(57)【要約】【課題】本発明は、温度応答性表面の細胞剥離性を向上させた細胞培養基材を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法であって、温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化する工程、および親水性分子を放射線照射により基材に固定化する工程を含む前記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法であって、
温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化する工程、および
親水性分子を放射線照射により基材に固定化する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
温度応答性ポリマーが固定化される領域と、親水性分子が固定化される領域とが重畳する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化した後、親水性分子を放射線照射により基材に固定化する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
親水性分子が、ポリアルキレングリコールである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素を用いることなくシート状に形成した細胞を低侵襲に回収する技術が再生医療分野において注目を集めている。その際に使用されるのが、温度応答性ポリマーを結合させた温度応答性細胞培養基材である。特許文献１には、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養容器上において、細胞を上限臨界溶解温度未満または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度未満にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる方法が記載されている。しかし細胞種によっては剥離しにくいものも存在しているため、細胞剥離性の向上が求められている。
【０００３】
特許文献２には、基材上に温度応答性ポリマーを含む溶液を塗布した後に電子線を多段階照射して温度応答性培養容器を製造する方法について記載されているが、基材表面に結合させているのは温度応答性ポリマーのみであり、剥離しにくい細胞種に対しては剥離性が十分とはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許１９７２５０２号
【特許文献２】ＷＯ９０／００３１３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、温度応答性表面の細胞剥離性を向上させた細胞培養基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
温度応答性ポリマーと細胞低接着性の親水性分子とを、多段階の放射線照射工程によって基材表面に結合させることによって、温度応答性細胞培養基材の細胞剥離性が向上すること、それにより、細胞剥離性を細胞種によって適切に調節できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法であって、
温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化する工程、および
親水性分子を放射線照射により基材に固定化する工程
を含む、前記方法。
（２）温度応答性ポリマーが固定化される領域と、親水性分子が固定化される領域とが重畳する、（１）記載の方法。
（３）温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化した後、親水性分子を放射線照射により基材に固定化する、（１）または（２）記載の方法。
（４）親水性分子が、ポリアルキレングリコールである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）温度応答性ポリマーがアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、温度応答性細胞培養基材の細胞剥離性を向上させることができ、それにより、細胞剥離性を細胞種によって適切に調節することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、細胞を培養して細胞シートを形成し、これを非浸襲的に回収するのに好適な、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法に関する。本発明の細胞培養基材の製造方法は、温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化する工程、および親水性分子を放射線照射により基材に固定化する工程を含む。
【００１０】
本発明において好適に使用できる親水性分子は、炭素成分を含み、親水性の官能基を含む分子のことを指し、細胞低接着性のものであれば特に制限されない。親水性分子は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を含む水溶性分子であることが好ましい。また、細胞培養に使用する観点から、生体毒性の低いものを採用することが好ましい。親水性分子として、親水性ポリマーを用いることもできる。
【００１１】
細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で、培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。細胞低接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【００１２】
親水性分子の具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、これらと他のモノマーとの共重合体や、グラフト重合体などが挙げられる。中でもポリアルキレングリコールは様々な分子量のものが市販されており、かつ生体適合性に優れているので好適に用いることができる。
【００１３】
ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）は、1つ以上のアルキレングリコール単位（（ＣＨ２）ｎ−Ｏ）からなるアルキレングリコール鎖（ＡＧ鎖）を少なくとも含むが、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキレングリコール鎖は、例えば、次式：
