(57)【要約】      （修正有）【課題】リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）の阻害剤を含む、線維症に関連する様々な疾患を予防及び治療するための組成物、並びにその治療方法及びキットの提供。【解決手段】ＬＯＸＬ２のインヒビターとして抗ＬＯＸＬ２抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスポリヌクレオチドを含む組成物、及び肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚瘢痕化及びケロイドを治療するための方法、並びにその関連組成物及びキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症の治療方法に使用するためのリシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）のインヒビターであって、ＬＯＸＬ２のインヒビターが抗ＬＯＸＬ２抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスポリヌクレオチドである、リシルオキシダーゼ様２のインヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、２００７年８月２日に出願した「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ，  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」と題する米国仮出願第６０／９６３，２８２号（整理番号第３５１２０−７０４．１０１号）、２００７年８月２日に出願した「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ」と題する米国仮出願第６０／９６３，２４９号（整理番号第３５１２０−７０６．１０１号）、２００７年８月２日に出願した「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する米国仮出願第６０／９６３，２１４号（整理番号第３５１２０−７０６．１０２号）、２００７年８月２日に出願した「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｙ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する米国仮出願第６０／９６３，２４８号（整理番号第３５１２０−７０６．１０３号）及び２００７年８月２日に出願した「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｌｙｓｙｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ」と題する米国仮出願第６０／９６３，２４６号（整理番号第３５１２０−７０７．１０１号）の恩典を主張するものであり、また２００８年８月１日に出願した出願番号第  号の「ＬＯＸ  ａｎｄ  ＬＯＸＬ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する同時係属米国特許出願（整理番号第３５１２０−７１５．２０１号）及び２００８年８月１日に出願した出願番号第  号の「ＬＯＸ  ａｎｄ  ＬＯＸＬ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＰＣ特許出願（整理番号第３５１２０−７１５．６０１号）に関連する。
【背景技術】
【０００２】
１．がん
がんは、米国及び他の先進国における深刻な公衆衛生上の問題である。現在、米国における４つの死因の１つはがんである。がん療法は、腫瘍細胞を殺滅する化学療法薬により患者を治療することを含む。しかし、腫瘍細胞のサブセットは、しばしば薬物療法に対して抵抗性であり、生残して最初の部位及び遠隔部位で再び増殖し、これが検出可能な疾患の再発及び罹患につながる。浸潤及び転移能が高いという特性、並びに薬物耐性の変化を有する多くの癌腫瘍細胞は、ＥＭＴ（上皮間葉移行）を含む又はそれと類似の形態的転換を受けると考えられる。ＥＭＴを受ける細胞は、上皮細胞の正常な接着特性を失い、Ｅ−カドヘリン発現及び間葉マーカーの発現の喪失、運動性の増大、浸潤性の増大、並びに細胞死に対する抵抗性の増大などの一連の変化を受ける。
がんの主要な療法は、現在のところ手術、放射線及び化学療法である。抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、ニトソ尿素、ビンカアルカロイド、ステロイドホルモン及び代謝拮抗薬などの化学療法アプローチは、腫瘍専門医に利用可能な療法の主体をなしている。がん治療の分野の発展があるにもかかわらず、がんは依然として重大な健康上の問題である。
【０００３】
２．血管新生
先在毛細血管からの新たな血管の形成である血管新生は、広範囲な生理学的及び病理学的過程における極めて重要である一連の事象である。胚発達、創傷治癒及び月経周期におけるような正常組織の成長は、酸素及び栄養の供給並びに廃棄物の除去のための新たな血管形成に対する依存性によって特徴づけられる。多くの異なる及び無関係の疾患も新たな血管系の形成に関連する。特定の病状の主なものは、血管新生が低く、疾患の状態を改善するために促進すべきである状態である。しかし、より頻繁には、過度の血管新生は、細胞の異常又は無制限増殖により特徴づけられる又はそれに関連する病変を含む様々な病変の重要な特性である。過度の血管新生を伴う病変としては、例えば、がん（充実性及び血液学的腫瘍）、心血管疾患（アテローム動脈硬化症及び再狭窄など）、慢性炎症（慢性関節リウマチ、クローン病）、糖尿病（糖尿病性網膜症）、乾癬、子宮内膜症、血管新生緑内障及び肥満症などがある。これらの状態は、血管新生の化学療法による抑制により利益を得ることができる。
【０００４】
一般的に言えば、血管形成過程は、正常に休止している内皮の増殖及び移動、細胞周囲マトリックスの制御されたタンパク質分解、毛細管を発生させることによる新たな細胞外マトリックス成分の合成を伴う。新たな細胞内及び細胞間接触の確立、並びに内皮細胞の毛細管様管状ネットワークへの形態的分化は、高度に組織化された機能的微小血管ネットワークを形成するためのそれらのその後の成熟、分岐、リモデリング及び選択的退行を支援する。血管内皮のその周囲の支質成分とのオートクリン、パラクリン及びアンフィクリン相互作用、並びに生理的血管新生を調節する血管新生向性及び血管形成阻害性サイトカイン並びに成長因子は、通常、空間的かつ時間的にしっかりと調節されている。
血管新生は、腫瘍性組織の成長に非常に重要なものである。１００年以上にわたって、腫瘍は、正常組織より血管が多いことが認められている。いくつかの実験的研究で、原発腫瘍の成長及び転移には新生血管形成が必要であることが示唆された。正常組織の成長について上で述べた十分に調節されている過程と対照的に、活発な腫瘍成長に必要な病的血管新生が一般的に持続し、存続し、血管形成表現型の最初の獲得が様々な充実性及び血液学的腫瘍型の発生の一般的なメカニズムである。血管ネットワークを補充し、維持することができない腫瘍は、一般的にｉｎ  ｓｕｔｕで無症候性病変として休止状態のままである。転移も血管新生依存性であり、転移に成功した腫瘍細胞の場合、一般的に原発腫瘍における血管系に近づく手段を獲得し、循環中で生残し、標的臓器の微小血管系において休止状態となり、この微小血管系から出て、標的臓器において成長し、標的部位における血管新生を誘発する。したがって、血管新生は、転移カスケードの開始時と完了時に必要であると思われる。
【０００５】
したがって、新生物の成長及び転移に対する血管新生の最も重要な段階は、化学療法における努力の最適な目標を与える。適切な血管新生阻害薬は、その開始を遅延させる（すなわち、「血管形成スイッチ」を阻止する）ことにより、又は多くの腫瘍型に特有な持続性及び病巣性新生血管形成を阻止することにより、腫瘍関連血管形成に影響を及ぼすように直接的又は間接的に作用することができる。腫瘍関連内皮並びに複数の分子及び細胞過程を対象とする血管新生阻害療法、並びに持続性の病的血管新生に関連する標的は、複数の臨床試験においてそれらの安全性と有効性について評価されている。しかし、現在までのところ安全かつ／又は有効な血管新生阻害薬の発見及び／又は特定に関する成功は限られている。
【０００６】
３．線維症
線維症は、損傷組織における創傷治癒過程の一部として起こり得る線維組織の異常な蓄積である。そのような損傷組織は、物理的損傷、炎症、感染、毒素への曝露及びその他の原因に起因し得る。線維症の例としては、皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症（例えば、珪肺症、石綿症）、腎線維症（糖尿病性腎症を含む）、強皮症及び糸球体硬化症などがある。
例えば、肝線維症は、慢性肝障害に対する創傷治癒反応の一部として発生する。線維症は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール症、住血虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞、毒素への曝露及び代謝障害の合併症として起こる。この瘢痕組織の形成は、損傷組織を封じ込める身体による試みであると考えられている。肝線維症は、正常な肝臓におけるものと定性的に区別することができる細胞外マトリックスの蓄積によって特徴づけられる。抑制のないままの肝線維症は、肝硬変（被包結節の存在によって定義される）、肝不全及び死亡に進行する。
Ｌｉ及びＦｒｉｅｍａｎ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、１４巻、６１８〜６３３頁、１９９９年）により要約されているように、肝線維症の実際及び提案された治療戦略は、基礎をなす原因（例えば、毒素又は感染因子）の除去、炎症の抑制（例えば、コルチコステロイド、ＩＬ−１受容体拮抗薬又は他の薬剤を用いた）、例えば、ガンマインターフェロン若しくは抗酸化剤を用いた星状細胞活性化のダウンレギュレーション、マトリックスの分解の促進又は星状細胞のアポトーシスの促進などである。最近の進歩にもかかわらず、これらの戦略の多くは依然として実験段階にあり、既存の療法は基礎をなす生化学的過程に対応するのではなく、炎症を抑制することを目的としている。したがって、肝及び肺線維症を含む線維症を治療するための物質及び方法が当技術分野において依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がん、異常又は望ましくない血管新生及び線維症に関連する疾患を治療する方法の改善が当技術分野において必要である。本開示は、この必要に対応するものであり、関連する恩恵を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ｉ．処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬを阻害することによる治療
本開示は、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患をリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を用いることにより予防及び治療するための革新的な方法並びに関連組成物及びキットを提供する。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、全長又は処理形であってよい。全長ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、プロ酵素又はプロペプチド形（すなわち、シグナル配列を含まない）であるが、処理形又は開裂形は、成熟形である。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの全長及び処理形は、活性であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性でもあり得る、分泌形であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害は、腫瘍浸潤及び転移を予防及び治療し、異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに有効である。
【０００９】
１つの実施形態において、有効な量の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤又は転移を治療又は予防する方法を提供する。
他の実施形態において、腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％減少させるような有効な量の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、転移性腫瘍である。
他の実施形態において、有効な量の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬタンパク質の阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法を提供する。例えば、対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させることができる。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、タンパク質分解処理又は切断の後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形であってよい。ＬＯＸＬの例は、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤であってよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の両方を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、例えば、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。阻害剤は、非競合阻害剤であってよい。
【００１０】
ＩＩ．ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方の阻害剤による治療
本開示はまた、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）及び１つ又は複数のリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害により異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患を予防し、治療するための革新的な方法並びに関連組成物及びキットを提供する。ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方の同時阻害は、種々の腫瘍の浸潤及び転移を予防又は治療するのに、また異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに有効である。
１つの実施形態において、有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍浸潤又は転移をｉｎ  ｖｉｖｏで治療又は予防する方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態において、腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％も減少させるような有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍成長をｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は、転移性腫瘍である。
他の実施形態において、有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法を提供する。例えば、対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させることができる。
ＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤は、異なっていてよく、それぞれがそれぞれＬＯＸ及びＬＯＸＬを特異的に阻害する。或いは、ＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方を阻害する同じ分子であってよい。ＬＯＸＬは、例えば、ＬＯＸＬ１、２、３又は４であってよい。いくつかの実施形態において、ＬＯＸＬは、ＬＯＸＬ２又は４である。特定の実施形態において、ＬＯＸＬは、ＬＯＸＬ２である。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、全長又は処理形であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、プロ酵素形又は成熟形であってよく、両方の形が活性であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性でもあり得る、分泌形であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形は、タンパク質分解又は切断後の形である。
ＬＯＸＬの例は、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤であってよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の両方を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、例えば、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。阻害剤は、非競合阻害剤であってよい。
【００１２】
ＩＩＩ．併用療法
本開示は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）のモジュレーター（例えば、活性化剤／作用薬又は阻害剤／拮抗薬）を用いることによりがん、腫瘍、糖尿病性網膜症、黄斑変性、肝線維症、腎線維症、肺線維症、強皮症、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病などの異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する疾患を予防し、治療するための組成物、キット、方法をさらに提供する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、これらの疾患又は状態を予防又は治療するために、化学療法薬、抗腫瘍生物製剤、血管新生阻害薬及び抗線維症薬などの他の治療薬と併用することができる。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害は、腫瘍細胞における上皮間葉移行（ＥＭＴ）の進行を遅らせるか、若しくは停止させ、又は間葉上皮移行（ＭＥＴ）をより低い腫瘍形成状態にし、それにより、腫瘍又は罹患細胞を化学療法薬、抗腫瘍生物製剤、血管新生阻害薬及び抗線維症薬に対してより感受性の高い状態にする可能性があると考えられている。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤と他の治療薬との相乗効果的な併用は、腫瘍細胞を治療薬の細胞傷害作用に対して感受性の状態にすることにより、腫瘍の浸潤及び転移を予防又は抑制し、原発腫瘍の成長を阻害するのに有用であり、またがんの効果的な予防又は治療にも有用である。
【００１３】
ＩＶ．薬剤の選択
他の態様において、本開示は、腫瘍浸潤、血管新生及び転移を予防又は抑制する薬剤を選択する革新的な方法を提供する。本開示によれば、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害は、腫瘍細胞における上皮間葉移行（ＥＭＴ）の進行を遅らせるか、若しくは停止させ、又は間葉上皮移行（ＭＥＴ）をより低い腫瘍形成状態にし、それにより、腫瘍の浸潤、血管新生及び転移を予防又は抑制し、原発腫瘍細胞を照射、化学療法薬、抗腫瘍生物製剤、血管新生阻害薬及び抗線維症薬などの他の治療介入に対してより感受性の高い状態にする可能性がある。
１つの実施形態において、ＥＭＴ状態にある細胞をＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤と接触させる段階、細胞のＥＭＴ状態の変化を検出する段階を含み、ＥＭＴ状態の減少又はＥＭＴ状態からＭＥＴ状態への移行がＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤であることを示す、腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤を選択する方法を提供する。
【００１４】
Ｖ．診断
他の態様において、本開示は、リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の活性又は成熟形を特異的に認識する分子又は物質を用いることにより、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患を診断又はモニタリングするための方法並びに関連化合物及びキットを提供する。発明者らは、処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、腫瘍浸潤及び転移、並びに異常な血管新生及び線維症に関連する疾患の重要なバイオマーカーであると考えている。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形は、活性であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、プロ酵素形又は成熟形であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性であってもよい、分泌形であってもよい。
１つの実施形態において、血液中又は腫瘍中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、それにより、参照試料と比較したときの血液中又は腫瘍中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍の成長の存在を示す、対象におけるがんの転移を診断又はモニタリングする方法を提供する。変化は、処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の増加又は低下であってよい。一般的に、参照試料と比較したときの血液中又は腫瘍中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の増加は、転移性腫瘍の成長の存在を示している。
他の実施形態において、がん、腫瘍、血管新生及び線維症の治療のような、ＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターを含む療法に対する対象の反応をモニターする方法を提供する。他の実施形態において、該方法は、対象にＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターを投与した後の対象におけるコラーゲンテロペプチド又はヒドロキシプロリン含量のレベルの変化を検出する段階を含み、変化がＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターが対象における治療効果を有することを示す。変化は、増加又は減少であってよい。例えば、コラーゲンテロペプチド又はヒドロキシプロリン含量の減少は、治療効果を示唆し得る。
該方法は、対象にＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターを投与した後の対象におけるＣ反応性タンパク質又は他の急性期反応物のレベルの変化を検出する段階を含み、変化がＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターが対象における治療効果を有することを示す。変化は、Ｃ反応性タンパク質レベルの増加又は減少であってよい。一般的に、Ｃ反応性タンパク質レベルの減少は、ＬＯＸ活性の低下を示す。
【００１５】
ＶＩ．線維症の治療
他の態様において、対象に有効な量のリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を投与する段階を含む、対象における線維症をｉｎ  ｖｉｖｏで予防、治療又は改善する方法を提供する。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性形の阻害剤であってよい。
線維症の具体例としての形は、心線維症、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚瘢痕化及びケロイド、並びにアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、心線維症は、高血圧、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄と関連する。
腎線維症は、糖尿病性腎症、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糸球体腎炎（ＧＮ）、局所分節性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎又は膜性増殖性ＧＮを含むが、これらに限定されない。肝線維症は、肝硬変、及び慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎）などの関連状態を含むが、これらに限定されない。肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）又は特発性線維化肺胞炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、及びび漫性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ））を含んでいてよい。心線維症、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞後の心機能欠陥、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、緑内障、年齢関連黄斑変性（湿性ＡＭＤ及び乾性ＡＭＤ）、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症及び慢性喘息も本明細書で述べる組成物により予防、治療又は改善することができる。
【００１６】
線維症の部位にＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害剤を局所的に送達するための組成物、用具、システム及びキットもここで提供する。カテーテル及びステントなどの医療機器を用いて、局所的に送達し、それにより、ＬＯＸ／ＬＯＸＬのそのような阻害剤の全身送達に伴う毒性又は他の副作用のリスクを実質的に低減することができる。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害剤は、高血圧、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄などの病的心状態又は疾患の前、同時に、又は後に対象に送達して、そのような病的心状態又は疾患に関連する病的線維症の発症を予防し、そのリスクを低減し、又は再治療することができる。例えば、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害剤は、そのような病的心状態又は疾患の発症の１時間、２時間、３時間、５時間若しくは１０時間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後若しくはそれを超える日の後に投与することができる。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、全長又は処理形であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、プロ酵素形又は成熟形であってよく、両方の形が活性であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性でもあり得る、分泌形であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形は、タンパク質分解又は切断後の形である。
ＬＯＸＬの例は、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤であってよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の両方を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、例えば、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。阻害剤は、非競合阻害剤であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＬＯＸ／ＬＯＸＬゲノム及びタンパク質構成の概略図である。
【図２】予測及び測定Ｎ−及びＯ−グリコシル化部位、２分節核局在化シグナル及びプロコラーゲンＣプロテイナーゼ部位を用いたＬＯＸ／ＬＯＸＬの配列アライメントを示す図である。
【図３】上皮間葉移行並びに浸潤及び転移におけるその役割を示す図である。
【図４】細胞のＥＭＴ又はＭＥＴ表現型を評価するためのＥＭＴ及びＭＥＴ並びにマーカーの概略図である。
【図５】ＥＭＴ−ＭＥＴ促進又は低減におけるＬＯＸ／ＬＯＸＬの役割、並びにＥＭＴ−ＭＥＴ細胞の薬物耐性又は感受性の概略図である。
