(57)【要約】【課題】  本発明の目的はエンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤を得ることにある。  さらには高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患にも有効な製剤を得ることにある。【解決手段】  真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするエンドセリン−１阻害剤、ＳＣＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ＨＧＦ阻害剤、美白剤及び美白用皮膚外用剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするエンドセリン−１阻害剤。
【請求項２】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするＳＣＦ阻害剤。
【請求項３】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするｂＦＧＦ阻害剤。
【請求項４】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするＨＧＦ阻害剤。
【請求項５】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とする美白剤。
【請求項６】
請求項５の美白剤を配合した美白用皮膚外用剤。
【請求項７】
アコヤガイ属の二枚貝を由来とする真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とする請求項１乃至請求項６のエンドセリン−１阻害剤、ＳＣＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ＨＧＦ阻害剤、美白剤、美白用皮膚外用剤。
【請求項８】
アコヤガイを由来とする真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とする請求項１乃至請求項６のエンドセリン−１阻害剤、ＳＣＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ＨＧＦ阻害剤、美白剤、美白用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニンは、紫外線から生体を保護する役目があり、紫外線を浴びると皮膚内に生成される。しかしながら、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミやソバカスの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。
【０００３】
これまでの美白剤の開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきた。しかし、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。
【０００４】
エンドセリン−１は、２１残基のアミノ酸からなる血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドで、エンドセリン−１は標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン−１の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの原因となる。
また、エンドセリン−１は、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイトとも言う）でエンドセリン−１が産生され（非特許文献１参照）、産生されたエンドセリン−１は、表皮メラニン細胞（メラノサイトとも言う）を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン−１の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる
またエンドセリンは、血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつであり、高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患に有効である。
【０００５】
幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）は、角化細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞等から産生されるタンパク質である。前記ＳＣＦは、多能性造血幹細胞、生殖細胞、肥満細胞、巨核球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞、色素細胞等の増殖や分化を促進する作用を有することが知られている。また、前記ＳＣＦは、シミ部位や紫外線照射等によって発現が亢進することが知られている。前記ＳＣＦとしては、２７３個のアミノ酸残基からなる膜結合型ＳＣＦと、タンパク質分解酵素の作用により切断され、膜から遊離する分泌型ＳＣＦとが知られている。膜結合型ＳＣＦは、角化細胞等に結合したまま色素細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖を促進する。また、分泌型ＳＣＦは、その結合部位にて切断され、細胞膜から遊離し、色素細胞のＳＣＦレセプターに結合することによって、色素細胞の増殖を促進する。
【０００６】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、紫外線照射により角化細胞からの遊離が促進され、遊離されたｂＦＧＦが色素細胞に作用してメラニン合成を促進し、かつ色素細胞の細胞分裂をも促進すると考えられている（非特許文献３参照）。
肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）は、毛母細胞を賦活化するとともに、メラノサイトの増殖を促進させて、メラニン生成を増加させる作用があるということが知られている。
【０００７】
このようにエンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの過剰産生は、色素細胞の過剰増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。したがって、これらの発現を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。
【０００８】
真珠や真珠層由来蛋白加水分解物は加水分解コンキオリンとして化粧品に古くより、利用されており、例えば、ヒスタミン抑制、活性酸素抑制等の効果が知られている。
【０００９】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ［１９９５，  ３７１（２）：１８８−１９０］
【非特許文献２】Ｈａｃｈｉｙａ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， Ｎｏ．１１６， ２００１， ｐ．５７８−５８６
【特許文献１】特開平０６−２１１６２５号公報
