(57)【要約】【課題】生物学的に活性なペプチドを含有する錯体の組成物、このような組成物の調合物及び使用法を提供する。【解決手段】本発明は、一群の新規な長期作用性バソプレッシン類似体、それらの調合物や、これらの化合物を用いて、血液量減少及び血圧低下状況における多様な臓器への血流を増加させたり、血液中の第ＶＩＩＩ因子及びプラスミノーゲン活性化因子のレベルを増加させたりするための処置法に関する。より具体的には、本発明は、バソプレッシンと、活性バソプレッシン又はバソプレッシン誘導体の徐放により働くと考えられる当該ポリペプチドの長期作用性類似体を生じるように結合性部分を共有結合させる修飾を施してある、バソプレッシンの生物学的に活性なポリペプチド誘導体とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、引用をもってその全文をここに援用することとする、２００７年８月３日出願の米国仮出願ＮＯ．６０／９５３，７８９号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦支援研究に関する宣言
本発明は部分的にナショナル・インスティテュート・オブ・ダイアビーティス・アンド・ダイジェスティブ・アンド・キドゥニー・ディジージズ(NIDDK)により付与される5R43DK069727の番号による政府支援を受けてなされた。合衆国政府はここに提供する主題について何らかの権利を有するであろう。
【背景技術】
【０００３】
生理学的に活性なペプチド及びたんぱく質並びに他の治療薬及び物質を投与するための新規な調合物及び送達系の開発は、これらのペプチド又はたんぱく質あるいは他の物質を提供して所望の生理学的効果を挙げる必要性に惹起されている。ペプチド及びたんぱく質に関しては、それらの多くは全身循環を通じて送達されねばならない。加えて、分子量の小さいペプチド及びたんぱく質は、腎臓により全身循環から効率的に取り除かれてしまうために、生物学的半減期が短い傾向にある。例えば、これらのペプチド及びたんぱく質の中には、単球／マクロファージによる認識や、あるいは補体成分によるオプソニン化を原因として、細網内細胞取り込みを通じて取り除かれるものもある。また多くのペプチド及びたんぱく質は、たんぱく質分解（ペプチド結合切断）が原因でinvivoでのそれらの活性を失うこともある。
【０００４】
ある部分ではこれらの望ましくない効果を避けるためには薬物送達系を用いてもよい。In vivoでのペプチド及びたんぱく質送達で有用であろういくつかの薬物送達戦略がある。第一に、ポンプを通じて薬物の連続全身輸注を用いることができる。この戦略は臨床の実際で効率的あることが立証されてはいるが、高レベルに可動性を要する外来患者には実際的でないことがあり、クオリティ・オブ・ライフの欠点や、潜在的静脈（I.V.）線感染が伴うこともある。このように、頻繁かつ反復的な投与又は輸注の必要を減らすために、半減期の長いペプチドを投与するための優れた組成物及び調合物が求められている。
【０００５】
肝硬変は過剰なアルコール消費又は肝炎によくある結果であり、生命を脅かす合併症につながる。肝硬変及びタイプＩ肝腎症候群（HRS）患者においては、門静脈高血圧を原因とする内臓血管拡張は、腎不全への進行において重要な役割を果たす。バソプレッシン・アゴニスト又はアルファ-1-アドレナリン作動性受容体アゴニストなどの内臓及び全身の血管収縮薬はタイプＩHRS患者において腎機能を向上させることができる。研究では更に、血管収縮薬の投与は、限定はしないが（１）タイプ２HRSにおける腎不全；（２）食道静脈瘤；（３）穿刺術誘導性循環機能不全；（４）細菌の副産物により誘導される動脈低血圧、（５）麻酔関連低血圧、（６）心臓停止、及び（７）産後出血に関与する血管拡張をターゲットとする、将来性ある治療アプローチであることが示されている。これらの条件下では、長期作用性のバソプレッシンなどの長期作用性血管収縮薬が患者にとっては有益であろう。
【０００６】
HRSは、進行した肝硬変及び肝不全や重篤な洞様毛細血管門脈高血圧のある患者における腎不全を特徴とする。HRSにはタイプ１及びタイプ２という二つの種類がある。タイプ１は、血清クレアチニンが２週間未満の間に倍増して2.5mg/dL (221uM)を越え、中間生存期間が１．７週という、腎機能の急速な悪化を特徴とする。タイプ２は安定又はゆっくりと進行する腎機能不全を特徴とし、その中間生存期間は６ヶ月である。腹水のある肝硬変患者においてHRSが発生する確率は１年目では１９％であるが、５年目には３９％まで増加する。
【０００７】
食道静脈瘤出血（EVH）は、肝硬変を原因とする門脈高血圧の合併症である。EVHは上部消化管出血の６−１２％を示す(Longstreth GF, et al.Am J Gastroenterol 1995； 90(2):206-210 ； Wilcox CM, et al. Southern MedicalJournal 1999；92(1):44-50； Sorbi D, et al. Am J Gastroenterol 2003；98(11):2424-2434)。AGGガイドライン（1997）によるEVHの処置は、例えばバソプレッシン又はその類似体など、血管作動性の治療薬と組合せた内視鏡処置（結紮又は硬化療法）である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本開示は、生物学的に活性なペプチドを含有する錯体の組成物、このような組成物の調合物及び使用法を提供するものである。部分的には、本発明は、生物学的に活性なペプチド及びたんぱく質を送達すると共にそのinvivoでの半減期を延長するように構成された、患者への投与用のペプチド錯体に関する。
【０００９】
本発明のある実施態様は、一群の新規な長期作用性バソプレッシン類似体、それらの調合物や、これらの化合物を用いて、血液量減少及び血圧低下状況における多様な臓器への血流を増加させたり、血液中の第ＶＩＩＩ因子及びプラスミノーゲン活性化因子のレベルを増加させたりするための処置法に関する。より具体的には、本発明は、バソプレッシンと、活性バソプレッシン又はバソプレッシン誘導体の徐放により働くと考えられる当該ポリペプチドの長期作用性類似体を生じるように結合性部分を共有結合させる修飾を施してある、バソプレッシンの生物学的に活性なポリペプチド誘導体とに関する。更に、本発明のバソプレッシン類似体をこのように修飾したことで、血液中への類似体の徐放や、バソプレッシン中へのそれらの活性化に向けて、この類似体を疎水性含有担体ポリマに装薬することが可能になる。本発明の別の局面では、バソプレッシン類似体はミセルを形成するために充分な疎水性鎖を含有するため、さらにゆっくりとした活性化やより長期間の徐放又は半減期が得られている。本開示はまた、血液中へ本類似体をゆっくりと放出させるために金属キレート含有ポリマ担体に装薬することができ、また必要であれば放出後のそれらの活性化を可能にする、本発明の類似体の修飾も提供するものである。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、ペプチドのカルボキシル又はアミノ末端に付着させた、脂肪酸などのキレート基又はアルキル基を持つペプチドや、それらの調合物及びこれらのペプチドを用いた処置法に関するものである。ある具体的な例では、本発明はGLP-1(7-36)及びGLP-1(7-37) の類似体に関し、この場合のカルボキシル末端はニトリロ三酢酸又はイミド二酢酸で修飾されることで、GLP-1 は、金属イオン、好ましくはZn又はCu、を含有する担体に非共有結合的に繋がれることとなる。更に、本発明のGLP-1類似体では、当該の類似体を、血液中にゆっくりと放出させるために、疎水性かつ金属イオン含有性のポリマに装薬することができる。長期作用性のGLP類似体は、糖尿病及び心臓血管疾患の処置に特に有用である。更に、当該ペプチドをアミノ又はカルボキシル末端でニトリロ三酢酸又はイミド二酢酸を付着させる修飾を施すことにより、血液中への当該類似体の徐放や、必要であれば放出後のプロテアーゼによるそれらの活性化に向けて、本発明のペプチド類似体を金属キレート含有ポリマ担体に装薬することができるようになる。
【００１１】
バソプレッシン・アゴニストは内臓及び全身の血管収縮を誘導することで血行力学的平衡を回復し、臓器の血流を増すために治療的に用いられる。しかし、バソプレッシンの使用は、その半減期が２４分間と短く、輸注又は反復的かつ頻繁の注射により投与する必要があるという制限がある。長期作用性の合成バソプレッシン類似体は、バソプレッシンの低分泌を特徴とする状態や、（フォン・ウィルブランド病のいくつかの形における）出血、小児による過度の夜尿症や食道静脈瘤において有用である(Barettet al., Gastroenterology 1970；58:926)。理想的には、大変長期作用性のバソプレッシン・アゴニストを１日に１回投与するというのが、継続的な輸注又は１日に２回の投与に比較して、肝臓移植を待つ患者の延命には有用であろう。本発明は、血液中でゆっくりと活性化して、可能性としては１日に１回、２日毎に１回、３乃至６日毎に１回、又は更に１週間に一回、投与することのできるバソプレッシン類似体に関する。これは、高用量の例えばドーパミン又はノルエピネフリンなどのイノトロープに応答しない敗血症ショック患者の管理のための二次処置として理想的であろう。非収縮性心臓停止においてバソプレッシン類似体はエピネフリンよりも有効であることが示されている(WenzelV, et al. A Comparison of Vasopressin and Epinephrine for Out-of-HospitalCardiopulmonary Resuscitation. N Engl J Med 2004；350:105-13)。全ての研究が一致するわけではないが、院外心臓停止の２００６年研究が、この状況下でのバソプレッシン及びその類似体の優位性の証拠に加えられている(Crit Care. 2006 Feb；10(1):R13 (CritCare. 2006 Feb；10(1):R13)。この有効性は更に、バソプレッシン類似体が今日存在するものよりも長期作用性である場合には更に増強されるであろう。
【００１２】
本発明におけるバソプレッシン類似体はまた、例えば麻酔関連低血圧、不応性敗血症ショック、非収縮性心臓停止、気管支鏡関連出血、火傷移植関連出血、子宮頚の集落形成（子宮頚の新生物形成の場合）関連出血、労働関連血液喪失など、肝臓疾患の関連しない障害にも用いることができる。
【００１３】
本発明の実施態様の一つは、類似体としては生物学的に活性であっても、又は活性でなくともよい生物学的に活性なペプチドの脂肪酸含有類似体であり、これは生物学的流体内では内因性酵素により脂肪酸含有部分の除去により容易に活性化することができる。ここで用いられる場合のペプチドという用語は、１００個未満のアミノ酸のポリマを意味する。更に、本発明の類似体を選択的には、疎水性基を連結させることで、生物学的流体内においてその後の脂肪酸含有部分の活性化又は除去に向けて当該ペプチド類似体を徐放可能にする、保護性のポリマ又は非ポリマ製担体のコアを含有する担体に装薬することができる。疎水性基を含有する保護性ポリマ担体を含むポリマ担体の一例は、引用をもってここに援用することとする米国特許出願第11/613,183号に解説されている。この装薬は、更に、脂肪酸含有部分の活性化又は除去あるいはその分解を遅らせることで、長期間にわたって生物学的流体内で持続的なレベルのペプチド活性を提供できるようにするものである。加えて、ペプチド又はその類似体を脂肪酸で修飾すると、生物学的流体中での当該類似体の活性化及び分解を遅らせると共に、おそらくは血中での活性化も遅らせることのできるミセルを形成することができる。本発明の別の実施態様では、ペプチドを修飾してキレート分子を含有させることで、配位により固定又はキレートさせた金属イオンを持つポリマ担体への装薬が容易となり、こうして生物学的流体中での当該ペプチドの放出と、それに続く活性化又は分化が鈍化するであろう。ここで用いられる場合の装薬という用語は、引用をもってここに援用することとする米国特許番号第7,138,105B2号に記載されたように、金属の架橋を含む担体へのペプチドの可逆的付着を意味する。
【００１４】
我々は、出血性の食道静脈瘤のコントロールに以前用いられていた合成ペプチドであるバソプレッシンの脂肪酸含有類似体が血清中では容易に活性化し得ることを見出した。更に、本発明のバソプレッシン類似体は、疎水性基を含有する保護性ポリマナノ担体に投薬することができる。この装薬は、活性バソプレッシンへの活性化を鈍化させることで、生物学的流体中におけるバソプレッシンのレベルを長期間にわたって維持することができる。加えて、バソプレッシン類似体であるテルリプレッシンを脂肪酸で修飾すると、生物学的流体中での当該類似体の活性化を遅らせ、そして潜在的には血中での活性化も遅らせることができるミセルを形成することができる。
【００１５】
バソプレッシン又は他のペプチドのヒスチジン−、イミノ二酢酸−、又はニトリロ二酢酸−含有類似体も、プロテアーゼにより生物学的流体中で容易に活性化させることができ、あるいはこれらは自己活性化性である場合もある。更に、本発明のバソプレッシン類似体を、キレートされた金属を含有する保護性ポリマ製又は非ポリマ製のナノ担体に装薬することができる。この装薬により、バソプレッシンのヒスチジン含有類似体の活性バソプレッシンへの転化を遅らせることができ、また生物学的流体中でのバソプレッシンのレベルを長期間にわたって維持することができる。
【００１６】
本発明は一般式：A-(Cm)x-ペプチド又はペプチド-(Cm)x-Aを有するペプチド類似体に関し、但しこの場合、式中においてペプチドの左側はN末端であり、そして右側はC末端であり；CmはGly、Ala、Arg、Lys、式(N)q-Argの部分（但しこの場合の N はいずれかのアミノ酸であり、q は0 又は 1である）、あるいは式(N)q-Lys（但しこの場合のN はいずれかのアミノ酸であり、そしてq は 0 又は 1である）の部分であり、そして x は０乃至６の整数であり；A は６乃至３６個の炭素を有するアルキル基を含有するいずれかの化学基又は部分、ニトリロ三酢酸基、イミド二酢酸基、又は式 (ZyHisw)p（但し式中、Zはヒスチジン以外のアミノ酸残基であり、His はヒスチジンであり、yは０乃至６の整数であり、wは１乃至６の整数であり、pは１乃至６の整数であり、そしてxは２乃至６の整数である）の部分であってよい。該ペプチドは５乃至１００個のアミノ酸のいずれかの配列又は鎖であってもよい。該鎖内のアミノ酸は２０個の天然発生型アミノ酸又はそれらの誘導体のいずれの組合せでもよい。
【００１７】
更に本発明は、一般式：A-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-D(SEQ ID NO: 1)を有するバソプレッシン類似体にも関し、但しこの場合、式中においてAは、３乃至３６個の炭素ユニットのアルキル基を含有する化学基又は部分、ニトリロ三酢酸基、イミド二酢酸基、又は(His)x 基（但しこの場合のxは２乃至６の整数であり；Gly はグリシンであり；Cys はシスチン又はシステインであり；Tyrはチロシンであり；Phe はフェニルアラニンであり；Gln はグルタミンであり；Asnはアスパラギンであり；Proはプロリンであり；Bはリジン又はアルギニンであり；C is グリシン又は又はアラニンであり；Dは NH2 又は Hである）である。
【００１８】
上記の組成物の別の実施態様では、A は式CH3(CH2)n-CO-の直鎖状アルキル基を含有する基であり、但しこの場合のnは４乃至３４の整数である。上記の組成物の別の実施態様では、Aは６乃至３６個の炭素ユニットを持つ分枝状アルキルカルボニル基である。上記の組成物の別の実施態様では、A はHis)x-であり、但しこの場合のxは２乃至６の整数である。
【００１９】
Aがアルキル基を含有する上記の組成物においては、当該組成物は、いずれのポリマ担体の非存在下でもバソプレッシン類似体の活性化及び分解を遅らせるであろうミセルを形成することができることが理解される。
【００２０】
本発明は、疎水性基を持つポリマ担体、あるいは、金属結合ドメイン及びキレートされた金属を共有結合させたポリマ担体、を更に含む上記の組成物にも関する。本発明の目的は、バソプレッシン類似体のヒスチジン部分、ニトリロ三酢酸又はイミド二酢酸部分を、このヒスチジン、ニトリロ三酢酸又はイミド二酢酸と、当該ポリマ担体にキレートされた金属との間の配位結合によりポリマ担体の金属結合ドメインにキレートされた金属に付着させることである。更に本発明の目的は、バソプレッシン類似体のアルキル部分を、当該ポリマ担体の疎水性部分に非共有結合的に付着させることでもある。これらの付着は、invivoにおいて急速な分解から当該類似体を保護するであろうが、バソプレッシン類似体を活性化に向けて循環中への徐放は可能とするであろう。基本的には、本ポリマ担体は、担体に対する当該バソプレッシン類似体の解離定数（Kd）に応じて該類似体を放出することとなる、この類似体にとっての貯蔵庫として作用するであろう。１）それが活性化するプロテアーゼにより、又は２）その生理的受容体により、未結合の類似体量が使い切られるにつれ、より多くの類似体が更なる活性化又は利用に向けて放出されるであろう。その結果、持続的なレベルのバソプレッシンが、長期間にわたって血中で活性のままとなるであろう。
【００２１】
