(57)【要約】      （修正有）【課題】様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼの提供。【解決手段】オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は５７個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、Ｎ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列は特定のアミノ酸配列であり、Ｎ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、Ｎ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列は他の特定のアミノ酸配列であり、少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２０番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、
そのアミノ酸配列は５７個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、Ｎ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列は配列番号３に示されるアミノ酸配列であり、Ｎ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、Ｎ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列であり、
少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２０番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼ。
【請求項２】
オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、
そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくともＮ末端側から２８５番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、
少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２８５番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼ。
【請求項３】
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が５５７から６１８ｎｍである請求項１または２に記載のルシフェラーゼ。
【請求項４】
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が６００から６１８ｎｍである請求項３に記載のルシフェラーゼ。
【請求項５】
前記２０番目のアミノ酸または前記２８５番目のアミノ酸は、スレオニン、リジンまたはイソロイシンである請求項１から４の何れか１項に記載のルシフェラーゼ。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が互いに異なる複数の請求項１または２に記載のルシフェラーゼから成る群から選択される少なくとも２つ以上のルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、
前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および
前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出すること
を含む被験試料を分析する方法。
【請求項９】
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が５５７ｎｍ以上且つ５７０ｎｍ未満である請求項１または２に記載のルシフェラーゼ、
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が５７０ｎｍ以上且つ６００ｎｍ未満である請求項１または２に記載のルシフェラーゼ、および
ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が６００ｎｍ以上且つ６１８ｎｍ以下である請求項１または２に記載のルシフェラーゼ
から成る群から選択される少なくとも２つのルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、
前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および
前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出すること
を含む被験試料を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の生物に由来するルシフェラーゼが多数知られている。異なる生物に由来するルシフェラーゼ同士は、互いに固有の色の発光を生じさせる場合が多い。しかしながら、所望の色の発光を生じさせるルシフェラーゼを多数揃えることは困難である。
【０００３】
一方、単一のルシフェラーゼに対して添加物を加えて発光の色を変化させることも試みられている。この場合、色ごとに添加物の成分や濃度等が異なる場合がある。
【０００４】
また、ルシフェラーゼのペプチドの構造やルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を、試行錯誤して改変することで、発光の色が異なる変異体を取得しようとする試みも存在する。この場合、ペプチドや塩基配列の改変部位が色ごとに異なる場合があり、色のバリエーションを増やすことは困難であり、また、改変後のルシフェラーゼ同士の特性が異なることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−３４０５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Bioluminescent Indicator for Determining Protein-Protein Interactions Using Intramolecular Complementation of Split Click Beetle Luciferase" Anal. Chem., 2007, 79 (13), pp 4820-4826
