(57)【要約】【課題】本発明は、熟練した技術者の判断によらず、簡便に多能性幹細胞の分化状態、すなわち、良否を判断する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、分化を開始した多能性幹細胞の自動判別に応用できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】多能性幹細胞の核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞の良否を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の核染色像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法。
【請求項２】
多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コロニー中心部の細胞密度と、場合によってはその周辺部の細胞密度とに基づいてコロニーの良否を評価する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コロニー内の細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることによりそのコロニーの良否を評価する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
予め作成したフィット関数が、
凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、
コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）
を含んでなる少なくとも１種類のフィット関数である（但し、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予め作成したフィット関数が、ｆｇｏｏｄ関数とｆｂａｄ関数とを含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｆｂａｄ関数が、
（条件Ｂ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｆｂａｄ関数が、
【数１】
2014018186.tif 000011
である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｆｇｏｏｄ関数が、
（条件Ｇ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｆｇｏｏｄ関数が、
【数２】
2014018186.tif 000012
である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線から抽出したパラメータを指標としてコロニーの良否を評価する、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値からなる群から選択される１以上のパラメータである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２つのパラメータの和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
２つのパラメータの和、差、積または比の値と、別の２つのパラメータの組み合わせにおける２パラメータの和、差、積または比の値との、和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
（i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
（v）上記の（i）〜（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
を用いて評価する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄおよびｆｂａｄの差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、および、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄの最大値と極小値との差
の和が閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項２３】
請求項２１に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核染色パターンに基づいて多能性幹細胞を評価する方法に関し、詳細には、多能性幹細胞が形成するコロニー内の細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞コロニーの良否を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、あらゆる組織に分化しうるその分化多能性ゆえに、組織分化の研究、薬物試験および再生医療などの様々な分野で幅広く用いられている。特にｉＰＳ細胞の樹立以降、この分野における研究の発展は著しく、再生医療実現に向けた様々な取り組みが世界中でなされている。
【０００３】
ところで、多能性幹細胞は、分化しやすく、一度分化してしまうと多能性を失う可能性があるため、多能性幹細胞の培養は、多能性幹細胞の未分化状態の維持しながら行う必要があり、未分化状態の維持は、多能性幹細胞の培養において最も重要な要素の一つであるといえる。
【０００４】
未分化状態を維持するためには、分化を阻害する薬剤の使用や、分化を開始した多能性幹細胞の除去などが行われる。多能性幹細胞の大量調製において、最も大きな障害となりうる問題の一つは、分化を開始した多能性幹細胞の除去である。分化を開始した細胞の除去が不十分な場合には、周囲の細胞の分化を誘導して培養細胞全体に悪影響を及ぼす可能性があるが、多能性幹細胞の分化状態は、熟練した技術者によらなければ判断が難しいからである。このようなことから、多能性幹細胞の大量調製には自ずと限界がある。
【０００５】
そのため、少なくとも熟練した技術者の判断に依らずに多能性幹細胞の分化状態を確認する方法の開発や、分化を開始した多能性幹細胞を自動判別できる方法の開発が望まれていた。この点で、臭気センサを利用した幹細胞の多分化能の喪失の検出法などが開発されているが複雑で大がかりな装置が必要であり（特許文献１）、簡便な方法の開発が依然望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２４６４４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、熟練した技術者の判断によらず、簡便に多能性幹細胞の分化状態（すなわち、コロニーの良否）を評価する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、多能性幹細胞の分化状態を自動判別できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、多能性幹細胞の核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞が形成するコロニーの分化状態を評価できることを見出した。本発明者らは特に、接着培養において多能性幹細胞が形成するコロニー内の細胞密度に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの分化状態を評価できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）多能性幹細胞の核染色像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法。
（２）多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（３）多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（４）コロニー中心部の細胞密度と、場合によってはその周辺部の細胞密度とに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（３）に記載の方法。
（５）コロニー内の細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価する、上記（３）に記載の方法。
（６）コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることによりそのコロニーの良否を評価する、上記（５）に記載の方法。
（７）予め作成したフィット関数が、
凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、
コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）
を含んでなる少なくとも１種類のフィット関数である（但し、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、上記（６）に記載の方法。
（８）予め作成したフィット関数が、ｆｇｏｏｄ関数とｆｂａｄ関数とを含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である、上記（７）に記載の方法。
（９）ｆｂａｄ関数が、
（条件Ｂ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）前記ｆｂａｄ関数が、
【数１】
2014018186.tif 000002
である、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ｆｇｏｏｄ関数が、
（条件Ｇ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記ｆｇｏｏｄ関数が、
【数２】
2014018186.tif 000003
である、上記（６）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する、上記（５）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線から抽出したパラメータを指標としてコロニーの良否を評価する、上記（５）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値からなる群から選択される１以上のパラメータである、上記（１４）に記載の方法。
（１６）２つのパラメータの和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）２つのパラメータの和、差、積または比の値と、別の２つのパラメータの組み合わせにおける２パラメータの和、差、積または比の値との、和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１６）に記載の方法。
（１８）パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータである、上記（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）
（i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
（v）上記の（i）〜（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
を用いて評価する、上記（１７）に記載の方法。
（２０）
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄおよびｆｂａｄの差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、および、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄの最大値と極小値との差
の和が閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定する、上記（１９）に記載の方法。
（２１）上記（１）〜（２０）のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
（２２）上記（２１）に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
（２３）上記（２１）に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
（２４）上記（２３）に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定システム。
【００１０】
本発明は、染色を行うことにより、熟練した技術者によらなくても、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価できる点で有利である。本発明はまた、核染色像から推定される細胞密度を比較することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価できる点で有利である。本発明はさらに、多能性幹細胞のコロニーの核染色像を得た後の工程は、全自動化が可能である点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｉＰＳ細胞コロニーの核染色像を示す図である。図１左は、ｉＰＳ細胞コロニーの位相差顕微鏡像を示し、図１右は、ＤＡＰＩによるｉＰＳ細胞コロニーの核染色像を示す。
【図２】図２は、コロニー内の細胞密度を測定する方法の一例を示す図である。図２Ａは、コロニーの中心部を通る直線に沿った細胞密度の計測法の一例を示す。図２Ａでは、グリッドの間隔は１００μｍであり、各マス目内の核の数により細胞密度が推定される。図２Ｂは、得られた細胞密度の分布を示す。図２Ｂのグリッドのマス目内の数字は、図２Ａの対応するマス目内の核の数を示している。
【図３】図３は、得られた細胞密度分布をグラフに表した図である。図３Ａは、優良なｉＰＳ細胞が形成するコロニーの細胞密度分布を示し、図３Ｂは、不良なｉＰＳ細胞が形成するコロニーの細胞密度分布を示し、図３Ｃは、除去しなくても周囲の細胞に悪影響を与えないｉＰＳ細胞が形成する良好なコロニーの台形型の細胞密度分布を示す。図３Ａ〜Ｃは、いずれも縦軸は１００μｍ×１００μｍ当りの核の数（×１００細胞／ｍｍ２）を示し、横軸は、測定した直線上の位置（×１００μｍ）を示す。
【図４】図４は、グレースケール画像に変換した細胞密度分布を示す図である。図４Ａは、優良なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例であり、図４Ｂは、良好なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例であり、図４Ｃは、不良なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例である。
【図５】図５は、コロニーの中心部の細胞密度を大きい順に並べて示した図である。
【図６】図６は、多能性幹細胞が形成するコロニーの細胞密度分布に対してフィット関数をカーブフィットした際の結果を示す図である。図６Ａは、良好なコロニーに対するｆｇｏｏｄ（ｘ）のカーブフィットを示し、図６Ｂは、不良なコロニーに対するｆｇｏｏｄ（ｘ）のカーブフィットを示す図である。
【図７】図７は、各コロニーにｆｇｏｏｄ（ｘ）をカーブフィットして得られるχ２／ＮＤＦを小さい順に並べて示した図である。
【図８】図８は、ｆｇｏｏｄ（ｘ）の最大値の大きい順にコロニーを並べて示した図である。
【図９】図９は、良好なコロニー（図９Ａ）および不良なコロニー（図９Ｂ）に対するｆｂａｄ（ｘ）のカーブフィットを示す図である。
【図１０】図１０は、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸として、各コロニーをパラメータに基づいてグラフ上にプロットして得た図である。
【発明の具体的な説明】
【００１２】
本発明で用いられる「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれの由来の細胞にも分化する能力を有する細胞を意味し、接着培養によりコロニーを形成する多能性幹細胞であれば、特に制限無く用いることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類の多能性幹細胞とすることができ、より好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヤギの多能性幹細胞とすることができ、さらに好ましくは、ヒトの多能性幹細胞とすることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。従って、本発明で用いられる多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳類のＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類若しくは齧歯類などのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本発明によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。
