(57)【要約】【課題】光毒性や消化器系障害についての副作用が軽減され、細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積に伴う線維化を抑制する活性を有する、安全性に優れた医薬を提供すること。【解決手段】本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有する医薬を提供する。2014141441.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有する、医薬。
【化１】
2014141441.tif 000007
【請求項２】
下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有する、線維症の治療剤又は予防剤。
【化２】
2014141441.tif 000008
【請求項３】
前記線維症は、肺線維症である、請求項２記載の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクタム誘導体の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が主な原因となって、種々の臓器の機能に悪影響を及ぼす疾患であり、特に、肺、肝臓、腎臓及び皮膚で発症する。線維症が発症した臓器では、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（以下、ＴＧＦ−β）の産生量が増加しており（非特許文献１）、このＴＧＦ−βが引き金となって、線維芽細胞の活性化と細胞外マトリックス成分の過剰生産を引き起こしていると考えられている。このことは、抗ＴＧＦ−β抗体を線維症の病態モデル動物に投与することによって、線維化症状が抑制されたことによって明らかにされており（非特許文献２）、ＴＧＦ−βは、主要な線維化促進因子の１つとして位置付けられている。
【０００３】
線維症の治療は、薬物療法が主であり、免疫抑制剤（コルチコステロイド等）や抗炎症剤が使用されてきたが、近年になって、ピルフェニドン（Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）が特発性肺線維症治療剤として承認され使用されている（非特許文献３〜６）。
【０００４】
一方、非特許文献７では、１−ベンジルアゼパン−２−オンの合成方法が開示され、中間体化合物として使用する例が開示されている。
【０００５】
また、特許文献１では、下記の一般式で示されるラクタム誘導体が開示され、１−ベンジルアゼパン−２−オンとは異なる一部の化合物が増殖性皮膚疾患の治療に有用であることが示唆されている。
【化１】
2014141441.tif 000002
[式中、Ｒ’は、水素などを表し、Ｒは、フェニルなどを表し、ｍは、３〜７の整数を表し、ｎは、０〜１７の整数を表す。]
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第１９８７／００４３４６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｒｏｅｋｅｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９１年、第８８巻、ｐ．６６４２−６６４６
【非特許文献２】Ｂｏｒｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、第２６巻、ｐ．３６１−３６４
【非特許文献３】Ｏｋｕら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８
【非特許文献４】Ｇａｒｃｉａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年、第３７巻、ｐ．７９７−８０５
【非特許文献５】Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９８年、第５４巻、ｐ．９９−１０９
【非特許文献６】Ｓｈｅｔｌａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、第１３２巻、ｐ．４９１−４９６
【非特許文献７】Ｈａｎａｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００９年、第１３１巻、ｐ．１５０３２−１５０４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、線維症の治療に処方されている免疫抑制剤や抗炎症剤では、線維化抑制効果が不十分な上に、強い副作用があることが知られ、ピルフェニドンについては、光毒性や消化器系障害等の重篤な副作用が知られている。したがって、現在の線維症の治療剤には、効果及び安全性の点で満足できるものはなく、これらの課題を解決・改善させた新たな線維症の治療薬の開発が望まれている。
【０００９】
また、非特許文献７で開示された１−ベンジルアゼパン−２−オンの利用は、中間体化合物としての利用に止まっており、線維症の治療用途への可能性については開示も示唆もされていない。
【００１０】
さらに、特許文献１で開示されたラクタム誘導体についても、線維症の治療用途への可能性については開示も示唆もされていない。
【００１１】
そこで本発明は、光毒性や消化器系障害についての副作用が軽減され、細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積に伴う線維化を抑制する活性を有する、安全性に優れた医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体が優れた線維化抑制作用を有し、かつ、光毒性を示さず、消化器系障害が軽減されていることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有する、医薬を提供する。
【化２】
2014141441.tif 000003
【００１４】
また、本発明は、上記のラクタム誘導体を有効成分として含有する、線維症の治療剤又は予防剤を提供する。上記の線維症の治療剤又は予防剤は、肺線維症の治療剤又は予防剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の医薬は、優れた線維化抑制作用を有し、かつ、光毒性を示さず、消化器系障害が軽減されており、安全性の高い線維症の治療剤又は予防剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける肺組織中ハイドロキシプロリン量の増加に対する実施例１の化合物の抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の医薬は、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有することを特徴としている。
