(57)【要約】【課題】腫瘍細胞において野生型ｐ５３活性を回復させることができる物質を同定すること。【解決手段】アミノアクリジンは、ＮＦ−κＢのインヒビターである。ＮＦ−κＢの阻害は、機能的にブロックされたｐ５３を有するガン細胞においてｐ５３の再活性化をもたらす。ＮＦ−κＢ活性に関連する状態を処置する方法であって、ＮＦ−κＢのインヒビターを含む組成物を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、方法。前記ＮＦ−κＢ活性は、構成的であるかまたは誘導されたものであり得る。前記ＮＦ−κＢ活性が基底レベルにあり得る。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願では、その内容が本明細書中に参考として援用される、２００４年７月２０日に提出された米国仮特許出願番号６０／５８９，６３７の利益を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、細胞増殖またはアポトーシスの調節に広く関係する。さらに具体的には、本発明は、細胞増殖またはアポトーシスの調節のための組成物、その使用方法、およびその同定方法に関係する。
【背景技術】
【０００３】
（２．関連技術の説明）
ヒトにおけるガンの頻度は、先進国世界においては集団の年齢が上がるとともに増大する。いくつかのタイプのガンと診断時の病期については、広く研究されているにもかかわらず、罹患率および死亡率は、近年、有意には改善されていない。プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスの誘導は、最も興味深いガンの治療方法の１つである。
【０００４】
ｐ５３は遺伝子の安定性を制御し、そして、ＤＮＡの損傷またはプロトオンコジーンの脱調節に応答して、増殖の停止またはアポトーシスの誘導を通じてガンのリスクを低下させる。腫瘍予防因子としてのｐ５３の効力は、不活化変異が原因で生じる、ヒト腫瘍の少なくとも５０％におけるｐ５３の消失の頻度によって反映される。野生型ｐ５３の機能の不活化についてのいくつかの機構がヒトの腫瘍について記載されており、これには通常は、プロテアソームを介し、そしてＭｄｍ２によって媒介されるｐ５３の過剰な分解が含まれる。Ｍｄｍ２は、低分子による抑制のため、あるいは、ｐ５３機能の回復により腫瘍細胞を選択的に死滅させるための他のアプローチについての興味深い標的と考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腎細胞ガン（ＲＣＣ）は野生型ではあるが機能的には不活性であるｐ５３を維持している。ＲＣＣにおけるｐ５３の抑制の機構は優勢であり、これは、ガンにおけるｐ５３機能の回復についての、これまでのところはまだ知られていない分子標的の存在を示している。腫瘍細胞において野生型ｐ５３活性を回復させることができる物質を同定することが大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
ＮＦ−κＢ活性に関連する状態は、ＮＦ−κＢのインヒビターを含む組成物をその必要がある患者に投与することによって処置することができる。ＮＦ−κＢ活性は構成的である場合も、誘導されたものである場合も、または基底レベルである場合もある。ＮＦ−κＢの阻害によってｐ５３が活性化される場合もある。ＮＦ−κＢの阻害によって機能的にサイレントであるｐ５３が活性化させられる場合もある。処置される状態は、ガン、炎症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、ＨＩＶ感染に関連する状態、または構成的に活性なＮＦ−κＢに依存して獲得された前ガン細胞であり得る。処置することができるガンの形態としては、腎細胞ガン、肉腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、骨髄腫、骨髄性白血病およびリンパ芽球性白血病、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、ＨＴＬＶ感染によって引き起こされるガンが挙げられるがこれらに限定はされない。
【０００７】
ＮＦ−κＢのインヒビターは以下の式のアミノアクリジンであり得る：
【０００８】
【化２】
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ここで、
Ｒ１は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ２は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；
Ｒ３は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；そして
Ｒ４は、Ｈまたは必要に応じて置換された脂肪族、アリール、もしくは複素環である。
【０００９】
アミノアクリジンは９−アミノアクリジンまたはキナクリンであり得る。組成物にはさらに、ＴＮＦファミリーのポリペプチドの死受容体の活性化因子が含まれる場合がある。活性化因子は、ＴＮＦポリペプチド（例えば、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、ＦａｓＬ／ＣＤ９５、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ−β／ＬＴ−α、ＬＴ−β、またはＴＲＡＩＬ）であり得る。
【００１０】
機能的にサイレントなｐ５３を調節する物質は、候補の物質を、ｐ５３応答性レポーターを含む細胞に対して加え、そしてｐ５３応答性レポーターのシグナルのレベルを測定することによって同定することができる。この物質は、対照と比較したシグナルの差によって同定することができる。この物質はｐ５３の活性を増大させる場合も、また低下させる場合もある。細胞には、機能的にサイレントなｐ５３が含まれる場合がある。
【００１１】
ＮＦ−κＢを調節する物質は、候補の物質を、ｐ５３応答性レポーターを含む細胞に対して加え、そしてｐ５３応答性レポーターのシグナルのレベルを測定することによって同定することができる。この物質は、対照と比較したシグナルの差によって同定することができる。この物質はＮＦ−κＢの活性を増大させる場合も、また低下させる場合もある。細胞には、機能的にサイレントなｐ５３が含まれる場合がある。細胞には、ＮＦ−κＢトランス活性化複合体も含まれる場合がある。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＮＦ−κＢ活性に関連する状態を処置する方法であって、ＮＦ−κＢのインヒビターを含む組成物を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記ＮＦ−κＢ活性が構成的であるかまたは誘導されたものである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＮＦ−κＢ活性が基底レベルにある、項目１に記載の方法。
（項目４）
ＮＦ−κＢの阻害によってｐ５３が活性化される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記状態がガンである、項目１に記載の方法。
（項目６）
ＮＦ−κＢの阻害によって、機能が損なわれた野生型ｐ５３の活性化が誘導される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ガンが、腎細胞ガン、肉腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、骨髄腫、骨髄性白血病およびリンパ芽球性白血病、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、およびＨＴＬＶ感染によって引き起こされるガンからなる群より選択される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記状態が、炎症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、またはＨＩＶ感染に関連する状態である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記状態が、構成的に活性なＮＦ−κＢに依存して獲得された前ガン細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ＮＦ−κＢのインヒビターが以下の式：
【化１】
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のアミノアクリジンであり、ここで、
Ｒ１は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ２は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；
Ｒ３は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；そして
Ｒ４は、Ｈまたは必要に応じて置換された脂肪族、アリール、もしくは複素環である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記アミノアクリジンが、９−アミノアクリジンおよびキナクリンからなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組成物はさらに、ＴＮＦファミリーのポリペプチドの死受容体の活性化因子を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記活性化因子が、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、ＦａｓＬ／ＣＤ９５、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ−β／ＬＴ−α、ＬＴ−β、およびＴＲＡＩＬからなる群より選択されるＴＮＦファミリーのポリペプチドである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
機能的にサイレントなｐ５３を活性化させる物質をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補の物質を、ｐ５３応答性レポーターを含む細胞に対して加える工程；
（ｂ）該ｐ５３応答性レポーターのシグナルのレベルを測定する工程
を包含し、それによって、（ｂ）での対照を上回るシグナルによって物質が同定される、方法。
（項目１５）
前記細胞が、機能的にサイレントなｐ５３を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ＮＦ−κＢを阻害する物質をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補の物質を、ｐ５３応答性レポーターを含む細胞に対して加える工程；
（ｂ）該ｐ５３応答性レポーターのシグナルのレベルを測定する工程を包含し、それによって、（ｂ）での対照を上回るシグナルによって物質が同定される、方法。
（項目１７）
前記細胞が機能的にサイレントなｐ５３を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞がＮＦ−κＢトランス活性化複合体を含む、項目１６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＲＣＣ細胞中でのｐ５３によって媒介されるトランス活性化の回復がＲＣＣ細胞の死によって行われることを示している。図１Ａ：種々の濃度のｐ５３またはＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入したＲＣＣ４５ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞中でのｐ−５３応答性レポーターの活性。β−ガラクトシダーゼ活性（ＯＮＰＧ染色）を、レンチウイルスの形質導入の４８時間後に測定し、タンパク質濃度によって正規化した。図１Ｂ：細胞の生存率を、レンチウイルスの形質導入の９６時間後にメチレンブルー染色によって測定し、同じ濃度のＧＦＰウイルスを形質導入した同じ細胞に対する、ｐ５３ウイルスを形質導入した細胞のメチレンブルー染色の強度の割合として示した。
【図２】図２は、化合物１の式の物質のｐ５３回復活性を示す。図２Ａ：読み出し細胞の選択と選択基準の設定。ＭＣＦ７、ＡＣＨＮ、ＲＣＣ２６ｂ、およびＲＣＣ４５細胞（全て、ＣｏｎＡＬａｃＺレポーターを含む）を９６ウェルプレートにプレートし、種々の濃度のドキソルビシンを含む培地の中で２４時間インキュベートした。その後、β−ガラクトシダーゼ活性をＯＮＰＧ染色によって測定し、タンパク質濃度によって正規化した。図２Ｂは、９ＡＡがＲＣＣ４５細胞中でｐ５３依存性レポーターの最も強い活性を引き起こすことを示している。化合物１の式の物質を、ＲＣＣ４５ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞中でのｐ５３トランス活性化について、用量依存性アッセイにおいて試験した。棒は２μＭのドキソルビシンの効果を上回る、化合物によって誘導されたｐ５３の活性化の倍数として計算したそれぞれの化合物の相対的活性を示す（３回の実験の結果）。
【図３】図３は、９ＡＡが様々な腫瘍細胞の中でｐ５３の転写活性を誘導することを示している。図３Ａは、９ＡＡが用量依存性の様式でｐ５３応答性レポーターを誘導することを示している。ＲＣＣ４５ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞およびＭＣＦ７ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞を、示した濃度のドキソルビシン（ｄｏｘ）または９ＡＡ（全ての濃度をμＭで示す）を含む培地の中で２４時間インキュベートし、その後、β−ガラクトシダーゼ活性をＯＮＰＧ染色によって測定し、タンパク質含有量によって正規化し、そして未処理の細胞と比較したレポーターの誘導の倍数として示した。図３Ｂは、９ＡＡが内因性ｐ５３依存性標的の発現を誘導することを示している。１０μＭの９ＡＡまたは２μＭのドキソルビシンで示した時間（時間）の間処理し、そして抗ｐ５３、抗Ｈｄｍ２、または抗ｐ２１抗体でプローブしたＲＣＣ４５細胞およびＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。図３Ｃは、９ＡＡが試験した腫瘍細胞の大部分においてドキソルビシンよりも強くｐ５３を活性化することを示している。ｐ５３応答性レポーターが組み込まれている示した細胞を、種々の濃度の９ＡＡ（１〜１０μＭ）およびドキソルビシン（ｄｏｘ、０．２〜２μＭ）で２４時間処理し、その後、β−ガラクトシダーゼ活性をＯＮＰＧ染色によって測定し、タンパク質含有量によって正規化した。データは、ｄｏｘの効果を上回る９ＡＡの最も有効な用量による、未処理の対照を上回るレポーターの誘導の倍数として示した。図３Ｄは、９ＡＡがｐ５３依存性の様式でβ−ガラクトシダーゼ活性を誘導することを示している。抗ｐ５３または抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを発現する構築物を形質導入したＨＴ１０８０ＣｏｎＡＬｕＣを、５μＭの９ＡＡで２４時間処理した。棒は、未処理の対照を上回るｐ５３応答性レポーターの誘導の倍数を示す。囲みは、基本的な条件、およびドキソルビシンで処理した条件の両方の細胞変異体の全タンパク質溶解物中でのｐ５３の発現についてのウェスタンブロットを示す（ｐ５３の基底レベルとＤＮＡ損傷によって誘導されたレベルを評価するため）。図３Ｅは、９ＡＡで２４時間処理したＨＴ１０８０ＣｏｎＡＬｕｃ細胞中のｐ５３応答性レポーターの活性の用量応答曲線を示す（タンパク質濃度に対する正規化は行わなかった）。誘導倍数は、未処理の対照を上回るレポーターの活性化の倍数として示した。図３Ｆは、９ＡＡのｐ５３誘導効果の時間依存性を示している。ＨＴ１０８０ＣｏｎＡＬｕＣ細胞を２０μＭの９ＡＡで１時間処理し、その後、β−ガラクトシダーゼ活性を示した時点で測定した。誘導倍数を未処理の対照を上回るレポーター活性化の倍数として示した。