【００１３】
本発明において多能性幹細胞の評価は、コロニー毎に行うことができる。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞の評価は、コロニー毎に多能性幹細胞の分化状態を評価することにより（すなわち、コロニー毎にコロニーの良否を評価することにより）行うことができる。ここで、良好なコロニーは、分化を開始した細胞を含まない（未分化の細胞から構成される）と評価されるコロニーであり、不良なコロニーは、分化を開始した細胞を含むと評価されるコロニーである。
【００１４】
本発明によれば、多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は、多能性幹細胞の核染色像を観察することにより行うことができ、具体的には、
（Ａ）多能性幹細胞コロニーの核染色を行うこと、および、
（Ｂ−ａ）多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価すること、または、
（Ｂ−ｂ）多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価すること
により行うことができる。
【００１５】
上記工程（Ｂ−ｂ）は、核染色像からコロニーの細胞密度または細胞密度分布を算出し、次いで、
（ｂ−１）コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を評価すること、
（ｂ−２）得られた細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価すること、若しくは、
（ｂ−３）コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットして、コロニーの良否を評価すること
により行うことができる。
【００１６】
本発明によれば、核染色後の工程（Ｂ−ａ）および工程（Ｂ−ｂ）は、全自動化することができる。
【００１７】
本発明によれば、核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。この方法は前記工程（Ａ）および工程（Ｂ−ａ）により行うことができる。
【００１８】
核染色パターンの差異に基づく多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、培養表面上でコロニーを形成した多能性幹細胞は、核染色を行うことができる。本発明によれば、核染色は、当業者に周知の様々な核染色剤を用いて行うことができる。当業者に周知の核染色剤としては、特に限定されないが、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＳＹＴＯ（商標）、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）、ＴＯ−ＰＲＯ（商標）−３イオダイド、ＴＯＴＯ−３イオダイドおよびエチジウムブロマイドなどを用いることができる。核染色は、死細胞に対して行っても良いが、生細胞に対して行うことが好ましい。染色は、当業者に周知の方法を用いることができるが、生細胞に対して行う場合は、細胞毒性の低い染色剤または染色方法を選択することが好ましい。例えば、ＤＡＰＩであれば、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含有するＰＢＳ中で細胞を１５分ほどインキュベートすれば核染色を行うことができる。
【００１９】
核染色されたコロニーは、位相差顕微鏡法や蛍光顕微鏡法などの顕微鏡法により観察することができる。本発明によれば、熟練者が目視により良好（未分化である）と判断する多能性細胞が形成するコロニーは、核染色像がコロニーの全体でほぼ均一な染色パターン（良好）か、コンパクトかつ中心で濃い染色パターン（優良）を示し、分化を開始している（不良）と判断する多能性幹細胞が形成するコロニーは、中心部が薄く、かつその周辺部が濃い染色パターンを示す。従って、この知見に基づけば、例えば、多能性幹細胞が形成するコロニーの核染色パターンに基づいて、多能性幹細胞が形成するコロニーの全体がほぼ均一であるか、中心が濃い染色パターンを示すコロニーを良好なコロニーであると評価し、中心部が薄く、その周辺部が濃い染色パターンを示すコロニーを不良なコロニーであると評価することができる。このように、接着培養中の多能性幹細胞が形成するコロニーの核染色パターンから多能性幹細胞のコロニーの良否の評価を行うことができる。本発明では、当業者に知られたパターン認識のアルゴリズムを用いれば、このようなパターンの類似性評価を自動処理により行うことが可能である。
【００２０】
本発明によれば、核染色パターンが、細胞密度の差を反映しているとして、細胞密度または細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞のコロニーの評価を行うことができる。従って、本発明によれば、多能性幹細胞の細胞密度または細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否の評価方法が提供される。この方法は前記工程（Ａ）および工程（Ｂ−ｂ）により行うことができる。
【００２１】
本発明において細胞密度は、細胞数は観察される核の数と等しいと仮定することにより、多能性幹細胞の核染色像において核の数を計測することにより推定することができる。例えば、コロニーの中心部の細胞密度は、適宜、中心部で観察される一定面積当りの核の数として求めることができる。
【００２２】
本発明において細胞密度分布は、以下に限定されないが、例えば、コロニーをグリッド状に分割して、グリッドの各マス目内の細胞核の数として取得することができる（図２ＡおよびＢ）。細胞密度分布は、コロニー全体を網羅するように取得してもよいが、かならずしも全体を網羅する必要はなく、少なくとも中心部の１領域、好ましくは、中心部の１領域およびその周辺部の１領域での細胞密度を算出することができればよい。ただし、評価の精度を向上させるためには、細胞密度の測定領域数は多い方が好ましく、例えば、多能性細胞が形成するコロニーの中心部を通る直線上に沿って連続的に細胞密度分布を取得し評価に用いることが好ましい（例えば、図２ＡおよびＢ）。細胞核の数の測定は、目視にて行ってもよいが、米国国立衛生学研究所（ＮＩＨ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により提供されるＩｍａｇｅＪなどの画像解析ソフトウェアを用いれば自動で算出することができる。
【００２３】
本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ−ｂ）として工程（ｂ−１）を行うことでコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度を算出し、コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を評価することにより行うことができる。
【００２４】
コロニー中心部の細胞密度に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、コロニーの中心部の１領域における細胞密度を測定し、コロニー間でその大小を比較することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。具体的には、中心部の細胞密度が高いコロニーを良好なコロニーであると評価し、中心部の細胞密度が低いコロニーを不良なコロニーであると評価することができる。評価の際には、閾値を定めて、閾値を超えるか否かにより、コロニーの良否を評価（すなわち、判定）することもでき、具体的には、中心部の細胞密度が閾値を超えるコロニーを良好なコロニーであると判定し、閾値以下であるコロニーを不良なコロニーであると判定することができる。本発明によれば、閾値を高く設定すると、不良なコロニーの混入率は低減するが、良好なコロニーの回収率も低減する傾向がみられる。また、閾値を低く設定すると、良好なコロニーの回収率は増加するが、不良なコロニーの混入率も増加する傾向が見られる。従って、当業者であれば、良好なコロニーの回収率および不良なコロニーの混入率に基づいて適宜閾値を設定することができる。本発明によるコロニーの良否の評価に用いられる閾値は、特に限定されないが、例えば、２０〜５０個（×１００／ｍｍ２）とすることができ、例えば、３５〜４０個（×１００／ｍｍ２）とすることができ、例えば、３５個（×１００／ｍｍ２）または４０個（×１００／ｍｍ２）とすることができる。
【００２５】
