(57)【要約】      （修正有）【課題】天然原料から誘導された産物に伴っている不都合な点を有さない生来の細胞環境の重要な特徴を模倣する細胞環境の創生を可能にする細胞培養および組織工学の目的のための合成の組成物および材料を提供する。【解決手段】(a)疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメイン；および(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第２のアミノ酸ドメインを含む自己組織化ペプチドを提供する。当該自己組織化ペプチドは、ここにおいて「修飾自己組織化ペプチド」と記載される。本発明はまた、修飾自己組織化ペプチドを含む医薬組成物、キットおよびマトリクス、並びに前記組成物、キットおよびマトリクスの使用方法および製造方法を提供する。【選択図】図１Ｂ
2014062102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第２のアミノ酸ドメインとを含む自己組織化ペプチド。
【請求項２】
第２のアミノ酸ドメインが少なくとも２つの最小の生物学的に活性のある配列を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記最小の生物学的に活性のある配列が、-PRGDSGYRGD-; -DGRGDSVAYG-; -ALKRQGRTLYGF-; -PFSSTKT-; -FLGFPT-; -KLTWQELYQLKYKGI-; -SKPPGTSS-; -STFTKSP-; -IKVAV-; -FHRRIKA-; -IKLLI-; -RGD-; -REDV-; -LKKTETQ-.からなる群より選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
少なくとも一つの前記最小の生物学的に活性のある配列が、-RGD-.を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のアミノ酸ドメインが単体で生物学的に活性を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合または非共有結合で接続されている請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合ペプチド結合またはアミノ酸リンカー基により共有結合性に接続されている請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
当該アミノ酸リンカー基が少なくとも一つのグリシンを含む請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(6.9オングストローム)である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(13.8オングストローム)である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
第一のアミノ酸ドメインが、アミノ酸配列: -RADA-; -IEIK-; または -FKFQ-の何れか１を少なくとも２回含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む請求項１に記載のペプチド；配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c; 配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c; 配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c; 配列番号52 n-IEIKIEIK-c; 配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
【請求項１３】
第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む請求項１２に記載のペプチド：配列番号21 -RAD ARAD ARADARAD A-; 配列番号51 -FKFQFKFQFKFQ-; 配列番号52 -IEIKIEIK-;  配列番号53 -KLDLKLDLKLDL-。
【請求項１４】
第２のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF、 FGFs、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPからなる群より選択される請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ヘパリン結合ドメインが、式（I）または（II）： -XBBXBX- または -XBBBXXBX- (I) (H)で示される請求項１４に記載のペプチド：ここで、XはF, I, L, P, M, W, Y, V, A, CおよびQからなる群より選択される疎水性のアミノ酸を表し、BはR, HおよびKからなる群より選択される正電荷のアミノ酸を表す。
【請求項１７】
当該自己組織化ペプチドが、以下からなる群より選択される請求項１に記載のペプチド；配列番号1 AC(RADA)4GGPFSSTKT-CONH2; 配列番号2 Ac(RADA)4GGFLGFPT-CONH2; 配列番号3 AC(RADA)4GGALKRQGRTLYGF-CONH2; 配列番号4 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号5 AC(RADA)4GGDGRGDSVAYG-CONH2; 配列番号6 Ac(RADA)4GGFHRRIKA-CONH2; 配列番号7 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDSG-CONH2; 配列番号8 Ac(RADA)4GGRGDSCONH2;配列番号9 Ac(RADA)4 GGGGRGDSCONH2; 配列番号10 Ac(RADA)4GGGGREDV-CONH2; 配列番号1 1 Ac(RADA)4GGGGKLTWQELYQLKYKGI- CONH2; 配列番号12 Ac(RAD A)4GGSKPPGTSS-CONH2; 配列番号13 ACIEIKIEIKIGGPRGSYRGDS-CONH2; 配列番号14 ACIEIKIEIKIGGPFSSTKT-CONH2; 配列番号15 ACIEIKIEIKIGGSKPPGTS-CONH2; 配列番号16 AcFKFQFKFQFKFQGPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号17 ACFKFQFKFQFKFQGGFHRRIKA-CONH2; 配列番号18 Ac(RAD A)4GGSTFTKSP-CONH2; 配列番号19 Ac(RADA)4GGSIKV AVS-CONH2; および配列番号20 Ac(RADA)4GGSEIKLLIS-CONH2。
【請求項１８】
当該自己組織化ペプチドが約５-９(5と9も含む)のpＨ の水性溶液中で正または負の総電荷を持つ請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
第一のアミノ酸ドメインが近中性であるか、または正電荷若しくは負電荷を有する請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
第２のアミノ酸ドメインが正電荷または負電荷を有する請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記溶液のｐＨが約６-８（6と8も含む）であるときに、第一のアミノ酸ドメインの電荷が−１から１である請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記水溶液のｐHが約６-８（6と8を含む）であるときに、第２のアミノ酸ドメインの電荷が−２かそれ以下である請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２３】
第一のアミノ酸ドメインが５−９（5と9を含む）の等電位点を有する請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２４】
当該自己組織化ペプチドが８または８以上の等電位点を有する請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２５】
当該溶液のｐHが約６-８（6と8を含む）であるときに、当該自己組織化ペプチドの総電荷が約２または２以上である請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２６】
単体で存在する場合、第２のアミノ酸ドメインは自己組織化せず、当該ペプチドが集合して巨視的な構造を形成するように、第一のアミノ酸ドメインの自己組織化を可能にする請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項２７】
当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む請求項２７に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項２８】
水溶液中で単独のペプチドとして存在するときに、当該ペプチドが自己組織化する請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項２９】
水溶液中に単独のペプチドとして存在するときには自己組織化せず、水溶液中に非修飾の自己組織化ペプチドと共に存在するときには自己組織化する請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３０】
さらに、第３のアミノ酸ドメインを含む請求項１に記載の自己組織化ペプチド；ここで、当該第３のアミノ酸ドメインは、(a) 疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、(b) 単独では自己組織化しないが、第１のアミノ酸ドメインの集合により、巨視的な構造の形成を可能にする第２のアミノ酸ドメイン、のいずれかを含む。
【請求項３１】
疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を介在する２つのアミノ酸ドメインの間に、生物学的に活性のあるペプチドモチーフまたは生分子との相互作用のための標的部位を含むアミノ酸ドメインの直鎖のペプチド鎖を含む請求項３０に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３２】
当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む請求項３１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３３】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドを含む溶液。
【請求項３４】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３５】
ゲル化剤を実質的に含まず、生体内で自己組織化して巨視的な構造を形成する請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、βシートに自己組織化し、巨視的な構造を取る、追加の自己組織化ペプチドを更に含み、当該追加の自己組織化ペプチドが細胞接着または細胞生存の適合性を低下させるアミノ酸を含まない請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約１：１の比率で存在する請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約５：１の比率で存在する請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約９：１の比率で存在する請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約９９：１の比率で存在する請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１に記載の自己組織化ペプチドを含むマトリクス。
【請求項４３】
当該マトリクスがゲルまたはハイドロゲルである請求項４２に記載のマトリクス。
【請求項４４】
当該マトリクスが更に追加の生物学的分子を含む請求項４２に記載のマトリクス。
【請求項４５】
前記追加の生物学的分子が正または負の総電荷を有する請求項４４に記載のマトリクス。
【請求項４６】
当該追加の生物学的分子がたんぱく質またはペプチドである請求項４４に記載のマトリクス。
【請求項４７】
当該たんぱく質またはペプチドが成長因子または自己組織化ペプチドである請求項４６に記載のマトリクス。
【請求項４８】
当該自己組織化ペプチドが以下からなる群より選択される請求項４７に記載のマトリクス：配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c; 配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c; 配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c; 配列番号52 n-IEIKIEIK-c; および配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
【請求項４９】
当該増殖因子がヘパリン結合増殖因子である請求項４７に記載のマトリクス。
【請求項５０】
当該ヘパリン結合増殖因子が、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-βおよび BMPからなる群より選択される請求項４９に記載のマトリクス。
【請求項５１】
当該追加の生物学的分子がグリコサミノグリカンである請求項４４に記載のマトリクス。
【請求項５２】
当該グリコサミノグリカンがヘパリンまたはヘパラン硫酸である請求項５１に記載のマトリクス。
【請求項５３】
当該マトリクスの表面に接着またはマトリクス内部に封入されている複数の細胞を更に含む請求項４２に記載のマトリクス。
【請求項５４】
当該細胞が実質的に均質に当該マトリクス内部に分散している請求項５３に記載のマトリクス。
【請求項５５】
当該細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、角質細胞、基底細胞、棘突起細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、子宮頸部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞およびそれらの前駆細胞からなる群より選択される請求項５３に記載のマトリクス。
【請求項５６】
当該マトリクスが３次元である請求項４２に記載のマトリクス。
【請求項５７】
当該マトリクスが更に固体物を含む請求項４２に記載のマトリクス。
【請求項５８】
当該固体物が無機塩である請求項５７に記載のマトリクス。
【請求項５９】
当該無機塩がカルシウムおよび／またはリン酸である請求項５８に記載のマトリクス。
【請求項６０】
当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される請求項５９に記載のマトリクス。
【請求項６１】
当該固体物が約１００−５００ミクロン（100と500を含む）の範囲の孔径を有する請求項５７に記載のマトリクス。
【請求項６２】
当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である請求項５７に記載のマトリクス。
【請求項６３】
(i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii) pHを調整する工程とを含む請求項４２に記載のマトリクスを製造する方法。
【請求項６４】
(iii)ゲル化剤を加える工程を更に含む請求項６３に記載のマトリクスを製造する方法。
【請求項６５】
(i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii)ゲル化剤を加える工程とを含む請求項４２に記載のマトリクスを製造する方法。
【請求項６６】
(iii) pHを調整する工程を更に含む請求項６５に記載のマトリクスを製造する方法。
【請求項６７】
当該ゲル化剤が電解質である請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６８】
当該ゲル化剤が食塩、食塩水、PBS、細胞培養液または生物学的流体である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
当該生物学的流体が血液またはリンパ液である請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ｐHが約５−９（5と9を含む）に調整されている請求項６３または６６に記載の方法。
【請求項７１】
ｐHが約６−８（6と8を含む）に調整されている請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ｐHが約５−７（5と7を含む）に調整されている請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ｐHが約5.7-5.8（5.7と5.8を含む）に調整されている請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
骨又は組織の欠損補填材としての請求項４２に記載のマトリクスの使用方法。
【請求項７５】
当該組織が、脳、皮膚、肝臓、膵臓、胃、腎臓、消化器、食道、心臓、筋肉、結合組織、軟骨、神経、脂肪または骨髄である請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
当該補填材が水溶液中の自己組織化ペプチドを含む請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
当該補填材が当該自己組織化ペプチドのハイドロゲルを含む請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液とゲル化剤との混合により形成される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
当該ゲル化剤が生物学的流体である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
当該生物学的流体が血液またはリンパ液である請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液のｐHを調整することによる形成される請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
更に固体物を含む請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
当該固体物が無機塩である請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
当該無機塩がカルシウムおよび／またはリン酸である請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記固体物が、約１００−５００ミクロン（100と500を含む）の孔径を有する請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
当該欠損が、損傷した組織、損傷した整形領域、骨欠損、骨隣接部、異所性の骨形成、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損である請求項７４に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１に記載の自己組織化ペプチド、請求項３４に記載の医薬組成物または請求項４２に記載のマトリクスをそれを必要とする対象に対して投与することを含む細胞の分化または機能活性を増強する方法。
【請求項９０】
請求項１に記載の自己組織化ペプチド、請求項３４に記載の医薬組成物または請求項４２に記載のマトリクスを対象の体の部位または体内に導入することを含む対象を治療する方法。
【請求項９１】
当該部位が、整形領域、骨欠損部、骨隣接部、異所性の骨形成部、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損部である請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
(a)(i)請求項１の自己組織化ペプチド、(ii)請求項３４の医薬組成物、または(iii)請求項４２のマトリクス；(b) 当該ペプチドの巨視的な構造への自己組織化を開始するための説明書；並びに(c) 細胞群、細胞または組織培養培地、あらかじめ定めた量の増殖因子、予め定めた量のイオンまたはその塩、当該自己組織化ペプチドを細胞培養のために準備するための説明書、ペプチドハイドロゲル構造の上または中で細胞を培養するための説明書、当該自己組織化ペプチドを対象に導入するための説明書、細胞培養を実施する容器、当該ペプチドを溶解する液体、注射器、ペプチドの自己組織化を開始するためのイオンまたはその塩、および１または１以上の増殖因子または分化因子からなる群より選択される少なくとも１の成分；を含む培養キット。
【請求項９３】
細胞を、請求項１の自己組織化ペプチド、請求項３４の医薬組成物、または請求項４２のマトリクスと接触させることと、当該マトリクスを細胞培養に適した条件下で細胞培養に適した時間に亘り維持することとを含む細胞を培養する方法。
【請求項９４】
当該細胞が、当該マトリクスの表面上で培養される、および／または当該マトリクス内に封入されて培養される請求項９２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
優先権情報
本出願は、35 U. S. C. 119(e)に基づき、２００６年９月２６日出願の米国仮出願U. S. S.N. 60/847,303による優先権を主張するものであり、当該出願内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）はタンパク質および多糖類の両方を含む巨大分子の多様なセットよりなり、これらは細胞が生体内において存在する３次元の環境を形成し、細胞間の空隙充填物を構成している。ＥＣＭはまた組織化されて基底層または基底膜として知られるシート様の層となる。身体の多くの領域において、基底膜は上皮細胞の層または管の下部に位置（例えば内脾細胞ライニング血管）するか、または、筋肉細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲して細胞層を相互から、または隣接する結合組織から隔たらせている場合が多い。  
ＥＣＭは主に、局所的に分泌されて組立られ細胞層および組織の物理的構造を安定化させ支持している骨格となる分子よりなる。しかしながら、単に細胞の結合のための不活性な物質であるであるよりはむしろ、ＥＣＭは生物学的情報に富んだ環境を構成する。ＥＣＭおよびそれに関連する（例えば局所的に分泌されるか、または何らかの別の場所から特定の部位に輸送される）種々の生体分子が細胞の挙動および表現型の多くの特徴に大きく影響することにより、遊走および増殖のような過程を調節し、細胞の発生および分化に影響し、そして細胞の形状および機能に作用していることがわかっている。ＥＣＭの構造もその内部にある細胞により影響を受ける。即ち、細胞−ＥＣＭ相互作用は生命にとって重要であることは明らかである。  
有用な生物学的情報の大量のものがガラスまたはプラスチックのような伝統的な組織培養基体の上での細胞の成育に対して実施された実験から収集されているが、生来の細胞の環境をより正確に反映している培養系および材料を開発することに対する関心が増大している。このような材料は、細胞培養のためのみならず、組織修復および組織工学のため、例えば細胞、組織および／または人工臓器の生育のため、または、生体分子の製造のための細胞系バイオリアクター中における使用のためにも用途を有している。
【０００３】
このような系を開発するために行われた多くのこれまでの研究では動物原料から得られたタンパク質およびペプチドのような材料の使用が行われていた。しかしながら、これらの材料は合成材料と比較して多くの不都合な点を有している。例えば、これらは疾患の伝染の危険性を高める。滅菌条件とされているもとで採取された場合であっても、汚染の危険性は高い。動物原料を使用する場合、材料をその後ヒト身体内に、例えば人工臓器中の成分として組織修復のために導入すれば、免疫原性の問題が生じる。さらにまた、材料の種々の調製品が一貫して再現性のある組成を有することは困難である場合がある。天然原料から単離した材料の既知成分に関して一貫性を達成することが可能である場合も、細胞の特性に影響する可能性がある未知の、おそらくは未同定の成分が確実に排除されるようにすることは困難または不可能である。さらにまた、これらの天然産物を採取、処理および／または再構成する過程において、これらは損傷を受けるか分解する可能性があり、従って潜在的にそれらが生来の細胞環境を複製する信頼性は低下する。  
ＥＣＭにより提供される環境を模倣する材料の開発の別の方法は、組み換えＤＮＡ手法により種々のＥＣＭ成分を生成することである。例えば、ＥＣＭタンパク質をコードする発言構築物は、原核細胞または真核細胞に導入することができ、分泌タンパク質の場合、興味あるタンパク質は細胞または培地より精製することができる。タンパク質はインビトロにて所望の比率で組み合わせることができる。疾病伝播の可能性の減少が起こり得るため、この取り組みもまた、いくつかの不利点を抱える。例えば純粋に合成の過程ではなく生物学的にタンパク質を製造する場合は、培養系由来の未確認の成分が高度に精製された調製品中にも存在する可能性が残存する。さらに、精製は時間と費用を要し、タンパク質の分解または変性をもたらす場合がある。  
生来のＥＣＭは大部分がタンパク質およびプロテオグリカンよりなるが、種々の合成の非アミノ酸系の重合体に基づいた細胞培養および組織工学の材料の開発に多大な研究が投じられている。例えば脂肪族炭化水素は種々の組織工学用途に広範に使用されている。一般的に使用されている完全に合成の材料には、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）、（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）およびこれらのものや他のものの種々の共重合体が包含される。しかしながら、これらの材料も多くの不都合な点を有している。例えばこれらは数十ミクロンのオーダーの直径を有する繊維を形成し、これは生来のＥＣＭ中に存在する繊維の直系よりはるかに大きい。さらにまた、このような材料から形成されたマトリックス内に細胞を導入するために必要とされる方法は細胞の生存性のための生理学的要件と容易には合致しない。  
即ち、天然原料から誘導された産物に伴っている不都合な点を有さない生来の細胞環境の重要な特徴を模倣する細胞環境の創生を可能にする細胞培養および組織工学の目的のための合成の組成物および材料がなお必要とされている。例えば生来のＥＣＭ成分により与えられるものに近似した生物学的に関連する刺激を細胞に提供する材料を開発することが望ましい。身体への移植を行う用途のためには、免疫または炎症応答の惹起が全く無いか最小限である組成物および材料および身体内で分解される組成物および材料の特別な必要性が存続している。さらにまた、所望な態様において細胞の特性および機能に影響する組成物および材料の必要性が当該分野で存続している。  
発明の要旨
本発明は特にこのような必要性を意図している。本発明は自己組織化ではない別のドメインを取り込むことにより自己組織化ペプチドを修飾することができるがなお自己組織化部分の組立を可能できるという発見を包含する。別のドメインは得られるペプチドに対して種々の特性を付与できる。好ましくは得られるペプチドは自己組織化してナノ繊維を形成し、そして好ましくは巨視的構造を形成する。ペプチドの自己組織化により形成される物質は特に細胞培養、組織工学および組織修復の分野において広範な用途を有する。  
１つの特徴において、本発明は（ａ）自己組織化を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己組織化して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの；および、（ｂ）単離された形態で自己組織化しない第２のアミノ酸；を含む自己組織化ペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態においては、第２のアミノ酸ドメインは生物学的に活性なペプチドモチーフ、例えば天然に存在するタンパク質中に存在するペプチドモチーフ、または生体分子との相互作用のための標的部位を含む。本発明の特定の実施形態においては、天然に存在するタンパク質は細胞外マトリックスの成分、例えば基底膜の成分である。  
本発明はさらに、自己組織化ペプチドを含む骨格、細胞培養、組織工学および組織修復等のために骨格を使用する方法、および、アミノ酸ドメインを選択する方法を提供する。
【０００４】
第二の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチドを含む溶液を提供する。
【０００５】
第三の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０００６】
第四の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチドを含むマトリクスを提供する。本発明の特定の実施形態として、マトリクスはゲルやハイドロゲルである。本発明は、骨や組織の補填材（例えば、組織工学や、組織修復の用途で）としてのマトリクスを製造し、使用する方法も提供する。例えば、本発明では、前駆細胞の増殖および分化活性を増強することで整形分野の組織再生を拡張する修飾自己組織化ペプチドを含むマトリクスを記述している。このようなマトリクスはインビボ（生体内）で骨または組織の再生を促進するための補填材として使用できる。
【０００７】
第五の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチド、その溶液、その医薬組成物、またはそれから作られるマトリクスを、それを必要とする対象に対して投与することを含む、細胞の分化または機能活性を増強する方法を提供する。
【０００８】
第六の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチド、その溶液、その医薬組成物、またはそれから作られるマトリクスを、対象の体の部位または体内に導入することを含む、前記対象を治療する方法を提供する。本発明の特定の実施形態においては、当該部位とは、整形領域である、骨欠損である、骨隣接部である、異所性の骨形成である、虚血領域である、心筋梗塞領域である、末梢血管領域であり、脳梗塞領域である、あるいは皮膚欠損である。
【０００９】
第七および最後の側面として、本発明は、修飾自己組織化ペプチド、その溶液、その医薬組成物、それから作られるマトリクスを含むキットおよびそのようなキットの使用方法を提供する。
【００１０】
本発明の実施形態の詳細は後述の図および特定の実施例の明細書に示される。本発明の他の特徴、対象および利点は、記述、図および請求項から明らかにされる。
【００１１】
引用による組み込み
本出願は種々の特許および出版物を参考にしている。これらの内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
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【００１３】
本発明の種々の態様のために有用な更なる情報は、米国特許出願公開第20050181973号にも記載されており、その内容は引用によりここに組み込まれる。仮に組み込まれた文献の何れかと本明細書の間に矛盾がある場合には、本明細書が制御するものとする。
【００１４】
定義
以下の定義が、発明を理解するのに用いられる。
【００１５】
アミノ酸ドメイン：「アミノ酸ドメイン」とはペプチド結合により連結されたアミノ酸少なくとも２個の隣接する重合体を意味する。ドメインはペプチド結合１つ以上により別のアミノ酸またはアミノ酸ドメインに連結されていてよい。アミノ酸ドメインはペプチドのＮ末端またはＣ末端においてアミノ酸少なくとも２個を構成できるか、またはペプチドの中央のアミノ酸少なくとも２個を構成できる。  
抗体：一般的に「抗体」という用語は免疫グロブリンを指し、これは本発明の種々の実施形態において天然であるか、または、完全または部分的に合成により製造されていてよい。抗体は天然の原料（例えばげっ歯類、ウサギ、ニワトリ（または卵）から、抗原または抗原をコードするコンストラクトで免疫化されている動物から精製したもの）から部分的に誘導されるか、または、完全に合成により製造されてよい。抗体は多くの免疫グロブリンのクラス、例えばヒトのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの何れかであってよい。抗体はＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（１鎖可変）のフラグメントまたは抗原構築部位を保有している他のフラグメント、または組み換え製造されたｓｃＦｖフラグメント、例えば組み換え製造フラグメントであってよい。例えばＡｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０−７６５，２００２およびその参考文献を参照できる。好ましい抗体、抗体フラグメント、および／または抗原結合部位を含むタンパク質ドメインは例えばファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５，１９９４）、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．，ａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：４９３７−４９４２，１９９７）等のような手法を用いてインビトロで発生および／または選択してよい。本発明の種々の実施形態において、抗体は例えばげっ歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させることによりげっ歯類抗体の特異性を温存させた「ヒト化」抗体である。ヒト起源のドメインはこれが人間内で最初に合成されるという意味においてヒトを直接の起源とする必要は無い。むしろ、「ヒト」ドメインは自身のゲノムがヒトの免疫グロブリン遺伝子を取り込んでいるげっ歯類において発生させてよい。例えばＶａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９を参照できる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。  
約：本明細書においては、「約」という用語は測定値または数が示された数字の１０％まで何れかの方向に偏っていてよいことを意味する。  
生物学的に活性なペプチドモチーフ：「生物学的に活性なペプチドモチーフ」とは適切な細胞型において細胞がペプチドと接触している場合に表現型の応答または変化を誘導するペプチドである。ペプチドは単離された形態またはより大型のポリペプチドまたは他の分子の部分として存在してよい。ペプチドが応答を示す能力は例えばペプチドの非存在下（例えばより大型のポリペプチド内に通常通り存在する場合にペプチドを突然変異または除去することによる）における関連のパラメーターを比較することにより測定してよい。本発明の種々の実施形態において、好ましい表現型の応答または変化は例えば細胞の展開、結合、接着、増殖、ＥＣＭ分子の分泌の増強、または、特定の分化した細胞型に特徴的な表現型の発現を包含する。 
生体分子：本明細書においては、「生体分子」とは生命体中に存在する分子に典型的な特徴を有するタンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物または核酸のような分子を指す。生体分子は天然に存在するか、または、人工（自然界に存在せず、自然界に存在する分子と同一ではない）であってよい。例えば人間の精神的過程から生じ、自然界に存在しない配列または修飾を有するタンパク質は人工生体分子とみなされる。
【００１６】
化学走性物質とは本明細書においては、物質が存在する部位に向かって細胞を収集する能力を有するその物質を指す。そのような細胞は例えば組織の形成または修復に寄与する（例えば成長因子を提供することによる）か、または免疫応答に寄与する能力を有する。 
相補的：「相補的」とは巨視的骨格の繊維における隣接するペプチドから生じる親水性の残基の間のイオンまたは水素結合の相互作用を形成する能力を有することを意味する。ペプチド中の各親水性残基は隣接するペプチド上の親水性の残基と、水素結合するか、またはイオン対形成するか、または、溶媒に曝露される。対形成はまたファンデルワールス力が関与するものであってよい。  
内皮細胞：「内皮細胞」という用語は当該分野で通常受け入れられている意味を与えられるものであり、即ち心臓、血管（毛細管を含む）およびリンパ管の空洞の内張りとなる細胞の最内層である。「内皮」および「血管内皮」という用語も本明細書においては互換的に使用する。
