(57)【要約】【課題】  低塩濃度の溶液中でタンパク質を吸着し、その溶液のｐＨを変えることで前記吸着したタンパク質を容易に溶出可能な、２種類以上の化合物を担体に固定化して得られる新規なタンパク質吸着剤、および当該吸着剤を用いたタンパク質の精製方法を提供すること。【解決手段】  一般式（１）【化１】          2014016289.tif 000019（式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立に水素原子またはアミノ基を表す。また、Ｒ１とＲ２は一体となってイミダゾール環を形成していてもよい。Ｘは、窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基を表す。）で表されるアリールカルボニル基のうち、少なくとも２種類以上をスペーサーを介して同一の担体に固定化して得られる、タンパク質精製用吸着剤、および当該吸着剤を用いたタンパク質の精製方法により前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2014016289.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立に水素原子またはアミノ基を表す。また、Ｒ１とＲ２は一体となってイミダゾール環を形成していてもよい。Ｘは、窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基を表す。）で表されるアリールカルボニル基のうち、少なくとも２種類以上をスペーサーを介して同一の担体に固定化して得られる、タンパク質精製用吸着剤。
【請求項２】
一般式（１）中、Ｒ１とＲ２が各々独立に水素原子またはアミノ基であり、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基であり、かつＲ１とＲ２が一体ではない、アリールカルボニル基と、
一般式（１）中、Ｒ１とＲ２が一体となってイミダゾール環を形成しており、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基である、アリールカルボニル基とを少なくとも含む、
請求項１に記載のタンパク質精製用吸着剤。
【請求項３】
スペーサーが一般式（２）
【化２】
2014016289.tif 000014
（式中、ｍは２から５の整数、ｐは０から５の整数を表す。）または一般式（３）
【化３】
2014016289.tif 000015
（式中、ｎは２から５の整数、ｑは０から５の整数を表す。）で表される、
請求項１または２記載のタンパク質精製用吸着剤。
【請求項４】
スペーサーを介してアリールカルボニル基を固定化させる担体が、その表面に水酸基を有している、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質精製用吸着剤。
【請求項５】
担体がポリメタクリレートゲルである請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質精製用吸着剤。
【請求項６】
担体表面に有する水酸基を、活性化剤を用いて活性化する工程と、
活性化した担体に一般式（４）
【化４】
2014016289.tif 000016
（式中、ｍは２から５の整数、ｐは０から５の整数を表す。）または一般式（５）
【化５】
2014016289.tif 000017
（式中、ｎは２から５の整数、ｑは０から５の整数を表す。）で表される化合物を固定化する工程と、
前記化合物を固定化した担体に、一般式（６）
【化６】
2014016289.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立に水素原子またはアミノ基を表す。また、Ｒ１とＲ２は一体となってイミダゾール環を形成していてもよい。Ｘは、窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基を表す。）で表されるアリールカルボン酸のうち、少なくとも２種類以上を反応させて固定化する工程とを含む、
タンパク質精製用吸着剤の製造方法。
【請求項７】
担体に固定化するアリールカルボン酸が、
一般式（６）中、Ｒ１とＲ２が各々独立に水素原子またはアミノ基であり、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基であり、かつＲ１とＲ２が一体ではない、アリールカルボン酸と、
一般式（６）中、Ｒ１とＲ２が一体となってイミダゾール環を形成しており、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基である、アリールカルボン酸である、
請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質精製用吸着剤にタンパク質と３００ｍＭ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨが６から８の緩衝液を接触させることで当該タンパク質を前記吸着剤に吸着させる工程と、ｐＨ３から５の緩衝液を用いて前記吸着剤に吸着したタンパク質を溶出させる工程とを含む、タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のリガンドを有する新規なタンパク質精製用吸着剤およびその製造方法ならびにそれを用いたタンパク質の精製方法に関する。本発明の吸着剤は、タンパク質、特に免疫グロブリンおよびその誘導体ならびにそれらの断片および融合体の精製を目的とする技術分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、医療用タンパク質を工業的なスケールで簡便に精製する技術の確立が切望されている。一般に、目的タンパク質を精製する際には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー分離技術が用いられる。しかしながら医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合、実験室で用いられるような分離剤や装置を使用したのでは経済性に乏しく、実用的とは言い難い。
【０００３】
また医療用タンパク質を工業的に製造する際、目的とする医療用タンパク質の他に多くの夾雑タンパク質が混在しており、一つの精製技術のみを用いて目的とするタンパク質を純度高く得ることは困難である。そのため通常は、複数の精製技術を用いて、高純度の医療用タンパク質を工業的に製造している。
【０００４】
医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンＧを精製するための低分子化合物および当該化合物を結合した不溶性担体の製造に関する研究開発は盛んに行なわれており、例えば、スルホン誘導体、トリアジン誘導体、４−ピリジルエチルチオアルカン誘導体、ピリジルアルキルアミン誘導体、アミノフェニルアルキルアミン誘導体等の低分子化合物やそれらを結合した不溶性担体が開示されている。
