(57)【要約】【課題】試料処理システムおよび方法の提供。【解決手段】本発明は、ａ）少なくとも１つの試料チャンバを有する回転容器に連結される、入力ポートおよび出力ポートを備える、試料処理ユニットであって、試料に第１の処理ステップを提供するように、または、チャンバの中で堆積された試料に遠心力を作用させ、堆積試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するために、容器を回転させるように構成される、試料処理ユニットと、ｂ）試料処理ユニットの出力ポートに連結される、試料分離ユニットであって、細胞分離ユニットは、分離カラムホルダと、ポンプと、流体回路およびホルダ内に配置された分離カラムを通る流量を少なくとも部分的に制御するように構成される、複数の弁と、を備え、分離カラムは、カラムを通して流された試料の標識および非標識成分を分離するように構成される、試料分離ユニットとを備える、システムに関する。【選択図】図３
2014100588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
種々のヒトの疾患は、現在、標準医薬品では満足いく態様で治療することができず、種々の疾患の治療の代替または追加選択肢として、１次ヒト細胞の使用を提案している。これらの細胞療法アプローチは、通常、不要な機能から必要な機能を分離するために、細胞生成物の重要な取扱いおよび処理、例えば、不要かつ生命にかかわるおそれのある対宿主性移植片反応における細胞の枯渇、必要な移植片対白血病／腫瘍効果に関与する細胞の濃縮を必要とする。
【０００２】
当技術分野で公知の方法は、良好な製造手順、適合する清潔な部屋、ならびに部屋、デバイス、生産、品質管理、および品質保証手順を維持する人員を含む、規制および安全要件を満たすために、病院内の巨大な基礎構造を必要とした。細胞生成物は通常、異なるデバイスおよび使い捨て品の組み合わせを、これらのシステム間の試料の手動移転とともに利用して、処理される。
【０００３】
本発明は、単一デバイスおよび使い捨て品に種々の細胞処理ステップを統合し、完全自動過程で制御されて、手動細胞移転、工程管理、細胞生成物への関連リスク、およびリスク削減対策の要件を排除し、したがって、直接使用の準備ができている細胞療法生成物の製造のためのデバイスおよび方法を提供する。
【０００４】
本発明は、概して、生物材料の処理に関する。より具体的には、本発明は、生体試料の成分を培養および／または分離するように、かつ、磁気分離の適用を含む、分離技法によって試料の成分をさらに分離するように、生物材料の処理のためのシステム、デバイス、および方法を提供する。
【０００５】
分離技法を利用する、試料または生物材料の成分を分離するための種々の技法が公知である。そのような技法は、パニング、磁気分離、遠心分離、濾過、免疫親和性分離、重力分離、密度勾配分離、および水簸を含むが、それらに限定されない。
【０００６】
免疫親和性方法は、試料のある成分の選択的標識化（例えば、抗体標識化）と、標識および非標識成分の分離とを含んでもよい。磁気分離方法は、典型的には、試料を分離カラムに通過させるステップを含む。
【０００７】
磁気分離は、磁界に配置されたチャンバまたはカラムの中に磁性材料を選択的に保持するための手順である。生物材料を含む標的物質は、粒子に接合される、特異結合パートナーによる磁性粒子への付着によって、磁気標識されてもよい。次いで、標識標的物質の懸濁が、チャンバに塗布される。標的物質は、磁界の存在下でチャンバの中に保持される。次いで、保持した標的物質は、磁界の強度を変更することによって、または磁界を排除することによって、溶出させることができる。
【０００８】
磁界がチャンバに印加されると、基質の表面の近くで高い磁界勾配が局所的に誘発されるように、好適な磁化率の材料の基質がチャンバの中に入れられてもよい。これは、弱磁化粒子の保持を可能にし、このアプローチは、高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）と呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物学的分離でのＨＧＭＳの使用は、条件が十分な純度で多収量を提供することを要求する。したがって、比較的構築および使用しやすいが、使用中に、最大限かつ均一な磁界勾配および流量特性を提供する、高勾配磁気分離器、デバイス、および方法を提供することが望ましい。標的物質が磁気標識される、適切な特異結合要素の選択により、種々の細胞選別または分析手順を行うために、そのような磁気分離器、デバイス、および方法を使用することができれば、最も有利であろう。
【００１０】
多くの場合において、分離方法は、試料の非汚染を確保するか、または無菌性を維持する条件下で行われなければならない。例えば、多くの現在の臨床細胞分離システムは、試料の無菌性を維持するために、質の高い清潔な部屋で操作される必要がある。しばしば、非汚染の確保は、煩雑で高価であり、別個の施設および人員、ならびに再現性および無菌性を維持するために大きな努力を必要とする、複雑な手順を必要とする。加えて、処理した試料の後続導入、ならびにシステムへの流体および試薬の付着とともに、分離システムとは別に、多数の処理および取扱ステップ（例えば、洗浄、体積低減等）を行わなければならず、無菌性の準拠をさらに複雑にする。そのようなものとして、試料の非汚染および／または試料処理の複雑性および経費の削減を確保するために、改良型方法およびシステムが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、試料処理ユニットおよび試料分離ユニットを含む、試料処理および分離システムを提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、生物材料の分離のための高勾配磁気分離デバイス、装置、および方法の改良を提供する。本デバイス、装置、および方法は、特定の細胞、タンパク質、多糖類、および他の生物材料、または磁性であるか、あるいは磁気標識結合要素との特異結合相互作用が可能である、他の材料の単離において、より優れた特異性および効率性を可能にする。
【００１３】
分離チャンバを画定する非磁性筐体と、例えば、チャンバ内の金属球の流体透過性基質とを有する、磁気分離カラムが提供される。球は、分離中の均質流動のために、実質的に均一なチャネルを作成する、密接に積み重ねられた格子を形成する。磁気分離器デバイスは、前置フィルタデバイスと併せて、分離カラムを使用してもよい。デバイスは、磁石を移動させるためのオプションの格納式アーム、標的材料を洗浄および分離するためのポンプ手段、および分離流量を制御するためのマイクロプロセッサとともに、分離中に使用するための永久磁石または電磁石を有する器具で使用されてもよい。
【００１４】
一実施形態では、システムは、ａ）少なくとも１つの試料チャンバを有する回転容器（または遠心分離チャンバ）に連結される、入力ポートおよび出力ポートを備える、試料処理ユニットであって、試料処理ユニットは、試料に第１の処理ステップを提供するように、または、チャンバの中で堆積された試料に遠心力を印加し、堆積試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するよう、容器を回転させるように構成される、試料処理ユニットと、ｂ）試料処理ユニットの出力ポートに連結される、試料分離ユニットであって、分離カラムホルダと、ポンプと、流体回路およびホルダの中に配置された分離カラムを通る流量を少なくとも部分的に制御するように構成される、複数の弁とを備える、試料分離ユニットであって、分離カラムは、カラムを通して流された試料の標識および非標識成分を分離するように構成される、試料分離ユニットとを備える。
【００１５】
回転容器は、回転容器中の堆積試料の少なくとも第１の成分および第２の成分の分離の進展を検出するための手段を備えることが好ましい。  
【００１６】
分離の進展を検出するための手段は、光源からの光が、分離されている試料の少なくとも一部を、少なくとも部分的に貫通することができ、試料の少なくとも一部を通過する光を、光検出器によって検出することができるように、位置することができる。
【００１７】
好ましくは、分離の進展を検出するための手段は、回転容器の回転軸に対して本質的に垂直に、回転容器において位置する。
【００１８】
分離の進展を検出するための手段は、回転容器の回転軸に隣接する領域から回転容器の周囲に隣接する領域まで、本質的に到達して、回転容器に配置されることがさらに好ましい。
【００１９】
回転容器の中の分離の進展を検出するための手段は、窓、プリズム、または鏡となり得る。窓、プリズム、または鏡は、回転容器の蓋または底部に形成されるチャネルを覆うように配置することができ、チャネルは、チャネルは、遠心分離中に試料の少なくとも一部がチャネルに流入することができるように構成される。窓はまた、チャネルなしで使用することもでき、すなわち、試料の分離は、回転チャンバの蓋または底部の窓を通して検出される。
【００２０】
好ましくは、回転容器は、細胞を培養するために使用可能であるように構成される。その場合、回転容器は、好ましくは、その上で細胞を増殖させるための少なくとも１つの層を備える。少なくとも１つの層は、回転軸に対して垂直に配置することができる。回転容器の中に、その上で細胞を増殖させるための複数の層を配設することが好ましい。
【００２１】
回転容器は、使い捨て形態で製造することができる。汚染のない細胞処理を可能にするように、回転容器を滅菌することも好ましい。
【００２２】
具体的には、回転容器は、プラスチック、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリルレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、シリコーンから成る群より選択される、材料を備えるか、または材料で作ることができる。チャンバはまた、ポリエチレン（ＰＥ）、コラーゲン、キチン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸誘導体、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、およびそれらの共重合体、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、セラミック、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸カルシウムのようなガラス材料、および上記の材料のうちの１つ以上を備える組成物で作ることもできる。
【００２３】
入力および出力ポートは、典型的には、少なくとも１つの滅菌フィルタを備える。
【００２４】
さらに、本発明は、
ａ）上記および本明細書で説明されるようなシステムを提供するステップと、ｂ）試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するように、第１の処理ステップを行うステップと、およびｃ）試料の処理した成分に試料分離ステップを行うステップであって、分離は、処理した試料成分から標識および非標識成分を分離するステップを含む、ステップと、を含む、または包含する、方法に関する。処理ステップはまた、分離ステップ後に行うこともできる。
【００２５】
上記および本明細書で説明されるようなシステムの中の回転チャンバの存在により、方法は、具体的には、試料の層の形成、ｐＨ値の変化、および／または温度の変化を検出することによって、分離の進展を検出するステップを含むことが好ましい。
【００２６】
方法は、好ましくは、試料が生体試料、具体的には、血液または骨髄である時に、行うことができる。
【００２７】
さらに、本発明は、具体的にはコンピュータ上で実行されると、上記および本明細書で記載されるような方法を行うために、上記および本明細書で記載されるようなシステムを制御するための、コンピュータプログラムに関する。コンピュータプログラムは、フロッピー（登録商標）ディスク等の記憶手段に保存することができる。
【００２８】
本発明はさらに、筐体と、使い捨て磁気分離チャンバ用の少なくとも１つの磁石ユニットと、使い捨て遠心分離機／培養チャンバ用の少なくとも１つの駆動部と、使い捨て管類セットの異なる配設を器具上に載置することができるように配設される、種々のピンチ弁とを備える、統合細胞処理器具に関する。さらに、器具は、異なる細胞処理操作を記憶し、行うための統合モニタおよび／またはコンピュータとともに、ユーザインターフェースを備えてもよい。この目的で、コンピュータを使用して、少なくとも１つのポンプ駆動部を操作することができる。チャンバの中の異なる位置の光学密度を測定するための遠心分離機用の光学検出システムが、存在することができる。遠心分離機チャンバは、使い捨てで、温度制御された領域に位置することができる。チャンバへと移動する流体の温度を調整するための手段が、存在することができる（加熱器、冷却器）。細胞培養カメラが回転容器に配置されてもよく、優先的に底部に位置し、おそらくはカメラの焦点を調整するための手段を伴う。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のシステムとともに使用するための、滅菌細胞処理用の使い捨て滅菌管類セットに関する。典型的には、開始細胞用の試料バッグまたはポートが提供される。管類および／またはシステムは、患者から試料バッグへの直接移転を可能にするように構成することができる。さらに、衝細胞培養培地用の異なる入力ポート、磁気標識試薬用の少なくとも１つの入力ポート、典型的には滅菌フィルタを伴う入力ポート、廃棄物用の出力ポート、および／または細胞用の出力ポートが、管類および／またはシステムの一部となり得る。出力ポートは、細胞凍結バッグと直接接続することができる。さらに、出力ポートは、輸血および／または注射用の容器と直接接続することができる。したがって、本発明は以下をも提供する。
（１）  ａ）試料処理ユニットであって、
該試料処理ユニットは、少なくとも１つの試料チャンバを有する回転容器に連結される、入力ポートおよび出力ポートを備え、
該試料処理ユニットは、
試料に第１の処理ステップを提供することと、
該チャンバ内に堆積された試料に遠心力を適用し、該堆積試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するように、該容器を回転させることと
を実行するように構成される、試料処理ユニットと、
ｂ）該試料処理ユニットの該出力ポートに連結される、試料分離ユニットであって、
該試料分離ユニットは、
分離カラムホルダと、
ポンプと、
流体回路および該ホルダ内に配置された分離カラムを通る流量を少なくとも部分的に制御するように構成される、複数の弁と
を備え、
該分離カラムは、該カラムを通して流された試料の標識および非標識成分を分離するように構成される、試料分離ユニットと
を備える、システム。
（２）  前記回転容器は、該回転容器内の前記堆積試料の前記少なくとも第１の成分および前記第２の成分の分離の進展を検出する手段を備える、項目１に記載のシステム。
（３）  前記分離の進展を検出する前記手段は、
光源からの光が、分離されている前記試料の少なくとも一部を、少なくとも部分的に貫通することと、
該試料の少なくとも一部を通過する光を、光検出器によって検出することと
が可能であるように位置する、項目１または２に記載のシステム。
（４）  前記分離の進展を検出する前記手段は、前記回転容器の回転軸に対して本質的に垂直に、該回転容器に位置する、項目１〜３のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（５）  前記分離の進展を検出する前記手段は、前記回転容器に配置され、該手段は、該回転容器の前記回転軸に隣接する領域から該回転容器の周囲に隣接する領域まで本質的に及ぶ、項目１〜４のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（６）  前記回転容器の中の前記分離の進展を検出する前記手段は、窓、プリズム、または鏡である、項目１〜５のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（７）  前記プリズムまたは鏡は、前記回転容器の蓋に形成されるチャネルを覆うように配置され、該チャネルは、遠心分離中に前記試料の少なくとも一部がそれに流入することができるように構成される、項目１〜６のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（８）  前記回転容器は、細胞を培養するために使用可能であるように構成される、項目１〜７のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（９）  前記回転容器は、その上で細胞を増殖させるための少なくとも１つの層を備える、項目１〜８のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（１０）
前記回転容器は、使い捨てであるか、および／または、滅菌することができる、項目１〜９のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（１１）  前記回転容器は、