【特許文献２】特開平０６−２１１６４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はエンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることであり、特に美白に有効な製剤を得ることにある。
さらには高血圧症、肺高血圧症、くも膜下出血後の脳血管攣縮、腎不全、心筋梗塞、喘息、動脈硬化、血管炎、敗血症等の疾患にも有効な製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが鋭意検討した結果、真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物が上記目的を達することがわかった。
ここで利用する真珠及び真珠層について説明する。
まず、真珠とは，生きた真珠貝の中で球状または半球状(多少の変形を含む)に形成される代謝生産物であって，かつ，この外見しうる部分の主たる構成物質が，真珠貝の真珠層と等質であるものをいう。
真珠貝は貝殻に真珠層を有する貝類をいうが、二枚貝綱、腹足綱、頭足綱などのうち特定の古い系統の貝類を指し、例示すれば、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイ、ベニコチョウガイ、マベガイ等のアコヤガイ属の二枚貝類の他に、イガイ、ムラサキイガイ、ヤコウガイ、イケチョウガイ、カワシンジュガイ、カサガイ等が挙げられる。
このうち、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイが養殖も実施されており原料の確保の点から好ましい。
【００１２】
真珠はそのままか或いは核を取り除く。
真珠層を有する貝殻を利用する場合は貝殻に付着した、触手動物、軟体動物、節足動物、環形動物、脊索動物、海藻類等々多種多様の生物や海泥等の無機物を、水、ブラシ、ヘラ等で取り除く。（勿論貝肉等もなるべく取り除いておく）
また、貝殻の内、殻皮層、稜柱層は場合によっては、ブラシ、ヘラ、グラインダーを用いて取り除く。また、特開昭６２−１２０３１９号公報、特開２００３−２５０４８９号公報、特開２０１１−７２２０７号公報等にも種々の方法が記載されているので任意の方法を選択すればよい。
以上、真珠或いは真珠層を有する貝殻の一方又は両方より、炭酸カルシウム等を除くために脱灰する。これをスムーズに行うために破砕・粉砕工程を必要に応じて加える。
破砕・粉砕は、金槌、棒等で破砕してもよいし、ジャイレトリクラッシャー 、コーンクラッシャー、シングルロールクラッシャー、ダブルロールクラッシャー 、インパクトクラッシャー、ボールミル、ハンマーミル、ロッドミル等のクラッシャーや粉砕機を用いて破砕・粉砕を行ってもよい。
【００１３】
脱灰は通常酸を用いて行われる。用いる酸は、カルシウムと反応して水に溶解するものであれば用いることができる。例示すれば、塩酸、硝酸、乳酸、酢酸、グリコール酸等の無機酸、有機酸を挙げることができるが、なかでもコストの面から塩酸が選択される場合が多い。塩酸を使用するときは発泡するので、必要に応じて、水を加えて、徐々に塩酸を加えながら撹拌する。撹拌は加えた水の量、貝殻の粉砕程度、反応温度、発砲の程度等によって撹拌の強度を選択する。
また、反応時間は粉砕の程度、反応温度等によって変化するが、１０時間〜１０日間程度が好ましい。
加える塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解する程度でよいが、後工程の蛋白の加水分解工程で酸を用いる場合は加水分解時の酸濃度が変化するので、塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解するに必要な量より若干多めにし、充分に脱灰しておく。
これを遠心分離、濾過等で不溶物を集める。用途によっては後述する脱塩工程を実施する場合、脱塩の方法によってはこの工程で充分に塩を取り除く必要があるので、不溶物に水を加えて、撹拌後、遠心分離、濾過等で不溶物を集める工程を複数回繰り返すとよい。
【００１４】
集めた不溶物を加水分解する。加水分解の方法は酸、アルカリ、蛋白分解酵素等を用いて行うが、真珠或いは真珠層の蛋白は通常の蛋白分解酵素では分解できないので、酵素の種類、分解条件を工夫する必要がある。
酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、亜硫酸、シュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸、乳酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が例示されるが、このうちの１種又は２種以上を用いて、さらには蛋白分解酵素と組み合わせて蛋白を加水分解する。この中でもよく用いられるのは、塩酸、硫酸が挙げられる。
加水分解の条件は、酸、アルカリ、酵素の種類によって選択されるが、塩酸や硫酸を用いる場合は、１〜１０モル、室温〜１２０℃、１時間〜１０日間程度がよく、加圧も加えてもよい。
加水分解後、酸やアルカリを用いた場合は中和、酵素を用いた場合は加熱等の失活操作を必要に応じて行う。さらに用途によっては、完全に或いは一部脱塩する。
その後、必要に応じて脱色工程や乾燥工程を加え、真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を得る。
また、特開昭６２−２２３１０４号公報、特開平０２−０７６５９７号公報、特開平０５−０４３４４４号公報の方法も参考になる。
【００１５】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１６】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１７】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１８】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１９】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００２０】
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２２】
製造例１
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約１〜５mm程度に粉砕したアコヤガイ貝殻５０kgに水４５０kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１００kgを徐々に加えた。さらに水１００kgを加え３日間撹拌した。塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３kgを徐々に加えた。
ｐＨ７になるように２５％水酸化ナトリウムで調整した後水２００kg加えた。これをシャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、０．１モル塩酸２０kgを加えて２４日間ゆっくり撹拌した。これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
この沈殿２００ｇに１０倍希釈した硫酸を３kg加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化バリウムを徐々に加えながらｐＨ３．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みにアンバーライトＩＲＡ９１０をｐＨ７．０になるまで徐々に加えた。これを濾過して濾液に活性炭を１０ｇ加え３０分間撹拌した。
