(57)【要約】      （修正有）【課題】血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏）を有する患者の非静脈内処置するための、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸ及び／又はＦＸＩが欠乏した患者を処置するための凝血促進活性を有する低分子量ペプチドを提供する。【解決手段】ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ、前記アミノ酸配列内に１、２、３又は４つのＬ−アミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列又は前記配列のうちのいずれか１つのペプチド又はペプチド誘導体のレトロインベルソバリアントを含むペプチド又はペプチド誘導体：ｉｍｆｗｙｄｃｙｅを含むＤ体アミノ酸配列又は前記配列内に１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／００９，３２６号、および２００８年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／１１３，０５５号の優先権を主張し、これらの米国仮特許出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩが欠乏した患者を処置するための凝血促進活性を有する低分子量ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血液凝固カスケードは、一連のセリンプロテアーゼ酵素（チモーゲン）およびタンパク質補助因子を含む。必要なときに、不活性なチモーゲン前駆体は、活性型に変換され、その結果として、カスケードにおける次の酵素が変換される。これは、３つの異なるセグメント：内因性経路（接触活性化）、外因性経路（組織因子）および共通経路に分けられる。
【０００４】
このカスケードの内因性経路において、血友病は、最も著しい出血障害であり、血友病は、第ＦＩＸ因子（ＦＩＸａ）／第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）複合体（内因性テナーゼ複合体）による第Ｘａ因子の産生が不十分であり、それにより、不十分な血餅の形成がもたらされる。そして、出血が自発的または損傷後に生じ得る。
【０００５】
血友病は、遺伝性の出血障害であり、血友病ＡおよびＢという２つの型の血友病が知られている。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ欠乏の結果であり、関節および筋肉への出血を特徴とする。ＦＶＩＩＩは、血漿中において非常に低濃度で循環するものであり、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）に対して非共有結合的に結合する。止血中、ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって活性化され、ｖＷＦから分離し、そして活性化の速度を上げることによって、活性化されたＦＩＸａ媒介性ＦＸ活性化に対する補助因子として作用する。
【０００６】
１％未満の正常なＦＶＩＩＩを有する患者が、重篤な血友病を有し、１〜５％が、中程度に重篤な血友病を有し、そして５％を超えるが４０％未満が、軽度の血友病を有すると考えられている。
【０００７】
現今では、血友病Ａを管理するための最適な処置は、様々な血漿由来または組換えのＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた補充療法である。溶媒−界面活性剤処理または液相熱処理を含む特定のウイルス不活性化工程は、ウイルスを不活性化するために利用可能であるが、血漿由来濃縮物中の十分に特徴付けされていない作用物質（例えば、プリオン）の伝達の可能性が、なおも当該分野において考察されている問題である。
【０００８】
ＦＶＩＩＩは、出血障害において治療的に使用するための組換えタンパク質としても合成される。このような製品は、ウイルス混入のリスクが低い。血友病Ａを処置するための多くの組換え製品が市場に存在する。これらの濃縮物のうちの１つは、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造する、ＣＨＯ細胞において産生されるＡｄｖａｔｅ（登録商標）ＦＶＩＩＩ組成物である。この製品の細胞培養プロセス、精製または最終的な製剤化にヒトまたは動物の血漿タンパク質は加えられない。
【０００９】
純度、有効性およびウイルスの安全性を保証するＦＶＩＩＩの製造が、過去数十年間にわたって進歩しているにもかかわらず、いくつかの限界が残っている。第一に、重篤な血友病Ａ患者は、治療を無効にしてしまう抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の形成に頻繁に影響を受ける。
【００１０】
重篤なＨＡを有する患者の約３０％は、ＦＶＩＩＩを中和し得る同種抗体インヒビターを産生する（Ｈａｙ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２００６；１２  Ｓｕｐｐｌ  ６：２３−９；Ｐｅｅｒｌｉｎｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２００６；１２：５７９−９０）。これらのインヒビターは、代表的には、補体を固定せず、循環免疫複合体とともに観察される末端器官の損傷をもたらさない、主にＩｇＧ４サブクラスの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。それらのインヒビターは、主に１％未満のＦＶＩＩＩを有する患者において、幼齢（約５０％が１０歳まで）において生じる。さらに、ＦＶＩＩＩ欠乏の履歴を有しない人におけるＦＶＩＩＩ抗体インヒビターの産生である、後天性の血友病が生じることがある。この状態は、特発性であり得るか（５０歳を超える人において起きる）、膠原血管病もしくは周産期と関連し得るか、または薬物反応（例えば、ペニシリンに対する）を示し得る。臨床目的のために、ベセズダ単位（ＢＵ）のインヒビター力価を得ることができる機能的インヒビターアッセイを行うことによって、抗体応答の大きさが定量化され得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（ＩＳＴＨ）における高力価応答の定義は、＞５ＢＵであり、低力価応答の定義は、０．５〜５ＢＵである。
【００１１】
大量のヒトＦＶＩＩＩを用いてそれらのインヒビターを圧倒する試みが試されている。ヒトＦＶＩＩＩ抗体との交差反応性が低いブタのＦＶＩＩＩもまた、投与されている。活性化されたプロトロンビン複合体濃縮物（例えば、ＦＥＩＢＡ（第８因子インヒビターバイパス物質）および組換え活性化ＦＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）を含むＦＶＩＩＩバイパス物質もまた、より頻繁に使用されている。
【００１２】
インヒビター産生の欠点に加えて、ＦＶＩＩＩなどの治療用ポリペプチド薬が、タンパク分解酵素によって急速に分解されるので、ＦＶＩＩＩは、頻繁に静脈内に投与される必要がある。様々なＦＶＩＩＩ製品の循環中の平均半減期を考慮に入れると、これは、通常、１週間に２〜３回ＦＶＩＩＩを投与することによって達成され得る。したがって、この処置は、外来患者集団、特に、小さい小児における外来患者集団にとってかなり困難である。
【００１３】
したがって、現在のところ、ＦＶＩＩＩの多くの製造者の目的は、製品の他のすべての特徴を維持しつつ、薬力学的および薬物動態学的特性が向上した次世代の製品を開発することである。循環半減期が長くなった改善されたポリペプチド薬は、投与の必要回数を減少させ得るので、そのポリペプチド薬の化学的または酵素的な改変が、この目標を達成する好ましいアプローチの１つである。
【００１４】
１つのそのような例は、薬力学的および薬物動態学的プロファイルを保護し、改善するポリペプチド薬のＰＥＧ化である（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ
Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１）。特許文献１では、ポリ（アルキレンオキシド）−ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ結合体が記載されており、そのタンパク質は、前記ＦＶＩＩＩのカルボニル基を介してポリ（アルキレンオキシド）に共有結合されている。
【００１５】
これらの方法が、インヒビターの発生を減少させるとしても、なおもそれらは静脈内投与の必要性を取り消さないだろう。上で考察された血友病処置法の欠点のほとんどを時代遅れにさせる最も精密で簡潔な選択肢は、凝血を改善する能力を備え、非静脈内経路によって投与することができる、ペプチド（ペプチド模倣物）などの低分子量化合物の開発だろう。そのような作用物質は、長年にわたってすでに検討されているが（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｉｐｅ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １９９８；４．３７０−９；Ｌｌｕｎｇ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９９；８２：５２５−３０）、現在のところ、利用可能でないし、臨床開発中でもない。
【００１６】
血液凝固における小ペプチドの使用についての現在の最先端は、例えば、以下の刊行物によって実証されている：ＤＫ  Ｌｉｌｅｓ，ＤＭ  Ｍｏｎｒｏｅ  ａｎｄ  ＨＲ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  Ｖｏｌ  ９０  Ｎｏ  １０  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
１，４６３ａは、リン脂質表面上でＦＸのＦＩＸａ媒介性活性化を促進し得るＦＶＩＩＩ由来のペプチド６９８−７１２を開示しているポスター要約である。しかしながら、ＦＶＩＩＩａの存在下では、そのペプチドは、リン脂質表面上でのＦＸのＦＩＸａ媒介性活性化を阻害する。今まで、このポスター要約において開示された結果を確証する、これらの著者らの査読刊行物は存在しない。
【００１７】
Ｂｌｏｓｔｅｉｎら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１２０００−１２００６では、両親媒性のアルファヘリックスが、ＦＩＸａ  Ｇｌａドメインと相互作用することができ、リン脂質の非存在下においてＦＸの活性化を高めることが開示されている。それらのペプチドは、リン脂質を模倣することによって、アミノ酸配列とは独立して作用すると見られた。そのようなペプチドを治療において使用するという提案は存在しない。健常な状態では、活性化された血小板は、脂質［０］表面を支持する凝血を提供する。血小板は、血管の損傷部位に形成されるトロンビンによって活性化されるので、凝血プロセスは、損傷部位に限定される。凝血促進脂質に対する一般的な代替物であるペプチドを身体に提供することは、全身性の凝血を引き起こし得、最終的には播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に導き得るので、非常に望ましくない。それゆえ、Ｂｌｏｓｔｅｉｎによって報告されたペプチドは、治療において有用ではないだろう。
【００１８】
特許文献２および特許文献３は、ＦＶＩＩＩａと相互作用するＦＩＸａプロテアーゼドメインの領域を開示している。それらのペプチドは、ＦＩＸａのＦＶＩＩＩａ結合部位を含み、ＦＩＸａがＦＶＩＩＩａに結合することを阻害する。しかしながら、それらは、血栓症を予防するためまたは処置するための抗凝固薬としてのみ有用である。
【００１９】
特許文献４は、ヒトＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ様タンパク質に対する結合分子を開示している。これらのポリペプチドは、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ様ポリペプチドに結合し、血液または条件培地などの溶液からのヒトＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ様ポリペプチドの検出および精製に有用である。
【００２０】
特許文献５では、ＦＩＸ／ＦＩＸａ活性化抗体および抗体誘導体が、ＦＩＸａのアミド分解活性を高めるため、ならびに血友病Ａおよび出血性素質などの血液凝固障害を処置するために使用されている。
【００２１】
特許文献６では、ＦＶＩＩａアンタゴニストが開示されている。これらのアンタゴニストは、ＦＶＩＩａ活性を阻害するペプチドであり、血栓溶解治療と併用して動脈血栓症の予防に有用であると言われている。
【００２２】
本明細書中の、以前に公開されている文書の列挙または考察は、その文書が、最先端の一部であるかまたは通常の一般的な知識であるという承認として必ずしも取られるべきでない。
【００２３】
当該分野では、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏）を有する患者を処置するための凝血促進活性を備えた低分子量ペプチドに対する大きな必要性が残っている。本発明は、血友病Ａの非静脈内処置に使用することができる凝血促進活性を備えた新規の低分子量ペプチドを提供する。本発明（Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、これらの新規ペプチドをＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏の処置のためにも提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６，０３７，４５２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１０９，１７０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６２４，２８９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００１００１４４５６Ａ１号明細書
【特許文献５】米国特許第７，０３３，５９０号明細書
【特許文献６】米国特許第７，０８４，１０９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要旨
本発明の第１の局面は：
（ｉ）ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）；または
（ｉｉ）ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）内に１、２、３または４つのＬ−アミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）部分（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つのペプチドまたはペプチド誘導体のレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）バリアント
を含むペプチドまたはペプチド誘導体を提供し、ここで、前記ペプチドまたはペプチド誘導体は、凝血促進活性を有する。
【００２６】
不確かさを回避するために、配列ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）は、アミノ酸に対する３文字コードを用いて、Ｌ−アミノ酸Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐとして表され得る。ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）のレトロインベルソバリアントは、ｗｖｉｅｆｙｌｄｗであり、Ｄ−アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明の第２の局面は：
（ｉ）ｉｍｆｗｙｄｃｙｅを含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）ｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内に１、２、３、４、５もしくは６つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列
を含むペプチドまたはペプチド誘導体を提供し、ここで、前記ペプチドまたはペプチド誘導体は、凝血促進活性を有する。
【００２８】
不確かさを回避するために、配列ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅは、アミノ酸に対する３文字コードを用いて、Ｄ−アミノ酸ｉｌｅ−ｍｅｔ−ｐｈｅ−ｔｒｐ−ｔｙｒ−ａｓｐ−ｃｙｓ−ｔｙｒ−ｇｌｕとして表され得る。
【００２９】
本発明の第３の局面は、本発明の第１または第２の局面のさらなるペプチドまたはペプチド誘導体に結合体化された、本発明の第１または第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体を含む二重ペプチドを提供し、ここで、その２つのペプチド／誘導体は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよく、その二重ペプチドは、凝血促進活性を有する。
【００３０】
本発明の第４の局面は、本発明の第１もしくは第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体、または本発明の第３の局面の二重ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明の第５の局面は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置するための、第１もしくは第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体、または本発明の第３の局面の二重ペプチドを提供する。
【００３２】
本発明の第６の局面は、患者におけるＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を処置するための薬物の製造における、第１もしくは第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体、または本発明の第３の局面の二重ペプチドの使用を提供する。
【００３３】
本発明の第７の局面は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の第４の局面の薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【００３４】
本発明の第８の局面は、凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体を提供し、ここで、そのペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、その凝血促進活性は、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける、少なくとも１００ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも３００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、より好ましくは、少なくとも９００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡの凝血促進活性と等しい、２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である。
【００３５】
本発明の第９の局面は、凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体を提供し、ここで、そのペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、その凝血促進活性は、３０分以内、好ましくは、１５分以内、最も好ましくは、１０分以内にピークを迎える、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である。
【００３６】
本発明の第１０の局面は、凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体を提供し、ここで、そのペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、そのペプチドまたはペプチド誘導体は、重篤なヒト血友病Ａの動物モデルにおいて投与されたときに、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの欠如を少なくとも部分的に補償し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）；または
（ｉｉ）ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）内に１、２、３もしくは４つのＬ−アミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）部分（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つのペプチドもしくはペプチド誘導体のレトロインベルソバリアント
