(57)【要約】【課題】標的遺伝子のプロモーターを含むカセットおよび該カセットを利用した遺伝子操作方法を提供する。【解決手段】標的遺伝子のプロモーターの少なくとも一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、該プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子、および該マーカー遺伝子の下流に連結され、標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む標的遺伝子を欠損させるためのカセット、ならびに該カセットを利用した遺伝子操作方法に関する。該カセットおよび該カセットを利用した遺伝子操作方法を利用して、細胞の効率的な遺伝子操作および選別が可能である。【選択図】図１Ｂ
2014140368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、
前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子、および
前記マーカー遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、カセット。
【請求項２】
前記プロモーター特異的相同部位は、前記標的遺伝子のプロモーターの３’末端から５’末端の方向に、４０〜１５０個のヌクレオチドと相同である、請求項１に記載のカセット。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、請求項１または２に記載のカセット。
【請求項４】
前記遺伝子特異的相同部位は、前記標的遺伝子の４０〜５００個のヌクレオチドと相同である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のカセット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のカセットを宿主細胞に導入する段階と、
前記カセットが導入された宿主細胞内で、標的遺伝子が欠損された細胞を確認する段階と、を含む、標的遺伝子が欠損された細胞の製造方法。
【請求項６】
前記カセットを調製する段階が、前記マーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドをテンプレートとし、前記マーカー遺伝子の５’末端部位の配列およびプロモーター特異的相同部位の配列を含むフォワードプライマー、ならびに前記マーカー遺伝子の３’末端部位の配列および遺伝子特異的相同部位の配列を含むリバースプライマーを利用して増幅された産物を得ることを含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
宿主細胞は、酵母である、請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
宿主細胞に導入された前記カセットは、相同組み換えによって、宿主細胞の染色体内に組込まれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記確認する段階は、前記抗生物質抵抗性遺伝子に対応する抗生物質が含まれた培地で増殖する細胞を確認する、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記確認する段階は、蛍光を発する細胞を確認する、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結された蛍光タンパク質遺伝子、および前記蛍光タンパク質遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、標的遺伝子を欠損させるためのカセット、を、宿主細胞に導入する段階と、
前記カセットが導入された宿主細胞内で、蛍光を発する細胞を分離する段階と、を含む標的遺伝子が欠損された細胞を分離する方法。
【請求項１４】
前記分離する段階は、フローサイトメトリー分析法によって行われる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子のプロモーターを含むカセットおよび該カセットを利用した遺伝子操作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝工学（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とは、遺伝子操作（ｇｅｎｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）技術を利用して、新たな代謝回路を取り入れたり、あるいは既存の代謝回路を除去・増幅・変更し、細胞や菌株の代謝特性を、所望の方向に変える一連の実験および予測技術をいう。かような技術を基にして、生命体の構成要素を多様な方式で組み合わせることにより、目的に合う効率的なシステムに変形したり、あるいは新たな生物学的システムを創出することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９６３８９６号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／００５４３０３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
