(57)【要約】      （修正有）【課題】抗凝固治療についての改良された解毒剤、特に特異的解毒剤がこれまでのところ開示されていないダビガトランのような直接トロンビン阻害剤のための解毒剤の提供。【解決手段】抗凝固薬、特にダビガトランに対する抗体分子。また、該抗体の、抗凝固薬の解毒剤としての効果に関しても示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固薬の活性を中和可能な抗体分子。
【請求項２】
抗凝固薬に対して結合特異性を有する、請求項１記載の抗体分子。
【請求項３】
抗凝固薬が、直接トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、またはビタミンＫアンタゴニストである、請求項１または２記載の抗体分子。
【請求項４】
抗凝固薬が、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アピキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンＩＩＩ、またはドロトレコギンアルファである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項５】
抗凝固薬が、一般式
【化１７】
2014210794.tif 000032
［式中、
Ａは、基Ｈｅｔのベンゾ、ピリドまたはチエノ部分に結合されたカルボニルまたはスルホニル基を表し、
Ｂは、基Ａｒに結合されたメチレン基が酸素もしくは硫黄原子によって、または−ＮＲ１−基によって置き換えられていてもよいエチレン基を表し、
ここで、Ｒ１は、水素原子またはＣ１−４−アルキル基を表し、
Ｅは、ＲｂＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−基を表し、
ここで、Ｒｂは、水素原子、ヒドロキシ、Ｃ１−９−アルコキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル、ベンゾイル、ｐ−Ｃ１−３−アルキル−ベンゾイルまたはピリジノイル基を表し、一方で該Ｃ１−９−アルコキシカルボニル基の２位のエトキシ部分は、Ｃ１−３−アルキルスルホニルまたは２−（Ｃ１−３−アルコキシ）−エチル基によって更に置換されていてもよく、
Ａｒは、塩素原子によって、またはメチル、エチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されている１，４−フェニレン基を表すか、あるいはＡｒは２，５−チエニレン基を表し、
Ｈｅｔは、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−ベンゾイミダゾリレン、１−シクロプロピル−２，５−ベンゾイミダゾリレン、２，５−ベンゾチアゾリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−インドリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニレン、３−（Ｃ１−３−アルキル）−２，７−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニレンまたは１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−チエノ［２，３−ｄ］イミダゾリレン基を表し、そして
Ｒａは、Ｒ２ＮＲ３−基を表し、
ここで、Ｒ２は、カルボキシ、Ｃ１−６−アルキルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニルアミノカルボニルもしくは１Ｈ−テトラゾール−５−イル基によって置換されていてもよいＣ１−４−アルキル基、
ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−３−アルキル）−カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノもしくはＮ−（Ｃ１−３−アルキル）−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ基によって置換されているＣ２−４−アルキル基であり、一方で上記基において隣接窒素原子に対してα−位にある炭素原子は、置換されていなくてもよく、
Ｒ３は、Ｃ３−７−シクロアルキル基、不飽和部分がＲ２ＮＲ３基の窒素原子に直接結合されていなくてもよいプロパルギル基、フッ素もしくは塩素原子によって、またはメチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されているフェニル基、メチル基によって場合により置換されているピラゾリル、ピリダゾリルまたはピリジニル基を表すか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらの間の窒素原子と一緒になって、カルボキシまたはＣ１−４−アルコキシカルボニル基によって場合により置換されている５〜７員シクロアルキレンイミノ基を表し、フェニル環が更に縮合されていてもよい］
で示される二置換二環式複素環、その互変異性体、立体異性体および塩である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項６】
抗凝固薬が、
（ａ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−アミド、
（ｂ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｃ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｄ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（３−ヒドロキシカルボニルプロピル）−アミド、
（ｅ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（ヒドロキシカルボニルメチル）−アミド、
（ｆ）  １−メチル−２−［２−（２−アミジノチオフェン−５−イル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｇ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｈ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｉ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｊ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｋ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｌ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｍ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｎ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｏ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［（Ｎ−ヒドロキシカルボニルエチル−Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−アミド、
（ｐ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｑ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｒ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｓ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｔ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−インドール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−メトキシカルボニルエチル）−アミド及び
（ｕ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−チエノ［２．３−ｄ］イミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｖ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｗ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｘ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｙ）  １−メチル−２−［Ｎ−［４−（Ｎ−ｎ−ヘキシルオキシカルボニルアミジノ）フェニル］−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−エトキシカルボニルエチル）−アミド、
より選択される化合物、その互変異性体、立体異性体および塩である、請求項５記載の抗体分子。
【請求項７】
抗凝固薬がダビガトランである、請求項２記載の抗体分子。
【請求項８】
ダビガトランおよびダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和可能である、請求項７記載の抗体分子。
【請求項９】
配列番号：１および配列番号：２から成る群より選択されるＣＤＲ１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８から成る群より選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：９および配列番号：１０から成る群より選択されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１１、配列番号：１２、および配列番号：１３から成る群より選択されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項５〜８のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項１０】
配列番号：１で示されるＣＤＲ１、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８から成る群より選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：１０で示されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１３で示されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項９記載の抗体分子。
【請求項１１】
配列番号：１６、１８、２０、２２、２４、および２６から成る群より選択される重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号：１７、１９、２１、２３、２５、および２７から成る群より選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項９または１０記載の抗体分子。
【請求項１２】
配列番号：１６で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：１７で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：１８で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：１９で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：２０で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：２１で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：２２で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：２３で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：２４で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：２５で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：２４で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：２７で示される軽鎖可変ドメイン、または配列番号：２６で示される重鎖可変ドメインおよび配列番号：２７で示される軽鎖可変ドメインを含む、請求項１１記載の抗体分子。
【請求項１３】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、特に単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディ、または設計されたアンキリン反復タンパク（Designed Ankyrin Repeat Protein）（ＤＡＲＰｉｎ）である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項１４】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、および配列番号：３１から成る群より選択されるリンカーペプチドを介して相互に結合されている、ｓｃＦｖである、請求項１３記載の抗体分子。
【請求項１５】
配列番号：３２、または配列番号：３３を含む、請求項１４記載の抗体分子。
【請求項１６】
配列番号：３４または配列番号：４０を含む重鎖および配列番号：３５を含む軽鎖、または配列番号：４２を含む重鎖および配列番号：４３を含む軽鎖を有する、請求項１３記載の抗体分子。
【請求項１７】
配列番号：３６、配列番号：３８、または配列番号：４１を含むＦｄフラグメントおよび配列番号：３７または配列番号：３９を含む軽鎖を有するＦａｂ分子である、請求項１３記載の抗体分子。
【請求項１８】
医学に使用するための、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項１９】
抗凝固治療の副作用の治療もしくは予防に使用するための、および／または抗凝固薬の過剰投与をリバースするための、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子。
【請求項２０】
副作用が出血事象である、請求項１９記載の抗体分子。
【請求項２１】
抗凝固治療の副作用、または抗凝固治療での過剰投与事象の治療または予防方法であって、それを必要とする患者に前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子を製造する方法であって、
（ａ）発現制御配列と機能的に関連して、該抗体分子をコードする一つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供すること、
（ｂ）該宿主細胞を培養すること、および
（ｃ）細胞培養物から該抗体分子を回収すること
を含む方法。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項記載の抗体またはその医薬組成物を含むキット。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜２０のいずれか一項記載の抗体またはその医薬組成物；
（ｂ）容器；および
（ｃ）ラベル
を含むキット。
【請求項２５】
請求項７〜２０のいずれか一項記載の抗体、およびダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含むキット。
【請求項２６】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の形態が、固体、液体またはゲルの形態である、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容されうる塩がメシラート塩である、請求項２５記載のキット。
【請求項２８】
用量単位あたりのダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の強度が、ＱＤまたはＢＩＤのいずれかで７５mg〜３００mgの間である、請求項２５または２７記載のキット。
【請求項２９】
（ａ）請求項７〜２０のいずれか一項記載の抗体、またはその医薬組成物；
（ｂ）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の医薬組成物；
（ｃ）容器；および
（ｄ）ラベル
を含むキット。
【請求項３０】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の形態が、固体、液体またはゲルの形態である、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容されうる塩がメシラート塩である、請求項２９記載のキット。
【請求項３２】
用量単位あたりのダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の強度が、ＱＤまたはＢＩＤのいずれかで７５mg〜３００mgの間である、請求項２９または３１記載のキット。
【請求項３３】
（ａ）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含む第１の医薬組成物；
（ｂ）請求項７〜２０のいずれか一項記載の抗体を含む第２の医薬組成物；
（ｃ）患者に該第１および第２の医薬組成物を別々に投与するための説明書
を含み、該第１および第２の医薬組成物が、別々の容器に入っており、そして該第２の医薬組成物が、ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの中和または部分中和を必要とする患者に投与されるキット。
【請求項３４】
請求項７〜２０のいずれか一項記載の抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されている患者におけるダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和または部分中和する方法。
【請求項３５】
患者におけるダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和または部分中和するため：
（ａ）患者がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されていたこと、および該患者によって取り込まれた量を確認すること；
（ｂ）ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドが、凝固または血液凝固の試験またはアッセイの結果の正確な読み出しを妨害するであろう該試験またはアッセイを行う前に、請求項７〜２０のいずれか一項記載の抗体でダビガトランまたは１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和すること；
（ｃ）ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドも存在しないときの血餅形成レベルを決定するために、該患者から採取された試料の凝固または血液凝固の試験またはアッセイを行うこと；ならびに
（ｄ）患者における血餅形成と分解の間に適切なバランスを達成するために、該患者に投与されるダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の量を調整すること
を含む方法。
【請求項３６】
ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドに対する抗体の量が、０．１〜１００の間のモル比である、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドに対する抗体の量が、０．１〜１０の間のモル比である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
