(57)【要約】【課題】アンジオテンシン変換酵素を阻害することにより降圧作用を発揮し、高血圧を効果的、かつ安全に治療、改善、又は予防することが可能な新規ペプチド、並びに、前記新規ペプチドを含む、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、及び飲食品の提供。【解決手段】Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表されるペプチド、並びに、前記ペプチドを含む、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、及び飲食品である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表されることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする抗高血圧剤。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表される新規ペプチド、並びに、前記新規ペプチドを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は世界で最も多い病気で、日本でも約４千万人、即ち、全人口の約３分の１を占めると概算されている。高血圧は自覚症状がなく、脳出血、クモ膜下出血、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、腎硬化症等、種々の深刻な合併症を引き起こすまで放置されてしまうケースが多い。即ち、こうした重篤な合併症の発症を防ぐためには、高血圧に対しては予防医学的な健康管理が求められる。こうしたことから、日常より服用可能な降圧作用を有する機能性食品の開発が推奨されている。
【０００３】
高血圧の発症機序として、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ、「アンギオテンシン」と称することもある）ＩＩによる血管の収縮作用によることが知られている。アンジオテンシンＩＩはアンジオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」と称することがある）により生成される。そのため、前記ＡＣＥの活性を阻害することによりアンジオテンシンＩＩの生成が抑制されて高血圧は改善される。
【０００４】
前記ＡＣＥは、特定のペプチドにより効率よく抑制されることが知られている。最初に経口によるＡＣＥ阻害剤として開発されたカプトプリルもジペプチドからデザインされた薬剤であり、現在でも高血圧症の治療に広く用いられ高い効果を上げている。しかし、医薬品として用いられているＡＣＥ阻害剤は有機合成化合物であり、顕著な効果が認められるのと同時に空咳、血管浮腫などの副作用を持つことが知られている。高血圧症を予防乃至治療するためには、ＡＣＥ阻害作用を有する化合物を長期間服用することが必要となるため、前記化合物としては、ＡＣＥ阻害作用を有しながらも副作用が低いことが重要な要件となる。
【０００５】
これまでに、副作用が少ないと考えられる天然物又はその分解物から得られたペプチドを用いる試みもなされ、ＡＣＥ阻害活性を有する種々のペプチドが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。そのほとんどは、食品素材タンパク質を酵素分解して得られるペプチドである。前記食品素材タンパク質として、例えば米糠、大豆タンパク質を用いて得られたペプチドが提案されている（例えば、特許文献１から１１参照）。その他、前記食品素材タンパク質として、大豆の麹菌発酵物を用いて得られたペプチドが提案されている（例えば、特許文献１２参照）。また、納豆由来のペプチドとしてはほとんど報告がないが、近年、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｐ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、及びＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒの各ペプチドが提案されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
しかしながら、ＡＣＥ阻害作用を有し、長期間服用することができ、高血圧症の治療、改善、又は予防に有用な化合物として、十分に満足できる化合物は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−３３９１６６号公報
【特許文献２】特開平６−９８７９２号公報
【特許文献３】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献４】特開平８−２２５５９３号公報
【特許文献５】特開平８−２６９０８７号公報
【特許文献６】特開２００２−５３５９５号公報
【特許文献７】国際公開第２００２／０５５５４６号
【特許文献８】国際公開第２００４／１０４０２７号
【特許文献９】特開２００５−１３９１５８号公報
【特許文献１０】特開２００６−２６５１３９号公報
【特許文献１１】特開２０１１−３６２４１号公報
【特許文献１２】特開２００９−４０６９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】食品成分のはたらき  朝倉書店（ＩＳＢＮ：４−２５４−４３５２３−１）２００４
【非特許文献２】食品・臨床栄養  ｅ２０１１：１−８、２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような現状に鑑み、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アンジオテンシン変換酵素を阻害することにより降圧作用を発揮し、高血圧を効果的、かつ安全に治療、改善、又は予防することが可能な新規ペプチド、並びに、前記新規ペプチドを含む、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、及び飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、大豆米糠発酵組成物（以下、「ＯＥ−１」と称することがある）がＡＣＥ阻害活性を有することを見出し、前記大豆米糠発酵組成物をカラムクロマトグラフィーにより活性画分を分離することによって、強いＡＣＥ阻害活性を有する画分を得た。前記画分よりペプチドを単離精製し、その構造を決定し、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表される新規ペプチドを同定し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表されることを特徴とするペプチドである。
＜２＞  前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。
＜３＞  前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする抗高血圧剤である。
＜４＞  前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする飲食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、前記目的を達成することができ、アンジオテンシン変換酵素を阻害することにより降圧作用を発揮し、高血圧を効果的、かつ安全に治療、改善、又は予防することが可能な新規ペプチド、並びに、前記新規ペプチドを含む、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、及び飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、試験例１の大豆米糠発酵組成物（以下、「ＯＥ−１」と称することがある）、カプトプリル、又は精製水を高血圧ラットに経口投与したときの血圧の変化について示した図である。
