(57)【要約】      （修正有）【課題】連続的又は経時的に測定することができ、かつ、生体内の特定の細胞又は細胞内オルガネラの内部のクエン酸濃度を非破壊的に測定することができる、クエン酸検出剤を提供する。【解決手段】クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、アミノ末端側からカルボキシル末端側へ順に、第１のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と、第２のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む。第１のクエン酸結合ポリペプチドと第２のクエン酸結合ポリペプチドとは、特定のアミノ酸配列からなるセンサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの細胞周辺腔ドメインのペプチド結合が切断されて得られる２個のポリペプチドである。前記蛍光タンパク質は、環状異性化蛍光タンパク質である。クエン酸検出剤は、前記センサータンパク質と、これを発現する形質転換体とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端側からカルボキシル末端側へ順に、
第１のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と、第２のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列とを含み、
第１のクエン酸結合ポリペプチドと第２のクエン酸結合ポリペプチドとは、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるセンサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの細胞周辺腔ドメインのペプチド結合が第５４番目又は第５５番目のアミノ酸残基と次のアミノ酸残基との間で切断されて得られる２個のポリペプチドのうち、それぞれ、アミノ末端側ポリペプチドと、カルボキシル末端側ポリペプチドとであり、前記蛍光タンパク質は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなる環状異性化蛍光タンパク質である、
クエン酸特異的蛍光センサータンパク質。
【請求項２】
第１のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間には第１のリンカーのアミノ酸配列が挿入され、前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列と第２のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列との間には第２のリンカーのアミノ酸配列が挿入される、請求項１に記載のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質。
【請求項３】
（１）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号５又は６に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号５又は６に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む、クエン酸特異的蛍光センサータンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１つのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが発現可能に導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１つのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質、及び／又は、請求項５に記載の形質転換体を含む、クエン酸検出剤。
【請求項８】
（１）請求項７に記載の形質転換体を含むクエン酸検出剤を被検サンプルに接触させるステップと、
（２）クエン酸濃度に依存する変化を示す第１の励起波長での蛍光特性と、クエン酸濃度に依存する変化を示さないか、あるいは、第１の励起波長でのクエン酸濃度に依存する蛍光特性の変化とは異なる蛍光特性の変化を示す第２の励起波長での蛍光特性とを測定するステップとを含む、クエン酸濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クエン酸検出剤とクエン酸の測定方法とに関し、具体的には、クエン酸濃度に依存して蛍光特性が変化する蛍光センサータンパク質、及び／又は、該センサータンパク質が発現可能に導入された形質転換体を含むクエン酸検出剤と、該クエン酸測定剤を用いるクエン酸の測定方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
クエン酸は、飲食品の酸味料をはじめ、各種の産業で用途がある。クエン酸は生化学的にトリカルボン酸回路における主要な中間体である。多種類の成分を含むサンプル中におけるクエン酸濃度を測定することは、産業利用の上でも生化学的にも意義が大きい。
【０００３】
従来のクエン酸測定方法には、クエン酸リアーゼ等の酵素反応で生成するＮＡＤ＋を吸光度で測定する方法（非特許文献１）と、０−アミノチオフェノールのような化合物とクエン酸との特異的な反応生成物を蛍光強度で測定する方法（特許文献１）と、ルテニウム錯体の共存下でのクエン酸の酸化反応生成物を化学発光で測定する方法（特許文献２）とが含まれる。これらの方法は、いずれも、クエン酸を直接検出するのではなく、クエン酸から出発する化学反応の生成物を通じて間接的に検出するため、操作が煩雑なうえ、クエン酸を連続的又は経時的に測定することができない。また、これらの方法では、生体内の特定の細胞又は細胞内オルガネラの内部のクエン酸濃度を非破壊的に測定することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭５５−３１８９８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４９６７５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｕｂｅｒ，Ｗ．及びＭｏｅｌｌｅｒｉｎｇ，Ｈ．