(57)【要約】【課題】ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法の提供。【解決手段】本明細書では、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性であり、活性化ＭＥＴ遺伝子突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅に関連する癌を治療するための方法を提供する。この方法では、抗ＥｒｂＢ治療剤と抗ＭＥＴ治療剤の組合せを対象に投与する。癌細胞におけるＥｒｂＢ媒介シグナル伝達またはＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達を低減するための方法も提供する。ある特定の実施形態では、この癌は、例えば、肺癌、脳の癌、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌とすることができる。例示的な実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。【選択図】図６
2014141530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年４月１３日に出願された、米国仮出願第６０／９２３，３８４号（上記出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた、認可番号ＲＯ１ＣＡ１１４４６５およびＫ０８ＣＡ１２００６０−０１下の政府支援で行われた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は、癌による死の主要原因であり、世界中のすべての死の３分の１を占める。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、すべての組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）の肺癌の約７５〜８５％を占め、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が残りを占める。大規模な前臨床的および臨床的研究にもかかわらず、ＮＳＣＬＣを有する患者についての全体的な予後は、依然として乏しいままであり、５年生存率はわずかに１４％である。
【０００４】
近年、細胞形質転換の基礎をなす分子機構および癌の発症に関する知見は、大いに拡大している。肺癌を含めた様々な癌に関与する、ＥｒｂＢ受容体などのチロシンキナーゼ受容体を標的にする治療剤が発見された。特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ受容体を標的にする薬剤が開発された。ＥＧＦＲ−チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）ＺＤ１８３９（Ｉｒｅｓｓａ（商標））およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））を含めた、小分子ＥＧＦＲ標的療法は、良好な最初の臨床的結果を示したが、腫瘍細胞は、時間ととともに耐性を発生させることが多く、治療に対して非応答性となる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のＴＫＩ療法に対して応答性でない、ＮＳＣＬＣなどの癌に罹患している患者を治療するための新規の手法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している対象を治療するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、癌は、例えば、肺癌、脳の癌（ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌とすることができる。例示的な実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【０００８】
ある特定の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅（例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４活性化突然変異または遺伝子増幅）を有する場合がある。ある特定の実施形態では、対象は、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合がある。ある特定の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅と、ＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅の両方を有する場合がある。
【０００９】
ある特定の実施形態では、癌は、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤の１つまたは複数を用いた治療に耐性である場合がある：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤。癌が耐性である抗ＥｒｂＢ治療剤は、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である場合がある。ある特定の実施形態では、癌は、抗ＥｒｂＢ抗体、ＥｒｂＢ遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡ、またはＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた治療に耐性となり得る。例示的な実施形態では、癌は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に用いた治療に耐性である。ある特定の実施形態では、癌は、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤の１つまたは複数を用いた治療に耐性である：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ（ｐａｎｔｉｎｕｍｕｍａｂ）、またはトラスツズマブ。
【００１０】
ある特定の実施形態では、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤の１つまたは複数を、対象に投与する：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤。対象に投与するのに適した抗ＥｒｂＢ治療剤には、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤が含まれる。例示的な実施形態では、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブ。
【００１１】
ある特定の実施形態では、以下の抗ＭＥＴ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤。例示的な実施形態では、以下の抗ＭＥＴ治療剤の１つまたは複数を対象に投与する：ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５。
【００１２】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を対象に同時に投与する。抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤は、同時製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として対象に投与することができる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している患者を治療するための方法は、少なくとも１つの追加の治療を前記対象に施すステップをさらに含むことができる。例示的な治療には、例えば、追加の治療剤の投与、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、または手術が含まれる。
【００１４】
ある特定の実施形態では、治療される対象は、哺乳動物、例えば、ヒトなどとすることができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、この対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に対する耐性を発生しており、この対象がＭＥＴ活性および／またはレベルの上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅）を有するかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する対象に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象をモニターすることによって、この患者が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅）を発生させるかどうかを判定するステップと、（ｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させている場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ活性化突然変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している対象を治療するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象をモニターすることによって、この対象が阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、（ｉｉ）この対象を検査することによって、この対象が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇（ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅など）を有するかどうかを判定するステップと、（ｉｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇している患者は、ＨＧＦレベルおよび／または活性も上昇している。
【００１８】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を評価するための方法であって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されている対象の集団をモニターすることによって、治療剤に対する耐性を発生させる対象を特定するステップと、（ｉｉ）耐性の対象を検査することによって、この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、（ｉｉｉ）この対象が、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、この対象の治療レジメンを修正することによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢはＥｒｂＢ−３とすることができ、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥｒｂＢ−３治療剤とすることができる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性を回復させるための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の成長または増殖を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を低減するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中の、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を治療するための方法であって、この細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、癌細胞は哺乳動物癌細胞、例えば、ヒト癌細胞などである。癌細胞は、細胞株または一次組織試料由来であってもよい。ある特定の実施形態では、癌細胞は、肺癌細胞、脳の癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、または膵癌細胞とすることができる。ある特定の実施形態では、癌細胞は、任意のＥｒｂＢ誘導性癌とすることができる。ある特定の実施形態では、癌細胞の成長および／または生存は、ＥｒｂＢによって促進される。ある特定の実施形態では、癌細胞は、ＥｒｂＢ活性化突然変異、例えば、ＥＧＦＲ活性化突然変異などを含むことができる。ある特定の実施形態では、癌細胞は、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子増幅などを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢ遺伝子増幅および／またはＭＥＴ増幅は、少なくとも２倍である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連するＥｒｂＢ遺伝子突然変異、例えば、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ突然変異などを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤からなる群から選択される。抗ＥｒｂＢ治療剤は、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤とすることができる。ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗体、アンチセンス分子、または小分子キナーゼ阻害剤である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢタンパク質治療剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ核酸治療剤はｓｉＲＮＡ分子である。
【００３０】
ある特定の実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、ＭＥＴに対する抗体、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する抗体である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５である。例示的な実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤はｓｉＲＮＡ分子である。
【００３１】
ある特定の実施形態では、細胞を抗ＭＥＴ治療剤およびＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップは、少なくとも１つの追加の治療様式を含む治療レジメンの一部であり、例えば、少なくとも１つの追加の治療様式は、前記細胞を１つまたは複数の追加の治療剤と接触させること、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、および手術からなる群から選択される。
【００３２】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されており、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した癌に罹患している対象を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を用いて治療するための候補として特定するための方法であって、前記対象由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を検出するステップを含む方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、抗ＭＥＴ治療剤を特定するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得し、ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物と接触させるステップと、抗ＥｒｂＢ治療剤のみと接触させた同じ細胞中の細胞の過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）と比較した、ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ会合（ＥｒｂＢ−ＭＥＴ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の減少、ＥＧＦＲリン酸化の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少、およびアポトーシスの増大からなる群から選択される前記細胞の過程の変化を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて治療されており、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得するリスクのある対象を特定するための方法であって、前記対象由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在を検出するステップを含み、前記ＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在が、前記耐性を獲得するリスクを示す方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を作製するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性である細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも４週間接触させるステップと、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子中に突然変異を含まない。
【００３６】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される方法によって作製される細胞を提供する。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を提供する。
【００３７】
別の態様では、本願は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である癌に罹患している対象を治療するための方法であって、この対象に、抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤を投与するステップを含む方法を提供する。ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤は、例えば、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体、例えば、抗ＨＧＦ抗体または抗ＭＥＴ抗体とすることができる。
【００３８】
別の態様では、本開示は、ＥＧＦＲのエクソン１９中の欠失およびＭＥＴ遺伝子増幅を含む細胞または細胞株を提供する。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、哺乳動物細胞または細胞株、例えば、ヒト細胞または細胞株などである。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、上皮細胞または細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、腺癌細胞または細胞株、例えば、肺腺癌細胞株などである。ある特定の実施形態では、エクソン１９中の欠失は、ヒトＥＧＦＲの残基Ｅ７４６−Ａ７５０の欠失である。ある特定の実施形態では、ＭＥＴ遺伝子は、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または３〜１０倍、３〜５倍、または５〜１０倍増幅される。ある特定の実施形態では、ＭＥＴ遺伝子増幅を有していない細胞中のＭＥＴタンパク質発現のレベルと比較した場合、ＭＥＴタンパク質発現のレベルは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、５倍、少なくとも１０倍、または３〜１０倍、３〜５倍、または５〜１０倍上昇する。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、ＥＧＦＲ遺伝子中にＴ７９０Ｍ突然変異を含まない。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、少なくとも１つのＴＫＩ、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤などに耐性である。ある特定の実施形態では、細胞または細胞株は、ＣＬ−３８７，７８５および／またはゲフィチニブに耐性である。
【００３９】
本発明の前述のおよび他の特徴および利点が、以下の添付の図面と併せて以下の例示的な実施形態の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される： 
（項目１）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を該被験体に投与するステップを含む方法。
（項目２）
前記癌が、肺癌、脳の癌、乳癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、または膵癌である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記被験体が、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４活性化変異または遺伝子増幅を有する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記被験体が、ＥＧＦＲ活性化変異またはＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記癌が、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記癌が、以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目１または７に記載の方法。
（項目９）
前記癌が、抗ＥｒｂＢ抗体を用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記癌が、ＥｒｂＢ遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡを用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記癌が、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記癌が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた処置に耐性である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記癌が、以下の抗ＥＧＦＲ治療剤：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブの１つまたは複数を用いた処置に耐性である、項目７に記載の方法。
（項目１４）
以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
以下の抗ＥｒｂＢ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１または１４に記載の方法。
（項目１６）
以下の抗ＥＧＦＲ治療剤：ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＥＸＥＬ−７６４７、ＡＶ−４１２、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブの１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
以下の抗ＭＥＴ治療剤：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
以下の抗ＭＥＴ治療剤：ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５の１つまたは複数が前記被験体に投与される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、前記被験体に同時に投与される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤および前記抗ＭＥＴ治療剤が、同時製剤として前記被験体に投与される、項目１に記載の方法。
（項目２１）
少なくとも１つの追加の処置を前記被験体に施すステップをさらに含む、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記追加の処置が、以下のうちの１つまたは複数である、項目２１に記載の方法：追加の治療剤の投与、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、または手術。
（項目２３）
前記被験体が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記哺乳動物がヒトである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生しており、該被験体がＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法。
（項目２６）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を発生させている場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目２７）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体を検査することによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目２８）
抗ＥｒｂＢ治療剤を評価するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体の集団をモニターすることによって、該治療剤に対する耐性を発生させる被験体を特定するステップと、
（ｉｉ）該耐性の被験体を検査することによって、該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有するかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体が、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップとを含む方法。
（項目２９）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３０）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３１）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３２）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性を回復させるための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３３）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の成長または増殖を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３４）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３５）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を低減するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３６）
ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞中の、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を処置するための方法であって、該細胞を抗ＭＥＴ治療剤および抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させるステップを含む方法。
（項目３７）
前記癌細胞が哺乳動物癌細胞である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物癌細胞がヒト癌細胞である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記癌細胞が細胞株である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記癌細胞が初代組織試料由来である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４１）
前記癌細胞が、肺癌細胞、脳の癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞または膵癌細胞からなる群から選択される、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記癌細胞が任意のＥｒｂＢ誘導性癌である、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
前記癌細胞がＥｒｂＢ活性化変異を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４４）
前記ＥｒｂＢ活性化変異がＥＧＦＲ活性化変異である、項目４４に記載の方法。
（項目４５）
前記癌細胞がＥｒｂＢ遺伝子増幅を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅がＥＧＦＲ遺伝子増幅である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＥｒｂＢ遺伝子増幅が少なくとも２倍である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ＭＥＴ増幅が少なくとも２倍である、項目２９〜４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記癌細胞が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連するＥｒｂＢ遺伝子変異を含む、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の増大に関連する前記ＥｒｂＢ遺伝子変異が、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、抗ＥＧＦＲ治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤、または抗ＥｒｂＢ４治療剤からなる群から選択される、項目２９〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である、項目２９〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、抗体、アンチセンス分子、または小分子キナーゼ阻害剤である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＨＫＩ−２７２、ＥＸＥＬ−７６４７、セツキシマブ、パンチヌムマブ、またはトラスツズマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
前記核酸治療剤がｓｉＲＮＡ分子である、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤である、項目２９〜５６のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＭＥＴに対する抗体、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する抗体である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、またはＯＡ−５Ｄ５である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記核酸治療剤がｓｉＲＮＡ分子である、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記細胞を抗ＭＥＴ治療剤およびＥｒｂＢ治療剤と接触させる前記ステップが、少なくとも１つの追加の処置様式を含む治療レジメンの一部である、項目２９〜６０のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
前記少なくとも１つの追加の処置様式が、前記細胞を１つまたは複数の追加の治療剤と接触させること、照射、光ダイナミック療法、レーザー療法、および手術からなる群から選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した癌に罹患している被験体を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を用いて処置するための候補として特定するための方法であって、該被験体由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を検出するステップを含む方法。
（項目６４）
抗ＭＥＴ治療剤を特定するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得し、ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を含む癌細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物と接触させるステップと、抗ＥｒｂＢ治療剤のみと接触させた同じ細胞中の細胞の過程と比較した、ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ会合の減少、ＥＧＦＲリン酸化の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少、およびアポトーシスの増大からなる群から選択される該細胞の過程の変化を検出するステップとを含む方法。
（項目６５）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されており、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得するリスクのある被験体を特定するための方法であって、該被験体由来の癌細胞中のＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在を検出するステップを含み、該ＭＥＴ活性化変異またはＭＥＴ遺伝子増幅の存在が、該耐性を獲得するリスクを示す方法。
（項目６６）
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を作製するための方法であって、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性である細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも４週間接触させるステップと、該抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定するステップとを含む方法。
（項目６７）