これを濾過し、凍結乾燥した。
【００２３】
製造例２
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約１〜５mm程度に粉砕した黒蝶貝殻５kgに水４５kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水１０kgを加え３日間撹拌した。塩酸１kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３００ｇを徐々に加えた。
１０％硫酸５００ｇを加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化ナトリウムを徐々に加えながらｐＨ７．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みを得た。これに２倍量のエタノールを加え、ゆっくり撹拌した後、４℃で１週間静置した。
これを濾過し、凍結乾燥した。
【００２４】
製造例３
市販品の加水分解コンキオリン液をエバポレートしたのち、凍結乾燥したものを用いた。（同品は加水分解コンキオリン、エタノール、水で構成されており、アコヤガイを由来とする）
【００２５】
確認試験１  ＤＮＡマイクロアレイ解析
試験方法は、製造例１の０．５％を表皮ケラチノサイトに作用して４８時間後に上記（ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ）と同様にしてコントロールと共にＲＮＡを抽出し、各３μｇのＲＮＡからＱｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，  ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣｙ３，Ｃｙ５標識プローブを作成した。Ｑｕｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて標識プローブを精製後、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅスライド（４×４４Ｋ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で６０℃、１７時間ハイブリダイズした。洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてスキャンし、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使ってデータ処理を行った。
【００２６】
試験結果は、Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏとして、エンドセリン−１は−０．２７８、ＳＣＦは−０．９０２、ｂＦＧＦは−０．６７０、ＨＧＦは−０．２５７となった。
【００２７】
確認試験２  ｍＲＮＡ遺伝子発現試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、製造例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００２８】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００２９】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
【００３０】
＜使用プライマー＞
エンドセリン−１：フォワードプライマーがＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＳＣＦ：フォワードプライマーがＣＴＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＡＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣ（配列番号４）の塩基配列とのセット
ｂＦＧＦ：フォワードプライマーがＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番号５）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＣ（配列番号６）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号７）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号８）の塩基配列とのセット
【００３１】
確認試験２は製造例をすべて０．５％作用させて実験した。製造例１のの結果を図１に示す。
結果を見ると、製造例１は、コントロールを１としてＳＣＦは約０．４、エンドセリン−１は約０．７、ｂＦＧＦは約０．６となり、製造例１はこれらの遺伝子の働きを抑制することがわかった。
製造例２の結果を図２に示すが、これもコントロールを１としてＳＣＦは約０．６５、エンドセリン−１は約０．５５となった。
製造例３の結果を図３に示すが、コントロールを１としてＳＣＦは約０．３５、エンドセリン−１は約０．２５となった。
【００３２】
このように、アコヤガイ由来の製造例１は、ＤＮＡマイクロアレイ解析で、エンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦの各遺伝子の発現を抑制することが示された。
さらに、定量的なｍＲＮＡ遺伝子発現試験で、エンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦの各遺伝子の発現を確認したところいずれも抑制することを確認した。
また、クロチョウガイ由来の製造例２や市販の加水分解コンキオリン液（アコヤガイ由来）でもエンドセリン−１、ＳＣＦの遺伝子発現を抑制することを確認した。
【００３３】
また、製造例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、エンドセリン−１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの過剰産生を抑制し、皮膚を健全に保ち、且つ美白に有効な製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】製造例１の終濃度０．５％での確認試験２の結果で、ＳＣＦ、エンドセリン−１、ｂＦＧＦの遺伝子発現量変化を示す図である。  縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図２】製造例２の終濃度０．５％での確認試験２の結果で、ＳＣＦ、エンドセリン−１の遺伝子発現量変化を示す図である。  縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図３】製造例３の終濃度０．５％での確認試験２の結果で、ＳＣＦ、エンドセリン−１の遺伝子発現量変化を示す図である  縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図１】
2014074017.tif 000003
【図２】
2014074017.tif 000004
【図３】
2014074017.tif 000005
【配列表】
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