(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルス様粒子（ＶＬＰ）（該ＶＬＰはアルミニウムアジュバントに吸着されている。）、並びにサポニン、コレステロール及びリン脂質を含むＩＳＣＯＭ型アジュバントを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】該アルミニウムアジュバントは無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートを含む。もう１つの態様は、ＨＰＶ  ＶＬＰと、ｍ−クレーゾール、フェノール及びベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤とを含む多用量ＨＰＶワクチン製剤を提供する。亦、ヒト患者においてＨＰＶに対する免疫応答を誘導するため及びＨＰＶ感染を予防するための、開示されている医薬組成物及び製剤の使用方法も含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＨＰＶ  ＶＬＰは、ＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含むＨＰＶウイルス様粒子、
（ｂ）アルミニウムアジュバント、及び
（ｃ）ｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤、
を含んでなる多用量ＨＰＶワクチン製剤であって、
前記ＨＰＶ  ＶＬＰは、前記アルミニウムアジュバント上に吸着されている、多用量ＨＰＶワクチン製剤。
【請求項２】
抗微生物保存剤が、０．１５から０．３１％の濃度のｍ−クレーゾル、０．２５から０．５５％の濃度のフェノールまたは０．７５から１．２％の濃度のベンジルアルコールよりなる、請求項１の多用量ＨＰＶワクチン製剤。
【請求項３】
抗微生物保存剤が、０．３％の濃度のｍ−クレーゾル、０．５％の濃度のフェノールまたは０．９％の濃度のベンジルアルコールよりなる、請求項２の多用量ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の予防に関する。より詳しくは、本発明は、ＨＰＶのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む医薬組成物および製剤に関する。該ＶＬＰはアルミニウムアジュバント上に吸着されており、第２アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含む。本発明はまた、ＨＰＶ ＶＬＰと抗微生物保存剤とを含む医薬組成物および製剤に関する。さらに、開示されている医薬組成物および製剤の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
８０を超える型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が存在し、それらの多くは良性増殖性疣贅から子宮頸部の悪性癌に及ぶ多種多様な病理に関連づけられている（概説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい。）。ＨＰＶ６型およびＨＰＶ１１型は「低リスク型」と称され、性器粘膜または呼吸器粘膜の良性疣贅、非悪性尖形コンジローマおよび／または低悪性度異形成に最も一般的に関連しているＨＰＶ型である。性器疣贅の約９０％はこれらの２つのＨＰＶ型により引き起こされる。これとは対照的に、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は「高リスク」ＨＰＶ型と称される。なぜなら、それらは子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の発生部位内（ｉｎ ｓｉｔｕ）癌および浸潤性癌に最も頻繁に関連しているからである。子宮頸癌の７０％以上はＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の感染により引き起こされる。より稀な発癌型ＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８と合わせると、これらの型は子宮頸癌の９０％以上の原因となる（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。子宮頸癌は全世界の女性における第２位の癌死亡原因である。
【０００３】
パピローマウイルスは、８個までの初期遺伝子（Ｅ１からＥ７）および２個の後期遺伝子（Ｌ１からＬ２）をコードする小型（５０から６０ｎｍ）非外包性二十面体ＤＮＡウイルスである。Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５から６０ｋＤａの分子量を有する。酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌におけるＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せ体の発現はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己集合を引き起こす（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６）を参照されたい。）。ＶＬＰは真正ビリオンに形態学的に類似しており、動物またはヒトに投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰは潜在的発癌性ウイルスゲノムを含有しないため、それは、ＨＰＶワクチン開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。この理由により、Ｌ１およびＬ２遺伝子はＨＰＶ感染および疾患に対する予防用および治療用ワクチンの開発のための免疫学的標的と目されている。
【０００４】
ＶＬＰに基づくワクチンは、２価ＨＰＶ１６および１８（Ｈａｒｐｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ３６４（９４４７）：１７５７−６５（２００４））ならびにＨＰＶ６、１１、１６および１８ ＶＬＰに基づく４価ワクチン（Ｖｉｌｌａら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：５５７１−５５８３（２００６））でワクチン接種されたヒト患者における免疫応答の誘導において有効であることが判明している。しかし、長期持続性防御免疫を誘導するために所望の抗原に対する免疫応答を増強することはワクチン開発の共通の目標である。
【０００５】
関心のある抗原に対する免疫応答を増強しうる化合物（アジュバントとして公知である。）とのワクチンの共投与が詳細に研究されている。関心のある抗原に対する免疫応答を増強することに加えて、いくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘発するのに必要な抗原の量を減少させるために、または持続性免疫応答を誘導し疾患に対する防御をもたらすための臨床治療計画において必要な注射の回数を減少させるために使用されうる。
【０００６】
アルミニウムに基づく化合物がアジュバント活性を有することは６０年以上前に確認された（概説としては、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，ａｎｄ Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４９７−５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい。）。アルミニウムアジュバントは、一般に、適当な投与量で使用された場合には安全であるとみなされている。ヒトへの投与に関して世界中の規制機関により多数が承認されている。
【０００７】
アルミニウムアジュバントの作用メカニズムは完全には理解されていないが、最適な免疫刺激効果のためには、標的化抗原がワクチン製剤中のアルミニウム上に吸着されるべきであると一般に考えられている（Ｌｉｎｄｂｌａｄ，前掲を参照されたい。）。このようにして製剤化された場合、アルミニウムアジュバントは多数の抗原に対する強力な抗体（ＴＨ２）応答を誘導しうるが、細胞性（ＴＨ１）免疫応答はめったに刺激しない。ＨＰＶに関しては、ＶＬＰがアルミニウムアジュバントに吸着された、ＨＰＶ６、１１、１６および１８ Ｌ１ ＶＬＰに基づくワクチンは、アルミニウムを欠く対応Ｌ１ ＶＬＰワクチンから生じた応答より有意に強力な免疫応答をアカゲザルにおいて生成したことが示されている（Ｒｕｉｚら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３（１）：２（２００５））。アルミニウムアジュバント化ワクチンからはＶＬＰ単独体より有意に高い抗体価が得られたが、アジュバント化ワクチンおよび非アジュバント化ワクチンの両方は類似したイソタイププロファイルを示したため、該免疫応答は定性的には異ならなかったことに注目することが重要である。
【０００８】
長期効力を有する予防用ＨＰＶワクチンを開発するためには、強力な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を含む、より高い規模の免疫応答を得ることが好都合であろう。現在の予防臨床計画と比べてワクチン注射回数を減少させるのに十分な程度に増強されたＨＰＶ Ｌ１に対する免疫応答を生成する、ＶＬＰに基づくワクチンを開発することも有益であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）
【非特許文献２】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３）
【非特許文献３】Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ  １０１−１２（１９９６）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ  ３６４（９４４７）：１７５７−６５（２００４）
【非特許文献６】Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：５５７１−５５８３（２００６）
【非特許文献７】Ｉｍｍｕｎｏｌ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：４９７−５０５（２００４）
【非特許文献８】Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）
【非特許文献９】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３（１）：２（２００５）
【発明の概要】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、ＨＰＶに関連した罹患および死亡をなくす最も有効な方法である、患者におけるＨＰＶに対する免疫応答の誘導および患者におけるＨＰＶの感染の予防をもたらしうる医薬組成物および製剤を提供する。本発明は、本発明で提供する組成物および製剤の使用方法も提供する。
【００１１】
１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つの型のＨＰＶのＶＬＰ（該ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、アルミニウムアジュバント（該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバントに吸着されている。）、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよび医薬上許容される担体、例えば賦形剤、希釈剤、安定剤、バッファーまたは患者への所望の量の医薬組成物の投与を促進するよう意図された代替物質を含む医薬組成物に関する。本発明で提供する組成物は、追加的な生理的に許容される成分、例えばバッファー、正常食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩および／またはポリソルベートをも含有しうる。
【００１２】
本発明は更に、（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型（該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる。）のＨＰＶ ＶＬＰ約１０μｇから約１００μｇ（該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、（ｂ）約１５０μｇから約６００μｇのアルミニウムアジュバント（該ＨＰＶ ＶＬＰは該アルミニウムアジュバントに吸着されている。）、および（ｃ）約１０μｇから約２００μｇのＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含む。）を含むＨＰＶワクチン製剤を提供する。
【００１３】
本発明のこの態様の特定の実施形態においては、該ＨＰＶワクチン製剤は、（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型のＶＬＰ約２０μｇから約６０μｇ、（ｂ）約２００μｇから約３００μｇの該アルミニウムアジュバント、および（ｃ）約１５μｇから約１２０μｇの該ＩＳＣＯＭ型アジュバントを含む。
【００１４】