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は５７個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、Ｎ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列は配列番号３に示されるアミノ酸配列であり、Ｎ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、Ｎ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列であり、少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２０番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【０００９】
また、本発明に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくともＮ末端側から２８５番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２８５番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１（ａ）は、それぞれ本発明に係るルシフェラーゼを発現する大腸菌から放射される発光を示す画像をモノクロで示した図であり、図１（ｂ）は、本発明に係るルシフェラーゼによる発光の最大発光波長を示す表である。
【図２】図２は、本発明に係る種々のルシフェラーゼによる発光スペクトルを示す図である。
【図３】図３は、図２に示された発光スペクトルの一部を示す図である。
【図４】図４は、図２に示された発光スペクトルの一部を示す図である。
【図５】図５は、図２に示された発光スペクトルの一部を示す図である。
【図６】図６は、図２に示された発光スペクトルの一部を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１実施形態はルシフェラーゼに関する。
【００１３】
本発明の第１実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は５７個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、Ｎ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列は配列番号３に示されるアミノ酸配列であり、Ｎ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、Ｎ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列であり、少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２０番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【００１４】
ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが酸化する際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。
【００１５】
本発明において、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）とは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科マドボタル属に属すホタルである。オキナワマドボタルの例は、主に沖縄本島に生息する基亜種ピロコエリア・マツムライ・マツムライ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）である。
【００１６】
本発明において、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼには、オキナワマドボタルが本来有する野生型のルシフェラーゼだけでなく、この野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異が生じた変異型ルシフェラーゼが含まれる。この変異は、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加である。この変異は、例えば、ルシフェラーゼの酵素活性には影響がないまたはほとんど影響がない変異、またはタンパク質の分解に対する耐性の向上といった酵素活性には直接影響しないものの、実験的な操作性を向上させる変異である。この変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００１７】
オキナワマドボタルの野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、次の通りである：
