(57)【要約】【課題】ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の初期段階における症状および病態を有するモデル動物を提供する。【解決手段】ＢＣＲ-ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が、放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物、および、造血幹細胞に、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する工程、および、得られた造血幹細胞を放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植する工程を含む、慢性骨髄性白血病モデル動物の作製方法を提供する。本発明の慢性骨髄性白血病モデル動物は、移植後ヒトＣＭＬ様骨髄増殖性腫瘍を発症する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲ-ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が、放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物。
【請求項２】
前記ヒト以外の動物が、免疫不全マウスまたは免疫不全ラットである、請求項１に記載のモデル動物。
【請求項３】
前記造血幹細胞が、モデル動物と同種の動物由来の造血幹細胞である、請求項１または２に記載のモデル動物。
【請求項４】
髄腔が、脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である、請求項１〜３のいずれか一に記載のモデル動物。
【請求項５】
自己の正常造血幹細胞と移植された細胞が髄腔内に共存している、請求項１〜４のいずれか一に記載のモデル動物。
【請求項６】
慢性骨髄性白血病の初期段階の症状を示す、請求項１〜５のいずれか一に記載のモデル動物。
【請求項７】
造血幹細胞に、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する工程、および、得られた造血幹細胞を放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植する工程を含む、慢性骨髄性白血病モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一に記載の慢性骨髄性白血病モデル動物または請求項７に記載の慢性骨髄性白血病モデル動物の作製方法より得られた慢性骨髄性白血病モデル動物を使用して、慢性骨髄性白血病の薬剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病モデル動物に関し、より詳細には、慢性骨髄性白血病の初期段階の症状が誘導された非ヒト慢性骨髄性白血病モデル動物、および、その作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（以下、「ＣＭＬ」と称する場合もある）は、造血幹細胞（以下、「ＨＳＣ」と称する場合もある）の悪性腫瘍化から生じる骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）である。わが国における慢性骨髄性白血病の頻度は１０万人に１〜２人と比較的まれで、成人における白血病全体の約２０％を占める。
【０００３】
慢性骨髄性白血病の発症する原因は、明確には解明されていなが、慢性期、移行期および急性期（急性転化期）の３段階に分けられる（非特許文献１）。慢性期は無症状であり、病気の進行とともに、血液中の白血球数と血小板数が増加し、その後、次第に貧血になる。さらに、白血球数が増加するに従って、全身の倦怠感や、腹部の膨満感などの症状が現れる。９０％以上のＣＭＬ症例は、フィラデルフィア染色体の存在と関係している。この染色体は、染色体９と２２の間の相互転座から生じて、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を形成する（非特許文献２）。この遺伝子がＣＭＬの病原であり（非特許文献３）、骨髄中のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物（活性化型チロシンキナーゼ）を発現した白血病幹細胞｛ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（ＬＩＣｓ）｝の存在が、ＣＭＬの慢性期の開始に深く関わっている（非特許文献４）。
【０００４】
Ｚｈａｎｇ等は、低細胞性（hypocellularity）、線維症のようなＣＭＬ様骨髄増殖性疾患を呈しているマウスの骨髄微細環境には、特有の変化を確認している。さらに、彼らは、間質由来因子（ＳＤＦ）−１／ＣＸＣＬ１２のダウンレギュレーションおよびＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのアップレギュレーションを含む骨髄におけるケモカイン／サイトカインの発現パターンの変化を検出した。加えて、彼らは、骨髄のケモカイン／サイトカイン発現の変化が、白血病幹細胞の優先増殖に関与することを示し、それは人間のＣＭＬ患者の骨髄において同様に起こることを確認した。これらの確認に基づいて、彼らは、骨髄微細環境において白血病幹細胞が優先して増殖し、正常な造血細胞と置き換わることを提案した（非特許文献５）。
【０００５】
ケモカインは、多種多様な血液細胞および間質細胞によって生成され、様々なタイプの骨髄由来細胞に対して多様な活性を示す。ＣＣケモカイン（ＭＩＰ−1α／ＣＣＬ３）が正常ＨＳＣ増殖に対して直接阻害活性を示す証拠が複数報告されている（非特許文献６−８）。ＣＣＬ３（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  （Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  ３）は、ＭＩＰ−１α（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）としても知られており、ＣＣケモカインファミリーに属する。生体内ＢＣＲ−ＡＢＬ発現誘導によって、骨髄中でＣＣＬ３の異常な発現が生じる（非特許文献５）。さらに、ＣＣＬ３媒介シグナルは、Ａｂｌタンパク質のキナーゼ活性に応じて、正常なＨＳＣおよび白血病幹細胞のin vitro増殖を、異なった方法で、制御することができることが報告されている（非特許文献９、１０）。これらの報告は、ＣＭＬ発症の初期プロセスでの正常ＨＳＣと白血病幹細胞との間の相互作用に、ＣＣＬ３が潜在的に貢献していることを示唆している（非特許文献５）。しかし、その正確な役割は、適切な実験モデル動物がないため不明である。
【０００６】
ヒト由来のＢＣＲ−ＡＢＬオンコジーンを形質導入した骨髄幹細胞を、致死的線量の放射線照射を受けたマウスへ移植することによって、マウスＣＭＬ様骨髄増殖性疾患を誘発することができる（非特許文献１１、１２）。この実験モデル動物は、ＣＭＬ発症におけるＢＣＲ−ＡＢＬオンコジーンの生体内での白血病誘発の役割を調べるために広く使用されている。しかしながら、このモデルでは、静脈投与したＢＣＲ−ＡＢＬ＋白血病細胞が骨髄に移動し増殖してＣＭＬが発症できるように、致死線量の照射により完全に造血系を破壊する。すなわち、このモデルは、ＣＭＬ発症における骨髄微小環境の役割を解明するためには利用できない。さらにまた、致死線量の照射は、一時的な白血球減少症を誘発し、さまざまな成長因子の過剰生産によって、ＣＭＬの症状に重大な影響を及ぼす。
【０００７】
定常状態の下でＣＭＬ発症の過程を観察するために、ＢＣＲ−ＡＢＬ誘導可能トランスジェニックマウスが報告されている（引用文献４）。実際のヒトＣＭＬの初期段階では、限られた病巣で、少数の白血病幹細胞が多数の正常造血細胞と共存する。しかし、このモデル動物は、初期段階にもかかわらず、さまざまな組織にある大部分の造血幹細胞がＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を発現して、白血病幹細胞になってしまう。このように、このモデル動物も、ＣＭＬの初期段階における、正常造血系と限定された数の白血病幹細胞との間の相互作用の研究には適していない
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lahaye, T., et al. Response and resistance in 300 patients with BCR-ABL-positiveleukemias treated with imatinib in a single center: a 4.5-year follow-up. Cancer103, 1659-1669 (2005).
