(57)【要約】【課題】ナンセンス変異を生ずる又は下流の塩基配列のフレームシフトを引き起こす変異をエクソン内に有するヒト筋ジストロフィーであって当該変異を有するエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるものに対する，経口投与が可能な低分子量化合物に基づく治療剤，特に，変異を有するエクソンのスキッピングを誘導し又は促進させることのできる治療剤の提供。【解決手段】少なくとも１種のポリフェノールを含有することを特徴とする，ヒト筋ジストロフィー治療剤であって，該ヒト筋ジストロフィーが，ジストロフィン遺伝子のエクソンに生じた変異に起因し，該変異がナンセンス変異であるか又はフレームシフトを引き起こす変異であり，且つ，当該変異を含むエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるエクソンである，ヒト筋ジストロフィー治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のポリフェノールを含有することを特徴とする，ヒト筋ジストロフィー治療剤であって，該ヒト筋ジストロフィーが，ジストロフィン遺伝子のエクソンに生じた変異に起因し，該変異がナンセンス変異であるか又はフレームシフトを引き起こす変異であり，且つ，当該変異を含むエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるエクソンである，ヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項２】
該ポリフェノールが，フラボノイド骨格又はイソフラボノイド骨格を１個又は２個有するポリフェノールである，請求項１のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項３】
該ポリフェノールが構造式（Ｉ），
【化１】
2014037387.tif 000010
〔式中，Ｒ１及びＲ２は，各々独立して，水素又はヒドロキシル基を表す。〕で示されるものである，請求項２のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項４】
該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群から選ばれるものである，請求項３のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項５】
該ヒト筋ジストロフィーが，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７，エクソン３１，又はエクソン３９において生じた変異に起因するものである，請求項１〜４の何れかのヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項６】
該変異が，配列番号１に示す野生型ヒトジストロフィンのｃＤＮＡにおいて，エクソン２７については３６１３番目のヌクレオチドであるＧの欠失，エクソン３１については４３０３番目のヌクレオチドであるＧのＴへの置換，エクソン３９については５５５１番目のヌクレオチドであるＣのＴへの置換に相当するものである，請求項５のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項７】
該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群より選ばれるものである，請求項５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項８】
該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３１に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，ダイゼイン，プロシアニジンＢ２，カテキン，モリン，及びゲニステインよりなる群より選ばれるものである，請求項５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項９】
該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３９に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，モリン，ケンペロール，ダイゼイン，ゲニステイン，没食子酸エピガロカテキン，プロシアニジンＢ２，フィセチン，及びカテキンよりなる群より選ばれるものである，請求項５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
【請求項１０】
該ヒト筋ジストロフィーがデュシェンヌ型又はベッカー型筋ジストロフィーである，請求項１〜９の何れかのヒト筋ジストロフィー治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，筋ジストロフィー治療剤に関し，より詳しくは，ヒトのジストロフィンｍＲＮＡのスプライシングにおいて，問題の変異を有するエクソンのスキッピングを誘導し又は促進させることに基く，ヒト筋ジストロフィー治療剤，及びヒト筋ジストロフィーの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィーは，骨格筋系を弱体化させ，運動の障害を引き起こす一群の筋肉疾患である。筋ジストロフィーは，骨格筋に生ずる進行性の変化，すなわち弱力化，タンパク質の欠損，筋細胞及び筋組織の壊死によって特徴づけられる。それらのうち，最も頻度が高く且つ最も重大な疾患は，デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne Muscular Dystrophy: ＤＭＤ）である。ＤＭＤは，劣勢のＸ染色体連鎖型の筋ジストロフィーであり，約3500人に１人の割合で男児が罹患する。
【０００３】
ＤＭＤの症状は，通常，５歳頃から現れる。両脚の近位及び骨盤の骨格筋の進行性の弱力化及び筋質量減少が最初に出現し，徐々に腕，首，その他の領域にまで拡大する。状態が進行するにつれ，筋組織の委縮，脂肪組織による置換が起こる。１０歳までには歩行に装具を要とすることになり，殆どの患者は１２歳までには車椅子に頼ることとなる。骨格筋の継続的変性のため，運動能力の喪失が起こり，麻痺に至る。全ての随意筋の他，心筋，呼吸筋も侵される結果，特別の延命措置を施さない限り，患者は，多くは心不全又は呼吸不全が原因で，２０才代で死に至る。人工呼吸法で患者の生命予後は５〜１０年程度延びるものの，根本的な治療方法は未だ確立されおらず，麻痺状態のまま病態の悪化を続ける患者及びその家族は，非常に過酷な状況に置かれ続けている。
【０００４】
ＤＭＤを引き起こすのは，ジストロフィン遺伝子中に生じた変異である。ジストロフィン遺伝子は，ヒトＸ染色体上に存し（遺伝子座Ｘp21），タンパク質であるジストロフィン（dystrophin）をコードしている。この棒状のタンパク質ジストロフィンは，細胞膜を貫通して筋繊維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスに結合させているものであるタンパク質複合体の，必須の構成要素の１つである。ＤＭＤ患者は，ジストロフィンを殆ど又は全く欠いている。
【０００５】
筋ジストロフィーの別の一形態にベッカー型筋ジストロフィー（Becker
Muscular Dystrophy：ＢＭＤ）がある。ＢＭＤも，ジストロフィン遺伝子中に生じた変異によるが，ＤＭＤより遥かに軽症である。ＢＭＤ患者では，ジストロフィンは，本来とはサイズが異なるものの，ジストロフィンタンパク質が生成されている。ＤＭＤと比べ，ＢＭＤの発症年齢は成人期と比較的遅く，また発症後に軽度の筋力低下は見られるものの，ほぼ正常な生存が可能である。
【０００６】
ヒトのジストロフィン遺伝子は約2.3 Mbpあり，ヒトの遺伝子中で最も長い。このような巨大なサイズであるが，ジストロフィン遺伝子中でジストロフィンタンパク質をコードしている領域は，僅か14 kbに過ぎない。しかもそのコード領域は79ものエクソンに分かれて，遺伝子内に分散して存在している（非特許文献１）。ジストロフィン遺伝子の転写物である前駆体ｍＲＮＡは，スプライシングを受けて14 kbの成熟ｍＲＮＡとなる。更にこの遺伝子には，8種の異なるプロモーター領域が，やはり遺伝子内に分散して存在しており，それぞれが異なったｍＲＮＡを産生している（非特許文献２〜４）。これらのことから，ジストロフィン遺伝子及びその転写物は，非常に複雑な構成になっている。
【０００７】
