(57)【要約】【課題】他の菌の増殖を抑制することなく、硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することが可能な硫酸還元菌の選択的制菌方法を提供する。【解決手段】硫酸還元菌の存在する環境に、キレート化Ａｌを併存させることにより、前記硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することを特徴とする硫酸還元菌の選択的制菌方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸還元菌の存在する環境に、キレート化Ａｌを併存させることにより、前記硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することを特徴とする硫酸還元菌の選択的制菌方法。
【請求項２】
前記硫酸還元菌の存在する環境に、Ａｌ3+源及びキレート剤を添加して、前記環境中で前記キレート化Ａｌを生成させる請求項１に記載の選択的制菌方法。
【請求項３】
前記Ａｌ3+源が、Ａｌ2Ｏ3、ＡｌＣｌ3、Ａｌ（ＯＨ）3及びＡｌ2（ＳＯ4）3からなる群より選択される少なくとも一種のＡｌ化合物である請求項２に記載の選択的制菌方法。
【請求項４】
前記硫酸還元菌が、中温域（２０〜４５℃）かつ中性域（ｐＨ５〜９）で生息する菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載の選択的制菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の菌の増殖を抑制することなく、硫酸還元菌の増殖のみを抑制する硫酸還元菌の選択的制菌方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
硫酸還元菌は、硫酸イオンを電子受容体として有機物を酸化し、エネルギーを獲得する細菌である。前記硫酸還元菌は種類によってその生育温度域が異なり、高温性菌、中温性菌、低温性菌および好冷性菌が存在する。また、生育ｐＨの違いによって、中性付近で良く生育する菌と、酸性あるいはアルカリ性の条件で良く生育する菌が存在する。また、生存域も海洋泥、一般土壌、熱水噴出域、パイプラインの中等と広域にわたる。
【０００３】
硫酸還元菌のエネルギー獲得の過程においては、硫酸イオンの還元体である硫化水素が生成される。この硫化水素は毒性や腐食性が強く、悪臭を放つ物質であるため、多量に生成されると問題となる。例えば、自然水、肥料（硫酸アンモニウム等）、不法投棄された石膏製品等に含まれる硫酸イオンを電子受容体として硫酸還元菌がエネルギーを獲得する際に硫化水素が発生し、農地において作物の生育を阻害し、或いは鉄材（埋設管等）を腐食する等の問題が知られている。
【０００４】
そこで、硫酸還元菌の増殖を抑制し、硫化水素の生成を抑制することが試みられている。例えば、本出願人の一は、石膏を主材とする土壌処理材に、アントラキノン化合物を添加することにより、硫酸還元菌の増殖を抑制し、硫化水素の生成を抑制する方法を開示している（特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、特許文献１に記載の技術は、非常に高価なアントラキノン化合物を用いるために、製造コストの面で問題があった。特に土壌処理材等の大量に使用される用途においては、コストが障害となって利用が拡大されないという実情があった。
【０００６】
そこで、本出願人の一は、石膏組成物に、アルミニウム硫酸塩水和物［Ａｌ2（ＳＯ4）3・ｎＨ2Ｏ（ｎ＝６、１０、１６、１８、２７）］等の特定のアルミニウム化合物を添加することにより、硫酸還元菌の増殖を抑制し、硫化水素の生成を抑制する方法も開示している（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１７７９９２号公報
【特許文献２】特開２０１０−２０８８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献２に記載の方法は、アントラキノン化合物と比較して安価で入手し易いアルミニウム化合物を用いるため、特許文献１に記載の技術が有する製造コストという問題を解決し得るものである。しかし、以下の点において未だ改良の余地を残すものであった。
【０００９】