、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７：３６９（１９６６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、クエン酸を直接検出して連続的又は経時的に測定することができ、かつ、生体内の特定の細胞又は細胞内オルガネラの内部のクエン酸濃度を非破壊的に測定することができる、クエン酸検出剤と、該クエン酸検出剤を用いるクエン酸測定方法とを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はクエン酸特異的蛍光センサータンパク質を提供する。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、アミノ末端側からカルボキシル末端側へ順に、第１のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と、第２のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む。第１のクエン酸結合ポリペプチドと第２のクエン酸結合ポリペプチドとは、配列番号１に列挙されるアミノ酸配列からなるセンサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの細胞周辺腔ドメインのペプチド結合が第５４番目又は第５５番目のアミノ酸残基と次のアミノ酸残基との間で切断されて得られる２個のポリペプチドのうち、それぞれ、アミノ末端側ポリペプチドと、カルボキシル末端側ポリペプチドとである。前記蛍光タンパク質は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列からなる環状異性化蛍光タンパク質（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ｃｐＦＰ」という。）である。
【０００８】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質のアミノ酸配列において、第１のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間には第１のリンカーのアミノ酸配列が挿入され、前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列と第２のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列との間には第２のリンカーのアミノ酸配列が挿入される場合がある。
【０００９】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、（１）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、（３）配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列と７８％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、（４）配列番号５又は６に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、（５）配列番号５又は６に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００１０】
本発明は、本発明のいずれかのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１２】
本発明は、本発明の発現ベクターが発現可能に導入された形質転換体を提供する。
【００１３】
本発明は、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質、及び／又は、本発明の形質転換体を含むクエン酸検出剤を提供する。
【００１４】
本発明は、クエン酸濃度の測定方法を提供する。本発明のクエン酸濃度の測定方法は、（１）本発明のクエン酸検出剤を被検サンプルに接触させるステップと、（２）クエン酸濃度に依存する変化を示す第１の励起波長での蛍光特性と、クエン酸濃度に依存する変化を示さないか、あるいは、第１の励起波長でのクエン酸濃度に依存する蛍光特性の変化とは異なる蛍光特性の変化を示す第２の励起波長での蛍光特性とを測定するステップとを含む。
【００１５】
本明細書において「クエン酸検出剤」とは、クエン酸の存在の有無、及び／又は、クエン酸の濃度を決定することができる組成物をいう。
【００１６】
本明細書において「クエン酸特異的蛍光センサー」とは、クエン酸の濃度に依存して蛍光特性が変化する物質をいう。本発明の「クエン酸特異的蛍光センサータンパク質」とは、クエン酸の濃度に依存して蛍光特性が変化するタンパク質をいう。本発明の「クエン酸特異的蛍光センサー活性」とは、クエン酸の濃度に依存して蛍光特性が変化する活性をいう。ここで蛍光特性には、蛍光強度、励起スペクトル及び／又は発光スペクトルを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
以下の実施例に詳しく説明されるとおり、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質のうち、ＣＦ９８（配列番号３に列挙されるアミノ酸配列、配列番号５に列挙されるヌクレオチド配列）は、５２５ｎｍの発光波長での蛍光強度を測定するとき、４７０−５１０ｎｍの範囲の励起波長での蛍光強度はクエン酸の濃度が高くなるに伴って強くなり、４００−４２０ｎｍの範囲の励起波長での蛍光強度はクエン酸の濃度が高くなるに伴って弱くなる。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質のうち、ＣＦ９９（配列番号４に列挙されるアミノ酸配列、配列番号６に列挙されるヌクレオチド配列）は、５２５ｎｍの発光波長での蛍光強度を測定するとき、４７０−５１０ｎｍの範囲の励起波長での蛍光強度はクエン酸の濃度が高くなるに伴って弱くなり、４００−４１５ｎｍの範囲の励起波長での蛍光強度はクエン酸の濃度が高くなるに伴って強くなり、４２０−４３０ｎｍの範囲の励起波長での蛍光強度はクエン酸の濃度に関係なく一定である。ＣＦ９８及びＣＦ９９の励起波長と蛍光強度との関係は、５４０ｎｍの発光波長で測定しても同じ傾向を示した。
【００１８】
