(57)【要約】【課題】カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母の育種方法を提供することを目的とする。【解決手段】セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理し、変異処理を行った醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離し、アルコール飲料及び清酒を製造する。醸造酵母はきょうかい１６０１号又はきょうかい１８０１号であり、変異処理はＵＶ処理である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理する工程と、
変異処理を行った醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離する工程と、
を有する醸造酵母の育種方法。
【請求項２】
前記醸造酵母がきょうかい１６０１号又はきょうかい１８０１号である請求項１に記載の醸造酵母の育種方法。
【請求項３】
前記変異処理がＵＶ処理である請求項１又は２に記載の醸造酵母の育種方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の醸造酵母の育種方法で育種された醸造酵母。
【請求項５】
請求項４に記載の醸造酵母を用いるアルコール飲料の製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載の醸造酵母を用いる清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、並びに該醸造酵母を用いたアルコール飲料及び清酒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類における消費者の嗜好は、時に大きく変わるが、その嗜好に合った酒類を製造するには、様々な特徴を備える醸造酵母を育種する必要がある。消費者の嗜好に大きくかかわる酒類の要素として、例えば、香気成分や酸度が挙げられる。酒類の香気成分は、主にエステル類により構成されており、例えば清酒の吟醸香として、酵母の発酵中に生産されるカプロン酸エチルや酢酸イソアミル等が知られている。
【０００３】
カプロン酸エチルは、リンゴ様の華やかな香を有し、特に清酒では重要な香気成分（吟醸香）である。しかし清酒によっては、カプロン酸エチルの香りが強すぎると当該清酒全体の香のバランスが崩れたり、食事との相性が悪くなったりする場合がある。その理由として、カプロン酸エチルを高含有している当該清酒は、同じく不快臭（脂肪酸臭）の原因となるカプロン酸をも高含有している事が挙げられる。清酒は発酵後に元々カプロン酸を含有しているが、生成工程、貯蔵、輸送、保管及び販売等において、清酒に含まれているカプロン酸エチルが分解してカプロン酸含有率がより高くなることがある。従って、カプロン酸エチルを高含有する清酒は、カプロン酸の含有率を低く維持するために発酵後の品質管理をしっかり行わなければならないといったコスト的なデメリットがあった。
【０００４】
酢酸イソアミルは、バナナ様のすっきりとした香りであり吟醸香の一つである。清酒に限らず、ビールやワイン等の醸造香を高める香気成分として知られている。この酢酸イソアミルは、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡとからアルコールアセチルトランスフェラーゼの触媒作用により生産される。酢酸イソアミルは、その生産量を高めると、出発物質であるイソアミルアルコールの必要量も増えることになる。イソアミルアルコールは、その含量が増えると、フーゼル油臭（重たいインク様の香り）が強くなるため、酢酸イソアミル／イソアミルアルコールの含有比率（以下、Ｅ／Ａ比と称する。）が高くなる程よい香とされ、Ｅ／Ａ比は酒類の吟醸香の善し悪しを評価する一つの指標とされている。
【０００５】
カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの含有量が共に多い酒類が望ましいが、上述したように、当該酒類は同時にカプロン酸の高含有の問題もあることから、必ずしも好ましい匂いだけの吟醸香の強い酒類にはならない。むしろ、カプロン酸エチルが少なく相対的にカプロン酸が少なく、さらに酢酸イソアミルが多く、Ｅ／Ａ比が高い酒類が、好ましい吟醸香のある酒となりうる。
【０００６】
これまで、吟醸香を高めるのに有効な変異株を育種する方法としては、吟醸香を構成する成分であるカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を高める育種法が多く開発されている。
【０００７】
例えば特許文献１では、セルレニン含有培地及びロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン含有培地で生育可能な変異株を選択してカプロン酸エチル及び酢酸イソアミル高生産株を取得する育種法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−０５４５６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
醸造酵母の変異株の育種は、これまで、特許文献１に見られるように、吟醸香が強く芳醇な酒類を製造するために行われてきた。しかし、消費者の様々な嗜好に合わせるため、吟醸香の強い酒類ばかりではなく、好ましい吟醸香の酒類の製造に適した様々な変異株を育種することが必要である。
【００１０】