即ち、特許文献２に記載の方法によれば、硫酸還元菌の増殖を抑制し、硫化水素の生成を抑制することは可能であるものの、硫酸還元菌以外の菌（以下、「他の菌」と記す。）の増殖を抑制してしまう場合があった。他の菌の増殖が抑制された場合、土壌等の微生物相が破壊され、悪臭の発生、植物の生育障害等の問題を生ずることがある。従って、他の菌の増殖を抑制することなく、硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することが可能な方法を確立することが切望されている。
【００１０】
本発明は、前記従来技術の課題を解決するためになされたものである。即ち、本発明は、他の菌の増殖を抑制することなく、硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することが可能な硫酸還元菌の選択的制菌方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは前記課題について鋭意検討を行った結果、キレート化Ａｌに硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制する作用があることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、硫酸還元菌の存在する環境に、キレート化Ａｌを併存させることにより、前記硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することを特徴とする硫酸還元菌の選択的制菌方法が提供される。
【００１３】
本発明においては、前記硫酸還元菌の存在する環境に、Ａｌ3+源及びキレート剤を添加して、前記環境中で前記キレート化Ａｌを生成させることが好ましい。また、本発明においては、前記Ａｌ3+源が、Ａｌ2Ｏ3、ＡｌＣｌ3、Ａｌ（ＯＨ）3及びＡｌ2（ＳＯ4）3からなる群より選択される少なくとも一種のＡｌ化合物であることが好ましい。更に、本発明においては、前記硫酸還元菌が、中温域（２０〜４５℃）かつ中性域（ｐＨ５〜９）で生息する菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る選択的制菌方法は、硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制することができる。より具体的には、硫酸還元菌の増殖を抑制し、硫化水素の生成を抑制することができる。一方、本発明に係る選択的制菌方法は、他の菌の増殖が抑制されないため、土壌等の微生物相が破壊されることもなく、悪臭の発生、植物の生育障害等の問題を生ずるおそれはない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】キレート化Ａｌによる硫酸還元菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【図２】キレート化Ａｌによる大腸菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【図３】キレート化Ａｌによる酪酸菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【図４】ＡｌＣｌ3による硫酸還元菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【図５】ＡｌＣｌ3による大腸菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【図６】ＡｌＣｌ3による酪酸菌の増殖抑制効果を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。但し、本発明は下記の実施形態に限定されず、その発明特定事項を有する全ての対象を含むものである。
【００１７】
［１］硫酸還元菌の選択的制菌方法：
本発明は、硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制する選択的制菌方法に関するものである。
【００１８】
前記のように、「硫酸還元菌」とは、硫酸イオンを電子受容体として有機物を酸化し、エネルギーを獲得する細菌である。この細菌は、一般土壌や下水汚泥等の嫌気環境に広く分布している。本発明の適用対象となる硫酸還元菌の種類は特に限定されない。例えば、グラム陰性菌であってもよいし、グラム陽性菌であってもよいし、古細菌でもよい。
【００１９】
具体的には、デスルホビブリオ属（Desulfovibrio；グラム陰性嫌気性桿菌、同らせん菌）、デスルフロモナス属（Desulfuromonas；グラム陰性嫌気性桿菌、同らせん菌）、デスルフィトバクテリウム属（Desulfitobacterium；グラム陰性偏性嫌気性菌）、デスルホトマキュラム属（Desulfotomaculum；グラム陽性内生胞子形成桿菌）等の硫酸還元菌を挙げることができる。