【０００５】
一方クロマトグラフィー分離技術の分野では前述した技術の他にも、疎水性相互作用と静電的相互作用を有する化合物を固定化した不溶性担体を用いる、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）がある。ＨＣＩＣでは、疎水性相互作用を利用して当該不溶性担体上に固定化した化合物に目的タンパク質を吸着後、静電的（イオン的）な相互作用を利用して当該不溶性担体上に固定化した化合物から目的タンパク質を溶出させることで、タンパク質を分離する（特許文献１から３、非特許文献１から２）。ＨＣＩＣでは、不溶性担体に固定化した化合物とタンパク質中に存在する疎水性部位との多点相互作用を利用してタンパク質を吸着しており、相互作用の強い点と弱い点の総和として決定される。一方タンパク質の溶出は、ｐＨ変化により当該化合物およびタンパク質の表面電荷を変化させ、吸着時に相互作用している部位またはその近傍に静電反発を誘発し、疎水性相互作用を弱めることにより行なわれる。
【０００６】
ＨＣＩＣに利用可能な、不溶性担体上に固定化させる化合物については、さらなる性能の向上が求められている。しかしながら、当該化合物とタンパク質の相互作用が一点でなく多点である場合、当該化合物がタンパク質と相互作用する部位や両者の量論的な関係等をＸ線結晶構造解析法などで決定することが困難なため、計算機化学的手法を利用した化合物の最適構造の推定が困難である。そのため当該化合物の探索は十分に行なわれていないのが現状である。
【０００７】
またＨＣＩＣに利用可能な化合物を固定化する不溶性担体としては、これまでに、アガロースゲルやセルロースゲルなどの多糖系天然高分子ゲルを用いた例（非特許文献１から３、特許文献１および３）や、メタクリレート系合成高分子ゲルを用いた例（特許文献２）が報告されている。しかしながら前述した例はいずれも、１種類の化合物を不溶性担体に固定化しており、タンパク質との相互作用は１種類の化合物に依存している。ＨＣＩＣにおいて２種類以上の化合物を不溶性担体に固定化し、その効果を確認した報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ１９９６／０９１１６号
【特許文献２】特開２０１０−０２９８４５号公報
【特許文献３】米国公開特許２００８／０２６２２０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８１４，７１−８１（１９９８）
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１（２０００）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１６，６０８１−６０８７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、低塩濃度の溶液中でタンパク質を吸着し、その溶液のｐＨを変えることで前記吸着したタンパク質を容易に溶出可能な、２種類以上の化合物を担体に固定化して得られる新規なタンパク質吸着剤、および当該吸着剤を用いたタンパク質の精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、上記条件下でタンパク質の吸着溶出能に優れた化合物群を見出した。さらに、それらのうち少なくとも２種類を混合し、単一の担体に固定化させることにより、それらを単独で固定化した場合よりもタンパク質の吸着溶出量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、一般式（１）
【００１３】
【化１】
2014016289.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立に水素原子またはアミノ基を表す。また、Ｒ１とＲ２は一体となってイミダゾール環を形成していてもよい。Ｘは、窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基を表す。）で表されるアリールカルボニル基のうち、少なくとも２種類以上をスペーサーを介して同一の担体に固定化して得られる、タンパク質精製用吸着剤に関するものである。
【００１４】
なお本発明の吸着剤の好ましい態様として、スペーサーが一般式（２）
【００１５】
【化２】
2014016289.tif 000003
（式中、ｍは２から５の整数、ｐは０から５の整数を表す。）または一般式（３）
【００１６】
【化３】
2014016289.tif 000004
（式中、ｎは２から５の整数、ｑは０から５の整数を表す。）で表される、
前記吸着剤があげられる。
【００１７】
また本発明は、
担体表面に有する水酸基を、活性化剤を用いて活性化する工程と、
活性化した担体に一般式（４）
【００１８】
【化４】
2014016289.tif 000005
（式中、ｍは２から５の整数、ｐは０から５の整数を表す。）または一般式（５）
【００１９】
【化５】
2014016289.tif 000006
（式中、ｎは２から５の整数、ｑは０から５の整数を表す。）で表される化合物を固定化する工程と、
前記化合物を固定化した担体に、一般式（６）
【００２０】
【化６】
2014016289.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立に水素原子またはアミノ基を表す。また、Ｒ１とＲ２は一体となってイミダゾール環を形成していてもよい。Ｘは、窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基を表す。）で表される２種類のアリールカルボン酸を反応させて固定化する工程とを含む、タンパク質精製用吸着剤の製造方法に関するものである。
【００２１】
さらに本発明は、タンパク質と３００ｍＭ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨが６から８の緩衝液を前記吸着剤に接触させることで当該タンパク質を前記吸着剤に吸着させる工程と、ｐＨ３から５の緩衝液を用いて前記吸着剤に吸着したタンパク質を溶出させる工程とを含む、
タンパク質の精製方法に関するものである。
【００２２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、前記一般式（１）で表されるアリールカルボニル基がスペーサーを介して担体に固定化して得られるタンパク質精製用吸着剤であって、かつ前記アリールカルボニル基が少なくとも２種類以上である、タンパク質精製用吸着剤を提供する。なお、本発明において、担体に固定化可能であり、かつタンパク質の吸着に関与する化合物をリガンドと称する場合がある。
【００２４】
本発明の吸着剤の好ましい態様として、
（ａ）一般式（１）中、Ｒ１とＲ２が各々独立に水素原子またはアミノ基であり、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基であり、かつＲ１とＲ２が一体ではない、アリールカルボニル基と、
