(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のコラーゲンを含む運搬体と比較して、徐放作用及び細胞の導入効率が高い運搬体を提供する。【解決手段】細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体であり、運搬対象が、タンパク質、ペプチド、核酸、及び／又は低分子化合物である運搬体。前記細胞膜透過性ペプチドは、後記（１）〜（３）のいずれか１以上から選ばれた運搬体。（１）ＴＡＴ又はＴＡＴ誘導体、（２）ｒ８又はｒ８誘導体、（３）ＭＰＧ−８又はＭＰＧ−８誘導体；前記コラーゲン又はコラーゲン誘導体がアテロコラーゲンである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体。
【請求項２】
前記細胞膜透過性ペプチドは、以下のいずれか１以上から選ばれる請求項１に記載の運搬体。
（１）TAT又はTAT誘導体
（２）r8又はr8誘導体
（３）MPG-8又はMPG-8誘導体
【請求項３】
前記細胞膜透過性ペプチドは、TATである請求項１又は２に記載の運搬体。
【請求項４】
前記コラーゲン又はコラーゲン誘導体がアテロコラーゲンである請求項１〜３のいずれか１に記載の運搬体。
【請求項５】
前記運搬体がゲル形成能を有する請求項１〜４のいずれか１に記載の運搬体。
【請求項６】
前記運搬体がネットワーク形成能を有する請求項１〜５のいずれか１に記載の運搬体。
【請求項７】
前記運搬対象が、タンパク質、ペプチド、核酸、及び／又は低分子化合物である請求項１〜６のいずれか１に記載の運搬体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１に記載の運搬体が表面に塗布されている医療用具。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１に記載の運搬体が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１に記載の運搬体を含む薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望のタンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等を標的細胞へ導入するための運搬体、該運搬体を含む細胞培養器具、医療用具、薬剤、並びに該運搬体を使用した標的細胞の性質を変える方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
（コラーゲンを用いた運搬体）
コラーゲンは、薬剤の徐放担体として知られており（参照：特許文献１〜２、非特許文献１）、さらに、核酸を標的細胞に導入するためのキットも市販されている（参照：非特許文献２）。
【０００３】
（特許文献１）
特許文献１は、「アテロコラーゲン、核酸導入剤及び核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイ」を開示している。
しかし、該アレイは、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体とは異なり、リポソームが含まれていることが必須である。
【０００４】
（特許文献２）
特許文献２は、「アテロコラーゲンと、所望の核酸とを含む複合体粒子であって、核酸が１本鎖又は２本鎖であり、粒子の長径が１００μｍ以下である複合体粒子」を開示している。
該文献では、「我々は複合体が様々な形状をとる原因が、複合体を構成するコラーゲン又はコラーゲン誘導体と核酸との割合にあること、さらに複合体の形状が専ら核酸と複合体を形成することによって促進されるコラーゲン又はコラーゲン誘導体による会合体（線維）形成の進展に依存することを見出した。会合体の過形成は核酸導入には不適であるという本発明における知見に基づき、我々は、かかる複合体の形状が、混合するコラーゲン又はコラーゲン誘導体及び所望の核酸の濃度の他、コラーゲンの会合体形成に影響を与える環境因子である塩濃度、温度、ｐＨ、グルコース濃度を調整することにより制御できることを見出した」及び｛「コラーゲンの会合体形成を抑制する物質」とは、コラーゲンの会合体形成が主としてコラーゲン分子中の塩基性アミノ酸や酸性アミノ酸の荷電によって生じることを考慮し、これらの静電的相互作用を抑制する物質及びコラーゲン分子を規則正しく会合させない物質が挙げられる。前者としては塩類、アミノ酸類、尿素であり、後者としてはシュクロース等の糖類及びアルギニンが挙げられる。｝を開示している。該特許文献に開示の複合体粒子は、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体とは異なり、積極的に会合体（線維形成）を避けるために、アテロコラーゲンの粒子径を調整している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2006-6262
【特許文献２】特許4081436
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Res. 2004 May 15;64(10):3365-70
【非特許文献２】http://www.atelocollagen.com/atelogene/japanese/index.html/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、従来のコラーゲンを含む運搬体と比較して、徐放作用及び細胞の導入効率が高い運搬体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究した結果、細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体は、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は以下の通りである。
１．細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体。
