(57)【要約】【課題】劣悪な環境、又は、緊急の事態においても、できるだけ簡便又は安価な手段で環境中又は生体由来物質中に含まれる各種の化学物質を迅速に測定することができる手段を提供すること。【解決手段】水系液体から成るそれぞれが独立した少なくとも２つの反応領域、及び、該水性液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から成る境界領域、及び、これら各領域を保持する容器、並びに、反応性物質が表面に固定化されてなる磁性粒子、を含む簡易測定器具であって、該反応領域は該境界領域によって互いに隔てられており、外部の磁場印加手段によって、各反応領域及び各境界領域の独立性並びに該磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して移動させることが可能である、前記簡易測定器具。【選択図】図４
2014077704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水系液体から成るそれぞれが独立した少なくとも２つの反応領域、及び、該水性液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から成る境界領域、及び、これら各領域を保持する容器、並びに、反応性物質が表面に固定化されてなる磁性粒子を含む、被検物質の簡易測定器具であって、該反応領域は該境界領域によって互いに隔てられており、外部の磁場印加手段によって、各反応領域及び各境界領域の独立性並びに該磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して移動させることが可能である、前記簡易測定器具。
【請求項２】
夫々が独立している複数の境界領域を含む、請求項１記載の簡易測定器具。
【請求項３】
反応領域の容量が１０〜１００μｌである、請求項１又は２記載の簡易測定器具。
【請求項４】
磁性粒子に移動方向における、境界領域の距離が２〜２０mmであり、反応領域の距離が１０〜８０mmである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
【請求項５】
容器が直径１．５〜２．４mm、長さ７５〜１２５mmの円筒形のキャピラリーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
【請求項６】
少なくとも２つの反応領域が互いに異なる組成を有する水系液体から成る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
【請求項７】
磁性粒子に固定される反応性物質が、抗体、受容体、抗原又はリガンドから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の簡易測定器具。    
【請求項８】
磁性粒子が１０〜２００μｇの範囲で含まれている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の簡易測定器具。    
【請求項９】
容器、反応物質が表面に固定化されてなる磁性粒子、水系液体、ゲル化物質の材料、ゲル化剤、及び、封止手段、請求項１〜８のいずれか一項に記載の簡易測定器具を製造するためのキット。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の簡易測定器具を用いる被検物質の測定方法であって、
（ａ）該簡易測定器具のいずれか一端に位置する反応領域（第一の反応領域）に試料を添加し、反応性物質が表面に固定化されて成る磁性粒子が含まれている該一端に位置する反応領域において最初（第一）の反応処理工程を実施し、
（ｂ）外部の磁場印加手段を用いて該磁性粒子を境界領域を通過させて隣接する（第二の）反応領域まで移動させ、該隣接する反応領域で次の（第二の）反応処理工程を実施し、
（ｃ）（ｂ）の操作を１回以上実施し、
（ｄ）最後の反応処理工程が終了した後、いずれかの反応領域における反応処理工程の結果を測定する、ことを含む前記測定方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの反応領域で抗原抗体反応を行う請求項１０記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外部の磁場印加手段によって、独立している各反応領域及び各境界領域の独立性並びに磁性粒子の機能を維持したまま、或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して該磁性粒子は移動させることによって、各反応領域において反応処理工程を閉鎖系で実施することが可能であるような簡易測定器具等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、診断及び検査、健康の促進、保健及び安全対策、並びに、環境保全等の様々な目的のもとに、医療現場又は日常の生活において、様々な環境又は生体から分離取得される各種の試料（検体）中に含まれる各種の化学物質、タンパク質、糖、糖タンパク質及び核酸等の生体由来物質、並びに、微生物、細菌及びウイルス等の様々な生物を定量的又は定性的に測定する必要がある。
【０００３】
特に、例えば、電力等のエネルギー供給、物的施設・設備、人的パワー又は資源等が不十分であるような劣悪な環境、又は、例えば、伝染病又はバイオテロ等の発生が疑われるような緊急の事態においては、できるだけ簡便又は安価な手段方法で迅速に上記の測定を行うことが求められる。