ＤＭＤもＢＭＤも，ジストロフィン遺伝子の変異により発症するが，上記のようにそれらの症状とその進行速度や重篤度は大きく異なっており，この相違は，読み枠ルール（reading frame rule）によって説明されている（非特許文献５）。すなわち，ＤＭＤでは，ジストロフィン遺伝子内の部分的な欠失によりジストロフィンｍＲＮＡにコードされるアミノ酸読み枠（リーディングフレーム）にずれが生じ（アウトフレーム：out-of-frame），その位置より下流のアミノ酸配列が全く変わってしまう上，結果的に早期にストップコドンが出現してタンパク質合成自体が途中で停止してしまう。これに対し，ＢＭＤでは，遺伝子に部分欠失が存在してもリーディングフレームが維持され（インフレーム：in-frame）て，本来のジストロフィンとは異なるものの，ジストロフィンの機能をほぼ備えたタンパク質が生成できる，というものである。ＤＭＤは，こうして，主として部分的欠失に起因するフレームシフトによるほか，コード領域のナンセンス変異によるタンパク質合成の停止によって生じていると考えられている。実際，患者の筋肉中のジストロフィンを調べると，ＤＭＤではジストロフィンが殆ど又は全く消失しているのに対し，ＢＭＤでは染色性を正常とは異にするジストロフィンが存在している。またＤＭＤ／ＢＭＤ患者でジストロフィン遺伝子異常から計算されたリーディングフレームの型と患者の表現型とを比較すると，90％以上の患者でこのフレームシフト説が当てはまっている。
【０００８】
筋ジストロフィーに対する試験的治療法としては，筋芽細胞の移植や，プラスミド又はウイルスベクターを用いることによる機能的ジストロフィン遺伝子の導入等が試みられている（非特許文献６）。
【０００９】
多くのＤＭＤ患者において，ジストロフィン陽性筋繊維が全く見出されないわけではない（非特許文献７）。ＤＭＤ患者に見られるジストロフィン陽性筋繊維は，エクソンスキッピング機構により生じることが提唱されており（非特許文献８），実際，mdxマウスの例で，主要なナンセンス変異を含有するエクソンがスキップされてリーディングフレームの維持されたジストロフィン遺伝子転写物が同定されている（非特許文献９）。
【００１０】
イントロンを含む遺伝子から転写された遺伝情報は，スプライシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を受け，エクソン配列のみからなる成熟ｍＲＮＡとなる。更に，この成熟ｍＲＮＡがそのリーディングフレームに従って翻訳され，遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実に従ったタンパク質の合成が可能となる。ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング時には，ｍＲＮＡ前駆体の塩基配列のうちでイントロン配列とエクソン配列を正確に決定する機構がある。そのためにイントロン・エクソン境界部の配列は一定のルールで全ての遺伝子で保存されており，コンセンサス配列として知られている。
【００１１】
コンセンサス配列として，イントロンの５’末端のスプライスドナーサイトと呼ばれるエクソンからイントロンへまたがる部位，イントロンの３’末端のスプライスアクセプターサイトと呼ばれる部位，そして，ブランチングポイントと呼ばれる部位の，３カ所の配列が知られている。
【００１２】
これらのコンセンサス配列の中で，わずか１塩基の置換でも発生すると，スプライシングの異常を起こすことが各種の疾病で報告されているように（非特許文献１０），コンセンサス配列は，スプライシングを進行させる鍵となっている。
【００１３】
前述のように，ＤＭＤ患者は，ジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームがずれてアウトフレームとなり早期にストップコドンを生じさせるような，或いは直接ナンセンス変異を生じさせるような，遺伝子異常を，エクソン中に有している。そのような変異を有するエクソンの野生型の塩基数が３の倍数である場合，それら変異を有するエクソンをスプライシング過程でスキップさせることができれば，読み枠がシフトしていた場合にはそれが回復され，またナンセンス変異を有していた場合にはそのエクソンごとナンセンス変異が除去されて，トランケート型ｍＲＮＡが産生され，それが翻訳される。その結果，当該エクソンの除去後の塩基配列に対応するトランケート型ジストロフィンが産生されることとなる。そのようなトランケート型ジストロフィンは，除去されたエクソンに対応した部分のアミノ酸配列を欠くだけであり，通常，ジストロフィンの機能をある程度保持している。それまで殆ど又は全くジストロフィンを欠いていたＤＭＤ患者の体内において，筋細胞に，このようにしてトランケート型ジストロフィンを産生させることができれば，ＤＭＤからＢＭＤへと，患者の病態の非常に大きな改善が期待できる筈である。
【００１４】
このような予測と，ジストロフィンｍＲＮＡのエクソン内の特定の塩基配列がスプライシングの進行に極めて重要であることの発見とに基づき，複数のタイプのＤＭＤ患者のジストロフィンｍＲＮＡのスプライシングにおいて，それぞれ特定のエクソンのスキッピングをそのような塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導し，前後のエクソンの直接のスプライシングを誘導して読み枠をインフレームに復帰させることによるＤＭＤ治療薬が報告されている（特許文献１〜３）。
【００１５】
幾つかのＢＭＤ患者で，ジストロフィン遺伝子上にナンセンス変異を有しているにも拘わらず，当該ナンセンス変異を含むエクソンがある程度スキッピングされてトランケートジストロフィンが産生されていることが報告されている（非特許文献１１〜１４）。このことは，ＤＭＤ患者におけるジストロフィンｍＲＮＡのスプライシングに際して問題の変異を含むエクソンのスキッピングを人為的に誘導できれば，病型をＢＭＤ型からより軽いＢＭＤ型へと転換させて患者の症状を大幅に改善できる，という考えを強く支持している。また，同時に，自然にエキソンスキッピングをある程度起こしていることによってＢＭＤの病態を示すものの，遺伝子レベルではナンセンス変異やフレームシフトを生ずる変異を有している患者の場合でも，変異のあるエクソンのスキッピングを促進させれば症状を一層軽くすることができることを示すものである。
【００１６】
このように，ジストロフィンｍＲＮＡのスプライシングにおける，変異を有するエキソンのスキッピングの誘導は，ＤＭＤ患者を現在の極めて過酷な状況から解放できる画期的な治療方法となり得る。既に，上述のエクソンの特定配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドについては，一部のものが臨床研究段階にある。
【００１７】
しかしながら，アンチセンスオリゴヌクレオチドは経口投与できず，患者への投与は，注射によって定期的に繰り返しなされる必要がある。治療が生涯にわたると想定されることから，反復されるそのような注射は，患者にとって苦痛であり，また患者及びその家族に，依然大きな生活上の制約が残ることにもなる。
【００１８】
また，ヒトに注射できるアンチセンスオリゴヌクレオチド製剤の製造と供給には，高額のコストがかかるのが避け難く，またそのような製剤による治療が生涯にわたることから，患者とその家族或いは医療財政にとって，負担要因となる。
【００１９】
このため，ジストロフィンｍＲＮＡのスプライシングにおいて，より低コストでの製造がし易い低分子量の化合物で，エクソンスキッピングの誘導に使用できるものが，求められている。
【００２０】
低分子量の非アミノグリコシドナンセンス変異サプレッサーである３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾリル−３−イル］安息香酸〔Ataluren（ＰＴＣ１２４）〕が，ナンセンス変異を持つ一部のＤＭＤ患者を治療し得ることが報告されている（非特許文献１５〜１６）。それによれば，この化合物は，ｍＲＮＡからアミノ酸への翻訳時にリボソームによるストップコドンの読み飛ばし（read-through）を誘導し，それによりジストロフィンの発現をある程度回復させるように働く。
【００２１】
また，同じく低分子量の化合物である，Cdc-like キナーゼ（Clk）特異的なキナーゼ阻害剤（TG003）が，ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを促進させ得ることが，細胞を用いたインビトロの試験結果に基づき報告されている（特許文献４）。
【００２２】