プラスチック、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリルレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、シリコーン、ポリエチレン（ＰＥ）、コラーゲン、キチン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸誘導体、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、およびそれらの共重合体、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、セラミック、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸カルシウムのようなガラス材料、および上記の材料のうちの１つ以上を備える組成物から成る群より選択される、材料を備えるか、または材料で作ることができる、項目１〜１０のうちのいずれか一項に記載のシステム。
（１２）  項目１〜１１に記載のシステムを提供することと、
試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するように、処理ステップを実行することと、
該試料の処理された成分に試料分離ステップを実行することであって、該分離は、該処理された試料成分から標識および非標識成分を分離することを含む、ことと
を含む、方法。
（１３）  具体的には前記試料の層の形成、ｐＨ値の変化、および／または温度の変化を検出することによって、前記分離の進展を検出することをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（１４）  前記試料は、生体試料であり、具体的には、血液、骨髄、細胞、細胞成分、白血球分離生成物、腫瘍またはその断片、組織、微生物、細菌、真菌、またはウイルスである、項目１２または１３に記載の方法。
（１５）  具体的にはコンピュータ上で実行されると、具体的には項目１２〜１４のうちのいずれか一項に記載の方法を行うために、項目１〜１１のうちのいずれか一項に記載のシステムを制御するコンピュータプログラム。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の例示的分離または前濾過カラムの概略図である。
【図２】図２は、一連の流体経路または流体回路によって相互接続される、試料および収集容器とともに、分離および前濾過カラムを描写する。図はまた、弁の配置、および分離システムの好ましい実施形態で使用される蠕動ポンプも示す。
【図３】図３は、その上に、図２に図示されるような、滅菌カラム、使い捨て管類、ならびに貯蔵および収集容器が付加される、コンピュータ制御ユニットを描写する。好ましい実施形態では、コンピュータ制御ユニットは、磁石、弁、および蠕動ポンプを含有する。
【図４】図４は、３つの接続球の間に形成された流量チャネルを描写する。
【図５】図５−７は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図６】図５−７は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図７】図５−７は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図８】図８は、本発明の実施形態による、処理システムのチャンバを図示する。
【図９】図９は、本発明の別の実施形態による、処理システムのチャンバを図示する。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明の実施形態による、処理システムのチャンバを図示する。
【図１０】図１０は、本発明の別の実施形態による、処理チャンバの断面図を示す。
【図１０Ａ】１０Ａは、本発明の実施形態による、処理チャンバの平面図を図示する。
【図１１】図１１は、本発明の別の実施形態による、処理チャンバの断面図を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、図１１に示されるような処理チャンバの一部分の集中図を図示する。
【図１２】図１２は、本発明のさらに別の実施形態による、処理チャンバの断面図を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ガス送達用の開口部と、結合疎水性膜とを伴う、処理チャンバの底部の図を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、チャンバの底部に結合された膜を通した通気用のらせん状チャネルを伴う、チャンバの底部を示す。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図１４Ａ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｃ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｄ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｅ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｆ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｇ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｈ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｉ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｊ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｋ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｌ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｍ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１４Ｎ】図１４Ａ−１４Ｎは、本発明の実施形態による、例示的試料処理方法を図示する。
【図１５】図１５は、本発明のシステムの一部となり得る、通気デバイスを図示する。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本発明のシステムの一部となり得る、ガス混合チャンバを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本発明のシステムの一部となり得る、ガス混合チャンバの底部を示す。
【図１７】図１７は、プリズムの形である、試料の分離の進展を検出するための手段を伴う、遠心分離中に試料が流れるチャネルまたは間隙を伴う回転チャンバ用の蓋の内側の図を示す。
【図１８】図１８は、プリズムによる試料を通る光の経路を示す。プリズム（二重プリズム）は、光源からの光が、遠心分離を通して分離されている試料の少なくとも一部を、少なくとも部分的に貫通することができ、試料の少なくとも一部を通過する光を、光検出器によって検出することができるように、構成される。
【図１９】図１９は、回転チャンバの蓋に位置するリブの一部である、二重プリズムを示す。
【図２０】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２０は、未処理の骨髄（Ａ、Ｃ）およびＣＤ１３３選択細胞（Ｂ、Ｄ）を示す。
【図２１】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２１は、未処理のアフェレ−シス生成物（Ａ、Ｂ）およびＣＤ１４濃縮生成物（Ｃ、Ｄ）を示す。
【図２２】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２２は、未処理のアフェレーシス収穫（左）および濃縮ＰＤＣ（右）を示す。
【図２３】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２３は、本発明を使用したＣＤ４選択であって、未処理のバフィーコート（左）、ＣＤ４濃縮標的細胞（右）を示す。
【図２４】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２４は、本発明を使用したＣＤ８枯渇の前（左）および後（右）のバフィーコート細胞を示す。
【図２５】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２５は、遠心分離機チャンバの中のＫ５６２細胞株の増殖を示す。
【図２６】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２６は、未処理の骨髄（左）、および２０ｍｌでの直接溶出後のＣＤ３４またはＣＤ１３３選択細胞（右）を示す。
【図２７】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２７は、未処理の骨髄（左）、および６ｍｌの少容量での直接溶出後のＣＤ３４またはＣＤ１３３選択細胞（右）を示す。
【図２８】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２８は、未処理の骨髄（左）、およびフィルタによる最終体積低減後のＣＤ３４またはＣＤ１３３選択細胞（右）を示す。
【図２９】図２０−２９は、本発明による方法を使用して、本発明によるシステムで行われる実験の結果を示す。図２９は、未処理の骨髄（左）、２０ｍｌでの直接溶出後（中央）、およびＡｕｔｏＭＡＣＳカラムによる最終体積低減後のＣＤ３４またはＣＤ１３３選択細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、試料分離システムおよび試料処理技法の両方を統合する、試料処理システムを提供する。システムは、磁気に基づいた分離、細胞培養、または細胞操作等の分離方法の前に、ある処理ステップを行うように構成される、試料処理ユニットを含むことができる。そのようなものとして、本発明は、複合試料処理システムおよび試料分離システムを含むことができる。試料処理システムまたはユニットは、細胞の培養、洗浄、調製、インキュベーション、標識化、および同等物等の、試料処理を提供することができる。加えて、試料処理システム／ユニットは、遠心分離に基づいた分離技法を含むことができ、その場合、試料から少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するよう、遠心力が試料に印加される。
【００３２】
したがって、本発明のシステムは、典型的には、試料処理ユニットおよび試料分離ユニットの両方を含む。システムはまた、複数の試料処理ユニットおよび／または複数の試料分離ユニットを備えるか、または含有してもよい。本発明の複合処理／分離システムは、密度に基づいた分離、免疫親和性分離、免疫磁気を含む磁気分離、細胞培養／刺激／活性化、洗浄、または最終処方ステップを含む、種々の複雑な細胞処理ステップを自動的に行うようにプログラムすることができる、閉鎖システムを含むことができる。この目的で、システムは、コンピュータ上で実行することができるコンピュータプログラムによって制御されてもよい。細胞処理ステップはまた、サイトカイン、ＤＮＡやＲＮＡのような遺伝物質、ウイルス、転写因子、抗原、または他の化学物質を含む、細胞へのある物質の送達を含むことができる。
【００３３】
本発明は、ユーザのエラーを最小化し、無菌状態を維持し、手動相互作用をほとんど、または全く用いずに複雑な細胞処理ステップを行い、感染性物質を処理する時に操作者の暴露を最小化する、システムを提供する。ベッドのそば、または手術室の中での処理が可能である。デバイスは、試料が得られる、または処理した試料またはその画分が投与される患者に接続されている間に、操作することができる。例えば、患者から得られた骨髄は、管類セットの投入バッグの中へ直接、処理されてもよい。そこから、例えば、骨髄を処理する、すなわち、少なくとも２つの成分に分離することができる。これらの成分のうちの少なくとも１つは、おそらく適した方法で成分を処理した後に、患者に投与されてもよい。
【００３４】
本発明のシステムの試料処理ユニットで行われる、密度に基づく分離過程は、無制限に、細胞洗浄、バフィーコート生成、密度媒体、例えば、ＦｉｃｏｌｌＴＭ、ＰｅｒｃｏｌｌＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する、密度に基づく分離、密度標識化（例えば、Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または他の密度標識化手段）に基づく分離、沈殿の速度、例えば、血小板の除去、水簸、細胞接着、および同等物による分離を含む。本システムの試料処理ユニットで行うことができる、付加的な処理ステップ／技法は、増殖を含む細胞培養、刺激、分化、再分化、抗原負荷、トランスフェクション、形質導入、培養、付着または懸濁中、多細胞型の多層または混合、静止状態または強制的な培養、または混合を含む。投入材料は、血液、白血球分離、骨髄、脂肪吸引、乳汁、任意の体液、組織からの細胞、例えば、種々の臓器からの細胞、腫瘍細胞、単細胞、細胞集塊、細胞集合体、機械的に、または酵素と併せて解離された組織を含むが、それらに限定されない。
【００３５】
上記のように、本発明のシステムは、典型的には、試料処理ユニット／システムおよび試料分離ユニット／システムの両方を含む。試料分離システムは、典型的には、磁気に基づく分離システムを含む。本発明のシステムに含むことができる、１つのそのような磁気に基づく試料分離システムは、例えば、ハイパーリンク「ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏ−ｔｅｃ．ｃｏｍ」においてワールドワイドウェブ上で説明されている、磁気分離システム／過程を含み、ほぼあらゆる細胞型に使用することができる。以下で部分的に説明される、例示的磁気分離システムは、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、欧州特許明細書ＥＰ０８６９８３８Ｂ１、および米国特許第５，６９１，２０８号でも説明されている。
【００３６】
磁気分離手順のための改良型磁気分離器、デバイス、および方法は、ＥＰ０８６９８３８Ｂ１で提供および説明されており、本発明のシステムに含むことができる。磁気分離器の基質は、空気または非標的物質の閉じ込めを低減し、機械的破砕による標的物質の損失を減少させる、均一な細孔またはチャネルを提供する。
【００３７】
種々のシステムおよび臓器からの標的細胞等の、生物学的物質は、好適な特異結合要素で磁気標識され、本発明のデバイスおよび方法を使用して単離される。造血幹または前駆細胞等の多能性細胞の単離が、特に興味深い。細胞分離手順の実施例を提供するために、造血細胞分離が本明細書で使用されるが、本発明は、広範な細胞型または他の生物学的物質に適用されてもよい。
【００３８】
本発明を使用して処理される細胞は、種々の目的で、例えば、それらの増殖および分化能力、ならびに、生体実体、例えば、血液または組織における、それらの生物学的機能を利用する、疾患の治療で使用することができる。
【００３９】
本発明を使用して処理されてもよい、細胞の用途は、
例えば、幹細胞移植と併せた、移植工学と、
臓器移植と、
急性骨髄性白血病や慢性骨髄性白血病を含む、白血病、および腎細胞癌、乳癌、黒色腫、膵臓癌等の固形腫瘍を含むが、それに限定されない癌治療と、
全身性エリテマトーデスまたは全身性強皮症、１型糖尿病、多発性硬化症等の、難治性自己免疫疾患の治療と、
エフェクター細胞を直接利用するステップを含むがそれに限定されない、細胞療法と、
感染性疾患の治療と、
心筋梗塞、肝臓障害、または神経変性疾患を含むが、それらに限定されない、組織再生と、
移植または自己免疫疾患を含むが、それらに限定されない、耐性誘導と、
を含むが、それらに限定されない。
【００４０】
本発明を使用する処理方法は、細胞洗浄、媒体交換、細胞濃縮、種々の物質（抗体、サイトカイン、磁気分離試薬、媒体を含む）による細胞のインキュベーション、磁気細胞分離、濾過、および細胞培養を含む、種々の操作を組み合わせることができる。
【００４１】
磁気細胞分離方法は、濃縮および枯渇手順の両方を備えることができる（Ｂｏｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ０３／２００９）。標的細胞を表面タンパク質に基づいて識別することができれば、標的細胞を高い純度に濃縮することができる。いくつかの状況では、特異的臨床状況内で、不要な機能的特性に基づいて、非標的細胞を識別することができる。これらの非標的細胞は、細胞生成物から除去することができ、異なる標的細胞の異種混合物をもたらす。
【００４２】