【図４】図４は、９ＡＡに伴う細胞傷害性がｐ５３依存性であることを示している。図４Ａは、示した濃度の９ＡＡで処理したＨＴ１０８０−ｓｉｐ５３およびＨＴ１０８０−ｓｉＧＦＰ細胞の生存率（「材料および方法」の項を参照のこと）を、未処理の対照と比較した細胞の割合として示した結果とともに示している。図４Ｂは、図４Ａについて記載した様式で試験した種々のレベルのｐ５３を用いた細胞の他の対を示している。上段のパネルは、作成した細胞の対におけるｐ５３タンパク質レベルのウェスタンブロット分析を示している。下段のパネルは、未処理の対照（１００％）と比較した９ａａ（２μＭ）での処理後の細胞の相対数を示している。図４Ｃは、３もしくは２０μＭの９ＡＡで示した時間の間、または２μＭのｄｏｘで２４時間処理した、ＨＴ１０８０  ｓｉｐ５３細胞またはＨＴ１０８０  ｓｉＧＦＰ細胞の細胞周期分析を示している。図４Ｄは、種々の薬物の細胞傷害性のｐ５３依存性を示している。図４Ａに記載したものと同じ実験を、３０ｄ９（最初のヒット、９ａａのアナログ、１〜１０μＭ），ドキソルビシン（ｄｏｘ、０．１〜１μＭ）、カンポテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）（ｃａｍｐ、０．１６〜１．６μＭ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌ、０．１〜１μＭ）、およびタキソール（ｔａｘ、０．０６〜０．６μＭ）を使用して行った。棒は薬物の用量についてプロットし、これは、ｐ５３「＋」細胞とｐ５３「−」細胞の間での感度の最大の差を示している。図４Ｅは、９ＡＡが正常な腎臓上皮細胞（ＮＫＥ）よりもＲＣＣに対してより高い毒性があることを示している。図４Ａに記載したものと同じ実験を、ＮＫＥ、ＲＣＣ４５、ＲＣＣ５４、およびＡＣＨＮ細胞を用いて行った。図４Ｆは、９ＡＡが低濃度でＲＣＣに対してより毒性があることを示している。いくつかの細胞型（ＮＫＥ−正常な腎臓上皮細胞、ＲＣＣ４５、ＡＣＨＮ−ＲＣＣ細胞株、ＨＣＴ１１６−結腸ガン、ｐ５３野生型、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−神経芽細胞腫、ｐ５３野生型、ＬＮＣａＰ前立腺線ガン、ｐ５３野生型、ＤＵ１４５、ＰＣ３−前立腺ガン、ｐ５３欠損、Ｍｅｌ７、Ｍｅｌ２９黒色腫、リー−フラウメニ癌症候群の患者由来の０４１−線維芽細胞、ｐ５３ヌル、ＷＩ３８−正常なヒト２倍体線維芽細胞）を、図４Ａに記載したように２μＭの９ＡＡで処理し、細胞の生存率を対応する未処理の細胞と比較した。
【図５】図５は、化合物１の式の物質が、活性なｐ５３を有している腫瘍細胞に対して毒性であることを示している。図５Ａは、複数の物質のインビボでのｐ５３誘導効果を示している。ＨＴ１０８０ＣｏｎＡＬｕＣ細胞をヌードマウスの両方の脇腹に接種した。腫瘍が５ｍｍの直径に達した時点で、マウスに示した濃度の薬物（ｍｇ／ｋｇ、１つのグループについて３匹のマウス）を腹腔内注射した。２４時間後にマウスを屠殺し、腫瘍を単離し、レポーター溶解試薬（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の中で溶解させ、ルシフェラーゼ活性を１０ｍｇの腫瘍タンパク質中で測定した。棒は、媒体で処理した腫瘍の中でのルシフェラーゼ活性を上回る、薬物で処理した腫瘍内でのルシフェラーゼ活性の誘導の倍数を示している。図５Ｂ：ＨＴ１０８０ｓｉｐ５３細胞またはＨＴ１０８０ｓｉＧＦＰ細胞を、それぞれ、ヌードマウスの左脇腹および右脇腹に接種した。腫瘍が５ｍｍの直径に達した時点で、マウスに媒体（ＰＢＳ中の５０％のＤＭＳＯ）、キナクリン（ＱＣ、５０ｍｇ／ｋｇ）、および５−フルオロウラシル（５ＦＵ，３５ｍｇ／ｋｇ）を２４時間おきに腹腔内注射した（１つのグループについて５匹のマウス）。結果は、処置の第１日目の腫瘍容積と比較した、個々の腫瘍の相対的な腫瘍容積の平均として示す。
【図６】図６は、９ＡＡ活性について考えられる機構の試験を示している。図６Ａは、９ＡＡで処理した細胞中でのＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ複合体形成の測定を示している。図６Ｂは、９ＡＡ（５μＭ）またはｄｏｘ（１μＭ）で１６時間処理したＲＣＣ４５細胞中でのｐ５３のリン酸化状態を示している。全タンパク質溶解物のウェスタンブロット分析を、ｐ５３（ＤＯ１）に対する抗体と、ｐ５３の中の特異的なリン酸化部位に対する抗体を使用して行った。図６Ｃは、プロテアソーム活性に対する９ＡＡの効果を示している。ＨＣＴ１１６細胞を１μＭのＰＳ−３４１で３０分間処理した。ＰＳ−３４１を３０分後に洗浄し、処理後３時間または１６時間での分析前に、細胞を、薬物を含まない培地の中で再度インキュベートした。９ＡＡの場合には、細胞を２μＭの９−アミノアクリジンで、分析の前に３時間または１６時間継続して処理した。プロテアソーム活性は、ＡＭＣ−蛍光性ペプチドの切断によって生じる遊離のＡＭＣの吸光度を測定することによって決定した。未処理の細胞のプロテアソーム活性を１００％に設定した。図６Ｄは、９ＡＡでの処理後のＩκＢ−αリン酸化の状態を示している。ＰＣ−３細胞を１０μＭの９−アミノアクリジンで１時間、２時間、４時間、および８時間、または１０μＭのＭＧ−１３２で８時間処理した。細胞溶解物を処理後の示した時間で単離し、ウェスタンブロッティングに使用した。ブロットを、ＩκＢ−αのリン酸化形態に特異的な抗体およびリン酸化されていない形態に特異的な抗体の両方でプローブした。β−アクチン特異的抗体をローディング対照として使用した。図６Ｅは、９ＡＡでの処理によってＩκＢ−αタンパク質レベルの低下が導かれることを示している。ウェスタンブロット分析は、抗ＩκＢ抗体とともに、１μＭのドキソルビシン（ｄｏｘ）および１０μＭの９ＡＡの中で８時間インキュベートしたＭＣＦ７細胞を示している。
【図７】図７は、ＮＦ−κＢ経路に対する９ＡＡの効果を示している。図７Ａは、９ＡＡがＮＦ−κＢ依存性の転写を阻害することを示している。Ｈ１２９９−ＮＦ−κＢＬｕｃ細胞を種々の濃度の９ＡＡおよびキナクリン（ＱＣ）で、ＴＮＦａ（１０ｎｇ／ｍｌ）の前（９ＡＡまたはＱＣの後にＴＮＦ）またはＴＮＦａと同時（ＴＮＦと９ＡＡまたはＱＣ）に、２時間処理した。ＴＮＦａの添加の６時間後に、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。図７Ｂは、９ＡＡがＴＮＦによって刺激されたＩκＢレベルの再構成を阻害することを示している。ＨＴ１０８０細胞をＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で、９ＡＡ（１０μＭ）の存在下または９ＡＡが存在しない条件で処理した。示した時点で全細胞溶解物を調製し、そしてＩκＢに対する抗体でのウェスタンブロッティングによって分析した。図７Ｃ：Ｈ１２９９−ＮＦ−κＢＬｕｃ細胞を示した濃度の９ＡＡおよびＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６時間後、細胞質および核の抽出物を単離し、ルシフェラーゼアッセイまたはゲルシフトアッセイにそれぞれ使用した。図７Ｄは、９ＡＡがｐ６５／ｐ５０およびｐ５０／ｐ５０  ＮＦκＢ複合体の蓄積を生じることを示している。ゲルシフトアッセイを、９ＡＡ（１０μＭ）およびＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理したＨ１２９９細胞の核抽出物を用いて行った。図７Ｅは、９ＡＡが核に由来するｐ６５複合体の排出を遅らせることを示している。ｐ６５に対する抗体とともに、示した時間の間９ＡＡ（１０ｍＭ）およびＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理したＨＴ１０８０細胞の免疫蛍光染色。図７Ｆは、９ＡＡがＴＮＦに応答してｐ６５のリン酸化を減少させることを示している。上段のパネル：示した時間の間、９ＡＡ（１０μＭ）の存在下または９ＡＡが存在しない条件においてＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＨＴ１０８０細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。同じメンブレンをｐ６５全体に対する抗体とホスホ−ｐ６５Ｓｅｒ５３６に対する抗体でプローブした。下段のパネル：ＢｉｏＲａｄ  ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用した上段のパネルに示した実験の定量。結果は、未処理の対照と比較したバンドの強度の変化の倍数として示す。図７Ｇは、９ＡＡによってｐ５０タンパク質レベルの増大が生じることを示している。ＨＴ１０８０細胞の核および細胞質画分（図７Ａに記載したように処理した）のウェスタンブロット分析。図７Ｈは、９ＡＡはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）によって誘導されたＮＦ−κＢのトランス活性化を阻害しないことを示している。ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼレポーターが組み込まれているＨ１２９９細胞を１００ｎＭのＴＳＡで、９ＡＡ（２０ｍＭ）の存在下または９ＡＡが存在しない条件において、４時間または１６時間処理した。ＴＮＦａでの処理を、レポーター活性の対照として使用した。
【図８】図８は、９ＡＡがＮＦ−κＢの阻害を通じてｐ５３依存性の転写を活性化させることを示している。図８Ａは、ＩκＢ  ＳｕｐｅｒＳｕｐｒｅｓｓｏｎ（ｓｓ）がＲＣＣ細胞中でｐ５３を活性化させることを示している。ＡＣＨＮ細胞をｐ２１−ＣｏｎＡＬｕｃと、ＩκＢ  ＳｕｐｒｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ、ｐ５３、およびＡｒｆ  ｃＤＮＡまたは抗Ｈｄｍ２  ｓｉＲＮＡを含む示したプラスミドで同時トランスフェクトした。４８時間後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。正規化を、ｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドの同時トランスフェクションによって行った。図８ＢはＩκＢ  ＳｕｐｒｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒがＮＦ−κＢ転写活性を阻害することを示している。ＡＣＨＮ細胞を、ＮＦ−κＢ応答性レポーターであるｐＮＦ−κＢＬｕｃとＩκＢ  ＳｕｐｅｒＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（ＳＳ）で同時トランスフェクトした。４８時間後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。図８Ｃは、９ＡＡは、ＮＦ−κＢが阻害されている細胞においてｐ５３を活性化させることができないことを示している。ＡＣＨＮ細胞を、ｐＣｏｎＡＬｕｃまたはｐＮＦ−κＢＬｕｃのいずれかと、ＩκＢ  ＳｕｐｒｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（ＳＳ）または空のベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、全ての細胞をバラバラにし、９ＡＡ（１０μＭ）で処理した。ＮＦ−κＢレポーター活性を処理の６時間後に測定し、ｐ５３応答性レポーター活性を処理の２４時間後に測定した。正規化を、ｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドの同時トランスフェクション（様々なプラスミドのセットによってトランスフェクトした細胞について）によって、そしてタンパク質濃度（９ＡＡで処理した細胞と未処理の細胞について）によって行った。
【図９】図９は、死リガンドとの９−アミノアクリジンの相乗効果を示している。
【図１０】図１０は、９ＡＡおよびＱＣが抗ＲＣＣ物質であることを示している。図１０Ａは、種々のＲＣＣ細胞および非ＲＣＣ細胞の９ＡＡ、ＱＣ、およびいくつかの抗ガン剤のＩＣ５０％用量の比較を示している。個々の細胞株と個々の薬物についてＩＣ５０％を決定した。それぞれの点は、特定の細胞株のＩＣ５０％を示しており、これらが以下にようにグループ分けされる：（ｉ）黒丸−ＲＣＣ細胞株（ＡＣＨＮ、ＲＣＣ９、ＲＣＣ１３、ＲＣＣ２９、ＲＣＣ４５、ＲＣＣ５４）、（ｉｉ）赤三角−非ＲＣＣ細胞株（ＭＣＦ７、ＨＴ１０８０、Ｈ１２９９、Ｕ２０Ｓ、ＬＮＣａＰ、ＨＣＴ１１６）、（ｉｉｉ）緑四角−正常な腎細胞（ＮＫＥ）。図１０Ｂは、キナクリンがエキソビボで培養されたＲＣＣ腫瘍においてｐ５３応答性レポーターを活性化することを示している。ｐ５３応答性レポーターレンチウイルスがエキソビボで形質導入され、そしてキナクリンまたはドキソルビシンで処理された腫瘍および正常な腎臓の断片のＸ−ｇａｌ染色。図１０Ｃは、キナクリンはＲＣＣ４５とＲＣＣ５４をＴＲＡＩＬに対して感作させるが、正常な腎臓上皮細胞（ＮＫＥ）は感作させないことを示している。９６ウェルプレートにプレートした細胞を、示した濃度のＴＲＡＩＬおよびキナクリンの存在下で２４時間インキュベートし、細胞数をメチレンブルーアッセイを使用して予測した。図１０Ｄは、キナクリン（ＱＣ）の抗腫瘍活性を示している。１０７個のＡＣＨＮ細胞をヌードマウスの皮下に接種した。腫瘍が５ｍｍの直径に達した時点で、５０ｍｇ／ｋｇのＱＣの腹腔内投与を開始した。５ＦＵ（３５ｍｇ／ｋｇ）を対照として使用した。腫瘍の大きさを一日おきに測定し、腫瘍の容積の倍数増加として示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本発明の化合物、生成物、および組成物、ならびに方法を開示し、そして記載する前に、本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、限定するようには意図されないことが理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、その状況が他の場所で明確に示されない限りは複数形についての言及も含まれることに留意されなければならない。
【００１４】
（１．定義）
用語「分岐している」は、本明細書中で使用される場合は、１個から２４個までの骨格原子を含む基であって、ここで、この基の骨格鎖が主鎖からの１つ以上の付随する分岐を含む基を意味する。本明細書中の好ましい分岐している基には１個から１２個までの骨格原子が含まれる。分岐している基の例としては、イソブチル、ｔ−ブチル、イソプロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３などが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００１５】
用語「分岐していない」は、本明細書中で使用される場合は、１個から２４個までの骨格原子を含む基であって、ここで、この基の骨格鎖が一直線に伸びている基を意味する。本明細書中の好ましい分岐していない基には１個から１２個までの骨格原子が含まれる。
【００１６】
用語「環式」または「シクロ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、３個から１２個までの骨格原子、好ましくは、３個から７個の骨格原子の環を保有している１つ以上の閉じた環（不飽和であるか飽和であるかは問わない）を有している基を意味する。
【００１７】
用語「低級」は、本明細書中で使用される場合は、１個から６個の骨格原子を有している基を意味する。
【００１８】
用語「飽和」は、本明細書中で使用される場合は、骨格原子の全ての利用可能な原子価結合が他の分子に結合している基を意味する。飽和基の代表的な例としては、ブチル、シクロヘキシル、ピペリジンなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００１９】
用語「不飽和」は、本明細書中で使用される場合は、２つの隣接している骨格原子の少なくとも１つの利用可能な原子価結合が他の原子には結合していない基を意味する。不飽和基の代表的な例としては、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、フェニル、ピロールなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２０】
用語「脂肪族」は、本明細書中で使用される場合は、分岐していない基、分岐している基、または環状の炭化水素基を意味し、これは置換されている場合も、また置換されていない場合もあり、飽和である場合も、また、不飽和である場合もあるが、芳香族ではない。用語「脂肪族」にはさらに、炭化水素骨格の１つ以上の炭素を置き換えている酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含む脂肪族基が含まれる。
【００２１】
用語「芳香族」は、本明細書中で使用される場合は、４ｎ＋２個の非局在π（パイ）電子を有している不飽和の環式炭化水基を意味し、これは置換されている場合も、また置換されていない場合もある。用語「芳香族」にはさらに、炭化水素骨格の１つ以上の炭素を置き換えている窒素原子を含む芳香族基が含まれる。芳香族基の例としては、フェニル、ナフチル、チエニル、フラニル、ピリジニル、（イソ）オキサゾリルなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２２】