を含むペプチドまたはペプチド誘導体であって、
ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、凝血促進活性を有する、ペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、Ｗ、ＬまたはＰであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、Ｐｈｇ、Ｌ、Ｅｂｗ、Ｐｆｆ、Ｔｈｉ、１Ｎｉ、Ｈｆｅ、ＥｃｅまたはＣｈａであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号１）、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目３）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ＷまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、ＰｈｇまたはＬであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号１）、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目４）
（１）ＲＭＥＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）；または
（２）ＲＭＫＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）
（２）ＲＭＥＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）もしくはＲＭＫＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）内に１から６つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列
を含む、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目５）
前記バリアントアミノ酸配列が、より多いＸ８Ｘ９Ｘ１０ＦＤＶＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ８は、ＲまたはＰであり、Ｘ９は、Ｍ、Ｎｖａ、Ｍｏｏ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｍｅｏ、Ｑ、Ｅａｇであり、Ｘ１０は、Ｅ、ＫまたはＤであり、Ｘ１は、Ｗ、ＬまたはＰであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、Ｐｈｇ、Ｌ、Ｅｂｗ、Ｐｆｆ、Ｔｈｉ、１Ｎｉ、Ｈｆｅ、Ｅｃｅ、Ｃｈａであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号２）、項目４に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目６）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＦＤＶＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ８は、ＲまたはＰであり、Ｘ９は、ＭまたはＮｖａであり、Ｘ１０は、Ｅ、ＫまたはＤであり、Ｘ１は、ＷまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、ＰｈｇまたはＬであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号２）、項目５に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目７）
Ｎ末端においてアセチル化されており、Ｃ末端においてアミド化されており、そして／またはいずれかの末端においてＰＥＧ化されている、項目１に記載のペプチド誘導体。
（項目８）
環状である、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目９）
【化６】
2014074052.tif 000002
【化７】
2014074052.tif 000003
を含むか、またはそれらからなる、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、−ｔｔｄｓ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンであり、（Ｎｖａ）は、ノルバリンであり、（Ｐｈｇ）は、フェニルグリシンであり、（Ｃｏｈ）は、システイン酸であり、（Ｍｏｏ）は、メチオニンスルホンであり、（Ｅｂｗ）は、３，３−ジフェニルアラニンであり、（Ｐｆｆ）は、４’−フルオロフェニル−アラニンであり、（Ｎｌｅ）は、ノルロイシンであり、（Ｍｅｏ）は、メチオニンスルホキシドであり、（Ｅａｇ）は、プロパルギルグリシンであり、（Ｔｈｉ）は、２−チエニルアラニンであり、（１Ｎｉ）は、１−ナフチル−アラニンであり、（Ｈｆｅ）は、ホモフェニルアラニンであり、（Ｅｃｅ）は、ｓ−ベンジル−Ｌ−システインであり、（Ｃｈａ）は、シクロヘキシルアラニンである、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１０）
（ｉ）ｉｍｆｗｙｄｃｙｅを含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）ｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内に１、２、３、４、５もしくは６つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列
を含むペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、凝血促進活性を有する、ペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１１）
（ｉ）ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅを含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内に１、２、３、４、５、６もしくは７つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列
を含む、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１２）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、存在する場合、ｃ、ｓ、ｙ、ｉ  Ｄ−Ｐｅｎ、Ｃ、ｔ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｎｌｅまたはｋであり、Ｘ２は、ｉ、ｙ、ｗまたはｄであり、Ｘ３は、ｃまたはｍであり、Ｘ４は、ｆ、ｔ、ｖまたはｃであり、Ｘ５は、ｗまたはｃであり、Ｘ６は、ｙまたはｃであり、Ｘ７は、ｄ、ｅまたはｆであり、Ｘ８は、ｃ、ｅ、ｆ、ｙまたはｄであり、Ｘ９は、ｙまたはｗであり、そしてＸ１０は、ｅまたはｉである、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１３）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ｗｙｄＸ８ｙｅを含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ｃ、Ｃ、Ｄ−Ｐｅｎまたはｓであり、Ｘ２は、ｉ、ｙまたはｗであり、Ｘ３は、ｃまたはｍであり、Ｘ４は、ｆ、ｔまたはｖであり、そしてＸ８は、ｃまたはｅである、項目１２に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１４）
前記バリアントアミノ酸配列が、Ｘ１Ｘ２ｍＸ４ｗｙｄＸ８ｙｅを含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ｃ、ＣまたはＤ−Ｐｅｎであり、Ｘ２は、ｉまたはｙであり、Ｘ４は、ｆ、ｔまたはｖであり、そしてＸ８は、ｃまたはｅである、項目１３に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１５）
Ｎ末端においてアセチル化されており、Ｃ末端においてアミド化されており、そして／またはいずれかの末端においてＰＥＧ化されている、項目１０に記載のペプチド誘導体。
（項目１６）
Ｎ末端においてアセチル化されており、Ｃ末端においてアミド化されており、そして／またはいずれかの末端においてＰＥＧ化されている、項目１１に記載のペプチド誘導体。
（項目１７）
環状である、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１８）
【化８】
2014074052.tif 000004
を含むか、またはそれらからなる、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、−ＴＴＤＳ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンであり、（Ｄ−Ｐｅｎ）は、Ｄ−ペニシラミンであり、（Ｄ−Ｎｖａ）は、Ｄ−ノルバリンであり、（Ｄ−Ｎｌｅ）は、Ｄ−ノルロイシンである、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目１９）
前述のいずれかの項目において定義されたようなさらなるペプチドまたはペプチド誘導体に結合体化された、項目１において定義されたようなペプチドまたはペプチド誘導体を含む二重ペプチドであって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、該さらなるペプチドまたはペプチド誘導体と同じであってもよいし、異なっていてもよく、該二重ペプチドは、凝血促進活性を有する、二重ペプチド。
（項目２０）
前述のいずれかの項目において定義されたようなさらなるペプチドまたはペプチド誘導体に結合体化された、項目１０において定義されたようなペプチドまたはペプチド誘導体を含む二重ペプチドであって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、該さらなるペプチドまたはペプチド誘導体と同じであってもよいし、異なっていてもよく、該二重ペプチドは、凝血促進活性を有する、二重ペプチド。
（項目２１）
０．５から３．５ｋＤの分子量を有する、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２２）
０．５から３．５ｋＤの分子量を有する、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２３）
前記凝血促進活性が、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける、少なくとも１００ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも３００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、より好ましくは、少なくとも９００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡの凝血促進活性と等しい、２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２４）
前記凝血促進活性が、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける、少なくとも１００ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも３００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、より好ましくは、少なくとも９００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡの凝血促進活性と等しい、２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド。
（項目２５）
前記凝血促進活性が、３０分以内、好ましくは、１５分以内、最も好ましくは、１０分以内にピークを迎える、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２６）
前記凝血促進活性が、３０分以内、好ましくは、１５分以内、最も好ましくは、１０分以内にピークを迎える、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２７）
重篤なヒト血友病Ａの動物モデルにおいて投与されたときに、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの欠如を少なくとも部分的に補償し得る、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２８）
重篤なヒト血友病Ａの動物モデルにおいて投与されたときに、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの欠如を少なくとも部分的に補償し得る、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目２９）
３０分後において、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、少なくとも９０％のヒト血漿中の安定性を有する、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目３０）
３０分後において、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、少なくとも９０％のヒト血漿中の安定性を有する、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目３１）
ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で、少なくとも２５μＭ、好ましくは、少なくとも６０μＭ、最も好ましくは、少なくとも１００μＭの水溶解性を有する、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目３２）
ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で、少なくとも２５μＭ、好ましくは、少なくとも６０μＭ、最も好ましくは、少なくとも１００μＭの水溶解性を有する、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目３３）
項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体、ならびに１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアおよび／もしくは希釈剤を含む薬学的組成物。
（項目３４）
項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体、ならびに１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアおよび／もしくは希釈剤を含む薬学的組成物。
（項目３５）
皮下投与、経鼻投与、口腔投与、経口投与または肺内投与に適した、項目３３に記載の薬学的組成物。
（項目３６）
皮下投与、経鼻投与、口腔投与、経口投与または肺内投与に適した、項目３４に記載の薬学的組成物。
（項目３７）
静脈内投与に適した、項目３５に記載の薬学的組成物。
（項目３８）
静脈内投与に適した、項目３６に記載の薬学的組成物。
（項目３９）
医薬において使用するための、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目４０）
医薬において使用するための、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目４１）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置するための、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目４２）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置するための、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目４３）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を処置するための薬物の製造における、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体の使用。
（項目４４）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を処置するための薬物の製造における、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体の使用。
（項目４５）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３３に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４６）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３４に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４７）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３５に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４８）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３６に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４９）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３７に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目５０）
ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の項目３８に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目５１）
前記患者が、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩに対するインヒビター抗体を有する、項目４１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目５２）
前記患者が、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩに対するインヒビター抗体を有する、項目４３に記載の使用。
（項目５３）
前記患者が、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩに対するインヒビター抗体を有する、項目４５に記載の方法。
（項目５４）
固相合成によって、項目１に記載のペプチドまたはペプチド誘導体を作製する方法。
（項目５５）
固相合成によって、項目１０に記載のペプチドまたはペプチド誘導体を作製する方法。
（項目５６）
凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、該凝血促進活性は、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける、少なくとも１００ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも３００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、より好ましくは、少なくとも９００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡの凝血促進活性と等しい、２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、ペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目５７）
凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、該凝血促進活性は、３０分以内、好ましくは、１５分以内、最も好ましくは、１０分以内にピークを迎える、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭのペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドのトロンビン生成時間である、ペプチドまたはペプチド誘導体。
（項目５８）