移植工学アプローチのために本発明によって処理される、細胞生成物は、ＣＤ３４やＣＤ１３３については濃縮し、ＣＤ３、ＣＤ３、およびＣＤ１９、ＣＤ６、ＣＤ４、およびＣＤ８、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ（ＴＣＲアルファ／ベータ）、またはＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ１６／ＣＤ１４については枯渇させることができ、濃縮幹細胞調製、または、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞等の、他の免疫細胞が補充された幹細胞のいずれかをもたらす。
【００４３】
細胞療法アプローチのために本発明によって処理される、細胞生成物は、例えば、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞）、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６、ナチュラルキラー細胞）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ８（細胞障害性Ｔ細胞）、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−Ｉ、血液樹状細胞サブセット）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４、血液樹状細胞サブセット）、ＮＫｐ８０（ナチュラルキラー細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、エフェクター／記憶Ｔ細胞）、「６Ｂ１１」（Ｖａ２４／Ｖｂ１１、不変ナチュラルキラーＴ細胞）、ＣＤ１３７（活性化Ｔ細胞）、ＣＤ２５（制御性Ｔ細胞）については濃縮し、または、ＣＤ１３８（形質細胞）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯについては枯渇させることができる。ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔ細胞、およびそれらのサブセットは、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または細菌を排除するために、ドナーリンパ球注入アプローチでエフェクター細胞として利用することができる。細胞培養で単球から生成されるか、または直接単離される、樹状細胞は、患者に「予防接種」をし、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、細菌、および／または真菌に対する、抗原特異的で自然な免疫を推進するために使用することができる。
【００４４】
有利なことに、本発明は、１つの使い捨て管類セットから別のセットへ細胞懸濁を移転する必要なしで、使い捨て管類セットの中で行うことができる、２つ以上のパラメータについて選別することによる細胞生成物の製造を可能にし、したがって、細胞生成物への潜在的な有害性（感染、汚染、温度上昇）を回避する。２つのパラメータの選別用途は、高濃縮制御性Ｔ細胞（細胞生成物は、最初にＣＤ８および／またはＣＤ１９および／またはＣＤ４９ｄについて枯渇させられ、後に、ＣＤ２５について濃縮される）、高濃縮ナチュラルキラー細胞（ＣＤ３枯渇、ＣＤ５６濃縮）、および高濃縮血液樹状細胞サブセット（ＣＤ１９枯渇、ＣＤ１ｃ濃縮）の生成を含む。
【００４５】
組織再生アプローチは、通常、組織に血管（再）形成する、新規組織の生成を推進する、または体外生成組織を直接提供するために、血液、骨髄、または組織からの前駆細胞を利用する。利用される組織は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ、間葉幹細胞）、抗ＭＳＣＡ−１（Ｗ８Ｂ２、間葉幹細胞）、ＣＤ１４４（内皮細胞）について濃縮される、細胞生成物を含むことができる。
【００４６】
１つの使い捨て管類セットから別のセットへ細胞懸濁を移転する必要なしで、細胞分離および培養による細胞生成物の製造を使い捨て管類セットの中で行うことができることは、本発明の特異的かつ新規の特性である。具体的には、本発明は、幹細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ４、８、５６、１９、１４、ＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）、ＣＤ１４４、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、またはＣＤ１３８等の、特定のマーカーに陽性である細胞を得るために、使用することができる。
【００４７】
（組成／処方：）
上記で説明されるような基本操作によって製造される細胞生成物を、直接臨床使用のために構成することができることは、本発明の特異的かつ新規の特性である。当技術分野で公知の方法は、臨床要件に適応させるために、作り出された細胞生成物の手動後処理を必要とする。本発明のシステムにより、細胞生成物を即時利用のために直接処方することができる。処方ステップは、所望の体積または細胞濃度への調整、注射用液による処理液の交換、安定剤（自家血漿または血清、血清アルブミン、他のタンパク質、または合成ポリマー等）またはアジュバントの添加、後の貯蔵のためのＤＭＳＯ等の凍結防止剤の補充、品質管理のための保持試料の引き抜き、注射用のバッグまたはシリンジの組み合わせへの送達を含む。最終処方のいくつかの成分、例えば、血漿、血小板、または血小板成分は、起源試料に由来してもよい。
【００４８】
本発明の磁気分離システムは、任意の所望の標的物質を磁気標識し、単離するために使用することができる。特に興味深いのは、複雑な混合物からの特定の成分の分離である。本発明の分離システムには、いったん特異結合要素が利用可能になると、ほぼあらゆる標的物質が分離されてもよいという点で、優れた多用途性がある。標的物質または検体は、特異結合対の任意の要素、または特異結合対の要素と関連する物質であってもよい。一例として、抗原自体、抗原を発現する細胞、抗原の処理に関与する特定の細胞小器官等を単離するために、細胞表面抗原・抗体結合対が使用されてもよい。本発明のデバイスおよび方法はまた、免疫学的検定および同等物等の、受容体またはリガンドの結合を伴う診断技法にも、有利に適用される。
【００４９】
その最も単純な形態で、本発明の細胞分離システムは、磁気分離器および細胞分離試薬といった、２つの主要構成要素を有する。磁気分離器デバイスの概略図が図１に挙げられている。図は、分離器の一般的構造、および金属球の基質の使用に起因する均一な流体通路を示す。図２は、流体通路、収集および貯蔵容器、および分離カラムの一般的位置を含む、より複雑な分離デバイスを描写する。流体回路は、統合弁を伴って構築することができ、または、弁は、流体経路の外部に適用されてもよい。
【００５０】
好ましい細胞分離システムに対する、オプションの第３の構成要素は、細胞分離器具である。図３は、磁石、ポンプ、およびキーボード制御とともに弁を組み込んでもよい、好ましくはコンピュータ制御された、細胞分離器具を描写する。弁なしで構築された、図２のデバイスと同様のデバイスが、標的細胞の自動分離で使用するために、図３の器具上に直接載置されてもよい。
【００５１】
共役抗体／磁性粒子試薬または磁気標識とも呼ばれてもよい、細胞分離試薬は、特異結合要素に結合された磁気応答性材料を含む。磁気分離方法で使用される、多くの周知の磁気応答性材料がある。本発明は、磁気応答性粒子または微粒子の使用を伴う。好適な磁性粒子は、参照することにより本明細書に組込まれる、Ｍｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号、および欧州特許明細書ＥＰ４５２３４２Ｂで説明されている。Ｏｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号、およびＬｉｂｅｒｔｉらの米国特許第５，２００，０８４号で説明されているもの等の、コロイドサイズの粒子も好適である。
【００５２】
本明細書で使用されるような、「特異結合要素」という用語は、特異結合対の要素、すなわち、２つの分子、通常は２つの異なる分子を指し、その場合、分子のうちの一方は、化学または物理的手段を通して、他方の分子に特異的に結合する。特異結合対の相補的要素は、リガンドまたは受容体と呼ばれることもある。抗原および抗体特異結合対である、ペプチド・ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対に加えて、関心の代替的特異結合対は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列（ＤＮＡハイブリダイゼーション分析でプローブおよび補足剤として使用される、核酸配列を含む）、ペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子、ホルモンおよびホルモン結合タンパク質、酵素補助因子および酵素、酵素阻害剤および酵素、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／１０１２６（参照することにより本明細書に組み込まれる）で説明されるような分泌マーカー、自家モノクローナル抗体、および同等物を含む。特異結合対は、元の特異結合要素の類似体、誘導体、および断片を含んでもよい。例えば、タンパク質抗原に向けられた抗体はまた、エピトープが存在する限り、ペプチド断片、化学合成ペプチド模倣薬、標識タンパク質、誘導体化タンパク質等を認識してもよい。
【００５３】
免疫学的特異結合対は、抗原、および抗原特異的抗体、またはＴ細胞抗原受容体を含む。好適な抗原は、ハプテン、タンパク質、ペプチド、炭水化物等であってもよい。結合対のいずか一方の要素のキメラ、切断、または単鎖類自体を賛成するために、組み換えＤＮＡ方法またはペプチド合成が使用されてもよく、その場合、キメラタンパク質が、その混合物または断片、または抗体および他の特異結合要素の混合物を提供してもよい。抗体およびＴ細胞受容体は、単クローン性または多クローン性であってもよく、トランスジェニック動物、免疫ヒトまたは動物Ｂ細胞、抗体またはＴ細胞受容体をコードするＤＮＡベクターが導入された細胞によって産生されてもよい。特異結合要素として使用するための抗体の調製およびそれらの好適性の詳細は、当業者に周知である。
【００５４】
簡潔にするために、末梢血液、骨髄、または臍帯、胎盤、胎児血液、あるいは白血球分離生成物からの血液等の、混合細胞集団から定義された細胞集団（標的細胞）を特異的に選択し、分離する能力に関して、分離システムを説明する。腫瘤からの腫瘍浸潤リンパ球の分離、腎組織からの島細胞の分離等の、特定の細胞の単離を可能にするように、いくつかの組織が、単細胞または単分散懸濁に分解されてもよいことも理解されるであろう。例えば、異なる細胞型が、細胞除去および／または細胞濃縮を可能にするように、特異的抗体で標識されてもよい。標的細胞集団は、概して、標的細胞上に存在する細胞表面抗原に選択的に結合する、上記で説明されるような特異結合要素によって識別される。しかしながら、本装置および方法は、そのような使用に限定されないことを理解されたい。
【００５５】
簡単にするために、特異結合要素を、抗体によって本明細書で例示する。抗体は、磁性粒子に直接または間接的に結合されてもよい。抗体が磁性粒子に直接結合される場合は、抗体が細胞表現抗原に結合されると、標的細胞集団が磁気標識される。抗体が磁性粒子に間接的に結合される場合は、抗体が標的細胞に結合されると、標的細胞集団が磁気標識を受けやすい。抗体結合細胞集団は、抗体に対する特異結合要素と細胞をさらに接触させることによって実際に標識され、その場合、その特異結合要素は、それ自体が磁性粒子に結合される。ついで、そのような磁気標的によって識別される、標的細胞は、磁界を用いて他の細胞から分離される。例えば、アビジン等の特異結合要素は、磁気粒子に接合させることができ、その場合、アビジンは、順に標的細胞に特異的に結合する、ビオチン化抗体に結合する。
【００５６】
特異結合要素は、磁気粒子に直接付着させられてもよい。これは、特異結合要素および磁気粒子自体の上の反応基を用いて、達成されてもよい。代替として、特異結合要素および磁気粒子は、結合剤またはリンカーを用いて接合されてもよい。本明細書で使用されるような、「結合剤」または「リンカー」という用語は、種々の二官能性架橋剤または結合剤、すなわち、スペーサによって分離されてもよい、２つの反応基または「末端」を含有する分子を含む。
【００５７】
従来の高勾配磁気分離基質は、典型的には、ワイヤ、金属被覆ファイバ、またはスチールウール等の材料から調製される。本発明の改良型磁気分離デバイスでは、高勾配磁気分離器の勾配識別基質は、磁気を受けやすい、または強磁性の材料の小球から形成される。そのような材料は、鉄、鋼鉄、コバルトニッケル、および他の強磁性希土類金属、またはそれらの合金を含むが、それらに限定されない。例えば、基質材料は、鉄球（例えば、ＭＡＲＡＢＵ  Ｂａｌｌｓ，Ｋｕｇｅｌｆａｂｒｉｋ  Ｓｃｈｕｌｔｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｗｅｒｍｅｌｓｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の強磁性金属球を含んでもよい。多くの異なる球の製造方法が公知である。通常、球は、大型細胞または細胞複合体の分離については約０．２〜１．５ｍｍに及ぶ平均直径、細胞内材料については約０．０５〜０．２ｍｍの直径を有する。好ましくは、球は、約０．２〜０．５ｍｍに及ぶ平均直径を有し、最も好ましくは、球は、約０．２〜０．３ｍｍに及ぶ平均直径を有するように選択される。球のサイズは、比較的一様であり、通常は平均サイズから多くて約１５％変動し、さらに通常は多くて約１０％、好ましくは多くて約５％変動する。
【００５８】
球が格子構成を成すことができ、球の間の間隙が基質に規則的なチャネルまたは細孔を形成するため、実質的に対照の球形、および球の実質的に均一なサイズが、磁気分離器基質の構築にとって望ましい。格子構成は、隣接する球の間で、かつ基質の全体を通して、規則的なサイズのチャネルを形成する、球のパターン化した枠組である。分離器に磁界を印加すると、磁界勾配が球の間の間隙に生成される。球の均一なサイズ、したがって間隔は、基質の全体を通して実質的に均一な磁気勾配、および実質的に均一な流量特性を提供する。流量チャネルが、図４に描写されている。チャネルの寸法は、基質球の間に嵌合する、最大サイズの玉または粒子によって表することができる。図４を参照すると、幾何学的関係は、ｒ＝約０．１５５Ｒである。チャネルサイズは、基質を作成するために使用される球のサイズを変動させることによって、所望の分離過程にとって最適な平均直径に調整されてもよいことが、本発明の教示から理解されるであろう。
【００５９】
球形は、球が分離チャンバを画定する筐体内に詰められると、実質的に安定した基質構造の形成を提供する。以下で詳細に説明されるように、基質はまた、プラスチックポリマー等の実質的に流体不透過性の材料で被覆される。プラスチックポリマー被覆を塗布すると、球の間の緊密な間隙が閉鎖され、流体力学的に最適化された基質をもたらす。結果して生じる強磁性基質は通常、分離チャンバの全容積の約６０％〜７５％を占有し、流体に対して透過性である。不透過性被覆は、全容積の約１〜５％を占有する。自由容積は、全分離チャンバ容積の約２０％〜４０％に及ぶ。好ましい実施形態では、全基質は、分離チャンバの全容積の約７５％〜８０％を占有する。
【００６０】
図１は、例示的分離カラムの概略図を提示する。球は、一定の縮尺ではないが、３次元の流体透過性基質６の形成をより良く描写するよう、描写されている。球は、非磁性材料でできている筐体４内に詰められる。磁気分離器筐体は、分離カラムの本体としての機能を果たし、筐体の内部は、分離チャンバを画定する。種々の長さ、形状、および直径の筐体は、プラスチックで有利にできている。磁気分離器筐体の構築のための好適な非磁性材料は、ステンレス鋼、ガラス、プラスチック等を含む。
【００６１】
１つの好ましい実施形態では、磁気分離器筐体は、基質被覆が接着するプラスチックであり、基質および筐体の境界における向上した流体力学的性質を可能にする。被覆材料および筐体材料は、相互との適合性のために選択されることが理解され、例えば、カラムの中に蓄積する非接着性プラスチック破片をもたらさない、ラッカー被覆が選択されなければならない。材料が相互に接着する、種々の機構が公知であり、この目的で利用されてもよい。好都合に、適合性のための選択は、ラッカーと併せて使用される溶媒に基づいて行われてもよい。溶媒は、溶媒中のラッカーが接着するように、プラスチック筐体とわずかに反応するが、ラッカー硬化過程中にカラムの構造的完全性が損なわれるほど反応しない。例えば、被覆材料は、プラスチック筐体の内部のわずかな溶解を引き起こす溶媒を含むように、選択されてもよい。硬化時に、プラスチックは再硬化し、それにより、被覆材料および筐体材料を相互に結合または密閉させる。当業者であれば、そのような反応性に関する情報が、概して利用可能であることを理解するであろう。好適な溶媒および筐体の組み合わせの例示的なものは、メチルエチルケトンおよびプラスチックＵＬＴＥＭ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）である。
【００６２】