−（（ＣＨ２）ｎ−Ｏ）ｍ−
（ｎはアルキレン鎖の炭素数を表し、ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｎは、同一または異なって、通常１〜１０の整数であり、好ましくは１〜４の整数であり、より好ましくは２〜３の整数である。ｍは、好ましくは１〜１３の整数であり、より好ましくは１〜１０の整数である。ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。ｍが１３以下であるＰＡＧは常温で液体であり、熱を加えて溶解させるなどの製造工程を省くことができるため、好ましい。
【００１４】
ＰＡＧとして、好ましくは、末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されているものを用いる。すべての末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよく、一部の末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよいが、放射線反応性官能基を２以上有することが好ましい。放射線反応性官能基を有するＰＡＧを基材に配置した後、放射線（例えば電子線）を照射することにより、ＰＡＧを基材に共有結合で結合させることができ、親水性分子の強固な固定化が達成できる。放射線反応性官能基は、ＰＡＧ末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＡＧに直接的に連結されていてもよいし、ＰＡＧの末端に結合したリンカーに結合した官能基として、ＰＡＧに間接的に連結されていてもよい。リンカーとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５の、二価の脂肪族炭化水素基、好ましくはアルキレン基が挙げられる。アルキレン基における炭素が、窒素、酸素および硫黄から選択される同一または異なるヘテロ原子で置換された基でもよい。
【００１５】
放射線反応性官能基、例えば電子線反応性官能基は、放射線（例えば電子線）を照射することにより、基材に共有結合で結合することができるものであれば特に制限されない。放射線反応性官能基は、高エネルギー照射下でラジカルを形成することができる部分であり、放射線源にさらされるとフリーラジカルを発生し、架橋およびグラフトを達成する。
【００１６】
放射線反応性官能基は、用いる温度応答性ポリマーにより適宜選択されるが、例えば、アクリロイル基、メタクリロイル基、アジド基、一級、二級または三級の脂肪族基、脂環式基、ベンジル基などの芳香族基などが挙げられる。親水性分子は、これらの放射線反応性官能基を１種類のみ有するものでもよいし、複数種有するものでもよい。放射線反応性官能基として、アクリロイル基またはメタクリロイル基を有する親水性分子を用いることが好ましい。アクリロイル基やメタクリロイル基を有する親水性分子は入手しやすく、また、アジド基の場合とは異なり、蛍光灯など照明の光が入らないように気を配る必要がないため、扱いが容易である。
【００１７】
また、ＰＡＧ末端のヒドロキシル基は、他の物質と共有結合を形成することが可能な官能基が直接的または間接的（リンカーを解して）に導入された状態であってもよい。導入される官能基としては、代表的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＡＧ末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＡＧに直接的に連結されていてもよいし、ＰＡＧの末端に結合したリンカーに結合した官能基として、ＰＡＧに間接的に連結されていてもよい。リンカーについては上記と同様である。
【００１８】
本発明における親水性分子の好ましい例としては、温度応答性ポリマーよりも分子量が小さい親水性分子であって、特に数平均分子量６００以下のポリエチレングリコール、具体的には、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、およびヘキサエチレングリコール、数平均分子量６００以下のポリプロピレングリコール、具体的には、トリプロピレングリコール、テトラプロピレングリコール、ペンタプロピレングリコール、およびヘキサプロピレングリコール、ならびにこれらのモノアクリレート、モノメタクリレート、ジアクリレート、およびジメタクリレートが挙げられる。このような分子量の親水性分子を用いることにより、温度応答性ポリマーが固定化された後において親水性分子が基材と結合し固定化しやすく、また、親水性分子が固定化された後において温度応答性ポリマーが基材と結合し固定化しやすくなるからである。
【００１９】
基材に固定する親水性分子の密度および親水性は、表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、親水性分子固定化後の表面の水接触角が典型的には４８°以下、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下であれば、親水性分子が十分な密度で存在し、親水性を有するとともに細胞の吸着や接着、特に非特異的吸着が抑制されていると考えられる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角をさす。
【００２０】
親水性分子を基材に配置する場合、親水性分子を、好ましくは適当な溶媒に溶解して基材に配置する。親水性分子は、一種類のみを用いてよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。溶媒としては、親水性分子を溶解しうるものであれば特に限定されないが、常圧下に於いて沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、２−ブタノール、ｎ−ブタノール、および水等が挙げられ、それらを１種以上使用してよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン(もしくはジエチレン)グリコールまたはそのモノエチルエーテル、等も１種以上使用してよい。上記溶液にはその他添加剤としてモール塩等を配合してよい。
【００２１】