【００１７】
ゲル化剤：本明細書での「ゲル化剤」とは、修飾された自己組織化ペプチドをマトリクス（ゲルやハイドロゲルなど）に変化させるものである。ある実施例では、ゲル化前のペプチド溶液は非粘性液体であったり、粘性液体であったり、ゾル状態であったりする。ゲル化剤の例としては、電解液(例えばNaOH, KCl, NaCl, 生理食塩水 (NaCl水溶液), リン酸バッファー食塩水 (PBS水溶液))、細胞培養培地(MEMのような哺乳類細胞培養培地等)、塩基性溶液(NaOH溶液等)や生物学的流体(血液、リンパ液など)）があるが、これに限定されない。
【００１８】
単離された：本明細書においては、「単離された」とは、１）自然界において通常伴っている成分の少なくとも一部から分離され；２）人間の作業が関与する工程により調製または精製され；および／または３）自然界に存在しないことを意味する。
【００１９】
等浸透圧溶質：「等浸透圧溶質」とは形成される溶液（等浸透圧溶液）が、１分間超、好ましくは５分間超、さらに好ましくは１０分間超、さらに好ましくは少なくとも１時間超の期間に渡り、細胞の生存性に適合する浸透圧または浸透性を有するように水溶液中に溶解された非イオン化化合物を意味する。一般的に好ましい等浸透圧溶液は細胞の細胞外または細胞内の環境（例えば組織培養用の培地、対象内等）の浸透圧に近似した浸透圧を有する。例えば等浸透圧溶液は２９０±１０ｍｏｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ内の浸透圧を有してよい。好ましい等浸透圧溶質は炭水化物、例えば単糖類または２糖類を包含する。好ましい炭水化物の例はスクロース、グルコース、ガラクトース、フラクトース、リボース、マンノース、アラビノースおよびキシロースを包含する。さらに別の好ましい等浸透圧溶質はグリセロール、例えば５〜２０％（ｖ／ｖ）グリセロールのグリセロール水溶液である。
【００２０】
巨視的：「巨視的」とは、１０倍以下の倍率下で目視可能であるために十分大型の寸法を有することを意味する。本発明の好ましい実施形態においては、巨視的構造は裸眼で目視可能である。巨視的構造は透明であってよく、そして２次元または３次元であってよい。二次元の場合、本発明の特定の実施形態においては、分子の単層より多いもの、例えば分子２層、３層またはこれ以上を包含する。典型的には、各寸法は少なくとも１０μｍの大きさである。特定の実施形態においては、少なくとも２次元は少なくとも１００μｍ、または少なくとも１０００μｍの大きさである。多くの場合、少なくとも２次元は少なくとも１〜１０ｍｍの大きさ、１０〜１００ｍｍの大きさまたはそれ以上である。該当する寸法は、例えば長さ、幅、深さ、広さ、高さ、半径、直径、円周であってよく、或は球、円筒、立方体等のような規則的な２または３次元の形状を有さない構造の場合は上記した何れかの近似値であってよい。他の該当する寸法も使用してよい。  
マーカー：「マーカー」とは特定の細胞型、組織型、発生学的起源、分化状態または生理学的または代謝的な状態を示すか、または、特定の罹患または生理学的状態（例えば癌、清浄、形成不全）を示すか発見する、何れかの遺伝子または遺伝子産物（例えばタンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ）であってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、検査対象である細胞または組織が特定の細胞型または組織型のものであるか、または特定の発生学的起源、分化状態、生理学的状態または代謝状態を有することを示すものであってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、患者、臓器、組織または細胞の特定の生理学的または罹患状態を示すものであってよい。好ましくは発現または無発現はノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、配列決定、免疫化学、イムノブロッティング、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンアレイ、タンパク質マイクロアレイ分析、質量分析等のような標準的な手法を用いて測定してよい。本発明の特定の実施形態においては、マーカー遺伝子の発現水準は定量可能である。種々のマーカーの発現はまた機能的試験により測定できる。例えばチトクロームＰ４５０遺伝子の発現（例えば肝細胞中）はＰ４５０タンパク質の存在に特徴的な反応を行う（例えば特定の基質を代謝する）細胞または細胞溶解物の能力を測定することにより評価できる。特定の細胞型を示すか識別する他のマーカーもまた使用してよい。例えば、特定の化合物の生産または取り込みをマーカーとして使用してよい。例えばＬＤＬの取り込みまたは酸化窒素の生産は内皮細胞のために有用なマーカーである。マーカーについては後にさらに考察する。
【００２１】
マイクロファイバー：本明細書においては、「マイクロファイバー」という用語はマイクロスケールの寸法の直径を有する繊維である。典型的にはマイクロスケール繊維は１０００μｍ以下、５００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、２０μｍ以下、１０〜２０μｍ、５〜１０μｍの直径を有する。
【００２２】
マイクロスケール：本明細書においては、「マイクロスケール」とは一般的にマイクロメーターの単位で表示されることがより好都合である寸法を有する構造を指す。例えば「マイクロスケール構造」という用語は約５００μｍ以下、約１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２０〜５０μｍ、約１０〜２０μｍ、約５〜１０μｍ、または１〜５μｍの寸法を有する構造を指す。当業者の知る通り、このような構造の長さはミリメートルに至る場合があるが、大部分の寸法はマイクロメートルの範囲内にある
ナノスケール：本明細書においては、「ナノスケール」という用語は一般的にナノスケール単位で表示されることが最も好都合である寸法を有する構造を指す。例えば「ナノスケール構造」または「ナノスケール骨格」という用語は約１μｍ以下、例えば約５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約２０〜５０ｎｍ、約１０〜２０ｎｍ、約５〜１０ｎｍ、または１〜５ｎｍ、約１ｎｍ、または０．１〜１ｎｍの寸法を有する構造を指す。範囲は両端を含む。該当する寸法は、例えば長さ、幅、深さ、広さ、高さ、半径、直径、円周であってよく、或は球、円筒、立方体等のような規則的な２または３次元の形状を有さない構造の場合は上記した何れかの近似値であってよい。構造の形状に応じて構造がナノスケール構造であるかどうかを決定するために他の該当する寸法を使用してもよい。当業者の知る通り、ナノスケール構造の寸法の１つ以上はナノメーター範囲に無くてもよい。例えばこのような構造の長さはミクロンの範囲以上に至ってもよい。しかしながら、一般的には大部分の寸法がナノメートルの範囲内にある。  
最小の生物学的に活性のある配列：本明細書中で、「最小の生物学的に活性のある配列」とは、特定の生物学的な機能を持ちために最小な長さのペプチドの配列のことである。第１の例として、-SEIKLLIS-はラミニンの生物学的に活性のある配列であるが、-IKLLI-は細胞接着のみの機能を持つ配列である。従って、この場合-IKLLI-は「最小の生物学的に活性のある配列」である。第１の例として、-DGRGDSVAYG-は-RGD-を配列として持っている。-RGD-は細胞接着機能を持つ。しかし、-DGRGDSVAYG-は骨芽細胞分化の機能を持つ。従って、この場合、- DGRGDSVAYG- と-RGD-の両方とも「最小の生物学的に活性のある配列」と考えられる。本発明で理解されるように、修飾されたペプチドの2番目のアミノ酸ドメインは少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を有する。最小の生物学的に活性のある配列は元のたんぱく質配列の内、どのような長さにもなりうる。更に、最小の生物学的に活性のある配列のアミノ酸以外の2番目のアミノ酸ドメインは、親水性や総電荷の調整のために変更・追加可能である。特定の実施形態においては、最小の生物学的に活性のある配列は表2aに示されるどの配列でも良い。
【００２３】
ナノ繊維：本明細書においては、「ナノ繊維」という用語はナノスケールの寸法の直径を有する繊維を指す。典型的にはナノスケール繊維は５００ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の実施形態によれば、ナノ繊維は１００ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は２０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は１０〜２０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５〜１０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５ｎｍ未満の直径を有する。範囲は両端を含む。
【００２４】
ナノスケール環境骨格：「ナノスケール環境骨格」という用語はナノ繊維を含む骨格を指す。本発明の特定の実施形態においては骨格を含む繊維の少なくとも５０％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては骨格を含む繊維の少なくとも７５％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては骨格を含む繊維の少なくとも９０％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては骨格を含む繊維の少なくとも９５％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては骨格を含む繊維の少なくとも９９％がナノ繊維である。当然ながら、骨格は非繊維の構成成分、例えば水、イオン、成長および／または分化を誘導する薬剤、例えば成長因子、治療薬または他の成分も含んでよく、これらは骨格中の溶液中および／または骨格に結合して存在してよい。  
天然に存在する：本明細書においては、、「天然に存在する」とは自然界に存在することを意味する。ナノ繊維生体分子は、一般的に、自然界に存在する生物により合成され、そして、人間の作業により修飾されないか、または、そのような分子の分解産物である。人間の作業が関与する工程（例えば生命体が関与しない化学合成を介するか、または、人間の作業により操作された生命体またはそのような生命体の子孫が関与する工程を介する）により合成されるが、自然界に存在する生物により合成され、人間の作業により修飾されていない分子と同一である分子もまた天然に存在する分子とみなされる。  
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質：本発明によれば、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸少なくとも２つの糸状物を含む。ペプチドは一般的に約２〜２００アミノ酸、より典型的には約６〜６４アミノ酸の糸状物となる。典型的には自己組織化ペプチドの自己組織化部分は約８〜２４、多くの場合約１２〜２０または１６〜２０アミノ酸である。ペプチドは個々のペプチドまたはペプチドの集合体を指す。本発明のペプチドは典型的にはわずか１つの天然のアミノ酸を含有するが、当該分野で知られている非天然のアミノ酸（即ち自然界には存在しないがポリペプチド鎖内に取り込まれることができる化合物；例えばＵＲＬがｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆであるウエブサイトを参照でき、これは機能的イオンチャンネル内に良好に取りこまれた非天然のアミノ酸の構造を表示している）および／またはアミノ酸類縁体も代替としてよい。特に、Ｄアミノ酸を使用してよい。さらにまた、本発明の種々の実施形態において、本発明のペプチド中のアミノ酸の１つ以上は例えばアシル基、炭水化物基、炭水化物鎖、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションまたは官能性付与のためのリンカー等のような化学的実体を付加することにより改変または誘導体化してよい。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドは分枝鎖であり、その場合、各々がペプチド結合により連結されたアミノ酸少なくとも３個よりなるアミノ酸重合体少なくとも２つを含むが、２アミノ酸重合体そのものはペプチド結合によって連結されていない。  
増殖剤および有糸分裂促進剤は本明細書においては互換的に使用し、細胞の増殖を増強する物質の能力を指す。  プロテアーゼは本明細書においては、ペプチドおよびタンパク質のフラグメントを発生する等にタンパク質分子中のアミノ酸を連結しているペプチド結合を切断するタンパク質切断酵素である。プロテアーゼおよびプロテアーゼファミリーの大きな収集物が発見されており、これらのプロテアーゼが標的タンパク質を切断する特異的な部位も当該分野で知られている。一部の例示されるプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（例えばマトリメタロプロテアーゼ）、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ等を包含する。  
再生：一般的に本発明の種々の実施形態において、組織の再生は、新しい組織（これは細胞または細胞の部分の何れかを意味する）の生成を含む傷害または変性または分解の過程よりも前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。本発明の特定の実施形態においては新しい組織の生成は既存の細胞の成長も含む。例えば、内皮細胞の場合は、再生は新しい血管の形成または既存の血管の伸長または成長を包含する。ニューロンの場合は、再生は軸索または他のニューロン突起の成長を包含する。このような突起は細胞体から直接生じたものであってよく、或は、傷害により切断または損傷を受けた突起の伸長であってよい。新しい組織は以前に存在していた組織を置き換えてよい。本発明の特定の実施形態においては、新しい組織の生成は既存の細胞の分裂を包含する。  
修復：一般的に本発明の種々の実施態様において、組織修復は損傷または変性の前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。例えばこれは傷害により分離された組織の部分の間の物理的連続性の復元を包含する。好ましくは、物理的連続性のこのような復元は、傷害の前には存在しなかった型の組織、例えば瘢痕組織の明らかな分離を行わない組織の部分の再付加または再連結を包含する。即ち修復は、組織の欠陥の充足を包含し、これは瘢痕組織の形成によるのではなく例えば欠陥により分離された組織の部分の再付加による、および／または、損傷または変性に付された型の新しい組織の生育によるものである。修復は例えば新しい組織の生育または発生を包含するが必須ではない。即ち、再生は修復の１つの特徴とみなしてよいが、修復は新しい組織の生育の証拠を伴うことなく起こりえる。
【００２５】
イオンを実質的に非含有の溶液：「イオンを実質的に非含有の溶液」とはイオン（またはその塩）が全く添加されていないか、イオン（またはその塩）の濃度が０．０１または０．００１ｍＭ未満である溶液を意味する。  
低分子：本明細書においては、「低分子」という用語は比較的小さい分子量を有し、そしてタンパク質、ポリペプチドまたは核酸ではない天然に存在する、または人工的に創生（例えば化学合成による）された有機の化合物を指す。典型的には、低分子は約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。さらにまた、低分子は典型的には複数の炭素−炭素結合を有する。
【００２６】
特異的結合：本明細書においては、「特異的結合」という用語は標的分子（例えば標的ペプチド）および結合分子と称される場合のある２つの分子の間の物理的会合を指す。相互作用は典型的には結合分子により認識される標的ドメインのような標的分子の特定の構造的特長の存在に依存している。標的分子は結合分子により認識される標的ドメインより完全になるものであってよい。例えば結合分子が標的ドメインＡを含有する標的分子に特異的である場合、遊離の標識されたＡおよびそれに特異的な結合分子の両方を含有する反応系中の、標的ドメインＡを含むポリペプチドの存在、または、遊離の未標識の標的ドメインの存在は、結合分子に結合する標識されたＡの量を低減する。特異性は絶対的でなくてもよいが、一般的には結合が行われる観点のものを指す。何れかの所定の用途において適切な性能を示すための十分な程度の特異性を有する標的ドメインおよび結合分子を当業者は選択できる。特異性は標的分子に対する結合分子の親和性ｖｓ他の標的、例えば競合物質に対する結合分子の親和性のような、別の因子の観点において評価してよい。１つ以上の観点において結合分子の特異性が明らかになった後、これを他の、好ましくは同様の観点において特にその特異性を再評価することなく使用してよい。  本発明の観点における好ましい結合分子は細胞表面に存在するタンパク質、細胞外環境中で身体内に存在するタンパク質（例えば細胞外マトリックスタンパク質、分泌された、または細胞表面のタンパク質、例えばプロテアーゼ、成長因子および血液中を循環するタンパク質）を包含する。本発明の特定の実施形態においては、結合分子は抗体である。自己組織化ペプチドと結合分子の間の相互作用の観点においては、本発明の特定の実施形態によれば、結合分子は、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも２倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも５倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも１０倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも５０倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも１００倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。結合は結合の強度および特異性の程度のような特性が分子双方の特徴に依存している２分子間の相互作用が関与する過程であるため、何れかの分子は標的分子として、または、結合分子と指定されてよいとみなされる。  
構造的に適合性がある：「構造的に適合性がある」とは構造の形成を可能にする十分一定のペプチド内距離を維持することができることを意味する。本発明の特定の実施形態においては、ペプチド内距離は４，３、２または１オングストローム未満である。ペプチド内距離のより大きい変動は十分な安定化力が存在すれば構造の形成を妨げない。この距離は分子モデリングに基づくか、または、以前に報告されている単純化された操作法（米国特許５，６７０，４８３）に基づいて計算してよい。この方法においては、ペプチド内距離は対の各アミノ酸の側鎖上の未分枝鎖の原子の数の合計を考慮して計算される。例えばリジン−グルタミン酸のイオン対のペプチド内距離は５＋４＝９原子であり、そして、グルタミン−グルタミンの水素結合対の距離は４＋４＝８原子である。原子当たり３オングストロームの変換ファクターを用いれば、リジン−グルタミン酸対およびグルタミン−グルタミン対（例えば９ｖｓ８原子）を有するペプチドのペプチド内距離の変動は３オングストロームである。  
被験体：被験体という用語は本明細書においては、例えば実験、診断および／または治療目的のために薬剤を送達するべき個体を指す。好ましい被験体は哺乳類、特に家畜哺乳類（例えばイヌ、ネコ等）、霊長類またはヒトである。
【００２７】
実質的に均一に分布した：一般的に、ペプチド骨格カプセル化細胞の場合においては、「実質的に均一に分布した」という表現は細胞の大部分が相互に概ね等距離であることを指す。例えば、ある特定の時点（例えば骨格形成直後）において、骨格にカプセル化されている細胞の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％の集団の中心が、最も近接した細胞（即ち集団中心が最も近接している細胞）の集団の中心から、５００、１００、５０，２０、１０または１μＭ未満変動する距離分だけ離れている場合に、実質的に均一に分布しているとみなされる。或は、細胞はある特定の時点において骨格が等しい容量を有する連続した区分（例えば立方体）に分割された場合に、その区分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％について、自らの中心が骨格の所定の容量内に含有される細胞の数が、その集団の中心がそのような容量内に含有される細胞の平均数と、細胞の平均数の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満だけ異なる場合に、実質的に均一に分布しているとみなされる。細胞が実質的に均一に分布している骨格はこの特性を長時間温存するか、または、細胞が初期には実質的に均一に分布していなかった骨格中で、細胞が最終的には実質的に均一に分布するようになる。  
治療用の分子、化合物または薬剤：「治療用の分子、化合物または薬剤」とは、それを必要とする被験体に投与した場合に、疾患または望ましくない臨床状態の１つ以上を緩解し、疾患または臨床状態の重症度を低減し、疾患または望ましくない臨床状態の発生を防止するかその可能性を低減するか、または、被験体への単なる一般的栄養支援とは異なる態様において組織修復または再生を促進するような何れかの型の分子または分子の組み合わせである。治療用の分子は一般的には有効量、即ち臨床的に意味のある結果を達成するために十分な量で投与する。治療分子は低分子、生体分子等であることができる。例えばＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ ＧｌｉｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄ．，およびＫａｔｚｕｎｇ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙを参照できる。  
三次元の配置：「三次元の配置」とは三次元に存在することを意味する。三次元の配置を有する細胞は同じ単層内の全部分ではない。本明細書においては、単層はカプセル化された細胞の平均直径に等しい厚みを有糸、そしてカプセル化された細胞少なくとも１つを含むペプチド骨格を横断する断面である。細胞の平均直径は細胞体の平均直径を測定することにより決定してよい。カプセル化された細胞は細胞の容量の少なくとも５１％が単層内に含有される場合に単層の部分とみなされる。好ましくは骨格形成直後は、単層少なくとも１つはカプセル化された細胞７５、５０、２５、２０、１５、１０、５または１％（好適度の順）未満を含有する。より好ましくは、骨格形成直後はカプセル化細胞の７５、５０、２５、２０、１５、１０、５または１％（好適度の順）未満が同じ単層の部分である。  
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図1A 代表的な自己組織化ペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（上）およびそのC末端において非自己組織化アミノ酸ドメイン(PRGDSGYRGDS: 配列番号4)を含むように修飾されたペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（下）を示す分子モデル。
【図１Ｂ】図1B ペプチドRAD 16-1およびN末端にアミノ酸ドメイン(PRGDSGYRGDS: 配列番号4)を延長した修飾RAD 16-1ペプチドを９：１で混合したもの（重量ベースで同じ濃度で溶解した場合の体積比ベースで）の自己組織化で生じた自己組織化ペプチドナノファイバーの２つのQ-シートテープの模式図。ナノファイバーテープから、配列(PRGDSGYRGDS: 配列番号4)が飛び出している。一般に、修飾したアミノ酸ドメインはペプチドの集合体（ナノファイバーまたは巨視的な構造体）または表面の端から延長されている。他の配置もありうる。
【図１Ｃ】図１C 一般のペプチドハイドロゲルネットワーク（太実線）に、いくつかの生活性のあるペプチドモチーフ（短い細線）が基本ペプチドのアミノ酸端末より延長しているものの模式図。拡大図：積み重ねられた自己組織化ファイバー（太実線）と生活性のあるペプチドモチーフ（短い細線）が基本ペプチドのアミノ酸端末より延長している。
【図１Ｄ】図1Ｄ 本発明による修飾された自己組織化ペプチドの可能な配置の種々のものを示している。ドメインＡは自己組織化アミノ酸ドメインである。ドメインＢは非自己組織化アミノ酸ドメイン（修飾ドメイン）を示す。図に示す通り、修飾ドメインは自己組織化ドメインのＮおよび／またはＣ末端に存在してよく、或は、２つの自己組織化ドメインの間に存在してよい。
【図２】図２  SEQ4ペプチドの質量分析器データ。
【図３】ハイドロゲル中のDNA量より算出された細胞数は、RAD 16-1に機能化ペプチドを加えたものは、RAD16-I単体または１型コラーゲンゲルに比較して、細胞増殖を促進することを示す。
【図４】図４  DNA量により規格化されたアルカリフォスファターゼ（ALP）活性。
【図５Ａ−Ｉ】図5A-5I  アルカリフォスファターゼ染色により、高いALP活性を確認される。
【図６】図６  培養培地に分泌されたオステオカルチンの結果は、機能化モチーフを有する自己組織化ペプチドが前駆骨芽細胞の分化を促進する潜在力を持つことを示している。
【図７】図７  機能化モチーフと自己組織化配列の間隔と細胞増殖の関係。図７は、機能化モチーフ（RGD）と自己組織化配列（RADA）の間隔は少なくとも２ペプチド結合（6.9オングストローム）分である必要がある。
【図８】図８  機能化ペプチドの混合比の影響。Y軸は、DNA量に比例する蛍光強度を示す。これは混合によって、RAD: DSG が99: 1 から67:33の広い範囲にわたって細胞増殖が増加することを示している。DSG100% ハイドロゲルでの減少は、DSGはRADに比較して低い強度のゲルを生成するため、機械的な特性の違いから生じていると考えられる。
【図９Ａ−Ｂ】図9A-9B 異なった機能化ペプチドの濃度で培養された細胞の共焦点顕微鏡の３次元再構築像。図9A はDSG の割合が 10%、図9B はDSG の割合が70%を示す。図９Aでは、細胞はペプチドマトリクス表面に存在するのに対し、図９B では細胞が３００μmの深さまでマトリクスに進展している。このデータは、細胞の挙動が機能化ペプチドの比を変えることで制御できることを示している。
【図１０】図10  RAD 16-1 1%溶液に0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータ。
【図１１】図１１  自己組織化ペプチドAC(RADA)4GGFHRRIKA-CONH2 (SEQ6)の構造。黒は、正電荷のアミノ酸を示し、灰色は負電荷のアミノ酸を示す。
【図１２】図12  FHR溶液に0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータ。
【図１３Ａ−Ｄ】図13 A-13D 共焦点顕微鏡像の３次元的再構築像。FHRペプチドが３次元的な細胞増殖を促進することを示す。
【図１４】図14  DNA量より算出された細胞数により、細胞増殖へのFHRペプチドハイドロゲルの影響を測定。
【図１５】図15   DNA量により規格化されたアルカリフォスファターゼ（ALP）活性により、分化へのFHRペプチドハイドロゲルの影響を測定。
【図１６Ａ−Ｂ】図16A-16B  アルカリフォスファターゼ染色：RAD(図16A)、FHR(図16B)。
【図１７】図17  培養培地に分泌されたオステオカルチン。
【図１８】図18  PFS 1%溶液に0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータ。
【図１９】図19  洗浄と培養中の増殖因子の保持率。
【図２０】図20  ｂFGFの分子内電荷分布。  暗い部分は正電荷を示し、白い部分は負電荷を示す。
【図２１Ａ−Ｆ】図21A-21F  異なったペプチドマトリクス上に培養されたHUVEC像。上列：RAD-2P; 下列： DGR-2P.。
【図２２】図22  増殖因子がゲル化前に混合された場合の増殖因子の保持率。
【図２３Ａ−Ｃ】図23A-23C  材料移植２週間後のラット頭骸骨のX線像。
【図２４Ａ−Ｍ】図24A-24M  ハイドロゲル上でHUVECを２日間培養した蛍光共焦点顕微鏡像。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。コラーゲン、マトリゲル、PRGmx、KLTmx、FHRmx、PFSmxはRADと比較して高い細胞接着性を示す。マトリゲル上では、HUVECは、脈管形成能と対応すると考えられる、脈管状構造を示す。KLTmx上では、細胞はマトリゲルと類似の脈管状構造を示す。
【図２５】図25  ペプチドナノファイバーマトリクス上で3日間培養されたHUVEC。
【図２６Ａ−Ｆ】図26A-26F  ペプチドマトリクス上のビーズの１日後および２日後の蛍光顕微鏡像。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。白いバーが100μmを示す。１日後ではほとんどの細胞がビーズ上にある。２日後では、RADに比較し、コラーゲンおよびPRGmx、KLTmxゲルでは細胞はビーズから良く遊走している。マトリゲル上では、ハイドロゲルに遊走する細胞は非常に少ない。
【図２７】図27  ２日後にビーズから遊走した細胞数。細胞数は図26A-26F.の蛍光顕微鏡像で数えた。
【図２８Ａ−Ｃ】図28播種から２日後の蛍光共焦点顕微鏡再構築像。緑は生細胞を、赤は死細胞の核を示す。これらの像は、ハイドロゲル中での高い細胞生存率を示す。
【図２９Ａ−Ｂ】図29A-29B  ３次元的培養中でのな脈管形成。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。図29Aは脈管内の空隙（矢印）を示す。図29Bは図29Aの点線部の断面を示す。脈管内の空隙は断面像でも示されている（点線で示される円）。
【図３０Ａ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｂ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｃ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｄ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｅ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｆ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３０Ｇ】図30A-30G  異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像。
【図３１Ａ−Ｋ】図31A-31K  異なったハイドロゲルへのHUVECの接着。
【図３２Ａ−Ｆ】図32A-32Jは、機能化ペプチドマトリクスでのADSCの３次元培養。
【図３２Ｇ−Ｊ】図32A-32Jは、機能化ペプチドマトリクスでのADSCの３次元培養。
【図３３】図33  機能化ペプチドマトリクスでのADSC培養の細胞密度。
【図３４】図34  機能化ペプチドマトリクスでのADSC培養の細胞遊走深度。
【図３５Ａ−Ｂ】図35A-35B  培地への増殖因子の分泌。
【図３６Ａ−Ｂ】図36A-36B  修飾ペプチドマトリクス、その医薬組成物、それから作られるマトリクスの典型的な投与方法。図36Aは二つの区画からなる針を示す。ペプチド溶液とゲル化剤が注入の直前に混合される。図36Bは二つの区画からなる針を示す。ペプチド溶液と細胞懸濁液が注入の直前に混合される。
【００２９】
本発明の詳細な説明と実施形態
I.  概要
新しい生物学的材料、特に細胞の成育、分化および生物学的機能に関する許容性物質として機能する生物学的に適合性のある材料の開発は、医療技術の進歩のため、および、細胞の生物学的特性を理解するために、広範な意味を有する。本発明は完全に合成の物質に典型的に備わっている利点を保有し、なおかつ天然原料に由来する物質の特定の望ましい特徴も保有している組成物を製造することが可能であるという認識を包含する。組成物は例えば細胞培養または組織工学、組織再生および／または修復を含む目的のため；および／または治療薬のような生物学的に活性な分子のための送達剤として、インビトロまたはインビボの何れかで使用できる。  
イオン性または極性の自己相補性のペプチドの自己組織化を介して作成される生物学的に意味のある物質のクラスは以前に報告されている（例えばＺｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，３３３４−３３３８，１９９３；Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６，１３８５−１３９３，１９９５；米国特許５，９５５，３４３および５，６７０，４８３参照）。ペプチドは相補的であり構造上適合性を有する。それらは荷電された残基が交互する正電荷および負電荷を含むことができる交互する親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位を含む。一般的に、これらのペプチドは十分な濃度のイオン（例えば１価のカチオン）への曝露により自己組織化して種々の巨視的構造となり、これにより安定な巨視的多孔性マトリックスを形成する。マトリックスは種々の物理的形態、例えばリボン、テープ様構造、２次元または３次元の骨格等を形成できると推測される。好ましいマトリックスは典型的には直径１０〜２０ｎｍまたは１０〜３０ｎｍの規則正しく相互に織り込まれたフィラメントよりなり、直径（または他の該当する大きさ）５０〜１００ｎｍのオーダーの孔径を有する。物質は典型的には約９９％以上の水分含有量を有するヒドロゲルである。ペプチドの特定のものは自己組織化を起こして極めて高度に水和したナノ繊維を形成する（例えば９９．５〜９９．９％（１〜５ｍｇ／ｍｌ）水）。ヒドロゲルはこのように極めて高い水分含有量を有するため、細胞はマトリックスの上または内部において培養された場合に自由に遊走でき、細胞相互の接触が生じる。このような環境はまたタンパク質およびシグナリング分子を含む低分子の拡散を可能にする。さらにまた、ヒドロゲルの特定のものは低い弾性率を有する。特に理論に制約されないが、低い弾性率は細胞−細胞の連絡を促進する。ヒドロゲルの性質は細胞培養および／または組織工学または修復のために研究さている多くの合成材料のものとは対照的であることが示唆されている。例えば、これらの材料の多くはマイクロファイバーを含み、そしてはるかに大きい孔径を有し、細胞およびその自然の環境との比較によれば適切な縮尺にはない環境を呈している。さらにまた、ヒドロゲルはゲル形成過程において細胞を播種および／または包埋する予備形成された構造ではなく、細胞をカプセル化するように形成される。
【００３０】
これらの材料の重要な特徴はそれらの特性および機械的強度が種々のペプチドパラメーターの操作により制御できることである（Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ，Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ）。例えば、ゲルの硬度はペプチド濃度と共に大きく上昇することがわかっている。ペプチドの配列、特徴および特性、および、自己組織化によりそれら如陸也；形成される構造は次のセクションでさらに考察する。
【００３１】
本発明者等および他の研究者等は、これらのペプチドの自己組織化により作成される構造は、細胞を構造の表面上で培養した場合に細胞の連結、生存性および生育を支援する能力があることを明らかにしている。さらにまたＲＡＤ１６−Ｉ（ＡｃＮ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２）（配列番号４６）により形成されるペプチド構造はニューロンをその表面上で生育させた場合にニューライトの派生および機能的に活性なシナプスの形成のための基板として機能することが可能であった（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。ペプチドゲルは内皮細胞の連結、遊走、増殖およびキャピラリー様構造の形成および少なくとも３週間の期間の生存を支援することがわかっている（ＷＯ２００３０９６９７２参照）。コラーゲンまたはフィブリンゲルまたはマトリゲルのようなインビトロの血管形成の試験のために使用されている他の三次元の基板とは対照的に、この血管形成応答は外部より供給された血管形成因子の非存在下において、そして、アポトーシスまたはタンパク質分解性ゲル分解の顕著な兆候を伴うことなく、観察された。  