【非特許文献２】Bartram, C.R., et al. Translocation of c-ab1 oncogene correlates with the presence of a Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature 306,277-280 (1983).
【非特許文献３】Sawyers, C.L. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 340, 1330-1340 (1999).
【非特許文献４】Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood 105, 324-334 (2005).
【非特許文献５】Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell 21, 577-592.
【非特許文献６】Broxmeyer, H.E., et al. Comparative analysis of the human macrophage inflammatory protein family of cytokines (chemokines) on proliferation of human myeloid progenitor cells. Interacting effects involving suppression, synergistic suppression, and blocking of suppression. J Immunol 150, 3448-3458 (1993).
【非特許文献７】Dunlop, D.J., et al. Demonstration of stem cell inhibition and myeloprotective effects of SCI/rhMIP1 alpha in vivo. Blood 79, 2221-2225 (1992).
【非特許文献８】Graham, G.J., et al. Identification and characterization of an inhibitor of haemopoietic stem cell proliferation. Nature 344, 442-444 (1990).
【非特許文献９】Eaves, C.J., Cashman, J.D., Wolpe, S.D. & Eaves, A.C. Unresponsiveness of primitive chronic myeloid leukemia cells to macrophage inflammatory protein 1 alpha, an inhibitor of primitive normal hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 12015-12019 (1993).
【非特許文献１０】Wark, G., et al. Abl protein kinase abrogates the response of multipotent haemopoietic cells to the growth inhibitor macrophage inflammatory protein-1 alpha. Oncogene 16, 1319-1324 (1998).
【非特許文献１１】Li, S., Ilaria,R.L., Jr., Million, R.P., Daley, G.Q. & Van Etten, R.A. The P190, P210, and P230 forms of the BCR/ABL oncogene induce a similar chronic myeloid leukemia-like syndrome in mice but have different lymphoid leukemogenic activity. J Exp Med 189, 1399-1412 (1999).
【非特許文献１２】Pear, W.S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood 92, 3780-3792 (1998).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の初期段階における症状および病態を有するモデル動物を提供する。また、ＣＭＬ初期段階における白血病幹細胞の機能を観察できるモデル動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、放射線非照射条件でのＣＭＬモデル動物を提供するために鋭意研究を行った。本願発明者等は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を造血幹細胞｛ｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）｝に導入し、その形質導入細胞をヒト以外の動物の髄腔に注入したところ、該動物が、著しい白血球数の増加や脾臓の腫大等のヒトＣＭＬの症状を呈する骨髄増殖性腫瘍を発症することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．ＢＣＲ-ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が、放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植された慢性骨髄性白血病モデル動物。
２．前記ヒト以外の動物が、免疫不全マウスまたは免疫不全ラットである、前項１に記載のモデル動物。
３．前記造血幹細胞が、モデル動物と同種の動物由来の造血幹細胞である、前項１または２に記載のモデル動物。
４．髄腔が、脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である、前項１〜３のいずれか一に記載のモデル動物。
５．自己の正常造血幹細胞と移植された細胞が髄腔内に共存している、前項１〜４のいずれか一に記載のモデル動物。
６．慢性骨髄性白血病の初期段階の症状を示す、前項１〜５のいずれか一に記載のモデル動物。
７．造血幹細胞に、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する工程、および、得られた造血幹細胞を放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植する工程を含む、慢性骨髄性白血病モデル動物の作製方法。
８．前項１〜６のいずれか一に記載の慢性骨髄性白血病モデル動物または前項７に記載の慢性骨髄性白血病モデル動物の作製方法より得られた慢性骨髄性白血病モデル動物を使用して、慢性骨髄性白血病の薬剤をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のモデル動物は、移植前には骨髄の状態が保存された放射線非照射動物であり、移植後、ヒトＣＭＬの症状を呈する骨髄増殖性腫瘍を発症することから、ヒトＣＭＬ発症初期段階の症状、骨髄状態、細胞状態を再現し、自然発症の白血病と類似した白血病過程、特に、発症初期段階を有する。
【００１３】