試験またはアッセイの結果の正確な読み出しが、フィブリノーゲンレベル、活性化プロテインＣ抵抗性または関連試験の正確な読み出しである、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、医学の分野、特に抗凝固治療の分野に関するものである。
【０００２】
背景の情報
抗凝固薬は、血液凝固を防止する物質であって；すなわち抗凝固薬は血液が凝固するのを妨げる。抗凝固薬は、血栓性障害のための薬物療法としてのヒトの治療、例えば素因をもつ者における深部静脈血栓、肺塞栓、心筋梗塞および脳卒中の一次および二次予防に広く使用される。
【０００３】
重要なクラスの経口抗凝固薬、例えばワルファリンを含めたクマリンは、ビタミンＫの効果と拮抗することによって作用する。第二のクラスの化合物は、アンチトロンビンIIIまたはヘパリンコファクターIIなどのコファクターを介して間接的に血液凝固を阻害する。これには、アンチトロンビンIIIを介して主に第Ｘａ因子（および低い程度にはトロンビン）の阻害を触媒するいくつかの低分子量ヘパリン製品（ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン）が含まれる。より小さなオリゴ糖（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス）は、アンチトロンビンIIIを介して第Ｘａ因子だけを阻害する。ヘパリノイド（ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸）は、両方のコファクターを介して作用し、第Ｘａ因子とトロンビンの両方を阻害する。第三のクラスは、血液凝固の直接阻害剤に相当する。直接第Ｘａ因子阻害剤には、アピキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバンが含まれ、直接トロンビン阻害剤には、二価ヒルジン（ビバリルジン、レピルジン、デシルジン）、ならびに一価化合物であるアルガトロバンおよびダビガトランが含まれる。
【０００４】
血液凝固は出血を止める生物学的メカニズムであるので、抗凝固治療の副作用は、望まれない出血事象のことがある。したがって、そのような抗凝固薬関連出血事象が起こったときにそれを止めることができる解毒剤を提供することが望ましい（Zikria and Ansell, Current Opinion in Hematology 2009, 16(5): 347-356）。これを達成するための一方法は、投与後に患者に存在する抗凝固化合物の活性を中和することによる。
【０００５】
抗凝固薬の現在入手可能な解毒剤は、プロタミン（ヘパリンの中和用）、およびワルファリンのようなビタミンＫアンタゴニストを中和するためのビタミンＫである。新鮮凍結血漿および組換え第ＶＩＩａ因子もまた、大外傷または重度出血を被った、低分子量ヘパリン処置下の患者における非特異的解毒剤として使用されている（Lauritzen, B. et al, Blood, 2005, 607A-608A.）。ヘパリンまたは低分子量ヘパリン解毒剤としてのプロタミンフラグメント（米国特許第６，６２４，１４１号）および小型合成ペプチド（米国特許第６，２００，９５５号）；ならびにトロンビン阻害剤用の解毒剤としてのトロンビンムテイン（米国特許第６，０６０，３００号）も報告されている。プロトロンビンの中間体および誘導体は、ヒルジンおよび合成トロンビン阻害剤に対する解毒剤として報告されている（米国特許第５，８１７，３０９号および第６，０８６，８７１号）。直接第Ｘａ因子阻害剤については、不活性第Ｘａ因子アナログが解毒剤として提案されている（国際公開公報第２００９０４２９６２号）。さらに、組換え第ＶＩＩａ因子が、フォンダパリヌクスおよびイドラパリヌクスなどの間接アンチトロンビンＩＩＩ依存性第Ｘａ因子阻害剤の効果をリバースするために使用されている（Bijsterveld, NR et al, Circulation, 2002, 106: 2550-2554; Bijsterveld, NR et al, British J. of Haematology, 2004 (124): 653-658）。抗凝固薬の効果をリバースする方法の総説は、Schulman and Bijsterveld, Transfusion Medicine Reviews 2007、21(1): 37-48に提供されている。
【０００６】
抗凝固治療についての改良された解毒剤、特に特異的解毒剤がこれまでのところ開示されていないダビガトランのような直接トロンビン阻害剤のための解毒剤を提供する必要性がある。
【０００７】
発明の簡単な概要
一局面では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和可能な抗体分子に関する。
【０００８】
さらなる局面では、抗体分子は、抗凝固薬に対する結合特異性を有する。
【０００９】
さらなる局面では、抗凝固薬は、直接トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、またはビタミンＫアンタゴニストである。
【００１０】
さらなる局面では、抗凝固薬は、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アピキサバン、オタミキサバン、エドキサバン、リバロキサバン、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンIII、またはドロトレコギンアルファである。
【００１１】
さらなる態様では、抗凝固薬は、一般式
【００１２】
【化１】
2014210794.tif 000002
［式中、
Ａは、基Ｈｅｔのベンゾ、ピリドまたはチエノ部分に結合されたカルボニルまたはスルホニル基を表し、
Ｂは、基Ａｒに結合されたメチレン基が酸素もしくは硫黄原子によって、または−ＮＲ１−基によって置き換えられていてもよいエチレン基を表し、
ここで、Ｒ１は、水素原子またはＣ１−４−アルキル基を表し、
Ｅは、ＲｂＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−基を表し、
ここで、Ｒｂは、水素原子、ヒドロキシ、Ｃ１−９−アルコキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル、ベンゾイル、ｐ−Ｃ１−３−アルキル−ベンゾイルまたはピリジノイル基を表し、一方で上記Ｃ１−９−アルコキシカルボニル基の２位のエトキシ部分は、Ｃ１−３−アルキルスルホニルまたは２−（Ｃ１−３−アルコキシ）−エチル基によって更に置換されていてもよく、
Ａｒは、場合により塩素原子によって、またはメチル、エチルもしくはメトキシ基によって置換されている１，４−フェニレン基を表すか、あるいはＡｒは２，５−チエニレン基を表し、
Ｈｅｔは、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−ベンゾイミダゾリレン、１−シクロプロピル−２，５−ベンゾイミダゾリレン、２，５−ベンゾチアゾリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−インドリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニレン、３−（Ｃ１−３−アルキル）−２，７−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニレンまたは１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−チエノ［２，３−ｄ］イミダゾリレン基を表し、そして
Ｒａは、Ｒ２ＮＲ３−基を表し、
ここで、Ｒ２は、カルボキシ、Ｃ１−６−アルキルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニルアミノカルボニルもしくは１Ｈ−テトラゾール−５−イル基によって置換されていてもよいＣ１−４−アルキル基、
ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−３−アルキル）−カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノもしくはＮ−（Ｃ１−３−アルキル）−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ基によって置換されているＣ２−４−アルキル基であり、一方で上記基において隣接窒素原子に対してα−位にある炭素原子は、置換されていなくてもよく、
Ｒ３は、Ｃ３−７−シクロアルキル基、不飽和部分がＲ２ＮＲ３基の窒素原子に直接結合されていなくてもよいプロパルギル基、フッ素もしくは塩素原子によって、またはメチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されているフェニル基、あるいはメチル基によって場合により置換されているピラゾリル、ピリダゾリルまたはピリジニル基を表すか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらの間の窒素原子と一緒になって、カルボキシまたはＣ１−４−アルコキシカルボニル基によって場合により置換されている５〜７員シクロアルキレンイミノ基を表し、フェニル環が更に縮合されていてもよい］
で示される二置換二環式複素環、その互変異性体、立体異性体および塩である。
【００１３】
さらなる態様では、抗凝固薬は、
（ａ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−アミド、
（ｂ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｃ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｄ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（３−ヒドロキシカルボニルプロピル）−アミド、
（ｅ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（ヒドロキシカルボニルメチル）−アミド、
（ｆ）  １−メチル−２−［２−（２−アミジノチオフェン−５−イル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｇ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｈ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｉ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｊ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｋ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｌ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｍ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｎ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｏ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［（Ｎ−ヒドロキシカルボニルエチル−Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−アミド、
（ｐ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｑ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｒ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｓ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｔ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−インドール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−メトキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｕ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−チエノ［２．３−ｄ］イミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｖ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｗ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｘ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｙ）  １−メチル−２−［Ｎ−［４−（Ｎ−ｎ−ヘキシルオキシカルボニルアミジノ）フェニル］−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−エトキシカルボニルエチル）−アミド、
より選択される化合物、ならびにその互変異性体、立体異性体および塩である。
【００１４】
別の局面では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、および／またはダビガトランのＯ−アシルグルクロニドに対する抗体分子に関する。
【００１５】
さらなる局面では、抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、特に単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、ナノボディ（nanobody）、ダイアボディ（diabody）、またはＤＡＲＰｉｎである。
【００１６】
さらなる局面では、本発明は、医学に使用するための上記抗体分子に関する。
【００１７】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固治療の副作用の治療または予防に使用するための上記抗体分子に関する。
【００１８】
さらなる局面では、副作用は出血事象である。
【００１９】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固治療の副作用の治療または予防方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【００２０】
別の局面では、本発明は、容器およびラベルと一緒に前記抗体分子を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】トロンビン凝固時間アッセイを用いて、ダビガトランの濃度の増加とともに凝固時間の増加が見られたことを示す図である。濃度２００nMは、凝固時間にベースラインからの５倍の延長を招き、この濃度を第１および第２セットの実験に使用した。最終セットの実験には濃度５００nM（治療濃度を超える）を使用した。
【図２】ダビガトランに対する４種の異なる抗体（Ａ〜Ｄ）全てが、ヒト血漿でのダビガトランの凝固時間延長を中和したことを示す図である。ヒト血漿でのベースライン凝固は１０．９秒であり、２００nMダビガトランを血漿と一緒に予備インキュベーションした場合、凝固は５１秒に延長した。２００nMダビガトランと一緒に予備インキュベーションされた血漿に各抗体を添加し、さらに５分間インキュベーションした。次に、トロンビンの添加によってトロンビン凝固時間を開始させた。各抗体は、ダビガトランの凝固時間を異なる程度にリバースすることができた。最も濃い溶液が抗凝固活性の最大のリバースを招いた。
【図３】２００nMダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿に添加される、漸増するポリクローナル抗体（抗体Ｄ）の濃度の作用を測定したことを示す図である。ベースライン凝固時間は１１秒であり、ダビガトランの添加は、凝固を６３．７秒に延長した。次に、抗体の漸増する希釈が、ダビガトランで延長されたトロンビン凝固時間のリバースに及ぼす作用を試験した。最低濃度はトロンビン凝固時間を４３．９秒に短縮した。より高い濃度は、トロンビン凝固時間をベースラインレベルに完全に減らし、ダビガトランの抗凝固作用の完全な中和をもたらした。非特異的ウサギポリクローナル抗体（四角）の添加は、ダビガトランの抗凝固作用のリバースに効果を有さなかった。
【図４】５００nMダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿に添加された、漸増するポリクローナル抗体（抗体Ｄ）の濃度の作用を測定したことを示す図である。ベースライン凝固時間は１０．９秒であり、このより高い濃度のダビガトランの添加は、凝固を１１１．７秒に延長した（約１０倍の増加）。抗体または原液の１：２希釈溶液の作用は、ダビガトランを用いたトロンビン凝固時間延長を濃度依存的にリバースした。最も高い濃度もまた、トロンビン凝固時間をベースラインレベルに完全にリバースさせ、たとえ治療濃度を超えるダビガトランの抗凝固作用であっても完全な中和を招いた。
【図５】抗ダビガトラン抗体分子重鎖の可変領域の配列を示す図である。
【図６】抗ダビガトラン抗体分子軽鎖の可変領域の配列を示す図である。
【図７】マウスモノクローナル抗体（クローン２２）が、ヒト血漿およびヒト全血でのダビガトランの抗凝固作用をリバースすることを示す図である。漸増する濃度のマウス抗体を、３０nMダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿または全血に添加した。１．５〜２U/mLトロンビンの添加によってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％のダビガトラン活性を、化合物の存在下と不在下の凝固時間の差として定義した。抗体は、凝固時間のダビガトラン介在性延長を用量依存的に阻害した。
【図８】クローン２２抗体から生成されたマウスＦａｂが、ヒト血漿でのダビガトランの抗凝固作用をリバースすることを示す図である。漸増する濃度のマウスＦａｂを、７nMダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿に添加した。インタクトな抗体も陽性対照として試験した。０．４U/mLトロンビンの添加によってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害を、凝固時間のダビガトラン介在性増加の完全遮断として定義した。Ｆａｂは、ヒト血漿での凝固時間におけるダビガトラン誘導延長を用量依存的に阻害した。
【図９】マウスモノクローナル抗体（クローン２２）が、ヒト血漿でのダビガトランアシルグルクロニドの抗凝固作用をリバースすることを示す図である。漸増する濃度のマウス抗体を、７nMダビガトランアシルグルクロニドまたはダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿に添加した。０．４U/mLトロンビンの添加によってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害を凝固時間における化合物介在性増加の完全遮断として定義した。抗体は、ヒト血漿での凝固時間におけるダビガトランアシルグルクロニド誘導延長を用量依存的に阻害した。
【図１０】ヒト化Ｆａｂ（Ｆａｂ１８／１５）が、ヒト血漿でのダビガトランの抗凝固作用をリバースすることを示す図である。漸増する濃度のＦａｂ１８／１５を、７nMダビガトランと予備インキュベーションされたヒト血漿に添加した。０．４U/mLトロンビンの添加によってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害を、凝固時間におけるダビガトラン介在性増加の完全遮断として定義した。Ｆａｂは、ヒト血漿での凝固時間におけるダビガトラン誘導延長を用量依存的に阻害した。
【図１１】ｔ＝０での等モル濃度のＦａｂのボーラス投与とダビガトランを連続注入として受けている、ラットにおけるex vivo全血トロンビン凝固時間（３．０U/mLトロンビン）を示す図である。無地丸との線は、薬物なしのビヒクル処置を表す。無地四角の線は、Ｆａｂなしのダビガトランの抗凝固活性を表す。無地三角との線は、Ｆａｂ投与後の抗凝固活性を表す。データを平均±ＳＥ（一処置群あたり動物数ｎ＝４）として表す。
