(57)【要約】      （修正有）【課題】薬剤耐性乳がん治療に対して、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子を提供する。【解決手段】ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子を、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制用核酸分子とする。（ａｓ１）特定の塩基配列からなるヌクレオチド。（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、薬剤耐性乳がんのターゲットであるＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド。（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制用核酸分子。
（ａｓ１）配列番号１〜５のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、薬剤耐性乳がんのターゲットであるＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド
【請求項２】
前記発現抑制配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの３’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項１記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項３】
前記発現抑制配列が、前記（ａｓ１）のヌクレオチドを含む、配列番号６〜１０のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドである、請求項１または２記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項４】
前記発現抑制配列の長さが、１８〜３２塩基長である、請求項１から３のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項５】
さらに、前記発現抑制配列とアニーリングする相補配列を有し、
前記相補配列は、前記発現抑制配列における前記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項６】
前記相補配列における前記ヌクレオチドが、下記（ｓ１）（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドである、請求項５記載の発現抑制用核酸分子。
（ｓ１）前記（ａｓ１）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ２）前記（ａｓ２）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ３）前記（ａｓ３）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
【請求項７】
前記（ｓ１）のヌクレオチドが、配列番号１１〜１５のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチドである、請求項６記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項８】
前記相補配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの５’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項５から７のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項９】
前記相補配列が、前記（ｓ１）のヌクレオチドを含む、配列番号１６〜２０のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドである、請求項６から８のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項１０】
前記オーバーハング配列が、１〜３塩基長である、請求項２から９のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項１１】
前記発現抑制用核酸分子が、２つの一本鎖から構成される二本鎖核酸分子であり、そのアンチセンス鎖が、前記発現抑制配列を有し、そのセンス鎖が、前記相補配列を有する、請求項５から１０のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
薬学的組成物である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＰＮ２遺伝子の発現に起因する疾患の治療用である、請求項１２または１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記疾患が、がん疾患または薬剤耐性疾患である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記がん疾患が、乳がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、膵臓がんからなる群から選択された少なくとも１つのがん疾患である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子を使用することを特徴とする抑制方法。
【請求項１８】
前記発現抑制用核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項１７記載の抑制方法。
【請求項１９】
前記発現抑制用核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項１７または１８記載の抑制方法。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現抑制用核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする、ＲＰＮ２遺伝子の発現に起因する疾患の治療方法。
【請求項２１】
前記疾患が、がん疾患または薬剤耐性疾患である、請求項２０記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん疾患または薬剤耐性疾患の原因となるＲＰＮ２遺伝子の発現抑制用核酸分子、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳がんは、日本人女性のがん罹患率のトップであり、他の国においても、女性のがん罹患率の上位を占めるに致っている。乳がんの治療には、トラスツズマブ、ドセタキセル等の薬物治療が行われているが、あらたに、前記薬物に抵抗性を示す薬剤耐性乳がんの問題が、指摘されている。
【０００３】
前記薬剤耐性乳がんでは、ＲＰＮ２遺伝子が、高発現していることが報告されている。そして、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制が、前記薬物耐性乳がんの治療に有効であることも報告されており、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制剤の開発も進められている（特許文献１）。しかし、現状報告されている、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制剤は、実用化に致っておらず、より優れたＲＰＮ２遺伝子の発現抑制剤の提供が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／１４４９８５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Honma  K,  Iwao-Koizumi  K,  Takeshita  F,  Yamamoto  Y,  Yoshida  T,  Nishio  K,  Nagahara  S,  Kato  K,  Ochiya  T.  “RPN2  gene  confers  docetaxel  resistance  in  breast  cancer.”、Nat  Med.、2008  Sep  14、vol.9、939-48頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ＲＰＮ２遺伝子の発現を効率的に抑制可能な新たな核酸分子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明のＲＰＮ２遺伝子の発現抑制用核酸分子は、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａｓ１）配列番号１〜５のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、薬剤耐性乳がんのターゲットであるＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド
【０００８】
本発明の組成物は、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の発現抑制用核酸分子を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の発現抑制用核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の発現抑制方法は、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制用核酸分子を使用することを特徴とする。
【００１１】
本発明のＲＰＮ２遺伝子の発現に起因する疾患の治療方法は、前記本発明の発現抑制用核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸分子によれば、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制が可能である。このため、本発明は、ＲＰＮ２遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、がん疾患、薬剤耐性疾患等の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１におけるＲＰＮ２遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例１におけるＲＰＮ２遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例１におけるＲＰＮ２遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例１におけるＲＰＮ２遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１５】
（発現抑制用核酸分子）
本発明の発現抑制用核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」ともいう）は、前述のように、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａｓ１）配列番号１〜５のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド
【００１６】
以下、前記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを、ａｓヌクレオチドといい、それぞれａｓ１ヌクレオチド、ａｓ２ヌクレオチド、ａｓ３ヌクレオチドという。
【００１７】
本発明において、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制は、特に制限されず、例えば、遺伝子の転写自体の抑制でも、遺伝子の転写産物を分解することによる抑制でも、遺伝子の転写産物からのタンパク質の翻訳を阻害することによる抑制でもよい。また、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制は、例えば、本来の機能を有するＲＰＮ２タンパク質の発現抑制であってもよく、タンパク質が発現された場合、前記タンパク質は、例えば、前記機能が阻害されたタンパク質でもよいし、前記機能が欠失したタンパク質でもよい。前記ＲＰＮ２遺伝子は、例えば、既存のデータベースに登録されている情報を参照できる。具体例として、ヒト由来ＲＰＮ２遺伝子は、例えば、ＮＣＢＩ  アクセッション番号Ｙ００２８２で登録されている。
【００１８】
前記発現抑制配列は、例えば、前記ａｓヌクレオチド配列からなる配列でもよいし、前記ａｓヌクレオチド配列を含む配列でもよい。
【００１９】
前記発現抑制配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。また、本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００２０】
前記ａｓ１ヌクレオチドの配列を以下に示す。なお、前記配列番号１〜５の塩基配列からなるヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現抑制配列、および前記ヌクレオチドを含む核酸分子を、それぞれ、以下に示す、配列番号の前の名称で表わすこともある。
ＮＩ−００６７（配列番号１）
3’−GGAUGUUCGAGUACCUAGU−5’
ＮＩ−００６９（配列番号２）
3’−GGCAUCUCGAGUCUCAGUU−5’
ＮＩ−００７３（配列番号３）
3’−CUAGGCCUAACCACGGUUA−5’
ＮＩ−００７４（配列番号４）
3’−CGUGUAAUCAAGGUCUUCU−5’
ＮＩ−００７５（配列番号５）
3’−GUUCUUGUUAAGUGUCAUA−5’
【００２１】
前記ａｓ２ヌクレオチドにおいて、「１もしくは数個」は、特に制限されない。「１もしくは数個」は、例えば、１〜７個であり、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜４個、さらに好ましくは、１個、２個または３個である。前記ａｓ２ヌクレオチドは、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドと同様の機能を有していればよく、より詳細には、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有していればよい。
【００２２】
前記ａｓ３ヌクレオチドにおいて、同一性は、９０％以上であり、好ましくは、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。前記ａｓ３ヌクレオチドは、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドと同様の機能を有していればよく、より詳細には、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制機能を有していればよい。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２３】
前記発現抑制配列は、前述のように、前記ａｓヌクレオチド配列からなる配列でもよいし、前記ａｓヌクレオチド配列を含む配列でもよい。後者の場合、前記発現抑制配列は、例えば、さらに、オーバーハング配列を有する形態があげられる。前記発現抑制配列において、例えば、前記ａｓヌクレオチドの５’末端および３’末端のいずれかに、前記オーバーハング配列が付加されていてもよく、好ましくは３’末端である。
【００２４】
前記オーバーハング配列は、特に制限されず、例えば、長さおよび配列も、特に制限されない。前記オーバーハング配列は、例えば、（Ｎ）ｎで表わすことができる。Ｎは、塩基であり、例えば、天然の塩基でもよいし、人工塩基でもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵおよびＴがあげられる。前記ｎは、正の整数であり、オーバーハング配列の塩基長を示す。前記オーバーハング配列（Ｎ）ｎの長さ（ｎ）は、例えば、１、２、３塩基長であり、好ましくは１または２塩基長であり、より好ましくは２塩基長である。前記オーバーハング配列（Ｎ）ｎの長さが２塩基長以上の場合（ｎ≧２）、連続する塩基（Ｎ）は、例えば、同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記オーバーハング配列（Ｎ）ｎの配列は、例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンスのオーバーハング配列が適用できる。前記（Ｎ）ｎは、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。
