(57)【要約】【課題】成人Ｔ細胞白血病細胞表層の糖鎖に特異的に結合するヒト抗体のＶＨペプチドとＶＬペプチド、及びそれらのリンカーペプチドを有する一本鎖抗体Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１を提供すること。【解決手段】成人Ｔ細胞白血病細胞から確立した培養細胞Ｓ１Ｔの細胞表層のＯ−結合型糖鎖を独自開発したリンカー化合物を用いて分画し、それらを固定化したファイバー型のシュガーチップを用いて、ヒトＢ細胞から誘導した抗体のＶＨペプチドとＶＬペプチドとそれらのリンカーペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ１０８の多様性を持ったファージをスクリーニングし、選択したファージから一本鎖抗体Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１を産生させた。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
図８に示す遺伝子の塩基配列から生成され、図９に示すアミノ酸配列からのポリペプチドからなりＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）とＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含むヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体。
【請求項２】
請求項1に示すアミノ酸配列のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％、約９８％または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体。
【請求項３】
請求項１に示す遺伝子の塩基配列から生成され、または請求項1に示すアミノ酸配列からのポリペプチドからなりＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）とＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含むヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１に示すアミノ酸配列が記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％、約９８％または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントを含む、ＡＴＬをはじめとした癌またはウイルス感染症の検出試薬または診断薬。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントを含む、ＡＴＬをはじめとした癌またはウイルス感染症の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞表層に特異的に発現している糖鎖を標的としたヒト抗体および該抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトレトロウイルスであるｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １（ＨＴＬＶ−１）が原因となって発症する成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）は、血液癌の１つである（非特許文献１）。ＨＴＬＶ−１の感染者は熱帯・亜熱帯地域を中心に分布している。ＡＴＬは一旦発症すると非常に予後の悪い白血病で、決定的な治療法は確立されていない。強力な、副作用も強い化学療法が試みられているが、治療開始後の５０％、生存率は１年を少し超えた程度で、満足な結果にはほど遠い。また、骨髄移植や造血幹細胞移植も試みられているが、一部の症例にしか効果が期待できず、有効なワクチンも存在しない。海外では抗体医療の有効性が示唆されているが、抗体の標的分子について決定的なものはない。わが国においては、特に鹿児島などの南九州を中心として、約１００万人ものＨＴＬＶ−１感染者が存在し、毎年１０００人以上のＡＴＬ患者が死亡している。対策の１つとして、妊婦を対象とした無料の抗体検査が平成２２年度から始められた。ＨＴＬＶ−１は、多くは母乳などの母子感染によって伝播される。ＡＴＬは、通常、長期の潜伏期間を経て発症するが、ＨＴＬＶ−１感染者（キャリア）のすべてが発症するわけではなく、その発症率は男性で７％  女性で２％  程度である。また、同じウイルスが原因となる神経変性疾患であるＨＡＭ（ＨＴＬＶ−１  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）を発症することもある。これらを一旦発症すると、その予後は悪く、現在有効な治療法も確立されていない（非特許文献２）。ＨＴＬＶ−１感染細胞に結合するモノクローナル抗体についての報告がなされているが（特許文献１）、ＨＴＬＶ−１感染細胞の糖鎖を標的として特異的に結合する抗体は報告されていない。
【０００３】
抗体医薬は、多くの疾患に対して有効な医薬品として認められつつある。抗体医薬は、生物由来の分子を医薬品とする生物医薬品であるため、毒性などの大きな副作用は少なく、抗体自身が免疫系のなかで異物の特異的な認識にかかわる最も重要な分子の一つであることから、それをもとに作られた抗体医薬も最も高度に分子認識を行う分子標的医薬の一つである。特に癌に対しては、すでに、Ｂ細胞リンパ腫に対する抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）や、乳癌に対する抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）などが先行して治療に用いられており、有効な治療効果が得られている。この治療効果は、癌に特異的な抗原（癌マーカー）に対する抗体を投与することで、抗体が結合集積した癌細胞に対し、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞などによる特異的な免疫誘導、すなわち抗体依存的細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）や補体依存的細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）が起こり、癌細胞をアポトーシスに導くことが主要なメカニズムと考えられている（非特許文献３、４）。