用語「置換された」は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上の水素または他の原子が炭素または適切なヘテロ原子から除去され、そして、別の基で置き換えられている基を意味する。本明細書中の好ましい置換された基は、１個から５個、最も好ましくは１個から３個の置換基で置換されている。２つの置換基を有している原子は「ジ」と記載され、一方、２つ以上の置換基を有している原子は「ポリ」によって記載される。このような置換基の代表的な例としては、脂肪族基、芳香族基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、ハロ、アリールオキシ、カルボニル、アクリル、シアノ、アミノ、ニトロ、リン含有基、硫黄含有基、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アシルアミノ、アミジノ、イミノ、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、ヘテロアリール、セミカルバジド、チオセミカルバジド、マレイミド、オキシイミノ、イミデート、シクロアルキル、シクロアルキルカルボニル、ジアルキルアミノ、アリールシクロアルキル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アリールシクロアルキルカルボニル、アリールホスフィニル、アリールアルキルホスフィニル、アリールシクロアルキルホスフィニル、アリールホスホニル、アリールアルキルホスホニル、アリールシクロアルキルホスホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、アリールシクロアルキルスルホニル、これらの組み合わせ、およびこれらの置換基が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２３】
用語「置換されていない」は、本明細書中で使用される場合は、それに対していずれの基もさらに結合させられていないか、またはそれについて置換されていない基を意味する。
【００２４】
用語「アルキル」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、分岐しているかまたは分岐していない、飽和脂肪族基を意味する。アルキル基の代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２５】
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、鎖に沿っていずれかの安定した部位で生じ得る少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、分岐しているかまたは分岐していない、不飽和脂肪族基を意味する。アルケニル基の代表的な例としては、エテニル、Ｅ−およびＺ−ペンテニル、デセニルなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２６】
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、鎖に沿っていずれかの安定した部位で生じ得る少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、分岐しているかまたは分岐していない、不飽和脂肪族基を意味する。アルキニル基の代表的な例としては、エチニル、プロピニル、プロパルギル、ブチニル、ヘキシニル、デシニルなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２７】
用語「アリール」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、必要に応じて他の芳香族環式基または非芳香族環式基に縮合させることができる、置換されているかまたは置換されていない芳香族基を意味する。アリール基の代表的な例としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、ベンジリジン、キシリル、スチレン、スチリル、フェネチル、フェニレン、ベンゼントリイルなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２８】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、１つの末端エーテル結合によって結合させられたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、２−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシ、３−メチルペントキシ、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
用語「アリールオキシ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、１つの末端エーテル結合によって結合させられたアリール基を意味する。
【００３０】
用語「ハロゲン」、「ハライド」、または「ハロ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、フッ素「Ｆ」、塩素「Ｃｌ」、臭素「Ｂｒ」、ヨウ素「Ｉ」、およびアスタチン「Ａｔ」を意味する。ハロ基の代表的な例としては、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミドなどが挙げられるがこれらの限定はされない。
【００３１】
用語「ヘテロ」は、本明細書中で使用される場合は、組み合わせて、炭素または水素以外の任意の元素の１つ以上の原子を含む基を意味する。ヘテロ基の代表的な例としては、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含むがこれに限定されないヘテロ原子を含む基が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３２】
用語「複素環」は、本明細書中で使用される場合は、ヘテロ原子を含む環式基を意味する。複素環の代表的な例としては、ピリジン、ピペラジン、ピリミジン、ピリダジン、ピペラジン、ピロール、ピロリジノン、ピロリジン、モルホリン、チオモルホリン、インドール、イソインドール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、フラン、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、チオフェン、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、ベンゾチオフェン、キノリン、イソキノリン、アザピン、ナフトピラン、フラノベンゾピラノンなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３３】
用語「カルボニル」または「カルボキシ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、炭素−酸素二重結合を含む基を意味する。カルボニルを含む基の代表的な例としては、アルデヒド（すなわち、ホルミル）、ケトン（すなわち、アシル）、カルボン酸（すなわち、カルボキシル）、アミド（すなわち、アミド）、イミド（すなわち、イミド）、エステル、無水物などが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３４】
用語「アクリル」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、ＣＨ２＝Ｃ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって表される基を意味する。ここでは、Ｑは脂肪族または芳香族基である。
【００３５】
用語「シアノ」、「シアネート」、または「シアン化物」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、炭素−窒素二重結合を意味する。シアノ基の代表的な例としては、イソシアネート、イソチオシアネートなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３６】
用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合は、単独で、または組み合わせて、骨格窒素原子を含む基を意味する。アミノ基の代表的な例としては、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、ウレイドなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３７】
用語「リン含有基」は、本明細書中で使用される場合は、酸化された状態で少なくとも１つのリン原子を含む基を意味する。代表的な例としては、リン酸、ホスフィン酸、リン酸エステル、ホスフィニデン、ホスフィノ、ホスフィニル、ホスフィニリデン、ホスホ、ホスホン、ホスホラニル、ホスホラニリデン、ホスホロソなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３８】
用語「硫黄含有基」は、本明細書中で使用される場合は、硫黄原子を含む基を意味する。代表的な例としては、スルフヒドリル、スルフェノ、スルフィノ、スルフィニル、スルホ、スルホニル、チオ、チオキソなどが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３９】
用語「必要に応じた」または「必要に応じて」は、本明細書中で使用される場合は、続いて記載される事象または状況が生じる場合も、または生じない場合もあり、そして、この記載には、上記の事象または状況が起こる例と、それが起こらない例が含まれることを意味する。例えば、表現「必要に応じて置換されたアルキル」は、アルキル基が置換されている場合も、または置換されていない場合もあり、そしてこの記載には、置換されていないアルキルと置換されているアルキルの両方が含まれることを意味する。
【００４０】
用語「有効量」は、本明細書中で提供される化合物、生成物、または組成物に関して使用される場合は、所望される結果を提供するために十分な量の化合物、生成物、または組成物を意味する。必要な抽出物の量は、使用される特定の化合物、生成物、または組成物、その投与形式などに応じて様々であろう。したがって、正確な「有効量」を特定することは必ずしも可能ではない。しかし、適切な有効量は、日常的に行われている実験だけを使用することによって本発明の開示によって与えられる情報により当業者であれば決定できる。
【００４１】
用語「適切な」は、本明細書中で使用される場合には、記載される目的についての本明細書中で提供される化合物、生成物、または組成物と適合する基を意味する。記載される目的についての適合は、日常的に行われている実験だけを使用して当業者であれば容易に決定できる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、用語「投与する」は、化合物の投与量を記載するために使用される場合には、化合物の単回投与または複数回投与を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、「アポトーシス」は、細胞小器官の完全性を保ったままの細胞体積の段階的な収縮；光学顕微鏡または電子顕微鏡で見ることができるクロマチンの凝縮（すなわち、核の凝縮）；ならびに／あるいは、遠心分離堆積アッセイ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって決定されるヌクレオソームのサイズの断片へのＤＮＡの切断を含む、細胞死の１つの形態を意味する。細胞死は、食作用性細胞による完全な細胞断片（「アポトーシスボディー」）の飲み込みを伴って、細胞膜の完全性が失われる（例えば、膜のブレブ形成）と生じる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、用語「ガン」は、アポトーシス性の刺激に対する耐性を特徴とする任意の状態を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、用語「ガンの処置」は、化学療法および放射線治療を含むがこれらに限定されない当該分野で公知のガンについての任意の処置を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合は、用語「〜との組み合わせ」は、アミノアクリジンの投与および別の処置手段を記載するために使用される場合には、アミノアクリジンを、別の処置の前に、別の処置と一緒に、または別の処置の後で、あるいはそれらと組み合わせて投与することができることを意味する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合は、用語「処置」または「処置する」は、ある状態からの哺乳動物の防御について言う場合には、この状態を予防する、抑制する、抑える、または排除することを意味する。状態の予防には、この状態の発症の前に哺乳動物を処置することが含まれる。状態の抑制には、状態の誘導後ではあるが、その臨床的所見の前に哺乳動物を処置することが含まれる。状態を抑えることには、状態の臨床的所見の後に哺乳動物を処置することが含まれ、その結果、状態は軽減されるか、または維持される。状態の排除には、状態の臨床的所見の後に哺乳動物を処置することが含まれ、その結果、哺乳動物はそれ以上の状態に見舞われることはない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合は、用語「腫瘍細胞」は、アポトーシス性の刺激に対する耐性を特徴とする任意の細胞を意味する。
【００４９】
（２．腫瘍中でのｐ５３の抑制についてのＮＦ−κＢによって媒介される機構）
本発明は、ＮＦ−κＢ活性を阻害することにより、機能的にブロックされたｐ５３を有しているガン細胞においてｐ５３が活性化される場合があるという発見に関係する。腫瘍中のｐ５３経路の不活化は、ｐ５３変異よりもはるかに広い範囲の現象である。腫瘍が野生型ｐ５３を維持していてもなお、その機能は通常は完全であるか、または一部が失われているかのいずれかである。これらの場合には、そのようなガンの中のｐ５３は薬理学的再活性化のための標的と見ることができるので、治療の観点から特に興味深い。ｐ５３活性が組織特異的機構によってブロックされているいくつかのタイプの腫瘍が存在している。したがって、Ｈｄｍ２の過剰発現は肉腫において特に頻度が高く、一方、ヒトパピローマウイルスのＥ６は大部分の子宮頸ガンにおいてｐ５３を不活化する。ＲＣＣは、この種類の腫瘍の別の例を提供し、これは、本発明者らによって最近報告されたように、ＲＣＣの中の野生型ｐ５３が、おそらくは組織特異的である未知の優勢な機構によって抑えられているので、とりわけ興味深い分析対象である。したがって、ｐ５３の再活性化は、この、これまでのところは治療不可能な形態のガンの処置のため、ならびに、ｐ５３を不活化させるための同様の機構を有している他のガンの処置についての興味深い方針であると考えられている。
【００５０】
ＮＦ−κＢ活性は、インビトロおよびインビボでのアポトーシスの抑制に関係している。常に、多くのアポトーシス耐性腫瘍はＮＦ−κＢの構成的な活性化を獲得する。腫瘍細胞中でのＮＦ−κＢの活性化は、おそらく、自然界での死の刺激（例えば、ＴＮＦ，Ｆａｓ、またはＴＲＡＩＬ）および薬理学的な死の刺激（化学療法剤）のいずれに対しても耐性を提供することによって、おそらくその悪性の表現型を導いている。構成的に活性なＮＦ−κＢは多くの腫瘍のタイプにおいて記載されているが、ＮＦ−κＢの活性化とｐ５３の阻害との間の関係は、完全には理解されてはいない。
【００５１】
ガン（例えば、機能性ｐ５３または野生型ｐ５３を有しているガン）は、ＮＦ−κＢ活性を阻害することによって処置される場合がある。これは、野生型ｐ５３活性の回復とその活性化を導くことができる。ＮＦ−κＢ活性のインヒビターはまた、化学療法、放射線治療、自然界に存在している死リガンド（例えば、ＴＮＦポリペプチド）のような処置によるｐ５３依存性のアポトーシスまたはｐ５３非依存性のアポトーシスに対してガンを感作させるためにも使用される場合がある。それらのｐ５３の状態にはかかわらず、大部分のヒトのガンは、構成的にＮＦ−κＢを過剰に活性化させる。結果として、ＮＦ−κＢのインヒビターは、トランス活性化ＮＦ−κＢ複合体の転写抑制複合体への再プログラミングの理由から、それらのｐ５３状態にはかかわらずいずれの腫瘍の処置にも使用することができる。
【００５２】
（３．アミノアクリジン）
アミノアクリジンは、ＮＦ−κＢ活性を阻害するために使用することができる物質の代表的な例である。アミノアクリジンは以下の式のものであり得る：
【００５３】
【化３】
2014074056.tif 000005
ここで、
Ｒ１は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ２は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；
Ｒ３は、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルコキシであり；そして
Ｒ４は、Ｈまたは必要に応じて置換された脂肪族、アリール、もしくは複素環である。
【００５４】
