(57)【要約】【課題】生体上のターゲット位置を正確に検出する。【解決手段】カメラ（撮影装置）１４により、生体（マウス）１２上の複数のマーカ１６を撮影する。解析装置（ターゲット位置検出手段）２０において、撮影された複数のマーカ位置をパターン認識で検出し、検出されたマーカ位置との相対関係に基づいて、ターゲット位置を検出し、ターゲット位置を追跡する。【選択図】図１
2014016657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体に備えられた複数のマーカを撮影する撮影装置と、
撮影された複数のマーカのパターンを予め記憶されている複数のマーカのパターンとのパターンマッチングにより検出し、パターンマッチングにより検出された複数のマーカの位置と、予め記憶されている複数のマーカに対するターゲットの相対位置関係に基づいて、ターゲット位置を検出するターゲット位置検出手段と、
を有し、
ターゲット位置を追跡するターゲット位置追跡装置。
【請求項２】
請求項１に記載のターゲット位置追跡装置であって、
前記マーカは、３個以上あるターゲット位置追跡装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載のターゲット位置追跡装置であって、
前記ターゲット位置検出手段において検出したターゲット位置を記憶する履歴記憶手段を有し、
前記記憶手段に記憶されている過去のターゲットの履歴から、今回検出したターゲット位置を検出するターゲット位置追跡装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のターゲット位置追跡装置において、
前記マーカは、前記生体のターゲットと同様にして発光する生体の部分、または生体に取り付けられた赤外線反射手段、または生体に取り付けられた紫外線発光シンチレータであり、前記ターゲット位置検出手段は前記マーカの発光を検出するターゲット位置追跡装置。
【請求項５】
生体に備えられた複数のマーカを撮影する複数の撮影装置と、
各撮影装置により撮影された複数のマーカのパターンを、予め記憶されている複数のマーカのパターンとのパターンマッチングによりそれぞれ検出し、複数の撮影装置からのマーカの位置検出結果と、予めわかっている複数のマーカに対するターゲットの相対位置関係に基づいて、ターゲットの三次元位置を検出するターゲット検出手段と、
検出したターゲットの発光量を検出する発光量検出手段と、検出したターゲットの発光量をターゲットの三次元位置に応じて、補正する補正手段と、
を有し、
ターゲット位置を追跡しながら、ターゲットの発光量を検出することを特徴とするターゲット発光検出装置。
【請求項６】
請求項５に記載のターゲット発光検出装置において、
前記ターゲット検出手段は、複数のマーカの三次元位置に基づき、生体の向きを検出し、前記補正手段は、検出した生体の向きに応じて、検出したターゲットの発光量を補正するターゲット発光検出装置。
【請求項７】
請求項５または６に記載のターゲット発光検出装置において、
前記マーカは、前記生体のターゲットと同様にして発光する生体の部分、または生体に取り付けられた赤外線反射手段、または生体に取り付けられた紫外線発光シンチレータであり、前記ターゲット検出手段は前記マーカの発光を検出するターゲット発光検出装置。
【請求項８】
請求項５または６に記載のターゲット発光検出装置において、
前記マーカは、紫外線発光シンチレータであり、複数の生体毎に発光色の異なる紫外線発光シンチレータを取り付け、
前記ターゲット検出手段は、紫外線発光シンチレータの発光色の違いから複数の生体を個別に認識し、前記ターゲット発光量検出手段は、個別の生体毎のターゲット発光量を検出し、前記補正手段は各生体のターゲットの発光量を補正するターゲット発光検出装置。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のターゲット位置追跡装置または請求項５〜８のいずれか１つに記載のターゲット発光検出装置であって、
検出したターゲット位置を記憶する履歴記憶手段を有し、