前記細胞が、前記抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子中に変異を含まない、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
項目６６に記載の方法によって作製される細胞。
（項目６９）
抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に耐性である癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤を投与するステップを含む方法。
（項目７０）
前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記抗体が抗ＨＧＦ抗体である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記抗体が抗ＭＥＴ抗体である、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記ＥｒｂＢがＥｒｂＢ−３である、項目２５、２６、２７、または２９に記載の方法。
（項目７４）
前記抗ＥｒｂＢ治療剤が抗ＥｒｂＢ３治療剤である、項目１または２５〜３６に記載の方法。
（項目７５）
前記癌細胞の成長および／または生存がＥｒｂＢによって促進される、項目２９〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた処置に対する耐性を発生させており、該方法は、該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しているかどうかを判定するステップと、ＭＥＴ活性が上昇している被験体に、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を投与するステップとを含む方法。
（項目７７）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、レベルおよび／またはＭＥＴ活性の上昇を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体が、ＭＥＴレベルおよび／または活性の上昇を発生させている場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目７８）
ＥｒｂＢ活性化変異またはＥｒｂＢ遺伝子増幅に関連する癌に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤を用いて処置されている被験体をモニターすることによって、該被験体が、阻害剤に対する耐性を発生させるかどうかを判定するステップと、
（ｉｉ）該被験体を検査することによって、該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇しているかどうかを判定するステップと、
（ｉｉｉ）該被験体のＭＥＴレベルおよび／または活性が上昇している場合、該被験体の処置レジメンを修正することによって、該抗ＥｒｂＢ治療剤に加えて抗ＭＥＴ治療剤を含めるステップと
を含む方法。
（項目７９）
前記ＭＥＴ活性の上昇が、ＭＥＴ遺伝子増幅、ＭＥＴ活性化変異、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連する、項目７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ発現レベルの上昇またはＨＧＦ活性の上昇に関連する、項目７６〜７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化が、ＨＧＦ遺伝子増幅またはＨＧＦ活性化変異に関連する、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記抗ＭＥＴ治療剤が、ＭＥＴのＨＧＦ媒介活性化を阻害する薬剤である、項目７６〜７８のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
前記薬剤が、ＨＧＦがＭＥＴに結合するのを妨げる抗体である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記抗体が、抗ＨＧＦ抗体または抗ＭＥＴ抗体である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
ＥＧＦＲのエクソン１９中の欠失およびＭＥＴ遺伝子増幅を含む細胞株。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞はインビトロでゲフィチニブに耐性であり、ＭＥＴ増幅を含む。Ａ．ＨＣＣ８２７細胞株は、ＥＧＦＲ（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）変異を有しており、ゲフィチニブ感受性（ＩＣ５０−４ｎＭ）であるが、ゲフィチニブの濃度を増加させながら増殖させることによってゲフィチニブ耐性となった。ＨＣＣ８２７親細胞株ならびに２種のゲフィチニブ耐性クローンであるＨＣＣ８２７ＧＲ５およびＨＣＣ８２７ＧＲ６をともに、ゲフィチニブの濃度を増加させながらＭＴＳ生存アッセイに供した。Ｂ．ゲフィチニブ耐性ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は、ゲフィチニブ存在下でＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化を維持する。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞をゲフィチニブの量を増加させながら６時間曝露した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＨＣＣ８２７ＧＲ５は、１０μＭのゲフィチニブが存在する場合でさえ、ＥＲＢＢ３およびＡｋｔ（および程度は小さいがＥＧＦＲ）のリン酸化を維持する。Ｃ．ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は、ゲフィチニブ存在下で、ＥＲＢＢ３およびＭＥＴのリン酸化を維持する。未処理のおよび１μＭのゲフィチニブで処理したＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞の溶解産物を、４２種の異なるホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対する抗体を含有するホスホＲＴＫアレイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）とハイブリダイズさせた。未処理のＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞は大量のｐ−ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＲＢＢ２、ｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＭＥＴを含有する。ゲフィチニブ処理後（右側パネル）、ＨＣＣ８２７細胞ではほんの一部のｐ−ＥＧＦＲが残存する。
【図１−２】ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞はインビトロでゲフィチニブに耐性であり、ＭＥＴ増幅を含む。Ｄ．ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞は、７番染色体に限局的な増幅を含有する。Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用してゲノムワイドなコピー数変化を生じさせ、前述のｄＣｈｉｐプログラムを使用して解析した。ＧＲクローンを親ＨＣＣ８２７細胞株と比較する。右側の赤色の垂直線は親細胞株に対して設定される。見てわかるように、７番染色体長腕に限局的な増幅がある。Ｅ．ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の増幅はＭＥＴを包含しているが、その既知のリガンドＨＧＦまたはＥＧＦＲを包含していない。１Ｄのデータの拡大図。７番染色体の限局的な増幅は７ｇ３１．１〜７ｇ３３．３まで及び、ＭＥＴを含有するがＨＧＦまたはＥＧＦＲを含有しない。
【図２−１】ＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時阻害はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制し、ＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。Ａ．ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞を、ゲフィチニブもしくはＰＨＡ−６６５７５２単独で、または組み合わせて、濃度を増加させながら処理し、ＭＴＳ生存アッセイ（方法）に供した。細胞は、ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せに曝露された場合にのみ顕著に成長を阻害された。Ｂ．ゲフィチニブ、ＰＨＡ−６６５７５２のいずれかまたは両方の薬物を用いて処理されたＨＣＣ８２７ならびにＨＣＣ８２７ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８細胞株のウェスタンブロット解析。細胞を１μＭのゲフィチニブもしくは１μＭのＰＨＡ−６６５７５２単独、または組合せの後に６時間処理した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＨＣＣ８２７親細胞株の場合とは異なり、ｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−Ａｋｔはゲフィチニブ存在下で維持される。親または耐性細胞株におけるＭＥＴ単独阻害はｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−Ａｋｔに顕著な影響を及ぼさない。しかしながら、ゲフィチニブと組み合わせると、ｐ−ＥＲＢＢ３、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ＥＲＫ１／２の顕著な阻害が起こる。Ｃ．ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せは、ＨＣＣ８２７ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８細胞におけるｐ８５とＥｒｂＢ３の結合を妨げる。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞を、１μＭのゲフィチニブもしくは１μＭのＰＨＡ−６６５７５２単独または組合せに６時間曝露させ、その後溶解した。溶解産物を抗ｐ８５抗体で免疫沈降し、この免疫沈降物を抗ホスホチロシン、抗ＥＲＢＢ−３、抗Ｇａｂ１および抗ｐ−８５抗体を用いてプローブした。ＨＣＣ８２７親細胞株において、ＥＲＢＢ３とｐ８５の結合はゲフィチニブにより妨げられるが、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてはゲフィチニブ存在下であってもこの相互作用は維持される。Ｇａｂ１とｐ８５の結合はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてＰＨＡ−６６５７５２単独で妨害される一方、ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の組合せのみがこれらの細胞株においてＥＲＢＢ３をｐ８５から解離させる。
【図２−２】ＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時阻害はＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制し、ＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。Ｄ．対照ｓｈＲＮＡまたはＭＥＴの異なる２つの領域に対するｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスコンストラクトをＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞に感染させ（方法）、ゲフィチニブ存在下での成長をＭＴＳアッセイにより検査した。ＭＥＴに対するｓｈＲＮＡを含有するＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞はゲフィチニブ感受性を回復するが、対照ｓｈＲＮＡに感染させたものは耐性のままである。Ｅ．ゲフィチニブは、ＭＥＴ  ｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞においてＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を下方制御する。対照ｓｈＲＮＡまたはＭＥＴに対するｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞を１μＭのゲフィチニブで６時間処理した。細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。対照ｓｈＲＮＡを感染させたＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞において、ゲフィチニブ処理はｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−ＡＫＴに影響を及ぼさない。対照的に、ＭＥＴの下方制御はＨＣＣ８２７ＧＲ６細胞においてゲフィチニブのｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＡＫＴを下方制御する能力を回復させる。
【図３−１】別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ａ．ＭＥＴ増幅細胞株はＥＲＢＢ３を利用してＰＩ３ＫＩＡＫＴシグナル伝達を活性化する。ＭＥＴ増幅胃癌（ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５）およびＮＳＣＬＣ（Ｈ１９９３）細胞、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ（ＨＣＣ８２７）およびＥＲＢＢ２増幅乳癌細胞（ＢＴ４７４）を、ゲフィチニブ（１μＭ）、ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）、ラパチニブ（１μＭ）またはＣＬ−３８７，７８５（１μＭ）で６時間処理した後、溶解した。溶解産物を抗ｐ８５抗体で免疫沈降し、この免疫沈降物を抗ホスホチロシン、抗ＥＲＢＢ−３および抗ｐ−８５抗体を用いてプローブした（＊ＰＴｙｒブロットに示す）。並行して、溶解産物をウェスタンブロット法により解析し、規定の抗体でプローブした。ＭＥＴ増幅細胞に見られるように、ＰＨＡ−６６５，７５２のみがＥＲＢＢ３とｐ８５の結合妨害ならびにＥＲＢＢ３およびＡｋｔのリン酸化の下方制御を引き起こした。対照として、ＥＧＦＲ変異ＨＣＣ８２７細胞およびＥＲＢＢ２増幅ＢＴ４７４細胞はそれぞれ、ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２阻害剤の存在下においてｐ８５とＥＲＢＢ３の結合の低下ならびにｐ−ＥＲＢＢ３およびｐ−ＡＫＴの下方制御を示す。ＰＨＡ−６６５，７５２はこれらの細胞株のいずれにおいてもＰＩ３シグナル伝達に影響を及ぼさない。
【図３−２】別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ｂ．ＥＲＢＢ３ノックダウンはＳＮＵ−６３８細胞においてｐ−ＡＫＴの下方制御を引き起こす。スクランブル（ＳＣ）配列、ＥＲＢＢ３特異的配列、対照配列（ＣＴＲＬ）またはＧＦＰを含有するレンチウイルスｓｈＲＮＡコンストラクトを、ＳＮＵ６３８細胞に感染させた（方法）。感染から７２時間後、細胞を溶解し、規定の抗体でプローブした。ＥＲＢＢ３特異的ｓｈＲＮＡはｐ−ＡＫＴの下方制御を引き起こす。Ｃ．ＥＲＢＢ３ｓｈＲＮＡはＳＮＵ−６３８細胞の成長を阻害する。ＳＮＵ−６３８細胞の成長を、ＢのｓｈＲＮＡコンストラクトの感染から５日後、ＭＴＳアッセイにより検査した。成長はＳＣｓｈＲＮＡに標準化した。ＥＲＢＢ３ｓｈＲＮＡの感染はＳＮＵ−６３８細胞の顕著な成長阻害を引き起こす。Ｄ．ＣＨＯ細胞においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。ＣＨＯ細胞を、ＧＦＰ、ＥＲＢＢ３ｃＤＮＡ単独でまたＭＥＴｃＤＮＡと組み合わせてトランスフェクトした。細胞を、ＰＨＡ−６６５，７５２（１ＰＭ）、ゲフィチニブ（３μＭ）、ラパチニブ（３μＭ）またはＰＰ２（１０μＭ）で６時間処理し、処理した細胞を溶解しｐ−ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ３でプローブした。見てわかるように、ＥＲＢＢ３はＭＥＴの存在下でのみリン酸化され、このリン酸化はＰＨＡ−６６５，７５２により阻害されるが、ゲフィチニブ、ラパチニブまたはＰＰ２では阻害されない。
【図３−３】別のＭＥＴ増幅細胞株においてＭＥＴはＥＲＢＢ３を活性化する。Ｅ．ＥＲＢＢ３はＭＥＴの存在下でｐ８５と共沈し、またＰＨＡ−６６５，７５２により阻害される。ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）、ゲフィチニブ（３μＭ）またはラパチニブ（３μＭ）の存在下または非存在下で、ＧＦＰ、ＥＲＢＢ３またはＭＥＴ、およびＥＲＢＢ３を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＥＲＢＢ３を用いて免疫沈降を行った。得られたタンパク質を溶解し、規定の抗体でプローブした。見てわかるように、ｐ８５はＭＥＴの存在下でのみＥＲＢＢ３と共沈し、これはＰＨＡ−６６５，７５２により阻害されるが、ゲフィチニブまたはラパチニブでは阻害されない。Ｆ．ＣＨＯ細胞のＭＥＴおよびＥＲＢＢ３共沈物。ＰＨＡ−６６５，７５２（１μＭ）処理有りまたは無しで、ＧＦＰ、ＭＥＴ単独、ＥＲＢＢ３単独またはＭＥＴおよびＥＲＢＢ３を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ＭＥＴを使用した免疫沈降を行った。得られた溶解産物をＥＲＢＢ３またはＭＥＴでプローブした。見てわかるように、ＭＥＴのみが両方のコンストラクトでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＥＲＢＢ３を免疫沈降させる。
【図４】異種移植片およびＮＳＣＬＣ患者の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析。ＨＣＣ８２７細胞およびＨＣＣ８７５ＧＲ５細胞異種移植片のパラフィン切片に対して、およびゲフィチニブ処理前および後の患者８の腫瘍標本に対して（図５）二重色ＦＩＳＨ（ＣＥＰ７（緑色）、１Ｄ７Ｓ５２２（赤色））を行った。ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞およびゲフィチニブ処理後腫瘍標本においてＭＥＴ増幅が明らかである。これらの画像の倍率は１０００×である。
【図５】ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する耐性を獲得したＮＳＣＬＣ患者における遺伝子変化の要約。ＥＧＦＲ変異を有する１８人のＮＳＣＬＣ患者を、処理前および後の標本の対（ｎ＝８）または処理後の標本のみ（ｎ＝１０）を用いて、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍの存在およびＭＥＴ増幅に関して定量ＰＣＲまたはＦＩＳＨによって解析した。結果の列は、ＱＰＣＲによって解析された患者のＭＥＴコピー数（標準偏差）およびＦＩＳＨによって解析された患者のＣＥＰ７と比較してさらに＞３のＭＥＴ遺伝子座のコピーを有する細胞のパーセントを示す。ＭＥＴ増幅を有する腫瘍標本に星印を付けている。１８人の患者のうち４人（２２％）に、処理後腫瘍標本における明らかなＭＥＴ増幅が見られ、１／４においてこの増幅はＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ同時変異を有する標本に起こる。
【図６】ＨＣＣ８２７耐性細胞および親細胞株について、定量ＰＣＲによって測定されたＭＥＴコピー数のプロットを示す。結果は、ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してすべてのＨＣＣ８２７耐性細胞株においてＭＥＴが５〜１０倍増幅されたことを示す。
【図７】親および耐性細胞をゲフィチニブ単独で、ＰＨＡ−６６５，７５２単独で、または両薬物を組み合わせて処理する。細胞抽出物を免疫ブロットし、規定の抗体でタンパク質を検出した。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞は、ゲフィチニブおよびＭＥＴキナーゼ阻害剤ＰＨＡ−６６５，７５２の両方で処理した後のみ、アポトーシスを受ける。対照的に、切断された（８９ｋＤＡ）ＰＡＲＰの出現による基準としてアポトーシスを誘導するにはゲフィチニブ単独で十分である。
【図８】ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してＨＣＣ８２７ＧＲクローンにおいて特異に過剰発現される上位２０個の遺伝子が示されている。遺伝子の染色体位置および発現レベルの（６個のＨＣＣ８２７ＧＲクローンの）平均倍率変化もまた示されている。
【図９】ＦＩＳＨにより分析した患者標本の破壊。各サンプルにおいて１００個の細胞を計数し、ＣＥＰ７と比較してさらに２個または３個より多いＭＥＴコピーを含有する細胞のパーセントを示す。
【図１０】ＨＧＦおよびゲフィチニブで処理した細胞の生存曲線。左上パネル、時間に対する生存細胞パーセント。右上パネルは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ゲフィチニブ（ＴＨＩ）、またはＨＧＦおよびゲフィチニブの両方を用いて処理した細胞においてＡｋｔおよびリン酸化Ａｋｔを検出するウェスタンブロットを図示する。下パネルはＨＧＦおよびゲフィチニブで処理したディッシュにおける生存細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
１．定義
本明細書で使用する場合、以下の用語および語句は、以下に示す意味を有する。他で定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４２】
用語「など」は、語句「それだけに限らないが、〜など」を意味するのに本明細書で使用し、これと互換的に使用する。
【００４３】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、脈絡により他に明確に指示されていない限り、複数の参照を含む。
【００４４】
用語「癌」は、本明細書で使用する場合、前癌性細胞と癌性細胞、および組織、ならびにすべての転移に対して、悪性であっても良性であっても、すべての腫瘍性の細胞成長ならびに増殖を指す。２つの一般的な癌の種類、すなわち良性と悪性が存在する。ほとんどすべての良性癌は被包性であり、非侵襲性である。対照的に、悪性癌は、ほとんど決して被包性ではなく、浸潤性、破壊性の成長によって隣接組織を浸潤する。この浸潤性成長に続いて、癌細胞が、原発癌と不連続な部位に移植する場合がある。最初の位置から遊走し、重要な器官を刺激する（それによって、転移性の病変を生じる）癌は、患部器官の機能劣化を通じて、最終的に対象の死に至る場合がある。転移は、原発癌から体の他の部分への癌細胞の内転移から生じる、原発癌の位置と異なる癌細胞の領域である。
【００４５】
用語「含む」および「含むこと」は、開放性の意味、すなわち追加の要素を含むことができる意味を含めて使用する。
【００４６】
用語「含めて」は、「それだけに限らないが、〜を含めて」を意味するのに使用する。「含めて」および「それだけに限らないが、〜を含めて」は、互換的に使用する。
【００４７】
「患者」または「対象」は、当技術分野で既知の哺乳動物を指す。例示的な哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタなどを含めて）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、当業者に十分に理解されているように、「治療」は、臨床的結果を含めた有益な、または所望の結果を得るための手段である。有益な、または所望の臨床的結果として、それだけに限らないが、検出可能であっても、検出不可能であっても、１つまたは複数の症状または状態の軽減または寛解、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患の蔓延の予防、疾患の経過の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、緩解（部分的または全体的）を挙げることができる。「治療」は、治療を受けていない場合に予期される生存時間と比較して、生存期間を延長することも意味することができる。
【００４９】
２．ＥＧＦＲ  ＴＫＩ耐性の癌を治療するための方法
本明細書では、抗ＥｒｂＢ治療剤と抗ＭＥＴ治療剤の組合せを使用して、癌を治療し、癌にかかっている対象の平均余命を延長し、または１つもしくは複数の、癌に関連する症状を低減するための方法を提供する。例えば、抗ＥｒｂＢｌ治療剤（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）、抗ＥｒｂＢ２治療剤（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ／Ｈｅｒ２）、抗ＥＲＢ３治療剤（ＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３）、または抗ＥｒｂＢ４治療剤（ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４）を含めた任意の抗ＥｒｂＢ治療剤を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ活性および／または発現レベルの上昇（例えば、ＥｒｂＢ活性化突然変異、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、またはリガンド媒介ＥｒｂＢ活性化）ならびにＭＥＴ活性および／または発現レベルの上昇（例えば、ＭＥＴ活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化など）に関連する癌に罹患している対象を治療するのに使用することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化は、ＨＧＦ活性および／または発現レベルのレベルの上昇（例えば、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅など）に関連する場合がある。
【００５０】
例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、以下の種類の癌の１つまたは複数を治療するのに使用することができる：卵巣、膵臓、肺、脳、乳房、頭頸部、大腸、胃、膵臓、直腸、腎臓、肝臓、膀胱、前立腺、胃、甲状腺、下垂体、副腎性またはグリア芽細胞腫の癌。例示的な実施形態では、この方法は、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などを治療するのに使用することができる。
【００５１】
癌に関連する場合があるＥｒｂＢ活性化突然変異の例として、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、反転またはＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる遺伝子増幅が挙げられる。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性（ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ４）、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、またはＥｒｂＢ媒介シグナル伝達が挙げられる。突然変異は、ＥｒｂＢ遺伝子の任意の部分、またはＥｒｂＢ遺伝子に関連する調節領域に位置することができる。例示的なＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）突然変異には、例えば、エクソン１８、１９、２０または２１における突然変異、キナーゼドメインにおける突然変異、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ｒ７４８  ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３  ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７  Ａｌ
ｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９  ＳＶＡ  ｉｎｓ、Ｐ７７２−Ｈ７７３  ＮＳ  ｉｎｓ、２４０２Ｇ＞Ｃ、２４８２Ｇ＞Ａ、２４８６Ｔ＞Ｃ、２４９１Ｇ＞Ｃ、２４９４Ｇ＞Ｃ、２５１０Ｃ＞Ｔ、２５３９Ｇ＞Ａ、２５４９Ｇ＞Ｔ、２５６３Ｃ＞Ｔ、２８１９Ｔ＞Ｃ、２４８２−２４９０  ｄｅｌ、２４８６−２５０３  ｄｅｌ、２５４４−２５４５  ｉｎｓ  ＧＣＣＡＴＡ、２５５４−２５５５  ｉｎｓ  ＣＣＡＧＣＧＴＧＧ、または２５６２−２５６３  ｉｎｓ  ＡＡＣＴＣＣが含まれる。ＥｒｂＢ１活性化突然変異の他の例は、当技術分野で既知である（例えば、米国特許公開第２００５／０２７２０８３を参照されたい）。例示的なＥｒｂＢ２突然変異には、例えば、キナーゼドメインにおける突然変異、またはエクソン２０挿入、例えば、Ｇ７７６ｉｎｓＶ＿Ｇ／ＣおよびＡ７７５ｉｎｓＹＶＭＡなどが含まれる。例示的なＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４突然変異として、例えば、キナーゼドメインにおける突然変異を挙げることができる。ヒトＥｒｂＢｌ、ヒトＥｒｂＢ２、ヒトＥｒｂＢ３およびヒトＥｒｂＢ４を含めた様々なＥｒｂＢ配列についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、公的に入手可能であり、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．でのワールドワイドウェブ上で見出すことができる。例えば、ヒトＥｒｂＢｌ（ＥＧＦＲ）についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００５２２８およびＮＰ＿００５２１９に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ２についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４４４８およびＮＰ＿００４４３９に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ３についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１９８２およびＮＰ＿００１９７３に見出すことができ、ヒトＥｒｂＢ４についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００５２３５およびＮＰ＿００５２２６に見出すことができる。受容体ホモ−およびヘテロ−二量体を含めたＥｒｂＢ受容体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達に関与するシグナル伝達分子についての情報は、当技術分野で既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ５巻：３４１〜３５４頁（２００５年）を参照されたい）。
【００５２】
他の実施形態では、ＥｒｂＢ活性化突然変異は、ＥｒｂＢ配列自体の外側の突然変異であってもよく、これは、ＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。例えば、ＥｒｂＢリガンドを過剰発現させる突然変異は、ＥｒｂＢ活性を増大させることができ、したがって、ＥｒｂＢ活性化突然変異とみなされるであろう。同様に、ＥｒｂＢ発現に関与する転写因子を過剰発現させる突然変異は、ＥｒｂＢタンパク質を過剰発現させ、ＥｒｂＢ活性を増大させることができ、したがって、やはりＥｒｂＢ活性化突然変異とみなされるであろう。そのような例は単に例示的であり、様々な他のＥｒｂＢ活性化突然変異は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者によって企図することができる。
【００５３】
例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗ＥｒｂＢ１療法、抗ＥｒｂＢ２療法、抗ＥｒｂＢ３療法、および／または抗ＥｒｂＢ４療法を含めた、１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ療法を用いた療法に耐性を獲得した癌を治療するのに使用することができる。様々な抗ＥｒｂＢ治療剤は、当技術分野で既知であり、例えば、小分子治療剤、タンパク質治療剤、または核酸治療剤を含む。さらに、抗ＥｒｂＢ治療剤の例は、本明細書で以下に提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤を用いた治療に耐性である癌を治療するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤を用いた療法に耐性である癌を治療するのに使用することができる。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ゲフィチニブ、エルロチニブまたは両方を用いた治療に耐性である癌を治療するのに使用することができる。
【００５４】
様々な質的および／または定量的な方法を、対象が抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性を発生させている、または耐性を発生させることに感受性であるかを判定するのに使用することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を服用しながら最初の改善を示した対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤の有効性が小さくなり、またはもはや有効でなくなった徴候を示す場合がある。耐性と関連して低下または減少し得る、有効な抗ＥｒｂＢ治療剤の例示的な指標には、例えば、患者の健康の改善、腫瘍サイズの減少または縮小、腫瘍成長の停止または減速、および／または体内の他の部位への癌細胞の転移のないことが含まれる。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性に関連し得る症状として、例えば、患者の健康の低下または横ばい状態、腫瘍サイズの増大、腫瘍成長低下の停止または減速、および／または１つの部位から他の器官、組織、または細胞への体内での癌性細胞の蔓延が挙げられる。
【００５５】
癌に関連する様々な症状は、抗ＥｒｂＢ療法に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性である対象を特定するのに使用することもできる。特に、そのような症状は、抗ＥｒｂＢ療法を用いて治療されている対象において、発症、悪化、または再発する場合がある。例示的な症状として、例えば、食欲不振症、認知機能障害、抑うつ症、呼吸困難、疲労、ホルモン撹乱、好中球減少、疼痛、末梢ニューロパチー、および性機能障害が挙げられる。癌に関連する症状は、癌の種類によって変化し得る。例えば、子宮頚癌に関連する症状には、例えば、異常出血、異常な大量の腟分泌物、通常の月経周期に関係していない骨盤痛、排尿の間の膀胱痛または疼痛、および規則的な月経期の間、性交、圧注、もしくは骨盤内診察後の出血が含まれる。肺癌に関連する症状として、例えば、持続性の咳、喀血、息切れ、喘鳴胸痛、食欲低下、試みや疲労を伴わない体重低下を挙げることができる。肝癌に対する症状として、例えば、食欲ならびに体重低下、特に、背中および肩に及ぶ場合のある、腹部の右上部分の腹痛、吐き気ならびに嘔吐、一般的な脱力感ならびに疲労、肝肥大、腹部膨満（腹水）、ならびに皮膚および白眼の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学における当業者は、特定の癌の種類に関連する症状を容易に特定することができる。