好ましくは、分離カラム２の構築のために選択される材料のそれぞれは、滅菌手順とも適合する。好ましくは、筐体は、分離チャンバを通る試料の流動ならびに筐体内の３次元基質６の形成を促進するように、形状が円筒形である。筐体の壁は、好ましくは、約１〜３ｍｍの厚さを有する。分離カラムは、流体の導入および排出のための入口１２および出口１４ポートを有する。概して、入口および出口ポートは、筐体の本体に対する狭い構造である。これは、分離システムにおいて、さらなる流体回路への分離器の取付を促進し、閉鎖システムとしてデバイスを有利に維持する。入口および出口ポートは、図１に描写されたのとは異なる部位に配置されてもよいが、分離器の全体的構造は、好ましくは、最も少ない屈曲または角を有し、そうでなければ、流量を減速する場合があるか、または試料が蓄積する場合のある空間を生成する、分離チャンバを提供することが理解されるであろう。
【００６３】
カラムの入口および出口において、カラムは、供給機構を有するように構築され、基質を通る最適な均質分配および流量を確保する。分配機構は、キャップ層８の前の体積およびキャップ層自体から成り、流動抵抗器としての役割を果たす。分配量（ミリメート単位）は、通常、約０．１対１０の比率を有する、カラムの幅（ミリメートル単位）に対して画定されてもよい。基層１０の前のチャンバ容積、ならびに基層自体もまた、出口ポートを介してチャンバの中へ通る流体のための供給機構としての役割を果たす。
【００６４】
直径対長さの比が少なくとも０．２対１である、カラム寸法を有することが好ましい。カラムの実際の寸法は、分離されている材料、および分離のための所望の流速に依存する。カラム寸法は、分離チャンバの中で十分な磁界勾配を生成するように適正な表面積を有し、磁気標識材料の効率的な保持を可能にする、基質を受け入れるチャンバを提供する。所与の分離のために必要な容積は、実験的に判定されてもよく、サイズ、細胞表面上の抗原密度、抗体親和性等とともに変動する。一例として、３ｃｍ２の断面積は、５〜４０ｍｌ／分の流速を可能にする。２×４ｃｍの基質の結合能力は、約１０９個の標識細胞である。
【００６５】
分離カラムの製造を促進するために、非磁性多孔質材料の基層１０は、強磁性球がチャンバの中に入れられた時に、出口ポート１４を通過しないように、筐体の中に配置される。基質の形成のための好適な多孔質材料は、多孔質プラスチック、焼結金属またはガラス、グリッド等を含むが、それらに限定されない。例えば、Ｐｏｒｅｘ  Ｓｉｎｇｗｉｔｚ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能な種々の多孔質フリットが使用されてもよい。通常、多孔質材料は、約２０〜２００μｍ、好ましくは５０〜１５０μｍの細孔径を有する。好適な細孔径は、標的物質の寸法および試料材料の構成に従って選択される。加えて、細孔径は、球が層材料の多孔質開口部を充填することを可能にするよう、あまり大きくはない。チャンバへの球の挿入後に、筐体は、より均一な構成への球の定着を促進するように、震盪または振動させられてもよい。随意で、貯蔵、取扱、および使用中に、基質の均一な構成を維持するように、非磁性多孔質材料のキャップ層８が、基質を覆って筐体の中で配置される。また、よりしっかりとチャンバ内に球を詰めるように、圧力がキャップ層８に印加されてもよい。次いで、本明細書で入口ポート１２を含む、分離カラムの上部分１６は、筐体４の最上部の上に配置され、筐体に取り付けられる。例えば、プラスチック材料を使用する時、上部分１６は、分離カラムの形成を完成させるように、筐体４に接着されるか、または超音波溶接される場合がある。筐体の完成後に、基質が被覆される。
【００６６】
図１を参照すると、被覆が上記で説明される流体透過性基質に塗布される。被覆は、イオンに対して実質的に不透過性となるように選択され、したがって、腐食から金属基質材料を保護し、ならびに、細胞を損傷する場合のある、基質からの陽イオンの脱出を阻止する。基質材料を覆う不透過性保護層の形成に加えて、基質の完全被覆は、球の間の間隙を閉鎖し、基質への機械的安定性および流体力学的に最適化された基質の両方を提供する。そのような機械的安定性は、上記で説明されるように、基質が磁気を受けやすい、または磁気反応性の金属から形成される時に、特に有利である。ラッカー被覆等の被覆材料は、分離カラムの入口ポート１２に流入させられてもよい。ラッカーは、キャップ層８、基質６、および基層１０を通って流れ、画成分の多孔質表面を被覆する。余分なラッカーは、チャンバ出口ポート１４から通って出て行かされる。被覆された分離カラムは、チャンバから過剰な被覆材料をさらに放出するように、遠心分離されてもよい。次いで、被覆は、乾燥させられる。分離カラムは、被覆の乾燥をさらに推進するように加熱されてもよい。例えば、被覆された分離カラムは、１１０℃で４〜５時間にわたってオーブンに入れられてもよく、続いて、室温で３〜７日間、継続的に乾燥させる。
【００６７】
乾燥すると、被覆が硬化し、それにより、基質に機械的支持を提供する。この機械的支持は、分離カラムの貯蔵および取扱中に基質の完全性を維持するのに役立つだけでなく、有意な弾性を示さない剛性構造も基質に提供する。この剛性は、そうでなければ、分離カラムへの外部磁界の印加時に基質が変形させられる場合があるため、有利である。外部磁性手段の印加された磁界強度は、典型的には、約０．１〜約１．５テスラの範囲内、より好ましくは、約０．２〜約０．８テスラの間である。磁界は、十分に大きくなるべきであり、磁石と分離カラムとの間の距離は、基質内で強化された磁界勾配を誘導するのに十分小さくなるべきである。分離器において均一な磁気勾配を維持するために、基質材料は、磁界の印加時にチャンバの中で移動または移行するべきである。球形金属構成要素、筐体、および被覆は、分離カラムが磁界内に配置された時に、大幅な変形に抵抗するのに十分な剛性を伴う改良型基質を提供するように、本発明において有利に組み合わせられる。
【００６８】
球形金属構成要素が分離カラム筐体内にある間に、基質を被覆することが好ましい。筐体内の基質を被覆することにより、被覆が塗布された後の基質の崩壊を回避する。さらに、筐体内の基質は、同時にチャネルに均一な表面を提供しながら、球の間ならびに球と筐体との間で、接触点付近に形成されるか、または球の分離した点によって形成される、わずかな隙間や裂け目を充填または密閉する働きをする。これらのチャネルまたは細孔は、基質の透過性をもたらす。隙間を密閉することによって、細胞または試料の固体成分が楔着するか、または磁界がなくても物理的に閉じ込められる場合がある、領域が減少する。
【００６９】
完成した分離カラムにおいて、基質被覆材料の選択は、好ましくは、２０〜６０μｍに及ぶ平均直径を有し、分離チャンバの全容積の約６０％〜８０％を占有する、透過性基質を通るチャンネルまたは経路をもたらす。例えば、血液細胞の分離のための分離カラムは、平均して２０μｍとなる最終被覆チャネルサイズを有してもよく、基質がチャンバの全容積の約８０％を占有する。
【００７０】
実質的に不透過性の被覆の調製後に、分離チャンバの基質および内面は、好ましくは、ポリビドン（ＢＡＳＦ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の親水性材料の添加によってさらに処理される。他の好適な親水性被覆材料は、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルスターチ、およびアクリルアミド、界面活性剤、または洗剤型湿潤剤、ならびにヘパリンおよびヒト血清アルブミンを含むがそれらに限定されない生物材料等の、親水性被覆を含むが、それらに限定されない。分離チャンバの内面はまた、表面のプラズマまたはコロナエッチングによって親水性にされてもよい。親水性被覆は、分離カラムの内面および流体透過性基質に、容易に質純可能な表面を提供する。これらの表面の湿潤性を強化することによって、分離カラムへの流体の導入は、チャンバを通過するにつれて、均一な流体前面を生成する。これは、分離チャンバの中で、透過性基質および他の隙間からの気泡の除去を促進する。分離過程中に空気を実質的に含まない閉鎖システムとして、分離カラムおよびデバイス構成要素を維持することが望ましい。標的細胞の分離中のシステムにおける空気の存在は、内面張力および無換気領域に影響を及ぼし、それが細胞破壊を引き起こし得る。
【００７１】
分離デバイスを描写する図２を参照すると、分離カラム４０の前には、前濾過デバイスがあってもよい。図は、前濾過デバイスをカラム３０として描写するが、前置フィルタ等の他の構成が使用されてもよいことが理解されるであろう。前濾過カラムは、概して、その構造的組成に関して、分離カラムと実質的に同一であってもよい、３次元構造である。しかしながら、前濾過カラムは、異なる寸法を有してもよく、基質は、異なる組成物、例えば、非強磁性材料を有する球で作られてもよく、または、基質は、分離カラムで使用されるものとは異なる直径を有する球で作られてもよく、それにより、分離カラムで見られるものとは異なる細孔またはチャネルサイズを提供する。一実施形態では、前濾過カラムは、分離カラムと同一である。試料の前濾過カラムの通過は、最終分離生成物において所望されない流体成分を捕らえ、除去する働きをする。例えば、血液細胞分離において、単球、顆粒球、および血小板等の「粘着性」細胞は、前濾過カラムによって細胞懸濁から除去されてもよい。代替として、前濾過カラムは、分離カラムで見られるものより小さい平均細孔径を有するように構築されてもよい。例えば、透過性基質の細孔径は、流体が分離カラムを通過する前に、試料から大型腫瘍細胞を除去するように選択されてもよい。流体試料の前濾過カラムの通過はまた、流体中に存在する場合がある、細胞集合体等の集合体を分化する働きをしてもよい。さらに、前濾過カラムが分離カラムの材料と実質的に同一の材料を含有するため、分離カラムに非特異結合する場合のある試料成分は、前濾過カラムによって有利に捕らえられる。したがって、前濾過カラムは、分離過程中に分離カラムを汚染する可能性を低減し、最終分離生成物中の不要な細胞または流体成分の集合を低減する。
【００７２】
図２を参照すると、分離デバイス２５の好ましい実施形態が描写されている。試料容器８１は、オプションの懸濁フィルタ３５に接続される。懸濁フィルタは、流体試料から不要な粒子成分を除去するために使用されてもよく、あるサイズを上回る粒子を除去するのに十分な細孔径を有するように選択される。例えば、懸濁フィルタは、造血細胞試料中の細胞塊または集塊等の、４０μｍより大きい粒子を除去するように選択される細孔径を有する、Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｌｌ  ＳＱ４０Ｓ；Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）であってもよい。懸濁フィルタは、第２流体経路１２によって、前濾過カラム３０の入口ポート３２に接続される。
【００７３】
前濾過カラム３０の出口ポート３４は、分離過程の経過中に磁界が印加される、分離カラム４０の入口ポート４２に、第５流体経路１５によって接続される。分離カラムの出口ポート４４は、第８流体経路１８によって、生成物収集容器８３、最終洗浄廃棄物容器８４、および非標識試料容器８５につながる、分配チャネル８８に接続される。別個の第９流体経路１９、第１０流体経路２０、および第１１流体経路２１は、それぞれ、これらの容器につながる。
【００７４】
この分離デバイスはさらに、それぞれ第１流体経路１６および第３流体経路１７によって第２流体経路１２に接続される、洗浄または緩衝剤容器８０および初期洗浄廃棄物容器８２を含む。緩衝剤容器８０はまた、洗浄または緩衝剤ライン９０（第６流体経路）を介して、分配チャネル８８に接続される。緩衝剤ラインはさらに、第４流体経路１４によって第５流体経路１５に接続される。流体経路、容器、フィルタ、およびカラムは、標準スパイク、ルアーロック、雄・雌型コネクタ、Ｔ字型コネクタ、Ｙ字型コネクタ、および４方向コネクタ、または静脈注射用溶液送達セットで一般的に使用されているような他の取付具等の、任意の好適な手段によって、相互に連結されてもよい。
【００７５】
分離デバイスの流体回路を通る流量は、流体経路内に配置される弁によって制御することができる。第１〜１１流体経路は、対応する第１〜１１（１−１１）弁と関連する。弁は、経路自体の内側にあってもよく、または経路の外部にあってもよい。流量はまた、ポンプによって制御されてもよい。例えば、流体経路は、可撓性管類等の可撓性材料でできており、流体輸送の制御のための好適な弁は、ピンチ弁を含む。ピンチ弁は、管類の壁を相互に対して押圧することによって流体経路を閉鎖する。そのようなピンチ弁は、流体経路として使用するために選択される管類のサイズに適応するように選択されることが、当業者によって理解されるであろう。加えて、ピンチ弁の圧縮力は、選択された管類の圧縮を達成するように選択され、それにより、流体経路の閉鎖に影響を及ぼす。したがって、弁の仕様は、選択された管類の軟度または硬度（デュロメータ）に一致する。
【００７６】
分離デバイスの実施形態はさらに、分離カラム４０をすでに通過した流体が、分離カラムを通って再循環させられてもよいように、再循環ループ９２（第７流体経路）を含む。典型的には、ポンプ６４は、分離カラムを通した流体の再生利用を促進し、ならびにカラムを通る流動を制御するように、再循環ループに接続される。種々のポンプが使用されてもよいことが、当業者によって理解されるであろう。例示的ポンプは、両方向性で、かつ種々の速度で、流体の再循環ループの通過を制御することができる、蠕動ポンプである。再循環ループを有する分離デバイスは、結合および溶出の過程によって、１つのカラム上での逐次分離を可能にし、それに続いて、第２の結合および溶出が行われる。逐次分離は、最終標的集団における向上した純度を提供する。
【００７７】
図２は、分離デバイスの好ましい実施形態を概略的に描写する。しかしながら、分離過程は、基本システム構成要素、すなわち、改良型磁気分離器および収集容器を使用して、達成されてもよいことが理解されるであろう。
【００７８】
本発明の再循環手段および流量経路は、代替分離システムで使用するためにも好適であることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、再循環手段は、システムで有利に使用されてもよく、分離手段は、磁気または電磁分離手段の代案として、遠心分離技法、吸収カラム、または化学的手段を伴う。
【００７９】
例示的細胞分離過程では、流体経路およびカラムは、好ましくは、様々な流速および圧力で、洗浄液が流体経路およびカラムの全てを通って流れることを可能にすることによって、準備される。洗浄液は、細胞がプラスチックのデバイス構成要素の内面に付着することを阻止する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の、生理学的に容認可能なタンパク質等の材料を含有してもよい。洗浄液はまた、内面の湿潤を工場させるように、少量の生理学的に容認可能な界面活性剤または洗剤を含有してもよい。
【００８０】
流体経路中の大型気泡は、生存細胞の回復にとって有害であることが分かっている。流体経路から気泡を除去する方法が当技術分野で公知であり、この目的で採用されてもよい。特に興味深い方法は、キャップ層および／または基層で使用されるもの等の透過性フリットが、約４００ｍｌ／分未満の流速での気泡の通過を許容しないという観察を利用する。カラムは、約４００ｍｌ／分未満の流速で再循環ループを通して洗浄液を循環させることによって、気泡を除去されてもよい。次いで、気泡は、基層および／またはキャップ層においてカラムの外側に蓄積する。次いで、流動の方向が逆転され、気泡は、システムから好適な廃棄物バッグの中へ洗い出される。好ましくは、全ての気泡の除去を確実にするように、順序が反復される。既存の気泡は、陰圧の生成によって、意図的に拡大されてもよい。
【００８１】
そのような例示的過程において、混合細胞集団中の所望の細胞を特異的に標的にするために、磁気共役抗体が使用されてもよい。磁気試薬が混合細胞集団とともにインキュベートされ、次いで、非結合粒子が、任意の便利な手段、例えば、遠心分離等によって、洗い流される。細胞の無菌性が所望される時は、閉鎖容器過程において、抗体インキュベーションおよび洗浄が行われてもよく、その場合、抗体および洗浄液は、滅菌シリンジまたは同様のデバイスによって、滅菌容器に添加される。このように、浮遊微生物による所望の細胞の汚染が最小化される。特に容器が可撓性バッグである、そのような閉鎖システムでは、細胞および抗体の混合は、約０．５〜２の空気対液体の比で、容器に少量の滅菌空気を注入することによって、改善されてもよい。
【００８２】
磁気標識標的細胞を含有する、インキュベートした細胞懸濁は、分離デバイスに通過させられる。システムは、磁界内に配置されるか、または磁界に隣接する磁気分離器を通して、細胞を輸送する。磁界源は、永久磁石または電磁石であってもよい。分離カラムは、好ましくは、上記で説明されるように、積み重ねられた強磁性球の強磁性基質を含むように構築される。随意で、試料は、分離カラムの通過の前に、同様に上記で説明されるように構築される、前濾過カラムを通過させられる。分離カラムが強磁性球以外から成る基質を含有する場合には、試料は、分離カラムと実質的に同一である、前濾過カラムを最初に通過させられてもよい。
【００８３】