フェノール性ヒドロキシル基を複数有することを特徴とする一群の有機化合物であるポリフェノールは，殆どの植物中に含まれ，植物色素や苦味の成分であり，抗酸化作用有を有していることがよく知られている。飲食物では，ポリフェノールは，例えば，ワイン（ブドウ），茶，ブラックベリー，チョコレート（カカオ）に多く含まれており，抗酸化作用との関連で，動脈硬化や脳梗塞の予防効果があるとの報告や，また抗アレルギー作用を有するとの報告もあるが，本発明者が知る限りにおいて，変異を有するジストロフィンエクソンのスキッピングとポリフェノールとの関連を示唆する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特開２０００−３２５０８５号公報
【特許文献２】特開２００２−０１０７９０号公報
【特許文献３】特開２００２−３２５５８２号公報
【特許文献４】国際公開公報２０１２／００１９４１号公報
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Genomics (1993) 16, 536-538
【非特許文献２】J. Clin. Invest. (1994) 94, 1073-1042
【非特許文献３】Nature Genet. (1993) 3, 283-291
【非特許文献４】Hum. Mol. Genet. (1995) 4, 837-842
【非特許文献５】Genomics (1988) 2, 90-95
【非特許文献６】Hum. Gene. Ther. (1994) 5, 195-173
【非特許文献７】J. Neurol. Sci. (1989) 94, 137-146
【非特許文献８】Am. J. Hum. Genet. (1992) 50, 950-959
【非特許文献９】Muscle Nerve (1997) 20, 728-734
【非特許文献１０】Genomics (1992) 12, 643-650
【非特許文献１１】Pediatr. Res. (2006) 59, 690-694
【非特許文献１２】Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 226,445-449
【非特許文献１３】J. Clin. Invest. (1995) 95, 515-520
【非特許文献１４】Lancet neurology (2009) 8, 873-875
【非特許文献１５】J Clin. Pharmacol. (2007) 47, 430-444
【非特許文献１６】Nature (2007) 447, 87-91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
上記背景において，本発明は，ナンセンス変異を生ずる，又は下流の塩基配列のフレームシフトを引き起こす変異をエクソン内に有する，ヒト筋ジストロフィーであって当該変異を有するエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるものに対する，経口投与が可能な低分子量化合物に基づく治療剤，特に，そのようなエクソンのスキッピングを誘導し又は促進させることのできるヒト筋ジストロフィーの治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは，患者から得られた，ナンセンス変異を生ずるか又は下流の塩基配列のフレームシフトを引き起こすような異常をエクソン内に有するジストロフィン遺伝子について，それらの異常を有するエクソンの転写物を含んだｍＲＮＡのスプライシングにおいて，それらのエクソンのスキッピングが，ある種のポリフェノールによって誘導され又は（ある程度スキッピングが既に自発的に生じている場合には）促進されることを見出した。本発明は，この発見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。即ち，本発明は，以下を提供する。
【００２７】
１．少なくとも１種のポリフェノールを含有することを特徴とする，ヒト筋ジストロフィー治療剤であって，該ヒト筋ジストロフィーが，ジストロフィン遺伝子のエクソンに生じた変異に起因し，該変異がナンセンス変異であるか又はフレームシフトを引き起こす変異であり，且つ，当該変異を含むエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるエクソンである，ヒト筋ジストロフィー治療剤。
２．該ポリフェノールが，フラボノイド骨格又はイソフラボノイド骨格を１個又は２個有するポリフェノールである，上記１のヒト筋ジストロフィー治療剤。
３．該ポリフェノールが構造式（Ｉ），
【化１】
2014037387.tif 000002
【００２８】
〔式中，Ｒ１及びＲ２は，各々独立して，水素又はヒドロキシル基を表す。〕で示されるものである，上記２のヒト筋ジストロフィー治療剤。
４．該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群から選ばれるものである，上記３のヒト筋ジストロフィー治療剤。
５．該ヒト筋ジストロフィーが，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７，エクソン３１，又はエクソン３９において生じた変異に起因するものである，上記１〜４の何れかのヒト筋ジストロフィー治療剤。
６．該変異が，配列番号１に示す野生型ヒトジストロフィンのｃＤＮＡにおいて，エクソン２７については３６１３番目のヌクレオチドであるＧの欠失，エクソン３１については４３０３番目のヌクレオチドであるＧのＴへの置換，エクソン３９については５５５１番目のヌクレオチドであるＣのＴへの置換に相当するものである，上記５のヒト筋ジストロフィー治療剤。
７．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群より選ばれるものである，上記５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
８．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３１に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，ダイゼイン，プロシアニジンＢ２，カテキン，モリン，及びゲニステインよりなる群より選ばれるものである，上記５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
９．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３９に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，モリン，ケンペロール，ダイゼイン，ゲニステイン，没食子酸エピガロカテキン，プロシアニジンＢ２，フィセチン，及びカテキンよりなる群より選ばれるものである，上記５又は６のヒト筋ジストロフィー治療剤。
１０．該ヒト筋ジストロフィーがデュシェンヌ型又はベッカー型筋ジストロフィーである，上記１〜９の何れかのヒト筋ジストロフィー治療剤。
１１．ヒト筋ジストロフィー治療剤用ポリフェノールであって，該ヒト筋ジストロフィーが，ジストロフィン遺伝子のエクソンに生じた変異に起因し，該変異がナンセンス変異であるか又はフレームシフトを引き起こす変異であり，且つ，当該変異を含むエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるエクソンである，ポリフェノール。
１２．該ポリフェノールが，フラボノイド骨格又はイソフラボノイド骨格を１個又は２個有するポリフェノールである，上記１１のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１３．該ポリフェノールが構造式（Ｉ），
【化２】
2014037387.tif 000003
【００２９】
〔式中，Ｒ１及びＲ２は，各々独立して，水素又はヒドロキシル基を表す。〕で示されるものである，上記１２のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１４．該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群から選ばれるものである，上記１３のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１５．該ヒト筋ジストロフィーが，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７，エクソン３１，又はエクソン３９において生じた変異に起因するものである，上記１１〜１４の何れかのヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１６．該変異が，配列番号１に示す野生型ヒトジストロフィンのｃＤＮＡにおいて，エクソン２７については３６１３番目のヌクレオチドであるＧの欠失，エクソン３１については４３０３番目のヌクレオチドであるＧのＴへの置換，エクソン３９については５５５１番目のヌクレオチドであるＣのＴへの置換に相当するものである，上記１５のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１７．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群より選ばれるものである，上記１５又は１６のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１８．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３１に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，ダイゼイン，プロシアニジンＢ２，カテキン，モリン，及びゲニステインよりなる群より選ばれるものである，上記１５又は１６のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