【化３】
2014141441.tif 000004
【００１８】
上記の医薬は、優れた線維化抑制作用を有し、光毒性を示さず、消化器系障害も軽減されていることから、線維化抑制効果及び安全性を兼ね備えた医薬、特に線維症の治療剤又は予防剤として用いることができる。
【００１９】
線維症とは、線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が主な原因で、組織に線維化病変が形成され、種々の臓器の機能に悪影響を及ぼす疾患であり、例えば、肺線維症、肝線維症、腎線維症又は皮膚線維症が挙げられる。上記の医薬は、肺線維症の治療又は予防剤としてより好ましく用いることができる。
【００２０】
肺線維症とは、種々の刺激により肺胞上皮又は基底膜が傷害され、その修復過程における線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が原因で、肺に線維化病変が形成される疾患であり、例えば、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、呼吸細気管支炎関連性間質性肺疾患又は放射線肺線維症が挙げられる。上記の医薬は、特に特発性肺線維症の治療又は予防に好ましく用いることができる。
【００２１】
上記の医薬が線維症の治療又は予防に有効であることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を用いて評価できる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験としては、例えば、ＴＧＦ-βの産生又は線維芽細胞の活性化測定系が挙げられる。ＴＧＦ-βの産生測定には、単球由来及びマクロファージ由来の細胞を用いる系（国際公開第０１／０５８４４８号）が挙げられる。  
【００２２】
また、線維芽細胞は組織の線維化過程で活性化されると、過剰増殖する及び細胞外マトリックス成分を過剰に産生するようになるほか、収縮能を獲得するが、これらを指標に線維芽細胞の活性化を評価することができる。過剰増殖を指標とした試験としては、例えば、肺、肝臓、腎臓若しくは皮膚などの各種臓器由来の線維芽細胞の通常培養条件下又は増殖因子（例えば、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を添加して培養した条件下での増殖を評価する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年、第３７巻、ｐ．５８４−５９１）が挙げられる。
【００２３】
細胞外マトリックス成分の過剰産生を指標とした試験としては、例えば、肺、肝臓、腎臓又は皮膚などの各種臓器由来の線維芽細胞を用いて、細胞外マトリックス成分の一つであるコラーゲンの産生量を測定する方法（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００８年、第８２巻、ｐ．２１０−２１７）が挙げられる。
【００２４】
また、収縮能を指標とした試験としては、例えば、肺、肝臓、腎臓又は皮膚などの各種臓器由来の線維芽細胞を包理培養したコラーゲンゲルを用いて、コラーゲンゲルの面積を測定する方法（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００９年、第２２巻、ｐ．４８７−４９１、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１０年、第１５９巻、ｐ．３０４−３１５、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００６年、第７０巻、ｐ．２９８−３０５、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年、第３０４巻、ｐ．２１７−２２２）が挙げられる。線維芽細胞をコラーゲンゲル内で包埋培養すると、線維芽細胞の活性化（例えば、ＴＧＦ−β１の添加）により生じる線維芽細胞の収縮に伴いコラーゲンゲルが収縮し、コラーゲンゲル面積は縮小するため、コラーゲンゲル面積を測定すれば線維芽細胞の収縮能を評価できる。
【００２５】
また、上記の医薬が線維症の治療又は予防に有効であることは、病態モデルを用いて評価できる。病態モデルとしては、例えば、ブレオマイシンによるブレオマイシン誘発肺線維症モデル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８）、四塩化炭素による肝硬変モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年、第３７巻、ｐ．７９７−８０５）、メタバナジン酸アンモニウムによる腎線維症モデル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００２年、第６４巻、ｐ．５１７−５２５）、慢性腎不全モデル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９８年、第５４巻、ｐ．９９−１０９）又はケロイドモデル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、第１３２巻、ｐ．４９１−４９６）が挙げられる。ブレオマイシン誘発肺線維症モデルは、肺線維症のモデルとして一般的であるが、その病態は特発性肺線維症に近いとされている。
【００２６】
上記の医薬の線維症の治療又は予防に対する有効性は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を用いて、例えば、ＴＧＦ-β産生量の低下、線維芽細胞の増殖の低下、線維芽細胞によるコラーゲン産生量の低下、又は、線維芽細胞の収縮能の指標であるコラーゲンゲル面積の縮小の抑制を指標に評価することができる。また、上記の病態モデルを用いて、例えば、線維化の特徴的指標である組織中ハイドロキシプロリン量の低下を指標に評価することができる。
【００２７】
光毒性とは、一般的には皮膚内に吸収された薬剤が、光エネルギーによって光化学反応を起こし活性化された結果、毒性を獲得して組織を傷害する性質をいう。
【００２８】
上記の医薬が光毒性を有していないことは、例えば、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を用いた光毒性試験（ＯＥＣＤ  ｔｅｓｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ４３２、２００４年）又はマウス、モルモット若しくはウサギを用いた光毒性試験で評価できる。
