(57)【要約】【課題】  不妊治療に資するヒト成熟卵子を安定的に得るための新たなヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織の過冷却凍結方法を提供すること。【解決手段】  本発明の凍結方法において、凍結するヒト試料を、好ましくは−５．０℃以下の過冷却状態において、一定時間保持する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気共鳴凍結方法において、凍結するヒト卵母細胞を含むヒト卵巣あるいは卵巣組織を、−５．０℃以下の過冷却状態において、一定時間保持することを特徴とする凍結方法。
【請求項２】
前記試料が、ヒト卵母細胞を含むヒト卵巣組織あるいはヒト卵巣であることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結方法。
【請求項３】
前記試料を、過冷却状態において、２０分以上保持することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の凍結方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、新たなヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織の過冷却凍結方法に関する。
【背景技術】
【０００２】不妊治療で利用するためのヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織の凍結保存方法が世界中で開発されているが、有効性および安全性の点で十分な凍結保存方法はいまだ確立されていない。一方、食品等を冷凍保存する際に食品の鮮度を損なわずに冷凍できる方法が提案されている（特許文献１および特許文献２）。この方法は、磁場内の対象物に対して所定周波数の電磁波を連続的又は間欠的に照射しながら冷却することによって、対象物を過冷却し、その後、通常以下の氷結温度で急速凍結する工程を含んでいる。しかし、特許文献２における「変動磁場下過冷却方法」に基いてなされた対象物がブタ卵巣についての実験では、ブタ卵巣については従来の凍結保存方法に比べて全く効果が認められないことが明らかとなった（Ｎｉｉｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳＣ誌（日本語論文）が、この事は、次のＷｅｂサイトにて２０１０年からすでに公知である（ｈｔｔｐ：／／ｇａｋｕｊｕｔｕ．ｕｍｉｎ．ｊｐ／ＡＣＳＣ／ＡＣＳＣ２０１０＿２＿１．ｈｔｍｌ）、ただし、この論文は２０１２年７月中旬から上記のＷｅｂサイトが閉鎖されるので、２０１２年７月２７日以降においては、その日本語論文が単に英文に翻訳されて次のＷｅｂサイトへ移動・再公開される：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｂｒｏｗｓｅ／ａｃｓｃ／−ｃｈａｒ／ｊａ／）。さらに特許文献２では対象物がヒト細胞・組織・臓器についての凍結保存効果にも言及されてはいるものの、それらの凍結保存効果を支持するデータが全く示されていない。したがって従来の「磁気共鳴凍結方法」及び「変動磁場下過冷却方法」（特許文献２）では、特にヒト細胞・組織・臓器の凍結保存効果が依然として不明なままである。以上の状況を踏まえ、不妊患者への臨床応用に好ましいヒト成熟卵子を安定的に得るための新たなヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織の過冷却凍結方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−３２５０６２号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０１６０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】本発明は、不妊治療に資するヒト成熟卵子を安定的に得るための新たなヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織の過冷却凍結方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】本発明の一実施形態は、凍結する試料（ヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織）を、−５．０℃以下の過冷却状態において、一定時間保持することを特徴とする過冷却装置利用の方法である。前記試料を、４．０℃から−５．０℃に冷却するのに、１分あたり０．５℃以上、好ましくは、１．０℃以上の速度で低下させてもよい。また、この方法において、前記試料を過冷却状態において、２０分以上保持することが好ましい。
【発明の効果】
