(57)【要約】      （修正有）【課題】１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光方法及び酵素免疫測定用基質試薬として使用可能な、熱安定性に優れた化学発光用材料の提供。【解決手段】式（Ｉ）2014141642.tif 000011で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２はＨ、アルキル基等；Ｒ３はアルキル基、アリール基；Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環とヘテロ原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは式（ＩＩ）2014141642.tif 000012であり、Ｒ４はリン酸塩基等；Ｒ５はＨ等である。）を、化学発光させる際に、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム及びフルオレセインを添加する化学発光方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2014141642.tif 000005
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、Ｒ１、Ｒ２は一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基を形成することもできる。Ｒ３はアルキル基又はアリール基であり、Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは一般式（ＩＩ）
【化２】
2014141642.tif 000006
であり、Ｒ４はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９（ただし、Ｒ９はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）の溶液、並びに、
カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有する溶液、
を有することを特徴とする、化学発光用材料。
【請求項２】
カチオン性界面活性剤が、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2014141642.tif 000007
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２およびＲ１３のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍは窒素原子またはリン原子を示す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩である、請求項１に記載の化学発光用材料。
【請求項３】
カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムである、請求項１または２に記載の化学発光用材料。
【請求項４】
カチオン性界面活性剤が塩化ベンザルコニウムである、請求項１または２に記載の化学発光用材料。
【請求項５】
一般式（Ｉ）
【化４】
2014141642.tif 000008
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、Ｒ１、Ｒ２は一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基を形成することもできる。Ｒ３はアルキル基又はアリール基であり、Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは一般式（ＩＩ）
【化５】
2014141642.tif 000009
であり、Ｒ４はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９（ただし、Ｒ９はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）を、
塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択される活性化剤により化学発光させる際に、
カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を添加することを特徴とする、化学発光方法。
【請求項６】
カチオン性界面活性剤が、一般式（ＩＩＩ）
【化６】
2014141642.tif 000010
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２およびＲ１３のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍは窒素原子またはリン原子を示す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩である、請求項５に記載の化学発光方法。
【請求項７】
カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムである、請求項５または６に記載の化学発光方法。
【請求項８】
カチオン性界面活性剤が塩化ベンザルコニウムである、請求項５または６に記載の化学発光方法。
【請求項９】
化学発光させる際に、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択される活性化剤にカチオン性界面活性剤および蛍光性物質を添加し、次いで一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を添加する、請求項５〜８いずれかに記載の化学発光方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１，２−ジオキセタンの化学発光方法および化学発光用材料に関する。本発明による方法は生体成分、酵素、化学品などの高感度分析に有用であり、かつ熱安定性が非常に高く、本発明による化学発光用材料は酵素免疫測定用基質試薬として好適に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
１，２−ジオキセタン構造を有する水溶性化学発光物質は、生体成分の分析などのようにプロトン性溶媒を用いる条件下で極めて有用な化合物であり、近年ますますその需要は高まっている。しかしながら、プロトン性溶媒中において１，２−ジオキセタンを単独で用いた場合、非常に低い発光効率しか得られず、臨床検査のための免疫測定に使おうとしても、実用に耐えうる程の化学発光強度を得ることが出来なかった。このため、水溶性化学発光性ジオキセタンの化学発光を増強する必要があった。さらに、これまでの溶液状態での１，２−ジオキセタンは非常に不安定であり、熱安定性を高くすることが必要であった。本願明細書では、化学発光性化合物の発光強度を高めるのに有用な物質を、電子エネルギーの移動に直接関わるか否かによらず、広く増感剤またはエンハンサーと呼ぶこととする。
【０００３】
従来、２個のカルボニル含有化合物に分解すると共に電子エネルギーを放出して光を発生する１，２−ジオキセタンに対するエンハンサーとして、カチオン性界面活性剤（例えば特許文献１参照）、カチオン性界面活性剤と蛍光性物質の混合物（特許文献２参照）、ビニルベンジル４級アンモニウム塩ポリマー（例えば特許文献３参照）およびポリカチオン性の高分子ホスホニウム塩（特許文献４参照）が提案されてきた。また、アクリジニウムエステルの化学発光系に第４級ホスホニウム塩を添加した例（特許文献５参照）がある。
【０００４】
一方、フラン環を有する１，２−ジオキセタン誘導体（例えば特許文献６参照）は、発光の際に２つの化合物に分解しない化学発光物質であるが、その化学発光強度を高める増感剤についても報告されている（例えば特許文献７参照）。しかしながら、１，２−ジオキセタン誘導体については、保存安定性のさらなる向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平７−１２１２３７号公報