さらに他の特定の実施形態においては、本発明は、（ａ）ＨＰＶ型６、１１、１６、１８、３１、４５、５２および５８のそれぞれのＶＬＰ約２０μｇから約６０μｇ（該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、（ｂ）約２００μｇから約３００μｇのアルミニウムアジュバント（該ＨＰＶ ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）、ならびに（ｃ）約３０μｇから約１２０μｇのＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含む。）を含むＨＰＶワクチン製剤を提供する。
【００１５】
本発明のもう１つの態様においては、ＨＰＶ  ＶＬＰと、ｍ−クレゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤と、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。該抗微生物保存剤含有ＨＰＶワクチン組成物は、場合によっては、前記のとおりのアルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントを含みうるが、アジュバントの非存在下に抗微生物保存剤を含むＨＰＶ  ＶＬＰ組成物も想定される。
【００１６】
本発明はまた、ヒト患者においてＨＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、ＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）を含む医薬組成物を該患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は更に、組換えＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバント、ここで、該ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＨＰＶによるヒト患者の感染を予防する方法に関する。
【００１８】
本明細書および添付されている特許請求の範囲の全体にわたって用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形の指示対象を含む。
【００１９】
本明細書および添付されている特許請求の範囲の全体においては、以下の定義および用語が適用される。
【００２０】
「ＨＰＶ」および「ＰＶ」なる語は、それぞれ、ヒトパピローマウイルスおよびパピローマウイルスを意味する。
【００２１】
「有効量」なる語は、患者におけるＨＰＶに対する免疫応答の誘導またはＨＰＶ感染の予防のような所望の効果を得るのに十分なＶＬＰワクチン組成物が患者の体内に導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変動しうると認識する。
【００２２】
「患者」なる語は、本明細書に記載されているＨＰＶワクチンまたは医薬組成物が投与される任意のヒトを意味する。本明細書中で定義される「患者」は、ＨＰＶに既に感染している者、およびＨＰＶ感染が予防されるべき者を含む。
【００２３】
「障害」は、本発明の組成物での治療から利益を受ける任意の状態である。ＨＰＶによる感染に関連している任意の障害または病状が、「障害」なる語に含まれる。本発明の組成物は、性器粘膜または呼吸器粘膜の良性疣贅、非悪性尖形コンジローマおよび／または低悪性度異形成ならびに子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の発生部位内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）および浸潤性癌を含む（これらに限定されるものではない。）ＨＰＶ感染により特徴づけられる障害または状態の治療としての又はそれらの予防のための使用を意図したものである。
【００２４】
「製剤」は、注射に適した任意の体積中に含まれうるワクチンの単一用量を意味する。特定の実施形態においては、製剤は０．５ｍＬの総体積中で製造される。特に示さない限り、「製剤」なる語の使用は、それを要する単一の患者に運搬されうる、ワクチンの単一用量に適用される。「多用量」なる語は、２以上の患者に投与されうる、２用量以上のワクチンを含有するＨＰＶ製剤を意味する。
【００２５】
「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を意味する。
【００２６】
「ＭＡＡ」はＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバントを意味する。ＭＡＡは、無定形（アモルファス）アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバントである。「ＭＡＡ」なる語は、本明細書においては、「ＡＡＨＳ」なる語と互換的に用いられる。
【００２７】
「ｃＬＩＡ」は競合的Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）イムノアッセイを意味し、その一例は米国特許第７，０６７，２５８号およびＯｐａｌｋａら，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１）：１０８−１５（２００３）に記載されている。
【００２８】
「ＧＭＴ」は相乗平均力価を意味する。
【００２９】
「ＩＳＣＯＭ型アジュバント」は、その機能に寄与する特有の球状籠様構造を有する特徴的な籠様粒子を一緒になって形成するサポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成される免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントである（概説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい。）。この用語は、抗原の存在下で産生されＩＳＣＯＭ粒子内に抗原を含むＩＳＣＯＭアジュバントと、抗原の非存在下で産生される中空型のＩＳＣＯＭ型アジュバントであるＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントとの両方を含む。本発明で提供する組成物および方法の好ましい実施形態においては、ＩＳＣＯＭ型アジュバントは、抗原の非存在下で製造されるＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）である（ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である。）。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実験用８価ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンで免疫化されたアカゲザルにおけるワクチン接種群ごとの経時的な抗ＨＰＶ１６相乗平均力価（ＧＭＴ）を示す。該ワクチンは、示されている免疫化計画に従い及び実施例１に記載されているとおりに、ＭＡＡまたはＭＡＡ＋ＩＭＸでアジュバント化された。
【図２】図２は、実験用８価ＨＰＶ ＶＬＰワクチンで免疫化されたアカゲザルにおけるワクチン接種群ごとの経時的な抗ＨＰＶ３１相乗平均力価（ＧＭＴ）を示す。該ワクチンは、示されている免疫化計画に従い及び実施例１に記載されているとおりに、ＭＡＡまたはＭＡＡ＋ＩＭＸでアジュバント化された。
【図３】図３は、第１日に関連ＨＰＶ型に対して血清陰性であったヒト被験者におけるワクチン接種群ごとの抗ＨＰＶ６、１１、１６または１８ ｃＬＩＡ相乗平均力価（ＧＭＴ）の要約を示す（第Ａ相の結果）。臨床プロトコールの簡潔な説明が実施例３に記載されている。
【図４】図４は、第１日に関連ＨＰＶ型に対して血清陰性であったヒト被験者におけるワクチン接種群ごとの抗ＨＰＶ６、１１、１６または１８  ｃＬＩＡ相乗平均力価（ＧＭＴ）の要約を示す（第Ｂ相の結果）。臨床プロトコールの簡潔な説明が実施例３に記載されている。
【図５】図５は、３７℃で保存された８価ＨＰＶ ＶＬＰワクチンサンプルの無傷単量体の経時的な比率（％）を示す。８価ワクチン製剤±ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸおよび±ＭＡＡアジュバントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの結果が示されている（実施例４および５を参照されたい。）。データは、時間＝０（点付きの棒グラフ）、１ヶ月（縞付きの棒グラフ）、３ヶ月（無地の棒グラフ）および６ヶ月（線影付きの棒グラフ）におけるものが示されている。
【図６】図６は、ＩＶＲＰ分析により測定された、ＩＭＸの存在下および非存在下の８価ＨＰＶ溶液およびＭＡＡサンプルのインビトロ抗原性（単位／ｍＬ）を示す（実施例４および６を参照されたい。）。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＭＸの非存在下の８価ＨＰＶワクチン製剤の安定性に対する保存剤の影響を示す（実施例１２を参照されたい。）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＭＸの非存在下の８価ＨＰＶワクチン製剤の安定性に対する保存剤の影響を示す（実施例１２を参照されたい。）。
【図８Ａ】図８Ａは、ＩＭＸの存在下の８価ＨＰＶワクチン製剤の安定性に対する保存剤の影響を示す（実施例１２を参照されたい。）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＩＭＸの存在下の８価ＨＰＶワクチン製剤の安定性に対する保存剤の影響を示す（実施例１２を参照されたい。）。
【図９Ａ】図９パネルＡは、ＩＭＸの非存在下のＨＰＶワクチン製剤における保存剤の安定性を示す（実施例１３を参照されたい。）。
【図９Ｂ】図９パネルＢは、ＩＭＸを含むＨＰＶワクチン製剤における保存剤の安定性を示す（実施例１３を参照されたい。）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明において、少なくとも１つのＨＰＶ型のＨＰＶ  ＶＬＰ、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよびアルミニウムアジュバントを含むＨＰＶワクチン製剤が、アルミニウムアジュバントのみを含むＶＬＰワクチンと比較して、該標的化ＨＰＶ型に対する、より高いＡｂ力価を、動物モデルおよびヒト患者において惹起しうることが示されている。この目的のために、後記で詳細に説明するとおり、ＩＳＣＯＭ型アジュバントと組合されたアルミニウムアジュバントに吸着されたＨＰＶ  ＶＬＰを含むＨＰＶ  ＶＬＰワクチン製剤および医薬組成物を本発明において提供する。
【００３２】
本明細書に記載されている本発明のもう１つの態様において、ＨＰＶ  ＶＬＰを含む医薬組成物および製剤へのｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物性保存剤の添加が微生物の減少または排除に有効であり、２から８℃における該ＶＬＰの構造的および熱的安定性に負の影響を及ぼさないことが示されている。したがって、本発明はまた、ＨＰＶ ＶＬＰと、ｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤とを含むＨＰＶワクチン製剤および医薬組成物に関する。本発明のこの態様におけるワクチン組成物は、前記のとおり、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよびアルミニウムアジュバントをも含みうる。
【００３３】
ウイルス様粒子に基づくワクチンはヒト患者における多数のＨＰＶ型に対する免疫応答の誘導において安全かつ有効であることが判明している。ヒトおよび動物パピローマウイルスの主要カプシドタンパク質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌内で発現される場合、ＶＬＰは自己集合しうる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ  １０１−１２（１９９６））。Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質の組合せを発現させることにより、形態学的に不明瞭なＨＰＶ ＶＬＰも製造されうる。ＶＬＰは、Ｔ＝７二十面体構造のＬ１の７２個の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５−５６（１９９１））。
【００３４】
ＶＬＰは真正ビリオンと形態学的に類似しており、動物に投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰでのウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９−６３（１９９５））およびイヌ（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））の免疫化は中和抗体の誘導および実験パピローマウイルス感染に対する防御の両方をもたらすことが示された。また、ＨＰＶ１６ ＶＬＰでの成人女性の免疫化はＨＰＶ１６感染およびＨＰＶ１６頸部上皮内新生物を防御することが示された（Ｋｏｕｔｓｋｙら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７：１６４５−５１（２００２））。ＶＬＰは、潜在的に発癌性のウイルスゲノムを含有せず、単一遺伝子から発現されると自己集合しうるため、それは、ＨＰＶワクチン開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。
【００３５】