【００５６】
対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させたかどうかを判定するための他の手段には、例えば、以下のうちの１つまたは複数を検査することが含まれる：ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４リン酸化、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）媒介シグナル伝達、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４媒介シグナル伝達、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、または癌細胞アポトーシス。例えば、対照と比較した場合の、ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達、および／またはＥｒｂＢ媒介シグナル伝達の増大は、対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性であることを示している場合がある。ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を判定するための方法は、既知の技法を使用して決定することができ、本明細書でさらに説明される。
【００５７】
さらに、対照と比較した場合の、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性の減少、癌細胞の成長もしくは増殖の増大、および／または癌細胞アポトーシスの減少も、対象が、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性であることを示している場合がある。本明細書でさらに説明される標準的な方法を使用して、癌細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスを判定することが可能である。例えば、癌細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスは、インサイチュまたはインビトロで判定することができる。インサイチュでの測定では、例えば、癌の成長または転移を検査することによって、対象における抗ＥｒｂＢ療法の効果を観察することができる。あるいは、対象由来の癌細胞の試料を取り出し、インビトロで試験することによって、例えば、対象由来の細胞の感受性、成長、増殖またはアポトーシスを判定することができる。インビトロ分析では、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いてインサイチュで処理し、次いでインビトロでの分析のために対象から取り出した細胞の分析を行うことができ、または癌細胞をインビトロで抗ＥｒｂＢ療法と接触させることができる。癌細胞の成長、増殖およびアポトーシスを検査するための適当な方法を、以下にさらに説明する。
【００５８】
様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性の１つまたは複数の測定値を対照と比較することが望ましい場合がある。例示的な対照として、例えば、治療前の同じ対象、治療の間のより早い時点での同じ対象、または療法に耐性であってもなくてもよい、同じ抗ＥｒｂＢ療法を受けている異なる対象における、健康、腫瘍サイズ、腫瘍成長、または転移の存在または速度が挙げられる。他の種類の適当な対照として、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の間のより早い時点での同じ対象、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の前の同じ対象、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に応答性である対照の対象、既知の抗ＥｒｂＢ応答性を有する細胞株、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性である対照の対象に由来する細胞の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性、成長、増殖もしくはアポトーシス、または所与の測定についての基準値が挙げられる。そのような対照は、所与の対象について上述したものと類似したインサイチュ測定またはインビトロ測定とすることができる。様々な実施形態では、対照は、治療前の同じ対象からの同じ組織由来の細胞、治療の間のより早期の同じ対象からの同じ組織由来の細胞、同じ対象由来の非腫瘍形成性細胞、他の対象由来の非腫瘍形成性細胞、集団または複数の対象由来の非腫瘍形成性細胞、または確立された細胞株を利用することができる。対照は、ハードコピーまたはデータベースにおける基準値または表とすることもでき、これは、関連情報、例えば、性別、癌の状態、任意の転移の存在、投与される任意の種類の治療、ＥｒｂＢ遺伝子中の活性化突然変異または遺伝子増幅の存在または非存在、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異または遺伝子増幅の存在または非存在、ＥｒｂＢリン酸化のレベル、ＰＩ３Ｋシグナル伝達のレベルなどを場合により伴った１つまたは複数の個体から導き出すことができる。
【００５９】
さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた対照の識別では、例えば、ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異、またはＭＥＴ遺伝子増幅から生じる、ＭＥＴ発現レベルの上昇、またはＭＥＴ活性の上昇を検出することができる。ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異は、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、反転またはＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる遺伝子増幅を含めた任意の種類の突然変異とすることができる。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＭＥＴ媒介シグナル伝達が挙げられる。突然変異は、ＭＥＴ遺伝子の任意の部分、またはこの遺伝子に関連する調節領域に位置することができる。例示的な突然変異には、例えば、ＭＥＴのキナーゼドメインにおける突然変異、または野生型ＭＥＴと比べて、以下の位置の任意の１つまたは複数でのアミノ酸変化をもたらす突然変異が含まれる：Ｎ３７５、Ｉ６３８、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｉ３１６およびＥ１６８。ＭＥＴ突然変異または遺伝子増幅を検出するための方法は、当技術分野で認められた技法を伴い、これらは、本明細書でさらに説明される。他の実施形態では、ＭＥＴ活性化突然変異は、ＭＥＴ配列自体の外側の突然変異であってもよく、これは、ＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。例えば、ＭＥＴリガンドを過剰発現させる突然変異は、ＭＥＴ活性を増大させることができ、したがって、ＭＥＴ活性化突然変異とみなされるであろう。同様に、ＭＥＴ発現に関与する転写因子を過剰発現させる突然変異は、ＭＥＴを過剰発現させ、ＭＥＴ活性を増大させることができ、したがって、やはりＭＥＴ活性化突然変異とみなされるであろう。そのような例は単に例示的であり、様々な他のＭＥＴ活性化突然変異は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者によって企図することができる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ＭＥＴ活性のレベルの上昇は、ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化と関連することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化は、例えば、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅と関連することができる。ＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化、ＨＧＦ活性化突然変異またはＨＧＦ遺伝子増幅を検出するための方法は、当技術分野で認められた技法を伴い、これらは、本明細書でさらに説明される。
【００６１】
例示的な実施形態では、上記方法の組合せは、抗ＥｒｂＢ療法に対する耐性を発生させた、または耐性を発生させることに感受性である対象を識別するのに使用することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の過程の間、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移を、医師によってモニターすることができる。対象が、抗ＥｒｂＢ療法の有効性が低下していることを示す症状を示し始めた場合、二次スクリーニングを使用することによって、抗ＥｒｂＢ療法に耐性となってきている対象を識別することができる。例えば、対象をスクリーニングすることによって、ＥｒｂＢリン酸化、ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達、ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、癌細胞アポトーシス、および／またはＭＥＴ活性もしくは発現のレベルの上昇、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、もしくはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化などの存在を検査することができる。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ療法を受けている対象は、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移に基づいて、耐性の徴候について治療過程の間モニターされる。次いで抗ＥｒｂＢ療法に耐性であるリスクの疑いのある対象は、試験されることによって、その対象がＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化を有するかどうかを識別される。他の実施形態では、対象の健康、腫瘍サイズ、および／または癌の転移に関わらず、ＭＥＴ遺伝子の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化の存在について、抗ＥｒｂＢ療法を用いた治療過程の間、対象をモニターすることができる。さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ療法を用いた治療を受けている対象を、治療の間モニターすることによって、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性、癌細胞の成長もしくは増殖、および／または癌細胞アポトーシスを判定することができる。次いで抗ＥｒｂＢ治療剤に耐性であるリスクの疑いのある対象は、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化の存在について試験することができる。上述した組合せは単に例示的であり、すべての他の可能な組合せも本明細書で企図されており、本開示に基づけば当業者に明白となるであろう。
【００６２】
様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性についてモニターされている対象は、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療の過程の間、１つまたは複数の時点で評価することができる。例示的な実施形態では、対象は、治療過程の間、規則的な間隔でモニターすることができる。例えば、対象は、それぞれ医師に診てもらう間、それぞれの抗ＥｒｂＢ治療剤の投薬などを施すとともに、少なくとも１日１回、１日おきに１回、１週間に１回、１週間おきに１回、１カ月に１回モニターすることができる。モニタリングは、対象による自己評価、医師による評価、実験室試験に基づく評価、およびこれらの様々な組合せを伴うことができる。
【００６３】
抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させ、またはそのような耐性を発生させることに感受性となり、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化を有する対象が特定された時点で、抗ＥｒｂＢ療法と抗ＭＥＴ療法の組合せがその患者に投与される。例示的な抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を本明細書でさらに説明する。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤は、以下の１つまたは複数からそれぞれ個々に選択される：小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤。例示的な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＥＧＦＲ治療剤、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２、ＥＸＥＬ−７６４７、ＨＫＩ−２７２、セツキシマブ、パンチヌムマブ、もしくはトラスツズマブ、またはこれらの組合せなどであり、抗ＭＥＴ治療剤は、ＰＨＡ−６６５，７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＰＦ−０２３４１０６６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、もしくはＯＡ−５Ｄ５、またはこれらの組合せである。
【００６４】
ある特定の実施形態では、抗ＭＥＴ治療剤との組合せの一部として投与される抗ＥｒｂＢ治療剤は、対象が耐性を発生させたのと同じ抗ＥｒｂＢ治療剤である。例えば、対象が、エルロチニブ（抗ＥｒｂＢ１治療剤）を用いて治療されており、次いでこの治療剤に対する耐性を発生させた場合、この対象は、将来、エルロチニブと、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２（抗ＭＥＴ治療剤）の組合せを用いて治療することができる。あるいは、抗ＥｒｂＢ治療剤は、対象が耐性を発生させた治療剤と異なっていてもよい。例えば、対象が、エルロチニブを用いて治療されており、次いでこの治療剤に対する耐性を発生させた場合、この対象は、将来、ゲフィチニブ（別の抗ＥｒｂＢ１治療剤）と、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２を用いて治療することができる。これらの組合せは単に例示的であり、多くの他の組合せは本明細書で企図されており、本開示に基づけば当業者に明白となるであろう。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法では、抗ＥｒｂＢ治療剤と抗ＭＥＴ治療剤の組合せを投与する。抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含む併用療法は、（１）少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤および少なくとも１つの抗ＭＥＴ治療剤の同時製剤を含む医薬組成物、ならびに（２）抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤が同じ組成物中で製剤化されていない（しかし、同じキットまたはパッケージ、例えばブリスター包装または他の多容器（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｍｂｅｒ）パッケージなど；使用者によって分離することができる、接続された、別々に密閉された容器（例えば、フォイルポーチ（ｆｏｉｌ  ｐｏｕｃｈ））；または治療剤が別々の容器中にあるキット内に存在することができる）、１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤と、１つまたは複数の抗ＭＥＴ治療剤の同時投与を指すことができる。別々の製剤を使用する場合、治療剤は、同じ時間（同時に）、断続的に、または交互に投与することができ、様々な実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤は、抗ＭＥＴ治療剤の前に、もしくは抗ＭＥＴ治療剤に続いて、または前述の様々な組合せで投与することができる。
【００６６】
様々な実施形態では、本明細書に提供される方法では、例えば、ＥｒｂＢ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、および／またはＨＧＦ遺伝子の活性化突然変異または遺伝子増幅を識別するために、対象由来の生体試料の分析を行う。例えば、対象から採取した体液試料、細胞試料、または組織試料を含めた、任意の適当な対象由来の生体試料を、本方法に従って使用することができる。適当な体液として、それだけに限らないが、胸膜液試料、肺または気管支の洗浄液試料、滑液試料、腹膜液試料、骨髄穿刺液試料、リンパ液、脳脊髄液、腹水試料、羊膜液試料、痰試料、膀胱洗浄液、精液、尿、唾液、涙、血液、ならびにその成分血清および血漿などが挙げられる。例示的な実施形態では、生体試料は、対象における１つまたは複数の部位に由来する癌細胞を含む試料である。例えば、腫瘍生検または切除から得た生体試料を使用することができる。ある特定の実施形態では、対象内の１つを超える部位に由来する腫瘍試料を試験することが望ましい場合がある。対象が１つを超える部位で腫瘍を有する場合、それぞれの腫瘍部位で、ＥｒｂＢ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、および／またはＨＧＦ遺伝子の活性化突然変異または遺伝子増幅について試験することによって、腫瘍が、同じまたは異なる遺伝子修飾に関連するのかを判定することが望ましい場合がある。
【００６７】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、他の治療または治療剤、例えば、抗原、アジュバント、免疫調節剤、もしくは抗体を含む受動免疫療法などの他の免疫療法などとともに使用することができる。抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、非薬物治療、例えば、手術、放射線療法、または化学療法などとともに投与することもできる。他の療法は、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を用いた治療の前、同時、または後に投与することができる。抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を、他の治療の前または後に投与することができるように、異なる治療の投与の間に、数時間、数日、および場合によって数週間の遅延が存在することもある。
【００６８】
一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、別の抗癌療法、特に、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の投与を含まない別の抗癌療法とともに（すなわち、前、間、または後）に対象に投与される。例えば、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、例えば以下のものなどの腫瘍学の当業者に既知の化学療法薬の任意の１つまたは複数と一緒に投与することができる（参考文献：Ｃａｎｃｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ＤｅＶｉｔａ，  Ｖ．  Ｔ．、Ｈｅｌｌｍａｎ，  Ｓ．、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ａ．、６版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１年）：アバレリクス、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アンチド、アリミデクス、アシミシン、アスパラギナーゼ、ＡＺＤ２１７１（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ（商標））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ／ＢＣＧ（ＴｈｅｒａＣｙｓ（商標）、ＴＩＣＥ（商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標））、ブラタシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（商標））、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ジスコデルモリド、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））、ドキソルビシン、Ａｂｘ−ＥＧＦ、エポチロン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、フィルグラスチム、フラボピリドール、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルベストラント、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））、ゲニステイン、ゴセレリン、グアナコン（ｇｕａｎａｃｏｎｅ）、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ（商標））、インターフェロン、インターロイキン、イリノテカン、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））、イロノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、イクサベピロン（ＢＭＳ−２４７５５０）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、パミドロネート、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、ラルチトレキセド（Ｔｏｍｕｄｅｘ（商標））、ラパマイシン、ランプトテシン（ｒａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ��、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、ロリニアスタチン、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（商標）／Ｂａｙｅｒ  ＢＡＹ４３−９００６）、スクアモシン、スクアモタシン（ｓｑｕａｍｏｔａｃｉｎ）、ストレプトゾシン、スラミン、リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（商標））、タモキシフェン、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（商標））、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（商標））、トラスツズマブ、トレチノイン、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ゾレドロネート。
【００６９】
抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、癌のための非薬物治療、例えば、癌塊を除去するための外科的手順、化学療法または放射線療法などとともに使用することもできる。非薬物療法は、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法を用いた治療の前、同時、または後に投与することができる。本発明の薬剤を、他の治療の前または後に投与することができるように、異なる治療の投与の間に、数時間、数日、および場合によって数週間の遅延が存在することもある。
【００７０】
一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、外科的手順の間、例えば、腫瘍の除去または腫瘍生検の間などに投与することができる。癌を治療するための外科的方法には、腹腔内手術、例えば、右または左結腸半切除、Ｓ字の、亜全または全結腸切除および胃切除、根治的または部分的乳房切除、前立腺切除および子宮摘出などが含まれる。一実施形態では、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、腫瘍の外科的除去の後、または間に、癌塊の範囲に局所的に投与することができる。
【００７１】
さらに、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法は、外部ビーム照射、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）を含めた任意の形態の放射線療法、ならびに例えば、γナイフ、サイバーナイフ、ライナック、および組織内照射（例えば、インプラント放射性シードまたはＧｌｉａＳｉｔｅバルーンなど）を含めた任意の形態の放射線手術と一緒に投与することができる。
【００７２】
別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＥｒｂＢリン酸化を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４の１つまたは複数のリン酸化を低減するのに使用することができる。ＥｒｂＢリン酸化を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、抗ホスホＥｒｂＢ抗体を使用することによって、細胞（例えば、免疫組織化学的技法）または細胞可溶化物中のリン酸化ＥｒｂＢの存在および／または量を判定することができる。あるいは、細胞可溶化物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させ、ニトロセルロースにブロットし、次いで抗ＥｒｂＢ抗体でプローブすることによって、細胞中の１つまたは複数のリン酸化ＥｒｂＢタンパク質の存在および／または量を検出することができる。さらに、抗ＥｒｂＢ（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ４）抗体を使用することによって、細胞可溶化物からＥｒｂＢタンパク質を免疫沈降することができ、次いでこのＥｒｂＢタンパク質をキナーゼアッセイにおいて使用することによって、細胞中の活性な、リン酸化ＥｒｂＢタンパク質の存在を検出することができる。ＥｒｂＢタンパク質についての適当なキナーゼアッセイは、タンパク質基質のリン酸化を測定するための方法として当技術分野で公知である。さらに別の実施形態では、抗ＥｒｂＢタンパク質の存在および／または量は、ホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アレイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）を使用して判定することができる。ＥｒｂＢ１、ホスホＥｒｂＢ１、ＥｂＢ２、ホスホＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ホスホＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４およびホスホＥｒｂＢ４に特異的な抗体は市販されている（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡを参照されたい）。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＥｒｂＢリン酸化のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。
【００７３】
別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、ＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇（例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連した）を含む。ＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許公開第２００５／０１７０４３９号には、ＥｒｂＢ受容体とＰＩ３キナーゼの間に形成される結合複合体を判定するための方法が記載されている。あるいは、ＰＩ３Ｋ活性化に応答してリン酸化されるタンパク質（例えば、Ａｋｔなど）のリン酸化形態の存在または非存在は、基質に特異的な抗体を使用してアッセイすることができる。ＰＫＢ／ＡＫＴの様々なリン酸化形態に特異的な抗体は市販されている（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）  Ｌｔｄ  ｏｆ  Ｈｉｔｃｈｉｎ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅを参照されたい）。他の適当な抗体は、当業者にわかるであろう。これらのタンパク質を測定するためのイムノアッセイは、多くの様々な、好都合な方法で実施することができ、これは当業者に公知である。あるいは、免疫組織化学的技法を使用することによって、癌細胞中のＰＫＢ／ＡＫＴのリン酸化形態を同定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＰＩ３Ｋ媒介シグナル伝達のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。
【００７４】
別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞におけるＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を低減するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法を使用することによって、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４の１つまたは複数によって媒介されるシグナル伝達を低減することができる。ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、ＥｒｂＢタンパク質の基質に特異的な抗体を使用することによって、細胞（例えば、免疫組織化学的技法）または細胞由来の溶解産物（例えば、ウエスタンブロッティング法）中に存在するリン酸化基質の存在を特定し、またはその量を求めることができる。さらに、ＥｒｂＢ基質は、細胞可溶化物から免疫沈降させ、活性アッセイにおいて使用することによって、この基質がリン酸化され、したがってＥｒｂＢ受容体キナーゼによって活性化されており、それによってＥｒｂＢ媒介シグナル伝達を反映しているかどうかを判定することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞中のＥｒｂＢ媒介シグナル伝達のレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。
【００７５】
別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、（ｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の感受性を回復し、（ｉｉ）抗ＥｒｂＢ治療剤に対する癌細胞の耐性を低減し、かつ／または（ｉｉｉ）癌細胞における、獲得された抗ＥｒｂＢ治療剤耐性を治療するための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法を使用することによって、以下のもの、すなわち、抗ＥｒｂＢ１治療剤、抗ＥｒｂＢ２治療剤、抗ＥｒｂＢ３治療剤および／または抗ＥｒｂＢ４治療剤の１つまたは複数に対する癌細胞の感受性を回復し、耐性を低減し、かつ／または獲得された耐性を治療することができる。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する細胞の感受性および／または耐性を検査するための方法は、当技術分野で既知である。例えば、細胞成長および／または増殖の量、ならびに／またはアポトーシスの量は、抗ＥｒｂＢ治療剤単独と比較した場合、抗ＥｒｂＢ／抗ＭＥＴ併用療法の存在下で求めることができる。癌細胞の細胞成長および／または増殖の減少、ならびに／またはアポトーシスの増大は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する感受性の増大、または耐性の低減を示す。細胞成長、増殖およびアポトーシスを検査するための方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で以下にさらに説明する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、細胞を、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤と接触させることによって、癌細胞の成長および／または増殖を低減し、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法を提供する。例示的な実施形態では、癌細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得しており、例えば、ＭＥＴ遺伝子中の活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化に関連するＭＥＴ活性および／または発現のレベルの上昇を含む。癌細胞の成長および／または増殖および／またはアポトーシスを検査するための方法は、当技術分野で公知である。細胞成長および／または増殖ならびに／またはアポトーシスを判定するための例示的な方法には、例えば、アラマーブルー、Ｂｒｄ
Ｕ、ＭＴＴ、トリパンブルー排除、３Ｈ−チミジン取り込み、ならびにＸＴＴアッセイが含まれる。細胞成長および／または増殖ならびに／またはアポトーシスを判定するためのキットは、様々な供給源から市販されている。ある特定の実施形態では、癌細胞の成長および／または増殖および／またはアポトーシスのレベルを、対照、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤、抗ＭＥＴ治療剤、もしくは両方と接触していない細胞、または異なる量の、治療剤の１つもしくは両方と接触した細胞、または所与のアッセイに対する期待値などの基準値と比較することが望ましい場合がある。
【００７７】
３．抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤
本明細書に記載される様々な方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を利用する。抗ＥｒｂＢ活性または抗ＭＥＴ活性を示す任意の種類の治療剤を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。抗ＥｒｂＢ活性を有する治療剤は、ＥｒｂＢタンパク質の少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズ（例えば、低減または阻害）する任意のものである。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性（ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ４について）、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＥｒｂＢ媒介シグナル伝達が挙げられる。同様に、抗ＭＥＴ活性を有する治療剤は、ＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズ（例えば、低減または阻害）する任意のものである。例示的な生物活性として、例えば、チロシンキナーゼ活性、タンパク質間相互作用の形成（例えば、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、リガンド結合、基質への結合など）、およびＭＥＴ媒介シグナル伝達が挙げられる。例示的な抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤として、例えば、小分子治療剤、核酸治療剤（例えば、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または酵素的核酸など）、およびタンパク質治療剤（例えば、抗体など）が挙げられる。さらに、本明細書に記載される様々な方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた癌の治療方法を伴う。この方法は、治療目的で、本明細書に記載される任意の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させた癌を治療するために使用することができる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢまたは抗ＭＥＴ治療剤は小分子治療剤である。小分子治療剤には、ＥｒｂＢまたはＭＥＴの少なくとも１つの生物活性をアンタゴナイズする任意の小分子が含まれる。例示的な小分子治療剤はキナーゼ阻害剤である。他の適当な小分子治療剤には、受容体二量体化またはリガンド結合をアンタゴナイズする小分子が含まれる。抗ＥｒｂＢ小分子治療剤および抗ＭＥＴ小分子治療剤の適当な例を以下に提供する。
【００７９】
一実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、アンチセンス核酸とすることができる。「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸）相互作用によって標的核酸に結合し、標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸化合物を意味する（概説については、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻、１００４頁ならびにＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。一般に、アンチセンス分子は、このアンチセンス分子の１つの連続した配列に沿って、標的配列と相補性である。しかし、ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、ループを形成し、ループを形成する基質核酸に結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２つ（もしくはそれ以上）の連続していない基質配列と相補性であることができ、またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の連続していない配列部分は、標的配列と相補性であることができ、あるいはその両方である。現在のアンチセンス戦略の概説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋら、１９９９年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７４巻、２１７８３〜２１７８９頁、Ｄｅｌｉｈａｓら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、１５巻、７５１〜７５３頁、Ｓｔｅｉｎら、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．  Ａ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７巻、１５１頁、Ｃｒｏｏｋｅ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３巻、３〜４５頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．、１５巻、１２１〜１５７頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９７年、Ａｄ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻、１〜４９頁を参照されたい。
【００８０】
他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、ｓｉＲＮＡとすることができる。用語「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」または「短鎖干渉核酸」は、細胞によって適切に処理される場合、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介することができる任意の核酸化合物を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子とすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物（例えば、ＲＴＫ）との相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を有する一本鎖のヘアピンポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物との相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、２つ以上のループ構造および自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する、環状の一本鎖ポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物との相補性を含み、環状のポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理されることによって、ＲＮＡｉを媒介することができる活性ｓｉＲＮＡを生成することができる。ｓｉＲＮＡは、標的核酸化合物との相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含むことができ、この一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸エステル基、例えば、５’−リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２年、Ｃｅｌｌ．、１１０巻、５６３〜５７４頁）、または５’，３’−二リン酸などをさらに含むことができる。
【００８１】
本明細書で記述する場合、ｓｉＲＮＡは、長さが約１９〜３０ヌクレオチド、または長さが２１〜２３ヌクレオチドとすることができる。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体をリクルートし、特定の配列と一対になることによって、この複合体を標的ｍＲＮＡに導くと理解されている。結果として、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、例えば、酵素ダイサーの存在下で、より長い二本鎖のＲＮＡを処理することによって生成することができる。一実施形態では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａインビトロ系が使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚に由来する可溶性抽出物と混合され、それによって組合せが生成される。この組合せは、ｄｓＲＮＡが処理されて約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子になる条件下で維持される。ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知のいくつかの技法を使用して精製することができる。例えば、ゲル電気泳動を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。あるいは、非変性カラムクロマトグラフィーなどの非変性方法を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いた親和性精製を使用することによって、ｓｉＲＮＡを精製することができる。
【００８２】
ｓｉＲＮＡの生成は、化学合成法または組換え核酸技法によって実施することができる。処理された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、インビボで転写を媒介することができ、またはクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、インビトロでの転写のために使用することができる。本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、ＤＮＡ鎖、いくつかのＤＮＡヌクレオチドを含有し、かつ／または化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低減し、バイオアベイラビリティーを改善し、製剤の特性を改善し、かつ／または他の薬物動態学的性質を変化させるために、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドに対する修飾を含むことができる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾することによって、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含めることができる。ＲＮＡ構造中の修飾を調整することによって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に対する一般的な応答を回避しながら、特定の遺伝的阻害を可能にすることができる。同様に、塩基を修飾することによって、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することができる。ｄｓＲＮＡは、酵素的に、または部分的／全有機合成によって生成することができ、任意の修飾されたリボヌクレオチドを、インビトロ酵素的または有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法は、ｄｓＲＮＡを修飾することにも適合させることができる（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：７７６〜７８０頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７巻：８９〜９８頁；Ｃｈｅｎら（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３巻：２６６１〜２６６８頁；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（１９９７年）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７巻：５５〜６１頁を参照されたい）。単に例えば、ｓｉＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、キメラのメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、オリゴマーまたは糖修飾を含む５−プロピニル−ピリミジン（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−配置）で修飾することができる。ある特定の場合では、本開示のｄｓＲＮＡｓは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、長さが約１〜約６ヌクレオチド、または長さが約２〜約４ヌクレオチド、または長さが約１〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、一方の鎖は３’オーバーハングを有し、他方の鎖は、平滑末端とするか、やはりオーバーハングを有することができる。オーバーハングの長さはそれぞれの鎖について、同じであっても、異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに高めるために、３’オーバーハングは、劣化に対して安定化させることができる。一実施形態では、ＲＮＡは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによって安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は許容されており、ＲＮＡｉの効率に影響しない。２’ヒドロキシルが存在しないことにより、組織培養培地中でオーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく増強され、インビボで有益となり得る。
【００８４】
他の実施形態では、干渉ＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡの形態とすることもできる。例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖の部分は、長さが少なくとも２５、５０、１００、２００、３００もしくは４００塩基、または長さが約４００〜８００塩基とすることができる。場合により、ｄｓＲＮＡは、例えば、細胞中にｓｉＲＮＡ配列を生成するために、細胞内で消化することができる。しかし、インビボで長い二本鎖ＲＮＡを使用することは必ずしも実用的ではないが、これはおそらく、配列非依存性のｄｓＲＮＡ応答によって生じる場合のある有害な効果のためである。そのような実施形態では、局所送達系および／またはインターフェロンもしくはＰＫＲの効果を低減する作用剤の使用が好適である。
【００８５】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヘアピン構造（例えば、ヘアピンＲＮＡ）の形態とすることができる。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することができ、またはインビボで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することができる。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためにそのようなヘアピンＲＮＡを作製または使用する例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００２年、１６巻：９４８〜５８頁；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８巻：３８〜９頁；ＭｃＭａｎｕｓら、ＲＮＡ、２００２年、８巻：８４２〜５０頁；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２年、９９巻：６０４７〜５２頁に記載されている。そのようなヘアピンＲＮＡは、細胞中または動物中で操作されることによって、所望の遺伝子の連続的で安定な抑制を確実にすることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞中でヘアピンＲＮＡを処理することによって生成することができることは、当技術分野で既知である。
【００８６】
ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０には、真核細胞中で、同じ導入遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じさせるために、導入遺伝子を双方向転写するための例示的なベクターが記載されている。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、以下の独特の特徴を有する組換えベクターを提供する：これは対抗する方向に、対象とするｓｉＲＮＡについての導入遺伝子と隣接して配置された２つの重複転写ユニットを有するウイルスレプリコンを含み、この２つの重複転写ユニットにより、宿主細胞中で同じ導入遺伝子断片からセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方が生じる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、酵素的核酸とすることができる。「酵素的核酸」とは、基質結合領域内で、指定された標的遺伝子との相補性を有し、標的核酸を特異的に切断することに活性である酵素活性も有する核酸を意味する。酵素的核酸は、分子間で核酸を切断することができ、それによって標的核酸を不活化すると理解されている。これらの相補性領域により、酵素的核酸の標的核酸への十分なハイブリダイゼーションが可能になり、したがって切断が可能になる。１００パーセントの相補性（同一性）が好適であるが、５０〜７５％の低い相補性でも有用となり得る（例えば、ＷｅｒｎｅｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３巻、２０９２〜２０９６頁；Ｈａｍｍａｎｎら、１９９９年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、９巻、２５〜３１頁を参照されたい）。酵素的核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基の箇所で修飾することができる。本明細書で記述する場合、用語「酵素的核酸」は、語句、例えば、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、アプタザイムもしくはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム（ｎｕｃｌｅｏｚｙｍｅ）、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素などと互換的に使用される。これらの専門用語のすべては、酵素活性を有する核酸を記述する。本明細書に記載される特異的な酵素的核酸は、限定的であることを意味するのでなく、当業者は、酵素的核酸において重要なのは、これは、１つまたは複数の標的核酸領域と相補性である特異的基質結合部位を有し、分子に核酸切断活性および／または核酸連結活性を付与するその基質結合部位内またはこの周囲にヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；Ｃｅｃｈら、１９８８年、２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０）。一実施形態では、酵素的核酸は、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断することによって、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように設計されたリボザイムである（例えば、１９９０年１０月４日に公開された、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：１２２２〜１２２５頁；および米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい）。別の実施形態では、酵素的核酸はＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素を作製し、投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。
【００８８】
別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤または抗ＭＥＴ治療剤は、抗体、例えば、ＥｒｂＢタンパク質（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４）、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、もしくはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））に結合する抗体などとすることができる。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、その抗原結合性断片を含むことが意図されている。抗体は、従来の技法を使用して断片化することができ、断片は、全抗体に対して適当であるのと同じ様式で、有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシンを用いて抗体を処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理することによって、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’断片を作製することができる。抗体には、二重特異性分子およびキメラ分子、ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）抗体が含まれることがさらに意図されている。三量体抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および単鎖抗体も含まれる。すべてのこれらの修飾形態の抗体、ならびに抗体の断片は、用語「抗体」に含まれることが意図されている。
【００８９】
抗体は、当技術分野で既知の方法によって誘発することができる。例えば、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、ＥｒｂＢタンパク質、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンドまたはＭＥＴリガンドの免疫原性形態（例えば、抗体応答を誘発することができる抗原断片）で免役することができる。あるいは、免疫化は、ＥｒｂＢタンパク質、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンドまたはＭＥＴリガンドをインビボで発現する核酸を使用して行うことができ、観察される免疫原性応答を生じる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法には、担体への結合、または当技術分野で公知である他の技法が含まれる。例えば、本発明のポリペプチドのペプチジル部分を、アジュバントの存在下で施すことができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によってモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗原としての免疫源とともに使用することによって、抗体のレベルを評価することができる。
【００９０】
免疫化した後、本発明のポリペプチドと反応性の抗血清を得ることができ、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物から収集し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技法は、当技術分野で公知であり、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  ７７〜９６頁）のようなハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁によって最初に開発された）を含む。ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングして、本発明のポリペプチドと特異的に反応性の抗体を生成することができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００９１】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、タンパク質ディスプレイ骨格（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）とすることができ（例えば、Ｈｏｓｓｅ，  Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻：１４〜２７頁（２００６年）を参照されたい）、これは、ＥｒｂＢタンパク質（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４）、ＭＥＴタンパク質、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、もしくはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））に結合する。一実施形態では、タンパク質ディスプレイ骨格は、フィブロネクチンベース「アドレス可能な」治療剤結合分子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／３４７８４号、同第ＷＯ０１／６４９４２号、同第ＷＯ０２／０３２９２５号を参照されたい）。フィブロネクチンドメインＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ループは、有用な治療ツールを開発するために、ランダムな突然変異にかけ、標的結合、選択、およびさらなる突然変異の反復ラウンドの進化スキーム（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｃｈｅｍｅ）に向けることができる領域を含む。
【００９２】
ある特定の実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、ＥｒｂＢ受容体またはＭＥＴ受容体とその対応するリガンドとの間の結合性を低減するポリペプチドとすることができる。一実施形態では、ポリペプチドは、可溶性のＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチド、特に、ＥｒｂＢまたはＭＥＴの細胞外ドメイン、例えば、ＥｒｂＢまたはＭＥＴタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインなどを含むポリペプチド、ならびにリガンド結合を保持する任意のその変異体（突然変異体、断片およびペプチド模倣体形態を含めて）とすることができる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドには、ペプチド模倣体が含まれる。ペプチド模倣体は、化学的に修飾されたペプチド、および天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含むペプチド様分子を指す。ペプチド模倣体は、対象に投与されたとき、安定性の増強を含めて、ペプチドに対して様々な利点を供給する。ペプチド模倣体を同定するための方法は、当技術分野で公知であり、潜在的なペプチド模倣体のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００化合物を超える収集を含む（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ、３５巻：２３３１頁（１９７９年））。標的分子の結晶構造が全く入手可能でない場合、構造は、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．  ２９巻：２５１頁（１９８９年））を使用して作製することができる。別のデータベース、ｔｈｅ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ
Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を含み、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドの潜在的なペプチド模倣体を同定するために検索することができる。
【００９４】
ある特定の態様では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴリガンド結合ポリペプチドの機能性変異体または修飾形態には、ＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチドの少なくとも一部、および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインの公知の例には、それだけに限らないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが含まれる。例示的な実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ−ポリペプチドは、インビボでＥｒｂＢまたはＭＥＴポリペプチドを安定化させるドメイン（「スタビライザー」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、血清半減期を増大させる任意のことを意味し、これが、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的効果のためであるかどうかに関係ない。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合により、広範囲のタンパク質に望ましい薬物動態学的性質が付与されることが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合も、望ましい性質を付与し得る。選択することができる他の種類の融合ドメインとして、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および機能ドメイン（追加の生物学的機能を付与する）が挙げられる。
【００９５】
抗ＥｒｂＢ１（抗ＥＧＦＲ）治療剤の例は、当技術分野で既知である。例えば、小分子抗ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）治療剤として、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｌｏｎｄｏｎ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＢＩＢＷ２９９２、ＺＤ６４７４、ＡＶ−４１２またはＨＫＩ−２７２などが挙げられる。抗ＥＧＦＲタンパク質治療剤として、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹおよびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ  ＡＧ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．およびＡｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、ＨＲ３（キューバ政府）、ＩｇＡ抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ）、ＴＰ−３８（ＩＶＡＸ）などが挙げられる。
【００９６】
抗ＥｒｂＢ２治療剤の例として、例えば、ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）（ペルツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ（Ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ））、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ８０２４（ＨＥＲ２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三官能性二重特異性抗体、ｍＡＢ  ＡＲ−２０９およびｍＡＢ  ２Ｂ−１が挙げられる。追加の抗ＥｒｂＢ２治療剤には、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９７／１３７６０、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ２００１／９８２７７、米国特許第５，５８７，４５８号、米国特許第５，８７７，３０５号、米国特許第６，４６５，４４９号、および同第６，２８４，７６４号に記載されているものが含まれる。
【００９７】
抗ＥｒｂＢ３治療剤の例には、例えば、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、米国特許公開第２００４０１９７３３２号を参照されたい）が含まれる。
【００９８】
抗ＥｒｂＢ４治療剤の例には、例えば、抗ＥｒｂＢ４  ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｍａａｔｔａら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １７巻：６７〜７９頁（２００６年）、またはＥｒｂＢ４キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ラパチニブ、ＰＦ００２９９８０４、およびＡＶ４１２などが含まれる。
【００９９】
抗ＥｒｂＢ治療剤は、複数の標的を含む治療剤、例えば、ＧＷ５７２０１６、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、およびＯｍｎｉｔａｒｇ（商標）を含めた、ｐａｎ  ＥＲＢＢ受容体阻害剤なども包含する。
【０１００】
例示的な抗ＭＥＴ治療剤として、例えば、ＭＥＴキナーゼ阻害剤、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＰＦ−０２３４１０６６（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＳＵ１１２７４、ＳＵ５４１６、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＸＬ１８４、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＳＧＸ−５２３、ＪＮＪ３８８７７６０５、ＡＭＧ１０２、およびＯＡ−５Ｄ５などが挙げられる。
【０１０１】
４．ＥｒｂＢ修飾およびＭＥＴ修飾を検出するための方法
様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＥｒｂＢ活性化突然変異、ＥｒｂＢ遺伝子増幅、リガンド誘発性ＥｒｂＢ活性化、ＭＥＴ活性化突然変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、および／またはリガンド媒介ＭＥＴ活性化の検出を伴うことができる。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性化突然変異の様々な例は、本明細書でさらに記載されており、ＥｒｂＢ配列およびＭＥＴ配列自体の外側の突然変異を含み、これは、ＥｒｂＢまたはＭＥＴタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる。核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の分析、タンパク質産物の分析、および／またはタンパク質活性の分析を伴う方法を含めて、突然変異または遺伝子増幅を検出するために、任意の当技術分野で認められた技法を使用することができる。そのような検出方法は、質的および定量的検出方法の両方を包含する。例示的な方法を本明細書でさらに説明する。
【０１０２】
遺伝子突然変異