ＭＥＤＤＨＫＮＩＶＨＧＰＡＰＦＹＰＬＥＥＧＴＡＧＥＱＬＨＲＡＭＫＲＹＡＱＶＰＧＴＩＡＦＴＤＡＨＶＥＶＮＩＴＹＳＥＹＦＥＭＡＣＲＬＡＥＴＭＫＲＹＧＬＧＬＱＨＨＩＡＶＣＳＥＮＳＬＱＦＦＭＰＶＣＧＡＬＦＩＧＶＧＶＡＰＴＮＤＩＹＮＥＲＥＬＹＮＳＬＳＩＳＱＰＴＩＶＦＣＳＫＲＡＬＱＫＩＬＧＶＱＫＫＬＰＶＩＥＫＩＶＩＬＤＳＲＥＤＹＭＧＫＱＳＭＹＳＦＩＥＳＨＬＰＡＧＦＮＥＹＤＹＶＰＤＴＦＤＲＥＴＡＴＡＬＩＭＮＳＳＧＳＴＧＬＰＫＧＶＥＬＴＨＫＮＶＣＶＲＦＳＨＣＲＤＰＶＦＧＮＱＩＩＰＤＴＡＩＬＴＶＩＰＦＨＨＧＦＧＭＦＴＴＬＧＹＬＴＣＧＦＲＩＶＬＭＹＲＦＥＥＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹＫＩＱＳＡＬＬＶＰＴＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬＶＤＫＹＤＬＳＮＬＨＥＩＡＳＧＧＡＰＬＡＫＥＶＧＥＡＶＡＫＲＦＫＬＰＧＩＲＱＧＹＧＬＴＥＴＴＳＡＶＩＩＴＰＥＧＤＤＫＰＧＡＣＧＫＶＶＰＦＦＳＡＫＩＶＤＬＤＴＳＫＴＬＧＶＮＱＲＧＥＬＣＬＫＧＰＭＩＭＫＧＹＶＮＮＰＥＡＴＮＡＬＩＤＫＤＧＷＬＨＳＧＤＩＡＹＹＤＫＤＧＨＦＦＩＶＤＲＬＫＳＬＩＫＹＫＧＹＱＶＰＰＡＥＬＥＳＩＬＬＱＨＰＦＩＦＤＡＧＶＡＧＩＰＤＡＤＡＧＥＬＰＡＡＶＶＶＬＥＥＧＫＴＭＴＥＱＥＶＭＤＹＶＡＧＱＶＴＡＳＫＲＬＲＧＧＶＫＦＶＤＥＶＰＫＧＬＴＧＫＩＤＳＲＫＩＲＥＭＬＴＭＧＫＫＳＫＬ（配列番号１）。
【００１８】
なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＭＹＲＦＥＥＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹＫＩＱＳＡＬＬＶＰＴＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬＶＤＫＹＤＬＳＮＬＨＥＩＡＳＧＧＡＰＬＡＫ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から２６６番目から３２２番目のアミノ酸配列と同一である。また、配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＭＹＲＦＥＥＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹＫＩＱ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から２６６番目から２８４番目のアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列と同一である。さらに、配列番号４に示されるアミノ酸配列（ＡＬＬＶＰＴＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬＶＤＫＹＤＬＳＮＬＨＥＩＡＳＧＧＡＰＬＡＫ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から２８６番目から３２２番目のアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列と同一である。
【００１９】
第１実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列に含まれる部分配列は、野生型ルシフェラーゼの配列番号２に示されるアミノ酸配列に対応しているものの、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸に変異している。すなわち、この部分配列のうち、Ｎ末端側から１番目から１９番目のアミノ酸配列は配列番号３に示されるアミノ酸配列であり、Ｎ末端側から２０番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、Ｎ末端側から２１番目から５７番目のアミノ酸配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列である。
【００２０】
部分配列のＮ末端側から２０番目のアミノ酸は、セリン以外の任意のアミノ酸とすることができる。例えば、この２０番目のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）である（括弧内のアルファベットはそれぞれのアミノ酸の一文字略号である。以下、同様）。特に、２０番目のアミノ酸の例は、スレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）またはイソロイシン（Ｉ）である。また、２０番目のアミノ酸の別の例は、修飾されたアミノ酸である。
【００２１】
第１実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、部分配列以外の配列において、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と完全に一致していなくてもよい。すなわち、第１実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、上述したように、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して変異が生じたものであってよい。
【００２２】
第１実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒される発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼによる発光とは異なる発光スペクトルを示す。ここにおいて、比較対象となるルシフェラーゼとは、第１実施形態に係るルシフェラーゼの部分配列のＮ末端側から２０番目のアミノ酸をセリンに置換されているアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。すなわち、第１実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較対象となるルシフェラーゼのアミノ酸配列とは、この２０番目のアミノ酸のみが異なる。
【００２３】
特に、第１実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒されるｐＨ７付近の環境下での発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼを用いた場合に生じる発光とは異なる最大発光波長を示す。好ましくは、これらの発光が異なる色として区別できる程度に、互いの最大発光波長は異なる。なお、ｐＨ７付近とは、生体内の主要な領域において検出されるｐＨを意味し、例えばｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲を意味する。実施形態に係るルシフェラーゼは、生体内の種々の領域においてｐＨが変動したとしても、ｐＨ７付近において示す特性を維持するものであってよい。
