(57)【要約】【課題】糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、糖鎖捕捉用粒子を得るための反応ステップを少なくすることにより、糖鎖捕捉用粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および糖鎖捕捉用粒子を提供する。【解決手段】糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、カルボキシル基を有する単量体と、架橋性単量体を重合して得られることを特徴とするポリマー粒子。  また、前記ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体７０ｍｏｌ％以上、９９．９９ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、
カルボキシル基を有する単量体と、架橋性単量体を重合して得られることを特徴とするポリマー粒子。
【請求項２】
前記ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体７０ｍｏｌ％以上、９９．９９ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものである請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項３】
前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（Ｉ）で表わされる請求項１または２
に記載のポリマー粒子。
【化１】
2014210845.tif 000007
[式（Ｉ）中Ｒ1は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
【請求項４】
前記カルボキシル基を有する単量体に含まれる窒素原子が１個以下である請求項１ないし３いずれかに記載のポリマー粒子。
【請求項５】
前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（ＩＩ）で表わされる請求項１ないし４いずれかに記載のポリマー粒子。
【化２】
2014210845.tif 000008
[式（ＩＩ）中Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数を示す。]
【請求項６】
請求項１ないし５いずれかに記載のポリマー粒子とヒドラジンを反応させ、前記ポリマー粒子にヒドラジド基を導入した糖鎖捕捉用粒子。
【請求項７】
前記糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基含有量が、糖鎖捕捉用粒子全体に対し、０．０１μｍｏｌ／ｍｇ以上、１０μｍｏｌ／ｍｇ以下である請求項６に記載の糖鎖捕捉用粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子および糖鎖捕捉用粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を担持してなる支持体及びこの支持体を適用したポリマー粒子を開示する。具体的には、オキシルアミノ基又はその誘導体を有するモノマーから懸濁重合反応によりポリマー粒子を製造することが開示する。
【０００３】
特許文献２は、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を含有する糖鎖アフィニティビーズ及びその製造方法を開示する。具体的には、重合性基を含むカルボン酸エステルモノマーを含む原料を架橋性単量体存在下で重合させてカルボン酸エステル含有ポリマーを得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を１０体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することを含む製法を開示する。
【０００４】
しかし、これらの特許文献で用いられるモノマーは市販されていないものが多く、糖鎖捕捉用粒子を得るためにはモノマーの合成ステップも含め、多くの反応ステップを要するため、糖鎖捕捉用粒子の製造方法が煩雑であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９７８４４号
【特許文献２】国際公開第２００８／０１８１７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、糖鎖捕捉用粒子を得るための反応ステップを少なくすることにより、糖鎖捕捉用粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および糖鎖捕捉用粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（９）に記載の本発明により達成される
（１）糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、カルボキシル基を有する単量体と、架橋性単量体を重合して得られることを特徴とするポリマー粒子。
（２）前記ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体７０ｍｏｌ％以上、９９．９９ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものである上記（１）に記載のポリマー粒子。
