(57)【要約】【課題】取り扱いよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができる電気泳動用分離媒体を提供する。【解決手段】本発明に係る電気泳動用分離媒体は、アクリルアミドまたは置換基を有するアクリルアミドであるアクリルアミド系モノマーと、架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリルアミドまたは置換基を有するアクリルアミドであるアクリルアミド系モノマーと、
下記の式（１）で表される架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいることを特徴とする電気泳動用分離媒体。
【化１】
2014092450.tif 000006
（Ｒ１は、炭素原子数が３〜６の炭化水素基である）
【請求項２】
上記置換基を有するアクリルアミドは、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびダイアセトンアクリルアミドからなる群より選択される物質であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項３】
上記炭化水素基は、アルカンジイル基、置換基を有するアルカンジイル基、アルケンジイル基、置換基を有するアルケンジイル基、アルキンジイル基、置換基を有するアルキンジイル基、シクロアルカンジイル基、置換基を有するシクロアルカンジイル基、シクロアルケンジイル基、置換基を有するシクロアルケンジイル基、フェニレン基、および、置換基を有するフェニレン基からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項４】
ｐＨ勾配を有することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項５】
上記架橋剤は、ペンタメチレンビスアクリルアミドであることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項６】
上記架橋剤と上記アクリルアミド系モノマーとを含む溶液において、当該架橋剤と当該アクリルアミド系モノマーとを共重合して得られる電気泳動用分離媒体であって、
当該溶液中に含まれる上記架橋剤および上記アクリルアミド系モノマーの合計濃度は、１．５％Ｔ以上、５％Ｔ以下であることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の電気泳動用分離媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質または核酸などの生体高分子を分離する電気泳動用分離媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬におけるバイオマーカー探索または食品における検査手法等として、生体高分子であるタンパク質または核酸などの試料を、分離または検出するさまざまな手法および装置が開発されている。分離手法としては、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィーなどがあるが、簡易さおよび分離能の高さからゲル電気泳動が広く利用されている。
【０００３】
ゲル電気泳動には、一方向にのみサンプルを分離する電気泳動および二方向へサンプルを分離する二次元電気泳動がある。二次元電気泳動は、一般にタンパク質を分析する場合に用いられている。
【０００４】
二次元電気泳動は、例えば、一次元目は等電点電気泳動（ＩＥＦ；ｉｓｏｅｌｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）により、個々の電荷に応じてタンパク質を分離する。このとき、例えば、ｐＨ勾配を有するゲルストリップ（Ｉｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔゲル：以下ＩＰＧゲル）を用いて、等電点電気泳動を行う。二次元目はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により、個々の分子量に応じてタンパク質を分離する。
【０００５】
二次元電気泳動法は、分解能が非常に高く、数千種類以上に及ぶタンパク質を高分解能にて分離することができる点において、他の分析手法に比べて大変優れている。そのため、二次元電気泳動法は、プロテオーム解析のための手法として広く用いられている。
【０００６】
また、二次元電気泳動に用いるゲルについて様々な研究がなされている。例えば、非特許文献１には、ゲルを重合するときのゲル溶液に対するアクリルアミドモノマーおよび架橋剤の割合（以下、パーセンテージとして「％Ｔ」と記載する）を調節することによって、ポリアクリルアミドゲルのポアサイズ（細孔サイズ）を制御することが記載されている。
【０００７】