また、コロニー中心部の細胞密度とその周辺部の細胞密度に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、コロニー中心部の少なくとも１領域とその周辺部の少なくとも１領域の細胞密度から、多能性幹細胞を評価することもできる。具体的には、中心部の細胞密度が低く、その周辺部の細胞密度が高いコロニーを不良なコロニーであると評価することができ、中心部の細胞密度が、その周辺部の細胞密度よりも高いコロニーや周辺部の細胞密度と同等のコロニーを良好なコロニーであると評価することができる。これらの細胞密度に基づく評価は自動化が可能であることは当業者であれば十分理解できるであろう。
【００２６】
本発明においてコロニーの「中心部」は、例えば、コロニーを円に見立てたときに、半径がコロニーの半径の３／４、好ましくは、２／３、より好ましくは、１／２、さらに好ましくは、１／３、最も好ましくは、１／４の半径の同心円の内部の領域とすることができる。また、「その周辺部」とは、コロニーの中心部の周辺部のことを意味し、コロニーの内部である。例えば、「その周辺部」は、コロニーを円に見立てたときに、コロニー中心部の外側で、半径がコロニーの半径の１／４、１／３、１／２、２／３、または、３／４の半径の同心円の外側であり、かつ、コロニーの内側の領域とすることができる。「その周辺部」はリング状の領域であってもよく、例えば、半径がコロニーの半径の１／４〜３／４、１／３〜２／３、または１／２〜２／３の半径の同心円に挟まれるリング状の領域とすることができる。円の式は、最小二乗法によりコロニーの輪郭に対してカーブフィットすることにより求めることができる。本発明によれば、コロニーの「中心部」（または「中心部の１領域」）は、好ましくはコロニーの中心部の１点である。コロニーの中心部の１点は、ある一定のルールに基づいて求められる１点であれば良く、特に限定されないが、コロニーの中心、例えば、上記円の中心として求めることができる。
【００２７】
本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ−ｂ）として工程（ｂ−２）を行うことでコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度分布を算出し、得られた細胞密度分布に基づいて、コロニーの良否を評価することにより行うことができる。
【００２８】
コロニーの細胞密度分布に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、細胞の密度分布をコロニーの中心部を通る直線に沿って算出し、その密度分布をコロニー間で比較することによって多能性幹細胞を評価することができる。細胞密度分布の比較は、例えば、視覚的に表された細胞密度分布のパターンに基づいて行うことができる。視覚的に細胞密度分布のパターンを表す方法としては、特に限定されないが、例えば、細胞密度分布をグラフ化する方法、または、グレースケール画像若しくはカラー画像に変換する方法などを挙げることができる。細胞密度分布のグラフ化は、特に限定されないが、例えば、平面直交座標系において細胞密度を縦軸（Ｙ軸）とし、コロニー中心部を通る直線を横軸（Ｘ軸）として、その分布を、例えば、棒グラフや点グラフとして表すことにより行うことができる。また、細胞密度分布のグレースケール画像またはカラー画像への変換は、細胞密度と色および／または階調とを対応させて変換することにより行うことができ、例えば、細胞密度０の場合を白（黒）とし、細胞密度の最大値を黒（白）として、細胞密度に応じて階調を設定して、１ビット〜３２ビット、好ましくは８〜１６ビットのグレースケール画像に変換することができる。細胞密度分布を視覚的なパターンに変換した後は、パターンの類似性に基づいて、目視または自動処理により多能性幹細胞の良否を評価することができる。パターンの類似性評価を自動処理により行う場合は、当業者に知られたパターン認識のアルゴリズムを用いることができる。
【００２９】
本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ−ｂ）として工程（ｂ−３）によりコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法では、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度分布を算出し、コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数をコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットして得られる近似曲線に基づいてコロニーの良否を評価することができる。例えば、予め作成したフィット関数は、カーブフィットするためのパラメータを含み、熟練した技術者により良好と判断されたコロニーおよび／または不良と判断されたコロニーの細胞密度分布を表すように作成することができる。その後、得られた少なくとも１種類のフィット関数は、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることにより各コロニーの細胞密度分布に対する近似曲線が得られる。このようなフィット関数や近似曲線は、当業者であれば細胞密度分布の形状を参考にして適宜作成することができる。フィット関数中のパラメータ数は、特に限定されないが、例えば、２〜１０個程度とすることができる。カーブフィットは、例えば、最小二乗法を用いて行うことができる。
【００３０】
熟練した技術者により良好と判断されたコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数としては、例えば、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数（ｙ＝ｆ（ｘ））のグラフを作成した場合に、凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）が挙げられる（図６Ａ参照）。本明細書では、「凸形状」とは、曲線のグラフが、良好なコロニーの細胞密度分布（例えば、図３ＡやＣ）により表される凸形状を意味する。凸形状の関数の一例としては、特に限定されないが、例えば、ｘがｘａより小さいときには単調増加し、ある実数ｘａにおいて極大値をとり、ｘがｘａより大きいときには単調減少する関数が挙げられる。極大値は、ｘａの近傍のｘにおいてｆ（ｘａ）≧ｆ（ｘ）を満たすｆ（ｘａ）の値のことを意味する（ｘａは任意の実数である）。したがって、本発明のある態様では、ｆｇｏｏｄ関数は、ｘ＝ｘａの１点において極大値をとる関数だけでなく、ｆｇｏｏｄ関数はｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が極大値となっている関数、例えば、上底に対応する部分全体で極大値をとる台形型の関数であってもよい。より具体的には、ｆｇｏｏｄ関数としては、例えば、直径１ｍｍのコロニーにおいて、ｘ＝３００μｍ〜７００μｍの範囲において一定値を示し、かつその一定値が極大値であり、かつ、ｘ＜３００μｍおよびｘ＞７００μｍの範囲では極大値をとらない関数を挙げることができる。ｆｇｏｏｄ関数は、評価したいコロニーにカーブフィットすると、好ましくは、良好なコロニーに対しては良好なフィッティングを示すが、不良なコロニーに対しては良好なフィッティングを示さない。
【００３１】
熟練した技術者により不良と判断されたコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数は、コロニーの中心部で凹形状を示し、かつ、その周辺部で凸形状を示すフィット関数（ｆｂａｄ関数）とすることができる（図９Ｂ参照）。すなわち、ｆｂａｄ関数のグラフは、１つの凹形状が２つの凸形状の間に挟まれた形状を示す。本明細書では、「凹形状」とは、コロニー中心部の細胞密度分布（例えば、図３Ｂ）により表される凹形状を意味する。凹形状の関数の一例としては、特に限定されないが、例えば、ｘがｘｂより小さいときには単調減少し、ある実数ｘｂにおいて極小値をとり、ｘがｘｂより大きいときには単調増加する関数、すなわち、コロニーの中心部でまたはｘの全域で１つのみ極小値をとる関数が挙げられる（ｘｂは任意の実数である）。極小値は、ｘｂの近傍の任意のｘにおいてｆ（ｘｂ）≦ｆ（ｘ）を満たすｆ（ｘｂ）の値のことを意味する。従って、ｆｂａｄ関数は、ｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が１つの極大値または極小値をとってもよい。従って、「コロニー中心部で凹形状であり、かつその周辺部で凸形状である関数」は、一例では、ｘが増加すると共に、単調増加し、あるｘｃで１つ目の極大値をとり、その後単調減少して、あるｘｄで１つの極小値をとり、その後さらに単調増加し、あるｘｅで２つ目の極大値をとり、その後単調減少する関数が挙げられる。また、本発明のある態様では、ｆｂａｄ関数は、ｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が極大値または極小値となっている関数を表すように作成される。ｆｂａｄ関数は、評価したいコロニーにカーブフィットすると、好ましくは、不良なコロニーに対しては良好なフィッティングを示すが、良好なコロニーに対しては良好なフィッティングを示さない。