【００２０】
デスルホビブリオ属の細菌の具体例としては、デスルホビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）、デスルホビブリオ・アフリカヌス（Desulfovibrio africanus）、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）、デスルホビブリオ・ギガス（Desulfovibrio gigas）等を挙げることができる。デスルホトマキュラム属の細菌の具体例としては、デスルホトマキュラム・ルミニス（Desulfotomaculum ruminis）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明の方法は、前記硫酸還元菌全般に対して抑制効果を奏する。中でも、中温域（２０〜４５℃）かつ中性域（ｐＨ５〜９）で生息する硫酸還元菌に対して好適に用いることができる。既述のデスルホビブリオ・ブルガリス、デスルホビブリオ・アフリカヌス、デスルホビブリオ・デスルフリカンス、デスルホビブリオ・ギガス、デスルホトマキュラム・ルミニスは、「中温域（２０〜４５℃）かつ中性域（ｐＨ５〜９）で生息する硫酸還元菌」である。
【００２２】
本発明の方法は、キレート化Ａｌが硫酸還元菌の硫酸還元機構に作用し、これにより硫酸還元菌の硫酸還元機構が停止し、結果として硫酸還元菌の増殖を選択的に抑制していると考えられる。「選択的」とは、増殖抑制効果が硫酸還元菌に対して特異的であること、即ち、硫酸還元菌に対する増殖抑制効果と比較して、硫酸還元菌以外の菌（他の菌）に対する増殖抑制効果が殆ど無いことを意味する。
【００２３】
「他の菌」の代表例としては、エセルシア・コリ（Escherichia coli；通性嫌気性グラム陰性桿菌、和名：大腸菌）、クロストリジウム・ブチリウム（Clostridium butyricum；グラム陽性内生胞子形成桿菌、和名：酪酸菌)等を挙げることができる。
【００２４】
なお、本発明に言う「制菌」とは、細菌の増殖を抑制することを意味する。即ち、殺菌や滅菌のように直接的に細菌数を減少させることまでは必要としない。
【００２５】
［１−１］キレート化Ａｌ：
本発明に係る方法は、硫酸還元菌の存在する環境に、キレート化Ａｌを併存させる点に特徴がある。「硫酸還元菌の存在する環境」は、硫酸還元菌の存在が確認可能な限り、特に制限はない。例えば一般土壌や下水汚泥等の嫌気環境を挙げることができる。「キレート化Ａｌ」とは、中心原子となるＡｌ3+にキレート剤が配位した錯体を指す。キレート化Ａｌは、後述するＡｌ3+源とキレート剤を混合することで速やかに形成される。
【００２６】
「キレート剤」とは、Ａｌ3+に配位してキレート化Ａｌを形成する多座配位子である。本発明において、キレート剤の種類は特に限定されない。例えば鎖状配位子であってもよいし、環状配位子であってもよい。
【００２７】
鎖状配位子としては、例えばシュウ酸、マロン酸、酒石酸、グルタル酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸（いずれも２座配位子）等の多価カルボン酸類；エチレンジアミン（ＥＤＡ、２座配位子）等の多価アミン類；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、６座配位子）等のアミノポリカルボン酸類；２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン（いずれも２座配位子）等のビピリジン類；等を挙げることができる。
【００２８】
環状配位子としては、例えばポルフィリン類（４座配位子）；クラウンエーテル類（化合物により配座数が異なる。例えば１８−クラウン−６は６座配位子）；等を挙げることができる。
【００２９】
前記キレート剤はＡｌ3+に配位して容易にキレート化Ａｌを形成するキレート剤であることが好ましい。また、本発明は自然環境中で実施することが多いため、環境に悪影響を与えないキレート剤であることが更に好ましい。具体的には、クエン酸、マロン酸、酒石酸、グルタル酸、リンゴ酸、マレイン酸等を挙げることができる。
【００３０】
Ａｌ3+とキレート剤の量比については特に限定されない。キレート剤の種類により、Ａｌ3+と安定な錯体を形成するモル比は異なる。但し、添加したＡｌ3+源の全量がキレート化し、Ａｌ3+が溶存するように、キレート剤の添加量（モル比）を調節することが望ましい。例えば、Ａｌ3+源とシュウ酸が安定な錯体を形成するモル比は１：３、Ａｌ3+源とクエン酸が安定な錯体を形成するモル比は１：２、Ａｌ3+源とＥＤＴＡが安定な錯体を形成するモル比は１：１である。