【特許文献２】特公平７−９１５３６号公報
【特許文献３】特公平７−３１２０１号公報
【特許文献４】特許第２６４８４２３号公報
【特許文献５】特開平５−７９９８５号公報
【特許文献６】特開平９−２１６８８７号公報
【特許文献７】特開２００５−７７１４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光に最適な発光方法を提供することを目的とする。また本発明は、酵素免疫測定用基質試薬としても使用可能な、熱安定性に優れ、高感度測定を可能にする化学発光用材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００８】
（１）一般式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
2014141642.tif 000002
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、Ｒ１、Ｒ２は一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基を形成することもできる。Ｒ３はアルキル基又はアリール基であり、Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環を形成してもよい。Ａｒは一般式（ＩＩ）
【００１０】
【化２】
2014141642.tif 000003
であり、Ｒ４はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９（ただし、Ｒ９はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）の溶液、並びに、
カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有する溶液、
を有することを特徴とする、化学発光用材料。
【００１１】
（２）カチオン性界面活性剤が、一般式（ＩＩＩ）
【００１２】
【化３】
2014141642.tif 000004
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２およびＲ１３のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍは窒素原子またはリン原子を示す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩である、（１）に記載の化学発光用材料。
【００１３】
（３）カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムである、（１）または（２）に記載の化学発光用材料。
（４）カチオン性界面活性剤が塩化ベンザルコニウムである、（１）または（２）に記載の化学発光用材料。
【００１４】
（５）一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択される活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を添加することを特徴とする、化学発光方法。
【００１５】
（６）カチオン性界面活性剤が、一般式（ＩＩＩ）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩である、（５）に記載の化学発光方法。
（７）カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムである、（５）または（６）に記載の化学発光方法。
（８）カチオン性界面活性剤が塩化ベンザルコニウムである、（５）または（６）に記載の化学発光方法。
（９）化学発光させる際に、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択される活性化剤にカチオン性界面活性剤および蛍光性物質を添加し、次いで一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を添加する、（５）〜（８）いずれかに記載の化学発光方法。
【００１６】
以下、本発明を更に詳細に説明する。はじめに、一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体について説明する。
【００１７】
置換基のアルキル基としては、炭素数１〜２０個の直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基（例えばｉ−プロピル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基等）、または環状になった基を例示することができる。これらのアルキル基は、さらに置換基を有していてもよく、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリール基等が置換していてもよい。
【００１８】
アリール基としては、例えばフェニル、ナフチル基等の炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素基、および、フリル、チエニル、ピリジル基等のように環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。アルコキシル基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基等の炭素数１〜２０個のアルコキシル基が直鎖状または分枝状に１〜５個結合したもの等を挙げることができる。アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ基等の炭素数７〜２０の基が例示でき、ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素等が例示できる。
【００１９】
またＲ１、Ｒ２が一体となり、ジオキセタン環にスピロ結合する環式又は多環式有機環基としては、例えばアダマンチル基をあげることができる。Ｒ３とＲ１又はＲ２とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環としては、例えばフラン環、ピラン環をあげることができる。またＲ４のリン酸塩基としては、例えばＰＯ４３−のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等をあげることができる。
【００２０】
このような置換基の中で、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２は炭素数１〜２０個の分枝鎖状アルキル基であり、Ｒ４はヒドロキシル基またはリン酸塩基であり、Ｒ５は水素原子またはハロゲン原子である。またＲ１が炭素数１〜２０個の分枝鎖状アルキル基であり、Ｒ２とＲ３とが一体となってジオキセタン環と酸素原子を含む縮合環を形成し、Ｒ４がリン酸塩基であり、Ｒ５が水素原子であることも好ましい。
【００２１】
このような置換基を有する一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体として、具体的には、リン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニル、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩、リン酸モノ−［５−（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプト−１−イル）−２−クロロフェニル］エステル  ジナトリウム塩などがあげられる。中でもリン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニル、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩が好ましく、５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩が更に好ましい。