【図２】図２は、試験例１の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製２＞におけるゲル濾過カラムを用いて精製された各成分のピークを示した図である。
【図３】図３は、試験例１の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製３＞におけるＯＤＳカラムを用いて精製された各成分のピークを示した図である。
【図４】図４は、試験例１の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製４＞におけるＲＰ−Ａｍｉｄｅカラム分析による各成分のピークを示した図である。
【図５】図５は、試験例１の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製４＞におけるＲＰ−Ａｍｉｄｅカラムを用いて精製された成分（Ｆ２２４２）の単一ピークを示した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例２の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製５＞におけるＯＤＳカラムを用いて精製された各成分のピークを示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例２の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製５＞において分取した各フラクションのＡＣＥ阻害活性の結果を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、試験例２の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製６＞におけるＴＫＳｇｅｌ  Ａｍｉｄｅカラムを用いて精製された各成分のピークを示した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、試験例２の＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）からのペプチド精製６＞において分取した各フラクションのＡＣＥ阻害活性の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎのいずれかで表されるトリペプチドである。これらの中でも、ＡＣＥ阻害活性に優れる点で、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏが好ましい。
前記ペプチドは、塩であってもよい。
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生理学的に許容されるイオンとの塩が挙げられる。
前記生理学的に許容されるイオンとの塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩など無機塩基との塩、並びに、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩などが挙げられる。
【００１５】
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により合成する方法、大豆米糠発酵組成物から精製する方法などが挙げられる。これらの中でも、効率良くペプチドを生産することができる点で、大豆米糠発酵組成物から精製する方法が好ましい。
【００１６】
前記化学合成により合成する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、Ｆｍｏｃ合成法などが挙げられる。
【００１７】
前記大豆米糠発酵組成物から精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の方法などが挙げられる。
【００１８】
＜大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）の製造＞
前記大豆米糠発酵組成物の製造方法は、発酵工程と、プロテアーゼ処理工程とを少なくとも含み、必要に応じて更に抽出工程、濾過工程などのその他の工程を含む。
前記大豆米糠発酵組成物は、少なくとも大豆蛋白質及び米糠を発酵させてなる発酵物をプロテアーゼで処理してなる組成物を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【００１９】
＜＜発酵工程＞＞
前記発酵工程は、少なくとも大豆蛋白質及び米糠を発酵させて発酵物を得る工程である。
【００２０】
−発酵物−
前記発酵物は、少なくとも大豆蛋白質及び米糠を発酵させた発酵物である。前記発酵物は、必要に応じて更にその他の成分を前記大豆蛋白質及び前記米糠と共に発酵させた発酵物でもよく、その他の成分を前記大豆蛋白質及び前記米糠とは別に発酵させた発酵物を更に含んでいてもよい。
【００２１】
−−大豆蛋白質−−
前記大豆蛋白質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質、脱脂豆乳、脱脂大豆などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記大豆蛋白質としては、適宜調製したものを用いても、市販品を用いてもよく、該市販品としては、例えば、ニューフジプロＳＥ、ニューフジプロ１７００、フジプロＥ（以上、粉末状大豆蛋白質、不二製油株式会社製）、ニューフジニックＰ５０、アペックス６００（以上、粒状大豆蛋白質、不二製油株式会社製）などが挙げられる。
【００２２】
前記大豆蛋白質としては、原料として大豆又はその類縁種を用いた大豆摩砕物の固形画分を用いてもよい。前記大豆摩砕物の固形画分は、例えば、豆腐を製造する過程で副生されるオカラであり、原料となる大豆の種類、製造条件などは特に制限されない。前記固形画分としては、その製造過程において濾過されたままのものでも、それを乾燥したものでもよい。
前記大豆固形画分の組成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乾物における含有量が、粗蛋白質２０質量％〜３０質量％、粗脂肪１０質量％〜１５質量％、可溶無窒素物２５質量％〜３５質量％、粗繊維１０質量％〜２０質量％であることが好ましく、前記固形画分における水分含有量が、７５質量％〜８０質量％であることが好ましい。
【００２３】
−−米糠−−
前記米糠としては、米糠、脱脂米糠、米胚芽、及び脱脂米胚芽の少なくともいずれかを含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、玄米を白米に精米する過程で除去される米の果皮、種皮、糊粉層、胚芽等を含む通常の米糠をそのまま用いることができる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記米糠としては、適宜調製したものを用いても、市販品を用いてもよく、該市販品としては、例えば、オリザジャーム−ＤＬＰ、オリザジャーム−ＤＬＳ、オリザドリム、脱脂コメヌカ（以上、脱脂米糠、オリザ油化株式会社製）、脱脂糠（築野食品工業株式会社製）などが挙げられる。
【００２４】
前記大豆蛋白質と前記米糠との質量比（大豆蛋白質／米糠）としては、特に制限はなく適宜選択することができるが、１／５〜１０／１が好ましく、１／２〜５／１がより好ましい。
【００２５】
−−その他の成分−−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、茶カテキン、アントシアニン、ルチン、ヘスペリジン、ケルセチン、イソフラボン、タンニン、クロロゲン酸、エラグ酸、クルクミン、リグナン、サポニン、食物繊維、ビタミン類などが挙げられる。
【００２６】
前記大豆蛋白質及び前記米糠に対する前記その他の成分の質量比（その他の成分／大豆蛋白質及び米糠）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
