(57)【要約】【課題】ヒトＣＧＲＰ受容体結合タンパク質の提供。【解決手段】ヒトＣＧＲＰ受容体（ＣＧＲＰ  Ｒ）に結合する抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質をコードする核酸、ベクター、および抗原結合タンパク質をコードする細胞も提供される。本抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  ＲのＣＧＲＰへの結合を阻害することができ、片頭痛の治療および／または予防を含む、多数のＣＧＲＰ  Ｒ関連疾患において有用である。したがって、ＣＧＲＰ  Ｒに対する所定の抗原結合タンパク質の結合は、以下の活性のうちの１つまたは複数を有し得る：ＣＧＲＰ  Ｒの阻害、干渉、または調節、血管拡張の阻害、神経性炎症の減少、および慢性疼痛または片頭痛の症状の緩和、改善、治療、予防、または軽減。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２００９年１２月１４日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ１４７２ＰＣＴ．ｔｘｔと命名され、サイズは３１２，４４７バイトである。
【０００２】
ペプチドのカルシトニンスーパーファミリーには、カルシトニン、アミリン、アドレノメデュリン、ならびに２つのカルシトニン遺伝子関連ペプチド（「ＣＧＲＰ」）である、ＣＧＲＰ１（ｃｔＣＧＲＰまたはＣＧＲＰとしても知られる）およびＣＧＲＰ２（βＣＧＲＰとしても知られる）の少なくとも５つの既知のメンバーが含まれる。ＣＧＲＰは、中枢および末梢神経系の両方で発現する３７個のアミノ酸の血管作動性神経ペプチドであり、ＣＧＲＰ含有ニューロンが血管と密接に関連する、末梢における強力な血管拡張薬であることが示されている。ＣＧＲＰ媒介性血管拡張薬は、血漿の溢出および微小血管系の拡張をもたらす事象の連鎖の一部として、神経性炎症とも関連付けられ、片頭痛に見られる。アミリンも、ＣＮＳにおいて特定の結合部位を有し、胃内容排出を調節し、炭水化物の代謝において役割を果たすと考えられている。アドレノメデュリンは、強力な血管拡張薬である。アドレノメデュリンは、星状細胞上に特定の受容体を有し、そのメッセンジャーＲＮＡは、虚血になりやすいＣＮＳ細胞において上方調節される（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｌｉｏｍａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ（ＮＧ１０８−１５），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７２４：２３８−２４５（１９９６）（非特許文献１）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｒｔｅｘ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｎｇ  ｆｏｃａｌ  ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄａｍａｇｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１４８０−１１４８４（１９９５））。
【０００３】
カルシトニンは、骨代謝の制御に関与し、中枢神経系（ＣＮＳ）においても活性である。ＣＧＲＰの生物活性は、神経筋接合部の調節、免疫系内の抗原提示の調節、感覚神経伝達の血管緊張の調節を含む（Ｐｏｙｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｃｔｉｏｎｓ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５６：２３−５１（１９９２）、Ｍｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｍｙｌｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１３３：１７−２０（１９９５））。３つのカルシトニン受容体刺激ペプチド（ＣＲＳＰ）も、多数の哺乳類種において同定され、ＣＲＳＰは、ＣＧＲＰファミリーにおいて新しいサブファミリーを形成し得る（Ｋａｔａｆｕｃｈｉ，Ｔ  ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２５（１１）：２０３９−２０４５（２００４））。
【０００４】
カルシトニンスーパーファミリーペプチドは、７つの膜貫通ドメインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を介して作用する。カルシトニン受容体（「ＣＴ」、「ＣＴＲ」、または「ＣＴ受容体」）およびＣＧＲＰ受容体は、ＩＩ型（「ファミリーＢ」）ＧＰＣＲであり、このファミリーは、調節ペプチド、例えば、セクレチン、グルカゴン、および血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）を認識する他のＧＰＣＲを含む。最良に特性化されたヒトカルシトニン受容体のスプライス変異は、第１の細胞内ループにおける１６個のアミノ酸の存在（以前はＣＴＲＩＩ＋またはＣＴＲ１、現在はＣＴ（ｂ）として知られる）または不在（主要なスプライス変異、以前はＣＴＲＩＩまたはＣＴＲ２、現在はＣＴ（ａ）として知られる）によって異なる（Ｇｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ  ｏｆ  ｂｏｎｅ：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：２６８０−２６９１（１９９５）、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３２：８６５−８６７（２００４）；Ｐｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。少なくとも２つのＣＧＲＰ受容体サブタイプの存在が、様々なインビボおよびインビトロバイオアッセイにおいて、特異的なアゴニスト親和性およびアゴニスト効力から提案されていた（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＧＲＰ８−３７，Ａ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５４：１２３−１２８（１９９０）、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５１：７１８−７２５（１９８９）、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＣＧＲＰ２  ａｇｏｎｉｓｔ，［Ｃｙｓ（Ｅｔ）２，７］ｈＣＧＲＰ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ  ＣＧＲＰ１  ａｎｄ  ＣＧＲＰ２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７５：６７１−６７６（１９９７））。
【０００５】
ＣＧＲＰ１受容体サブタイプは、アンタゴニスト断片ＣＧＲＰ（８−３７）に対して敏感であることが分かっている（Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＧＲＰ−（８−３７），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５６：Ｅ３３１−Ｅ３３５（１９８９）、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、Ｍｉｍｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５８：１０８４−１０９０（１９９１））。対照的に、ＣＧＲＰ２受容体は、線形ヒトＣＧＲＰ（ｈＣＧＲＰ）類似体に敏感であり、２位および７位におけるシステイン残基が、（例えば、アセトアミノメチル［Ｃｙｓ（ＡＣＭ）２，７］またはエチルアミド［Ｃｙｓ（Ｅｔ）２，７］）により誘導体化されたが、ＣＧＲＰ２受容体は、断片ＣＧＲＰ（８−３７）に対して敏感でなかった（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７））。
【０００６】
カルシトニン受容体およびカルシトニン様受容体（「ＣＬ」、「ＣＬＲ」、または「ＣＲＬＲ」）のリガンド特異性は、受容体活性調節タンパク質（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＡＭＰ））と呼ばれる付属タンパク質ファミリーメンバーの共発現に依存する。ＲＡＭＰファミリーは、カルシトニンファミリーメンバーの受容体のリガンド特異性を決定する受容体モジュレータとして作用する、３つのポリペプチド（ＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２、およびＲＡＭＰ３）を含む。ＲＡＭＰは、短細胞質Ｃ末端と１つの膜貫通ドメイン、および特異性に関与する大きい細胞外Ｎ末端と、約３０％のアミノ酸配列同一性および共通の予測トポロジーを共有する、Ｉ型膜貫通タンパク質である（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＲＡＭＰｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：３３３−３３９、Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５：１０５４−１０５９）。
【０００７】
１９９８年、ＣＧＲＰ１受容体は、新規の単一膜貫通ドメイン付属タンパク質、受容体活性調節タンパク質１（ＲＡＭＰ１）、およびＣＲＬＲで構成される、ヘテロ二量体として同定された（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。架橋実験は、ＣＧＲＰ受容体が、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の１対１化学量論配置から成ることを示唆し（Ｈｉｌａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ２７６，４２１８２−４２１９０（２００１））、ＢＲＥＴおよびＢｉＦＣ等のいくつかの方法を使用した最近の研究では、機能的ＣＧＲＰ受容体複合体が、ＣＲＬＲの非対称ホモオリゴマーおよびＲＡＭＰ１のモノマーで構成され得ることが明らかになった（Ｈｅｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ２８２，３１６１０−３１６２０（２００７））。
【０００８】
精製したＣＲＬＲ  Ｎ末端ドメインは、１２５Ｉ−ＣＧＲＰと特異的に結合することが示されており（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，７８２（２００５））、ＣＲＬＲとＣＧＲＰリガンドとの間の重要な直接相互作用が確認されている。特に、ＣＲＬＲのＬｅｕ２４およびＬｅｕ３４が、ＣＧＲＰのＣ末端Ｐｈｅ３７のドッキング部位を構成すると考えられている（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６，９（２００６））。さらに、Ｋｏｌｌｅｒら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３１，４６４−４６８（２００２））は、ＣＲＬＲのＮ末端１８アミノ酸残基が、ＣＧＲＰまたはアドレノメデュリンとの選択的相互作用に寄与するという証拠を得、Ｉｔｔｎｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，５７４９−５７５４（２００５））は、ＣＲＬＲのＮ末端アミノ酸残基２３−６０が、ＲＡＭＰ１との関連を媒介することを示唆した。
【０００９】
ＲＡＭＰ１の構造機能分析は、「ヘリックス３」と相関する残基９１−１０３が（Ｓｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９１，６６２−６６９（２００６））、ＣＲＬＲとの相互作用において潜在的に重要であることを同定し、残基Ｔｒｐ７４およびＰｈｅ９２が、ＣＧＲＰ受容体複合体へのその結合に関連して、ＣＧＲＰリガンドと潜在的に相互作用することを同定した。ヒト／ラットＲＡＭＰ１キメラを使用するリガンド結合研究は、ＣＧＲＰ  Ｒのある種の小分子阻害剤の結合部位（例えば、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ）が、ＲＡＭＰ１のアミノ酸６６−１０２を含む領域内に位置することを示唆する（Ｍａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ２７７，１４２９４−１４２９８（２００２））。
【００１０】
ＣＲＬＲは、ＣＴＲと５５％の全体アミノ酸配列同一性を有するが、膜貫通ドメインは、約８０％同一である（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｐｏｙｎｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＸＸＸＩＩ．Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，ａｍｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５４：２３３−２４６（２００２））。
【００１１】
ＣＲＬＲは、ＲＡＭＰ１と会合されると、ＣＧＲＰに対する高親和性受容体を形成するか、またはＲＡＭＰ２あるいはＲＡＭＰ３と会合されると、アドレノメデュリンを選択的に結合することが示されている（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｓｅｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１３：７３−８３（２００１）、Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（Ｐａｒｔ  ４）：４５１−４５４（２００２））。ＣＲＬＲのグリコシル化状態は、その薬物動態と関連する。ＲＡＭＰ１、２、および３は、同様の効率でＣＲＬＲを細胞膜に輸送する。しかしながら、ＲＡＭＰ１は、ＣＲＬＲを末端グリコシル化成熟糖タンパク質およびＣＧＲＰ受容体として提示する一方で、ＲＡＭＰ２および３は、ＣＲＬＲを未成熟のコアグリコシル化アドレノメデュリン受容体として提示する（「ＡＭ」または「ＡＭＲ」または「ＡＭ受容体」（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））。放射性リガンド結合（放射性リガンドとしての１２５Ｉ−アドレノメデュリン）、機能検定（ｃＡＭＰ測定）、または生化学分析（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ２およびＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ３受容体の特性化は、ＲＡＭＰ２および３が３０％のアミノ酸配列同一性しか共有しない場合であっても、それらが区別できないことを明らかにした（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９））。しかしながら、ＲＡＭＰ２と３により発現されたＣＲＬＲの薬理学において、差異が認められた。ＣＧＲＰおよびＣＧＲＰ８−３７、ならびにアドレノメデュリンおよびアドレノメデュリン由来ペプチドＡＭ２２−５２はともに、ＲＡＭＰ３ヘテロ二量体において活性であり、この複合体が、ＣＧＲＰおよびＡＭ受容体の両方として作用し得ることを示している（Ｈｏｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４０：４７７−４８６（２００３）、Ｍｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．Ｒｅｓ．，２６：Ｓ３−Ｓ８（２００３））。ラットＲＡＭＰ１によるヒトＣＲＬＲの共発現、およびその逆は、ＲＡＭＰ１種が、試験したいくつかの小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストに関して、ＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１の薬理学的特徴を決定することを示唆した（Ｍａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＧＲＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１６）：１４２９４−１４２９８（２００２））。ＲＡＭＰと会合されない限り、ＣＲＬＲは、いかなる内因性リガンドと結合することも知られておらず、現在、ＣＲＬＲがこのように振舞うと考えられている唯一のＧＰＣＲである（Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ
ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  Ｂ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６７（１）：２０−３１（２００５））。
【００１２】
カルシトニン受容体（ＣＴ）も、ＲＡＭＰとヘテロ二量体複合体を形成することが証明されており、これはアミリン受容体として知られている（「ＡＭＹ」、「ＡＭＹ  Ｒ」または「ＡＭＹ受容体」）。一般的に、ＣＴ／ＲＡＭＰ１受容体（「ＡＭＹ１」または「ＡＭＹ１」と称される）は、サケカルシトニン、アミリン、およびＣＧＲＰに対して高い親和性を有し、哺乳類カルシトニンに対して低い親和性を有する。ＣＴ／ＲＡＭＰ２受容体（「ＡＭＹ２」または「ＡＭＹ２」）およびＣＴ／ＲＡＭＰ３受容体（「ＡＭＹ３」または「ＡＭＹ３」）の場合、主として同様のパターンが認められるが、ＣＧＲＰに対する親和性はより低く、生理的に適切なリガンド濃度において有意となり得ない。正確な受容体発現型は、受容体細胞型およびＣＴＲスプライス変異（ＣＴ（ａ）またはＣＴ（ｂ））に依存し、特にＲＡＭＰ２生成アミリンについてそれがあてはまる。例えば、破骨細胞様細胞の純粋集団は、ＲＡＭＰ２、ＣＴＲ、およびＣＲＬＲを発現したが、ＲＡＭＰ１またはＲＡＭＰ３を発現しなかったことが報告されている（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｍｙｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｒｉｓｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５６：２３５−２４２（１９９９）、Ｍｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｍｙｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１  ｏｒ  −３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０：２９２４−２９２７（１９９９）、Ｓｅｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｌｅｕｔｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｏｒｍｓ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５１：３４７−３５１（２０００）、Ｔｉｌａｋａｒａｔｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＲＡＭＰ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９４：６１−７２（２０００）、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃ��ｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，３４：２５７−２６１（２００５））。
【００１３】
以下の表１は、上述の受容体成分の関係を要約する。
【００１４】
【表１】
2014210815.tif 000002
【００１５】
ＣＧＲＰアンタゴニストの治療的使用が提案されている。Ｎｏｄａらは、血小板凝集を阻害するため、および動脈硬化または血栓症の治療または予防のためのＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ誘導体の使用について説明した（欧州特許第ＥＰ０３８５７１２  Ｂ１号）。Ｌｉｕらは、カルシトニンおよびヒトαＣＧＲＰ等の媒体共役ペプチドを含む、ＣＴＲの活性を調節する治療薬を開示した（国際公開第ＷＯ０１／８３５２６  Ａ２号、第ＵＳ２００２／００９０６４６  Ａ１号）。血管作用ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、およびＣＧＲＰがＣＧＲＰ受容体に結合することを阻害するための方法におけるそれらの使用が、Ｓｍｉｔｈらによって開示され、そのようなＣＧＲＰペプチドアンタゴニストは、ＣＧＲＰが冠動脈膜に結合することを阻害し、カプサイシン処置したブタ冠動脈を弛緩させることが示された（米国特許第６，２６８，４７４  Ｂ１号、および米国特許第６，７５６，２０５  Ｂ２号）。Ｒｉｓｔらは、ＣＧＲＰ受容体アンタゴニスト活性を有するペプチド類似体、および多様な疾患の治療および予防のための薬物におけるそれらの使用を開示した（独国特許第ＤＥ  １９７３２９４４  Ａ１号）。
【００１６】
ＣＧＲＰは、多数の血管運動症状、例えば、片頭痛（前兆の有無にかかわらず）および群発頭痛を含む血管性頭痛のすべての形態の病理において関連があるとされている、強力な血管拡張因子である。Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１０７３−１０７５，２００４。片頭痛の病態生理は、ＣＧＲＰが位置する三叉神経節の活性化を伴い、ＣＧＲＰレベルは、片頭痛発作中に有意に増加する。これは、次いで、頭蓋血管拡張、神経原性炎症および感作を促進する（Ｄｏｏｄｓ，Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２：１２６１−１２６８（２００１））。さらに、外部頸静脈中のＣＧＲＰ血清レベルが、片頭痛中の患者において上昇する。Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２８：１８３−７，１９９０。ヒトｃｉ−ＣＧＲＰの静脈内投与は、前兆のない片頭痛を患う患者において、頭痛および片頭痛を誘発し、ＣＧＲＰが、片頭痛の原因となる働きがあるという見解を支持している（Ｌａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  ２２：５４−６１，２００２）。
【００１７】
片頭痛は、複雑で、よく発症する神経学的状態であり、重度の一時的頭痛発作、および吐き気、嘔吐、光、音、または運動への過敏症を含む、それに伴う症状により特徴付けられる。一部の患者において、頭痛には前兆が先行するか、または前兆を伴う。頭痛は重度であり得、特定の患者においては片側性でもあり得る。片頭痛発作は、日常生活に悪影響を及ぼす。米国および西欧諸国では、片頭痛患者の全体罹患率は、人口の１１％である（男性６％、女性１５〜１８％）。さらに、個人の発作頻度の中央値は、１．５／月である。症状を緩和または軽減するために使用可能な治療は多数あるが、１ヶ月当たり３〜４回を超える発作を経験する患者に対しては、予防療法が推奨されている。Ｇｏａｄｓｂｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（４）：２５７−２７５，２００２。一部の片頭痛患者は、電位依存性ナトリウムチャネルおよびある種のグルタミン酸塩受容体（ＡＭＰＡ−カイニン酸）を遮断し、ＧＡＢＡ−Ａ受容体活性を増強し、炭酸脱水酵素を遮断する抗けいれん剤である、トピラマートにより治療されている。一部の患者における、スマトリプタン等のセロトニン５ＨＴ−Ｉ  Ｂ／ＩＤおよび／または５ＨＴ−１ａ受容体アゴニストの比較的最近の成功により、研究者による疾患のセロトニン作動性の病因の提案が導かれた。残念ながら、この治療に対して良好に応答する患者もいれば、その効果に対して比較的耐性がある患者もいる。
【００１８】
片頭痛におけるＣＧＲＰ関与の可能性が、ＣＧＲＰの放出を阻害するか（例えば、スマトリプタン）、ＣＧＲＰ受容体において拮抗するか（例えば、ジペプチド誘導体ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＣＧＲＰ（８−３７））、または受容体関連タンパク質のうちの１つもしくは複数、例えば、ＲＡＭＰ１と相互作用する、多数の化合物の開発および試験の基礎となっている。Ｂｒａｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２３：５１−５３，２００２。α−２アドレノセプターサブタイプおよびアデノシンＡ１受容体も、ＣＧＲＰの放出および三叉神経の活性化を制御（阻害）する（Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １２５：１３９２−４０１，２００２）。一方、神経原性炎症の活性化のみを阻害（例えば、タキキニンＮＫＩ受容体アンタゴニスト）または三叉神経の活性化のみを阻害（例えば、５ＨＴ１０受容体アゴニスト）する化合物による治療は、片頭痛の急性治療として比較的有効ではないと見られ、一部研究者は、ＣＧＲＰの放出を阻害することが、有効な抗片頭痛治療の基礎となるか否かについて疑問視するようになっている。Ａｒｕｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５００：３１５−３３０，２００４。
【００１９】
片頭痛の正確な病態生理は、未だ十分理解されていないが、ＣＧＲＰアンタゴニストおよびＣＧＲＰ標的アプタマーの治療的使用が、片頭痛および他の疾患の治療に対して提案されている（例えば、Ｏｌｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＢＩＢＮ  ４０９６  ＢＳ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｇｒａｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：１１０４−１１１０（２００４）、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ：ＣＧＲＰ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ――  ａ  ｆｒｅｓｈ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｉｇｒａｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：１０７５（２００４）、Ｖａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ  ｔｏ  ｍｉｇｒａｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ：ｔａｉｌｏｒｅｄ−ＳＥＬＥＸ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（２１  ｅ１３０）：１−７（２００３）、国際公開第ＷＯ９６／０３９９３号）。さらに、強力な小分子ＣＧＲＰアンタゴニストが、最近の第３相臨床試験において、片頭痛および片頭痛関連症状を含む、中度から重度の片頭痛発作を緩和することが示された（Ｃｏｎｎｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｅｌｃａｇｅｐａｎｔ（ＭＫ−０９７４），ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｏｒａｌ  ＣＧＲＰ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｆｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｉｇｒａｉｎｅ  Ａｔｔａｃｋｓ．Ｐｏｓｔｅｒ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｍｉｇｒａｉｎｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８）。
【００２０】
ＣＧＲＰは、片頭痛以外の慢性疼痛症候群にも関与し得る。齧歯類において、髄腔内送達されたＣＧＲＰは、重度の疼痛を誘発し、多数の疼痛モデルにおいてＣＧＲＰレベルが増強される。さらに、ＣＧＲＰアンタゴニストは、齧歯類において、急性膵炎の痛覚を部分的に遮断する（Ｗｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
１３９，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｐａｇｅｓ  １９７−２０１）。併せて、これらの観察は、強力で選択的なＣＧＲＰ受容体アンタゴニストが、片頭痛を含む慢性疼痛の治療のための有効な治療薬となり得ることを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｌｉｏｍａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ（ＮＧ１０８−１５），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７２４：２３８−２４５（１９９６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本明細書では、ＣＧＲＰ  Ｒ、特に霊長類ＣＧＲＰ  Ｒ、例えば、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに結合する単離抗体、その抗原結合断片、および他の単離抗原結合タンパク質について説明する。そのような単離抗原結合タンパク質は、（霊長類ＡＭ１、ＡＭ２、ＣＴ、またはアミリン受容体と比較して）選択的にＣＧＲＰ  Ｒを阻害し得、ＣＧＲＰ  ＲのＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１成分の両方に結合し得る。ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒに関連する生物学的反応のうちの少なくとも１つを阻害するか、干渉するか、または調節することが分かっており、したがって、ＣＧＲＰ  Ｒ関連疾患または障害の影響を改善するために有用である。したがって、ＣＧＲＰ  Ｒに対する所定の抗原結合タンパク質の結合は、以下の活性のうちの１つまたは複数を有し得る：ＣＧＲＰ  Ｒの阻害、干渉、または調節、血管拡張の阻害、神経性炎症の減少、および慢性疼痛または片頭痛の症状の緩和、改善、治療、予防、または軽減。
【００２３】
典型的な一態様において、単離抗原結合タンパク質は、（ＡＭ１、ＡＭ２、ＣＴまたはアミリン受容体と比較して）ヒトＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、選択比５０以上、７５以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、４００以上、５００以上、７５０以上、または１０００以上で、ヒトＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する。選択的阻害の程度は、任意の適切な方法を使用して、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して決定することができる。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＡＭＰ１の両方に特異的に結合し、ヒトＡＭ１、ヒトＡＭ２、またはヒトアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１またはＡＭＹ２）に対して特異的に結合しない。例えば、単離抗原結合タンパク質は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＧＲＰ  Ｒと特異的に結合し得る。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定され、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載される方法を使用して分析して、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＧＲＰ  Ｒと特異的に結合する。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ結合競合検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下である。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下である。
【００２４】
別の典型的な態様において、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒの細胞外部分への結合に対して、配列番号１５８〜１７０から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１３７〜１５３から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む基準抗体と競合する。一部の実施形態において、結合競合は、ビニング検定を使用して、例えば、本明細書の実施例７に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ検定を使用して評価される。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して、（ｉ）配列番号１６１、１６３、１６４、１６６、および１６８から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号１４０、１４３、１４６、１４８、および１５０から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、基準抗体と競合する。所定の実施形態において、基準抗体は、（ｉ）配列番号３２、３４、３５、３７、および３９から成る群から選択される配列によって定義される重鎖、および（ｉｉ）配列番号１５、１８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列によって定義される軽鎖を含む。一部の特定実施形態において、基準抗体は、以下の配列対：（ｉ）配列番号３２および配列番号１５、（ｉｉ）配列番号３４および配列番号１８、（ｉｉｉ）配列番号３５および配列番号２１、（ｉｖ）配列番号３７および配列番号２３、ならびに（ｖ）配列番号３９および配列番号２５のうちの１つによって定義される重鎖および軽鎖を含む。そのような一実施形態において、基準抗体は、配列番号３２を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む。別のそのような実施形態において、基準抗体は、配列番号３４を含む重鎖と、配列番号１８を含む軽鎖とを含む。別のそのような実施形態において、基準抗体は、配列番号３５を含む重鎖と、配列番号２１を含む軽鎖とを含む。別のそのような実施形態において、基準抗体は、配列番号３７を含む重鎖と、配列番号２３を含む軽鎖とを含む。別のそのような実施形態において、基準抗体は、配列番号３９を含む重鎖と、配列番号２５を含む軽鎖とを含む。
【００２５】
所定の実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質は、選択率１００以上、２５０以上、５００以上、７５０以上、１，０００以上、２，５００以上、５，０００以上、または１０，０００で、ヒトＣＧＲＰ受容体も選択的に阻害し、そのような選択性は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して決定され得る。関連実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定し、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載される方法を使用して分析して、ＫＤが１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒと特異的に結合する。関連実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞からの膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下である。
【００２６】
上述の実施形態のうちのいずれにおいても、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体、またはその抗原結合断片であってもよい。さらに、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二特異性抗体または単鎖抗体分子であり得、例えば、ヒトモノクローナル抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型抗体であってもよい。ある実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して競合する単離抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質であり得る。
【００２７】
所定の典型的な態様において、記載される単離抗原結合タンパク質、例えば、単離抗体またはその断片は、（Ａ）（ｉ）配列番号１３４を有するＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１３５を有するＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１３６を有するＣＤＲＨ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で４つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群から選択される、１つまたは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、（Ｂ）（ｉ）配列番号１０７、１１１、および１１８から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号１０８、１１２、および１１９から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号１０９、１１３、および１２０から成る群から選択されるＣＤＲＬ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で４つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから成る群から選択される、１つまたは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含む。
【００２８】
一部の実施形態において、ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号１３１を有するＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１３２を有するＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１３３を有するＣＤＲＨ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で３つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群からさらに選択される。関連実施形態において、ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号７６、８８、１００、１２１、１２５、および１２８から成る群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号８９、１０１、１２２、１２４、１２６、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号７８、９０、１０２、１２３、１２７、および１３０から成る群から選択されるＣＤＲＨ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で２つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群からさらに選択される。他の関連実施形態において、ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００から成る群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３から成る群から選択されるＣＤＲＨ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で２つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群からさらに選択される。
【００２９】
一部の実施形態において、ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１０７、１１１、および１１５から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号１０８、１１２、および１１６から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号１０９、１１３、および１１７から成る群から選択されるＣＤＲＬ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから成る群からさらに選択される。一部の実施形態において、アミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、または挿入は、ＣＤＲＬ当たりまとめて合計３つのアミノ酸を超えることはない。一部の実施形態において、アミノ酸置換、欠失、または挿入は、ＣＤＲＬ当たりまとめて合計２つのアミノ酸を超えることはない。関連実施形態において、ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号４２、４５、５１、５７、６２、６９、１０３、および１１０から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号４３、５２、５５、５８、６３、７０、１０４、１０８、および１１４から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５３、５６、５９、６４、１０５、および１０６から成る群から選択されるＣＤＲＬ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、それが全体で２つのアミノ酸を超えない、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから成る群からさらに選択される。追加の関連実施形態において、ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２から成る群から選択されるＣＤＲＬ３、および任意で（ｉｖ）１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換基（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから成る群からさらに選択される。一実施形態において、アミノ酸置換、欠失、または挿入の総数は、ＣＤＲ当たり２つ以下のアミノ酸である。別の実施形態において、アミノ酸置換は、保存置換である。
【００３０】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、上述の（Ａ）および上述の（Ｂ）のうちのいずれかの少なくとも１つまたは２つのＣＤＲＨを含む。さらに別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）上述の（Ａ）のうちのいずれかの少なくとも３つのＣＤＲＨであって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む、３つのＣＤＲＨと、（ｉｉ）上述の（Ｂ）のうちのいずれかの少なくとも３つのＣＤＲＬを含み、３つのＣＤＲＬは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。さらなる実施形態において、上述の単離抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲＨを含む第１のアミノ酸と、少なくとも１つのＣＤＲＬを含む第２のアミノ酸とを含む。一実施形態において、第１および第２のアミノ酸配列は、相互に共有結合する。
【００３１】
別の態様において、単離抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む。一実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７３を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７４を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７５を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７７を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７９を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８０を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８１を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号８２を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８３を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号８５を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８６を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号８８を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８９を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９０を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９１を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号９２を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９３を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９５を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号７３を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７４を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９６を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号９７を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９８を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９９を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号１００を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号１０１を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号１０２を含む。
【００３２】
別の態様において、単離抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、およびＣＤＲＬ３配列を含む。一実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４２を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４３を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４６を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４８を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４９を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５０を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５１を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５２を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５３を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５４を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５７を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５８を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５９を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６０を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６１を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６２を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６３を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６６を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６７を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６８を含む、別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６９を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号７０を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号７１を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６９を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号７０を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号７２を含む。
【００３３】