そこで本発明者らは、吟醸香の内、華やかで香の強いカプロン酸エチルの生産量に着目し、カプロン酸エチルの生産を抑えた変異株を育種、取得することを行った。得られた変異株の特徴を調べると、その全ての変異株が酢酸イソアミルを高生産し、さらにＥ／Ａ比が高い変異株であり、好ましい吟醸香の酒を製造することができることを見出して本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、上述の酒類を製造するために、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母の育種方法を提供することを目的とする。さらに、当該育種方法で育種された醸造酵母を用いて、好ましい吟醸香を有するアルコール飲料及び清酒の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明に係る醸造酵母の育種方法の特徴構成は、
セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理する工程と、
変異処理を行った醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離する工程と、
を有することにある。
【００１３】
上記説明したように、これまで、カプロン酸エチルの生産性を抑制した好ましい吟醸香を有する酒類の製造に適した醸造酵母の育種に関する十分な研究は行われてこなかった。本構成の醸造酵母の育種法では、セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を変異処理し、醸造酵母の母集団からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を選択分離することから、カプロン酸エチルの生産を抑制した醸造酵母を確実に選抜することができ、さらに酢酸イソアミル高生産であり、Ｅ／Ａ比が高い変異株を取得することができる。
【００１４】
本発明に係る醸造酵母の育種方法において、前記醸造酵母がきょうかい１６０１号又は１８０１号であることが好ましい。
【００１５】
有機酸の低生産性清酒酵母は、例えば、きょうかい１６０１号（以下、Ｋ−１６０１と称す）及び１８０１号（以下、Ｋ−１８０１と称す）が該当するが、有機酸の低生産性の形質を有した優良な清酒酵母が少ないのが現状である。本構成の育種方法では、育種に用いる親株としてＫ−１６０１又はＫ−１８０１を用いることから、有機酸の低生産性といった親株の形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、酢酸イソアミルが高生産であり、さらにＥ／Ａ比が高く、さらに有機酸の低生産性である優良な酵母の変異株を取得することができる。
【００１６】
本発明に係る醸造酵母の育種方法において、前記変異処理がＵＶ処理であることが好ましい。
【００１７】
本構成の醸造酵母の育種方法では、変異処理としてＵＶ処理を行うことから、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を効率的に誘発させることができるため、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を効率的に分離することができる。
【００１８】
上記課題を解決するための本発明に係る醸造酵母の特徴構成は、上記何れかの育種方法を用いて育種された醸造酵母である。
【００１９】
本構成の醸造酵母は、上記何れかの育種方法を用いて育種された醸造酵母であることから、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比の値が高くなるように発酵することができるので、好ましい吟醸香の酒を効率的に醸造することができる。
【００２０】
上記課題を解決するための本発明に係るアルコール飲料の製造方法の特徴構成は、
上記醸造酵母を用いてアルコール飲料を製造することである。また、アルコール飲料は清酒であることが好ましい。
【００２１】
本構成のアルコール飲料の製造方法は、上記本構成の醸造酵母を用いることから、好ましい吟醸香を有したアルコール飲料を容易に製造することが可能であり、本構成の醸造酵母は、従来のきょうかい酵母（カプロン酸高生産）とは異なる性質から、従来のきょうかい酵母を用いて醸造した清酒とは異なる新しい清酒（本醸造、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米大吟醸など）を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、セルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との増殖能を比較したグラフである。
【図２】図２は、セルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との発酵経過に伴う炭酸ガス減量を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明者らは、先ず親株のアルコールの生産性やアルコール耐性等の形質に与える影響を低減しながら、カプロン酸エチルの生産を抑えた変異株を育種、取得することを行った。カプロン酸エチルは、前駆体であるカプロン酸のエステル化によって生成され、カプロン酸は、脂肪合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）によって生成される。抗生物質であるセルレニンは、ＦＡＳの阻害物質であり、セルレニン耐性の変異株を取得することにより、カプロン酸の量を増加させ、これに伴ってカプロン酸エチル高生産株を取得している。したがって、本発明者らは、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母を穏やかな条件で変異処理し、ヘテロ接合性の消失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，以下、ＬＯＨと称する。）を誘発させ、変異処理を行った醸造酵母の母集団からセルレニン感受性を指標としてホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するカプロン酸エチルの生産を抑制させた変異株を取得した。その変異株の形質を調べたところ、予期しないことに、その全ての変異株は、酢酸イソアミル高生産であり、Ｅ／Ａ比の値が高い変異株であるという新しい知見を得た。