【００２２】
本発明で使用されるカチオン性界面活性剤としては、後述の蛍光性物質と共に一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光を増強する効果をもつものであれば特に限定はない。好適なカチオン性界面活性剤として、例えば市販のＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ（ＴＲＯＰＩＸ社製）に含有されるポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリドや、一般式（ＩＩＩ）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩があげられる。
【００２３】
一般式（ＩＩＩ）において、炭素数８〜２０のアルキル基としては、炭素数８〜２０個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数１〜８のアルキル基としては、炭素数１〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数８〜２０のアリール基としては、例えばナフチル基等の炭素数８〜２０個の芳香族炭化水素基、又は環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が例示できる。
【００２４】
以上のような置換基を有する、一般式（ＩＩＩ）で表される第４級アンモニウム塩の好適な例として、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムがあげられる。また第４級ホスホニウム塩の好適な例は、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム、臭化エチルトリフェニルホスホニウム、臭化トリヘプチルフェニルホスホニウムおよび臭化テトラデシルトリフェニルホスホニウムがあげられる。その中でも、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムがきわめて望ましい。
【００２５】
本発明で用いられる蛍光性物質としては、カチオン性界面活性剤と共に一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光を増強する効果を持つものであれば特に限定はないが、例えばフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体（フルオレセインナトリウム、アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）色素、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、Ｒｈｏｄｏｌ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）およびヒドラジド、５−（および−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセインが挙げられる。その中でも、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソシアネートが好ましく、フルオレセインが特に望ましい。
【００２６】
本発明の化学発光用材料は、前述の溶液を有するものである。その溶媒としては、例えば水や水性緩衝液などのプロトン性溶媒が用いられる。また溶液中の１，２−ジオキセタン誘導体、カチオン性界面活性剤、蛍光性物質の濃度は特に限定されるものではないが、酵素免疫測定の基質として使用する場合には、後述のように使用時にその好適な濃度範囲をとれるものであることが好ましい。また１，２−ジオキセタン誘導体の溶液は、実質的にカチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有せず、これによって１，２−ジオキセタン誘導体の高い保存安定性が得られる。一方、ｐＨ調整剤や、保存安定性を確保するためにアジ化ナトリウムなどの保存剤を適宜含有していてもよい。
【００２７】
本発明では、一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を、活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を添加する。これにより従来法と同等以上の発光量を得ることができる。この時、本発明の化学発光用材料を用いることができる。
【００２８】
またここで使用される活性化剤は、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択されるものである。この活性化剤は、一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を発光させるために使用するが、一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の基Ｒ４に作用して不安定なオキシド中間体を経てカルボニル化合物に変化させると同時に化学発光を生じさせることのできるものである。例えばＲ４がヒドロキシル基ならば塩基が、またＲ４が−ＯＳｉ（Ｒ６Ｒ７Ｒ８）（ただし、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基ならばテトラブチルアンモニウムフルオライドが活性化剤として好適に使用できる。一般式（Ｉ）で表される１，２−ジオキセタン誘導体を酵素免疫測定の基質として使用する場合は、活性化剤として各種酵素たとえば、アルカリ性ホスファターゼ、アリールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼおよびガラクトシダーゼなどが好適に使用できる。特にＲ４がリン酸塩基の場合は、アルカリ性ホスファターゼが好適に使用できる。
【００２９】
本発明の方法において、使用する１，２−ジオキセタン誘導体の濃度は、特に限定はないが、酵素免疫測定の基質として使用する場合は、測定対象のゼロ濃度およびポジ（陽性）濃度の標準溶液に対する測定値が濃度対測定値の略直線関係が成り立つ範囲で適宜決定することが好ましい。好適にはその濃度は０．１〜３．０ｍＭの範囲に設定することができる。この範囲より低い濃度領域では、ポジ濃度に対する測定値が頭打ちの状態になり測定範囲の上限が低下してしまう恐れがある。逆にこの範囲より高い濃度領域では、ゼロ濃度に対する測定値のバックグラウンドが上がり、測定対象の低濃度領域の検出感度が悪化する恐れがある。
【００３０】
使用するカチオン性界面活性剤の濃度は０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭの範囲とするのが好適である。最適な発光量を得るためには０．５〜４．０ｍＭとするのが特に好ましい。使用する蛍光性物質の濃度は、１，２−ジオキセタン誘導体の濃度が高ければそれにつれて高くする必要があるが、約０．１〜４．０ｍＭとすることが増感効果を高める点で好ましい。
【００３１】
化学発光のさせ方には限定はなく、１，２−ジオキセタン誘導体を活性化剤により発光させる際に、カチオン性界面活性剤及び蛍光性物質を添加すればよい。添加の順序には特に限定はなく、適宜、順次添加すればよく、また同時に添加してもよい。活性化剤にカチオン性界面活性剤及び蛍光性物質を添加し、次いで１，２−ジオキセタン誘導体を添加してもよい。その反応溶液を一定時間後に発光検出器に導入し、化学発光を検出することができる。発光検出器としては、シングルフォトンカウンターを装備したルミノメーターが好適に使用できる。増感剤等により強度の高い発光が得られるときは、シリコンフォトダイオードや写真フィルムが使用できる。活性化剤として酵素を用いるときは、反応溶液を発光検出器に導入する前に酵素反応停止剤を添加してもよい。
【００３２】
