(57)【要約】      （修正有）【課題】グルカゴン様ペプチドの逆相高速液体クロマトグラフィによる精製方法の提供。【解決手段】グルカゴン様ペプチドを、グルカゴン様ペプチド及び少なくとも１の関連する不純物を含む組成から精製するための逆相高速液体クロマトグラフィプロセスであって、溶出に使用される溶媒が約ｐＨ４〜１０の範囲に緩衝化され、前記溶媒がアルコールを約１０〜８０％ｗ／ｗの濃度で含むグルカゴン様ペプチドの精製方法、前記精製方法によって単離されたグルカゴン様ペプチド生成物及び前記グルカゴン様ペプチドを乾燥し薬学的に許容される賦形剤と混合した医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴン様ペプチドを、グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも１の関連する不純物を含む組成から精製するための逆相高速液体クロマトグラフィプロセスである方法であって、溶出に使用される溶媒が、約pH4〜約pH10の範囲にpH緩衝化され、前記溶媒がアルコールを約10％w/w〜約80％w/wの濃度で含む、グルカゴン様ペプチドを精製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記溶媒が、約pH5〜約pH9の範囲にpH緩衝化される方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記溶媒が、前記グルカゴン様ペプチドの等電点よりも高いpHでpH緩衝化される方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、pHの可動域が、当該溶出工程の間中、設定値から+/-1.0pH単位よりも大きくなるのを防ぐようにpH緩衝化された溶媒である方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、pHの可動域が、当該溶出工程の間中、設定値から+/-0.5pH単位よりも大きくなるのを防ぐようにpH緩衝かされた溶媒である方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールがエタノールである方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールが2-プロパノールである方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールがメタノール、1-プロパノールおよびヘキシレングリコールからなる群より選択される方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか1項に記載の方法であって、前記逆相高速液体クロマトグラフィプロセスが、シリカベースのクロマトグラフィ用樹脂を使用して実施される方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記樹脂が置換されたシリカゲルであり、例えば、C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、C18-、C20-、フェニル-またはベンゼン-などで置換されたシリカゲルである方法。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか1項に記載の方法であって、前記逆相高速液体クロマトグラフィプロセスが、ポリマーベースの物質であるクロマトグラフィ用樹脂を使用して行われる方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか1項に記載の方法であって、前記関連不純物が、前記グルカゴン様ペプチドの切断型である方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか1項に記載の方法であって、前記関連不純物が、前記グルカゴン様ペプチドがグリコシル化された形態である方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、アルコールを約20％w/w〜約60％w/wの濃度で含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、アルコールを約20％w/w〜約40％w/wの濃度で含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-1、GLP-1類似体、GLP-1の誘導体またはGLP-1類似体の誘導体である方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記GLP-1類似体が以下からなる群より選択される方法；Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-アミド、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-アミド、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Asp22-GLP-1(7-37) 、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド 、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1 (7-36)-アミド、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)、その類似体およびこれらの何れかの誘導体。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記GLP-1の誘導体またはGLP-1類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、1のリジン、を有する誘導体であり、親油性の置換基が任意にスペーサ-を介して前記リジンのイプシロンアミノ基に結合している方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記親油性の置換基が8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば12〜18の炭素原子を有する方法。
【請求項２０】
請求項１８〜１９の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサ-が存在し、アミノ酸、例えば、ベータ-Ala、L-Glu、またはアミノブチロイルから選択される方法。
【請求項２１】
請求項１から２０の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが、DPPIV保護グルカゴン様ペプチドである方法。
【請求項２２】
請求項１から２１の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが血漿安定性グルカゴン様ペプチドである方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法であって、前記GLP-1類似体の誘導体が、Arg34、Lys26 (Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37).
【請求項２４】
請求項１６〜２３の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが、25〜37のアミノ酸残基、好ましくは27〜35のアミノ残基、更により好ましくは29〜33アミノ酸残基を有する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１５の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-2、GLP-2類似体,GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体である方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、１のリジンであり、親油性置換基が任意にスペーサを介して前記リジンのイプシロンアミノ基に結合する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記親油性置換基が、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する方法。
【請求項２８】
請求項26〜27の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサが存在し、アミノ酸、例えばベータ-Ala、L-Glu、アミノブチロイルから選択される方法。
【請求項２９】
請求項２５〜２８の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが27〜39アミノ酸残基、好ましくは29〜37アミノ酸残基、更に好ましくは31〜35アミノ酸残基を有する方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGly2-GLP-2(1-33)である方法。
【請求項３１】
請求項１〜１５の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがエキセンジン-4、エキセンジン-4 類似体、エキセンジン-4の誘導体、またはエキセンジン-4 類似体の誘導体である方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがエキセンジン-4である方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがZP-10、即ち、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2である方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記エキセンジン-4の誘導体またはエキセンジン-4類似体の誘導体がアシル化またはペグ化されている方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、前記エキセンジン-4の誘導体、またはエキセンジン-4 類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、１のリジンを有し、前記リジンが、親油性置換基が任意にスペーサを介して前記リジンのエプシロンアミノ基に結合するようなリジンである方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記親油性置換基が8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する方法。
【請求項３７】
請求項３５〜３６の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサが存在し、アミノ酸、例えば、ベータ-Ala、L-Glu、またはアミノブチロイルから選択される方法。
【請求項３８】
以下の工程を具備するプロセスにより製造されるグルカゴン様ペプチド生成物；
a)グルカゴン様ペプチドを請求項１〜３７の何れか１項に記載の方法を使用して精製すること、および
b)前記グルカゴン様ペプチドを単離し、得られるポリペプチド生成物を与えること。
【請求項３９】
以下の工程を具備するプロセスにより製造される医薬組成物；
a)第１に、グルカゴン様ペプチドまたはその前駆体を請求項１〜３７の何れか１項に記載の方法を使用して精製すること；
b)次に、前記グルカゴン様ペプチドを乾燥すること；および
c)最後に、薬学的に許容される賦形剤と混合すること。
【請求項４０】
請求項３９に記載の医薬組成物の有効量を非経口投与することを具備する高血糖の治療方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-1ペプチドである方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の医薬組成物の有効量を非経口投与することを具備する短腸症候群の治療方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-2ペプチドである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野に関する。特に、本発明はグルカゴン様ペプチド、および少なくとも１の関連する不純物を含む組成物からグルカゴン様ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィにより精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質とペプチド（ポリペプチド）の精製と分析のために、クロマトグラフィは周知であり広く使われている方法である。これらの逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の中で、多くの異なるクロマトグラフィ原理が適用される。RP-HPLC分離原理は、ポリペプチド溶質とクロマトグラフィ用樹脂面の上での疎水性結合との間の疎水性関係に基づく。RP-HPLC精製は、通常、以下の１以上の部分からなる：平衡、添加（load）、洗浄、溶出および再生。
