(57)【要約】【課題】修飾された組換え第ＶＩＩＩ因子およびフォンウィルブランド因子ならびにその使用方法の提供。【解決手段】本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで減少したクリアランスおよび増加した半減期を有するコンジュゲート化凝固タンパク質への当技術分野における必要性を満たす。本発明は、クリアランス受容体との相互作用を阻害することによって凝固タンパク質の残存を増加させる新規な方法を提供する。本発明はまた、凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害する組成物を調製する方法も提供する。その組成物および製剤を含む、コンジュゲート化凝固タンパク質もまた、本発明によって提供される。【選択図】図１
2014141532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００７年１１月９日に出願したＵＳＳＮ６０／９８６，９７５に対する優先権を主張する。ＵＳＳＮ６０／９８６，９７５は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
なし
（コンパクトディスクで提出される表、またはコンピュータプログラムリスト付録である、「配列表」への言及。）
なし
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
止血は様々な止血反応経路の相互作用を含み、最終的に血栓の形成をもたらす。血栓は、主に凝集した血小板および不溶性の架橋化フィブリンからなる、血管壁表面への血液成分の堆積物である。フィブリン形成は、凝固酵素であるトロンビンによるフィブリノゲンの制限されたタンパク質分解の結果である。トロンビンは、活性化された血小板および白血球ならびに様々な血管細胞の表面で起こる一連の酵素前駆体の活性化、凝固カスケードの最終生成物である（概論に関しては、非特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
凝固カスケードにおける重要な機能は、活性化第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）および活性化第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子）の複合体による第Ｘ因子の活性化にある。この複合体の成分の欠乏または機能低下は、血友病として公知である血液疾患に関与している（非特許文献２）。血友病Ａは第ＶＩＩＩ因子活性の欠乏に関連しており、一方、血友病Ｂは第ＩＸ因子の欠乏に関連している。現在の治療は、正常な凝固因子を含む医薬製剤を使用した補充療法からなる。これらの血小板症のうち、血友病Ａがより頻繁に起こり、男性１００００人のうち約１人が罹患する。血友病Ａ患者における補充療法は、静脈内注入による正常な第ＶＩＩＩ因子を含有する製剤の反復投与を含む。注入の間隔は、血液循環における第ＶＩＩＩ因子活性の低下の関数である。注入後の第ＶＩＩＩ因子活性の半減期は、個体によって１０〜３０時間まで異なる。したがって、予防的療法は２〜３日おきの注入を必要とする。このことは、特に、静脈内注入のための頻繁な針穿刺後の局所的止血のために静脈アクセスが困難となった場合、血友病患者の生活の重い負担となる。
【０００５】
半減期の長い第ＶＩＩＩ因子を使用することによって注入の頻度を下げることができれば、特に有利であるだろう。第ＶＩＩＩ因子の半減期は、例えば、当該のクリアランス受容体に対する（１つまたは複数の）結合部位上において第ＶＩＩＩ因子を修飾することによって直接的に、またはそれらの受容体と第ＶＩＩＩ因子の相互作用を妨害する化合物を使用することによって間接的に、そのクリアランスに不可欠な受容体に対する第ＶＩＩＩ因子の親和性を減少させることによって、第ＶＩＩＩ因子分解（クリアランス）の機構を妨害することによって延長することができる。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子クリアランス機構、このプロセスに関わる細胞受容体、および第ＶＩＩＩ因子受容体相互作用に関わる分子部位が不明であることから、このような作用物質の設計はこれまで妨げられてきた。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子のクリアランス機構に関する分子領域における知見は限られている。第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、２３３２個のアミノ酸を含み、典型的なドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する一本鎖ポリペプチドとして合成される（非特許文献３；非特許文献４）。第ＶＩＩＩ因子は、細胞内エンドプロテアーゼによるプロセシングの結果として、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体複合体として血液循環に入る。軽鎖は、アミノ酸残基１６４９〜２３３２からなり、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインを含む。重鎖は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ（残基１〜１６４８）を含み、Ｂドメイン内の複数の位置における限定タンパク質分解のために不均一である。第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体は生物学的活性を有さないが、ヘテロ二量体は、トロンビンまたは第Ｘａ因子のタンパク質分解による活性化後に、酵素第ＩＸａ因子の補因子として活性になる。タンパク質分解は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖の両方に影響を及ぼし（非特許文献５）、軽鎖のアミノ末端断片の切断および重鎖内のドメイン連結部位の開裂（ドメインＡ１−Ａ２およびＡ２−Ｂの間）をもたらす。活性型補因子、第ＶＩＩＩａ因子は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメインおよびドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２を含む軽鎖からなるヘテロ三量体である。
【０００７】
非活性型第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体の半減期は、（第ＶＩＩＩａ因子ではなく）第ＶＩＩＩ因子に対する強い親和性を示し、キャリアタンパク質として働くフォンウィルブランド因子の存在に強く依存することが当技術分野において周知である（非特許文献２）。血液循環中に検出可能なフォンウィルブランド因子を有さない３型フォンウィルブランド病に罹患している患者は、二次的な第ＶＩＩＩ因子欠乏症にも罹患することが公知である。加えて、こうした患者に静脈内投与された第ＶＩＩＩ因子の半減期は２〜４時間であり、これは血友病Ａ患者において観察される１０〜３０時間よりも著しく短い。
【０００８】
これらの発見から、第ＶＩＩＩ因子は血液循環からの急速なクリアランスが起こり易く、このプロセスは、天然の担体であるフォンウィルブランド因子との複合体形成によってある程度まで阻害されることになる。それにもかかわらず、望ましくないことにその半減期は短いままである。
【０００９】
最近、トロンビンによって活性化された第ＶＩＩＩ因子が、低密度リポタンパク質受容体タンパク質（「ＬＲＰ」）に結合することが速報において示された（非特許文献６）。この要約は、トロンビンによって活性化された第ＶＩＩＩ因子断片の細胞吸収および分解を記載し、Ａ２ドメインが、第ＶＩＩＩａ因子ヘテロ三量体の２つの別のサブユニットとは異なり、細胞結合ＬＲＰと相互作用することを報告している。著者らは、Ａ２ドメインのＬＲＰへの結合が、第ＶＩＩＩａ因子ヘテロ三量体におけるＡ２ドメインの緩い相互作用をさらに不安定にし、それにより第ＶＩＩＩａ因子活性を低下させるように調節することを示唆した。
【００１０】
ＬＲＰは、様々なタンパク質のクリアランスに関わる受容体の１つであることが公知である。この分野においてＬＲＰは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体のファミリーに属するアルファ２−マクログロブリン受容体としても公知である。これは、非共有結合によって連結された２つのポリペプチド鎖であるアルファ鎖（５１５ｋｄ）およびベータ鎖（８５ｋｄ）で構成される（概説については非特許文献７を参照されたい）。ＬＲＰは、リポタンパク質およびプロテイナーゼ異化のマルチリガンド受容体である。β鎖は、膜貫通ドメインおよびエンドサイトーシスに不可欠な短い細胞質尾部を含む。アルファ鎖は大きな細胞外ドメインとして機能し、３種類の繰り返し：上皮成長因子様ドメイン、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号：１）配列およびＬＤＬ受容体クラスＡドメインを含む。これらのクラスＡドメインは、４つの分かれたクラスター、クラスターＩ（２ドメイン）、ＩＩ（８ドメイン）、ＩＩＩ（２０ドメイン）およびＩＶ（１１ドメイン）に存在する。これらのクラスターが、リガンド結合に関与していることが示された。ＬＲＰは、胎盤、肺、脳および肝臓などの複数の組織において発現される。肝臓において、ＬＲＰは実質細胞およびクッパー細胞上に存在する。さらにＬＲＰは、線維芽細胞、平滑筋細胞、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、および単球などの複数の細胞型において発現される。単球からマクロファージへの分化は、ＬＲＰ発現の劇的な増加と関連している。最後に、ＬＲＰは、ともに第ＶＩＩＩ因子を含む哺乳動物タンパク質を発現させるために頻繁に使用される（非特許文献８）サル腎細胞（ＣＯＳ）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの細胞型においても発現される（非特許文献９）。
【００１１】
ＬＲＰは、プロテアーゼ、クニッツ型インヒビター、プロテアーゼセルピン複合体、リパーゼおよびリポタンパク質を含む多様なリガンドのクリアランスに関わっており、このことは、ＬＲＰが様々な生理学的および病態生理学的なクリアランスプロセスにおいて極めて重要な役割を果たすことを示唆している（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＬＲＰの生理学的重要性は、ＬＲＰノックアウトマウスが胚形成期後に残存しないという発見に端を発する（非特許文献１３）。ＬＲＰ分泌は、ＬＲＰが多数のリガンドと相互作用することによって複雑化されることがある。しかしながら、細胞内でＬＲＰは、そのシャペロンタンパク質、受容体結合タンパク質（ＲＡＰ）と結合している。ＲＡＰに結合すると、ＬＲＰはその公知のリガンドのいずれとも相互作用することができない（非特許文献１４）。
【００１２】
ＬＲＰとその天然リガンドとの相互作用は、可溶性ＬＲＰ断片によって効果的に遮断することができる。こうした断片は、組換え技術を含む様々な当技術分野において公知の方法によって得ることができ、したがって有効なＬＲＰアンタゴニストへのアクセスを提供する（非特許文献１５；非特許文献１６）。
【００１３】
プロテアーゼ、インヒビターおよびプロテアーゼインヒビター複合体のクリアランスにおけるＬＲＰの典型的な役割を考慮すると、ＬＲＰは活性化された非酵素補因子第ＶＩＩＩａ因子にも結合することに注意するべきである（非特許文献６）。この開示は第ＶＩＩＩａ因子の調節におけるＬＲＰの役割を示唆しているものの、非活性型ヘテロ二量体第ＶＩＩＩ因子の調節における役割に関して、これは血液循環からの第ＶＩＩＩ因子のクリアランス、したがって第ＶＩＩＩ因子の半減期に関して興味深い可能性があるのだが、何の手掛かりも与えない。
【００１４】
そのため、非特許文献１７および特許文献１において、第ＶＩＩＩ因子の重鎖ではなく軽鎖が、表面が露出したＬＲＰ１受容体タンパク質に結合することがさらに示された。さらなる実験により、ＬＲＰ１結合活性に関与する軽鎖のＣ２およびＡ３−Ｃ１領域の両方において、いくつかのエキソサイトの特定につながった。これにより、この領域の特定の突然変異がタンパク質間の相互作用を弱めるという発見につながった。
【００１５】
フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）は、約５００〜２００００ｋＤの範囲の大きさの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ｖＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって一緒に結合した２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットで構成される。ｖＷＦは、損傷した血管壁の内皮下への初期の血小板接着を仲介し、またより大きな多量体だけが止血活性を示す。多量体化したＶＷＦは、血小板接着を促進するために、ＶＷＦのＡ１ドメインにおける相互作用によって血小板表面糖タンパク質Ｇｐ１ｂαに結合する。内皮細胞は大きいポリマー形態のｖＷＦを分泌し、低分子量を有するこうした形態のｖＷＦ（低分子量ｖＷＦ）はタンパク質分解による切断から生じることが推定される。大きい分子量を有する多量体は、内皮細胞のバイベル−パラーデ小体中に蓄積され、刺激されると遊離する。ｖＷＦの完全長ｃＤＮＡがクローニングされた；プロポリペプチドは完全長プレプロｖＷＦのアミノ酸残基２３〜７６４に対応する（非特許文献１８）。
【００１６】
さらに、単量体ｖＷＦは、血漿中で第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の分子担体として機能し、凝固因子を安定化させる。ｖＷＦタンパク質レベルの減少またはＦＶＩＩＩ結合親和性の低下によるＦＶＩＩＩ結合活性の減少は、フォンウィルブランド病の３つの型のうちの１つを引き起こす。加えて、または代わりに、ある特定の型のフォンウィルブランド病は、Ｇｐ１ｂαを介した血小板結合レベルの、すなわち、２Ａ、２Ｂ、および２Ｍ型の増加または減少によって特徴付けられる（非特許文献１９に要約されている）。したがって、ＦＶＩＩＩおよびＧｐ１ｂαの両方とのｖＷＦの相互作用の調整は、血友病およびフォンウィルブランド病の両方の治療のために実行可能な戦略である。
【００１７】
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの様々な領域における修飾を含む、第ＶＩＩＩ因子の薬物動態プロファイルを向上させようと試みるいくつかの従来技術が存在した。
【００１８】
特許文献２は、特定のプロテアーゼにより触媒される切断のための分子の不安定性を減少させる、アルギニンおよびリジン残基を含むタンパク質分解のインターフェース、例えば、Ａｒｇ１７２１およびＡｌａ１７２２の間の第ＶＩＩＩａ因子インターフェースの様々な修飾を記載している。
【００１９】
特許文献３、特許文献４および特許文献５は、重鎖のＡ２領域において修飾を有する第ＶＩＩＩ因子誘導体を記載している。
【００２０】
特許文献６は、修飾が分子の金属結合特性の改変を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド類似体を開示している。
【００２１】
特許文献７は、Ａｒｇ残基に隣接する１つまたはいくつかのアミノ酸残基上に修飾が提供される第ＶＩＩＩ：Ｃ因子ポリペプチド類似体を記載している。
【００２２】
ＥＰ−０８０８９０１は、第ＶＩＩＩ因子の少なくとも１つの免疫優勢領域中に少なくとも１つの突然変異を含む第ＶＩＩＩ因子変異体の構築および第ＶＩＩＩ因子インヒビターを用いた患者の治療におけるこれらの第ＶＩＩＩ因子変異体の使用を記載している。こうした修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、第ＶＩＩＩ因子変異体の半減期の延長または安定性の向上をもたらさない。
【００２３】
特許文献１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＲＰ１に対する親和性の減少した突然変異第ＶＩＩＩ因子変異体の構築を記載しており、これらのタンパク質変異体がｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合に半減期が増加するであろうことをさらに示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６９１９３１１号明細書
【特許文献２】国際公開第８７／０７１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／１８８２７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９５／１８８２８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９５／１８８２９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９７／０３１９３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９７／０３１９５号パンフレット
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｋ．  Ｇ．  Ｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ、１９９０年、７６巻、１〜１６頁
【非特許文献２】Ｊ．  Ｅ．  ＳａｄｌｅｒおよびＥ．  Ｗ．  Ｄａｖｉｅ：Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ，  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ，  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｇ．  Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（編）：Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８７年、５７６〜６０２頁
【非特許文献３】Ｇ．  Ａ．  Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、１９８４年、３３７〜３４２頁
【非特許文献４】Ｊ．  Ｊ．  Ｔｏｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、１９８４年、３４２〜３４７頁
【非特許文献５】Ｍ．  Ｊ．  Ｓ．  Ｈ．  Ｄｏｎａｔｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７０巻、１９９５年、３６４８〜３６５５頁
【非特許文献６】Ａ．  Ｙａｋｈｙａｅｖら、Ｂｌｏｏｄ、第９０巻（付録１）、１９９７年、１２６−Ｉ（要約）
【非特許文献７】Ｄ．  Ｋ．  Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９巻、１９９５年、８９０〜８９８頁
【非特許文献８】Ｒ．  Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇ．  Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．  第８巻（付録２）、１９９７年、３〜１４頁
【非特許文献９】Ｄ．  Ｊ．  ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２９巻、１９９５年、１５３３〜１５４１頁
【非特許文献１０】Ｎａｒｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ、２巻、５５５〜５６０頁、１９９８年
【非特許文献１１】Ｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８９巻、７４２２〜７４２６頁、１９９２年
【非特許文献１２】Ｋｏｕｎｎａｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻、６５２３〜６５２９頁、１９９６年
【非特許文献１３】Ｈｅｒｚ，  Ｊ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ  ４巻、１９９３年、１０７〜１１３頁
【非特許文献１４】Ｈｅｒｚら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻、２１２３２〜２１２３８頁、１９９１年
【非特許文献１５】Ｉ．  Ｒ．  Ｈｏｒｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻、１９９７年、１３６０８〜１３６１３頁
【非特許文献１６】Ｂ．  Ｖａｓｈら、Ｂｌｏｏｄ、９２巻、１９９８年、３２７７〜３２８５頁
【非特許文献１７】Ｌｅｎｔｉｇら（ＪＢＣ  ２７４巻（３４号）：２３７３４〜９頁（１９９９年））
【非特許文献１８】Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍら（１９９５年）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ第１巻、７７  ９０