さらにまた、細胞はペプチドヒドロゲル内部にカプセル化され、これにより細胞はペプチド骨格内の三次元の配置内におかれること、および、細胞はそのようにカプセル化されると生存性および機能を維持することが明らかになった（係争中の２００１年２月６日出願の「組織細胞のペプチド骨格カプセル化およびその使用」と題された米国特許出願ＵＳＳＮ０９／７７８，２００、「ペプチドヒドロゲル内の肝細胞リプログラミングおよびその使用」と題されたＵＳＳＮ１０／１９６，９４２参照）。さらにまたＫＬＤ１２（ＡｃＮ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ＣＯＮＨ２）（配列番号４７）の自己組織化により形成されるヒドロゲル構造内にカプセル化された軟骨細胞はその形態を保持しており、プロテオグリカンおよびII型コラーゲンに富んだ軟骨様の機械的に着旺盛のＥＣＭを発生し、安定した軟骨細胞の表現型を示していた（Ｋｉｓｉｄａｙ，ｅｔａｌ．，２００２）。ＲＡＤ１６−Ｉの自己組織化により作成されたペプチド骨格内にカプセル化された肝先祖細胞は肝細胞の表現型を示すマーカーを発現した（Ｓｅｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このような結果は、自己組織化ペプチドゲルにより与えられるナノスケールの環境が細胞型の多様なセットの機能的活性を増強し、細胞の指令および分化した細胞の表現型の発現を可能にすることを示している。  
細胞、組織工学等のための適当な環境を得るための研究においてこれまで使用されていた多くの天然および人工の材料とは異なり、本発明の材料はマイクロスケールではなくナノスケールで細胞と相互作用する。材料は種々の他の材料に典型的なマイクロファイバーではなくナノ繊維により形成される。特に理論に制約されないが、繊維のサイズが小さいことおよび／または材料の開放織込み構造が、細胞の成育のための独特の利点を与える態様において細胞の突起の伸長を促進し、栄養物質、老廃物等の拡散を可能にすると考えられる。材料を含むナノ繊維は弱い相互作用の分子の力により相補的な状態で自己組織化の間に秩序付けられる。しかしながら、それらは特定の用途のためには好ましい無秩序の状態であってもよい。換言すれば、繊維は秩序のある内部構造を有していてよいが、それらは相互に対する方向性または整列性を欠いていてもよい。例えば、繊維は相互に実質的に平行でなくてもよい。
【００３２】
後に記載する通り、本発明者等は今回、意外にも、自己組織化のための構造的要件に必ずしも合致しない別のアミノ酸ドメイン（これは本明細書においては、少なくとも３アミノ酸の長さであればペプチドドメインとも称する）を取り込むことにより前記した自己組織化ペプチドを広範に修飾することが、自己組織化して巨視的構造を形成するという修飾ペプチドの能力を排除することなく可能であることを発見した。例えば、自己組織化ペプチドは、例えば生物学的に活性なペプチドモチーフまたは結合分子との相互作用のための標的部位であることができる、非自己組織化アミノ酸ドメインを取り込むように修飾することができる。得られるペプチドは自己組織化ペプチドドメインおよび非自己組織化アミノ酸ドメインを含む。非自己組織化アミノ酸ドメインとは、後のセクションIIIにおいて記載する原則に従って設計された未修飾の自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらす条件下（例えばイオン濃度、ペプチド濃度、ｐＨ、温度）において、単離されたペプチドとして存在する場合（即ち未修飾のすぁペプチドに連結されていない場合）に自己組織化しないアミノ酸ドメインを意味する。「自己組織化しない」とはアミノ酸ドメインまたはペプチドがナノフィラメントまたはナノ繊維を形成しないか、巨視的構造を形成しないか、または、典型的にはβシート、ナノ繊維または巨視的構造の何れかを形成しないことを意味する。  
以下のセクションは本発明に従って修飾できる自己組織化ペプチドおよび自己組織化の過程および／または組み立てられた構造の特徴を制御する方法を記載する。その後のセクションは本発明の方法および組成物、本発明の修飾された自己組織化ペプチドから形成された特徴を特性化する方法、細胞の表現型を評価するため、および、修飾のために使用されるアミノ酸ドメインを選択するための方法等を、詳述する。  
II．自己組織化ペプチド、それより作成した構造、および使用方法
Ａ．ペプチド配列および巨視的構造
以前に記載された未修飾の自己組織化ペプチドは、相補的であり構造的に適合性がある分子のファミリーを含んでいる。ペプチドおよびその特性は米国特許５，９５５、３４３および５，６７０，４８３、「組織細胞のペプチド骨格カプセル化およびその使用」と題された２００１年２月６日出願の同時係争中の米国特許出願０９／７７８２００およびその他の文献に記載されている。これらの物質は種々の交互するパターンにおける親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位よりなる。  
このクラスの第１の分子、ＥＡＫ１６−ＩＩ（ＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫ、Ａ、アラニン、Ｅ、グルタミン、および、Ｋ、リジン、配列番号１８）、即ち１６アミノ酸ペプチドは、左利きＺ−ＤＮＡへの結合により最初に特徴付けられたコウボタンパク質ズオチン（ｚｕｏｔｉｎ）内のセグメントとして発見された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。このペプチドに基づいて、アミノ酸配列を変化させ、周期的パターンに従うことにより、多数の自己組織化イオン性自己相補ペプチドが系統的に設計されている。好ましいペプチドは溶液（例えば水溶液）中で規則的な二次構造、例えばβシート構造であると推測される。これはペプチドが２つの異なる表面、即ち１つは親水性であり、もう１つは疎水性であるものを含み、そして親水性の表面上に規則的な反復を有する相補イオン結合を形成するためと考えられている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ペプチドの側鎖は２面、即ち荷電されたイオン側鎖を有する極性面および例えばアラニンまたは他の疎水性基を有する非極性の面に分配される。これらのイオン側鎖は正荷電および負荷電のアミノ酸残基が相補イオン対を形成できるという点において相互に自己相補である。従ってこれらのペプチドはイオン性の自己相補ペプチドと称される。
【００３３】
相補イオン側鎖は数種類の基準、即ち基準Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ等および混合基準に分類されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。イオン性の残基が１正荷電および１負荷電の残基を交互させている（−＋−＋−＋−＋）場合、ペプチドは「基準Ｉ」と記載され；イオン性残基が２正荷電および２負荷電の残基を交互させている（−−＋＋−−＋＋）場合、ペプチドは「基準ＩＩ」と記載され；イオン性残基が４正荷電および２負荷電の残基を交互させている（−−−−＋＋＋＋）場合、ペプチドは「基準ＩＶ」と記載される。上記した基準に合致するペプチドは本明細書においては未修飾の自己組織化ペプチドと称することにより、これらを上記した基準に合致せず、自己組織化でないペプチドドメインを含む本発明の自己組織化ペプチドと区別する。  
多くの基準ＩおよびＩＩの自己相補ペプチド、例えばＥＡＫＡ１６−Ｉ（配列番号６）、ＲＡＤＡ１６−Ｉ（配列番号１）、ＲＡＥＡ１６−Ｉ（配列番号８）およびＫＡＤＡ１６−Ｉ（配列番号１０）は以前に分析されている（表１）。これらのペプチドはまたＲＡＤ１６−Ｉ、ＲＡＥ１６−Ｉ、ＫＡＤ１６−Ｉ等とも称されている（即ち４アミノ酸モジュールの最後のアミノ酸は略記においては省略されえる）。１６アミノ酸を含有する基準ＩＶイオン性自己相補ペプチド、例えばＥＡＫ１６−ＩＶ、ＫＡＥ１６−ＩＶ、ＤＡＲ１６−ＩＶおよびＲＡＤ１６−ＩＶもまた検討されている。これらの自己組織化ペプチドにおける荷電された残基が上記した全体的パターンを変化させること無く適切に置換されれば（例えば正荷電のリジンが正荷電のアルギニンと置き換えられ、そして、負荷電のグルタメートが負荷電のアスパルテートと置き換えられる）、自己組織化の過程に対して本質的に影響はない。しかしながら、正荷電された残基であるリジンおよびアルギニンが負荷電の残基、例えばアスパルテートおよびグルタメートと置き換えられれば、ペプチドはもはや自己組織化して巨視的構造を形成できなくなるが、それらはなお塩の存在下にβ−シート構造を形成できる。  
水素結合を形成するアスパラギンおよびグルタミンのような他の親水性残基を荷電された残基の代替として、またはこれに追加してペプチド内に取り込んでよい。ペプチド内のアラニンがより疎水性の残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンに変更されれば、これらのペプチドは自己組織化して増強された強度を有するペプチドマトリックスを形成する傾向が大きくなる。上記したペプチドと同様の組成および長さを有する一部のペプチドはβ−シートではなくアルファヘリックスおよびランダムコイルを形成する。このようなペプチドは典型的には巨視的構造を形成しないが、構造形成が絶対的に排除されるわけではない。即ち、自己相補製に加えて、他の要因、例えばペプチドの長さ、分子間の相互作用の程度およびスタッガードアレイを形成する能力が巨視的構造の形成にとって重要であると考えれられる。  
本発明の特定の実施形態においてはアシル基（ＲＣＯ−、式中Ｒは有機性の基）、例えばアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）のような基または残基をペプチドのＮ末端に存在させることにより、さもなくば存在するかもしれない超過の正電荷中和する（例えばＮ末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷）を中和する。同様に、アミン基（ＮＨ２）のような基を用いることにより、さもなくばＣ末端に存在するかもしれない超過の正電荷（例えばＣ末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷）を中和してよく、即ち、Ｃ末端をアミド（−ＣＯＮＨ２）に変換する。特に理論に制約されないが、末端のＮおよびＣの分子上の電荷の中和は自己組織化を促進する場合がある。他の適当な基は当業者が選択できる。
【００３４】
種々の条件下において、例えば水性のペプチド溶液への１価のカチオンの天下または１価のカチオンを含有する溶液へのペプチド溶液の導入により、ペプチドは自己組織化して巨視的構造を形成する。自己組織化の前に、ペプチドは１価のイオン（例えばカチオン）を実質的に含まない、または、そのようなイオンを低濃度のみ、例えば１０、５、１、０．５または０．１ｍＭ未満含有する溶液中に溶解してよい。自己組織化はペプチド溶液へのイオン性溶質の添加により、または、ｐＨの変化により、開始または実質的に加速してよい。例えば５ｍＭ〜５Ｍの濃度のＮａＣｌはペプチドの組立を誘導し、数分以内に巨視的構造が形成される。より低濃度のＮａＣｌも組立を誘導するが、より低速度である。ペプチドの特定のものは有意な濃度のイオンの非存在下、ｐＨに依存する過程においても自己組織化することができる。例えばペプチドの特定のものは約３．０のｐＨでは溶液中に残存するが、ｐＨを上昇させると自己組織化する場合がある。  
或は、自己組織化は、イオンを含有する溶液、例えば標準的なリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、組織培養培地、または生理学的な液体、例えば血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）等にペプチドを導入することにより開始してよい。即ちペプチドはインビボの位置において自己組織化できる。好ましいイオンは１価のカチオン、例えばＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣｓ＋である。好ましくはイオンの濃度は実質的に加速された自己組織化を誘導するためには少なくとも５、１０、２０または５０ｍＭである。特定のペプチド配列および／または濃度および望ましい組立速度に基づいて、当業者は好ましいイオン濃度を選択できる。一般的に、得られる構造の強度はイオンの非存在下またはより低いイオン濃度における強度と比較してイオンの存在下で上昇する（ただしイオン濃度の上昇が強度上昇をもたらさないプラトーに達する場合がある）。
【００３５】
上記したとおり、好ましいペプチドは自己組織化してナノ繊維のネットワークを形成し、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で水に溶解した場合に９９％より高値の水分含有量のヒドロゲルをもたらす（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｋｉｓｉｄａｙ ｅｔ ａｌ．，２００２）。図１は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した場合の代表的ペプチド、ＲＡＤ１６−ＩＩ（ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ、Ｒ、アルギニン、Ａ、アラニン、Ｄ、アスパラギン酸）（配列番号４）ヒドロゲルの構造を示す。これよりわかる通り、材料は自己組織化して〜５０−１００ｎｍの直径の包囲部を形成する〜１０−２０ｎｍの相互に織り込まれた繊維となっている。ナノ繊維ネットワークはヒドロゲルの形成を起こし、好ましくは裸眼で観察でき、３次元であるサイズの巨視的構造を創生する。
【００３６】
巨視的構造を形成するペプチドは８〜２００アミノ酸、８〜６４アミノ酸、８〜３６アミノ酸、または、８〜１６アミノ酸を含有する。１２〜１６アミノ酸の長さを典型的に使用する。自己組織化の前のペプチドの濃度は例えば．０１（．１ｍｇ／ｍｌ）〜９９．９９％（９９９．９ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。より好ましくは、自己組織化の前のペプチドの濃度は特に細胞培養および／または治療用途のためには．１（１ｍｇ／ｍｌ）〜１０％（１００ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。本発明の特定の実施形態においては自己組織化の前のペプチドの濃度は．１（１ｍｇ／ｍｌ）〜５％（５０ｍｇ／ｍｌ）、または．５（５ｍｇ／ｍｌ）〜５％（５０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。本発明の特定の実施形態においては自己組織化の前のペプチドの濃度は約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、または約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００３７】
望まれる場合、マトリックスは「３次元」になる。例えば、あらかじめ定まった形状や体積に形作ることができる。マトリクスを希望した形や大きさにするために、ペプチド水溶液はあらかじめ形作られ型に導入され、本明細書中に記述されたようにイオンを加えることによりペプチドを自己組織化させマトリクスにすることができる。３次元であるマトリクスとは、マトリクスが単なる他の材料の平らなコーティング物質ではなく、少なくとも複数の細胞が埋め込まれるだけの厚みがあることである。
【００３８】
所望により、ペプチド骨格は予め決められた形状または容量となるように形成してよい。所望の幾何学的特長または寸法を有する骨格を形成するためには、水性のペプチド溶液を所定の形状を有する成型金型内に入れ、そして本明細書に記載したとおりイオンを添加することにより骨格へのペプチドの自己組織化を誘導する。或は、金型内への溶液の投入の直前にペプチド溶液にイオンを添加してよいが、ただし、実質的に組立が起こる前に金型内に溶液を入れるように留意しなければならない。得られる材料の特徴、組立に必要な時間、および巨視的ペプチド骨格の幾何学的特長および寸法は、適用されるペプチド溶液の濃度および量、骨格の組立を誘導するために使用されるイオンの濃度、ｐＨ、特定の自己組織化ペプチドの配列、および、成型装置の寸法を含むパラメーターにより左右される。ペプチド骨格または骨格が身体内に移植される場合は、形状は意図される移植部位に基づいて選択してよい。骨格は本発明の種々の実施形態に応じて、薄層、例えば従来の組織培養の底面のコーティングまたは溶液中の浮遊物として存在してよい。層は数ミクロンの厚み、例えば１０ミクロン、１０〜５０ミクロン、５０〜１００ミクロン、１００〜２００ミクロンであることができる。層は複数のβシート層を含んでよい。
【００３９】
自己組織化ナノスケール骨格は様々な程度の硬度または弾性を有するように形成することができる。ペプチド骨格は標準的なコーン−プレートレオメーターで測定した場合、典型的には低い弾性率を有し、例えば１〜１０ｋＰａの範囲である。このような低い値は細胞の収縮の結果としての骨格の変形を可能にし、この変形は細胞−細胞の連絡のための手段を提供する。骨格の硬度はペプチド配列の変化、ペプチド濃度の変化およびペプチド長の変化を含む種々の手法により制御できる。高度を増大させるための他の方法も用いてよく、例えばビオチン分子をペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に連結するか、または、アミノ末端とカルボキシ末端の間に連結させて後にこれらを交差結合してよい。  
【表１】
2014062102.tif 000003
【００４０】
Ｎ／Ａは適用せずを意味する。
【００４１】
＊これらのペプチドはＮａＣｌを含有する溶液中でインキュベートするとβシートを形成するが、それらは自己組織化して巨視的構造を形成するとは観察されていない。
【００４２】
ペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸またはこれらの組み合わせを含んでよい。Ｌアミノ酸が骨格に存在する場合は、分解により、例えば培養中の細胞により、または宿主組織中の細胞により再使用してよいアミノ酸が生成する。本発明の特定の実施形態におけるペプチドの塩基性の単量体サブユニットは身体内で天然に存在するＬアミノ酸であるという事実は、多くの他の生体適合性の物質から化合物のこのクラスを差別化しており、特有の利点を与えるものである。ペプチドは化学合成されるか天然物または組み換え原料から精製してよく、そして、ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端を保護しても保護しなくてもよい。ペプチド骨格は相互に相補であり構造的に適合性を有するペプチドの異なる分子種１つ以上から形成してよい。ミスマッチ対を含有するペプチド、例えば隣接するペプチドに由来する２つの同様に荷電した残基の反発性の対形成もまた、反発力がペプチド間の相互作用を安定化させることにより支配されれば構造を形成してよい。ペプチド骨格はまた、本明細書においては、ペプチドヒドロゲルまたはペプチドヒドロゲルすかとも称してよい。  
ペプチド、例えば交差結合されることのできるペプチドおよび本発明の修飾された自己組織化ペプチドは標準的なｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成してよく、そして高速液体クロマトグラフィーを用いて精製してよい。ペプチド骨格の形成は本明細書に記載する通り、イオンまたはその塩の添加により開始してよい。芳香族側鎖を有する疎水性残基はＵＶ照射への曝露により交差結合してよい。交差結合の程度はＵＶ光への曝露の所定の時間および所定のペプチド濃度により厳密に制御してよい。交差結合の程度は光分散、ゲル濾過または走査電子顕微鏡により、標準的な方法を用いて測定してよい。さらにまた、交差結合の程度はまたプロテアーゼによる消化の後の構造のＨＰＬＣまたは質量スペクトル分析により調べてもよい。材料の強度は交差結合の前後に測定してよい。
【００４３】
未修飾の自己組織化ペプチドまたは本発明の修飾された自己組織化ペプチドの何れかから形成されたペプチドヒドロゲルは細胞および組織を培養するために種々の方法において使用してよい。細胞および組織はヒドロゲル構造の表面上で培養できる。特に理論に制約されないが、本発明者等はこのような環境は従来のプラスチックの組織培養皿のような合成の基板上の培養よりも天然の細胞の環境をより綿密に模倣していることを示唆している。ヒドロゲルが三次元の構造を形成する場合は、細胞は構造内に突起を伸長でき、或は、その内部に遊走できる。  
細胞はまたヒドロゲル内にカプセル化できる。ペプチド構造内に細胞をカプセル化する場合、ペプチドおよび生細胞を、ペプチドが実質的に自己組織化しない条件下、細胞の生存性を支援する適切な濃度で等浸透圧の溶質を有する水溶液中でインキュベートしてよい。本発明の特定の実施形態においては、溶液は１０、５、１または０．１ｍＭ未満の１価カチオン濃度を含有するか、または１価カチオンを実質的に非含有である。溶液はまた他のイオン種、例えば他のカチオンまたはアニオンを１０、５、１または０．１ｍＭ未満含有するか、または実質的に非含有である。十分なイオン（例えば１価のカチオン）を溶液に添加することによりペプチドから巨視的構造、好ましくはβシート巨視的構造への自己組織化を開始することにより、細胞は巨視的構造の形成によりカプセル化される。カプセル化された細胞は好ましくは三次元配置における巨視的構造内に存在する。溶液は所望の体積または形状の巨視的構造を確立するための寸法を有する所定の形状を有する成型金型内に入れてよい。
【００４４】
本発明の特定の実施形態においては、添加イオンの濃度は少なくとも５、１０、２０または５０ｍＭである。適当なイオンには例えばＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣｓ＋が包含される。一部の実施形態においては、等浸透圧溶質の濃度は以下の範囲：２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭまたは８００〜９００ｍＭの１つに含まれる。適当な等浸透圧溶質は例えば炭水化物、例えばスクロース、マンニトール等である。他の等浸透圧溶質、好ましくは使用濃度において細胞に対して非毒性であるものも使用してよい。自己組織化はまたｐＨの変化（例えば低ｐＨから高ｐＨへの上昇）により起こすこともできる。
【００４５】
細胞および生体分子のような薬剤（例えば分化促進剤、増殖剤）、治療用化合物は自己組織化の前にペプチド溶液中に導入してよい。次に、自己組織化工程により細胞または分子をカプセル化する構造が形成される。構造内の細胞または分子の均一な分布を達成するためには、自己組織化の開始前に溶液を十分混合することが望ましい。ペプチド溶液に細胞または薬剤を混合すると即座に自己組織化が開始されたり加速されたりすることを回避するためには、実質的に無イオンまたは低濃度のみのイオンを含有する溶液中に細胞または薬剤を維持することが望ましい。このような場合、細胞は好ましくはペプチド溶液との混合の前にスクロースのような等浸透圧溶質中に維持する。ペプチド自体は細胞（例えば細胞ペレット）または薬剤を添加する等浸透圧溶液中に溶解してよい。得られた組成物を混合して細胞および／または薬剤のより均一な分布を達成し、その後、組成物をイオンに曝露する（例えばイオンを組成物に添加するか、または組成物をイオン含有溶液と混合する）。
【００４６】
細胞は、組織培養皿またはスライド、またはコラーゲン、マトリゲル等のような生物学的に誘導された物質でコーティングされている組織培養皿またはスライドのような、それらが従来の基板上で培養されている場合と同様の態様においてペプチドヒドロゲル構造の表面上で培養してよい。一般的に細胞は何れかの所望の水準のコンフルエント状態において培養できる。カプセル化された場合、細胞は好ましくは三次元の配置における巨視的構造内に存在する。細胞の密度は例えば５ｘ１０３／ｍｌ〜５ｘ１０４／ｍｌ、５ｘ１０４／ｍｌ〜５ｘ１０５／ｍｌ、５ｘ１０５／ｍｌ〜５ｘ１０６／ｍｌ、または、５ｘ１０６／ｍｌ〜５ｘ１０７／ｍｌであってよい。他の範囲も使用してよい。培養の条件は生理学的条件に近似することが好ましい。例えば培地のｐＨは生理学的ｐＨに近似するのが好ましく、好ましくはｐＨ６〜８、例えば約７〜７．８、特にｐＨ７．４である。生理学的温度範囲は約３０℃〜４０℃である。哺乳類細胞は好ましくは約３２℃〜約３８℃、例えば約３５℃〜約３７℃の温度で培養する。  
細胞は所望の細胞数および密度、細胞の増殖速度および所望の細胞のリプログラミングが起こるために必要な時間に応じて、何れかの適切な時間、ペプチド構造の上または内部で培養してよい。これらのパラメーターは本発明を使用する特定の細胞および目的に応じて変動する。当業者はこれらのパラメーターを変更でき、そしてそうすることの作用を観察することにより、構造の上または内部の培養物中に細胞を維持するための旨適時間を決定できる。本発明の特定の実施形態においては細胞は約３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、５６日間または９０日間培養する。本発明の特定の実施形態においては細胞は１〜３日間、４〜７日間、８〜１４日間、１５〜２１日間、２２〜２８日間、２９〜５６日間、または５７〜９０日間培養する。より長期または短期の培養期間も使用してよい。
【００４７】
好ましくは細胞（表面上で培養またはまたはカプセル化の何れか）の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％が巨視的骨格の形成後１、２、４、６週間以上、生存性を示す。別の好ましい実施形態においては、細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％が巨視的骨格の形成後１日または１週間、生存性を示す。
【００４８】
一般的に、血管内皮細胞およびその前駆体、骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞または筋細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、非血管内皮細胞または平滑筋、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、肺細胞、免疫系の細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞または包皮細胞細胞を含む何れの細胞型も本発明に従って培養および／またはカプセル化できる。細胞は胚性、胎児性または成体の幹細胞、例えば上記した細胞型のいずれかに分化できる、またはそれを誘導できる幹細胞を包含する。
【００４９】
細胞の原料は、胎児または成熟生物、特に哺乳類または樹立された細胞系統を包含してよい。多くの樹立された細胞系統は当該分野で知られており、その多くがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる（これらの細胞系統を説明する参考文献も呈示しているｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇのＵＲＬのウエブサイト参照）。細胞および細胞系統を考察する場合、「誘導された」という表現は細胞が特定の原料から得られたものであること、または、細胞がその原料から得られた細胞の子孫であることを指す。例えば、肝誘導細胞は肝臓から得られた細胞、または、そのような細胞の子孫または継代物である。「子孫」という用語を本明細書において使用する場合、それは細胞分裂による即時の産物のみならず、後の細胞分裂の産物、即ち特定の細胞の継代物も指すものとする。細胞系統から誘導された細胞はその細胞系統のメンバーであるか、または、その細胞系統のメンバーである細胞の子孫または継代物である。臓器、組織、個体、細胞系統等より誘導された細胞はそれが得られた後にインビトロで修飾してよい。そのような細胞はなおもとの原料より誘導されたものとみなされる。  
細胞を単離する方法は当該分野で知られている。個体から採取された細胞は培地中での増殖期間を設けるか、設けることなく使用してよい。或は、細胞は安定な細胞系統として培地中で増殖させてある細胞を使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、例えば特定の治療用途（後述参照）においては、細胞は自系であるが、本発明の別の実施形態においては細胞は同種異系または異種である。非自系の細胞を使用する場合は、細胞を種々の方法で処理した後に身体内に導入することにより被験体による免疫系の応答の可能性を低減するか、または、その範囲を低減する。このような処理は例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２０１２９に記載されているように細胞の表面上の抗原を修飾、マスキングまたは排除することを包含する。  
本発明の特定の実施形態においては、細胞を被験体、例えば患者から採取し、そしてクローン細胞系統をこれらの細胞の１つ以上から誘導する。クローン系統は限界希釈によるプレーティングまたは単細胞ソーティングにより得てよい。クローン細胞系統を得るための方法は当該分野でよく知られており、例えばＰｕｃｋ、Ｔ．Ｔ．およびＭａｒｃｕｓ，Ｐ．Ｉ．，Ｊ．（１９５６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０３，６５３；Ｎｉａｓ，Ａ．Ｈ．Ｗ．ａｎｄ Ｌａｊｔｈａ，Ｌ．Ｇ．（１９６５）「Ｃｌｏｎｅ ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃ．Ｖ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，ｅｄ．（Ｄｒ．Ｗ．Ｊｕｎｋ Ｐｕｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびＬｅｏｎｇ，Ｐ．−Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｓ．（１９８５）「Ｖａｒｉａｎｃｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ ａｔ ４ ｇｅｎｅ ｌｏｃｉ」，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１５０（１−２）：４０３−１０に記載されている。細胞系統から得た細胞を本発明の実施において使用する。特定の患者の治療を意図する場合は、マッチしたドナーから得た細胞を好都合に使用してよい。個体から単離され細胞系統として維持されている細胞は本発明の実施において使用する前に標準的な細胞培養手法を含む何れかの適切な手法に従って培養してよい。  
細胞を遺伝子的に改変した後に本発明において使用することが望ましい場合がある。外因性の遺伝子物質を細胞に導入するための多くの方法が当該分野で知られている（例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２０１２９参照）。このような方法は典型的には、核酸分子（例えばＤＮＡ）のような遺伝子物質を細胞内に導入することを包含し、ここでその核酸分子は細胞により発現されるべき産物をコードするものである。産物は例えば成長因子、他の遺伝子産物の発現を誘導する転写因子等のようなリプログラミング剤であることができる。本発明の特定の実施形態においては、細胞に選択可能なマーカーを導入することが望ましい。本発明の特定の実施形態においては、選択可能なマーカー（例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子）または検出可能なマーカー（例えばＧＦＰ）をコードする遺伝子を組織特異的プロモーターの制御下に導入することが望ましい。次に検出可能なマーカーは、細胞またはその子孫がその組織に特徴的な特定の細胞の直系の経路に沿って分化、脱分化または相互分化したかどうかを調べる手段として使用してよい。マーカーはまた、免疫学的な方法、ＦＡＣＳ等、または当該分野でよく知られた別の方法を用いて、特定の経路に沿って分化、脱分化または相互分化した細胞を単離する手段として使用してよい。多くの選択可能および検出可能なマーカーが当該分野で知られている。さらに組織特異的、臓器特異的および直系特異的なプロモーターが知られている。遺伝子は当該分野で多くが知られている構成または誘導プロモーターの何れかの制御下に導入してよい。
【００５０】
細胞を培養または細胞をカプセル化している骨格は細胞の表現型に影響する種々の環境条件に付してよい。例えば骨格はＥＣＭ成分の改変された合成をもたらす種々の明確化された、または予め設定された機械的な応力、例えば剪断応力、圧縮方法等に付してよい。例えばインビトロで培養された細胞によるタンパク質の分泌は流動、例えば脈流により改変することができる。ネイティブの関節軟骨内、および、組織工学コンストラクト内の細胞は複数の調節経路を経由して機械的刺激に応答する。このような刺激は改変された細胞内および細胞間のシグナリング、転写水準の改変、タンパク質翻訳、翻訳後修飾および細胞内および細胞外の巨大分子の合成をもたらす（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。  
Ｃ．アミノ酸ドメインの付加による自己組織化ペプチドの修飾
本発明者等は自己組織化ペプチドが、前記したペプチド（表1で示されたような）が自己組織化する条件化（例えばイオン強度、ペプチド濃度、ｐＨ、温度）で単離された形態で存在する場合には自己組織化しないアミノ酸ドメインの付加により自己組織化ペプチドが修飾できるという予測できない柔軟性を発見した。さらにまた、本発明の好ましい実施形態においては、非自己組織化アミノ酸ドメインの付加は修飾されたペプチドが自己組織化して例えばナノ繊維、巨視的構造または両方の形成することを妨げない。好ましくは、修飾されたペプチドは自己組織化してナノ繊維よりなる巨視的構造を形成する。得られる構造は未修飾のペプチドの自己組織化から得られる構造よりも強度および／または安定性が小さいが、実施例に示すとおり目視による観察および／またはレオロジー実験によれば、ゲルの形成が起こることが確認される
即ち修飾されたペプチドを本明細書に記載した種々の目的のために使用してよい。本発明の目的のためには、上記したセクションに記載した構造的側面を有し、そのような特徴を欠いた部分を含まない自己組織化ペプチドは、未修飾の自己組織化ペプチドと称する。（未修飾の自己組織化ペプチドはペプチドへのアミノ酸の付加を包含しない上記した多くの方法のいずれかにおいて改変してよい。このように改変された自己組織化ペプチドは本明細書における用語の意味内では「修飾された」とは称さず、むしろ「改変された」または「誘導体化された」と称する。）本発明の修飾された自己組織化ペプチドは天然に存在する分子とは異なり、即ちそれらは天然には存在しないが、本発明のペプチドのアミノ酸ドメインの１つ以上は天然に存在する分子内に存在してよい。従ってこれらは「単離された」または「合成された」ものとみなされ、ペプチドの全体的配列が人間の介入無く天然に存在することはないことを意味する。  
未修飾の自己組織化ペプチドを含むアミノ酸ドメインおよび未修飾の自己組織化ペプチドの構造的側面の１つ以上を欠いており、そのため未修飾の自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらすような条件下で自己組織化してナノ繊維を形成したり、または巨視的構造を形成することのない第２のアミノ酸ドメインを包含するペプチドは、それが未修飾の自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらすような条件下で自己組織化（例えばナノ繊維、巨視的構造または好ましくは両方を形成）することが可能であれば、「修飾された自己組織化ペプチド」と称する。一般的に修飾された自己組織化ペプチドは第２のアミノ酸ドメインを含まないが同じ自己組織化部分を有する特定の未修飾の自己組織化ペプチドに相当することになる。本発明の特定の実施形態においては、修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は、相当する未修飾の自己組織化ペプチドが組み立てられる条件と同様である。本発明の別の実施形態においては、修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は相当する未修飾の自己組織化ペプチドが組み立てられる条件とは異なる。この場合、修飾された自己組織化ペプチドのの自己組織化のための条件は異なる（非相当の）未修飾の自己組織化ペプチドが自己組織化する条件と同様である。  
即ち本発明の修飾された自己組織化ペプチドは（ａ）自己組織化を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして自己組織化して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの；および（ｂ）単離された形態（即ち上記した未修飾の自己組織化ペプチドの組立をもたらす条件下において溶液中で唯一のペプチドとして存在する場合）で自己組織化しない第２のアミノ酸を含む。
【００５１】
好ましくは第２のアミノ酸ドメインはペプチドが組み立てられてナノ繊維および／または巨視的構造を形成するように第１のアミノ酸ドメインの組立を可能にする。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチドはβシートを形成する。
【００５２】
