(57)【要約】【課題】汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質を提供する。【解決手段】プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合したものであるタンパク質検出用融合タンパク質である。【選択図】図１
2014100095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合したものであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質検出用融合タンパク質であって、
前記タンパク質ドメインが、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合されたものであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質検出用融合タンパク質であって、
前記融合型アルカリホスファターゼが、
ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼＩＰＰまたはＩＩＰであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。
【請求項４】
タンパク質の検出方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中には種々のタンパク質が存在するが、特定のタンパク質を検出、定量するための方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が知られている。
【０００３】
ＥＬＩＳＡは、試料中に含まれる抗原等の特定のタンパク質を、酵素標識した抗体を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、免疫検査等において汎用されている手法の１つである。ＥＬＩＳＡには、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等が知られている。
【０００４】
例えば、固相の表面に吸着させた目的物質（抗原）に対する１次抗体を抗原抗体反応により結合させる。未反応の１次抗体を洗い流した後、酵素標識した標識２次抗体を添加して、再び抗原抗体反応により結合させる。ここで未反応の標識２次抗体を洗い流し、発色基質を添加すると、抗原の量に比例して発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計等により測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、抗原の量を定量することができる。
【０００５】
しかし、このような方法では、目的物質（抗原）に特異的に結合する１次抗体に対して特異的に結合する標識２次抗体が必要となり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合、複数種類の１次抗体に対して、それぞれに特異的に結合する標識２次抗体を用意する必要があり、汎用性が低い。
【０００６】
一方、標識２次抗体の代わりに、アルカリホスファターゼ等の酵素とプロテインＧとを化学反応で結合した酵素標識プロテインＧを用いる方法がある。プロテインＧは、連鎖球菌の細胞壁由来タンパク質で、ほとんどの哺乳動物のＩｇＧと結合する性質を持つ。このような酵素標識プロテインＧを用いれば多くの１次抗体と結合可能であり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合でも、それぞれに特異的に結合する抗体を用意しなくてもよく、汎用性が高い。
【０００７】
しかし、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識した酵素標識プロテインＧを用いる方法は、検出感度が低いという問題があった。また、熱安定性が低いものもあり、取扱中に失活する場合があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Engineering of Functional Chimeric Protein G-Vargula Luciferase, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 249, pp.147-152 (1997)
【非特許文献２】Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G, Biochem J., 267, pp.171-177 (1990)
【非特許文献３】「アイソザイム間キメラ化による高活性かつ熱安定なアルカリフォスファターゼの創出」，第６１回日本生物工学会大会  ２Ｅａ０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質およびそれを用いたタンパク質の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合したものであるタンパク質検出用融合タンパク質である。
【００１１】
また、前記タンパク質検出用融合タンパク質において、前記タンパク質ドメインが、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合されたものであることが好ましい。
【００１２】
また、前記タンパク質検出用融合タンパク質において、前記融合型アルカリホスファターゼが、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼＩＰＰまたはＩＩＰであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、タンパク質の検出方法であって、前記タンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出するタンパク質の検出方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合させることにより、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質およびそれを用いたタンパク質の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の一例の構造を示す模式図である。
【図２】実施例１における、一過性分泌発現させた各培養上清（各レーン２００μＬ分）のＣＢＢ染色と抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットの結果を示す図である。
【図３】実施例１における、各精製フラクション（各レーン１０μＬ分）のＣＢＢ染色と抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットの結果を示す図である。
【図４】実施例２における、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】実施例３における、免疫沈降を説明する図である。
【図６】実施例３における、免疫沈降を説明する図である。
【図７】実施例３における、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】実施例４における、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図９】実施例５における、免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合したものである。