アミノアクリジンの代表的な例としては、９−アミノアクリジンまたはメパクリン（Ｍｅｐａｃｒｉｎｅ）（これは、キナクリンとしても知られている）、さらには、実施例２に記載されるアミノアクリジンが挙げられるがこれらに限定はされない。腫瘍細胞を感作させるためにアミノアクリジンを使用することは、多くのアミノアクリジンが限られた副作用しか有さないので、魅力的である。
【００５５】
９ＡＡは、１９４２年から治療薬として使用されている。特定の９ＡＡ誘導体は、ＤＮＡ損傷活性を介在できると考えられている。しかし、本発明者らにより、９ＡＡとキナクリンはＤＮＡ損傷活性を示さないことが見出された。９ａａとキナクリンはいずれも、インビトロおよびインビボで正常な細胞に比べて腫瘍に対してより毒性があることが明らかにされている。さらに、いずれの化合物も、ＲＣＣを除く様々な腫瘍細胞のタイプについてｐ５３を活性化させることができ、そしてｐ５３依存性の死滅をさせることができることが示されている。ｐ５３依存性のそれらの抗腫瘍活性は、それらの野生型ｐ５３または機能性ｐ５３を有している腫瘍の標的化に基づいて、従来の化学療法剤からアミノアクリジンを明確に区別させる。
【００５６】
アミノアクリジンはｐ５３活性化物質のいずれの既知のカテゴリーにも適合しない。これらはｐ５３の蓄積を引き起こし得るが、これらは、ＤＮＡ損傷薬とは異なり、ｐ５３のリン酸化を誘導することはできない。さらに、アミノアクリジンはＤＮＡの損傷を引き起こすことはない。その代わりに、アミノアクリジンの最初の効果は、ｐ５３の活性化に対しては現れず、ＮＦ−κＢの抑制に対して現れる。これは、後にｐ５３の誘導を導く。重要なことは、ＮＦ−κＢの阻害によって、細胞内で、ｐ５３の活性化に対する直接的なアプローチのいずれによっても「目を覚まさせる」ことができないｐ５３機能が活性化されることであり、これには、Ａｒｆの導入、Ｈｄｍ２のノックダウン、またはｐ５３の異所性の過剰発現が含まれる。
【００５７】
ＮＦ−κＢの阻害は、通常は、ＮＦ−κＢの主要なネガティブ調節因子であるＩκＢの安定化を通じて行われる。遺伝的には、これは、このタンパク質の調節性のリン酸化部位を変異させることによって、そして、ＩκＢリン酸化のブロックを導く上流のキナーゼの阻害を通じて薬理学的に行うことができる。多くの既知のＮＦ−κＢの化学的インヒビターは、この機構を通じて作用する。ＩκＢの安定化によって、細胞質隔離と、転写因子としてのＮＦ−κＢ複合体の機能的不活化が生じる。
【００５８】
アミノアクリジンの活性は、それらが、トランス活性化の完全な抑制を伴う活性化の刺激に応答して、核内でのＮＦ−κＢ複合体の蓄積を強力に促進するので、これまでの薬物よりも優れている場合がある。したがって、アミノアクリジンは、ＩκＢの下流で作用し、そしてＮＦ−κＢの不活性な複合体への変換を含む機構によってＮＦ−κＢを阻害することができる。ＮＦ−κＢ依存性転写の欠損によって、ＩκＢ（これは、ＮＦ−κＢの直接的な転写標的である）のプールの枯渇と、通常は、ＩκＢによって発揮される、核からの排出の欠損が原因である核内でのＮＦ−κＢの保持が導かれる場合がある。興味深いことに、ＮＦ−κＢ活性化が関係している細胞性因子（ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＴＢＫ１、ＰＫＣ−ζ）のいずれのノックアウトによっても、アミノアクリジンの効果は模倣されず、このことは、これらの全てがアミノアクリジンの標的ではないことを示唆している。ｐ６５を含む不活性なＮＦ−κＢ複合体の核での蓄積がＵＶ、ドキソルビシン、およびダウノルビシンでの細胞の処理の後に生じることが最近報告されたが、これらの処置はいずれも、おそらくはＮＦ−κＢ阻害活性が弱いことが原因で、ｐ５３を活性化することにおいてはアミノアクリジンと匹敵するものではない。
【００５９】
アミノアクリジンは、ＮＦ−κＢによるシグナル伝達（「標準的な」ＮＦ−κＢ活性化経路）のＩκＢリン酸化アームに対してだけではなく、ＮＦ−κＢ活性化の別の機構を介しても有効であり得る。これは、刺激されたＮＦ−κＢ活性をブロックするアミノアクリジン（例えば、９ＡＡ）の能力によってサポートされ、そして腫瘍細胞の中での構成的ＮＦ−κＢ活性の基底レベルをもまた効率よく低下させる。対照的に、ＩＫＫ２インヒビターは、刺激されたＮＦ−κＢ活性をブロックすることができるのみである。
【００６０】
（４．組成物）
本発明は、アミノアクリジンと必要に応じて化学療法剤を含む組成物に関係する。本発明はまた、アミノアクリジンと必要に応じてＴＮＦポリペプチドを含む組成物にも関係する。
【００６１】
（ａ．化学療法剤）
化学療法剤は、アポトーシスを誘導する任意の薬理学的物質または化合物であり得る。薬理学的物質または化合物は、例えば、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または抗体である場合もある。
【００６２】
化学療法剤は、細胞傷害性物質または細胞増殖抑制剤、あるいはそれらの組み合わせである場合もある。細胞傷害性物質は、（１）ＤＮＡを複製する細胞の能力を妨害すること、ならびに（２）ガン細胞中で細胞死および／またはアポトーシスを誘導することによって、ガン細胞が増殖することを妨げる。細胞増殖抑制剤は、細胞増殖を調節する細胞性のシグナル伝達プロセスの調節、妨害、または阻害を通じて作用し、そして時には低い連続的レベルで存在する。
【００６３】
細胞傷害性物質として使用することができる化合物のクラスとしては、以下が挙げられる：アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、およびトリアジンを含むがこれらに限定はされない）；ウラシルマスタード、クロロメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗物質（葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、およびアデノシンデアミナーゼインヒビターを含むがこれらに限定はされない）：メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン；自然界に存在している生成物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（Ｔａｘｏｌ（登録商標））として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコ−ホルマイシン、マイトマイシン−ｃ、ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（好ましくは、ＩＦＮ−α）、エトポシド、およびテニポシド。他の増殖性細胞傷害性物質は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォサミド、およびドロロキサフィンである。
【００６４】
微小管に影響を及ぼす物質は、細胞の有糸分裂を妨害し、そしてそれらは細胞傷害活性について当該分野でよく知られている。本発明に有用な微小管に影響を及ぼす物質としては、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＥＣ３３４１０）、ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、マイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、ＮＳＣ１２５９７３）、タキソール（登録商標）誘導体（例えば、誘導体（例えば、ＮＳＣ６０８８３２）、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステイン（ＮＳＣ８３２６５）、硫酸ビンブラスチン（ＮＳＣ４９８４２）、硫酸ビンクリスチン（ＮＳＣ６７５７４）、自然界に存在しているエポチロンおよび合成のエポチロン（エポチロンＡ、エポチロンＢ、およびジスコデルモライドを含むがこれらに限定はされない）（Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：２００９を参照）、エストラムチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４などが挙げられるがこれらに限定はされない。このような物質の例はまた、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１０：３０５５−３０６４；Ｐａｎｄａ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０５６０−１０５６４；Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３３４４−３３４６；Ｎｉｃｏｌａｏｕ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：２６８−２７２；Ｖａｓｑｕｅｚ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：９７３−９８５；およびＰａｎｄａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９８０７−２９８１２にも記載されている。
【００６５】
エピドフィロトキシンのような細胞傷害性物質；抗新生物性の酵素；トポイソメラーゼインヒビター；プロカルバジン；ミトキサントロン；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金配位錯体；生物学的応答修飾因子；増殖インヒビター；抗ホルモン治療薬；ロイコボリン；テガフール；および造血性成長因子もまた適している。
【００６６】
使用することができる細胞増殖抑制剤としては、ホルモンおよびステロイド（合成のアナログを含む）が挙げられるがこれらに限定はされない：１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニソン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニソロン、メチル−テストステロン、プレドニソロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン（ｈｌｏｒｏｔｒｉａｎｉｓｅｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００６７】
他の細胞増殖抑制剤は、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターのような抗血管形成剤、および抗ＶＥＧＦ抗体のような他のＶＥＧＦインヒビターであり、そして、ＺＤ６４７４およびＳＵ６６６８のような低分子もまた含まれる。Ｇｅｎｅｔｅｃｈによる抗Ｈｅｒ２抗体もまた利用することができる。適切なＥＧＦＲインヒビターはＥＫＢ−５６９（不可逆的インヒビター）である。ＥＧＦＲに免疫特異的なＩｍｃｌｏｎｅ抗体Ｃ２２５、およびｓｒｃインヒビターもまた含まれる。
【００６８】
カソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））（ビカルタミド、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）もまた細胞増殖抑制剤としての使用に適している。これは、アンドロゲン依存性のガン腫を非増殖性にする。細胞増殖抑制剤のさらに別の例は抗エストロゲンであるタモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（登録商標））であり、これは、エストロゲン依存性の乳ガンの増殖または成長を阻害する。細胞増殖シグナルの伝達のインヒビターは、細胞増殖抑制剤である。代表的な例としては、上皮成長因子インヒビター、Ｈｅｒ−２インヒビター、ＭＥＫ−１キナーゼインヒビター、ＭＡＰＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３インヒビター、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、およびＰＤＧＦインヒビターが挙げられる。
【００６９】
（ｂ．ＴＮＦポリペプチド）
ＴＮＦポリペプチドは、リガンドのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり得る。ＴＮＦポリペプチドの代表的な例としては、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、ＦａｓＬ／ＣＤ９５、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ−β／ＬＴ−α、ＬＴ−β、およびＴＲＡＩＬが挙げられるがこれらに限定はされない。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、免疫系の維持および機能に関係しており、そしてアポトーシスを誘発することができる、自然界に存在しているタンパク質である。ＴＮＦポリペプチドはＴＲＡＩＬである場合もあり、これは、主に腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、正常な細胞では誘導しない。
【００７０】
これらのいわゆる「死リガンド」の活性は、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーとの結合によって媒介されると考えられている。ＴＮＦ受容体ファミリーには、それらの細胞内部分に構造が類似している死ドメインが含まれる。個々の死リガンドに特異的なこれらの受容体の連結によって、カスパーゼの活性化を生じる事象のカスケードの活性化が誘発される。ＴＮＦポリペプチドによって結合されるＴＮＦ−Ｒ受容体の代表的な例としては、ＬＮＧＦＲ／ｐ７５、ＣＤ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ／ＩＬＡ、ＴＮＦＲＩ／ｐ５５／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＩＩ／ｐ７５／ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０／ＡＣＴ３５、ＣＤ２７、Ｆａｓ／ＣＤ９５／ＡＰＯ−１、ＣＤ３０／Ｋｉ−１、ＬＴ−βＲ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１／ＴＲＩＤ、ＴＲ２、ＧＩＴＲ、およびオステオプロテゲリンが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００７１】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの特有の能力の理由から、ＴＮＦファミリーのメンバーは抗ガン剤である可能性があると考えられる。しかし、多くの腫瘍細胞は死リガンドのプロアポトーシス作用を回避し、それによって死リガンド感受性であるガンに対するこれらの物質の使用を減少させ、腫瘍が宿主免疫応答を回避できる。ＮＦ−κＢのインヒビターの使用は、死リガンド（例えば、ＴＮＦポリペプチド）の死滅に対して腫瘍細胞を感作させるために使用することができる。
【００７２】
他の物質をＴＮＦポリペプチドの代わりに使用できることもまた想定される。例えば、ＴＮＦポリペプチドの活性を模倣する抗体を使用することができる。このような抗体の代表的な例としては、ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ受容体、またはＴＮＦＲに対するアゴニスト抗体が挙げられるがこれらに限定はされない。加えて、アプタマーおよび対応するレセプターを活性化することができる他の合成のリガンドが使用される場合もある。
【００７３】
（ｃ．塩）
組成物の有効成分は、種々の薬学的に許容される塩の形態で有用であり得る。用語「薬学的に許容される塩」は、薬剤師に明らかである塩の形態、すなわち、実質的に非毒性であり、所望される薬物動態特性、おいしさ、吸収、分布、代謝、または排せつの特性を提供するものを意味する。より実際的には、選択においてもまた重要である他の要因は、原材料費、結晶化の容易さ、収量、安定性、吸湿性、および得られるバルクの薬物の流動性である。好都合なことに、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて有効成分から、またはそれらの薬学的に許容される塩から調製され得る。
【００７４】
有効成分の薬学的に許容される塩としては、塩酸、ヒドロキシメタンスルホン酸、臭化水素、メタンスルホン酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファミン酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、パモン酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセトン酸（ｉｓｅｔｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような様々な有機酸および無機酸を用いて形成された塩が挙げられるがこれらに限定はされず、そして、種々の他の薬学的に許容される塩（例えば、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩など）が含まれる。四級アンモニウムイオンのような陽イオンは、陰イオン性部分についての薬学的に許容される対イオンとして想定される。加えて、本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウム、およびリチウムのようなアルカリ金属；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属；ジシクロヘキシルアミン、トリブチルアミン、およびピリジンのような有機塩基；ならびにアルギニン、リジンなどのアミノ酸を用いて形成され得る。
