことを特徴とする方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法であって、
（ａ）神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第一工程と、
（ｂ）第一工程により染色されたネプリライシンを定量する第二工程と、
（ｃ）第二工程により定量されたネプリライシン量を対照値と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有するネプリライシンの活性の有無若しくはその程度を評価する第三工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
神経細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）被験物質と神経細胞とを接触させる第一工程と、
（ｂ）第一工程後に得られる神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第二工程と、
（ｃ）第二工程により染色されたネプリライシンを定量する第三工程と、
（ｄ）第三工程により測定されたネプリライシン量を対照と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有する活性の有無若しくはその程度を評価する第四工程と、
（ｅ）第四工程により得られる評価結果に基づき、神経細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質である被験物質を選択する第五工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
第四工程における対照が、被験物質を接触させていない神経細胞の表面上に存在するネプリライシン量又はそれと相関する指標値であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記神経細胞がネプリライシン及び／又はソマトスタチンレセプター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が宿主となる神経細胞内に導入されて得られる形質転換体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
前記神経細胞が初代培養神経細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞が、膜透過処理を施されていない細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項７】
請求項１記載の第二工程又は請求項２記載の第三工程が、画像解析装置を用いて定量することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は進行性の認知障害を特徴とする神経変性疾患の一種である。アルツハイマー病患者の脳では大脳皮質の萎縮、神経細胞脱落、老人斑や神経原線維変化等の特徴的な病理学的な変化が観察される。これらのうち、老人斑の形成は初期段階から見られる病理変化であり、その主要構成成分がアミロイドβタンパク質（以下、「Ａβ」と記すこともある）であることから、Ａβの産生又は分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深く関わっていると考えられている。Ａβの分解に関与する主要な分解酵素として、ペプチダーゼの一つであるネプリライシン（以下、「NEP」と記すこともある）がすでに同定されている。
従って、神経細胞が有するネプリライシンの活性を増加させ、Ａβの分解を促進することにより、Ａβの蓄積が抑制されると考えられる。このような知見に基づけば、神経細胞が有するネプリライシンの活性を評価することによって、ネプリライシンの活性を増強する物質を探索し特定できる。当該物質は、Ａβタンパク質関連疾患を治療又は予防するための薬剤（即ち、具体的には例えば、アルツハイマー病の治療剤又は予防剤）として有用であり、前記疾患の治療又は予防が可能となる。
【０００３】
このようなネプリライシンの活性の評価方法として、非特許文献１にはネプリライシンの蛍光標識ペプチド基質を用いた活性の評価方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Neuroscience Methods 190, 57−62, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ペプチダーゼ等には基質特異性が厳密でないものも多いため、従来から知られている蛍光標識ペプチド基質を用いたネプリライシンの活性の評価方法では、感度が十分ではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、このような状況を鑑み鋭意検討した結果、神経細胞の表面上に移行したネプリライシンが細胞外に存在するＡβ等の基質を分解することから、神経細胞の表面上に存在するネプリラシンの量を測定することで、前記神経細胞が有するネプリライシンの活性が評価できると考えた。即ち、神経細胞が有するネプリライシンの活性は前記神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量に比例する。そこで、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を高感度で、正確かつ簡便に測定することにより、本発明に至った。
【０００７】
即ち、本発明は
１．神経細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法であって、
（ａ）神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第一工程と、
（ｂ）第一工程により染色されたネプリライシンを定量する第二工程と、
（ｃ）第二工程により定量されたネプリライシン量を対照値と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有するネプリライシンの活性の有無若しくはその程度を評価する第三工程と、
を含むことを特徴とする方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
【０００８】
２．神経細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）被験物質と神経細胞とを接触させる第一工程と、
（ｂ）第一工程後に得られる神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第二工程と、
（ｃ）第二工程により染色されたネプリライシンを定量する第三工程と、
（ｄ）第三工程により測定されたネプリライシン量を対照と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有する活性の有無若しくはその程度を評価する第四工程と、
（ｅ）第四工程により得られる評価結果に基づき、神経細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質である被験物質を選択する第五工程と、
を含むことを特徴とする方法（以下、本発明スクリーニング方法と記すこともある。）；
【０００９】
３．第四工程における対照が、被験物質を接触させていない神経細胞の表面上に存在するネプリライシン量又はそれと相関する指標値であることを特徴とする前項２記載の方法；
４．前記神経細胞がネプリライシン及び／又はソマトスタチンレセプター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が宿主となる神経細胞内に導入されて得られる形質転換体であることを特徴とする前項１〜３のいずれか記載の方法；
５．前記神経細胞が初代培養神経細胞であることを特徴とする前項１〜３のいずれか記載の方法；
６．前記神経細胞が、膜透過処理を施されていない細胞であることを特徴とする前項１〜３のいずれか記載の方法；
７．前項１記載の第二工程又は前項２記載の第三工程が、画像解析装置を用いて定量することを特徴とする前項１〜７のいずれか記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞が有するネプリライシンの活性の優れた評価方法等を提供可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明において使用したSH-SY5Y細胞と作製したネプリライシン安定発現細胞であるSH-SY5Y/NEP#12細胞、ソマトスタチンレセプター４安定発現細胞であるSH-SY5Y/SSTR4#12細胞、ネプリライシンとソマトスタチンレセプター４の両方の安定発現細胞であるSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞におけるネプリライシン（A）の発現量とソマトスタチンレセプター４（B）の発現量とをリアルタイムPCR法により測定した結果を示している。
【図２】図２は、本発明で用いられる染色方法によりSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した結果を示している。