【００２４】
本発明に係る醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、該醸造酵母を用いたアルコール飲料（特に、清酒）の製造方法に関する実施形態について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態や図面に記載される構成に限定されることを意図しない。
【００２５】
ここで、本明細書中に記載される「アルコール飲料」とは、アルコール分一度以上を含む飲料を意味し、具体的には酒類を指し示し、発泡性酒類、醸造酒類、蒸留酒類及び混成酒類を含み、より具体的には、ビール、発泡酒、清酒、果実酒、その他の醸造酒、連続式蒸留焼酎、単式蒸留焼酎ウイスキー、ブランデー、原料用アルコール、スピリッツ、合成清酒、リキュール、粉末酒、雑酒を含む飲料を意味する。また、本明細書中に記載される「カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母」とは、本発明で用いられる親株と比較してカプロン酸エチルの生産が抑制されており、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い醸造酵母を意味する。
【００２６】
［醸造酵母の育種方法］
本発明に係る醸造酵母の育種方法は、ＬＯＨを誘導することにより、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン耐性株からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を育種する。ここで、ＬＯＨとは、二倍体細胞中の一対の相同染色体の特定の遺伝子座における対立遺伝子が異なる状態（ヘテロ接合型：例えば、正常型と変異型）の場合に、染色体の不分離や重複、体細胞分裂時に起こる遺伝子組換え、変換、欠失等により、その遺伝子座における対立遺伝子が同一の状態（ホモ接合型：正常型と正常型、又は変異型と変異型）へと変化する現象である。例えば、出芽酵母の場合、細胞１００万個乃至１万個に１個の頻度でＬＯＨが生じる。
【００２７】
（育種に用いる親株）
本発明の醸造酵母の育種方法に用いる親株としては、セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母に利用することができる。例えば、実験室酵母や醸造酵母が挙げられるが、より醸造酵母が好ましい。また上述のセルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母は公知の方法（非特許文献：Ｉｃｈｉｋａｗａ,  Ｅ.  ｅｔ  ａｌ.：  Ａｇｒｉｃ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｈｅｍ.,  ５５,  ２１５３（１９９１）.）により、既存の醸造酵母（例えば、公益社団法人日本醸造協会から頒布されている、きょうかい酵母６号、７号、９号、１０号、１１号、１４号、６０１号、７０１号、９０１号、１００１号、１４０１号及び１５０１号、焼酎用きょうかい２号、３号、ブドウ酒用きょうかい１号、３号及び４号。各県工業総合研究センターが開発した、まほろば華酵母、吟醸２号、宮城マイ酵母、愛美酵母、泡なし宮城マイ酵母、秋田流・花酵母、秋田純米酵母、こまち酵母、秋田流・雅酵母。東京農大が開発した花酵母（ＮＤ−４、ＡＢ−２、ＮＩ−２、ＨＮＧ−５、ＣＡＲ−１、ＫＳ−３、ＳＵＮＦ−５、ＢＫ−１、ＳＮ−３、ＭＲ−４、ＧＥ−１、ＫＡＦ−２及びＳＴ−４））から容易に取得できる。また、セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母は、公益財団法人日本醸造協会より頒布されている、例えば、Ｋ−１６０１、きょうかい１７０１号、Ｋ−１８０１、きょうかい７７号、及び焼酎用きょうかい４号、また、秋田今野商店より販売されている、清酒用Ｎｏ．２４、清酒用Ｎｏ．２５、及び清酒用Ｎｏ．３５等を購入することにより取得することができる。本発明の醸造酵母の育種方法は、これら醸造酵母を親株として用いることにより、親株の形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルが高生産であり、Ｅ／Ａ比が高い優良な酵母の変異株を取得することができ、好ましい吟醸香を有したアルコール飲料を容易に製造することが可能となる。
【００２８】
また、上述の既存の醸造酵母に対して交配、細胞融合、形質転換、及び変異処理等を行うことによりセルレニン耐性株を分離することができる。醸造酵母を変異処理する方法としては、紫外線、放射線、イオンビーム、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、又はメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等を用いて醸造酵母に対して適宜変異処理を行えばよいが、好ましくはＥＭＳを用いた変異処理である。これにより、醸造酵母のセルレニン耐性株を容易に選択分離することができる。使用する醸造酵母としては、醸造酵母であれば何れの酵母であってもよいが、例えば、上述の既存の醸造酵母等が挙げられる。
【００２９】