前記のとおり、ＶＬＰに基づくワクチンは多数の動物モデルおよびヒト患者における免疫応答の誘導において有効であることが判明している。しかし、ワクチン開発の目的は、長く持続する防御免疫をもたらす、より高い抗体価を誘導することであることが多い。この目的のために、本明細書に開示されているとおり、少なくとも１つのＨＰＶ型のＨＰＶ  ＶＬＰ、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよびアルミニウムアジュバントを含む医薬組成物およびワクチンを開発した。該医薬組成物およびワクチンは、アルミニウムアジュバントのみを含むＶＬＰワクチンより高い、標的化ＨＰＶ型に対するＩｇＧ Ａｂ力価を惹起しうる。この組合せは、ＨＰＶ感染に対する長く持続する有効な免疫予防の誘導、抗原投与量の低減、および経時的な注射回数の減少を含む免疫化計画をもたらしうる。
【００３６】
したがって、本発明は、ＨＰＶウイルス様粒子（該ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、アルミニウムアジュバント（該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバントに吸着されている。）、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物および製剤に関する。
【００３７】
任意のＨＰＶ  ＶＬＰに基づくワクチンが本発明の医薬組成物および方法における使用に適している。アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントの両方を含むよう、公知ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンが修飾されうる。また、本明細書に記載されている本発明に従い、ＩＳＣＯＭ型アジュバントと組合されたアルミニウムアジュバントに吸着されたＨＰＶ  ＶＬＰの形態の少なくとも１つのＨＰＶ型を含む新規ワクチンが開発されうる。
【００３８】
典型的なＨＰＶ  ＶＬＰワクチンは４価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組換えワクチンであり、これは、本明細書においては、その商標名であるＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（Ｂｒｙａｎ，Ｊ．Ｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２５（１６）：３００１−６（２００７）；Ｓｈｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８１（２）：２５９−６４（２００７））と称される。ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）は、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型の主要カプシド（Ｌ１）タンパク質の高精製ＶＬＰから製造された非感染性組換え４価ワクチンである。Ｌ１タンパク質は組換えサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において別々の発酵から製造され、ＶＬＰへと自己集合する。各ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）ワクチン用量は、ＶＬＰに加えて、（無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートとしての）アルミニウムアジュバント、塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート８０、ホウ酸ナトリウムおよび水を含有する。したがって、本発明は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のようなＩＳＣＯＭ型アジュバントとのＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）の組合せを含む。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、該医薬組成物および製剤は、１価、２価または３価である、ＨＰＶ  ＶＬＰに基づくワクチンを含む。例えば、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８のＶＬＰを他のＨＰＶ  ＶＬＰ型の含有を伴うことなく含む医薬組成物が本発明の範囲内に含まれる。ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）に含まれるＨＰＶ型とは異なるＨＰＶ ＶＬＰを含む４価ワクチンも本発明において想定される。例えば、ＨＰＶ３１、４５、５２および５８型のＶＬＰを含む医薬組成物が本発明の範囲内である。
【００４０】
他の実施形態においては、該医薬組成物は、５つ以上の異なる型のＶＬＰを含有する、ＶＬＰに基づくワクチンを含む。１つの好ましい実施形態においては、該医薬組成物は８つの異なるＨＰＶ ＶＬＰ型を含む。特に好ましい８価ワクチンは実施例１および２に記載されており、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、４５、５２および５８型を含む。本発明のもう１つの８価組成物は、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３５、４５および５８型を含む。他の８価ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンも本発明において想定され、例えば、ＨＰＶ３１の代わりにＨＰＶ３３が使用されうる。本明細書に記載されているワクチン製剤に追加的なＨＰＶ  ＶＬＰを加えて、９価、１０価などのＨＰＶワクチンを得ることも可能である。
【００４１】
前記のとおり、本発明の医薬組成物および製剤は少なくとも１つのＨＰＶ ＶＬＰ型、例えばＨＰＶ１６または１８を含む。本明細書に開示されている組成物の好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型のＶＬＰを含む。特に好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、ＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２から構成されるＨＰＶ ＶＬＰを含む。ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質は、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節要素を含有する発現ベクター内へのＬ１またはＬ１＋Ｌ２ ＤＮＡの分子クローニングにより組換え的に発現されることが可能であり、それは、組換えタンパク質の産生のために原核または真核宿主細胞内に導入されうる。そのような操作のための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）（これを参照により本明細書に組み入れることとする。）に十分に記載されている。Ｌ１タンパク質が宿主細胞内で組換え的に発現される場合、ＶＬＰは自己集合しうる。
【００４３】
本発明の組換えＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、天然で見出されうる任意の完全長Ｌ１タンパク質配列であることが可能であり、あるいはＶＬＰへ自己集合しうる任意の突然変異した又はトランケート化されたＬ１タンパク質であることが可能である。選択されたＨＰＶ型を含有する１以上の臨床サンプルからＤＮＡを単離し、ＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡ配列の配列を決定し、遺伝暗号を用いてＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳することにより、本発明において使用するＬ１タンパク質配列が決定されうる。本発明での使用に適した多数の典型的なＬ１配列が文献中に見出されうる。例えば、米国特許第５，８２０，８７０号、第７，２５０，１７０号、第７，２７６，２４３号および第５，４３７，９５１号、Ｋｉｒｉｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５（１）：４２４−４２７（１９９１）を参照されたい。本発明の組成物および製剤において有用な他のＬ１タンパク質には、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化（必ずしもこれらに限定されるわけではなく、これらの突然変異は、ＶＬＰを形成しうるＬ１タンパク質またはタンパク質断片を与える。）を含む、ＨＰＶ Ｌ１配列の生物学的に活性な断片および／または突然変異体が含まれる。例えば、国際公開ＷＯ ２００６／１１４３１２および米国特許第６，５９９，５０８号を参照されたい。
【００４４】
組換えＨＰＶ Ｌ１または組換えＬ１＋Ｌ２の発現、およびそれに続く、ＶＬＰの自己集合のための適当な宿主細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または真菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の典型的な実施形態においては、該ＶＬＰは、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる酵母において産生される。酵母細胞におけるＨＰＶ  ＶＬＰの発現は、費用効果的であり発酵における大規模増殖に容易に適合化されるという利点をもたらす。
【００４５】
本発明はまた、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化（必ずしもこれらに限定されるわけではなく、これらの突然変異は治療用または予防用のタンパク質またはタンパク質断片を与え、ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンの開発に有用であろう。）を含む、ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ２タンパク質の生物学的に活性な断片および／または突然変異体を含むＨＰＶ  ＶＬＰのようなＨＰＶ  ＶＬＰの突然変異形態を含む医薬組成物を含む。ＨＰＶＬ１タンパク質のそのような突然変異形態はいずれも、ＶＬＰを形成し、ヒトに投与された場合に所望のＨＰＶ型に対する免疫応答を惹起しうるべきである。
【００４６】
また、本明細書に開示されている組成物中に含有させるＶＬＰを自己集合させるために使用されるＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質は完全長野生型ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２ポリヌクレオチドによりコードされうる、あるいは公知野生型配列の断片または突然変異体によりコードされうる、と当業者は認識するであろう。ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする野生型ポリヌクレオチド配列は当技術分野において入手可能である。突然変異体ポリヌクレオチドはいずれも、ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ２タンパク質の薬理学的特性（ヒトに投与された場合に、関心のあるＨＰＶ型に対する免疫応答を惹起しうるＶＬＰを形成する能力を含む。）を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片のいずれかをコードする。そのようなポリヌクレオチドはいずれも、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化（必ずしもこれらに限定されるわけではない。）を含む。
【００４７】
本発明の製剤および組成物中に含有させる各ＨＰＶ型のウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性に左右される。一般に、免疫学的または予防的に有効な用量は約１０μｇから約１００μｇ、好ましくは、約２０μｇから８０μｇのＶＬＰを含む。
【００４８】
アルミニウムは、主としてＴＨ２応答を刺激することにより、共投与された抗原に対する免疫応答を刺激することが、古くから示されている。ＨＰＶＶＬＰおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントに加えて、本発明のこの態様の製剤はアルミニウムアジュバント上に吸着されている。本発明で提供する組成物のアルミニウムアジュバントはアルミニウム沈降物の形態ではないことが好ましい。アルミニウム沈降ワクチンは標的抗原に対する免疫応答を増強するが、非常に不均一な製剤であることが示されており、一貫しない結果を示している（Ｌｉｎｄｂｌａｄ Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：４９７−５０５（２００４）を参照されたい。）。これとは対照的に、アルミニウム吸着ワクチンは、標準化された様態で予備調製されることが可能であり、これは、ヒトへの投与のためのワクチン製剤の必須の特性である。さらに、アルミニウムアジュバント上への所望の抗原の物理的吸着は、おそらく１つには注射部位からのより遅い消失を可能にすることにより又は抗原提示細胞による抗原のより効率的な取り込みを可能にすることにより、アジュバント機能における重要な役割を担うと考えられている。