別の態様において、単離抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、ＣＤＲＬ３配列、ＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、およびＣＤＲＨ３配列を含む。一実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４２を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４３を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４４を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７３を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７４を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７５を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４６を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４７を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７７を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４８を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４９を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５０を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７９を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８０を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８１を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５１を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５２を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５３を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号８２を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８３を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５４を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号８５を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８６を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号５７を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５８を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５９を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号８８を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８９を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９０を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６０を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号８５を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８６を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６１を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４７を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９１を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６２を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６３を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６４を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号９２を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９３を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９４を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６１を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４７を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７６を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９５を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号７８を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６５を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号５６を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号８５を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号８６を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号８７を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号４２を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号４３を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号４４を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号７３を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号７４を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９６を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６６を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号６７を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６８を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号９７を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号９８を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号９９を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６９を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号７０を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号７１を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号１００を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号１０１を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号１０２を含む。別の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号６９を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号７０を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号７２を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号１００を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号１０１を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号１０２を含む。
【００３４】
上述の配列定義実施形態のうちのいずれかおいても、単離抗原結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体、またはその抗原結合断片であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質の抗原断片は、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二特異性抗体、または単鎖抗体分子であり得る。例えば、単離抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体であり得、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型抗体であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質であり得る。
【００３５】
上述の配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＡＭＰ１の両方に特異的に結合し得、ＡＭ１、ＡＭ２、またはヒトアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１）に特異的に結合せず、例えば、単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定し、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載の方法を使用して分析して、ＫＤ１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下でヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合し得る。上述の配列が定義される実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはＡＭ１受容体に対して、例えば、１００以上、２５０以上、５００以上、７５０以上、１，０００以上、２，５００以上、５，０００以上、または１０，０００以上の選択比で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを選択的に阻害し得、選択的阻害の程度は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して、任意の適切な方法を使用して決定することができる。上述の配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であり得る。
【００３６】
別の一連の実施形態は、以下に記載されるコンセンサス配列を有するＣＤＲのうちの１つまたは組み合わせを含み、任意で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに結合する、単離抗原結合タンパク質を含む。コンセンサス配列は、系統発生的に関連するＣＤＲ配列に由来する。一態様において、様々な群からのＣＤＲは、ヒトＣＧＲＰ  Ｒと結合する任意の特定単離抗原結合タンパク質において混合および一致され得る。別の態様において、抗原結合タンパク質は、同一の系統発生的に関連する抗体クローン群に由来する、重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。典型的なＣＤＲコンセンサス配列は以下のとおりである。
【００３７】
Ｋ１コンセンサス
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＧＩＲＸ１ＤＬＧ（配列番号１０３）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＫから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＡＳＳＬＱＳ（配列番号１０４）、式中、Ｘ１は、ＡおよびＧから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  ＬＱＹＮＸ１Ｘ２ＰＷＴ（配列番号１０５）、式中、Ｘ１は、ＩおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＹおよびＦから成る群から選択される。
Ｋ４コンセンサス
ＣＤＲ３  ＱＱＹＧＮＳＬＸ１Ｒ（配列番号１０６）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＣから成る群から選択される。
Ｋ１，４コンセンサス
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５ＬＸ６（配列番号１０７）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ２は、ＶおよびＩから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、ＮおよびＫから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＤから成る群から選択され、Ｘ６は、ＴおよびＧから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＡＳＳＸ２Ｘ３Ｘ４（配列番号１０８）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＲおよびＬから成る群から選択され、Ｘ３は、ＡおよびＱから成る群から選択され、Ｘ４は、ＴおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１ＱＹＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１０９）、式中、Ｘ１は、ＱおよびＬから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＮから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＴから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、ＹおよびＦから成る群から選択され、Ｘ５は、ＬおよびＰから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｃ、Ｗ、およびＳから成る群から選択され、Ｘ７は、ＲおよびＴから成る群から選択される。
Ｋ３コンセンサス
ＣＤＲ１  ＫＳＳＱＳＬＬＨＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＹＬＹ（配列番号１１０）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＲおよびＫから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＴから成る群から選択される。
Ｋ２，３コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＳＳＱＳＬＬＨＳＸ２ＧＸ３Ｘ４ＹＬＸ５（配列番号１１１）、式中、Ｘ１は、ＲおよびＫから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｄ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｙ、Ｒ、およびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、ＮおよびＴから成る群から選択され、Ｘ５は、ＤおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＳＮＲＸ３Ｓ（配列番号１１２）、式中、Ｘ１は、ＬおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＶから成る群から選択され、Ｘ３は、ＡおよびＦから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  ＭＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔ（配列番号１１３）、式中、Ｘ１は、ＡおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＬおよびＦから成る群から選択され、Ｘ３は、ＱおよびＰから成る群から選択され、Ｘ４は、ＴおよびＬから成る群から選択され、Ｘ５は、ＦおよびＬから成る群から選択される。
Ｌｍ３コンセンサス
ＣＤＲ２  ＲＸ１ＮＱＲＰＳ（配列番号１１４）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
Ｌｍ１，２，３コンセンサス
ＣＤＲ１  ＳＧＳＳＳＮＩＧＸ１ＮＸ２ＶＸ３（配列番号１１５）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、Ｎ、およびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＮＸ３ＲＰＳ（配列番号１１６）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｔ、およびＲから成る群から選択され、Ｘ２は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ３は、ＫおよびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７ＶＶ（配列番号１１７）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＴおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＷおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ５は、ＲおよびＳから成る群から選択され、Ｘ６は、ＳおよびＮから成る群から選択され、Ｘ７は、ＡおよびＧから成る群から選択される。
ＬｍＡｌｌコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＧＸ２Ｘ３ＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１１８）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＱから成る群から選択され、Ｘ２は、存在または不在であって、存在する場合はＳであり、Ｘ３は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合はＮであり、Ｘ５は、ＩおよびＬから成る群から選択され、Ｘ６は、ＧおよびＲから成る群から選択され、Ｘ７は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、ＮおよびＦから成る群から選択され、Ｘ９は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＶおよびＡから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｎ、およびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＮＸ３ＲＰＳ（配列番号１１９）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、およびＲから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｎ、Ｋ、およびＳから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｋ、Ｎ、およびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｖ（配列番号１２０）、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｎ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＷおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ５は、ＲおよびＳから成る群から選択され、Ｘ６は、ＬおよびＶから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｓ、Ｙ、およびＮから成る群から選択され、Ｘ８は、Ａ、Ｈ、およびＧから成る群から選択され、Ｘ９は、ＶおよびＬから成る群から選択される。
ＨＣ１コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＹＹＭＸ２（配列番号１２１）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＤから成る群から選択され、Ｘ２は、ＨおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  ＷＩＸ１ＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２２）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＸ１３ＧＭＤＶ（配列番号１２３）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＧから成る群から選択され、Ｘ２は、ＱおよびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、ＭおよびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、ＩおよびＧから成る群から選択され、Ｘ５は、ＩおよびＹから成る群から選択され、Ｘ６は、ＭおよびＡから成る群から選択され、Ｘ７は、存在または不在であって、存在する場合はＬであり、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合はＲであり、Ｘ９は、ＶおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１１は、ＰおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＰおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１３は、存在または不在であって、存在する場合はＹである。
ＨＣ２コンセンサス
ＣＤＲ２  ＲＩＫＳＸ１ＴＤＧＧＴＴＤＹＸ２ＡＰＶＫＧ（配列番号１２４）、式中、Ｘ１は、ＫおよびＴから成る群から選択され、Ｘ２は、ＴおよびＡから成る群から選択される。
ＨＣ３コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号１２５）、式中、Ｘ１は、ＴおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２６）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＲから成る群から選択され、Ｘ６は、ＲおよびＴから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＹＳＸ８Ｘ９ＷＹＤＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１２７）、式中、Ｘ１は、ＥおよびＤから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＱから成る群から選択され、Ｘ３は、ＶおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＥから成る群から選択され、Ｘ５は、ＧおよびＶから成る群から選択され、Ｘ６は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ７は、存在または不在であり、存在する場合はＳであり、Ｘ８は、ＩおよびＳから成る群から選択され、Ｘ９は、ＳおよびＧから成る群から選択される。
ＨＣ４コンセンサス
ＣＤＲ１  ＳＸ１ＧＭＨ（配列番号１２８）、式中、Ｘ１は、ＦおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  ＶＩＳＸ１ＤＧＳＸ２ＫＹＸ３Ｘ４ＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、式中、Ｘ１は、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ２は、ＩおよびＨから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、ＶおよびＡから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８ＹＹＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＹＧＸ１２Ｘ１３Ｖ（配列番号１３０）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、ＬおよびＫから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＹおよびＶから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ６は、ＤおよびＭから成る群から選択され、Ｘ７は、ＳおよびＴから成る群から選択され、Ｘ８は、ＧおよびＬから成る群から選択され、Ｘ９は、ＨおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１０は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１１は、ＫおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＡおよびＤから成る群から選択される。
ＨＣＡコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４（配列番号１３１）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｙ、およびＦから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｗ、Ａ、およびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＨから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＶＫＧ（配列番号１３２）、式中、Ｘ１は、Ｒ、Ａ、およびＶから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、およびＷから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、Ｆ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合は、ＫおよびＴから成る群から選択され、Ｘ５は、存在または不在であって、存在する場合はＴであり、Ｘ６は、ＤおよびＳから成る群から選択され、Ｘ７は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、Ｉ、Ｎ、およびＨから成る群から選択され、Ｘ９は、ＴおよびＫから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＤおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１１は、ＹおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１２は、Ｔ、Ａ、およびＶから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＡおよびＤから成る群から選択され、Ｘ１４は、ＰおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＧＸ１８Ｘ１９Ｖ（配列番号１３３）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、およびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｒ、Ｑ、およびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｔ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、およびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、およびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、Ｙ、Ｖ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ｙ、ＡおよびＴから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｉ、Ｐ、Ｄ、ＡおよびＭから成る群から選択され、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合は、ＳおよびＹから成る群から選択され、Ｘ９は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｗ、Ｓ、およびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、Ｇ、およびＬから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、Ｌ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ１２は、存在または不在であって、存在する場合は、ＷおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＹおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１４は、存在または不在であって、存在する場合は、ＹおよびＤから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｙ、ＫおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１６は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１７は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１８は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１９は、ＤおよびＡから成る群から選択される。
ＨＣＢコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１３４）、式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｗ、Ｙ、Ａ、およびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ５は、ＳおよびＨから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｇ（配列番号１３５）、式中、Ｘ１は、Ｒ、Ｗ、Ａ、Ｖ、ＳおよびＦから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、およびＲから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、Ｐ、Ｇ、Ｆ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合、Ｋ、Ｔ、およびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、存在または不在であって、存在する場合、ＴおよびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ７は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ９は、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｔ、Ｋ、Ｒ、およびＰから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、Ｙ、およびＥから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＹおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１３は、Ｔ、Ａ、およびＶから成る群から選択され、Ｘ１４は、Ａ、Ｑ、およびＤから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｐ、Ｋ、およびＳから成る群から選択され、Ｘ１６は、ＶおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１７は、ＫおよびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＳＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＸ１７Ｘ１８Ｖ（配列番号１３６）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、Ａ、およびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｒ、Ｇ、およびＱから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、およびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｎ、ＩおよびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、Ｙ、Ｉ、Ｇ、Ｖ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｓ、Ｉ、Ｙ、Ｇ、ＡおよびＴから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＰおよびＤから成る群から選択され、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｓ、Ｌ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ９は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｗ、Ｒ、Ｓ、およびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、Ｇ、およびＬから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ１２は、存在または不在であって、存在する場合、Ｆ、Ｙ、およびＷから成る群から選択され、Ｘ１３は、Ｙ、Ｐ、Ｓ、およびＨから成る群から選択され、Ｘ１４は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｙ、Ｐ、Ｄ、およびＨから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｙ、Ｋ、およびＦから成る群から選択され、Ｘ１６は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１７は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１８は、ＭおよびＬから成る群から選択される。
【００３８】
上述のコンセンサス配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、例えば、ＡＶＩＭＥＲポリペプチド、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体、またはその抗原結合断片であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二特異性抗体または単鎖抗体分子であり得る。例えば、単離抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体であり得、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型抗体であってもよい。さらに、単離抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質であり得る。
【００３９】
上述のコンセンサス配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＡＭＰ１の両方に特異的に結合し得、ＡＭ１、ＡＭ２、またはヒトアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１）に特異的に結合せず、例えば、単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定し、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載の方法を使用して分析して、ＫＤ１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下でヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合し得る。上述のコンセンサス配列定義実施形態のうちのいずれにおいて、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはＡＭ１受容体に対して、例えば、１００以上、２５０以上、５００以上、７５０以上、１，０００以上、２，５００以上、５，０００以上、または１０，０００以上の選択比で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを選択的に阻害し得、選択的阻害の程度は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して、任意の適切な方法を使用して決定することができる。上述の配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であり得る。
【００４０】
記載される単離抗原結合タンパク質のいくつかは、配列番号１５８〜１７０から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、および９０％または９５％の配列同一性を有する、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。記載される単離抗原結合タンパク質のいくつかは、配列番号１３７〜１５３から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、および９０％または９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。記載される単離抗原結合タンパク質のいくつかは、配列番号１５８〜１７０から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、および９０％または９５％の配列同一性を有する、ＶＨ配列と、配列番号１３７〜１５３から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、および９０％または９５％の配列同一性を有する、ＶＬと、を含む。いくつかの実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１５８〜１７０から成る群から選択されるか、または（ｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、１つまたは複数（例えば、５個、１０個、１５個、または２０個）のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、（Ｂ）（ｉｉｉ）配列番号１３７〜１５３から成る群から選択されるか、または（ｉｖ）（ｉｉｉ）によって定義されるとおりであり、１つまたは複数（例えば、５個、１０個、１５個、または２０個）のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列を含む、配列を含むＶＬ、または（Ｃ）（Ａ）のＶＨおよび（Ｂ）のＶＬを含む。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、配列番号１５８〜１７０から成る群から選択される配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１３７〜１５３から成る群から選択される配列を含む、ＶＬを含む。
【００４１】
一実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６４、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６５、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６６、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１６９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１７０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。
【００４２】
一実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１３７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１３８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１３９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４４、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４５、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４６、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１４９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。
【００４３】
上述のＶＬおよびＶＨ配列定義実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体、またはその抗原結合断片であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二特異性抗体または単鎖抗体分子であり得る。例えば、単離抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体であり得、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型抗体であってもよい。さらに、単離抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質であり得る。
【００４４】
上述のＶＬおよびＶＨ配列定義実施形態のうちのいずれにおいて、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＡＭＰ１の両方に特異的に結合し得、ＡＭ１、ＡＭ２、またはヒトアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１）に特異的に結合せず、例えば、単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定し、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載の方法を使用して分析して、ＫＤ１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下でヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合し得る。上述のＶＬおよびＶＨ配列定義実施形態のうちのいずれかにおいて、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはＡＭ１受容体に対して、例えば、１００以上、２５０以上、５００以上、７５０以上、１，０００以上、２，５００以上、５，０００以上、または１０，０００以上の選択比で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを選択的に阻害し得、選択的阻害の程度は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して、任意の適切な方法を使用して決定することができる。上述のＶＬおよびＶＨ配列定義実施形態のうちのいずれにおいて、単離抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ結合競合検定において、例えば、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定において、Ｋｉが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であり得る。
【００４５】
一態様において、単離抗原結合タンパク質は、配列番号２９〜４１から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。記載される単離抗原結合タンパク質のいくつかは、配列番号１２〜２８から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。単離抗原結合タンパク質のいくつかは、配列番号２９〜４１から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖配列と、配列番号１２〜２８から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖配列と、を含む。いくつかの実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号２９〜４１から成る群から選択されるか、または（ｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、１つまたは複数（例えば、５個、１０個、１５個、または２０個）のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む、配列を含む重鎖、（Ｂ）（ｉｉｉ）配列番号１２〜２８から成る群から選択されるか、または（ｉｖ）（ｉｉｉ）によって定義されるとおりであり、１つまたは複数（例えば、５個、１０個、１５個、または２０個）のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む、配列を含む軽鎖、または（Ｃ）（Ａ）の重鎖および（Ｂ）の軽鎖を含む。一部の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、配列番号２９〜４１から成る群から選択される配列を含む重鎖と、配列番号１２〜２８から成る群から選択される配列を含む軽鎖と、を含む。
【００４６】
一実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号２９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００４７】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００４８】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１４、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００４９】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１５、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５０】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１６、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５１】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号２９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５２】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３４、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５３】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５４】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号２９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５５】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３５、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５６】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３６、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２２、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５７】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５８】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００５９】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３３、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２４、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００６０】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号３９、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２５、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００６１】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号４０、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２６、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００６２】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号４１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２７、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００６３】
別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号４１、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖と、（Ｂ）（ｉ）配列番号２８、（ｉｉ）（ｉ）によって定義される配列と、少なくとも９０％または９５％同一である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）によって定義されるとおりであり、最大１０個のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）、欠失、または挿入を含む配列、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。
【００６４】
上述の軽鎖および重鎖配列が定義された実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、特定された重鎖および／または軽鎖配列を含み得るが、異なるシグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを有しない。上述の軽鎖および重鎖配列が定義された実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはその抗体結合断片であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二特異性抗体、または単鎖抗体分子であり得る。例えば、単離抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体であってもよく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型抗体であり得る。さらに、単離抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質であり得る。
【００６５】
上述の軽鎖および重鎖配列が定義された実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＡＭＰ１の両方に特異的に結合し得、ＡＭ１、ＡＭ２、またはヒトアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１）に特異的に結合しない。例えば、単離抗原結合タンパク質は、例えば、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定および分析して、例えば、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載される方法を使用して、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合する。上述の軽鎖および重鎖配列が定義された実施形態のうちのいずれにおいても、単離抗原結合タンパク質は、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはＡＭＹ１受容体に関して、１００以上、２５０以上、５００以上、７５０以上、１、０００以上、２，５００以上、５，０００以上、または１０，０００以上の選択率で、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを選択的に阻害し得、選択的阻害の程度は、任意の適切な方法を使用して、例えば、本明細書の実施例において記載されるようなｃＡＭＰ検定を使用して、決定することができる。上述の軽鎖および重鎖配列が定義された実施形態のうちのいずれにおいて、単離抗原結合タンパク質は、例えば、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から膜への放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定、例えば、本明細書の実施例５に記載される検定においてのような、ＣＧＲＰ結合競合検定において、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下のＫｉであり得る。
【００６６】
さらなる態様において、上で要約されるＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質のうちのいずれかをコード化する、単離核酸ポリヌクレオチドも提供される。一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、および２１０から成る群から選択される配列を含む。別の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２２４〜２５８から成る群から選択される配列を含む。別の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、厳しいハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２２４〜２５８から成る群から選択される配列とハイブリダイズすることができる配列を含む。別の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２２４〜２５８から成る群から選択される配列に対して、約８０％、８５％、９０％または９５％以上同一である配列を含む。一部の例において、単離核酸分子は、制御配列に対して操作可能に結合される。関連実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれる。
【００６７】
上述のような単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換される細胞株も含まれる。関連態様において、上述のＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質をコード化する、前述の単離核酸分子を含む、発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。
【００６８】
別の態様において、抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から、抗原結合タンパク質を調製するステップを含む、抗原結合タンパク質を調製するための方法も提供される。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、可溶性ＣＧＲＰ受容体を含む免疫原を使用して生成される。一部の実施形態において、そのような可溶性ＣＧＲＰ受容体は、ヒトＣＲＬＲのＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびヒトＲＡＭＰ１のＥＣＤ、例えば、本明細書の実施例１および２に記載されるように、例えば、配列番号６を含むヒトＣＲＬＲのＥＣＤおよび配列番号８を含むＲＡＭＰ１のＥＣＤを共発現および精製することによって得られる。
【００６９】
さらに別の態様において、上で要約される抗原結合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤のうちの少なくとも１つを含む、薬学的組成物が提供される。一実施形態において、薬学的組成物は、放射性同位体、放射性ヌクリド、毒素、または治療薬および化学療法薬群から成る群から選択される、追加の活性薬剤を含んでもよい。
【００７０】
