(57)【要約】【課題】本発明の目的は、粒子径を小さくすることなく、免疫反応性を高める磁性粒子を提供することにある。【解決手段】平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を非磁性金属酸化物（Ｄ）中に含有し、（Ｃ）と（Ｄ）の合計重量に対して（Ｃ）を６０〜９５重量％含有してなる磁性粒子であって、該磁性粒子の平均粒子径が１〜５μｍであり、かつ形状係数ＳＦ１が１０１〜２００であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２２０である磁性粒子。（Ｄ）が、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化カルシウム、酸化イットリウムおよび酸化タンタルからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、（Ｃ）が酸化鉄からなる粒子であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を非磁性金属酸化物（Ｄ）中に含有し、（Ｃ）と（Ｄ）の合計重量に対して（Ｃ）を６０〜９５重量％含有してなる磁性粒子であって、該磁性粒子の平均粒子径が１〜５μｍであり、かつ形状係数ＳＦ１が１０１〜２００であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２２０である磁性粒子。
【請求項２】
前記非磁性金属酸化物（Ｄ）が、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化カルシウム、酸化イットリウムおよび酸化タンタルからなる群から選ばれる少なくとも１種の非磁性金属酸化物である請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
前記超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）が酸化鉄（Ｆ）を含有してなる請求項１または２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
表面にグルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチンおよび官能基を有する金属アルコキシド（Ｎ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を結合させてなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の磁性粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の磁性粒子からなる生体物質結合用磁性担体。
【請求項６】
生体物質（Ｊ）が固定化されてなる請求項５に記載の磁性担体。
【請求項７】
前記生体物質（Ｊ）が、相互に特異的結合を有する抗体もしくは抗原のいずれか一方、又は生体レセプターもしくはリガンドのいずれか一方である請求項６に記載の磁性担体。
【請求項８】
平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）、（Ｃ）の重量に基づいて３０〜１５００重量％の金属アルコキシド（Ｎ）、および分散剤（Ｋ）を含有する分散液（Ａ）と、水（Ｌ）、非イオン性界面活性剤（Ｐ）及び金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）を含有する溶液（Ｂ）とを混合して水中油型エマルションを形成する工程を含み、かつ全工程中で有機溶剤を用いない請求項１〜４のいずれか１項に記載の磁性粒子の製造方法。
【請求項９】
前記分散剤（Ｋ）が、分子内にカルボキシル基を１個有する炭素数１０〜３０の有機化合物である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤（Ｐ）が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、及び高級アルコールエチレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８または９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子に関する。更に詳しくは、診断薬、治療薬、タンパク質精製及び細胞分離等に用いる磁性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体物質を含有する試料、例えば生体サンプルからタンパク質等を検出又は精製する方法としてタンパク質が結合し得る粒子を用いて、この粒子表面に生体サンプル中のタンパク質等を結合させ、生体サンプル中の目的タンパク質等以外の不純物を除くために、粒子を洗浄しタンパク質等が結合した粒子を回収して、タンパク質の結合量を検出する方法やタンパク質解離溶液中に解離させて精製する方法が知られている。
【０００３】
また、磁力によって容易に分離、回収が可能であることから、磁性を有する粒子が用いられており、例えば特許文献１に、酸化鉄からなる芯粒子の表面にシリカの被膜が形成されてなる磁性シリカ粒子が知られている。しかし、この磁性粒子は、磁性体が強磁性であり、回収時の磁場を取り除いても強磁性により磁性体自身が一時的な磁場を示し粒子同士が自己会合して洗浄性が悪くなったり、免疫反応等に悪影響を及ぼす。
【０００４】
更に、強磁性による磁性体自身の自己会合を解決する目的で、例えば、特許文献２に、磁性体に超常磁性である磁性体を用いた磁性シリカ粒子が開示されている。しかし、この磁性粒子は、粒子径が小さい場合は、磁性体の含有量が低く、磁力で粒子を回収する際に時間がかかり、粒子径が大きい場合は、比表面積が小さいために、結合するタンパク質等の量が少ないという問題がある。
【０００５】
平均粒子径１−５μｍの場合、磁力で粒子を分離回収する際に時間がかからず、かつ粒子同士が自会合することのない磁性粒子であった。（特許文献３）しかし、平均粒子径１−５μｍで免疫反応性をより向上するために、平均粒径を保ったまま、粒子表面に結合するタンパク質の量をさらに多くすることが要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２５６３８８号公報
【特許文献２】特開２０００−４０６０８号公報
【特許文献３】特開２０１３−１９８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、粒子径を小さくすることなく、免疫反応性を高める磁性粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果本発明に到達した。即ち本発明は、平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を非磁性金属酸化物（Ｄ）中に含有してなり、（Ｃ）と（Ｄ）の合計重量に対して（Ｃ）を６０〜９５重量％含有してなる磁性粒子（Ｅ）であって、該磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径が１〜５μｍであり、かつ形状係数ＳＦ１が１０１〜２００であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２２０である磁性粒子（Ｅ）；該磁性粒子（Ｅ）からなる生体物質結合用磁性担体（Ｈ）；平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）、（Ｃ）の重量に基づいて３０〜１５００重量％の金属アルコキシド（Ｎ）、及び分散剤（Ｋ）を含有する分散液（Ａ）と、水、非イオン性界面活性剤（Ｐ）及び金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）を含有する溶液（Ｂ）とを混合して水中油型エマルションを形成する工程を含むことを特徴とする磁性粒子（Ｅ）の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の磁性粒子（Ｅ）を使用することにより、粒子径を小さくすることなく、免疫反応性を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜磁性粒子（Ｅ）＞
