(57)【要約】【課題】縮合型タンニンを検出又は定量するために用いる試薬、及び縮合型タンニンを検出又は定量する方法を提供する。【解決手段】オリゴアルギニン構造を有する、縮合型タンニン検出用試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴアルギニン構造を有する、縮合型タンニン検出用試薬。
【請求項２】
前記オリゴアルギニン構造が、アルギニンが２〜５個連続した構造である、請求項１に記載の縮合型タンニン検出用試薬。
【請求項３】
さらに検出用標識を有する、請求項１又は２に記載の縮合型タンニン検出用試薬。
【請求項４】
前記検出用標識が、色素標識である、請求項１〜３のいずれかに記載の縮合型タンニン検出用試薬。
【請求項５】
試料中の縮合型タンニンを検出する方法であって、
（１）オリゴアルギニン構造を有する縮合型タンニン検出用試薬を、前記試料と接触させる工程
を含む方法。
【請求項６】
前記縮合型タンニン検出用試薬が、さらに検出用色素標識を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料中の縮合型タンニンの量を評価する方法であって：
（１）オリゴアルギニン構造及び検出用色素標識を有する縮合型タンニン検出用試薬を含有する溶液に、前記試料を添加する工程；及び
（２）工程（１）の前後における前記溶液の吸光度の減少度合いに基づいて、前記試料中の縮合型タンニン量を評価する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴアルギニン構造を有する縮合型タンニン検出用試薬、及びそれを用いる縮合型タンニン検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンニン（Ｔａｎｎｉｎ）とは、果実、葉その他の植物の様々な部位に存在するポリフェノール化合物の総称である。タンニンは、食品、飲料、薬品及び肥料等の幅広い分野で重要である。一般にタンニンは、その構造の違いから（１）グルコース等の多価アルコールを核に没食子酸がエステル結合しているいわゆる「加水分解型タンニン」と、（２）プロシアニジンの名でも知られるカテキンやガロカテキン等の、フラバン−３−オール（Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）を構成単位とした重合体であるいわゆる「縮合型タンニン」の、主に二つのグループに分けることができる。
【０００３】
タンニンは様々なタンパク質との吸着沈殿作用、及び酵素への吸着阻害作用を示すことが知られている。特に吸着沈殿作用はいわゆる澱や渋みの原因であり、ワイン及びジュース等の飲料においては品質劣化の原因、及び品質の良し悪しを左右する重要な因子となっている。しかしながら、タンニンの分析法や定量法は未だ確立されていないのが現状である（非特許文献１〜６）。
【０００４】
ポリフェノール化合物の検出法として、いわゆるフォリン反応が知られている。フォリン反応を利用することにより、塩基性条件下でフォリン−チオカルト試薬とポリフェノール化合物を反応させることによる呈色を測定し、ポリフェノール化合物の検出又は定量を行うことができる。この他に、アルギニン又はリジンから選択される同一又は異なる２以上の残基がペプチド又はタンパク質に付加した試薬を用いてポリフェノール化合物を検出する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、これらの方法は、あくまでフェノール化合物又はポリフェノール化合物全般を検出又は定量する方法であり、ポリフェノール化合物としてタンニン以外の成分が試料中に混在する場合には、タンニンを正確に検出又は定量することはできない。
【０００５】
このように、タンニンを高選択的に検出又は定量する方法については全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２４１５７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tanaka T. Chemical studies on plant polyphenols and formation of black tea polyphenols. Yakugaku Zasshi, 2008, 128, 1119-1131.
【非特許文献２】Hamada, S.; Kontani, M.; Hosono, H.; Ono, H.; Tanaka, T.; Ooshima, T.; Mitsunaga, T.; Abe, I. Peroxidase-catalyzed generation of catechin oligomers that inhibit glucosyltransferase from Streptococcus sobrinus. FEMS Microbiol Lett. 1996, 15, 35-40.
【非特許文献３】Dou J.; Lee VS.; Tzen JT.; Lee MR. Identification and comparison of phenolic compounds in the preparation of oolong tea manufactured by semifermentation and drying processes. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 7462-8.
【非特許文献４】The World Cancer Report 2008, World Health Organization
【非特許文献５】Steele, V. E.; Kelloff, G. J.; Balentine, D.; Boone, C. W.; Mehta, R.; Bagheri, D.; Sigman, C. C.; Zhu, S.;  Sharma, S.; Comparative chemopreventive mechanisms of green tea, black tea and selected polyphenol extracts measured by in vitrobioassays. Carcinogenesis, Oxford University Press , 2000, 21, 1, 63-67.