遺伝子突然変異は、核酸試料を、突然変異体配列と特異的にハイブリダイズすることができるプローブと接触させ、次いでプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって検出することができる。プローブは一般に、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、３３ｐなど）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセイン、など）または発色剤（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）などで検出可能に標識されることによって、ハイブリダイゼーションの検出を促進する。当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、対象の突然変異を検出するのに適したプローブを容易に設計することができる。例えば、プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えば、ＰＮＡ、モルホリノ−ホスホラミデート、ＬＮＡまたは２’−アルコキシアルコキシとすることができ、長さを約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約７５、約１５〜約５０、または約２０〜約３０ヌクレオチドとすることができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプローブは、固体支持体上に孤立させることができ、検出可能に標識された核酸試料は、支持体上でプローブとハイブリダイズすることができる。例えば、このプローブは、複数の固定化された配列を含むマイクロアレイの一部とすることができる。アレイハイブリダイゼーションおよび分析のための方法は、当業者に既知である。
【０１０３】
あるいは、遺伝子突然変異は、突然変異を含んでいると思われる核酸配列またはその一部を増幅し、増幅核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較することによって、試料中で検出することができる。移動度の差は、増幅核酸配列中の突然変異の存在を示す。電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で求めることができる。この方法は、挿入および／または欠失突然変異の検出に特に有用である。
【０１０４】
突然変異の別の適当な検出方法では、酵素突然変異検出（ＥＭＤ）（Ｄｅｌ  Ｔｉｔｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４巻：７３１〜７３９頁、１９９８年）を使用する。ＥＭＤは、バクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用し、これは、点突然変異、挿入および欠失から生じる塩基対ミスマッチに起因する構造的な歪みを検出し、切断するまで、二本鎖ＤＮＡに沿って走査する。例えば、ゲル電気泳動による、リゾルベース切断によって形成された断片の検出は、突然変異の存在を示す。ＥＭＤ法の利点は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされる、点突然変異、欠失、挿入を同定するための単一のプロトコルであり、試料精製の必要性を排除し、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させる。最大２０倍過剰の正常ＤＮＡと、サイズが最大４ｋｂの断片を含む混合試料を、この方法を使用してアッセイすることができる。しかし、ＥＭＤ走査により、突然変異陽性試料において起こる特定の塩基変化は同定されず、必要であれば、突然変異の素性に対して追加の配列決定手順を必要とする。ＣＥＬ
Ｉ酵素も、米国特許第５，８６９，２４５号で実証されているように、リゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。
【０１０５】
点突然変異の検出は、当技術分野で公知である技法を使用して、分子クローニングおよびポリヌクレオチドの配列決定によって実現することができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、生体試料、例えば、癌細胞などに由来するゲノムＤＮＡ標本から遺伝子配列を直接増幅することができる。次いで増幅された配列のＤＮＡ配列を求め、それから突然変異を同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：４８７頁、１９８８年；米国特許第４，６８３，２０３号；および米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。
【０１０６】
さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲも、突然変異を検出するのに使用することができる（ＲｕａｎｏおよびＫｉｄｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７巻、８３９２頁、１９８９年）。この技法によれば、特定の配列の３’末端とハイブリダイズするプライマーが使用される。突然変異のために特定の配列が存在しない場合、増幅産物は産生されない。
【０１０７】
遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出することができる。さらに、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）は、配列変化を記録するのに使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析も、塩基変化変異体（ｂａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を検出するのに使用することができる（例えば、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻、２７６６〜２７７０頁、１９８９年、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ、５巻、８７４〜８７９頁、１９８９年を参照されたい）。当技術分野で知られているような、挿入および欠失を検出するための他の技法は、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。  
【０１０８】
ミスマッチ検出（例えば、１００％相補性でない二本鎖の検出）も、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列中の点突然変異を検出するのに使用することができる（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号、同第５，５５６，７５０号、同第５，６７９，５２２号、同第５，８６１，４８２号、同第５，９２２，５３９号、および同第６，００８，０３１号を参照されたい）。
【０１０９】
ミスマッチ切断を伴うＲＮａｓｅ保護も、点突然変異を含めた突然変異を検出するのに使用することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、７５７５頁、１９８５年、およびＭｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻、１２４２頁、１９８５年を参照されたい）。手短に言えば、この方法では、野生型配列と相補性である標識リボプローブを使用する。リボプローブおよび試料から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡは、一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、引き続いて、二本鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅ  Ａで消化される。ＲＮａｓｅ  Ａによってミスマッチが検出された場合、これは、ミスマッチの部位で切断し、それによってより短い断片を生成し、この断片は、ゲル電気泳動などの分離技術を使用して検出することができる。
【０１１０】
同様の様式で、ＤＮＡプローブを使用することによって、酵素的または化学的切断を通じてミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、４３９７頁、１９８８年；およびＳｈｅｎｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７２巻、９８９頁、１９７５年を参照されたい。あるいは、ミスマッチは、マッチ二本鎖と比べた、ミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度のシフトによって検出することができる。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４２巻、７２６頁、１９８８年を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブとともに、突然変異を含んでいる場合のある細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲを使用して増幅することができる。特に変化が、欠失および挿入などのグロス再配列（ｇｒｏｓｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）である場合、ＤＮＡ配列の変化は、サザンハイブリダイゼーションを使用しても検出することができる。
【０１１１】
遺伝子増幅
増幅した標的遺伝子の存在は、標的遺伝子のコピー数、すなわち、標的タンパク質をコードする、細胞中のＤＮＡ配列の数を求めることによって評価することができる。一般に、正常な二倍体細胞は、２コピーの所与の常染色体遺伝子を有するが、コピー数は、遺伝子増幅または複製によって増加させることができる。特定の遺伝子のコピー数の評価方法は、当技術分野で公知であり、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の増幅されたコピーの実際の数が求められる。あるいは、遺伝子増幅の質的な尺度を得ることができる。遺伝子増幅を検出するための様々な方法には、例えば、増幅に基づく方法、およびハイブリダイゼーションに基づく方法（サザンブロット法、ＦＩＳＨ、ＣＧＨおよびマイクロアレイ技法など）が含まれ、本明細書でさらに説明する。
【０１１２】
増幅に基づく方法
遺伝子増幅を検出するための増幅に基づく方法は、増幅された配列のコピー数を測定するのに使用することができ、対象とする配列の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲを使用して）を伴う。定量的な増幅では、増幅産物の量は、最初の試料中の鋳型の量に比例する。適切な対照との比較により、所与の試料中の対象とする配列のコピー数の尺度が提供される。対照と比較した場合の、より高いレベルの増幅産物の存在は、配列が増幅されたことを示す。
【０１１３】
定量的増幅の方法は、当業者に公知である。例えば、定量的ＰＣＲでは、同じプライマーを使用して、既知量の制御配列を同時に増幅する。これにより内部標準が提供され、これは、ＰＣＲ反応を較正するのに使用することができる。定量的なＰＣＲのための詳細なプロトコルは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ
Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．に提供されている。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ遺伝子についての核酸配列は既知であり、これらの遺伝子の任意の部分を増幅するのに使用することができるプライマーを、当業者が選択することを可能にするのに十分である。
【０１１４】
リアルタイムＰＣＲは、遺伝子コピーレベルまたはｍＲＮＡ発現のレベルを求めるために使用することができる別の増幅技法である（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６巻：９９５〜１００１頁、１９９６年；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲは、増幅の間のＰＣＲ産物蓄積のレベルを評価する。この技法により、複数の試料におけるｍＲＮＡレベルの定量的評価が可能になる。遺伝子コピーレベルについては、全ゲノムＤＮＡが試料から単離される。ｍＲＮＡレベルについては、ｍＲＮＡが試料から抽出され、ｃＤＮＡが標準的な技法を使用して調製される。リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）７７００プリズム計測器を使用して実施することができる。マッチングプライマーおよび蛍光プローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって提供されるプライマーエクスプレスプログラムを使用して、対象とする遺伝子について設計することができる。プライマーおよびプローブの至適濃度は、当業者によって最初に求めることができ、対照（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から市販で入手することができる。試料中の対象とする特定の核酸の量を定量化するために、検量線が対照を使用して作成される。検量線は、リアルタイムＰＣＲで求められたＣｔ値を使用して作成することができ、これは、アッセイで使用される、対象とする核酸の初期濃度に関係する。対象とする遺伝子の１０〜１０６コピーの範囲の標準希釈は、一般に十分である。さらに、制御配列についての検量線が作成される。これにより、比較目的で、対照の量に対する、組織試料中の対象とする核酸の初期含量の標準化が可能になる。
【０１１５】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用するリアルタイム定量的ＰＣＲの方法は、当技術分野で公知である。リアルタイム定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、例えば、ＲＮＡについては、Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６年、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１０巻：９９５〜１００１頁；およびＤＮＡについては、Ｈｅｉｄら、１９９６年、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１０巻：９８６〜９９４頁に提供されている。ＴａｑＭａｎ（商標）に基づくアッセイは、５’蛍光色素および３’クエンチ剤を含む蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、ＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、３’末端の遮断剤のためにそれ自体で伸長することはできない。ＰＣＲ産物が引き続くサイクルで増幅されるとき、ポリメラーゼ、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）の５’ヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが切断される。この切断により、５’蛍光色素と３’クエンチ剤が分離され、それによって増幅の関数として蛍光が増大する（例えば、ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブを参照されたい）。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
ハイブリダイゼーションアッセイも、遺伝子コピー数を検出するのに使用することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイには、それだけに限らないが、サザンブロットまたはインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）などの従来の「直接プローブ」法、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの「比較プローブ」法が含まれる。この方法は、それだけに限らないが、以下に説明するように、基質結合（例えば、膜またはガラス）法またはアレイに基づく手法を含めた、多種多様な形式で使用することができる。
【０１１７】
遺伝子コピー数を評価するための一方法は、サザンブロット法を伴う。サザンブロットを行うための方法は、当業者に既知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年を参照されたい）。そのようなアッセイでは、ゲノムＤＮＡ（一般に、電気泳動ゲル上で断片化および分離される）は、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズされる。標的領域についてのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度を、通常のゲノムＤＮＡ（例えば、同じまたは関連する細胞、組織、器官などの増幅されていない部分）の分析からの対照プローブシグナルと比較することにより、標的核酸の相対的なコピー数の推定値が提供される。対照より高い強度レベルは、配列が増幅されたことを示す。
【０１１８】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）も、遺伝子のコピー数を求めるのに使用することができる。ＦＩＳＨは、当業者に既知である（Ａｎｇｅｒｅｒ、１９８７年  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２巻：６４９頁を参照されたい）。一般的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞または組織切片は、固体支持体、一般にガラススライドに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は、熱またはアルカリを用いて一般に変性される。次いで細胞を、適度な温度のハイブリダイゼーション溶液と接触させることによって、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする。次いで標的（例えば、細胞）は、適切な信号対雑音比が得られるまで、所定のストリンジェンシーまたは漸増ストリンジェンシーで一般に洗浄される。そのような用途で使用されるプローブは、放射性同位体または蛍光レポーターで一般に標識される。好適なプローブは、ストリンジェントな条件下で、標的核酸（複数も）との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするために、十分に長く、例えば、約５０、１００、または２００ヌクレオチド〜約１０００以上のヌクレオチドである。用途によっては、反復配列のハイブリダイゼーション能力を遮断することが必要である。したがって、いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−１  ＤＮＡを使用することによって、非特異的なハイブリダイゼーションを遮断する。
【０１１９】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）も、遺伝子コピー数を求めるのに使用することができる。比較ゲノムハイブリダイゼーション方法では、核酸の「試験」収集物（例えば、可能性がある腫瘍から）が、第１の標識で標識され、第２の収集物（例えば、正常細胞または正常組織から）が第２の標識で標識される。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイ中で、それぞれファイバー（ｆｉｂｅｒ）に結合している第１および第２の標識の比によって求められる。例えば、試験収集物中の遺伝子増幅による、２つの標識からのシグナルの比の差が検出され、この比により、使用された特定のプローブに対応して、遺伝子コピー数の尺度が提供される。ＤＮＡコピー数変化の細胞遺伝学的な表示は、ＣＧＨによって生成することができ、これは、差次的に標識された試験ゲノムＤＮＡおよび基準ゲノムＤＮＡ由来の染色体の長さに沿った蛍光比を提供する。
【０１２０】
ＤＮＡコピー数は、マイクロアレイに基づくプラットフォームによっても分析することができる。様々なマイクロアレイ方法の詳細は、文献中に見出すことができる。例えば、米国特許第６，２３２，０６８号；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、２３巻（１号）：４１〜６頁、（１９９９年）、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７年）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７巻：６０６〜６１４頁；Ｊａｃｋｓｏｎ  （１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：１６８５頁；Ｃｈｅｅ（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：６１０頁；ＷＯ９６／１７９５８、Ｐｉｎｋｅｌら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０巻：２０７〜２１１頁などを参照されたい。
【０１２１】
アレイを調製するのに使用されるＤＮＡは、重要ではない。例えば、アレイは、ゲノムＤＮＡ、例えば、重複クローンを含むことができ、これは、所望の遺伝子を含むゲノムの一部、または遺伝子自体の高分解能走査を提供する。ゲノム核酸は、例えば、ＨＡＣ、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＰＩ、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンのＡｌｕ間（ｉｎｔｅｒ−Ａｌｕ）ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化、ｃＤＮＡクローン、増幅（例えば、ＰＣＲ）産物などから得ることができる。アレイは、オリゴヌクレオチド合成技術を使用しても作製することができる。したがって、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ならびにＰＣＴ特許公開第ＷＯ９０／１５０７０号および同第ＷＯ９２／１００９２号には、高密度オリゴヌクレオチドアレイの光指向コンビナトリアル合成の使用が教示されている。
【０１２２】
マイクロアレイ法ともに使用するのに適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３巻：１２２７〜１２３４頁；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ
８５巻：９１３８〜９１４２頁；ＥＰＯ公開第４３０，４０２号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３巻：Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０巻：２０７〜２１１頁、またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９巻：５３２１〜５３２５頁（１９９２年）などに記載されている。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションアッセイの感受性は、検出される標的核酸を増殖させる核酸増幅系を使用することによって増強することができる。そのような系の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が含まれる。最近当技術分野で記載された他の方法は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡＯ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβレプリカーゼ系である。
【０１２４】
発現レベル
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅の検出は、ＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルを含めた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ発現レベルを分析することによっても検出することができる。ＲＮＡ発現レベルの分析は、１つもしくは複数の転写産物、例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡなど、および／またはｍＲＮＡの１つもしくは複数のスプライス変異体の判定を伴うことができる。例えば、タンパク質、スプライスされたｍＲＮＡ変異体から生じるタンパク質変異体、および翻訳後に修飾されたタンパク質を含めた、様々なタンパク質産物も測定することによって、発現レベルを判定することができる。
【０１２５】
ＲＮＡ発現
ＲＮＡ産物の発現レベルを測定する任意の適当な手段を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。例えば、この方法は、例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、または１つもしくは複数のＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ  ＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズする、天然に存在する修飾ヌクレオチドの他の組合せを含めた、１つまたは複数のＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズする様々なポリヌクレオチドを利用することができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、アレイハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護およびノーザンブロットを含めた、本明細書にさらに記載される、ＲＮＡ発現を測定するための方法と組み合わせて使用することができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、アレイハイブリダイゼーションを使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ発現のレベルを評価することができる。アレイハイブリダイゼーションでは、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ発現産物とハイブリダイズすることができる、支持体に安定に付随した核酸メンバーが利用される。アレイに付着される核酸メンバーの長さは、８〜１０００ヌクレオチドの範囲とすることができ、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ産物に特異的であるように選択される。このアレイは、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、およびＭＥＴ、ならびに前述の任意のリガンド、例えば、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４）、またはＭＥＴリガンド（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ））を含めた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴに特異的な１つもしくは複数の核酸メンバー、またはその変異体（例えば、スプライス変異体）を含むことができる。核酸メンバーは、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡとすることができ、かつ／またはオリゴヌクレオチド、もしくはｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片とすることができる。オリゴヌクレオチドは、長さが約１０〜１００、１０〜５０、２０〜５０、または２０〜３０ヌクレオチドであることが好ましい。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの発現された領域の部分は、アレイ上でプローブとして利用することができる。より詳細には、ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ遺伝子と相補性であるオリゴヌクレオチド、ならびにまたはＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ遺伝子に由来するｃＤＮＡは有用である。オリゴヌクレオチドベースのアレイについては、プローブとして有用である、対象とする遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は、当技術分野でよく理解されている。より詳細には、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする領域を選択することが重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、ＧＣ含量率、二次構造の程度、および核酸の長さなどの要因は、重要な要因である。例えば、米国特許第６，５５１，７８４号を参照されたい。
【０１２７】
アレイは、特別に仕立てて構築するか、市販供給業者から購入することができる。アレイを構築するための様々な方法は、当技術分野で公知である。例えば、アレイフォーマットにおける、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成に適用可能な方法および技法は、例えば、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号、および同第６，４２８，７５２号、ならびにＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻：５４０９〜５４１７頁（２００４年）に記載されている。
【０１２８】
例示的な実施形態では、構築および／または選択オリゴヌクレオチドは、マスクレスアレイシンセサイザー（ＭＡＳ）を使用して、固体支持体上で合成することができる。マスクレスアレイシンセサイザーは、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／４２８１３号および対応する米国特許第６，３７５，９０３号に記載されている。アレイを構築するための他の方法として、例えば、マスクを利用する光指向法（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５１０，２７０号および同第５，５２７，６８１号に記載されているＶＬＳＩＰＳ（商標）法）、フローチャネル法（例えば、米国特許第５，３８４，２６１号を参照されたい）、スポッティング法（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号を参照されたい）、ピンベース法（ｐｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号を参照されたい）、および複数の支持体を利用する方法（例えば、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，６３９，６０３号、および同第５，５４１，０６１号を参照されたい）が挙げられる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、支持体の表面に安定に付随した核酸メンバーのアレイは、相補性の核酸メンバー／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを作製するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含む試料と接触し、アレイ上の独特の位置における１つまたは複数の相補性の核酸メンバーは、標的核酸に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズする標的核酸の素性は、アレイ上の核酸メンバーの位置を参照して求めることができる。
【０１３０】
ゲノムＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチドまたは核酸、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、陰性および陽性対照遺伝子などを含む核酸メンバーを含めた対照核酸メンバーは、アレイ上に存在することができる。対照核酸メンバーは、較正または対照遺伝子であり、その機能は、対象とする特定の遺伝子が発現されるかどうかを伝えることではなく、むしろ発現のバックラウンドまたは基礎レベルなどの他の有用な情報を提供することである。
【０１３１】
アレイ上の他の対照核酸を、標的発現対照核酸およびミスマッチ対照ヌクレオチドとして使用することによって、プローブが向けられる標的以外の、試料中の核酸への非特異的結合またはクロスハイブリダイゼーションをモニターすることができる。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的であるか、特異的でないかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全にマッチしたプローブは、ミスマッチしたプローブより常に鮮明であるはずである。さらに、すべての対照ミスマッチが存在する場合、ミスマッチプローブは、突然変異を検出するのに使用される。
【０１３２】
本明細書に提供されるアレイは、アレイが使用されるアッセイ条件下、特にハイスループット取り扱い条件下で、上に存在する付随した核酸に対して物理的な支持体および構造を提供するのに十分な基質を含むことができる。
【０１３３】
基質は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、ビーズ、容器、キャピラリー、詰め物、薄片、膜、プレート、スライド、チップなどとして存在する、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組合せとすることができる。基質は、好都合な形状、例えば円盤、正方形、球、円などを有することができる。基質は、平ら、すなわち平面であることが好ましいが、様々な代替の表面構成を採用することができる。基質は、重合ラングミュアーブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳＩＮ４、変性ケイ素、または多種多様なゲルもしくはポリマー、例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの任意の１つ、またはこれらの組合せとすることができる。他の基質材料は、本開示を考慮して、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、標的核酸試料は、生体試料から単離された、全ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対応する核酸試料（例えば、ｃＤＮＡ）を含むことができる。全ｍＲＮＡは、例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して、所与の試料から単離することができ、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ）ｎ磁気ビーズを使用して単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９年）、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。ある特定の実施形態では、全ＲＮＡは、ＴＲｌｚｏｌ（商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５９６）を使用して抽出することができる。ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度およびアガロースゲル電気泳動とその後の紫外光下での検査によって評価することができる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸試料を増幅することが望ましい場合がある。当業者は、いかなる増幅方法も使用され、定量的結果が望まれる場合、増幅核酸の相対度数について維持または制御する方法を使用するように注意しなければならないことを理解するであろう。定量的な増幅方法は、当業者に公知である。例えば、定量的ＰＣＲでは、同じプライマーを使用して、既知量の制御配列を同時に増幅する。これにより、ＰＣＲ反応を較正するのに使用することができる内部標準が提供される。したがって高密度アレイは、増幅核酸の定量化のための内部標準に特異的なプローブを含むことができる。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．、（１９９０年）に提供されている。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、標的核酸試料のｍＲＮＡは、逆転写酵素ならびにオリゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーで逆転写されることによって、一本鎖のＤＮＡ鋳型を提供する。第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖のｃＤＮＡの合成の後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが加えられ、ＲＮＡがｃＤＮＡ鋳型から転写される。それぞれ１つのｃＤＮＡ鋳型からの転写の連続的なラウンドにより、ＲＮＡが増幅される。インビトロ転写の方法は、当業者に公知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）、この特定の方法は、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：１６６３〜１６６７頁に詳細に記載されており、この筆者らは、この方法によるインビトロ増幅により、様々なＲＮＡ転写物の相対度数が保存されることを実証している。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３０１０〜３０１４頁は、インビトロ転写による２ラウンドの増幅を使用することによって、最初の出発材料の１０６倍を超える増幅を実現し、それによって生体試料が限られている場合でさえ発現をモニターすることを可能にするプロトコルを提供している。