本発明の磁性粒子（Ｅ）は、非磁性金属酸化物（Ｄ）マトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を含有してなり、好ましくは（Ｄ）を（Ｃ）中に分散させてなる。磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径が１〜５μｍであり、かつ形状係数ＳＦ１が１０１〜２００であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２２０である粒子である。
【００１１】
非磁性金属酸化物（Ｄ）としては、公知の種々の非磁性金属酸化物を用いることが出来る。非磁性金属酸化物（Ｄ）の内、磁性粒子（Ｅ）の水への分散性の観点から酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化カルシウム、酸化イットリウム及び酸化タンタルが好ましく、更に好ましくは酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム及び酸化アルミニウムが好ましく、最も好ましいのは酸化ケイ素である。
【００１２】
本発明における超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の平均粒子径は、任意の２００個の（Ｃ）について走査型電子顕微鏡で観察して測定された粒子径の平均値である。
（Ｃ）の平均粒子径は、後述の（Ｃ）作製時の金属イオン濃度を調節することにより制御することができる。また、通常の分級等の方法によっても超常磁性金属酸化物の平均粒子径を所望の値にすることができる。
【００１３】
超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
【００１４】
平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
（Ｃ）の平均粒子径が１ｎｍ未満の場合は合成が困難であり、平均粒子径が１５ｎｍを超える場合は得られた磁性粒子（Ｅ）の磁気特性が強磁性となり、実際の用途面において磁場を取り除いても磁性体自身が一時的な磁場を示し粒子同士が自己会合し、洗浄性が悪い及び／又は免疫反応等に悪影響を及ぼすという問題がある。
【００１５】
酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。
【００１６】
磁性粒子（Ｅ）中の超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の含有量の下限は、６０重量％、好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％、好ましくは８０重量％である。（Ｃ）の含有量が６０重量％未満の場合、得られた（Ｅ）の磁性が十分でないため、生体物質結合用磁性担体として用いた際に分離操作に時間がかかり、９５重量％を超えるものは合成困難かつ、診断薬、タンパク質精製及び核酸精製等に用いた場合、洗浄性が悪い。
【００１７】
超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）や水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法により合成することができる。
【００１８】
磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径は、１〜５μｍであり、好ましくは１〜３μｍである。平均粒子径が１μｍ未満の場合、分離回収の際に時間がかかる。５μｍを超えると、表面積が小さくなり、生体物質の結合量が低く回収効率が低くなってしまう。
【００１９】
本発明の磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径は、任意の２００個の（Ｅ）について走査型電子顕微鏡で観察して測定された粒子径の平均値である。
（Ｅ）の平均粒子径は、後述の水中油型エマルションを作製する際の混合条件（せん断力等）を調節して水中油型エマルションの粒子径を調整することにより制御することができる。また、（Ｅ）製造時の水洗工程の条件変更や通常の分級等の方法によっても平均粒子径を所望の値とすることができる。
【００２０】
磁性粒子（Ｅ）は、形状係数ＳＦ１が１０１〜２００であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２２０である。好ましくは形状係数ＳＦ１が１０５〜１９０であり、かつ形状係数ＳＦ２が１１０〜２００である。さらに好ましくはＳＦ１が１１０〜１８０であり、かつ形状係数ＳＦ２が１２０〜１９０である。
磁性粒子（Ｅ）は、表面が凹凸状であるため真球とはならず、ＳＦ１は１０１以上となる。形状係数ＳＦ１が２００を超える粒子は、形状が不定形になり、免疫測定精度が悪くなる。形状係数ＳＦ２が１１０未満の場合、表面積が小さくなり、生体物質の結合量が少なくなる。形状係数ＳＦ２が２２０を超える場合表面の凹凸が微細すぎて、凹凸に生体物質が入り込み、反応性が低下する。
【００２１】
形状係数ＳＦ１は、粒子の形状の丸さを示すものであり、下記式（１）で表される、磁性粒子を２次元平面に投影してできる図形の最長径の二乗を図形面積ＡＲＥＡで除して、１００π／４を乗じた値である。
ＳＦ１＝｛（最長径）２／（ＡＲＥＡ）｝×（１００π／４）（１）
ＳＦ１の値が１００の場合、磁性粒子の形状は真球であり、ＳＦ１の値が大きくなるほど、粒子は不定形になる。
【００２２】
形状係数ＳＦ２は、粒子の形状の凹凸の割合を示すものであり、下記式（２）で表される、磁性粒子を２次元平面に投影してできる図形の周長ＰＥＲＩの二乗を図形面積ＡＲＥＡで除して、１００／４πを乗じた値である。
ＳＦ２＝｛（ＰＥＲＩ）２／（ＡＲＥＡ）｝×（１００／４π）（２）
ＳＦ２の値が１００の場合磁性粒子表面に凹凸が存在しなくなり、ＳＦ２の値が大きくなるほど磁性粒子表面の凹凸が顕著になる。
形状係数ＳＦ１及びＳＦ２の測定は、走査型電子顕微鏡（例えばＳ−８００：日立製作所製）、マイクロスコープ（ＵＳＢデジタルスケール：スカラ（株）製）等で磁性粒子の写真を撮り、これを画像解析装置（例えばＭａｃ−ＶＩＥＷ：マウンテック社製）に導入して解析する方法、フロー式粒子像分析装置（例えばＦＰＩＡ−３０００：マルバーン社製）を用いて測定する方法などが挙げられる。
【００２３】
＜磁性粒子（Ｅ）の製造方法＞
