(57)【要約】【課題】細胞のコラーゲン産生量を増加させるコラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。【解決手段】細胞（Ｃ）のコラーゲン産生を促進する人工タンパク質（Ａ）からなるコラーゲン産生促進剤であって、人工タンパク質（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２であるコラーゲン産生促進剤。ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞（Ｃ）のコラーゲン産生を促進する人工タンパク質（Ａ）からなるコラーゲン産生促進剤であって、
人工タンパク質（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、
人工タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２であるコラーゲン産生促進剤。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【請求項２】
人工タンパク質（Ａ）が、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）とアミノ酸配列（Ｘ）及び下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：２〜１：２０である請求項２に記載のコラーゲン産生促進剤。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸の２０〜８０％がリシン及び／又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【請求項４】
人工タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（２）であるポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシンで置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）である請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項６】
人工タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）である請求項２〜５のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項７】
細胞（Ｃ）が線維芽細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜６のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤及び水を含有する細胞（Ｃ）のコラーゲン産生促進用培養液。
【請求項９】
コラーゲン産生促進用培養液中のコラーゲン産生促進剤の濃度が、コラーゲン産生促進用培養液の体積を基準として、０．０００００００００１〜１ｇ／Ｌである請求項８に記載のコラーゲン産生促進用培養液。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤及び水を含有する抗老化剤。
【請求項１１】
抗老化剤の重量を基準として、コラーゲン産生促進剤が０．００００００００１〜３５重量％、水が６５〜９９．９９９９９９９９９重量％である請求項１０に記載の抗老化剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤及び水を含むコラーゲン産生促進用ゲルであって、コラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、コラーゲン産生促進剤が５〜３５重量％、水が６５〜９５重量％であるコラーゲン産生促進用ゲル。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液を４〜８０℃にするコラーゲン産生促進用ゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生促進用培養液、抗老化剤、コラーゲン産生促進用ゲル、及び、コラーゲン産生用ゲルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は加齢により、弾力性が低下したり、水分含有量が減少したりすることで、表皮におけるシワの増加やたるみ（皮膚の老化）などを引き起こす。このような皮膚の老化は、他者に与える印象に大きく影響するため、中高年者から皮膚の老化の改善に対する要望は大きい。
近年の皮膚の老化現象に関する研究より、皮膚の老化の原因として、皮膚真皮線維芽細胞の機能低下、真皮の主要なマトリックス成分であるコラーゲンの変性や減少、保水作用に関与するヒアルロン酸などのムコ多糖類の減少等が明らかになっている。
コラーゲンは、真皮組織の水分を除く成分の７０％を占めるものである。皮膚の弾性は、コラーゲン線維が絡み合い網目構造を形成することで発揮される。したがって、皮膚弾性を維持するために、コラーゲンは非常に重要なタンパク質である。このコラーゲンを産生するのが真皮組織に存在する線維芽細胞である。線維芽細胞は、加齢による新陳代謝の低下により、コラーゲンを産生する機能が低下する。このことが、皮膚の老化を引き起こす大きな原因の一つになっている。
線維芽細胞の機能が低下することにより減少した皮膚内のコラーゲンの量を補うために、コラーゲンを皮下組織に注入する手法が美容的用途で広く使われている（特許文献１及び特許文献２）。しかしながら、注入したコラーゲンは、体内のコラゲナーゼによる分解を受けやすく、短期間の内に分解されるため、頻繁に注入する必要がある。
また、培養した線維芽細胞を直接皮下組織に注入する研究も行われている（特許文献３）。しかしながら、まだ研究段階であり、改善すべき問題が多く残っている。
これらのことから、真皮組織中の線維芽細胞等の細胞の機能を向上させて、コラーゲン産生量を増加させるコラーゲン産生促進用材料が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−２３６１５６号公報
【特許文献２】特開２０１２−７７０１９号公報
【特許文献３】特表２００１−５０９０６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、細胞のコラーゲン産生量を増加させる、コラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、細胞（Ｃ）のコラーゲン産生を促進する人工タンパク質（Ａ）からなるコラーゲン産生促進剤であって、人工タンパク質（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２であるコラーゲン産生促進剤である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、細胞のコラーゲン産生量を増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００８】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、細胞（Ｃ）のコラーゲン産生を促進する人工タンパク質（Ａ）からなるものであって、人工タンパク質（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２であるコラーゲン産生促進剤である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【０００９】
本発明においてポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列、（ＧＰＰ）ｄ配列、（ＧＡＰ）ｅ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｆ配列である。（なお、ｂ〜ｆは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
人工タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列、（ＧＰＰ）ｄ配列、（ＧＡＰ）ｅ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｆ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ｂ〜ｆが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｆが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