【０００４】
現在、数多くの抗体医薬品が開発されているが、それらの抗体を作製する手法としては、大きく三つあげられる。一つは、従来のマウスハイブリドーマ法を用いてマウスモノクローナル抗体を作成しこれを抗体工学によってヒト化する方法である。しかし、ヒト化抗体は非ヒト由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与により、投与するヒト化抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなく、重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活性が低下することも多く、構築には多大な労力とコストを要する（非特許文献５）。
【０００５】
その他の抗体作製方法として、ヒト染色体の一部を組み込んだいわゆるトランスクロモマウスを用いたハイブリドーマ技術による方法と抗体ファージライブラリー法がある（非特許文献６）。これらの２つは直接ヒト抗体を獲得できるため、その利用が加速されると予想される。
【０００６】
抗体分子の型で分類すると２種類ある。その１つの完全分子型抗体については、長年の研究により抗体医薬としての実績は最も多い。半減期が数週間以上と長いことも長所の一つと考えられている（非特許文献７）。
【０００７】
もう１つの低分子化抗体については、タンパク質工学的手法による分子改変や修飾が容易であるという特徴を有する（非特許文献８）。一般的に、低分子化抗体そのものは血中半減期が非常に短いものの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾や、アルブミンとの融合、或いはアルブミンまたはＩｇＧ結合配列との融合等により、血中半減期を延長させることが可能であることが知られている（非特許文献９）。
【０００８】
また、完全分子型抗体はＦｃ領域を介してＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を発揮するが、それらの活性は標的細胞に対しては有効に働き得るが、標的細胞以外の細胞に抗体が作用してしまう場合には、有害な副反応を引き起こす可能性が懸念される。それに対して、Ｆｃ領域を有しない低分子化抗体であれば、可変領域のみの作用を想定すればよいため、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等による副反応の可能性を否定できる。
【０００９】
また、低分子化抗体については、分子サイズの小ささから、生産性が高い点や組織浸透性に優れている点など、用途によっては完全分子型抗体よりも医薬品としての有用性が高いとも考えられている。
【００１０】
我々はこのような背景に立脚して研究を開始し、ＡＴＬに対し、「糖鎖」という新たな分子に標的を定め、「シュガーチップ」や「ファージ・ディスプレイ法」など、最新のナノテクノロジーを駆使してＡＴＬの抗体療法や早期発症診断に向けたアプローチを行ってきた。そして、以下の５つを明らかにした。即ち、（ｉ）ライン化したＡＴＬ細胞を直接抗原としたファージ・ディスプレイ法では、親和性の低い「糖鎖」に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を得ることは困難である（非特許文献１０）。（ｉｉ）ＡＴＬ細胞に発現量が多い蛋白質を標的としたｓｃＦｖは健常人のＴ細胞にも細胞障害活性をもつ（特許文献１）。（ｉｉｉ）ライン化したＡＴＬ細胞と非ＡＴＬのＴ細胞間では、発現しているＮ−およびＯ−型糖鎖にはそれぞれ違いがある（非特許文献１１）。（ｉｖ）新しい蛍光性のリンカー化合物と光ファイバーの先端をシュガーチップ化した局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）測定システムを開発し、細胞由来の微量の「糖鎖」を固定化してスクリーニングできるシステムを確立した（特許文献２、３）。（ｖ）ライン化ＡＴＬ細胞由来Ｎ−型糖鎖を固定化したシステムと合成ファージライブラリーを用いて、ライン化したＡＴＬ細胞に特異性の高いｓｃＦｖを３クローン得、そのうちの１つは細胞障害活性も有し、ＡＴＬの抗体療法に使用できる可能性を有した（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９−０６６６５５号パンフレット
【特許文献２】特許第４８０２３０９号公報
【特許文献３】特開２００９−２５６２６１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：２５３４−２５３７（１９８４）．
【非特許文献２】Ｏｈｓｈｉｍａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９８：７７２−７７８（２００７）．
【非特許文献３】Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １３：１８７５−１８８２（２００７）．
【非特許文献４】Ｔｅｅｌｉｎｇ，  Ｊ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７７：３６２−３７１（２００６）．
【非特許文献５】Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９３：５５６−５６５（２００１）．