【非特許文献１９】Ｃａｓｔａｍａｎら、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  第８８巻（１）：９４〜１０８頁（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従来技術を考慮すると、第ＶＩＩＩ因子またはフォンウィルブランド因子の化学的コンジュゲートが細胞のクリアランス受容体に対する修飾された結合親和性を示し、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のクリアランス率の減少、結果として第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長および安定性の向上をもたらすであろうと示唆する文献はない。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで減少したクリアランスおよび増加した半減期を有するコンジュゲート化凝固タンパク質への当技術分野における必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の簡単な説明）
本発明は、クリアランス受容体との相互作用を阻害することによって凝固タンパク質の残存を増加させる方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、治療的有効量の、修飾された結合タンパク質を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程とを含む。
【００２８】
一実施形態において、本発明の修飾された凝固タンパク質は、凝固カスケードに関与するものから選択される。特定の実施形態において、凝固タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）またはフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）であってもよい。一実施形態において、クリアランス受容体は、ＬＦＰ受容体、ｖＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、メガリン受容体、およびマクロファージマンノース受容体のクラスから選択されてもよい。特定の実施形態において、クリアランス受容体はＬＲＰ１である。
【００２９】
ある種の実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、ポリ炭水化物、ポリシアル酸などの水溶性ポリマーのコンジュゲーションによって修飾される。特定の実施形態において、水溶性ポリマーは、リンカーを介して凝固タンパク質にコンジュゲートされていてもよい。別の実施形態において、水溶性ポリマーは、タンパク質に直接結合されていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーは、凝固タンパク質に安定にコンジュゲートされていても、あるいは、切り離し可能なリンカーを介して凝固タンパク質にコンジュゲートされていてもよい。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、クリアランス受容体との相互作用を阻害することによって第ＶＩＩＩ因子の残存を増加させる方法を提供する。ある種の実施形態において、この方法は、（ａ）第ＶＩＩＩ因子の結合タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、（ｂ）治療的有効量の、前記修飾された結合タンパク質を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程とを含む。特定の実施形態において、結合タンパク質はフォンウィルブランド因子である。ある種の実施形態において、クリアランス受容体はＬＲＰ１である。特定の実施形態において、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリ炭水化物、ポリシアル酸などから選択される。さらに別の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子とＦＶＩＩＩ結合タンパク質の両方が水溶性ポリマーで修飾される。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害する組成物を調製する方法を提供する。ある種の実施形態において、この方法は、凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程を含み、この修飾が、凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害することによって哺乳動物の血液循環におけるタンパク質の残存を増加させる。本発明のある実施形態において、凝固タンパク質はＦＶＩＩＩまたはＶＷＦである。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでクリアランス受容体への結合の減少を示し、増加した半減期を有する修飾された凝固タンパク質を提供する。ある種の実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、水溶性ポリマーまたは炭水化物部分にコンジュゲートされる。一実施形態において、本発明の修飾された凝固タンパク質は、ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩから選択される。特定の実施形態において、本発明の修飾された凝固タンパク質は、血漿（血漿由来）ＶＷＦもしくはＦＶＩＩＩ、組換えＶＷＦもしくはＦＶＩＩＩ、または生物学的に活性なＶＷＦもしくはＦＶＩＩＩ誘導体であってもよい。
【００３３】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで残存の増加した修飾凝固タンパク質を含む組成物であって、前記凝固タンパク質が水溶性ポリマーで修飾されている組成物もまた提供する。ある種の実施形態において、本発明の修飾された凝固タンパク質は、それらのクリアランス受容体に対して減少した結合親和性を有する。本発明はまた、血液凝固疾患の個体に投与するための修飾された凝固タンパク質の医薬製剤も提供する。ある種の実施形態において、本発明の医薬組成物は、修飾されたＦＶＩＩＩ、修飾されたＶＷＦ、または両方を含む。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、血液凝固疾患の個体を治療する方法であって、修飾された凝固タンパク質を、それを必要とする患者に投与する工程を含み、前記凝固タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで増加した残存を有する方法を提供する。ある種の実施形態において、凝固タンパク質はＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ、または両方である。別の実施形態において、凝固タンパク質は、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリ炭水化物、ポリシアル酸などの水溶性ポリマーで修飾される。一実施形態において、修飾された凝固タンパク質は、そのクリアランス受容体に対する減少した結合親和性を有する。特定の一実施形態において、クリアランス受容体はＬＲＰ１である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
クリアランス受容体との相互作用を阻害することによって凝固タンパク質の残存を増加させる方法であって、
（ａ）凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、
（ｂ）治療的有効量の、該修飾された凝固因子を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程と
を含み、
該修飾が哺乳動物の血液循環における該タンパク質の残存を増加させる方法。
（項目２）
前記凝固タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子またはフォンウィルブランド因子である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記クリアランス受容体が、ＬＦＰ受容体、ｖＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、メガリン受容体、およびマクロファージマンノース受容体のクラスに由来する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記クリアランス受容体がＬＲＰ１である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記水溶性ポリマーが前記凝固タンパク質から切り離し可能である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記水溶性ポリマーが前記タンパク質に安定に結合されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記水溶性ポリマーが前記タンパク質にリンカーを介して結合されている、項目１に記載の方法。
（項目９）
クリアランス受容体との相互作用を阻害することによって第ＶＩＩＩ因子の残存を増加させる方法であって、
（ａ）第ＶＩＩＩ因子の結合タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、
（ｂ）治療的有効量の、該修飾された結合タンパク質を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程と
を含み、
該結合タンパク質がフォンウィルブランド因子である方法。
（項目１０）
前記クリアランス受容体がＬＲＰ１である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
第ＶＩＩＩ因子が、修飾されたフォンウィルブランド因子とともに投与される、項目９に記載の方法。
（項目１３）
投与される前記第ＶＩＩＩ因子も水溶性ポリマーで修飾されている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害する組成物を調製する方法であって、凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程を含み、該修飾が、凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害することによって哺乳動物の血液循環における該タンパク質の残存を増加させる方法。
（項目１５）
前記凝固タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子およびフォンウィルブランド因子からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記クリアランス受容体が、ＬＦＰ受容体、ｖＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、メガリン受容体、およびマクロファージマンノース受容体のクラスに由来する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記受容体がＬＲＰ１である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記水溶性ポリマーが前記凝固タンパク質から切り離し可能である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記水溶性ポリマーが前記タンパク質に安定に結合されている、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記水溶性ポリマーが、前記タンパク質にリンカーを介して結合されている、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
血液凝固疾患の個体を治療する方法であって、血液凝固疾患に罹患している患者に水溶性ポリマーで修飾された凝固タンパク質を投与する工程を含み、該修飾された凝固タンパク質がそのクリアランス受容体に対する減少した結合親和性を有する方法。
（項目２２）
前記凝固タンパク質が第ＶＩＩＩ因子またはＶＷＦである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記クリアランス受容体がＬＲＰ１である、項目２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記血液凝固疾患が、血友病およびフォンウィルブランド病からなる群から選択される、項目２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
個体において第ＶＩＩＩ因子欠乏を特徴とする疾患を治療する方法であって、修飾されたＶＷＦを該個体に投与する工程を含み、該ＶＷＦが水溶性ポリマーにコンジュゲートされている方法。
（項目２７）
ＦＶＩＩＩを前記個体に投与する工程をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ＦＶＩＩＩが水溶性ポリマーにコンジュゲートされていない、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ＦＶＩＩＩが水溶性ポリマーにコンジュゲートされている、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
水溶性ポリマーにコンジュゲートされた凝固タンパク質を含む修飾された凝固タンパク質であって、そのクリアランス受容体に対する減少した結合親和性を有する修飾された凝固タンパク質。
（項目３１）
前記凝固タンパク質がＦＶＩＩＩまたはＶＷＦのいずれかである、項目３０に記載の修飾された凝固タンパク質。
（項目３２）
前記クリアランス受容体が、ＬＦＰ受容体、ｖＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、メガリン受容体、およびマクロファージマンノース受容体のクラスに由来する、項目３０に記載の修飾された凝固タンパク質。
（項目３３）
前記クリアランス受容体がＬＲＰ１である、項目３０から３２のいずれか一項に記載の修飾された凝固タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】固定化ＬＲＰ１に対するｗｔ−ｒＦＶＩＩＩ（０〜５０μｇ）の結合のＳＰＲ解析。
【図２】ＳＰＲ解析によって決定された、固定化ＬＲＰ１に対するｗｔ−ＦＶＩＩＩの結合とｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの結合との比較。
【図３】ＳＰＲ解析によって決定された、固定化ＬＲＰ１に対するｗｔ−ＦＶＩＩＩの結合とＰＳＡ−ＦＶＩＩＩの結合との比較。
【図４】ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合に対するｖＷＦとＰＥＧ化ｖＷＦとの阻害性結合効果の比較。両方のｖＷＦ構築体について、同様の阻害がみられる。
【図５】ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合に対するｖＷＦとＰＳＡ−ｖＷＦとの阻害性結合効果の比較。ＰＳＡ−ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１相互作用の妨害において、ｗｔ−ｖＷＦよりもわずかに効率が低いようである。
【図６】ＳＰＲ解析によって決定された、ボトロセチンの存在下におけるＧｐＩｂαへのｒＶＷＦ、天然ＶＷＦおよびコンジュゲート化ＶＷＦの結合の比較。ＧｐＩｂαへのＰＥＧ化ＶＷＦの結合は約５０％減少し、ＰＳＡ−ＶＷＦはボトロセチン依存的なＧｐＩｂαへの結合能を実質的に欠く。
【図７】ナノボディＡＵ／ｖＷＦａ−１１へのｒＶＷＦ（ｗｔ）、天然ＶＷＦ（ＮＰＰ）、突然変異ｒＶＷＦ（２Ｂ）、およびコンジュゲート化ＶＷＦの結合の比較。ナノボディへのコンジュゲート化ＶＷＦの結合は、大幅に減少する。
【図８】血友病Ａおよび３型フォンウィルブランド病に罹患している患者に投与された組換えＦＶＩＩＩの生存アッセイ。投与されたｒＦＶＩＩＩは、おそらく前者における機能しうるｖＷＦの存在によって、３型ＶＷＤ患者と比較して血友病Ａ患者において安定化されるようである。
【図９】ＶＷＦの計算された半減期および血友病Ａ患者において投与されたｒＦＶＩＩＩの半減期の間の相関関係。３８人の患者のうち３３人において、ＶＷＦの半減期が投与されたｒＦＶＩＩＩの半減期以上であることに注意する。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｖｏでの遊離およびＶＷＦ−結合ＦＶＩＩＩ間の平衡の図。
【図１１】固定化ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ（０〜５０μｇ）の結合のＳＰＲ解析。
【図１２】固定化ＬＲＰ１へのｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ（５０μｇ）の結合のＳＰＲ解析。
【図１３】（上パネル）ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのｗｔ−ｒＦＶＩＩＩおよびｈＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの結合（０〜５０μｇ）の比較。（下パネル）ｒＦＶＩＩＩにコンジュゲートした加水分解性のＰＥＧ部分の化学構造。
【図１４】固定化ＬＲＰ１へのｗｔ−ｒＦＶＩＩＩおよびｈＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの結合（５０μｇ）を比較したＳＰＲの結果。
【図１５】（上パネル）ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのｗｔ−ｒＦＶＩＩＩおよびｓＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの結合（０〜５０μｇ）の比較。（下パネル）安定なｒＦＶＩＩＩにコンジュゲートしたＰＥＧ部分の化学構造。
【図１６】トロンビン切断によって活性化されたｗｔおよびコンジュゲート化ＦＶＩＩＩタンパク質に関する平衡ＬＲＰ１結合応答の比較。結果は、ｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩではなく、ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが、トロンビン活性化によってＬＲＰ１に結合するよう誘導されることを示す（バー７および８とバー３および４を比較）。
【図１７】（上パネル）ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合に対するｗｔ−ＶＷＦおよびｓＰＥＧ化ＶＷＦ（０〜１００μｇ）の効果の比較。（中央パネル）安定なｒＦＶＩＩＩにコンジュゲートしたＰＥＧ部分の化学構造を示す図である。（下パネル）ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１結合に対するｗｔ−ＶＷＦおよびｓＰＥＧ−ＶＷＦ効果についてＩＣ５０値を示す図である。
【図１８】（上パネル）ＳＰＲ解析によって決定された、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合に対するｗｔ−ＶＷＦおよびｈＰＥＧ化ＶＷＦ（０〜１００μｇ）の効果の比較。（中央パネル）ｒＦＶＩＩＩにコンジュゲートされた加水分解性のＰＥＧ部分の化学構造を示す図である。（下パネル）ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１結合に対するｗｔ−ＶＷＦおよびｈＰＥＧ−ＶＷＦの効果についてＩＣ５０値を示す図である。
【図１９】固定化ヘパリンへのｗｔ−ＶＷＦ、ｈＰＥＧ−ＶＷＦ、およびｓＰＥＧ−ＶＷＦの結合のＳＰＲ解析。
【図２０】固定化されたｗｔおよびコンジュゲート化ＶＷＦへの、ＰＭＮ静的接着の画像。
【図２１】固定化ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩおよびｓＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの結合のＳＰＲ解析。
【図２２】ＳＰＲ解析によって決定された、固定化ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩおよびｓＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ（０〜１５０ｎＭ）の結合の比較。
【図２３】固定化ＬＲＰ１へのｈＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの結合のＳＰＲ解析。
【図２４】固定化ＬＲＰ１へのｗｔおよびコンジュゲート化ＶＷＦの結合のＳＰＲ解析。
【図２５】ＳＰＲ解析によって決定された、固定化ＬＲＰ１へのｗｔおよびコンジュゲート化ＶＷＦ（０〜１０００ｎＭ）の結合の比較。
【図２６】ＬＲＰ１のクラスターＩＩへのｗｔ−ＦＶＩＩＩおよびコンジュゲート化ＦＶＩＩＩの結合を比較したＥＬＩＳＡ実験の結果。
【図２７】ＬＲＰ１のクラスターＩＶへのｗｔ−ＦＶＩＩＩおよびコンジュゲート化ＦＶＩＩＩの結合を比較したＥＬＩＳＡ実験の結果。