【０００３】
RP-HPLCで最も一般に応用溶解力があるシステムは水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（TFA）に基づく、そして、溶質の溶出は通常、クロマトグラフィーのカラムに適用される液体の有機物の量、即ち、アセトニトリルを増加させることによって達成される。アセトニトリルは、RP-HPLCでポリペプチド溶質に対して強い選択性と変性効果を有する（Boysen、R.I.、et al.、J. Biol. Chem. 277、23-31（2002））、そして、TFA（結果的に低いpH ~ 2で）と結合され、このシステムは、製薬産業と他の産業で標準の分析的ツールとして適用されている（スナイダーら（Snyder、L.R.）「実際的なHPLC方法開発」（第2編集）「生化学サンプル：タンパク質、核酸、炭水化物および関連した合成物」（John Wiley&Sons社）第11章、ニューヨーク（1997））。また、生産スケールで低いpHのアセトニトリルがポリペプチド精製のため、即ち、ヒトインシュリンの精製のために広く使われる（Kroeff、E.P. et al.,）J. Chromatogr 461、45-61（1989））。非置換型重合体ベースの逆相樹脂が、膵臓腺（US 4,617,376）から、グルカゴンの最初の回収のために使われた。当該クロマトグラフィーのカラムは、緩衝構成要素としてのグリシンと有機溶剤としてアセトニトリルとでpH 2.8で操作された。関連した不純物の除去の徴候は、この工程によっては存在しなかった。ペプチド合成から得られるさまざまなグルカゴンの類似体は、低いpHでアセトニトリル／TFA系で、リニアグラジエントでC18-カラムの上で精製された（Krstenansky. J.L.、et al.、J. Biochem. 25、3839-3845（1986））。グルカゴンは、緩衝物質としてTFAを使用している低いpHでリニアアセトニトリルグラジエントを使用しているC18-カラムの上で、エラスモブランチアンフィッシュ(elasmobranchian fish)から単離された（Conlon J.M. and Thim L. Gen. Comp. Endocrinol. 60、398-405（1985））。組み替えニワトリグルカゴンは、E. coliにおいて発現し、続いて、低pHのアセトニ
トリル／TFAシステムで、リニアグラジエントのRP-HPLCを含むさまざまなステップを使用して精製された（Kamisoyama H.  et al. Anim. Sci. J. 71、428-431（2000））。
【０００４】
インスリンとグルカゴンは、緩衝系として50mMの酢酸アンモニウムを使用するpH 7.65でリニアアセトニトリルグラジエントを使用するC18-カラムの上で、エレファントフィッシュから分離された（Berks B.C.、et al.、Giochem. J. 263、261-266（1989））。
【０００５】
WO 99/52934はさまざまなインスリン誘導体の分離のためのRP-HPLC方法を開示するものであり、標的構成要素とグリコシル化された、関連する不純物との間の分離の改善が、カルシウムイオンの追加によって成し遂げられた。精製は有機溶剤としてエタノールを使用し、22〜25℃で、更に、インスリンの等電点より上である約7.0-7.2のpH範囲の緩衝構成要素としてのトリスまたはBis-トリスを使用して実行された。
【０００６】
アンモニウム硫酸塩緩衝剤を使用する低いｐHおよびトリス緩衝剤を使用する中性近くのｐHの両方で、有機溶出剤としてエタノールを使用するC18カラム上でのRP-HPLC工程を含むインスリンのための精製プロセスも記載されている（Mollerup I. et al.、「バイオプロセス技術の百科事典」の「インスリン精製」Eds. Flickinger M.C. and Drew S.W.、pp 1491-1498（John Wiley&Sons社1999））。インスリンに関連した不純物は、これらの方法によって除去された。
【０００７】
C18-カラム上において、分離はpH 3.0でリン酸10mMとトリエチルアミン緩衝剤を含む水の中で40%のメタノールから始め、50％の（アセトニトリル／0.1Mアンモニウムカルボネート、pH9.0）または12.5％の（アセトニトリル／0.1Mトリス−HCl、pH9.0）の何れかで終結される種々のグラジエントを使用してヨウ素化グルカゴン生成物が得られている(Rojas F. J. et al.、Endo. 113、711-719(1983))。グルカゴン生成物は、ヨウ素化の程度によってこの入り混じった様式のRP-HPLC（溶媒とpHの両方とも）によって分離された。加えて、当該方法はグルカゴンの酵素消化物およびヨウ素化グルカゴンを分離するために使用される。
【０００８】
多くの他のポリペプチドの場合のように、類似体と誘導体を含むグルカゴン様ペプチドは、少量のTFAを緩衝物質として含むアセトニトリルのリニアグラジエントを使用する低いPH、即ち、当該標的ポリペプチド成分の等電点（pl）よりも低いpHのHPLCを使用して広く精製されている。GLP-1は、2つの種、ブタおよびヒトからの小腸から分離された(φrskov C. et al.、J. Bio. Chem.264、12826-12829)。精製は、エタノール/TFA系でリニアグラジエントを使用して得られ、更なる精製は、両方ともC18-カラム上での低いpHでのアセトニトリル/TFA系でイソクラティックな溶出を使用して得られた。存在する2つの関連したGLP-1形状（GLP-1および NH２-末端が伸長されたGLP-1）は、どちらの方法にもよって分離されなかった。
【０００９】
アセトニトリル/TFAベースのRP-HPLC系が、回腸におけるイヌGLP-1の形状の調査のために適用された（ナンバ M.ら、Biomedical. Res.11 (4)（247-254の(1990)））。さまざまな形状が分離されたという若干の徴候と、およびその合成的に得られたGLP-1およびdes-Gly37-GLP-1アミド標準に、この方法の適用においてわずかに異なる溶出時間を有することが示された。低いpHのアセトニトリル/TFAベースのRP-HPLC系のC4-カラムは、GLP-1誘導体とエキセンジン-4の抗体フラグメントとヒト血清アルブミンとの精製融合タンパク質に適用されている（WO 02/46227）。
【００１０】
さまざまなプレプログルカゴン切断産物は、低いpHで、アセトニトリル/TFA系で、グラジエントな溶出でC18-カラム上で分離された（Noe B.D. and  Andrews P.C.（peptides 7）331-336 (1986)）。
【００１１】
低いpHのアセトニトリル/TFAベースのRP-HPLC系におけるシアノプロピルカラムは、化学合成から得られるさまざまなGLP-1類似体の精製のために使われている（WO 98/08871）。
【００１２】
GLP-2は、2つの種、ブタおよびヒト、の腸管から他のプログルカゴン関連ペプチドから分離された（Guhl T.ら、J. Biol. Chem. 263、8621-8624（1988））。精製は低いpHでアセトニトリル/TFA系でリニアグラジエントを使用して得られ、更なる精製は、C18-カラム上でどちらも低いpHでのエタノール/TFA系でイソクラティック(isocratic)な溶出を使用して適用された。後の方法によって、シトクロムＣオキシダーゼはGLP-2から分離されたが、しかしながら、存在する2つの関連したGLP-2形態（GLP-2 およびNH2-末端伸長GLP-2）は、分離されなかった。
【００１３】
WO 01/04156は、合成的およびリコンビナント技術の両方によって得られるエキセンジン-4変異体とGLP-1変異体を開示する。ペプチド合成から得られた変異体は、低いpHでアセトニトリル/TFA系のグラジエント溶出法を適用するC18-カラムの上で精製され、それと同時に、リコンビナントペプチドが低いpHでアセトニトリル/TFA系のリニアグラジエントを適用するC8-カラムの上で精製された。
【００１４】
WO 00/41548は、低いpHでアセトニトリル/TFA系のグラジエント溶出を適用してC18-カラムの使用して、ペプチド合成から得られたエキセンジン-3とエキセンジン-4を精製することを開示する。
【００１５】
WO 99/25727は、低いpHでアセトニトリル/TFA系のグラジエント溶出を適用するC18-カラムを使用し、ペプチド合成から得られる種々のエキセンジンアゴニスト（エキセンジン類似体と誘導体）を精製することを開示する。
【００１６】
ヒトの膵臓抽出物からのグルカゴン、GLP-1およびGLP-2は、低いpHでアセトニトリル/TFA系でリニアグラジエントを使用するC18-カラムの上で分離された(スダK.ら、Biomedical Res. 9、39-45（1988）)。
【００１７】
流速と温度の効果が、クロマトグラフィ溶媒のpHを制御することなく有機溶出剤としてエタノールを用いてC18-カラムの上でのリコンビナント技術から得られたGLP-1類似体のRP-HPLC精製のために開示された（Schou,O.、Biologicals、6th Interlaken Conference Advances in Production of Biologicals、インターラーケン、スイス、2003年3月25〜28日）。
【００１８】
EP 0708179は、さまざまなGLP-1類似体と誘導体を生成するための固相合成の使用を開示する。使用される1つの精製プロトコルは、低いpHでアセトニトリル/TFA系でリニアグラジエントを使用する45°CでC18-カラムの上での精製を含んだ。もう１つの精製プロトコルは、周囲温度で2つのRP-HPLC工程を含んだ：低いpHでアセトニトリル/TFA系でリニアグラジエントを使用するC4-カラムの上の精製と、それに続く、pH 7.7でアセトニトリル/炭酸アンモニウム系でリニアグラジエントを使用するC18-カラムの上で精製。さまざまな関連する不純物と開始物質は、2工程の方法によって除去され、目標成分の約99%と全体の収率が14.8%だけのHPLC精製に帰着した。
【００１９】
センダーオフ(Senderoff)らは、固相合成と、未変化のヒトGLP-1を生ずる酵母における発現を使用するリコンビナント技術を使用して構造変化を研究した(J.Pharm. Sci. 87、183-189)。リコンビナントGLP-1のための精製プロトコルは、特に、有機溶出剤としてエタノールを使用する2つのRP-HPLC工程を含んだ。第1のRP-HPLC工程は緩衝剤として0.05Mの水酸化アンモニウムでpH 10.7で実行され、同時に、第2のRP-HPLC工程は緩衝剤として1%の酢酸で低いpH（pH 3以下）で実行された。当該精製プロトコルは約98.5%のGLP-1純度を生じたが、しかしながら、当該産物が、劇的な構造変化を受けることは当該産物の再溶解において問題が生じる。加えて、第1のRP-HPLC工程を含むプロセス工程に関係する高いpHは、当該目標化合物より生理活性の低い塩基触媒作用を受けた分解産物を誘導した。第３のRP-HPLC工程は、幾つかの工程のうちの１つとして使用され、当該標的のGLP-1を再処理し、それを正しい高次構造上の構造に戻した（条件は特定されない）。
【００２０】
中性に近いpHで、グルカゴン様ペプチドとその類似体および誘導体のRP-HPLC精製のための有機溶出剤としてアルコールを含むpH緩衝化溶媒の適用における本発明は、新しいものである。
【００２１】
本発明は、アルコールベースの溶媒系を使用するグルカゴン様ペプチドのRP-HPLC精製の範囲内で、現在の技術水準と比較して工業的用途のために分離効率の増加と適用を促進する。驚くべきことに、標的グルカゴン様ペプチド化合物と関連した不純物の分離が、新規方法論により改善され、より安定したグルカゴン様ペプチド産物が得られる。
【００２２】