前記大豆蛋白質及び前記米糠を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、飲食品用途、菌自体の有する栄養素、発酵香などの観点から、納豆菌、テンペ菌、乳酸菌、及び酵母菌の少なくともいずれかを用いて発酵させることが好ましい。
なお、前記納豆菌、テンペ菌、乳酸菌、及び酵母菌としては、安全性が保証されている限り、自然的に、又は人為的な変異手段により生成し、菌学的性質が変異した変異株も用いることができる。
【００２８】
前記納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ）としては、特に制限はなく、市販されている一般的な納豆菌を用いることができ、例えば、株式会社成瀬醗酵化学研究所から入手することができる。前記納豆菌は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
前記テンペ菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒなどが挙げられる。これらの中でも、発酵の容易さの観点から、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓが好ましい。なお、これらのテンペ菌は、インドネシアからの輸入品として、或いは日本の種麹業者から容易に入手することができる。前記テンペ菌は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラクトバシルス・アシドフィルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ)、ラクトバシルス・ビフィズス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ)、ストレプトコッカス・フェカリス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ)、ラクトバシルス・ブルガリカス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ)、ラクトバシルス・サンフランシスコ(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ)、ラクトバシルス・カゼイ(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ)、ストレプトマイセス・ラクチス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ)などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの乳酸菌は、いずれも公知の菌で、容易に入手することができる。
【００３１】
前記酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属、クルイベロミセス属などが挙げられる。これらの中でも、飲食品用途の観点から、サッカロミセス属の酵母が好ましく、清酒酵母、ビール酵母が特に好ましい。これらの酵母菌は、例えば、財団法人日本醸造協会から入手することができる。前記酵母菌は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
前記菌の接種量としては、菌が増殖し得る限り特に制限はなく、菌の種類に応じて適宜選択できるが、発酵の対象物が液体である場合には、通常１×１０３個／ｍＬ〜１×１０８個／ｍＬであり、発酵の対象物が固体である場合には、通常１×１０３個／ｇ〜１×１０８個／ｇである。前記接種量が、１×１０３個／ｍＬ又は１×１０３個／ｇ未満であると、菌による発酵に時間がかかることがあり、１×１０８個／ｍＬ又は１×１０８個／ｇを超えると、菌の増殖が抑制されて発酵が進まないことがある。
【００３３】
前記発酵の条件、例えば、発酵温度、発酵時間、発酵の形態、ｐＨ、通気条件等も適宜決定されうるが、使用する菌の増殖等の特性に適した条件とすることが好ましい。
【００３４】
前記発酵温度としては、前記菌による発酵が進む限り特に制限はなく、使用する菌の種類に応じて適宜選択することができるが、通常１０℃〜５５℃であり、２０℃〜５０℃が好ましく、２５℃〜４５℃がより好ましい。
【００３５】
前記発酵時間としては、菌が増殖し得る限り特に制限はなく、菌の種類に応じて適宜選択することができるが、通常１時間〜５日間であり、３時間〜３日間が好ましく、６時間〜２日間がより好ましい。
【００３６】
前記発酵の対象としては、固体でもよく、液体でもよく、また、適宜通気を行ってもよい。前記発酵の対象が液体である場合、振とう又は攪拌しながら発酵を行ってもよいし、静置で発酵を行ってもよいが、前記菌の増殖を促進し、発酵を促進させる点で、振とう又は攪拌を行うことが好ましい。
前記振とうの条件としては、特に制限はなく、よく攪拌されていればよい。
【００３７】
前記発酵時のｐＨとしては、菌が増殖し得る限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常４．５〜８．５であり、５．５〜７．５が好ましい。なお、ｐＨの調整には、ｐＨ調整用の塩酸又は水酸化ナトリウムを使用してもよいし、ｐＨ調整用バッファーを使用してもよい。
【００３８】
＜＜プロテアーゼ処理工程＞＞
前記プロテアーゼ処理工程は、前記発酵物をプロテアーゼで処理する工程である。
本明細書においては、前記プロテアーゼによる処理を「プロテアーゼ消化」又は「蛋白質分解」とも呼ぶ。この処理は、前記発酵物に由来する蛋白質又はペプチドの分解を目的としたものである。
【００３９】
−プロテアーゼ−
前記プロテアーゼは、ペプチド結合加水分解酵素の総称であり、蛋白質分解酵素ともいう。
前記プロテアーゼとしては、前記発酵物に含まれる蛋白質又はペプチドを分解することができる限り特に制限はなく、蛋白質分子のペプチド結合を加水分解するプロテイナーゼを用いてもよいし、ペプチド鎖のアミノ末端或いはカルボキシ末端のペプチド結合を加水分解するペプチダーゼを用いてもよい。また、前記プロテアーゼは、至適ｐＨによって、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ性プロテアーゼに分類されるが、これらの中でも、酵素処理効率が高く、高い機能性を持った生成物が得られる点で、中性プロテアーゼが好ましい。
前記プロテアーゼの具体例としては、金属プロテアーゼ（サーモライシン等）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシン等）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤ等）、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、酵素処理効率が高く、高い機能性を持った生成物が得られる点で、セリンプロテアーゼ及びアミノペプチダーゼを含むものが好ましい。
なお、これらのプロテアーゼは、精製されていても、或いは精製されていなくてもよく、また、それらの起源は、微生物由来、植物由来及び動物由来のいずれであってもよい。
【００４０】
