(57)【要約】      （修正有）【課題】グルコース濃度が高い条件下でもイソマルトースをグルコースに分解する新たな酵素、及びデンプンからグルコースの工業的生産方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるイソマルターゼ、又は上記アミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおいて、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上がイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したイソマルターゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおいて、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上がイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したイソマルターゼ。
【請求項２】
アミノ酸変異が、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の中のメチオニン、グルタミン、グリシン及びアルギニンから選ばれる１又は２以上が、イソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したものである請求項１記載のイソマルターゼ。
【請求項３】
アミノ酸変異が、Ｍ２０３Ｗ、Ｑ２１６Ｅ、Ｇ２５９Ｅ及びＲ２９８Ｉから選ばれる１〜４個である請求項１又は２記載のイソマルターゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のイソマルターゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソマルターゼを採取することを特徴とするイソマルターゼの製造法。
【請求項８】
デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、請求項１〜３のいずれか１項記載のイソマルターゼとを作用させることを特徴とするグルコースの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプンからのグルコース生産に有用なイソマルターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンからの工業的グルコース生産において、α−アミラーゼによる液化、グルコアミラーゼによる糖化、イソアミラーゼやプルラナーゼなどによる枝切り処理などに、様々な酵素が利用されている。このグルコース生産の一連の糖化工程において、糖化酵素であるグルコアミラーゼが有する糖転移、縮合反応等の副反応によって、副産物としてイソマルトースが生じ、デンプンをすべてグルコースに変換することができず、デンプンからのグルコース生産性が低下するという問題点がある。
【０００３】
イソマルトースは、グルコースがα−１，６グルコシド結合したものであるが、これをグルコースに分解することができれば、グルコースの収率上昇が期待できると考えられている。イソマルトースをグルコースに分解するために、α−１，６グルコシド結合を分解する酵素、イソマルターゼ（イソマルトシダーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ）の働きが期待されている。
例えば、Geobacillus thermoglucosidasius由来のオリゴ−１，６−グルコシダーゼは耐熱性に優れ、イソマルターゼ活性を有することから、デンプンからグルコースを生産するためのイソマルターゼとして期待されている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta, 445(1976), 386-397
【非特許文献２】Journal of Bacteriology, Feb.1989, P.1219-1222
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、イソマルターゼは、１分子のイソマルトースを分解して２分子のグルコースにする酵素であり、この反応でグルコース濃度が２％程度になるとイソマルトースを分解する酵素反応は進行しなくなるという問題がある。本発明者の検討によっても、前記耐熱性イソマルターゼもグルコース濃度が２．２％で反応が進行しなくなることが判明した。
従って、本発明の課題は、グルコース濃度が高い条件下でもイソマルトースをグルコースに分解する新たな酵素、及びデンプンからグルコースの工業的生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の酵素の特性の探索及びそのアミノ酸改変をしてきたところ、前記耐熱性イソマルターゼの特定部位のアミノ酸を変異させることにより、当該イソマルターゼのグルコース耐性を１０〜２３％向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［８］を提供するものである。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおいて、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上がイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したイソマルターゼ。
［２］アミノ酸変異が、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の中のメチオニン、グルタミン、グリシン及びアルギニンから選ばれる１又は２以上が、イソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したものである［１］記載のイソマルターゼ。
