(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経系に影響する疾患を治療するための方法および組成物の提供。【解決手段】中枢神経系に影響するリソソーム蓄積症のごとき神経代謝性疾患、例えば、ニーマン−ピック病Ａ型を含む。た、アルツハイマー病のごとき疾患を含む。疾患の治療法として、神経の軸索末端に治療用の導入遺伝子を有する高力価のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む組成物を注入することにより、ＡＡＶベクターが逆行性様式で移送され、導入遺伝子の産物を投与部位より遠位で発現する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
注入されるＡＡＶベクターが中枢神経系の遠位部位に局在する細胞を透過し、コードされた生物学的に活性な分子が翻訳される条件下において、生物学的に活性な分子をコードするＡＡＶベクターを含む組成物を哺乳類の疾患にかかっている中枢神経系部位に投与することを含む方法。
【請求項２】
次いで、翻訳された生物学的に活性な分子が発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類がリソソーム蓄積症または異常なコレステロール代謝である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リソソーム蓄積症がニーマン−ピック病Ａ型である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遠位部位が投与部位に対して対側である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
投与部位が脊髄、脳幹、海馬、線条体、延髄、脳橋、中脳、小脳、視床、視床下部、大脳皮質、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉からなる群から選択されるＣＮＳ領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
投与部位が海馬内であり、遠位部位が対側の歯状回、対側のＣＡ３、内側隔壁、および嗅内皮質からなる群から選択される脳の領域内である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
投与部位が線条体および小脳からなる群から選択される脳の領域内であり、遠位部位が黒質および延髄からなる群から選択される脳の領域内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
投与部位が小脳の深部小脳核内である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型１キャプシドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型１キャプシドを有する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型１キャプシドを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ１またはＡＡＶ２／１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ１またはＡＡＶ２／１である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＡＶベクターＡＡＶ１またはＡＡＶ２／１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類のＣＮＳ内の第２部位への組成物の投与をさらに含む方法であって、組成物が生物学的に活性な分子の産物をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第２の投与部位が第１の投与部位の対側である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的に活性な分子がリソソーム加水分解酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
リソソーム加水分解酵素が表１に記載されるリソソーム加水分解酵素のうちのいずれか１つである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
リソソーム加水分解酵素が酸スフィンゴミエリナーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
投与部位が深部小脳核内であり、遠位部位が脊髄である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
投与部位および遠位部位の間の距離が少なくとも２ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
組成物中のＡＡＶベクター濃度が少なくとも５×１０１２ｇｐ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
注入されるＡＡＶベクターが中枢神経系の遠位部位に局在する細胞を透過し、コードされた金属エンドペプチダーゼが発現される条件下において、金属エンドペプチダーゼをコードするＡＡＶベクターを含む組成物をアルツハイマー病にかかっている哺乳類の中枢神経系部位に投与することを含む方法。
【請求項２６】
金属エンドペプチダーゼがネプリライシン、インスリジン、およびチメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８からなる群から選択される、請求項１または２５に記載の方法。
【請求項２８】
投与部位と遠位部位の間の距離が少なくとも２ｍｍである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
組成物中のＡＡＶベクター濃度が少なくとも５×１０１２ｇｐ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＡＡＶが組み換えＡＡＶベクターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
組み換えＡＡＶベクターがＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８血清型ベクターからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国法典第３５編１１９条（ｅ）項のもとに２００５年５月２日に提出された米国仮出願第６０／６７７０５７号および米国仮出願第６０／６８５８０８号の優先権を主張し、それらの内容を参照により本明細書に一体化させる。
【０００２】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）および特に脊髄に患った疾患を治療するための組成物および方法に関する。本発明はさらにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのごときウイルスベクターを含む組成物およびその投与方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）として知られる代謝性疾患のグループは、４０種類以上の遺伝子疾患を含み、それらの多くは多様なリソソーム加水分解酵素における遺伝子欠損に関する。代表的なリソソーム蓄積症および関連する欠損酵素が表１に記載される。
【表１】
2014037418.tif 000002
【０００４】
ＬＳＤの顕著な特徴はリソソーム代謝産物の異常な蓄積であり、核周辺部における多数の膨張したリソソーム形成を導く。ＬＳＤ治療の（肝臓特異的な酵素病の治療に対する）主な試みは、複数の別々の組織において、リソソーム蓄積の病態を逆行させることを必要とする。いくつかのＬＳＤは、酵素補充療法（ＥＲＴ）として知られる欠乏した酵素の経静脈内注入により効果的に治療され得る。例えば、ゴーシェ病１型患者が内臓疾患のみにかかっていると、組み換えグルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、ジェンザイム社）を用いてＥＲＴに有利に反応する。しかし、ＣＮＳに罹患する代謝性疾患にかかっている患者（例、２または３型のゴーシェ病）は、補充酵素が血液脳関門（ＢＢＢ）により脳に入ることを阻害されるため、静脈内のＥＲＴに反応しない。さらに、直接注射による補充酵素を脳へ導入する試みは、１つには局所的な高濃度による酵素の毒性（未発表データ）および脳における限られた実質拡散の割合のために成功していない（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）異化反応の減少によるＡβの蓄積に特徴付けられる中枢神経（ＣＮＳ）に罹患する疾患である。Ａβの蓄積とともに、Ａβが細胞外プラーク内に凝集し、シナプス機能障害および神経喪失を引き起こす。病態は認知症、運動障害、次いで死を招く。
【０００６】
遺伝子治療は、ＬＳＤおよびアルツハイマー病を含むＣＮＳに罹患した疾患のために現れた治療法である。このアプローチにおいて、正常な代謝経路への回復および病態の逆行が、遺伝子の正常型または改良型の遺伝子を有するベクターを罹患した細胞に伝達することによって生じる。
【０００７】
ＣＮＳ遺伝子治療は、分裂終了神経に効率的に感染できるウイルスベクターの発展により促進されてきた。ＣＮＳへの遺伝子送達のためのウイルスベクターの総説については、Ｄａｖｉｄｓｏｎら．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，４：３５３-３６４を参照。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは好都合な毒性および免疫原性特性を示し、神経細胞に導入でき、ＣＮＳにおける長期発現を媒介できることから、ＣＮＳ遺伝子治療に最適と考えられている（Ｋａｐｌｉｔｔら．  （１９９４）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ８：１４８-１５４；  Ｂａｒｔｌｅｔｔら．  （１９９８）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ９：１１８１-１１８６；およびＰａｓｓｉｎｉら．  （２００２）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２２：６４３７-６４４６）。
【０００８】
治療用導入遺伝子産物、例えば酵素は、導入した細胞付近に分泌され、次いで他の細胞により吸収されて病態を緩和しうる。このプロセスはクロスコレクション（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）として知られる（Ｎｅｕｆｅｌｄら．  （１９７０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６９：１４１−１４６）。しかし、ＬＳＤ状況下の蓄積病態のごとき病態の修復は、典型的には、注入ベクターの限られた実質拡散および分泌される導入遺伝子産物のため、注射部位の極めて近くに限定される（Ｔａｙｌｏｒら．  （１９９７）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ３：７７１-７７４；  Ｓｋｏｒｕｐａら．  （１９９９）  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １６０：１７-２７）。よって、複数の脳領域に罹患する神経病態は、特にヒトのごとき大きな脳において、複数の領域に分布した注入を用いた広範囲のベクター送達を必要とする。これは脳の損傷の危険性を著しく増大させる。加えて、脳のいくつかの領域は外科手術でアクセスすることが困難でありうる。それゆえ、拡散を除いたＣＮＳ内へのベクター輸送の他の様式が有益であろう。
【０００９】
ウイルスが軸索の末端に投与される場合、ウイルスは内部に移行し、軸索に沿って逆行して核に輸送される。ある脳領域の神経は軸索により遠位の脳領域まで相互に連結し、それによりベクター送達に輸送系を提供する。アデノウイルス、ＨＳＶ、および仮性狂犬病ウイルスの研究は、脳内の遠位構造に遺伝子に送達するこれらウイルスの輸送特性を利用してきた（Ｓｏｕｄａｓら．  （２００１）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １５：２２８３-２２８５；  Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄら．  （１９９１）  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．，  ３：２０３-２１８；およびｄｅＦａｌｃｏら．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９１：２６０８-２６１３）。
【００１０】
数グループは、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）による脳への送達が頭蓋内の注入部位に限定されることを報告した（Ｋａｐｌｉｔｔら．  （１９９４）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ８：１４８-１５４；  Ｐａｓｓｉｎｉら．  （２００２）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２２：６４３７-６４４６；  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら．  （１９９８）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  ７９３：１６９-１７５）。１つの最近の報告では、ＡＡＶ２の逆行性の軸索輸送が、正常なラット脳の回路選択時に起こり得ることが示唆される（Ｋａｓｐａｒら．（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５：５０-５６）。しかし、どんな特異的なパラメーターが確認された軸索輸送を担い、十分かつ有効な軸索輸送が細胞障害の状態の疾患神経で起きているのかどうか、知られていない。実際、ＬＳＤの神経で見られる損傷が軸索の輸送を干渉するか、または妨害することさえ報告され（Ｗａｌｋｌｅｙ（１９９８）  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，  ８：１７５-１９３で考察されている）、疾患の神経は軸索に沿ったＡＡＶの輸送を支持しないであろうと推定される。
