(57)【要約】    【課題】ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤を提供することなどを課題とする。    【解決手段】オウゴン抽出物を含むＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤などを提供する。【選択図】  図３
2014141430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オウゴン抽出物を含むＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤。
【請求項２】
オウゴン抽出物を含む皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤。
【請求項３】
オウゴン抽出物を含む皮膚外用剤。
【請求項４】
オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞の分裂方向を制御する皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び、皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物や被子植物などの高等生物は、外界からの刺激及び体内の様々な生理現象に対応して恒常性を維持している。そして、高等生物は、恒常性を維持すべく、神経系や内分泌系などの情報伝達機構を備えている。情報伝達機構においては、細胞内の情報伝達物質としてのＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）などが、体内の様々な情報伝達の役割を担っている。
【０００３】
ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）としては、三量体Ｇタンパク質及び低分子量Ｇタンパク質が知られており、このうちの低分子量Ｇタンパク質としては、例えば、Ｒｈｏタンパク質などが知られている。
【０００４】
Ｒｈｏタンパク質は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合型（活性期）及びグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合型（不活性期）の２つの型になることが知られている。この２つの型を繰り返すことを制御するタンパク質の１種として、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）が知られている。
【０００５】
Ｒｈｏタンパク質の型を制御するＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）は、例えば、ＧＤＰ結合型のＲｈｏタンパク質に選択的に結合することにより、ＧＤＰ結合型Ｒｈｏタンパク質を細胞内にとどめて、Ｒｈｏタンパク質がＧＴＰ結合型へ変化することを防止するものとして知られている（非特許文献１）。
そして、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）としては、例えば、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質などが知られている。
【０００６】
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質に関しては、例えば、非特許文献２に記載されているように、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（１−１９）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が、ガン細胞の細胞死を誘導することなどが知られているものの、生物体内における他の様々な作用が必ずしも十分に明らかにされているわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Trends. Biochem. Sci. 20: 227-231,1995; Genes to cells.1 : 615-632, 1996
【非特許文献２】広島大学原爆放射線医科学研究所  年報48号  ゲノム障害制御研究部門  ゲノム応答研究分野研究概況  「２．研究題目：電離放射線誘発細胞死シグナルにおける分断化ＬｙＧＤＩ／ＲｈｏＧＤＩ2／ＲｈｏＧＤＩβの機能解析」p.12，2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、生物体内の様々な組織においてＲｈｏタンパク質と結合し、細胞内の情報伝達をしていると考えられていることから、例えば、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すれば、生体における好ましくない生理現象を抑制することができると考えられる。しかしながら、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるものは、現状、あまり知られていない。
そこで、生体における生理現象を制御すべく、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるものが要望されている。
【０００９】
本発明は、上記の要望点等に鑑み、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できる皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤及び皮膚外用剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できる皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。オウゴン抽出物により、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。
【００１２】
本発明に係る皮膚外用剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。
【００１３】
本発明に係る皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるという効果を奏する。
また、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるため、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】紫外線照射後におけるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を示す電気泳動後の写真。
【図２】ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の細胞分裂方向への関与を示す図。
【図３】ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制能、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現抑制能を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明に係るＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤の実施形態について説明する。
【００１７】
本実施形態のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むものである。