［３］アミノ酸変異が、Ｍ２０３Ｗ、Ｑ２１６Ｅ、Ｇ２５９Ｅ及びＲ２９８Ｉから選ばれる１〜４個である［１］又は［２］記載のイソマルターゼ。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のイソマルターゼをコードする遺伝子。
［５］［４］記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
［６］［５］記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
［７］［６］記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソマルターゼを採取することを特徴とするイソマルターゼの製造法。
［８］デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、［１］〜［３］のいずれかに記載のイソマルターゼとを作用させることを特徴とするグルコースの製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のイソマルターゼを用いれば、デンプンからグルコースの生産効率が飛躍的に向上する。デンプンのα−アミラーゼなどによる分解によって生じるイソマルトースは、全体の３％程度である。副生したイソマルトースを分離して、糖化工程への再利用を考えた場合、イソマルターゼによりイソマルトースからグルコースを得ることができる。この際、より高いグルコース濃度でも反応可能であることが求められるが、野生型イソマルターゼはグルコース濃度２．２％で反応を停止してしまうため、分解できるイソマルトースは反応系全体の７０％程度が限界である。これに対して、本発明のイソマルターゼを用いればグルコース濃度２．７％まで反応が可能であり、反応系全体の９０％にあたるイソマルトースが分解できることになり、デンプンからグルコースの生産が極めて大量であることを考慮すると、その生産性の向上は顕著である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】変異イソマルターゼの耐熱性を示す図である。
【図２】変異イソマルターゼの最適温度を示す図である。
【図３】変異イソマルターゼの基質特異性を示す図である。
【図４】変異イソマルターゼのグルコース耐性を示す図である。
【図５】変異イソマルターゼの糖化工程への応用例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のイソマルターゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおいて、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上がイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したイソマルターゼである。
【００１１】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼは、非特許文献１及び２に記載された、Geobacillus thermoglucosidasiusが産生するイソマルターゼである。このイソマルターゼには、同一のアミノ酸配列を有する限り、Geobacillus thermoglucosidasius由来でないイソマルターゼが含まれる。また、同一アミノ酸配列を有する限り、ポリペプチドだけでなく、糖ペプチドも含まれる。
【００１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおける、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜８個がさらに好ましい。また、当該欠失、置換又は挿入されたイソマルターゼと配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができる。
【００１３】
本発明のイソマルターゼは、前記イソマルターゼのアミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上がイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したものである。当該変異箇所は、アミノ酸番号２０３のＭから２９８のＲまでの間がより好ましく、２０３のＭ、２１６のＱ、２５９のＧ及び２９８のＲから選ばれる位置がさらに好ましい。すなわち、Ｍ２０３、Ｑ２１６、Ｇ２５９及びＲ２９８から選ばれる１〜４個のアミノ酸が、イソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に変異したものがより好ましい。
さらに好ましいアミノ酸変異は、Ｍ２０３Ｗ、Ｑ２１６Ｅ、Ｇ２５９Ｅ及びＲ２９８Ｉから選ばれる１〜４個である。さらに、グルコース耐性の点から、Ｑ２１６Ｅ、Ｇ２５９Ｅ、Ｒ２９８Ｉ、Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ（２重変異）、Ｍ２０３Ｗ／Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ（３重変異）、及びＭ２０３Ｗ／Ｑ２１６Ｅ／Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ（４重変異）が好ましい。
【００１４】
本発明の変異イソマルターゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソマルターゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソマルターゼにおいて、アミノ酸番号２００〜３００のアミノ酸の１又は２以上をイソロイシン、トリプトファン及びグルタミン酸から選ばれるアミノ酸に置換することにより構築した遺伝子を用いて製造することができる。
【００１５】