【非特許文献６】Kakiuchi, N.; Hattori, M.; Nishizawa, M.; Yamagishi, T.; Okuda, T.; Namba, T.  Studies on dental caries prevention by traditional medicines. VIII. Inhibitory effect of various tannins on glucan synthesis by glucosyltransferase from Streptococcus mutans. Chem. Pharm. Bull., 1986, 34, 720.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、縮合型タンニンを検出又は定量するために用いる試薬、及び縮合型タンニンを検出又は定量する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、本発明者は、オリゴアルギニン構造を有する検出用試薬を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。
【００１０】
本発明は上記の新しい知見に基づいてさらなる研究を重ねることにより完成されたものであり、以下に掲げる通りである。
Ｉ．縮合型タンニン検出用試薬
項Ｉ−１．
オリゴアルギニン構造を有する、縮合型タンニン検出用試薬。
項Ｉ−２．
前記オリゴアルギニン構造が、アルギニンが２〜５個連続した構造である、項Ｉ−１に記載の縮合型タンニン検出用試薬。
項Ｉ−３．
さらに検出用標識を有する、項Ｉ−１又はＩ−２に記載の縮合型タンニン検出用試薬。
項Ｉ−４．
前記検出用標識が、色素標識である、項Ｉ−１〜Ｉ−３のいずれかに記載の縮合型タンニン検出用試薬。
ＩＩ．縮合型タンニンを検出する方法
項ＩＩ−１．
試料中の縮合型タンニンを検出する方法であって、
（１）オリゴアルギニン構造を有する縮合型タンニン検出用試薬を、前記試料と接触させる工程
を含む方法。
項ＩＩ−２．
前記オリゴアルギニン構造が、アルギニンが２〜５個連続した構造である、項項ＩＩ−１．に記載の方法。
項ＩＩ−３．
前記検出用標識が、さらに検出用標識を有する、項ＩＩ−１又はＩＩ−２に記載の方法。
項ＩＩ−４．
前記検出用標識が、色素標識である、項ＩＩ−３に記載の方法。
ＩＩＩ．縮合型タンニンの量を定量する方法
項ＩＩＩ−１．
試料中の縮合型タンニンの量を評価する方法であって：
（１）オリゴアルギニン構造及び検出用色素標識を有する縮合型タンニン検出用試薬を含有する溶液に、前記試料を添加する工程；及び
（２）工程（１）の前後における前記溶液の吸光度の減少度合いに基づいて、前記試料中の縮合型タンニン量を評価する工程
を含む、方法。
項ＩＩＩ−２．
前記オリゴアルギニン構造が、アルギニンが２〜５個連続した構造である、項項ＩＩＩ−１．に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を利用することにより、タンニン、特に縮合型タンニン、を高選択的に検出又は定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）溶液 ２０μＬ、１００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０ μＬ及び２００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０ μＬをＨＰＬＣ分析した結果を示す。
【図２】ワイン１を遠心分離し、上清を蒸留水と０．１ Ｍ  酢酸緩衝溶液（ｐＨ ５．０）でそれぞれ２，４，８，１６倍希釈した後、４９２ ｎｍの吸光度を測定した結果を示す。
【図３】ワイン１及び２をそれぞれ蒸留水で２，４，８，１６，３２倍希釈し、４９２ ｎｍの吸光度を測定した結果を示す。
【図４】ワイン１及び２、並びに紅茶においてそれぞれＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを反応させた前後の吸光度の変化を示す。
【図５】五倍子の組織切片を、塩化第二鉄及びＤａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇでそれぞれ染色した結果を示す。
【図６】市販のブドウの切断面をを塩化第二鉄、Ｄａｂｓｙｌ Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇで染色し、顕微鏡で観察した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．  縮合型タンニン検出用試薬
本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、オリゴアルギニン構造を有する。
【００１４】
本発明において、オリゴアルギニン構造とは、アルギニンが連続した構造をいう。左記において、連続するアルギニンの数は、本発明の効果が得られる範囲内で適宜設定できる。左記において、連続するアルギニンの数は、特に限定されないが、扱いやすさ及び調製しやすさの観点で、２〜５個であれば好ましく、２〜４個であればより好ましく、３個であればさらに好ましい。
【００１５】
本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、オリゴアルギニン構造に加えて他の構造をさらに有していてもよい。左記において、他の構造は、何らかの機能を有する構造であってもよいし、特に機能を有さない構造であってもよい。機能を有する構造としては、検出用標識及び測定用標識等が挙げられる。検出用標識については後述する。
【００１６】
本発明の縮合型タンニン検出用試薬に含まれるオリゴアルギニン構造は、縮合型タンニンと強く相互作用するが、加水分解型タンニンとは強く相互作用しない。このことを利用して、本発明の縮合型タンニン検出用試薬を使って縮合型タンニンを選択的に検出及び定量することができる。
【００１７】
本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、二以上のオリゴアルギニン構造を有していてもよい。この場合、それぞれのオリゴアルギニン構造は、互いに他の構造を介して連結されている。左記において、他の構造は、何らかの機能を有する構造であってもよいし、特に機能を有さない構造であってもよい。
【００１８】