（ｂ）一般式（１）中、Ｒ１とＲ２が一体となってイミダゾール環を形成しており、Ｘが窒素原子または無置換もしくはアミノ基で置換されたメチン基である、アリールカルボニル基、
とを少なくとも含む、吸着剤があげられる。このうち前記（ａ）のアリールカルボニル基の具体例として、
Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘがアミノ基で置換されたメチン基であるアリールカルボニル基、
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がアミノ基であり、Ｘが無置換のメチン基であるアリールカルボニル基、
Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが無置換のメチン基であるアリールカルボニル基、
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がアミノ基であり、Ｘが窒素原子であるアリールカルボニル基、
Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが窒素原子であるアリールカルボニル基、
をあげることができる。また前記（ｂ）のアリールカルボニル基の具体例として、
Ｒ１とＲ２が一体となってイミダゾール環を形成しており、Ｘが無置換のメチン基であるアリールカルボニル基、
をあげることができる。
【００２５】
本発明におけるスペーサーの一例として、前記一般式（２）または前記一般式（３）で表される、炭素鎖を介して両端に二級のアミノ基が結合している構造があげられる。なお炭素鎖中には、窒素原子または酸素原子を含んでいてもよい。また窒素原子または酸素原子を含む場合、これら窒素原子または酸素原子により区切られる炭素鎖の長さは同一または異なっていてもよい。当該化合物を化学式で表した際、炭素鎖を形成する炭素原子の数としては、好ましくは２個から５個である。また、上記した炭素数を有する炭素鎖の数は、好ましくは１個から６個である。さらに、炭素鎖に窒素原子または酸素原子を含む場合、窒素原子または酸素原子の数は、好ましくは１個から５個である。
【００２６】
前記一般式（１）で表されるアリールカルボニル基のうち、少なくとも２種類以上をスペーサーを介して固定化した担体は、タンパク質精製用吸着剤として優れた吸着性および溶出性を有する。本発明において、優れた吸着性とは低塩濃度下（具体的には３００ｍＭ以下（好ましくは１００ｍＭから２００ｍＭ）の塩を含む溶液下）において精製目的のタンパク質を吸着する性質を意味し、優れた溶出性とは低塩濃度下かつ低ｐＨ条件下（具体的にはｐＨ５以下の溶液下）にて前記吸着したタンパクを溶出する性質を意味する。タンパク質の吸着および溶出に用いる溶液に含まれる塩は、タンパク質と担体との非特異吸着を抑えることが可能な塩であれば特に限定はなく、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムがあげられる。なお、これらの塩を一種類用いてもよいし、複数種類用いてもよい。
【００２７】
本発明において担体とは、タンパク質の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつスペーサーとなる化合物を共有結合で固定化するための官能基（例えば水酸基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
【００２８】
本発明の吸着剤は、担体表面に有する官能基を、活性化剤を用いて活性化後、当該活性化した担体にスペーサーとなる化合物を反応させて担体に固定化させ、前記一般式（６）で表されるアリールカルボン酸のうち、少なくとも２種類以上を反応させて固定化することで製造することができる。
【００２９】
担体表面に有する官能基が水酸基の場合、当該水酸基を活性化するには、活性化剤を用いて、前記担体表面にスペーサーとなる化合物の一級または二級のアミノ基と反応可能な活性化基を形成させればよい。前記活性化剤として、具体的には、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）等があげられるが、その中でも１，１’−カルボニルジイミダゾールが好ましい。
【００３０】
前記スペーサーとなる化合物の例として前記一般式（４）または前記一般式（５）で表される化合物があげられ、具体的には、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン等があげられる。
【００３１】
リガンドとして機能する、前記一般式（６）で表されるアリールカルボン酸の具体例としては、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸、３，５−ジアミノ安息香酸、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、６−アミノニコチン酸、５−アミノニコチン酸があげられる。２種類以上の前記アリールカルボン酸を担体に固定化して本発明の吸着剤を製造する際添加する、前記アリールカルボン酸のモル比については特に制限はなく、例えば前記アリールカルボン酸として、６−アミノニコチン酸と５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を用いる場合、６−アミノニコチン酸の添加量に対する５−ベンゾイミダゾールカルボン酸の添加量は、６−アミノニコチン酸に対するモル比にして０．１から９の間であればよく、０．２から４の間にあるとより好ましく、０．４から２．４の間にあるとさらに好ましい。なお前記リガンドを、前記スペーサーとなる化合物を固定化した担体へ固定化させるには、前記リガンドが有するカルボン酸を活性化後、前記スペーサーとなる化合物の末端にあるアミノ基と反応させればよい。カルボン酸の活性化法は、前記スペーサーとなる化合物のアミノ基と反応する活性化法であれば特に限定はなく、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド−パラ−トルエンメトスルホン酸、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムパラトルエンスルホン酸等の縮合剤を使用することで、容易に前記カルボン酸と前記アミノ基によるアミド結合を形成し、担体へ固定化することができる。
【００３２】