本発明の特定の実施形態においてはアミノ酸ドメインは少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸以上、例えば１５または１６アミノ酸、２０アミノ酸等である。本発明の特定の実施形態においては第一のアミノ酸ドメイン（自己組織化部位）は少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸以上、例えば１５または１６アミノ酸、２０アミノ酸等である。本発明の特定の実施形態においては第一のアミノ酸ドメイン（自己組織化部位）は少なくとも12から16アミノ酸である。本発明の特定の実施形態においては第２のアミノ酸ドメイン（非自己組織化部位）は少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸以上、例えば１５または１６アミノ酸、２０アミノ酸等である。しかしながら、本発明の特定の実施形態においては第２のアミノ酸ドメインの長さを２０アミノ酸以下、１８アミノ酸以下、１６アミノ酸以下、１２アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、８アミノ酸以下、６アミノ酸以下、４アミノ酸以下等に制限される。 
ペプチドの自己組織化および非自己組織化部分のアミノ酸の特定の比率を維持することが望ましい場合がある。例えば本発明の特定の実施形態においては非自己組織化ドメインはペプチドのアミノ酸の総数の５０％以下を構成することが望ましい場合がある。  自己組織化部分は長さが１２アミノ酸以上、例えば１６アミノ酸以上であることが望ましい場合がある。特に非自己組織化ドメインが２つの自己組織化ドメインの間に存在する場合、非自己組織化ドメインにフランキングする自己組織化ドメインの各々は長さが８アミノ酸超、例えば１２アミノ酸、１６アミノ酸等であることが望ましい場合がある。
【００５３】
図1Aは代表的な自己組織化ペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（上）およびそのＮ末端において非自己組織化アミノ酸ドメインを含むように修飾されたペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（下）を示す分子モデルである。 
図1Ｄは本発明による修飾された自己組織化ペプチドの可能な配置の種々のものを示している。ドメインＡは自己組織化アミノ酸ドメインである。ドメインＢは非自己組織化アミノ酸ドメイン（修飾ドメイン）を示す。図に示す通り、修飾ドメインは自己組織化ドメインのＮおよび／またはＣ末端に存在してよく、或は、２つの自己組織化ドメインの間に存在してよい。
【００５４】
アミノ酸ドメインはアミノ酸１つ以上または異なる分子実体であってよいリンカーまたは架橋を介して連結されてよい。リンカーは非自己組織化ドメイン（例えば後に記載する生物学的に活性なペプチドモチーフ）が巨視的構造の端部または表面から伸長できるようにしてよい。特に理論に制約されないが、これはペプチド構造の上または内部で培養された細胞との活性モチーフの相互作用を促進すると考えられる。グリシン（Ｇ）残基１つ以上、例えば１、２、３、４、５個等のグリシンよりなるリンカードメインを使用してよい。グリシンはそれが小型であり非極性の側鎖を有するため、自己組織化に対する実質的干渉の可能性を最小限にするために好ましい。アラニンおよび非極性側鎖を有する他のアミノ酸も使用できる。
【００５５】
実施例に記載した修飾されたペプチドは線状の鎖を与える伸長ペプチドの固相合成により作成されているが、修飾もふが側鎖にコンジュゲートまたは交差結合されるような変法も本発明に包含される。このようなコンジュゲーションまたは交差結合を行うための方法は当該分野でよく知られている。例えばシステイン残基（またはイオウ原子を含むように修飾された何れかのアミノ酸）を含有するペプチドをジスルフィド結合の形成によりイオウ原子を含有する第２のペプチドにカップリングすることができる。即ち、一般的に修飾された自己組織化ペプチドはペプチド結合により連結されたアミノ酸の単一の線状の重合体（好ましい構造）であってよく、または、アミノ酸の２つの重合体（各々がペプチド結合で連結されたアミノ酸の重合体）が共有結合的、または非共有結合的（例えばビオチン−アビジン相互作用による）に相互に連結されている分枝鎖の構造をとることもできる。
交差結合法の例はαアミノ基およびεアミノ基を介して主にカップリングする基たるアルデヒド法、マレイミド−スルフィドリルカップリング化学（例えばマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）法）および過ヨウ素酸酸化法を包含する。さらに多くの交差結合剤が知られている。例示される交差結合剤は例えばカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨＳ−ＡＳＡ）、２塩酸ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルズベリミデート（ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）等を包含する。コンジュゲーション法および交差結合剤に関する別の情報は一般的にはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ，ＰＯＢｏｘ３３３７，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，４３２１０の雑誌Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照できる。またＵＲＬがｗｗｗ．ｐｉｒｅｃｅｎｔ．ｃｏｍを有するウエブサイトで入手可能であり、本来は１９９４〜９５のＰｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇにおいて公開された「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙおよびそこで引用される参考文献、およびＷｏｎｇ ＳＳ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９１も参照できる。
【００５６】
２官能性の交差結合剤は反応性の基２個を有し、これにより標的基２個を共有結合する手段を提供する。化学交差結合試薬中の反応性の基は典型的にはスクシンイミジル基、マレイミドおよびヨードアセトアミドを含む官能基のクラスに属する。ヘテロコンジュゲートを形成するための多くの一般的なスキームでは通常は２または３段階の反応手順による１つの生体分子上のアミン基の第２の生体分子上のチオール基ヘの間接的カップリングを行う。チオールの高い反応性および大部分の生体分子中においてそれが比較的稀であることは、チオール基を化学交差結合の制御のための良好な標的としている。何れの分子もチオール基を含有しない場合は、数種のチオール化方法の１つを用いて１つ以上を導入できる。次にチオール含有の生体分子をヘテロ２官能性交差結合剤、例えばスクシンイミジルエステルおよびマレイミドまたはヨードアセトアミドの何れかの両方を含有する試薬を用いてアミン含有生体分子と反応させてよい。アミン−カルボン酸およびチオール−カルボン酸の交差結合も使用してよい。例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を生体分子と反応させることにより通常は分子内またはタンパク質複合体のサブユニットの間に「ゼロ長」の交差結合を形成することができる。この化学操作においては交差結合剤は最終生成物中に取り込まれない。
【００５７】
数種の方法がチオールを生体分子に導入するために使用でき、例えば内在性のジスルフィドの還元並びにアミン、アルデヒドまたはカルボン酸の基のチオール基ヘの変換が挙げられる。タンパク質中のシステインのジスルフィド交差結合はジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはトリス−（２−シアノエチル）ホスフィンにより還元してシステイン残基とすることができる。アミンはスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応、次いでＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いた３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルコンジュゲートの還元により間接的にチオール化することができる。アミンはスクシニミジルアセチルチオアセテートとの反応、次いで５０ｍＭヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いてほぼ中性のｐＨにおいてアセチル基を除去することにより間接的にチオール化できる。チオール非含有タンパク質内のトリプトファン残基は酸化してメルカプトトリプトファンとし、次にこれをヨードアセトアミドまたはマレイミドにより修飾することができる。  
D．ペプチド混合物
本発明は種々の比において本発明の修飾された自己組織化ペプチド１つ以上に未修飾の自己組織化ペプチド１つ以上を混合することができること、および、未修飾および修飾された自己組織化ペプチドの両方を含む巨視的構造がこのような混合物から形成できることの認識を包含している。得られる構造は均質な自己組織化ペプチド（即ち１００％単一のペプチド）の自己組織化により形成される構造と比較して特定の好都合な側面を有している。例えば上記したとおり、修飾された自己組織化ペプチドは相当する未修飾のペプチドから形成される構造よりも弱い巨視的構造をもたらす場合があり、即ち、それらはゲル性の低い特徴を有する場合がある。
【００５８】
しかしながら、修飾されたペプチドは所望の細胞表現型を誘導してよく、所望に応じて細胞の挙動を改変してよく、ＥＣＭ分子の結合を所望に応じて改変するなどしてよい。未修飾および修飾された自己組織化ペプチドの複合物（ブレンド物とも称する）から形成される巨視的構造は未修飾のペプチドの自己組織化により形成された巨視的構造のものに似た機械的特性を有する場合があるが、細胞の挙動、表現方等に所望の態様で影響する能力を保有している。
【００５９】
一般的に、形成すべき巨視的骨格の所望の性質に応じて、広範な種類の未修飾ペプチドの修飾ペプチドに対する比を使用することができる。例えば未修飾ペプチドの修飾すべきペプチドに対する比は１００：１、５０：１、２５：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００等であることができる。これらの比は例示を目的として記載しており、限定を意図していない。実施例に記載する通り、９：１の比を多くのペプチドと共に試験した。ペプチドをモル基準または重量、ペプチド溶液の容基等を基準として混合することができる。ペプチドは乾燥形態で混合し、その後、混合ペプチド溶液を形成する
或は、各ペプチドを溶解し、そして得られた溶液を混合してもよい。本発明はまた種々の修飾された自己組織化ペプチドの所望の側面を組み合わせた巨視的構造が作成されるように未修飾の自己組織化ペプチドの添加を行うか行うことなく、複数の修飾された自己組織化ペプチドを混合することも包含する。種々の修飾された自己組織化ペプチドは、同じ天然に存在するタンパク質に由来するか、または、異なるタンパク質に由来する異なるアミノ酸ドメイン、または完全に人工のアミノ酸ドメイン等を含有してよい。  
本発明の特定の実施形態においては修飾された自己組織化ペプチドは相当する未修飾ペプチドの組立をもたらすような条件下において溶液中の唯一のペプチドとして存在する場合には自己組織化しないが、未修飾の自己組織化ペプチドと組み合わせて存在する場合にはそのようなペプチドと共に自己組織化する。自己組織化により未修飾ペプチドと修飾ペプチドの両方の混合物、例えば主に未修飾のペプチドを含有する、好ましくは巨視的構造を形成するナノ繊維よりなる組成物が得られる。或は、組成物は何れの修飾ペプチドも含有しない一部のナノ繊維を含有するが、他のナノ繊維はそのようなペプチドを含有していてよい。
【００６０】
Ｅ．機能化モチーフ
一般的に広範な種類の異なるアミノ酸ドメインの何れも未修飾の自己組織化ペプチドに付加してよいが、ただし、追加されたドメインの存在が自己組織化（ナノ繊維、巨視的構造、または好ましくは両方の形成）を妨げてはならない。追加のドメインは得られるペプチドに対して多くの望ましい特性の何れかを付与してよい。例えば追加のドメインは生物学的な活性を媒介してよく、例えばペプチドの自己組織化により形成される骨格に接触した細胞の挙動に影響してよい。追加のドメインは天然に存在するまたは人工の生体分子、例えばＥＣＭタンパク質、細胞表面の分子、抗体等のいずれかに結合してよい。追加のドメインは金属、イオン等のような無機の物質に結合してよい。追加ドメインの存在は、ペプチドの自己組織化により生成される巨視的構造の材料特性（例えば強度、弾性等）を、未修飾の自己組織化により生成される巨視的構造の特性と比較して、改変する場合がある。即ち、非自己組織化ドメインを含むように自己組織化ペプチドを修飾することにより、巨視的構造の材料特性をユーザーの必要性に応じて調節することができる。例えば、身体内に移植するためには、移植の部位および／または移植片が交換すべき組織（例えば骨、結合組織、軟組織、例えば筋肉、眼の組織、固形臓器組織等）に応じて、異なる材料特性を有する材料を使用することが望ましい場合がある。以下のセクションは未修飾の自己組織化ペプチドに付加することができる例示的アミノ酸ドメインおよびその選択方法の非限定的な説明である。
【００６１】
表2aは、様々なシステムにおいて生物学的な活性があると知られている、種々の最小の生物学的に活性のある配列の例を示した表である。これらの配列のどれでも、「非修飾」自己組織化ペプチドに２番目のアミノ酸ドメインとして取り込んだり、用いたりすることができる。特定の実施形態において、２番目のアミノ酸ドメインは少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列から構成される。特定の実施形態において、２番目のアミノ酸ドメインは少なくとも２つの最小の生物学的に活性のある配列から構成される。これらのどのような配列であっても、またそれ以外の配列であっても、実際に修飾ペプチドを合成することで、例えばβシート、ナノファイバーおよび／または巨視眼的な構造をとるといった自己組織化の能力は、非修飾ペプチドが自己組織するような条件化で実際にテスト可能であることを理解されたい。そのようなテストは後述され、日常的に実施されている実験以上のものを要求しない。特定の実施形態において、βシート、ナノファイバーおよび／または巨視眼的な構造に自己組織化する修飾ペプチドが選択される。
【００６２】
表２ａに加えて、様々な追加の最小の生物学的に活性のある配列を、非修飾自己組織化ペプチドを修飾するための生物学的に活性のある配列として用いることができる。そのような配列は、ＥＣＭの組成、細胞接着分子、細胞表面レセプター、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン等といった幅広い範囲の天然に存在するたんぱく質やペプチドから由来する。例えば、-RGD-は、フィブロネクチンに見出される原型的な細胞認識配列で、インテグリンによって認識され、細胞接着を介在する。
【表２ａ】
2014062102.tif 000004
【００６３】
本明細書に示されるように、発明者は前述の最小の生物学的に活性のある配列を取り込んだ様々な修飾ペプチド（表2a）を創り、細胞有りまたは無しで細胞培養、組織再生や治療用途に用いることのできる巨視的な構造に組織化できるか評価した。驚くべきことに、マトリックス形成を妨げることなく、広範囲な修飾が可能であるが示された。発明者は、これらの新しい材料が、マウス前駆骨芽細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト脂肪幹細胞(ADSC)、ヒト間葉系幹細胞（MSC）の単層形成の支持、増殖、機能を評価した。上記の数々の最小の生物学的に活性のある配列を加えることによって、新しい生物学的活性がペプチドに付与され、それは修飾ペプチドから作成されたマトリクスの元で培養された細胞の振る舞いの変化として証明された。
【表２ｂ】
2014062102.tif 000005
【００６４】
繰り返しRGD結合配列(-PRGDSGYRGD-, 配列番号4: PRGmx, 配列番号7: DSG)： RGDは、特にインテグリンと一緒に働く、細胞接着のためのキー結合配列である。-PRGDS- と-YRGDS-は天然のたんぱく質で最も頻繁に現れるRGDモチーフである。-RGD-結合は、たんぱく質の立体構造に影響する(Kantlehner et ah , Chembiochem (2000) 1 : 107-1 14)。RGD結合配列を繰り返すことで細胞接着の可能性を増加させ、効果的な立体構造をとる可能性を増す。
【００６５】
破骨細胞および骨芽細胞およびの為の、オステオポンチンモチーフ(-DGRGDSVAYG-, 配列番号5: DGRmx)。オステオポンチンは、種によって264-301のアミノ酸によりなり、骨で骨芽細胞および破骨細胞により生成およびリン酸化され、また象牙芽細胞のセメント質生成の際にも生成される。またウロポンチン、骨シアロプロテイン(BSPl), 2aR, 2B7, eta-1 , 44Kd 骨フォスフォプロテイン、分泌型フォスフォプロテインとも呼ばれる (Kreis and Vale, (1999) Guide book to the extracellular matrix, anchor, and adhesion proteins, 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford, UK)。オステオポンチンは、細胞接着、遊走、生存、NF-kB 活性、NO合成、カルシウム結晶精製を制御している。このたんぱく質に重要ないくつかのモチーフが発見されている。
【００６６】
骨成長ペプチド(-ALKRQGRTLYGF-, 配列番号3: ALKmx): 骨成長ペプチド (OGP) (ALKRQGRTLYGFGG)は局所の骨髄損傷に対するシステム的な骨新生反応のメカニズムのキーファ、クターである。インビボ（生体内）で投与された場合、OGPは骨生成と造血を刺激する。C-末端の５アミノ酸のペプチド OGP (10-14)はOGP様の活性を有する最小のアミノ酸配列である。当然OGPの生理的な活性型である。OGPのTyr (10), Phe (12), GIy (13), GIy (14)は、OGP (10-14) 活性の根本である(Greenberg et al , J Cell Biochem. (1997) 65: 359-67; Chen et al., J Med Chem. (2002) 45: 1624-1632)。したがって、OGPの全長およびOGPの活性型が、骨細胞のためのテーラーメードマトリクスの機能モチーフとして用いられた。
【００６７】
ファージディスプレイ選択骨髄ペプチド (-PFSSTKT-, 配列番号l: PFSmx, -SKPPGTSS-; 配列番号12: SKP, -STFTKSP-, 配列番号18: STF): Beckerと仲間は、７アミノ酸長のファージディスプレイを用いて骨髄ホーミングアッセイを選択した。彼らは、K, P, F, S, S, T, Tを抱負に含むペプチドのファミリーを見出だした。これらのペプチドは幹細胞に結合し、インビボで８５%が骨髄に維持された(Nowakowski et al., "Bone marrow homing heptapeptides bears homology to CD84," Preventive Oncology & Intervention Strategies (Conference); Paris, February 9th to 12th, 2002)。骨髄に維持され更に原始的な幹細胞に結合するそのようなペプチドの一つは、リンパ球の表面に発現しているCD84のN末端に相同である(Palou et a , Tissue Antigens (2000) 55 : 1 18-127)。
【００６８】
ミエロペプチド (MPs) (-FLGFPT-, 配列番号2: FLGmx)：ヒトと多くの動物の骨髄細胞は、ミエロペプチド (MPs)といわれる生制御的メディエーターペプチドを生成している。その一つMP-I (Phe-Leu-Gly- Phe-Pro-Thr)は合成され、その生物学的活性は包括的に研究されている。この６アミノ酸ペプチドは、強烈な免疫制御活性を有する(Petrov et al. , Biopolymers (1997) 43 : 139-146)。このペプチドはロシアで様々な病気の治療のための臨床研究に使用された(Petrov et al. , Ann N. Y. Acad Sci. (1993) 685:351- 361)。MPは健康人および白血病のドナーから得られた骨髄細胞と末梢血液細胞の分化に影響を与えた。ヒトHL-60白血病セルラインに最終分化を引き起こした。MPは免疫制御だけでなく、異なったシステムおよび臓器で複雑な相互作用に関わっている(Petrov et al. , Biosci Rep. (1995) 15, 1-14)。MP-Iは、シクロフォスファミド(Cy)-処置マウスの抗体生成の量を減少させたが、正常な動物の抗体生成に影響を与えなかった(Mikhailova et al. , Regul Pept. (2003) 1 14: 183- 187).。
【００６９】
ヘパリン結合モチーフ配列(-FHRRIKA-, 配列番号6: FHR)。フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-β、 BMPといった細胞接着たんぱく質の接着モチーフ配列に、ヘパリン結合モチーフ配列がある。多くの配列は、- XBBXBX- と-XBBBXXBX-, （Xは非荷電または疎水性のアミノ酸 (F, I, L, P, M, W, Y, V, A, C,Q等)、Bは正電荷のペプチド (R, H ,K)を示す）というヘパリン結合コンセンサス配列を維持している。ヘパリン結合モチーフ配列は- RGD-モチーフと相乗的に働き、骨芽細胞の石灰化を促進する(Rezania A et.al, Biotechnol. Prog. 1999, 15, 19-32)。自己組織化ペプチドマトリクスに修飾ペプチドの機能モチーフとしてヘパリン結合モチーフを用いることで、ヘパリンまたはヘパラン硫酸をマトリクスに取り込むことができる。ヘパリンまたはヘパラン硫酸をマトリクスに取り込んだ自己組織化ペプチドマトリクスは、ヘパリン結合増殖因子の制御徐放に用いることができる。
【００７０】
ラミニン細胞接着ドメイン(-IKVAV-, 配列番号20: SIK; - IKLLS-, 配列番号21 : SEI)：ラミニンは基底膜の主要な構成要素で、幹細胞の維持に重要と考えられている。-IKVAV- (SEQ20に含まれる) とIKLLS (SEQ21に含まれる)は、ラミニンの細胞接着ドメインとして知られている。これらは、細胞生存の維持、アポトーシスの減少、カプセルかされたβ細胞のインシュリンの分泌の抑制に有効である(Laney et al., Biomaterials (2007) 28:3004-301 1 )。
【００７１】
ヒト血清フィブロネクチンのIII-CSドメイン(-REDV-, 配列番号10: REDmx)。ヒト血清フィブロネクチンのIII-CSドメイン(REDV)は、血管内皮細胞の接着と進展を支持するShin et al., Biomaterials (2003) 24:4353-4364; Welsh et al., Biomaterials (2000) 1 :23-30)。
【００７２】
チモシンβ４のアクチン結合部(-LKKTETQ-, 配列番号9: LKKmx)：チモシンβ４のアクチン結合部(-LKKTETQ-)は、血管内皮細胞の遊走、接着、脈管形成、動脈状環形成、血管新生を促進する(Huff et al., FASEB Journal (2003) 17:2103-2105)。
【００７３】
フィブロネクチン細胞接着ドメイン(-RGD-, 配列番号4: PRGmx; 配列番号5 : DGRmx; 配列番号7:DSG; 配列番号8:2G; 配列番号9: 4G)：１つのArg-Gly Asp (RGD)配列が、フィブロネクチンの１０番目のIII型繰り返しユニットに存在している。RGDはフィブロネクチンだけでなく、ラミニン、骨シアロプロテイン、オステオポンチン、ビトロネクチンといった細胞外マトリクスたんぱく質に存在する。RGD配列は細胞接着に重要である。RGDモチーフのポリマーやアルギン酸ゲルへの固定化は、インビトロとインビボ（生体内）で骨形成を促進する(Alsberg E et.al, J Dent Res 80:2025-2029.DJ (2001 ))。
【００７４】
Ｆ．生物学的に活性なペプチドモチーフ
既に発見された自己組織化ペプチドを修飾するという試みは、細胞の基底膜により与えられる微小環境の重要な側面を再生する完全に合成の物質を生成したいという要望により部分的には惹起されている。細胞の基底膜はラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカンにより主に構成される三次元のネットワークである。基底膜は上皮細胞のシートおよびチューブに伏在し、そして筋肉細胞、脂肪細胞およびシュワン細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲している。特定の位置（例えば肺、腎臓の糸球体）においては、基底膜は細胞のシートを分離し、フィルターとして機能する。電子顕微鏡可視化の下においては、基底膜は２つの異なる層、即ち基底膜上に静置した細胞の基底原形質膜に隣接する電子透過性の層、および、その下部の電子緻密層を含むように観察できる。基底膜はまたより下部の層を伏在する結合組織に結合させる第３の層を含む場合がある。 
構造成分としての重要性、細胞の連結の支援、および、種々の細胞、組織および臓器を分離する障壁として機能することのほかに、細胞に対してそれと相互作用する指示的な微小環境を与え、その機能をモジュレートする。細胞の極性、代謝、分化および遊走は基底膜によりモジュレートされる細胞機能の特徴の一部である。さらに、基底膜の分子は原形質膜および細胞内分子の構造的組織化に寄与することができる。基底膜分子はまた相互に相互作用する。  
細胞機能のモジュレーションにおけるＥＣＭの役割は、血管および心室が下部の筋肉層から内皮細胞を分離する基底膜の最上部に位置する内側の内皮細胞を含んでいる血管系の範囲において特に興味深いものである。基底膜は血管形成のような過程において重要な役割を果たすと考えられており、そしてその一体性は適切な血管の機能を維持するために重要である。内皮細胞の層および／または伏在する基底膜の損傷または変化はアテローム性動脈硬化症のような種々の疾患の過程において中心的役割を果たしていると考えられる。
基底膜のタンパク質内に存在する短ペプチドは細胞の連結、増殖、分化および遊走を含む重要な生物学的機能の種々に関与するものとして発見されている（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，１９８７、Ｋｌｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｋｏｌｉａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｋｕｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。身体内の異なるＥＣＭ分子の間の結合またはＥＣＭ分子と非ＥＣＭ分子との間の結合を媒介するペプチド配列もまた発見されている。以下のセクションはこのようなペプチドモチーフを含有および／または相互作用する種々の基底膜分子の特徴を説明するものであり、そして血管系、内皮細胞および内皮基底膜の該当する特徴をさらに詳述するものである。  
（ｉ）ラミニン−１
ラミニンはα、βおよびγ鎖を含有するヘテロ３量体のタンパク質ファミリーを示す。ラミニンは主に基底膜に位置するが、間葉コンパートメントにも存在する。ラミニニンは支質マトリックスおよび上皮、内皮、筋肉および神経細胞の間の物理的結合を創生する。現在まで、少なくとも１１種のラミニンのアイソフォーム（α、βおよびγ鎖の種々の組み合わせ）が発見されている。これら全てに共通なものは、ヘテロ３量体の組み立てにおいて中心的役割を果たすコイルドコイルドメインである。ラミニン−１が胚盤胞期よりも前のマウスの発生において生産される最早期のラミニンであり、臓器形成の間の上皮組織に寄与している（Ｄｚｉａｄｅｋ＆Ｔｉｍｐｌ，１９８５；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ラミニン−１（Ｍｒ＝９００，０００）はα１、β１およびγ１サブユニットから形成され、これらが組み立てられて十字架様の構造になる（Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。これはニドジェンと複合体を形成し、準６角形のパターンおよび３次元の構造を有するネットワークをもたらす。複合体の形成はカルシウム、温度および濃度の態様において起こる（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ＆Ｃｈｅｎｇ，１９９３）。
【００７５】
ラミニン−１は体輻相互作用または異なるアイソフォームの間の双方を含む重要な相互作用多数に関与している。これはまた細胞膜受容体を介したタンパク質複合体と細胞膜の間に架橋を形成する細胞外マトリックスの他のタンパク質と相互作用するか、或は、数種のインテグリンおよび非インテグリンの受容体を介して細胞と直接相互作用する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。ラミニン−１に帰属する重要な生物学的機能には、細胞接着、細胞遊走、細胞分化および増殖の促進、ニューライト派生の増強、細胞形状の調節、および、種々の細胞型の細胞極性の樹立が包含される（Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｉｍｐｌ，１９８７，Ｔｉｍｐｌ，１９８０，Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｅｎｇｅｌ，１９９２）。  
(H)コラーゲンＩＶ
コラーゲン性のタンパク質はその主要機能としての構造的役割を有する細胞外マトリックスタンパク質のスーパーファミリーを構成している。全てのコラーゲンは三重螺旋のコンホーメーションを有するドメインを有する。このようなドメインは各々が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎの反復配列モチーフを含有する３サブユニット（α鎖）から形成される。
【００７６】
コラーゲンＩＶは基底膜の主要コラーゲン性成分であり、ラミニン、ニドジェンおよびヘパランスルフェートプロテオグリカンを含む他の基底膜成分との相互作用が関与するネットワーク構造を形成する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。コラーゲン分子は２α１（ＩＶ）鎖および１α２（ＩＶ）鎖よりなる。コラーゲンＩＶは直接の低親和性相互作用によりラミニンを介して間接的に（Ｙｕｃｈｅｎｃｏ＆Ｏ’Ｒｅａｒ，１９９４，Ｃｈａｒｏｎｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、または、ラミニンに堅固に結合する約１５０Ｋｄａの糖タンパク質であるニドジェンにより媒介される強力な結合により（Ｐａｕｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｏｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、細胞と相互作用すると考えられており、コラーゲンＩＶに対する結合部位も有している（Ｔｉｍｐｌ，１９９６）。ＩＶ型コラーゲンはまたヘパリンおよびヘパランスルフェートプロテオグリカンとも結合する（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ＆Ｏ’Ｒｅａｒ，１９９４，Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｋｏｌｉａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
【００７７】
ニドジェン。ニドジェン（以前は文献中でエンタクチンと称せられていた）は５６残基の１モジュール（ＬＥ）によりラミニン−１γ鎖に結合する１ポリペプチド鎖よりなる（Ｐｏｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ニドジェンはまた別のエピトープを介してＩＶ型コラーゲンと相互作用し、基底膜においてラミニン−１とＩＶ型コラーゲンとの間のリンカー分子として機能すると考えられている。さらに、ニドジェンはインテグリン分子を介した細胞連結部位として機能するＲＧＤ配列を含有している（Ｔｉｍｐｌ，１９８９）。  
(iv)プロテオグリカン
プロテオグリカンは細胞の表面を含む種々の位置、細胞内嚢胞の内部に存在するタンパク質のセットであり、細胞外マトリックスに取り込まれる。それらは共通の翻訳後の修飾、多糖類の特殊な型、グリコサミノグリカンのファミリーの存在により定義されて分類される。プロテオグリカンは１〜数１００個のグリコサミノグリカン鎖を担持した小型または大型のポリペプチド鎖（１０〜４００ｋＤａ）よりなることができるコアタンパク質を含む巨大分子の多様なセットである。プロテオグリカンは多くの知られた活性を有している。中でも、他の細胞外マトリックスタンパク質と結合することにより細胞−細胞および細胞−マトリックスの相互作用を調節することがわかっている。細胞外マトリックスの組立および構造を調節し、そして保存および放出のコンパートメントとしての細胞外マトリックス内に拡散性分子を固定化する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。  
別の基底膜成分。上記したタンパク質のほかに、多くの他のタンパク質が基底膜中に存在し、意味のある役割を果たしている。それらにはパーレカン、アグリン、Ｂ−４０／ＳＰＡＲＣ、フィビュリン−１、フィビュリン−２が包含される（Ｔｉｍｐｌ １９９６，およびその参考文献）。これらに関連する多くのタンパク質も発見されている。  
血管系およびＥＣＭ。血管内皮細胞は全身循環と軟組織との間の界面を与え、そして炎症、凝固および脂血を含む重要な過程に関与している。血管内皮細胞もまたアテローム性動脈硬化症〜糖尿病性腎症に渡る多様なセットの病的状態において役割を果たしている。既存の血管の伸長および／または既存の血管からの新血管の形成（血管形成）は組織の修復および再生並びに胚の発生において本質的な役割を果たしている。一般的に、これらの過程には栄養および酸素を供給し老廃物を細胞から除去する三次元の血管ネットワークの形成が含まれる。血管形成は過去２０年に渡り集中的な研究の対象となっている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２０００，Ｈａｎ＆Ｌｉｕ，１９９９）。
【００７８】
血管化された三次元の構造の生成は今日では組織工学における主要な課題の１つとなっている（Ｅｉｓｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。細胞はそれらが血液供給の〜１００〜２００μｍ内に位置する場合にのみ栄養の拡散により生存を維持できる（Ｃｏｌｔｏｎ，１９９５）。栄養および酸素が拡散により送達できる皮膚のような薄膜構造を超えた組織工学用途における使用のための人工血管ネットワーク（Ｃａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）または軟骨のような非血管の組織を創生する方法を開発することが望ましい。  
血管の一般的構造は、薄膜である細胞外マトリックスの基底膜により伏在する平滑筋細胞から分離された細胞の単層を形成するコブルストーン形態を有する平板化された内皮細胞の内張りを含む（図８）。内皮細胞は血小板の接着に反発する負の外部電荷を有し、アンチトロンビンＩＩＩに結合するグリコサミノグリカン並びに内皮細胞の抗凝固および線溶活性を促進する組織プラスミノーゲン活性化物質を生産する。殆どの他の基底膜に共通して、血管の基底膜は主にラミニン−１、ＩＶ型コラーゲン、ニドジェンおよびプロテオグリカンよりなる。内皮細胞の挙動は基底膜との相互作用により影響されることは十分明らかにされている（Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｋｕｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｋａｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｏｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｏｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。  
(v)ヘパリン
ヘパリンとヘパラン硫酸(HS)は、コンドロイチン硫酸、ダーマタン硫酸、ケラタン硫酸などの炭水化物を含む複雑な糖類のグループであるグリコサミノグリカンの一種である。HSは細胞表面および細胞外マトリクスに遍在している。ヘパリンとヘパラン硫酸(HS)は、ヘパリン結合成長因子、細胞外マトリクス因子、セレクチン、プロテアーゼインヒビター、脂質タンパク質リパーゼのような様々なたんぱく質と相互作用し、それによって細胞増殖、分化、接着、遊走、発生の際の形態制御などの様々な動的な細胞の振る舞いに影響している。
【００７９】
ヘパリンとヘパリン結合増殖因子(VEGF, FGF, PDGF, HGF, TGF-β、BMP)の強い親和性を利用して、ヘパリンやHSを組み込んだバイオマテリアルによる増殖因子の制御された徐放が研究されている(Ishihara et.al, J Biomed Mater Res 64A: 551-559, 2003).