一態様において、単離抗原結合タンパク質は、患者に投与されると、血管拡張を阻害し、および／または神経性炎症を減少させるのに有効である。一実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、例えば、片頭痛等の頭痛の頻度および／または重度を低減するのに有効である。例えば、抗原結合タンパク質は、片頭痛の急性治療として、および／または症状、特に片頭痛発作と関連付けられる疼痛症状の頻度および／または重度を予防または低減させるための予防的処置として使用されてもよい。
【００７１】
他の態様は、患者においてＣＧＲＰ  Ｒと関連付けられる状態を治療または予防するための方法をさらに提供し、上で要約される少なくとも１つの単離抗原結合タンパク質を有効量で患者に投与することを含む。一実施形態において、状態は頭痛であり、例えば、片頭痛または群発頭痛、あるいは別の種類の疼痛、例えば、慢性疼痛であり、別の実施形態において、それは糖尿病（ＩＩ型）であり、別の実施形態において、それは炎症、特に神経性炎症であり、別の実施形態において、それは心血管疾患であり、別の実施形態において、それは内毒素血および敗血症と関連付けられる血行動態異常であり、別の実施形態において、それは血管拡張である。
【００７２】
別の態様において、患者におけるヒトＣＧＲＰ  Ｒ、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒの細胞外部分へのＣＧＲＰの結合を阻害する方法も提供され、本明細書において提供される、および／または上で要約される、有効量の少なくとも１つの抗原結合タンパク質を投与することを含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
単離抗原結合タンパク質であって、ヒトＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する、単離抗原結合タンパク質。
（項目２）
前記単離抗原結合タンパク質は、前記ヒトＣＧＲＰ受容体を、１００以上の選択率で選択的に阻害する、項目１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目３）
前記単離抗原結合タンパク質は、前記ヒトＣＧＲＰ受容体を、５００以上の選択率で選択的に阻害する、項目２に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目４）
前記単離抗原結合タンパク質は、１００ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＧＲＰに特異的に結合する、項目１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目５）
前記単離抗原結合タンパク質は、ＦＡＣＳ結合検定を使用して決定して、１０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＧＲＰに特異的に結合する、項目４に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目６）
前記単離抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ結合競合検定において、１０ｎＭ未満のＫｉを有する、項目１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目７）
前記単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞からの膜に対する放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合競合検定において、１ｎＭ未満のＫｉを有する、項目６に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目８）
前記単離抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して基準抗体と競合し、前記基準抗体は、（ｉ）配列番号１６１、１６３、１６４、１６６、および１６８から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号１４０、１４３、１４６、１４８、および１５０から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、項目１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目９）
前記基準抗体は、（ｉ）配列番号３２、３４、３５、３７、および３９から成る群から選択される配列によって定義される重鎖と、（ｉｉ）配列番号１５、１８、２１、２３、および２５から成る群から選択される配列によって定義される軽鎖と、を含む、項目８に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１０）
前記基準抗体は、以下の配列対のうちの１つによって定義される、重鎖および軽鎖を含む、項目９に記載の単離抗原結合タンパク質：
配列番号３２および配列番号１５、
配列番号３４および配列番号１８、
配列番号３５および配列番号２１、
配列番号３７および配列番号２３、ならびに
配列番号３９および配列番号２５。
（項目１１）
（Ａ）（ｉ）配列番号１３４を有するＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号１３５を有するＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３６を有するＣＤＲＨ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のＣＤＲＨとから成る群から選択される、１つまたは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、
（Ｂ）（ｉ）配列番号１０７、１１１、および１１８から成る群から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号１０８、１１２、および１１９から成る群から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号１０９、１１３、および１２０から成る群から選択されるＣＤＲＬ３と、任意で（ｉｖ）１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬとから成る群から選択される、１つまたは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、
または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＬ、
を含む、単離抗原結合タンパク質。
（項目１２）
前記ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号１３１を有するＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号１３２を有するＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３３を有するＣＤＲＨ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨとから成る群からさらに選択される、項目１１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１３）
前記ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号７６、８８、１００、１２１、１２５、および１２８から成る群から選択されるＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号８９、１０１、１２２、１２４、１２６、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号７８、９０、１０２、１２３、１２７、および１３０から成る群から選択されるＣＤＲＨ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨとから成る群からさらに選択される、項目１２に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１４）
前記ＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００から成る群から選択されるＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３から成る群から選択されるＣＤＲＨ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨとから成る群からさらに選択される、項目１３に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１５）
前記ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１０７、１１１、および１１５から成る群から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号１０８、１１２および１１６から成る群から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号１０９、１１３および１１７から成る群から選択されるＣＤＲＬ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬとから成る群からさらに選択される、項目１１に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１６）
前記ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号４２、４５、５１、５７、６２、６９、１０３、および１１０から成る群から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号４３、５２、５５、５８、６３、７０、１０４、１０８、および１１４から成る群から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５３、５６、５９、６４、１０５、および１０６から成る群から選択されるＣＤＲＬ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬとから成る群からさらに選択される、項目１５に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１７）
前記ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９から成る群から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０から成る群から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２から成る群から選択されるＣＤＲＬ３と、（ｉｖ）１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬとから成る群からさらに選択される、項目１６に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１８）
前記単離抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲＨおよび少なくとも１つのＣＤＲＬを含む、項目１１〜１７のうちのいずれかに記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目１９）
前記単離抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＣＤＲＨおよび少なくとも２つのＣＤＲＬを含む、項目１８に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２０）
前記単離抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む、項目１１〜１９のうちのいずれかに記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２１）
配列番号１５８〜１７０から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
（項目２２）
配列番号１３７〜１５３から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む、単離抗原結合タンパク質。
（項目２３）
配列番号１５８、１５９、および１６２〜１７２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ配列と、配列番号１３７、１３８、１４０〜１４５、１４８〜１５１、および１５３〜１５７から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬ配列と、を含む、単離抗原結合タンパク質。
（項目２４）
前記単離抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二重特異性抗体、および単鎖抗体から成る群から選択される、項目１〜２３のうちのいずれかに記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２５）
前記単離抗原結合タンパク質は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体から成る群から選択される、モノクローナル抗体である、項目２４に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２６）
前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、またはＩｇＧ４型抗体である、項目２５に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２７）
前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である、項目２６に記載の単離抗原結合タンパク質。
（項目２８）
項目１〜２７のうちのいずれかに記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離核酸ポリヌクレオチド。
（項目２９）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、および２１０から成る群から選択される配列と８０％以上同一である配列を含む、項目２８に記載の単離核酸ポリヌクレオチド。
（項目３０）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２２４〜２５８から成る群から選択される配列と８０％以上同一である配列を含む、項目２８に記載の単離核酸ポリヌクレオチド。
（項目３１）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２２４〜２５８から成る群から選択される配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成可能な配列を含む、項目２８に記載の単離核酸ポリヌクレオチド。
（項目３２）
項目２８〜３１のうちのいずれかに記載の単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目３３）
項目３２に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞株。
（項目３４）
前記抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製することを含む、項目１〜２７のうちのいずれかに記載の抗原結合タンパク質を形成する方法。
（項目３５）
前記抗原結合タンパク質は、可溶性ＣＧＲＰ受容体を含む免疫原を使用して生成される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記可溶性ＣＧＲＰ受容体は、ヒトＣＲＬＲおよびヒトＲＭＡＰ１のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を共発現および精製することによって得られる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ヒトＣＲＬＲのＥＣＤは、配列番号６を含み、前記ＲＡＭＰ１のＥＣＤは、配列番号８を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
項目１〜２７のうちのいずれかに記載の抗原結合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目３９）
患者において、ＣＧＲＰ  Ｒと関連付けられる状態を治療するための方法であって、項目１〜２７のうちのいずれかに記載の有効量の単離抗原結合タンパク質を患者に投与することを含む、方法。
（項目４０）
前記状態は頭痛である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記状態は片頭痛である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記方法は、予防的処置を含む、項目３９〜４１のうちのいずれかに記載の方法。
【００７３】
これらおよび他の態様は、本明細書において詳細に説明される。提供される態様のそれぞれは、本明細書において提供される様々な実施形態を包含することができる。したがって、１つの要素または要素の組み合わせを含む実施形態のそれぞれは、記載される各態様に含まれ得ることが予期され、上記態様および実施形態のそのような組み合わせは、すべて明示的に考慮される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ヒト、カニクイザル、およびラットからのＲＡＭＰ１配列の整列を示す。
【図２】ヒト、カニクイザル、およびラットからのＣＲＬＲ配列の整列を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂ。κ軽鎖を有する表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの軽鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂ。κ軽鎖を有する表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの軽鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図４】λ軽鎖を有する表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの軽鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅ。表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの重鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅ。表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの重鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅ。表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの重鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅ。表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの重鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ｅ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅ。表示される抗ＣＧＲＰ受容体抗体クローンからの重鎖ＣＤＲの系統発生ベースの配列の整列、および所定の対応するコンセンサス配列を示す。
【図５Ｆ】本明細書に開示される典型的な抗ＣＧＲＰ受容体抗体重鎖ＣＤＲのコンセンサス配列を示す。
【図６】１０９２抗体ＣＧＲＰ  Ｒハイブリドーマ上清（菱形）および６８陰性対照上清（正方形）による、ＣＧＲＰ  Ｒに結合する標識リガンドの阻害率を示す、２つの実験からのデータのプロットを示す。
【図７Ａ】図７Ａ−Ｄ。３つの示される抗ＣＧＲＰ  Ｒ  ｍＡｂに対する、ｈＣＧＲＰ受容体（図７Ａ）、ｈＡＭ１（図７Ｂ）、ｈＡＭ２（図７Ｃ）、およびヒトアミリン受容体（図７Ｄ）を発現する細胞からの典型的なｃＡＭＰ検定ＩＣ５０データを示す。
【図７Ｂ】図７Ａ−Ｄ。３つの示される抗ＣＧＲＰ  Ｒ  ｍＡｂに対する、ｈＣＧＲＰ受容体（図７Ａ）、ｈＡＭ１（図７Ｂ）、ｈＡＭ２（図７Ｃ）、およびヒトアミリン受容体（図７Ｄ）を発現する細胞からの典型的なｃＡＭＰ検定ＩＣ５０データを示す。
【図７Ｃ】図７Ａ−Ｄ。３つの示される抗ＣＧＲＰ  Ｒ  ｍＡｂに対する、ｈＣＧＲＰ受容体（図７Ａ）、ｈＡＭ１（図７Ｂ）、ｈＡＭ２（図７Ｃ）、およびヒトアミリン受容体（図７Ｄ）を発現する細胞からの典型的なｃＡＭＰ検定ＩＣ５０データを示す。
【図７Ｄ】図７Ａ−Ｄ。３つの示される抗ＣＧＲＰ  Ｒ  ｍＡｂに対する、ｈＣＧＲＰ受容体（図７Ａ）、ｈＡＭ１（図７Ｂ）、ｈＡＭ２（図７Ｃ）、およびヒトアミリン受容体（図７Ｄ）を発現する細胞からの典型的なｃＡＭＰ検定ＩＣ５０データを示す。
【図８】ヒトＣＧＲＰ受容体に対するｍＡｂのＫｉを決定するために用い得るような、１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合データの実施例を示す。
【図９Ａ】図９Ａ−Ｄ。本明細書に開示される選択された抗体に関するＢｉａｃｏｒｅ競合データを示す。
【図９Ｂ】図９Ａ−Ｄ。本明細書に開示される選択された抗体に関するＢｉａｃｏｒｅ競合データを示す。
【図９Ｃ】図９Ａ−Ｄ。本明細書に開示される選択された抗体に関するＢｉａｃｏｒｅ競合データを示す。
【図９Ｄ】図９Ａ−Ｄ。本明細書に開示される選択された抗体に関するＢｉａｃｏｒｅ競合データを示す。
【図１０】ｍＡｂ  １２Ｇ８のＦＡＣＳ  Ｋｄ決定を示す。
【図１１】カニクイザル、ヒトキメラ、ラット、およびアカゲザルＲＡＭＰ１配列の整列を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｂ。ヒト、カニクイザル、アカゲザル、ラット、ヒトキメラ、およびコンセンサスＣＲＬＲ配列の整列を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｂ。ヒト、カニクイザル、アカゲザル、ラット、ヒトキメラ、およびコンセンサスＣＲＬＲ配列の整列を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ−１３Ｃ。抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体に結合する異なるキメラＣＧＲＰ受容体の代表的なＦＡＣＳデータを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ−１３Ｃ。抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体に結合する異なるキメラＣＧＲＰ受容体の代表的なＦＡＣＳデータを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ−１３Ｃ。抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体に結合する異なるキメラＣＧＲＰ受容体の代表的なＦＡＣＳデータを示す。
【図１４】ＣＧＲＰ  ＲのＡｓｐＮ消化のみ、（クロマトグラムＡ）およびＣＧＲＰ  Ｒモノクローナル抗体１２Ｇ８を含む対照試料の消化（クロマトグラムＢ）に由来するペプチドマップを示す。
【図１５】異なる濃度のＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体の存在下のＣＧＲＰ  ＲのＡｓｐＮ消化を示す。
【図１６】異なる濃度のＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体、４Ｅ４の存在下のＣＧＲＰ  ＲのＡｓｐＮ消化を示す。
【図１７】抗体３２Ｈ７により様々な受容体成分を発現する細胞の免疫組織化学染色強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本明細書で使用される節の表題は、単に構成上の目的のためであり、記載される主題を制限するものとして見なされるものではない。
【００７６】
本明細書において特に定義されない限り、本出願との関連で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含む。
【００７７】
一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微小生物学、遺伝子学、およびタンパク質ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法および技術は、該技術分野においてよく知られ、一般に使用されるものである。本出願の方法および技術は、一般に、該技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、特に明記されない限り、本明細書全体で引用および論考される、様々な一般的および特定の参考文献に記載されるように行われる。例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、該技術分野において一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われる。本明細書に記載される分析的化学、合成有機化学、および医療ならびに薬化学の研究室手順および技術と関連して使用される用語は、該技術分野においてよく知られ、一般に使用されるものである。標準技術を、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療に使用することができる。
【００７８】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコル、および試薬等に限定されないこと、およびそれらは異なり得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、請求項によってのみ定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００７９】
操作の実施例、または別様に示される場合を除いて、本明細書において使用される成分または反応状態の量を表すすべての数字は、すべての例において「約」という用語によって修正されるものと理解されたい。用語「約」は、パーセンテージに関して使用される場合、±１％を意味する。
【００８０】
定義
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、単鎖および二重鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。該修飾は、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、およびホスホロアミデート等のヌクレオチド間結合修飾を含む。
【００８１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築に使用する場合、単鎖または二重鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出検定のための放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマ、クローニングプライマ、またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００８２】
「単離核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源あるいはそのある種の組み合わせのＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、単離ポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドが自然界において見出されるか、またはそれが自然界で結合されないポリヌクレオチドに結合される、ポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連付けられないものである。この開示の目的で、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、処理されていない完全な染色体を包含しないことを理解されたい。特定の核酸配列「を含む」単離核酸分子は、特定の配列に加えて、最大１０または最大２０もの他のタンパク質またはその部分に対するコーディング配列を含み得るか、または列挙される核酸配列のコーディング領域の発現を制御する、操作可能に結合された調節配列を含み得るか、および／またはベクター配列を含み得る。
【００８３】
特に明記されない限り、本明細書において論じられる任意の単鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり、二重鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。初期ＲＮＡ転写の５’から３’の添加の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写の５’から５’末端である、ＲＮＡ転写と同一配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上方配列」と称され、ＲＮＡ転写の３’から３’末端である、ＲＮＡ転写と同一配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下方配列」と称される。」
【００８４】
「制御配列」という用語は、それが結紮されるコーディング配列の発現および処理に影響を及ぼし得るポリヌクレオチドを意味する。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の制御配列は、プロモータ、リボソーム結合部位、および転写末端配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子、転写エンハンサ配列、および転写終結配列のための１つまたは複数の認識部位を含むプロモータを含み得る。「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
【００８５】
「ベクター」という用語は、タンパク質コーディング情報を宿主細胞に移行するために使用される、任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス）を意味する。
【００８６】
「発現ベクター」または「発現コンストラクトコンストラクト」という用語は、宿主細胞の形質転換に適切なベクターを意味し、そこに操作可能に結合される１つまたは複数の異種コーディング領域の発現を（宿主細胞と併せて）指示および／または制御する核酸配列を含む。発現コンストラクトには、転写、翻訳に影響するか、または制御する配列、およびイントロンが存在する場合は、そこに操作可能に結合されるコーディング領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書で使用する、「操作可能に結合された」とは、用語が適用される成分が、適切な条件下で、それらの本来の機能を行うことができるようにする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コーディング配列に「操作可能に結合された」ベクターにおける制御配列は、タンパク質コーディング配列の発現が、制御配列の転写活動と適合する条件下で、タンパク質コーディング配列の発現が達成されるように、そこに結紮される。
【００８８】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列により形質転換されているか、または形質転換でき、それによって関心対象の遺伝子を発現する細胞を意味する。用語は、関心対象の遺伝子が存在する限り、起源の親細胞と形態学または遺伝的構成において同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を含む。
【００８９】
「形質導入」という用語は、通常、バクテリオファージによって、一方のバクテリアから別のバクテリアへの遺伝子の移行を意味する。「形質導入」は、複製欠陥レトロウイルスによる真核細胞配列の取得および移行も意味する。
【００９０】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの摂取を意味し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されると、「トランスフェクト」されたこととなる。多数のトランスフェクション技術が、該技術分野においてよく知られており、本明細書に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ上記、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ
ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
【００９１】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変更を意味し、細胞は、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含むように修飾されると、形質転換されたこととなる。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して、新しい遺伝子物質を導入することにより、その生来の状態から遺伝子的に修飾される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に一体化することによって、細胞のそれと組み換えし得るか、または複製されることなく、エピソーム要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、形質転換ＤＮＡが、細胞の分割をと共に複製される場合、「安定して形質転換された」と見なされる。
【００９２】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する自然発生アミノ酸、ならびに自然発生するアミノ酸ポリマーの類似体または模倣体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、例えば、炭水化物残基を追加して、糖タンパク質を形成するか、またはリン酸化することによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し得る。ポリペプチドおよびタンパク質は、自然発生および非組み換え細胞によって生成され得るか、または遺伝子組み換えまたは組み換え細胞によって生成され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、追加、および／または置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、それへの追加、および／または置換を有する配列を特定的に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを意味する。そのような断片は、全長タンパク質と比較して、修飾アミノ酸も含み得る。所定の実施形態において、断片は、約５〜５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片は、結合ドメインを含む、免疫的に機能する断片を含む。ＣＧＲＰ  Ｒ結合抗体の場合において、有用な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変領域、抗体鎖の部分、または２つのＣＤＲを含むその可変ドメイン等が挙げられるが、これらに限定されない。「ＣＧＲＰ受容体」または「ＣＧＲＰ  Ｒ」は、ＲＡＭＰ１およびＣＲＬＲを含むことが理解される。
【００９３】
「単離タンパク質」（例えば、単離抗原結合タンパク質）、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」という用語は、対象のタンパク質、ポリペプチド、または抗体が、（１）通常は共に見出される少なくとも一部の他のタンパク質を含まないこと、（２）同一の源、例えば、同一の種からの他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種からの細胞によって発現されること、（４）自然界において付随するポリヌクレオチド、脂質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されていること、（５）自然界において付随しないポリペプチドと（共役または非共役相互作用によって）操作可能に関連付けられること、または（６）自然界において発生しないことを意味する。通常、「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡ、あるいはそれらの任意の組み合わせは、そのような単離タンパク質をコード化し得る。好ましくは、単離タンパク質ポリペプチドまたは抗体は、その治療、診断、予防、研究、または他の用途に干渉する、その自然環境において見出される他のタンパク質または他のポリペプチド、あるいは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００９４】
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）の「変異型」は、１つまたは複数のアミノ酸残基が別のポリペプチド配列に対するアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換される、アミノ酸配列を含む。変異型は、融合タンパク質を含む。
【００９５】
ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、または置換変異型とは異なる何らかの方法で、例えば、別の化学部分に対する共役を介して、化学的に修飾されたポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）である。
【００９６】
「自然発生する」という用語は、ポリペプチド、核酸、宿主細胞等の生物学的物質と関連して、本明細書全体で使用される場合、自然界で見出される物質を意味する。
【００９７】
本明細書で使用する、「抗原結合タンパク質」は、ＣＧＲＰ  Ｒ等、特に霊長類、例えば、ヒトＣＧＲＰ  Ｒの特定の標的抗原と特異的に結合するタンパク質を意味する。ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ受容体と特異的に結合する。
【００９８】
抗原結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が１０−６以下である場合に、その標的を「特異的に結合する」と言われる。抗体は、ＫＤが１ｘ１０−８Ｍ以下である場合、「高い親和性」で標的抗原と特異的に結合する。一実施形態において、抗体は、ＣＧＲＰ  Ｒ、またはヒトＣＧＲＰ  Ｒに５ｘ１０−７以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、１ｘ１０−７以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、５ｘ１０−８以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、１ｘ１０−８以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、５ｘ１０−９以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、１ｘ１０−９以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、５ｘ１０−１０以下のＫＤで結合し、別の実施形態において、抗体は、１ｘ１０−１０以下のＫＤで結合する。
【００９９】
抗体、その抗原結合断片、または抗原結合タンパク質は、特定の受容体の阻害検定において、抗体、その抗体結合断片、または抗原結合タンパク質のＩＣ５０が、別の「基準」受容体の阻害検定におけるＩＣ５０よりも少なくとも５０倍低い場合、他の受容体に対して、特定の受容体を「選択的に阻害する」。「選択率」は、基準受容体のＩＣ５０を特定の受容体のＩＣ５０で割ったものである。抗体、その抗原結合断片、または抗原結合タンパク質は、ｃＡＭＰ検定、例えば、本明細書の実施例４に記載されるようなｃＡＭＰ阻害検定における抗体、その抗原結合断片、または抗原結合タンパク質のＩＣ５０が、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、またはアミリン受容体（例えば、ＡＭＹ１）の阻害検定における同一抗体、その抗原結合断片、または抗原結合タンパク質のＩＣ５０よりも少なくとも５０倍低い場合、ヒトＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する。非限定例として、ｈＣＧＲＰ  ＲのｃＡＭＰ検定における特定の抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体のＩＣ５０が、例えば、０．１ｎＭから２０ｎＭの間であり、ｈＡＭ１、ｈＡＭ２、またはヒトＡＭＹ１受容体のｃＡＭＰ検定における同一抗体のＩＣ５０が、１０００ｎＭ以上である場合、該抗体は、ｈＣＧＲＰ受容体を選択的に阻害する。特定の受容体を選択的に阻害する抗原結合タンパク質は、該受容体に関する中和抗原結合タンパク質となることも理解される。
【０１００】
「抗原結合領域」は、特定された抗原と特異的に結合する、タンパク質またはタンパク質の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質にその特異性および抗原に対する親和性を付与するアミノ酸残基を含む、抗原結合タンパク質の該部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、通常、１つまたは複数の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある抗原結合領域は、１つまたは複数の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な構成を維持することを支援して、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。
【０１０１】
ある態様において、ＣＧＲＰ  Ｒタンパク質またはヒトＣＧＲＰ  Ｒに結合する組み換え抗原結合タンパク質が提供される。この文脈において、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術を使用して形成される、すなわち、本明細書に記載される組み換え核酸の発現を通じて形成されるタンパク質である。組み換えタンパク質を生成するための方法および技術は、該技術分野においてよく知られている。
【０１０２】
用語「抗体」は、任意のアイソタイプの正常な免疫グロブリン、または無傷の抗体と標的抗原への特異的な結合に対して競合し得る、その抗原結合断片を意味し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二特異性抗体を含む。そのような「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。無傷の抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含むが、いくつかの例において、重鎖のみを含み得るラクダ化動物において自然発生する抗体等のように、それより少ない鎖を含む場合がある。抗体は、単一の源のみに由来し得るか、または「キメラ」であり得、つまり、抗体の異なる部分が、以下でさらに詳述されるように、２つの異なる抗体に由来し得る。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組み換えＤＮＡ技術、または正常抗体の酵素または化学的開裂によって、生成されてもよい。特に指定されない限り、用語「抗体」は、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異型、断片、および変異体を含み、その実施例が以下に記載される。
【０１０３】
用語「軽鎖」は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。
【０１０４】
用語「重鎖」は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインは、カルボキシル末端に位置し、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、任意のアイソタイプであってもよく、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、およびＩｇＥを含む。
【０１０５】
「シグナル配列」、「リーダー配列」、または「シグナルペプチド」用語は、タンパク質の輸送を指示する、短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖を意味する。シグナルペプチドは、標的シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化シグナルとも呼ばれ得る。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによって、タンパク質から開裂され、タンパク質（例えば、本明細書に記載されるような抗原結合タンパク質）の生物学的活性形態は、開裂された短い形態である。したがって、「重鎖…を含む抗体」、「軽鎖…を含む抗体」等の用語は、抗体が特定の同定された配列の、重および／または軽鎖を有するものとして特徴づけられる場合、特定の同定された配列を有する抗体、シグナル配列が、異なるシグナル配列によって置換されることを除いて、特定の同定された配列を有する抗体、ならびに任意のシグナル配列を差し引いて、同定される配列を有する抗体を含むことが理解される。
【０１０６】
本明細書で使用する、抗体または免疫グロブリン鎖（重または軽鎖）の「抗原結合断片」（または単に「断片」）という用語は、少なくとも全長鎖で存在するいくつかのアミノ酸を欠失するが、抗原に特異的に結合することができる抗体の部分（該部分が、どのように入手または合成されるかにかかわらず）を含む。そのような断片は、それらが特異的に標的抗原に結合し、無傷の抗体を含む他の抗原結合タンパク質と所与のエピトープへの特異的な結合に対して競合することができるという点で、生物学的に活性である。一態様において、そのような断片は、全長軽または重鎖に存在する、少なくとも１つのＣＤＲを維持し、いくつかの実施形態において、単一の重鎖および／または軽鎖またはその部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組み換えＤＮＡ技術によって生成され得るか、または無傷の抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素または化学的開裂によって生成され得る。免疫学的に機能する免疫グロブリン断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、またはウサギを含むが、これらに限定されない任意の哺乳類源に由来し得る。さらに、本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能部分、例えば、１つまたは複数のＣＤＲは、第２のタンパク質または小分子に共役結合されて、体内の特定標的に向けられる治療薬剤を形成することができ、二官能性治療特性を有するか、または長い血清半減期を有することが企図される。
【０１０７】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖および１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成することができない。
【０１０８】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
【０１０９】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖およびＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に領域を含む１つの重鎖の部分を含み、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成できるようにする。
【０１１０】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖およびＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部分を含む２つの重鎖を含み、鎖間ジスルフィド結合が、２つの重鎖間に形成されるようにする。Ｆ（ａｂ’）２断片は、したがって、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片で構成される。
【０１１１】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠失する。
【０１１２】
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が、可撓性リンカーによって接続され、抗原結合領域を形成する、単一のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号において詳細に論じられ、それらの開示は、参照することにより組み込まれる。
【０１１３】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む、免疫的に機能する免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーで共役結合され、二価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的とし得る。
【０１１４】
「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例において、２つの結合部位は、同一の抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質および二価抗体は、二特異性であり得る。以下を参照されたい。
【０１１５】
「多特異性抗原結合タンパク質」または「多特異性抗体」は、複数の抗原またはエピトープを標的するものである。
【０１１６】
「二特異性」、「二重特異性」、または「二官能性」抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体であり、２つの異なる抗原結合部位を有する。二特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多特異性抗原結合タンパク質の種または多特異性抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含むが、これらに限定されない多様な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、それらのエピトープは、同一または異なるタンパク質標的上に存在し得る。
【０１１７】
「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体」という用語は、それぞれ、リガンドに結合し、その結合パートナーへのリガンドの結合を妨げ、そうでなければリガンドがその結合パートナーに結合することから生じるであろう生物反応を妨害する、抗原結合タンパク質または抗体を意味する。抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその免疫的に機能する抗原結合断片の結合および特異性を評価する際に、抗体または断片は、過剰な抗体が、リガンドに結合される結合パートナーの量を、（インビトロ競合結合検定において測定して）少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上低減する場合、その結合パートナーに対するリガンドの結合を大幅に阻害する。ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質の場合において、そのような中和分子は、ＣＧＲＰ  ＲがＣＧＲＰと結合する能力を減退させる。
【０１１８】
「競合する」という用語は、標的抗原上の同一領域と結合し得る抗原結合タンパク質の文脈において使用される場合、抗原結合タンパク質間の競合が、検定によって決定されることを意味し、そこでは、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能する抗原結合断片）が、共通の抗原（例えば、ＣＧＲＰ  Ｒまたはその抗原結合タンパク質）に対する基準抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは基準抗体）の特異的な結合を妨げるか阻害する。多数の競合結合検定のうちのいずれをも使用することができ、例えば、固相直接または間接放射性免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合検定（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照）、固相直接標識検定、固相直接標識サンドウィッチ検定（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）である。そのような検定は、これらの非標識試験抗原結合タンパク質および標識基準抗原結合タンパク質のうちのいずれかを担持する固体表面または細胞に結合される精製抗原の使用を伴い得る。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面に結合される標識の量を決定することによって測定することができる。競合検定により同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）は、基準抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質、およびステアリン障害が起こるだけ充分に、基準抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近接する隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。通常、競合抗原結合タンパク質が、過剰に存在する場合、共通の抗原に対する基準抗原結合タンパク質の特異的な結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上阻害される。競合阻害は、基準抗原結合タンパク質を、基質、例えば、「センサーチップ」に固定し、基準抗体に結合することによって基質上の抗原を捕捉して、異なる高原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）が、追加で抗原に結合することができるか否かを検定することによって測定することができる。後者の競合結合検定の実施例は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用い、本明細書の実施例７に記載される。
【０１１９】
「抗原」または「免疫原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫的機能抗原結合断片を含む）等の選択的結合剤によって結合され得、さらに、動物において使用されて該抗原に結合可能な抗体を生成することができる分子またはその部分を意味する。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用できる１つまたは複数のエピトープを有し得る。
【０１２０】