本発明の第１及び第２のクエン酸結合ポリペプチドは、クエン酸と結合するタンパク質ドメインのペプチド結合が１カ所で切断されて得られる。本発明では、クエン酸と結合する前記タンパク質ドメインとして、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の膜タンパク質である、センサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡ（ＣＩＴＡ＿ＫＬＥＰＮ、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５２６８７）の細胞周辺腔ドメイン（全長５４７残基のうち第４５番目から第１７６番目までのアミノ酸配列、配列番号１、以下、「ＣｉｔＡＰ」という。Ｋａｓｐａｒ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３３：８５８（１９９９））が用いられる。本明細書では、クエン酸特異的蛍光センサータンパク質はＣＦＮ（Ｎは９７から１０５までの整数）と命名される。ここでＣＦＮの一次構造は、前記ＣｉｔＡＰのポリペプチドが第Ｎ番目のアミノ酸残基と第Ｎ＋１番目のアミノ酸残基との間のペプチド結合が切断されて得られたアミノ末端側の第１のクエン酸結合ポリペプチドと、カルボキシル末端側の第２のクエン酸結合ポリペプチドとの間に、第１のリンカーペプチドと、以下に説明するｃｐＦＰと、第２のリンカーペプチドとがこの順でアミノ末端側からカルボキシル末端側に並ぶように挿入される。なお、前記第Ｎ番目のアミノ酸残基は、ＣｉｔＡタンパク質の全長のアミノ末端残基を第１番目として表記したものであり、配列番号１に列挙されるＣｉｔＰＡポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端を第１番目とすると、第Ｎ−４４番目のアミノ酸残基に相当する。ＣＦ９８のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３及び５に列挙される。ＣＦ９９のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号４及び６に列挙される。
【００１９】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質において、第１のリンカーペプチドのアミノ酸配列は「Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ」であり、第２のリンカーペプチドのアミノ酸配列は「Ｇｌｙ−Ｔｈｒ」である。
【００２０】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に含まれる、環状異性化蛍光タンパク質（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ｃｐＦＰ」という。）は、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体のβ−ｃａｎ構造内に、ポリペプチドの２つの部分が中央部位の周りにフリップする環状異性化（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を許容する可能性がある部位が存在するとの発見（Ｂａｉｒｄ，  Ｇ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：１１２４１（１９９９））に基づいて設計されたＧＦＰの改変体で、他のポリペプチドとの融合タンパク質の状態で、該他のポリペプチドと別の分子との相互作用の情報を蛍光特性の変化に変換することができる（Ｎａｇａｉ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：３１９７（２００１））。本発明のｃｐＦＰは、６個の点突然変異（Ｆ４６Ｌ、Ｔ６６Ｇ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ、Ｈ１４８Ｄ及びＴ２０３Ｆ）を有するＧＦＰポリペプチドの第１４４番目のアミノ酸残基と第１４５番目のアミノ酸残基との間のペプチド結合が切断され、第１４５番目からカルボキシル末端の第２３８番目のアミノ酸残基までのポリペプチドに続けて、配列番号７に列挙されるアミノ酸配列（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）からなるリンカーを介して、前記６個の点突然変異を有するＧＦＰの第２番目から１４４番目までのポリペプチドが連結された構造を有する。本発明のｃｐＦＰのアミノ酸配列は配列番号２に列挙される。
【００２１】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００２２】
染色体ＤＮＡの調製、目的遺伝子の増幅、電気泳動、染色等は定法に従って行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照せよ。
【００２３】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、問合せ（クエリー）のヌクレオチド配列と、比較対象（サブジェクト）のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を問合せ（クエリー）のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、問合せ（クエリー）のアミノ酸配列と、比較対象（サブジェクト）のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、アミノ酸配列が一致する部分のアミノ酸残基の数の合計を問合せ（クエリー）のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。前記ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、配列番号３又は４に列挙されるアミノ酸配列からなるタンパク質との相同性が、７８％以上、８０％以上、９０％以上、又は、９５％以上の場合がある。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、配列番号５又は６に列挙されるアミノ酸配列からなるタンパク質との相同性が、８０％以上、９０％以上、又は、９５％以上の場合がある。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎに説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことをいう。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。所望のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと、前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、所望のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることをいう。