【００２５】
前記発現抑制配列が前記オーバーハング配列を有する場合、前記発現抑制配列は、具体例として、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドを含む、配列番号６〜１０のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドがあげられる。以下の配列において、（Ｎ）ｎは、オーバーハング配列であり、特に制限されず、前述の通りであり、好ましくは、前記オーバーハング配列の塩基長ｎが２である。また、各配列の横に、オーバーハング配列の一例（3’-5’方向に記載）を示すが、本発明は、これには限定されない。また、下記配列において、（Ｎ）nを除く領域が、前記ａｓ２ヌクレオチドまたは前記ａｓ３ヌクレオチドであってもよい。
ＮＩ−００６７（配列番号６）
TT        3’−(N)nGGAUGUUCGAGUACCUAGU−5’
ＮＩ−００６９（配列番号７）
TT        3’−(N)nGGCAUCUCGAGUCUCAGUU−5’
ＮＩ−００７３（配列番号８）
TT        3’−(N)nCUAGGCCUAACCACGGUUA−5’
ＮＩ−００７４（配列番号９）
TT        3’−(N)nCGUGUAAUCAAGGUCUUCU−5’
ＮＩ−００７５（配列番号１０）
TT        3’−(N)nGUUCUUGUUAAGUGUCAUA−5’
【００２６】
本発明の核酸分子は、さらに、前記発現抑制配列とアニーリングする相補配列を有することが好ましい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列における前記ａｓ１ヌクレオチド、前記ａｓ２ヌクレオチドまたは前記ａｓ３ヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド（以下、相補的ヌクレオチドという）を含む。
【００２７】
前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列とアニーリング可能であればよい。前記相補配列における前記相補的ヌクレオチドと、前記発現抑制配列における前記ａｓヌクレオチドとは、その相補性が、例えば、９０％以上が好ましく、より好ましくは、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であり、特に好ましくは１００％である。なお、前記発現抑制配列と前記相補配列とは、例えば、前者のａｓヌクレオチドと後者の相補的ヌクレオチドとが、前述のような相補性を示すことが好ましく、前者のａｓヌクレオチド以外の領域および後者の相補的ヌクレオチド以外の領域は、相補的でもよいし、非相補的でもよい。前記発現抑制配列と前記相補配列とをアライメントした際、例えば、前者のａｓヌクレオチド以外の領域および後者の相補的ヌクレオチド以外の領域は、例えば、対応する配列が存在しなくてもよい。具体例として、前記オーバーハング配列があげられる。すなわち、前記発現抑制配列と前記相補配列とをアライメントした際、前記発現抑制配列は、３’側にオーバーハング配列が突出した形状となり、前記相補配列は、５’側にオーバーハング配列が突出した形状となってもよい。
【００２８】
前記相補配列における前記相補的ヌクレオチドは、例えば、下記（ｓ１）（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドがあげられる。
（ｓ１）前記（ａｓ１）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ２）前記（ａｓ２）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ３）前記（ａｓ３）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
【００２９】
以下、前記（ｓ１）、（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドを、ｓヌクレオチドといい、それぞれｓ１ヌクレオチド、ｓ２ヌクレオチド、ｓ３ヌクレオチドという。
【００３０】
前記相補配列は、例えば、前記ｓヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記ｓヌクレオチドを含む配列でもよい。
【００３１】
前記相補配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。
【００３２】
前記ｓ１ヌクレオチドの配列の具体例を以下に示す。配列番号１１〜１５の配列は、それぞれ、前記配列番号１〜５の塩基配列からなるａｓ１ヌクレオチドに完全に相補的である。なお、前記配列番号１１〜１５の塩基配列からなるヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現抑制配列、および前記ヌクレオチドを含む核酸分子を、それぞれ、以下に示す、配列番号の前の名称で表わすこともある。
ＮＩ−００６７（配列番号１１）
5’−CCUACAAGCUCAUGGAUCA−3’
ＮＩ−００６９（配列番号１２）
5’−CCGUAGAGCUCAGAGUCAA−3’
ＮＩ−００７３（配列番号１３）
5’−GAUCCGGAUUGGUGCCAAU−３’
ＮＩ−００７４（配列番号１４）
5’−GCACAUUAGUUCCAGAAGA−3’
ＮＩ−００７５（配列番号１５）
5’−CAAGAACAAUUCACAGUAU−3’
【００３３】
前記相補配列は、前述のように、前記相補的ヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記相補的ヌクレオチドを含む配列でもよい。後者の場合、前記相補配列は、例えば、さらに、オーバーハング配列を有する形態があげられる。前記相補配列において、前記相補的ヌクレオチドの５’末端および３’末端のいずれかに、前記オーバーハング配列が付加されていてもよく、好ましくは３’末端である。
【００３４】
前記オーバーハング配列は、特に制限されず、前記発現抑制配列における記載を援用できる。前記相補配列における前記オーバーハング配列（Ｎ）ｎの配列は、例えば、ｓｉＲＮＡのセンスのオーバーハング配列が適用できる。前記（Ｎ）ｎは、例えば、５’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。
【００３５】
前記相補配列が前記オーバーハング配列を有する場合、前記相補配列は、具体例として、例えば、前記ｓ１ヌクレオチドを含む、配列番号１６〜２０のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドがあげられる。以下の配列において、（Ｎ）ｎは、オーバーハング配列であり、特に制限されず、前述の通りであり、好ましくは、前記オーバーハング配列の塩基長ｎが２である。また、各配列の横に、オーバーハング配列の一例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、下記配列において、（Ｎ）ｎを除く領域が、前記ｓ２ヌクレオチドまたは前記ｓ３ヌクレオチドであってもよい。
ＮＩ−００６７（配列番号１６）
5’−CCUACAAGCUCAUGGAUCA(N)n−3’      TT
ＮＩ−００６９（配列番号１７）
5’−CCGUAGAGCUCAGAGUCAA(N)n−3’      TT
ＮＩ−００７３（配列番号１８）
5’−GAUCCGGAUUGGUGCCAAU(N)n−3’      TT
ＮＩ−００７４（配列番号１９）
5’−GCACAUUAGUUCCAGAAGA(N)n−3’      TT
ＮＩ−００７５（配列番号２０）
5’−CAAGAACAAUUCACAGUAU(N)n−3’      TT
【００３６】
以下に、前記ａｓヌクレオチド配列と前記ｓヌクレオチド配列との組合せを例示する。本発明は、これらの例示には制限されない。
【００３７】
【表１】
2014140341.tif 000003
【００３８】
本発明の核酸分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。
【００３９】