概略的には、ある局面では、組成物が提供される。本組成物は一般式A-(Cm)x-ペプチドの化合物を含み、但しこの場合、式中において該ペプチドは１００個を越えないアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドであり；Cmは、Gly部分（この場合のxは０乃至６の整数である）又はAla部分（この場合のxは０乃至６の整数である）又はArg部分（この場合のxは０乃至６の整数である）；又はLys 部分（この場合のxは０乃至６の整数である）；あるいは式(N)q-Argの部分（この場合のNはいずれかのアミノ酸であり、そしてqは０又は１であり、そしてxは０乃至６の整数である）；あるいは式(N)q-Lysの部分（この場合のNはいずれかのアミノ酸であり、そしてq は０又は１であり、xは０乃至６の整数であり；そしてAは６乃至３６個の炭素を有するアルキル基であり、そしてxは２乃至６の整数である）；あるいはニトリロ三酢酸部分；イミド二酢酸部分；あるいは式(ZyHisw)pの部分（但しこの場合の式中Zはヒスチジン以外のいずれかのアミノ酸残基であり、His はヒスチジンであり、yは０乃至６の整数であり、wは１乃至６の整数であり、pは１乃至６の整数であり；そしてxは２乃至６の整数である）である。代表的な実施態様では、AはHis6である。いくつかの局面では、本組成物の化合物はCm を含むが、この場合の Cm はGlyであり、そしてA-(Gly)x は当該ペプチドのＮ末端のアミド結合を通じて付着さしている。ある実施態様では、Cmは Gly であり、そしてA-(Gly)x は当該ペプチドに、当該ペプチドのアミノ酸の側鎖を通じて付着している。別の実施態様では、Cm はGlyであり、そしてA-(Gly)x は当該ペプチドに、Ｃ末端のアミド結合を通じて付着している。別の実施態様では、本組成物は A- (Cm)x-ペプチドの一般式を有することができ、但しこの場合の(Cm)xは Gly-Gly-Gly-であり；A- は -Gly-Gly-Gly-のアミノ末端に結合したアミドであり；そしてA-Gly-Gly-Gly- は当該ペプチドのいずれかのアミノ基に結合したアミドである。前述の実施態様の一例においては、当該ペプチドは一般式Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であり、但しこの場合のBは リジン又はアルギニンであり；C はグリシン又はアラニンであり；そしてD はNH2 又はHである。上述の実施態様の別の例では、当該ペプチドはGLP であり、そしてA-(Cm)x- は当該ペプチドのＮ末端に付着していない。更に上述の実施態様には、Aが、式CH3(CH2)n-CO-の直鎖状アルキルカルボニル基（但し式中、nは４乃至３４の整数であり、あるいはnは６又は１０であり、そしてCmが Gly-Gly-Gly である）である組成物も含まれよう。上述の実施態様の別の例では、Aは、カルボニル基の炭素を通じて６乃至３６の炭素ユニットを付着させた分枝状アルキルカルボニル基である。ある実施態様では、当該バソプレッシン類似体はCH3(CH2)6CO-OCH(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2である。別の実施態様では、当該バソプレッシン類似体はHis-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2である。
【００２２】
別の局面では、上述の組成物は更に、６乃至３６個の炭素ユニットの複数のアルキル鎖を持つポリマ担体を含み、但しこの場合、複数のペプチド類似体化合物のアルキルカルボニル基は、疎水性相互作用により、当該ポリマ担体の複数のアルキル鎖に非共有結合的に結合している。別の実施態様では、上述の組成物は更に、共有結合させた金属結合ドメインとキレートさせた金属イオンとを持つポリマ担体を含む。
【００２３】
別の局面では、本組成物はポリマ担体を含むが、前記ポリマ担体は、ポリマのコアと；前記ポリマのコアに共有結合した複数の第一疎水性基と；各々がポリマのコアに共有結合し、ポリマのコアの重量からは独立に約４００乃至２０，０００ダルトンの分子量を有する複数の保護側鎖と；各々が第二疎水性基に共有結合したペプチドを含む複数のペプチド類似体であって、前記第一疎水性基と第二疎水性基との間の疎水性相互作用を通じて前記ポリマ担体に非共有結合的に結合している、ペプチド類似体と、を含む。ある実施態様では、前記ペプチドは、一般式：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であり、但しこの場合のBはリジン又はアルギニンであり、Cは グリシン又はアラニンであり、そしてDはNH2 又は Hである。上述の実施態様では、疎水性基は式CH3(CH2)n-COの直鎖状アルキルカルボニル基であり、但しこの場合のnは４乃至３４の整数である。上述の例示的な実施態様では、当該のバソプレッシン類似体はCH3(CH2)6CO-OCH(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2である。別の実施態様では、上述の組成物のペプチドはGLPである。例示的な実施態様では、上述の組成物のペプチド類似体はGLP-Gly-Gly-Gly（但し式中、Gly-Gly-Gly- は当該ペプチドのＣ末端又は側鎖に付着している）である。
【００２４】
別の局面では、本組成物はポリマ担体を含むが、前記ポリマ担体は、ポリマのコアと；前記ポリマのコアに共有結合した複数の第一キレート基であって、前記第一キレート基が遷移金属イオンに配位結合した第一キレート基と；各々がポリマのコアに共有結合し、ポリマのコアの重量からは独立に約４００乃至２０，０００ダルトンの分子量を有する複数の第一保護側鎖と；各々が第二キレート基に共有結合したペプチドを含む複数のペプチド類似体であって、前記遷移金属イオンへの配位結合を通じて前記ポリマ担体に非共有結合的に結合している、ペプチド類似体と、を含む。ある実施態様では、前記ペプチドは、一般式:Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であり、但しこの場合のBはリジン又はアルギニンであり、Cはグリシン又はアラニンであり、そしてDはNH2 又はHである。ある例示的な実施態様では、前記バソプレッシン類似体は式His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2を有する。別の実施態様では、上述の組成物のペプチドはGLPである。ある例示的な実施態様では、上述の組成物のペプチド類似体はGLP-Gly-Gly-Gly（但し式中、Gly-Gly-Gly-は当該ペプチドのＣ末端又は側鎖に付着している）である。
【００２５】
本発明の別の局面では、上述の組成物は薬学的に許容可能な担体中に調合される。
【００２６】
更に別の局面では、本発明は、患者に上述の組成物を投与する方法を提供するものである。ある実施態様では、本発明は、血液量減少、内臓血管拡張、全身性血管拡張、低血圧、食道静脈瘤出血、肝腎障害症候群、アルコール又は肝炎により引き起こされる肝硬変、又は敗血症の処置において上述のバソプレッシン類似体を患者に投与する方法を提供する。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）
一般式：A-(Cm)x-ペプチドを有する組成物であって、但し式中：
（ａ）前記ペプチドは１００個以下のアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドであり；
（ｂ）Cmは：
（ｉ）Gly部分（この場合、x は０−６の整数である）；
（ｉｉ）Ala部分（この場合、x は０−６の整数である）；
（ｉｉｉ）Arg 部分（この場合、x は０−６の整数である）；
（ｉｖ）Lys部分（この場合、x は０−６の整数である）；
（ｖ）式(N)q-Argの部分（この場合、Nはいずれかのアミノ酸であり、そしてqは0 又は1であり、そしてxは０−６の整数である）；又は
（ｖｉ）式(N)q-Lysの部分（この場合、Nはいずれかのアミノ酸であり、そしてq は 0 又は 1であり、 xは０−６の整数である）であり；そして
（ｃ）Aは：
（ｉ）６乃至３６個の炭素ユニットを有するアルキル基、そしてxは２乃至６の整数であり；
（ｉｉ）ニトリロ三酢酸部分；
（ｉｉｉ）イミノ二酢酸部分；又は
（ｉｖ）式 (ZyHisw)pの部分（この場合、Z はヒスチジン以外のいずれかのアミノ酸残基であり、Hisはヒスチジンであり、yは０乃至６の整数であり、wは１乃至６の整数であり、p は１乃至６の整数であり、そしてxは２乃至６の整数である）である、
組成物。
（項目２）
CmがGlyであり、そしてA-(Gly)xが前記ペプチドにＮ末端でのアミド結合を介して付着している、項目１に記載の組成物。
（項目３）
Cm がGlyであり、そしてA-(Gly)xが前記ペプチドのアミノ酸の側鎖を介して前記ペプチドに付着している、項目１に記載の組成物。
（項目４）
Cm がGlyであり、そしてA-(Gly)xが前記ペプチドにＣ末端のアミド結合を介して付着している、項目１に記載の組成物。
（項目５）
一般式：A-(Cm)x-ペプチドを有する項目１の組成物であって、但し式中、
（ａ）(Cm)xがGly-Gly-Gly-であり；
（ｂ）A-が、-Gly-Gly-Gly-のアミノ末端に結合したアミドであり；そして
（ｃ）A-Gly-Gly-Gly-が、前記ペプチドのいずれかのアミノ基に結合したアミドである、
項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記ペプチドが、一般式：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であって、但し式中、
Cysがシスチン又はシステインであり；
Tyr がチロシンであり；
Phe がフェニルアラニンであり；
Gln がグルタミンであり；
Asnがアスパラギンであり；
Pro がプロリンであり；
B がリジン又はアルギニンであり；
C がグリシン又はアラニンであり；そして
D がNH2 又はHである、
項目５に記載の組成物。
（項目７）
Aが式CH3(CH2)n-CO-の直鎖状アルキルカルボニル基であり、但しこの場合、nは４乃至３４の整数である、項目５に記載の組成物。
（項目８）
A が式CH3(CH2)n-CO-の直鎖状アルキルカルボニル基であり、但しこの場合、nは４乃至３４の整数である、項目６に記載の組成物。
（項目９）
nが 6 であり、そしてCmがGly-Gly-Gly-である、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
n が10であり、そしてCmが Gly-Gly-Gly-である、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
式：CH3(CH2)6CO-OCH(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2を有する、項目６に記載の組成物。
（項目１２）
式：：His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2を有する、項目６に記載の組成物。
（項目１３）
A が、前記カルボニル基の炭素に付着した、６乃至３６個の炭素ユニットを持つ分枝状アルキルカルボニル基である、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
A が、前記カルボニル基の炭素に付着した、６乃至３６個の炭素ユニットを持つ分枝状アルキルカルボニル基である、項目５に記載の組成物。
（項目１５）
A が、前記カルボニル基の炭素に付着した、６乃至３６個の炭素ユニットを持つ分枝状アルキルカルボニル基である、項目６に記載の組成物。
（項目１６）
６乃至３６個の炭素ユニットの複数のアルキル鎖を持つポリマ担体を更に含み、この場合、複数のペプチド類似体のアルキルカルボニル基が、前記ポリマ担体の複数のアルキル鎖に、疎水性相互作用により非共有結合的に結合している、項目６乃至１１、１３乃至１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
Aがニトリロ三酢酸基又はイミド二酢酸基である、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
共有結合した金属結合ドメイン及びキレ−トされた金属イオンを持つポリマ担体を更に含む、項目１２又は１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記ペプチドがGLP であり、そしてA-(Cm)x- が前記ペプチドのＮ末端に付着していない、項目１に記載の組成物。
（項目２０）
Aが１）ニトリロ三酢酸基、２）イミノ二酢酸基、又は３）(ZyHisw)pを含有する化学基又は部分である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
共有結合した金属結合ドメイン及びキレ−トされた金属イオンを持つポリマ担体を更に含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
A が、６乃至３６個の炭素ユニットを持つアルキル基を含有する化学基又は部分である、項目１９に記載の組成物。
（項目２３）
６乃至３６個の炭素ユニットの複数のアルキル鎖を持つポリマ担体を更に含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
AがHis6である、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
薬学的に許容可能な担体に入れた項目１に記載の組成物を含む医薬組成物。
（項目２６）
項目１に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
（項目２７）
項目１９乃至２４のいずれかから選択される組成物を対象に投与するステップを含む、前記対象の糖尿病を処置する方法。
（項目２８）
対象における血液量減少症、内臓血管拡張、全身性血管拡張、血圧低下、食道静脈瘤出血、肝腎障害症候群、又は敗血症を処置する方法であって、項目１に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含み、但し前記ペプチドが式：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dのバソプレッシン類似体であり、但し式中、
Cysがシスチン又はシステインであり；
Tyr がチロシンであり；
Pheがフェニルアラニンであり；
Gln がグルタミンであり；
Asn がアスパラギンであり；
Pro がプロリンであり；
Bがリジン又はアルギニンであり；
C がグリシン又はアラニンであり；そして
D がNH2又はHである、
方法。
（項目２９）
A が式CH3(CH2)n-CO-を持つ直鎖状アルキルカルボニル基であり、この場合nが４乃至３４の整数である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
(Cm)xがGly-Gly-Gly-である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
血液量減少症又は血圧低下が処置されようとする、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
血圧低下が穿刺術を原因とする、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
食道静脈瘤出血が処置されようとする、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
肝腎障害症候群が処置されようとする、項目２８に記載の方法。
（項目３５）
敗血症が処置されようとする、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
肝腎障害症候群が肝硬変により引き起こされる、項目２８に記載の方法。
（項目３７）
肝硬変がアルコ−ル又は肝炎により引き起こされる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
（ａ）
（ｉ）ポリマのコア；
（ｉｉ）前記ポリマのコアに共有結合した複数の第一疎水性基；
（ｉｉｉ）複数の保護側鎖であって、各々が前記ポリマのコアに共有結合しており、前記ポリマのコア重量とは独立に約４００乃至２０，０００ダルトンの分子量を有する、複数の保護側鎖；
を含むポリマ担体と：
（ｂ）各々が第二疎水性基に共有結合したペプチドを含む、複数のペプチド類似体と
を含み、この場合、前記ペプチド類似体は前記ポリマ担体に、前記第一疎水性基及び前記第二疎水性基間の疎水性相互作用を介して非共有結合的に結合している、
組成物。
（項目３９）
前記ペプチドが一般式：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であり、但し式中、
Cysがシスチン又はシステインであり；
Tyr がチロシンであり；
Phe がフェニルアラニンであり；
Gln がグルタミンであり；
Asn がアスパラギンであり；
Pro がプロリンであり；
B がリジン又はアルギニンであり；
C がグリシン又はアラニンであり；そして
D がNH2又はHである、
項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記疎水性基が式CH3(CH2)n-CO-を持つ直鎖状アルキルカルボニル基であり；但し式中、nが４乃至３４の整数である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