１９．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３９に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，モリン，ケンペロール，ダイゼイン，ゲニステイン，没食子酸エピガロカテキン，プロシアニジンＢ２，フィセチン，及びカテキンよりなる群より選ばれるものである，上記１５又は１６のヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
２０．該ヒト筋ジストロフィーがデュシェンヌ型又はベッカー型筋ジストロフィーである，上記１１〜１９の何れかのヒト筋ジストロフィー治療用ポリフェノール。
２１．ポリフェノールの有効量を患者に投与することを含む，ヒト筋ジストロフィーの治療方法であって，該ヒト筋ジストロフィーが，ジストロフィン遺伝子のエクソンに生じた変異に起因し，該変異がナンセンス変異であるか又はフレームシフトを引き起こす変異であり，且つ，当該変異を含むエクソンが野生型において３の倍数個のヌクレオチドで構成されるエクソンである，ヒト筋ジストロフィー治療方法。
２２．該ポリフェノールが，フラボノイド骨格又はイソフラボノイド骨格を１個又は２個有するポリフェノールである，上記２１のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２３．該ポリフェノールが構造式（Ｉ），
【化３】
2014037387.tif 000004
【００３０】
〔式中，Ｒ１及びＲ２は，各々独立して，水素又はヒドロキシル基を表す。〕で示されるものである，上記２２のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２４．該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群から選ばれるものである，上記２３のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２５．該ヒト筋ジストロフィーが，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７，エクソン３１，又はエクソン３９において生じた変異に起因するものである，上記２１〜２４の何れかのヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２６．該変異が，配列番号１に示す野生型ヒトジストロフィンのｃＤＮＡにおいて，エクソン２７については３６１３番目のヌクレオチドであるＧの欠失，エクソン３１については４３０３番目のヌクレオチドであるＧのＴへの置換，エクソン３９については５５５１番目のヌクレオチドであるＣのＴへの置換に相当するものである，上記２５のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２７．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン２７に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，及びミリセチンよりなる群より選ばれるものである，上記２５又は２６のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２８．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３１に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，ダイゼイン，プロシアニジンＢ２，カテキン，モリン，及びゲニステインよりなる群より選ばれるものである，上記２５又は２６のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
２９．該変異が，野生型ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン３９に生じた変異であり，該ポリフェノールが，ルテオリン，ケルセチン，ミリセチン，モリン，ケンペロール，ダイゼイン，ゲニステイン，没食子酸エピガロカテキン，プロシアニジンＢ２，フィセチン，及びカテキンよりなる群より選ばれるものである，上記２５又は２６のヒト筋ジストロフィーの治療方法。
３０．該ヒト筋ジストロフィーがデュシェンヌ型又はベッカー型筋ジストロフィーである，上記２１〜２９の何れかのヒト筋ジストロフィーの治療方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば，ヒトのジストロフィンエクソン前駆体ｍＲＮＡのスプライシングにおいて，遺伝子変異を含んだエクソンをスキップさせることにより，トランケート型ヒトジストロフィンの発現を促すことができるため，ＤＭＤの非常に重篤な疾患状態をＢＭＤのようなより軽い状態へと転換させることが可能となる。また，ＢＭＤ患者において，ナンセンス変異やフレームシフトを生ずる変異を有するにも拘わらずエクソンのスキッピングが自然にある程度生じていることによって軽症化している場合でも，スキッピングを促進して，症状の更なる緩和を図ることが可能となる。
【００３２】
また，ポリフェノールは，植物由来の食品，飲料に広く含有され，古くから日常的に摂取されており，特に，ワイン（ブドウ），茶，コーヒー，チョコレート（カカオ）に多く含まれていることが知られている成分でもあり，水溶性で体内に蓄積することもない。このため，本発明の治療剤及び治療方法には，生涯にわたる継続的治療の前提として求められる高い安全性が見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は，ヒトのジストロフィンの７９個のエクソンの配置を示す。各ブロックは各エクソンを示し，各々の上側の数字はエクソン番号を，またブロック数字は当該エクソンを構成するヌクレオチドの数を，それぞれ示す。また，隣接する一対のエクソンの境目が垂直に切られているものでは，その境目はコドンの境目と一致し，境目が比較的緩い勾配のもの（例えばエクソン１と２の境目）は，その境目がコドンの１文字目と２文字目の間にあり，境目が比較的急な勾配のもの（例えば，エクソン６と７の境目）は，その境目がコドンの２文字目と３文字目の間にあることを示す。
【図２】図２は，発現用ベクターＨ４９２のエクソンＡからエクソンＢまで及び両側の隣接領域を含んだ塩基配列（配列番号７）を示す。図において，塩基1〜12：HindIII部位及びAcc65I部位を含む隣接領域（配列番号８），塩基13〜110：エクソンＡ（配列番号２），塩基111〜177：イントロンＡ（配列番号３），塩基178〜205：マルチクローニングサイト（配列番号４），塩基206〜321：イントロンＢ（配列番号５），塩基322〜419：エクソンＢ（配列番号６），塩基420〜443：XhoI部位，XbaI部位及びApaI部位を含む隣接領域（配列番号９）
【図３】図３は，発現用ベクターＨ４９２の構造を示す概要図である。
【図４】図４は，変異型エクソン２７を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，試験した各ポリフェノール存在下での当該変異型エクソンのスキッピング率を示すグラフである。
【図５】図５は，変異型エクソン３１を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，試験した各ポリフェノール存在下での当該変異型エクソンのスキッピング率を示すグラフである。
【図６】図６は，変異型エクソン３９を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，試験した各ポリフェノール存在下での当該変異型エクソンのスキッピング率を示すグラフである。