遺伝子操作技術を介して特定遺伝子を欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させたり、あるいは導入させ、対象細胞をして所望の形質を有させることが可能である。遺伝子操作が成功するためには、マーカーを利用して、標的遺伝子が操作された細胞を効率的に選別する技術が必要である。
【０００５】
特定遺伝子を欠損させようとする場合、標的遺伝子と置換されるＤＮＡ断片が染色体内に導入される、相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が一般的に用いられている。従来は、ＤＮＡ断片が無作為に染色体に挿入された場合であっても、マーカーが発現されるという問題点があった。特に、遺伝子操作効率が低い細胞において、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）が正確に標的化された（ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ）細胞を区分することができる技術の開発が要求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らは、標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子、および前記マーカー遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、標的遺伝子を欠損させるためのカセットによって、上記課題が解決されることを見出した。すなわち、本発明は、以下の内容をその骨子とする。
（１）  標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子、および前記マーカー遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、カセット。
（２）  前記プロモーター特異的相同部位は、前記標的遺伝子のプロモーターの３’末端から５’末端の方向に、４０〜１５０個のヌクレオチドと相同である、（１）に記載のカセット。
（３）  前記マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、（１）または（２）に記載のカセット。
（４）  前記遺伝子特異的相同部位は、前記標的遺伝子の４０〜５００個のヌクレオチドと相同である、（１）〜（３）のいずれか１つに記載のカセット。
（５）  （１）〜（４）のいずれか１つに記載のカセットを宿主細胞に導入する段階と、前記カセットが導入された宿主細胞内で、標的遺伝子が欠損された細胞を確認する段階と、を含む、標的遺伝子が欠損された細胞の製造方法。
（６）  前記カセットを調製する段階が、前記マーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドをテンプレートとし、前記マーカー遺伝子の５’末端部位の配列およびプロモーター特異的相同部位の配列を含むフォワードプライマー、ならびに前記マーカー遺伝子の３’末端部位の配列および遺伝子特異的相同部位の配列を含むリバースプライマーを利用して増幅された産物を得ることを含む、（５）に記載の製造方法。
（７）  宿主細胞は、酵母である、（５）または（６）に記載の製造方法。
（８）  宿主細胞に導入された前記カセットは、相同組み換えによって、宿主細胞の染色体内に組込まれる、（５）〜（７）のいずれか１つに記載の製造方法。
（９）  前記マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子である、（５）〜（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１０）  前記確認する段階は、前記抗生物質抵抗性遺伝子に対応する抗生物質が含まれた培地で増殖する細胞を確認する、（９）に記載の製造方法。
（１１）  前記マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質遺伝子である、（５）〜（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１２）  前記確認する段階は、蛍光を発する細胞を確認する、（１１）に記載の製造方法。
（１３）  標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結された蛍光タンパク質遺伝子、および前記蛍光タンパク質遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、標的遺伝子を欠損させるためのカセット、を、宿主細胞に導入する段階と、前記カセットが導入された宿主細胞内で、蛍光を発する細胞を分離する段階と、を含む標的遺伝子が欠損された細胞を分離する方法。
（１４）  前記分離する段階は、フローサイトメトリー分析法によって行われる、（１３）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるカセットを利用すれば、細胞の効率的な遺伝子操作および選別が可能である。
【０００８】
また、本発明によるカセットを利用した標的遺伝子欠損細胞製造方法を利用すれば、細胞の効率的な遺伝子操作、選別および遺伝子欠損細胞の取得が可能である。
【０００９】