前記プロテアーゼとしては、市販品を用いてもよく、該市販品としては、例えば、デナチームＡＰ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来中性プロテアーゼ、ナガセケムテックス株式会社製）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、プロチンＳＤ−ＮＹ１０、プロチンＳＤ−ＰＣ１０Ｆ（以上、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来中性プロテアーゼ、天野エンザイム株式会社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来中性プロテアーゼ、天野エンザイム株式会社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来中性プロテアーゼ、天野エンザイム株式会社製）、パパインＷ−４０（パパイヤラテックス由来中性プロテアーゼ、天野エンザイム株式会社製）、プロメラインＦ（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ Ｍ由来中性プロテアーゼ、天野エンザイム株式会社製）、ＰＴＮ（豚の膵臓由来中性プロテアーゼ、ノボザイムズジャパン株式会社製）、オリエンターゼ９０Ｎ、ヌクレイシン、オリエンターゼ１０ＮＬ（以上、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来中性プロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社製）、オリエンターゼＯＮＳ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来中性プロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社製）などが挙げられる。
【００４１】
前記プロテアーゼ処理における処理条件、例えば、前記発酵物に対するプロテアーゼ量、処理温度、処理時間、ｐＨなどは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
前記発酵物の固形分に対する前記プロテアーゼの質量比（プロテアーゼ／発酵物の固形分）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常１／５００〜１／１０であり、１／２００〜１／２０が好ましい。前記質量比が、１／５００未満であると、蛋白質分解反応（プロテアーゼ消化）が不十分であり、或いは反応に長時間を要することがあり、１／１０を超えると、経済的に好ましくない。
【００４３】
前記処理温度としては、使用するプロテアーゼの至適温度を考慮して決定すべきであるが、通常１５℃〜７０℃であり、４０℃〜６５℃が好ましい。
【００４４】
前記処理時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜決定されるが、反応性及び雑菌混入防止の観点から、通常、１０分間〜２日間であり、３時間〜２４時間が好ましい。
【００４５】
前記プロテアーゼ処理のｐＨとしては、使用するプロテアーゼの至適ｐＨを考慮して決定すべきであり、通常３〜１０である。前記中性プロテアーゼを用いる場合のｐＨとしては、４．５〜８．０が好ましく、５〜７．５がより好ましい。
ｐＨの調整には、ｐＨ調整用の塩酸又は水酸化ナトリウムを使用してもよいし、ｐＨ調整用バッファーを使用してもよい。
【００４６】
前記プロテアーゼ処理においては、前記発酵物の他に、必要に応じてその他の成分を含んでもよい。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱脂米糠、米胚芽、茶カテキンなどが挙げられる。
【００４７】
＜＜その他の工程＞＞
−抽出工程−
前記抽出工程は、前記大豆米糠発酵組成物を熱水及びエタノールのいずれかで抽出する工程である。効率的に活性物質を抽出できる点で、熱水による抽出が好ましい。
抽出の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を用いることができ、例えば、熱水及びエタノールのいずれかを前記大豆米糠発酵組成物に加え、攪拌して抽出後、遠心分離機により固液分離する方法などが挙げられる。前記遠心分離機としては、例えば、デカンター連続式横型遠心分離機、自動バスケット型遠心分離機などが挙げられ、これらは組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
−濾過工程−
前記濾過工程は、前記大豆米糠発酵組成物を濾過する工程である。
前記濾過の方法としては、特に制限はなく、公知の濾過装置を用いることができ、例えば、フィルタープレス、ラインフィルターなどを用いることができる。なお、これらは併用してもよい。
【００４９】
−濃縮工程−
前記濃縮工程は、前記大豆米糠発酵組成物を濃縮する工程である。前記濃縮の方法としては、特に制限はなく、公知の濃縮方法を用いることができる。
【００５０】
＜大豆米糠発酵組成物からの精製＞
前記大豆米糠発酵組成物から本発明のトリペプチドを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種のカラムを用いて精製する方法が挙げられる。
前記カラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲル濾過カラム、ＯＤＳ（オクタデシルシリル）カラム、ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
これらの中でも、ゲル濾過カラムと、ＯＤＳカラムと、ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラム又はＴＫＳｇｅｌ  Ａｍｉｄｅカラムとをこの順で用いて精製することが好ましい。
【００５１】
前記精製で得られたフラクションが本発明のトリペプチドを含んでいることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するか否かを指標として確認することが好ましい。
前記アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例に示すような遊離馬尿酸測定法により測定することができる。
【００５２】
前記精製された物が、本発明のトリペプチドであることを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、Ｎ末端アミノ酸配列解析、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により確認することができる。前記Ｎ末端アミノ酸配列解析に用いる装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−２３Ａ、株式会社島津製作所製）が挙げられる。前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に用いる装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ，＃  ｙｂａ０３７，Ｗａｔｅｒｓ社製）が挙げられる。
【００５３】
＜用途＞
本発明のペプチドは、優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用、及び降圧作用を有し、安全性に優れるので、例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗高血圧剤、飲食品、医薬品として好適に用いることができる。
【００５４】
（アンジオテンシン変換酵素阻害剤）
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤は、本発明のペプチドを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、ＡＣＥ阻害活性に優れる点で、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含むことが好ましい。
【００５５】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルチン、ヘスペリジン、タンニン、リコピン、テアニン、セサミン、ギャバなどが挙げられる。
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状、液体状などが挙げられる。
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、優れたアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、かつ、安全性に優れるため、例えば、医薬品、飲食品として好適に用いることができる。
【００５７】
（抗高血圧剤）