【０００４】
一方、特許文献１には、液滴操作マイクロデバイス及び該デバイス内での磁性体粒子を含む水系液体から成る液滴の操作方法に関する発明が開示されている。該文献には、この操作方法では、磁性体粒子と共に液滴を搬送するものであり、核酸抽出、精製及び遺伝子増幅に用いられる旨記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２３２２６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、特に、上記のような劣悪な環境、又は、緊急の事態においても所望の目的を達するために、簡便又は安価な手段方法で迅速に上記の各種測定を行うことが出来る簡易測定器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意、研究の結果、以下の各態様に示されるような、簡易測定器具等を開発し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、より具体的には以下の態様を提供するものである。
［態様１］
水系液体から成るそれぞれが独立した少なくとも２つの反応領域、及び、該水性液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から成る境界領域、及び、これら各領域を保持する容器、並びに、反応性物質が表面に固定化されて成る磁性粒子を含む、被検物質の簡易測定器具であって、該反応領域は該境界領域によって互いに隔てられており、外部の磁場印加手段によって、各反応領域及び各境界領域の独立性並びに該磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して移動させることが可能である、前記簡易測定器具。
［態様２］
夫々が独立している複数の境界領域を含む、態様１記載の簡易測定器具。
［態様３］
反応領域の容量が１０〜１００μｌである、態様１又は２記載の簡易測定器具。
［態様４］
磁性粒子に移動方向における、境界領域の距離が２〜２０mmであり、反応領域の距離が１０〜８０mmである、態様１〜３のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
［態様５］
容器が直径１．５〜２．４mm、長さ７５〜１２５mmの円筒形のキャピラリーである、態様１〜４のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
［態様６］
少なくとも２つの反応領域が互いに異なる組成を有する水系液体から成る、態様１〜５のいずれか一項に記載の簡易測定器具。
［態様７］
磁性粒子に固定される反応性物質が、抗体、受容体、抗原又はリガンドから選択される、態様１〜６のいずれか一項に記載の簡易測定器具。    
［態様８］
磁性粒子が１０〜２００μｇの範囲で含まれている、態様１〜７のいずれか一項に記載の簡易測定器具。    
［態様９］
容器、反応物質が表面に固定化されてなる磁性粒子、水系液体、ゲル化物質の材料、ゲル化剤、及び、封止手段、態様１〜８のいずれか一項に記載の簡易測定器具を製造するためのキット。
［態様１０］
態様１〜８のいずれか一項に記載の簡易測定器具を用いる被検物質の測定方法であって、
（ａ）該簡易測定器具のいずれか一端に位置する反応領域（第一の反応領域）に試料を添加し、反応性物質が表面に固定化されて成る磁性粒子が含まれている該一端に位置する反応領域において最初（第一）の反応処理工程を実施し、
（ｂ）外部の磁場印加手段を用いて該磁性粒子を境界領域を通過させて隣接する（第二の）反応領域まで移動させ、該隣接する反応領域で次の（第二の）反応処理工程を実施し、
（ｃ）（ｂ）の操作を１回以上実施し（必要に応じて、（ｂ）の操作を繰り返し）、
（ｄ）最後の反応処理工程が終了した後、いずれかの反応領域における反応処理工程の結果を測定する、ことを含む前記測定方法。
［態様１１］
少なくとも一つの反応領域で抗原抗体反応を行う態様１０記載の測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の簡易測定器具は操作が極めて簡単であり、様々な劣悪な環境下においても外部の磁場印加手段を用いることによって、各種の測定を迅速に定量、半定量及び定性的に実施することが可能である。更に、本発明の簡易測定器具を用いて被検物質を測定する際に、外部から試薬及び反応液等を添加したり、又は外部に反応液等を排出又は移動等させずに全ての反応処理工程を閉鎖系（密閉状態）で行うことが可能であるので、病原菌又は病原ウイルス等の危険物質の測定を安全に行うことが出来る。
【００１０】
又、本発明の簡易測定器具は、小型・軽量及び／又は使い捨て型とすること可能であり、その為に、持ち運びが容易であり、更に、特別な測定装置等がなくとも測定できるので、屋外等の現場でも安全かつ容易に使用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の簡易測定器具を模したキャピラリーの写真である。スケール（数字はcm）を下に示す。左から右へ順にcha-seal（Hemato-Seal Tube Sealing compound：白色）、PBST溶液（PBST、0.02% Tween 20含有リン酸緩衝食塩水：薄青色）、ゲル（茶色）、PBST溶液（薄青色）である。尚、溶液とゲルに色素を入れ、可視化している。
【図２】ビーズに固定化するAP（アルカリフォスファターゼ） conjugate Goat anti-mouse IgG量的変化の確認の結果を示す。