【００１０】
ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、コラーゲン産生促進の観点から、ＶＰＧＶＧ配列（１）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（２）が好ましい。つまり、コラーゲン産生促進の観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）として（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列が好ましい。
人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有する場合、ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、コラーゲン産生促進の観点から、（ＧＰＰ）ｄ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｆ配列からなる群より選ばれる２種以上の配列であることが好ましく、特に好ましくは（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｆ配列である。
【００１１】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、コラーゲン産生能を長期的に促進させる観点から、連続する個数は２〜５０個（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜５０）が好ましく、さらに好ましくは２〜３０個（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜３０）である。
【００１２】
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖である。具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部が、下記アミノ酸配列（Ｘ’）に置換され、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がＫ及び／又はＲで置換されたものとなったポリペプチド鎖である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の２０〜８０％がＫ及び／又はＲで置換されたアミノ酸配列。
【００１３】
アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数（Ｋ及び／又はＲで置換された数）は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜４個であり、次にさらに好ましくは１〜３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸が置換された割合は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、２０〜６０％が好ましい。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及びＧＫＧＫＰ配列（８）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００１４】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
なお、アミノ酸配列（Ｘ）がＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）である場合は、配列中にＫが存在するので、判断方法を以下のように変更する。
人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ＧＡＨＧＰＡＧＰαという配列が現れたときは（αはＧ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）、さらにαをＫに置きかえる。その結果、その配列がポリペプチド鎖（Ｙ）となる場合、アミノ酸を置きかえる前の配列は、ポリペプチド鎖（Ｙ’）と判断する。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の置換されるアミノ酸の数は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲンとの親和性の観点から、１〜７０個が好ましく、さらに好ましくは１〜３０個である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸の０．１〜５％がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であるが、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲン産生促進の観点から、０．１〜４％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜３％である。
【００１５】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である人工タンパク質である。人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）も同様である。
【００１６】
人工タンパク質（Ａ）は、人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を合計１〜１００個有するものであるが、コラーゲン産生促進の観点から、１〜８０個が好ましく、特に好ましくは１〜６０個である。
【００１７】
人工タンパク質（Ａ）において、同じアミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合している部分はポリペプチド鎖（Ｙ）１個とし、アミノ酸配列（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）１００ＧＡＧＡＧＳ（ＶＰＧＶＧ）２０である場合、ポリペプチド鎖（Ｙ）は（ＧＶＧＶＰ）１００と（ＶＰＧＶＧ）２０との２個である。また、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、アミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合しているものとなる部分をポリペプチド鎖（Ｙ’）１個とし、アミノ酸配列（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３ＧＡＧＡＧＳ（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３には、ポリペプチド鎖（Ｙ’）である（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３が２個ある。
【００１８】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であるが、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、ゲル化する観点から、０．３〜１．２が好ましく、さらに好ましくは０．４〜１．２であり、次にさらに好ましくは０．４５〜１．２であり、特に好ましくは０．６０〜１．２であり、最も好ましくは０．６０〜０．７５である。
人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は、人工タンパク質（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、人工タンパク質（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数（ＭＴ）を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ．ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学  上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６−３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：人工タンパク質（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、人工タンパク質（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）である場合、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．０である。
