(57)【要約】      （修正有）【課題】ケトミウム・フニコラ（Chaetomium  funicola）を種レベルで迅速かつ正確に検出し、他の種の真菌と識別しうる方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法。（ａ）特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド（ｂ）他の特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項５】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、請求項５記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項７】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項５又は６記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項８】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項７記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌の一種であるケトミウム（Chaetomium）属の菌類は、自然界に広く分布し、食品や飲料の変敗に関与することが知られている。このうち、ケトミウム属菌類の１種であるケトミウム・フニコラは飲食品事故の原因菌として知られている。
飲食品製造において、内容物（飲食品自体）やその原材料だけではなく、製造装置、製造環境、包装容器等に関しても殺菌処理が行われる。内容物やその原材料に関しては加熱殺菌を行うが、製造環境、製造設備、包装容器等に関しては薬剤による殺菌等種々の殺菌法が提案されている。その１つである無菌充填方式は、製造環境、製造設備、包装容器等を過酢酸等を用いて殺菌し、加熱殺菌を行った内容物を充填し製品の商業的無菌性を担保するものである。ここで、ケトミウム・フニコラは、無菌充填方式で用いられる殺菌剤の１種である過酢酸に対し耐性を有することが知られており、過酢酸を用いて滅菌、殺菌を行う飲食品製造においてケトミウム・フニコラは最重要危害菌に位置付けられている。よって、ケトミウム・フニコラの検出が極めて重要である。
【０００３】
ケトミウム・フニコラの検出方法、及び他の種との識別方法は、培養を用いた形態学的な種分類が主となっている。この方法は形態学的な特徴が確認できるまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などによる損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出・識別結果の正確性に問題があった。
このように真菌の検出に長期間を要し、さらには他の種との識別結果の正確性に問題がある形態学的な方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
【０００４】
特許文献１には、ケトミウム・フニコラを含むケトミウム属の菌類のゲノムＤＮＡ中の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅することにより、ケトミウム属の菌類を検出する方法が記載されている。しかし、特許文献１記載の方法はケトミウム属の菌類を属レベルで検出することはできるが、ケトミウム属の菌類のうちケトミウム・フニコラのみを検出することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲食品の無菌充填方式はホットパック充填方式と異なり、包装容器を加熱しないため、包装容器には耐熱性が求められない。したがって、過酢酸や過酸化水素を用いて製造環境、製造設備、包装容器等を殺菌する無菌充填方式を導入することにより、包装容器の肉薄化が可能になり、生産コストの減少や、包装容器運搬に係るコストの低減及びＣＯ2排出量の低下が実現できる。したがって、過酢酸耐性を有し、無菌充填方式における危害菌であるケトミウム・フニコラの迅速かつ正確な検出が、特に飲食品業界において強く望まれている。
さらに、ケトミウム・フニコラを始めとする真菌の過酢酸耐性は、菌種により強さ、すなわち無菌充填方式における危害性が大きく異なる。したがって、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することが重要となる。
【０００７】
本発明は、飲食品業界などにおいて危害菌とされているケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出し、他の種の真菌と識別しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のようにケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法ではケトミウム・フニコラに対する特異性が低く、擬陽性や擬陰性の結果となる可能性が高い点が挙げられる。これは、ケトミウム・フニコラの遺伝子のデータベースが現在のところ脆弱であり、ケトミウム・フニコラの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確に解析されていないために、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることなどが原因であると考えた。
【０００９】
このような課題に鑑み、本発明者等は、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【００１０】
本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００１１】
また、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法は、飲食品の汚染事故の原因菌の１種であるケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出し、他の属の真菌と識別することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ケトミウム属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づいて作成した、ケトミウム属真菌の分子系統樹を示す図である。
【図２】ケトミウム・フニコラ及びケトミウム・インディカム（Chaetomium indicum）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、並びにケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図３】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図６】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの検出を行い、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。
【００１５】
本発明における「ケトミウム・フニコラ」とは、担子菌類の１種で、酸性食品、乳製品、甘味食品からの検出例の報告の多い過酢酸耐性菌類である。
本明細書において、「過酢酸耐性菌類」とは、無菌充填飲食品の事故報告がある菌種又は無菌充填飲食品の事故を起こし得る菌種であり、かつ１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも生残する菌類を指す。具体的には、前記条件下の過酢酸殺菌によっても、食品業界において商業的無菌を担保する殺菌である６Ｄ殺菌（初発菌数を1／1000000に低減する殺菌）を確保することが出来ない菌類を指す。本発明者らは、ケトミウム・フニコラNBRC6555株について、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理によるＤ値（初期の菌数を1／10にするのに必要な滅菌処理単位）を測定したところ、Ｄ値＝０．２Ｄであった。すなわち、ケトミウム・フニコラは、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも、初発菌数が1／1000000まで低減せず、６Ｄに満たなかった。
【００１６】
本明細書において、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
【００１７】
本明細書における「種」とは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列について分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹に基づいて分類した菌種群を意味する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining  method）、最大節約法（Maximum  parsimony）、最尤法（Maximum  likelihood  estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted  Pair  Group  Method  with  Arithmetic  mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１９】
本発明の検出方法は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
発明者等は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中に同一種内では保存性が高いが異なる種間で塩基配列の保存性が低く、種によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてケトミウム・フニコラは種固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
【００２０】
本発明の検出方法は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
前記オリゴヌクレオチド対を使用してケトミウム・フニコラを種レベルで検出し、同定することにより、ケトミウム・フニコラの検出が可能となる。
【００２１】
ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位を図２、及び配列番号３に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、図２は、ケトミウム・フニコラC73株(DDBJ  getentry  検索：http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/top-j.htmlアクセッションナンバーHM365300)及びケトミウム・インディカムC57株（DDBJ  getentry  検索：http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/top-j.htmlアクセッションナンバーHM365273株）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、並びにケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す。また、配列番号３に記載の塩基配列は、ケトミウム・フニコラ  C73株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示す。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_F2ともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_R2ともいう）はそれぞれ、配列番号３に記載の塩基配列のうち１９位〜４３位までの領域及び２８９位〜３１０位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はケトミウム・フニコラが固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればケトミウム・フニコラに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりケトミウム・フニコラを検出することが可能となる。
【００２２】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００２３】
本発明の検出方法に用いる前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出に使用できれば、配列番号１又は２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１又は２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつケトミウム・フニコラの種レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。本発明においては、本発明の方法により検出するケトミウム・フニコラと、ケトミウム・インディカムとを区別するために、ケトミウム・インディカムのβ−チューブリン遺伝子に本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端側でハイブリダイズしないよう、本発明のオリゴヌクレオチドを設計するのが好ましい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２４】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２５】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、ケトミウム・フニコラの遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００２６】
前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、ケトミウム・フニコラを種レベルで検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００２７】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。
【００２８】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでケトミウム・フニコラを種レベルで検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００２９】
本発明の検出方法において、ケトミウム・フニコラを種レベルで検出するために、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００３０】
被検体中のケトミウム・フニコラを種レベルで検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のケトミウム・フニコラを迅速かつ正確に種レベルで検出することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３１】
本発明の検出方法において、ケトミウム・フニコラの検出を行うため、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いケトミウム・フニコラの検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００３２】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、本発明における「ケトミウム・フニコラ」は、分類学上の分類に関わらず、配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号３に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列、又は、配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をβ−チューブリン遺伝子に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をケトミウム・フニコラ検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３３】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９℃以上（好ましくは６１℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
【００３４】
本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にケトミウム・フニコラが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約300bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。
【００３５】
本発明において、前記オリゴヌクレオチド対を用いて被検体のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかに含まれるか否かを確認することで、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・フニコラを種レベルで検出することもできる。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、その一致又は相違に基づいて前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・フニコラの種レベルの検出を行うものである。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をケトミウム・フニコラと同定することができる。このようにして、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００３６】
本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００３７】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、ケトミウム・フニコラの検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００３８】
本発明のケトミウム・フニコラ検出キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のケトミウム・フニコラの検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、ケトミウム・フニコラ検出キット、使用並びに方法を開示する。
【００４０】
＜１＞下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００４１】
＜２＞検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、前記＜１＞項記載の検出方法。
＜３＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞前記ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００４２】
＜５＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
【００４３】
＜６＞前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、前記＜５＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜７＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜５＞又は＜６＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜８＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜７＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【００４４】
＜９＞前記＜５＞〜＜８＞のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ検出キット。
【００４５】
＜１０＞ケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーとしての、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１１＞ケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１２＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーとして使用する方法。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