【００３２】
従って、本発明によれば、多能性幹細胞が形成するコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数を用いることにより、多能性細胞を評価することができる。
【００３３】
すなわち、本発明によれば、予め作成したフィット関数が、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数（ｙ＝ｆ（ｘ））のグラフを作成した場合に、凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）を含んでなる、少なくとも１種類のフィット関数である、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。評価に用いるフィット関数は、１種類であってもよいが、好ましくは、２種類以上であり、より好ましくは、熟練した技術者により良好と判断されたコロニーについて１種類以上と熟練した技術者により不良と判断されたコロニーについて１種類以上の計２種類以上とすることができる。従って、本発明によれば、予め作成したフィット関数が、凸形状の関数を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）を含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である（ただし、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。
【００３４】
本発明によれば、細胞密度分布は、コロニー外の細胞については考慮する必要が無い。従って、フィット関数は、少なくともコロニー内で良好な近似を示すものであれば十分である。ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数は、コロニー外の領域では、一定値に収束する関数でも、発散する関数でも、振動する関数でもよいが、関数のコロニー外の領域での挙動により解析に影響が出る場合には、コロニー外の領域を排除してから解析を行うことが好ましく、この場合、例えば、細胞密度の実測値が１０以下、５以下または３以下の値（×１００／ｍｍ２）となる領域をコロニー外の領域と判断して排除することができる。また、近似対象がコロニーの細胞密度であることを考慮すれば、本発明のｆｇｏｏｄ関数またはｆｂａｄ関数は、好ましくは、常に０以上であり、かつコロニー外では０あるいは０に近い値をとる細胞密度分布を表すように作成することができる。上記いずれの方法によっても、コロニー外の領域による解析の悪影響を低減することができる。
【００３５】
従って、本発明によれば、ｆｇｏｏｄ関数は、好ましくは、凸形状を表す関数であり、かつ、下記条件： 
（条件Ｇ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たすように作成することができ、より好ましくは、すべての条件を満たすように作成することができる。本明細書では、「収束する関数」は、一定値、好ましくは、解析に悪影響を与えない程度に十分小さい値（例えば、以下、１５以下、１０以下、５以下、１以下の値、または０（×１００／ｍｍ２））に収束する関数である。上記条件Ｇ１〜Ｇ３のすべてを満たし、かつ凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数としては、例えば、下記式のガウス関数：
【数３】
2014018186.tif 000004
（式中、ａ、ｂおよびｃは、パラメータであり、ｘは変数である。）
とすることができる。上記条件Ｇ１〜Ｇ３のすべてを満たし、凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数としては、コロニーの中心部において関数値が一定であり、かつ極大値を示すように作成された関数（例えば、台形型の関数）も好適に用いられ得る。また、別の例では、上記条件Ｇ１〜Ｇ３のすべてを満たし、かつ凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数は、好ましくは、下記式の関数ｆｇｏｏｄ（ｘ）：
【数４】
2014018186.tif 000005
（式中、Ａ０、Ａ１、ａ１、ａ２、ｘ０およびｘ１はパラメータであり、ｘは変数である。）
である。これらのｆｇｏｏｄ関数は、特にｉＰＳ細胞コロニーの良否の判断に好ましく用いられ得る。
【００３６】
本発明によれば、ｆｂａｄ関数は、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表す関数（すなわち、２つの凸形状の領域に１つの凹形状の領域が挟まれている関数）であり、好ましくは、下記条件： 
（条件Ｂ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たすように作成することができ、より好ましくは、すべての条件を満たすように作成することができる。例えば、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表し、かつ、上記条件Ｂ１〜Ｂ３のすべてを満たすｆｂａｄ関数は、好ましくは、下記式の関数ｆｂａｄ（ｘ）：
【数５】
2014018186.tif 000006
（式中、Ａ０、Ａ１、ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｘ１およびｘ２はパラメータであり、ｘは変数である。）
である。これらのｆｂａｄ関数は、特にｉＰＳ細胞コロニーの良否の判断に好ましく用いられ得る。
【００３７】
本発明によれば、工程（ｂ−３）の近似曲線に基づく多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。
【００３８】
例えば、本発明の工程（ｂ−３）によれば、カーブフィットにより得られた少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのカーブフィッティングの良好さに基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。一般的に、カーブフィッティングの良好さは、少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標として評価することができる。従って、本発明によれば、少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する方法が提供される。近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれ（近似曲線のフィッティングの良好さ）の程度は、当業者に周知の方法を用いて評価することができ、目視によって評価しても良いが、数学的手法を用いて評価してもよい。数学的手法を用いる場合には、特に限定されないが、近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度の指標として、例えば、χ２／ＮＤＦ（自由度＝フィットしたデータ数−近似式のパラメータ数）を用い、その大小を比較することで多能性幹細胞の良否を判断することができる。あるいは、近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度の指標として、実測値と近似曲線との差の二乗和の平均を用い、その大小を比較することで多能性幹細胞の良否を評価しても良い。χ２／ＮＤＦおよび実測値と近似曲線との差の二乗和の平均は、カーブフィットのずれが少ないほど小さくなる傾向がある。従って、予め作成した少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標として、χ２／ＮＤＦまたは実測値と近似曲線との差の二乗和の平均の大小を用いて、多能性幹細胞コロニーの良否を評価することができる。
【００３９】