凝血促進活性を有するペプチドまたはペプチド誘導体であって、ここで、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではなく、該ペプチドまたはペプチド誘導体は、重篤なヒト血友病Ａの動物モデルにおいて投与されたときに、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの欠如を少なくとも部分的に補償し得る、ペプチドまたはペプチド誘導体。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１：規定の二重経路トロンビン生成アッセイにおける、ピークトロンビン生成およびトロンビンピーク時間に対する、血友病の処置について承認された治療法の効果。
【図２】図２：ＦＶＩＩＩ−／−マウス出血モデル−失血量に対するＡ０１の効果。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の範囲内の用語「アミノ酸」は、天然に存在するすべてのＬ  α−アミノ酸を含むと意図される。天然に存在するアミノ酸に対して、１文字および３文字の省略形が本明細書中で使用される（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  ｅｄ．，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５：７１−９２）。用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）および改変物、非タンパク新生アミノ酸、ならびにアミノ酸を模倣するように設計された構造も含む。
【００３９】
改変されたアミノ酸および非タンパク新生アミノ酸は、Ｇｒａｎｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２において広く説明されている。
【００４０】
例えば、天然に存在しない様々なアミノ酸の導入または本明細書中で述べられるようなアミノ酸の改変によって、そのペプチドの改善された安定性および溶解性、プロテアーゼ分解に対する抵抗性、ならびに活性を提供することが可能である。
【００４１】
非タンパク新生アミノ酸としては、β−アラニン（β−Ａｌａ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、サルコシン、シトルリン、システイン酸（Ｃｏｈ）およびシクロヘキシルアラニン、メチオニンスルホキシド（Ｍｅｏ）、メチオニンスルホン（Ｍｏｏ）、ホモセリンメチルエステル（Ｈｓｍ）、プロパルギルグリシン（Ｅａｇ）、５−フルオロトリプトファン（５Ｆｗ）、６−フルオロトリプトファン（６Ｆｗ）、３’，４’−ジメトキシフェニル−アラニン（Ｅａｒ）、３’，４’−ジフルオロフェニルアラニン（Ｄｆｆ）、４’−フルオロフェニル−アラニン（Ｐｆｆ）、１−ナフチル−アラニン（１Ｎｉ）、１−メチルトリプトファン（１Ｍｗ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、ホモセリン（ＨＳｅ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。さらに、そのようなアミノ酸としては、α−アミノイソ酪酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ベンゾチエニルアラニン（Ｂｔａ）、Ｌ−ホモ−システイン（Ｌ−Ｈｃｙｓ）、Ｎ−メチル−フェニルアラニン（ＮＭＦ）、２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、３，３−ジフェニルアラニン（Ｅｂｗ）、ホモフェニルアラニン（Ｈｆｅ）、ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン（Ｅｃｅ）またはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらおよび他の非タンパク新生アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体として存在し得る。異性体の表示が与えられていない場合、Ｌ−異性体が意図される。
【００４２】
アミノ酸を模倣するように設計された構造は、アミノ酸のアミノ基および／またはカルボキシル基が別の基で置き換えられた化合物である。非限定的な例は、チオアミド、尿素、チオ尿素、アシルヒドラジド、エステル、オレフィン、スルホンアミド、リン酸アミド、ケトン、アルコール、ボロン酸アミド、ベンゾジアゼピンおよび他の芳香族複素環または非芳香族複素環の組み込みである（概説として、Ｍ．Ａ．Ｅｓｔｉａｒｔｅ，Ｄ．Ｈ．Ｒｉｃｈ，Ｂｕｒｇｅｒｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐａｒｔ  ４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２を参照のこと）。これらの構造が、ペプチド誘導体内に含まれている場合、それらは、通常、アミド結合の代わりに、上で述べた官能基の少なくとも１つを用いてペプチド誘導体の残りの部分に接続される。
【００４３】
「ペプチド」とは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結されている分子だけではなく、ペプチド結合が逆転している分子も含む。「逆改変された（ｒｅｔｒｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ペプチドとは、逆改変される本来のペプチドと逆の方向でアミノ酸残基が会合されるアミノ酸で構成されているペプチドである。本来のペプチドがＬ−アミノ酸を含む場合、「逆改変された」ペプチドもまたＬ−アミノ酸を含み得る。しかしながら、本来のペプチドがＤ−アミノ酸を含む場合、「逆改変された」ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含み得る。逆ペプチドは、ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含む。「インベルソ改変された（ｉｎｖｅｒｓｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ペプチドとは、インベルソ改変される本来のペプチドと同じ方向でアミノ酸残基が会合されるが、それらのアミノ酸のキラリティが反転しているペプチドである。したがって、本来のペプチドが、Ｌ−アミノ酸を含む場合、「インベルソ改変された」ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含み得る。本来のペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含む場合、「インベルソ改変された」ペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含み得る。インベルソペプチドは、依然としてＣＯ−ＮＨペプチド結合を有し得る。「レトロインベルソ改変された」ペプチドとは、レトロインベルソ改変される本来のペプチドに対して逆の方向で会合され、かつ、キラリティが反転している、アミノ酸残基で構成されているペプチドのことを指す。レトロインベルソアナログは、本来のペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーをほぼ維持しつつ、逆転した末端および逆転したペプチド結合の方向（すなわちＮＨ−ＣＯ）を有する。Ｇｕｉｃｈａｒｄら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９７６５−９７６９では、レトロインベルソペプチドが、Ｄ−ペプチドおよび逆ペプチドではなく、天然のＬ−ペプチドＩＲＧＥＲＡの構造および抗原活性を模倣すると記載された。そのようなレトロインベルソペプチド模倣物は、当該分野で公知の方法、例えば、本明細書中で参考として援用されるＭｅｚｉｅｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されている方法を用いて作製され得る。部分的なレトロインベルソペプチドアナログは、配列の一部だけが、逆転していて、鏡像異性のアミノ酸残基で置き換えられているポリペプチドである。そのようなアナログを作製するためのプロセスは、欧州特許９７９９４−ＢであるＰｅｓｓｉ，Ａ．，Ｐｉｎｏｒｉ，Ｍ．，Ｖｅｒｄｉｎｉ，Ａ．Ｓ．＆  Ｖｉｓｃｏｍｉ，Ｇ．Ｃ．（１９８７）“Ｔｏｔａｌｌｙ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ）−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ，ｕｓｉｎｇ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｓａｒｃｏｓｉｎｙｌ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ａｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ”に記載されている。
【００４４】
慣例的に、Ｌ−アミノ酸は、大文字を用いて表され、Ｄ−アミノ酸は、小文字を用いて表される。本発明のペプチドおよびペプチド誘導体は、好ましい形態で表されるが、それらはその好ましい形態に限定されない。本発明の第１の局面のペプチドは、ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）またはそのバリアントを含むと表される。本発明の第１の局面のペプチドは、ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）のレトロインベルソバリアントまたはそのバリアント、すなわちｗｖｉｅｆｙｌｄｗまたはそのバリアントでもあり得る。本発明の第２の局面のペプチドは、ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅまたはそのバリアントを含むと表される。
【００４５】
慣例的に、アミノ酸が、ペプチド結合によって連結される場合、ペプチドは、Ｎ末端におけるアミノ基が左側に見られ、Ｃ末端におけるカルボキシル基が右側に見られるように表示される。本発明に記載のペプチドおよびペプチド誘導体は、この様式で表示される。
【００４６】
「ペプチド誘導体」は、１つ以上のアミノ酸残基の改変、またはリンカー基もしくは他の共有結合された基を含む。
【００４７】
誘導体の例としては、アミノ末端または別の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、カルボキシル末端または別の遊離カルボキシル基もしくは遊離ヒドロキシ基のエステル、カルボキシル末端またはアンモニアもしくは適当なアミンとの反応によって生成される別の遊離カルボキシル基のアミド、グリコシル化された誘導体、ヒドロキシル化された誘導体、ヌクレオチジル化された（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌａｔｅｄ）誘導体、ＡＤＰ−リボシル化された誘導体、ペグ化された誘導体、リン酸化された誘導体、脂肪親和性部分に結合体化された誘導体、および抗体または他の生物学的リガンドに結合体化された誘導体が挙げられる。ペプチド結合−ＣＯ−ＮＨ−の改変、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−への還元または−ＣＯ−Ｎ（アルキル）−へのアルキル化によって得られる誘導体もまた化学誘導体の中に含まれる。
【００４８】
好ましい誘導体化は、Ｃ末端のアミド化である。ペプチドのＣ末端のアミド化は、Ｃ末端の負電荷を除去する。Ｃ末端のアミドを有するペプチド誘導体は、Ｃ末端において「ＮＨ２」を用いて表示され、例えば、Ａｃ−ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ−ＮＨ２（配列番号１）である。別の好ましい誘導体化は、Ｎ末端のアセチル化である。これは、Ｎ末端における正電荷を除去する。Ｃ末端のアミド化またはＮ末端のアセチル化などによるＣ末端またはＮ末端のブロッキングは、エキソタンパク分解（ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）消化に対する感受性を低下させるので、タンパク分解に対する安定性を改善し得る。
【００４９】
適当なリンカーとしては、可撓性リンカー４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｔｔｄｓ）、グリシン、６−アミノヘキサン酸、ベータ−アラニン、またはＴｔｄｓ、グリシン、６−アミノヘキサン酸およびベータ−アラニンの組み合わせが挙げられる。
【００５０】
本発明のペプチドは、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的もしくは酵素的な断片化、前述のものの組み合わせまたは他の任意の方法によって生成され得る。
【００５１】
ペプチド（少なくとも、アミノ酸残基間にペプチド結合を含むもの）は、“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０００およびその中の参考文献に記載されているような固相ペプチド合成のＦｍｏｃストラテジーによって合成され得る。一時的なＮ−アミノ基の保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の切断の反復は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて実施される。側鎖の官能性は、ブチルエーテル（セリン、トレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システイン、アスパラギンおよびグルタミンの場合）および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護され得る。固相支持体は、３つのモノマー、ジメチルアクリルアミド（骨格モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（クロスリンカー）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能性付与物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））から構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーに基づくものである。ペプチドと樹脂とが切断可能に連結された、使用される作用物質は、酸不安定性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体であるか、またはＣ末端のアミドの場合、Ｒｉｎｋ−アミドリンカーである。すべてのアミノ酸誘導体が、アスパラギンおよびグルタミンを除いて、予め成形された対称的な無水物誘導体として加えられ、それらは、逆転されたＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介性の結合方法を用いて加えられる。すべての結合反応および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験法を用いてモニターされる。合成が完了したら、５０％スカベンジャー混合物を含む９５％トリフルオロ酢酸で処理することによって、ペプチドを樹脂の支持体から切断し、同時に側鎖保護基を除去する。通常使用されるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、正確な選択は、合成されるペプチドの構成要素であるアミノ酸に依存する。真空中で蒸発させることによってトリフルオロ酢酸が除去され、次いで、ジエチルエーテルで倍散されることにより、粗ペプチドが得られる。存在するいずれのスカベンジャーも、単純な抽出方法によって除去され、水相の凍結乾燥により、スカベンジャーを含まない粗ペプチドが得られる。ペプチド合成のための試薬は、一般に、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ７  ２ＱＪ，ＵＫから入手可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）および��主に）逆相高速液体クロマトグラフィなどの手法のうちのいずれか１つまたはそれら組み合わせによって実施され得る。ペプチドの解析は、薄層クロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ、酸加水分解後のアミノ酸解析を用いて、および高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光解析によって、行われ得る。
【００５２】
連続したセルロース膜上での位置的にアドレス可能なペプチドの化学合成を可能にするＳＰＯＴ合成もまた使用され得る（Ｒ  Ｆｒａｎｋ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９２）４８，９２１７）。
【００５３】
固相ペプチド合成手法の代替物として、組換えタンパク質発現またはインビトロ翻訳系によってもペプチドは産生され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２００１，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。当然のことながら、それは、ポリヌクレオチドによってコード可能な、天然に存在するペプチド結合によって連結された天然に存在するアミノ酸残基を含むペプチドだけである。そのような方法は、ペプチドが、特に大きい、例えば、５０アミノ酸より大きい、または１００アミノ酸より大きい場合に、固相ペプチド合成手法よりも好ましい。
【００５４】
「バリアント」アミノ酸配列は、本発明の第１の局面に関して定義されるとき、ＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号１）内に１、２、３または４つのＬ−アミノ酸置換を含み得る。
【００５５】
好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、Ｗ、ＬまたはＰであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、Ｐｈｇ、Ｌ、Ｅｂｗ、Ｐｆｆ、Ｔｈｉ、１Ｎｉ、Ｈｆｅ、ＥｃｅまたはＣｈａであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号１）。
【００５６】
より好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ＷまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、ＰｈｇまたはＬであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号１）。
【００５７】
「バリアント」アミノ酸配列は、本発明の第２の局面に関して定義されるとき、ｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内に１、２、３、４、５または６つのアミノ酸置換を含み得る。
【００５８】
好ましくは、ｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内の前記置換の少なくとも１、２、３、４、５または６つが、Ｄ−アミノ酸である。
【００５９】
バリアント内のいずれの置換も、非保存的であってもよいし、保存的であってもよい。
【００６０】
「保存的置換」とは、以下の基：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの中の置換のことを意味する。
【００６１】
好ましくは、本発明の第１の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、ＲＭＥＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）またはＲＭＫＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）；またはＲＭＥＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）もしくはＲＭＫＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）内に１、２、３、４、５または６つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列を含む。
【００６２】
不確かさを回避するために、配列ＲＭＥＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）は、アミノ酸に対する３文字コードを用いて、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐとして表され得る。ＲＭＫＦＤＶＷＤＬＹＦＥＩＶＷ（配列番号２）は、アミノ酸に対する３文字コードを用いて、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐとして表され得る。
【００６３】
より好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＦＤＶＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ８は、ＲまたはＰであり、Ｘ９は、Ｍ、Ｎｖａ、Ｍｏｏ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｍｅｏ、Ｑ、Ｅａｇであり、Ｘ１０は、Ｅ、ＫまたはＤであり、Ｘ１は、Ｗ、ＬまたはＰであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、Ｐｈｇ、Ｌ、Ｅｂｗ、Ｐｆｆ、Ｔｈｉ、１Ｎｉ、Ｈｆｅ、Ｅｃｅ、Ｃｈａであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号２）。