本発明の核酸分子は、例えば、ＲＮＡ分子である。本発明の核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基のみからなるＲＮＡ分子でもよいし、リボヌクレオチド残基の他に、デオキシリボヌクレオチド残基および／または非ヌクレオチド残基を含むＲＮＡ分子でもよい。
【００４０】
本発明の核酸分子は、例えば、前記二本鎖核酸分子でもよいし、前記一本鎖核酸分子でもよい。
【００４１】
（１）二本鎖核酸分子
前記核酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの前駆体等があげられる。前記二本鎖核酸分子は、例えば、そのアンチセンス鎖が、前記発現抑制配列を有し、そのセンス鎖が、前記相補配列を有することが好ましい。前記アンチセンス鎖は、例えば、前記発現抑制配列からなる一本鎖でもよいし、前記発現抑制配列を含む一本鎖でもよい。前記センス鎖は、例えば、前記相補配列からなる一本鎖でもよいし、前記相補配列を含む一本鎖でもよい。
【００４２】
前記二本鎖核酸において、各一本鎖の長さは、特に制限されない。前記アンチセンス鎖は、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。前記センス鎖は、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。
【００４３】
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖は、それぞれ、３’末端にオーバーハングを有することが好ましい。前記オーバーハングは、例えば、例えば、１、２、３塩基長であり、好ましくは１または２塩基長であり、より好ましくは２塩基長である。オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、前述の例示があげられる。
【００４４】
（２）一本鎖核酸分子
前記核酸分子は、例えば、１つの一本鎖から構成される一本鎖核酸分子である。前記核酸分子は、例えば、前記発現抑制配列と前記相補配列とを、アニーリング可能な方向で有していればよい。前記発現抑制配列と前記相補配列との連結順序は、特に制限されず、例えば、前記発現抑制配列の３’末端と前記相補配列の５’末端とが連結してもよく、前記相補配列の５’末端と前記抑制配列の３’末端とが連結してもよく、好ましくは前者である。前記一本鎖核酸分子は、例えば、前記発現抑制配列と前記相補配列とが、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。前記間接的な連結は、例えば、リンカー領域を介した連結があげられる。前記発現抑制配列と前記相補配列との連結順序は、特に制限されず、例えば、前記発現抑制配列の３’末端と前記相補配列の５’末端とが連結してもよく、前記相補配列の５’末端と前記抑制配列の３’末端とが連結してもよく、好ましくは前者である。前記リンカー領域は、例えば、ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、非ヌクレオチド残基から構成されてもよく、前記ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。
【００４５】
以下に、前記一本鎖核酸分子の具体例を例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００４６】
（２−１）第１形態
前記一本鎖核酸分子の第１形態として、５’側領域および３’側領域が、互いにアニーリングして二本鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。これは、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡまたはｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）の形態とも言える。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造をとっており、一般的に、一つのステム領域と一つのループ領域とを有する。
【００４７】
前記核酸分子は、例えば、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結された構造が好ましい。そして、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的である構造が好ましく、具体的には、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のうち、一方が、前記発現抑制配列を含み、他方が、前記相補配列を含むことが好ましい。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）は、それぞれ、前記発現抑制配列および前記相補配列のいずれかを有するため、例えば、分子内アニーリングにより、ステム構造を形成でき、前記リンカー領域（Ｌｘ）がループ構造となる。
【００４８】
前記核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）のいずれに配置してもよく、前記相補配列の上流側、すなわち、前記相補配列よりも５’側に配置することが好ましい。
【００４９】
本形態の核酸分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００５０】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００５１】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【００５２】
前記領域（Ｘ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００５３】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００５４】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００５５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００５６】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前述のようにヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【００５７】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００５８】
（２−２）第２形態
前記一本鎖核酸分子の第２形態として、５’側領域および３’側領域が、それぞれ別個に分子内アニーリングして、２つの二本鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。
【００５９】
本形態の核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である構造が好ましい。そして、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことが好ましい。具体的には、前記内部領域（Ｚ）の前記内部５’側領域（Ｘ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記５’側領域（Ｘｃ）が前記相補配列を有することが好ましく、前記内部領域（Ｚ）の前記内部３’側領域（Ｙ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記３’側領域（Ｙｃ）が前記相補配列を有することが好ましい。また、前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）の前記内部５’側領域（Ｘ）が前記相補配列を有することが好ましく、前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）の前記内部３’側領域（Ｙ）が前記相補配列を有することが好ましい。