【００１１】
それゆえ、ＣＮＳに罹患する代謝性疾患を処置するための新しい治療方法を開発することが必要とされる。
【発明の概要】
【００１２】
（発明の要約）
本発明は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、またはＣＮＳ機能の減少のリスクに特徴付けられるもしくは関連する異常なコレステロール蓄積機能のごとき代謝性疾患を治療または予防するための方法および組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、ＣＮＳ機能の減少のリスクに特徴付けられるもしくは関連するアルツハイマー病のごとき中枢神経系（ＣＮＳ）に罹患する疾患を治療または予防するための方法および組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに罹患した患者の脳における領域を選択するために、最小限の侵襲で導入遺伝子を標的に送達する方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる利点は、部分的には以下の記載で説明され、部分には以下の記載から理解され、または本発明の実施によって理解されるかもしれない。
【００１６】
ニーマン−ピック病Ａ型のモデルである酸スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）ノックアウトマウスに、ヒトＡＳＭ遺伝子（ＡＡＶ−ＡＳＭ）を有するＡＡＶ２ベクターが脳の片側半球への単一頭蓋内注射によって投与された。本発明は、部分的には、疾患脳への高力価ＡＡＶ−ＡＳＭの注入が、注入部位に分布する投射神経の組織分布に沿った一貫したパターンにおいて、複数の遠位部位内でのＡＡＶ−ＡＳＭの発現を生じるという知見および実施に基づく。本発明はさらに、部分的には、ＡＡＶ−ＡＳＭが輸送され、ＡＳＭが発現される注入部位および遠位部位におけるリソソーム蓄積病態の広範な修復の知見および実施に基づく。
【００１７】
別の態様では、本発明は、深部小脳核内への片側または代替的には両側の注入後、ＡＳＭＫＯマウスにおいてコレステロール蓄積の病態を補正し、機能の回復を開始する方法を提供する。
【００１８】
さらに、上記記載の方法であって、導入遺伝子がＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８血清型からなる群から選択される組み換えＡＡＶベクターに送達される方法が提供される。実施の目的のみにおいて、組み換えベクターはマウスモデルにおける機能的なヒトＡＳＭタンパク質をコードした。
【００１９】
従って、一の態様では、本発明は、哺乳類において神経代謝性疾患を治療する方法を提供する。本発明の方法によって治療される個体群は、表１に記載される疾患のごとき、特にかかる疾患がＣＮＳに罹患する場合には、ＬＳＤにかかっている患者またはＬＳＤに発展する危険性のある患者を含むが、それらだけに限らない。実施の具体例では、該疾患はニーマン−ピック病Ａ型および／または一般にＮＰＡに関連した第二のコレステロール蓄積の病態である。
【００２０】
一の態様では、開示した方法は、患っている患者のＣＮＳに治療産物をコードする導入遺伝子を有するＡＡＶウイルスベクターを投与し、導入遺伝子が治療レベルで投与部位から遠位のＣＮＳ内において発現されることを可能にすることを含む。加えて、該ベクターは、ＣＮＳ障害を治療するのに有効である生物学的に活性な分子をコードするポリヌクレオチドを含んでよい。かかる生物学的に活性な分子は、全長タンパク質の野生型または変異型、タンパク質断片の野生型または変異型、合成ポリペプチド、抗体、およびＦａｂ’分子のごとき抗体断片を含むがそれらだけに限らないペプチドを含んでよい。生物学的に活性な分子はまた、一本鎖または二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでよい。本明細書で開示される方法の実施に用いられてよい典型的なヌクレオチド技術の総説には、Ｋｕｒｒｅｃｋ，  （２００３）  Ｊ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０，  １６２８−１６４４  ［アンチセンス技術］；  Ｙｕら．，  （２００２）  ＰＮＡＳ  ９９（９），  ６０４７−６０５２  ［ＲＮＡ干渉技術］；ならびにＥｌｂａｓｈｉｒら．，  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５（２）：１８８−２００  ［ｓｉＲＮＡ技術］を参照。
【００２１】
例示の具体例では、投与は疾患脳への高力価ＡＡＶベクター溶液の直接柔組織内注射によって行われる。その後、導入遺伝子は、投与部位から少なくとも２、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍにおいて治療レベルで投与部位の遠位、対側または同側で発現される。
【００２２】
別の態様では、本発明はまた、インビトロにおいて、組み換えＡＡＶゲノムを疾患に冒された神経の核に送達する方法を提供する。いくつかの具体例では、神経で示される細胞病態は、表１に記載される疾患のごときリソソーム蓄積症の細胞病態である。例示の具体例では、病気はニーマン−ピック病Ａ型である。他の具体例では、示される細胞病態はアルツハイマー病の細胞病態である。組み換えＡＡＶゲノムを病気に冒された神経の核に送達する方法は、病気に冒された神経の軸索末端を、組み換えＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を含む組成物に接触させ、ウイルス粒子が取り込まれ、神経の核まで軸索に沿って細胞内部を逆行的に輸送されることを含む。組成物中のベクター濃度は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（ｘ１０１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（ｘ１０９ｔｕ／ｍｌ）；あるいは（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（ｘ１０１０ｉｕ／ｍｌ）である。ある具体例では、神経が投射神経であり、および／または神経の核までの軸索末端の距離が少なくとも２、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍである。
【００２３】
本発明は、患者の脳の深部小脳核（ＤＣＮ）領域の少なくとも１つの領域に、導入遺伝子を含む組み換え向神経性ウイルスベクターを投与することにより、患者の脊髄および／または脳幹領域に送達する方法および組成物を提供する。ウイルス送達は、脊髄および／または脳幹領域において導入遺伝子の発現に好ましい条件下で行う。例示の具体例では、該疾患はニーマン−ピック病Ａ型である。他の具体例では、示される細胞の病態がアルツハイマー病の病態である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、患者の脳の運動皮質領域に導入遺伝子を含む組み換え向神経性ウイルスベクターを投与することにより、患者の脊髄に導入遺伝子を送達する方法および組成物を提供する。ウイルスベクター送達は、脊髄および／または脳幹領域において導入遺伝子の発現に好ましい条件下で行う。運動皮質領域に投与されるウイルスベクターは、細胞体領域を介して運動神経によって内部移入され、導入遺伝子が発現される。次いで、発現した導入遺伝子は、脊髄に存在する運動神経の軸索末端部分への順行性輸送を経てよい。運動皮質の特性から、脳のこの領域に投与されるウイルスベクターはまた、運動神経の軸索末端まで内部移行されてよい。ウイルスベクターはまた、運動神経の軸索に沿って逆行性移行を経て、運動神経の細胞体で発現されてよい。例示の具体例では、該疾患はニーマン−ピック病Ａ型である。他の具体例では、示される細胞の病態はアルツハイマー病の病態である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、神経代謝性疾患、例えば、ＣＮＳで発症するＬＳＤを患っている哺乳類の神経またはグリア細胞であるＣＮＳの標的細胞に、治療上の導入遺伝子産物を送達する方法を提供する。該方法は、神経の軸索末端に治療上の導入遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部を有するＡＡＶベクターを含む組成物を接触させ、ウイルス粒子を取り込ませ、神経の核まで神経に沿って細胞内を逆行的に移行させること；治療上の導入遺伝子産物を発現させ、神経付近で分泌させ、次いで標的細胞に治療上の導入遺伝子産物を取り込ませ、それにより標的細胞内の病態を軽減することを含む。特定の具体例では、組成物中のベクター濃度は、少なくとも（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０９ｔｕ／ｍｌ）；あるいは（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１０ｉｕ／ｍｌ）である。
【００２６】
本発明の方法では、治療上の導入遺伝子は生物学的に活性のある分子をコードし、ＣＮＳでのその発現は少なくとも神経病態の部分的な修復を生じる。いくつかの具体例では、治療上の導入遺伝子産物はリソソーム加水分解酵素である。例示の具体例では、リソソーム加水分解酵素はＡＳＭである。他の具体例では、治療上の導入遺伝子は金属エンドペプチダーゼ、例えば、ネプリライシンである。
【００２７】
前記の一般的な記載および下記の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、請求される発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、海馬への高力価（９．３×１０１２ｇｐ／ｍｌ）ＡＡＶ−ＡＳＭの２μｌ注入後の５または１５週齢のＡＳＭＫＯマウス脳の横断面の図を表す。注入部位が垂直線で示される；ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで検出されるＡＳＭｍＲＮＡの発現は小さな円で表され；免疫組織学的染色で検出されるＡＳＭタンパク質の発現は、大きな斜線の円で表される。発現パターンは、脳の両半球における海馬および皮質領域の病態と逆の広範な領域（薄い斜線で表される）で生じた。
【００２９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａで示される海馬内への高力価ＡＡＶの注入後のマウス脳の遠位領域へのＡＡＶの軸索輸送を表す。海馬（１０）への注入は、対側海馬（２０）への海馬内回路を媒介および嗅内皮質への嗅内歯状（ｅｎｔｏｒｈｉｎｏｄｅｎｔａｔｅ）回路を媒介するウイルスベクターの軸索輸送を生じた。
【００３０】
【図１Ｃ】図１Ｃは、マウス脳の海馬内および嗅内歯状回路の接続を示す模式図である。海馬内（１０）への注入は、アンモン角領域３（ＣＡ３）および歯状回顆粒細胞層（Ｇ）に局在する細胞体の感染および送達を生じた。加えて、注入したＡＡＶベクターのサブセットは、注入部位を神経分布する投射神経の軸索末端に感染し、逆行性軸索輸送を経て、海馬（２０）の対側部分のＣＡ３領域（ＣＡ）および門部（Ｈ）、ならびに嗅内皮質（３０）の同側部分のＣＡ３領域（ＣＡ）および門部（Ｈ）に導入遺伝子を送達する。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａは、図１Ａに記載される高力価ＡＡＶ−ＡＳＭの海馬内注入後の５または１５週齢のＡＳＭＫＯマウス脳の横断面の図を表す。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎで検出されるＡＳＭｍＲＮＡ発現は小さい円で表され；免疫組織化学的染色で検出されるＡＳＭタンパク質発現は大きい斜線の円で表される。該注入は、中隔で検出されるＡＳＭｍＲＮＡおよびタンパク質を起こした。この発現パターンは病態と逆の広範な領域で生じた（薄茶色の斜線で表される）。
【００３２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、図１Ａで表される海馬への高力価注入のマウス脳の遠位領域へのＡＡＶの軸索輸送を表す。海馬（１０）への注入は、注入部位（垂直線で表される）から中隔（４０）までの中隔海馬回路を媒介するウイルスベクターの軸索輸送を生じた。
【００３３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、中隔海馬回路の接続を表す模式図である。海馬への注入は、ＣＡ３領域（１１）に局在する細胞体への形質導入を生じた。加えて、ＡＡＶベクターのサブセットは、注入部位に神経分布する投射神経の軸索末端に感染し、逆行性の軸索輸送を経て、内側中隔（４０）に導入遺伝子を送達する。
【００３４】
【図３】図３は、マウス脳の線条体（５０）へのＡＡＶの高力価注入後の黒質線条体回路におけるＡＡＶの軸索輸送を表す。ＡＡＶの軸索輸送は、注入部位（垂直線で表される）から黒質（６０）まで生じる。
【００３５】
【図４】図４は、ＡＳＭＫＯマウス脳の小脳（７０）へのＡＡＶ−ＡＳＭの高力価注入後の小脳髄質（ｍｅｄｕｌｌｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ）回路におけるＡＡＶの軸索輸送を表す。ＡＡＶ２の軸索輸送は、注入部位（垂直線で表される）から延髄（８０）まで生じる。
【００３６】
【図５】図５は、同側海馬（１０）におけるＡＡＶ７−ＡＳＭの高力価注入後の海馬内、黒質線条体、および嗅内歯状の回路におけるＡＡＶの軸索輸送、ならびにを表す。同側海馬（垂直線で表される）のＡＡＶ７−ＡＳＭ注入後、形質導入された細胞を、対側海馬（９０）、内側中隔（４０）、および嗅内皮質（１００）の全体の吻尾軸に沿ってｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて調べることで検出した。
【００３７】
【図６】図６Ａないし６Ｅは、ＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へのヒトＡＳＭをコードする異なるＡＡＶ血清型ベクター（（Ａ）２／１、（Ｂ）２／２、（Ｃ）２／５、（Ｄ）２／７および（Ｅ）２／８）の注入後の矢状小脳切片におけるヒトＡＳＭ免疫陽性染色を示す。
【００３８】