【００６４】
より好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＦＤＶＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４ＥＸ５Ｘ６Ｘ７を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ８は、ＲまたはＰであり、Ｘ９は、ＭまたはＮｖａであり、Ｘ１０は、Ｅ、ＫまたはＤであり、Ｘ１は、ＷまたはＬであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、Ｆ、ＰｈｇまたはＬであり、Ｘ５は、ＩまたはＦであり、Ｘ６は、Ｓ、ＶまたはＧであり、そしてＸ７は、ＷまたはＬである（配列番号２）。
【００６５】
適切には、本発明の第１の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、以下の表に表されるようなペプチドもしくはペプチド誘導体であるか、あるいは以下の表１〜３に表されるようなペプチドもしくはペプチド誘導体のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる：
【００６６】
【表１−１】
2014074052.tif 000005
【００６７】
【表１−２】
2014074052.tif 000006
【００６８】
【表２】
2014074052.tif 000007
【００６９】
【表３】
2014074052.tif 000008
上の表において、−ｔｔｄｓ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンである。「Ｎ」は、アスパラギンである。「ＮＨ２」は、Ｃ末端のアミド基である。
【００７０】
好ましくは、本発明の第１の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、以下のリストに表されるペプチドを含まないか、またはそれらからならない：
【００７１】
【化１】
2014074052.tif 000009
【００７２】
【化２】
2014074052.tif 000010
【００７３】
【化３】
2014074052.tif 000011
【００７４】
【化４】
2014074052.tif 000012
。
【００７５】
好ましくは、本発明の第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は：
（ｉ）ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅを含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内に１、２、３、４、５、６もしくは７つのアミノ酸置換を含むバリアントアミノ酸配列
を含む。好ましくは、ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅ内の前記置換の少なくとも１、２、３、４、５、６または７つが、Ｄ−アミノ酸である。
【００７６】
好ましくは、本発明の第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０を含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、存在する場合、ｃ、ｓ、ｙ、ｉ、Ｄ−Ｐｅｎ、Ｃ、ｔ、Ｄ−Ｎｖａ、Ｄ−Ｎｌｅまたはｋであり、Ｘ２は、ｉ、ｙ、ｗまたはｄであり、Ｘ３は、ｃまたはｍであり、Ｘ４は、ｆ、ｔ、ｖまたはｃであり、Ｘ５は、ｗまたはｃであり、Ｘ６は、ｙまたはｃであり、Ｘ７は、ｄ、ｅまたはｆであり、Ｘ８は、ｃ、ｅ、ｆ、ｙまたはｄであり、Ｘ９は、ｙまたはｗであり、そしてＸ１０は、ｅまたはｉであり、ｃｉｍｆｗｙｄｃｙｅと比べて７を超えないアミノ酸置換が存在する。
【００７７】
好ましくは、ペプチドまたはペプチド誘導体は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ｗｙｄＸ８ｙｅを含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ｃ、Ｃ、Ｄ−Ｐｅｎまたはｓであり、Ｘ２は、Ｉ、ｙまたはｗであり、Ｘ３は、ｃまたはｍであり、Ｘ４は、ｆ、ｔまたはｖであり、そしてＸ８は、ｃまたはｅである。
【００７８】
好ましくは、ペプチドまたはペプチド誘導体は、Ｘ１Ｘ２ｍＸ４ｗｙｄＸ８ｙｅを含むアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ｃ、ＣまたはＤ−Ｐｅｎであり、Ｘ２は、ｉまたはｙであり、Ｘ４は、ｆ、ｔまたはｖであり、そしてＸ８は、ｃまたはｅである。
【００７９】
適切には、本発明の第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、以下の表に表されるようなペプチドもしくはペプチド誘導体であるか、または以下の表４〜６に表されるようなペプチドもしくはペプチド誘導体のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれらからなる：
【００８０】
【表４】
2014074052.tif 000013
好ましい実施形態において、ペプチドＢ０５、Ｂ０６、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ３４、Ｂ３５およびＢ３７は、環状である。
【００８１】
【表５】
2014074052.tif 000014
好ましい実施形態において、ペプチドＢ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ３０、Ｂ３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３６、Ｂ３８およびＢ３９は、環状である。
【００８２】
【表６】
2014074052.tif 000015
好ましい実施形態において、ペプチドＢ０１、Ｂ０２、Ｂ１１、Ｂ２５およびＢ２９は、環状である。
【００８３】
上の表において、−ＴＴＤＳ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンである。「ＮＨ２」は、Ｃ末端のアミド基である。
【００８４】
Ｂ０８は、Ｂ０１と同一であるので、上の表において削除されている。Ｂ１２は、Ｂ０２と同一であるので、上の表において削除されている。
【００８５】
好ましくは、本発明の第１の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、以下のリストに表されるペプチドを含まないか、またはそれらからならない：
【００８６】
【化５】
2014074052.tif 000016
。
【００８７】
好ましくは、本発明の第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、環状ペプチドである。第１の局面のペプチドまたはペプチド誘導体もまた、環状であり得る。
【００８８】
用語「環状ペプチド」とは、本明細書中で使用されるとき、例えば、環化に適した２つ以上の追加の基がしばしばカルボキシル末端およびアミノ末端において付加されているペプチドの環状誘導体のことを指す。適当な基としては、アミノ酸残基が挙げられる。環状ペプチドは、分子内ジスルフィド結合、すなわち−Ｓ−Ｓ−、２つの付加された残基間の分子内アミド結合、すなわち−ＣＯＮＨ−もしくは−ＮＨＣＯ−、または分子内Ｓ−アルキル結合、すなわち−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ−もしくは−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−のいずれかを含み得、ここで、ｎは、１、２またはそれ以上であり、好ましくは、６を超えない。環化は、Ｓｃｈａｒｎ，Ｄ．ら（２００１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ６６；５０７において例示されているようなトリアジン化学によっても行われ得る。環状ペプチド配列は、ペプチド配列の前に接頭辞「シクロ」を用いて表示され、配列の環状部分は、括弧内に組み込まれ、さらに、配列の残りの部分とハイフンによって分離される。
【００８９】
本発明の第１または第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への結合体化によって改変され得る。ＰＥＧ化の適当な方法は、米国特許第５，１２２，６１４号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ；Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．）および同第５，５３９，０６３号（Ｈａｋｉｍｉら；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）に開示されており、これらのＰＥＧ化方法のすべてが本明細書中で参考として援用される。様々な分子量のＰＥＧが、使用され得、適切には、５０００〜４００００ｋＤが使用され得る。好ましい分子量は、５０００ｋＤである。好ましくは、ＰＥＧは、単分散であり、これは、ＰＥＧ分子間の分子量にほとんど変動がないことを意味する。ＰＥＧ化は、ペプチドの溶解性および血漿半減期を改善し得る。
【００９０】
本発明の第３の局面は、本発明の第１または第２の局面のさらなるペプチドまたはペプチド誘導体に結合体化された、本発明の第１または第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体を含む二重ペプチドを提供し、ここで、そのペプチドまたはペプチド誘導体は、そのさらなるペプチドまたはペプチド誘導体と同じであってもよいし、異なっていてもよく、その二重ペプチドは、凝血促進活性を有する。
【００９１】
二重ペプチドは、ペプチド、ペプチド模倣物もしくは非ペプチドであり得る可撓性リンカーによって、または立体構造的に束縛されたペプチド、ペプチド模倣物または非ペプチドの基本単位、例えば、トリアジン部分を含み得る立体構造的に束縛されたリンカーによって、または当該分野で公知の他の任意の可能性のある方法によって、互いに共有結合された、２つの同じまたは２つの異なる、本発明の第１または第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体を含み得る。
【００９２】
好ましくは、本発明の第１および第２の局面のペプチドまたはペプチド誘導体ならびに本発明の第３の局面の二重ペプチドは、０．５〜３．５ｋＤの分子量を有する。「分子量」とは、任意の対イオンまたは付加物を除いた、ペプチドまたはペプチド誘導体のモノマーの理論的質量のことを意味する。ＰＥＧ化されたペプチドの場合、分子量は、任意の対イオンまたは付加物を除き、ＰＥＧ部分を除いた単量体分子の質量と定義される。０．５ｋＤ〜３．５ｋＤのペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドが、それよりも大きいペプチドよりも容易に合成され、免疫原性であるリスクが低く、一般に、容易に患者に投与される。０．５ｋＤ未満のペプチドは、容易に合成され得、投与され得、そして免疫原性である可能性は低いが、必要とされる凝血促進活性を有しないことがある。それにもかかわらず、０．５ｋＤ未満および３．５ｋＤ超のペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドは、適切な活性を有する場合、本発明によって包含される。
【００９３】
本発明の第１および第２の局面のペプチドおよびペプチド誘導体ならびに本発明の第３の局面の二重ペプチドは、凝血促進活性を有する。
【００９４】
「凝血促進活性」とは、適当な試験系においてトロンビン生成および／またはフィブリン沈着を促進する能力のことを意味する。
【００９５】
様々なアッセイが凝血促進活性を測定するために利用可能であることが認識されるだろう。実際に、様々なタイプの凝血促進活性が存在する。ペプチドおよびペプチド誘導体は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸまたはＦＸＩが枯渇した血漿中で凝血を促進し得る。好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩが枯渇しているかまたは存在しない血漿中においてトロンビン生成および／またはフィブリン沈着を促進する。このタイプの活性は、凝血ＦＶＩＩＩ活性と呼ばれる。血漿が、ＦＶＩＩＩを欠いている個体由来である場合、その活性は、代表的には、ＦＶＩＩＩ等価活性と呼ばれる。血漿が、ＦＶＩＩＩに対するインヒビターを含む場合、その活性は、代表的には、ＦＶＩＩＩインヒビターバイパス等価活性と呼ばれる。他の凝血促進活性としては、ＦＶ活性、ＦＶＩＩ活性、ＦＸ活性およびＦＸＩ活性が挙げられる。
【００９６】
個別のペプチドおよびペプチド誘導体は、様々なタイプのアッセイ間において、相対的な有効性が異なり得る。それゆえ、ペプチドまたはペプチド誘導体が、特定のアッセイにおいて低い有効性を有すると見られたとしても、それにもかかわらずそれは、別のアッセイでは適切に高レベルの凝血促進活性を有することがある。
【００９７】
凝血促進活性を測定するための適当なアッセイは、以下に記載される、規定の内因性トロンビン生成アッセイである。このアッセイでは、ある化合物が、２５、５０または１００μＭの濃度において、６０分間、好ましくは、５０、４０、３０、２０または１０分間で５ｎＭのトロンビンの生成を刺激することができる場合、その化合物は、凝血促進活性を有すると考えられる。好ましくは、その化合物は、６０分間、より好ましくは、５０、４０、３０、２０または１０分間で１０ｎＭのトロンビンの生成を刺激することができる。代替のアッセイは、以下に記載される、規定の二重経路トロンビン生成アッセイである。このアッセイでは、ある化合物が、２５、５０または１００μＭの濃度において、７０分間、好ましくは、６０、５０、４０、３０または２０分間で５ｎＭのトロンビンの生成を刺激することができる場合、その化合物は、凝血促進活性を有すると考えられる。好ましくは、その化合物は、７０分間、より好ましくは、６０、５０、４０、３０または２０分間で１０ｎＭのトロンビンの生成を刺激することができる。上記のアッセイは、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿またはＦＶＩＩＩ阻害血漿の存在下において行われるので、それらは、凝血ＦＶＩＩＩ活性を測定するために特に有用である。しかしながら、それらは、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿またはＦＶＩＩＩ阻害血漿の代わりに、適当な枯渇血漿または阻害血漿を用いることによって、他のタイプの凝血促進活性について試験するために容易に適応され得る。
【００９８】
適切には、凝血促進活性は、少なくとも１００ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも３００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、より好ましくは、少なくとも６００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡの凝血促進活性と等しい、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭの化合物のトロンビン生成時間である。トロンビン生成時間またはピーク時間は、以下に記載されるアッセイにおいて、予め温められた血漿を他の成分に加えた時点から、トロンビンがピーク最大値になる時点までの時間である。
【００９９】
あるいは、凝血促進活性は、少なくとも１ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも５ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも１０ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡに等しい、規定の二重経路トロンビン生成アッセイ（ＤＤＰＴＧＡ）における２５、５０または１００μＭの化合物のトロンビンピーク最大値である。ピークＩＩａとも呼ばれるトロンビンピーク最大値は、アッセイ中に生成される最大トロンビン濃度である。適当な因子が枯渇した血漿が、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＶＩＩＩ阻害血漿の代わりに用いられる場合、規定の二重経路トロンビン生成アッセイを用いることにより、ＦＶＩＩＩ活性以外の凝血活性を測定することができる。本発明のペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドが、２５、５０または１００μＭの濃度において、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸまたはＦＸＩ欠乏血漿を用いるそれぞれ１２０分にわたるＤＤＰＴＧＡにおいて、ペプチドの非存在下で刺激されたときよりも多いトロンビンの生成を刺激することができる場合、それらは、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸまたはＦＸＩ活性を有すると考えられる。
【０１００】
適切には、凝血促進活性は、３０分以内、好ましくは、１５分以内、最も好ましくは、１０分以内にピークを迎える、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭの化合物のトロンビン生成時間である。［０］あるいは、凝血促進活性は、５０分以内、好ましくは、４５分以内、最も好ましくは、３０分以内にピークを迎える、規定の二重経路トロンビン生成アッセイにおける２５、５０または１００μＭの化合物のトロンビン生成時間である。
【０１０１】
トロンビン生成に対するペプチドもしくはペプチド誘導体または二重ペプチドの効果は、ＦＶＩＩＩ免疫阻害患者、ＦＶＩＩＩ免疫除去患者、ＦＶＩＩＩインヒビター患者もしくは血友病Ａ患者の血漿、または他のタイプの凝固因子が欠如した血漿において、例えば、以下に記載されるように、黒色９６ウェルマイクロプレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）内でトロンビン特異的蛍光発生基質Ｉ−１１４０（Ｂａｃｈｅｍ）のゆっくりとした切断を連続的にモニターすることによって、測定され得る。ペプチドまたはペプチド誘導体の効果を測定するトロンビン生成アッセイにおいて有益に測定され得るパラメータは、ピーク時間におけるトロンビン濃度；ピークトロンビンにおけるトロンビン生成時間；トロンビン生成曲線の増大相の傾きおよびトロンビン生成の時間のずれ（開始相）である。
【０１０２】
トロンビン生成の内因性経路は、ＦＸＩａおよびリン脂質を含めることによって、トロンビン生成アッセイにおいてアッセイされ得る。活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験に類似したそのようなアッセイでは、トロンビン生成は、単独で内因性経路に向けられ、そしてＦＶＩＩＩ依存的である。適当なアッセイは、以下に記載される、規定の内因性トロンビン生成アッセイである。あるいは、ＦＸＩａおよびリン脂質の代わりに低濃度のＴＦおよびリン脂質を使用することによって、トロンビンは、外因性経路（組織因子）と内因性経路の両方によって生成される。この形態のトロンビン生成アッセイは、両方のトロンビン生成経路が関わるので、より生理的なアッセイであり；それは、部分的にＦＶＩＩＩ依存的である。適当なアッセイは、規定の二重経路トロンビン生成アッセイである。
【０１０３】
規定の内因性トロンビン生成アッセイは、以下のとおり行われる。４０μｌのヒト正常血漿を、ヤギにおいて産生された１０μｌの熱失活された抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿（６００ＢＵ／ｍｌ、５６℃において６時間インキュベート）とともにインキュベートすることによって（２時間、３７℃）、ヒト血漿のＦＶＩＩＩ活性を阻害する。ＦＸＩａ（１６．６７ｎＭ）（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とリン脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン６０％／４０％、１２０μＭ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）との１５μｌの混合物、３．３３ｍＭ  Ｉ−１１４０と５０ｍＭ  ＣａＣｌ２との１５μｌの混合物、および１０μｌのペプチド溶液（様々な濃度）を、１０μｌの２×ＨＮａ／ＨＳＡ５（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３５、１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ）に加える。３７℃において６分間インキュベートした後、５０μｌの予め温められた（３７℃）ＦＶＩＩＩ阻害血漿を加えることによって、トロンビン生成を開始する。ＦＶＩＩＩ阻害血漿の代わりに、ＦＶＩＩＩインヒビター患者血漿またはいくつかが欠如した血漿を用いることができる。マイクロプレートをすぐにＧＥＮｉｏｓ  Ｐｌｕｓ（Ｔｅｃａｎ）またはＳａｆｉｒｅ  ２（Ｔｅｃａｎ）蛍光リーダーに入れ、そのプレートを２１秒ごとに読み出すことによって、蛍光シグナル（ｅｘ  ３４０ｎｍ／ｅｍ  ４４０ｎＭ）を動力学的に追跡する。もとの蛍光データから逸脱することによって、ある濃度範囲のトロンビンを用いて構築された標準曲線から、生成されたトロンビンの量が算出される。