【００１９】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有していることが好ましい。人工タンパク質（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有していると、人工タンパク質（Ａ）が生体内でより分解されにくくなり、さらに長期的にコラーゲン産生促進作用を得ることができるので好ましい。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）は、生体内難分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が連続する数は、生体内難分解性の観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、次にさらに好ましくは３〜４０個であり、特に好ましくは４〜３０個である。
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｓ）を１つ以上有すればよいが、生体内難分解性の観点から、１〜２０個が好ましく、さらに好ましくは３〜１０個である。
【００２０】
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したアミノ酸配列であって、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）又はポリペプチド鎖（Ｓ）では無いアミノ酸配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
【００２１】
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したアミノ酸配列であって、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）又はポリペプチド鎖（Ｓ）では無いアミノ酸配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。
【００２２】
人工タンパク質（Ａ）は、上記末端アミノ酸配列（Ｔ）以外に、発現させた人工タンパク質（Ａ）の精製または検出を容易にするために、人工タンパク質（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２３】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、細胞との相互作用及びコラーゲン産生促進の観点から、人工タンパク質（Ａ）の分子質量を基準として、１０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０重量％である。
【００２４】
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
島津製作所社製ペプチドシーケンサ（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００  （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸の数
β：各アミノ酸の分子質量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数
【００２５】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、細胞（Ｃ）のコラーゲン産生促進の観点から、人工タンパク質（Ａ）の分子質量を基準として１０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０重量％である。
【００２６】
人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシーケンサによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、人工タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシーケンサにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、人工タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を測定する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛人工タンパク質（Ａ）の分子質量｝×１００
【００２７】
人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）とアミノ酸配列（Ｘ）及び下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）の個数：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及びコラーゲン産生促進の観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。
【００２８】
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、長期的にコラーゲン産生促進する観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは１５〜１００ｋＤａである。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【００２９】
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（２）の人工タンパク質
（１−１）ＧＶＧＶＰ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１３）である。
具体的には、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１５）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６２）；ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７２）等である。
（１−２）ＧＶＧＶＰ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）を有する人工タンパク質（Ａ２）であり、さらに好ましくは、ＧＶＧＶＰ配列（２）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が６個連続したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）を有する人工タンパク質（Ａ２１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ２１）とポリペプチド鎖（Ｓ２−１）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が２９個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約９３ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．１、疎水性度０．４７）である。
（１−３）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の２個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’３）を有する人工タンパク質（Ａ３）であり、さらに好ましくは、ＧＫＧＶＰ配列（７）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ’３１）、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が６個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が１０個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−２）を有する人工タンパク質（Ａ３１）である。
