(57)【要約】【課題】血球系細胞から酪酸ナトリウム処理によりリポソームを作製する新規リポソーム作製方法において、リポソームをより高効率に誘導作製する必要があった。【解決手段】本発明は、血球系細胞から酪酸ナトリウム処理によりリポソームを誘導作製する新規リポソーム作製方法において、高効率にリポソームを作製する酪酸ナトリウム処理条件を提供する。血球系細胞の１つであるＲａｍｏｓ細胞に対して、添加する酪酸ナトリウムを所定の処理濃度とし、かつ、所定の処理時間とすることにより、高効率なリポソーム作製が実現される。【選択図】図３
2014210750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム作製方法であって、
Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、
前記酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、
を含み、
前記酪酸ナトリウムの濃度が、５ｍＭであり、
前記培養工程の処理時間が、４４時間である、
リポソーム作製方法。
【請求項２】
リポソーム作製方法であって、
Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、
前記酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、
を含み、
前記酪酸ナトリウムの濃度が、１０ｍＭであり、
前記培養工程の処理時間が、３０時間以上４４時間以下である、
リポソーム作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞からリポソームを作製する、新規リポソーム作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来までに、膜タンパク質等の機能を保持したままプロテオリポソームを作製する方法としては、細胞破砕法、界面活性剤処理法、有機溶媒処理法、無細胞合成による作製法、などがあった（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
しかし、それらの方法は、一般に操作が煩雑であり、作成した膜タンパク質等の機能を保つことが難しいという課題を有している。例えば、非特許文献１に記載の方法では、タンパク質の精製過程を伴う。このため、膜タンパク質などの機能が失われることが多い上に、膜タンパク質の配向性を制御できない。また、非特許文献２の方法では、膜タンパク質の配向性が逆転するなど、生体内とは異なる環境でタンパク質を発現させる必要がある。
【０００４】
近年、特許文献１に記載されているような哺乳動物細胞から物理的処理や薬剤による化学処理などによりリポソーム（ベシクル）を作製する方法が考案され、非特許文献３では、血球系細胞から酪酸ナトリウム（ＮａＢ）処理により細胞サイズの大型リポソームを作製するという方法が開示された。この方法を用いれば、あらかじめ細胞へ遺伝子導入を行うことにより目的のタンパク質を発現させた状態を作成し、その細胞からリポソームを作製すれば、簡便に機能性プロテオリポソームを作製できると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１２−５３２１２４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】１．    Ｒｉｇａｕｄ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｐｉｔａｒｄ，  Ｂ．  ＆  Ｌｅｖｙ，  Ｄ．  （１９９５）．  ＲＥＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＩＮＴＯ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  −  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＯ  ＥＮＥＲＧＹ−ＴＲＡＮＳＤＵＣＩＮＧ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ−ＰＲＯＴＥＩＮＳ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  １２３１，  ２２３−２４６．
【非特許文献２】２．    Ｌｉｇｕｏｒｉ，  Ｌ．，  Ｍａｒｑｕｅｓ，  Ｂ．，  Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｍｅｎｄｅｚ，  Ａ．，  Ｒｏｔｈｅ，  Ｒ．  ＆  Ｌｅｎｏｒｍｏｎｄ，  Ｊ．  Ｌ．  （２００７）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，  ７９−９０．