用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって結合される分子の部分である。この用語は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは、隣接または非隣接し得る（例えば、（ｉ）単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列において相互に隣接しないが、分子の文脈において、抗原結合タンパク質によって結合されるアミノ酸残基、または（ｉｉ）マルチマー受容体において、例えば、２つ以上の個別の成分、例えば、個別の成分のうちの２つ以上に存在するＲＡＭＰ１およびＣＲＬＲ、アミノ酸残基を含むが、マルチマー受容体の文脈では、抗原結合タンパク質によって結合される、ＣＧＲＰ  Ｒ）。ある実施形態において、エピトープは、それらが、抗原結合タンパク質の生成に使用されたエピトープに類似する３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質の生成に使用された該エピトープにおいて見出されるアミノ酸残基は含まないか、またはわずかに含むという意味で、模倣体であり得る。ほとんどの場合、エピトープは、タンパク質上に存在するが、いくつかの例において、他の種類の分子、例えば、核酸に常駐し得る。エピトープ決定因子は、分子の化学的に活性な表面分類、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル群を含み得、特定の３次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／またはマクロ分子の複合混合物において、標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。
【０１２１】
「同一性」という用語は、配列を配置および比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の間の関係を意味する。「同一性パーセント」は、比較される分子におけるアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、配列整列におけるギャップ（存在する場合）を、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処する必要がある。整列される核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ
Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものを含む。
【０１２２】
同一性パーセントを計算する際に、比較されている配列は、配列間に最大の一致をもたらすように整列される。同一性パーセントを決定するために使用されたコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージであり、ＧＡＰを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ
ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを使用して、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列し、配列同一性のパーセントが決定される。配列は、それらそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドを最適に整合させるために整列される（アルゴリズムによって決定される「整合スパン」）。ギャップ開口ペナルティ（３ｘ平均ダイアゴナルで計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用されている比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり、「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリクスによって、各完全アミノ酸整合に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ拡張ペナルティ（通常、ギャップ開口ペナルティの１０分の１倍）、ならびに比較マトリクス、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２を、アルゴリズムと併せて使用する。ある実施形態において、標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスの場合、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスの場合、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）も、アルゴリズムによって使用される。
【０１２３】
ＧＡＰプログラムを使用して、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータは、以下のとおりである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
比較マトリクス：上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２からのＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２（但し、末端ギャップのペナルティはない）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【０１２４】
２つのアミノ酸配列を整列するためのいくつかの整列スキームは、２つの配列の短領域のみの整合をもたらし得、この小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないとしても、極めて高い配列同一性を有し得る。したがって、選択される整列方法（ＧＡＰプログラム）を調整して、所望される場合に、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸に渡る整列をもたらすことができる。
【０１２５】
本明細書で使用する、「実質的に純粋」は、記載される分子の種が、存在する優勢種であること、つまり、モル基準で、同一混合物において他のいかなる個別の種よりも豊富にあることを意味する。ある実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象の種が、存在する全マクロ分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を成す組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全マクロ分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を成す。他の実施形態において、対象の種は、本質的な均質性まで精製され、汚染種は、従来の検出方法によって、組成物中で検出することができず、したがって、組成物は、単一の検出可能なマクロ分子種で構成される。
【０１２６】
用語「治療する」は、傷害、病理、または状態の治療または軽減における任意の成功の現れを指し、それには、症状の軽減、寛解、減退、または傷害、病理、または状態を患者が耐えられるようにすること、悪化または消耗の速度を遅延させること、悪化の最終点の消耗性を低下させること、患者の身体的または精神的健康を向上させること等の任意の客観的または主観的パラメータを含む。症状の治療または軽減は、客観的または主観的パラメータに基づき得、身体検査、神経精神検査および／または精神鑑定の結果を含む。例えば、本明細書に提示されるある方法は、予防的または急性治療のいずれかとして、片頭痛を成功裏に治療し、片頭痛の頻度を減少させ、片頭痛の重度を低下させ、および／または片頭痛に伴う症状を緩和する。
【０１２７】
「有効量」は、概して、症状の重度および／または頻度を低減し、症状および／または根本原因を排除し、症状および／またはそれらの根本原因の発生を予防し、および／または片頭痛に起因するか、またはそれに伴う損傷を改善または修復するのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、治療上有効な量または予防的に有効な量である。「治療上有効な量」は、疾患状態（例えば、片頭痛）または症状、特に、疾患状態に伴う状態または症状を治療するか、またはそうでなければ、任意の何らかの方法で、疾患状態または疾患と関連付けられる他の望ましくない症状の進行を予防、妨害、遅延または反転させるのに十分な量である。「予防上有効な量」は、対象に投与されると、意図される予防効果を有する、例えば、片頭痛の発生（または再発）を予防または遅延させるか、または片頭痛または片頭痛症状の発生（または再発）の可能性を低減する医薬組成物の量である。完全な治療または予防効果は、１用量の投与によって必ずしも発生するとは限らず、一連の用量の投与後に起こり得る。したがって、治療上または予防上有効な量は、１回または複数の投与において投与されてもよい。
【０１２８】
「アミノ酸」は、該技術分野におけるその通常の意味を含む。２０個の自然発生するアミノ酸およびそれらの省略形は、従来の慣行に従う。任意の目的で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非従来のアミノ酸は、ポリペプチドに適した成分であり得、「アミノ酸」という語句に含まれる。非従来のアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記において、標準の慣行および慣例に従って、左方向は、アミノ末端方向であり、右方向は、カルボキシル末端方向である。
【０１２９】
概要
ヒトＣＧＲＰ  Ｒ（ｈＣＧＲＰ  Ｒ）タンパク質を含む、ＣＧＲＰ  Ｒタンパク質に結合する抗原結合タンパク質が、本明細書において提供される。抗原結合タンパク質は、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、本明細書に記載されるように、組み込まれ、および／または結合される、ポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域に組み込まれ、それはＣＤＲを配向し、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるようにする。一般に、提供される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰとＣＧＲＰ  Ｒとの間の相互作用を干渉、遮断、低減、または調節することができる。
【０１３０】
本明細書に記載される所定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、または抗体に由来する。ある実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二特異性抗体、小体、ドメイン抗体、合成抗体（「抗体模倣体」と呼ばれる場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合（本明細書では「抗体共役」と称される場合がある）、およびそれらの断片を含むが、これらに限定されない抗体に基づく。様々な構造が、本明細書において以下でさらに説明される。
【０１３１】
本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒ、特に、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに結合することが証明されている。以下の実施例においてさらに説明されるように、所定の抗原結合タンパク質を試験したところ、ＣＧＲＰ  Ｒの成分の一方または他方に対して配向される多数の他の抗体によって結合されるものとは異なるエピトープに結合することが分かった。提供される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰと競合し、それによってＣＧＲＰがその受容体に結合するのを防ぐ。結果として、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒ活性を阻害することができる。特に、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、以下の活性のうちの１つまたは複数を有し得る：、特に、ＣＧＲＰ  Ｒシグナル変換経路誘発の阻害、血管拡張の阻害、血管萎縮の誘発、炎症、例えば、神経性炎症、およびＣＧＲＰ結合の際にＣＧＲＰ  Ｒによって誘発される他の生理的効果の減少。
【０１３２】
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、多様な用途を有する。抗原結合タンパク質の一部は、例えば、特定の結合検定、ＣＧＲＰ  Ｒ、特に、ｈＣＧＲＰ  Ｒまたはそのリガンドの親和性精製、およびＣＧＲＰ  Ｒ活性の他のアンタゴニストを同定するスクリーニング検定において有用である。抗原結合タンパク質のいくつかは、ＣＧＲＰ  Ｒに対するＣＧＲＰの結合を阻害するために有用である。
【０１３３】
抗原結合タンパク質は、本明細書において説明されるように、多様な治療適用において使用することができる。例えば、あるＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒ媒介性シグナル伝達と関連付けられる状態を治療する、例えば、片頭痛の頻度および／または重度を軽減、緩和、または治療する、群発頭痛を軽減、緩和、または治療する、慢性疼痛を軽減、緩和、または治療する、糖尿病（ＩＩ型）を緩和または治療する、心血管疾患を軽減、緩和、または治療する、および患者における内毒素血および敗血症に伴う血行動態異常を軽減、緩和、または治療するために有用である。抗原結合タンパク質の他の用途は、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ関連疾患または状態の診断、およびＣＧＲＰ  Ｒの存在または不在を決定するためのスクリーニング検定を含む。本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいくつかは、ＣＧＲＰ  Ｒ活性と関連付けられる結果、症状、および／または病理を治療する際に有用である。これらには様々な種類の片頭痛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
ＣＧＲＰ受容体
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒ、特に、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに結合する。ＣＧＲＰ  Ｒは、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方を含む多量体である。ヒトＣＲＬＲのヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号１として提供される。ヒトＣＲＬＲのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号２として提供される。ヒトＲＡＭＰ１のヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号３として提供される。ヒトＲＡＭＰ１のアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号４として提供される。本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒの細胞外部分に結合し、それはＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の細胞外部分を含む。典型的なヒトＣＲＬＲの細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）は、配列番号５として提示されるヌクレオチド配列によってコード化され、配列番号６として提示されるアミノ酸配列を有する。この配列は、シグナルペプチドを含み、典型的な成熟（シグナルペプチドを差し引いた）ＣＲＬＲ  ＥＣＤは、配列番号１０として提示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＲＡＭＰ１の典型的なＥＣＤは、配列番号７として提示されるヌクレオチド配列によってコード化され、配列番号８として提示されるアミノ酸配列を有する。この配列は、シグナルペプチドを含み、典型的な成熟（シグナルペプチドを差し引いた）ＲＡＭＰ１  ＥＣＤは、配列番号１１として提示されるアミノ酸配列を有する。以下に記載されるように、ＣＧＲＰ  Ｒタンパク質は、断片を含んでもよい。本明細書で使用するそれらの用語は、同義的に使用されて、受容体、特に、指定されない限り、ＣＧＲＰに特異的に結合するヒト受容体を意味する。
ＣＧＲＰ  Ｒという用語は、ＣＧＲＰ  Ｒアミノ酸配列の翻訳後修飾、例えば、可能なＮ結合グリコシル化部位も含む。したがって、抗原結合タンパク質は、１つまたは複数の位置においてグリコシル化されるタンパク質に結合するか、またはそこから生成されてもよい。
【０１３５】
ＣＧＲＰ受容体結合タンパク質
ＣＧＲＰ  Ｒの活性を調節するために有用な多様な選択的結合剤が提供される。これらの薬剤は、例えば、抗原結合タンパク質ドメインを含む抗原結合タンパク質（例えば、単鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着、および抗原結合領域を有するポリペプチド）を含み、ＣＧＲＰ  Ｒ、特にヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合する。それらの薬剤のいくつかは、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒに対するＣＧＲＰの結合を阻害する際に有用であり、ＣＧＲＰ  Ｒシグナル伝達と関連付けられる１つまたは複数の活性を阻害、干渉、または調節するために用いることができる。
【０１３６】
一般に、提供される抗原結合タンパク質は、通常、本明細書に記載されるような１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のＣＤＲを含む。いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造および（ｂ）ポリペプチド構造に挿入される、および／または結合される１つまたは複数のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、多様な異なる形態を取り得る。例えば、自然発生する抗体、またはその断片または変異型のフレームワークであり得るか、またはそれを含み、あるいは本質的に完全に合成のもので得る。様々なポリペプチド構造の実施例は、以下でさらに説明される。
【０１３７】
所定の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は抗体であるか、または抗体に由来し、モノクローナル抗体、二特異性抗体、小体、ドメイン抗体、合成抗体（「抗体模倣体」と呼ばれる場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合（本明細書では「抗体共役」と称される場合がある）、およびそれぞれの部分または断片を含むが、これらに限定されない。一部の例において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片である（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ）。様々な構造は、本明細書においてさらに説明および定義される。
【０１３８】
本明細書において提供されるある種の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＣＲＬＲを含むヒトＣＧＲＰ  Ｒタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＲＡＭＰ１を含む、ヒトＣＧＲＰ  Ｒタンパク質に特異的に結合する。
【０１３９】
抗原結合タンパク質が治療用途に使用される実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒの１つまたは複数の生物活性を阻害、干渉、または調節することができる。この例において、抗原結合タンパク質は、過剰な抗体が、ＣＧＲＰに結合するヒトＣＧＲＰ  Ｒの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上減少させる場合（例えば、インビトロ競合結合検定において結合を測定することによって）、ＣＧＲＰに対するヒトＣＧＲＰ  Ｒと特異的に結合し、および／またはその結合を実質的に阻害する。
【０１４０】
自然発生する抗体構造
提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、通常、自然発生する抗体に伴う構造を有する。これらの抗体の構造単位は、通常、１つまたは複数の四量体を含み、それぞれ２つの同一のポリペプチド鎖のカプレットで構成されるが、ある種の哺乳類種は、単一の重鎖のみを有する抗体も生成する。通常の抗体において、各対またはカプレットは、１つの全長「軽」鎖（所定の実施形態において、約２５ｋＤａ）および１つの全長「重」鎖（所定の実施形態において、約５０〜７０ｋＤａ）を含む。各個別の免疫グロブリン鎖は、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」で構成され、それぞれ約９０〜１１０個のアミノ酸で構成され、特徴的な折り畳みパターンを発現する。これらのドメインは、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。各鎖のアミノ末端部分は、通常、抗原認識に関与する可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は、鎖の他の末端よりも進化的に保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、κおよびλ軽鎖として分類され、これらのそれぞれは、１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む。重鎖は、通常、μ、δ、γ、α、またはε鎖として分類され、これらは、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ，ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、いくつかのサブタイプを有し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭ１、およびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖および４つの軽鎖を含み、ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖および５つの軽鎖を含む。重鎖Ｃ領域は、通常、エフェクタ機能に関与し得る１つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３として知られている、それぞれ３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのうちのいずれかを有し得る。所定の実施形態において、ＣＧＲＰ  Ｒ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４サブタイプである。
【０１４１】
全長軽鎖および重鎖において、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい（あらゆる目的で、参照することによりその全体が組み込まれる）。各軽／重鎖対の可変領域は、通常、抗原結合部位を形成する。
【０１４２】
典型的なＣＧＲＰ  Ｒモノクローナル抗体のＩｇＧ２重定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２９として示される配列の最後の３２６個の残基）
【０１４３】
典型的なＣＧＲＰ  Ｒモノクローナル抗体のκ軽定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１４として示される配列の最後の１０７個の残基）
【０１４４】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、概して、同一の全体構造を呈し、「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる場合がより多い３つの超可変領域によって結合された比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述の各重鎖／軽鎖対の２つの鎖からのＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質（例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ）上の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、自然発生する軽鎖および重鎖可変領域は、いずれも通常、以下の順序の要素に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。付番システム、これらのドメインのそれぞれにおいて位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために考案されている。この付番システムは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７および１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３において定義される。
【０１４５】
本明細書において提供される、様々な重鎖および軽鎖可変領域は、表３に表される。これらの可変領域のそれぞれは、上記重鎖および軽鎖定常領域に付着されて、それぞれ完全な抗体重鎖および軽鎖を形成し得る。さらに、そのように生成された重鎖および軽鎖配列のそれぞれを組み合わせて、完全な抗体構造を形成することができる。本明細書において提供される重鎖および軽鎖可変領域は、上に列挙される典型的な配列とは異なる配列を有する他の定常領域にも付着され得ることを理解されたい。
【０１４６】
提供される抗体の全長重鎖および軽鎖のいくつか、およびそれらの対応するアミノ酸配列の特定の実施例が、表２Ａおよび２Ｂに要約される。表２Ａは、典型的な軽鎖配列を示し、表２Ｂは、典型的な重鎖配列を示す。
【０１４７】
【表２Ａ−１】
2014210815.tif 000003
【０１４８】
【表２Ａ−２】
2014210815.tif 000004
【０１４９】
【表２Ａ−３】
2014210815.tif 000005
【０１５０】
【表２Ａ−４】
2014210815.tif 000006
【０１５１】
【表２Ｂ−１】
2014210815.tif 000007
【０１５２】
【表２Ｂ−２】
2014210815.tif 000008
【０１５３】
【表２Ｂ−３】
2014210815.tif 000009
【０１５４】
【表２Ｂ−４】
2014210815.tif 000010
【０１５５】
【表２Ｂ−５】
2014210815.tif 000011
【０１５６】
表２Ａの軽鎖配列のそれぞれの最初の２２アミノ酸は、３２Ｈ７および３２ＨＣＳを除いて、シグナル配列である。３２Ｈ７および３２Ｈ７ＣＳの場合において、シグナル配列は、２０アミノ酸である。同様に、表２Ｂにおける重鎖配列の最初の２２アミノ酸は、シグナル配列である。シグナルペプチドは、例えば、ある宿主細胞においてより最適な発現のために、異なる配列を有するシグナルペプチドに変更されてもよい。したがって、本発明は、表２Ａおよび２Ｂに特定されるような軽および／または重鎖配列を有するが、異なるシグナル配列の抗体も含むことを理解されたい。
【０１５７】
さらに、表２Ｂに列挙される典型的な重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３等）のそれぞれは、表２Ａに示される典型的な軽鎖のうちのいずれかと組み合わせて、抗体を形成することができる。そのような組み合わせの実施例には、Ｌ１〜Ｌ１７のうちのいずれかと組み合わされるＨ１、Ｌ１〜Ｌ１７のうちのいずれかと組み合わされるＨ２、Ｌ１〜Ｌ１７のうちのいずれかと組み合わされるＨ３等が挙げられる。いくつかの例において、抗体は、表２Ａおよび２Ｂに列挙されるものから、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。いくつかの例において、抗体は、表２Ａおよび２Ｂに列挙される２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を含む。他の例において、抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含む。実施例として、抗体または免疫的に機能する断片は、２つのＨ１重鎖および２つのＬ１軽鎖、または２つのＨ２重鎖および２つのＬ２軽鎖、または２つのＨ３重鎖および２つのＬ３軽鎖、および表２Ａおよび２Ｂに列挙されるような軽鎖対および重鎖対の他の類似する組み合わせを含み得る。
【０１５８】
提供される他の抗原結合タンパク質は、表２Ａおよび２Ｂに示される重鎖および軽鎖の組み合わせによって形成される抗体の変異型であり、これらの鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有する、軽鎖および／または重鎖を含む。一部の例において、そのような抗体は、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含むが、他の例において、変異型は、２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖を含む。
【０１５９】
抗体の可変ドメイン
以下の表３に示される、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、およびＶＨ１３から成る群から選択される抗体重鎖可変領域、および／またはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、およびＶＬ１７から成る群から選択される抗体軽鎖可変領域、およびこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫的に機能する断片、誘導体、変異体、および変異型を含む抗原結合タンパク質も提供される。
【０１６０】
様々な重鎖および軽鎖可変領域の配列整列は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに提供される。
【０１６１】
この種類の抗原結合タンパク質は、概して、式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」によって指定することができ、式中、「ｘ」は、重鎖可変領域の数に対応し、「ｙ」は、軽鎖可変領域の数に対応する。
【０１６２】
【表３−１】
2014210815.tif 000012
【０１６３】
【表３−２】
2014210815.tif 000013
【０１６４】
【表３−３】
2014210815.tif 000014
【０１６５】
【表３−４】
2014210815.tif 000015
【０１６６】
【表３−５】
2014210815.tif 000016
【０１６７】
【表３−６】
2014210815.tif 000017
【０１６８】
表３に列挙される重鎖可変領域のそれぞれは、表３に示される軽鎖可変領域のうちのいずれかと組み合わされて、抗原結合タンパク質を形成し得る。そのような組み合わせの例には、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、またはＶＬ１７のうちのいずれかと組み合わされるＶＨ１、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、またはＶＬ１７のうちのいずれかと組み合わされるＶＨ２、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、またはＶＬ１７のうちのいずれかと組み合わされるＶＨ３等が挙げられる。
【０１６９】
いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、表３に列挙されるものとは異なる少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１つの軽鎖可変領域を含む。いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、表３に列挙されるものとは異なる少なくとも２つの重鎖可変領域および／または１つの軽鎖可変領域を含む。そのような抗原結合タンパク質の例は、（ａ）１つのＶＨ１、および（ｂ）ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、またはＶＨ１３のうちの１つを含む。別の例は、（ａ）１つのＶＨ２および（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、またはＶＨ１３のうちの１つを含む。さらに別の例は、（ａ）１つのＶＨ３および（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、またはＶＨ１３のうちの１つを含む。そのような抗原結合タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶＬ１および（ｂ）ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、ＶＬ１７、ＶＬ１８、ＶＬ１９、ＶＬ２０、またはＶＬ２１のうちの１つを含む。そのような抗原結合タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶＬ２および（ｂ）ＶＬ１、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、ＶＬ１７、ＶＬ１８、ＶＬ１９、ＶＬ２０、またはＶＬ２１のうちの１つを含む。そのような抗原結合タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶＬ３および（ｂ）ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、ＶＬ１７、ＶＬ１８、ＶＬ１９、ＶＬ２０、またはＶＬ２１のうちの１つを含む等である。
【０１７０】
重鎖可変領域の様々な組み合わせは、当業者には明らかなように、軽鎖可変領域の様々な組み合わせのうちのいずれかと組み合わせてもよい。
【０１７１】
他の例において、抗原結合タンパク質は、２つの同一の軽鎖可変領域および／または２つの同一の重鎖可変領域を含む。実施例として、抗原結合タンパク質は、表３に列挙される、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域を、軽鎖可変領域の対および重鎖可変領域の対と併せて含む、抗体または免疫学的に機能する断片であってもよい。
【０１７２】
提供されるいくつかの抗原結合タンパク質は、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基において、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、およびＶＨ１３から選択される重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む、重鎖可変ドメインを含み、そのような配列差異のそれぞれは、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換のいずれかであり、欠失、挿入、および／または置換は、前述の可変ドメイン配列に対して１５個を超えるアミノ酸変化をもたらすことはない。一部の抗原結合タンパク質における重鎖可変領域は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、およびＶＨ１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１７３】
所定の抗原結合タンパク質は、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基において、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、またはＶＬ１７から選択される軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む、軽鎖可変ドメインを含み、そのような配列差異のそれぞれは、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換のいずれかであり、欠失、挿入、および／または置換は、前述の可変ドメイン配列に対して１５個を超えるアミノ酸変化をもたらすことはない。一部の抗原結合タンパク質における軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、またはＶＬ１７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１７４】
追加の例において、抗原結合タンパク質は、以下の軽鎖および重鎖可変ドメインの対を含む。ＶＬ１とＶＨ１、ＶＬ２とＶＨ２、ＶＬ３とＶＨ３、ＶＬ４とＶＨ４、ＶＬ５とＶＨ５、ＶＬ６とＶＨ１、ＶＬ７とＶＨ６、ＶＬ８とＶＨ５、ＶＬ９とＶＨ１、ＶＬ１０とＶＨ７、ＶＬ１１とＶＨ８、ＶＬ１２とＶＨ９、ＶＬ１２とＶＨ１０、ＶＬ１３とＶＨ５、ＶＬ１４とＶＨ１１、ＶＬ１５とＶＨ１２、ＶＬ１６とＶＨ１３、およびＶＬ１７とＶＨ１３。いくつかの例において、上記対における抗原結合タンパク質は、特定の可変ドメインと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
【０１７５】
さらに他の抗原結合タンパク質、例えば、抗体または免疫学的に機能する断片は、上で説明された変異型可変重鎖および変異型可変軽鎖の変異型を含む。
【０１７６】
ＣＤＲ
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、ポリペプチドであり、１つまたは複数のＣＤＲが移植、挿入、および／または結合される。抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを有し得る。抗原結合タンパク質は、したがって、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を含む。いくつかの抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の両方を含む。特定の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、表４Ａおよび４Ｂにおいてそれぞれ特定される。
【０１７７】
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１によって説明されるシステムを使用して、特定することができる。本明細書において開示されるある種の抗体は、表４Ａ（ＣＤＲＨ）および表４Ｂ（ＣＤＲＬ）に提示されるＣＤＲのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列に対して同一であるか、または高い配列同一性を有する、１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
【表４Ａ−１】
2014210815.tif 000018
【０１７９】
【表４Ａ−２】
2014210815.tif 000019
【０１８０】
【表４Ａ−３】
2014210815.tif 000020
【０１８１】
【表４Ｂ−１】
2014210815.tif 000021
【０１８２】
【表４Ｂ−２】
2014210815.tif 000022
【０１８３】
【表４Ｂ−３】
2014210815.tif 000023
【０１８４】
自然発生する抗体内のＣＤＲの構造および特性について上で述べた。簡潔に述べると、伝統的な抗体において、ＣＤＲは、重鎖および軽鎖可変領域においてフレームワーク内に組み込まれ、それらは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する。可変領域は、上記（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ
Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３も参照）に参照される、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを、フレームワーク領域（指定フレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４、上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、上記Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７も参照）に含む。本明細書において提供されるＣＤＲは、しかしながら、伝統的な抗体構造の抗原結合ドメインを定義するように使用されるだけでなく、本明細書に記載されるように、多様な他のポリペプチド構造に組み込むことができる。
【０１８５】
一態様において、提供されるＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００から成る群から選択されるＣＤＲＨ１と、（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２と、（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３から成る群から選択されるＣＤＲＨ３と、（ｉｖ）５、４、３、２、または１個を超えないアミノ酸の１つまたは複数、例えば、１、２、３、４個以上のアミノ置換（例えば、保存アミノ酸置換）、削除、または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群から選択されるＣＤＲＨ、（Ｂ）（ｉ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９から成る群から選択されるＣＤＲＬ１と、（ｉｉ）配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０から成る群から選択されるＣＤＲＬ２と、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２から成る群から選択されるＣＤＲＬ３と、（ｉｖ）５、４、３、２、または１個を超えないアミノ酸の１つまたは複数、例えば、１、２、３、４個以上のアミノ置換（例えば、保存アミノ酸置換）、削除または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ、から成る群から選択されるＣＤＲＬ、を含む。
【０１８６】
別の態様において、抗原結合タンパク質は、表４Ａおよび４Ｂに列挙されるＣＤＲの１、２、３、４、５、または６個の変異型を含み、それぞれ表４Ａおよび４Ｂに列挙されるＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。一部の抗原結合タンパク質は、表４Ａおよび４Ｂに列挙されるＣＤＲの１、２、３、４、５、または６個の変異型を含み、それぞれこれらの表に列挙されるＣＤＲと１、２、３、４、または５個を超えないアミノ酸が異なる。
【０１８７】
さらに別の態様において、本明細書に開示されるＣＤＲは、関連モノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列を含む。本明細書に記載される、「コンセンサス配列」は、いくつかの配列間で共通する保存アミノ酸、および所与のアミノ酸配列内で変化する可変アミノ酸を有するアミノ酸配列を意味する。提供されるＣＤＲコンセンサス配列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のそれぞれに対応するＣＤＲを含む。
【０１８８】
さらに別の態様において、抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の関連を含む：配列番号４２、４３、および４４、配列番号４５、４６、および４７、配列番号４８、４９、および５０、配列番号５１、５２、および５３、配列番号５４、５５、および５６、配列番号５７、５８、および５９、配列番号６０、５５、および５６、配列番号４５、６１、および４７、配列番号６２、６３、および６４、配列番号６５、５５、および５６、配列番号６６、６７、および６８、配列番号６９、７０、および７１、および配列番号６９、７０、および７２。
【０１８９】
追加の態様において、抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の関連を含む：配列番号７３、７４、および７５、配列番号７６、７７、および７８、配列番号７９、８０、および８１、配列番号８２、８３、および８４、配列番号８５、８６、および８７、配列番号８８、８９、および９０、配列番号７６、９１、および７８、配列番号９２、９３、および９４、配列番号７６、９５、および７８、配列番号７３、７４、および９６、配列番号９７、９８、および９９、配列番号１００、１０１、および１０２。
【０１９０】
別の態様において、抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３との関連を含む：配列番号４２、４３、および４４と、配列番号７３、７４、および７５；配列番号４５、４６、および４７と配列番号７６、７７、および７８；配列番号４８、４９、および５０と配列番号７９、８０、および８１；配列番号５１、５２、および５３と配列番号８２、８３、および８４；配列番号５４、５５、および５６と配列番号８５、８６、および８７；配列番号５７、５８、および５９と配列番号８８、８９、および９０；配列番号６０、５５、および５６と配列番号８５、８６、および８７；配列番号４５、６１、および４７と配列番号７６、９１、および７８；配列番号６２、６３、および６４と配列番号９２、９３、および９４；配列番号４５、６１、および４７と配列番号７６、９５、および７８；配列番号６５、５５、および５６と配列番号８５、８６、および８７；配列番号４２、４３、および４４と配列番号７３、７４、および９６；配列番号６６、６７、および６８と配列番号９７、９８、および９９；配列番号６９、７０、および７１と配列番号１００、１０１、および１０２；配列番号６９、７０、および７２と配列番号１００、１０１、および１０２。
【０１９１】
コンセンサス配列は、抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体のＶＨおよびＶＬに対応するＣＤＲの標準系統発生分析を使用して決定した。コンセンサス配列は、ＶＨまたはＶＬに対応する同一配列内でＣＤＲを隣接するように保持することによって決定した。
【０１９２】
図３Ａ、３Ｂ、４、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、および５Ｅに示されるように、本明細書において提供される多様な抗原結合タンパク質の系統解析は、関連配列の群をもたらし、軽鎖ＣＤＲ群Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４（図３Ａおよび３Ｂ）、軽鎖ＣＤＲ群Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４（図４）、および重鎖ＣＤＲ群ＨＣ１（図５Ａ）、ＨＣ２（図５Ｂ）、ＨＣ３（図５Ｃ）、ＨＣ４（図５Ｃ）、ＨＣ５（図５Ｄ）およびＨＣ６（図５Ｅ）と指定命名される。上記群のうちのいくつかを使用して、図３Ａ、３Ｂ、４、および５Ｆに示される、追加のコンセンサス配列を生成し、軽鎖ＣＤＲ群Ｋ１，４（図３Ａ）、Ｋ２，３（図３Ｂ）、Ｌ１，２，３（図４）、およびＬＡｌｌ（図４）、および重鎖ＣＤＲ群ＨＣＡおよびＨＣＢ（図５Ｆ）を生じた。
【０１９３】
様々なＣＤＲ領域群のコンセンサス配列は、以下に提供される。
Ｋ１コンセンサス
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＧＩＲＸ１ＤＬＧ（配列番号１０３）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＫから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＡＳＳＬＱＳ（配列番号１０４）、式中、Ｘ１は、ＡおよびＧから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  ＬＱＹＮＸ１Ｘ２ＰＷＴ（配列番号１０５）、式中、Ｘ１は、ＩおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＹおよびＦから成る群から選択される。
Ｋ４コンセンサス
ＣＤＲ３  ＱＱＹＧＮＳＬＸ１Ｒ（配列番号１０６）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＣから成る群から選択される。
Ｋ１，４コンセンサス
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５ＬＸ６（配列番号１０７）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ２は、ＶおよびＩから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、ＮおよびＫから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＤから成る群から選択され、Ｘ６は、ＴおよびＧから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＡＳＳＸ２Ｘ３Ｘ４（配列番号１０８）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＲおよびＬから成る群から選択され、Ｘ３は、ＡおよびＱから成る群から選択され、Ｘ４は、ＴおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１ＱＹＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１０９）、式中、Ｘ１は、ＱおよびＬから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＮから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＴから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｓ、ＹおよびＦから成る群から選択され、Ｘ５は、ＬおよびＰから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｃ、ＷおよびＳから成る群から選択され、Ｘ７は、ＲおよびＴから成る群から選択される。
Ｋ３コンセンサス
ＣＤＲ１  ＫＳＳＱＳＬＬＨＳＸ１ＧＸ２Ｘ３ＹＬＹ（配列番号１１０）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＲおよびＫから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＴから成る群から選択される。
Ｋ２，３コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＳＳＱＳＬＬＨＳＸ２ＧＸ３Ｘ４ＹＬＸ５（配列番号１１１）、式中、Ｘ１は、ＲおよびＫから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｆ、ＤおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｙ、ＲおよびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、ＮおよびＴから成る群から選択され、Ｘ５は、ＤおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＳＮＲＸ３Ｓ（配列番号１１２）、式中、Ｘ１は、ＬおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＶから成る群から選択され、Ｘ３は、ＡおよびＦから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  ＭＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔ（配列番号１１３）、式中、Ｘ１は、ＡおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＬおよびＦから成る群から選択され、Ｘ３は、ＱおよびＰから成る群から選択され、Ｘ４は、ＴおよびＬから成る群から選択され、Ｘ５は、ＦおよびＬから成る群から選択される。
Ｌｍ３コンセンサス
ＣＤＲ２  ＲＸ１ＮＱＲＰＳ（配列番号１１４）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
Ｌｍ１，２，３コンセンサス
ＣＤＲ１  ＳＧＳＳＳＮＩＧＸ１ＮＸ２ＶＸ３（配列番号１１５）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、ＮおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＮＸ３ＲＰＳ（配列番号１１６）、式中、Ｘ１は、Ｄ、ＴおよびＲから成る群から選択され、Ｘ２は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ３は、ＫおよびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７ＶＶ（配列番号１１７）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＴおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＷおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ５は、ＲおよびＳから成る群から選択され、Ｘ６は、ＳおよびＮから成る群から選択され、Ｘ７は、ＡおよびＧから成る群から選択される。
ＬＡｌｌコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＧＸ２Ｘ３ＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１１８）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＱから成る群から選択され、Ｘ２は、存在または不在であって、存在する場合はＳであり、Ｘ３は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合はＮであり、Ｘ５は、ＩおよびＬから成る群から選択され、Ｘ６は、ＧおよびＲから成る群から選択され、Ｘ７は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、ＮおよびＦから成る群から選択され、Ｘ９は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＶおよびＡから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、ＮおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１Ｘ２ＮＸ３ＲＰＳ（配列番号１１９）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、ＴおよびＲから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｎ、ＫおよびＳから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｋ、ＮおよびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｖ（配列番号１２０）、式中、Ｘ１は、Ｇ、ＮおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｔ、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＷおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＤから成る群から選択され、Ｘ５は、ＲおよびＳから成る群から選択され、Ｘ６は、ＬおよびＶから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｓ、ＹおよびＮから成る群から選択され、Ｘ８は、Ａ、ＨおよびＧから成る群から選択され、Ｘ９は、ＶおよびＬから成る群から選択される。