【００１８】
本発明者らは、検出対象であるタンパク質と直接または間接的に結合するタンパク質ドメインとして、プロテインＧに着目した。プロテインＧは、連鎖球菌の細胞壁由来タンパク質で、ほとんどの哺乳動物のＩｇＧと結合する性質を持つ。このプロテインＧをアルカリホスファターゼ標識し、標識２次抗体等に代わるものとして利用できないかを検討した。
【００１９】
また、本発明者らは、検出感度および安定性に寄与する酵素標識としてのアルカリホスファターゼのうち、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）は熱安定性が高く、ヒト小腸型アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）は比活性が高いこと、そのヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼ両者の配列をキメラ化することで、高活性かつ安定性の高いキメラタンパク質が創出されることに着目した。なお、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼはアミノ酸配列にして８８％の相同性を持つ。
【００２０】
そこで、鋭意検討したところ、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合させることにより、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質が得られることを見出した。
【００２１】
タンパク質ドメインとしては、プロテインＧのＩｇＧ結合ドメインであるＣ２ドメインおよびＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むものであればよく、特に制限はないが、抗体から脱離しにくい等の点から、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが連結されているものを含むことが好ましい。また、プロテインＧの抗体等に対する反応性が向上する等の点から、プロテインＡのＢドメインを含むことが好ましい。特に、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合されたものであることが好ましい。
【００２２】
ヒト胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）とヒト小腸型アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）それぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとしては、比活性が高く、熱安定性が高い等の点から、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼＩＰＰまたはＩＩＰ（非特許文献３参照）が好ましく、生産性や、比活性が高く、熱安定性が高い等の点から、ＩＰＰが好ましい。
【００２３】
融合型アルカリホスファターゼのＣ末端側にプロテインＧのＣ２ドメインを融合させたものでもよいし、Ｎ末端側に融合させたものでもよいが、生産性等の点から、融合型アルカリホスファターゼのＣ末端側にプロテインＧのＣ２ドメインを融合させたものであることが好ましい。
【００２４】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、６個程度の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からなるタグペプチドの一種であるＨｉｓタグ等のタグを有していてもよい。
【００２５】
図１に、本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の一例の構造を模式的に示す。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、例えば、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼ（キメラＡＰ）のＣ末端側に、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合され、プロテインＧドメインのＣ末端側にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００２６】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、遺伝子工学的手法により、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合した融合タンパク質として発現させて得ることができる。また、その際、プロテインＧドメインのＣ末端側にＨｉｓタグ等のタグを付与してもよい。
【００２７】
融合タンパク質の精製は、Ｎ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し、ゲル濾過クロマトグラフィ、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ等により行うことができる。
【００２８】
融合タンパク質のアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認することができる。融合タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で行うことができる。
【００２９】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質によれば、ほぼ全ての動物種の１次抗体を検出可能である。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の検出感度は、従来の標識プロテインＧより高く、安定性も高い。また、従来の標識２次抗体と検出感度は同等以上であり、汎用性が高い。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質を用いれば多くの１次抗体と結合可能であり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合でも、それぞれに特異的に結合する抗体を用意しなくてもよく、汎用性が高い。
【００３０】
また、本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、変性ＩｇＧを検出しない傾向にある。そのため、例えば、ＩｇＧが多く含まれるサンプルであっても、内在性ＩｇＧが検出されない（後述する実施例４参照）。また、免疫沈降のキャプチャー抗体が検出されない（後述する実施例３参照）という利点がある。
【００３１】
＜タンパク質の検出方法＞
本実施形態に係るタンパク質の検出方法は、前記タンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合しているタンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出する方法である。
【００３２】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法は、例えば、
ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、
免疫組織化学（免疫染色）等の基礎研究分野や、
病理検査分野等に利用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例中、室温とは２０〜２５℃である。
【００３４】
＜実施例１＞
融合型アルカリホスファターゼ（ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合タンパク質ＩＰＰ）と、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメイン（ＰＧ１（ｐＡ−ｐＧ−ｐＧ））と、Ｈｉｓタグとを接続した融合タンパク質遺伝子配列を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ−５  ＨｉｓＡベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して作製した発現ベクター（ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃１（配列番号：１））、および、その融合タンパク質遺伝子配列のＧＣ含量を５４％程度に下げると共に回文配列の除去を行った配列を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ−５  ＨｉｓＡベクターに導入して作製した発現ベクター２種（以下、ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２（配列番号：２）およびｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２（配列番号：３））の、ヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔにおける一過性発現、および発現タンパク質の金属固定化アフィニティカラム（ＩＭＡＣカラム、ＴＡＬＯＮ）による精製を行った。以下、これら３種の発現ベクターによる生産物をそれぞれＰＧ１−ＩＰＰ＃１（配列番号：４）、ＰＧ１−ＩＰＰ＃２（配列番号：５）およびＩＰＰ−ＰＧ１＃２（配列番号：６）と略記する。
【００３５】
［材料と試験方法］
１．発現プラスミド
使用したプラスミド
ａ．ｐＩＲＥＳｎｅｏ３（コントロールベクター）
ｂ．ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃１（ｐＧ−ｐＧ−ｐＡ−ＩＰＰ）
ｃ．ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２（ｐＧ−ｐＧ−ｐＡ−ＩＰＰ）
ｄ．ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２（ＩＰＰ−ｐＡ−ｐＧ−ｐＧ）
【００３６】
２．培養細胞
ヒト胎児腎細胞由来でＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、理研細胞バンクより入手した（＃ＲＣＢ２２０２）。
【００３７】
３．一過性分泌発現試験
（１）細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養に使用する増殖培地には、１０％ＦＢＳと２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＤＭＥＭ培地を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０ｃｍ−ｄｉｓｈ中、ＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）で静置培養し、７０〜８０％コンフルエントの細胞集団を３日に１度、１／８に希釈して継代した。トランスフェクション用の細胞は、１０ｃｍ−ｄｉｓｈに培養した８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションを行う２４時間前に１／２に希釈継代し作製した。
【００３８】
（２）トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｐｌｕｓ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５３３８−１００）を使用した。また、トランスフェクションに使用するプラスミドは、以下（３）で示すものである。
【００３９】
トランスフェクションに先立ち、１０ｃｍ−ｄｉｓｈ×４枚のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（８０％コンフルエント）を準備し、培養液を除き、１０ｃｍ−ｄｉｓｈ  １枚あたり５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃３１９８５−０７０）で洗浄し、１０ｃｍ−ｄｉｓｈ  １枚あたり９ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を添加した。
【００４０】
続いて以下の表２に示す用量および時間でＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と発現プラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬（Ｐｌｕｓ試薬およびＬＴＸ試薬）を混合し、室温で放置してトランスフェクション混合液を作製した。
【００４１】
各トランスフェクション混合液は、８ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を加えた１０ｃｍ−ｄｉｓｈ上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に滴下し、７２時間培養を継続して一過性発現を行った。
【００４２】
（３）調製したエンドトキシンフリープラスミド
調製したエンドトキシンフリープラスミドを表１に示す。
【００４３】
【表１】
2014100095.tif 000003
【００４４】
（４）トランスフェクション混合液の調製
トランスフェクション混合液の調製方法を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2014100095.tif 000004
【００４６】
（５）培養上清の回収
トランスフェクション７２時間後の培養上清を回収し、１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、Ｓｙｒｉｎｇｅ−Ｆｉｌｔｅｒ０．２２μm（ＴＰＰ、＃９９７２２）でろ過し、ろ液を４℃で保存した。各培養上清のろ液１０ｍＬのうち、１ｍＬはサンプルとし、１ｍＬを培養上清の発現確認のために、残り８ｍＬをＨｉｓタグによる簡易カラム精製のためにそれぞれ使用した。
【００４７】
４．培養上清の発現確認と精製
（１）培養上清の発現確認
フィルタろ過済みの培養上清各１ｍＬ分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０ｍｅｍｂｒａｎｅ（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＵＦＣ５０１０９６）で５０μＬに濃縮（２０倍濃縮）した。濃縮した各培養上清１０μＬ分（原液２００μＬ分に相当）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色および抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｑｉａｇｅｎ、＃３４６６０）を使用したイムノブロッティングにより、分泌発現の有無を確認した。