【非特許文献３】３．    Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｍ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｉｎｏｕｅ，  Ａ．，  Ｙａｓｕｄａ，  Ｔ．，  Ｉｎｏｕｅ，  Ｙ．  ＆  Ｋａｗａｈａｒａ，  Ｈ．  （２０１０）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６２，  ２８７−２９１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献３に報告されている代表的な血球系細胞であるＲａｍｏｓ細胞を用いた場合、非特許文献３に報告されているリポソーム作製方法ではリポソームの作製効率は非常に低いという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、より高効率に血球系細胞からリポソームを作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明のリポソーム作製方法は、Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、前記酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、を含み、前記酪酸ナトリウムの濃度が、５ｍＭであり、前記培養工程の処理時間が、４４時間である。
【００１０】
また、本発明の別のリポソーム作製方法は、Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、前記酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、を含み、前記酪酸ナトリウムの濃度が、１０ｍＭであり、前記培養工程の処理時間が、３０時間以上４４時間以下である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のリポソーム作製方法によれば、高効率にリポソームを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態１における生成したリポソームを示す図
【図２】本発明の実施例におけるリポソーム誘導作製効率の評価法を表した図
【図３】本発明の実施例におけるリポソーム誘導作製効率の経時変化を表した図
【図４】本発明の実施例における各ＮａＢ濃度でのリポソーム誘導作製効率の経時変化を表した図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１４】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では血球系細胞としてＲａｍｏｓ細胞を用いてリポソームを誘導作製した。
【００１５】
リポソームの誘導作製には生育した血球系細胞を用いるため、まず血球系細胞を培養する。
【００１６】
次に、リポソームを誘導作製する際には、培養した細胞を新たなプレートへ播種する。このとき、リポソームを誘導作製する直前にプレートへ播種し直すことが好ましい。また、このときコンフルエント状態である細胞を用いることが好ましい。
【００１７】
続いて、血球系細胞が播種されたプレートに酪酸ナトリウム（ＮａＢ）を添加する。
【００１８】
ＮａＢが添加された後、リポソームが誘導作製されるまでＮａＢが添加された細胞を再び培養する。培養条件は前記細胞培養条件と同じである。
【００１９】
ＮａＢ添加後、数時間経過後からリポソームが生成し始め、ＮａＢ添加後３０時間以上５０時間以下の再培養を行ったプレート上にはリポソームが生成された。
【００２０】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２について説明する。実施の形態２については、実施の形態１と同じ構成となる場合、その詳細な説明を省略する。
【００２１】
実施の形態２において、実施の形態１と同様に血球系細胞であるＲａｍｏｓ細胞を培養し、播種する。その後、ＮａＢを添加した上で、ＮａＢ添加後４４時間再培養を行ったところ、リポソームが生成された。
【００２２】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３について説明する。実施の形態３については、実施の形態１と同じ構成となる場合、その詳細な説明を省略する。
【００２３】
実施の形態３において、実施の形態１と同様に血球系細胞であるＲａｍｏｓ細胞を培養し、播種する。その後、濃度が５ｍＭ以上となるＮａＢを添加した後に再び培養を行ったところ、リポソームが生成された。
【００２４】
（実施の形態４）
以下、本発明の実施の形態４について説明する。実施の形態４については、実施の形態１ならびに実施の形態２と同じ構成となる場合、その詳細な説明を省略する。