【図２８】ＬＲＰ１のクラスターＩＩへのｗｔ−ＶＷＦおよびコンジュゲート化ＶＷＦの結合を比較したＥＬＩＳＡ実験の結果。
【図２９】ＬＲＰ１のクラスターＩＶへのｗｔ−ＶＷＦおよびコンジュゲート化ＶＷＦの結合を比較したＥＬＩＳＡ実験の結果。
【図３０ａ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｂ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｃ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｄ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｅ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｅ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｅ−３】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｅ−４】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｆ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例を示す図である。
【図３０ｆ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例を示す図である。
【図３０ｆ−３】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例を示す図である。
【図３０ｇ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｇ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｈ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｈ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｈ−３】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｉ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｉ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｉ−３】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｉ−４】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｊ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｊ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｋ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｌ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｌ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｍ−１】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｍ−２】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【図３０ｎ】本発明の凝固タンパク質とのコンジュゲーションによく適合する水溶性ポリマー部分の非限定的な例。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クリアランス受容体との相互作用を阻害するまたは減少させることによって凝固タンパク質の残存または半減期を増加させる方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、治療的有効量の、修飾された凝固因子を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程とを含む。本発明により包含される凝固タンパク質は、凝固カスケードに関与する経路の調節に関与または加担するものを含む。
【００３７】
本発明の凝固タンパク質は、プールされたヒト血漿などの内在性供給源から精製されてもよく、または組換え手段により製造されてもよい。一実施形態において、本発明の方法で修飾された凝固タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）から選択される。特定の実施形態において、凝固タンパク質は、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）および組換えフォンウィルブランド因子（ｒＶＷＦ）から選択される。
【００３８】
ＦＶＩＩＩの１つの公知のクリアランス受容体は、ＬＲＰ１である。ある種の実施形態において、本発明は、ＬＲＰ１に対するＦＶＩＩＩの結合親和性を阻害するまたは減少させることによってＦＶＩＩＩの残存または半減期を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、治療的有効量の、ＬＲＰ１に対する減少した結合親和性を有する修飾またはコンジュゲートされたＦＶＩＩＩ分子を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。特定の実施形態において、修飾されたＦＶＩＩＩは、ＶＷＦと同時にまたは予備形成されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体において投与されてもよい。
【００３９】
関連する実施形態において、本発明の方法は、（ａ）凝固タンパク質の結合タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程と、（ｂ）治療的有効量の、前記修飾された結合タンパク質を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程とを含む。一実施形態において、ＦＶＩＩＩとクリアランス受容体ＬＲＰ１の間の相互作用は、修飾されたＶＷＦタンパク質を哺乳動物に投与することによって阻害される。ある種の実施形態において、修飾されたＶＷＦは、ＦＶＩＩＩと同時にまたは予備形成されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体において投与される。さらに別の実施形態において、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの両方が修飾される。
【００４０】
本発明は、凝固タンパク質およびクリアランス受容体間の相互作用を阻害する組成物を調製する方法もまた提供する。ある種の実施形態において、本方法は凝固タンパク質を水溶性ポリマーで修飾する工程を含み、凝固タンパク質クリアランス受容体を阻害することによって、この修飾が哺乳動物の血液循環におけるタンパク質の残存を増加させる。特定の実施形態において、凝固タンパク質組成物は、ＦＶＩＩＩ、ＶＷＦまたは予備形成されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を含む。
【００４１】
一実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのクリアランス受容体への結合の減少を示し、増加した半減期を有する、修飾またはコンジュゲートされた凝固タンパク質もまた提供する。別の実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物に投与するための、修飾またはコンジュゲートされた凝固タンパク質の医薬製剤を提供する。特定の実施形態において、この製剤は、修飾されたＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ、または予備形成されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を含む。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、血液凝固疾患の個体を治療する方法であって、修飾された凝固タンパク質を、それを必要とする患者に投与する工程を含み、前記凝固タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで増加した残存を有する方法を提供する。本発明の方法は、本明細書に提示されている修飾された凝固タンパク質、その組成物、または製剤のいずれかによって実施することができる。特定の実施形態において、凝固疾患は、血友病またはフォンウィルブランド病である。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、修飾されたＶＷＦを個体に投与することによって、ＦＶＩＩＩの欠乏により特徴付けられる疾患に罹患している個体を治療する方法であって、前記ＶＷＦが水溶性ポリマーにコンジュゲートされている方法を提供する。ある種の実施形態において、本方法は、ＦＶＩＩＩを個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩもまた水溶性ポリマーによって修飾されていてもよい。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩは水溶性ポリマーによって修飾されていない。特定の実施形態において、患者は、ＶＷＦが水溶性ポリマーにコンジュゲートされている、予備形成されたＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ複合体を投与される。ある種の実施形態において、疾患は、血友病またはフォンウィルブランド病であってもよい。
【００４４】
定義
本明細書において使用される場合、「凝固タンパク質」は、凝固カスケードの経路において機能し、または調節的な役割を有し、フィブリン分子の架橋をもたらすタンパク質を指す。本発明に包含される凝固タンパク質は、例えば、組織因子もしくは外因系凝固経路、接触活性化もしくは内因系経路、または最終共通凝固経路に関与していても、またはこれらを調節してもよい。凝固タンパク質の非限定的な例は、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＩＩａ因子（トロンビン）、第ＩＩＩ因子（組織因子）、第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ−依存性プロテアーゼインヒビター（ＺＰＩ）、プラスミノゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ１）、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−２（ＰＡＩ２）、癌凝血原などを含む。本発明の凝固タンパク質は、完全長タンパク質、ならびに成熟ポリペプチド、活性型ポリペプチド、前駆体ポリペプチド、部分的にタンパク質分解されたポリペプチドなどを含む。本発明の凝固タンパク質は、選択的にスプライスされた形態、保存的に修飾されたタンパク質、実質的に同一のタンパク質、相同体などを含むことが理解される。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「クリアランス受容体」は、凝固タンパク質に結合し、これを個体の血液または血漿から除去し、それにより所与の凝固タンパク質の有効濃度を減少させる、タンパク質のクラスを指す。一般に、クリアランス受容体は、少なくとも細胞外ドメインおよび膜付着ドメインを含む膜タンパク質である。ある種の実施形態において、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、内在性膜タンパク質、または表在性膜タンパク質であってもよい。本発明に包含される例示的なクリアランス受容体は、ＬＦＰ受容体、ｖＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、メガリン受容体、およびマクロファージマンノース受容体を含む。例えば、ＬＲＰ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子に結合し、これを除去する。当業者は、本発明における使用によく適合する多くのクリアランス受容体を知っているであろう。
【００４６】
用語「水溶性」は、水においてある程度の検出可能な溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出および／または定量化する方法は、当技術分野において周知である。例示的な水溶性ポリマーは、ペプチド、糖、ポリ（ビニル）、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などを含む。ペプチドは、混合配列を有する、または単一のアミノ酸、例えば、ポリ（リジン）で構成することができる。例示的な多糖は、ポリ（シアル酸）またはヒドロキシルエチルデンプンである。例示的なポリ（エーテル）は、ポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。本発明における使用に適切な別の水溶性ポリマーは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンなどのポリアルキレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（プルロニック）；ポリメタクリレート；およびカルボマーを含む。当業者は、本発明における使用によく適合する別の水溶性ポリマーについて知っているであろう。
【００４７】
水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）とすることができる。しかしながら、別の関連するポリマーもまた、本発明の実施における使用に適すること、およびこの点において用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は包含的であって排他的ではないことを意図するものであることが理解されるべきである。用語ＰＥＧは、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多分岐ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格にぶら下がった１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、または中に分解可能な結合を有するＰＥＧを含むその形態のいずれかにおけるポリ（エチレングリコール）を含む。
【００４８】
ポリマー骨格は、直鎖状または分岐状とすることができる。分岐状ポリマー骨格は、当技術分野において一般に公知である。典型的には、分岐状ポリマーは、中心分岐コア部分、およびこの中心分岐コアに結合した複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールにエチレンオキシドを付加することによって調製することができる、分岐状形態においてよく使用される。中心分岐部分もまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸から得ることができる。分岐状ポリ（エチレングリコール）は、式中、Ｒがグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、ｍがアームの数を表す、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍの一般式で表すことができる。その全体が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，９３２，４６２号に記載されているものなどの多分岐ＰＥＧ分子もまた、ポリマー骨格として使用することができる。
【００４９】
多くの他のポリマーもまた、本発明に適する。２〜約３００個の末端を有する水溶性非ペプチドポリマー骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例は、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの別のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン酸アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、その全体が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５６２９３８４号に記載されているものなどのポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびコポリマー、ターポリマー、ならびにこれらの混合物を含むがこれらに限定されるものではない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は異なっていてもよく、典型的には約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、しばしば約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「糖コンジュゲーション」は、ポリペプチド、例えば、本発明の凝固タンパク質のアミノ酸またはグリコシル残基への、酵素により仲介される修飾された糖部分のコンジュゲーションを指す。「糖コンジュゲーション」の亜属は、修飾された糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）、およびそのアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である、「グリコール−ＰＥＧ化」である。
【００５１】
用語「グリコシル結合基」は、本明細書において使用される場合、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分または別の水溶性ポリマー）が共有結合しているグリコシル残基を指し、グリコシル結合基はコンジュゲートの残部に修飾基を連結する。本発明の方法において、「グリコシル結合基」は、グリコシル化または非グリコシル化凝固タンパク質に共有結合し、それによりペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に作用物質を結合させる。「グリコシル結合基」は一般に、凝固タンパク質のアミノ酸および／またはグリコシル残基へ「修飾された糖」を酵素により結合することによって、「修飾された糖」から得られる。グリコシル結合基は、修飾基−修飾糖カセットの形成（例えば、酸化シッフ塩基形成還元）中に分解される糖由来の構造とすることができ、またはグリコシル結合基はインタクトであってもよい。「インタクトなグリコシル結合基」は、修飾基を結合させコンジュゲートの残部に結合する糖モノマーが分解されない、例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによって、例えば、酸化された、グリコシル部分に由来する結合基を指す。本発明の「インタクトなグリコシル結合基」は、グリコシル単位（複数可）の付加または親糖構造からの１つまたは複数のグリコシル単位の除去によって、天然起源のオリゴ糖から得られてもよい。
【００５２】
「生理学的に切断可能な」ならびに「加水分解可能な」結合は、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的弱い結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を連結している結合の一般的なタイプだけでなく、これらの中心原子に結合された置換基にも依存する。例示的な加水分解可能な結合は、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、およびオルトエステルを含むがこれらに限定されるものではない。
【００５３】
「切り離し可能な結合（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、または「加水分解可能な結合（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、または「切り離し可能な結合（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」は、生理学的に切断可能な結合（ｂｏｎｄ）、加水分解可能な結合（ｂｏｎｄ）、および酵素により分解可能な結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含むがこれらに限定されるものではない。したがって、「切り離し可能な結合（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」は、生理学的条件下で加水分解または他の何らかの（例えば、酵素を触媒とする、酸を触媒とする、塩基を触媒とする、などの）機構による切断を受けうる結合（ｌｉｎｋａｇｅ）である。例えば、「切り離し可能な結合（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」は、駆動力としてプロトン（例えば、イオン化可能な水素原子、Ｈα）を塩基で抽出する脱離反応を含むことができる。本明細書における目的のため、「切り離し可能な結合（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」は「分解可能な結合（ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）」と同義である。したがって、切り離し可能な部分は、生理学的および／または実験室条件下で切り離し可能な、分解可能な、または除去もしくは切断可能な、したがって、例えば、コンジュゲーション部分に結合されたタンパク質、または保護基から水溶性ポリマーを遊離する、１つまたは複数の基（例えば、リンカー）を有する。
