(57)【要約】【課題】種々の生体高分子を制限なく、迅速に分離可能な生体分子分離媒体を提供すること。【解決手段】本発明の生体分子分離媒体は、乾燥の前後において、分散質によって形成されている網目構造１を維持しているゲルを含んでいる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥している生体分子分離媒体であって、
分散質によって形成されている網目構造を有しているゲルを含んでおり、
乾燥前に分散媒によって満たされていた部分が空隙に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されていることを特徴とする生体分子分離媒体。
【請求項２】
上記分散質は、有機物、無機物またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子分離媒体。
【請求項３】
上記ゲルは、固定化ｐＨ勾配ゲルであることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子分離媒体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子分離媒体を、製造する方法であって、
未乾燥の生体分子分離媒体を凍結乾燥によって乾燥させる工程を包含していることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子分離媒体を、製造する方法であって、
未乾燥の生体分子分離媒体を超臨界乾燥によって乾燥させる工程を包含していることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子分離媒体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノムの生物学的研究においてプロテオーム解析が注目されている。プロテオーム解析は、タンパク質の構造および機能の解明を目的とする大規模な研究を指す。通常、プロテオーム解析には、生体由来のサンプルに含まれている多数のタンパク質を個々のタンパク質に分離する必要がある。タンパク質またはＤＮＡなどの生体高分子を分離する分子生物学的および生化学的な手法として、電気泳動が広く用いられている。その分解能の高さから、二次元電気泳動によるタンパク質の分離は、数千を超える種類のタンパク質の分離を要するプロテオーム解析にとって非常に有用である。
【０００３】
二次元電気泳動は、異なる性質に基づく電気泳動によってタンパク質を２段階に分離する手法である。１段階目に等電点電気泳動（ＩＥＦ：isoelectric focusing）を利用し、２段階目にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ:sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）を利用することが一般的である。ＩＥＦは、タンパク質に固有の等電点（ｐＩ:isoelectric point）に基づいてタンパク質を分離する手法である。
【０００４】
ＩＥＦには、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ：Immobilized pH gradient）ゲルが分離媒体として使用される。ＩＰＧゲルは、一端から他端にかけてｐＨ勾配が形成されているゲルである。例えば、長期の保存を目的として乾燥されているＩＰＧゲルは、膨潤させた後に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１８９２２９号公報（２０１０年９月２日公開）
【特許文献２】特表２００６−５２４７４２号公報（２００６年１１月２日公表）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来の乾燥させたゲルは、使用前の膨潤に長時間を要すること、および分子量の高い分子がゲルに導入されにくいという問題を有している。例えば、市販のＩＰＧゲルは、１００ｋＤａ程度を上限とするタンパク質のみを導入可能であり、高分子量のタンパク質を導入する場合には、膨潤に長時間（例えば数時間〜数十時間）を要する。このように、従来の乾燥ゲルには、分析可能な分子に制限があり、分析の準備に長時間を要する。
【０００７】