【００４９】
本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、アルミニウムヒドロキシホスファート、無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）、またはいわゆる「ミョウバン」（ＫＡｌ（ＳＯ４）・１２Ｈ２Ｏ）の形態でありうる（Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｙ（２７）Ａｌ  ＭＡＳ  ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照されたい。）。本発明で提供する本発明の典型的な実施形態においては、アルミニウムアジュバントはアルミニウムヒドロキシホスファートまたはＡＡＨＳである。アルミニウムアジュバントにおけるアルミニウムに対するホスファートの比は０から１．３の範囲でありうる。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、アルミニウムに対するホスファートの比は０．１から０．７０の範囲内である。特に好ましい実施形態においては、アルミニウムに対するホスファートの比は０．２から０．５０の範囲内である。
【００５０】
本発明の幾つかの実施形態においては、アルミニウムアジュバントはＡＡＨＳ（本明細書においては互換的にＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバント（ＭＡＡ）とも称される。）の形態である。ＭＡＡは中性ｐＨで無電荷を含有し、一方、ＡｌＯＨは正の実効電荷を含有し、ＡｌＰＯ４は典型的には中性ｐＨで負の実効電荷を含有する。ＭＡＡは、ＡｌＯＨより高い、ＨＰＶ  ＶＬＰへの結合能を有する。また、ＭＡＡに吸着されたＶＬＰは、マウスにおいて、ＡｌＯＨに吸着されたＶＬＰより大きな体液性免疫応答を誘導しうる（Ｃａｕｌｆｉｅｌｄら，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３：１３９−１４６（２００７））。理論により束縛されることを望むものではないが、アルミニウムアジュバントの実効電荷はＶＬＰ抗原へのその結合能に影響を及ぼしうる可能性があり、強く荷電したアジュバントは、中性荷電アジュバントと同じくらい強く抗原に結合することはできない。この理由により、本発明の医薬組成物のアルミニウムアジュバントは中性ｐＨにおいてゼロ点表面電荷を有することが好ましい。当業者は、中性ｐＨにおけるゼロ点表面電荷を可能にするためにバッファー、塩濃度および／または遊離ホスファートの比率を変更しうるであろう。
【００５１】
当業者は、標的化ＨＰＶ型に対する免疫応答の増強において有効であり且つ安全であるアルミニウムアジュバントの最適な投与量を決定しうるであろう。アルミニウムの安全性プロファイル、およびＦＤＡ認可ワクチンにおけるアルミニウムの量の考察は、Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は１５０から６００μｇ／用量（３００から１２００μｇ／ｍＬの濃度）と様々である。本発明の製剤および組成物の特定の実施形態においては、ワクチンの１用量当たり２００から３００μｇのアルミニウムアジュバントが存在する。本発明の製剤および組成物の他の実施形態においては、ワクチンの１用量当たり３００から５００μｇのアルミニウムアジュバントが存在する。
【００５２】
前記のとおり、本発明の１つの態様は、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントと組合されたＨＰＶ  ＶＬＰを含むワクチンおよび製剤を提供する。本発明で提供する製剤および方法においては、ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、免疫刺激性複合体、すなわちＩＳＣＯＭを形成する。典型的にはキライア・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）樹木の樹皮から単離されるサポニンの強力なアジュバント活性は８０年以上前に最初に実証された（概説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）；ならびにＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：５３−５９（２００６）を参照されたい。）。アルミニウムアジュバントと比べて、ＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはＩＳＣＯＭは、Ｔ細胞応答および抗体応答の両方を含む、共投与された抗原に対する、より広範な免疫応答を惹起しうる。しかし、毒性および溶血活性の可能性が見出され、当時のヒトまたは動物への使用の見込みは限定的なものであった。
【００５３】
その後、サポニンは、コレステロールおよびリン脂質と組み合わされると、２０個以上のサブユニットから構成される籠様構造を有する特徴的な粒子を形成することが見出された。この特有の構造はＩＳＣＯＭのアジュバント活性に寄与する。また、コレステロールおよびリン脂質と共にサポニンがＩＳＣＯＭ内に取り込まれるとサポニンの溶血活性が排除されることが示された。また、ＩＳＣＯＭをアジュバントとして使用した場合、遊離サポニンと比較して、免疫応答を誘導するのにアジュバントが少量で済むことも示された（ＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，前掲を参照されたい。）。これらの理由により、ＩＳＣＯＭは潜在的ワクチンアジュバントとして精力的に研究されている。
【００５４】
本発明において、ＶＬＰに基づくワクチンにおけるアルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバントの組合せは、アルミニウムアジュバントのみで製剤化された同じワクチンより強力な抗体価を惹起しうることが判明した。また、アルミニウムおよびＩＭＸの両方を含むＨＰＶ ＶＬＰワクチン製剤は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の存在下または非存在下でアルミニウムアジュバントの非存在下で製剤化されたＶＬＰワクチンより安定であることが判明した。
【００５５】
この目的において、本発明は、少なくとも１つの型のＨＰＶのＶＬＰ（該ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、アルミニウムアジュバント（該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）、ＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含む。）および医薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
本発明のこの態様の特定の実施形態においては、少なくとも１つの型のＨＰＶのＶＬＰは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれるＨＰＶ型を含む。しかし、病態または障害に関連した任意のＨＰＶ型が、本発明で提供する医薬組成物に含有させるのに適している。本発明の幾つかの実施形態においては、該医薬組成物はＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含む。他の実施形態においては、該組成物はＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、４５、５２および５８のＶＬＰを含む。他の実施形態においては、該組成物は、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３５、４５および５８型のＶＬＰを含む。さらに他の実施形態においては、前記の４価および８価組成物を包含する本発明の組成物は更に、少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型のＶＬＰを含み、ここで、その少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型は、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる。
【００５７】
本発明のこの態様の医薬組成物はアルミニウムアジュバントを含み、ＶＬＰが該アルミニウムアジュバントに吸着されており患者に投与された場合、該アルミニウムアジュバントは、関心のあるＨＰＶ型に対する体液性免疫応答を有効に増強する。本発明の特定の実施形態においては、該アルミニウムアジュバントはアルミニウムヒドロキシホスファート（ＡＨ）または無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）である。これらの特定の実施形態においては、該アルミニウムアジュバントは、アルミニウム（Ａｌ）に対するホスファート（ＰＯ４）のモル比約０．１から約１．１で存在するホスファートおよびアルミニウムを含むことが好ましい。該アルミニウムアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌのモル比約０．２から約０．５で存在するホスファートおよびアルミニウムを含むことが、より好ましい。本発明のこの態様の他の実施形態においては、該アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウムである。
【００５８】
本発明で提供する組成物のＩＳＣＯＭ型アジュバントは、当技術分野で公知のＩＳＣＯＭを製造するための幾つかの公知方法のいずれかにより製造されうる（概説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい。）。よく知られた製造方法は、Ｂａｒｒ，前掲に記載されているとおり、遠心分離法および透析法を含む。ＩＳＣＯＭアジュバントは商業的入手源からも入手可能である。ほとんど全てのリン脂質がＩＳＣＯＭ粒子の製剤化において有用であることが判明しているが（ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，前掲を参照されたい。）、ＩＳＣＯＭ型ワクチンは、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）サポニン、コレステロールおよびリン脂質、例えばホスファチジルコリンで製剤化される。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、ＩＳＣＯＭ型アジュバントは、いわゆるＩＳＣＯＭ−マトリックスアジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）であり、これは、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（登録商標）サポニン（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）コレステロールおよびジパルミトイルホスファチジルコリンを含む。
【００６０】
本発明の組成物は、最適には、ＶＬＰワクチンの０．５ｍＬの用量当たり１０から２００μｇ（２０から４００μｇ／ｍＬ）のＩＳＣＯＭ−マトリックスアジュバントを含む。本発明のこの態様の典型的な実施形態においては、該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）である。
【００６１】
本発明はまた、（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型（該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる。）のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）（該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、いずれか１つのＨＰＶ型のＶＬＰは約１０μｇから約１００μｇの濃度で存在し、合計ＶＬＰ濃度は１０μｇから６００μｇである。）、（ｂ）約１５０μｇから約６００μｇのアルミニウムアジュバント（該ＨＰＶ ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）、および（ｃ）約１０μｇから約２００μｇのＩＳＣＯＭ型アジュバントを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン製剤を含むＨＰＶワクチン製剤に関する。
【００６２】
本発明のこの態様の特定の実施形態においては、該ＨＰＶワクチン製剤は、（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型のＶＬＰ約２０μｇから約８０μｇ、（ｂ）約２００μｇから約３００μｇの該アルミニウムアジュバント、および（ｃ）約１５μｇから約１２０μｇの該ＩＳＣＯＭ型アジュバントを含む。他の実施形態においては、該製剤は更に、少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型のＶＬＰ約２０μｇから約６０μｇを含む。
【００６３】
本発明は、１つの実施形態においては、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含むＨＰＶワクチン製剤に関する。本発明はまた、ＨＰＶ３１、４５、５２および５８型のＶＬＰを更に含むＨＰＶワクチン製剤を提供する。本発明は更に、ＨＰＶ３１、３５、４５および５８型を更に含む前記のＨＰＶワクチン製剤を提供する。