【図３】AP （アルカリフォスファターゼ）conjugate Goat anti-mouse IgG固定化ビーズのゲル通過による影響の確認の結果を示す。
【図４】本発明の簡易測定器具の一具体例であるキャピラリーの写真である。スケール（数字はcm）を下に示す。左から右へ順に封止手段であるcha-seal （Hemato-Seal Tube Sealing compound：白色）、PBST溶液（透明で中間に赤帯が印されている領域、黒いのはビーズ：反応領域１）、ゲル（透明：境界領域１）、PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate)溶液（反応後で黄色に発色し、中間に黒線が印されている領域：反応領域２）、ゲル（透明で中間に赤帯が印されている：境界領域２）、PBST溶液（透明な領域：反応領域３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、水系液体から成るそれぞれが独立した少なくとも２つの反応領域、及び、該水性液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から成る境界領域、及び、これら各領域を保持する容器、並びに、反応性物質が表面に固定化されてなる磁性粒子、を含む簡易測定器具であって、該反応領域は該境界領域によって互いに隔てられており、外部の磁場印加手段によって、各反応領域及び各境界領域の独立性並びに該磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から境界領域を介して隣接する別の反応領域へ該境界領域を通過して移動させることが可能である、前記簡易測定器具に係る。
【００１３】
反応領域及び境界領域：
本発明の簡易測定器具は、水系液体から成る少なくとも２つの反応領域及び、該水系液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から成る境界領域を含んでおり、各反応領域は該境界領域によって互いに隔てられている。従って、最も簡単な簡易測定器具の場合には、［反応領域１］−［境界領域１］−［反応領域２］の順に各領域が含まれている。更に、簡易測定器具が夫々が独立している複数の境界領域を含む場合には、例えば、［反応領域１］−［境界領域１］−［反応領域２］−［境界領域２］−［反応領域３］のような構成を有する。かかる構成を有する本発明の簡易測定器具のイメージを図４に示す。尚、後述するように、測定に際して、容器のいずれか一端に位置する反応領域（第一の反応領域）を構成する水系液体の少なくとも一部と試料を外部で予め混合させ、これを第一の反応領域に添加することもあるので、このような場合には、本発明の簡易測定器具の該第一の反応領域には、これを構成する水系液体の一部しか含まれていない場合もある。
【００１４】
各反応領域の容量は、本発明の簡易測定器具を用いて実施される各反応処理工程の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来、互いに異なっていても良い。経済性及び操作性等を考慮すると、例えば、１０〜１００μｌの範囲とすることが可能である。
【００１５】
又、各境界領域の厚み（磁性粒子の移動方向における距離）は、外部の磁場印加手段によって、磁性粒子が隣接する一方の反応領域から反対側に隣接する別の反応領域へ該境界領域を通過して移動する際に、該境界領域の独立性が維持される（境界領域の構造が保持される）限り、特に制限はない。水系液体及びゲル状物質の種類、並びに、操作性等を考慮して、例えば、２〜２０mmの厚みとすることが可能であり、互いに異なっていても良い。
【００１６】
上記の各領域は適当な容器内に保持されており、それぞれが独立性を有している。その結果、本発明の簡易測定器具各反応領域での反応処理工程は閉鎖系で実施することが可能となる。
【００１７】
容器：
外部の磁場印加手段によって、各反応領域及び各境界領域を保持又は画し、更に、これら領域の独立性並びに磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して移動させることが可能である限り、容器の大きさ、形状及び材質に特に制約はない。
【００１８】
このような容器の材質としては、水系液体からなる反応領域の所望の反応後の吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化等の測定を行う場合に、光学的な検出等ができるようにするために光透過性を有するものであることが好ましい。
【００１９】
更に、外部の磁場印加手段によって磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へそれらを隔てる境界領域を通過して移動させるために、容器の内面は平滑面であることが好ましく、例えば、表面粗さが、Ｒａ＝０．１μｍ以下であることが好ましい。
【００２０】
以上の条件、並びに、耐熱性、液滴移動時に求められる撥水性、接着性、加工性及び安価性等を考慮すると、容器の材質としては、強度、操作性、経済性等を考慮すると、例えば、ガラス、並びに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、及びテフロン（登録商標）等の樹脂類が好適である。
【００２１】