具体的には、ポリペプチド鎖（Ｓ２−１）にポリペプチド鎖（Ｙ’３１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｓ２−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約７３ｋＤａの配列（１８）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．２、疎水性度０．２０）等である。
【００３０】
（２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（１）の人工タンパク質
（２−１）ＶＰＧＶＧ配列（１）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ４）を有する人工タンパク質（Ａ４）であり、具体的には、ＶＰＧＶＧ配列（１）が１６０個連続したポリペプチド鎖（Ｙ４１）を有する分子質量が約６５ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質（ＥＬＰ１、疎水性度１．２０）である。
（２−２）ＶＰＧＶＧ配列（１）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）及びＶＰＧＶＧ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）を有する人工タンパク質（Ａ５）であり、さらに好ましくは、ＶＰＧＶＧ配列（１）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）、ＶＰＧＶＧ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有する人工タンパク質（Ａ５１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ５−１）にＧＡＧＡＧＳ配列（４）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｙ５−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が４０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約２２０ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質（ＥＬＰ１．１、疎水性度１．１２）である。
【００３１】
本発明のコラーゲン産生促進剤によりコラーゲン産生量を増加させることができる細胞（Ｃ）としては、公知のコラーゲンを産生する能力を有する細胞が含まれ、具体的には、線維芽細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞等が挙げられる。
細胞（Ｃ）としては、体内でコラーゲンを産生している主な細胞という観点から、線維芽細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００３２】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、動物由来の血清等が含まれていないので、抗原性が低いと推察される。また、人工タンパク質（Ａ）は、生物由来配列を有するので、生体適合性が高いと推察される。さらに、人工タンパク質（Ａ）は大腸菌等の細菌により、安価に大量生産できるので、コラーゲン産生促進剤を容易に入手できる。
また、本発明のコラーゲン産生促進剤は、体内のコラゲナーゼを含むプロテアーゼによる分解を受けにくいため、持続性があり、長期的に細胞のコラーゲン産生量を増加させることができる。
また、本発明のコラーゲン産生促進剤は、溶液状態又はゲル状態で皮膚内部又は皮下組織に注入することができ、作業量が少なく用いることができる。
また、皮下組織にコラーゲンを直接注入する方法とはことなり、皮膚内部又は皮下組織の線維芽細胞等の細胞に働きかけて、コラーゲン量を増やすことができるので、頻繁にコラーゲンを注入する必要がない。
【００３３】
本発明のコラーゲン産生促進剤の適用方法としては、特に限定はないが、下記（ｉ）培養液中の細胞のコラーゲン産生促進、（ｉｉ）抗老化剤としての適用方法及び（ｉｉｉ）コラーゲン産生促進用ゲルとしての適用方法が含まれる。
（ｉ）培養液中の細胞のコラーゲン産生促進
本発明のコラーゲン産生促進剤は、培養液中で細胞（Ｃ）を培養する際に、培養液中に含有することで、細胞のコラーゲン産生量を増加させることができる。したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤を用いれば、コラーゲンを大量に得ることができる。
本発明のコラーゲン産生促進剤を用いて培養液中の細胞のコラーゲン産生促進する方法としては、後述するコラーゲン産生促進用培養液を培養液として用いて細胞を培養する方法と、細胞を懸濁させた培地中にコラーゲン産生促進剤を添加する方法が含まれる。
本発明において、培養液中におけるコラーゲン産生促進剤の含有量は特に制限はなく、培養する細胞の種類（由来する生物の種類、細胞の種類など）、培養目的、基礎培地の種類等に応じて、適宜変更可能である。
培養液中のコラーゲン産生促進剤の濃度は、コラーゲン産生促進の観点から、０．０００００００００１〜１ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．００００００１〜０．００１ｇ／Ｌである。
【００３４】
培養液中のコラーゲン産生促進剤の濃度は以下のように測定する。
コラーゲン産生促進剤が１重量％になるように水を用いて希釈する。その溶液をさらに１０分の１倍希釈し、０．１重量％の濃度の溶液を作製する。さらに１０分の１倍希釈を繰り返し、コラーゲン産生促進剤の含有量が既知な標準溶液を作製する。この標準溶液と含有濃度を調べたい溶液を、同じゲル上でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供する。その後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーする。その後、一次抗体にラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行う。標準溶液の結果と比較することで、コラーゲン産生促進剤の含有量を明らかにすることができる。
【００３５】
（ｉｉ）抗老化剤としての適用
本発明のコラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤を、皮膚に適用することで、皮膚内部又は皮下組織の線維芽細胞等の細胞に働きかけて、皮膚のコラーゲン量を増やすことができる。具体的な一例を示す。
（１）人工タンパク質（Ａ）及び水を所定量含む、後述する抗老化剤を４〜４０℃で作製する。抗老化剤には、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）等のその他の成分を含んでもよい。また、抗老化剤は、必要により皮膚に適用する直前に温めてもよい。
（２）皮下組織に抗老化剤を適用する。
【００３６】
抗老化剤中の各成分の量は、後述する本発明の抗老化剤と同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００３７】
抗老化剤の皮膚への適用方法としては、注射器やマイクロニードルで皮下組織に投与する方法等が挙げられる。
また、皮膚は、人の皮膚に限定されることなく、動物（ペットや家畜）の皮膚にも使用することができる。
【００３８】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、水に溶解できるので、コラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤を皮膚内部又は皮下組織に投与することで、老化により機能が低下した線維芽細胞等の細胞に働きかけ、コラーゲン産生を増加させ、老化現象を抑えることができる。
【００３９】
（ｉｉｉ）コラーゲン産生促進用ゲルとしての適用