【図７】図７Ａないし７Ｅは、深部小脳核から脊髄までのｈＡＳＭ輸送を示す。この効果は、ＡＡＶ２／２−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／５−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭで処理したマウスで観察された。（Ａ）ｈＡＳＭ  １０×拡大図；（Ｂ）ｈＡＳＭ  ４０×拡大図；（Ｃ）共焦点ｈＡＳＭ；（Ｄ）共焦点ＣｈＡＴ；ならびに（Ｅ）共焦点ｈＡＳＭおよびＣｈＡＴ
【００３９】
【図８】図８は、深部小脳核へのヒトＡＳＭをコードする異なるＡＡＶ血清型ベクター（２／１、２／２、２／５、２／７および２／８）の注入後の小脳組織の均一レベルを示す（ｎ＝５／群）。同一の文字が並んでいない群は有意に異なる（ｐ＜０．０００１）。
【００４０】
【図９】図９ＡないしＧは、ＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へのヒトＡＳＭをコードする異なるＡＡＶ血清型ベクター［（Ａ）２／１、（Ｂ）２／２、（Ｃ）２／５、（Ｄ）２／７および（Ｅ）２／８］の注入後の矢状小脳切片のカルビンジン免疫陽性染色を示す。
【００４１】
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、（ＡＡＶ−βｇａｌを注入した）ＡＳＭＫＯ、ＷＴ、およびＡＡＶ−ＡＳＭを処理したＡＳＭＫＯマウス（ｎ＝８／群）における加速およびロッキングロータロッドの成績（１４週齢）を示す。同一文字が並んでいない群は有意に異なる。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭを注入されたマウスは、加速ロータロッド試験において、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入されたＡＳＭＫＯマウスより有意（ｐ＜０．００９）に長い落下するまでの待ち時間を示した。ロッキングロータロッド試験では、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭを注入されたマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入されたマウスより有意に（ｐ＜０．０００１）長い落下するまでの待ち時間を示した。
【００４２】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡＳＭＫＯ（ｎ＝８）、ＷＴ（ｎ＝８）、および両側にＡＡＶ−ＡＳＭ（ｎ＝５／群）を処理したマウス（２０週齢）におけるロータロッドの成績を示す。加速およびロッキングの両試験において、ＡＡＶ−ＡＳＭを処理したマウスが、ＡＳＭＫＯ  ＡＡＶ２／１−βｇａｌを処理したマウスより有意（ｐ＜０．０１）に良好な成績を示した。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭを注入したマウスの成績は、加速およびロッキングの両試験において野生型と区別できなかった。
【００４３】
【図１２】図１２は、ＡＡＶ１−βｇａｌまたはｈＡＳＭをコードするＡＡＶ血清型１と２を両側に注入したＡＳＭＫＯマウスにおける脳のスフィンゴミエリンレベル（２０週齢）を示す。脳を５個の吻尾方向の切片に分けた（Ｓ１＝最も吻側およびＳ５＝最も尾側）。星印はデータ点がＡＳＭＫＯマウスと有意に異なることを示す（ｐ＜０．０１）。
【００４４】
【図１３Ａ】図１３Ａは、深部小脳核領域（内側、中間部、および外側）および脊髄領域（頸部、胸部、腰部、および仙骨部）間の接続を表す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、深部小脳核領域（内側、中間部、および外側）および脳幹領域（中脳、脳橋、および延髄）間の接続を表す。接続は矢印で表され、神経の細胞体領域から開始し、神経の軸索末端領域で終結する。例えば、ＤＣＮの３つの領域は各々、脊髄の頸部領域で終結する軸索を送り出す細胞体を有する神経である。一方、脊髄の頸部領域は、ＤＣＮの内側または中間領域のどちらかで終結する軸索を送り出す細胞体を有する。
【００４５】
【図１４】図１４は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達後の脳幹または上部運動神経における緑色蛍光タンパク質の分布を表す。
【００４６】
【図１５】図１５は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達後の脊髄領域における緑色蛍光タンパク質の分布を表す。
【００４７】
【図１６】図１６は、深部小脳核（ＤＣＮ）へのＡＡＶ１ベクターを発現するＧＦＰの両側送達後のマウス脳内のＧＦＰ分布を示す。ＤＣＮに加えて、ＧＦＰ陽性染色はまた、嗅球、大脳皮質、視床、脳幹、小脳皮質および脊髄でも観察された。これらの領域の全ては、ＤＣＮからの投射を受け取るか、および／またはＤＣＮへの投射を送り出すかのどちらかである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明を、より容易に理解できるように、最初に一定の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【００４９】
「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、適切な条件下で翻訳でき、および／または発現でき、それを導入した細胞に所望の性質を付与し、あるいは所望の治療結果をもたらすポリヌクレオチドを称す。
【００５０】
ウイルス力価に関して用いられる「ゲノム粒子（ｇｐ）」、または「ゲノム等価体」という用語は、感染性または機能性とは無関係に組換えＡＡＶ  ＤＮＡゲノムを含有するビリオン数を称す。特定のベクター調製におけるゲノム粒子数は、本明細書における実施例、または、例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０：１０３１−１０３９；  Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ６：２７２−２７８に記載されるような手法により測定できる。
【００５１】
ウイルス力価に関連して用いられる「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」という用語は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：１９６３−１９７３に記載されている複製中心アッセイとしても知られている感染中心アッセイにより測定される感染性および複製能力のある組換えＡＡＶベクター粒子数を称す。
【００５２】
ウイルス力価に関連して用いられる「形質導入単位（ｔｕ）」という用語は、本明細書の実施例、または、例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １４４：１１３−１２４；  またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０：５２０−５３２  （ＬＦＵ  ａｓｓａｙ）に記載されているものなど、機能性アッセイにより測定される機能性導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子数を称す。
【００５３】
「治療的」、「治療的有効量」という用語およびそれらの同源語は、神経病理学、例えば、本明細書またはＷａｌｋｌｅｙ  （１９９８）  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，  ８：１７５−１９３に記載されているものなどのリソソーム蓄積症と関連する細胞病態の矯正など、対象における症状の予防もしくは発症の遅延あるいは改善、または所望の生物学的結果の達成をもたらす化合物量を称す。「治療的矯正」という用語は、対象における症状の予防もしくは発症の遅延あるいは改善をもたらす程度の矯正を称す。有効量は、当業界に周知の方法、および引き続く節に記載された方法により決定できる。
【００５４】
方法および組成物
ＡＳＭＫＯマウスは、Ａ型およびＢ型のニーマン−ピック病の公認モデルである（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら（１９９５）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １０：２８８−２９３；  Ｊｉｎら（２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １０９：１１８３−１１９１；  およびＯｔｔｅｒｂａｃｈ  （１９９５）  Ｃｅｌｌ，  ８１：１０５３−１０６１）。ニーマン−ピック病（ＮＰＤ）は、リソソーム蓄積症として分類され、酸スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ；スフィンゴミエリンコリンホスホヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．３．１２）における遺伝子欠損を特徴とする遺伝性神経代謝障害である。機能性ＡＳＭタンパク質の欠乏により、脳の至る所でニューロンおよびグリア細胞のリソソーム内にスフィンゴミエリン基質の蓄積を生じる。これによって、Ａ型ＮＰＤの特徴でありかつ第一の細胞表現型である神経細胞体において多数の膨張性リソソームの形成に至る。膨張性リソソームの存在は、正常な細胞機能の喪失および幼児期における罹患個体を死亡に至らしめる進行性神経変性過程と相互に関連する（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ｅｄｓ．  Ｓｃｒｉｖｅｒら，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１，  ｐｐ．  ３５８９−３６１０）。第二の細胞表現型（例えば、さらなる代謝異常性）はまた、この疾患、とりわけリソソームコンパートメントにおけるコレステロールの高レベル蓄積に関連している。スフィンゴミエリンは、コテステロールに対して強力な親和力を有し、ＡＳＭＫＯマウスおよびヒト患者のリソソームにおいて大量のコレステロールの封鎖を生じさせる（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：４４９７６−４４９８３；  Ｓｌｏｔｔｅ  （１９９７）  Ｓｕｂｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２８：２７７−２９３；  およびＶｉａｎａら（１９９０）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２７：４９９−５０４）。
【００５５】
本発明は、ＡＳＭＫＯマウスの疾患脳への高力価ＡＡＶ−ＡＳＭの海馬内への注入により、注入部位を神経支配する突出ニューロンの局所解剖学的組織化と一致する様式で、注入部位から遠位にＡＳＭ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が生じるという発見と立証に一部基づいている。注入部位での強い発現に加えて、ＡＳＭ  ｍＲＮＡおよびタンパク質はまた、同側（注入された）海馬の外側の幾つかの遠位領域、特に対側海馬歯状回とＣＡ３、ならびに内側隔壁と嗅内皮質において検出される。本発明はさらに、遠位部位における海馬貯蔵病態の広範な矯正、それによってより少数の注入部位による、より大容量の矯正を可能にすることの発見および立証に一部基づいている。
【００５６】
したがって、一態様において、本発明は、哺乳動物における神経代謝障害を治療する方法を提供する。本発明の方法により治療を受ける集団としては、限定はしないが、表１に掲げられた疾患、特にこのような疾患がＣＮＳに影響を及ぼす場合などの神経代謝障害、例えば、ＬＳＤに罹っているか、またはそれを発現する危険性のある患者が挙げられる。例示となる実施形態において、該疾患はニーマン−ピック病Ａ型である。一定の実施形態において、神経代謝障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、テイ−サックス病、レッシュ−ナイハン病、およびクロイツフェルト−ヤコブ病が挙げられる。しかしながら、治療的導入遺伝子としてメタロエンドペプチダーゼを利用する本発明の方法は、アルツハイマー病およびアミロイド関連障害の治療に特に有用である。
【００５７】
幾つかの実施形態において、神経代謝障害を治療する方法は、導入遺伝子産物が第一の部位に対して遠位のＣＮＳ内の第二の部位に治療的レベルで発現されるように、治療用導入遺伝子を担持する高力価ＡＡＶベクターの投与を含んでなる。幾つかの実施形態において、高力価の組成物は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０９ｔｕ／ｍｌ）；または（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１０ｉｕ／ｍｌ）である。さらなる実施形態において、この投与は、疾患脳内への高力価ＡＡＶベクター液の直接的柔組織内注入により達成され、その後、導入遺伝子は、投与部位から少なくとも２、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍの治療レベルで投与部位に対して遠位に、対側的または同側的に発現される。
【００５８】
第一の部位と第二の部位との間の距離は、投与部位（第一の部位）と、当業界に公知の手法を用いて測定された、または実施例に記載された、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションの遠位部位（第二の部位）の検出可能な形質導入の境界域との間の最小距離領域として規定される。より大きな哺乳動物のＣＮＳにおける幾つかのニューロンは、軸策突起のため大きな距離に亘っていることがあり得る。例えば、ヒトにおいて、幾つかの軸索は、１０００ｍｍ以上の距離に亘っていることがあり得る。したがって、本発明の種々の方法において、ＡＡＶは、このような距離での軸索の全長に沿って軸索輸送されて親細胞体に到達し、形質導入できる。
【００５９】