本発明の縮合型タンニン検出用試薬がオリゴアルギニン構造に加えて特に機能を有さない他の構造をさらに有している場合、及び二以上のオリゴアルギニン構造が特に機能を有さない他の構造を介して連結されている場合、特に機能を有さない構造としては、特に限定されないが、例えば、ペプチド構造及びエステル構造等が挙げられる。
【００１９】
上記において、ペプチド構造としては、例えば、１〜３個のアミノ酸からなるペプチド構造が挙げられる。ペプチド構造の構成アミノ酸としては、例えば、塩基性のアミノ酸、中性のアミノ酸及び酸性のアミノ酸等が挙げられる。塩基性のアミノ酸としては、例えば、リジン、ヒスチジンが挙げられる。中性のアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン及びフェニルアランニン等が挙げられる。酸性のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。
【００２０】
上記において、エステル構造としては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ステアリルエステル及びベンジルエステル等が挙げられる。
【００２１】
本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、さらに少なくとも一種の検出用標識を有していてもよい。検出用標識としては、縮合型タンニンを検出するために用いることができればよく、特に限定されないが、例えば、色素標識、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等が挙げられる。これらのうち、検出の簡便さという観点では、色素標識が好ましい。本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、これらのうち、二種以上の検出用標識を有していてもよい。
【００２２】
色素標識としては、縮合型タンニンを検出するために用いることができればよく、特に限定されないが、例えば、赤色を呈するダブシル基、黄色を呈するジニトロフェノール基等が挙げられる。これらのうち、生産の容易さという観点では、アルギニンのアミノ末端に付加することができるダブシル基が好ましい。また、蛍光色素標識も使用できる。蛍光色素標識としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン、ダンシル基及びオルトフタレイン等が挙げられる。これらのうち、肉眼的にも見やすいという観点や反応の容易さの観点では、フルオレセイン基が好ましい。
【００２３】
特に限定されないが、本発明の縮合型タンニン検出用試薬の好ましい態様の一つとしては、実質的にオリゴアルギニン構造及び検出用標識からなるもの、又はオリゴアルギニン構造及び検出用標識からなるものが挙げられる。さらに好ましい態様の一つとしては、実質的にアルギニンが２〜５個連続した構造及び検出用標識からなるもの、又はアルギニンが２〜５個連続した構造及び検出用標識からなるものが挙げられる。
【００２４】
２．  縮合型タンニンを検出する方法
本発明の縮合型タンニンを検出する方法（縮合型タンニン検出方法）は、
試料中の縮合型タンニンを検出する方法であって、
（１）オリゴアルギニン構造を有する縮合型タンニン検出用試薬を、前記試料と接触させる工程
を含む方法である。
【００２５】
オリゴアルギニン構造を有する縮合型タンニン検出用試薬についての説明は、上記１．でした通りである。
【００２６】
工程（１）は、縮合型タンニン検出用試薬を、縮合型タンニンを含有する試料と接触させる工程である。
【００２７】
縮合型タンニンを含有する試料は、特に限定されないが、例えば、縮合型タンニンを含有する未加工の試料であってもよい。本発明の縮合型タンニン検出方法を利用することによって、これら未加工の試料から直接縮合型タンニンを検出できる。ここでいう未加工の試料とは、粉砕、特定成分の抽出又は固定化等の物理的又は化学的処理を行っておらず、例えばブドウ等の果実を単に切断することにより検出対象面として断面を露出させた状態とする等のごく単純な処理しか行っていないような試料をいう。未加工の試料としては、ブドウ等の果実のほか、バナナ、リンゴ、柿及び茶等も挙げられる。例えば、ブドウの果実の断面に本発明の縮合型タンニン検出用試薬を接触させることによって、果皮等に存在する他のポリフェノールは検出されないが、縮合型タンニンのみが高選択的に検出される。例えば、検出用標識として色素標識を用いた場合、ブドウの果実の断面において、縮合型タンニンのみが高選択的に染色される。
【００２８】
特に限定されないが、工程（１）において、縮合型タンニン検出用試薬を試料と接触させる手段としては、例えば、縮合型タンニン検出用試薬を溶解又は懸濁させた溶液を、試料に添加する手段等が挙げられる。この場合、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、溶液中における縮合型タンニン検出用試薬の濃度は、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、通常の分光光度計や蛍光光度計で測定しやすい範囲という点では０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、沈殿の濁度が大きく色素標識の波長での測定を妨害しないという点では０．１〜１ｍｇ／ｍＬがより好ましい。この場合、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば果実に直接適用するとき、試料に適用する縮合型タンニン検出用試薬含有溶液の量は、通常、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、測定のしやすさの点では０．１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜１０ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００２９】
縮合型タンニンを含有する試料は、縮合型タンニンを含有する加工済みの試料であってもよい。特に限定されないが、加工済みの試料としては、縮合型タンニンを含有する試料を溶液に溶解又は懸濁させたもの等が挙げられる。この場合、縮合型タンニンを含有する試料を溶解又は懸濁させた溶液に、縮合型タンニン検出用試薬を添加する等して接触させることにより、縮合型タンニンを検出できる。
【００３０】