【図６】ＬＯＸＬ２によるＭＣＦ−７（低ＬＯＸＬ２）細胞のトランスフェクションによるＥＭＴの誘導を示す図である。（Ａ）ＭＣＦ−７野生型（ＷＴ）細胞及び（Ｂ）ＭＣＦ−７−Ｌｏｘｌ２．クローン１をＥ−カドヘリンについて染色した。一次抗体：抗Ｅ−カドヘリン（１０μｇ／ｍｌ）；二次抗体：抗マウスｃｙ３（赤）；ＤＡＰＩ：核（青）。（Ｃ）ＭＣＦ−７野生型細胞及び（Ｄ）ＭＣＦ−７−Ｌｏｘｌ２．クローン１をローダミン−ファロイジン：アクチン細胞骨格（赤）及びＤＡＰＩ：核（青）で染色した。野生型ＭＣＦ７は、上皮表現型を示し、強度にＥ−カドヘリン陽性であり（膜性染色）（Ａ）、アクチン細胞骨格のローダミン−ファロイジン染色により、円形パターンが示されている（Ｃ）。ＬＯＸＬ２をトランスフェクトしたＭＣＦ７は、間葉表現型に変化し、Ｅ−カドヘリン発現を喪失し（Ｂ）、アクチン細胞骨格のリモデリングをする（伸長、紡錘形、長アクチン線維（Ｄ）。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＬＯＸＬ２を枯渇させることによるＭＥＴ様変化の誘導を示す図である。（Ａ〜Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＷＴ細胞及び（Ｃ〜Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＬｏｘｌ２（Ｃ、Ｄ）：プール１；（Ｅ、Ｆ）：プール２）安定ノックダウン細胞をローダミン−ファロイジンで染色した（アクチン細胞骨格染色）。細胞はＷＴ細胞では伸長し、紡錘形である（Ａ〜Ｂ）が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＬｏｘｌ２安定ノックダウン細胞は形状が丸く、より小さい（Ｃ〜Ｆ）。Ｆ−アクチン染色（ローダミン−ファロイジン）はｓｈＲＮＡノックダウンによるＬＯＸＬ２枯渇により原線維から円形／細胞縁に移動する。
【図８】ＭＣＦ−７ＷＴ細胞に対する安定ＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２細胞から得られたならし培地（ＣＭ）の影響を示す図である。（Ａ〜Ｂ）３０％ＳＦＩＩ培地：３５０μｌの通常の完全ＭＣＦ−７培地中１５０μｌのＳＦＩＩ培地（ＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２細胞に用いた培地）中で増殖させたＭＣＦ−７細胞。（Ｃ〜Ｄ）３０％ならし培地（ＣＭ）：３５０μｌの通常の完全ＭＣＦ−７培地中ＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２からの１５０μｌのＣＭ（３日血清不含有ＣＭから２２倍濃縮）中で増殖させたＭＣＦ−７細胞。ＭＣＦ−７細胞をＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２細胞からの濃縮血清不含有ＣＭで４日間処理した。ＬＯＸＬ２発現細胞からのならし培地で処理したＭＣＦ−７（Ｃ〜Ｄ）は、アクチン細胞骨格のローダミン−ファロイジン染色によって明らかになったように、対照ならし培地で処理した細胞（ＬＯＸＬ２を発現しない細胞）と比較して表現型の変化を受ける（Ａ〜Ｂ）。細胞は、より円形の「アクチン縁」染色を示す対照処理細胞と異なり、ＥＭＴを受けた細胞と同様に長いＦ−アクチン原線維により伸長している。これらのデータは、ＬＯＸＬ２により誘発されるＥＭＴ様変化は分泌（細胞外）ＬＯＸＬ２によリ誘発されることを裏づけている。（Ｅ）ＭＣＦ−７ＷＴ細胞及びそれらの形態の変化に対する安定ＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２細胞由来のＣＭの各種濃度の影響を示す。漸増濃度のＬＯＸＬ２含有ＣＭで細胞を処理することにより、ＥＭＴ様表現型変化の調和した増加がもたらされる。
【図９】抗Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓが、ＭＣＦ−７ＷＴ細胞とともにＭＢＡ−ＭＤ−ＭＢ−２３１（高レベルのＬＯＸＬ２を発現する）をインキュベートすることによって認められるＥＭＴ表現型を阻害することができることを示す図である。（Ａ、Ｃ、Ｅ）ＭＣＦ−７ＷＴ細胞とＭＣＦ−７細胞からのＣＭ及び（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＭＣＦ−７ＷＴ細胞とＭＢＡ−ＭＤ−２３１細胞からのＣＭ、（Ｃ〜Ｆ）細胞と、ＭＣＦ−７細胞に加える前に抗Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓとともにプレインキュベートしたＣＭを示す（それぞれ）（Ｃ、Ｄ）：ｍＡｂ＃４１８及び（Ｅ、Ｆ）：ｍＡｂ＃４２３、異なる濃度の抗体（Ｃ、Ｅ）：２μｇ；（Ｄ、Ｆ）：４μｇ）。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＣＭをＭＣＦ−７細胞とともにインキュベートすることによるＥＭＴ様変化の特異的ブロッキング効果を示す図である。（Ａ）「プレインキュベーション」：採取し、浄化したＣＭを抗Ｌｏｘｌ２（室温（ＲＴ）で１．５時間）＃４１８又は＃４２２ｍＡｂとともにプレインキュベートし、次いで、ＭＣＦ−７細胞上に４日間適用した。（Ｂ）「プレインキュベートせず」：ＣＭとＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は抗Ｌｏｘｌ２＃４１８又は＃４２２ｍＡｂの存在下（３日）で、採取し、浄化する前であり、次いで、ＭＣＦ−７細胞上に４日間適用した。ＥＭＴ様形態は（Ａ）及び（Ｂ）でブロックされる。非ＥＭＴ様対照としての（Ｃ）ＭＣＦ−７細胞からの３日ならし培地（ＣＭ）で４日間処理し、野生型ＭＣＦ−７細胞に特有な丸く、平らな形態を有していたＭＣＦ−７細胞。ＥＭＴ様対照としての（Ｄ）Ｌｏｘｌ２ｍＡｂとともにインキュベートしなかったＭＤＡ２３１細胞からの３日ＣＭで処理したＭＣＦ−７細胞（４日間インキュベーション）及び（Ｅ）抗アクチン抗体とともにプレインキュベートしたＭＤＡ２３１細胞からの３日ＣＭで処理したＭＣＦ−７細胞（４日間インキュベーション）。（Ｄ）及び（Ｅ）の両方、紡錘形細胞のＥＭＴ様形態が認められる。
【００１８】
【図１１】ＭＣＦ−７（低ＬＯＸＬ２）をＨｓ５７８ｔ腫瘍細胞（高レベルのＬＯＸＬ２を発現する）からのならし培地で処理することによるＥＭＴ様表現型の変化の誘導を示す図である。抗Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓがＥＭＴ表現型をブロックすることができることが認められる。（Ａ）ＭＣＦ−７細胞からの３日ならし培地（ＣＭ）からのならし培地をＭＣＦ−７細胞に４日間適用したところ、野生型ＭＣＦ−７細胞に特有な丸く、平らな形態を有していた。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）Ｈｓ−５７８ｔ細胞（ＬＯＸＬ２高）からのならし培地をＭＣＦ−７細胞（ＬＯＸＬ２低／陰性）に適用した。（Ａ〜Ｄ）ローダミン−ファロイジン（Ｆ−アクチン、赤）及びＤＡＰＩ（核、青）で染色した細胞。これらの効果はＬＯＸＬ２に特異的であり、他のタンパク質に特異的でないことが確認される。ならし培地は４μｇの（Ｃ）陰性対照としての抗β−アクチン抗体又は（Ｄ）抗ＬＯＸＬ２抗体と混合した。Ｈｓ−５７８ｔ細胞からのならし培地をＭＣＦ７細胞に加える前に抗ＬＯＸＬ２抗体とともにプレインキュベートした場合、ＥＭＴ表現型がブロックされた（Ｄ）。同じ方法で抗β−アクチン抗体でＣＭを処理した場合、ＭＣＦ７細胞の表現型の変化はブロックされず（Ｃ）、ＬＯＸＬ２抗体による遮断は特異的であり、ＣＭへの抗体の添加に起因する非特異的効果ではないことが裏づけられた。
【図１２】ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞からのならし培地（ＣＭ）とともにインキュベートしたＳＷ６２０細胞はＥＭＴ表現型の変化を受けることを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ＳＷ６２０細胞をＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞からのならし培地（ＣＭ）とともにインキュベートした（２０倍及び４０倍）。矢印は、ＥＭＴ様表現型を受けたＳＷ６２０細胞の形態を示す。細胞は、ＥＭＴ表現型（ローダミン−ファロイジン染色により示される）の変化を７２時間後に受ける。（Ｃ〜Ｄ）２９３野生型細胞からのならし培地（ＣＭ）とともにインキュベートしたＳＷ６２０細胞は７２時間後に典型的な「正常な」円形を維持している（２０倍及び４０倍）。ＭＤＡ  ＭＢ２３１又は２９３細胞からのならし培地（ＣＭ）は、３日ＣＭである。
【図１３】２９３：Ｌｏｘｌ２．ＭＣＤトランスフェクタントからのＣＭとともにインキュベートしたＳＷ６２０細胞を示す図である。（Ａ、Ｃ、Ｅ）は７２時間後にＥＭＴ表現型（ローダミン−ファロイジン染色により示される）の変化を受けた細胞を示す（５０％ＣＭ：５０％完全培地）。（Ｂ、Ｃ、Ｅ）はそれぞれ（Ａ、Ｃ、Ｅ）の拡大写真であり、矢印はＥＭＴ様表現型を受けたＳＷ６２０細胞の形態を示す。２９３：Ｌｏｘｌ２．ＭＣＤは、リシルオキシダーゼ酵素ドメインを含むＬＯＸＬ２−ＭＣＤと呼ばれるＬＯＸＬ２のフラグメントをトランスフェクトされ、それを発現する２９３細胞であった。ＬＯＸＬ２のこの部分は単独で十分に少なくとも部分的なＥＭＴ様表現型変化を誘発すると思われる。すべての細胞が表現型の変化を受けるわけではないが、受ける細胞の群は明らかに区別される。
【図１４】（Ａ）非切断の細胞内ＬＯＸ／ＬＯＸＬ及び切断された活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを示す、（Ｂ）活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬ細胞取込み及び活性はＥＭＴを促進するが、ＥＭＴを減少させかつ／又はＥＭＴを増加させる抗体などの阻害剤に結合した場合には活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの取込みは阻止されることを示す概略図である。
【図１５】３Ｔ３細胞中の表面結合ＬＯＸ活性がＢＡＰＮ、ＬＯＸｍＡｂ及びＬＯＸｓｉＲＮＡにより阻害されることを示すグラフである。特異的ＬＯＸ活性は、１，５−ジアミノペンタン基質を用いたＡｍｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄの酸化に基づく西洋ワサビ結合蛍光検定法により定量した３Ｔ３細胞の細胞表面上で明らかである。ＬＯＸ活性は、可逆性小分子阻害剤ＢＡＰＮにより、ＬＯＸペプチドに対するモノクローナル抗体により、またＬＯＸ  ｍＲＮＡを特異的に標的とするｓｉＲＮＡオリゴヌクレチドにより阻害された。
【図１６】細胞株においてＬＯＸＬ２の２つの形が優勢であることを示す図である。（Ａ）ＬＯＸＬ２タンパク質発現及び細胞株における分泌。乳房腫瘍細胞株：Ｈｓ５７８ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７；肺腫瘍細胞株：Ａ５４９。（Ｂ）一般的に検出されるＬＯＸＬ２形の概略図。
【図１７】ＣＨＯ細胞から精製されたＬＯＸＬ２タンパク質発現を示す図である。Ｍｙｃ−Ｈｉｓ標識（Ｃ末端）ＬＯＸＬ２がＣＨＯ細胞中で発現した。次の２つの形が優勢である（図１６と同様）：ペプチドＬＯＸＬ２及びＳＲＣＲ２とＳＲＣＲ３の間に開裂したＬＯＸＬ２。ＬＯＸＬ２はＣＨＯ細胞中にも分泌される。
【図１８】クロマトグラフィーによるＬＯＸＬ２の分離を示す図である。（Ａ）分離されたＬＯＸＬ２種のクロマトグラフ。（Ｂ）ＬＯＸＬ２種の分離を確認するウエスタンブロット分析。
【図１９】ＬＯＸＬ２の両形が活性であることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素検定を示す図である。
【図２０】ＬＯＸＬ２のＩＣ５０グラフである。ＬＯＸＬ２の阻害は、活性ＬＯＸＬ２及びＬＯＸＬ２抗体であるＡＢ００２３を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素検定において行った。Ｍ１及びＭ２０は、ＡＢ００２３である。Ａｓｃ＝腹水発生、非表示＝バイオリアクター発生、同じ結果。抗体の濃度の増加に伴う活性の低下を示す用量反応。ＬＯＸＬ２標本は、両処理形（ペプチド及び成熟）を含む。
【００１９】
【図２１Ａ】ＬＯＸＬ２の阻害の様式を示すグラフである。（Ａ）ＡＢ００２３はＬＯＸＬ２の非競合的阻害剤であるが、（Ｂ）βＡＰＮはＬＯＸＬ２の競合的阻害剤である。Ｅ＝酵素、Ｐ＝生成物、Ｓ＝基質、Ｉ／Ａ＝阻害剤／抗体
【図２１Ｂ】ＬＯＸＬ２の阻害の様式を示すグラフである。（Ａ）ＡＢ００２３はＬＯＸＬ２の非競合的阻害剤であるが、（Ｂ）βＡＰＮはＬＯＸＬ２の競合的阻害剤である。Ｅ＝酵素、Ｐ＝生成物、Ｓ＝基質、Ｉ／Ａ＝阻害剤／抗体
【図２２】ＬＯＸＬ２の最小触媒ドメイン領域（ＭＣＤ）が酵素的に活性であることを示す図である。（Ａ）ＬＯＸＬ２のＭＣＤ構成体の概略図である。（Ｂ）ＬＯＸＬ２  ＭＣＤが効率よく分泌されることを示す図である。（Ｃ）ＬＯＸＬ２  ＭＣＤが酵素的に活性であることを示す図である。
【図２３】抗ＬＯＸ抗体のインターナリゼーション及び取込みを示す図である。抗体を用いて肝腫瘍細胞におけるＬＯＸの免疫蛍光分析を行った。（Ａ〜Ｂ）Ｈｓ５７８ｔ細胞にｓｉＮＴ（非標的ノックダウン対照）をトランスフェクトし、ｍＡｂｓとともに３時間インキュベートした。ＬＯＸはサイトゾル中に局在化していた。（Ｃ〜Ｄ）ｓｉＬＯＸをトランスフェクトしたＨｓ５７８ｔ細胞をｍＡｂｓとともに３時間インキュベートした。ＬＯＸタンパク質レベルは減少し、ｓｉＬＯＸによる枯渇が裏づけられる。ＬＯＸタンパク質は、細胞内でペリプラズムでもあった。ＬＯＸは、Ｍ３７（Ａ、Ｃ）又はＭ６４抗体（Ｂ、Ｄ）により検出された。ＬＯＸ１２ｍＡｂｓのインターナリゼーション及び取込みの同様な結果が得られた。したがって、結果は、染色がＬＯＸ又はＬＯＸＬ２に対して特異的であるという結論を裏づけるものである。
【図２４】（Ａ）集密Ｈｓ５７８ｔ及び透過化又は（Ｂ）非透過化細胞の抗ＬＯＸ抗体のインターナリゼーション及び取込みを示す図である。細胞は、集密状態の２日後、４日後に８チャンバー・スライドで５００００細胞／ウエルで平板培養した。細胞を抗ＬｏｘＭ６４とともに３時間インキュベートし、Ａｌｅｘａ４８８−ｇｒｅｅｎにより検出した。Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓのインターナリゼーション及び取込みの同様な結果が得られた。
【図２５】ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｓ５７８ｔにおける抗ＬＯＸ抗体のインターナリゼーション及び取込みを示す図である。Ｈｓ５７８ｔ細胞に（Ａ、Ｂ）ｓｉＮＴ又は（Ｃ、Ｄ）ｓｉＬＯＸをトランスフェクトし、ＬＯＸ抗体とともに５時間インキュベートした。抗ＬｏｘＭ６４（Ａ、Ｃ）又は抗コラーゲンＩ（Ｂ、Ｄ）により検出された細胞の画像をトランスフェクトしてから７日後に撮影した。Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓのインターナリゼーション及び取込みの同様な結果が得られた。
【図２６Ａ−Ｂ】ＬＯＸ  Ｐｅｐ２  Ｍ６４の特異性を示す図である。ｍＡｂｓを、（Ａ）コラーゲンＩ及び／又は（Ｂ）コラーゲンＩＶマトリックスを介しての細胞浸潤及び移動を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。（Ｃ）Ｈｓ５７８Ｔ細胞に対するＭ６４ｍａｂの特異性がチャンバー・スライド上で検出された（集密後：６日後）。（Ｄ）チャンバー・スライド上でコラーゲンＨｓ５７８Ｔ細胞と比較してＬＯＸの局在化（集密後：６日後）。細胞は透過化せず、画像は６３倍であった。
【図２６Ｃ−Ｄ】ＬＯＸ  Ｐｅｐ２  Ｍ６４の特異性を示す図である。ｍＡｂｓを、（Ａ）コラーゲンＩ及び／又は（Ｂ）コラーゲンＩＶマトリックスを介しての細胞浸潤及び移動を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。（Ｃ）Ｈｓ５７８Ｔ細胞に対するＭ６４ｍａｂの特異性がチャンバー・スライド上で検出された（集密後：６日後）。（Ｄ）チャンバー・スライド上でコラーゲンＨｓ５７８Ｔ細胞と比較してＬＯＸの局在化（集密後：６日後）。細胞は透過化せず、画像は６３倍であった。
【図２７】集密後０日目から１５日目までのＨｓ５７８Ｔ細胞の時間経過試験を示す図である。
【図２８】転移性乳房腫瘍組織（リンパ節）試料上のＬＯＸＬ２及びＬＯＸ抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す図である。ＩＨＣは、次の乳房ＴＭＡを用いて実施した：（Ａ、Ｂ）ＬＯＸＬ２、（Ｃ、Ｄ）細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７（Ｃ、Ｄ）並びに（Ｅ、Ｆ）及びＬＯＸに関して転移性非特異的浸潤乳管癌試料であるＣＣ０８−２１−００２（Ｃｙｂｒｄｉ）。ＬＯＸＬ２及びＬＯＸは、腫瘍細胞により発現され、間質細胞によるＬＯＸＬ２及びＬＯＸの発現の証拠が存在する（褐色染色）。（Ａ、Ｃ、Ｅ）２０倍；（Ｂ、Ｅ、Ｆ）４０倍
【００２０】
【図２９】原発乳房腫瘍試料上のＬＯＸＬ２及びＬＯＸ抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す図である。ＩＨＣは、次の乳房ＴＭＡを用いて実施した：（Ａ、Ｂ）ＬＯＸＬ２、（Ｃ、Ｄ）細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７（Ｃ、Ｄ）並びに（Ｅ、Ｆ）及びＬＯＸに関して非特異的浸潤乳管癌悪性度ＩＩ試料であるＣＣ０８−２１−００２（Ｃｙｂｒｄｉ）。原発乳房腫瘍においてＬＯＸＬ２とＬＯＸの共発現が存在し、ＬＯＸＬ２タンパク質は腫瘍細胞中に高度に検出され、ＬＯＸタンパク質は腫瘍細胞を直接取り囲む間質細胞（間質線維芽細胞及び／又は筋線維芽細胞）中に主として検出される。（Ａ、Ｃ、Ｅ）２０倍；（Ｂ、Ｅ、Ｆ）４０倍
【図３０】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．により供給されたＤＮＡチップを用いて測定した、正常組織と比較して腫瘍及び線維症組織中で過剰発現したＬＯＸ及びＬＯＸＬ２のｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【図３１】同じ患者からの隣接する正常組織の発現と比較した肺腺癌試料におけるＬＯＸ／ＬＯＸＬの発現を示す図である。Ａ）ＬＯＸ、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ４を、Ｂ）はＡ）と同じデータで、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２のみをプロットする。Ｔ：腫瘍；Ｎ：正常
【図３２】ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対して標準化した肺腺癌試料におけるＬＯＸ／ＬＯＸＬの発現を示す図である。腫瘍及び隣接正常試料は別個にプロットする。Ａ）と同じデータに基づいてＡ）ＬＯＸ、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ４を、Ｂ）ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２のみをプロットする。Ｔ：腫瘍；Ｎ：正常
【図３３】低酸素性ＭＣＦ−７細胞におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の共発現を示す図である。ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２は、通常は非常に低いレベルのＬＯＸ及びＬＯＸＬ２を発現するＭＣＦ−７細胞における低酸素により誘導される（左の軸に酸素正常状態で成長した細胞に対するアップレギュレーションの倍率をプロットする）。細胞は、２％Ｏ２、５％ＣＯ２に調節した組織培養インキュベーター中で３日間増殖させた（対酸素正常状態：約２０％Ｏ２、５％ＣＯ２）。ＭＣＦ７：乳房腫瘍細胞株
【図３４】ヒト細胞株におけるリシルオキシダーゼ・ファミリー・メンバーのｍＲＮＡレベルを示す図である。１段階ｑＲＴ−ＰＣＲを１００ｎｇ／ｒｘｎＲＮＡについて実施した。ＭＣＦ７、ＭＢ２３１、ＢＴ５４９、Ｈｓ５７８ｔ：乳房腫瘍細胞株；Ａ５４９：肺腫瘍細胞株；ＨＴ１０８０：線維肉腫細胞株；ＨＦＦ：線維芽細胞株
【図３５Ａ−Ｂ】図３６〜３９におけるＬＯＸ／ＬＯＸＬ２の（Ａ）ｓｈＲＮＡ及び（Ｂ）ｓｉＲＮＡノックダウンのＲＴ−ＰＣＲバリデーションのグラフである。（Ｃ）Ｌｏｘ、Ｌｏｘｌ２、Ｌｏｘ／Ｌｏｘｌ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞を用いた移動検定も実施した。Ｌｏｘ  ｓｉＲＮＡノックダウンは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の浸潤特性を非標識ｓｉＲＮＡ対照と比較して５２％抑制する。（Ｄ）（Ｃ）に示すＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞におけるｓｉＲＮＡノックダウンに関するＴａｑｍａｎデータを裏づけている。
【図３５Ｃ−Ｄ】図３９〜４５におけるＬＯＸ／ＬＯＸＬ２の（Ａ）ｓｈＲＮＡ及び（Ｂ）ｓｉＲＮＡノックダウンのＲＴ−ＰＣＲバリデーションのグラフである。（Ｃ）Ｌｏｘ、Ｌｏｘｌ２、Ｌｏｘ／Ｌｏｘｌ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞を用いた移動検定も実施した。Ｌｏｘ  ｓｉＲＮＡノックダウンは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の浸潤特性を非標識ｓｉＲＮＡ対照と比較して５２％抑制する。（Ｄ）（Ｃ）に示すＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞におけるｓｉＲＮＡノックダウンに関するＴａｑｍａｎデータを裏づけている。
【図３６】ｓｈＬＯＸＬ２細胞のエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）感受性を示すグラフである。ｓｈＬＯＸＬ２ノックダウン細胞株（ｓｈＬＯＸＬ２．１９５）は、細胞生存能の約７倍の低下を示した。計算ＩＣ５０を対照系（ｓｈ対照）と比較した。親細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１である。増殖率（生存能）を左軸にプロットする。エルロチニブは、ゲフィチニブを含む薬物クラスＥＧＦＲ阻害剤を代表する。
【図３７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｈＬＯＸ細胞株のメトトレキサート（ＭＴＸ）感受性を示すグラフである。成長率（生存能）を左軸にプロットする。ｓｈＬＯＸノックダウン細胞株は、対照系（ＧＦＰ対照）と比較して生存能の約２倍の低下を示した。
【００２１】
【図３８Ａ】ｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２又はＬＯＸ抗体を用いたシスプラチン（ＤＤＰ）感受性を示すグラフである。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２細胞株又は（Ｂ）ＭｉａＣａＰａ２細胞株、抗ＬＯＸを用いた場合、及びそれらのＤＤＰに対する感受性。生存能を左軸にプロットする。ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２ノックダウン細胞株は、対照系（非標的対照）と比較して生存能の約２０％の低下を示した。（Ｃ）抗ＬＯＸで処理した又は処理しなかったＭｉａＣａＰａ２及び他の細胞株のＤＤＰのＩＣ５０。（Ｄ）無処理（Ｕｎｔ）と比較したＬＯＸ（Ｍ６４）又はＬＯＸＬ２（Ｍ２０）抗体単独の成長阻害のグラフ。
【図３８Ｂ−Ｃ】ｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２又はＬＯＸ抗体を用いたシスプラチン（ＤＤＰ）感受性を示すグラフである。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２細胞株又は（Ｂ）ＭｉａＣａＰａ２細胞株、抗ＬＯＸを用いた場合、及びそれらのＤＤＰに対する感受性。生存能を左軸にプロットする。ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２ノックダウン細胞株は、対照系（非標的対照）と比較して生存能の約２０％の低下を示した。（Ｃ）抗ＬＯＸで処理した又は処理しなかったＭｉａＣａＰａ２及び他の細胞株のＤＤＰのＩＣ５０。（Ｄ）無処理（Ｕｎｔ）と比較したＬＯＸ（Ｍ６４）又はＬＯＸＬ２（Ｍ２０）抗体単独の成長阻害のグラフ。
【図３８Ｄ】ｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２又はＬＯＸ抗体を用いたシスプラチン（ＤＤＰ）感受性を示すグラフである。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２細胞株又は（Ｂ）ＭｉａＣａＰａ２細胞株、抗ＬＯＸを用いた場合、及びそれらのＤＤＰに対する感受性。生存能を左軸にプロットする。ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２ノックダウン細胞株は、対照系（非標的対照）と比較して生存能の約２０％の低下を示した。（Ｃ）抗ＬＯＸで処理した又は処理しなかったＭｉａＣａＰａ２及び他の細胞株のＤＤＰのＩＣ５０。（Ｄ）無処理（Ｕｎｔ）と比較したＬＯＸ（Ｍ６４）又はＬＯＸＬ２（Ｍ２０）抗体単独の成長阻害のグラフ。
【図３９Ａ】ｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２又はＬＯＸ抗体を用いたシスプラチン（ＤＤＰ）感受性を示すグラフである。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２細胞株又は（Ｂ）ＭｉａＣａＰａ２細胞株、抗ＬＯＸを用いた場合、及びそれらのＤＤＰに対する感受性。生存能を左軸にプロットする。ｓｉＬＯＸ及びｓｉＬＯＸＬ２ノックダウン細胞株は、対照系（非標的対照）と比較して生存能の約２０％の低下を示した。（Ｃ）抗ＬＯＸで処理した又は処理しなかったＭｉａＣａＰａ２及び他の細胞株のＤＤＰのＩＣ５０。（Ｄ）無処理（Ｕｎｔ）と比較したＬＯＸ（Ｍ６４）又はＬＯＸＬ２（Ｍ２０）抗体単独の成長阻害のグラフ。
【図３９Ｂ−Ｃ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ細胞株のドキソルビシン感受性を示すグラフである。（Ａ）ｓｉＬＯＸ、ｓｉＬＯＸＬ２及びｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２細胞株。生存能を左軸にプロットする。ｓｉＬＯＸ、ｓｉＬＯＸＬ２及びｓｉＬＯＸ／ｓｉＬＯＸＬ２二重ノックダウン細胞株は、ドキソルビシンに対する高い感受性を示し、計算ＩＣ５０は親細胞株（対照）と比較して２７％〜５５％の低下を示す。（Ｂ）（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＬＯＸ及びｓｈＬＯＸＬ２細胞株のドキソルビシン感受性と比較したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｉＬＯＸ、ｓｉＬＯＸＬ２及びｓｉＬＯＸ／ＬＯＸＬ２ノックアウトのドキソルビジン感受性を示すグラフ。生存能を左軸にプロットする。
【図４０】ヌード・マウスの腎被膜下に移植したＭＣＦ７腫瘍細胞及びＬＯＸＬ２をトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞からのインプラント・サイズの平均増加（ｇａｉｎ）を示すグラフである。インプラントに１６日間にわたり腫瘍形成させた。ＭＣＦ７内へのＬＯＸＬ２の安定トランスフェクションにより、野生型ＭＣＦ７細胞で認められるものよりはるかに大きい／攻撃的な原発腫瘍がもたらされた。
【図４１】ヌード・マウスの腎被膜下に移植したＨＴ１０８０腫瘍細胞からのインプラント・サイズの平均増加を示すグラフである。インプラントに１０日間にわたり腫瘍形成させた。マウスに種々の抗体で週２回治療した（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）。５匹のマウスの各群にＡＣ１：陰性対照抗体；Ｍ６４、Ｍ５、又はＭ１１：「非ＬＯＸＬ２」抗体（抗ＬＯＸ抗体）；又はＡＢ２３：ＬＯＸＬ２抗体で治療した。ＡＢ２３の傾向：この攻撃的な原発腫瘍モデルにおいて腫瘍サイズの平均が約２５％より小さい。
【図４２】リシルオキシダーゼ酵素学を示す図である。ＬＯＸ／ＬＯＸＬ酵素は、ミカエリス−メンテン速度論により記述することができるピンポン・メカニズムにより作用する。
【図４３】酵素阻害の共通様式を示す図である。
【図４４】ＬＯＸＬ２の阻害などの酵素阻害の様式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害による治療
本開示は、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患をリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を用いることにより予防及び治療するための革新的な方法並びに関連組成物及びキットを提供する。
理論により束縛されることを望まないが、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形の阻害は、腫瘍浸潤及び転移を予防及び治療するのに、また異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに有効である。
１つの実施形態において、有効な量のＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤又は転移を治療又は予防する方法を提供する。
【００２３】
他の実施形態において、腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％減少させるような有効な量の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は、転移性腫瘍であってよい。
【００２４】