【図３】図３は、SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を用いて本発明スクリーニング方法により神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを定量した結果を示している。L803,087又はNNC 26-9100の添加により前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加していることから、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合における、前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を「１００」とした。
【図４】図４は、SH-SY5Y/NEP#12細胞を用いて本発明スクリーニング方法により、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを定量した結果を示している。L803,087の添加により前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加していることから、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合における、前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を「１００」とした。
【図５】図５は、SH-SY5Y/SSTR4#12細胞を用いて本発明スクリーニング方法により、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを定量した結果を示している。NNC 26-9100の添加により前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加していることから、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合における、前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を「１００」とした。
【図６】図６は、SH-SY5Y細胞を用いて本発明スクリーニング方法により、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを定量した結果を示している。L803,087又はNNC 26-9100の添加により前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加していることから、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合における、前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を「１００」とした。
【図７】図７は、初代培養神経細胞を用いて本発明スクリーニング方法により、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを定量した結果を示している。L803,087の添加により前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加していることから、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合における、前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を「１００」とした。
【図８】図８は、SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を用いて公知の手法を用いてネプリライシンの活性を測定した結果を示している。L803,087の添加によりネプリライシンの活性が上昇していることを示している。ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した場合におけるネプリライシンの活性を「１００」とした。
【図９】図９は、SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した結果を示している。  図９Ａは、抗NEP抗体F4（SantaCruz社製）を用いて、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した結果を示している。  図９Ｂは、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を用いて、神経細胞の表面上及び細胞内に存在するネプリライシンを染色した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、DNAの調製やプラスミドの調製等の遺伝子工学的な手法、免疫染色等のタンパク質工学的な手法は、特に明記しない限り、Molecular Cloning, A Laboratory  Manual（T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory（1982））、新生化学実験講座（日本生化学会編；東京化学同人）等の実験書に記載される方法又はそれに準じた方法により行うことができる。
【００１３】
本発明における「ネプリライシン」とは、Ａβ分解活性を有することが知られている、中性エンドペプチダーゼの一種である。当該タンパク質は、例えば、Nature Med. 6, 143−150, 2000, 等に記載された公知なタンパク質である。
当該タンパク質は、例えば、NCBIデータベースにおいて「NP＿000893」で示されるタンパク質であり、CALLA、CD10、NEP、SFEとも呼ばれることもある。
ネプリライシンのノックアウトマウスでは脳内Ａβレベルが上昇しており、その上昇は海馬において最も顕著であることが知られている（Science 292, 155−1552, 2001）。また、実際に、アルツハイマー病患者の脳においてネプリライシンの発現が低下していることが知られている（Neuroscience Lett 297, 97−100, 2001）。
【００１４】
本発明における「ネプリライシン」としては、本発明において効果を有する実質的に同一のアミノ酸配列を有するものであれば如何なるネプリライシンであってもよいが、例えば、哺乳動物由来のネプリライシン等を好ましく挙げることができる。また、具体的には例えば、下記のいずれかのネプリライシンを好ましいものとして挙げることができる。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
【００１５】
ネプリライシンは細胞内では主にゴルジ体に局在しているが、何らかの刺激により活性化されると細胞の表面上への移行が促進される。その結果、細胞外の基質（Ａβ等）の分解が促進される。
【００１６】
Ａβは、約４０のアミノ酸残基からなるペプチドであり、前駆体タンパク質（βＡＰＰ）からアスパラギン酸プロテアーゼに属するβ−セクレターゼ（Science 286, 735−741, 1999）とγ−セクレターゼとにより切断され産生される。γ−セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）原因遺伝子、プレセニリン又はプレセニリンを含む複合体がその活性発現に関与していることが明らかにされている（Nature 398, 513−517, 1999、Nature 405, 689−694, 2000）。
このＡβは健常者の体内においても定常的に合成・分泌されており、正常状態では速やかに分解されて過度な蓄積は生じないと考えられている。アルツハイマー病患者では、Ａβの分解能力が低下しているために過剰なＡβの蓄積が起こると考えられる。
【００１７】
脳内においてネプリライシンの活性を上昇させる方法がアルツハイマー病の治療方法の一つとして考えられる。例えば、培養神経細胞においてソマトスタチン処理によりネプリライシンの酵素活性が約２倍程度増加することから、ソマトスタチンレセプターを標的にした薬剤はアルツハイマー病に対する有効な原因療法になりうると考えられる（Nature Med. 11, 434−439, 2005、J. Neuroscience Methods 190, 57−62, 2010）。
【００１８】
本発明における「神経細胞が有するネプリライシンの活性」としては、例えば、神経細胞１個あたりのネプリライシンの比活性を挙げることができる。ネプリライシンは細胞膜貫通型で作用する酵素であり、神経細胞の表面上に移行したネプリライシンが細胞外に存在するＡβ等の基質を分解することから、神経細胞の表面上に存在するネプリラシンを定量することにより、神経細胞１個あたりのネプリライシンの比活性を測定できる。
【００１９】
本発明における「ソマトスタチンレセプター４」とは、ネプリライシンの活性を制御することが知られているホルモンであるソマトスタチンのレセプターファミリーの一つとして知られているタンパク質である。当該タンパク質は、例えば、Eur. J. Pharmacolgy 654, 53−59, 2011 等に記載された公知なタンパク質である。
当該タンパク質は、NCBIデータベースにおいて「NP＿001043」で示されるタンパク質である。
【００２０】
本発明における形質転換体は、下記（１）のタンパク質又は下記（２）のタンパク質のいずれか、或いは、下記（１）のタンパク質と下記（２）のタンパク質との両方のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が宿主細胞内に導入されて得られる。
（１）ネプリライシン