【非特許文献６】Ｎａｇｙ，Ｚ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：  ８０１−８０７（２００２）．
【非特許文献７】Ｚａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２８：１５７−１５９（２０１０）．
【非特許文献８】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．，  Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１１２６−１１３６（２００５）．
【非特許文献９】Ｃｈａｐｍａｎ  Ａ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７:７８０−７８３  （１９９９）
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｏｋａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４５：７９９−８１０  （２００９）
【非特許文献１１】ＨＴＬＶ−１関連疾患に対する発症予防と治療法確立に関する研究：文部科学省特別教育研究経費：研究推進（大学間連携推進経費、平成２０−２２年度）：研究報告書
【非特許文献１２】第２９回日本糖質学会年会要旨集、平成２１年９月、高山、ｂ２−１１、ｐ４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ＡＴＬ細胞株の細胞表層の糖鎖に対して特異的な反応性を有し、かつ安全性と検査診断及び治療効果を兼ね備えたヒト抗体及び該抗体フラグメントを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では以上の知見にもとづき、ＡＴＬの新規検査診断法および新しい癌治療法確立のための抗体医薬の創製を目指し、ＡＴＬ患者由来の細胞株であるＳ１Ｔに対する特異的なヒト抗体を、あらたに構築した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ファージライブラリーからのスクリーニングによって単離することに成功した。
【００１５】
本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜４）の発明を含むものである。
１）添付図８に示した遺伝子の塩基配列を有するモノクローナルファージ
２）添付図９に示したアミノ酸配列を持つポリペプチドからなるＨ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体または該抗体フラグメント
３）添付図９に示したアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖を認識するポリペプチド。
４）添付図９に記載のポリペプチドが、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％、約９８％または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記１）に記載のヒト抗ＡＴＬ細胞表層Ｏ−結合型糖鎖抗体または該抗体フラグメント。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヒトモノクローナル一本鎖抗体及び該抗体フラグメントは、ＡＴＬという腫瘍細胞に高発現している細胞表面分子であるＯ−結合型糖鎖を標的とし、ＡＴＬ細胞への特異的結合作用を有する。
【００１７】
抗体医薬は、その標的化メカニズム、作用機序が明確であり、医薬品開発の実用化へのプロセスが比較的容易なため、実用化の可能性は極めて高い。本発明の抗体が認識するＯ−結合型糖鎖は、ＡＴＬの優れたマーカーである可能性は高く、比較的容易に治療法の確立を達成できる可能性があり、産業上の有用性は十分に大きいと言える。加えて、自己免疫疾患や移植片拒絶反応など、免疫系の異常が引き起こす免疫疾患や、各種感染症に対しても有効な治療薬となる可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ−結合型糖鎖リガンド複合体のＨＰＬＣ分析を示す図
【図２】ファイバー型シュガーチップを用いたファージライブラリーのバイオパニングの流れを示す図。
【図３】ＬＰＲによるｓｃＦｖ蛋白質を発現しているファージの相互作用解析の結果を示す図。
【図４】ｓｃＦｖ蛋白質の発現と抽出の流れを示す図。
【図５】ＦＡＣＳ解析のプロトコールを示す図。
【図６】ｓｃＦｖ抗体（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１）のＨＴＬＶ−１感染ＡＴＬ株（ｏｈ１３Ｔ）の細胞に対する結合特性を比較したＦＡＣＳの結果を示す図。ＰＣ（陽性コントロール）は非特許文献１０のＳ１ＴＡ３抗体。
【図７】ｓｃＦｖ抗体（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１）のＨＴＬＶ−１非感染の非ＡＴＬ株（ＣＥＭ）の細胞に対する結合特性を比較したＦＡＣＳの結果を示す図。ＰＣ（陽性コントロール）は非特許文献１０のＳ１ＴＡ３抗体。
【図８】Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１をコードする遺伝子の塩基配列。
