(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子解析などを用いることなくその場で簡易に老化を評価する。【解決手段】生物の加齢とともに体内に増加する蛍光物質に基づいて、老化の進行度合を評価する。所定範囲の波長の励起光を生物に照射することによって、若齢期に比べて老齢期に特徴的な蛍光物質が発する蛍光スペクトルを測定することで、老化の進行度合いを評価する。励起光の波長は、３０５〜３６５ｎｍの範囲。蛍光物質が最大の蛍光強度となる蛍光スペクトルは、４００〜４７０ｎｍ±半値幅の範囲が好ましい。老化評価装置は、老化の進行度合いを示す判定結果を出力する老化判定手段と、判定結果を表示装置に表示させる表示制御手段を備える。また、指先挿入部と、指先に対して励起光を照射する光源部と、蛍光スペクトルを検出する検出部を更に備える。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の加齢とともに体内に増加する蛍光物質に基づいて、老化の進行度合を評価することを特徴とする、老化評価方法。
【請求項２】
所定範囲の波長の励起光を前記生物に照射することによって、若齢期に比べて老齢期に特徴的な前記蛍光物質が発する蛍光スペクトルの蛍光強度を測定することを特徴とする、請求項１に記載の老化評価方法。
【請求項３】
前記励起光の波長は、３０５〜３６５ｎｍの範囲であることを特徴とする、請求項２に記載の老化評価方法。
【請求項４】
前記蛍光物質が最大の蛍光強度となる蛍光スペクトルは、４００〜４７０ｎｍ±半値幅の範囲に含まれることを特徴とする、請求項３に記載の老化評価方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の老化評価方法を用いることにより老化を評価する、老化評価装置。
【請求項６】
所定範囲の波長の励起光を生物に照射して、若齢期に比べて老齢期に特徴的な蛍光物質が発する蛍光スペクトルの蛍光強度を用いて所定の演算を行うことにより、老化の進行度合いを示す判定結果を出力する老化判定手段と、
上記老化判定手段が出力した判定結果を表示装置に表示させる表示制御手段とを備えることを特徴とする、請求項５に記載の老化評価装置。
【請求項７】
指先を挿入するための指先挿入部と、
前記指先挿入部に挿入された指先に対して前記励起光を照射する光源部と、
前記励起光を照射することにより生じた前記蛍光スペクトルを検出する検出部とをさらに備えることを特徴とする、請求項５または６に記載の老化評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの老化を評価する老化評価方法および老化評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化を評価するための技術が従来知られている。例えば、特許文献１には、被験者から採取した生体由来試料における、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子、Ｔ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｈ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）遺伝子、Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ−１遺伝子、Ｌａｍｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ  ３遺伝子、Ｊａｇｇｅｄ  １遺伝子、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １遺伝子及びＫｅｒａｔｉｎ  １０遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現を測定するステップと、測定対象の遺伝子の発現レベルに基づいて、上記被験者における皮膚老化度を評価するステップとを含む肌評価方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１１５１３１号公報（２０１０年５月２７日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような従来技術は、遺伝子解析といった煩雑なものであり、遺伝子解析を行う前に試料の調整などの前処理が必要である。また、遺伝子解析には、高額の解析装置が必要となる。このため、その場で老化度を測定、評価することが不可能である。
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、この発明の目的は、遺伝子解析などを用いることなくその場で簡易に老化を評価することが可能な老化評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る老化評価方法は、生物の加齢とともに体内に増加する蛍光物質に基づいて、老化の進行度合を評価する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一態様によれば、簡易に老化を評価することができるといった効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態における老化評価装置の構成の一例を示す図である。