RP-HPLC精製の間に中性近くのpHを使用することは、これらのグルカゴン用ペプチドが当該カラム上における凝集する可能性を回避できるということが有利な点であり、それは例により反映されるだろう。これは驚くべきことであり、何故ならば、上記で示された通りインスリンとグルカゴンは、低いpHで当該カラムにおける凝集なく取り扱われることが可能であり、それにより一方でインスリンとグルカゴンの間の性質における違いを、他方でグルカゴン用ペプチドとの間の性質における違いを示し得る。
【００２３】
RP-HPLC精製の間のアルコールの使用は、より一般に使用されるアセトニトリルと比較して、ペプチドのより良い高次構造上の保存が誘導できる更なる有利さがある。更に、アセトニトリル（および、TFA）は有毒な化学製品であり、これは、環境および健康面で問題となるために適切でなく、および工業用スケールでの使用は避けるべきである。アルコールは、通常、毒性が低く、工業的用途によりふさわしい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1。AU280対、C4を置換された120Åシリカゲルを使用する分取分離の時間のクロマトグラム、およびグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）のpH 3.5での溶出。
【図２】図2。AU280対、C4を置換された120Åシリカゲルを使用する分取分離の時間のクロマトグラム、およびと切断型（Arg34-GLP-1（9-37））と同様にグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）のpH 7.5での溶出。
【図３】図3。AU280対、C18を置換された200Åシリカゲルを使用する分取分離の時間のクロマトグラム、およびグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）のpH 3.5での溶出。
【図４】図4。AU280対、C18を置換された200Åシリカゲルを使用する分取分離の時間のクロマトグラム、およびグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）および切断型、Arg34-GLP-1（9-37）のpH 7.5での溶出。
【図５】図5。AU280対、C18を置換された120Åシリカゲルを使用する分取分離の時間のクロマトグラム、およびグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）、および切断型、Arg34-GLP-1（9-37）、のpH 7.5での溶出。
【図６】図6。AU280対、C4を置換された120Åシリカゲルを使用してグリコシル化された不純物である関連した不純物からのArg34-GLP-1（7-37）の分取分離の時間のクロマトグラム、pH緩衝化のない溶媒のpH 7.5での溶出。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
［定義］
以下は、本明細書で使用される用語の詳細な定義である。
【００２６】
ペプチドと１以上の夾雑物を含む組成物からペプチドを「精製する」の語は、当該組成物から少なくとも1つの夾雑物の含有を減らすことによって、当該組成物においてペプチドの純度を上げることを意味する。
【００２７】
ここで使用される用語「関連した不純物」は、標的グルカゴン様ペプチドと構造上の類似点を持つ不純物を意味する。関連した不純物は、標的グルカゴン様ペプチドとは異なる化学的または物理的構造を有し、例えば、切断された形態、伸長された形態（余分なアミノ酸、種々の誘導体など）、脱アミノ酸化形態、不適当な折りたたみ形態、シアル酸付加を含む望まれないグリコシル化を有する形態、酸化形態、ラセミ化により得られる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸が欠失している形態、ペプチド鎖内に余分なアミノ酸を有する形態、所望ではない他の残基においてアシル化が生じた形態などを有する。
【００２８】
ここで使用される用語「緩衝剤」は、クロマトグラフィ溶媒のpHの傾向が、他の状態であれば時間と共に生じる変化を減少する化合物をいう。緩衝剤は、これに限定するものではないが、薬品、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシルグリシン、グリシン、ヒスチジン、リジン、リン酸ナトリウム、ホウ酸塩、TRIS（トリス・ヒドロキシメチル-アミノメタン）、エタノールアミンまたはそれらの混合物を含む。
【００２９】
ここで使用される用語「グルカゴン様ペプチド」は、相同的なペプチドグルカゴン様ペプチド 1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド 2 (GLP-2)、およびプレプログルカゴン遺伝子から誘導されたオキシントモジュリン(oxynthomodulin、OXM))、エキセンジン、並びにその類似体および誘導体をいう。ドクトカゲにおいて発見された当該エキセンジンは、GLP-1に相同であり、また、インスリン分泌性効果を発揮する。エキセンジンの例は、エキセンジン-4およびエキセンジン-3である。
【００３０】
当該グルカゴン様ペプチドは、以下の配列を有する(SEQ ID Nos 1〜5)：
1   5     10    15    20    25    30    35
GLP-1          HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G
GLP-2          HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD
エキセンジン-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2
エキセンジン-3 HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2
OXM            HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA
ペプチドに関してここで使用される「類似体」の語は、修飾されたペプチドであって、当該ペプチドの１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されている、および／または当該ペプチドから１以上のアミノ酸が欠失している、および／または当該ペプチドから１以上のアミノ酸が欠失している、および／または当該ペプチドに対して１以上のアミノ酸残基が付加しているペプチドを意味する。そのようなアミノ酸残基の付加または欠失は、当該ペプチドのN末端および／またはC末端で起こり得る。２つの異なる単純な系が、多くの場合使用され、類似体が記述される：例えば、Arg34-GLP-1(7-37)またはK34R-GLP-1(7-37)は、GLP-1類似体であって、34位に天然に生じるリジンがアルギニンで置換されているものを呼ぶ(IUPAC-IUB命名法に従って使用されるアミノ酸の標準的な一文字略号)。
【００３１】
親ペプチドに関してここで使用される「誘導体」の語は、化学的に修飾された親タンパク質またはその類似体を意味し、またここで、当該親タンパク質またはその類似体において少なくとも１の置換基も存在しない、即ち、共有結合的に修飾されている親タンパク質である。典型的な修飾は、アミド化、炭水化物化、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化(pegylations)などである。GLP-1(7-37)の誘導体の例は、Arg34、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
【００３２】
ペプチドに関してここで使用される「そのフラグメント」の語は、親ペプチドの少なくとも20％のアミノ酸を有する当該ペプチドの何れかのフラグメントを意味する。従って，ヒト血清アルブミンに関して、フラグメントは、ヒト血清アルブミンが585アミノ酸を有しているので、少なくとも117アミノ酸を含むだろう。1態様において、当該フラグメントは、少なくとも35％の当該親ペプチドのアミノ酸を有する。更なる態様において、当該フラグメントは、少なくとも50％の当該親ペプチドのアミノ酸を有する。更なる態様において、当該フラグメントは、少なくとも75％の当該親ペプチドのアミノ酸を有する。
【００３３】
ペプチドに関してここで使用される「変異体」の語は、当該親ペプチドの類似体、当該親ペプチドの誘導体または当該親ペプチドの類似体の誘導体である修飾されたペプチドを意味する。
【００３４】
ここで使用される用語「GLP-1 ペプチド」は、GLP-1(7-37)、GLP-1類似体、GLP-1誘導体またはGLP-1類似体の誘導体を意味する。
【００３５】
ここで使用される「GLP-2 ペプチド」の語は、GLP-2(1-33)、GLP-2類似体、GLP-2誘導体、GLP-2類似体の誘導体を意味する。
【００３６】
ここで使用される「エキセンジン-4 ペプチド」の語は、エキセンジン-4(1-39)、エキセンジン-4類似体、エキセンジン-4誘導体またはエキセンジン-4類似体の誘導体を意味する。
【００３７】
ここで使用される「血漿安定性グルカゴン様ペプチド」の語は、化学的に修飾されたグルカゴン様ペプチド、即ち、以下の方法で測定した場合に、ヒトにおいてインビボ血漿消失半減期が少なくとも10時間を示す類似体または誘導体を意味する。ヒトにおけるグルカゴン様ペプチドの血漿消失半減期当該測定方法は、:当該化合物を、等張性緩衝液、pH7．4のPBSまたは何れかの適切な緩衝液に溶解する。その投与量を、末梢性、好ましくは腹腔または上部大腿部に注射する。活性化合物を測定するための血液サンプルを頻回な間隔で、且つ終末消失部分を包含するのに十分な期間(例えば、投与前、投与後 1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 時間(2日目)、36 時間(2日目)、48 時間(3日目)、60時間(3日目)、72 時間(4日目)および84 時間(4日目)など)で採取する。活性化合物の濃度の測定は、ウィルケンら(Wilken et al.、Diabetologia 43(51):A143、2000)が記載している通りに行う。誘導薬物動態学的パラメーターは、各個々の対象について濃度−時間データから、ノンコンパートメント法を用いて、商業的に入手可能なソフトウェア、ウィンノンリン・バージョン2.1(WinNonlin Version 2.1 (Pharsight、Cary、NC、USA)を使用して計算する。終末消失速度定数は、濃度−時間曲線の当該終末の対数線形部分における対数線形回帰により評価され、消失半減期計算のために使用される。
【００３８】
ここで使用される「DPP-IV保護グルカゴン様ペプチド」の語は、前記ペプチドの未変性形態ではなく、血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-4 (DPP-IV)に対する抵抗性を前記ペプチドに与える化学的な修飾をされたグルカゴン様ペプチドを意味する。
【００３９】
ここで使用される「免疫調節性エキセンジン-4 ペプチド」の語は、エキセンジン-4(1-39)と比較すると、ヒトにおける免疫応答が減少しているエキセンジン-4(1-39)の類似体また誘導体であるエキセンジン-4 ペプチドを意味する。免疫応答を評価するための方法は、当該患者に4週間処置した後で、当該エキセンジン-4 ペプチドに対する抗体反応性の濃度を測定すればよい。
【００４０】
ここで使用される「グルカゴン様ペプチド産物」の語は、医薬組成物の製造に使用されるべき生成されたペプチド産物を意味する。従って、当該グルカゴン様ペプチド産物は、最終精製、乾燥またはコンディショニング過程からの産物として標準的に得られる。当該産物は、結晶、沈殿物、溶液または懸濁液であってもよい。当該グルカゴン様ペプチド産物もまた、薬物、即ち、活性な薬学的成分として当該分野において公知である。
【００４１】
ここで使用される「等電点」の語は、高分子、例えば、ポリペプチドなどの全体的な正味の電荷がゼロであるpH値を意味する。ポリペプチドにおいて、多くの電荷をもつ基が存在してよく、当該等電点では、これらの全ての電荷の和がゼロになる。等電点以上のpH値では、当該ポリペプチドの全体の正味の電荷は陰性になるであろうし、他方、当該等電点以下のpH値では、当該ポリペプチドの全体の正味の電荷は陽性になるであろう。
【００４２】
ここで使用される「医薬品」の語は、それが障害または疾病を治療するために使用されることを意味する組成物を言う。
【００４３】
ここで使用される「薬学的に許容される」の語は、通常の薬学的適用に適する、即ち、患者などにおいて何れの有害なイベントも生じないことを意味する。
【００４４】