２．前記細胞膜透過性ペプチドは、以下のいずれか１以上から選ばれる前項１に記載の運搬体。
（１）TAT又はTAT誘導体
（２）r8又はr8誘導体
（３）MPG-8又はMPG-8誘導体
３．前記細胞膜透過性ペプチドは、TATである前項１又は２に記載の運搬体。
４．前記コラーゲン又はコラーゲン誘導体がアテロコラーゲンである前項１〜３のいずれか１に記載の運搬体。
５．前記運搬体がゲル形成能を有する前項１〜４のいずれか１に記載の運搬体。
６．前記運搬体がネットワーク形成能を有する前項１〜５のいずれか１に記載の運搬体。
７．前記運搬対象が、タンパク質、ペプチド、核酸、及び／又は低分子化合物である前項１〜６のいずれか１に記載の運搬体。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の運搬体が表面に塗布されている医療用具。
９．前項１〜７のいずれか１に記載の運搬体が細胞培養面に塗布されている細胞培養器具。
１０．前項１〜７のいずれか１に記載の運搬体を含む薬剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体は、従来のコラーゲンを含む運搬体と比較して、下記の効果を有する。
（１）ゲル形成能が高いので高濃度の運搬対象を長時間保持することができる。
（２）ネットワーク形成能が高いので標的細胞周辺で運搬対象を局在させることによる細胞への標的効果が高い。
（３）ネットワークを標的細胞周辺特異的に形成できるので、標的細胞周辺以外での運搬対象の放出が少ない。
（４）運搬対象の標的細胞内導入効率が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの電気泳動の結果。
【図２】比旋光度及び変性温度の測定結果｛（a）比旋光度及び変性温度のグラフ、（b）比旋光度及び変性温度の数値化｝。
【図３】ゲル形成能の測定結果｛（a）ゲル形成時間のグラフ、（b）ゲル形成時間の数値化｝。
【図４】核酸の細胞内導入及びネットワーク形成の観察結果。
【図５】TAT-ACの細胞周辺特異的ネットワーク形成の観察結果。
【図６】細胞表面へのネットワーク形成能の比較結果。
【図７】運搬対象の標的細胞内導入効率の確認
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体）
本発明の「細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体（以後、「本発明の運搬体」と称する場合がある）」は、細胞膜透過性ペプチドが付加されたコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体である。
【００１３】
本発明の「運搬体」は、運搬対象を細胞｛標的細胞（運搬対象を導入する細胞）｝に運搬する作用を有する。さらに、本発明の運搬体は、単に運搬対象を細胞に運搬するだけでなく、徐放性作用、標的細胞への長時間滞留作用、標的細胞周辺特異的な局在作用、を有する。
【００１４】
（細胞膜透過性ペプチド）
本発明の「細胞膜透過性ペプチド」は、細胞内に移行する性質、より詳しくは、細胞膜を透過する性質、さらに詳しくは、細胞膜又は核膜を透過して細胞質内又は核内に透過する性質を有するペプチドである。該ペプチドのアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば以下を例示することができる。
（１）TAT（GRKKRRQRRRPQ：配列番号１）
（２）r8｛rrrrrrrr (D体-R)：配列番号２｝
（３）MPG-8（βAFLGWLGAWGTMGWSPKKKRK：配列番号３）
（４）SynB1（RGGRLSYSRRRFSTSTGR：配列番号４）
（５）SynB3（RRLSYSRRRF：配列番号５）
（６）PTD-4（PIRRRKKLRRLK：配列番号６）
（７）PTD-5（RRQRRTSKLMKR：配列番号７）
（８）FHV Coat-(35-49)（RRRRNRTRRNRRRVR：配列番号８）
（９）BMV Gag-(7-25) （KMTRAQRRAAARRNRWTAR：配列番号９）
（１０）HTLV-II Rex-(4-16)（TRRQRTRRARRNR：配列番号１０）
（１１）D-Tat（GRKKRRQRRRPPQ：配列番号１１）
（１２）R9-Tat（GRRRRRRRRRPPQ：配列番号１２）
（１３）Transportan（GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL chimera：配列番号１３）
（１４）MAP（KLALKLALKLALALKLA：配列番号１４）
（１５）SBP（MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV：配列番号１５）
（１６）FBP（GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV：配列番号１６）
（１７）上記のペプチドの誘導体
なお、上記細胞膜透過性ペプチドの好ましい例は、TAT、r8及び MPG-8である。
【００１５】
本発明の「細胞膜透過性ペプチドの誘導体」は、上記（１）〜（１６）のいずれか１の細胞膜透過性ペプチドの保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体であり、上記（１）〜（１６）のいずれか１の細胞膜透過性ペプチドと90〜99％以上の相同性を有しかつ該ペプチドと実質的同質の膜透過性作用を持つペプチドであり、又は上記（１）〜（１６）のいずれか１の細胞膜透過性ペプチドにおいて、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しておりかつ該ペプチドと実質的同質の膜透過性作用を持つペプチドである。
【００１６】
（コラーゲン又はコラーゲン誘導体）
本発明の「コラーゲン又はコラーゲン誘導体」とは、通常、医療分野、化粧品分野、工業分野及び食品分野で用いられているあらゆる「コラーゲン又はコラーゲン誘導体」を意味する。コラーゲンは、可溶性又は可溶化コラーゲンを用いることが好ましい。