更に、容器の形状としては、細長い円筒形のキャピラリー、又は、各反応領域及び各境界領域が形成される流路を内部に有する平板型のチップ等が好適である。このようなキャピラリーは、例えば、直径１．５〜２．４mm、長さ７５〜１２５mmとし、マイクロデバイス又はマイクロチップとして使用することが出来る。又、例えば、ガラス製のキャピラリーの場合に、ガラスの厚みは、通常、０．３〜０．７mm程度である。従って、このような細長い円筒形のキャピラリーを使用する場合には、通常、水系液体から成る各反応領域の厚み（磁性粒子の移動方向における距離）は１０〜８０mmである。
【００２２】
尚、容器の両端の少なくとも一方は当業者に公知の任意の適当な封止手段によって塞がれている。このような封止手段は、例えば、特別材料を使用せずに、単に、容器自身の一端を封鎖したものでも良い。更に、試料又はそれを含む水系液体を添加する、容器のいずれか一端に位置する第一の反応領域も封止手段で塞ぐ場合には、これに用いる封止手段は開閉（取り外し）自在である必要がある。このような封止手段としては、例えば、適当な材料（例えば、樹脂製）から成る詰物を用いて、これを適宜開口部に詰めたり、はずしたりすることができる。或いは、試料又はそれを含む水系液体を添加する第一の反応領域の側の容器の端は、本発明の簡易測定器具を用いて被検物質を測定する際に封止手段によって特に塞がれていなくとも良い。
【００２３】
水系液体：
水系液体は、反応領域における様々な反応の場を提供するものであり、該反応の単なる媒体として機能する他に、該反応に関与するか若しくはその成分である各種の化合物を成分として含むことが出来る。例えば、磁性粒子表面に固定化されている反応性物質と反応する物質、この反応によって磁性粒子表面に結合された物質と更に反応する物質、当業者に公知の各種の緩衝剤、界面活性剤、塩類、及びその他の各種補助剤、反応試薬、蛍光物質、並びに、アルコール等の有機溶剤等を例示することができる。又、該水系液体は、水、水溶液及び水懸濁液等の任意の態様で提供され得る。
【００２４】
該水系液体の種類及び組成（pH、成分濃度等）は、本発明の簡易測定器具を使用する環境及び目的等、並びに、本発明の簡易測定器具を用いて実施される各反応処理工程の種類等に応じて、当業者が適宜選択することが出来る。又、各反応領域を構成する水系液体の種類及び組成は互いに同じであっても異なっていてもよい。
【００２５】
ゲル状物質：
本発明の簡易測定器具において、２つの反応領域を互いに隔てている境界領域は、水性液体に不溶性又は難溶性であるゲル状物質から構成される。即ち、ゲル状物質とは、水系液体から成る反応領域における反応処理工程の実施時であるか否かを問わずに、水系液体に化学的な影響を及ぼさない化学的に不活性な物質を意味する。本発明におけるゲル状物質は、容器への充填前においてゾル状態であることが好ましい。通常、非水溶性又は水難溶性である液体物質にゲル化剤を添加して容器へ充填した後に、ゲル−ゾル転移点以下に温度を下げることによって、容易にゲル化させることが出来る。
【００２６】
こうして調製されたゲル状物質から成る境界領域は、各反応領域及び各境界領域の独立性並びに該磁性粒子の機能を維持したまま、実質的に該磁性粒子のみを或る反応領域から別の反応領域へ該境界領域を通過して移動させることが可能であるような物性を有している必要がある。例えば、動的粘弾性のうち貯蔵粘弾性Ｅ’が好ましくは常温（２０℃±１５℃）下で１０〜１００ｋＰａ、より好ましくは２０〜５０ｋＰａである。
【００２７】
従って、非水溶性又は水難溶性である液体物質としては、２５℃における水に対する溶解度が概ね１００ｐｐｍ以下であり、常温（２０℃±１５℃）において液体状であるような油性物質、例えば、当業者に公知の各種の液体油脂、エステル油、炭化水素油、及びシリコーン油からなる群から１種又は２種以上が組み合わされて用いられうる。
【００２８】
例えば、液体油脂としては各種植物油等、炭化水素油としては、ミネラルオイル及び流動パラフィン等、更に、シリコーン油としては、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンその他のフェニル基含有シリコーン油、メチルハイドロジェンポリシロキサン等が挙げられる。
【００２９】
ゲル化剤としては、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、及びグリセリン脂肪酸エステル等からなる群から選ばれる当業者に公知の任意の油ゲル化剤が１種又は２種以上組み合わされて用いられうる。
【００３０】
ヒドロキシ脂肪酸としては、例えば、ヒドロキシステアリン酸（１２−ヒドロキシステアリン酸、和光純薬社製）、ジヒドロキシステアリン酸、リシノレイン酸が好ましい。
【００３１】
デキストリン脂肪酸エステルとしては、例えば、ミリスチン酸デキストリン（商品名「レオパールＭＫＬ」、千葉製粉株式会社製）、パルミチン酸デキストリン（商品名「レオパールＫＬ」、「レオパールＴＬ」、いずれも千葉製粉株式会社製）、（パルミチン酸／２−エチルヘキサン酸)デキストリン（商品名「レオパールＴＴ」、千葉製粉株式会社製）等が挙げられる。
【００３２】
又、グリセリン脂肪酸エステルとしては、ベヘン酸グリセリル、オクタステアリン酸グリセリル、エイコ酸グリセリル等が挙げられ、これらを１種以上組み合わせて使用してもよい。具体的には、２０％ベヘン酸グリセリル、２０％オクタステアリン酸グリセリル及び６０％硬化パーム油を含む商品名「ＴＡＩＳＥＴ ２６」（太陽化学株式会社製）、５０％ベヘン酸グリセリル及び５０％オクタステアリン酸グリセリルを含む商品名「ＴＡＩＳＥＴ ５０」（太陽化学株式会社製）等を挙げることができる。
【００３３】
