(57)【要約】【課題】  脆弱な材料に適用可能な耐衝撃特性評価方法および疲労特性評価方法、ならびに、耐衝撃特性評価装置および疲労特性評価装置を提供する。【解決手段】  脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含む、脆弱試料の耐衝撃特性評価方法、脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含むサイクルを、複数回繰り返すことを含む、脆弱試料の疲労特性評価方法、ならびに、試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えた、脆弱試料の耐衝撃特性評価装置および疲労特性評価装置。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含む、脆弱試料の耐衝撃特性評価方法。
【請求項２】
落下させた液滴を計量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含むサイクルを、複数回繰り返すことを含む、脆弱試料の疲労特性評価方法。
【請求項４】
繰り返したサイクルの回数を計数する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料がシート状細胞培養物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
液滴１個あたりの質量が１〜１０００ｍｇである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えた、脆弱試料の耐衝撃特性評価装置。
【請求項８】
液滴計量器をさらに備えた、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えた、脆弱試料の疲労特性評価装置。
【請求項１０】
サイクルカウンタをさらに備えた、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
破損検出器をさらに備えた、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
破損検出器が、導電率センサ、抵抗計、ｐＨセンサ、イメージセンサ、比色計、分光光度計、色彩計、測色計、吸光度計、濁度計、透視度計、色度計、温度センサ、赤外線センサからなる群から選択されるセンサを備えている、請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脆弱試料の耐衝撃特性評価方法および耐衝撃特性評価装置に関する。本発明はまた、脆弱試料の疲労特性評価方法および疲労特性評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。
【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００４】
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。
【０００５】
このような細胞培養物を臨床応用する場合には、その適用可能性や有効性、安全性、保存性、移送性などを担保するため、製造方法を最適化する指標の設定や、品質管理の一環としてシート状細胞培養物の強度や耐久性を評価することが必要である。特許文献１には、細胞培養物の培養基材からの脱着の容易性などから定性的・経験的にその強度を推定したことが記載されている。また、特許文献４には、シート状細胞培養物などの脆弱試料を、該試料が液中もしくは液面に位置する状態で、荷重測定装置に連結された固定表面に固定し、その引張特性を測定する方法および装置が記載されている。しかしながら、シート状細胞培養物などの脆弱試料の耐衝撃特性や疲労特性を評価する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９９１号公報
【特許文献４】特開２０１２−１５９４０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒトを含む動物へ移植し、治療することを目的とするシート状細胞培養物は、移植可能な耐衝撃特性や疲労特性を有する必要がある。例えば、シート状細胞培養物移植後、止血などの目的で移植部位にフィブリン糊を噴霧することがあるが、その際、シート状細胞培養物は噴霧による衝撃にさらされる。しかしながら、本発明者は、移植用のシート状細胞培養物の研究を進める中で、シート状細胞培養物の中には、脆弱なため、従来用いられる衝撃試験や疲労試験による評価が困難なものがあることを見出した。本発明の目的は、脆弱なシート状細胞培養物、さらには脆弱な材料一般に広く適用可能な耐衝撃特性評価方法および疲労特性評価方法、ならびに、耐衝撃特性評価装置および疲労特性評価装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、脆弱なシート状細胞培養物に、所定の高さから液滴を落下させ、破損の有無を検出する工程を複数回繰り返すことで、破損に要する衝撃力および衝撃回数を定量化し、耐衝撃特性および疲労特性を評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含む、脆弱試料の耐衝撃特性評価方法。