(vi)増殖因子
増殖因子は、細胞増殖・分化・成熟を促進する天然のたんぱく質である。多くの増殖因子が知られている。繊維芽細胞増殖因子 (酸性FGF(FGFl) 、塩基性 FGF(FGF2)),血管内皮増殖因子(VEGF), 骨形成たんぱく質 (bone morphogenic protein), 形質転換成長因子β(TGF-β), 神経成長因子 (NGF), 血小板由来増殖因子(PDGF), 上皮細胞増殖因子(EGF), 肝細胞増殖因子(HGF)。増殖因子は、インビトロの細胞培養に用いるだけでなく、治療用途にも用いられる。EGFとFGFは創傷治癒に用いられている。VEGFとHGFは、虚血疾患において血管新生の促進のために用いられている。BMPは骨再生の加速のために用いられている。増殖因子が組織再生の領域で用いられているにも関わらず、インビボ（生体内）でいつも成功するわけではない。その理由は急激な拡散と、、生物学的な活性をインビボ（生体内）で維持するための増殖因子の半減期が短いためである。増殖因子の制御徐放と保持の様々な手法が研究されている (Ishihara et.al, J Biomed Mater Res 64A: 551-559, 2003)。
【００８０】
増殖因子は、総電荷と例えば図20で示されるような局所電荷分布を持っているたんぱく質である。増殖因子は、局所的な疎水性の反応領域も有している。従って、それぞれの増殖因子は、異なった総電荷、異なった局所電荷分布、異なった疎水性の反応領域を有する異なったアミノ酸配列に対し、異なった親和性を有している。自己組織化配列または機能化配列でのアミノ酸配列の違いによって、特定の増殖因子に対する親和性は異なり、従って修飾された自己組織化ペプチドマトリックスを増殖因子の制御徐放と保持に用いることができる。
【００８１】
(vii)内皮細胞の機能
内皮細胞の単層は、特に非血栓形成性の表面を与えることによる血流の促進、代謝産物に対する透過性障壁および輸送界面となること、炎症応答をモジュレートすること、血管平滑筋および心筋の収縮性をモジュレートすること、および、血管の張力および止血を調節することを含む複数の機能を有している（Ｂｏｅｙｎａｅｍｓ＆Ｐｉｒｒｏｔｏｎ，１９９４，Ｃｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。  
内皮細胞は継続的に自身の基底膜を生成、分泌およびリモデリングし、そしてまた血管の張力および止血に寄与する血管作用性のオータコイド（Ｇｒｅｅｋ ａｕｔｏｓ−ｓｅｌｆ ａｎｄ ａｋｏｓ−ｒｅｍｅｄｙより）も合成する。酸化窒素（ＮＯ）は最も知られた血管拡張剤の１つである。生物学的な系においては、ＮＯはもう１つの反応生成物Ｌ−シトルリンがあれば酸化窒素シンターゼの作用によりＬ−アルギニンから合成される。別の強力な血管拡張剤および血小板凝集抑制剤はプロスタサイクリン（プロスタグランジンＩ２、ＰＧＩ２とも称する）である。ＰＧＩ２はエイコサノイドのファミリーに属し、プロスタサイクリン合成酵素によりプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）を介してアラキドン酸から形成される。２１アミノ酸ペプチドであるエンドセリン−１（ＥＴ−１）は血管収縮を促進することがわかっている。これらの３物質は（そして恐らくは他のものも）共に血管張力調節物質として機能する。  
健常な内皮の欠如は血栓のような主要な血管の病態に寄与することがわかっている。例えば平滑筋内皮細胞の単層の破壊はアテローム性動脈硬化症のプラーク中に存在する脂質および他の物質の付着により起こる場合があり、そして／またはアテローム性動脈硬化症の患部の発生に寄与している（Ｃｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。内皮細胞のコンフルエントの単層の存在は血栓耐性を改善する場合がある。これはまた擬似内膜過形成のような他の疾患を、例えば平滑筋の収集および／または増殖に寄与する可能性がある生物活性因子を放出する血小板の接着を防止することにより、防止すると考えられる。さらにまた平滑筋内皮細胞単層を形成する能力は血管形成術、カテーテル挿入等のような侵襲性の処置の後の内皮の一体性を回復するために有用である。従って、かなりの作業が現在、インビトロおよびインビボの両方における内皮細胞形成の研究に向けられている。  
多くの研究者等は血管形成における細胞外マトリックスの役割を研究している。このような研究の多くではマトリゲル、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍から得られた基底膜誘導材料またはコラーゲンのような細胞外マトリックス誘導材料に対するＥＣの挙動の観察を行っている（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。管形成のような血管形成の過程は２Ｄおよび３Ｄのシステムの両方において研究されている（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。数種の合成ペプチドとのＥＣの相互作用（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｏｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｏｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）も検討されている。  
G.生物学的活性に関する試験
本セクションは候補ペプチドが生物学的に活性なペプチドモチーフを含むかそれよりなることを調べるために使用できる種々の試験を説明する。以下に記載する試験は例示を目的とするのみであり、そして当業者は目的の細胞型および細胞の挙動に応じて、種々の別の試験および本明細書に記載した試験の変法を選択して使用できる。これらの試験のいずれにおいても、可溶性ペプチドを対照として使用できる。ある範囲のペプチド濃度（基板結合、修飾された自己組織化ペプチドの部分としての存在の両方、または可溶性形態）を使用してよい。  
さらにまた、細胞の表現型、細胞の生存性または増殖、細胞の表現型および／または細胞の機能的状態または種々の細胞の挙動の種々の指標の何れかを評価および／またはモニタリングすることが望ましい場合がある。当該分野で知られている通り、細胞の生存性、増殖を評価するため、および、細胞の挙動および表現方の種々の特徴を評価するための多くの方法がある。一般的に何れかの適切な方法を使用して本明細書に記載した条件下に細胞を培養することの作用を検査および評価してよい。さらにまた、細胞／ヒドロゲル組立て物の全体的組成および特性に対する細胞の作用をモニタリングしてよい。タンパク質含有量、強度等の側面を調べることができる。  
(i) 細胞の生存性および増殖。
【００８２】
細胞の生存性は生体染料排出（例えばトリパンブルー排出）を調べることにより評価してよい。細胞分裂は光学顕微鏡で観察してよく、そして有糸分裂像の存在により示される。分裂に伴う細胞数の増大もまた、例えば血球計を用いて計数することにより、観察してよい。細胞の丸型化のような形態学的変化もまた分裂に伴う。ＤＮＡ合成は種々の物質、例えば放射標識ヌクレオチド（例えば３［Ｈ］チミジン）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等のＤＮＡへの取り込みを検出および／または測定することによりモニタリングしてよい。多くの他の試験も使用可能である。例えばＭＴＳ試験によれば、ＭＴＳ試薬（テトラゾリウム塩）を生存細胞に適用した場合、それは４９０ｎｍの発光を伴いながら着色化合物（ホルマザン）に変換される。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性試験キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｌ−３２２４）のようなキットが広範に使用されている。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のような細胞の増殖を示すタンパク質に結合する抗体を用いた免疫染色もまた使用できる。アポトーシスを評価するための方法は当該分野でよく知られており、目視による検査、ＴＵＮＥＬ、および、ｍＲＮＡまたはアポトーシスに伴うタンパク質、例えばカスパーゼの測定が包含される。  
(U)細胞の連結。
【００８３】
ペプチドの細胞連結促進活性を測定するための好都合な方法は、ペプチドをビーズ（例えばセファロースビーズ）にコンジュゲートし、そして、細胞を官能性付与されたビーズの存在下、可溶性ペプチド添加または無添加でインキュベートすることである。非官能性付与ビーズを対照として使用できる。インキュベーションの後、ＥＤＴＡ含有溶液による処理のような種々の方法を用いて細胞を脱着させ、染色し、そして顕微鏡ＦＡＣＳ等で分析することができる（詳細はＮｏｍｉｚｕ ２００１参照）。同様の方法を用いて修飾および／または未修飾の自己組織化ペプチドを含む骨格への細胞の連結を試験することができる。
【００８４】
(Ui) 細胞の形態特徴および展開
細胞の展開には細胞型により異なる多くの形態学的側面が関与している。例えば、ヒト包皮線維芽細胞は典型的には展開時には伸長された多角形の細胞の形状をとり（Ｈｅｒｎ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９８）、そして組織化されたＦアクチン張線維ネットワークをディスプレイする（後述参照）。細胞の形態特徴は光学顕微鏡で評価でき、そして修飾ｖｓ未修飾の骨格上および／または競合する可溶性ペプチドの存在下または非存在下に展開する細胞に特徴的な形態をとる細胞の数を調べることができる。  
(iv) 細胞骨格の組織化
特定のペプチドは細胞の形状および遊走に影響する細胞骨格の組織化に作用する。細胞内部のＦアクチン張線維の組織化はローダミンコンジュゲートファロイジン染色により調べることができる（Ｈｅｒｎ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌ，１９９８）。例えばペプチド骨格上に培養した細胞を４％ホルムアルデヒド溶液中に固定し、透過性とし（例えばＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００）、ローダミンコンジュゲートファロジンとともにインキュベートし、再度固定する。次にそれらを例えばエピ蛍光顕微鏡を用いて顕微鏡的に可視化することができる。
【００８５】
(v) 細胞の遊走
本発明の修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格を包含する種々の基板の上またはこれを通過する細胞の遊走を定量するための多くの試験法が使用可能である。例えば、遊走は細胞を基板上、例えば修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格上で、障壁の存在下に培養するフェンススタイル試験を用いて評価できる。障壁の位置を記録する。次に障壁を除去し、細胞を所定時間維持する。所定時間内に障壁を通過する細胞の数を細胞遊走の測定値とする。数値は基板により異なる細胞の増殖を考慮して補正する。上記した方法の変法においては、後に除去する障壁により容器の領域を分離することにより異なる表面２つ以上を含む基板を作成できる。種々の表面への示差的遊走を評価できる。遊走はまた、平滑筋細胞（Ｍａｎｎ ２００２）およびヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（Ｓａｇｎｅｌｌａ ２００４）について記載されている通り放射状テフロン（登録商標）フェンス遊走試験を用いて定量することもできる。  
(vi) 細胞の分化、脱分化および相互分化。
【００８６】
これらの特徴は形態特徴を含む多くのパラメーターに基づいて評価できる。細胞の分化、脱分化および相互分化はまたマーカーとして知られている特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在を検出および／または測定することによっても評価してよい。後者の方法は広範に使用されており、多くの異なる細胞型に特徴的な細胞マーカーが識別されている。ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現は当該分野で知られた手法で検出してよい。例えばｍＲＮＡはノーザンブロット、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いて検出し、定量してよい。タンパク質の発現は免疫ブロッティング分析、免疫蛍光分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ分析等を用いて検出し、定量してよい。このような免疫学的手法はタンパク質に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用してよい。  
マーカーの種類は膨大であり、新しいマーカーが日常的に発見されている。例えばネスチンは神経上皮ニューロン前駆体幹細胞中で発現される中間フィラメントタンパク質であり、その発現はニューロンの成熟と共に低減される（Ｌｅｎｄａｈｌ １９９０）。ネスチンは未成熟ニューロンのマーカーと考えられ、そしてネスチン陽性細胞はニューロンまたはグリアのいずれかに分化できる。ＮｅｕＮは有糸分裂後の細胞中で発現されるニューロン特異的マーカーである（Ｓａｒｎａｔ １９９８）。グリアフィブリルアレイ酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は伝統的なグリア星状細胞マーカーである。ベータＩＩＩチュブリンは別のニューロン特異的タンパク質である。ＣＹＰ４５０タンパク質の発現は肝細胞に特徴的である。
【００８７】
本発明の範囲において特に重要なものは、血管内皮細胞尾を識別するため、および、血管内皮細胞の機能的活性を評価するために使用してよい。フォンビルブランド因子は血管内皮細胞の広範に認識されたマーカーである。血管内皮細胞に関する他のマーカーはＣＤ３１、ＤＣ１０２、ＣＤ１０６およびイソレクチンＢ４を包含する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＫＳ，１９９５；「Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ」Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｙｒｅ．Ｒｏｙ Ｂｉｃｋｎｅｌｌ（ｅｄ）．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９６）。本発明の特定の実施形態においては、ペプチド骨格は望ましくは血管形成を促進する。血管形成のマーカーは血管形成関連成長因子ＶＥＧＦ、アンジオポエチン１および２、およびそれらの受容体Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ２を包含する（Ｆｅｒｒａｒａ，２００１；Ｇａｌｅ ａｎｄ Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，１９９９）。これらのマーカーの種々のものに結合する蛍光染料に直接コンジュゲートされたモノクローナル抗体は例えばＤａｋｏ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ等から入手可能である。  
機能的試験はまた細胞の表現型または状態を評価するためにも使用できる。例えば、細胞が特定の細胞型に特徴的な特定の分子の取り込み、生産または分泌を行える、または特定の細胞型に特徴的な酵素的反応を行える能力を評価できる。実施例に記載する通り、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびＮＯの放出は内皮細胞に特徴的である。
【００８８】
(vii) ＥＣＭ成分の生産
ＥＣＭ成分の生産に対する種々の候補となる生物学的に活性なペプチドモチーフ、活性な生体分子、環境パラメーター、例えば機械的力の適用等の影響を評価すること、および／または、そのような成分の生産を経時的にモニタリングすることは特に有利である。このための種々の方法が使用できる。実施例３に記載する通り、ウエスタンブロット（または他の免疫学的方法）を用いてＥＣＭタンパク質の生産を定量できる。組織学的分析のためには、プロテオグリカン成分であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のトルイジンブルー染色を標準的操作法に従って実施できる。コラーゲンの付着は知られた手法を用いて測定できる（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９７：１４１−１４７，１９９９；Ｄｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｔｈｏｐａｄｅ ２９：９１−９９，２０００）。細胞外タンパク質の生産は［３Ｈ］−プロリンの培地への添加により測定できる。放射標識プロリンは細胞により取り込まれ、そして新しく合成されるタンパク質中に取り込まれる。放射標識培地中で一定時間（例えば１６〜２４時間）の後、遊離の［３Ｈ］−プロリンを洗浄により除去する。細胞外タンパク質は例えば約６０℃で一夜プロテイナーゼＫ溶液中でインキュベートすることにより消化し、消化タンパク質中に存在する放射能をシンチレーション計数により定量する。プロテオグリカンの生産は［３Ｈ］−プロリンの変わりに［３５Ｓ］−スルフェートを培地に添加する以外は同様に測定できる。ＧＡＧの総蓄積は結合したＤＭＭＢ染料の量の蛍光分析に基づいて測定できる（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６１（１）：１０３−１０８，１９８７）。
【００８９】
(viii) 神経系の試験
神経系の組織（例えば神経、グリア細胞）のインビトロの培養、神経系の組織の修復および再生のために有用な材料を開発することは大変興味深いことである。神経組織の機能の指標となる種々のパラメーターを測定できる。例えばニューライトの派生はペプチド骨格の上面上で培養した単離細胞、例えばＰＣ１２細胞の顕微鏡観察（および場合によりデジタル画像処理）により評価できる（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。このような細胞もまたカプセル化できる。別の方法は、ニワトリのような動物から摘出した脊髄神経節をカプセル化し、種々の時点において神経節から伸長するニューライトの平均の長さを測定することである（Ｓｃｈｅｎｓｅ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９９；Ｓｃｈｅｎｓｅ ＪＣ，Ｂｌｏｃｈ Ｊ．，Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ Ｐ．，ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ（２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：４１５−４１９）。シナプス形成は例えばＨｏｌｍｅｓ，２０００に記載の通り評価することができる。神経伝達物質および神経伝達物質の合成に関与することがわかっている酵素の生産は神経組織の機能的活性を評価する別の手段を与える。  
(ix) 内皮細胞の新芽形成
大動脈輪をラットのような動物から単離し、一定期間ペプチド骨格上で培養して新芽形成させ、その後固定して顕微鏡検査する大動脈輪試験を用いて候補の生物学的に活性なペプチドが血管形成の重要な特徴である内皮細胞新芽形成を誘導する能力を定量することができる（Ｍａｌｉｎｄａ，１９９９）。
【００９０】
(x) 内皮細胞管形成
ペプチド骨格の表面上または内部にカプセル化してＥＣを培養した後の細胞の組織化およびキャピラリー様の構造の形成は種々の時点において、例えば播種後２時間、８時間、１２時間、２４時間、３日、１週間および２週間の時点で、ＷＯ２００３０９６９７２に記載の通り相関長を測定することにより定量できる。ヘマトキシリンおよびエオシン染色、Ｍａｓｓｏｎｅ３色、並びにアクチンに関する免疫染色により内皮細胞のクラスターの形成、新芽形成、キャピラリー様構造の形成を目視で評価できるようになる。キャピラリー様構造中の管腔の存在は目視により、および三次元画像化システムを含む自動画像化システムを用いることにより評価することができる。管形成の評価方法は当該分野で知られている（例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。  
H. 目的のアミノ酸ドメインの発見
本発明のペプチドの非自己組織化部分として使用してよい別のアミノ酸ドメインを発見するための１つの方法は細胞との相互作用、特定の分子への結合等が考えられる天然に存在するタンパク質の配列から誘導した合成ペプチドを系統的にスクリーニングすることである。この方法は上記したとおり多くの生物学的に活性なペプチドを発見するために使用されている。一般的に、一緒になって配列の全部分または大部分を包含している、場合により重複しているペプチドのセットを、インビトロで合成する。次に細胞または潜在的な結合分子を個々のペプチドと接触させ、そして細胞の応答、結合の程度等を評価する。ペプチドは検出を容易にするために標識することができる。  
一般的に、例えば上記した特定のタンパク質を含む何れかの天然に存在するタンパク質の配列から得られるペプチドをスクリーニングすることができ、生物学的に活性なペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）およびＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号 ３５）を含むラミニン−１および生物学的に活性なペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）を有するＩＶ型コラーゲンを例示できる。これらのタンパク質、関連するタンパク質、他の目的のタンパク質（例えば他のＥＣＭタンパク質）、タンパク質をコードする遺伝子等の完全な配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを有するウエブサイト参照）から入手可能なもののような公的データベースにおいて、例えばＥｎｔｒｅｚ検索エンジンを用いながら、当業者は容易に特定することができる。データベースは遺伝子またはタンパク質の名称により、ヌクレオチド配列（例えばＧｅｎＢａｎｋを検索することにより）またはタンパク質配列によるなどして検索できる。例えばＩＶ型コラーゲンをコードする遺伝子は「コラーゲン」の用語を用いてＧｅｎｅデータベースを検索することにより発見することができる。検索結果の代表的で非限定的な部分的セットを付録Ａに示す。結果には目的の候補アミノ酸ドメインを選択するもととなるタンパク質配列へのリンクが含まれる（リンクは除去されている）。付録Ｂは配列番号３３、配列番号３５および配列番号３７の配列を用いてタンパク質配列のデータベースを検索することにより得られた検索結果の非限定的なセットを示し、これらの配列に含まれるタンパク質を識別するアクセッション番号も含まれる。同様であるが同一ではない配列を含むタンパク質が容易に発見できる。  
上記したとおり、目的の他のタンパク質は別のＥＣＭタンパク質、例えば別の基底膜タンパク質を含む。異なる細胞型に対して特に適するペプチド骨格は、細胞型が典型的に担持または包含されるＥＣＭ中に存在することがわかっているタンパク質をスクリーニングすることにより作成してよい。例えば異なる細胞型が共通して含まれる基底膜はラミニン、コラーゲン等の異なるアイソフォームを含有する場合がある。アミノ酸ドメインは目的の何れかの細胞型の細胞外環境に存在するタンパク質から選択できる。理論に制約されないが、これらのタンパク質はその細胞型の培養のため、および／または、その型の細胞を含有することがわかっているかその型の細胞を移植または誘引することが望まれる部位において身体内に導入するために好ましいものである。  
即ち、本発明は目的の細胞型に対するペプチド骨格の形成のための自己組織化ペプチドを設計するための方法を提供し、これは、その細胞型の細胞外環境（例えば細胞型が天然に担持または包含されるＥＣＭまたは基底膜中）に存在する天然に存在するタンパク質に存在するアミノ酸ドメインを発見すること、ペプチドが細胞上に対する生物学的作用を示すかどうか調べるためにこれをスクリーニングすること（ペプチド骨格内に存在するか上記した別の態様で細胞の環境中に存在する場合）、修飾された自己組織化ペプチドの第２のアミノ酸ドメインとしてアミノ酸ドメインを利用すること、および、修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格が細胞の成育のために良好かどうか、改変された細胞の表面型をもたらすかどうか等を調べるためにこれを試験すること、を包含する。スクリーニング段階は省略することができ、即ち、候補ペプチドは、所望により、生物学的作用についてそれをまず試験することなく、修飾された自己組織化ペプチドの部分として直接取り込むことができる。  
別の方法は、ファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイまたはリボソームディスプレイのようなペプチドライブラリを使用するディスプレイ手法を用いることである（Ｓａｒｉｋａｙａ ２００４およびその参考文献を参照）。ファージディスプレイおよび細胞表面ディスプレイはファージまたは細胞の表面上に天然に存在するキメラタンパク質を使用する。キメラタンパク質は一般的には天然に存在するファージまたは細胞の表面のタンパク質の全てまたは部分、および、ファージまたは細胞により発現される核酸によりコードされるランダムなペプチド配列を含有する第２のドメインを含有する。核酸の部分は典型的には種々の分子生物学の手法のいずれかによりランダム化された後にファージまたは細胞（またはその前駆体）の内部に導入されるか、後に突然変異により改変されることができる。自身の表面上にキメラタンパク質の異なるバージョンを各々が発現しているファージまたは細胞のライブラリを標的（例えばリガンド（固定化されていてよい）または細胞の集団）に接触させる。接触段階の後、キメラタンパク質を発現する弱く結合した細胞またはファージを洗浄除去し、強力に結合しているものを残存させる。工程を反復することにより堅固に結合しているものをリッチ化する（バイオパニング）。指向性の進化を実施する種々の方法も用いることができる。
【００９１】
有用なアミノ酸ドメインを発見するための別の方法は、既知の生物学的に活性なペプチドモチーフ、結合ペプチド等に対し、例えばアミノ酸１つ以上の置換により、限定された数量の突然変異を行うことである。これは出発配列と比較した場合に進歩した特性を有するペプチドを発見させる。本発明は１、２または３アミノ酸残基により本明細書に記載した配列とは異なる配列を有するアミノ酸ドメインの使用を包含する。  
/. 自己組織化ペプチドおよびそれを含む組成物の特性化
本発明の未修飾の自己組織化ペプチドまたは修飾された自己組織化ペプチドまたはその組成物の何れかにより形成される構造（例えばナノ繊維、巨視的構造、ヒドロゲル）は種々の生物物理学的および工学的な手法を用いて特性化してよい。適当な手法は目視検査、円偏光二色性（ＣＤ）、動的光散乱、フーリエ変換赤外スペクトル分析（ＦＴＩＲ）、レオロージ試験、例えば振動レオメーター観察、原子力顕微鏡観察（ＡＴＭ）、走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を包含する。例えば生物物理学的方法を用いてペプチド骨格内のβ−シートの二次構造の程度を測定してよい。さらに、フィラメントおよび孔径、繊維の直径、長さ、弾性および容量区分を走査および透過型電子顕微鏡観察の定量的画像分析を用いて測定してよい。
【００９２】
ペプチド骨格はまた膨潤の程度、骨格形成に対するｐＨおよびイオン濃度の影響、種々の条件下での水和の程度、および、引張強度を測定する数種の標準的な機械的試験手法を用いて検査してよい。弾性率のようなパラメーターを測定できる。これらの方法により当業者等は後に記載するペプチドに対する種々の修飾および付加のどれが本発明の方法における使用に適するかを判断できる。実施例１は未修飾のペプチド（ＲＡＤ１６−Ｉ）、ＲＡＤ１６−Ｉの種々の修飾ペプチド誘導体、および、ＲＡＤ１６−Ｉと種々の修飾ペプチド誘導体の複合物から形成した構造（即ちＲＡＤ１６−Ｉおよび修飾ペプチドの両方が存在する溶液から形成した構造）を特性化するために使用した種々の方法を記載している。使用してよい特定の手法の非限定的な説明は後のセクションに記載する。
【００９３】
例えば本明細書に記載したレオロジー試験を用いて定量的な態様でゲル形成を評価することに加えて、またはそれの代替として、より定量的な評価法、例えば単純な目視的検査を使用できる。ゲル形成の再現性のある評価法は、マイクロ遠沈管のような組成物を含有する容器の側面に材料を攪拌して摺上がらせることによりペーパークリップを用いて組成物をプロービングすることを包含する（Ｓｐｅｒｉｎｄｅ，ＪＣ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＬＧ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００），３３：５４７６−５４８０）。組成物はそれがペーパークリップを捕獲すればゲル化を起こしたとみなすことができる。それ以上のゲル化またはゲル状態の可逆性は、別のプロービングにより評価できる。それ以上のゲル化はより強固で低粘度の材料をもたらす。
【００９４】
(i) レオメトリー
レオロジー測定はペプチド骨格の粘弾性を試験するために実施できる。例えば試料を振動応力または振動歪に付す振動レオメトリーは、例えば周波数の範囲内で制御された歪において試料を剪断する制御された歪レオメーターを用いて実施できる。使用できる種々のレオメーターは市販されている。レオメトリーの原理およびゲルへのその適用は例えばＣｌａｒｋ，１９８７およびＫａｖａｎａｇｈ＆Ｒｏｓｓ Ｍｕｒｐｈｙ，１９９８に記載されている。
【００９５】
一般的にそのような試験の出力はＧ＊、即ち複合基準である。この複合基準は以下の通り定義される：G*=G'+iG" [eq. 1]Ｇ＊＝Ｇ’＋ｉＧ’’［等式１］本等式中、Ｇ’は材料の弾性／固体特性を示す蓄積基準である。Ｇ’’は材料の粘性／液体特性を示す損失基準である。  
振動レオメトリーにおいて、粘稠な溶液の場合、複合基準の粘性成分、損失基準（Ｇ’’）は典型的には振動周波数が低減するに従って、そして蓄積基準Ｇ’が低値であれば低下する。ゲルについては、Ｇ’およびＧ’’は振動周波数に対して比較的一定である。例えば本発明の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはｄＧ’／ｄｗおよびｄＧ’’／ｄｗの桁数は２未満、より好ましくは１未満であり、ここでＧ’およびＧ’’はパスカル（Ｐａ）で測定し、ｗはｒａｄ／ｓの周波数を示す。周波数の範囲は例えば０．１〜１ｒａｄ／ｓ、１〜１０ｒａｄ／ｓ等であることができる。本発明の別の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはｄＧ’／ｄｗおよびｄＧ’’／ｄｗの桁数は０．５未満、０．２未満、または０．１未満であり、ここでＧ’およびＧ’’はＰａで測定し、ｗはｒａｄ／ｓの周波数を示す。  
ゲルの場合、Ｇ’は典型的にはゼロより高値である。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化により形成された組成物のＧ’は０．５Ｐａ以上である。本発明の他の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化により形成された組成物のＧ‘は動的周波数掃引試験を用いて直線領域において測定した場合、１．０Ｐａ以上、５Ｐａ以上、１０Ｐａ以上、１０〜１００Ｐａまたは１００Ｐａ超である。直線領域は得具０．１〜１ｒａｄ／ｓ、１〜１０ｒａｄ／ｓ、または１０〜１００ｒａｄ／ｓであってよい。このような測定を行う場合、動的歪掃引をまず材料に対して実施することにより試験の直線的な粘弾性の領域を設定して動的周波数掃引試験のための固定された歪を選択してよい。この直線的な粘弾性の範囲は一般的には一定の基準Ｇ’およびＧ’’により定義される。この範囲内の歪を選択することは信頼性のある結果を得るために重要である（Ｓｃｈｒａｍｍ，１９９４）。例えば実施例１で試験したペプチド骨格の場合は、選択された歪は０．０１（無次元）であり、全ての試験に適用した。  
上記した説明は本発明を限定する意図はなく、単にその特定の実施形態に関するものである。実際、ゲルは「溶液中の是非に関わらず交差結合の相互作用（共有結合または非共有結合）を生じてネットワークを形成する何れかの物質」として定義されており、物質は低応力下において材料の変形の点においてある程度の弾性特性を保持していると理解される（Ｓｃａｌｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｐｉｅｒｒｅ−Ｇｉｌｌｅｓ ｄｅ Ｇｅｎｎｅｓ，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９７９））。ヒドロゲルの場合、ネットワークはかなりの量の水を保持している。  
(H) 原子間力顕微鏡
原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）は試料の表面および試料をスキャンするために使用される顕微鏡の鋭利な先端の相互作用を測定することによりナノメーターの尺度まで表面構造の分解を可能にする技術である。ＡＦＭは小さい一定の力を維持しながら試料表面を通過して可撓性のカンチレバーの末端上の鋭利な先端を走査することを包含する。走査の動作は試料に対してラスタパターンで先端を走査する（または先端に対して試料を走査する）圧電気管スキャナにより実施する。先端−試料の相互作用は典型的にはスプリット光ダイオード検出器内のカンチレバーの背部にレーザーを反射させることによりモニタリングされる。光検出器の出力電圧の差を検出することによりカンチレバーの偏向または振動振幅の変化を測定できる。  
最も一般的に使用されている操作様式は２種類、即ち接触モードＡＦＭおよびＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭであり、これは空気中または液体の環境において実施される。接触様式ＡＦＭは先端と試料の間の反発力を測定することにより操作される（Ｂｉｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。機器は先端に僅かに接触する。ＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭにおいては、画像は吸引力の測定から誘導され、先端は試料に接触しない。自身の共鳴振動数において振動し、走査の間に表面上を僅かに「タッピング」する。ＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭは、軟質で壊れやすく接着性の表面において、接触モードのＡＦＭの欠点である損傷を与えることなく測定を可能にすることから、本発明のペプチド骨格におけるナノ繊維の形成を評価するために特に適している。  
J. 治療用途
本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化によるか、または、本明細書に記載した修飾または未就職の自己組織化ペプチドの組み合わせの自己組織化により作成されたペプチド構造は種々の組織の欠陥および疾患を治療するために使用してよい。ペプチドヒドロゲル構造は表面上に生育するか内部にカプセル化されている細胞の有無に関わらず、例えば手術により、または、何れか他の適当な処置を用いて身体内に移植してよい。他の経路、例えば経口、経皮、筋肉内、静脈内および皮下の経路を使用してよい。当業者は適切な送達手法を選択できる。  
一般的に本発明の方法および組成物は組織の傷害または損傷が関与する何れかの状況において有用である。このような傷害は手術、外傷、腫瘍、変性疾患または他の疾患または状態の結果として生じる。必ずしもではないが、傷害は細胞の死を伴う。方法および組成物は組織の構造的および／または機能的な一体性を回復するため、すなわち傷害の前に存在していた機能的または構造的な状態に組織を回復させるために有用である。特定の傷害は組織の再生または修復を妨害する物理的障壁を与える場合がある。このような障壁は壊死、空洞化または瘢痕組織の形成の領域を含む。本発明の特定の実施形態においては、傷害の部位において本明細書に記載した材料を導入することは、傷害または障壁の部位に近接する位置から傷害または障壁の部位から隔たった位置までの細胞または組織の成育を可能にする。  