【００６０】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【００６１】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが、例えば、前記核酸分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００６２】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【００６３】
前記核酸分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【００６４】
前記核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接的に連結された形態があげられる。また、後者の場合、例えば、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接的に連結された形態があげられる。
【００６５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００６６】
本形態の核酸分子について、前記リンカー領域を有さない一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００６７】
前記核酸分子について、前記リンカー領域を有する一例を、図３の模式図に示す。図３（Ａ）は、一例として、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、ループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００６８】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。
【００６９】
前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的でもよい。
【００７０】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００７１】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的でもよい。
【００７２】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００７３】
前記核酸分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００７４】
本発明の核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００７５】
前記核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００７６】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【００７７】
前記（ａ）〜（ｄ）の核酸分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に示す。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含む核酸分子であり、図４（Ａ）は、前記（ａ）の核酸分子、図４（Ｂ）は、前記（ｂ）の核酸分子、図４（Ｃ）は、前記（ｃ）の核酸分子、図４（Ｄ）は、前記（ｄ）の核酸分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４の核酸分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【００７８】
前記（ａ）〜（ｃ）の核酸分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、および、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）の核酸分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００７９】
他方、前記(ｄ)の核酸分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）の核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００８０】
前記核酸分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８１】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００８２】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。
【００８３】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００８４】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００８５】
前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００８６】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００８７】
前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００８８】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【００８９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前述のようにヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、例えば、同じでも異なってもよく、また、その塩基配列も、同じでも異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【００９０】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００９１】
本形態の核酸分子は、例えば、５’末端と３’末端とが、結合してもよいし、未結合でもよい。前者の場合、本形態の核酸分子は、環状の一本鎖核酸分子である。後者の場合、本形態の核酸分子は、例えば、両末端の未結合を維持できることから、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
【００９２】
（２−３）第３形態
前記一本鎖核酸分子の第３形態として、前記リンカー領域が、非ヌクレオチド構造である分子があげられる。
【００９３】
本形態は、前記第１形態および前記第２形態の核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド構造を有する以外は、前述の説明を援用できる。
【００９４】
前記非ヌクレオチド構造は、特に制限されず、例えば、ポリアルキレングリコール、ピロリジン骨格、ピペリジン骨格等があげられる。前記ポリアルキレングリコールは、例えば、ポリエチレングリコールがあげられる。
【００９５】
前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００９６】
前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、より好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００９７】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００９８】
前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
2014140341.tif 000004
【００９９】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【０１００】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【０１０１】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【０１０２】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【０１０３】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【０１０４】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【０１０５】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基でもよい。