また、本発明によるカセットを利用した標的遺伝子欠損細胞分離方法を利用すれば、細胞の効率的な遺伝子操作および選別が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１は、カセットの相同組み換えによる標的遺伝子欠損を示す模式図であり、図１Ａはゲノム内で無作為に前記カセットが挿入（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）される場合を示す。無作為に前記カセットが挿入された場合は、レポーター遺伝子（マーカー遺伝子）は発現しない。
【図１Ｂ】図１は、カセットの相同組み換えによる標的遺伝子欠損を示す模式図であり、図１Ｂはゲノム内の標的遺伝子に対して前記カセットが標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）される場合を示す。カセットが標的遺伝子に対して標的化された場合は、プロモーター特異的相同部位が組込まれた標的遺伝子のプロモーターにより、レポーター遺伝子（マーカー遺伝子）が発現する。
【図２】図２はＳｃＡＤＥ２（Ｓ．セレビシエ  ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））遺伝子欠損のためのカセットの模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、カセットを取り込まない細胞をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）で測定した結果である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、カセットがＳｃＡＤＥ２遺伝子に標的化された細胞をＦＡＣＳで測定した結果である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、カセットがランダムに挿入された細胞をＦＡＣＳで測定した結果である。
【図４Ａ】図４Ａは、カセットを導入していない細胞を蛍光顕微鏡で観察したイメージである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、カセットがＳｃＡＤＥ２遺伝子に標的化された細胞を蛍光顕微鏡で観察したイメージである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、カセットがランダムに挿入された細胞を蛍光顕微鏡で観察したイメージである。
【図５】図５は、カセットを利用したＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損を確認するための、ＰＣＲ分析を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
１つの実施形態では、標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎ）、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）マーカー遺伝子、および前記マーカー遺伝子の下流に連結され、前記標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、標的遺伝子を欠損させるためのカセットを提供する。
【００１３】
前記カセット（欠損カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ））は、相同性を有した配列を利用して、標的遺伝子を直接欠損させるための一定構造を有するＤＮＡモジュールを意味する。本明細書で使用される用語「相同」とは、標的配列についての同一性の程度を示すものであり、例えば、９０％以上または９５％以上の同一性であるということを意味する。同一性の上限は特に制限されないが、例えば１００％である。
【００１４】
前記プロモーター特異的相同部位は、例えば、前記標的遺伝子のプロモーター配列の一部と９０％以上または９５％以上同一である配列を含む。同一性の上限は特に制限されないが、例えば１００％である。前記プロモーター特異的相同部位は、例えば、前記標的遺伝子のプロモーターの３’末端から５’末端の方向に、４０〜２００個のヌクレオチド、４０〜１５０個のヌクレオチド、４０〜１００個のヌクレオチド、４０〜８０個のヌクレオチドと相同でもある。ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｎｕｍｂｅｒｓ．ｈｍｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｎｕｍｂｅｒ．ａｓｐｘ？＆ｉｄ＝１０４３３８＆ｖｅｒ＝１（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｓｏｎ  Ｅ，  ら．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．  （２００９）  ２６（６）：１２９９−３０７、についてのコメント）には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロモーター長の中央値が４５０ｂｐであることが示されている。
【００１５】
前記「プロモーター特異的相同部位と作動的に連結された」とは、前記プロモーター特異的相同部位が前記標的遺伝子のプロモーター内に組込まれた場合、前記組込まれたプロモーターによって、前記マーカー遺伝子が発現されるように、プロモーター特異的相同部位とマーカー遺伝子とが連結されていることを意味する。例えば、前記プロモーター特異的相同部位が、相同性がない配列と組み換えが起きた場合、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子は、発現されない。例えば、前記プロモーター特異的相同部位が、前記標的遺伝子のプロモーターの一部と相同組み換えが起きた場合、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結されたマーカー遺伝子が発現される。