【００１８】
前記産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むため、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、例えば、生物体内において、
ＲｈｏＧＤＩβが引き起こす、アポトーシス（細胞死）といった好ましくない生理現象を抑制することができる。また、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、例えば、後述するように、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
【００１９】
前記オウゴン抽出物は、シソ科タツミナソウ属に属するコガネバナ（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ.）の根を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００２０】
前記オウゴンの抽出部分としては、コガネバナの根であれば、特に限定されないが、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生をより抑制できるという点で、根の周皮を取り除いた部分が好ましい。
【００２１】
前記オウゴン抽出物は、通常、前記抽出溶媒による抽出液、その希釈液、その濃縮液、又はその抽出溶媒を除去した乾燥物などの態様になり得る。具体的には、各抽出物は、例えば、溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状などの態様になり得る。
【００２２】
前記抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類；アセトニトリルなどのニトリル類；酢酸エチルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。
これらの抽出溶媒としては、１種の単独物、又は、２種以上の混合物が採用され得る。２種以上の抽出溶媒が混合されたものにおける混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
【００２３】
前記抽出溶媒としては、少なくとも水を含む水含有抽出溶媒が好ましい。
【００２４】
前記オウゴン抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコールとしてのエタノールと水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
前記オウゴン抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールと水とを、脂肪族アルコール：水＝７：３〜３：７の容量比で混合した抽出溶媒が好ましく、エタノールと水とをエタノール：水＝７：３〜３：７の容量比で混合した抽出溶媒がより好ましい。
【００２５】
前記抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法が採用される。
前記抽出においては、抽出原料としての各植物の抽出部位が、そのまま若しくは乾燥されて用いられ得る。
前記抽出における抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、前記抽出における抽出温度は、通常、２０℃〜８０℃であり、前記抽出における抽出時間は、通常、２時間〜３日間である。抽出後の粗抽出物に対しては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理が施される。
【００２６】
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物以外の成分を含んでいてもよい。
【００２７】
なお、前記オウゴン抽出物としては、例えば、化粧料用原料、食品原料の用途のために市販されているものが採用され得る。
【００２８】
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤に含まれる上記の抽出物の濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、乾燥物換算で０．００１〜５．０質量％が挙げられる。
なお、乾燥物換算とは、抽出物から抽出溶媒を除いた残渣である乾燥物の質量に換算することである。
【００２９】
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、通常、液状である。また、前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、上記の抽出物以外に、水やエタノールなどの溶媒、界面活性剤、防腐剤などを含み得る。
【００３０】
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、前記オウゴン抽出物の濃度が乾燥物換算で１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬとなるように希釈されて使用される。
【００３１】
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、該産生抑制剤を生物組織へ注入すること、生物組織へ塗布すること、動物に摂食させること等によって使用される。
【００３２】
次に、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤の実施形態について説明する。
【００３３】
本実施形態の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を少なくとも含むものである。
前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
【００３４】
前記皮膚表皮細胞は、皮膚の外方側にある表皮を構成する細胞である。表皮は、生体を防御したり、水分の過剰な蒸発を防いだりするバリア機能を有している。表皮は、通常、最も内方側にある基底層と、該基底層から外方側へ向かって順に配されている有棘層と顆粒層と角質層との４層で構成されている。
前記皮膚表皮細胞は、通常、基底層で生じ、基底層から外方側へ角化過程を経ながら押し出され、最外層の角質層を形成したあと、最終的には角質層から剥がれ落ちる。
また、前記皮膚表皮細胞は、表皮におけるバリア機能を維持するため、基底層で生じ角質層に至って剥がれ落ちるという代謝のサイクルを、通常、約４週間かけて繰り返す。
【００３５】
前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、基底層にて細胞分裂する皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
即ち、前記オウゴン抽出物の存在下にて基底層の皮膚表皮細胞が分裂すると、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなる。皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなることにより、角質層における細胞の配列がより整ったものとなり得るため、肌のキメが整うことになり得る。
【００３６】
詳しくは、前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、皮膚の表皮において、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が抑制されると、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生も抑制される。