【図９】Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１をコードする遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明について詳述する。ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーは、以下のようにして作製することができる。複数の健常者から採取した末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを合成する。次に各種プライマーを組み合わせて、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）とＬ鎖可変領域（ＶＬ）を増幅させ、両者をｌｉｎｋｅｒ  ＤＮＡで結合させることにより、健常者リンパ球由来のＶＨとＶＬのランダムな組み合わせによるｓｃＦｖ遺伝子のライブラリーが作製される。このｓｃＦｖ遺伝子をファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、約１０８クローンからなる健常者由来ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを構築することができる。
【００２０】
抗体ファージライブラリーを用いて特異的な抗体を単離する手法をパンニングと呼んでいるが、これにはさまざまな方法が報告されている。最も一般的なものは、標的とする抗原が明らかである場合、抗原を組み換えタンパクなどによって調製し、それをプラスチックプレートなどに固定化し、抗体ファージライブラリーを反応させ特異的に結合する抗体ファージを濃縮するという方法がとられる。しかしながら今回のように、標的とするＯ−結合型糖鎖抗原が明らかではない状態で、その糖鎖への特異的な抗体ファージを単離するためには、細胞表層の糖鎖を抽出、分画して、チップへ固定化し、そのチップを用いてパンニングを行う方法が有効である。
【００２１】
チップへの糖鎖の固定化については、例えば、標的細胞であるＳ１Ｔ細胞を界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で処理して膜画分を抽出する。その画分をトリプシンで処理して蛋白質を部分的に分解させたのち、糖タンパク質からＮ−結合型糖鎖を切り出す酵素であるＥｎｄｏ−Ｆで処理する。処理した残渣に、無水ヒドラジンを加えて、Ｏ−結合型糖鎖を蛋白質から切り出す。この溶液をＢｌｏｔＧｌｙｃｏ法の樹脂（住友ベークライト社製）で処理して、糖鎖画分を得る。さらに、金との結合性を有しかつ蛍光性のリンカー化合物を糖鎖の還元末端に反応させる。そして、リンカー化合物が固定化された糖鎖（以下、糖鎖リガンド複合体画分と称する）を逆相クロマトグラフィーを行って分画する。その分画した糖鎖リガンド複合体を、局在プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップの金ナノ粒子で修飾した先端部位と反応させ、Ｓ１Ｔ細胞のＯ−結合型糖鎖が固定化されたチップを製造する。
【００２２】
チップを抗体ファージライブラリーの溶液に浸し、室温で１時間反応させる。チップをファージライブラリー溶液から離し、リン酸緩衝液で３回洗浄した後、１００ｍＭのトリエチルアミン溶液に室温５分間浸漬してチップ上の固定化されたＯ−結合型糖鎖に結合しているファージを溶出し、直ちにその溶液を氷冷下に酢酸で中和する。次いで、大腸菌（ＴＧ１）に感染させる。ヘルパーファージを用いて抗体ファージをレスキューし、特異クローンを濃縮することができる。
【００２３】
得られた抗体ファージについては、まず上記のＯ−結合型糖鎖が固定化されたチップとＬＰＲを用いて結合活性を調べるとよい。
【００２４】
糖鎖への結合が確認されれば、その抗体ファージを大腸菌に感染後クローン化し、各ファージクローンとＳ１Ｔ細胞との結合活性をフローサイトメータを用いて解析するとよい。その結果、Ｓ１Ｔ細胞に対する特異的反応性が認められれば、それらのクローンについて、ＤＮＡシーケンス解析を行うことにより、ＤＮＡ配列から翻訳される抗体のアミノ酸配列を同定することができる。
【００２５】
このようにして得られたクローンのｓｃＦｖを調製し、種々のＡＴＬ細胞や非ＡＴＬ細胞との反応性を確認するとよい。ｓｃＦｖの発現方法としては、例えば大腸菌で発現させることができ、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等を機能的に結合させて発現させることができる。プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を用いることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ  Ｒ  １９８７，１６９：４３７９−４３８３）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３タンパク質のシグナル配列を用いることもできる。
【００２６】
細胞内外に発現されたｓｃＦｖは、宿主から分離し均一にまで精製することができる。ｓｃＦｖのＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列が付加されている場合には、ＮＴＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせて抗体を分離・精製することができる。精製した標品については、ＨＰＬＣゲルろ過分析等で分子形態を分析することができる。
【００２７】
得られたｓｃＦｖ精製品を用いて、種々のＡＴＬ細胞や非ＡＴＬ細胞との結合性をフローサイトメーター解析により確認することができる。
【００２８】
得られたｓｃＦｖ抗体の特異性については、種々のＨＴＬＶ−１感染株のセルライン（例えばＨＴＬＶ−１感染ＴリンフォーマであるＳ１Ｔ，ＭＴ−４，Ｍ８１６６及びＭＴ−２）と非感染株のセルライン（例えば非ＨＴＬＶ−１感染リンフォーマであるＭＯＬＴ−４，ＣＥＭ，Ｊｕｒｋａｔ及びＤａｕｇｉ）を用いて解析することが望ましい。ＨＴＬＶ−１感染株に対して非感染株より強く結合する傾向が見られれば、当該ｓｃＦｖ抗体がＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞リンフォーマに対する有効な標的抗体である可能性が示唆される。