前記記憶手段に記憶されている過去のターゲットの履歴から、今回検出したターゲット位置を検出する請求項１〜４のいずれか１つに記載のターゲット位置追跡装置または請求項５〜８のいずれか１つに記載のターゲット発光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内のターゲットを追跡するターゲット位置追跡装置およびターゲット発光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生きている哺乳動物などの生体対象の目的遺伝子あるいはそのプロモータに対して、蛍光物質遺伝子や発光物質遺伝子を結合させ、対象から発生される蛍光や発光の量を検出することにより、遺伝子発現量を定量化する方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
このような手法により、生体対象における病原体など目標となる細胞の位置や細胞の増減の経過および病変による目的遺伝子産物の量的変化などを知ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０００−５０２８８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、上述のような遺伝子産物等からの蛍光や発光は、微弱であり、暗箱内にて高感度カメラを使用して発光を観測することが多い。
【０００６】
また、正確な測定のためには、測定の条件を同一とするために、対象を動かないように固定することが必要な場合がある。特にマウスやラットを用いる場合には、麻酔条件下で測定を行うこともあるが、この場合には麻酔使用上の制限から、遺伝子発現の経時変化を観測する場合でも、最大６時間程度の短時間でしか測定ができず、日単位や月単位での測定は困難である。
【０００７】
一方、無麻酔無拘束条件下にてマウスやラットについての蛍光や発光の検出をしたいという要求もある。しかし、動きに伴う画像のぼけなどの原因で、蛍光や発光の定量は難しい。また、微弱光である上に、動きによる画像のぼけを伴うことにより、三次元空間内における蛍光や発光の位置を特定することが困難な場合も多い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、生体に備えられた複数のマーカを撮影する撮影装置と、撮影された複数のマーカのパターンを予め記憶されている複数のマーカのパターンとのパターンマッチングにより検出し、パターンマッチングにより検出された複数のマーカの位置と、予めわかっている複数のマーカに対するターゲットの相対位置関係に基づいて、ターゲット位置を検出するターゲット位置検出手段と、を有し、ターゲット位置を追跡することを特徴とする。
【０００９】
また、前記マーカは、３個以上あることが好適である。
【００１０】
また、前記ターゲット位置検出手段において検出したターゲット位置を記憶する履歴記憶手段を有し、前記記憶手段に記憶されている過去のターゲットの履歴から、今回検出したターゲット位置を検証することが好適である。
【００１１】
また、前記マーカは、前記生体のターゲットと同様にして発光する生体の部分、または生体に取り付けられた赤外線反射手段、または生体に取り付けられた紫外線等により発光するシンチレータであり、前記ターゲット位置検出手段は前記マーカの発光を検出することが好適である。
【００１２】
また、本発明は、生体に備えられた複数のマーカを撮影する複数の撮影装置と、各撮影装置により撮影された複数のマーカのパターンを、予め記憶されている複数のマーカのパターンとのパターンマッチングによりそれぞれ検出し、複数の撮影装置からのマーカの位置検出結果と、予めわかっている複数のマーカに対するターゲットの相対位置関係に基づいて、ターゲットの三次元位置を検出するターゲット検出手段と、検出したターゲットの発光量を検出する発光量検出手段と、検出したターゲットの発光量をターゲットの三次元位置に応じて、補正する補正手段と、を有し、ターゲット位置を追跡しながら、ターゲットの発光量を検出することを特徴とする。
【００１３】
また、前記ターゲット検出手段は、複数のマーカの三次元位置に基づき、生体の向きを検出し、前記補正手段は、検出した生体の向きに応じて、検出したターゲットの発光量を補正することが好適である。
【００１４】