以上の点を鑑みて、本発明の目的は、種々の生体高分子を制限なく、迅速に導入可能な生体分子分離媒体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明の生体分子分離媒体は、乾燥している生体分子分離媒体であって、分散質によって形成されている網目構造を有しているゲルを含んでおり、乾燥前に分散媒によって満たされていた部分が空隙に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
以上のように、本発明は、種々の生体高分子を制限なく、迅速に導入可能な生体分子分離媒体を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係る生体分子分離媒体の部分的な構造を示す図であり、（ａ）は膨潤ゲルの一部を示しており、（ｂ）は凍結乾燥後のゲルの一部を示しており、（ｃ）はタンパク質を含んでいるサンプルを用いてふたたび膨潤させたゲルの一部を示している。
【図２】従来の生体分子分離媒体の部分的な構造を示す図であり、（ａ）は膨潤ゲルの一部を示しており、（ｂ）は自然乾燥後のゲルの一部を示しており、（ｃ）はタンパク質を含んでいるサンプルを用いてふたたび膨潤させたゲルの一部を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態について、以下にその詳細に説明する。
【００１２】
〔１．生体分子分離媒体〕
本発明に係る生体分子分離媒体は、乾燥している生体分子分離媒体であって、分散質によって形成されている網目構造を有しているゲルを含んでおり、乾燥前に分散媒によって満たされていた部分が空隙に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されている。
【００１３】
ここで、本明細書に使用されている用語「生体分子」は、生体（の器官系、器官、組織、細胞または体液）由来の分子、および生体によって生成される分子を意味する。すなわち、生体分子は、本発明に係る生体分子分離媒体によって分離される対象物である。生体分子の例としては、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、および脂質などが挙げられる。これらのうち、核酸の例としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【００１４】
上述のように、本発明に係る生体分子分離媒体は、ゲルによって主に構成されている。ゲルは、必要に応じて分散媒を介した、分散質（コロイド分子）の集合体である。分散質が集合することによって、ゲルの内部に複雑な網目構造（細孔）が形成される。ゲルに導入された生体分子は、この細孔を通ってゲル内を移動する。生体分子は、ゲルに対する電圧の印加などによって、固有の化学的または物理学的な性質に基づく移動度に応じてゲル内を移動するので、生体分子分離媒体によって分離され得る。すなわち、生体分子分離媒体は、上記生体分子に固有の化学的または物理学的な性質に基づいて、当該生体分子を分離する媒体を意味する。化学的または物理学的な性質は、例えば、分子量または電荷などである。
【００１５】
ここで、本発明に係る生体分子分離媒体は、乾燥前に分散媒によって満たされていた部分（細孔）が空隙（分散質に囲まれており、外部に通じている空洞）に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されている。つまり、本発明に係る生体分子分離媒体は、乾燥による細孔の収縮を生じていない。よって、液体の分散媒に浸すと、細孔は分散媒によって速やかに満たされる。また、細孔が十分に広いため、実質的にすべての生体分子が細孔内を通過可能である。すなわち、巨大な生体分子が容易にゲルに導入され得る。
【００１６】
以上のように、本発明に係る生体分子分離媒体は、多数の生体分子を含んでいる生体由来のサンプルから、固有の性質にしたがって生体分子を網羅的に分離可能な媒体である。ここでは、本発明に係る生体分子分離媒体の一例として、生物学的な研究用の媒体を挙げて説明する。なお、本発明に係る生体分子分離媒体は、研究用途に限らず、生体分子の分離を実施する種々の用途（例えば、医薬、農薬、食品および化粧品の研究開発など）において好適である。
【００１７】
本発明に係る生体分子分離媒体における各構成の詳細について以下に説明する。
【００１８】
（分散質）
分散質は、網目構造を取ることによってゲルを形成し得るコロイド分子である。分散質は、無機物、有機物、またはこれらの混合物であり得る。
【００１９】