本発明のコラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液は、コラーゲン産生促進剤を所定量含み、溶液を４〜８０℃にすることでゲル化する。このゲルは、コラーゲン産生促進剤を含むので、細胞（Ｃ）の培養に使用した場合、細胞（Ｃ）のコラーゲン産生を促進することができ、細胞（Ｃ）培養時のコラーゲン産生促進用ゲルとして用いることができる。また、皮膚内部又は皮下組織に投与することで、老化により機能が低下した線維芽細胞等の細胞に働きかけ、コラーゲン産生を増加させ、老化現象を抑える抗老化用ゲルとして用いることができる。
【００４０】
＜コラーゲン産生促進用培養液＞
本発明のコラーゲン産生促進用培養液は、コラーゲン産生促進剤及び水を含有するコラーゲン産生促進用培養液である。
本発明のコラーゲン産生促進用培養液は、細胞（Ｃ）の培養に用いることで、細胞（Ｃ）のコラーゲンの産生能を高めることができる。したがって、本発明のコラーゲン産生促進用培養液を用いることで、コラーゲンを大量に得ることができる。
コラーゲン産生促進用培養液中のコラーゲン産生促進剤の濃度は、コラーゲン産生促進の観点から、０．０００００００００１〜１ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．００００００１〜０．００１ｇ／Ｌである。
【００４１】
本発明のコラーゲン産生促進用培養液において、コラーゲン産生促進剤は、上記コラーゲン産生促進剤であり、コラーゲン産生促進用培養液に使用するコラーゲン産生促進剤として好ましいものは、コラーゲン産生促進剤として好ましいものと同様である。
【００４２】
コラーゲン産生促進用培養液中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して加熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【００４３】
コラーゲン産生促進用培養液中には、上記コラーゲン産生促進剤及び水以外に無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
コラーゲン産生促進用培養液中の塩の含有量（重量％）は、細胞増殖性の観点から、コラーゲン産生促進用培養液の重量を基準として０〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．３重量％であり、次にさらに好ましくは０．７〜１．１重量％であり、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
【００４４】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
コラーゲン産生促進用培養液中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
コラーゲン産生促進用培養液中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、人工タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、コラーゲン産生促進用培養液の重量を基準として０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１０〜０．３０重量％であり、次にさらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００４５】
また、コラーゲン産生促進用培養液中には、上記以外に、従来の細胞培養に用いられる培地成分（糖、ビタミン、アミノ酸、ピルビン酸及びフェノール指示薬等）を含んでもいい。
【００４６】
コラーゲン産生促進用培養液のｐＨは、組織親和性の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８である。
また、細胞（Ｃ）を培養時のコラーゲン産生促進用培養液の温度は、コラーゲン産生促進剤の熱安定性及び操作の容易さの観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは４〜５０℃、特に好ましくは４〜４０℃である。
【００４７】
また、水及びその他の成分（培地成分等）を含む下記培地を用いてコラーゲン産生促進用培養液を作成してもよい。
培地としては、細胞培養に用いられる培地を制限なく用いることができ、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
【００４８】
本発明の抗老化剤は、コラーゲン産生促進剤及び水を含有する抗老化剤である。
抗老化剤中のコラーゲン産生促進剤の含有量（重量％）は、効率よくコラーゲン産生促進する観点及び人工タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、抗老化剤の重量を基準として、０．００００００００１〜３５重量％が好ましく、さらに好ましくは５〜３０重量％であり、次にさらに好ましくは１０〜３０重量％であり、特に好ましくは１５〜３０重量％である。また、人工タンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、１０〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１５〜３０重量％である。
抗老化剤中の水の含有量（重量％）は、効率よくコラーゲン産生促進する観点及び人工タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、６５〜９９．９９９９９９９９９重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜９０重量％であり、次にさらに好ましくは７０〜８５重量％である。
【００４９】
抗老化剤中のコラーゲン産生促進剤の含有量は、上記培養液中のコラーゲン産生促進剤の濃度を測定する方法と同様の方法で測定することができる。
【００５０】
本発明の抗老化剤において、コラーゲン産生促進剤は、上記コラーゲン産生促進剤であり、抗老化剤に使用するコラーゲン産生促進剤として好ましいものは、コラーゲン産生促進剤として好ましいものと同様である。
【００５１】
抗老化剤中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して加熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。また、上述の培地を水として用いて、抗老化剤を作成してもよい。
【００５２】
抗老化剤中には、上記コラーゲン産生促進剤及び水以外に無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
抗老化剤中の塩の含有量（重量％）は、人間の体液と同等にするという観点から、抗老化剤の重量を基準として０〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．３重量％であり、次にさらに好ましくは０．７〜１．１重量％であり、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
【００５３】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
抗老化剤中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
抗老化剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、タンパク質溶解性の観点から、抗老化剤の重量を基準として０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１０〜０．３０重量％であり、次にさらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００５４】
また、抗老化剤には、上記以外に、コラーゲン及びヒアルロン酸等を含んでもいい。
【００５５】
また、抗老化剤には、成長因子を添加してもいい。成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。
抗老化剤中の成長因子の濃度は細胞増殖の観点から、抗老化剤の重量を基準として、０．００３〜９．１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００３〜６．２５重量％である。
【００５６】
抗老化剤を皮膚内部又は皮下組織に注入する場合の温度は、コラーゲン産生促進剤の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【００５７】