【００６４】
本発明で提供する本発明の或る態様においては、ＩＳＣＯＭ型アジュバントがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）である、ＩＳＣＯＭ型アジュバントを含むＨＰＶワクチン製剤を提供する。
【００６５】
また、（ａ）ＨＰＶ型６、１１、１６、１８、３１、４５、５２および５８のそれぞれのＶＬＰ約２０μｇから約４０μｇ（該ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、（ｂ）約２００μｇから約３００μｇのアルミニウムアジュバント（該ＨＰＶ  ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）、ならびに（ｃ）約３０μｇから約１２０μｇのＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含む。）を含むＨＰＶワクチン製剤も本発明で提供する。
【００６６】
前記のワクチン製剤において使用されるＨＰＶ型の代わりに、他のＨＰＶ型またはそれらの組合せ（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３５、４５および５８型を含む８価ワクチン製剤）が使用されうる。
【００６７】
本発明の医薬組成物および製剤は、患者においてＨＰＶに対する持続性かつ有効な免疫応答を誘導するために、およびＨＰＶ感染を予防するために使用されうる。その目的において、本発明は、ヒト患者においてＨＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、ＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）を含む医薬組成物を該患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
本発明はまた、組換えＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、ステロールおよびリン脂質を含み、該ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＨＰＶによるヒト患者の感染を予防する方法を提供する。
【００６９】
本発明で提供する方法の特定の実施形態においては、患者に投与される医薬組成物はＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含む。他の実施形態においては、該組成物は更に、ＨＰＶ３１、４５、５２および５８のＶＬＰを含む。他の実施形態においては、該組成物は更に、ＨＰＶ３１、３５、４５および５８型のＶＬＰを含む。他の実施形態においては、該組成物は更に、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる少なくとも１つの追加的なＨＰＶ型のＶＬＰを含む。
【００７０】
本発明のワクチン組成物は、最小の潜在的毒性でＨＰＶ感染の最適抑制を可能にする適当な投与量で単独で使用されうる。また、他の物質の共投与または連続的投与が望ましいかもしれない。
【００７１】
本発明の製剤および組成物は、筋肉内注射、皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）により患者に投与されうる。他の投与方法、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入運搬も想定される。本発明の好ましい実施形態においては、該ワクチンおよび医薬組成物は筋肉内投与により投与される。
【００７２】
本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているＨＰＶ医薬組成物および製剤は、増強された持続的な免疫応答を誘導するために種々の初回免疫／追加免疫の組合せで患者に投与される。この場合、２つの医薬組成物が「初回免疫および追加免疫」計画において投与される。例えば、第１組成物が１回以上投与され、ついで、所定の長さの時間、例えば２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月または他の適当な間隔の後、第２組成物が１回以上投与される。
【００７３】
好ましくは、臨床計画において使用される２以上のＨＰＶ医薬組成物は、同じＨＰＶ型またはＨＰＶ型の組合せのＶＬＰを含む。しかし、２つのワクチン投与を隔てる適当な時間間隔で２つの異なるＨＰＶ医薬組成物が患者に投与される臨床計画に従うことも望ましいかもしれない。例えば、ＨＰＶ１６および１８ ＶＬＰを含むワクチン組成物が１つの時点で投与され、ついで所定の長さの時間が経過した後、ＨＰＶ３１、４５、５２および５８  ＶＬＰを含むＨＰＶワクチン組成物が第２の時点で投与されうる。そのような場合、それらの２つの異なるＨＰＶワクチン組成物のそれぞれは患者に一度に、または適当な長さの時間を隔てて２回以上で投与されうる。
【００７４】
本発明の１つの態様においては、ＡＡＨＳおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の両方でアジュバント化されたＨＰＶ  ＶＬＰワクチンを使用する２用量臨床計画は、ＡＡＨＳのみでアジュバント化されたＶＬＰワクチンを使用する３用量計画に匹敵する大きさの免疫応答を誘導しうることが示された（実施例１を参照されたい。）。
【００７５】
その点において、本発明は、ヒト患者におけるＨＰＶ感染を予防する方法であって、（ａ）組換えＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、ステロールおよびリン脂質を含み、該ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバントに吸着されている。）を含む第１医薬組成物を該患者に導入し、（ｂ）所定の長さの時間を経過させ、（ｃ）組換えＨＰＶ  ＶＬＰ、アルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント（該ＩＳＣＯＭ型アジュバントはサポニン、ステロールおよびリン脂質を含み、該ＨＰＶ  ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含み、該ＶＬＰは該アルミニウムアジュバントに吸着されている。）を含む第２医薬組成物を該患者に導入することを含む方法を提供する。
【００７６】
前記方法の特定の実施形態においては、第１および第２組成物は同一であり、該臨床計画は、ＨＰＶに対する免疫応答を「感作（初回免疫）」するための該組成物の少なくとも１回の注射、および該免疫応答を「増強（追加免疫）」するための少なくとも１回の注射を含む。しかし、本明細書に記載されている本発明においては、該免疫応答を感作（初回免疫）および／または増強（追加免疫）するために複数の注射を行う他の方法も想定される。
【００７７】
いくつかの場合には、同一バイアル内に２用量以上のワクチンを含む多用量ＨＰＶワクチン製剤を提供することが望ましいかもしれない。多用量製剤が望まれる場合には、例えば細菌および真菌のような微生物の殺し、その成長を妨げるために、抗微生物保存剤を使用すべきである。抗微生物保存剤を含有する多用量ワクチン製剤は、単一用量製剤と比べて幾つかの利点をもたらす。例えば、１回目の抜き取りが不注意にも微生物汚染を招いたという懸念を伴うことなく、複数用量のワクチンが或る時間にわたってバイアルから抜き取られることが可能となる（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６（１２）：３１５５−３１６７（２００７））。ＨＰＶに無関係な多数の市販ワクチン製品は抗微生物保存剤としてフェノキシエタノール（ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）、ＨＡＶＲＩＸ（登録商標）およびＴＷＩＮＲＩＸ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ），Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）またはチメロサール（ＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）およびＥＮＧＥＲＴＸ−Ｂ（登録商標）（ＧＳＫ））を含む（Ｍｅｙｅｒら，前掲を参照されたい。）。また、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３（Ｍｅｒｃｋ  ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）製剤は抗微生物保存剤としてフェノールを含有する。しかし、ＨＰＶ  ＶＬＰ含有ワクチン製剤の、抗微生物保存剤との適合性は、これまでに検討されていない。
【００７８】
したがって、本発明の１つの態様において、ＨＰＶ  ＶＬＰを含むワクチン製剤へのｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物性保存剤の添加は微生物の減少または排除に有効であり、２から８℃における該ＶＬＰの構造的および熱的安定性に負の影響を及ぼさないことが示された。また、ｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤は、ＩＳＣＯＭ型アジュバントと共にＨＰＶ ＶＬＰを含むＨＰＶワクチン製剤における有効な保存剤であることが、本明細書中に示されている。したがって、本発明はまた、ＨＰＶ  ＶＬＰと、ｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤とを含むＨＰＶワクチン製剤に関する。本発明のこの態様におけるワクチン組成物は、前記のとおり、ＩＳＣＯＭ型アジュバントおよびアルミニウムアジュバントをも含みうる。
【００７９】
本発明のこの態様の幾つかの好ましい実施形態においては、ｍ−クレーゾルは約０．１５から約０．３１％の濃度で該多用量ＨＰＶワクチン製剤中に含まれる。より好ましい実施形態においては、該多用量ワクチン製剤はｍ−クレーゾールを約０．２５から約０．３１％の濃度で含む。１つの好ましい実施形態においては、ｍ−クレーゾールは約０．３％の濃度で該多用量製剤中に含まれる。
【００８０】
本発明の他の実施形態においては、該多用量ＨＰＶ  ＶＬＰワクチン製剤中にフェノールが約０．２５から約０．５５％の濃度で含まれる。より好ましい実施形態においては、フェノールは約０．４から約０．５５％の濃度で含まれる。１つの特に好ましい実施形態においては、フェノールを約０．１５％の濃度で含む多用量ＨＰＶ  ＶＬＰワクチン製剤を提供する。
【００８１】
さらに他の実施形態においては、該多用量ＨＰＶワクチン製剤はベンジルアルコールを約０．７５から約１．２％の濃度で含む。より好ましい実施形態においては、ベンジルアルコールは約０．８から約１．０％の濃度で該多用量ワクチン製剤中に含まれる。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、ベンジルアルコールの濃度は０．９％である。
【００８２】
したがって、本発明の１つの態様は、（ａ）少なくとも１つのＨＰＶ型（該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２よりなる群から選ばれる。）のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）（該ＨＰＶ ＶＬＰはＨＰＶの組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む。）、（ｂ）アルミニウムアジュバント（該ＨＰＶ  ＶＬＰは該アルミニウムアジュバント上に吸着されている。）、ならびに（ｃ）ｍ−クレーゾール、フェノールおよびベンジルアルコールよりなる群から選ばれる抗微生物保存剤を含む多用量ＨＰＶワクチン製剤に関する。
【００８３】
前記の多用量ＨＰＶワクチン製剤は、場合によっては、ＩＳＣＯＭ型アジュバントを含みうる。
【００８４】
本発明に関連して用いられうる方法および材料を記載し開示する目的で、本明細書に記載のすべての刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。ここで、本発明が先行発明としてそのような開示に先行するものではないと自認するものと解釈されるべきではない。
【００８５】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの実施形態そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明には種々の変更および修飾が当業者によって施されうると理解されるべきである。
【００８６】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【００８７】
アジュバントを含むＨＰＶ製剤の開発
【実施例１】
【００８８】
アカゲザルへのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘアジュバントを含有するＨＰＶ  ８価ワクチンの投与
ＨＰＶ ＶＬＰに基づくワクチンに対する免疫応答が、アルミニウムアジュバントのみで得られる力価より増大しうるかどうかを判定するために、８価ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンを、無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントと共に、アカゲザルに投与した。
【００８９】