【０１０４】
活性等価単位を算出するために、第８因子インヒビターバイパス作用物質（ＦＥＩＢＡ、Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ）、Ｉｍｍｕｎａｔｅ（ヒトＦＶＩＩＩ、精製された血漿由来）対照基準（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ）またはＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ標準物質（ヒトＦＶＩＩＩ、精製された組換え、Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ）の希釈物を用いて、実験を行う。ピークトロンビンにおけるトロンビン生成時間に対してプロットされたＦＥＩＢＡ（ＦＶＩＩＩ）濃度の対数の線形の当てはめにより、標準曲線がもたらされる。この曲線を用いて、ＦＥＩＢＡ（ＦＶＩＩＩ）等価活性が、規定のペプチド濃度について算出される。
【０１０５】
ペプチド濃度が本明細書中で与えられる場合、それは、最終的なアッセイ体積におけるペプチドの濃度ではないが、血漿体積について補正された濃度であることが理解されるべきである。最終的なアッセイ体積における濃度は、補正された濃度を２．５で割った値である。したがって、１００μＭという濃度が与えられる場合、最終的なアッセイ体積における実際の濃度は、４０μＭである。同様に、ＦＥＩＢＡ等価活性もまた、血漿体積について補正される。したがって、１００μＭにおいて、ペプチドが、ＤＩＴＧＡにおける１００ｍＵ／ｍｌのＦＥＩＢＡと等しい活性を有すると述べられる場合、最終的なアッセイ体積におけるペプチドの濃度は、４０μＭであり、コントロールアッセイにおけるＦＥＩＢＡの等しい濃度は、４０ｍＵ／ｍｌのＦＥＩＢＡである。
【０１０６】
規定の二重経路トロンビン生成アッセイは、市販の試験キット（Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ，Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＧｍｂＨ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて以下に記載されるように行われる。簡潔には、４０μｌの１．２５ｍＭ蛍光発生基質（Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ）１８．７５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０μｌのＴＧＡ試薬Ｂ（リン脂質ベシクルホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン８０％／２０％（３．２μＭ）含有１７．９ｐＭ組換えヒト組織因子；Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＧｍｂＨ）または１０μｌのＴＧＡ試薬Ｃ  ｈｉｇｈ（リン脂質ベシクルホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン８０％／２０％（３２μＭ）含有７１．６ｐＭ組換えヒト組織因子；Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＧｍｂＨ）および１０μｌのペプチド希釈物、ＦＥＩＢＡ対照基準またはＦＶＩＩａ標準希釈物（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，Ｉｎｄｉａｎａ  ＵＳＡ）の混合物を３７℃において４分間インキュベートする。好ましくは、試薬Ｃ  ｈｉｇｈを用いる。いくつかのタイプのうちの１つのヒト血漿４０μｌを加えることによって、トロンビン生成を開始する（３７℃）。トロンビンによる蛍光発生基質の変換の後、すぐにそのプレートを予め加熱された（３７℃）マイクロプレート蛍光リーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２，ｅｘ  ３６０ｎｍ／ｅｍ  ４６０ｎｍ）に入れ、そのプレートを３０秒ごとに動力学的に読み出す。もとの蛍光データから逸脱することによって、ある濃度範囲のトロンビンを用いて構築された標準曲線から、生成されたトロンビンの量が算出される。トロンビン生成曲線のピークまたはトロンビンがピークを迎える時間において、トロンビンに対してプロットされた第ＶＩＩａ因子またはＦＥＩＢＡ濃度の非線形回帰分析によって、標準曲線がもたらされる。これらの曲線を用いて、第ＶＩＩａ因子またはＦＥＩＢＡ等価活性が、規定のペプチド濃度について算出され得る。ＤＩＴＧＡに関して記載されるように、ペプチド濃度が、本明細書中でＤＤＰＴＧＡに関して与えられる場合、それは、最終的なアッセイ体積におけるペプチドの濃度ではないが、血漿体積について補正された濃度であることが理解されるべきである。最終的なアッセイ体積における濃度は、補正された濃度を２．５で割った値である。ＦＥＩＢＡ等価活性もまた、同じ補正率を適用することによって、血漿体積について補正される。
【０１０７】
凝血促進活性、特に、ＦＶＩＩＩ等価活性またはＦＶＩＩＩインヒビターバイパス活性を測定するための別の適当なアッセイは、以下に記載されるような、規定のフィブリン沈着アッセイである。適切には、規定のフィブリン沈着アッセイにおける２５μＭの試験化合物のサンプルの凝血促進活性は、少なくとも３０ｍＵ／ｍＬの第８因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、好ましくは、少なくとも８０ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡ、最も好ましくは、少なくとも２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡと等しい。このアッセイは、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿またはＦＶＩＩＩ阻害血漿の存在下において行われるので、凝血ＦＶＩＩＩ活性を測定するために特に有用である。
【０１０８】
規定のフィブリン沈着アッセイは、以下のとおり行われる。まず、１００μｌのヒト正常血漿を、ヤギにおいて産生された２５μｌの熱失活された抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿（３００ＢＵ／ｍｌ、５６℃において６時間インキュベートしたもの）とともにインキュベートすることによって（２時間、３７℃）、ヒトクエン酸塩加血漿（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ）のＦＶＩＩＩ活性を阻害する。試験される各サンプルについて、このＦＶＩＩＩ阻害ヒト正常血漿１２５μｌを、予め温められたキュベットに移し、７５μｌの試験化合物またはＦＥＩＢＡ対照基準（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ）の希釈物を加える。その試験化合物またはＦＥＩＢＡ対照基準の希釈物は、５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４を含む。トリガーとして、および凝血促進表面を提供するために、５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４中の、ヒト第ＸＩａ因子（３．１３ｎＭ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とリン脂質（ＰＬ）ベシクル（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン６０％／４０％、３０μＭ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）との１００μｌの混合物を含める。３７℃において３分間インキュベートした後、１００μｌの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えることによって、凝血反応を開始する。凝固計（ＫＣ１０Ａ，Ａｍｅｌｕｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって血餅形成をモニターする。手短に言うと、各キュベットを磁気的検出デバイスの上でゆっくりと回転させ、その各キュベットは小さな磁性金属球を含む。血漿成分が溶液中に残存する一方で、その球は、キュベットの底に溜まる。やがて血餅が形成し始め、その球が、回転しているキュベット内において成長中の血餅を伴って回転し始める。「凝固時間」は、ＣａＣｌ２を加えた時点から、成長中の血餅が金属球のまわりを回転し始める時点までの時間と定義され、それが記録される。ＦＥＩＢＡ対照基準希釈物に対する標準曲線は、凝固時間（ｙ軸）に対する対数ＦＥＩＢＡ濃度（ｘ軸）の線形回帰によって算出される。各化合物濃度の凝固時間に基づいて、ＦＥＩＢＡ等価活性が、この標準曲線に従って算出される。
【０１０９】
ペプチド濃度が、規定のフィブリン沈着アッセイに関して本明細書中で与えられる場合、それは、最終的なアッセイ体積におけるペプチドの濃度ではないが、血漿体積について補正された濃度であることが理解されるべきである。最終的なアッセイ体積における濃度は、補正された濃度を４で割った値である。したがって、１００μＭという濃度が与えられる場合、最終的なアッセイ体積における実際の濃度は、２５μＭである。同様に、ＦＥＩＢＡ等価活性もまた、血漿体積について補正される。したがって、１００μＭにおいてペプチドが、規定のフィブリン沈着アッセイにおける１００ｍＵ／ｍｌのＦＥＩＢＡと等しい活性を有すると述べられる場合、最終的なアッセイ体積におけるペプチドの濃度は、２５μＭであり、コントロールアッセイにおけるＦＥＩＢＡ等価濃度は、２５ｍＵ／ｍｌのＦＥＩＢＡである。
【０１１０】
好ましくは、本発明の第１および第２の局面のペプチドおよびペプチド誘導体ならびに本発明の第３の局面の二重ペプチドは、重篤なヒト血友病Ａの動物モデルにおいて投与されたときに、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの欠如を少なくとも部分的に補償し得る。例えば、それらは、ＦＶＩＩＩ欠損マウス（例えば、ＦＶＩＩＩのエキソン１７またはエキソン１６が破壊されている、Ｂｉら（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５；１０：１１９−２１）に詳細に記載されているような系統）において出血を調節する際に活性であり得る。エキソン１６ＦＶＩＩＩ−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６００  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ  ０４６０９  ＵＳＡから入手可能である（系統名：Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ）。
【０１１１】
化合物が出血を調節する能力を試験するのに適したアッセイは、尾クリップ（ｔａｉｌ  ｃｌｉｐ）アッセイである。ペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドが、適当なビヒクルにおいて、マウスに、代表的にはｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与される。様々な用量の各ペプチドまたはペプチド誘導体が、様々な群のマウスに投与されることにより、用量依存性が測定され得る。マウスの群、代表的には、重篤な出血性素質を有する８〜１６匹の雄および雌のエキソン１７ＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、単回のｉ．ｖ．（尾静脈）、ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．ボーラス注射を行う（１０ｍｌ／ｋｇ体重）。尾クリップの２分前に、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジンのｉ．ｐ．適用によって動物を麻酔する。ペプチドまたはペプチド誘導体をｉ．ｖ．投与した５分後、およびｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与した６０分後に、尾端の０．５ｃｍを切除する。その創傷からの血液滴下を、定義された時間（例えば、０〜２分、２〜４分、４〜６分、６〜８、８〜１０、１０〜１２、１２〜１４、１４〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜４２、４２〜５２および５２〜６２分）にわたって、５．０ｍｌの０．０４％ＮＨ３が入ったチューブに回収する。各チューブ内の血液細胞を破壊し、室温における３時間のインキュベート時間の後、超音波処理することによって、ヘモグロビンを抽出する。その抽出物の４１４ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロタイタープレートにおいて測定する。６２０ｎｍは、参照波長であり、Ａ６２０読み出しをＡ４１４読み出しから減算する。Ｃ５７／Ｂｌ６マウスなどの野生型コントロールマウス由来の既知量の血液によって作成された標準曲線から、減算された読み出しに相当する抽出物中の血液の量を算出する。記録されるマウスの出血特徴のパラメータは、総失血量、出血速度、出血時間、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、２４ｈおよび４８ｈ生存である。累積の失血量を、各時間に対する血液の量を合計することによって算出する。動物の群についてのデータを平均し、出血時間に対してプロットする。各時点における処置群およびビヒクルコントロール群に対するデータセットをスチューデントのｔ検定によって統計的有意性について解析する。
【０１１２】
好ましくは、ペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドを投与されたマウスは、尾クリップアッセイにおける尾クリップから６２分後において、ビヒクル単独を投与されたマウスの７０％を超えない失血量、より好ましくは、ビヒクル単独を投与されたマウスの６０％を超えない、最も好ましくは、５０％を超えない失血量という失血量を有する。
【０１１３】
好ましくは、上記のアッセイにおいてペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドを投与されたマウスの生存は、尾クリップの２時間後において、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも６０％、最も好ましくは、少なくとも８０％である。好ましくは、尾クリップアッセイにおいてペプチドまたはペプチド誘導体を投与されたマウスの生存は、尾クリップの２４時間後において、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、最も好ましくは、少なくとも４０％である。
【０１１４】
好ましくは、本発明の第１および第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体または本発明の第３の局面の二重ペプチドは、３０分後において、ヒト血漿中で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、最も好ましくは、少なくとも９０％の安定性を有する。ヒト血漿中における安定性を測定するのに適したアッセイは、実施例に記載される。
【０１１５】
好ましくは、本発明の第１および第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体または本発明の第３の局面の二重ペプチドは、２５℃のリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４において、少なくとも２５μＭ、好ましくは、少なくとも６０μＭ、最も好ましくは、少なくとも１００μＭの水溶解性を有する。２５℃のリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４における水溶解性を測定するのに適したアッセイは、実施例に記載される。
【０１１６】
本明細書中において、用語「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」とは、天然のＦＶＩＩＩと関連する生物学的活性を示す任意のＦＶＩＩＩ部分のことを指す。ＦＶＩＩＩの配列は、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０００１２３またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ００４５１として見出され得る。
【０１１７】
本明細書中で使用されるとき、「血漿由来ＦＶＩＩＩ」は、凝血経路を活性化する特性を有する哺乳動物から得られる血液中に見られるすべての形態のそのタンパク質を含む。
【０１１８】
本明細書中で使用されるとき、「ｒＦＶＩＩＩ」とは、組換えＤＮＡ技術を介して得られたＦＶＩＩＩのことを示す。
【０１１９】
本発明の第４の局面は、本発明の第１もしくは第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体または本発明の第３の局面の二重ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。ペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドは、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物または水和物の形態であり得る。適切には、薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。キャリアは、好ましくは、液体処方物であり得、好ましくは、等張性の緩衝水溶液である。適切には、薬学的組成物は、生理的または生理的に近いｐＨを有する。適切には、それは、生理的または生理的に近いオスモル濃度および塩分である。それは、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含み得る。本発明のペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドは、生物学的処理の発生が生じ得る著しい発熱性なしに作製され得る。これは、特に、低レベルのエンドトキシンしか許容され得ない静脈内処方物に対して重要であり得る。皮下、腹腔内、口腔、静脈内および他の非経口処方物は、無菌であり、エンドトキシンを含まないことが、好ましい。
【０１２０】
薬学的に許容可能なキャリアは、賦形剤（例えば、希釈剤など）および添加剤（例えば、安定化剤、保存剤、可溶化剤など）も含み得る。本発明のペプチドは、いずれの薬学的に許容可能な塩の形態でも存在し得る。
【０１２１】
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な」とは、ＵＳもしくはＥＵの規制当局または他の政府によって承認されているか、あるいはヒトにおいて使用するために米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
【０１２２】
本組成物は、例えば、懸濁液、エマルジョン、徐放処方物、クリーム、ゲルまたは粉末でもあり得る。本組成物は、従来の結合剤、およびトリグリセリドなどのキャリアを用いて、坐剤として製剤化され得る。
【０１２３】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドの静脈内送達が、可能であり得るが、非静脈内経路、特に、皮下送達、経鼻送達、口腔送達、経口送達または肺送達が好ましい。腹腔内（ｉ．ｐ．）送達もまた用いられ得る。
【０１２４】
薬学的組成物は、例えば、水、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、エタノール、鉱油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、佐剤、ポリペプチドもしくはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤および／または保存剤の１つ以上をさらに含み得る。さらに、１つ以上の他の活性成分が、本明細書中に提供される薬学的組成物中に含められ得る（が、含められなくてもよい）。
【０１２５】
薬学的組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所的（例えば、経皮的または眼球）、経口投与、口腔投与、経鼻投与、膣内投与、直腸内投与または非経口投与を含む）に対して製剤化され得る。非経口という用語は、本明細書中で使用されるとき、皮下、皮内、脈管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液包内および腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入手法を含む。経口使用に適した形態としては、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤が挙げられる。本明細書中に提供される組成物は、凍結乾燥物として製剤化され得る。