【００２４】
第１実施形態に係るルシフェラーゼは、既知の手法によって作製することができる。例えば、一般的な変異導入方法を用いて、野生型のルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を改変し、第１実施形態に係るルシフェラーゼの遺伝子を取得できる。さらに、この遺伝子を細胞に導入し、細胞内で第１実施形態に係るルシフェラーゼを発現させることができる。第１実施形態に係るルシフェラーゼは、その他のタンパク質と融合した状態で細胞内に発現させることもできる。
【００２５】
本発明の第２実施形態はルシフェラーゼに関する。
【００２６】
本発明の第２実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくともＮ末端側から２８５番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、少なくともｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記２８５番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【００２７】
第２実施形態に係るルシフェラーゼは、第１実施形態に係るルシフェラーゼと同様に、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼである。
【００２８】
第２実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）と比較した場合、少なくともＮ末端側から２８５番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸となっている。この２８５番目のアミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）である。特に、２８５番目のアミノ酸の例は、スレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）またはイソロイシン（Ｉ）である。また、２８５番目のアミノ酸の別の例は、修飾されたアミノ酸である。
【００２９】
第２実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で、２８５番目のアミノ酸だけでなく、それ以外のアミノ酸も異なっていてもよい。
【００３０】
第２実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒される発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼによる発光とは異なる発光スペクトルを示す。ここにおいて、比較対象となるルシフェラーゼとは、第２実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のアミノ酸をセリンに置換したアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。すなわち、第２実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較対象となるルシフェラーゼのアミノ酸配列とは、この２８５番目のアミノ酸のみが異なる。
【００３１】
特に、第２実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒されるｐＨ７付近の環境下での発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼを用いた場合に生じる発光とは異なる最大発光波長を示す。好ましくは、これらの発光が異なる色として区別できる程度に、互いの最大発光波長は異なる。なお、ｐＨ７付近とは、生体内の主要な領域において検出されるｐＨを意味し、例えばｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲を意味する。実施形態に係るルシフェラーゼは、生体内の種々の領域においてｐＨが変動したとしても、ｐＨ７付近において示す特性を維持するものであってよい。
【００３２】
第２実施形態に係るルシフェラーゼは、第１実施形態に係るルシフェラーゼと同様に、既知の手法によって作製することができる。
【００３３】
第１および第２実施形態に係るルシフェラーゼにおいて、ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長は、５５７から６１８ｎｍであってよい。さらに、第１および第２実施形態に係るルシフェラーゼにおいて、ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長は、６００から６１８ｎｍであってよい。
【００３４】
第１実施形態に係るルシフェラーゼを利用して、部分配列のＮ末端側から２０番目のアミノ酸が互いに異なる複数の第１実施形態に係るルシフェラーゼから成るルシフェラーゼのセットを構成することができる。また、第２実施形態に係るルシフェラーゼを利用して、そのアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のアミノ酸が互いに異なる複数の第２実施形態に係るルシフェラーゼから成るルシフェラーゼのセットを構成することができる。
【００３５】
第１実施形態または第２実施形態に係るルシフェラーゼによれば、わずか１つのアミノ酸の置換により発光の色を変化させることができる。このような１つのアミノ酸の置換により得られる、互いに発光の色が異なる複数のルシフェラーゼは、互いに１つのアミノ酸しか違わないため、立体構造といったタンパク質の特性に殆ど差がでない。そのため、これらのルシフェラーゼを同一の条件の下で使用することが可能となり、それぞれから得られた結果を直接比較することも可能となる。また、これらのルシフェラーゼに対して、単一のルシフェリンを使用することができるため、これらのルシフェラーゼを単一の被験試料中に同時に発現させることができ、同時に測定することが可能となる。