【００２９】
消化器系障害とは、服用した薬剤により、上腹部不快感、腹痛、腹部膨満感、食欲不振、悪心、嘔吐及び／又は下痢などの症状を引き起こすものである。
【００３０】
上記の医薬の消化器系障害作用が低いことは、例えば、ラットにおける色素を用いた胃排泄能に関する試験若しくは炭素末を用いた小腸輸送能に関する試験又はフェレット催吐に関する試験で評価できる。
【００３１】
上記の医薬は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル及びヒト）、特にヒトに対して投与した場合に、線維症の病態の改善効果、治療効果及び／又は予防効果を発揮できる。
【００３２】
上記の医薬は、無添加の状態で又は医薬として許容される担体を配合した製剤として、経口的又は非経口的に投与できる。
【００３３】
上記の医薬を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤及びマイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤又は坐剤が挙げられる。  
【００３４】
また、上記の医薬は、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも可能である。また、上記の医薬のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化又は包装化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【００３５】
上記の医薬を上記の剤形に調製する場合は、製剤分野で一般的に用いられている方法に従って行うことができる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤及び／又は乳化剤などを含有させて調製できる。
【００３６】
錠剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤及び／又は滑沢剤を含有させて行うことができ、丸剤及び顆粒剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤及び／又は崩壊剤を含有させて行うことができる。
【００３７】
また、散剤及びカプセル剤の調製は、例えば、賦形剤を含有させて行うことができ、シロップ剤の調製は、例えば、甘味剤を含有させて行うことができ、乳剤及び懸濁剤の調製は、例えば、界面活性剤、懸濁化剤及び／又は乳化剤を含有させて行うことができる。
【００３８】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム又は硫酸カルシウムが挙げられる。
【００３９】
結合剤としては、例えば、デンプンのり液、アラビアゴム液、ゼラチン液、トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液又はグリセリンが挙げられる。
【００４０】
崩壊剤としては、例えば、デンプン又は炭酸カルシウムが挙げられる。
【００４１】
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又は精製タルクが挙げられる。
【００４２】
甘味剤としては、例えば、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン又は単シロップが挙げられる。
【００４３】
界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル又はステアリン酸ポリオキシル４０が挙げられる。
【００４４】
懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース又はベントナイトが挙げられる。
【００４５】
乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン又はポリソルベート８０が挙げられる。
【００４６】
さらに、上記の医薬を上記の剤形に調製する場合は、製剤分野において一般的に用いられる、着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤及び／又は粘稠剤などを添加してもよい。
【００４７】
上記の医薬の投与量は、目標とする治療効果、投与方法、年齢又は体重などによって変化するため、一概には規定できないが、通常一日の経口的な投与量は、有効成分として１００〜１００００ｍｇが好ましく、２００〜８０００ｍｇがより好ましい。これを１日に１〜５回に分割して投与すればよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を示して本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）  １−ベンジルアゼパン−２−オンの合成：
アルゴン置換した反応容器に６０％水素化ナトリウム（０．５５１ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を入れ、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥した。テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を加え、氷浴で冷却し、ε−カプロラクタム（１．２０ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）、次いでベンジルブロミド（１．３９ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を氷浴で冷却し、水を加え、得られた反応混合物を減圧濃縮した。濃縮後の反応混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝３０／７０〜５５／４５）で精製し、以下の化学式（Ｉ）で示される１−ベンジルアゼパン−２−オン（以下、実施例１の化合物）（２．０６ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、収率９６％）を得た。
【化４】
2014141441.tif 000005
1H-NMR (400MHz, CDCl3)δ: 7.34-7.23 (5H, m), 4.59 (2H, ｓ), 3.30-3.28 (2H, ｍ), 2.62-2.60 (2H, m), 1.75-1.66 (4H, ｍ), 1.51-1.46 (2H, ｍ).