【図１２】ｔ＝０で等モル濃度のＦａｂのボーラス投与とダビガトランを連続注入として受けている、投与されているラットにおけるex vivo全血ａＰＴＴを示す図である。無地丸は、薬物なしのビヒクル処置を表す。無地四角との線は、Ｆａｂなしのダビガトランの抗凝固活性を表す。無地三角との線は、Ｆａｂ投与後の抗凝固活性を表す。データを平均±ＳＥ（一処置群あたり動物数ｎ＝４）として表す。
【図１３】ｔ＝０での漸増する用量のＦａｂのボーラス投与とダビガトランを連続注入として受けている、ラットにおけるex vivo全血トロンビン凝固時間（３．０U/mLトロンビン）を示す図である。無地丸との線は、薬物なしのビヒクル処置を表す。無地四角とのの線は、Ｆａｂなしのダビガトランの抗凝固活性を表す。無地三角との線は、等モルのＦａｂを投与後の、破線は、等モル用量の５０％を投与後の抗凝固活性を表す。データを平均±ＳＥ（一処置群あたり動物数ｎ＝４）として表す。
【図１４】ｔ＝０での漸増する用量のＦａｂのボーラス投与とダビガトランを連続注入として受けている、ラットにおけるex vivo全血ａＰＴＴを示す図である。無地丸は、薬物なしのビヒクル処置を表す。無地四角との線は、Ｆａｂなしのダビガトランの抗凝固活性を表す。無地三角との線は、等モルのＦａｂを投与後の、破線は、等モル用量の５０％を投与後の抗凝固活性を表す。データを平均±ＳＥ（一処置群あたり動物数ｎ＝４）として表す。
【００２２】
発明の詳細な説明
一局面では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和可能な抗体分子に関する。
【００２３】
抗体（免疫グロブリン、略してＩｇとしても知られている）は、脊椎動物の血液または他の体液中に見出されるガンマグロブリンタンパク質であって、細菌およびウイルスなどの外来物を同定および中和するために免疫系によって使用される。抗体は、典型的には基本構造ユニットでできており、それぞれが２本の大きな重鎖および２本の小さな軽鎖を有し、例えば１個のユニットを有するモノマー、２個のユニットを有するダイマーまたは５個のユニットを有するペンタマーを形成する。抗体は、抗原として知られている他の分子または構造に非共有相互作用によって結合することができる。この結合は、抗体が高親和性で特異構造だけに結合するという意味で特異的である。抗体によって認識される抗原の独特な部分は、エピトープまたは抗原決定基と呼ばれる。抗体のエピトープ結合性部分は、時にパラトープと呼ばれ、抗体のいわゆる可変ドメイン、または可変領域（Ｆｖ）に位置する。可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって間隔が空けられた３個のいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２４】
本発明の状況の範囲内で、ＣＤＲへの参照は、Chothia（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917）ならびにKabat（E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)）の定義に基づく。
【００２５】
当該技術は、さらに抗体を開発し、それらを医学および工学における多用途の道具にしている。したがって、本発明の状況で「抗体分子」または「抗体」という用語（本明細書において同義語として使用される）には、例えば２本の軽鎖および２本の重鎖、またはラクダ科の種のように２本の重鎖だけを含む、自然界に見出されうる抗体が含まれるだけではなく、さらには抗原への結合特異性および免疫グロブリンの可変ドメインとの構造類似性を有する少なくとも１個のパラトープを含む全ての分子も包含する。
【００２６】
したがって、本発明による抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、特に単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫医薬（Small Modular Immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディでありうる。
【００２７】
ポリクローナル抗体は、異なるアミノ酸配列を有する抗体分子の集合を表し、当技術分野で周知のプロセスにより抗原で免疫処置した後に、脊椎動物の血液から得ることができる。
【００２８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂまたはｍｏＡｂ）は、アミノ酸配列が同一の単一特異性抗体である。それらは、ハイブリドーマ技法によって、特異抗体産生性Ｂ細胞と骨髄腫（Ｂ細胞ガン）細胞の融合体のクローンを意味するハイブリッド細胞系（ハイブリドーマと呼ばれる）から製造することができる（Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.）。または、モノクローナル抗体は、宿主細胞での組換え発現によって製造することができる（Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77-87；下記も参照されたい）。
【００２９】
人間に応用するために、マウスのような本来他の種由来の抗体の免疫原性を減少させることが望ましいことが多い。これは、キメラ抗体の構築によって、または「ヒト化」と呼ばれるプロセスによって行うことができる。この状況で「キメラ抗体」は、ある種（例えばマウス）由来の配列部分（例えば可変ドメイン）が別の種（例えばヒト）由来の配列部分（例えば定常ドメイン）と融合したものを含む抗体であると理解される。「ヒト化抗体」は、本来非ヒト種由来の可変ドメインを含む抗体であって、その可変ドメインの全体的な配列がヒト可変ドメインの配列により密接に類似するように、あるアミノ酸が突然変異された抗体である。抗体のキメラ化方法およびヒト化方法は、当技術分野において周知である（Billetta R, Lobuglio AF. "Chimeric antibodies". Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323.）。
【００３０】
さらに、例えばファージディスプレイによって、またはトランスジェニック動物を使用してヒトゲノム由来の配列に基づき抗体を作出するための技法が開発されている（国際公開公報第９０／０５１４４号; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brueggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.）。そのような抗体は、本発明の状況で「ヒト抗体」である。
【００３１】
本発明による抗体分子には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗原結合特性を保持する免疫グロブリンのフラグメントも含まれる。そのようなフラグメントは、免疫グロブリンのフラグメント化によって、例えばタンパク質分解消化によって、またはそのようなフラグメントの組換え発現によって得ることができる。例えば、免疫グロブリンの消化は、日常的な技法によって、例えばパパインもしくはペプシン（国際公開公報第９４／２９３４８号）、またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Kleemann, et al, Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008）を使用して達成することができる。抗体のパパインまたはＬｙｓ−Ｃ消化によって、典型的にはそれぞれ単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合フラグメント、いわゆるＦａｂフラグメントおよび残余のＦｃフラグメントが製造される。ペプシン処理によってＦ（ａｂ’）２が回収される。宿主細胞での組換え発現によってＦａｂ分子を製造する方法を下記により詳細に概要する。
【００３２】
免疫グロブリンの可変ドメインまたはそのような可変ドメイン由来の分子を異なる分子状況に配置するためにいくつかの技法が開発されている。それらもまた、本発明による「抗体分子」と見なすべきである。一般にこれらの抗体分子は、免疫グロブリンよりもサイズが小さく、単一のアミノ酸鎖を含むか、または数本のアミノ酸鎖から構成されることがある。例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短いリンカー、通常はセリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）で一緒に結合されている、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域との融合体である（国際公開公報第８８／０１６４９号；国際公開公報第９１／１７２７１号; Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217）。「単一ドメイン抗体」または「ナノボディ」は、単一のＩｇ様ドメインに抗原結合部位を有する（国際公開公報第９４／０４６７８号；国際公開公報第０３／０５０５３１号、Ward et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6; Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005）。同一または異なる抗原に対して結合特異性を有する一つ以上の単一ドメイン抗体が一緒に結合されることがある。ダイアボティは、２個の可変ドメインを含む２本のアミノ酸鎖から成る二価抗体分子である（国際公開公報第９４／１３８０４号、Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8）。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体である（ＩｇＳＦ; Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96）。異なる考え方が、定常ドメインＣＨ１を欠如する単鎖ヒンジおよびエフェクタードメインに結合したＦｖドメインを含む、いわゆる小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）につながっている（国際公開公報第０２／０５６９１０号）。
【００３３】
さらなる局面では、本発明の抗体分子は、免疫グロブリン可変ドメインに匹敵するある一定の結合特異性および親和性を有する限り、免疫グロブリン可変ドメインとかけ離れた構造関連性だけさえ有していればよいし、またそのような関係を全く有していなくてもよい。そのような非免疫グロブリン「抗体模倣物」は、時に「足場タンパク質」と呼ばれ、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンの遺伝子に基づくことがある（Skerra, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18(4): 295-304）。本発明の状況における好ましい態様は、設計されたアンキリンリピートタンパク質である（ＤＡＲＰｉｎ; Steiner et al., J Mol Biol. 2008 Oct 24;382(5): 1211-27; Stumpp MT, Amstutz P. Curr Opin Drug Discov Devel. 2007 Mar;10(2):153-9）。
【００３４】
抗体分子は、その抗体分子の性質に所望の影響を有する他の分子実体に融合されるか（融合タンパク質として）、または別の方法で結合される（共有または非共有結合により）ことがある。例えば、特に単鎖抗体またはドメイン抗体の場合、抗体分子の薬物動態特性、例えば血液のような体液中での安定性を改善することが望ましいことがある。これに関して、特に循環中でのそのような抗体分子の半減期を延長するために、ＰＥＧ化（国際公開公報第９８／２５９７１号；国際公開公報第９８／４８８３７号；国際公開公報第２００４０８１０２６号）、その抗体分子を、アルブミンのような血清タンパク質に対して親和性を有する別の抗体分子と融合もしくは別の方法で共有結合させること（国際公開公報第２００４０４１８６５号；国際公開公報第２００４００３０１９号）、またはアルブミンもしくはトランスフェリンのような血清タンパク質の全てまたは一部との融合タンパク質としてその抗体分子を発現させること（国際公開公報第０１／７９２５８号）などのいくつかの技法が開発されている。
【００３５】
さらなる局面では、抗体分子は、抗凝固薬に対する結合特異性を有する。「結合特異性」は、抗体分子が、構造的に無関係の分子よりも抗凝固薬に対して有意に高い結合親和性を有することを意味する。
【００３６】
親和性は、抗体分子上の単一抗原結合部位と単一エピトープの間の相互作用である。親和性は、結合定数ＫＡ＝ｋａｓｓ／ｋｄｉｓｓ、または解離定数ＫＤ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓによって表される。
【００３７】
本発明の一局面では、抗体は、例えば表面プラズモン共鳴分析によって決定されるとき、０．１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１μMの範囲のＫＤ値を有する親和性で抗凝固薬に結合する（Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.）。抗体親和性は、また、動力学排除アッセイ（kinetic exclusion assay）（ＫｉｎＥｘＡ）技法を用いて測定することもできる（Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions."  ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657）。
【００３８】
抗体分子の結合親和性は、親和性成熟として知られているプロセスによって高めることができる（Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783; Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155）。したがって、親和性成熟された抗体もまた、本発明に包含される。
【００３９】
本発明のさらなる局面では、抗体分子は、抗凝固薬の活性を中和可能である。すなわち抗凝固薬は、抗体分子に結合すると、もはやその抗凝固活性を発揮することができないか、または有意に減少した大きさでこの活性を発揮する。好ましくは抗凝固活性は、当該抗凝固薬にとって適切な活性アッセイで、特にエカリン凝固時間またはトロンビン凝固時間などの、トロンビンに感受性の凝固アッセイで決定されるとき、抗体の結合について、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍で減少している（H. Bounameaux, Marbet GA, Lammle B, et al. "Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time, activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behaviour of antithormbin III". American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1): 68-72）。
【００４０】
本発明の抗体分子を製造するために、当業者は、当技術分野で周知の多様な方法より選択することができる（Norderhaug et al., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004; Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39）。
【００４１】
抗凝固薬は、上記に概要するように当技術分野において周知である。本発明のさらなる局面では、抗凝固薬は、直接トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、またはビタミンＫアンタゴニストである。ビタミンＫアンタゴニストの例は、ワルファリンが含まれるクマリンである。主に第Ｘａ因子の間接阻害剤の例は、アンチトロンビンIIIの活性化を介して作用するヘパリン群の物質であって、それらには、いくつかの低分子量ヘパリン製品（ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン）、ある種のオリゴ糖（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス）、ヘパリノイド（ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸）、および直接第Ｘａ因子阻害剤（アピキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン）が含まれる。トロンビン阻害剤の例には、二価ヒルジン（ビバリルジン、レピルジン、デシルジン）、ならびに一価化合物アルガトロバンおよびダビガトランが含まれる。
【００４２】
したがってさらなる局面では、抗凝固薬は、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アピキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンＩＩＩ、またはドロトレコギンアルファである。
【００４３】
さらなる態様では、抗凝固薬は、一般式
【００４４】
【化２】
2014210794.tif 000003
［式中、
Ａは、基Ｈｅｔのベンゾ、ピリドまたはチエノ部分に結合したカルボニルまたはスルホニル基を表し、
Ｂは、基Ａｒに結合されたメチレン基が酸素もしくは硫黄原子によって、または−ＮＲ１−基によって置き換えられていてもよいエチレン基を表し、
ここで、Ｒ１は、水素原子またはＣ１−４−アルキル基を表し、
Ｅは、ＲｂＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−基を表し、
ここで、Ｒｂは、水素原子、ヒドロキシ、Ｃ１−９−アルコキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル、ベンゾイル、ｐ−Ｃ１−３−アルキル−ベンゾイルまたはピリジノイル基を表し、一方で上記Ｃ１−９−アルコキシカルボニル基の２位のエトキシ部分は、Ｃ１−３−アルキルスルホニルまたは２−（Ｃ１−３−アルコキシ）−エチル基によって更に置換されていてもよく、
Ａｒは、塩素原子によって、またはメチル、エチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されている１，４−フェニレン基を表すか、もしくはそれは２，５−チエニレン基を表し、
Ｈｅｔは、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−ベンゾイミダゾリレン、１−シクロプロピル−２，５−ベンゾイミダゾリレン、２，５−ベンゾチアゾリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−インドリレン、１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニレン、３−（Ｃ１−３−アルキル）−２，７−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニレンまたは１−（Ｃ１−３−アルキル）−２，５−チエノ［２，３−ｄ］イミダゾリレン基を表し、そして
Ｒａは、Ｒ２ＮＲ３−基を表し、
ここで、Ｒ２は、カルボキシ、Ｃ１−６−アルキルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニルアミノカルボニルもしくは１Ｈ−テトラゾール−５−イル基によって置換されていてもよいＣ１−４−アルキル基、
ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−３−アルキル）−カルボキシ−Ｃ１−３−アルキルアミノもしくはＮ−（Ｃ１−３−アルキル）−Ｃ１−３−アルコキシカルボニル−Ｃ１−３−アルキルアミノ基によって置換されているＣ２−４−アルキル基であり、一方で上記基において隣接窒素原子に対してα−位にある炭素原子は、置換されていなくてもよく、
Ｒ３は、Ｃ３−７−シクロアルキル基、不飽和部分がＲ２ＮＲ３基の窒素原子に直接結合されていなくてもよいプロパルギル基、フッ素もしくは塩素原子によって、またはメチルもしくはメトキシ基によって場合により置換されているフェニル基、あるいはメチル基によって場合により置換されているピラゾリル、ピリダゾリルまたはピリジニル基を表すか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらの間の窒素原子と一緒になって、カルボキシまたはＣ１−４−アルコキシカルボニル基によって場合により置換されている５〜７員シクロアルキレンイミノ基を表し、フェニル環が更に縮合されていてもよい］
で示される二置換二環式複素環、その互変異性体、立体異性体および塩である。式（Ｉ）で示される化合物、これらの化合物の調製および抗凝固薬としてのそれらの使用は、国際公開公報第９８／３７０７５号に記載されている。
【００４５】
さらなる態様では、抗凝固薬は、
（ａ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−アミド、
（ｂ）  ２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾチアゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｃ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｄ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（３−ヒドロキシカルボニルプロピル）−アミド、
（ｅ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（ヒドロキシカルボニルメチル）−アミド、
（ｆ）  １−メチル−２−［２−（２−アミジノチオフェン−５−イル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｇ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｈ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｉ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｊ）  １−メチル−２−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｋ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−アミド、
（ｌ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｍ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｎ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−Ｎ−メチル−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｏ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−［（Ｎ−ヒドロキシカルボニルエチル−Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−アミド、
（ｐ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｑ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｒ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｓ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｔ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−インドール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−メトキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｕ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）アミノメチル］−チエノ［２．３−ｄ］イミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｖ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−フェニル−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｗ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｘ）  １−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノ−２−メトキシ−フェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミド、
（ｙ）  １−メチル−２−［Ｎ−［４−（Ｎ−ｎ−ヘキシルオキシカルボニルアミジノ）フェニル］−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−エトキシカルボニルエチル）−アミド、
より選択される化合物、その互変異性体、立体異性体および塩であり、それらの全ては、国際公開公報第９８／３７０７５号に記載されている。
【００４６】
本発明の状況で好ましい抗凝固薬は、化学式（II）：
【化３】
2014210794.tif 000004
を有するダビガトラン（ＣＡＳ２１１９１４−５１−１、Ｎ−［２−（４−アミジノフェニルアミノメチル）−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イルカルボニル］−Ｎ−（２−ピリジル）−β−アラニン）である。
【００４７】
ダビガトランは、トロンビン阻害作用およびトロンビン時間延長作用を有する化合物を１−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミドの名称で開示している国際公開公報第９８／３７０７５号から公知である。Hauel et al. J Med Chem 2002, 45 (9): 1757-66も参照されたい。
【００４８】
ダビガトランは、式（III）：
【化４】
2014210794.tif 000005
で示されるプロドラッグとして適用される。
【００４９】
式IIIで示される化合物（名称ダビガトランエテキシラート、ＣＡＳ２１１９１５−０６−９；エチル３−［（２−｛［４−（ヘキシルオキシカルボニルアミノ−イミノ−メチル）−フェニルアミノ］−メチル｝−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−プロピオナート）は、体内に入った後で活性化合物（ＩＩ）に変換される。ダビガトランエテキシラートの好ましい多形は、ダビガトランエテキシラートメシラート塩である。
【００５０】
ダビガトランの主要効能は、深部静脈血栓の術後予防、確立した深部静脈血栓の処置および心房細動を有する患者における発作の予防である（Eriksson et al., Lancet 2007, 370 (9591): 949-56; Schulman S et al, N Engl J Med 2009, 361 (24): 2342-52; Connolly S et al., N Engl J Med 2009, 361 (12): 1139-51; Wallentin et al., Lancet 2010, 376 (9745): 975-983）。
【００５１】
ヒトの身体では、カルボキシラート部分のグルクロン酸抱合がダビガトランの主要なヒト代謝経路である（Ebner et al., Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75）。それは、１−Ｏ−アシルグルクロニド（βアノマー）の形成をもたらす。１−Ｏ−アシルグルクロニドは、アグリコンへのマイナー加水分解（minor hydrolysis）に加えて、水溶液中で非酵素的アシル転移を受けて、２−Ｏ−、３−Ｏ−、および４−Ｏ−アシルグルクロニドの形成をもたらすことがある。精製１−Ｏ−アシルグルクロニドおよびその異性体性転位産物を用いた実験は、ダビガトランに比べて等しい効力の活性化部分トロンボプラスチン時間の延長を明らかにした。
【００５２】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ダビガトランとダビガトランエテキシラートの両方に結合する。
【００５３】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ダビガトランとダビガトランのＯ−アシルグルクロニドの両方に、特にダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドに結合する。
【００５４】
本発明の別の局面では、抗体分子は、さらにダビガトランの２−Ｏ−、３−Ｏ−、および４−Ｏ−アシルグルクロニドに結合する。
【００５５】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ダビガトランおよびダビガトランのＯ−アシルグルクロニド、特にダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和可能である。
【００５６】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、図５および６に示されるＣＤＲ配列を含む。
【００５７】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５に示される重鎖ＣＤＲ配列、および図６に示される軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００５８】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５に示される重鎖可変ドメイン配列、および図６に示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００５９】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称ＤＢＧ １３ ＶＨで示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称ＤＢＧ １３ ＶＫで示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６０】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称ＤＢＧ １４ ＶＨで示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称ＤＢＧ １４ ＶＫで示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６１】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称ＤＢＧ ２２ ＶＨで示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称ＤＢＧ ２２ ＶＫで示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６２】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称Ｅｎｇ ＶＨ＃ １４で示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称Ｅｎｇ ＶＫ＃ １１で示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６３】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称Ｅｎｇ ＶＨ＃ １５で示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称Ｅｎｇ ＶＫ＃ １７で示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６４】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称Ｅｎｇ ＶＨ＃ １５で示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称Ｅｎｇ ＶＫ＃ １８で示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６５】
本発明の別の局面では、抗体分子は、図５において名称Ｅｎｇ ＶＨ＃ ３１で示される重鎖可変ドメイン配列、および図６において名称Ｅｎｇ ＶＫ＃ １８で示される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００６６】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号：１および配列番号：２から成る群より選択されるＣＤＲ１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８から成る群より選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：９および配列番号：１０から成る群より選択されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１１、配列番号：１２、および配列番号：１３から成る群より選択されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６７】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１で示されるＣＤＲ１、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８から成る群より選択されるＣＤＲ２、ならびに配列番号：１０で示されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１３で示されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、および配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６８】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１で示されるＣＤＲ１、配列番号：７で示されるＣＤＲ２、および配列番号：１０で示されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号：１３で示されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、および配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００６９】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１で示されるＣＤＲ１、配列番号：５で示されるＣＤＲ２、および配列番号：１０で示されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号：１１で示されるＣＤＲ１、配列番号：１４で示されるＣＤＲ２、および配列番号：１５で示されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００７０】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１６、１８、２０、２２、２４、および２６から成る群より選択される重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号：１７、１９、２１、２３、２５、および２７から成る群より選択される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７１】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１６で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：１７で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７２】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：１８で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：１９で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７３】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：２０で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：２１で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７４】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：２２で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：２３で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７５】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：２４で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：２５で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７６】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：２４で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：２７で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７７】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：２６で示される重鎖可変ドメイン、および配列番号：２７で示される軽鎖可変ドメインを含む。
【００７８】
本発明の別の局面では、抗体分子は、ｓｃＦｖ分子である。この形式では、本明細書に開示された可変ドメインは、例えば配列番号：２８、２９、３０、または３１から成る群より選択される、適切なリンカーペプチドで相互に融合されていることがある。その構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（重鎖可変ドメイン）−（リンカーペプチド）−（軽鎖可変ドメイン）、または（軽鎖可変ドメイン）−（リンカーペプチド）−（重鎖可変ドメイン）の順序でこれらの要素を含むことがある。
【００７９】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３２または配列番号：３３を含むｓｃＦｖ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３２または配列番号：３３から成るｓｃＦｖ分子である。
【００８０】