【００３１】
なお、後述するように、キレート化Ａｌは、安価で入手し易いアルミニウム化合物から形成することが可能であり、アントラキノン化合物を用いる場合に比して製造コストの低廉化を図ることができる。特に、キレート剤として、安価で入手し易い２〜４価の有機酸を用いた場合、製造コストの低廉化の効果が大きい。
【００３２】
［１−２］Ａｌ3+源：
キレート化Ａｌは、それ自体（即ち、既にキレート化されているＡｌ3+）を硫酸還元菌の存在する環境に添加してもよいし、前記環境に、Ａｌ3+源及びキレート剤を添加して、前記環境中で前記キレート化Ａｌを生成させてもよい。Ａｌ3+源とキレート剤を個別に添加しても前記環境中で速やかにキレート化Ａｌが形成される。
【００３３】
「Ａｌ3+源」とは、水の存在下においてキレートの中心原子となるＡｌ3+を生成し得る物質である。具体的な物質の種類は特に限定されない。但し、Ａｌ2Ｏ3、ＡｌＣｌ3、Ａｌ（ＯＨ）3及びＡｌ2（ＳＯ4）3からなる群より選択される少なくとも一種のＡｌ化合物であることが好ましい。なお、「少なくとも一種」であるから、前記化合物の一種を単独で用いてもよいし、前記化合物を二種以上併用してもよい。
【００３４】
「Ａｌ2Ｏ3、ＡｌＣｌ3、Ａｌ（ＯＨ）3及びＡｌ2（ＳＯ4）3」には、これらの無水物は勿論のこと、水和物も含まれる。また、これらの化合物の形態は、結晶であってもよいし、アモルファス（例えば非晶質アルミナ等）であってもよい。更に、これらの化合物として、純物質を用いる必要はなく、混合物を用いてもよい。例えば、これらの化合物を含有する鉱物をＡｌ3+源として用いることもできる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例及び比較例により、本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明は、下記の実施例の構成のみに限定されるものではない。なお、以下の記載における「部」、「％」は特に断らない限り質量基準である。
【００３６】
［前培養］
実施例及び比較例においては、代表的な基準株である以下の菌株を用いた。Desulfovibrio vulgariss DSM 644Tについては、ドイツ国の標準菌株保存機関であるＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）から、その他の菌については製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手した。これらの菌株については分譲機関指定の培地を用いて前培養を行った。前培養期間は約１週間とした。
（１）硫酸還元菌：Desulfovibrio vulgariss DSM 644T
（２）大腸菌：Escherichia coli NBRC 102203T
（３）酪酸菌：Clostridium butyricum NBRC 13949T
【００３７】
［継代培養］
前培養を行った後、菌体のみを回収し、各菌について表１〜表３に示す組成の培地にて継代培養を行った。前記継代培養後、集菌・洗浄した菌体を、実施例及び比較例にて使用した。なお、表中の「脱イオン水／Ａｌ水溶液」は、調製したＡｌ水溶液の濃度が０ｍＭの系では脱イオン水を用い、調製したＡｌ水溶液の濃度が２ｍＭ、２０ｍＭの系では後述するＡｌ溶液を用いたことを示す。
【００３８】
2014037364.tif 000002
【００３９】
2014037364.tif 000003
【００４０】
2014037364.tif 000004
【００４１】
［Ａｌ溶液（ＡｌＣｌ3水溶液）の調整］
所定量のＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏを蒸留水に添加し、オートクレーブにて加熱溶解した後、ＫＯＨ水溶液を適量添加して、ｐＨを７．０付近に調整した。これにより、ＡｌＣｌ3の濃度が２ｍＭ、２０ｍＭの培地添加用ＡｌＣｌ3水溶液を調製した。このＡｌＣｌ3水溶液を比較例１の方法に供した。
【００４２】
［Ａｌ溶液（キレート化Ａｌ水溶液）の調整］
所定量のＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏを蒸留水に添加し、オートクレーブにて加熱溶解した後、加熱溶解したＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ水溶液に、前記水溶液中のＡｌＣｌ3と等モル量のクエン酸、及び水を添加し、１時間撹拌した。その後、ＫＯＨ水溶液を適量添加して、ｐＨを７．０付近に調整した。これにより、クエン酸・Ａｌキレートの濃度が２ｍＭ、２０ｍＭの培地添加用キレート化Ａｌ水溶液を調製した。このキレート化Ａｌ水溶液を実施例１の方法に供した。