ＣＮＳ内へのベクター投与部位は、投与部位および標的領域が軸策接続を有する限り、神経病理学の所望の標的領域および関与する脳回路のトポロジーに基づいて選択される。この標的領域は、例えば、３−Ｄの定位座標を用いて規定できる。幾つかの実施形態において、投与部位は、注入されたベクター全量の少なくとも０．１、０．５、１、５、または１０％が、少なくとも１、２００、５００、または１０００ｍｍ３の標的領域において遠位に送達されるように選択される。投与部位は、脳の遠位領域に接続する突出ニューロンにより神経支配された領域に局在化できる。例えば、黒質および被蓋野は、高密度突出を尾状核および被殻（集合的に線条体として知られている）へ送り出している。黒質および腹側被蓋内のニューロンは、線条体への注入後のＡＡＶの逆方向輸送による形質導入のために標的化できる。別の例として、海馬は、脳の他の領域から十分に規定された予測可能な軸索突出を受け入れている。他の投与部位は、例えば、脊髄、脳幹（延髄と脳橋）、中脳、小脳（小脳核を含む）、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または、皮質内の後頭葉、側頭葉、頭頂葉または前頭葉）、またはそれらの組合せにおいて局在化できる。
【００６０】
ヒト脳における構造確認に関しては、例えば、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ：  Ｓｕｒｆａｃｅ，  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｗｉｔｈ  ＭＲＩ，  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｐｐｌｙ，第２版  Ｄｅｕｔｅｒｏｎら，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｌａ，  １９９９；  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ，ら編．  Ｍａｉら，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  １９９７；  および  Ｃｏ−Ｐｌａｎａｒ  Ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ：  ３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ：  Ａｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，ら編．  Ｔａｍａｒａｃｋら，  Ｔｈｙｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂ．，  １９８８を参照されたい。ヒト脳における構造確認に関して、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，第２版，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００を参照されたい。所望ならば、ヒトの脳構造は、別の哺乳動物の脳における同様の構造と相互に関連させることができる。例えば、ヒトおよびげっ歯類を含む大部分の哺乳動物は、海馬の脊椎部分または中隔ポールに突出している同側および内側嗅内皮質双方の同側部分におけるニューロンと同様の嗅内海馬突出の局所解剖学的組織を示すが、一方、腹側海馬への突出は、主に嗅内皮質の内側部分のニューロンから出ている（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第４版，Ｋａｎｄｅｌら編，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  １９９１；  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，第２版  Ｐａｘｉｎｏｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５）。さらに、嗅内皮質の層ＩＩ細胞は、歯状回に突起し、それらは歯状回の分子層の外側三分の二において終結する。層ＩＩＩ細胞からの軸索は、海馬のアンモン角領域ＣＡ１およびＣＡ３に両側的に突出する。層ＩＩＩ細胞からの軸索は、海馬のアンモン角領域ＣＡ１およびＣＡ３に両側的に突出して、表皮ラクノース（ｌａｃｕｎｏｓｅ）分子層内で終結する。
【００６１】
第二の部位（標的）は、第一の部位（投与）に突出しているニューロンを脳および脊髄など、ＣＮＳの任意の領域を配置できる。幾つかの実施形態において、第二の部位は、黒質、延髄、または脊髄から選択されたＣＮＳの領域にある。
【００６２】
中枢神経系の特定領域、特に脳の特定領域にベクターを特異的に送達させるために、それを定位ミクロ注入により投与できる。例えば、手術日に患者は、適切に固定された定位固定フレーム基材（頭蓋骨にねじ止めされた）を有する。定位固定フレーム基材を有する脳（受託者マーキングとＭＲＩ適合性）を、高分解能ＭＲＩを用いて画像化する。次にＭＲＩ画像を、定位固定ソフトウェアを作動させているコンピュータに移す。一連の冠状、矢状および軸性画像を用いて、ベクター注入および軌道の標的部位を判定する。該ソフトウェアは、軌道を定位固定フレームに適切な３次元座標に直接翻訳する。バーホールは、入口部位上に穴があけられ、定位固定装置を所与の深部に移植された針で局在化する。次いで製薬的に許容できる担体中のベクターが注入される。次にＡＡＶベクターが、第一次標的部位への直接注入により投与され、軸索を介して遠位標的部位に逆方向的に輸送される。さらなる投与経路、例えば、直接的可視化下の表層皮質適用、または他の非定位固定適用を用いることができる。
【００６３】
投与される物質の全容量、および投与されるベクターの全粒子数は、遺伝子療法の既知の態様に基づいて当業者により決定される。治療的有効性および安全性は、適切な動物モデルにおいて試験できる。ＬＳＤ類に関して、例えば、種々の十分に特性化された動物モデルには、例えば、本明細書またはＷａｔｓｏｎら（２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ７６：３８３−４０３；  または、Ｊｅｙａｋｕｍａｒら（２００２）  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ａｐｐｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  ２８：３４３−３５７に記載されたものが存在する。
【００６４】
実験的マウスにおいて、注入ＡＡＶ液の全量は、例えば、１μｌと５μｌとの間である。ヒト脳などの他の哺乳動物に関して、容量および送達速度を適切に調整する。例えば、１５０μｌの用量が、霊長類の脳に安全に注入できることが立証されている（Ｊａｎｓｏｎら（２００２）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １３：１３９１−１４１２）。治療は、１標的部位当り単回注入からなるか、または必要ならば、注入路に沿って反復することができる。複数注入部位を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、最初の投与部位に加えて、導入遺伝子を担持するＡＡＶを含んでなる組成物を、最初の投与部位に対して対側または同側であり得る別の部位に投与する。
【００６５】
別の態様において、本発明は、インビボで疾患危険性ニューロンの核への逆方向軸索輸送を介して組換えＡＡＶゲノムを送達する方法を提供する。幾つかの実施形態において、ニューロンにより示される細胞病態は、表１に掲げられるＬＳＤなどである（例えば、Ｗａｌｋｌｅｙ  （１９９８）  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，  ８：１７５−１９３を参照）。例示的実施形態において、該疾患は、ニーマン−ピック病Ａ型である。組換えＡＡＶゲノムの疾患危険性ニューロン核への送達方法は、疾患危険性ニューロンの軸索末端と、組換えＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を含んでなる組成物とを接触させること、ウイルス粒子を形質膜陥入させ、軸索に沿って細胞内に逆方向でニューロン核へ輸送させることを含み、組成物中のＡＡＶゲノム濃度は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０９ｔｕ／ｍｌ）；または（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１０ｉｕ／ｍｌ）である。一定の実施形態において、ニューロンは突出ニューロンであり、および／または軸索末端からニューロン核への距離は、少なくとも２、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍである。種々の実施形態において、ＡＡＶゲノムは、軸索長に依って変わる距離で軸索の全長に沿って輸送される。ヒトにおいて、これらの距離は、１０００ｍｍ以上の大きさであり得る。
【００６６】
別の態様において、本発明は、障害、例えば、表１に掲げられるＬＳＤに罹患した哺乳動物のニューロンまたはグリア細胞であるＣＮＳの標的細胞に、導入遺伝子産物を送達する方法を提供する。該方法は、ニューロンの軸索末端と、治療用遺伝子導入産物をコードする遺伝子の少なくとも一部を担持するＡＡＶベクターを含んでなる組成物とを接触させること；ウイルス粒子を形質膜陥入させ、軸索に沿って細胞内に逆方向でニューロン核へ輸送させること；導入遺伝子産物をニューロンにより発現させ、分泌させること；および第二の細胞に導入遺伝子産物を取り込ませることを含み、それによって導入遺伝子産物は、第二の細胞における病態を軽減する。幾つかの実施形態において、組成物中のＡＡＶベクターの濃度は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０９ｔｕ／ｍｌ）；または（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５、または５０（×１０１０ｉｕ／ｍｌ）である。例えば、リソソームヒドロラーゼは、形質導入細胞により分泌させることができ、引き続きマンノース−６−ホスフェート受容体媒介飲食作用を介して別の細胞により取り込ませ、第二の細胞に形質導入してもよいし、非形質導入でもよい（Ｓａｎｄｏら（１９７７）  Ｃｅｌｌ，  １２：６１９−６２７；  Ｔａｙｌｏｒら（１９９７）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ３：７７１−７７４；  Ｍｉｒａｎｄａら（２０００）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ７：１７６８−１７７６；  および  Ｊｉｎら（２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １０９：１１８３−１１９１）。
【００６７】
本発明の方法において、ベクターが疾患危険性の脳において逆方向性軸索輸送を起こすことができる限り、任意の血清型のＡＡＶもまた使用できる。本発明の一定の実施形態に用いられるウイルスベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８よりなる群から選択される（例えば、Ｇａｏら（２００２）  ＰＮＡＳ，  ９９：１１８５４−１１８５９；  およびＶｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｅｄ．  Ｍａｃｈｉｄａ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３を参照）。本明細書に掲げたもの以外の他の血清型も使用できる。さらに、偽型ＡＡＶベクターもまた、本明細書に記載された方法に利用できる。偽型ＡＡＶベクターは、第二のＡＡＶ血清型のカプシドにおいて１つのＡＡＶ血清型のゲノムを含有するものであり；例えば、ＡＡＶ２カプシドおよびＡＡＶ１ゲノムを含有するＡＡＶベクターまたはＡＡＶ５カプシドおよびＡＡＶ２ゲノムを含有するＡＡＶベクター。（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら，  （２００１）  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １０（２６）：３０７５−８１）。しかしながら、ＡＡＶ５は、治療用導入遺伝子としてメタロエンドペプチダーゼ、例えば、ネプリリシンを利用する本発明の方法から特に除外し得る。
【００６８】
ＡＡＶベクターは、哺乳動物にとって非病原性である一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡパルボウイルスに由来する（Ｍｕｚｙｓｃｋａ  （１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：９７−１２９にレビューされている）。簡潔に言えば、ＡＡＶベースのベクターは、  ウイルスＤＮＡ複製、パッケージングおよび組込みを開始させるために用いられる２つのフランキング１４５−塩基対（ｂｐ）逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を残して、除去されるウイルスゲノムの９６％を占めるｒｅｐおよびｃａｐウイルス遺伝子を有する。ヘルパーウイルスの不在下、野生型ＡＡＶは、染色体１９ｑ  １３．３において優先部位特異性を有してヒト宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、またはエピソーム的に発現を続けることができる。単一のＡＡＶ粒子は、５ｋｂのｓｓＤＮＡまで収容でき、したがって、導入遺伝子および調節要素にとって一般的に十分である約４．５ｋｂを残す。しかしながら、例えば、米国特許第６，５４４，７８５号明細書に記載されたトランス−スプライシング系は、この制限のほぼ二倍であり得る。
【００６９】
例示的実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ１である。多数の血清型の中でアデノ関連ウイルス、特にＡＡＶ２は、広範に研究されており、遺伝子療法ベクターとして特性化されている。当業者は、機能性ＡＡＶベース遺伝子療法ベクターの調製に精通している。ヒト対象への投与のために種々のＡＡＶ製造法、精製法および製剤に関する多数の文献が、広範な公表文献集団に見ることができる（例えば、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｅｄ．  Ｍａｃｈｉｄａ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３を参照）。さらに、ＣＮＳの細胞に標的化されたＡＡＶベース遺伝子療法は、米国特許第６，１８０，６１３号明細書および米国特許第６，５０３，８８８号明細書に記載されている。