【図７】図７は，変異型エクソン２７を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したケルセチン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【図８】図８は，変異型エクソン３１を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したケルセチン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【図９】図９は，変異型エクソン３９を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したケルセチン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は，変異型エクソン２７を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したルテオリン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【図１１】図１１は，変異型エクソン３１を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したルテオリン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【図１２】図１２は，変異型エクソン３９を含んだミニ遺伝子で形質転換した細胞における，添加したルテオリン濃度とエクソンスキッピング率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において，「スプライシング」とは，遺伝子から転写されたばかりの状態のｍＲＮＡが，分散して存在するエクソンと呼ばれる複数のコード領域と，イントロンと呼ばれる複数の非コード領域とから構成されるものである場合に，そのようなｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡ）からイントロンが除去されてエクソンのみが繋ぎ合わされて（spliced）成熟ｍＲＮＡが形成されるプロセスをいう。
【００３５】
本明細書において，あるエクソンについて「スキッピング」とは，スプライシングにおいて，当該エクソンが飛び越され（skipped）て，その前後に位置するエクソンが直接繋ぎ合わされることをいう。
【００３６】
本発明は，変異を有するエクソン（変異型エクソン）のスキッピングを誘導又は促進させることで，当該エクソンを欠き正常より長さは短いものの正常に近い機能を有するトランケート型ジストロフィンを患者体内で産生させ，それにより筋ジストロフィーの治療を行うものである。変異型エキソンが有する変異には，１個又は２個以上のヌクレオチドの欠失，置換又は挿入，あるいはこれらの組み合わせがあり得るが，筋ジストロフィーが発症している限りその変異型エクソンは患者にとって有害であり，当該変異型エクソンのスキッピングを誘導又は促進させれば，患者の症状は改善できる筈である。但し，このようにして治療が行えるためには，変異型エクソンに対応する野生型エクソンが３の倍数個のヌクレオチドで構成されていることを要する。さもなければ，当該変異型エクソンのスキッピングそれ自体が，下流の塩基配列に，本来の野生型での読み枠からのフレームシフトを引き起こすからである。
【００３７】
従って，本発明の治療剤は，ヒトジストロフィンにおいて，野生型では３の倍数個のヌクレオチドによって構成されているエクソン中，遺伝子変異により，直接ストップコドンが導入（ナンセンス変異）され又はフレームシフトが引き起こされていることによって発症する筋ジストロフィーに対し，適用することができる。野生型において３の倍数個のヌクレオチドによって構成されているエクソンは，エクソン３，４，５，９，１０，１３，１４，１５，１６，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４７，４８，４９，６０，６４，７１，７２，７３，７４，７７，及び７９であり（図１），これらのエクソンの何れかに生じた上記の変異による筋ジストロフィーが治療対象となり得る。
【００３８】
上記変異の具体例としては，野生型のヒトジストロフィン遺伝子において，ｃＤＮＡ上で３６１３番目に位置するヌクレオチド（エクソン２７中にある）Ｇの欠失が挙げられ，これはフレームシフトを生じて，早期のストップコドンを生じさせる。また，別の例として，ｃＤＮＡ上で４３０３番目に位置するヌクレオチド（エクソン３１中にある）ＧのＴへの置換が挙げられ，これは，直接にストップコドンを生じるナンセンス変異である。更に別の例として，ｃＤＮＡ上で５５５１番目に位置するヌクレオチド（エクソン３９中にある）ＣのＴへの置換であり，これもナンセンス変異である。
【００３９】
本発明において，ポリフェノールのうち，好ましいのは比較的低分子量のものであり，それらのうち特に，フラボノイド骨格（ａ）又はイソフラボノイド骨格（ｂ），
【００４０】
【化４】
2014037387.tif 000005
【００４１】
を有するものが好ましい。これらの骨格の好ましい個数は，１個又は２個である。特に好ましいポリフェノールは次の一般式（Ｉ），
【００４２】
【化５】
2014037387.tif 000006
【００４３】
〔式中，Ｒ１及びＲ２，各々独立して，水素又はヒドロキシル基を表す。〕で示されるものである。このうち，Ｒ１，Ｒ２が共に水素原子のものはルテオリン（luteolin）として知られており，Ｒ１が水素原子，Ｒ２がヒドロキシル基のものはケルセチン（quercetin）として，またＲ１，Ｒ２が共にヒドロキシル基のものはミリセチン（myricetin）として知られている。本発明において，特に好ましいのは，これら３種の化合物であり，それらのうちルテオリン及びケルセチンが取り分け好ましい。
【００４４】
本発明は，エクソンに変異（ストップコドンの導入やフレームシフト）を有することに起因する種々のヒト筋ジストロフィーの治療に用いることができる。主たる治療対象としてＤＭＤ患者が挙げられるが，ＢＭＤ患者であっても，本来ならＤＭＤの症状を呈するタイプの遺伝子変異を有しながら，変異のあるエクソンの自発的なスキッピングがある程度生じているためにＢＭＤの症状を呈する患者にも，症状を更に軽くするために適用することができる。
【００４５】
ヒトＤＭＤ及びＢＭＤは，ヒトジストロフィン遺伝子中の変異に原因があり，その遺伝子がヒト固有のもので，それにより産生されるジストロフィンも，またそれが発現し且つ機能する細胞環境もヒト固有のものであるため，ヒトの筋ジストロフィーに対する治療効果を評価できるような動物モデルは現在のところ存在しない。
【００４６】
しかしながら，ある化合物が，野生型では３の倍数個のヌクレオチドで構成されている筈の，変異を含んだエクソン（変異型エクソン）のスキッピングを誘導又は促進する効果を有しているか否か，を判定する方法として次のものが確立されている。即ち，(i) 当該変異型エクソンと，その両側にそれぞれイントロン領域を介して隣接させた人工的エクソン領域とを含むＤＮＡ断片（本明細書において，「ミニ遺伝子」という。）を作製し，(ii) これを適当な哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで組換えベクターを構築し，(iii)
当該組換えベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし，(iv) 得られた形質転換細胞を，当該化合物に接触させた状態で培養し，(v) 細胞からＲＮＡを単離し，これを鋳型としてミニ遺伝子に対応しているＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりを増幅し，(vi) 増幅産物を解析（例えば，電気泳動や配列決定で）することにより，変異型エクソンのスキッピングが誘導又は促進されたか否かを確認する，という方法である。
【００４７】
ある化合物が，上記のミニ遺伝子において上記の変異型エクソンのスキッピングを誘導又は促進する場合，同じ変異型遺伝子を有する実際の患者においては，当該化合物の投与により筋細胞を当該化合物と接触させ，筋細胞内でジストロフィンｍＲＮＡのスプライシング中に変異型エクソンのスキッピングを誘導（又は促進）し，それにより，ナンセンス変異の回避やフレームシフトの回避を促し（又は回避割合を高め），全長に近い長さのトランケート型ジストロフィンの合成を起こさせる（又は促進させる）ことができる。これはＤＭＤの軽症化すなわちＢＭＤ様の疾患への転換（又はＢＭＤの更なる症状緩和）である。
【００４８】