非水溶性又は難水溶性である液体物質中に添加されるゲル化剤の含有量は、種類等に応じて当業者が適宜決めることが出来、例えば、該液体物質の全重量の０．１〜０．５重量％、０．５〜２重量％、或いは１〜５重量％とすることができる。
【００３４】
ゲル化は当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、非水溶性又は難水溶性である液体物質を加熱し、加熱された当該液体物質にゲル化剤を添加し、ゲル化剤を完全に溶解させた後、冷却することができる。加熱温度としては、用いる液体物質及びゲル化剤の物性を考慮して適宜決定すればよい。例えば、６０〜８０℃程度とすることが好ましい場合がある。ゲル化剤の溶解は、穏やかに混和しながら行うと良い。冷却はゆっくり行うことが好ましい。上記ゲル化の方法の好ましい態様が適用される一態様として、例えば上述のＴＡＩＳＥＴ ２６（太陽化学株式会社製）を用いる態様が挙げられる。
【００３５】
尚、ゾル−ゲル転移点は、オイルの種類、ゲル化剤の種類、及びゲル化剤の添加量等の条件によって変動しうる。従って、当該各条件は、所望のゾル−ゲル転移点を達成できるよう、当業者によって適宜選択される。ゾル−ゲル転移点は、例えば、４０〜５０℃となるように設定することができる。
【００３６】
磁性粒子：
このような磁性粒子は、磁気に応答する粒子であれば特に限定されず、例えば、マグネタイト、γ−酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト等の磁性体を有する粒子が挙げられる。磁性粒子の表面は、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の親水性基により被覆されていることが好ましい。
【００３７】
表面に親水性基を有する磁性粒子の大きさとしては、平均粒径が０．１μｍ〜５００μｍ程度でありうる。平均粒径が小さいと、磁性粒子は液滴中に分散した状態で存在しやすくなり好ましくない。
【００３８】
本発明で用いる磁性粒子はその表面に反応性物質が固定化されており、外部の磁場印加手段によって実質的に該磁性粒子のみが各反応領域に移動し、そこで様々な反応処理工程に供せられる。尚、本発明で使用する磁性粒子の量は、測定対象となる被検物質及び各反応領域における反応処理工程の種類、各反応領域の容量等の各種条件にもよるが、例えば、測定器具が、上記に示したような、各反応領域の容量を有する細長い円筒形のキャピラリーである場合には、通常、１０〜２００μｇの範囲が好適である。  
【００３９】
即ち、磁性粒子の表面には、抗体（例えば、標識抗体）、受容体、抗原及びリガンド等の当業者に公知の適当な化学構造を有する反応性物質が、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ、等の当業者に公知の任意の結合手段を介して、又は、直接に、共有結合、静電気力、ファンデルワールス力等により固定化されている。測定対象となる被検物質は反応処理工程等によって該反応性物と直接又は間接的に結合し、最終的には磁性粒子の表面に選択的に吸着又は固定させることができる。
【００４０】
尚、磁性粒子は、予め本発明の簡易測定器具のいずれか一端に位置する反応領域に予め含まれていても良いし、簡易測定器具本体とは別に、単独に又は該反応領域に添加される水系液体に含有される形態で独立していても良い。又、本発明の簡易測定器具を作製するためのキットとして提供される場合には、容器やその他の材料とともに、該キットに含めることが出来る。
【００４１】
反応処理工程
本発明の測定方法は、
（ａ）該簡易測定器具のいずれか一端に位置する反応領域（第一の反応領域）に試料を添加し、反応性物質が表面に固定化されて成る磁性粒子が含まれている該一端に位置する反応領域において最初（第一）の反応処理工程を実施し、
（ｂ）外部の磁場印加手段を用いて該磁性粒子を境界領域を通過させて隣接する（第二の）反応領域まで移動させ、該隣接する反応領域で次の（第二の）反応処理工程を実施し、
（ｃ）（ｂ）の操作を１回以上実施し（必要に応じて、（ｂ）の操作を繰り返し）、
（ｄ）最後の反応処理工程が終了した後、いずれかの反応領域における反応処理工程の結果を測定する、ことを含む。即ち、［反応領域１］−［境界領域１］−［反応領域２］−［境界領域２］−［反応領域３］のような構成を有する本発明の簡易測定器具を使用する場合には、（ｂ）の操作が２回実施され、［反応領域１］又は［反応領域３］における最後の反応処理工程が終了した後に、反応様式及び種類等に応じて、いずれかの反応領域における反応処理工程の結果を測定する。
【００４２】
尚、試料は第一の反応領域を構成する水系液体の少なくとも一部（反応性物質が表面に固定化されてなる磁性粒子が含まれていても良い）と外部で前処理した後に該第一の反応領域に添加するか、又は、該磁性粒子を含む第一の反応領域に直接添加することができる。又、各反応領域における反応時間及び磁性粒子の保持時間及び移動速度等は各反応の種類、簡易測定器具を用いる環境（温度、湿度等）等に応じて当業者が適宜設定することができる。又、例えば、本発明の簡易測定器具をローテーター等の適当な装置に装着し、各反応領域内において磁性粒子を適当な時間水系液体中に拡散させて反応処理工程を行なうことも出来る。
【００４３】