ここで使用される「有効量」の語は、治療をしない場合に比べて、当該患者の治療効果が十分である用量を意味する。
【００４５】
ここで使用される「医薬組成物（pharmaceutical composition）」の語は、活性化合物またはその塩を、薬学的な賦形剤、例えば、緩衝剤、保存剤、および任意の張性調節剤および／または安定剤と共に含有する生産品を意味する。従って、医薬組成物はまた、製剤(pharmaceutical formulation)としても当該技術分野において公知である。
【００４６】
ここで使用される「賦形剤」の語は、標準的に医薬組成物に対して添加される化合物、例えば、緩衝剤、張性調節剤、保存剤などを意味する。
【００４７】
ここで使用される「障害の治療」の語は、障害、状態または疾病が発生している患者の管理および看護を意味する。治療の目的は、障害、状態または疾病と闘うことである。治療には、当該障害、状態または疾病を除去または調節するため、並びに当該障害、状態または疾病と関連する症状または合併症を緩和するために活性化合物を投与することを含む。
【００４８】
［発明の詳細な説明］
第1の側面において、本発明は、前記グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも１の関連する不純物を含む組成からグルカゴン様ペプチドを精製する方法に関し、当該方法は、逆相高速液体クロマトグラフィプロセスであり、ここで、溶出に使用される溶媒は、約pH4〜約pH10の範囲でpH緩衝化されており、且つ前記溶媒は、アルコールを約10％w/w〜約80％w/wの濃度で含有する方法である。
【００４９】
標的GLPモイエティおよび不純物が、工程、即ち、有機溶媒中における漸近またはリニアな電荷グラジエントまたはイソクラティカリー、またはこれらの組み合わせよって、溶出および分離される。当該有機溶媒成分グラジエントは、より低い濃度からより高い濃度までであろう。溶出はまた、溶出画分におけるpHおよび/または温度の変化によっても可能である。
【００５０】
平衡溶液および適用するためのサンプルは、有機溶媒を含有しても含有しなくてもよい。当該有機溶媒は、これに限定するものではないが、何れかの一価脂肪族アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールなど）であってもよい。クロマトグラフィ精製の何れの画分についての任意の塩成分は、これに限定するものではないが、NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムなどを含む何れの塩であってもよい。これに限定するものではないが、何れの緩衝剤成分が使用されてよく、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液などが含まれる緩衝剤が使用されてもよい。また、当該方法は、クロマトグラフィ用逆相樹脂を任意の何れかの種類の置換基を伴うどのような選択も適用することが可能であり、これに限定するものではないが、例えば、シリカベース樹脂、例えば、クロマシル(Kromasil) 100 C18、ポリマーベース樹脂、例えば、アマシャム・バイオサイエンス(Amarsham Biosciences)から供給されるもの、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)からのポロス・マテリアルス(Poros materials)、例えば、ポロス R1、R2 および R3逆相樹脂、シファージェン(Ciphergen)からのセラミックベース樹脂、金属酸化物ベース樹脂などが含まれる。好ましくは、シリカベースの樹脂が使用される。
【００５１】
本発明の１態様において、当該溶媒はpH緩衝化が約pH5〜約pH9の範囲でなされる。
【００５２】
本発明のもう1つの態様において、当該溶媒は、pH緩衝化が、前記グルカゴン様ペプチドの等電点よりも高いpHでなされてもよい。
【００５３】
本発明の更なる態様において、当該溶媒は、溶出工程における設定値から＋/−1.0pH単位よりも大きなpHの変動を防ぐようにpH緩衝化がなされる。
【００５４】
本発明の更なる態様において、当該溶媒は、溶出工程における設定値から＋/−0.5pH単位よりも大きなpHの変動を防ぐようにpH緩衝化がなされる。
【００５５】
本発明の更なる態様において、当該アルコールはエタノールである。
【００５６】
本発明の更なる態様において、当該アルコールは2-プロパノールである。
【００５７】
本発明の更なる態様において、当該アルコールは、以下からなる群より選択される；メタノール、1-プロパノールおよびヘキシレングリコール。
【００５８】
本発明の更なる態様において、当該逆相高速液体クロマトグラフィプロセスはシリカベースクロマトグラフィ用樹脂を使用して実施される。
【００５９】
本発明のもう１つの態様において、当該樹脂は、置換されたシリカゲル、例えば、C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、C18-、C20-、フェニル-またはベンゼン置換シリカゲルなどである。
【００６０】
本発明の更なる態様は、当該逆相高速液体クロマトグラフィプロセスがポリマーベースの物質であるクロマトグラフィ用の樹脂を使用して実施される。
【００６１】
中性pHに近いグルカゴン様ペプチドの選択性が増大されたRP-HPLC法が、好ましく適用されて、標的グルカゴン様ペプチドとは異なる化学的または物理的構造を有する関連する不純物、例えば、切断型、全ての種類の伸長型（余分なアミノ酸、種々の誘導体など）、脱アミド型、不適当なホールディング形態、シアリル化を含む望まれないグリコシル化、酸化型、ラセミ化からの生成される形態、ペプチド鎖内におけるアミノ酸を欠失している形態、ペプチド鎖内における余分なアミノ酸を有する形態およびその他の形態などを除去する。
【００６２】
本発明の１態様において、当該関連する不純物は、前記グルカゴン様ペプチドの切断型である。
【００６３】
本発明の更なる態様において、当該関連する不純物は、前記グルカゴン様ペプチドのグリコシル化された形態である。
【００６４】
本発明の更なる態様において、当該溶媒は、アルコールを約20％w/w〜約60％w/wの濃度で含む。
【００６５】
本発明の更なる態様において、当該溶媒は、アルコールを約20％w/w〜約40％w/wの濃度で含む。
【００６６】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、GLP-1、GLP-1類似体、GLP-1誘導体またはGLP-1類似体の誘導体である。
【００６７】
本発明の更なる態様において、当該GLP-1類似体は、以下の群より選択される； Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-アミド、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-アミド、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Asp22-GLP-1(7-37) 、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド 、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)、その類似体およびこれらの何れかの誘導体。
【００６８】
本発明の更なる態様において、当該GLP-1の誘導体またはGLP-1類似体の誘導体は、リジン残基、例えば、１のリジンを有し、これは、親油性置換基が任意のスペーサ-を介して、前記リジンのイプシロンアミノ基に結合するものである。
【００６９】
本発明の更なる態様において、当該親油性置換記は、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する。
【００７０】
本発明の更なる態様において、当該スペーサーが存在し、アミノ酸、例えばベータ-Ala、L-Glu、またはアミノブチロイルから選択される。
【００７１】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、DPPIV保護グルカゴン様ペプチドである。当該ペプチダーゼDPPIVは、グルカゴン様ペプチドを加水分解し、グルカゴン様ペプチドのクリアランス速度は、DPPIV保護のグルカゴン様ペプチドの天然型の類似体、即ち、生理学的条件下でDPPIV酵素による加水分解が遅い速度になるそれらのアナログ、によって減少し得る。
【００７２】
更なる本発明の態様において、当該グルカゴン様ペプチドは血漿安定グルカゴン様ペプチドである。
【００７３】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、GLP-1類似体の誘導体、Arg34、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
【００７４】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、GLP-1 ペプチドであり、これは、25〜37 アミノ酸残基、好ましくは27〜35 アミノ酸残基、更により好ましくは29〜33 アミノ酸残基を有する。
【００７５】
本発明の１態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、GLP-2、GLP-2類似体、GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体である。
【００７６】
本発明の更なる態様において、当該GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体は、リジン残基を有し、例えば、１のリジンであって、前記リジンの当該イプシロンアミノ基に対して、親油性置換基を任意にスペーサを介して結合するリジンを有する。
【００７７】
本発明の更なる態様において、当該親油性置換記は、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18炭素原子を有する。
【００７８】
本発明の更なる態様において、当該スペーサが存在し、これはアミノ酸、例えばベータ-Ala、L-Glu、アミノブチロイルから選択される。
【００７９】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、27〜39のアミノ酸残基、好ましくは29〜37アミノ酸残基、更により好ましくは31〜35アミノ酸残基を有するグルカゴン様ペプチドである。
【００８０】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、Gly2-GLP-2(1-33)である。
【００８１】
本発明の１態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4、エキセンジン-4類似体、エキセンジン-4の誘導体、またはエキセンジン-4類似体の誘導体である。
【００８２】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドはエキセンジン-4である。
【００８３】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4類似体ZP-10 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2)である。
【００８４】
本発明の更なる態様において、当該エキセンジン-4の誘導体またはエキセンジン-4の類似体の誘導体は、アシル化またはペグ化されている。
【００８５】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、安定したエキセンジン-4 ペプチドである。
【００８６】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、DPP-IV 保護エキセンジン-4 ペプチドである。
【００８７】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、免疫調節性のエキセンジン-4 ペプチドである。
【００８８】
本発明の更なる態様において、当該エキセンジン-4誘導体またはエキセンジン-4類似体の誘導体は、リジン残基、例えば、１のリジンであって、親油性置換基が、前記リジン残基のエプシロンアミノ基に任意のスペーサを介して結合しているリジン残基を有する。
【００８９】
本発明の更なる態様において、当該親油性置換記は、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する。
【００９０】