本発明の抗高血圧剤は、本発明のペプチドを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記抗高血圧剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、ＡＣＥ阻害活性に優れる点で、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含むことが好ましい。
【００５８】
前記抗高血圧剤における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤におけるその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記抗高血圧剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
前記抗高血圧剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状、液体状などが挙げられる。
前記抗高血圧剤は、優れた降圧効果を有し、かつ、安全性に優れるため、例えば、医薬品、飲食品として好適に用いることができる。
【００６０】
（飲食品）
本発明の飲食品は、本発明のペプチドを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の飲食品としては、例えば、本発明のペプチドをそのまま、或はペレット、粉末、顆粒などの形態として使用してもよく、食品添加物、調味料、ふりかけとして使用してもよい。また、本発明のペプチドを食材中に含有せしめて使用してもよい。これにより、機能性食品或いは健康食品を得ることができる。
本発明の飲食品における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、飲食品に対して、０．０１質量％〜１質量％が好ましい。
前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、ＡＣＥ阻害活性に優れる点で、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含むことが好ましい。
前記その他の成分としては、飲食品に用いることができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記飲食品における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、試験例、製造例、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの試験例、製造例、実施例に何ら限定されるものではない。
【００６２】
（試験例１：新規ペプチドの探索−１）
＜大豆米糠発酵組成物の製造＞
＜＜工程１：大豆固形画分発酵物の調製＞＞
大豆を水に１７時間浸漬し十分に吸水させ、豆挽機（スーパーマスコロイダー、増幸産業株式会社製）を用いて水とともに大豆を摩砕した。
前記摩砕された大豆の懸濁液（以下、「摩砕大豆懸濁液」と称することがある）をよく撹拌しながら２０分間、１００℃で加熱した。加熱後、絞り器（ＫＭ−１０００、ミナミ産業株式会社製）を用いて摩砕大豆懸濁液から液相を除去し、固相（大豆固形画分）を回収した。このとき、液相の除去は、自然落下によって行った。得られた大豆固形画分１００ｋｇを適度に加温し、十分に攪拌した後に、納豆菌（成瀬醗酵化学研究所から入手）０．６Ｌ（菌数１．０×１０１０個）を均一に添加した。納豆菌接種後の大豆固形画分をステンレス容器若しくはポリエチレン袋に移し、通気性を確保した状態で、４０℃の恒温培養器若しくは恒温室内で１８時間発酵を行った。得られた大豆固形画分発酵物は、使用時まで冷凍保管した。
【００６３】
＜＜工程２：大豆米糠発酵液の調製＞＞
原料として、大豆蛋白質（ニューフジプロＳＥ、不二製油株式会社製）、脱脂米糠及び米胚芽（以上、オリザ油化株式会社製）を用いた。ステンレス製のタンクに水３，０００Ｌを入れ、続いて大豆蛋白質２００ｋｇ、脱脂米糠５０ｋｇ、米胚芽５０ｋｇを投入した。その後、９０℃になるまで加温し、昇温後１時間攪拌した。攪拌終了後、４２℃まで冷却し、得られた大豆米糠液に、前記工程１で用いたものと同じ納豆菌を１Ｌ（菌数１．０×１０１１個）添加した。納豆菌接種後、４２℃で２８時間撹拌し、大豆米糠発酵液を得た。
【００６４】
＜＜工程３：プロテアーゼ処理＞＞
前記工程２で得られた大豆米糠発酵液に、前記工程１で得られた大豆固形画分発酵物２００ｋｇ、脱脂米糠５０ｋｇ、米胚芽５０ｋｇ、及び茶カテキン２６０ｇを投入した。
これを３時間攪拌しながら混合した後、５０℃になるまで加温した。昇温後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来中性プロテアーゼ（デナチームＡＰ、ナガセケムテックス株式会社製）を１０ｋｇ投入し、５０℃で１５時間撹拌してプロテアーゼ消化を行った。
その後、９０℃で１０分間加熱することによりプロテアーゼを失活させ、プロテアーゼ処理物を得た。
【００６５】
＜＜工程４：抽出＞＞
前記工程３で得られたプロテアーゼ処理物を２時間攪拌し、熱水（９０℃）抽出を行った。抽出後、遠心分離機（デカンター連続式横型遠心分離機、タナベウィルテック社製；３，０００ｒｐｍ、３０分間）を用いて固液分離を行った。液相のみを回収し、クエン酸ナトリウムを用いてｐＨを３．８に調整した。ｐＨ調整後、９０℃で１０分間加熱殺菌し、１０℃で１２時間静置させた。
【００６６】
＜＜工程５：濾過＞＞
前記工程４で得られた抽出物をフィルタープレス及び０．５μｍラインフィルターを組み合わせて濾過を行い、澄明な溶液を回収した。得られた澄明液を大豆米糠発酵組成物（ＯＥ−１）とした。
【００６７】
＜大豆米糠発酵組成物の高血圧自然発症ラットへの投与による降圧効果の評価＞
本評価には、１０週齢の雄性ＳＨＲ／Ｈｏｓラットを株式会社星野試験動物飼育所より入手して使用した。前記ラットを、室温２３±１℃、相対湿度５５±１０％、照明時間１２時間／日（８時〜２０時）の条件で、日本クレア社の固形飼料ＣＥ−２を与えて飼育し、飲料水としては水道水を自由に摂取させた。入荷後、１週間の予備飼育を行い、健康状態に異常を認めない動物を試験に用いた。
【００６８】
−血圧の測定−
ラットの収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ、以下「ＳＢＰ」と称する）の測定は、実験動物用ラット・マウス非観血血圧測定装置（Ｓｏｆｔｒｏｎ  ＢＰ−９８Ａ、株式会社ソフトロン製）を用い、ラットを３９℃で保温して、非観血的にｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法にて行った。測定は、各測定点（前記大豆米糠発酵組成物の投与前、並びに投与後１時間、４時間、７時間、及び２４時間）において少なくとも６回ずつ行い、その平均値をＳＢＰとした。
試験に使用するラットは、予備飼育後、ＳＢＰが１８５ｍｍＨｇ以上を示す動物を用いた。各ラットを試験前日より一昼夜絶食させ、試験開始前の血圧及び体重を指標として、動物を１群あたり６匹〜７匹ずつに群分けした。前記大豆米糠発酵組成物は、１回３００ｍｇ／ｋｇの投与量でゾンデによる単回投与を行った。コントロール群には同量の精製水（１０ｍＬ／ｋｇ）を投与した。対照薬群としては、ＡＣＥ阻害剤の１つであるカプトプリルを用い、３０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。
【００６９】
ＳＢＰ値の変動について、投与開始前のＳＢＰ値と投与後各時間におけるＳＢＰ値を図１に示した。図１中、「○」は、コントロール群（対照）を示し、「▲」は、大豆米糠発酵組成物を投与した群（試験物質投与群）を示し、「■」は、対照薬群（カプトプリルを投与した群）を示す。
なお、得られた値は、平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）で表記した。コントロール群と試験物質投与群間におけるＳＢＰ値の統計学的な差の検定は、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定法を用いて行った。検定での有意水準は、５％未満とし、図１中には、＊＊：１％未満として表示した。