他の実施形態において、有効な量の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させる。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形は、活性であり得る。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性でもあり得る、分泌形でもあり得る。活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、タンパク質分解処理又は切断の後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形であってよい。ＬＯＸＬの例は、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤である。例えば、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、下の表１及び２に示す配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である。
下及び実施例の項でより詳細に述べるように、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの様々な阻害剤（小分子又は抗体など）は、腫瘍浸潤、血管新生又は転移を抑制するのに、またがん、腫瘍、並びに異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに用いることができる。
ＩＩ．ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方の阻害剤による治療
本開示はまた、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）処理形の阻害剤を用いることにより、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患を予防し、治療するための革新的な方法並びに関連組成物及びキットを提供する。
ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方の同時阻害は、種々の腫瘍の浸潤及び転移を予防又は治療するのに、また異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに有効である。
１つの実施形態において、有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍浸潤又は転移をｉｎ  ｖｉｖｏで治療又は予防する方法を提供する。
【００２６】
他の実施形態において、腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％減少させるような有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍成長をｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は、転移性腫瘍であってよい。
他の実施形態において、有効な量のＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させる。
【００２７】
ＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤は、異なっていてよく、それぞれがそれぞれＬＯＸ及びＬＯＸＬを特異的に阻害する。或いは、ＬＯＸの阻害剤及びＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方を阻害する同じ分子であってよい。いくつかの実施形態において、ＬＯＸＬは、ＬＯＸＬ１、２、３又は４である。いくつかの実施形態において、ＬＯＸＬは、ＬＯＸＬ２又は４であり、例えば、ＬＯＸＬは、ＬＯＸＬ２である。
場合によって、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、タンパク質分解又は切断後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの形を阻害する。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、プロ酵素形又は成熟形であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、活性形であってよい。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの全長又は処理形は、活性であり得る。
場合によって、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの分泌形を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、下の表１及び２に示す配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である。
下及び実施例の項でより詳細に述べるように、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの様々な阻害剤（小分子又は抗体など）は、腫瘍浸潤、血管新生又は転移を抑制するのに、またがん、腫瘍並びに異常な血管新生及び線維症に関連する疾患を治療するのに用いることができる。
【００２９】
ＩＩＩ．併用療法
本開示は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）のモジュレーターを含む併用療法を用いることにより、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患を予防し、治療するための革新的な方法並びに関連組成物及びキットも提供する。
下でより詳細に述べるように、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害は、腫瘍細胞における上皮間葉移行（ＥＭＴ）の進行を遅らせるか、若しくは停止させ、又は間葉上皮移行（ＭＥＴ）をより低い腫瘍形成状態にし、それにより、腫瘍又は罹患細胞を照射、化学療法薬、抗腫瘍生物製剤、血管新生阻害薬及び抗線維症薬に対してより感受性の高い状態にする。
【００３０】
ＩＶ．薬剤の選択
本開示は、腫瘍浸潤、血管新生及び転移を予防又は抑制する薬剤を選択する革新的な方法を提供する。これらの薬剤は、がん、腫瘍、糖尿病性網膜症、黄斑変性、強皮症、肝線維症、腎線維症、肺線維症、強皮症、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病などの異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する疾患を予防し、治療するために、単独で用いるか、又は他の治療薬と併用することができる。
本開示によれば、上皮間葉移行（ＥＭＴ）状態にある細胞をリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤と接触させる段階、細胞のＥＭＴ状態の変化を検出する段階を含み、ＥＭＴ状態の減少又はＥＭＴ状態からＭＥＴ状態への移行が、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が線維症、腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤であることを示す、腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤を選択する方法を提供する。したがって、腫瘍細胞におけるＥＭＴからＭＥＴへの移行を促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤をスクリーニングするためのＥＭＴ−ＭＥＴ検定を用いる方法もここに提供する。
【００３１】
理論により束縛されることを望まないが、ＥＭＴにおけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの役割は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬが関連する細胞内補因子と接触することを可能にする、腫瘍細胞による活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの取込みに関連し、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害は、腫瘍細胞における上皮間葉移行（ＥＭＴ）の進行を遅らせるか、若しくは停止させ、又は間葉上皮移行（ＭＥＴ）をより低い腫瘍形成状態にし、それにより、腫瘍の浸潤、血管新生及び転移を予防又は抑制し、原発腫瘍細胞を照射、化学療法薬、抗腫瘍生物製剤、血管新生阻害薬及び抗線維症薬に対してより感受性の高い状態にする可能性がある。
細胞のＥＭＴ状態は、低レベルのＥ−カドヘリン染色を伴う陽性ビメンチン又はフィブロネクチン染色並びにＦ−アクチンのファロイジン染色により示される伸長及びリモデリングされたアクチン細胞骨格などの特性を有する。したがって、ＥＭＴ状態の減少又はＥＭＴからＭＥＴ状態への移行は、ビメンチン又はフィブロネクチン染色の減少、Ｅ−カドヘリン染色の増加、及び／又はＦ−アクチンのファロイジン染色によるアクチン細胞骨格のリモデリングを測定又は検出することによってモニターすることができる。
【００３２】
場合によって、浸潤性及び移動能力の増加はＥＭＴに関連するので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍浸潤又は移動は、細胞のＥＭＴ又はＭＥＴ表現型を評価するのに用いることができる。例えば、浸潤性及び移動性がより大きいＥＭＴ状態にある細胞は浸潤性又は移動性がより低い細胞よりすり傷を速やかに満たすので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒又はすり傷アッセイを用いてＥＭＴ状態からＭＥＴ状態への移行をモニターすることができる。
下及び実施例の項でより詳細に述べるように、ＥＭＴ−ＭＥＴ移行検定を用いることにより、様々なＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤（小分子又は抗体など）を腫瘍浸潤、血管新生又は転移を阻害するそれらの能力について試験することができる。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの全長又は処理形の阻害は、腫瘍浸潤及び転移を予防又は治療するのに有効である。したがって、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性形の阻害のための候補化合物をスクリーニングし、選択し、設計する方法、並びにＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性形に対する抗体を産生させる方法もここに提供する。
【００３３】
Ｖ．診断
本開示は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の処理形を特異的に認識する分子又は物質を用いることにより、異常な細胞増殖、血管新生及び線維症に関連する様々な疾患を診断又はモニタリングするための方法並びに関連組成物及びキットを提供する。理論に束縛されることなしに、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形は、腫瘍浸潤及び転移、並びに異常な血管新生及び線維症に関連する疾患の重要なバイオマーカーである。
１つの実施形態において、血液中又は腫瘍中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、それにより、参照試料と比較したときの血液中又は腫瘍中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍の成長の存在を示す、対象における癌の転移を診断又はモニタリングする方法を提供する。変化は、処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の増加又は低下であってよい。一般的に、参照試料と比較したときの血液中又は腫瘍試料中の処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の増加は、転移性腫瘍の成長の存在を示している。
【００３４】
下でより詳細に述べるように、処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬのレベルは、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理形に特異的に結合する抗体を用いることによる免疫組織化学を含むが、これに限定されない種々の方法により評価することができる。活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの酵素活性は、色素及び蛍光定量法を含むが、これに限定されない種々の方法により測定することができる。
【００３５】
ＶＩ．線維症の治療
リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の活性形を用いることにより、線維症に関連する様々な疾患を予防又は治療するための組成物、方法及びキットもここに提供する。
１つの態様において、有効な量のＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における病的心状態又は疾患を治療する方法を提供する。例えば、病的心状態又は疾患は、高血圧、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄であってよい。
他の態様において、有害心事象の前に、それと同時に、又はその後に有効な量のＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における病的心状態又は疾患を治療する方法を提供する。有害心事象は、急性心筋梗塞などの心筋梗塞であってよい。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、有害心事象の前に、それと同時に、又はその後に投与することができる。例えば、阻害剤は、心筋梗塞から１時間、２時間、３時間、５時間若しくは１０時間後、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４目若しくはそれを超える日数後に投与することができる。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、有害心事象によって引き起こされる線維症の部位に局所的に対象に送達することができる。
【００３６】
他の態様において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を含むコンポーネントを含む、対象における病的心状態又は疾患を予防又は治療するための用具を提供する。コンポーネントは、β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）などの５００ダルトン未満の分子量を有する小分子であってよいＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を組み込んだステントであってよい。阻害剤は、ステントに被覆することができる。
或いは、用具は、有害心事象によって引き起こされる心線維症の部位に局所的にＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を送達するためのカテーテルを含んでいてよい。
【００３７】
他の態様において、薬剤学的に許容できる賦形剤中にＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を含む薬剤組成物、並びに薬剤組成物を用いて病的心状態又は疾患をどのように予防又は治療するかの指示書を含むキットを提供する。
有効な量のＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における線維症に関連する疾患を治療又は予防するための方法、組成物及びキットも提供する。線維症に関連する疾患は、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚瘢痕化及びケロイド形成、並びにアルツハイマー病から選択することができる。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤であってよい。活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬは、タンパク質溶解処理又は切断後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形であってよい。ＬＯＸＬの例は、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を含むが、これらに限定されない。ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤であってよい。いくつかの実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドであってよい。
【００３８】
特定の実施形態において、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤は、下の表１及び２に示す配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である。
下及び実施例の項でより詳細に述べるように、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの様々な阻害剤（小分子又は抗体など）を用いることができる。
【００３９】
１．リシルオキシダーゼ及びリシルオキシダーゼ様タンパク質
本明細書で用いているように、「リシルオキシダーゼ」という用語は、次の反応を触媒する酵素を意味する：ペプチジル−Ｌ−リシルペプチド＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→ペプチジル−アリルシルペプチド＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２。リシルオキシダーゼの他の同義語（ＥＣ１．４．３．１３）は、タンパク質−リシン６−オキシダーゼ及びタンパク質−Ｌ−リシン：酸素６−オキシドレダクターゼ（脱アミノ化）などである。例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３４１巻、３３２〜４４頁（１９７４年）、Ｒａｙｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４巻、６２１〜２６頁（１９７９年）、Ｓｔａｓｓｅｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４３８巻、４９〜６０頁（１９７６年）を参照のこと。その活性中心にチロシルキノンのリシル付加体を有する銅含有キノタンパク質であるリシルオキシダーゼは、ペプチジルα−アミノアジピン−δ−セミアルデヒドを生成するペプチジルリシンの酸化を触媒する。生成すると、このセミアルデヒドは、隣接したアルデヒドと、又は他のリシル基と自発的に縮合して、鎖内及び鎖間架橋を形成する。例えば、Ｒｕｃｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、６７巻、９９６Ｓ〜１００２Ｓ頁（１９９８年）を参照のこと。リシルオキシダーゼ及びリシルオキシダーゼ様タンパク質の例は、次の配列の１つから発現又は翻訳されるポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有する酵素を含む：ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：Ｍ９４０５４；ＡＡＡ５９５２５．１―ｍＲＮＡ；Ｓ４５８７５；ＡＡＢ２３５４９．１−ｍＲＮＡ；Ｓ７８６９４；ＡＡＢ２１２４３．１−ｍＲＮＡ；ＡＦ０３９２９１；ＡＡＤ０２１３０．１−ｍＲＮＡ；ＢＣ０７４８２０；ＡＡＨ７４８２０．１−ｍＲＮＡ；ＢＣ０７４８７２；ＡＡＨ７４８７２．１−ｍＲＮＡ；Ｍ８４１５０；ＡＡＡ５９５４１．１−ゲノムＤＮＡ。ＬＯＸの１つの実施形態は、ヒトリシルオキシダーゼ（ｈＬＯＸ）プレプロタンパク質である。
【００４０】
リシルオキシダーゼ様酵素又はタンパク質の例は、すべてが参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｏｌｎａｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１６４７巻、２２０〜２４頁（２００３年）、Ｃｓｉｓｚａｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、７０巻、１〜３２頁（２００１年）及び２００１年１１月８日に公開された国際公開第０１／８３７０２号に記載されている。（これらの３つの刊行物において「ＬＯＸＬ１」が「ＬＯＸＬ」と呼ばれているが、本開示では「ＬＯＸＬ」は一般的にリシルオキシダーゼ様タンパク質を意味し、ＬＯＸＬ１ではないことが注目される。）これらの酵素は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＢＣ０１５０９０で寄託されたｍＲＮＡによりエンコードされるＬＯＸＬ１；ＡＡＨ１５０９０．１；ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  Ｕ８９９４２で寄託されたｍＲＮＡによりエンコードされるＬＯＸＬ２；ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＡＦ２８２６１９で寄託されたｍＲＮＡによりエンコードされるＬＯＸＬ３；ＡＡＫ５１６７１．１；及びＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＡＦ３３８４４１で寄託されたｍＲＮＡによりエンコードされるＬＯＸＬ４；ＡＡＫ７１９３４．１を含む。
【００４１】
「リシルオキシダーゼ」又はＬＯＸはまた、リシル残基の脱アミノ化を触媒するその酵素活性を実質的にまだ保持している機能的フラグメント又は誘導体を含む。一般的に、機能的フラグメント又は誘導体は、そのリシル酸化活性の少なくとも５０％を保持している。いくつかの実施形態において、機能的フラグメント又は誘導体は、そのリシル酸化活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％を保持している。リシルオキシダーゼは、その活性を実質的に変化させない保守的アミノ酸置換基を含み得る。アミノ酸の適切な保守的置換基は、当業者に知られており、得られる分子の生物学的活性を変化させずに一般的に調製することができる。当業者は、一般的にポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している。例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７年、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁を参照のこと。
リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質のいくつかの例の詳細は、下で述べる。
【００４２】
リシルオキシダーゼは、第一級アミン基質を反応性アルデヒドに酸化する銅含有アミンオキシダーゼである。リシルオキシダーゼは、コラーゲンにおけるペプチジルリシン及びヒドロキシリシン残基、並びにエラスチンにおけるペプチジルリシン残基の酸化的脱アミノ化を触媒し、細胞外マトリックスの形成に必須である。発生するペプチジルアルデヒドは、自発的に縮合し、酸化反応を受けて、細胞外マトリックスの正常な構造上の完全性に必要なリシン由来の共有結合性架橋を形成する。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びアンモニウムがペプチジルアルデヒド生成物と化学量論的な量で放出される。例えば、Ｋａｇａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８８巻、６６０〜６７２頁（２００３年）を参照のこと。
ＬＯＸの主な活性は、細胞外のコラーゲン及びエラスチンにおける特定のリシン残基の酸化であるが、細胞内でも作用し、遺伝子発現を調節することがあり得る（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１２８１７〜１２８２２頁（１９９７年）、Ｇｉａｍｐｕｚｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５巻、３６３４１〜３６３４９頁））。さらに、ＬＯＸは、単球、線維芽細胞及び平滑筋細胞の化学走性を誘発する（Ｌａｚａｒｕｓら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．、１４巻、７２７〜７３１頁（１９９５年）、Ｎｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１８８巻、３４６〜３５２頁（１９８８年））。ＬＯＸ自体は、多くの成長因子並びにＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びインターフェロンなどのステロイドにより誘導される（Ｃｓｉｓｚａｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、７０巻、１〜３２頁（２００１年））。最近の研究で、発達調節、腫瘍抑制、細胞運動性及び細胞老化などの多様な生物学的機能における他の役割がＬＯＸに帰せられた。ＬＯＸの多様な役割、並びにその最近発見されたアミノオキシダーゼファミリーであるＬＯＸ様（ＬＯＸＬ）は、それらの細胞内及び細胞外局在化に伴う重要な役割を果たしている可能性がある。
【００４３】
５種の異なるリシルオキシダーゼがヒト及びマウスに存在することが知られている。すなわち、本開示の目的のために「ＬＯＸ／ＬＯＸＬ」と総称するＬＯＸと４種のＬＯＸ関連又はＬＯＸ様タンパク質（ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３、ＬＯＸＬ４）である。これらのリシルオキシダーゼの５種の形は、５種の異なる染色体上にある。これらのファミリー・メンバーは、構造及び機能のある程度の重複を示すが、異なる機能も有すると思われる。例えば、突然変異誘発による標的ＬＯＸ欠失は、マウスにおいて分娩時に致死性であると思われる（Ｈｏｒｎｓｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８巻、１４３８７〜１４３９３頁（２００３年））が、ＬＯＸＬの欠乏は、苛酷な発達表現型をもたらさない（Ｂｒｏｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、３９０巻、１１８〜１２２頁（２００５年））。
ＬＯＸは、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、魚及びキイロショウジョウバエなどのいくつかの種において保存的である、高度に保存的なタンパク質ドメインを有する。ヒトＬＯＸファミリーは、２０５アミノ酸ＬＯＸ触媒ドメインを含む高度に保存的なＣ末端領域を有する。保存的領域は、銅結合（Ｃｕ）、保存的サイトカイン受容体様ドメイン（ＣＲＬ）、及びリシルチロシルキノン補因子部位（ＬＴＱ）を含む。予測される細胞外シグナル配列は、陰影線付きの枠で表される。１２システイン残基も同様に保存されており、それらのうちの２つはプレプロペプチド領域内にあり、１０はＬＯＸの触媒的に活性な処理形に位置する（Ｃｓｉｓｚａｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、７０巻、１〜３２頁（２００１年））。保存領域は、フィブロネクチン結合ドメインも含む。
【００４４】
ＬＯＸのプレプロペプチド領域は、シグナルペプチドを含み、切断されて（切断部位はＣｙｓ２１〜Ａｌａ２２間にあると予想される）、シグナル配列ペプチド、及び全長形とも本明細書で呼ぶＬＯＸの４８ｋＤａのアミノ酸プロペプチド形を生ずる。該プロペプチドは、ゴルジ体を通過中にＮ−グリコシル化され、細胞外環境中に分泌され、そこで、プロ酵素又はプロペプチドは、Ｂｍｐ１、Ｔｌｌ１及びＴｌｌ２遺伝子の産物である、プロコラーゲンＣプロテイナーゼであるメタロエンドプロテアーゼによりＧｌｙ１６８〜Ａｓｐ１６９間で切断されて、酵素の処理又は成熟形を生ずる。ＢＭＰＩ（骨形態発生タンパク質Ｉ）は、プロペプチドを処理して、機能的３０ｋＤａ酵素及び１８ｋＤａプロペプチドを生成させるプロコラーゲンＣプロテイナーゼである。プロペプチドをコードする配列は中等度に保存的である（６０〜７０％）が、活性部位が位置するプロ酵素のＣ末端３０ｋＤａ領域をコードする配列は高度に保存的である（約９５％）（Ｋａｇａｎ及びＬｉ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８８巻、６６０〜６７２頁（２００３年）、Ｋａｇａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻、３２９〜３８頁（１９９５年））。その後、Ｎ−グリコシル単位も除去される。
【００４５】
ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４のアミノ末端における同様な潜在的シグナルペプチドが予測された。予測されたシグナル切断部位は、ＬＯＸＬについてはＧｌｙ２５〜Ｇｌｎ２６間、ＬＯＸＬ２についてはＡｌａ２５〜Ｇｌｎ２６間、ＬＯＸＬ３についてはＧｌｙ２５〜Ｓｅｒ２６間にある。プロコラーゲン及びプロＬＯＸにおけるＢＭＰ−１切断に関するコンセンサスは、Ａｌａ／Ｇｌｙ〜Ａｓｐ間にあり、しばしば酸性又は荷電残基が後続する。処理ＬＯＸＬを生成させる潜在的切断部位は、Ｇｌｙ３０３〜Ａｓｐ３０４であるが、非定型的Ｐｒｏが後続する。ＬＯＸＬ３も、Ａｓｐが後続するＧｌｙ４４７〜Ａｓｐ４４８における潜在的切断部位を有し、この部位における処理により、成熟ＬＯＸと同様なサイズの成熟ペプチドが生成する。ＢＭＰ−１の潜在的切断部位もＬＯＸＬ４内の残基Ａｌａ５６９〜Ａｓｐ５７０に特定された（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８巻、５２０７１〜５２０７４頁（２００３年））。ＬＯＸＬ２もＬＯＸＬファミリーの他のメンバーと同様にタンパク質分解により切断され、媒体中に分泌される（Ａｋｉｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６３巻、１６５７〜１６６６頁（２００３年））。