（３）前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（Ｉ）で表わされる上記（１）
または（２）に記載のポリマー粒子。
【化１】
2014210845.tif 000002
[式（Ｉ）中Ｒ1は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
（４）前記カルボキシル基を有する単量体に含まれる窒素原子が１個以下である上記（１）ないし（３）いずれかに記載のポリマー粒子。
（５）前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（ＩＩ）で表わされる上記（１）ないし（４）いずれかに記載のポリマー粒子。
【化２】
2014210845.tif 000003
[式（ＩＩ）中Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数を示す。]
（６）上記（１）ないし（５）いずれかに記載のポリマー粒子とヒドラジンを反応させ、前記ポリマー粒子にヒドラジド基を導入した糖鎖捕捉用粒子。
（７）前記糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基含有量が、糖鎖捕捉用粒子全体に対し、０．０１μｍｏｌ／ｍｇ以上、１０μｍｏｌ／ｍｇ以下である上記（６）に記載の糖鎖捕捉用粒子。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、糖鎖捕捉用粒子を得るための反応ステップを少なくすることにより、糖鎖捕捉用粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および糖鎖捕捉用粒子を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係る、ポリマー粒子は、糖鎖捕捉用粒子の製造に用いられるものであり、カルボキシル基を有する単量体と、架橋性単量体を重合して得られるものである。
【００１０】
前記重合に前記カルボキシル基を有する単量体を用いることにより、前記ポリマー粒子にカルボキシル基が導入される。導入されたカルボキシル基は、後述するヒドラジンと容易に反応し、ヒドラジド基を生成するため、前記ポリマー粒子に容易にヒドラジド基を導入することができ、糖鎖捕捉用粒子を容易に製造することができる。
また、前記重合に前記架橋性単量体を用いることにより、前記ポリマー粒子内において、架橋構造が形成され、前記ポリマー粒子に、高い耐溶剤性、力学的強度を付与することができる。
すなわち、前記重合にカルボキシル基を有する単量体と、架橋性単量体を用いることにより、高い耐溶剤性、力学的強度を有する糖鎖捕捉用粒子を容易に製造することができるポリマー粒子を得ることができる。
【００１１】
［カルボキシル基を有する単量体］
ここで、前記カルボキシル基を有する単量体（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう」）としては、限定されない一又は複数の実施形態において、下記一般式（Ｉ）で表されるモノマーが挙げられる。
【化１】
2014210845.tif 000004
[式（Ｉ）中Ｒ1は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
【００１２】
また、前記モノマー（Ａ）に含まれる窒素原子は、１個以下であることが望ましい。これにより、得られるポリマー粒子、および前記ポリマー粒子から製造される糖鎖捕捉用粒子中の窒素原子数が少なくなり、粒子の表面電荷が低く抑えられ、糖鎖捕捉用粒子の使用にあたっては、糖鎖以外のタンパク質等の、粒子表面への静電的且つ非特異的な吸着を抑えることができる。
尚、前記モノマー（Ａ）は窒素原子を含まないものであることがより好ましい。これにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。
【００１３】
さらに、一般式（Ｉ）の化合物としては、限定されない一又は複数の実施形態において、下記式（ＩＩ）で表されるものが挙げられる。
【化２】
2014210845.tif 000005
[式（ＩＩ）中Ｒ2はＨ、ＣＨ3又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数を示す。]
【００１４】
尚、前記一般式（ＩＩ）の化合物としては、入手性から、下記式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表されるものが好ましい。
【化３】
2014210845.tif 000006
【００１５】
また、本発明に用いるモノマー（Ａ）のカルボキシル基は、カルボキシル基のままでも、電離していても、中和されて塩になっていてもよい。
【００１６】
［架橋性単量体］
ここで、架橋性単量体（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう」）としては、多官能の化合物であって、モノマー（Ａ）と共重合を行う化合物を好適に用いることができ、限定されない一又は複数の実施形態において、
（１）ポリオールのジ又はトリ（メタ）アクリル酸エステル類、例えばポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロールプロパン、グリセリン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン等であるもの、