【００２９】
上記の方法により、ＡＴＬ細胞由来の細胞株であるＳ１Ｔ細胞表層糖鎖に対する特異的なヒト抗体をヒトｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーからスクリーニングした結果、特異クローンの取得に成功した。この抗体は、Ｓ１Ｔ細胞に特異的に結合するだけでなく、他のＡＴＬ関連細胞株にも結合するが、ＡＴＬ非関連の細胞株にはほとんど結合しなかった。このことから、この抗体の認識する抗原は、ＡＴＬの優れた癌マーカーになる可能性が大きい。さらに得られた抗体を完全抗体（ＩｇＧ）へ誘導することは、技術的に確立されているため、ＡＴＬ癌細胞の治療薬としての利用可能性が期待される。
【００３０】
上記結合活性を有するｓｃＦｖ（クローンＳ１ＴＳＣＦＲ−３）をコードする塩基配列およびそのアミノ酸配列は、それぞれ図８に示す配列と図９に示す配列のとおりである。
【００３１】
本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。すなわち、図９に示す配列に記載されたアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＴＬ細胞表層のＯ−結合型糖鎖を認識する抗体のＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域となるポリペプチドも含まれる。置換、欠失、挿入、および／または付加される１またはそれ以上のアミノ酸としては、例えば１〜１２個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸が挙げられる。
【００３２】
アミノ酸配列に変異を導入して機能的に同等なタンパク質を取得する方法は、当業者に公知である。例えば、変異の導入方法としては部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｔ．  １９８７，５：Ｓｅｃｔｉｏｎ８，１８）や、抗体の可変領域にランダムに変異を導入する方法（ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９２，２：２８−３３）、その他、抗体の親和性を試験管内で向上させる方法（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １９９６，  ２：１００−１０２）が挙げられる。これらの方法によって取得した抗体から、本発明の特性を有する抗ＡＴＬ細胞Ｏ−結合型糖鎖抗体を選択することが可能である。
【００３３】
このように、「変異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３４】
別の好ましい実施形態においては、本発明の抗ＡＴＬ細胞Ｏ−結合型糖鎖抗体は、該抗体のＶＨ鎖が、図８に示す配列に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３５】
別の好ましい実施形態においては、本発明の抗ＡＴＬ細胞Ｏ−結合型糖鎖抗体は、該抗体のＶＬ鎖が、配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３６】
さらに、別の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、（ａ）該抗体のＶＨ鎖が、図８に示す配列に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｂ）該抗体のＶＬ鎖が、配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３７】
アミノ酸配列同一性の程度は、例えば約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％、約９８％または約９９％以上であり得る。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。
【００３８】
本発明で開示される一本鎖抗体は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られたものであり、その評価もｓｃＦｖの分子形態で行ったが、原則としてその適用はそれらの分子形態に限定されることはない。例えば、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたＦａｂ，Ｆａｂ‘，またはＦ（ａｂ’）２、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＬ鎖の定常領域と結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）やｓｃＦｖを２個連結して一本鎖化した分子である（ｓｃＦｖ）２などの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。
【００３９】
また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体であってもよい。
【００４０】
また、これらの抗体及び抗体フラグメントタンパク質分子に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾タンパク質分子も同様に本発明に包含される。
【００４１】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、図８に示す配列及び２に示した本発明により得られた各クローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主（例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。
【００４２】