【００２５】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で、本発明のクエン酸濃度の測定方法に使用される場合がある。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記タンパク質を発現する宿主生物すなわち形質転換体が生きた状態で本発明のクエン酸濃度の測定方法に用いられる場合がある。その場合には、生物体内でのクエン酸濃度を非破壊的に、かつ、連続的に測定することができる。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、精製された状態で本発明のクエン酸濃度の測定方法に使用されてもよい。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質の検出、分離、精製及び保存は当業者に周知な方法で実施される。
【００２６】
本明細書において「ベクター」とは、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み、宿主生物へ導入することにより、前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは、前記ベクターはプラスミドの場合がある。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み、宿主生物へ導入するのに用いるベクターは、例えば、ｐＥＴベクターシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ、メルク株式会社）と、ｐＰＩＣＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）と、ｐＣＭＶ−ＨＡ及びｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、タカラバイオ株式会社）とを含むが、これらに限定されない。本明細書において「発現ベクター」とは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、いずれかのベクターとを連結することによって作製される、前記タンパク質を宿主生物で発現可能なベクターである。
【００２７】
本明細書において「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質を発現することができるようになった生物である。本発明の形質転換体は、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質が、細胞の特定のオルガネラに局在するか、あるいは、細胞内に均一に分布する場合がある。本発明の形質転換体が多細胞生物個体のとき、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、特定の細胞タイプ、組織、器官又は臓器に局在するように発現される場合がある。本発明の形質転換体は、クエン酸の膜透過、生成及び／又は分解に関与する他の遺伝子産物、例えば、クエン酸輸送体タンパク質を、構成的に、あるいは、誘導可能に発現する場合がある。
【００２８】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、前記発現ベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。
【００２９】
前記形質転換体は、前記発現ベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。発現ベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【００３０】
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、遺伝子組換え技術を利用して形質転換体が生きている状態で体外に放出される場合がある。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、同一の形質転換体で他のタンパク質と共発現される場合がある。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、別々の形質転換体で発現する場合がある。前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質の発現が強制されるとき、形質転換体が増殖する間は、所望の機能を有するタンパク質の発現は抑制され、形質転換体が十分に増殖した後、発現が人工的に誘導されることが好ましい。かかる発現の誘導及び抑制は、大腸菌ラクトースオペロンの発現制御システムとイソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とを含むが、これらに限定されない、当業者に周知ないずれかの発現制御システム及び誘導物質を用いて達成される場合がある。
【００３１】
本明細書において「融合タンパク質」とは、特異的結合タグペプチドと、クエン酸特異的蛍光センサータンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端とが連結した融合タンパク質をいう。前記特異的結合タグペプチドは、前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドか、形質転換体内で前記クエン酸特異的蛍光センサータンパク質が発現するとき、形質転換体内で局在するように、細胞膜、核その他の細胞内オルガネラのレセプターと特異的に結合するポリペプチドかである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えたりすることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドと、細胞外分泌シグナルペプチド、核移行シグナルペプチドその他の細胞内オルガネラ特異的局在に関与するペプチドとが含まれるが、これらに限定されない。特異的結合タグは、融合タンパク質が、クエン酸特異的蛍光センサー活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３２】