ＨＣ１コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＹＹＭＸ２（配列番号１２１）、式中、Ｘ１は、ＧおよびＤから成る群から選択され、Ｘ２は、ＨおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  ＷＩＸ１ＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２２）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＸ１３ＧＭＤＶ（配列番号１２３）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＧから成る群から選択され、Ｘ２は、ＱおよびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、ＭおよびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、ＩおよびＧから成る群から選択され、Ｘ５は、ＩおよびＹから成る群から選択され、Ｘ６は、ＭおよびＡから成る群から選択され、Ｘ７は、存在または不在であって、存在する場合はＬであり、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合はＲであり、Ｘ９は、ＶおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１１は、ＰおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＰおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１３は、存在または不在であって、存在する場合はＹである。
ＨＣ２コンセンサス
ＣＤＲ２  ＲＩＫＳＸ１ＴＤＧＧＴＴＤＹＸ２ＡＰＶＫＧ（配列番号１２４）、式中、Ｘ１は、ＫおよびＴから成る群から選択され、Ｘ２は、ＴおよびＡから成る群から選択される。
ＨＣ３コンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号１２５）、式中、Ｘ１は、ＴおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＳＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２６）、式中、Ｘ１は、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＲから成る群から選択され、Ｘ６は、ＲおよびＴから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＹＳＸ８Ｘ９ＷＹＤＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１２７）、式中、Ｘ１は、ＥおよびＤから成る群から選択され、Ｘ２は、ＧおよびＱから成る群から選択され、Ｘ３は、ＶおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＥから成る群から選択され、Ｘ５は、ＧおよびＶから成る群から選択され、Ｘ６は、ＳおよびＧから成る群から選択され、Ｘ７は、存在または不在であって、存在する場合はＳであり、Ｘ８は、ＩおよびＳから成る群から選択され、Ｘ９は、ＳおよびＧから成る群から選択される。
ＨＣ４コンセンサス
ＣＤＲ１  ＳＸ１ＧＭＨ（配列番号１２８）、式中、Ｘ１は、ＦおよびＹから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  ＶＩＳＸ１ＤＧＳＸ２ＫＹＸ３Ｘ４ＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、式中、Ｘ１は、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ２は、ＩおよびＨから成る群から選択され、Ｘ３は、ＳおよびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、ＶおよびＡから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８ＹＹＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＹＹＧＸ１２Ｘ１３Ｖ（配列番号１３０）、式中、Ｘ１は、ＤおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、ＬおよびＫから成る群から選択され、Ｘ３は、ＮおよびＲから成る群から選択され、Ｘ４は、ＹおよびＶから成る群から選択され、Ｘ５は、ＹおよびＴから成る群から選択され、Ｘ６は、ＤおよびＭから成る群から選択され、Ｘ７は、ＳおよびＴから成る群から選択され、Ｘ８は、ＧおよびＬから成る群から選択され、Ｘ９は、ＨおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１０は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１１は、ＫおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＡおよびＤから成る群から選択される。
ＨＣＡコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４（配列番号１３１）、式中、Ｘ１は、ＮおよびＳから成る群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｙ、およびＦから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｗ、Ａ、およびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＳおよびＨから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＶＫＧ（配列番号１３２）、式中、Ｘ１は、Ｒ、Ａ、およびＶから成る群殻選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、およびＷから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、Ｇ、Ｆ、およびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合は、ＫおよびＴから成る群から選択され、Ｘ５は、存在または不在であって、存在する場合はＴであり、Ｘ６は、ＤおよびＳから成る群から選択され、Ｘ７は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、Ｉ、ＮおよびＨから成る群から選択され、Ｘ９は、ＴおよびＫから成る群から選択され、Ｘ１０は、ＤおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１１は、ＹおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１２は、Ｔ、Ａ、およびＶから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＡおよびＤから成る群から選択され、Ｘ１４は、ＰおよびＳから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＧＸ１８Ｘ１９Ｖ（配列番号１３３）、式中、Ｘ１は、Ｄ、ＡおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｒ、ＱおよびＧから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｔ、Ｒ、Ｌ、ＧおよびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｅ、Ｎ、ＩおよびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、Ｙ、Ｖ、およびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ｙ、ＡおよびＴから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｉ、Ｐ、Ｄ、ＡおよびＭから成る群から選択され、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合は、ＳおよびＹから成る群から選択され、Ｘ９は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｗ、ＳおよびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、ＧおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、ＬおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１２は、存在または不在であって、存在する場合は、ＷおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１３は、ＹおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１４は、存在または不在であって、存在する場合は、ＹおよびＤから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｙ、ＫおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１６は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１７は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１８は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１９は、ＤおよびＡから成る群から選択される。
ＨＣＢコンセンサス
ＣＤＲ１  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１３４）、式中、Ｘ１は、Ｎ、Ｇ、Ｄ、ＳおよびＡから成る群から選択され、Ｘ２は、Ａ、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｗ、Ｙ、ＡおよびＧから成る群から選択され、Ｘ４は、ＭおよびＬから成る群から選択され、Ｘ５は、ＳおよびＨから成る群から選択される。
ＣＤＲ２  Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｇ（配列番号１３５）、式中、Ｘ１は、Ｒ、Ｗ、Ａ、Ｖ、ＳおよびＦから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｋ、Ｎ、Ｓ、ＷおよびＲから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｓ、Ｐ、Ｇ、ＦおよびＹから成る群から選択され、Ｘ４は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｋ、ＴおよびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、存在または不在であって、存在する場合は、ＴおよびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、ＳおよびＹから成る群から選択され、Ｘ７は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ８は、ＧおよびＳから成る群から選択され、Ｘ９は、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｉ、Ｎ、ＨおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｔ、Ｋ、ＲおよびＰから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｄ、Ｎ、ＹおよびＥから成る群から選択され、Ｘ１２は、ＹおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１３は、Ｔ、ＡおよびＶから成る群から選択され、Ｘ１４は、Ａ、ＱおよびＤから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｐ、ＫおよびＳから成る群から選択され、Ｘ１６は、ＶおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１７は、ＫおよびＱから成る群から選択される。
ＣＤＲ３  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＳＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＸ１７Ｘ１８Ｖ（配列番号１３６）、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｇ、ＡおよびＥから成る群から選択され、Ｘ２は、Ｒ、ＧおよびＱから成る群から選択され、Ｘ３は、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、ＧおよびＫから成る群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｎ、ＩおよびＲから成る群から選択され、Ｘ５は、Ｙ、Ｉ、Ｇ、ＶおよびＡから成る群から選択され、Ｘ６は、Ｓ、Ｉ、Ｙ、Ｇ、ＡおよびＴから成る群から選択され、Ｘ７は、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＰおよびＤから成る群から選択され、Ｘ８は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｓ、ＬおよびＹから成る群から選択され、Ｘ９は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｗ、Ｒ、ＳおよびＴから成る群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、ＧおよびＬから成る群から選択され、Ｘ１１は、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＧおよびＹから成る群から選択され、Ｘ１２は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｆ、ＹおよびＷから成る群から選択され、Ｘ１３は、Ｙ、Ｐ、ＳおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１４は、存在または不在であって、存在する場合は、Ｙ、Ｐ、ＤおよびＨから成る群から選択され、Ｘ１５は、Ｙ、ＫおよびＦから成る群から選択され、Ｘ１６は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１７は、存在または不在であって、存在する場合はＹであり、Ｘ１８は、ＭおよびＬから成る群から選択される。
【０１９４】
いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列のうちの１つを有する、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。一部の例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列のうちの１つを有する、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。他の例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列に従う少なくとも２つの重鎖ＣＤＲおよび／または上記コンセンサス配列に従う少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲを含む。さらに他の例において、抗原結合タンパク質は、上記コンセンサス配列に従う少なくとも３つの重鎖ＣＤＲおよび／または上記コンセンサス配列に従う少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０１９５】
典型的な抗原結合タンパク質
一態様に従って、（Ａ）（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００から成る群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３から成る群から選択されるＣＤＲＨ３、および（ｉｖ）５個、４個、３個、２個、または１個を超えないアミノ酸の、１つまたは複数、例えば、１個、２個、３個、４個以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ、から成る群から選択される、１つまたは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、（Ｂ）（ｉ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２から成る群から選択される、ＣＤＲＬ３、および（ｉｖ）５個、４個、３個、２個、または１個を超えないアミノ酸の、１つまたは複数の、例えば、２個、３個、４個以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから成る群から選択される、１つまたは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含む、ＣＧＲＰ  Ｒと結合する、単離結合タンパク質が提供される。
【０１９６】
さらに別の実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００から成る群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９から成る群から選択されるＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３から成る群から選択されるＣＤＲＨ３から成る群から選択されるＣＤＲＨ、（Ｂ）（ｉ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９から成る群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０から成る群から選択されるＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２から成る群から選択されるＣＤＲＬ３、から成る群から選択されるＣＤＲＬ、または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含んでもよい。一実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、（Ａ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００のＣＤＲＨ１、配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９のＣＤＲＨ２、および配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３のＣＤＲＨ３、ならびに（Ｂ）配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９のＣＤＲＬ１、配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０のＣＤＲＬ２、および配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２のＣＤＲＬ３を含んでもよい。
【０１９７】
別の実施形態において、重鎖可変領域（ＶＨ)は、配列番号１５８〜１７０から成る群
から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有し、および／またはＶＬは、配列番号１３７〜１５３から成る群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、ＶＨは、配列番号１５８〜１７０から成る群から選択され、および／またはＶＬは、配列番号１３７〜１５３から成る群から選択される。
【０１９８】
別の態様において、ＣＧＲＰ  ＲのＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１成分の両方からのアミノ酸残基で形成されたエピトープに特異的に結合する、単離抗原タンパク質も提供される。
【０１９９】
さらに別の実施形態において、上述の単離抗原結合タンパク質は、本明細書に開示されるＣＤＲＨコンセンサス配列のうちの少なくとも１つを含む、第１のアミノ酸配列と、本明細書に開示されるＣＤＲＬコンセンサス配列のうちの少なくとも１つを含む、第２のアミノ酸配列と、を含む。一態様において、第１のアミノ酸配列は、ＣＤＲＨコンセンサス配列のうちの少なくとも２つを含み、および／または第２のアミノ酸配列は、ＣＤＲＬコンセンサス配列のうちの少なくとも２つを含む。
【０２００】
所定の実施形態において、第１および第２のアミノ酸配列は、相互に共有結合する。
【０２０１】
さらなる実施形態において、単離抗原結合タンパク質の第１のアミノ酸配列は、配列番号７５、７８、８１、８４、８７、９０、９６、９９、１０２、および１２３のＣＤＲＨ３、配列番号７４、７７、８０、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９８、１０１、および１２９のＣＤＲＨ２、ならびに配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９２、９７、および１００のＣＤＲＨ１を含み、ならびに／または単離抗原結合タンパク質の第１のアミノ酸配列は、配列番号４４、４７、５０、５３、５６、５９、６４、６８、７１、および７２のＣＤＲＨ３、配列番号４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６３、６７、および７０のＣＤＲＨ２、および配列番号４２、４５、４８、５１、５４、５７、６２、６５、６６、および６９のＣＤＲＨ１を含む。
【０２０２】
さらなる実施形態において、単離抗原結合タンパク質は、表５Ａに示される、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、またはＨ１３の少なくとも２つのＣＤＲＨ配列を含む。さらに、さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ｂに示される、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、またはＬ１７の少なくとも２つのＣＤＲＬ配列を含む。さらに、さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ａに示される、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、またはＨ１３の少なくとも２つのＣＤＲＨ配列を含み、表５Ｂに示される、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、またはＬ１７の少なくとも２つのＣＤＲＬ配列を含む。
【０２０３】
さらに、別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ａに示される、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、またはＨ１３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。さらに別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ｂに示される、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、またはＬ１７のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。
【０２０４】
さらに別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ａおよび表５Ｂに示される、Ｌ１およびＨ１、またはＬ２およびＨ２、またはＬ３およびＨ３、またはＬ４およびＨ４、またはＬ５およびＨ５、またはＬ６およびＨ１、またはＬ７およびＨ６、またはＬ８およびＨ５、またはＬ９およびＨ１、またはＬ１０およびＨ７、またはＬ１１およびＨ８、またはＬ１２およびＨ９、またはＬ１２およびＨ１０、またはＬ１３およびＨ５、またはＬ１４およびＨ１１、またはＬ１５およびＨ１２、またはＬ１６およびＨ１３、またはＬ１７およびＨ１３の６つのＣＤＲをすべて含む。
【０２０５】
【表５Ａ−１】
2014210815.tif 000024
【０２０６】
【表５Ａ−２】
2014210815.tif 000025
【０２０７】
【表５Ｂ−１】
2014210815.tif 000026
【０２０８】
【表５Ｂ−２】
2014210815.tif 000027
【０２０９】
一態様において、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはその抗体抗原結合断片であり得る。
【０２１０】
別の実施形態において、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、二重特異性抗体、または単鎖抗体分子であり得る。
【０２１１】
さらなる実施形態において、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型であり得る。
【０２１２】
別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ａ−５Ｂに記載される軽鎖または重鎖ポリペプチドのみで構成される。一部の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表５Ａ−５Ｂに列挙される軽鎖可変または重鎖可変ドメインのみで構成される。そのような抗原結合タンパク質は、１つまたは複数のＰＥＧ分子によりＰＥＧ化され得る。
【０２１３】
さらに別の態様において、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質は、標識群に結合することができ、ヒトＣＧＲＰ  Ｒの細胞外部分への結合に対して、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質のうちの１つの抗原結合タンパク質と競合し得る。一実施形態において、本明細書において提供される単離抗原結合タンパク質は、患者に投与されると、単球走化を低減させ、腫瘍への単球移行を阻害するか、腫瘍における腫瘍関連マクロファージの蓄積および機能を阻害することができる。
【０２１４】
当業者に理解されるように、描写される配列から複数のＣＤＲを有するいかなる抗原結合タンパク質の場合も、描写される配列から独立して選択されるＣＤＲの組み合わせが有用である。したがって、独立して選択される１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを有する抗原結合タンパク質を生成することができる。しかしながら、当業者に理解されるように、特定の実施形態は、一般に、非反復的なＣＤＲの組み合わせを利用し、例えば、抗原結合タンパク質は、一般に、２つのＣＤＲＨ２領域で形成されない。
【０２１５】
提供される抗原結合タンパク質のいくつかが、以下で詳細に論じられる。
【０２１６】
抗原結合たんぱく質および結合エピトープおよび結合ドメイン
抗原結合たんぱく質が、エピトープ例えば、ＣＧＲＰ  Ｒの一方または両方の成分、またはＣＧＲＰ  Ｒの細胞外ドメインと結合すると言われる場合、これは、抗原結合タンパク質が、ＣＧＲＰ  Ｒの特定部分に特異的に結合することを意味し、ＣＲＬＲ、ＲＡＭＰ１、またはＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方にわたる部分上であってもよい。抗原結合タンパク質が、（ＲＡＭＰ１ではなく）ＣＲＬＲのみと結合する場合において、抗原結合タンパク質は、ＣＲＬＲが特にＡＭ１およびＡＭ１受容体と共有されるため、ＣＧＲＰ  Ｒを選択的に結合することが予期されない。同様に、抗原結合タンパク質が、（ＣＲＬＲではなく）ＲＡＭＰ１のみと結合する場合において、抗原結合タンパク質は、ＲＡＭＡＰ１が特にＡＭＹ１受容体と共有されるため、ＣＧＲＰ  Ｒを選択的に結合することが予期されない。抗原結合タンパク質が、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方と相互作用する場合において、抗原結合タンパク質は、残基または残基の配列、あるいはＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方における領域と結合することが予期される。前述の実施形態のいずれにおいても、抗原結合タンパク質は、ＣＲＬＲまたはＲＡＭＰ１内のすべての残基と接触することが予期されない。同様に、ＣＲＬＲ、ＲＡＭＰ１、またはその細胞外ドメイン内のすべてのアミノ酸置換または欠失が、結合親和性に有意に影響することが予期されるわけではない。
【０２１７】
例えば、実施例１０において詳述される方法を使用して、多量体受容体、例えばＣＧＲＰ  Ｒのどの領域が、選択された抗原結合タンパク質に結合する際に関与し得るかを評価することができる。
【０２１８】
競合抗原結合タンパク質
別の態様において、ＣＧＲＰ  Ｒへの特異的な結合に対して、上述のエピトープに結合する、例証または「基準」抗体または機能断片のうちの１つと競合する、抗原結合タンパク質が提供される。そのような抗原結合タンパク質は、本明細書で例証される抗原結合タンパク質のうちの１つ、または重複するエピトープと同一のエピトープに結合し得る。例証または基準抗原結合タンパク質と同一のエピトープと競合するか、または結合する抗原結合タンパク質および断片は、同様の機能特性を示すことが予期される。例証される抗原結合タンパク質および断片は、重鎖および軽鎖、可変領域ドメインＶＬ１−ＶＬ１７およびＶＨ１−ＶＨ１３、および表２Ａ、２Ｂ、３、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および５Ｂに含まれるＣＤＲを有するものを含む。したがって、具体的な実施例として、提供される抗原結合タンパク質は、（ａ）表５Ａおよび５Ｂに列挙される抗体に対して列挙される６つのＣＤＲすべて、（ｂ）ＶＬ１−ＶＬ１７およびＶＨ１−ＶＨ１３から選択され、表５Ａおよび５Ｂに列挙される抗体に対して列挙されるＶＨおよびＶＬ、または（ｃ）表５Ａおよび５Ｂに列挙される抗体に対して特定される２つの軽鎖および２つの重鎖を有する抗体と競合するものを含む。適切な基準抗体の一実施例には、配列番号１５８〜１７０として同定される配列のうちのいずれかに対応する配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１３７〜１５３として同定される配列のうちのいずれかに対応する配列を有する、軽い鎖可変領域を有するものが挙げられる。
【０２１９】
結合競合は、例えば、以下の実施例７に記載されるＢｉａｃｏｒｅ検定等のビニング検定を使用して評価することができる。該実施例において、本明細書に記載される１９個の抗体を、５つの中和抗体（１１Ｄ１１、３Ｂ６、４Ｈ６、１２Ｇ８、および９Ｆ５）および１つの非中和抗体（３４Ｅ３）を含む、６つの「基準」抗体のそれぞれに対して試験した。表１３に示されるように、検定結果は、試験したすべての中和抗体（１Ｅ１１、１Ｈ７、２Ｅ７、３Ｂ６、３Ｃ８、４Ｅ４、４Ｈ６、５Ｆ５、９Ｄ４、９Ｆ５、１０Ｅ４、１１Ｄ１１、１１Ｈ９、１２Ｅ８、１２Ｇ８、１３Ｈ２および３２Ｈ７）が、本質的にＣＧＲＰ  Ｒの同一領域に結合することを示し、これは、試験した非中和抗体（３２Ｈ８、３３Ｂ５、３３Ｅ４および３４Ｅ３）によって結合される、ＣＧＲＰ  Ｒの領域とは異なる。これらのデータに基づいて、中和抗体のうちいずれも、特に、実施例７−１１Ｄ１１、３Ｂ６、４Ｈ６、１２Ｇ８、および９Ｆ５に記載される検定において不死化された中和抗体のうちのいずれかも、競合検定において、典型的な基準抗原結合タンパク質となる。
【０２２０】
モノクローナル抗体
提供される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒに結合するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、免疫付与スケジュールの完了後、トランスジェニック動物から採取された膵臓細胞を不死化することによって生成され得る。膵臓細胞は、該技術分野において知られている任意の技術を使用して、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化することができる。ハイブリドーマ生成融合手順において使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体生成であり、高い融合効率および酵素欠損を有し、それらが所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する所定の選択的媒体において成長できないようにする。マウス融合に使用するのに適した細胞株の実施例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合に使用される細胞の実施例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。モノクローナル抗体を調製する典型的な方法は、以下の実施例２に記載される。
【０２２１】
一部の例において、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）にＣＧＲＰ  Ｒ免疫原を免疫付与し、免疫付与した動物から膵臓細胞を採取し、採取した膵臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それによって、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞から確立し、（例えば、以下の実施例１〜３に記載されるように）ＣＧＲＰ  Ｒと結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を特定することによって生成される。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびそれらによって生成される抗ＣＧＲＰ  Ｒモノクローナル抗体は、本出願の態様である。
【０２２２】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、該技術分野において知られる任意の技術を使用して生成することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、特定の特性、例えば、ＣＧＲＰを発現する細胞に結合する能力、ＣＧＲＰリガンドまたはＣＧＲＰ８−３７ペプチドの結合を遮断または干渉する能力、または例えば、以下に記載されるように、ｃＡＭＰ検定を使用して、受容体を機能的に遮断する能力を有するｍＡｂを特定。
【０２２３】
キメラおよびヒト化抗体
前述の配列に基づくキメラおよびヒト化抗体も提供される。治療薬として使用するためのモノクローナル抗体は、使用前に様々な方法で修飾され得る。一実施例は、キメラ抗体であり、これは、機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖、あるいはその免疫学的機能部分を生成するように、共役結合される、異なる抗体からのタンパク質切片で構成される抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、鎖の残りは、別の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する。キメラ抗体に関連する方法については、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号に記載されている。
【０２２４】
一般に、キメラ抗体を形成する目的は、意図された患者の種からのアミノ酸の数を最大化するキメラを形成することである。一実施例は、「ＣＤＲ移植された」抗体であり、抗体は、特定の種から、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、抗体鎖の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに起因する対応配列と同一または相同である。ヒトにおいて使用する場合、齧歯類抗体からの可変領域または選択されたＣＤＲがヒト抗体に移植される場合が多く、ヒト抗体の自然発生する可変領域またはＣＤＲを置換する。
【０２２５】
キメラ抗体の１つの有用な型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物において最初に産生されるモノクローナル抗体から生成される。このモノクローナル抗体における、通常、抗体の非抗原認識部分からのある種のアミノ酸残基が、対応するアイソトープのヒト抗体において対応する残基に相同するように修飾される。ヒト化は、例えば、齧歯類可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域と置換することによって、様々な方法を使用して行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、および第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照）。
【０２２６】
一態様において、本明細書において提供される抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ（表４を参照）は、同一または異なる系統種の抗体からのフレームワーク領域（ＦＲ）に移植される。例えば、重鎖および軽鎖可変領域ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２、およびＶＨ１３および／またはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、ＶＬ１３、ＶＬ１４、ＶＬ１５、ＶＬ１６、およびＶＬ１７のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを形成するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を特定することが。他の実施形態において、本明細書に開示される重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖からのＦＲと置き換えられる。一態様において、抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおける希少アミノ酸は置換されないが、ＦＲアミノ酸の残りは、置換される。「希少アミノ酸」は、この特定のアミノ酸が、通常、ＦＲにおいて見出されない位置にある特定のアミノ酸である。代替として、ある重鎖または軽鎖から移植された可変領域は、本明細書に開示されるような特定の重鎖または軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と併用されてもよい。他の実施形態において、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。
【０２２７】
所定の実施形態において、ヒト以外の種からの定常領域を、ヒト可変領域とともに使用して、ハイブリッド抗体を生成することができる。
【０２２８】
完全ヒト抗体
完全ヒト抗体も提供される。ヒトを抗原に曝露させることなく、所定の抗原に特異的な完全ヒト抗体を形成するための方法が使用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の生成を実装するために提供される１つの具体的な手段は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）位置の導入は、任意の所望の抗原により免疫付与され得る動物である、マウスにおいて、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する１つの手段である。完全ヒト抗体の使用は、マウスまたはマウス由来ｍＡｂを治療薬としてヒトに投与することによってもたらされ得る場合がある、免疫原性およびアレルギー性反応を最小化することができる。
【０２２９】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン生成の不在下で、一連のヒト抗体を生成することができる、トランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫付与することによって生成することができる。この目的のための抗原は、通常、６個以上の隣接するアミノ酸を有し、任意で、ハプテン等の担体に共役される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８、およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そのような方法の一実施例において、トランスジェニック動物は、そこでマウス重および軽免疫グロブリン鎖をコード化する内因性マウス免疫グロブリン位置を機能しないようにし、ヒト重および軽鎖タンパク質をコード化する、ヒトゲノムＤＮＡ位置の大きい断片をマウスゲノムに挿入することによって生成される。部分的に修飾される動物は、ヒト免疫グロブリン位置の総数よりも少なく、次に、所望の免疫系修飾のすべてを有する動物を得るために交配される。免疫原を投与されると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるが、マウスアミノ酸配列ではなく、可変領域を含むヒトアミノ酸配列を有する抗体を生成する。そのような方法のさらなる詳細については、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３３７３５号および第ＷＯ９４／０２６０２号を参照されたい。ヒト抗体を形成するためのトランスジェニックマウスに関連する追加の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，５４５，８０７号、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第５，５４５，８０６、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、ＷＯ９０／０４０３６、および欧州特許第ＥＰ５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第ＥＰ５４６０７３Ａ１号において記載されている。
【０２３０】
上述のトランスジェニックマウスは、本明細書において「ＨｕＭａｂ」マウスと称され、内因性［μ］および［κ］鎖遺伝子座を不活性化する標的された変異とともに、再配列されていないヒト重（［μ］および［γ］）および［κ］軽鎖免疫グロブリン配列をコード化する小遺伝子座を有するヒト免疫グロブリン遺伝子を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、マウスは、免疫付与に応答して、マウスＩｇＭまたは［κ］の低い発現を呈し、導入されたヒト重鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞変異を経て、高親和性のヒトＩｇＧ［κ］モノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４：８４５−８５１において詳述され、前述の参考文献は、あらゆる目的でそれら全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第ＷＯ９３／１２２７号、第ＷＯ９２／２２６４６号、および第ＷＯ９２／０３９１８号を参照し、それらすべての開示は、あらゆる目的でそれら全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。これらのトランスジェニックマウスにおいて、ヒト抗体を生成するために利用される技術は、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号およびＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６においても開示され、参照することにより本明細書に組み込まれる。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス株を使用して、抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体を生成することができる。トランスジェニックマウスを使用するヒト抗体の生成に関するさらなる詳細は、以下の実施例において提供される。
【０２３１】
ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを生成し、上述のもの等のトランスジェニックマウスから選択することができる。そのような抗体は、適切なベクターおよび宿主細胞を使用して、クローン化および発現され得る、または抗体は、培養されたハイブリドーマ細胞から採取することができる。
【０２３２】
完全ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１において開示されるとおり）。ファージ表示技術は、糸状バクテリオファージの表面上に抗体レパートリー、および選択した抗原に結合することによって、ファージの後次選択を表示することによって、免疫選択を模倣する。そのような技術の１つは、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１０４９４号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載され、そのようなアプローチを使用する、ＭＰＬおよびｍｓｋ受容体の高親和性および機能性アゴニスト抗体の単離について説明する。
【０２３３】
二特異性または二機能性抗原結合タンパク質
提供される抗原結合タンパク質は、上述のように、１つまたは複数のＣＤＲあるいは１つまたは複数の可変領域を含む、二特異性および二機能性抗体も含む。二特異性または二機能性抗体は、いくつかの例において、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合が挙げられるが、これに限定されない、多様な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
【０２３４】
様々な他の形態
提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、上で開示される抗原結合タンパク質（例えば、表２−５に列挙される配列を有するもの）の変異型である。例えば、抗原結合タンパク質のいくつかは、表２−５に列挙される重鎖または軽鎖、可変領域、またはＣＤＲの1つ以上において、１つまたは複数の保存アミノ酸置換を有する。
【０２３５】
自然発生するアミノ酸は、共通する側鎖特性に基づいて、以下のクラスに分割され得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏおよび
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２３６】
保存アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、同一クラスの別のメンバーと交換することを含み得る。保存アミノ酸置換は、非自然発生アミノ酸残基を包含してもよく、通常、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらは、アミノ酸部分のペプチド模倣体および他の反転または逆転形態を含む。
【０２３７】
非保守的置換は、上記クラスのうちの１つのメンバーを別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。そのような置換残基は、ヒト抗体と相同である抗体の領域、または分子の非相同領域に導入されてもよい。
【０２３８】
そのような変更を形成する際に、所定の実施形態に従うと、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質のヒドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値を割り当て（「ヒドロパシー指標」）、次に、これらの値をペプチド鎖に沿って繰り返し平均化することによって計算される。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【０２３９】
タンパク質に対する相互作用生物機能の付与におけるヒドロパシープロファイルの重要性は、該技術分野において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。ある種のアミノ酸は、類似するヒドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換されてもよく、依然として同様の生物活性を維持することが知られている。ヒドロパシー指標に基づいて変更を行う際に、ある実施形態において、そのヒドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの態様において、±１以内のものが含まれ、他の態様において、±０．５のものが含まれる。
【０２４０】
該技術分野において、類似するアミノ酸の置換は、特に、本例のように、生物学的に機能するタンパク質またはそれによって形成されるペプチドが、免疫的実施形態における使用が意図される場合、親水性に基づいて効果的に形成され得ることも理解される。ある実施形態において、タンパク質の最大局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配され、その免疫原性および抗原結合または免疫原性、つまり、タンパク質の生物特性と相関する。
【０２４１】
以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて変更を行う際に、ある実施形態において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態において、±１以内であるものが含まれ、さらに他の実施形態において、±０．５以内であるものが含まれる。いくつかの例において、親水性に基づいて、主要なアミノ酸配列からエピトープを特定してもよい。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
【０２４２】
典型的な保存アミノ酸置換が、表６に記載される。
【表６】
2014210815.tif 000028
【０２４３】
熟練者であれば、周知の技術を使用して、本明細書に説明されるようなポリペプチドの適切な変異型を決定することができるであろう。当業者は、活性に重要であると考えられない領域を標的することによって、活性を破壊することなく、変更され得る分子の適切な領域を特定し得る。当行者は、類似ポリペプチドの中で保存される分子の残基および部分を特定することもできるであろう。さらなる実施形態において、生物活性または構造に重要であり得る領域であっても、生物活性を破壊しないか、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに保存アミノ酸置換に供され得る。
【０２４４】
追加として、当業者は、活性または構造に重要な類似ポリペプチドにおいて残基を特定する構造機能研究を検討することができる。そのような比較を参照して、類似タンパク質における活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似するアミノ酸置換を選択し得る。
【０２４５】
当業者は、３次元構造および類似ポリペプチドにおいて該構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報を考慮して、当業者は、その３次元構造に関する抗体のアミノ酸残基の配列を予測することができる。当業者は、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に対するラジカル変更を行わないことを選択し得る。それは、そのような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。さらに、当業者は、それぞれ所望されるアミノ酸残基において、単一のアミノ酸置換を含む試験変異型を生成することができる。次に、これらの変異型は、ＣＧＲＰ  Ｒ中和活性に関する検定を使用してスクリーニングすることができ（以下の実施例を参照）、どのアミノ酸を変更することができ、どれを変更してはならないかに関する情報が得られる。言い換えれば、そのようなルーチン実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異との組み合わせで、さらなる置換を回避する必要があるアミノ酸位を容易に決定することができる。
【０２４６】
多数の科学出版物が、二次構造の予測をテーマにしている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：２２２−２４５、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６、およびＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、二次構造の予測を支援するコンピュータプログラムが現在使用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性または４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似する構造トポロジーを有し得る。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチドまたはタンパク質構造内の潜在的な折り返し数を含む、二次構造の予測可能性を高めている。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質において、限定数の折り畳みが存在し、臨界数の構造が解決されると、構造予測は劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０２４７】
二次構造を予測する追加の方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−３８７、Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的結合」（Ｈｏｌｍ，１９９９、上記、およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７、上記を参）が挙げられる。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を改変し、および／または（５）そのようなポリペプチドに関する他の物理化学的または機能的特性を付与または改変する、アミノ酸置換がなされる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（所定の実施形態において、保存アミノ酸置換）は、自然発生する配列において形成されてもよい。置換は、分子間接触を形成するドメインの外側にある抗体の部分において形成することができる。そのような実施形態において、親配列の構造特徴を大幅に変更しない保存アミノ酸置換を使用することができる（例えば、親または天然抗原結合タンパク質を特徴化する二次構造を妨害しない１つまたは複数の置換アミノ酸）。該技術分野で認識されているポリペプチド二次および三次構造の実施例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５において説明され、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２４９】
追加の好適な抗体変異型には、親または天然アミノ酸配列における１つまたは複数のシステイン残基が別のアミノ酸（例えば、セリン）から削除されるか、または置換される、システイン変異型が挙げられる。システイン変異型は、特に、抗体を生物学的に活性な配座に再折り畳みをしなければならない場合に有用である。システイン変異型は、天然抗体よりも少ないシステイン残基を有してもよく、通常、非対システインから生じる相互作用を最小化するように、偶数個を有する。
【０２５０】