【００５４】
「酵素により切り離し可能な結合」は、１つまたは複数の酵素による分解を受ける結合を意味する。
【００５５】
「加水分解に安定な」結合（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｂｏｎｄ）は、水中で実質的に安定な、換言すると、生理学的条件下で長期間にわたって感知可能な程度の加水分解を受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に安定な結合の例は、以下のものを含むがこれらに限定されるものではない：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖において）、エーテル、アミドなど。一般に、加水分解に安定な結合は、生理学的条件下で１日当たり約１〜５％未満の加水分解率を示す結合である。
【００５６】
本明細書において使用される場合、受容体に対する「減少した結合親和性」を有するタンパク質は、特定の受容体との相互作用が部分的にまたは完全に阻害、低下、減少または下方制御された修飾または組換えタンパク質を指す。本発明との関連において、修飾または組換え凝固タンパク質は、低い親和性で結合する、または全く結合しない場合、そのクリアランス受容体との相互作用を阻害するといわれる。凝固タンパク質の結合減少は、クリアランス受容体との相互作用において約５％〜約１００％またはそれより大きい減少であってもよい。例えば、減少は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きくてもよい。同様に、修飾または組換え凝固タンパク質およびクリアランス受容体間の結合阻害は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の相互作用の阻害であってもよい。ある種の実施形態において、減少した相互作用は、野生型凝固タンパク質およびクリアランス受容体間の相互作用と比較して約１倍〜約１０倍減少した、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれより減少した結合であってもよい。別の実施形態において、減少した相互作用は、野生型タンパク質と比較して約１０１倍〜約１０５倍減少した、例えば１０１倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、またはそれより減少したものであってもよい。相互作用の親和性を測定する定量的手段は、当技術分野において周知であり、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析、等温滴定熱量測定、親和性クロマトグラフィー、蛍光偏光（ＦＰ）、および異方性（ＦＡ）アッセイなどを含むがこれらに限定されるものではない。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「コンジュゲーション部分」は、本発明のような凝固タンパク質などのタンパク質に共有結合した水溶性ポリマーを含む化学構造を指す。コンジュゲーション部分は、１つまたは複数の結合基ならびに１つまたは複数の分岐基をさらに含んでもよい。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「治療」は、治療される個体または状態、例えば、血友病またはフォンウィルブランド病などの血液凝固障害の自然経過を変更しようとする目的の臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過中に行われてもよい。望ましい効果は、疾患の症状の発症または再発の予防、症状緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患進行速度の低減、病態の改善または一時的緩和、および寛解または予後改善を含む。
【００５９】
「有効量」または「治療的有効量」は、例えば、血友病、フォンウィルブランド病、または関連する凝固疾患などの病態の治療において、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。疾患の対象の臨床反応に関して、有効量は、疾患を一時的緩和、改善、安定化、後退、または進行抑制する、あるいはそうでなければ疾患の病理学的結果を減少させるために十分な量である。有効量は、単回または分割投与されてもよい。
【００６０】
本発明の方法および組成物で治療されてもよい凝固疾患の非限定的な例は、抗トロンビンＩＩＩ欠乏、プロテインＣ欠乏、活性型プロテインＣ耐性、プロテインＳ欠乏、第Ｖ因ライデン、高プロトロンビン症などの凝固亢進疾患；本態性血小板血症；Ａ、Ｂ、およびＣ型を含む血友病、フォンウィルブランド病、低プロトロンビン症／第ＩＩ因子欠乏、低フィブリノゲン症、第ＸＩＩＩ因子欠乏などの凝固低下疾患；Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エバンス症候群、および血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）などの紫斑病；ならびにヘパリン起因性血小板減少症を含む血小板減少症を含む。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）」または「血友病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）」は、血液の凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）の減少によって広く特徴付けられる病態のグループを指す。血友病は、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型血友病、または３つ全ての疾患型の複合型を指してもよい。Ａ型血友病（血友病Ａ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の減少または欠損により引き起こされ、血友病サブタイプのうちで最も顕著なものである。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）凝固機能の損失または減少によって起こる。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）凝固活性の損失または減少の結果である。血友病ＡおよびＢはＸ連鎖疾患であるが、血友病Ｃは常染色体疾患である。血友病の一般的な治療は、Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）ＶＨ、およびＦＸＩを含むＦＶＩＩＩ、ＦＩＸなどの凝固因子、ならびにＦＥＩＢＡ−ＶＨ、デスモプレシンの予防的およびオンデマンド投与の両方、および血漿注入を含む。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「フォンウィルブランド病（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」または「フォンウィルブランド病（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」（ｖＷＤ）は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の正常な活性の欠乏によって特徴付けられる疾患のクラスを指す。ｖＷＦの欠乏は、１型、３型、および一部の２型フォンウィルブランド病のように機能の欠損または減少を含んでもよく、または代替として、２Ｂ型および血小板型ｖＷＤのように機能獲得から生じてもよい。本発明に関連して、ｖＷＤは、１型、２型、３型、および血小板型ｖＷＤ、２Ａ型、２Ｂ型、２Ｍ型、もしくは２Ｎ型などの任意のサブタイプの疾患、または全体としての疾患グループを含む任意の型の疾患を指してよい。
【００６３】
ＶＷＤのための一般的な治療は、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌ  Ｍ、ＭＯＮＡＲＣ−Ｍ（商標）、およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅなど、ＶＷＦ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ組成物ならびに同等物の投与を含む。別の治療は、経口もしくは静脈内（ＤＤＡＶＰ）、皮下（ｏｃｔｏｓｔｉｍ）、または経鼻（ｏｃｔｏｓｔｉｍスプレー）投与することができるデスモプレシン；定着した凝血塊の安定化を助けるシクロカプロンおよびアミカル；出血部位および全身血漿注入に直接適用することができるトロンビンを含む。
【００６４】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は天然におよび治療製剤中に、単一遺伝子産物から生じたポリペプチドの不均一な分布として存在する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８３巻、２９７９〜２９８３頁、１９８６年５月を参照されたい）。用語「第ＶＩＩＩ因子」は、本明細書において使用される場合、血漿由来であるか、または組換えＤＮＡ技術の使用によって製造されるかにかかわらず全てのポリペプチドを指す。第ＶＩＩＩ因子を含有する治療製剤の市販の例は、ＨＥＭＯＦＩＬ  ＭおよびＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＩＩ．、米国から入手可能）の商品名で販売されているものを含む。現在開発中の別の製剤は、分子のＢドメイン部分を欠く第ＶＩＩＩ因子分子の主に単一の亜集団を含む。本発明に関連して、ＦＶＩＩＩは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されていても、および／または水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ＰＯＥなどのポリエーテルにコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩ分子は、ポリシアル酸化、ＰＥＧ化、または別の方法で翻訳後修飾されていてもよい。
【００６５】
本発明における使用に特によく適合するＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ分子は、完全長タンパク質構築体、前駆体タンパク質構築体、生物学的に活性な断片、サブユニット、またはこれらの誘導体、プラズモンポリペプチド、組換えポリペプチドなどを含む。
【００６６】
ある種の実施形態において、本発明のＶＷＦタンパク質は、例えば、組換えＶＷＦを製造する方法に関して参照により本明細書に組み込まれるＧｉｎｓｂｕｒｇらの、１９８６年１０月２３日に公開された国際公開第１９８６／０６０９６号パンフレットおよび１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願シリアル番号０７／５５９５０９の通り調製した構築体を含んでもよい。本発明に有用なＶＷＦは、単量体および多量体形態を含む全ての潜在的な形態を含む。ＶＷＦの１つの特に有用な形態は、少なくとも２つのＶＷＦのホモ多量体である。ＶＷＦタンパク質は、生物学的に活性な誘導体であってもよく、またはＦＶＩＩＩの安定剤として単独で使用される場合、ＶＷＦは生物学的に活性でない形態であってもよい。本発明が、組み合わせて使用される異なる形態のＶＷＦを包含することもまた理解されるべきである。例えば、本発明に有用な組成物は、異なる多量体、異なる誘導体ならびに生物学的に活性な誘導体および生物学的に活性でない誘導体の両方を含んでもよい。一時止血において、ＶＷＦは、血小板およびコラーゲンなどの細胞外マトリクスの特定成分の間の架橋として働く。このプロセスにおけるＶＷＦの生物学的活性は、２つの異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって測定することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋら、Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．  ２８巻：１４９〜１６０頁、２００２年）。リストセチン補因子アッセイは、ＶＷＦ存在下で抗生物質リストセチンによって誘導される、新鮮なまたはホルマリンで固定した血小板の凝集に基づく。血小板凝集度は、ＶＷＦ濃度に依存し、比濁法によって、例えば、アグリゴメーターを使用して測定することができる（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５２巻：２７０８〜２７１６頁、１９７３年；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｄｉａｔｈ．  Ｈａｅｍｏｒｒｈ．  ３４巻：３０６〜３０８頁、１９７５年）。２つめの方法は、ＥＬＩＳＡ技術に基づくコラーゲン結合アッセイである（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  Ｂｏｓａｋ，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  ４３巻：３０３〜３１１頁、１９８６年；Ｆａｖａｌｏｒｏ，
Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８３巻：１２７〜１３５頁、２０００年）。マイクロタイタープレートを、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンでコーティングする。次いで、ＶＷＦをコラーゲン表面に結合させ、その後、酵素標識されたポリクローナル抗体を検出する。最終工程は基質反応であり、これはＥＬＩＳＡリーダーを用いて光度測定によってモニター可能である。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「血漿由来ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）」は、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定化させる、例えば、結合させる特性を有する哺乳動物から得られた成熟ＶＷＦを含む、血液中にみられる全ての形態のタンパク質を含む。しかしながら、本発明は成熟ＶＷＦに限定されるものではない。１つの、前記ｐＶＷＦの生物学的に活性な誘導体は、プロ−ペプチドを含有するプロ−ＶＷＦである。本発明に有用なＶＷＦの別の形態は、内皮細胞および巨大核細胞により合成された前駆体ＶＷＦ分子（プレ−プロ−ＶＷＦ）を含む未成熟ＶＷＦ、および／またはＶＷＦプロペプチド（プロ−ＶＷＦ）および／またはそれぞれ前駆体分子のシグナルペプチドおよびプロ−ペプチドの切断により得られる成熟ｐｄＶＷＦを含むタンパク質構築体を含む。ｐｄＶＷＦの生物学的に活性な誘導体のさらなる例は、生物学的に活性な形態にプロセシングもしくは転換される、またはそれ自体が生物学的に活性な、切断型形態、欠失を有する形態、置換を有する形態、プロ形態以外の付加を有する形態、成熟形態の断片、キメラ形態、および天然形態と比較して翻訳後修飾を有する形態である、プロドラッグを含む。本発明に有用なｐｄＶＷＦはまた、生物学的に活性でない形態も含む。これは、成熟ＶＷＦまたは血液中にみられる別の天然形態の修飾によって達成することができる。本発明に有用なＶＷＦ源は、ブタおよびヒトバージョンを含む哺乳動物である。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）」は、組換えＤＮＡ技術によって得られたＶＷＦを含む。有用なｒＶＷＦの１つの形態は、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を少なくともｉｎ  ｖｉｖｏ安定化させる、例えば、結合させる、および薬理学的に許容可能なグリコシル化パターンを任意選択で有する特性を有する。これらの特定の例は、Ａ２ドメインを有さない、したがってタンパク質分解に耐性のＶＷＦ、（Ｌａｎｋｈｏｆら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７７巻：１００８〜１０１３頁、１９９７年）、糖タンパク質１ｂ−結合ドメインならびにコラーゲンおよびヘパリン結合部位を含むＶａｌ４４９〜Ａｓｎ７３０のＶＷＦ断片（Ｐｉｅｔｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６４巻：１３３９〜１３４７頁、１９８９年）を含む。少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子の安定化の決定は、当技術分野の現状において公知の方法に従って、ＶＷＦ−欠損哺乳動物において行うことができる。ＦＶＩＩＩ活性レベルは、例えば、ヨーロッパ薬局方において発表されたもの（Ｐｈ．  Ｅｕｒ．、第３版増補版、１９９７年：２．７．４）などの発色アッセイによって測定することができる。
【００６９】
ある種の実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、米国特許第４７５７００６号；同第５７３３８７３号；同第５２５０４２１号；および同第５９１９７６６号のいずれかの通り、またはＥＰ３０６９６８の通り調製された構築体を含んでもよい。一般に、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩに関連する生物学的活性を有するインタクトなＢドメインの少なくとも一部を有する任意のＦＶＩＩＩ分子を含んでもよい。例えば、構築体は、完全長ＦＶＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子：Ｃをコードする核酸に加水分解することができるヌクレオチドにコードされる構築体であってもよい。このようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の間または中の様々な部位にアミノ酸欠失を含有してもよい（米国特許第４８６８１１２号）。ＦＶＩＩＩ分子はまた、部位特異的突然変異誘発法によって１つまたは複数のアミノ酸残基が置換されたネイティブなＦＶＩＩＩの類似体であってもよい。本発明の方法における使用によく適合する構築体の非限定的な例は、例えば、国際公開第２００７／１２６８０８号パンフレットに記載されているものを含む。
【００７０】
ｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩの産生は、（ｉ）例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡ増幅を介した、遺伝子工学による組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介した、トランスフェクションによる原核または真核細胞中への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）例えば、連続またはバッチ式の、前記形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば、構成的または誘導性の、ｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩの発現、および（ｖ）例えば、培養培地からの、または形質転換細胞の回収による前記ｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩの単離のための、（ｖｉ）例えば、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されたｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩを得るための、当技術分野において公知の任意の方法を含むことができる。
【００７１】
ｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩは、薬理学的に許容可能なｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩ分子を産生することによって特徴付けられる、適切な原核または真核宿主系に発現によって産生することができる。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞である。本発明によるｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩを産生または単離するために使用される試薬または条件に特に制限はなく、当技術分野において公知の、または市販の任意の系を採用することができる。