（２）ソマトスタチンレセプター４
【００２１】
本発明における形質転換体の宿主となる細胞としては、公知のいかなる神経細胞でも用いることができる。例えば、昆虫起源の神経細胞、動物起源の神経細胞、初代培養神経細胞等を挙げることができる。好ましくは、例えば、哺乳動物由来の培養細胞（例えば、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等）を挙げることができる。
【００２２】
本発明における形質転換体は、このような宿主となる神経細胞に対して、ネプリライシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するプラスミドの形態である核酸、又は、ソマトスタチンレセプター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するプラスミドの形態である核酸のいずれか、或いは、その両方を外来的に導入するような人為的操作を施すことにより作製することができる。
前記人為的操作としては、用いられる宿主となる神経細胞に応じた通常の遺伝子工学的手法を利用すればよい。具体的には例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いて、当該試薬に添付された説明書に記載される方法に従い行う方法を挙げることができる。また、外来遺伝子としてプラスミドの形態である核酸を利用する場合には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法等を挙げることができる。
【００２３】
ここで「プラスミド」としては、ネプリライシン及び／又はソマトスタチンレセプター４を宿主となる神経細胞内で発現させることが可能なプラスミドを挙げることができる。このようなプラスミドは、通常の遺伝子工学的手法に従い、ネプリライシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸、又は、ソマトスタチンレセプター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を、公知の発現プラスミドのプロモーター下流の発現可能な位置に連結することにより作製することができる。
ここで「発現プラスミド」としては、例えば、昆虫神経細胞を宿主とする場合には、AcNPV等、動物神経細胞を宿主とする場合には、pUC18、pcDNA3.1、pcDNA6.2、p3XFLAG-CMV10等の公知のプラスミドを挙げることができる。
【００２４】
本発明における形質転換体でのネプリライシン又はソマトスタチンレセプター４のいずれか、或いは、両方のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子の宿主となる神経細胞内での保持は、一過的に保持されたものであってもよいし、また安定的に保持させたものであってもよい。安定的に保持された形質転換体は、当該外来遺伝子と同時に宿主となる神経細胞内に導入された薬剤耐性マーカー等（例えば、発現プラスミドに含有された薬剤耐性マーカー等）を指標にして選択すればよい。
【００２５】
本発明における形質転換体の細胞内で、ネプリライシン又はソマトスタチンレセプター４のいずれか、或いは、両方のタンパク質を発現させるには、例えば、本発明における形質転換体を培養液の中で培養すればよい。
本発明における形質転換体の培養条件は、前記形質転換体の種類に応じた条件を適宜選択すればよい。
【００２６】
また形質転換体が昆虫神経細胞の場合には、昆虫神経細胞の種類に応じて適した培養条件とすればよい。例えば、FBS及びYeastolateを含むGrace's medium等の昆虫神経細胞用培地を用いて培養すればよい。培養温度としては、例えば、２５℃〜３５℃の範囲を挙げることができる。培地のpHとしては、昆虫神経細胞の生育可能範囲であればよい。例えば、pH６〜pH８の範囲を挙げることができる。培養時間としては、その他の培養条件により異なるが、例えば、１日間〜５日間の範囲、好ましくは２日間〜３日間の範囲を挙げることができる。
発現プラスミドとしてBaculovirus等のウィルスを含む形質転換体の場合には、培養時間としては、例えば、細胞質効果が現れて細胞が死滅する前までの期間（例えば、３日間〜７日間の範囲、好ましくは４日間〜６日間の範囲）等を挙げることができる。
【００２７】
また、本発明における形質転換体が哺乳動物神経細胞である場合には、哺乳動物神経細胞の種類に応じて適した培養条件とすればよい。例えば、FBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて５％CO２存在下、数日毎に新しい培地に交換しながら培養すればよい。哺乳動物神経細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、トリプシン溶液を加えて個々の細胞に分散させ、得られた細胞の懸濁液を数倍に希釈して新しいシャーレに播種し継代を続ければよい。
培養温度としては、例えば、３６℃〜３８℃の範囲を挙げることができる。培地のpHとしては、哺乳動物神経細胞の生育可能範囲であればよく、例えば、pH６〜pH８の範囲を挙げることができる。培養時間としては、その他の培養条件により異なるが、例えば、２日間〜５日間の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、２日間〜３日間の範囲を挙げることができる。
【００２８】
本発明における形質転換体の細胞内で、ネプリライシン又はソマトスタチンレセプター４のいずれか、或いは、両方のタンパク質が発現していることを確認する方法としては、通常のタンパク質工学的方法を利用すればよい。具体的には例えば、本発明における形質転換体より調製されたタンパク質抽出液を、抗ネプリライシン抗体又は抗ソマトスタチンレセプター４抗体を用いてウエスタンブロットを行う方法等を挙げることができる。またソマトスタチンレセプター４が発現していることを確認する方法としては、ソマトスタチンレセプター４に対するアゴニストで細胞を刺激した際のアデニル酸シクラーゼ抑制活性を評価する方法を利用することも可能である。またRT-PCR、リアルタイムPCRによりmRNAを検出する方法を利用することも可能である。
【００２９】
本発明において使用される「ネプリライシンを認識する抗体」は、ネプリライシンを認識可能な抗体であれば特に限定は無いが、例えば、白血病患者由来の白血球又はそれらを培養して得られた株化細胞を抗原として作製された抗体を挙げることができる。これらの抗体は公知の方法（例えば、Nature 265, 495-97，1975、Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984、J.  Immunol.  Methods 35: 1-21,1980等に記載の方法）を用いて調製することができる。
このような抗体として、例えば、CB-Calla、HI10a、W8E7、MEM-78等を挙げることができる。
【００３０】
本発明において使用する初代培養神経細胞は、例えば、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）から公知の方法（例えば、Culturing Nerve Cells（The MIT press, 1991）等に記載の方法）を用いて採取すればよい。本発明においては、好ましくは、大脳皮質又は海馬から採取した初代培養神経細胞を用ればよい。
【００３１】
本発明においては、上記のようにして採取・単離される神経細胞をそのまま用いることもできるが、通常は、採取した細胞を培養して得られる培養細胞を用いる。培養することにより細胞の性質が安定化し付着性になるので、好ましくは、初代培養神経細胞が用いられる。
【００３２】
初代培養神経細胞の培養は、当業者によって適宜選択される条件で行われる。例えば、上記のような部位から採取した細胞を、マイクロタイタープレートを用いて、B27 supplement （インビトロジェン社製）を添加したNeurobasal Medium（インビトロジェン社製）、血清を添加したDMEM、血清を添加したMEM等のような培地中で、３７℃、５％CO２存在下で、３日間〜１４日間培養する。必要に応じて、これ以上の期間、例えば、２１日間〜２８日間培養してもよい。
【００３３】
本発明評価方法においては、被験物質等を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を固定化剤を用いて固定することが好ましい。本発明で用いられる細胞固定化剤としては、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、アセトン等が用いことができる。好ましくは、例えば、１−４％のパラホルムアルデヒド溶液である。固定化の条件は、当業者によって適宜選択することができる。例えば、パラホルムアルデヒド溶液（４％ パラホルムアルデヒド, 100 mM リン酸緩衝液、pH 7.0）中で１０分から６０分間細胞を処理することにより固定化を行う。
【００３４】
本発明スクリーニング方法は、（ａ）被験物質と神経細胞とを接触させる第一工程と、（ｂ）第一工程後に得られる神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する第二工程と、（ｃ）第二工程により染色されたネプリライシンを定量する第三工程と、（ｄ）第三工程により測定されたネプリライシン量を対照と比較して、その差異に基づいて神経細胞が有する活性の有無若しくはその程度を評価する第四工程と、（ｅ）第四工程により得られる評価結果に基づき、細胞が有するネプライシンの活性を増強する物質である被験物質を選択する第五工程とを含む。