式：CH3(CH2)6CO-OCH(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2を有する項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記ペプチドがGLPである、項目３８に記載の組成物。
（項目４３）
前記ペプチド類似体がGLP-Gly-Gly-Glyであり、但しこの場合、Gly-Gly-Gly- は前記ペプチドのＣ末端又は側鎖に付着している、項目３８に記載の組成物。
（項目４４）
（ａ）
（ｉ）ポリマのコア；
（ｉｉ）前記ポリマのコアに共有結合した複数の第一キレ−ト基であって、遷移金属イオンに配位結合した第一キレ−ト基；
（ｉｉｉ）複数の第一保護側鎖であって、各々が前記ポリマのコアに共有結合すると共に前記ポリマのコア重量とは独立に約400乃至20,000ダルトンの分子量を有する、第一保護側鎖；
を含むポリマ担体と；
（ｂ）各々が第二キレ−ト基に共有結合したペプチドを含む複数のペプチド類似体であって、前記ポリマ担体に、前記遷移金属イオンへの配位結合を介して非共有結合的に結合している、ペプチドの類似体と
を含む組成物。
（項目４５）
前記ペプチドが一般式： Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-Dを有するバソプレッシン類似体であり、但し式中、
Cys がシスチン又はシステインであり；
Tyr がチロシンであり；
Pheがフェニルアラニンであり；
Gln がグルタミンであり；
Asn がアスパラギンであり；
Pro がプロリンであり；
Bがリジン又はアルギニンであり；
C がグリシン又はアラニンであり；そして
D がNH2又はHである、
項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記ペプチド類似体が式：
His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2
を有する、項目４４に記載の組成物。
（項目４７）
前記ペプチド類似体が式：
His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2
を有する、項目４４に記載の組成物。
（項目４８）
前記ペプチドがGLPである、項目４４に記載の組成物。
（項目４９）
前記ペプチド類似体がGLP-Gly-Gly-Glyであり、但しこの場合、Gly-Gly-Gly- が前記ペプチドのＣ末端又は側鎖に付着している、項目４４に記載の組成物。
【００２７】
引用による援用
本明細書で言及された全ての公開文献、特許、及び特許出願は、各個々の公開文献、特許、又は特許出願を具体的かつ個別に、引用をもって援用することを示唆した場合と同程度に、引用をもってここに援用されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の新規な特徴を付属の請求項で具体的にして記載することとする。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理を用いた例示的な実施態様を挙げた以下の詳細な解説及びその付随する図面を参照されれば得られるであろう。
【図１】図１は、Ｎ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。この構造はテルリプレッシンとしても知られる。
【図２】ラウリン酸に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。これは「C12TerA」とも呼ばれる。Rainin(C18,5 um, 4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、水/ 0.1% TFA から 100% アセトニトリル/0.1% TFA までの線形勾配で1ml/分の流速で２０分間かけて溶出させると、C12TerA は215 nm で観察したときに14.86分の保持時間を示し、９０％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1409.5Da の質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1410.4 Da に合致する。吸収スペクトルは260nmでピークを示し、これは210nmでの２４分の１であった。
【図３】図３は、ラウリン酸に乳酸エステルを介して付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。これは「C12TerE」とも呼ばれる。Rainin(C18, 5 um, 4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、30% アセトニトリル／水/ 0.1% TFA から 90% アセトニトリル／水0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、C12TerE は220 nm で観察したときに20.91分の保持時間を示し、９０％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1481.6Da の質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1482.5 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは220nmでの約１８分の１であった。
【図４】図４は、オクタン酸に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。これは「C8TerA」とも呼ばれる。Rainin(C18, 5 um, 4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、10% アセトニトリル／水/0.1% TFA から70% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、C8TerA は220 nm で観察したときに23.17分の保持時間を示し、９０％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1354.0ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1354.4 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは210nmでの約２５分の１であった。
【図５】図５は、オクタン酸に乳酸エステルを介して付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。これは「C8TerE」とも呼ばれる。Rainin(C18, 5 um, 4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、10% アセトニトリル／水/0.1% TFA から70% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、C8TerE は220 nm で観察したときに27.32分の保持時間を示し、９５％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1425.7ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1426.5 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは210nmでの約４０分の１であった。
【図６】図６は、三つのヒスチジン残基に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つリジンバソプレッシンの化学構造を示す。これは「His3Ter」とも呼ばれる。Supelco(C18, 5 um,4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、0% アセトニトリル／水/0.1% TFA から60% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、His3Ter は220 nm で観察したときに15.47分の保持時間を示し、９５％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1639.8ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1639.1 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは210nmでの約４０分の１であった。
【図７】図７は、六つのヒスチジン残基に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つリジンバソプレッシンの化学構造を示す。これは「His6Ter」とも呼ばれる。Vydac(C18, 5 um,4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、0% アセトニトリル／水/0.1% TFA から100% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、His6Ter は220 nm で観察したときに18.81分の保持時間を示し、９５％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する2051.3ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量2051.1 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは220nmでの約４２分の１であった。
【図８】図８は、三つのヒスチジン残基に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つアルギニンバソプレッシンの化学構造を示す。これは「His3Vas」とも呼ばれる。Rainin(C18, 5 um,4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、0% アセトニトリル／水/0.1% TFA から60% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、His3Vas は215 nm で観察したときに18.45分の保持時間を示し、９５％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する1668ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量1667.9 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは210nmでの約３８分の１であった。
【図９】図９は、六つのヒスチジン残基に付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つアルギニンバソプレッシンの化学構造を示す。これは「His6Vas」とも呼ばれる。Supelco(C18, 5 um,4.6x250mm)で逆相HPLCクロマトグラフィを用い、0% アセトニトリル／水/0.1% TFA から60% アセトニトリル／水/0.1%TFAまでの線形勾配で1 ml/分の流速で４５分間かけて溶出させると、His6Vas は220 nm で観察したときに17.27分の保持時間を示し、９５％を越える純度を示した。総イオン電流について質量分光分析を用いて純度を確認し、プロトン付加したペプチド、即ち質量分光分析上の分子イオンピークに相当する2080.5ダルトンの質量を見出した。これはプロトン付加したときの理論上分子量2079.3 ダルトン に合致する。吸収スペクトルは260 nmでピークを示し、これは210nmでの約４８分の１であった。
【図１０】図１０は、脂肪鎖を含有するバソプレッシン類似体を形成するミセルの概略的横断面を示す。暗い太線は疎水性鎖であり、明るい線はジスルフィド結合を持つバソプレッシンを表す。図１乃至５に示す切断部位はミセル表面から隠されており、この図面では明るい線及び太線の接合部にある。
【図１１】図１１は、ヒト血清中で２時間インキュベートした後のテルリプレッシン及び他のバソプレッシン類似体の血清による活性化能を示す。Ｙ軸は９６ウェル・プレート中でfura-2を装薬されたヒト臍帯細胞での相対的蛍光ユニットである。蛍光は細胞質内のカルシウムに比例する。バソプレッシンは細胞質内へのカルシウム内向きフラックスを起こすことで、蛍光増加を引き起こす。多様なバソプレッシン類似体がヒト血清と一緒に２時間、インキュベートされて培養細胞に適用される。蛍光は、図示するように１分間の間、３秒間毎に測定された。適用後、血清により活性化した使用はカルシウム内向きフラックスを起こし、従って蛍光を増加させる。
【図１２】図１２はすべて、x軸に秒による時間を関数として示した、Fura-2蛍光の２０回の反復を示す。y軸は蛍光強度を相対的蛍光単位[RFU]で示す。最初の４つのデータ時点後、薬物を組織培養ウェルに注入し、蛍光測定を更に４８秒、続行する。Fura-2蛍光は、刺激に応答して細胞内Ca2+濃度が上昇すると強くなる。テルリプレッシンは血清の存在下で注射された場合のみ完全に活性である。それはなぜなら、類似体であるため、完全に活性なバソプレッシンが後に残るにはアミノ酸の短い配列が切断されねばならないからである。ヒト血清の添加によりテルリプレッシンの活性が３７℃での予備インキュベートなしでも著しく上昇するため、このステップは大変速いであるか、あるいはこのステップを行う酵素は氷上で活性である。テルリプレッシンは、血清中でのインキュベーション時間が増すことによる分解が原因でその活性を急速に失う。ヒト血清中に含まれる内因性成長因子のために、ヒト血清はそれ自体、測定可能なCa内向きフラックス・シグナルを生じる。従って薬物の活性はヒト血清シグナルを越えねばならない。テルリプレッシンのC8TerA、C12TerA及びC12TerE 誘導体は同様に活性であるが、血清中での分解から最長４時間、保護されている。
【図１３】図１３は、PBS中でのテルリプレッシン及び誘導体を示す図１２の方法の結果を示す。
【図１４】図１４は、ヒト血清中でのテルリプレッシンを様々な間隔で示した、図１２の方法の結果を示す。
【図１５】図１５は、ヒト血清中でのC8TerA類似体を様々な間隔で示した、図１２の方法の結果を示す。
【図１６】図１６は、ヒト血清中でのC12TerA類似体を様々な間隔で示した、図１２の方法の結果を示す。
【図１７】図１７は、引用をもってここに援用することとする米国特許出願番号第11/613,183号に開示された疎水性基を含有するポリマ担体へのC12TerAの結合を示すスカッチャード表である。PGC-HC18又は20PLPEG555-C18とも呼ばれるこの担体は、15-30kDaのポリリジンから成り、このときアミノ基の５５％はスクシネート・リンカーを介して結合した5kDa のメトキシポリエチレングリコールを含有するように共有結合的に修飾されており、アミノ基の残りの４５％は、全て米国特許出願番号第11/613,183号に開示されたステアリン酸カルボキシル基にアミド結合している。250μlの担体溶液(2.5 mg/試験管) を 0.20、0.15、0.10、0.075、0.050、及び 0.025 mg の C12TerAと混合した。試料を150 μl のPBSにし、一晩インキュベートした。75μl から結合したものをBio-spin-P30で溶出させた。装薬された担体を含有するボイド容量を、75μlのアセトニトリルを添加してから100kDa MWCO フィルタを通してろ過することで装薬を外した。結合したC12TerA を含有するろ過物をHPLCで定量した。50%アセトニトリル中で同じフィルタを通過したコントロールを各試験管の総C12TerAの基準として用いることで、もとのインキュベーション混合物中の遊離C12TerAを計算可能とした。C12-TerAは２．４分で溶出する。1.5ml/分の流速での1-6分からの25-99%アセトニトリルの勾配を用いた。カラムはPhenomenex社製のMercury MS20x 4mm；2μm； C12 だった。スキャッチャード表は完全には線形ではないが、1-5 μMの平均Kdを推測することができ、疎水性基を含有する担体とのC12TerA の強い相互作用が示され、これはC12TerAの生物学的半減期を延長すると共にその急速な活性化及び分解を遅らせるには充分である。C12TerAの中にはミセルを形成することができ、また、用いた分析技術が原因で結合したと計数されるものもあるかも知れないことは留意されねばならない。
【図１８】図１８は、10 mg/mlの PGC-HC18 又は20PLPEG555-C18の存在下における結合型及び遊離C12TerAを示すグラフである。C12TerAの大半が、疎水性基を含有する担体に結合することは注目されるべきであり、これはC12TerAの生物学的半減期を延長すると共にその活性化及び分解を遅らせるには充分である。
【図１９】図１９は、ニトリロ三酢酸のカルボキシル基の一つに付着させたＮ末端に三つのグリシン残基を持つバソプレッシンの化学構造を示す。これは「NTA-Ter」とも呼ばれる。これは、Ｎ末端が二つのカルボキシメチル基に付着した、四つのグリシン残基を持つバソプレッシンと見ることもできる。