試験例１  ケトミウム属に属する菌類の分子系統樹の作成
下記の方法により、ケトミウム属に属する菌類各種（ケトミウム・フニコラ、ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）、ケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）、ケトミウム・インディカム、ケトミウム・クリスパタム（Chaetomium crispatum）、ケトミウム・トランカチュラム（Chaetomium truncatulum）、ケトミウム・カリンチアカム（Chaetomium carinthiacum）、ケトミウム・アトロブランネウム（Chaetomium atrobrunneum）及びケトミウム・ムロラム（Chaetomium murorum））のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
【００４８】
ポテトデキストロース寒天培地（PDA培地、Difco社製）を用いて、The  Centraalbureau  voor  Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、及びThe  CABI  Bioscience  Fungal  Reference  Collectionが保管しIMIナンバーにより管理されている株を適温（２５〜３７℃）で２〜５日間暗所培養を行った。
培養後の菌体１白金耳量をPrepman  UltraReagent（商品名、Applied  Biosystems社製）を使用し、マニュアルに準じた操作手順でＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度はNanoDrop（商品名、エル・エム・エス社製）を用いて測定し、ultra  PURE  Distilled  Water（商品名、インビトロジェン社製）を用いて５ｎｇ／μＬとなるように希釈調製した。
各菌種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列をDNA  data  bank  of  Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）のARSA検索、及びBt2aプライマー（5’-aataggtgccgctttctgg-3’：配列番号４）とBt2bプライマー（5’-agttgtcgggacggaagag-3’：配列番号５）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を用いたＰＣＲ（変性温度９５℃１分、アニーリング温度５５℃１分、伸長温度７２℃１分の３５サイクル）で得られたＰＣＲ産物の解析により得た。ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver．1.1（商品名、Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetic  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC  Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
得られた塩基配列をClustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を使用してアライメント解析を行い、ソフトウェアNJPLOTを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
【００４９】
図１に示すように、ケトミウム・フニコラが存在するクレイド（C. indicum  clade）にはケトミウム・フニコラ以外にもケトミウム・インディカムが含まれることが明らかとなった（Asgari  B，Zare  R.，The  genus  Chaetomium  in  Iran，a  phylogenic  study  including  six  new  species.，Mycologia，2011，vol．103(4)，p．863-882参照）。
ケトミウム・フニコラとケトミウム・インディカムとでは子のう胞子の形態に違いは認められないが、頂毛（子のう殻孔口周辺の付属糸）の形態に大きな違いが認められる。具体的には、ケトミウム・フニコラは頂毛が部分的に剛毛もしくは枝分しているのに対してケトミウム・インディカムは頂毛が全て枝分している。さらには、β−チューブリン遺伝子の塩基配列の比較から分子系統的に別種と考えることが妥当である。従って、食品分野では事故事例報告のあるケトミウム・フニコラを選択的に検出することがより好ましい。
【００５０】
試験例２  ケトミウム・フニコラに特異的なβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の解析
上記の方法により決定したケトミウム属真菌各種や、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、ケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列（Cfu_F2：agttgtagccgaaacaaggacgtgt（配列番号１）、Cfu_R2：ttgccggaggcctgaagtaggg（配列番号２））を決定した。
【００５１】
実施例
（１）プライマーの設計
上記で決定したケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_F2プライマー）及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_R2プライマー）を設計し、シグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
【００５２】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちケトミウム・フニコラとその他のケトミウム属菌類、及び飲食品での事故事例で報告されている真菌等としては、表１〜４に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、The  Centraalbureau  voor  Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、千葉県立中央博物館が保管しCBM-FAナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが保管しIAMナンバーにより管理されている株、財団法人発酵研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び国立医薬品食品衛生研究所が保管しNIHSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて各菌の至適温度で７日間培養した。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
【表２】
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【００５５】
【表３】
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【００５６】
【表４】
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【００５７】
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan  ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。
【００５８】
（３）ケトミウム・フニコラの検出
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre  Mix  Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Cfu_F2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びCfu_R2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
【００５９】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic  Acid  sample  loading  buffer  ５×（BIO  RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図３〜６に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図３は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図４は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図５は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図６は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００６０】
その結果、ケトミウム・フニコラのゲノムＤＮＡを含む試料では、約300bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、ケトミウム・フニコラ以外のケトミウム属及び、その他食品の製造環境から広く検出される菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、ケトミウム・フニコラを種レベルで特異的に検出することができる。
【００６１】
上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の存在を確認することができ、ケトミウム・フニコラを種レベルで特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、種レベルでより迅速かつより正確にケトミウム・フニコラを検出することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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