【０１２６】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物において活性成分を含む。そのような賦形剤としては、懸濁剤（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム）；ならびに分散剤または湿潤剤（例えば、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合物（例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）が挙げられる。水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１つ以上の着色剤、１つ以上の着香料および１つ以上の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）も含み得る。
【０１２７】
ペプチドまたはペプチド誘導体は、局部的または局所的投与（例えば、皮膚、創傷、または粘膜への局所的適用、眼内など）のために製剤化され得る。局所的投与用の処方物は、代表的には、追加の随意の成分を伴って、または伴わずに、活性な作用物質と組み合わされる局所用ビヒクルを含む。適当な局所用ビヒクルおよび追加の成分は、当該分野で周知であり、ビヒクルの選択が、特定の物理的形状および送達様式に依存することは明らかであろう。局所用ビヒクルとしては、水；アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロピルアルコール）またはグリセリンなどの有機溶媒；グリコール（例えば、ブチレングリコール、イソプレングリコールまたはプロピレングリコール）；脂肪族アルコール（例えば、ラノリン）；水と有機溶媒との混合物および有機溶媒の混合物（例えば、アルコールおよびグリセリン）；脂質ベースの材料（例えば、脂肪酸、アシルグリセロール（鉱油などの油、および天然起源または合成起源の脂肪を含む）、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質およびろう）；タンパク質ベースの材料（例えば、コラーゲンおよびゼラチン）；シリコーンベースの材料（不揮発性と揮発性の両方）；および炭化水素ベースの材料（例えば、マイクロスポンジおよびポリマーマトリックス）が挙げられる。組成物は、適用される処方物の安定性または有効性を改善するように適応された１つ以上の成分（例えば、安定化剤、懸濁剤、乳化剤、粘度調整剤、ゲル化剤、保存剤、酸化防止剤、皮膚浸透促進剤、保湿剤および徐放材料）をさらに含み得る。そのような成分の例は、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ−Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９３）およびＭａｒｔｉｎ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。処方物は、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルなどのマイクロカプセル、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子またはナノカプセルを含み得る。
【０１２８】
薬学的組成物は、スプレー、ミストまたはエアロゾルを含む吸入処方物として製剤化され得る。吸入処方物の場合、本明細書中に提供される化合物は、当業者に公知の任意の吸入方法を介して送達され得る。そのような吸入方法および吸入デバイスとしては、ＣＦＣもしくはＨＦＡなどの噴霧剤、または生理的および環境的に許容可能な噴霧剤を含む定量吸入器が挙げられるが、これに限定されない。他の適当なデバイスは、呼吸によって操作される吸入器、多用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）乾燥粉末吸入器およびエアロゾル噴霧器である。本方法において使用するためのエアロゾル処方物は、代表的には、噴霧剤、界面活性物質および共溶媒を含み、適当な計量弁によって閉じられている従来のエアロゾル容器内に満たされ得る。
【０１２９】
吸入組成物は、噴霧化および気管支内使用に適した活性成分を含む液体もしくは粉末の組成物、または計量された用量を分配するエアロゾルユニットを介して投与されるエアロゾル組成物を含み得る。適当な液体組成物は、薬学的に許容可能な水性の吸入溶媒、例えば、等張性食塩水または静菌水において活性成分を含む。それらの溶液は、ポンプ、もしくは圧搾により作動し噴霧されるスプレーディスペンサーを用いて、または必要な投薬量の液体組成物を患者の肺に吸入させるか、もしくは吸入させることができる他の任意の従来の手段によって投与される。例えば、点鼻薬または点鼻液として投与するためのキャリアが液体である適当な処方物は、活性成分の水性または油性の溶液を含む。
【０１３０】
鼻投与に適した処方物または組成物（キャリアは固体である）は、嗅剤が投与される様式で（すなわち、鼻に近づけられた粉末の容器からの鼻腔を通じた急速な吸入によって）投与される、例えば、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。適当な粉末の組成物としては、例として、ラクトースまたは気管支内投与に対して許容可能な他の不活性な粉末と十分に混合された活性成分の粉末状の調製物が挙げられる。その粉末の組成物は、エアロゾルディスペンサーを介して投与され得るか、またはカプセルを穿刺し、吸入に適した一様の流れで粉末を噴出するデバイスに患者によって挿入され得る、壊れやすいカプセルの中に入れられ得る。
【０１３１】
薬学的組成物は、徐放処方物（すなわち、投与後に調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の緩徐放出をもたらすカプセルなどの処方物）として製剤化され得る。そのような処方物は、一般に、周知の技術を用いて調製され得、例えば、経口、直腸もしくは皮下埋没、または所望の標的部位における埋没によって、投与され得る。そのような処方物内において使用するためのキャリアは、生体適合性であり、生分解性でもあり得る；好ましくは、その処方物は、比較的一定レベルの調節因子の放出をもたらす。徐放処方物内に含まれる調節因子の量は、例えば、埋没部位、放出の速度および予想される持続時間、ならびに処置されるかまたは予防される状態の性質に依存する。
【０１３２】
薬学的組成物が、バイオアベイラビリティを改善する作用物質、例えば、有機溶媒を用いて製剤化され得る。例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏ．００６４７／１／６３；ＢＡＳＦ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、３５モルのエチレンオキシドを１モルのひまし油と反応させることによって調製されるポリエトキシ化ひまし油である。それを用いることにより、水溶液系において無極性材料のエマルジョンが安定化され得る。あるいは、ペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドは、バイオアベイラビリティを改善するために、タンパク質性の微小粒子内またはナノ粒子内に組み込まれ得るか、またはそれらに結合され得る。適当な微小粒子およびナノ粒子は、ＵＳ５，４３９，６８６（Ｄｅｓａｉら；Ｖｉｖｏｒｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）およびＵＳ５，４９８，４２１（Ｇｒｉｎｓｔａｆｆら；Ｖｉｖｏｒｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）に記載されている。適切には、タンパク質性のナノ粒子は、ヒト血清アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンまたはその組換え型を含む。ＷＯ２００７／０７７５６１（Ｇａｂｂａｉ；Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）には、ナノ構造、およびその中においてＮｅｏｗａｔｅｒＴＭと呼ばれている液体を含む別の適当なキャリアが記載されている。
【０１３３】
ヒト患者を含む患者への経口および非経口投与の場合、本発明のペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドの１日の投薬量レベルは、通常、単回量または分割量として投与される２〜２０００ｍｇ／成体（すなわち、約０．０３〜３０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。
【０１３４】
したがって、例えば、本発明のペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドの錠剤またはカプセルは、単独で、または必要に応じて一度に２つ以上での投与について、２ｍｇ〜２０００ｍｇの活性な化合物を含み得る。いかなる事象においても、医師が、任意の個別患者に最も適するであろう実際の投薬量を決定し得、その投薬量は、特定の患者の年齢、体重および応答によって変動し得る。上記の投薬量は、平均的な症例の典型である。当然のことながら、それよりも高いまたは低い投薬量の範囲が正当である個別の例が存在し得、そのような範囲は、本発明の範囲内である。
【０１３５】
獣医学的に使用する場合、本発明のペプチド、ペプチド誘導体または二重ペプチドは、通常の獣医学診療に従って適切に許容可能な処方物として投与され、獣医学の外科医が、特定の動物について最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を決定する。
【０１３６】
本明細書中に開示されるペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドは、医学的応用および畜産または獣医学的応用のために使用され得る。代表的には、本生成物は、ヒトにおいて使用される。用語「患者」とは、哺乳動物の個体のことを示すと意図され、本明細書全体および請求項においてそのように使用される。
【０１３７】
本発明の第５の局面は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置するための、本発明の第１もしくは第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体または第３の局面の二重ペプチドを提供する。
【０１３８】
本発明の第６の局面は、患者におけるＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を処置するための薬物の製造における、第１または第２の局面のペプチドもしくはペプチド誘導体または本発明の第３の局面の二重ペプチドの使用を提供する。
【０１３９】
本発明の第７の局面は、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を有する患者を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の第４の局面の薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０１４０】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体および二重ペプチドは、急性の出血の予防と処置の両方の目的でＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸおよび／またはＦＸＩの欠乏を処置するために使用され得る。ＦＶＩＩＩ欠乏（血友病Ａ）を有する患者は、ＦＶＩＩＩに対するインヒビター抗体を産生することが多い。インヒビターの産生（ＦＩＸに対する）は、ＦＩＸ欠乏（血友病Ｂ）においても知られている。ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸＩおよびＦＸ欠乏を有する患者がインヒビターを産生し得ることがあり得るにもかかわらず、このような障害が非常に珍しい先天性の障害であるので、インヒビターの産生についてほとんど知られていない。インヒビター患者の処置は、第５、第６および第７の局面の好ましい実施形態である。そのようなインヒビター患者は、５ＢＵよりも高い高力価応答または０．５〜５ＢＵの低力価応答のいずれかを有し得る。代表的には、それらのインヒビターは、ＦＶＩＩＩに対するものであり、その患者は、血友病Ａを有する。
【０１４１】
ＦＶＩＩＩに対する抗体応答の大きさは、機能的インヒビターアッセイ（例えば、［０］Ｋａｓｐｅｒ  ＣＫら（１９７５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：Ａ  ｍｏｒｅ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉａｔｈ  Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４（２）：６１２に記載されているようなアッセイ）を用いて定量化され得る。ＦＸＩインヒビターは、Ｋａｓｐｅｒによって報告されているようにａＰＴＴアッセイによって定量化され得る。ＦＶ、ＦＶＩＩおよびＦＸのインヒビターは、Ｋａｓｐｅｒの手順に従ってＰＴベースのアッセイによって定量化され得る。
【０１４２】
本発明の第８、第９または第１０の局面に記載のペプチドまたはペプチド誘導体は、ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントではない。代表的には、それは、ヒト起源、哺乳動物起源または脊椎動物起源に関係なく、いずれのＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列からもならないか、またはそれらを含まない。それは、ＦＶＩＩＩタンパク質のフラグメントからなるものでもない。代表的には、それは、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質などのＦＶＩＩＩタンパク質の、５０より少ない、２０より少ない、１０より少ない、５より少ない連続したアミノ酸を含む。好ましいペプチドおよびペプチド誘導体は、本発明の第１および第２の局面のペプチドおよびペプチド誘導体または本発明の第３の局面の二重ペプチドである。代替のペプチドおよびペプチド誘導体が、例示されるペプチドおよびペプチド誘導体に関して記載されるように、合成され得、凝血促進活性について試験され得る。
【０１４３】
本発明の第８、第９または第１０の局面のペプチドおよびペプチド誘導体は、上に記載されたように薬学的組成物として製剤化され得、上に記載されたように医薬において使用され得る。
【０１４４】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証されるが、それらの実施例にいかなる限定もされない。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：トロンビン生成活性を有する化合物の合成および同定
第ＸＩａ因子およびリン脂質ベシクルの存在下におけるＦＶＩＩＩ阻害ヒト血漿中のトロンビン生成をインビトロにおいて定量化する「規定の内因性トロンビン生成アッセイ」を用いて、化合物をスクリーニングした。上記のアッセイ、ならびに具体的な説明に記載されているように第ＸＩａ因子およびリン脂質の代わりに組織因子およびリン脂質を用いる「規定の二重経路トロンビン生成アッセイ」において、さらに化合物をスクリーニングした。
【０１４６】
従来の固相ペプチド合成、または連続的なセルロース膜上でのペプチドの位置的にアドレス可能な化学合成を可能にする５０〜１００ｎｍｏｌペプチド／スポットでのＳＰＯＴ合成によって、ペプチドおよびペプチド誘導体である化合物を合成した。ペプチドを、１０％または５０％ＤＭＳＯ水溶液に溶解した。
【０１４７】
ペプチドおよびペプチド誘導体のＰＥＧ化を以下のとおり行った。ＰＥＧ５０００  ＮＨＳ−エステルを、溶液中でＨＰＬＣ精製ペプチドのＮ末端に結合した。ペプチド配列内にリジンが存在する場合、ε−アミノ基におけるＰＥＧ化を回避するために、このアミノ酸をｉｖＤｄｅ保護基で保護した。ＰＥＧ５０００をＮ末端に結合した後、ｉｖＤｄｅ保護基をジメチルホルムアミド中の３％水和ヒドラジンによって切断した後、ＨＰＬＣによって最終生成物を再精製した。
【０１４８】
以下の表７および８に示されるような、トロンビン生成を促進するとみられる化合物を同定した。
【０１４９】
【表７】
2014074052.tif 000017
上の表において、Ｏ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（ｔｔｄｓ）である。
【０１５０】
【表８】
2014074052.tif 000018
上の表において、−Ｏ−は、４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（ｔｔｄｓ）である。Ｂ０１、Ｂ０２、Ｂ０５およびＢ０６と命名されている、本研究において使用された実際のペプチドは、環状だった。
【０１５１】
実施例２：内因性経路および二重経路のトロンビン生成アッセイにおける化合物の試験
ＦＶＩＩＩ阻害ヒト血漿を用いる、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおいて、様々な濃度の各ペプチドを試験した。結果を以下の表に示す。
【０１５２】
【表９】
2014074052.tif 000019
フルオロフォアのＡＭＣを放出するＺ−ＧＧＲ−ＡＭＣの切断に基づくインビトロトロンビン生成アッセイ、すなわち、規定の二重経路トロンビン生成アッセイを、正常ヒト血漿を用いて行った。固定された濃度のリン脂質（すなわち、３．２μＭ）を含む組成物における、ピークトロンビン生成およびトロンビンピーク時間の組織因子依存性を特徴づけた。固定された濃度の組織因子（すなわち、７．２ｐＭ）を含む組成物における、リン脂質依存性を特徴づけた。ピーク時間（ピークトロンビン生成までの時間）は、リン脂質または組織因子の濃度に依存した。最終版のこのアッセイは、具体的な説明に記載されているとおりであり、ここで、（３２μＭリン脂質および７１．６ｐＭ組織因子）を含む１０μｌの試薬Ｃ  ｈｉｇｈを総体積１００μｌにおいて使用する。
【０１５３】
ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＶＩＩＩ阻害血漿中の３．２μＭリン脂質および７．２ｐＭ組織因子を用いて、さらなる研究を行うことにより、様々な凝固因子調製物のピークトロンビン生成およびトロンビンピーク時間に対する効果を特徴づけた。本研究は、このアッセイにおける化合物の有効性を比較する根拠を提供した。簡潔には、ｒＦＶＩＩＩ（Ｂａｘｔｅｒ製のＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）ＦＶＩＩＩ）を、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中の０、５、１０、２０、４０および８０ｍＵ／ｍｌにおいて試験した。ＦＶＩＩＩ阻害血漿中の０、８、１６、３１、６３および１２５ｍＵ／ｍｌにおいてＦＥＩＢＡを試験した。ＦＶＩＩＩ阻害血漿中の０、０．１、０．４、１．６、６．３および２５ｎＭにおいてＦＶＩＩａを試験した。結果を図１に示す。ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中の組換えＦＶＩＩＩ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標））およびＦＶＩＩＩ免疫阻害血漿中のＦＥＩＢＡとＦＶＩＩａとの両方について、トロンビン生成パラメータの濃度依存性の改善が観察される。ピークトロンビンが増加し、時間のずれとトロンビンピーク時間の両方が短くなる。
【０１５４】
この規定の二重経路トロンビン生成アッセイ（ＤＤＰＴＧＡ）において、トロンビン生成を引き起こすために試薬Ｃ  ｈｉｇｈ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）を用いて、化合物を試験した。結果を以下の表に示す。このアッセイは、規定の内因性トロンビン生成アッセイ（ＤＩＴＧＡ）よりもＦＶＩＩＩ様活性に対する感度が低いにもかかわらず、いくつかの化合物が、検出可能な活性を有した。
【０１５５】
【表１０】
2014074052.tif 000020
「ピークＩＩａ」は、トロンビン生成曲線のピークにおいて生成されたトロンビンの量である。「ピーク時間」は、トロンビン生成反応の開始から最大量が生成されるまでの時間である。ＢＬＳ＝最低基準未満。
【０１５６】
トロンビンは、添加されるペプチドの非存在下でさえも、依然としてこのアッセイにおいて生成される。したがって、ピークＩＩａが、特定のペプチド濃度において「ＢＬＳ」である場合、依然としてトロンビンピークが存在するが、それは、最低濃度の基準（５ｍＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ、８ｍＵ／ｍｌのＦＥＩＢＡまたは０．１ｎＭのＦＶＩＩ）によって達成されるものよりも低い。同様に、ピーク時間が、「ＢＬＳ」であるとき、トロンビン生成がピークを迎えるまでの時間は、最低濃度の標準物質によって達成されるピーク時間よりも長い。あるペプチドは、ピーク時間に対して有意な効果を有し得るが、ピークＩＩａに対しては有意な効果を有し得ないか、またはその逆である。しかしながら、ペプチドが、ピーク時間とピークＩＩａの両方に対して効果を有することが、好ましい。Ｂ０３、Ｂ０４およびＡ１５は、トロンビン生成の両方の局面に対して正に影響した。いくつかのペプチドの場合、トロンビン生成に対する効果の濃度依存性は、高ペプチド濃度において見られず、これは、非特異的な相互作用によって説明され得る。