加工済みの試料として、縮合型タンニンを含有する試料を溶液に溶解又は懸濁させたもの等を用いる場合、より詳細には、例えば次のようにして検出することができる。本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、溶液中において縮合型タンニンとの間で複合体を形成する。このため、縮合型タンニンを含有する試料を溶液に溶解又は懸濁させたものに、本発明の縮合型タンニン検出用試薬を接触させると、本発明の縮合型タンニン検出用試薬が縮合型タンニンとの間で複合体を形成するため、この複合体が沈殿すれば、縮合型タンニン不存在の場合と比べて溶液中に存在する縮合型タンニン検出用試薬の量が少なくなる。このことを利用して検出を行うことができる。例えば、本発明の縮合型タンニン検出用試薬として色素標識を有するものを用いる場合、これと縮合型タンニンとの間で複合体を形成させた後に例えば遠心分離を行うなどにより複合体を沈殿させると、縮合型タンニン存在時のほうが縮合型タンニン不存在時と比べて溶液全体としての呈色の度合いが弱くなる。このことを利用して、試験溶液中に縮合型タンニンが存在するか否かを判別することができる。この場合、呈色の度合いは、肉眼によって観察することによって評価してもよいし、例えば吸光度を測定すること等により評価してもよい。ダブシル基を検出用標識として有する本発明の縮合型タンニン検出用試薬を使用する場合は、４９２ｎｍの吸光度を測定することにより評価できる。
【００３１】
さらに、一方、本発明の縮合型タンニン検出用試薬は、加水分解型タンニンとの間では沈殿物を形成する能力が弱い。このため、試験溶液中にたとえ加水分解タンニンが存在しており、縮合型タンニンが存在していなかったとしても、本発明の縮合型タンニン検出用試薬を使って検出を試みた場合には沈殿物が形成されにくいため偽陽性の結果が得られる危険性が低く、縮合型タンニンが不存在であるという正しい結果を導き出すことができる可能性が高い。
【００３２】
上記において、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、溶液中における縮合型タンニン検出用試薬の濃度は、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、通常の分光光度計や蛍光光度計での測定の範囲という点では０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、沈殿の濁度が大きく色素標識の波長での測定を妨害しないという点では０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００３３】
本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、遠心分離の条件としては、例えば、３，０００〜１５，０００ｒｐｍ、５分等が挙げられる。
【００３４】
本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、吸光度測定の条件としては、濁りが少ないことが挙げられる。
【００３５】
３．  縮合型タンニンを定量する方法
本発明の縮合型タンニンを定量する方法（縮合型タンニン定量方法）は、
試料中の縮合型タンニンの量を評価する方法であって：
（１）オリゴアルギニン構造及び検出用色素標識を有する、縮合型タンニン検出用試薬を含有する溶液に、前記試料を添加する工程；及び
（２）工程（１）の前後における前記溶液の吸光度の減少度合いに基づいて、前記試料中の縮合型タンニン量を評価する工程
を含む、方法である。
【００３６】
工程（１）で用いる縮合型タンニン検出用試薬は、オリゴアルギニン構造及び検出用色素標識を有する、縮合型タンニン検出用試薬である。縮合型タンニン検出用試薬についての説明は、検出用色素標識を有することを必須とする点を除けば、上記１．でした通りである。
【００３７】
検出用色素標識としては、縮合型タンニンを定量するために用いることができればよく、特に限定されないが、例えば、赤色を呈するダブシル基、黄色を呈するジニトロフェノール基等が挙げられる。これらのうち、生産の容易さという観点では、アルギニンのアミノ末端に付加することができるダブシル基が好ましい。また、蛍光色素標識も使用できる。蛍光色素標識としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン、ダンシル基、オルトフタレイン等が挙げられる。これらのうち、肉眼的にも見やすいという観点や反応の容易さの観点では、フルオレセイン基が好ましい。
【００３８】
縮合型タンニン検出用試薬を含有する溶液としては、本発明の効果が奏されればよく特に限定されないが、通常、縮合型タンニン検出用試薬を０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬ含有する溶液を用いることができる。特に、実用的な比色分光光度計や蛍光光度計を用いることができるという点では、縮合型タンニン検出用試薬を０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する溶液が好ましく、沈殿の濁度が大きく色素標識の波長での測定を妨害しないという点では縮合型タンニン検出用試薬を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する溶液がより好ましい。
【００３９】
縮合型タンニン検出用試薬を含有する溶液は、縮合型タンニン検出用試薬の他、さらに他の成分を含有していてもよい。他の成分としては本発明の効果が奏されればよく特に限定されないが、例えば、グリセリン、緩衝液、塩類及び防腐剤等が挙げられる。
【００４０】
上記２．で説明したように、縮合型タンニンを含有する試料を溶液に溶解又は懸濁させたものに、本発明の縮合型タンニン検出用試薬を接触させると、本発明の縮合型タンニン検出用試薬が縮合型タンニンとの間で複合体を形成するため、これが沈殿すると、縮合型タンニン不存在の場合と比べて溶液中に存在する縮合型タンニン検出用試薬の量が少なくなる。本発明の縮合型タンニン検出用試薬と縮合型タンニンとの間で複合体を形成させた後に例えば遠心分離を行うなどにより複合体を沈殿させると、縮合型タンニンの存在量が多ければ多いほど、溶液の吸光度がより減少する。このことを利用して、試験溶液中に存在する縮合型タンニンの量を定量できる。この場合、既知量の縮合型タンニンを含有する標準試料を用いて作成した標準曲線と比較することにより、試料中の縮合型タンニン量を定量化できる。
【００４１】