無機物の例としては、シリカ、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタン、酸化クロム、酸化スズ、カーボン、クレイおよびこれらの組合せが挙げられる。有機物の例としては、アクリルアミド、ホルムアルデヒド、メラミン、レゾルシノール、イソシアルヌル酸、尿素、ウレタン、フェノール、フルフラールおよびこれらの組合せが挙げられる。有機物および無機物の混合物における有機物および無機物のそれぞれは、以上に挙げた具体例から選択され得る。
【００２０】
（ゲル）
本発明に係る生体分子分離媒体に含まれているゲルは、共有結合または非共有結合を介して上述の分散質同士が３次元構造の網目構造を形成している物質である。上記ゲルは、無機ゲル、有機ゲルまたは有機−無機ハイブリッドゲルであり得る。
【００２１】
無機ゲルとしては、シリカゲル、アルミナゲル、ジルコニアゲルおよびチタニアゲルが挙げられる。有機ゲルとしては、アクリルアミドゲル、レゾルシノール／ホルムアルデヒドゲル、メラミン／ホルムアルデヒドゲル、イソシアヌレートゲル、ポリウレアゲル、ウレタンゲルおよびフェノール／フルフラールゲルが挙げられる。有機−無機ハイブリッドゲルとしては、アルキル置換されているケイ素アルコキシドの重合体、およびクレイと末端修飾された有機高分子との複合化ゲルが挙げられる。
【００２２】
生体分子の分離時におけるゲルの一形態は湿潤ゲルである。湿潤ゲルは、有機ゲルの一般的な例である。有機物の湿潤ゲルは、原料である単量体（例えばアクリルアミド）を水において架橋剤（例えば、ビスアクリルアミド（ＢｉｓＡＡ）、ピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）、またはジアリルテトラジアミド（ＤＡＴＤ））などと混合して、重合および架橋することによって生成される。上述のように、有機物の湿潤ゲルは、複数の単量体を使用して、共重合体として形成され得る。本発明に係る生体分子分離媒体のゲルは、分散媒が水であるヒドロゲルの場合に、アクリルアミドゲルであることが最も好ましい。
【００２３】
また、有機−無機ハイブリッドゲルは、有機ゲルと同じく湿潤ゲルであり得る。このようなゲルは、使用する無機物に対して高い親和性を示す基によって修飾されている有機化合物を、水においてクレイなどの無機物と混合することによって生成され得る。これらの詳細は、Wang Q et al. Nature. 2010 Jan 21;463(7279):339-43.に記載されている。
【００２４】
生体分子の分離時におけるゲルの一形態はエアロゲルである。エアロゲルは、例えば、湿潤ゲルを超臨界乾燥することによって製造され得る。シリカエアロゲルは、ケイ素アルコキシド先駆体（例えばオルトケイ酸テトラエチル）を原料としている。当該原料を溶媒（例えばエタノール）に溶解させ、加水分解および縮重合させて、湿潤ゲルを生成させる。浸潤ゲルの分散媒を、例えばアセトンに置き換えた後に、超臨界流体化させた二酸化炭素とさらに置き換える。二酸化炭素は、温度および圧力を超臨界点未満に下げることによって気化する。これによって、ゲルにおける網目構造を損なうことなく、シリカエアロゲルが得られる。
【００２５】
また、カーボンエアロゲルは、有機物の湿潤ゲルであるレゾルシノール／ホルムアルデヒドゲルをエアロゲルにした後に、不活性ガス下における炭化処理および賦活化処理によって、生成される。カーボンエアロゲルは、もとになるゲルの炭素構造を維持している。
【００２６】
他の無機物に基づくエアロゲルは、S. S. Kistler, Nature 1931, 127, 741.およびR. W. Pekala, Journal of Materials Science 1989, 24 (9), 3221.に記載されている。また、種々のエアロゲルの製造方法は、特表２００２−５２１３０２などに説明されている。
【００２７】
ゲルは、ゲルに取り込まれて、生体分子に対して化学的または物理的な作用を及ぼすか、またはゲルを安定化させる添加剤を含み得る。上記添加剤はゲルの合成前にゲルの材料として混合される。上記添加剤は、例えば、酸解離定数が異なるアクリルアミド誘導体である。酸解離定数が異なるアクリルアミド誘導体を添加剤として含んでいる好適なゲルは、等電点電気泳動（ＩＥＦ：isoelctric focusing）に使用される固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ；Immobilized pH gradient）ゲルである。
【００２８】