可溶性コラーゲンとは、酸性又は中性の水や塩溶液に可溶であり、可溶化コラーゲンとは、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲンがあり、いずれも孔サイズが１マイクロメートルのメンブレンフィルターを通過できることが好ましい。また、コラーゲンは、いかなる動物種から抽出されたものでも用いることが出来るが、好ましくは脊椎動物から抽出されたもの、さらに好ましくは哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたもの、より好ましくは変性温度が高い哺乳類、鳥類から抽出されたコラーゲンが望ましい。コラーゲンのタイプもいかなるタイプのコラーゲンでも良いが、動物体内の存在量からＩ〜Ｖ型が好ましい。具体的には例えば、哺乳動物の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲンが挙げられ、より好ましくは例えば、仔牛の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲン、遺伝子工学的に生産されるＩ型コラーゲンなどが挙げられる。
また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲン又は遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましく、１０００残基あたりチロシン残基が３以下であるアテロコラーゲンがより好ましい。
なお、本発明の好ましいコラーゲン又はコラーゲン誘導体は、アテロコラーゲンである。
【００１７】
（本発明の運搬体の作製方法）
本発明の運搬体は、自体公知の方法により、膜透過性ペプチドを、コラーゲン又はコラーゲン誘導体に付加することにより作製できる。
なお、「付加」とは、膜透過性ペプチドを直接又は間接的にコラーゲン又はコラーゲン誘導体に結合させることを意味する。該結合方法の例示として、膜透過性ペプチドとコラーゲン又はコラーゲン誘導体を直接的に結合する方法、又は公知のリンカーを介して膜透過性ペプチドとコラーゲン又はコラーゲン誘導体を間接的に結合する方法があるが特に限定されない。
直接的に結合する方法としては、膜透過性ペプチドが、例えば塩基性アミノ酸の場合、アミノ基やグアニジノ基を適当な保護基で保護したのち、遊離のカルボキシル基をエステル化反応によってコラーゲンのアミノ基と直接結合させる。
間接的に結合する方法としては、膜透過性ペプチドとコラーゲンを、架橋剤を用いて結合させることが挙げられる。架橋剤としては、同一の反応基を有するホモバイファンクショナルな試薬を用いることも可能だが、好ましくは両端が別々の反応基を有するヘテロバイファンクショナルな試薬が望ましい、より好ましくは、コラーゲンは溶液状態で反応できる架橋試薬、例えば、
AMAS  （N-[α-Maleimidoacetoxy]succinimide ester）
BMPH  （N-[β-Maleimidopropionic acid] hydrazideoTFA）
BMPS  （N-[β-Maleimidopropyloxy] succinimide ester）
EDC  （1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimidehydrochloride）
EMCS  （N-[ε-Maleimidocaproyloxy] succinimide ester）
GMBS  （N-[γ-Maleimidobutyryloxy] succinimide ester）
MBS  （m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）
SBAP  （Succinimidyl 3-[bromoacetamido] propionate）
SIA  （N-Succinimidyl iodoacetate）
SIAB  （N-Succinimidyl[4-iodoacetyl]aminobenzoate）
SMCC  （Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate）
SM(PEG)n  （Succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-n-ethyleneglycol) ester）
Sulfo-EMCS  （N-[ε-Maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester）
Sulfo-GMBS  （N-[γ-Maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester）
等が挙げられる。
【００１８】
（本発明の運搬体の組成）
本発明の運搬体は、細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体に加えて、生体親和性材料、添加剤等も含むこともできる。
生体親和性材料としては、例えば、ゼラチン、フィブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、アガロース、ハイドロキシアパタイト、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、又はグリコール酸、乳酸もしくはアミノ酸の重合体もしくはこれらの共重合体、又はこれらの生体親和性材料の２種類以上の混合物等が挙げられる
添加剤としては、注射剤として用いる場合の等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、又は固形剤として用いる場合の賦形剤、崩壊剤、コーティング剤が挙げられる。具体的にはｐＨを６〜８に保つため、又は細胞と等張に保つために用いられる塩類や糖類が挙げられる。さらに、本発明の運搬体は、固体状であっても溶液状であってもよい。本発明の運搬体が固体状である場合、そのままの状態又は精製水、生理的食塩水、生体と等張な緩衝液等を用いて溶液状とし、所望の細胞に負荷する。
【００１９】
（本発明の運搬体の用途）
本発明の運搬体の用途は、特に限定されないが、薬剤、医療器具、細胞培養器具、標識剤等に使用することができる。