本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、ＡＴＬの検出試薬及び診断薬として利用可能である。さらに、本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、ＡＴＬをはじめ各種癌の治療薬として利用可能である。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００４４】
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
Ｊ．  Ｄ．  Ｍａｒｋｓ  ら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７，  １９９１）により報告されている方法を参考にし、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料とし、ファージライブラリーを構築した。構築したＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλの各サブライブラリーはともに１．０×１０８クローンの多様性を有すると評価された。
【００４５】
《実施例２：Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ−結合型糖鎖の抽出》
Ｓ１Ｔ細胞７．６ｘ１０８個をエッペンチューブに移した後、遠心（８００ｒｐｍ，５分間）上清を除去した後、ＨＥＰＥＳバッファー（１ｍｌ）を加え、超音波で破砕（５分間）した。次に調製した溶液を超遠心（４００００ｒｐｍ、６０分間）し上清を回収後  、ＴＸ−１１４溶液を５０μｌ加え、テルモシリンジ（１ｍｌ）に針（２２Ｇ）を付け細胞が破砕するまでピストンさせた。細胞破砕を、トリパンブルー染色によって確認した。確認後、超遠心（４００００ｒｐｍ、６０分間）して上清を回収した。その後、上清を遠心濃縮し、凍結乾燥し、Ｓ１Ｔ細胞の膜画分を抽出した。まず、膜画分からＮ−型糖鎖を以下の方法で切り出した。膜画分を、１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（１０μｌ）、１２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ、１０μｌ）、純水（１００μｌ）に溶解させ、６０℃で３０分間静置した。その後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ、２０μｌ）を加え、遮光下室温で１時間静置した。続いてトリプシン（２０μｌ）を加え３７℃で１時間静置した。９０℃で５分間加温しトリプシンを失活させ、ＰＮＧａｓｅ（５μｌ）を加えて１２時間撹拌した後、９０℃で５分間加温し、遠心濃縮した。残渣を２０μｌの水に溶解し、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズに加え、糖鎖を捕捉した。その後、２％  酢酸／アセトニトリル１８０μｌを添加し、８０℃で１時間加熱した。続いて、２Ｍグアニジン溶液を加え遠心し、Ｏ型糖鎖を含む糖タンパク質を分離した。このＯ型糖鎖を含む糖タンパク質をヒドラジン分解し、得られたＯ−型糖鎖をＢｌｏｔ  Ｇｌｙｃｏビーズに捕捉し、２％酢酸／アセトニトリル１８０μｌを添加し、８０℃で１時間加熱した。続いて、２Ｍグアニジン溶液を、１％  トリエチルアミン／メタノール２００μｌ、メタノール２００μｌで洗浄し、１０％  無水酢酸溶液１００μｌを加え３０分間静置し、ビーズの残った官能機をアセチル基でキャッピングし、メタノール２００μｌ、１０ｍＭ塩酸２００μｌ、純水２００μｌで再度洗浄し、Ｏ−結合型糖鎖を精製した。
【００４６】
《実施例３：Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ−結合型糖鎖のリガンド複合体化と分画》
得られたＯ−型糖鎖を含んでいるカラムに水（２０μｌ）加え、その後、２％酢酸／アセト二トリル溶液（１８０μｌ）に溶解させ、７０℃で１分間加熱した。次にｆ−ｍｏｎｏ  リンカー（特許文献３、１０ｍｇ）を、３０％酢酸／ＤＭＳＯ（１００μｌ）で溶解させた溶液をカラムに加えた。その後、６０℃で１２時間静置した後、遠心して溶液を回収した。さらにＢｌｏｔＧｌｙｃｏに付随してある過剰試薬除去カラムを使って過剰な試薬を取り除き、ｆ−ｍｏｎｏ化Ｏ−型糖鎖を調製した。続いて、ｆ−ｍｏｎｏ化糖鎖のＨＰＬＣによる分離を以下のように行った。ＨＰＬＣのモニタリングは蛍光検出器（ＦＰ２０２０ｐｌｕｓ、ＪＡＳＣＯ社製）を用い、カラムにはＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ  ＢＰ  ２５０ｍｍ×４．６（ＤＡＩＳＯ社製）を使用した。また、測定溶媒はメタノール／水＝１：１とし、サンプルを１０μｌインジェクトした後、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでモニターし、３つの画分に分取し、遠心濃縮し凍結乾燥した。
【００４７】
《実施例４：Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ−結合型糖鎖を固定化したファイバー型シュガーチップ》