開示される重鎖および軽鎖、可変領域ドメイン、およびＣＤＲを使用して、ＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合することができる抗原結合領域を含むポリペプチドを調製することができる。例えば、表４および５に列挙されるＣＤＲのうちの１つまたは複数は、共役的または非共役的に分子（例えば、ポリペプチド）に組み込まれ、免疫接着を形成することができる。免疫接着は、大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込み得るか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共役結合し得るか、またはＣＤＲを非共役的に組み込み得る。ＣＤＲは、免疫接着によって、関心対象の特定抗原（例えば、ＣＧＲＰ  Ｒまたはそのエピトープ）に対して特異的に結合できるようにする。
【０２５１】
本明細書に記載される可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓまたはｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド、またはペプチドおよび非ペプチド領域の組み合わせであり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９は、任意の目的で参照することにより本明細書に組み込まれる。治療上有効なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、同様の治療または予防効果をもたらすことができる。そのような化合物は、コンピュータ化された分子モデリングの援助を受けて開発される場合が多い。一般に、ペプチド模倣体は、所望の生物活性、例えば、ここではＣＧＲＰ  Ｒと特異的に結合する能力を示すが、該技術分野において知られている方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯから選択される結合によって任意で置換される１つまたは複数のペプチド結合を有する、抗体と構造的に類似するタンパク質である。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸を同一種のＤアミノ酸と系統的に置換することは（例えば、Ｌリシンに換えてＤリシン）、ある実施形態において使用され、より安定したタンパク質を生成し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変型例を含む制限ペプチドは、該技術分野において知られている方法によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を追加することによって生成され得る（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）。
【０２５２】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質の誘導体も提供される。誘導体化抗原結合タンパク質は、所望の特性、例えば、特定用途における長い半減期を抗体または断片に付与する任意の分子または物質を含むことができる。誘導体化抗原結合タンパク質は、例えば、検出可能な（または標識）部分（例えば、放射性、比色、抗原または酵素分子、検出可能なビーズ（磁気または電子密度の高い（例えば、金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン））、治療または診断部分（例えば、放射性、細胞毒性、または薬学的に活性な部分）、または特定の用途に対する抗原結合タンパク質の適切性を高める分子（例えば、ヒト対象等の対象に対する投与、インビボまたはインビトロ用途におけるその他）を含むことができる。抗原結合タンパク質を誘導体化するために使用することができる分子の実施例には、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗原結合タンパク質のアルブミン結合およびＰＥＧ化誘導体は、該技術分野においてよく知られている技術を使用して調製することができる。所定の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるＰＥＧ化単鎖ポリペプチドを含む。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異型に共役されるか、または他の方法で結合される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異型は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールから成る群から選択される化学物質により化学的に修飾することができる。
【０２５３】
他の誘導体は、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される異種ポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質の発現による、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共役または凝集結合を含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、イーストα因子リーダー、またはエピトープタグ等のペプチドである。ＣＧＲＰ抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質（例えば、ポリＨｉｓ）の精製または特定を促進するように追加されるペプチドを含むことができる。ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質は、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるようにＦＬＡＧペプチドに結合することもできる。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性が高く、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって逆結合されるエピトープを提供して、発現した組み換えタンパク質の急速検定および簡易精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するために有用な試薬は、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０２５４】
１つまたは複数のＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含むオリゴマーを、ＣＲＲＰ  Ｒアンタゴニストとして用いることができる。オリゴマーは、共役結合または非共役結合二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形態であってもよい。２つ以上のＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含むオリゴマーは、ホモダイマーである一実施例との併用が意図される。他のオリゴマーは、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等を含む。
【０２５５】
一実施形態は、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質に融合されるペプチド部分間の共役または非共役相互作用を介して結合される複数のＣＧＲＰ  Ｒ結合ポリペプチドを含むオリゴマーを対象とする。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。抗体に由来するロイシンジッパーおよび所定のポリペプチドは、以下に詳述されるように、そこに付着されるＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドである。
【０２５６】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２〜４個のＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含む。オリゴマーのＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質部分は、上述の形態、例えば、変異型または断片のうちのいずれかであり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＣＧＲＰ  Ｒ結合活性を有する、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含む。
【０２５７】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを使用して調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合される、ある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５、Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７、およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  ″Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ″，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１．によって説明されている。
【０２５８】
一実施形態は、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を抗体のＦｃ領域に融合することによって形成される、２つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコード化する遺伝子融合を、適切な発現ベクターに挿入すること、組み換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞において遺伝子融合を発現させること、および発現された融合タンパク質を抗体分子のように組み立てさせることによって形成され得、そこで、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分の間に形成され、二量体を産生する。
【０２５９】
本明細書で使用する、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来する天然および変異型のポリペプチドを含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有する、そのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇカラムに渡る、親和性クロマトグラフィによる簡易精製の利点を提供する。
【０２６０】
ＰＣＴ国際出願題ＷＯ９３／１０１５１号および米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号において説明される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端まで延在する単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１において記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変更され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変更され、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変更されたことを除いて、国際公開第ＷＯ９３／１０１５１号において提示される天然Ｆｃ配列のそれと同一である。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対して低い親和性を呈する。
【０２６１】
他の実施形態において、本明細書に開示されるようなＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分と置換されてもよい。
【０２６２】
代替として、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサペプチド）を有し、または有さず、複数のＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものである。
【０２６３】
オリゴマーＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質誘導体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、最初にいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以来、多様な異なるタンパク質において見出されている。特に知られているロイシンジッパーは、自然発生するペプチドおよび二量化または三量化するその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの実施例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１０３０８号において記載され、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１において説明され、参照することにより本明細書に組み込まれる。そこに融合される異種タンパク質の安定した三量化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−２７８において説明される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合されるＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質断片または誘導体を含む、組み換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞において発現され、形成する可溶性オリゴマーＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質断片または誘導体は、培養上清から回復される。
【０２６４】
ある実施形態において、抗原結合タンパク質は、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭまたは５０ｎＭ未満のＫＤ（平衡結合親和性）を有する。
【０２６５】
別の態様は、インビトロまたはインビボで（例えば、ヒト対象に投与される場合）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態において、抗体またはその部分は、４日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体またはその部分は、８日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、非誘導体化または非修飾抗体と比較して、長い半減期を有するように誘導体化または修飾される。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、点変異を含み、血清半減期を増加させ、例えば、参照することにより組み込まれる、２０００年２月２４日公開の国際公開第ＷＯ００／０９５６０号において説明される。
【０２６６】
グリコシル化
抗原結合タンパク質は、天然種において見出されるものとは異なるか、または変更されたグリコシル化パターンを有し得る。該技術分野において知られるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じられる、特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質が生成される宿主細胞または生物の両方に依存し得る。特定の発現系は、以下で論じられる。
【０２６７】
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的なセリンまたはトレオニンに対する、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシローズのうちの１つの付着を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。
【０２６８】
抗原結合タンパク質に対するグリコシル化部位の追加は、簡便に、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むように、アミノ酸配列を変更することによって達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。変更は、開始配列に対する１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の追加または置換によって形成されてもよい（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、事前選択した塩基において、標的ポリペプチドをコード化するＤＮＡを変異させることによるＤＮＡレベルでの変化により変更されてもよい。
【０２６９】
抗原結合タンパク質の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質に対するグリコシドの化学または酵素結合による。これらの手段は、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化に対する、グリコシル化能力を有するタンパク質を宿主細胞において生成することを必要としないという利点がある。使用される結合モードに応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システイン等の遊離スルヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリン等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第ＷＯ８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６において説明されている。
【０２７０】
開始抗原結合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または相当する化合物に対するタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、結合する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いて、大部分またはすべての糖の開裂をもたらす一方で、ポリペプチドを無傷に保つ。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって説明されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されるように、多様な内因性および外因性グリコシダーゼを使用することによって達成することができる。潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明されるように、化合物ツニカマイシンの使用によって回避され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【０２７１】
したがって、態様は、抗原結合タンパク質のグリコシル化変異型を含み、そこではグリコシル化の数および／または種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されている。ある実施形態において、抗体タンパク質変異型は、天然抗体よりも多数または少数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの配列によって特徴付けられ、式中、Ｘとして指定されるアミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を形成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合炭水化物鎖の追加のための潜在的な新規部位を提供する。代替として、この配列を排除または変更する置換は、天然のポリペプチドに存在するＮ結合炭水化物鎖の追加を回避する。例えば、グリコシル化は、Ａｓｎを削除するか、またはＡｓｎを異なるアミノ酸と置換することによって、低減させることができる。他の実施形態において、１つまたは複数の新規Ｎ結合部位が形成される。通常、抗体は、Ｆｃ領域にＮ結合グリコシル化部位を有する。
【０２７２】
標識およびエフェクタ基
一部の実施形態において、抗原結合は、１つまたは複数の標識を含む。「標識基」または「標識」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。適切な標識基の実施例には、以下の放射性アイソトープまたは放射性ヌクリド（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリンホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル群、または二次レポータにより認識される事前決定したポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標識基は、様々な長さのスペーサアームを介して抗原結合タンパク質に結合され、潜在的な立体障害を低減する。タンパク質を標識するための様々な方法が、該技術分野において知られており、適合するとみなされるように使用することができる。
【０２７３】
用語「エフェクタ基」は、細胞毒性剤として作用する、抗原結合タンパク質に結合される任意の基を意味する。適切なエフェクタ群の実施例は、放射性アイソトープまたは放射性ヌクリド（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の適切な基には、毒素、治療薬基、または化学療法薬基が挙げられる。適切な基の実施例には、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、およびマイタンシンが挙げられる。一部の実施形態において、エフェクタ基は、様々な長さのスペーサアームを介して、抗原結合タンパク質に結合されて、潜在的な立体障害を低減する。
【０２７４】
一般に、標識は、それらが検出される検定に応じて、多様な群、すなわち、ａ）放射性または重同位体であり得る同位体標識、ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子、ｃ）レドックス活性部分、ｄ）光学染色、酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリンホスファターゼ）、ｅ）ビオチニル化群、およびｆ）二次レポータにより認識される事前決定したポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）に分類される。一部の実施形態において、標識基は、様々な長さのスペーサアームを介して、抗原結合タンパク質に結合されて、潜在的な立体障害を低減する。タンパク質を標識するための様々な方法は、該技術分野において知られている。
【０２７５】
特定の標識は、光学染色を含み、クロモフォア、ホスフォア、およびフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されず、後者は、多くの例において特異的である。フルオロフォアは、「小分子」フルオレ、またはタンパク性フルオレのいずれかであり得る。
【０２７６】
「蛍光標識」とは、その生来の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子を意味する。適切な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅグリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ染色（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む適切な光学染色は、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄにおいて説明され、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２７７】
適切なタンパク性蛍光標識には、ＧＦＰのＲｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ、Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）およびＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第ＷＯ９２／１５６７３号、第ＷＯ９５／０７４６３号、第ＷＯ９８／１４６０５号、第ＷＯ９８／２６２７７号、第ＷＯ９９／４９０１９号、米国特許第５２９２６５８号、第５４１８１５５号、第５６８３８８８号、第５７４１６６８号、第５７７７０７９号、第５８０４３８７号、第５８７４３０４号、第５８７６９９５号、第５９２５５５８号）も含まれるが、これらに限定されない。
【０２７８】
ＣＧＲＰ抗原結合タンパク質をコード化する核酸配列
本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコード化する核酸、またはその部分も提供され、抗体の一方または両方の鎖をコード化する核酸、またはその断片、誘導体、変異体、または変型、重鎖可変領域またはＣＤＲのみをコード化するポリヌクレオチド、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを同定、分析、変異、または増幅させるためのＰＣＲプライマまたは配列決定プライマ、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述の相補配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得、および／または１つまたは複数の追加の配列、例えば、調節配列を含み得、および／または大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、単鎖または二重鎖であり得、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、およびそれらの人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含むことができる。
【０２７９】
表７は、ＩｇＧ２重鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、およびλｈＣＬ−１軽鎖定常領域をコード化する典型的な核酸配列を示す。本明細書において提供される任意の可変領域は、これらの定常領域に付着されて、完全な重鎖および軽鎖配列を形成することができる。しかしながら、これらの定常領域配列は、単なる特定の実施例として提供されることを理解する必要があり、当業者は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含む他の定常領域、ｈＣＬ−１、ｈＣＬ−２、ｈＣＬ−３およびｈＣＬ−７を含む７つのλ軽鎖定常領域のいずれも、および安定性、発現、製造可能性、または他の所望される特性を向上させるために修飾された定常領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、可変領域配列は、該技術分野において知られる他の定常領域配列に結合される。重鎖および軽鎖可変領域をコード化する典型的な核酸配列は、表８に提供される。
【０２８０】
【表７】
2014210815.tif 000029
【０２８１】
表８は、重鎖および軽鎖可変領域をコード化する典型的な核酸配列を示し、様々なＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列が組み込まれる。
【０２８２】
【表８−１】
2014210815.tif 000030
【０２８３】
【表８−２】
2014210815.tif 000031
【０２８４】
【表８−３】
2014210815.tif 000032
【０２８５】
【表８−４】
2014210815.tif 000033
【０２８６】
【表８−５】
2014210815.tif 000034
【０２８７】
【表８−６】
2014210815.tif 000035
【０２８８】
【表８−７】
2014210815.tif 000036
【０２８９】
【表８−８】
2014210815.tif 000037
【０２９０】
表９は、完全な重鎖および軽鎖、ならびに、典型的な単離抗原結合タンパク質、特に、本明細書に開示されるｈＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質の重鎖および軽鎖可変領域をコード化する典型的な核酸配列の配列番号を示す。
【０２９１】
【表９−１】
2014210815.tif 000038
【０２９２】
【表９−２】
2014210815.tif 000039
【０２９３】
ある抗原結合タンパク質をコード化する核酸、またはその部分（例えば、全長抗体、重または軽鎖、可変ドメイン、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３）は、例えば、全長ＣＧＲＰ  Ｒ（ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方を含む）、ＣＧＲＰ  Ｒの細胞外ドメイン（ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方を含む）、ＣＧＲＰ  Ｒの細胞外ドメイン（ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の細胞外ドメインを含む）、ＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞全体、ＣＧＲＰ  Ｒを発現する細胞から調製された膜、融合タンパク質、例えば、Ｆｃに融合されたＣＲＬＲ、ＲＡＭＰ１（またはその細胞外ドメイン）を含むＦｃ融合、および例えば、本明細書における実施例１〜３に記載されるような該技術分野において知られている他の方法で免疫付与することによって、ＣＧＲＰ  Ｒで免疫付与されたマウスのＢ細胞、またはその免疫原性成分から単離することができる。核酸は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等の従来手順によって単離することができる。ファージディスプレイは、抗体の誘導体および他の抗原結合タンパク質を調製することができる、周知の技術の別の実施例である。１つのアプローチにおいて、関心対象の抗原結合タンパク質の成分であるポリペプチドが、任意の適切な組み換え発現系において発現され、発現されたポリペプチドを組み合わせて、抗原結合タンパク質分子を形成することができる。
【０２９４】
表７〜９において提供される核酸は、単なる例証である。遺伝子コードの縮退に起因して、表２〜５に列挙されるか、またはそうでなければ本明細書に表されるポリペプチド配列のそれぞれは、提供されるもの以外に、多数の他の核酸配列によってもコード化される。当業者であれば、本出願が、したがって、各抗原結合タンパク質をコード化する縮重ヌクレオチド配列に対する適切な記述および使用可能性を提供することを理解されたい。
【０２９５】
１つの態様は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸（例えば、表７、表８、表９および／または配列番号２２４〜２５８において列挙されるヌクレオチド配列を含む核酸）に対してハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズするための方法は、該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書において定義される、中度に厳しいハイブリダイゼーション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６ｘＳＳＣ、および５５℃のハイブリダイゼーション温度を含有する事前洗浄液（または他の同様のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約５０％のホルムアミドを含有するもの、４２℃のハイブリダイゼーション温度）および６０℃、０．５ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を使用する。厳しいハイブリダイゼーション条件は、６ｘ  ＳＳＣ中４５℃でハイブリダイズし、続いて、０．１ｘＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中６８℃で１回または複数回洗浄する。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションの厳密性を増減させて、相互に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、通常、相互にハイブリダイズされた状態であるようにすることができる。
【０２９６】
適切な条件を設定するためのハイブリダイゼーション条件およびガイダンスの選択に影響する基本パラメータは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，上記、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．１０および６．３−６．４節）によって説明され、例えば、核酸の長さおよび／または塩基組成物に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【０２９７】
核酸への変異によって変化を導入することができ、それによって、それがコード化するポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、抗体または抗体誘導体）の変化をもたらす。変異は、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して導入することができる。一実施形態において、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基は、例えば、部位特異的な突然変異誘発プロトコルを使用して変えられる。別の実施形態において、１つまたは複数のランダムに選択された残基が、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを使用して変えられる。どのように生成されても、変異ポリペプチドを発現させ、所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０２９８】
変異は、それがコード化するポリペプチドの生物活性を有意に変更することなく、核酸に導入することができる。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非必須アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらすことができる。代替として、１つまたは複数の変異は、それがコード化するポリペプチドの生物活性を選択的に変更する核酸に導入させることができる。例えば、変異は、量的または質的に生物活性を変えることができる。量的変化の実施例には、活性を増加、低減、または排除することが挙げられる。質的変化の実施例には、抗体の抗原特異性を変えることを含む。一実施形態において、本明細書に記載される任意の抗原結合タンパク質をコードする核酸を変異させて、当該技術分野において十分に確立された分子生物学的技術を使用して、アミノ酸配列を変更することができる。
【０２９９】
別の態様は、核酸配列の検出のためのプライマまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。核酸分子は、全長ポリペプチドをコード化する核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマとして使用することができる断片またはポリペプチドの活性部分（例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ結合部分）をコード化する断片を含むことができる。
【０３００】
核酸の配列に基づくプローブを使用して、核酸または同様の核酸、例えば、ポリペプチドをコード化する転写を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性アイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子を含むことができる。そのようなプローブを使用して、ポリペプチドを発現する細胞を特定することができる。
【０３０１】
別の態様は、ポリペプチドまたはその部分（例えば、１つまたは複数のＣＤＲを含有する断片、または１つまたは複数の可変領域ドメイン）をコード化する核酸を含む、ベクターを提供する。ベクターの実施例には、プラスミド、バイアルベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、および発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができる。組み換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に操作可能に結合される、１つまたは複数の調節配列を含む。調節配列は、多くの種類の宿主細胞において、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの（例えば、ＳＶ４０早期遺伝子エンハンサ、ラウス肉腫ウイルスプロモータおよびサイトメガロウイルスプロモータ）、ある種の宿主細胞において、ヌクレオチド配列の発現のみを指示するもの（例えば、組織特異的調節配列、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）、および特定の治療または状態に応答してヌクレオチド配列の誘導発現を指示するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオニンプロモータ、および原核および真核系の両方におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモータ（同文献を参照）を含む）。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞、所望されるタンパク質の発現レベル等、そのような因子に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、それによって本明細書に記載されるような核酸によってコード化される、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生成する。
【０３０２】
別の態様は、組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、イースト菌、昆虫、または哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞に導入することができる。哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小断片のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに統合し得ることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性に対する）選択可能マーカーをコード化する遺伝子は、一般に、関心対象の遺伝子に沿って、宿主細胞に導入される。好適な選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、およびメトトレキセート等の薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸によって安定してトランスフェクトされる細胞は、他の方法の中でも、薬物選択によって特定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０３０３】
抗原結合タンパク質の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、任意の抗体生成動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたは赤毛サル）または類人猿（例えば、チンパンジー）に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロ細胞培養および細胞培養ベースの適用、または抗体への免疫反応が起こらないか、または有意でない、回避できる、関心事でないか、または所望される任意の他の適用において使用することができる。ある実施形態において、抗体は、上述のように、および／または以下の実施例１〜３において記載されるように、該技術分野において知られている方法を使用して、動物に免疫付与することによって生成することができる。それらの実施例は、３つの異なる免疫原調製−（ｉ）ＣＧＲＰ  Ｒ−ＲＡＭＰ１およびＣＲＬＲの２つの主要成分の全長版を発現する全体細胞、（ｉｉ）そのような細胞からの膜抽出物、および（ｉｉｉ）ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１のＮ末端細胞外ドメインを共発現および精製することによって得られる可溶性ＣＧＲＰ  Ｒを使用して、抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体の生成について説明する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナルであり得、または組み換えＤＮＡを発現することによって宿主細胞において合成され得る。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン位を含有する形質転換動物に免疫付与するか、または一連のヒト抗体を発現しているファージ表示ライブラリを選択することによって、上述のように調製することができる。
【０３０４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、多様な技術によって生成することができる。代替として、モノクローナル抗体を生成するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するために適した動物系の１つは、マウス系であり、非常に良く確立された手順である。免疫付与プロトコルおよび融合用の免疫付与した脾細胞の単離技術は、該技術分野において知られており、例示的アプローチを、以下の実施例において記載する。そのような手順の場合、免疫付与されたマウスからのＢ細胞が、通常、適切な不死化融合パートナー、例えば、マウス骨髄腫細胞株と融合される。所望される場合、ラットまたはその他の哺乳類を、マウスの代わりに免疫付与することができ、そのような動物からのＢ細胞を、マウス骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成することができる。代替として、マウス以外の源からの骨髄腫細胞株を使用してもよい。ハイブリドーマを形成するための融合手順もよく知られている。
【０３０５】
提供される単鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変領域（Ｆｖ領域）断片を、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して結合することによって形成されてもよく、単一のポリペプチド鎖をもたらす。そのような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコード化するＤＮＡ間でペプチドリンカーをコード化するＤＮＡを融合することによって調製されてもよい。得られるポリペプチドは、折り畳み返して抗原結合モノマーを形成することができるか、または２つの可変ドメイン間の可撓性リンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。ポリペプチドを含む異なるＶＬおよびＶＨを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。単鎖抗体の生成のために開発された技術は、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４，ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−３８７において説明されるものが挙げられる。本明細書において提供される抗体に由来する単鎖抗体には、表３に表される重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むｓｃＦｖ、または表４Ａおよび４Ｂに表されるＣＤＲを含む、軽および重鎖可変領域ドメインの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
１つのサブクラスである本明細書において提供される抗体は、サブクラス交換方法を使用して、異なるサブクラスから抗体に変更することができる。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体から得ることができ、その逆も同様であり得る。そのような技術は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに伴う生物学的特性も呈する、新しい抗体の調製を可能にする。組み換えＤＮＡ技術を用いてもよい。特定の抗体ポリペプチドをコード化するクローニングＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコード化するＤＮＡを、そのような手順に用いてもよい。例えば、Ｌａｎｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−３１６。
【０３０７】
したがって、提供される抗体は、例えば、上述の可変ドメインの組み合わせを含み、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）ならびにそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を含むものを含むものを含む。さらに、ＩｇＧ４が所望される場合、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７，本明細書において参照することにより組み込まれる）に記載されるように、ヒンジ領域において、点変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均質性に至り得る、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減させることも所望され得る。
【０３０８】
さらに、異なる特性を有する抗体を得る（すなわち、それらが結合する抗原の親和性を変える）ための技術も知られている。鎖シャッフリングと称されるそのような技術の一つは、ファージ提示法と称される場合が多い、糸状バクテリオファージの表面に、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを表示することを伴う。鎖シャッフリングは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９によって記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−ｏｎｅに対する高親和性抗体を調製するように使用されている。
【０３０９】
保存修飾を、表３に記載される重鎖および軽鎖可変領域、または表４Ａおよび４Ｂに記載されるＣＤＲに対して（およびコード化する核酸に対応する修飾）行って、所定の所望される機能的および生化学的特徴を有するＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を生成することができる。そのような修飾を達成するための方法は、上に記載される。
【０３１０】
ＣＧＲＰ抗原結合タンパク質は、様々な方法でさらに修飾され得る。例えば、治療目的で使用される場合、血清半減期を延長するか、またはタンパク質送達を強化するように、ポリエチレングリコールと共役（ペギル化）されてもよい。代替として、対象の抗体またはその断片のＶ領域は、異なる抗体分子のＦｃ領域と融合されてもよい。この目的で使用されるＦｃ領域は、相補体と結合しないように修飾されてもよく、したがって、融合タンパク質が治療薬剤として使用される場合、患者において細胞融解を誘発する可能性を低減する。さらに、対象の抗体またはその機能的断片は、抗体またはその抗原結合断片を強化するように、ヒト血清アルブミンと共役されてもよい。抗原結合タンパク質またはその断片の別の有用な融合パートナーは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは、テトラマーを形成する能力を有し、したがって、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、その結合親和力を増加させ得る多価抗体を形成することができる。
【０３１１】
代替として、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の機能的および／または生化学的特徴における大幅な修飾は、（ａ）置換の領域における分子骨格の構造、例えば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高性を維持することに対するそれらの影響が有意に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の置換を形成することによって達成され得る。「保存アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響しないか、またはまったく影響しない非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。上記の表４を参照されたい。さらに、ポリペプチドにおけるいかなる天然残基も、アラニンと置換されてもよく、それはアラニン走査変異に関して前述されるとおりである。
【０３１２】
対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、ルーチン技術を適用することによって、当業者により実現され得る。アミノ酸置換を使用して、本明細書に提供される抗体の重要な残基を同定するか、またはヒトＣＧＲＰ  Ｒに対するこれらの抗体の親和性を増減させるか、または本明細書に記載される他の抗原結合タンパク質の結合親和性を改変することができる。
【０３１３】
抗原結合タンパク質を発現する方法
上述のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現系および構造物、ならびにそのような発現系および構造物を含む宿主細胞も、本明細書において提供される。
【０３１４】
本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、多数の従来技術のうちのいずれかによって調製され得る。例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、該技術分野において知られている任意の技術を使用して、組み換え発現系により生成することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照されたい。
【０３１５】
抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株（例えば、特に抗体は、ハイブリドーマにおいて発現し得る）またはハイブリドーマ以外の細胞株において発現することができる。抗体をコード化する発現コンストラクトを使用して、哺乳類、昆虫、または微生物宿主細胞を形質転換させることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の知られている方法を使用して行うことができ、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、第４，９５９，４５５号により例証されるように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにおいて包装すること、および該技術分野において知られているトランスフェクション手順により宿主細胞をコンストラクトにより形質導入することを含む。使用される最適な形質転換手順は、どの種類の宿主細胞が形質転換されているかに依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入するための方法は、該技術分野においてよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、カルシウムリン酸沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化、核酸と正荷電脂質との混合、および核へのＤＮＡの直接微小注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１６】
組み換え発現コンストラクトは、通常、本明細書において提供される１つまたは複数のＣＤＲ、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）、および／またはＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質の別の足場部分のうちの１つまたは複数を含む、ポリペプチドをコード化する核酸分子を含む。これらの核酸配列は、標準結紮技術を使用して、適切な発現ベクターに挿入される。一実施形態において、重または軽鎖定常領域は、抗ＣＧＲＰ  Ｒ特異的重または軽鎖可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターに共役される。ベクターは、通常、用いられる特定の宿主細胞において機能的となるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現が起こり得るようにする）。一部の実施形態において、ジヒドロ葉酸還元酵素等のタンパク質レポータを使用する、タンパク質断片相補性検定を用いる、ベクターが使用される（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２７０，９６４号を参照）。適切な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（前「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。抗体および断片をクローニングおよび発現するための他の有用なベクターは、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｂｉａｎｃｈｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９−４４に記載されるものを含む。追加の適切な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにおいて論じられる。
【０３１７】
通常、宿主細胞のうちのいずれかに使用される発現ベクターは、プラスミド維持および外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。ある実施形態において、集合的に「フランキング配列」と称されるそのような配列は、通常、プロモータ、１つまたは複数のエンハンサ、複製の起源、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタスプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコード化する配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコード化する核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカー要素のうちの１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。これらの配列のそれぞれは、以下に論じられる。
【０３１８】