（２）前記（１）において、不飽和酸が（メタ）アクリル酸以外のもの、例えばマレイン酸、フマル酸などであるもの、
（３）ビスアクリルアミド類、例えばＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドなど、
（４）ポリエポキシドと（メタ）アクリル酸を反応させて得られるジ又はトリ（メタ）アクリル酸エステル類、
（５）ポリイソシアネートと（メタ）アクリル酸ヒドロキシエステルを反応させて得られるジ（メタ）アクリル酸カルバミルエステル類、例えばポリイソシアネートがトリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどであるもの、及び/又は、
（６）多価アリル化合物、例えばアリル化デンプン、アリル化セルロース、ジアリルフタレート、テトラアリロキシエタン、ペンタエリストールトリアリルエーテル、トリメチロールプロパントリアリルエーテル、ジエチレングリコールジアリルエーテル、トリアリルトリメリテート等、が挙げられる。
【００１７】
尚、モノマー（Ａ）とモノマー（Ｂ）の組み合わせは、限定されない一又は複数の実施形態において、モノマー（Ａ）が前記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、メタクリル酸、アクリル酸のいずれかであるとき、モノマー（Ｂ）はエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドのいずれかであることが好ましく、モノマー（Ａ）が前記（ＩＩＩ）、（ＩＶ）のいずれかであるとき、モノマー（Ｂ）がエチレングリコールジ（メタ）アクリレートのいずれかであることがより好ましい。
【００１８】
また、前記重合反応に用いられるモノマー（Ａ）とモノマー（Ｂ）の割合は、モノマー（Ａ）が７０ｍｏｌ％以上、９９．９９ｍｏｌ％以下であるとき、モノマー（Ｂ）が０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、モノマー（Ａ）が８０ｍｏｌ％以上、９９ｍｏｌ％以下であるとき、モノマー（Ｂ）が１ｍｏｌ％以上、２０ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。
前記重合反応に用いられるモノマー（Ａ）とモノマー（Ｂ）の割合が前記範囲内にあることにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。
【００１９】
また、本発明に係る、重合の方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、懸濁重合や、逆相懸濁重合等が挙げられる。
【００２０】
［懸濁重合反応］
ここで、懸濁重合とは、一又は複数の実施形態において、非水溶性モノマーまたは水に対して難溶性のモノマー、必要に応じて他のモノマー若しくは架橋性単量体、及び重合開始剤等を含有する油相を、重合に不活性な水相中に分散及び懸濁させ、水中油滴型の懸濁重合を行う方法である。したがって、本発明においては、一又は複数の実施形態において、水相に、少なくともモノマー（Ａ）、架橋性単量体、及び重合開始剤を含む混合物を分散させて水中油滴型エマルションを形成する。
一方、逆相懸濁重合とは、一又は複数の実施形態において、水溶性モノマー、必要に応じて他のモノマー若しくは架橋性単量体、及び重合開始剤等を含有する水相を、重合に不活性な疎水性有機溶媒を含む油相中に分散及び懸濁させ、油中水滴型の懸濁重合を行う方法である。したがって、本発明においては、一又は複数の実施形態において、有機溶媒に、少なくともモノマー（Ａ）、架橋性単量体、及び重合開始剤を含む混合物を分散させて油中水滴型エマルションを形成する。
【００２１】
尚、重合反応前の水中油滴型エマルションまたは油中水滴型エマルション又は前記エマルションを形成するための分散媒におけるモノマー（Ａ）の含有量としては、限定されない一又は複数の実施形態において、溶媒１００ｍＬに対し、１ｍｍｏｌ以上、８０ｍｍｏｌ以下、５ｍｍｏｌ以上、５０ｍｍｏｌ以下、又は、５ｍｍｏｌ以上、３０ｍｍｏｌ以下である。なお、本開示の製造方法に用いるモノマー（Ａ）は、一又は複数の実施形態において、１種類でもよく、複数種類であってもよい。
【００２２】
また、重合反応前の水中油滴型エマルションまたは油中水滴型エマルション又は前記エマルションを形成するための溶液における（Ｂ）架橋性単量体の含有量としては、限定されない一又は複数の実施形態において、全モノマーに対し、０．０１ｍｍｏｌ以上、３０ｍｏｌ％以下が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ以上、２０ｍｏｌ％以下、最も好ましくは、０．１ｍｍｏｌ以上、１０ｍｏｌ％以下である。
【００２３】
なお、架橋性単量体（Ｂ）の重合反応系への添加タイミングは特に限定されず、一又は複数の実施形態において、重合前、重合中、重合後のいずれか時点で添加されうる。
【００２４】
［水相］
また、通常の懸濁重合に使用しうる水相は、限定されない一又は複数の実施形態において、重合に不活性な水溶液である。必要に応じてポリビニルアルコールなど公知の分散剤を添加してもよい。
［有機溶媒］