【００２０】
（本発明の運搬体の投与方法）
本発明の運搬体を生体（ヒトを含む動物、特に、ヒトを含む哺乳類）に投与する方法としては、経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収のいずれでも良く、好ましくは注射である。投与部位は疾患に応じて選択できるが、手術時に必要な部位に直接留置することもできる。例えば、本発明の運搬体を、静脈注射（点滴等）による全身投与、患部（癌細胞等）に注射することによる局所投与等が挙げられる。
【００２１】
（ゲル形成能）
本発明の運搬体は、下記実施例４の結果により、公知のコラーゲン（アテロコラーゲン）を含む運搬体と比較して、ゲル形成能が高い。本発明の運搬体の高いゲル形成能により、高濃度の運搬対象を長期保持することができる。
【００２２】
（ネットワーク形成能）
本発明の運搬体は、下記実施例５の結果により、公知のコラーゲン（アテロコラーゲン）を含む運搬体と比較して、ネットワーク形成能が高い。なお、「ネットワーク形成」とは、細胞存在下において細胞表面特異的に線維を形成（局在）し、かつその線維が網目様に形成することを、意味する。本発明の運搬体の高いネットワーク形成能により、標的細胞周辺で運搬対象を局在させることにより細胞への標的効果が高い。
さらに、本発明の運搬体は、下記実施例６の結果により、ネットワークを細胞周辺特異的に形成できるので、標的細胞周辺以外での運搬対象の放出が少ない。例えば、抗癌作用を有する物質を運搬する場合には、該物質が標的細胞周辺以外に拡散すれば正常な細胞、組織等に損害を与える。よって、本発明の運搬体は、公知のコラーゲンを含む運搬体と比較して、副作用を抑えることができる。
【００２３】
（運搬対象）
本発明における「運搬対象」は、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等である。
【００２４】
（タンパク質）
酵素や標的受容体に対するアゴニスト・アンタゴニスト、受容体そのもの、抗体等が挙げられるが、特に限定されるものでは無い。
（ペプチド）
低分子のタンパクであり酵素活性を有するものや機能性たんぱく質の一部分を合成したもの、標的受容体に対するアゴニスト・アンタゴニスト等が挙げられるが、特に限定されるものでは無い。
（低分子化合物）
低分子医薬である抗癌剤等の腫瘍細胞の死滅に特異的に効果を示すものや、細胞の生理的活性を亢進又は抑制させるものが挙げられるが、特に限定されるものでは無い。
（核酸）
本発明における「運搬対象である核酸」は、ポリヌクレオチドであってもオリゴヌクレオチドであってもよく、またDNAでもRNA分子でもあり得る。DNA分子の場合、プラスミドDNA、cDNA、ゲノミックDNA又は合成DNAであってもよい。またDNA及びRNAはいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得る。１本鎖の場合、コード鎖又は非コード鎖であり得る。「核酸」にはDNA誘導体又はRNA誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチオエート結合を有する核酸、又は酵素による分解を避ける為にインターヌクレオチドのリン酸部位、糖部分、塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。また、「核酸」にはアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスも含まれる。
核酸がプラスミドDNA又はウイルス等の遺伝子治療に用いられるベクターである場合、細胞内に導入されたとき、コードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモーター等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する、又は染色体への組み込みを可能とする要素を含有するベクター等である。
【００２５】
（医療用具又は細胞培養器具）
本発明は、本発明の運搬体が表面に塗布されている医療用具又は細胞培養器具も対象とする。
本発明の運搬体を固相表面に塗布し、そこへ標的細胞を接触させると、標的細胞の上から本発明の運搬体を滴加するよりも、運搬対象の導入効率が向上する。
本発明の医療用具とは、人工臓器、より具体的には、人工血管、血管を補強する医療用具ステント、粘着シート又は人工心臓が含まれる。
本発明の細胞培養器具とは、細胞培養実験に通常用いられているシャーレ、フラスコ、９６穴マイクロプレート、三次元培養担体等が挙げられる。
【００２６】
（標的細胞における遺伝子又はタンパク質の機能を調べる方法）
本発明の運搬体を使用すれば、遺伝子又はタンパク質の標的細胞内での機能を容易に調べることができる。例えば、細胞内に機能を調べたい遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを導入して発現させることによってその遺伝子の機能を調べる方法、又は機能を調べたい遺伝子の発現を抑制するsiRNA核酸を細胞内に導入して遺伝子の発現を抑制することによってその遺伝子の機能を調べる方法が有用である。
具体的な測定方法としては、機能を解明したい遺伝子を発現するプラスミドDNA、アデノウイルスベクター又は機能を解明したい遺伝子の発現を抑制するsiRNA核酸と本発明の運搬体を混合し、培養プレート固相上に塗布、整列配置する。塗布した運搬体を乾燥して固相上に固定した後、細胞を播種し、数日間プレート上で培養する。塗布された運搬体は、塗布された部分に接着した細胞に効率的に導入され、機能を調べたい遺伝子を発現又はその発現を長期間抑制する。数日後、細胞の増殖率、形態（表現型）や細胞内での遺伝子発現の状態（遺伝子発現レベル）、又は細胞から産生されたタンパク質の種類や量を調べることによって標的とした遺伝子の機能を明らかにすることができる。
【００２７】
（疾患を処置できる運搬対象をスクリーニングする方法）