（２）落下させた液滴を計量する工程をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）脆弱試料に液滴を落下させる工程と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程とを含むサイクルを、複数回繰り返すことを含む、脆弱試料の疲労特性評価方法。
（４）繰り返したサイクルの回数を計数する工程をさらに含む、（３）に記載の方法。
（５）試料がシート状細胞培養物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）液滴１個あたりの質量が１〜１０００ｍｇである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えた、脆弱試料の耐衝撃特性評価装置。
（８）液滴計量器をさらに備えた、（７）に記載の装置。
（９）試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えた、脆弱試料の疲労特性評価装置。
（１０）サイクルカウンタをさらに備えた、（９）に記載の装置。
（１１）破損検出器をさらに備えた、（７）〜（１０）のいずれかに記載の装置。
（１２）破損検出器が、導電率センサ、抵抗計、ｐＨセンサ、イメージセンサ、比色計、分光光度計、色彩計、測色計、吸光度計、濁度計、透視度計、色度計、温度センサ、赤外線センサからなる群から選択されるセンサを備えている、（１１）に記載の装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の耐衝撃特性評価方法および耐衝撃特性評価装置により、脆弱な材料の耐衝撃特性を簡単な操作で評価することが可能となり、シート状細胞培養物などの製造方法の最適化や品質管理の拡充に資することができる。また、液滴を複数回落下させることで、脆弱試料の疲労強度をも評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の耐衝撃特性評価装置の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施態様に基づき、本発明を説明する。
［耐衝撃特性評価方法］
まず、本発明の耐衝撃特性評価方法について説明する。
本発明の耐衝撃特性評価方法は、脆弱試料に液滴を落下させる工程（滴下工程）と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程（破損検出工程）とを含む。
また、本実施態様の耐衝撃特性評価方法は、滴下工程と、破損検出工程と、滴下工程において落下させた液滴を計量する工程（液滴計量工程）とを含む。
以下、本実施態様の各工程について説明する。
【００１３】
＜滴下工程＞
滴下工程においては、脆弱試料（以下、単に試料ともいう）に液滴を落下させる。
本発明において、脆弱試料とは、固形の球体や錐体を利用した従来の衝撃試験機（例えば、振り子式衝撃試験機、落球衝撃試験機、落錐衝撃試験機など）での耐衝撃特性の評価が、その脆弱性のために困難であるか、実質的に不可能である試料を指す。
【００１４】
本発明における脆弱試料には、シート状細胞培養物や、プラスチック、紙、織布、不織布、金属、高分子、脂質といった種々の材質のフィルム等が含まれる。脆弱試料は、シート状、柱状、線状、管状などいずれの形状であってもよいが、滴下位置による衝撃特性のばらつきの少なさや、破損検出の容易性などの観点からシート状であることが好ましい。したがって、本発明における好ましい脆弱試料には、シート状細胞培養物や、種々の材質のフィルムなどが含まれる。脆弱試料は、１枚のみを単層の状態で滴下工程に供してもよいし、２枚以上を重ねた積層の状態で滴下工程に供してもよい。後者の場合、積層の各層は互いに連結していても、連結していなくてもよく、連結している場合は、重なり合っている部分が全て連結していても、部分的に連結していてもよい。積層状態のシート状細胞培養物は、例えば、単層もしくは多層のシート状細胞培養物上に、別の単層もしくは多層のシート状培養物を重ね、所定の時間培養することにより作製することができる。
【００１５】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００１６】