ＬＯＸ及びＬＯＸＬについて共通であることが知られていない特徴は、スカベンジャー受容体システイン・リッチ（ＳＲＣＲ）ドメインである。ＬＯＸ及びＬＯＸＬは、ＳＲＣＲドメインを欠いているが、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４は、それぞれＮ末端に４つのＳＲＣＲドメインを有する。ＳＲＣＲドメインは、分泌、貫膜又は細胞外マトリックス・タンパク質に認められる。ＳＲＣＲドメインは、多くの分泌及び受容体タンパク質におけるリガンド結合を媒介することも知られている（Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６巻、２２８〜２３２頁（１９９９年）；Ｓａｓａｋｉら、ＥＭＢＯＪ．，１７巻、１６０６〜１６１３頁（１９９８年））。ＬＯＸＬに特有な他のドメインは、プロリン・リッチ・ドメインの存在である（Ｍｏｌｎａｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｓｙｃａ  Ａｃｔａ、１６４７巻、２２０〜２２４頁（２００３年））。
【００４６】
組織分布もＬＯＸと各種ＬＯＸＬとで異なる可能性がある。ＬＯＸは、心臓、胎盤、精巣、肺、腎臓及び子宮において高度に発現するが、脳及び肝臓ではわずかである。ＬＯＸＬ１は、胎盤、腎臓、筋肉、心臓、肺及び膵臓において発現し、ＬＯＸと同様に脳及び肝臓でははるかに低い発現を示す（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻、７１７６〜７１８２頁（１９９５年））。ＬＯＸＬ２は、子宮、胎盤及び他の臓器において高度に発現するが、ＬＯＸ及びＬＯＸＬと同様に、脳及び肝臓では低い発現を示す（Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｌｅ−Ｓａｕｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４巻、１２９３９〜１２９４４頁（１９９９年）））ＬＯＸＬ３は、精巣、脾臓及び前立腺において高度に発現し、胎盤において中等度に発現し、肝臓では発現しないが、ＬＯＸＬ４は、肝臓において高度に発現する（Ｈｕａｎｇら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．、２０巻、１５３〜１５７頁（２００１年）、Ｍａｋｉ及びＫｉｖｉｒｉｋｋｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３５５巻、３８１〜３８７頁（２００１年）、Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｌｅ−Ｓａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７４巻、２１１〜２１８頁（２００１年）、Ａｓｕｎｃｉｏｎら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．、２０巻、４８７〜４９１頁（２００１年））。
【００４７】
疾患におけるＬＯＸと各種ＬＯＸＬタンパク質の発現又は関連性も異なり得る。これは、組織分布、処理、ドメイン、活性の調節の差、並びにタンパク質間の他の差異のような多くの理由に起因すると思われる。例えば、ＬＯＸ及びＬＯＸＬは線維性部位の周囲の筋線維芽細胞において高度に発現するので、ＬＯＸ及びＬＯＸＬは線維症に関連づけられている（Ｋａｇｅｎ、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．、１９０巻、９１０〜９１９頁（１９９４年）、Ｍｕｒａｗａｋｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１４巻、１１６７〜１１７３頁（１９９１年）、Ｓｉｅｇｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻、２９４５〜２９４９頁（１９７８年）、Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｌｅ−Ｓａｕｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９９巻、５８７〜５９２頁（１９９４年）、Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２巻、１８１〜１８８頁（１９９９年））。ＬＯＸ及び各種ＬＯＸＬは、いくつかのがんにも関連づけられている。例えば、ＬＯＸＬ１及びＬＯＸＬ４は、後成的にサイレントであることが示されており、ヒト膀胱がんにおけるｒａｓ／細胞外シグナル調節キナーゼ・シグナリング経路を阻害することができる（Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻、４１２３〜４１２９頁（２００７年））。他の研究者らは、頭部及び頚部の扁平上皮癌におけるＬＯＸＬ４遺伝子の選択的アップレギュレーション及び増幅を示した（Ｇｏｒｏｕｇｈら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２１２巻、７４〜８２頁（２００７年））。ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２は、大腸及び食道がんなどの多くの腫瘍にも関連づけられたＣｓｉｓｚａｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、７０巻、１〜３２頁（２００１年））。乳がんにおいて、ＬＯＸ及びＬＯＸＬファミリー・メンバーががんに関連づけられた（Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２巻、４４８〜４４８３頁（２００２年））。
【００４８】
２．活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターのスクリーニング
活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターは、種々のスクリーニング検定法を用いることによっても選択することができる。プレプロタンパク質の分泌及びタンパク質分解による切断後の活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬは、種々のスクリーニング検定法を用いることによって選択することができる。１つの実施形態において、候補結合化合物を活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬのポリペプチドとともにインキュベートする段階、及び結合が起こった場合に判断する段階を含む、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬに結合する化合物を選択する方法を提供する。
他の実施形態において、候補化合物を活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬとともにインキュベートする段階、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの生物学的活性を測定する段階、及び活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの生物学的活性が変化したかどうかを判断する段階を含む、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーター、例えば、活性化剤／作用薬又は阻害剤／拮抗薬を特定する方法を提供する。
【００４９】
他の実施形態において、候補化合物を活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを含む細胞培養中でインキュベートする段階、及び培養中の細胞の生物学的活性の変化を検出する段階を含み、培養中の細胞の生物学的活性の変化が活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの活性化剤又は阻害剤を示唆する、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの活性化剤又は阻害剤を特定する方法を提供する。生物学的活性の変化は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの特異的機能、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの酵素活性又はＬＯＸ／ＬＯＸＬのレベルであってよい。いくつかの実施形態において、生物学的活性は、移動、ＥＭＴ／ＭＥＴ又はその他のものなどの細胞機能であり、変化を対照若しくは参照試料と比較する。例えば、陰性対照試料を含んでよい対照は、候補化合物が加えられる、低いレベルの活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを含む培養又は同じ量の活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを含むが、候補化合物が加えられていない培養を含んでよい。いくつかの実施形態において、異なる量の活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを含む別個の培養を候補化合物と接触させる。例えば、生物学的活性の変化が認められる場合、そして変化が、より高い量の活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを有する培養においてより大きい場合、化合物は活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの活性化剤と特定される。
他の例において、有意な量のＬＯＸ及び／又はＬＯＸＬを発現することは、本明細書で述べるスクリーニング検定法用の活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの源として用いることはできるが、全細胞溶解物は、活性ＬＯＸ及び／又はＬＯＸＬを含むだけでなく、不活性ＬＯＸ及び／又はＬＯＸＬも含むであろう。
化合物又は複数の化合物は、化学的に合成又は微生物学的に産生させ、かつ／又は例えば、試料、例えば、植物、動物若しくは微生物からの細胞抽出物中に含めることができる。さらに、化合物は、当技術分野で知られているが、これまで活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを抑制又は活性化することができることは知られていない。反応混合物は、無細胞抽出物であってよく、又は細胞若しくは組織培養を含んでいてよい。本開示の方法のための適切な装置一式は、当業者に知られており、例えば、一般的にＡｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版（１９９４年）及び追加する実施例に記載されている。複数の化合物を例えば、反応混合物、培養培地に加え、細胞中に注入、又は別の方法でトランスジェニック動物に適用することができる。本開示の方法に用いることができる細胞又は組織は、本開示の宿主細胞、哺乳類細胞又は非ヒト・トランスジェニック動物である。
【００５０】
化合物又は複数の化合物を含む試料が本開示の方法において特定されている場合、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを抑制又は活性化することができる化合物を含むと特定された最初の試料から該化合物を分離することが可能であるか、或いは、試料当たりの異なる物質の数を減らし、最初の試料の再分割物を用いて方法を反復するように、例えば、複数の異なる化合物からなる場合に最初の試料をさらに再分割することができる。試料の複雑さによって、例えば、本開示の方法により特定された試料が限られた数又は１つの物質を含むまで、上述の段階を数回実施することができる。いくつかの実施形態において、試料は、類似の化学的及び／又は物理的特性の物質を含み、また、いくつかの実施形態において、物質は同じである。
活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬのような標的に対する特異的親和性を有する化合物を特定するために大ライブラリーを作製し、スクリーニングするいくつかの方法が当業者に知られている。これらの方法としては、無作為化ペプチドをファージからディスプレイし、固定化受容体に対してアフィニティ・クロマトグラフィーによりスクリーニングするファージディスプレイ法などがある。例えば、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５，２２３，４０９号を参照のこと。
【００５１】
他のアプローチにおいて、チップ上に固定化したポリマーのコンビナトリアル・ライブラリーをフォトリソグラフィーを用いて合成する。例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開第９０／１５０７０号及び国際公開第９２／１００９２号を参照のこと。固定化ポリマーを標識受容体と接触させ、標識についてスキャンして、受容体に対するポリマーの結合を同定する。本開示のポリペプチドの結合リガンド並びに、したがって、可能な阻害剤及び活性化剤を特定するのに用いることができる連続細胞膜支持体上のペプチド・ライブラリーの合成及びスクリーニングが、例えば、Ｋｒａｍｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、８７巻（１９９８年）、２５〜３９頁に記載されている。この方法は、例えば、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬにおける結合部位及び認識モチーフを確定するのにも用いることができる。同様な方法で、ＤｎａＫチャペロンの基質特異性が測定され、ヒトインターロイキン−６とその受容体との接触部位が判定された。例えば、それぞれＲｕｄｉｇｅｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６巻（１９９７年）、１５０１から１５０７頁及びＷｅｉｅｒｇｒａｂｅｒ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３７９巻（１９９６年）、１２２〜１２６頁を参照のこと。
【００５２】
さらに、上記の方法は、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬ由来の結合エピトープの構築に用いることができる。抗ｐ２４（ＨＶ−１）モノクローナル抗体のペプチド抗原についての同様のアプローチが成功裏に記載された。例えば、Ｋｒａｍｅｒ、Ｃｅｌｌ、９１巻（１９９７年）、７９９〜８０９頁を参照のこと。クラスターアミノ酸ライブラリーを用いたペプチド−抗体相互作用のフィンガープリント分析への一般的なルートがＫｒａｍｅｒ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２巻（１９９５年）、４５９〜４６５頁に記載された。さらに、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの拮抗薬は、Ｄｏｒｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻（１９９４年）、１０５９〜１０６７頁に記載されている方法に従って本開示のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体から誘導し、同定することができる。
【００５３】
より最近、国際公開第９８／２５１４６号は、所望の特性、例えば、ポリペプチド若しくはその細胞受容体の活性を増大し、それに結合し、又は拮抗する能力を有する化合物の複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）のライブラリーをスクリーニングする方法を記載している。そのようなライブラリーにおける複合体は、被験化合物、化合物の合成における少なくとも１つの段階を記録しているタグ及びリポーター分子による修飾に感受性のテザーを含む。テザーの修飾は、複合体が所望の特性を有する化合物を含むことを表すのに用いる。タグは、そのような化合物の合成における少なくとも１つの段階を明らかにするために解読することができる。本開示によるポリペプチドと相互作用する化合物、又はそのような分子をエンコードする核酸を同定する他の方法は、例えば、ファージ・ディスプレイ・システムを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング並びにフィルター結合検定又は例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる相互作用の「実時間」測定である。
これらの方法のすべては、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬ又は関連ポリペプチドの活性化剤／作用薬及び阻害剤／拮抗薬を特定するために本開示に従って用いることができる。
【００５４】
そのような活性化剤又は阻害剤の基本構造に関する様々な情報源を用いることができ、例えば、本開示のポリペプチドの擬似類似体を含む。本開示のポリペプチドの擬似類似体又はその生物学的に活性なフラグメントは、生物学的活性に必須であると予測されるアミノ酸を例えば、立体異性体、すなわち、Ｄ−アミノ酸で置換することによって得ることができる。例えば、Ｔｓｕｋｉｄａ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４０巻（１９９７年）、３５３４〜３５４１頁を参照のこと。さらに、フラグメントを生物学的に活性な類似体の設計に用いる場合、最初のポリペプチドの一部の除去により失われた可能性がある立体配置特性の少なくとも一部を再確立するために、プロ擬似成分をペプチドに組み込むことができる。例えば、Ｎａｃｈｍａｎ、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．、５７巻（１９９５年）、３５９〜３７０頁を参照のこと。さらに、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬは、天然ペプチドと同様に効率よく、本開示のポリペプチドのリガンド、基質、結合パートナー又は受容体として結合する、又は機能することができる合成化学ペプチド擬似体を特定するのに用いることができる。例えば、Ｅｎｇｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９９巻（１９９７年）、２２８４〜２２９２頁を参照のこと。例えば、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの構造モチーフの折りたたみシミュレーション及びコンピュータ再設計は、適切なコンピュータプログラムを用いて行うことができる（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２５巻（１９９６年）、２８６〜２９９頁、Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１１巻（１９９５年）、６７５〜６７９頁）。タンパク質の折りたたみのコンピュータモデリングは、詳細なペプチド及びタンパク質モデルの立体配置及びエネルギー解析に用いることができる（Ｍｏｎｇｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４７巻（１９９５年）、９９５〜１０１２頁、Ｒｅｎｏｕｆ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、３７６巻（１９９５年）、３７〜４５頁）。適切なプログラムは、相補的ペプチド配列のコンピュータ援用検索によるリシルオキシダーゼポリペプチド及びその相互作用タンパク質の相互作用部位の特定に用いることができる（Ｆａｓｓｉｎａ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、５巻（１９９４年）、１１４〜１２０頁）。タンパク質及びペプチドの設計のためのさらなる適切なコンピュータ・システムは、従来技術、例えば、Ｂｅｒｒｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２２巻（１９９４年）、１０３３〜１０３６頁、Ｗｏｄａｋ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５０１巻（１９８７年）、１〜１３頁、Ｐａｂｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５巻（１９８６年）、５９８７〜５９９１頁）に記載されている。上述のコンピュータ解析から得られた結果は、例えば、本開示のタンパク質又はそのフラグメントのペプチド擬似体の調製に用いることができる。タンパク質の天然アミノ酸配列のそのような擬似ペプチド類似体は、親タンパク質を非常に効率よく模擬する（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻（１９９６年）、３３２１８〜３３２２４頁）。例えば、容易に入手可能なアキラルｏ−アミノ酸残基の本開示のタンパク質又はそのフラグメンへの組込みは、脂肪鎖のポリメチレン単位によるアミド結合の置換をもたらし、それにより、ペプチド擬似体を構築するための都合のよい戦略を提供する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、３９巻（１９９６年）、７６９〜７７７頁）。他のシステムにおける小ペプチドホルモンの超活性ペプチド擬似体は、従来技術において記載されている（Ｚｈａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２４巻（１９９６年）、３２７〜３３１頁）。活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターの適切なペプチド擬似体も、連続アミドアルキル化によるペプチド擬似コンビナトリアル・ライブラリーを合成し、得られた化合物を例えば、それらの結合及び免疫学的特性について試験することによって特定することができる。ペプチド擬似コンビナトリアル・ライブラリーの生成及び使用の方法は、例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６７巻（１９９６年）、２２０〜２３４頁及びＤｏｍｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４巻（１９９６年）、７０９〜７１５頁に記載されている。さらに、本開示のポリペプチドの３次元及び／又は結晶学的構造は、本開示のポリペプチドの生物学的活性のペプチド擬似阻害剤の設計に用いることができる（Ｒｏｓｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５巻（１９９６年）、１２９３３〜１２９４４頁、Ｒｕｔｅｎｂｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４巻（１９９６年）、１５４５〜１５５８頁）。
【００５５】
天然の生物学的ポリペプチドの活性を模倣する低分子量合成分子の構造に基づく設計及び合成は、例えば、Ｄｏｗｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（１９９８年）、１９０〜１９５頁、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻（１９９７年）、４３５〜４４１頁、Ｍｏｏｒｅ、Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．、４０巻（１９９７年）、１１５〜１１９頁、Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｏｃ．、４０巻（１９９７年）、１２１〜１２５頁、Ｍｕｋｈｉｊａ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４巻（１９９８年）、４３３〜４３８頁に記載されている。
例えば、活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬ又は関連ポリペプチドの基質又はリガンドとして作用することができる小有機化合物の擬似体を設計、合成及び評価することが可能であることも当業者によく知られている。例えば、ハパロシンのＤ−グルコース擬似体は、細胞毒性における多剤耐性補助関連タンパク質に拮抗する点についてハパロシンと同様な効率を示したことが記載された（Ｄｉｎｈ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４１巻（１９９８年）、９８１〜９８７頁を参照）。
【００５６】
本明細書で開示する抗体などの阻害剤は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬに結合することができ、競合的阻害剤、不競合的（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）阻害剤又は非競合的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）阻害剤であり得る。競合的阻害に関しては、阻害剤は、通常基質と構造上の類似性を有する。阻害は、低基質濃度では顕著であるが、高基質濃度では打ち勝つことができない。不競合的阻害に関しては、阻害剤は、基質が結合部位に結合した後に利用可能になる部位に結合する。阻害は、高基質濃度で最も顕著である。非競合的阻害に関しては、阻害剤は、基質結合部位から離れた部位に結合し、相対的阻害は、一般的にすべての基質濃度で同じである。１つの実施形態において、本明細書で述べる抗体又はその抗原結合フラグメントは、全長及び処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２の両方に特異的に結合する。１つの態様において、全長及び処理ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２の両方は、酵素の活性形である。
【００５７】
３．ＬＯＸ／ＬＯＸＬに対する抗体
本明細書で用いているように、「抗体」という用語は、抗原性エピトープに特異的に結合するために必要な可変領域配列を含む分離又は組換え結合物質を意味する。したがって、抗体は、所望の生物学的活性を示す、例えば、特定の標的抗原に結合するあらゆる形の抗体又はそのフラグメントである。したがって、それは、広い意味で用いられ、具体的にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）並びに所望の生物学的活性を示す限り、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ２を含むが、これらに限定されない抗体フラグメントを含む。したがって、「ヒト抗体」という用語は、可能な非ヒトＣＤＲ領域を除くヒト由来の配列を含む抗体を意味し、Ｉｇ分子の完全な構造が存在することを意味せず、抗体がヒトにおいて最小限の免疫原性効果を有することのみを意味する。
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部、例えば、完全な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻（１０号）、１０５７〜１０６２頁（１９９５年））、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成された多特異性抗体などである。抗体のパパイン消化により、それぞれ単一結合部位、及び容易に結晶化する能力を反映する名称である残存「Ｆｃ」を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが生ずる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生ずる。
【００５８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、強固な非共有結合の１つの重及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなっている。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義する各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互に作用するのは、この立体配置にある。ひとまとめにすると、その６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、全結合部位より低い親和力であるが、単一可変ドメイン（すなわち、抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識し、結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」フラグメントは軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が付加されている点がＦａｂ’ フラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として最初は生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【００５９】
脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる明らかに異なるタイプの１つに帰属させることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、異なるクラスに帰属させることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられ得る。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単ポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照のこと。
【００６０】