本発明の更なる態様において、当該スペーサーが存在し、且つそれはアミノ酸、例えば、ベータ-Ala、L-Gluまたはアミノブチロイルから選択される。
【００９１】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4ペプチドであって、これは30〜48のアミノ酸残基、33〜45のアミノ酸残基、好ましくは35〜43アミノ酸残基、更により好ましくは37〜41のアミノ酸残基を有する。
【００９２】
本発明の態様において、当該GLP-2ペプチドは、以下に列記するものから選択される: K30R-GLP-2(1-33); S5K-GLP-2(1-33); S7K-GLP-2(1-33); D8K-GLP-2(1-33); E9K-GLP-2(1-33); M10K-GLP-2(1-33); N11K-GLP-2(1-33); T12K-GLP-2(1-33); I13K-GLP-2(1-33); L14K-GLP-2(1-33); D15K-GLP-2(1-33); N16K-GLP-2(1-33); L17K-GLP-2(1-33); A18K-GLP-2(1-33); D21K-GLP-2(1-33); N24K-GLP-2(1-33); Q28K-GLP-2(1-33); S5K/K30R-GLP-2(1-33); S7K/K30R-GLP-2(1-33); D8K/K30R-GLP-2(1-33); E9K/K30R-GLP-2(1-33); M10K/K30R-GLP-2(1-33); N11K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2 (1-33); L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP-2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33); A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33); K30R/D33K-GLP-2(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); および、その誘導体。
【００９３】
本発明の態様において、当該GLP-2誘導体は、以下からなる群より選択される；
S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33); 
L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)-GLP-2(1-33);
A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33); 
S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
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L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
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L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-カルボキシ-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
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L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R-GLP-2(1-33);
A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R-GLP-2(1-33);
D3E/S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33); 
D3E/S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ウンデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ドデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(トリデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(テトラデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ペンタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ヘプタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(オクタデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(ノナデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(エイコサノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-カルボキシ-4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(オクタノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ノナノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);および
D3E/Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
【００９４】
GLP-2、その類似体、並びにGLP-2誘導体の製造方法は、例えば、WO 99/43361およびWO 00/55119において見つけることが可能である。
【００９５】
更なる本発明の態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4(1-39)のインスリン分泌性の類似体、例えば、Ser2Asp3-エキセンジン-4(1-39)などであり、これは、その2位および3位のアミノ酸残基が、セリンおよびアスパラギン酸に夫々置換されているものである（この特別な類似体もまた、エキセンジン-3として当該技術分野において公知である）
更に、本発明の発明において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4の誘導体であり、ここで、当該導入された置換基は、アミド、炭水化物、アルキル基、エステルおよび親油性置換基から選択される。エキセンジン-4(1-39)のインスリン分泌性誘導体およびその類似体の例はTyr31-エキセンジン-4(1-31)-アミドである。
【００９６】
本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、安定なエキセンジン-4 ペプチドである。本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、DPP-IV保護エキセンジン-4 ペプチドである。本発明の更なる態様において、当該グルカゴン様ペプチドは、免疫調節性のエキセンジン-4 ペプチドである。
【００９７】
エキセンジン-4、その類似体、並びにエキセンジン-4誘導体の製造方法は、WO 99/43708、WO 00/41546 および WO 00/55119に見出すことができる。
【００９８】
当該親グルカゴン様ペプチドは、ペプチド合成，例えば、固相ペプチド合成により、Boc-またはFmoc-化学またはその他の良好に確立された技術を使用して、生成され得る。当該親グルカゴン様ペプチドはまた、当該ポリペプチドをコードし、且つ適切な栄養性培地において当該ペプチドの発現を可能にする条件下で当該ポリペプチドの発現を可能にするDNA配列を含むホスト細胞を培養すること、その後、得られたペプチドを培養物から回収することを具備する方法によって産生することも可能である。
【００９９】
当該細胞を培養するために使用される培地は、当該ホスト細胞が成長するために適切な何れかの従来の培地、例えば、適切な補充を含むミニマルまたはコンプレックス培地など、でよい。適切な培地は、商業的な供給者から入手するか、公表されている処方（例えば、the American Type Culture Collectionのカタログ）に従って製造することが可能である。当該細胞により生成された当該ペプチドは、次に、従来の方法により培地から回収することが可能であり、そのような方法は、遠心分離または濾過によりホスト細胞を分離すること、当該分離物または濾過物の沈殿成分により、培地からホスト細胞を分離すること、当該上清または濾液の分離物タンパク質のような成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムなどにより沈殿させること、問題のペプチドの種類に依存して、多様なクロマトグラフィの手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどにより生成することを含む。
【０１００】
当該親ペプチドをコードするDNA配列は、適切なゲノムまたはcDNA起源であってよく、例えばゲノムまたはcDNAライブラリーを製造すること、および標準的な技術(例えば、Sambrook、J、Fritsch、EF and Maniatis、T、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989などを参照されたい)に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダイゼーションにより当該ペプチドの全体または一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることにより得られる。当該ペプチドをコードするDNA配列は、また、確立された標準的な方法により合成的に製造されてもよく、例えば、ホスホアミジン方法（Beaucage and Caruthers、Tetrahedron Letters 22 (1981)、1859-1869により記載される方法）またはマッテスらにより記載された方法（Matthes et al.、EMBO Journal 3 (1984)、801 - 805）などにより合成的に製造されてもよい。当該DNA配列はまた、特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応、例えば、US 4,683,202 またはサイキら(Saiki et al.、Science 239 (1988)、487-491)によって製造されてもよい。
【０１０１】
当該DNA配列は、従来の組み替えDNA産物の支配下ににあり得る何れかのベクターに挿入されてもよく、ベクターの選択は、多く場合、導入されるべき当該ホスト細胞に依存するであろう。従って、当該ベクターは、自立的に複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在するベクターなどであってよく、その複製は、染色体複製、例えば、プラスミドなどとは無関係である。或いは、当該ベクターが、ホスト細胞に導入されたものである場合、ホスト細胞のゲノムに組み込まれ、そこに組み込まれている染色体とともに複製される。
【０１０２】
当該ベクターは好ましくは、発現ベクターであり、そこにおいて、当該ペプチドをコードするDNA配列は、当該DNAの転写のために必要とされる更なるセグメント、例えば、プロモーターに動作可能に連結する。当該プロモーターは、選択された当該ホスト細胞における転写活性を示す何れかのDNA配列であればよく、また、当該ホスト細胞に対して相同または非相同の何れかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。例えば、多様なホスト細胞において本発明のペプチドがコードされるDNAの転写を方向付けるための適切なプロモーターの例は、例えば、サンブロックら(Smbrockら、上述)において周知である。
【０１０３】
当該ペプチドをコードするDNAは配列は、必要であれば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列および翻訳エンハンサー配列と動作可能に連結していてもよい。本発明の当該組み替えベクターは更に、当該ベクターに、問題のホスト細胞内で複製することを可能にする機能を付加するDNA配列を含んでもよい。
【０１０４】