本発明の磁性粒子（Ｅ）の製造方法は、平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）、（Ｃ）の重量に基づいて３０〜１５００重量％の金属アルコキシド（Ｎ）及び分散剤（Ｋ）を含有する分散液（Ａ）と、水、非イオン性界面活性剤（Ｐ）及び金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）を含有する溶液（Ｂ）とを混合して水中油型エマルションを形成する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
上記水中油型エマルション形成後、金属アルコキシド（Ｎ）の加水分解反応及び縮合反応を行い、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を非磁性金属酸化物（Ｄ）中に包含、好ましくは（Ｄ）中に（Ｃ）が均一に分散した磁性粒子（Ｅ）の水性分散体が得られる。
得られた磁性粒子（Ｅ）の水性分散体を遠心分離及び／又は集磁により固液分離し、水で洗浄して乾燥することにより磁性粒子（Ｅ）が得られる。
【００２５】
分散液（Ａ）
（Ａ）は、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）を分散剤（Ｋ）を用いて、金属アルコキシド（Ｎ）中に分散させた分散液（Ａ）である。上記分散剤（Ｋ）としては、分子内に１個のカルボキシル基を有する有機化合物等が挙げられる。具体的には、以下に例示する有機化合物等が挙げられ、これらは１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００２６】
カルボキシル基を１個有する有機化合物：
炭素数１０〜３０の脂肪族飽和モノカルボン酸（ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸及びベヘニン酸等）、炭素数１０〜３０の脂肪族不飽和モノカルボン酸（オレイン酸、ステアリン酸等）、炭素数１０〜３０のヒドロキシ脂肪族モノカルボン酸、炭素数１０〜３０の脂環式モノカルボン酸、炭素数１０〜３０の芳香族モノカルボン酸、炭素数１０〜２０のヒドロキシ芳香族モノカルボン酸及び炭素数１０〜２０のパーフルオロカルボン酸。
【００２７】
分散剤（Ｋ）の使用量は、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の重量を基準として、１００〜２，０００重量％、特に２５０〜１，０００重量％であることが好ましい。（Ｋ）が１００重量％以上の場合、（Ｃ）が金属アルコキシド溶液に分散し易くなる傾向にあり、２，０００重量％以下であると後の工程の水溶液への分散の際にエマルションが形成し易くなる傾向にある。
【００２８】
使用する金属アルコキシド（Ｎ）としては、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
Ｒ１ｍＭ（ＯＲ２）ｎ          （１）
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されていてもよい炭素数１〜１０の１価の炭化水素基を表す。
【００２９】
炭素数１〜１０の炭化水素基としては、炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素基（メチル基、エチル基、ｎ−又はｉｓｏ−プロピル基、ｎ−又はｉｓｏ−ブチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ペンチル基及びビニル基等）、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素基（フェニル基等）及び炭素数７〜１０の芳香脂肪族基（ベンジル基等）等が挙げられる。
【００３０】
一般式（１）におけるＭは金属元素を表す。金属元素の具体例としては、Ｓｉ、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ、Ｃａ、Ｙ及びＴａ等が挙げられる。
【００３１】
一般式（１）におけるｍ及びｎは整数を表し、ｍとｎの和は金属元素Ｍの価数であり、例えばＳｉは４、Ａｌは３、Ｔｉは４である。
Ｍの価数が４の場合、ｍは０〜３の整数、ｎは１〜４の整数、ｍ＋ｎが４である。
価数が３の場合、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数、ｍ＋ｎが３である。
【００３２】
一般式（１）においてＭがＳｉの場合、ｎが１のアルキルアルコキシシランを用いるときには、ｎが２〜４の（アルキル）アルコキシシランと併用する必要がある。反応後の粒子の強度及び粒子表面のシラノール基の量の観点からｎは４であることが好ましい。  
金属元素ＭがＳｉの場合、金属アルコキシドの具体例としては、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトライソプロピルシラン及びテトラブトキシシラン等のアルコキシシラン；メチルトリメトキシシラン及びメチルトリエトキシシラン等のアルキルアルコキシシラン；３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリメトキシシラン及びＮ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；７−カルボキシ−ヘプチルトリエトキシシラン及び５−カルボキシ−ペンチルトリエトキシシラン等のカルボキシル基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−ヒドロキシプロピルトリメトキシシラン及び３−ヒドロキシプロピルエトキシシラン等の水酸基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン等のメルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン；３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン等のグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン等が挙げられる。
【００３３】
金属元素ＭがＴｉの場合、金属アルコキシドの具体例としては、トリメトキシチタン、テトラメトキシチタン、トリエトキシチタン、テトラエトキシチタン、テトラプロポキシチタン、クロロトリメトキシチタン、クロロトリエトキシチタン、エチルトリメトキシチタン、メチルトリエトキシチタン、エチルトリエトキシチタン、ジエチルジエトキシチタン、フェニルトリメトキシチタン、フェニルトリエトキシチタンなどが挙げられる。
金属元素ＭがＡｌ、Ｚｒ、Ｃａ、Ｙ及びＴａの場合、金属アルコキシドの具体例としては、トリメトキシアルミニウム、トリエトキシアルミニウム、トリ−ｎ−プロポキシアルミニウム、トリイソプロポキシアルミニウム、トリ−ｎ−ブトキシアルミニウム、トリイソブトキシアルミニウム、トリ−ｓｅｃ−ブトキシアルミニウム及びトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシアルミニウム等のアルミニウムアルコキシド；ジルコニウムテトラエトキシド、ジルコニウムテトラプロポキシド及びジルコニウムテトラブトキシド等のジルコニウムアルコキシド；カルシウムメトキシド、カルシウムエトキシド、カルシウムプロポキシド及びカルシウム イソプロポキシド等のカルシウムアルコキシド、イットリウムトリエトキシド、イットリウムトリイソプロポキシドシド及びイットリウムトリメトキシエトキシドシド等のイットリウムアルコキシド；タンタルペンタメトキシド、タンタルペンタエトキシド、タンタルペンタイソプロポキシド及びタンタルペンタブトキシド等のタンタルアルコキシドが挙げられる。