光ファイバー（内径約５０μｍ）を８本束ねた８チャンネルファイバー端面をエタノールに浸し超音波洗浄した後、エタノール１．５ｍｌ、酢酸７５μｌ、ＴＥＤ１６．８μｌを混合した溶液に１０分間浸漬させ、１２０℃で３０分間加熱することで、末端のアミノシリル化を行った。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１．５ｍｌ）に３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨｏＡｔ、３．９６ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・モノハイドクロリド（ＥＤＣ・ＨＣｌ、５．５６ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１１．４μｌ、２４．２μｍｏｌ）、チオクト酸（６．００ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）を加えた溶液にファイバー端面を１８時間浸漬させ、チオクト酸をアミノ基に縮合させた。エタノールで洗浄したのち、ＮａＢＨ４で還元処理をして、ジスルフィド結合を切断し、末端にチオール基をもつファイバーを調製した。そのチオール基に対し金ナノ粒子（φ：〜４０ｎｍ、田中金属工業社製）を固定化し、さらに１０μＭに調整した１０μｌのｆ−ｍｏｎｏ化糖鎖リガンド複合体溶液に浸漬させ、ファイバー型シュガーチップを作製した。８チャンネルのファイバーにはＨＰＬＣフラクション１〜３をそれぞれ２本ずつと、コントロールとしてＧａｌβ１−３Ｇｌｃ−ｍｏｎｏを２本ずつ固定化した。
【００４８】
《実施例５：Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ−結合型糖鎖を固定化したシュガーチップを用いたバイオパンニング》
Ｓ１Ｔ細胞由来Ｏ−型糖鎖を固定化したファイバー型のシュガーチップを用いて、ファージライブラリーより糖鎖に特異的に結合するファージのパニングを行った。チップ端面をファージ溶液１００μｌ（１．０×１０１１／ｍｌ）に２０分間浸漬させ、ＬＰＲセンサーでモニタリングしながら、各画分の糖鎖に結合するファージをパニングした。次いで、ＰＢＳ／Ｔ溶液１００μｌに５分間浸漬させ、非特異的に結合したファージを除去した。このＰＢＳ／Ｔによる洗浄を３回繰り返した。その後１００ｍＭ  ＴＥＡ  ５０μｌに浸漬させることで糖鎖に結合したファージを溶出させた。得られた溶出液を氷冷した後、１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００μｌを加え中和（ｐＨ  ７．４）してファージ溶液を調製した。
【００４９】
《実施例６：大腸菌ＴＧ−１株（サプレッサー変異株）を用いたファージの調製》
ＴＧ−１シングルコロニーを２ＴＹ液体培地中（５ｍｌ）３７℃で一晩振とう培養し、オーバーナイトカルチャーを調製した。そのオーバーナイトカルチャー５００μｌにファージ溶液３０μｌを加え、３７℃で１時間培養することで、大腸菌にファージを感染させた。その後、２ＴＹＡＧアガロースプレートで、３７℃一晩培養することでファージを感染させたＴＧ−１シングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを２ＴＹＡＧ液体培地中３７℃で一晩振とう培養させたのち、このオーバーナイトカルチャー（１００μｌ）を２ＴＹＡＧ液体培地（１ｍｌ）に加え、ＯＤ６００＝０．５になるまで培養した。次いで、培養液にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（２０μｌ，ｍｏｉ＝５）を重感染させた。遠心後（３０００ｇ，１０分間）上清を除去し２ＴＹＡＫ（１ｍｌ）を加え培地を交換し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心（３０００ｇ，１５分間，４℃）し、上清をＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（３００μｌ）に加えよく攪拌させた後、４  ℃で４時間静置した。遠心（１００００ｇ，２０分間，４℃）後、上清を除去し、ＰＢＳ溶液（３００μｌ）に溶出させることでファージ溶液を調製した。  
【００５０】
《実施例７：  ＬＰＲによるＳ１Ｔ細胞由来糖鎖とのファージ結合特性解析》
Ｓ１Ｔ細胞由来糖鎖とのファージ結合活性解析は、ＬＰＲを用いて実験例５と同様の操作手順で行った。即ち、ＰＢＳ／Ｔでシグナルの安定化を確認した後、ファージ溶液を加え糖鎖との結合挙動を観測した。その後、ＰＢＳ／Ｔで置換し、解離挙動を観測した。その後、ＳＤＳ溶液によりファイバーを洗浄し、再びＰＢＳ／Ｔに置換した。以上を一連の操作として測定を行った。
【００５１】
《実施例８：ＰＣＲによるファージＤＮＡの増幅とアガロース電気泳動による確認》
ファージｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させ、アガロースゲル電気泳動により分析した。プライマー（つくばオリゴサービス社製）には以下の配列を用いた。
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  （１０７）  ：  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＣＧＣ
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （１０８）  ：  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＧＧ
【００５２】
《実施例９：ファージｃＤＮＡのシークエンス解析》
実験例８により得られたｃＤＮＡをＧｅｌ／ＰＣＲ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ）により精製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．３．１を用いて、以下に示した配列のプライマー（つくばオリゴサービス社製）をもちいたＰＣＲにより、プラスミドＤＮＡを増幅させた。
ｐｒｉｍｅｒ  （ＫＳＢ−１）  ：  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＴ
その後、エタノール沈殿により精製しシークエンス解析を行った。その結果、すべてのクローンが図８にしめす単一の配列を有していることがわかった。またその塩基配列から推定される抗体のアミノ酸配列を図９に示した。
【００５３】
《実施例１０：大腸菌非サプレッサー変異株ＨＢ２１５１を用いた可溶性タンパク質（ｓｃＦｖ）の調製と精製》