前記製造方法により得られるタンパク質精製用吸着剤は、低塩濃度下における前記タンパク質の吸着性および溶出性が優れている。本発明の吸着剤により精製可能なタンパク質に特に限定はなく、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、アルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、キモトリプシノーゲンＢ、キモトリプシノーゲンＣ、キモトリプシンＡα、キモトリプシンＣ、キモトリプシンインヒビター、トリプシン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、アスパラギナーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼインヒビターＩ、α−アミラーゼインヒビターＩＩ、アルギナーゼ、インスリン、インターフェロン、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エストロゲンレセプターＩ、エノラーゼ、エラスターゼ、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、カタラーゼ、カリクレイン、カリクレインインヒビター、カルシトニン、キモシン、プロキモシン、パパイン、キモパパインＡ、キモパパインＢ、グルカゴン、α−グルコシダーゼ、血液凝固因子、甲状腺刺激ホルモン、コリンエステラーゼ、コンカナバリンＡ、チトクロームｂ５、チトクロームｂ５６２、チトクロームｃ、チトクロームｃ２、チトクロームｃ５５０、チトクロームｆ、スブチリシン、成長ホルモン、セルラーゼ、セルロプラスミン、チログロブリン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターＩＩ、トランスフェリン、トリプシノーゲン、トロンビン、プロトロンビン、ヌクレアーゼ、ノイラミニダーゼ、パンクレアチン、フィブリノーゲン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミンインヒビター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、プロテインキナーゼ、プロラクチン、ヘキソキナーゼ、ペプシノーゲン、ペプシン、ヘモグロビン、ヘモシアニン、ヘモペキシン、ペルオキシダーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリラーゼａ、ホスホリラーゼｂ、ホスホリラーゼキナーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ミオグロビン、メタロチオネイン、モノアミンオキシダーゼ、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、リパーゼ、レクチン、レニン、ロドプシンがあげられる。中でも本発明の吸着剤は、特に免疫グロブリンまたはその類縁体、ならびにそれらの断片および融合体を精製するのに適している。なお前述したタンパク質は、天然由来でもあってもよく、遺伝子工学的手法により得られた組換えタンパク質であってもよい。本明細書において、免疫グロブリンの類縁体とは、免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された天然もしくは人工的に作られたタンパク質またはタンパク質コンジュゲートを意味し、免疫グロブリンの断片とは、酵素的な処理または遺伝子工学的手法により作製された免疫グロブリンの部分構造を有したタンパク質を意味し、免疫グロブリンの融合体とは、各種サイトカインまたはサイトカイン受容体��の生物活性を有したタンパク質の機能部分を免疫グロブリンの全領域または部分領域と遺伝子工学的手法により融合させ作製したものを意味する。
【００３３】
本発明の吸着剤を用いて、タンパク質の吸着および溶出操作を行なうのに用いる溶液は、緩衝液成分を含む緩衝液であれば特に限定はなく、具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ緩衝液等があげられる。
【００３４】
本発明の吸着剤は、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等のアルカリ性水溶液、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液等の酸性水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液等のタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジン等のアミノ酸を含んだ水溶液、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ（商品名）等の界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコール等のアルコール溶液、または、これらの成分を複数含んだ混合溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、タンパク質の吸着／溶出操作（すなわち精製操作）を繰り返し行なうことができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のタンパク質精製用吸着剤は、低塩濃度下の溶液で容易にタンパク質を吸着でき、その溶液のｐＨを変えることで容易に吸着したタンパク質を溶出できることから、医療用タンパク質、特に免疫グロブリンまたはその誘導体およびそれらの断片および融合体を精製する分野において利用価値が高い。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３７】
実施例１
（１）ポリメタクリレートゲルの活性化
（１−１）ポリメタクリレートゲルであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｆ（商品名）（東ソー社製）をガラスフィルターにて吸引ろ過し、６０ｇを量りとった。
（１−２）ゲルを１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）に懸濁し３０分静置後、ガラスフィルターにて吸引ろ過し、回収した。この操作を５回繰り返した。
（１−３）密栓付き５００ｍＬ容三角フラスコ内で１，１’−カルボニルジイミダゾール（５．０ｇ，３０．８５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）に溶解し、ガラスフィルターにて吸引ろ過したゲル（５０ｇ）を添加した。
（１−４）三角フラスコを密封し、４５℃・１５０ｒｐｍにて１．５時間撹拌後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（１−５）回収したゲルに１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）を添加し、撹拌、混合後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。本操作を５回繰り返し行ない、活性化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
【００３８】
（２）活性化ポリメタクリレートゲルへの１，２−ジアミノエタンの固定化