本発明に係るゲルはＩＰＧゲルであることが好ましい。上述のように、ＩＰＧゲルはＩＥＦ用のゲルである。ＩＥＦは、分子が有している電荷に応じて分子を分離する。分子量に基づく分子の分離ではないため、ゲル内部を分子（特に巨大な分子）が速やかに移動することによって、分離に要する時間が短縮される。同じ理由によって、巨大な分子であってもその移動は細孔によって妨げられない。十分に大きい細孔を有している本発明に係る生体分子分離媒体を用いれば、ＩＥＦにおいて、サンプルに含まれている分離対象のすべての分子を、速やかに導入し、高い分解能において分離し得る。
【００２９】
（分散媒）
分散媒は、ゲルの細孔内に存在している種々の流体である。ゲルが湿潤ゲルである場合、分散媒は液体である。液体の分散媒は、水性溶液（例えば、水、種々の水溶液、または水と有機溶媒の混和物）、または水と混和しない有機溶媒（例えば、アセトンなど）である。ゲルがエアロゲルである場合、分散媒は、ゲルの網目構造を損なわない気体である。
【００３０】
（生体分子分離媒体の用途）
本発明に係る生体分子分離媒体は、例えば、電気泳動の分離ゲルとして使用され得る。より詳細には、本発明に係る生体分子分離媒体は、等電点電気泳動（ＩＥＦ：isoelctric focusing）の分離ゲルとして使用される。このとき、ＩＥＦは、二次元電気泳動の一段階目であることが好ましい。
【００３１】
二次元電気泳動は、２段階の電気泳動によってタンパク質を二次元的に分離する手法である。例えば、１段階目はＩＥＦである。ＩＥＦは、タンパク質に固有の等電点に応じてタンパク質を分離する。２段階目は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質が有している分子量にしたがってタンパク質を分離する。二次元電気泳動を利用すれば、生体由来のサンプルにおける多数のタンパク質を精度よく分離し得る。
【００３２】
ここでは、生体分子分離媒体の好適な用途として電気泳動の分離ゲルを挙げた。しかし、本発明に係る生体分子分離媒体は、他の公知の分析手法においても使用可能である。
【００３３】
〔２．生体分子分離媒体の製造方法〕
本発明は、上述の生体分子分離媒体を製造する方法をさらに提供する。当該方法は、未乾燥の生体分子分離媒体を凍結乾燥または超臨界乾燥によって乾燥させる工程を包含している。
【００３４】
当該方法にしたがえば、生体分子分離媒体と同様の利点が得られる。特に当該方法は、従来技術における使用前の膨潤に長時間を要すること、および分子量の高い分子がゲルに導入されにくいという問題を解決する。このような問題は、有機物の湿潤ゲルを自然乾燥させた場合に、以下の現象にしたがって生じている。
【００３５】
ゲルを自然乾燥させたときに生じる、分散媒の蒸発にともなってゲルの細孔に形成された気−液界面（メニスカス）によって毛細管力が生じる。さらに、ゲルの空隙には、分散媒の表面張力が働いている。特に、水は、他の汎用溶媒に比べて、大きい表面張力および高い沸点を有している。したがって、乾燥の終了までに水以外の分散媒が昇華して、ゲルの細孔には水のみが残る。ゲルの細孔にできた空隙に対して残った水の大きな表面張力が作用して、細孔を収縮させる。
【００３６】
以上のように、自然乾燥させるとゲルの細孔は収縮する。ゲルの細孔は分離する対象（例えばタンパク質）の通路である。収縮した細孔は、高分子量の（例えば、１００ｋＤａを超える）対象を受け入れ得ない。
【００３７】
また、ゲルが乾燥すると、ゲル骨格の主成分である長鎖アルキル基は、疎水性相互作用にしたがって分子間結合する。この分子間結合を切断し、乾燥前と同等の細孔の大きさに復元させるには、非常に長い時間をかけて水に浸して膨潤させる必要がある。
【００３８】
しかし、本発明に係る方法にしたがえば、分散媒を凍結させた後に乾燥させるか、または超臨界流体に分散媒を置き換えた後に超臨界流体を気化させる。よって、分散質によって形成されている網目構造を維持したまま、ゲルから分散媒を除去し得る。
【００３９】
（乾燥させる工程）
乾燥させる工程において使用される手法は、上述のように膨潤ゲル内の細孔を維持したままゲルを乾燥させる手法である。したがって、乾燥後のゲルは、ゲル骨格の大きさを最大に維持している。上記手法は、凍結乾燥または超臨界乾燥であることが好ましい。
【００４０】
凍結乾燥は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の手順において実施される。（ａ）約０℃〜−８０℃／時間の冷却速度における０．５〜４８時間にわたる冷却（ｂ）０．５〜４８時間にわたる温度（約０℃〜−８０℃）の維持、および（ｃ）０．００８〜１Ｔｏｒｒにおける０．５〜４８時間にわたる凍結乾燥。