シート状細胞培養物は、上記の構造を形成し得る任意の細胞から構成される。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、上皮細胞（例えば、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞）、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、歯根膜細胞、皮膚細胞などが挙げられる。本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞などが好ましい。細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００１７】
また、本発明において、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。シート状細胞培養物は、同一条件で作製された複数のシート状細胞培養物からなるシート状細胞培養物のロットを代表するものであってもよい。この場合、本方法によりかかるシート状細胞培養物に対してなされた耐衝撃特性の評価結果を、同培養物が属するロット全体に適用することができる。
シート状細胞培養物は、任意の既知の手法によって製造されたものであってよい。シート状細胞培養物の製造方法は、例えば特許文献１〜３等に記載されている。
【００１８】
本発明において、液滴は、液滴を形成し得る任意の液体で構成される。液滴を構成する液体は、試料の耐衝撃特性を顕著に変化させないもの（例えば、試料を分解したり、腐食させたりしないもの）が好ましく、試料に対して不活性なものが特に好ましい。試料が細胞培養物であれば、例えば、生理食塩水、生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、培地などを用いることができる。当業者は、試料の性質に合わせて、適切な液体を選択することができる。液滴の質量および液滴を落下させる高さは、試料の耐衝撃特性の評価を適切に行うことができるように適宜調節することができる。液滴１個あたりの質量は、例えば、１〜１０００ｍｇ、５〜５００ｍｇ、１０〜２５０ｍｇまたは２０〜１００ｍｇとすることができる。また、液滴を落下させる高さは、１ｃｍ〜１００ｃｍ、２〜７５ｃｍまたは３〜５０ｃｍとすることができる。
【００１９】
液滴の落下により試料が受ける衝撃力は以下のように算出する。一般に、質量ｍ［ｋｇ］の物体が地上より高さｈ［ｍ］のところから落下したときの地上での速さｖ［ｍ／ｓ］は、重力加速度をｇ［ｍ／ｓ２］としてｖ＝√（２ｇｈ）で与えられる。この物体はそのとき、ｍｖ［ｋｇ・ｍ／ｓ］という運動量を持つ。着地によって、この物体は着地面より力Ｆ［Ｎ］を時間Δｔ［ｓ］だけ受け、その運動量はゼロになるため、力Ｆ［Ｎ］が、時間Δｔ［ｓ］の全体にわたり一定であると仮定すると、ＦΔｔ＝ｍｖという関係が成り立つ。作用反作用の関係から、着地面は、前記物体から同じ大きさの力Ｆ［Ｎ］を時間Δｔ［ｓ］だけ受ていることになるため、この力Ｆ［Ｎ］を、着地面がその物体から受ける衝撃力とみなすことができる。ここで、着地面を試料、物体を液滴にそれぞれ置き換えると、本発明の滴下工程において試料が受ける衝撃力Ｆ［Ｎ］は、液滴の質量をｍ［ｋｇ］、液滴を落下させる高さをｈ［ｍ］として、Ｆ＝ｍ√（２ｇｈ）／Δｔにより算出できることになる。したがって、液滴の質量および／または液滴を落下させる高さを変化させることにより、試料が受ける衝撃力をきめ細かく調節することができる。
【００２０】
滴下工程で落下させる液滴の数は１個でも２個以上でもよい。２個以上の液滴を落下させた場合、試料が受けた衝撃力は各液滴の衝撃力の総和として算出する。
液滴の供給は既知の任意の手法により行うことができる。例えば、スポイトやシリンジなどを用いて手動で行ってもよいし、液体滴下器により自動的に行ってもよい。液滴の質量、液滴を落下させる高さ、落下の時間間隔（液滴を２個以上落下させる場合）を一定に保つことで、評価の再現性を高めることができる。
液滴が周囲に漏れないよう、試料は液体が漏出しない容器内に配置することが望ましい。
【００２１】
＜破損検出工程＞
破損検出工程においては、液滴による落下衝撃を受けた脆弱試料の破損の有無を検出する。破損の有無は、種々の手法で検出することができる。破損の有無の検出は、例えば、目視によって行うこともできるし、破損により生じる試料の外観の変化を画像解析で検出することにより行うこともできる。また、破損箇所の光透過率の変化を検出することにより行うこともできる。