金属アルコキシド（Ｎ）は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３４】
金属アルコキシド（Ｎ）の使用量は、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）に対して、３０〜１５００重量％、好ましくは９０〜６００重量％である。金属アルコキシドが３０重量％未満の場合、（Ｃ）の表面が均一に被覆されにくくなり、１５００重量％を超えると、（Ｃ）の含有率が小さくなり、磁力による回収時間が長くなる。
【００３５】
分散液（Ａ）の作成方法としては、特に限定されず、例えば、分散剤（Ｋ）を金属アルコキシド（Ｎ）に溶解後、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）と混合することが出来る。また、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）に分散剤（Ｋ）を物理吸着後、余分な分散剤を洗浄除去し金属アルコキシド（Ｎ）に分散させて調整することも出来る。
【００３６】
溶液（Ｂ）
溶液（Ｂ）は、非イオン性界面活性剤（Ｐ）及び金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）を水に溶解させたものである。
【００３７】
非イオン性界面活性剤（Ｐ）としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのプルロニック型非イオン性界面活性剤（Ｐ１）、炭素数８〜２４の高級アルコールのエチレンオキサイド１〜５０モル付加物（Ｐ２）等が挙げられる。（Ｐ１）の具体例としては、ポリオキシエチレン１〜２００モル付加物及びポリオキシプロピレン１〜５０モル付加物のプルロニック型界面活性剤が挙げられる。好ましいものはポリオキシエチレン１００〜２００モル付加物及びポリオキシプロピレン１０〜５０モル付加物のプルロニック型非イオン性界面活性剤である。（Ｐ２）の具体例としては、炭素数１２〜２４の高級アルコールのエチレンオキサイド３０〜５０モル付加物等が挙げられる。これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００３８】
非イオン性界面活性剤（Ｐ）の使用量は、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）に対して、１００〜１，０００重量％、特に３００〜５００重量％が好ましい。１００重量％以上又は１，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなり好ましい。
【００３９】
溶液（Ｂ）の使用量は、（Ｃ）に対して、１，０００〜１０，０００重量％、特に１，５００〜４，０００重量％が好ましい。１，０００重量％以上又は１０，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなり好ましい。
【００４０】
金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）としては、ルイス酸や塩基等を用いることができ、具体的には、塩酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、アンモニア等の無機塩基化合物、エタノールアミン等のアミン化合物を用いることができる。
加水分解用触媒の使用量は、金属アルコキシド（Ｎ）の重量に対して、０．０１〜５００重量％、特に０．５〜３００重量％が好ましい。
【００４１】
水の使用量は、（Ｃ）に対して１００〜９，０００重量％であることが好ましく、特に８００〜６，０００重量％が好ましい。
【００４２】
溶液（Ｂ）の作成方法としては、特に限定されず、例えば、非イオン性界面活性剤（Ｐ）、金属アルコキシドの加水分解用触媒（Ｑ）、水を混合させることで調整できる。
【００４３】
分散液（Ａ）と溶液（Ｂ）との混合方法は、特に限定されず、後述の設備を使用して一括混合することもできるが、磁性粒子（Ｅ）の粒子径の均一性の観点から、溶液（Ｂ）を撹拌しながら、溶液（Ｂ）に分散液（Ａ）を滴下する方法が好ましい。
（Ｂ）の使用量は、（Ａ）に対して、２〜３５０重量％が好ましい。この範囲であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなり好ましい。
【００４４】
分散液（Ａ）と溶液（Ｂ）との混合及び反応する条件としては、１０〜１００℃であることが好ましく、更に好ましくは２０〜６０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、更に好ましくは１〜２時間である。
【００４５】
分散液（Ａ）と溶液（Ｂ）とを混合する際の設備としては、一般に乳化機、分散機として市販されているものであれば特に限定されず、例えば、ホモジナイザー（ＩＫＡ社製）、ポリトロン（登録商標、キネマティカ社製）及びＴＫオートホモミキサー（プライミクス社製）等のバッチ式乳化機、エバラマイルダー（荏原製作所社製）、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー（プライミクス社製）、ヒストコロン（マイクロテック・ニチオン社製）、コロイドミル（神鋼パンテック社製）、クリアミックス（エムテクニック社製）、スラッシャー、トリゴナル湿式微粉砕機（日本コークス工業社製）、キャピトロン（ユーロテック社製）及びファインフローミル（太平洋機工社製）等の連続式乳化機、マイクロフルイダイザー（みずほ工業社製）、ナノマイザー（登録商標、ナノマイザー社製）及びＡＰＶガウリン（ガウリン社製）等の高圧乳化機、膜乳化機（冷化工業社製）等の膜乳化機、バイブロミキサー（登録商標、冷化工業社製）等の振動式乳化機、超音波ホモジナイザー（ブランソン社製）等の超音波乳化機等が挙げられ、粒子径の均一化の観点から、ＡＰＶガウリン、ホモジナイザー、ＴＫオートホモミキサー、エバラマイルダー、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー、ヒストコロン、及びクリアミックスが好ましい。
【００４６】
本発明の磁性粒子（Ｅ）は、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）が非磁性金属酸化物（Ｄ）中に包含され、粒子表面に存在しないことから、生体物質結合用磁性担体として使用する場合、多くの生体物質を結合することができる。
【００４７】
本発明の磁性粒子（Ｅ）を生体物質結合用磁性担体として使用する場合、（Ｅ）に生体物質（Ｊ）を物理吸着させることもできるが、より効率良く生体物質（Ｊ）を結合させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有する金属アルコキシド（Ｎ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を（Ｅ）の表面に結合させることが好ましい。これらの有機化合物の内、特定の生体物質（Ｊ）を結合させる観点から、官能基を有する金属アルコキシド（Ｎ）が更に好ましい。