【０１５７】
実施例３：いくつかの枯渇血漿を用いたトロンビン生成アッセイにおける化合物の試験
具体的な説明において記載される、フルオロフォアのＡＭＣを放出するＺ−ＧＧＲ−ＡＭＣの切断に基づくインビトロトロンビン生成アッセイ、すなわち、規定の二重経路トロンビン生成アッセイを用いることにより、いくつかの枯渇ヒト血漿において化合物の効果を特徴づけた。これらの実験では、各１００μｌの反応物が、リン脂質ベシクルのホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン８０％／２０％（３．２μＭ）および１７．９ｐＭ組換えヒト組織因子を含む１０μｌの試薬Ｂを含んでいた。１０μｌのペプチド希釈物、４０μｌのＴＧＡ基質および４０μｌの血漿を、具体的な説明に記載されるように使用した。
【０１５８】
これらの実験において使用された血漿は、新鮮凍結されたものであり、第Ｖ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩ因子欠乏だった（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）。欠乏血漿の残留凝固因子レベルは、１％未満と特定された。
【０１５９】
実験において使用された枯渇血漿の各々について、２つの濃度、すなわち、５０μＭおよび８０、９０または１００μＭにおいて化合物を試験した。試験化合物を含まないネガティブコントロールを使用した。結果を以下の表に要約する。
【０１６０】
【表１１】
2014074052.tif 000021
トロンビン生成の刺激：「＋」は、刺激ありを意味し；「−」は刺激なしを意味する。コントロール実験では、ペプチドを含めなかった。
【０１６１】
試験されたすべての枯渇血漿が、ペプチドの非存在下においてトロンビン生成を示さなかったか、または非常に低いトロンビン生成を示したことから、使用された組織因子濃度では、すべての凝固因子の相互作用がトロンビン生成にとって重要であることが示唆される。いくつかのペプチドが、すべてのチモーゲン枯渇血漿（ＦＶＩＩ、ＦＸまたはＦＸＩ）においてトロンビン生成を刺激したのに対して、ＦＶ枯渇血漿中のトロンビン生成が、低いことから、共通の経路が、ペプチドによって刺激されるトロンビン生成にとって重要であることが示唆される。
【０１６２】
実施例４：規定のフィブリン沈着アッセイにおける化合物の活性
具体的な説明に記載されるように、規定のフィブリン沈着アッセイにおいて、フィブリン沈着を刺激する能力について様々なペプチドを試験した。結果を以下の表に示す。
【０１６３】
【表１２】
2014074052.tif 000022
すべての試験化合物が、ＦＶＩＩＩ阻害血漿の凝固時間およびフィブリン形成を短縮した。トロンビン生成実験と組み合わせて、このことから、試験化合物の凝血促進活性が確かめられる。ほとんどの化合物が、濃度依存的様式で作用したが、少数のものが、高濃度において低い活性を有した（これは非特異的な相互作用に起因し得る）。
【０１６４】
実施例５：化合物を特徴付けるためのインビトロアッセイ
トロンビン生成アッセイにおける活性だけでなく、薬物動態、溶解性、ＨＥＲＧ阻害および分子量についても、化合物を特徴づける。
【０１６５】
薬物動態学的（ＰＫ）研究
インビボにおける有効性研究のデザインおよび解釈のために、ＰＫ研究が必要である。血漿タンパク質の結合性、血漿中安定性およびミクロソーム安定性がすべて、このカテゴリーの中に含められる。
【０１６６】
１．血漿タンパク質の結合性
ヒト血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）、マウス血漿（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）またはマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（マトリックスと呼ばれる）に対する化合物の結合の程度を、９６ウェルマイクロ平衡透析ブロックシステム（ＨＤＴ−９６；ＨＴＤｉａｌｙｓｉｓ，ＬＬＣ，Ｇａｌｅｓ  Ｆｅｒｒｙ，ＣＴ）において測定した。簡潔には、そのシステムの各ユニットは、半透膜によって分断されたドナーチャンバーおよびレシーバーチャンバーを備える。この実験の原理は、タンパク質（およびそのタンパク質に結合した化合物）がドナーチャンバー内に保持されて、膜を通過できないということである。遊離化合物は、膜を介して両方のチャンバー間を拡散することができ、この実験中に平衡に達する。これらの実験において、半透膜は、再生セルロースから作製されたものであり、１２〜１４ｋＤの分子量カットオフを有するものだった（ｃａｔ．ｎｏ  １１０１，ＨＴＤｉａｌｙｓｉｓ，ＬＬＣ）。
【０１６７】
Ｓｉｇｍａから購入したプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ２７１４−１ＢＴＬ）をそのアッセイに含めることにより、試験化合物のタンパク質分解を阻害した。そのカクテルは、蒸留水において５０×原液として新しく調製した。マウス血清アルブミンを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において４０ｇ／Ｌにて新しく調製した。そのＰＢＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入したものであり、使用する前にｐＨ７．４に調整した。血漿は、希釈せずに使用した。プロテアーゼインヒビター原液を各マトリックス（すなわち、ＰＢＳ中のマウス血清アルブミン）に最終１×濃度において加えた。コントロール化合物のワルファリンを含むＤＭＳＯ中で各試験化合物の原液を調製した。ワルファリンは、タンパク質に強く結合する化合物であり、本実験中の膜の完全性を保証するために、これを各原液に含めた。原液のアリコートを各マトリックスに加えることにより、５μＭの試験化合物および１０μＭのワルファリンという最終濃度を得た。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．７２％（ｖ／ｖ）だった。他の成分を加えることによるマトリックスの希釈は無視できた（４％未満）。その膜片を１時間蒸留水で水和した；その膜を３０％エタノール水溶液中に２０分間浸漬し、次いで、その膜を蒸留水で２回すすいだ。すすいだ後、その膜をＰＢＳ中に入れ、使える状態にした。透析ブロックの組み立ては、製造者のプロトコルに従った。組み立てた後、１５０μｌの各マトリックス／試験化合物のアリコートを別々のドナーチャンバーに加え、１５０μｌのＰＢＳを膜の反対側の対応するレシーバーチャンバーに加えた。各マトリックス／試験化合物の残りを、さらなる解析のために−８０℃において保存した。これらのマトリックスにおける試験化合物およびワルファリンの濃度を測定し、それらの値を回収率の算出に用いた。次いで、９６ウェル透析ブロックを、３７℃に予め温められた閉鎖系の加熱された振盪器に置き、６時間インキュベートした。インキュベート後、両側をサンプリングした。試験化合物ならびにワルファリンの濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって測定した。
【０１６８】
回収率およびタンパク質結合値を以下のとおり算出した：
％回収＝［（ドナー内濃度＋レシーバー内濃度）／（マトリックスにおける測定された濃度）］×１００％（１）
％結合＝［（ドナー内濃度−レシーバー内濃度）／（ドナー内濃度）］×１００％（２）
「％回収」は、マトリックスに加えられた化合物が、ドナーおよびレシーバーチャンバーからどれくらい回収可能であるかの尺度である。回収率が、１００％未満である場合、化合物の割合は、チャンバーの膜またはプラスチック表面に結合したかもしれないか、または分解されたかもしれない。「％結合」は、化合物がどれくらいマトリックスに結合しているか、ゆえに、化合物がどれくらいドナーチャンバーとレシーバーチャンバーとの間で平衡することができないかの尺度である。
【０１６９】
Ａ０１およびワルファリン（コントロール）についての結果を以下の表に示す。
【０１７０】
【表１３】
2014074052.tif 000023
【０１７１】
【表１４】
2014074052.tif 000024
２．血漿中安定性
ヒトもしくはマウスの血漿中における化合物の半減期、またはヒトもしくはマウスの血漿中でのインキュベート後に残留している化合物のパーセンテージを以下のとおり測定する。この実験手順において、試験化合物の濃度は、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの試験化合物原液から調製される５μＭである。プロパンテリンを標準物質として使用する。試験サンプルを調製するために、ＤＭＳＯ中の試験化合物原液の１／２０希釈物を５０％アセトニトリル／５０％Ｈ２Ｏ中で調製し、次いで、これを１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内で、予め温められた（３７℃）血漿（５μｌの化合物［１／２０希釈物］＋４９５μｌの血漿）において１／１００希釈する。標準化合物の２ｍＭプロパンテリンは、ＤＭＳＯで１／４希釈し、続いて、１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内で、予め温められた血漿（５μｌの化合物［１／４希釈物］＋４９５μｌの血漿）において１／１００希釈する。それらのすべてのサンプルを３７℃の水浴内でインキュベートする。化合物またはプロパンテリン標準物質を血漿と混合した直後に、５００μｌのアセトニトリルを加える（ｔ＝０分と命名）。選択されたインキュベート時間が経過した後（通常、ｔ＝６０分）、各サンプルをさらなる５００μｌのアセトニトリルと混合する。それらのサンプルをボルテックスミキサー上で３０秒間混合し、１０分間氷上に置き、そして遠心分離するために回収する。サンプルを４℃において１０分間２００００ｇで遠心する。５００μｌの上清を新しい１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、等体積のアセトニトリルを加える。そのサンプルを、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間再度混合する。２回目の遠心分離工程（２００００ｇ，１０分，４℃）の後、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析するために、２５０μｌの上清をＨＰＬＣガラスバイアルに移す。ＨＰＬＣを行うための条件は、以下のとおりである：注入体積を２０μｌに設定する。温度を２５℃に設定する。０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）を含む９５：５〜５：９５の水：アセトニトリルの線形勾配を０．３ｍｌ／分の流速で１０分間適用する。ＰＤＡ−検出器が、２１０〜４００ｎｍにおいてスキャンする。イオントラップが２８０℃における温度のＥＳＩ源を備え、５０〜２０００ａｍｕでのフルスキャンモードで質量スキャンを行った後、１．５Ｖの衝突エネルギーを用いて動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ＭＳ２実験を行う（親イオンの最小カウント（ｍｉｎ．ｃｏｕｎｔ）として１０５）。０分間のインキュベーション時間に対する６０分間のインキュベーション時間（または最適な時間）における、フルスキャンモードでの総イオン流（ｔｏｔａｌ−ｉｏｎ−ｃｕｒｒｅｎｔ）（ｔｉｃ）中の標的化合物のプロトン化分子質量のイオンをモニターする曲線下面積（ＡＵＣ）比からパーセント安定性を算出する。
【０１７２】
結果を以下の表に示す。経時的な化合物濃度の低下は、タンパク分解性の分解および／または化学修飾に起因し得る。
【０１７３】
【表１５】
2014074052.tif 000025
３．ミクロソーム安定性
試験を用いることにより、ヒト起源または動物起源のミクロソーム調製物中での化合物の安定性を測定した。Ｃｅｒｅｐによって提供されるアッセイ（Ｆｒａｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｒｅｆ．９００−８ｈ）または以下に記載されるプロトコルにおいて、ミクロソーム安定性を測定する。１０ｍＭ／５ｍＭの化合物溶液（試験化合物、標準物質のベラパミル、イミプラミンおよびテルフェナジン）を１００％ＤＭＳＯ中で調製する。それらを、蒸留されたＨ２Ｏ／ＭｅＯＨによって希釈することにより、最終混合物中で０．４％未満の（ｌｅｓｓ  ｔｈｅｎ）ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む、アッセイにおける１μＭの最終濃度がもたらされる。安定性アッセイ用のマスターミックス：３４１４μｌの蒸留水、４４０μｌの５００ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液ｐＨ７．４、４４０μｌのＮＡＤＰ（１０ｍＭ）、２２μｌのＧｌｃ−６−Ｐ（１Ｍ）、１７．６μｌのＧｌｃ−６−Ｐ−ＤＨの１Ｕ／ｍｌ溶液、６６μｌの肝臓ミクロソーム（ラットまたはマウス、アッセイにおける最終濃度３００μｇ／ｍｌ）を、１０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎｔｕｂｅ（総容積４．４ｍｌ）中で調製する。そのマスターミックスを３７℃の水浴内において１０分間プレインキュベートする。９６ウェル−Ｕ−プレート（ＰＰ−Ｎｕｎｃ）において、３００μｌの反応混合物（プレインキュベートされたマスターミックス）とともに、１ウェルあたり５μｌの６０μＭ化合物溶液を加える。次の工程の前に、すべてのウェルを慎重に混合することにより、確実に均質の懸濁液にしなければならない。ｔ＝０分において７５μｌのサンプル（２つ組）を各化合物について採取する。プレートを密閉し、水浴／サーモミキサーに３０分間戻す。内標準も含む、試験化合物／標準物質を、２００μｌのメタノールを加えることによって抽出する。内標準は、「Ｐｅｐ７７０」（Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であり、最終濃度６．２５ｎｇ／ｍｌにおいて使用される。それらのサンプルを４℃、１３００ｇで１０分間遠心する。２００μｌの上清を、１ウェルあたり１０μｌのＤＭＳＯが入った９６ウェルプレートに移す。化合物の安定性をＨＰＬＣ−ＭＳ解析によって測定する（３つ組）。同じ手順を３０分後に繰り返す。平均「ＡＵＣ  ｔ＝０分」および「ＡＵＣ  ｔ＝３０分」の比を算出し、３０分後の残留化合物の量のパーセンテージを決定する。すべてのピークに対するシグナルとノイズとの比は、５：１またはそれより良好なものでなければならない。異なる時点における比ＡＵＣ検体：ＡＵＣ標準物質が、用いられなければならない。コントロール化合物に対して算出された安定性は、このアッセイの正当性を立証するある特定の範囲内に入っていなければならない。
【０１７４】
結果を以下の表に示す。
【０１７５】
【表１６】
2014074052.tif 000026
溶解性
Ｃｅｒｅｐによって提供されるアッセイ（Ｆｒａｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｒｅｆ．９００−１１ａ）において、または以下のプロトコルに従って、ｐＨ７．４のＰＢＳにおいて水溶解性を測定する。この手順の目的は、ＨＰＬＣを用いて緩衝液における候補薬（被検体）の飽和濃度を推定することによって、緩衝液におけるその候補の溶解性を決定することである。有機溶媒における既知濃度の候補を、標準物質として使用する。最初の工程として、ＤＭＳＯにおいて試験化合物の原液を調製しなければならない。化合物の最大溶解性に応じて、ＤＭＳＯにおける５０ｍＭという濃度が、達成されるべきである。ＤＭＳＯ原液を、ＤＭＳＯ（１００％参照溶液）および緩衝液（試験溶液）を用いて５０μＭという最終濃度に希釈することにより、各々、最大体積５００μＬを得る。両方の溶液を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ「サーモミキサーコンフォート」において少なくとも６０分間、２５℃、９５０ｒｐｍにおいて振盪する。その懸濁液を２２３３０ｇで少なくとも２分間遠心し、１００μＬの上清をガラスバイアル内に置かれたポリプロピレン挿入物に移し、止め輪キャップで閉じる。あるいは、前に記載された出発溶媒体積の半分を用いて、それらの溶液をマイクロタイタープレートにおいて調製することができる。溶解性を決定するために、すべてのサンプルをＨＰＬＣによって３つ組で解析する。注入体積は、少なくとも１０μＬである。得られたデータを「Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア」（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって解析する。有機溶液の解析からのピークを積分し、算術平均を「ＡＵＣ１」（ＨＰＬＣにおいて注入された既知量の参照面積）として報告する。同じ手順を、緩衝溶液の解析から得られたスペクトルに適用することにより、「ＡＵＣ２」（緩衝液に溶解された未知量の化合物の面積）を得る。一般に、ＡＵＣは、２０面積単位（ａｒｅａ  ｕｎｉｔｓ）よりも大きく（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈｅｎ）なければならず、ノイズに対するシグナル（ピークの高さ）は、３よりも良好でなければならない。平均「ＡＵＣ２」と「ＡＵＣ１」との比を算出し、それにより、緩衝液中に溶解された化合物の量のパーセンテージが得られ、溶解性が、μＭを単位として報告され得る。
【０１７６】
結果を以下の表に示す。
【０１７７】
【表１７】
2014074052.tif 000027
ＨＥＲＧ阻害
ＱＴ延長を、パッチクランプ手法またはＲｂ＋流出によって測定されるＨＥＲＧ阻害によって評価する。
【０１７８】
Ｒｂ＋流出法（Ｃｅｒｅｐ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ．Ｒｅｆ．９００−３６ｒｂ）を、最初のスクリーニングのために用いる。Ｒｂ＋流出アッセイでは、アッセイの適格性を評価するために、試験化合物と同時に参照化合物（アステミゾール）を試験した。それは、１０μＭにおいて試験され、そのデータを、Ｃｅｒｅｐにおいて測定された既存値と比較した。
【０１７９】
ＨＥＲＧ阻害を精密に特徴づけるために、パッチクランプアッセイ（Ｃｅｒｅｐ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｒｅｆ．９００−３６）を適用する。一般的な力価序列システムをＲｏｃｈｅら、２００２，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ３：４５５−４５９から採用する。アッセイの感度が変化しなかったことを確かめるために、１０ｎＭ  Ｅ−４０３１（Ｗａｋｏ，ｃａｔ．ｎｏ．０５２−０６５２３）を用いて同じ（クローン）バッチの細胞において行われる別個の実験から、Ｃｅｒｅｐにおいて歴史的に得られたデータ（５８．４±２．０％阻害、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）に匹敵する結果（５６．７±１．８％阻害、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が得られた。試験化合物（１０ｍＭ原液）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。その１μＭの溶液は、０．０１％ＤＭＳＯを含んでいた。最大１％ＤＭＳＯを含む両方の（Ｂａｔｈ）溶液が、ＨＥＲＧによって電気信号に直されるテール電流に対して有意な効果を有しない。
【０１８０】
１０μＭにおけるＲｂ＋流出法によるいくつかの化合物のスクリーニングは、ＨＥＲＧチャネル活性の阻害を示さなかった。より感度の高いパッチクランプアッセイでは、化合物Ａ０１、Ａ０５およびＡ１６が、低力価ＨＥＲＧチャネル遮断物として分類され得るのに対し、Ｂ０３は、高力価ＨＥＲＧチャネル遮断物として同定された。結果を以下の表に示す。
【０１８１】
【表１８】
2014074052.tif 000028
分子量
分子量を、任意の対イオンまたは付加物を除いた単量体分子の理論的質量として定義する。化合物の分子量を以下の表に示す。
【０１８２】
【表１９】
2014074052.tif 000029
実施例６：ＡＤＭＥ−Ｔｏｘ
実施例５に記載されたように、様々な化合物のＡＤＭＥ−Ｔｏｘ解析を行った。要約結果を以下の表に示す。
【０１８３】
【表２０】
2014074052.tif 000030
簡潔には、ＰＢＳｐＨ７．４において水溶解性を試験した。結果は、μＭを単位として示される。ヒト血漿中において３０分間、タンパク質分解に対する安定性を試験した。各々についての結果は、％安定性として示される。マウスミクロソーム調製物において３０分間、ミクロソーム安定性を試験した。結果は、％安定性として示される。１μＭのペプチドまたはペプチド誘導体におけるパッチクランプ法を用いて、ＨＥＲＧチャネル阻害を試験し、％阻害として示す。
【０１８４】
実施例７：動物モデル
以下のアッセイを動物において行う。
【０１８５】
１．急性毒性学
毒性学研究は、有毒作用に起因する態度の変化を適用の直後および１日２回モニターすること；体重のモニタリング；脳、心臓、腎臓、肝臓、肺の組織病理学を含んだ。
【０１８６】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて実験を行った。
【０１８７】
２．薬物動態
化合物の薬物動態を、１〜３０ｍｇ／ｋｇにおいてＣ５７Ｂｌ／６マウスまたはＷｉｓｔａｒラットにおいて試験した。ＬＣ−ＭＳを用いて、適切な間隔で血流中の化合物濃度をモニターした。
【０１８８】
３．循環解析