本発明の特定の組成物および方法は臓器の疾患または変性の作用を緩解するため、臓器または他の身体構造への損傷を修復するため、または、臓器または他の身体構造を形成するために使用してよい。このような臓器または身体構造は、例えば、血管組織、脳、神経組織、食道、ファローピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、子宮および皮膚を包含する。  
一般的に種々の装置を用いて傷害の部位に骨格材料を導入してよい。シリンジを用いた送達は１つの好都合な手法である。ペプチドはまた手術部位においてカテーテルによるか直接導入することもできる。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドが未組立であるか、最小限にしか組立てられていないペプチド溶液（即ちゲルを形成していない溶液）を身体内に導入する。本発明の別の実施形態においては骨格の形成はインビトロで可能であり、そして組立てられた骨格を身体内に導入する。  
細胞をカプセル化したペプチド骨格は種々の治療目的のために使用してよい。未組立のペプチドおよび細胞をインビトロで混合し、次に、投与後に構造を自己組織化させ、細胞をインビボでカプセル化してよい。上記したとおり、本発明の特定の実施形態においては、投与した溶液は１０、５、１．０または０．１ｍＭ未満のイオン（例えばカチオン）を含有するか、実質的にイオン（例えばカチオン）含有であり、そして等浸透圧溶質の濃度は少なくとも５、１５０または３００ｍＭである。１つの実施形態においては、等浸透圧溶質の濃度は以下の範囲、即ち、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭまたは８００〜９００ｍＭの１つに含まれる。適当な等浸透圧溶質は例えば炭水化物、例えばスクロースである。
【００９６】
上記した細胞型の何れかを使用してよい。即ち血管内皮細胞に加えて、或はその代替として、本発明の組成物は種々の他の細胞型および／またはそのような細胞型の前駆体を包含する。細胞は自系または非自系であってよい。それらは同種異系または非同種異系であってよい。それらはそれらが導入される被験体と同じ種に由来、または異なる種に由来してよい。それらは胎児性または成熟性であってよい。  
本発明の種々の実施形態において、自己組織化の前または後に、別の物質１つ以上をペプチド骨格に添加する。物質は多くの目的、例えば後述するものの何れかに対応するものである。骨格を身体内に移植する場合、生育中の細胞の突起または組織はそれらがペプチド骨格に占有されている区域内に伸長または生育するに従って物質と接触する。本発明の特定の実施形態においては物質は例えば拡散により、またはそれが経時的に分解するのに従って骨格から放出されることにより、骨格から放出される。特定のペプチド配列および／またはペプチド濃度およびパラメーター、例えば交差結合度を選択することにより物質の分解および放出の所望の速度を得てよい。物質は移植の部位またはその近傍において細胞および組織と接触および／または血流中に進入してより遠位まで移動してよい。添加できる物質は、例えば、感染症を治療するか危険性を低下させるための抗生物質または抗カビ剤、腫瘍を治療するための化学療法剤等を包含する。即ち、巨視的構造の原料となったペプチド溶液は治療活性化合物または化学誘引剤を含んでよい。このような化合物の例は、天然または合成の低分子；核酸分子、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する核酸分子（Ｄｏｒｓｅｔｔ ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｉ ２００４，およびその参考文献）、例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはプラスミド；ペプチドまたはタンパク質、例えばインテグリンまたは細胞接着分子；タンパク質、例えば抗体等を包含する。  
本発明の特定の実施形態においては、ペプチド溶液またはそれから形成された巨視的構造は分化、脱分化または相互分化を増強または誘発する薬剤、例えば成長因子、例えば欠陥内皮成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、アンジオポエチン１または２、表皮成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子−α、トランスフォーミング増殖因子−β、腫瘍壊死因子α、血小板誘導成長因子、インスリン様成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、脳誘導神経親和性因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態形成タンパク質または軟骨誘導因子を取り込む。成長因子および／または治療薬または化学誘引物質の組み合わせも使用してよい。ペプチドホルモンも使用してよい。天然に存在するペプチドまたは修飾されたバージョン、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドのようなペプチドも使用してよい。
【００９７】
巨視的構造は細胞周期への再進入を誘導する薬剤を取り込んでよい。このような薬剤は自己組織化の開始前にペプチド溶液に、または、電解質溶液に添加してよい。このような場合、薬剤の濃度は組立てられた構造内部では実質的に均質であると考えられる。本発明の特定の実施形態においては、薬剤は細胞の添加の前または後にペプチド構造を共にインキュベートする培地に添加する。培地への添加の後、薬剤の一部は例えば拡散を介してペプチド構造に進入する。この過程は勾配をもたらす。構造の異なる領域の上または内部の細胞は細胞の位置における薬剤の濃度に応じて薬剤への異なる応答を示す。分解を誘発すること、遮蔽すること、発現を低減すること、または、細胞との分子の相互作用をブロックすることによりにより組織の再生または修復に対して抑制的である分子の作用に対抗して作用する物質もまた取り込んでよい。  
成長因子は典型的には約１ｆｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間の濃度において使用される。多くの場合、成長因子は低ナノモル範囲、例えば１〜１０ｎＭの濃度で使用する。本発明の特定の実施形態においては、成長因子は従来技術において典型的に使用されていない、または、正常な条件下ではインビボで典型的には観察されない濃度において使用される。例えば、成長因子は作用をもたらすために典型的に必要な濃度よりも、または、インビボで典型的に存在する濃度よりも、５倍高値、１０倍高値、２０倍高値、１００倍高値等の濃度おいて使用してよい。特定の所望の作用に応じて、特定の薬剤、例えば成長因子の旨適濃度を決定するために滴定実験を実施することができる。因子は精製された形態で、または、血清のような複合的生物学的混合物の成分として添加してよい。
【００９８】
上記したとおり、組織の修復および再生は成長因子、細胞接着分子、インテグリン等の因子を供給することにより増強できる。このような分子（または他のもの）を提供するための１つの方法は傷害の部位における細胞の送達である。細胞は再生を促進するかそれ以外の態様で再生を可能にする環境の創生に寄与する分子を生産する。種々の先祖細胞も有用である。これらの細胞型の何れかを骨格内に取り込んでよい。さらにまた、これらの細胞型（または他のもの）のいずれかは例えば再生促進因子の生産を増大させるように遺伝子的に修飾させた後に骨格内に取り込むことができる。
【００９９】
遺伝子療法の手法を用いて所望の産物をコードする遺伝子の発現を増大させてよい。遺伝子療法は目的の細胞への目的の分子の合成のための鋳型を含む核酸の送達を包含する。核酸（または例えば逆転写により核酸から誘導された核酸）を細胞のゲノム内に取り込ませるか、または、エピソームとして細胞内に永久的に残存させてよい。しかしながら、遺伝子療法はまた核酸が送達される細胞内に一体化または永久的に残存することのない核酸の送達も包含する。このような方法は目的の分子の一時的または一過性の合成を可能にする。  
所望の分子の合成のための鋳型を含む核酸を提供するベクターまたはビヒクルをペプチド骨格に取り込ませ、これから、傷害の部位または近傍において細胞によりそれらを取り込ませてよい。好ましくは、核酸は目的の細胞内で発現されるべき遺伝子のコーディング配列を包含し、そしてまた、適切な発現シグナル、例えばプロモーター、ターミネーター等を含むことにより、適切な発現を確保する。本発明の特定の実施形態においては、遺伝子が特定の細胞型の細胞内でのみ発現されるように発現シグナルは細胞型特異的である。
一般的に、ウィルス性または非ウィルス性のベクターを使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、ベクターはニューロンに感染できるウィルスベクターである。例えばヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルスまたはレンチウィルスを使用してよい。細胞への鋳型の送達において未損傷のウィルスを使用することは回避することが好ましい。即ち、ＤＮＡベクターまたは線状ＤＮＡ分子を送達することが好ましい。これらのベクターは必須ではないが長末端反復等のウィルス配列を含んでよい。トランスフェクションに有用な広範な種類の薬剤のいずれかを用いて細胞による核酸の取り込みを増強してよい。このような薬剤は広範なカチオン性重合体および修飾されたカチオン性重合体、脂質等を含む。細胞型特異的なターゲティングリガンド、例えば目的の細胞型の上で発現される分子に特異的に結合するリガンドまたは抗体を遺伝子療法送達剤に結合させることによりその薬剤が特定の細胞型のみに導入されるようにしてよい。一般的に核酸および何れかの適切な遺伝子療法送達剤（例えばカチオン性重合体）を本明細書に記載した方法のいずれかにおいて骨格内に取り込んでよい。  
本発明の特定の実施形態においては、治療上望ましい遺伝子の修飾を行ってよい。例えば固体が特定の遺伝子において突然変異を保有している場合、遺伝子療法目的のために先祖細胞内に遺伝子の野生型コピーを導入することが望ましい場合がある。本発明の特定の実施形態においては、特定の受容体、例えば成長因子受容体をコードする遺伝子を導入することにより特定の分化、脱分化または相互分化の能力を付与または増強することが望ましい場合があり、これは成長因子に細胞を応答させることにより行う。  
治療目的のために投与されるべき細胞の数、異なる表現型の細胞の相対的比率、および／またはペプチド構造中の細胞の濃度は治療すべき特定の状態または傷害に対して適宜改変することができる。  
本発明の特定の実施形態においては、例えばペプチド構造の上または内部において増殖および／または分化している血管内皮細胞および／またはその先祖細胞は構造から除去または抽出される。除去または抽出は適当な手段、例えば吸引ピペットを用いた除去、骨格の機械的破壊、インビトロでの構造の酵素的分解等により達成してよい。本発明の特定の実施形態においては、選択された方法は細胞の約１０％、細胞の１０％〜２５％、細胞の２５％〜５０％、細胞の５０％〜７５％、または細胞の７５％〜１００％の除去または抽出をもたらす。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。本発明の特定の実施形態においては、除去または抽出された細胞の生存性は細胞の約１０％、細胞の１０％〜２５％、細胞の２５％〜５０％、細胞の５０％〜７５％、または細胞の７５％〜１００％である。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。  
抽出された細胞はさらにペプチドヒドロゲル構造の上または内部において、または何れかの他の培養容器中、インビトロで培養してよい。抽出された細胞は適切な経路、例えば静脈内、皮下、経口、経皮、筋肉内または外科的に被験体に投与してよい。投与された細胞は組織、臓器または身体構造、例えば血管組織の不全を有する組織、臓器または身体構造に補給するために使用してよい。投与された細胞はタンパク質、例えば個体が欠損している酵素を供給してよい。投与された細胞を遺伝子的に修飾し、遺伝子療法を送達する手段として使用してよい。  
本発明の自己組織化ペプチドは、例えば血管形成術のような処置の後に、傷害の部位において血管の内皮の層の形成を促進するために使用してよい。それらはまた、内皮化を促進するために例えば血管移植片またはステントのような装置のためのコーティング物質として使用してよい。別の方法においては、ペプチドは人工血管のような人工の導管の内面上に層を形成する。内皮細胞は一定期間ペプチドの自己組織化により形成された層の上で培養する。細胞はＥＭＣ成分を分泌する。次に細胞を除去すると、細胞により合成されたＥＣＭ分子を含有する未損傷の基底膜層が残る。次に人工の導管を宿主内に移植する。別の方法においては、導管は内皮細胞を除去することなく宿主に委嘱する。  
本発明の自己組織化修飾ペプチドおよびそれを含有する構造は例えば末梢神経系における軸索および神経の再生を促進するために神経ガイドとして、またはその内部において使用できる。
【０１００】
本発明の自己組織化ペプチドおよび構造は、骨の再生および修復を骨芽細胞の結晶化の活動の促進および前駆骨芽細胞の分化の促進によって加速するために、使用することができる。
【０１０１】
K. キット
本発明は細胞を培養するため、および／または、被験体の身体内に導入できるペプチド骨格を形成するために使用してよいキットを提供する。キットは乾燥または凍結乾燥形態、溶液、または組立または部分的組立の状態で提供してよい本発明の自己組織化ペプチド１つ以上を含む。キットはさらに、以下の要素、即ち、細胞の集団、細胞または組織の培養基、所定量の成長因子、所定量のイオンまたはその塩、細胞培養用の自己組織化ペプチドの調製のための取扱説明書、ペプチドヒドロゲル構造の上または内部において細胞を培養するため（例えば細胞をカプセル化するため）の取扱説明書、被験体に自己組織化ペプチドを導入するための取扱説明書、細胞培養を実施する容器、ペプチドを溶解できる液体、シリンジ、ペプチドの自己組織化を開始するためのイオンまたはその塩、成長因子または分化因子の１つ以上、組織培養用の培地、細胞（例えば血管内皮細胞）、対照ペプチド等の１つ以上を含んでよい。別の要素も含んでよい。
【０１０２】
III. 本発明の様々な実施形態の要約(i) 修飾自己組織化ペプチド
上に一般的に記載および考察したように、本発明は以下を含む修飾自己組織化ペプチドを提供する：
(a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第２のアミノ酸ドメイン。
【０１０３】
ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが、アミノ酸配列: -RADA-; -IEIK-; or -FKFQ-の少なくとも２回含む。ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが、表1の何れか一つを含む。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが、-RADARAD ARADARADA- (配列番号21 ); -FKFQFKFQFKFQ- (配列番号51); -IEIKIEIK- (配列番号52); -KLDLKLDLKLDL- (配列番号53).のアミノ酸配列の何れか一つを含む。
【０１０４】
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが少なくとも２つの最小の生物学的に活性のある配列を有する。別の実施形態では第２のアミノ酸ドメインが少なくとも３つの最小の生物学的に活性のある配列を有する。さらに別の実施形態では最小の生物学的に活性のある配列が、表２から選択される。ある実施形態では、少なくとも最小の生物学的に活性のある配列の一つが、-RGD-.を有する。
【０１０５】
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合または非共有結合で接続されている。他の実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合ペプチド結合により接続されている。さらに他の実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端とアミノ酸リンカー基により接続されている。
【０１０６】
ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(6.9オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が約２アミノ酸長(6.9オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が２アミノ酸長(6.9オングストローム)未満である。
【０１０７】
ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも４アミノ酸長(13.8オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が約４アミノ酸長(13.8オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が４アミノ酸長(13.8オングストローム)未満である。
【０１０８】
ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも８アミノ酸長(27.5オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が約８アミノ酸長(27.5オングストローム)である。他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が８アミノ酸長(27.5オングストローム)未満である。
【０１０９】
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが少なくとも単体で生物学的に活性を有する
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である。ある実施形態では、細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-β、 BMPのグループから選ばれている、
他の実施形態では、ヘパリン結合ドメインが、式（I）または（II）で示される： (I)- XBBXBX-(II) XBBBXXBX-, Xは非荷電または疎水性のアミノ酸 (F, I, L, P, M, W, Y, V, A, C,Q)、Bは正電荷のペプチド (R, H ,K)から選択される 
ある実施形態では、修飾自己組織化ペプチドは正または負の総電荷を有する。ある実施形態では、電荷は水溶液が約５-９のpＨ の範囲で現れる。他の実施形態では、自己組織化ペプチドが８以上の等電位点を有する。更に他の実施形態では、溶液のｐHが約６-８の範囲である時に、自己組織化ペプチドの総電荷が約２以上である。
【０１１０】
ある実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが近中性であるか、正電荷か負電荷を有する。ある実施形態では、その電荷が約５-９のpＨ の範囲で現れる。別の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが約６-８のpＨ の範囲で−１から１の間の電荷を持つ。更に他の実施形態では、第一のアミノ酸ドメインが５−９の範囲で等電位点を有する。
【０１１１】
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが正電荷か負電荷を有する。ある実施形態では、約５-９のpＨ の範囲でこの電荷が現れる。更に他の実施形態では、２のアミノ酸ドメインが約６-８のpＨ の範囲で−２かそれ以下の電荷を持つ。
【０１１２】
ある実施形態では、第２のアミノ酸ドメインが、単体では自己組織化しないが、ペプチドが巨視的な構造に集合するように、第一のアミノ酸ドメインの自己組織化を許可する。ある実施形態では、この巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む。
【０１１３】
ある実施形態では、ペプチドが溶液である時にそのペプチド単独で自己組織化する。ある実施形態では、溶液は水溶液である。
【０１１４】
更に他の実施形態では、溶液である時にそのペプチド単独では自己組織化しないが、非修飾の自己組織化ペプチドと一緒の溶液で自己組織化をする。
【０１１５】
更に他の実施形態では、下記を含む第３のアミノ酸ドメインを有する：(a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、(b) 単独では自己組織化しないが、第１のアミノ酸ドメインの集合により、巨視的な構造の形成を許可する第２のアミノ酸ドメイン。
【０１１６】
そのような修飾自己組織化ペプチド（第３のアミノ酸ドメインを有する）は、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインからなり、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を介在する２つのアミノ酸ドメインの間に、生物学的に活性のある配列または生分子との相互作用のための標的箇所を含むアミノ酸ドメインの直鎖のペプチド鎖であってよい。
【０１１７】
ある実施形態では、修飾自己組織化ペプチドは表2のペプチドから選択される。
【０１１８】
ある実施形態では、修飾自己組織化ペプチドが、生物学的分子と、親和性を有するか、複合体を形成する、最小の生物学的に活性のある配列を有する。
【０１１９】
そのような生物学的分子は、たんぱく質やペプチド（ヘパリン、ヘパラン硫酸、増殖因子、等）、および／または細胞（骨芽細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、角質細胞、基底細胞、棘突起細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、子宮頸部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞またはそれらの前駆細胞のグループ）を含むが限定されない
(U) 医薬組成物
本発明は、本明細書に記載された、修飾自己組織化ペプチドを含む医薬組成物も提供する。
【０１２０】
本発明の修飾自己組織化ペプチド、および／またはこれを含む医薬組成物、および／またはこれを含むマトリクスは、体内に注入または外科的に移植することができる。ペプチド／医薬組成物／マトリクスは、径静脈、径筋肉、径動脈、径髄内、径髄腔内、経皮下、径脳室内といったの様々な経路で体内に注入することができる。特に意図された経路としては、径血液  および／またはリンパ液、および／または欠損部への直接の投与である。一般的に最適な投与の経路は、ペプチド／医薬組成物／マトリクスの性質（環境に対する安定性など）、欠損の位置、対象の状態（患者がそのような投与に耐えられるかなど）などの様々な要因に依存する。
【０１２１】
滅菌された注入可能な水または油の懸濁液は既知の適切な分散剤、湿潤剤、懸濁化剤を用いて処方される。滅菌された注入可能な準備は、1 ,3-ブタンジオールの溶液のよううな、無毒の希釈液や溶媒を用いた、滅菌された注入可能な溶液、懸濁液、エマルジョンである。そのような媒体や溶媒として、水、リンゲル液、U. S. P.、等張食塩水がある。この目的で合成のモノグリセリドやジグリセリドなどの組成の明確な油を用いることもできる。更にオレイン酸などの脂肪酸も注入剤の準備に用いることができる。
【０１２２】
注入可能な処方は、バクテリア除去フィルターによるろ過、滅菌水または他の滅菌溶液に溶解または分散できる滅菌剤の導入によって滅菌される。
【０１２３】
本発明の修飾自己組織化ペプチド、および／またはこれを含む医薬組成物、および／またはこれを含むマトリクスは、治療に効果的な量、重量、濃度で（注入または外科的な移植で）投与される。組成物は、投与に容易な単位で処方される。特定の患者あるいは臓器に対して、治療用途に効果的な量は、ペプチド／医薬組成物／マトリクスの性質および／または活性、対象の年齢、体重、健康状態、性、栄養状態、投与経路、ペプチド／医薬組成物／マトリクスの生分解率、治療の頻度、ペプチド／医薬組成物／マトリクスと一緒に用いられる追加の生物学的な活性のある薬剤などの様々なしかしこれらに限定されない要因に依存する。
【０１２４】
本発明の様々な医薬組成物の処方が意図される。例えば、ある実施形態では、医薬組成物は（注入のための）自己組織化ペプチド溶液である。ある実施形態では、医薬組成物は（注入または／かつ移植のための）修飾自己組織化ペプチドである。ある実施形態では、マトリクスはゲルかハイドロゲルである。
【０１２５】
ある実施形態では、本発明は、注入可能な修飾自己組織化ペプチド溶液を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、組成物は、針または細いチューブでシリンジから欠損に導入される。ある実施形態では、組成物は、カテーテルによりシリンジから欠損に導入される（例えば径血管または内視鏡的送達）。ある実施形態では、医薬組成物は、ゲル化剤と、注入可能な修飾ペプチド溶液を注入の直前に混合するものを含む（例えば図36Aに、ペプチド溶液とゲル化剤がシリンジ／カテーテルの先端で、生体への注入直前に混合されるペプチド溶液とゲル化剤のシリンジ／カテーテルによる投与方法を示す。
【０１２６】
ある実施形態では、本発明は、注入可能な修飾自己組織化ペプチド溶液を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、組成物は、針または細いチューブでシリンジから欠損に導入される。ある実施形態では、組成物は、カテーテルによりシリンジから欠損に導入される（例えば径血管または内視鏡的送達）。
【０１２７】
ある実施形態では、この医薬組成物はさらに一つ以上の増殖因子を有する。ある実施形態では、一つ以上の増殖因子が修飾自己組織化ペプチドに注入の前に事前混合される。ある実施形態では、事前混合された組成物が、滅菌されたシリンジや容器（保存瓶やバイアル等）に保存される。しかしながら、ある実施形態では、一つ以上の増殖因子とペプチド溶液は別に保存され、注入の直前に増殖因子溶液とペプチド溶液が混合される（例えば図36Aのような構成で）。
【０１２８】
ある実施形態では、この医薬組成物はさらに一つ以上の固体物（顆粒など）を有する。ある実施形態では、固体物が修飾自己組織化ペプチドに注入の前に事前混合される。ある実施形態では、事前混合された組成物が、滅菌されたシリンジや容器（保存瓶やバイアル等）に保存される。しかしながら、ある実施形態では、固体物とペプチド溶液は別に保存され、注入の直前に固体物とペプチド溶液が混合される（例えば図36Aのような構成で）。
【０１２９】
ある実施形態では、この医薬組成物はさらに生物学的分子（たんぱく質、ペプチドなど本明細書に記述の通り）を有する。ある実施形態では、生物学的分子が修飾自己組織化ペプチドに注入の前に事前混合される。ある実施形態では、生物学的分子は滅菌されたシリンジや容器（保存瓶やバイアル等）に保存される。しかしながら、ある実施形態では、生物学的分子とペプチド溶液は別に保存され、注入の直前に生物学的分子とペプチド溶液が混合される（例えば図36Aのような構成で）。
【０１３０】
ある実施形態では、この医薬組成物はさらに細胞を有する。ある実施形態では、細胞が修飾自己組織化ペプチドに注入の前に事前混合される。ある実施形態では、細胞は滅菌されたシリンジや容器（保存瓶やバイアル等）に保存される。しかしながら、ある実施形態では、細胞／細胞懸濁液とペプチド溶液は別に保存され、注入の直前に細胞／細胞懸濁液とペプチド溶液が混合される（例えば図36Bのような構成で）。
【０１３１】
ある実施形態では、この医薬組成物はさらに、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインからなり、相補的で、構造的に適合し、βシートに自己組織化し、巨視的な構造を取る、追加の自己組織化ペプチドを更に有し、追加された自己組織化ペプチドは細胞接着や細胞生存の適合性を低下させるようなアミノ酸を含まない、追加の非修飾自己組織化ペプチド（表1に示されるような）を有する。ある実施形態では、自己組織化ペプチドと追加の自己組織化ペプチドの比が約１：１、5: 1 , 9: 1 , 99: 1である
ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は酸性のｐHである。ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は投与前に近中性のｐHに調整される。ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は投与前に近中性のｐHに調整され、滅菌されたシリンジや容器に保存される。ある実施形態では、ｐHは近中性のｐHに調整液（例えばNaOHのような塩基性溶液）で調整される。
【０１３２】
ある実施形態では、医薬組成物が、ゲル化剤が実質的になく、生体内で自己組織化し、巨視的な構造（ナノファイバーおよび／またはβシート）を形成する。ある実施形態では、そのような医薬組成物が、体液（血液、リンパ液など）との接触で自己組織化する。
【０１３３】
ある実施形態では、医薬組成物が、薬剤に受容される賦形剤を有する。典型的な薬剤に受容される賦形剤は、特定の投与および用量に適応した溶剤、分散溶媒、賦形剤、またはその他の液体、分散補助剤、懸濁補助剤、肥厚剤、乳化剤、保存剤、固体バインダー、潤滑剤など、を含む。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)に医薬組成物を処方するための様々なキャリアと準備方法について開示されている。医薬組成物と相互作用し、任意の望ましくない生物学的効果を起こすような物質またはその誘導体以外の従来のキャリアを除いて、この使用は本発明の範囲である。
【０１３４】
ある実施形態では、薬剤に受容される賦形剤は、少なくとも95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%純粋である。ある実施形態では、賦形剤は、ヒトおよび動物で使用が認可されている。ある実施形態では、賦形剤はUnited States Food and Drug Administrationに認可されている。ある実施形態では、賦形剤は、米国薬局方 (USP), ヨーロッパ薬局方 (EP), イギリス薬局方、国際薬局方の基準を単体で／組み合わせて満たす。
【０１３５】
本明細書で示した医薬組成物は、ヒトに投与するのに適した医薬組成物を指向しているが、熟練した専門家であれば、他の動物への投与へも一般的に適応させることができる。ヒトに投与するのに医薬組成物を他の動物への投与へ適応させる方法はよく理解されており、熟練した獣薬剤師であれば、そのような設計や変更を行なうことは通常である。
【０１３６】
(Hi) マトリクス
上述の通り、本発明は自己組織化ペプチドを含む本発明のマトリクスも提供する。ある実施形態では、マトリクスはゲルかハイドロゲルである。他の実施形態では、マトリクスが３次元である（例えば特定の形状を持つ）
ある実施形態では、マトリクスが更に追加の生物学的分子を有する。ある実施形態では、追加の生物学的分子が正または負の総電荷を有する。他の実施形態では、追加の生物学的分子がたんぱく質またはペプチドである。さらに他の実施形態では、追加の生物学的分子が成長因子か、自己組織化ペプチドである
ある実施形態では、追加の生物学的分子が、自己組織化ペプチドである。ある実施形態では、追加の生物学的分子が、修飾自己組織化ペプチド（表2aに示されたような）である。更に他の実施例では、追加の生物学的分子が、非修飾自己組織化ペプチド（表１に示されたような）である。
【０１３７】
ある実施形態では、追加の生物学的分子が増殖因子である。ある実施形態では、追加の生物学的分子がヘパリン結合増殖因子である。ある実施形態では、追加の生物学的分子がVEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-β, BMPのグループの中から選択される。
【０１３８】
他の実施形態では、追加の生物学的分子がグリコサミノグリカンである。ある実施形態では、そのグリコサミノグリカンが、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である。
【０１３９】
ある実施形態では、複数の細胞がマトリクスの表面に接着、またはマトリクス内部に封入されている。ある実施形態では、細胞が実質的に均質にマトリクス内部に分散している。ある実施形態では、細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、角質細胞、基底細胞、棘突起細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、子宮頸部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞またはそれらの前駆細胞のグループから選択されている。
【０１４０】
ある実施形態では、マトリクスが更に固体物を含む。ある実施形態では、固体物が塩である。ある実施形態では、固体物が無機塩である。ある実施形態では、無機塩がカルシウムおよび／またはリン酸である。他の実施形態では、無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、炭酸カルシウムのグループから選択される。
【０１４１】
ある実施形態では、固体物が、約１００−５００ミクロンの範囲の孔径を有する
他の実施形態では、固体物がブロック状、円柱状、板状、顆粒状である。
【０１４２】
(iv) 本発明のマトリクスの製造法
本明細書で示されるとおり、本発明は本発明のマトリクスの製造法も提供する。例えば、ある実施形態では、(i)自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する, (ii) pHを調整する工程を含むマトリクスの製造法を提供する。ある実施形態では、更に(iii)ゲル化剤を加える工程を含む。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明は、(i)自己組織化ペプチドを水溶液に溶解すること, (ii)ゲル化剤を加えることを含むマトリクスの製造方法を提供する。ある態様においては、当該方法は、更に(iii) pHを調整することを含む。
【０１４４】
ある実施形態では、ゲル化剤が電解質である。ある実施形態では、ゲル化剤が食塩、食塩水、PBS、細胞培養液または生物学的流体（血液、リンパ液など）である。
【０１４５】
ある実施形態では、ｐHは酸性（pHが約２−３の範囲）から塩基性の間に調整されている。ある実施形態では、ｐHが約５−９の範囲に調整されている。ある実施形態では、ｐHが約６−８の範囲に調整されている。ある実施形態では、ｐHが約５−７の範囲に調整されている。ある実施形態では、ｐHが約６−８の範囲に調整されている。ある実施形態では、ｐHが約５．７−５．８の範囲に調整されている。
【０１４６】
(v) 本発明の他の方法
本明細書中に記載されるように、本発明は、本発明の修飾自己組織化ペプチド、および／または自己組織化ペプチド、および／またはその医薬組成物、および／またはそれからなる骨および／または組織の欠損補填材として作られたマトリクスを用いた方法を提供する。「組織」は、何れかの外部または内部の体の組織を含む。組織には、脳、皮膚、肝臓、膵臓、胃、腎臓、消化器、食道、心臓、筋肉、結合組織、軟骨、神経、脂肪、骨髄が例示されるが、これに限定されるものではない。
【０１４７】
更に、本明細書中に記載されるように、本発明は、自己組織化ペプチド、あるいはその医薬組成物、あるいはそれから作られるマトリクスを投与することを含む、細胞の分化および機能的活性を増強する方法を提供する。
【０１４８】
更に、本明細書中に記載されるように、本発明は、自己組織化ペプチド、あるいはその医薬組成物、あるいはそれから作られるマトリクスを、対象の体の部位または体内の部位に導入することを含む、対象を治療する方法を提供する。ある実施形態では、特定の部位とは、部位整形領域である、骨欠損である、骨隣接部である、異所性の骨形成である、虚血領域である、心筋梗塞領域である、末梢血管領域であり、脳梗塞領域である、あるいは皮膚欠損である。
【０１４９】
(vi) キット