当該ベクターはまた、選択可能なマーカー、例えば、当該ホスト細胞における欠損を補足する遺伝子産物、または薬物、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどに対する耐性を与えるようなものを含んでもよい。
【０１０５】
発明の親ペプチドを当該ホスト細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌性シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知）が当該組み替えベクターに提供されてもよい。当該分泌性シグナル配列は、当該ペプチドをコードするDNA配列に妥当な読み取り枠で連結される。当該分泌性シグナル配列は、一般的に当該ペプチドをコードするDNA配列の5'に位置される。当該分泌シグナル配列は、一般的に当該ペプチドに関連する、または更なる分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からのものであってよい。
【０１０６】
本ペプチドをコードするDNA配列、プロモーターおよび任意のターミネータ−および／または分泌性シグナル配列を夫々に連結に使用される手順、および複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者には周知である（例えば、Sambrocckらの前出の文献を参照されたい）。
【０１０７】
当該DNA配列または組み替えベクターが導入される当該ホスト細胞は、本ペプチドを産生することが可能な何れか細胞でよく、細菌、酵母、真菌、より高等な真核生物細胞を含む。当該技術分野において周知であり、使用されている適切なホスト細胞の例は、これらに限定するわけではないが、例えば、E.coli、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、または哺乳類のBHKまたはCHO細胞株などである。
【０１０８】
本発明に従って精製されたグルカゴン様ペプチドを含む医薬組成物は、典型的に多様な薬学的賦形剤、例えば、保存剤、等張性剤および界面活性剤などを含む。医薬組成物の製造は、当業者には周知である。都合よくは、レミントン（ Remington: The Science and Practice of Pharmacy、19th edition、1995）を参考にしてよい。
【０１０９】
本発明に従って精製されたグルカゴン様ペプチドを含む医薬組成物は、非経口的にそのような治療を必要とする患者に投与されてもよい。非経口投与は、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射により、注射器、任意にはペン型シリンジにより実施されてもよい。或いは、投与は、インフュージョンに、例えば、インフュージョンポンプを使用することにより行ってもよい。
【０１１０】
本発明は、更に、以下の例により説明するが、これらが発明の保護範囲を制限するとは解釈されるべきではない。前述の記載において開示された当該特徴および以下の例はともに、別々に、および何れかのその組み合わせにおいて、その多様な形態における本発明を現実化するための材料であってもよい。
【実施例】
【０１１１】
例１
分析用のRP-HPLC。収集されたピークの同定／検証のためのRP-HPLC分析は、ウォーターズシンメトリーRP-18、3.5 μm、100Å、4.6 x 150 mm カラムにおいて実行した。緩衝液Aは、7.8 % (w/w)アセトニトリル中の0.15Mの(NH4)2SO4 を含み、pH 2.5であり、緩衝液Bは、63.4 %(w/w)のアセトニトリルを含む。リニアなグラジエント、即ち、37〜44.1%のBで15分間、続いて、44.1〜100%のBで10 分間を、流速を1ml/minで流した。当該クロマトグラフィ温度は、60℃に維持し、UV 検出は214nmで行った。
【０１１２】
例２
Arg34GLP-1(7-37) を通常の組み替えDNA技術、即ち、WO 98/08871に記載の方法によって、酵母(S. cerevisiae)に発現させた。発酵浴中のArg34GLP-1(7-37) を、次に、通常の逆相クロマトグラフィにより精製し、引き続いて当該ペプチドの等電点のpH、即ち、pH 5.4で沈殿した。当該沈殿物を遠心分離で単離した。
【０１１３】
Arg34GLP-1(7-37)および関連する不純物、特に切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含む等電点の沈殿物を水に溶解し、pHを3.5に調整し、15mLの当該溶液（0.91 mg/mL）を20mLの120Å C4-置換された（ジメチルブチルジメチルシリル）シリカ樹脂（粒子サイズ10μｍ、YMC）を40ｍL の0.15mol/Kg硫酸アンモニウム、5mmol/Kgクエン酸、25％（w/w）エタノールpH3.5で平行化したものに添加した。
【０１１４】
Arg34GLP-1(7-37) および関連する不純物、特に切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含む当該等電点の沈殿物を、水に溶解し、pHを3.5に調製した。15mLの溶液（0.91mg/ml）を20ｍL の120Å C4-置換（ジメチルブチルジメチルシリル）シリカ樹脂（粒子サイズ10μm、YMC）で40mLの0.15mol/Kgの硫酸アンモニウム、5mmol/Kgクエン酸、25％(w/w)エタノールpH3.5で平衡化されたシリカ樹脂に充填した。当該カラムを10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出は、リニアグラジエントで35〜45％エタノール(0.15mol/Kg 硫酸アンモニウム、5mmol/Kgのクエン酸)で240mLの間で行った。
【０１１５】
分取精製用のクロマトグラムをFig.1に示す。当該クロマトグラフィプロファイルから、グリコシル化された不純物が分離されたことが観察されるが、如何なる明瞭なピークもまたは分離も、切断型と標的GLP-1部分との間に得られなかった。Arg34GLP-1(7-37) とArg34GLP-1(9-37)の間の如何なる分離もRP-HPLC分析では観察できなかった。
【０１１６】
例３
Arg34GLP-1(7-37)は、酵母において発現され、RP-LCにより捕捉され、例２に記載された通りに沈殿した。
【０１１７】
Arg34GLP-1(7-37) および関連する不純物、特に切断型不純物Arg34PLP-1(9-37)を含む等電点の沈殿物は、水に溶解し、pHを7.5に調製した。15mLの当該溶液(0.91mg/mL)を、20mL、120Å C4置換(ジメチルブチルジメチルシリル)シリカゲル(粒子サイズ10μm、YMC)であり、40mL、5mmol/Kgのリン酸一水素ナトリウム、210mmol/Kgの酢酸カリウム、25％(w/w)エタノールpH7.5で平行化したものに添加した。
【０１１８】
当該カラムを10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出は、30〜40％のエタノール(5mmol/Kg、リン酸一水素ナトリウム、210mmol/Kgの酢酸カリウム)のリニアグラジエントで240mLに亘って実施した。
【０１１９】
分取精製用のクロマトグラムを図２に示す。単独で、クロマトグラムプロファイルから、グリコシル化された不純物が分離されたことが観察され、更に、切断型と標的GLP-1部分の間の分離が、クロマトグラフィ溶媒の緩衝液がpH 7.5に調製されたときに得られた。加えて、表1に記載されたフラクションのRT-HPLC分析の結果は、当該メインピークにおける切断型Arg34GLP-1(9-37)の含有量が容認されるレベルに減少したことを示す。
【表１】
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【０１２０】
例１および２のクロマトグラフィプロファイルを比較することにより、中性のpHの更なる利点が認められる：非常により高く、より狭いメインピーク、および従って望ましいより高いプール濃度が得られる。例１と２の間に計画された僅かの相違は：それぞれのクロマトグラフィ操作のコントロールpHに対する異なる緩衝液系、異なる塩系である。更に、同様に急勾配なグラジエントだが、異なるエタノール出発濃度が使用されたが、同様の滞留が得られた。
【０１２１】
例４
Arg34GLP-1(7-37) は、酵母(S. cerevisiae)に通常の組み替えDNA技術、例えば、WO 98/08871に記載の方法などによって発現された。発酵ブロスフリーの細胞におけるArg34GLP-1(7-37)は、陽イオン交換クロマトグラフィにより精製され、Arg34GLP-1(7-37)を含む得られたプールのｐHはｐH9.0に調整した。
【０１２２】
Arg34GLP-1(7-37) (3.49 mg/mL)および関連する不純物、特に、切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含む10 mLのプールを、0.15mol/Kg硫酸アンモニウム、 5 mmol/kgのクエン酸、25% (w/w)のエタノール を含有するpH 3.5の40mLの溶媒で平衡化した20 mLの200Å、C18 置換 (オクタデシルジメチルシリル)シリカゲル(粒子サイズ15μm)に添加した。
【０１２３】
当該カラムを、10 mLの平衡溶液で洗浄し、溶出は、35〜45％ エタノール (0.15 mol/kg 硫酸アンモニウム、5 mmol/kg、クエン酸)のリニアグラジエントで240ｍLに亘り行った。温度は、起動している間中23℃に維持した。
【０１２４】
分取精製のクロマトグラフィをFig３に示す。グリコシル化された不純物を分離したが、しかしながら、標的GLP-1の部分は、適切には溶出されず、これは当該カラム上での繊維化によるが、全く回収できなかった。従って、低いpHに関連する高い疎水性結合、例えば、C18などは使用されるべきではない。
【０１２５】
例５
Arg34GLP-1(7-37)は、通常の組み替えDNA技術、例えば WO 98/08871に記載さえる通りの技術などにより酵母(S. cerevisiae)において発現された。Arg34GLP-1(7-37) は、陽イオン交換クロマトグラフィにより例４に記載された通りの方法により捕獲された。
【０１２６】
Arg34GLP-1(7-37) (3.49 mg/mL)および関係する不純物、特に、切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含む当該プール(室温でpH8.9)の10 mLを、250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸二水素カリウム、25％(w/w)のエタノールを含むpH7.5の溶液の40mLで平衡化された、20mL、200Å、C18置換（オクタデシルジメチルシリル）シリカゲル（粒子サイズ15μm）に添加した。
【０１２７】
当該カラムを10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出をリニアグラジエントの30〜40％エタノール(250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸二水素カリウム)で240mL中で行った。温度は、全体を流す間中23℃に維持した。
【０１２８】
分取精製のクロマトグラムを図４に示した。単独で、クロマトグラフィプロファイルからグリコシル化した不純物が分離されたことが観察でき、また更に切断型と標的GLP-1部分の間の分離がクロマトグラフィ用溶媒をpH7.5に調整した緩衝液で得られた。
【０１２９】
例４と５のクロマトグラフィプロファイルを比較すると、標的GLP-1部分のみが、中性のpHでのクロマトグラフィの流出から回収され得ることが示される。例４と５の間に計画されたの僅かな違いは；夫々のクロマトグラフィの工程のpHを調節するための異なる緩衝液系と、異なる塩系である。更に、同じグラジエントの急勾配が使用されるが、異なるエタノール出発濃度を伴うことにより、同じ維持を得た。
【０１３０】
例６
Arg34GLP-1(7-37)が酵母において発現され、例４で示された通りに陽イオン交換クロマトグラフィで捕獲された。
【０１３１】