【００３５】
本発明スクリーニング方法において「被験物質」としては、特に限定は無く、例えば、タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等を挙げることができる。被験物質の形態としては、特に限定は無く、固体、液体、基剤との混合物、縣濁液又は溶液等を挙げることができる。縣濁液若しくは溶液とする場合、水、pH緩衝液、メチルセルロース溶液、生理食塩水、有機溶媒水溶液（有機溶媒としては通常エタノールやジメチルスルホキシドが用いられる。）等を用いればよい。
被験物質の接触量、接触回数及び接触時間は、例えば、細胞に重篤な影響を及ぼさない範囲内とすればよい。形質転換体を用いる場合、被験物質の接触は通常はネプリライシンやソマトスタチンを宿主細胞に導入した後に実施するが、導入前又は導入時から実施しておくことも可能である。
【００３６】
本発明スクリーニング方法の第一工程における「接触」は、当業者に汎用されている方法で実施することができる。被験物質を本発明形質転換体に接触する場合、その接触方法には特に限定はなく、例えば、本発明形質転換体を含む培養液・寒天培地等の中に、0.001〜100 μM程度の濃度となるように被験物質を添加すればよい。
【００３７】
本発明スクリーニング方法の第二工程における「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを、ネプリライシンを認識する抗体を用いて特異的に染色する」方法としては、免疫組織化学的手法等を用いることができる。これらの方法では、通常の免疫化学的手法・生化学的手法・タンパク質工学的手法等を用いて分析すればよい。具体的には例えば、まず被験物質を接触させた細胞をパラホルムアルデヒド溶液等を用いて固定する。次いで抗ネプリライシン抗体を細胞と反応させる。この際に界面活性剤等による膜透過処理を行わずに反応させることで、細胞内のネプリライシンとは反応せず、細胞表面上のネプリライシンのみと反応させることができる。また細胞の表面上に存在するネプリライシンを認識するが、細胞内部のネプリライシンは認識しない抗ネプリライシン抗体を用いることで、膜透過処理の有無に関わらず抗体は細胞表面上のネプリライシンのみと反応する。抗ネプリライシン抗体を細胞表面上に存在するネプリライシンと反応させて結合させた後、さらに蛍光物質を融合させた抗ネプリライシン抗体に対する２次抗体を反応させてネプリライシンと抗ネプリライシン抗体との複合体に結合させる。その後、この複合体を２次抗体に融合している蛍光物質に由来する蛍光を観察することにより細胞表面上のネプリライシンの検出を行うことができる。また抗ネプリライシン抗体に蛍光物質を融合させてその蛍光を観察することで細胞表面上のネプリライシンを検出することも可能である。蛍光物質としては既知のいかなる物質も使用可能であるが、GFP、CFP、YFP、Fluorescein、FITC、Rhodamine、Texas Red、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594等のAlexa Fluor色素（インビトロジェン社製）等を好ましく挙げることができる。また、抗ネプリライシン抗体や２次抗体に蛍光物質以外の検出用の置換基を導入しておくことでこれらの置換基を検出に用いることも可能である。検出用の置換基としては酸化還元酵素やアルカリフォスファターゼ等が利用可能である。
【００３８】
本発明スクリーニング方法の第三工程における「染色されたネプリライシンを定量する」方法としては公知の定量化法を用いればよいが、例えば、蛍光置換基由来の蛍光強度をプレートリーダーにて測定することができる。また、蛍光顕微鏡にて染色像を撮影して市販の画像解析ソフトを用いて定量化すればよい。また、ArrayScan等の細胞イメージアナライザーにより定量化することができる。具体的には例えば、間接免疫蛍光法により検出された細胞表面上のネプリライシンの蛍光染色強度を測定し、同様に、対照におけるネプリライシンの蛍光染色強度も測定する。次いで、対照におけるネプリライシンの蛍光染色強度を100％とし、被検物質を接触させた細胞で検出されたネプリライシンの蛍光染色強度のパーセンテージを算出する。被検物質を接触させた細胞において検出されたネプリライシンの蛍光染色強度のパーセンテージが、例えば、110％以上、好ましくは、150％以上、更に好ましくは、200％以上になる被検物質を、ネプリライシン活性制御物質の候補物質として選択すればよい。
【００３９】
本発明スクリーニング方法の第四工程における対照との比較では、例えば、被験物質を接触させた神経細胞において第三工程で測定された前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を、被験物質を接触させていない神経細胞において第三工程で測定された前記細胞の表面上に存在するネプリライシンの量と比較すればよい。ここで「被験物質を接触させていない細胞」とは、例えば、溶媒のみを接触させた神経細胞であってもよい。
かかる対照は、対照とする神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を、被験物質を接触させた神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。
例えば、被験物質と接触させた神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量の測定値が、対照とする神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量よりも高ければ、前記被験物質との接触は、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを増加させる。そして、細胞が有するネプリライシンの活性が上昇していることが確認できる。これは、前記被験物質は、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果を有することを意味し、そして当該被験物質はネプリライシン活性増強因子として選択することが可能となる。
【００４０】
尚、被験物質の代わりに「対照物質」となり得るポジティブコントロール又はネガティブコントロールを用いて本発明スクリーニング方法を実施することにより、場合に応じて上記の対照とすることもできる。
ここで「ポジティブコントロール」とは、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果を有する任意の物質を表し、また「ネガティブコントロール」としては、被験物質に含まれる溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等が挙げられる。
「対照物質」をネガティブコントロールとする場合、被験物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」が、対照物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」よりも大きければ、当該被験物質は「神経細胞の表面上に存在するネプリライシン量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」を有すると評価すればよい。一方、被験物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」が、対照物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」と同程度若しくは小さければ、当該被験物質は「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞のネプリライシンの活性を増強させる効果」を有さないと評価することができる。
【００４１】
また、対照物質をポジティブコントロールとする場合、被験物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」と、対照物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強させる効果」とを比較することにより、被験物質が有する「神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を増加させる、即ち、細胞のネプリライシンの活性を増強させる効果」を評価すればよい。
このようにして効果を有すると評価された場合には、当該被験物質を、ネプリライシン活性増強因子として選択することができる。また、ネプリライシン活性増強因子として選択された物質は、Ａβの蓄積を抑制する物質として、アルツハイマー病等のＡβタンパク質関連疾患の治療又は予防剤の候補物質として選択することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明の実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１（ネプリライシン又はソマトスタチンレセプター４のいずれか、或いは、両方のタンパク質を導入した細胞の作成）
【００４４】
（１）ネプリライシン遺伝子の取得及びpcDNA6.2-NEPの構築