【０１３７】
本明細書に記載される方法に従って使用するのに適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。有用な標識として、標識ストレプトアビジンコンジュゲートを用いた染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、および熱量測定標識、例えば、コロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、など）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０１３８】
そのような標識の検出手段は、当業者に公知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、光検出器を使用して発光を検出することによって検出することができる。酵素標識は、一般に、基質とともに酵素を提供し、その基質に対する酵素の作用によって生成した反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は、着色標識を単に可視化することによって検出される。
【０１３９】
標識は、当業者に公知の任意のいくつかの手段によって組み込むことができる。例えば、標識は、試料核酸の調製中に、増幅ステップの間に同時に組み込むことができる。したがって、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識増幅産物を提供することになる。さらに、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用した、上述したような転写増幅は、転写核酸中に標識を組み込む。
【０１４０】
あるいは、標識は、最初の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、など）、または増幅が完了した後の増幅産物に直接添加することができる。核酸に標識を付ける手段は、当業者に公知であり、例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のキナージング（ｋｉｎａｓｉｎｇ）による末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いて）、およびその後の試料核酸を標識（例えば、フルオロフォア）に結合する核酸リンカーの結合（連結）を含む。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはアレクサ色素によるものである（Ｋｈａｎら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８巻：５００９〜５０１３頁）。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、例えば、対象（例えば、癌または別の過剰増殖障害を有するか、これらを有するリスクのある対象）に由来する標的核酸試料、および対照核酸試料（例えば、健康な個体）を含めた、２つの標的核酸試料をアレイに同時にハイブリダイズすることが望ましい場合がある。さらなる実施形態では、一方の標的核酸試料は、対象の腫瘍または他の癌性成長から得ることができ、第２の標的核酸試料は、同じ対象由来の健康な生体物質から得ることができる。比較のために使用される２つの標的試料は、区別可能な検出シグナルを生成する異なる蛍光色素で標識され、例えば、対照試料由来の標的は、Ｃｙ５で標識され、モニターまたは診断される対象由来の標的は、Ｃｙ３で標識される。異なって標識された標的試料は、同じマイクロアレイに同時にハイブリダイズされる。標識された標的は、当技術分野で既知の方法を使用して、例えば、エタノール精製またはカラム精製によって精製することができる。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、標的核酸試料は、マイクロアレイから生じるシグナルを標準化するために、マイクロアレイ上の対照プローブとハイブリダイズする、１つまたは複数の対照分子を含む。標識された標準化標的は、例えば、上述したマイクロアレイ上にスポットされる対照オリゴヌクレオチドと完全に相補性である核酸配列とすることができる。ハイブリダイゼーション後に標準化対照から得たシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読み効率（ｒｅａｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させる場合のある他の要因の変化についての対照を提供する。アレイ中のすべての他のプローブから読まれるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）によって除し、それによって測定値を標準化することができる。
【０１４４】
標準化標的は、試料中に存在する他の標的の平均長を反映するように選択することができ、これらは、様々な長さを網羅するように選択することができる。標準化対照（複数も）も、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは数個のみの標準化プローブが使用され、これらは、満足にハイブリダイズし（すなわち、二次構造を全く有さず、自己ハイブリダイズしない）、任意の標的分子とマッチしないように選択される。標準化プローブは、アレイ中の任意の位置またはアレイ全体にわたって複数の位置で局在化することによって、ハイブリダイゼーション効率の空間的変化を制御することができる。例えば、標準化対照は、アレイの隅角部または縁部ならびに中間部に位置することができる。
【０１４５】
核酸のアレイへのハイブリダイゼーションでは、プローブまたは標的核酸メンバーおよびその相補性の標的が、相補性の塩基対合を通じて安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件下で、アレイ上の変性プローブまたは標的核酸メンバーおよび標的核酸試料をインキュベートする。次いでハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、一般に、付けられた検出可能な標識の検出によって検出されるハイブリダイズした核酸を残して洗い流される。核酸は、温度を上昇させ、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させることによって変性されることが一般に認識されている。低いストリンジェンシー条件下で（例えば、低温および／または高濃度の塩）、アニールされた配列が完全に相補性でない場合でも、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）は形成する。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで低減される。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、高温またはより低濃度の塩）では、順調なハイブリダイゼーションには、ミスマッチがより少ないことが要求される。ハイブリダイゼーション条件を至適化する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ編  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３年）を参照されたい）。
【０１４６】
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズされていない標識された、または標識されていない核酸は、洗浄によって支持体表面から除去され、それによって基質表面上にハイブリダイズした標識核酸のパターンが生成する。様々な洗浄液が、当業者に知られており、使用することができる。標識され、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の得られたハイブリダイゼーションパターンは、様々方法で可視化または検出することができ、検出の特定の様式は、標的核酸試料の特定の標識に基づいて選択され、代表的な検出手段には、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定の測定、発光測定などが含まれる。
【０１４７】
ハイブリダイゼーション、洗浄ステップおよび／または引き続く処理の後、得られたハイブリダイゼーションパターンは検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出、または可視化することにおいて、標識の強度またはシグナル値は、検出されるだけでなく、定量化され、例えば、ハイブリダイズしたアレイ上の各スポットからのシグナルは測定され、既知数の末端標識標的核酸によって発せられるシグナルに対応する単位値と比較されることによって、ハイブリダイゼーションパターン中のアレイ上の特定のスポットにハイブリダイズした、各末端標識標的のコピー数のカウントまたは絶対値を得る。
【０１４８】
アレイハイブリダイゼーションから収集したデータを分析するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を伴う場合、データ分析は、収集したデータから、基質の位置の関数として蛍光強度を求めるステップ、異常値、すなわち、所定の統計的分布から逸脱しているデータを除去するステップ、および残りのデータから、試験核酸の相対的結合親和性を計算するステップを含むことができる。得られたデータは、付随したオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と試験核酸の間の結合親和性によって変化する、各領域での強度を含む画像として表示される。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ産物の発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）を使用して、試料に由来するＲＮＡ産物を増幅することによって測定することができる。ある特定の実施形態では、当業者に理解されるように、ＲＴは定量的とすることができる。
【０１５０】
試料に由来する全ＲＮＡ、またはｍＲＮＡは、鋳型として使用することができ、ＲＴＫの転写部分に特異的なプライマーは、逆転写を開始するのに使用される。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする方法は公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年の上記に記載されている。プライマー設計は、市販のソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅなど）または標準的で当技術分野で公知である方法を利用して実現することができる。プライマーの設計および選択を支援するのに使用することができるプライマーソフトウェアプログラムには、例えば、Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアが含まれ、これは、以下のウェブサイトリンクを通じて入手可能である：ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ／。さらに、ＲＴＫのプライマー設計において使用するために、ヒトゲノムデータベースから配列情報を検索し、更新する場合、以下のウェブサイトリンクが有用であり：ｌ）  ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ  Ｈｏｍｅｐａｇｅ：  ｎｃｂｉ．ｎｌｒｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／のワールドワイドウェブ、および２）  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ：ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓのワールドワイドウェブ、適切なＲＴＫ情報、例えば、遺伝子または配列の記述、アクセションまたは配列ＩＤ、遺伝子記号、ＲｅｆＳｅｑ  ＃、および／またはＵｎｉＧｅｎｅ  ＃などを使用することが好ましい。
【０１５１】
本明細書に記載される方法に従って使用することができるプライマーを設計するための一般的な指針には、以下のことが含まれる。産物または単位複製配列の長さは、約１００〜１５０塩基とすることができ、至適Ｔｍは、約６０℃、または約５８〜６２℃とすることができ、ＧＣ含量は、約５０％、または約４５〜５５％とすることができる。さらに、１つまたは複数の以下のものなどのある特定の配列を回避することが望ましい場合がある：（ｉ）同じプライマーの別の部分、またはプライマー−二量体形成を低減するための別のプライマーと相補性であるそれぞれのプライマーの３’末端での３つ以上の塩基のストリング（ｉｉ）別のプライマー配列と相補性であるプライマー内の配列、（ｉｉｉ）３’末端での３つ以上のＧまたはＣの連続、（ｉｖ）３塩基を超える単一塩基の繰り返し（ｖ）Ｇ／Ｇ−およびＡ／Ｔリッチドメインの不均衡な分布、ならびに／または（ｖｉ）３’末端でのＴ。
【０１５２】
逆転写の産物は、ＰＣＲのための鋳型として引き続いて使用される。ＰＣＲは、熱安定性の、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、複数のサイクルのＤＮＡ複製を使用することにより、対象とする標的配列を増幅することによって、特定の核酸配列を急速に増幅するための方法を提供する。ＰＣＲは、増幅される核酸、増幅される配列に隣接する２つの一本鎖のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液および塩の存在が必要である。ＰＣＲの方法は、当技術分野で公知である。ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５巻：３３５頁に記載されているように実施される。
【０１５３】
本質的に定量的であるＱＲＴ−ＰＣＲを実施することによっても、ＲＴＫ遺伝子発現レベルの定量的尺度を提供することができる。ＱＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写およびＰＣＲは、２ステップで実施することができ、またはＰＣＲと組み合わせた逆転写は、同時に実施することができる。ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの市販のキットが存在する、これらの技法の１つは、転写物特異的なアンチセンスプローブを用いて実施される。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子に由来する核酸断片）に特異的であり、クエンチャーおよびオリゴヌクレオチドの５’末端と複合体形成した蛍光レポータープローブを用いて調製される。異なる蛍光マーカーが異なるレポーターに付けられ、１つの反応で２つの産物の測定を可能にしている。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化されると、これは、５’−〜−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、鋳型に結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーの非存在下で、レポーターはすぐに蛍光を発する。レポーターの色変化は、それぞれ特異的な産物の量に比例し、蛍光光度計によって測定される。したがって各色の量が測定され、ＰＣＲ産物が定量化される。ＰＣＲ反応は、９６ウェルプレート中で実施され、その結果、多くの個体に由来する試料が同時に処理され、測定される。ＴａｑＭａｎ（商標）系は、ゲル電気泳動を必要としないという追加の利点を有し、検量線とともに使用される場合、定量化を可能にする。
【０１５４】
ＰＣＲ産物を定量的に検出するのに有用な第２の技法は、市販のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｃａｌｉｆ．）などの挿入色素を使用することである。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光標識としてＳＹＢＲグリーンを使用して実施され、これは、ＰＣＲ段階の間にＰＣＲ産物中に組み込まれ、ＰＣＲ産物の量に比例した蛍光を生成する。さらに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）を含めた、ｍＲＮＡ発現産物を定量的に測定するための他の系が知られている。
【０１５５】
ＲＮＡ発現を定量的に測定するための追加の技法には、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑβレプリカーゼ（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号を参照されたい）、等温増幅法（例えば、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２年）ＰＮＡＳ  ８９巻：３８２〜３９６号を参照されたい）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、修復連鎖反応、非対称定量的ＰＣＲ（例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３３０１３４３０７Ａ１号を参照されたい）、およびＦｕｊａら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０８巻：１９３〜２０５頁に記載されている多重化ミクロスフェアビーズアッセイが含まれる。
【０１５６】
遺伝子発現のレベルは、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含めた、転写ベース増幅系（ＴＡＳ）を使用して、試料由来のＲＮＡを増幅することによって測定することができる。例えば、Ｋｗｏｈら（１９８９年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁；国際公開第ＷＯ８８／１０３１５号；および米国特許第６，３２９，１７９号を参照されたい。ＮＡＳＢＡでは、増幅のための核酸は、従来のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液を用いた処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出を使用して調製することができる。これらの増幅技法では、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングする。重合の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化され、一方二本鎖ＤＮＡ分子は、再び熱変性される。いずれの場合でも、一本鎖のＤＮＡは、第２の標的特異的プライマーを添加し、その後に重合することによって、完全に二本鎖にされる。次いで二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼによって多数回転写される。等温サイクル反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）では、ＲＮＡは、逆転写されて二本鎖ＤＮＡになり、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼで一度転写される。得られた産物は、切断されていても、完全であっても、標的特異的配列を示す。
【０１５７】
増幅産物を分離するのに、いくつかの技法を使用することができる。例えば、増幅産物は、従来方法を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照されたい。電気泳動を用いることなく、ＰＣＲ産物を定量的に検出するためのいくつかの技法も使用することができる（例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．、（１９９０年））を参照されたい。例えば、クロマトグラフィー技法を使用することによって、分離を行うことができる。使用することができる多くの種類のクロマトグラフィー、すなわち、吸着、分配、イオン交換および分子篩、ＨＰＬＣが存在し、カラム、ペーパー、薄層、ガスクロマトグラフィーを含めた、これらを使用するための多くの特殊化された技法が存在する（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ｗｍ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年）。
【０１５８】
対象とする核酸配列の増幅を確認するために、増幅産物は可視化されなければならない。１つの一般的な可視化方法では、臭化エチジウムを用いてゲルを染色し、ＵＶ光下で可視化する。あるいは、増幅産物が、放射測定的または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで一体的に標識されている場合、増幅産物は、分離した後に、Ｘ線フィルムに曝露するか、適切な刺激スペクトル下で可視化することができる。
【０１５９】
あるいは、可視化は、間接的に実現することができる。増幅産物を分離した後、標識された核酸プローブは、対象とする増幅核酸配列と接触させる。プローブは、発色団と結合し、放射標識し、または抗体もしくはビオチンなどの結合パートナーと結合することができ、結合対の他のメンバーは検出可能部分を担持する。
【０１６０】
さらに、検出は、サザンブロット法および標識プローブとのハイブリダイゼーションを使用して実施することができる。サザンブロット法が関与する技法は、当業者に公知であり、分子プロトコルについての多くの標準的な書籍において見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記を参照されたい。簡単に言えば、増幅産物は、ゲル電気泳動によって分離される。次いでゲルは、ニトロセルロースなどの膜と接触し、核酸の移動および非共有結合が可能になる。引き続いて、この膜は、標的増幅産物とハイブリダイズすることができる、発色団結合プローブとともにインキュベートされる。検出は、膜のＸ線フィルムへの曝露またはイオン放出検出デバイスによる。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、核酸分解酵素保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびＳｉヌクレアーゼアッセイの両方を含めて）を使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ  ＲＮＡ産物を検出し、定量化することができる。核酸分解酵素保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば、放射標識されたか、非同位体標識された）は、ＲＮＡ試料と溶液中でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、一本鎖の、ハイブリダイズしていないプローブおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼによって分解される。残りの保護された断片を分離するために、アクリルアミドゲルが使用される。一般に、溶液ハイブリダイゼーションは、最大約１００μｇの試料ＲＮＡに適応することができるが、ブロットハイブリダイゼーションは、約２０〜３０μｇのＲＮＡ試料しか適応することができない。
【０１６２】
最も一般的な種類の核酸分解酵素保護アッセイであるリボヌクレアーゼ保護アッセイは、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドおよび他の一本鎖ＤＮＡプローブは、Ｓ１ヌクレアーゼを含むアッセイにおいてのみ使用することができる。一本鎖の、アンチセンスプローブは、一般に、ヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を防止するために、標的ＲＮＡと完全に相同性でなければならない。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ノーザンブロットアッセイを使用することによって、ＲＮＡ転写物のサイズを確認し、選択的にスプライスされたＲＮＡ転写物、ならびにＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ遺伝子のＲＮＡ産物の相対量を特定することができる。ノーザンブロットでは、ＲＮＡ試料は、変性条件下のアガロースゲル中の電気泳動により、サイズによって最初に分離される。次いでＲＮＡは、膜に移され、架橋され、標識プローブとハイブリダイズされる。ランダムに初回刺激された（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）、ニックトランスレートされた、またはＰＣＲで生成したＤＮＡプローブ、インビトロで転写されたＲＮＡプローブ、およびオリゴヌクレオチドを含めた非同位体、または高比放射能放射標識プローブを使用することができる。さらに、部分的な相同性しか含まない配列（例えば、異なる種に由来するｃＤＮＡ、またはエクソンを含む場合のあるゲノムＤＮＡ断片）を、プローブとして使用することができる。標識プローブ、例えば、全長の、一本鎖ＤＮＡ、またはそのＤＮＡ配列の断片を含む放射標識ｃＤＮＡは、長さが少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００の連続したヌクレオチドまでの任意の長さとすることができる。プローブは、当業者に既知である、任意の多くの様々な方法によって標識することができる。これらの研究のために、最も一般に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光に曝されると蛍光を発する化学物質などである。いくつかの蛍光物質が知られており、標識として利用することができる。これらには、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローが含まれる。特定の検出物質は、ヤギ中で調製され、イソチオシアネートによってフルオレセインと結合した抗ウサギ抗体である。同位元素の非限定例として、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅが挙げられる。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている熱量測定、分光光度的、蛍光分光光度的、電流測定、または気体定量技法のいずれによっても検出することができる。酵素は、架橋分子、例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどとの反応によって、選択されたプローブに結合することができる。例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含めた、当業者に既知の任意の酵素を利用することができる。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、および同第４，０１６，０４３号は、代替の標識物質および方法の開示について例として参照される。
【０１６４】
タンパク質発現
活性化突然変異または遺伝子増幅は、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質発現レベルを検査することによっても検出することができる。タンパク質発現レベルを測定するための任意の当技術分野で認められた技法は、例えば、ゲル電気泳動（２−Ｄゲル電気泳動を含めて）、質量分析法および抗体結合を含むことができる。生体試料中でタンパク質レベルをアッセイするための好適な方法には、抗体に基づく技法、例えば、イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫組織学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはタンパク質チップなどが含まれる。例えば、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ特異的モノクローナル抗体を、免疫吸着剤および酵素−標識プローブの両方として使用することによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴを検出および定量化することができる。試料中に存在するＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの量は、線形回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準試料中に存在する量を参照することによって計算することができる。別の実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴは、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質に特異的な抗体を使用して、生体試料から免疫沈降させることができる。次いで単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを実施し、標準的な手順を使用してブロットすることができる（例えば、ニトロセルロースまたは他の適当な物質に）。次いでブロットを抗ＥｒｂＢおよび／または抗ＭＥＴ特異抗体でプローブすることによって、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質の発現レベルを求めることができる。
【０１６５】
ゲル電気泳動、免疫沈降法および質量分析法は、標準的な技法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｇ．  Ｓｕｉｚｄａｋ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６年）、ならびに本明細書に引用される他の参考文献に記載されているものなどを使用して実施することができる。
【０１６６】
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴの単離および検出に適した抗体は、様々な供給源から市販で購入することができる。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴに特異的な抗体は、本明細書にさらに記載されている標準的な技法を使用して作製することもできる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい）。
【０１６７】
活性レベル
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅は、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を測定することによっても検出することができる。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を判定するための様々な方法は、当業者に既知であり、本明細書にさらに記載されている。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性を測定するための例示的な方法には、例えば、以下のうちの１つまたは複数を検査することが含まれる：ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴリン酸化、ＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴキナーゼ活性、またはＥｒｂＢおよび／もしくはＭＥＴ媒介シグナル伝達。ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴ活性は、細胞可溶化物を使用して細胞に基づくアッセイにおいて、または精製された成分もしくは部分的に精製された成分を使用してインビトロで判定することができる。一実施形態では、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴリン酸化は、米国特許第６，１９７，５９９号に記載されている抗体アレイを使用して検査することができる。複数のリン酸化受容体チロシンキナーゼに結合する市販の抗体アレイには、ＲａｙＢｉｏ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＡｒｒａｙおよびＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＰｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ  Ａｒｒａｙが含まれる。
【０１６８】
リガンド媒介活性化
ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、本明細書にさらに記載されている、様々な当技術分野で認められた技法を使用して判定することができる。例えば、リガンド媒介活性化は、リガンド遺伝子の遺伝子増幅を検出することによって、またはリガンド遺伝子中の活性化突然変異を検出することによって判定することができる。遺伝子増幅および遺伝子突然変異を検出するための様々な方法は、本明細書で上記に説明されている。代替の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ活性のレベルを求めることによって分析することができ、ＥｒｂＢまたはＭＥＴ活性の増大は、リガンドの量の増加に関連する。ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性を判定するための方法は、本明細書で上記に説明されている。他の実施形態では、ＥｒｂＢまたはＭＥＴのリガンド媒介活性化は、例えば、免疫組織化学的分析、ＥＬＩＳＡ、または活性アッセイを使用して、リガンドタンパク質発現または活性のレベルをアッセイすることによって判定することができる。ＥｒｂＢリガンドは、当技術分野で既知であり、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＡＲ、ＢＴＣ、ＨＢ−ＥＰＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４を含む。肝細胞成長因子すなわちＨＧＦは、ＭＥＴについてのリガンドである。