本発明の筋ジストロフィー治療剤は，非経口投与（注射，点滴）されても良いが，ポリフェノールは元来，植物由来の種々の飲食物に含まれており，古くから日常的に摂取されてきたものであるから，患者に継続的に経口投与するのに特に適している。
【００４９】
経口投与用製剤としては，錠剤，顆粒剤，カプセル剤，散剤等，任意の形態とすることができる。製剤の製造は，主薬であるポリフェノールに，製剤分野の当業者に知られている賦形剤，結合剤，滑沢剤，崩壊剤，湿潤剤その他から，採用する製剤の種類に応じて適宜選択して配合し，常法に従って行えばよい。
【００５０】
賦形剤としては，例えば乳糖，白糖，Ｄ−マンニトール，デンプン，結晶セルロース，軽質無水ケイ酸が挙げられ，結合剤としては，例えば，結晶セルロース，白糖，Ｄ−マンニトール，デキストリン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ポリビニルピロリドン等の高分子化合物が挙げられ，滑沢剤としては，例えば，ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸カルシウム，タルク，及びコロイドシリカが挙げられ，崩壊剤としては，例えば，デンプン，カルボキシメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースカルシウム，クロスカルメロースナトリウム，及びカルボキシメチルスターチナトリウムが挙げられ，湿潤剤としては，例えば，グリセリン，ブチレングリコール，プロピレングリコール，ソルビトール，及びトリアセチンが挙げられるが，これらに限られない。
【００５１】
本発明の治療剤において，主薬であるポリフェノールの経口投与量は，患者の疾患状態や体重に合わせて担当医師が適宜増減するものであるが，一般的には，患者の体重当たり１０〜２００ｍｇ／ｋｇ／日，より好ましくは２０ｍｇ〜１５０ｇ／ｋｇ／日，更に好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり，これが朝昼晩等，複数回に分割して投与されることが好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下，実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明がそれらの実施例に限定されることは意図しない。
【００５３】
〔実施例１〕
１．筋ジストロフィー患者のジストロフィン遺伝子の同定
次の筋ジストロフィー患者の検査によりジストロフィンの変異がそれぞれ確認された。
（１）ＫＵＣＧ＃５７９（男，2002年8月生）
２才時，腸炎の際に血液検査を施行し，偶然高ＣＫ血症（3743 IU/L）を指摘された。精査目的で神戸大学病院小児科受診し，エクソン２７内に，配列番号１に示すヒトジストロフィンのｃＤＮＡ（成熟ｍＲＮＡに対応）における３６１３番目に位置するヌクレオチドＧの欠失（ｃ．３６１３  ｄｅｌＧ）が認められた。これはフレームシフトを引き起こす変異であり，野生型におけるｃ．３６７４〜３６７６に対応する位置にストップコドンを生じさせる。ＣＫ値は3950〜27160 IU/Lで推移していた。
（２）患者ＫＵＣＧ＃７９７（男，生検時４歳，2004年10月生）
２才時に定期血液検査でクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値が2567 IU/Lと高ＣＫ血症の状態を呈し，精密検査のため受診した神戸大学病院小児科における遺伝子解析にて，ジストロフィン遺伝子エクソン３１内にナンセンス変異が同定された。同変異は，配列番号１に示すヒトジストロフィンｃＤＮＡの配列において，第４３０３番のヌクレオチドＧがＴに（ＲＮＡではＧがＵに）置き換わったものである（ｃ．４３０３  Ｇ＞Ｔ）。この変異は，ＧＡＧからストップコドンＴＡＧへの変異である。従って，このナンセンス変異は，ジストロフィンを欠く重篤なＤＭＤの症状を予想させるものであるが，変異型エクソン３１の自発的スキッピングが幾分起こるため，患者において，同エクソンがコードするアミノ酸配列領域のみを欠いたジストロフィンがある程度の量産生されている（特許文献４）。
（３）患者ＫＵＣＧ＃５７７（男，生検時12歳，2009年8月生）
４歳時に転びやすい，階段を登りにくいなどの症状よりＤＭＤを疑われ，近医で筋生検施行しＤＭＤと診断された。遺伝子診断目的で5歳時に神戸大学病院小児科受診し，エクソン３９にナンセンス変異（ｃ．５５５１  Ｃ＞Ｔ）が同定された。
【００５４】
２．変異型エクソンを含むミニ遺伝子を組み込んだ発現ベクターへの作製
上記の何れかの変異型エクソンと，その前後にそれぞれ連結した非翻訳領域である上流側イントロン及び下流側イントロン，更にそれらの前後にそれぞれ連結した翻訳領域である人工的エクソン（それぞれ，「エクソンＡ」，「エクソンＢ」という。）からなる各ヌクレオチド（ミニ遺伝子）を含む発現ベクターを，発現用ベクターＨ４９２を用いて，以下の手順で作製した。なお，上記の上流側イントロンは，当該発現用ベクターＨ４９２が有するマルチクローニングサイトの5'末端に連結しているイントロン（「イントロンＡ」という。）に，当該マルチクローニングサイトの5'末端の６塩基（NheI部位）が連結したまま残り，その3'末端に更に，ジストロフィン遺伝子における変異型エクソンの5'末端に連結するイントロンのうち変異型エクソン側（3'側）の125〜192個の塩基が連結したものである。また，上記の下流側イントロンは，上記発現用ベクターＨ４９２が有するマルチクローニングサイトの3'末端に連結しているイントロン（「イントロンＢ」という。）に，当該マルチクローニングサイトの3'末端の６塩基（BamHI部位）が連結したまま残り，その5'末端に更に，ジストロフィン遺伝子における変異型エクソンの3'末端に連結するイントロンのうち変異型エクソン側（5'側）の96〜182個の塩基が連結したものである。
【００５５】
（１）発現用ベクターＨ４９２
文献〔Mol Genet Metab (2005) 85, 213-219., J
Med Genet (2006) 43, 924-930., Hum Genet (2007) 120, 737-742.〕の記載に従って作製された発現ベクターＨ４９２を準備した。Ｈ４９２は，ｐｃＤＮＡ３
(invitrogen) をKpnI及びXhoIで切断しエクソンＡ（配列番号２）,イントロンＡ（配列番号３），マルチクローニングサイト（配列番号４），イントロンＢ（配列番号５）及び エクソンＢ（配列番号６）を挿入したものである。これら挿入された部分の塩基配列及びその前後の塩基配列断片を図２及び配列番号７に示す。図２において，末端側の1〜12番目の塩基（配列番号８）は，HindIII部位及びAcc65I部位を含む隣接領域， 13〜110番目の塩基はエクソンＡ，
111〜177番目の塩基はイントロンＡ， 178〜205番目の塩基はマルチクローニングサイト， 206〜321番目の塩基はイントロンＢ， 322〜419番目の塩基はエクソンＢ，そして420〜443番目の塩基（配列番号９）は，XhoI部位，XbaI部位及びApaI部位を含む隣接領域を，それぞれ構成する。図３は，得られた発現用ベクターＨ４９２の構造の概要図である。
【００５６】
（２）ミニ遺伝子の作成
（ａ）Ａ−１．Ｈ４９２制限酵素反応
Ｈ４９２ (600 ng/μL)
7.5μLに，制限酵素であるNheI (New England
Biolabs) 及びBamHI (New England Biolabs) を各々0.7μL，NEBuffer 2 (New
England Biolabs) を3.0μL，MQ（Milli-Q, Milllipore Corp.）を総量が30μLになるように加え，混合し，37℃で2時間インキュベートした。その後CIP (Calf
intestine alkaline phosphatase，
New England Biolabs) 1.0μLを加え，37℃で更に1時間インキュベートした。反応完了後，MinElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN) を用い，製品に付属のプロトコールに従い精製を行った。
【００５７】
（ｂ）挿入用遺伝子の増幅
変異を持つ上記患者のgDNA（ゲノムDNA）及びコントロール用の健常者のgDNAをPCR法により増幅した。増幅用のプライマーは，変異のあるエクソンの前後のイントロンを100〜150塩基程度含むような場所にPrimer3
(v.0.4.0) Pick primers from a DNA sequence. (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)