試料がシート状である場合、試料の破れにより生じる、試料の上下方向の液体の移動を検出することにより、破損を検知することもできる。例えば、液滴を構成する液体を、同液体が試料の破損箇所を通過して試料の下面に流入したときに、当該流入を検出可能な特性を有するものとすることで、当該流入を検出することにより試料の破れを検出することができる。また、液滴を構成する液体とは異なる特性を有する液体を試料の下部に配置することで、試料の下部に存在する液体の特性が、液滴を構成する液体の流入により受ける変化、および／または、試料の上部に存在する液滴を構成する液体の特性が、試料の下部に存在する液体の流入により受ける変化を検出することにより試料の破れを検出することができる。
【００２２】
より具体的には、例えば、液滴を構成する液体に特定の導電率有するもの（例えば、電解質を含むもの）を用いると、試料が破れたときに、試料の上面に存在する液滴を構成する液体が試料の下面に流入し、試料の下面の導電率や電気抵抗が変化するため、この変化を検出することにより試料の破れを検出できる。また、試料の下部に、液滴を構成する液体とは導電率の異なる液体を配置すると、試料が破れたときに、試料の上面に存在する液滴を構成していた液体が試料の下面に流入して、試料の下部に存在する液体の導電率や電気抵抗が変化するとともに、試料の上面に存在する液滴を構成していた液体に、試料の下部に存在する液体の成分が拡散などにより流入し、試料の上面に存在する液体の導電率や電気抵抗も変化するため、この変化を検出することにより試料の破れを検出できる。変化の検出対象とする特性としては、導電率のほか、ｐＨ、光学的特性（色、透明度など）、温度、化学物質の存否または濃度などが挙げられる。
【００２３】
上記の変化は、検出対象となる特性の検出に適した既知の任意の手法により検出することができる。例えば、導電率であれば導電率センサや抵抗計など、ｐＨであればｐＨセンサや指示薬など、光学特性であれば、目視、画像解析、比色計、分光光度計、色彩計、側色計、吸光度計、濁度計、透視度計、色度計など、温度であれば、温度センサ、赤外線センサなどを用いて、変化を検出できる。変化は、検出対象となる特性を連続的にモニターすることにより検出しても、液滴が試料に落下する前後の検出値の比較により検出してもよい。
破損の有無の検出は、液滴を１個落下させた後に行うことも、複数個落下させた後に行うこともできる。
【００２４】
＜液滴計量工程＞
液滴計量工程においては、滴下工程において落下させた液滴を計量する。
液滴の計量は、液滴数の計数または液滴質量の計量によって行う。液滴数の計数または液滴質量の計量は、既知の任意の手法により行うことができる。
液滴数の計数は、目視により手動で行うことも、プロセッサに接続されたセンサなどにより自動で行うこともできる。液滴の落下は、例えば、光学的手法や、電気的手法などにより検出できる。光学的手法の具体例としては、例えば、レーザーなどの光線中を液滴が通過する際に発する散乱光を検出する方法が挙げられる。電気的手法の具体例としては、例えば、電極間を液滴が通過する際の静電容量の変化を検出する方法が挙げられる。液滴の給源となっている液体の質量や体積は、液滴が１個落下するごとにその分減少するため、当該液体の残量の変化を検出することにより、液滴の落下を検出することもできる。また、滴下工程開始前の液体の残量と、液滴計量工程時の液体の残量との差分を、液滴１個あたりの質量や体積で除することで、滴下工程から液滴計量工程までに落下した液滴数を算出することができる。本発明の耐衝撃特性評価装置を使用する場合は、液滴を落下させる際に耐衝撃特性評価装置のプロセッサが液体滴下器に送る滴下信号を検知し、これをプロセッサのカウンタ回路で計数してもよい。
【００２５】
液滴の質量の計量は、液滴の数に、事前に測定した液滴１個あたりの質量を乗じることで算出することができる。また、液滴の給源となっている液体の、液滴落下前の質量または体積から、液滴落下後の質量または体積を減じることで算出することができる。
液滴計量工程は、滴下工程または破損検出工程と同時に行うことも、滴下工程と破損検出工程との間に行うことも、滴下工程と破損検出工程の両方が終了した後で行うこともできる。
【００２６】
計量した液滴数または液滴量は、そのまま耐衝撃特性の指標とすることもできるし、得られた液滴の質量と液滴を落下させた高さとから、上述のように衝撃力を算出し、これを耐衝撃特性の指標とすることもできる。また、破損が検出されるまでの液滴数もしくは液滴量の総量、または、衝撃力の累積値を耐衝撃特性の指標とすることもできるし、所定の液滴数もしくは液滴量を落下させた後、または、所定の衝撃力を負荷した後に破損が生じているか否かを耐衝撃特性の指標とすることもできる。
【００２７】
［耐衝撃特性評価装置］
次に、本発明の耐衝撃特性評価装置について説明する。
本発明の耐衝撃特性評価装置は、試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えている。
また、本実施態様の耐衝撃特性評価装置は、液滴計量器および破損検出器をさらに備えている。
以下、図１を参照して本実施態様の各構成要素について説明する。
【００２８】
＜試料収容容器＞