【００４１】
超臨界乾燥は、ゲルにおける分散媒を超臨界流体に交換する手法である。超臨界流体は、例えば、３０４．１Ｋおよび７．３８ＭＰａを超える条件における二酸化炭素である。超臨界流体は、超臨界点未満において、液体の気化のような相変化をもたらさずに気化する。よって、超臨界流体の気化はゲル骨格に不要な力を与えない。種々の超臨界流体が知られており、それらの化学種における超臨界点も公知である。
【００４２】
ゲルは、乾燥後に必要に応じて所望の大きさに切断され得る。また、ゲルは、使用するまで低温において保存される。保存時の温度は、加熱による劣化または破損を防ぐという観点から、冷凍保存が好ましく、−２０℃以下がさらに好ましい。また、ゲルは、使用前に室温に戻されて、好適な溶液（例えば生体分子を含んでいるサンプル溶液）に浸して膨潤される。
【００４３】
図１および図２に基づいて、本発明に係る方法および当該方法によって得られる生体分子分離媒体の構造について以下に説明する。ここでは、有機ゲルであるポリアクリルアミドゲルを、凍結乾燥または自然乾燥させた場合を例にして説明する。
【００４４】
図１は、本発明に係る生体分子分離媒体の部分的な構造を示す図であり、（ａ）は膨潤ゲルの一部を示しており、（ｂ）は凍結乾燥後のゲルの一部を示しており、（ｃ）はタンパク質を含んでいるサンプルを用いてふたたび膨潤させたゲルの一部を示している。図２は、従来の生体分子分離媒体部分的な構造を示す図であり、（ａ）は膨潤ゲルの一部を示しており、（ｂ）は自然乾燥後のゲルの一部を示しており、（ｃ）はタンパク質を含んでいるサンプルを用いてふたたび膨潤させたゲルの一部を示している。
【００４５】
図１（ａ）に示すように、新たに作製した湿潤ゲルは、そのゲル骨格１内に豊富な水分子２を含んでいる。この湿潤ゲルを上述した条件のもとに凍結乾燥させる。図１（ｂ）に示すように、図１（ａ）に示した湿潤ゲルを凍結乾燥させたため、ゲル骨格１は湿潤ゲルと同等の大きさを維持している。自然乾燥のように、水を、液体から気化させるのではなく、固体から昇華させる。このような凍結乾燥では、ゲル骨格１内部の細孔における毛細管力、および液面における表面張力は生じない。すなわち、ゲル骨格１を縮小させる力が生じない。図１（ｃ）に示すように、タンパク質３を含んでいるサンプル溶液を用いて、乾燥させたゲルを膨潤させると、タンパク質３とともに速やかに液体は吸収される。乾燥前後において、ゲル骨格１の大きさが維持されているからである。
【００４６】
これに対して、図２を参照して、自然乾燥させた場合のゲルについて説明する。図２（ａ）に示すように、乾燥前の湿潤ゲルの状態は、図１（ａ）と同じである。図２（ｂ）に示すように、湿潤ゲルを自然乾燥させると、水の蒸発にともなって、上述のような毛細管力および表面張力が生じて、収縮したゲル骨格１’をもたらす。このとき、ゲル骨格１’を形成しているポリアクリルアミド分子同士が、膨潤状態よりはるかに接近している。これによって、ポリアクリルアミド分子間に疎水性相互作用が生じる。単に収縮したゲル骨格１’を生じるだけでなく、その構造が非共有結合によって安定化される。図２（ｃ）に示すように、いったん収縮し、安定化された構造は膨潤によって容易に復元せず、ゲル骨格１’’は、膨潤時のゲル骨格１より小さい容積を有している。したがって、導入され得るタンパク質３の量およびそのサイズに制限を受ける。また、液体の吸収に長時間を要する。
【００４７】
以上のように、本発明に係る生体分子分離媒体は、高分子量の（１００ｋＤａ以上の）タンパク質を容易に導入可能であり、速やかに（例えば５分において）膨潤され得る。よって、生体由来のサンプルは、本発明に係る生体分子分離媒体を用いることによって、短時間において網羅的に分離され得る。
【００４８】
〔まとめ〕
上記の課題を解決するために、本発明の生体分子分離媒体は、乾燥している生体分子分離媒体であって、分散質によって形成されているゲル骨格１を有しているゲルを含んでおり、乾燥前に分散媒によって満たされていた部分が空隙に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されていることを特徴とする。
【００４９】