【００７５】
薬学的に許容される塩は、通常の化学的な方法によって合成することができる。一般的には、塩は、遊離の塩基または酸を、化学量論的な量または過剰な、所望される塩を形成する、無機もしくは有機の酸または塩基と、適切な溶媒または溶媒混合物中で反応させることによって調製される。
【００７６】
一般的には、塩の対イオンは、化合物を合成するのに使用される反応物質によって決定することができる。反応物質に応じた、塩の対イオンの混合物が存在する場合がある。例えば、ＮａＩが反応を促進させるために添加される場合は、対イオンは、ＣｌとＩとの対アニオンの混合物であり得る。さらに、プレパラティブＨＰＬＣによって、酢酸が溶媒の中に存在する場合には、元々の対イオンが、酢酸陰イオンによって交換されることになる場合もある。塩の対イオンは、様々な対イオンに交換することができる。対イオンは好ましくは、上記に記載される塩を形成するように、薬学的に許容される対イオンに交換される。対イオンを交換するための手順は、ＷＯ２００２／０４２２６５、ＷＯ２００２／０４２２７６、およびＳ．Ｄ．Ｃｌａｓ，「Ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅｄ  Ｃｏｌｅｓｔｉｐｏｌ，ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ａｂｓｏｒｂｅｎｔ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８０（２）：１２８−１３１（１９９１）（その内容は引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。明確にするという理由のために、対イオンは、本明細書中の化学構造に示すことはできない。
【００７７】
（ｄ．処方物）
組成物にはさらに、１つ以上の薬学的に許容される別の成分（単数または複数）（例えば、ミョウバン、安定剤、抗微生物剤、緩衝液、着色剤、香味剤、アジュバントなど）が含まれる場合がある。
【００７８】
組成物は、通常の様式で処方された錠剤またはトローチ剤の形態である場合もある。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセル剤には、一般的な賦形剤が含まれる場合がある。賦形剤としては、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、および湿潤剤が挙げられるがこれらに限定はされない。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液、およびポリビニルピロリドンが挙げられるがこれらに限定はされない。増量剤としては、乳糖、糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが挙げられるがこれらに限定はされない。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられるがこれらに限定はされない。崩壊剤としては、ジャガイモデンプン、およびグリコール酸ナトリウムデンプンが挙げられるがこれらに限定はされない。湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定はされない。錠剤は、当該分野で周知の方法にしたがってコーティングすることができる。
【００７９】
組成物はまた、液体処方物である場合もある。これには、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれるがこれらに限定はされない。組成物はまた、使用前に水または他の適切な媒体で構成するための乾燥生成物として処方される場合もある。このような液体調製物には、添加剤が含まれる場合がある。添加剤としては、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体、および保存剤が挙げられるがこれらに限定はされない。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化食用脂が挙げられるがこれらに限定はされない。乳化剤としては、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアカシアが挙げられるがこれらに限定はされない。非水性媒体としては、食用油脂、アーモンド油、ヤシ油、油性のエステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが挙げられるがこれらに限定はされない。保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、およびソルビン酸が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００８０】
組成物はまた、坐剤として処方することもできる。これには、ココアバターまたはグリセリドを含むがこれらに限定はされない坐剤基剤が含まれ得る。組成物はまた、吸入用に処方される場合もある。これは、液剤、懸濁液、または乳濁液を含むがこれらに限定されない形態であり得、乾燥粉末として、あるいは、高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタン）を使用してエアゾールの形態で投与される場合がある。組成物はまた、クリーム剤、軟膏、ローション、ペースト、薬の入った湿布薬、パッチ、または膜を含むがこれらに限定はされない、水性または非水性の媒体を含む、処方された経皮用処方物である場合もある。
【００８１】
組成物はまた、注射または点滴を含むがこれらに限定されない方法による、非経口投与用に処方される場合もある。注射用の処方物は、油性または水性の媒体中の懸濁液、液剤、または乳濁液の形態であり得、そして懸濁剤、安定剤、および分散剤を含むがこれらに限定はされない処方剤が含まれる場合がある。組成物はまた、滅菌の発熱物質を含まない水を含むがこれに限定はされない適切な媒体での再構成用の粉末形態で提供される場合もある。
【００８２】
組成物はまた、デポー製剤として処方される場合もある。これは、移植によって、または筋肉内注射によって投与することができる。組成物は、適切な高分子物質または疎水性物質（例えば、許容される油の中の乳濁液として）、イオン交換樹脂とともに、あるいは、難溶性誘導体として（例えば、難溶性の塩として）処方される場合もある。
【００８３】
組成物はまた、リポソーム調製物として処方される場合もある。リポソーム調製物には、目的の細胞または角質層に浸潤して細胞膜と融合し、それによってリポソーム内容物の細胞内への送達を生じるリポソームを含めることができる。例えば、米国特許第５，０７７，２１１号、米国特許第４，６２１，０２３号、または米国特許第４，５０８，７０３号（これらは引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているリポソームのようなリポソームを使用することができる。皮膚の状態を標的化するように意図された組成物は、酸化によるダメージを引き起こすＵＶまたは複数の物質に対する哺乳動物の皮膚の露出前、露出の間、または露出後に投与することができる。他の適切な処方物は、ニオゾーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）を使用することができる。ニオゾームは、大部分が非イオン性脂質から構成される膜を有している、リポソームと類似している脂質小胞であり、そのいくつかの形態は角質層を通過して化合物を輸送するために有効である。
【００８４】
（５．処置）
組成物は、アミノアクリジンをそれを必要としている患者に投与することにより、インビボでＮＦ−κＢ活性に関連する状態を処置するために使用され得る。ＮＦ−κＢ活性は、任意のレベルであり得、その低下によって状態の処置が導かれる。ＮＦ−κＢ活性はまた基底レベルである場合もある。ＮＦ−κＢ活性はまた、構成的なレベルである場合もある。ＮＦ−κＢ活性はまた、誘導された構成的なレベルである場合もある。
【００８５】
ＮＦ−κＢ活性に関連する状態はガンである場合もある。以下を含むがそれらに限定はされない種々のガンが処置され得る：膀胱ガン（加速された膀胱ガンおよび転移性膀胱ガン）、乳ガン、結腸ガン（結腸直腸ガンを含む）、腎臓ガン、肝臓ガン、肺ガン（小細胞性肺ガンおよび非小細胞性肺ガン、ならびに肺腺ガンを含む）、卵巣ガン、前立腺ガン、睾丸ガン、尿生殖路ガン、リンパ系のガン、直腸ガン、咽頭ガン、膵臓ガン（外分泌性膵臓ガンを含む）、食道ガン、胃ガン、胆嚢ガン、頸ガン、甲状腺ガン、腎ガン、および皮膚ガン（扁平上皮細胞ガンを含む）；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血系腫瘍；急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血系腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢神経系および抹消神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉種を含む間葉に由来する腫瘍；ならびに、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌、腎細胞ガン（ＲＣＣ）、膵臓ガン、骨髄腫、骨髄性白血病およびリンパ芽球性白血病、神経芽細胞腫、および膠芽細胞腫を含む他の腫瘍。
【００８６】
成人のＴリンパ芽球性白血病（ＡＴＬ）の原因因子であるＨＴＬＶのｔａｘによって誘導されるトランスフォーメーションは、ＲＣＣに関係しているものと同じ分子標的を共有し得る。例えば、ＮＦ−κＢは、ｔａｘでトランスフォーメーションされた細胞において構成的に活性である。ＲＣＣと同様に、ｐ５３活性は、ｔａｘでトランスフォーメーションされた細胞においてはＮＦ−κＢの活性化を通じて阻害され、そしてｐ５３の阻害には、ｐ３００の隔離は含まれない。Ｐ５３の不活化についての共通の機構に基づくと、組成物はまた、ＨＴＬＶによって誘導される白血病を処置するために使用することもできる。それらのｐ５３状態にはかかわらず、ヒトのガンの大半は、構成的に過剰に活性化されたＮＦ−κＢを有している。組成物はまた、トランス活性化ＮＦ−κＢ複合体を転写抑制複合体に再プログラミングすることによってＮＦ−κＢを阻害することもできる。これはまた、それらのｐ５３状態とは無関係に、任意の腫瘍の処置にも使用することができる。組成物はまた、ＨＩＶ  ＬＴＲがＮＦ−κＢ活性に強く依存しているので、ＨＩＶ感染を処置するために使用することもできる。
【００８７】
組成物はまた、構成的なＮＦ−κＢ活性化によって引き起こされ得る抗ガン剤耐性を克服するためのアジュバント療法に使用される場合もある。抗ガン剤は本明細書中に記載される化学療法剤であり得る。
【００８８】
（ａ．投与）
組成物は、化学療法および放射線治療のような他の抗ガン治療と同時に、またはそれと一緒に一定の間隔で（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）投与することができる。用語「同時」または「同時に」は、本明細書中で使用される場合は、他の抗ガン治療および組成物が、互いに４８時間、２４時間、１２時間、６時間、３時間またはそれ未満の間に投与されることを意味する。用語「一定の間隔で」は、本明細書中で使用される場合は、化学療法とは別のタイミングでの、そして反復投与および／または化学療法の投薬計画に対して一定の頻度での組成物の投与を意味する。
【００８９】
組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、粘膜を介して、局所、吸入によって、口腔投与によって、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の形式で投与することができる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、および関節内が挙げられるがこれらに限定はされない。組成物はまた、組成物を徐放することができ、さらに、ゆっくりに制御された静脈内注入が可能であるインプラントの形態で投与される場合もある。
【００９０】
（ｂ．投与量）
治療での使用に必要な薬剤の治療有効量は、処置される状態の性質、活性が所望される時間、ならびに、患者の年齢および状態に応じて変化し、最終的にはかかりつけの医師によって決定される。所望される用量は、好都合には、単回投与で、または例えば、１日に１回、２回、３回、４回、またはそれ以上に分けられた用量として適切な間隔で投与される複数回投与として投与され得る。複数回投与が多くの場合に所望、または必要とされる。
【００９１】
他の治療薬と組み合わせて投与される場合には、組成物は、比較的少ない投与量で投与され得る。加えて、標的化剤の使用によって必要な投与量を比較的少なくすることができる。特定の組成物は、低い毒性、高いクリアランス、第３アミンの遅い切断速度を含むがこれに限定されない要因が原因で、比較的多い投与量で投与される場合がある。結果として、組成物の投与量は、約１ｎｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または約１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでであり得る。組成物の投与量としては、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇが挙げられるがこれらに限定はされない任意の投与量であり得る。
【００９２】
（６．診断方法）
組成物はまた、患者の腫瘍を組成物によって処置することができるかどうかを診断するために使用することもできる。腫瘍の試料は患者から得ることができる。腫瘍の細胞には、その後、ｐ５３レポーターシステム（例えば、ｐ５３応答性ｌａｃＺレポーター）が形質導入され得る。形質導入された細胞は、その後、組成物とともにインキュベートされる。対照を上回る、ｐ５３によって媒介されるシグナルの生産は、腫瘍を組成物で処置できることを示す。
【００９３】
（７．スクリーニング方法）
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を調節する物質を同定する方法にも関する。ＮＦ−κＢ活性を調節する物質は、ＮＦ−κＢ活性の調節因子の候補を細胞をベースとするＮＦ−κＢによって活性化される発現システムに対して加えることを含む方法によって同定することができる。ここでは、ＮＦ−κＢ活性の調節因子は、ＮＦ−κＢによって活性化された発現のレベルを変化させる能力によって同定される。ＮＦ−κＢ活性を調節する物質はまた、ＮＦ−κＢ活性の調節因子の候補を、細胞をベースとするｐ５３によって活性化される発現システムに対して加えることを含む方法によっても同定することができる。ここでは、ＮＦ−κＢ活性の調節因子は、ｐ５３によって活性化させられる発現のレベルを変化させる能力によって同定される。ＮＦ−κＢ活性を調節する物質はまた、ＮＦ−κＢまたはｐ５３によって活性化される発現システムに対して、アミノアクリジンとＮＦ−κＢ活性の調節因子の候補を添加すること、ＮＦ−κＢまたはｐ５３によって活性化された発現のレベルを対照と比較することを含む方法によって同定することもできる。ここでは、ＮＦ−κＢ活性の調節因子は、ＮＦ−κＢまたはｐ５３によって活性化される発現システムのレベルを対照と比較して変化させる能力によって同定される。
【００９４】
細胞には、機能的にサイレントなｐ５３が含まれる場合がある。細胞には、また、ＮＦ−κＢトランス活性化複合体も含まれる場合がある。ｐ５３によって活性化される発現システムは、腎ガン細胞株である場合がある。細胞株は、肉腫細胞株である場合もある。細胞株はまた、増幅されたｍｄｍ２を有している細胞株である場合もある。細胞株はまた、ＨＰＶ−Ｅ６を発現する細胞株である場合も、また、ＨＰＶ−Ｅ６を発現することが可能な細胞株である場合もある。
【００９５】
候補の物質は、ライブラリー（すなわち、化合物のコレクション）の中に存在する場合がある。このような物質は、例えば、発現ライブラリーの中のＤＮＡ分子によってコードされる場合もある。候補の物質は、馴化培地中、または細胞抽出物中に存在する。他のこのような物質としては、１０５ダルトン未満、好ましくは、１０４ダルトン未満、そしてなおさらに好ましくは、１０３ダルトン未満の分子量を有している「低分子」として当該分野で公知である化合物が挙げられる。このような候補の物質は、複数の予め決定された化学反応にしたがって調製された複数の合成の物質（例えば、ペプチド）を含む組み合わせライブラリーのメンバーとして提供される場合もある。多様な種類のこのようなライブラリーは確立されている手順にしたがって調製することができ、そして候補の物質のライブラリーのメンバーを本明細書中に記載されているように同時にまたは連続してスクリーニングできることは、当業者に明らかであろう。