また、前記マーカは、紫外線発光シンチレータであり、複数の生体毎に発光色の異なる紫外線発光シンチレータを取り付け、前記ターゲット検出手段は、紫外線発光シンチレータの発光色の違いから複数の生体を個別に認識し、前記ターゲット発光量検出手段は、個別の生体毎のターゲット発光量を検出し、前記補正手段は各生体のターゲットの発光量を補正することが好適である。
【００１５】
また、検出したターゲット位置を記憶する履歴記憶手段を有し、前記記憶手段に記憶されている過去のターゲットの履歴から、今回検出したターゲット位置を検証することが好適である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、生体上の複数のマーカ位置から相対位置としてターゲット位置を検出するため、ターゲット位置を正確に検出することができる。従って、ターゲット位置における微弱な発光量の定量も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施形態の構成を示す図である。
【図２】処理の手順を示すフローチャートである。
【図３】Ｐｅｒｉｏｄ１の発現についての撮影画像の一例を示す写真である。
【図４】Ｐｅｒｉｏｄ１の発現についての６０秒間の発光量についての図である。
【図５】Ｂｍａｌ１の発現についての撮影画像の一例を示す写真である。
【図６】Ｂｍａｌ１の発現についての６０秒間の発光量についての図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、図面に基づいて説明する。
【００１９】
図１は、実施形態に係るターゲット検出システムの概略構成を示す図である。ケージ１０内には、検出ターゲット１８を保有する動物であるマウス等１２が飼育されており、ケージ１０内を自由に移動する。
【００２０】
ケージ１０のマウス１２を観察しやすい位置（例えば、上部）には、１台または２台のカメラ１４（１４ａ，１４ｂ）が設置されており、マウス１２を含む映像を得る。マウス１２に発光装置２４（２４ａ，２４ｂ）から発せられる光をマウス１２に照射することも好適である。
【００２１】
発光装置２４は、例えば白色ＬＥＤであり、これによって白色光がマウス１２に照射され、マウス１２の映像が確実に撮影できる。上述のように、マウス１２の目的遺伝子あるいはそのプロモータに対して、蛍光物質遺伝子や発光物質遺伝子を結合させることで、マウスのターゲット１８から蛍光が発生される。この例では、マウス１２の嗅球がターゲット１８であるが、この場合にマウス１２の耳や鼻なども同様の蛍光を発する。従って、マウス１２の耳や鼻をマーカ１６とすることが可能である。
【００２２】
ここで、このようなターゲット１８となる嗅球と同様の発光（蛍光）はその発光強度が弱い。そこで、マーカ１６をもっと確実に発光するものにすることも好適である。このようなマーカ１６として、赤外線反射部材や、紫外線発光シンチレータなどが採用できる。
マーカ１６として赤外線反射部材が採用された場合には、発光装置２４として赤外線ＬＥＤが採用され、ここから発生される赤外線の反射光がカメラ１４によって撮影される。赤外線を照射して、これをマーカ１６が反射するため、十分な強度の反射光が得られ、マーカ１６の位置を確実に検出することができる。
【００２３】
また、マーカ１６として紫外線発光シンチレータが採用された場合には、発光装置２４として紫外線ＬＥＤが採用され、ここから発生される紫外線によって励起され発光する紫外線発光シンチレータからなるマーカ１６の発光がカメラ１４によって撮影される。
【００２４】
特に、紫外線発光シンチレータの場合、紫外線の照射によって発光する光を材質によって、赤、青、緑のように決定できる。従って、複数のマウス１２が存在する場合に、第１のマウス１２には赤発光のマーカ１６、第２のマウス１２には緑発光のマーカ１６、第３のマウス１２には青発光のマーカ１６というように色を変更することができる。従って、カメラ１４をカラーのカメラにすることによって、複数のマウス１２をそれぞれ別に（個体）毎に認識して、マーカ１６を検出することが可能となる。
【００２５】