さらに、逆相懸濁重合に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、重合に不活性な疎水性有機溶媒である。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、脂肪族炭化水素、脂環族炭化水素、芳香族炭化水素、脂肪族アルコール、脂肪族ケトン、及び脂肪族エステル類が挙げられる。前記脂肪族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン及びｎ−ヘプタン等の炭素数５以上の脂肪族炭化水素が挙げられる。前記脂環族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサン等の炭素数５以上の脂環族炭化水素が挙げられる。前記芳香族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、ベンゼン並びにトルエン及びキシレン等のベンゼン誘導体が挙げられる。前記脂肪族アルコールは、限定されない一又は複数の実施形態において、ｎ−ブチルアルコール及びｎ−アミルアルコール等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族アルコールが挙げられる。前記脂肪族ケトンは、限定されない一又は複数の実施形態において、メチルエチルケトン等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族ケトンが挙げられる。前記脂肪族エステル類は、限定されない一又は複数の実施形態において、酢酸エチル等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族エステル類が挙げられる。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、１種単独でもよく、２種以上の混合溶媒でもよい。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、上述の各有機溶媒１種のみでもよく、２種以上を混合してもよい。
【００２５】
前記水相および有機溶媒の使用量には特に限定はなく、モノマー（Ａ）の量等に応じて適宜設定することができる。前記モノマー（Ａ）１００質量部に対する前記水相または有機溶媒の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、５００質量部以上、５０００質量部以下が好ましく、５００質量部以上、３０００質量部以下がより好ましい。
【００２６】
［重合開始剤］
また、懸濁重合に使用しうる重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、油溶性である。本発明で用いる油溶性重合開始剤としては、例えば、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサネート、メチルエチルケトンパーオキサイドなどの有機過酸化物、アゾビスイソブチルニトリル、（１−フエニルエチル）アゾジ−フエニルメタン、２，２−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）などのアゾ化合物が挙げられる。これら重合開始剤は単独使用でもよく、２種以上を併用してもよい。
また、逆相懸濁重合に使用しうる重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、水溶性である。前記重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、水溶性のラジカル重合開始剤等が挙げられる。前記重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、（１）過酸化水素、（２）過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、及び過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、（３）過塩素酸カリウム及び過塩素酸ナトリウム等の過塩素酸塩、（４）塩素酸カリウム及び臭素酸カリウム等のハロゲン酸塩、（５）ｔ‐ブチルハイドロパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、及びジアルキルパーオキシド（ジ−ｔ−ブチルパーオキシド、ｔ−ブチルクミルパーオキシド等）等のパーオキシド類、（６）メチルエチルケトンパーオキシド及びメチルイソブチルケトンパーオキシド等のケトンパーオキシド、（７）ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、及びｔ−ブチルパーオキシピバレート等のアルキルパーオキシエステル、並びに（８）アゾビスイソブチロニトリル及び２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソブチルアミジン）ジヒドロクロリド等のアゾ化合物等が挙げられる。
【００２７】
さらに、前記重合開始剤の使用量は、懸濁重合および逆相懸濁重合の条件に応じて適宜設定することができる。前記重合開示剤の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、前記モノマー（Ａ）１００質量部に対して０．００５質量部以上、２０質量部以下、０．０１質量部以上、１０質量部以下、０．０２質量部以上、１０質量部以下、又は、０．０５質量部以上、５質量部以下である。なお、前記重合開始剤の添加方法には特に限定はない。
【００２８】
［分散剤］