（２−１）密栓付き５００ｍＬ容三角フラスコ内で１，２−ジアミノエタン（３．３４ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）に溶解し、（１）で調製した活性化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（５０ｇ）を添加した。
（２−２）三角フラスコを密封し、４０℃・１５０ｒｐｍで１６時間撹拌後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（２−３）回収したゲルを５００ｍＬ容三角フラスコに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（２５０ｍＬ）を添加後、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液を、ガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（２−４）（２−３）と同様な方法で、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順にゲルを洗浄した。
（２−５）洗浄したゲルを５００ｍＬ容三角フラスコに移した後、１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過してゲルを回収した。本操作を５回繰り返し、スペーサーとなる１，２−ジアミノエタンを固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
【００３９】
（３）５−アミノニコチン酸および６−アミノニコチン酸の１，２−ジアミノエタン固定化ポリメタクリレートゲルへの固定化
（３−１）密栓付き５０ｍＬ容三角フラスコ内で５−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）、６−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および２−フルオロ−１−メチルピリジニウムパラトルエンスルフォネート（１．４１７ｇ，５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．３９４ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）と（２）で調製した１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（５ｇ）を添加した。
（３−２）三角フラスコを密封し、２５℃・１５０ｒｐｍで１６時間撹拌混合後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（３−３）回収したゲルを２０ｍＬ容三角フラスコに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（３−４）（３−３）と同様な方法で、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順でゲルを洗浄した。
（３−５）洗浄したゲルを１００ｍＬ容三角フラスコに移した後、水（５０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過してゲルを回収した。本操作を５回繰り返し、５−アミノニコチン酸および６−アミノニコチン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
【００４０】
（４）５−アミノニコチン酸および６−アミノニコチン酸を固定化したポリメタクリレートゲルへの抗体吸着溶出量の測定
（４−１）（３）で調製した５−アミノニコチン酸および６−アミノニコチン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（０．２ｇ）を緩衝液Ａ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２ｍＬ）で混合し３０分懸濁後、卓上遠心機にてゲルを沈降し、上清を取り除いた。この操作を３回繰り返すことで、ゲル中の水を緩衝液Ａに置換した。
（４−２）ヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製）（１５０ｍｇ（ＩｇＧ）／ｍＬ）を水で希釈し抗体溶液（６６．７ｍｇ（ＩｇＧ）／ｍＬ）を調製した。
（４−３）緩衝液Ａで置換したゲルをマイクロスピンカラムに移し、卓上遠心機にて緩衝液Ａと分離後、１．５ｍＬ容マイクロチューブに０．１ｇを秤量した。
（４−４）２倍濃度の緩衝液Ａ（０．１５ｍＬ）と抗体溶液（０．１５ｍＬ）を添加し、２５℃・１２０ｒｐｍで撹拌混合した。１６時間後、卓上遠心機にてゲルを沈降し、上清を取り除いた。
（４−５）緩衝液Ａを１ｍＬ添加し、撹拌混合後、卓上遠心機にてゲルを沈降し、上清を取り除いた。本操作を３回繰り返し、ゲルに吸着しない抗体を取り除いた。
（４−６）緩衝液Ｂ（１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、１ｍＬ）をゲルに添加し撹拌混合後、卓上遠心機にてゲルを沈降し、ゲルと上清を分離した。本上清中に含まれる抗体量を２８０ｎｍにおける吸光度より求め、抗体の吸着溶出量とした。結果、抗体の吸着溶出量は１０．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４１】
実施例２  
実施例１（３）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸および３−アミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１２．８ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４２】
実施例３
実施例１（３）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および４−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸および４−アミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１７．０ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４３】
実施例４
実施例１（３）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８０．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸および３，５−ジアミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１５．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４４】
実施例５