本明細書中に記載されたように、本発明は、本発明の自己組織化ペプチド、その医薬組成物またはそれから作られるマトリクスを含むキットを提供する。キットは、通常適切な容器（フォイル、プラスチック、段ボール箱等）に提供される。ある実施形態では、本発明のキットは、本明細書に記載されて様な、一つかそれ以上の薬剤の賦形剤、薬剤の添加剤を含む。ある実施形態では、本発明のキットは、この本発明のマトリクス内に細胞を培養するために適切な投与を行なうための、目盛り付きのカップ、シリンジ、ニードル、洗浄補助具、などを含む。ある実施形態では、本発明のキットは、適切な投与や培養や、および／または適切な投与や培養のための準備の説明書を含む。
【０１５０】
例えば、ある実施形態において本発明は、(a)本発明の自己組織化ペプチド、またはその医薬組成物、またはそれから作られるマトリクス、(b) ペプチドを巨視的な構造への自己組織化を開始するための説明書、(c) 細胞、組織培養培地、あらかじめ定まった量の増殖因子、定まった量のイオンまたは塩、自己組織化ペプチドを細胞培養に準備するための説明書、ペプチドハイドロゲルの上または中で細胞を培養する方法、自己組織化ペプチドを対象に導入する方法の説明書、細胞培養をするための容器、ペプチドを溶解する容器、注射器、ペプチドの自己組織化を始めるためのイオンや塩、一つまたはそれ以上の増殖因子または分化因子、を含む培養キットをを提供する。
【０１５１】
他の実施形態では、細胞を、本発明の自己組織化ペプチド、またはその医薬組成物、またはそれから作られるマトリクス、と接触させ、マトリクスを細胞培養に適した状態で、ある期間維持する、細胞培養方法を提供する。ある実施形態では、細胞が、マトリクスの表面上  および／またはマトリクス内に封入されて培養される。
【０１５２】
例証
下記の実施例は、発明を説明する目的であって、発明の範囲を限定する意図ではなく、また解釈されるべきではない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、様々な改変やさらなる実施例が、実施例や引用された科学・特許文献を含むこの文書の全体から、この分野の専門家にとっては自明である。下記の実施例は、様々な実施形態および同等物においてこの発明の実施に適応できる、重要な追加情報、例証、手引きを含んでいる。
【０１５３】
実施例１  前駆骨芽細胞の増殖と分化への影響
近年高齢化のため、骨の老化および骨折は、患者のQOL（生活の質）および医療費の双方に重要な課題となっている。骨折は、主に骨粗鬆症に由来するが、同時に骨再生の低下によるものである。従って、バイオマテリアルの移植および組織工学的なアプローチによる骨再生の加速は興味をもたれている。また本骨芽細胞の石灰化の活動の促進および前駆骨芽細胞の分化の促進にも関心がもたれている。
【０１５４】
骨再生は表２に示される機能モチーフ(Synpep Corporation製)によって評価された。マウス前駆骨芽細胞  細胞ライン(MC3T3-E1)の増殖と分化への影響について、RAD16-1にモチーフを付加したものと、１型コラーゲンのハイドロゲルをコントロールとして比較された。増殖はDNA量の測定により、分化はアルカリフォスファターゼ（ALP）活性および分泌されたオステオカルチンの測定により評価された。アルカリフォスファターゼは骨分化の早期の分化マーカとして知られている。分泌されたオステオカルチンは後期の骨分化マーカとして知られ、骨石灰化と関係していることが知られている。
【０１５５】
図１は、Grant, G. A. ed.: Synthetic Peptides. A User's Guide, UWBC Biotechnical Resource Series (Burgess, R. R. Series Editor), Oxford University Press (1992) and Atherton, E. and Sheppard, R. C: Solid phase peptide synthesis A practical approach, IRL Press, Oxford (1989)に記載されたFmoc固層合成法によって合成された配列番号4のペプチドの質量分析のデータである。相対信号強度は、定量的ではないがピークに対応するペプチドの量に相関している（表３参照）。このデータはC-末端側に機能モチーフを設けることで、機能モチーフの配列を維持できることを示している。
【表３】
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【０１５６】
典型的には、FmocやtBoc固層合成法といったペプチド合成法では、C-末端側から合成が開始される。ペプチド合成のほとんどの副産物は主に短いペプチドであり、これらが主な不純物の原因である。C-末端側に機能モチーフを設けることによって、自己組織化配列が短くなることはあっても、機能モチーフが短い材料は製造されない。自己組織化配列の１から数個のアミノ酸が欠けてもハイドロゲルとしての機能性には影響しない。それに対し、機能モチーフにおける１から数個のアミノ酸の欠損は、機能の欠損を引き起こす。従って、機能モチーフは、機能性を保証するためには、自己組織化配列に対し、C端末側に設ける必要がある。
【０１５７】
機能モチーフは、自己組織化配列の両側に設けることもできる。これにより、機能モチーフの濃度を増加させることができる。自己組織化配列の末端に設けられた機能モチーフは、同じアミノ酸配列（機能モチーフ）ものを設けることも、異なったアミノ酸配列（機能モチーフ）ものを設けることもできる。２つの異なったペプチドを合成するのに対し、自己組織化配列の両側に異なった１つのペプチドを製造する方が安価である。
【０１５８】
1% RAD16 溶液 はRAD16-1(Puramatrix(TM), 3DM Inc./ BD Bioscience)として購入した。表２に示される機能化ペプチドは水に最終濃度が 1% (w/v)となるように溶解された。機能化ペプチド溶液は1％PuraMatrix溶液と1:1で混合された（表４）。それぞれのペプチド溶液は組織培養用culture insert (10mm diameter, Millicell-CM, Millipore)に導入され、静かに後述の維持培地を溶液の上に導入することによってハイドロゲル化された。 ラット尾から抽出した１型コラーゲンゲル(BD Bioscience)が組織培養用culture insertに導入され、コントロールとされた。
【表４】
2014062102.tif 000007
【０１５９】
細胞培養と評価。MC3T3-E1はATCCより入手した。細胞は維持培地により維持培養された。維持培地として、α-改変最小必須培地（α-MEM、Gibco)に10% ウシ血清（ FCS, gibco）と抗生物質  （penicillin/streptomycin）を添加したものを使用した。培地は３日ごとに交換した。細胞は、2x104 個/wellの密度でハイドロゲル上に播種された。細胞はDay 0 から Day 2 まで維持培地で培養され、その後L-Ascorbic acid （Sigma）50μg/ml と[beta]-glycerophosphate (Sigma)10mMを添加した分化培地に変更された。培地は３日ごとに交換した。ゲル、細胞溶解液、培養培地が14日の培養後回収された。
【０１６０】
細胞増殖は、PicoGreen dsDNA Kits (Molecular Probes).を用いてハイドロゲル中のDNA量から評価した。ALP活性はAlkaline Phosphatase Fluorescence Assay Kit (Sigma)を用いて定量的に計測した。Osteocalcinは細胞培養培地より、Mouse Osteocalcin EIA Kit (Biomedical Technologies Inc., MA) を利用して測定した。
【０１６１】
細胞増殖の結果：DNA計量から算出された細胞数によって、機能化ペプチドをRAD16-1に有するものは、RAD16-1単体または１型コラーゲンに比較して細胞増殖を促進した（図３）
アルカリフォスファターゼ（ALP）活性：機能化ペプチドのALP活性は、コントロール（RAD16-1単体、１型コラーゲン）に比較して同様又はそれ以上に高かった（図４）。この結果は、アルカリフォスファターゼ染色（図５A-５I）によって確認された。図５A-５Iの暗い（青っぽい）範囲が高いALP活性を示している。
【０１６２】
培養培地中のオステオカルチン量：培養培地中のオステオカルチン量は、コントロールに比較して高い濃度であった（図６）。これらの結果からは、機能モチーフを有する自己組織化ペプチドは、前駆骨芽細胞の分化を促進することを示している。機能化自己組織化ペプチドマトリクスは、骨芽細胞の増殖と分化を促進する潜在力を持っている。これらは、骨組織再生および骨代謝研究用のマトリクスとして有用であると考えられる。
【０１６３】
PRGmx、DGRmx、PRFmx は-RGD-接着モチーフを共通に持っている。これは、RGDモチーフが、増殖と分化を促進することを示している。-PRGDSGYRGDS モチーフを有するPRGmx とPRFmxは、他のペプチドに比較して、数倍以上高いオステオカルチン分泌を示している。一つの理由は、-DGRGDSVA YGに対して、RGDが細胞により良く提示されているからである。RGDモチーフが自己組織化ファイバーに近いと、細胞表面とファイバーが干渉して、細胞のインテグリンがRGDに接続されない。
【０１６４】
リンカーの長和の影響を機能化モチーフ（RGD）と自己組織化配列（RADA）との間の距離を可変して評価した（表５−７）。細胞はハイドロゲル上で７日間培養された。細胞増殖は、前述の実験と同様にハイドロゲル内のDNA量を測定して評価した。
【表５】
2014062102.tif 000008
【表６】
2014062102.tif 000009
【表７】
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【０１６５】
この結果を図７に示す。Y軸はDNA量と比例する蛍光強度を示している。これらの結果は、機能モチーフ（RGD）と自己組織化配列（RADA）の間の距離は少なくとも２アミノ基(6.9A)長以上ある必要があることを示している。４アミノ基(6.9A)長以上の距離がより望ましい。他の理由として、PRGDSGYRGDSGは複数のRGDモチーフを有しているため、３次元的な構造の中で細胞のインテグリンがRGDにモチーフにくっつく確率がより増していることがある。
【０１６６】
実施例２  機能化ペプチドの混合比の影響
自己組織化配列ペプチド（例  1％RAD16-1ペプチド溶液）と自己組織化配列（RADA）と機能化モチーフ（RGD）を有する機能化ペプチド(配列番号7)の混合比の影響を評価した（表８−９）。配列番号7は、N-末端に配列番号4と比較して疎水性を増すための追加のグリシンを持っている。配列番号4 と 配列番号7は同様の効果を持つと考えられる。
【表８】
2014062102.tif 000011
【表９】
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【０１６７】
ハイドロゲルは、RADとDSGの混合比が100:0 から 0: 100に変わるように準備された（図８）。細胞はハイドロゲル上で７日間培養された。細胞増殖は、実施例１と同様にハイドロゲル内のDNA量を測定して評価された。
【０１６８】
結果を図８に示す。Y軸はDNA量と比例する蛍光強度を示している。これは混合によって、RAD: DSG が99: 1 から67:33の広い範囲にわたって細胞増殖が増加することを示している。DSG100% ハイドロゲルでの減少は、DSGはRADに比較して低い強度のゲルを生成するため、機械的な特性の違いから生じていると考えられる。
【０１６９】
図９は、異なった機能化ペプチドの濃度で培養された細胞の共焦点顕微鏡の３次元再構築像である。図9A はDSG の割合が 10%、図9B はDSG の割合が70%を示す。図９Aでは、細胞はペプチドマトリクス表面に存在するのに対し、図９B では細胞が３００μmの深さまでマトリクスに進展している。
【０１７０】
実施例３  荷電機能モチーフを用いた３次元培養
前述の自己組織化ペプチドハイドロゲルは、細胞に対し、コラーゲンと同様の３次元的な生育のための人工的な細胞外マトリクス環境（ECM）を提供する。細胞を３次元的に播種する場合、粘性溶液の状態を維持するために、自己組織化ペプチド溶液は、低いｐH （通常２−３）で保存する必要がある。しかし、生きている細胞を低いｐH溶液に長い間混合することは、細胞の生存に大きな影響を与える(多くのヒト細胞はｐH2-3の環境では数分しか生きられない)。そこで、低いpH にある自己組織化ペプチド溶液と細胞を混合する場合、(1)細胞を播種したら、(2)直ちにｐH を近中性(pH5-8)または塩基性にする。
【０１７１】
図10は、RAD 16-1 1%溶液に0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータを示す。pH 3.6の時に、粘性の液体がゲル化し、高いG' (硬さ), G" (粘性)を示す。pHが増加すると、ゲルは粉々になり、ペプチドの沈殿を含む溶液になる。低いpHではペプチドはファイバーを形成して、ファイバーが溶液を粘性にする。pHが高くなり、等電位点に近づくとペプチドは電荷を失い、集合してゲルを構成する。同様のゲル形成が、塩を含んだ溶液(ゲル生成液や等張液)によりペプチドの電荷が隠蔽された場合にも起きる。一度ゲル形成すると、ファイバー構造が壊れると粉々になり、沈殿物を生じる。
【０１７２】
自己組織化ペプチドは、-RADA- や -KLDL-のように、[正電荷][疎水性][負電荷][疎水性]という繰り返し配列で構成され、等電位点は7（中性）に近く、細胞増殖を支持することで知られている。自己組織化ペプチドは、pHの観点では同様の振る舞いをする（例えば、ｐHが等電位点に近づくとペプチドファイバーの電荷を失い、ゲルを構成する）。例えば、-XBBXBX- や -XBBBXXBX-といったヘパリン結合コンセンサス配列は、両方とも高度に正電荷を帯びている。Xは電荷がないか疎水性、Bは正電荷のアミノ酸を示す。図１１は、自己組織化ペプチドAC(RADA)4GGFHRRIKA-CONH2 (SEQ6)（表１０）の構造を示す。黒は、正電荷のアミノ酸を示し、灰色は負電荷のアミノ酸を示す。
【表１０】
2014062102.tif 000013
【０１７３】
自己組織化配列にヘパリン結合モチーフを有する1 % Ac(RADA)4GGFHRRIKA CONH2 (配列番号6) 溶液(コード: FHR)が比較された。図12は、FHR溶液にｐH 調整のため、0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータを示す。ペプチド分子の総電荷はpH<10では2より大きくなっている。ｐH 5.7まで溶液は粘液状態を維持する。このゲル化ｐH の移動、自己組織化ペプチドの追加モチーフにより導入された電荷によるものである。導入された電荷が、ペプチドが集合してゲル化するのを妨げている。従って、細胞とペプチド溶液をより中性に近いｐH で混合することができる。完全な混合の後、塩を含んだ溶液(ゲル生成液や等張液)によりゲル化させることができる。
【０１７４】
ゲル化ｐHを中性域でのペプチド電荷の変更により行なうことは、重要である。なぜならば、もともとの自己組織化配列の自己組織化能と生物学的特性を失わずにできるからである。
【０１７５】
正電荷自己組織化ペプチドは、蒸留水に溶解できる。ｐHの調整(例えば、NaOHのような塩基性溶液を利用して)は、ペプチド溶液をゾル状態に維持できる(例えば、FHRペプチドではpH=5.7で)この場合、ｐH を安定化するための高濃度緩衝液の使用は避けるべきである。なぜならば緩衝塩の許容濃度以上の濃度は、ハイドロゲル生成を起こすからである(Caplan 2000, Caplan 2002a)。
【０１７６】
３次元培養の場合、塩分のない等張液に懸濁された細胞は、pH調整されたペプチド溶液と混合できる。塩を含んだ溶液(ゲル生成液や等張液)を加えることで、細胞を含んだハイドロゲルを生成することができる。
【０１７７】
インビボ（生体内）での使用の場合、pH調整されたペプチド溶液は、細胞を含んだ溶液・懸濁液(例えば、幹細胞懸濁液、脂肪由来細胞懸濁液、骨髄細胞懸濁液)と混合することができる。ペプチド溶液は、細胞混合懸濁液や血液やリンパ液などの体液と接触することで、ハイドロゲルを生成できる。ペプチド溶液は、細胞懸濁液入りまたは無しで導入することができる。生体への導入時に、細胞は周辺の組織や血液から遊走されたり、また遊走したりする。
【０１７８】
3次元培養実験：実施例１に示されたのと同じプロトコルでMC3T3-E1細胞を得、播種した。細胞は遠心濃縮され、スクロース溶液(10%)に4x106 cells/mlの濃度で混合された。FHRペプチドは水に溶解され1.0%溶液を得た。1 % RAD 16-1 溶液は、RAD 16-1 (Puramatrix(TM), 3DM Inc./ BD Bioscience)として入手した。FHRペプチド溶液のpHはNaOH溶液により（例えば、細胞がより中性域で混合できるように）ｐH5.7に調整された。細胞溶液とペプチド溶液(FHR / RAD16-I)は、1:5で混合された。混合溶液はインサートに導入され、細胞培養培地がインサートに加えられ、ハイドロゲルを生成した。細胞は、維持培地（本文中に記載）で維持された。
【０１７９】
細胞の蛍光観察：  14日の培養後、インサートはPBSにより洗浄され、Calcein AM 溶液(4uM, Invitrogen)により染色された。この染色液は480nmの光で励起した際に、生細胞を緑の蛍光で染色する。
【０１８０】
インサート内のRAD 16-1 と FHRハイドロゲルを共焦点顕微鏡で観察した。図１３A-13Dは、蛍光像の３次元的再構築像を示す。明るい領域が細胞を示す。このデータは、FHRペプチドがRAD 16-1に比較して、より３次元的な細胞増殖を促進することを示している。図14-16A/Bに定量的な細胞増殖および分化への影響の測定結果を示す。分析手法は、ハイドロゲル生成に1%FHRペプチド溶液が用いられている以外実施例１と同じである。
【０１８１】
このペプチドマトリクスは、ペプチドファイバーが中性域で正に荷電しているため、３次元および２次元の細胞増殖を促進している。細胞は負に帯電しているため、細胞は正電荷のファイバーに吸着される。従って、このような影響はポリリジンのような他の正電荷の配列についても生じる可能性がある。
【０１８２】
図14-16A/Bは、図３−４と比較してFHRは更に前駆骨芽細胞の分化を促進する機能を持っていることを示している。しかし、図17と図6を比較すると、FHRの細胞分化の促進への影響はRGD配列を持っているPRGmxや PRFmxと比較すると強くない。
【０１８３】
図18は、PFS 1 %溶液に0.1 N NaOH溶液を加えた時の等電位図と対応するレオロジーデータを示す。1 % Ac(RADA)4GGSKPPGTSS-CONH2 溶液 (コード: SKP, ペプチド配列 配列番号7)は、自己組織化配列と正電荷の機能モチーフで構成されるハイドロゲルである。等電位点は9.74でありｐH 7 近傍まで正電荷を保つが、ゲルはｐH 4.5 で生成する。これは、pH近傍での総電荷は＋１であり、AC(RADA)4GGFHRRIKA CONH2 (FHR)の３以上に対し、小さいためと考えられる。ペプチドの総電荷は、細胞混合時に２以上である必要がある。混合時のｐH は細胞への障害を最小化するためには6-8である必要がある。
【０１８４】
この配列は、ヘパリン結合配列であるため、ファイバーは細胞表面に多量に存在するヘパリン様分子に結合できる。ヘパリン結合モチーフは、細胞への特徴的な碇となる。この結合は、実施例１に示したような、他の結合モチーフ（RGDなど）と相乗的に、細胞増殖や分化のための生物学的刺激として働く。この効果は、前述の配列に限定されず、- XBBXBX-や -XBBBXXBX- 配列を含む他のモチーフでも働く。
【０１８５】
実施例４  自己組織化ペプチドを用いたたんぱく質の保持およびデリバリー
前述のヘパリン結合モチーフを有する自己組織化ペプチドは、組織工学あるいは他の治療目的に対し、成長因子および、あるいはまた治療に用いられるたんぱく質の維持および、あるいはデリバリーに有用である。VEGF、FGF類、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPはヘパリンおよびヘパラン硫酸に吸着されることが知られている。ヘパリンまたはヘパラン硫酸とヘパリン結合ペプチド溶液と成長因子が混合された時、ペプチドはヘパリンまたはヘパラン硫酸に結合し、ヘパリンまたはヘパラン硫酸は成長因子と結合する。このようにして、成長因子はペプチドマトリクス中で長期間保持され、細胞を継続的に刺激し、ペプチドマトリクスの分解と共にゆっくりと放出される。例えば、ペプチドマトリクスが生体に移植され、生体に存在するヘパリンと成長因子が、移植されたマトリクスに供給されうる。
【０１８６】
自己組織化ペプチドに正電荷または負電荷のモチーフを付加することは、組織工学あるいは他の治療目的に対し、成長因子および、あるいはまた治療に用いられるたんぱく質の維持および、あるいはデリバリーに有用である。VEGF、FGF類、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPは電気的極性を有し、増殖因子およびペプチドマトリクスの局所的な電荷の分布に応じて正電荷または負電荷のマトリクスに結合性を持つ。Ac(RADA)4- GGDGRGDSVAYG-CONH2 (配列番号9)はそのようなペプチドの例の一つである。配列番号9自身、細胞結合機能を有している。自己組織化配列に正電荷または負電荷のモチーフを付加することで、元の自己組織化ペプチドの機能を維持しながら、たんぱく質の保持と生物学的な機能を同時に導入することができる。
【０１８７】
他の可能性は、電荷を有する自己組織化ペプチドを用いることである。Ac(FKFQ)3-CONH2 (配列番号51 )は正電荷を有する分子で、同時に自己組織化能を有する。この方法は単純であるが、自己組織化配列そのものを変えるため、自己組織化ペプチドそのものの特性も変わってしまうことを避けられない。
【０１８８】
自己組織化ペプチドを用いたたんぱく質保持とデリバリーへの影響を検討した（表１１）。bFGFをモデルたんぱく質として用いた。異なった電荷状態を持つペプチドマトリクスのbFGFの保持はPBSで洗い流した後ELISAにより測定された。未結合のbFGFを洗い流した後、自己組織化ペプチドマトリクスに保持されたたんぱく質の保持の影響はHUVEC(ヒト臍帯静脈上皮細胞)の培養により評価された。
【表１１】
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【０１８９】
電荷状況の異なるペプチドマトリクスは、表１２のように選定された。RAD 16-1は中性電荷の自己組織化配列である。配列番号5は、中性電荷の自己組織化配列を有するが、負電荷の細胞結合配列(-DGRGDSVAYG-)がリンカー配列を用いて結合されている。配列番号6は、中性電荷の自己組織化配列を有するが、正電荷のヘパリン結合配列(-FHRRIKA-)がリンカー配列を用いて結合されている。配列番号51は、正電荷の自己組織化配列からなる。
【表１２】
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【０１９０】
表１２に示されたペプチド溶液が、培養インサート(10mm diameter, Millicell-CM, Millipore)に導入し、PBSによりゲル化された。ゲル化後175ngのbFGFが溶解したPBSをインサートの内外にペプチドマトリクス上に添加し、一晩留置する。PBSでゲルを３回（２時間、９時間、１２時間）吸着されなかったbFGFを洗い流した。その後、PBSを細胞培養維持培地（EGM-2-MV(Camblex)から添付されているbFGFやVEGFなどの増殖因子を除いたもの）に交換し、一日以上留置後、HUVECを7.5x10^4 個 インサートに播種し、３日間培養した。
【０１９１】
ネガティブコントロールとして、bFGFを吸着させず、EGM-2-MV（Camblex)から添付されているbFGFやVEGFなどの増殖因子を除いた培地で培養したものを用意した。ポジティブコントロールとし、bFGFを吸着させず、EGM-2-MV（Camblex)に付されているbFGFやVEGFなどの増殖因子を加えたものを用意した。洗浄緩衝液（PBS）および細胞培養培地(EGM-2-MV)中のbFGF濃度がELISAにより測定された。洗浄緩衝液および細胞培養培地は、それぞれの測定時（洗浄時：２時間、９時間、１２時間、細胞播種時(DO), 培養１日後(Dl ), ２日後(D2) 、３日後(D3)）成長因子の保持率は、測定されたｂFGF量を積算することで算出された。
【０１９２】
結果を図19に示す。保持率は、KFQ-2P, FHR-2P, RAD-2P 、DGR-2Pの順で高い。ハイドロゲルの電荷特性に対応して、たんぱく質の保持・放出プロファイルが異なっている。KFQ-2P と FHR-2P は正電荷で、DGR-2Pは負電荷である。bFGFは正電荷の分子であるが、電荷分布は図20のように局所的になっている。従って、正電荷のマトリクスが正電荷のたんぱく質を吸引することはありうる。たんぱく質の放出率を上げることは、保持率を下げることと等価である。たんぱく質放出率もペプチドマトリクスの分子内電荷分布により制御可能である。
【０１９３】
図20は、ｂFGFの分子内電荷分布を示す。これらの結果から、たんぱく質の保持および放出プロファイルが、ペプチドマトリクスの電荷特性を変化することで制御可能であることを示している。このプロファイルは、たんぱく質およびペプチドマトリクスファイバーの分子内電荷分布といった、局所的な分子のアフィニティによって制御される。
【０１９４】
図２１は、ペプチドマトリクスRAD-2P と DGR-2P上で３日間培養した細胞の蛍光顕微鏡像である。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。2日目まで細胞はbFGFを吸着させたものおよびポジティブコントロール（増殖因子が添加された培地で培養したもの）では、ペプチドマトリクス上で維持されていた（図示無し）。しかし細胞接着と細胞の広がりは、RAD-2PとDGR-2Pの両方で、ネガティブコントロールは勿論、ポジティブコントロールよりも優れていた。これは、マトリクスへの増殖因子の吸着がマトリクスへの細胞接着の維持に有効であることを示している。またこれはペプチドマトリクスへの成長因子の保持または固定化が液相で提供されるよりも効果が高いことを示唆している。
【０１９５】
ペプチドマトリクスに成長因子を取り込ませる方法は、前述以外の方法もある。図22は、bFGFをペプチド溶液に混合したのちゲル化させた場合を示す。この場合、ゲル化した後にｂFGFを取り込ませた場合（例：図19）に比較し、非常に高い保持率を維持しており、同時にbFGFの放出率は小さくなっている。
【０１９６】
実施例５  機能化ペプチドのインビボ（生体内）アプリケーション
機能化ペプチドマトリクスの骨新生に対する効果の予備的なIn vivoの評価実験をラットで行なった。６週令の押すラットを評価に用いた（各条件につき、２つずつの試料を用意した）。
【０１９７】
ラット頭骸骨に左右対称に２箇所4mmの欠損部を設け、欠損部にそれぞれ下記の材料を充填した。欠損部に表１３のハイドロゲルを充填した。またコントロールとして、何も材料を設けない欠損部を設けた。ベータ三リン酸カルシウム（βTCP）は、合成の人工骨で比較対象として用いられた（図23Bに示されるように、βTCPは、頭骸骨の右側に移植された（白い顆粒））
【表１３】
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【０１９８】
ペプチド溶液は欠損部に細胞無しで注入された。ペプチド溶液は、欠損部に存在する体液（血液・リンパ液など）に含まれる塩によって直ちにゲル化した
骨新生量の評価：各グループのラットは、２週間後および４週間後に、X線像を撮像後、頭骸骨を回収・固定した。脱灰、パラフィン包埋後、HE染色を行ない、獣病理医に欠損部内の組織の病理学的形態によって評価を依頼した。骨再生の程度は、１：80％以上、２：50％以上、３：X線上で再生弱  とスコア化した。
【０１９９】
２週間後の結果（表１４および図23A-23C)からは、ALKmxとPRGmxは初期のステージで骨再生を促進することが示唆された(図23A-23Cは２週間後の頭骸骨のX線像を示す)。４週間後の結果（表15）からは、ペプチドマトリクスは骨再生を促進することが示唆された。これらの結果から、RAD16-IおよびSEQ3、SEQ4または SEQ5を混合したものは骨再生を促進する骨補填材として使用することができることが示唆される。
【表１４】
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【表１５】
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【０２００】
ペプチドハイドロゲルは、ベータ三リン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトといった人工骨と組み合わせて用いることができる。ベータ三リン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトといった人工骨は、骨芽細胞が機能するための機械的に安定的な空間である空孔を提供することで骨再生を支持している。それらの空孔構造は60％以上の空孔率を有し、孔の直径が100-500μmである。空孔のそれぞれが連通して細胞と血管の進展を可能にしている。人工骨の形状は数cmのプロックであったり、数cmの円筒形であったり、数cmのプレートであったり、数mmの顆粒であったりする。形状は、術者により、移植時に欠損部のサイズに応じて容易に適合させることができる。
【０２０１】
それらはまた、骨再生のためのカルシウムの源泉でもある。ペプチドハイドロゲルと人工骨の混合によって、骨芽細胞の生物学的および機械的両方の支持を提供することで、骨再生を促進する可能性がある。
【０２０２】
しかし中性域において、ゼロまたは弱い電荷しか持たないペプチドからなるペプチド溶液は、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトといった塩基性塩と混合することはできない。これは、ゼロまたは弱い電荷しか持たないペプチド分子は、溶液のpHが強酸性である場合にのみ溶解するからである。このような酸性状態では、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトといった塩基性塩はペプチド溶液に溶解してしまい、固体を維持できない。ペプチド溶液のｐHを増すと、ペプチド溶液は脆弱なハイドロゲルになってしまい、人工骨との統合ができなくなる。
【０２０３】
実施例３で記述したように、FHR (SEQ6)のような正電荷のペプチド溶液は、ハイドロゲルになることなく、中性に近いｐH に調整することができる。これにより、ペプチド溶液とリン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトといった空孔性の塩基性塩と混合することができる。ペプチド溶液は低粘度溶液なので、空孔に侵入することができる。ペプチドが塩溶液（培養培地や血液などの体液）の影響で自己組織化した場合、ペプチドハイドロゲルと空孔を持つマトリクスが良く統合される。
【０２０４】
同様の効果が他のペプチド配列、例えば配列番号51 (表16)でも得られる。配列番号51は中性ｐH 域で正電荷を持ち、FKFは中性ｐH 域で液相を保つ(Caplan 2002a)。FKFとリン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトといった空孔性の塩基性塩と混合は可能である。塩溶液を添加することでハイドロゲルを生成できる（表17）。FKFは、ハイドロゲルとなった時に、前駆骨芽細胞の増殖を支持する。正電荷の自己組織化ペプチド配列からなるハイドロゲルは、実施例３に示されたようにたんぱく質の保持に有益である。ペプチドが異なった電荷を持つ場合にも、正電荷のペプチドの量が多ければ、電荷を有するペプチド溶液の特性を保つ。従ってペプチドと人工骨の混合物も機能化ペプチドによって機能化可能である。
【表１６】
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【表１７】
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【０２０５】
実施例６  血管新生と脈管化のための機能化ペプチドマトリクス
血管新生と脈管化を促進することは、心筋梗塞、末梢血管障害、脳梗塞などの虚血障害の治療に莫大な可能性を持っている。血管新生と脈管化は、創傷治癒や骨再生といった組織再生においても重要な役割を担っている。また、皮膚、肝臓、膵臓、骨、筋肉などの３次元的な組織の構築にも重要である。血管構造を構成する、血管内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、繊維芽細胞などに適切な微小環境を提供することで、血管新生と脈管化を促進するマトリクスを開発することは重要である。
【０２０６】
いくつかの機能モチーフが血管新生を促進するとして知られている。例えば、チモシンのアクチン結合部位であるβ4 (-LKKTETQ-)は、血管内皮細胞の遊走および接着、脈管形成、動脈管芽形成、血管新生を促進する(Huff et al., FASEB Journal (2003) 17:2103-2105)。ヒト血清のフィブロネクチンのIII-CSドメイン(-REDV-)は、血管内皮細胞の接着と進展を支持する(Shin et al., Biomaterials (2003) 24:4353-4364; Welsh et al., Biomaterials (2000) 1 :23-30)。VEGFVEGF結合インターフェース(-KLTWQELYQLKYKGI-)はVEGF のへリックス領域17-25 を模擬したもので、内皮細胞を増殖させVEGF 依存の細胞シグナル経路を活性化し、インビトロで脈管形成を促進する(D'Andrea et al., PNAS (2005) 102: 14215-14220)。
【０２０７】
機能化ペプチドマトリクスのHUVEC(ヒト臍帯静脈上皮細胞)への影響がゲル上の２次元的培養で評価された。実験に用いられた自己組織化ペプチドを表18に示す。
【表１８】
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【０２０８】
表１９に示されたペプチド溶液が、培養インサート(10mm diameter, Millicell-CM, Millipore)に導入し、細胞培養培地(EGM-2-MV, Camblex)によりゲル化された。１型コラーゲンおよびマトリゲルがコントロールとして用いられた。HUVEC(ヒト臍帯静脈上皮細胞) を8x10^4 個 インサートに播種し、７日間培養した。
【表１９】
2014062102.tif 000022
【０２０９】
図24A-24Mは、ハイドロゲル上でHUVECを２日間培養した蛍光共焦点顕微鏡像である。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。コラーゲン、マトリゲル、PRGmx、KLTmx、FHRmx、PFSmxはRADと比較して高い細胞接着性を示す。マトリゲル上では、HUVECは、脈管形成能と対応すると考えられる、脈管状構造を示す。KLTmx上では、細胞はマトリゲルと類似の脈管状構造を示す
結果を表20と図25に要約する。表19のハイドロゲルの内、選択されたものについて、３日培養後のウエル内のDNA量が評価された。DNA量は細胞数と比例している。図25は、コラーゲン、PRGmx と KLTmxゲルがRADに対し、統計的に高いDNA量が得られている。これらの結果は、元の自己組織化配列に結合された機能モチーフに依存して、機能化ペプチドマトリクスは非機能化ペプチドマトリクスよりも優位な血管内皮細胞接着性を有し、コラーゲンやマトリゲルといった天然由来のマトリクスと細胞形態において類似の機能を有することを示している。
【表２０】
2014062102.tif 000023
【０２１０】
血管内皮細胞のハイドロゲルに対する遊走の効果が評価された。血管内皮細胞の遊走は、マトリクス中への血管の成長に重要である。HUVEC(ヒト臍帯静脈上皮細胞)が、コラーゲンコートされたデクストランビーズ(Cytodex3, microcarrier beads, Sigma)に播種され、表19に示される異なったハイドロゲルに移植された。
【０２１１】
図26A-26Fは、ペプチドマトリクス上のビーズの１日後および２日後の蛍光顕微鏡像である。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。白いバーが100μmを示す。１日後ではほとんどの細胞がビーズ上にある。２日後では、RADに比較し、コラーゲンおよびPRGmx、KLTmxゲルでは細胞はビーズから良く遊走している。マトリゲル上では、ハイドロゲルに遊走する細胞は非常に少ない。