さらに、特許文献１には、ナイロン等のマルチフィラメントを有する２％Ｔの糸ゲルは、その形状を維持した状態で二次元目のゲルに接続できることが記載されている。
【０００８】
なお、特許文献２には、主鎖としてアクリルアミドではなく、ＮＡＴ（Ｎ−アクリロイル−トリスアミノメタン）を含むポリマーを電気泳動用のゲルに使用することが記載されている。
【０００９】
特許文献３には、アクリルアミド誘導体、ヘキサメチレンビスアクリルアミドなどを共重合することによって得られたゲル、および、当該ゲルをイオン交換カラムクロマトグラフィに用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−８４０４７号公報（２００５年３月３１日公開）
【特許文献２】特開平１−５０３６２９号公報（１９８９年１２月７日公開）
【特許文献３】特開昭５７−３８０６号公報（１９８２年１月９日公開）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Giovanni Candiano, Luca Musante,Maurizio Bruschi, Gan Marco Ghiggeri, Ben Herbert, Francesca Antonucci, Pier Giorgio Righetti, Two-dimensional maps in soft immobilized pH gradient gels:A new approach to the proteome of the third millennium electrophoresis
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、従来技術に係る二次元電気泳動技術では、分子量の高いタンパク質（例えば、数１００ｋＤａ程度）の導入が困難であるという問題がある。
【００１３】
すなわち、一次元目電気泳動にて用いられるゲルのポアサイズが小さい場合、分子量が高いタンパク質をゲル中に導入することは困難である。
【００１４】
非特許文献１に記載のように、％Ｔを調節することによって、ポリアクリルアミドゲルのポアサイズを制御し、分子量の高いタンパク質をゲル中に導入することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲルの％Ｔを通常市販されている４％Ｔから３．３％Ｔまで低くすることによって、ゲルのポアサイズを大きくし、４％Ｔでは見えていなかった分子量の高いスポットを確認することに成功している。しかし、３％Ｔまで低くすると、ポリアクリルアミドゲルは柔らかく、当該ゲルの形状を保持することが困難になる。そのため、一次元目電気泳動後、二次元目のゲルに接続するときの取り扱いが難しいという問題が顕著になる。よって、非特許文献１の技術は、実用化には至っていない。
【００１５】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、取り扱いがよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができる電気泳動用分離媒体を提供することを主たる目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る電気泳動用分離媒体は、上記課題を解決するために、アクリルアミドまたは置換基を有するアクリルアミドであるアクリルアミド系モノマーと、下記の式（１）で表される架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいることを特徴としている。
【００１７】
【化１】
2014092450.tif 000002
【００１８】
（Ｒ１は、炭素原子数が３〜６の炭化水素基である）
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る電気泳動用分離媒体は、取り扱いがよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例にて二次元電気泳動を行ったときのサンプルの分布を示す図である。
【図２】比較例にて二次元電気泳動を行ったときのサンプルの分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００２２】
［第１実施形態］
〔電気泳動用分離媒体〕
本実施形態に係る電気泳動用分離媒体は、アクリルアミドまたは置換基を有するアクリルアミドであるアクリルアミド系モノマーと、下記の式（１）で表される架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいる。
【００２３】
【化２】
2014092450.tif 000003
【００２４】
（Ｒ１は、炭素原子数が３〜６の炭化水素基である）
電気泳動用分離媒体とは、サンプルが導入可能であり、当該サンプルを電気泳動して分離するための媒体として働くものである。