上記において、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、溶液中における縮合型タンニン検出用試薬の濃度は、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、通常の分光光度計や蛍光光度計で測定しやすい範囲という点では０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、沈殿の濁度が大きく色素標識の波長での測定を妨害しないという点では０．１〜１ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００４２】
本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、遠心分離の条件としては、例えば、３，０００〜１５，０００ｒｐｍ、５分等が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：本発明の縮合型タンニン検出用試薬（ダブシル化トリアルギニン（Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ））の合成
１．合成方法
１．１  材料
Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔはＢａｃｈｅｍ ＡＧ． (Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)、Ｄａｂｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅは Ｔｏｋｙｏ Ｋａｓｅｉ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌｔｄ．  （Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ)より購入した。９，１０−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅは Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．， Ｌｔｄ． (Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ) より購入した。その他の試薬は、特に断りがない限り市販の特級試薬を用いた。
【００４５】
１．２  装置
恒温槽は ＴＨＥＲＭＯＭＩＮＤＥＲ ＳＭ−０５Ｒ (ＴＡＩＴＥＣ Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ， Ｓａｉｔａｍａ， Ｊａｐａｎ)、マイクロプレートリーダーはＭｉｃｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＥＺＳ−ＡＢＳ (ＡＧＣ Ｔｅｃｈｎｏ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌｔｄ．， Ｃｈｉｂａ， Ｊａｐａｎ) を用いた。溶液の攪拌には、ローテーター ＲＴ−３０ ｍｉｎｉ (ＴＡＩＴＥＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｉｔａｍａ， Ｊａｐａｎ)を用いた。
【００４６】
１．３  ダブシル化トリアルギニンの合成
１０ μｍｏｌ／ｍＬ Ｄａｂｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ アセトン溶液  １ ｍＬと１０μｍｏｌ／ｍＬ Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）の溶液 １ ｍＬを混合させた。振り混ぜながら７０ ℃で６分間反応させた後、反応停止し、減圧乾圧した。ブタノール / 酢酸エチル / 酢酸 / 水 ＝ ２ ／ １０ ／ ５ ／ ５ を用いて平衡化 Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ クロマトグラフィー（３５５ ｎｍ × １８０ ｍｍ）に供した。得られた各フラクションとカラムに供する前のＤａｂｓｙｌ Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇをＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ にスポットし、ブタノール / 酢酸エチル/ 酢酸 / 水 ＝ ２ ／ １０ ／ ５ ／ ５ で展開させた。Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇのスポットが得られたフラクションを回収した。
【００４７】
１．４  Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析条件は下記の通りとした。
【００４８】
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＳ（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）
溶離液：Ａ)  １０ ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ ６．２， ７５ ｍＭ過塩素酸ナトリウム含有）
Ｂ)  アセトニトリル/水＝９／１
温度：４０ ℃
検出：４３０ ｎｍ
サンプル量：２０μＬ
グラジェント：表１記載の通り実施
【００４９】
【表１】
2014062834.tif 000002
【００５０】
５ ｍＭのダブシルクロライド溶液（ダブシルクロライド１．６ ｍｇをアセトン１ ｍＬに溶解）と（１）０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）溶液 ２０ μＬ、（２）１００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０μＬ、（３）２００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０ μＬ、（４）１００ ｎｍｏｌ アラニン溶液 １０ μＬ、１００ ｎｍｏｌ プロリン溶液 １０ μＬを混合し、７０ ℃で２０分加熱した。反応終了後、溶液Ａを３００μＬ加え、カラムに注入した。
【００５１】