本発明のクエン酸検出剤は、本発明のいずれかのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質と、該クエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの含む発現ベクターが発現可能に導入された形質転換体とからなるグループから選択される少なくとも１つを含む。本発明のクエン酸検出剤は、被検サンプルを含む溶液中に溶解されて被検サンプルに接触される場合がある。あるいは、本発明のクエン酸検出剤は、固相に固定されて被検サンプルに接触される場合がある。本発明のクエン酸検出剤の蛍光特性は、蛍光分光光度計、顕微蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡画像解析装置その他の蛍光測定装置を用いて検出される。
【００３３】
以下の実施例で詳しく説明するとおり、本発明のクエン酸検出剤は、第１の励起波長ではクエン酸濃度に依存する蛍光特性の変化を示すが、第２の励起波長ではクエン酸濃度に依存する蛍光特性の変化を示さない場合があり、あるいは、第１の励起波長での蛍光特性の変化とは異なる蛍光特性の変化を第２の励起波長で示す場合がある。本発明のクエン酸検出剤によるクエン酸濃度の測定方法では、本発明のクエン酸検出剤の第１の励起波長での蛍光特性と、第２の励起波長での蛍光特性との定量値に基づく関数から得られるパラメーター値を、既知濃度のクエン酸についてプロットして得られる検量線を用意するステップと、被検サンプルに接触されたときのパラメーター値を前記検量線を参照して、前記被検サンプルにおけるクエン酸濃度を決定するステップとを含む場合がある。本発明のクエン酸検出剤の第１の励起波長での蛍光特性と、第２の励起波長での蛍光特性との定量値に基づく関数は、本発明のクエン酸検出剤の第１の励起波長での蛍光特性の定量値を、第２の励起波長での蛍光特性の定量値で除算して得られる比の場合がある。以下の実施例では、前記蛍光特性の定量値として、蛍光強度が用いられる。第１の励起波長での蛍光特性の定量値を得る作業と、第２の励起波長での蛍光特性の定量値を得る作業とは、ともに短時間で実行できるので、本発明のクエン酸濃度の測定方法によると、連続的又は経時的にクエン酸濃度を測定することができる。また、本発明のクエン酸検出剤の第１の励起波長での蛍光特性と、第２の励起波長での蛍光特性との定量値に基づく関数が、本発明のクエン酸検出剤の第１の励起波長での蛍光特性の定量値を、第２の励起波長での蛍光特性の定量値で除算して得られる商又はその逆数の場合には、本発明のクエン酸検出剤の量に依存せずにクエン酸濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８の励起スペクトル（測定波長５２５ｎｍ）のクエン酸濃度による変化を示すグラフ。
【図１Ｂ】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８の励起スペクトル（測定波長５４０ｎｍ）のクエン酸濃度による変化を示すグラフ。
【図２Ａ】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９９の励起スペクトル（測定波長５２５ｎｍ）のクエン酸濃度による変化を示すグラフ。
【図２Ｂ】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９９の励起スペクトル（測定波長５４０ｎｍ）のクエン酸濃度による変化を示すグラフ。
【図３】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８の蛍光特性関数パラメーターとクエン酸濃度との関係を示すグラフ。
【図４】本発明の実施例のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９９の蛍光特性関数パラメーターとクエン酸濃度との関係を示すグラフ。
【図５Ａ】クエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とが共発現された大腸菌の蛍光顕微鏡画像。
【図５Ｂ】クエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とが共発現された大腸菌にクエン酸を添加した後の蛍光強度の経時的変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００３６】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００３７】
１．クエン酸特異的蛍光センサータンパク質発現ベクターの構築
１．１  材料
大腸菌ＪＭ１０９株と、ＢＬ２１（ＤＥ３）株とが、それぞれ、発現ベクター構築用宿主と、組換えタンパク質産生用宿主として用いられた。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に使用するクエン酸結合タンパク質であるセンサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの遺伝子はグラム陰性桿菌クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＢＲＣ１３５４１株から取得された。クレブシエラ・ニューモニエ菌は独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手された。本発明の実施例で用いるクエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴは大腸菌Ｗ３１１０株から取得された。これらの細菌の培養にはＬＢ培地が使用され、必要に応じて適切な抗生物質（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）が添加された。遺伝子操作に用いるＰＣＲプライマーＰｒ１ないしＰｒ３２は以下の表１に示される。Ｐｒ１ないしＰｒ３２のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列表では配列番号８ないし配列番号３９に列挙される。