本発明に係る生体分子分離媒体は、ゲルによって主に構成されている。ゲルは、必要に応じて分散媒を介した、分散質（コロイド分子）の集合体である。分散質が集合することによって、ゲルの内部に複雑なゲル骨格１（細孔）が形成される。ゲルに導入された生体分子は、この細孔を通ってゲル内部を移動する。ゲルに対する電圧の印加などによって、生体分子は、固有の性質（電荷または分子量など）に基づく移動度に応じてゲル内部を移動するので、生体分子分離媒体によって分離され得る。
【００５０】
ここで、本発明に係る生体分子分離媒体は、乾燥前に分散媒によって満たされていた部分が空隙に置き換わることによって、当該部分の体積が維持されている。つまり、本発明に係る生体分子分離媒体は、乾燥による細孔の収縮を生じていない。よって、液体の分散媒に浸すと、細孔は分散媒によって速やかに満たされる。また、細孔が十分に広いため、実質的にすべての生体分子が細孔内を通過可能である。すなわち、巨大な生体分子が容易にゲルに導入され得る。
【００５１】
以上のように、本発明によれば、種々の生体高分子を制限なく、迅速に導入可能である。
【００５２】
また、本発明の生体分子分離媒体において、上記分散質は、有機物、無機物またはこれらの混合物であり得る。
【００５３】
また、本発明の生体分子分離媒体において、上記ゲルは、固定化ｐＨ勾配ゲルであることが好ましい。
【００５４】
固定化ｐＨ勾配ゲルは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）用のゲルである。ＩＥＦは、分子が有している電荷に応じて分子を分離する。分子量に基づく分子の分離ではないため、ゲル内部を分子（特に巨大な分子）が速やかに移動することによって、分離に要する時間が短縮される。同じ理由によって、巨大な分子であってもその移動は、細孔によって妨げられない。十分に大きい細孔を有している本発明に係る生体分子分離媒体を用いれば、ＩＥＦにおいて、サンプルに含まれている分離対象のすべての分子を、速やかに導入し、高い分解能において分離し得る。
【００５５】
また、本発明は、上記の生体分子分離媒体を製造する方法であって、未乾燥の生体分子分離媒体を凍結乾燥によって乾燥させる工程を包含していることを特徴とする。
【００５６】
当該方法にしたがえば、分散媒を凍結させた後に乾燥させる。よって、分散質によって形成されているゲル骨格１を維持したまま、ゲルから分散媒を除去し得る。
【００５７】
また、本発明は、上記の生体分子分離媒体を製造する方法であって、未乾燥の生体分子分離媒体を超臨界乾燥によって乾燥させる工程を包含していることを特徴とする。
【００５８】
当該方法にしたがえば、分散媒を超臨界流体に置き換えた後に、超臨界流体を気化させる。よって、分散質によって形成されているゲル骨格１を維持したまま、ゲルから分散媒を除去し得る。
【００５９】
よって、本発明に係る方法によれば、上述の生体分子分離媒体を容易に製造可能である。
【実施例】
【００６０】
〔実施例：本発明に係るＩＰＧゲル〕
本発明を以下の実施例によってより詳細に説明する。本発明の範囲は、以下の実施例に限定されない。
【００６１】
（ＩＰＧゲルの作製）
ゲルにｐＨ勾配を付与するための酸性溶液および塩基性溶液を、アクリルアミドモノマー、架橋剤モノマー（ビスアクリルアミド（ＢｉｓＡＡ））、アクリルアミド誘導体を含んでいるバッファー、蒸留水、尿素、およびグリセロール（酸性溶液または塩基性溶液の一方のみ）を混合して、調製した。
【００６２】
上記バッファーは、異なる酸解離定数を示すアクリルアミド誘導体を含んだ市販のアクリルアミドバッファー（Acrylamide Buffer、Sigma-Aldrich社）を適宜組み合わせた溶液である。これらの上記アクリルアミドバッファーは、異なる酸解離定数（１、３．１、３．６、４．４、４．６、６．２、７．０、７．４、８．５、９．３、１０．３、１２以上）を示す１２種類のアクリルアミド誘導体のいずれか１つを含んでいる溶液である。上記バッファーは、最終的に得られるゲルのｐＨの値（例えば、４〜７および３〜１０）に合わせて、これらのアクリルアミドバッファーの任意の組合せおよび混合比を有している。上記バッファーにおけるこれらのアクリルアミドバッファーの組合せおよび混合比は、P.G.Righetti, Immobilized pH gradients:theory and methodology（1990）を参照して、決定された。
【００６３】
アクリルアミドモノマーおよび架橋剤モノマーの混合比を、５％Ｔ以下にし、１０％Ｃ以下にした。「％Ｔ」は、酸性溶液および塩基性溶液にそれぞれ含まれているモノマーの重量濃度を表す単位であり、「％Ｃ」は、アクリルアミドポリマーが架橋される度合を表す単位である。それぞれの値は、以下の式：