「二重特異性抗体」という用語は、フラグメントが同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを意味する。短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対を作ることを可能にしないリンカーを用いることにより、ドメインは他の鎖の相補的ドメインと対を作らされ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により十分に記載されている。
【００６１】
「分離」抗体は、同定され、その自然環境の構成要素から分離されかつ／又は回収されたものである。その自然環境の混入物成分は、抗体の診断又は治療における使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質などである可能性がある。いくつかの実施形態において、抗体は、（１）ローリー法により定量したとき、抗体の９５重量％を超える、例えば、９９重量％を超えるまで、（２）スピニング・カップ・シーケネーターを用いることにより、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシー・ブルー又は銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまで精製する。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、分離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体を含む。しかし、通常は、分離抗体は少なくとも１つの精製段階により調製する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、その免疫グロブリン鎖又はフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、親和力及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト動物種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基により置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列にも認められない残基を含んでいてよい。一般的に、ヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも１つの、一般的に２つの可変ドメインを含み、すべて又は実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべて又は実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。
【００６３】
ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリンのそれも場合によって含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２９頁（１９８８年）及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２巻、５９３〜５９６頁（１９９２年））。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」又は「ドナー」残基としばしば呼ばれており、「移入」又は「ドナー」可変ドメインから一般的にとられる。ヒト化は、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いて、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁（１９８８年）の方法に従って本質的に実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない配列が非ヒト動物種の対応する配列により置換された、キメラ抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際に、ヒト化抗体は、一般的に、一部のＣＤＲ残基及びおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位の残基により置換されている、ヒト抗体である。
【００６４】
ヒト抗体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを含む当技術分野で知られている様々な手法を用いて作製することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻、３８１頁（１９９１年）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻、５８１頁（１９９１年）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの手法もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）及びＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１号）、８６〜９５頁（１９９１年））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することによって調製することができる。チャレンジにより、遺伝子再配列、集合及び抗体レパートリーを含むすべての点でヒトで認められるものと極めて類似した、ヒト抗体産生が認められる。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、並びに次の科学刊行物に記載されている。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁（１９２２年）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、８５６〜８５９頁（１９９４年）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、８１２〜１３頁（１９９４年）、Ｆｉｓｈｗａｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻、８４５〜５１頁（１９９６年）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻、８２６頁（１９９６年）、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻、６５〜９３頁（１９９５年）。
抗体は、上述の既知の選択及び／又は突然変異誘発法を用いて親和性を成熟させることもできる。いくつかの実施形態において、親和性成熟抗体は、成熟抗体を調製する出発抗体（一般的にマウス、ウサギ、ニワトリ、ヒト化又はヒト）より５倍、１０倍以上、２０倍以上、又は３０倍以上大きい親和力を有する。
【００６５】
抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体は、二特異性抗体であってもよい。二特異性抗体は、モノクローナルであり、いずれかは、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有するヒト又はヒト化抗体であってよい。この場合、結合特異性の１つは、ＬＯＸに対するものであり、他の１つは、他の抗原、例えば、細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに対するものである。さらなる実施形態において、結合特異性の１つは、ＬＯＸに対するものであり、他の１つは、ＬＯＸＬタンパク質、例えば、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４に対するものである。
抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体は、免疫複合体であってもよい。そのような免疫複合体は、化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）或いは放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害性物質に結合させた抗ＬＯＸ抗体を含む。
【００６６】
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープ「に特異的に結合する」又は「に対して特異的」である抗体は、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又は抗体の他の形で約４℃、２５℃、３７℃又は４２℃の温度で測定される１００ｎＭに等しいか若しくはそれより低く、場合によって１０ｎＭより低く、場合によって１ｎＭより低く、場合によって０．５ｎＭより低く、場合によって０．１ｎＭより低く、場合によって０．０１ｎＭより低く、又は場合によって０．００５ｎＭより低い解離定数Ｋｄで、ヒトＬＯＸ／ＬＯＸＬ（ｈＬＯＸ及びｈＬＯＸＬ１〜４のような）に特異的に結合する。
【００６７】
場合によって、本開示の抗体は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの成熟形を処理し、それにより、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬのレベルを減少させるためにＬＯＸ又はＬＯＸＬの処理を効果的に阻止するための切断部位などのＬＯＸ又はＬＯＸＬの１つ又は複数のタンパク質溶解切断部位に結合する。
場合によって、本開示の抗体は、ヒトＬＯＸのプレプロタンパク質、成熟若しくは処理ヒトＬＯＸ、又は他のリシルオキシダーゼ様若しくはリシルオキシダーゼ関連タンパク質（例えば、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４）に対する結合親和力より大きい親和力、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍大きい親和力で、ＬＯＸの全長形に特異的かつ選択的に結合する（Ｍｏｌｎａｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１６４７巻、２２０〜２２４頁、Ｃｓｉｓｚａｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、７０巻、１〜３２頁（２００１年）及び２００１年１１月８日に公開された国際公開第０１／８３７０２号を参照）。
【００６８】
場合によって、本開示の抗体は、ヒトＬＯＸのプレプロタンパク質、ヒトＬＯＸの全長形、又は他のリシルオキシダーゼ様若しくはリシルオキシダーゼ関連タンパク質（例えば、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４）に対する結合親和力より大きい親和力、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍大きい親和力で、ＬＯＸの成熟若しくは処理形に特異的かつ選択的に結合する（Ｍｏｌｎａｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１６４７巻、２２０〜２２４頁を参照）。
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１〜１８から選択されるｈＬＯＸの領域におけるエピトープに特異的に結合する。
場合によって、本開示の抗体は、他のリシルオキシダーゼ様若しくはリシルオキシダーゼ関連タンパク質（例えば、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４）に対する結合親和力より大きい親和力、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍大きい親和力で、ヒトＬＯＸ及びヒトＬＯＸＬ２の両方に結合する（（Ｍｏｌｎａｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１６４７巻、２２０〜２２４頁を参照）。
【００６９】
場合によって、本開示の抗体は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに結合するだけでなく、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの取込み又はインターナリゼーション（例えば、インテグリンβ１又は他の細胞受容体若しくはタンパク質による）も減少又は阻害する。そのような抗体は、ＥＭＴを減少させる可能性があり、したがって、本明細書で開示する適用分野に有用であると考えられている。
場合によって、本開示の抗体は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬに結合するだけでなく、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのリシルオキシダーゼ酵素活性も低下又は阻害する。そのような抗体は、ＥＭＴを減少させる可能性があり、したがって、本明細書で開示する適用分野に有用であると考えられている。
細胞受容体（例えば、取込み受容体インテグリンβ１）、ＢＴＫ（バートン型低γグロブリン血チロシンキナーゼ）又は他のインテグリンなどの他のタンパク質とＬＯＸ／ＬＯＸＬの結合も上述の検定を用いて行い、この場合、ＥＣＭタンパク質を用いる代わりに、細胞受容体（例えば、取込み受容体インテグリンβ１）、ＢＴＫ（バートン型低γグロブリン血チロシンキナーゼ）又は他のインテグリンを用いる。
【００７０】
ＥＣＭタンパク質、細胞受容体及びインテグリンに対するＬＯＸ／ＬＯＸＬの結合を阻害するそれらのＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体をさらなる進展のための候補として選択する。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ酵素は、ミカエリス−メンテン速度論により記述することができるピンポン・メカニズムにより作用する（図４１）。本開示のＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの競合的阻害剤、不競合的阻害剤又は非競合的阻害剤であり得る。競合的阻害剤、不競合的阻害剤及び非競合的阻害剤として作用する抗体の作用機序を図４２に示す。競合的阻害に関しては、阻害剤は、通常基質と構造上の類似性を有する。阻害は、低基質濃度では顕著であるが、高基質濃度では打ち勝つことができない。不競合的阻害に関しては、阻害剤は、基質が結合部位に結合した後に利用可能になる部位に結合する。阻害は、高基質濃度で最も顕著である。非競合的阻害に関しては、阻害剤は、基質結合部位から離れた部位に結合する。相対的阻害は、一般的にすべての基質濃度で同じである。したがって、競合的阻害剤、不競合的阻害剤又は非競合的阻害剤である抗体は、ＬＯＸＬ２などのＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体であり得る（図４３）。
【００７１】
４．ＬＯＸ／ＬＯＸＬを標的とするポリヌクレオチド
ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬをエンコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリッド形成することができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて生じさせることができる。
場合によって、本開示のポリヌクレオチド阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの取込み又はインターナリゼーションを減少又は阻害することができる。そのようなポリヌクレオチド阻害剤はＥＭＴを減少させる可能性があり、したがって、本明細書で開示する適用分野に有用であると考えられている。
【００７２】
場合によって、本開示のポリヌクレオチド阻害剤は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのリシルオキシダーゼ酵素活性を低下又は阻害することができる。そのようなポリヌクレオチド阻害剤はＥＭＴを減少させる可能性があり、したがって、本明細書で開示する適用分野に有用であると考えられている。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２を効率よくダウンレギュレートするのに用いることができるアンチセンス分子の設計は、一般的にアンチセンス・アプローチに用いられる２つの態様因子を考慮しながら行うことができる。第１の態様は、適切な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレチドの送達であり、一方、第２の態様は、その翻訳を阻害する形での細胞内の指定のｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレチドの設計である。
アンチセンスオリゴヌクレチドを設計する場合、一般的にいくつかの考慮すべき事項を考慮に入れる。アンチセンスオリゴヌクレチド又は類似体を用いた遺伝子発現の効率のよいｉｎ  ｖｉｖｏ阻害のために、オリゴヌクレチド又は類似体は、一般的に次の要件を満たす：（ｉ）標的配列に対する結合の十分な特異性、（ｉｉ）水に対する溶解度、（ｉｉｉ）細胞内及び細胞外ヌクレアーゼに対する安定性、（ｉｖ）細胞膜透過能、及び（ｖ）生物を治療するために用いる場合、低い毒性。標的ｍＲＮＡ及びオリゴヌクレチドの構造変化のエネルギーの説明となる熱力学的サイクルに基づくそれらの標的ｍＲＮＡに対する最高予測結合親和力を用いたそれらの配列を特定するアルゴリズムは、例えば、Ｗａｌｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、６５巻、１〜９頁（１９９９年）に記載されているように利用可能である。
【００７３】
そのようなアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンス・アプローチを実行するために用いられて成功を収めた。例えば、Ｗａｌｔｏｎらにより開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギβ−グロブリン（ＲＢＧ）及びマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレチドを成功裏に設計することを可能にした。同じ研究グループは、動力学的ＰＣＲ法により評価した細胞培養中の３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡ及びＢ並びにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレチドのアンチセンス活性が、２つの細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含むほぼすべての場合に有効であることがホスホジエステル及びホスホロチオアートオリゴヌクレチド化学により証明されたことも報告した。
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを用いて特定のオリゴヌクレチドを設計し、その効率を予測するいくつかのアプローチも公表された（Ｍａｔｖｅｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、１３７４〜１３７５頁（１９９８年））。
本開示で用いることができるアンチセンス分子は、ギャップ形成ペナルティが８に等しく、ギャップ拡大ペナルティが２に等しい、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを用いて決定される配列番号１、４、５又は７と少なくとも５０％相同、或いはそのＮ末端部分と少なくとも７５％相同のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の一部と生理的条件下でｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリッド形成可能な少なくとも１０塩基、例えば、１０〜１５、１５〜２０塩基、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも４０塩基のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を含む。
【００７４】
本開示により用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、組織中に投与した核酸構成体から発現させることができ、この場合、アンチセンス発現をオンオフ切り替えすることができるような誘導性プロモーターを用いるか、或いはそのようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、例えば、薬剤組成物の一部として組織中に直接投与することができる。
選択されるあらかじめ決定した配列を有するオリゴヌクレオチド及びその類似体を化学合成する能力は、遺伝子発現をダウンモジュレートする手段を提供する。４種類の遺伝子発現調節戦略を考慮することができる。
転写レベルでは、鎖置換又は三重らせんの形成によりゲノムＤＮＡに結合するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド又は類似体は、転写を妨げることができる。転写レベルでは、標的ｍＲＮＡ分子に結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチド又は類似体は、細胞内ＲＮアーゼＨによるハイブリッドの酵素的切断をもたらす。この場合、標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成することにより、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、二重らせんハイブリッドがＲＮアーゼＨ酵素により認識され、破壊されることを可能にする。或いは、そのようなハイブリッド形成は、正しいスプライシングの妨害につながる可能性がある。結果として、両方の場合に、翻訳の準備が整っている標的ｍＲＮＡの完全な転写物の数は減少するか、又は消失する。
【００７５】
翻訳レベルでは、標的ｍＲＮＡ分子に結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチド又は類似体は、標的ｍＲＮＡに対する必須翻訳因子（リボソーム）の結合を立体障害により妨げる。これは、そのようなｍＲＮＡｓの翻訳を不可能にするハイブリッド形成停止として当技術分野で知られている現象である。
非修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼにより速やかに分解されて、短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するので、アンチセンス配列として用いることは一般的に実際的でない。さらに、それらは、ミリグラム以上の量で調製することがしばしば困難である。さらに、そのようなオリゴヌクレオチドは、通常、不良な細胞膜透過物である。したがって、オリゴヌクレオチド類似体は、通常、適切な方法で工夫されている。
例えば、三重らせんの形成による２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）認識に関連して生ずる問題は、巧妙な「スイッチバック」化学結合により減少し、それにより、１本の鎖上のポリプリンの配列が認識され、「スイッチバック」により、他の鎖上のホモプリン配列を認識することができる。また、人工塩基を用いることにより良好ならせん形成が得られ、それにより、結合状態がイオン強度及びｐＨに関して改善する。
【００７６】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドも、標的との安定なＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんを形成し、効率のよい阻害が示唆されるので、アンチセンス阻害に用いることができる。しかし、それらの安定性が低いため、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、一般的にこの目的のために設計されたベクターを用いて細胞内で発現させる。このアプローチは、豊富で、寿命が長いタンパク質をエンコードするｍＲＮＡを標的とすることを試みる場合に用いることができる。
アンチセンス療法は、多くの生命を脅かす疾患を治療するのに用いることができ、伝統的な薬剤と比べて多く利点がある。伝統的な薬剤は、一般的に、疾患を引き起こすタンパク質が生成した後に介入する。しかし、アンチセンス療法は、ｍＲＮＡ転写／翻訳を阻止し、タンパク質が生成する前に介入することができ、アンチセンス療法は１つの特定のｍＲＮＡのみを標的にするので、現行のタンパク質阻害療法より有効で、副作用が少ないことがあり得る。
【００７７】
いくつかの臨床試験で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性及び活性が実証された。例えば、がんの治療に適するアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用されて成功を収め（Ｈｏｌｍｕｎｄら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１巻、３７２〜３８５頁（１９９９年））、一方、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３及びＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液学的悪性腫瘍の治療が臨床試験に入り、患者により耐えられることが示された（Ｇｅｒｗｉｔｚ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１巻、２９７〜３０６頁（１９９９年））。
より最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制がマウス・モデルにおけるヒトがん細胞の胸膜播種を抑制することが報告された（Ｕｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１巻、７８５５〜６０頁（２００１年））。
最初のアンチセンス薬が最近ＦＤＡにより承認された。該薬物フォミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）は、Ｉｓｉｓにより開発され、ＣＭＶ網膜炎に対する他の療法に不耐性であるか、又は禁忌を有する、或いはＣＭＶ網膜炎に対する以前の療法に対する反応性が不十分であったＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルスの局所療法に適応となる（Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｅｗｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）。
したがって、現在のコンセンサスは、上述のようなアンチセンス技術の分野の最近の発展が、不適切な試験や誤った実験に頼ることなく、当業者が既知の配列の発現をダウンレギュレートするのに適するアンチセンス・アプローチを設計し、実行することを可能にする、高度に正確なアンチセンス設計アルゴリズム及び種々のオリゴヌクレオチド・デリバリー・システムの創生につながったことである。
【００７８】
ＬＯＸ又はＬＯＸＬを阻害する他のメカニズムは、標的ｍＲＮＡと相同であり、その分解をもたらす小干渉性ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又は小ヘアピンＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）分子を用いるアプローチであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である（Ｃａｒｔｈｅｗ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１３巻、２４４〜２４８頁（２００１年））。例えば、ＬＯＸＬ２特異的ｓｈＲＮＡの発現を伴う種々の種類のがん細胞の感染は、それらの形態及び浸潤性を変化させるのに有効である。
ＲＮＡ干渉は、一般的に２段階過程である。開始段階と呼ばれる第１段階において、ｄｓＲＮＡ（直接又はトランス遺伝子若しくはウイルスを介して導入された）をＡＴＰ依存的に処理する（切断する）、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）の作用により、恐らく、インプットｄｓＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）小干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。連続的な切断事象がＲＮＡを、それぞれ２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する１９〜２１ｂｐ二重らせん（ｓｉＲＮＡ）に分解する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２巻、２２５〜２３２頁（２００２年）、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４０９巻、３６３〜３６６頁（２００１年））。
【００７９】
エフェクター段階において、ｓｉＲＮＡ二重らせんは、ヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重らせんのＡＴＰ依存性巻き戻しは、ＲＩＳＣの活性化を必要とする。活性ＲＩＳＣは、次に塩基対合相互作用により相同性転写物を標的にし、一般的にｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドフラグメントに切断する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２巻、２２５〜２３２頁（２００２年）、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．、２巻、１１０〜１１９頁（２００１年）、Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．、１５巻、４８５〜４９０頁（２００１年）。切断のメカニズムは解釈すべきであるが、研究により、各ＲＩＳＣが単一ｓｉＲＮＡ及びＲＮアーゼを含むことが示されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２巻、２２５〜２３２頁（２００２年））。