また、酵素反応の進行と同時に進行する化学発光反応を連続的にモニターし、発光量の増加率を測定することができる。増加率が一定の時間領域であれば、酵素反応開始時すなわち化学発光反応開始時と発光検出時との間の時間を厳密に規定する必要がなくなる。化学発光反応を連続的にモニターする場合、化学発光基質との酵素反応の至適ｐＨと、それに引き続いて起こる化学発光反応の至適ｐＨとは、できるだけ一致していることが好ましい。例えば活性化剤がアルカリ性ホスファターゼのときは、酵素反応の至適ｐＨと化学発光反応の至適ｐＨとはほぼ一致し、ｐＨ約１０の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液またはジエタノールアミン緩衝液を使用することが好適である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の化学発光用材料は、従来のものよりきわめて高い保存安定性を有する。また本発明の化学発光方法によれば、高い発光量を得ることができる。
【実施例】
【００３４】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
リン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニルを０．８ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５０ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を調製した。蛍光性物質としてフルオレセインを０．３ｍＭ、カチオン性界面活性剤として臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを２．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５００ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を調製した。この調製したそれぞれの溶液を、４℃又は４０℃に７日間保管した。各溶液を２５μＬとり混合したのちに、アルカリ性ホスファターゼ０．００５μｇ／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬと反応させ、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（検出器：シングルフォトンカウンター；測定波長領域：３８０〜６３０ｎｍ）を使用し、測光条件は上述のように化学発光用材料と酵素の溶液とを混合した５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。４℃保管品の発光量は１，７３６，６５８であった。４０℃保管品の発光量は１，６２１，７９３であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９３．４％であった。
【００３６】
［実施例２］
１，２−ジオキセタン誘導体を５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩とした以外は、実施例１と同様の方法にて実施した。４℃保管品の発光量は２，２０４，７４１であった。４０℃保管品の発光量は２，１４７，３３１であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９７．４％であった。
【００３７】
［実施例３］
カチオン性界面活性剤を塩化ベンザルコニウムとした以外は、実施例２と同様の方法にて実施した。４℃保管品の発光量は１，００５，６５１であった。４０℃保管品の発光量は１，００４，２９３であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９９．９％であった。
【００３８】
［実施例４］
アルカリ性ホスファターゼ０．００５μｇ／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬに、蛍光性物質としてフルオレセインを０．３ｍＭ、カチオン性界面活性剤として臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを２．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５００ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）（４℃又は４０℃に７日間保管したもの）を２５μＬ添加し、次いで５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩を０．８ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５０ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）（４℃又は４０℃に７日間保管したもの）を２５μＬ添加し、その発光量を実施例１と同様にして測定した。４℃保管品の発光量は２，１０２，１０３であった。４０℃保管品の発光量は２，０５５，８１８であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９７．８％であった。
【００３９】
［比較例１］
リン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニルを０．４ｍＭ、蛍光性物質としてフルオレセインを０．１５ｍＭ、カチオン性界面活性剤として臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを１．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５００ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を調製した。この調製した溶液を、４℃又は４０℃に７日間保管した。この溶液５０μＬと、アルカリ性ホスファターゼ０．００５μｇ／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬと、を反応させ、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（検出器：シングルフォトンカウンター；測定波長領域：３８０〜６３０ｎｍ）を使用し、測光条件は上述のように化学発光用溶液と酵素の溶液とを混合した５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。４℃保管品の発光量は１，６１０，０８６であった。４０℃保管品の発光量は１，４２９，５３６であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は８８．８％であった。実施例１と比較して、４．６％安定性が低下した。
【００４０】
［比較例２］
１，２−ジオキセタン誘導体を５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩とした以外は、比較例１と同様の方法にて実施した。４℃保管品の発光量は２，１２７，８３５であった。４０℃保管品の発光量は１，９６０，６５５であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９２．１％であった。実施例２と比較して、５．３％安定性が低下した。実施例４と比較して、５．７％安定性が低下した。
【００４１】
［比較例３］
カチオン性界面活性剤を塩化ベンザルコニウムとした以外は、比較例２と同様の方法にて実施した。４℃保管品の発光量は１，１２５，１２２であった。４０℃保管品の発光量は１，０４８，６５９であった。４０℃の発光量は４℃の発光量と比較して、残存率は９３．２％であった。実施例３と比較して、６．７％安定性が低下した。
【００４２】
以上の結果から、１，２−ジオキセタン誘導体の溶液と、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有する溶液とは、別々の溶液として保存することにより、熱安定性に優れた化学発光基質溶液を提供することができる。