【００７０】
本発明の一定の方法において、ベクターは、プロモーターに操作可能に結合した導入遺伝子を含んでなる。該導入遺伝子は、生物活性分子をコードし、ＣＮＳにおけるその発現により、神経病態の少なくとも部分的な矯正をもたらす。幾つかの実施形態において、導入遺伝子は、リソソームヒドロラーゼをコードする。例示的実施形態において、リソソームヒドロラーゼはＡＳＭである。ヒトＡＳＭのゲノムおよび機能性ｃＤＮＡの配列は、公表されている（例えば、米国特許第５，７７３，２７８号明細書および米国特許第６，５４１，２１８号明細書を参照）。他のリソソームヒドロラーゼも、例えば、表１に掲げられているように、適切な疾患に使用できる。
【００７１】
本発明はさらに、ヒトなどの哺乳動物におけるアルツハイマー病を治療する方法を提供する。このような方法において、導入遺伝子は、メタロエンドペプチダーゼをコードする。メタロエンドペプチダーゼは、例えば、アミロイド−ベータ分解酵素ネプリリシン（ＥＣ  ３．４．２４．１１；配列登録番号、例えば、Ｐ０８４７３（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））、インスリン分解酵素インスリシン（ＥＣ  ３．４．２４．５６；配列登録番号、例えば、Ｐ１４７３５  （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））またはチメットオリゴペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．１５；配列登録番号、例えば、Ｐ５２８８８（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））であり得る。
【００７２】
真核細胞における導入遺伝子発現レベルは、主として導入遺伝子発現カセット内の転写プロモーターにより判定される。長期活性を示し、組織特異的、さらに細胞特異的であるプロモーターは、幾つかの実施形態に使用される。プロモーターの非限定例としては、限定はしないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ８：１４８−１５４）、ＣＭＶ／ヒト／β３−グロビンプロモーター（Ｍａｎｄｅｌら（１９９８）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １８：４２７１−４２８４）、ＧＦＡＰプロモーター（Ｘｕら（２００１）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ８：１３２３−１３３２）、１．８−ｋｂニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ｋｌｅｉｎら（１９９８）  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １５０：１８３−１９４）、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ  （１９８９）  Ｇｅｎｅ，  ７９：２６９−２７７）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター（Ｓｈｉｐｌｅｙら（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １０：１００９−１０１８）が挙げられる。発現を延長させるために、他の調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスポスト調節要素（ＷＰＲＥ）（Ｄｏｎｅｌｌｏら（１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ５０８５−５０９２）またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位などの導入遺伝子に操作可能にさらに結合できる。
【００７３】
幾つかのＣＮＳ遺伝子療法適用に関して、転写活性を制御することが必要である。このために、最後にＡＡＶベクターによる遺伝子発現の薬理学的調節は、例えば、Ｈａｂｅｒｍａら（１９９８）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ５：１６０４−１６０１１；  およびＹｅら（１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８３：８８−９１に記載されているように、種々の調節要素および薬物応答プロモーターにより得ることができる。
【００７４】
高力価ＡＡＶ製剤は、例えば、米国特許第５，６５８，７７６号明細書およびＶｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｅｄ．  Ｍａｃｈｉｄａ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３に記載された当業界に公知の技法を用いて製造できる。
【００７５】
以下の実施例により、本発明の例示的実施形態が提供される。当業者は、本発明の趣旨および範囲を変更することなく実施できる多数の変更および変型を認識するであろう。このような変更および変型は、本発明の範囲内に包含される。これらの実施例は本発明を決して限定するものではない。
【実施例】
【００７６】
組換えベクターの力価
ＡＡＶベクター力価は、ゲノムコピー数（１ミリリットル当りゲノム粒子）によって測定された。ゲノム粒子濃度は、以前に報告された（Ｃｌａｒｋら（１９９９）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０：１０３１−１０３９；  Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ６：２７２−２７８）ベクターＤＮＡのＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲに基づいた。簡潔に言えば、精製ＡＡＶ−ＡＳＭを、カプシド消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１．０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、１．０  ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）により５０℃で１時間処理し、ベクターＤＮＡを放出させた。ＤＮＡサンプルに、ベクターＤＮＡ内のプロモーター領域、導入遺伝子、またはポリＡ配列などの特定配列にアニールするプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行した。次にＰＣＲ結果を、パーキンエルマー−アプライドバイオシステムス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ、カリフォルニア州）プリズム（Ｐｒｉｓｍ）７７００シークエンスディテクターシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）などにより提供される、リアルタイムタックマン（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））ソフトウェアにより定量化した。
【００７７】
β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）などのアッセイ可能なマーカー遺伝子を担持するベクターは、感染力アッセイを用いて滴定できる。感受性細胞（例えば、ＨｅＬａ、またはＣＯＳ細胞）に、ＡＡＶを形質導入し、アッセイを実施して、β−ガラクトシダーゼベクター形質導入細胞のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）の染色またはＧＦＰ形質導入細胞に対する蛍光顕微鏡などの遺伝子発現を測定する。例えば、アッセイは、以下のとおり実施される：４×１０４ＨｅＬａ細胞を、規定の増殖培地を用いて２４ウェル培養プレートの各ウェルに入れる。付着後、すなわち、約２４時間後、細胞に１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄタイプ５を感染させ、パッケージベクターの一連の希釈液により形質導入し、３７℃でインキュベートした。１日から３日後、広範な細胞変性効果が観察される前に、適切なアッセイを細胞に実施する（例えば、Ｘ−ｇａｌ染色または蛍光顕微鏡）。β−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子が用いられる場合、細胞を、２％パラホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒドで固定し、Ｘ−ｇａｌを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色する。十分に分離した細胞を提供するベクター希釈液をカウントする。各陽性細胞は、ベクターの１形質導入単位（ｔｕ）を表す。
【００７８】
マウス脳におけるＬＳＤ病態の矯正
１０週齢ＡＳＭＫＯマウスは、中枢神経系において顕しいＮＰＤ病態を含有する。ホモ接合劣性変異体の同定を、ＰＣＲにより検証した。１６匹の１０週齢ＡＳＭＫＯマウスをイソフルランで麻酔にかけ、定位固定フレームに乗せて、基底頭骨を露出させるために切開し、単一のドリルホールを、各マウスの１つの半球上に作製した。２マイクロリットルの高力価（９．３×１０１２ｇｐ／ｍｌ）ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭ（ターゲッテド・ジェネティックス（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、シアトル、ワシントン州）を、前頂の２．０ｍｍ吻側、正中線の１．５ｍｍ右側、および軟膜表面に対して２．０ｍｍ腹側の最終定位固定座標で海馬に注入した。この海馬座標は、ＡＡＶ２ベクターが歯状回のニューロンおよびアンモン角領域（ＣＡ３）のニューロン、ならびに対側海馬の突出ニューロンの軸索末端、内側中隔および嗅内皮質に露出されることを確実にする。注入は、０．２μｌ／分の速度で実施し、全部で１．８６×１０１０のゲノム粒子を各脳に投与した。
【００７９】
当業界に公知であり、Ｓｌｅａｔら（２００４）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４：９１１７−９１２６で再現された方法を用いてＳｍａｒｔｒｏｄ（ＡｃｃｕＳｃａｎ）に対して運動機能に関するロータロッドを加速させ、ロッキングすることにより該マウスを試験した。図１０Ａ／Ｂおよび図１１Ａ／Ｂは、  運動機能の回復測定としてのロータロッド試験結果をグラフとして示している。
【００８０】
次にマウスを、注入後（ｐｉ）５週目（Ｎ＝８）または１５週目（ｎ＝８）に殺処理した。８つの脳（ｐｉ５週目および１５週目における各々ｎ＝４）を、ＡＳＭ  ｍＲＮＡおよびタンパク質に関して、およびリソソーム中のコレステロールの超生理的レベルの減少に関して分析した。残りの８つの脳（ｐｉ５週目および１５週目における各々ｎ＝４）を、ＬＳＤ類の貯蔵病態の反転を判定するための最も直接的で正確な方法である、蓄積され、膨張したリソソームの矯正を分析するために組織病理学に関して処理した。
【００８１】
強い形質導入が、ｐｉ５週目および１５週目に注入（同側）海馬内で検出された。顆粒細胞層および歯状回の門部、ならびにＣＡ３の錐体細胞層およびオリエンズ（ｏｒｉｅｎｓ）細胞層に、ＡＡＶ２ベクターが広範に形質導入された。形質導入のこの印象的なパターンは、海馬台およびアンモン角領域１（ＣＡ１）および２（ＣＡ２）などの同側海馬の他の領域に拡張した。抗ヒトＡＳＭモノクローナル抗体による免疫蛍光法により、多数の細胞中にＡＳＭタンパク質の存在を確認した。全体的なタンパク質パターンは、ｍＲＮＡパターンと同様であり、一部はタンパク質のさらなる局在化分布を有した。
【００８２】
ヒトＡＳＭ  ｍＲＮＡおよびタンパク質はまた、両時点で同側海馬の外側の領域にも検出された。対側歯状回およびＣＡ３、ならびに内側中隔および嗅内皮質は、インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光法に対して陽性であった（図１Ａおよび２Ａ）。これらの遠位部位における形質導入パターンは、注入部位を神経支配する突出ニューロンの局所解剖学的組織化と一致した（図１Ｂおよび２Ｂ）。これにより、ＡＡＶ２が、ＡＳＭＫＯ脳の海馬内、中隔海馬および嗅内歯状回路内の逆方向軸索輸送を起こし、ウイルスベクターが、軸索上での輸送後、核を標的化することを立証した（図１Ｃおよび２Ｃ）。形質導入パターンは、これら遠位部位へのＡＡＶ２輸送に関する理由として柔組織の拡散が支持されていない。このような拡散が生じた場合、注入部位と遠位部位との間の構造は、移動性ウイルスに曝露されていたであろう。しかし、これらの中間構造は、インサイチュハイブリダイゼーションに関して否定的である。例えば、ＡＡＶ２に対して強力な自然的向性を有する線条体は、海馬と内側中隔との間に直接的な経路に存在しているにもかかわらず、遺伝子輸送に関して否定的である。したがって、遠位部位への遺伝子輸送は、逆方向軸索輸送により引き起こされていたに違いなく、このことは、罹患突出ニューロンが、疾患脳を通るＡＡＶ２移動のための有効なハイウェイ輸送系として機能できることを示している。
【００８３】
ＡＳＭＫＯ脳におけるコレステロール異常を反転させるＡＳＭの能力がさらに調査された。フィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ）は、コレステロール複合体に結合するストレプトミセス属フィリピネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ）から単離された自己蛍光分子である（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：４４９７６−４４９８３；  およびＳａｒｎａら（２００１）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １３：１−９）。非注入ＡＳＭＫＯ脳は、これらのコレステロール複合体が豊富なため高レベルのフィリピン染色を有したが、一方、正常なマウス脳では、フィリピン染色が生じなかった。
【００８４】
ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭの注入により、ＡＳＭＫＯマウスのｐｉ５週目および１５週目に同側および対側海馬、中隔および嗅内皮質の全体を通してフィリピン染色の完全な喪失がもたらされた（図１Ａおよび２Ａ）。これは、非注入週齢マッチドＡＳＭＫＯ対照と完全に対照的であり、高レベルのフィリピン染色が、これら前記構造に検出された。ＡＡＶ２注入脳のフィリピン染色の喪失は、ＡＳＭ疾患の第二の細胞表現型（例えば、代謝欠損）が矯正されたことを立証している。これは、ＡＳＭタンパク質がリソソームに標的化され、スフィンゴミエリン−コレステロール複合体と相互作用していることを強く示唆している。この相互作用により、スフィンゴミエリンからのコレステロール放出、引き続いてコレステロールの通常の生物学的経路（分解または細胞膜への転座など（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：４４９７６−４４９８３））への進入を生じ易い。
【００８５】
フィリピン染色の喪失は、全ての細胞層および海馬内、中隔海馬ならびに嗅内歯状回路のサブフィールドに見られた。コレステロール矯正領域は、ＡＳＭタンパク質パターンよりもはるかに大きく、広範囲であった。これは、ＡＡＶ２の逆方向軸索輸送後、突出ニューロンが「酵素ポンプ」として機能し、ＡＳＭタンパク質を周囲組織内に分泌させた可能性を示している。意義深いことに、ＡＳＭＫＯ罹患細胞内のコレステロール蓄積に対する治療効果を得るために必要なのは、ほんの少量のＡＳＭであり、これは免疫蛍光プロトコルの検出限界未満の量である。
【００８６】
ＡＡＶ２−ＡＳＭベクターの軸索輸送が、ＮＰＤの第一の細胞表現型の矯正をもたらすかどうかを評価した。１ミクロンの厚さの組織病理学的脳切片により、ｐｉ５週目でＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭの注入脳において蓄積し、膨張したリソソーム病態の著しい減少が立証された（表２）。正常な細胞構造の部分的または完全修復をもたらす病態の反転が、海馬の同側および対側半球の全ての領域に生じた。内側中隔および嗅内皮質もまた、貯蔵病巣においてかなりの減少を示した。フィリピンデータと同様に、矯正された細胞数は、ＡＳＭタンパク質パターンよりも多く、広く行き渡っていた。病態の反転は、海馬内、中隔海馬ならびに嗅内歯状回路などの海馬に突出することが知られている領域内で明白であった。総合して、矯正容量は、対側海馬において３０〜３５ｍｍ３以上、同側嗅内皮質において５〜８ｍｍ３以上、対側嗅内皮質において１〜２ｍｍ３以上、および内側中隔において２〜３ｍｍ３以上であった。これは、ウイルスが単に拡散により媒介される場合、近くの構造（これらの回路に寄与しない）が矯正されたであろうから、ウイルスベクターの軸索輸送がこの治療効果を招いたことをさらに支持している（表２の「同側線条体」および「対側線条体」を参照）。
【００８７】
病態の反転が、ＡＳＭに特異的であることを立証するために、ＡＳＭＫＯマウスのさらなる群に、レポーター遺伝子、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（ｐｉ５週目および１５週目における各々ｎ＝２）を担持する対照ベクターを注入し、組織病理学に関して処理した。４つの脳の全てにおいて、細胞は、膨張性リソソームにより満たされたままであり、細胞質膨張および非組織化細胞層などの他の異常を含んだ。
表２
【表２】
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【００８８】
このように本発明によれば、高力価ＡＡＶ２ベクターの単回注入により、ＡＳＭＫＯ罹患海馬を神経支配する構造にＡＳＭ遺伝子を移動させるのに十分である。ＡＡＶ２ベクターに関して肯定的な構造数は、嗅内歯状回路にのみ軸索輸送を示した正常なラット海馬における最近の研究により立証されたものよりも多かった（Ｋａｓｐａｒら（２００２）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ５：５０−５６）。本明細書に記載された結果により、軸索輸送が、貯蔵病態に罹った突出ニューロンに生じることができ、この輸送モードが、注入部位に近位の構造および遠位の複数領域における貯蔵病態のクリアランスをもたらすことを立証している。軸索輸送が、海馬に関連するこれらの回路のみに限定されていないこともまた我々は立証している。逆方向軸策輸送が、黒質線条体（図３）および髄小脳（図４）に生じた。これは、疾患危険性ニューロンにおけるＡＡＶ２の軸索輸送が、ウイルスベクターの一般的性質であることを立証している。
【００８９】
同様の試験を、１〜４×１０１３ｇｐ／ｍｌの濃度でのＡＡＶ１−ＡＳＭおよび８．４×１０１２ｇｐ／ｍｌの濃度でのＡＡＶ７−ＡＳＭを用いて実施した。ＡＡＶ１は、検出可能な逆方向軸索輸送を示さなかったが、ＡＡＶ７は、ＡＡＶ２と同様の逆方向軸索輸送を受けて、遠位領域におけるＬＳＤ病態を矯正した（図５を参照）。
【００９０】
小脳へのＡＡＶの注入
ＡＳＭＫＯマウスを、イソフルランで麻酔にかけ、定位固定フレーム上に乗せた。前頂を参照点として配置し、小脳の深部小脳核領域への注入のためのドリル位置を決定した。配置したら、基底の頭骨を露出させるために切開を行い、単一のドリルホールを、脳表面に貫通させることなく頭骨に作製した。ハミルトンシリンジを、このホールを介して脳内に降下し、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭを、１秒当り０．５マイクロリットルの速度で深部小脳核に注入した。全用量が１×１０１０ゲノム粒子の３マイクロリットルが注入された。マウスを注入７週後に殺処理した。脳および脊髄を、ＡＳＭ  ｍＲＮＡ発現、ＡＳＭタンパク質発現、フィリピン染色、およびカルビンジン染色に関して評価した。
【００９１】
フィリピンは、コレステロール複合体に結合する自己蛍光分子である。未処置ＡＳＭＫＯマウスは、それらの疾患の結果蓄積する豊富なコレステロール複合体のため高レベルのフィリピン染色を有した。対照的に正常なマウス脳は、フィリピン染色を生じない。
【００９２】
カルビンジンは、小脳に見られ、協調運動に関与するプルキンエ細胞のマーカーである。ＡＳＭＫＯ細胞において、プルキンエ細胞は、それらの加齢化と共に次々に死滅し、協調運動挙動の低下をもたらす。このプルキンエ細胞の喪失およびそれに関連する協調運動挙動の喪失は、正常なマウスには見られない。
【００９３】
深部小脳核へのＡＡＶ２注入後、小脳は、ＡＳＭ  ｍＲＮＡ、ＡＳＭタンパク質、およびカルビンジン染色に関して陽性であった。これらの結果により、深部細胞核への注入後、小脳に形質導入するＡＡＶ２の能力を立証している。さらに、小脳への形質導入および生じたＡＳＭ発現は、処置マウスにおけるカルビンジン染色の存在により証明されるようにプルキンエ細胞死を防止した。ＡＡＶ−ＡＳＭ処置マウスにおいて、ｈＡＳＭタンパク質の発現もまた、脳幹、視床、および中脳の随所に見られた。これらの領域におけるｈＡＳＭタンパク質発現は、フィリピン／コレステロール染色領域のクリアランスと重なっていた。全体的に見ると、小脳においてＡＳＭタンパク質レベルと、フィリピンクリアランスおよびプルキンエ細胞の生存との間に正の相関が存在した。
【００９４】
ＡＳＭ  ｍＲＮＡおよびＡＳＭタンパク質は、小脳の外側にも検出された。特に脊髄は、インサイチュハイブリダイゼーションにより証明されるようにＡＳＭ  ｍＲＮＡ発現に陽性であった。脊髄はまた、ＡＳＭ特異的免疫蛍光法により証明されたＡＳＭタンパク質に関して陽性であった。これらの結果により、深部小脳核へのＡＡＶベクターの遠位注入後、脊髄に形質導入されたことを示している。この形質導入パターンは、深部小脳核領域を神経支配する突出ニューロンの局所解剖学的組織化と一致した。これらの結果により、ＡＡＶ２ベクターは、遠位脊髄細胞により取り込まれ、発現されたことを示している。
【００９５】
アルツハイマー病の処置
アルツハイマー病（ＡＤ）は、Ａβ異化作用の減少による、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の蓄積を特徴とする神経変性障害である。Ａβが蓄積されるにつれて、細胞外プラーク内へ凝集し、シナプス機能障害およびニューロンの喪失を引き起こす。この病態は、認知症、協調喪失、および死亡に至る。
【００９６】
ネプリリシンは、Ａβの正常な分解における速度制限酵素である９７ｋＤ膜結合亜鉛メタロエンドペプチダーゼである。ネプリリシンの導入は、凝集前にＡβプールを除去することにより疾患の進行を減速させることができる。実際、ネプリリシンは、Ａβのオリゴマー形体を分解し、それによってＡＤの動物モデルに存在するプラークを除去することが示されている（Ｋａｎｅｍｉｔｓｕら（２００３）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  ３５０：１１３−１１６）。ネプリリシンノックアウトマウスは、高レベルのＡβを示す（Ｉｗａｔａら（２００１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４：９９１−９９８）。チオルファンおよびホスホルアミドンなどのネプリリシン阻害剤は、マウス脳におけるＡβレベルを増加させる（Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ６：１４３−１５０）。さらにネプリリシンｍＲＮＡレベルの減少は、ヒト脳における高いアミロイドプラーク負荷領域に見られており、ネプリリシンとＡＤとの間の結合をさらに立証している（Ｙａｓｏｊｉｍａら（２００１）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  ２９７：９７−１００）。
【００９７】
ＡＤに最も罹患した脳領域は、海馬、皮質、小脳、線条体および視床である（例えば、Ｉｗａｔａら（２００１）上記文献；  Ｙａｓｏｊｉｍａら（２００１）上記文献を参照）。これらは、ＡＡＶによる効率的な逆方向軸策輸送を示す脳領域と同じである。
【００９８】
したがって、脳回路を介する我々の標的部位へのウイルスの直接注入、引き続く転座により、治療用導入遺伝子を高いプラーク負荷の領域に送達させるためにＡＡＶを使用することができる。ネプリリシンのウイルスベクター媒介遺伝子移動は、ＡＤのマウスモデルの処置において有効であった  （Ｍａｒｒら（２００３）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２３：１９９２−１９９６；  Ｍａｒｒら（２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２２：５−１１；  Ｉｗａｔａら（２００４）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４：９９１−９９８）。最近の報告で、ＡＡＶ５−ネプリリシンは、ネプリリシン欠損マウスにおける海馬のシナプス前末端からＡβを除去し、シナプスにおけるプラーク形成を減速したことが示された（Ｉｗａｔａら（２００４）上記文献）。この報告書において、ネプリリシンは対側海馬に見られたが、これが、ウイルスの逆方向輸送に起因するのか、または発現タンパク質の順行性輸送に起因するのかは未だ不明である。
【００９９】
コレステロール貯蔵病態の矯正
以下の実験では、深部小脳核内への片側注入後、ＡＳＭＫＯマウスにおいてｈＡＳＭタンパク質を発現し、コレステロール貯蔵病態を矯正し、輸送を受け、プルキンエ細胞を救出し、機能性回復を開始させるための、ヒトＡＳＭ（ｈＡＳＭ）をコードする組換えＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８血清型ベクターの相対的能力を評価した。導入遺伝子タンパク質の分布／発現の増大により、挙動性機能回復が改善するかどうかを評価するために、ＡＳＭＫＯマウスのさらなる群は、両側注入をＤＣＮに受けた。
【０１００】
６６匹のオスホモ接合性（−／−）酸スフィンゴミエリナーゼノックアウト（ＡＳＭＫＯ）マウスおよび１６匹のオス野生型同腹仔対照を、ヘテロ接合体交配（＋／−）から飼育した。マウスを、Ｇａｌら（１９７５）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ：２９３：６３２−６３６に記載された手法に従ってＰＣＲにより遺伝子型化した。元の群体からのマウスを、Ｃ５７／Ｂｌ６系統と戻し交配させた。  動物を１２：１２時間の明暗サイクル下に収容し、飼料と水を自由に与えた。全ての手法は、動物実験委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可されたプロトコルの下で実施された。
【０１０１】
イソフルランで麻酔にかけた後、マウス（凡そ７週齢）は、以下のＡＡＶ血清型ベクター（ｎ＝８／ベクター）：ＡＡＶ１−ＣＭＶ−βｇａｌ、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ５−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ７−ＣＭＶ−ＡＳＭ、およびＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＡＳＭのうちの１種を、深部小脳核（ＤＣＮ）（Ａ−Ｐ：前頂から−５．７５、Ｍ−Ｌ：前頂から−１．８、Ｄ−Ｖ：硬膜から−２．６、切歯バー：０．０）内の片側に注入した。ベクターは、１脳当りの全数が１．８６×１０１０個のゲノム粒子を０．５μｌ／分の速度でシリンジポンプに据え付けた１０μｌハミルトンシリンジにより送達された。各ベクターの最終注入容量は４μｌであった。外科手術１時間前および２４時間後のマウスに、麻酔のためにケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ：ＳＣ）を投与した。マウス（１４週齢）を、注入７週後に殺処理した。マウスの殺処理時点で、ユータゾール（ｅｕｔｈａｓｏｌ）（１５０ｍｇ／ｋｇ；ＩＰ）を過量投与し、迅速に断頭するか（ｎ＝５／群）、または経噴門灌流した（ｎ＝３／群）。断頭マウスからの脳を迅速に取り出し、液体窒素中でスナップ凍結し、３つの断面（右大脳半球、左大脳半球、および小脳）に切断し、ホモジナイズし、ＥＬＩＳＡによるｈＡＳＭの分析にかけた。灌流マウスからの脳および脊髄を、ヒトＡＳＭタンパク質発現、フィリピン染色により検出されるコレステロール蓄積、および５０μｍのビブラトーム断片上のカルビンジン染色によるプルキンエ細胞の生存に関して処理した。
【０１０２】