【００３６】
本発明の第３実施形態は核酸に関する。
【００３７】
第３実施形態に係る核酸は、第１または第２実施形態に係るルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。第３実施形態に係る核酸は、プロモーターといった転写制御のための因子が結合する領域をさらに含んでよい。第３実施形態に係る核酸は、第１または第２実施形態に係るルシフェラーゼとは異なるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでよい。この場合、この異なるタンパク質とルシフェラーゼとが融合した状態で発現されるように、ルシフェラーゼの遺伝子とこの異なるタンパク質の遺伝子とが核酸上に配置されている。
【００３８】
本発明の第４実施形態はベクターに関する。
【００３９】
第４実施形態に係るベクターは、第３実施形態に係る核酸を含む。第４実施形態に係るベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
【００４０】
第３実施形態に係る核酸によれば、第１または第２実施形態に係るルシフェラーゼを遺伝子の形で保存することができる。さらに、第４実施形態に係るベクターによれば、このような遺伝子を生物に対して容易に導入することができる。
【００４１】
本発明の第５実施形態は被験試料を分析する方法に関する。
【００４２】
第５実施形態に係る方法は、ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が５５７ｎｍ以上且つ５７０ｎｍ未満である請求項１または２に記載のルシフェラーゼ、ｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が５７０ｎｍ以上且つ６００ｎｍ未満である請求項１または２に記載のルシフェラーゼ、およびｐＨ７付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が６００ｎｍ以上且つ６１８ｎｍ以下である請求項１または２に記載のルシフェラーゼから成る群から選択される少なくとも２つのルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出することを含む。
【００４３】
被験試料は、種々の生物であってよい。被験試料は、例えば、細胞、組織または個体である。細胞は、例えば哺乳類の細胞であってよい。被験試料へのルシフェラーゼの導入は、既知の方法により行うことができる。例えば、ルシフェラーゼの遺伝子を被験試料に導入して、遺伝子を発現させることができる。少なくとも２つのルシフェラーゼは被験試料中に同時に存在してもよく、またはそれぞれのルシフェラーゼが被験試料中に存在する時間がずれていてもよい。
【００４４】
ルシフェリンの投与は既知の方法により行うことができる。例えば、被験試料が培養細胞である場合には、培養液中にルシフェリンを投与することができる。あるいは、マイクロマニュピレーション法により被験試料中に直接ルシフェリンを投与してもよい。ルシフェリンは、任意のタイミングで投与することができる。被験試料に対して、単一のルシフェリンを投与することができる。
【００４５】
発光の検出は経時的に行うことができる。発光の検出は、既知の方法により行うことができる。例えば、光電子倍増管を用いて、光子の量を定量することができる。あるいは、光学的結像手段を用いて行うことができる。光学的結像手段は、特定の波長を有した光を選択的に捉える手段を備えてよい。また、光学的結像手段は、検出した画像を電子データに変換するための撮像素子を備えてよい。光学的結像手段の例は蛍光顕微鏡である。また別の例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社）である。
【００４６】
第５実施形態に係る方法で使用される３種のルシフェラーゼは、互いに区別可能な色を有した発光をそれぞれ生じさせる。したがって、第５実施形態に係る方法によれば、単一の被験試料から複数の異なる発光を検出することが可能となる。また、いずれのルシフェラーゼについても単一のルシフェリンによって発光を生じさせることができるため、操作が容易となるだけでなく、条件のそろった精度の高い観察が可能となる。
【００４７】
本発明の第６実施形態は、タンパク質間の相互作用を観察する方法に関する。
【００４８】
第６実施形態に係る方法は、少なくとも２種以上の融合タンパク質を含む被験試料を用意すること、被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および被験試料から放射される発光を検出することを含む。
【００４９】
被験試料に含まれる融合タンパク質の１つは、第１または第２実施形態に係るルシフェラーゼの断片Ａと任意のタンパク質Ｘとから成る。便宜的にこの融合タンパク質をＡ−Ｘと呼ぶ。残る融合タンパク質は、第１または第２実施形態に係るルシフェラーゼの断片Ｂｎと任意のタンパク質Ｙｎとから成る。便宜的にこの融合タンパク質をＢｎ−Ｙｎと呼ぶ。
【００５０】
ここで、ｎは任意の整数であり、被験対象に発現する融合タンパク質の種類の数から１を引いた値である。例えば、被験対象が３種の融合タンパク質を発現する場合、ｎは２となる。この場合、３種の融合タンパク質のうちの１種はＡ−Ｘであり、その他の２種はＢ１−Ｘ１およびＢ２−Ｘ２である。
【００５１】
断片Ａは、例えばルシフェラーゼのＮ末端側断片であり、断片Ｂｎはその残りとなるＣ末端側断片である。あるいは、断片Ａは、例えばルシフェラーゼのＣ末端側断片であり、断片Ｂｎはその残りとなるＮ末端側断片である。いずれの断片も、全長ルシフェラーゼが本来有する酵素活性を失っている。
【００５２】
ここで、第１実施形態に係るルシフェラーゼの部分配列のＮ末端側から２０番目のアミノ酸および第２実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のアミノ酸を、便宜的に、ともに「置換アミノ酸」と呼ぶ場合、断片Ｂｎは必ずこの置換アミノ酸を含む。一方、断片Ａはこの置換アミノ酸を含まない。そして、ｎが３以上である場合、すなわち、Ｂｎ−Ｙｎが被験試料中に複数種存在する場合、融合タンパク質中の置換アミノ酸のアミノ酸の種類は互いに異なる。