ＨＢ２１５１  シングルコロニーを２ＴＹ液体培地中（５ｍｌ）３７℃で一晩振とう培養し、オーバーナイトカルチャーを調製した。オーバーナイトカルチャー（０．５ｍｌ）を２ＴＹ液体培地（５ｍｌ）に加え、ＯＤ６００＝０．５になるまで培養した。次いで、培養液にファージ溶液（３０μｌ）を加え、ＨＢ２１５１  へ感染させた後、ＳＯＢＡＧ−Ｎプレートで３７℃  一晩培養し、ファージを感染させたＨＢ２１５１シングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを２ＴＹＡＧ液体培地中（５ｍｌ）３７℃で一晩振とう培養した。培養液（５ｍｌ）を２ＴＹＡＧ液体培地（５０ｍｌ）に加え、１時間培養した。次いで、培養液を遠心（３０００ｇ、１０ｍｉｎ）後、上清をすて２ＴＹＡＩ  ５０ｍｌを加え培地交換し、３０℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心（３０００ｇ、２０ｍｉｎ  ４℃）し、沈殿物を回収した。次に、沈殿物に１×ＴＥＳ（２ｍｌ）を加えて懸濁し、氷冷下、５分間静置した。つぎに、１／５×ＴＥＳ（７５０μｌ）加え、氷冷、３０分間静置した。その後、超音波処理（１０秒間×１０、氷冷）後、遠心（１５０００ｇ，５分間，４℃）し、上清を回収した。回収した上清を、０．４５μｍフィルターに通し、可溶性タンパク質（ｓｃＦｖ）を調製した。可溶性タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色により可視化しタンパク質バンドと、抗ヒスチジンタグ抗体をもちいたウェスタンブロッティングにより確認した。その後、Ｎｉ−ｃｏｌｕｍｎを用いてｓｃＦｖの精製をした。即ち、アフィニティーカラムにはＨｉｓ−Ａｃｃｅｐｔ  Ｂａｔｃｈ  ２ｍｌ（ナカライテスク社）を用い、パスツールに加え、カラムを作成した。まず、カラムを水（１ｍｌ）  ×３回と−結合型緩衝液（５０ｍＭ  リン酸緩衝液，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ８．０）１ｍｌ×３回洗浄した。次に、タンパク質（１ｍｌ）添加し、カラムに充填した。洗浄緩衝液（５０ｍＭ  リン酸緩衝液，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ  ８．０）１ｍｌ×５回で、余計なタンパク質を除去し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  リン酸緩衝液，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，５００  ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ  ８．０）１ｍｌ×３回で、ｓｃＦｖを溶出させた。ｓｃＦｖの存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色により可視化しタンパク質バンドと、抗ヒスチジンタグ抗体をもちいたウェスタンブロッティングにより確認した。
【００５４】
《実施例１１：ＦＡＣＳによるｓｃＦｖ結合活性解析》
細胞を１×１０６／ｍｌに調整し、遠心（１５００ｒｐｍ、  ５ｍｉｎ）上清を捨てた後、ｓｃＦｖ溶液１０μｌを加え、細胞と３０分間反応させた。ＰＢＳ  １ｍｌを加え、遠心後（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）上清を捨てた。次いで１次抗体としてＨｉｓ−ｔａｇと特異的に結合するＡｎｔｉ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）２μｌを加え、細胞と３０分間反応させた。ＰＢＳ  １ｍｌを加え、遠心後（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）上清を捨てた。続いて二次抗体であるＡｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ＢＥＣＫＭＡＮ）２μｌを加え、細胞と３０分間反応させた。ＰＢＳ  １ｍｌを加え、遠心（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）上清を捨てた後、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ  ０．０５％  ＮａＮ３と１０％ＦＢＳを含む）１ｍｌを加え、細胞を分散させた後、フローサイトメーター（ＢＥＣＫＭＡＮ）で測定した。得られたｓｃＦｖ抗体（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３−１）の結合を、種々のＨＴＬＶ−１感染株と非感染株のセルラインで比較した結果の一部を図６と図７に示す。ＨＴＬＶ−１感染のＴ細胞株であるＳ１Ｔやｏｈ１３Ｔには強く結合した。これに対しＣＥＭ細胞などＴ細胞由来の非感染株に対しては、いずれもほとんど結合が見られなかった。これらのことは、本ｓｃＦｖ抗体がＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞癌細胞（ＡＴＬ）に対する有効な特異抗体である可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上の結果より、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）に高発現している細胞表面Ｏ−結合型糖鎖を標的としたヒト抗体である当該抗体及び抗体フラグメントについては、ＡＴＬの早期診断ならびに治療への利用可能性が大いに期待される。
【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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