【００４８】
上記金属アルコキシド（Ｎ）が有する官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基等が挙げられ、（Ｎ）１分子中に異なる種類の官能基を有していてもよい。
【００４９】
（Ｅ）の表面に官能基を有する（Ｎ）を結合させる方法としては、前述のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルコキシド（Ｎ１）を使用する方法や、これらの置換基を有しないアルコキシド（Ｎ２）を使用して（Ｅ）を作製した後、（Ｅ）を（Ｎ１）で処理する方法等が挙げられる。
【００５０】
後者の方法の具体例としては、（Ｅ）をその濃度が１〜５０重量％になるように溶媒に分散し、この分散液に（Ｎ１）の溶液を添加して、１時間以上室温で加水分解反応及び縮合反応を行う方法が挙げられる。
【００５１】
（Ｎ１）の使用量は、処理前の磁性粒子（Ｅ）に対して０．１〜５重量％であることが好ましい。０．１重量％以上であると、導入される官能基数が十分であり、５重量％以下であると粒子表面の官能基量を更に増加させる効果があるので好ましい。
【００５２】
グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン又はビオチンを磁性粒子（Ｅ）の表面に結合させる方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして結合させることができる。
アルデヒド基を有するグルタルアルデヒド及びカルボキシル基を有するビオチンは、アミノ基を有する金属アルコキシドが表面に結合した（Ｅ）と反応させることで、（Ｅ）の表面に結合させることができる。また、アミノ基を有するアルブミン及びストレプトアビジン並びにカルボジイミド基を有するカルボジイミドは、カルボキシル基を有する金属アルコキシドが表面に結合した（Ｅ）と反応させることで、（Ｅ）の表面に結合させることができる。
【００５３】
本発明における生体物質（Ｊ）とは、生物に由来する物質を意味するが、生体物質そのものに限らず、生体物質と相互作用を有する物質をも含み、例えば、糖質、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞、微生物、薬剤若しくは薬剤候補物質、環境ホルモン等の有害物質又はビオチン等の他の生体物質の固定に利用できる物質が挙げられる。
【００５４】
磁性粒子（Ｅ）に固定化する生体物質（Ｊ）のタンパク質又はペプチドは、相互に特異的結合性を有する、抗体若しくは抗原のいずれか一方、又は生体レセプター若しくはリガンドのいずれか一方であることが好ましい。抗体／抗原の場合、精製すべきタンパク質が抗体となる場合には、抗原となるタンパク質又はペプチドを粒子に固定化することになる。一方、精製すべきタンパク質が抗原となる場合には、抗体となるタンパク質又はペプチドを粒子に固定化することになる。生体レセプター／リガンドについても抗体／抗原の場合と同様である。
【００５５】
生体物質（Ｊ）を磁性粒子（Ｅ）に結合させる方法は特に限定されず、例えば、生体物質（Ｊ）が抗体又は抗原の場合、アミノ基を有するため、表面にグルタルアルデヒドを結合させた（Ｅ）と反応させることで生体物質（Ｊ）を（Ｅ）の表面に結合させることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００５７】
製造例１
セトステアリルアルコール（花王株式会社製「カルコール 6850」、セチルアルコールとステアリルアルコールからなる油脂原料）２５２部（１モル部）、水酸化カリウム０．５部を加圧反応容器に投入して密閉、窒素置換した後、１３０℃で脱水する。次いで、エチレンオキシド１８４８部（４２モル部）を１３０℃で付加反応させ、８０℃に冷却して酢酸０．５部で水酸化カリウムを中和して、セトステアリルアルコールのエチレンオキサイド付加物（付加モル数４２）である非イオン性界面活性剤（Ｐ−１）を調製した。
【００５８】
実施例１                  
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物２．７部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物１．０部及び水３７５部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５％アンモニア水３．８部と水１００部を混合した溶液を１時間かけて滴下し、滴下後１時間撹拌し、水中にマグネタイト粒子である超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−１）を得た。得られた（Ｃ−１）にオレイン酸である分散剤（Ｋ−１）１０．５部加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水５０部で洗浄する操作を３回行った。得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を容器に仕込み、テトラエトキシシランである金属アルコキシド（Ｎ−１）６．０部を加えて混合し、分散液（Ａ−１）を調製した。
【００５９】
反応容器にアンモニア（Ｑ−１）２５％水溶液３８．５部、製造例１で得られた非イオン性界面活性剤（Ｐ−１）１．３部、  ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー（三洋化成工業株式会社製「ニューポールＰＥ６８」）である非イオン性界面活性剤（Ｐ−２）１．３部、水４９．８部加えてヒストコロン（マイクロテック・ニチオン社製）を用いて１０分間混合し、５０℃に昇温後、ヒストコロンの回転数１５，０００ｒｐｍで攪拌しながら上記分散液（Ａ−１）を１時間かけて滴下した後、１時間乳化反応させた。
乳化反応後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除いた。得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を１０回行った。続いて、得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて目的とする粒子径を有する粒子を含有する上清（１）を回収した。残った固相に水５０部を加えて５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清（２）を回収する操作を２回行い、固相中に存在する目的とする粒子径を有する粒子を回収した。次に、上清（１）及び（２）について、磁石を用いて粒子を集磁し、集磁された粒子を８０℃で８時間乾燥させて本発明の磁性粒子（Ｅ−１）を得た。
【００６０】
実施例２
実施例１において、マグネタイト粒子作製時における２５％アンモニア水３．８部と混合する水の量を１００部から７５部に代えた以外は、実施例１と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−２）を得た。また（Ｃ−２）を用いて実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−２）を得た。
【００６１】
実施例３