MS (ESI)： 204 ([M+H]+).
【００５０】
なお、４００  ＭＨｚ  ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＥＣＳ４００型核磁気共鳴装置（日本電子社）を用いて測定した。また、ＮＭＲデータ中に示される溶媒名は、測定に使用した溶媒を示している。ケミカルシフトは、テトラメチルシランを基準として、δ（単位：ｐｐｍ）で表し、シグナルはそれぞれｓ（一重線）、ｍ（多重線）で表した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｇ６１３０Ａ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いて測定した。
【００５１】
（実施例２）  ヒト単球ＴＨＰ−１細胞におけるＴＧＦ−β産生抑制作用：
ヒト単球細胞株であるＴＨＰ−１細胞を用いて、リポポリサッカライド（以下、ＬＰＳ）刺激によるＴＧＦ−β産生に対する実施例１の化合物の抑制作用を、国際公開第０１／０５８４４８号に記載の方法を一部改変して検討した。
【００５２】
ＴＨＰ−１細胞は、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて継代維持した。以下の実験には、３％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。
【００５３】
９６ウェル平底プレート中で、実施例１の化合物又はピルフェニドンの１００％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）溶液とＴＨＰ−１細胞（細胞密度１×１０６個／ｍＬ）を混合した後、ＬＰＳ（シグマ、最終濃度０．３μｇ／ｍＬ）を加えて３７℃、２４時間インキュベーションした（ＤＭＳＯ最終濃度１％）。インキュベーション後、培養上清中のＴＧＦ−βをＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β１、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により定量した。
【００５４】
その結果、ピルフェニドン及び実施例１の化合物は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＧＦ−β産生を濃度の増加に伴って抑制し、ＩＣ５０値は、それぞれ５６６０μｍｏｌ／Ｌ及び３４９μｍｏｌ／Ｌであった。
【００５５】
この結果から、本発明の医薬は、線維症の病態進展に関与するＴＧＦ−β産生を抑制することが明らかとなった。すなわち、本発明の医薬は、線維化の進展に対して抑制的に働くと考えられる。
【００５６】
（実施例３）  マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける評価：
マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルの肺組織中ハイドロキシプロリン量に対する実施例１の化合物の作用を検討した。マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルとして、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８に記載の方法を一部改変して用いた。
【００５７】
ＩＣＲ系マウス（雄、１３週齢、日本チャールス・リバー）にブレオマイシン（日本化薬）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で、５日間連日、１日１回尾静脈内投与し、線維化を惹起した。線維化を惹起しないマウス（正常群）には、生理食塩水を同様に投与した。
【００５８】
線維化を惹起したマウスに、ブレオマイシン投与開始日から１０日間連日、実施例１の化合物を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日２回経口投与した（３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。なお、実施例１の化合物は、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。正常群及び溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。
【００５９】
実施例１の化合物投与終了日の翌日に、イソフルラン麻酔下にて放血致死後、左肺を採取した。線維化の指標である肺組織中ハイドロキシプロリン量は、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ法（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、１９６１年、第９３巻、ｐ．４４０−４４７）を一部改変して以下の通り定量した。採取した左肺（全部）に蒸留水を１ｍＬ加えホモジナイズし、これに濃塩酸を１ｍＬ加えて、１２０℃にて２４時間加熱した。その後、５Ｎ  ＮａＯＨを２．４ｍＬ加えて中和し、これを測定用試料とした。
【００６０】