【図２０】図２０は、概略的にはペプチドのカルボキシル末端にニトリロ三酢酸誘導体[N’,N’,ビス(カルボキシメチル)-リジン] を付着させることで、このペプチドがニトリロ三酢酸残基を有することができるようにした、ペプチドの化学構造を示す。ある具体的な実施態様では、該ペプチドは：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO: 2)； 又はHis-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO: 3)； 又は His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly(SEQ ID NO: 4)； 又はHis-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 5)の配列を有することができる。三文字コードは当業で公知のペプチドのアミノ酸表示である。
【図２１】図２１は、概略的にはペプチドのカルボキシル末端にイミノ二酢酸を付着させることで、イミノ二酢酸を当該ペプチドが有することができるようにしたペプチドの化学構造を示す。ある具体的な実施態様では、当該ペプチドは：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO: 2)； 又はHis-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO: 3)； 又は His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly(SEQ ID NO: 4)； 又はHis-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 5)の配列を有することができる。三文字コードは当業で公知のペプチドのアミノ酸表示である。
【図２２】図２２は、概略的にはペプチドのアミノ末端又はＮ末端にニトリロ三酢酸を付着させることで、当該ペプチドがイミノ二酢酸残基を有することができるようにしたペプチドの化学構造を示す。これは本発明の別の実施態様である。
【図２３】図２３は、10 mg/ml40PLPEG537-Zn-キレートの存在下における結合型及び遊離型His6Terを示すグラフである。米国特許第7,138,105号に解説されている通り、40PLPEG537-Zn-キレートは40kDaポリリジン骨格であるが、そのリジン・イプシロンアミノ基の３７％は5 kDaのポリエチレングリコールに付着しており、残りの６３％はZn イオン・キレートに付着している。x軸の装薬率は、10mg/mlの担体のパーセントでHis6Terの量を表している。His6Terの大半が、キレートされた亜鉛を含有する担体に結合しており、これは、His6Terの生物学的効果を延長させるのに充分であることに留意されたい。担体の複数のアリクォート（2.5mg 担体／試験管）を0.25、0.20、0.15、0.10、0.075、0.050、及び0.025 mg のHis6Terに混合し、250 μl のPBSにし、一晩、インキュベートした。結合型及び遊離型を分離するために溶液を100kDa 分子量カットオフのセルロース・フィルタ (Millipore 社製のMicrocon Ultracel YM-100)を用い、12,000 x g で１０分間、遠心分離してろ過した。ろ過物中のHis6Terをsynergimax(20x4mm)を用いた逆相 HPLCにより、１−５分の間、1.5分の流速で 0-50% B (A は 0.1%TFA を加えた5% アセトニトリル、そしてBは0.1%TFA を加えた 100% アセトニトリル) の勾配で定量した。His6Ter は3.1分に出てくる。遊離型、即ち未結合のHis6Ter を曲線下方の面積で表した(AUC；y軸)。担体のないコントロールを同じフィルタに通過させ、同様に定量し、総His6Terの基準として用いたが、ここから遊離型を除算して結合型を計算することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本開示は、生物学的に活性なペプチド錯体の組成物、患者の治療のためのこのような組成物の調合物及び使用法を提供する。本組成物と、同組成物の作成法及び使用法は数多くの所望の結果及び特徴を達成するであろう。ある局面では、本発明は、生物学的に活性なペプチドを、患者への投与後にコントロールされた態様で送達する、放出する、及び／又はその半減期を延長するように構成されたペプチド類似体の錯体及びポリマ担体分子に関する。別の局面では、本発明は、当該ペプチドを安定化させることで患者への投与に適した調合物となるペプチド類似体の錯体及びポリマ担体分子に関する。本開示は、疎水性及び／又は金属結合性の基の結合性部分を共有結合させて持つペプチド（「ペプチド類似体」）を提供するものであり、該ペプチドは、疎水性ポリマ担体のコアを含有するポリマ担体に、又は、共有結合させた金属結合ドメイン及びキレートさせた金属を持つポリマ担体に、可逆的に結合することで、患者への投与に適した錯体を形成することができる。更に本開示は、疎水性のポリマ担体のコアと一緒に、又は前記コアなしで、ミセル又はリポソームを形成することのできる、アルキル基を持つペプチドも提供するものである。更なる実施態様を挙げると、本ペプチドを、選択に応じて、生物学的流体又は組織中のホストプロテアーゼで切断することのできる切断可能なリンカー部分により疎水性又は金属結合性の基に共有結合させてもよく、それにより、送達用錯体からの活性ペプチドのコントロールされた及び／又は持続的な放出が可能になる。
【００３０】
米国特許第7,138,105号及び米国特許公報2005-0260259号、2007-0141145号及び2008-0015263号は、ペプチドなど、疎水性及び金属結合性の分子を可逆的に結合させる薬物ポリマ担体分子を解説している。これらのポリマ担体分子は、例えばポリリジンなど、ポリアミノ酸などのポリマのコア（例えば骨格）を含むことができる。ポリエチレングリコールなどの保護基をこのコアに付着させることができる。更に、送達しようとする分子に結合する結合性部分もこのコアに付着している。いくつかの実施態様では、該結合性部分は、疎水性基を持つ分子に結合する。この場合、結合性部分はアルキル基などの疎水性の基であってもよい。代替的には、結合性部分は、それ自体が金属に結合する分子に結合する。このような結合性部分には、遷移金属（例えばZn、Ni、Cuなど)の金属に結合した、キレート基などの金属結合性の基がある。
【００３１】
Ｉ．ペプチド類似体組成物
本発明は、疎水性基又は金属結合性基などの結合性部分を含むように修飾することで、この結合性部分を通じてペプチドをポリマ担体分子に結合可能にしたペプチドを提供するものである。修飾には、本発明のペプチド類似体を作製するための疎水性部分又は金属結合性部分を含めることができる。例えば、疎水性基は６乃至３６個の炭素原子を有するアルキルであってよい。金属結合性基は、例えばHisタグ（His6など）であってよい。いくつかの実施態様では、結合性部分は、送達しようとするペプチドの直接、付着している。他の実施態様では、結合性部分は、Gly-Gly-Glyなどのアミノ酸配列や以下に詳述する通りの切断が置き易いアミノ酸配列を含め、切断可能な部分を介してペプチドに付着している。このように、本発明の目的のためには、「ペプチド類似体」とは、共有結合による結合性部分を持つペプチドや、共有結合による切断可能部分及び共有結合による結合性部分を持つペプチドを意味する。切断可能部分が体内で切断すると、当該ペプチドはポリマ担体から放出される。このように、本発明のペプチド組成物は一般式：結合性部分−選択的な切断可能部分−ペプチド、を有し、この場合、前記結合性部分及び選択的な切断可能部分は、例えば共有結合により、当該ペプチドに、このペプチドのいずれかの適した位置で結合することができる。切断可能部分は、結合性部分がペプチドの生物学的活性と干渉する場合にその用途がある。
【００３２】
従って本発明は、ポリマ担体と、本発明の修飾されたペプチドとの間のペプチド錯体も提供するものであり、この場合の修飾されたペプチドは、この修飾されたペプチドとポリマ担体との間の疎水性引力を通じて、又は、修飾されたペプチドの金属結合性基と、ポリマ担体の金属結合性基及び関連金属イオンとの間の金属イオン結合性相互作用を通じて、ポリマ担体に可逆的に結合している。
【００３３】
Ａ．  ペプチド
本発明の目的のためには、「ペプチド」とは、５乃至１００個の範囲のアミノ酸の、生物学的に活性なポリアミノ酸を意味する。過去において、５１個を越えるアミノ酸のポリアミノ酸はたんぱく質と呼ばれ、５１個以下のアミノ酸より小さいものはペプチドと呼ばれた。たんぱく質とペプチドの間の区別は単に大きさの問題である。たんぱく質などの長いポリアミノ酸の合成は、過去、ペプチド合成装置の何らかの技術的限界が原因で課題が多かった。この困難の結果、ペプチドとたんぱく質の区別が生まれた。しかし、ペプチド合成技術の進歩により、最高で１００アミノ酸までの長いポリペプチドの合成が今や可能である。また、技術により、５乃至１００個のアミノ酸のペプチドの自動ペプチド合成装置で可能になり、ペプチドの古い定義が広くなったために、このようなポリペプチドもペプチドの定義に含めることも、本発明の意図である。大半の大型のたんぱく質は未だに生物系において組換え法で作製されているが、ペプチドはペプチド合成装置を用いて作製されている。アルキル基、ヒスチジン、ニトリロ三酢酸、又はイミノ二酢酸のペプチドへの添加は、ペプチド合成中にペプチド合成装置を用いて容易に行うことができる。組換えたんぱく質の場合、これらのアルキル基、ニトリロ三酢酸、又はイミノ二酢酸を成熟たんぱく質中に導入することができようが、たんぱく質からたんぱく質への反応予測性には限界がある。本発明の目的のための「ペプチド」には、ポリリジン、ポリグルタミン酸などのアミノ酸のホモポリマは、それらは生物学的に活性ではないために含まれない。本発明の目的のための用語「生物学的に活性な」とは細胞内で第二メッセンジャ系を通じて伝令を送り、そうして生物学的応答を引き起こすことのできる細胞受容体に、当該ペプチドが結合することができることを意味する。これらが、本明細書で概略したように修飾された場合の本発明のペプチドであるペプチド／たんぱく質である。
【００３４】
本発明での使用に適した生物学的に活性なペプチドには、血漿等の生物学的流体中で酵素切断をそれ自体が受け易いか、あるいは、体内で除去されるために半減期の短い、ペプチドがある。本開示は、バソプレッシン、テルリプレッシン、グルカゴン様ペプチド(GLP)、又はこれらの類似体など、患者を処置するために適した生物学的活性を持つペプチドを含有する組成物を提供する。ペプチドの他の非限定的な例には、限定はしないが、レプチン・フラグメント、胃抑制ポリペプチド(GIP)、上皮成長因子(EGF)受容体リガンド、EGF、トランスフォーミング成長因子アルファ (TGF-アルファ)、ガストリン／コレシストキニン受容体リガンド、ガストリン、コレシストキニン、リゾスタフィン、インターフェロン、インターフェロン・ガンマ、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・アルファ、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-6、インターロイキン-8、インターロイキン-10、インターロイキン-12、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、アウリスタチン、ナイシン、インシュリン、インシュリン様成長因子、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、エンドスタチン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、第七血液凝固因子、第八血液凝固因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー−刺激因子(G-CSF)、トロンボポエチン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン(PTH) 及びそのフラグメント、エリスロポエチン、心房性ナトリウム利尿因子、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、黄体ホルモン放出ホルモン、濾胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、スロンボポエチン、フィルグラスチン、プロスタグランジン、エポプロステノール、プロスタサイクリン、デズモプレッシン、又は血管作用性腸管ペプチド(VIP)がある。
【００３５】
ここで用いられる場合の用語「誘導体」とは、コア構造が親化合物と同じであるか、又は似ているが、異なる又は付加的な基をなどの化学的又は物理的修飾を有する化合物を言う。用語「誘導体」には、他の原子又は分子に連結することのできる親化合物のコポリマが含まれる。また用語「誘導体」には、親ペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を持つペプチドも含まれる。更に用語「誘導体」には、脂肪酸及び／又は付加的なアミノ酸などの付加的な基をそれに付着させて持つペプチドも含まれるが、ここで定義されるような結合性部分又は切断可能な部分は含まれない。ここで用いられる場合のバソプレッシンには、テルリプレッシンなどの誘導体やそれらの他の変形が含まれる。ここで用いられる場合のグルカゴン様ペプチド(GLP)には、GLP及びその誘導体、例えばGLP-1 (7-36)、GLP-1(7-37)、並びにエキセナチド及び他のこれらの変形が含まれる。本明細書の明晰性のために言うと、ポリペプチド又はポリアミノ酸と呼ばれる直線状のペプチドはＮ末端及びＣ末端を有する。Ｎ末端とは、ペプチド結合を形成するために使われてない末端アミノ酸のアルファアミノ基を言う。Ｃ末端とは、ペプチド結合を形成するために用いられていない末端アミノ酸のアルファカルボキシル基を言う。ペプチドのＮ末端及びＣ末端は、当該ペプチドを構成するいずれのアミノ酸の（当業で公知の）Ｒ基中にはない。本発明の目的のためのアルキル基は、炭素及び水素のみから成る化学基である。本発明において好適なアルキル基は、それらの共有結合した水素原子を持つ６乃至３６個の炭素ユニットを含有する。
【００３６】
ペプチド類似体は標準的なペプチド化学技術を用いて作製することができ、また、血清中でのインキュベート前又は後のいずれでも活性について評価することができる。本発明で特に好適なペプチド類似体は、１）直線状ペプチドのＮ又はＣ末端の６乃至３６個の炭素ユニットで出来たアルキル基；又は２）ニトリロ三酢酸の一部分であっても、又はなくともよいイミノ二酢酸である。本類似体は一般式：A-(Gly)x-ペプチド又はペプチド-(Gly)x-Aを有することができ、但し式中、当該ペプチドの左側はＮ末端であり、そして右側はＣ末端であり；Glyはグリシンであり；x は０乃至５の整数であり； A は８乃至３６個の炭素ユニットを持つアルキル基、ニトリロ三酢酸基、イミド二酢酸基、又は (His)yを含有するいずれの化学基又は部分であってよく；yは２乃至６の整数である。当該ペプチドは５乃至１００個のアミノ酸のいずれの配列又は鎖であってもよい。当該アミノ酸は２０種の天然型アミノ酸又はそれらの誘導体のいずれであってもよい。Aの当該ペプチドへの付着は、乳酸又はグリシンなどの簡単なリンカー基が関係するものでもよい。乳酸は、アルキル基をエステル結合を用いてペプチドのアミノ末端に付着させたい場合には、特に重要である。アルキル基をペプチドのカルボキシル末端にアミド結合により付着させるには、一般式CH3(CH)n-NH-（但し式中、nは５乃至３４である）のアミノ−アルキル基が用いられよう。
【００３７】
バソプレッシンに代表されるペプチドの類似体は標準的なペプチド化学技術を用いて作製することができ、また、血清中でのインキュベート前及び後に、すべてここで提供する指針に従って、カルシウム流入活性について評価することができる。本発明の好適な類似体は、以下の通りのバソプレッシンの配列に基づくものである：
A-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-B-C-D (SEQ ID NO: 1)
但し式中：  
Aは３乃至３６個の炭素ユニット持つアルキル基を含有する選択された基、ニトリロ三酢酸、イミド二酢酸又は (ZxHisy)p（但しこの場合Zはアミノ酸残基であり、Hisはヒスチジンであり、x は０乃至６の整数であり；yは１乃至６の整数であり；そしてpは１乃至６の整数である）；
Gly はグリシン、
Cys は シスチン又はシステイン、
Tyr は チロシン、
Phe は フェニルアラニン、
Gln は グルタミン、
Asn は アスパラギン、
Pro はプロリン、
B は リジン又はアルギニン、
C は グリシン又はアラニン、
D は NH2 又はH、
A-Gly-Gly-Gly-サブユニットは当該ペプチドのいずれか利用可能なアミノ基にアミド結合を介して共有結合している。
【００３８】