セルレニン耐性を備えるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母の選抜方法の例としては、先ずセルレニン含有培地で培養を行い、セルレニン耐性株を分離する。培地は、固体培地、液体培地の何れでもよいが、好ましくは固体培地である寒天培地であり、特にＳＤ寒天培地（２％グルコース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（アミノ酸を含まないもの）、２％寒天）が好ましい。セルレニンのＳＤ寒天培地への添加量は、０．５〜７．５μｇ／ｍｌであり、好ましくは２〜３μｇ／ｍｌであり、より好ましくは２μｇ／ｍｌである。培養条件は、例えば、２５〜３７℃、培養時間４８〜１２０時間であるが、使用する醸造酵母に応じて適宜選択される。セルレニン耐性を備える醸造酵母の多くは、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有しているが、まれにホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有しているため、シークエンス解析により、ヘテロ接合型であることを確認することが好ましい。ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を取得する方法について以下に説明する。
【００３０】
（セルレニン感受性変異株の取得）
清酒の中でも、本醸造、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米大吟醸などの特定名称酒においては、酸度が低いものが求められる場合もあるが、これまで清酒酵母において酸度が低い酵母は少なかった。酸度は、清酒の製造過程で酵母や麹、米から発生した乳酸・コハク酸・クエン酸・リンゴ酸等の有機酸の量を表したものである。酸度が高い場合、味に旨みと爽快感があり、酸度が低いと淡麗辛口のすっきり感がある。淡麗ですっきり感のある酒を嗜好する消費者も多く、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルなどの吟醸香のある清酒においては、淡麗辛口の酒を製造するために酸度を低くする酵母を選択することも課題となっていた。
【００３１】
そこで、セルレニン感受性変異株の取得に使用する親株として、有機酸の低生産性のＫ−１８０１を使用した。Ｋ−１８０１は、カプロン酸エチル高生産性であるとともに有機酸の低生産性のＫ−１６０１と、常用されているきょうかい９号（以下、Ｋ−９と称す。）とから一倍体株を単離し、両者をマス−メーティング（Ｍａｓｓ−ｍａｔｉｎｇ）法により交雑したものであり、エステルを高生産し、発酵力が強いという形質を有している。
【００３２】
先ず、このＫ−１８０１を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で１日間培養後、菌体を遠心分離にて集菌し、洗浄した。生存率が０．０１〜９０％、好ましくは１０〜８０％、より好ましくは５０〜６０％となるように、ＵＶ照射処理を行い、ＬＯＨを誘発させた。ＵＶ照射条件は、１×１０5〜１×１０9細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０７細胞／ｍｌに調整した洗浄菌体の懸濁液１〜２０ｍｌ、好ましくは１２ｍｌを直径２０−２００ｍｍ、好ましくは直径８５ｍｍのシャーレに入れ、シャーレを紫外線ランプ（波長１４〜２８０ｎｍ，１５Ｗ）から１０〜６０ｃｍ、好ましくは３５ｃｍの距離に配置し、ＵＶを５〜５００秒、好ましくは１０〜２００秒、より好ましくは４５秒間照射して処理した。処理後、回収した菌体を滅菌水で洗浄後、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ培地に２％の寒天を添加）に塗布して、３０℃で培養した。ＹＰＤ寒天培地上で増殖したコロニーを、セルレニン０．５〜７．５μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜３μｇ／ｍｌであり、より好ましくは２μｇ／ｍｌを含むＳＤ寒天培地にレプリカして、３０℃で培養した。ＹＰＤ寒天培地で増殖し、セルレニン含有ＳＤ寒天培地で増殖しなかったコロニーをセルレニン感受性変異株として釣菌して、セルレニン感受性変異株１０株（ＦＭＮ−１８Ｎｏ．１５株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２５株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．５０株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．６４株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．８０株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．８８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９１株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．１１３株）を取得した。シークエンス解析を行った結果、全ての変異株がホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有していることが確認された。Ｋ−１８０１からホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株の取得頻度は、２．５×１０−３であった。比較対象として、ＵＶ照射を行なかった場合の取得頻度は、１０−7以下であった。このうちＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株（識別の表示は、ＦＭＮ−１８−２８）及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株（識別の表示は、ＦＭＮ−１８−９８）は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８２及び受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託している。ＵＶ処理によるＬＯＨ誘発は、生存率８０％以上ではＬＯＨ誘発率の向上が見られず、生存率５０−６０％ではＬＯＨ誘発率が非照射と比較して約１０4倍上昇し、生存率１％以下では最も重要な形質であるアルコールの生産性に悪影響を及ぼす変異が導入された（データ示さず）。