測定用試料を蒸留水で適宜希釈し、１．４％クロラミンＴ溶液を１ｍＬ加えて室温にて２０分間反応させた後、３．１５Ｍ過塩素酸及び２０％パラジメチルアミノベンズアルデヒド／２−メトキシエタノール溶液を各々１ｍＬ加えて６０℃にて２０分間反応させた。その後、直ちに水浴中で冷却し、吸光度を測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｄｅｌ  ６８０）にて測定波長５７０ｎｍを測定した。肺組織（左肺）中のハイドロキシプロリン量は、直線回帰解析により得られた検量線（１〜１５μｇ）から算出した。
【００６１】
肺組織中ハイドロキシプロリン量の定量結果を図１に示す。図中の値は平均値±標準誤差（ｎ＝８）を示す。図中の「正常」は、線維化を惹起しないマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（正常群）を示し、「溶媒」は、線維化を惹起したマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒群）を示し、「実施例１の化合物」は、線維化を惹起したマウスに実施例１の化合物３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを経口投与した群を示す。＃印は正常群との比較（Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）で統計学的に有意であることを示し（＃＃：Ｐ＜０．０１）、＊印は溶媒群との比較（Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ検定）で統計学的に有意であることを示す（＊：Ｐ＜０．０５）。
【００６２】
溶媒群の肺組織中ハイドロキシプロリン量は、正常群に比べ統計学的に有意に増加し、ブレオマイシン投与により肺線維化が惹起されていることが示された。ブレオマイシン投与により線維化を惹起したマウスに実施例１の化合物を投与すると、肺組織中ハイドロキシプロリン量は正常群と同等のレベルにまで抑制され、その値は溶媒群に比べ統計学的に有意に減少した。
【００６３】
この結果から、本発明の医薬は、優れた線維化抑制効果を示すことが明らかとなった。
【００６４】
（実施例４）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ光毒性評価：
実施例１の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ光毒性作用を、ピルフェニドンと比較検討した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ光毒性試験はＯＥＣＤガイドライン（ＯＥＣＤ  ｔｅｓｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ４３２、２００４年）に従い実施した。
【００６５】
９６ウェル平底プレートの各ウェルにマウス線維芽細胞株であるＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞０．１ｍＬ（細胞密度１×１０５個／ｍＬ）を播種し、２８時間の前培養を行った（培養培地：１０％Ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）。前培養後、培養液を除去した。ＤＭＳＯに溶解しＥａｒｌ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＥＢＳＳ）で希釈した実施例１の化合物又はピルフェニドンを０．１ｍＬ各ウェルに加え（ＤＭＳＯ最終濃度１％）、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００６６】
その後、紫外線照射装置（タイプＳＯＬ５００；Ｄｒ．Ｈｏｎｌｅ）下にセットし、紫外線（照射総線量約５Ｊ／ｃｍ２：放射照度約１．７ｍＷ／ｃｍ２、５０分間照射）を照射した。なお、紫外線を照射しない場合（紫外線非照射時）は、暗所にて５０分間放置した。照射後、細胞をＥＢＳＳで洗浄し、培養培地を０．１ｍＬ各ウェルに加え、３７℃で２０時間インキュベーションした。インキュベーション後、培養培地を除去し、０．０５ｍｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍを０．１ｍＬ各ウェルに加え、３７℃で３時間インキュベーションした。その後、細胞をＥＢＳＳで洗浄し、抽出液（１％酢酸含有５０％エタノール溶液）を０．１５ｍＬ各ウェルに加え、吸光度を測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて測定波長５５０ｎｍを測定した。
【００６７】
得られた吸光度から、下記式にて相対生存率（％）を算出した。なお、細胞非添加かつ化合物非添加を無処置対照とし、細胞添加かつ化合物非添加を処置対照とした。
相対生存率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）×１００
Ａ：化合物処置の吸光度
Ｂ：無処置対照の吸光度
Ｃ：処置対照の吸光度
Ｄ：無処置対照の吸光度
【００６８】