２００ ｎｍｏｌ  Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇをエバポレーターで濃縮した後、６ Ｎ ＨＣｌを１．５ ｍＬ加え、混合したものを脱気処理し密封し、１０５ ℃、３時間加水分解を行った。反応終了後、エバポレーターで濃縮した後、水１ ｍＬ加えた。このうち半分の０．５ ｍＬをとり、溶離液Ａ液で１０倍に希釈し、２０ μＬをカラムに注入した。また、残り半分の０．５ ｍＬは、エバポレーターで濃縮した後、０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）溶液  ２０ μＬ、５ ｍＭ ダブシルクロライド溶液  １００ μＬを加え混合し、７０ ℃で２０分間反応させた。溶離液Ａ液 ３００μＬを加えた後、溶離液Ａ液で１０倍に希釈し、２０ μＬをカラムに注入した。
【００５２】
図１(ａ)、(ｂ)及び(ｃ)はそれぞれ０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）溶液 ２０μＬ、１００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０ μＬ及び２００ ｎｍｏｌ アルギニン溶液 ２０ μＬをＨＰＬＣ分析した結果である。１９〜２０分に溶出するピークが、図１の(ａ)には見られず、(ｂ)から(ｃ)で２倍になっていることから、このピークが Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇであると推測できる。 フェナンスロンキノンをＮａＯＨ性アルカリ性の条件で反応させたところ、紫外線ランプで蛍光を発したことから、Ｄａｂｓｙｌ  ＣｈｌｏｒｉｄｅはＡｒｇのグアニジル基とは反応していないことが確認された。
【００５３】
単離したＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇにおける分析結果において、理論上は、加水分解後にさらにＤａｂｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅを加え反応させて得たＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇは、加水分解後にそのまま得たＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇの３倍となるはずである。表２の条件でダブシルクロライドとアルギニン溶液を混合し、７０ ℃で２０分加熱した。反応終了後、溶液Ａを３００ μＬ加え、カラムに注入した。
【００５４】
【表２】
2014062834.tif 000003
【００５５】
この反応結果から、２倍、４倍とほぼ正確なピークが得られたため、Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇの同定実験を、２００ ｎｍｏｌから６０ ｎｍｏｌに変更して再度行った。加水分解後にさらにＤａｂｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅを加え反応させて得たＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇは、加水分解後にそのまま得たＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇの２．５倍となった。
以上より、Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは単離調製されていると判断し、以下これを用いて実験を行った。
【００５６】
２．  実施例２：Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとサンプルの反応
実施例１で合成・単離したＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとタンニンの親和性について詳しく評価するため、数種類のワインと紅茶中に含まれるタンニンにＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを反応させ、親和性等の諸性質について検討した。Ｄａｂｓｙｌ Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとサンプル（紅茶、ワイン２種）を反応させ、試薬Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを加えた後のサンプルの変化について分析した。
【００５７】
２．１  材料
ＰＡＲＩＮＧＡ ＳＯＵＴＨ ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ ２００７ ＶＡＢＥＲＮＥＴ ＳＡＵＶＩＧＮＯＮ（ワイン１）及びＣｈａｔｅａｕ Ｌｅｙ ｄｅ Ｆａｕｒｅ ＢＯＲＤＥＡＵＸ ２００６、ＲＯＵＸ ＰＥＲＥ＆ＦＩＬＳ ＢＯＵＲＧＯＧＮＥ ２００９（ワイン２）（渋みの程度はワイン１のほうがワイン２よりも強かった）を用いた。
【００５８】
紅茶 (ＴＷＩＮＩＮＧＳ ＤＡＲＪＥＥＬＩＮＧ， ２０ ＴＥＡ ＢＡＧＳ) はＲ． ＴＷＩＮＩＮＧ ＆ ＣＯ． ＬＴＤ. (Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ)より、購入した。紅茶ティーバッグ１袋を１００℃の熱湯２００ ｍＬに１０分間浸した後、ティーバッグを取り出したものを原液（１００％）とした。その他の試薬は、特に断りがない限り市販の特級試薬を用いた。
【００５９】
２．２  装置
マイクロプレートリーダーはＭｉｃｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＥＺＳ−ＡＢＳ (ＡＧＣ Ｔｅｃｈｎｏ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌｔｄ．， Ｃｈｉｂａ， Ｊａｐａｎ) を用いた。溶液の攪拌には、ローテーター ＲＴ−３０ｍｉｎｉ (ＴＡＩＴＥＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｉｔａｍａ， Ｊａｐａｎ) を用いた。遠心分離器はＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ (Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ) を用いた。