本発明の好適な化合物を合成する際に有用な、保護されたアミノ酸残基の多くは、多くのアミノ酸提供業者から市販されているものを利用することができる。更に、本発明の主題である類似体の全てが、例えば米国カリフォルニア州サンホセ、Anaspec社、カリフォルニア州トランス、Polypeptidelaboratories社、又はフロリダ州マイアミ、ChemPep社など、外部のカスタム・ペプチド提供業者により合成することができる。本出願で開示された明細書に従ったペプチドの合成は、当業者であれば容易に行うことができるが、好ましくは、特に修飾がペプチドの末端残基にある場合には、固相合成法を用いて行うとよい。カルボキシル末端にニトリロ三酢酸を持つペプチドの場合（図２０）、Ｎ末端で（当業で公知の通り、Fmoc又はBocにより）保護された[N’,N’,ビス(カルボキシメチル)-リジン]などのニトリロ三酢酸をまず、樹脂に固定又は結合し、そこで残りの未反応のカルボキシル基を、必要であれば保護することができる。入って来る保護されたアミノ酸の活性化カルボキシル基は、こうして、固定されたN’,N’,ビス(カルボキシルメチル)-リジンのアミノ基に、Fmoc又は Boc除去後に結合させることができ、この合成は通常の固相ペプチド合成の通りに続行する。樹脂からの切断、脱保護及び精製は、従来のペプチド合成と同様であるが、付加的な選択肢としては、精製ステップにおいて金属アフィニティ・クロマトグラフィを用いて精製する。イミノ二酢酸をカルボキシル末端に持つペプチドの場合（図２１）、イミノ二酢酸をまずFmoc又はBocによりN-保護した後、そのカルボキシル基で樹脂に固定又は結合させ、二番目の未反応のカルボキシル基を、必要であれば保護することができる。保護されたアミノ酸の入って来る活性化カルボキシル基は、こうして、Fmoc又はBoc除去又は脱保護後に）固定したイミノ二酢酸の二番目のアミノ基に結合させることとなり、合成は通常の固相ペプチド合成の通り、続行する。アミノ末端にイミノ二酢酸を持つペプチドの場合（図１９及び２２）、合成は通常の固相ペプチド合成として続行し、最後のアミノ酸残基で、活性化ニトリロ三酢酸を成長中の鎖のアミノ末端に結合させる。ニトリロ三酢酸の活性化は、ニトリロ三酢酸一つ当たりカルボキシル一個に限定することができるが、これは、過剰量の完全に活性化し、かつＮ−保護されたニトリロ三酢酸が一個の末端アミノ基にしか反応しないため、我々の経験では必要ではない。樹脂からの切断、脱保護及び精製は従来のペプチド合成と同様であるが、付加的な選択肢として、精製ステップにおいて金属アフィニティ・クロマトグラフィを用いて精製する。
【００３９】
所望のペプチド類似体が合成され、樹脂から切断され、完全に脱保護されたら、次にこのペプチドを精製して、所望の官能基を持つ選択されたアミノ酸配列を有する単一のオリゴペプチドが回収されたことを確認する。精製は標準的なアプローチのいずれを用いても行うことができるが、その中には、C4-18シリカなどのアルキル化シリカ・カラム上での逆相高圧液体クロマトグラフィ（RP-HPLC）がある。このようなカラム分画は一般に、通常、TFA又はTEAなどの対合剤を少量（例えば0.1%）含有する水性緩衝剤中にアセトニトリルなど、例えば10-90%などの次第にパーセントを高くした有機溶媒の線形勾配を走らせることにより、達成される。代替的には、イオン交換HPLCを用いてもペプチド種をそれらの電荷特徴に基づいて分離することができる。カラム画分を採集し、選択的には所望の／必要な純度のペプチドを含有するものをタンデムマス分光検出器の指針によってプールしていく。本発明のある実施態様では、その後バソプレッシンペプチドを確立された態様で処理して、切断性の酸（例えばTFA）を薬学的に許容可能な陰イオンに交換すると共に、適した酸化剤の下で希釈溶液中に分子内ジスルフィド架橋が形成できるようにする。この分子内ジスルフィド架橋の形成はHPLC/MS解析により確認することができる。
【００４０】
Ｂ．  結合性部分
本開示は、ペプチド錯体を形成するためのポリマ担体への化学的な結合を可能にする実施態様のペプチド及びポリマ担体分子に付着させることのできる疎水性又は金属結合性基の結合性部分を提供するものである。
【００４１】
１．  疎水性基
ある局面では、修飾されたペプチドの結合性部分は、例えば６乃至３６個の炭素ユニットのアルキル基など、疎水性基である。このような疎水性基は、担体分子中の疎水性基に非共有結合的に結合させることができる。ある実施態様では、前記結合性部分のアルキル基は式CH3(CH2)n-CO-を有する直鎖状アルキルカルボニル基（但しこの場合、nは４乃至３４の整数である）、又は、６乃至３６個の炭素ユニットを持つ対応するアミノ−アルキル基（但しこの場合、各アルキル基は当該ペプチドのＮ−又はＣ−末端か、あるいは、当該ペプチドのアミノ酸の側鎖に付着させることができる。別の実施態様では、結合性部分のアルキル基はそれぞれ６乃至３６の炭素ユニットを当該ペプチドのＮ又はＣ末端又は当該ペプチドのアミノ酸の側鎖に付着させた分枝状アルキルカルボニル基又は分枝状アミノ−アルキル基である。更に疎水性基は６乃至３６個の炭素ユニットの環状化合物であってもよい。
【００４２】
２．  金属結合性基
別の局面では、本開示は、引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許出願番号11/112,879に開示されたものなどの金属結合性ドメインを持つ結合性部分を提供する。
【００４３】
金属結合性部分は、金属イオンと化学基との間で配位結合により錯体を形成することのできる複数の化学基のいずれのコンホメーション上の配置であってもよい。いくつかの実施態様では、金属結合性部分はキレート基である。キレート基は、金属イオンとの配位結合に利用することができる一対の不対電子を持つ。二座−、三座、及び四座キレート基が当業で公知である。
【００４４】
ある実施態様では、キレートされた金属イオンを持つ複数の金属結合性部分をポリマ担体のコアポリマに共有結合により付着させ、金属結合性部分は、該金属イオンに可逆的な配位結合を形成するペプチドに共有結合させる。一般的には、本発明で用いられる金属結合性部分の金属結合ドメインは、金属イオンと配位結合を形成することのできる多種の構造上、化学上、及び他の特徴を有する数多くの化学的部分を包含すると考えられるルイス塩基フラグメントを含有する。金属イオンと配位錯体を形成することのできる官能基の種類は当業者に公知である。例えば、このような部分には、一般的には、窒素、酸素、硫黄、及びリンなどのヘテロ原子など、金属中心との相互作用を行うことができる官能基が含まれるであろう。金属陽イオンはほとんど必ずルイス酸性であり、従ってルイス塩基として働くであろう多様な部分に結合することができる。好適な実施態様では、金属キレートイオンには、限定はしないが、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe 2+ 、Mn2+、及びCu2+ がある。
【００４５】
一般的には、ルイス塩基として働く部分は例えば約７未満のpKa、そしてより好ましくは５未満のpKaを有する強酸性基であり、適した条件下では共役塩基を生ずると考えられ、金属イオンに電子対を供与することで配位結合を形成するのに充分な強度のルイス塩基である。このルイス酸対ルイス塩基の相互作用の程度は、特定の金属イオンの働きだけでなく、配位部分の働きでもある。なぜなら後者は塩基性の程度や大きさ及び立体到達可能性の点でも様々だと考えられるからである。金属結合ドメインに含めてもよいルイス塩基部分の例には：アミン（一級、二級、及び三級）及び芳香族アミン、アミノ基、アミド基、ニトロ基、ニトロソ基、アミノアルコール、ニトリル、イミノ基、イソニトリル、シアネート、イソシアネート、ホスフェート、ホスホネート、ホスファイト、ホスフィン、酸化ホスフィン、ホスホロチオエート、ホスホールアミデート、ホスホンアミジト、ヒドロキシル、カルボニル（例えばカルボキシル、エステル及びホルミル基）、アルデヒド、ケトン、エーテル、カルバモイル基、チオール、スルフィド、チオカルボニル（例えばチオールカルボキシル、チオールエステル及びチオールホルミル基）、チオエーテル、メルカプタン、スルホン酸、スルホキシド、スルフェート、スルホネート、スルホン、スルホンアミド、スルファモイル及びスルフィニルがある。
【００４６】
適した金属結合ドメインの例には、少なくとも一種のルイス塩基性窒素、硫黄、リン又は酸素原子、あるいはこのような窒素、硫黄、リン及び酸素原子の組合せを含有する化学的部分がある。このような部分の炭素原子は、脂肪族、環式脂肪族又は芳香族部分の一部であってもよい。有機ルイス塩基官能基に加え、このような部分は更に、例えばアルキル、アリール及びハロゲン置換基などの他の原子及び／又は基も含んでもよい。好適な結合性部分はニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸基、又は、２乃至７個の連結したヒスチジン残気から成るhisタグであってもよい。
【００４７】
ある実施態様では、ペプチド類似体の金属結合性部分を共有アミド結合によりペプチドのＮ末端に付着させる。別の実施態様では、ペプチド類似体の金属結合性部分を共有アミド結合によりペプチドのＣ末端に共有結合させる。別の実施態様では、ペプチド類似体の金属結合はペプチドのアミノ酸の側鎖に共有結合により付着させる。更なる実施態様では、切断可能な部分を共有結合させ、金属結合性部分とペプチドとの間に位置的に配置する。例示的な実施態様では、金属結合性部分は、式His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 6)の切断可能な部分を持つhisタグであり、但しこの場合、当該部分はペプチドのＮ末端、又はＣ末端に、あるいはアミノ酸の側鎖に結合させる。更なる実施態様では、金属結合性部分は式(ZyHisw)p（但し式中のZはヒスチジン以外のアミノ酸残基であり、yは０乃至６の整数であり、wは１乃至６の整数であり、そしてpは１乃至６の整数である）であり、切断可能な部分に結合している。別の実施態様では、金属結合性部分はニトリロ三酢酸であり、Gly3などの切断可能部分とペプチドとに結合させる。別の実施態様では、金属結合性部分はイミノ二酢酸であり、Gly3などの切断可能部分とペプチドとに結合している。
【００４８】
いくつかの実施態様では、ペプチドがGLPである場合、A はペプチドにアミノ末端以外の位置で付着している。
【００４９】
他のキレート基には、1,4,7,10-テトラアザ-シクロドデカン-N,N′,N″-三酢酸； 1,4,7-トリス（カルボキシメチル)-10-(2′-ヒドロキシプロピル)-1,4,7,10-テトラアゾシクロデカン、1,4,7-トリアザシクロナン-N,N′,N″-三酢酸；及び1,4,8,11-テトラアザシクロテトラ-デカン-N,N′,N″,N′″-四酢酸；ジエチレントリアミン-五酢酸 (DTPA)； トリエチレンテトラアミン-六酢酸；エチレンジアミン−四酢酸(EDTA)； EGTA； 1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N′,N′-四酢酸、しかし好ましくはyN-(ヒドロキシエチル)エチレンジアミン三酢酸； ニトリロ三酢酸(NTA)； 及びエチレン-ビス（オキシエチレン-ニトリロ）四酢酸、ヒスチジン、システイン、オリゴアスパラギン酸、オリゴグルタミン酸、S-アセチルメルカプトアセテート及びメルアクトアセチルトリグリシンがある。
【００５０】
３．  切断可能部分
本開示は、生物学的に活性なペプチドと結合性部分との間のリンカーとして働く切断可能部分を提供するものである。該切断可能部分には、通常は細胞外プロテアーゼであるプロテアーゼの基質として働くことのできるアミノ酸配列が含まれよう。ある実施態様では、結合性部分はGly-Gly-Glyなどのポリグリシン切断可能部分を介してペプチドに付着している。別の実施態様では、結合性部分は、ポリマ担体に導入された対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することのできる一つ以上のシステイン残基を含み、この結合は還元剤の作用により切断することができる。このような実施態様では、体内での切断可能部分の切断により、当該ペプチドがポリマ担体から放出される。切断可能部分は(Gly)x基であってよく、その中には、限定はしないが、Gly2、Gly3、Gly4、Gly5及び Gly6が含まれる。切断化合部分はまた (Ala)x であってもよく、その中には、限定はしないが、Ala2、Ala3、Ala4 、Ala5 及びAla6がある。更に切断可能部分は (Lys)x基であってもよく、その中には、限定はしないが Lys 2、Lys 3、Lys 4及び Lys5 及びLys 6がある。また切断可能部分は(Arg)x 基であってもよく、その中には、限定はしないが、Arg2、Arg 3、Arg 4、Arg 5 及び Arg 6がある。また切断可能部分は(Ala-Arg)n 基（但し式中、n は１乃至３である）であってもよい。また切断可能部分は式 (N)q-Arg）（但し式中、Nはいずれかのアミノ酸であり、そしてqは０又は１である）の部分であってもよい。切断可能部分はまた式Arg-(N)q（但し式中、Nはいずれかのアミノ酸であり、そしてqは０又は１である）の部分であってよい。また切断可能部分は式Lys-(N)q（但し式中、Nはいずれかのアミノ酸であり、そしてqは０又は１である）の部分であってもよい。更に切断可能部分は、一方がArg又はLysである二つのアミノ酸の配列であってもよい。代替的には、切断可能部分は、Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Thr(SEQ ID NO: 7)； Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg (SEQ ID NO: 8)；Glu-Arg-Nle-Phe-Leu-Ser-Phe-Pro(SEQ ID NO: 9)； Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln (SEQ ID NO: 10)；Arg-Gly-Val-Val-Asn-Ala-Ser-Ser-Arg-Leu-Ala (SEQ ID NO: 11)；Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Phe-Lys (SEQ ID NO: 12)； Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys(SEQ ID NO: 13)；Glu-Val-Lys-Val-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO: 14)；His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Lys (SEQ ID NO:15)；Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe(SEQ ID NO: 16)；Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu (SEQ ID NO: 17)；Pro-Gln-Gly-Leu-Glu (SEQ ID NO: 18)； Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(SEQ ID NO: 19)；Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-Lys (SEQ ID NO: 20)；Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 21)； Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser(SEQ ID NO: 22)； Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-Lys (SEQ ID NO: 23)；Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg (SEQ ID NO: 24)； Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (SEQID NO: 25)； Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 26)；Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg (SEQ ID NO: 27)； Asp-Glu-Val-Asp (SEQ ID NO: 28)；Asp-Met-Gln-Asp (SEQ ID NO: 29)； Leu-Glu-Val-Asp (SEQ ID NO: 30)；Val-Glu-Ile-Asp (SEQ ID NO: 31)； Ile-Glu-Thr-Asp (SEQ ID NO: 32)； 及びLeu-Glu-His-Asp(SEQ ID NO: 33)から成る群のうちのいずれかの一つであってもよい。
【００５１】
ＩＩ．  ポリマ担体
本発明のポリマ担体には、直鎖状又は分枝状構造のポリマ及びコポリマ、あるいはその結合体、ミセル、乳濁液、コロイド及び固体表面が含まれ、その上この場合のポリマは少なくとも二種のポリマを含む超分子構造に自己集合してもよい。コポリマには、主なポリマ要素の一方として、疎水性結合性基又は金属結合性基としての骨格コアポリマと、そしていくつかの実施態様では、PEG又はmPEGなどの保護側鎖とが含まれる。
【００５２】