本実施態様において、試料収容容器１４は、耐衝撃特性評価装置１の台座１６上に配置され、試料３は、試料収容容器１４内の、液体滴下器１０からの液滴４が当たる位置に配置される。試料収容容器１４は、試料３を収容でき、試料３への液滴２の落下を妨げない構造を有する。試料収容容器１４は、内部に存在する液体が漏出しない構造、材質（例えば、ガラス、プラスチックなど）であることが好ましい。また、試料に落下した液滴が周囲に飛散しないような構造とすることもできる。
【００２９】
＜液体滴下器＞
液体滴下器１０は、試料収容容器１４の上部に配置され、試料３に液滴２を滴下する。本実施態様の液体滴下器は、滴下ノズル１０５、流量制御弁１０４および液体タンク１０１を備えている。液体タンク１０１に収容された液体１０２は、流量制御弁１０４を通り、滴下ノズル１０５に到達し、液滴２となり試料３に落下する。本実施態様において、流量制御弁１０４は、プロセッサ１５により電気的に制御されるが、本発明は、流量制御弁が手動で操作される態様や、機械的に操作される態様をも含む。流量制御弁１０４は、液滴２のサイズや質量を一定に保つことができるものが望ましい。
【００３０】
本実施態様において、液体滴下器１０は、滴下ノズル１０５が試料３の鉛直上方に位置するよう、耐衝撃特性評価装置１の支柱１１に、アタッチメント１２を介して垂直方向に摺動可能に固定されており、液滴２を落下させる高さを調節できるようになっている。高さは、１〜１００ｃｍの間で調節可能である。なお、このような高さ調節機構は必須のものではなく、かかる機構を含まないものも本発明の耐衝撃特性評価装置に含まれる。本実施態様においては、液体滴下器１０の位置を変化させることで液滴２を落下させる高さを調節するが、本発明は試料収容容器の位置を変化させて液滴を落下させる高さを調節する態様をも含む。また、本発明の耐衝撃特性評価装置は、試料における液滴の落下位置を変化させる機構を備えていてもよい。これは、例えば、滴下ノズルおよび／または試料収容容器を、試料と水平な平面上で移動させる機構や、試料収容容器を試料と水平な平面上で回転させる機構を含む。
【００３１】
＜液滴計量器＞
液滴計量器は、落下させた液滴２を計量する。本実施態様において、液滴計量器は、液体滴下器１０の液体タンク１０１の内部に設置された水位センサ１０３、および、台座１６に内蔵されたプロセッサ１５で構成され、液滴の計量を液滴質量の計量によって行う。具体的には、水位センサ１０３からの信号をプロセッサ１５が検知し、液体タンク１０１中の液体１０２の体積の変化から、液滴２の質量を算出する。水位センサ１０３の代わりに、または、水位センサ１０３に加えて、質量センサなどを設けてもよい。液滴の計量は、上記のとおり液滴質量の計量によって行うこともできるが（この場合、液滴計量器のことを、液滴質量計量器ともいう）、液滴数の計数によって行うこともできる。液滴の計量を液滴数の計数によって行う場合、液滴計量器（この場合、液滴数計数器ともいう）としては、液滴の落下を例えば、光学的手法や、電気的手法などにより検出する既知のものを使用することができる。また、液滴数計数器は、液滴を落下させる際に耐衝撃特性評価装置のプロセッサが液体滴下器に送る滴下信号を検知し、これをプロセッサのカウンタ回路で計数することで液滴数の計数を行う回路などであってもよい。
【００３２】
＜破損検出器＞
破損検出器は、液滴２の落下衝撃により試料３に破損が生じたか否かを検出する。本実施態様において、破損検出器は、プロセッサ１５、および、これに接続されたイメージセンサ１３で構成され、試料３の破損は、上述のとおり、破損により生じる試料３の外観の変化をプロセッサ１５による画像解析で検出することにより行う。イメージセンサ１３は、試料３の画像を取得できる位置で、支柱１１に固定されている。
プロセッサは、本実施態様のように耐衝撃特性評価装置１に内蔵されていてもよいが、同装置に接続された外部のコンピュータなどで代替することもできる。また、破損の検出は、破損箇所の光透過率の変化を検出することにより行うこともできるため、破損検出器は、光源と、光度センサとを備えたものであってもよい。
【００３３】
試料がシート状である場合、上述のとおり、試料の破れにより生じる、試料の上下方向の液体の移動を検出することにより、破損を検知することが可能なため、破損検出器は、試料の破れを検出するもの（以下、破れ検出器ともいう）であってもよい。破れ検出器の具体例としては、例えば、導電率センサ、抵抗計、ｐＨセンサ、イメージセンサ、比色計、分光光度計、色彩計、測色計、吸光度計、濁度計、透視度計、色度計、温度センサ、赤外線センサからなる群から選択されるセンサを備えたものが挙げられる。これらのセンサは、耐衝撃特性評価装置における検出に適した部位、例えば、試料収容容器内、試料収容容器の上部または下部などに設置することができる。
【００３４】