【図２】老化モデル生物に励起光を照射したときにおける励起光の波長と蛍光スペクトルとの関係を示した図である。
【図３】老化モデル生物の加齢に伴う蛍光強度の増大を示すグラフである。
【図４】１７日齢の構造解析結果を示す図である。
【図５】老化に伴って増加するタンパク質を糖化させることにより得られる蛍光スペクトルを示す図である。
【図６】７日齢の２匹の老化モデル生物それぞれに異なる餌を与えたときに得られた蛍光スペクトルを示す図である。
【図７】変形例１における老化評価装置の構成の一例を示す図である。
【図８】指尖測定装置の構成の一例を示す図である。
【図９】変形例３における老化評価装置の構成の一例を示す図である。
【図１０】変形例４における老化評価装置が備える測定プローブを示す図である。
【図１１】制御装置の構成の一例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
図面を参照しつつ、本発明の実施の形態について説明する。以下の説明では、同一の部材には同一の符号を付してある。それらの名称および機能も同じである。したがって、それらについての詳細な説明は繰り返さない。
【００１０】
図１は、本実施形態における老化評価装置の構成の一例を示す図である。図１に示されるように、老化評価装置１００は、ヒトの老化を評価する装置であり、励起用光源１０１と、検出器１０３と、測定プローブ１０５と、制御装置１とを備える。
【００１１】
測定プローブ１０５は、入射用光ファイバ１０５ａと出射用光ファイバ１０５ｂとの２種類が同軸に設けられている。入射用光ファイバ１０５ａの一端には、励起用光源１０１が取付けられ、励起用光源１０１が発する励起光を伝搬し、入射用光ファイバ１０５ａの他端に出射する。なお、励起用光源１０１は、３２５ｎｍの波長の励起光を発する光源であり、例えばハロゲンやキセノン光源のような管球タイプ、ＬＥＤ（ＤＯＷＡエレクトロニクス社製等）またはＬＤなどであればよい。
【００１２】
入射用光ファイバ１０５ａの出射側の端部は、例えば生物の評価対象に向けられる。これにより、評価対象に、励起用光源１０１が発する励起光を照射することができる。本願出願人は、生物は老化が進むにつれ、励起光により蛍光を発する蛍光物質の体内における蓄積量が増加することに着目した。蛍光物質とは、特定の波長の光により励起して蛍光を発する物質である。蛍光を励起させる光は、励起光と称される。
【００１３】
出射用光ファイバ１０５ｂは、入射用光ファイバの出射側の端部を入射側の端部とし、該入射側の端部より評価対象から発せられた蛍光が入射される。出射用光ファイバ１０５ｂにおける蛍光の出射側の端部は検出器１０３に接続されている。
【００１４】
検出器１０３は、蛍光を検出する機器であり、例えば、ＣＣＤ検出器ＩＬＸ５１１Ｂ（ＳＯＮＹ社製）やフォトディテクター；ＰＤ（Ｓｉ  ＰＩＮ  フォトダイオード  浜フォト製）ＣＭＯＳイメージセンサ、光電子倍増管（ＰＭＴ）、チャンネルトロン検出器などである。検出器１０３は、出射用光ファイバ１０５ｂを伝搬する蛍光を検出し、その結果を制御装置１に出力する。
【００１５】
制御装置１は、励起用光源１０１の輝度調整、照射または非照射の切換制御、データの記憶、データの表示およびデータの分析などが可能な装置であればよく、例えばパーソナルコンピュータである。制御装置１は、検出器１０３から入力された検出結果として、蛍光スペクトルをモニターに表示する。
【００１６】
図１１は、制御装置の構成の一例を示すブロック図である。図１１に示されるように、制御装置１は、制御部３００、操作部３１０、表示部３２０および記憶部３３０を備える。なお、制御装置１は例えばパーソナルコンピュータであり、そのハードウエア構成については周知であるので、ここでは詳細な説明は繰り返さない。制御装置１が備える制御部３００は、老化評価値算出部（老化評価値算出手段）３１１と、老化判定部（老化判定手段）３１３とを含む。
【００１７】
老化評価値算出部３１１は、老化の進行度合いを示す老化評価値を算出し、算出した老化評価値を老化判定部３１３に出力する。具体的には、測定蛍光強度と、記憶部３３０に記憶された基準の蛍光強度とに基づいて、測定蛍光強度に対する基準の蛍光強度の大きさの程度を示す値を老化評価値として算出する。測定蛍光強度は、検出器１０３から入力される蛍光強度である。老化評価値は、基準の蛍光強度に対する測定蛍光強度の差または比であればよい。
【００１８】
老化判定部３１３は、老化評価値算出部３１１により算出された老化評価値と記憶部３３０に記憶された老化評価データに基づいて、老化の進行度合いを判定し、表示部３２０を制御して、判定結果を表示部３２０に表示させる。老化評価データは、老化の進行度合いを老化評価値で定めたデータであり、複数の老化評価値の範囲それぞれに対して老化の進行度合いが関連付けられている。
【００１９】