該ワクチンは、８つの異なるＨＰＶ  Ｌ１ウイルス様粒子よりなるものであった。該ＶＬＰを、４５０ｍｃｇ／ｍＬの濃度で存在するアルミニウムヒドロキシドホスファートアジュバント（ＭＡＡ）上に吸着させた。該ＭＡＡ吸着ワクチンを、２００ｍｃｇ／ｍＬで存在するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ  ＡＢＮ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の更なる添加の存在下または非存在下で試験した。該ワクチンは、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ６．２）および０．０１％ ポリソルベート８０よりなるバッファー中に存在していた。０．５ｍＬの容量の該ワクチンの１回の注射を各インドアカゲザルの右三角筋に行った。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
以下の免疫化計画を試験した（各群に関してｎ＝４）。群ＩにはＭＡＡアジュバント化８価ワクチンで第０週および第８週に免疫化を行った。群ＩＩにはＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンで第０週および第８週に免疫化を行った。群ＩＩＩにはＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンで第０週、第８週および第２４週に免疫化を行った。群ＩＶにはＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンで第０週および第２４週に免疫化を行った。血清サンプルを４週間隔で各動物から集めた。
【００９２】
結果は、ＭＡＡアジュバント化またはＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンで免疫化された全ての動物がそれらの８つのＨＰＶ型のそれぞれにセロコンバージョンしたことを示している。群ＩおよびＩＩを比較した場合、ＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチン投与動物（群ＩＩ）においては、ＭＡＡアジュバント化ワクチン投与動物（群Ｉ）と比べて、該ＨＰＶ型のそれぞれに対する相乗平均力価が一貫して上昇した。該改善は第５２週においても依然として明白であり、このことは、該効果が長く持続することを示唆している。
【００９３】
群ＩおよびＩＶを比較した場合、単一用量の投与の後、ＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンコホート（群ＩＶ）のピーク力価は、ＭＡＡワクチン（群Ｉ）の単一用量により惹起されるものより高いだけでなく、ＭＡＡワクチンの２用量により惹起されるピーク力価に匹敵するものであったことを、結果は示している（ＨＰＶ１６および３１の代表的な結果に関しては、図１および２を参照されたい。）。ＭＡＡ−ＩＭＸアジュバント化ワクチンでの０、２４投与計画（群ＩＶ）に関する第５２週における力価は、同じワクチンでの０、８、２４投与計画（群ＩＩＩ）の場合より若干低いに過ぎなかった。これは、ＭＡＡ／ＩＭＸアジュバント化ワクチンを使用する２用量計画が、ＭＡＡアジュバント化ワクチンでの３用量計画に匹敵するレベルの免疫応答を誘導する可能性を有することを示唆している。
【実施例２】
【００９４】
ＨＰＶ競合Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
免疫応答を示すために、免疫化されたサルからの血清抽出物を競合Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｃＬＩＡ）により分析した。該ＨＰＶ ｃＬＩＡは、ＨＰＶ ８価ワクチンでの免疫化に対する免疫応答をモニターするために８つの型特異的コンホメーション依存性ｍＡｂを使用する。試験サンプル中の複数のＨＰＶ型に対する抗体の存在を同時に測定するために粒子に基づくフローサイトメトリー分析を利用する競合Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイの、より詳細な説明は、米国特許第７，０６７，２５８号およびＯｐａｌｋａら，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１）：１０８−１５（２００３）に記載されている。抗体除去ヒト血清（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ）（ＡＤＨＳ）を含有する前スクリーニングアッセイマトリックスにおいて、各ＨＰＶ型に関して８価参照標準溶液を調製した。該参照標準は、ＨＰＶ １価Ｌ１ ＶＬＰ ６、１１、１６、１８、３１、４５、５２、５８型で過免疫化されたアカゲザルからの血清サンプルのプールであった。すべての標準、対照およびサンプルを２回重複して試験した。血清サンプルの試験は、１：４、１：４０、１：４００または１：４０００の希釈度で行った。蛍光単位を読取り、２回重複試験のウェルを平均した。各アッセイプレートに関する標準曲線の４パラメータロジスティックフィットに基づいて、希釈度補正ｍＭｕ／ｍＬ血清値を計算した。標準曲線に関する定量の限界を超えたサンプルは、より高い希釈度で再試験した。過剰変動性（ｅｘｔｒａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を満たさなかった重複試験物は表示されておらず、ついで該サンプルは、それらが重複パラメーターを満足するまで再試験した。該アッセイに関する対照仕様を開発し、定量の限界を各ＨＰＶ型に関して確定した。
【実施例３】
【００９５】
ＭＡＡおよびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）アジュバントと組合されたＨＰＶ ＶＬＰワクチンの免疫原性
ヒト患者においてＨＰＶに対する免疫応答を増強するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＩＭＸ）の能力を臨床治験において評価した。無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＭＡＡ）でアジュバント化された８価ＨＰＶ ＶＬＰワクチンを試験する２相無作為化二重盲検多施設ＩＭＸ用量増加対照研究を開始した。被験者を２つの別々の研究相に無作為化した。ＭＡＡ（２８１ｍｃｇ）で製剤化された一定濃度のＨＰＶ  ＶＬＰを含有する実験用８価ワクチンの場合において、各０．５ｍＬ用量当たり１５または３０ｍｃｇ（相Ａ）および６０または１２０ｍｃｇ（相Ｂ）のＩＭＸ濃度を評価し、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）と比較した。該８価ワクチンは、６型（２０ｍｃｇ）、１１型（４０ｍｃｇ）、１６型（４０ｍｃｇ）、１８型（２０ｍｃｇ）、３１型（２０ｍｃｇ）、４５型（２０ｍｃｇ）、５型（２０ｍｃｇ）および５８型（２０ｍｃｇ）のＨＰＶ  ＶＬＰを含有していた。ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）は、高精製Ｌ１  ＶＬＰから製造された４価ＨＰＶ（６、１１、１６、１８型）組換えワクチンである。ＶＬＰに加えて、各ワクチン用量はＭＡＡ（２２５ｍｃｇ）、塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート８０、ホウ酸ナトリウムおよび水を含有していた。
【００９６】
該研究の各部門において、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）または前記のＭＡＡ／ＩＭＸを伴う８価ＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰの４つの製剤のいずれか１つの０．５ｍＬの筋肉内注射として第１日、第２月および第６月にワクチンを投与した。該研究は登録時点で１８から２４歳のから１５０人の健常女性を含むものであった。第１日、第２月、第３月（第２投与の１ヶ月後）、第６月、第７月（第３投与の１ヶ月後）および第１２月に採取した血液サンプルを、実施例２に記載されているとおり、競合Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｃＬＩＡ）を用いる関連ＨＰＶ型に対する免疫応答の評価のために使用した。
【００９７】
ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）の場合と比較して、該ワクチン製剤に対する免疫応答の分析を行った。該分析においては、相Ａおよび相Ｂにおける１４５人の被験者（９７％）において、第３月（第２投与後）の免疫原性データが入手可能であり、相Ａにおける７３人の被験者（９７％）において、第７月（第３投与後）の免疫原性データが入手可能であった。相Ａにおける被験者が、（ｉ）適当な日範囲において全３回のワクチン接種を受け、（ｉｉ）適当な日範囲において集められた血清学サンプルを有し、（ｉｉｉ）第１日において関連ＨＰＶ型に対して血清陰性であり、（ｉｖ）適当な日範囲において集められた妥当な第７月の血清学的結果を有していた場合に、該被験者は該分析に含められた。相Ｂにおける被験者が、（ｉ）適当な日範囲において最初の２回のワクチン接種を受け、（ｉｉ）適当な日範囲において集められた血清学サンプルを有し、（ｉｉｉ）第１日において関連ＨＰＶ型に対して血清陰性であった場合に、該被験者は該分析に含められた。
【００９８】
相Ａ（１５および３０ｍｃｇのＩＭＸ，＋ＭＡＡ）の被験者に関する治療群ごとの第３月（第２投与後）および第７月（第３投与後）の両方の時点における結果、ならびに相Ｂ（６０および１２０ｍｃｇのＩＭＸ，＋ＭＡＡ）の被験者に関する第３月の時点における結果を、それぞれ、図３および４に示す。該結果は、ＭＡＡのみでアジュバント化されたＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）の場合と比較して、関連ＨＰＶ型に対する免疫応答のＩＭＸ用量関連増強を示している。
【実施例４】
【００９９】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＩＭＸ）の存在下および非存在下の８価ＨＰＶ ＭＡＡおよび溶液製剤の安定性
４つの異なる８価ＨＰＶサンプル、±ＭＡＡおよび±ＩＭＸを製剤化した。すべての製剤はＨＰＶ  ＶＬＰを以下の量で含有していた：４０μｇ／ｍＬ ＨＰＶ６、８０μｇ／ｍＬ  ＨＰＶ１１、８０μｇ／ｍＬ  ＨＰＶ１６、ならびにＨＰＶ１８、３１、４５、５２および５８ ＶＬＰのそれぞれ４０μｇ／ｍＬ。また、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ６．２）および０．０１％  ポリソルベート８０（ＰＳ８０）が該製剤のそれぞれに含まれていた。第１製剤はＩＭＸアジュバントもＭＡＡアジュバントも含有していたなかった。第２製剤は２４０μｇ／ｍＬのＩＭＸを含有し、ＭＡＡを含有していなかった。試験した第３製剤はＩＭＸを含有せず、５６２．５μｇ／ｍＬ（１．２５×）のＭＡＡを含有していた。試験した第４製剤は２４０μｇ／ｍＬのＩＭＸおよび５６２．５μｇ／ｍＬ（１．２５×）ＭＡＡの両方を含有していた。
【０１００】
これらの４つの製剤を、４℃および３７℃で６ヶ月保存された後、ＨＰＶ  ＶＬＰの完全性に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、そしてインビトロ抗原性に関してインビトロ相対効力アッセイ（ＩＶＲＰ）により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（実施例５）およびＩＶＲＰアッセイ（実施例６）からの結果は、ＭＡＡの非存在下ではＨＰＶ  ＶＬＰが安定ではなく、ＭＡＡの存在下ではＩＭＸがＨＰＶ  ＶＬＰの安定性に影響を及ぼさないことを示した。結果は、ＩＭＸ含有ＨＰＶワクチン製剤中にＭＡＡが含められるべきであることを示している。
【実施例５】
【０１０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＰＶ ＶＬＰの完全性の評価
サンプルを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４から２０％または１４％、１．５ｍｍ、１０ウェルＴｒｉｓ−グリシンゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。サンプルを還元性サンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ  ＰＨ６．８、８％  ＳＤＳ、４０％ グリセロール、０．００８％  ブロモフェノールブルー、ジチオトレイトール）中で調製し、７０℃で１０分間加熱する。アルミニウムアジュバントを含有するサンプルをサンプル調製前に７６２μｇ／ｍＬまで濃縮し、該アルミニウムを溶解するために０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えた。
【０１０２】
該高負荷を１×還元性サンプルバッファー（４×還元性サンプルバッファー：ＭｉｌｌｉＱ水（１：３）の部分）に加えて低負荷（２．５μｇ）を調製した。各サンプルごとに１２ｍｃｇ（高）および２．５ｍｃｇ（低）の負荷を泳動させた。
【０１０３】