ヒト脳由来cDNAライブラリー（TAKARA社製）２０ngを鋳型に用いて且つ１０μMのフォワードプライマーNEP-5’（５’−CACCATGGGCAAGTCAGAAAGTCAG；配列番号１）、１０μMのリバースプライマーNEP-3’（５’−TCACCAAACCCGGCACTTC；配列番号２）及びKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡製）を用いてPCRを行った。PCR条件は、９５℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで６８℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約２．３kbのバンドを切り出し、pENTR/D−TOPOベクター（インビトロジェン社製）へクローニングすることにより、pENTR−NEPを作製した。次いで、４μl pENTR-NEP、１μl  pcDNA6.2V5-DEST及び２μl  LRクロナーゼII（インビトロジェン社製）を混合し、得られた混合物を室温で1時間保持することにより、プラスミドpcDNA6.2-NEPを作製した。
【００４５】
（２）pcDNA3.1-SSTR4の構築
HEK293FT細胞（インビトロジェン社製）からゲノムDNA精製キット（DNeasy Blood & Tissue Kit; QIAGEN社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従ってゲノムDNAを回収、精製した。次いで、前記ゲノムDNA １０ngを鋳型に用いて且つ１０μMのフォワードプライマーSSTR4-5’（５’−ATTGGATCCGCCACCATGAGCGCCCCCTCGACGCTG；配列番号３）、１０μMのリバースプライマーSSTR4-3’（５’−ATTGAATTCTCAGAAGGTGGTGGTCCTGGTG；配列番号４）及びKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡製）を用いてPCRを行った。PCR条件は、９５℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで６８℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．２kbのバンドを切り出し、制限酵素BamHI及びEcoRIで二重消化した後、このDNA断片をアガロースゲル電気泳動し、当該ゲル上で検出された約１．２kbのバンドを切り出し、インサートDNAとした。pcDNA3.1ベクター（インビトロジェン社製）を制限酵素BamHI及びEcoRIで二重消化したものをベクターとして用い、これにインサートDNAをライゲースを用いて連結することにより、プラスミドpcDNA3.1-SSTR4を作製した。
【００４６】
（３）pcDNA3.1の調製  
pcDNA3.1は、インビトロジェン社から販売されている市販品を購入し、これを用いた。
【００４７】
（４）pcDNA6.2-NEPの細胞への導入及びネプリライシン安定発現細胞の作製
SH-SY5Y細胞を１０ cmシャーレに５×１０6ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで、当該細胞に、上記（１）で構築して得られた「ネプリライシン発現プラスミド（pcDNA6.2-NEP; 10μg）」を、20μlのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）及び、500μlのOPTI-MEM（インビトロジェン社製）と混合し、２０分間保持したものをトランスフェクションした。２４時間後に１０ cmシャーレに２×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し直した。更に２４時間後に終濃度４μg/mlとなるようにBlasticidin S（科研製薬社製）を培地に添加して更に１４日間培養することにより、Blasticidin S耐性細胞株コロニーを得た。得られたコロニーをクローニングし、それらの中からネプリライシン安定発現細胞SH-SY5Y/NEP#12を取得した。
【００４８】
（５）pcDNA3.1-SSTR4の細胞への導入及びソマトスタチンレセプター４安定発現細胞の作製
SH-SY5Y細胞を１０ cmシャーレに５×１０6ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで、当該細胞に、上記（２）で構築して得られた「ソマトスタチンレセプター４発現プラスミド（pcDNA3.1-SSTR4; 10μg）」を、20μlのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）及び、500μlのOPTI-MEM（インビトロジェン社製）と混合し、２０分間保持したものをトランスフェクションした。２４時間後に１０ cmシャーレに２×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し直した。更に２４時間後に終濃度0.4mg/mlとなるようにG418（ナカライテスク社製）を培地に添加して更に１４日間培養してG418耐性細胞株コロニーを得た。得られたコロニーをクローニングし、それらの中からソマトスタチンレセプター４安定発現細胞SH-SY5Y/SSTR4#12を取得した。
【００４９】
（６）ネプリライシンとソマトスタチンレセプター４との両方を安定発現する細胞の作製
上記（５）で作製したソマトスタチンレセプター４安定発現細胞であるSH-SY5Y/SSTR4#12を１０ cmシャーレに５×１０6ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで、当該細胞に、上記（１）で構築して得られた「ネプリライシン発現プラスミド（pcDNA6.2-NEP; 10μg）」を、20μlのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）及び、500μlのOPTI-MEM（インビトロジェン社製）と混合し、２０分間保持したものをトランスフェクションした。２４時間後に１０ cmシャーレに２×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し直した。更に２４時間後に終濃度４μg/mlとなるようにBlasticidin S（科研製薬社製）と終濃度0.4mg/mlとなるようにG418（ナカライテスク社製）を培地に添加して更に１４日間培養して、Blasticidin SとG418との両方に耐性を示す細胞株コロニーを得た。得られたコロニーをクローニングし、それらの中からネプリライシンとソマトスタチンレセプター４との両方を安定発現する細胞SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3を取得した。
【００５０】
（７）SH-SY5Y、SH-SY5Y/NEP#12、SH-SY5Y/SSTR4#12、SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3のネプリライシン及びソマトスタチンレセプター４の発現量測定
SH-SY5Y細胞と上記（４）、（５）、（６）で作製した各細胞株SH-SY5Y/NEP#12、SH-SY5Y/SSTR4#12、SH-SY5Y/SSTR4/NEP#3からRNA精製キット（RNeasy Mini Kit; QIAGEN社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従ってTotal RNAを回収し、精製した。次いで、前記Total RNAを鋳型にし、Super Script III逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて、６０℃で５分間、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温し、逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNAを鋳型に用いて且つTaqMan probe（Applied Biosystems社製）を用いてリアルタイムPCRを行い、各遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムPCRはTaqMan Fast Advanced Master Mixを用い、当該キットに添付された説明書に従って、7900 HT Fast Real-Time PCR Systemで実施した。各TaqMan probeは、ネプリライシンがHs00153510_m1、ソマトスタチンレセプター４がHs01566620_s1を用いた。また内部標準としてPPIB（サイクロヒィリンＤ）遺伝子の発現量を測定し、PPIBの発現量で各細胞のネプリライシン及びソマトスタチンレセプター４の発現量を標準化した。PPIBの測定用TaqMan probeにはHs00168719_m1を用いた。SH-SY5Y/NEP#12とSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3では親株のSH-SY5Yと比較してネプリライシンの発現量が増加しており（図１A参照）、SH-SY5Y/SSTR4#12とSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3では親株のSH-SY5Yと比較してソマトスタチンレセプター４の発現量が増加していることを確認した（図１B参照）。
【００５１】