老化判定部３１３は、記憶部３３０に記憶された老化評価データを参照して、老化評価データで示される複数の範囲のうち老化評価算出部３１１により算出された老化評価値が含まれる範囲を特定する。老化判定部３１３は、老化評価データにおいて特定された範囲に対応する老化の進行度合いを判定結果として表示部３２０に出力する。
【００２０】
＜老化評価方法＞
ここで、老化評価装置１００を用いた老化評価方法について説明する。老化の評価に備えて、老化マーカーとなる蛍光スペクトルを特定した。具体的には、市販（日立製蛍光分光高度計  ＦＬ−４５００）を用いて、励起用光源が発する光を２５０〜４００ｎｍの範囲で調整し、老化モデル生物の老齢期と若齢期に照射した。これにより、特に老化モデル生物の老齢期において、特徴的な蛍光スペクトルを確認することができた。なお、用いた老化モデル生物は、線虫であり、線虫はヒトの老化モデルに適用できることが一般的に知られている。
【００２１】
図２は、老化モデル生物に励起光を照射したときにおける励起光の波長と蛍光スペクトルとの関係を示した図である。縦軸は２５０〜４００ｎｍまでの励起光の波長を示し、横軸は蛍光スペクトルを示す。図２には、励起光の波長に応じた蛍光スペクトルがプロットされている。図２において、鳥瞰図の密度が高いところが特定の励起光の波長に応じて蛍光を発したスペクトルを示しており、図２より、波長３２５ｎｍの励起光（Ｅｘ）で励起した場合に４２０ｎｍの蛍光スペクトル（Ｅｍ）が存在することが確認された。このため、Ｅｘ：３２５ｎｍで励起させることにより、Ｅｍ:４２０ｎｍを発する蛍光物質が加齢に伴い体内に蓄積される物質であると想定し、Ｅｘ:３２５ｎｍ、Ｅｍ:４２０ｎｍを老化マーカーとして用いた実験を行うこととした。
【００２２】
図３は、老化モデル生物の加齢に伴う蛍光強度の増大を示すグラフである。横軸が波長を示し、縦軸が蛍光強度を示す。図３に示されるように、複数の曲線（１）〜（９）それぞれは、老化モデル生物の異なる測定時期における蛍光強度を示す。具体的には、生後３日齢から２日ごとに、寿命を迎える１７日齢までの各年齢時を測定時期として、蛍光強度を測定することにより得られた曲線である。
【００２３】
蛍光マーカーは上述のＥｘ:３２５ｎｍ、Ｅｍ:４２０ｎｍとした。また、タンパク質濃度を規格化するため、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度の定量を行い、０．２ｍｇ／ｍｌ相当量として測定時期に蛍光強度を測定した。その結果、図示のように蛍光強度は生後３日齢から５日齢になると増加する蛍光を示した。また、７日齢から１３日齢にかけては、非常に類似した蛍光強度となることが観察された。この老化モデル生物は５日齢から産卵期を迎えるため、この時期に徐々に体内で生成される成長因子の変化に伴って、蛍光物質の生産が体内で起こっていることが示唆される。また、１７日齢では、老化モデル生物が寿命を向かえ、１５日齢までの曲線に比べて高い蛍光強度を示している。このことから、１７日齢では、酸化ストレスを受けている可能性が高いと予想される。
【００２４】
図３の結果から、３日齢と１７日齢とを比べて、１７日齢で蛍光強度が高くなる蛍光物質が体内で生産されていると予想できたため、この蛍光物質を同定した。具体的には、ＬＣ−ＭＡＬＤＩという分析装置（ＡＢＳｃｉｅｘ社  ＬＣ−ＭＡＬＤＩ  ＱＳＴＡＲ  ５８００）を利用して蛍光物質の構造を解析した。液体クロマトグラフィにより、３日齢と１７日齢の構造解析結果を比較することで、明らかに１７日齢で増加が認められる蛍光強度の蛍光物質について、カラムを用いて分取を行い、その蛍光物質の構造を解析した。
【００２５】
タンパク質データベース（公開データベース  Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ）により同定されたピークより、１７日齢ではＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒとＶｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ−２，５，６が確認された（図４参照）。Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒは加齢に伴い酸化することが知られており、ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎは卵黄ホルモンの前駆体タンパク質であり、腸管に蓄積することが報告されている。どちらのタンパク質も加齢に伴ってＡＧＥ化した物質が蛍光を発している。
【００２６】
図５は、老化に伴って増加するタンパク質を糖化させることにより得られる蛍光スペクトルを示す図である。励起光（Ｅｘ）の波長は３２５ｎｍである。ここでは、老化に伴って増加するタンパク質として、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎを対象とした。これらタンパク質をグルコース溶液と混合し、３５℃で１０日間インキュベートさせることにより、糖化させた。図５に示される複数の曲線は、これらタンパク質の糖化物質の蛍光スペクトルを示す。
【００２７】