磁気標識細胞は、磁界に応じて分離カラムの中で蓄積する。非標識細胞および他の懸濁成分は、分離カラムを通過し、非標識試料容器および／または廃棄物容器の中へ入る。次いで、磁界から分離カラムを除去するか、または分離カラムから磁界を除去することによって、標識または精製細胞が分離カラムから溶出されてもよい。分離カラムから生成物収集容器の中へ標識細胞を洗い流すように、緩衝化液等の洗浄液が、分離カラムに通過させられる。収集容器は、標的細胞のさらなる処理、または標的細胞の冷凍保存に使用されてもよい。
【００８４】
好ましい実施形態では、分離カラムは、上記で説明されるように、強磁性球から構築される高勾配磁気分離カラムである。本明細書で参照される容器は、典型的には、静脈内輸液の貯蔵および送達に使用されるもの等のプラスチックバッグであるが、任意の好適な容器を使用することができる。容器は、それらの必要な貯蔵または収集容積、それらの滅菌能力、および、閉鎖システム、すなわち、使用前にそこから空気の実質的に全てを除去することができる分離システムで使用される能力について、選択される。
【００８５】
別の実施形態では、磁気標識細胞は、標的細胞の選択、および不要な細胞または他の懸濁成分の除去を強化するように、分離カラムを通して再循環させられる。いくつかの好ましい実施形態はまた、前濾過カラムの使用も含む。しかしながら、前濾過カラムは、磁界を受けない。その代わり、細胞懸濁の前濾過カラムの予備通過は、そうでなければ分離カラムに非特異結合する場合がある、懸濁成分または材料の捕捉をもたらす。そのような非特異結合は、分離カラムの閉塞または汚染を引き起こす場合があり、それは順に、標識細胞集団の分離および収集を阻止または低減し得る。
【００８６】
流体経路、収集容器、懸濁フィルタ、前濾過カラム、および分離カラムは、使い捨て分離デバイスとして構築され、相互接続され、供給されてもよい。標的細胞は、好ましくは、そこから細胞を患者に移植することができる、または、その中で細胞を貯蔵するか、あるいはさらなる処理を受けさせることができる、滅菌血液移転容器に収集される。完全細胞分離デバイスは、好適な容器に事前包装されてもよい。事前包装されたデバイスは、本発明の改良型磁気分離過程で使用するために、滅菌し、提供することができる。所望の分離過程のために必要な試薬は、キットの形態でも提供されてもよい。例えば、標的細胞集団または他の検体に対して特異的な複合体が、デバイスとは別に、またはデバイスとともに提供されてもよい。キットはまた、洗浄溶液、例えば、標準滅菌生理食塩水、および／または、リン酸緩衝生理食塩水、１ｍｍｏｌ／１ＥＤＴＡ、および０．５％ヒト血清アルブミン等の、他の緩衝化液を含んでもよい。これらの試薬または他の溶液は、細胞分離デバイスの適切な流体通路に接続することができる、プラスチックバッグ等の容器の中に提供することができる。
【００８７】
本発明の改良型分離システムは、完全に自動化されてもよい。移動システムでは、コンピュータが、流体回路および分離カラムを通る流体の流動を制御し、磁気標識標的細胞または非検体の保持および解放を提供するように、磁石および／または分離カラムの磁界強度または配置を制御し、適切な容器の中へ最終収集生成物を方向付ける。
【００８８】
図３に描写されるような、自動細胞分離器具の一実施形態は、機械的、電気機械的、および磁性構成要素を含む。機械構成要素は、器具外殻または筐体１５と、調整可能な容器ホルダ２１と、蠕動ポンプ６４と、前濾過カラムホルダ３２と、分離カラムホルダ４２とを含んでもよい。電気機械的構成要素は、ソレノイドピンチ弁１−１１と、蠕動ポンプ６４を駆動する内部モータ（図示せず）と、磁界の内外に分離カラムホルダ４２を移動させる（それにより、分離カラム４０を移動させる）か、または磁石５０を移動させる、内部モータ（図示せず）と、流体回路中の流体の存在を検出するために使用される、気泡検出器（超音波センサ）６５とを含んでもよい。磁性手段は、永久磁石および電磁石を含んでもよい。これらの個々の構成要素は、多数の容易に入手可能な代替物から選択されてもよく、本発明の改良型磁気分離システムの一般的説明から逸脱することなく、種々の構成で組み合わされてもよいことが理解されるであろう。
【００８９】
分離デバイスの好ましい実施形態では、流体経路、溶液および収集容器、懸濁フィルタ、前濾過カラム、分離カラム、およびコネクタは、分離システムに対する事前に組み立てられた使い捨て構成要素として提供される。分離デバイスは、分離過程の実施のために、分離器具上に載置される。分離過程の完了時に、生成物収集容器が除去されてもよく、残りの分離デバイス構成要素は処分される。
【００９０】
好ましくは、内蔵マイクロプロセッサ（図示せず）が、器具の電気機械的構成要素の全てを制御し、ソフトウェアが、標準的順序で適切な操作を行うようにシステムに命令する。ディスプレイ６２および操作者キーパッド６０は、操作者が自動システム動作を監視し、手動モードでの器具の動作を制御することを可能にする。プリンタ（図示せず）が、過程情報、標識等を印刷するために、マイクロプロセッサに接続されてもよい。
【００９１】
図３は、分離器具およびされた分離デバイスを描写する。この実施形態では、分離デバイスは、上記で説明されるように、各外部ピンチ弁１−１１に流体経路の管類を配置することによって、器具上に載置または設置される。前濾過カラム３０は、前濾過カラムホルダ３２内に配置される。分離カラム４０は、格納式アーム４４によって磁石５０に対して移動させられる、分離カラムホルダ４２内に配置される。調整可能なクランプ２０は、上昇位置でハンガアーム２１を固定するために使用される。必要に応じて、初期洗浄廃棄物容器８２と、緩衝剤および試料容器（図示せず）とをその上に配置するように、ハンガアーム上に架台またはペグ２２がある。装置はさらに、生成物収集容器（図示せず）から最終廃棄物容器および非標識試料容器を分離するように、貯蔵区画７０を含んでもよい。
【００９２】
前述のように、上記で説明されるような分離システムはさらに、既述の磁気に基づいた分離技法による試料成分分離の前に、試料調製ステップを達成するための種々の試料／細胞処理システムと一体化することができる。図５は、本発明の実施形態によるシステムを図示する。上記のように、本発明のシステムは、種々の機械的、電気機械的、および磁性構成要素を含むことができる。システム１００は、外殻または筐体１０５を含有する単一システムに統合された、分離ユニット１０６および処理ユニット１０４を含む。システム１００は、上記で説明されるものと同様の磁気分離システムまたはユニットを含むことができる。システム１００は、磁気分離ユニット１０６に分離カラム（例えば、上記で説明されるような磁気分離カラム、図１）を配置するための、筐体を含む磁気分離ユニット１０６を含む。システム１００はさらに、ポンプ１０８と、弁１１０によって図示されるような、複数の流量制御手段または弁を含む。弁１１０のみが番号によって具体的に識別されているが、図５に示されるようなシステム１００は、弁１１０と同一の図示された構造を有するものとして識別可能である、多数の弁を図示することに留意されたい。さらに、複数の流量制御手段／弁は、例証目的で図５において同一であるが、本発明による流量制御手段は、種々の実施形態を挙げることができ、かつ１つ以上の異なる種類の手段／弁を単一システムに含むことができると認識されるであろう。システム１００の構成要素（例えば、弁、ポンプ、分離ユニット等）は、上記で論議されるようなものと同様である、一連の流体経路または流体回路を形成するよう、１つ以上の留迂路によって連結または接続することができる。システムはさらに、システム１００の１つ以上の側面の監視および／または制御を提供する、コンピュータ制御システムまたはユニット１１２を含む。
【００９３】
上記で説明されるようなコンピュータシステム１１２は、１つ以上の入力および／または出力デバイス、画像ディスプレイ、ユーザインターフェースを含むことができ、システム１００動作および機能の手動および／または自動制御を可能にしてもよい。コンピュータ制御システム１１２は、システム１００内の情報（例えば、流量情報等）を処理するモジュールまたはシステムを含むことができ、かつ、１つ以上の処理構造および同等物を有する、多種多様な専用および／または市販のコンピュータ、構成要素、または電子機器を含むことができ、そのようなシステムはしばしば、本明細書で説明されるような方法のステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせを実施するように構成される、データ処理ハードウェアおよび／またはソフトウェアを備える。ソフトウェアは、典型的には、メモリ等の有形媒体、デジタルまたは光学記録媒体、光学、電気、または無線テレメトリ信号、または同等物等で具体化される、プログラミング命令の機械可読コードを備え、これらの構造のうちの１つ以上はまた、多種多様な信号処理構造のうちのいずれかにおいて、システムの構成要素の間で、データ、信号、または情報を出力または伝送するために使用されてもよい。
【００９４】
システムはさらに、本明細書で説明されるような方法を実施するように本システムと連結することができる、種々の構成要素のための、種々の支持材、センサ、筐体等を含むことができる。システム１００はさらに、本発明によるシステム１００とともに利用することができる、種々の流体、試薬、試料流体貯留部、フィルタ、および同等物を担持および／支持するように構成される、１つ以上の支持構造１１４を含む。支持構造は、種々のフックまたはハンガ、あるいはホルダ（例えば、フィルタホルダまたは筐体）構成を含むことができ、任意の特定の設計に限定されない。支持材１１４の上に配置される、流体、緩衝剤、試薬等は、流路または管類に連結することができ、それは順に、システム１００の１つ以上の構成伊要素に接続することができる。システム１００は、システムを通る流体を監視する、および／またはさらに制御するためのセンサを含むことができる。センサは、例えば、気泡検出器（超音波検出器）を含むことができる、液体センサ、圧力センサ、および同等物を含むことができる。気泡検出器１１６および圧力センサ１１８が示されている。フィルタまたは体積低減ユニットを担持するように構成することができる、支持体１２０が示されている。収集領域１２２は、収集容器、試薬等を支持することができる。
【００９５】
図６を参照して、システム１００をさらに図示する。処理ユニット１０４は、１つ以上のヒンジの周囲で移動可能（例えば、除去可能）となり得る、筐体またはカバー１２４を含むことができる。カバー１２４は、温度制御することができ、かつシステム１００の筐体１０５内に収納されてもよい、温度監視および制御構成要素に連結することができる、処理領域１２６を少なくとも部分的に画定する。処理ユニット１０４は、試料を担持し、処理する（例えば、遠心分離、培養、試料成分分離等）ために構成される、試料チャンバ１２８を含む。示された試料チャンバ１２８は、回転防止ロック１３０を含むことができる軸の周囲で定位置に担持される、回転チャンバである。処理ユニット１０４は、カバー１２４内に配置され、チャンバ１２８の中の試料の処理を検出または監視するように構成される、光学検出器１３２等の１つ以上の検出システムを含むことができる。１つ以上の流体入力／出力ラインは、チャンバ１２８に連結することができ、ホルダ１３４によって定位置で担持されてもよい。
【００９６】
図７は、システム１００の裏面図を図示する。回転枢軸の周囲でシステム筐体１０５に連結された構成要素とともに、コンピュータ制御ユニット１１２が示されており、ユニット１１２は、記憶媒体（例えば、プログラムカード）入力スロット１３８を有する。外部構成要素、収集機器等に対する支持を提供することができる、ハンガ１４０が示されている。システム１００は、電力接続およびスイッチ１４２と、種々のインターフェース接続１４４（例えば、バーコードリーダ接続、プリンタ接続、ネットワーク接続等）と、通気口１４６と、内部温度制御システムの構成要素を提供するヒートシンク１４８とを含む。
【００９７】
図８〜１２を参照して、試料チャンバを含む、処理ユニットの構成要素をさらに説明する。図８を参照すると、上部分１５２および下基礎部分１５４を有する、処理チャンバ１５０が図示されている。上部分１５２は、補強または支持構造１５６を含むことができる。チャンバ１５０はさらに、その周囲でチャンバ１５０が回転する軸１５８であって、回転ロックを有する軸１５８であって、チャンバ１５０の中心の周囲を通って延在し、かつ上部分１５２から出て延在する、軸１５８を含む。回転手段または軸受１６０は、軸１５８の周囲でのチャンバ１５０の回転運動を提供する。チャンバ１５０はさらに、軸１５８を包囲する筐体構造に連結される、流体ポートまたはライン接続１６２、１６４と、処理チャンバ１５０の１つ以上の内部区画に流体接続される、ポート１６２、１６４とを含む。
【００９８】
ポートのうちの１つは、ガスを交換するために通気口として使用されてもよい。
【００９９】
図９を参照して、本発明の別の実施形態による、処理チャンバを説明する。チャンバ１７０は、上記で説明されるのと同様に構成される、回転軸１７６およびポート１７８、１８０とともに、上部分１７２と、下部分１７４とを含む。上部分１７２は、支持構造１８２、ならびに、窓またはプリズム１８８を通して可視的な、少なくとも一部分を含むことができるチャネル１８６を含む、構造１８４を含む。
【０１００】
チャネル１８６は、チャンバ１７０の中の試料格納区画に流体連結し、試料処理の外部監視または検出のために構成することができる。例えば、チャネル１８６の中の流体中の成分（例えば、細胞）は、処理ステップ中に可視的に分離されてもよく、それにより、チャンバの１つ以上の内部区画の中の細胞または試料成分の分離を示す。
【０１０１】
チャンバ１７０はさらに、優先的に滅菌疎水性膜またはタンポンを備える、少なくとも１つの通気口を備えてもよい。好ましくは、これらの膜またはタンポンは、チャンバの最上部または底部に位置してもよい。チャンバの少なくとも１つの通気口には、チャンバの中の圧力を変更することなく、または空気あるいはガスの交換用のさらなる入口および／または出口ポートを提供することなく、チャンバの中の体積を変更することができるという特定の利点がある。
【０１０２】
本発明の遠心分離機は、バッチ式ならびに連続遠心分離を可能にし、試料、媒体、ガス、および他の材料は、遠心分離チャンバの回転を止めて、遠心分離機を補充する（バッチ式遠心分離）必要なしで、例えば、入口および出口ポート（例えば、図１の１７８および１８０）を通して、システムに進入および退出することができる。これは、試料の連続濃縮を可能にし、生成物は、遠心分離の終わりに一度だけ除去されてもよく、したがって、付加的な取り扱いによる潜在的な汚染を回避する。
【０１０３】
図９ａでは、回転容器または遠心分離チャンバ５００が示されている。回転チャンバ５００の底部では、少なくとも１つのセンサパッド５０４を備える、顕微鏡焦点領域５０５が配置される。回転チャンバ５００より下では、顕微鏡光学部５０１と、光学部の焦点を合わせるための顕微鏡駆動モータ５０２とを備える、顕微鏡カメラモジュール５０３が位置する。顕微鏡光学部５０１は、自動的に焦点を合わせ、遠心分離中に少なくとも２つの成分に分離されている試料を検出することができるように構成される。それにより、遠心力によりチャンバ５００の中の分離された試料によって形成される、異なる層を検出するために、顕微鏡カメラモジュール５０３を使用することができる。加えて、試料成分のｐＨ値を測定することができる。この目的で、存在するｐＨ値に応じて色を変化させるインジケータが、チャンバ５００で使用される。さらに、外側から顕微鏡カメラモジュール５０３で位置を検出することができるように、チャンバの中に配置される液晶を使用して、チャンバの中の試料の温度が測定されることが可能である。それにより、チャンバ５００の中の温度を判定することができる。
【０１０４】
異なるセンサパッド５０４における顕微鏡光学部５０１がチャンバ５００の壁の中に位置した状態で、モジュール５０３を方向付けることができるように、顕微鏡カメラモジュール５０３を可動式に載置することができる。これは、チャンバ５００の中で形成された種々の層の検出、またはチャンバ５００内の異なる位置でのｐＨまたは温度の検出を促進する。
【０１０５】
図１０は、本発明の実施形態による、試料処理チャンバの断面図を図示する。チャンバ１９０は、上部分１９２および基礎部分１９４と、１つ以上の内部区画とを含む。チャンバ１９０は、チャンバ中の１つ以上の区画の中に配置された試料に遠心力を印加するよう、軸の周囲で回転するように構成され、それにより、試料の少なくとも２つの成分を分離する。チャンバは、チャンバの少なくとも１つの区画に流体接続される中央ライン１９６を含む。チャンバ１９０の構成要素はさらに、外側ライン１９８と、回転軸受２００と、回転シール２０２、２０４、２０６と、チャンバへの外側進入ライン２０５と、下部放射状チャネル２０８と、チャンバ区画への内側ライン入口２１０と、斜面２１２と、偏向器２１４とを含む。チャンバ保持器２１６が含まれ、本発明のシステムの他の構成要素とのチャンバ１９０の確実な位置付け／連結のために構成される。
【０１０６】