【００８０】
ＲＮＡｉの効力は顕著であるため、ＲＮＡｉ経路内の増幅段階が示唆された。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡｓを発生させるインプットｄｓＲＮＡｓのコピー、又は生成するｓｉＲＮＡｓの複製によって起こる可能性がある。或いは又はさらに、増幅は、ＲＩＳＣの複数の代謝回転事象によってもたらされる可能性がある（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１２巻、２２５〜２３２頁（２００２年）、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．、２巻、１１０〜１１９頁（２００１年）、Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．、１５巻、４８５〜４９０頁（２００１年）。ＲＮＡｉは、Ｔｕｓｃｈｌ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２巻、２３９〜２４５頁（２００１年）、Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻、５９７〜５９９頁（２００２年）及びＢｒａｎｔｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．、１５７５巻、１５〜２５頁（２００２年）にも記載されている。
本開示により用いるのに適するＲＮＡｉ分子の合成は、次のように実施することができる。第１に、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ  ｍＲＮＡ配列をＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンの下流にスキャンする。各ＡＡ及び３’隣接１９ヌクレオチドの存在を、潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲｓ）は調節タンパク質結合部位においてより富んでいるので、ｓｉＲＮＡ標的部位は、開いた読み枠から選択する。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する可能性がある（Ｔｕｓｃｈｌ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２巻、２３９〜２４５頁（２００１年））。ＧＡＰＤＨについて示されたように、非翻訳領域を標的とするｓｉＲＮＡも有効である可能性があることは認識されよう。５’ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡは、細胞ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に低下させる（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。第２に、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアなどの配列アライメントソフトウエアを用いて、潜在的標的部位を適切なゲノム・データベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコーディング配列と有意な相同性を示す推定標的部位は、フィルターにかけて除去する。
【００８１】
適格標的部位をｓｉＲＮＡ合成の鋳型として選択する。選択される配列は、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有するものと比べて遺伝子サイレンシングを媒介するのに有効であることが示されたので、低いＧ／Ｃ含量を有するものを含むことができる。評価に供する標的遺伝子の長さに沿っていくつかの標的遺伝子を選択することができる。選択されたｓｉＲＮＡｓのより十分な評価のために、陰性対照をともに用いる。陰性対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡｓと同じヌクレオチド組成であるが、ゲノムに対する有意な相同性を欠くものを含み得る。したがって、他の遺伝子と有意な相同性を示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列を用いることができる。
本開示のｓｉＲＮＡ分子は、一旦宿主細胞中に導入されたならば、ｓｉＲＮＡ転写物の安定な発現を促進することができる発現ベクターから転写することができる。これらのベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子特異的サイレンシングを行うことができるｓｉＲＮＡ分子に処理されるｓｈＲＮＡを発現するように遺伝子工学により改変される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、５５０〜５５３頁（２００２年）、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１６巻、９４８〜９５８頁（２００２年）、Ｐａｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０巻、５０５〜５０８頁（２００２年）、Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻、６０４７〜６０５２頁（２００２年））。
【００８２】
ｓｈＲＮＡは、ヘアピン・ループ構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドである。１本鎖ポリヌクレオチドは、２本鎖領域における１つの鎖の３’末端と２本鎖領域における他の鎖の５’末端を結合させるループ・セグメントを有する。２本鎖領域は、ＬＯＸ若しくはＬＯＸＬ、又はＬＯＸ若しくはＬＯＸＬ  ｍＲＮＡをエンコードするポリヌクレオチドなどの標的配列及び第１の配列と相補的である第２の配列とハイブリッド形成可能である第１の配列から形成され、それにより、第１及び第２の配列が、結合配列がヘアピン・ループ構造の末端を結合させて、ヘアピン・ループ構造を形成している、２本鎖領域を形成している。第１の配列は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬをエンコードするポリヌクレオチドのあらゆる部分とハイブリッド形成することができる。ｓｈＲＮＡの２本鎖ステムドメインは、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。
ｓｈＲＮＡのステムループ構造は、２ｂｐオーバーハング、例えば、３’ＵＵオーバーハングなどの任意選択のヌクレオチドオーバーハングを有することができる。変動はあり得るが、ステムは、一般的に約１５〜４９、約１５〜３５、約１９〜３５、約２１〜３１ｂｐ、又は約２１〜２９ｂｐであり、ループは、約４〜３０ｂｐ、例えば、約４〜２３ｂである。
【００８３】
細胞内のｓｈＲＮＡｓの発現のために、ポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーター、ステムループＲＮＡインサートのクローニング部位、及び４５−チミジン転写末端シグナルを含むプラスミドベクターを用いることができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、一般的に明確な開始及び停止部位を有し、それらの転写物は、ポリ（Ａ）テイルを欠いている。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジントラクトによって定義され、転写物は、一般的に第２のウリジンの後で切断される。この位置での切断により、発現ｓｈＲＮＡにおける３’ＵＵオーバーハングが発生する。これは、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似している。哺乳類細胞におけるｓｈＲＮＡを発現させるさらなる方法は、上で引用した参考文献に記載されている。
【００８４】
適切な発現ベクターの例は、転写の明確な開始及び列（ｒｏｗ）（Ｔ５）における５つのチミジンからなる終結シグナルを有するポリメラーゼ−ＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ遺伝子プロモーターを含むｐＳＵＰＥＲ（商標）である（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｎｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、５５０〜５５３頁（２００２年））。終結部位における転写物の切断は、第２のウリジンの後の部位にあり、それにより、ヌクレオチドオーバーハングも含む合成ｓｉＲＮＡｓの末端に類似する転写物を生じさせる。ｓｉＲＮＡは、目的とする配列、すなわち、同じ配列の逆相補配列から短いスペーサーにより分離されたＬＯＸ又はＬＯＸＬを含むようにクローンする。得られる転写物は、それ自体の上で折り返して、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ  ＲＮＡｉを媒介するステムループ構造を形成する。
他の適切なｓｉＲＮＡ発現ベクターは、独立したｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節のもとにセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡをエンコードする（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０巻、４９７〜５００頁（２００２年））。このベクターにより生成したｓｉＲＮＡも５つのチミジン（Ｔ５）終結シグナルを含む。
リポフェクションにより合成ｓｉＲＮＡを細胞に導入するアプローチは、いくつかの細胞型における低いトランスフェクション効率及び／又はサイレンシング効果の短期持続をもたらし得るので、ベクター媒介法が開発された。
したがって、本開示により用いたｓｉＲＮＡ分子は、レトロウイルスを用いて細胞内に送達することができる。レトロウイルス送達は、一般的により効率が高く、均一で、安定な「ノックダウン」細胞を即時に選択するので、レトロウイルスを用いるｓｉＲＮＡの送達は、リポフェクションのような方法に比べていくつかの利点がある（Ｄｅｖｒｏｅ及びＳｉｌｖｅｒ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２巻、１５頁（２００２年））。
【００８５】
最近の科学刊行物で標的ｍＲＮＡ発現の阻害におけるそのような短い２本鎖ＲＮＡ分子の効率がバリデートされ、そのような分子の治療における可能性が明らかに示された。例えば、ＲＮＡｉは、Ｃ型肝炎（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、３８〜３９頁（２００２年））、ＨＩＶ−１（Ｊａｃｑｕｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、４３５〜４３８頁（２００２年））、子宮頚がん細胞（Ｊｉａｎｇ及びＭｉｌｎｅｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１巻、６０４１〜６０４８頁（２００２年））及び白血病細胞（Ｗｉｌｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１巻、５７１６〜５７２４頁（２００２年））の発現を抑制するために用いた。
【００８６】
５．抗腫瘍又は抗線維症薬
本開示によれば、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤は、化学療法薬に対して腫瘍細胞を感受性にし（例えば、ＥＭＴ状態からＭＥＴ状態への移行）、それにより、腫瘍浸潤及び転移を予防又は抑制するだけでなく、原発腫瘍の成長を抑制するためにも化学療法薬と併用することができる。
本明細書で用いているように、「化学療法薬」又は「化学療法剤」（又は化学療法薬による治療の場合における「化学療法」）は、がんの治療に有用な非タンパク質性（すなわち、非ペプチド性）化合物を含むことを意味する。化学療法薬の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファン及びピプロスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドーパ、カルボキノン、メツレドーパ及びウレドーパなどのアジリデン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンなどのエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホレムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；エネジイン抗生物質（例えば、カリヘアマイシン、特に、カリヘアマイシンガンマＩＩ及びカリヘアマイシンファイＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３巻、１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；クロドロナートなどのビホスホナート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素蛋白エネジイン抗生物質発色団）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（Ａｄｒａｍｙｃｉｎ（商標））（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、キエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デモプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミド；デメコルシン；ジアジキオン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシン及びアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジキオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ−２毒素、ベルラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；デカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオペタ；トキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトロキサントロン；バンクリスチン；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼオローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド：カペシタビン；並びに上のいずれかの薬剤学的に許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（商標）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（商標））を含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭｓ）；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲステロール（Ｍｅｇａｃｅ（商標））、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（Ｒｉｖｉｓｏｒ（商標））、レトロゾー���（Ｆｅｍａｒａ（商標））及びアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標））などの副腎におけるエストロゲン産生を調節するアロマターゼ酵素の阻害薬；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン薬、並びに上のいずれかの薬剤学的に許容できる塩、酸又は誘導体も「化学療法薬」の定義に含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＬＯＸ／ＬＯＸＬモジュレーターと併用する抗腫瘍薬は、チロシンキナーゼ阻害薬である。例えば、ＺＤ１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｋ．Ｋ．のＩｒｅｓｓａ（商標））は、ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位においてＡＴＰに対して競合的作用を示し、チロシンキナーゼの自己リン酸化を阻害することによってチロシンキナーゼ活性を阻害する。
結果として、抗がん効果は、ＥＧＦＲに備わっているシグナル伝達を遮断することによって発現する（表皮成長因子（ＥＧＦ）のようなリガンドがＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合した後、細胞内ドメインにおけるＥＧＦＲチロシンキナーゼが活性化され、ＥＧＦＲの自己リン酸化だけでなく、種々の細胞内標的タンパク質のリン酸化も引き起こされ、がん細胞表面から核へ増殖シグナルを伝達し、がん細胞の増殖、浸潤、転移及び血管新生がもたらされる）。
ＥＧＦＲ標的モノクローナル抗体）であるＩＭＣ−Ｃ２２５又はセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））は、細胞膜表面上のＥＧＦＲの受容体部分を認識し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害し、それにより、チロシンキナーゼ活性を阻害する。ＥＧＦＲと相同であるＨｅｒ２／Ｎｅｕに対するモノクローナル抗体であるヘルセプチン、及びイマチニブメシラート（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）、以前はＳＴＩ−５７１）は、ＢＣＲ−Ａｂ１及びｃ−ｋｉｔの両チロシンキナーゼ活性を阻害することができる（非特許文書２）。ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（商標））は、Ｒａｆキナーゼ、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＶＥＧＦ受容体２及び３キナーゼ並びにｃ−Ｋｉｔの小分子阻害薬である。
【００８８】
本明細書で用いているように、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体は、腫瘍及び白血病細胞により発現される抗原、例えば、腫瘍特異抗原に対して誘発された抗体である。モノクローナル抗体は、完全にヒト及びヒト化抗体も含む。
がん療法用の治療用抗体の他の例としては、トラツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、診療所におけるより攻撃的疾患及びより不良な予後に関連する）；リンパ腫細胞上のＣＤ２０に対して産生され、正常及び悪性ＣＤ２０＋プレＢ及び成熟Ｂ細胞を選択的に枯渇させるリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））；Ｂ及びＴリンパ球上に認められるＣＤ５２抗原を特異的に標的にし、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びリンパ腫の治療に用いられるモノクローナル抗体であるアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標））；並びにＣＤ３３に対する特異的抗体を化学療法薬（ゾガマイシン）と組合せ、再発性成人急性骨髄性白血病の治療を適応とする抗体結合体であるゲムツズマブゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標））などが挙げられる。
【００８９】
他の実施形態において、がん及び異常又は望ましくない血管新生に関連する他の疾患を治療するために、血管新生阻害薬をＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤と併用する。血管新生阻害薬の例は、レチノイン酸及びその誘導体、２−メトキシエストラジオール、ＡＮＧＩＯＳＴＡＴＩＮ（商標）、ＥＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）、スラミン、スクアラミン、メタロプロテイナーゼ−Ｉの組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、軟骨由来阻害剤、パクリタキセル、血小板因子４、硫酸プロタミン（クルペイン）、硫酸化キチン誘導体（松葉ガニの殻から調製）、硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ｓｐ−ｐｇ）、スタウロスポリン、例えば、プロリン類似体（Ｉ−アゼチジン−２−カルボン酸（ＬＡＣＡ））を含むマトリックス代謝のモジュレーター、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｉ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α−ジピリジル、フマル酸β−アミノプロピルニトリル、４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート、ミトキサントロン、ヘパリン、インターフェロン、２マクログロブリン−血清、チンプ−３、キモスタチン、テトラデカ硫酸β−シクロデキストリン、エポネマイシン；フマギリン、チオマレイン酸金ナトリウム、ｄ−ペニシラミン（ＣＤＰＴ）、β−１−抗コラゲナーゼ−血清、α−２−抗プラスミン、ビサントレン、ロベンザリト二ナトリウム、ｎ−２−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸二ナトリウム又は「ＣＣＡ」、タリドミド；血管形成阻害性ステロイド、カルグボキシンアミノールミダゾール（ｃａｒｇｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；ＢＢ９４などのメタロプロテイナーゼ阻害薬を含むが、これらに限定されない。他の血管新生阻害薬としては、抗体、例えば、これらの血管新生成長因子に対するモノクローナル抗体：ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦイソ型、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨＧＦ／ＳＦ及びＡｎｇ−１／Ａｎｇ−２などが挙げられる。Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．及びＡｌｉｔａｌｏ  Ｋ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻、１３５９〜１３６４頁。他の血管新生阻害薬は、ＶＥＧＦ転写の阻害薬を含んでいてよい。
【００９０】
具体例としての抗線維症薬は、β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）、並びに参照により本明細書に組み込まれている、様々な病的線維症状態の治療のためにＬＯＸを阻害する化合物に関する、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ，ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ」と題する１９９０年１０月２３日に発行されたＰａｌｆｒｅｙｍａｎらへの米国特許第４，９６５，２８８号、「Ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｊａｃｅｎｔｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ｄｉａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」と題する１９９１年３月５日に発行されたＫａｇａｎらへの米国特許第４，９９７，８５４号に開示されている化合物を含むが、これらに限定されない。さらなる具体例としての阻害薬は、参照により本明細書に組み込まれている、２−イソブチル−３−フルオロ、クロロ又はブロモアリルアミンなどの化合物に関する「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ」と題する１９９０年７月２４日に発行されたＰａｌｆｒｅｙｍａｎらへの米国特許第４，９４３，５９３号、並びに例えば、米国特許第５，０２１，４５６号；米国特許第５，５０５９，７１４号；米国特許第５，１２０，７６４号；米国特許第５，１８２，２９７号；米国特許第５，２５２，６０８号（２−（１−ナヒチルオキシメチル）−３−フルオロアリルアミン）に関する）；及び米国特許出願第２００４／０２４８８７１号に記載されている。具体例としての抗線維症薬はまた、カルボニルと結合した後に以下の第一級アミンのような共鳴により安定化する生成物を生成するものを含む、リシルオキシダーゼの活性部位のカルボニル基と反応する第一級アミンを含む：エチレンジアミン、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、及びそれらの誘導体、セミカルバジド、並びに尿素誘導体、β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）などのアミノニトリル、又は２−ニトロエチルアミン、２−ブロモエチルアミン、２−クロロエチルアミン、２−トリフルオロエチルアミン、３−ブロモプロピルアミン、ｐ−ハロベンジルアミンなどの不飽和若しくは飽和ハロアミン、セレノホモシステインラクトン。他の実施形態において、抗線維症薬は、細胞に浸透する、又は浸透しない銅キレート化剤である。さらなる具体例としての化合物は、チオールアミン、例えば、Ｄ−ペニシラミン、又は２−アミノ−５−メルカプト−５−メチルヘキサン酸、Ｄ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アセトアミドエチル）ジチオ）ブタン酸、ｐ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アミノエチル）ジチオ）ブタン酸、ナトリウム−４−（（ｐ−１−ジメチル−２−アミノ−２−カルボキシエチル）ジチオ）ブタンスルフィナート、２−アセトアミドエチル−２−アセトアミドエタンチオールスルファナート、ナトリウム−４−メルカプトブタンスルフィナート三水和物などのその類似体によるリシル及びヒドロキシリシル残基の酸化的脱アミノ化によりアルデヒド誘導体が生ずることを阻止する、そのような化合物の間接的阻害薬を含む。
【００９１】
６．製剤、キット及び投与経路
開示した方法を用いたＬＯＸ／ＬＯＸＬモジュレーターとして確認される治療用の組成物も考えられる。１つの実施形態において、転移性腫瘍成長の予防及び治療用の組成物をここに提供し、該組成物は、薬剤学的に許容できる担体物質中に治療上有効な量のＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を含み、該阻害剤は、リシルオキシダーゼ又はＬＯＸＬ−２などのリシルオキシダーゼ様タンパク質を阻害し、該阻害剤の量は、転移性腫瘍成長を予防し、治療するのに有効である。他の実施形態において、放射線、手術、化学療法、又はＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤でない抗がん生物製剤と併用する、薬剤学的に許容できる担体物質中に治療上有効な量のＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を含む転移性腫瘍成長の予防及び治療用の組成物をここに提供する。
本明細書で用いているように、「治療上有効な量」又は「有効な量」は、単独又は他の治療薬と併用して細胞、組織又は対象に投与したとき、疾患状態又は疾患の進行を予防又は改善するのに有効である治療薬の量を意味する。治療上有効な用量は、症状の改善、例えば、関連する医学的状態の治療、治癒、予防又は改善、或いはそのような状態の治療、治癒、予防又は改善の速度の増加をもたらすのに十分な化合物の量をさらに意味する。単独で投与した個々の有効成分に適用する場合、治療上有効な用量は、当成分のみに当てはまる。併用に適用する場合、治療上有効な用量は、一緒に、連続的に、又は同時に投与するどうかにかかわりなく、治療効果をもたらす、有効成分のすべてを含めた量を意味する。例えば、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与を用いる場合、通常の投与量は、投与経路によって、哺乳類体重又は１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１μｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、場合によって約１００μｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、又は１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日に変化する可能性がある。
【００９２】
様々な薬剤組成物並びにそれらの調製及び使用の技術は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。適切な薬剤組成物及び関連する投与技術の詳細なリストについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ、２００３年）のような教科書によりさらに補足することができる、本明細書における詳細な教示を参照することができる。