また、本発明のモデル動物を用いて、ヒトＣＭＬ発症初期段階の白血病幹細胞の機能を解明することができる。例えば、本モデル動物は、移植部位である始原部位から他の造血器官（例えば、脾臓および肝臓）まで白血病幹細胞の浸潤を調べるために有用である。さらに、ＣＭＬ発症の初期段階の骨髄中の正常造血細胞と白血病幹細胞の間の相互作用を明らかにするために、非常に有用である。
【００１４】
加えて、本発明のモデル動物を用いて、白血病治療剤候補，特に，発症初期段階で効果のある白血病治療剤候補をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】髄腔への移植後の細胞構成のイメージを示す図である。
【図２】ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の導入効率を示す図である。レトロウイルスベクター感染の４日後に、ＢＣＲ−ＡＢＬ導入効率をＧＦＰシグナルによって測定した。ｃ−ｋｉｔ＋ＧＦＰ＋細胞の割合（％）を各パネルに示す。３回の独立実験からの代表的な結果を示す。
【図３】（ａ）ＣＭＬモデルマウス｛レシピエント：野生型（以下、「ＷＴ」と称する場合がある）マウス｝の末梢血の白血球数を示すグラフである。４回の独立した実験の結果であり、○は個々のマウスの末梢血中の白血球数を示す。（ｂ）末梢血白血球のＣＤ１１ｂおよびＧＦＰの発現を示す図である。ＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋細胞およびＣＤ１１ｂ−ＧＦＰ＋細胞の割合（％）を各パネルに示す。４回の独立した実験から代表的な結果を示す。
【図４】ＣＭＬモデルマウス（レシピエント：ヌードマウス）のＣＭＬ様骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）の症状を示す。（ａ）末梢血中の白血球数を示すグラフである。「○」は個々のマウスの末梢血中の白血球数を示し、「＋」は、４週以内に死んだマウスを示す。（ｂ）末梢血白血球のＣＤ１１ｂおよびＧＦＰの発現を示す図である。ＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋細胞およびＣＤ１１ｂ−ＧＦＰ＋細胞の割合を各パネルに示す。１２回の独立した実験から代表的な結果を示す。（ｃ）移植後７０日以内の生存率を示すグラフである（ｎ＝１２）。（ｄ）移植後の脾臓を示す写真である。３回（Ｐｒｅ）または５回（第２週、第３週）の独立した実験からの代表的な結果を示す。（ｅ）ｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋細胞のｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ−１の発現を示す図である。骨髄移植後の第２週と第３週に全末梢血、脾臓、移植骨髄（ｔＢＭ）および非移植骨髄（ｎＢＭ）で分析した。ｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋白血病幹細胞の割合（％）を各パネルに示す。５回の独立した実験からの代表的な結果を示す。
【図５】ＣＭＬモデルマウス（レシピエント：ヌードマウス）の組織病理学的分析の結果を示す。（ａ）ヌードマウスの骨髄に移植した３週間後の全血のギムザ染色（左）およびＧｒ−１の蛍光免疫染色（右）結果を示す。（スケールバー；１００μｍ）（ｂ）脾臓、肝臓および肺組織を、ＣＭＬ様骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）が発達したＣＭＬモデルマウス（レシピエント：ヌードマウス）から収集して、ＨＥ染色を行った。３回の独立実験からの代表的な結果を示す。（スケールバー：２００μｍ）
【図６】ＣＭＬモデルマウス（レシピエント：ヌードマウス）のケモカイン発現を示すグラフである。血清は、図に示す移植後各時点で集められた。ＫＣ／ＣＸＣＬ２、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４およびＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の濃度は、Ｂｉｏｐｌｅｘシステムを使用して決定した。データは、３回の独立実験から平均±ＳＤで表す。Ｐ値は、unpaired Student's t-testによって算出した。
【図７】ＣＣＬ３不全の白血病幹細胞は、ＣＭＬ様骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を発病しないことを示す図である。野生型（ＷＴ）またはＣＣＬ３−／−ドナー由来白血病幹細胞をヌードマウスの髄腔に直接移植した。（ａ）総骨髄細胞は、ＷＴ白血病幹細胞の移植後第２〜３週に分離して、細胞内ＣＣＬ３染色に供した。総骨髄細胞中ｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ−およびｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋細胞は、ｃ−ｋｉｔおよび細胞内ＣＣＬ３の発現を分析するために使用した。ｃ−ｋｉｔ＋ＣＣＬ３＋およびｃ−ｋｉｔ−ＣＣＬ３＋細胞の割合（％）は、各パネルに示されている。３回の独立実験からの代表的な結果を示した。（ｂ）末梢血中の白血球数は、ＣＣＬ３−／−白血病幹細胞の移植後測定した。「○」は、個々のマウスを表す。（ｃ）末梢血中の白血球のＣＤ１１ｂおよびＧＦＰ発現を、ＣＣＬ３−／−白血病幹細胞の移植後測定した。ＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋およびＣＤ１１ｂ−ＧＦＰ＋細胞の割合（％）は、各パネルに示される。５回の独立実験からの代表的な結果を示した。（ｄ）脾臓（ＳＰ）重量は、ＷＴまたはＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞の移植後、図中に示された時点で計量した。「○」は、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Mann-Whitney's U testによって算出した。（ｅ）脾臓（ＳＰ）、移植骨髄（ｔＢＭ）および非移植骨髄（ｎＢＭ）におけるＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞の数は、ＷＴまたはＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞の移植後の第３週に測定した。各シンボルは、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Mann-Whitney's U testによって算出した。
【図８】ＣＣＬ３投与により、ＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞の白血病誘発能力が回復することを示す図である。（ａ）ＣＣＬ３−／−ドナー由来白血病幹細胞が移植されたヌードマウスに、図中に示された時点にヒト組換えＣＣＬ３（大塚製薬により提供）を皮下投与した。コントロールとしてＰＢＳを投与した。（ｂ）末梢血の白血球数（第２週、第３週）、（ｃ）脾臓重量（第３週）及び（ｄ）移植骨髄（ｔＢＭ）中のＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞の数（第３週）を測定した。各シンボルは、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Mann-Whitney's U testによって算出した。