【００７２】
広範な種類のベクターが、ｒＶＷＦまたはｒＦＶＩＩＩの調製のために使用可能であり、真核および原核生物発現ベクターから選択することができる。原核生物発現のためのベクターの例は、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのプラスミドを含み、原核生物発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｅ、ｔｉｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどを含む。真核生物発現のためのベクターの例は、（ｉ）酵母における発現用の、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用したｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター；（ｉｉ）昆虫細胞における発現用の、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用したｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのベクター、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞における発現用の、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのベクター、ならびにＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ．ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびアクチンなどのプロモーターを使用した、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系由来のベクターを含む。
【００７３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において交換して使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００７４】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸と同様に機能する天然および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードにコードされているもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンなどである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００７５】
本明細書において、一般に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている１文字記号によってアミノ酸を指す場合がある。ヌクレオチドも同様に、一般に認められている１文字コードで指す場合がある。
【００７６】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定される全ての位置で、コードされているポリペプチドを変更することなく、コドンを記載の対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の一種である、「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異も示す。当業者は、核酸における各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾することにより、機能的に同一の分子を得ることができることを理解するであろう。したがって、発現産物に関して、ポリペプチドをコードする核酸の全てのサイレント変異が各記載の配列に含まれる。
【００７７】
アミノ酸配列について、当業者は、コード配列中の単一アミノ酸または少数のアミノ酸を変更、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、変更により、化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを理解するであろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的な置換の表は、当技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外しない。当業者はまた、本発明に包含されるタンパク質に対する保存的な置換が、特に、活性部位に関与しないまたは特定の触媒機能に必要な残基においてなされる場合、耐容性良好となることも理解するであろう。当業者は、相同性の低い領域においてまたは活性部位もしくはタンパク質結合インターフェースから遠位でなされる過度の保存的な突然変異ならびに非保存的な突然変異が耐性良好となりえ、当技術分野において容易に入手できる高分解能構造情報の調査によって設計することができることを理解するであろう。
【００７８】
以下の８グループは、互いに保存的な置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
【００７９】
用語「組換え」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、異種核酸もしくはタンパク質の導入によって、ネイティブな核酸もしくはタンパク質の変更によって、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが修飾されていること、または、細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内にはみられない遺伝子を発現するか、または組み換えなければ異常に発現された、発現不足の、または全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００８０】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、ネイティブな状態においてみられるような通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。純度および均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して一般に決定される。製剤中に存在する優勢種である凝固タンパク質または凝固タンパク質複合体、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ、またはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦは、十分に精製される。用語「精製された」は、いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示す。別の実施形態において、核酸またはタンパク質が、少なくとも純度５０％、より好ましくは少なくとも純度６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であることを意味する。別の実施形態において「精製する」または「精製」は、少なくとも１つの夾雑物を精製しようとする組成物から除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質、例えば、純度１００％であることを必要としない。
【００８１】
用語「同一な」または「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、同じである、あるいは、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記の初期設定パラメータを用いて使用して、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定した場合に同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定のパーセンテージ（すなわち、指定領域にわたって、比較ウィンドウまたは指定の領域にわたって最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有する（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照されたい）、２つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列はしたがって、「実質的に同一」であるといわれる。この定義は、試験配列の相補体のことも指し、またはこれに適用される場合がある。この定義はまた、欠知および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものも含む。上述のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチド長領域にわたって、または、より好ましくは、５０〜１００、２００、３００、４００、５００以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００８２】
配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用した場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、初期設定プログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムは次いで、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００８３】
「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用される場合、２つの配列の最適アラインメント後に、配列を同数の隣接位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数の任意の１つのセグメントの参照を含む。比較のための配列アラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７〜２００５、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照されたい）によって実施することができる。
【００８４】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載のパラメータを用いて、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターから公開（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）されている。このアルゴリズムは、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、データベース配列において同じ長さのワードとアライメントしたときにある正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす高スコア配列の対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に伸長する。例えば、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチしている残基対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して、累積スコアが計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少する場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００８５】
コンジュゲートおよび翻訳後修飾
一般に、本発明の凝固タンパク質のコンジュゲーション、翻訳後修飾，または共有結合修飾は、ＮまたはＣ末端残基の修飾ならびに選択された側鎖、例えば、遊離スルフヒドリル基の、第１級アミン、およびヒドロキシル基の修飾を含む。一実施形態において、水溶性ポリマーは、リジン基または別の第１級アミンによってタンパク質（直接またはリンカーを介して）に結合されている。一実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを含むがこれらに限定されない、水溶性ポリマーのコンジュゲーションによって、修飾されていてもよい。
【００８６】
本発明の凝固タンパク質を修飾するために使用してもよい水溶性ポリマーは、直鎖状および分岐状構造を含む。コンジュゲート化ポリマーは、本発明の凝固タンパク質に直接結合されてもよく、または代替として結合部分を介して結合されていてもよい。水溶性ポリマーによるタンパク質コンジュゲーションの非限定的な例は、米国特許第４６４０８３５号；同第４４９６６８９号；同第４３０１１４４号；同第４６７０４１７号；同第４７９１１９２号、および同第４１７９３３７号において、ならびにＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ「Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ」、ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、３６７巻３８３頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１年）、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  ２００８年において見ることができる。
【００８７】
タンパク質コンジュゲーションは、当技術分野において周知の多くの技術によって行うことができ、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  ２００８年を参照されたい。例は、凝固タンパク質または水溶性ポリマー部分のうち一方のカルボキシル基と他方のアミン基の間のペプチド結合、または一方のカルボキシル基と他方のヒドロキシル基の間のエステル結合による結合を含む。本発明の凝固タンパク質を水溶性ポリマー化合物にコンジュゲートしうる別の結合は、シッフ塩基を介する、過ヨウ素酸酸化によりポリマーの非還元末端で形成されるアルデヒド基と反応するポリマー部分の遊離アミノ基間である（ＪｅｎｎｉｎｇｓおよびＬｕｇｏｗｓｋｉ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８１年；１２７巻：１０１１〜８頁；ＦｅｍａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｎｒａｄｉｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９７年；１３４１巻；２６〜３４頁）。生成したシッフ塩基は、ＮａＣＮＢＨ３による特異的還元によって安定化することができ、第２級アミンを生成する。別のアプローチは、事前酸化後のＮＨ４Ｃｌを用いた還元的アミノ化による、ポリマー上での末端遊離アミノ基の生成である。２つのアミノまたは２つのヒドロキシル基を結合するために、二官能性試薬を使用することができる。例えば、アミノ基を含有するポリマーは、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート／Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）のような試薬を用いて凝固タンパク質のアミノ基に結合することができる。加えて、例えば、アミンおよびチオール基を結合するために、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）のようなヘテロ二官能性架橋試薬を使用することができる。別の実施形態において、ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、およびＰＥＧクロリド＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートおよびｐ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧなどのアルデヒド反応基が、凝固タンパク質のコンジュゲーションにおいて使用されてもよい。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態において、様々な反応基、例えば、イミドエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）、ペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰ−エステル）、ソラレン基、アリールアジド、ヒドラジド、イソシネート、マレイミド、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホンなどを使用して水溶性ポリマーを本発明の凝固タンパク質にコンジュゲートさせてもよい。
【００８９】
用語「シアル酸」は、９炭素カルボキシル化糖ファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最もよく見られるメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）ファミリーの２番目のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。３番目のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１巻：１１５５０〜１１５５７頁；ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻：２１８１１〜２１８１９頁（１９９０年））である。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸もまた含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２巻：２５〜４０頁（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ
Ａｃｉｄｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．  Ｓｃｈａｕｅｒ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年））を参照されたい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４３５６１７０号に記載されている方法によって、ポリシアル酸部を本発明の凝固タンパク質にコンジュゲートすることができる。本発明の一実施形態において、多糖化合物は、天然多糖、天然多糖の誘導体、または天然の多糖誘導体であってもよい。
【００９０】
本発明の範囲内に含まれる共有結合修飾の１つの種類は、凝固タンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変更することを含む。一般に、タンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変更することは、凝固タンパク質とそのクリアランス受容体の間の相互作用が減少または阻害されるように、１つまたは複数のグリコシル化部位を、凝固タンパク質から除去する、および／またはこれに付加することを指す。さらに、凝固タンパク質のネイティブなグリコシル化パターンは、存在する様々な炭水化物部分を量的または質的に変化させることによって変更されてもよく、すなわち、１分子当たりのグリコシル化の量を増加させてもよく、または炭水化物部分の同一性を変化させてもよい。一実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、例えば、国際公開第８７／０５３３０号パンフレットまたはＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）のように、化学的または酵素的にグリコシドに結合されてもよい。
【００９１】
一実施形態において、本発明は、Ｏ−結合型グリコシル化凝固タンパク質、これらの種のコンジュゲート、および選択されたアミノ酸配列を含むＯ−結合型グリコシル化ペプチド（「Ｏ−結合型グリコシル化部位」）を形成するための方法を提供する。対応する野生型凝固タンパク質中には存在しないＯ−結合型グリコシル化部位を含む突然変異凝固タンパク質は特に興味深い。Ｏ−結合型グリコシル化部位は、修飾基を有するグリコシル残基の結合のための場所である。
【００９２】
一実施形態において、本発明の凝固因子にコンジュゲートされたポリマーは、分岐していてもまたは分岐していなくてもよい多糖を含む。コンジュゲーションのために使用される多糖のモノマー単位は、Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸などを含むがこれらに限定されない。使用することができる多糖の非限定的な例は、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストランサルフェート、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンなどのホモ多糖およびヘテロ多糖、または酸性ムコ多糖、例えば、ヒアルロン酸の多糖サブユニット；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールポリマー；ヘパリン、ヘパリンなどを含む。