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて血圧および心拍数をモニターし、心電図を採った。
【０１８９】
４．動物疾患モデル
ＦＶＩＩＩ−／−（Ｅ１７）マウス、ＦＩＸ−／−マウスおよびＣ５７Ｂｌ／６コントロールマウスにおける尾クリップモデルを用いた。定量化されるパラメータは、総失血量、出血時間、出血速度および生存だった。
【０１９０】
実施例８：急性毒性学
体重が１８〜２０ｇのＣ５７Ｂｌ／６マウスに、適当なビヒクル中の化合物を、１０ｍｌ／ｋｇにおいて、尾静脈にｉ．ｖ．投与するか、またはｉ．ｐ．もしくはｓ．ｃ投与した。投与された化合物の量は、０．０７５〜１２５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）、１５〜１２５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）および１２５ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）の範囲だった。１群あたり４匹のマウスだった。有毒作用に起因する態度の変化を、化合物を投与した直後およびその６０分後にモニターした。投与後５日間にわたって体重をモニターした。投与の５日後に、マウスを選別し、剖検を行った。脳、心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓の生検を実施した。結果を以下の表に記載する。
【０１９１】
【表２１】
2014074052.tif 000031
上の表では、投与後の６０分間で毒性不検出、いくらか毒性または重度の毒性を生じる試験された最大用量が記録されている。「毒性不検出」は、急性の毒性の観察結果がなかったことを示す。「いくらか毒性」は、失調またはカタレプシーが記録されたが、動物は死亡しなかったことを示す。「重度の毒性」は、動物のうちの１匹が化合物適用の１時間以内に死亡したことを示す。
【０１９２】
要約すると、化合物の大部分が、十分に許容された。特定の経路によって投与されたときに重度の毒性を生じた化合物の用量は、薬物動態、循環解析または動物疾患モデルにおいてその経路によって試験されなかった。
【０１９３】
化合物の大部分については、最高用量でさえも、生存マウスから５日後に回収された生検サンプルにおいて肉眼での病理所見は観察されず、このことから、それらの化合物が十分に許容されたことが示唆される。どの動物においても同定された唯一の病理学的変化は、肝臓、腎臓、肺または心臓における軽度の異常だった。これらは、おそらく、化合物に関連しない軽度の感染症に起因するか、または選別に起因する、個々の動物における自発性の観察結果だった。
【０１９４】
試験された各化合物について、負の応答を示唆する生存マウスの平均体重に対する作用が無かったことが顕著だった。
【０１９５】
実施例９：化合物の薬物動態
ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与後の血漿中の化合物濃度をモニターするために、薬物動態学的研究を行った。研究は、体重が約２０ｇのＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行った。
【０１９６】
各ペプチドに対して、すべての投与経路について同じ処方物を使用し、それらは以下のとおりだった：Ａ０１は、５％ＤＭＳＯ、５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０において製剤化され；Ａ０２およびＡ０９は、各々、５％ＤＭＳＯ、３０％ＰＥＧ４００（ポリエチレングリコール）５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４において製剤化され；Ａ０５は、５％ＤＭＳＯ、２０ｍＭグリシンｐＨ９．０において製剤化され；Ａ０６およびＡ０７は、各々、５％ＤＭＳＯ、０．９％ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４において製剤化された。
【０１９７】
ＥＳＩ源を備えた、質量分析計ＬＣＱ  ｃｌａｓｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，ＵＳ）またはＡｄｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，ＵＳ）と組み合わされたＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣにおけるＨＰＬＣ−ＭＳによって、血漿中のペプチド濃度を解析した。すべてのＨＰＬＣ実験は、線形勾配：溶出剤Ａ  ０．０５％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＦＡ）の水溶液；溶出剤Ｂ  ０．０５％ＴＦＡのアセトニトリル溶液；流速０．３ｍＬ／分を１０分間用いるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ−１８  Ｌｕｎａカラム（５０ｍｍ×２．０ｍｍ，５μｌの注入体積）において行われた。２２０〜４００ｎｍにおけるＵＶスペクトルをＰＤＡによって記録した。内標準は、１００％メタノール中の０．１μｇ／ｍｌ溶液として調製する。５０μｌの血漿および５０μｌの内標準を混合する。１００μｌのメタノールを加え、完全に混合する。氷上で３０分間インキュベートした後、バイアルを４℃において１５分間遠心する（２０８２０ｇ）。１５０μｌの上清をＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１９８】
ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与後の結果を以下の表に示す。簡潔には、ｉ．ｖ．投与後の血漿からのペプチドのクリアランスは、おおよそ対数的な経過をたどった。ｉ．ｐ．投与後については、４０〜６０分後にＣｍａｘに達した。次いで、化合物濃度が低下した。このプロファイルは、ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与にとって特徴的である。
【０１９９】
【表２２】
2014074052.tif 000032
実施例１０：Ａ０１の投与後の循環解析
３匹の雄および３匹の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（各々、約２０ｇの体重）の３群において、平均動脈圧および心拍数をモニターし、心電図を採った。それらの群を、１０ｍｌ／ｋｇ  ＮａＣｌをｉ．ｖ．投与される「コントロール」；１０ｍｌ／ｋｇをｉ．ｖ．投与される「ビヒクル」；または２０ｍｇ／ｋｇでビヒクル中のＡ０１をｉ．ｖ．投与される「化合物」に割り当てた。「ビヒクル」は、注射用水におけるＤＭＳＯ５％、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．０５％だった。
【０２００】
各マウスについて、食塩水／ヘパリンで満たされたカテーテルを頚動脈に固定した。そのカテーテルを、トランスデューサーを介して血圧Ｐｌｕｇｓｙｓ−モジュール（Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＨＳＥ））に連結した。ＥＣＧ電極を、皮下に埋め込み、ＥＣＧ  Ｐｌｕｇｓｙｓ−モジュール（ＨＳＥ）を介してＰＣに連結した。ＥＣＧから心拍数を算出した。循環パラメータを安定化させるために少なくとも１０分後に、食塩水、ビヒクルまたは化合物を、必要に応じて、頚静脈に接続されたカテーテルを介して投与した。投与後の６０分間にわたって循環パラメータをモニターし、記録した。各動物について、研究薬投与後の観察時間内の平均動脈圧および心拍数の経過を、線形台形公式を用いる曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて推定した。個別のＡＵＣ（Ａ０１  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）を、ビヒクル（１０ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）および食塩水（１０ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）のＡＵＣと比較した。帰無仮説（化合物とビヒクルまたは食塩水との間に差はない）を、正確なウィルコクソン順位和検定を用いて評価した。多重比較のために、非調整および調整両側ｐ値を算出した。多重性についての調整を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ法を用いることによって行った。有意水準は、５％に設定した。すべての統計解析を、Ｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．４．０を用いて行った。差はないという帰無仮説を、両側対立仮説に対して試験した。結果を以下の表に示す。
【０２０１】
【表２３】
2014074052.tif 000033
Ａ０１  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．と食塩水１０ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｖ．との間、ならびにＡ０１  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．とビヒクル１０ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｖ．との間の、研究薬投与後の６０分以内の平均動脈圧のＡＵＣに統計学的に有意な（５％レベル）差はなかった。Ａ０１  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．と食塩水１０ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｖ．との間、ならびにＡ０１  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．とビヒクル１０ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｖ．との間の、研究薬投与後の６０分以内の心拍数のＡＵＣに統計学的に有意な（５％レベル）差はなかった。
【０２０２】
実施例１１：動物疾患モデル−コントロール実験
ＦＶＩＩＩ（Ｅ１７）−／−、ＦＩＸ−／−（Ｌｉｎ  ＨＦ  Ｂｌｏｏｄ  １９９７；９０：３９６２−６）および野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける出血パラメータ、ならびに凝固因子調製物に対するそれらの応答を特徴づけるマウス尾クリップアッセイを開発するために実験を行った。
【０２０３】
試験された凝固因子調製物は、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびＩｍｍｕｎｉｎｅ（登録商標）だった。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）は、ｒＦＶＩＩＩ調製物（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）である。Ｉｍｍｕｎｉｎｅ（登録商標）は、精製された血漿ＦＩＸ調製物（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）である。
【０２０４】
具体的な説明において記載されるように、尾クリップアッセイにおいて尾クリップ後の６２分間、失血量をモニターした。ＦＶＩＩＩ−／−マウスに、２５、５０もしくは１００Ｕ／ｋｇのｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））ｉ．ｖ．投与するか、またはビヒクル単独を投与した。そのビヒクルは、３８ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのトレハロース、１０８ｍＥｑ／ｌのナトリウム、１２ｍＭのヒスチジン、１２ｍＭのＴｒｉｓ、１．９ｍＭのカルシウム、０．１７ｍｇ／ｍｌのＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０、０．１ｍｇ／ｍｌのグルタチオンである、Ａｄｖａｔｅ処方物緩衝液だった。コントロールとして、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにビヒクル単独を投与した。ｒＦＶＩＩＩの投与によって、６２分間にわたって、失血量の用量依存的減少がもたらされた。この実験に対する生存データを以下の表に示す。
【０２０５】
【表２４】
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５０、１００または２００Ｕ／ｋｇのＩｍｍｕｎｉｎｅ（登録商標）ＦＩＸをｉ．ｖ．投与されたか、またはビヒクル単独を投与されたＦＩＸ−／−マウスの失血量を、尾クリップ後の６２分間、モニターした。コントロールとして、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにビヒクル単独を投与した。ＦＩＸの投与によって、６２分間にわたって失血量の用量依存的減少がもたらされた。この実験に対する生存データを以下の表に示す。
【０２０６】
【表２５】
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このデータは、ＦＶＩＩＩ−／−モデルにおいて２５〜１００Ｕ／ｋｇにおけるＡｄｖａｔｅ（登録商標）ＦＶＩＩＩが、出血パラメータおよび生存を用量依存的に改善することを示している。ＦＩＸ−／−モデルにおいて、５０〜２００Ｕ／ｋｇにおけるＩｍｍｕｎｉｎｅ（登録商標）ＦＩＸは、出血パラメータおよび生存を用量依存的に改善する。したがって、ＦＶＩＩＩ−／−モデルは、リード化合物の凝血ＦＶＩＩＩ活性を試験するための適切なモデルである。ＦＩＸ−／−モデルは、化合物の凝血ＦＩＸ活性を試験するための適切なモデルである。
【０２０７】
実施例１２：動物疾患モデル−Ａ０１の有効性
ＦＶＩＩＩ−／−マウスの出血パラメータおよび生存に対する投与されたＡ０１の効果を、具体的な説明に記載される尾クリップモデルにおいて試験した。同様の実験をＦＩＸ−／−マウスにおいて行った。
【０２０８】
尾クリップの５分前に２０ｍｇ／ｋｇのＡ０１をｉ．ｖ．投与された８匹の雄および８匹の雌のＦＶＩＩＩ−／−マウスの群における尾クリップ後の失血量の平均体積は、ビヒクル単独を投与されたマウスのコントロール群による失血量の平均体積と比べて、大部分の時点において有意に異なった（ｐ＜０．０５）。ビヒクルは、注射用水における、５％ＤＭＳＯ、５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０だった。尾クリップの５２分後および６２分後において、差がｐ＜０．０１において有意だった。データを図２および以下の表に示す。この実験においてマウスの生存曲線を比較するために使用したログランク検定は、ビヒクルコントロールよりも２０ｍｇ／ｋｇのＡ０１  ｉ．ｖ．を用いたほうが統計学的に有意に長い生存時間を示している（ｐ値＝０．００２８）。
【０２０９】
【表２６】
2014074052.tif 000036
上記の実験を繰り返すことにより、その再現性の示唆が得られた。結果を以下の表に示す。独立して行われたこれらの２つの実験においてばらつきが観察されているが、Ａ０１で処置された動物は、より少ない出血であり、より長く生存する。
【０２１０】
【表２７】
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同じモデルを用いてさらなるデータを得たが、尾クリップを０．５ｃｍではなく１ｃｍとし、マウスを性別に従ってグループ化した。作用物質をｉ．ｖ．投与した。この実験では、Ａ０１は、雄マウスよりも雌において有効であると見られた。結果を以下の表に示す。
【０２１１】
【表２８】
2014074052.tif 000038
別段述べられない限り、群は、同数の雄および雌マウスを含んでいた。
【０２１２】
尾クリップの５分前に２０ｍｇ／ｋｇのＡ０１をｉ．ｖ．投与された１６匹のＦＩＸ−／−マウスの群における尾クリップ後の失血量の平均体積は、ビヒクル単独を投与されたマウスのコントロール群による失血量の平均体積と比べて、いずれの時点においても有意に異ならなかった（ｐ＜０．０５）。Ａ０１を投与されたマウスの生存と、ビヒクル単独を投与されたマウスの生存とに有意差はなかった。
【０２１３】
これらの結果から、Ａ０１が、尾クリップ後に失血量を減少させ、生存時間を延長することによってＦＶＩＩＩ−／−マウスにおけるＦＶＩＩＩの欠乏について少なくとも部分的に補償し得るが、ＦＩＸ−／−マウスでは効果を有しないことが証明される。Ａ０１は、血友病モデルにおいて有効性を示したので、最も好ましいペプチドと考えられる。
【０２１４】
実施例１３：ＦＶＩＩＩ−／−マウス尾クリップモデルにおいて試験する化合物の結果
０．５ｃｍの尾クリップを用いるＦＶＩＩＩ−／−尾クリップモデルにおけるｉ．ｐ．投与によって、Ａ０１をさらに試験した。データを以下の表に要約する。
【０２１５】
【表２９】
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２０ｍｇ／ｋｇのＡ０１を投与された雌マウスは、１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルをｉ．ｐ．投与された雌マウスよりも統計学的に有意（５％レベル）に長い生存時間を有した（両側ｐ値ｐ＝０．００７３；ログランク検定）。２０ｍｇ／ｋｇのＡ０１をｉ．ｐ．投与された雄マウスと、１０ｍｌ／ｋｇのビヒクルをｉ．ｐ．投与された雄マウスとの間には、生存曲線の統計学的有意差はなかった（５％レベル）。この実験では、コントロール群内の雄は、コントロール群内の雌よりも良好に生存すると見られた。
【０２１６】
実施例１４：リード化合物を特徴づけるための実験の要約
以下の化合物は、規定の内因性トロンビン生成アッセイにおいて活性を有する：Ａ０１、Ａ０３、Ａ０５、Ａ１９、Ｂ０１、Ａ０２、Ｂ０３、Ｂ０５、Ｂ０６、Ａ０６、Ａ２０、Ａ０７、Ａ０８、Ａ０９およびＢ０７。これらのうち、Ａ０３、Ａ０２、Ｂ０３、Ａ０８およびＡ０９は、１００μＭにおいて少なくとも１２００ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡのトロンビン生成活性を有する。
【０２１７】
以下の化合物は、規定の二重経路トロンビン生成アッセイにおいて活性を有する：Ａ０２、Ａ０３、Ａ０８、Ａ０９、Ａ１８、Ｂ０３、Ｂ０４、Ａ０７、Ａ１５、Ａ０６およびＡ１７。これらのうち、Ａ０９は、５０μＭにおいて少なくとも１０ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡのピークＩＩａ活性を有した。Ｂ０３、Ｂ０４およびＡ１５は、５０または１００μＭにおいて少なくとも１０ｍＵ／ｍＬのＦＥＩＢＡのピークＩＩａ活性を有した。
【０２１８】
以下の化合物は、規定のフィブリン沈着アッセイにおいて活性を有する：Ａ０１、Ｂ０１、Ａ０５、Ｂ０３、Ａ０６およびＡ０７。
【０２１９】
以下の化合物は、ヒト血漿中での３０分間のインキュベート後に少なくとも５０％の安定性を有する：Ａ０１、Ａ１９、Ａ０７、Ａ２０、Ａ０６、Ａ０２、Ａ０３、Ａ０８、Ａ０９、Ｂ０７、Ｂ０６、Ｂ０５およびＡ０５。
【０２２０】
以下の化合物は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４において少なくとも２５μＭの溶解性を有する：Ａ０９、Ｂ０３、Ｂ０７、Ｂ０６、Ｂ０５、Ａ０７、Ａ２０、Ａ０６、Ａ０２、Ａ０３およびＡ１６。これらのうち、Ｂ０３、Ｂ０７、Ｂ０５、Ａ０７、Ａ２０、Ａ０６、Ａ０３およびＡ１６は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４において少なくとも１００μＭの溶解性を有する。
【０２２１】
Ａ０１、Ａ０５およびＡ１６は、低力価ＨＥＲＧチャネル遮断物として同定された。
【０２２２】
Ａ０１は、ＦＶＩＩＩ−／−マウスにおける尾クリップアッセイにおいて活性を有すると同定された。
【０２２３】
実施例１５：成人被験体における血友病Ａの処置
高用量ＦＶＩＩＩ治療後にＦＶＩＩＩに対する同種抗体インヒビターを産生することは血友病Ａ患者に対して特徴的である。代表的なシナリオでは、患者の血漿から調製される血清中のそのような抗体の存在は、臨床医によってモニターされる。抗体応答の力価が、許容し難いほど高くなるとき（例えば、約５ＢＵ）、臨床医は、患者にＦＶＩＩＩを注入することを中止し、そしてペプチドＡ０１などの本発明のペプチドを投与し始めることを決め得る。
【０２２４】
本ペプチドは、ＵＳ５，４３９，６８６に記載されているように、アルブミン殻内の直径約１０μｍの微小粒子として製剤化され得、水性媒質に懸濁され得る。患者は、噴霧器を用いて吸入によってその処方物を自己投与し得る。５または１０ｍｇという１日量または１日２回の用量が、吸入され得る。臨床医は、有効性を確かめるために、ペプチド治療を開始したすぐ後に部分トロンボプラスチン時間を試験し得る。その結果に応じて、用量をしかるべく変更させ得る。用量を大幅に増加させる必要がある場合、より小さい微小粒子、代表的には直径約５μｍの小さい微小粒子が使用され得、それらを静脈内に投与し得る。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2014074052000001.app
【外国語明細書】
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