【００２５】
サンプルとしては、電気泳動によって分離または分析すべき物質であればよく、例えば、タンパク質、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｅｉｃ  ａｃｉｄ；デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；リボ酢酸）などの生体高分子が挙げられる。
【００２６】
本発明に係る電気泳動用分離媒体は、取り扱いがよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができるが、そのことについて、当該電気泳動用分離媒体の各構成に基づき以下に説明する。
【００２７】
（アクリルアミド系モノマー）
アクリルアミド系モノマーとしては、アクリルアミド、または置換基を有するアクリルアミドが挙げられる。本明細書において、「置換基を有するアクリルアミド」とは、炭素または窒素に結合している水素が他の官能基（例えば、アルキル基、ケトン基）に置換されているものをいう。
【００２８】
置換基を有するアクリルアミドとしては、これらに限定されないが、例えば、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたはダイアセトンアクリルアミドなどが挙げられる。上記の置換基を有するアクリルアミドと下記の架橋剤とを共重合させることにより、電気泳動用分離媒体を好適に作製することができる。
【００２９】
（架橋剤）
本実施形態にて用いる架橋剤は、下記の式（Ｉ）にて表される。
【００３０】
【化３】
2014092450.tif 000004
【００３１】
（Ｒ１は、炭素原子数が３〜６の炭化水素基である）。
【００３２】
ここで、従来技術に係る架橋剤としては、ビスアクリルアミド（ｂｉｓＡＡ）、ピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）、ヂアリルテトラジアミド（ＤＡＴＤ）、ビスアクリロイルシスタミン（ＢＡＣ）が用いられている。しかし、これらの従来技術に係る架橋剤は主鎖構造が短いため、当該架橋剤を用いて作製した分離媒体のポアサイズが小さくなる。したがって、サンプルが分子量の高いタンパク質である場合に、当該架橋剤を用いて作製した分離媒体に当該サンプルを導入することは困難である。％Ｔを調節することによって、分離媒体のポアサイズを制御し、分子量の高いタンパク質を当該分離媒体中に導入することができる。しかし、％Ｔを低くすると、分離媒体は柔らかく、当該分離媒体の形状を保持することが困難になる。
【００３３】
一方、長鎖構造を有する架橋剤を用いて電気泳動用分離媒体を形成した場合、従来の分離媒体と比較してポアサイズが大きくなる。そのため、サンプルとして分子量の高いタンパク質を、電気泳動用分離媒体に導入することができる。ポアサイズが大きいため、電気泳動用分離媒体内に導入可能なサンプル質量が増加し、また、一次元目の等電点電気泳動のサンプル分離時間を短縮することができる。さらに、上記電気泳動用分離媒体は、％Ｔを低くせずに、ポアサイズを大きくすることができる。よって、当該電気泳動用分離媒体の形状を保持することが容易であり、当該電気泳動用分離媒体は取り扱いがよい。なお、本実施形態において、％Ｔとは、アクリルアミド系モノマーと架橋剤とを含む溶液において、アクリルアミド系モノマーおよび架橋剤の合計濃度のことをいう。
【００３４】
上記式（Ｉ）にて表される架橋剤のＲ１は、二価の炭化水素であればよいが、電気泳動用分離媒体の強度を高くするために、三重結合、ベンゼン環等の環状構造を有しているか、または、アクリルアミド系モノマーからなる主鎖に対して複数点で架橋する構造を有していることがより好ましい。これら架橋剤を用いて電気泳動用分離媒体を形成した場合、当該電気泳動用分離媒体に強度をもたせることができる。そのため、％Ｔを低くして電気泳動用分離媒体のポアサイズを大きくしてもその形状を保持することができ、％Ｔが３％以下であっても電気泳動用分離媒体の形状を保持することが容易である。このように、当該架橋剤を用いて形成される電気泳動用分離媒体では、その形状を保持することができるため、一次元目電気泳動後、二次元目に接続するときの扱いがさらに容易となる。
【００３５】
上記式（Ｉ）にて表される架橋剤を構成するＲ１として、これらに限定されないが、アルカンジイル基、置換基を有するアルカンジイル基、アルケンジイル基、置換基を有するアルケンジイル基、アルキンジイル基、置換基を有するアルキンジイル基、シクロアルカンジイル基、置換基を有するシクロアルカンジイル基、シクロアルケンジイル基、置換基を有するシクロアルケンジイル基、フェニレン基、または、置換基を有するフェニレン基が挙げられる。
【００３６】
本実施形態にて用いる架橋剤としては、式（Ｉ）を満たすものであれば限定されないが、ペンタメチレンビスアクリルアミドが好ましい。架橋剤としてペンタメチレンビスアクリルアミドを用いることにより、従来技術と比較して高分子量のサンプルを容易に導入することができる。