【００９６】
スクリーニング方法は、インビトロアッセイ、細胞をベースとするアッセイ、およびインビボアッセイを含む種々の形式で行うことができる。任意の細胞を、細胞をベースとするアッセイとともに使用することができる。好ましくは、本発明と共に使用される細胞としては哺乳動物細胞が挙げられ、さらに好ましくは、ヒト細胞、およびヒト以外の霊長類の細胞が挙げられる。細胞をベースとするスクリーニングは、ＮＦ−κＢおよび／またはｐ５３の活性化についての代理マーカーを発現する遺伝子修飾された腫瘍細胞を使用して行うことができる。このようなマーカーとしては、細菌のβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および機能強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が挙げられるがこれらに限定はされない。代理マーカーの発現量は、比色分析、発光分析、および蛍光分析を含むがこれらに限定されない当該分野で標準的である技術を使用して測定することができる。細胞をベースとするアッセイにおいて使用することができる細胞の代表的な例としては、腎細胞ガン細胞が挙げられるがこれに限定はされない。
【００９７】
予想される調節因子が、例えば混合によって細胞に添加される条件は、アポトーシスまたはシグナル伝達を妨害する他の調節性の化合物が原則としては存在しない場合に細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を受けることができる条件である。効果的な条件には、細胞増殖を可能にする適切な培地、温度、ｐＨ、および酸素条件が含まれるがこれらに限定はされない。適切な培地は、通常、増殖因子および吸収できる炭素、窒素、およびリン酸塩の供給源、さらには適切な塩、無機化合物、金属、および他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む固体または液体の培地である。これには、細胞を培養することができ、その結果、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を示すことができる有効な培地が含まれる。例えば、哺乳動物細胞については、培地としては、１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を挙げることができる。
【００９８】
細胞は、組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿を含むがこれらに限定はされない様々な容器の中で培養することができる。培養は、細胞に適切な温度、ｐＨ、および二酸化炭素含有量で行われる。このような培養条件はまた、当業者の範囲内である。
【００９９】
予想される調節因子を細胞に対して添加するための方法としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞による発現（すなわち、裸の核酸分子、組み換え体ウイルス、レトロウイルス発現ベクター、およびアデノウイルスの発現を含む発現システムを使用する）、イオン対合剤（ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の使用、および細胞透過のための界面活性剤の使用が挙げられるがこれらに限定はされない。
【０１００】
本発明には、以下の限定ではない実施例によって説明される複数の態様がある。
【実施例】
【０１０１】
（材料および方法）
（細胞）
使用した腎細胞ガン細胞株、ＲＣＣ４５、ＲＣＣ５４、およびＡＣＨＮは、Ｇｕｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，１９５１−１９５８に記載されている。Ｈ１２９９、ＨＴ１０８０、ＭＣＦ７、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＨＣＴ１１６、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｗ１３８細胞は、ＡＴＣＣから入手した。正常な腎臓上皮細胞（ＮＫＥ）の初代培養物は、Ｊ．Ｄｉｄｏｎａｔｏ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＯＨ）から提供された。リー−フラウメニ癌症候群の患者に由来する０４１線維芽細胞株は、Ｇ．Ｓｔａｒｋから提供された。Ｍｅｌ７およびＭｅｌ２９細胞は、Ｋｉｃｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
２２，４９１１−４９１７に記載されている黒色腫細胞株である。全ての細胞を、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、５５ｎＭのβ−メルカプトエタノールと、抗生物質を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地の中で維持した。
【０１０２】
ｐ５３応答性β−ガラクトシダーゼを有しているレポーター細胞株は、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，１９５１−１９５８に記載されているものであった。ｐ５３応答性ルシフェラーゼを有しているレポーター細胞株は、ｐ２１−ＣｏｎＡＬｕｃプラスミドのトランスフェクションと、その後のＧ４１８での選択によって作成した。ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼを有しているレポーター細胞株は、ｐＮＦ−κＢＬｕｃとｐＥＧＦＰ−ｍｉｔｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドの同時トランスフェクションと、その後のＧ４１８（ｐＥＧＦＰ−ｍｉｔｏプラスミドによって提供されるマーカー）についての選択によって得た。ｍｙｃ、またはＣｌｏｃｋ／Ｂｍａｌ応答性レポーターを有しているレポーター細胞株は、Ｃ．Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ａｎｔｏｃｈ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＯＨ）から好意によって提供された。
【０１０３】
ｐ５３の発現が阻害されている細胞は、ｓｉＲＮＡの発現のためのｐＢａｂｅＨ１−ｓｉｐ５３またはｐＢａｂｅＨ１−ｓｉＧＦＰベクターのレトロウイルス形質導入と、その後のピューロマイシンについての選択によって作成した。
【０１０４】
（プラスミド）
ｐ５３、Ａｒｆ発現ベクター、ｐＢａｂｅＨ１−ｓｉＨｄｍ２、ｐ２１−ＣｏｎＡＬｕｃレポータープラスミドは、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ  ６４，１９５１−１９５８に記載されている。ｐＮＦ−κＢＬｕｃプラスミドは、Ｎ．Ｎｅｚｎａｎｏｖ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｒｅｆ．５９）によって提供された。ｐｓｓ−ＩκＢを発現するｐＣＤＮＡ３ベクターは、Ｉ．Ｂｕｄｕｎｏｖａ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供された。ｓｉＲＮＡの発現のためのｐＢａｂｅＨ１−ｓｉｐ５３およびｐＢａｂｅＨ１−ｓｉＧＦＰベクターは、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ  ６４，１９５１−１９５８に記載されているｐＢａｂｅＨ１−ｓｉＨＤＭ２ベクターと同様に、ｓｉＲＮＡの発現のためのＨ１プロモーターと６４オリゴヌクレオチドループ鋳型を、ｐＢａｂｅＨ１−ｐｕｒｏベクターの左のＬＴＲに挿入することによって作成した。ｐ５３およびＧＦＰに対するｓｉＲＮＡの配列は、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，５５０−５５３に記載されている。ｐ５３またはＧＦＰの発現のためのレンチウイルスプラスミドは、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，１９５１−１９５８に記載されている。
【０１０５】
（化学物質）
３４，０００種類の化合物のＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーは、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，Ｉｎｃ．から入手した。３０ｄ９および９ＡＡの周辺の集中的ライブラリーは、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，Ｉｎｃ．から提供された。全ての他の化合物はＳｉｇｍａより入手した。
【０１０６】
（レトロウイルスおよびレンチウイルスの形質導入）
６０ｍｍのプレートにプレートしたパッケージング細胞（ＣｌｏｎｔｅｃｈによるＡ２９３）を、製造業者による推奨にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２μｇのレトロウイルスベクターＤＮＡでトランスフェクトした。培地を８時間後に交換した。８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ））を補充したウイルスを含む培地を、トランスフェクションの２４時間後および４８時間後に回収し、そして感染のために使用した。ウイルスが形質導入された細胞を、感染していない細胞を完全に死滅させることができる適切な選択物質（ベクターに応じて、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはピューロマイシン）に対する耐性について選択した。
【０１０７】
ｐ５３またはＥＧＦＰ（対照ベクター）を有している組み換え体レンチウイルスのストックを、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して水疱性口内炎ウイルスのウイルス構造タンパク質とＧタンパク質をコードするパッケージングプラスミドとともにｐＬＶ−ＣＭＶ−ｐ５３およびｐＬＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞株を使用して調製した。２９３Ｔ細胞によるウイルスを含む培地を４８時間後に回収し、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で標的細胞に移し、そしてウイルスを超遠心分離によって５０〜１００倍に濃縮した。ウイルス力価（通常は、１０８ＩＵ／ｍｌ）を、Ｒａｔ  １ａ細胞（ｐ５３の異所性発現に対して耐性であることが知られている）の感染、その後のピューロマイシンに対する選択およびコロニーのカウントによって決定した。
【０１０８】
（化合物のライブラリーのスクリーニング）
２×１０４個のＲＣＣ４５ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞を、標準的な添加剤を含む２００μＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地中の９６ウェルプレートのウェルにプレートした。一晩のインキュベーションの後、対照とともに、ＤＭＳＯ溶液中の化合物のライブラリーを、プラスチック製の細菌増殖装置（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ）（２００＋／−１００ｎＬ）の助けを借りて添加した。化合物の最終濃度はおよそ５μｇ／ｍｌであった。ネガティブ対照はＤＭＳＯとし、ポジティブ対照はドキソルビシン溶液（０．２、０．６、および２μＭ）とした。２４時間後、ＯＮＰＧを含む溶解緩衝液を、氷上の培地に直接添加した。３７℃で３時間のインキュベーションの後、β−ガラクトシダーゼ活性を、λ＝４３０ｍｍでのＷａｌｌａｃｋ  １４２０プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の吸光度の読取値から概算した。ドキソルビシンの最も有効な濃度よりも強いＯＮＰＧ反応を誘導した全ての化合物を、最初のヒットと考えた。
【０１０９】
（レポーターアッセイ）
同時トランスフェクションの準備のために、２×１０５個の細胞を６ウェルプレートにプレートし、そして一晩のインキュベーションの後、種々の濃度のｐ５３、Ａｒｆ、Ｓｓ−ＩκＢ、またはｓｉＨＤＭ２を発現するプラスミドと組み合わせた０．５μｇのレポータープラスミド（ｐ２１−ＣｏｎＡＬｕｃまたはｐＮＦ−κＢＬｕｃ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。対応する空のベクターを、２μｇまでの量の全ＤＮＡで、全てのトランスフェクションに加えた。トランスフェクション効率の正規化を０．２μｇのｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドを添加することによって行った。ルシフェラーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはβ−ガラクトシダーゼ酵素システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）でのトランスフェクションの４８時間後に調製した溶解物中で測定した。発光反応と比色反応を、Ｗａｌｌａｃｋ  １４２０プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。組み込まれたレポーターの準備。レポーターが組み込まれている２×１０４個の細胞を９６ウェルプレートにプレートした。一晩のインキュベーションの後、化合物またはレンチウイルスを生産する細胞からの培地を添加した。様々なタイミングで細胞溶解物を、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して調製した。ルシフェラーゼ活性またはβ−ガラクトシダーゼ活性、およびタンパク質濃度を、標準的なキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を使用して細胞溶解物のアリコートの中で測定した。
【０１１０】
（細胞生存率のアッセイ）
５×１０３個の細胞を６ウェルプレートにプレートし、様々な濃度の薬物で２４時間処理した。その後、薬物を含まない新しい培地を添加した。コロニーの数を、５〜６日間のインキュベーション後に概算した。細胞の生存率は、未処理の対照と比較した、処理した細胞のメチレンブルー染色の強度の割合として概算した（染色したコロニーからメチレンブルーを０．１％のＳＤＳによって抽出し、そして分光光度計で定量した）。
【０１１１】
（細胞周期の分析）
１０６個の細胞を１００ｍｍのプレートにプレートし、そして一晩のインキュベーションの後、種々の濃度の９ＡＡまたはドキソルビシンを添加した。インキュベーション時間の終了後、細胞を回収し、固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。ＤＮＡ含有量をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０１１２】
（ウェスタンブロット分析）
細胞を、１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）、および１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で溶解させた。タンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄ  Ｄｃタンパク質アッセイキットを用いて決定した。等量のタンパク質を４〜２０％の勾配のプレキャストゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で泳動させ、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットした。以下の抗体を使用した：抗ｐ５３モノクローナルマウスＤＯ１（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、抗ｐ２１モノクローナルマウスＦ−５（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、抗ｍｄｍ２モノクローナルマウスＳＭＰ１４（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）。ｐ５３のリン酸化状態を、製造業者による推奨にしたがって、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇによるホスホ−ｐ５３サンプラーキット、抗ｐ６５（Ｃ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ホスホ−ｐ６５（ｓｅｒ５３６，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＩκＢａ（Ｃ２１，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ｐ５０（ＮＬＳ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用して分析した。ＨＲＰ結合二次抗体はＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚから購入した。データの定量はＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して行った。