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が１９番目のアスパラギン酸部位で分断されＮ末欠損することにより産生し、特に紫外線の照射により産生が促進される。
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、ＲｈｏファミリーＧタンパク質の１種であるＣｄｃ４２と結合する作用を有している。Ｃｄｃ４２は、様々な細胞の形態形成などの過程で重要な役割を担っているタンパク質であり、皮膚表皮細胞の分裂においても、細胞の形態形成に関わっている。詳しくは、Ｃｄｃ４２は、皮膚表皮細胞が２つに分裂する際に、通常、細胞の核を通る直線に沿うように２箇所に配される。そして、細胞は、２つのＣｄｃ４２がその直線に沿って互いに離れるように分裂する。即ち、その直線の延在方向が分裂方向となる。従って、Ｃｄｃ４２がΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質と結合すること等によって、Ｃｄｃ４２の機能が阻害されると、細胞の分裂方向がよりランダムなものとなり得る。
このように、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が増えると、皮膚表皮細胞の分裂方向の制御に関わっているＣｄｃ４２とΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質との結合が起こりやすくなり、分裂する皮膚表皮細胞のＣｄｃ４２の機能を阻害しやすくなる。従って、細胞の分裂方向がよりランダムなものとなり得る。
これに対して、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すべく、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、分裂する皮膚表皮細胞でＣｄｃ４２の機能阻害が抑制され、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなる。
【００３７】
前記分裂方向制御剤は、通常、液状である。また、前記オウゴン抽出物を乾燥物換算で０．００１〜５．０質量％含む。また、上記の抽出物以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤などを含み得る。
【００３８】
前記分裂方向制御剤は、例えば、上記の抽出物が乾燥物換算で上述した濃度範囲となるように、希釈されて使用される。
【００３９】
前記分裂方向制御剤は、例えば、該分裂方向制御剤を皮膚表皮細胞へ注入すること、又は、皮膚表皮細胞へ塗布すること等によって使用される。
【００４０】
続いて、本発明の皮膚外用剤の実施形態について説明する。
本実施形態の皮膚外用剤は、前記オウゴン抽出物を少なくとも含むものである。
また、前記皮膚外用剤は、ヒトの皮膚表面に接触されて使用されるものである。
【００４１】
前記皮膚外用剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、上述したように、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
【００４２】
前記皮膚外用剤は、上記の抽出物以外に、前記分裂方向制御剤と同様に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。
【００４３】
皮膚外用剤の処方例を以下にしめす。
＜クリームの処方例＞
配合成分                                      配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有）                            3.0
マイクロクリスタリンワックス                                0.5
流動パラフィン                                              2.0
ミリスチン酸オクチルドデシル                                2.0
オリーブ油                                                  5.0
親油型モノステアリン酸グリセリン                            3.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレン                          0.5
モノステアリン酸ソルビタン                                  1.5
メチルポリシロキサン                                        0.4
セタノール                                                  0.25
1,3-ブチレングリコール                                      5.0
グリセリン                                                  8.0
香料                                                        適量
防腐剤                                                      適量
精製水                                                      残量
【００４４】
＜ジェルの処方例＞
配合成分                                      配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有）                            3.0
酢酸トコフェロール                                          0.1
1,3-ブチレングリコール                                      6.0
グリセリン                                                  2.0
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                    0.2
クエン酸                                                    0.01
クエン酸ナトリウム                                          0.03
水酸化ナトリウム                                            0.08
香料                                                        適量
防腐剤                                                      適量
精製水                                                      残量
【００４５】
＜エッセンスの処方例＞
配合成分                                      配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有）                            3.0