組成物はさらに、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料などの薬剤学的に許容できる材料、組成物又は媒体、すなわち、担体を含む。これらの担体は、１つの臓器又は身体の一部から他の臓器又は身体の一部に対象化学物質を輸送するのに関与する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に有害でないという意味で「許容できる」べきである。薬剤学的に許容できる担体として働くことができる物質のいくつかの例は、乳糖、ブドウ糖及びショ糖などの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末状タラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含有水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質を含む。ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、並びに着色剤、はく離剤、コーティング剤、甘味料、着香剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤も組成物中に存在していてもよい。
【００９３】
本開示の他の態様は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬモジュレーターと他の治療薬との併用投与を行うためのキットに関する。１つの実施形態において、キットは、薬剤担体で製剤化したＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤及び１つ又は複数の別個の医薬製剤として適宜製剤化したＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤でない少なくとも１つの治療薬を含む。
製剤及び送達方法は、一般的に治療する部位及び疾患に応じて適応させる。具体例としての製剤は、ミセル、リポソーム又は薬物放出カプセル中に封入された製剤（活性物質が徐放用に設計された生体適合性コーティング内に組み込まれている）を含む、非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下投与に適するもの；摂取可能な製剤；クリーム剤、軟膏剤及びゲル剤などの局所用製剤；並びに吸入剤、エアゾール剤及び噴霧剤などの他の製剤を含むが、これらに限定されない。本開示の化合物の用量は、治療の必要の程度及び重症度、投与する組成物の活性、患者の一般的健康状態、並びに当業者によく知られている他の考慮事項によって異なる。
【００９４】
本明細書で述べる薬剤は、投与に適する薬剤組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、一般的に薬剤及び薬剤学的に許容できる担体を含む。追加の活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
他の実施形態において、本明細書で述べる薬剤は、局所的に送達される。局所的送達は、例えば、全身送達と比較して患者の全身への影響を少なくするために線維症の部位に薬剤を非全身的に送達することを可能にする。そのような局所送達は、ステント及びカテーテルを含むが、これらに限定されない様々な医学的に埋め込まれた用具を介して達成することができる。ステント及びカテーテルなどの医療機器に所望の薬剤をコーティングし、植込み、埋込み、また別の方法で取り付ける方法は、当技術分野で確立されており、ここに考慮する。
【００９５】
植込み式ステントは、血栓溶解薬などの薬剤を保持するのに用いられている。米国特許第５，１６３，９５２号は、ステント自体の材料に薬剤を保持するために開発された熱記憶拡張式プラスチック・ステント用具を開示している。米国特許第５，０９２，８７７号は、化合物の送達に関連するコーティングを施すことができるポリマー材料のステントを開示している。生分解性及び生体吸収性ポリマーを用いるクラスの用具を対象とする他の特許は、米国特許第４，９１６，１９３号、米国特許第４，９９４，０７１号などである。例として、ヒドロゲルポリマー及び細胞成長阻害薬又はヘパリンなどのあらかじめ選択した化合物からなるステントに施されたコーティングを開示している。治療用物質を保持する被覆血管内ステントを製造する方法は、米国特許第５，４６４，６５０号に記載されており、ポリマーコーティング材料を溶媒に溶解し、治療用物質を溶媒中に分散させる。次いで、施行後に溶媒を蒸発させる。
米国特許第６，１２０，５３６号は、ステントを含む様々な人工補装具ととともに使用するためのさらなる種類のコーティングを記載している。本明細書で述べる薬剤について有用であると思われる医療機器又は人工補装具の例は、血液交換用具、血管アクセス・ポート、中心静脈カテーテル、心血管カテーテル、体外循環、代用血管、ポンプ、心臓弁及び心血管縫合糸を含むが、これらに限定されない。本明細書で述べる詳細な実施形態にかかわりなく、本開示の適用可能性は、インプラントの設計、インプラントの位置、又は構成材料に関して限定して考えるべきではない。ステント及びカテーテルなどの、本明細書で述べる物質で被覆した用具を使用することにより、物質を特定又は局所的部位に送達することができる。そのような部位特異的送達は、溶解度、全身毒性の懸念又は他の問題のために全身送達に適用できないようなβ−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）及び関連化合物又は他のアミンオキシダーゼ阻害剤（上述のＬＯＸ／ＬＯＸＬの小分子阻害剤など）などの用量及び薬物の使用の手段を提供し得る。例として、ＢＡＰＮは、ＬＯＸ阻害剤として有用であることが知られているが、この化合物は、非常に有毒であり、全身投与した場合にその有効な使用についての問題がある。ＢＡＰＮなどの活性薬又は化合物の送達のためのステント、カテーテル又は他の医療機器を使用することにより、標的を定めた又は局所的な、有効な用量の化合物の使用、ひいては、そのような化合物及び現行の投与経路に関連する全身毒性効果の低減が可能になる。
【００９６】
７．組成物の適応
本開示による医薬製剤は、種々の疾患を治療するために用いることができる。
本明細書で用いているように、「予防」は、症状の発症の予防、線維症に関連する又はＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性と相関する疾患又は障害の進行の予防を含む。本明細書で用いているように、「阻害」、「治療」、「治療すること」及び「改善すること」は、同義で用いられ、例えば、症状の停止、生存期間の延長、症状の部分的若しくは完全な改善、並びに線維症に関連する又はＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性と相関する、状態、疾患又は障害の部分的若しくは完全な根絶を意味する。
【００９７】
組成物は、医学的治療に適用できる妥当なベネフィット／リスク比で、線維症又はＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性に関連する本明細書で述べるような疾患又は障害を抑制することによる所望の治療効果を得るために有効である、治療上有効な量で患者（例えば、ヒト又は霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の非ヒト動物）に投与することができる。本開示の組成物のヒトへの投与のために、組成物は、当業者に知られている方法を用いて製剤化することができる。治療上有効な量は、臓器又は組織における少なくとも部分的に所望の治療又は予防効果を達成する量である。１つの例において、疾患又は障害の予防及び／又は治療を達成するのに必要なＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害剤の量は、本質的に固定されない。投与されるＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害剤の量は、疾患又は障害の種類、疾患又は障害の程度、疾患又は障害に罹患する哺乳動物の大きさによって異なる。
反応は、患者が疾患の徴候又は症状の部分的若しくは完全な緩和、又は低減を経験するときに達成され、特に、制限なしに生存期間の延長を含む。予測される無進行生存期間は、再発の回数、病期及び他の因子を含む予後因子によって、数カ月から数年で測定することができる。生存期間の延長は、制限なしに、少なくとも１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年又はそれ以上の時間を含む。総生存期間も数カ月から数年で測定することができる。患者の症状は、固定したまま又は低減していてよい。
【００９８】
本開示の医薬製剤を用いて治療することができる非限定的な適応症は、望ましくない又は抑制されていない細胞増殖に伴うものを含む。そのような適応症は、良性腫瘍、原発性腫瘍などの種々の種類のがん並びに腫瘍転移、再狭窄（例えば、冠動脈、頚動脈及び脳血管病変）、血液学的障害、内皮細胞の異常な刺激（アテローム動脈硬化症）、手術に起因する身体の傷害、異常な創傷治癒、異常な血管新生、組織の線維症をもたらす疾患、黄斑変性、肝線維症、腎線維症、肺線維症、強皮症、アテローム動脈硬化症及びアルツハイマー病、反復運動障害、高度に血管化していない組織の障害、並びに臓器移植に伴う増殖反応などである
一般的に、良性腫瘍における細胞は、それらの分化した特徴を保持しており、完全に抑制されていない仕方では分裂しない。良性腫瘍は、通常、局在化しており、非転移性である。本開示を用いて治療することができる特定の種類の良性腫瘍は、血管腫、肝細胞腺腫、海綿状血管腫、限局性結節性過形成、聴神経腫、神経線維腫、胆管腺腫、胆管のう胞腺腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、中皮腫、奇形腫、粘液腫、結節性再生性過形成、トラコーマ及び化膿性肉芽腫などである。
【００９９】
悪性腫瘍において、腫瘍細胞は、未分化の状態になり、身体の増殖制御シグナルに反応せず、抑制されていない仕方で増殖する。悪性腫瘍は、浸潤性であり、遠隔部位に広がることができる（転移性）。悪性腫瘍は、一般的に原発性と続発性の２つのカテゴリーに分けられる。原発性腫瘍は、それらが認められる組織から直接生ずる。続発性腫瘍又は転移は、身体のほかの場所で生じたが、現在は遠隔臓器に広がっている腫瘍である。転移の一般的な経路は、隣接する構造中での直接的増殖、血管又はリンパ系を介する広がり、組織面及び体腔に沿う追随（腹水、脳脊髄液等）である。
ここに開示する方法により治療することができる原発性及び転移性腫瘍は、肺がん（肺腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫を含むが、これらに限定されない）；乳がん（乳管癌、小葉癌、炎症性乳がん、明細胞癌、粘液癌を含むが、これらに限定されない）；大腸直腸がん（大腸がん、直腸がんを含むが、これらに限定されない）；肛門がん；膵がん（膵腺癌、島細胞癌、神経内分泌腫瘍を含むが、これらに限定されない）；前立腺がん；卵巣癌（卵巣上皮又は漿液性腫瘍を含む表面上皮−間質腫瘍、類内膜腫瘍及び粘液のう胞腺癌、性索−間質腫瘍を含むが、これらに限定されない）；肝及び胆管癌（肝細胞癌、胆管癌、血管腫を含むが、これらに限定されない）；食道癌（食道腺癌及び扁平細胞癌を含むが、これらに限定されない）；非ホジキンリンパ腫；膀胱癌；子宮癌（子宮内膜腺癌、子宮乳頭状漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫及び平滑筋肉腫、ミューラー管混合腫瘍を含むが、これらに限定されない）；神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌａｂｌａｓｔｏｍａ）及び脳の他の腫瘍；腎臓がん（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されない）；頭部及び頚部のがん（扁平細胞癌を含むが、これに限定されない）；胃のがん（胃腺癌、胃腸間質腫瘍を含むが、これらに限定されない）；多発性骨髄腫；精巣がん；胚細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍；子宮頚がん；胃腸、乳房及び他の臓器の癌；並びに印環細胞癌を含んでいてよいが、これらに限定されない。
【０１００】
間葉腫瘍は、肉腫、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周囲細胞腫、偽血管腫様増殖、筋線維芽腫、線維腫症、炎症性筋線維芽細胞腫、脂肪腫、血管細胞腫、顆粒細胞腫、神経線維腫、シュワン細胞腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫及び平滑筋肉腫を含んでいてよいが、これらに限定されない。
本開示を用いて治療することができる原発性又は続発性の特定の種類のがん又は悪性腫瘍は、皮膚がん、骨がん、脳のがん、咽頭、胆嚢、膵臓、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭部及び頚部、気管支のがん、基底細胞肉腫、潰瘍化及び乳頭状タイプの扁平細胞肉腫、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、島細胞腫、原発性脳腫瘍、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、有毛細胞腫、腺癌、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体型腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ  ｈａｂｉｔｕｓ  ｔｕｍｏｒ）、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｓｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、子宮頚部形成異常及び上皮内癌、神経芽腫、網膜芽腫、軟組織肉腫、悪性類癌腫、局所皮膚病変、キノコ状真菌症、横紋筋肉腫、カポシ肉腫、骨原性及び他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性一次性赤血球増加症、腺癌、多形性神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌並びに他の癌及び肉腫も含むが、これらに限定されない。
血液学的障害は、赤血球の異形成変化及び種々の白血病のような血液学的悪性腫瘍につながり得る血液細胞の異常増殖などである。血液学的障害の例は、急性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及び鎌状赤血球貧血を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人において起こる最も一般的な種類の急性白血病である。いくつかの遺伝性障害及び免疫不全状態は、ＡＭＬのリスクの増大に関連する。これらは、ブルーム症候群、ファンコニ貧血、リー−フラウメニキンドレド（ｋｉｎｄｒｅｄｓ）、失調性毛細血管拡張及びＸ連鎖無ガンマグロブリン血症などのランダム染色体切断をもたらすＤＮＡの安定性の欠如に伴う疾患を含む。
急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）は、ＡＭＬの別個なサブグループに相当する。このサブタイプは、１５；１７染色体転座を含む前骨髄芽球によって特徴づけられる。この転座は、レチノイン酸受容体及び配列ＰＭＬの融合転写の発生をもたらす。
急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）は、種々のサブタイプにより示される別個の臨床像を有する異質性疾患である。再発性細胞遺伝学的異常がＡＬＬにおいて示された。最も一般的な細胞遺伝学的異常は、９；２２転座である。結果として発生するフィラデルフィア染色体は、患者の不良な予後を示す。
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、多能性幹細胞のクローン性骨髄増殖性障害である。ＣＭＬは、フィラデルフィア染色体を生じさせる染色体９及び２２の転座を伴う特定の染色体異常により特徴づけられる。電離放射線はＣＭＬの発症を伴う。
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄系、赤血球系及び巨核球系における異形成性変化を含む、造血系の１つ又は複数の異形成性変化の存在のため、一つのグループにまとめられている異質性クローン性造血幹細胞障害である。これらの変化は、３系列の１つ又は複数における細胞減少をもたらす。ＭＤＳに罹患している患者は、一般的に貧血、好中球減少症（感染）又は血小板減少症（出血）に関連する合併症を発現する。一般的に、ＭＤＳ患者の約１０％〜約７０％が急性白血病を発現する。
【０１０２】
手術中の身体組織の傷害に起因する異常な細胞増殖の治療は、関節手術、腸手術及びケロイド瘢痕を含む様々な外科処置について可能である。線維性組織をもたらす疾患としては、気腫などがある。本開示を用いて治療することができる反復運動障害としては、手根管症候群などがある。本開示を用いて治療することができる細胞増殖性障害の例は、骨腫瘍である。
本開示を用いて治療することができる臓器移植に伴う増殖性反応としては、臓器拒絶反応又は関連合併症の一因である増殖性反応などがある。具体的には、これらの増殖性反応は、心臓、肺、肝臓、腎臓及び他の臓器又は器官系の移植中に起こる可能性がある。
本明細書で述べる医薬製剤は、病因の一部としてのコラーゲンの架橋又は線維症の亢進を有する種々の疾患の予防又は治療に用いることができる。例えば、組成物の適応は、線維症を含み得る。線維症は、損傷組織における創傷治癒過程の一部として起こり得る線維性組織の異常な蓄積である。そのような組織の損傷は、物理的損傷、炎症、感染、毒素への曝露及び他の原因に起因する可能性がある。線維症の例としては、皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症（例えば、珪肺症、石綿症）、腎線維症（糖尿病性腎症を含む）、糸球体硬化症などがある。他の例は、気腫及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；多発性硬化症；慢性喘息；アテローム性動脈硬化症；慢性関節リウマチ；緑内障；年齢関連性黄斑変性（湿性ＡＭＤ及び乾性ＡＭＤ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
心血管線維症
例えば、うっ血性心疾患、心筋症、心筋梗塞後の心機能欠陥、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、アテローム性動脈硬化症、再狭窄（例えば、冠動脈、頚動脈及び脳血管病変）及び心虚血性事象に関連する心疾患などの心血管疾患に関連する心血管又は心線維症の治療又は予防のための組成物、方法、システム、医療機器及びキットをここに提供する。
特定のリシルオキシダーゼの発現は、炎症反応及び心筋梗塞後の創傷治癒の種々の段階に関連する可能性がある。下流線維症反応に関連する特定のリシルオキシダーゼを特異的に阻害することにより、ＭＩ直後の修復／治癒過程が起こることを可能になると同時に、心リモデリング及び創傷治癒の有害な結果を避けることができる。
ＭＩ後治癒反応は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの発現を誘発し得るが、この過程が抑制されずに続く場合、過剰な架橋が、心不全をもたらす細胞外マトリックスのリモデリング又は線維症をもたらす。マトリックス及び架橋コラーゲン又はエラスチンを分解する酵素は、より遅く又はより低効率で機能し、架橋事象のほうが優勢であるように思われる。ＬＯＸ／ＬＯＸＬも上皮間葉移行（ＥＭＴ）において役割を果たすので、これが、マトリックス・リモデリングに加えて、心筋細胞リモデリング及び心筋細胞肥大にさらに寄与する。
ＭＩにより誘発された初期の修復可能な線維症は、助けとなる可能性があり（例えば、動脈瘤及び関連損傷を防ぐ）、妨害を受けずに進行させることができる。しかし、特定の理論又は作用機序に束縛されることを望まないが、発明者らは、この修復可能な線維症の段階の後に開始する抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ治療は心不全をもたらす反応性（不適応（ｍａｌ−ａｄａｐｔｉｖｅ））線維症を減弱させることができると考えている。例えば、抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ治療は、ＭＩから２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１６、２０、２２、２４、３６、４８時間又はそれを超える時間数後に開始することができる（間のすべての整数及び時間を含む）。さらに、抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ治療は、ＭＩから２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれを超える日数後に開始することができる。同様に、血圧の上昇（高血圧）は心臓組織におけるコラーゲンの沈着の増加及びタンパク質の分解の減少をもたらす（Ｂｅｒｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻（３号）、５６８〜５７５頁（２００７年））。高血圧性心疾患又は高血圧の診断及び／又は確定の後に開始した抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ治療は、高血圧に関連する線維症を予防し、減少させ、又は改善することができる。そのような抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ治療は、高血圧又は全身血圧の増加が診断又は検出されてから２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日又はそれを超える日数後に開始する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーを用いて、架橋の不適切なレベルが発生したときを判断することができ、ＬＯＸレベルは、一般的に用いられるバイオマーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）と相関することが示されており、ＣＲＰレベルが適切な正常レベル以上に上昇したときに、治療を開始することができる。より直接的に、尿又は血液中の架橋コラーゲンテロペプチドの放出を測定するための方法及び検査キットが存在する。これらのコラーゲンフラグメントのレベルの上昇は、修復可能な線維症の反応性（不適応）線維症への移行を示している可能性がある。さらに、心室の効率のよい収縮に関連するものを含む、心機能及び拍出量の測定を行うことができる。
いくつかの実施形態において、限られた治療期間が想定される。心不全を予防又は少なくするために、治療は、一般的に反応性線維症を予防又は減少させるのに十分に長く持続すべきである。例えば、より短い治療期間を望む場合、短い寿命のＦａｂ抗体フラグメントを用いる。或いは、血清中半減期がより長い全長抗体を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週又はそれを超える週（間のすべての日を含む）にわたる限られた投与で用いることができる。心機能の標準的試験を、上述の関連するバイオマーカーとともに用いて経過をモニターし、必要に応じて投与を調節することができる。限られた治療期間がこのアプローチの安全性に加わる。
本明細書で述べる組成物の投与の適応は、心血管適応外に認められる線維症も含む。線維症は、損傷組織における創傷治癒プロセスの一部として起こり得る線維性組織の異常な蓄積である。そのような組織の損傷は、物理的傷害、炎症、感染、毒素への曝露並びに他の原因に起因する可能性がある。線維症の例としては、皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症（例えば、珪肺症、石綿症）及び腎線維症（糖尿病性腎症及び糸球体硬化症を含む）などがある。さらに、線維症及びコラーゲンの沈着は、β−アミロイドプラークの形成に関連づけられ、したがって、アルツハイマー病の発現及び進行の一因である。本明細書で述べる組成物は、以下の線維症状態の治療、予防及び／又は改善のためにも考慮される。
【０１０５】
皮膚瘢痕及びケロイド形成
皮膚瘢痕及びケロイド形成は、過剰なコラーゲン沈着及び／又はコラーゲン沈着の調節不良に関係することが知られている。損傷皮膚組織の正常な線維芽細胞リモデリングからのこの逸脱は、肥厚及び目ざわりな瘢痕形成をもたらし得る。ケロイドは、一部は、創傷治癒の調節不良とその後のコラーゲン沈着の増加の結果であることが知られている。ケロイドは、通常の創傷治癒で認められる瘢痕と異なり、時間の経過とともに消失又は退行しない。ケロイドは、一般的に良性皮膚腫瘍であるが、目ざわりであり、蓄積して、より問題のある皮膚の変形及び／又は病変になることがあり得る（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  Ｉら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｉｍｐｒｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｋｅｌｏｉｄｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４９巻（５号）、１４４１〜１４４７頁（１９９６年））。皮膚におけるコラーゲンの蓄積は、一般的要素が線維芽細胞による皮膚組織におけるコラーゲンの過剰産生又は調節不良である、皮膚組織の肥厚又は硬化の多くの状態の一般的用語である強皮症にも関連づけられている（Ａｋａｇｉ  Ａ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ＸＶＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｖｒｏｂｌａｓｔｓ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｉｂｒｏｔｉｃ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１３巻、２４６〜２５０頁（１９９９年）。強皮症及びケロイド形成のような線維性皮膚疾患におけるコラーゲンの沈着の中心的役割を考慮すると、本明細書で述べる組成物は、強皮症及びケロイド形成を含むが、これらに限定されない線維性皮膚疾患の予防、治療及び／又は改善に有用である。
【０１０６】
肝線維症
肝臓の線維症は、多くの肝臓疾患の病理に関連づけられる。前述のように、線維症は、青銅色糖尿病、ウィルソン病、アルコール中毒、住血吸虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞、毒素への曝露及び代謝障害の合併症として起こる。抑制しないまま放置すれば、肝線維症は、肝硬変（被包性結節の存在により定義される）、肝不全及び死亡に進行する。
肝硬変並びに慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎などの関連状態を含むが、これらに限定されない、肝線維症は、本明細書で開示する組成物及び方法により治療することができる。
寄生虫及びウイルス感染（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、住血吸虫症）のような原因による肝臓の慢性傷害又はアルコールの摂取による長期のストレスは、おそらく損傷した部分を封じ込め、残りの肝臓組織を損傷から保護するために肝臓のリモデリングをもたらす（Ｌｉ及びＦｒｉｅｄｍａｎ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、１４巻、６１８〜６３３頁、１９９９年）。肝線維症は、肝細胞、肝星状細胞及び内皮細胞の代謝及び合成機能を障害する、総コラーゲンの３〜１０倍の増加及び高密度マトリックスによる低密度基底膜の置換を含む細胞外マトリックスの変化をもたらす（Ｇｉｒｏｇｅｓｃｕ  Ｍ．、Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．、１５巻（２号）、１４９〜１５９頁（２００６年））。したがって、本明細書で述べる組成物は、線維性肝疾患の予防、治療及び／又は改善に有用であり、そのような使用をここで考慮する。
【０１０７】
腎線維症
肝線維症と同様に、腎線維症は、腎臓の種々の疾患及び傷害に起因し得る。そのような疾患及び傷害の例としては、慢性腎疾患、代謝症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糖尿病（糖尿病性腎症を含む）、局所分節性糸球体腎炎及び膜性糸球体腎炎、膜性増殖性ＧＮを含むが、これらに限定されない結果として生ずる糸球体腎炎（ＧＮ）などがある。
代謝症候群は、インスリン抵抗性のような糖尿病の顕著な特徴、並びに中心性又は内臓肥満及び高血圧を含む異常のクラスターであることがわかった。ほぼすべての症例において、ブドウ糖の調節不良は、サイトカイン放出の刺激及び細胞外マトリックスの沈着のアップレギュレーションをもたらす。慢性腎疾患、糖尿病、代謝症候群及び糸球体腎炎に寄与する追加の因子は、すべてが腎臓のさらなる損傷をもたらし、細胞外マトリックスの沈着をさらに刺激する、高脂血症、高血圧及び蛋白尿などである。したがって、主要な原因にかかわりなく、腎臓の傷害は、腎線維症と腎機能の同時の喪失をもたらす可能性がある（Ｓｃｈｅｎａ  Ｆ．及びＧｅｓｕａｌｄｏ  Ｌ．、Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１６巻、Ｓ３０〜３３頁（２００５年）、Ｗｈａｌｅｙ−Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ａ．及びＳｏｗｅｒ  Ｊ．Ｒ．、Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｙｐｅｒｔ．、８巻（８号）、５４６〜４８頁（２００６年））。したがって、本明細書で述べる組成物は、線維性腎疾患（慢性腎疾患、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、代謝症候群）の予防、治療及び／又は改善に有用であり、そのような使用をここで考慮する。
【０１０８】
肺線維症