総モノマー濃度（％Ｔ）＝（アクリルアミドの総重量＋架橋剤の総重量）／総液量×１００；
架橋度（％Ｃ）＝架橋剤の総重量／（アクリルアミドの総重量＋架橋剤の総重量）×１００
によって算出される。
【００６４】
なお、上述の混合物のうち、架橋剤モノマーとして、ピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）またはジアリルテトラジアミド（ＤＡＴＤ）を用いた場合もビスアクリルアミド（ＢｉｓＡＡ）を用いた場合と同様に、ゲルを作製することができた。
【００６５】
酢酸および水酸化ナトリウムを用いて、塩基性溶液のｐＨを７．０に調整した。次に、重合開始剤としての過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、および重合促進剤としてのテトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、各溶液に添加した。グラジエントミキサーおよびペリスタポンプを用いて、２つの溶液の混合比を変えながらガラス製のゲル作製器具に注ぐことによって、ｐＨ勾配を形成した。当該ゲル作製器具には、ゲルを保持するシートがあらかじめ取り付けられている。この操作を、上記ゲル作製器具を４〜１０℃に冷却しながら行って、上記操作中の混合溶液のゲル化を防止した。混合溶液をすべて注いだ後に、約１５分にわたって室温において放置し、それから１〜２時間にわたって５０℃の恒温槽に入れて、ゲル化を促進させた。
【００６６】
ゲル化の完了後に、ゲル作製器具から作製したゲルを取り出し、純水または０．０１〜０．５Ｍの酢酸ナトリウム水溶液を用いて、３〜６回（各５分間）のゲルの洗浄を行った。洗浄後、ゲルを１〜５％のグリセロール溶液に１０分にわたって浸漬した。浸漬後、グリセロール溶液からゲルを取り出し、以下の（ａ）〜（ｃ）順に処理してゲルを凍結乾燥させた。（ａ）約０℃〜−８０℃／時間の冷却速度における０．５〜４８時間にわたる冷却（ｂ）０．５〜４８時間にわたる温度（約０℃〜−８０℃）の維持、および（ｃ）０．００８〜１Ｔｏｒｒにおける０．５〜４８時間にわたる凍結乾燥。凍結乾燥させたＩＰＧゲルを、数ｍｍサイズに切断してストリップ状にし、−２０℃において保存した。
【００６７】
（ＩＰＧゲルの膨潤および高分子タンパク質の導入）
高分子量のタンパク質を含んでいるタンパク質溶液を、サンプル溶液として使用した。乾燥させたＩＰＧゲルをサンプル溶液に浸漬し、膨潤させた。ＩＰＧゲルは、乾燥前と同程度の容積に膨潤していた。膨潤させたＩＰＧゲル、および分子量にしたがってサンプルを分離する従来のポリアクリルアミドゲルを用いて２次元電気泳動を行った。その結果として、高分子量のタンパク質は、上述の短時間における膨潤において本発明に係るＩＰＧゲルに導入されていることが確認できた。
【００６８】
以上のことから、本発明に係るＩＰＧゲルは、短時間に膨潤し、かつ分子量の多き分子を内部に効率よく導入し得ることを確認した。これは、乾燥後にゲルが収縮せずに、空隙を介して分散質同士が十分に隔てられているためであった。
【００６９】
〔比較例：従来技術に基づくＩＰＧゲル〕
ゲルを凍結乾燥させる代わりに、１〜２日にわたって室温に放置して、乾燥させることを除いて、実施例の見出し「ＩＰＧゲルの作製」の記載と同様に、乾燥ゲルを作製した。
【００７０】
乾燥したＩＰＧゲルを、上述のタンパク質溶液を用いて膨潤させた。ゲルの膨潤には３０分を要した。実施例と同様に、ゲルに導入されたタンパク質を確認したが、高分子量のタンパク質はゲルに導入されていなかった。
【００７１】
本発明は、上述した各実施形態および実施例に限定されない。本発明は、特許請求の範囲に示す範囲において種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態は、本発明の技術的範囲に包含される。
【００７２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、生体分子の分離を実施する分野において広く利用可能である。本発明は、生物学的な研究において特に有用である。
【符号の説明】
【００７４】
１      ゲル骨格（網目構造）
１’    ゲル骨格
１’’  ゲル骨格
２    水分子（分散媒）
３    タンパク質（生体分子）
【図１】
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【図２】
2014092449.tif 000004