遠心分離チャンバ１９０は、好ましくは、随意で２つの流体ラインを伴う、好ましくは２つの流体ラインを伴う、回転シールを備える。流体ラインは、異なる位置でチャンバ１９０に進入することができる。例えば、上部分１９２（蓋）の外周に第１の流体ラインを配置することが可能である。第２の流体ラインは、さらに内側、例えば、チャンバ１９０の中心にさらに向かって２ｍｍから２０ｍｍに配置することができる。随意で、通気口が、例えば、膜の形で、上部分１９２に位置することができる。
【０１０７】
概して、遠心分離チャンバの穴またはライン入口等の開口部の位置は、特定の試料の遠心分離に最適であるように構成することができる。特定の試料の成分および試料中の各成分の相対体積に応じて、特定の成分の除去および／または検出を達成することができるように、開口部を配置することができる。
【０１０８】
図１０Ａは、チャンバ２０１の平面図を図示する。チャンバ２０１は、内側ライン２０３と、下部放射状チャネル２０５と、チャンバへの内側ライン入口２０７と、随意で、偏向器２０９と、斜面２１１と、光通路２０９とを含む。
【０１０９】
図１１は、本発明の別の実施形態による、チャンバの断面図を図示する。チャンバ２２０は、その周囲でチャンバが回転する軸と、中央ライン接続２２２および外側ライン接続２２４と、１つ以上の内部区画とを含む。さらに、回転軸受２２６、ならびに回転シール２２８、２３０、２３２、内側チャネル２３４、光学検出チャネル２３６（上記と同様）、チャンバへの内側ライン入口２３８、内側ライン２４０、下部放射状チャネル２４２が図示されている。チャンバはさらに、内側補強２４６と、チャンバ保持器２４８とを含む。図１１Ａは、上記で説明されるようなチャンバ２２０の一部分の集中図を図示する。光学検出チャネル２３６、プリズム２３７、および光通路２３９（矢印によってさらに示される）が示されている。
【０１１０】
本発明の別の実施形態では、チャンバの底部は、疎水性膜２９２で覆われる、１つ以上の開口部（図１２Ａ、２９１）を保有することができる。これらの開口部は、例えば、細胞培養過程のために、ガスがチャンバの中へ送達され、チャンバから除去されるために使用される。膜は、チャンバとの滅菌接続を確保する方法で、チャンバの底部に接着する、熱的に、超音波で、または他の手段で結合することができる。
【０１１１】
本発明の別の実施形態（図１２Ｂ）では、チャンバは、ガス流用のチャネルのシステム、例えば、ガスとチャネル（図示せず）を覆って結合された膜との間で広い接触面積を確保する、らせん状システム２９３として組み立てられるチャネルを保有することができる。好ましくは、これらの膜は、チャンバの最上部または底部に位置してもよい。チャネルシステムは、少なくとも１つの入力（開口部）２９４と、オプションのガス用の出力（開口部）２９５とを保有する。
【０１１２】
図８−１１Ａのチャネルの入口またはポートは、数およびチャネル内の場所が変動してもよい。
【０１１３】
図１２は、本発明の別の実施形態による、チャンバの断面図を図示する。チャンバ２５０の構造は、上記で説明されるようなチャンバと多くの点で同様であるが、複数の層状構造２５２をさらに含む。層状構造２５２は、細胞培養構造または層を提供するように構成することができる。使用中、細胞を含む試料をチャンバに導入し、層２５２を越えて流すことができる。分離処理は、層に付着する細胞が、層に対する親和性が少ない細胞から分離されるように、チャンバの回転を含むことができる。断続的回転および／または回転中の中断は、分離処理のために、層状構造２５２の表面から培養細胞をさらに断絶することができる。驚いたことに、この断続的過程は、培養後の細胞のような塊状または付着生物材料を再懸濁することもできることが分かった。チャンバはさらに、図示された中央ライン２５１と、外側ライン２５３と、軸受２５５と、回転シール２５７と、チャンバへの外側ライン入口２５９と、上部分２６１と、内側チャネル２６３と、基礎部分２６５と、保持器２６７と、下部放射状チャネル２６９と、チャンバへの内側ライン入口２７１とを含む。
【０１１４】
チャンバは、種々の材料を備えてもよく、または種々の材料で作られてもよい。好ましい実施形態では、プラスチック、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ガラス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリルレート（ＰＭＭＡ）、および／またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のような、透明材料が使用される。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）および／または熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、シリコーン、または上記の材料のうちの１つ以上を備える組成物。チャンバはまた、ポリエチレン（ＰＥ）で作ることもできる。好ましい実施形態では、チャンバの中の層は、コラーゲン、キチン、アルギン酸塩、および／またはヒアルロン酸誘導体を備えるか、またはそれで作られる。生分解性である、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、およびそれらの共重合体も可能である。代替として、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリメチルメタクリルレート（ＰＭＭＡ）、および／またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の、非生分解性材料を使用することができる。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）および／または熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）も使用することができる。他の代替案は、セラミックと、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）またはリン酸カルシウムのようなガラス材料とを含む。チャンバの中の層は、固体材料または有孔性となり得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、チャンバは、直径２ｃｍから５０ｃｍのサイズ、および５ｍｍから５０ｃｍの高さを有する。遠心分離は、優先的に、最大１０００ｘｇで実行される。
【０１１６】
層の数および層の間の距離は、可変である。
【０１１７】
好ましい実施形態では、チャンバは、試料が遠心分離されるための適切な温度を提供するように、加熱および冷却することができる。この目的で、加熱および／冷却手段が、システムに位置する。
【０１１８】
図１７に示されるように、円筒形遠心分離機チャンバは、平坦な頂面上に１つ以上の安定化リブ８０５を携持してもよい、蓋８００によって、その上側で制限されてもよい。これらの放射状リブ８０５のうちの少なくとも１つは、蓋８００が遠心分離機チャンバに取り付けられると遠心分離機の内部体積に開口する、狭い間隙またはチャネル８０１を覆うことができる。間隙８０１は、蓋内面から、蓋８００を数ミリメートル通ってリブ８０５の中へ、軸方向に延在する。したがって、それは、透明材料が使用されると、リブ８０５内で外側から可視的であってもよい。放射状拡張で、間隙８０１は、中心付近から、円筒形遠心分離機壁（図１７）まで到達する。
【０１１９】
遠心分離中に、遠心分離機チャンバ全体の中と同じ力が、間隙８０１の中で効果を生じる。リング状の隣接する懸濁層が、間隙８０１の中へ並列に延在し、外部光学センサによって十分に検出可能である、横断して切断された薄い層のような、軸方向に起立した隣接する薄い領域として表示されている。
【０１２０】
間隙８０１の幅は、自由に決定することができ、間隙の中の全層関連領域の透過光分析にとって十分小さくもある。それにより、光透過測定を通して外側から「触れることができない」方式で、遠心分離機チャンバの中の懸濁の全ての層の光学密度および色を定量化することが可能である。
【０１２１】
垂直照明およびセンサ位置が、間隙の中の層の運動を観察できるようにするために、鏡、または優先的にプリズムを、リブの両側に追加することができ、それは、透明筐体材料自体によって行われてもよい。
【０１２２】
プリズム８１０は、間隙（水平）を通って、垂直の生成された照明光線を屈折させ、最上部に戻し、再び垂直になる（図１８）。遠心分離中に、同期位置の誘起された電子閃光が、プリズム８１０の片側、例えば、左プリズムの中へ光を透過させ、屈折によって間隙を照射することができる。透過結果は、プリズム８１０の反対側、例えば、右プリズムによって屈折されて、おそらくは最上部の上部閃光源に隣接している、垂直に載置されたセンサまたはカメラに戻される。結果として生じる光学センサユニットは、反射センサのように扱いやすいが、同時に、完全透過測定を可能にする。
【０１２３】
プリズムの角度の配設は、照明閃光のためのプリズム内面上の「全反射」を確保し、光源とカメラとの間で外面上の直接反射を回避する。したがって、鏡面被覆の必要性がなく、設備の再加工を必要とされることなく、射出成形技術を使用することができる（図１９）。
【０１２４】
したがって、図１３を参照して、本発明の別の実施形態を説明する。図示されるように、処理システムは、種々の連結された構成要素、流量チャネル、緩衝剤、試薬等を含む。多数の構成が利用可能であり、現在の構成は、例証目的で提供されていることが認識されるであろう。図１３を参照すると、構成要素は、システム緩衝剤３００と、スパイクポート３０１と、滅菌フィルタ３０２と、血漿／処理中バッグ３０３と、磁気標識試薬容器３０４と、スパイクポート３０５と、磁気試薬滅菌フィルタ３０６と、滅菌フィルタ３０７と、緩衝剤／媒体バッグ３０８と、細胞培養培地ポートと、補助ポート３０９と、おそらくフィルタを含む、下向きの単一方向弁３１０と、上向きの単一方向弁３１１と、試料バッグ３１２と、試料バッグコネクタ３１３と、試料フィルタ３１４と、試料ポート３１５と、フィルタ３１６と、分離前フィルタ３２０と、処理中貯蔵バッグ３２１と、磁気分離カラム３２２と、廃棄物バッグ３２３と、体積低減ユニット３２４と、陽性留分バッグ３２５と、陰性留分バッグ３２６と、滅菌空気フィルタ３２７と、ポンプ３２８と、圧力センサ１への空気フィルタ３２９と、圧力センサ２への空気フィルタ３３０と、試料／細胞処理ユニット３３２とを含む。
【０１２５】
図１３に図示され、上記で説明されるようなシステムの典型的な使用を、図１４Ａ〜１４Ｎを参照して論議する。システムの種々の構成要素の起動は、所望の経路に沿って流動を方向付けるように選択することができる。選択された流れを、図１４Ａ〜１４Ｎを参照して図示し、暗い流路および流動方向矢印によって示す。図１４Ａは、試料処理ユニットの回転／処理チャンバへの試料搭載を図示する。試料は、試料源から開放弁５、９、１６を通り、ポンプを通って処理ユニットに流入する。図１４Ｂは、システムのライン／構成要素の洗浄を図示し、緩衝剤が、開放弁１、９、１６、ポンプを通って処理ユニットに流入する。試料および緩衝剤を図示されるように流し、処理ユニットの中の試料を成分の分離のために遠心分離し、洗浄過程を反復することができる。図１４Ｃは、赤血球細胞の低減および試料からの除去を図示する。上述のように、赤血球細胞の分離のためのバフィーコートの形成を含む、成分の分離のために、試料ユニットの中の試料を遠心分離機することができる。次いで、赤血球細胞成分を処理ユニットから除去し、システムを通り、開放弁１７、１２を通って、廃棄物容器に流入させることができる。図１４Ｄは、処理ユニットの中のチャンバからの血漿の除去を図示し、血漿洗浄／成分は、システムを通り、開放弁１６、１２を通って、廃棄物容器に流入させられる。図１４Ｅは、血漿が処理ユニットから除去され、システムを通り、開放弁１６、９、４を通って、血漿収集容器に流入させられる際の、血漿の収集を図示する。図１４Ｆは、チャンバへの試薬の搭載および細胞の標識化を図示する。試薬（例えば、磁気標識）は、開放弁２、９、１６においてシステムを通り、チャンバに流入させられる。細胞は、標識試薬ともにインキュベーションのために処理する（例えば、撹拌、再構成、試薬と混合する等）ことができる。図１４Ｇは、チャンバへの血漿の添加を図示する。血漿容器からの血漿は、システムを通り、開放弁４、９、１６を通って、チャンバに流入させられる。付加的な処理、洗浄等のステップ（例えば、図１４Ｂに図示されるような）を行うことができる。図１４Ｈは、試料の標識および非標識成分の磁気に基づいた分離を図示する。試料／再懸濁標識細胞は、システムを通り、開放弁１６を通り、フィルタまたは（前）カラム（例えば、塊状再傍を除去するよう、サイズに基づいた分離フィルタ）を通り、開放弁７、１１を通り、標識細胞が向かう磁気カラムを通って流され、主に非標識細胞が、開放弁１９を通って、陰性／非標識細胞容器に流入する。図１４Ｉは、緩衝剤が開放弁１、１５、７、１１、１９においてシステムを通り、細胞容器に流入させられる、カラム洗浄を図示する。洗浄ステップは、システム／磁気分離カラムから非標識細胞を洗い流すように選択される。図１４Ｊは、カラムからの細胞の溶出および再適用を図示する。磁気印加がオフにされ、流体は、カラムから細胞を洗い流すよう、例えば高速で、弁１１、１０、１４を通って図示されるように流される。次いで、磁界印加は、磁気分離カラムへの標識細胞の再付着のために、オンに戻される。図１４Ｋは、溶出緩衝剤によるカラムの洗浄を図示する。緩衝剤は、分離カラムから廃棄物容器の中へ、非標識細胞を優先的に洗い流すよう、図示されるように流される。図１４Ｌは、カラムから再適用バッグの中へ標識細胞を除去するよう、カラムの洗浄を図示する。示されるように、磁界は、カラムから標識細胞を解放するようにオフにされる。図１４Ｍは、体積低減ステップを図示する。細胞を含有する溶液は、フィルタＦ７に溶液を通過させるよう、図示されるように流される。フィルタは、溶液が通って流れるにつれて細胞を収集する、膜フィルタを含む。図１４Ｎは、最終溶出、および収集容器の中への生成物の収集を図示する。血漿は、図示されるように、開放弁４、９、１４、１８を通って流され、フィルタから陽性収集溶液の中へ細胞を洗い流すよう、流体がフィルタＦ７を通過する。
【０１２６】
本発明の管類セットは、培養液、サイトカイン、増殖因子、血清、および細胞の培養に必要な他の物質の送達のために、または培養チャンバから試料を取り出すために、使用することができる。培養液は、ポンプ３２８（図１３）を使用することによって、または管類セットに接続される付加的なシリンジを使用することによって、チャンバの中へ継続的または周期的に送達することができるか、またはポート２２２および２２４（図１１）を通してチャンバから引き出すことができる。培養液は、細胞培養過程中に、新しい培養液と完全または部分的に交換することができる。培養液は、Ｏ２、ＣＯ２、Ｎ２、空気、または細胞の増殖に必要な他のガスを混入することができる。培養液の濃縮は、ポート２２２または２２４（図１１）を通り、疎水性膜（図１２Ａおよび１２Ｂ）で覆われた培養チャンバの底部における付加的な開口部を通って、培養チャンバの中へガスを直接注入することによって、または培養チャンバの外側に配置される通気デバイス（図１５）を使用することによって、行うことができる。
【０１２７】
そのような通気デバイスの例を、図１５に描写する。それは、例えば、片側に彫り込まれたチャネルを伴う、ポリカーボネート（ＰＣ）またはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）でできた２つの部品（４１５および４１６）から成る。両方の部品が引き合わされ、少なくとも１つの膜（４１７）によって２つ以上の区画に分離される、空洞を間に形成する。膜を部品のうちの一方に結合することができ、またはいくつかの膜を両方の部品に結合することができる。区画は、管類セットとの接続のために、少なくとも１つの入口（４１８）および１つの出口（４１９）ポートを含有する。第１の区画は、ガス混合物に使用される。第２の区画は、ガス混合物の成分を混入されなければならない、培養液に使用される。両方の区画の間に配置される膜は、ガスに対して透過性であるが、液体に対しては透過性ではない。優先的に、これは、１つの疎水性膜、例えば、ナイロン疎水性膜である。優先的に、疎水性膜の細孔は、０．２μｍよりも小さく、それが培養液とガス混合物との間の滅菌接続を確保する。通気デバイスの別の実施形態では、ガスが培養液含有区画の間を流れる方法で、１つ以上の付加的な膜を、図１５に描写された部品のうちのいずれか一方に結合することができる。この場合、培養液とガス混合物との間の接触面は、使用される膜の数に応じて、多数であるだけ大きい。
【０１２８】
通気デバイスの中の膜は、熱結合、超音波結合または接着、またはプラスチック部品と膜との間の滅菌接続を可能にする、他の好適な結合過程によって、部品に結合することができる。
【０１２９】
通気デバイスは、照射（例えば、ガンマ、ベータ線）、プラズマ（例えば、過酸化水素）、熱蒸気／スチーム（例えば、高圧蒸気殺菌法）、またはエチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌によって、滅菌することができる。優先的に、通気デバイスは、使い捨て管類セットの一部として使用される。
【０１３０】