本発明の運搬体を使用すれば、遺伝子疾患、癌、AIDS、慢性関節リウマチ、生活習慣病等の様々な疾患を処置し得る候補物質をスクリーニングすることができる。例えば、固相上に疾患の治療効果を調べたい候補物質（例、核酸）と本発明の運搬体を混合し、培養プレート固相上に塗布、整列配置する。塗布した運搬体を乾燥して固相上に固定した後、細胞を播種し、数日間プレート上で培養する。
核酸の効果は、細胞の表現型の変化、細胞死、細胞の増殖、細胞内での遺伝子発現のパターン、産生されるタンパク質の種類や量により解析することができる。
【００２８】
（運搬体を使用した標的細胞の性質を変える方法）
本発明の運搬体を使用すれば、標的細胞の性質を変えることができる。例えば、特定の細胞内受容体の活性を抑えるアンタゴニストを運搬対象として、標的細胞に投与すれば、該標的細胞は、該アンタゴニストが投与されていない標的細胞と比較して、受容体の活性を低くすることができる（標的細胞の性質を変えることができる）。
加えて、特定のmRNAを分解できるsiRNAを運搬対象として標的細胞に投与すれば、該mRNAを分解し、そのmRNAがコードする機能性タンパク質の発現量を低減させた細胞を得ることができる。
【００２９】
（標識剤）
本発明は、本発明の運搬体を含む標識剤も対象とする。例えば、標的細胞等を特異的に認識する物質（標的細胞に特異的に結合するペプチド、タンパク質等）に標識物質を結合させた運搬対象を生体に投与すれば、標的細胞を標識することができる。
【００３０】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したコラーゲン又はコラーゲン誘導体を含む運搬体の作製）
本実施例では、細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの作製及び該作製の確認をした。詳細は、以下の通りである。
【００３２】
１．細胞膜透過性ペプチドの合成
本実施例で使用する細胞膜透過性ペプチドは、下記表１に記載のTAT｛配列番号１、Human immunodeficiency virus 1（HIV-1）TAT由来のアミノ酸配列｝、r8（配列番号２、TAT同様膜透過性を持つといわれているアルギニンリッチペプチド）及びMPG-8（Ｎ末端側に膜貫通型シグナルを持つHIV protein gp41由来の疎水性モチーフのペプチドとC末端側には核移行型シグナルを持つSV40 large T antigen由来の親水性モチーフのペプチドが融合したアミノ酸配列）を使用した。
TATペプチドは、配列番号１に記載のポリペプチドのC末端にシステインを付加し、N末端には6-アミノカプロン酸を介し蛍光標識化合物5FAMを付加することにより、合成した。
r8ペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドのC末端にグリシン−システインを付加し、N末端には6-アミノカプロン酸を介し蛍光標識化合物5FAMを付加することにより、合成した。
MPG-8は、配列番号３に記載のポリペプチドのC末端にバリン−aca−リジン−5FAMシステインを付加し、N末端にはシステインを付加することにより、合成した。
なお、上記のこれらのペプチドは、ペプチド受託会社に依頼して合成した。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
２．細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの作製
下記実施例で使用した細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの作製方法を例示する。
【００３５】
（１）TAT付加アテロコラーゲン｛以後、「TAT-AC」と称する場合がある｝の作製
0.2％（2 mg/ml）アテロコラーゲン ｛0.1 Ｍリン酸緩衝液、pH8：(株)高研｝と10 mM EMCS（N-[ε-Maleimidocaproyloxy] succinimide ester）を混合し、4℃下で1時間撹拌した溶液に、上記で合成した5 mM TATペプチド（0.1 M リン酸緩衝液、pH6）を添加し、遮光状態で4℃にて3時間撹拌架橋反応した。この時、反応比がモル比換算でAC：EMCS： TAT=1：50：100となるように混合した。撹拌終了後、反応停止剤として、1 Ｍ システインをEMCSの20倍量添加し、遮光状態で4℃にて10分撹拌した。撹拌後、遠心分離にて不溶解物を除去し、上清は透析にて未反応物の除去及び1 mM HClへの溶媒置換を行い、濃度0.1%（1 mg/ml） のTAT-AC溶液を得た。
【００３６】
（２）r8付加アテロコラーゲン｛以後、「r8-AC」と称する場合がある｝の作製
0.1％（1 mg/ml）アテロコラーゲン （0.1 Ｍ リン酸緩衝液、pH7.4）と10 mM EMCSを混合し、4℃下で1時間撹拌した溶液に、上記で合成した5 mM r8（0.1 M リン酸緩衝液、pH6）を添加し、遮光状態で4℃にて20時間撹拌架橋反応した。この時、反応比がモル比換算でAC：EMCS： r8=1：50：60となるように混合した。撹拌終了後、反応停止剤として、1 M システインをEMCSの20倍量添加し、遮光状態で4℃にて10分撹拌した。その後、遠心分離にて不溶解物を除去し、上清は透析にて未反応物の除去及び1 mM HClへの溶媒置換を行い、濃度0.1%（1 mg/ml）のr8-AC溶液を得た。
【００３７】
（３）MPG-8付加アテロコラーゲン｛以後、「MPG-8-AC」と称する場合がある｝の作製
0.2％（2 mg/ml）アテロコラーゲン （0.1 Ｍ リン酸緩衝液、pH8）と10 mM EMCSを混合し、4℃下で1時間撹拌した溶液に、上記で合成した10 mM MPG-8（in DMSO）を添加し、遮光状態で4℃にて3時間撹拌架橋反応した。この時、反応比がモル比換算でAC：EMCS： MPG-8=1：50：100となるように混合した。撹拌終了後、反応停止剤として、1 M システインをEMCSの20倍量添加し、遮光状態で4℃にて10分撹拌した。遠心分離にて沈殿を回収し、その沈殿を5 mM HClで再溶解した。その後、透析にて未反応物の除去及び1 mM HClへの溶媒置換を行い、濃度0.1％（1 mg/ml）のMPG8-AC溶液を得た。
【００３８】