【図９】脾臓重量の変化を示すグラフである。ＷＴ、ＣＣＬ３−／−、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−ドナー由来白血病幹細胞は、ＷＴ、ＣＣＬ３−／−、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−レシピエントマウスの骨髄腔に、図中に示された組合せで直接移植した。脾臓重量は、示された時点で測定した。各シンボルは、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Dunnett testによって算出された。
【図１０】骨髄および脾臓の白血病細胞の存在を示す図である。ＷＴおよびＣＣＬ３−／−ドナー由来白血病幹細胞を、それぞれ、ＷＴおよびＣＣＬ３−／−レシピエントの骨髄腔に直接移植した。移植骨髄（ｔＢＭ）および脾臓（ＳＰ）から分離される総細胞のｌｉｎｅａｇｅマーカーとＧＦＰの発現を、移植後、第２週に測定した。ｌｉｎｅａｇｅ＋ＧＦＰ＋およびｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋細胞の割合（％）は、各パネルに示される。５回の独立実験からの代表的な結果を示した。
【図１１】ＣＣＬ３によって媒介される骨髄の白血病幹細胞の維持には、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５が必要であることを示す図である。ＷＴ、ＣＣＬ３−／−、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−ドナー由来白血病幹細胞を、ＷＴ、ＣＣＬ３−／−、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−レシピエントマウスの骨髄腔に図中に示された組合せで直接移植した。非移植骨髄中、ｌｉｎｅａｇｅ＋ＧＦＰ＋分化白血病細胞（上方パネル）、ｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋未分化白血病細胞（中間パネル）及びＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞（下方パネル）の数を、移植後第２週に測定した。各シンボルは、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Dunnett testによって算出した（Ｎ．Ｓ．：有意差なしを意味する）。
【図１２】ＣＣＬ３によって媒介されるシグナルは、骨髄中で正常造血細胞を移動させることができることを示す図である。（ａ）３０μｌＰＢＳ中の５ｎｇの組み換えマウスＣＣＬ３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を、ＷＴ、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−マウスの骨髄腔に直接投与した。ＰＢＳをコントロールとして投与した。投与された骨髄のｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋ＨＰＣの数は、投与後６時間に測定した。ＰＢＳを陰性コントロールとして処置した場合の細胞数に対するＣＣＬ３を処置した場合の細胞数をコントロールに対する相対値として算出した。データは、３回の独立実験から平均±ＳＤで表す。Ｐ値は、Dunnett testによって算出した。（ｂ）ＷＴまたはＣＣＬ３−／−ドナー由来白血病幹細胞をヌードマウスの骨髄腔に直接移植した。移植骨髄における総ＧＦＰ−細胞およびＧＦＰ−ｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎｅａｇｅ−ＨＰＣの数を、移植後第３週に測定した。各シンボルは、個々のマウスを表す。Ｐ値は、Turkey-Kramer testによって算出した。（ｃ）「正常ＫＬＳ＋細胞／白血病幹細胞競合分析」の実験的な手順のスキーマである。骨髄に移植する前に、ＷＴドナー由来白血病幹細胞は、非導入のＷＴ、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−ＫＬＳ＋細胞と混合した。（ｄ）ＢＭ末梢血の白血球細胞数、（ｅ）脾臓重量、及び（ｆ）移植骨髄のＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞の数を測定した。（ｄ：第２週および第３週；ｅおよびｆ：第３週）。各マウスは、同じ色を有する同じシンボルを用いて示される。Ｐ値は、Dunnett testによって算出した。
【図１３】ＣＣＬ３の骨髄内部投与は、ＨＰＣの組成にはほとんど影響を与えないことを示す図である。３０μｌＰＢＳ中５ｎｇの組み換えマウスＣＣＬ３を、ＷＴマウスの骨髄腔に、直接投与した。ＰＢＳを、コントロールとして投与した。ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋骨髄細胞中のＣＤ３４およびＳｃａ−１の発現を分析した。ＣＤ３４−Ｓｃａ−１＋細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）およびＣＤ３４＋Ｓｃａ−１＋細胞（ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰ）の割合（％）は、各パネルに示される。３回の独立実験からの代表的な結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のＣＭＬモデル動物は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が、放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植されている。
【００１７】
また、本発明のＣＭＬモデル動物の作製方法は、造血幹細胞に、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する工程、および、得られた造血幹細胞を放射線非照射のヒト以外の動物の髄腔に移植する工程を含む。
【００１８】
（動物）
ヒト以外の動物は、哺乳動物が好ましい。野生型（ＷＴ）動物、所望の遺伝子が欠損した動物、免疫不全動物等が挙げられる。好ましくは、免疫不全動物である。また、哺乳動物の中では、マウスまたはラットが好ましい。免疫不全マウスまたは免疫不全ラットがさらに好ましい。免疫不全のマウスやラットは、数種類開発されているが、胸腺を欠損しているヌードマウスまたはヌードラットが最も好ましく用いられる。
【００１９】
（放射線非照射）
従来、レシピエント動物は放射線照射により全身の免疫系が破壊されていた。しかし、本発明では、免疫系を破壊するような放射線の照射がされていないレシピエント動物を用いる。本発明のモデル動物は、放射線照射されないことにより、レシピエントの骨髄内部には、正常な造血幹細胞が存在している。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞を骨髄に移植することにより、正常な造血幹細胞とＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞が髄腔内で共存し、ヒトのＣＭＬ発症初期段階の骨髄内の状態と同様の状態になる。
【００２０】