【０２１２】
図27は、２日後にビーズから遊走した細胞の数を示す。細胞数は蛍光顕微鏡像で数えた。前述の観察結果はグラフ上でも確認できた。
【０２１３】
3次元培養実験：HUVECがスクロース溶液(10%)に懸濁され、ペプチド溶液と混合された。細胞懸濁ペプチド溶液はインサート(10mm diameter, Millicell-CM, Millipore)に導入され、直ちに細胞培養培地(EGM-2-MV, Camblex)によりゲル形成された。ウェルに播種された細胞数は、1x105 cells/wellであった。図28は、播種から２日後の蛍光共焦点顕微鏡像である。緑は生細胞を、赤は死細胞の核を示す。これらの像は、ハイドロゲル中での高い細胞生存率を示す。PRGmx と KLTmxは細胞が進展した形態を示すが、これは細胞接着が良いことを示す。
【０２１４】
VEGF (20 ng/ml)が細胞培養培地に添加され、細胞は７日間培養された。蛍光共焦点顕微鏡により、PRGmxでは３次元的な脈管構造が観察された。図29A-29Bは再構築像を示す。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。図29Aは脈管内の空隙（矢印）を示す。図29Bは図29Aの点線部の断面を示す。脈管内の空隙は断面像でも示されている（点線で示される円）
血管新生のインビボ（生体内）の実験を絨毛尿膜（CAM）を用いて行なった。有精卵の８日の孵卵後、直径10mm厚み1mmのハイドロゲルを鶏卵の絨毛尿膜に移植した。ハイドロゲルは表19から選択され、ゲルは移植前に作成された。12日目に、CAMは病理分析のために回収された。ハイドロゲル内部およびハイドロゲル下部の血管新生が病理断層像により評価された。
【０２１５】
図30A-30Gは、異なったハイドロゲルを乗せて孵卵した絨毛尿膜（CAM）の病理像を示す。RAD (図30A-B), PRGmx (図30E) 、コラーゲン(図30F)は、ハイドロゲルの内部および下部に血管新生を認めない。一方KLTmx (図30C-D) とマトリゲル(図30G)は、ゲル中の結合組織内部への血管新生を認める（黒矢印）。KLTmxでは、ゲルと絨毛尿膜との境界にも血管新生を認める（黒矢印）。
【０２１６】
実施例７  様々な自己組織化配列での機能化ペプチド
前述の実施例ではRAD16-1 ((RADA)4)が、自己組織化の基本構成ブロックとして用いられていた。基本となる自己組織化配列の変更により、ハイドロゲルの特性が制御できる。(IEIK)2は８つのアミノ酸からなる短い配列であるが、(RADA)4に比較して硬いゲルを生成する。それは、イソロイシン（I）がアラニン（A）よりもフレキシブルでないためである。更に硬いゲルが、自己組織化配列の繰り返しを(IEIK)3, (IEIK)4と伸ばすことによって得られる。
【０２１７】
前述の通り、(FKFQ)3は中性pH域で正電荷を持ち、中性pH域で溶液を保つ。
【０２１８】
(IEIK)2 と (FKFQ)3に基づく機能化ペプチドが表21に示されるように合成された。表21のペプチドから生じるハイドロゲルを表22に示す。溶液は、機能化ペプチドまたは、機能化ペプチドと塩基性の繰り返し配列(配列番号54 または 配列番号55)を混合したものである。
【表２１】
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【表２２】
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【０２１９】
全ての(FKFQ)3を基本とするペプチド溶液(FKF, KPRG, KPRGmx and KFHRmx)は中性域pHからpH８まで溶液を維持した。この特性は、細胞や、三リン酸カルシウムのような塩基性物質や、酸に敏感な薬剤（例えばたんぱく質や成長因子など）をペプチドハイドロゲルに導入する際に有用である。
【０２２０】
ハイドロゲルに対する細胞接着と細胞生存性をHUVEC(ヒト臍帯静脈上皮細胞)を用いて評価した。表２２に示されるペプチド溶液が細胞培養インサート(10 mm diameter, Millicell-CM, Millipore)に導入され、細胞培養培地(EGM-2-MV, Camblex)によりゲル化された。HUVECは8x104 個 インサートに播種され、３日間培養した。
【０２２１】
図31A-31Kは、HUVECの蛍光顕微鏡像を示す。緑は細胞核を、赤はアクチンファイバーを示す。
【０２２２】
基本の自己組織化ペプチドハイドロゲル（EIK とFKF)に比較して、繰り返しRGD接着配列を持つハイドロゲルはより高い細胞接着性を有する。この結果を表23に要約する。この結果は実施例５の表20に類似する。これは、ハイドロゲルの特性は、基本的な繰り返し配列を構成するアミノ酸や長さを変えることで制御できる一方で、基本的な繰り返し配列に関わらず、自己組織化ペプチドの機能化は有用であることを示唆している。
【表２３】
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【０２２３】
実施例８  幹細胞を支持するための機能化ペプチドマトリクス
現在、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）、脂肪由来幹細胞（ADSC）などが細胞治療のために臨床研究が進んでいる。幹細胞治療において、細胞が移植組織の微小環境に定着するまで、細胞およびそのバイアビリティを維持することが第一に重要である。幹細胞治療においては細胞のバイアビリティを維持するのみならず、幹細胞の性質を維持することも重要である。例えば、骨再生や軟骨再生では、骨芽細胞や軟骨細胞への分化能を維持する必要がある。
【０２２４】
一方、心筋梗塞や、末梢血管閉塞、脳梗塞など、虚血性疾患に対する幹細胞治療では、抗アポトーシスや血管新生を促進する増殖因子などのサイトカインの分泌能を維持するために、幹細胞性を維持することが重要である。
【０２２５】
幹細胞の生存、分化能、および幹細胞性を維持するために、細胞治療において、一時的に幹細胞を維持するための微小環境を提供することが重要である。機能化ペプチドマトリクスは、幹細胞と混合し損傷組織に注入することが容易に行え、この目的に適していると考えられる。繰り返しRGD細胞接着配列、ヘパリン結合モチーフ、骨髄細胞接着モチーフは、これまでの骨芽細胞および血管内皮細胞など様々な細胞の生存の維持に有効であることが示されている。ラミニンは基底膜の主要構成成分で、幹細胞維持に重要であると考えられる。IKVAV (SEQ20に含まれる)と IKLLS  (SEQ21に含まれる)は、ラミニン中の細胞接着モチーフとして知られている。これらのモチーフは、すい臓β細胞の生存の維持、アポトーシスの抑制、インシュリンの分泌の促進に有用である(Laney et al., Biomaterials (2007) 28:3004-301 1)。
【０２２６】
脂肪由来幹細胞（ADSC)を機能化ペプチドマトリクス(表24)内で３次元培養し、機能化自己組織化ペプチドマトリクスの細胞維持能の評価を行った。ADSCは10%スクロース溶液に懸濁され、表25から選択されたペプチド溶液と混合された。細胞懸濁ペプチド溶液は、細胞培養インサート (直径10mm、 Millicell-CM, Millipore)に導入され、細胞培養培地によって直ちにゲルを形成された。ADSCは各ウエル4x104 個播種された。
【表２４】
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【表２５】
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【０２２７】
表25で示されたペプチド溶液は、、細胞培養インサート (直径10mm、 Millicell-CM, Millipore)に導入され、培養培地(DMEM-F12+10%FBS, Gibco)によってゲルを形成された。ADSCは各ウエル4x104 個播種され、７日間培養された。
【０２２８】
図32A-32Eは、７日間培養後の、蛍光共焦点顕微鏡の再構築拡張合焦像である。上段は、水平面の像、下段は対応する縦方向の断層像である。緑は細胞核、アクチンファイバーを赤で示す。細胞はマトリクスの上面に播種したにもかかわらず、細胞はマトリクス内によく遊走している。
【０２２９】
図33は細胞の密度を示す。細胞密度は初期播種密度より増している（破線で示す）。これはADSCがマトリクス上と内部で増殖していることを示している。
【０２３０】
図３４はペプチドマトリクス内への細胞の進達深度を示す。細胞は特にPRGmxハイドロゲルで深く遊走している。RADmxおよびFHRmxではPRGmxに対し進達深さは浅いが、深くに進展している細胞数の割合は多い。これらの結果は、自己組織化ペプチドマトリクスおよび機能化ペプチドマトリクスが、間葉系幹細胞の細胞生存を維持するのに有効な潜在性を示している。
【０２３１】
培養培地中に分泌された成長因子をELISA法を用いて評価した(図35A-35B)。幹細胞により分泌された増殖因子は、アポトーシスを抑制し、血管新生を促進することで、細胞治療の主な要因と考えられている。特にHGFとVEGFはアポトーシス抑制と、血管新生に主要な因子と考えられている。コントロールとして通常の培養プレートで増殖したものを示す（コード：TCPにしめす）。FHRmx と RADにおいて、培養１日目から７日目に渡って、大幅なHGFの分泌の促進が見られた。VEGFについては、１日目の培養培地では全てのペプチドマトリクスでVEGF分泌の増加が見られた。
【０２３２】
他の実施例
前述は、本発明の特定の好ましいが限定されない実施形態の記述である。下記の請求項で定義されるとおり、本発明の精神と範囲を超えない範囲で、この分野の通常のスキルのものであれば、さまざまな変更を加えることができることが理解できる。
【図１Ａ】
2014062102.tif 000029
【図１Ｂ】
2014062102.tif 000030
【図１Ｃ】
2014062102.tif 000031
【図１Ｄ】
2014062102.tif 000032
【図２】
2014062102.tif 000033
【図３】
2014062102.tif 000034
【図４】
2014062102.tif 000035
【図５Ａ−Ｉ】
2014062102.tif 000036
【図６】
2014062102.tif 000037
【図７】
2014062102.tif 000038
【図８】
2014062102.tif 000039
【図９Ａ−Ｂ】
2014062102.tif 000040
【図１０】
2014062102.tif 000041
【図１１】
2014062102.tif 000042
【図１２】
2014062102.tif 000043
【図１３Ａ−Ｄ】
2014062102.tif 000044
【図１４】
2014062102.tif 000045
【図１５】
2014062102.tif 000046
【図１６Ａ−Ｂ】
2014062102.tif 000047
【図１７】
2014062102.tif 000048
【図１８】
2014062102.tif 000049
【図１９】
2014062102.tif 000050
【図２０】
2014062102.tif 000051
【図２１Ａ−Ｆ】
2014062102.tif 000052
【図２２】
2014062102.tif 000053
【図２３Ａ−Ｃ】
2014062102.tif 000054
【図２４Ａ−Ｍ】
2014062102.tif 000055
【図２５】
2014062102.tif 000056
【図２６Ａ−Ｆ】
2014062102.tif 000057
【図２７】
2014062102.tif 000058
【図２８Ａ−Ｃ】
2014062102.tif 000059
【図２９Ａ−Ｂ】
2014062102.tif 000060
【図３０Ａ】
2014062102.tif 000061
【図３０Ｂ】
2014062102.tif 000062
【図３０Ｃ】
2014062102.tif 000063
【図３０Ｄ】
2014062102.tif 000064
【図３０Ｅ】
2014062102.tif 000065
【図３０Ｆ】
2014062102.tif 000066
【図３０Ｇ】
2014062102.tif 000067
【図３１Ａ−Ｋ】
2014062102.tif 000068
【図３２Ａ−Ｆ】
2014062102.tif 000069
【図３２Ｇ−Ｊ】
2014062102.tif 000070
【図３３】
2014062102.tif 000071
【図３４】
2014062102.tif 000072
【図３５Ａ−Ｂ】
2014062102.tif 000073
【図３６Ａ−Ｂ】
2014062102.tif 000074
【配列表】
2014062102000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月5日(2013.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインであって、アミノ酸配列 -FKFQ-（配列番号69）を少なくとも２回含む第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第２のアミノ酸ドメインと
を含み、
前記最小の生物学的に活性のある配列が、-PFSSTKT-（配列番号57）、-SKPPGTSS-（配列番号60）、-PRGDSGYRGD-（配列番号54）、-DGRGDSVAYG-（配列番号55）、-ALKRQGRTLYGF-（配列番号56）、-FLGFPT-（配列番号58）、-KLTWQELYQLKYKGI-（配列番号59）、-STFTKSP-（配列番号61）、-IKVAV-（配列番号62）、-FHRRIKA-（配列番号63）、-IKLLI-（配列番号64）、-REDV-（配列番号65）、および-LKKTETQ-（配列番号66）からなる群より選択される、自己組織化ペプチド。
【請求項２】
第２のアミノ酸ドメインが少なくとも２つの最小の生物学的に活性のある配列を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
第２のアミノ酸ドメインが単体で生物学的に活性を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合または非共有結合で接続されている請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合ペプチド結合またはアミノ酸リンカー基により共有結合性に接続されている請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
当該アミノ酸リンカー基が少なくとも一つのグリシン、好ましくは３つのグリシンを含む請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(6.9オングストローム)である請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも４アミノ酸長(13.8オングストローム)である請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
第一のアミノ酸ドメインが、アミノ酸配列 n-FKFQFKFQFKFQ-c（配列番号51）を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
第２のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF、 FGFs、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPからなる群より選択される請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
手術、外傷、腫瘍、または変性疾患から生じる傷害を治療する際に使用するための、請求項１〜１１の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記傷害が、血管組織、脳、神経組織、食道、ファローピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、骨、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、子宮または皮膚に対するものである請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
幹細胞の生存、分化能、または幹細胞性を維持する；
幹細胞と組み合わせて注入したときに損傷領域を修復する；
血管新生および脈管化を促進する；
骨再生を促進する；および／または
治療用タンパク質を保持および／またはデリバリーする
際に使用するための、請求項１〜１１の何れか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の自己組織化ペプチドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
他の実施例
前述は、本発明の特定の好ましいが限定されない実施形態の記述である。下記の請求項で定義されるとおり、本発明の精神と範囲を超えない範囲で、この分野の通常のスキルのものであれば、さまざまな変更を加えることができることが理解できる。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  (a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第２のアミノ酸ドメインとを含む自己組織化ペプチド。
［２］  第２のアミノ酸ドメインが少なくとも２つの最小の生物学的に活性のある配列を含む［１］に記載のペプチド。
［３］  前記最小の生物学的に活性のある配列が、-PRGDSGYRGD-; -DGRGDSVAYG-; -ALKRQGRTLYGF-; -PFSSTKT-; -FLGFPT-; -KLTWQELYQLKYKGI-; -SKPPGTSS-; -STFTKSP-; -IKVAV-; -FHRRIKA-; -IKLLI-; -RGD-; -REDV-; -LKKTETQ-.からなる群より選択される［１］に記載のペプチド。
［４］  少なくとも一つの前記最小の生物学的に活性のある配列が、-RGD-.を含む［１］に記載のペプチド。
［５］  第２のアミノ酸ドメインが単体で生物学的に活性を有する［１］に記載のペプチド。
［６］  第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合または非共有結合で接続されている［１］に記載のペプチド。
［７］  第２のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合ペプチド結合またはアミノ酸リンカー基により共有結合性に接続されている［６］に記載のペプチド。
［８］  当該アミノ酸リンカー基が少なくとも一つのグリシンを含む［６］に記載のペプチド。
［９］  第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(6.9オングストローム)である［１］に記載のペプチド。
［１０］  第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第２のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも２アミノ酸長(13.8オングストローム)である［１］に記載のペプチド。
［１１］  第一のアミノ酸ドメインが、アミノ酸配列: -RADA-; -IEIK-; または -FKFQ-の何れか１を少なくとも２回含む［１］に記載のペプチド。
［１２］  第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む［１］に記載のペプチド；配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c; 配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c; 配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c; 配列番号52 n-IEIKIEIK-c; 配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
［１３］  第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む［１２］に記載のペプチド：配列番号21 -RAD ARAD ARADARAD A-; 配列番号51 -FKFQFKFQFKFQ-; 配列番号52 -IEIKIEIK-;  配列番号53 -KLDLKLDLKLDL-。
［１４］  第２のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である［１］に記載のペプチド。
［１５］  前記細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF、 FGFs、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPからなる群より選択される［１４］に記載のペプチド。
［１６］  前記ヘパリン結合ドメインが、式（I）または（II）： -XBBXBX- または -XBBBXXBX- (I) (H)で示される［１４］に記載のペプチド：ここで、XはF, I, L, P, M, W, Y, V, A, CおよびQからなる群より選択される疎水性のアミノ酸を表し、BはR, HおよびKからなる群より選択される正電荷のアミノ酸を表す。
［１７］  当該自己組織化ペプチドが、以下からなる群より選択される［１］に記載のペプチド；配列番号1 AC(RADA)4GGPFSSTKT-CONH2; 配列番号2 Ac(RADA)4GGFLGFPT-CONH2; 配列番号3 AC(RADA)4GGALKRQGRTLYGF-CONH2; 配列番号4 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号5 AC(RADA)4GGDGRGDSVAYG-CONH2; 配列番号6 Ac(RADA)4GGFHRRIKA-CONH2; 配列番号7 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDSG-CONH2; 配列番号8 Ac(RADA)4GGRGDSCONH2;配列番号9 Ac(RADA)4 GGGGRGDSCONH2; 配列番号10 Ac(RADA)4GGGGREDV-CONH2; 配列番号11 Ac(RADA)4GGGGKLTWQELYQLKYKGI- CONH2; 配列番号12 Ac(RAD A)4GGSKPPGTSS-CONH2; 配列番号13 ACIEIKIEIKIGGPRGSYRGDS-CONH2; 配列番号14 ACIEIKIEIKIGGPFSSTKT-CONH2; 配列番号15 ACIEIKIEIKIGGSKPPGTS-CONH2; 配列番号16 AcFKFQFKFQFKFQGPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号17 ACFKFQFKFQFKFQGGFHRRIKA-CONH2; 配列番号18 Ac(RAD A)4GGSTFTKSP-CONH2; 配列番号19 Ac(RADA)4GGSIKV AVS-CONH2; および配列番号20 Ac(RADA)4GGSEIKLLIS-CONH2。
［１８］  当該自己組織化ペプチドが約５-９(5と9も含む)のpＨ の水性溶液中で正または負の総電荷を持つ［１］に記載のペプチド。
［１９］  第一のアミノ酸ドメインが近中性であるか、または正電荷若しくは負電荷を有する［１８］に記載のペプチド。
［２０］  第２のアミノ酸ドメインが正電荷または負電荷を有する［１８］に記載のペプチド。
［２１］  前記溶液のｐＨが約６-８（6と8も含む）であるときに、第一のアミノ酸ドメインの電荷が−１から１である［１９］に記載のペプチド。
［２２］  前記水溶液のｐHが約６-８（6と8を含む）であるときに、第２のアミノ酸ドメインの電荷が−２かそれ以下である［２０］に記載のペプチド。
［２３］  第一のアミノ酸ドメインが５−９（5と9を含む）の等電位点を有する［１８］に記載のペプチド。
［２４］  当該自己組織化ペプチドが８または８以上の等電位点を有する［１８］に記載のペプチド。
［２５］  当該溶液のｐHが約６-８（6と8を含む）であるときに、当該自己組織化ペプチドの総電荷が約２または２以上である［１８］に記載のペプチド。
［２６］  単体で存在する場合、第２のアミノ酸ドメインは自己組織化せず、当該ペプチドが集合して巨視的な構造を形成するように、第一のアミノ酸ドメインの自己組織化を可能にする［１］に記載の自己組織化ペプチド。
［２７］  当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む［２７］に記載の自己組織化ペプチド。
［２８］  水溶液中で単独のペプチドとして存在するときに、当該ペプチドが自己組織化する［１］に記載の自己組織化ペプチド。
［２９］  水溶液中に単独のペプチドとして存在するときには自己組織化せず、水溶液中に非修飾の自己組織化ペプチドと共に存在するときには自己組織化する［１］に記載の自己組織化ペプチド。
［３０］さらに、第３のアミノ酸ドメインを含む［１］に記載の自己組織化ペプチド；ここで、当該第３のアミノ酸ドメインは、(a) 疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、(b) 単独では自己組織化しないが、第１のアミノ酸ドメインの集合により、巨視的な構造の形成を可能にする第２のアミノ酸ドメイン、のいずれかを含む。
［３１］  疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を介在する２つのアミノ酸ドメインの間に、生物学的に活性のあるペプチドモチーフまたは生分子との相互作用のための標的部位を含むアミノ酸ドメインの直鎖のペプチド鎖を含む［３０］に記載の自己組織化ペプチド。
［３２］  当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む［３１］に記載の自己組織化ペプチド。
［３３］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドを含む溶液。
［３４］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドを含む医薬組成物。
［３５］  ゲル化剤を実質的に含まず、生体内で自己組織化して巨視的な構造を形成する［３４］に記載の医薬組成物。
［３６］  当該巨視的な構造がナノファイバーおよび／またはβシートを含む［３５］に記載の医薬組成物。
［３７］  疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、βシートに自己組織化し、巨視的な構造を取る、追加の自己組織化ペプチドを更に含み、当該追加の自己組織化ペプチドが細胞接着または細胞生存の適合性を低下させるアミノ酸を含まない［３４］に記載の医薬組成物。
［３８］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約１：１の比率で存在する［３７］に記載の医薬組成物。
［３９］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約５：１の比率で存在する［３７］に記載の医薬組成物。
［４０］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約９：１の比率で存在する［３７］に記載の医薬組成物。
［４１］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約９９：１の比率で存在する［３７］に記載の医薬組成物。
［４２］  ［１］に記載の自己組織化ペプチドを含むマトリクス。
［４３］  当該マトリクスがゲルまたはハイドロゲルである［４２］に記載のマトリクス。
［４４］  当該マトリクスが更に追加の生物学的分子を含む［４２］に記載のマトリクス。
［４５］  前記追加の生物学的分子が正または負の総電荷を有する［４４］に記載のマトリクス。
［４６］  当該追加の生物学的分子がたんぱく質またはペプチドである［４４］に記載のマトリクス。
［４７］  当該たんぱく質またはペプチドが成長因子または自己組織化ペプチドである［４６］に記載のマトリクス。
［４８］  当該自己組織化ペプチドが以下からなる群より選択される［４７］に記載のマトリクス：配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c; 配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c; 配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c; 配列番号52 n-IEIKIEIK-c; および配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
［４９］  当該増殖因子がヘパリン結合増殖因子である［４７］に記載のマトリクス。
［５０］  当該ヘパリン結合増殖因子が、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-βおよび BMPからなる群より選択される［４９］に記載のマトリクス。
［５１］  当該追加の生物学的分子がグリコサミノグリカンである［４４］に記載のマトリクス。
［５２］  当該グリコサミノグリカンがヘパリンまたはヘパラン硫酸である［５１］に記載のマトリクス。
［５３］  当該マトリクスの表面に接着またはマトリクス内部に封入されている複数の細胞を更に含む［４２］に記載のマトリクス。
［５４］  当該細胞が実質的に均質に当該マトリクス内部に分散している［５３］に記載のマトリクス。
［５５］  当該細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、角質細胞、基底細胞、棘突起細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、子宮頸部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞およびそれらの前駆細胞からなる群より選択される［５３］に記載のマトリクス。
［５６］  当該マトリクスが３次元である［４２］に記載のマトリクス。
［５７］  当該マトリクスが更に固体物を含む［４２］に記載のマトリクス。
［５８］  当該固体物が無機塩である［５７］に記載のマトリクス。
［５９］  当該無機塩がカルシウムおよび／またはリン酸である［５８］に記載のマトリクス。
［６０］  当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される［５９］に記載のマトリクス。
［６１］  当該固体物が約１００−５００ミクロン（100と500を含む）の範囲の孔径を有する［５７］に記載のマトリクス。
［６２］  当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である［５７］に記載のマトリクス。
［６３］  (i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii) pHを調整する工程とを含む［４２］に記載のマトリクスを製造する方法。
［６４］  (iii)ゲル化剤を加える工程を更に含む［６３］に記載のマトリクスを製造する方法。
［６５］  (i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii)ゲル化剤を加える工程とを含む［４２］に記載のマトリクスを製造する方法。
［６６］  (iii) pHを調整する工程を更に含む［６５］に記載のマトリクスを製造する方法。
［６７］  当該ゲル化剤が電解質である［６４］または［６５］に記載の方法。
［６８］  当該ゲル化剤が食塩、食塩水、PBS、細胞培養液または生物学的流体である［６７］に記載の方法。
［６９］  当該生物学的流体が血液またはリンパ液である［６７］に記載の方法。
［７０］  ｐHが約５−９（5と9を含む）に調整されている［６３］または［６６］に記載の方法。
［７１］  ｐHが約６−８（6と8を含む）に調整されている［７０］に記載の方法。
［７２］  ｐHが約５−７（5と7を含む）に調整されている［７１］に記載の方法。
［７３］  ｐHが約5.7-5.8（5.7と5.8を含む）に調整されている［７２］に記載の方法。
［７４］  骨又は組織の欠損補填材としての［４２］に記載のマトリクスの使用方法。
［７５］  当該組織が、脳、皮膚、肝臓、膵臓、胃、腎臓、消化器、食道、心臓、筋肉、結合組織、軟骨、神経、脂肪または骨髄である［７４］に記載の方法。
［７６］  当該補填材が水溶液中の自己組織化ペプチドを含む［７４］に記載の方法。
［７７］  当該補填材が当該自己組織化ペプチドのハイドロゲルを含む［７４］に記載の方法。
［７８］  当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液とゲル化剤との混合により形成される［７７］に記載の方法。
［７９］  当該ゲル化剤が生物学的流体である［７８］に記載の方法。
［８０］  当該生物学的流体が血液またはリンパ液である［７９］に記載の方法。
［８１］  当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液のｐHを調整することによる形成される［７７］に記載の方法。
［８２］  更に固体物を含む［７４］に記載の方法。
［８３］  当該固体物が無機塩である［８２］に記載の方法。
［８４］  当該無機塩がカルシウムおよび／またはリン酸である［８３］に記載の方法。
［８５］  当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される［８４］に記載の方法。
［８６］  前記固体物が、約１００−５００ミクロン（100と500を含む）の孔径を有する［８２］に記載の方法。
［８７］  当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である［８２］に記載の方法。
［８８］  当該欠損が、損傷した組織、損傷した整形領域、骨欠損、骨隣接部、異所性の骨形成、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損である［７４］に記載の方法。
［８９］  ［１］に記載の自己組織化ペプチド、［３４］に記載の医薬組成物または［４２］に記載のマトリクスをそれを必要とする対象に対して投与することを含む細胞の分化または機能活性を増強する方法。
［９０］  ［１］に記載の自己組織化ペプチド、［３４］に記載の医薬組成物または［４２］に記載のマトリクスを対象の体の部位または体内に導入することを含む対象を治療する方法。
［９１］  当該部位が、整形領域、骨欠損部、骨隣接部、異所性の骨形成部、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損部である［９０］に記載の方法。
［９２］  (a)(i)［１］の自己組織化ペプチド、(ii)［３４］の医薬組成物、または(iii)［４２］のマトリクス；(b) 当該ペプチドの巨視的な構造への自己組織化を開始するための説明書；並びに(c) 細胞群、細胞または組織培養培地、あらかじめ定めた量の増殖因子、予め定めた量のイオンまたはその塩、当該自己組織化ペプチドを細胞培養のために準備するための説明書、ペプチドハイドロゲル構造の上または中で細胞を培養するための説明書、当該自己組織化ペプチドを対象に導入するための説明書、細胞培養を実施する容器、当該ペプチドを溶解する液体、注射器、ペプチドの自己組織化を開始するためのイオンまたはその塩、および１または１以上の増殖因子または分化因子からなる群より選択される少なくとも１の成分；を含む培養キット。
［９３］  細胞を、［１］の自己組織化ペプチド、［３４］の医薬組成物、または［４２］のマトリクスと接触させることと、当該マトリクスを細胞培養に適した条件下で細胞培養に適した時間に亘り維持することとを含む細胞を培養する方法。
［９４］  当該細胞が、当該マトリクスの表面上で培養される、および／または当該マトリクス内に封入されて培養される［９２］に記載の方法。
【外国語明細書】
2014062102000001.pdf