【００１６】
前記マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子でもある。前記抗生物質抵抗性遺伝子は、例えば、カナマイシン遺伝子、クロラムフェニコール遺伝子およびテトラサイクリン遺伝子からなる群から選択されるものでもある。前記蛍光タンパク質遺伝子は、例えば、酵母強化緑色蛍光タンパク質（ｙＥＧＦＰ：ｙｅａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ：ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ：ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子からなる群から選択されるものでもある。前記マーカー遺伝子は、例えば、転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を含んでもよい。前記転写ターミネーターは、例えば、ＣＹＣ１（イソ−１−チトクロームＣ（ｉｓｏ−１−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ））遺伝子の転写ターミネーター、ＴＲＰ１（ホスホリボシル−アントラニル酸イソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））遺伝子の転写ターミネーター、およびＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １））遺伝子の転写ターミネーターからなる群から選択されるものでもある。
【００１７】
前記遺伝子特異的相同部位は、例えば、標的遺伝子の４０〜５００個のヌクレオチド、４０〜１５０個のヌクレオチド、４０〜１００個のヌクレオチド、または４０〜８０個のヌクレオチドと相同でもある。遺伝子特異的相同部位は、標的遺伝子の３’側非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相同でもよい。
【００１８】
他の実施形態は、標的遺伝子を欠損させるためのカセットを宿主細胞に導入する段階と、前記カセットが導入された宿主細胞内で、標的遺伝子が欠損された細胞を確認する段階と、を含む標的遺伝子が欠損された細胞の製造方法を提供する。
【００１９】
前記方法は、標的遺伝子を欠損させるためのカセットを調製する段階をさらに含む。前記カセットについては、前述の通りである。前記調製する段階は、例えば、前記マーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドをテンプレートとし、前記マーカー遺伝子の５’末端部位の配列およびプロモーター特異的相同部位の配列を含むフォワードプライマー、ならびに前記マーカー遺伝子の３’末端部位の配列および遺伝子特異的相同部位の配列を含むリバースプライマーを利用して増幅された産物を得ることを含むものでもある。前記テンプレートとするポリヌクレオチドは、例えば、前記マーカー遺伝子を含むプラスミドの形態でもある。前記マーカー遺伝子については、前述の通りである。
【００２０】
増幅は、当業者に公知の方法、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行えばよい。
【００２１】
前記フォワードプライマーは、例えば、３’末端部に、前記マーカー遺伝子の５’末端から３’末端の方向に、１０〜３０個のヌクレオチド配列と同一である配列、または相補的な配列を含んでもよい。また、前記フォワードプライマーは、例えば、５’末端部に、前記カセットのプライマー特異的相同部位の配列を含んでもよい。
【００２２】
前記リバースプライマーは、例えば、３’末端部に、前記マーカー遺伝子の３’末端から５’末端の方向に、１０〜３０個のヌクレオチド配列と相補的な配列を含んでもよい。また、前記リバースプライマーは、例えば、５’末端部に、前記カセットの遺伝子特異的相同部位の配列を含んでもよい。
【００２３】
前記宿主細胞は、例えば、酵母でもある。前記酵母は、例えば、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス  フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス  ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス  マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびシゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択されるものでもある。
【００２４】
前記導入する段階は、例えば、マイクロンジェクション、カルシウムホスフェート沈澱法、電気穿孔法、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションおよび遺伝子衝撃（ｇｅｎｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）からなる群から選択される一つ以上の方法によって行われる。
【００２５】