各反応領域で実施される反応としては、当業者に公知の任意の各種反応、例えば、結合反応、分解反応、発色反応、呈色反応、酸化還元反応等の化学反応、並びに、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質の合成系、触媒系、代謝系及び抗原抗体反応のような免疫系生化学反応等を挙げることができる。更に、化合物の化学的変化を伴わない処理工程として、例えば、前記反応に先立って行われる前処理、分取（分離）処理、溶解処理、混合処理、希釈処理、撹拌処理、洗浄処理、及び、温度調節（加熱及び冷却）処理等の各種の処理を挙げることができる。尚、少なくとも２つの反応領域で実施される反応処理工程は、同種のものでも、又は、互いに異なるものでも構わない。
【００４４】
従って、本発明の簡易測定器具を用いることによって、一連の工程からなる従来公知の任意の測定方法（アッセイ系）全てを閉鎖系で連続的に実施することが可能となる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を実施する場合には、外部の磁場印加手段によって、実質的に磁性粒子のみを独立している各反応領域を隔てる境界領域を通過させて、順次各反応領域に移動させることによって、例えば、第一の反応領域で磁性粒子表面に固体化されている第一次抗体と試料中の被検抗原（被検物質）との間の抗原反応を行わせ、第二の反応領域で洗浄処理し、第三の反応領域で酵素標識第二次抗体と被検抗原との抗原反応を行わせ、更に、第四の反応領域で再度洗浄処理し、最後に第五の反応領域において磁性粒子表面に固体化された第二次抗体に結合している酵素と該反応領域の水系液体に含まれる発色物質との間で発色反応を一定時間行わせ、更に、必要に応じて、第六の反応領域に磁性粒子を移動させて最後の反応処理工程（例えば、混合）を行った後に、第五の反応領域における反応結果を定量的に測定することが可能となる。この結果、従来の方法では、発色試薬では一定時間で発色を止めるために水酸化ナトリウム等の反応停止試薬を新たに加える必要があるが、この本発明の簡易測定器具を使用する反応系では磁性粒子を移動することで反応を止めるので、閉鎖系において簡便に反応結果がえることが可能である。
【００４５】
外部の磁場印加手段としては当業者に公知の任意の手段を使用することが出来る。例えば、所謂、携帯可能な磁石、又は、適当な磁場発生装置等を上げることができる。磁場印加手段によって本発明の簡易測定器具内で磁性粒子を移動させるには、例えば、携帯可能な磁石を手動等によって動かすか、又は、本発明の簡易測定器具を上記の磁場発生装置内で移動させる等の適当な方法で実施することができる。但し、既に記載したように、外部の磁場印加手段によって、磁性粒子が隣接する一方の反応領域から反対側に隣接する別の反応領域へ該境界領域を通過して移動させる際には、該境界領域の独立性が維持される（境界領域の構造が保持される）必要がある。
【００４６】
尚、試料としては、様々な環境中又は生体内から適当な方法で分離取得され、或いは生体に由来し、目的に応じて、適宜、処理又は加工された、被検物質を含む可能性のある任意の物質（組成物）である。
【００４７】
本発明の簡易測定器具を使用した測定方法の最後の反応処理工程が終了した後、いずれかの反応領域における反応処理工程の結果を、例えば、分光光度計のような当業者に公知の任意の適当な外部の定装置又は手段を用いて測定することによって、試料に含まれている被検物質を定性的、半定量的、又は定量的に測定することができる。定性的反応の場合には、目視による測定も可能である。
【００４８】
本発明は、以上の簡易測定器具を作製するためのキットにもかかる。該キットは、容器、反応物質が表面に固定化されてなる磁性粒子、当該キットに含まれる容器や水系液体、ゲル化物質の材料、ゲル化剤、及び、封止手段、並びに、適宜、磁場印加手段、試料と水系液体との前処理（例えば、混合）用器具等を含む。また、本発明のキットにおいては、当該液体物質とゲル化剤とが既に混合及びゲル化された状態で提供されてもよいし、ゲル化前の当該液体物質とゲル化剤とが別個の要素として提供されても良い。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に則して本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の具体的態様を例示するものであって、本発明の技術的範囲はこれらによって何れ制限されることはない。尚、本明細書において使用されている略記の内容は以下の通りである。
BSA：牛血清アルブミン；
PBS：リン酸緩衝食塩水；
PBST溶液：0.02% Tween 20含有リン酸緩衝食塩水;及び
AP conjugate Goat anti-mouse IgG ：アルカリフォスファターゼ結合ヤギ由来抗マウスIgG抗体
【００５０】
［参考例１］
12-HSAゲル充填キャピラリー作製
12-HSAゲル溶液はシリコンオイルKF-56（信越シリコーン社製）1mlに12-ヒドロキシステアリン酸（和光純薬社製）0.005gを加え80℃でインキュベート（ゲルは用事調整をし、充填するまで80℃でインキュベートし続ける）。リングキャップ管 (200 μl)に5%BSA/ PBS (5%牛血清アルブミン含有リン酸緩衝食塩水)溶液を充填し1時間浸し、その後、溶液を抜き取り蒸留水で洗浄後、窒素でリングキャップ管内を乾燥させた。リングキャップの片方の末端をcha-seal  (Hemato-Seal Tube Sealing compound)で開口部を塞ぎ、もう片方から試薬を充填した。
【００５１】
充填順序はPBST溶液を80μl充填、続いて80℃にインキュベートしてある12-HSA (0.5% w/v)溶液20μl充填、最後にPBST溶液を80μlで充填した。充填は垂直に立てた状態で行い、充填は空気をかまないようにした。ゲルを充填した後は15分間をおいてから、最後のPBST溶液を加えた。このようにして作製したゲル充填キャピラリー（本発明の簡易測定器具）の模式的な図を示す（図１）。溶媒およびゲルは無色で見難いため、色付けした（溶媒が薄青色、ゲルが茶色）。右端はcha-sealで塞ぎ、左端は解放している。