【０１６９】
５．アッセイ、キットおよび細胞株
別の態様において、本発明は抗ＭＥＴ療法を特定する方法を提供する。一般に、本方法は細胞を１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤および試験化合物、例えば、候補抗ＭＥＴ治療剤の組合せと接触させることを含む。例えば細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対して耐性を獲得した癌細胞であってもよい。加えて、細胞はＭＥＴ遺伝子またはＭＥＴ遺伝子増幅中に活性化突然変異を含んでもよい。抗ＭＥＴ治療剤としての試験化合物の有効性は、ＭＥＴタンパク質の１つまたは複数の生物活性の減少を検出することによって測定することができる。ＭＥＴタンパク質の生物活性減少の測定は、例えば、以下の細胞の過程の変化：ＥｒｂＢリン酸化の減少、ＭＥＴリン酸化の減少、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ結合の減少、ＰＩ３Ｋ活性の減少、ＡＫＴリン酸化の減少、細胞成長の減少、細胞増殖の減少またはアポトーシスの増加の１つまたは複数を検出することによって検査することができる。ある特定の実施形態では、結果を、試験化合物の非存在下で行った２回反復アッセイまたは既知の抗ＭＥＴ活性を有する試験化合物の存在下で行った２回反復アッセイなどの対照と比較することが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、対照はデータベース中の参照番号であってもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＭＥＴタンパク質の生物活性を試験化合物の非存在下での生物活性と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれ以上減少させる試験化合物を特定するために使用してもよい。例示的なＭＥＴ生物活性は、例えば、キナーゼ活性、タンパク質間相互作用（例えば、受容体ホモもしくはヘテロ二量体化、リガンド結合、または基質への結合など）、またはＭＥＴ媒介シグナル伝達を含む。
【０１７０】
本明細書に記載のアッセイにおいて活性を試験する試験化合物は、化合物のライブラリーを含めて、タンパク質（翻訳後修飾されたタンパク質を含む）、ペプチド（化学的または酵素的に修飾されたペプチドを含む）、または小分子（炭水化物、ステロイド、脂質、アニオンまたはカチオン、薬物、有機小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、および薬剤のタンパク質をコードする遺伝子またはアンチセンス分子を含む）を含むことができる。試験化合物は天然起源の（例えば、自然界にあるまたは自然界から単離された）ものであってもよく、または非天然起源の（例えば、合成の、化学合成されたまたは人工の）ものであってもよい。
【０１７１】
必要に応じて、試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的に位置指定可能な平行固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１−ビーズ１−化合物」ライブラリー法、および選択的親和性クロマトグラフィーを使用した合成ライブラリー法を含むがこれらに限定されるものではない、当技術分野において既知の多くのコンビナトリアルライブラリー法のいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーによるアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２巻、１４５頁、１９９７年を参照されたい。
【０１７２】
分子ライブラリーの合成方法は当技術分野においてよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻、６９０９頁、１９９３年；ＥｒｂらＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１巻、１１４２２頁、１９９４年；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ  ＭｅｄＣｈｅｍ．  ３７巻、２６７８頁、１９９４年；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻、１３０３頁、１９９３年；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ３３巻、２０５９頁、１９９４年；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３巻、２０６１頁；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ３７巻、１２３３頁、１９９４年を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３巻、４１２〜４２１頁、１９９２年を参照）に、またはビーズ（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻、８２〜８４頁、１９９１年）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４巻、５５５〜５５６頁、１９９３年）、細菌もしくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９巻、１８６５〜１８６９頁、１９９２年）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、４０４〜４０６頁、１９９０年）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９７巻、６３７８〜６３８２頁、１９９０年；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻、３０１〜３１０頁、１９９１年；およびＬａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）上に提供することができる。
【０１７３】
試験化合物を、ハイスループットスクリーニングを使用してＭＥＴ活性をアンタゴナイズする能力についてスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多数の試験化合物を迅速にスクリーニングできるように、多くの別個の化合物を並行して試験することができる。最も広範に確立されている技術では、９６ウェルマイクロタイタープレートを利用する。プレートに加えて、多くの器具、材料、ピペッター、自動制御装置、プレートウォッシャー、およびプレートリーダーは９６ウェルフォーマットに合うものが市販されている。
【０１７４】
あるいは、フリーフォーマットアッセイ、またはサンプル間に物理的障壁のないアッセイを使用することができる。フリーフォーマットを含むアッセイは例えば、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．においてＦｉｒｓｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ
Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇで報告されたＪａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９巻、１６１４〜１８頁（１９９４年）；Ｃｈｅｌｓｋｙ、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、（１１月７日〜１０日、１９９５年）；およびＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ２巻、５７〜６３頁（１９９６年）に記載されている。別のハイスループットスクリーニング法は、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許第５，９７６，８１３号に記載されている。
【０１７５】
別の態様において、本発明は抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を産生する方法を提供する。本方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に感受性の細胞を、少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させること、および抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得する細胞を特定することを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生された細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を付与するＥｒｂＢ遺伝子に変異を含有せず、例えば、異なる機構またはＥｒｂＢ配列ではない配列中の変異によって細胞は耐性を獲得している。細胞は、抗ＥｒｂＢ治療剤と少なくとも５日間、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、またはそれ以上接触させてもよい。細胞は、経時的に濃度を増加させて抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させてもよい。例えば、所定の濃度の存在下で細胞成長が回復するにつれて濃度を増加させてもよく、この過程を繰り返してもよい。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤の濃度を約ＩＣ３０〜約ＩＣ４０、ＩＣ５０、およびＩＣ６０、またはそれ以上まで経時的に増加させてもよい。抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞を特定する種々の方法を使用してもよく、本明細書にさらに記載する。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を獲得した細胞の特定は、例えば、抗ＥｒｂＢ治療存在下において以下：細胞成長の増加、細胞増殖の増加、アポトーシスの減少、ＥｒｂＢリン酸化の増加、ＭＥＴリン酸化の増加、ＥｒｂＢ−ＭＥＴ結合の増加、ＡＫＴリン酸化の増加、ＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達の増加、ＥｒｂＢ媒介シグナル伝達の増加、ＭＥＴ媒介シグナル伝達の増加、ＭＥＴ活性化突然変異の存在、ＭＥＴ遺伝子増幅の存在、ＭＥＴの過剰発現、ＭＥＴリガンドの過剰発現などのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、細胞の感受性を、例えば抗ＥｒｂＢ治療剤の非存在下で行った２回反復アッセイなどの対照と比較することが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、対照はデータベース中の参照番号であってもよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性が対照と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれ以上増加する細胞株を産生するために使用してもよい。
【０１７６】
種々の実施形態において、細胞が１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の異なる抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させることが望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、細胞を単一タイプの抗ＥｒｂＢ治療剤（例えば、小分子治療剤、核酸治療剤、またはタンパク質治療剤）と接触させることが望ましい場合がある。あるいは、例えば、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤とｓｉＲＮＡ、またはＥｒｂＢキナーゼ阻害剤と抗ＥｒｂＢ抗体の組合せなど異なるクラスの抗ＥｒｂＢ治療剤の組合せを使用してもよい。ある特定の実施形態では、細胞が例えば抗ＥｒｂＢ１治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞をＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうち１つのみを対象とする抗ＥｒｂＢ治療剤と接触させることが望ましい場合がある。別の実施形態において、細胞を異なるＥｒｂＢタンパク質を標的とする抗ＥｒｂＢ治療剤の組合せと接触させることが望ましい場合がある。例えば、細胞が両タイプの治療剤に対する耐性を発生させるように、細胞を抗ＥｒｂＢ１（抗ＥＧＦＲ）治療剤および抗ＥｒｂＢ２治療剤と接触させることが望ましい場合がある。さらに別の実施形態において、本方法は、細胞を１つまたは複数の多特異的ＥｒｂＢ治療剤、例えば、２つ以上のＥｒｂＢタンパク質を標的とする１つまたは複数のキナーゼ阻害剤と接触させることを含んでもよい。このような治療剤の例は本明細書中にさらに記載されている。
【０１７７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって産生された細胞または細胞株を提供する。特に、抗ＥｒｂＢ２治療剤耐性を生じさせるＥｒｂＢ配列に変異を含有しない、抗ＥｒｂＢ２治療剤耐性を獲得した細胞を本明細書において提供する。
【０１７８】
別の態様において、本発明は研究目的、創薬、診断目的、治療経過のモニタリング、用量最適化などに役立つキットを提供する。
【０１７９】
一実施形態において、本発明は、抗ＥｒｂＢ治療剤に耐性の癌に罹患している患者を治療するためのキットを提供する。このようなキットは、ＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、もしくはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化（前述）を検出するための少なくとも１つの構成要素、および抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤（前述）を含んでもよい。例えば、キットは抗ＥｒｂＢ治療剤、およびＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化を検出するための少なくとも１つの構成要素を含んでもよい。このようなキットは、治療に対する耐性を発生する患者を特定するための、抗ＥｒｂＢ治療剤で治療されている対象のモニタリングに役に立ち得る。別の実施形態では、キットはＭＥＴ活性化変異、ＭＥＴ遺伝子増幅、またはＨＧＦに媒介されるＭＥＴ活性化を検出するための少なくとも１つの構成要素、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を含んでもよい。このようなキットは、治療に対する耐性を発生する患者を特定するための、抗ＥｒｂＢ治療剤で治療されている対象のモニタリングに役に立ち、抗ＥｒｂＢ治療に耐性であると発見された、およびＭＥＴ活性化突然変異またはＭＥＴ遺伝子増幅を有する対象のための改良された治療レジメンを提供する。このようなキットは例示に過ぎず、本明細書に提供された開示に基づいて多くの他のタイプのキットが当業者によって想定され得る。
【０１８０】
ＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅を検出するための構成要素は、突然変異または遺伝子増幅を検出するための本明細書に記載の種々の方法と併用して使用できる任意の構成要素であってよい。例示的な構成要素は、例えば、ＭＥＴ（またはホスホＭＥＴ）、ＭＥＴリガンド、またはＭＥＴの基質に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、ＭＥＴまたはＭＥＴリガンドを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセット、または支持体に接着された、ＭＥＴまたはＭＥＴリガンドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む固体支持体（マイクロアレイチップなど）を含む。キットは、以下の１つまたは複数をさらに含有してもよい：検出標識、陽性対照、陰性対照、ＭＥＴタンパク質、キナーゼアッセイを行うための試薬、結合アッセイを行うための試薬、ＥｒｂＢ、ＭＥＴおよび／またはＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達を測定するための試薬、使用説明書、反応容器、緩衝液など。キットはまた、ＥｒｂＢ活性化突然変異または遺伝子増幅を検出するための構成要素を含んでもよい。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、キットは、抗ＥｒｂＢ治療剤を用いた治療に耐性の、ＥｒｂＢおよびＭＥＴ活性化突然変異または遺伝子増幅を有する癌細胞を含んでもよい。キットはまた、以下の１つまたは複数をさらに含有してもよい：検出標識、陽性対照、陰性対照、使用説明書、反応容器、緩衝液、抗ＥｒｂＢ治療剤、細胞の増殖、成長および／またはアポトーシスを測定するための試薬、キナーゼアッセイを行うための試薬、結合アッセイを行うための試薬、ＥｒｂＢ、ＭＥＴおよび／またはＰＩ３キナーゼ媒介シグナル伝達を測定するための試薬など。このようなキットは、例えば、ＭＥＴ治療剤の特定、抗ＥｒｂＢおよび抗ＭＥＴ治療剤の組合せの試験、薬剤投与または治療レジメンの最適化などに役に立ち得る。
【０１８２】
キットのそれぞれの構成要素は、反応に適した最終濃度を実現するために混合してもよい。さらに、これらの構成要素に加えて、キットは反応に適した条件を与える緩衝液を含んでもよい。抗体、基質、リガンド、キナーゼなどのタンパク質構成要素を安定剤と混合してもよい。例えば、キット構成要素は、凍結乾燥後のタンパク質変性を防止するために、約１％ＢＳＡおよび約１％ポリオール（例えば、スクロースまたはフルクトースなど）の存在下で保存および／または輸送してもよい。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるキットはまた、ＥｒｂＢおよび／またはＭＥＴタンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するための構成要素を含んでもよい。このような構成要素は、例えば、（１）生体試料のＲＮＡを精製するための試薬；（２）試験核酸を作製するためのプライマー；（３）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（プレミックスまたは別個の）、場合により１つまたは複数の独自に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化またはＣｙ３またはＣｙ５タグ付きｄＮＴＰ）と一緒に；（４）蛍光色素の化学的に活性な誘導体などの合成後標識試薬；（５）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素；（６）種々の緩衝媒体、例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄用緩衝液など；（７）スピンカラムなどのような標識化プローブ精製試薬および構成要素；（８）タンパク質精製試薬；および（９）シグナル生成および検出試薬、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、化学蛍光または化学発光基質などの、タンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するために必要な材料および試薬を含む。特定の実施形態において、キットは、対照として使用するための生体試料から単離された、前標識され、品質管理されたタンパク質およびまたはＲＮＡを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、キットはＲＴ−ＰＣＲ構成要素、またはハイブリダイゼーション構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、核酸アレイ、タンパク質アレイ、抗体アレイ、ホスホタンパク質アレイ、ホスホ抗体アレイなどを含んでもよい。このようなキットを使用して、ＭＥＴ、ＥｒｂＢ、これらのリガンド、および／またはこれらの基質の発現レベルを測定することができる。
【０１８５】
６．医薬組成物
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象への１つまたは複数の抗ＥｒｂＢ治療剤および／または１つまたは複数の抗ＭＥＴ治療剤の投与を含んでもよい。抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、従来の様式で処方することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤、およびこれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、例えば、注射（例えば、ＳｕｂＱ（皮下）、ＩＭ（筋肉内）、ＩＰ（腹腔内））、吸入もしくは吹送（口または鼻を通して）、または経口、口腔、舌下、経皮、経鼻、非経口もしくは直腸投与による投与用に処方してもよい。一実施形態では、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、標的細胞が存在する部位に、すなわち、特定の組織、器官、または体液（例えば、血液、脳脊髄液、腫瘍塊など）に局所的に投与することができる。
【０１８６】
抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、全身、および局所的または限局的投与を含む、種々の投与方法用に処方することができる。技術および処方は通常、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡで見ることができる。非経口投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射用に、化合物を溶液中に、好ましくは例えばハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性のある緩衝液中に処方することができる。加えて、化合物を固体形態に処方し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。
【０１８７】
経口投与用に、医薬組成物は、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは二酸化ケイ素など）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプンなど）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などの薬学的に許容可能な賦形剤を用いて従来の手段によって調製される、例えば、錠剤、薬用ドロップ、またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができ、または、使用前に水または他の適当なビヒクルと構成するための乾燥品として存在してもよい。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂など）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴムなど）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、オイルエステル、エチルアルコールまたは精留植物油など）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いて従来の手段によって調製することができる。製剤はまた、緩衝塩、香料、着色剤および甘味剤を適切なように含有してもよい。経口投与用の製剤は、活性化合物の放出を制御するように適切に処方してもよい。
【０１８８】
吸入による投与（例えば、肺送達）用には、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスなどの適当な推進剤の使用によって、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー状の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定できる。吸入器または吹送器で使用する、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤を含有して処方することができる。
【０１８９】
抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、注射、例えばボーラス注射または持続注入などによる非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、例えば、アンプルなどの単位剤形で、または防腐剤を添加した複数回投与容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質除去水などと構成するための粉末形態であってもよい。
【０１９０】
加えて、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤はまた、デポー製剤として処方することもできる。このような長時間作用型の製剤は、埋込み（例えば、皮下または筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、適当なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と一緒に、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として処方することができる。放出制御処方はまたパッチも含む。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物を、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達用に処方することができる（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０４巻：２９〜４５頁（２００４年）に概説されている）。ＣＮＳへの薬物送達のための従来のアプローチは以下を含む：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入など）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用するための薬剤の分子操作（例えば、それ自体はＢＢＢを通過できない薬剤と組み合わせて、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質）；薬剤の脂溶性を高めるように設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤の脂質またはコレステロール担体へのコンジュゲーションなど）；および（マンニトール溶液の頸動脈への注入またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用の結果生じる）高浸透圧破壊によるＢＢＢ完全性の一時的破壊。
【０１９２】
一実施形態において、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤は、一般に局所的薬物投与に適する局所用担体を含有し、当技術分野において知られる任意のこのような材料を含む、局所製剤に組み込まれる。局所用担体は、例えば、軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョン、ゲル、オイル、溶液など所望の形態の組成物を提供するように選択してもよく、天然起源または合成起源の材料から構成されてもよい。選択した担体が局所製剤の活性薬剤または他の構成要素に悪影響を及ぼさないことが好ましい。本明細書で使用される適当な局所用担体の例は、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどを含む。
【０１９３】
医薬組成物（化粧品を含む）は、０．００１〜１０重量％または０．１％〜５重量％など約０．００００１〜１００重量％の１つまたは複数の本明細書に記載の抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を含むことができる。ある特定の局所製剤では、活性薬剤は製剤の約０．２５重量％〜７５重量％、好ましくは製剤の約０．２５重量％〜３０重量％、より好ましくは製剤の約０．５重量％〜１５重量％、および最も好ましくは製剤の約１．０重量％〜１０重量％の量で存在する。
【０１９４】
目の疾患を、例えば、抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の全身、局所的、眼内注射によって、または抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を放出する持続放出デバイスの挿入によって、治療または予防することができる。抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を、化合物が眼表面と十分な時間接触を維持し、化合物を眼の角膜および内部領域、例えば、前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜および強膜などに浸透させるように、薬学的に許容可能な眼用ビヒクルで送達することができる。薬学的に許容可能な眼用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化材料であってもよい。あるいは、化合物を硝子体液または房水中に直接注射してもよい。さらに別法では、目の治療のために化合物を静脈内注入または注射など全身に投与することができる。
【０１９５】
核酸治療剤の送達方法は、当技術分野において知られている（例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、２巻、１３９頁；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５年；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５９５号を参照されたい）。これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸の送達にも利用することができる。イオントフォレシスによる、またはヒドロゲル、シクロデキストリンなどの別のビヒクルへの組み込みによるリポソームカプセル化、生物分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアを含むがこれらに限定されない当業者に知られている様々な方法によって、核酸を細胞に投与することができる。あるいは、直接注射によってまたは注入ポンプの使用によって核酸／ビヒクルの組合せを局所的に送達する。他の送達経路は、経口（錠剤またはピル形態）および／または髄腔内送達（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７６巻、１１５３〜１１５８頁）を含むがこれらに限定されない。他のアプローチは、例えば、コンジュゲートおよび生物分解性ポリマーの使用による様々な輸送および搬送システムの使用を含む。薬物送達戦略についての包括的概説に関しては、Ｈｏら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１巻、３３６〜３４３頁およびＪａｉｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ、Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、１９９８年およびＧｒｏｏｔｈｕｉｓら、１９９７年、Ｊ．  ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ．、３巻、３８７〜４００頁を参照されたい。核酸送達および投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、上記、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０５０９４号およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０４８１９号に提供されている。
【０１９６】
抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。ＬＤ５０は集団の５０％を致死させる用量である。ＥＤ５０は集団の５０％において治療的に有効な用量である。毒性および治療有効性の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数である。大きい治療指数を示す抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤が好ましい。毒性の副作用を示す抗ＥｒｂＢ治療剤および／または抗ＭＥＴ治療剤を使用してもよいが、非感染細胞に対して予想される損傷を最小限にし、およびそれによって副作用を低減させるために、このような化合物を標的とする患部組織への薬物送達の設計には注意を払うべきである。
【０１９７】
細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用するための用量範囲を処方する際に使用することができる。このような化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあってもよい。用量は、採用された剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。任意の化合物について、治療的に有効な用量を、最初は細胞培養物アッセイから予測することができる。細胞培養物において測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を達成するために、用量を動物モデルにおいて処方してもよい。ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を使用することができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【実施例】
【０１９８】
以下に一般的に記述する本発明は、本発明のある特定の態様および実施形態を例示するためだけに含まれ、本発明を制限することを決して意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【０１９９】
（実施例１）
ＭＥＴ増幅はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性を引き起こす
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、標的キナーゼが遺伝子機構により活性化される、腫瘍の有効な抗癌治療として登場した。説得力のある臨床例として、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ、ＢＣＲ−ＡＢＬ転座）または消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ、ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡの活性化突然変異）治療のためのイマチニブ、ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に活性化突然変異を保有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）治療のためのＥＧＦＲ  ＴＫＩゲフィチニブおよびエルロチニブの使用が挙げられる（１〜４）。
【０２００】