前記宿主細胞に導入された前記カセットは、例えば、相同組み換えによって、宿主細胞の染色体内に組込まれる。すなわち、前記導入によって、前記カセットのプロモーター特異的相同部位とその標的部位との間、および遺伝子特異的相同部位とその標的部位との間で、相同組み換えが起こることにより、標的遺伝子が欠損される。
【００２６】
前記標的遺伝子の欠損は、例えば、前記宿主細胞の染色体内に組込まれた前記カセットのマーカー遺伝子から発現されるタンパク質によって確認される。前記マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子でもある。前記抗生物質抵抗性遺伝子については、前述の通りである。前記マーカー遺伝子が抗生物質抵抗性遺伝子である場合、前記確認する段階は、例えば、前記抗生物質抵抗性遺伝子に対応する抗生物質が含まれた培地で増殖する細胞を確認することでもある。前記抗生物質は、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンからなる群から、前記抵抗性遺伝子に対応して選択されるものでもある。前記抗生物質抵抗性遺伝子に対応する抗生物質が含まれた培地で増殖する細胞は、当業者であれば公知の方法によって適宜回収できる。また、前記マーカー遺伝子は、例えば、蛍光タンパク質遺伝子でもある。前記蛍光タンパク質遺伝子については、前述の通りである。前記マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である場合、前記確認する段階は、蛍光を発する細胞を確認することでもある。例えば、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いるなど、蛍光を発する細胞は、当業者であれば公知の方法によって適宜回収できる。
【００２７】
他の実施形態は、標的遺伝子のプロモーターの一部と相同であるプロモーター特異的相同部位、前記プロモーター特異的相同部位と作動的に連結された蛍光タンパク質遺伝子、および前記蛍光タンパク質遺伝子の下流に連結され、標的遺伝子の少なくとも一部と相同である遺伝子特異的相同部位を含む、標的遺伝子を欠損させるためのカセット、を、宿主細胞に導入する段階と、前記カセットが導入された宿主細胞内で、蛍光を発する細胞を分離する段階と、を含む、標的遺伝子が欠損された細胞を分離する方法を提供する。
【００２８】
前記方法は、標的遺伝子を欠損させるためのカセットを調製する段階をさらに含む。前記調製する段階および導入する段階については、前述の通りである。前記分離する段階は、例えば、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析法によって行われる。前記フローサイトメトリー分析法は、例えば、ＦＡＣＳでもある。
【実施例】
【００２９】
以下、下記実施例によって、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
図１Ａおよび図１Ｂは、１つの実施形態によるカセットの相同組み換えによる標的遺伝子欠損を示す模式図であり、図１Ａは、前記カセットがゲノム内で無作為に挿入（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）される場合であり、図１Ｂは、前記カセットがゲノム内の標的遺伝子に標的化される場合を示している。前記カセットが無作為に挿入される場合、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）が発現されない一方、標的遺伝子に標的化される場合には、プロモーター特異的相同部位が組込まれた標的遺伝子のプロモーターによって、レポーター遺伝子が発現される。
【００３１】
＜実施例１：ＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損カセットの調製＞
標的遺伝子Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＥ２（ＳｃＡＤＥ２）欠損のための欠損カセットを調製した。
【００３２】
アンピシリン抵抗性遺伝子および多重クローニング部位を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクター（ストラタジーン）をＰｓｔＩで切断した後、ＣＩＡＰ（仔ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ，ファーメンタス（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））で処理した。ＹＥＧａ−ＭＣＳ−ＣＥＮ（配列番号１）酵母ベクターをＰｓｔＩで切断し、ＳｃＵＲＡ３のＯＲＦと、ＧＦＰタンパク質の正しい翻訳終端のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７ターミネーター（ＳｃＧＡＬ７Ｔ）とを含む１，５７８ｂｐサイズのＤＮＡ断片（断片１）（配列番号２）を得た。断片１、ＰｓｔＩおよびＣＩＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターをライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、ｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡベクターを調製した。ｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡベクターをＥｃｏＲＩで切断およびＣＩＡＰ処理した。