Arg34GLP-1(7-37) (0.7 mg/mL)および関連する不純物、特に切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含む51mLのプール(pH7.45で22.5℃)を、250mmol/kg塩化カリウム、5mmol/kgリン酸二水素カリウム、25％(w/w)エタノールを含む、pH7.5の溶媒の40mLで平衡化された20mLの200Å C18で置換された(オクタデシルジメチルシリル)シリカゲル(粒子サイズ15μm)に添加された。当該カラムを10mLの平衡化溶液で洗浄し、溶出をリニアグラジエントの30〜40％エタノール(250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸二水素カリウム)で240mLまでの間行った。温度は、全工程中、4℃に維持された。
【０１３２】
明瞭なピークとArg34GLP-1(7-37)、切断型のArg34GLP-1(9-37)および当該ペプチドのグリコシル化型の間の分離が、この温度で得られ、例５で得られたのもと同じものが得られた。本例と例５の間で計画された僅かな違いは、添加するために異なるサンプルを使用したことである。
【０１３３】
例７
Arg34GLP-1(7-37)を酵母で発現させ、例４に記載した通りの陽イオン交換クロマトグラフィにより捕獲した。
【０１３４】
Arg34GLP-1(7-37) (0.7 mg/mL)および関連する不純物、特に切断型Arg34GLP-1(9-37)を含む51mLのプール(pH8.88で24.6℃)を、250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸二水素カリウム、25％(w/w)のエタノールを含みpH7.5の溶液の40mLで平衡化された20mL、200ÅC18置換(オクタデシルジメチルシリル)シリカゲル(粒子サイズ15μm)に対して添加した。当該カラムは、10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出はリニアグラジエントの25〜35％エタノール(250mmol/kg塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸二水素カリウム)で240mLの間行った。温度は、全工程の間、50℃に維持した。
【０１３５】
明瞭なピーク、並びにArg34GLP-1(7-37)、切断型Arg34GLP-1(9-37)および当該ペプチドのグリコシル化型間の分離が、この温度で得られ、例５で得られたのと同様だった。本例と例５の間で計画された僅かな構成の違いは、添加するために異なるサンプルを使用したことである。
【０１３６】
例８
Arg34GLP-1(7-37)が酵母において発現され、例４に記載された通りの陽イオン交換クロマトグラフィにより捕獲された。
【０１３７】
Arg34GLP-1(7-37) (0.7 mg/mL)および関連する不純物、特に切断型不純物Arg34GLP-1(9-37)を含むプール(20.9°CでpH 8.89)の51mLを、250mmol/kg塩化カリウム、5mmol/kgのリン酸ジヒドロカリウム、25％(w/w) エタノール、pH7.5の溶液の40mLで平衡化された20mL、120ÅC18置換(オクタデシルジメチルシリル)シリカゲル(粒子サイズ15μm)に添加した。当該カラムを10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出は、リニアグラジエントの30〜40％エタノール(250mmol/kg塩化カリウム、5mmol/kgリン酸二水素カリウム)で240mLに亘り行った。温度は、全体工程の間中23℃に維持した。
【０１３８】
分取精製用のクロマトグラムを図５に示す。単独で、当該クロマトグラフィプロファイルから、グリコシル化不純物が分離されたことが観察でき、更に、切断型と標的GLP-1部分との間の分離が当該クロマトグラフィ用溶媒がpH7.5に調整される前の緩衝液で得られた。実際、当該Arg34GLP-1(7-37)のピークとArg34GLP-1(9-37)を含む周囲のピークの間よりも高い分解能が、例５で記載された200Åの物質を用いたときではなく120Åの物質を用いた時に達成された。本例と例５の間に計画された僅かな違いは、添加のために異なるサンプルの使用したことである。
【０１３９】
例９
例4で述べられたように、Arg34GLP-1（7-37）は酵母で発現され、陽イオン交換クロマトグラフィによって捕獲された。
【０１４０】
Arg34GLP-1（7-37）（0.6mg/mL）および関連する不純物、特に、切断型不純物Arg34GLP-1（9-37）、を含むプール（22.1℃でpH 8.84）の63mLを、250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのカリウム二水素リン酸塩、25%(w/w)エタノール含むpH 7.0の溶媒の40mLで平衡化されたC18置換（オクタデシルジメチル・シリル）20mLの120Åシリカゲル（粒径15μm）に添加された。当該カラムは10mLの平衡溶液で洗われた、そして、溶出は240mLの間、30〜40%エタノール（250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのカリウム二水素リン酸塩）のリニアグラジエントで実行された。温度は、全ての流出の間、23℃に保たれた。
【０１４１】
Arg34GLP-1（7-37）、切断型Arg34GLP-1（9-37）およびこのpHでのペプチドのグリコシル化型との間の明瞭なピークと分離が得られ、例8に示されたものと類似していた。本例と例8の間で計画された僅かな違いは、添加のために異なるサンプルを使用したことである。
【０１４２】
例１０
例4で述べられたように、Arg34GLP-1（7-37）は酵母で発現され、陽イオン交換クロマトグラフィによって捕獲された。
【０１４３】
例9で述べられたように、精製は実行されたが、溶媒のpHは8.0であった。
【０１４４】
Arg34GLP-1（7-37）、切断型Arg34GLP-1（9-37）およびこのpHのペプチドでのグリコシル化型との間の明瞭なピークと分離が得られ、例8に示されたものと類似していた。本例と例8の間で計画された僅かな違いは、添加のための異なるサンプルを使用したことである。
【０１４５】
例１１
例2で述べられるように、Arg34GLP-1（7-37）は酵母で発現され、RP-ＬＣで捕えられて、沈殿された。
【０１４６】
Arg34GLP-1（7-37）および関連する不純物、特に、切断型不純物Arg34GLP-1（9-37）を含む等電沈殿物を水に溶かし、pHを7.5に調整した。当該溶液（0.91mg/mL）の15mLを、40mLの210mmol/kgの酢酸カリウム、25%（w/w）エタノールのpH7.5で平衡化されたC4置換された（ジメチルブチルジメチルシリル）20mLの120Åシリカゲル（粒径10μm、YMC）にロードした。当該カラムは10mLの平衡溶液で洗浄し、溶出は、240mLの間、30〜40%エタノール（210mmol/kgの酢酸カリウム）のリニアグラジエントで、即ち、応用pHで緩衝物質なしの系において実行された。
【０１４７】
分取精製用のクロマトグラムは、図6で示される。単独で、当該クロマトグラフィプロファイルから、グリコシル化された不純物が分離されたことが認められるが、しかしながら、切断型と標的GLP-1の部分との間の明瞭なピークも分離も得られなかった。
【０１４８】
例3と11のクロマトグラフィプロファイルを比較すると、仮にpHが緩衝物質により制御される場合、標的GLP-1部分は、pH7.5で切断型不純物から分離されるが、例えば、pHを制御する緩衝物質なしで中性pHで当該分離を走らせることは、当該系の分離効率を低下させることが示される。例3と11の間において計画された他の何れの違いも、適用されなかった。
【０１４９】
例１２
Arg34GLP-1（7-37）は、他で記載されたような従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871の技術によって酵母（S.cerevisiae）で発現された。発酵ブロス中のArg34GLP-1（7-37）は、次に、pH 9.0でグリシン・バッファでの溶出による逆相クロマトグラフィによって精製された。
【０１５０】
pH 7.5（1.1mg/mL）の溶出液の33mLが、25％のエタノール、250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのクエン酸ナトリウム、pH6.75の40mLで平衡化された、20ｍLのソース(Source)15RPC(アマシャム・ファルマシア・バイオテック(Amaersham Pharmacia Biotech))ポリスチレン／ジビニルベンゼン(粒径15μm)カラムに添加された。当該カラムは10mLの平衡溶液で洗浄され、溶出は35〜45%のエタノール(250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのクエン酸ナトリウム)pH 6.75 のリニアグラジエント240mLの間で実行された。温度は、全工程の間、23℃に保たれた。
【０１５１】
Arg34GLP-1（7-37）と当該ペプチドのグリコシル化型との間の明瞭なピークと分離が得られた。
【０１５２】
例１３
Arg34GLP-1（7-37）は、他で記載される従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871に記載の技術によって酵母（S.cerevisiae）で発現された。発酵ブロスでのArg34GLP-1（7-37）は、次にpH 9.0でグリシン・バッファでの溶出により逆相クロマトグラフィによって精製された。
【０１５３】
4.6mLの溶液（1.2mg/mL）が、25%のエタノール、250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのNaH2PO4、pH 7.5の6mLで平衡化された3mLのRPC PolyBio(BioSepra)(粒径15μm)のカラムに添加された。当該カラムは1.5mLの平衡溶液で洗浄され、溶出は35〜45%のエタノール(250mmol/kgの塩化カリウム、5mmol/kgのNaH2PO4)のリニアグラジエントで、pH 7. 5で36mLの間実行された。温度は、全工程の間、23℃に保たれた。
【０１５４】
Arg34GLP-1（7-37）と当該ペプチドのグリコシル化型との間の明瞭なピークと分離が得られた。
【０１５５】
例１４
Arg34GLP-1（7-37）は、他で記載される従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871に記載の技術によって酵母（S.cerevisiae）において発現された。発酵ブロスにおけるArg34GLP-1（7-37）は、従来の逆相クロマトグラフィによって精製され、続いて、ペプチドの等電pH、すなわちpH 5.4で沈殿された。当該沈殿物は、遠心分離によって単離された。
【０１５６】
イソプレシピテイト(isoprecipitate)な30gは、1.5Lの水の中に溶解された。pHは、8.37に調整された。当該溶液の220mLのプールは、ほぼpH 3.5に合っており、45%(w/w)のエタノール、20mmol/kgのクエン酸、75モル/kgの塩化カリウム、pH 3.5で平衡化された７８ｍLのソース(Source)30S(アマシャム・ファルマシア・バイオテック)のカラムに添加した。当該カラムは、45%(w/w)のエタノール、20モル/kgのクエン酸、87.5モル/kgの塩化カリウム、pH 3.5の160mLで洗浄され、Arg34GLP-1（7-37）は400mLの200mmol/kgのグリシン(pH 9.0)で溶離された。溶離液はプールされた。
【０１５７】
CIEC-プール（1.8mg/mL）の160mLは、pH 7.5に調整され、250mmol/kgの塩化ナトリウム、5mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、25%(w/w)エタノール、pH 7.0含む溶媒の160mLで平衡化されたC18置換された(OdDMeSi)の78mLの120Åシリカゲル(粒径15μm)に添加された。当該カラムは40mLの平衡溶液で洗われ、溶出は936mLの間、28〜38%エタノール (250mmol/kgの塩化ナトリウム、5mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム)のリニアグラジエントで実行された。温度は、全工程の間、23℃に保たれた。
【０１５８】
Arg34GLP-1（7-37）と当該ペプチドのグリコシル化型との間の明瞭なピークと分離が得られた。
【０１５９】
例14と5の間で計画された僅かな相違は：より高い添加、添加のための異なるサンプル、異なる塩-およびバッファ・システム、およびより規模が大きい。
【０１６０】
例１５