【００２５】
実施の形態４において、実施の形態１と同様に血球系細胞であるＲａｍｏｓ細胞を培養し、播種する。その後、濃度が１０ｍＭとなるＮａＢを添加した後に、４４時間の再培養を行ったところ、リポソームが生成された。
【００２６】
なお、本発明の実施の形態１〜４において、血球系細胞としてＲａｍｏｓ細胞を用いたが、Ｎａｍａｌｗａ細胞を用いても良い。
【実施例】
【００２７】
以下、実施の形態を裏付ける実施例が説明される。
【００２８】
（実施例１）
非特許文献３に記載されているリポソームを生じる細胞種の中から、最も誘導作製効率が高いＲａｍｏｓ細胞を選択した。
【００２９】
まず、Ｒａｍｏｓ細胞を以下の培養条件で培養した。
【００３０】
ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＲＰＭＩ１６４０  １１８７５−０９３、＋ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、フェノールレッド含）に、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＬｏｔＮｏ．  ＧＰＫ０２９、５６℃で３０分間非働化して使用）、１００  ｍｇ／Ｌ  ペニシリン、１０万Ｕｎｉｔ／Ｌ  ストレプトマイシンを添加したものを使用し、３７℃、ＣＯ２濃度５％において培養を行った。
【００３１】
次に、培養されコンフルエント状態になったＲａｍｏｓ細胞を細胞数が４×１０５ｃｅｌｌｓとなるよう６ｗｅｌｌプレート（培地量２ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ３５１６）に播種した。
【００３２】
細胞数はセルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃ２０８３１，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてカウントした。
【００３３】
酪酸ナトリウム（ＮａＢ）は和光純薬（１９３−０１５２２）から購入したものを用いた。
【００３４】
ストック溶液として、５ＭＮａＢ水溶液を作製し、４℃で保存した。ＮａＢストック溶液を終濃度５ｍＭとなるよう培地中へ添加した。
【００３５】
ＮａＢ添加後、前記培養条件と同様の条件で再び培養したところ、リポソームが生成された。
【００３６】
図１に示した写真は実施例１において誘導作製したリポソームの写真である。
【００３７】
白く光る円状のもの１００が細胞、輪郭はあるものの色が暗く光沢のないもの１０１をリポソームとして、目視によって識別した。
【００３８】
リポソームは、細胞と明確に分離しているもの１０２と、細胞と完全に分離せず接着しているもの１０３に分けられた。
【００３９】
後者は、リポソーム誘導を行うためにより長い時間を要する細胞が、撮影時点では細胞と分離途中の状態であったためと考えられる。
【００４０】
そして、０，２０，２４，３０，４４，５０時間経過後に、細胞数とリポソーム数を顕微鏡観察によりカウントした。
【００４１】
細胞数ならびにリポソーム数は、写真を撮影した四辺内（６０μｍ×３７．５μｍ）にある細胞数とリポソーム数、そして未分離リポソームの数をカウントし、算出した。
【００４２】
未分離リポソームは、未分離体１つにつき、細胞１個かつリポソーム１個として数えた。例として、図２に示す。図２では細胞数４個リポソーム数３個であるとした。
【００４３】
そして、リポソーム誘導作製効率を式１で算出し、評価した。
【００４４】
リポソーム誘導作製効率＝リポソーム個数÷細胞個数  ・・・（式１）
この算出方法は、細胞からリポソームが誘導作製されることを前提に、全ての細胞がリポソーム化したときに誘導作製効率が１００％となるように設定した。例えば、図２ではリポソーム誘導作製効率は、３÷４＝７５％である。
【００４５】
図３は、ＮａＢ５ｍＭ添加時におけるリポソーム誘導作製効率の経時変化を評価した結果である。
【００４６】
まず、ＮａＢ添加前ならびに添加直後において、一部リポソームの存在が確認された（０ｈ）。このことから、通常の細胞死においても、リポソームの生成がわずかに生じていると推測される。
【００４７】
ＮａＢ添加後、図１に示すようなリポソームの生成が確認された。このとき、ＮａＢを添加したものは、ＮａＢ未添加（０ｈ）の時点と比較すると、リポソームの個数が明らかに増加することが確認された。
【００４８】
次に、従来例として非特許文献３に記載されているＮａＢ添加後２０時間で生成したリポソーム誘導作製効率を評価した。その結果、今回採用した評価方法を用いた場合、リポソームの誘導作製効率はおよそ２２％であった（図３従来例）。
【００４９】
さらに、ＮａＢ処理時間を様々に変化させてリポソーム誘導作製効率を評価した結果、ＮａＢ処理時間３０時間から５０時間にかけて、従来例より高効率にリポソームが誘導作製されることが確認できた（図３）。