算出した相対生存率（％）から、各化合物の５０％細胞生存濃度（ＩＣ５０値）を、Ｐｈｏｔｏｔｏｘ  ２．０（ＺＥＢＥＴ）を用いて算出し、続いて光細胞毒性の指標であるＰＩＦ（紫外線非照射時のＩＣ５０値／紫外線照射時のＩＣ５０値）を算出した。ＰＩＦが２未満の場合は陰性と判定し、２以上の場合は陽性と判定した。
【００６９】
その結果、実施例１の化合物は、ＰＩＦが２未満であり陰性と判定された。一方、ピルフェニドンは、ＰＩＦが２以上であり陽性と判定された。
【００７０】
この結果から、ピルフェニドンが光毒性を示すのに対し、本発明の医薬は、光毒性を示さないことが明らかとなった。
【００７１】
（実施例５）  ラットにおける消化器系障害評価：
実施例１の化合物の消化器系障害作用を、ラットにおける胃排泄能試験によりピルフェニドンと比較検討した。ＳＤ系ラット（雄、６週齢、日本チャールス・リバー）に、実施例１の化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、又はピルフェニドンを３０ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。なお、実施例１の化合物及びピルフェニドンは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。
【００７２】
被験化合物投与前日から１８時間以上ラットを絶食させた。被験化合物投与６０分後に０．１％エバンスブルー溶液を０．２ｍＬの容量（２００μｇ）で経口投与した。０．１％エバンスブルー溶液投与３０分後に頸椎脱臼によりラットを安楽死させ、直ちに開腹し、胃を摘出した。摘出した胃を６．３ｍｏｌ／Ｌの尿素液４ｍＬ中に浸漬、振とうした。さらにアセトン ８ｍＬ、２０％ＺｎＳＯ４  ０．４ｍＬ、１Ｎ  ＮａＯＨ  ０．４ｍＬの順に添加し、振とうを繰り返した。その後、溶液から胃を取り出し、メスシリンダーを用いて溶液の容量を測定した。溶液を濾紙で濾過後、波長６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で測定した。
【００７３】
検量線用標準液から作成した検量線を用いて、溶液中のエバンスブルー色素の濃度を求めた。溶液中に含まれるエバンスブルー色素量を算出し、胃残存色素量とした。胃残存色素量及び胃排泄能は下記式より算出した。
胃残存色素量（μｇ）＝濃度（μｇ／ｍＬ）×容量（ｍＬ）
胃排泄能（％）＝（１−胃内残存色素量（μｇ）／投与したエバンスブルーの量（μｇ））×１００
【００７４】
また、実施例１の化合物の消化器系障害作用を、ラットにおける小腸輸送能試験によりピルフェニドンと比較検討した。ＳＤ系ラット（雄、６週齢、日本チャールス・リバー）に、実施例１の化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、又はピルフェニドンを３０ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。なお、実施例１の化合物及びピルフェニドンは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。
【００７５】
被験化合物投与前日から１８時間以上ラットを絶食させた。被験化合物投与６０分後に５％炭素末懸濁液（１０％アラビアゴム（和光純薬工業）に炭素末（和光純薬工業）を５％の割合で懸濁させた液）を１ｍＬの容量で経口投与した。５％炭素末懸濁液投与３０分後に頸椎脱臼によりラットを安楽死させ、直ちに開腹し、胃及び腸管を、腸間膜を剥離しながら摘出した。腸管をのばして、小腸全長（胃幽門部から盲腸開口部まで）及び胃幽門部から炭素末懸濁液先端部までの距離を、メジャーを用いて測定した。小腸全長に対する５％炭素末懸濁液の移行率を小腸輸送能（％）として、下記式により算出した。
小腸輸送能（％）＝胃幽門部から炭素末懸濁液先端部までの距離／小腸全長×１００
【００７６】
胃排泄能試験及び小腸輸送能試験の結果を表１に示す。表中の値は平均値±標準誤差（ｎ＝８）を示す。表中の「溶媒」は０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒群）を示し、「実施例１の化合物」は実施例１の化合物３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した群を示し、「ピルフェニドン」はピルフェニドン３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した群を示す。＊印は溶媒群との比較（ｔ検定）で統計学的に有意であることを示す（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
この結果から、本発明の医薬はピルフェニドンより胃排泄能及び小腸輸送能に及ぼす影響が低いことが明らかとなった。これは、本発明の医薬の消化器系障害作用が低いことを示唆するものであった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の医薬は、優れた線維化抑制作用を有し、かつ、光毒性を示さず、消化器系障害も軽減されていることから、効果及び安全性を兼ね備えた医薬、特に線維症の治療剤又は予防剤として利用できる。
【図１】
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