【００３３】
ｐＭＯＸ−ＧＦＰ（パークら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｏｂｉｏｌ，２００７，７３：５９９０−６０００）ベクターをＥｃｏＲＩ処理し、７２３ｂｐサイズの断片（断片２）（配列番号３）を得た。断片２、ＥｃｏＲＩおよびＣＩＡＰ処理したｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡベクターをライゲーションし、ＧＦＰ遺伝子がＳｃＧＡＬ７Ｔ前方に、フォワード挿入されたベクターであるｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡ−ＥＧＦＰベクターを得た。
【００３４】
Ｓ．セレビシエゲノム・データベースを基に、プライマー５ＵＴＲ−ＳｃＡＤＥ２−ＧＦＰ＿１Ｆ＿Ｘ（配列番号４、ＡＤＥ２遺伝子の５’末端部位の配列およびプロモーター特異的相同部位の配列を含む。）およびｙＥＧＦＰＧｌｙ＿２Ｂ＿４４＿ＨＨ（配列番号５）を調製した。前記プライマーを使用して、ｐＭＯＸ−ＧＦＰベクターをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後、ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ／ＨｐａＩで処理し、ＳｃＡＤＥ２遺伝子のプロモーター部位（配列番号６）を含むＤＮＡ断片を得た（断片３）。断片３とｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡ−ＥＧＦＰベクターとを、ＸｈｏＩ／ＨｐａＩで切断したものとをライゲーションし、ｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡ−Ｎａｄｅ−ＥＧＦＰベクターを得た。
【００３５】
ＹＥＧａ−ＭＣＳ−ＣＥＮベクターをテンプレートとして、プライマーｐＳｃＵＲＡ３＿１Ｆ＿Ｂａｍ＿４１（配列番号７）およびＳｃＵＲＡ３＿２Ｂ＿４３（配列番号８）を使用して、ＰＣＲを行った後、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶで処理し、ＳｃＵＲＡ３のプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た（断片４）（配列番号９）。Ｓ．セレビシエ  ＢＹ４７４２菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマー３ＵＴＲＳｃＡＤＥ２＿１Ｆ＿Ｂａｍ＿４４（配列番号１０）および３ＵＴＲＳｃＡＤＥ２＿２Ｂ＿Ｓａｃ＿４２（配列番号１１）を使用して、ＰＣＲを行った後、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩで処理し、ＳｃＡＤＥ２遺伝子の３’ＵＴＲ相同部分１５０ｂｐ（配列番号１２）を含むＤＮＡ断片を得た（断片５）。
【００３６】
断片４、断片５およびＥｃｏＲＶ／ＳａｃＩを処理したｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡ−Ｎａｄｅ−ＥＧＦＰベクターを３ピースライゲーションし、最終的にＳｃＡＤＥ２欠損カセットを含んだｐＢｌｕＴＳｃＵＲＡ−ＮＡｄｅ−ＥＧＦＰ−Ｃａｄｅベクターを得た。このベクターをＸｈｏＩ／ＳａｃＩ処理し、２，７３３ｂｐサイズのＤＮＡ断片（配列情報１３）を最終欠損カセットとして使用した。
【００３７】
図２は、ＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損のためのカセットの模式図を示している。前記カセットは、５０ｂｐのプロモーター特異的相同部位の配列（左Ｐ）、マーカー遺伝子として酵母強化緑色蛍光タンパク質（ｙＥＧＦＰ：ｙｅａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子およびその転写ターミネーター（左Ｔ）、ＳｃＵＲＡ３（Ｕｒａ３：オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））遺伝子、そのプロモーター（右Ｐ）および転写ターミネーター（右Ｔ）、ならびに１５０ｂｐの遺伝子特異的相同部位の配列から構成された。
【００３８】
＜実施例２：実施例１のカセットの導入＞
Ｓ．セレビシエ  ＢＹ４７４２（ＭＡＴα  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０）菌株を、３ｍｌの液体ＹＰＤ培地で１６時間前培養し、５０ｍｌ液体ＹＰＤに初期ＯＤ値０．４で接種し、ＯＤ値が１になるまで約３時間培養した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）して細胞を回収し、２０ｍｌ  １Ｘ  ＴＥ（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０））で１回洗浄した後、５００μｌ  １Ｘ  ＴＥ／ＬｉＡｃを入れ、コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を作製した。その後、１００μｌコンピテントセル、１０μｌ遺伝子欠損カセットＤＮＡ断片（約０．５μｇ）、１００μｇ／１０μｌサケ精巣ＤＮＡ、６００μｌ  ＰＥＧ／ＬｉＡｃ（５０％ポリエチレングリコール、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＬｉＡｃ（ｐＨ７．