【００７０】
図１から、大豆米糠発酵組成物は、投与後１時間より持続的な血圧降下作用を示し、その最大反応(−３６．４ｍｍＨｇの低下)は投与後７時間にみられた。対照薬として用いたカプトプリルは、３０ｍｇ／ｋｇ投与で投与後１時間に最大反応(−３６．４ｍｍＨｇの低下)を示した。
【００７１】
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製１＞
前記大豆米糠発酵組成物５０．０４ｇに、純水１５０．０４ｇを添加し、２５質量％の懸濁液とした。この懸濁液をセパビーズＳＰ８２５（三菱化学株式会社製）  ５００ｍＬを充填し純水で平衡化したオープンカラムに添加し、純水  ２Ｌ、１０容量％エタノール  ３Ｌ、２０容量％エタノール  ２Ｌ、４０容量％エタノール  ２Ｌ、７０容量％エタノール  ２Ｌ、１００容量％エタノール  ２Ｌで順次溶出し、順に、フラクションＦ１〜Ｆ６とした。得られた各フラクションをエバポレーターにて濃縮後、凍結乾燥した。回収量を算出し、乳鉢で粉砕後ガラス製サンプル瓶に入れ、デシケーター内で室温保存した。
【００７２】
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製２＞
前記フラクションＦ２  ２７０ｍｇについて、分取用ＨＰＬＣにてゲル濾過カラムを用いた精製を実施した。以下に条件を記す。
ＬＣシステム  ：  ＰＵ−９８０  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ  ｗｉｔｈ  ＵＶ−９７０  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＵＶ／ＶＩＳ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （日本分光社製）
カラム  ：  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）
アイソクラティック溶出  ：  溶媒  アセトニトリル：水＝１：９（０．１％ＴＦＡ）
注入量  ：  １００μＬ
流量  ：  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長  ：  ２２０ｎｍ
カラム温度  ：  室温
【００７３】
前記ＨＰＬＣ（分取ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを図２に示した。図２において、Ｆ２１からＦ２４は、フラクション名を示す。
得られたフラクションＦ２１〜Ｆ２４について、それぞれの画分ごとにまとめ、エバポレーターにて濃縮後、凍結乾燥した。分取は計２７回実施し、回収量を算出した後、粉砕後、デシケーター内で室温保存した。
【００７４】
得られたフラクションＦ２１〜Ｆ２４、及び前記大豆米糠発酵組成物について、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡプロテインアッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりタンパク質の定量を行った。
また、得られたフラクションＦ２１〜Ｆ２４、及び前記大豆米糠発酵組成物について、以下のようにして、ＡＣＥ阻害活性を測定した。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用の試料は、タンパク質濃度が０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬとなるように純水で調製し、終濃度０．０２ｍｇ／ｍＬにおけるＡＣＥ活性阻害率の測定を実施した。前記Ｆ２３、Ｆ２４についてはタンパク質含量が１００％を超えたため、タンパク質含量を１００％として扱った。結果を表１に記す。
−ＡＣＥ阻害活性の測定−
ＡＣＥ阻害活性の測定は、遊離馬尿酸測定法により行った。
具体的には、基質溶液（終濃度３．５μＭ、Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、ペプチド研究所製）１５０μＬに被験試料５０μＬを添加し、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ  １ｕｎｉｔ、シグマアルドリッチ製）を５０μＬ加え、３７℃で、３０分間反応させた。反応後、１Ｎ塩酸２５０μＬを添加し反応を止めた。前記反応液に酢酸エチル（ナカライテスク株式会社製）１．５ｍＬを加え、遊離馬尿酸を溶媒抽出した。前記抽出物を３，０００ｒｐｍ、１０分間室温で遠心分離を行い、上層の酢酸エチル層１ｍＬをスピッツ管に分取した。真空乾燥機（４０℃）にて蒸発乾固定を行い、純水２．５ｍＬを加え、馬尿酸を再溶解した。前記馬尿酸を再溶解させた溶液の２２８ｎｍの吸光度を分光光度計（ＵＶ−２５００ＰＣ；島津社製）により、測定し、以下の式から、ＡＣＥ活性阻害率を算出した。
ＡＣＥ活性阻害率（％）＝｛１−（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）｝×１００
Ａ：被験試料なし、ＡＣＥありのときの２２８ｎｍの吸光度
Ｂ：被験試料あり、ＡＣＥありのときの２２８ｎｍの吸光度
Ｃ：被験試料なし、ＡＣＥなしのときの２２８ｎｍの吸光度
【００７５】
【表１】
2014141462.tif 000002
【００７６】
表１の結果から、Ｆ２１からＦ２４の４つのフラクションのうち、Ｆ２１とＦ２２のＡＣＥ阻害活性が高く、Ｆ２３は大豆米糠発酵組成物よりも低かった。
【００７７】
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製３＞
前記フラクションＦ２２について、分取用ＨＰＬＣにてＯＤＳカラムを用いた精製を実施した。以下に条件を記す。
ＬＣシステム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム  ：  Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−５  φ４．６×２５０ｍｍ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ社製）
溶媒  ：  Ａ液  ０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ液  ０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエント溶出  ：  Ｂ液  １％（０ｍｉｎ）  →  Ｂ液  ６％（５０ｍｉｎ）  →  洗浄  →  平衡化
注入量  ：  ２μＬ
流量  ：  １ｍＬ／ｍｉｎ
スペクトル  ：  ２１０ｎｍ〜６００ｎｍ
カラム温度  ：  ４０℃
【００７８】
前記ＨＰＬＣ（分取ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを図３に示した。図３において、Ｆ２２１、Ｆ２２４、及びＦ２２５は、フラクション名を示す。
得られたフラクションＦ２２１、Ｆ２２４、及びＦ２２５について、それぞれの画分ごとにまとめ、エバポレーターにて濃縮後、凍結乾燥し、冷凍保存した。なお、分取は、計５５回実施した。
【００７９】
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製４＞
−Ｆ２２４の精製−
前記フラクションＦ２２４について、ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラムにより分析したところ、主要なピークが２本存在することが判明した（図４参照）。
そこで、前記フラクションＦ２２４をＲＰ−Ａｍｉｄｅカラムを用いて更に精製した。試料には、前記Ｆ２２４の凍結乾燥品全量を純水５００μＬに溶解した溶液を用いた。以下に条件を記す。