本発明の抗老化剤は、上記コラーゲン産生促進剤を含んでいるので、老化により線維芽細胞の機能が低下し、コラーゲン量が減少した皮下組織に注入し、皮膚の老化を改善する溶液として有効である。
【００５８】
また、本発明のコラーゲン産生促進用ゲルは、コラーゲン産生促進剤及び水を含むコラーゲン産生促進用ゲルであって、コラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、コラーゲン産生促進剤が５〜３５重量％、水が６５〜９５重量％であるコラーゲン産生促進用ゲルである。
【００５９】
本発明のコラーゲン産生促進用ゲルにおいて、コラーゲン産生促進剤の含有量（重量％）は、コラーゲン産生促進及びゲル化する観点から、コラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、１０〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１５〜３０重量％である。
また、水の含有量（重量％）は、コラーゲン産生促進剤の溶解性の観点から、コラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、７０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜８５重量％である。  
【００６０】
また、本発明のコラーゲン産生促進用ゲルにおいて、ゲル中には、コラーゲン産生促進剤及び水以外に、コラーゲン産生促進用培養液及び／又は抗老化剤中に含んでもよいその他の成分（無機塩、リン酸（塩）、コラーゲン、ヒアルロン酸及び培地成分等）を含んでもいい。その他の成分の好ましい量は、上述のコラーゲン産生促進用培養液及び／又は抗老化剤と同様である。
【００６１】
本発明のコラーゲン産生促進用ゲルの製造方法は、上記コラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液を４〜８０℃にするコラーゲン産生促進用ゲルの製造方法である。
【００６２】
コラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液の温度は、ゲル化時間及びコラーゲン産生促進剤の熱安定性の観点から、２５〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【００６３】
本発明の製造方法において、溶液の温度が高い方が、溶液がゲルとなるまでの時間が短い。
本発明のコラーゲン産生促進用ゲルの製造方法において、コラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液中のコラーゲン産生促進剤の含有量（重量％）は、コラーゲン産生促進及びゲル化する観点から、作製されるコラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、５〜３５重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％であり、次にさらに好ましくは１５〜３０重量％である。
また、水の含有量（重量％）は、コラーゲン産生促進剤の溶解性の観点から、作製されるコラーゲン産生促進用ゲルの重量を基準として、６５〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜９０重量％であり、次にさらに好ましくは７０〜８５重量％である。  
【００６４】
また、本発明の製造方法において、コラーゲン産生促進剤及び水を含む溶液中には、コラーゲン産生促進剤及び水以外に、コラーゲン産生促進用培養液及び／又は抗老化剤中に含んでもよいその他の成分（無機塩、リン酸（塩）、コラーゲン、ヒアルロン酸及び培地成分等）を含んでもいい。その他の成分の好ましい量は、上述のコラーゲン産生促進用培養液及び／又は抗老化剤と同様である。
【００６５】
本発明の製造方法により得られたゲルは、コラーゲン産生促進剤を含むので、皮膚内部又は皮下組織に投与することで、老化により機能が低下した線維芽細胞等の細胞に働きかけ、コラーゲン産生を増加させることができる。
【００６６】
また、本発明の製造方法で得られるコラーゲン産生促進用ゲルは、細胞（Ｃ）の培養に用いることができる。コラーゲン産生促進用ゲルを細胞（Ｃ）の培養に用いると、コラーゲンを大量に得ることができる。
本発明のコラーゲン産生促進用ゲルを細胞（Ｃ）の培養に用いる方法は、特に限定はなく、下記に一例を示す。
方法（Ｉ）
（Ｉ−１）コラーゲン産生促進用ゲル中に細胞（Ｃ）を混合する。
（Ｉ−２）一定時間、一定温度で細胞（Ｃ）を培養する。
（Ｉ−３）ゲル中からコラーゲンを取り出す。
方法（ＩＩ）
（ＩＩ−１）水中に細胞（Ｃ）を懸濁させ、細胞懸濁液を作成する。
（ＩＩ−２）細胞懸濁液にコラーゲン産生促進剤を加え、均一になるまで攪拌する。
（ＩＩ−３）（ＩＩ−２）の溶液を４〜８０℃にし、ゲルを作成する。
（ＩＩ−４）一定時間、一定温度で細胞（Ｃ）を培養する。
（ＩＩ−５）ゲル中からコラーゲンを取り出す。
方法（ＩＩ）において、（ＩＩ−３）は、本発明のコラーゲン産生促進用ゲルを製造する工程である。
【００６７】
（Ｉ−２）において、細胞（Ｃ）を培養する時間は、通常、細胞培養する時間と同じでよく、細胞成育の観点から、１〜３０日が好ましく、さらに好ましくは１〜１４日である。
また、細胞（Ｃ）を培養する温度は、通常、細胞培養する際の温度と同じでよく、細胞成育の観点から、２０〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜４０℃である。
（Ｉ−３）において、ゲル中からコラーゲンを取り出す方法としては、酵素抽出法、酸抽出法及び熱水抽出法等を用いることができる。
【００６８】
（ＩＩ−１）において、水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。また、上述の培地を水として用いてもよい。
（ＩＩ−２）において、細胞懸濁液中のコラーゲン産生促進剤の含有量（重量％）は、コラーゲン産生促進剤及び水の合計重量を基準として、ゲル化する観点及び効率よくコラーゲン産生促進する観点から、５〜３５重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％であり、次にさらに好ましくは１５〜３０重量％である。
（ＩＩ−３）において、溶液の温度は、コラーゲン産生促進剤の熱安定性の観点から、２５〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
（ＩＩ−４）において、培養時間及び培養温度は（Ｉ−２）と同様である。
（ＩＩ−５）は（Ｉ−３）と同様である。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
＜実施例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。ＳＥＬＰ８Ｋをコードしている遺伝子の３´末端には、６×Ｈｉｓタグをコードした遺伝子が含まれている。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液の６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）を測定し、培養液がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間インキュベートした。該培養体を氷上で冷却し、培養液のＯＤ６００を測定し、培養に異常がないことを確認した。大腸菌を遠心分離で集めた。集菌した大腸菌から人工タンパク質を取り出すために、超音波破砕（４℃、３０秒×１０回）をして溶菌した。
この大腸菌により産生された人工タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーした。その後、一次抗体にラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行なった。該生成物の見かけ分子質量は約８０ｋＤａであった。よってＳＥＬＰ８Ｋ生産株は、見かけ分子質量が約８０ｋＤａのラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体反応性を有するＳＥＬＰ８Ｋを生成したことが分かった。
【００７１】
○ＳＥＬＰ８Ｋの精製