実施例２（細胞表面上に存在するネプリライシン染色方法）
実施例１（６）に記載のSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞をカバーガラス（松浪硝子社製）を底に敷いた２４wellシャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１×１０5cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。その後、抗NEP抗体と２次抗体としてAlexa488抗マウスIgG抗体（インビトロジェン社製）とを用いて細胞表面上のネプリライシンを以下の手順により染色した。細胞をPBSで４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いで抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して細胞に添加した。室温で１時間インキュベートした後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）を３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを細胞に添加して１時間室温でインキュベートした。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。カバーガラスをシャーレから剥がして、マウント剤（PermaFluor）（Thermo Fisher Scientific社製)を乗せたスライドガラス上に置き室温で１時間静置してカバーガラスをスライドガラスに接着させた。このようにして得られたサンプルを共焦点レーザー顕微鏡システム、Fluoview FV1000（オリンパス社製）を用いて緑色の蛍光を検出して、ネプリライシンの細胞における局在を確認した。図２に示すとおり、本染色方法を用いることで細胞表面のネプリライシンを極めて特異的に検出することができていることを確認した。
【００５２】
実施例３（本発明の細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法及びスクリーニング方法：神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの発現、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング）（その１）
実施例１（６）に記載されたSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を96 wellシャーレ（コーニング社製）に３×１０4cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換した。次いで、被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬である、１μM、 １０μMのL803,087（Tocris社製）、又は、１００nM、１μM のNNC 26-9100（Tocris社製）を培養液中に添加した後得られた培養物を３７℃で２４間静置した。次いで、得られた細胞を上記、実施例２の染色方法に基づき、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した。まず細胞をPBSで４回洗浄した後、各wellに５０μlの４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに各wellに５０μlの３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いでブロッキングに用いた溶液を除いた後、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して各wellに５０μlずつ添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを各wellに５０μlずつ添加して室温で１時間静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。次いで、ArrayScan VTI HCS Reader（Thermo Scientific社製）を用いて各細胞の緑色蛍光の強度を測定することにより、各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定した。各細胞の蛍光強度、即ち、ネプリライシンの量は細胞の面積当たりの量として算出した。各被験物質処理群で約３００個程度の細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定してその平均値を求めた。ネプリライシンの量は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合のネプリライシンの量を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、L803,087は細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を最大で約５９％増加させた。またNNC 26-9100は最大で５１％増加させた（図３参照）。このことからL803,087とNNC 26-9100はネプリライシン活性増強因子であることが判明した。
【００５３】
実施例４（細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法及びスクリーニング方法：神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの発現、即ち、細胞のネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング）（その２）
実施例１（４）に記載されたSH-SY5Y/NEP#12細胞を96 wellシャーレ（コーニング社製）に３×１０4cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換した。次いで、被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬である１０μMのL803,087（Tocris社製）を培養液中に添加した後得られた培養物を３７℃で２４間静置した。次いで、得られた細胞を上記の実施例３と同様に神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した。まず細胞をPBSで４回洗浄した後、各wellに５０μlの４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに各wellに５０μlの３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いでブロッキングに用いた溶液を除いた後、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して各wellに５０μlずつ添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを各wellに５０μlずつ添加して室温で１時間静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。次いで、ArrayScan VTI HCS Reader（Thermo Scientific社製）を用いて各細胞の緑色蛍光の強度を測定し、各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定した。各細胞のネプリライシンの量は細胞の面積当たりの量として算出した。各被験物質処理群で約３００個程度の細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定してその平均値を求めた。ネプリライシンの量は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合のネプリライシンの量を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、L803,087は神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を最大で約１４％増加させた（図４参照）。SH-SY5Y/NEP#12細胞はソマトスタチンレセプター４の発現量が少ないため、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量の増加は実施例３のSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を用いた場合と比較して小さいが、実施例３と同様にL803,087はネプリライシン活性増強因子であることが確認できた。
【００５４】
実施例５（細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法及びスクリーニング方法：神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの発現、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング）（その３）