骨格はポリアミノ酸などの直鎖状ポリマでよく、例えばホモポリマ又は核酸でもよく、あるいは糖質などの分枝状ポリマでもよい。一例では、本発明のポリマ担体組成物は、重合の程度が２乃至１０，０００の範囲の骨格直線状ホモポリアミノ酸コアを含み、このコアに、個別かつ共有結合的にポリグリコール酸側鎖及びキレート基が連結しており、このときこの鎖及びキレート基は骨格コアポリマに個別に連結している。別の例では、骨格コアの重合の程度は１００乃至１，０００の範囲である。更に別の例では、重合の程度は１００乃至３００の範囲である。ポリマ骨格コアの例には、カルボキシル化又はカルボキシメチル化直鎖状ポリ-1-リジン(PL) 又はポリ-D-リジン、カルボキシル化又はカルボキシメチル化ポリ-アルファ,ベータ-(2-アミノエチル)-D,L-アスパルタミド；ポリ-アスパラギン酸、ポリ-グルタミン酸、正又は負に帯電したアミノ酸を持つヒスチジンのコポリマ、カルボキシル化ポリエチレンイミン、即ち炭酸の誘導体と反応させたポリエチレンイミン、がある。好適な実施態様では、骨格直鎖状コアはポリ-リジンを含む。
【００５３】
別の実施態様では、本ポリマ担体は更に保護側鎖を含む。ある実施態様では、前記保護側鎖はポリエチレングリコール(PEG)を含む。更なる実施態様では、前記保護側鎖はアルコキシポリエチレングリコールを含む。更なる実施態様では、前記保護側鎖はメトキシポリエチレングリコール(MPEG)を含む。本実施態様の保護側鎖はポリマコア重量とは独立に２００乃至６０，０００ダルトンの質量、好ましくは１，０００乃至４０，０００ダルトンの質量、そしてより好ましくは２，０００乃至２０，０００ダルトンの質量を有するであろう。
【００５４】
ポリマ担体の金属結合性ドメインには、窒素を含むポリカルボン酸が含まれてもよいが、この場合、カルボン酸基の少なくとも一つは、本発明の組成物の担体骨格ポリマ成分へのキレートの共有結合に用いられてもよい。本発明のポリマ担体組成物に含まれたキレートへ前記金属イオンを室温か、又は、高温で添加すると、配位錯体（金属−キレート）が形成される。これらの金属−キレート錯体は、精製状態で添加されるにしろ、あるいは、バルクたんぱく質又は血漿タンパク質の存在下で添加されるにしろ、当該ペプチドの金属結合性ドメインに結合することで、ポリマ担体の金属−キレートとペプチドとの間に形成されるはいい錯体を含有するペプチド錯体組成物を形成する。本発明のペプチドのアミノ酸配列には、ペプチドとポリマ担体金属−キレート錯体との間に形成される錯体の安定性を高めるヒスチジン又はシステインを一つ以上、含めてもよい。
【００５５】
担体に付着させる疎水性結合性部分にはアルキル基を含めることができる。更なる実施態様では、前記アルキル基は直鎖状又は分枝状アルキル基を含む。更なる実施態様では、前記アルキル基は少なくとも部分的に飽和していてもよい。更なる実施態様では、前記アルキル基はエチル又はプロピル基を含む。更なる実施態様では、前記アルキル基はブチル、ペンチル又はヘキシル基である。更なる実施態様では、前記アルキル基はCH3(CH2)nCH2 −、CH3 (CH2)nCH2NH−、CH3(CH2)nCO−、CH3(CH2)nCH2O−、CH3(CH2)nCH2S−、−OC(CH2)nCH2−、−OC(CH2)nCH2NH−、−OC(CH2)nCO−、−OC(CH2)nCH2O−、−OC(CH2)nCH2S−、−HNC(CH2)nCH2 −、−HNC(CH2)nCH2 −、−HNC(CH2)nCH2NH−、−HNC(CH2)nCO−、−HNC(CH2)nCH2O−、−HNC(CH2)nCH2S−、−OCH2(CH2)n CH2 −、−OCH2(CH2)nCH2NH−、−OCH2(CH2)n CO−、−OCH2(CH2)nCH2O−、又は−OCH2(CH2)nCH2S−基であり、但しこの場合のnは４以上３４以下である。更なる実施態様では、前記疎水性鎖は−CH2)4NHCO(CH2) nOC-A-OR 3 、−CH2)4 NHCO(CH2)nNHCO(CH2)y CO-A-OR3、−CH2OOC(CH2)nOC-A-OR3、−CH2OOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3 、−CH(CH3)OOC(CH2) nOC-A-OR3、−CH(CH3)OOC(CH2)n NHCO(CH2)yCO-A-OR3 、−CH2COOC(CH2)n CO-A-OR3、−CH2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、−CH2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR 3 、−CH2CONH(CH2) nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、−CH2)2COOC(CH2)n CO-A-OR3 、−(CH2)2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3 、−(CH2)2CONH(CH2 ) n NHCOCH2CH2-A-OR3、−(CH2)2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、−(C6H4)OCO(CH2)nCO-A-OR3、及び−(C6H4)OCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3（但し式中、nは２乃至２２であり；yは２乃至６であり；R 3 はH、(CH2)pCH3又は (CH2)pCOOH（（但し式中、pは０乃至７である））であり；そしてA は [OCH2CH2]x又は[OCHCH3CH2]x（（但しこの場合のxは１７乃至２５０である））、あるいは合計１７乃至２５０ユニットの [OCH2CH2]又は[OCHCH3CH2] の多様な組合せである）である。 別の実施態様では、前記疎水性基は芳香族の環状化合物を含む。更なる実施態様では、前記の芳香族の環はフェニルである。更なる実施態様では、前記の芳香族の環はナフチルである。更なる実施態様では、前記の芳香族の環はコレステロ−ルである。更なる実施態様では、前記の芳香族の環式化合物はフルオレセインであり、フルオレセイン中のカルボキシル基が配向分子として作用するであろう。
【００５６】
ペプチド類似体のポリマ担体の装薬能率は、担体及びペプチド類似体の各組成に応じて様々であろう。ある実施態様では、本発明のペプチド類似体は、非経口的薬物投与に適合性あることが当業で公知の、リン酸緩衝生理食塩水、食塩水、酢酸緩衝液、水又は他の適した溶媒などの適した溶媒に100mgのポリマ担体を溶解又は懸濁させるステップと、最終単位体積が100μl乃至1mlの本発明のペプチド類似体を1乃至200mg、ペプチド類似体が担体に結合するまで混合するステップとにより、ポリマ担体化合物と錯体形成させる。その結果できる調合物は、その後、患者への投与に適した体積での再構築に向けて、凍結乾燥させることができる。本調合物はまた、凍結乾燥前、又は、患者への投与前にろ過滅菌することもできる。代替的には、当該担体を、同様な態様で予め滅菌された本発明のペプチド類似体と混合する前に、フィルタ（0.10μm乃至0.22μmのフィルタ）を通すことによりろ過滅菌することができる。
【００５７】
ＩＩＩ．  ペプチド調合物
患者の投与に向け、本ペプチド錯体組成物は薬学的に許容可能な形で提供される。ある実施態様では、当該バソプレッシン類似体ペプチド又はその塩は、例えば0.22μmのフィルタなどを通して滅菌ろ過され、実質的には無発熱源である製剤として、薬学的に許容可能な賦形剤に入れて提供される。好ましくは、調合しようとするバソプレッシン類似体ペプチドが、HPLC上で単一又は個別化したピ−クで泳動し、その解析時には均一かつ真正なアミノ酸組成及び配列を示し、他の点では、薬学的製品の質を調節する多様な国立組織が設定した標準に合致するとよい。６乃至３６炭素ユニットのアルキル基を持つ類似体はミセルを形成することができ、また適した溶媒に入れて投与することができる。代替的には、６乃至３６炭素ユニットのアルキル基を持つ類似体を、米国特許出願第11/613,183号に解説されたものなどの疎水性のコアを持つ担体に導入することもできる。代替的には、当該のアルキル含有類似体をミセル又はリポソ−ムに取り入れてもよい。２乃至６個のヒスチジン残基を持つ類似体は、米国特許番号第7,138,105号に解説されたものなどの金属含有担体に取り入れることができる。これらの担体は更に、血液からの急速な除去が後に続くであろう、それらの急速な活性化を妨げることにより、これらの類似体の血液循環中半減期を延長するであろう。
【００５８】
治療用用途の場合、選ばれたバソプレッシン−又は他のペプチド−類似体を、担体（例えば援用をもってここに援用することとする米国特許第7,138,105号及び米国出願第11/613,183号に解説されたものなど）及び／又は、選ばれた投与経路により当該ペプチドを送達するのに適した他の薬学的に許容可能な希釈剤又は医薬品添加物と一緒に調合する。他の適した薬学的に許容可能な希釈剤又は医薬品添加物は、従来、ペプチド・ベ−スの薬物と一緒に用いられているものである。一般的な薬物調合の指針についてはRemington’sPharmaceutical Sciences”, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn.,1985を参照されたい。本発明のある実施態様では、化合物は、例えば皮下、筋肉内又は静脈内など、輸注又は注射による投与に向けて調合され、従って無菌かつ無発熱源の形の水溶液として用いられ、選択的には、例えば僅かに酸性又は生理学的ｐＨなど、生理的に寛容できるｐＨになるように緩衝される。このように、本化合物を、蒸留水、又はより好ましくは生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水又は5%デキストロ−ス溶液などの賦形剤に入れて投与してもよい。バソプレッシン／又は他のペプチド類似体、特にアルキル基を持つもの、の水溶性は、必要であれば、可溶性促進剤を導入することにより、高められよう。本発明のバソプレッシン／又は他のペプチド類似体はまた、作用期間を更に延長するために徐放埋め込みデバイスとして調合されてもよい。このような持続的放出調合物の例には、例えばポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコ−ル酸）、メチルセルロ−ス、ヒアルロン酸、コラ−ゲン等の生体適合性ポリマの、好ましくは疎水性部分又は金属キレ−トを共有結合させた複合材が含まれる。薬物ポリマ担体中の分解可能なポリマの構造、選択、及び使用は、A. Domb et al.,Polvmers for Advanced Technologies 3:279-292 (1992)を含む複数の公開文献にレビュ−されてきた。医薬調合物中のポリマを選択及び使用する更なる指針は、M.Chasin and R. Langer (eds.), ‘‘Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,Vol. 45 of “Drugs and the Pharmaceutical Sciences,” M. Dekker, New York, 1990による文章に見ることができる。更にリポソ−ムを用いて、バソプレッシン類似体の作用を更に持続させてもよい。目的の薬物のリポソ−ム調合物をどのように用い、作製するかに関する詳細は、とりわけ、米国特許第4,944,948号；米国特許第5,008,050号；米国特許第4,921,706号；米国特許第4,927,637号；米国特許第4,452,747号；米国特許第4,016,100号；米国特許第4,311,712号；米国特許第4,370,349号；米国特許第4,372,949号；米国特許第4,529,561号；米国特許第5,009,956号；米国特許第4,725,442号；米国特許第4,737,323号；米国特許第4,920,016号に見ることができる。本発明のある実施態様では、当該パッケ−ジは本バソプレッシン／又は他のペプチド類似体（バソプレッシン類似体として同様に変更された）を、付加的な担体、希釈剤及び医薬品添加物有り又は無しで、すぐに投与できる調合物として含有する。代替的には、そして本発明の別の実施態様では、本パッケ−ジは、当該バソプレッシン／又はペプチド類似体を、リン酸緩衝生理食塩水などの適した希釈剤又は医薬品添加物に入れて再構築するのに適した、凍結乾燥型などの形で担体と一緒に、又は担体無しで、提供するものである。ある実施態様では、本パッケ−ジは���水溶性の賦形剤に溶解させた有効量のバソプレッシン／又は他のペプチド類似体を含む注射可能な溶液を含有する無菌充填されたバイアル又はアンプルである。注射可能な調合物の替わりに、本バソプレッシン／又は他のペプチド類似体を他の経路による投与に向けて調合してもよい。錠剤、カプセル等の経口用剤形は、標準的な製薬上の慣行に従って調合することができる。
【００５９】
ＩＶ．  使用の方法
ここで開示する新規な組成物は、提供するペプチド類似体及びポリマ担体の組合せや、患者の基礎疾患又は生理条件、及び／又は、分子タ−ゲット及びその位置に応じて、患者の処置法での使用に選択することができる。本ペプチド類似体組成物は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含むいずれの適した手段又は経路によっても、そして必要に応じて、局所注射でも、投与することができる。非経口投与経路には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与がある。
【００６０】
ペプチド類似体の適した投薬量は、治療しようとする疾患又は状態の種類、疾患の重篤度及び経過、患者の臨床歴及びペプチド類似体への応答、及び、担当医の裁量に応じるであろう。ペプチド類似体は適宜、単一用量、分割された用量、又は一連の処置にわたって患者に投与することができる。再度、本発明は、二種以上のペプチド類似体の混合物や、他の治療薬との併用も考察するものである。
【００６１】
いくつかの実施態様では、当該化合物の投薬量は、大まかに言って、体重1kg当たり約 0.01 ng乃至約1 gの範囲内、具体的には1kg当たり約1 ng 乃至約0.1gの範囲内、そしてより具体的には1kg当たり約100 ng 乃至約10 mgの範囲内であろう。
【００６２】
本ペプチド類似体及びポリマ担体組成物は、良好な医学上の慣例に一致する態様で調合、投薬、及び投与されるであろう。この文脈で考慮する因子には、処置しようとする特定の障害、処置しようとする特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、当該ペプチドの送達部位、投与方法、投与のスケジュ−ル、及び、医療実務者に公知の他の因子、がある。投与されるペプチド組成物及びポリマ担体錯体の「治療上有効量」はこのような考慮により決定され、また、疾患又は障害を防止する、緩和する、又は処置するのに必要な最低量である。
【００６３】
ある患者において最も有効な処置を生ずるであろういずれか特定の化合物の精確な投与時期及び投薬量は、特定の化合物の活性、薬物動態、及び生物学的利用能、（年齢、性別、疾患の種類及び段階、全身の身体状態、医薬の投薬量及び種類に対する応答性を含む）患者の生理学的状態、投与経路等に応じるであろう。ここで提供する指針を用いて、例えば、投与の最適な時期及び／又は量を判断するなど、処置を最適化してもよく、その最適化は、ごく通常の実験しか要さず、あるいは対象の観察及び投薬量及び／又は時期の調節から成るであろう。有効な用量又は量、及び、前記用量の投与時期に対するいずれか可能な影響を、本発明のいずれか特定の組成物について明らかにする必要があるかも知れない。本発明の化合物の投薬量は、当業者に公知の技術により、容易に判定されよう。ある実施態様では、有効な用量は、一群以上の動物（好ましくは１群当たり少なくとも５匹の動物）を用いた通常の実験により、あるいは、適切であればヒトでの治験で、判定できよう。別の実施態様では、本発明の組成物及び処置又は防止の方法の有効性は、当該ペプチド類似体を投与し、目的の疾患又は状態に関連する一つ以上の指数を測定し、そして処置前の同じ指数の数値に対するこれらの指数の処置後数値を比較することで投与の効果を評価することで、評価できよう。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、所望の疾患症状抑制が起きるまで、処置を維持する。従って、処置方法の実施態様には、本組成物の投与後に患者から一回又は順次、血液又は他の体液試料を採取するステップと、例えばHPLC、バイオアッセイ、質量スペクトロノミ−（原語：spectronomy）法など、当業で公知の検定法を用いて遊離ペプチドを定量的に検定するステップとを含めることができる。結果的な数値を、例えば曲線下の面積(AUC)、半減期、Cmax、及び当業で公知の他の薬物動態パラメ−タなど、当業において治療上有効である濃度に対応することが公知の閾値に比較することができる。
【００６４】
概して、疾患又は障害の緩和又は処置は、この疾患又は障害に関連する一つ以上の症状又は医学的問題の軽減を含む。このように、本発明の一実施態様は、患者に投与される徐放性ポリマ担体錯体に新規な長期作用性バソプレッシンペプチド類似体を入れて使用することで、血液量減少性及び低血圧性状態にある多様な臓器への血行を増加させる、及び／又は、血液中の第ＶＩＩＩ因子及びプラスミノ−ゲン・アクチベ−タのレベルを増加させる、方法に関する。本開示のバソプレッシンペプチド類似体を用いた処置法が実用性を有するであろう代表的な疾患又は生理的状態には、限定はしないが、血液量減少症、内臓血管拡張症、全身血管拡張症、低血圧、食道静脈瘤出血、肝腎症候群(HRS)、１型HRS、２型HRS、敗血症、肝硬変、門脈静脈高血圧、食道静脈瘤、穿刺術誘発性循環機能不全、細菌の副産物により誘発される動脈低血圧、麻酔関連低血圧、心臓停止、及び分娩後出血がある。これらの状況下では、本発明のバソプレッシン類似体などの長期作用性血管収縮剤がこれらの患者にとって有益であろう。