ＥＧＦＲの体細胞変異は、白人のＮＳＣＬＣ腫瘍の１０〜１５％およびアジア人のＮＳＣＬＣ腫瘍の３０〜４０％に起こり、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのエクソン１８〜２１に位置する。一連のオーバーラップしたエクソン１９の欠失およびエクソン１２のミスセンス変異（Ｌ８５８Ｒ）という２つのよくあるタイプの変異が、すべての既知のＥＧＦＲ変異の８５％を占める（５）。ＥＧＦＲ変異細胞株をゲフィチニブで処理すると、患者において観察される劇的な臨床反応と同様のアポトーシスを引き起こす（６）。しかしながら、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣは最初ＥＧＦＲ阻害剤に反応するが、ゲフィチニブおよびエルロチニブで処置した患者の大多数において最終的にはこれらの薬剤に対する耐性を獲得する。このような患者の５０％において、７９０番目のトレオニンのメチオニンへの置換（Ｔ７９０Ｍ）という、単一の二次変異が特定された（７、８）。しかしながら、残りの腫瘍における耐性獲得の機構は不明である。ＥＧＦＲ変異腫瘍がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を活性化するために特にＥＲＢＢ３を利用すること、およびゲフィチニブがＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣにおいてアポトーシスを誘導するためにはＥＲＢＢ３／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の下方制御が必要であることが示されている（９、１０）。とりわけ、ＥＲＢＢ２増幅乳癌細胞においてＥＲＢＢ３リン酸化の持続がゲフィチニブ耐性を引き起こすこともまた示されている（１１）。
【０２０１】
ゲフィチニブ耐性のさらなる機構を探求するために、ゲフィチニブ高感受性（ＩＣ５０
１０ｎＭ）ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）変異ＮＳＣＬＣ細胞株、ＨＣＣ８２７の耐性クローンを、ゲフィチニブ濃度を増加させながら細胞を６カ月曝露させることによって作製した。得られた細胞株ＨＣＣ８２７ＧＲ（Ｇｅｆｔｉｎｉｂ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（ゲフィチニブ耐性））および単一細胞から単離した６個のクローンは、インビトロでゲフィチニブ耐性であった（ＩＣ５０＞１０μＭ。図１Ａ）。親細胞株の場合とは異なり、ＧＲ細胞においてＥＲＢＢ３およびＡｋｔのリン酸化はゲフィチニブ存在下で維持された（図１Ｂ）。この観察結果はＥＧＦＲの二次変異によるものであったのかを確認するため、６個すべてのＧＲクローンのＥＧＦＲの全コード領域を配列決定したところ、既知のエクソン１９の欠失変異が明らかになった。しかしながら、Ｔ７９０Ｍ変異は検出されなかった。加えて、１％の頻度でも遺伝子変異を検出可能な高感度酵素法（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標））を使用して、６個すべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＥＧＦＲの全コード領域における変化を検査した（１２）。ＨＣＣ８２７親細胞株との差異は検出されなかった。さらに、Ｔ７９０Ｍ変異を保有するＮＳＣＬＣ細胞株の成長を阻害できる不可逆的阻害剤ＣＬ−３８７，７８５は、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株の成長を抑制しなかった（１３）。
【０２０２】
別の受容体の異常活性化が、観察された耐性を仲介しているかどうかを確認するために、ホスホ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アレイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞の４２個の異なるリン酸化ＲＴＫパネルに対するゲフィチニブの効果を比較した（図１Ｃ）。ＨＣＣ８２７細胞株において、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ２およびＭＥＴはすべてリン酸化されており、これは１μＭのゲフィチニブ処理後に完全にまたは顕著に低下した。対照的にＨＣＣ８２７ＧＲ細胞において、ゲフィチニブ存在下であってもＭＥＴの顕著なリン酸化、ならびにＥＲＢＢ３およびＥＧＦＲの持続的なリン酸化が認められた（図１Ｃ）。耐性の背景にある機構をさらに探求するために、本発明者らはＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株のゲノムワイドなコピー数解析を行い、Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイを使用してそれらをＨＣＣ８２７親細胞と比較した（図１Ｄ）。耐性細胞株において、親細胞株には存在しなかった７番染色体長腕（７ｇ３１．１〜７ｇ３３．３を包含している）における著しい限局的な増幅が検出された。この領域はＭＥＴ癌原遺伝子を含有する（図１Ｅ）。定量ＰＣＲを使用して、ＨＣＣ８２７親細胞株と比較してすべてのＨＣＣ８２７耐性細胞株においてＭＥＴが５〜１０倍増幅されたことを確認した（図６）。ｍＲＮＡ発現プロファイリングを使用して、本発明者らはさらにＧＲおよび親細胞株におけるｍＲＮＡ発現プロファイルを比較した（図８）。ＧＲ細胞において最も特異に過剰発現された２０個の配列のうち、ＭＥＴ自体は３回出現した。６個すべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＭＥＴの全コード領域を配列決定したが、ＭＥＴ変異は検出されなかった。総合すると、これらの結果はＭＥＴ増幅がＭＥＴ発現の増加を引き起こし、これがＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株におけるゲフィチニブ存在下でのＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ３のリン酸化、およびインビトロでのゲフィチニブ耐性に関連することを示唆する。
【０２０３】
ＭＥＴシグナル伝達の増加がゲフィチニブ耐性獲得を引き起こすかどうかを確認するため、ＭＥＴ阻害がＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の成長を抑制するかどうかを調べた。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞をＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤であるＰＨＡ−６６５，７５２に単独で、またはゲフィチニブと組み合わせて曝露させた（１４）。ＨＣＣ８２７ＧＲ５細胞はゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２単独の両方に耐性であったが、組み合わせると、両薬物の濃度＞３３ｎＭで、顕著なアポトーシスを伴って（図７）８５％を超える成長阻害が認められた（図２Ａ）。他のすべてのＨＣＣ８２７ＧＲクローンで同様の結果が観察された。次に、耐性細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達に対するゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２の効果を調べた。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株において、親細胞の場合とは異なり、ゲフィチニブは単独でＥＧＦＲのリン酸化を低下させるが完全には阻害できず、ｐ−ＥＲＢＢ３またはｐ−Ａｋｔに対する効果は最小であった。しかしながら、ＰＨＡ−６６５，７５２と組み合わせると、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株におけるＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化は完全に抑制される。注目すべきは、ゲフィチニブ処理で観察された残りのＥＧＦＲリン酸化もまた、ＰＨＡ−６６５，７５２の添加により除去され、前述のように残りのＥＧＦＲリン酸化がＭＥＴキナーゼ活性に起因していたことを示唆した（１５）。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてＰＩ３ＫＩＡｋｔが活性化された機構をより正確に定義するために、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットを免疫沈降し、共沈したタンパク質を分析した。ＨＣＣ８２７親細胞株において、２つの主要なホスホチロシンタンパク質、ＥｒｂＢ３および既知のＭＥＴアダプタータンパク質である成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）結合バインダー１（Ｇａｂ１）がｐ８５と共沈する（図２Ｃ）（１６）。どちらの相互作用もゲフィチニブ存在下で妨害された。対照的に、ＥｒｂＢ３およびＧａｂ１はともに、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞においてゲフィチニブ単独の存在下でｐ８５とやはり共沈したが、これらの相互作用はゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５，７５２の両方の存在下で完全に妨害された（図２Ｃ）。これらの観察結果は細胞抽出物において観察されたホスホＥＲＢＢ３の消失と一致し、ＭＥＴがＥＧＦＲキナーゼ活性に関係なくＥＲＢＢ３活性化を誘発できることを示唆する。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞をＰＨＡ−６６５，７５２単独で処理すると、Ｇａｂ１のｐ８５との結合を妨げるがｐ−Ａｋｔレベルに対する効果は最小であり（図２Ｂおよび２Ｃ）、その結果、これらのゲフィチニブ耐性細胞株においてＧａｂ１のＰＩ３Ｋとの結合はＡｋｔリン酸化に必要ないことを示す。重要なことには、ＭＥＴの２つの異なる領域に対するショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡを使用してＭＥＴを下方制御すると、ＨＣＣ８２７ＧＲのゲフィチニブに対する感受性もまた回復する（図２Ｄ）（１７）。さらに、ＭＥＴ特異的ｓｈＲＮＡは２つともＭＥＴをＨＣＣ８２７親細胞株に見られるレベル（図２Ｂ参照）まで下方制御し、これらの細胞株においてＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化の両方を下方制御するゲフィチニブの能力を回復させた。総合すると、これらの結果はＭＥＴ増幅がＥＲＢＢ３リン酸化を維持することによってゲフィチニブ存在下でＰＩ３ＫＩＡｋｔシグナル伝達の持続的な活性化を引き起こすことを示唆する。
【０２０４】
ＭＥＴ増幅およびそのＰＨＡ−６６５，７５２に対するインビトロ感受性との関連が、胃癌細胞株において最近報告された（１８）。したがって、ＭＥＴ増幅を有する他の細胞株もまたＥＲＢＢ３を利用してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を活性化するかどうかを確認した。ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞と同様に、Ｈ１９９３ＮＳＣＬＣ細胞においてならびにＳＮＵ６３８およびＭＫＮ４５胃癌細胞においてＥＲＢＢ３はｐ８５と結合することがわかった。この結合はＰＨＡ−６６５，７５２によって妨害されたが、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ２二重阻害剤ラパチニブによってまたはＣＬ−３８７，７８５によって妨害されなかった（図３Ａ）。したがって、ＭＥＴはＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２非依存的にＥＲＢＢ３リン酸化およびＰＩ３Ｋとの結合を引き起こす。同様にＥＲＢＢ３およびＡｋｔリン酸化はＰＨＡ−６６５，７５２のみに阻害された（図３Ａ）。加えて、ＥＲＢＢ３はＳＮＵ６３８細胞において、レンチウイルスを用いてこれらの細胞をＥＲＢＢ３特異的ｓｈＲＮＡに感染させ、顕著なｐ−Ａｋｔの減少（図３Ｂ）および成長阻害（図３Ｃ）を引き起こすことによって下方制御された。これらの検討を総合すると、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化の機構としてＥＲＢＢ３がＭＥＴ依存的にチロシンリン酸化されるというＨＣＣ８２７ＧＲ細胞での観察結果は、他のＭＥＴ増幅細胞において一般化可能であることが示唆される。
【０２０５】
そこで、ＭＥＴが直接ＥＲＢＢ３リン酸化を引き起こすことができるかどうかを確認した。検出可能なレベルのＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３を通常発現しないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＥＲＢＢ３を単独でまたはＭＥＴと組み合わせて発現させた。ＭＥＴおよびＥＲＢＢ３を共発現しているＣＨＯ細胞において顕著なＥＲＢＢ３リン酸化が認められ、これはＰＨＡ−６６５，７５２によって妨げられたが、高用量のゲフィチニブ、ラパチニブまたはＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ２には妨げられなかった（図３Ｄ）。これらの細胞において、チロシンリン酸化ＥＲＢＢ３はＭＥＴキナーゼ依存的にｐ８５と共免疫沈降した（図３Ｅ）。また、ＣＨＯ細胞からのＥＲＢＢ３およびＭＥＴの共沈も観察された（図３Ｅおよび３Ｆ）。総合すると、これらの結果により、非ＥＲＢＢまたはＳＲＣ依存的にＭＥＴがＥＲＢＢ３と結合でき、ＥＲＢＢ３リン酸化およびＰＩ３Ｋとの結合を促進できることが示唆される。
【０２０６】
次に、ゲフィチニブ耐性を獲得したＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ患者においてＭＥＴ増幅が起こり得るかどうかを調べた。全員が最初ゲフィチニブおよびエルロチニブに対して部分反応を得たが、その後ゲフィチニブまたはエルロチニブを受けている間に癌が成長した、１８人の患者を分析した。ＭＥＴ遺伝子座の定量ＰＣＲ（ｎ＝１１、腫瘍由来ＤＮＡのみが入手可能だった場合）または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、ｎ＝７、腫瘍切片が入手可能だった場合）の両方を使用した。８人の患者において、ゲフィチニブ耐性の発生前後の腫瘍切片対が入手可能であったが、１０人の患者においてはゲフィチニブおよびエルロチニブに対する臨床的耐性の後にのみ切片が入手可能であった（図５および図９）。サンプル対のある８人の患者のうち、ＭＥＴ増幅は２個の処置後の切片に検出されたが、処置前の切片には存在しなかった。患者１において、処置後切片のＭＥＴ増幅は、ＨＣＣ８２７ＧＲ細胞株に見られた増幅レベルと同様であった（図５および６）。加えて、処置後切片のみが入手可能であった別の２人の患者（患者１２および１３）においてもＭＥＴ増幅が検出された。全体としてＭＥＴ増幅はゲフィチニブ／エルロチニブ耐性腫瘍切片の４／１８（２２％）に検出された。重要なことには、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を有さない３個の切片において、およびＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ同時変異を有する１個の切片においてＭＥＴ増幅が観察された。興味深いことに、患者１２はＥＧＦＲ  Ｔ７９０ＭおよびＭＥＴ増幅の両方を有していたが、それぞれの耐性様式は２つの異なる再発部位で別々に起こった。これらの結果は、ゲフィチニブ耐性を有するＮＳＣＬＣ患者においてＭＥＴ増幅が検出可能であることを示唆する。さらに、多数の耐性機構が同じ患者において同時に起こり得る。
【０２０７】
方法
細胞培養および試薬
ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ細胞株ＨＣＣ８２７（Ｅ７４６〜Ａ７５０欠失）、Ｈ３２５５（Ｌ８５８Ｒ）およびＨ３２５５ＧＲを本研究において使用し、広範に特徴づけた（３、３０〜３１、１０）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から１１１９９３およびＢＴ４７４細胞を入手した。ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５胃癌細胞はＷｏｎ  Ｋｉ  Ｋａｎｇ博士（Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から入手し、以前に特徴づけられている（１８、３２）。ＨＣＣ８２７、Ｈ１９９３  ＳＮＵ−６３８およびＭＫＮ−４５細胞株は、１０％ＦＢＳ（ＭＫＮ−４５には２０％）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＣＡ）中に維持した。１１３２５５およびＨ３２５５ＧＲは、５％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを添加したＡＣＬ−４培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中に維持した。
【０２０８】
ゲフィチニブは商業的供給源から入手し、酢酸エチル抽出によって精製した。得られた生成物を液体クロマトグラフィーおよび質量分析法によって確認した。ラパチニブはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｃｌ−３８７，７８５はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＰＨＡ−６６５，７５２はＰｆｉｚｅｒのギフトであった。すべての薬物のストック溶液をＤＭＳＯで調製し、−２０℃で保存した。
【０２０９】
細胞増殖および成長アッセイ
成長および成長阻害をＭＴＳアッセイにより評価した。生存細胞の数を測定するための比色法であるこのアッセイは、細胞による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）から、細胞培養培地に可溶で分光光度法により検出できるホルマザン生成物への生物還元に基づいており、以前に確立された方法に従って行った（３、３１、１０）。
【０２１０】
細胞は７２時間処理に曝露させ、実験毎に使用した細胞数は経験的に測定し、事前に確立されている（３１）。すべての実験点を６〜１２個のウェルに設定し、すべての実験を少なくとも３回繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．００ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ワールドワイドウェブのｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して、データを図で示した。非線形回帰モデルを使用してＳ字状の用量反応に曲線を適合させた。
【０２１１】
抗体およびウェスタンブロット法
以前に指定された条件下で増殖させた細胞を次の溶解緩衝液中で溶解した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０／１０％グリセロール／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／５ｍＭピロリン酸ナトリウム／５０ｍＭ  ＮａＦ／１０ｎＭ（３−グリセロホスフェート／１ｍＭバナジウム酸ナトリウム／０．５ｍＭ  ＤＴＴ／４μｇロイペプチン／４μｇ／ｍｌペプスタチン／４μｇ／ｍｌアポタンパク質／１ｍＭ  ＰＭＳＦ。細胞溶解後、溶解産物を１６，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を次の手順に使用した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動による分離の後にウェスタンブロット解析を行い、ニトロセルロース膜に移した。抗体メーカーの推奨に従って免疫ブロット法を行った。高感度化学発光システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して抗体結合を検出した。
【０２１２】
抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ−４７３）、抗トータルＡｋｔ、抗ＥＧＦＲ、および抗ホスホＥｒｂＢ−３（Ｔｙｒ−１２８９）抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。抗ＥｒｂＢ−３抗体はＬａｂ  Ｖｉｓｉｏｎから入手した。ホスホ特異的ＥＧＦＲ（ｐＹ１０６８）、ＭＥＴ（ｐＹ１２３４／１２３５）、トータルＥＲＫ１／２、ホスホＥＲＫ１／２（ｐＴ１８５／ｐＹ１８７）抗体はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．から購入した。抗ｐ８５抗体はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。トータルＭｅｔ（Ｃ−２８）抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。
【０２１３】
インビトロゲフィチニブ耐性ＨＣＣ８２７の作製
耐性細胞株を作製するために、Ｈ３２５５を使用して本発明者らが以前に記載した方法と同様に、ゲフィチニブ濃度を増加させながらＨＣＣ８２７細胞を曝露させた（１０）。細胞が未処理の親細胞と同様な増殖動態を回復したときに、ゲフィチニブ濃度を１〜１００ｎＭまで段階的に増加させた。１００ｎＭのゲフィチニブ中で増殖可能であった細胞を、最初の薬物曝露から６カ月後に得た。耐性クローンの出現を確認するため、細胞を薬物のない状態で少なくとも４日間増殖させた後に各濃度で増殖後、ＭＴＳアッセイを行った。耐性ＨＣＣ８２７細胞はゲフィチニブ非存在下で１７回継代され、ＭＴＳで確認されたように耐性を維持した。６個の個々のクローン（ＨＣＣ８２７ＧＲ１、ＧＲ２、ＧＲ５、ＧＲ６、ＧＲ７およびＧＲ８）を単離し、すべてがゲフィチニブ耐性であることを個別に確認した。ＨＣＣ８２７細胞をゲフィチニブを用いずに維持し、そのゲフィチニブ感受性を５継代毎に検査した。期間中、親細胞株においてゲフィチニブ感受性に顕著な変化はなかった。
【０２１４】
ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）分析
ＨＣＣ８２７ＧＲクローンのＥＧＦＲ全コード領域を、以前に記載された高感度遺伝子スキャニング法の改良法を使用して遺伝子変化について調べた（１０、１２）。ＥＧＦＲ全コード領域を包含する７個のオーバーラップしたｃＤＮＡセグメントを作製し、以前に記載されたように分析した（１２）。ＰＣＲプライマーは要求に応じて入手可能である。
【０２１５】
細胞株のｃＤＮＡ配列決定
Ｔｒｉｚｏｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して細胞株から全ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニエリュートクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを転写した。このｃＤＮＡをその後のＥＧＦＲおよびＭＥＴのＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲ条件およびプライマーの詳細は以前に公表されている（３、１７）。
【０２１６】
ＭＥＴｓｈＲＮＡコンストラクトおよびレンチウイルス感染
ｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏベクターでクローニングしたＭＥＴｓｈＲＮＡコンストラクトは、Ｈａｒｖａｒｄ  ＲＮＡｉコンソーシアムから入手し、以前に特徴づけられている（１０、１７）。各コンストラクトは、ＭＥＴの異なる領域を標的とする２１ｂｐの配列、ヌクレオチド６個のヘアピン配列（ＣＴＣＧＡＧ）、および２１ｂｐの相補鎖配列を含有していた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するベクターを対照として使用した。特異的ｓｈＲＮＡ配列は要求に応じて入手可能である。レンチウイルス産生および感染は以前に記載されたように行った（１０）。
【０２１７】
ＳＮＰおよび発現解析
ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞を、培地および前述の収集した全ＲＮＡを含有する血清中で、細胞を供給後６時間、６０％コンフルエンスまで平板培養した。その後、ＲＮＡ標本を処理し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧＵ１３３Ａマイクロアレイにハイブリダイズさせ、スキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェアを使用して各遺伝子の発現値を計算し、ｄＣｈｉｐソフトウェア（ワールドワイドウェブのｂｉｏｓｕｎ１．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｌａｂ／ｄｃｈｉｐ／）を使用してデータを解析した。
【０２１８】
ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＨＣＣ８２７およびＨＣＣ８２７ＧＲ細胞からゲノムＤＮＡを単離した。メーカーの使用説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ、ただし、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーを「Ｂｌｏｃｋ」モードに設定し、すべての変性サイクルを９２℃で行った）に従って、Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ２５０Ｋ  Ｓｔｙ一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ用にサンプルを処理し、各サンプルにつき４回のＰＣＲ反応を行い、１２０μｇのＰＣＲ産物を断片化し、標識し、各アレイにハイブリダイズさせた。以前に確立された方法に従ってｄＣｈｉｐソフトウェアを使用して、ＨＣＣ８２７およびＧＲクローンの遺伝子コピー数の差異の比較を行った（３３）。
【０２１９】
定量ＰＣＲ
ＰＲＩＳＭ７５００配列検出キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用した定量リアルタイムＰＣＲを使用してＭＥＴの相対的コピー数を測定した。検量線法を使用して、コピー数が正常細胞および癌細胞間でほぼ同じＬｉｎｅ−１反復エレメントである基準に対する細胞株および腫瘍ＤＮＡサンプル中のＭＥＴ遺伝子コピー数を計算した（３３）。正常なヒトゲノムＤＮＡの連続希釈による検量線に基づいて定量した。すべての標本を３回反復して分析した。ＰＣＲプライマーは要求に応じて入手可能である。
【０２２０】
異種移植片
Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｓｔｏｎによる承認を得たプロトコルに基づくＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の基準に従ってインビボ試験にヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、世話をした。２％Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ）酸素混合物吸入を使用してマウスに麻酔をかけた。５×１０６個のＨＣＣ８２７またはＨＣＣ８２７ＧＲ５肺癌細胞の懸濁液（０．２ｍｌのＰＢＳ中）を各マウスの脇腹の右下四半分に皮下接種した。週に２回、カリパスを使用して腫瘍を測定し、式（長さ×幅２×０．５２）を使用して体積を計算した。毎日、体重および全身状態についてマウスをモニターした。大きさの平均が１０００ｍｍ３に達したときに腫瘍を収集した。
【０２２１】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
Ｖｙｓｉｓ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）から購入したＤ７Ｓ５２２プローブおよび７番染色体セントロメアプローブ（ＣＥＰ７）を使用して蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。キシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で脱水することによって、異種移植片からまたは患者標本から作製した５ミクロン（５ｐｍ）の腫瘍切片を調製した。Ｔｒｉｓ塩基およびＥＤＴＡ（ＴＥ）中に浸漬させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で洗浄し、Ｄｉｇｅｓｔ−Ａｌｌ（Ｚｙｍｅｄ）で消化することにより切片を消化した。ホルマリンを使用して切片を固定し、エタノール中で脱水した。切片およびプローブ（Ｄ７Ｓ５２２およびＣＥＰ７）の同時変性を完了し、切片を３７度で２〜３晩ハイブリダイズさせた。Ｔｗｅｅｎ−２０溶液と一緒にクエン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸緩衝液を使用してハイブリダイゼーション後の洗浄を行い、ＤＡＰＩ対比染色の上にカバースリップを被せた。Ｄ７Ｓ５２２プローブはＨＣＣ８２７ＧＲ細胞の小さなアンプリコン中に含有される（図１Ｆ）。各腫瘍標本から１００個の細胞を分析し、Ｄ７Ｓ５２２およびＣＥＰ７シグナルの数を定量した。細胞を、（１）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＜１、（２）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＞２、または（３）ＣＥＰ７と比較してＤ７Ｓ５２２のコピーがさらに＞３、に分類した。
【０２２２】
患者
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  ＳｔｕｄｉｅｓのもとでＤａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、愛知県がんセンター中央病院（名古屋、日本）、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から、およびＢｅｌｌａｒｉａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｌｏｇｎａ、Ｉｔａｌｙ）から、ゲフィチニブおよびエルロチニブ治療患者の腫瘍切片を入手した。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。エクソン特異的増幅（エクソン１８〜２１）を使用して、その後サブクローニングおよび直接配列決定法によって、または変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）を併用したＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）エンドヌクレアーゼ、分画、および以前に公表された方法（１２、７）を使用した配列決定の使用によって、各標本におけるＥＧＦＲ変異の存在を確認した。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異の検出は、ＤＨＰＬＣを併用したＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）エンドヌクレアーゼを使用して、またはＣｙｃｌｅａｖｅリアルタイムＰＣＲアッセイ（１０、３２、１２）を使用することによって行った。いずれの方法も１〜５％の対立遺伝子頻度でＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を検出することができる。
【０２２３】
（実施例２）
ＭＥＴ誘導はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性を引き起こす
ＭＥＴのリガンドであるＨＧＦ（肝細胞成長因子）でＨＣＣ８２７細胞を処理することによって、ＭＥＴ活性を誘導した。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ゲフィチニブを同時投与した。図１０の左上パネルは、ゲフィチニブ存在下でＨＣＣ８２７細胞を異なる濃度のＨＧＦ（２、１０および５０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、ＭＴＳ生存アッセイに供したときに作製した生存曲線を示す。５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦによる処理は顕著に生存の改善を引き起こす。
【０２２４】
図１０の右上パネルは、ゲフィチニブ存在下でＨＣＣ８２７細胞においてＨＧＦがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化を維持することを示す。ＨＣＣ８２７細胞をゲフィチニブ単独でまたはＨＧＦと一緒に６時間処理し、その後溶解した。溶解産物を規定の抗体を用いてウェスタンブロット分析により分析した。結果は、ＡＫＴタンパク質レベルは比較的一定であったが、ゲフィチニブ（ＴＫＩ）処理によって起こったＡＫＴリン酸化の減少はＨＧＦ処理によって少なくとも部分的に回復したことを示す。
【０２２５】
図１０の下パネルは、ＨＧＦおよびゲフィチニブを同時投与した場合の細胞の生存を示す。５０ｔ０Ｋ細胞を１０ｃｍのペトリ皿に接種し、規定の条件で１０日間処理した。ゲフィチニブは１μＭで使用し、ＨＧＦは５０、１０、または２ｎｇ／ｍｌで使用した。次いでプレートをクリスタルバイオレットで染色し、生存細胞を視覚化した。未処理のウェルは最多の生存細胞集団を示し、ゲフィチニブのみで処理した細胞は最多の細胞死を示した。ゲフィチニブ処理された細胞の生存は、ＨＧＦ濃度の増加とともに増加した。
【０２２６】
総合すると、データは、ＨＣＣ８２７細胞においてリガンドに誘導されるＭＥＴ活性化がＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する耐性を誘導することを示す。
【０２２７】
参考文献
【０２２８】
【化１】
2014141530.tif 000003
均等物
本発明はとりわけ、抗ＥｒｂＢ治療剤および抗ＭＥＴ治療剤を使用する癌治療の方法を提供する。対象発明の特定の実施形態が論じられたが、上記の詳述は例示であって制限するものではない。本明細書の概説によって、本発明の多くの変形形態が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、均等物および明細書の全範囲とともに、前述の変形形態とともに、特許請求の範囲を参照することにより決定されるべきである。
【０２２９】
参照による組み込み
本明細書で述べられたすべての刊行物および特許は、以下に記載の項目を含めて、個々の刊行物または特許が具体的および個々に参照により組み込まれることを示すように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配する。
【０２３０】
Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されているものなどの公開データベース中のエントリに関連するアクセション番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、参照によりその全体が組み込まれる。
【図１−２】
2014141530.tif 000004
【図２−１】
2014141530.tif 000005
【図４】
2014141530.tif 000006
【図５】
2014141530.tif 000007
【図６】
2014141530.tif 000008
【図８】
2014141530.tif 000009
【図９】
2014141530.tif 000010
【図１−１】
2014141530.tif 000011
【図２−２】
2014141530.tif 000012
【図３−１】
2014141530.tif 000013
【図３−２】
2014141530.tif 000014
【図３−３】
2014141530.tif 000015
【図７】
2014141530.tif 000016
【図１０】
2014141530.tif 000017
【外国語明細書】
2014141530000001.pdf