【０１０６】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.  F.  W.  McOmie,  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」  Prenum  Press,  London  and  New  York,  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【０１０７】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【０１０８】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【０１０９】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）または（Ｌｙ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【０１１０】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【０１１１】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【０１１２】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、前記リンカー領域（Ｌｘ）に、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、前記リンカー領域（Ｌｙ）に、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接的に連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【０１１３】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【０１１４】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
2014140341.tif 000005
【０１１５】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝７）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【化３】
2014140341.tif 000006
【０１１６】
前記核酸分子において、前記リンカー以外の領域の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１１７】
前記核酸分子において、前記リンカー領域の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１１８】
前記核酸分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【０１１９】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明の核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方でもよい。前記核酸分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明の核酸分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【０１２０】
前記核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基でもよい。前記核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１２１】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１２２】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１２３】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基でもよい。
【０１２４】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【０１２５】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１２６】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１２７】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１２８】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１２９】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき、前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１３０】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１３１】
本発明の核酸分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１３２】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【０１３３】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１３４】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１３５】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１３６】
本発明の核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１３７】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１３８】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１３９】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１４０】
本発明の核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【０１４１】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、ＲＰＮ２遺伝子の発現が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１４２】
前記疾患は、特に制限されず、がん疾患、薬剤耐性疾患等があげられる。前記がん疾患は、例えば、乳がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、膵臓がん等があげられる。前記乳がんの場合、例えば、トラスツズマブ、ドセタキセル等の薬剤耐性乳がんに適している。
【０１４３】
本発明の核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、ＲＰＮ２遺伝子を有する投与対象に、前記核酸分子を投与すればよい。
【０１４４】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物あげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ等の非ヒト哺乳類動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１４５】
前記細胞は、特に制限されず、例えば、生体の細胞、生体から単離した細胞、その培養細胞があげられる。前記培養細胞は、例えば、初代培養細胞、継代細胞、株化培養細胞等があげられる。前記細胞の種類は、特に制限されず、ＭＣＦ７−ＡＤＲ等の腫瘍細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞等があげられる。