ｓＦｖ構築物をコードする核酸を、宿主細胞（E. coli、Pichia pastoris、または哺乳動物細胞系、例えばＣＨＯもしくはＮＳ０など）に、組換え発現させて、機能的ｓｃＦｖ分子を得るプロセスは、当技術分野において公知である（例えばRippmann et al., Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda et al., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253を参照されたい）。
【００８１】
特に、本発明のｓｃＦｖ抗体分子は、以下のように製造することができる。構築物は、Ｗ３１１０、ＴＧ１、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＭＭ２９４のような異なるE. coliに誘導性プロモーターのコントロール下で発現させることができる。このプロモーターは、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、Ｔ７、ｔｒｐ、ｔｒｃ、Ｔ５、ａｒａＢより選択することができる。培養培地は、好ましくはWilmsら、２００１（Wilms et al., Biotechnology and Bioengineering 2001, 73(2): 95-103）、DeLisaら、１９９９（DeLisa et al., Biotechnology and Bioengineering 1999, 65(1): 54-64）にしたがって十分に定義されているか、または同等である。しかしながら、バッチ培地および／または供給培地へのイソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリンなどのアミノ酸、またはダイズペプトンまたは酵母エキスなどの複合培地成分の補給が有益なことがある。発酵のためのプロセスは、流加モードで行う。条件：温度２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜７．５、ＤＯは２０％よりも高く保つ。最初の炭素源の消費後に、培養物に上記供給培地（または同等物）を供給する。発酵槽中で４０〜１００g/Lの乾燥細胞重量に達したときに、使用されるプロモーター系に対応する適切な誘導物質（例えばＩＰＴＧ、ラクトース、アラビノース）で培養物を誘導する。誘導は、パルス完全誘導として、またはそれぞれの誘導物質を発酵槽中に長時間供給することによる部分誘導もしくはその組み合わせとしてのいずれかで行うことができる。生産期は、少なくとも４時間持続すべきである。細胞は、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機またはディスクスタック遠心分離機での遠心分離によって回収され、培養上清は捨てられる。
【００８２】
E. coli細胞塊を、４〜８倍量の溶解緩衝液（リン酸緩衝液またはトリス緩衝液、ｐＨ７〜８．５）中に再懸濁する。細胞溶解を、好ましくは、高圧ホモジナイズに続いて、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機またはディスクスタック遠心分離機での遠心分離によるペレットの回収によって行う。ｓｃＦｖ封入体を含有するペレットを、２０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、２Ｍ尿素、０．５％トリトンＸ−１００（ｐＨ８．０）で２〜３回洗浄し、２０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を使用する２回の洗浄段階が続く。ｓｃＦｖ封入体は、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機またはディスクスタック遠心分離機での遠心分離によって最終的に回収する。ｓｃＦｖ封入体の可溶化は、６Ｍグアニジン−ＨＣｌまたは８〜１０mM尿素などのカオトロピック剤を含有する１００mMグリシン／ＮａＯＨ、５mM ＥＤＴＡ、２０mMジチオトレイトール（ｐＨ９．５〜１０．５）中で行うことができる。３０〜６０分間インキュベーション後に、溶液を遠心分離し、その後の再フォールディングのためにターゲットタンパク質を含有する上清を回収する。再フォールディングは、好ましくは流加モードでタンパク質溶液を再フォールディング緩衝液に１：１０〜１：５０希釈して０．１〜０．５mg/mlの最終タンパク質濃度にすることによって行われる。再フォールディング緩衝液は、５０〜１００mMトリスおよび／または５０〜１００mMグリシン、５０〜１５０mM ＮａＣｌ、１〜３Ｍ尿素、０．５〜１Ｍアルギニン、例えばシテイン（cytein）／シスチンまたは酸化／還元型グルタチオンなどの２〜６mMの酸化還元系（ｐＨ９．５〜１０．５）を含有することがある。４℃で２４〜７２ｈインキュベーション後に、再フォールディング溶液を、場合により０．２２μmフィルターを使用して濾過し、希釈し、ｐＨをｐＨ７．０〜８．０に調整する。タンパク質を、結合モードの陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばToyopearl GigaCap S-650M、ＳＰセファロースＦＦまたはS HyperCel（商標））を介してｐＨ７．０〜８．５で分離する。溶離を、漸増するＮａＣｌの直線勾配によって行う。ターゲットタンパク質を含有する画分をプールし、次に非結合モードの陰イオン交換カラム（例えばToyopearl GigaCap Q-650M、Ｑ−セファロースＦＦ、Q HyperCel（商標））に続く陽イオン交換仕上げステップ（例えばＳＰセファロースＨＰ）で分離する。最低限で９０％の純度レベルのターゲットタンパク質を含有する画分をプールし、ダイアフィルトレーションまたはＰＢＳを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって製剤化する。製造されたｓｃＦｖ分子の同一性および製品品質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その場合ｓｃＦｖは、約２６kDaの１本の主バンドの形で検出することができる。ｓｃＦｖの特徴づけのためのさらなるアッセイには、質量分析、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣが挙げられる。
【００８３】
本発明の別の局面では、抗体分子は、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ１またはそのエフェクター機能ノックアウトまたはＩｇＧ４型の免疫グロブリンである。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３４、配列番号：４０、または配列番号：４２を含む重鎖、および配列番号：３５または配列番号：４３を含む軽鎖を有する免疫グロブリンである。
【００８４】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３４を含む重鎖および配列番号：３５を含む軽鎖、または配列番号：４０を含む重鎖および配列番号：３５を含む軽鎖を有する免疫グロブリンである。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：４２を含む重鎖および配列番号：４３を含む軽鎖を有する免疫グロブリンである。
【００８５】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３４から成る重鎖および配列番号：３５から成る軽鎖、または配列番号：４０から成る重鎖および配列番号：３５から成る軽鎖を有する免疫グロブリンである。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：４２から成る重鎖および配列番号：４３から成る軽鎖を有する免疫グロブリンである。
【００８６】
本発明の別の局面では、抗体分子はＦａｂ分子である。その形式では、上に開示された可変ドメインは、それぞれ免疫グロブリン定常ドメイン、好ましくはヒト起源に融合されていてもよい。したがって、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメインに融合されていることがあり（いわゆるＦｄフラグメント）、軽鎖可変ドメインはＣＬドメインに融合されていることがある。
【００８７】
本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３６または配列番号：３８を含むＦｄフラグメントおよび配列番号：３７または配列番号：３９を含む軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３６を含むＦｄフラグメントおよび配列番号：３７を含む軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３８を含むＦｄフラグメントおよび配列番号：３９を含む軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：４１を含むＦｄフラグメントおよび配列番号：３７を含む軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３６から成るＦｄフラグメントおよび配列番号：３７から成る軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：３８から成るＦｄフラグメントおよび配列番号：３９から成る軽鎖を有するＦａｂ分子である。本発明の別の局面では、抗体分子は、配列番号：４１から成るＦｄフラグメントおよび配列番号：３７から成る軽鎖を有するＦａｂ分子である。
【００８８】
E. coli、Pichia pastoris、または哺乳動物細胞系（例えばＣＨＯまたはＮＳ０）のような宿主細胞にそのような重鎖および軽鎖を発現させるために、Ｆａｂ構築物をコードする核酸を使用することができる。Ｆｄフラグメントおよび軽鎖を含む機能的Ｆａｂ分子に、これらの鎖を適切にフォールディング、会合、およびジスルフィド結合させる方法は、当技術分野において公知である（Burtet et al., J. Biochem. 2007, 142(6), 665-669; Ning et al., Biochem. Mol. Biol. 2005, 38: 204-299; Quintero-Hernandez et al., Mol. Immunol. 2007, 44: 1307-1315; Willems et al. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003;786:161-176.）。
【００８９】
特に、本発明のＦａｂ分子は、以下のようにＣＨＯ細胞から製造することができる。無血清培地中に懸濁状態で成長しているＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Urlaub,G., Kas,E., Carothers,A.M., and Chasin,L.A. (1983). Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405-412.）に、Lipofectamine（商標） and Plus（商標）試薬（Invitrogen）を製造業者の説明書にしたがって使用して、Ｆａｂ分子の重鎖および軽鎖をコードする発現構築物をトランスフェクションする。４８時間後に、２００μg/mLの抗生物質Ｇ４１８を含有し、ヒポキサンチンおよびチミジンを有さない培地中で細胞を選択に供し、安定的にトランスフェクションされた細胞集団を発生させる。続いて、漸増する濃度（最大１００または４００nM）のメトトレキサート（ＭＴＸ）を培養培地に添加することによって、これらの安定トランスフェクタントを遺伝子増幅に供する。いったん細胞が適応したならば、それらを１０〜１１日間流加発酵に供し、Ｆａｂタンパク質材料を製造する。
【００９０】
化学的に限定された無血清培養培地中でＣＨＯ−ＤＧ４４細胞およびその安定トランスフェクタントの懸濁培養物をインキュベーションする。播種用保存培養物を２〜３日毎にそれぞれ細胞３×１０５〜２×１０５個/mLの播種密度で継代培養する。細胞を振盪フラスコ中、Multitron HTインキュベーター（Infors）で５％ ＣＯ２、３７℃および１２０rpmで成長させる。流加実験のために、細胞を振盪フラスコの中で抗生物質もＭＴＸも有さないＢＩ独自の生産培地中に細胞３×１０５個/mLとなるように播種する。培養物を１２０rpmで３７℃および５％ ＣＯ２にて撹拌し、細胞数が増加するにつれてＣＯ２をその後２％に減少させる。細胞数、生存率、ｐＨ、グルコースおよび乳酸濃度を含めた培養パラメーターを毎日決定し、必要に応じて炭酸塩を使用してｐＨをｐＨ７．０に調整する。ＢＩ独自の栄養溶液を２４時間毎に添加する。異なる時点で上清から試料を採取し、ＥＬＩＳＡによってＦａｂ産物濃度を決定する。１０〜１１日後に、細胞培養液を遠心分離によって回収し、精製研究室に移送する。
【００９１】
Ｆａｂ分子を、流加培養の上清からクロマトグラフィーおよび濾過によって精製する。一次捕捉ステップとして、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＧまたはプロテインＬを適用する。または、低結合親和性および低結合能の場合、Ｆａｂを、分子のｐＩを利用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって捕捉する。追加的な直交性の精製ステップによって、宿主細胞タンパク質および混入物、例えばＤＮＡまたはウイルスを除去する。
【００９２】
製造されたＦａｂ分子の同一性および製品品質を、電気泳動法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、それによって約５０kDaの１本の主バンドとしてＦａｂを検出することができる。Ｆａｂ産物の特徴づけのためのさらなるアッセイには、質量分析、等電点電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。結合活性をBIAcore分析によって追跡する。
【００９３】
細胞培養上清中のＦａｂまたは完全長ＩｇＧ分子の定量を、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により行う。完全長ＩｇＧは、ヒト−Ｆｃフラグメント（Jackson Immuno Research Laboratories）およびヒトκ軽鎖に対して産生された抗体（ペルオキシダーゼ−コンジュゲーション型、Sigma）を使用して検出することができる。Ｆａｂフラグメントを、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（ＨおよびＬ、Novus）によって固定化し、ヒトＩｇＧに対して産生されたヒツジポリクローナル抗体（ペルオキシダーゼ−コンジュゲーション型、結合部位）によって検出する。
【００９４】
Ｆａｂ分子は、また、酵素的切断によって完全長抗体分子から生成させることができる。このアプローチの利点は、所望の製品品質でのスケールアップおよび高収量が容易な、堅調で効率的な発酵および精製のための足場となるプロセスが適用可能であることである。精製のために、組換えプロテインＡ樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーを一次捕捉ステップとして使用することができ、それは通常、高い純度をもたらす。
【００９５】
この目的のために、Ｆａｂ配列をコードする重鎖を、ヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ領域に融合する。次に、得られた発現構築物を、無血清培地中に懸濁状態で成長しているＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にリポフェクションを用いてトランスフェクションする。４８時間後に２００μg/mLの抗生物質Ｇ４１８を含有しヒポキサンチンおよびチミジンを有さない培地中で細胞を選択に供し、安定トランスフェクションされた細胞集団を発生させた。続いて、メトトレキサート（ＭＴＸ）を漸増する濃度（最大１００または４００nM）で培養培地に添加することによって、これらの安定トランスフェクタントを遺伝子増幅に供する。いったん細胞が適応したならば、それらを１０〜１１日間流加発酵に供し、ＩｇＧタンパク質材料を製造する。ＩｇＧタンパク質を、組換えプロテインＡ−アフィニティークロマトグラフィーを使用することによって培養上清から精製する。次に、所望の中和Ｆａｂフラグメントを得るために、ヒンジ領域内でＩｇＧを切断するパパインの存在下で完全長ＩｇＧをインキュベーションし、それによって２本のＦａｂフラグメントおよびＦｃ部分を放出させる。配列番号：４１のＦｄ鎖を含むＦａｂ分子は、完全長ＩｇＧタンパク質のパパイン消化によって得られるＦａｂ分子の一例である。
【００９６】
Ｆａｂ分子を、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＧまたはプロテインＬによって単離する。または、低結合親和性および低結合能の場合、Ｆａｂを、分子のｐＩを利用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって捕捉する。追加的な直交性の精製ステップによって宿主細胞タンパク質および混入物、例えばパパイン、ＤＮＡまたはウイルスを除去する。
【００９７】
本発明の別の局面では、抗体分子は、本明細書記載の抗体分子のアミノ酸配列変異体である。
【００９８】
抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような変異体には、例えば本明細書における例に示される抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはその配列への挿入および／またはその配列の置換が挙げられる。最終構築物が所望の性質を有するという条件で、その最終構築物に到達するために欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが作られる。アミノ酸変化は、また、ヒト化または変異抗体の翻訳後プロセスを変え、グリコシル化部位の数または位置などを変化させることがある。
【００９９】
突然変異誘発のために好ましい位置である、抗体のある種の残基または領域を同定するための有用な方法は、CunninghamおよびWells（Science, 244:1081-1085 (1989)）によって記載されたような「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、ターゲット残基のうちの一残基または群（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、アミノ酸と抗原の相互作用に影響するように中性または負電荷アミノ酸（典型的にはアラニン）によって置き換えられる。次に、置換に機能的感受性を示しているアミノ酸位置は、置換部位で、または置換部位の代わりにさらなる変異体または他の変異体を導入することによって洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、突然変異自体の性質が予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発がターゲットのコドンまたは領域で行われ、発現された抗体変異体は、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１００】
アミノ酸配列の挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに一つ以上のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例には、エピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端もしくはＣ末端と、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドとの融合体が挙げられる。
【０１０１】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子から少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発のための最大に関心がもたれる部位には、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変化も考えられる。保存的置換を、下表に「好ましい置換」の見出しのもとに示す。そのような置換が生物学的活性の変化を招くならば、「例示的な置換」と呼ばれるより実質的な変化またはアミノ酸クラスに関して下にさらに説明するような変化を導入して、その産物をスクリーニングすることができる。