本開示の製造方法の限定されない一又は複数の実施形態において、通常の懸濁重合を行う際は水相に、逆相懸濁重合を行う際は前記有機溶媒に、分散剤を含有させることが好ましい。通常の懸濁重合に使用可能な分散剤を例示すると、（１）高分子分散剤およびＨＬＢ値が８〜１８の非イオン性界面活性剤としては、タンパク質（例；ゼラチンなど）；レシチン；アラビアゴム、トラガントゴムなどの水溶性ゴム、；アルギン酸ナトリウム；カルボキシメチルセルロース、エトキシセルロースなどのセルロース誘導体；澱粉およびその誘導体；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリビニルアルコールなど；ソルビタンオレイン酸エステル、ソルビタンステアリン酸エステル、ソルビタンパルミチン酸エステルなどのソルビタン脂肪酸エステル；セチルアルコールなど、（２）イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤；アルキルピリジニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤；ヒドロキシエチルイミダゾリン硫酸エステルナトリウム、イミダゾリンスルホン酸ナトリウムなどの両性界面活性剤、（３）無機化合物の分散剤として、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどを挙げることができる。このような分散剤あるいは界面活性剤は単独であるいは組み合わせて使用することができる。
逆相懸濁重合の分散剤としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＨＬＢが３〜１０、又は３〜９の油溶性界面活性剤が挙げられる。そのような油溶性界面活性剤は、一又は複数の実施形態において、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタン、ソルビタンモノオレート等）、ショ糖脂肪酸エステル（ショ糖と、ステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、オレイン酸などの脂肪酸とのモノ、ジまたはトリエステル等）が挙げられる。前記分散剤は１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
前記分散剤の使用量は特に限定はなく、懸濁重合および逆相懸濁重合の条件に応じて適宜選択することができる。分散剤の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、前記モノマー（Ａ）１００質量部に対して０．１質量部以上、２０質量部以下、０．１質量部以上、１５質量部以下、又は０．１質量部以上、１０質量部以下である。
【００３０】
また、本発明の重合においては、モノマー滴に適宜溶媒を添加してもよい。
通常の懸濁重合では、油滴にモノマー（Ａ）、架橋性単量体、開始剤の他に有機溶媒を適宜添加してもよい。有機溶媒はモノマーを溶解し、かつ、分散媒である水に不溶または難溶のものが好ましい。一方、逆相懸濁重合においては、水滴にモノマー（Ａ）、架橋性単量体、開始剤の他に水を適宜添加してもよい。添加する有機溶媒または水の量は分散媒中で液滴を作製出来れば任意である。
【００３１】
通常の懸濁重合反応は、前記モノマー（Ａ）、架橋性単量体及び前記重合開始剤を含む混合物が前記有機溶媒に分散した油中水滴型エマルションを懸濁しながら重合を行う。前記油中水適型エマルションの形成と前記懸濁は同時であってもよく、前記油中水適型エマルションの形成が先であってもよい。また、各成分は、全量を重合反応前に混合してもよく、一部又は全部を撹拌しながら添加混合してもよい。重合反応条件は、限定されない一又は複数の実施形態において、温度に関しては５０℃以上、９０℃以下、好ましくは６０℃以上、８０℃以下、時間に関しては０．５時間以上、４８時間以下、好ましくは１時間以上、２４時間以下である。
逆相懸濁重合反応は、前記モノマー（Ａ）、架橋性単量体、水、及び前記重合開始剤を含む混合物が前記有機溶媒に分散した油中水滴型エマルションを懸濁しながら重合を行う。前記油中水適型エマルションの形成と前記懸濁は同時であってもよく、前記油中水適型エマルションの形成が先であってもよい。また、各成分は、全量を重合反応前に混合してもよく、一部又は全部を撹拌しながら添加混合してもよい。重合反応条件は、限定されない一又は複数の実施形態において、温度に関しては５０℃以上、９０℃以下、好ましくは６０℃以上、８０℃以下、時間に関しては０．５時間以上、４８時間以下、好ましくは１時間以上、２４時間以下である。
【００３２】
ここで、本発明のポリマー粒子とヒドラジンを反応させることにより、ポリマー粒子中のカルボキシル基とヒドラジンが化学結合を形成され、ヒドラジド基が導入された糖鎖捕捉粒子を得ることができる。
ポリマー粒子とヒドラジンを反応させる方法は特に限定されないが、ポリマー粒子とヒドラジン化合物とを、脱水縮合剤を用いて反応させる方法が簡便で好ましい。
【００３３】
上記脱水縮合剤を例示すると、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロリド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジフェニルリン酸アジド"ジフェニルリン酸アジド又はジイソピルカルボジイミドなどが挙げられる。
【００３４】
尚、前記脱水縮合剤の濃度は、特に限定されないが、１０ｍｇ／ｍL以上飽和濃度以下が好ましく、５０ｍｇ／ｍL以上３００ｍｇ／ｍL以下がより好ましく、１００ｍｇ／ｍL以上３００ｍｇ／ｍL以下が最も好ましい。使用量が少ないと反応が十分に進行せず、使用量が多いと経済的でない。