実施例１（５）に記載されたSH-SY5Y/SSTR4#12細胞を96 wellシャーレ（コーニング社製）に３×１０4cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換した。次いで、被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬である１μMのNNC 26-9100（Tocris社製）を培養液中に添加した後得られた培養物を３７℃で２４間静置した。次いで、得られた細胞を上記の実施例３と同様に細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した。まず細胞をPBSで４回洗浄した後、各wellに５０μlの４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに各wellに５０μlの３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いでブロッキングに用いた溶液を除いた後、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して各wellに５０μlずつ添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを各wellに５０μlずつ添加して室温で１時間静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。次いで、ArrayScan VTI HCS Reader（Thermo Scientific社製）を用いて各細胞の緑色蛍光の強度を測定し、各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定した。各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量は細胞の面積当たりの量として算出した。各被験物質処理群で約３００個程度の神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定してその平均値を求めた。ネプリライシンの量は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合のネプリライシンの量を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、NNC 26-9100は神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を最大で約６４％増加させた（図５参照）。このことから実施例３と同様にNNC 26-9100がネプリライシン活性増強因子であることを確認できた。
【００５５】
実施例６（細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法及びスクリーニング方法：神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの発現、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング）（その４）
SH-SY5Y細胞を96 wellシャーレ（コーニング社製）に３×１０4cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換した。次いで、被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬である、１０μMのL803,087（Tocris社製）又は１μMのNNC 26-9100（Tocris社製）を培養液中に添加した後得られた培養物を３７℃で２４間静置した。次いで、得られた細胞を上記、実施例３と同様に細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した。まず細胞をPBSで４回洗浄した後、各wellに５０μlの４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに各wellに５０μlの３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いでブロッキングに用いた溶液を除いた後、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して各wellに５０μlずつ添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを各wellに５０μlずつ添加して室温で１時間静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。次いで、ArrayScan VTI HCS Reader（Thermo Scientific社製）を用いて各細胞の緑色蛍光の強度を測定し、各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定した。各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量は細胞の面積当たりの量として算出した。各被験物質処理群で約３００個程度の神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定してその平均値を求めた。ネプリライシンの量は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合のネプリライシンの量を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、L803,087は神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を最大で約１４％増加させた。またNNC 26-9100は最大で１２％増加させた（図６参照）。このことから、SH-SY5Y細胞はソマトスタチンレセプター４の発現量が少ないためネプリライシンの増加量は実施例３のSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を用いた場合と比較して小さいが、実施例３と同様にL803,087とNNC 26-9100はネプリライシン活性増強因子であることが確認できた。
【００５６】
実施例７（細胞が有するネプリライシンの活性の評価方法及びスクリーニング方法：神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの発現、即ち、細胞が有するネプリライシンの活性を増強する物質のスクリーニング）（その５）
ラット胎仔大脳皮質から神経細胞を調製し、ポリ−Ｌ−リジンをコートした96 wellシャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１×１０5細胞／wellの濃度で播種し、２％のB27 supplement （インビトロジェン社製）を添加したNeurobasal Medium（インビトロジェン社製）中で、３７℃、５％CO２存在下で７日間培養した。培養終了後、培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換し、被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬である、１０μMのL803,087（Tocris社製）を培養液中に添加した後、得られた培養物を３７℃で２４間静置した。次いで、得られた細胞を上記、実施例３と同様に細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色した。まず細胞をPBSで４回洗浄した後、各wellに５０μlの４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに各wellに５０μlの３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いでブロッキングに用いた溶液を除いた後、抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して各wellに５０μlずつ添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを各wellに５０μlずつ添加して室温で１時間静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。次いで、ArrayScan VTI HCS Reader（Thermo Scientific社製）を用いて各細胞の緑色蛍光の強度を測定し、各細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定した。各細胞のネプリライシンの量は細胞の面積当たりの量として算出した。各被験物質処理群で約３００個程度の神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を測定してその平均値を求めた。ネプリライシンの量は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合のネプリライシンの量を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、L803,087は神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量を最大で約２１％増加させた（図７参照）。このことからより生体に近い初代培養神経細胞においても実施例３と同様にL803,087はネプリライシン活性増強因子であることが確認できた。