（髄腔移植）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞は、ヒト以外の動物の髄腔に移植する。髄腔は、骨髄の内腔である。本願発明では、注射器またはその他の道具にて、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞を、髄腔内に直接又は間接的に移植する。移植される骨髄の場所は、限定されず、移植可能であればどこでもよい。移植が容易な骨髄の髄腔は、脛骨または大腿骨の骨髄の髄腔である。また、複数回移植してもよい。マウスであれば、３〜９週齢、好ましくは、４〜８週齢、より好ましくは５〜７週齢のマウスに移植する。
【００２１】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子導入造血幹細胞）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を導入する造血幹細胞は、レシピエントの動物とは別のまたは同一の動物の骨髄から得ることができる。採取した骨髄から既知の造血幹細胞の分子マーカーを用いて造血幹細胞を選択して得ることができる。たとえば、ｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）の細胞を選択することができる。前記造血幹細胞は、モデル動物と同種の動物由来であることが好ましい。モデル動物と同種の動物であって、野生型の動物由来であることが、さらに好ましい。
【００２２】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子）
本発明で用いるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子は、９．２２番染色体の相互転座ｔ（９；２２）の結果生じるＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ遺伝子が融合した遺伝子である。発現タンパク質がチロシンキナーゼ活性を有しＣＭＬの原因となる遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、文献Proc. Natl. Acad. Sci. USA  Vol. 83,pp. 9768-9772, December 1986に記載の遺伝子配列が挙げられる。この配列の、一部欠失、置換、付加された配列も含まれる。これら一部欠失、置換、付加された配列は、好ましくは、上記配列と７０％以上、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００２３】
（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の導入）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の造血幹細胞への導入は、既知の方法により導入することが可能である。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子をウイルスベクターに挿入し、造血幹細胞に導入することができる。ウイルスベクターは既知のベクターを用いることができる。例えば、レトロウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクターが挙げられ、好ましくは、ＭＳＣＶベクターを用いることができる。また、遺伝子導入後の解析のために検出マーカーをコードする遺伝子を付加しておくことができる。例えば、蛍光物質であるＧＦＰをコードする遺伝子を付加することができる。
【００２４】
（移植細胞数）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞の移植細胞数は、適宜調整することができる。モデル動物がマウスの場合は、１マウスあたり、５０〜１００００個、好ましくは、１００〜１０００個、さらに好ましくは、２００〜８００個、最も好ましくは、４００〜５００個移植する。モデル動物がラットの場合は、１ラットあたり、１マウスあたりと同数の移植細胞数、２倍の移植数又は３倍の移植数で良い。
【００２５】
本願発明のＣＭＬモデル動物をＣＭＬ発症の初期段階のモデル動物として使用するときには、移植後１〜５週間、好ましくは移植後２〜４週間での使用が望ましい。
【００２６】
（移植後の症状）
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が導入されている造血幹細胞の移植細胞数は、上記に記載のとおりわずかであり、この少量の造血幹細胞が、骨髄中でレシピエント自身の多数の正常の造血細胞およびドナーからの多数の正常な造血細胞と共存する。移植後、２〜３週間で、著しい白血球増加と脾臓の腫大を呈するＣＭＬ様疾患を発症する。このように、この新規なモデル動物は、特にＣＭＬ発症の初期段階で、骨髄中の正常造血細胞と白血病幹細胞の間の相互作用を明らかにするために、非常に有用である。さらに、このモデルで、右の脛骨の骨髄の髄腔へ直接移植した後、白血病幹細胞は、自発的に移動して、反対側の左の脛骨の骨髄の髄腔で再び増殖した。加えて、ＣＭＬ患者において観察されるような、脾臓および肝臓において骨髄外造血が同様に再現された。このように、このＣＭＬモデル動物は、移植部位である始原部位から他の造血器官（例えば脾臓および肝臓）まで白血病幹細胞の浸潤を調べるために有用である。
【００２７】
（慢性骨髄性白血病の薬剤をスクリーニングする方法）
本発明のモデル動物は、ヒトＣＭＬ発症初期段階の症状、骨髄状態、細胞状態を再現し、自然発症の白血病と類似した白血病過程、特に、発症初期段階を有する。すなわち、慢性骨髄性白血病の薬剤となる候補化合物を本発明のモデル動物に投与すれば、従来の慢性骨髄性白血病の薬剤とは異なり、ヒトＣＭＬ発症初期段階に効果のある薬剤をスクリーニングすることができる。
【００２８】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例は、金沢大学動物実験規定に従って行った。
【実施例１】
【００２９】
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００３０】
（マウス）
特定病原体フリーの５〜７週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ胸腺欠損マウスを、日本チャールス・リバー(株)（横浜、日本）から購入した。それぞれ、本実施例において、ＷＴマウス、ヌードマウスとした。
ＣＣＬ３-/-マウスは、The Jackson Laboratoryから購入した（Bar Harbor, ME）。ＣＣＲ１-/-マウスおよびＣＣＲ５-/-マウスは、それぞれ、Philip M. Murphy博士および松島 綱治博士より贈与を受けた。
これらの遺伝子欠失マウスは、８世代以上のBALB/Cマウスと交配して得た。すべてのマウスは、特別な病原菌フリーな状態で飼育した。
【００３１】
（抗体）
以下のラット抗マウスモノクローナル抗体を使用した。
ａｎｔｉ-ＣＤ４（ＲＭ４−５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＣＤ８（５３−６．７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＣＤ３４（ＲＡＭ３４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ（ＡＣＫ２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-Ｌｙ−６Ａ／Ｅ／Ｓｃａ−１（Ｄ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