【００６５】
別の実施態様では、本発明は、新規なGLPペプチド類似体組成物の使用法に関する。好適な実施態様では、本組成物はインシュリン分泌活性を持つGLP-1類似体である。用語「インシュリン分泌活性」とは、ある物質の、ホルモン・インシュリンの合成を刺激する能力、又は、その刺激を起こさせる能力、に関する。このように、本発明の一実施態様は、新規な長期作用性GLP−1類似体を徐放性ポリマ担体錯体に入れて患者に投与することで、患者のインシュリン・レベルを上昇させると同時に、循環中グルコ−ス・レベルを下げることに関する。ある実施態様では、GLP−1類似体のインシュリン分泌性を、当該類似体を患者に投与し、循環系への免疫反応性インシュリン（IRI）の放出を観察することにより、判定してもよい。IRIの存在は、インシュリンを特異的に検出することができるラジオイムノアッセイの使用や、あるいは、当業で公知の他の方法により、検出される。別の実施態様では、GLP−1類似体の治療効果は、一回、反復、又は食後もしくは糖負荷後の血液試料で循環中血糖変数に対する効果を観察し、該濃度を、絶食時の正常な糖寛容の、糖寛容不全の、又は糖尿病随伴性の数値に対応することが当業で公知の数値や、負荷後糖及びインシュリン、糖鎖付加ヘモグロビン（HbAlc）、脂質やインシュリン耐性パラメ−タに比較することにより、判定することができる。別の実施態様では、本発明は、治療上の実用性を有するGLP−2類似体の組成物の、胃腸管の疾患処置における使用法に関する。具体的には、当該GLP-2類似体は、胃腸管の機能亢進及び維持のための、そして腸管組織の成長促進のための栄養剤として作用させることができる。本発明の方法及び調合物は、好ましくは、約0.1乃至 約 50 mg/ml のGLP-2もしくはその生物学的に活性なフラグメント、好ましくは約 5 乃至約 40 mg/ml、より好ましくは約 7 乃至約 30 mg/ml、更により好ましくは約 10乃至 約 20 mg/ml、そして最も好ましくは約 20 mg/mlを提供するものであるとよい。
【００６６】
本発明は以下の例を参照されるとより良好に理解されるであろう。これらの例は本発明の具体的な実施態様の代表として意図されたものであり、いずれのペプチドも、バソプレッシンに行われる変更と同様に変更可能であり、また同様な遅い活性化が血清存在下では観察されると予測されるため、本発明の範囲を限定するものとしては、意図されていない。ペプチドに応じてその場その場で改変されたペプチドは、ここで提案するGLP−1修飾などの修飾後に活性であってもよい（実施例９；図２０及び２１）。
【００６７】
本発明の好適な実施態様をここで示し、解説するが、当業者であれば、このような実施態様は単に例示として提供されるものであることは自明であろう。本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置換が当業者には想到されるであろう。ここで解説する本発明の実施態様に対する様々な選択肢を本発明の実施に当って用いてもよいことは理解されよう。
【実施例】
【００６８】
実施例
実施例１
二つのシステイン残基（Cys4及びCys9）間をジスルフィド結合させたCH3(CH2)10CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 34)（リジンバソプレッシン類似体であるC12TerA とも言及する）の合成が、カリフォルニア州サンホセのAnaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図２を参照されたい）。このリジンバソプレッシン類似体においては、ラウリン酸をペプチドのＮ末端アミノ基に、ラウリン酸のカルボキシル基と、ペプチドのグリシン残基のアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して付着させた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1409.5Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1410.4 Da と合致する。このペプチドは水溶性の限られた白色粉末であり、 この場合は９０％を超える純度で容易に得られた。このペプチドは水中でミセルを形成することができ（図１０を参照されたい）、それによりペプチドがバソプレッシンへの急速な活性化（表１を参照されたい）及び最終的な失活から保護される。図１１及び１２に見られるように、血清中で２時間、インキュベ−トした後では、バソプレッシン類似体(C12TerA) はヒト臍帯内皮細胞培養株でカルシウムの内向き流入を誘導することができ、生物学的活性の存在が示された。アルキル基（C12）をペプチドに加えると、天然のバソプレッシン（リジンバソプレッシン又はアルギニンバソプレッシン）又はテルリプレッシンなどの他の長期作用性類似体よりもその生物学的活性が長くなる（図１及び表１を参照されたい）。ミセルの形成に加え、このバソプレッシン類似体は（図１７及び１８を参照されたい）、引用をもってここに援用することとする米国特許出願番号第11/613,183号に解説されたものなどの疎水性基を含有するポリマ薬物担体に装薬することができる。
【００６９】
実施例２．
二つのシステイン残基（Cys4 及びCys9）間をジスルフィド結合させたCH3(CH2)10CO-OHC(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 35) (C12TerEとも言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセの注文ペプチド提供業者Anaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図３を参照されたい）。この構造では、１２個の炭素のアルキル基を、ペプチドのアミノ末端に付着させた乳酸のヒドロキシル基に、そのカルボキシル基のアミド結合を介して付着させた。これにより、アミド結合よりも不安定と考えられる加水分解可能なエステル結合が提供され、１２個の炭素の脂肪酸の除去が容易になるであろう。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1481.6Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1482.5 Da と合致する。このペプチドは水溶性の限られたオフホワイトの粉末であり、この場合は９０％を超える純度で容易に得られた。このペプチドは水中でミセルを形成することができ（図１０を参照されたい）、それによりペプチドがリジンバソプレッシンへの急速な活性化（表１を参照されたい）及び最終的な失活から保護される。
【００７０】
実施例３．
二つのシステイン残基間をジスルフィド結合させたCH3(CH2)6CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 36) (C8TerAとも言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセの注文ペプチド提供業者Anaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図４を参照されたい）。このバソプレッシン類似体においては、オクタン酸をペプチドのＮ末端アミノ基に、オクタン酸のカルボキシル基とグリシンのアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して付着させた。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1354Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1354.4 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９０％を超える純度で容易に得られた。
【００７１】
実施例４．
二つのシステイン残基をジスルフィド結合させたCH3(CH2)6CO-OHC(CH3)CO-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 37) (C8TerEとも言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセのAnaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図５を参照されたい）。このバソプレッシン類似体においては、オクタン酸を乳酸のヒドロキシル基にエステル結合を介して付着させ、また乳酸のカルボキシル基をグリシンのアミノ基にアミド結合を介して付着させた。これにより、アミド結合よりも安定性が小さいと考えられる、invivoで加水分解可能なエステル結合が提供され、８個の炭素の脂肪酸の除去が容易となる。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1425.7Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1426.5 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９０％を超える純度で容易に得られた。
【００７２】
実施例５．
二つのシステイン残基をジスルフィド結合させたHis-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 38) (His6Terとも言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセのAnaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図７を参照されたい）。このバソプレッシン類似体においては、６個のヒスチジン残基をグリシンのアミノ基にアミド結合を介して付着させた。これにより、このバソプレッシン類似体を金属キレ−トを含有する保護担体に付着させるのに用いることのできる金属結合ドメインが提供された。ポリマ担体に共有結合させることのできる金属キレ−トの例には、限定はしないが、DTPA-Zn2+、NTA--Zn2+、DTPA-Ni2+、NTA-Zn2+がある。該付着により、患者への投与後にこのリジンバソプレッシン類似体の徐放が提供されるであろう。更に、放出される分子は体内の酵素により活性化してバソプレッシンへの転化を起こすであろう。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する2051.1Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量2051.3 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９５％を超える純度で容易に得られた。
【００７３】
実施例６．
二つのシステイン残基をジスルフィド結合させたHis-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(SEQ ID NO: 39) (His3Terとも言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセのAnaspec社で本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図８を参照されたい）。このバソプレッシン類似体においては、３個のヒスチジン残基を末端グリシンのアミノ基にアミド結合を介して付着させた。これにより、このバソプレッシン類似体を金属キレ−トを含有する保護担体に付着させるのに用いることのできる金属結合ドメインが提供される。ポリマ担体に共有結合させる金属キレ−トの例には、限定はしないが、DTPA-Zn2+、NTA--Zn2+、DTPA-Ni2+、及びNTA-Zn2+がある。金属キレ−トを持つ付加的な担体は、引用をもってここに援用することとする米国特許第7,138,105B2号に開示されている。保護担体への付着により、患者への投与後にこのバソプレッシン類似体の徐放が提供されるであろう。更に、放出される分子は体内の酵素により活性化してバソプレッシンへの転化を起こすであろう。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1639.1Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1639.8 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９５％を超える純度で容易に得られた。
【００７４】
実施例７．
二つのシステイン残基をジスルフィド結合させたHis-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO: 40) (His3Vasと言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセの注文ペプチド提供業者 Anaspec社で、本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図８を参照されたい）。このアルギニンバソプレッシン類似体においては、６個のヒスチジンをペプチドのＮ末端アミノ基に、ヒスチジンのカルボキシル基とグリシンのアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して付着させた。これにより、このバソプレッシン類似体を金属キレ−トを含有する保護担体に付着させるのに用いることのできる金属結合ドメインが提供された。ポリマ担体に共有結合させる金属キレ−トの例には、限定はしないが、DTPA-Zn2+、NTA--Zn2+、DTPA-Ni2+、及びNTA-Zn2+がある。金属キレ−トを持つ付加的な担体は、引用をもってここに援用することとする米国特許番号第 7,138,105 B2 号に開示されている。保護担体への付着により、患者への投与後にこのアルギニンバソプレッシン類似体の徐放が提供されるであろう。更に、放出されるものは体内の酵素により活性化してアルギニンバソプレッシンへの転化を起こすであろう。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する1668Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量1667.9 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９５％を超える純度で容易に得られた。
【００７５】
実施例８．
二つのシステイン残基をジスルフィド結合させたHis-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO: 41) (His6Vasと言及される) の合成が、カリフォルニア州サンホセの注文ペプチド提供業者 Anaspec社で、本発明者の明細に従って行われた。上記の式の公知の標準的アミノ酸は当業者に公知の三文字略語で表されている（化学式全体については図９を参照されたい）。このバソプレッシン類似体においては、６個のヒスチジンをペプチドのＮ末端アミノ基に、ヒスチジンのカルボキシル基とグリシンのアミド基の間に形成されるアミド結合を介して付着させた。これにより、このバソプレッシン類似体を金属キレ−トを含有する保護担体に付着させるのに用いることのできる金属結合ドメインが提供される。ポリマ担体に共有結合させる金属キレ−トの例には、限定はしないが、DTPA-Zn2+、NTA--Zn2+、DTPA-Ni2+、及びNTA-Zn2+がある。金属キレ−トを持つ付加的な担体は、引用をもってここに援用することとする米国特許番号第7,138,105 B2 号に開示されている。保護担体への付着により、患者への投与後にこのアルギニンバソプレッシン類似体の徐放が提供されるであろう。更に、放出されるものは体内の酵素により活性化してアルギニンバソプレッシンへの転化を起こすであろう。合成の最後に決定された分子量はプロトン付加されたペプチド、即ち質量分光解析での分子イオン・ピ−クに相当する2080.5Daであることが判明した。これはプロトン付加したときの理論上の分子量2079.3 Da と合致する。このペプチドは水溶性で、白色粉末であり、この場合は９５％を超える純度で容易に得られた。
【００７６】
実施例９．
イミノ二酢酸 (IDA) 又はニトリロ三酢酸 (NTA) をＣ末端に付加的に含むGLP-1 類似体 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQID NO: 4、及びSEQ ID NO: 5 の合成が、カリフォルニア州サンホセのAnaspec社により、本発明者の明細及び手法に従って行われた（付着は図２０及び２１に示す通りであり、この場合の当該ペプチドはSEQID NO: 2での通り、GLPである）。合成は、イミノ二酢酸又はニトリロ三酢酸誘導体 (遮断されたイプシロン・アミノ基を持つN’,N’,ビス(カルボキシメチル)-リジン)のワン樹脂への付着で開始され、続いて残りのカルボキシル基が遮断された。この合成の結果、以下の配列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-IDA(SEQ ID NO: 42)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-IDA(SEQ ID NO: 43)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-IDA(SEQ ID NO: 44)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-IDA(SEQ ID NO: 45)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NTA(SEQ ID NO: 46)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-NTA(SEQ ID NO: 47)；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-NTA(SEQ ID NO: 48)； 及び