溶媒に溶解させる親水性分子の量は、好ましくは０．００５重量％以上、より好ましくは０．０１重量％以上であり、好ましくは０．５重量％以下、より好ましくは０．１重量％以下である。上記範囲内であれば、親水性分子の固定化量が多くなりすぎて細胞接着性が不十分になることもなく、適度な細胞接着性を維持することができる。
【００２２】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞シートを細胞培養基材から分離させることで、細胞シートの回収を一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。
【００２３】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。
【００２４】
温度応答性ポリマーの分子量は、特に制限されないが、分子量に応じてグラフト密度を調整することが好ましい。例えば、比較的分子量の小さいポリマーは密に固定化し、比較的分子量の大きいポリマーは疎に固定化することが好ましい。
【００２５】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、例えばモノマーの単独重合体がＴ＝０〜８０℃を有するようなモノマーであって、放射線照射によって重合し得るモノマーが挙げられる。モノマーとしては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ−(もしくはＮ,Ｎ−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体、およびビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはコポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養基材との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞培養基材の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。
【００２６】
温度応答性ポリマーは、上記のようなモノマーを、好ましくは適当な溶媒に溶解して基材上に配置し、放射線照射することにより、基材に固定化することができる。モノマーとともに、前記モノマーが重合してなるオリゴマーまたはプレポリマーを、好ましくは適当な溶媒に溶解して基材上に配置し、放射線照射することにより、温度応答性ポリマーを基材に固定化することもできる。ここでオリゴマーまたはプレポリマーの大きさはダイマー以上のものであれば特に限定されず、分子量約３，３００（典型的には２８分子ポリマー）より大きいものが好ましく、分子量５，７００以上のものがより好ましい。上限は特に限定されないが、ポリマーと区別する観点から、通常は１００万以下である。なお「プレポリマー」という用語は放射線照射前のポリマーを指す。
【００２７】
溶媒に溶解させるモノマーの量は、好ましくは５重量％以上、より好ましくは２０重量％以上であり、好ましくは７０重量％以下、より好ましくは５０重量％以下である。モノマーに加えて、オリゴマーまたはプレポリマーを添加する場合の量は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは１重量％以上であり、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下である。
【００２８】
温度応答性ポリマーを、適当な架橋剤とともに、適当な溶媒に溶解して基材上に配置し、放射線照射することにより、温度応答性ポリマーを、架橋剤を介して基材に固定化することもできる。架橋剤としては、好ましくは放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤を用いる。
【００２９】
架橋剤の具体例としては、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、ならびにエトキシ化グリセリン（メタ）アクリレート、例えば、エトキシ化グリセリンジアクリレート、エトキシ化グリセリントリアクリレート、エトキシ化グリセリンジメタクリレート、およびエトキシ化グリセリントリメタクリレートなどが挙げられる。
【００３０】
温度応答性ポリマーを架橋剤とともに基材に配置する場合、温度応答性ポリマーと架橋剤を、適当な溶媒に溶解することにより混合物を調製して基材に配置してもよいし、温度応答性ポリマーと架橋剤をそれぞれ別々に、適当な溶媒に溶解して基材に配置してもよい。別々に配置する場合は、同時に配置する必要はなく、例えば、架橋剤を基材に配置して乾燥した後に、温度応答性ポリマーを重ねて配置してもよい。
【００３１】
温度応答性ポリマーの固定化に使用する溶媒としては、それぞれ温度応答性ポリマー、モノマー、オリゴマー、プレポリマー、および／または架橋剤を溶解しうるものであれば特に限定されないが、常圧下に於いて沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、２−ブタノール、ｎ−ブタノール、および水等が挙げられ、それらを１種以上使用してよい。中でもｉ−プロパノールが好ましい。i-プロパノールは薄膜に塗布することで室温にて容易に揮発するため、特段の乾燥工程なしに、後述の乾燥によるメリットを得ることができるからである。また、基材として細胞培養に汎用されるポリスチレンを選択した場合においても表面を侵さないため有利である。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン(もしくはジエチレン)グリコールまたはそのモノエチルエーテル、等も１種以上使用してよい。上記溶液にはその他添加剤として、硫酸等で代表される酸類、モール塩等を配合してよい。
【００３２】
基材は、その表面が、放射線反応性官能基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであることが好ましい。表面のみが、放射線照射により放射線反応性官能基と共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、基材表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。
【００３３】
基材を構成する材料であって、それ自体が放射線反応性官能基と共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。
【００３４】