ａｎｔｉ-ＭＩＰ−1α／ＣＣＬ３（３９６２４；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）
ａｎｔｉ-ＴＥＲ−１１９（ＴＥＲ−１１９；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
マウスｌｉｎｅａｇｅ抗体カクテルを、アイソタイプコントロールセットと共にＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
個々のラットモノクローナル抗体のためのアイソタイプマッチコントロールＩｇＧを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００３２】
（細胞の調製）
大腿骨および／または脛骨からの総骨髄細胞を、冷磁気細胞分離用緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３％のＦＢＳ添加ＰＢＳ）で洗浄した。総骨髄細胞を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ-１０８３試薬（シグマアルドリッチ）を用いた密度勾配遠心分離によって分離した。そして、ｌｉｎｅａｇｅマーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、Ｂ２２０およびＴＥＲ−１１９）−ｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてソートして、ＫＬＳ＋骨髄細胞を得た。総脾臓細胞は、機械的消化により脾臓より分離した。白血球を、塩化アンモニウム溶解緩衝液（0.826% NH4Cl, 0.1% KHCO3および0.004% EDTA-4Naを含む）により溶解した後に、骨髄、脾臓及び末梢血でのフローサイト分析を行った。
【００３３】
（レトロウィルスの調製）
ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰプラスミドを、文献（Naka, K., et al. Nature 463, 676-680.）に記載の方法で調製した。詳しくは、ＫＬＳ＋骨髄細胞導入用のレトロウィルスを生成するために、ｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて、ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰプラスミドをレトロウイルスパッケージング細胞（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ２９３Ｔ）にトランスフェクションし、培養上清中に産出したレトロウイルスを回収した。
【００３４】
（ＣＭＬモデルマウスの作製）
分離したＫＬＳ＋骨髄細胞を、１％  ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（和光純薬工業）、１００ｎｇ／ｍｌ  トロンボポイエチン、２５ｎｇ／ｍｌ  ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｌｉｇａｎｄ  （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した無血清培地Ｓ−Ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３（三光純薬）で１日間培養した。白血病幹細胞を得るために、ＶｉｒｏＭａｇ  Ｒ／Ｌキット（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）使用して、ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ担持しているレトロウィルスを、培養ＫＬＳ＋細胞に感染させた。右の膝関節を曲げ、そして、膝蓋靭帯より上の脛骨の先端に２９Ｇの針を使用して穴をあけた。その後、３０μｌの量の白血病幹細胞を、インシュリン・シリンジ（テルモ）を結合した２９Ｇの針で注入して、ＣＭＬモデルマウスを作製した。なお、本願発明では、右脛骨および左脛骨を、それぞれ、移植骨髄および非移植骨髄と記載することもある。
【００３５】
（フローサイトメトリー）
単離された白血球を、ＭＡＣＳバッファー中で蛍光染料結合抗体のさまざまな組合せで染色した。細胞内ＭＩＰ−1α／ＣＣＬ３染色のために、白血球を、０．１％のＧｏｌｇｉＳｔｏｐ試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した無血清培地Ｓ−Ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３中に、４時間インキュベートした。その後、細胞内ＣＣＬ３を、ＰＥ結合抗ＣＣＬ３抗体およびＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。各分子の発現を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【００３６】
（組織病理学）
組織サンプルを、Ｕｆｉｘ試薬（サクラファインテック）で固定して、パラフィン・ブロックに包埋した。各４−μｍセクションをヘマトキシリンとエオジンによって染色した。全血サンプルは、ガラススライドに塗布し、１００％のメタノールで固定した。そして、それをギムザ染料または蛍光免疫染色に供した。
【００３７】
（ケモカイン測定）。
血清中のケモカイン発現は、Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２３−ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＢｉｏｐｌｅｘ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で決定した。すべての手順は、kitに記載のマニュアルの指示に従って行った。
【００３８】
（統計解析）
データは、各図凡例に示す方法を使用して統計学的に分析した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【実施例２】
【００３９】
（ＣＭＬモデルマウスの症状の確認）
ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ担持しているレトロウィルスを、精製ＫＬＳ＋細胞に感染させた。感染４日後に、ｃ−ｋｉｔ＋細胞の約１％はＧＦＰレポータータンパク質を発現した（図２）。陽性細胞の割合は、感染後７日まで増加しなかった。各髄腔に総ＫＬＳ＋細胞（約４×１０４細胞）を注入したので、４００〜５００のＢＣＲ-ＡＢＬ発現白血病幹細胞が各マウスに注入されたと算出できる。
【００４０】
始めに、白血病幹細胞をＷＴマウスの髄腔に直接注入した。末梢血（ＰＢ）の白血球数は、移植後２〜３週まで増加して、その後減少した（図３ａ）。ＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋白血病細胞は２〜３週まで末梢血に一過性に現れた、しかし、その数は４週目に減少した（図３ｂ）。非照射の免疫コンピテントマウスでは、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬおよびＧＦＰのような外因性のタンパク質が免疫応答を誘導することより、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋白血病細胞がＴ細胞依存的な免疫応答から生存することができないと考えられた。