上記で得たＳＥＬＰ８Ｋを、菌体溶解、遠心分離による不溶性細片の除去、及びアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、コラーゲン産生促進剤である分子質量が約８０ｋＤａの人工タンパク質（Ａ−１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
【００７２】
○ＳＥＬＰ８Ｋの同定
得られた人工タンパク質（Ａ−１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量が約８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７％），アラニン（１２．３％），セリン（５．３％），プロリン（１１．７％）及びバリン（２１．２％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、人工タンパク質（Ａ−１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）がＧＶＧＶＰ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）においてＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）が化学結合した配列（１５）の人工タンパク質であることを確認した。
【００７３】
【表１】
2014062048.tif 000002
【００７４】
＜実施例２＞
実施例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＥＬＰ０ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３６４」を用いる以外は同様にして、コラーゲン産生促進剤である分子質量が約８２ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（Ａ−２）を得た。
【００７５】
＜実施例３＞
実施例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、コラーゲン産生促進剤である分子質量が約９３ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（Ａ−３）を得た。
【００７６】
＜実施例４＞
実施例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−１」を用いる以外は同様にして、コラーゲン産生促進剤である分子質量が約２２０ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質（Ａ−４）を得た。
【００７７】
＜実施例５＞
実施例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２」を用いる以外は同様にして、コラーゲン産生促進剤である分子質量が約６５ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質（Ａ−５）を得た。
【００７８】
細胞増殖試験及びコラーゲン産生能試験には、下記の試薬を用いた。
Ｄ−ＭＥＭ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，製造元：Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ
ペニシリン・ストレプトマイシン：製造元：Ｓｉｇｍａ
Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ロット番号：ＡＶＨ７７９９０、製造元：Ｔｈｅｒｍｏ（以下、ＦＢＳと表記する）
１０重量％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地：Ｄ−ＭＥＭ培地に１００分の１重量のペニシリン・ストレプトマイシンと、１０分の１重量のＦＢＳを添加し、４℃の条件下で保管したもの
ＰＢＳ：製造元：日本製薬、購入したものをオートクレーブ滅菌後、室温で保管したもの
トリプシン溶液：トリプシン（製造元：Ｓｉｇｍａ）を０．２５重量％の濃度になるようにＰＢＳで希釈し、−２０℃で保管したもの
Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ：製造元：ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
コラーゲン染色キット：製造元：コラーゲン技術協会、４℃の条件下で保管したもの
【００７９】
（Ｉ）培養液中の細胞のコラーゲン産生促進
＜細胞増殖性試験＞
（１）細胞培養
試験には、マウス線維芽細胞であるＬ９２９細胞を使用し、滅菌シャーレ、および滅菌プレートに播種し、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で３日間培養を行った。１０ｃｍのシャーレで培養したサブコンフルエント状態のＬ９２９細胞を、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン溶液を加えた。トリプシン溶液を除去し、１０重量％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を２ｍＬ加え、ピペッティングを行い、細胞懸濁液を作製した。さらに、２×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し、２４穴プレートに２５０μＬずつ添加した。３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で６時間培養後、人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）を培養液の体積を基準としてそれぞれ０．０００００００００１ｇ／Ｌ、０．０００００００１ｇ／Ｌ、０．０００００１ｇ／Ｌ、０．００１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌの濃度となるように添加して実施例６〜１０とし、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で３日間培養を行った。
（２）細胞数の測定
その後、プレートにＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液を５０μＬ滴下し、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で２時間静置させた。その後、吸光度計（ＶＥＲＳＡｍａｘ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定した。あらかじめ作製しておいた、細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）の相関性がある検量線にあてはめ、培養液中の細胞数を算出した。
【００８０】
＜コラーゲン産生能試験＞
（１）細胞培養
細胞増殖性試験の（１）と同様にしてＬ９２９細胞を培養し、３日間培養を行った。
（２）総コラーゲン量の測定
上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、コラーゲン染色キットＡ液を１００μＬ滴下し、３７℃で３０分間静置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、コラーゲン染色キットＢ液を２００μＬ滴下し、１分後に全量を９６穴プレートに移した。その後、吸光度計を用いて、５３０ｎｍ及び６０５ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ５３０及びＯＤ６０５）を測定した。総コラーゲン量は以下の式を用いて算出した。
総コラーゲン量（ｎｇ）＝［｛（ＯＤ５３０）−０．２５４×（ＯＤ６０５）｝×１００００００］／４０．８
【００８１】
また、実施例１〜５の人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）を添加しない以外は同様にして細胞増殖性試験及びコラーゲン産生能試験を行い、比較例１とした。
【００８２】
＜評価：コラーゲン産生能＞
上記細胞増殖試験及びコラーゲン産生能試験の結果を下記式に当てはめることにより、単位細胞当たりにおけるコラーゲン量であるコラーゲン産生能を求めた。
コラーゲン産生能（ｎｇ／ｃｅｌｌ）＝［総コラーゲン量］／［細胞数］
コラーゲン産生能について、コラーゲン産生促進剤を添加していないもの（比較例１の結果）を１００％とした相対値で表し、結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