【００３３】
上記のように、高い生存率の穏やかな条件下で親株をＵＶ処理するだけで、ＬＯＨの頻度を上げることが可能であり、セルレニン感受性変異株を高頻度で取得することができた。ＵＶ照射による生存率は、０．０１〜９０％、好ましくは１〜８０％、より好ましくは５０〜６０％である。これにより、親株のアルコール耐性や、他の香気成分の生産等の有用な形質の変化を低減しながら、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を効率的に取得することができる。
【００３４】
本発明の育種方法では、ＬＯＨを誘発させる変異処理としてＵＶ処理を用いたが、使用する醸造酵母により、変異処理の方法を適宜選択可能である。変異処理としては、生存率の高い穏やかな条件下で変異処理を行えるものであればよく、ＵＶ、放射線、イオンビーム、ＮＴＧ、又はＥＭＳ等を用いた処理が挙げられるが、好ましくは、ＵＶ、放射線、又はイオンビームであり、さらに好ましくは、ＵＶである。また、ＬＯＨの出現頻度は低くなるが、自然突然変異によるＬＯＨの誘発により、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株の取得を行ってもよい。これにより、親株の有用な形質の変化をさらに低減しながら、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株を取得することができる。
【００３５】
図１は、１０株のセルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との増殖能を比較したグラフである。各酵母の増殖能は、５ｍｌのＹＰＤ培地に各酵母の菌体濃度をＯＤ６００（吸光度６００ｎｍにおける濁度）＝０．０１となるように植菌し、バイオフォトレコーダ（アドバンテック社製、型番：ＴＶＳ０６２ＣＡ）でＯＤ６００を経時的に測定して評価した。図１に示されるように、Ｋ−１８０１を親株とするセルレニン感受性変異株の１０株の増殖能は、Ｋ−１８０１と比較して、略同等の増殖能を示した。以下、これら変異株を小仕込み試験に供し、各変異株の形質を比較した。
【００３６】
［小仕込み試験］
得られたセルレニン感受性変異株の１０菌株と、親株であるＫ−１８０１とを用いて総米約２００ｇの小仕込み試験を行い、製成酒の成分について検討した。小仕込み試験の配合量としては、掛米にはα化米（精米歩合７０％）１６０ｇ、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）４０ｇ、汲水３６５ｍｌ、１／１０乳酸５００μｌ、及び酵母添加量５×１０９細胞で実施した。発酵温度は、１５℃の一定で行い、１７日後に上槽した。上槽液の成分の分析結果を以下の表１に示す。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１の結果をみると、セルレニン感受性変異株１０株のアルコール生産量は、親株であるＫ−１８０１と略同じ値を示した。吟醸香のひとつであるカプロン酸エチルの生産量は、全ての変異株において親株より減少し、親株の生産量に対して０．２１〜０．５９倍の生産量を維持していた。また、全ての変異株は従来法であるロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシンの薬剤耐性を用いて選抜しなかったにもかかわらず、酢酸イソアミルの生産量は、親株より７．４〜１４．１倍と非常に高い値を示した。さらに、吟醸香の善し悪しを評価する１つの指標であるＥ／Ａ比に関しても、親株と比較して７．７倍〜１３．２倍と非常に高い値を示した。
【００３９】
図２は、セルレニン感受性変異株とＫ−１８０１との発酵経過に伴う炭酸ガス減量を比較したグラフである。図２から明らかなように、Ｋ−１８０１を親株とするセルレニン感受性変異株１０株の炭酸ガス減量の経過は、親株と比較して差異は認められなかった。従って、セルレニン感受性変異株の１０株は、親株と同等の発酵力を有しており、清酒の製造に十分利用できる酵母であることが認められた。また、得られたセルレニン感受性変異株１０株のうち９株は、親株と同等の有機酸の低生産性の形質を有していた。
【００４０】
公知の酢酸イソアミル高生産変異酵母の育種方法としては、ＥＭＳ等の変異剤で親株を変異処理後、ロイシンアナログの５’−５’−５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性株を取得する方法がこれまで知られているが、強い変異処理を行うことから親株の有用な形質を維持できない場合がある。これに対して、本発明の育種方法では、上述したように、温和な条件でＵＶ処理を行ってＬＯＨを誘発させ、Ｋ−１８０１をホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するセルレニン感受性変異株に育種していることから、Ｋ−１８０１のアルコールの生産性やアルコール耐性等の有用な形質を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比の高い変異株を取得することができた。また、Ｋ−１８０１及びＫ−１６０１は、有機酸の低酸性の特徴を有していることから、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株等の有機酸の低酸性の特徴を維持した多くの変異株を取得した。つまり、本発明の育種方法を用いてＫ−１８０１やＫ−１６０１等の低酸性の醸造酵母を育種すると、酸度が低いという醸造酵母の有用な形質を維持した低酸性変異株を取得することが可能である。以下に、Ｋ−１８０１及びＫ−１６０１由来の変異株について実施した試験醸造結果を示す。