放射線反応性官能基と共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーロイからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーロイからなるものであってもよい。
【００３５】
基材の形状としては、ディッシュ形状、フィルム形状、多孔質形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面に温度応答性ポリマーと親水性分子の層を形成した後、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。また、ディッシュ形状の容器の細胞培養面に、フィルム形状の基材を接着剤などにより貼り付けてもよい。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分が温度応答性ポリマーと親水性分子の層により被覆されればよい。
【００３６】
本発明で用いる基材としては、細胞培養において実績のある、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、多孔質ポリエチレンテレフタレート、多孔質ポリカーボネートが特に適している。
【００３７】
温度応答性ポリマーの固定化のために基材上に形成する、モノマー、オリゴマー、プレポリマー、温度応答性ポリマーおよび／または架橋剤を含む塗膜の塗布量は温度応答性ポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮するのに必要な塗布量であり、５０ｍｇ／ｍ２以上あればよい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、１０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。親水性分子を配置することにより基材上に形成する塗膜の塗布量は親水性分子が機能（例えば剥離性の向上）を発揮するのに必要な塗布量であり、親水性分子の塗布量は、温度応答性ポリマーの固定化量に応じて、細胞接着性を著しく低下させない範囲で適宜選択される。
【００３８】
塗布量が多すぎると、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、ならびに照射エネルギーに由来する膜内の対流により被覆量にムラが生じる場合がある。また、遊離のポリマーや分子を洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は１０ｇ／ｍ２以下が望ましい。
【００３９】
温度応答性ポリマーおよび親水性分子の基材への小面積への塗布方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、グラビアダイレクト法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。
【００４０】
ベタ形成においては、グラビアコート法、ロールコート法、スロットコート法、キスコ−ト法、スプレーコート法、ファウンテンコーティング法等公知のコーティング法を用いて形成することができる。又、絵柄層のパターン形成においては、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法等公知の印刷法を用いることができる。塗布方法として連続のコート法または印刷法を使用することもできる。連続のコート法または印刷法としては、具体的にはホットメルトコート、ホットラッカーコート、グラビアダイレクトコート、グラビアリバースコート、ダイコート、マイクログラビアコート、スライドコート、スリットリバースコート、カーテンコート、ナイフコート、エアコート、ロールコート等の塗布方法が使用できるが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば適用可能なものを使用することができる。
【００４１】
本発明の方法は、温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化する工程、および親水性分子を放射線照射により基材に固定化する固定を含む。放射線照射により、基材表面と温度応答性ポリマーとの結合反応、基材表面と親水性分子との結合反応、および温度応答性ポリマーと親水性分子との結合反応を進行させる。ここでいう結合反応は、放射線照射によって、基材と温度応答性ポリマーの間の共有結合や、親水性分子と温度応答性ポリマーの間の共有結合や、基材と親水性分子の間の共有結合が形成される反応をさす。本発明においては、好ましくは温度応答性ポリマーが固定化される領域と、親水性分子が固定化される領域とが重畳し、重畳した領域が、細胞が培養される領域となる。ここで重畳するとは、温度応答性ポリマーが固定化される領域と、親水性分子が固定化される領域とが、少なくとも一部重なっていることをさす。
【００４２】
本発明の方法においては、温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化した後に、親水性分子を放射線照射により基材に固定化してもよいし、親水性分子を放射線照射により基材に固定化した後に、温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化してもよいが、好ましくは温度応答性ポリマーを放射線照射により基材に固定化した後に、細胞剥離性を調整するために親水性分子を放射線照射により基材に固定化する。先に温度応答性ポリマーを固定化した方が、温度応答性ポリマーに被覆されていない領域、すなわち温度応答性ポリマーの間隙に親水性分子が入り込んで固定化され、細胞剥離性をより向上させることができるため好ましい。基材に固定化された温度応答性ポリマー以外の遊離ポリマーを除去した後、親水性分子を基材に固定することで、温度応答性ポリマーに被覆されていない領域に親水性分子が入り込み易くなり、細胞剥離性をより向上させることができるためさらに好ましい。
【００４３】
使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。γ線と電子線が、エネルギー効率がよいが、特に生産性の面から電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば５０ｋＧｙ〜５００ｋＧｙが好ましく、γ線であれば５ｋＧｙ〜５０ｋＧｙが好ましい。上記は一般的によく用いられる線量範囲であり、線量が低すぎると固定化するためのエネルギーが足りず、高すぎると基材にダメージを与えるおそれがあるため好ましくない。