【００３７】
〔電気泳動用分離媒体の製造方法〕
以下に本発明に係る電気泳動用分離媒体の製造方法について説明する。電気泳動用分離媒体は、例えば、アクリルアミドと架橋剤とを含む溶液において、アクリルアミドと、架橋剤とを共重合することにより作製することができる。
【００３８】
アクリルアミドと架橋剤とを含む溶液におけるアクリルアミド系モノマーおよび上記式（Ｉ）にて表される架橋剤の合計濃度は、１．５％Ｔ以上、５％Ｔ以下であることが好ましく、２％Ｔであることがより好ましい。合計濃度が、１．５％Ｔ以上であることにより、電気泳動用分離媒体は、好適にその形状を保持することができる。合計濃度が、５％Ｔ以下であることにより、電気泳動用分離媒体は、分子量の高いタンパク質を好適に分離することができる。
【００３９】
また、アクリルアミド系モノマーおよび上記式（Ｉ）にて表される架橋剤に対する架橋剤の割合（以下、「％Ｃ」と称する。）は、１０％Ｃ以下になるように調製することが好ましい。架橋剤の割合が、１０％Ｃ以下であることにより、電気泳動用分離媒体が光散乱により白濁することを防止できる。
【００４０】
アクリルアミド系モノマーと上記式（Ｉ）にて表される架橋剤とを共重合させる前に、他の添加物を加えてもよい。他の添加剤としては、例えば、バッファー、蒸留水、グリセロール、重合開始剤および重合促進剤などが挙げられる。
【００４１】
重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ；Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ）が挙げられ、重合促進剤としては、例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）が挙げられる。
【００４２】
重合開始剤および重合促進剤などの試薬を添加した後、アクリルアミド系モノマーと上記式（Ｉ）にて表される架橋剤とを共重合させてゲル化を進行させるために、窒素雰囲気下において、温度を２０〜５０℃に制御してもよい。これにより、アクリルアミド系モノマーと上記式（Ｉ）にて表される架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいる電気泳動用分離媒体が得られる。
【００４３】
［第２実施形態］
〔ＩＰＧゲル〕
本発明に係る電気泳動用分離媒体として、例えば、ＩＰＧゲルが挙げられる。ＩＰＧゲル（Ｉｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔゲル）とは、個々の電荷に応じてタンパク質を分離する等電点電気泳動（ＩＥＦ；ｉｓｏｅｌｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を行なう際に用いられるｐＨ勾配を有するゲルである。なお、最終的なＩＰＧゲルのｐＨ範囲は、個々の電荷に応じてタンパク質が分離されていることを確認できる範囲であればよく、特に限定されない。
【００４４】
ＩＰＧゲルの表面には、保護フィルムが接着されていてもよい。保護フィルムの材料としては、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
また、ＩＰＧゲルの表面に保護フィルムを接着させた後、当該ゲルをストリップ状に切断してもよい。
【００４６】
本実施形態に係るＩＰＧゲルについても、第１実施形態に係る電気泳動用分離媒体と同様、取り扱いがよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができる。さらに、一次元目の等電点電気泳動のサンプル分離時間を短縮することができる。
【００４７】
〔ＩＰＧゲルの製造方法〕
以下に、本実施形態に係るＩＰＧゲルの製造方法について説明する。なお、説明の便宜上、前記第１実施形態にて説明した事項については、その説明を省略する。
【００４８】
ＩＰＧゲルを作製する場合、予め酸性側溶液および塩基性側溶液として、アクリルアミド系モノマー、上記式（Ｉ）にて表される架橋剤、アクリルアミドバッファー、蒸留水を混ぜ合わせ、酸性側または塩基性側の一方の溶液にグリセロールを混ぜ合わせる。
【００４９】
アクリルアミドバッファーとしては、例えば、ｐＫ（解離定数）が１．０、３．１、３．６、４．６、６．２、６．８５、７．０、７．４、８．５、１０．３、１２．０以上のものを用いることができるが、これらに限定されない。
【００５０】
中性条件で重合を開始することによって、重合効率を向上させることができるため、上記酸性溶液および塩基性溶液を混合したときの溶液のｐＨが７．０になるように、酢酸・水酸化ナトリウム溶液などのバッファーを用いて調整した後、重合開始剤および重合促進剤を加える。但し、本発明はこれに限定されず、ｐＨ未調整で重合を行ってもよい。重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）が挙げられ、重合促進剤としては、例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）が挙げられる。