破損検出器が破れ検出器である場合、試料収容容器は、試料の上面に滴下された液体が、試料の破れ以外からは試料の下面に流入することを阻止する機構を有していてもよい。かかる機構としては、例えば、試料の上面に設置可能で、試料への液滴の落下を妨げない、上下方向に開口した中空の部材などが挙げられる。かかる中空部材を試料上面の液滴落下箇所を含む部分に設置することで、滴下された液体を、当該部材により画定された試料上面の部分に保持することが可能となり、当該液体の、試料の破れ以外からの試料下面への流入を防ぐことができる。当該部材の下面は、試料と液密的に接触することが好ましい。また、当該部材と試料とで画定された空間は、想定される落下液量を上回る容積を有することが好ましい。当該部材と試料とで画定された空間に、落下した液滴からの液体が貯まると、その液体がクッションとなり、試料に衝撃力が伝わりにくくなるため、当該部材は過剰な液体を除去するドレンなどを備えていてもよい。
【００３５】
［疲労特性評価方法］
次に、本発明の疲労特性評価方法について説明する。
本発明の疲労特性評価方法は、脆弱試料に液滴を落下させる工程（滴下工程）と、前記脆弱試料の破損の有無を検出する工程（破損検出工程）とを含むサイクル（滴下−破損検出サイクル）を、複数回繰り返すことを含む。
また、本実施態様の疲労特性評価方法は、繰り返したサイクルの回数を計数する工程（サイクル数計数工程）をさらに含む。
滴下工程および破損検出工程は、本発明の耐衝撃性評価方法について説明したものと同様であるため、以下では、滴下−破損検出サイクルおよびサイクル数計数工程について説明する。
【００３６】
＜滴下−破損検出サイクル＞
滴下−破損検出サイクルは、滴下工程と破損検出工程とを含む。本発明の疲労特性評価方法においては、滴下−破損検出サイクルを複数回繰り返す。本発明の疲労特性評価方法においては、繰り返した滴下−破損検出サイクルの数を疲労特性の指標とするため、１回の滴下−破損検出サイクルで試料に負荷する衝撃力は、試料が破損する衝撃力を下回るように設定することが好ましい。滴下−破損検出サイクルの反復は、試料の破損を検出するまで継続しても、試料の破損の有無に拘わらず、所定の回数繰り返した後に終了してもよい。
【００３７】
＜サイクル数計数工程＞
サイクル数計数工程においては、繰り返した滴下−破損検出サイクルの回数を計数する。サイクルの回数は手動で計数してもよいし、サイクルカウンタなどにより自動的に計数してもよい。
【００３８】
［疲労特性評価装置］
次に、本発明の疲労特性評価装置について説明する。
本発明の疲労特性評価装置は、試料収容容器と、該試料収容容器の上部に配置された液体滴下器とを備えている。
また、本実施態様の疲労特性評価装置は、サイクルカウンタをさらに備えている。
試料収容容器および液体滴下器は、本発明の耐衝撃性評価装置について説明したものと同様であるため、以下では、サイクルカウンタを中心に、本発明の耐衝撃性評価装置と異なっている事項について説明する。
【００３９】
サイクルカウンタは、繰り返した滴下−破損検出サイクルの回数を計数する。サイクル回数の計数は、既知の任意の方式で行うことができる。具体的には、例えば、滴下工程の開始と破損検出工程の終了とを検知し、これを１回のサイクルとして計数する手法が挙げられる。滴下工程の開始は、液滴の落下や、液滴を落下させる際に疲労特性評価装置のプロセッサが液体滴下器に送る滴下信号を検出することなどにより検知することができる。破損検出工程の終了は、破損検出器からの終了信号を検出することなどにより検知することができる。
【００４０】
本発明の疲労特性評価装置においては、１回の滴下−破損検出サイクルで試料に負荷する衝撃力を、試料が破損する衝撃力を下回るように設定することが好ましい。試料に負荷する衝撃力は、上記で既に説明したとおり、液滴の質量や、液滴を落下させる高さを変化させることにより調節することができる。滴下−破損検出サイクルの反復は、試料の破損を検出するまで継続するよう設定することができる。この場合、疲労特性評価装置のプロセッサは、破損検出器から破損検出の信号を受け取ると、液体滴下器に液滴の落下を停止する信号を送る。滴下−破損検出サイクルの反復は、試料の破損の有無に拘わらず、所定の回数繰り返した後に終了するよう設定することもできる。この場合、疲労特性評価装置のプロセッサは、サイクルカウンタが示すサイクル数が所定の値になると、液体滴下器に液滴の落下を停止する信号を送る。
【００４１】
本発明の耐衝撃特性評価装置や疲労特性評価装置は、細胞培養用のインキュベーターや、シート状細胞培養物の剥離装置、ならびに解離された細胞の特性を解析する装置、例えば細胞数を測定する細胞計数装置（ベックマン社製コールターカウンターなど）、バイアビリティを測定する生死細胞自動測定装置、純度を測定するフローサイトメーター等と一体化または接続することにより、細胞の培養からシート状の細胞培養物の作製、その品質管理までを自動化することができる。
【００４２】