任意で、ベクターは、「タグ」コード化配列、すなわち、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質コード化配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでもよく、オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）、または別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、またはｍｙｃをコード化し、それらには市販の抗体が存在する。このタグは、通常、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質の親和精製または検出のための手段として機能することができる。親和精製は、例えば、親和性マトリクスとして、タグに対する抗体を使用し、カラムクロマトグラフィによって達成することができる。任意で、タグは、後に開裂のための所定のペプチダーゼを使用する等、様々な手段によって、精製されたＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質から除去することができる。
【０３１９】
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同一種および／または株から）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種から）、ハイブリッド（すなわち、複数の源からのフランキング配列の組み合わせ）、合成または天然であり得る。したがって、フランキング配列の源は、フランキング配列が、宿主細胞機構において機能的であり、それによって活性化され得る限り、任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物、あるいは任意の植物であってもよい。
【０３２０】
ベクターにおいて有用なフランキング配列は、該技術分野においてよく知られているいくつかの方法のうちのいずれかによって得ることができる。通常、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって既に同定されているため、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織源から単離することができる。いくつかの例において、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が知られている場合がある。ここで、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングのための、本明細書に記載される方法を使用して合成され得る。
【０３２１】
フランキング配列のすべてまたは一部のみが知られている場合、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、および／または同一または別の種からのオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片等の適切なプローブにより、ゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えば、コーディング配列または別の１つまたは複数の遺伝子をも含み得るＤＮＡの大きい断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生成した後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または熟練者に知られている他の方法を使用して単離することにより達成され得る。この目的を達成するために適切な酵素の選択は、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０３２２】
複製の起源は、通常、商業的に購入された原核発現ベクターの一部であり、起源は、宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。選択したベクターが、複製部位の起源を含まない場合は、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに共役させてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）からの複製の起源は、大部分のグラム陰性菌に適切であり、様々なウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶ等のパピローマウイルス）は、哺乳類細胞においてベクターをクローニングするために有用である。一般に、複製成分の起源は、哺乳類発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０起源が、ウイルス早期プロモータも含むという理由だけで使用される場合が多い）。
【０３２３】
転写終結配列は、通常、ポリペプチドコーディング領域の３’〜末端に位置し、転写を終結させる。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃを多く含む断片であり、ポリＴ配列が続く。配列は、ライブラリから容易にクローン化されるか、ベクターの一部として商業的に購入することもできるが、本明細書に記載されるもの等の核酸合成の方法を使用して、容易に合成することもできる。
【０３２４】
選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培地において成長される宿主細胞の生存および成長に必須のタンパク質をコード化する。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピリシン、テトラシクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥を相補するか、または（ｃ）複合体または定義された培地から得られない重要な栄養素を補給する、タンパク質をコード化する。具体的な選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピリシン耐性遺伝子、およびテトラシクリン耐性遺伝子である。有利に、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核および真核宿主細胞の両方における選択に使用することができる。
【０３２５】
他の選択可能な遺伝子を、発現される遺伝子を増幅するように使用することができる。増幅は、成長または細胞生存に不可欠なタンパク質の生成に必要とされる遺伝子が、組み換え細胞の連続世代のクロモソーム内で並んで繰り返される、過程である。哺乳類細胞に適切な選択可能マーカーの実施例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモータレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞形質転換細胞は、選択圧力下に置かれ、形質転換細胞のみが固有に適合されて、ベクターに存在する選択可能遺伝子によって生存する。選択圧力は、培地中の選択薬剤の濃度が漸増する条件下で、形質転換された細胞を培養することによって印加され、それによって、選択可能遺伝子および別の遺伝子をコード化するＤＮＡ、例えば、ＣＧＲＰ  Ｒに結合する抗原結合タンパク質の両方の増幅をもたらす。結果として、増量したポリペプチド、例えば、抗原結合タンパク質が、増幅したＤＮＡから合成される。
【０３２６】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（原核）またはＫｏｚａｋ配列（真核）によって特徴付けられる。要素は、通常、発現されるポリペプチドのプロモータに対して３’およびコーディング配列に対して５’に位置する。
【０３２７】
真核宿主細胞の発現系においてグリコシル化が所望される場合等の、いくつかの例において、様々なプレまたはプロ配列を操作して、グリコシル化または収率を向上させることができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変更するか、またはグリコシル化にも影響し得るプロ配列を添加してもよい。最終タンパク質性生物は、（成熟タンパク質の第１アミノ酸に対する）−１位において、発現から起こる１つまたは複数の追加アミノ酸を有し得、完全に除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質生成物は、ペプチダーゼ開裂部位において認められ、アミノ末端に付着する、１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。代替として、一部の酵素開裂部位の使用は、成熟ポリペプチド内のそのような領域において酵素が切断される場合、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態をもたらし得る。
【０３２８】
発現およびクローニングは、通常、宿主生物によって認識され、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質をコード化する分子に操作可能に結合されるプロモータを含む。プロモータは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’）に位置する未転写配列である。プロモータは、慣行として、２つの群、誘導プロモータおよび構成的プロモータのうちの１つに分類される。誘導プロモータは、培養条件の一部変更、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応答して、それらの制御下で、増加したレベルの転写をＤＮＡから開始する。一方、構成的プロモータは、それらが操作可能に結合される遺伝子を均一に転写する、すなわち、遺伝子発現に対する制御がほとんどまたはまったくない。多様な潜在的宿主細胞により認識される、多数のプロモータがよく知られている。適切なプロモータは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモータを除去し、所望のプロモータ配列をベクターに挿入することによって、ＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含む、ＤＮＡコード化重鎖または軽鎖に操作可能に結合される。
【０３２９】
イースト菌宿主細胞と併用するために適したプロモータも、該技術分野においてよく知られている。イーストエンハンサは、イーストプロモータと有利に併用される。哺乳類宿主細胞と併用するために適したプロモータは、よく知られており、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳類プロモータには、例えば、熱衝撃プロモータおよびアクチンプロモータ等の異種哺乳類プロモータが挙げられる。
【０３３０】
関心対象となり得る追加のプロモータには、ＳＶ４０早期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ
ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ７８：１４４４−１４４５）、メタロチオニン遺伝子からのプロモータおよび調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、およびβラクタマーゼプロモータ等の原核生物プロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域も関心対象となり得る。膵臓細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６、Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）、膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、睾丸、乳房、リンパ細胞およびマスト細胞において活性であるマウス哺乳類腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性であるα−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）、肝臓において活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳のオリゴ樹状細胞において活性であるミエリン塩基性タ���パク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１４：２８３−２８６）、および副甲状腺において活性である性腺刺激ホルモン放出遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０３３１】
エンハンサ配列をベクターに挿入して、高等真核生物による、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含むＤＮＡコード化軽鎖または重鎖の転写を増加させてもよい。エンハンサは、ＤＮＡのｃｉｓ作用要素であり、通常、長さが約１０〜３００ｂｐであって、プロモータに作用して転写を増加させる。エンハンサは、配向および位置に関して比較的独立であり、転写単位に対する５’および３’の両方の位置において認められている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサ配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェト−タンパク質およびインスリン）。しかしながら、通常、ウイルスからのエンハンサが使用される。該技術分野において知られているＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス早期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、およびアデノウイルスエンハンサは、真核生物プロモータの活性のための典型的な強化要素である。エンハンサは、ベクターにおいてコーディング配列に対して５’または３’に位置し得るが、通常、プロモータから５’の部位に位置する。適切な天然または異種シグナル配列をコード化する配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）は、発現ベクターに組み込まれて、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が生成される宿主細胞の種類に依存し、異種シグナル配列が、天然シグナル配列を置換することができる。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの実施例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７５６６号に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、欧州特許第０４６０８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【０３３２】
提供される発現ベクターは、市販のベクター等の開始ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列のすべてを含んでも、含まなくてもよい。本明細書に記載される１つまたは複数のフランキング配列がベクター中に既存しない場合、それらは、個別に取得しベクター中に結紮してもよい。フランキング配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者によく知られている。
【０３３３】
ベクターが構成され、核酸分子コード軽鎖、重鎖、またはＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合配列を含む軽鎖および重鎖が、ベクターの特定部位に挿入された後、増幅および／またはポリペプチド発現のために、完全なベクターを適切な宿主細胞に挿入することができる。抗原結合タンパク質の発現ベクターの、選択された宿主細胞への変換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈降、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、または他の知られている技術を含む、よく知られている方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に使用される宿主細胞の種類の関数となり得る。これらの方法および他の適切な方法は、当業者によく知られており、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に説明されている。
【０３３４】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、それを続いて、培地から（宿主細胞が培地に分泌する場合）またはそれを生成する宿主細胞から直接（分泌しない場合）、収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいか、または必要であり、生物活性分子への折り畳みが容易なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）、および様々な要因に依存する。
【０３３５】
発現の宿主細胞として使用可能な哺乳類細胞株は、該技術分野においてよく知られており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞株を含むが、これらに限定されない、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能な不死細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、ＣＧＲＰ  Ｒ結合特性を有する抗原結合タンパク質を構造的に産生するかを決定することによって選択することができる。別の実施形態において、その独自の抗体を形成しないが、異種抗体を形成および分泌する能力を有するＢ細胞系からの細胞株を選択することができる。
【０３３６】
診断および治療目的でのヒトＣＧＲＰ抗原結合タンパク質の使用
抗原結合タンパク質は、生物試料中のＣＧＲＰ  Ｒを検出し、ＣＧＲＰ  Ｒを生成する細胞または組織の特定に有用である。例えば、ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、診断分析、例えば、組織または細胞中で発現したＣＧＲＰ  Ｒを検出および／または定量するための結合分析において使用することができる。ＣＧＲＰ  Ｒに特異的に結合する抗原結合タンパク質は、必要とする患者において、ＣＧＲＰ  Ｒに関連する疾患の治療に使用することもできる。さらに、ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質を使用して、そのリガンドＣＧＲＰと複合体を形成するのを阻害し、それによって、細胞または組織におけるＣＧＲＰ
Ｒの生物活性を調節することができる。調整され得る活性の実施例には、血管拡張の阻害および／または神経性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＧＲＰ  Ｒに結合する抗原結合タンパク質は、したがって、他の結合化合物との相互作用を調整および／または遮断することができ、そのようにして、ＣＧＲＰ  Ｒに関連する疾患を緩和する際の治療用途を有し得る。
【０３３７】
適応症
ヒトＣＧＲＰ  Ｒに関連する疾患または状態には、患者において、ＣＧＲＰ  ＲとそのリガンドＣＧＲＰの相互作用によって少なくとも部分的に発症する、任意の疾患または状態を含む。疾患または状態の重度も、ＣＧＲＰ  ＲとＣＧＲＰの相互作用によって増減し得る。本明細書に記載される抗原結合タンパク質によって治療され得る疾患および状態の実施例には、頭痛、例えば、群発頭痛、片頭痛による頭の痛みを含む偏頭痛、慢性疼痛、ＩＩ型糖尿病、炎症、例えば、神経性炎症、心血管疾患、および内毒素血および敗血症に伴う血行動態異常が挙げられる。
【０３３８】
特に、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、片頭痛を治療するために、片頭痛発作が開始した後に始まる急性治療として、および／または例えば、１日１回、週１回、隔週、月１回、隔月、隔年等に投与される、例えば、片頭痛発作に関連付けられる疼痛症状等の症状の頻度および／または重度を予防または低減するために、予防的処置としてのいずれかで使用することができる。
【０３３９】
診断方法
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ＣＧＲＰ  Ｒと関連付けられる疾患および／または状態を検出、診断、または監視する診断目的で使用することができる。当業者に知られている標準的な免疫組織学的方法を使用して、試料中のＣＧＲＰ  Ｒの存在を検出するための方法も提供される（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ  １５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６を参照）。ＣＧＲＰ  Ｒの検出は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【０３４０】
本明細書に提供される診断的適用は、ＣＧＲＰ  Ｒの発現およびＣＧＲＰ  Ｒへのリガンドの結合を検出するための抗原結合タンパク質の使用を含む。ＣＧＲＰ  Ｒの存在の検出に有用な方法の実施例には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定（ＲＩＡ）等の免疫測定が挙げられる。
【０３４１】
診断的適用の場合、抗原結合タンパク質は、通常、検出可能な標識基により標識される。適切な標識基には、以下の放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光群（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリンホスファターゼ）、化学発光群、ビオチニル群、または二次レポータにより認識される事前決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標識基は、潜在的な立体障害を減少させるように、様々な長さのスペーサアームを介して、抗原結合タンパク質に結合される。タンパク質を標識するための様々な方法が、該技術分野において知られており、使用することができる。
【０３４２】
別の態様において、抗原結合タンパク質はＣＧＲＰ  Ｒを発現する１つまたは複数の細胞を特定するように使用することができる。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、標識基により標識され、ＣＧＲＰ  Ｒへの標識化抗原結合タンパク質の結合が検出される。さらに特定の実施形態において、ＣＧＲＰ  Ｒへの抗原結合タンパク質の結合はインビボで検出される。さらに特定の実施形態において、ＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、該技術分野において知られている技術を使用して単離および測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１および定期補刊）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照されたい。
【０３４３】
別の態様はＣＧＲＰ  Ｒへの結合に対して、提供される抗原結合タンパク質と競合する試験分子の存在を検出することを提供する。そのような検定の一例は、試験分子の存在または不在下で、ある量のＣＧＲＰ  Ｒを含む溶液中の遊離抗原結合タンパク質の量を検出することを含む。遊離抗原結合タンパク質（すなわち、ＣＧＲＰ  Ｒに結合されない抗原結合タンパク質）の量の増加は、ＣＧＲＰ  Ｒ結合に対して抗原結合タンパク質と競合できるあることを示すこととなる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、標識基により標識される。代替として、試験分子が標識され、遊離試験分子の量が、抗原結合タンパク質の存在および不在下で監視される。
【０３４４】
治療方法：医薬製剤、投与経路
抗原結合タンパク質を使用する方法も提供される。いくつかの方法において、抗原結合タンパク質は、患者に提供される。抗原結合タンパク質は、ヒトＣＧＲＰ  ＲへのＣＧＲＰの結合を阻害する。
【０３４５】
治療上有効寮の１つまたは複数の抗原結合タンパク質および薬学的に許容される希釈剤、担体、溶解剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物も提供される。さらに、例えば、片頭痛に対して、そのような薬学的組成物を投与することによって患者を治療する方法が含まれる。「患者」という用語は、ヒト患者を含む。
【０３４６】
許容される製剤材料は、用いられる用量および濃度において、受容者に対して非毒性である。特定の実施形態において、治療上有効量のヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物が提供される。
【０３４７】
ある実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、用いられる用量および濃度において、受容者に対して非毒性である。ある実施形態において、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、滅菌性、安定性、溶解率または放出率、吸収または貫通を改変、維持、または保持するための製剤材料を含有し得る。そのような実施形態において、適切な製剤材料は、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、疎水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤、または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、等張化増強剤（例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトールソルビトール）、送達媒体、希釈剤、賦形剤、および／または薬学的アジュバントを含むが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８″Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０３４８】
所定の実施形態において、最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態および所望の用量に応じて、当業者により決定される。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。ある実施形態において、そのような組成物は、開示される抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出率およびインビボクリアランス率に影響を及ぼし得る。所定の実施形態において、医薬組成物中の一次媒体または担体は、性質が水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切な媒体または担体は、注入用の水、生理学的食塩水、または人工脳脊髄液であってもよく、場合によって、非経口投与のための組成物に広く用いられる他の材料によって補充される。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、さらに典型的な媒体である。特定の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトールまたは適切な代替物質をさらに含んでもよい。所定の実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質組成物は、所望の純度を有する選択組成物を、任意の製剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照）と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、保存用に調製されてもよい。さらに、所定の実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、スクロース等の適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥体として製剤されてもよい。
【０３４９】
医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。代替として、組成物は、消化管を通じて、例えば、経口的に吸入または送達するために選択されてもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。
【０３５０】
製剤成分は、好ましくは、投与の部位に許容される濃度で存在する。所定の実施形態において、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはそれよりもわずかに低いｐＨ、通常、約５〜約８のｐＨ範囲内で組成物を維持するように使用される。
【０３５１】
非経口投与が意図される場合、治療組成物は、ピロゲンを含まず、薬学的に許容される媒体中に所望のヒトＣＧＲＰ  Ｒ結合タンパク質を含む、非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注入に特に適した媒体は、滅菌蒸留水であり、ヒトＣＧＲＰ
Ｒ抗原結合タンパク質は、滅菌等張液として製剤され、適切に保存される。ある実施形態において、調製は、注入可能な微小球、生物分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを含む、所望の分子の製剤を伴い得、デポー注入によって送達され得る生成物の制御または持続放出を提供してもよい。ある実施形態において、循環における持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸を使用してもよい。所定の実施形態において、埋め込み型薬物送達装置を使用して、所望の抗原結合タンパク質を導入してもよい。
【０３５２】
ある医薬組成物は、吸入用に製剤される。一部の実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、吸入可能な乾燥粉末として製剤される。特定の実施形態において、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質吸入溶液は、エアロゾル送達のために噴射剤とともに製剤されてもよい。所定の実施形態において、溶液は、噴霧されてもよい。肺投与および製剤方法は、参照することにより組み込まれ、化学修飾されたタンパク質の肺送達について説明している国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号においてさらに説明される。いくつかの製剤は、経口投与することができる。この様式で投与されるヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、錠剤およびカプセル等の固体投与形態の化合物において、慣習的に使用される担体と共に、またはそれを含まずに製剤することができる。ある実施形態において、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、プレシステミック分解が最小化される時点で、胃腸管において、製剤の活性成分を放出するように設計することができる。追加の薬剤を含めて、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質の吸収を促進させることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、野菜油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤分解剤、および結合剤を用いることができる。
【０３５３】
いくつかの医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物中に、有効量の１つまたは複数のヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質を含む。滅菌水、または別の適切な媒体に錠剤を溶解させることによって、溶液を単位用量形態で調製することができる。適切な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、または重炭酸、ラクトース、または燐酸カルシウム等の不活性希釈剤、またはスターチ、ゼラチン、またはアラビアゴム等の結合剤、またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の滑沢剤を含むが、これらに限定されない。
【０３５４】
持続または制御送達製剤中に、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質を伴う製剤を含む、さらなる医薬組成物は、当業者に明らかとなるであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子、または多孔ビーズおよびデポー注射等を製剤するための技術も当業者に知られている。例えば、参照することによって組み込まれ、医薬製剤の送達のための多孔ポリマー微粒子の制御放出について説明する、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。持続放出調製物は、半透過性ポリマーマトリクスを、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で含んでもよい。持続放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号において開示され、それぞれ参照することによって組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、酢酸ビニルエチレン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、上記参照）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を含んでもよい。持続放出組成物は、当該技術分野において知られているいくつかの方法のうちのいずれによっても調製することができる、リポソームを含んでもよい。例えば、参照することにより組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号、第ＥＰ０８８，０４６号、および第ＥＰ１４３，９４９号を参照されたい。
【０３５５】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、通常、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜を通るろ過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および復元の前または後に行ってもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で保存することができる。非経口組成物は、一般に、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、静脈注射溶液バッグ、または皮下注射によって穿孔可能なストッパを有するバイアルの中に置かれる。
【０３５６】
ある実施形態において、本明細書に開示されるような組み換え抗原結合タンパク質を発現する細胞は、送達用に被嚢される（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ４３：３２９２−３２９８，２００２およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１０３：３８９６−３９０１，２００６を参照）。
【０３５７】
ある製剤において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、または１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。一部の製剤は、緩衝剤、スクロース、および多糖を含有する。製剤の実施例は、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの抗原結合タンパク質、５〜２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５〜１０％  ｗ／ｖスクロース、および０．００２〜０．００８％  ｗ／ｖ多糖を含むものである。ある製剤は、例えば、９〜１１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に６５〜７５ｍｇ／ｍＬの抗原結合タンパク質、８〜１０％  ｗ／ｖスクロース、および０．００5〜０．００6％  ｗ／ｖ多糖を含有する。所定のそのような製剤のｐＨは、４．５〜６の範囲である。他の製剤は、ｐＨが５．０〜５．５である（例えば、ｐＨ５．０、５．２、または５．４）。
【０３５８】
一旦、薬学的組成物が製剤されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳化剤、固体、結晶として、または脱水または凍結乾燥した粉末として、滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態、または投与前に再構築される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存されてもよい。単回投与単位を生成するためのキットも提供される。あるキットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器とを含む。ある実施形態において、単一および複数室の事前に充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）が提供される。用いられる治療上有効量のヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質含有医薬組成物は、例えば、治療内容および目的に依存する。当業者であれば、治療のための適切な用量レベルが、部分的に、送達される分子、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質が使用される適応症、投与経路、および患者の体格（体重、体表面、または器官サイズ）および／または状態（年齢および一般健康状態）に応じて異なることを理解するであろう。ある実施形態において、医師は、用量を滴定してもよく、最適な治療効果を得るように投与形態を修正してもよい。
【０３５９】
通常用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態において、用量は、１０μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ、任意で０．１ｍｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ、代替として、０．３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの適用において、用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり得る。いくついかの例において、抗原結合タンパク質は、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかのの治療投与計画における投与スケジュールは、０．３ｍｇ／ｋｇ（週１回）、０．５ｍｇ／ｋｇ（週１回）、１ｍｇ／ｋｇ（週１回）、３ｍｇ／ｋｇ（週１回）、１０ｍｇ／ｋｇ（週１回）、または２０ｍｇ／ｋｇ（週１回）の用量である。
【０３６０】
投与頻度は、使用される製剤中の特定のヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質の薬物動態パラメータに依存する。通常、医師は、所望の効果を達成する用量に到達するまで、組成物を投与する。組成物は、したがって、単回投与として、または時間をかけて２回以上の投与として（同一量の所望の分子を含有しても、しなくてもよい）、または埋め込み装置またはカテーテルを介した連続注入として投与されてもよい。適切な用量は、適切な用量反応データの使用を通じて確認することができる。ある実施形態において、抗原結合タンパク質は、長期間に渡って患者に投与することができる。抗原結合タンパク質の長期投与は、完全にヒトでない抗原結合タンパク質、例えば、非ヒト動物中のヒト抗原に対する抗体、例えば、非ヒト種において生成された不完全ヒト抗体または非ヒト抗体に一般に伴う免疫またはアレルギー性服作用を最小限にする。
【０３６１】
薬学的組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路、持続放出システム、または埋め込み型装置による。所定の実施形態において、組成物は、ボーラス注射、または注入によって連続的に、あるいは埋め込み型装置によって投与されてもよい。
【０３６２】
組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収または包含された別の適切な材料を埋め込むことによって、局所的に投与されてもよい。ある実施形態において、埋め込み型装置が使用される場合、装置は、任意の適切な組織または器官の中に埋め込まれてもよく、所定の分子の送達は、分散、徐放性ボーラス、または連続投与を介してもよい。
【０３６３】
ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質医薬組成物をエクスビボで使用することも望ましい場合がある。そのような例において、患者から除去された細胞、組織、または器官が、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質医薬組成物に曝露され、その後、細胞、組織、および／または器官は、続いて患者の体内に戻される。
【０３６４】
特に、ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるような方法を使用して、遺伝子操作されたある種の細胞を埋め込むことによって送達し、ポリペプチドを発現および分泌させることができる。所定の実施形態において、そのような細胞は、動物またはヒト細胞であってもよく、自己、ヘテロ、または異種であり得る。ある実施形態において、細胞は、不死化されてもよい。他の実施形態において、免疫反応の可能性を減少させるために、細胞を被嚢して、周囲組織の浸潤を回避してもよい。さらなる実施形態において、被嚢材料は、通常、生体適合性の半透過性ポリマー筐体または膜であり、タンパク質生成物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊を回避する。
【０３６５】
行った実験および得られた結果を含む、以下の実施例は、単なる例示目的で提供され、添付の請求項の範囲を制限するものとして見なされるものではない。
【実施例１】
【０３６６】
抗原としてのＣＧＲＰ受容体の生成
Ａ．  ヒトＣＲＬＲおよびＲＭＡＰ１の分子クローニング
ヒトＣＲＬＲ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ１７４７３、配列番号１）およびＲＡＭＰ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ００１０１４、配列番号３）を、下記の通り、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションのために、哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＺｅｏおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にそれぞれクローニングした。ｈＣＲＬＲ  ｃＤＮＡおよびｈＲＡＭＰ１  ｃＤＮＡも、ＡＭ−１ＣＨＯ細胞（米国特許第６，２１０，９２４）のトランスフェクションのために、ｐＤＳＲα２４ベクター（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．（２００７）１２：４８−４９）にクローニングした。
【０３６７】
Ｂ．  安定してトランスフェクトされた細胞株
１．２９３ＥＢＮＡ細胞におけるヒトＣＧＲＰ  Ｒの安定発現
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を、１００ｍｍ皿当たり１．５ｘ１０６細胞の密度で播種した。２４時間後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供される指示に従って、ｈｕＲＡＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１―ＨｙｇおよびｈｕＣＲＬＲ／ｐｃＤＮＡ３．１―Ｚｅｏの線形化ＤＮＡ６μｇと、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により、細胞を共トランスフェクトした。２日後、細胞をトリプシン化し、４００μｇ／ｍＬヒグロマイシン＋２５０μｇ／ｍＬゼオシンを含有する成長培地に二次培養した。２週間後、得られた薬物耐性コロニーをトリプシン化し、結合してプールにした。プールは、４回のＦＡＣＳに供し、Ａｌｅｘａ６４７標識化ＣＧＲＰ８―３７ペプチドアナログ（下記）を分類した。各回で、発現する細胞の最も高い５％を収集した。
【０３６８】
２．ＡＭ−１ＣＨＯ細胞におけるヒトＣＧＲＰ  Ｒの安定発現
ＡＭ−１ＣＨＯ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７，４２１６（１９８０））に記載されるＣＨＯ  ＤＨＦＲ欠損細胞株からの無血清成長培地に適合した変異体を、１００ｍｍ皿当たり、１．５ｘ１０６細胞の密度で播種した。２４時間後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供される指示に従って、ｐＤＳＲα２４／ｈｕＲＡＭＰ１およびｐＤＳＲα２４／ｈｕＣＲＬＲそれぞれの線形化したＤＮＡ４μｇと、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により、細胞を共トランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に、トランスフェクトした細胞をトリプシン化し、１０％の透析したＦＢＳを含有するＣＨＯ  ＤＨＦＲ選択的成長培地に、ヒポキサンチン／チミジン補充なしに播種した。２週間後、得られたトランスフェクト化コロニーをトリプシン化し、プールした。プールは、ＦＡＣＳ分類検定に供した。
【０３６９】
３．ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞におけるヒトアドレノメデュリン（ＡＭ１）の安定発現
２９３ＥＢＮＡ細胞を、１００ｍｍ皿に１．５ｘ１０６細胞／皿の密度で、ＤＭＥＭ（高グルコース）＋５％ＦＢＳ＋１％ＭＥＭ非必須アミノ酸＋１％ピルビン酸ナトリウム中で播種した。翌日、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）と、ｐｃＤＮＡ３．１／ゼオシン／ｈｕＣＲＬＲプラスｐｃＤＮＡ３．１／ヒグロマイシン／ｈｕＲＡＭＰ２を使用して、細胞を共トランスフェクトした。両方のＤＮＡ組成物をＦｓｐＩで線形化した。４８時間後、１００ｍｍ皿に移し、３つの細胞密度で（８ｘ１０５、３．２ｘ１０５、および８ｘ１０４細胞／皿）、２００μｇ／ｍＬゼオシンを含有する成長培地中で、細胞を二次培養した。培地は、週に２回交換した。１週間後、２００μｇ／ｍＬヒグロマイシン＋２００μｇ／ｍＬゼオシンを含有する培地をプレートに与えた。２週間後、９６コロニーを、クローニングリングを用いて単離した。残りのコロニーは、単一のプール培地に収集した。クローンおよびプールは、受容体アゴニストまたはホルスコリンによる刺激に対するそれらの応答について検定した。いくつかのクローンは、良好な応答を示し、後次実験で使用するために１つを選択した。
【０３７０】
４．ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞におけるｃｙｎｏＣＧＲＰ  Ｒの安定発現
２９３ＥＢＮＡ細胞を、１００ｍｍ皿に１．５ｘ１０６細胞／皿の密度で、ＤＭＥＭ（高グルコース）＋５％ＦＢＳ＋１％ＭＥＭ非必須アミノ酸＋１％ピルビン酸ナトリウム中で播種した。翌日、ＦｕＧＥＮＥ６と、ｐｃＤＮＡ３．１／ゼオシン／ｃｙｎｏＣＲＬＲプラスｐｃＤＮＡ３．１／ヒグロマイシン／ｃｙｎｏＲＡＭＰ１を使用して、細胞を共トランスフェクトした。両方の組成物をＦｓｐＩで線形化した。４８時間後、２００μｇ／ｍＬゼオシン＋４００μｇ／ｍＬヒグロマイシンを１：２０、１：４０、１：１００、および１：２００の希釈で含有する成長培地中で、細胞を二次培養した。培地は、週に２回交換した。２週間後、９６個のトランスフェクトしたコロニーを、クローニングリングを用いて単離した。クローンは、ＣＧＲＰリガンドによる刺激に対するそれらの応答について検定した。いくつかのクローンが、同様の高レベルの応答を示し、後次実験に使用するために１つを選択した。
【０３７１】
Ｃ．  高発現ＣＧＲＰ受容体細胞の単離
ＣＧＲＰ８−３７ペプチドアナログを、以下の配列により合成した（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）。
Ａｃ−ＷＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＶＶＲＣＮＦＶＰＴＤＶＧＰＦＡＦ−ＮＨ２（配列番号９）
【０３７２】
ペプチドは、製造者の指示に従って、Ａｌｅｘａ６４７−ＮＨＳで標識した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．カタログＡ２００６）。Ａｌｅｘａ６４７標識ＣＧＲＰ８−３７は、ＣＧＲＰ受容体トランスフェクト細胞の特異的な染色を示し、非トランスフェクト親細胞では示さず、ＦＡＣＳ試薬として使用した。
【０３７３】
ｈｕＣＧＲＰ受容体トランスフェクト２９３ＥＢＮＡおよびＡＭ−１ＣＨＯ細胞プール（上記のように生成された）は、Ａｌｅｘａ６４７標識ＣＧＲＰ８−３７ペプチドを使用して、最大４回繰り返しプールを分類した。高発現細胞を各分類で収集し、拡大して、最終分類後にバイアル中で凍結させた。ＡＭ−１ＣＨＯ／ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ細胞は、下記のように免疫付与に使用し、２９３ＥＢＮＡ／ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ細胞は、免疫付与後にマウス血清を滴定するために、ハイブリドーマ上清の結合スクリーンにおいて使用した。
【０３７４】
Ｄ．  可溶性ＣＧＲＰ受容体の生成
ヒトＣＲＬＲ（配列番号６）およびヒトＲＡＭＰ１（配列番号８）のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有する可用性ＣＧＲＰ受容体ポリペプチドを、下記のような対応するｃＤＮＡ（配列番号５または配列番号７を含有するベクターと、２９３  ６Ｅ細胞を一時的に共トランスフェクトすることによって生成した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：Ｅ９（２００２））。一般に使用されるタグ（ｐｏｌｙＨｉｓ、Ｆｌａｇ、ＨＡおよび／またはＦｃ）を、分泌および／または後次精製を促進するように用いた。
【０３７５】
Ｆｃに融合した可溶性ヘテロ二量体ＣＧＲＰ  Ｒ  ＥＣＤを、適切なプライマを用いて、一時的発現ベクターｐＴＴ５へのＰＣＲクローニングによって調製した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。ＣＲＬＲ  Ｎ末端ＥＣＤ−Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合したＣＲＬＲ（配列番号６）のＮ末端細胞外ドメインから成っていた。ＲＡＭＰ１ＥＣＤ−Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合したＲＡＭＰ１（配列番号８）の細胞外ドメインを含む。いずれの場合においても、ＥＣＤドメインとＦｃとの間に５つの連続するグリシンから成るリンカーが存在した。
【０３７６】
可溶性ヘテロ二量体ＣＧＲＰ受容体は、以下のような２つのコンストラクトを共トランスフェクトすることによって発現させた。攪拌フラスコ中１ｘ１０６細胞／ｍＬの２９３−６Ｅ細胞を、０．５ｍｇ／Ｌ  ＤＮＡ（ｈＣＲＬＲ  Ｎ−ｔｅｒ  ＥＣＤ−Ｆｃ／ｐＴＴ５およびｈｕＲＡＭＰ１  ＥＣＤ−Ｆｃ／ｐＴＴ５）と、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３倍地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の３ｍＬ  ＰＥＩ／ｍｇ  ＤＮＡでトランスフェクトした。０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８および５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地において懸濁させて、７日間、細胞を成長させ、精製のために採取した。
【０３７７】
馴化培地（「ＣＭ」）からの精製は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  クエン酸ナトリウムの添加によってＣＭを緩衝し、ｐＨを８．５に調整することによって行った。次に、緩衝化ＣＭを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  クエン酸ナトリウム中で平衡化し、ｐＨをｐＨ８．５に調整したタンパク質Ａ親和性カラム上を通過させた。タンパク質ＡカラムをＰＢＳで洗浄し、Ｆｃ融合タンパク質を、０．１Ｎ  ＨＯＡｃで溶出した。溶出したピークは、ＣＲＬＲまたはＲＡＭＰ１のいずれかに特異的な個別の抗体を使用するウェスタンブロットによって試験した際、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１成分の両方を含有した。さらに、ＬＣ−ＭＳおよびＮ末端配列決定により、ＣＲＬＲ：ＲＡＭＰ１ヘテロ二量体およびＣＲＬＲ：ＣＲＬＲホモ二量体の両方が、約（２：３）の比率で存在することを確認した。この「可溶性ＣＧＲＰ受容体」は、ＦＭＡＴ分析において、ＣＧＲＰ受容体発現組み換え細胞に結合するＡｌｅｘａ６４７標識ＣＧＲＰ８−３７中で競合することを示したが、Ｂｉａｃｏｒｅ試験を使用して決定されるように、ＣＧＲＰリガンドへの結合には失敗した。材料は、特にその不均質性およびＣＧＲＰリガンド結合の欠如にもかかわらず、実施例に記載のとおり、免疫原として使用した。
【０３７８】
Ｅ．  組み替えＣＧＲＰ受容体発現細胞からの膜抽出の生成
膜抽出は、Ｂｏｓｓe，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，３（４）：２８５−２９２（１９９８））によって記載される方法を使用して、ＣＧＲＰ受容体発現細胞から調製した。簡潔に述べると、約５ｇの細胞ペーストを、５０ｍＬのＰＢＳ中、３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃でペレット化し、３０ｍＬの冷溶解バッファ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２プラス１Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠／５０ｍＬ）中で再懸濁させた。溶解物は、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ（テフロン（登録商標）−ガラスホモジナイザ）を用いて、約２０ストローク、５，０００ｒｐｍで均質化し、ＪＡ２１中、２０，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で回転させた。このプロセスを再度繰り返し、最終ペレットを約１〜５ｍＬの「最終ペレット」バッファ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％（ｗ／ｖ）スクロースプラス１Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠／５０ｍＬ）中で再懸濁させた。膜抽出物を、１６Ｇおよび２５Ｇニードルを２−３回通過させることによってせん断した。総膜タンパク質濃度は、マイクロプレートＢＣＡタンパク質測定（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。
【実施例２】
【０３７９】
ＣＧＲＰ受容体に対する抗体の生成
Ａ．  免疫付与
免疫付与は、実施例１に記載のとおり調製した、以下の形態のＣＧＲＰ受容体抗原を使用して行なった。
（ｉ）細胞表面において全長ヒトＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１を発現し、ＣＨＯ細胞を、配列番号２を有するポリペプチドをコード化するヒト全長ＣＲＬＲ  ｃＤＮＡ（配列番号１）および配列番号４を有するポリペプチドをコード化するＲＡＭＰ１  ｃＤＮＡ（配列番号３）で共トランスフェクトすることによって得られる、ＡＭ−１  ＣＨＯトランスフェクタント、