1,3-ブチレングリコール                                      5.0
グリセリン                                                  4.0
ヒアルロン酸ナトリウム                                      0.1
エタノール                                                  3.0
クエン酸                                                    0.1
クエン酸ナトリウム                                          0.1
香料                                                        適量
防腐剤                                                      適量
精製水                                                      残量
【００４６】
＜乳液の処方例＞
配合成分                                      配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有）                            3.0
サフラワー油                                                3.0
オリーブ油                                                  3.0
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン                1.0
モノステアリン酸ソルビタン                                  0.5
ステアリンアルコール                                        0.4
セタノール                                                  0.6
1,3-ブチレングリコール                                      3.0
グリセリン                                                  5.0
ヒアルロン酸ナトリウム                                      0.5
クエン酸                                                    0.1
クエン酸ナトリウム                                          0.5
香料                                                        適量
防腐剤                                                      適量
精製水                                                      残量
【００４７】
前記皮膚外用剤は、通常、オウゴン抽出物を乾燥物換算で０．００１〜5質量％含む。
【００４８】
前記皮膚外用剤は、例えば、液状、ジェル状、乳液状、クリーム状、固形状などの態様になる。また、前記皮膚外用剤は、例えば、皮膚表面と接するシート状の層を少なくとも備え、該層がオウゴン抽出物を含むように構成されたシート状物の態様であってもよい。
【００４９】
なお、前記皮膚外用剤は、例えば、ヒトの皮膚に塗布又は貼付されることにより使用される。
また、前記皮膚外用剤は、例えば、化粧品、医薬部外品、又は医薬品などの分野において使用される。
【００５０】
さらに、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法の実施形態について説明する。
【００５１】
本実施形態の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞の分裂方向を制御するものである。
【００５２】
前記分裂方向制御方法は、例えば、生体において実施することができる。
前記分裂方向制御方法は、ヒトの生体又はヒト以外の動物の生体において実施することが好ましく、ヒトの生体において、美容上の目的で、非治療的に実施することがより好ましい。
【００５３】
前記分裂方向制御方法は、例えば、オウゴン抽出物を含む上記の分裂方向制御剤を皮膚表皮組織に注入する処置を施すことにより実施することができる。
【００５４】
また、前記分裂方向制御方法は、例えば、オウゴン抽出物を含む上記の皮膚外用剤を、皮膚の表皮組織（角質層など）に塗布することにより実施することができる。
【００５５】
前記分裂方向制御方法においては、前記オウゴン抽出物を上述したように乾燥物換算で適当な濃度に希釈すべく、希釈液を用いることができる。希釈液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、表皮細胞の培養液などを用いることができる。
【００５６】
前記皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法によれば、前記オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞においてＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。従って、上述したように、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなり、角質層における細胞の配列がより整ったものとなり得るため、肌のキメが整うことになり得る。
【００５７】
本実施形態のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法に限定されるものではない。また、本発明では、一般のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【００５８】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例）
下記のようにして、オウゴン抽出物を製造した。
即ち、コガネバナ（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ.）の根（オウゴン）の周皮を取り除いたものを乾燥して細かく砕いたもの２０ｇに５０容量％エタノール水溶液２００ｍＬを加え、室温（２０℃）にて５日間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行うことにより、オウゴン抽出物を製造した。
このオウゴン抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を１．２質量％含むものであった。
【００６０】
＜紫外線照射によるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生促進について＞
まず、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が、紫外線の照射によって促されることを下記の方法によって確認した。
【００６１】