【００４４】
放射線照射後は、塗膜を乾燥させて溶媒を除去することが好ましい。前記塗布工程で形成される塗膜は残留溶剤量の影響により結晶が形成されることがないため、乾燥前の塗膜に放射線を照射した後、乾燥を行ってもよいし、塗膜を乾燥した後に放射線を照射してもよい。ただし、乾燥前のウェットな状態の塗膜に放射線照射を行うと、環境変化や異物、塗膜厚変動等の影響を受ける可能性があることから、塗膜を乾燥した後に放射線を照射することが好ましい。乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風（温風）乾燥法、（遠）赤外乾燥法などが挙げられる。
【００４５】
上述の工程を経て形成された細胞培養基材には、基材表面上に共有結合により固定化されたポリマー分子だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応の親水性分子等が存在している。そこでこれらの遊離ポリマーや未反応物を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。
【００４６】
洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養基材に応じて適宜選択すればよい。
【００４７】
細胞培養基材表面における温度応答性ポリマーの被覆量は、０．５〜５．０μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、１．０〜４．０μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。被覆量が５．０μｇ／ｃｍ２を超過すると細胞は細胞培養基材表面上に付着せず、逆に被覆量が０．５μｇ／ｃｍ２未満だと培養細胞を基材から剥離回収することが困難となる。親水性分子の被覆量は、温度応答性ポリマーの固定化量に応じて、細胞接着性を著しく低下させない範囲内で適宜選択される。
【００４８】
このような温度応答性ポリマーや親水性分子の被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆部もしくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に接触角測定等による表面分析を単独或は併用して求めることができる。
【００４９】
本発明の細胞培養基材を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等から細胞シートを作製することができる。
【００５０】
本発明の細胞培養基材は、細胞剥離性が高いことから、細胞接着性の強い細胞の培養において、特に有利に用いられる。細胞接着性の強い細胞としては、扁平上皮細胞を含む上皮細胞、例えばＡ４３１細胞（ヒト扁平上皮ガン細胞）、平滑筋細胞、例えばラット平滑筋細胞などが挙げられる。
【００５１】
こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。
【００５２】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
（製造例）
試料１
Ｎ−イソプロアクリルアミドを最終濃度４０重量％になるようにイソプロプルアルコール（ｉ−プロパノール）に溶解させて塗工液を作製した。厚さ５０μｍのポリスチレンフィルム（旭化成ケミカルズより入手）にコロナ処理を施して親水化した面に、グラビアダイレクト法により上記塗工液をフィルム上に塗布した（１．４ｇ／ｍ２、搬送速度：５ｍ／ｍｉｎ）。その後４０℃の乾燥フードを２ｍ通過させて乾燥させた後、電子線を照射してＮ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、フィルム表面に温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドを固定化した（２００ｋＶ、１２０ｋＧｙ）。その後、水中に４時間浸漬して余分な分子を洗い流した。
【００５４】
試料２
平均分子量５７５であるポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を最終濃度０．０４重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液を作製した。試料１の表面に、グラビアダイレクト法により上記塗工液を塗布した（１．４ｇ／ｍ２）。電子線を照射してＰＥＧＤＡを試料１の表面に結合させ（２００ｋＶ、１２５ｋＧｙ）、水中に４時間浸漬させて余分な分子を洗い流した。
【００５５】
試料３
親水性分子であるテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）が最終濃度０．２５重量％に、平均分子量５７５であるＰＥＧＤＡを最終濃度０．０４重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液を作製した。試料１の表面に、グラビアダイレクト法により上記途工液を塗布した（１．４ｇ／ｍ２）。電子線を照射してＴＥＧとＰＥＧＤＡを試料１の表面に結合させ（２００ｋＶ、１２５ｋＧｙ）、水中に４時間浸漬させて余分な分子を洗い流した。
【００５６】
試料４
平均分子量５７５であるＰＥＧＤＡを最終濃度０．０８重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液を作成した。試料１の表面に上記途工液を滴下し、スピンコートした（１，０００ｒｐｍ、１０秒）。電子線を照射してＰＥＧＤＡを表面に結合させ（２００ｋＶ、１２５ｋＧｙ）、水中に４時間浸漬させて余分な分子を洗い流した。
【００５７】
（試験例）
作製した試料１〜４に、ウシ大動脈血管内皮細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。使用培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）であり、培養はＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件にて４８時間行った。その後、培養皿を２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。２０分後、２０℃のインキュベーターから出庫した。試料１では細胞が剥離せず細胞シートが得られなかったが、試料２〜４では細胞シートが剥離できることを確認した。