【００３８】
【表１】
2014100100.tif 000002
【００３９】
１．２  クエン酸結合タンパク質センサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの細胞周辺腔ドメインの遺伝子クローニング
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に使用するクエン酸結合タンパク質として、クレブシエラ・ニューモニエ菌のセンサーヒスチジンキナーゼＣｉｔＡの細胞周辺腔ドメインが選択された。ＣｉｔＡ細胞周辺腔ドメインは、全長アミノ酸残基５４７個のＣｉｔＡタンパク質の第４５番目から１７６番目までのアミノ酸残基の部分である。ＣｉｔＡ細胞周辺腔ドメインをエンコードするＤＮＡは、クレブシエラ・ニューモニエ菌ＮＢＲＣ１３５４１株の染色体ＤＮＡ抽出物から、表１に列挙されたＰｒ１及びＰｒ２プライマーを用いるＰＣＲ法で増幅された。得られた増幅断片はｐＥＴ−２１ｄ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、メルク株式会社）のＮｃｏ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ部位に挿入され、プラスミドｐＥＣｉｔＡＰが得られた。
【００４０】
１．３  ｃｐＦＰの作成
緑蛍光タンパク質の野生型のＳ６５Ｔ変異体（ＥＧＦＰ）をエンコードするプラスミドｐＢＥＧＦＰ−ＦのＤＮＡを鋳型として、表１に列挙されたＰｒ３及びＰｒ４プライマーにより、ＥＧＦＰの第１４５番目から第２３８番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片Ａが増幅された。また、Ｐｒ５及びＰｒ６プライマーにより、ＥＧＦＰの第２番目から第１４４番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片Ｂが増幅された。つぎに、ＤＮＡ断片Ａ及びＤＮＡ断片Ｂの混合物を鋳型として、Ｐｒ３及びＰｒ６プライマーにより、ｃｐＦＰをエンコードするＤＮＡ断片Ｃが増幅された。ＤＮＡ断片ＣはｐＵＣ１９のＰｓｔ  Ｉ及びＫｎｐ  Ｉ部位に挿入された。さらに、Ｐｒ７ないしＰｒ１２のプライマーを用いて、Ｆ４６Ｌ、Ｔ６５Ｇ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ、Ｈ１４８Ｄ及びＴ２０３Ｆ（アミノ酸残基の番号はＧＦＰ野生型タンパク質のアミノ末端を第１番目の残基とする。）の突然変異がＤＮＡ断片Ｃに導入され、ＤＮＡ断片Ｃ−ｍｕが得られた。
【００４１】
１．４  ＣｉｔＡＰとｃｐＦＰとの融合タンパク質の作成
ＣｉｔＡＰの第９７番目から第１０５番目までのアミノ酸残基は、クエン酸との結合の際に最も大きい構造変化を示す可動性領域である。そこで、ＣｉｔＡＰの第Ｎ番目のアミノ酸残基と、第Ｎ＋１番目のアミノ酸残基との間にｃｐＦＧが挿入される融合タンパク質ＣＦＮ（Ｎは９７から１０５までの整数）が作成された。まず、第１のリンカー（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）と、ｃｐＦＰと、第２のリンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）とが連結されたポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片Ｄが、点突然変異が導入されたｃｐＦＰのＤＮＡ断片Ｃ−ｍｕを鋳型として、Ｐｒ１３及びＰｒ１４プライマーを用いてＰＣＲ増幅された。つぎに、ＣＰ９７、ＣＰ９８、・・・、Ｐ１０５の第１のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片は、Ｐｒ１プライマーと、それぞれ、Ｐｒ１５、Ｐｒ１７、・・・、Ｐｒ３１との対を用いてＰＣＲ増幅された。ＣＰ９７、ＣＰ９８、・・・、ＣＰ１０５の第２のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片は、Ｐｒ２プライマーと、それぞれ、Ｐｒ１６、Ｐｒ１８、・・・、Ｐｒ３２との対を用いてＰＣＲ増幅された。そして、ＣＰ９７、ＣＰ９８、・・・、ＣＰ１０５のそれぞれについて、第１のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片と、ＤＮＡ断片Ｃ−ｍｕと、第２のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ断片との混合物を鋳型として、Ｐｒ１及びＰｒ２を用いて、ＣｉｔＡＰとｃｐＦＰとの融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片がＰＣＲ増幅により得られた。これらのＤＮＡ断片はｐＥＴ−２１ｄ（＋）のＮｃｏ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ部位に挿入され、発現ベクターｐＥＣＦ９７、ｐＥＣＦ９８、・・・、ｐＥＣＦ１０５が得られた。
【００４２】
１．５  ＣｉｔＡＰとｃｐＦＰとの融合タンパク質の遺伝子発現
発現ベクターｐＥＣＦ９７、ｐＥＣＦ９８、・・・、ｐＥＣＦ１０５は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換され、ＣＦ９７、ＣＦ９８、・・・、ＣＦ１０５のそれぞれとＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現された。これらの形質転換された大腸菌は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されたＬＢ培地３ｍＬ中で３７°Ｃ、１６０ｒｐｍ、８時間振盪培養され、前培養液が得られた。この前培養液５０μＬは、バッフル付き５００ｍＬ三角フラスコ中の前記アンピシリン添加ＬＢ培地５０ｍＬに稙菌され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍ、３時間振盪培養された。その後、イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍ、１８時間振盪培養され、組換えタンパク質が産生された。培養終了後の大腸菌は遠心分離で回収され、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．０）で２回洗菌された。前記大腸菌は超音波破砕機（ＵＤ−２０１、株式会社トミー精工）により破砕され、得られた細胞破砕液は、遠心分離（１５，０００×ｇ、４°Ｃ、３０分）され、上清が無細胞抽出液とされた。