電気泳動後、ゲルを、１２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸溶液を使用して固定し、Ｐｒｏ−Ｂｌｕｅ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎで染色した。バンドパターンを、デンシトメーターを使用して得、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して分析した。分解産物の相対量を決定するために該高負荷を用い、無傷ＨＰＶの相対量を決定するために該低負荷を用いた。
【０１０４】
結果は、６ヵ月後に、３７℃で保存された＋（プラス）ＭＡＡサンプル（±ＩＭＸ）の両方に関する無傷単量体の比率（％）における小さな減少（１０％未満）が存在することを示した（図５）。しかし、同じ時点および保存における−（マイナス）ＭＡＡサンプルの両方に関する無傷単量体の比率（％）における、−（マイナス）ＩＭＸサンプルに関しては６９％まで、そして＋（プラス）ＩＭＸサンプルに関しては３９％までの、遥かに大きな減少が存在した。ＩＭＸの存在下、ＨＰＶ  ＶＬＰは、溶液製剤中よりＭＡＡ製剤中のほうが安定であることを、該データは示している。
【実施例６】
【０１０５】
ＩＶＲＰアッセイによるＨＰＶ  ＶＬＰのインビトロ抗原性の評価
インビトロ相対効力（ＩＶＲＰ）試験により、参照標準と比較して、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、４５および５２型ＶＬＰサンプルの効力を定量した。ＩＶＲＰアッセイは、捕捉および検出のために別々のモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ型イムノアッセイである。
【０１０６】
８つの血清型特異的アッセイのそれぞれにおいて使用した抗体はＳｔｒａｔｅｇｉｃ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）により製造された。以下の血清型特異的捕捉抗体を該ＩＶＲＰアッセイにおいて使用した：ＨＰＶ６に対してはＨ６．Ｍ４８  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）、ＨＰＶ１１に対してはＫ１１．Ｂ２  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）、ＨＰＶ１６に対してはＨ１６．Ｊ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａ）、ＨＰＶ１８に対してはＨ１８．Ｊ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａ）、ＨＰＶ３１に対してはＨ３１．５Ｆ１２．Ｄ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）、ＨＰＶ４５に対してはＨ４５．６Ｇ６．Ａ８  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ５２に対してはＨ５２．８Ｄ１１．Ｃ４ ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、およびＨＰＶ５８に対してはＨ５８．２Ｃ３．Ｆ７  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）。以下の血清型特異的検出抗体を該アッセイにおいて使用した：ＨＰＶ６に対してはＨ６．Ｂ１０．５  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ１１に対してはＨ１１．Ｂ２  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ１６に対してはＨ１６．Ｖ５  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ１８に対してはＨ１８．Ｒ５  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ３１に対してはＭ３１．５Ｄ１０．Ｅ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＰＶ４５に対してはＨ４５．１０Ｂ４．Ｈ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）、ＨＰＶ５２に対してはＨ５２．９Ｆ７．Ｅ１０  ｍＡｂ（ＩｇＧ２３）、およびＨＰＶ５８に対してはＨ５８．６Ｅ１１．Ｆ４  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）。
【０１０７】
白色ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯワークステーション（Ｔｅｃａｎ  ＵＳＡ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ，ＮＣ）上で該アッセイを行った。まず、アッセイプレートを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で緩衝化された１Ｍ  硫酸アンモニウム中、捕捉抗体（１００μＬ／ウェル）でコートし、ついで２から８℃で１６から２４時間インキュベートした。該インキュベーション後、該プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、ついで２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および１％  ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ）で１時間ブロッキングした。サンプル添加前に、アジュバント吸着サンプルおよび標準を、１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０４％  Ｔｗｅｅｎ８０を含有する６％ クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６．７から６．８）中で５倍希釈し、アジュバントの溶解のためにニューテーター（ｎｕｔａｔｏｒ）上で外界温度で２±０．５時間インキュベートした。アジュバントに吸着されなかったサンプルをも該溶解バッファー中で希釈したが、インキュベートしなかった。ついで各サンプルおよび参照標準を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＮｕｎｃ  ９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート内でアッセイ希釈剤で血清型特異的目標濃度に希釈した。この初期希釈のために、該アッセイプレート内で各サンプルごと及び該参照標準に関して１１個の２倍系列希釈液を調製した。振とうしながら室温で１２から２０時間インキュベートした後、該プレートを洗浄し、ついで１００μＬの該検出抗体を各ウェルに加えた。該プレートを室温で１時間インキュベートし、再び洗浄した。
【０１０８】
つぎに、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）またはＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から供給された、アルカリホスファターゼに結合した１００μＬのラット抗マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）を各ウェルに加えた。室温で１時間のインキュベーションの後、該プレートを洗浄して未結合コンジュゲートを除去した。つぎに、ＶｉｒｏＬａｂｓ（ＳｕｐｅｒＰｈｏｓ；Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の１００μＬの４−メチルウンベリフェリルホスファート（４−ＭＵＰ）基質溶液を加え、１時間反応させた。
【０１０９】
励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍでＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３８４プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＵＳＡ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ，ＮＣ）において該プレートを読取ることにより、各ウェルの蛍光を測定した。得られた蛍光強度を希釈ファクターに対してプロットし、４パラメータロジスティックモデルを用いて該データを分析した。
【０１１０】
【数１】
2014062117.tif 000003
ここで、Ｘはサンプル希釈度であり、ｙは、測定された蛍光応答であり、Ａは漸近的最大値であり、Ｂは傾きであり、ＣはＥＤ５０（すなわち、最大応答の５０％に等しい応答を与える理論的希釈度）であり、Ｄは漸近的最小値である。同じ漸近的最大値および最小値を該標準および該サンプルの両方に適用し、根二乗平均誤差が最小になるまで各サンプルおよび標準に関するＥＤ５０および傾きを反復的に調整した。各サンプルおよび標準に関する最適なＥＤ５０および傾きが特定されたら、平行に関する試験を該サンプルに適用した。該サンプル傾きが該参照標準傾きの２０％以内であれば、該試験サンプルは該標準に平行であるとみなし、共通の傾きモデルを用いて該データを再分析した。共通の傾き、漸近的最大値および最小値を該サンプルおよび該標準の両方に適用し、該サンプルおよび標準ＥＤ５０を別々に、根二乗平均誤差が最小になるよう最適化した。以下の式：
ＩＶＲＰ＝（ＥＤ５０サンプル／ＥＤ５０標準）×参照標準効力
を用いて、最終ＩＶＲＰを計算した。ついで該結果を、タンパク質濃度で割り算してＩＶＲＰ対タンパク質比を得ることにより正規化した。該ＩＶＲＰ対タンパク質比は単位質量当たりの機能性エピトープの尺度となる。
【０１１１】
ＩＭＸの存在および非存在には無関係に、プラスおよびマイナスＭＡＡサンプルの両方において、８個全ての型のＨＰＶ抗原が、４℃で６ヶ月間保存された後では１００％の抗原性を保有していたことを、該結果は示している（図６を参照されたい。）。３７℃で６ヶ月後には、マイナスＭＡＡ製剤（±ＩＭＸ）の両方における全ＨＰＶ型の抗原性は僅か１０％保有されているに過ぎなかった。しかし、プラスＭＡＡ製剤（±ＩＭＸ）の両方における各ＨＰＶ型は尚も７５％以上活性であり、このことは、ＭＡＡの非存在下のＨＰＶ  ＶＬＰが安定ではなかったことを示唆している。該ＩＶＲＰ結果は該ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータに匹敵するものであり、これは、ＩＭＸに基づくＨＰＶ製剤においてはＭＡＡが必要であることを示している。
【０１１２】
保存剤を含むＨＰＶ製剤の開発
【実施例７】
【０１１３】
抗微生物保存剤の有効性の評価
抗微生物試験（抗微生物有効性（ＡＭＥ）試験）を用いて、候補ＨＰＶワクチン製剤における種々の保存剤の有効性を評価した。産物の取り出し後にバイアル内に導入されうる微生物を減少させ又は排除する保存剤の能力を決定するために、ＡＭＥ試験を用いた。該アッセイの説明は、米国薬局方（ＵＳＰ）＜５１＞、欧州薬局方５．１．３およびＭｅｙｅｒら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６（１２）：３１５５−３１６７（２００７）（これを参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。簡潔に説明すると、ＡＭＥ試験はＥＰＡ、ＥＰＢおよびＵＳＰ基準を含み、それらは、時間０の時点で容器当たり１０５から１０６  ＣＦＵ／ｍＬの微生物（例えば、細菌および真菌）を接種し、経時的な対数減少を評価することよりなる（Ｍｅｙｅｒら，前掲）。
【０１１４】
以下の７種の保存剤を使用して、初期保存剤スクリーニングを行った：種々の用量および組合せのベンジルアルコール、クロロブタノール（＋ＥｔＯＨ）、ｍ−クレーゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェノールおよび２−フェノキシエタノール。これらの保存剤は市販非経口製品において抗微生物保存剤として使用されている。チメロサールも参照体として含めた。
【０１１５】
該保存剤の初期用量および組合せを、これまでの研究結果および入手可能な文献に基づいて選択した。より詳しくは、以下の範囲の濃度を試験した：０．５から１．２％  ベンジルアルコール、０．２５から０．５％ クロロブタノール（０．５％ ＥｔＯＨまたは３．０％  ＥｔＯＨ）、０．１５から０．３％  ｍ−クレーゾール、０．０４５から０．１８％  メチルパラベン、０．００５から０．０２％  プロピルパラベン、０．２５から０．５％  フェノール、０．２５から０．５％  ２−フェノキシエタノール、および０．００２から０．０１％  チメロサール。全てのサンプルは５６２．５ｍｃｇ／ｍＬ  ＭＡＡ、０．３２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｉｓ、０．０１％  ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）（ｐＨ６．２）を含有していた。１２０ｍｃｇ／ｍＬ  ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の添加の存在下または非存在下、クロロブタノールおよびプロピルパラベンを含有する製剤を試験した。
【０１１６】
ベンジルアルコール、フェノール、２−フェノキシエタノールおよびｍ−クレーゾールは溶液として提供され、それらを該ＨＰＶ製剤に直接的に加えた。クロロブタノールは粉末で提供され、これを１００％ エタノールに溶解してストック溶液を調製した。チメロサールをＵＳＰ水に溶解してストック溶液を調製した。メチルパラベンおよびプロピルパラベンの組合せを、各粉末を秤量し１００％エタノール中のストック溶液を調製することにより調製した。該溶液のｐＨを６．２の目標ｐＨに調節した。