本発明の変異イソマルターゼを製造するための遺伝子は、前記の変異イソマルターゼをコードする塩基配列を有する遺伝子であり、例えば前記の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸配列をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
【００１６】
このようにして得た遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られている。変異イソマルターゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ−１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。
【００１７】
得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等の微生物に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明変異イソマルターゼが得られる。
【００１８】
本発明の変異イソマルターゼは、イソマルトースをグルコースに分解する作用を有し、高濃度のグルコース存在下でも作用する。
従って、デンプンに、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ及びプルラナーゼから選ばれる酵素と、本発明のイソマルターゼを作用させれば、グルコースが高収率で製造できる。ここで、α−アミラーゼとしては、例えばクライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。グルコアミラーゼとしては、例えばＧＯＤＯ−ＡＮＧＨ（合同酒精株式会社）を用いることができる。イソアミラーゼとしては、例えばＧＯＤＯ−ＦＩＡ（合同酒精株式会社）を用いることができる。プルラナーゼとしては、例えばプルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム株式会社）を用いることができる。
【００１９】
反応は、例えばデンプンおよびアミラーゼ等のデンプン糖化酵素に前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、グルコース濃度が向上しても反応が進行するので高収率でグルコースを製造することができる。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
（Geobacillus thermoglucosidasius由来のイソマルターゼ遺伝子のクローニングと発現）
イソマルターゼ遺伝子の発現には、発現ベクターとしてプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト社製）、および発現の宿主としてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト社製）をそれぞれ用いた。
Geobacillus thermoglucosidasius  ＮＣＩＭＢ  １１９５５株を培養し、全ゲノムを抽出した。ゲノム中に含まれるイソマルターゼ遺伝子(ｇｔａｇｌ)をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの際に、制限酵素サイトが導入されるように設計した。
ｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイトに、Bacillus subtilis の蛋白質高発現プロモーターを導入し、さらにその下流側に、ＰＣＲにより増幅したｇｔａｇｌ配列を導入し、イソマルターゼ発現用のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ−ＧＴＡＬを調製した。調製した発現用プラスミドｐＨＹ３００ＰＫＬ−ＧＴＡＧＬをBacillus subtilis  ＩＳＷ１２１４株へ、エレクトロポレーション法により導入し、組換えＧＴＡＧＬ生産系を構築した。
得られたイソマルターゼ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２２】
実施例２
（イソマルターゼ遺伝子に対する変異導入）
PrimeSTARTM Mutagenesis Kit（TAKARA）を使用し、ＰＣＲ法を利用した変異導入を行った。ＰＣＲに用いた部位特異的変異導入用のプライマー配列を表１に示した。
【００２３】
【表１】
2014100090.tif 000002
【００２４】
２重〜４重変異体については、ｐＨＹ３００ＰＬＫ−ＧＴＡＬを鋳型とし、まずＧ２５９Ｅ変異を加えるプライマーを用いて変異を導入し、ｐＨＹ３００ＰＬＫ−ＧＴＡＬ−Ｇ２５９Ｅプラスミドを調製し、その後ｐＨＹ３００ＰＬＫ−ＧＴＡＬ−Ｇ２５９Ｅを鋳型として２つ目の変異であるＲ２９８Ｉ変異を導入した。同様の方法で、Ｍ２０３Ｗ、Ｑ２１６Ｅ変異を順番に導入し、２重〜４重変異体を得るためのプラスミドを調製した。
【００２５】
得られたプラスミドを同じくBacillus subtilis  ＩＳＷ１２１４株へ、エレクトロポレーション法により導入し、変異体ＧＴＡＧＬ蛋白を得た。
【００２６】
Ｍ２０３Ｗ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
Ｑ２１６Ｅ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３に示す。Ｇ２５９Ｅ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｒ２９８Ｉ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号５に示す。Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号６に示す。Ｍ２０３Ｗ／Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号７に示す。Ｍ２０３Ｗ／Ｑ２１６Ｅ／Ｇ２５９Ｅ／Ｒ２９８Ｉ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００２７】