【００４１】
次に、白血病幹細胞をＴ細胞依存的な免疫応答を欠いている胸腺欠損ヌードマウスの髄腔に直接注入した。白血病幹細胞が髄腔に注入した後、すべてのヌードマウスはＣＭＬ様白血球増多症を発症した（図４ａおよび図５ａ）。そして、白血病幹細胞から誘導されたＧＦＰ＋細胞（特にＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋細胞）は末梢血で優勢であった（図５ａ、図４ｂ）。白血病幹細胞が投与されたすべてのヌードマウスでは、特徴的徴候である脾臓の腫大が認められ（図４ｄ）、ほとんどのヌードマウスは２ヵ月以内に死んだ（図４ｃ）。さらに、組織病理検査では、脾臓および肝臓における髄外造血、および肺における異常な白血球浸潤が認められた（図５ｂ）。また、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞は、移植骨髄と同様に反対側の非移植骨髄にも存在していた（図４ｅ）。
以上により、本実施例により、本モデルマウスは、非照射レシピエントでＣＭＬ様ＭＰＮ（骨髄増殖性腫瘍）を発症していることを確認した。すなわち、本願発明のモデルマウスは、ヒトのＣＭＬの初期の状態を示すことができる。
【実施例３】
【００４２】
（ＣＭＬの初期段階におけるＣＣＬ３の重要性の確認）
本モデルの初期段階において、正常造血細胞は、骨髄および末梢血で維持されていた。ＭＩＰ−1α／ＣＣＬ３発現がＢＣＲ−ＡＢＬ発現によってポジティブ制御されるという以前の報告と整合して、ＢＣＲ−ＡＢＬが発現している白血病幹細胞の骨髄への移植後第２週に、血清ＭＩＰ−1α／ＣＣＬ３の一過性の増加を確認した（図６）。さらに、フローサイトメトリー解析により、ＣＣＬ３が主にＢＣＲ−ＡＢＬ＋ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ−細胞によって産生され、ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ−細胞によっては、わずかしか産生されていないことを確認した（図７ａ）。
【００４３】
ＣＣＬ３−／−マウスから精製されたＫＬＳ＋細胞が、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子により形質導入されたとき、ＷＴマウスを用いたときと同様に、形質導入効率は約１．５％であった（データは示されていない）。しかしながら、ＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞が、ヌードマウス髄腔に移植されたとき、ＣＭＬ様白血球増加（図７ｂ）および脾臓の腫大（図７ｄ）を誘導できなかった。少数のＣＤ１１ｂ＋ＧＦＰ＋白血病細胞が、骨髄移植後の第３週に出現したが、第４週で消失した（図７ｃ）。さらに、ＷＴ白血病幹細胞（図７ｅ）と比較すると、脾臓および骨髄のＧＦＰ＋白血病幹細胞の数は、著しく低かった。
【００４４】
遺伝子修飾による白血病誘発欠損の可能性を排除するために、ＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞が移植されたヌードマウスに、ＣＣＬ３を投与した（図８ａ）。ＣＣＬ３の投与により、ＣＭＬ様白血球増加（図８ｂ）、脾臓の腫大（図８ｃ）および骨髄のＧＦＰ＋白血病幹細胞の維持（図８ｄ）のような表現型が回復した。
以上により、本実施例により、ＣＣＬ３は、造血組織の白血病幹細胞を維持することによって、ＣＭＬの初期段階において重要な役割をしていることを確認した。すなわち、ＣＣＬ３の作用を阻害する物質は、ＣＭＬの治療剤の候補となりうる。
【実施例４】
【００４５】
（ドナー細胞およびレシピエント細胞でのＣＣＲ１およびＣＣＲ５の発現は骨髄の白血病幹細胞の維持のために不可欠であることの確認）
白血病幹細胞を免疫コンピテントＷＴマウスの髄腔内へ投与した後、第３週までは、白血病幹細胞由来細胞が末梢血（ＰＢ）に出現して、白血球増加は持続した（図３）。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ導入ＷＴマウス由来ＫＬＳ＋細胞がＷＴマウスに移植されると、脾臓の腫大が一過性に現れ、移植後第２週に最大に達して、その後急速に縮小した（図９）。付随して、ｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋細胞は、移植後の第２週に骨髄および脾臓（ＳＰ）で大量に存在した（図１０）。反対に、ＢＣＲ−ＡＢＬ導入ＣＣＬ３−／−マウス由来ＫＬＳ＋細胞が移植されると、わずかに脾臓の重量が増加し、また、骨髄中のｌｉｎｅａｇｅ−ＧＦＰ＋細胞数もわずかに増加しただけであった（図９および図１０）。
上記結果がヌードマウスでの結果に一致していたので、骨髄移植後の第２週の白血病幹細胞の移植効果を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＷＴ）とＣＣＬ３の特定レセプターであるＣＣＲ１またはＣＣＲ５を欠損するＢＡＬＢ／ｃマウスで比較した。
【００４６】
ＷＴ由来白血病幹細胞がＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−マウスの骨髄に移植されたときに、両者は、脾臓を腫大させず（図９）、骨髄中の、ＧＦＰ＋ｌｉｎｅａｇｅ−未成熟細胞、および、ＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞の出現は観察されなかった（図１０）。しかしながら、白血病幹細胞由来ＧＦＰ＋ｌｉｎｅａｇｅ＋成熟細胞は、これらのマウスの骨髄中にＷＴマウスと同程度のレベルで出現した（図１１）。同様に、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−由来白血病幹細胞が移植されたＷＴマウスは、脾臓を腫大させず（図９）、骨髄中の、ＧＦＰ＋ｌｉｎｅａｇｅ−未成熟細胞、および、ＧＦＰ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞の出現は観察されなかった（図１０）。しかし、ＧＦＰ＋ｌｉｎｅａｇｅ＋成熟細胞はＷＴマウスと同程度のレベルで骨髄中に出現した（図１１）。
以上により、本実施例により、ドナーおよびレシピエント細胞上のＣＣＲ１およびＣＣＲ５発現は、成熟細胞への分化のためにではなく、骨髄の白血病幹細胞の維持のために不可欠であることを確認した。すなわち、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５の作用を阻害する物質（アゴニスト、アンタゴニスト等）は、ＣＭＬの治療剤の候補となりうる。
【実施例５】
【００４７】
（ＣＣＬ３シグナルの非存在下での正常造血始原細胞（ＨＰＣ）の白血病幹細胞優性に対する阻害作用の確認）
低いＢＣＲ−ＡＢＬ導入効率（図２）を考慮すると、骨髄移植の直後には、少数のＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＫＬＳ＋白血病幹細胞が、多数のレシピエントおよびドナーの正常ＫＬＳ＋細胞と共存している（図１）。そこで、白血病幹細胞と、レシピエントおよびドナー由来正常造血細胞との間の競合において、白血病幹細胞がＣＣＬ３を利用して生き残ることができると考えた。そして、ＣＣＬ３には、造血始原細胞（以下、ＨＰＣ）を骨髄からの移動させる作用があることから、ＣＣＬ３の骨髄内投与の効果を調べた。