本発明の工程（ｂ−３）によればまた、ｆｇｏｏｄ関数若しくはｆｂａｄ関数のどちらかを用いて、または、ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の両方を用いて、多能性幹細胞コロニーの良否を評価することができる。評価の際には、上述のようにそれぞれの関数に対するカーブフィットの良好さを指標として、多能性幹細胞を評価しても良いし、これらの関数から設定したパラメータを指標として評価しても良い。例えば、多能性幹細胞を評価するための指標となるパラメータとしては、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値などを挙げることができる。多能性幹細胞は、これらのパラメータのいずれか１つを指標として評価しても良いし、これらのパラメータのうちの２以上を組合せて指標として評価しても良い。パラメータを設定する際、または、組み合わせる際には、例えば、良好なコロニーと不良なコロニーの近似曲線のグラフの形状の違いを抽出できるようにパラメータを設定し、組み合わせることができる。特に、不良なコロニーの細胞密度分布の近似曲線は、コロニー中心部において特徴的な凹形状を示す。従って、評価の際には、不良なコロニーの細胞密度分布に特徴的な凹形状を対比できるようにパラメータを設定することが好ましく、例えば、特徴的な凹形状を反映するコロニー中心部の細胞密度の実測値またはｆｂａｄ関数による近似値は、コロニー良否の評価指標の有用なパラメータとして設定し得る。パラメータの組み合わせとしては、例えば、コロニー内におけるｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値および実測値の最大値のいずれか１以上と、コロニー内におけるｆｂａｄ関数の極小値または実測値の最小値のいずれか１以上との組み合わせを挙げることができる。または、他のパラメータの組み合わせとしては、コロニー内におけるｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータの組み合わせを挙げることができる。パラメータを組み合わせた後は、良好なコロニーと不良なコロニーの差異をより強調するように２以上のパラメータの和、差、積または比をとることができる。２以上のパラメータの和、差、積または比から新たなパラメータを作成し、他のパラメータと、組み合わせて評価に用いることもできる。
【００４０】
本発明の工程（ｂ−３）によれば、パラメータの組み合わせ方のより具体的な例としては、特に限定されないが、
（i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
（v）上記（i）〜（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
などを用いることができる。（i）のパラメータを指標とすれば、大きいほど良好なコロニーであると評価することができる。（ii）〜（iv）のパラメータを指標とすれば、これらのパラメータが大きいほど不良なコロニーであると評価することができる。（i）〜（iv）はまた、（v）のように、これらの一部または全部を組み合わせてコロニーの良否を評価しても良い。（v）による評価の一例としては、例えば、（ii）〜（iv）の和が大きいほど不良なコロニーであると評価することができる。従って、本発明によれば、特に限定されないが、上記（i）〜（vi）のいずれかを用いて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。パラメータの組み合わせ方の他の具体的な例としては、特に限定されないが、例えば、（vi）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との積または和を用いることもできる。（vi）のパラメータを指標とすれば、数値が大きいほど良好なコロニーであると評価することができる。従って、本発明のある態様では、上記（i）〜（iv）および（vi）の一部または全部の組み合わせから選択されるパラメータの組み合わせを用いても良い。このように、本発明によれば、適宜設定したパラメータを組み合わせて得られた値の大小関係を指標としても、コロニーの良否を評価することができる。
【００４１】
本発明の工程（ｂ−３）によれば、評価の際には、それぞれのパラメータに対して閾値を設定し、閾値を超えるか否かにより、コロニーの良否を評価（すなわち、判定）することもできる。例えば、（ii）〜（iv）の和により評価する場合には、閾値を設定して、閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。具体的には、ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数として、それぞれｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）を用いて、閾値を４０〜４５に設定し、閾値以下のものを良好なコロニーと判定し、閾値を超えたものを不良なコロニーであると判定することができる。（i）のパラメータについても、同様に閾値を設定することができ、例えば、（i）の閾値を３５〜４５に設定すると、良好なコロニーのうち、閾値を超えたものを優良なコロニー（最も未分化である）と評価することができる。なお、これらの閾値は当業者であれば、所望の細胞の回収率や不良な細胞の混入率に従って、適宜設定することができる。また、上記（i）〜（vi）のパラメータは、細胞密度分布パターンに基づいて良好なコロニーと不良なコロニーとの間で差が生じるように設定したパラメータであるが、良好なコロニーと不良なコロニーとの間で差が生じる限り、上記（i）〜（vi）のパラメータに限らず、様々なパラメータを設定し、用いることができる。
【００４２】
本発明によれば、多能性幹細胞のコロニーの良否の評価において、（Ｂ−ａ）核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価すること、および（Ｂ−ｂ）核染色像から得られた細胞密度または細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価することは、コンピュータ等により全自動化することができる。従って、本発明では、コンピュータに本発明の工程（Ｂ−ａ）および／または工程（Ｂ−ｂ）を実行させるための、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定プログラムが提供される。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞の核染色画像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を自動判定するプログラムであって、
（Ｂ−ａ）多能性幹細胞の核染色画像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を判定すること、または、
（Ｂ−ｂ）多能性幹細胞の核染色画像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を判定すること
を含んでなる工程をコンピュータに実行させるためのプログラム
｛ここで、工程（Ｂ−ｂ）は、核染色画像からコロニーの細胞密度または細胞密度分布を算出し、次いで、
（ｂ−１）コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を判定する、
（ｂ−２）得られた細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を判定する、または、
（ｂ−３）予め作成したコロニーの細胞密度分布を表す少なくとも１種類のフィット関数から得られた各コロニーの近似曲線に基づいてコロニーの良否を判定する｝が提供される。このように、本発明によれば、本発明の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本発明によればまた、本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本発明によればさらに、本発明のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは多能性幹細胞のコロニーの良否のための自動判定システムが提供される。
【００４３】
本発明のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリなどの固定型の記録媒体でもよい。また、本発明のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ｉＰＳ細胞の良否判定の指標
本実施例では、ｉＰＳ細胞の良否判定の指標として利用しうるパラメータを検討した。本実施例では、まず、細胞の核染色を行った。
【００４５】