【００４３】
１．６  ＣＦＮのＨｉｓタグ融合タンパク質の精製
前記大腸菌無細胞抽出液は、ＴＮＩ５バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＬ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  イミダゾール）で平衡化されたＨｉｓＴｒａｐＨＴカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）に供された。その後カラム容量の５倍量のＴＮＩ５バッファーが前記カラムに通液されてカラムがリンスされた。ＣＦＮのＨｉｓタグ融合タンパク質はＴＮＩ５００バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＬ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭ  イミダゾール）で溶出された。ＣＦＮのＨｉｓタグ融合タンパク質は、さらに、セファデックスＧ−２５（ＰＤ−１０カラム、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いたゲル濾過により、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．０）にバッファーが置換された。精製されたＣＦＮのＨｉｓタグ融合タンパク質の定量には、クーマジータンパク質アッセイ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）が用いられた。
【実施例２】
【００４４】
２．クエン酸特異的蛍光センサータンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付け
２．１  材料及び方法
精製されたＣＦＮは、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．０）中で、蛍光分光光度計（ＦＰ−６２００、日本分光株式会社）で励起スペクトルが測定され、クエン酸濃度による蛍光特性の変化が調べられた。測定条件は、励起波長範囲：３５０−５１２ｎｍ、発光波長５２５ｎｍ又は５４０ｎｍ、スペクトルバンド幅５ｎｍ、応答性：中、波長走査速度：２０００ｎｍ／分、利得：中。
【００４５】
２．２  結果
ＣＦＮの精製タンパク質のうち、ＣＦ９７、ＣＦ９９、ＣＦ１００、ＣＦ１０２、ＣＦ１０３、ＣＦ１０４及びＣＦ１０５は、クエン酸濃度の上昇とともに蛍光強度が減少した。これに対しＣＦ９８及びＣＦ１０１は、クエン酸濃度の上昇とともに蛍光強度が増大した。そこで、ＣＦＮタンパク質はいずれもクエン酸特異的蛍光センサータンパク質であることが示された。ＣＦＮタンパク質のうち、ＣＦ９８及びＣＦ９９は他のＣＦＮタンパク質よりもクエン酸濃度依存的な蛍光強度の変化が顕著であった。そこで、以下では、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質の典型例として、ＣＦ９８及びＣＦ９９について詳細に蛍光特性が調べられた。
【００４６】
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、ＣＦ９８及びＣＦ９９の励起スペクトルのクエン酸濃度による変化を示すグラフである。図１Ａ及び図２Ａの横軸は励起波長であり、縦軸は５２５ｎｍでの蛍光強度である。図１Ｂ及び図２Ｂの横軸は励起波長であり、縦軸は５４０ｎｍでの蛍光強度である。図１Ａ及び図１Ｂに示すとおり、ＣＦ９８はクエン酸濃度依存的に蛍光強度が増大した。詳細に励起スペクトルを検証するとＣＦ９８は、４１３ｎｍと５０３ｎｍの２つのピークを示し、クエン酸濃度の上昇とともに４１３ｎｍにおける蛍光強度が減少し、５０３ｎｍにおける蛍光強度が増大した。一方図２Ａ及び図２Ｂに示すとおり、ＣＦ９９はクエン酸濃度依存的に蛍光強度が減少した。さらにＣＦ９９においても、励起スペクトルを検証すると４１３ｎｍと５０３ｎｍの２つのピークを示し、クエン酸濃度の上昇とともに４１３ｎｍにおける蛍光強度が増大し、５０３ｎｍにおける蛍光強度が減少した。図３及び図４は、それぞれＣＦ９８及びＣＦ９９の蛍光特性関数パラメーターとクエン酸濃度との関係を示すグラフである。図３での前記蛍光特性関数パラメーターは、励起波長５０４ｎｍでの蛍光強度（測定波長５２５ｎｍ）の実測値を励起波長４１３ｎｍでの蛍光強度（測定波長５２５ｎｍ）の実測値で除算した商である。図４での前記蛍光特性関数パラメーターは、励起波長４１３ｎｍでの蛍光強度（測定波長５２５ｎｍ）の実測値を励起波長５０４ｎｍでの蛍光強度（測定波長５２５ｎｍ）の実測値で除算した商である。図３及び４の横軸はクエン酸の濃度で、縦軸は前記蛍光特性関数パラメーターの計測値である。図３及び図４に示すとおり、この２つのピークにおける蛍光強度の比を用いることで、クエン酸特異的蛍光センサータンパク質の濃度に依存せずにクエン酸の濃度を決定することが可能であった。また、クエン酸の添加による蛍光強度変化は迅速であり、本実施例での使用機器では１ミリ秒以下の瞬時に変化することを確認した。
【００４７】
ｃｐＦＰを利用する従来のバイオセンサータンパク質では、被検物質と特異的に結合するタンパク質が単独で応答する被検物質の濃度範囲と、当該特異的結合タンパク質とｃｐＦＰとが融合されたバイオセンサータンパク質が応答する被検物質の濃度範囲とはほぼ一致する。例えば、Ｎａｇａｉ、Ｔ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９８：３１９７（２００１））の報告によると、カルモジュリンと、カルモジュリンがｃｐＦＰに融合されたＣａ２＋イオンのインジケータータンパク質とが応答するＣａ２＋イオンの濃度範囲はともに１μＭ前後であった。また、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ、Ｖ．Ｖ．ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３：２８１（２００６）の報告によると、大腸菌由来のＨ２Ｏ２感受性タンパク質ＯｘｙＲと、この断片とｃｐＦＰとが融合されたＨ２Ｏ２特異的インジケータータンパク質の応答濃度範囲は、ＯｘｙＲのＨ２Ｏ２応答濃度範囲（Ａ▲Ａの上に補助記号リング（○）▼ｓｌｕｎｄ、Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６：６１６１（１９９９））とほぼ同一である。これに対し、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８及びＣＦ９９は、０．１ｍＭから１０ｍＭまでの濃度範囲で応答する。Ｋａｓｐａｒ、Ｓ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３３：８５８（１９９９））によると、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に用いられたクエン酸結合タンパク質ＣｉｔＡＰのクエン酸との解離定数ＫｄはｐＨ７、２５°Ｃで５．５μＭと報告された。これに対し、ＣＦ９８及びＣＦ９９のクエン酸との解離定数Ｋｄは、それぞれ図３及び４から数ｍＭと考えられる。このように、クエン酸結合タンパク質と、その融合タンパク質のバイオセンサーとで応答クエン酸濃度が１０００倍も変化することは予想外であった。
【００４８】
また、０．１ｍＭから１０ｍＭまでの濃度範囲はさまざまな細胞における細胞内クエン酸濃度に対応する。例えば、ＬＡＧＵＮＡＳ、Ｒ．及びＧＡＮＣＥＤＯ、Ｃ．（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３７，  ４７９  （１９８３））によると、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞内クエン酸濃度は、嫌気的条件か好気的条件か、増殖状態か静止状態かによって異なるが、０．２１ｍＭから５．２ｍＭの範囲内である。Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｂ．Ｄ．ら（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ５：５９３  （２００９））によると、大腸菌Ｋ１２株の細胞内クエン酸濃度は、グルコース、グリセロール及び酢酸を炭素源とする培養条件下で、それぞれ、１．９６、２．３２及び２１．９ｍＭである。そこで、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８及びＣＦ９９は細胞内クエン酸濃度の非侵襲的検出に適する。
【００４９】
ＴＣＡ回路周辺の有機酸の添加によって蛍光強度が変化するかどうかについて検討された。表２のとおり、クエン酸以外の有機酸によってＣＦ９８およびＣＦ９９の蛍光強度が顕著に変化することは認められなかった。そこで、ＣＦ９８及びＣＦ９９はクエン酸に特異的な蛍光センサータンパク質であることが示された。
【００５０】
【表２】
2014100100.tif 000003
【実施例３】
【００５１】
３．クエン酸特異的蛍光センサータンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの特徴付け
３．１  材料及び方法
ＣｉｔＴをエンコードするＤＮＡ断片は大腸菌Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡ抽出物を鋳型としてＰＣＲ増幅により得られた。前記ＤＮＡ断片は、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、メルク株式会社）のＮｄｅ  Ｉ及びＭｆｅ  Ｉ部位に挿入され、発現ベクターｐＲＣＩＴＴが得られた。ｐＲＣＩＴＴか、その空ベクターのｐＲＳＦＤｕｅｔ−１かがｐＥＣＦ９８とともに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入された形質転換体が作成された。クエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とクエン酸輸送体ＣｉｔＴとが共発現する大腸菌の培養液に２．５ｍＭのクエン酸を添加したときの蛍光を、ＣＦ９８のみが発現する大腸菌の蛍光と比較された。
【００５２】
３．２  結果
図５Ａは、クエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とが共発現された大腸菌のクエン酸添加前に撮影された蛍光顕微鏡画像である。スケールは１０μｍである。大腸菌の菌体全体が均一に蛍光を発していた。図５Ｂは、クエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とが共発現された大腸菌に、０．０２５ｍＭ、０．２５ｍＭ及び２．５ｍＭのクエン酸を添加したときの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。陰性対照として、ＣｉｔＴの発現ベクターｐＲＣＩＴＴのかわりに空ベクターｐＲＳＦＤｕｅｔ−１がｐＥＣＦ９８とともに形質転換され、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８のみが発現された大腸菌に２．５ｍＭのクエン酸を添加したときの蛍光強度の経時変化が調べられた。縦軸は蛍光強度で、横軸は測定開始後の経過時間（単位：秒）で、矢印はクエン酸が添加された時刻を表す。蛍光測定開始から２５秒後にクエン酸が添加された。クエン酸輸送体タンパク質ＣｉｔＴと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質ＣＦ９８とが共発現された大腸菌では、クエン酸の添加後に蛍光強度が増大した。蛍光強度は添加されたクエン酸の濃度が高いほど強かった。ＣＦ９８のみが発現する大腸菌では蛍光強度の変化はほとんど認められなかった。図５Ａ及び図５Ｂは、ともに、励起波長は４８５ｎｍ、発光波長は５３５ｎｍであった。なお、ｐＨ蛍光指示剤のＳＮＡＲＦ−５Ｆを用いて、クエン酸の添加により大腸菌菌体内のｐＨは変化しないことが確認された。したがって、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、生体細胞内のクエン酸濃度を非破壊的に、経時的に測定することができる。
【図１Ａ】
2014100100.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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