（ｉｉ）上記（ｉ）に記載される細胞からの膜抽出、および
（ｉｉｉ）実施例１に記載されるようなＣＲＬＲのＮ末端ＥＣＤ（配列番号６）およびＲＡＭＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号８）を共発現および精製することによって得られる、可溶性ＣＧＲＰ受容体。
【０３８０】
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ動物に、精製した可溶性ＣＧＲＰ受容体タンパク質、およびＣＧＲＰ  Ｒを安定して発現するＡＭ−１  ＣＨＯ細胞から調製した精製ＣＧＲＰ  Ｒ膜を、それぞれ１０μｇ／マウスおよび１５０μｇ／マウスの用量を使用して同一の方法で免疫付与した。
【０３８１】
その後の追加免疫付加は、１０μｇ／マウスの可溶性ＣＧＲＰ  Ｒまたは７５μｇの精製ＣＧＲＰ  Ｒ膜の用量で投与した。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ動物は、３．４ｘ１０６ＣＧＲＰ  Ｒトランスフェクト細胞／マウスの用量を使用して、ＣＧＲＰ受容体発現細胞でも免疫付与し、その後の追加免疫付加は、１．７ｘ１０６ＣＧＲＰ  Ｒトランスフェクト細胞／マウスであった。使用される注入部位は、皮下尾基底部および腹腔内の組み合わせであった。免疫付与は、２００２年２月１９日に提出された米国特許第７，０６４，２４４号に開示される方法に従って行い、その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。アジュバントＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２６８４）、Ａｌｕｍ（Ｅ．Ｍ．Ｓｅｒｇｅｎｔ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ、カタログ番号１４５２−２５０）は、製造者の指示に従って調製し、アジュバント乳剤：抗原溶液を１：１の比率で混合した。
【０３８２】
血清を、最初の注入から４〜６週間後に収集し、特異的抗体価を、組み換えＣＧＲＰ受容体発現２９３ＥＢＮＡ細胞のＦＡＣ染色によって決定した。
【０３８３】
マウスは、全長ＣＧＲＰ  Ｒ細胞を発現する細胞／膜または可溶性ＣＧＲＰ  Ｒ細胞外ドメインのいずれかにより、約１〜３ヶ月半の期間をかけて、１１〜１７回の範囲で免疫付与した。最高の血清力価を有するマウスを特定し、ハイブリドーマ生成のために準備した。免疫付与は、複数のマウス、通常１０匹の群において行った。膝窩および鼠径リンパ節ならびに脾臓組織を、通常、融合を生成するために、各群からプールした。
【０３８４】
Ｂ．  モノクローナル抗体の調製
適切な力価を呈する動物を特定し、リンパ球を排出リンパ節から得て、必要に応じて、各群にプールした。リンパ球は、適切な培地中（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）で、リンパ組織から解離し、細胞を組織から放出して、ＤＭＥＭ中に懸濁させた。適切な方法を使用して、Ｂ細胞を選択および／または拡大し、適切な融合パートナー、例えば、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と融合させた（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＲＬ  １５８０、Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８−１５５０）。
【０３８５】
リンパ球は、１：４の比率で融合パートナー細胞と混合した。細胞混合物は、４００ｘｇで４分間、遠心分離によって徐々にペレット化し、上清を移して、細胞混合物を、１ｍＬピペットを使用して徐々に混合した。融合は、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから入手可能、リンパ球１００万個当たり１ｍＬ）により誘発した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯを徐々に添加した後、１分かけてやさしく攪拌し、１分間混合した後、グルタミンを含まないＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり２ｍＬ）を、２分かけてやさしく攪拌しながら添加した後、追加のＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり８ｍＬ）を、３分かけて添加した。
【０３８６】
融合細胞を徐々にペレット化し（４００ｘｇ、６分）、Ｂ細胞１００万個当たり２０ｍＬの選択培地中（例えば、アザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］および必要に応じて他の補足物質を含有するＤＭＥＭ）で再懸濁させた。細胞は、２０〜３０分間、３７℃で培養した後、２００ｍＬの選択培地中で再懸濁させて、９６ウェルプレートに載置する前に、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養した。
【０３８７】
得られたコロニーのクローン性を最大化するために、標準技術を使用して、細胞を９６ウェルプレートに分配した。数日培養した後、ハイブリドーマ上清を収集し、以下の実施例に詳述されるように、ヒトＣＧＲＰ受容体に対する結合の確認、リガンド結合競合検定およびＣＧＲＰ受容体に関連する他の受容体（例えば、ヒトアドレノメデュリン受容体）との交差反応の評価による遮断抗体の特定を含む、スクリーニング検定に供した。さらに陽性細胞を選択し、標準クローニングおよびサブクローニング技術に供した。クローン株をインビトロで拡大し、分泌されたヒト交代を分析用に取得した。
【０３８８】
Ｃ．  選択したモノクローナル抗体の配列分析
選択したサブクローニングモノクローナル抗体を、標準ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して配列決定した。表２Ａは、本明細書に開示される典型的な抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す。表２Ｂは、本明細書に開示される典型的な抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
【０３８９】
配列決定された抗体のＣＤＲ領域に対応するアミノ酸配列を整列させ、整列を使用して、類似性によりクローンを分類した。
【０３９０】
κ軽鎖を有するクローンからの軽鎖ＣＤＲの配列の整列、およびいくつかの対応するコンセンサス配列を、図３Ａおよび３Ｂに示す。
【０３９１】
λ軽鎖を有するクローンからの軽鎖ＣＤＲの配列の整列、およびいくつかの対応するコンセンサス配列を、図４に示す。
【０３９２】
本明細書に開示される典型的な抗体の重鎖ＣＤＲの配列の整列、およびいくつかの対応するコンセンサス配列を、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅに示す。
【０３９３】
本明細書に開示される典型的な重鎖ＣＤＲの所定のコンセンサス配列を、図５Ｆに示す。
【実施例３】
【０３９４】
ＣＧＲＰ受容体特異的抗体の特定
Ａ．  ＦＭＡＴによるＣＧＲＰ受容体特異的抗体の選択
１４日の培養後、ハイブリドーマ上清を、ＣＧＲＰ  Ｒ特異的モノクローナル抗体について、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によってスクリーニングした。上清は、ＡＭ−１  ＣＨＯ  ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ細胞またはヒトＣＧＲＰ  Ｒでトランスフェクトした組み換えＨＥＫ２９３細胞のいずれかに対してスクリーニングし、親ＨＥＫ２９３細胞（実施例１に記載されるように調製）に対して逆スクリーニングした。
【０３９５】
簡潔に述べると、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の細胞を、３８４ウェルのＦＭＡＴプレートに、５０μＬ／ウェルの量で、安定したトランスフェクタントの場合は約４０００細胞／ウェルの密度で、親細胞の場合は約１６，０００細胞／ウェルの密度で播種し、細胞を一晩３７℃で培養した。次に、１０μＬ／ウェルの上清を添加し、プレートを約１時間、４℃で培養した後、１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、２．８μｇ／ｍＬの濃度（最終濃度４００ｎｇ／ｍＬ）で添加した。次に、プレートを１時間４℃で培養し、ＦＭＡＴマクロ共焦点スキャナ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して蛍光を読み取った。
【０３９６】
逆スクリーニングの場合、親ＡＭ１  ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を同様に播種し、これらの細胞上で上清をＦＭＡＴによりスクリーニングすると同時に、細胞性タンパク質に結合するが、ＣＧＲＰ受容体には結合しないハイブリドーマを分化および排除した。
【０３９７】
Ｂ．  ＦＭＡＴを通じたリガンド結合競合検定による遮断抗体の特定
リガンド結合競合方法を、ＣＧＲＰ受容体に結合し、ＣＧＲＰリガンド結合を遮断する抗体を（ハイブリドーマ上清中で）特定するために開発した。３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７１２）を、５，０００ＡＭ１  ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ  プール２細胞および２０，０００個の非トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞により各ウェルで調製した。２０μＬの抗ＣＧＲＰ  Ｒハイブリドーマ上清を各ウェルに添加し、プレートを１時間室温で培養した。次に、１０μＬの２．８μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰ８−３７ペプチドを各ウェルに添加し、プレートをさらに３時間、室温で培養した。細胞に結合したＡｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰ８−３７の量を、ＦＭＡＴ８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で測定した。出力データは、シグナル強度のＦＬ１数値（高いＦＬ１値は、高いシグナル強度を示す）および細胞の画像の両方であった。
【０３９８】
実験は、陰性対照のハイブリドーマ上清を含んだ。これらの陰性対照実験において認められた平均ＦＬ１値を、測定の最大可能シグナルとして採用した。実験上清をこの最大シグナルと比較し、各ウェルに対して阻害パーセントを計算した（阻害％＝（１−（抗ＣＧＲＰ  Ｒハイブリドーマ上清のＦＬ１／最大ＦＬ１シグナル））。
【０３９９】
データの概要を、図６に示す。この実験において、１０９２の抗ＣＧＲＰ  Ｒ上清を、受容体リガンド検定を使用して試験した。データは、平均阻害％を使用して、ランク付けした。９０例の上清が、２５％を超える平均阻害率を有し、これらのうちの３１例は、５０％、７例は７０％を超える平均阻害率であった。
【０４００】
省略したデータセットを、以下の表１０に示す。試料識別番号１〜５は、ＣＧＲＰ受容体に対するＡｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰ８−３７ペプチドの結合を阻害した抗ＣＧＲＰ  Ｒハイブリドーマ上清の試料を示し、試料識別番号５３６〜５４０は、ＣＧＲＰ受容体に対するＡｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰ８−３７ペプチドの結合を阻害しなかった抗ＣＧＲＰ
Ｒハイブリドーマ上清の実施例を示す。
【０４０１】
【表１０】
2014210815.tif 000040
【０４０２】
これらの結合競合検定に基づいて、さらなる特性化のために約３０の上清を選択した。
【実施例４】
【０４０３】
ｃＡＭＰ機能検定におけるＣＧＲＰ受容体特異的遮断モノクローナル抗体の活性
Ａ．ＣＧＲＰ受容体抗体活性
選択されたＣＧＲＰ受容体抗体を、インビトロＣＧＲＰ受容体媒介性ｃＡＭＰ検定においてスクリーニングし、本来の能力を決定した。インビトロｃＡＭＰ検定は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１０、「ＨＴＢ−１０細胞」）から取得したヒト神経芽細胞腫由来の細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、Ｓｐｅｎｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ８：４１０）を用いた。ＨＴＢ−１０細胞は、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１を発現し、ＣＧＲＰ受容体を形成する（Ｌ．Ｍ．ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。組み換えカニクイザルＣＧＲＰ  Ｒを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞株を、実施例１に記載されるように生成し、ラットＣＧＲＰ受容体を発現するラットＬ６細胞株を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４５８）から取得した。
【０４０４】
ＬＡＮＣＥ  ｃＡＭＰ検定キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）をスクリーニングに使用した。検定は、白い９６ウェルプレートにおいて、総量６０μＬで行った。簡潔に述べると、検定の日に、凍結したＨＴＢ−１０細胞を３７℃で解凍し、検定バッファで細胞を１回洗浄し、Ａｌｅｘａ標識された抗ｃＡＭＰ抗体と混合される１００００個の細胞を含む１２μＬの細胞懸濁液を、９６半領域の白いプレートに添加した。１２μＬ  ＣＧＲＰ受容体抗体を添加した後、混合物を３０分間室温で培養した。次に、１２μＬ  ＣＧＲＰ受容体アゴニストヒトα−ＣＧＲＰ（最終濃度１ｎＭ）を添加し、さらに１５分間室温で培養した。ヒトα−ＣＧＲＰ刺激の後、２４μＬの検出混合物を添加し、６０分間室温で培養して、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ器具（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上で、Ｅｍ６６５ｎＭで読み取った。Ｐｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）またはＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）によってデータを処理および分析した。
【０４０５】
図７Ａは、３つの抗体３Ｃ８、１３Ｈ２および１Ｅ１１に対して、ｈＣＧＲＰ受容体発現細胞株ＨＴＢ−１０を使用して、上述のように得られた典型的なデータを示す。データは、抗体（３Ｃ８、１３Ｈ２および１Ｅ１１）濃度の関数として、対照（「ＰＯＣ」）に対するパーセンテージとしてプロットされ、標準非線形後退曲線と適合されて、図の下に示されるＩＣ５０値を得る。
【０４０６】
Ｂ．関連受容体における抗体活性の欠落
関連受容体ＡＭ１（ｈＣＲＬＲ＋ｈＲＡＭＰ２を発現するＨＥＫ２９３細胞、Ｄ．Ｒ．Ｐｏｙｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ，５４：２３３−２４６，２００２）、ＡＭ２（ｈＣＲＬＲ＋ｈＲＡＭＰ３を発現するＣＨＯ細胞、Ｄ．Ｒ．Ｐｏｙｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ，５４：２３３−２４６，２００２）またはヒトアミリンＡＭＹ１受容体（ｈＣＴＲ＋ｈＲＡＭＰ１を発現するＭＣＦ−７細胞、Ｗｅｎ−Ｊｉ  Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５２：１１６４−１１７５，１９９７）を発現する細胞を使用して、試験した抗体の選択性を決定した。ＡＭ１発現ＨＥＫ２９３細胞株は、上記の実施例１に記載されるように生成した。ＡＭ２発現ＣＨＯ細胞株は、ＥｕｒｏＳｃｒｅｅｎ（現在のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）から購入し、ヒトアミリンＡＭＹ１受容体発現ＭＣＦ−７細胞株（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４２３−４３１，１９９７）は、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２２）から取得した。上述のようにプロットされた典型的な結果を、図７Ｂ（ｈＡＭ１−ＨＥＫ細胞）、７Ｃ（ｈＡＭ２−ＣＨＯ細胞）および７Ｄ（ｈＡＭＹ−ＭＣＦ−７細胞）に示す。試験した抗体のいずれも、試験した範囲において、ｈＡＭ１、ｈＡＭ２またはｈＡＭＹ１受容体に対して有意な阻害活性を有しなかったことに留意されたい。
【０４０７】
カニクイザルＣＧＲＰ受容体を発現する組み換えＨＥＫ細胞およびラットＣＧＲＰ受容体を発現するラットＬ６細胞（ＡＴＣＣ）を使用して、類似する実験を行った。これらの研究から得られたデータ、ならびに本実施例のパートＡに記載されるように得られた追加のＩＣ５０データは、以下の表１１の「ｃＡＭＰ」の列に示される。ヒトおよびカニクイザルＣＧＲＰ受容体に対するＩＣ５０は、ナノモル範囲内であるが、ラットＣＧＲＰ受容体、ヒトＡＭ１、ＡＭ２、およびＡＭＹ１受容体、ならびにカルシトニンを発現するＭＣＦ７細胞（データ図示せず）に対する活性は、すべて１マイクロモルより大きいことに留意されたい。ヒトＣＧＲＰ受容体とヒトＡＭ１、ＡＭ２、アミリンおよびカルシトニン受容体の間のＩＣ５０の差異は、同一の受容体成分の一部において形成される関連受容体と比較して、ＣＧＲＰ受容体に対するこれらの抗体の高い選択性を示す。ヒトおよびカニクイザルＣＧＲＰ受容体を使用して得られたＩＣ５０は類似しているが、試験した抗体は、ラットＣＧＲＰ受容体と交差反応するように見られなかった。
【０４０８】
【表１１】
2014210815.tif 000041
【実施例５】
【０４０９】
Ｋｉ決定受容体遮断抗体のための放射性リガンドＣＧＲＰ結合検定
１２５Ｉ標識化ＣＧＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＨＴＢ−１０細胞からの細胞膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、試験抗体の様々な濃度の存在下で、放射性リガンド結合実験に使用し、対応するＫｉ値を決定した。ＣＧＲＰ結合検定は、室温で、１１０μＬ結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ／５０ｍＬ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤））、２０μＬ試験化合物（１０Ｘ）、２０μＬ１２５Ｉ−ｈαＣＧＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０Ｘ）、および５０μＬヒト神経芽細胞腫細胞（ＨＴＢ−１０）膜懸濁液（１０μｇ／ウェル、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する９６ウェルプレートにおいて行った。プレートを、６０ｒｐｍで振動させながら室温で２時間培養し、次いで、各ウェルの内容物を０．５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）処理した（少なくとも１時間）ＧＦ／Ｃ９６ウェルフィルタプレートによりろ過した。ＧＦ／Ｃフィルタプレートを、氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で６回洗浄し、５５℃のオーブンで１時間乾燥させた。次に、ＧＦ／Ｃプレートの底部を密閉した。４０μＬ  ＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔＴＭ  ２０を各ウェルに添加し、ＧＦ／Ｃプレートの上部をＴｏｐＳｅａｌＴＭ−Ａ（プレスオン接着密閉フィルム）で密閉し、ＧＦ／Ｃプレーを、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。データは、Ｐｒｉｚｍを使用して分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）
【０４１０】
抗体３Ｃ８、１２Ｈ２、および１Ｅ１１を使用して得られる典型的なデータおよびＫｉ値を、図８に示す。
【０４１１】
上記の表１１の右端の列は、ＨＴＢ−１０細胞膜に対する放射性標識１２５Ｉ−ＣＧＲＰ競合結合検定において表示されるｍＡｂｓのＫｉ値を列挙する。データは、ＣＧＲＰ受容体抗体が、ＣＧＲＰ結合に対して（すべてのサブナノモル範囲で）競合性が高かったことを証明する。
【実施例６】
【０４１２】
ＣＧＲＰ受容体遮断抗体のＫＤ決定のためのＦＡＣＳ結合検定
細胞上で発現されるＣＧＲＰ受容体に対する抗ＣＧＲＰ  Ｒ  ｍＡｂの親和性は、ＦＡＣＳ法を使用して決定した。簡潔に述べると、上述のとおり調製されたＡＭ−１  ＣＨＯ
ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ発現細胞を、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ＰＳ、Ｌ  Ｇｌｕｔ、ＮａＰｙｒおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地において、ウェル当たり１６，０００または１６０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。ＣＧＲＰ受容体抗体を、５０ｎＭ〜１ｐＭの同一培地において滴定し、細胞とともに培養した。総容量１２０μＬ中、プレートシェーカ上で、一晩４℃で培養した後、細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、遠心分離して、その都度上清を破棄した。７ＡＡＤ（５μＬ／ウェル）を含有する１００μＬ／ウェルのＧ抗−Ｈｕ  Ｆｃ  Ｃｙ５（５μｇ／ｍＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、次に添加し、４℃で４０分間培養した。細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、遠心分離して、その都度上清を破棄した。次に１００μＬ  ＰＢＳ＋２％  ＦＢＳ緩衝液を添加し、ＦＡＣＳによって分析して、結合幾何平均を決定した。Ｋｄは、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用して、各抗体濃度における負の幾何平均を、存在する遊離Ａｂの量とすることによって計算した。Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３。２つの異なる細胞濃度において得られたデータを、ｎ曲線分析によって解析し、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３４（２００５）１００４−１０１３に記載されるように、Ｋｄおよび９５％信頼区間を決定した。
【０４１３】
対応する曲線適合を有する典型的なデータを、抗体１２Ｇ８．２について図１０に示す。本開示を支持する、生成された８つの遮断抗体に関するデータを、表１２に示す。抗体のうちの１つ（３Ｂ６）は、２つの異なる日に解析した。１６Ｋの細胞を用いる実験で得られた０．９という比率は、抗原濃度が、Ｋｄの０．９倍であると予測され、したがって、実験により得られた曲線は、Ｋｄ制御曲線であることを示す。この方法で得られるＫｄ値は、すべての試験した抗体について、低い一桁ナノモル範囲であったことが理解できる。
【０４１４】
【表１２】
2014210815.tif 000042
【実施例７】
【０４１５】
ＢＩＣＯＲＥ結合競合によるＣＧＲＰ受容体遮断抗体のビニング
Ｂｉａｃｏｒｅ分析（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６：９９−１１０（１９９４）は、以下のように行った。製造者の指示に従い、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｐ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＰバッファ）の連続フローを使用して、抗ＣＧＲＰ受容体抗体をＣＭ５センサーチップ表面に固定した。センサーチップ表面上のカルボキシル基を、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を含有する６０μＬの混合液を注入することによって活性化した。特定の表面を、１０ｍＭ酢酸中に希釈された１８０μＬの抗ＣＧＲＰ受容体抗体を、ｐＨ４．０、濃度３０μｇ／ｍＬで注入することによって取得した。表面上の過剰な反応基を、６０μＬの１Ｍエタノールアミンを注入することによって不活性化した。別個の抗体に対する最終固定レベルは、以下のとおりであった。
【０４１６】
【表１２−２】
2014210815.tif 000043
ブランクの擬似結合基準表面も、センサーチップ上で調製した。１００ｎＭの濃度において、上で参照される６つの固定された抗体（１１Ｄ１１、３Ｂ６、４Ｈ６、１２Ｇ８、９Ｆ５または３４Ｅ３）のうちの１つを有する、可溶性ｈｕＣＧＲＰ受容体が、センサーチップ上で捕捉された。次に、２０の試験抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体のそれぞれを、ｈｕＣＧＲＰ受容体にわたって注入した。注入した抗体が、固定された抗体によって認識されたものに対して、個別のエピトープを認識した場合、二次結合事象が認められることとなる。抗体が、同一または極めて類似するエピトープを認識する場合、ｈｕＣＲＰ受容体の結合のみが認められることとなる。
【０４１７】
固定された抗体３Ｂ６により被覆されるセンサーチップを使用して得られた典型的なデータを、図９Ａに示す。４つのトレースは、注入溶液中の抗体１Ｅ１１、４Ｅ４、２Ｅ７、および１２Ｇ８を使用して得られたデータである。実験中の事象は、ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ−Ｆｃの注入に対応して「Ａ」、ｈｕＣＧＲＰ  Ｒ−Ｆｃ注入の末端に対応して「Ｂ」、第２のｍＡｂの注入に対応して「Ｃ」、および第２のｍＡｂ注入の終了およびバッファ洗浄の開始に対応して「Ｄ」とともに、文字によって表される。固定された抗体表面上に注入された抗体のうちのいずれかからも、いかなる結合シグナルの表示もなく、４つの注入された抗体が、同一または極めて類似するエピトープを固定された抗体として明らかに認識することを示していることに留意されたい。本質的に、５つの固定された中和抗体表面のそれぞれにおいて洗浄されたすべての試験遮断抗体に関して、同一の結果が認められ、すべての試験抗ｈｕＣＧＲＰ受容体遮断抗体が、同一または極めて類似し、強く重複するエピトープを認識することを示している。
【０４１８】
対照的に、図９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄの一部に示されるように、４つの試験した非遮断ＣＧＲＰ受容体特異的抗体３２Ｈ８、３３Ｂ５、３３Ｅ４および３４Ｅ３は、１１Ｄ１１（データ図示せず）、３Ｂ６（図９Ｂ）、１２Ｇ８（図９Ｃ）および９Ｆ５（データ図示せず）との競合に失敗したが、３４Ｅ３は、４Ｈ６（図９Ｄ）と競合することができ、３２Ｈ７（データ図示せず）と弱く競合した。３２Ｈ８は、３Ｂ６、４Ｈ６、１２Ｇ８、９Ｆ５または非遮断抗体３４Ｅ３との競合に失敗したが、３３Ｂ５および３３Ｅ４は、非遮断抗体３４Ｅ３と競合することができた。すべての遮断および非遮断抗体に関するデータを、以下の表１３に要約する。「ＮＢ」は、結合がないことを示し、「＋」は、有意な結合を示し、「弱」は弱い結合を示す。
【０４１９】
【表１３】
2014210815.tif 000044
【０４２０】
データから理解され得るように、試験した遮断または中和抗体のすべては、５つの固定された遮断抗体として同一領域に結合し、すなわち、試験した中和抗体のすべてが、ＣＧＲＰ  Ｒ分子の同一領域に結合する。一方、非遮断抗体は、概して、固定された遮断抗体と競合せず、非遮断抗体が、主にＣＧＲＰ  Ｒの異なる領域に結合することを示している。
【実施例８】
【０４２１】
ウェスタンブロットにおける可溶性ＣＧＲＰ受容体に対するＣＧＲＰ受容体抗体の結合
ウェスタンブロットを使用して、可溶性ＣＧＲＰ受容体−ｍｕＦｃ融合タンパク質に対する結合について、３つの代表的なＣＧＲＰ受容体遮断抗体を試験した。
【０４２２】
１００ｎｇの精製ＣＧＲＰ  Ｒ−ｍｕＦｃ（マウスＦｃが使用され、ＲＡＭＰ１またはＣＲＬＲ  ＥＣＤとｍｕＦｃとの間のリンカーが、「ＧＧＧＧＧＶＤＧＧＧＧＧＶ」（配列番号２１３）に変更されたことを除いて、ＣＧＲＰ  Ｒ−ｈｕＦｃに関して上述のように生成および精製される）を、β−メルカプトエタノール（βＭＥ）を伴う（還元）か、または伴わずに（非還元）、１３．３％の濃度でＰＡＧＥ試料バッファを含むＰＢＳ中で希釈した。次に、βＭＥを含む試料を４分間沸騰させた。還元および非還元試料を、個別の４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、ＣＧＲＰ  Ｒ−Ｆｃタンパク質と分子重量マーカ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の交互のレーンとともに載置した。ゲルを０．２μｍのニトロセルロースフィルター上に電気ブロットした。ブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、ＴＢＳＴ＋５％粉末乾燥ミルクで３０分間遮断した。分子重量マーカーレーンに沿って、ブロットをストリップに切断した。それぞれ還元および非還元ＣＧＲＰ  Ｒ−ｍｕＦｃを有する１つのストリップを、精製されたｈｕＣＧＲＰ  Ｒ抗体４Ｅ４、９Ｆ５、または３Ｂ６（ＴＢＳＴ＋５％ミルク中１：５００希釈）、ヤギ抗ｈｕＲＡＭＰ１  Ｎ−２０（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、ウサギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（１：１０，０００）（Ｐｉｅｒｃｅ）、またはヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（１：１０，０００）（Ｐｉｅｒｃｅ）で培養した。ブロットを抗体で１時間培養した後、ＴＢＳＴ＋１％ミルクで３ｘ１０分洗浄した。次に、ｈｕＣＧＲＰ  Ｒで処理したブロットを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（ＴＢＳＴ＋１％ミルク中１：１０，０００）で培養し、抗ｈｕＲＡＭＰ１（Ｎ−２０抗ＲＡＭＰ１ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＣＡ）で処理したブロットを、ウサギ抗ヤギＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（１：１０，０００）で２０分間培養した。ブロットを、ＴＢＳＴで３ｘ１５分洗浄した。ｈｕＣＧＲＰ  Ｒおよび抗ｈｕＲＡＭＰ１抗体ブロットは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ検出試薬で処理し、抗マウスおよび抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰブロットは、Ｐｉｅｒｃｅ標準検出試薬で処理した（１分）。次に、ブロットをＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳ  Ｘ線フィルムに曝露した。
【０４２３】
３つのＣＧＲＰ受容体抗体、４Ｅ４、９Ｆ５および３Ｂ６はすべて、可溶性ＣＧＲＰ  Ｒ−ｍｕＦｃ（ＲＡＭＰ１−ＥＣＤおよびＣＲＬＲ  ＥＣＤを含む）を、非還元条件下で検出することがでたが、還元条件下ではできず、これらのＣＧＲＰ  Ｒ抗体の結合エピトープが立体配座であり、ジスルフィド結合（ＲＡＭＰ１−ＥＣＤにおける３つの対、およびＣＲＬＲ  Ｎ−ｔｅｒＥＣＤにおける３つの対）に敏感であったことを示した。対照的に、市販の抗ＲＡＭＰ１抗体Ｎ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、還元および非還元条件の両方でＲＡＭＰ１と結合し、Ｎ−２０抗体の結合部位が、主に線形であり、ジスルフィド結合に敏感でないことを示している。
【実施例９】
【０４２４】
キメラ受容体に対するＣＧＲＰ受容体遮断抗体の結合
天然ＲＡＭＰ１とキメラＣＲＬＲ、または天然ＣＲＬＲとキメラＲＡＭＰ１のいずれかで形成されるＣＧＲＰ受容体を使用して、抗体結合に関与するＣＧＲＰ受容体配列を特定した。試験したヒトＣＧＲＰ受容体遮断交代のすべてが、ラットＣＧＲＰ受容体に対する機能的活性を示すことができなかったため、キメラ成分は、ヒト配列バックグラウンドにおいて、ラット配列の領域を含んでいた。以下のキメラを、ＦＡＣＳによる結合分析用に生成した。
ＲＡＭＰ１キメラ番号１（Ｑ２８〜Ａ３４）、配列番号２１７
ヒトＲＡＭＰ１におけるアミノ酸残基Ｑ２８〜Ａ３４を、ラットＲＡＭＰ１からの対応する配列で置換した。この範囲は、ヒトとラットＲＡＭＰ１との間で異なる５つのアミノ酸残基を含んだ。
ＲＡＭＰ１キメラ番号２（Ｑ４３〜Ｅ５３）、配列番号２１８
ヒトＲＡＭＰ１におけるアミノ酸残基Ｑ４３〜Ｅ５３を、ラットＲＡＭＰ１からの対応する配列で置換した。この範囲は、ヒトとラットＲＡＭＰ１との間で異なる６つのアミノ酸残基を含んだ。
ＲＡＭＰ１キメラ番号３（Ｒ６７〜Ｅ７８）、配列番号２１９
ヒトＲＡＭＰ１におけるアミノ酸残基Ｒ６７〜Ｅ７８を、ラットＲＡＭＰ１からの対応する配列で置換した。この範囲は、ヒトとラットＲＡＭＰ１との間で異なる７つのアミノ酸残基を含んだ。
ＣＲＬＲキメラ番号１（Ｌ２４〜Ｑ３３）、配列番号２２３
ヒトＣＲＬＲにおけるアミノ酸残基Ｌ２４〜Ｑ３３を、ラットＣＲＬＲからの対応する配列で置換した。この範囲は、ヒトＣＲＬＲとラットＣＲＬＲとの間で異なる８つのアミノ酸残基を含んでいた。
【０４２５】
図１１は、カニクイザル（配列番号２１５）、ヒト（配列番号４）、ラット（配列番号２１４）、およびアカゲザル（配列番号２１６）からのＲＡＭＰ１アミノ酸配列の整列を、ＲＡＭＰ１キメラ番号１（配列番号２１７）、キメラ番号２（配列番号２１８）およびキメラ番号３（配列番号２１９）の配列とともに示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ヒト（配列番号２）、カニクイザル（配列番号２２１）、アカゲザル（配列番号２２２）、ラット（配列番号２２０）からのＣＲＬＲアミノ酸配列の整列、ならびにＣＲＬＲキメラ番号１（配列番号２２３）のアミノ酸配列を示す。
【０４２６】
２９３−６Ｅ細胞を、ＣＧＲＰ  ＲキメラＤＮＡ組成（ＣＲＬＲ  ｗｔ＋ＲＡＭＰ１  Ｑ２８−Ａ３４、ＣＲＬＲ  ｗｔ＋ＲＡＭＰ１  Ｑ４３−Ｅ５３、ＣＲＬＲ  ｗｔ＋ＲＡＭＰ１  Ｒ６７−Ｅ７８、ＣＲＬＲ  Ｌ２４−Ｑ３３＋ＲＡＭＰ  ｗｔ、ＣＲＬＲ  ｗｔ＋ＲＡＭＰ１  ｗｔ、ｐＴＴ５ベクター対照）により一時的にトランスフェクトした。７２時間後に細胞を収集し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで洗浄して、計数した。各トランスフェクトした細胞株は、１００μＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡ当たり５ｘ１０５細胞の希釈で再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液は、９６ウェルの丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中のウェル当たりのアリコートであった。細胞を１２００ｒｐｍで５分間ペレットした。上清を除去し、０．５μｇの精製ヒトＣＧＲＰ  Ｒ抗体１Ｈ７、２Ｅ７、３Ｂ６、９Ｆ５、４Ｈ６、１２Ｇ８、３Ｃ８、１０Ｅ４、１１Ｄ１１、３２Ｈ８、または３３Ｂ５を含有する１００μＬで置き換えた。対照ウェルを抗ＤＮＡ  ｈｕＩｇＧ２（０．５μｇ）、Ａｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰペプチド（０．５μｇ）、またはＰＢＳ／ＢＳＡ単独で処理した。細胞は、氷上で１時間培養した後、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した。細胞を抗ｈｕｇ−Ｆｃ−ＦＩＴＣ（０．５μｇ）を含有する１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。（Ａｌｅｘａ６４７−ＣＧＲＰ処理した細胞を除く）。細胞を氷上で１時間、暗所で培養した後、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した。細胞を２００μＬのＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ較正器を使用して分析した。
【０４２７】
１０個の代表的な遮断抗体（３Ｂ６、９Ｆ５、４Ｈ６、１２Ｇ８、３Ｃ８、１０Ｅ４、３２Ｈ７、４Ｅ４、１１Ｄ１１および１Ｈ７）および２つの非遮断抗体（３２Ｈ８および３３Ｂ５）を試験した。代表的なデータ（９Ｆ５抗体）を、図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃに示す。図１３Ａは、野生型のＣＧＲＰ受容体に対する結合を示し、図１３Ｂは、ＣＲＬＲ  Ｌ２４−Ｑ３３キメラを含むＣＧＲＰ受容体に対する結合を示し、図１３Ｃは、ＲＡＭＰ１  Ｑ２８−Ａ３４キメラを含むＣＧＲＰ受容体に対する結合を示す。ＦＡＣＳ分析は、予想されたとおり、１２個の抗体すべてが、野生型ヒトＣＧＲＰ受容体対照に結合することを示した。１２個の抗体すべては、３つのＲＡＭＰ１キメラＲＡＭＰ１（Ｑ２８−Ａ３４）、（Ｑ４３−Ｅ５３）および（Ｒ６７−Ｅ７８）のうちのいずれに対しても、有意に減少した結合を示した。これは、（１）キメラ受容体の発現レベルがはるかに低かったこと、（２）ＲＡＭＰ１キメラが、ヒトＣＲＬＲの折り畳みに失敗し、受容体複合体の構成を変更したこと、および／または（３）ＲＡＭＰ１上のこれら３つの選択された領域が、ＣＧＲＰ受容体に対するこれらの抗体の結合に直接関与することに起因する。
【０４２８】
ＦＡＣＳ追跡をゲートコントロールして、極めて小さい「発現」細胞集団のみを含めた場合、非遮断抗体３３Ｂ５および３２Ｈ８は、遮断抗体と比較して、ＲＡＭＰ１  Ｑ４３−Ｅ５３キメラに対して絶えず良好に結合していないようであり、ＲＡＭＰ１  Ｑ４３−Ｅ５３領域に対する結合が、非遮断抗体に対してより重要であり得ることを示唆する。一方、３３Ｂ５および３２Ｈ８は、絶えず遮断抗体よりも良好にＲＡＭＰ１  Ｒ６７−Ｅ７８キメラに結合し、ＲＡＭＰ１  Ｒ６７−Ｅ７８配列が、遮断抗体に対してより重要であり得ることを示唆する。
【０４２９】
試験したすべてのＣＧＲＰ受容体抗体は、ＣＲＬＲキメラ（Ｌ２４−Ｑ３３）に対して適度に良好に結合し、この部位は、遮断抗体の結合に必須でないことを示唆する。
【０４３０】
要約すると、データは、ＲＡＭＰ１（Ｑ２８−Ａ３４）、（Ｑ４３−Ｅ５３）および（Ｒ６７−Ｅ７８）上の３つの不連続領域が、ＣＧＲＰ受容体への抗体の結合に関与し得、（Ｒ６７−Ｅ７８）が遮断抗体に対してより重要であることを示す。ＣＲＬＲのＮ末端配列（Ｌ２４−Ｑ３３）は、本方法によって分析すると、ＣＧＲＰ受容体抗体の結合に強く関与するようではなかった。本アプローチは、この分析において標的とされたヒトとラットＣＧＲＰ受容体との間での同一または類似する配列を共有する、追加の結合部位を除外するものではない。
【実施例１０】
【０４３１】
プロテアーゼ保護検定による抗ＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体のヒトＣＧＲＰ  Ｒエピトープの特定
ＣＲＬＲ−Ｆｃ融合分子の成熟形態におけるＣＲＬＲ部分（シグナルペプチドが除去されている、配列番号１０として本明細書に開示）は、１１６個のアミノ酸（グリシンリンカーに先行する）を含み、３つのジスルフィド結合の形成によって形成される３つの大きいループ構造を有する。ＣＲＬＲにおける３つのジスルフィド結合は、配列位置２６におけるＣｙｓ１であり（このパラグラフに列挙されるすべてのＣＲＬＲ配列位置は、配列番号１０として提示される成熟配列に関する）、配列位置５２においてＣｙｓ３に結合され（ＣＲＬＲ  Ｃ１−Ｃ３と称される）、配列位置４３におけるＣｙｓ２は、配列位置８３におけるＣｙｓ５に結合され（ＣＲＬＲＣ２−Ｃ５と称される）、配列位置６６におけるＣｙｓ４は、配列位置１０５におけるＣｙｓ６に結合される（Ｃ４−Ｃ６と称される）。ＲＡＭＰ１−Ｆｃ融合分子の成熟形態におけるＲＡＭＰ１部分は、グリシンリンカーに先行して９１個のアミノ酸（配列番号１１）を含み、これも３つの分子内ジスルフィド結合を形成する。ＲＡＭＰ１における３つのジスルフィド結合は、配列位置１においてＣｙｓ１であり（このパラグラフに列挙されるすべてのＲＡＭＰ１配列位置は、配列番号１１として提示される成熟配列に関する）、配列位置５６におけるＣｙｓ５に結合され（ＲＡＭＰ１  Ｃ１−Ｃ５と称される）、配列位置１４におけるＣｙｓ２は、配列位置４６におけるＣｙｓ４に結合され（ＲＡＭＰ１  Ｃ２−Ｃ４に参照される）、配列位置３１におけるＣｙｓ３は、配列位置７８におけるＣｙｓ６に結合される（ＲＡＭＰ１  Ｃ３−Ｃ６と称される）。
【０４３２】
抗ＣＧＲＰ中和モノクローナル抗体によって結合されるヒトＣＧＲＰ受容体タンパク質の領域を、ｈＣＧＲＰ  Ｒを特定のプロテアーゼを有するペプチドへ断片化すること、および得られたｈＣＧＲＰ  Ｒペプチド（すなわち、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１部分のジスルフィドおよび非ジスルフィド含有ペプチド断片の両方）の配列を決定することによって特定した。次に、プロテアーゼ保護検定を行って、結合モノクローナル抗体の存在下でのｈＣＧＲＰ  Ｒのタンパク質分解消化を決定した。この検定の一般原理は、ＣＧＲＰ  Ｒに対するｍＡｂの結合が、ある特定のプロテアーゼ開裂部位の保護をもたらし得るということであり、この情報を使用して、ｍＡｂが結合する領域または部分を決定することができる。
【０４３３】
簡潔に述べると、ペプチド消化物は、ＨＰＬＣペプチドマッピングに供され、個別のピークが収集され、オンライン電気スプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ）分析および／またはＮ末端配列決定によって、ペプチドが特定およびマップされた。これらの試験に対するすべてのＨＰＬＣ分析は、オフライン分析の場合は、狭孔逆相Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ１５ｃｍ長、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ、５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行い、ＬＣ−ＭＳの場合は毛細血管逆相Ｃ１８カラム（０．５ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ２５ｃｍ、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  ＭＳ、５μｍ、Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ）を使用して行った。ＨＰＬＣペプチドマッピングは、０．０５％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）から０．０５％トリフルオロ酢酸中の９０％アセトニトリルへの線形勾配を用いて行った。カラムは、９０分かけて、オフラインまたはオンラインＬＣ−ＭＳ分析の場合、狭孔ＨＰＬＣに対して０．２５ｍＬ／分の流速で、オンラインＬＣ−ＭＳ分析の場合、毛細血管ＨＰＬＣに対して０．０１８ｍＬ／分で展開した。
【０４３４】
成熟型のヒトＣＧＲＰ  Ｒを、ＡｓｐＮ（アミノ末端におけるアスパラギン酸およびいくつかのグルタミン酸残基の後に開裂する）によって、約１００μｇのＣＧＲＰ  Ｒを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中１．０ｍｇ／ｍＬで、２０時間、３７℃で、２μｇのＡｓｐＮを用いて培養することによって消化した。
【０４３５】
ＡｓｐＮ消化のＨＰＬＣクロマトグラフィは、図１４に示されるようなペプチドプロファイル（各試料に３０μｇを注入）、ＣＧＲＰ  Ｒ単独の場合のクロマトグラム標識Ａ（濃度１ｍｇ／ｍＬ）を生成し、一方、同様の量のＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体による対照消化、クローン１２Ｇ８は、抗体が、ＡｓｐＮエンドプロテイナーゼ（クロマトグラム標識Ｂ、ＣＧＲＰ  Ｒ：抗体比率、それぞれ重量比で１００：２、１００：７、１００：２０）に対して本質的に耐性があることを示す。配列分析は、ＨＰＬＣから回復されたペプチドピークにに対するオンラインＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＥｄｍａｎ配列決定によって行った。ペプチド消化のオンラインＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳ分析を行って、ＨＰＬＣによって分離されたペプチドの正確な質量および配列を決定した。したがって、ＡｓｐＮ消化からのペプチドピークに存在するいくつかのペプチドが何であるかを決定した（図１４において番号付きピークとして表示される）。以下の表１４は、ｈＣＧＲＰ  Ｒの対応する成分（ＣＲＬＲまたはＲＡＭＰ１）におけるこれらのペプチド配列の位置を示す。数字またはＸが続く大文字のＣは、ＣＲＬＲペプチドとして特定されたペプチドを表し、数字またはＸが続く大文字のＲは、ＲＡＭＰ１ペプチドであり、「Ｆｃ」は、ＣＲＬＲ−ＦｃおよびＲＡＭＰ１−Ｆｃ融合分子から放出される大きい未消化のＦｃ断片を表す。
【０４３６】
【表１４】
2014210815.tif 000045
【０４３７】
図１５は、ＣＧＲＰ  Ｒ単独（クロマトグラム標識Ａ）によるＡｓｐＮ消化実験（各試料に３０μｇを注入）と、中和抗体１２Ｇ８（クロマトグラム標識Ｂ）の存在下で行われたものとの比較を示す。ＣＧＲＰ  Ｒ：抗体の重量比は、１：１であった。いくつかのピーク（Ｃ５、Ｃ６、およびＣ７）は、クロマトグラムＡに対してクロマトグラムＢのピーク高の減少を示すが、２つの他のピーク（Ｃ−ＸおよびＲ−Ｘ）は、クロマトグラムＡに対してクロマトグラムＢのピーク高の増加を示す。同様のペプチドマップパターンが、同様の量において異なる中和抗ＣＧＲＰ抗体（１０Ｅ４、３Ｂ６、３Ｃ８、または４Ｅ４）が、クロマトグラム標識Ｃに見られるように、消化試料に存在した場合にも認められた。Ｃ６およびＣ７はいずれも、ジスルフィド結合ペプチドであり、ＣＲＬＲ分子の主要部分をカバーするが、Ｃ５は、分子のＮ末端に存在するＣＲＬＲ非ジスルフィド含有ペプチドであり、Ｃ７ジスルフィドペプチドに対して最後から二番目である。ピークＣ−Ｘは、複数の配列との３つのＣＲＬＲジスルフィド結合を含み、少なくとも２〜３個のペプチドが、ジスルフィド結合によって一緒に結合されることを示す。ピークＣ−Ｘが、ＣＧＲＰ中和抗体の存在下で、ＣＧＲＰ  Ｒ消化におけるピーク高を増加させたという事実は、抗体が、Ｇｌｕ２５およびＡｓｐ５５に関連するいくつかの開裂部位において、ＡｓｐＮ消化からＣＧＲＰ  Ｒを保護したことを示す。抗体は、ペプチドＣ２およびＣ４のピーク強度が全く減少しなかったため、Ａｓｐ３３およびＡｓｐ７２に対して有意な保護効果を有するとは考えられない。したがって、抗体は、Ｃｙｓ５３とＣｙｓ６６との間のループ領域と一緒に、ＣＲＬＲ  Ｃ１〜Ｃ３およびＣＲＬＲ  Ｃ４〜Ｃ６ジスルフィド領域を含む、ＣＲＬＲの領域に結合すると考えられる。
【０４３８】
ＣＧＲＰ  ＲのＡｓｐＮマッピングは、ＲＡＭＰ１ジスルフィドペプチド（Ｒ２）およびＲＡＭＰ１非ジスルフィドペプチド（Ｒ１）も特定した（表１４および図１４を参照）。上述の中和抗体（１２Ｇ８、１０Ｅ４、４Ｅ４、３Ｂ６または３Ｃ８）のうちのいずれの存在下でも、ペプチドＲ−Ｘは、試料中に抗体を有しない消化から得られたものよりも有意に高いピーク強度で回復した。質量および配列分析は、Ｒ−ｘが、Ｃｙｓ１とＡｒｇ８６との間のＲＡＭＰ１配列に対応する単一のポリペプチド鎖を含むことを示した。これらの実験は、ＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体が、ＡｓｐＮタンパク質分解消化からＲＡＭＰ１の有意領域を保護することができることを示す。
【０４３９】
ＣＧＲＰ  Ｒ  ＡｓｐＮタンパク質分解の保護効果が、（抗ＣＧＲＰ  Ｒ非中和抗体と比較して）ＣＧＲＰ  Ｒ中和（遮断）抗体に特異的であるか否かを評価するために、ＣＧＲＰ  Ｒ活性を中和しない、非関連制御モノクローナル抗体の存在下で、ＣＧＲＰ  ＲのＡｓｐＮ消化を行った。結果を、図１５のクロマトグラムＤに示す。非中和抗体は、ＣＧＲＰ  Ｒ  ＡｓｐＮタンパク質分解に対して、有意な遮断効果を全く示さず、実際に、ペプチドマッププロファイル（クロマトグラムＤ）は、ＣＧＲＰ  Ｒ単独の消化に由来するプロファイル（クロマトグラムＡ）に対する関連態様とほぼ区別不可能である。
【０４４０】
タンパク質分解保護効果は、消化試料に添加される濃度に依存した。図１６に示されるように、可変量の抗ＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体４Ｅ４（ＣＧＲＰ  Ｒ：抗体のマイクログラム比率、それぞれ１００：２、１００：７、１００：２０重量別）を伴う試料（１００μｇ）中の固定ＣＧＲＰ  Ｒ定量を、Ａｄｐｅｎタンパク質分解について行った。保護プロファイルを認めることができ、保護は、抗体濃度に依存する。
【０４４１】
まとめると、これらのデータは、本明細書に開示される抗ＣＧＲＰ  Ｒ抗体を遮断または中和することが、ＣＧＲＰ  Ｒ（ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１成分の両方において）をＡｓｐＮタンパク質分解から遮断し得ることを証明し、これらの抗体がＣＧＲＰ受容体に結合する場合、遮断抗体は、ＣＲＬＲおよびＲＡＭＰ１の両方に結合することを示唆する。さらに、保護効果は、抗体濃度に依存する。これらの結果は、ＣＧＲＰ  Ｒ中和抗体が、ＡｓｐＮ開裂部位に近いヒトＣＧＲＰ  Ｒ上の共通領域に結合することも示す。
【実施例１１】
【０４４２】
ｃＡＭＰ機能検定における市販の抗ＲＡＭＰ１および抗ＣＲＬＲ抗体
ヒトＣＧＲＰ受容体の１つまたは他の成分（ＲＡＭＰ１またはＣＲＬＲ）に対する市販の抗体を、上記実施例４に記載されるようなＨＴＢ−１０細胞を使用して、ＣＧＲＰ受容体媒介性ｃＡＭＰ検定においてスクリーニングし、抗体が生物活性を有するか否かを決定した。データを、以下の表１５に提示する。それらの抗体は、本明細書に開示される典型的な抗体が強い生物活性を有する濃度範囲において、検出不可能（「ＮＤ」）、非常に弱い（「ＶＷ」）、または弱い（「Ｗ」）生物活性のいずれかを有した。
【０４４３】
【表１５】
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【実施例１２】
【０４４４】
異なる受容体成分を発現する細胞の免疫組織化学染色
２−４ｘ１０６個の細胞を、コラプラグ（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ
Ｃｏ．，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ）ごとに注入した。コラプラグをＯＣＴ培地（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に埋め込み、−２０℃で凍結させ、クリオスタットを使用して、２０μｍの切片に切断した。切片を４％パラホルムアルデヒドで１時間、室温（ＲＴ）で固定し、続いて、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを３％  Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで１５分間遮断し、続いて、切片を遮断溶液（３％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および０．３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ）中で１時間培養した。続いて、切片をヒト抗ＣＧＲＰ受容体一次抗体（３２Ｈ７、０．０３−０．１μｇ／ｍＬ）中、４℃で一晩培養し、ＰＢＳ中で洗浄して、１％正常ヤギ血清中の二次抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片、１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）において１時間、室温で培養した。Ｖｅｃｔｏｒ  Ｅｌｉｔｅキットを使用し、製造者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）に従って、免疫反応を増幅させ、色原体として３，３’−ジアミノベンジジン−ニッケル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、染色を展開させた。切片をキシレンでクリアし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔにより（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）カバースリップした。免疫反応は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ−８００顕微鏡および関連ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して分析した。
【０４４５】
上述のように抗体３２Ｈ７を使用した、異なる受容体成分（以下に同定）を発現する細胞からのデータは、組み換えヒトＣＧＲＰ受容体（ＣＲＬＲ＋ＲＡＭＰ１、「ＣＨＯ／ＣＧＲＰ  Ｒ細胞」）を発現するＣＨＯ細胞の顕著な発現およびＣＧＲＰ（はるかに低い受容体密度に起因して）受容体を内因的に発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の弱い染色を明らかにした。親ＣＨＯ細胞株、未関連の組み換えタンパク質（ＴＲＰＭ８）を発現するＣＨＯ細胞、対応する３２Ｈ７抗原による事前吸収後のＣＨＯ／ＣＧＲＰ  Ｒ細胞、組み換えヒトアドレノメデュリン受容体２（ＣＲＬＲ＋ＲＡＭＰ３）を発現するＣＨＯ細胞、アミリン受容体を内因的に発現するＭＣＦ−７細胞、ヒトアドレノメデュリン受容体１（ＣＲＬＲ＋ＲＡＭＰ２）を発現するＨＥＫ細胞、または親ＨＥＫ細胞において染色は認められなかった。これらの実験からのデータを、以下の表１６に要約す。
【０４４６】
【表１６】
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【０４４７】
特定されるすべての特許および他の発行物は、例えば、本明細書に開示される主題との関連で使用され得るそのような発行物に記載される方法を説明および開示する目的で、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる、。これらの発行物は、本出願の提出日に先行しする、開示についてのみ提供される。この点において、発明者が、先行発明であるというだけで、または任意の他の理由で、そのような開示に先行することを認められないことを承認するものとして見なされるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表現に関するすべての陳述は、出願人が入手可能な情報に基づき、これらの文書の日付または内容の正当性に関して、何らかの承認をもたらすものではない。
【図１】
2014210815.tif 000048
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2014210815.tif 000053
【図５Ｂ】
2014210815.tif 000054
【図５Ｃ】
2014210815.tif 000055
【図５Ｄ】
2014210815.tif 000056
【図５Ｅ】
2014210815.tif 000057
【図５Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図６】
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【配列表】
2014210815000001.app
【外国語明細書】
2014210815000001.pdf