ＬＣシステム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ＆Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム  ：  Ａｓｃｅｎｔｉｓ  ＲＰ−Ａｍｉｄｅ  φ４．６×７５ｍｍ
溶媒  ：  Ａ液  ０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ液  ０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ
アイソラクティック溶出  ：  Ａ液：Ｂ液＝９７：３
注入量  ：  ５μＬ〜５０μＬ
流量  ：  １ｍＬ／ｍｉｎ
スペクトル  ：  ２１０ｎｍ〜３５０ｎｍ
カラム温度  ：  ４０℃
【００８０】
前記ＨＰＬＣ（分取ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを図４に示した。図４において、Ｆ２２４２及びＦ２２４３は、フラクション名を示す。
得られたフラクションＦ２２４２及びＦ２２４３について、それぞれの画分ごとにまとめ、エバポレーターにて濃縮後、凍結乾燥し、冷凍保存した。なお、分取は、計３３回実施した。
【００８１】
前記Ｆ２２４２について、ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラムにより分析した結果を図５に示した。図５より、前記Ｆ２２４２は、単一なピークであることがわかった。
【００８２】
＜Ｎ末端アミノ酸配列解析＞
前記単離されたフラクションＦ２２４２のアミノ酸配列について、試料を精製水で溶解後、Ｎ末端から５サイクルまでをプロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−２３Ａ、株式会社島津製作所製）で分析した（株式会社東レリサーチセンター）。
前記Ｎ末端アミノ酸配列解析の結果、前記Ｆ２２４２から、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏのペプチドが得られた。
【００８３】
（製造例１：ペプチド合成）
前記Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏの配列からなるペプチドをＦｍｏｃ合成法により、合成した（株式会社東レリサーチセンター）。
【００８４】
（実施例１：合成ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定）
前記製造例１で合成したペプチドのＡＣＥ阻害活性を、上記した遊離馬尿酸測定法により測定した。なお、本実施例では、ＩＣ５０値を算出するために、複数の異なる濃度の被験試料について測定した。
その結果、ＩＣ５０値は２４５．３μｇ／ｍＬ（ＴＦＡ塩として４８４μｍｏｌ／Ｌ）であった。
したがって、本発明のトリペプチドが、ＡＣＥ阻害活性を有することが示された。
【００８５】
（試験例２：新規ペプチドの探索−２）
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製５＞
−Ｆ２２１の精製−
前記試験例１の＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製３＞で得られたフラクションＦ２２１について分析用ＨＰＬＣにてＯＤＳカラムを用いた精製を実施した。試料にはＦ２２１の凍結乾燥品全量を純水５００μＬに溶解した溶液を用いた。以下に条件を記す。
ＬＣシステム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ＆Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム  ：  Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ５  φ４．６×２５０ｍｍ（野村化学社製）
溶媒  ：  Ａ液  ０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ液  ０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエント溶出  ：  Ｂ液１％（０ｍｉｎ）  →  Ｂ液６％（５０ｍｉｎ）  →  洗浄  →  平衡化
注入量  ：  １０μＬ〜２０μＬ
流量  ：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
スペクトル  ：  ２１０ｎｍ〜６００ｎｍ
カラム温度  ：  ４０℃
【００８６】
前記ＨＰＬＣ（分析ＨＰＬＣ）では、Ｆ２２１のフラクションを図６Ａの点線で示したように１分間〜３．５分間の間隔で分取し、Ｆ２２１−１からＦ２２１−１７まで１７分割し、それぞれの画分を凍結乾燥した。前記ＨＰＬＣ（分析ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを図６Ａに示した。図６Ａにおいて、Ｆ２２１−９、Ｆ２２１−１３は、フラクション名を示す。なお、図６Ａは、３０分間までのクロマトグラムである。
【００８７】
−ＡＣＥ阻害活性の測定−
前記各フラクション（Ｆ２２１−１〜Ｆ２２１−１７）の凍結乾燥品を純水５００μＬに溶解し、上記した遊離馬尿酸測定法によりＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を図６Ｂに示す。なお、図６Ｂ中、１〜１７は、それぞれＦ２２１−１〜Ｆ２２１−１７に対応する。
図６Ｂの結果から、フラクションＦ２２１−９、及びＦ２２１−１３に強い活性が認められた。
【００８８】
＜大豆米糠発酵組成物からのペプチド精製６＞
−Ｆ２２１−９の精製−
前記フラクションＦ２２１−９について、ＴＫＳｇｅｌ  Ａｍｉｄｅカラムを用いた精製を実施した。以下に条件を記す。
ＬＣシステム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ＆Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム  ：  ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ８０  φ４．６×２５０ｍｍ（東ソー社製）
溶媒  ：  Ａ液  ０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液  ０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ
グラジエント溶出  ：  Ｂ液  ３％（０ｍｉｎ）  →  ２１％（３０ｍｉｎ）  →  洗浄  →平衡化
注入量  ：  ３０μＬ
流量  ：  １ｍＬ／ｍｉｎ
スペクトル  ：  ２１０ｎｍ〜６００ｎｍ
カラム温度  ：  ４０℃
【００８９】
前記ＴＫＳｇｅｌ  Ａｍｉｄｅカラムを用いた精製では、Ｆ２２１−９のフラクションを図７Ａの点線で示したように１分間〜２分間の間隔で分取し、Ｆ２２１−９−１からＦ２２１−９−１８まで１８分割し、それぞれの画分を合一して濃縮した後、凍結乾燥した。前記ＴＫＳｇｅｌ  Ａｍｉｄｅカラムを用いた精製のクロマトグラムを図７Ａに示した。図７Ａにおいて、Ｆ２２１−９−１５、Ｆ２２１−９−１６、Ｆ２２１−９−１７は、フラクション名を示す。なお、図７Ａは、３０分間までのクロマトグラムである。
【００９０】
−ＡＣＥ阻害活性の測定−
前記各フラクション（Ｆ２２１−９−１〜Ｆ２２１−９−１８）の凍結乾燥品を純水５００μＬに溶解し、上記した遊離馬尿酸測定法によりＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を図７Ｂに示す。なお、図７Ｂ中、１〜１８は、それぞれＦ２２１−９−１〜Ｆ２２１−９−１８に対応する。
図７Ｂの結果から、フラクションＦ２２１−９−１５、Ｆ２２１−９−１６、及びＦ２２１−９−１７に強い活性が認められた。
【００９１】
＜ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるペプチド配列解析＞