通気デバイスに使用されるガス組成物は、優先的に、ガス混合チャンバの使用を通して構成される。ガス混合チャンバの好ましい実施形態を、図１６Ａに示す。それは、それらの間に空洞を形成する方法で、ボルトで接続される、接着される、熱的結合、または超音波結合される、好ましくは、プラスチック材料、例えば、ＰＯＭ（ポリオキシメチレン）でできた、２つの部品（４２１および４２２）から成る。優先的に、部品のうちの一方は、両方の部品の間の密閉（４３３、図１６Ｂ）を確保する、密閉リング用のチャネルを含有する。ガス混合チャンバは、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポート（４２３）を保有する。それは、チャンバの内側の圧力の測定のための圧力センサデバイスの接続のために、ポート（４３０）を備える。ガス混合チャンバは、チャンバの中の圧力がある値を超えて上昇すると自動的に開く、安全弁との接続のために、別のポート（４３２、図１６ｂ）を随意で含有する。ガス混合チャンバは、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口弁との接続のための入口および出口（４３５）、ならびに、ガス混合チャンバの壁への入口および出口弁の接続のためのネジ山付き穿孔（４３６）を保有する。
【０１３１】
ガス混合チャンバの中および／または外へのガスの流速を低減するために、随意で、壁に混合物を含むことができる。
【０１３２】
ガス混合チャンバの動作の原則：ガス混合チャンバの入口ポートは、ガス供給と接続される。流入ガスの供給は、大気圧、例えば、２バールよりも大きい圧力を有するべきである。操作者は、測定および自動化ソフトウェアプログラムを使用することによって、所望のガス組成物の内容を求めることができる。所望の組成物のガスのそれぞれの内容は、ガス混合物中のそのガスの分圧として求められる。ガス組成過程は、入力弁４２４（図１６Ａ）によって制御される、ガス混合物の第１の成分で開始する。入力弁は、一定の期間にわたって、通常は５０ミリ秒から２００ミリ秒の間で開き、次いで閉じ、圧力センサが読み取られる。チャンバの中の測定圧力は、Ｐｍである。圧力Ｐｍ＜Ｐ１であり、Ｐ１が操作者によって与えられる圧力である場合、入力弁が再び開く。過程は、Ｐｍ＞＝Ｐ１まで反復される。次いで、入力弁４２５が開き、入力弁４２４を伴う場合で説明されるように、第２のガス成分の組成が行われる。全ての流入ガスが混合チャンバの中へ構成されると、ガス混合チャンバの中の圧力が、操作者によって事前に求められる値Ｐｏｕｔに到達するまで、出力弁４２７が開く。Ｐｏｕｔは常に、大気圧に等しいか、またはそれより高いかのいずれか一方である。出口弁の開放の時間および頻度も、操作者によって求めることができる。次いで、ガス組成過程は、第１の入口弁（４２４）の開放と再開する。出口弁４２８および４２９は、随意で、別の細胞培養チャンバ、バッグ、または本発明で使用される他の容器の通気のために使用することができる。
【０１３３】
試料チャンバは、細胞の増殖、分離、洗浄、細胞または異なる種類の細胞の濃縮、またはその他等の、広い範囲の細胞培養方法が行われることを可能にする。本発明のシステムはまた、薬剤を処方するために使用することもできる。
【０１３４】
細胞療法に必要とされる細胞製剤の製造は、規定の特性を伴う規定の細胞生成物を得るように、基本的操作の種々の組み合わせを含むことができる。これらの基本的操作の全てを、単一の閉鎖管類セットの中で行うことができ、そうでなければ必要とされる手動試料移転ステップの危険性を排除することが、本発明に特有である。
【０１３５】
細胞培養条件は、当技術分野で公知である。
【０１３６】
本明細書で説明される特徴は、任意の組み合わせにおいて、本発明の実現に関連してもよい。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【０１３８】
（実施例１：臍帯血からの幹細胞および前駆移植片の製造）
ヒト臍帯血を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈し、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４またはＣＤ１３３試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ３４またはＣＤ１３３陽性細胞を、細胞懸濁から濃縮し、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。濃縮または単離幹細胞を、最大で３週間にわたって培養する。補充細胞培養培地を断続的に添加する。細胞培養培地を除去するように、拡張臍帯血細胞を遠心分離によって洗浄し、細胞をヒト血清アルブミンが補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。
【０１３９】
（実施例２：樹状細胞ワクチンの製造）
ヒト全血またはアフェレーシス収穫を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈し、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１４試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ１４陽性単球を、細胞懸濁から濃縮し、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャ
ンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。濃縮または単離単球を、未熟単球由来樹状細胞に培養する。培地を遠心分離によって交換し、付加的な補充物を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。細胞を培養し、成熟時に、抗原（組み換えタンパク質、ペプチド、細胞溶解物、ＤＮＡ）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。単球由来樹状細胞を抗原処理のために培養する。細胞培養培地を、遠心分離によって除去し、細胞をヒト血清アルブミンが補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。
【０１４０】
（実施例３：ｍＤＣおよびｐＤＣ血液樹状細胞ワクチンの製造）
アフェレーシス収穫を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈して、自動的にＣＤ１９を枯渇させ、後に、ＭＡＣＳカラムを介して、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４、ＣＤ１ｃ、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）またはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）について濃縮する。ＤＣを、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン、組み換えタンパク質、ペプチド、細胞溶解物、ＤＮＡのような活性化成分）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加し、最適な成熟および活性化を達成するように、細胞を２４時間にわたって培養する。細胞培養培地を、遠心分離によって除去し、細胞をヒト血清アルブミンが随意で補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。生成物容器は、さらなる使用のために、本発明の管類セットから除去する。
【０１４１】
（実施例４：抗原特異的Ｔ細胞の製造）
ヒト全血またはアフェレーシス収穫を洗浄し、細胞培養培地で希釈し、細胞培養チャンバの中へ移転させる。抗原（組み換えタンパク質、ペプチドプール、または腫瘍細胞溶解物）および培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。抗原特異的Ｔ細胞を再刺激するように、細胞および抗原を３〜１６時間にわたって培養する。細胞懸濁を、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＩＦＮ−ガンマＣａｔｃｈｍａｔｒｉｘ試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去する。細胞を細胞培養容器に移転させ、サイトカインの放出のためにインキュベートする。細胞懸濁を、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＩＦＮ−ガンマ濃縮試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、抗原特異的細胞を、細胞懸濁から磁気的に濃縮し、補充輸液を使用するＭＡＣＳカラムからの直接溶出によって、わずかな注射用量に濃縮し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。
【０１４２】
（実施例５：活性化ナチュラルキラー細胞の製造）
ヒト全血またはアフェレーシス収穫を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈し、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ３陽性細胞を細胞懸濁から枯渇させる。ＣＤ３陰性標的細胞を標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ５６陽性細胞を濃縮し、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５等のサイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。濃縮または単離ＮＫ細胞を、８〜４８時間にわたって培養する。細胞培養培地を、遠心分離によって細胞生成物から除去し、細胞をヒト血清アルブミンが補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。
【０１４３】
（実施例６：拡張ナチュラルキラー細胞の製造）
ヒト全血またはアフェレーシス収穫を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈し、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ３陽性細胞を細胞懸濁から枯渇させる。ＣＤ３陰性標的細胞を標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ５６陽性細胞を濃縮し、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。ＣＤ２およびＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、またはＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）およびＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）に対する抗体が搭載された細胞拡張ビーズを、バイアルから細胞培養区画に移転させる。濃縮または単離ＮＫ細胞を、１週間にわたって培養し、第７日より開始して、補充細胞培養培地を１：１の比率で３日ごとに添加し、細胞を第１４〜２１日まで培養する。
【０１４４】
細胞拡張ビーズを除去するように、拡張ＮＫ細胞をＭＡＣＳカラムの上方に通す。随意で、ＣＤ３枯渇またはＣＤ５６濃縮（上記参照）によって、拡張ＮＫ細胞をさらに生成する。細胞培養培地を、遠心分離によって細胞生成物から除去し、細胞をヒト血清アルブミンが補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。
【０１４５】
（実施例７：拡張Ｔヘルパー細胞の製造）
ヒト全血またはアフェレーシス収穫を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で希釈し、遠心分離によって規定の標識量に調整し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４試薬を添加し、指定の標識時間にわたって細胞試料とともにインキュベートさせ、遠心分離機チャンバの中で洗浄することによってアクセス試薬を除去し、ＣＤ４陽性細胞を濃縮し、細胞培養培地とともに直接ＭＡＣＳカラムから溶出させ、細胞培養チャンバの中へ移転させる。培地補充物（ヒト血清アルブミン、サイトカイン）を、管類セットに取り付けられたバイアルから自動的に添加する。ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ２８、または代替としてＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体が搭載された細胞拡張ビーズを、バイアルから細胞培養区画に移転させる。単離Ｔヘルパー細胞を培養し、第３日より開始して、補充細胞培養培地を１：１の比率で２日ごとに添加し、細胞を第１４日まで培養する。細胞拡張ビーズを除去するように、拡張Ｔ細胞をＭＡＣＳカラムの上方に通す。細胞培養培地を、遠心分離によって細胞生成物から除去し、細胞をヒト血清アルブミンが補充された輸液（生理食塩水）中で再懸濁し、最終生成物容器（輸液バッグまたはシリンジ）に移転させる。生成物容器は、さらなる使用のために、本発明の管類セットから除去する。
【０１４６】
（実施例１０：ＣＤ１３３陽性幹細胞の選択）
ＣＤ１３３抗原は、幹細胞マーカーであり、一部の未成熟ＣＤ３４＋細胞上、循環内皮前駆細胞上、およびＣＤ３４−幹細胞サブセット上で特異的に発現される（Ｄｅ  Ｗｙｎｔｅｒら，１９９８）。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１３３システムを使用する、濃縮または単離ＣＤ１３３陽性細胞は、臍帯血からの造血前駆細胞の生体外拡張のため、ならびに自家（Ｐａｓｉｎｏら，２０００）および同種（Ｋｏｅｈｌら，２００２）移植で使用されている。
【０１４７】
ＣＤ１３３＋幹細胞は、再生医療のための非血液学的用途で利用することができる。骨髄からのＣＤ１３３選択細胞が、例えば、虚血性心疾患の治療に関して、明確になってきている（Ｓｔａｍｍら，２００３）。
【０１４８】
ＣＤ１３３＋細胞の濃縮または単離は、９９．４％（２．２ｌｏｇ）以上の非標的細胞の除去をもたらす。表１を参照されたい。
【０１４９】
【表１】
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比較のために、同様の結果とともに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ１３３システムを使用して、全ての骨髄生成物も処理されている。
【０１５０】
図２０のドットプロットは、本発明を使用した自動処理の前（左）および後（右）の試料特性を示す。
【０１５１】
（実施例１１：ＣＤ１４陽性細胞の選択）
ＣＤ１４抗原は、ＬＰＳ受容体複合体に属し、単球は、抗原を強く発現する。ＣＤ１４選択単球は、ヒト単球由来樹状細胞の後続の生成のために使用することができる（ＭｏＤＣｓ；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００５）。樹状細胞には、固形腫瘍、血液学的悪性腫瘍、ウイルス感染症、および自己免疫疾患を含む、種々の疾患に対する細胞ワクチンとしての大きな可能性がある。
【０１５２】
単球は、本発明およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１４試薬を使用して、２つの白血球分離収穫から単離されている。単球を、５８％／２１％の収率で、１９．７％／３１．８％（未処理の収穫）から９８．２％／９９．７％（最終細胞生成物）に濃縮した（図２１参照）。
【０１５３】
ＭｏＤＣは、本発明を使用して単離された単球から生成することができ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ単離単球から生成されたＭｏＤＣと同一の特性を示した。
【０１５４】
単球はまた、本発明を使用して、ヒト全血からのバフィーコートからも単離され、６４％の単球収率で、９．８％（未処理のバフィーコート）から９８．９％（最終細胞生成物）の純度に濃縮することができた。
【０１５５】
（実施例１２：ＣＤ３０４選択）
末梢血において、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）を、ヒト形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）上で発現させる。ＰＤＣは、最も強力なＩ型インターフェロン産生細胞である（Ｄｚｉｏｎｅｋら、２００２）。ＣＤ３０４は、（ＭｏＤＣについて）培養期間なしで、末梢血から樹状細胞を直接濃縮または単離するために使用することができる。
【０１５６】
ＣＤ３０４陽性標的細胞の濃縮または単離は、血液バッグ遠心分離機においてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試料調製手順を利用する、時間のかかる長時間の洗浄ステップを必要とする。自動試料処理は、ワクチン接種試験でのＣＤ３０４単離細胞の使用を促進する。