【００４１】
［試験醸造１］
Ｋ−１８０１から得られたセルレニン感受性変異株のうち、特徴的な形質を有しているＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株と、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミル以外のＫ−１８０１の形質と良く似た形質を有しているＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株を用いて清酒の試験醸造を行い、製成酒を成分分析に供した。試験醸造には、セルレニン感受性酵母であるＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株と比較するために、当該菌株の親株であるＫ−１８０１と、Ｋ−１８０１の親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１８０１の親株であるＫ−９と同じ形質を備えているきょうかい９０１号（以下、Ｋ−９０１と称す。）と、Ｋ−１６０１の親株であるきょうかい１００１号（以下、Ｋ−１００１と称す。）及びきょうかい７０１号（以下、Ｋ−７０１と称す。）と、を用いて行った。試験醸造の配合量は、以下の表２に示すとおりである。
【００４２】
【表２】
2014018107.tif 000004
【００４３】
この試験醸造では、掛米には精米歩合７０％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度経過は、初添を１１℃で、中添を１０℃で、留添を９℃で行い、以降０．５℃／日ずつ昇温して、最高温度を１５℃とした。留添後、２０日目で上槽した。
【００４４】
［試験醸造１の製成酒の成分分析］
製成酒は、一般分析、成分分析、及び官能試験に使用した。其々の菌株を用いた製成酒の一般分析及び生産性の結果を表３に、其々の菌株の香気成分の結果を表４に、有機酸組成の結果を表５に示した。香気成分はヘッドスペース法によりガスクロマトグラフィー（島津製作所製、型番ＧＣ-２０１０）で分析し、有機酸は高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、型番ＬＣ-２０）で分析した。
【００４５】
【表３】
2014018107.tif 000005
【００４６】
表３に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れで仕込んだ清酒においても、アルコール濃度及び使用した白米に対する製成清酒の割合である酒化率に関しては、他のきょうかい酵母と略同等の値を示し、両菌株とも一般の醸造に用いても十分に実用性のある酵母であることが示された。酸度及び日本酒度に関しては、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は親株であるＫ−１８０１と比較して、略同じ値を示したが、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株は、酸度に関しては何れのきょうかい酵母よりも高く、日本酒度に関しては低いという特徴を有していた。
【００４７】
【表４】
2014018107.tif 000006
【００４８】
表４に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れも、カプロン酸エチルの生産量に関して、カプロン酸エチル高生産株であるＫ−１６０１及びＫ−１８０１より生産量は低くなったが、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株は他のきょうかい酵母と同等の値を示し、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は他のきょうかい酵母よりも高い値を示した。また、酢酸イソアミルに関しては、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の何れの菌株も他のきょうかい酵母よりも高い生産量を示し、Ｅ／Ａ比に関しても高い値を示した。このように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株は、カプロン酸エチルの生産量を抑え、酢酸イソアミルの生産量を増強しており、香において、バランスの良い、変異株となっている。このことから、本発明の育種方法を用いて変異株を取得すると、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を変化させることができるため、様々な吟醸香を有する変異株を取得することができる。
【００４９】
【表５】
2014018107.tif 000007
【００５０】
表５に示されるように、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の有機酸濃度の特徴は、有機酸の低生産性であり、親株であるＫ−１８０１とＫ−９０１の中間の値を示しており、非常にバランスのとれた清酒酵母となっている。これに対して、ＦＭＮ-１８Ｎｏ．２８株は、リンゴ酸、乳酸、酢酸等の有機酸が他のきょうかい酵母よりも高い値を示し、非常に特徴のある清酒酵母となっている。