紫外線（ＵＶＢ）を照射した正常ヒト表皮細胞におけるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生をWesternBlotting法（Immunoblot（ＩＢ）法、電気泳動法）により下記のようにして確認した。
正常ヒト表皮細胞としては、ＤＳファーマ社製の製品名「ＫＪＢ−１００」を使用した。表皮角化細胞用培地（Lonza社製、製品名「KGM-Gold Bullet kit」）において正常ヒト表皮細胞を３７℃、５％ＣＯ2濃度の条件下で前培養した。
次いで、前培養した正常ヒト表皮細胞を100mm dishに播き、３日後の細胞にＵＶＢを照射した。ＵＶＢ照射条件は、３０ｍＪ／ｃｍ2とした。その後、１日目、３日目、８日目に細胞を回収した。
なお、コントロールとして、紫外線未照射細胞も同様に準備した。
ＵＶＢを照射した細胞、及び、コントロールとしての紫外線未照射細胞をセルスクレーパーによってディッシュから剥ぎ取って回収し、回収したものを３０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離することにより上清液を取り除いた。さらに、リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（−）（−は、Ｃａイオン、Ｍｇイオンを含まないことを表す）で洗浄処理を行い、遠心分離後、上清液を取り除き、細胞を−８０℃で保存した。
WesternBlotting法においては、−８０℃で保存した細胞に、SDS-Sample bufferを２０μＬ加え、評価用サンプルを調製した。また、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質検出用抗体としては、D4-GDI Mm Ab（Active Motif ＃40941）を使用した。ＲｈｏＧＤＩβタンパク質抗体としては、Ly GDI（C-20）Goat Ab（Santa Cruz sc-6047）を使用し、ＲｈｏＧＤＩαタンパク質抗体としては、RhoGDI（A-20）Rabbit Ab（Santa Cruz sc-360）を使用した。そして、これら抗体と評価用サンプルとを混合した後に、電気泳動することにより、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質、及び、ＲｈｏＧＤＩαタンパク質の産生の有無を確認した。
【００６２】
上記のごとき方法によって各Ｒｈｏタンパク質を電気泳動させた結果を図１に示す。図１における上段の結果は、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質を特異的に検出する抗体を用いた結果で、中段の結果は、ＲｈoＧＤＩβタンパク質（ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質も含む）を検出する抗体を用いた結果である。
ＵＶＢ照射後、１、３日目の正常ヒト表皮細胞において、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が確認された。
【００６３】
＜ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の細胞分裂方向への関与を実証する試験＞
続いて、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が正常ヒト表皮細胞の細胞分裂方向の乱れに関与することを実証すべく、下記の試験を行った。
【００６４】
詳しくは、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子を正常ヒト表皮細胞において過剰発現させ、該細胞の細胞分裂方向を観察した。
まず、表皮における基底膜を再現したマトリゲルコートプレートを準備すべく、次の操作を行った。即ち、６ウェル培養プレート（IWAKI社製）のウェルに、基礎培地（添加物を加えていない表皮角化細胞用培地）で１５倍に希釈したマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、製品番号「356230」）を加え、ウェルの上にカバーガラスを置き、３時間静置した。余った上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で１回洗浄し、マトリゲルコートプレートを作製した。
また、試験に用いる細胞としては、正常ヒト表皮細胞（KURABO社製、製品名「KK-4009」）を使用し、表皮角化細胞用培地としては、Lonza社製の「KGM-Gold Bullet kit」を使用し、３７℃、５％ＣＯ2濃度の条件において正常ヒト表皮細胞を培養した。
続いて、上記のごとく作製したマトリゲルコートプレートに上記の正常ヒト表皮細胞を１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように播き、１日後に正常ヒト表皮細胞への遺伝子導入操作を行った。
遺伝子導入操作は、次のようにして行った。即ち、基礎培地にLipofectamine LTX試薬とプラスミド（ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子導入プラスミド、又は、ベクターのみ）とを加えた複合培地を正常ヒト表皮細胞に加えた。６時間後にＰＢＳ（−）で洗浄し、さらに、表皮角化細胞用培地にて遺伝子導入細胞を培養した。なお、ベクターのみを加えたものは、コントロールとした。
次に、細胞を染色すべく、免疫蛍光染色処理を行った。即ち、培養した遺伝子導入細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、さらに、３．７質量％ホルムアルデヒド水溶液で３７℃にて５分間処理した。続いて、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、−２０℃メタノールで２０分間処理した。さらに、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳで４℃にて、細胞にブロッキング処理を１時間施した。その後、２００倍希釈したanti γ-Tubulin-Cy3（SIGMA社製）、２００倍希釈したanti α-Tubulin-FITC（SIGMA社製）、及び、２万倍希釈したHoechst33258（Invitrogen社製）で細胞を１．５時間処理した。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、６ウェル培養プレートからカバーガラスを取り出し、マウント剤（Invitrogen社製、製品名「ProLong Gold」）を用いてスライドガラス上に細胞を包埋した。
細胞の分裂方向を下記のようにして解析した。詳しくは、共焦点蛍光顕微鏡（OLYMPUS社製、製品名「FV-1000D」）を用いて、細胞分裂中期から後期の細胞を３次元（Ｘ，Ｙ，Ｚ軸）画像で撮影し、Ｘ、Ｚ軸の細胞切片画像を作製した。画像処理ソフトウェア（製品名「image-J」）を用い、作製した細胞切片画像における、分裂細胞の中心体同士を結んだ線の角度を測定した。なお、斯かる角度としては、画像において、２つに分裂しつつあるどちらの細胞の表面にも接する線と、分裂しつつある細胞の中心体同士を結んだ線との間における角度を採用した。なお、画像において評価対象とした細胞の数は、４０〜６０とした。
【００６５】
上記の試験結果を図２に示す。なお、図２のグラフにおいては、測定対象とした分裂しつつある細胞の合計数に対する、所定範囲の角度を示す細胞の数の割合が示されている。
図２から把握されるように、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子を過剰に発現させた細胞においては、細胞分裂方向が乱れる。なお、図２の下側の写真は、角度を測定した画像の具体例を示したものである。