【表１】
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【０１０２】
タンパク質化学において、抗体の生物学的性質は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の、例えばシートまたはヘリカルコンフォメーションとしての構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに及ぼす作用が顕著に異なる置換を選択することによって達成できることが、一般に受け入れられている。天然残基は、共通の側鎖性質に基づき群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１０３】
非保存的置換は、これらのクラスのうち一つの一メンバーを別のクラスに交換することを伴うものである。
【０１０４】
ヒト化抗体または変異型抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基も一般にセリンで置換して、分子の酸化的安定性を改善するか、異常な架橋を防止するか、または細胞毒性化合物もしくは細胞増殖抑制性化合物への所定の結合点を与えることができる。逆に、抗体にシステイン結合を加えて、その安定性を改善することができる（特にその抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０１０５】
置換変異体の１種は、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の一つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、得られる変異体は、それらが生成された親抗体よりも改善された生物学的性質を有するものである。そのような置換変異体を生成させるために好都合な方法は、ファージディスプレイを用いたアフィニティー成熟である。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７個の部位）を突然変異させて、各部位で全ての可能なアミノ置換を生成させる。そのように生成された抗体変異体は、線維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価的にディスプレイされる。次に、ファージディスプレイされた変異体をそれらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。または、あるいは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトダビガトランの間の接触点を同定することが有益なことがある。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述される技法による置換のための候補である。そのような変異体がいったん生成されたならば、そのパネルの変異体を本明細書記載のスクリーニングに供し、一つ以上の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１０６】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変える。「変えること」によって、抗体に見られる一つ以上の糖質部分を除去すること、および／またはその抗体に存在しない一つ以上のグリコシル化部位を付加することが意味される。
【０１０７】
いくつかの態様では、本発明の抗体を改変してグリコシル化部位を付加することが望ましいことがある。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基側鎖に糖質部分が結合していることを表す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に結合させるための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位が生じる。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニン（もっとも５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる）に糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つを結合させることを表す。したがって、所与のタンパク質、例えば抗体をグリコシル化するために、タンパク質のアミノ酸配列を操作して（Ｎ−結合型グリコシル化部位のために）一つ以上の上記トリペプチド配列を有するようにされる。その変化は、また、（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）本来の抗体配列への一つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加またはその残基による置換によって行うことができる。
【０１０８】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の多様な方法によって調製される。これらの方法には、非限定的に、天然起源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）または初期に調製された変異体もしくは非変異体版の本明細書記載の抗体分子のオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。上記に概要するように、本発明の抗体分子の抗原は、抗凝固薬である。抗原は、動物の免疫処置によって、またはファージディスプレイ法を用いるような、配列ライブラリーから抗体配列を選択することによってのいずれかで抗体分子を生成させるために使用される。
【０１０９】
動物のための免疫処置プロトコールは、当技術分野において周知である。適切な免疫応答を達成するために、抗原をリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、スクアレン、またはフロイントの完全／不完全アジュバントなどのアジュバントと結合することが必要なことがある。ダビガトランのような本発明に関連する抗原は、主に比較的小型の有機分子であって、動物に投与されたときに抗体の形成を刺激しないことがある有機分子である。したがって、抗原をハプテンとしての巨大分子に結合させることが必要なことがある。
【０１１０】
さらなる局面では、本発明は、医学に使用するための上記抗体分子に関する。
【０１１１】
さらなる局面では、本発明は、前記抗体分子および医薬担体を含む医薬組成物に関する。
【０１１２】
治療に使用するために、抗体分子は、動物またはヒトへの投与を容易にするために適切な医薬組成物に含まれる。抗体分子の典型的な製剤は、抗体分子を生理学的に許容されうる担体、賦形剤または安定化剤を混合することによって、凍結乾燥もしくはその他の方法で乾燥された製剤、あるいは水性溶液または水性もしくは非水性懸濁液の剤形に調製することができる。担体、賦形剤、改質剤（modifier）または安定化剤は、採用される薬用量および濃度で無毒である。それらには、リン酸、クエン酸、酢酸ならびに他の無機酸または有機酸およびそれらの塩などの緩衝系；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなどの保存料）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリンまたはデキストランを含めた単糖、二糖、オリゴ糖または多糖および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）もしくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテルもしくは糖エステルなどのイオン性もしくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。有機溶媒もエタノールまたはイソプロパノールなどの抗体製剤に含有されることがある。賦形剤は、また、放出改変または吸収改変機能を有することがある。
【０１１３】
一局面では、医薬組成物は、水性緩衝液中に１０〜２０mg/mlの濃度で抗体分子を含むか、またはそのような溶液から作られた凍結乾燥物を含む。
【０１１４】
好ましい適用様式は、注入または注射（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内）による非経口的であるが、吸入、経皮、鼻腔内、口腔、経口などの他の適用様式もまた適用可能なことがある。
【０１１５】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固治療の副作用、特に出血事象の治療または予防に使用するための上記抗体分子に関する。さらなる局面では、本発明は、抗凝固薬、特にダビガトランまたはダビガトランエテキシラートの過剰投与のリバースに使用するための上記抗体分子に関する。
【０１１６】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固薬、特にダビガトランまたはダビガトランエテキシラートの解毒剤として使用するための上記抗体分子に関する。
【０１１７】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固治療の副作用の治療または予防方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１１８】
さらなる局面では、本発明は、抗凝固治療における過剰投与事象の処置方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１１９】
投与されるべき抗体の「治療有効量」は、抗凝固治療の副作用を予防、改善、または治療するために必要な最小量、特に出血を止めるために有効な最小量である。これは、抗体分子の化学量論量で達成することができる。
【０１２０】
ダビガトランは、例えば、推奨用量で与えられた場合に２００nMの大きさの血漿中濃度に達することがある。分子量約５０kDの一価抗体分子が使用される場合、ボーラスとして静脈内に与えたとき例えば約１mg/kgの用量で中和に達することができる。別の態様では、ヒト患者に適用されたＦａｂ分子の用量は、適用１回あたり５０〜１０００mg、例えば１００、２００、５００、７５０、または１０００mgのことがある。状況に応じて、例えばダビガトランが患者に過剰投与されている場合、より高い用量、例えば適用１回あたり１２５０、１５００、１７５０または２０００mgを適用することさえ妥当なことがある。適切な用量は、投与される抗凝固薬の種類および用量；そのような投与から経過した時間、抗原分子の性質、患者の状態、ならびに他の要因に応じて異なることがある。熟練の専門家は、治療的に有効かつ安全な用量を確立するための方法を知っている。
【０１２１】
さらなる局面では、本発明は、ダビガトランおよび／またはダビガトランエテキシラートに対する結合親和性を有する抗体分子に関する。好ましくは、抗体分子は、例えば表面プラズモン共鳴分析（Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics. "Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.）または動力学排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）技法（Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions."  ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657）により決定されるとき、０．１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１００μM、より好ましくは１pM〜１μMの範囲のＫＤ値を有する親和性でダビガトランおよび／またはダビガトランエテキシラートに結合する。
【０１２２】
本発明の抗体分子を、また、分析および診断手順のために使用して、例えば血漿、血清、または他の体液などの試料中の抗原濃度を決定することができる。例えば、抗原分子は、実施例に記載されたような酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用することができる。したがって、さらなる局面では、本発明は、本明細書記載の抗体分子を含む分析キットおよび診断キットならびにそれぞれの分析方法および診断方法に関する。
【０１２３】
さらなる局面では、本発明は、前記請求項のいずれか一項記載の抗体分子を製造する方法であって、
（ａ）発現制御配列と機能的に関連して該抗体分子をコードする一つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供すること、
（ｂ）該宿主細胞を培養すること、および
（ｃ）細胞培養物から抗体分子を回収すること
を含む方法に関する。
【０１２４】
本発明は、さらに、経口抗凝固薬、特に直接トロンビン阻害剤の中和に有用な材料が入っている製品およびキットを提供する。製品は、ラベル付きの容器を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、および試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属、プラスチックまたはその組み合わせなどの多様な材料から形成されていることがある。容器は、本明細書記載の抗体またはダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含む医薬組成物を収容する。医薬組成物中の活性薬剤は、特定の抗体またはダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩である。抗体の容器上のラベルは、その医薬組成物がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を中和または部分的に中和するためにin vivoで使用されることを表示している。
【０１２５】
本発明のキットは、一つ以上の上記容器を含む。そのキットは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用法を掲載した添付文書を含めた、商業的および利用者の観点から望ましい他の材料を包含することができる。
【０１２６】
本発明の一態様では、キットは、本明細書記載の任意の一つの抗体である抗体またはその医薬組成物を含む。例えば、キットは、（１）本明細書記載の任意の一つの抗体またはその医薬組成物、（２）容器および（３）ラベルを含むことができる。
【０１２７】
別の態様では、キットは、本明細書記載の任意の一つの抗体である抗体またはその医薬組成物、およびダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含む。ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の形態は、固体、液体またはゲルの形態のことがある。好ましい態様では、ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容されうる塩は、メシラート塩である。なお別の好ましい態様では、投薬ユニットあたりのダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の量は、約５０mg〜約４００mg、約７５mg〜約３００mg、約７５mg〜１５０mg、または約１１０mg〜約１５０mgの間であって、１日１回（ＱＤ）または１日２回（ＢＩＤ）与えられる。例えば、キットは、（１）本明細書記載の任意の一つの抗体またはその医薬組成物、（２）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の医薬組成物、（３）容器および（４）ラベルを含むことがある。
【０１２８】
代替の態様では、キットは、（１）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩を含む第１の医薬組成物、（２）本明細書記載の抗体の任意の一つまたはその組み合わせを含む第２の医薬組成物、（３）患者に該第１および第２の医薬組成物を別々に投与するための説明書を含み、ここで、該第１および第２の医薬組成物は、別々の容器に入っており、該第２の医薬組成物は、ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの中和または部分中和を必要とする患者に投与される。本発明は、また、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されている患者においてダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和または部分中和するための診断方法であって、本明細書記載の抗体の任意の一つ、その組み合わせまたはその医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的には、本発明は、患者においてダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和または部分中和するための方法であって、（ａ）患者がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩で処置されていたこと、およびその患者によって取り込まれた量を確認するステップ；（ｂ）ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドが試験またはアッセイの結果の正確な読み出しを妨害するであろう試験またはアッセイを行う前に、本明細書記載の抗体の任意の一つまたはその組み合わせでダビガトランまたは１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和するステップ；（ｃ）ダビガトランもダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドも存在しないときの血餅形成レベルを決定するために、患者から採取された試料に凝固または血液凝固の試験またはアッセイを行うステップ；ならびに（ｄ）患者における血餅形成と分解の間に適切なバランスを達成するために、患者に投与されるダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグまたはその薬学的に許容されうる塩の量を調整するステップを含む方法を提供する。ダビガトランまたはダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドに対する抗体のモル比は、０．１〜１００の間、好ましくは０．１〜１０の間のモル比である。試験またはアッセイの結果の正確な読み出しは、フィブリノーゲンレベル、活性化プロテインＣ抵抗性または関連試験の正確な読み出しのことがある。
【０１２９】
実施例
Ｉ．  ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造
ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造のために、２種の異なるハプテンおよびハプテンと担体タンパク質（ＢＳＡ）の異なるモル投入量比で、３種の異なる免疫原を製造した。
【０１３０】
スクリーニングのために、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲートを製造し、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。
【０１３１】
ポリクローナル抗体のさらなる精製は、プロテインＡセファロース ＦＦを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０１３２】
１．  材料および方法
【表２】
2014210794.tif 000007
【０１３３】
１．１  免疫原およびトレーサーを合成するために使用されたハプテン
【表３】
2014210794.tif 000008
【０１３４】
【表４】