カメラ１４からの映像は、解析装置２０に供給される。この解析装置２０はカメラ１４からの映像を解析する。ここで、マウス１２には、３つのマーカ１６（１６ａ，１６ｂ，１６ｃ）が取り付けられている。一対の耳、鼻を３つのマーカ１６として採用した場合、これら３つのマーカ１６と、ターゲット１８となる嗅球の相対位置関係は予めわかっている。従って、検出した３つのマーカ位置からターゲット位置を決定することができる。
【００２６】
また、赤外線反射板や、紫外線発光シンチレータをマーカ１６として採用した場合も、これらマーカ１６とターゲット１８の相対位置関係は予めわかっているので、得られた画像からターゲット位置を検出することができる。
【００２７】
すなわち、解析装置２０に供給された映像には、マーカ１６が含まれており、３つのマーカ１６のパターンも予めわかっている。３つのマーカ１６が２つの耳および鼻である場合、これらは真上から見てほぼ２等辺三角形をなす。従って、画像中に現れた３つのマーカ１６を予めテンプレートとして記憶してある３つのマーカのパターンと比較してパターンマッチングを行うことで、３つのマーカ１６を特定することができる。
【００２８】
そして、３つのマーカの画像上の位置に基づき、ターゲット１８の位置も特定でき、ターゲット１８の発光輝度を検出することが可能となる。
【００２９】
マウス１２には、目的遺伝子あるいはそのプロモータに対して、蛍光物質遺伝子や発光物質遺伝子を結合させることにより、目的とするターゲット１８においてプロモータ支配下にある目的遺伝子産物から発光や蛍光が発せられる。この発光量は非常に小さいため、直接検出することが困難な場合が多い。本実施形態によれば、パターン認識によりマーカ１６を検出する。従って、比較的微弱な発光のマーカ１６であっても正確な検出が行える。このようにして、ターゲット１８であるマウス１２における嗅球の位置を解析装置２０によって特定して、その位置の発光強度を撮影画像において測定することで、ターゲット１８の発光量を定量することができる。
【００３０】
また、本実施形態においては、カメラ１４は、２台あり、マーカ１６をステレオ撮影している。このため、これらマーカ１６の位置を３次元位置として、特定できる。特に、３つのマーカ１６の三次元位置をそれぞれ検出できるため、これら３つのマーカ１６が形成する面の方向も検出できる。
【００３１】
ターゲット１８の撮影画面における輝度は、ターゲット１８の発光量だけでなく、ターゲットのカメラからの距離、およびマウス１２の向きによって変化する。すなわち、同一の発光量であっても、画像上での輝度は変化する。マウス１２（ターゲット１８）がカメラ１４の正面を向いている場合が最も輝度が大きく、横からの撮影になると輝度が小さくなる。基本的には、上方から撮影しているので、比較的変化は小さいが、マウス１２の位置（カメラとの距離）、向き（カメラに対する角度）により同一の発光量でも画像上の輝度は変化する。
【００３２】
本実施形態では、上述したように、３つのマーカ１６の三次元位置を検出する。従って、３つのマーカ１６が規定する面の方向がわかる。この面は、マウス１２の嗅球の向きと一定の関係があり、この関係を予め調べておくことによって、画面から検出したターゲット１８の輝度を補正して正しい輝度を検出することができる。すなわち、ターゲット位置（カメラからの距離）に基づく補正と、３つのマーカ１６の三次元位置から検出したターゲット１８の向きからの補正の両方を行うことで、より精度の高いターゲット１８の発光量の検出ができる。
【００３３】
このような補正については、３つのマーカ１６位置と補正値の関係をマップに記憶しておけばよいが、変換式による補正を組み合わせることも好適である。
【００３４】
解析装置２０には、履歴記憶部２２が接続されている。この履歴記憶部２２には、ターゲット１８の位置およびその発光強度が時系列データとして記憶される。ターゲット１８は、ケージ１０内の３次元位置として記憶されるが、３つのマーカ１６の位置の履歴も記憶されることが好適である。
【００３５】
「パターンマッチングについて」
このように、本実施形態では、ターゲット１８における、蛍光または発光の位置を正確に特定するために、周囲に指標となる複数のマーカ１６（１６ａ，１６ｂ，１６ｃ）を配置している。そして、カメラ１４で撮影した画像から、複数のマーカ１６をパターンマッチングで検出し、解析装置２０において検出された複数のマーカ１６によって、ターゲット１８の画像上の位置を検出する。従って、比較的正確なターゲットの検出が行える。