実施例１において、マグネタイト粒子作製時における２５％アンモニア水３．８部と混合する水の量を１００部から３３．８部に代えた以外は、実施例１と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−３）を得た。また（Ｃ−３）を用いて乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−３）を得た。
【００６２】
実施例４
実施例１において、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−４）を得た。
【００６３】
実施例５
乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代え、テトラエトキシシランの仕込量を６．０部から２．０部に代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−５）を得た。
【００６４】
実施例６
実施例３と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−３）を得た。実施例１において、（Ｃ−１）の代わりに（Ｃ−３）を用い、テトラエトキシシランの仕込量を６．０部から２．０部に代え、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００に代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−６）を得た。
【００６５】
実施例７
実施例３と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−３）を得た。実施例１において、（Ｃ−１）の代わりに（Ｃ−３）を用いて、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代え、非イオン性界面活性剤（Ｐ−１）１．３部、非イオン性界面活性剤（Ｐ−２）１．３部を（Ｐ−２）２．６部に代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−７）を得た。
【００６６】
実施例８
実施例２と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−２）を得た。実施例１において、（Ｃ−１）の代わりに（Ｃ−２）を用いて、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−８）を得た。
【００６７】
実施例９
実施例２と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−２）を得た。実施例１において、（Ｃ−１）の代わりに（Ｃ−２）を用いて、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代え、非イオン性界面活性剤（Ｐ−１）１．３部、非イオン性界面活性剤（Ｐ−２）１．３部を、（Ｐ−１）１．７部、（Ｐ−２）０．９部に代えた以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−９）を得た。
【００６８】
実施例１０
実施例９において、非イオン界面活性剤（Ｐ−１）１．７部、非イオン界面活性剤（Ｐ−２）０．９部を、（Ｐ−１）２．１部、（Ｐ−２）０．５部に代えた以外は、実施例９と同様にして磁性粒子（Ｅ−１０）を得た。
【００６９】
実施例１１
実施例１において金属アルコキシド（Ｎ−１）６．０部をテトラエトキシチタン［和光純薬工業（株）製］である金属アルコキシド（Ｎ−２）６．０部に代える以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−１１）を得た。
【００７０】
実施例１２
実施例１において、金属アルコキシド（Ｎ−１）６．０部を、テトラエトキシシラン４．８部及びテトラエトキシチタン１．２部の混合物である金属アルコキシド（Ｎ−３）に代える以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−１２）を得た。
【００７１】
実施例１３
実施例３と同様にして超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ−３）を得た。実施例１において、（Ｃ−１）の代わりに（Ｃ−３）を用い、（Ｃ−３）と混合するテトラエトキシシラン６．０部をアルミニウムエトキシド［和光純薬工業（株）製］である金属アルコキシド（Ｎ−４）６．０部に代え、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００に代える以外は、実施例１と同様にして磁性粒子（Ｅ−１３）を得た。
【００７２】
比較例１  
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物２．７部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物１．０部及び水３７５部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃に保持しながら、２５％アンモニア水３．８部と水１００部を混合した溶液を１時間かけて滴下し、滴下後１時間撹拌し、水中にマグネタイト粒子（Ｃ−１’）を得た。得られたマグネタイト粒子（Ｃ−１’）に分散剤（Ｋ−１）であるオレイン酸１０．５部加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水５０部で洗浄する操作を３回行った。得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を容器に仕込み、デカン５．７部及びテトラエトキシシラン（Ｎ−１）２．２部を加えて混合し、分散液（Ａ−１’）を調製した。
反応容器にアンモニア（Ｑ−１）２５％水溶液３９．０部、イソプロパノール５５．４部、ソルビタンモノオレエート２．９部（三洋化成工業株式会社製「イオネットＳ−８０」）（Ｐ−１’）及びポリオキシエチレン（付加モル数２０モル）アルキルエーテル（三洋化成工業株式会社「エマルミン２００」）（Ｐ−２’）２．０部を加えてヒストコロンを用いて混合し、５０℃に昇温後、ヒストコロンの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（Ａ−１’）を１時間かけて滴下後、５０℃で１時間乳化反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除いた。得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を１０回行った。続いて、得られた固相に水５０部を加えて粒子を分散させて５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて目的とする粒子径を有する粒子を含有する上清（１）を回収した。残った固相に水５０部を加えて５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清（２）を回収する操作を２回行い、固相中に存在する目的とする粒子径を有する粒子を回収した。次に、上清（１）及び（２）について、磁石を用いて粒子を集磁し、集磁された粒子を８０℃で８時間乾燥させて比較磁性粒子（Ｅ−１’）を得た。