【００４８】
ＣＣＬ３の骨髄内投与は、骨髄のｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋始原細胞の数を、ＷＴマウスでは半分に減少させたが、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−マウスでは減少させなかった（図１２ａ）。しかしながら、ＣＣＬ３の骨髄内投与は、ｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋骨髄始原細胞中の、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）および多能性始原細胞（ＭＰＰ）の組成を変えなかった（図１３）。ＷＴ由来白血病幹細胞の移植は、骨髄中のＧＦＰ非発現総細胞数とｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋始原細胞数を著しく減少させた。そして、ＣＣＬ３−／−由来白血病幹細胞の移植は、これらの減少は軽減された（図１２ｂ）。同様に、ＷＴ由来白血病幹細胞がＣＣＲ１−／−およびＣＣＲ５−／−マウスに移植された場合も、ＧＦＰ非発現の骨髄始原細胞の減少は軽減された（データは示していない）。
【００４９】
ＷＴ  ＫＬＳ＋細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬを導入された後、非導入ＷＴ、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−のＫＬＳ＋細胞と混合させ、得られた細胞集団を、ヌードマウスの骨髄腔に投与した（図１２ｃ）。ＢＣＲ−ＡＢＬを導入したＷＴ白血病幹細胞は、競合細胞の非存在下で、効率的にＣＭＬ様白血球増加および脾臓の腫大を誘導した（図１２ｄおよびｅ）。ＢＣＲ−ＡＢＬ非導入のＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−由来ＫＬＳ＋細胞の混合物は、白血球増増加および脾臓の腫大を軽減させ（図１２ｄおよびｅ）、骨髄中の白血病幹細胞の数を著しく減少させた（図１２ｆ）。しかし、ＷＴ由来ＫＬＳ＋細胞の混合物は、白血球増多症および脾臓の腫大を軽減せず（図１２ｄおよびｅ）、骨髄中の白血病幹細胞の数を著しく減少させなかった（図１２ｆ）。
以上により、本実施例では、白血病細胞由来ＣＣＬ３が、骨髄空間で白血病幹細胞と競合して、正常ＨＰＣにとって代わることができることを確認した。
【００５０】
（総括）
本願発明のモデル動物において、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現している白血病細胞がケモカイン（ＣＣＬ３）の主要な出所であることを確認した。さらに、ヌードマウスの骨髄に直接投与したとき、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現しているＣＣＬ３不全の白血病幹細胞によっては骨髄を占有できず、ＣＭＬ様白血球増加および脾臓の腫大が発症しなかったことを確認した。
さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現している白血病幹細胞がマウスの骨髄に直接投与されたときでも、ＣＣＲ１またはＣＣＲ５（ＣＣＬ３の特定のレセプター）不全マウスの骨髄においては、ＷＴ−マウス由来白血病幹細胞は、生存能力の低下を呈した。
これらの結果は、ＣＣＬ３とそのレセプター（ＣＣＲ１およびＣＣＲ５）間の相互作用とＣＭＬの発症の初期段階の重要な関係を示している。
【００５１】
ＣＣＬ３の骨髄内部投与がＷＴマウス骨髄内のＨＰＣ数を減少させるが、ＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−マウスでは減少させないことを本実施例で示した。ＷＴ由来ＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞をヌードマウスの骨髄に投与したとき、一貫して、骨髄中のｌｉｎｅａｇｅ−ｃ−ｋｉｔ＋ＨＰＣの数を著しく減少させたが、ＣＣＬ３−／−由来ＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞は減少させなかった。ＢＣＲ−ＡＢＬを発現している白血病幹細胞がＣＣＲ１−／−またはＣＣＲ５−／−マウスの骨髄で生存し続けることができない結果から、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現している白血病幹細胞由来ＣＣＬ３は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５を発現している正常ＨＰＣを骨髄から移し、白血病幹細胞の増殖を押し上げることができるとの見解である。
ＣＣＲ１−／−マウス由来ＨＰＣとＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞混合物、または、ＣＣＲ５−／−マウス由来ＨＰＣとＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞混合物が、ヌードマウスの骨髄に投与されたとき、ＣＭＬ様骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）の発症を減衰させたが、ＷＴマウス由来ＨＰＣとＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞混合物では、発症を減衰させなかったという結果は、上記見解を支持している。
【００５２】
ＣＣＬ３は、「骨髄から正常ＨＰＣを移動させて最終的に骨髄中の正常ＨＰＣの数を減らすことによって骨髄のＢＣＲ−ＡＢＬ発現白血病幹細胞の維持」に、決定的に関与することを、本実施例で示した。
さらに、本実施例では、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現している白血病幹細胞由来ＣＣＬ３が、骨髄から正常ＨＰＣを移動させて、最終的に骨髄中に白血病幹細胞のためのスペースを作ることによって、ＣＭＬの発症での重要な役割を有することを示した。
【００５３】
ＣＣＬ３が、ＣＭＬの初期段階において、正常ＨＰＣに対する増殖優位性を有する白血病幹細胞を提供するという作用により、骨髄を含む造血組織で、ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）耐性白血病幹細胞のコロニー形成に関与することができる。
すなわち、ＣＣＬ３遮断を有する物質は、ＣＭＬに対するＴＫＩ治療を補完することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本願発明のＣＭＬモデル動物は、慢性骨髄性白血病の研究に利用することにより、新規治療方法、新規薬剤の開発に利用することができる。また、白血病治療剤候補のスクリーニングに用いることができる。
【図９】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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