【００５１】
上記重合開始剤および重合促進剤を添加した後、調製した酸性溶液および塩基性溶液の２液を、混ぜ合わせる割合を連続的に変えながら、ポンプまたは自然落下現象を用いて、ゲルを保持するシートが予め設置されているガラス製の作製治具へ流しこむことが好ましい。２液の混合比を変えながら混合することにより、ｐＨ勾配を有するＩＰＧゲルを作製することができる。
【００５２】
酸性溶液および塩基性溶液の割合を線形または非線形に変えるために、例えば、グラジエントミキサー、スタティックミキサーなどの混合手段が用いられるが、これらに限定されない。
【００５３】
ポンプとしては、ペリスティックポンプまたはピエゾポンプなどの脈流が少ないものを使用することが好ましいが、これらに限定されない。
【００５４】
重合開始剤および重合促進剤などの試薬を添加した後、アクリルアミド系モノマーと上記式（Ｉ）にて表される架橋剤とを共重合させてゲル化を進行させるために、窒素雰囲気下において、温度を２０〜５０℃に制御してもよい。
【００５５】
ゲルが重合された後、作製治具よりシート状のゲルを取り出し、純水で洗浄した後、グリセロール溶液に浸漬させる。浸漬後、ゲルを取り出し１〜２日放置し、ゲルを十分に乾燥させる。ゲルが十分に乾燥したことを確認し、ゲル表面に保護フィルムを接着させた後、ゲルをストリップ状に切断する。そして、低温で保存することによりＩＰＧゲルを作製する。
【００５６】
ｐＨ勾配を有するＩＰＧゲルを作製することにより、等電点電気泳動を好適に実行することができる。但し、本発明はこれに限定されず、例えば、ｐＨ勾配を付与する他の試薬（キャリアアンフォライト等）を別途添加する形態であってもよい。
【００５７】
〔まとめ〕
本発明に係る電気泳動用分離媒体は、アクリルアミドまたは置換基を有するアクリルアミドであるアクリルアミド系モノマーと、下記の式（１）で表される架橋剤とを共重合させた共重合体を含んでいる。
【００５８】
【化４】
2014092450.tif 000005
【００５９】
（Ｒ１は、炭素原子数が３〜６の炭化水素基である）
上記（Ｉ）にて表される架橋剤は、従来架橋剤として用いられている化合物と比較して、長鎖構造を有している。そのため、長鎖構造を有する架橋剤を用いて電気泳動用分離媒体を形成した場合、従来の分離媒体と比較してポアサイズが大きくなる。したがって、サンプルが分子量の高いタンパク質であっても、電気泳動用分離媒体に導入することができる。
【００６０】
ポアサイズが大きいため、電気泳動用分離媒体内に導入可能なサンプル質量が増加し、また、一次元目の等電点電気泳動のサンプル分離時間を短縮することができる。
【００６１】
さらに、上記電気泳動用分離媒体は、％Ｔを調整することなく、ポアサイズを大きくすることができるため、当該分離媒体の形状を保持することが容易であり、取り扱いがよい。
【００６２】
以上により、本発明に係る電気泳動用分離媒体は、取り扱いがよく、分子量の高いタンパク質を効率よく分離することができる。
【００６３】
本発明の一態様に係る電気泳動用分離媒体では、上記置換基を有するアクリルアミドは、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびダイアセトンアクリルアミドからなる群より選択される物質である。
【００６４】
上記の置換基を有するアクリルアミドと上記式（Ｉ）にて表される架橋剤とを共重合することにより、電気泳動用分離媒体を好適に提供することができる。
【００６５】
本発明の一態様に係る電気泳動用分離媒体では、上記炭化水素基は、アルカンジイル基、置換基を有するアルカンジイル基、アルケンジイル基、置換基を有するアルケンジイル基、アルキンジイル基、置換基を有するアルキンジイル基、シクロアルカンジイル基、置換基を有するシクロアルカンジイル基、シクロアルケンジイル基、置換基を有するシクロアルケンジイル基、フェニレン基、および、置換基を有するフェニレン基からなる群より選択されるものである。
【００６６】
上記官能基を有する架橋剤は、％Ｔを小さくして分離媒体のポアサイズを大きくした場合であっても、電気泳動用分離媒体に強度を好適にもたせることができる。そのため、分離媒体のポアサイズを大きくしてもその形状を保持することができる。よって、一次元目電気泳動後、二次元目に接続するときの扱いがさらに容易となる。
【００６７】
本発明の一態様に係る電気泳動用分離媒体は、ｐＨ勾配を有していてもよい。
【００６８】
上記構成の電気泳動用分離媒体を用いることにより、等電点電気泳動を実行することができる。
【００６９】