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-1(7-37)は、WO 00/55119で述べられるようなアシル化により、親ペプチドArg34GLP-1（7-37）から製造された。
【０１６１】
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-1（7-37）は、40mLの25%のw/wエタノールで平衡化されたC18置換された（オクタデシルジメチル・シリル）20mLのシリカゲル（粒径15μm）に添加された。当該カラムは10mLの25%のw/wエタノール、250mmol/kgの塩化カリウム、20mmol/kgのBis-トリス・プロパン、pH 6.5、で洗浄され、Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-1（7-37）は、480mLの間、37〜47.5%エタノール（250mmol/kgの塩化カリウム、20mmol/kgのBis-トリス・プロパン、pH 6.5）のリニアグラジエントで溶出された。温度は、全工程の間、50の℃に保たれた。
【０１６２】
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-1（7-37）並びに未アシル化およびジアシル化された形態の間の明瞭なピークおよび分離が得られ、さらに、未確認の関連する不純物が後の方で分離された。
【０１６３】
例１６
Lys17Arg30GLP-2（1-33）は、従来の組み換えDNA技術によって、例えば、WO 98/08871で述べられるように酵母(S.cerevisiae)において発現された。Lys17Arg30GLP-2（1-33）は、RP-LCで捕捉され、Lys17Arg30GLP-2（1-33）(pH 4.0)の等電pHで沈殿した。当該ペプチドは、更にヒドロキシアパタイトカラムの上で精製されて、100mmol/kgのカリウム水素リン酸塩（pH 7.8）で溶出された。捕獲物のプールは、pH 8で陰イオン交換クロマトグラフィによって精製された。
【０１６４】
陰イオン交換ステップからの当該プールは、25%w/wのエタノール、10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、250mmol/kgの塩化カリウム、pH 7.5で平衡化されたC18置換された（オクタデシルジメチル・シリル）4Lの100Åシリカゲル（粒径15μm）に添加された。当該カラムは、7.8Lの25%のエタノール(10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、250mmol/kgの塩化カリウム、pH 7.5)で洗浄され、続いて23.6Lの34%のエタノール（10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、250mmol/kgの塩化カリウム、pH 7.5）で洗浄された。Lys17Arg30GLP-2（1-33）の溶出は、34〜40%エタノール（10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、250mmol/kgの塩化カリウム、pH 7.5）のリニアグラジエントで78.6Lの間実行された。当該温度は全工程の間、23℃に保たれた。
【０１６５】
Lys17Arg30GLP-2（1-33）と当該ペプチドのmet-酸化された形状との間の明瞭なピークと分離が得られた。さらに、Lys17Arg30GLP-2（1-33）は、切断型不純物（des His-Ala Lys17Arg30GLP-2（1-33））から単離された。
【０１６６】
例１７
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2（1-33）は、WO 00/55119で述べられるようなアシル化によって親ペプチド、Lys17Arg30GLP-2（1-33）から製造された。
【０１６７】
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2（1-33）は、12Lの40%w/wのエタノール、10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、250mmol/kgの塩化カリウム、pH 7. 5で平衡化されたC18置換された（オクタデシルジメチル・シリル）4Lの100Åシリカゲル（粒径15μm）に添加された。当該カラムは、平衡溶媒の4Lと、43%w/wのエタノール、10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、227mmol/kgの塩化カリウム、pH 7.5の4Lで洗浄された。
【０１６８】
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2（1-33）は、45〜60%w/wのエタノール(211〜94mmol/kgの塩化カリウム、10mmol/kgのリン酸二水素ナトリウム、pH 7.5)のリニアグラジエントで120Lの間溶出された。当該温度は、全工程の間、23℃に保たれた。
【０１６９】
他の関連した不純物をプラスしたArg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2（1-33）と非アシル化された形態、加えて、他の関連する不純物との間の明瞭なピークと分離が得られた。
【０１７０】
例１８
エキセンジン-4(1-39)(アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)とエキセンジン-4(2-39)(アミノ酸配列GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)は、Fmoc化学を使用する標準的固相合成方法によって合成された。
【０１７１】
エキセンジン-4（2-39）に関連する不純物を含むエキセンジン-4(1-39)の溶液は、1mgのペプチド/mLの総濃度で水中に溶解された。6mLの当該溶液を、25%w/wのエタノール、0.069%のw/wナトリウム二水素リン酸塩一水和物、2.06%のw/w酢酸カリウムを含みpH 4.02の溶媒15.7mLで平衡化された120Å C18置換された（オクタデシル-ジメチル・シリル）シリカゲル（粒径15μm）含む7.85mLのカラムに添加された。当該カラムを、3.9mLの平衡溶液で洗浄した。溶出は、イソクラティックグラジエントで36％のエタノールで157mL(20CV)の間の行い、続いて、23.6mL(3CV)のリニアグラジエントで0.069％w/wナトリウム・二水素リン酸一水和物、2.06％w/wの酢酸カリウム、pH4.02中で36％〜39％のエタノールにより行われた。その後、溶出は0.069%w/wナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06%w/w酢酸カリウム、pH 4.02、7.85mL(1CV)で維持される中で、59％のエタノールに対するステップグラジエントによって行われた。実験は、室温で実行された。
【０１７２】
エキセンジン-4(1-39)とエキセンジン-4(2-39)との間の明瞭なピークと分離が得られ、エキセンジン-4(2-39)の前にエキセンジン-4(1-39)が溶出された。
【０１７３】
例１９
エキセンジン-4(1-39)とエキセンジン-4(2-39)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって合成された。
【０１７４】
エキセンジン-4（2-39）に関連する不純物含むエキセンジン-4（1-39）の溶液は、水に溶解され1mgのペプチド/mLの総濃度にされた。当該溶液の8mLが、25%w/wのエタノール、0.069%のw/wナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06%のw/w酢酸カリウムを含有するpH 3.5の溶媒の15.7mLで平衡化された120Å、C18置換された(オクタデシル-ジメチル・シリル)シリカゲル(粒径15μm)含む7.85mLのカラムに添加された。当該カラムは、3.9mLの平衡溶液で洗浄された。溶出は、110mL(14CV)の間の37％のエタノールのイソクラティックグラジエントと、続く、24mL(3CV)による、0.069％w/wのナトリウム・二水素リン酸塩一水和物中、2.06%のw/w酢酸カリウム、pH 3.5中で、37％〜39％のエタノールのリニアグラジエントで実行された。その後、溶出は、0.069%のw/wナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06%のw/w酢酸カリウム、pH 3.5中で59%エタノールまでのリニアグラジエントによって71mL(9CV)の間実行された。実験は、室温で実行された。
【０１７５】
エキセンジン-4（1-39）とエキセンジン-4（2-39）との間の明瞭なピークと分離が、得られ、エキセンジン-4(2-39)の前にエキセンジン-4(1-39)が溶出された。
【０１７６】
例２０
L-His1エキセンジン-4(1-39)とD-His1エキセンジン-4(1-39)(アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって総合された。
【０１７７】
関連する不純物D-His1エキセンジン-4（1-39）を含むL-His1エキセンジン-4(1-39)の溶液は、水中で総濃度1mgのペプチド/mLに溶解された。当該溶液の8mLは、25%w/wエタノール、0.069%のw/wナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06%のw/w酢酸カリウム、pH 3.5を含む溶媒の15.7mLで平衡化された120Å、C18置換された(オクタデシル-ジメチル・シリル)シリカゲル(粒径15μm)を含む7.85mLの当該カラムに添加された。当該カラムは、3.9mLの平衡溶液で洗浄された。当該溶出は、37％のエタノールで63mL(8CV)の間のイソクラティックグラジエントで行われ、続いて、0.069％w/wナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06％w/w酢酸カリウム、pH 3.5中で、24mL(3CV)の39％〜39％までのエタノールのリニアグラジエントを行った。続いて、当該溶出は、0.069％w/wのナトリウム・二水素リン酸塩一水和物、2.06％w/wの酢酸カリウム中で59％のエタノールまでのリニアグラジエントにより、71mL(9CV)の間、行った。実験は室温で実行された。
【０１７８】
L-His1エキセンジン-4(1-39)とD-His1エキセンジン-4(1-39)との間の分離が得られて、保持時間分析によって、D-His1エキセンジン-4(1-39)がL-His1にエキセンジン-4 (1-39)の前に抽出されたことが確認された。
【０１７９】
例２１
L-His1エキセンジン-4(1-39)とD-His1エキセンジン-4(1-39)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって合成された。
【０１８０】
関連する不純物D-His1エキセンジン-4(1-39)を含むL-His1エキセンジン-4(1-39)の溶液は、1mgのペプチド/mLの総濃度に水中に溶解された。当該溶液の8mLは、25％w/wエタノール、0.13%のw/w MES、2.06%のw/w酢酸カリウム、pH 6.7を含む溶媒の15.7mLで平衡化された120Å、C18置換された(オクタデシルジメチル・シリル)シリカゲル(粒径15μm)含む7.85mLのカラムに添加された。当該カラムは、3.9mLの平衡溶液で洗われた。溶出は、157mL(20CV)の間、34％のエタノールのイソクラティックグラジエントで行い、続いて、0.13％w/wNES、2.06％w/wの酢酸カリウム、pH6.7中で34％〜39％までのエタノールのリニアグラジエント、24mL(3CV)により行った。その後、当該溶出を、0.13w/w MES、2.06％w/wの酢酸カリウム、pH6.7、7.85mL(1CV)に維持された中で、59％エタノールまでのステップグラジエントにより行った。実験は、室温で実行された。
【０１８１】
L-His1エキセンジン-4（1-39）とD-His1エキセンジン-4（1-39）との間の分離が得られて、保持時間分析によって、D-His1エキセンジン-4（1-39）がL-His1エキセンジン-4（1-39）の前に溶出することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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