【００５７】
比較例１（既存のネプリライシンの活性の測定方法）
J. Neuroscience Methods 190, 57−62, 2010での報告に基づきネプリライシンの活性を測定した。実施例１（６）に記載のSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞を24 wellシャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１×１０5細胞／wellの濃度で播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。次いで、培養液を血清を含まないDMEM培地（ナカライテスク社製）に交換し、更に被検物質としてソマトスタチンレセプター４選択的作動薬であるL803,087（Tocris社製）を終濃度１０μMで培養液中に添加した。得られた培養物を３７℃で２４間静置する。培養液を除いた後、ネプリライシンの蛍光基質ペプチドとしてFluorogenic Peptide Substrate V（Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K(Dnp)-OH）（R & D systems社製）を終濃度２０μMとなるように300μlのOPTI-MEM（インビトロジェン社製）に希釈した反応溶液を細胞に添加した。その際、ネプリライシンの阻害剤であるThiorphan（Sigma社製）を終濃度１０μMで含有する反応溶液を細胞に添加したものをネガティブコントロールとして細胞のネプリライシン以外のペプチド分解活性の測定に使用した。反応溶液を添加後、３７℃で３０分間静置した。次いで反応溶液から５０μlを採取して96 wellシャーレ移して蛍光プレートリーダー、EnVision（パーキンエルマー社製）で蛍光ペプチド基質の分解量を測定した。測定は励起波長320ｎｍ、放射波長400ｎｍで測定した。ネプリライシンの阻害剤であるThiorphanを含まない反応溶液中の蛍光ペプチド基質の分解量からThiorphanを含む反応溶液中の蛍光ペプチド基質の分解量を差し引いた値を正味のネプリライシンの活性とした。活性値は対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した場合の活性を１００とした場合の相対値として算出した。その結果、L803,087はネプリライシンの活性を約18%増加させ、公知の活性測定法を用いても活性増強因子であることが確認できた（図８参照）。
【００５８】
参考例１Ａ（神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの染色）
実施例１（６）に記載されたSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞をカバーガラス（松浪硝子社製）を底に敷いた２４wellシャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１×１０5cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。その後、抗NEP抗体と２次抗体としてAlexa488抗マウスIgG抗体（インビトロジェン社製）を用いて神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを以下の手順により染色した。細胞をPBSで４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、膜透過処理を行わずに３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いで抗NEP抗体F4（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して細胞に添加した。室温で１時間インキュベートした後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを細胞に添加して１時間室温で静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。カバーガラスをシャーレから剥がして、マウント剤（PermaFluor）（Thermo Fisher Scientific社製)を乗せたスライドガラス上に置き室温で１時間静置してカバーガラスをスライドガラスに接着させた。このようにして得られたサンプルを共焦点レーザー顕微鏡システム、Fluoview FV1000（オリンパス社製）を用いて緑色の蛍光を検出して、ネプリライシンの細胞における局在を確認した。図９Ａに示すとおり、本染色方法では実施例２（図２）と比較して神経細胞の表面上に存在するネプリライシンに由来する明瞭な染色像は観察できていない。このことから抗NEP抗体F4よりも抗NEP抗体CB-Callaの方が細胞の表面上に存在するネプリライシンを染色するのにより好ましい抗体であることが確認できた。
【００５９】
参考例１Ｂ（神経細胞の表面上及び細胞内に存在するネプリライシンの染色）
実施例１（６）に記載されたSH-SY5Y/SSTR4/NEP#3細胞をカバーガラス（松浪硝子社製）を底に敷いた２４wellシャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１×１０5cells/wellで播種し、１５％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％CO２条件下にて約２４時間培養した。その後、抗NEP抗体と２次抗体としてAlexa488抗マウスIgG抗体（インビトロジェン社製）を用いて（ａ）細胞の表面上、又は、（ｂ）細胞の表面上及び細胞内に存在するネプリライシンを以下の手順により染色した。細胞をPBSで４回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド  りん酸緩衝液（和光純薬製）を添加して３０分間、室温で静置することで細胞を固定した。更にPBSで２回洗浄した後、０．１％ Triton X-100（ナカライテスク社製）を含むPBS溶液を添加して１０分間室温で静置して膜透過処理を実施した。次いでPBSで２回洗浄した後、３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液を添加して３０分間、室温で静置することでブロッキングを行った。次いで抗NEP抗体CB-Calla（SantaCruz社製）を終濃度1μg/mlとなるように３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈して細胞に添加した。室温で１時間静置した後、５分おきに計４回、PBSで洗浄した。その後、終濃度２μg/mlとなるように２次抗体であるAlexa488抗マウスIgG抗体と終濃度３μg/mlとなるようにDAPI（40 , 6-diamidino-2-phenylindole）とを３％BSA（Sigma社製）を含むPBS溶液で希釈したものを細胞に添加して１時間室温で静置した。更に得られた細胞を、PBSで５分おきに計４回洗浄した。カバーガラスをシャーレから剥がして、マウント剤（PermaFluor）（Thermo Fisher Scientific社製)を乗せたスライドガラス上に置き室温で１時間静置してカバーガラスをスライドガラスに接着させた。このようにして得られたサンプルを共焦点レーザー顕微鏡システム、Fluoview FV1000（オリンパス社製）を用いて緑色の蛍光を検出して、ネプリライシンの細胞における局在を確認した。図９Ｂに示すとおり、膜透過処理を行う染色方法では神経細胞の表面上に存在するネプリライシンに加えて神経細胞内に存在するネプリライシンも染色されており、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンを特異的に染色するためには膜透過処理を行わない方がより好ましいことが確認できた。
【００６０】
実施例３と比較例１の結果から、神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量が増加するとネプリライシンの活性が上昇することを確認できた。比較例１で示した公知の活性測定法ではL803,087によるネプリライシンの活性の増加は約18%であったが、本発明では約59%の神経細胞の表面上に存在するネプリライシンの量の増加が観察できた。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、細胞が有するネプリライシンの優れた評価方法等を提供可能にする。また、ネプリライシンの活性を増強する物質をスクリーニングする方法も提供可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2014074684.tif 000002
【図２】
2014074684.tif 000003
【図３】
2014074684.tif 000004
【図４】
2014074684.tif 000005
【図５】
2014074684.tif 000006
【図６】
2014074684.tif 000007
【図７】
2014074684.tif 000008
【図８】
2014074684.tif 000009
【図９】
2014074684.tif 000010
【配列表】
2014074684000001.app