【００６６】
＜ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現量の評価＞
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質による細胞分裂方向の乱れを抑制するためには、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の前駆物質であるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すること、又は、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現を抑制することが必要である。そこで、実施例のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤について、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制性能、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現性能を評価した。
【００６７】
１．正常ヒト表皮細胞の培養
正常ヒト表皮細胞としては、ＤＳファーマ社製、製品名「KJB-100」を使用した。表皮角化細胞用培地としては、Lonza社製の製品名「KGM-Gold Bullet kit」を使用した。そして、正常ヒト表皮細胞を培地中で３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて培養した。
その後、１２ウェル培養プレートに２１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように正常ヒト表皮細胞を播いた。２４時間培養後、オウゴン抽出物が１質量％（乾燥物換算で１２０μｇ／ｍＬ（０．０１２質量％））となるように調製した同様の培地へと、培地を交換し、さらに細胞を２４時間培養した。なお、比較対照サンプル（コントロール）においては、抽出物を加えていない培地へと交換して、さらに細胞を２４時間培養した。
【００６８】
２．ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生性能の評価
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の検出は、WesternBlotting法により、下記のようにして行った。即ち、セルスクレーパーで細胞をディッシュから剥ぎ取って回収し、回収したものを３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離することにより上清を取り除いた。この上清を取り除いたものをＰＢＳ（−）で洗浄し、遠心分離後、さらに上清を取り除き、−８０℃で保存した。
−８０℃で保存したサンプルにSDS-Sample bufferを２０μＬ加えた。ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質検出用抗体としては、D4-GDI Mm Ab（Active Motif＃40941）を使用した。ＲｈｏＧＤＩβタンパク質抗体としては、LyGDI(C-20)Goat Ab(Santa Cruz sc-6047) を使用した。ＲｈｏＧＤＩαタンパク質抗体としては、RhoGDI(A-20)Rabbit Ab(Santa Cruz sc-360)を使用した。
【００６９】
３．ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現量の評価
一方で、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現量を下記のようにして調べた。
まず、培養した正常ヒト表皮細胞のＲＮＡ抽出処理を次のようにして行った。即ち、培養後の細胞にＲＮＡ抽出液（TaKaRa社製、製品名「RNAiso Plus」）を１ｍＬ加え、細胞をエッペンチューブに回収した。室温で５分間静置した後、クロロホルムを２００μＬ加えて細胞と混合した。混合したものを１２０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離し、上層の上清を別のエッペンチューブに移した。移した上清にイソプロパノール４００μＬを加えてエッペンチューブを複数回転倒させることによりチューブ内容物を撹拌した後、チューブを１０分間静置した。さらに、１２０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離した後、上清を取り除き、７５％エタノール水溶液をチューブに１ｍＬ加えることにより洗浄処理を行った。加えて、７５００ｒｐｍ、５分間、４℃にて遠心分離し、上清を取り除いた。その後、室温で１０分間乾燥させ、水２０μＬをチューブに入れて懸濁液を調製した。
さらに、次のようにしてリアルタイムＰＣＲ操作を行った。詳しくは、リアルタイムＰＣＲ試薬（TaKaRa社製、製品名「One Step SYBER PrimeScript RT-PCR Kit PLUS」）を用いて試験サンプルを調製した。
プライマーとしては、
RhoGDIβ Fw（GAGACAGAGGCACCCCGGACA）、primer1（配列番号１）
RhoGDIβ Rv（CAGGGACTTCTGTGGTGGAGGC）、primer2（配列番号２）
βactin Fw（ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG）、primer3（配列番号３）
βactin Rv（ACATGCCGGAGCCGTTGTCG）primer4（配列番号４）
を使用した。
また、測定機器としては、Applied Biosystems社製「7300 Fast Real-Time PCR System」を用いた。
【００７０】
オウゴン抽出物のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制能、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現抑制能の評価結果を図３に示す。なお、図３においては、コントロールの値を１００としたときの相対値が示されている。
図３から把握されるように、実施例のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現抑制能を必ずしも十分に有していないものの、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制能を十分に有している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御するために好適に使用される。また、例えば、細胞のアポトーシス（細胞死）を抑制するために好適に使用される。
本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
本発明の皮膚外用剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
【図１】
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【図２】
2014141430.tif 000004
【図３】
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【配列表】
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