【００５１】
官能試験は、４人のパネラーの評価で行った。当該パネラーの評価として、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株の清酒は、吟醸香は抑えられているが、香がよく、爽やかであるとの評価が得られ、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株の清酒は、吟醸香は抑えられているが、口中華やかであるとの評価が得られた。この結果から、ＦＭＮ−１８Ｎｏ．９８株及びＦＭＮ−１８Ｎｏ．２８株で醸造した清酒は、好ましい香（すっきりとした香）を有する清酒としての商品価値は十分あると考えられる。
【００５２】
［試験醸造２］
本醸造酵母の育種方法を用いて取得したＫ−１６０１由来の変異株であるＦＭＮ−１６株による清酒の試験醸造を行い、製成酒を成分分析に供した。ＦＭＮ−１６株（識別の表示は、ＦＭＮ−１６−０１）は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８４として 独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託している。試験醸造には、セルレニン感受性酵母であるＦＭＮ−１６株と比較するために、当該菌株の親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１６０１の親株であるＫ−１００１と、を用いて行った。試験醸造の配合量は、以下の表６に示すとおりである。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
この試験醸造では、掛米には精米歩合７０％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７０％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度経過は、初添を１１℃で、中添を１０℃で、留添を９℃で行い、以降１．０℃／日ずつ昇温して、最高温度を１５℃とした。留添後、２２日目で上槽した。
【００５５】
［試験醸造２の製成酒の成分分析］
製成酒は、一般分析、及び成分分析に使用した。其々の菌株を用いた製成酒の一般分析及び生産性の結果を表７に、其々の菌株の香気成分の結果を表８に、有機酸組成の結果を表９に示した。
【００５６】
【表７】
2014018107.tif 000009
【００５７】
表７に示されるように、ＦＭＮ−１６株で仕込んだ清酒は、酒化率に関して、他のきょうかい酵母と略同等の値を示し、ＦＭＮ−１６株は一般の醸造に用いても十分に実用性のある酵母であることが示された。ＦＭＮ−１６株は、酸度に関しても低い値に維持されていた。
【００５８】
【表８】
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【００５９】
表９に示されるように、ＦＭＮ−１６株は、カプロン酸エチルの生産量に関して、カプロン酸エチル高生産株であるＫ−１６０１より生産量は低くなり、Ｋ−１００１と略同等の値を示した。酢酸イソアミルに関しては、Ｋ−１６０１と比較して略同等の値であったが、Ｅ／Ａ比に関しては高い値を示した。このように、ＦＭＮ−１６株は、カプロン酸エチルの生産量を抑えて、Ｅ／Ａ比の値が高くなっており、香において、バランスの良い、変異株となっている。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
表９に示されるように、ＦＭＮ−１６株の有機酸濃度の特徴は、有機酸の低生産性であり、親株であるＫ−１６０１と、Ｋ−１００１との中間の値を示しており、バランスのとれた清酒酵母となっている。
【００６２】
上記結果から、本発明に係る醸造酵母の育種方法では、セルレニン耐性であるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する醸造酵母から、既存の醸造酵母と同等のアルコールの生産性を維持しながら、カプロン酸エチルの生産を抑制して、さらに酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ／Ａ比が高い変異株を育種することができるため、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの生産量を変化させた様々な吟醸香を有する実用的な醸造酵母を取得することが可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係る醸造酵母の育種方法、該育種方法で育種された醸造酵母、並びに該醸造酵母を用いたアルコール飲料及び清酒の製造方法は、カプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルの生産を高生産させ。Ｅ／Ａが高い醸造酵母の育種方法に利用でき、また、親株として有機酸低生産性酵母を用いることにより、有機酸低生産性を保持しつつカプロン酸エチルの生産を抑制し、さらに酢酸イソアミルの生産を高生産させ、Ｅ／Ａが高い醸造酵母の育種方法にも利用できる。当該育種方法により育種された醸造酵母は、アルコール飲料、清酒、焼酎、ビール、ワイン等の製造に利用することができ、特に清酒醸造において利用可能であり、本醸造、純米酒の製造に好適に利用できる。
【図１】
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【図２】
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