【００３６】
「ステレオ撮影について」
さらに、複数のカメラ１４（１４ａ，１４ｂ）においてステレオ撮影した画像から、マーカ１６の３次元位置を検出して、ターゲット１８の三次元位置および方向を特定する。従って、解析装置２０では、対象となるマウス１２の頭の向きおよび仰角を検出し、カメラ１４に対する距離および角度から、測定量に対する補正を行う。これによって、ターゲット１８の発光量の定量の精度向上が図れる。
【００３７】
さらに、２台のカメラ１４から得られる情報を生かし、その平均値をとるなどして、より信頼性の高い測定が可能である。
【００３８】
「履歴の考慮について」
また、履歴記憶部２２には、ターゲット１８（マウス１２）の動きの履歴を記憶する。従って、動きの履歴から、マウス１２の旋回角度、移動量を考慮して、ターゲット１８の位置についてフィルタリングすることができ、ターゲット１８の精度の高い追跡を行うことが可能となり、あり得ない場所をターゲット位置と検出することを防止することができる。
【００３９】
「複数個体の識別について」
マーカ１６には、赤外線反射マーカの他、紫外線発光シンチレータを用いて紫外線で励起発光させることもできる。これによって、暗闇でも観察、追跡が可能になり、夜行性動物に対する追跡も可能になる。さらに、紫外線発光シンチレータによれば、発光色を赤、緑、青などと選択することができる。従って、１つの紫外線の照射によって、マウス１２毎のマーカ１６に用いる紫外線発光シンチレータを異なる蛍光色（波長）のものに設定することで、個体毎の識別が可能になり、追跡対象の弁別が可能になる。従って、複数のマウス１２を同一のケージ１０内に飼育した状態で、複数のマウス１２のターゲット１８の発光量の経時変化をそれぞれ検出することが可能になる。
【００４０】
また、長期的に３次元座標を計測することで、対象の行動パターンなども計測できる。なお、対象は、マウスや、ラットなどのほか各種の哺乳動物や他の生物でも利用可能である。
【００４１】
「実施例」
ターゲット１８として、マウスの嗅球を選択し、この蛍光発光を測定するために、同時に発光する鼻先および両耳の、形態情報を利用したパターンマッチングを行った。これによって、精度よく自動追跡することに成功した。形態構造から嗅球の相対的な位置を計算し、嗅球発光の自動定量が可能になった。
【００４２】
さらにマウス１２嗅球の周りに貼り付けた紫外線発光シンチレータを紫外光により励起発光させ、高感度カメラでステレオ撮影することによって、自由に行動しているマウス頭部の経時的な３次元座標取得も成功した。また、複数のマーカの三次元位置から、ターゲット位置およびマウスのカメラに対する向きの関係から、ターゲット１８の発光量に対する補正が可能になった。
【００４３】
ここで、解析装置２０において、実際のマーカ１６の検出、ターゲット１８の位置検出について、図２に基づいて説明する。
【００４４】
３点のマーカ１６として耳、鼻を利用し、マーカ１６をカメラ１４で撮影し、解析装置２０において、マーカ１６ａ〜１６ｃの位置を検出する（Ｓ１）。この検出は、３点のパターンについてのテンプレートとのパターンマッチングによって行った。比較的発光量が少なくても、パターンマッチングによりマーカ１６を正確に検出することができた。
【００４５】
次に、３つのマーカ１６との相対位置によって、ターゲット１８の位置を特定する（Ｓ２）。マウス１２上の３つマーカ１６の位置は予めわかっており、この３つのマーカ１６との関係で、ターゲット１８位置を一義的に決定できる。
【００４６】
次に、２つのカメラ１４から画像を比較するステレオ投影によって、ターゲット１８の３次元位置として検出する（Ｓ３）。２つのカメラ１４においてそれぞれ検出した３つのマーカ１６の位置に基づき、マーカ１６の３次元位置が求まり、これに基づいてターゲット位置が求まる。そして、検出した３次元位置に基づいて、カメラ画像におけるターゲット１８の強度を補正する（Ｓ４）。
【００４７】
また、これまでに記憶されている過去のターゲット１８の位置の時系列データに基づいて、今回検出したターゲット１８の位置が許容される位置かを判定する（Ｓ５）。この判定において、許容できる場合には、最終的なターゲット１８の位置を確定し、この位置を出力すると共に、時系列データとして履歴記憶部２２に記憶する（Ｓ６）。