【０００６】本発明によって、不妊治療の成功率と安全性を飛躍的に向上させうるヒト成熟卵子を安定的に得るための新たなヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織凍結方法を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】  本発明の一実施例において、凍結前のヒト卵巣皮質から得られた卵母細胞、過冷却を用いない凍結−融解方法（本明細書では、Ｃ．Ｔ．と称することがある）にしたがって凍結−融解したヒト卵巣皮質から得られたヒト卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）、市販されている変動磁場下冷却装置（株式会社  アビー、千葉：特許文献１及び特許文献２）を利用するＣ．Ｓ．Ｃ．法によってヒト卵巣皮質から得られたヒト卵母細胞、市販されている変動磁場を用いない過冷却装置（ＭＡＧＩＱＵＯＡＬ、格式会社  創建商事、大阪）を利用するＳ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｏｃｙｔｅｓ（Ｓ．Ｃ．））、Ｓ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞（逆転写酵素無添加）  （ＮｏＲＴ）におけるヒト卵母細胞マーカー遺伝子発現を調べた結果である。
【図２】  本発明の一実施例において、Ｓ．Ｃ．法を用いて得られたヒト卵母細胞をヒト体内で育成後に体外に取り出されたヒト成熟卵子の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．；Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）；Ｍａｒｙ  Ｄａｓｓｏ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）；Ｊ．Ｂ．Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｌ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｋ．Ｍ．Ｙａｍａｄａ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．等の標準的なプロトコール集に記載の方法を修飾あるいは改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載事項を読めば、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは本発明の好ましい実施態様を示すものであり、単に説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、様々な改変や修飾ができることは当業者にとって明らかである。
＝＝本発明におけるＳ．Ｃ．法＝＝
本発明のＳ．Ｃ．法の詳細を以下に説明する。まず、凍結する試料を準備する。試料はヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織とする。チューブに入れたヒト試料を、３０〜６０分程度、適当な溶液に浸し、４．０℃に保存してもよい。溶液は、特に限定されないが、１．５Ｍ  ＤＭＳＯ及び１Ｍスクロースを加えたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培養液が好ましい。この試料を、４．０℃から−５．０℃以下−１０℃以上になるまで冷却する。冷却速度や冷却装置は特に限定しないが、１０．０℃以下／分が好ましく、５．０℃以下／分がより好ましく、２．０℃以下／分がさらに好ましく、１．０℃以下／分が最も好ましい。そして、上述の試料を、過冷却状態のまま、−５．０℃以下で、一定時間保持する。時間は特に限定されないが、最も好ましくは、２０分以上放置する。その後、プログラムフリーザーを用いて試料を冷却し、−１９６．０℃の液体窒素などを用いて試料を保存する。冷却工程は特に限定されないが、所定の温度（例えば、−４０．０℃）までは比較的ゆっくり（例えば、１．０℃以下／分など）冷却し、その後、目的の温度（例えば、−８０．０℃あるいは−１５０．０℃など）まで急速に（例えば、１０．０℃以下／分など）冷却してもよい。なお、本明細書における変動磁場下過冷却装置（株式会社  アビー、千葉：特許文献１及び特許文献２）を利用する方法を用いるケース（Ｃ．Ｓ．Ｃ．法）においては、磁場の周波数や磁場強度は特に限定されないが、磁場の周波数は約２ＫＨｚ程度の周波数とし、磁場強度は０．３ｍＴ程度にする。
＝＝凍結試料の融解＝＝
凍結した試料は、従来から周知された方法によって融解することができるが、プログラムフリーザーや、液体窒素などに保存された試料の入ったチューブを、急速に昇温することにより、融解することが好ましい。例えば、凍結したチューブを２５．０℃から３７．０℃の温水に浸すことによって、中の試料を融解できる。
＝＝本発明の方法によって凍結保存されたヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織におけるヒト卵母細胞＝＝
Ｓ．Ｃ．法によって凍結−融解されたヒト卵巣皮質における卵母細胞は、融解後、Ｃ．Ｓ．Ｃ．法あるいはＣ．Ｔ．法にしたがって凍結−融解されたヒト卵巣皮質から得られたヒト卵母細胞よりも、ヒト卵母細胞マーカー遺伝子レベルでの発現（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１８，ｐ．４１３−４２１，２０１２など）が非常に安定的であり、発現レベルが低下しなかった。一方、上記のヒト卵母細胞マーカー遺伝子発現が低かったり不完全な場合、それらのヒト卵母細胞は、ヒト成熟卵子にまで成長できなかった（本明細書後述の実施例３を参照）。なお、Ｓ．Ｃ．法による凍結−融解後のヒト卵母細胞の形状は、凍結前と比べて変化は無い。以上を踏まえると、本発明の方法（Ｓ．Ｃ．法）によって凍結されたヒト卵巣皮質における卵母細胞は、凍結−融解の影響を受けず、凍結−融解後も形態・遺伝子レベルで正常な状態に保たれていると言える。総じて、人工授精・体外受精などの生殖補助医療において、凍結−融解したヒト卵巣における卵母細胞を用い、ヒト成熟卵子へ成長させた後に受精させた場合、本発明の方法を用いることによって、従来の方法よりも生殖補助医療の成功確率が格段に上がるだけではなく、さらに安全性の高い人工授精・体外受精が可能になると考えられる。