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-NTA(SEQ ID NO: 49)が生じた。
【００７７】
一番目のアミノ酸は、樹脂に固定されたN’,N’,ビス(カルボキシメチル)-リジンのイミノ二酢酸の２級アミノ基又は１級アミノ基（脱遮断の後）に付着させた。これに続き、上に示したアミノ酸を、当業で公知の標準的なプロトコルに従って順に添加した。この例は本発明の範囲を制限するものではなく、いずれのGLP類似体も同様な態様で処理することができることは留意されたい。また、本発明において、最初の６つのアミノ酸(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser)とＮ末端を除き、IDA及びNTAをGLP−1のいずれのアミノ酸のR−基に付着させることもできることも理解されたい。ある具体的な例ではグリシンを最初に付着させた。グリシンの数は、アルギニン添加前で０乃至３であってもよい。これに、上記の配列に従ってArg、Gly、Lys等々が続いた。合成の最後にペプチドを樹脂から切り離し、脱保護し、精製した。このGLP-1 類似体においては、イミノ二酢酸又はニトリロ三酢酸は当該ペプチドのＣ末端カルボキシル基側にある。これにより、金属アフィニティ・カラムを用いたペプチドの精製も容易となる。より重要なことに、これにより、金属キレ−トを含有する保護担体にこのGLP−1又はその類似体を付着させるために用いることのできるGLP−1に付加的な金属結合ドメインが提供される。ポリマ担体に共有結合させる金属キレ−トの例には、限定はしないが、DTPA-Zn2+、NTA-Zn2+、DTPA-Ni2+、及びNTA-Zn2+がある。金属キレ−トを持つ付加的な担体は、引用をもってここに援用することとする米国特許番号第 7,138,105 B2 号に開示されている。保護担体への付着により、患者への投与後にこのGLP−1又はその類似体の徐放が提供される。
【００７８】
実施例１０:  多様なバソプレッシン類似体の生物学的活性の検査
ヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAEC）のバソプレッシン類似体刺激後のカルシウム内向きフラックスを用いて、多様なバソプレッシン類似体の生物学的活性を検査した。用いた材料は：マサチュ−セッツ州ベッドフォ−ド、BDBioSciences社、75 cm2組織培養フラスコ、（カタログ番号137787）に0.2 μm の通気プラグ・シ−ル・キャップ（カタログ番号353136）を付けたもの；メリ−ランド州ウォ−カ−ズビル、Lonza社、ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC) (カタログ番号 CC-2520)； EGM-2 完全補充培地（カタログ番号CC-3162)；カリフォルニア州カ−ルスバッド、Invitrogen/Molecular Probes社、Fura-2 AM（カタログ番号 F-1221)(Fura-2AM は、レシオメトリック及び紫外光惹起性の高アフィニティの細胞内カルシウム指標子である)； アセトキシメチル (AM) エステル型は細胞透過性であるため、非浸潤性の細胞内装薬にとって有用である。細胞内にいったん入ると、このエステルが切り離されて、Fura−2分子が細胞非透過性となるため、中に閉じ込められる。）；本発明者の明細に従ってカリフォルニア州サンホセのAnaspec社により注文作製されたテルリプレッシン誘導体；ミズ−リ州セントルイス、Sigma社、ヒト血清プ−ル(カタログ番号H4522)；ニュ−ジャ−ジ−州フェアロ−ン、Fisher Scientific社製、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) (カタログ番号 BP399-500)；カリフォルニア州カ−ルスバッド、Invitrogen/Gibco社製、トリプシン-EDTA溶液、0.25% (カタログ番号25200-072)；カリフォルニア州カ−ルスバッド、Invitrogen/Gibco社製、熱不活化ウシ胎児血清(FBS) (カタログ番号10438-026)；ニュ−ヨ−ク州コ−ニング、黒ポリスチレン９６ウェル・平底検定プレ−ト（カタログ番号 3916)；ワシントンＤＣ、Bioscan社により流通、フィンランド、ツルク、Hidek社製、カメレオン・プレ−ト・マルチラベル検出リ−ダ−；ニュ−ジャ−ジ−州フェアロ−ン、FisherScientific 社製、ジメチルスルホキシド (DMSO)（カタログ番号 D-136-1)、である。
【００７９】
組織又は細胞培養に用いた方法は以下の通りである： HUAEC (> 0.5 x106 個の細胞) のバイアルを解凍し、それぞれ15mlのEGM−2培地を入れた二つの75cm2フラスコに播種した。細胞を一晩、成長させ、培地を取り替えた。フラスコ中の培地は月曜日、水曜日、金曜日のスケジュ−ルで取り替えられた。細胞をほぼ80%コンフルエントのときに分割した（トリプシンを用いて）。培地を取り除き、フラスコを10 ml 1x PBSで洗浄した。 PBSを取り除き、1.5 ml トリプシン-EDTA 溶液を加え、５分間、３７℃でインキュベ−トした。３mlのpfFBSを加え、細胞を計数した。細胞を 200 x G で５分間、遠心し、EGM-2 培地中に再懸濁させ、1cm2当たり3000-5000 個の細胞になるように新しい75cm2フラスコ内に配分した。
【００８０】
Ca2+-内向きフラックス検定の準備のために、細胞を105細胞／ウェルになるように一枚の黒色96ウェル・プレ−ト内に配分した。細胞を一晩、接着させた後、培地を取り替えた。50μgのFura-2を50 μl DMSO に溶解させ、10 ml PBS/2%FBSに加えた。細胞を、PBS/2% FBS に入れた20 μl の 5 μg/ml Furaで２時間、染色した後、CaCl2及びグルコ−スを添加した180μl EGM-2 培地を加えた (10mM CaCl2 及び 11.1mM グルコ−ス最終濃度)。
【００８１】
検査用の類似体を調製するために、50uM テルリプレッシン（又は誘導体）のDMSOストック溶液を調製した。30 ml の薬物 (500 nM 最終濃度) を3 ml の100% ヒト血清 (熱不活性化していないもの) 中で０、１、２、及び２４時間、３７℃でインキュベ−トした（インキュベ−ト後、氷上に置いた）。
【００８２】
Ca-内向きフラックスを測定するために、Fura-2 蛍光を１ウェル毎に 340 nm ex/510nm em 及び 420 nm ex/510 nm で４回繰り返して（薬物の注射前及びし注射から１６時間後に４回測定）で測定した。t=12secのときに20 μl の テルリプレッシン又は誘導体を500 nM 溶液（又は血清）として最終濃度が1ウェル当たり 50 nM になるように注射した。Fura-2 蛍光は更に１ウェル毎に340nmex/510nm em 及び 420 nm ex/510nm em （薬物の注射前及びし注射から１６時間後に４回測定）で更に１６回繰り返して測定された。コントロ−ルにはヒト血清のみの注射、そして陰性コントロ−ルとしてテルリプレッシン又は誘導体のPBS溶液が含まれた。測定はすべて６重にして行われた。
【００８３】
デ−タ解析はGraphpad Prism バ−ジョン5.0 ソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ、Graphpad software 社)を用いて行われた。デ−タは、注射後の読み取り値から基線読み取り値（薬物の注射前の最初の４回の反復Fura−2蛍光測定の平均）を減算することにより正規化された。該実験結果を図１１−１８に示す。図１２−１６は、Fura−2蛍光の２０回の反復を、x軸を秒での時間とした関数として示す。y軸は相対的蛍光単位［RFU］における蛍光強度を示す。最初の４つのデ−タ時点後に、薬物は組織培養ウェルに注入され、蛍光測定が更に４８秒、続行される。Fura−2蛍光は、刺激に応答して細胞内Ca2＋濃度が増すにつれ、強くなる。
【００８４】
図１１は、ヒト血清中で２時間インキュベ−トした後のテルリプレッシン及び他のバソプレッシン類似体の活性可能を示す。Y軸はfura−2を９６ウェル・プレ−トで装薬したヒト臍帯細胞中の相対的蛍光単位である。蛍光は細胞質中のカルシウムに比例する。バソプレッシンは細胞質内へのカルシウム内向きフラックスを起こさせることで、蛍光の増加を引き起こす。多様なバソプレッシン類似体をヒト血清と一緒に２時間、インキュベ−トし、培養細胞に適用した。蛍光は図示するように３秒毎に１分間の間、読み取られた。適用後、血清により活性化した試料はカルシウムの内向きフラックスを起こし、従って蛍光を増加させる。具体的には、テルリプレッシン類似体C12TerA ( C12Amideとラベルされたもの) は、未修飾のテルリプレッシン及びC12TerE（C12 エステルとして標識された）に比べて顕著なカルシウム内向きフラックスを起こした。
【００８５】
図１２−１３は、テルリプレッシンは血清の存在下で注射された場合のみに完全に活性であることを示しており、それはなぜなら、類似体であるため、完全に活性なバソプレッシンを後に残すためにはアミノ酸の短い配列が切断されねばならないからである。３７℃での予備インキュベ−トなしでもヒト血清の添加がテルリプレッシン活性を上昇させるため、このステップは大変速いか、あるいは、このステップを行う酵素は氷上で活性である。図１２は、バソプレッシンの類似体すべてがPBS中では不活性であることを示す。図１３は、テルリプレッシンは血清中で迅速に活性化して（リジンバソプレッシンになり）、活性はすぐに（０時間で）見られ、その後はすぐに活性を失うことを示す。テルリプレッシンはいったん活性化してリジンバソプレッシンになるとその活性を迅速に失うが、それは血清中で更に分解することが原因である。ヒト血清中に含まれる内因性の成長因子のために、ヒト血清はそれ自体で測定可能なCa内向きフラックス・シグナルを生じる。従って薬物の活性はヒト血清シグナルを越えねばならない。本発明のバソプレッシン類似体であるC8TerA(C8テルリプレッシンアミド)、C12TerA (C12テルリプレッシンアミド) 及びC12TerE (C8テルリプレッシンエステル)は血清中で活性化し、最長４時間、活性のままでいる。長期作用性類似体はアミド結合のあるものである（図１４−１６を参照されたい）。
【００８６】
図１７は、引用をもってここに援用することとする米国特許出願番号第11/613,183号に開示された疎水性基を含有するポリマ担体へのC12TerAの結合を示すスカッチャ−ド表である。PGC-HC18又は20PLPEG555-C18とも呼ばれるこの担体は、15-30kDaのポリリジンから成り、このときアミノ基の５５％はスクシネ−ト・リンカ−を介して結合した5kDa のメトキシポリエチレングリコ−ルを含有するように共有結合的に修飾されており、アミノ基の残りの４５％は、全て米国特許出願番号第11/613,183号に開示されたステアリン酸カルボキシル基にアミド結合している。250μlの担体溶液(2.5 mg/試験管) を 0.20、0.15、0.10、0.075、0.050、及び 0.025 mg の C12TerAと混合した。試料を150 μl のPBSにし、一晩インキュベ−トした。75 μl から結合したものをBio-spin-P30で溶出させた。装薬された担体を含有するボイド容量を、75μlのアセトニトリルを添加してから100kDa MWCO フィルタを通してろ過することで装薬を外した。結合したC12TerA を含有するろ過物をHPLCで定量した。50%アセトニトリル中で同じフィルタを通過したコントロ−ルを各試験管の総C12TerAの基準として用いることで、もとのインキュベ−ション混合物中の遊離C12TerAを計算可能とした。C12-TerAは２．４分で溶出する。1.5ml/分の流速での1−6分からの25-99%アセトニトリルの勾配を用いた。カラムはPhenomenex社製のMercury MS 20x 4mm；2μm； C12 だった。スキャッチャ−ド表は完全には線形ではないが、1-5 μMの平均Kdを推測することができ、疎水性基を含有する担体とのC12TerA の強い相互作用が示され、これはC12TerAの生物学的半減期を延長すると共にその急速な活性化及び分解を遅らせるには充分である。C12TerAの中にはミセルを形成することができ、また、用いた分析技術が原因で結合したと計数されるものもあるかも知れないことは留意されねばならない。
【００８７】
担体に結合させることのできるC12TerA の量は、10 mg/ml の疎水性基含有担体PGC-HC18 又は20PLPEG555-C18の存在下での類似体の量を様々にすることにより、判定された。グラフで提供された担体は20kDaのポリリジンを含有するが、このときポリリジンのイプシロン・アミノ基の５５％は5 kDa のメトキシPEG で誘導体化し、そして４０％はステアリン酸で誘導体化した。図１８に示すように、C12TerA の大半が、疎水性基を含有する担体に結合し、これは、患者に投与されたときのC12TerAの生物学的半減期を延長すると共にその急速な活性化及び分解を遅らせるには充分であろう。
【００８８】
表１は、検査試料を図示した時間、血清に暴露した後、上述した方法に従って検定した実験の結果を要約したものである。検出可能な活性がなかった場合には「−」で、それぞれ僅か乃至高い活性が示された場合には「+」から「+++」として当該尺度で表現されたその結果は、C8又はC12 アルキル基をテルリプレッシンのアミドに結合させて持つテルリプレッシン類似体は、当該類似体を保護し、活性化テルリプレッシンの生物学的活性を少なくとも４時間、維持することを示している。この結果は、テルリプレッシンに疎水性基を添加すると、C12TerAの生物学的半減期を延長し、そして患者に投与されたときにその活性化及び分解を遅らせることができるであろうことを示している。
【００８９】
【表１】
2014062128.tif 000002
【００９０】
実施例１１：  in vivoでのバソプレッシン類似体の生物学的活性の検査
ラットの耳モデルを用い、本発明の金属結合性部分を持つバソプレッシン類似体 His6Terを、長時間のその血管収縮維持能について評価した。該類似体は、40PLPEG537-Zn-キレ−トを含有するポリマ担体に2%の装薬で調合された。該ペプチド類似体−ポリマ錯体を一組のラットの背中に皮下注射し、テルリプレッシンのみも別の組のラットの同様に注射した。耳を基線及び間隔を置きながら最高４８時間まで調べた。ポリマ担体に入れたペプチド類似体を注射されたラットの耳は、公知の長期作用性類似体テルリプレッシンよりも長い薬理学的効果を有しており、それは、His6Ter類似体プラス・ポリマ担体で処理されたラットの耳は６時間目及び２４時間の時点の両方で青白いままだった一方、未調合のテルリプレッシン処理ラットの耳は、６時間目では青白かったが、２４時間目では肉眼でも明白なほど正常な血流のある基線色に戻っていたことが見出されたことでも実証された。
【００９１】
同じモデルを用い、生物学的に活性なリジンバソプレッシンの、ペプチド類似体His6Terからの放出遅延の効果を、ポリマ担体との錯体形成有り又は無しで検査した。実験において、テルリプレッシンをhisタグ金属結合性部分に結合させることでHis6Terペプチド類似体を作製した。His6Ter類似体の一部分を40PLPEG537-Zn-キレ−トに2% 装薬量で調合した。３種類の検査物質をラット群に皮下注射し、６時間後及び２４時間後に耳を調べた。調べた結果、耳の蒼白化は40PLPEG537-Zn-キレ−ト中に調合されたHis6Terの皮下注射から２４時間の間、明白であったが、His6Terのみ及びテルリプレッシンのみは６時間後には蒼白化の喪失を示した。この結果は、ポリマ担体に錯体形成させたペプチド類似体は生物学的に活性なリジンバソプレッシンを、テルリプレッシンのみに比較して、そしてポリマ担体と一緒に調合されていないHis6Terペプチド類似体に比較して、長時間徐放させることができることを実証するものである。
【００９２】
前述の発明は、明晰な理解を目的として描写及び実施例により幾分詳細に解説されてきたが、当業者であれば、付属の請求項の精神及び範囲から逸脱することなく、いくつかの変更及び改良が実施できようことは容易に確認できることであろう。
【００９３】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求項の包含するところと意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【外国語明細書】
2014062128000001.pdf