【００５２】
［参考例２］
TAISET26ゲル充填キャピラリー作製
TAISET26ゲル溶液はシリコンオイルKF-56（信越シリコーン社製）1mlにTAISET26 （和光純薬社製）0.012gを加え70℃でインキュベート（ゲルは用事調製をし、充填するまで80℃でインキュベートし続ける）。リングキャップに5%BSA/PBS溶液を充填し1時間浸し、その後、溶液を抜き取り蒸留水で洗浄後、窒素でリングキャップ管内を乾燥させた。リングキャップの片方の末端をcha-sealで開口部を塞ぎもう片方から試薬を充填した。
【００５３】
充填順序はPBST溶液を80μl、続いて70℃にインキュベートしてあるTAISET26 (1.2% w/v)溶液を20μl充填、最後にPBST溶液を80μlで充填した。充填は垂直に立てた状態で行い、充填は空気をかまないようにする。ゲルを充填した後は15分間をおいてから、最後のPBST溶液を加えた。
【００５４】
［比較例１］
PBST充填キャピラリー作製
リングキャップに5%BSA/PBS溶液を充填し1時間浸しておいた。その後溶液を抜き取り蒸留水で洗浄後、窒素でリングキャップ管内を乾燥させた。リングキャップの片方の末端をcha-sealで開口部を塞ぎもう片方からPBST溶液を180μl充填した。充填は垂直に立てた状態で行い、充填は空気をかまないように留意した。
【００５５】
［参考例３］
AP (アルカリファスファターゼ）conjugate Goat anti-mouse IgG固定化ビーズ（磁性粒子）の作製（量的変化の確認用）
プロテインGコーティング磁性ビーズ（DYNAL社製）をボルテックスし懸濁後3μlずつ各チューブに分注し、100μlのPBST溶液を加えボルテックスした後に遠心(1000rpm ,5  秒)、マグネティックスタンド（life technologies社製）にチューブを立て5分静置後磁性ビーズを吸い込まないように留意して溶液を抜き取った。この工程を2回繰り返し行った後、198μlのPBST溶液を加えた。続いて、下記のように（a〜f）10倍希釈で濃度を変えたAP  (アルカリファスファターゼ）conjugate Anti-Mouse IgG (Promega社製) 2μlを各チューブに加えて2秒間混合し、ローテーター上で室温、15分間撹拌した後に遠心(1000rpm、5秒間)し、マグネティックスタンドにチューブを立て磁性体ビーズを捕捉後（5分間）、磁性ビーズを含まないように溶液を抜き取った。このビーズ洗浄プロトコールは以下の参考例で共通なため、以下では磁性ビーズ洗浄作業と呼ぶ。
【００５６】
200μlのPBST溶液を加え、再度磁性ビーズ洗浄作業を行った。
【００５７】
AP conjugate Anti-Mouse IgG希釈濃度（IgG最終濃度）
a) 1000ng/μl  (final conc. 10000pg/μl)
b) 100ng/μl   (final conc. 1000pg/μl)
c) 10ng/μl    (final conc. 100pg/μl)
d) 1ng/μl     (final conc. 10pg/μl)
e) 0.1ng/μl   (final conc. 1pg/μl)
f) 0.01ng/μl   (final conc. 0.1pg/μl)
【００５８】
［参考例４］
ビーズに固定化するAP conjugate Goat anti-mouse IgG量的変化の確認
参考例３で作製した各AP conjugate Goat anti-mouse IgG固定化ビーズに100μl PNPP発色試薬(Thermo社製)を加えボルテックス後、チューブミキサー(TOMY社）上で室温で15分間アルカリフォスファターゼ反応を行った。続いて反応停止剤（2N水酸化ナトリウム水溶液）を50μl加えてよく混合した後、軽く遠心(1000rpm,  5秒) し、マグネティックスタンドにチューブを立て5分静置後反応溶液を50μl抜き取りBioSpec-nano（島津製作所製）で吸光度測定した（波長405nm）。
【００５９】
AP conjugate Goat anti-mouse IgGの定量分析の結果（図２）は、PNPP発色試薬を用いた場合、a, b（1ng/μl以上の反応系）で観測の上限（飽和）値に達しており、e, f（1pg/μl以下の反応系）で観測限界値以下となっていた。これにより、濃度変化が確認できる範囲は1pg/μlから1ng/μlの範囲であることを確認した。この結果より、ゲル通過によるビーズ固定化抗体の影響の実験に用いるAP conjugate Goat anti-mouse IgGの濃度は、濃度変化が定量できる濃度(50pg/μl)で行うことにした。
【００６０】
［参考例５］
AP conjugate Goat anti-mouse IgG固定化ビーズの作製（検討用）
プロテインGコーティングビーズ（DYNAL）をボルテックスし懸濁後3μlずつチューブに分注し、100μlのPBST溶液を加えて混合した後に磁性ビーズ洗浄作業を行った。
【００６１】
この洗浄作業を2回行った後、198μlのPBST(tween20 0.02%)溶液を加え、続いて0.05ng/μlのAP conjugate Anti-Mouse IgG (Promega社製) 2μlを加えた。その後、ローテーター上で室温で１５分間混合した後に、磁性ビーズ洗浄作業を行った。回収された磁性ビーズに、200μlのPBST溶液を加え混合した後、磁性ビーズ洗浄作業を行った。