【０１４６】
本発明の核酸分子に関しては、後述する本発明の組成物、抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【０１４７】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制できることから、例えば、医薬品および診断薬、ならびに、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１４８】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸分子をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、ベクターに発現可能なように前記ＤＮＡが挿入されている。前記ＤＮＡを挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、一般的なベクターが使用でき、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクターがあげられる。
【０１４９】
本発明のベクターによれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの投与によって、投与された対象内で、本発明の発現抑制用核酸分子を発現することができる。
【０１５０】
（組成物）
本発明の組成物は、本発明の発現抑制用核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現抑制用核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。
【０１５１】
本発明の組成物によれば、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制できるため、本発明の組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１５２】
本発明によれば、例えば、ＲＰＮ２遺伝子が存在する対象、特に、ＲＰＮ２遺伝子の発現が相対的に高い対象、相対的に高くなると予測される対象に投与することで、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制できる。
【０１５３】
また、本発明の発現抑制用核酸分子は、前述のように、疾患の治療に使用できることから、本発明の組成物は、薬学的組成物、疾患の治療薬、医薬品ともいえる。
【０１５４】
本発明によれば、例えば、ＲＰＮ２遺伝子の発現が原因となる疾患の患者に投与することで、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療できる。前記疾患は、例えば、前述の通りであって、がん疾患または薬剤耐性疾患があげられる。前記がん疾患は、例えば、前述の通りであって、乳がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、膵臓がん等のがん疾患があげられる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１５５】
本発明の組成物の使用方法は、特に制限されず、例えば、ＲＰＮ２遺伝子が存在する対象、特に、ＲＰＮ２遺伝子またはＲＰＮ２タンパク質の発現が相対的に高い対象、または、相対的に高くなると予測される対象に、前記組成物を投与すればよい。投与対象は、例えば、前述の通りである。
【０１５６】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が、前記培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法、ナノバブル法等があげられる。前記投与対象が生体の場合、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。非経口投与は、例えば、局所投与、静脈内投与等があげられる。前記投与部位は、例えば、がん、血管等があげられる。本発明の組成物の投与条件、例えば、投与回数、投与量等は、特に制限されない。
【０１５７】
本発明の組成物において、前記発現抑制用核酸分子の配合量は、特に制限されない。本発明の組成物は、例えば、本発明の発現抑制用核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物の配合量は、前記発現抑制用核酸分子の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１５８】
本発明の組成物において、前記添加物は、例えば、前記発現抑制用核酸分子と複合体を形成するものが好ましい。この場合、前記添加物は、例えば、複合化剤ともいえる。本発明の組成物において、前記発現抑制用核酸分子を複合体とすることによって、例えば、前記発現抑制用核酸分子を効率よくデリバリーできる。前記発現抑制用核酸分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体があげられる。
【０１５９】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１６０】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤、基剤、安定化剤、保存剤等があげられる。
【０１６１】
（ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制方法）
本発明の抑制方法は、前述のように、ＲＰＮ２遺伝子の発現を抑制する方法であって、本発明の発現抑制用核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の抑制方法は、本発明の発現抑制用核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１６２】
本発明の抑制方法は、例えば、ＲＰＮ２遺伝子が存在する対象、特に、ＲＰＮ２遺伝子の発現が相対的に高い対象または相対的に高くなると予測される対象に、前記発現抑制用核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記発現抑制用核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、前述と同様に、ヒト、前記非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１６３】
本発明の抑制方法は、例えば、前記発現抑制用核酸分子を単独で投与してもよいし、前記発現抑制用核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択でき、前述の記載が援用できる。
【０１６４】
（治療方法）
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、本発明の発現抑制用核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、本発明の発現抑制用核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明が対象とする疾患は、例えば、前述の通りであって、がん疾患または薬剤耐性疾患があげられる。前記がん疾患は、例えば、前述の通りであって、乳がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、膵臓がん等のがん疾患があげられる。
【０１６５】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、前述のように、非経口投与および経口投与のいずれでもよい。
【０１６６】
（発現抑制用核酸分子の使用）
本発明の使用は、ＲＰＮ２遺伝子の発現またはＲＰＮ２タンパク質の機能の抑制のための、本発明の発現抑制用核酸分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制のための医薬の製造における使用である。
【０１６７】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１６８】
［実施例１］