【００７３】
比較例２
実施例１において、テトラエトキシシランの仕込量を６．０部から２４．０部に代えた以外は、実施例１と同様にして比較磁性粒子（Ｅ−２’）を得た。
【００７４】
比較例３
実施例１において、テトラエトキシシランの仕込量を６．０部から２．０部に代え、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから１０，０００ｒｐｍに代えた以外は、実施例１と同様にして比較磁性粒子（Ｅ−３’）を得た。
【００７５】
比較例４
実施例１において、乳化の際のヒストコロンの回転数を１５，０００ｒｐｍから４，０００ｒｐｍに代えた以外は、実施例１と同様にして比較磁性粒子（Ｅ−４’）を得た。
【００７６】
比較例５
１００部の硫酸第一鉄を１，０００部の水に溶解し、撹拌下、水５００部に水酸化ナトリウム２８．８部を溶解した水溶液を１時間かけて滴下後、撹拌しながら、８５℃まで昇温して空気を懸濁液に吹き込み８時間酸化し、遠心分離することにより得られたマグネタイト粒子（Ｃ−２‘）を得た。マグネタイト粒子（Ｃ−２‘）２．２部をテトラエトキシシラン６．０部と混合して分散液（Ｒ−１）を得た。分散液（Ａ−１）を分散液（Ｒ−１）に代える以外は、実施例１と同様にして比較磁性粒子（Ｅ−５’）を得た。
【００７７】
実施例１〜１３で得られた本発明の磁性粒子（Ｅ−１）〜（Ｅ−１３）および比較例の磁性粒子（Ｅ−１’）〜（Ｅ−５’）について、以下に示す方法で磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径、超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の含有量、平均粒子径、（Ｅ）の形状係数ＳＦ１、ＳＦ２を測定し、結果を表１に示した。
【００７８】
＜超常磁性金属酸化物粒子（Ｃ）の平均粒子径の測定方法＞
任意の２００個の超常磁性金属酸化物について、走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名日本電子株式会社）で観察して粒子径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
【００７９】
＜磁性粒子（Ｅ）の平均粒子径の測定方法＞
任意の２００個の磁性粒子（Ｅ）について、査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名日本電子株式会社）で観察して粒子径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
【００８０】
＜磁性粒子（Ｅ）中の超常磁性金属酸化物の含有量の測定方法＞
任意の２０個の磁性粒子（Ｅ）について、上記走査型電子顕微鏡で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置（型番ＩＮＣＡ  Ｗａｖｅ／Ｅｎｅｒｇｙ、メーカー名オックスフォード）により超常磁性金属酸化物の含有量を測定してその平均値を含有量とした。
【００８１】
＜磁性粒子（Ｅ）の形状係数ＳＦ１、ＳＦ２の測定方法＞
形状係数ＳＦ１、ＳＦ２の測定は、走査型電子顕微鏡で、５，０００〜２０，０００倍で撮影し、得られた画像から５０個の粒子を無作為に選択し、これを画像解析装置（Ｍａｃ−ＶＩＥＷメーカー名マウンテック）に導入して解析を行い、平均のＳＦ１、ＳＦ２の値を算出した。
【００８２】
実施例１〜１３で得られた本発明の磁性粒子（Ｅ−１）〜（Ｅ−１３）および比較例の磁性粒子（Ｅ−１’）〜（Ｅ−５’）について、以下に示す方法で、集磁性、短時間での免疫測定における洗浄性及び感度、磁性粒子（Ｅ）１ｍｇ当りの結合抗体量を評価し、結果を表１に示した。
【００８３】
＜磁性粒子（Ｅ）の集磁性の評価方法＞
１．０ｍｇの磁性粒子（Ｅ）を２ｍＬのイオン交換水に分散させ、口内径×胴径×全高＝φ１０．３ｍｍ×φ１２．０ｍｍ×３５ｍｍのガラス容器に入れ、１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍのネオジウム磁石を側面につけ、紫外可視分光光度計（装置型番ＵＶ−１８００、メーカー名株式会社島津製作所）を使用して、初期吸光度が２０％となるまでの時間を測定した。この時間が短いほど集磁性が良好である。
【００８４】
抗α−フェトプロテイン（以下、ＡＦＰと略記）抗体結合磁性粒子の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶またはポリスチレン瓶に、磁性粒子（Ｅ）４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、当該瓶をゆっくりと２回倒置撹拌した後、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子（Ｅ）を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。次いで、この洗浄後の磁性粒子（Ｅ）を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶またはポリスチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、当該瓶をゆっくりと２回倒置撹拌したのち、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子（Ｅ）を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。更にこの洗浄後の磁性粒子（Ｅ）を抗ＡＦＰモノクローナル抗体（ダコジャパン社より購入）８０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶またはポリスチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子（Ｅ）を作製した。これを０．１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）４０ｍＬに浸漬し５℃で保存した。
【００８５】
ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体の作製：
抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコジャパン社より購入）、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製、以下ＰＯＤと略記する）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体を調製し、−３０℃で冷凍保存した。
【００８６】
＜短時間での免疫測定における洗浄性の評価方法＞
磁性粒子（Ｅ）表面にＡＦＰ抗体を固定化させ、以下に示す免疫測定を行い、洗浄性について以下の基準で判定した。