同様のプロトコルを用いて、ＡＳＭＫＯマウス（凡そ７週齢）に、ＡＡＶ２／１−βｇａｌ（ｎ＝８）、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭ（ｎ＝５）、およびＡＡＶ２／２−ＡＳＭ（ｎ＝５）を両側注入し、ロータロッド試験を受けさせた２０週齢目に殺処理した。脳を液体窒素中スナップ凍結し、正中線で２等分し、次いでマウス脳マトリックス（ＡＳＩインスツルメンツ社（ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）、ミシガン州）を用いて５つの断片（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５）に分けた。断片１〜４は約２ｍｍ離れており、Ｓ１は最も頭側で、Ｓ４は最も尾側であった。断片５は、小脳のみを含んだ。右半球は脳スフィンゴミエリンレベルを、左半球はｈＡＳＭレベルを定量化するために用いた。
【０１０３】
ＳＶ４０ポリアデニル化配列およびハイブリッドイントロンを有するヒトサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下、完全長ヒトＡＳＭ  ｃＤＮＡを、血清型２からのＩＴＲ（ＡＡＶ２  ＩＴＲ）類を含有するプラスミドにクローン化した。  Ｊｉｎら（２００２）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９：１１８３−１１９１。ＡＡＶ２型複製遺伝子に加えて、血清型特異的カプシドコード化ドメインを含有する一連のヘルパープラスミドを用いる三重トランスフェクションによりハイブリッドベクターを作製した。この方法により、各血清型特異的ビリオンへのＡＡＶ２ＩＴＲベクターのパッケージングが可能になるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ら（２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７９１−８０１。このアプローチにより、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を含む種々の血清型の一連のｒＡＡＶ−ｈＡＳＭベクターを生成するためにｈＡＳＭ組換えゲノムを使用した。組換えＡＡＶベクター（血清型２／１、２／２および２／５）を、イオン交換クロマトグラフィにより精製した。Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ，ら（２０００）  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２：  ４４４−５４  ｏｒ  ＣｓＣｌ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  （血清型２／８および２／７）Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）  Ｊ．  Ｕｒｒｏｌ．  ７６：７９１−８０１。ＡＡＶ−ＡＳＭビリオン粒子（ＤＮＡアーゼ耐性粒子）の最終力価を、ＣＭＶ配列のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより測定した。Ｃｌａｒｋら（１９９９）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：１０３１−１０３９。
【０１０４】
ヒトＡＳＭ抗体はヒト特異的であり、マウスＡＳＭと交差反応しない。５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈されたモノクローナル組換えヒトＡＳＭ（ｒｈＡＳＭ）抗体（２μｇ／ｍｌ）でコーティングされたコスター（Ｃｏｓｔｅｒ）（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州）９０１８プレート（１００μｌ／ウェル）を、２〜８℃で一晩インキュベートした。過剰のコーティング抗体を除去し、遮断用希釈剤（ＫＰＬ社、メリーランド州）を３７℃で１時間加えた。プレートを、マイクロプレート洗浄器（モレキュラーデバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州）で２サイクル洗浄した。標品、対照および標準的希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン、１％  ＨＰ−ＢＳＡ）で希釈されたサンプルを、２つ組でピペットで入れ、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のとおり洗浄した。ビオチン化組換えヒトＡＳＭ（ｒｈＡＳＭ）抗体（標準希釈緩衝液中１：２０Ｋで希釈）の１００マイクロリットルを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートしてから、マイクロプレート洗浄器で除去した。次に１：１０Ｋ希釈のストレプタビジン−ＨＲＰ（ピアスバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、イリノイ州）を加え（１００μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で３０分間インキュベートした。プレートを上記のとおり洗浄してから、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ（ＫＰＬ社（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）、メリーランド州）と共に３６〜３８℃で１５分間インキュベートした。反応を停止用液（ＫＰＬ社（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）、メリーランド州）で停止させ、次いで吸光度値を、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０プレートリーダー（モレキュラーデバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州）を用いて４５０ｎｍで読取った。データ解析は、ソフトマックス・プロ（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ）４．３ソフトウェア（モレキュラーデバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州）を用いて完了した。
【０１０５】
各サンプルのタンパク質濃度は、標品としてウシ血清アルブミンを用い、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアスバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、イリノイ州）を用いて測定した。
【０１０６】
マウスは、２％パラホルムアルデヒド、０．０３％グルタルアルデヒド、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ  ６．５中、０．００２％ＣａＣｌ２を含有する固定液で経噴門灌流し、続いてｐＨ８．５の同じ固定液で灌流した。マウスの脳および脊髄を切開し、グルタルアルデヒドなしのｐＨ８．５固定液中、４℃で一晩、後固定した。この組織を、０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ  ７．４中で洗浄し、３．５％寒天中に埋め込み、ビブラトームにより５０μｍの矢状切片に切断した。
【０１０７】
脳および脊髄を、５０μｍ間隔で矢状にビラトーム切断した。切片を、ヒトＡＳＭに対する一次抗体（１：２００）による免疫蛍光法用に処理した。切片を、ＰＢＳ中、１０％ロバ血清、０．３％トリトンＸ−１００中で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ中の２％ロバ血清、０．２％トリトンＸ−１００中、ビオチン化マウス抗ヒトＡＳＭと共に７２時間インキュベートした。洗浄後、シグナルは、Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて増幅させた。ヒトＡＳＭタンパク質を、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）蛍光顕微鏡で可視化し、画像は、ＳＰＯＴカメラおよびアドビ・フォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）ソフトウェアで捕捉した。
【０１０８】
フィリピン複合体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）を、最初に１ｍｇ／ｍｌの貯蔵濃度用に１００％メタノールで希釈した。貯蔵液は、−２０℃で４週間安定である。ＰＢＳで洗浄後、切片を、ＰＢＳ中、新鮮に作製された１０μｇ／ｍｌのフィリピン液中、暗所で３時間インキュベートした。次に切片を、ＰＢＳで３回洗浄した。コレステロール蓄積を、蛍光顕微鏡上紫外線フィルターの下で視覚化した。
【０１０９】
カルシウム結合タンパク質のカルビンジンに対して特異的な一次抗体を用いて脳を免疫蛍光法用に処理した。切片を、リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）で洗浄してから、リン酸カリウム緩衝生理食塩水（ＫＰＢＳ）によりリンスした。次に切片を、ＫＰＢＳ中、５％ロバ血清、０．２５％トリトンＸ−１００中で３時間遮断してから、ＫＰＢＳ中、５％ロバ血清、０．２％トリトンＸ−１００およびマウス抗カルビンジン（１：２５００、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ中）中でインキュベートした。４℃で７２時間後、切片を、０．１％トリトンＸ−１００を含むＫＰＢＳで３回リンスした。二次抗体、ロバ抗マウスＣＹ３（１：３３３、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を、ＫＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００に室温で９０分間加えた。切片を、ＫＰＢで洗浄してから、ゲルコーティングスライド上に乗せた。カルビンジン陽性細胞を、エピ蛍光下で可視化した。小脳のプルキンエ細胞を定量化するために、４つの全断面内側小脳切片を、各動物から選択した。カルビンジン−免疫陽性プルキンエ細胞を、蛍光顕微鏡下で目視し、細胞本体を２０×の倍率でカウントした。各小葉は別個にカウントされた。１小葉当り２つの別個の焦点面をカウントした。細胞を二度カウントしないことを保証するために焦点の合った細胞だけをカウントした。
【０１１０】
５０μｍのビブラトーム切片を、上記のとおりヒトＡＳＭに対して特異的な抗体を用いる免疫蛍光法用に最初に処理した。次に切片を、ＰＢＳ中で洗浄し、カルビンジン用に上記に概説されたプロトコルを用いてコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；ウサギポリクローナル、１：５００、ケミクロンインターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、テメキュラ、カリフォルニア州）に対して染色した。ＣＹ３二次抗体ではなく、ロバ抗ウサギＦＩＴＣ（１：２００、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を用いた。染色は最初、エピ蛍光下で可視化し、後に共焦点顕微鏡により画像を得た。
【０１１１】
フィリピン染色を以下のとおり定量化した。露出を合わせた画像を、ＳＰＯＴデジタルカメラが装備されたニコン（Ｎｉｋｏｎ）Ｅ６００の広視野直立式エピ蛍光顕微鏡を用いて捕捉した。ＡＡＶ２／１−β−ｇａｌ群を最初に画像化し、その露出を、全ての追加画像獲得のために使用した。分析された各画像は、各々半分の脳の全長に亘る内側矢状面を表す。形態計測分析は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて実施した。ＡＡＶ２／１−β−ｇａｌ画像を閾値化し；確立されたら、同じ閾値を全ての画像に使用した。使用者により手動で以下の領域が選択され、別個に分析された：小脳、脳橋、延髄、中脳、大脳皮質、海馬、視床、視床下部および線条体。積分強度を、各領域において測定し、所与の動物群からの全ての測定値（ｎ＝３／群）を用いて、平均値を出した。次に処置動物におけるコレステロールの減少を、β−ｇａｌ注入ノックアウトマウスと比較した積分強度の減少パーセントとして算出した。
【０１１２】
陽性ｈＡＳＭ免疫染色は、深部小脳核内へのＡＡＶ−ＡＳＭの片側注入後、小脳（図６、表３）、脳橋、延髄および脊髄（図７）の随所に見られた。
表３
ＡＡＶ血清型の関数として陽性ｈＡＳＭ染色を有する領域。＊は、陽性ｈＡＳＭが検出限界未満であったが、コレステロール病態の矯正が依然として生じたことを示す。
【表３】
2014037418.tif 000004
【０１１３】
ＡＡＶ２／１−ＡＳＭで処置された小脳マウス内で、最も広範な（すなわち、同じ矢状切片内の小葉間に分布）ｈＡＳＭ発現レベルを有したが、一方、ＡＡＶ２／２−ＡＳＭで処置されたマウスは、最も制限されたレベルのヒトＡＳＭタンパク質発現を有した。ＡＡＶ２／５−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭで処置されたマウスにおけるヒトＡＳＭタンパク質発現は、これら２つの群の間の中間であった。矢状切片間の内側−外側分布は、血清型１および８で処置したマウスで最大であり、最小は血清型２により注入されたマウスである。血清型５および７は、血清型１と２の間の中間に内側−外側分布パターンを開始した。小脳の各層（すなわち、分子、プルキンエおよび顆粒）は、各ＡＡＶ血清型により形質導入されたが；分子層への親和力増加は、全ての血清型に明白であった。プルキンエ細胞の形質導入は、血清型１および５で処置されたマウスにおいて最大であった。血清型７を注入されたマウスは、最も少数の形質導入プルキンエ細胞を有した。血清型８で処置されたマウスもまた、形質導入プルキンエ細胞を殆ど有さなかったが、血清型１、２、５および７と比較した場合、顆粒層内のＡＳＭ発現が少なかった。ＡＳＭを形質導入した形質導入プルキンエ細胞は、健常な細胞構造を有するように見える。小脳組織ホモジネートにおけるＥＬＩＳＡによるＡＡＶ媒介ｈＡＳＭタンパク質発現の定量分析は、我々の免疫組織化学的知見を支持している。血清型１および８を注入したマウスは、全ての他のマウスと比較した場合、有意に（ｐ＜．０００１）高い小脳ｈＡＳＭタンパク質レベルを示した（図８）。血清型２、５、および７を注入したマウスの小脳ｈＡＳＭレベルは、ＷＴレベル（すなわち、バックグラウンド）超ではなかった。予想されたように、ヒトＡＳＭは、野生型マウスに検出されず−ＥＬＩＳＡに使用されたｈＡＳＭ抗体はヒト特異的である。