【実施例】
【０００９】（１）ヒト卵巣あるいはヒト卵巣組織における卵母細胞の調製
ヒト卵巣組織は、子宮頸がん患者から、がん治療（化学療法、放射線治療）前に外科的に摘出されたものを用いた。摘出された卵巣を、直ちにＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地に移し、４０個の小片（１ｃｍ四方）に切り刻み、凍結保護培地（１．５Ｍ  ＤＭＳＯ、０．１Ｍ  スクロース、１０％患者血清の添加されたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地）に移して、４．０℃、３０分インキュベートした。次に。各小片を、１．４ｍＬの凍結保護培地に入った２ｍＬバイアル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｖｉａｌ、ＢＤＦａｌｃｏｎ社）に移し、以下のように本発明のＳ．Ｃ．法によって凍結した。まず、バイアルを４．０℃にし、ＭＡＧＩＱＵＯＡＬ（株式会社、創建商事、大阪）内部を−５．０℃まで冷却して、ＭＡＧＩＱＵＯＡＬ内部で上述のヒト試料を２０分間にわたり過冷却状態で−５．０℃で維持した。その後、プログラムフリーザー（Ｐｌａｎｎｅｒ  Ｋｒｙｏ  ３６０−３．３，Ｄｅｐｅｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にヒト試料（ヒト卵巣組織）を移し、１．０℃／分の速度で−４０．０℃まで冷却し、さらに１０．０℃／分の速度で−１４０．０℃まで冷却して、その後は液体窒素中で維持した。融解させるときは、バイアルを２分間室温に放置し、２５．０℃の温水中に２分間浸した。その後、１．０Ｍ凍結保護培地含有培地、凍結保護培地含有培地、凍結保護培地の含有しない培地の順で、遠心−回収を繰りかえしながら、各５分ずつ処理した。一方、コントロール群として、Ｃ．Ｔ．法またはＣ．Ｓ．Ｃ．法を用いた。その際、Ｃ．Ｔ．法としては、バイアルを４．０℃にし、その後、プログラムフリーザー（Ｐｌａｎｎｅｒ  Ｋｒｙｏ  ３６０−３．３，Ｄｅｐｅｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にヒト試料（ヒト卵巣組織）を移し、２．０℃／分の速度で−７．０℃まで冷却して、１０分間維持した。その後、０．３℃／分の速度で−４０℃まで冷却して、さらに、１０．０℃／分の速度で−１４０．０℃まで冷却して、その後は液体窒素中で維持した。一方、変動磁場下過冷却装置（株式会社  アビー、千葉：特許文献１及び特許文献２）を利用するＣ．Ｓ．Ｃ．法においては、バイアルを４．０℃にし、その後、磁場（周波数２ｋＨｚ、強度０．３ｍＴ）の下で、１．０℃／分の速度で−５．０℃まで冷却した。その際、上述のＳ．Ｃ．法のようにヒト試料を２０分間にわたり過冷却状態で維持することを試みた。しかし、その際に過冷却状態がわずかに解消する現象が観察されていた。その後、プログラムフリーザー（Ｐｌａｎｎｅｒ  Ｋｒｙｏ  ３６０−３．３，Ｄｅｐｅｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にヒト試料（ヒト卵巣組織）を移し、１．０℃／分の速度で−４０．０℃まで冷却し、さらに１０．０℃／分の速度で−１４０．０℃まで冷却して、その後は液体窒素中で維持した。なお、これらのヒト卵巣皮質からは、Ｗｈｉｔｅ  ＹＡらの方法を用いてヒト卵母細胞を単離した（Ｗｈｉｔｅ  ＹＡ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１８，ｐ．４１３−４２１，２０１２）。
（２）ＲＴ−ＰＣＲによるヒト卵母細胞マーカー遺伝子の発現レベルの測定
得られたヒト卵母細胞から、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、
2014018198.tif 000002
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲを行った（９４．０℃で３０秒、−６０．０℃で３０秒、−７２．０℃で１分  ３５サイクルの後、７２．０℃で７分）。
以下に、用いたプライマー配列を示す。
ＤＤＸ４：Ｆ：ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧ
Ｒ：ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡ
ＹＢＸ２：Ｆ：ＡＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＴ
Ｒ：ＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧ
ＮＯＢＯＸ：Ｆ：ＡＴＡＡＡＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＣＡＧＡ
Ｒ：ＡＡＧＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＬＨＸ８：Ｆ：ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡ
Ｒ：ＧＧＣＡＣＧＴＡＧＧＣＡＧＡＡＴＡＡＧＣ
ＫＩＴ：Ｆ：ＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣ
Ｒ：ＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＧ
ＧＤＦ９：Ｆ：ＴＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴ
Ｒ：ＡＡＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴ
ＺＰ１：Ｆ：ＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡ
Ｒ：ＣＧＴＴＴＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧ
ＺＰ２：Ｆ：ＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＡＣＴ
Ｒ：ＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧ
ＺＰ３：Ｆ：ＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡ
Ｒ：ＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＴＣＡＴＧＧＴ
β−ａｃｔｉｎ：Ｆ：ＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣ
Ｒ：ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ
なお、ネガティブコントロール（図１ではＮｏＲＴと示す。）として、Ｓ．Ｃ．法によって得られた試料を用いて逆転写酵素だけを入れずにＰＣＲまでの反応を行った。図１は、凍結前のヒト卵巣皮質から得られた卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、Ｃ．Ｔ．法にしたがって凍結−融解されたヒト卵巣皮質から得られたヒト卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）、Ｃ．Ｓ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｏｃｙｔｅｓ（Ｃ．Ｓ．Ｃ．））、今回発明のＳ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｏｃｙｔｅｓ（Ｓ．Ｃ．））、Ｓ．Ｃ．法によってヒト卵巣皮質から得られた卵母細胞（逆転写酵素無添加）（ＮｏＲＴ）におけるヒト卵母細胞マーカー遺伝子の発現を調べた結果である。図１に示すように、全てのヒト卵母細胞マーカー遺伝子において、Ｃ．Ｔ．法やＣ．Ｓ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞より、Ｓ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞では、より高レベルの発現が検出された。しかも、Ｓ．Ｃ．法によって得られたヒト卵母細胞では凍結前のヒト卵巣皮質から得られた卵母細胞と同等レベルの発現が検出された。
（３）凍結−融解したヒト卵母細胞をヒト体内で育成後体外に取り出されたヒト成熟卵子子宮頸がん患者から得られたヒト卵巣皮質を１０％ヒト血清アルブミンを含むＭＥＭ−α培地にて、ｂｐＶ（ｐｉｃ）１００μＭと７４０Ｙ−Ｐ（Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ、１０２８０−１０２８４、２０１０）を用いて４８時間にわたり処理した。その後、子宮頸がん患者の卵管に、そのヒト卵巣皮質から上述の方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．ｖｏｌ、１８，ｐ．４１３−４２１，２０１２など）によって得られたヒト卵母細胞を移植した。さらに、その後、２４週間にわたり患者の体内で、そのヒト卵母細胞を育てることで、ヒト成熟卵子（受精できる状態のヒト卵子）を体外に取りだすことに成功した。その際、凍結−融解に用いる方法として、Ｃ．Ｔ．法、Ｃ．Ｓ．Ｃ．法とＳ．Ｃ法との間で比較すると、Ｃ．Ｔ．法やＣ．Ｓ．Ｃ．法の場合ではヒト卵母細胞が正常なヒト成熟卵子（受精できる状態のヒト卵子）にまで全く成長しなかった（０％）が、Ｓ．Ｃ．法の場合ではヒト卵母細胞が正常なヒト成熟卵子にまで１００％成長した。なお、ヒト成熟卵子のカウント法は「Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ、１０２８０−１０２８４、２０１０」の文献記載の方法に従って行われた。
【図１】
2014018198.tif 000003
【図２】
2014018198.tif 000004