（４）細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの作製の確認
細胞膜透過性ペプチドが合成されているかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
上記で作製したTAT-AC、r8-AC及びMPG8-ACを、5% SDS-PAGE及び3.5% Native-PAGE電気泳動を行い、ペプチドに付加してある5FAMの蛍光を検出し、次いで、CBB染色にてアテロコラーゲンの染色を行った。
【００３９】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの作製の確認結果）
電気泳動の結果を図１に示す。
図１の電気泳動の結果から明らかなように、各ペプチドの蛍光部分とアテロコラーゲンの染色部分が一致していることから、アテロコラーゲンにペプチドが付加されていることを確認した。
【実施例２】
【００４０】
（アテロコラーゲンへの細胞膜透過性ペプチドの修飾量の確認）
本実施例では、アテロコラーゲンへの細胞膜透過性ペプチドの修飾量を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４１】
（アテロコラーゲンへの細胞膜透過性ペプチドの修飾量の算出方法）
実施例１で作製したTAT-AC及びr8-ACにおける細胞膜透過性ペプチドの修飾率をアミノ酸分析にて算出した。詳しくは、加水分解溶液（各0.1％溶液：12N HCl=1:1）をネジ口ガラス試験管に採取し、加水分解を行った（110℃で24時間。酸素共存下）。
加水分解後、蒸発乾固した後、0.1M HClで再溶解した。0.2 μmフィルターでろ過後、サンプルのアミノ酸分析（Agilent1100シリーズHPLCシステム）を行った。
ACをコントロールとして、内部補正をAla(A)とした場合のArg(R)増加量を基にして修飾率を算出した。
【００４２】
（アテロコラーゲンへの細胞膜透過性ペプチドの修飾率の算出結果）
アテロコラーゲンへのペプチド修飾率は、TAT-ACでは8.7％、r8-ACでは6.1％であった。
【実施例３】
【００４３】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの立体構造及び変性温度の確認）
細胞膜透過性ペプチドを付加したことによりアテロコラーゲンの立体構造及び変性温度が変化したかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４４】
（アテロコラーゲンの立体構造及び変性温度の確認方法）
実施例１で作製したTAT-AC、r8-AC及びMPG8-ACの比旋光度及び変性温度の測定を行った。詳しくは、氷冷下、各サンプル（AC、TAT-AC、r8-AC又はMPG8-AC）を1 mM HClで0.05%（0.5 mg/ml）に希釈し、撹拌（30分、4℃）後，遠心脱泡（2000 rpm，3 分，4℃）した。脱泡したサンプルをジャケット付セルに移し、旋光度を測定した。測定条件を以下に示す。
比旋光度は、下記式（１）より算出した。この際、5℃〜35℃の平均値を変性前の比旋光度とし、47℃〜50℃の平均値を変性後の比旋光度とした。また、比旋光度が50%になったときの温度を変性温度とした。
＜測定条件＞
旋光計：日本分光 DIP-1000、光源：ナトリウムＤ線（589 nm）、スリット径：3 mm
光路長：50 mm、積分時間：20秒、測定間隔：600秒、測定回数：36回
恒温槽：15〜50℃/6 hr（昇温速度1℃/10 min）
式（１）［α］Dt = 10000 δ／ｌｐ
α：旋光度、δ：偏光計で測定された回転角、ｌ：物質層の厚さ  (mm)
ｐ：溶液の濃度  (%)、t ：測定時の温度
【００４５】
（アテロコラーゲンの立体構造及び変性温度の確認結果）
アテロコラーゲンの立体構造及び変性温度の確認結果を図２に示す。コントロールであるACと比較して、各細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンで変性前後の比旋光度及び変性温度に大きな変化は見られず、ペプチド付加による立体構造の変化はなく、さらにコラーゲンの３重らせん構造及び変性温度の維持も確認した。
以上により、細胞膜透過性ペプチドの種類が、コラーゲンの立体構造及び変性温度に影響を与えないことを確認した。
【実施例４】
【００４６】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンのゲル形成能の確認）
本実施例では、細胞膜透過性ペプチドの付加によりアテロコラーゲンのゲル形成能が変化するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４７】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンのゲル形成能の測定）
実施例１で作製したTAT-AC及びr8-ACのゲル化能の測定を行った。詳しくは、氷冷下、アテロコラーゲン（1 mM HCl）、TAT-AC（1 mM HCl）又はr8-AC（1 mM HCl）を撹拌しながら、96wellプレートに分注し、溶液｛0.1％（1 mg/ml）AC / PBS、0.1％TAT-AC（1 mg/ml） / PBS、0.1％（1 mg/ml）r8-AC / PBS）を全量100μL／wellになるように溶液調整した。
その後、吸光マイクロプレートリーダー（TECAN、サンライズサーモRC-R）を用いて、ゲル化試験を行った（測定温度：37℃、測定波長：400 nm、測定間隔：30秒、測定時間：3時間）。測定後、各時間における測定値の平均（n=3）をゲル化試験結果とし、この際の最大勾配時間をゲル形成時間として算出した。
【００４８】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンのゲル形成能の測定結果）