【００６０】
２．３  条件設定
ワイン１（ＰＡＲＩＮＧＡ ＳＯＵＴＨ ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ ２００７ ＶＡＢＥＲＮＥＴ ＳＡＵＶＩＧＮＯＮ）を、１０分、２．５×１０００ ｒｐｍで遠心分離し、上清を蒸留水と酢酸緩衝溶液（ｐＨ ５．０）でそれぞれ２，４，８，１６倍希釈した後、４９２ ｎｍの吸光度を測定した（図２）。
【００６１】
試薬Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは２０％エタノール水溶液とし、プレートリーダーで４９２nmの吸光度が１.０８のものを調製し以下使用した。
【００６２】
ワイン１及び２をそれぞれ蒸留水で２，４，８，１６，３２倍希釈し、４９２ ｎｍの吸光度を測定した（図３）。
【００６３】
２．４  サンプルとＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ反応物のＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析条件は次の通りとした。
【００６４】
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＳ（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）
溶離液：５０ ％ エタノール溶液
流速：０．１ ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２８０ ｎｍ
サンプル量：２０ μＬ
グラジェント：なし
ワイン１（ＰＡＲＩＮＧＡ ＳＯＵＴＨ ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ ２００７ ＶＡＢＥＲＮＥＴ ＳＡＵＶＩＧＮＯＮ）原液を８倍希釈した溶液２０ μＬ、８倍希釈した赤ワインにＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ試薬を加え混合したもの４０ μＬをカラムに注入した。同様に、紅茶原液２０ μＬ、紅茶原液にＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ試薬を加え混合したもの４０ μＬをカラムに注入した。
【００６５】
紅茶、赤ワイン両方において、ＨＰＬＣ分析での試薬Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとの反応前後での変化は、ほとんどないことが確認された。このことから、ワイン中のタンニンは、色素やポリフェノールに比べて微量であることが考えられた。
【００６６】
２．５  サンプルと試薬の反応前後における吸光度の変化
サンプル（紅茶、ワイン１及び２）２００ μＬに試薬Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ４０ μＬを加え、混合したのち遠心分離を行った。遠心後、上清２００ μＬをとり、４９２ ｎｍの吸光度を測定した。
【００６７】
図４は、ワイン１及び２、並びに紅茶における試薬反応前後の吸光度の変化を示す。吸光度の変化は、それぞれのサンプルの吸光度と蒸留水に試薬を加えたものの吸光度を加え、それぞれのサンプルに試薬を加え遠心した後の上清の吸光度を差し引いた結果を指す。試薬反応前後においてワイン１がもっとも吸光度の差が大きかったことから、タンニン量は、ワイン１＞ワイン２＞紅茶であると結論づけた。実際の赤ワインの渋みの知覚は、ワイン１＞ワイン２であり、今回のＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを用いた定量法の結果と整合するものであった。
【００６８】
実施例３：  ＢＳＡ沈殿を利用したタンニン定量方法との比較
従来のタンニンの定量方法であるＢＳＡを用いた方法で、実施例２で用いた各サンプル（ワイン１及び２、並びに紅茶）のタンニン量を確認した。これらの方法と実施例２で示したＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ試薬を用いた定量方法を用いて定量されたタンニン量の結果を比較、検討した。
【００６９】
３．１  材料
実施例２と同じものを使用した。
【００７０】
３．２  装置
恒温槽は ＴＨＥＲＭＯＭＩＮＤＥＲ ＳＭ−０５Ｒ (ＴＡＩＴＥＣ Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ， Ｓａｉｔａｍａ， Ｊａｐａｎ)を用いた。その他の装置は実施例２と同じものを使用した。
【００７１】
３．３  ＢＳＡ沈殿を利用したタンニンの定量方法
試験管でサンプル（ワイン１及び２、並びに紅茶）１ ｍＬに１．０ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ ０．２ Ｍ 酢酸緩衝溶液（ｐＨ ５．０） ０．１７ Ｍ ＮａＣｌ ２．０ ｍＬを加え、混合したものを１０分、２．５×１０００ ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、４ ｍＬ  ＳＤＳ−トリエタノールアミンを加え、さらに１．０ ｍＬ ＦｅＣｌ３ ／ ０．０１ Ｎ ＨＣｌを加え１５〜３０分静置した後、５１０ ｎｍの吸光度を測定した。
【００７２】
ＢＳＡを用いたタンニン定量方法におけるそれぞれのサンプルの５１０ ｎｍの吸光度は以下に示す通りである。（紅茶  ０．４１±０．０４７、ワイン１  １．０３±０．０４９、ワイン２  ０．８６±０．０３８）。これらの結果からタンニン量は、ワイン１＞ワイン２＞紅茶であることが確認された。この結果は、実施例２におけるＤａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを用いたタンニン定量法における結果と同一であった。
【００７３】
実施例４：  試薬Ｄａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとタンニン酸の反応
タンニン酸（６２．５，１２５，２５０，５００，１０００ μｇ／ｍＬ）２００ μＬとＤａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ４０ μｇを混合し、遠心分離した後上清において４９２ ｎｍの吸光度を測定した。
【００７４】