【００４８】
また、ターゲット１８の位置が確定されるため、この位置におけるターゲット１８の発光量を検出する（Ｓ７）。この場合、カメラ１４によるターゲット１８の発光量（カメラ１４においては受光量）の測定は、カメラ１４の感度にもよるが、０．５秒〜１秒程度の露光時間を用いるのが好適である。
【００４９】
発光量が検出限界以下の場合（Ｓ７）および過去のターゲット位置との相対関係から認識したターゲット位置が許容できなかった場合（Ｓ５）には、測定したデータを採用しないなどの処理が可能である。
【００５０】
また、上述したように、３つのマーカ１６の三次元位置が検出できることから、ターゲットの向きによる補正を行うことも好適である。
【００５１】
このように、本実施形態では、複数のマーカ１６について、パターン認識により検出を行い、マウス１２のマーカ１６との相対位置で決定される位置（同一位置）でのターゲット１８の発光強度を検出する。これによって、ターゲット１８の発光強度が経時変化により、大きく変動し追跡できないという課題を解決でき、ターゲット１８における極微弱の蛍光発光の強度を正確に認識することができる。
【００５２】
ここで、図３〜６には、実際に動いているマウスについての嗅球の画像および発光輝度を６０秒間に渡って検出した例を示す。図３，４は、時計遺伝子Ｐｅｒｉｏｄ１の発現を可視化したもので、発現量が比較的高い例であり、図５，６は時計遺伝子Ｂｍａｌ１の発現を可視化したもので、発現量が比較的低い例である。
【００５３】
図３において、左下の発光が嗅球の発光の画像であり、この例では０．５秒間露光している。また、１秒ごとに０．５秒露光の画像を１枚得て、各画像から嗅球の発光量を定量した結果が図４に示してある。図４において、発光値が変動しているのは動物の頭が動いているため、カメラに対する嗅球の面がいろいろ変化しているからである。なお、この図３，４は、１台のカメラで撮影し、マーカを利用しない状態で、普通に検出した結果である。
【００５４】
上述のように、マーカのパターンマッチングを利用してターゲット位置を検出することで、正確な嗅球の発光量の定量が行え、長時間（数か月）連続測定できる。
【００５５】
なお、図３で撮影した発光値は、体の中で一番発光値が高くなるときに撮影した結果である。この撮影の１０時間後にはほとんど嗅球での発光はなくなり、検出するのが難しくなる。従って、赤外線反射マーカや紫外線発光シンチレータを用いることにより、発光の周期に依存することなく、継続的な検出が行える。
【００５６】
図４の発光量の定量は、画像を取得後、１枚１枚画像を見ながら画像を○で囲みながら定量したものであり、６０秒間に１秒間隔で６０枚撮影した中で最も発光値が高く、正確な値を示している、つまりＣＣＤカメラに対して、嗅球が正面を向いている（撮影角度）ものと考えられるものである。この場合の発光値が７．５×１０6ｐｈｏｔｏｎ／ｐｉｘｅｌである。
【００５７】
ここで、この値は、マウス嗅球からカメラのＣＣＤセンサまでの距離が約３０ｃｍにおいて、カメラの撮影時間０．５秒の間に嗅球から平均的に１画素あたり（ＣＣＤ：５１２ｘ５１２画素において）７．５×１０6が検出されることを示している。
【００５８】
一方、Ｂｍａｌ１の発現による発光量は極めて小さく、一般的にＣＣＤで撮影することが困難である。図５は、Ｂｍａｌ１についてのものであるが、本測定装置においては、１秒間露光で、１秒あたり約６００００ｐｈｏｔｏｎ／ｐｉｘｅｌを検出することが可能である。
【００５９】
また、図６は、Ｂｍａｌ１についての６０秒間の検出結果であり、発光量の時間変化を計測できていることが分かる。
【符号の説明】
【００６０】
１０  ケージ、１２  マウス、１４  カメラ、１８  ターゲット、２０  解析装置、２２  履歴記憶部。
【図１】
2014016657.tif 000003
【図２】
2014016657.tif 000004
【図３】
2014016657.tif 000005
【図４】
2014016657.tif 000006
【図５】
2014016657.tif 000007
【図６】
2014016657.tif 000008