図５に示されるように、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒの糖化物質の蛍光スペクトル（Ｅｍ）は４２０ｎｍにおいて蛍光強度が高いことがわかる。すなわち、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒの糖化物質はＥｘ:３２５ｎｍ、Ｅｍ:４２０ｎｍの蛍光マーカーと高い相関性があることが確認された。この結果により、Ｅｘ:３２５ｎｍ、Ｅｍ:４２０ｎｍの蛍光マーカーは、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒを主成分とする蛍光物質であることが明らかとなった。
【００２８】
なお、ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎは、構造解析において老化マーカーとしての可能性があったが、Ｅｘ:３２５ｎｍの励起条件で蛍光強度が低いことや、分子構造として蛍光を発しないことを確認したため、Ｅｘ:３２５ｎｍ、Ｅｍ:４２０ｎｍの蛍光マーカーの対象から除外した。
【００２９】
次に、上述のような老化評価方法を用いて、同一日齢の２匹の老化モデル生物それぞれに異なる餌を与えたときに得られた蛍光スペクトルを測定した。図６は、７日齢の２匹の老化モデル生物それぞれに異なる餌を与えたときに得られた蛍光スペクトルを示す図である。励起光（Ｅｘ）の波長は３２５ｎｍである。一方の老化モデル生物Ａには、通常の餌を与え、もう一方の老化モデル生物Ｂには長寿命化物質を含んだ餌を与えた。長寿命化物質は、ビタミンＣとした。
【００３０】
図６に示されるように、老化モデル生物Ａに比べて、老化モデル生物Ｂについての蛍光強度が低下した。これより、老化モデル生物Ｂにおいて、老化に伴って増加するＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒを低下させることができたことがわかる。そして、このことから、長寿命化物質を投与したことが、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒの増加を抑える効果として適していたと判断することができ、老化評価方法が正しいことが立証された。さらに、老化評価方法は、長寿命化効果についての指針を得ることができた。
【００３１】
また、この老化モデル生物は、ヒトの老化モデルにも適用できることから、ヒトの長寿命化効果についての指針を得ることができる。なお、ヒトの長寿命化を促進する方法として、長寿命化物質を投与する方法以外に、抗酸化物質して、ポリフェノール類、ビタミン類、カロテノイド類、グルタチオン、ユビキノールなどの補酵素類、尿酸またはリポ酸などを投与してタンパク質の酸化を抑える方法による長寿命化、運動による長寿命化、ストレスを抑えることによる長寿命化などのスクリーニングを可能とすることは自明である。
【００３２】
＜変形例１＞
変形例１における老化評価装置は、評価対象が溶液状のものであるときに、蛍光を検出する構成である。図７は、変形例１における老化評価装置の構成の一例を示す図である。図７に示されるように、老化評価装置１００Ａは、制御装置１と測定ユニット１１０とを備える。測定ユニット１１０は、その筐体内に励起用光源１０１と、検出器１０３と、セルホルダー１１１とが配置される。励起用光源１０１は、励起光をセルホルダー１１１に向けて照射する。セルホルダー１１１には、溶液状の評価対象が入った透明な容器が配置され、励起用光源１０１から発せられた励起光が溶液状の評価対象を透過し、検出器１０３に入射される。
【００３３】
＜変形例２＞
変形例２においては、本実施形態における老化評価装置１００に指尖測定装置を備える構成である。その他の構成および機能は、老化評価装置１００と同じであるので、ここでは説明を繰り返さない。
【００３４】
図８は、指尖測定装置の構成の一例を示す図である。図８に示されるように、指尖測定装置２００は、指先挿入部２１０と測定部材配置部２２０とを有する。測定部材配置部２２０は、指先挿入部２１０と連通する部分に、指先を接触させる測定台２１１を有している。測定台２１１は、後述する測定プローブ１０５からの励起光を取り出すために５〜１０ｍｍφの穴が設けられ、その穴に石英のカバーガラス（図示せず）が設置されている。指先挿入部２１０は、指先を挿入するための挿入孔２１５と空間を有している。
【００３５】
また、測定部材配置部２２０には、測定プローブ１０５における入射用光ファイバ１０５ａの出射側であると共に出射用ファイバ１０５ｂの入射側となる端部が、測定台２１１のカバーガラスに向けられた状態で配置される。これにより、指先挿入部２１０より挿入され、測定台２１１に載せられる指先に励起光を照射することができると共に、照射された励起光によって指先から発せられた光を検出器１０３に導くことができるので、その蛍光を検出することができる。
【００３６】
また、ユーザが指先挿入部２０１に指を挿入したとき、測定台２１１の存在により、指が測定プローブ１０５の先端を押し込むことを防ぐので、出射用ファイバ１０５ｂの入射側となる端部と対象物（指先）との距離関係を一定に保つことができる。なお、測定台２１１は、出射用ファイバ１０５ｂの入射側となる端部の径より大きく設定している。これにより、赤外線カメラを使用して、指先の血管の位置を測定することも可能としている。