2014210794.tif 000009
【０１３５】
１．２  ハプテンの合成
ハプテンである、ハプテン１およびハプテン２を以下のように合成した：
ハプテン１  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（４−アミノ−ブチルカルバモイル）−エチル］−フェニル−アミド
【化５】
2014210794.tif 000010
【０１３６】
１ａ  ３−［（４−メチルアミノ−３−ニトロ−ベンゾイル）−フェニル−アミノ］−プロピオン酸メチルエステル
【化６】
2014210794.tif 000011
４−メチルアミノ−３−ニトロ−安息香酸クロリド（２３．３mmol）および３−フェニル−アミノ−プロピオン酸メチルエステル（２３．３mmol）の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８０mL中の溶液に、トリエチルアミン（５０．２mmol）を撹拌しながら室温で滴下により加えた。３時間後に反応混合物を蒸発乾固し、残りの固体を水で粉砕し、固体生成物を濾過により単離した。
収率：９９％
Ｃ１８Ｈ１９Ｎ３Ｏ５（３５７．３６）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール  １９：１）：Ｒｆ＝０．４８
【０１３７】
１ｂ  ３−［（３−アミノ−４−メチルアミノ−ベンゾイル）−フェニル−アミノ］−プロピオン酸メチルエステル
【化７】
2014210794.tif 000012
触媒としてＰｄ（炭上に１０％）を用いてエタノール中で室温で水素化することによって生成物１ａのニトロ基を還元した。
収率：９９％
Ｃ１８Ｈ２１Ｎ３Ｏ３（３２７．３８）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール  ９：１）：Ｒｆ＝０．２３
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３２８
【０１３８】
１ｃ  ３−（｛３−［２−（４−シアノ−フェニルアミノ）−アセチルアミノ］−４−メチルアミノ−ベンゾイル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸メチルエステル
【化８】
2014210794.tif 000013
生成物１ｂ（２３．２mmol）およびＮ−（４−シアノ−フェニル）−グリシン（２３．２mmol）を無水ＴＨＦ中で室温にてＣＤＩ（２３．２mmol）でカップリングさせた。反応の完了後に、その混合物を蒸発乾固させ、粗生成物をさらに精製せずに使用した。
収率：９７％
Ｃ２７Ｈ２７Ｎ５Ｏ４（４８５．５４）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４８６
【０１３９】
１ｄ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸メチルエステル
【化９】
2014210794.tif 000014
生成物１ｃ（２２．６mmol）の濃酢酸１００mL中の溶液を１時間加熱還流した。次に、その溶液を蒸発乾固し、残った固体を水で粉砕し、撹拌しながらｐＨを約８〜９に調整した。酢酸エチルで抽出することによって粗生成物を単離し、シリカゲルを用いたクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／エタノール  １：１）によって精製した。
収率：５８％
Ｃ２７Ｈ２５Ｎ５Ｏ３（４６７．５２）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール  ９：１）：Ｒｆ＝０．７１
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６８
【０１４０】
１ｅ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸
【化１０】
2014210794.tif 000015
生成物１ｄ（１３．０mmol）の１００mLメタノール中の溶液に、水酸化ナトリウム（２０．０mmol）を添加した。その混合物を４０℃で２．５時間撹拌し、次に蒸発乾固した。残った固体を水１００mLと一緒に撹拌し、そして濃酢酸でｐＨを約６に調整した。沈殿した生成物を濾過によって単離し、水で洗浄し、６０℃で乾燥させた。
収率：８８％
Ｃ２６Ｈ２３Ｎ５Ｏ３（４５３．４９）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール  ９：１）：Ｒｆ＝０．３３
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４５４
【０１４１】
１ｆ  ｛４−［３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオニルアミノ］−ブチル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル
【化１１】
2014210794.tif 000016
生成物１ｅ（５．２３mmol）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、５．２３mmol）およびＮ−メチル−モルホリン（５．２３mmol）のＤＭＦ ２０mL中の溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、（４−アミノ−ブチル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５．２３mmol）を添加し、その混合物を室温で新たに２４時間撹拌した。次に、その混合物を水（１００mL）で希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離した。
収率：９２％
Ｃ３５Ｈ４１Ｎ７Ｏ４（６２３．７５）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール  ９：１）：Ｒｆ＝０．５１
【０１４２】
１ｇ  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（４−アミノ−ブチルカルバモイル）−エチル］−フェニル−アミド
【化１２】
2014210794.tif 000017
生成物１ｆ（４．８１mmol）をＨＣｌの飽和エタノール溶液（２５０mL）に溶解させ、その混合物を室温で一晩撹拌し、次に３０℃で蒸発乾固した。残った原材料を無水エタノール２００mLに溶解させ、次に炭酸アンモニウム（４８．１mmol）を添加し、その混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒の蒸発後に、残った原材料をエタノール約５mLと一緒に摩砕し、不溶性物質を濾過によって分離し、溶媒を３０℃で蒸発させた。次に、生成物を水３０mLに溶解させ、溶液を約２ｇの炭と一緒に撹拌し、濾過し、蒸発乾固した。
収率：９０％
Ｃ３０Ｈ３６Ｎ８Ｏ２（５４０．６７）
ＴＬＣ（逆相ＲＰ−８；メタノール／５％ＮａＣｌ水溶液  ９：１）：Ｒｆ＝０．７９
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４１
［Ｍ＋Ｃｌ］−＝５７５／７
【０１４３】
ハプテン２  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（２−アミノ−エチルカルバモイル）−エチル］−ピリジン−２−イル−アミド
【化１３】
2014210794.tif 000018
【０１４４】
２ａ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオン酸
【化１４】
2014210794.tif 000019
水酸化ナトリウム（５０．０mmol）のエタノール５００mLおよび水５０mL中の溶液に、３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル（４１．４mmol）を添加した。その混合物を室温で３時間撹拌し、次にエタノール約３５０mLを留出させ、水約１００mLを添加し、ｐＨを６に調整した。次にジエチルエーテル（５０mL）を添加し、その混合物を一晩撹拌した。生成物を濾過により単離し、さらに精製せずに使用した。
収率：７８％
Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６Ｏ３（４５４．４８）
【０１４５】
２ｂ  ｛２−［３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオニルアミノ］−エチル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル
【化１５】
2014210794.tif 000020
生成物２ａ（２．２０mmol）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、２．２０mmol）およびＮ−メチル−モルホリン（２．２０mmol）の無水テトラヒドロフラン（１００mL）中の溶液を室温で１５分間撹拌した。次に（２−アミノ−エチル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２．２０mmol）を添加し、そしてその混合物を室温で新たに２４時間撹拌した。次にその混合物を水４０mLで希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離し、クロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン／メタノール  １５：１）によって精製した。
収率：６１％
Ｃ３２Ｈ３６Ｎ８Ｏ４（５９６．６８）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５９７
［Ｍ＋Ｈ］−＝５９５
【０１４６】
２ｃ  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（２−アミノ−エチルカルバモイル）−エチル］−ピリジン−２−イル−アミド
【化１６】
2014210794.tif 000021
生成物２ｂ（１．３４mmol）をＨＣｌの飽和無水エタノール溶液（３０mL）に添加した。その溶液を室温で５時間撹拌し、次に３０℃で蒸発乾固した。エタノール（３０mL）および炭酸アンモニウム（１３．０mmol）を添加し、そしてその混合物を室温で一晩撹拌した。次に溶媒を蒸発させ、無機塩からの生成物を分離するために残った物質をジクロロメタン／メタノール（３０：１）混合物約４mLで５回粉砕し、濾過し、蒸発させた。
収率：２７％
Ｃ２７Ｈ３１Ｎ９Ｏ２（５１３．６１）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｃｌ］−＝５４８／５０
［Ｍ＋ＨＣｌ＋Ｃｌ］−＝５８４／６
［Ｍ＋Ｈ］＋＝５１４
【０１４７】
２．  化学物質
２．１  試薬合成用の化学物質
【表５】
2014210794.tif 000022
【０１４８】
２．２  ＥＬＩＳＡ用化学物質
【表６】
2014210794.tif 000023
【０１４９】
２．３  ＥＬＩＳＡ用緩衝液
【表７】
2014210794.tif 000024
【０１５０】
３．  免疫原の合成
ウサギの免疫系を刺激してダビガトランに対するポリクローナル抗体を生成するために、カップリング試薬として１，４−ベンゾキノンまたは１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を使用して、ハプテンであるハプテン１およびハプテン２を担体タンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングさせることによって、３種の免疫原（ロット番号ＧＬ２５６、ＧＬ２５８、およびＧＬ２６２）を合成した。
【０１５１】
ＧＬ２５６の合成のために、２個の反応部位を有するホモ二官能性化合物として１，４−ベンゾキノンを使用した。まず、それは酸性ｐＨで２個の部位のうち一方のアミノ基だけと反応し、そして最小限のポリマー化で、アルカリ性ｐＨでもう一方の部位で反応する。ＧＬ２５８およびＧＬ２６２は、ハプテンに対する担体タンパク質の異なる投入量比で、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）をカップリング試薬として使用して合成した。
【０１５２】
３．１  ＧＬ２５６の合成
０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液８．５mL中の０．７５μMol ＢＳＡの溶液（ｐＨ＝４．５）に、０．４１６mMol １，４−ベンゾキノン（エタノール１．５mL中）を添加し、そして室温、暗中で１．５時間インキュベーションした。その後０．１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ２５カラムにその溶液を通過させ、過剰の１，４−ベンゾキノン（最終体積１２．５mL）を除去した。
【０１５３】
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝８．５）２mLに溶解された５２５μMolハプテンであるハプテン１の溶液に、撹拌しながら精製ＢＳＡ溶液２．５mL（０．１５μMol）をゆっくりと添加した。ＢＳＡ溶液を添加する間に、ｐＨを約８．０に調整した。ハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は、３５００：１であった。
【０１５４】
室温で一晩インキュベーション後に、免疫原を１リットルの蒸留水で６回透析した。薄層クロマトグラフィーは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残った非結合ハプテンのスポットを示さなかった。
【０１５５】
免疫原を小分けして−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清中のハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって決定したとおり、約１：１８であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２５６/mL  ０．７５mgであった。
【０１５６】
３．２  ＧＬ２５８の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６．３mL中の１５８μMolハプテン２の溶液を室温で調製した。１５８μMol １，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、そしてまず１０℃で４時間、そしてその後室温で３０分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、そしてそれは約２０〜２５％であった。次に、０．７５μMol ＢＳＡを０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３ ２mLに溶解させ、撹拌しながらＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１mLを滴下により加えた。ｐＨを約８．３に調整した。その後、撹拌しながらハプテン溶液（６．３mL）および０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３  ４mLをＢＳＡ溶液に滴下により加え、ｐＨを８．４に調整した。免疫原ＧＬ２５８についてハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は２１０：１であった。
【０１５７】
室温で一晩、撹拌条件下でインキュベーション後に、免疫原を１リットルの蒸留水で６回透析した。薄層クロマトグラフィーは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残った非結合ハプテンのスポットを示さなかった。
【０１５８】
免疫原を小分けにして−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清中のハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって決定したとき約１：５であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２５８/mL  ０．２８mgであった。
【０１５９】
３．３  ＧＬ２６２の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）８．７５mL中の２２５μMolハプテン２の溶液を室温で調製した。２２５μMol １，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、そして１０℃で４時間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、それは約２０〜２５％であった。
【０１６０】
次に０．４９μMol ＢＳＡを０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３２mLに溶解させ、撹拌しながらＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１mLを滴下により加えた。ｐＨを約８．２に調整した。その後、撹拌しながらハプテン溶液（８．７５mL）および０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３ ６mLをＢＳＡ溶液に滴下により加え、ｐＨを８．３に調整した。免疫原ＧＬ２６２についてハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は、４６０：１であった。
【０１６１】
室温で一晩、撹拌条件下でインキュベーション後に、免疫原を１リットルの蒸留水で６回透析した。薄層クロマトグラフィーは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残った非結合ハプテンのスポットを示さなかった。
【０１６２】
免疫原を小分けにして−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清中のハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって決定したとき約１：３２であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２６２/mL  ０．７１mgであった。
【０１６３】
４．  コンジュゲートの合成
４．１  ＧＬ２６１の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１．５mL中の３７．４μMolハプテン２の溶液を室温で調製した。３７．５μMol １，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、そしてまず１０℃で４時間、そしてその後室温で３０分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックし、それは約２０〜２５％であった。
【０１６４】
次に１．１２５μMol酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３ ０．４mLに溶解させ、撹拌しながらＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．２６７mLを滴下により加えた。ｐＨを約８．２に調整した。その後、撹拌しながらハプテン溶液（２２．５μMol）０．９mLおよび０．１３Ｍ ＮａＨＣＯ３ ０．５７mLをＨＲＰ溶液に滴下により加え、そしてｐＨを８．４に調整した。ＨＲＰコンジュゲートＧＬ２６１についてハプテンとＨＲＰのモル投入量比は、２０：１であった。
【０１６５】
室温で一晩、撹拌条件下でインキュベーション後に、ＨＲＰコンジュゲートを有機溶媒および過剰のハプテンからゲルクロマトグラフィーによって分離した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラムにその溶液を通過させた。最終濃度のハプテン−ＨＲＰコンジュゲート（トレーサー、５．６４mg/mL）は、ＢＳＡによりスパイクされ、濃度約１０mg/mLで得られ、凍結防止のために等体積のグリセリン、および細菌の成長を防止するためにチモールの結晶を加えた。トレーサー溶液をロット番号ＧＬ２６１とラベルして、小分けして−２０℃で保存した。