を利用して設計した。この際エクソンの上流側のイントロンの枝分かれ部位を含むように注意した。設計したプライマーに対し，フォワード側にNheI制限酵素部位 (GCTAGC)，リバース側にBamHI制限酵素部位 (GGATCC) を追加した。またそれぞれの5'側にG及びCの組み合わせからなる3塩基を追加した。設計したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
＜エクソン２７用プライマー＞
Int26f-NheI (5'-GCGGCTAGCAAATTTATGGAAGAGACTGGAGTTCA-3':
配列番号１０) 及び
Int27r-BamHI (5'-GCGGGATCCCAAGTTAAGCAAATGGCCCAAA-3':
配列番号１１）
＜エクソン３１用プライマー＞
Int30f-NheI (5'-GCGGCTAGCGTGATCCACCTGCCTCGAC-3':
配列番号１２）及び
Int31r-BamHI (5'-GCGGGATCCTCAAATCCAATCTTGCCAAT-3':
配列番号１３）
＜エクソン３９用プライマー＞
Int38f-NheI （5'-gcggctagcgcattccatgaaagttttaaattgg-3': 配列番号１４）及び
Int39r-BamHI （5’-gcgggatccgcaacacatcgttcaaaatcaa-3':
配列番号１５）
【００５８】
エクソン２７，３１，又は３９に変異を有する患者からの上記gDNAについて，対応するエクソンのプライマー対を用いて，それぞれ，gDNA 2.0μL， Ex Taqポリメラーゼ 0.5 U，10×Ex Taq
Buffer 2.0μL，2.5 mM dNTPs 1.5μL，フォワードプライマー
10 pmol 1.0μL，リバースプライマー 10 pmol 1.0μL，MQを総量が20μLになるように調製しPCR法により増幅した。PCRの条件は，94℃で5分間加熱の後，94℃30秒，60℃30秒，及び72℃90秒からなる反応サイクルを35回，次いで72℃で5分間加熱とした。増幅したPCR産物を，MinElute PCR Purification Kitを用い，製品に付属のプロトコールに従い精製した。
【００５９】
（ｃ）挿入用遺伝子の制限酵素反応
上記で精製したDNA産物10μLに対し，NEBuffer（New England Biolabs）2.5μL，NheI（New England Biolabs） 1.0μL，BamHI（New
England Biolabs） 1.0μL，MQを総量が25μLとなるように加え，37℃で2時間インキュベートした。反応終了後，MinElute Reaction Cleanup Kitを用い精製を行った。
【００６０】
（ｄ）ライゲーション
DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）を用い，Ｈ４９２ベクター1.0μLに，挿入用遺伝子2μL，Ｉ液（Enzyme Solution，Takara）5μL，MQを総量10μLになるように加え，16℃で2 時間インキュベートした。
【００６１】
こうして得られた各発現ベクターにおいて，元のＨ４９２のマルチクローニングサイトのNheI部位とBamHI部位間には，ジストロフィン由来DNAが挿入されている。すなわち，変異型エクソン２７用発現ベクターにおいては，配列番号１６に示すジストロフィン由来DNAが挿入されており，そのうち1〜156番目の塩基はジストロフィンイントロン２６の一部を，157〜338は変異型エクソン２７を，そして339〜499番目の塩基はイントロン２７の一部を，それぞれ構成する。変異型エクソン３１用発現ベクターにおいては，配列番号１７に示すジストロフィン由来DNAが挿入されており，そのうち1〜192番目の塩基はイントロン３０の一部を，193〜303番目の塩基は変異型エクソン３１を，そして304〜399番目の塩基はイントロン３１の一部を，それぞれ構成する。また，変異型エクソン３９用発現ベクターにおいては，配列番号１８に示すジストロフィン由来DNAが挿入されており，そのうち1〜125番目の塩基はイントロン３８の一部を，126〜263番目の塩基は変異型エクソン３９を，そして264〜445番目の塩基はイントロン３９の一部を，それぞれ構成する。
【００６２】
（ｅ）形質転換
ライゲーション反応液4μLに対し，III液（Transfection Enhancer，Takara）0.4μL及びE. coli. DH5α Competent Cells（Takara）30μLを加え，氷中に30分間静置した後，42℃で1分間インキュベートし，再び氷中に1分間静置した。その後あらかじめ37℃に保温しておいたSOC培地を300μL加え，37℃，200 rpmで1時間振とうした。振とう後，室温で4,500 rpmで1分間遠心し，上清を220μL除去し，再けん濁後LBプレートに撒き，37℃で一晩培養した。
【００６３】
（ｆ）塩基配列の確認
形成された単一コロニーを滅菌済みの爪楊枝で拾い，Ex Taqポリメラーゼ0.5 U，10×Ex Taq
Buffer 2.0μL，2.5 mM dNTPs 1.5μL，フォワードプライマー 10 pmol/μL 1.0μL，リバースプライマー 10 pmol/μL 1.0μLを加え，MQを総量が20μLになるように調製した反応液でPCR法により増幅した。PCRの条件は，94℃で5分間加熱の後，94℃30秒，60℃30秒，及び72℃90秒からなる反応サイクルを35回，次いで72℃で5分間加熱とした。PCR産物につき，2%アガロースゲルを用いて135 Vで20分間電気泳動を行い，サイズの確認を行った。目的のサイズのPCR産物について塩基配列の確認を行った。塩基配列が確認されたミニ遺伝子発現ベクターを含んだコロニーを，LB 培地5 mLを14 mL遠心管に入れたものに滅菌済みの爪楊枝で添加し，37℃ 200 rpmで一晩振とうし，ミニ遺伝子発現ベクターを増幅した。増幅したミニ遺伝子発現ベクターを，QIAprerp Miniprep kit（QIAGEN）を用い，製品に付属のプロトコールに従って精製した。
【００６４】
３．トランスフェクション
（１）HeLa細胞の培養
24ウェルプレートに，各ウェルあたり1.5×105 個のHeLa細胞を5 %FBS（Gibco），及び1%
ABAM （Invitrogen）を含むDMEM（D-MEM High Glucose; Wako）を用いて，37℃，5% CO2存在下で一晩培養した。
【００６５】
（２）トランスフェクション
上記のウェルあたりミニ遺伝子発現ベクター30 ngを，lipofectamine2000（Invitrogen）を用い製品に付属のプロトコールに従って，細胞にトランスフェクションさせた。即ち，50μLのOpti-MEM（Invitrogen）とミニ遺伝子発現ベクター30 ngの混合液中に，Opti-MEM50μLとlipofectamine2000
1μLとの混合液を加え，よく混ぜた後，室温で20分間インキュベートした。その間に，Hela細胞を含んだ上記の24ウェルプレートをPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で2回洗浄し，各ウェルにOpti-MEM 400μLを加えた。これらのウェルの各々に，インキュベーションが終了したミニ遺伝子とlipofectamine2000の複合体を添加し，2.5時間トランスフェクションを行った。
【００６６】
（３）ポリフェノールの添加
トランスフェクション後，各ウェルから培地を除去し，各ウェルに，5%FBS（Gibco）を含むDMEM（D-MEM
High Glucose; wako）1 mLを加えた。これに，DMSO中に溶解した次の表に示す各ポリフェノールを添加後，37℃，5% CO2存在下で24時間，細胞を培養した。ポリフェノールの添加に当たっては，DMSOの細胞毒性を考慮しその添加量が僅かで済むよう，ポリフェノール溶液2μLを添加したときに培地中で目的の最終ポリフェノール濃度（ＱＤは50μM，ＬＴは30μM，他は100μM）が達成できるような濃度の溶液を用いた。また，対照として，ポリフェノール溶液無添加のもの（-），及びポリフェノール不含のDMSO 2μLを添加したものを設けた。
【００６７】
【表１】
2014037387.tif 000007
【００６８】
４．総RNAの抽出
各ウェルから培地を吸引除去した後，ウェルをPBSで2回洗浄し，0.25% トリプシン
250μLを加え37℃，5%CO2存在下で10分間インキュベートし，ウェルから細胞をはがし回収した。回収した細胞から，High Pure RNA Isolation Kit（Roche）を用い，製品に付属のプロトコールに従って，RNAを抽出した。
【００６９】
５．スプライシング産物の分析
（１）逆転写反応