【００９３】
特定の一実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、図３０に示されたものから選択される水溶性ポリマーにコンジュゲートされていてもよい。
【００９４】
本発明の凝固タンパク質のコンジュゲーションに使用されるポリマーは、約１００Ｄａ〜約５０００００Ｄａの平均分子量を有してもよい。ある種の実施形態において、ポリマーは、約１０００Ｄａ〜約２００００Ｄａの平均分子量を有してもよい。別の実施形態において、ポリマーの平均分子量は、約１ｋＤａ、または約２ｋＤａ、３ｋＤａ、３．５ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ以上であってもよい。本発明の凝固タンパク質をコンジュゲートさせるために使用されるポリマーの平均分子量は、凝固タンパク質の性質、ポリマーの性質、コンジュゲーションの程度などを含む多くの要因に依存するはずである。
【００９５】
ある種の実施形態において、本発明は、第１のリンカー基、第１の分岐基、および前記分岐基に結合された１つまたは複数の水溶性ポリマーを含むコンジュゲーション部分に結合された凝固タンパク質を含む。別の実施形態において、コンジュゲーション部分は、前記分岐基および前記水溶性ポリマーを連結する少なくとも第２の結合基をさらに含んでもよい。適切な結合基は、ウレタン、アミド、尿素、エステル、チオエーテルなどを含むがこれらに限定されない。当業者は、本発明における使用に特によく適合する別の結合基を知っているであろう。さらに別の実施形態において、コンジュゲーション部分は、コポリマー、例えば、交互コポリマー、周期コポリマー、ランダムコポリマー、ジブロックもしくはトリブロックなどのブロックコポリマー、または分岐コポリマーを含んでもよい。本発明での使用によく適合する多くのコンジュゲーション部分が、当技術分野において公知であり、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．  ２００８年において見ることができる。
【００９６】
一実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、可逆的なまたは加水分解可能な結合によって水溶性ポリマーにコンジュゲートされていてもよい。米国特許出願公開第２００５／００７９１５５号は、可逆的な結合を使用したコンジュゲートを記載している。この公開に記載されているように、可逆的な結合は、酵素基質部分の使用によって実施することができる。可逆的なＰＥＧ化のための別のアプローチは、米国特許第７０６０２５９号に記載されており、生物学的に活性な作用物質が加水分解可能なカルバメート結合によって水溶性非免疫原性ポリマーに結合されている、水溶性プロドラッグを記載している。これに記載されているように、生物学的に活性な作用物質は、カルバメート結合の加水分解によって、酵素または触媒物質を添加する必要なくｉｎ  ｖｉｖｏで容易に遊離することができる。可逆的部分のコンジュゲーションのための異なるアプローチが、Ｐｅｌｅｇ−Ｓｃｈｕｌｍａｎ（２００４年）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４７巻：４８９７〜４９０４頁、国際公開第２００４／０８９２８０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００６／０１７１９２０号によって記載されている。限定された数の活性薬剤にこのアプローチが適用されたが、これらの参照は、可逆的なＰＥＧ化が特に適合するであろう別の活性薬剤を無視している。さらに別の切り離し可能なアプローチが、米国特許出願公開第２００６／０２９３４９９号に記載されている。
【００９７】
一実施形態において、本発明は、一般構造：
【００９８】
【化１】
2014141532.tif 000003
【００９９】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、Ｌ１は結合基であり、およびＸ１は水溶性ポリマーである）を有する修飾された凝固タンパク質を提供する。
【０１００】
本発明における使用によく適合する凝固部分の例は、例えば、全てが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、分解可能な結合を有するコンジュゲーション部分の使用を記載している米国特許出願第２００６０２９３４９９号；９−ヒドロキシメチル−７−スルホフルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド結合（ＰＥＧ−ＦＭＳ）によってタンパク質に結合されたＰＥＧ化部分を含む、可逆的なＰＥＧ化部分の使用を記載している国際公開第２００４／０８９２８０号パンフレット、ポリマーを本発明の凝固タンパク質に結合させるために使用することができる様々な結合部分の使用を記載している米国特許出願第２００５０００９９８８号；タンパク質コンジュゲーションのための一置換ポリ（エチレングリコール）および関連部分の使用を記載している米国特許第５６７２６６２号；ポリマーのタンパク質へのコンジュゲーションのための、Ｆｍｏｃおよび２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）などの緩和な塩基性条件に感受性の修飾基の使用を記載している米国特許出願第２００６０１７１９２０号；ＦＶＩＩＩのポリマーコンジュゲートを記載している米国特許出願第２００４０２３５７２３号および同第２００８００５８５０４号；ならびにＶＷＦおよびＦＶＩＩＩポリマーコンジュゲートを記載している米国特許出願第２００６０１６０９４８号において見ることができる。ある種の実施形態において、本発明の方法は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０８２６６９号パンフレットまたは国際公開第２００７／１２６８０８号パンフレットに記載されている修飾された凝固タンパク質を使用して実践されてもよい。
【０１０１】
本発明のコンジュゲートは、様々な式を含んでもよい。一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、一般式；
【０１０２】
【化２】
2014141532.tif 000004
【０１０３】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３はリンカー部分であり、Ｂ１は第１の分岐部分、およびＸ１およびＸ２は水溶性ポリマー基である）を含んでもよい。ある種の実施形態において、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は任意選択である。特定の実施形態において、コンジュゲーション部分は、化学的に安定であってもよい。別の実施形態において、本発明において使用されるコンジュゲーション部分は、加水分解可能であってもよい。ある種の実施形態において、Ｌ１またはＢ１は、アルコール保護基、アミン保護基、カルボニル保護基、カルボキシル保護基などの保護基を含んでもよい。
【０１０４】
特定の実施形態において、保護基は置換されたＦｍｏｃ基である。一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式；
【０１０５】
【化３】
2014141532.tif 000005
【０１０６】
（式中、ＰＯＬＹ１は第１の水溶性ポリマーであり；ＰＯＬＹ２は第２の水溶性ポリマーであり；Ｘ１は第１のスペーサー部分であり；Ｘ２は第２のスペーサー部分であり；Ｈαはイオン化可能な水素原子であり；Ｒ１はＨまたは有機ラジカルであり；Ｒ２はＨまたは有機ラジカルであり；（ａ）は０または１であり；（ｂ）は０または１であり；Ｒｅ１は、存在する場合、第１の電子変更基であり；Ｒｅ２、存在する場合、第２の電子変更基であり；Ｙ１はＯまたはＳであり；Ｙ２はＯまたはＳであり；Ｒは凝固タンパク質である）を含んでもよい。
【０１０７】
特定の一実施形態において、本発明は、構造；
【０１０８】
【化４】
2014141532.tif 000006
【０１０９】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、Ｘ１およびＸ２は水溶性ポリマーである）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。別の実施形態において、本発明のコンジュゲーション部分は、図１３または１５に示すもののうちの１つであってもよい。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、構造；
【０１１１】
【化５】
2014141532.tif 000007
【０１１２】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、ｍ−ＰＥＧＯは、エーテル結合を介して構造の残部に連結されたＰＥＧ部分、または別の水溶性ポリマーである）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１１３】
特定の一実施形態において、本発明は、構造；
【０１１４】
【化６】
2014141532.tif 000008
（式中、Ｒは凝固タンパク質である）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１１５】
特定の一実施形態において、本発明は、構造；
【０１１６】
【化７】
2014141532.tif 000009
【０１１７】
（式中、Ｒは凝固タンパク質である）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、構造；
【０１１９】
【化８】
2014141532.tif 000010
【０１２０】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、ＹはＰＥＧなどの水溶性ポリマーである）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、式；
【０１２２】
【化９】
2014141532.tif 000011
【０１２３】
（式中、Ｒは凝固タンパク質であり、Ｘ１はＮＨ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＨ２、ＳＯ２、ＳＯ３、ＰＯ２、およびＰＯ３からなる群から選択され、Ｘ２は水溶性部分をＸ１に連結する結合またはリンカーであり、Ｙは水溶性部分である）を含む凝固タンパク質のコンジュゲートを提供する。特定の実施形態において、水溶性部分はＰＥＧである。ある種の実施形態において、コンジュゲーション部分は、アミノ酸側で、タンパク質のカルボキシ末端で、またはタンパク質のアミノ末端でコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、水溶性部分は、遊離スルフヒドリル基、第１級アミン、ヒドロキシル基、またはこれらの組合せで側鎖にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、水溶性タンパク質はＶＷＦまたはＦＶＩＩＩである。
【０１２４】
修飾またはコンジュゲートされた本発明の凝固タンパク質は、一般に、所与のバッチまたは溶液中のタンパク質の少なくとも約４０％が同程度に修飾される場合、「実質的に均一に修飾された」とみなされる。別の実施形態において、均一に修飾されたバッチまたは溶液中の凝固タンパク質は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上が同程度に修飾されてもよい。ある種の実施形態において、タンパク質修飾の程度は、タンパク質モル数当たりの修飾しているポリマーモル数で決定されてもよい。例えば、修飾された本発明の凝固タンパク質は、約１〜約３０個の水溶性ポリマーによってコンジュゲートされていてもよい。ある種の実施形態において、本発明の凝固タンパク質は、１モルタンパク質当たり約１、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０モル以上のコンジュゲート化ポリマーを含んでもよい。典型的には、コンジュゲーション反応において起こる修飾の程度は、制御することができる。例えば、平均的な反応は、約５０％未満のコンジュゲーションの程度の変化をもたらすことができる。別の実施形態において、コンジュゲーションの程度の変化は、約４０％未満、約３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満であってもよい。代替として、特定のバッチの凝固タンパク質のコンジュゲーションの程度の変化は、コンジュゲーション反応後の分画によって、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに制御されてもよい。したがって、コンジュゲーションの程度の少量の変化を達成することができる。別の実施形態において、修飾の程度は、修飾されている可能性のあるコンジュゲーション部位のパーセントで表されてもよい。例えば、凝固タンパク質は、約１％〜約１００％修飾されていてもよい。ある種の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上修飾されていてもよい。
【０１２５】
組成物および製剤
ある種の実施形態において、本発明の凝固タンパク質組成物、すなわち、ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦ、またはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦは、充填剤、安定化剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、カルシウム塩、および、有利には、別の賦形剤をさらに含む。これらの賦形剤は、凍結乾燥製剤における第ＶＩＩＩ因子の安定性を最大にするために選択された。しかしながら、本発明の血液因子組成物は、液体状態においても同様に安定性を示す。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、「充填剤」は、凍結乾燥された後に医薬製剤の「ケーキ」または残渣固体塊に構造を提供し、医薬製剤の崩壊を防ぐ化学的実体を指す。「結晶化可能な充填剤」は、塩化ナトリウム以外の、凍結乾燥中に結晶化することができる本明細書に記載の充填剤を意味するものとする。本発明における使用に特に良く適合する充填剤は、マンニトール、グリシン、アラニン、およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
凍結乾燥産物の結晶部分を形成する（ＨＥＳの場合を除く）、本製剤において使用される充填剤は、マンニトール、グリシン、アラニン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などからなる群から選択される。当業者は、本発明での使用に特によく適合する別の充填剤を知っているであろう。マンニトール、グリシンまたはアラニンは、約１％〜約１５％の量で存在する。ある種の実施形態において、この量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上である。充填剤としてＨＥＳが使用される場合、約１％〜約１０％の量で存在する。ある種の実施形態において、この量は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上のＨＥＳである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明の製剤において使用される安定化剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、ソルビトール、グリセロール、またはアルギニンなどからなる群から選択される。当業者は、本発明での使用に特によく適合する別の安定剤を知っているであろう。これらの作用物質は、本発明の製剤において約１％〜約１０％の量で存在する。ある種の実施形態において、この量は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上の安定化剤である。
【０１２９】
様々な生理学的に適合可能な塩もまた、本発明の製剤において使用することができる。本発明の一実施形態において、塩化ナトリウムは、約１００〜約３００ｍＭ、または約１５０〜約２５０ｍＭ、または約２２５ｍＭの量で本製剤中に含まれる。本発明の一実施形態において、いずれの前述の充填剤も用いずに塩化ナトリウム自体を使用することができ、この場合ＮａＣｌ約３００ｍＭ〜約５００ｍＭの量で製剤中に含まれる。本発明のある実施形態において、生理学的に適合可能な塩は、約５０〜約１０００ｍＭで使用することができる。別の実施形態において、製剤中の塩濃度は、約５０ｍＭ、または約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ以上であってもよい。薬学的に許容可能な塩は非毒性であることが理解される。適切な薬学的に許容可能な塩に関するさらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年において見ることができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で緩衝液を含む。別の実施形態において、緩衝液濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。さらに別の実施形態において、本発明の組成物は、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、または２００ｍＭ以上の緩衝液を含んでもよい。本発明における使用によく適合する緩衝液は、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳなどを含むがこれらに限定されない。当業者は、本発明の組成物において使用するために特に良く適合する他の緩衝液を知っているであろう。本発明の組成物は、酸化防止剤をさらに含んでもよい。
【０１３１】
本明細書において使用される場合、「投与すること」は、対象への経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、鼻腔内もしくは皮下投与、または徐放デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋め込みを意味する。投与は、非経口、および経粘膜（例えば、経口、経鼻、経膣、経直腸、または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内を含む。別の送達方法は、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用を含むがこれらに限定されるものではない。
【０１３２】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適切な製剤は、製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および溶質を含有することができる水性および非水性等張無菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液を含む。本発明の実践において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内にまたは髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多用量密封容器で、提供することができる。注射液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０１３３】
ある種の実施形態において、医薬製剤は、単位剤形である。このような形態では、製剤は、適当な量の活性成分を含有する単位用量にさらに分割される。単位剤形は、バイアルまたはアンプル中にパケット化された錠剤、カプセル、および粉末など、個別量の製剤を収容しているパッケージ化製剤とすることができる。また、単位剤形は、それ自体をカプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはトローチ剤とすることができ、または、適当な数のこれらのパッケージ化形態のいずれかとすることができる。組成物は、所望であれば、別の適合可能な治療剤も含有することができる。
【０１３４】
薬学的に許容可能な担体は、一部には投与される特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の様々な適切な処方が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２００３年、上記、を参照されたい）。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、コンジュゲートと組み合わせる場合にコンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の材料を含む。例は、リン酸緩衝生理食塩液、水、水中油型乳剤などの乳剤、および様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを含むがこれらに限定されるものではない。別の担体はまた、無菌溶液、コーティングされた錠剤およびカプセルを含む錠剤も含んでもよい。典型的には、このような担体は、デンプン、乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または別の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体はまた、香料および着色添加物または別の成分も含んでもよい。このような担体を含む組成物は、従来の周知の方法によって処方される。