【００４３】
加熱溶解したＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ水溶液に、前記水溶液中のＡｌＣｌ3と等モル量のシュウ酸、及び水を添加することを除いては、実施例１と同様にして、シュウ酸・Ａｌキレートの濃度が２ｍＭ、２０ｍＭの培地添加用キレート化Ａｌ水溶液を調製した。このキレート化Ａｌ水溶液を実施例２の方法に供した。
【００４４】
加熱溶解したＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ水溶液に、前記水溶液中のＡｌＣｌ3と等モル量のＥＤＴＡ、及び水を添加することを除いては、実施例１と同様にして、ＥＤＴＡ・Ａｌキレートの濃度が２ｍＭ、２０ｍＭの培地添加用キレート化Ａｌ水溶液を調製した。このキレート化Ａｌ水溶液を実施例３の方法に供した。
【００４５】
［Ａｌ添加培地の調製］
前記のように調製したＡｌＣｌ3水溶液またはキレート化Ａｌ水溶液に、予めオートクレーブにて滅菌処理した表１〜表３に記載の培地の成分を、表１〜表３に記載の組成比となるように添加し、Ａｌ添加培地を調製した。このＡｌ添加培地を水酸化カリウムと塩酸を適量添加して、表１〜表３に記載のｐＨに調整して用いた。
【００４６】
［培養］
滅菌済み１００ｍｌ（公称）バイアル瓶に、前記Ａｌ添加培地１００ｍｌを注入し、前記培地に脱酸素した窒素ガスを一定時間吹き込むことによって、前記培地内を嫌気状態とした。この培地に、菌体濃度が１０6個となるように、継代培養した各菌体（硫酸還元菌、大腸菌、酪酸菌）を植菌した。その後、ブチルゴム栓およびアルミシールによりバイアル瓶を密封し、３７℃のインキュベータ内で振盪培養を行った。振盪培養は、水酸化物が沈殿しない程度の振盪回数（１１０回／分）で行った。培養液からサンプルを抜き取り、評価に使用した。
【００４７】
［評価方法（タンパク量測定）］
バイアル瓶から培地１ｍｌを採取し、培地成分を取り除き、滅菌蒸留水１ｍｌに懸濁させた。その懸濁液から超音波破砕機によってタンパクを抽出し、ＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）によりタンパク量を測定した。このタンパク量により各菌体に対する増殖抑制効果（制菌効果）を評価した。
【００４８】
［結果］
実施例１の方法（クエン酸・Ａｌキレートの添加）について、硫酸還元菌に対する制菌効果を表したグラフを図１に、大腸菌に対する制菌効果を表したグラフを図２に、酪酸菌に対する制菌効果を表したグラフを図３に示す。また、比較例１の方法（ＡｌＣｌ3の添加）について、硫酸還元菌に対する制菌効果を表したグラフを図４に、大腸菌に対する制菌効果を表したグラフを図５に、酪酸菌に対する制菌効果を表したグラフを図６に示す。これらのグラフにおいて、横軸は経過時間（単位：時間）を示し、縦軸はタンパク量（単位：ｍｇ／Ｌ）の対数値を示す。
【００４９】
比較例１の方法（ＡｌＣｌ3の添加）によれば、図４〜図６に示すように、硫酸還元菌、大腸菌、酪酸菌の全ての培養液においてタンパク量の増加が抑制された。即ち、比較例１の方法によれば、硫酸還元菌の増殖が抑制されるのみならず、大腸菌や酪酸菌の増殖も抑制された。
【００５０】
また、実施例１の方法（クエン酸・Ａｌキレートの添加）によれば、図１に示すように、硫酸還元菌の培養液においてはタンパク量の増加が抑制された。即ち、硫酸還元菌の増殖が抑制された。
【００５１】
一方、図２及び図３に示すように、大腸菌、酪酸菌の培養液においては、Ａｌキレートを添加しても、不添加の場合と同様にタンパク量が増加した。即ち、大腸菌および酪酸菌の増殖は抑制されておらず、実施例１の方法については、選択的な制菌効果が認められた。なお、グラフには示さなかったが、実施例２の方法（Ａｌ・シュウ酸キレートの添加）及び実施例３の方法（Ａｌ・ＥＤＴＡキレートの添加）についても、実施例１と同様の選択的制菌効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明に係る制菌方法は、硫酸還元菌の増殖抑制、ひいては硫化水素の生成抑制に利用することができる。
【図１】
2014037364.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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