【００５３】
ルシフェリンの投与は、第５実施形態に係る方法と同様に行うことができる。
【００５４】
発光の検出は、第５実施形態に係る方法と同様に行うことができる。但し、第６実施形態に係る方法では、ｎが３以上である場合、発光の色が何であるかの判断が行われる。すなわち、発光の最大発光波長が特定される。
【００５５】
第６実施形態に係る方法では、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙｎとが相互作用した場合、それぞれに融合している断片Ａと断片Ｂｎとが接近し、ルシフェラーゼの酵素活性が復活する。このとき、付近にルシフェリンが存在していれば、ルシフェラーゼの触媒作用によりルシフェリンが酸化され、発光が生じる。この発光に基づいて、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙｎとの相互作用を確認することができる。
【００５６】
さらに、ｎが３以上であり、被験試料中に融合タンパク質Ｂｎ−Ｙｎが複数種存在する場合には、Ｂｎに応じて生じる発光の色が異なるため、発光の色に基づいて、タンパク質Ｘに対して、どのタンパク質Ｙｎが結合したかを判定することができる。
【００５７】
また、光学的結像手段を用いて被験試料を観察することで、タンパク質同士の局所的な相互作用を調べることができる。さらに、経時的に観察することで、相互作用の変動を調べることができる。
【実施例】
【００５８】
（１）野生型ルシフェラーゼ遺伝子の取得
特開２０１１−１６７０７９号に開示される方法に倣って、野生型ルシフェラーゼ遺伝子を取得した。すなわち、オキナワマドボタルから作製した完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、適宜設定したプライマーセットを用いてＰＣＲ法により野生型ルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした。
【００５９】
完全長ｃＤＮＡライブラリーは次のようにして取得した。沖縄県沖縄本島で採集したオキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）の幼虫から発光器を採取し、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）とともに入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着して、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製した後、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）を使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。
【００６０】
プライマーセットは、オキナワマドボタルに由来する野生型ルシフェラーゼの遺伝子（配列番号５）に基づいて適宜作製した。ＰＣＲ法によって増幅された遺伝子を含む核酸をベクターに挿入した。以下に、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す：
ATGGAAGATGATCATAAAAATATTGTGCACGGTCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAGGAGGGAACTGCTGGAGAACAATTGCACAGAGCGATGAAGAGGTATGCACAGGTTCCAGGGACAATTGCTTTTACTGATGCACACGTAGAGGTAAACATTACATATTCCGAATATTTTGAAATGGCTTGCCGATTGGCCGAAACTATGAAGAGGTACGGACTTGGTTTGCAACACCACATTGCTGTTTGTAGTGAAAATTCTCTTCAGTTTTTTATGCCTGTATGCGGTGCTCTATTTATTGGGGTTGGAGTTGCACCAACAAATGATATTTACAATGAACGTGAATTATACAACAGTTTGTCCATATCACAACCTACAATAGTATTTTGTTCCAAAAGAGCTCTGCAAAAAATTCTAGGAGTACAAAAGAAATTACCTGTAATTGAGAAAATTGTTATTCTGGATTCTCGAGAGGATTATATGGGGAAACAATCTATGTACTCGTTCATTGAATCTCATTTACCTGCCGGTTTTAATGAATATGATTACGTACCGGATACTTTTGATCGCGAAACAGCAACAGCACTTATAATGAATTCATCAGGATCTACTGGATTGCCCAAGGGTGTTGAGCTTACTCACAAAAATGTTTGTGTTAGATTTTCTCACTGCAGAGATCCTGTGTTTGGTAATCAAATTATTCCCGATACTGCGATTTTAACAGTTATACCATTTCATCATGGTTTTGGAATGTTTACAACACTAGGATACTTAACGTGTGGATTTCGTATTGTGCTTATGTATAGATTTGAAGAGGAATTATTTTTACGATCACTTCAAGATTATAAAATTCAAAGTGCGTTGTTGGTACCAACCCTATTTTCATTCTTTGCCAAAAGCACCTTAGTCGACAAATACGATTTATCCAACTTACATGAAATTGCATCTGGTGGAGCTCCCCTCGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCCGTAGCAAAACGTTTTAAGCTGCCGGGTATACGACAAGGGTACGGACTTACCGAAACTACCTCAGCTGTTATAATTACACCAGAAGGGGATGATAAACCAGGAGCATGTGGTAAAGTTGTTCCATTCTTTTCTGCCAAAATTGTTGATCTCGATACAAGCAAAACTTTGGGTGTTAATCAGCGAGGGGAATTATGTCTGAAAGGTCCAATGATAATGAAGGGTTACGTAAACAATCCAGAAGCAACAAATGCATTGATAGACAAAGATGGATGGTTACACTCTGGTGACATAGCTTACTATGACAAAGATGGTCATTTCTTCATAGTGGATCGTTTGAAATCGTTAATTAAATACAAAGGTTACCAGGTACCACCTGCCGAATTAGAATCGATATTGCTGCAACATCCCTTCATATTTGATGCAGGTGTTGCAGGAATTCCCGACGCAGATGCCGGTGAACTTCCTGCAGCCGTTGTTGTCTTAGAGGAAGGTAAAACGATGACTGAACAAGAAGTGATGGATTATGTTGCGGGACAAGTAACTGCTTCTAAACGTTTACGTGGAGGAGTTAAGTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTAACTGGAAAGATTGATTCAAGAAAAATCAGGGAAATGCTTACGATGGGAAAAAAATCCAAATTGTAA（配列番号５）。
【００６１】
（２）変異型ルシフェラーゼ遺伝子の作製
取得された野生型ルシフェラーゼ遺伝子に対して変異を導入し、変異型ルシフェラーゼ遺伝子を作製した。この変異は、アミノ酸配列のＮ末端側から２８５番目のセリンが、セリン以外の種々のアミノ酸に置換されるような変異であった。
【００６２】
変異の導入は、一般的な部位特異的突然変異導入法により行った。２８５番目のセリンを、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）に置換するための変異導入用オリゴヌクレオチドをそれぞれ作製し、変異導入のために用いた。具体的には、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に記載される方法に倣って行った。
【００６３】
作製された１９個の変異型ルシフェラーゼ遺伝子および野生型ルシフェラーゼ遺伝子を、それぞれ発現用ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに挿入した。
【００６４】
（３）大腸菌におけるルシフェラーゼの発現
上記の通り作製した２０種の発現用ベクターを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にそれぞれ形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを培養し、ＬＢ寒天培地に塗布し、２４時間かけて再度コロニーを形成させた。そして、５５℃で１時間熱処理し、１時間室温で放置した後に、０．５ｍＭのＤ−ルシフェリンを含む液体を噴霧した後、ＣＣＤカメラ（ＤＰ７０、オリンパス製）で１分間撮影した。
【００６５】
取得された画像を図１（ａ）に示す。但し、この図に含まれる画像は、カラーにて取得された画像をモノクロに変換したものである。それぞれの大腸菌の左上には、２８５番目のアミノ酸をどのアミノ酸に置換したかが記載されており、例えば「Ｓ２８５Ｎ」と付された大腸菌は、２８５番目のアミノ酸がセリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）に置換されたルシフェラーゼを発現する大腸菌である。なお、「Ｓ２８５Ｓ」と付された大腸菌は、２８５番目のアミノ酸がセリン（Ｓ）のままであることを意味しており、すなわち、この大腸菌は野生型ルシフェラーゼを発現する。
【００６６】
取得されたカラーの画像から、野生型ルシフェラーゼを発現するＳ２８５Ｓでは、菌体が緑色に発光することがわかる。一方、変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌では、菌体が種々の色で発光していることがわかる。例えば、２８５番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたＳ２８５Ｔでは菌体が黄色に発光しており、リジンに置換されたＳ２８５Ｋでは菌体がオレンジ色に発光しており、イソロイシンに置換されたＳ２８５Ｉでは菌体が赤色に発光していることがわかる。
【００６７】
（４）ルシフェラーゼの精製
上記２０種のルシフェラーゼの各々を、それらが発現する大腸菌から抽出した。
【００６８】
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収した。菌体は、２００μｌのB-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に再度懸濁し、マニュアルに従って破砕およびルシフェラーゼを含む上清を抽出した。
【００６９】
（５）発光スペクトルの測定
抽出したルシフェラーゼに各々ついて、インビトロで発光スペクトルを測定した。最終濃度２ｍＭとなるようにＤ−ルシフェリンを加えた後、発光スペクトルを測定した。測定には、ＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用いた。
【００７０】
測定した結果を図２から６に示した。図２には、「Ｓ２８５Ｗ」、「Ｓ２８５Ｐ」および「Ｓ２８５Ｄ」以外の発光スペクトルを示した。なお、参考のために、「２５℃」および「３７℃」として、それぞれの温度においてコメツキムシ由来のルシフェラーゼを使用した場合に得られる発光スペクトルを示した。個々のスペクトルを確認し易くすることを目的として、図３から６には、図２に示された発光スペクトルを４から５個ずつに分けてそれぞれ示した。また、図１（ｂ）の表には、それぞれのルシフェラーゼの最大発光波長をまとめた。図２から６から、変異型ルシフェラーゼは、それぞれ野生型ルシフェラーゼとは異なる発光スペクトルを示すことがわかる。
【００７１】
以上の結果から、２８５番目のセリンを置換するだけで、種々の発光スペクトルを有するルシフェラーゼを取得できることが示された。
【図１】
2014018191.tif 000003
【図２】
2014018191.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014018191.tif 000008
【配列表】
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