ＡＣＥ阻害活性が求められたフラクションのＦ２２１−９−１５、Ｆ２２１−９−１６、及びＦ２２１−９−１７についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、各試料に、０．２％ギ酸含超純水を加えて、２倍希釈したものを以下のＬＣ及びおよびＭＳ条件で測定した。
【００９２】
−ＬＣ条件−
ＬＣシステム  ：  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ，＃  ｙｂａ０３７、Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム  ：  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）
溶媒  ：  Ａ液０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ、Ｂ液０．１％ギ酸／ＣＨ３ＣＮ
グラジエント溶出  ：  Ｂ液０％（０ｍｉｎ）  →  １００％（８ｍｉｎ）→  洗浄  →  平衡化
注入量  ：  ０．１μＬ〜２．０μＬ
流量  ：  ０．２ｍＬ／ｍｉｎ
スペクトル  ：  ２００ｎｍ〜４００ｎｍ
カラム温度  ：  ４０℃
【００９３】
−ＭＳ条件−
イオン化モード  ：  ＥＳＩ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｅ，  ＭＳＥ）
キャピラリー電圧  ：  ２．８ｋＶ
サンプルコーン電圧  ：  １５Ｖ
エクストラクションコーン電圧  ：  ４．０Ｖ
イオン源ヒーター  ：  １２０℃
脱溶媒ガス  ：  ８００Ｌ／ｈｒ（４５０℃）
コーンガス  ：  ５０Ｌ／ｈｒ
スキャン範囲  ：  ｍ／ｚ  ５０−１０００
コリジョンエネルギー  ：  ＭＳＥ  Ｌｏｗ  ｅｎｅｒｇｙ：６ｅＶ，  Ｈｉｇｈ  ｅｎｅｒｇｙ：１５−４５ｅＶ  ｒａｍｐｉｎｇ
スキャン時間  ：  ０．２ｓｅｃ、Ｌｏｃｋ  ｓｐｒａｙ：３．０μＬ／ｍｉｎ、Ｉｎｔｅｒｖａｌ：１０ｓｅｃ
【００９４】
−ペプチド配列解析−
前記分析後、２１５ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるＵＶクロマトグラムにてピークを確認した。検出されたピークについてＰｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅソフトウェアで解析し、ペプチド配列を推定した。なお、解析時に考慮したタンパク質翻訳後の修飾は、トリプトファン及びメチオニンの酸化、アスパラギン及びグルタミンの脱アミド化、Ｎ末グルタミンのピロリドカルボン酸化である。
また、イオンピークの元素組成解析を行い、推定されたペプチド配列の元素組成と比較した。
これらの結果から、前記フラクションＦ２２１−９−１５は、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの可能性が推測され、Ｆ２２１−９−１６は、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙの可能性が推測され、Ｆ２２１−９−１７は、Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ、及びＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎいずれか、並びにＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、及びＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎのいずれかである可能性が推測された。
【００９５】
（製造例２：ペプチド合成）
前記推測された各ペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、又はＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎの配列からなるペプチド）をＦｍｏｃ合成法により、合成した（株式会社東レリサーチセンター）。
【００９６】
＜精製ペプチドと合成ペプチドの比較＞
前記フラクションのＦ２２１−９−１５、Ｆ２２１−９−１６、又はＦ２２１−９−１７から精製されたペプチド（以下、「精製ペプチド」と称することがある）と、上記Ｆｍｏｃ合成法により合成されたペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、又はＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎの配列からなるペプチド；以下、「合成ペプチド」と称することがある）とについて、イオンクロマトグラム及び２８０ｎｍにおけるピークの保持時間及び質量を確認し、一致した場合は精製ペプチドと合成ペプチドは同じアミノ酸配列であると判断した。
その結果、前記Ｆ２２１−９−１５の配列は、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒであり、前記Ｆ２２１−９−１６の配列は、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙであり、前記Ｆ２２１−９−１７の配列は、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎであることが示された。
【００９７】
（実施例２：合成ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定）
前記製造例２で合成した各ペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、及びＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ）のＡＣＥ阻害活性を、上記した遊離馬尿酸測定法により測定した。なお、本実施例では、ＩＣ５０値を算出するために、複数の異なる濃度の被験試料について測定した。
その結果、各合成ペプチドのＩＣ５０値は、以下のとおりであった。
・  Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ  ：  ４７０．１μｇ／ｍＬ（ＴＦＡ塩として１，０７０μｍｏｌ／Ｌ）
・  Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ  ：  ８３９．１μｇ／ｍＬ（ＴＦＡ塩として１，７４７μｍｏｌ／Ｌ）
・  Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ  ：  ８８２．６μｇ／ｍＬ（ＴＦＡ塩として１，７７８μｍｏｌ／Ｌ）
・  Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ  ：  ９３４．８μｇ／ｍＬ（ＴＦＡ塩として１，７３６μｍｏｌ／Ｌ）
したがって、本発明のトリペプチドが、ＡＣＥ阻害活性を有することが示された。
【００９８】
上記試験例、製造例、及び実施例の結果から、本発明のトリペプチドは、アンジオテンシン変換酵素を阻害することができ、高血圧を効果的、かつ安全に治療、改善、又は予防することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明のトリペプチドは、アンジオテンシン変換酵素を阻害し、アンジオテンシンＩＩの生成を抑制することにより、血圧降下作用を示すことから、高血圧の治療、改善、又は予防において有用であり、高血圧症の予防、改善又は治療のための飲食品、医薬品などに好適に用いることができる。また、前記トリペプチドは、大豆米糠発酵組成物より効率よく得ることができ、天然物由来であることから、副作用がなく、安全性に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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