【０１６６】
ハプテンによるＨＲＰの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって決定したとき１：０．２であった。
【０１６７】
ＢＳＡでブロッキングされたマイクロタイタープレート中、基質としてｏ−フェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）および対照物質としてネイティブなＨＲＰを使用してトレーサーの比活性を測定した。希釈されたＨＲＰ標準、またはハプテン−ＨＲＰコンジュゲート及び基質溶液との混合物を暗中で、３０分間インキュベーションし、硫酸で停止させ、吸光度を４９０nmで測定した。残りの活性はネイティブなＨＲＰの９４％であって、グリセリン中でのコンジュゲート形成の比活性は６１１U/mLであった。
【０１６８】
トレーサーの特定の概要：
【０１６９】
【表８】
2014210794.tif 000025
【０１７０】
５  免疫処置および抗体の製造
５．１  ウサギの免疫処置
１２匹の雌チンチラウサギ（３月齢）を、１００μg免疫原ＧＬ２５６、ＧＬ２５８およびＧＬ２６２の、０．９％ ＮａＣｌ溶液０．５mLおよびフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）０．５mLのエマルションで免疫化した。何回かの追加免疫処置を翌月に続けた。３回目の免疫処置については、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）０．５mLを使用した。４箇所の皮下部位および４箇所の筋肉内部位に各免疫処置を行った。
【０１７１】
Ａ群  −  免疫原ＧＬ２５６
ウサギ１  ＃５０
ウサギ２  ＃５１
ウサギ３  ＃５２
ウサギ４  ＃５３
Ｂ群  −  免疫原ＧＬ２５８
ウサギ５  ＃５４
ウサギ６  ＃５５
ウサギ７  ＃５６
ウサギ８  ＃５７
Ｃ群  −  免疫原ＧＬ２６２
ウサギ９  ＃４６
ウサギ１０  ＃４７
ウサギ１１  ＃４８
ウサギ１２  ＃４９
【０１７２】
【表９】
2014210794.tif 000026
*ウサギ番号１〜１２を５回目の免疫処置の１０日後に完全に瀉血した。
キシラジン（Rompun（登録商標）, Bayer, Leverkusen, Germany)および塩酸ケタミン(Ketavet（登録商標）, Parke-Davis, Freiburg, Germany)での麻酔下で、頸動脈を介して瀉血を行った。
【０１７３】
５．２  ウサギ血清の分析
凝固したウサギ血液の遠心分離によって血清を調製した。硫酸アンモニウム沈殿およびセファデックスＧ２５カラム内に通過させる脱塩によってタンパク質画分を得た。
【０１７４】
ウサギ血清からの個別のタンパク質画分を標準ＥＬＩＳＡ法によって抗ダビガトラン力価についてスクリーニングした。
【０１７５】
スクリーニング−ＥＬＩＳＡ
【表１０】
2014210794.tif 000027
【０１７６】
５．３  ウサギ血清中の抗ダビガトラン抗体の検出
最後の３個の欄：値はダビガトランに関するものである。
【０１７７】
【表１１】
2014210794.tif 000028
2014210794.tif 000029
【０１７８】
採血２からの全ウサギのタンパク質画分のスクリーニング後に、ウサギ番号５（＃５４）が好ましいハプテンであるハプテン２で、最も高い力価の抗ダビガトラン抗体を有することが明らかとなった。さらに、低濃度の分析物（ダビガトラン）だけで抗体結合部位からトレーサーを置換させることが可能であった。
【０１７９】
最終の採血３のスクリーニングについて、使用された免疫原に関する情報が欠落しているので、低濃度の分析物（ダビガトラン）を用いた抗体結合部位からのトレーサーの置換を主な決定基準として使用した。したがって、ウサギ番号２、３および５をさらなる精製のために使用した。
【０１８０】
５．４  ポリクローナル抗体の精製
ウサギ番号５（＃５４）、採血番号２およびウサギ番号２、３および５採血番号３（最後の採血）の抗血清を硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿を４５００U/min、１０℃で３０分間遠心分離し、溶液から分離し、トリス緩衝液中に再溶解させた。この手順を繰り返した。プロテインＡセファロースＦＦを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってさらなる精製を行った。カラム緩衝液は０．０１Ｍトリス（ｐＨ＝７．５）であり、そして０．１Ｍグリシン（ｐＨ＝３．０）を溶離のために使用した。ウサギＩｇＧを含有する画分を合わせた。タンパク質濃度は、２８０nmでのＵＶ分光法によって決定した。
【０１８１】
抗体の特定の概要：
【表１２】
2014210794.tif 000030
【０１８２】
ＩＩ．  ダビガトランの中和
２系列の実験を行って、ダビガトラン抗凝固活性に対する抗体のin vitro作用を示した。４種のポリクローナル抗体を実験室に受け入れ、ヒト血漿でさらに試験した。これを機能的アッセイであるトロンビン凝固時間で試験した。
【０１８３】
アッセイの説明：
簡潔には、３．１３％クエン酸ナトリウムへ全血を入れて、ヒト血漿を得る。次に、これを遠心分離して無血小板血漿を得て、そして別個のチューブに移し、アッセイの日に必要とされるまで凍結する。アッセイの日に血漿を３７℃で解凍する。
【０１８４】
トロンビン凝固時間は以下のように行う。最初に、提供された緩衝液（Dade Behring Test kit）中に、製造業者の説明書通りにトロンビンを希釈し（３IU/mLトロンビン）、３７℃に予熱する。それは、調製してから２時間以内に使用する。全てのアッセイを市販のＣＬ４凝固測定機（Behnk Electronics, Norderstadt, Germany）で行った。磁気スターラーの入った、提供されたキュベットに血漿５０μLをピペットで入れ、ＣＬ４機で３７℃に予熱されたウェルの中で２分間撹拌させる。この時点でトロンビン溶液１００μLを添加し、血漿試料が凝固するために必要な時間をＣＬ４によって自動的に記録する。提供されたキュベット中の血漿に入れてダビガトランを５分間予備インキュベーションしてからトロンビンを添加し、測定を開始する。抗体も試験する場合（原液５０μLまで）、３７℃でさらに５分間インキュベーションしてから凝固を開始する（すなわちダビガトランと一緒に合計１０分間インキュベーション、抗体と一緒に合計５分間インキュベーション、次にトロンビンで凝固を開始）。
【０１８５】
最初に、ヒト血漿に漸増する濃度のダビガトランを添加し、トロンビンを添加後に凝固までの時間を測定することによって、ダビガトランの標準曲線を作成した（図１）。漸増する濃度のダビガトランと一緒にトロンビン凝固時間の濃度依存的増加があった。
【０１８６】
最初のセットの中和実験について、臨床的に関連する濃度である２００nMのダビガトランを中和のために全血漿試料に添加した。４個の抗体調製物は、全て、ダビガトランを含有する血漿での凝固時間を短縮することができた（図２）。中和度は、各抗体調製物中のタンパク質濃度に関連した。次に、最も高い濃度を有する抗体溶液（Ｄ）を系列希釈し、別々の実験セットで２００nMダビガトランの抗凝固活性を中和する能力について試験した。図３から、抗体濃度が増加するとともに、ダビガトラン誘導抗凝固活性の濃度依存的阻害があった。加えて、非特異的ウサギポリクローナル抗体（青色四角）をダビガトラン含有血漿に添加した場合、それは、抗凝固活性を中和する能力を有さなかった。濃度依存性および非特異的抗体の中和欠如は、抗体による抗血液凝固のリバースがダビガトランに特異的であることを示している。
【０１８７】
しかし、これらの濃度のダビガトランは臨床的に意義があるものであって、出血または過剰投与は、おそらくより高い濃度で起こるものである。したがって、抗体が、図１の標準曲線における最も高い濃度のダビガトラン（５００nM）の抗凝固活性を阻害する能力も試験した。図４に、抗体Ｄが高濃度のダビガトランも阻害することができたことを図示する。
【０１８８】
ＩＩＩ．  モノクローナル抗ダビガトラン抗体の製造および特徴づけ
１．  モノクローナル抗ダビガトラン抗体およびＦａｂの製造
ヘモシアニンおよび免疫グロブリンなどの担体タンパク質にコンジュゲーションしたハプテン１（実施例１．１参照）をマウスに免疫処置し、標準的な手順によりハイブリドーマを発生させた。培養上清から精製されたモノクローナル抗体は、ダビガトラン−タンパク質コンジュゲートに結合し、そしてこの結合を溶液中のダビガトランと１〜１０nMの範囲の濃度の最大半値阻害で競合することができた。モノクローナル抗体のパパイン切断に続く、プロテインＡによるＦｃドメインの除去によってＦａｂを生成させた。
【０１８９】
マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をクローニングし、標準法を用いて配列決定した。抗体の質量分析およびＮ−末端配列決定によるタンパク質分析によって配列を確認した。特異的マウス可変領域およびヒトＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体をコードするＤＮＡ構築物を生成させ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からタンパク質を発現させ、それを精製した。
【０１９０】
２．  モノクローナル抗ダビガトラン抗体およびＦａｂの特徴づけ
３種のモノクローナル抗体クローンの可変ドメイン配列を図５および６に示す。クローン１３の可変ドメインのアミノ酸配列を図５（ＤＢＧ １３ ＶＨ、重鎖、配列番号：１６）および図６（ＤＢＧ １３ ＶＫ、軽鎖、配列番号：１７）に示す。クローン１４の可変ドメインのアミノ酸配列を図５（ＤＢＧ １４ ＶＨ、重鎖、配列番号：１８）および図６（ＤＢＧ １４ ＶＫ、軽鎖、配列番号：１９）に示す。クローン２２の可変ドメインのアミノ酸配列を図５（ＤＢＧ ２２ ＶＨ、重鎖、配列番号：２０）および図６（ＤＢＧ ２２ ＶＫ、軽鎖、配列番号：２１）に示す。
【０１９１】
マウスモノクローナル抗体クローン２２が、実施例ＩＩに概要されたトロンビン凝固時間アッセイにおいてヒト血漿中のダビガトランの抗凝固活性を中和する能力について、試験した。その抗体は、ヒト血漿中のトロンビン依存性凝固のダビガトラン介在性延長を用量依存的に完全にリバースした（図７）。その抗体は、また、ヒト全血中のダビガトランの機能を効果的に阻害した。この抗体から生成されたＦａｂは、ヒト血漿におけるダビガトラン活性を遮断したが、このことは、一価の抗原結合ドメインが化合物の抗凝固活性を中和することができることを示している（図８）。
【０１９２】
ヒトでのダビガトランの主要代謝経路は、カルボン酸部分のグルクロン酸抱合による。ダビガトランアシルグルクロニドは、薬理学的に活性であることが示されている（Ebner et al., Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75）。マウスモノクローナル抗体クローン２２がこれらの代謝物を中和できるかどうかを試験するために、ダビガトランで処置されたアカゲザルの尿からダビガトランアシルグルクロニドを精製し、トロンビン凝固時間アッセイで評価した。抗体は、ヒト血漿におけるトロンビン依存性凝固のダビガトランアシルグルクロニド介在性延長を、ダビガトランで見られたものと類似の効力で用量依存的にリバースした（図９）。したがって、抗体は、ヒトで見られるダビガトラン代謝物の抗凝固活性の遮断に有効である。
【０１９３】
Ｆａｂと、クローン２２、１３および１４の可変ドメインならびにヒト免疫グロブリン定常領域（軽鎖定常領域：配列番号：４４；重鎖定常領域：配列番号：４５）を含むマウス−ヒトキメラ抗体との親和性は、Kinexa技法を用いて決定した。平衡に到達するまで様々な濃度のダビガトランで、一定濃度のＦａｂまたはキメラ抗体をインキュベーションした。このインキュベーションの後に、ビオチン−コンジュゲーション型ダビガトランアナログとカップリングされたニュートラアビジンビーズ上に抗体を捕捉することによって、遊離抗体の濃度を決定した。捕捉されたＦａｂを、ＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて検出した。捕捉されたキメラ抗体を、Ｃｙ５とコンジュゲーションされた抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。解離定数は１：１結合モデルを用いて計算した。これらの実験からの結果を下記表に概要する。
【０１９４】
抗ダビガトラン抗体の親和性
【表１３】
2014210794.tif 000031
【０１９５】
Ｆａｂとキメラ抗体の両方が高親和性でダビガトランと結合する。
【０１９６】
３．  ヒト化モノクローナル抗ダビガトラン抗体およびＦａｂの生成
人間に投与後の潜在的免疫原性を減少させるために、マウスモノクローナル抗体を「ヒト化」した。マウス先導物のために、フレームワークの相同性、ＣＤＲの構造、保存されたカノニカル残基、保存された界面充填残基および他のパラメーターに基づきヒトフレームワーク配列を選択した。これらのフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の特異的置換は、結合親和性および／または安定性を含めた抗体の性能の様々な局面を、ヒト生殖細胞系フレームワーク領域へのＣＤＲまたはＨＶＬの「直接スワップ」によって形成されたヒト化抗体において実証されたものよりも改善することができる。キメラ親Ｆａｂに比べて、より良いまたは同等の結合と改善された発現とを示したＦａｂを、さらなる特徴づけのために選択した。ヒト化Ｆａｂの可変ドメインのアミノ酸配列を、図５（Ｅｎｇ ＶＨ １４、配列番号：２２；ＥＮＧ ＶＨ １５、配列番号：２４；およびＥＮＧ ＶＨ ３１、配列番号：２６）および図６（Ｅｎｇ ＶＫ １１、配列番号：２３；ＥＮＧ ＶＫ １７、配列番号：２５；およびＥＮＧ ＶＫ １８、配列番号：２７）に示す。Ｅｎｇ ＶＨ １５およびＥｎｇ ＶＫ １８を含むＦａｂ（軽鎖：配列番号：３７；重鎖：配列番号：３６）をＣＨＯ細胞に直接発現させ、カッパー選択およびプロテインＧ樹脂を使用して精製した。
【０１９７】
Ｅｎｇ ＶＨ １５およびＥｎｇ ＶＫ １８を含むＦａｂもまた、ＩｇＧ１ＫＯ形式での完全長ＩｇＧ（軽鎖：配列番号：３５；重鎖：配列番号：４０）に変換した。ＩｇＧ１ＫＯ（エフェクター機能のノックアウト）は、ＦｃｇＲおよび補体の結合などのエフェクター機能を減少させる、Ｆｃ領域中の２個の突然変異、Ｌｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａを有する。ＩｇＧ形式は、文献に記載されている（例えばHezareh et al. (2001) Journal of Virology 75: 12161-12168参照）。ヒト化抗ダビガトラン抗体は、場合により、コンセンサス領域または生殖系フレームワーク領域に特異的アミノ酸置換を含む。１８／１５抗体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞に発現させ、精製した。インタクトな抗体のＬｙｓ−Ｃまたはパパイン切断のいずれかによってＦａｂフラグメントを生成させ、プロテインＡによりＦｃドメインを除去して精製した。
【０１９８】
４．  抗ダビガトランＦａｂの特徴づけ
インタクトな抗体のＬｙｓ−Ｃ切断によって生成された１８／１５ Ｆａｂフラグメントを、実施例ＩＩに概要されたトロンビン凝固時間アッセイにおいてそれがヒト血漿でのダビガトラン抗凝固活性を中和する能力について試験した。Ｆａｂは、ヒト血漿におけるトロンビン依存性凝固のダビガトラン介在性延長を２．６nMのＩＣ５０で用量依存的に完全にリバースした（図１０）。直接発現されたＦａｂフラグメントおよびインタクトな抗体のパパイン切断によって生成されたＦａｂフラグメントもまた、それぞれ２．６および２．７nMのＩＣ５０でダビガトランの抗凝固活性を中和した。
【０１９９】
インタクトな抗体のＬｙｓ−Ｃ切断によって生成された１８／１５ Ｆａｂおよび直接発現されたＦａｂの親和性を、ＳＰＲ技法を利用してBIAcore装置で決定した。Ｆａｂを漸増する濃度のダビガトランと一緒に室温で３０分間予備インキュベーションした。固定化ビオチン−コンジュゲーション型ダビガトランアナログをコーティングされたセンサーチップの上にその混合物を流し、遊離Ｆａｂの結合をモニターした。この溶液競合アッセイ設計を使用して、ダビガトランに対するＦａｂのＫＤ値をＬｙｓ−Ｃで生成されたＦａｂについて０．１６pM、直接発現されたＦａｂについて０．４５pMと決定した。
【０２００】
パパイン切断によって生成されたＦａｂを用いたin vivo実験
ラット（雄性Wistar、約３００ｇ）を、ペントバルビタールでボーラス（６０mg/kg i.p.）および維持麻酔のための連続注入（２０mg/kg/hr i.p.）として麻酔し、内部体温を維持するために３７℃の温熱パッド上に置いた。採血のために頸動脈を、物質投与のために右頸静脈を分離し、カニューレを挿入した。ダビガトランをボーラスとして開始し（０．３μM/kg）、続いて２０分間かけて注入し（０．１μM/kg/hr）、定常状態の血漿レベルを達成した。２０分後に、左頸静脈を介してＦａｂを等モル濃度または等モル濃度の半分のいずれかで単回ボーラスとしてｉ．ｖ．注射した。血液試料（３．１３％クエン酸ナトリウム中に１／１０希釈）をベースライン（−２０、−２min）で、そしてＦａｂ注射後に様々な間隔で３０分間採取する。
【０２０１】
ダビガトランの抗凝固作用を、トロンビン時間（ＴＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を含めた全血凝固時間として測定した。簡潔には、トロンビン時間は、３７℃に予熱されたウェルに全血５０μLを添加することによって凝固計で行う。濃度３．０U/mLのトロンビン（Siemens Healthcare, Marburg, Germany）を添加し（体積１００μL）、試料を凝固させるために必要な時間を測定する。凝固計で全血５０μLを３７℃に予熱し、ａＰＴＴ試薬（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）５０μLを３分間添加することによって全血ａＰＴＴを行う。０．０２５Ｍ予熱（３７℃）塩化カルシウム５０μLの添加によって凝固時間を開始する。次に、全血試料を凝固させるために必要な時間を記録する。
【０２０２】
ダビガトランと等しいモル用量での単回ｉ．ｖ．注射として与えられた１８／１５Ｆａｂ（軽鎖：配列番号：３７、重鎖Ｆｄフラグメント：配列番号：４１；ＣＨＯ細胞で発現された完全免疫グロブリンのパパイン切断によって製造）の結果を図１１および１２に示す。このモデルにおいて、ＴＴ（図１１）とａＰＴＴ（図１２）の両方として測定された、ダビガトラン抗凝固活性の迅速でほぼ即時の阻害があった。注射から１分以内で、ダビガトランの抗凝固活性は、完全に中和されてベースラインレベルに戻った。これは、ダビガトランの継続中のｉ．ｖ．連続注入にかかわらず、２０分よりも長く維持された。
【０２０３】
より低い用量である半分のモル用量のダビガトランが与えられた場合も、ＴＴ（図１３）とａＰＴＴ（図１４）の両方に初回減少があった。しかしこれは、ダビガトランの継続中の連続注入の条件下で、より高い用量ほど長くは維持されなかった。
【０２０４】
したがって、これらの結果から、この動物モデルにおいて抗ダビガトランＦａｂの単回ｉ．ｖ．投与後のダビガトラン抗凝固活性の、予測可能で、用量依存的で、非常に迅速な中和が実証される。
【図５】
2014210794.tif 000033
【図６】
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【図１】
2014210794.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014210794.tif 000041
【図１０】
2014210794.tif 000042
【図１１】
2014210794.tif 000043
【図１２】
2014210794.tif 000044
【図１３】
2014210794.tif 000045
【図１４】
2014210794.tif 000046
【配列表】
2014210794000001.app
【外国語明細書】
2014210794000001.pdf