（イソマルターゼ活性測定法：ＧＯＤ法）
イソマルターゼ活性は、ＧＯＤ法により測定した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、最終濃度が０．０４１％ＧＯＤ、０．０１％ＰＯＤ、０．５％Ｏ−ジアニシジンとなるように添加・混合し、ＧＯＤ試薬とした。２０ｍｇ／ｍＬイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。また、酵素溶液を蒸留水にした溶液をコントロールとした。酵素反応液を、６０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応液を１００℃で３分間処理した後、ＧＯＤ試薬２００μｌ加えて３０℃で１０分間インキュベートした。４Ｎ  ＨＣｌを４μｌ加えた後、４００ｎｍにおける吸光度から、活性を測定した。（以下、「ＧＯＤ法」）。また、各試験により、反応溶液のｐＨおよび反応温度を変化させた。ＧＯＤ法の原理については以下の通りである。
【００２８】
【化１】
2014100090.tif 000003
【００２９】
α−グルコシダーゼ活性の１Ｕは、本条件において、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成させる活性と定義し、以下の式より酵素活性を算出した。
【００３０】
【数１】
2014100090.tif 000004
【００３１】
実施例３
（変異イソマルターゼの特性）
（１）耐熱性
２０ｍｇ／ｍＬイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、各温度（４、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）で１０分間加熱処理をした酵素溶液５μｌを加え反応液とし、ＧＯＤ法によりイソマルターゼ活性を測定した。（全量２０μｌ）。
その結果、図１に示すように、ＧＴＡＧＬとその４重変異体は７０℃でおよそ６０％の活性を維持した。
【００３２】
（２）最適温度
２０ｍｇ／ｍＬイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μｌの混合液に、酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。反応液を４〜８０℃の温度で１０分間インキュベートし、ＧＯＤ法によって活性を測定した。
その結果、図２に示すようにＧＴＡＧＬとその４重変異体は６０℃で最高の活性を示した。
【００３３】
（３）最適pH
２０ｍｇ／ｍＬのイソマルトース１０μｌ、２００ｍＭの各種ｐＨの緩衝液５μｌの混合液に、酵素溶液５μｌを加え反応液とした（全量２０μｌ）。反応液を、６０℃で１０分間インキュベートし、ＧＯＤ法によって活性を測定した。
その結果、ＧＴＡＧＬでは、ｐＨ７．０で最高の活性を示した。４重変異体ではｐＨ６．０で最高の活性を示した。
【００３４】
（４）基質特異性
ＴＬＣにて、ＧＴＡＧＬ、ＧＴＡＧＬ−４重変異体の基質特異性および転移反応について確認した。２％基質の３種に対して、６０℃、２４時間の条件でＧＴＡＧＬおよびその４重変異体を作用させた。展開溶媒はイソプロパノール／ｎ−ブタノール／水（１０／５／４）で、展開後、風乾し、アンスロン硫酸液を噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。その結果、図３に示すように、ＧＴＡＧＬ、４重変異体ともに目立った糖転移反応は示さなかった。
【００３５】
（５）グルコース耐性
イソマルトース濃度を１％とし、グルコース濃度が２％になる基質条件で、６０℃におけるＧＴＡＧＬとその変異体の反応性を調べた。反応液中の酵素活性は０．５Ｕ／ｍＬで反応を行った。経時的にサンプリングを行い、液体クロマトグラフィーによりイソマルトースの分解を確認した（〜２０時間）。イソマルターゼの分解反応が進行しなくなった時のグルコース濃度を確認し、その数値をグルコース耐性の値とした。
その結果、表２及び図４に示すように、４重変異体では最大２．７％グルコース存在下での反応が可能であることが示された。
【００３６】
【表２】
2014100090.tif 000005
【００３７】
実施例４
（糖化工程サンプルへの応用例）
溶性デンプンを濃度30％(w/w)となるように、０．１Ｍ 酢酸緩衝液(ｐＨ４．２)に加熱溶解した。溶性デンプン液５０ｍＬに対して、市販糖化用酵素ＯＰＴＩＭＡＸ  ４０６０(グルコアミラーゼ・プルラナーゼ混合酵素)を４０μＬ加え、６０℃にて１６時間酵素反応を行った。反応後、試料を１００℃加熱し、酵素反応を停止させた(デンプン分解物)。
デンプン分解物を０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６．８)にて、グルコース濃度が２．５％になるように希釈した後、実施例１または実施例２により得られたＧＴＡＧＬおよびその４重変異体を加え、６０℃で２０時間反応させた。反応後、シリカゲルＴＬＣに供して分析した。展開溶媒はイソプロパノール／ｎ−ブタノール／水（１０／５／４）で、展開後、風乾し、アンスロン硫酸液を噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。
その結果、２．７％のグルコース存在下でも反応可能なＧＴＡＧＬ−４重変異体のみで、デンプン分解物中に見られるイソマルターゼを分解することが可能であった（図５）。
【００３８】
本発明のイソマルターゼにより、デンプンからの工業的グルコース生産工程で、グルコースの収率を飛躍的に向上させることが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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