４９２ ｎｍの吸光度を測定した結果、どの濃度でも沈殿は生じず吸光度の変化も認められなかった。以上から、Ｄａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは、縮合型タンニンに高選択的であると考えられた。
【００７５】
実施例５：  試薬Ｄａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇと五倍子の反応
五倍子（漢方薬の一種で、加水分解性タンニンの原料として用いられる）の組織切片を、塩化第二鉄及びＤａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇでそれぞれ染色した。結果を図５に示す。上段が塩化第二鉄で染色した結果、下段がＤａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇで染色した結果である。加水分解性タンニンは容易に水に溶け出し、塩化第二鉄で染色すると濃い青色が呈色形成される。これに対して、Ｄａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇで染色するとそのような現象は見られず、組織の一部が弱く朱く染まるのみであった。このように、Ｄａｂｓｙｌ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは、加水分解性タンニンやこれを加水分解したタンニン酸に対する反応性が弱いと思われる。
【００７６】
実施例６：試薬Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇの染色試薬としての使用
Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを用いて市販のブドウを染色し、タンニンの視認化における可能性を検討した。また、アミノ酸と容易に反応することで知られ蛍光化剤として広範囲に使用されるＦＩＴＣを同様に反応させた試薬でも染色することで、より明瞭に染色できるかを検討した。
【００７７】
６．１  材料
ブドウ（品種：コールマン、レッドグローブ）は市販のものを購入した。その他の試薬は、特に断りがない限り市販の特級試薬を用いた。
【００７８】
６．２  装置
顕微鏡観察は、オリンパス位相差顕微鏡のＢＸ−５１で行い、撮影は、オリンパス顕微鏡撮影装置のＤＰ−２０で行った。
【００７９】
６．３  フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇの合成と単離
ＦＩＴＣ ７ ｍｇと溶解したアセトン溶液３．６ ｍＬとＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ５ ｍｇを溶解した０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）の溶液 １．２ ｍＬを混合させた。振り混ぜながら７０ ℃で２０分間反応させた後、反応停止した（１倍量）。さらに別の試験管で、ＦＩＴＣ ２１．６ ｍｇと溶解したアセトン溶液３．６ ｍＬとＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ５ ｍｇを溶解した０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．９）の溶液 ３．６ ｍＬを混合させた（３倍量）。振り混ぜながら７０ ℃で２０分間反応させた後、反応停止した。
上記のうち反応率の高いものを減圧乾圧し、ブタノール / 酢酸エチル / 酢酸 / 水 ＝ ２ ／ １０ ／ ５ ／ ２．５を用いて平衡化 Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ クロマトグラフィー（３５５ ｎｍ × １８０ ｍｍ）に供した。得られた各フラクションとカラムに供する前のフルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇをＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ にスポットし、ブタノール / 酢酸エチル / 酢酸 / 水 ＝ ２ ／ １０ ／ ５ ／ ２．５ で展開させた。フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇのスポットが得られたフラクションを回収した。このフラクションを減圧乾固し、２０％エタノール ５ ｍＬに溶解したもの（１％溶液）を以降試薬フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇとして使用した。
【００８０】
１倍量と３倍量の反応率を調べたところ、ダブシル化の場合と同様に３倍量のほうがより効率的にフルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを単離できたため、以降の実験においてはこちらを試薬として用いた。
【００８１】
６．４  染色
市販のブドウを二等分した後、果皮に近い部分をできるだけ薄くカッターで切った。それらを塩化第二鉄（１０％溶液）、Ｄａｂｓｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（１％溶液）、フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（１％溶液）で染色し、顕微鏡で観察した。
【００８２】
顕微鏡観察の結果は、図６に示した。塩化第二鉄による染色では、ブドウの果皮も染色したが、ダブシル化及びフルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇによる染色では、果皮を除いてほぼ同じ部分がより明瞭に染色された。よってダブシル化及びフルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは、明瞭に染色でき、タンニン検出・相互作用確認に有用であると考えられた。また、フルオレセイン化Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇは、実施例２で行った吸光度の反応差の測定においても、有効に利用できると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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