【０１３５】
本発明の組成物の有効な剤形、投与方法および投薬量は、経験的に決定することができ、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。投薬量は、採用される特定の組成物、治療される状態、状態の重症度、投与経路、排泄速度、治療期間、哺乳動物に投与されている他の任意の薬剤の種類、哺乳動物の年齢、大きさおよび種、ならびに医学および獣医学分野において周知の類似の要因によって異なることが当業者によって理解される。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低の用量である量であろう。しかしながら、１日総用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師または獣医によって決定されるであろう。所望であれば、１日を通して適当な間隔で別々に投与される、複数の分割用量で、１日用量を投与してもよい。
【実施例】
【０１３６】
（実施例１）
ＬＲＰ１は、ＦＶＩＩＩ血漿レベルの調節に寄与することが示された。ＬＲＰ１は、ＦＶＩＩＩに結合し、これを細胞内分解経路に輸送することができる細胞受容体である。本実施例は、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化またはポリシアル化がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＲＰ１への結合を妨害することを示す。
【０１３７】
成分：精製された組換え野生型ＦＶＩＩＩ（バッチＭＯＱ−Ｈｅｐｅｓ−０８Ｅ；２．２８ｍｇ／ｍｌ；１２１１７ＩＵ／ｍｌ）；ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ（バッチ加水分解可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩＯＲＨＬＵＦＢ０７００１ＰＨＲ；１．７６ｍｇ／ｍｌ；２４９８ＩＵ／ｍｌ）；ポリシアル化ＦＶＩＩＩ（バッチＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ−１１．０ＫＤ  ＮＨＳ；０．６１３ｍｇ／ｍｌ；２６８ＩＵ／ｍｌ）。精製ＬＲＰ１は、Ｂｉｏｍａｃ（Ｌｅｉｐｚｉｇ；カタログ番号０４−０３）から入手した。
【０１３８】
実験設計：ＦＶＩＩＩまたはその誘導体のＬＲＰ１への結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００装置を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を使用して評価した。詳述：ＬＲＰ１を、標準的なＣＭ５−バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定化した。物質輸送制限のために起こり得る再結合を避けるために、流速を２０μｌ／分に設定した。２５℃で、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、および２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有している緩衝液中に試料を流した。タンパク質含量に基づいてタンパク質を希釈した。平衡に達するまでタンパク質を１０分間注入し、続いてさらに２．５分間解離を行った。データ解析では、タンパク質濃度に対する平衡での応答のプロッティングを行うことを含んでいた。解析の間、実験系は緩衝液組成の変化に強く影響を受けるため（緩衝液屈折指数）、注入される全ての製剤を、同様の緩衝液組成を含有するように設計した。したがって、ｗｔ−ＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ間の比較では、等量のそれぞれの緩衝液が最終製剤中に存在していた。ｗｔ−ｒＦＶＩＩＩおよび加水分解可能なＰＥＧ−ＦＶＩＩＩのための、実験のセットアップの例を表１に示す。
【０１３９】
【表１】
2014141532.tif 000012
【０１４０】
一例として、固定化ＬＲＰ１へのｗｔ−ｒＦＶＩＩＩ結合についてのセンサーグラムの生データを、図１に示す。公開されているデータ（例えば、Ｌｅｎｔｉｎｇら、１９９９年、ＪＢＣ２７４巻：２３７３４頁）と一致して、ＦＶＩＩＩは用量依存的に、ＬＲＰ１に効率的に結合する。１０分の注入は、平衡に達するのに実際に十分であるようであった。図２および３に、それぞれＰＥＧ−ＦＶＩＩＩおよびＰＳＡ−ＦＶＩＩＩについての典型的な平衡−応答を示す。注目すべきことに、固定化ＬＲＰ１へのＰＥＧ−ＦＶＩＩＩまたはＰＳＡ−ＦＶＩＩＩの結合は、５０μｇ／ｍｌ（通常の血漿濃度の５０倍に相当）の濃度でさえ、検出されなかった。
【０１４１】
（実施例２）
ＦＶＩＩＩがＶＷＦに結合するとＦＶＩＩＩ軽鎖内のＬＲＰ１相互作用部位に到達できないため、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩの結合はＶＷＦの存在下で阻害される。本実施例は、ｖＷＦのＰＥＧ化またはポリシアル化が、ＦＶＩＩＩによるｖＷＦを介するＬＲＰ１結合阻害を妨害しないことを示す。
【０１４２】
成分：精製された組換え野生型ＦＶＩＩＩ（バッチＭＯＱ−Ｈｅｐｅｓ−０８Ｅ；２．２８ｍｇ／ｍｌ；１２１１７ＩＵ／ｍｌ）；組換え−ｗｔ−ｖＷＦ（バッチＯＲＷＳＥＣ０６００６ＦｌＨＬ；０．４６４ｍｇ／ｍｌ；７２．１ＩＵ  Ａｇ／ｍｌ；２０．６ＩＵ
ＲＣｏ／ｍｌ）、安定なＰＥＧ−ｖＷＦ（バッチＮＴＴ−ＶＷＦ−６００−Ｓ２Ｉ；１．０２１ｍｇ／ｍｌ；６１．４ＩＵ  Ａｇ／ｍｌ；４１．９ＩＵ  ＲＣｏ／ｍｌ）；および安定なＰＳＡ−ｖＷＦ（バッチＰＳＡ−ＲＶＷＦ−１９．３ＫＤ  ＣＡＯバッチ２（０６．１０．２００６）；０．００８７ｍｇ／ｍｌ；１１．３ＩＵ  Ａｇ／ｍｌ；０．２ＩＵ  ＲＣｏ／ｍｌ）。
【０１４３】
野生型組換えＦＶＩＩＩ（４０ｎＭ）を、様々な濃度のｖＷＦ（ｗｔ−ｖＷＦおよびＰＥＧ−ｖＷＦについては０〜４００ｎＭおよびＰＳＡ−ｖＷＦについては０〜２００ｎＭ）でプレインキュベートした。ｖＷＦ濃度は、タンパク質濃度およびｖＷ単量体１つ当たり２５０ｋＤａの分子量を基にした。この場合もやはり、様々なタンパク質が異なる緩衝液中に存在したため、解析全体にわたって緩衝液組成が等しいままであるような方法で希釈スキームを設計した。ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦの混合物を、２５℃で、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有している系−緩衝液中で、２０μｌ／分の流速で、ＬＲＰ１（ＣＭ５−バイオセンサーチップ上に固定化）に適用した。
【０１４４】
ｖＷＦの非存在下で、効率的なＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩの結合が観察された。しかしながら、ｖＷＦ濃度を増加させると、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩの結合は一致して減少した。ＰＥＧ−ｖＷＦに関して、この調節されたタンパク質は、ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１相互作用を妨害するのにｗｔ−ｖＷＦと同程度に効率的であるようであった（図４）。ＰＳＡ−ｖＷＦもまたＬＲＰ１結合を妨害したが（図５）、このコンジュゲート化タンパク質は、ｗｔ−ｖＷＦよりもわずかに効率が悪いようであった。しかしながら、これらのデータは単一の濃度範囲に基づいており、この差異が実験の範囲内であるのか、またはＦＶＩＩＩ／ＬＲＰ１相互作用を阻害する能力の実際の減少を表すのかを判断するために、追加実験を行う必要がある。それにもかかわらず、両方のコンジュゲーションが、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩの結合を阻害するｖＷＦの能力に、あったとしてもごくわずかにしか影響を及ぼさなかったので、これらのデータは、ＰＥＧまたはＰＳＡのいずれかによってｖＷＦをコンジュゲートすることが、ＦＶＩＩＩと相互作用するｖＷＦの能力に、あったとしても重大な程度には影響を及ぼさないことも示す。
【０１４５】
ＦＶＩＩＩのキャリアタンパク質として機能することは別として、ｖＷＦはまた、血小板の血管損傷部位への動員においても重大な役割を果たす。ＶＷＦは、内皮下マトリクスおよび血小板糖タンパク質（Ｇｐ）−Ｉｂ／ＩＸ／Ｖ受容体複合体間の分子架橋として働く。ＧｐＩｂαと相互作用するために、ｖＷＦは潜在性の立体配座から活性な立体配座に転換される必要がある。ｖＷＦの化学修飾はＧｐｌｂα結合部位の露出に影響を及ぼしうるため、本発明者らは、ｗｔ−ｖＷＦおよびそのコンジュゲート化誘導体の、Ｇｐｌｂαに対する（ボトロセチンの非存在下および存在下で）、およびナノボディＡＵ／ｖＷＦａ−１１、活性な立体配座でｖＷＦへの優先的な結合を示す抗体断片に対する結合を試験した。
【０１４６】
成分：組換え−ｗｔ−ｖＷＦ（バッチＯＲＷＳＥＣ０６００６ＦｌＨＬ；０．４６４ｍｇ／ｍｌ；７２．１ＩＵ  Ａｇ／ｍｌ；２０．６ＩＵ  ＲＣｏ／ｍｌ）、安定なＰＥＧ−ｖＷＦ（バッチＮＴＴ−ｖＷＦ−６００−Ｓ２Ｉ；１．０２１ｍｇ／ｍｌ；６１．４ＩＵ
Ａｇ／ｍｌ；４１．９ＩＵ  ＲＣｏ／ｍｌ）；および安定なＰＳＡ−ｖＷＦ（バッチＰＳＡ−ＲｖＷＦ−１９．３ＫＤ  ＣＡＯバッチ２（０６．１０．２００６）；０．００８７ｍｇ／ｍｌ；１１．３ＩＵ  Ａｇ／ｍｌ；０．２ＩＵ  ＲＣｏ／ｍｌ）。組換えＧｐｌｂα（残基１〜２９０を含む）は、以前に記載されている（Ｈｕｉｚｉｎｇａら（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７３１７６）。ボトロセチンはＫｏｒｄｉａ  ＢＶ  （Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）から入手した。抗−Ｇｐｌｂα抗体２Ｄ４は、Ｈ．Ｄｅｃｋｍｙｎ博士（Ｋｏｒｔｒｉｊｋ、ベルギー）より親切にも提供された。ナノボディＡＵ／ｖＷＦａ−１１は以前に記載されている（Ｈｕｌｓｔｅｉｎら２００５年  Ｂｌｏｏｄ  １０６巻：３０３５頁）。ＨＲＰ−コンジュゲート化ポリクローナル抗−ｖＷＦ抗体は、Ｄａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）から購入した。
【０１４７】
本質的に記載されている通り（それぞれ、ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｔｅら、２００５年、ＪＴＨ  ３：２２２８およびＨｕｌｓｔｅｉｎら２００５年  Ｂｌｏｏｄ  １０６巻：３０３５頁）、免疫吸着検定法でＧｐｌｂαおよびＡＵ／ｖＷＦａ−１１への結合を行った。ボトロセチンの非存在下で、ｗｔ−ｖＷＦまたはそのコンジュゲート化誘導体（１μｇ／ｍｌまで）のＧｐｌｂａへの結合を観察することができなかった。したがって、試験したいずれの製剤においても（ｗｔ−ｖＷＦを含む）、自発的にＧｐｌｂαと相互作用することができるｖＷＦ分子は存在しないようである。しかしながらボトロセチンの存在は、ｗｔ−ｖＷＦの場合においてＧｐｌｂαへの効率的な結合を誘導するのに十分である（図６）。実際、Ｂａｘｔｅｒから提供されたｗｔ−ｖＷＦは、通常のプール血漿中に存在するＶＷＦ、または大学の研究室環境において作製された組換えＶＷＦよりもわずかに効率が良いようである。ＰＥＧ−ｖＷＦおよびＰＳＡ−ｖＷＦはともに、非コンジュゲート化ｖＷＦと比較して低い親和性でＧｐｌＢαに結合するため、ｖＷＦのコンジュゲーションはボトロセチン−誘導性Ｇｐｌｂα結合を減少させる。ＰＥＧ−ｖＷＦは、ｗｔ−ｖＷＦよりも約２倍低い親和性で結合したが、ＰＳＡ−ｖＷＦはボトロセチンの存在下においてＧｐｌｂαに実質的に結合することができなかった。ＰＳＡ−ｖＷＦがＧｐｌｂαへのボトロセチン結合の強い阻害を示したという事実は、このタンパク質（２．３ＩＵ／ｍｇのタンパク質）について報告されている低いリストセチン−補因子活性と一致する。対照的に、ＰＥＧ−ｖＷＦは、ｗｔ−ｖＷＦと比較して同様のリストセチン−補因子活性（それぞれ、４４．４ＩＵ／ｍｇと比較して４１．０ＩＵ／ｍｇ）を有する。しかしながら、両方のアッセイが、リストセチンまたはボトロセチンによるｖＷＦの活性化に依存しているということが重要である。ｖＷＦのＰＥＧ化および／またはポリシアル化がこれらのアクチベーターとの相互作用に影響を及ぼすのを排除することはできない。ＶＷＦおよびＧｐｌｂａ間の相互作用に関する決定的なデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの灌流実験から得ることができる。
【０１４８】
ＡＵ／ｖＷＦａ−１１結合実験の結果を図７に示す。通常のプール血漿（ＮＰＰ）を結合対照参照として使用し、この勾配を１と任意に割り当てる。陽性対照として、本発明者らは、血小板−結合立体配座を誘導するＡｒｇ１３０６Ｇｌｎ突然変異（２Ｂ型）を有する組換えｖＷＦを含めた。この製剤の相対的な活性（通常のプール血漿の勾配に対する製剤の勾配の比として定義される）は、６．９である。ユトレヒト大学医療センター調製の組換えｗｔ−ｖＷＦは、ナノボディＡＵ／ｖＷＦａ−１１への結合のわずかな上昇を示した（相対活性１．６）が、一方、Ｂａｘｔｅｒにより提供された組換えｗｔ−ｖＷＦは通常のプール血漿と同様（相対活性１．１）であった。対照的に、ＰＥＧ−ｖＷＦおよびＰＳＡ−ｖＷＦはともに、ＡＵ／ｖＷＦａ−１１への結合の減少を示した（それぞれ、相対活性０．０４および０．３）。通常、これらのタイプの相対活性の減少は２Ａ型突然変異を有するｖＷＦ分子において見られる。ＡＵ／ｖＷＦａ−１１への結合の減少は、ｖＷＦのＰＥＧまたはＰＳＡとのコンジュゲーションが分子を活性な、血小板結合立体配座に転換しないことを示す。あるいは、ＶＷＦのコンジュゲーションは、ｖＷＦＡ１ドメイン内のその結合部位に対するナノボディのアクセスを変更させる可能性がある。
【０１４９】
（実施例３）
ＶＷＦ存在および非存在下におけるＦＶＩＩＩの半減期残存率間の関係を、血友病Ａおよび３型フォンウィルブランド病患者において試験した。血友病Ａ患者はＦＶＩＩＩレベルが欠乏しているが、典型的には正常なＶＷＦ発現を示す。反対に、３型フォンウィルブランド病（ＶＷＤ）患者はＶＷＦの欠乏については同じであるが、正常なＦＶＩＩＩ発現を示す。しかしながら、３型フォンウィルブランド病患者における正常なＦＶＩＩＩ発現にもかかわらず、おそらくＶＷＦのＦＶＩＩＩへの安定な結合によって正常に提供されるタンパク質の欠乏のために、凝固因子の血漿レベルは大幅に減少する。したがって、ＦＶＩＩＩ濃縮物の血友病Ａ患者への投与は、３型フォンウィルブランド病患者への投与よりも長い半減期の凝固因子をもたらすであろうことが予想される。
【０１５０】
上記で提起された仮説を、血友病Ａ患者および３型ＶＷＤ患者において投与されたＦＶＩＩＩの残存率を測定することによって試験した。簡潔に述べると、３０ＩＵ／ｋｇｂ．ｗ．の第ＶＩＩＩ因子濃縮物（Ａｄｖａｔｅ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を、血友病Ａおよび３型ＶＷＤ患者に投与した。血液試料を採取し、クエン酸血漿を調製し、ＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ、Ｓｔａｇｏ；Ａｓｎｉｅｒｅｓ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、フランス）によって、ＦＶＩＩＩに特異的なモノクローナル抗体を使用して、投与後の異なる時点でＦＶＩＩＩレベルを測定した。図８において見られるように、血友病Ａ患者において投与されたＦＶＩＩＩの半減期はおよそ２０時間であるが、３型フォンウィルブランド病患者における半減期は、わずか１〜２時間である。したがって、３型フォンウィルブランド病患者に投与されたＦＶＩＩＩの半減期の減少によって示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩクリアランスは、野生型ＶＷＦの非存在下において非常に大きい割合で起こる。
【０１５１】
次に、投与されたＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの半減期の関係を血友病Ａ患者において判定した。患者におけるＶＷＦの半減期を、Ｎｏｓｓｅｎｔら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、４巻（１２号）：２５５６〜６２頁（２００６年））により提案されている通り計算した。特に、ＶＷＦの時間での半減期は、プロペプチドの定常状態濃度に対する定常状態ＶＷＦ濃度の比の２倍に等しいと想定された。このようにして、３８人の重症血友病Ａ患者において、３０ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｋｇ
ｂ．ｗ．の第ＶＩＩＩ因子濃縮物を投与した後、ＶＷＦに特異的なポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を使用したＥＬＩＳＡによりＶＷＦ−抗原の血漿レベル、および特異的モノクローナル抗体によってＶＷＦプロペプチドレベル（Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＮＬ）を測定することによって半減期を計算した。試料コホートから測定されたＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの半減期をプロットし、２つの半減期が強い相関を有することを示す０．６（Ｐ＝０．０００１）のピアソンの順位相関係数を見出した（図Ｆ）。注目すべきことに、３８人のうち３３人の患者において、ＶＷＦの半減期がＦＶＩＩＩ半減期よりも大きかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩクリアランスについて提案された平衡を、図１０に示す。
【０１５２】
（実施例４）
ＬＤＬ−受容体関連タンパク質（ＬＲＰ１、ＣＤ９１）／メガリン（Ｌｅｎｔｉｎｇら、ＪＢＣ  ２７４巻：２３７３４〜９頁（１９９９年）；Ｓａｅｎｋｏら、ＪＢＣ  ２７４巻：３７６８５〜９２頁））、ＬＤＬ−受容体／ｖＬＤＬ−受容体Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０６巻：９０６〜１２頁（２００５年））、アシアロ糖タンパク質−受容体（Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ３巻：１２５７〜６５頁（２００５年））、およびＣＤ２０６（マクロファージマンノース−受容体）（Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５巻：１３５３〜６０頁（２００７年））を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩクリアランスに関与すると推定されるいくつかの受容体が記載されている。これらの受容体へのＦＶＩＩＩ結合の結合は、ＶＷＦ存在下において防止されるまたは減少することが公知である。しかしながら、ＬＲＰ１だけが、ＦＶＩＩＩクリアランスに関して生理学的に適切であると示されている（Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０１巻（１０号）：３９３３〜９頁（２００３年））。そのため、ＦＶＩＩＩおよびＬＲＰ１間の相互作用の動態試験は、ＬＲＰ１を介するＦＶＩＩＩクリアランスの減少をもたらす条件を決定する試みにおいて行われた。
【０１５３】
化学的コンジュゲーションおよびさらなる血液因子の存在がＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１結合の動態に与える影響を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行った。簡潔に述べると、Ｈｕｉｚｉｎｇａら（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ３巻：２２２８〜３７頁（２００５年）により記載された通りに精製したＬＲＰ１を、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に４０００ＲＵ／ｍｍ２で固定化し、これは約６．７ｆｍｏｌ／ｍｍ２のＬＲＰ１であると測定された。様々な濃度の組換えＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ化（図１１）および非コンジュゲート化（図１２）を、チップ上に２０μｌ／分で流し、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムおよびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して相互作用の定常状態の動態を測定した。ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、図１３に示す加水分解可能なＰＥＧ部分で修飾し、ＵＳ２００８／０２３４１９３Ａ１に記載の通り結合させた。図１３において見られるように、ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、５０μｇ／ｍｌという高濃度でさえＬＲＰ１を結合させることができなかった。次いで、図Ｌに示す安定なＰＥＧ部分によって修飾した、ｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを用いて実験を繰り返した。図１４および１５において見られるように、ｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ（白丸）は、ＬＲＰ１に結合したレベルは、修飾されていないＦＶＩＩＩ（黒丸）と比較して、実質的に減少した。これらの実験は、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化がＬＲＰ１への結合を阻害することを示す。