【０１１３】
（免疫蛍光の免疫染色）
チャンバースライドの中の細胞をＰＢＳで洗浄し、そこで室温の１０％のリン酸緩衝化ホルマリン、−２０℃の１００％のメタノール、および−２０℃のアセトンで固定した。その後、スライドをＰＢＳ中の３％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の溶液中で１時間ブロックした。抗ｐ６５抗体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）を、ブロッキング溶液中で１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。二次抗ウサギＣｙ２結合抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用した。全ての洗浄は、ブロッキング溶液を用いて行った。
【０１１４】
（ＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ活性のアッセイ）
ＨＴ１０８０細胞を、０．０２から０．０４ｍＣｉ／ｍＬの［１４Ｃ］チミジン、比活性５３ｍＣｉ／ｍｍｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で２４時間標識した。標識したＨＴ１０８０細胞を、種々の濃度のエトポシド（ＶＰ−１６）、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、または９−アミノアクリジンで１時間処理した。トポＩＩによって媒介されるＤＮＡの切断の誘導を、ＳＤＳ−ＫＣｌ技術の改良を使用してタンパク質ＤＮＡ複合体の沈殿を測定することによって決定した。
【０１１５】
（プロテアソーム阻害アッセイ）
プロテアソームアッセイキットは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．から購入し、製造業者による推奨にしたがって使用した。
【０１１６】
（電気泳動の移動度のアッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物は、Ｃｈｅｒｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２５０３−２５１０に記載されているように調製した。ＮＦ−κＢ結合部位に相当するアニーリングしたオリゴヌクレオチド（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）を、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによって［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで、その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰで放射標識した。１０７ｃｐｍの標識したオリゴヌクレオチドを、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕａｎｔカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でアフィニティー精製した。放射標識したオリゴヌクレオチドを、非特異的結合を防ぐための１μｇのポリ−ｄＩｄＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに、１０μｇのタンパク質核抽出物に対して添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。スーパーシフトのために、２００ｎｇの抗ｐ６５抗体、抗ｐ５０抗体、または抗−抗体を反応に添加した（全ての抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚによる）。３０分間のインキュベーションの後、反応混合物の全てを０．５×ＴＢＥ緩衝液中の４％のポリアクリルアミドゲルにロードし、２００Ｖで２時間泳動した。乾燥させたゲルをＸ線フィルムに対して３０分から１時間露光させた。
【０１１７】
（動物実験）
５〜６週齢の雄のＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓ無胸腺ヌードマウスをＨａｒｌａｎから購入した。５×１０６個の腫瘍細胞を１００μＬのＰＢＳの中でマウスの脇腹に接種した。腫瘍が５ｍｍの直径に達した時点で、薬物の腹腔内注射を、ＰＢＳ中の５０％のＤＭＳＯの１００μｌの溶液の中で開始した（ＰＢＳに溶解させたキナクリンを除く）。媒体として、ＰＢＳ中の５０％のＤＭＳＯを使用した。腫瘍の大きさを一日おきに三次元で測定した。
【０１１８】
（実施例１）
（ＲＣＣ細胞をベースとする、ｐ５３活性化物質の単離のための読み出し）
ｐ５３のトランス活性化機能は、まだ知られていないインヒビターによってＲＣＣ細胞の中で阻害され、このことは、このタイプの腫瘍細胞、さらにはｐ５３と同様の阻害を有している他の腫瘍細胞を選択的に死滅させるためのアプローチとしての、薬物によって媒介されるｐ５３機能の回復を示唆している。ｐ５３の再活性化がＲＣＣ細胞に対して毒性であるかどうかを試験するために、本発明者らは、インヒビターを枯渇させる試みにおいて５種類のＲＣＣに由来する細胞株においてｐ５３を異所で発現させた。細胞に、組み込まれたｐ５３応答性レポーター（ＣｏｎＡＬａｃＺ）を補ってｐ５３の再活性化をモニタリングした。ｐ５３  ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを有しているレンチウイルスベクターを使用して形質導入した。ｐ５３欠損肺腺ガン細胞株Ｈ１２９９（これは野生型ｐ５３に対して反応性である）およびラットの繊維芽細胞様細胞株Ｒａｔ１（これは、ヒトｐ５３に対して耐性である）を対照として使用した。
【０１１９】
図１に示すように、ＲＣＣ中の休眠状態のｐ５３は再活性化させることができ、そしてこの再活性化によって腫瘍細胞の死が導かれた。特定の発現レベルから開始すると、ｐ５３は、同時に、細胞傷害性になり、そしてＲＣＣ４５細胞中のレポーターを誘導することにおいて活性となった（図１ａおよびｂ）。このことは、細胞（例えば、ＲＣＣ細胞）を、ｐ５３を再活性化させることができる物質のスクリーニングのための細胞をベースとするレポーターシステムにおいて使用できることを示している。このことはまた、腫瘍細胞（例えば、ＲＣＣ細胞）中でのｐ５３の再活性化が細胞傷害性であり得ることも示している。
【０１２０】
（実施例２）
（化合物のライブラリーのスクリーニングによるＲＣＣの中での強力なＰ５３活性化因子としてのアミノアクリジンの同定）
本発明者らは、ＲＣＣ特異的ｐ５３の抑制の機構を解明するためのツールとしてもまた使用することができる治療可能性を有している低分子を単離するために、ＲＣＣ中のｐ５３トランス活性化を回復することができる化合物の、細胞をベースとする直接のスクリーニングを行った。ＲＣＣ４５ＣｏｎＡＬａｃＺ細胞を、３４，０００種類の化合物の様々な化学的ライブラリーをスクリーニングするために使用した（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。β−ガラクトシダーゼ活性を、化合物とのインキュベーションの２４時間後に細胞溶解物中で測定した。１μＭのドキソルビシンよりも高いβ−ガラクトシダーゼ活性を誘導した２８種類の化合物を、最初のヒットと考えた（図２ａ）。最も活性のあった化合物（化合物３０ｄ９）は、ＲＣＣ４５細胞中のレポーターの２２倍の誘導を生じ、これは、ドキソルビシンよりも７倍強く作用した。化合物３０ｄ９の近くで構築した、４０種類の化合物からなる構造アナログのライブラリーを、同じ細胞をベースとするレポーターアッセイを使用してスクリーニングした。化合物１の式の２つの物質が活性であることが明らかになった。
【０１２１】
その後、化合物３０ｄ９の５９種類の誘導体のライブラリーをスクリーニングした。これには、抗ガン剤であるアムサクリン（ａｍｓａ）と抗マラリア薬であるキナクリンを含めた。試験した化合物のうちの１２種類が、ＲＣＣ４５細胞の中でｐ５３を再活性化させ、それらの活性はドキソルビシンと同等（例えば、ａｍｓａ）からドキソルビシンよりも７〜１０倍高い活性までの範囲であった。化合物３０ｄ９および９ＡＡが最も強かった（図２ｂ）。キナクリンは中程度のレベルの活性を示した。ＳＡＲ分析は、アミノアクリジンがｐ５３を再活性化させることができることを示していた。
【０１２２】
（実施例３）
（アミノアクリジンは種々の細胞型におけるｐ５３の強力な活性化因子である）
９ＡＡは、ＲＣＣ４５細胞中でのｐ５３レポーター遺伝子の誘導だけではなく、ｐ２１／Ｗａｆ１およびＨｄｍ２のタンパク質レベルの分析によって判断される内因性ｐ５３応答性遺伝子の誘導においても、ドキソルビシンよりもはるかに強かった（図３ａおよびｂ）。興味深いことに、ｐ５３経路が極めて活性であるＭＣＦ７細胞においては、９ＡＡの効果はドキソルビシンよりも弱かった（図３ａおよびｂ）。
【０１２３】
本発明者らは、野生型ｐ５３を有しているいくつかの他のレポーター細胞株中でのｐ５３のトランス活性化に対する９ＡＡの効果を試験した。試験した細胞の大部分において、９ＡＡは、ドキソルビシンまたは使用した他のＤＮＡを損傷させる薬物よりもはるかに強いレポーター活性を刺激し（図３ｃおよびデータは示さない）、このことは、共通の機構が種々の腫瘍細胞型における活性なｐ５３のネガティブな制御に関係していることを示唆している。９ＡＡによるｐ５３の最も強い誘導は、多くのアッセイにおいてＲＣＣ細胞株と並行して使用したヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞において観察された。９ＡＡの効果はｐ５３依存性であった。なぜなら、レポーター活性の刺激は、ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞またはｓｉＲＮＡによってｐ５３発現が阻害されている細胞においては検出されなかったからである（図３ｃおよびｄ）。
【０１２４】
９ＡＡは、１μＭのような低い濃度でｐ５３を活性化させた（図３ｅ）。活性化の速度はＤＮＡを損傷させる刺激と比較すると異常に遅い。９ＡＡによって誘導されるｐ５３依存性トランス活性化は１２時間でわずかに検出できるようになり、そして、処理のおよそ３６時間後に最大に達した（図３ｆ）。９ＡＡとの１時間のインキュベーションが、数時間後に検出可能なｐ５３の活性化を開始させるには十分であった（図３ｆ）。
【０１２５】
（実施例４）
（アミノアクリジンは野生型ｐ５３を有している腫瘍に対しては毒性がある）
ｐ５３の活性化がｐ５３依存性細胞傷害性に形を変えるかどうかを試験するために、本発明者らは、ｐ５３の状態が異なる細胞の生存率に対する９ＡＡの効果を比較した。この目的のために、本発明者らは、抗ｐ５３を発現する構築物または対照であるｓｉＲＮＡを発現する構築物のいずれかを発現する同系の対である細胞株のシリーズを作成した。ｓｉＲＮＡによるｐ５３のダウンレギュレーションの程度を、ウェスタン免疫ブロッティングによって試験した。試験した全ての細胞変異体に対して９ＡＡが毒性を有していることが明らかになった。しかし、これはｐ５３の発現が低下している細胞に対しては毒性が低く、ＨＴ１０８０細胞においては極大差が観察された（図４ａおよびｂ）。
【０１２６】
用量に応じて、９ＡＡは、ｐ５３依存性の増殖の停止（３μＭ）またはアポトーシス（２０μＭ、図４ｃ）を生じた。低用量の９ＡＡは、さらに長い時間のインキュベーション（４８時間まで）の後でもなおアポトーシスを生じることはなく、一方、高用量のこの化合物によって、先に増殖が停止されることなくアポトーシスが誘導された。おそらくはＧ１チェックポイントの制御の欠損が原因で対照細胞よりもｐ５３が欠損している細胞の周期の中での細胞の分布の変化がより強く生じたドキソルビシンとは反対に、細胞周期の分布におけるごくわずかな変化が９ＡＡで処理したｐ５３欠損細胞において観察された（図４ｃ）。
【０１２７】
興味深いことに、ＤＮＡの損傷を生じる機構を通じて作用する化学療法剤（例えば、カンプトテシン、ドキソルビシン）か、または微小管ネットワークに影響を与えることによって作用する化学療法剤（例えば、タキソール、ビンブラスチン）のいずれの毒性も、ｐ５３依存性ではないことが明らかになった（図４ｄ）。このことは、アミノアクリジンが従来の化学療法剤とは異なる機構を通じて腫瘍細胞を死滅させることを示唆している。正常な細胞も活性なｐ５３を有しているので、本発明者らは、正常な腎臓上皮細胞およびヒトの２倍体線維芽細胞ＷＩ３８に対する９ＡＡの毒性を試験した。これらの正常な細胞型はいずれも、ＲＣＣまたは他の腫瘍細胞と比較して、９ＡＡに対してより耐性があった（図４ｅおよびｆ）。
【０１２８】
（実施例５）
（アミノアクリジンをベースとする薬物はインビボで抗腫瘍効果を有している）
アミノアクリジンのインビボでの抗腫瘍効果を、それらのｐ５３状態が異なり、そしてヌードマウスにおいて皮下で増殖させたｐ５３ルシフェラーゼレポーターを有しているＨＴ１０８０細胞を使用して、異種移植腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍細胞中でのｐ５３依存性ルシフェラーゼレポーターの活性を、インビボでの９ＡＡの生体利用性を試験するために使用した。９ＡＡおよびキナクリンはいずれも、腫瘍中のｐ５３を活性化させることができ（図５ａ）、そしていずれの化合物も、上記の実験と同様の特性を示した（データは示さない）。
【０１２９】
キナクリンの効果についてのｐ５３依存性を十分に引き出すために、ＨＴ１０８０ｓｉｐ５３細胞（左脇腹）およびＨＴ１０８０ｓｉＧＦＰ細胞（右脇腹）をマウスに接種した。腫瘍が５ｍｍの直径に達した後、マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのキナクリンを毎日腹腔内注射し、５−フルオロウラシル（５ＦＵ、３５ｍｇ／ｋｇ）を比較のために使用した。図５ｂに示すように、キナクリンは、５ＦＵと同じ程度までｐ５３を発現する腫瘍の増殖を阻害し、そしてｐ５３欠損腫瘍の増殖に対しては効果がなかった。これは、アミノアクリジンがｐ５３依存性の様式で異種移植腫瘍のインビボでの増殖を阻害することを示している（図５ｂ）。
【０１３０】
マウスにはまた、２×１０６個のヒト前立腺ガン細胞をＰＣ３  ｐ５３ネガティブを使用して、または変異体ｐ５３を含むＤＵ１４５細胞を接種した。マウスを、経口強制飼養によって１００ｍｇ／ｋｇの用量のキナクリンで、または対照としての滅菌水で処置した。腫瘍の増殖は、キナクリンで処置したマウスにおいては約５０％減少した。興味深いことに、このことは、アミノアクリジンもまた、ｐ５３依存性の様式で異種移植腫瘍のインビボでの増殖を阻害することを示している。
【０１３１】
（実施例６）
（アミノアクリジンによって媒介されるｐ５３の活性化の機構）
本発明者らは、最初に、アミノアクリジンが、ｐ５３を誘導する化合物についての周知の作用機構であるＤＮＡの損傷を通じてｐ５３を活性化させるかどうかを試験した。９ＡＡ誘導体の１つであるａｍｓａはトポイソメラーゼＩＩの毒性を介してＤＮＡの損傷を引き起こすので、本発明者らは、トポイソメラーゼＩＩの別のインヒビターであるａｍｓａおよびエトポシドと比較して、９ＡＡがインビトロではトポイソメラーゼＩＩ活性に対して効果がないことを試験し、明らかにした（図６ａ）。さらに、９ＡＡは、ＤＮＡの切断に感受性であるキナーゼ（ＡＴＭ、ＡＴＲなど）を介してｐ５３を活性化するＤＮＡを損傷させる薬物から予想することができるように、ｐ５３のリン酸化状態には影響は与えなかった。ポジティブ対照としてこれらの実験で使用したドキソルビシンは、ｐ５３のリン酸化を誘導し、このことによって、上流のｐ５３によるシグナル伝達がＲＣＣにおいて機能的であることが確認された（図６ｂ）。この結果は、様々なタイプのＤＮＡの損傷によってはＲＣＣ中のｐ５３は活性化させられないことを示す以前の結果とともに、アミノアクリジンがＤＮＡの損傷とは異なる機構によってｐ５３を活性化させることを示している。
【０１３２】