【００３７】
指先は、ＡＧＥ化した物質が溜まりやすい場所である。したがって、ＡＧＥ化した物質が発する蛍光を測定する場所を指先とすることで、測定精度を上げることができる。加えて、指先にはメラニンが存在しない為、経皮蛍光測定の際にメラニンによる励起光の吸収について、留意する必要が無い。すなわち、日焼けの影響や人種の違いによる影響（有色人種でも白色人種でも測定できるなど）を排除して、老化の進行度合いを評価することができる。
【００３８】
＜変形例３＞
変形例３における老化評価装置は、測定プローブ１０５を用いずに、指先挿入部２１０に向けて励起光を照射し、蛍光を検出する構成である。変形例２における指尖測定装置２００と異なる点について主に説明する。図９は、変形例３における老化評価装置の構成の一例を示す図である。図９に示されるように、老化評価装置１００Ｂが備える励起用光源１０１と検出器１０３は、測定部材配置部２２０内に配置され、指先挿入部２１０の下方に、反射鏡２１３が水平方向に対して所定の角度で配置される。
【００３９】
反射鏡２１３は、励起用光源１０１から発せられた励起光を反射し、指先挿入部２１０の空間に向けて出射する。このため、指先挿入部２１０に指先が挿入されることにより、指先に励起光を照射することができる。また、指先に励起光が照射されることにより発せられた蛍光は、測定部材配置部２２０の空間に向けて出射され、反射鏡２１３に反射され、検出器１０３に入射される。
【００４０】
＜変形例４＞
変形例４における老化評価装置は、図１０に示されるように先端が９０度湾曲した測定プローブ１０５Ａを備える構成であり、その他の構成は本実施形態における老化評価装置１００と同じであるので、ここでは説明を繰り返さない。測定プローブ１０５Ａは、その支柱を固定軸に固定されているため、励起光は基本的に下方へ発生する。このため、老化モデル生物培養容器での測定を簡便にすることが可能である。また、９０°の曲がりがあることで、測定者の目に直接光が入る懸念が著しく低減させる。
【００４１】
〔まとめ〕
以上のように、本発明の一態様に係る老化評価方法は、生物の加齢とともに体内に増加する蛍光物質に基づいて、老化の進行度合を評価する。
【００４２】
上記の方法によれば、老化の評価対象を蛍光物質としているので、遺伝子解析のような高額な装置および煩雑な処理は不要である。そして、加齢とともに体内に増加する蛍光物質を特定するだけで良いので、老化の評価が簡単であり、その場で評価することも可能である。したがって、遺伝子解析などを用いることなくその場で簡易に老化を評価することができる。また、糖化による肌の老化を測定する装置が開発され、抗加齢化粧品、抗加齢サプリメントの効果を見せる化できるといった応用が考えられる。
【００４３】
また、本発明の一態様に係る老化評価方法は、所定範囲の波長の励起光を前記生物に照射することによって、若齢期に比べて老齢期に特徴的な前記蛍光物質が発する蛍光スペクトルの蛍光強度を測定することで、老化の進行度合を評価する。
【００４４】
また、本発明の一態様に係る老化評価方法において、前記励起光の波長は、３０５〜３６５ｎｍの範囲であることが好ましい。
【００４５】
また、本発明の一態様に係る老化評価方法において、前記蛍光物質が最大の蛍光強度となる蛍光スペクトルは、４００〜４７０ｎｍ±半値幅の範囲に含まれることが好ましい。
【００４６】
なお、本実施形態、変形例１〜４において、測定条件を一定にする為、励起光の出力を常に一定にするような制御回路を追加しても良い。市販の蛍光分光光度計は、装置が大掛かりで汎用性がないため、測定にスペース的、コスト的な制約が発生してしまうからである。
【００４７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００４８】
１  制御装置
１００，１００Ａ，１００Ｂ  老化評価装置
１０１  励起用光源
１０３  検出器
１０５，１０５Ａ  測定プローブ
１０５ａ  入射用光ファイバ
１０５ｂ  出射用光ファイバ
１１０  測定ユニット
１１１  セルホルダー
２００  指尖測定装置
２１０  指先挿入部
２１１  測定台
２１３  反射鏡
２１５  挿入孔
２２０  測定部材配置部
３００  制御部
３１１  老化評価値算出部（老化評価値算出手段）
３１３  老化判定部（老化判定手段）
【図１】
2014062740.tif 000003
【図２】
2014062740.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014062740.tif 000009
【図８】
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【図９】
2014062740.tif 000011
【図１０】
2014062740.tif 000012
【図１１】
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