０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液中の抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子（Ｅ）を磁石で集磁後、液をアスピレーターで除去し、抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子（Ｅ）に生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子の集磁後液をアスピレーターで除去する洗浄操作を３回行った。該磁性粒子（Ｅ）と、１重量％の牛血清アルブミンを含有したリン酸緩衝液で調製したＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準溶液０．０２５ｍＬと免疫反応用緩衝液［０．１重量％の牛血清アルブミン、０．８５重量％の塩化ナトリウム及び０．５重量％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（界面活性剤）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）］０．０２５ｍＬを試験管に入れ、試験管中で３７℃、３分間反応させた。反応後、試験管の外側から磁石で粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、次いで生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子を分散させて集磁後、さらにアスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。続いて、洗浄した磁性粒子（Ｅ）に、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体を２００ｎＭ含有する免疫反応緩衝液０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃、３分間反応させた。反応後、該試験管の外側から磁石で粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、洗浄した磁性粒子（Ｅ）に、発光試薬Ａ［０．１８ｇ／Ｌのルミノールと０．１ｇ／Ｌの４−（シアノメチルチオ）フェノールとを含有する０．１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）］０．０７ｍＬと０．０１％過酸化水素水０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量を発光検出器［ＢＬＲ−２０１（アロカ社製）：光電子倍増管を使用］で測定した。この平均発光量を測定し、洗浄性を平均発光量（単位ｃｐｓ）で示した。発光量が小さいほど洗浄性が良好である。
【００８７】
ＡＦＰ免疫測定法：
抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子（Ｅ）を２５μｇ含有する上記牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液中の粒子を磁石で集磁後、液をアスピレーターで除去し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子を集磁後液をアスピレーターで除去する洗浄操作を３回行った後、該磁性粒子（Ｅ）と、１重量％の牛血清アルブミンを含有したリン酸緩衝液で調製したＡＦＰ濃度が２ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液０．０２５ｍＬと免疫反応用緩衝液［０．１％の牛血清アルブミン、０．８５％の塩化ナトリウム及び０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（界面活性剤）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）］０．０２５ｍＬを試験管に入れ、試験管中で３７℃、３分間反応させ、粒子／ＡＦＰ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側から磁石で粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
【００８８】
続いて、ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体を２００ｎＭ含有する免疫反応緩衝液０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃、３分間反応させ、粒子／ＡＦＰ／ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側から磁石で粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、生理食塩水０．５ｍＬを加えて粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
【００８９】
最後に、発光試薬Ａ［０．１８ｇ／Ｌのルミノールと０．１ｇ／Ｌの４−（シアノメチルチオ）フェノールとを含有する０．１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）］０．０７ｍＬと０．０１％過酸化水素水０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量を発光検出器［ＢＬＲ−２０１（アロカ社製）：光電子倍増管を使用］で測定した。尚、ＡＦＰ濃度が２ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液の代わりにＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。
【００９０】
＜免疫測定感度の評価方法＞
免疫測定感度については、ＡＦＰ濃度が０ｎｇ／ｍＬと２ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の差を求めた。発光量の差が大きいほど感度が高い。
【００９１】
＜磁性粒子（Ｅ）に固定化する抗体量の評価方法＞
磁性粒子（Ｅ）表面にＡＦＰ抗体を固定化し、反応後の反応液を以下に示すように液体クロマトグラフィーを用いてピーク面積解析を行い、反応前後でのピーク面積の差算出し、磁性粒子（Ｅ）に結合した抗体量とした。差が大きいほど抗体の固定化量が多い。
【００９２】
＜磁性粒子（Ｅ）に固定される抗体量の評価方法＞
ＡＦＰ免疫測定法と同様に抗体結合粒子を作製する。
磁性粒子（Ｅ）を抗ＡＦＰモノクローナル抗体を８０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、抗ＡＦＰ抗体含有リン酸緩衝液を回収し、回収溶液と反応前の溶液について液体クロマトグラフで解析（型番ＣＬＡＳＳ−ＶＰ、メーカー名島津製作所）を行った。得られたピークの面積の差から磁性粒子（Ｅ）に結合した抗体量を算出し、磁性粒子（Ｅ）１ｍｇ当たりの固定化抗体量（単位μｇ）とした。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
表１から、本発明の磁性粒子（Ｅ−１）〜（Ｅ−１３）は、比較例の磁性粒子（Ｅ−１’）〜（Ｅ−５’）と比較すると、粒子径を小さくすることなく、免疫測定感度が高く、磁性粒子（Ｅ）１ｍｇ当たりの固定化抗体量が大きいことが判った。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の磁性粒子は、粒子径を小さくすることなく免疫反応性を高めることができるため、診断薬、治療薬、タンパク質精製及び細胞分離等の用途に好適に用いることができる。