【０１５４】
ＬＲＰ１は、完全長ＦＶＩＩＩ重鎖ではなくＦＶＩＩＩ軽鎖と相互作用することが公知である（Ｌｅｎｔｉｎｇら、ＪＢＣ  ２７４巻（３４号）：２３７３４〜９頁（１９９９年））。しかしながら、トロンビンによる部分的なタンパク質分解の後、ＦＶＩＩＩ重鎖はＬＲＰ１に結合できるようになる（Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ４巻（７号）：１４８７〜９３頁（２００６年））。したがって、トロンビン活性化ＦＶＩＩＩのＬＲＰ１への結合に対するＰＥＧ化の影響を調べた。簡潔に述べると、２５０μｇ／ｍｌの修飾されていないＦＶＩＩＩ、ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ、およびｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを、２ｎＭのトロンビンで５分間、３７℃でインキュベートした。タンパク質分解を停止させるために、反応混合物を、トロンビン特異的インヒビター（ＰＰＡＣＫ、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔ．、ドイツ）の５０ｎＭ水溶液中に１０倍希釈した。次いで活性型ＦＶＩＩＩ溶液のＬＲＰ１結合を、前述の通りＢｉａｃｏｒｅ２０００システムを使用してＳＰＲによって解析した。図１６に示すＳＰＲＦＶＩＩＩ結合実験の結果に見られるように、トロンビン切断はｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩではなく、修飾されていないおよびｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＬＲＰ−結合を誘導する。
【０１５５】
次に、ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１結合に対するＶＷＦの影響をＳＰＲ解析によって試験した。４０ｎＭの修飾されていないＦＶＩＩＩを、０〜４００ｎＭの修飾されていないまたはＰＥＧ化ＶＷＦと一緒に３７で２５分間プレインキュベートした。ＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ複合体を次いで、上述の通りＳＰＲ解析にかけた。ｓＰＥＧ化（図１７）およびｈＰＥＧ化（図１８）ＶＷＦはともに、修飾されていないＶＷＦに対して、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合をさらに阻害した。これらのデータは、ＶＷＦのＰＥＧ化が、ＬＲＰ１受容体を介するＦＶＩＩＩクリアランスをさらに減少させることができることを示す。
【０１５６】
要約すると、ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ１結合実験は、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化がＦＶＩＩＩおよびそのクリアランス受容体ＬＲＰ１間の相互作用を大幅に減少させることを示す。さらに、ｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩではなく、ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのトロンビン切断は、修飾されていないＦＶＩＩＩと同レベルまでではないが、ＬＲＰ１への結合を誘導する。最後に、ＶＷＦのＰＥＧ化は、ＦＶＩＩＩおよびそのクリアランス受容体ＬＲＰ１間の相互作用のＶＷＦを介する阻害を妨害しない。反対に、ＰＥＧ化は、示されている通り、ＬＲＰ１へのＦＶＩＩＩ結合に対するＶＷＦの阻害効果を実際に増加させる。これらの実験は、組換えＶＷＦおよびＦＶＩＩＩのいずれかまたは両方のＰＥＧ化が、血友病およびフォンウィルブランド病などの血液凝固障害の患者における投与に有益な効果を有する可能性があることを示す。
【０１５７】
（実施例５）
ＶＷＦのＰＥＧ化の影響をさらに特徴付けるために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムにおいてＳＰＲ実験を使用して、コンジュゲート化ＶＷＦのヘパリンへの結合を試験した。簡潔に述べると、ビオチニル化ヘパリンを、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に７０ＲＵ／ｍｍ２でコンジュゲートさせた。次いで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液において、２５μｇ／ｍｌの非コンジュゲート化、ｓＰＥＧ化、およびｈＰＥＧ化ＶＷＦを、１０μｌ／ｍｌの流速でチップ上に流した。前述同様に、データを収集し、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアパッケージを使用して解析した。図１９において見られるように、非コンジュゲート化ＶＷＦは、低い親和性でヘパリンに結合した。これは、ヘパリンに全く結合しなかったＰＥＧ化ＶＷＦと対照的である。これらのデータは、ＶＷＦのＰＥＧ化が、タンパク質のヘパリンに結合する能力を低減または除去することを示す。
【０１５８】
（実施例６）
ＧｐＩｂαへのＶＷＦ結合に対してＰＥＧ化が与える影響を測定するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。簡潔に述べると、組換えＧｐＩｂαを、抗体をコンジュゲートしたマイクロタイタープレート上に固定化し、ｐＨ７．４の、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液でブロックした。様々な起源由来の０〜５００ｎｇ／ｍｌのＶＷＦを、３％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液中に透析し、次いでマイクロタイターウェル中で３７℃で１２０分間インキュベートした。次いで結合していないタンパク質を除去し、ウェルを洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したポリクローナル抗−ＶＷＦ抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｎ）を使用して、ＶＷＦを検出した。図６において見られるように、ＰＥＧ化ＶＷＦは、非コンジュゲート化ＶＷＦと比較してわずかに低い親和性でＧｐＩｂαに結合した。これらの結果は、ＰＥＧ化ＶＷＦが、依然としてＧｐＩｂαを介する血小板結合能を有することを示す。
【０１５９】
（実施例７）
ＶＷＦは、灌流および静止条件下の両方で白血球に結合する（Ｐｅｎｄｕら、Ｂｌｏｏｄ  １０８巻（１２号）：３７４６〜５２頁（２００６年））。静止結合アッセイを行い、ＰＥＧ化がこれらの相互作用に対して与える影響を調べた。簡潔に述べると、修飾されていない、ｈＰＥＧ化、およびｓＰＥＧ化ＶＷＦを、マイクロタイターウェル中に固定化し、次いでＰＭＮ細胞を前処理し、その後タンパク質コーティングしたウェルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした（Ｐｅｎｄｕら、Ｂｌｏｏｄ  １０８巻（１２号）：３７４６〜５２頁（２００６年））。次いで、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４でウェルを穏やかに洗浄することによって、結合していない細胞を除去した。図２０において見られるように、静止条件下で、ｓＰＥＧ化およびｈＰＥＧ化ＶＷＦはともに、非コンジュゲート化ＶＷＦと同様のレベルで、ＰＭＮ細胞に安定に結合した。このデータは、ＶＷＦのコンジュゲーションが白血球との特異的な相互作用に影響を与えないことを示す。
【０１６０】
（実施例９）
ＰＥＧ化がＦＶＩＩＩ／ＶＷＦおよびＬＲＰ１間の相互作用に与える影響を特徴付けるため、ＳＰＲ実験を行った。簡潔に述べると、前述と同様に、ＬＲＰ１をＣＭ５−バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートし、約８ｆｍｏｌ／ｍｍ２のＬＰＲ１でコンジュゲーションを測定した。様々な濃度のコンジュゲート化および非コンジュゲート化ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの両方を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した。次いで、タンパク質試料を、２０μＬ／ｍｌの流速でチップ上に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムを使用してＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して平衡動態を測定した。以前に見られたように、ｓＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、非コンジュゲート化ＦＶＩＩＩと比較して低い親和性でＬＲＰ１に結合し（図２１および２２）、ｈＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、ＬＲＰ１に全く結合しなかった（図２３）。驚くべきことに、非コンジュゲートおよびＰＥＧ化ＶＷＦの両方が、ＦＶＩＩＩよりもはるかに低い親和性であるが、ＬＲＰ１にも結合することが分かった（図２４および２５）。ＰＥＧ化ＶＷＦは、非コンジュゲート化タンパク質のおよそ半分の親和性でＬＲＰ１に結合した。これらのデータは、クリアランス受容体ＬＲＰ１に対するＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの両方の親和性が、ＰＥＧの血液凝固因子へのコンジュゲーションによって減少することを示す。まとめると、これにより、これらの修飾された因子はＬＲＰ１クリアランス受容体に対する親和性の減少を示すため、ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦのＰＥＧ化は、血友病およびフォンウィルブランド病などの血液凝固障害に罹患している患者に投与された前記タンパク質の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を高めることを示す。
【０１６１】
（実施例１０）
ＬＲＰ１の細胞外ドメインにおいて異なるクラスターは、異なる基質に異なる親和性で結合することが広く認められている（Ｗｉｌｌｎｏｗら、ＪＢＣ  ２６９巻（２２号）：１５８２７〜３２頁（１９９４年））。特に、クラスターＩＩおよびＩＶは、最大の結合の乱交雑を示し、そのためＦＶＩＩＩおよびＶＷＦなど血液因子に対する結合親和性に寄与する可能性が高いと考えられている。個々のＬＲＰ１クラスターについてＦＶＩＩＩ／ＶＷＦおよびＬＲＰ１間の相互作用を特徴付けるため、コンジュゲート化および非コンジュゲート化血液因子のＬＲＰ１クラスターＩＩおよびＩＶに対する結合親和性を比較するＥＬＩＳＡ実験を行った。簡潔に述べると、組換えクラスターＩＩまたはクラスターＩＶペプチドを、マイクロタイターウェル中に固定化し、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１％のＨＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）でブロックした。コンジュゲート化および非コンジュゲート化ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦを同じＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中に透析した。次いで、マイクロタイターウェル中で、血液因子を３７℃で１２０分間インキュベートした。結合していないタンパク質を除去し、ウェルをＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄した。ＨＲＰ標識ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（Ｌｅｎｔｉｎｇら、ＪＢＣ  ２６９巻：７１５０〜５頁（１９９４年）またはＨＲＰ標識ＶＷＦポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で、結合したＦＶＩＩＩまたはＶＷＦを検出した。図２６および２７において見られるように、コンジュゲート化および非コンジュゲート化ＦＶＩＩＩは、ＬＲＰ１クラスターＩＩおよびＩＶの両方に結合した。ＳＰＲデータと一致して、コンジュゲート化ＦＶＩＩＩは、非コンジュゲート化タンパク質と比較して低い親和性でＬＲＰ１クラスターに一定して結合した。同様に、コンジュゲート化および非コンジュゲート化ＶＷＦもまた、両方のＬＲＰ１クラスターに結合した。この場合もやはりＳＰＲ結果と一致して、ＰＥＧ化ＶＷＦは、顕著に低い親和性でクラスターＩＩおよびＩＶの両方に再現可能に結合した。
【０１６２】
（実施例１１）
本実施例は、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ−リンカーを使用したＰＳＡによるｒＦＶＩＩＩのコンジュゲーションを示す。ｒＦＶＩＩＩ−ＰＳＡコンジュゲートの調製のために、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４中に、Ａｄｖａｔｅ製造プロセスから入手した組換えＦＶＩＩＩ溶液（４．５ｍｇ／ｍｌ）６ｍｌ、二官能性リンカーＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＳＵ（Ｔｓｕｂｅｒｙら、ＪＢＣ  ２００４年；２７９巻：３８１１８〜２４頁に概説されている通りに調製）を加え（濃度：０．３１５ｍｇ／ｍｇタンパク質）、室温で３０分間インキュベートした。次いで、末端ＳＨ基を含む誘導体化ＰＳＡを調製した。ＰＳＡ誘導体を、混合物に加え（濃度：２７．８ｍｇ  ＰＳＡ−ＳＨ／ｍｇタンパク質−４５０倍モル過剰）、さらに２時間、室温でインキュベートした。０．１Ｍグリシン（最終濃度１０ｍＭ）および５ｍＭシステイン（最終濃度０．５ｍＭ）の水溶液を添加することによって反応を停止させた。予め充填されたＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって遊離試薬をｒＦＩＸ−ＰＳＡコンジュゲートから分離した。５ＭのＮａＣｌ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−緩衝液、５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、６．７ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液をＰＳＡ−ｒＦＩＸ含有溶液に加え、最終濃度３ＭのＮａＣｌを得た。次いでこの混合物をカラムに添加し、続いて、１０ＣＶ平衡緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−緩衝液、３ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ８０、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐ  ６．９）で洗浄し、クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４（１３．６ｍＭのクエン酸Ｎａ３、２０ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのヒスチジン、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０）でｒＦＩＸ−ＰＳＡコンジュゲートの溶出を行った。コンジュゲートを溶出した後、ｐＨを６．９に調製した。溶出物は、２．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質（ＢＣＡアッセイ）を含んでいた。
【０１６３】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示を目的としたものにすぎず、これに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用された全ての出版物、特許、特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
2014141532.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2014141532.tif 000040
【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３０ｃ】
2014141532.tif 000044
【図３０ｄ】
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【図３０ｅ−１】
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【図３０ｅ−２】
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【図３０ｅ−３】
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【図３０ｅ−４】
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【図３０ｆ−１】
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【図３０ｆ−２】
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【図３０ｆ−３】
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【図３０ｇ−１】
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【図３０ｇ−２】
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【図３０ｈ−１】
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【図３０ｈ−２】
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【図３０ｈ−３】
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【図３０ｉ−１】
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【図３０ｉ−２】
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【図３０ｉ−３】
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【図３０ｉ−４】
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【図３０ｊ−１】
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【図３０ｊ−２】
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【図３０ｋ】
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【図３０ｌ−１】
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【図３０ｌ−２】
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【図３０ｍ−１】
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【図３０ｍ−２】
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【図３０ｎ】
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【外国語明細書】
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