プロテアソームインヒビターは未修飾のｐ５３タンパク質の蓄積を引き起こすｐ５３活性化物質の別のクラスを構成する。９ＡＡでの処置に応答したリン酸化されていないｐ５３の蓄積と、細胞質内での薬物の顕著な局在化（蛍光顕微鏡でモニターした）は、アミノアクリジンがプロテアソームの分解のインヒビターとして作用できることを示唆しした。この仮説は、直接的なインビトロでのアッセイを使用して（図６ｃ）、そしてプロテアソームの分解についての別の標的であるＩκＢのレベルに対する９ＡＡの効果をモニターすることによって［２１］（これは、プロテアソーム活性とは無関係な指標として使用した）排除された。ＭＧ１３２（ポジティブ対照として使用したプロテアソームの分解のインヒビター）は、ＩκＢのリン酸化形態の蓄積を生じたが、９ＡＡでの処置によっては、驚くべきことに、反対の効果があり、これによって、ＩκＢの段階的な減少と、その後の完全な消滅が導かれた（図６ｄおよびｅ）。これらの結果は、アミノアクリジンはプロテアソームの阻害によってはｐ５３を活性化をさせることはないことを示している。
【０１３３】
（実施例７）
（アミノアクリジンはＮＦ−κＢを阻害する）
実施例６に示したように、９ＡＡによってＩκＢの分解は予想外に誘導された。これらの結果に基づいて、本発明者らはＮＦ−κβ経路に対するアミノアクリジンの可能性のある効果に焦点をあてた。本発明者らは、ＮＦ−κＢの転写活性に対する９ＡＡの効果を試験するために、ＮＦ−κＢ応答性レポーターが組み込まれているｐ５３ヌルＨ１２９９細胞を使用した。本発明者らは、９ＡＡとキナクリンはいずれも、レポーターの基底の活性およびＴＮＦ−によって誘導される活性を阻害したことを明らかにした（図７ａ）。これらは、ＴＮＦでの刺激前（−２４〜０時間）、ＴＮＦでの刺激と同時（０時間）、またはＴＮＦでの刺激の後（０〜６時間）に添加された場合に有効であった（データは示さない）。これらはまた、ＮＦ−κＢフィードバック調節ループの不可欠な部分であるＩκＢのＴＮＦによって刺激される誘導も阻害した（図７ｂ）。驚くべきことに、９ＡＡおよびキナクリンによるＮＦ−κＢ依存性トランス活性化のブロックは、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性における同時用量依存性の増加と同時に生じた（図７ｃ）。いくらかの増大は、ＴＮＦでの刺激を伴わない場合にもなお観察され、これには、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体が主に関係している（図７ｄ）。この増大は、薬物をＴＮＦと組み合わせて投与した場合に特に強く、これには、ｐ６５／ｐ５０およびｐ５０／ｐ５０  ＮＦ−κＢ複合体の両方が関係していた（図７ｃおよびｄ）。
【０１３４】
ＮＦ−κＢ複合体のＤＮＡ結合活性の増大は、免疫蛍光染色によって観察した場合には、９ＡＡの存在下では、ＴＮＦで刺激した場合のｐ６５を含むＮＦ−κＢ複合体の核での蓄積と相関していた。本発明者らは、ｐ６５は９ＡＡの存在とは無関係に核に侵入するが、薬物によって核の中でのその存在時間が有意に延長させられることを見出した（図７ｅ）。これはおそらく、核からのＮＦ−κＢのシャトル輸送の役割を担うＩκＢの欠損が原因である。
【０１３５】
これらの結果は、アミノアクリジンが、異常な機構を通じて作用するＮＦ−κＢのトランス活性化の強力なインヒビターであることを示している。ＩκＢを安定化させることによって作用する以前に記載されたインヒビターとは反対に、アミノアクリジンは、ＮＦ−κＢ複合体を転写不活性な状態に転換させることによって作用し得る。これは、そのシャトル因子（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）ＩκＢの誘導の欠損が原因で核に捕捉される。
【０１３６】
ＮＦ−κＢ複合体の機能的な不活化に応答することができる機構のなかでも、ｐ６５のリン酸化（ＮＦ−κＢ活性に不可欠であると報告されている）を欠損させることにより、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を複合体に動員して、転写開始部位のクロマチンの不活性な形態への変換を生じる。この可能性を試験するために、本発明者らは、ＴＮＦで処理した細胞の核内でのｐ６５のリン酸化に対する９ＡＡの効果を分析した。ＴＮＦだけで処理した細胞の中では、リン酸化されたｐ６５の割合は全ｐ６５と平行して増加した。ＴＮＦと９ＡＡで処理した細胞においては、リン酸化されたｐ６５の割合は増加しなかった（図７ｆ）。これらの結果は、アミノアクリジンの存在下では、ｐ６５はリン酸化された状態、したがって、おそらくは不活性な形態で優先的に核に侵入することを示している。
【０１３７】
不活性なＮＦ−κＢは、刺激されていない核内では、ＨＤＡＣとの複合体として存在する。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）によるＨＤＡＣ活性の阻害によって、ＮＦ−κＢ依存性の転写の活性化が生じ、これにはさらなる刺激はともなわない。アミノアクリジンによるＮＦ−κＢの不活化もまたＨＤＡＣに関係している場合には、ＮＦ−κＢのＴＳＡによって刺激された誘導に対して効果はないはずである。実際、ＮＦ−κＢレポーター細胞のＴＳＡでの処理によって、９ＡＡによってブロックすることはできなかったＮＦ−κＢ依存性転写の有意な活性化が生じた（図７ｈ）。これらの結果は、アミノアクリジンは不活性なＮＦ−κＢ複合体の蓄積を生じることができ、そして、それらの不活化がＨＤＡＣに関係していることを示している。
【０１３８】
ｐ６５のリン酸化のブロックは、アミノアクリジンの抗ＮＦ−κＢ活性についての唯一の機構ではない可能性がある。本発明者らは、９ＡＡでの処理によって、細胞質および核のプールにおいてｐ５０の増加が生じることを明らかにした（図７ｇ）。ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体（その割合はこのＮＦ−κＢサブユニットの９ＡＡによって媒介される蓄積にともなって増加した（図７ｄ））はまた、不活性なＮＦ−κＢ複合体の形成にも関係している可能性があった。
【０１３９】
（実施例８）
（アミノアクリジンはＮＦ−κＢの阻害を通じてＲＣＣの中でｐ５３を活性化させる）
アミノアクリジンはＲＣＣ細胞中で２つの強い効果を生じる。これらは、ＤＮＡの損傷、またはプロテアソームの分解の阻害には関係していない異常な方法でｐ５３を活性化させる。これはまた、ＮＦ−κＢも、異常な方法で、転写活性のあるＮＦ−κＢ複合体を転写不活性な形態に変換させることによって阻害する。これはおそらく、ｐ６５／ＲｅｌＡのリン酸化の阻害が原因である。ｐ５３およびＮＦ−κＢに対するアミノアクリジンの効果は極めて特異的である。なぜなら、これらは、ｃ−Ｍｙｃ、またはＮ−Ｍｙｃ、アンドロゲン受容体、またはＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１のような他の試験した因子によって調節された転写に対しては効果がないからである（データは示さない）。本発明者らは、アミノアクリジンによるｐ５３の活性化およびＮＦ−κＢの抑制が薬物の活性と関係しているのか、または薬物の活性とは無関係であるのか、そして、相関している場合には、これは初期事象であるのかどうかを知ることについて興味を抱いた。本発明者らは、ｐ５３の活性化がＮＦ−κＢの抑制の要因である可能性を容易に排除することができた。なぜなら、ＮＦ−κＢ経路に対するアミノアクリジンの効果の全てがｐ５３欠損細胞（Ｈ１２９９）と、さらにはｐ５３野生型細胞（ＨＴ１０８０）細胞において見られたからである。さらに、アミノアクリジンによるＮＦ−κＢの阻害は、化合物の投与後１時間以内に検出できるが、ｐ５３に対するそれらの効果は、通常はゆっくりであり、効果が見え始めるには１２から１６時間の処置が必要である（図２ｄ）。正反対のモデル（アミノアクリジンによるＮＦ−κＢの抑制がｐ５３の活性化を駆動する）を研究するために、本発明者らは（ｉ）ＮＦ−κＢが別の機構によって阻害された場合にｐ５３活性と共に何が生じるかを試験し、そして（ｉｉ）ＮＦ−κＢ欠損細胞中でのｐ５３活性化に対するアミノアクリジンの効果を分析した。
【０１４０】
ｐ５３およびＮＦ−κＢに対する９ＡＡおよびキナクリンの二重効果をさらに確認するために、本発明者らは、２種類の用量の９ＡＡ（２μＭおよび１０μＭ、それぞれ、増殖の停止とアポトーシスを引き起こす）で処理した２種類のＲＣＣ細胞株、ＲＣＣ４５とＲＣＣ５４の全体的な遺伝子発現プロフィールの変化を、マイクロアレイハイブリダイゼーションを使用して分析した。ＲＮＡを処理の１６時間後に単離し、この処理は、細胞死の兆候が生じる前にｐ５３を誘導するために十分であった。アレイ上に提示された３６８４７遺伝子のうちのわずかに０．６％が、両方の細胞株において少なくとも一方の用量で少なくとも２倍、それらのｍＲＮＡ量を変化させた。最もアップレギュレートされた遺伝子としては、ｐ２１、ｍｄｍ２、さらにはいくつかの他のｐ５３標的が挙げられる（表１）。一方、ＩκＢα、ＩＬ−８、ならびに、いくつかのケモカインおよびサイトカイン（表２）（全てＮＦ−κＢ応答性遺伝子によってコードされる）は、処理の結果として強く抑制された。これらの結果により、ｐ５３のインデューサー、およびＮＦ−κＢの転写のインヒビターとしてのアミノアクリジンの二重効果を確認した。
【０１４１】
ＲＣＣ細胞中のＮＦ−κＢ活性を抑制するために、本発明者らは、両方のリン酸化部位が欠失している安定なＩκＢ変異体である、ＩκＢスーパーサプレッサー（ｓｓ−ＩκＢ）を使用した。この変異体のＲＣＣ  ＡＣＨＮ細胞への形質導入によって、ＮＦ−κＢレポーター活性の３倍の阻害が生じ（図８ａ）、これは、ＮＦ−κＢが試験した全てのＲＣＣ細胞株の中で構成的に活性であるという本発明者らの観察と一致していた。重要なことは、同じ細胞の中でのｐ５３応答性レポーターの活性は、ＮＦ−κＢ阻害性ｓｓ−ＩκＢが形質導入されると５倍に増大したことである（図８ｂ）。同様の効果が、別のＲＣＣ株であるＲＣＣ５４、さらには、非ＲＣＣ細胞であるＨＴ１０８０（データは示さない）において観察された。これらはいずれも、ｐ５３の活性化により９ＡＡに応答した（図３ａ）。注目すべきは、ｓｓ−ＩκＢは、ｐ５３経路の「直接的」な調節因子（例えば、Ａｒｆ、ｓｉＲＮＡからＨｄｍ２、またはｐ５３自体）の形質導入よりもはるかに強く、ＲＣＣにおいてｐ５３を活性化させた（図８ｂ）。したがって、本発明者らは、ＮＦ−κＢ活性のブロックによって、ＲＣＣ細胞中のｐ５３のトランス活性化を回復させることができること、そしてアミノアクリジンはおそらくこの機構を通じて作用することを明らかにした。
【０１４２】
アミノアクリジンによるＮＦ−κＢの阻害がそのｐ５３活性化効果に唯一関与しているものであるかどうかを試験するために、本発明者らは、ｓｓ−ＩκＢによって阻害されているＮＦ−κＢを有しているＲＣＣ細胞を９ＡＡで処理した。本発明者らは、ｓｓ−ＩκＢを安定に発現するＲＣＣ細胞株を作成することはできなかった。なぜなら、ＮＦ−κＢの阻害はＲＣＣ細胞の生存率を妨害したからである（非公開の観察）。したがって、ＮＦ−κＢが抑制されている細胞に対するアミノアクリジンの効果を、一時的なトランスフェクション実験において試験した。ここでは、ｓｓ−ＩκＢの導入を、ＮＦ−κＢまたはｐ５３応答性レポーターのいずれかと組み合わせた。ＡＣＨＮへのｓｓ−ＩκＢのトランスフェクションによってＮＦ−κＢレポーター活性が阻害され、９ＡＡでの処理によって全くさらなる阻害が生じなかった場合のレベルにまで低下した。これらの条件下では、９ＡＡはそれ以上ｐ５３応答性レポーターを活性化させることはできず（図８ｃ）、これは、アミノアクリジンのｐ５３活性化効果がＮＦ−κＢ機能の阻害によって媒介されていること、そしてＮＦ−κＢ活性がＲＣＣにおいてはｐ５３の抑制に応答性であることを示している。
【０１４３】
（実施例９）
（耐性腫瘍細胞の感作）
本発明者らは、次に、死リガンドに耐性である腫瘍細胞を感作させるアミノアクリジンの能力を試験した。本発明者らは、前立腺、腎臓、肺、および乳房に由来する、もともと死リガンドでの処理に対して耐性であった腫瘍細胞が、非毒性または毒性が低い濃度のアミノアクリジンの存在下で処理した場合には、ＴＮＦ、Ｆａｓ、およびＴＲＡＩＬに対して劇的に感作させられたことを見出した（図９）。
【０１４４】
（実施例１０）
（アミノアクリジンの抗腫瘍適用）
本発明者らは、従来の化学療法に対するアミノアクリジンの効力を試験した。この目的のために、本発明者らは、ＲＣＣに由来する腫瘍細胞とＲＣＣ以外に由来する腫瘍細胞（それぞれのタイプについて６種類）、さらには、正常な腎臓細胞（ＮＫＥ）のセットについて、いくつかの化学療法剤（ドキソルビシン、タキソール、および５−フルオロウラシル）、９ＡＡ、およびキナクリン（ＱＣ）のＩＣ５０％を比較した。非ＲＣＣ細胞株には、ＭＣＦ７（ｗｔ  ｐ５３）、ＨＴ１０８０（ｗｔ  ｐ５３）、Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）、Ｕ２ＯＳ（ｗｔ  ｐ５３）、ＬＮＣａＰ（ｗｔ  ｐ５３）、およびＨＣＴ１１６（ｗｔ  ｐ５３）を含めた。ＲＣＣの平均のＩＣ５０％は、使用したすべての化学療法剤について非ＲＣＣ細胞株よりも高く、そして正常な細胞のＩＣ５０％に近かった。これは、臨床報告と一致していた（図１０）。９ＡＡおよびキナクリンは、試験した１０種類のＲＣＣ細胞株のうちの９種類においてｐ５３によって媒介されるトランス活性化を効率よく回復させた（データは示さない）。これらの化合物は、後者のｐ５３状態とは無関係に、ＲＣＣ細胞および非ＲＣＣ細胞の両方に対して同等に有効であった。さらに表３も参照のこと。
【０１４５】
本発明者らは、次に、アミノアクリジンがエキソビボでの臓器の培養においても同様の効果を生じることを確認した。新しいＲＣＣ標本と同じ患者に由来する正常な腎臓の断片を、ｐ５３応答性ｌａｃＺレポーター（図１０Ｂ）を有しているレンチウイルスベクターを含む培地中の短時間臓器培養物の中に２４時間入れた。その後、組織試料をキナクリンまたはドキソルビシンでさらに２４時間処理し、その後、グルタルアルデヒドで固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性についてＸ−ｇａｌ（青色染色）を使用して染色した。図１０Ｂに示すように、キナクリンは、腫瘍試料中でｐ５３応答性レポーターの発現を誘導したが、ドキソルビシンは誘導しなかった。いずれの薬物によっても、正常な腎臓試料（内因性β−ガラクトシダーゼ活性を発現する正常な腎臓構造が見られた）中ではレポーターの誘導は検出できなかった。レポーターを形質導入しなかった全ての腫瘍試料においては、Ｘ−ｇａｌポジティブ染色は観察されなかった。したがって、ｐ５３機能はアミノアクリジンによって回復させられた。このアッセイはまた、アミノアクリジン処理に対する腫瘍の応答性を予想することができる予後検査の基準として使用することもできる。
【０１４６】
１つの化合物において２つの重要な特性（ＮＦ−κＢ活性の阻害とｐ５３の活性化）が組み合わされていることによって、アミノアクリジンの可能な用途が提供される。最も将来性のある自然界に存在している抗ガン性サイトカインの１つであるＴＲＡＩＬに対する腫瘍細胞の耐性には、通常、構成的に活性なＮＦ−κＢと、ｐ５３の阻害が関係している。これは、ＴＲＡＩＬ受容体の１つであるＤＲ５の発現を制御する。９ＡＡは、試験した２種類のＲＣＣ細胞株においてＴＲＡＩＬレポーター（ＤＲ５）の発現を誘導することができた（表１）。したがって、ＮＦ−κＢの阻害とｐ５３の活性化を同時に行うことができる化合物は、ＴＲＡＩＬに対して耐性である腫瘍細胞を覆すと予想される。本発明者らは、ＴＲＡＩＬ耐性ＲＣＣ細胞株であるＲＣＣ５４とＲＣＣ４５をキナクリンと組み合わせて処理することによってこれを試験した。正常な腎臓上皮細胞を比較のために使用した。図１０Ｃに示すように、キナクリンは、腫瘍のＴＲＡＩＬ耐性を覆したが、正常な腎臓細胞については覆すことはできず、このことは、アミノアクリジンのガンに対する適用の別の形態を示している。
【０１４７】
最後に、本発明者らは、ヌードマウスに皮下注射したＡＣＨＮ細胞によって形成された腫瘍の異種移植片の増殖に対するキナクリンの効果を試験し、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いた場合に観察された効果と同様の、腫瘍増殖の約５０％の阻害を見出した。しかし、これには、５ＦＵの投与にともなった有意な体重の減少（２０％まで）はなかった（図１０Ｄ）。
【０１４８】
【表１】
2014074056.tif 000006
【０１４９】
【表２】
2014074056.tif 000007
【０１５０】
【表３】
2014074056.tif 000008
【図１】
2014074056.tif 000009
【図２】
2014074056.tif 000010
【図３】
2014074056.tif 000011
【図４】
2014074056.tif 000012
【図５】
2014074056.tif 000013
【図６】
2014074056.tif 000014
【図７】
2014074056.tif 000015
【図８】
2014074056.tif 000016
【図９】
2014074056.tif 000017
【図１０】
2014074056.tif 000018
【外国語明細書】
2014074056000001.pdf