【０１１４】
機能性ＡＳＭタンパク質の欠如は、スフィンゴミエリンのリソソーム蓄積をもたらし、引き続き、異常なコレステロール輸送などの二次的代謝欠陥をもたらす。Ｓａｒｎａら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １３：１８７３−１８８０およびＬｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：４４９７６−４４９８。ＡＳＭＫＯマウス脳における遊離コレステロールの蓄積は、ストレプトミセス属フィリピネンシス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ）から単離された自己蛍光分子であるフィリピンを用いて可視化される。野生型マウス脳は、フィリピンに対して陽性染色されない。全てのＡＡＶ処置マウスにおいて（ＡＡＶ２／１−βｇａｌを除いて）、フィリピン染色のクリアランス（表４）は、ｈＡＳＭ免疫染色に陽性であった領域と重なり、各血清型のベクターが機能的な導入遺伝子産物を生成できることを示した。
【０１１５】
表４
ＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核にヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型（ｎ＝３／血清型；２／１、２／２、２／５、２／７および２／８）の小脳内注入後、選択された脳領域における、ＡＡＶ−βｇａｌにより処置されたＡＳＭＫＯマウスと比較したフィリピン（すなわち、コレステロール）クリアランスの減少パーセント。
【表４】
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【０１１６】
（Ｐａｓｓｉｎｉら（２００３）  ｉｎ  “Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ”、ニューオルリンズ、ルイジアナ州）により以前に立証されたように、フィリピンクリアランスはまた、注入部位と解剖学的に接続した領域に生じるが、ｈＡＳＭに対して陽性染色されなかった。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ解析により、フィリピン染色の減少が、頭側尾側軸全体の随所に生じたことを示した。小脳および脳幹において、フィリピンは、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭにより処置されたマウスにおいて減少が最大であったが、一方、間脳および大脳皮質において、ＡＡＶ２／８−ＡＳＭを注入したマウスは、全体的に最良レベルのフィリピンクリアランスを有した（表４）。それにもかかわらず、これらの結果は、コレステロール貯蔵病態を矯正するために必要なｈＡＳＭのレベルはＡＳＭＫＯマウスＣＮＳが最小であることを示している（すなわち、ｈＡＳＭ免疫蛍光法の検出限界未満）。
【０１１７】
表５
組織学的研究では、ＡＳＭＫＯマウスの小脳が急速な悪化を受けることが示されている。より具体的には、プルキンエ細胞が、８週齢と２０週齢との間に進行的に漸次死滅する（Ｓａｒｎａら（２００１）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １３：１８１３−１８８０およびＳｔｅｗａｒｔら（２００２）  ｉｎ  “Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ”オーランド、フロリダ州）。カルビンジンは、広く許容されているプルキンエ細胞マーカーである。ＡＡＶ−ＡＳＭ処置マウスにおける陽性カルビンジン染色は、ｈＡＳＭのＡＡＶ媒介発現が治療的であることを示唆すると思われる。総合的に見て、我々の結果は、小脳におけるＡＡＶ媒介ｈＡＳＭ発現が、ＡＳＭＫＯマウスにおけるプルキンエ細胞死を防止することを示している（表５、図９）。予想されたように、プルキンエ細胞残存は、小葉Ｉ−ＩＩＩに生じず；マウスは７週齢で注入を受け、８週齢までに、これらの細胞の大部分は既に漸次死滅していた。小葉ＩＶ／Ｖにおけるプルキンエ細胞残存は、血液型１で処置されたマウスにおいて最大であった。小葉ＶＩにおける有意なプルキンエ細胞残存は、ＡＡＶ処置マウスで見られなかった。小葉ＶＩＩにおいて、血液型５で処置されたマウスだけが有意なプルキンエ細胞残存を示した。小葉ＶＩＩＩにおいて再度血清型５ならびに血清型２で処置されたマウスでは、有意なプルキンエ細胞残存を示した。小葉ＩＸおよびＸにおいては、プルキンエ細胞カウントにおけるＷＴとＫＯマウスとの間（またはＡＡＶ処置マウス間）に有意差はなかった。このことは、１４週齢（すなわち、殺処理の週齢）においてこれら小葉のプルキンエ細胞が、ＡＳＭＫＯマウスにおいて依然として生存しているので予想された。全ての小葉の随所に、プルキンエ細胞残存は、血清型１、２、および５で処置されたマウスで最多であり、血清型７および８で処置されたマウスで最少であった。前小脳小葉内のプルキンエ細胞残存（カルビンジン染色に基づく）は、血清型１を注入したマウスにおいて最大であった。
【０１１８】
ＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核にヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型（ｎ＝３／血清型；２／１、２／２、２／５、２／７、および２／８）の小脳内注入後、ＷＴおよびＡＳＭＫＯマウスの小脳小葉Ｉ−Ｘにおいてプルキンエ細胞をカウントする。太字イタリックに見える数値は、ＫＯマウス（すなわち、ＡＡＶ２／１−βｇａｌで処置されたマウス）とは有意差があるｐ  ≦  ．０１。
【表５】
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【０１１９】
加速ロータロッド試験において、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭを片側注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したＡＳＭＫＯマウスよりも有意に（ｐ＜  ．０００９）長い落下待ち時間を示した（図１０）。血清型ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスは、野生型マウスとは有意差はなかった。ＡＡＶ２／２−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／５−ＡＳＭを注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したＡＳＭＫＯマウスよりも長い落下待ち時間の傾向を示し；一方、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭを注入したマウスは、その傾向を示さなかった。ロッキングロータロッド試験に関しては、ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスのみが、ＡＡ２／１−βｇａｌを注入したマウスよりも有意に（ｐ＜  ．０００１）長い落下待ち時間を示した。この場合、野生型マウスは、ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスよりも有意に良好な成績であった（図１０）。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭまたはＡＡＶ２／２−ＡＳＭのいずれかの両側注入を受けたＡＳＭＫＯマウスは、加速およびロッキング双方の試験に関してＡＳＭＫＯ  ＡＡＶ２／１−βｇａｌ処置マウスよりも有意に（ｐ  ＜  ．００１）良好な成績であった（図１１）。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭ両側注入マウスは、双方の試験に関する野生型マウスと同等な成績であった。
【０１２０】
ＡＡＶ生成ｈＡＳＭが、ＡＳＭＫＯ  ＣＮＳ内で機能的に活性であるかどうかを判定する１つの方法は、コレステロール貯蔵病態−ＮＰＡ疾患の二次的代謝欠陥への影響を評価することである。全てのＡＡＶ処置マウス（ＡＡＶ２／１−βｇａｌを除いて）において、コレステロール貯蔵病態の矯正は、ｈＡＳＭ免疫染色に陽性であった領域と重なっており、各血清型ベクターは、機能的な導入遺伝子産物を生成できることを示した。先に立証されたように、コレステロール代謝の異常矯正の矯正は、注入部位と解剖学的に接続した領域にも生じたが、ｈＡＳＭに陽性に染色しなかった領域にも生じ、コレステロール貯蔵病態の矯正に必要なｈＡＳＭのレベルが最小であることを示した。我々のｈＡＳＭ組織化学的および生化学的結果と一致して、血清型１および８で処置されたマウスは、コレステロール貯蔵病態において著しい減少を示した。血清型２、５、および７で処置したマウスもまた、コレステロール貯蔵病態における減少を示したが、血清型１および８で処置したマウスと同程度の減少を示さなかった。
【０１２１】
コレステロール貯蔵病態の変化は例示的なものであるが、ｈＡＳＭ酵素活性のより直接的な測定は、ニーマン−ピック病の哺乳動物の組織に蓄積された主要基質であるスフィンゴミエリンレベルの解析による。ＡＡＶ血清型１および２の両側注入を受けたマウスの脳組織を、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）レベルに関してアッセイした（ＳＰＭの検出のための組織破砕法は、ｈＡＳＭの検出には適合性でない）。小脳内のＳＰＭ組織含量の有意な（ｐ＜０．０１）減少が、血清型１および２の双方で処置されたマウスに見られた（図１２）。ＳＰＭ組織含量レベルはまた、血清型１を注入したマウスにおける切片２、３、および４（各切片は、隣の切片と２ｍｍ離れている）において有意に減少したが、血清型２を注入したマウスでは減少しなかった。
【０１２２】
ｈＡＳＭをコードするＡＡＶ血清型１および２の両側小脳内注入を受けたＡＳＭＫＯマウスは、小脳内のスフィンゴミエリン貯蔵において有意な減少を示した。コレステロール貯蔵の蓄積により見られるように、スフィンゴミエリン貯蔵の有意な減少は、ＡＡＶ１で両側に処置されたＡＳＭＫＯマウスの小脳の外側の領域にも生じた。
【０１２３】
総合的に見て、これらの結果により、酵素発現を開始し、脳における貯蔵病態を矯正し、神経変性を防止し（例えば、プルキンエ細胞死を防止することにより）、および運動機能の結果を改善するその相対的能力においてＡＡＶ１は、血清型２、５、７、および８よりも好ましいことを示されている。さらに、ＤＣＮは、ＣＮＳの随所で酵素発現を最大にする注入部位として利用できる。
【０１２４】
ＤＣＮへのＡＡＶベクター注入後の導入遺伝子の発現の分布を評価するために、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１（本明細書でＳＯＤ１マウスと称されるＳＯＤ１Ｇ９３Ａ変異マウス）に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする組換えＡＡＶベクターを注入した。マウスの一群には、緑色蛍光タンパク質をコードするＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１−ＧＦＰ）を注入したが、一方、別の群には、緑色蛍光タンパク質をコードするＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２−ＧＦＰ）を注入した。
【０１２５】
マウスは、上記と同様の方法を用いてＡＡＶ組換えベクターを有するＤＣＮへ両側注入された。用量は、１部位につき約２．０ｅ１０ｇｃ／ｍｌであった。マウスは、誕生約１１０日後に殺処理し、脳と脊髄をＧＦＰ染色に関して分析した。
【０１２６】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達後、緑色蛍光タンパク質分布が、脳幹（図１４を参照）および脊髄領域（図１５を参照）に見られた。ＧＦＰ染色は、ＤＣＮならびに嗅球、大脳皮質、視床、脳幹、小脳皮質および脊髄にも見られた。全てこれらの領域は、ＤＣＮからの投射を受け入れるか、および／またはＤＣＮへの投射を送っている（図１６を参照）。
【０１２７】
本明細書は、本明細書中に引用された参照文献の教示に鑑みて最も完全に解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。他の多くの実施形態が、本発明に包含されることは当業者により容易に認識される。全ての刊行物、特許および本開示に引用された生物学的配列は、参照としてその全体が本明細書に援用されている。参照として援用されている資料が矛盾するか、または本明細書と一致しない範囲で、本明細書は、このような資料に優先するであろう。本明細書のいずれの参照文献の引用は、このような参照文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０１２８】
他に指定されない限り、特許請求の範囲を含む本明細書に用いられる成分量、細胞培養、処置条件などを表す全ての数値は、全ての場合、「約」という用語により修飾されるものとして解されるべきである。したがって、相反する記載がないかぎり、数値パラメーターは、近似値であり、本発明により得られることが求められる所望の性質に依って変わり得る。他に指定されない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連の要素におけるあらゆる要素を指すものとして解すべきである。当業者は、慣例的な実験を用いるのみで、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できるであろう。このような等価物は、冒頭の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月4日(2013.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【外国語明細書】
2014037418.tif 000028
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