また、試料収容容器、液体滴下器、液滴計量器、サイクルカウンタおよび破損検出器の全てを備えた装置は、耐衝撃特性および疲労特性の両方を評価することができる。このような、耐衝撃特性／疲労特性評価装置も本発明に含まれる。
【００４３】
以上、本発明を好適な実施態様について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
実施例１  シート状細胞培養物の調製
耐衝撃特性を評価するための試料として、以下の３種類のシート状細胞培養物を作製した。骨格筋芽細胞としては、ヒト骨格筋試料より単離したヒト骨格筋芽細胞を、２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＭＣＤＢ１３１培地（GIBCO製）で増殖させた後、回収し、１０％のＤＭＳＯを含む凍結保存液内で凍結保存し、凍結保存した細胞を約３７℃に設定したウォーターバス内で解凍し、０．５％のヒト血清アルブミンを含む緩衝液で洗浄したものを各実験に用いた。
【００４６】
（１）シート状細胞培養物１（試料１）
骨格筋芽細胞を４℃環境下で４日間保存した後、２０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）を入れた温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３．５ｃｍディッシュ、セルシード製）に、１×１０７個または５×１０６個播種した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、単層のシートを形成させた後、培養皿の温度を２０℃に降下させてシート状細胞培養物を培養皿から剥離した。得られた細胞培養物の寸法は、直径１５ｍｍ程度、厚さ３０〜６０μｍ程度であった。
【００４７】
（２）シート状細胞培養物２（試料２）
骨格筋芽細胞を−８０℃環境下で急速凍結した後、これを融解し、２０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）を入れた温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３．５ｃｍディッシュ、セルシード製）に１×１０７個または５×１０６個播種した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、単層のシートを形成させた後、培養皿の温度を２０℃に降下させてシート状細胞培養物を培養皿から剥離した。得られた細胞培養物の寸法は、直径１５ｍｍ程度、厚さ３０〜６０μｍ程度であった。
【００４８】
（３）シート状細胞培養物３（試料３）
骨格筋芽細胞を凍結処理容器（BICELL、日本フリーザー製）に入れ、−８０℃環境下で緩速凍結した後、これを融解し、２０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen製）を入れた温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３．５ｃｍディッシュ、セルシード製）に１×１０７個または５×１０６個播種した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、単層のシートを形成させた後、培養皿の温度を２０℃に降下させてシート状細胞培養物を培養皿から剥離した。得られた細胞培養物の寸法は、直径１５ｍｍ程度、厚さ３０〜６０μｍ程度であった。
【００４９】
実施例２  耐衝撃特性の評価
実施例１で調製した各試料に５、１０、１５または２０ｃｍの高さから１ｍLの緩衝液（ＨＢＳＳ）を滴下し（液滴数２０）、滴下後の試料の状態を観察した。結果を表１に示す。衝撃力は、液滴１個あたりの衝撃力Ｆ［Ｎ］を、液滴の質量をｍ［ｋｇ］、液滴を落下させる高さをｈ［ｍ］、試料が液滴の衝撃力を受ける時間をΔｔとして、Ｆ＝ｍ√（２ｇｈ）／Δｔにより算出し、これに落下させた液滴数（２０個）を乗じて求めた。なお、ｍ＝６×１０−５ｋｇ、Δｔ＝０．０１として計算した。
【００５０】
【表１】
2014140323.tif 000002
表１に示すとおり、試料１および２ではそれぞれ１５ｃｍおよび２０ｃｍの高さからの滴下により破損が認められたのに対して、試料３では破損は認められなかった。
【符号の説明】
【００５１】
１        耐衝撃特性評価装置
１０      液体滴下器
１０１    液体タンク
１０２    液体
１０３    水位センサ
１０４    流量制御弁
１０５    滴下ノズル
１１      支柱
１２      アタッチメント
１３      イメージセンサ
１４      試料収容容器
１５      プロセッサ
１６      台座
２        液滴
３        試料
【図１】
2014140323.tif 000003