実施例１（３）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４０５．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は２２．４ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４５】
実施例６
実施例１（３）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸および３−アミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１４．６ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４６】
実施例７
実施例１（３）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および４−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸および４−アミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１７．８ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４７】
実施例８
実施例１（３）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８０．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸および３，５−ジアミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は２２．６ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４８】
実施例９
実施例１（３）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸（３４５．３ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４０５．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、６−アミノニコチン酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は２５．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００４９】
実施例１０
実施例１（３）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および４−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸および４−アミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１３．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５０】
実施例１１
実施例１（３）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８０．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸および３，５−ジアミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は２．４ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５１】
実施例１２
実施例１（３）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４０５．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、３−アミノ安息香酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１３．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５２】
実施例１３
実施例１（３）と同様な方法で、４−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８０．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、４−アミノ安息香酸および３，５−ジアミノ安息香酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は３．５ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５３】
実施例１４
実施例１（３）と同様な方法で、４−アミノ安息香酸（３４２．８５ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４０５．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、４−アミノ安息香酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１２．２ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５４】
実施例１５
実施例１（３）と同様な方法で、３，５−ジアミノ安息香酸（３８０．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４０５．３８ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、実施例１（４）と同様な方法で、３，５−ジアミノ安息香酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は５．９ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５５】
実施例１から１５の結果をまとめたものを表１に示す。
【００５６】
【表１】
2014016289.tif 000008
実施例１６  １，２−ジアミノエタン固定化ポリメタクリレートゲルへ固定化させる際の、６−アミノニコチン酸と５−ベンゾイミダゾールカルボン酸とのモル比の検討
（１）密栓付き２０ｍＬ容三角フラスコ内で６−アミノニコチン酸、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸および２−フルオロ−１−メチルピリジニウムパラトルエンスルフォネート（０．２８３ｇ，１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．２７８ｍＬ，２ｍｍｏｌ）と実施例１（２）で調製した１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（２ｇ）を添加した。本実施例で検討した、６−アミノニコチン酸の添加量と５−ベンゾイミダゾールカルボン酸の添加量の組み合わせは以下の通りである。