【００５０】
また、５０時間以上経過すると、リポソーム誘導作製効率が低下していたほか、細胞と接着しない遊離リポソームの割合が増加していた。
【００５１】
本実施例中において、ＮａＢ処理時間を３０時間から５０時間とすれば、リポソーム誘導作製効率が従来例であるＮａＢ処理時間２０時間の場合よりも明らかに大きいことがわかった。
【００５２】
以上より、実施例１の方法によれば、従来例よりも高効率にプロテオリポソームを誘導作製することが可能となる。
【００５３】
（実施例２）
実施例２では、ＮａＢ処理時間を４４時間とし、そのときに生成するリポソームの誘導作製効率を評価した（図３）。
【００５４】
その結果、ＮａＢ処理時間４４時間ではリポソーム誘導作製効率が約８０％と従来例のＮａＢ処理時間２０時間の場合の約３．６倍となった。
【００５５】
このとき、２０時間後と４４時間後の場合を検定し、検定統計量のＰ値を求めたところＰ＜０．０５（Ｐ＝０．００３７）となった。
【００５６】
このように、従来例と比べ実施例２のＮａＢ処理時間が４４時間で生成されるリポソーム作製効率は有意に大きくなった。
【００５７】
以上より、実施例２の方法によれば、従来例より高効率にリポソームを誘導作製することが可能となる。
【００５８】
（実施例３）
実施例３では、ＮａＢ処理濃度を終濃度５ｍＭ以上である１０ｍＭとなるように添加し、そのときに生成するリポソームの誘導作製効率を評価した。
【００５９】
また、比較例として、ＮａＢ０ｍＭ、ならびに５ｍＭの場合と合わせてリポソームの誘導作製効率を図４に示している。
【００６０】
その結果、ＮａＢ０ｍＭではリポソーム誘導作製効率は常に１５％以下であり、処理時間による影響は見られなかった。
【００６１】
ＮａＢ５ｍＭの場合の結果は、実施例１の場合（図３）と同様である。
【００６２】
一方、ＮａＢを１０ｍＭ添加した場合、処理時間が３０時間の場合で、既にリポソーム誘導作製効率に大きな増加が見られた。
【００６３】
このことから、ＮａＢ５ｍＭ以上の条件では、従来例の５ｍＭよりも短い処理時間でリポソーム誘導作製効率が最大値に達すると考えられる。
【００６４】
機能性プロテオリポソームを作製する場合において、リポソーム作製に要する時間は短い方が望ましい。このため、ＮａＢ処理濃度は従来例の５ｍＭよりも実施例３に示す１０ｍＭが好適である。
【００６５】
以上より、実施例３の方法によれば、従来例よりも簡便かつ高効率にリポソームを誘導作製することが可能となる。
【００６６】
（実施例４）
実施例４では、ＮａＢ処理濃度を１０ｍＭとし、かつ、ＮａＢ処理時間を４４時間としたときに生成するリポソームの誘導作製効率を評価した。
【００６７】
その結果、図４に示すように、リポソーム誘導作製効率は８４％となった。
【００６８】
以上より、実施例４の方法によれば、従来例よりも簡便かつ高効率にリポソームを作製することが可能となる。
【００６９】
以上のように、実施の形態のある一局面においては、リポソーム作製方法は下記の構成を有する。
【００７０】
すなわち、実施の形態のある一局面におけるリポソーム作製方法は、Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、を含む。このとき、酪酸ナトリウムの濃度が、５ｍＭである。さらに、培養工程の処理時間が、４４時間である。
【００７１】
また、実施の形態のある別の一局面においては、リポソーム作製方法は下記の構成を有する。
【００７２】
すなわち、実施の形態のある別の一局面におけるリポソーム作製方法は、Ｒａｍｏｓ細胞に酪酸ナトリウムを添加する添加工程と、酪酸ナトリウムが添加された状態で培養を行う培養工程と、を含む。このとき、酪酸ナトリウムの濃度が、１０ｍＭである。さらに、培養工程の処理時間が、３０時間以上４４時間以下である。
【００７３】
以上の方法によれば、高効率に血球系細胞からリポソームを作製することができる。よって、血球系細胞への遺伝子導入効率が低い場合においても、効率良く機能性プロテオリポソームを作製することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明にかかる新規リポソーム作製方法では、簡便に機能性プロテオリポソームを作製することができ、バイオセンサやＤＤＳなどへの応用が期待できる。
【符号の説明】
【００７５】
１００    培養培地中の細胞
１０１    誘導作製されたリポソーム
１０２    細胞と明確に分離されたリポソーム
１０３    細胞と未分離状態のリポソーム
【図２】
2014210750.tif 000003
【図３】
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【図４】
2014210750.tif 000005
【図１】
2014210750.tif 000006