本発明の一態様に係る電気泳動用分離媒体では、上記架橋剤は、ペンタメチレンビスアクリルアミドであってもよい。
【００７０】
長鎖構造を有する架橋剤であるペンタメチレンビスアクリルアミドとアクリルアミド系モノマーとを共重合させることにより、電気泳動用分離媒体を好適に提供することができる。
【００７１】
本発明の一態様に係る電気泳動用分離媒体は、上記架橋剤と上記アクリルアミド系モノマーとを含む溶液において、当該架橋剤と当該アクリルアミド系モノマーとを共重合して得られるものであって、当該溶液中に含まれる上記架橋剤および上記アクリルアミド系モノマーの合計濃度は、１．５％Ｔ以上、５％Ｔ以下である。
【００７２】
合計濃度が、１．５％Ｔ以上であることにより、電気泳動用分離媒体は、その形状を好適に保持することができる。合計濃度が５％Ｔ以下であることにより、電気泳動用分離媒体は、分子量の高いタンパク質を好適に分離することができる。
【００７３】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７４】
（実施例１：ＩＰＧゲルの作製）
ＩＰＧゲルを作製するにあたって、予め酸性側溶液および塩基性側溶液として、アクリルアミド、架橋剤、アクリルアミドバッファー（Sigma-Aldrich社）、蒸留水を混ぜ合わせ、酸性側または塩基性側の一方の液体にグリセロールを混ぜ合わせた。架橋剤としては、ペンタメチレンビスアクリルアミドを用いた。アクリルアミドにペンタメチレンビスアクリルアミドを、％Ｃ＝２．６％および％Ｔ＝４．０％の条件で混合した。
【００７５】
酸性溶液および塩基性溶液を混合したときの溶液のｐＨが７．０になるように、酢酸・水酸化ナトリウム溶液などのバッファーを用いて調整した後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、および重合促進剤としてテトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を加えた。
【００７６】
上記重合開始剤・重合促進剤を添加した後、調製した酸性溶液・塩基性溶液の２液を、混ぜ合わせる割合を連続的に変えながら、ゲルを保持するシートを予め設置してあるガラス製の作製治具へ流し込んだ。それから、流し込んだ溶液をゲル化させた。
【００７７】
ゲルが重合された後、作製治具よりシート状のゲルを取り出し、純水で１０分間３〜６回振とうさせ洗浄した後、１〜５％のグリセロール溶液に１０分間浸漬させた。浸漬後、ゲルを取り出し１〜２日放置し、ゲルを十分に乾燥させた。ゲルが十分に乾燥したことを確認し、ゲル表面に保護フィルムを接着させた後、ゲルをストリップ状に切断し、−２０℃で保存した。このようにして、ＩＰＧゲルを作製した。
【００７８】
（実施例２：二次元電気泳動）
実施例１にて作製したＩＰＧゲルを用いて、二次元電気泳動の実験を行った。
【００７９】
まず、上記ＩＰＧゲルをタンパク質および尿素、チオ尿素、３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、両性電解質（Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、およびサンプルとして予め蛍光標識を行ったマウス肝臓を混ぜ合わせたサンプルバッファーに浸漬し、８時間〜１６時間放置した。その後、当該ＩＰＧゲルに電場を印加し、一次元目等電点電気泳動を行い、一次元目電気泳動が終了後、ＳＤＳを含む平衡化バッファーにＩＰＧゲルを１０分程度振とうさせ、平衡化終了後ＩＰＧゲルをＰＡＧＥゲルに接続し二次元目の電気泳動を行った。
【００８０】
泳動終了後、スキャナーで確認した結果を図１に示す。それに対し、架橋剤として従来から用いられているビスアクリルアミドを用いて同様の条件で実験を行った結果を図２に示す。図１は、実施例にて二次元電気泳動を行ったときのサンプルの分布を示す図であり、図２は、比較例にて二次元電気泳動を行ったときのサンプルの分布を示す図である。
【００８１】
図１、２において５０ｋＤａを示すラインより高分子側のスポットに関して、ペンタメチレンビスアクリルアミドから形成したＩＰＧゲルを用いた二次元電気泳動では、ビスアクリルアミドから形成したＩＰＧゲルを用いた二次元電気泳動と比較して、スポットの蛍光強度が平均して約１．８６倍高い結果となった。この結果から、ペンタメチレンビスアクリルアミドから形成したＩＰＧゲルは、分子量の高いサンプルをより多く、二次元目のＰＡＧＥゲルに導入できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明に係る電気泳動用分離媒体は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの生体高分子を等電点の違いにより分離させる等電点電気泳動を行うときに利用することができる。
【図１】
2014092450.tif 000007
【図２】
2014092450.tif 000008