300 ngの総RNAを6μLになるようMQで調製し，20×ランダム  ヘキサマー  プライマー 2μLと2.5 mM dNTP mix (Takara) 5μLとを加え，65℃で5分間加熱後，25℃で10分間反応を行い，M-MLV
RT (Invitrogen) 1μL，RNase out (Invitrogen)
1μL，0.1 M DTT (Invitrogen) 1μL，5×First strand
Buffer (Invitrogen) 4μL を加え37℃で55分間反応させ，70℃で15 分間加熱し，cDNAを合成した。
【００７０】
（２）PCR 法によるDNAの増幅
合成したcDNA 2μLに対し，10×PCR Buffer (Takara) 2μL，2.5 mM dNTP mix (Takara) 1.6μL，フォワードプライマー（YH307：5'-ATTACTCGCTCAGAAGCTGTGTTGC-3'：配列番号１９） 10 pmol/1μL 1μL，リバースプライマー（YH308：5'-AAGTCTCTCACTTAGCAACTGGCAG-3'：配列番号２０）
10 pmol/1μL 1μL，Ex Taqポリメラーゼ (Takara) 0.5 U，及びMQ 12.3μLを加え，総量が20μLになるように調整し，PCR反応を行いDNAを増幅した。PCRの条件は，94℃ 5分加熱後，94℃30秒，60℃30秒，及び72℃90秒からなる反応サイクルを25回，次いで72℃ 3分加熱とした。
【００７１】
（３）電気泳動
上記で増幅したPCR産物につき，Agilent
2100 Bioanalyzer（Agilent technology）及びDNA1000 LabChip kit（Agilent technology）を使用し，付属のプロトコールに従い解析を行った。解析に際しては，解析ソフトである2100 Expet（Agilent technology）に示されるpeak height値を使用し，スプライシングにおいて変異型エクソンのスキッピングの起こる割合（エクソンスキッピング率）を，「スキッピング産物／総スプライシング産物」比として計算した。
【００７２】
結果を図４〜６に示す。図において，縦軸は，エクソンスキッピング率を示す。図４に見られるように，変異型エクソン２７のミニ遺伝子を導入した細胞は，約０．２５のエクソンスキッピング率で，変異型エクソンの自発的スキッピングを起こしエクソンＡにエクソンＢが直接連結したmRNAを産生した。これに対して，ケルセチン（ＱＤ），ミリセチン（ＭＣ），及びルテオリン（ＬＴ）を添加した細胞では，エクソンスキッピング率は約0.3まで上昇しており，変異型エクソンのスキッピングを促進していることがうかがわれる。
【００７３】
図５は，変異型エクソン３１のミニ遺伝子を導入した細胞での各ポリフェノールの添加による影響を示す。変異型エクソン３１の場合，自発的なエクソンスキッピング率は約0.07であり，これに対してケルセチン（ＱＤ）及びルテオリン（ＬＴ）を添加した場合，共に約0.14と，２倍のエクソンスキッピング率を示している。他のポリフェノール，例えばダイゼイン（ＤＤ）でも，エクソンスキッピング率は0.1と増大しており，ミリセチン（ＭＣ），プロシアニジンＢ２（ＰＣＢ２），カテキン（ＣＣ），モリン（ＭＨ），ゲニステイン（ＧＳ），ノビレチン（ＮＬ）でも増加が見られる。
【００７４】
図６は，変異型エクソン３９のミニ遺伝子を導入した細胞での各ポリフェノールの添加による影響を示す。変異型エクソン３９の場合，自発的なエクソンスキッピング率は約0.03であるのに対し，ルテオリン（ＬＴ）を添加した場合約0.16と５倍以上に著しく増大しており，ケルセチン（ＱＤ）を添加した場合も約0.115と約３倍に，またミリセチン（ＭＣ）添加でも0.065と２倍以上に増大している。また，モリン（ＭＨ）で約0.05，ケンペロール（ＫＦ），ダイゼイン（ＤＤ），及び，ゲニステイン（ＧＳ）で何れもに約0.045以上に増大し，没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ），プロシアニジンＢ２（ＰＣＢ２），フィセチン（ＦＴ），及びカテキン（ＣＣ）でも増大傾向が見られる。
【００７５】
上記の結果は，ジストロフィンmRNAのスプライシングにおける変異型エクソン２７，３１，又は３９に対して特定のポリフェノールがスキッピングを誘導又は促進することを示している。エクソンスキッピングの促進又は誘導が認められるのは，変異型エクソン２７に対してはケルセチン（ＱＤ），ミリセチン（ＭＣ），及びルテオリン（ＬＴ）；変異型エクソン３１に対してはケルセチン（ＱＤ），ルテオリン（ＬＴ），ダイゼイン（ＤＤ），ミリセチン（ＭＣ），プロシアニジンＢ２（ＰＣＢ２），カテキン（ＣＣ），モリン（ＭＨ），ゲニステイン（ＧＳ）；変異型エクソン３９に対してはルテオリン（ＬＴ），ケルセチン（ＱＤ），ミリセチン（ＭＣ），モリン（ＭＨ），ケンペロール（ＫＦ），ダイゼイン（ＤＤ），ゲニステイン（ＧＳ），没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ），プロシアニジンＢ２（ＰＣＢ２）であり，変異型エクソンによって異なるが，ケルセチン，ルテオリン，ミリセチンは，変異型エクソン２７，３１及び３９の何れについても，スキッピングの誘導又は促進効果を示し，特に，ケルセチン及びルテオリンについては，効果が特に顕著である。
【００７６】
上記の，エキソンスキッピングを誘導又は促進する効果が見られたポリフェノールの構造式を次に示す。
【００７７】
【化６】
2014037387.tif 000008
【００７８】
【化７】
2014037387.tif 000009
【００７９】
変異型エクソンスキッピング率に対する増大効果が，試験した各変異型エクソンの全てに対し共通して取り分け顕著に見られたケルセチン（ＱＤ）及びルテオリン（ＬＴ）について，各変異型ミニ遺伝子導入細胞の培地に次の濃度：
ケルセチン：５μＭ，１０μＭ，２５μＭ，５０μＭ，及び１００μＭ
ルテオリン：５μＭ，１０μＭ，３０μＭ及び３０μＭ
でそれぞれ添加し，各変異型エクソンのスキッピング率を調べた。細胞の準備，各ポリフェノール溶液の調製，添加及び細胞培養は，前記の条件に準じて行った。結果を図７〜１２に示す。
【００８０】
図７〜９は，それぞれ，変異型エクソン２７，３１及び３９を含むミニ遺伝子導入細胞への，ケルセチン（ＱＤ）添加とエクソンスキッピング率との関係を示す。横軸はケルセチンの添加濃度を，縦軸はエクソンスキッピング率を表す。これらの図から明らかなとおり，各変異を含んだエクソンのエクソンスキッピング率におけるケルセチン用量への依存性が確認された。
【００８１】
図１０〜１２は，それぞれ，変異型エクソン２７，３１及び３９を含むミニ遺伝子導入細胞での，ルテオリン添加の結果を示し，何れの変異においても，エクソンキッピング率におけるルテオリン用量への依存性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のヒト筋ジストロフィー治療剤又は治療方法によれば，トランケート型ヒトジストロフィンの発現を誘導又は促進することができるため，ＤＭＤ患者及びにおける重篤な疾患状態をＢＭＤのようなより軽い病型へと転換させることが可能となる。また，ＢＭＤ患者において，ナンセンス変異やフレームシフトを生ずる変異を有するエクソンのスキッピングが自然にある程度生じていることによって幾分軽症化している場合でも，スキッピングを促進して，症状の更なる緩和を図ることが可能となる。
また，遺伝子疾患であるため患者は生涯の治療を要するが，ポリフェノールは，植物由来の飲食物に広く含有され，古くから日常的に摂取されており，体内に蓄積することもないため，生涯にわたって投与する上で安全性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号２：  エクソンＡ
配列番号３：  イントロンＡ
配列番号４：  マルチクローニングサイト
配列番号５：  イントロンＢ
配列番号６：  エクソンＢ
配列番号７：  エクソンＡ〜Ｂ及び隣接領域
配列番号８：  エクソンＡの隣接領域
配列番号９：  エクソンＢの隣接領域
配列番号１０：  プライマーInt26f-NheI
配列番号１１：  プライマーInt27r-BamHI
配列番号１２：  プライマーInt30f-NheI
配列番号１３：  プライマーInt31r-BamHI
配列番号１４：  プライマーInt38f-NheI
配列番号１５：  プライマーInt39r-BamHI
配列番号１９：  プライマーYH307
配列番号２０：  プライマーYH308
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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