５））を混合した後、３０℃で振蕩（ｓｈａｋｉｎｇ）培養器で３０分間撹拌した。ここに、７０μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して混合した後、４２℃で１５分間熱ショックを与えた。氷で５分間冷却した後、３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、滅菌三次蒸溜水１００μｌに懸濁した。前記懸濁液をＳＣ−Ｕｒａ選択培地（０．６７％アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、２％グルコース、ウラシル不含アミノ酸欠損混合物（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｕｒａｃｉｌ））に塗布し、細胞コロニーを得るために培地を３０℃で３日間培養した。２９個コロニーをＳＣ−Ｕｒａ選択培地に再接種した。
【００３９】
ＳｃＵＲＡ３が組込まれた細胞は、ＳＣ−Ｕｒａ選択培地においても増殖が可能である。
【００４０】
＜実施例３：ＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損細胞の確認＞
実施例２で得た２９個の細胞のうち、ＳｃＡＤＥ２遺伝子が欠損された欠損細胞を分離するために、フローサイトメトリー分析機器を利用して、ｙＥＧＦＰタンパク質を発現する菌株を選別した。ＢＤ  Ｆａｃｓｃａｌｉｂｅｒフローサイトメトリー分析機器で、ダイクロイックミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ）（ＤＭ５６ＳＰ）、９０／１０ビームスプリッタ、５３０／３０フィルタを使用して、４８８ｎｍ  アルゴンイオンレーザを照射し、蛍光パラメーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）ＦＬで蛍光値を測定した。ＢＹ４７４２野生型菌株を対照群にし、２９個候補菌株のうち２７個の菌株において、対照群対比で、蛍光ピークが移動するということを確認した（図３Ａ〜図３Ｃ）。野生型菌株のような蛍光値を示した菌株２個の場合、蛍光顕微鏡（ツァイス  アキソフォト落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ  ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ），カールツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ）を利用して分析した結果、ｙＥＧＦＰタンパク質が正しく発現されないことが確認された（図４Ａ〜図４Ｃ）。
【００４１】
ｙＥＧＦＰが発現される菌株で、欠損カセットが正しく挿入され、ＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損が起きたか否かを確認するために、２９個の菌株を３種の方法でＰＣＲを行って確認した。図５は、ｙＥＧＦＰ欠損カセットを利用したＳｃＡＤＥ２遺伝子欠損確認のためのＰＣＲ分析を示す。最初のＰＣＲでは、ＳｃＡＤＥ２  ＯＲＦの増幅を確認することができるプライマーセットであるＩｄｅｎ＿ＳｃＡＤＥ２ｉｎｓｉｄｅ＿１Ｆ（配列番号１４）およびＩｄｅｎ＿ＳｃＡＤＥ２ｉｎｓｉｄｅ＿２Ｂ（配列番号１５）を使用し（ＰＣＲ１）、２番目のＰＣＲでは、カセット外側に位置したＳｃＡＤＥ２のプロモーターに付くフォワードプライマーＩｄｅｎ＿５ＵＴＲＳｃＡＤＥ２＿１Ｆ（配列番号１６）およびマーカーとして使用されたＳｃＵＲＡ３  ＯＲＦ下端に付くリバースプライマーＳｃＵＲＡ３＿Ｃ＿１Ｆ（配列番号１７）を使用し（ＰＣＲ２）、３番目のＰＣＲでは、ＳｃＵＲＡ３上端に付くフォワードプライマーＳｃＵＲＡ３＿Ｎ＿２Ｂ（配列番号１８）およびカセット外側に位置したＳｃＡＤＥ２の３’ＵＴＲに付くリバースプライマーＩｄｅｎ＿３ＵＴＲＳｃＡＤＥ２＿２Ｂ（配列番号１９）を使用して（ＰＣＲ３）、増幅の有無を確認した。
【００４２】
その結果、フローサイトメトリー分析において、蛍光値が野生型のような菌株の場合、ＳｃＡＤＥ２  ＯＲＦが維持されていることがＰＣＲ１において確認された。フローサイトメトリー分析において蛍光ピークが移動した２７個の菌株は、ＰＣＲ１においてＯＲＦが増幅しなかった。ＯＲＦが増幅しなかった２７個の菌株のうち、４個の菌株は、２番目のＰＣＲで増幅されなかったが、３番目のＰＣＲでは増幅された。すなわち、一方の方向にのみカセットが挿入されたと考えられた。
【００４３】
前記の通り、ｙＥＧＦＰ欠損カセットおよびフローサイトメトリー分析を利用した欠損菌株選別を介して、２７個のｙＥＧＦＰ発現菌株のうち、２３個の正しい欠損菌株を選別することができた。これは、ｙＥＧＦＰ発現のみを介して、約８５％の効率で、欠損菌株の選別が可能であるということを意味する。結論として、ｙＥＧＦＰ欠損カセットを使用することにより欠損された菌株の選別に、フローサイトメトリー分析方法が有効であるということを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の標的遺伝子のプロモーターを含むカセットおよび該カセットを利用した遺伝子操作方法は、例えば、生物学的システム関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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