本実施例では、細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人  先端医療振興財団  細胞評価グループ  川真田研究室による樹立株）を用いた。培養は、フィーダーを用いるオンフィーダー条件およびフィーダーレス条件の２条件で行った。フィーダー細胞は、ＳＮＬ細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製、製品番号：ＥＣ０７０３２８０１）を使用した。培地は、オンフィーダー条件では、ヒトＥＳ細胞培養用培地（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ６４２１）５００ｍＬ、ノックアウト血清代替物（インビトロジェン社製、製品番号：１０８２８−０２８）１２５ｍＬ、非必須アミノ酸溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｍ７１４５）５ｍＬ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、製品番号：２５０３０−０８１）６．２５ｍＬ、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加したＰＢＳ（インビトロジェン社製、製品番号：２１９８５）５００μＬ、ｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４−０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを用い、フィーダーレス条件では、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）にｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４−０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを添加した培地を用いた。細胞を通常の培養皿に播種し、５日後、細胞密度の計測のために、核染色を行った。細胞の核染色は、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝溶液（和光純薬工業社製、製品番号：１６３−２０１４５）中で細胞を４℃にて一晩固定した後に、固定液を除去して、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍＬ）を用いて２５℃で１５分処理することにより行った。染色された細胞は、ＰＢＳで３回洗浄してから、４倍の対物レンズおよび１０倍の接眼レンズを備えた倒立型位相差顕微鏡ＩＸ８１（オリンパス社製）で観察した。
【００４６】
すると図１に示されるように、ｉＰＳ細胞のコロニーは核が良好に染色されていた。ｉＰＳ細胞のコロニーは、立体状に細胞が幾重にも重なる形態を取るが、核染色を行うと、コロニー内のほぼすべての細胞の核が明確に染色された（図１）。
【００４７】
一方で、観察したｉＰＳ細胞コロニーは、従来法によっても評価した。具体的には、位相差顕微鏡像に基づき目視により、観察したｉＰＳ細胞コロニーを、最も良好とされるコンパクトなｉＰＳ細胞コロニー（優良なコロニー）、良好でないとされる分化を開始したｉＰＳ細胞コロニー（不良なコロニー）、どちらにも分類されないが、除去しなくても周囲の細胞に分化などの悪影響を与えないｉＰＳ細胞コロニー（良好なコロニー）の３つのタイプに分類した。その後、核染色パターンと照らし合わせて各ｉＰＳ細胞コロニーの良否の評価を行った。
【００４８】
その結果、得られた染色パターンは、優良なコロニーでは、コロニーの中心部で濃くなる染色像が見られる傾向があったが、不良なコロニーでは、コロニーの周囲部では濃く、中心部では薄い染色像が見られる傾向があった。また、良好なコロニーの典型的な染色パターンとして、コロニー全体が比較的均一に染まる染色像が観察された。
【００４９】
これらの染色像のパターンの違いは、細胞密度の違いで表すことができる可能性が考えられたので、細胞密度を測定するため、コロニーの中心部を通る幅２００μｍの長方形を設定し、長方形内を一辺１００μｍの正方形に分割して（図２Ａ）、それぞれの正方形に含まれる細胞数を計数し、細胞密度（×１００細胞／ｍｍ２）として求めた。得られた細胞密度の分布は、図２Ｂに示される通りであった。
【００５０】
さらなる分析のために、コロニーを横切る中心線に沿って得られた細胞密度分布を棒グラフに表した（図３Ａ〜Ｃ）。グラフは、コロニー中心部を通る直線の位置（μｍ）を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度（×１００細胞／ｍｍ２）を縦軸（Ｙ軸）として作成した。
【００５１】
その結果、優良なコロニーでは、細胞密度は、中心部で高い傾向が見られたが（図３Ａ）、不良なコロニーでは、細胞密度は、周囲部では高く、中心部では低い傾向があった（図３Ｂ）。また、良好なコロニーでは、細胞密度はコロニー全体にわたり均一で、台形型の細胞密度分布を示す傾向があった（図３Ｃ）。このように、異なる３つのタイプのコロニーは、３種類の異なる細胞密度分布パターンを示した。また、優良なコロニーと良好なコロニーとを比較したところ、中心部の細胞密度において優良なコロニーの方が良好なコロニーよりも大きくなる傾向が見られた（図３ＡおよびＣ）。また、観察した２０例のｉＰＳ細胞コロニーはいずれも、上記の図３Ａ〜Ｃのいずれかのタイプの細胞密度分布パターンを示した。すなわち、すべてのｉＰＳ細胞コロニーは、コロニー内の細胞密度分布を指標とすることにより、ｉＰＳ細胞コロニーを明確に上記３種類のタイプのコロニーのいずれかに分類できた。
【００５２】
このことから、核染色によりｉＰＳ細胞コロニーの細胞密度を測定することが可能であること、および、コロニー内の細胞密度分布を指標とすることにより、個々のｉＰＳ細胞コロニーの良否の評価が可能であることが明らかとなった。
【００５３】
実施例２：ｉＰＳ細胞コロニーにおける細胞密度分布に基づくコロニーの良否判定
本実施例では、実施例１で得られた細胞密度分布の数値からグレースケール画像を取得して比較することにより、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定を行った。
【００５４】
まず、熟練した技術者により判別した、優良なコロニー（１０コロニー）、良好なコロニー（１０コロニー）および不良なコロニー（１７コロニー）の計３７コロニーについて、実施例１と同様の方法により各コロニーの細胞密度分布を取得した。便宜的に、各細胞密度分布から、細胞密度が５０（×１００細胞／ｍｍ２）の場合を白色とし、０（×１００細胞／ｍｍ２）の場合を黒色とした８ビットのグレースケール画像を作成した（図４）。得られたグレースケール画像を目視により比較し、優良なコロニー、良好なコロニーおよび不良なコロニーのいずれかに振り分けた。その結果は表１の通りであった。
【００５５】
【表１】
2014018186.tif 000007
2014018186.tif 000008
【００５６】
表１に示されるとおり、位相差画像に基づく熟練した技術者により判別した場合と、細胞密度分布をグレースケール画像化して判別した場合とでは、整合率が９１．９％（３７コロニー中３４コロニーで整合）であった。
【００５７】
位相差画像に基づく判断と、細胞密度に基づく判断が１００％整合しなかったことから、細胞密度以外の指標が重要であること、および、熟練した技術者は細胞密度以外の指標を判断指標として用いていることが示唆された。一方で、本実施例では、細胞密度にのみ基づく評価を行ったとしても、ある一定の良好な整合率を示したことから、多能性幹細胞コロニーの核染色パターンから細胞密度を推定し、その細胞密度に基づいてコロニーの良否を判断または判定しうることが明らかとなった。
【００５８】
実施例３：ｉＰＳ細胞コロニーの中心部の細胞密度に基づくコロニーの良否判定
実施例１および２では、良好なｉＰＳ細胞コロニーは、中心部の細胞密度が高い傾向を示し、他方、不良なｉＰＳ細胞コロニーは、中心部の細胞密度が低い傾向を示した。そこで、本実施例では、ｉＰＳ細胞コロニーの中心部の細胞密度を比較することにより、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能であるかを調べた。
【００５９】
具体的には、本実施例では、実施例２で得られた細胞密度分布から各コロニーの中心部における細胞密度を取得し、その大小の比較を行った。
【００６０】
その結果、優良なコロニーは、コロニー中心部の細胞密度が最も高く、次いで良好なコロニーの中心部の細胞密度が高く、不良なコロニーの中心部の細胞密度が最も低くなる傾向が見られた（図５）。そのため、コロニー中心部の細胞密度の比較は、ｉＰＳ細胞の良否判定に利用できることが明らかとなった。
【００６１】
しかしながら、分化を開始したと考えられる不良なコロニーであっても、優良なコロニーよりも細胞密度が高くなる場合が見られた（図５）。そのため、コロニー中心部の細胞密度のみの比較によっては、優良なコロニーと不良なコロニーとを完全に判別することはできなかった。また、良好なコロニーと不良なコロニーとを判別することはほとんどできなかった。この理由として、不良なコロニーの中心部の細胞密度は、分化初期には比較的大きいこと、および細胞密度の低下は必ずしもコロニー中心部から開始されるわけではないことが考えられる。