細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンのゲル形成能の測定結果を図３に示す。TAT-AC及びr8-ACのゲル形成能は、それぞれ、コントロールであるACのゲル形成能と比較して、約2.6倍及び約1.5倍であった。なお、従来の知見では、コラーゲンにEMCS等を付加すれば、ゲル形成能が阻害されると考えられていた。しかし、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、従来の知見とはまったく異なり、ゲル形成能が向上した。
ゲル形成能が高いことは、「迅速にゲル化するので、運搬対象がゲルに封入されている割合が高く、該運搬対象を長期間保持できる」ことを意味する。一方、ゲル形成能が低いことは、「ゲル化が遅いので、ゲル形成時間内に一部抜けていき、該運搬対象を高濃度で保持できない」ことを意味する。
以上により、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、高濃度の運搬対象を長期間保持することができる。
【実施例５】
【００４９】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの核酸の細胞内導入効率及び細胞周辺へのネットワーク形成能の確認）
本実施例では、実施例１で合成したTAT-AC、r8-AC及びMPG8-ACが、ACと比較して、核酸の細胞内導入効率及び細胞周辺へのネットワーク形成能が向上するかどうかを確認した。  詳細は、以下の通りである。
【００５０】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの核酸の細胞内導入効率及び細胞周辺へのネットワーク形成能の確認方法）
0.1%（1 mg/ml） AC、0.1% （1 mg/ml）TAT-AC、0.1% （1 mg/ml）r8-AC又は0.1% （1 mg/ml）MPG8-ACに無血清培地Opti-MEM及びAlexa555 siRNA（AllStars Neg. siRNA AF 555[QIAGEN]、このsiRNA は既知の哺乳類の遺伝子とは相同性がなく、非特異的な影響を最小限に抑えたsiRNAであり、RNAi実験のネガティブコントロールに使用される試薬である。また、蛍光標識Alexa修飾されているため、siRNAの局在箇所が可視化出来る。）を混合し、4℃で20分静置後、トランスフェクション試薬（0.001％AC＋30 nM siRNA+Opti-MEM、0.001％TAT-AC＋30 nM siRNA+Opti-MEM、0.001％r8-AC＋30 nM siRNA+Opti-MEM、0.001％MPG8-AC＋30 nM siRNA+Opti-MEM）溶液を調製した。
Dual-luc N2A細胞（1ｘ104 cells/well）を96wellプレートに播種し、5% CO2、37℃条件下で20時間培養した。次に、培地を吸引し、PBSで洗浄後、該トランスフェクション試薬100 μLを各ウェルに添加し、24時間トランスフェクションした。
観察は、培地を吸引し、PBSで洗浄後、PBS 100 μL添加した状態で蛍光顕微鏡にて観察した。
共焦点顕微鏡観察の場合には、細胞（5×104 cells/ well）を、カバーガラスを挿入した24wellプレートに播種し、5% CO2、37℃条件下で20時間培養後、該トランスフェクション試薬500 μLを各ウェルに添加し、24時間トランスフェクションした。観察は、培地を吸引し、PBSで洗浄後、3.7%ホルマリンで固定、次いで、アクチン染色及びDAPI染色を行い、スライドガラスにマウントさせ、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss, LSM710）で観察した。
【００５１】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの核酸の細胞内導入効率及び細胞周辺へのネットワーク形成能の確認結果）
細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの核酸の細胞内導入効率及び細胞周辺へのネットワーク形成能の確認結果を図４に示す。
図４の画像が示すように、TAT-AC、r8-AC及びMPG8-ACは、細胞周辺にネットワークを形成した。なお、コントロールであるACでも細胞周辺にネットワークを形成するが、細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンと比べ、非常に弱いものであり、コントロールACの場合、0.001％のペプチド修飾アテロコラーゲンと同程度のネットワーク形成をするためには、0.005％濃度にする必要があった。すなわち、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、少なくとも５倍以上のネットワーク形成能があることを確認した。
さらに、運搬対象であるsiRNAが、該ネットワーク上に集積していることを確認した。すなわち、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、運搬対象との結合が強く、さらに標的細胞周辺の局所に運搬対象を滞留させることができることを確認した。
加えて、共焦点レーザー顕微鏡の観察結果より、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、運搬対象であるsiRNAの細胞内導入率が向上していることも確認した。
以上により、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、ネットワーク形成能の向上により、標的細胞周辺で運搬対象を長時間保持できるので、運搬対象の標的細胞への導入効率が著しく向上した。
【実施例６】
【００５２】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの標的細胞周辺特異的なネットワーク形成の確認）
本実施例では、実施例１で作製したTAT-ACが細胞周辺特異的にネットワークを形成するかどうか、及びTAT-ACのネットワーク形成能が、コントロールと比較して、向上しているかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５３】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの標的細胞周辺特異的なネットワーク形成の確認方法）