2014062048.tif 000003
【００８４】
表２のコラーゲン産生能測定の結果から、人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）を用いた実施例６〜１０では、用いていない比較例１と比較して、線維芽細胞のコラーゲン産生能が１００％以上であった。したがって、線維芽細胞のコラーゲン産生能を促進し、産生されたコラーゲン量が多いことが分かる。
【００８５】
（ＩＩ）コラーゲン産生促進用ゲル
＜細胞増殖性試験＞
（１）細胞培養
試験には、マウス線維芽細胞であるＬ９２９細胞を使用し、滅菌シャーレ、および滅菌プレートに播種し、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で３日間培養を行った。１０ｃｍのシャーレで培養したサブコンフルエント状態のＬ９２９細胞を、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン溶液を加えた。トリプシン溶液を除去し、１０重量％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を２ｍＬ加え、ピペッティングを行い、細胞懸濁液を作製した。さらに、２×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）をそれぞれ２０重量％及びＰＢＳを８０重量％を混合した。その混合液２００μＬと細胞懸濁液５０μＬをピペッティングで混ぜ合わせ、２４穴プレートに全量滴下し、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で５分間で静置してゲル化させた。さらに、１０重量％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、実施例１１〜１５として、３日間培養を行った。
（２）細胞数の測定
その後、プレートにＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液を５０μＬ滴下し、３７℃、ＣＯ２濃度が５体積％の空気中で２時間静置させた。その後、吸光度計（ＶＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定した。あらかじめ作製しておいた、細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）の相関性がある検量線にあてはめ、培養液中の細胞数を算出した。
【００８６】
＜コラーゲン産生能試験＞
（１）細胞培養
細胞増殖性試験の（１）と同様にしてＬ９２９細胞を培養し、３日間培養を行った。
（２）総コラーゲン量の測定
上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのエラスターゼ溶液を添加し、３７℃で１０分静置した。その後、溶液を除去し、コラーゲン染色キットＡ液を１００μＬ滴下し、３７℃で３０分間静置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、コラーゲン染色キットＢ液を２００μＬ滴下し、１分後に全量を９６穴プレートに移した。その後、吸光度計を用いて、５３０ｎｍ及び６０５ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ５３０及びＯＤ６０５）を測定した。総コラーゲン量は以下の式を用いて算出した。
総コラーゲン量（ｎｇ）＝［｛（ＯＤ５３０）−０．２５４×（ＯＤ６０５）｝×１００００００］／４０．８
【００８７】
また、人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）の代わりにコラーゲンを用いた以外は同様にして細胞増殖性試験及びコラーゲン産生能試験を行い、比較例２とした。
【００８８】
＜評価：コラーゲン産生能＞
上記細胞増殖試験及びコラーゲン産生能試験の結果を下記式に当てはめることにより、単位細胞当たりにおけるコラーゲン量であるコラーゲン産生能を求めた。
コラーゲン産生能（ｎｇ／ｃｅｌｌ）＝［総コラーゲン量］／［細胞数］
コラーゲン産生能について、コラーゲン産生促進剤を添加していないもの（比較例２の結果）を１００％とした相対値で表し、結果を表３にまとめた。
【００８９】
【表３】
2014062048.tif 000004
【００９０】
表３のコラーゲン産生能測定の結果より、実施例１１〜１５の本発明のコラーゲン産生促進用ゲルを用いた場合、コラーゲンを用いた比較例２と比較して、線維芽細胞のコラーゲン産生能が１００％以上であった。したがって、線維芽細胞のコラーゲン産生能を促進し、産生されたコラーゲン量が多いことが分かる。
【００９１】
（ＩＩＩ）抗老化剤
＜動物実験＞
人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）をそれぞれ２０重量％含む水溶液を０．０５ｍＬずつ、モルモット皮下中に注入し、実施例１６〜２０とした。処置１４日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、パラフィン包埋標本を作製した。ミクロトームを用いて、厚さ１０μｍになるように切り、プレパレート用ガラスに塗布した。
【００９２】
＜コラーゲン産生能試験＞
（１）総コラーゲン量の測定
サンプルに脱パラフィン処理を施し、プレパレート上の切片に、コラーゲン染色キットＡ液を２００μＬ滴下し、３７℃で３０分間静置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、コラーゲン染色キットＢ液を２００μＬ滴下し、１分後に全量を９６穴プレートに移した。その後、吸光度計を用いて、５３０ｎｍ及び６０５ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ５３０及びＯＤ６０５）を測定した。総コラーゲン量は以下の式を用いて算出した。
総コラーゲン量（ｎｇ）＝［｛（ＯＤ５３０）−０．２５４×（ＯＤ６０５）｝×１００００００］／４０．８
また、非コラーゲンタンパク質の量を以下の式を用いて算出した。
非コラーゲンタンパク質量（ｎｇ）＝（ＯＤ６０５）／２．０４×１００００００
【００９３】
また、実施例１〜５の人工タンパク質（Ａ−１）〜（Ａ−５）を注入しない以外は同様にしてコラーゲン産生能試験を行い、比較例３とした。  
【００９４】
＜評価：コラーゲン産生能＞
上記コラーゲン産生能試験の結果を下記式に当てはめることにより、コラーゲン産生量を求めた。
コラーゲン産生能（％）＝［総コラーゲン量］／｛［総コラーゲン量］＋［非コラーゲンタンパク質量］｝
コラーゲン産生能について、コラーゲン産生促進剤を添加していないもの（比較例３の結果）を１００％とした相対値で表し、結果を表４にまとめた。
【００９５】
【表４】
2014062048.tif 000005
【００９６】
表４のコラーゲン産生能測定の結果より、実施例１６〜２０の本発明の抗老化剤を用いた場合、用いていない比較例３と比較して、線維芽細胞やその他の細胞を含むモルモット皮下組織のコラーゲン産生能が１００％以上であった。したがって、線維芽細胞やその他の細胞を含むモルモット皮下組織のコラーゲン産生能を促進し、産生されたコラーゲン量が多いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、培養液中の細胞の機能を向上させて、コラーゲン産生量を増加させるコラーゲン産生促進剤として有効である。したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤を含むコラーゲン産生促進用培養液を用いると、コラーゲンを大量に得ることができる。また、本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚組織中の線維芽細胞等の細胞の機能を向上させて、コラーゲン産生量を増加させることも可能である。したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤を含む溶液は、加齢による弾力性の低下や、水分含有量の減少による皮膚の老化を、予防及び改善する抗老化剤としても有効である。さらに、本発明のコラーゲン産生促進剤を含むコラーゲン産生促進ゲルは、細胞の培地及び抗老化剤として有効である。
【配列表】
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