【００４８】
（２）Ｈｉｓタグによる簡易カラム精製
Ｈｉｓタグによるカラム精製には、ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、＃６３５５０４）を使用した。フィルタろ過済みの培養上清各８ｍＬ分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０ｍｅｍｂｒａｎｅ（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＵＦＣ８０１０２４）を使用して５００μＬに濃縮（１６倍濃縮）し、５ｍＬの結合／洗浄バッファ（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を加えて希釈し、カラムへのアプライサンプルとした。
【００４９】
各アプライサンプルは、結合／洗浄バッファで平衡化したＴＡＬＯＮカラム（ｂｅｄ  ｖｏｌ．２００μＬ）にアプライし、その後それぞれのカラムを２ｍＬの結合／洗浄バッファで２回洗浄した。溶出は段階溶出で４００μＬずつ３回施行した。１回目と２回目は、４００μＬの溶出バッファ＃１５０（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した（以下溶出＃１、溶出＃２）。３回目は、４００μＬの溶出バッファ＃５００（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した（以下溶出＃３）。
【００５０】
各精製画分（アプライサンプル、素通り画分、および溶出＃１、溶出＃２、溶出＃３）それぞれ１０μＬ分を、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色およびＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を使用したイムノブロッティングにより確認した。
【００５１】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、ｅ−ＰＡＧＥＬ  １０％（ＡＴＴＯ、＃Ｅ−Ｒ１０Ｌ）を使用した。分子量マーカは、Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ，Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（ＮＥＢ、＃Ｐ７７０８Ｓ）を使用した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの転写には、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ（ＧＥ、＃ＲＰＮ３０３２Ｄ）を使用した。
【００５２】
抗Ｈｉｓ抗体は、マウスモノクローナル抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｑｉａｇｅｎ、＃３４６６０）を最終濃度０．４μｇ／ｍＬで使用した。また、二次抗体は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ  標識ヤギ抗マウス抗体（＃６１０−７３１−１２４、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を最終濃度２μg／ｍＬで使用した。
【００５３】
［結果］
（１）培養上清の発現確認
一過性分泌発現させた各培養上清（各レーン２００μＬ分）のＣＢＢ染色と抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットの結果を図２に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色および抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットのいずれにおいても、ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃１による一過性発現では微弱にしか検出できなかった標的タンパク質を、ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２およびｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２による一過性発現では、８５ｋＤａ付近および１７０ｋＤａ付近に、顕著なバンドとして確認できた。
【００５４】
ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２とｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２について比較すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色においても、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットにおいても、ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２の方が圧倒的に強い発現となった。
【００５５】
ここでは標準アルブミン溶液を用いた定量は行わなかったが、バンドの濃度からの概算として、ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２とｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２はそれぞれ１０μg／ｍＬ程度の発現レベルとなったことが推定される。
【００５６】
（２）Ｈｉｓタグによる簡易カラム精製
各精製フラクション（各レーン１０μＬ分）のＣＢＢ染色と抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットの結果を図３に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色および抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によるイムノブロットの結果、結合／洗浄バッファに平衡化後のアプライサンプルからは、上記（１）のろ過培養上清と同様に、８５ｋＤａおよび１７０ｋＤａ付近に二つの顕著なバンドが検出される一方、ＴＡＬＯＮカラムによるＨｉｓタグ精製では、目的物の大部分はアプライサンプルと同様な８５ｋＤａ付近および１７０ｋＤａ付近の２つのバンドとして溶出＃１の画分に、また一部はフロースルーと溶出＃２の画分に検出された。溶出＃３画分での検出は、わずかであった。
【００５７】
結論として、培養上清の発現産物は、結合／洗浄バッファ（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）の平衡化条件で結合し、溶出バッファ１５０（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）の溶出条件で溶出されることが判明した。このことから、培養上清からの目的産物のＨｉｓタグによる簡易カラム精製は可能と結論される。
【００５８】
ｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２とｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２は、ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃１によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性発現と比較し、格段の発現の向上が得られた。また、この結果で、ｐＰＧ１−ＩＰＰ＃２とｐＩＰＰ−ＰＧ１＃２との間でも大きな発現効率の違いが認められているが、この両発現ベクターでは、挿入標的遺伝子配列以外の相違はないので、発現効率には、挿入配列に含まれる要因が関与していると考えられる。
【００５９】
＜実施例２および比較例１＞
［検出感度の比較］
１．サンプルの調製
トランスフェリンタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、６１６４１９）を滅菌水で溶解（１０ｍｇ／ｍＬ）した。これに等量の２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，４％  ＳＤＳ，０．０１％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ，１０％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ６．８）を加えて熱変性した（１００℃、５分間）。希釈倍率３．１６倍、希釈液１×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、３．１６ｎｇ／１５μＬ、１ｎｇ／１５μＬ、３１６ｐｇ／１５μＬ、１００ｐｇ／１５μＬ、３１．６ｐｇ／１５μＬ、１０ｐｇ／１５μＬ、３．１６ｐｇ／１５μＬの希釈系列サンプルを作製した。
【００６０】
２．ウエスタンブロット
ポリアクリルアミドゲルに希釈系列サンプルを１５μＬずつアプライし（３．１６ｎｇ〜３．１６ｐｇ／レーン）、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２００Ｖ定電圧、３０〜３５分間）により分離した。
電気泳動槽：ミニプロティアンＴｅｔｒａセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ポリアクリルアミドゲル：ミニプロティアンＴＧＸゲル１０％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４５６−１０３５）
泳動バッファ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％ＳＤＳ，ｐＨ８．３
分子量マーカ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１−０３７３）
【００６１】
ブロッティング（２００ｍＡ定電流、４０分間）は、以下の条件で行った。
メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐメンブレン、ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２０２０Ｆ（１００％メタノールに１分間浸漬した後、蒸留水で５分間洗浄し、転写バッファに浸して平衡化））
転写バッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ８．３）
【００６２】
ブロッティング後のメンブレンをＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）に浸し、室温で３分間振盪し、メンブレンをＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で溶解した５％スキムミルクに浸し、室温で６０分間振盪し、メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、４回振盪し、ＴＢＳＴで希釈した１次抗体にメンブレンを浸した（１次抗体：Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＡＫＯ、Ａ００６１）、濃度：４．３μｇ／ｍＬ）。４℃で終夜静置した後、メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、４回振盪し、ＴＢＳＴで希釈した下記プロテインＧまたは２次抗体それぞれにメンブレンを浸した。
【００６３】
［実施例２］
ＡＰ標識プロテインＧ（実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２）  ０．４μg／ｍＬ
［以下、比較例１］
ＡＰ標識プロテインＧ（Ａｂｃａｍ、ａｂ７４６１）  ０．４μg／ｍＬ
ＡＰ標識プロテインＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＰＧ００−０５）  ０．４μg／ｍＬ
ＡＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６１１−１５０２）  ０．１μg／ｍＬ
ＡＰ標識２次抗体（ＫＰＬ、４７５１−１５０６）  ０．１μg／ｍＬ
ＨＲＰ標識プロテインＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＰＧ００−０３）  ０．１μg／ｍＬ
ＨＲＰ標識プロテインＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ−２１０４１）  ２．０μg／ｍＬ
ＨＲＰ標識２次抗体（ＧＥヘルスケア、ＮＡ９３４−１ＭＬ）  ０．００６μg／ｍＬ
ＨＲＰ標識２次抗体（ＰＩＥＲＣＥ、３１４６２）  ０．０２μg／ｍＬ
【００６４】
室温で６０分間振盪し、メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、４回振盪し、メンブレンをハイブリバッグに入れ、発光基質を加えてシーラーでシールした。発光基質は、ＡＰについては、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ、２０４１６７７）を用い、ＨＲＰについては、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２２３２）を用いた。メンブレンを画像撮影システム（ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  ｐｌｕｓシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撮影した。結果を図４に示す。
【００６５】
実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２は、検出感度が従来の標識プロテインＧより高く、標識２次抗体と同程度であった。
【００６６】
＜実施例３および比較例２＞
［免疫沈降］