【０１５７】
ＣＤ３０４陽性細胞を、本発明およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３０４試薬を使用して、２つの白血球分離収穫から単離または濃縮した。ＰＤＣを、３０％の収率で０．２９％から３４．４％に、３９％の収率で０．４３％から８０．５％に濃縮した。
【０１５８】
第２の手順からの形質細胞様樹状細胞を、成熟誘導のために、ＣＰＧ  Ｃ（ＯＤＮ２３９５）およびＩＬ−３、またはＩＬ−３単独とともに、２４時間にわたって培養した。培養細胞を成熟マーカーＣＤ４０およびＣＤ８０について分析し、マーカープロファイルは、培養時にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３０４システムを使用した単離ＣＤ３０４陽性ＰＤＣと同一であった。
【０１５９】
（実施例１３：ＣＤ４陽性細胞の選択）
ＣＤ４は、Ｔ細胞による、ＭＨＣクラスＩＩ抗原と関連した外来抗原の認識におけるアクセサリー分子である。Ｔヘルパー細胞、より低い程度で、単球および樹状細胞は、ＣＤ４を発現する。
【０１６０】
ある腫瘍学的設定について、予備データは、移植片中の、またはドナーリンパ球輸液としてのＴ細胞が、有益であってもよいことを示唆している（Ｆａｌｋｅｎｂｕｒｇら、１９９９）。これらの設定において、ＣＤ４設定またはＣＤ８枯渇（実施例５参照）が、同種移植設定で所望されてもよい。Ｔヘルパー細胞は、抗腫瘍反応を備えることが可能であってもよく、移植片対宿主疾患の危険性を低減し（Ａｌｙｅａら、１９９８）、受容者の免疫系を再構成する（Ｂｅｌｌｕｃｃｉら、２００２）。
【０１６１】
ＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞はまた、ＨＩＶの感染および進行でも重要な役割を果たす。（潜在的に、遺伝子組み換え後の）選択されたＴヘルパー細胞が、ＨＩＶ合併症の治療のために所望されてもよい。
【０１６２】
ＣＤ４陽性細胞を、本発明およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４試薬を利用して、ヒト全血からの３つのバフィーコート生成物から単離または濃縮した。Ｔヘルパー細胞を、９３％／９８％／５１％の収率で、２７％／８．６％／１５．９％から９０％／８０％／８１．３％の純度に濃縮した。これらの結果は、十分にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４システムを使用して得られた結果の範囲内であった。
【０１６３】
（実施例１４：ＣＤ８陽性細胞の枯渇）
ＭＨＣクラスＩ分子に対するコレセプターである、ＣＤ８抗原は、細胞障害性Ｔ細胞上で、およびかすかに一部のＮＫ細胞上で発現される。
【０１６４】
同種移植設定において、ＣＤ８Ｔ細胞は、移植片対白血病効果を維持しながら移植片対宿主疾患を予防する目的で、移植片またはドナーリンパ球輸液から除去されてもよい（Ｍｅｙｅｒら、２００７）。
【０１６５】
ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を、本発明およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ８試薬を利用して、３つのバフィーコート生成物から枯渇させた。細胞障害性Ｔ細胞を、それぞれ、１１．５％／８％／１２％から０．００５％／０．００４％／０．００２％に枯渇させた。これは、非標的細胞の＞９９．９７％（＞３．５ｌｏｇ）除去を表す。ＣＤ８陰性標的細胞を、ほぼ完全に回収した（８５．１％／９０．９％／９４．４％）。
【０１６６】
（実施例１５：密度勾配遠心分離による、末梢血単核細胞の調製）
Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭは、骨髄、末梢血、および臍帯血からの単核細胞の単離のための滅菌密度媒体である。それは、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００（高度に分岐した高質量の親水性多糖）、ジアトリゾ酸ナトリウム、およびエデト酸カルシウム二ナトリウムＥＤＴＡから成る、密度１．０７７ｇ／ｍｌの水溶液である。赤血球および顆粒球が、１．０７７ｇ／ｍｌ以上の密度を有する一方で、リンパ球および単球は、より低い密度を有する。ヒト血液がＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの最上部で層状になると、遠心力下でリンパ球および単球を赤血球および顆粒球から分離することができる。
【０１６７】
本発明は、密度勾配遠心分離による末梢血単核細胞の調製に使用されている。遠心分離チャンバが回転している間に、ヒト全血からのバフィーコートを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅのリング上で層状にした。回転速度は、毎分２，９００回に調整され、２０分間維持されている。赤血球および顆粒球の外側リング、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅのリング、標的細胞（末梢血単核細胞、すなわち、リンパ球および単球）のリング、ならびに、血小板含有血漿およびＰＢＳ緩衝剤の内側リングを検出することができた。ルアーポートを通して、本発明の遠心分離チャンバから異なる層を除去し、異なる細胞の内容について分析した。元の血液生成物のＰＢＭＣの７０％を、ＰＢＭＣ層から回収した。この細胞懸濁は、元の赤血球細胞の１．１％しか含有しなかった。したがって、本発明は、末梢血単核細胞（第２のリング）または血小板が豊富な血漿（内側リング）の自動調製に使用することができる。
【０１６８】
（実施例１６：細胞培養）
本発明の遠心分離チャンバは、細胞培養フラスコまたはバッグと同様に、細胞の培養に使用することができる。３．２Ｅ５／ｍｌのヒト細胞株Ｋ５６２を、１０％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地の３０ｍｌの体積中で、遠心分離チャンバに塗布した。チャンバは、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベータの中に入れた。２４、４８、および７０時間後に、細胞計数および生存評価のために、内容物のアリコートをチャンバから除去した。播種した細胞は、８０％、９５％、および９５％生存率で、４．１Ｅ５／ｍｌ、６．４Ｅ５／ｍｌ、および９．２Ｅ５／ｍｌの生存細胞に拡大した。
【０１６９】
（実施例１７：本発明のシステムを使用する、ＣＤ１３３＋細胞の分離のための方法）ＣＤ１３３＋細胞の分離手順全体は、以下の作業を伴う、いくつかのステップを含む。
１．緩衝剤を入れることによる管類セットの準備
２．遠心分離チャンバへの骨髄試料の移転
３．遠心分離チャンバの中での骨髄試料の調製
４．ＣＤ１３３＋細胞の磁気分離
５．最終体積低減
【０１７０】
以下では、いくつかのステップを詳細に説明する。
１．緩衝剤を入れることによる管類セットの準備
第１のステップでは、ＰＥＢ（２ｍｍｏｌ／１ＥＤＴＡ、０．５％ＨＡＳが補充されたリン酸緩衝生理食塩水）を入れて、管類セットを準備した。
２．遠心分離チャンバへの骨髄試料の移転
管類セットの準備後、骨髄試料を試料バッグ３１２から遠心分離チャンバ３３２に移転させた。
３．遠心分離チャンバの中での骨髄試料の調製。遠心分離チャンバの中での試料調製は、上清がチャンバから除去される、いくつかのステップを含む。上清除去中、細胞を含まない上清のみ、または血小板洗浄の場合は血小板を伴う上清が、移転されるべきである。白血球（ＷＢＣ）、したがってＣＤ１３３＋細胞が、上清とともに除去されることを回避することが目標である。試料調製は、以下のステップを含む。
−血漿の生成
−血小板の低減
−ＣＤ１３３  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によるインキュベーション
−非結合ＣＤ１３３  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓの除去
【０１７１】
（血漿の生成：）
試料調製過程の始めに生成される血漿は、以下の２つの機能を果たす。
１．単球のＦｃ受容体を遮断し、単球に付着するマイクロビーズに結合されたＣＤ１３３抗体のＦｃ部を妨害する、遮断試薬としての役割を果たすこと。これは、単球による免疫磁気分離過程の生成物の低減した純度につながる。
２．最終細胞生成物が懸濁される、緩衝液に対する補充物としての役割を果たすこと。これは、使用した緩衝剤単独よりも、細胞生成物に対する生理的環境を提供する。血漿の生成および収集のために、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、および血小板としての材料の細胞成分の大部分がペレット化されるまで、試料が遠心分離される。細胞を含まない上清は、貯留部としての役割を果たす容器（３０３）に移転される。
【０１７２】
血漿生成のために、ＷＢＣ、ＲＢＣ、および血小板としての材料の細胞成分がペレット化されるまで、細胞材料を遠心分離チャンバ中、２０００ｒｐｍで遠心分離した。血漿の生成は、可能な限り低い細胞濃度の上清、したがって、全ての細胞血液成分のほぼ完全な沈殿につながる、遠心分離を必要とする。沈殿時間は、遠心分離チャンバの中への試料移転中に、自動的に決定される試料量に依存する。異なる試料量に対する沈殿時間を表２に示す。
【０１７３】
【表２】
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２０００ｒｐｍでの遠心分離後、６３２ｒｐｍ／分の減速率で、回転速度を１０００ｒｐｍまで穏やかに低減した。次いで、空気がチャンバから送出されるまで、６ｍｌ／分のポンプ速度で血漿を除去する。次いで、細胞を含まない上清を、貯留部としての役割を果たす容器に移転させる。後に、血漿を容器から処理中の部位に移転させることができ、そこで、遠心分離中に除去されなかった全ての残留細胞を除去するように、０．２μｍのフィルタに通して流すために使用される。
【０１７４】
（血小板の低減：）
血漿生成がチャンバの中の全上清を除去すると、７０ｍｌの残留量がチャンバの中にある。懸濁を希釈するように１５０ｍｌのＰＥＢを添加し、２２０ｍｌの合計量をもたらす。次いで、ドラムが６３２ｒｐｍ／分の減速率で１０００ｒｐｍまで減速される前に、ＲＢＣおよびＷＢＣをペレット化するために、ドラムを２０００ｒｐｍまで加速し、沈殿を１００秒間行う。この沈殿時間内に、チャンバの減速が開始すると、血小板のほんの一部しかペレットに達しない。次いで、全上清を６ｍｌ／分の速度で除去する。試料および除去した上清の分析は、５０．８％の実験的判定血小板除去を示した。残りの血小板は、フィルタ（３１０）を使用して除去する。
【０１７５】
（ＣＤ１３３マイクロビーズによるインキュベーション）
ＣＤ１３３マイクロビーズを、隔壁を有するガラスバイアル中で提供する。無菌状態を確保するために、０．２μｍの細孔径（３０６）のフィルタは、バイアルに接続された管類セットの分岐に統合される。バイアルは、通気式バイアルアダプタ（３０５）によって管類セットに接続される。試薬がチャンバに送出されると、ドラムの前の管類セットの部品内の圧力が監視される。バイアルが空になると、空気がフィルタへと移動する。フィルタが試薬によって湿潤されると、空気がフィルタの中へ移動する時に、細孔は依然として液体で充填されている。毛細管力により、空気はフィルタの膜を通過することができない。ポンプが稼働し続けると、圧力降下が圧力センサ（３２９）によって検出され、ソフトウェアがポンプを止める。このように、残留試薬を除去する洗浄ステップと組み合わされて、試薬がチャンバ中の細胞懸濁に自動的に移転される。
【０１７６】
遮断目的での血漿の移転後、量が９５ｍｌの標識量に調整され、インキュベーションが開始する。従来の試料調製過程では、試料調製バッグは、軌道震盪器の上に置かれ、室温で３０分間インキュベートされなければならない。本発明のシステムによるインキュベーション過程は、以下のとおりである。
１．ドラムを３００ｒｐｍの速度まで加速する。これは、液体をチャンバの壁に移動させる。
２．遠心分離を１０秒間実行する。
３．その後、ドラムを止める。液体が戻り、水平に整合した表面を有する。
４．チャンバが５０秒間停止し続ける。
５．３０分のインキュベーション時間が経過するまで、ステップ１−４を反復する。
【０１７７】
この過程は、チャンバの中の液体の効率的な混合につながる。
【０１７８】
（非結合抗ＣＤ１３３マイクロビーズの除去：）
標識化およびインキュベーション後に非結合試薬を除去するために、ビーズ洗浄を行う。洗浄過程では、以下のステップが３回反復される。
１．ＰＥＢ懸濁を希釈するために遠心分離機に移転させ、２３０ｍｌの合計量をもたらす。
２．ＲＢＣおよびＷＢＣの沈殿を２０００ｒｐｍで１４０秒間実行する。
３．チャンバの速度を２０００ｒｐｍから１０００ｒｐｍに低減する。
４．上清を２０ｍｌ／分の速度で完全に除去する。ビーズ洗浄過程は、３つの洗浄ステップから成り、非結合試薬の少なくとも９７．２％が除去される。
【０１７９】
４．ＣＤ１３３＋細胞の磁気分離
ビーズ洗浄過程後、磁気分離カラム（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ１３３＋細胞を分離する。したがって、５ｍｌ／分の負荷速度で、細胞懸濁を分離カラム上に移転させる。磁気標識細胞を磁化カラムの中に保持し、カラムをＰＥＢで洗浄することによって、非標識細胞から分離する。保持したＣＤ１３３＋細胞を、カラムから磁界を除去することによって溶出させる。ＣＤ１３３＋細胞を管類セットのループの中へ送出し、分離カラム上に再搭載する。この過程をもう一度反復し、３度目の再搭載過程後に、最終的にＣＤ１３３＋細胞を２０ｍｌの溶出緩衝剤中で溶出させる（表３および図２６を参照）。溶出速度は、６００ｍｌ／分である。
【０１８０】
５．最終体積低減
心臓幹細胞療法のために、ＣＤ１３３＋細胞は、最大限でも６ｍｌの少ない最終量で入手可能となるべきである。通常、ＣＤ１３３＋細胞は、最終的に２０ｍｌ溶出緩衝剤中でＣｌｉｎｉＭＡＣＳカラムから溶出させられる。最終量の低減のために、３つの方法が可能である。単離または濃縮ＣＤ１３３＋細胞の最終量は、以下によって低減することができる。
【０１８１】
１．少量でのカラムからの溶出
２．磁気分離後の濾過、または
３．ＡｕｔｏＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用
【０１８２】
（少量でのカラムからの溶出：）
２０ｍｌの溶出緩衝剤中での溶出の代わりに、ＣＤ１３３＋細胞を、６ｍｌの溶出緩衝剤中でＣｌｉｎｉＭＡＣＳカラムから溶出させることができる。溶出速度は、６００ｍｌ／分である。この方法を、骨髄からのＣＤ１３３＋細胞の濃縮によって試験した。濃縮細胞をＦＡＣＳ分析によって判定した（表４および図２７を参照）。
【０１８３】
（磁気分離後の濾過）
２０ｍｌの溶出緩衝剤中でＣｌｉｎｉＭＡＣＳ分離カラムからの溶出後、ＣＤ１３３＋細胞を、４ｍｌ／分の速度でフィルタ（Ｐａｌｌ  ＩＶ−５、０．２μｍ、またはＲｏｗｅＦｉｌ  ２４、１．２μｍ）上に移転させることができる。その後、細胞をフィルタから２ｍｌで溶出させる。この方法を、骨髄からのＣＤ１３３＋細胞の濃縮によって試験した。濃縮細胞をＦＡＣＳ分析によって判定した（表５および図２８を参照）。
【０１８４】
（ＡｕｔｏＭＡＣＳカラムを使用することによる最終体積低減）
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳカラムからの溶出後、ＣＤ１３３＋細胞を、４ｍｌ／分の速度でａｕｔｏＭＡＣＳカラム上に搭載することができる。その後、ＣＤ１３３＋細胞をａｕｔｏＭＡＣＳカラムから４ｍｌで溶出させる。この方法を、骨髄からのＣＤ１３３＋細胞の濃縮によって試験した。濃縮細胞をＦＡＣＳ分析によって判定した（表６および図２９を参照）。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
【表４】
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【０１８７】
【表５】
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【０１８８】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９Ａ】
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【図１０】
2014100588.tif 000019
【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１４Ｍ】
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【図１４Ｎ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2014100588.tif 000055
【図２９】
2014100588.tif 000056
【外国語明細書】
2014100588000001.pdf