【００３５】
また、前記脱水縮合時の反応温度は、０℃以上、８０℃以下が好ましく、１０℃以上、７０℃以下がより好ましく、１５℃℃以上、５０℃以下が特に好ましい。
【００３６】
さらに前記脱水縮合反応は水溶液中にて行うのが好ましい。その場合、水溶液のｐＨは３〜７が好ましく、４〜６がより好ましい。
【００３７】
尚、前記糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基含有量は、糖鎖捕捉用粒子全体に対し、０．０１μｍｏｌ／ｍｇ以上、１０μｍｏｌ／ｍｇ以下であることが好ましく、１μｍｏｌ／ｍｇ以上、５μｍｏｌ／ｍｇ以下であることがより好ましい。前記糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基含有量が前記範囲内にあることにより、前記糖鎖捕捉用粒子は、糖鎖以外の共雑物の非特異的な吸着を抑えつつ、糖鎖を効率的に捕捉することができる。
【００３８】
［用途］
本発明のポリマー粒子は、糖鎖捕捉用粒子の製造に使用できる。そして糖鎖捕捉用粒子は、糖鎖捕捉の用途に使用できる。例えば、試料中の還元末端を有する糖鎖の捕捉に使用できる。ポリマー粒子で捕捉した糖鎖は、一又は複数の実施形態において、ＰＮＧａｓｅＦ等の酵素やヒドラジン分解により精製することができる。或いは、ポリマー粒子で捕捉した糖鎖は、一又は複数の実施形態において、ヒドラゾン−オキシム交換反応又はヒドラゾン−ヒドラゾン交換反応により、標識化合物を標識することができる。これにより、検出感度の高感度化、高分解能化、及び/又は容易化が可能となる。
【００３９】
以下、本発明を以下の実施例及び比較例に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
［実施例１］
［モノマー（Ａ）を用いたカルボキシル基を有する粒子の合成］
ｍｏｎｏ‐２‐（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ （シグマアルドリッチ社製）４．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート０．１ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、クロロホルム５ｍＬを混合し、さらにアゾビスイソブチロニトリル６６ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させモノマー溶液を作製した。０．２６ｗｔ％のポリビニルアルコール水溶液１００ｍＬにモノマー溶液を添加し、撹拌しながら２０分間窒素ガスでバブリングした。撹拌とバブリングを継続しながら６０℃で１６時間加熱した後、エタノールと純水で洗浄し、カルボキシル基を有する粒子を得た。
[粒子のヒドラジド化]
５０μＬ／ｍＬのヒドラジン一水和物溶液（ＰＢＳバッファにヒドラジン一水和物を溶解しＨＣｌでｐＨ５．８に調製）１０ｍＬに水溶性カルボジイミド２．５ｇを溶解した。この溶液に前記カルボキシル基を有する粒子を０．５ｇ添加し、３７℃で２時間転倒混和した。水洗後、粒子を１Ｎ  ＨＣｌに分散した。遠心分離して上清を除去し、さらに水洗を繰り返した。凍結乾燥してヒドラジド化した粒子（糖鎖捕捉用粒子）を得た。
糖鎖捕捉用粒子を得るまでの反応ステップ数は２であり、糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基量を一般にアミノ基、ヒドラジド基の定量化に用いられるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法（以下、「ＴＮＢＳ法」とも称す）で求めたところ、２．５μｍｏｌ／ｍｇであった。
尚、得られた糖鎖捕捉用粒子を下記「糖鎖捕捉機能の評価方法」に基づき評価した結果、ピークの総面積（Ｓ）は３２０万であった。
【００４１】
［実施例２］
粒子のヒドラジド化の際のヒドラジン一水和物溶液の濃度を１０μＬ／ｍＬにした以外は実施例１と同様に糖鎖捕捉用粒子を作製した。
糖鎖捕捉用粒子を得るまでの反応ステップ数は２であり、糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基量をＴＮＢＳ法で求めたところ、１．２μｍｏｌ／ｍｇであった。
尚、得られた糖鎖捕捉用粒子を下記「糖鎖捕捉機能の評価方法」に基づき評価した結果、ピークの総面積（Ｓ）は２９０万であった。
【００４２】
［実施例３］
ｍｏｎｏ‐２‐（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅの配合量を２．３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレートの配合量を２ｇ（１０ｍｍｏｌ）に変更した以外は実施例１と同様に粒子を作製した。粒子のヒドラジド化についても実施例１と同様に実施し、糖鎖捕捉用粒子を得た。糖鎖捕捉用粒子を得るまでの反応ステップ数は２であり、糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基量は、０．６μｍｏｌ／ｍｇであった。
尚、得られた糖鎖捕捉用粒子を下記「糖鎖捕捉機能の評価方法」に基づき評価した結果、ピークの総面積（Ｓ）は７０万であった。
【比較例】
【００４３】
国際公開第２００８／０１８１７０号に記載の実施例に基づき、モノマー合成および粒子の合成を行った。