（Ａ）１ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１３８．１ｍｇ）
（Ｂ）０．１ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１６．２ｍｇ）＋０．９ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１２４．３ｍｇ）
（Ｃ）０．２ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（３２．４ｍｇ）＋０．８ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１１０．５ｍｇ）
（Ｄ）０．３ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４８．６ｍｇ）＋０．７ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（９６．７ｍｇ）
（Ｅ）０．４ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（６４．８ｍｇ）＋０．６ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（８２．９ｍｇ）
（Ｆ）０．５ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（８１．１ｍｇ）＋０．５ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（６９．１ｍｇ）
（Ｇ）０．６ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（９７．３ｍｇ）＋０．４ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（５５．２ｍｇ）
（Ｈ）０．７ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１１３．５ｍｇ）＋０．３ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（４１．４ｍｇ）
（Ｉ）０．８ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１２９．７ｍｇ）＋０．２ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（２７．６ｍｇ）
（Ｊ）０．９ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１４５．９ｍｇ）＋０．１ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１３．８ｍｇ）
（Ｋ）１ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１６２．３ｍｇ）
（２）三角フラスコを密封し、２５℃・１５０ｒｐｍで１６時間撹拌混合後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（３）回収したゲルを２０ｍＬ容三角フラスコに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（４）（３）と同様な方法で、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順でゲルを洗浄した。
（５）洗浄したゲルを５０ｍＬ容三角フラスコに移した後、水（２０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過してゲルを回収した。本操作を５回繰り返し、６−アミノニコチン酸および５−ベンゾイミダゾールカルボン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
（６）実施例１（４）と同様な方法で、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸および６−アミノニコチン酸を固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。結果を表２に示す。６−アミノニコチン酸と５−ベンゾイミダゾールカルボン酸の２種類のアリールカルボン酸を担体に固定化することで、６−アミノニコチン酸のみを固定した場合（前記（Ａ））や５−ベンゾイミダゾールカルボン酸のみを固定した場合（前記（Ｋ））と比較し、抗体吸着溶出量が向上していることがわかる。
【００５７】
【表２】
2014016289.tif 000009
参考例１
（１）密栓付き５０ｍＬ容三角フラスコ内で５−アミノニコチン酸（６９０．６ｍｇ，５ｍｍｏｌ）および２−フルオロ−１−メチルピリジニウムパラトルエンスルフォネート（１．４１７ｇ，５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１．３９４ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）と実施例１（２）で調製した１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（５ｇ）を添加した。
（２）三角フラスコを密封し、２５℃・１５０ｒｐｍで１６時間撹拌混合後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（３）回収したゲルを５０ｍＬ容三角フラスコに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（４）（３）と同様な方法で、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順でゲルを洗浄した。
（５）洗浄したゲルを１００ｍＬ容三角フラスコに移した後、水（５０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過してゲルを回収した。本操作を５回繰り返し、５−アミノニコチン酸固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
（６）実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１８．７ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５８】
参考例２
参考例１と同様な方法で、６−アミノニコチン酸（６９０．６ｍｇ，５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１８．３ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００５９】
参考例３