ｓｉＲＮＡ、ｎｋＲＮＡおよびＰｎｋＲＮＡを合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＲＰＮ２遺伝子の発現抑制を確認した。
【０１６９】
（１）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡとして、下記配列の二本鎖ＲＮＡを合成した。各二本鎖において、上の配列をセンス鎖、下の配列をアンチセンス鎖とした。センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端のオーバンハング配列は、いずれもｎ＝２であり、ＴＴ、ＣＡ、ＵＧのいずれかとし、アンチセンス鎖の下線部は、発現抑制配列とした。下記ＮＩ−００６７、ＮＩ−００６９、ＮＩ−００７３およびＮＩ−００７５は、実施例のｓｉＲＮＡであり、下線部の発現抑制配列は、それぞれ順に配列番号１〜３および５とした。ＮＩ−００４８は、スクランブルｓｉＲＮＡであり、ＮＩ−００００は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡである。
【０１７０】
【表２】
2014140341.tif 000007
【表３】
2014140341.tif 000008
【０１７１】
（２）ｎｋＲＮＡ
ｎｋＲＮＡとして、下記配列の一本鎖ＲＮＡを合成した。下記配列において、下線部領域は、前記ｓｉＲＮＡと共通する前記発現抑制配列とし、アスタリスクを付した塩基は、前記フリー塩基を示す。下記ＮＫ−０１５５、ＮＫ−０１５６、ＮＫ−０１５７およびＮＫ−０１５８は、実施例のｎｋＲＮＡであり、下線部の発現抑制配列は、それぞれ順に配列番号１、２、４および５とした。ＮＫ−００００は、ネガティブコントロールｎｋＲＮＡである。
【０１７２】
【表４】
2014140341.tif 000009
【０１７３】
（３）ＰｎｋＲＮＡ
ＰｎｋＲＮＡとして、下記配列の一本鎖ＲＮＡを合成した。下記配列において、ＬｘおよびＬｙは、それぞれリンカー領域ＬｘおよびＬｙであり、それぞれ、Ｌ−プロリンジアミドアミダイトを用いて下記構造式とした。また、下記配列において、下線部領域は、前記ｓｉＲＮＡと共通する前記発現抑制配列とし、アスタリスクを付した塩基は、前記フリー塩基を示す。下記ＰＫ−００８８、ＰＫ−００８９、ＰＫ−００９０およびＰＫ−００９１は、実施例のＰｎｋＲＮＡであり、下線部の発現抑制配列は、それぞれ順に配列番号１、２、４および５とした。ＰＫ−００００は、ネガティブコントロールＰｎｋＲＮＡである。
【０１７４】
【表５】
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【化４】
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【０１７５】
（４）ヒトＲＰＮ２遺伝子の発現量の測定
前記各ｓｉＲＮＡ、ｎｋＲＮＡおよびＰｎｋＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【０１７６】
細胞は、抗癌剤耐性乳癌細胞株（多剤耐性乳癌細胞株）ＭＣＦ７−ＡＤＲ（国立がんセンター落谷先生より提供）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０１７７】
前記細胞を含む前記培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、６×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。その後、前記ウェル中の前記細胞に、前記（１）ＲＮＡ核酸分子を、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールに従って導入した。具体的には、前記ウェルあたり、前記ＲＮＡ核酸分子と前記トランスフェクション試薬との混合液１００μｌを添加し、前記細胞培養液と併せて全量を５００μｌとした。前記ＲＮＡ核酸分子の最終濃度は、０．１、１または１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０１７８】
トランスフェクション後、前記ウェル中の前記細胞を同条件で２４時間培養した。そして、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを、添付のプロトコールに従って合成した。
【０１７９】
得られた前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＲＰＮ２遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。ＲＰＮ２遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。前記ＰＣＲにおいて、ＲＰＮ２遺伝子および前記β−アクチンの増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。
ヒトＲＰＮ２遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号３５）5’-ATCTAACCTTGATCCCAGCAATGTG-3’
（配列番号３６）5’-CTGCCAGAAGCAGATCTTTGGTC-3’
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号３７）5’-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3’
（配列番号３８）5’-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’
【０１８０】
コントロールとして、前記（１）ＲＮＡ核酸分子および前記トランスフェクション試薬を添加していない細胞（−）ならびに前記ＲＮＡ核酸分子を未添加とし、前記トランスフェクション試薬のみを添加した細胞（モック）についても、同条件下で培養、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの合成および、ＰＣＲを行い、遺伝子発現量を測定した。ＲＰＮ２遺伝子の発現量は、前記細胞（−）を1として、相対的に比較した。
【０１８１】
前記ｓｉＲＮＡを用いた結果を図５に示す。図５は、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制を示すグラフである。横軸は、前記ｓｉＲＮＡの種類および濃度を示し、縦軸は、ＲＰＮ２遺伝子の相対的遺伝子発現量を示す。図５に示すように、前記ｓｉＲＮＡは、いずれもネガティブコントロールよりも強い発現抑制活性を示した。
【０１８２】
前記ｓｉＲＮＡを用いた結果を図６に示す。図６は、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制を示すグラフである。横軸は、前記ｓｉＲＮＡの種類および濃度を示し、縦軸は、ＲＰＮ２遺伝子の相対的遺伝子発現量を示す。図６に示すように、いずれのｓｉＲＮＡもネガティブコントロールよりも強い発現抑制活性を示した。
【０１８３】
前記ｎｋＲＮＡを用いた結果を図７示す。図７は、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制を示すグラフである。横軸は、前記ｎｋＲＮＡの種類及び濃度を示し、縦軸は、ＲＰＮ２遺伝子の相対的遺伝子発現量を示す。図７に示すように、前記ｎｋＲＮＡは、いずれもネガティブコントロールよりも強い発現抑制活性を示した。
【０１８４】
前記ＰｎｋＲＮＡを用いた結果を図８示す。図８は、ＲＰＮ２遺伝子の発現量抑制を示すグラフである。横軸は、前記ＰｎｋＲＮＡの種類を示し、縦軸は、ＲＰＮ２遺伝子の相対的遺伝子発現量を示す。図８に示すように、前記ＰｎｋＲＮＡは、いずれもネガティブコントロールよりも強い発現抑制活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
以上のように、本発明の核酸分子によれば、ＲＰＮ２遺伝子の発現抑制が可能である。このため、本発明は、ＲＰＮ２遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、がん疾患または薬剤耐性疾患等の治療に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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