（１）モノマー前駆体の合成
無水メタクリル酸 （ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）を １００ ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇ の(エチレンジオキシ) ビス (エチルアミン) （ＥＤＢＥＡ： ２５ｇ, ０．１７ ｍｏｌ） を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させてモノマー前駆体を得た。
【００４４】
（２）モノマーの合成
５ｇの化合物モノマー前駆体（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチルおよび１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させてモノマーを得た。
【００４５】
２．メチルエステル含有ポリマー粒子の合成
三口フラスコに２５ｍｌの５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液を装入し、そこ
へ窒素をパージした。１ｇのモノマー（２．６ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ：モノマーに対して５ｍｏｌ％）および１ｍｌのクロロホルムからなる混合物を、前記三口フラスコに導入し、６０℃に保ちながら攪拌して、モノマーとしておよびＥＧＤＭＡをＰＶＡ水溶液中に分散させた。続いて、モノマーに対して３重量％の重合開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加えて重合を開始させた。６０℃で１６時間反応させた後、生成したポリマー粒子を遠心分離により回収し、メタノールと水とで洗浄した。
【００４６】
３．ヒドラジド基の導入
ポリマー粒子４００ｍｇを容器にとり、ヒドラジン１水和物４ｍｌを加えて攪拌し、室温で２時間静置した。反応後、ヒドラジン１水和物を除去し、メタノールで洗浄したのち、１Ｍ塩酸でリンスした。その後さらに純水で洗浄し、糖鎖捕捉用粒子を得た。糖鎖捕捉用粒子を得るまでの反応ステップ数は４であり、糖鎖捕捉用粒子のヒドラジド基量をＴＮＢＳ法で求めたところ、３．０μｍｏｌ／ｍｇであった。
尚、得られた糖鎖捕捉用粒子を下記「糖鎖捕捉機能の評価方法」に基づき評価した結果、ピークの総面積（Ｓ）は３７０万であった。
【００４７】
＜糖鎖捕捉機能の評価方法＞
（糖鎖捕捉用粒子を用いたウシ血清由来ＩｇＧの糖鎖分析）
１  生体試料の予備処理
ウシ血清由来ＩｇＧ１ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μＬに溶解させた後、１２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００４８】
２  糖鎖捕捉工程（ａ）、洗浄工程（ｂ）
実施例１〜３および比較例で作製した糖鎖捕捉用粒子５ｍｇが入ったディスポカラムに予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬ及び１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、純水、メタノール、トリエチルアミン溶液にて粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、純水にてビーズを洗浄した。
【００４９】
３  糖鎖遊離工程（ｃ）
前記粒子の入ったディスポカラムに純水２０μＬ及び２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１．５時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。
【００５０】
４  標識化工程（ｄ）
粒子の入ったディスポカラムに、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μＬを添加し、６０℃で２時間反応させた。
【００５１】
前記、糖鎖捕捉工程（ａ）、洗浄工程（ｂ）、糖鎖遊離工程（ｃ）、及び標識化工程（ｄ）は同一の容器であるディスポカラム内で行なった。
【００５２】
５  余剰試薬除去工程
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、シリカゲル  （Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ、６ＲＳ−８０６０、三菱化学ヤトロン製）を詰めたカラムに添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
【００５３】
６  標識化糖鎖の検出
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製、Ｎｅｘｅｒａ）にて測定した。アミノカラム（Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０）を用いて励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにて測定し、２ＡＢにより標識化された糖鎖を検出した。
上記手法により得られたＨＰＬＣチャートにおいて、２ＡＢにより標識化された糖鎖に由来するピークの総面積（Ｓ）を求めた。尚、前記ピークの総面積（Ｓ）は総糖鎖捕捉量に相当する。