参考例１と同様な方法で、３−アミノ安息香酸（６８５．７ｍｇ，５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は２１．１ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００６０】
参考例４
参考例１と同様な方法で、４−アミノ安息香酸（６８５．７ｍｇ，５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１６．０ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００６１】
参考例５
参考例１と同様な方法で、３，５−ジアミノ安息香酸（７６０．８ｍｇ，５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１６．０ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００６２】
参考例６
参考例１と同様な方法で、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（８１０．８ｍｇ，５ｍｍｏｌ）の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。抗体の吸着溶出量は１５．４ｍｇ／ｇ（ｇｅｌ）と算出された。
【００６３】
参考例１から６の結果をまとめたものを表３に示す。
【００６４】
【表３】
2014016289.tif 000010
参考例７  １，２−ジアミノエタン固定化ポリメタクリレートゲルへ固定化させる際の、６−アミノニコチン酸添加量の検討
（１）密栓付き２０ｍＬ容三角フラスコ内で６−アミノニコチン酸および２−フルオロ−１−メチルピリジニウムパラトルエンスルフォネート（６−アミノニコチン酸添加量と等モル量）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６−アミノニコチン酸添加量の２倍モル量）と実施例１（２）で調製した１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲル（２ｇ）を添加した。本参考例で検討した、６−アミノニコチン酸の添加量は以下の通りである。
（Ａ）０．２ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（２７．６ｍｇ）
（Ｂ）０．３ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（４１．４ｍｇ）
（Ｃ）０．４ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（５５．２ｍｇ）
（Ｄ）０．５ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（６９．１ｍｇ）
（Ｅ）０．６ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（８２．９ｍｇ）
（Ｆ）０．７ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（９６．７ｍｇ）
（Ｇ）０．８ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１１０．５ｍｇ）
（Ｈ）０．９ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１２４．３ｍｇ）
（Ｉ）１ｍｍｏｌ  ６−アミノニコチン酸（１３８．１ｍｇ）
（２）三角フラスコを密封し、２５℃・１５０ｒｐｍで１６時間撹拌混合後、ゲル懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（３）回収したゲルを２０ｍＬ容三角フラスコに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過し、ゲルを回収した。
（４）（３）と同様な方法で、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順でゲルを洗浄した。
（５）洗浄したゲルを５０ｍＬ容三角フラスコに移した後、水（２０ｍＬ）を添加し、１５０ｒｐｍで１５分間撹拌混合した懸濁液をガラスフィルターにて吸引ろ過してゲルを回収した。本操作を５回繰り返し、５−アミノニコチン酸固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルを得た。
（６）実施例１（４）と同様な方法で、５−アミノニコチン酸固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルの抗体吸着溶出量を測定した。結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
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参考例８  １，２−ジアミノエタン固定化ポリメタクリレートゲルへ固定化させる際の、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸添加量の検討
参考例１と同様な方法で、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸の１，２−ジアミノエタン固定化ＴＯＹＯＰＥＡＲＬゲルへの固定化を行ない、当該ゲルの抗体吸着溶出量を測定した。本参考例で検討した、５−ベンゾイミダゾールカルボン酸の添加量は以下の通りである。
（Ａ）０．２ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（３２．４ｍｇ）
（Ｂ）０．３ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（４８．６ｍｇ）
（Ｃ）０．４ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（６４．８ｍｇ）
（Ｄ）０．５ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（８１．１ｍｇ）
（Ｅ）０．６ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（９７．３ｍｇ）
（Ｆ）０．７ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１１３．５ｍｇ）
（Ｇ）０．８ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１２９．７ｍｇ）
（Ｈ）０．９ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１４５．９ｍｇ）
（Ｉ）１ｍｍｏｌ  ５−ベンゾイミダゾールカルボン酸（１６２．３ｍｇ）
結果を表５に示す。
【００６６】
【表５】
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