【０１１７】
実施例１に記載されているとおりの８つの型のＨＰＶ ＶＬＰを含む８価ＨＰＶ製剤に保存剤を加え、ＡＭＥ試験の前に２から８℃で１週間保存した。１．２％ ベンジルアルコール、０．５％  クロロブタノールおよび０．３％  ｍ−クレーゾールを含有する製剤はＡＭＥ試験のＵＳＰ、ＥＰ−ＢおよびＥＰ−Ａ基準を満たした（Ｍｅｙｅｒら，前掲を参照されたい。）。０．４％および０．５％ フェノールを含有する製剤はＵＳＰおよびＥＰ−Ｂを満たしたが、ＥＰ−Ａ試験に合格しなかった。ＵＳＰ試験のみに合格した、他の保存剤を含有する製剤を試験した。したがって、１．２％ ベンジルアルコール、０．５％ クロロブタノール、０．３％ ｍ−クレーゾールおよび濃度０．４％または０．５％のフェノールを含有する製剤を更なる評価のために選択した。
【実施例８】
【０１１８】
ＨＰＶ ＶＬＰ抗原の構造的安定性に対する保存剤の影響の評価
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を用いて、タンパク質の構造的および熱的安定性に対する保存剤の影響を評価した。ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、抗原熱安定性の分析を行った。用いた条件の詳細な説明はＩｏｎｅｓｃｕら（２００７）（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ ９７（４）：１４１４−１４２６（２００８））に開示されている。
【０１１９】
ＤＳＣ分析のためのモデルＨＰＶ抗原として、ＨＰＶ１８  ＶＬＰを選択した。なぜなら、この型のＶＬＰは最も確固たるＤＳＣシグナルを与え、試験される他の型と比べて低い安定性を有する型のＶＬＰを代表するからである。種々の濃度の種々の保存剤の存在下でＤＳＣ評価を行った。結果は、０．５％  クロロブタノール、０．１５％ ｍ−クレーゾール、０．２５％ フェノール、０．５％  エタノール（クロロブタノール用の溶媒）および０．２５％ ２−フェノキシエタノールが、ＨＰＶ１８型の熱安定性に対して最も小さい影響を及ぼしたことを示している（データ非表示）。熱安定性に対する最大の影響がチメロサール、１．２％  ベンジルアルコールおよび０．０４５／０．００５メチルパラベンで観察された。しかし、１．２％ ベンジルアルコール製剤はＥＰ−Ａを満たし（実施例７）、また、高いビアコア（ｂｉａｃｏｒｅ）応答を示したため（実施例９）、それを尚も更なる安定性試験のために選択した（実施例１１から１２）。また、より高い濃度のｍ−クレーゾール（０．３％）およびフェノール（０．５％）は、より低い濃度のこれらの保存剤と比較して、熱安定性に対して比較的大きな影響を及ぼしたが、ＥＰ−Ａ（０．３％ ｍ−クレーゾール）およびＥＰ−Ｂ（０．５％ フェノール）に適合していることに基づいて、高いほうの濃度を更なる評価のために選択した（実施例７を参照されたい。）。保存剤２−フェノキシエタノールは、ＥＰ−ＢまたはＥＰ−Ａを満たさなかったため（実施例７を参照されたい。）、更なる評価の対象外となった。
【実施例９】
【０１２０】
ＨＰＶ ＶＬＰ抗原の活性に対する保存剤の影響
ＨＰＶ１８  ＶＬＰおよび種々の保存剤を含むＨＰＶワクチン製剤のインビトロ抗原性を、中和抗体結合アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ，表面プラズモン共鳴）を用いて評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００（ＶＰＲ  ３３２）およびＢｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＶＰＲ  ６９６）（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、抗原生物活性の分析を行った。用いた条件は、Ｍａｃｈら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９５：  ２１９５−２２０６ （２００６））に記載されているものに修飾を施したものであった。
【０１２１】
サンプルを２から８℃で２ヶ月間インキュベートした後、アルミニウム溶解によるサンプル処理を行い、ついで最終的なＢｉａｃｏｒｅ分析を行った。該Ｂｉａｃｏｒｅ結果は、試験した保存剤がＨＰＶ１８型 ＶＬＰの生物活性に対して有意な影響を及ぼさないことを示した（データ非表示）。全ての結果は、メチルパラベン／プロピルパラベン（７７％の平均相対インビトロ抗原性，ｎ＝２）およびチメロサール（８０％の平均相対インビトロ抗原性，ｎ＝２）を除き、該アッセイの変動性の範囲（最大の＋／−１５％）内であった。
【実施例１０】
【０１２２】
アルミニウムおよびＩＭＸ、ガラスバイアルおよび栓との保存剤の相互作用
Ｄｕｎｎら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ  ７２：２７７−８０（１９８３））に記載されているとおりに逆相（ＲＰ）−高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、保存剤安定性の分析を行った。この方法を用いて、アルミニウムアジュバント、ガラス容器および栓との保存剤の可能な相互作用を評価した。
【０１２３】
結果は、アルミニウムアジュバントとの接触後に保存剤の検出可能な喪失は存在しないことを示した（データ非表示）。これらの結果は、試験した保存剤がＭＡＡに結合しないことを示した本発明者らのこれまでの研究に一致していた。これらの研究は、ＩＭＸが保存剤濃度またはＨＰＶ安定性に影響を及ぼさないことも示した。
【０１２４】
同様の研究をガラスバイアル（データ非表示）および栓で行った。テフロン（登録商標）被覆栓（ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標），Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）との該保存剤の適合性をＨＰＶ製剤バッファー中の４つの異なる保存剤で評価した。試験した製剤は最終濃度で１．２％  ベンジアルアルコール、０．５％ フェノール、０．５％  クロロブタノールまたは０．３％ ｍ−クレーゾールを含むものであった。ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）被覆栓を伴う２個の３ｍＬ ガラスバイアル内に各サンプルを０．７５ｍＬの容量で充填した。一方のバイアルは倒立させ、もう一方は直立させて、該バイアルを室温で６ヶ月間保存した。前記のＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて、該保存剤の濃度を測定した。
【０１２５】
該栓と接触したサンプルに関して、室温で６ヶ月間の保存の後に保存的喪失は検出されなかったことを、結果は示している。これらの結果は、該保存剤がＨＰＶ製剤バッファー中でＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）被覆栓と相互作用せず、また、それに吸着しないことを示している。
【０１２６】
また、ＨＰＶワクチン製剤中の保存剤安定性を評価するために、該ＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いた。短期予備研究は、該ＨＰＶワクチンを２から８℃で保存した場合、選択された保存剤が非常に安定であることを示した（データ非表示）。長期安定性研究による、より詳細な評価を実施例１１から１２に記載する。
【実施例１１】
【０１２７】
ＨＰＶワクチン製剤の安定性の評価：材料および方法
ＡＭＥ、ＤＳＣおよびＢｉａｃｏｒｅ分析から得られた初期データ（実施例７から９）に基づいて、５つの保存剤含有製剤（１．２％および０．９％ ベンジルアルコール、０．５％ クロロブタノール、０．３％ ｍ−クレーゾールおよび０．５％ フェノール）を、長期安定性研究における更なる分析のために選択した。ＩＭＸアジュバントの存在下または非存在下に種々の用量および組合せの保存剤を含有する幾つかのＨＰＶワクチン製剤を試験した。
【０１２８】
各型のＨＰＶ  ＶＬＰ水性バルクを０．７１のタンパク質対アジュバント比でＭＡＡ上に別々に吸収させて、０．３２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ６．２）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ−８０中の１価ワクチンを形成させた。ついで８つの個々の１価ワクチンを一緒に混合して、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、４５、５２および５８型に関してそれぞれ４０、８０、８０、４０、４０、４０、４０および４０ｍｃｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。この組合せは該８価ワクチンを形成した。
【０１２９】
また、いくつかの製剤はＩｓｏｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＭＸ，ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）アジュバントを含有していた。ＨＰＶワクチンバッファー（前記）中でストックＩＭＸを調製した。ついで沈降−デカント法を用いて、ＩＭＸを２４０ｍｃｇ／ｍＬの最終濃度まで該８価ワクチンに加えて、ＩＭＸアジュバントを含有する８価ワクチンを形成させた。該製剤を穏やかに混合し、４℃で一晩保存した。初期保存剤スクリーニング（実施例７）はクロロブタノール製剤中で１２０ｍｃｇ／ｍＬ  ＩＭＸを使用した。なぜなら、これらの実験を行った際には、最終ＩＭＸ濃度が決定されていなかったからである。
【０１３０】
該製剤を０．７５ｍＬの容量で、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）被覆栓（ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標），Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を伴う３ｍＬ ガラスバイアル内に充填し、試験前に制御熱ユニット内で２から８、２５、３０および３７℃で保存した。該製剤化および充填操作は無菌条件下で行った。２から８℃で保存した製剤に関しては、保存剤、ＨＰＶ ＶＬＰおよびＩＭＸアジュバントの試験のために第０、８、１２、２４および３６月の時点で測定されることが予定されている。
【実施例１２】
【０１３１】
ＨＰＶワクチン製剤の安定性の評価：ＡＭＥ試験による保存剤の有効性
まず、即時研究（２から８℃）からの製剤を、ＡＭＥ試験を用いて、保存剤有効性に関して時間０の時点で評価した。ＩＭＸの存在下または非存在下に０．５％ クロロブタノールおよび０．３％ ｍ−クレーゾールを含有する製剤はＵＳＰ、ＥＰ−ＢおよびＥＰ−Ａ試験に合格した。１．２％  ベンジルアルコールを含有する製剤はＩＭＸの非存在下ではＵＳＰ、ＥＰ−ＢおよびＥＰ−Ａに合格したが、ＩＭＸ含有製剤においてはＥＰ−Ａに合格しなかった。ＩＭＸの存在下または非存在下でＥＰ−Ａに合格しなかった製剤は０．９％ ベンジルアルコールおよび０．５％ フェノールをも含んでいた。
【０１３２】
３．３．３  ２から８℃で８ヶ月ならびに３０および３７℃で３ヶ月の保存に関する安定性データ
多用量保存剤含有サンプルの安定性を、ＨＰＶ ＶＬＰに関してはインビトロ抗原性（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、そして保存剤およびＩＭＸの安定性に関してはＲＰ−ＨＰＬＣを用いて評価した。
【０１３３】
加速安定性研究からのデータ（図７および８）は、全ての保存剤が３０および／または３７℃における８価ＨＰＶワクチンの安定性に負の影響を及ぼすことを示した。しかし、該製剤を２から８℃で保存した場合には、該保存剤は８ヶ月の保存の後でもＨＰＶワクチンの安定性に有意な影響を示さなかった（図７および８）。該データはまた、ＨＰＶワクチンに対する保存剤の効果が保存剤のタイプによって異なることを示している。３０℃での該加速安定性研究の結果は、試験した全ての保存剤の比較において、０．３％  ｍ−クレーゾールが、多用量ＨＰＶワクチンの安定性に対する最小の影響を伴う最も最適な保存剤であり、一方、１．２％  ベンジルアルコールおよび０．５％  クロロブタノール保存剤がＨＰＶワクチン安定性に最も影響を及ぼすことを示した。総合すると、３つの保存剤（０．９％  ベンジルアルコール、０．５％  フェノールおよび０．３％ ｍ−クレーゾール）のみがＨＰＶワクチン安定性に対して比較的小さい影響を及ぼした。
【実施例１３】
【０１３４】
ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによるＨＰＶワクチン製剤中の保存剤の安定性の評価
多用量ＨＰＶワクチンにおける保存剤の安定性を、既に記載されているとおりに（実施例１０）、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりモニターした。結果は、全５種の保存剤が、ＩＭＸの存在下または非存在下、多用量ワクチン製剤中で安定であったことを示している（図９）。保存温度または期間にかかわらず、この研究中に試験した全ての製剤に関して、保存剤の喪失は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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