【００６２】
次に、コロニー中心部の細胞密度の比較がｉＰＳ細胞の良否判定に利用できる可能性を検証するために、コロニー中心部の細胞密度に閾値（×１００細胞／ｍｍ２）を設けて、コロニーの良否判定を行った。コロニー中心部の細胞密度の閾値を５５（×１００細胞／ｍｍ２）とした場合には、優良なコロニーの回収率は５０％（１０コロニー中５コロニー）、不良なコロニーの混入率は０％（１７コロニー中０コロニー）となり、閾値を３５（×１００細胞／ｍｍ２）とすると、優良なコロニーの回収率は７０％（１０コロニー中２コロニー）、不良なコロニーの混入率は１１．８％（１７コロニー中２コロニー）となった。
【００６３】
このように、本実施例では、優良なコロニーと不良なコロニーとを判別することは可能であった。特に、優良なコロニーの回収率を５０％（細胞密度の閾値を５５（×１００細胞／ｍｍ２））とすれば、不良なコロニーの混入をほぼ回避することができることが分かった。回収率と混入率の点で改善すべき点があるものの、本実施例は、細胞密度の大小を単純に比較することにより、細胞の良否を判定することが可能であることを示すものであり、細胞密度に基づけば、コンピュータによって細胞の良否を自動判定することができることを意味するものである。
【００６４】
実施例４：細胞密度分布に対する近似式を用いたｉＰＳ細胞コロニーの良否判定
本実施例では、細胞密度分布に対してフィット関数を作成し、得られたフィット関数を用いてｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能か否かを調べた。
【００６５】
本実施例では、優良なコロニーと良好なコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数としては、凸形状の関数、具体的には、台形型のフィット関数を作成して評価に用いた。本実施例では、台形型のフィット関数として、良好なコロニーの細胞密度分布の形状を良好に表すｆｇｏｏｄ関数：
【数６】
2014018186.tif 000009
を用いた場合の例を示す。
【００６６】
まず、実施例２で得られた３７コロニーの細胞密度分布のそれぞれに対して、最小二乗法を用いてｆｇｏｏｄ（ｘ）をカーブフィットした。その結果、優良なコロニーおよび良好なコロニーでは、ｆｇｏｏｄ（ｘ）は、細胞密度分布の実測値に対して良好なフィッティングを示した（図６Ａ）。一方で、不良なコロニーでは、ｆｇｏｏｄ（ｘ）は良好なフィッティングは示さなかった（図６Ｂ）。
【００６７】
そこで、ｆｇｏｏｄ（ｘ）と細胞密度分布の実測値とのずれの大小を指標として、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能かを調べた。具体的には、カーブフィットのずれの大小の指標として、χ２／ＮＤＦ（自由度＝フィットしたデータ数−近似式のパラメータ数）を算出し、コロニー毎に算出されるχ２／ＮＤＦの値の大小を比較することでｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能かを調べた。フィッティングが良好であるほど、χ２／ＮＤＦ値は小さくなることが知られている。
【００６８】
上述のようにカーブフィットのずれの大小の指標として評価したところ、図７に示されるように、優良なコロニーおよび良好なコロニーは、不良なコロニーと比較して、ｆｇｏｏｄ（ｘ）に対するフィッティングがより良好である傾向が見られた。また、図７からは、χ２／ＮＤＦに閾値を設定して、優良なコロニーの回収率を９０％とした場合には、不良なコロニーが１１．８％混入し、優良なコロニーの回収率を８０％とした場合には、不良なコロニーが５．９％混入し、優良なコロニーの回収率を６０％とした場合には、不良なコロニーが０％混入することが分かった。このことから、χ２／ＮＤＦに閾値を設定することにより、優良なコロニーの回収率と良好なコロニーの混入率を適宜調整することができることが理解できる。
【００６９】
このように、近似式からのずれの大小を指標として評価した場合にも、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能であることが明らかとなった。
【００７０】
次に、コロニー毎に上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）の最大値を算出し、その大小を比較した。その結果、驚くべきことに、優良なコロニーと良好なコロニーとが明確に区別できることが明らかとなった（図８）。特に、閾値を４０〜４５に設定することにより、優良なコロニーと良好なコロニーとを明確に判定することができた（図８）。
【００７１】
これらの結果から、近似式のカーブフィットがｉＰＳ細胞コロニーの良否判定に有効であることが示された。
【００７２】
実施例５：細胞密度分布に対するフィット関数を複数用いた場合のｉＰＳ細胞コロニーの良否判定
本実施例では、優良なコロニーおよび良好なコロニーに対するフィット関数に加え、不良なコロニーに対するフィット関数をさらに用いてｉＰＳ細胞コロニーの良否判定を行った。
【００７３】
本実施例では、実施例１で得られた２０例の細胞密度分布を解析した。優良なコロニーおよび良好なコロニーに対するフィット関数としては、上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）を用い、不良なコロニーに対するフィット関数としては、不良なコロニーの細胞密度分布の形状を良好に表すｆｂａｄ関数：
【数７】
2014018186.tif 000010
を用いた。
【００７４】
ｆｂａｄ（ｘ）を用いてカーブフィットを行ったところ、不良なコロニーの細胞密度分布に対して良好なフィッティングを示した（図９Ｂ）。
【００７５】
次に、すべてのコロニーに対して、上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）をカーブフィットし、それぞれのコロニーに対して、以下のパラメータを算出した。具体的には、パラメータＡは、コロニー中心部におけるｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）の値のうち、実測値に近い値とした。パラメータＡは、良好なｉＰＳ細胞コロニーほど大きな値を示すと予想される。パラメータＢは、（コロニー中心部におけるｆｇｏｏｄ（ｘ）とｆｂａｄ（ｘ）の差）＋（コロニー内で測定される実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値の差）＋（コロニー内のｆｂａｄ（ｘ）の最大値と極小値の差）とした。パラメータＢは、分化を開始した不良なｉＰＳ細胞コロニーほど大きな値を示すと予想される。
【００７６】
ｉＰＳ細胞コロニー毎にパラメータＡおよびＢを算出し、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸として、各コロニーをグラフにプロットした結果、優良なコロニー、良好なコロニーおよび不良なコロニーがそれぞれ明瞭に分離されることが分かった（図１０）。特に、パラメータＢを指標とすると、優良なコロニーや良好なコロニーと不良なコロニーとを判別することが可能であること、並びに、さらにパラメータＡを指標とすると、優良なコロニーと良好なコロニーとを判別することができることが分かった（図１０）。具体的には、本実施例では、パラメータＢを４６とすることで、不良なコロニーの混入率を０とすることができ、かつ、優良なコロニーおよび良好なコロニーを９０％回収できた。また、パラメータＡを４０とすることで、優良なコロニーと良好なコロニーとを１００％判別できた。
【００７７】
このように、未分化で良好なｉＰＳ細胞コロニーと、分化を開始したｉＰＳ細胞コロニーとは、細胞密度分布を比較することで、明確に判別が可能であることが明らかとなった。
【００７８】
実施例１によれば、位相差画像に基づく判断と、細胞密度に基づく判断とは、かならずしも整合しない。このことは、熟練した技術者は細胞密度以外の指標を判断指標として用いていることを示唆するものであるが、本実施例によれば、近似式を活用することにより、細胞密度のみに基づく判断によっても、細胞の高精度な良否判定が可能であった。しかも、本実施例の方法は、コンピュータによる細胞の良否の自動判定に適用できるものであり、従来行われてきた経験に基づく判断を自動化するための方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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