図５および図６に示すように、ｄｉｍｅｒを形成するＤＪ−１タンパク質にタグを付加したＦＬＡＧ−ＤＪ−１とＨＡ−ＤＪ−１を２９３Ｔ細胞に共発現させ、細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体（α−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ）を加え、ＦＬＡＧ−ＤＪ−１を免疫沈降した。上清を除去した免疫沈降サンプルにＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（終濃度：１×）を加えて熱変性（１００℃、５分間）し、同じ量をアプライしたメンブレンを２枚作製してウエスタンブロットを行った。共沈したＨＡ−ＤＪ−１をＨＡ抗体で検出し、一方を実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２、他方を蛍光標識２次抗体で検出して比較した。
【００６７】
上記（実施例２の２．ウエスタンブロット）と同様にして分離、ブロッティングした後、メンブレンをＴＢＳＴで溶解した２．５％スキムミルクに浸し、室温で３０分間振盪し、メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、３回振盪し、ＴＢＳＴで希釈した１次抗体にメンブレンを浸した（１次抗体：α−ＨＡ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＢＬ５６１−５、Ｌｏｔ．０５３）、希釈倍率：１，０００倍）。室温で６０分間振盪し、メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、３回振盪し、ＴＢＳＴで希釈した以下のプロテインＧまたは２次抗体にメンブレンを浸した。
【００６８】
［実施例３］
ＡＰ標識プロテインＧ（実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２）  ０．４g／ｍＬ
［比較例２］
Ａｌｅｘａ６８０標識２次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−２１１０９）  ０．３μg／ｍＬ
【００６９】
メンブレンをＴＢＳＴに浸し、室温で５分間、３回振盪し、蒸留水に浸した。ＡＰ標識プロテインＧの方は、メンブレンをハイブリバッグに入れ、発色基質を加えてシーラーでシールし（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液、和光純薬工業、０２２−１８２３１）、室温で１０分間静置し、メンブレンを蒸留水に浸し、メンブレンをスキャナで撮影した。Ａｌｅｘａ６８０標識２次抗体の方は、メンブレンをＯｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ）で撮影し、蛍光検出した。結果を図７に示す。
【００７０】
ＤＪ−１は１８９ａ．ａ．で、ウエスタンブロットする際に軽鎖とほぼ同じ位置に出る。Ａｌｅｘａ６８０標識２次抗体で検出した方には、ＩＰしたサンプル全てで、免疫沈降に用いた抗体の軽鎖を検出してしまい、共沈してきたＨＡ−ＤＪ−１のバンドと重なっているが、ＡＰ標識プロテインＧ（実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２）の方では、免疫沈降で使用した抗体の軽鎖は検出されず、目的とするバンドのみの結果となった。また、単なるｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧも熱変性してから泳動した。Ａｌｅｘａ６８０標識２次抗体の方では重鎖が検出されているが、ＡＰ標識プロテインＧ（実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２）の方では検出されなかった。
【００７１】
このように、実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２を用いると、免疫沈降のキャプチャー抗体が検出されなかった。
【００７２】
＜実施例４および比較例３＞
［内在性ＩｇＧの検出の有無の確認］
以下の方法により、内在性ＩｇＧの検出の有無を比較した。結果を図８に示す。
【００７３】
１．サンプルの調製
ラット脳組織抽出液（２ｍｇ／ｍＬ）に等量の２×ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えて熱変性した。
【００７４】
２．ウエスタンブロット
ポリアクリルアミドゲルにサンプルを２μＬ（２μｇ）、１０μＬ（１０μｇ）アプライし、実施例２の「２．ウエスタンブロット」と同様の条件でウエスタンブロットを行った。
【００７５】
［実施例４］
ＡＰ標識プロテインＧ（実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２）
［以下、比較例３］
ＡＰ標識プロテインＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＰＧ００−０５）
ＡＰ標識２次抗体（ＫＰＬ、４７５１−１５０６）
【００７６】
実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２では、内在性ＩｇＧが検出されなかった。
【００７７】
＜実施例５＞
［免疫染色］
マウス組織（腎臓、脾臓、肝臓、心臓）をアレイにしたブロックを作製し、下記ＡＰ標識プロテインＧまたはＡＰ標識２次抗体を用いて表３に示す手順により、発色基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰにより免疫染色を行った。マウス心臓についての免疫染色の結果を図９に示す。
【００７８】
（１）１次抗体：なし、ＡＰ標識プロテインＧ：実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２  ２ｕｇ／ｍＬ
（２）１次抗体：Ａｃｔｉｎ（Ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ、Ａ２０６６、Ｓｉｇｍａ）（１／２００）、ＡＰ標識プロテインＧ：実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２  ２ｕｇ／ｍＬ
（３）１次抗体：Ａｃｔｉｎ（１／２００）、標識２次抗体：ＫＰＬ、４７５１−１５０６  ２ｕｇ／ｍＬ
【００７９】
【表３】
2014100095.tif 000005
【００８０】
このように、実施例１で調製したＩＰＰ−ＰＧ１＃２を用いると、ＡＰ標識２次抗体と同様のシグナルが得られ、非特異的結合によるバックグラウンドの上昇はほとんど見られなかった。
【００８１】
以上の通り、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ヒト胎盤型アルカリホスファターゼとヒト小腸型アルカリホスファターゼそれぞれの部分配列を融合した融合型アルカリホスファターゼとを融合させることにより、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質が得られた。また、そのタンパク質検出用融合タンパク質を用いて、汎用性が高く、検出感度が高いタンパク質の検出方法を提供することができた。
【図１】
2014100095.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014100095.tif 000012
【図８】
2014100095.tif 000013
【図９】
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【配列表】
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