【００６２】
このビーズ洗浄作業を2回繰り返した後、20μlのPBST溶液を加えた。尚、2回目の洗浄時にゲル先導用の磁気ビーズ（Roche社製）を各チューブに3μl分加えて一緒に洗浄した。
【００６３】
［参考例６］
AP conjugate Goat anti-mouse IgG固定化ビーズのゲル通過による影響の確認
参考例５で作製したGoat anti- mouse IgG AP固定抗体ビーズ溶液を参考例１及び２、並びに比較例１で調製した磁性ビーズを各キャピラリーに全量添加した。
【００６４】
比較例１のキャピラリーはコントロールとして使用した。ビーズ添加後磁石でキャピラリー管内を上下（左右）にビーズを3往復させ、開口部に100μlのPBST溶液が入っているチューブを配置し、そこに、ビーズを排出させた。
【００６５】
参考例１の12-HSAゲル充填キャピラリーも同様に、ビーズ添加後磁石でキャピラリー管内を上下（左右）にビーズを3往復（ゲルの中を6回通過したことになる）させた後、開口部に100μlのPBST溶液が入っているチューブを配置し、そこにビーズを排出させた。
【００６６】
参考例２のTAISET26ゲル充填キャピラリーを用いてビーズアプライ後磁石でキャピラリー管内を上下（左右）にビーズを3往復（ゲルの中を6回通過したことになる）させた後、開口部に100μlのPBST溶液が入っているチューブを配置し、そこにビーズを排出させた。
【００６７】
それぞれの排出されたビーズに磁気ビーズ洗浄作業を行った後、100μl PNPP発色試薬(Thermo社)を加えボルテックス後、チューブミキサー上で室温で15分間参考例４に記載するアルカリフォスファターゼ反応を行った。続いて反応停止剤（2N水酸化ナトリウム水溶液）を50μl加えて、混合後に遠心(1000rpm, 5秒) し、マグネティックスタンドにチューブを立て、5分静置後反応溶液を50μl抜き取りBioSpec nano（島津製作所製）で吸光度測定した（波長405nm）。
【００６８】
以上の３つのサンプル測定した結果、コントロールのキャピラリーを通したビーズの吸光度測定値とゲルを通過させて測定したビーズの値がほぼ同等の数値（参考例１：7.135、参考例２：7.031、比較例１：7.129）を示していることが確認できた（図３）。すなわち、ゲルを通したことよるプロテインGのAP conjugate Goat anti-mouse IgGの保持能力に影響がなく、さらにゲルを通したことよる測定の影響もないことが確認できた。
【実施例１】
【００６９】
キャピラリーの中で反応が完結する系の構築
以上の結果に基づき、本発明の簡易測定器具の一例を以下の通り作製した。即ち、参考例２と同様にBSAブロッキングしたリングキャップ（200μl）の片方の末端をcha-sealで開口部を塞ぎもう片方から試薬を充填した。
【００７０】
充填順序はPBST溶液を80μl［反応領域１］、続いて70℃にインキュベートしてあるTAISET26 (1.2% w/v)溶液を15μl充填［境界領域１］、PNPP発色試薬 40μl充填し［反応領域２］、再度70℃にインキュベートしてあるTAISET26 (1.2% w/v)溶液を15μl充填［境界領域２］、最後にPBST溶液を80μlで充填した［反応領域３］。充填は垂直に立てた状態で行い、充填は空気をかまないようにした。ゲルを充填した後は15分間をおいてから、最後のPBST溶液を加えキャピラリーを作成した。
【００７１】
こうして作製した本発明の簡易測定器具であるキャピラリーに参考例５で作製したGoat anti- mouse IgG AP固定抗体ビーズ溶液を反応領域３に全量アプライした。
【００７２】
キャピラリー内でアプライしたビーズを磁石で集めPBST溶液［反応領域３］から上記のゲル化物質から成る境界領域２を通過させてPNPP発色試薬溶液相［反応領域２］にビーズを移動させ、磁石をいったん外しキャピラリーをローテーターに装着し15分間ビーズが溶液内で拡散するように回転させた後、再度磁石でビーズを集めて上記のゲル化物質から成る境界領域１を通過させて次溶液相のPBST溶液［反応領域１］へ移動させ、最後に、反応領域２におけるPNPP発色試薬溶液が透明から黄色に発色していることを確認し、ビーズにAP conjugate Goat anti-mouse IgGが存在し、反応していることが確認できた（図４）。
【００７３】
従来の発色試薬では一定時間で発色を止めるために水酸化ナトリウム等の反応停止試薬を新たに加える必要があるが、この反応系ではビーズを移動することで反応を止めているので、ビーズを動かすだけで簡便に反応結果が確認できる。目視による確認のため、発色度合いを数値で確認することは難しいが、検出限界以下か以上の有る・無し（濃い・薄い）による判定が可能ということが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の簡易測定器具は小型・軽量及び／又は使い捨て型とすることが可能であり、特別な測定装置等がない環境、例えば、屋外または開発途上国等の現場でも安全かつ容易に各種の測定又は診断等を安全且つ迅速に実施することが出来るので、公衆衛生の向上、環境問題の解決等に大いに役立つことが期待される。
【図２】
2014077704.tif 000003
【図３】
2014077704.tif 000004
【図１】
2014077704.tif 000005
【図４】
2014077704.tif 000006