HCT116細胞（ヒト結腸腺癌細胞、1x104 cell/well）を、スフェロイド形成用96wellプレートに播種し、5% CO2、37℃条件下で7日間培養した。0.001％（0.01 mg/ml）TAT-AC in Opti-MEMを、プレートの細胞に添加し、5% CO2、37℃条件下で24時間培養後の様子を蛍光顕微鏡で観察し、コントロールである細胞なしの条件と比較した。
次に、0.1%（1 mg/ml） TAT-ACに無血清培地Opti-MEM及びAlexa555 siRNAを混合し、4℃で20分静置後、溶液（0.001％TAT-AC＋30 nM siRNA+Opti-MEM）を調製した。
該溶液を、上記同様に培養したスフェロイド形成HCT116細胞に添加し、5% CO2、37℃条件下で24時間トランスフェクションした。その後、培地を吸引除去し、PBSで洗浄後、カバーガラス上にのせ、蛍光顕微鏡にて、コントロールであるACとの違いを観察した。
【００５４】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの標的細胞周辺特異的なネットワーク形成の確認結果）
細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの標的細胞周辺特異的なネットワーク形成の確認結果を図５に示す。図５の画像から明らかなように、細胞存在下でのTAT-ACは、細胞なしのTAT-ACと比較して、細胞周辺に特異的にネットワークを形成していることを確認した。
さらに、細胞表面へのネットワーク形成能の比較結果を図６に示す。図６の画像から明らかなように、TAT-ACはネットワーク形成が見られた。一方、コントロールであるAC（TAT-ACと同濃度）は、ネットワーク形成が見られなかった。
以上により、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンは、標的細胞周辺特異的にネットワーク形成し、さらにネットワーク形成能が高いことを確認した。
【実施例７】
【００５５】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの運搬対象の標的細胞内導入効率の確認）
本実施例では、実施例１で作製したTAT-AC、r8-AC及びMPG8-ACが、ACと比較して、運搬対象の標的細胞内導入効率が向上するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５６】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの運搬対象の標的細胞内導入効率の確認方法）
0.1%（1 mg/ml） AC、0.1%（1 mg/ml）TAT-AC、0.1%（1 mg/ml）r8-AC又は0.1%（1 mg/ml）MPG-8に無血清培地Opti-MEM及びRRM2 siRNAを混合し、4℃で20分静置後、トランスフェクション試薬溶液（0.006％AC＋60 nM siRNA+Opti-MEM、0.006％TAT-AC＋60 nM siRNA+Opti-MEM、0.006％r8-AC＋60 nM siRNA+Opti-MEM、0.006％MPG-8＋60 nM siRNA+Opti-MEM）を調製した。なお、RRM2 siRNAはアポトーシスを誘導するsiRNAであり、細胞の増殖を抑制することが報告されている。
該トランスフェクション試薬（20 μL）を、96wellプレートに添加し、さらに4ｘ104 cells/mL Dual-luc N2A細胞（100 μL）を播種し、5% CO2、37℃条件下で3日間トランスフェクションした｛終濃度 0.001％AC（又は、0.001％TAT-AC、0.001％r8-AC又は0.001％MPG-8）、10 nM siRNA、4 ｘ104 cells/well｝。
該トランスフェクション後、培地を全量吸引し、110 μL Wst-8試薬（100 μL 培地 + 10 μL Cell Counting Kit-8）を添加し、5% CO2、37℃で1時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーにて吸光度（λ=450 nm）を測定した。該測定した値をACの細胞増殖抑制効果が１の場合の相対値に換算し、細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの細胞増殖抑制効果を比較した。
【００５７】
（細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの運搬対象の標的細胞内導入効率の確認結果）
細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンの運搬対象の標的細胞内導入効率の確認結果を図７に示す。
図７の結果から明らかなように、すべての細胞膜透過性ペプチドを付加したアテロコラーゲンが、ACと比較して、高い増殖抑制効果（高い運搬対象の標的細胞内導入効率）を示した。より詳しくは、TAT-AC、MPG8-AC及びr8-ACの運搬対象の標的細胞内導入効率は、それぞれ、ACの運搬対象の標的細胞内導入効率と比較して、26.5倍、11.9倍及び2.0倍であった。
【００５８】
（総論）
上記すべての実施例の結果より、本発明の運搬体は、従来の運搬体であるACと比較して、以下の効果を有することを確認した。
（１）ゲル形成能が高いので高濃度の運搬対象を長時間保持することができる。
（２）ネットワーク形成能が高いので標的細胞周辺で運搬対象を局在させることによる細胞への標的効果が高い。
（３）ネットワークを標的細胞周辺特異的に形成できるので、標的細胞周辺以外での運搬対象の放出が少ない。
（４）運搬対象の標的細胞内導入効率が高い。
【図１】
2014210730.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014210730.tif 000009
【配列表】
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