肺の線維症は、多くの症候群及び疾患を含む。具体例としての疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性間質性肺炎及び急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）などである。肺線維症は、特発性線維化肺胞炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、及びび漫性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）も含むが、これらに限定されない。
上述の疾患を含む大部分の肺線維症の病因は、十分に理解されていないが、すべてが炎症細胞の流入並びにその後のコラーゲンに富む細胞外マトリックスの合成及び沈着の増加によって特徴づけられる（Ｃｈｕａら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３巻、９〜１３頁（２００５年）、Ｔｚｏｒｔｚａｋｉら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、５４巻（６号）、６９３〜７００頁（２００６年）、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１６０巻、１９１０〜１９１５頁（１９９９年）。肺線維症におけるコラーゲン及び細胞外マトリックスの沈着の増加の確認された役割を考慮すると、本明細書で述べる組成物は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害による肺線維症の予防、治療及び／又は改善に有用である。
【０１０９】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は、アミロイドβプラークの蓄積に起因するニューロンの喪失によって特徴づけられる進行性の神経変性障害であり、リシルオキシダーゼ活性もアルツハイマー病において増加することが知られている（Ｇｉｌａｄら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、３７６巻（３号）、２１０〜１３頁（２００５年））。アミロイドβは、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性の標的である複数のリシン残基を含み、したがって、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの阻害は、アルツハイマー病におけるアミロイドプラークの蓄積を治療し、予防し、又は改善することができる。アミロイドβプラークは、さらなるタンパク質からなることも知られている。アミロイドβプラークの形成及び含量に寄与しているそのような１つのタンパク質は、ＣＬＡＣ−Ｐと呼ばれるコラーゲンタンパク質である。ＣＬＡＣ−Ｐは、コラーゲンＸＩＩＩ型と構造が類似しているが、ニューロンに分布している。ＣＬＡＣ−Ｐは、アミロイドβと結合し、アミロイドβプラークの形成に寄与している（Ｓｏｅｄｅｒｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０巻（２号）、１００７〜１０１５頁（２００５年））。したがって、本明細書で述べる組成物は、アミロイドβプラークの形成の予防、並びにアミロイドβプラークの存続の減少を含むが、これらに限定されない、アルツハイマー病の予防、治療及び／又は改善に有用である。
【０１１０】
明細書で述べる方法及び組成物を用いることによって治療又は予防することができる異常な血管新生は、慢性関節リウマチ、虚血性再潅流関連脳浮腫及び損傷、皮質虚血、卵巣過形成及び血管過多、（多嚢胞性卵巣症候群）、子宮内膜症、乾癬、糖尿病性網膜症並びに未熟児網膜症（水晶体後線維増殖症）、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障（ｎｅｕｒｏｓｃｕｌａｒ  ｇａｌｕｃｏｍａ）及びオスター−ウェバー症候群などの他の眼血管新生疾患を伴う異常な血管新生などである。
異常な血管新生に関連する疾患は、血管の増殖を必要又は誘発する。例えば、角膜血管新生は、前血管潜伏期、活動性新生血管形成、並びに血管成熟及び退行の３段階を含む。白血球、血小板、サイトカイン、及びエイコサノイド又は未同定の血漿成分などの炎症反応の要素を含む、種々の血管形成の同一性及びメカニズムは、明らかにしなければならない。
【０１１１】
他の実施形態において、本開示の製剤は、望まない又は異常な血管新生に関連する疾患を治療するのに用いることができる。方法は、望まない又は異常な血管新生に罹患している患者にＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤でない抗腫瘍薬又は血管新生阻害薬と併用してＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を投与する段階を含む。血管新生及び／又は血管形成疾患を抑制するのに必要なこれらの薬剤の個々の用量は、状態の重症度、投与経路及び担当医が決定することができる他の関連因子に依存する可能性がある。一般的に、許容される有効１日投与量は、血管新生及び／又は血管形成疾患を効果的に抑制するのに十分な量である。
この実施形態によれば、本開示の製剤は、網膜／脈絡膜新生血管形成及び角膜新生血管形成などの望ましくない血管新生に関連する様々な疾患を治療するのに用いることができる。網膜／脈絡膜新生血管形成の例は、ベスト病、近視、視神経小窩、シュタルガルト病、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、偽黄色腫弾性頚動脈閉塞性疾患、慢性ぶどう膜炎／ヴィトリティス、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、糖尿病性網膜症、黄斑変性、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷及びレーザー後合併症、ルベシス（隅角の新生血管形成）及び増殖性硝子体網膜症のすべての形を含む、線維性血管又は線維性組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患を含むが、これらに限定されない。角膜新生血管形成の例は、表皮角膜結膜炎、ビタミンＡ欠乏、コンタクトレンズ装用過多、アトピー角膜炎、上輪部角結膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶反応、モーレン潰瘍、テリエンス辺縁変性、角膜辺縁溶解、多発動脈炎、ウェゲナー類肉腫症、強膜炎、ペリフィゴイド（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ）放射状角膜切開、血管新生緑内障及び水晶体後線維増殖症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原性動物感染及びカポシ肉腫を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
他の実施形態において、本開示の製剤は、異常な血管新生に関連する慢性炎症性疾患を治療するのに用いることができる。方法は、異常な血管新生に関連する慢性炎症性疾患に罹患している患者にＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤でない抗腫瘍薬又は血管新生阻害薬と併用してＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を投与する段階を含む。慢性炎症は、炎症細胞の流入を維持するための毛細血管芽の持続的形成に依存する。炎症細胞の流入及び存在は、肉芽腫を生じさせ、それにより、慢性炎症状態を維持する。本開示の製剤を用いた血管新生の阻害により、肉芽腫の形成を妨げることができ、それにより、疾患を緩和することができる。慢性炎症性疾患の例は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、類肉腫症及び慢性関節リウマチを含むが、これらに限定されない。
クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は、胃腸管の種々の部位における慢性炎症及び血管新生によって特徴づけられる。例えば、クローン病は、遠位回腸及び結腸を最も一般的に罹患させる慢性貫壁性炎症性疾患として発生するが、口から肛門及び肛門周囲部までの胃腸管のあらゆる部位においても発生する可能性がある。クローン病を有する患者は、一般的に腹痛を伴う慢性下痢、発熱、食欲不振、体重減少及び腹部腫脹を有する。潰瘍性大腸炎も大腸粘膜に発生する慢性、非特異性の炎症性及び潰瘍性疾患であり、血性下痢によって特徴づけられる。これらの炎症性腸疾患は、一般的に胃腸管全域の慢性肉芽腫性炎症によって引き起こされ、炎症細胞の円筒によって囲まれている新たな毛細管芽に関係する。本開示の製剤による血管新生の阻害により、芽の形成が抑制され、肉芽腫の形成が妨げられる。炎症性腸疾患は、皮膚病変などの腸以外での発現も示す。そのような病変は、炎症及び血管新生によって特徴づけられ、胃腸管以外の多くの部位に発生し得る。本開示の製剤による血管新生の阻害により、炎症細胞の流入が減少し、病変形成が妨げられるはずである。
【０１１３】
他の慢性炎症性疾患である、類肉腫は、マルチシステム肉芽腫性障害として特徴づけられる。この疾患の肉芽腫は、身体の任意の場所で形成される可能性があり、したがって、症状は、肉芽腫の部位及び疾患が活動性であるかどうかに依存する。肉芽腫は、炎症細胞を絶え間なく供給する血管形成毛細管芽によって形成される。血管新生を阻害するために本開示の製剤を用いることにより、そのような肉芽腫形成を抑制することができる。慢性及び再発性炎症性疾患でもある、乾癬は、種々のサイズの丘疹及びプラークによって特徴づけられる。本開示の製剤を用いる治療により、特徴的な病変を維持するのに必要な新たな血管の形成が妨げられ、症状の除去が患者にもたらされるはずである。
慢性関節リウマチ（ＲＡ）も末梢関節の非特異的炎症によって特徴づけられる慢性炎症性疾患である。関節の滑膜ライニングにおける血管が血管新生を受けると考えられている。新たな血管ネットワークが形成されることに加えて、内皮細胞が、パンヌスの成長と軟骨の破壊をもたらす因子と活性酸素種を放出する。血管新生に関与する因子は、慢性関節リウマチの慢性的な炎症状態に能動的に寄与し、維持する助けとなっている可能性がある。本開示の製剤を単独で用いる、又は他の抗ＲＡ薬と併用する治療により、慢性炎症の維持するのに必要な新たな血管の形成が妨げられ、症状の除去がＲＡ患者にもたらされる。
【０１１４】
８．疾患の診断
本開示はまた、種々の形のＬＯＸ又はＬＯＸＬを認識する物質を用いることにより、上述の疾患を診断し、モニターし、その病期を判定し、又は検出する方法を提供する。例えば、上述のように、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの種々の形、すなわち、プレプロタンパク質、分泌、成熟形に対する抗体をこれらの目的のために用いることができる。
上述のように、成熟ＬＯＸ又はＬＯＸＬを切断し、その分子量の変化（イムノブロット）により、又はＬＯＸ／ＬＯＸＬの非切断対切断形を検出する抗体、並びに免疫組織化学（ＩＨＣ）などの種々の検出方法を用いることによる細胞局在化を用いることにより検出することができる。
細胞外マトリックス及びならし培地（例えば、実施例４参照）は、タンパク質分解により処理したＬＯＸ又はＬＯＸＬを含むべきであり、一方、非切断ＬＯＸ／ＬＯＸＬは細胞内に局在化すべきであると考えられている。一部の切断ＬＯＸ／ＬＯＸＬは、細胞外空隙からの取込みの結果として細胞内でも検出することができる。
個人からの試料を収集し、不活性若しくは活性ＬＯＸレベル又は異なる形のＬＯＸ／ＬＯＸＬレベルを測定することにより分析することができる。この分析は、高い活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬ発現又は活性を有する腫瘍を特定するために、リシルオキシダーゼ特異的療法を用いた治療の開始の前に実施することができる。そのような診断分析は、細胞、タンパク質若しくは細胞の膜抽出物、痰、血液、血清、血漿、若しくは尿などの生物学的液、又は組織試料、ホルマリン固定若しくは凍結組織切片などの生物学的試料を含むが、これらに限定されない試料を用いて実施することができる。
【０１１５】
不活性及び／又は活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬの検出及び分析の適切な方法を用いることができる。本明細書で用いているように、「試料」という用語は、ヒト、動物からの試料、又は研究試料、例えば、細胞、組織、臓器、液、ガス、エアゾール、スラリー、コロイド、若しくは凝固物質を意味する。試料は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、ヒト若しくは動物から除去せずに試験することができ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。試料は、例えば、組織学的方法により処理した後に試験することができる。「試料」という用語は、ヒト若しくは動物から新たに採取した細胞、組織、臓器若しくは液、又は処理若しくは保存した細胞、組織、臓器若しくは液を意味する。
１つの実施形態において、血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、それにより、参照試料と比較した血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍の成長の存在を示す、対象におけるがんの転移を診断する方法を提供する。いくつかの例において、血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性は、以前に測定したときより低いことがあり、これは、対象ががんの転移のリスクがより大きいこと、がんが転移したこと、或いはがんの転移が増加したことを示すものである。
他の実施形態において、腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、それにより、参照試料と比較した腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍の成長の存在を示す、腫瘍を有する対象におけるがんの転移を診断する方法を提供する。いくつかの例において、腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性は、以前に測定したときより高いことがあり、これは、対象ががんの転移のリスクがより大きいこと、がんが転移したこと、或いはがんの転移が増加したことを示している可能性がある。
【０１１６】
参照試料は、同じ対象由来で、異なる時点に同じ腫瘍から若しくは身体の他の部位から、又は他の個人から採取してよい。
活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルの測定は、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬタンパク質の存在を、該タンパク質に対する抗体、例えば、活性又は分泌ＬＯＸ又はＬＯＸＬに特異的に結合する抗体により検出する、免疫学的検定の形をとってよい。
免疫検定は、レーザー誘導蛍光とともに用いることもできる（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｎａｓｈａｂｅｈ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１８巻、２１８４〜９３頁（１９９７年）、Ｂａｏ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、６９９巻、４６３〜８０頁（１９９７年）を参照）。（フローインジェクションリポソーム免疫検定法及びリポソーム免疫センサーなどのリポソーム免疫検定法（Ｒｏｎｇｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４巻、１０５〜１３３頁（１９９７年）も本開示の方法に従って活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルを測定するために用いることができる。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡｓ）などの免疫検定法は、ここに提供する方法に有用である。放射免疫検定法も試料が活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬについて陽性であるかどうかを判断するのに、又は活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルを測定するのに有用であり得る。例えば、ヨウ素１２５標識二次抗体を用いる放射免疫検定法を用いることができる。
【０１１７】
さらに、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性を測定し、それにより、不活性酵素の量を無視することができる。活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬの酵素活性は、標識リシンを基質とした可溶性エラスチン又は可溶性コラーゲンを用いて多くの方法で測定することができる。活性検定の詳細は、Ｒｏｙｃｅら、「Ｃｏｐｐｅｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍｏｔｔｌｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｌｙｓｙｌ  ｏｃｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒｉｎｄｅｄ  （Ｍｏｂｒ）  ｍｉｃｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１９８２年２月１５日、２０２巻（２号）、３６９〜３７１頁に示されている。色素原検定を用いることができる。１つは、Ｐａｌａｍａｋｕｍｂｕｒａら、「Ａ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２年１月１５日、３００巻（２号）、２４５〜５１頁に記載されている。
がん、腫瘍及び線維症の治療などのＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターを含む療法に対する対象の反応をモニタリングする方法もここに提供する。該方法は、対象にＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターを投与した後の対象におけるＣ反応性タンパク質又は他の急性期反応物のレベルの変化を検出する段階を含み、変化が、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターが対象に対する治療効果を有することを示す。Ｃ反応性タンパク質は、全身性炎症の重要な薬力学的マーカーである。さらに、Ｃ反応性タンパク質は、ＬＯＸの発現を増大させると考えられる（Ｌｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２００４年）、９５〜８７７頁）。したがって、理論に束縛されることなく、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤の投与前と比べた（例えば、対象の血液試料中の）Ｃ反応性タンパク質のレベルの低下は、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を用いた療法に対する対象の反応を示唆し得る。方法は、対象の療法に対する反応を示す、Ｃ反応性タンパク質のレベルの増加又は低下をモニタリングする段階を含む。
【０１１８】
他の実施形態において、がん、腫瘍及び線維症の治療などのＬＯＸ／ＬＯＸＬのモジュレーターを含む療法に対する対象の反応をモニタリングする方法を提供する。該方法は、対象にＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターを投与した後の対象におけるコラーゲンテロペプチド又はヒドロキシプロリン含量のレベルの変化を検出する段階を含み、変化が、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターが対象に対する治療効果を有することを示す。変化は、増加又は減少であってよい。例えば、コラーゲンテロペプチド又はヒドロキシプロリン含量の減少は、治療効果を示唆し得る。
本開示の具体例としての実施形態を述べ、示したが、本明細書で述べたように、本開示の多くの変更、修正又は改変を行うことができ、そのいずれも本開示の精神から逸脱しないことは、当業者には明らかであろう。したがって、そのようなすべての変更、修正又は改変は、本開示の範囲内にあるとみなすべきである。以下の実施例は、本開示を例示するものであり、限定するものでない。
【実施例１】
【０１１９】
ＥＭＴ／ＭＥＴ検定
細胞がＥＭＴ又はＭＥＴ状態であるかどうかを検出するために、Ｅ−カドヘリン、ビメンチン、フィブロネクチン及びファロイジンなどの上皮又は間葉の細胞タンパク質マーカーに特異的な抗体で染色して、Ｆ−アクチンを検出する（図４）。
ローダミンファロイジン染色プロトコール：
細胞を染色の当日の２４時間前に播種した。細胞は、８チャンバー・スライドにおいて２４時間後に約８０％集密であるべきである。翌日、培地を吸引し、チャンバーを１ＸＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で２０分間固定し、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。透過化のために、細胞をＰＢＳ中０．５％サポニン（ＪＴＢａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）で室温で５分間処理した。チャンバーを１ＸＰＢＳで１回注意深く洗浄し、ＰＢＳ中１：１００の希釈度のローダミンファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）を細胞に加え、室温で１５分間インキュベートした。チャンバーを１ＸＰＢＳで２回洗浄し、スライドをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ）でマウントした。
Ｅ−カドヘリン染色プロトコール：
細胞を染色の当日の２４時間前に播種した。細胞は、８チャンバー・スライドにおいて翌日に約８０％集密であるべきである。翌日、培地を吸引し、チャンバーを１ＸＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を氷冷メタノールで固定し、−２０℃で２分間インキュベートした。細胞を１ＸＰＢＸで１回洗浄し、１μｇ／ｍｌのＥ−カドヘリンＡｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）をスライド・チャンバーに加えた。次いで、スライドを３７℃で１時間インキュべートした。チャンバーを１ＸＰＢＳで１回注意深く洗浄した後、二次抗体Ａｂ（抗マウスＩｇＧｃｙ３複合体、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ）を加え、室温で３０〜４５分間インキュベートした。チャンバーを１ＸＰＢＳで２回洗浄し、スライドをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ）でマウントした。
【実施例２】
【０１２０】
有意なレベルのＬＯＸ／ＬＯＸＬを内因的に発現する細胞におけるＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤の検定
ＢＴ−５４９、Ｈｓ５７８８ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１又はＮＣＩ−Ｈ２２６細胞は、有意なレベルのＬＯＸ／ＬＯＸＬを発現し、ＥＭＴ又はＥＭＴ様状態にある。細胞を８ウエル・チャンバー・ガラス・スライド（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）上に約２５〜５０％集密で播種した。細胞を低酸素（２％酸素）、無酸素（０．０２％酸素）又は酸素正常（２１％酸素）条件下で１８時間インキュベートした。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤（例えば、抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体、ＬＯＸ／ＬＯＸＬｓｉＲＮＡ、ＬＯＸ／ＬＯＸＬｓｈＲＮＡ、βＡＰＮ又はＤ−ペニシラミンなどの小分子阻害剤）及び対照（例えば、ＬＯＸ／ＬＯＸＬセンスオリゴヌクレオチド、関連のない対照抗体、ＤＭＳＯなどの小分子溶媒）を細胞培養培地に加えた。ＬＯＸ／ＬＯＸＬレベルをＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロット分析により測定する。
４８〜７２時間後に、細胞を実施例１に従って染色した。ＬＯＸ／ＬＯＸＬセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞は、低レベルのＥ−カドヘリン染色による陽性ビメンチン又はフィブロネクチン染色、並びにＦ−アクチンのファロイジン染色により示される伸長及びリモデリングされたアクチン細胞骨格のＥＭＴ特性を維持すべきである。ＥＭＴ細胞のＭＥＴ誘導をもたらすために、ＬＯＸ／ＬＯＸＬを効率よく標的にしない候補ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤で処理した細胞もこれらのＥＭＴ特性を維持すべきである。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤で処理した細胞は、ＥＭＴ特性を減少させ、Ｅ−カドヘリン染色の増加並びに低い又は無視できるビメクチン又はフィブロネクチン染色というＭＥＴの特性を発現する。これらの細胞のローダミン−ファロイジン染色で、よりコンパクトで、規則的なアクチン細胞骨格が示される。
浸潤性及び移動能力の増大はＥＭＴに関連するので、浸潤／移動アッセイも用いて細胞のＥＭＴ及びＭＥＴ表現型を評価する（例えば、Ｂｅｄｏｇｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６４巻、２５５２〜２５６０頁（２００４年）を参照）。細胞を２４時間血清枯渇させ、次いで、１０４〜１０６細胞を被覆及び非被覆インサート（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）被覆インサート）上に３つの複製試料として播種し、酸素正常又は酸素枯渇条件下で２４時間インキュベートする（例えば、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ発現は図３３に示すように酸素正常／低酸素条件下で異なりえる）。ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤及び対照による処理を実験中継続する。
ＥＭＴ状態を維持する細胞は、浸潤性かつ移動性であり、ＭＥＴ細胞と比較して容易に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）被覆インサートに浸潤、又は他の表面修飾インサートを渡って移動することができる。創傷治癒又はひっかき傷試験を用いて同様な分析を行う。ひっかき傷は、細胞の集密ローンにピペットの先端を用いて造る。ひっかき傷を顕微鏡を用いて２４〜９６時間にわたってモニターする。浸潤性及び移動性がより大きいＥＭＴの状態にある細胞は、浸潤性及び移動性がより小さい細胞よりひっかき傷を速やかに満たすはずである。
ＥＭＴを減少し、ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤をさらなる開発の候補として選択する。
図２６Ａ及びＢに示すように、細胞浸潤及び移動を阻害するｍＡｂｓのスクリーニングを実施した。スクリーニングした最終Ｐｅｐ２上清を精製し、濃縮した（ＭＯ６３〜ＭＯ８２、それぞれについて５０ｎｇ及び２００ｎｇ）。ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞を２４時間血清枯渇させ、血清不含有培地中で２００００細胞／ウエルで播種した。細胞を５０ｎｇ及び２００ｎｇの抗体血清の３複製セットで処理し、４８時間インキュベートした。浸潤性細胞をカルセインＡＭで死亡させ、９６ウエル蛍光リーダー（４８５ｎｍ励起、５２０発光）で蛍光を測定した。
【実施例３】
【０１２１】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬをトランスフェクトした細胞のＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤の検定
ＭＤＣＫ、ＭＣＦ−７又はＳＷ６２０細胞は、有意なレベルのＬＯＸ／ＬＯＸＬを発現せず、ＥＭＴ状態にない。細胞にＬＯＸ／ＬＯＸＬを発現するプラスミドをトランスフェクトして、細胞にＥＭＴを誘導する（例えば図６を参照）。トランスフェクトした細胞を酸素正常（２１％酸素）、低酸素（２％酸素）、又は無酸素（０．０２％酸素）条件下で１８時間インキュベートする。ＬＯＸ／ＬＯＸＬレベルの発現をＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロットにより測定する。
トランスフェクトした細胞をＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤及び対照で処理し、実施例２に記載したようにＭＥＴ／ＥＭＴ状態を測定する。処理細胞のＬＯＸ／ＬＯＸＬレベルの発現をＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロット分析により測定する。
有効なＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤は、トランスフェクト細胞のＥＭＴ状態を妨げ、又はＭＥＴを誘導すべきである（図７）。ＬＯＸ／ＬＯＸＬセンスで処理したトランスフェクト細胞は、処理しない、又は関連性のない対照抗体のような対照で処理したトランスフェクト細胞と同様に、ＥＭＴ状態にあるべきである。処理トランスフェクト細胞のＥＭＴ／ＭＥＴ状態は、実施例１で述べたように分析する。細胞は、実施例２で述べたように浸潤及び／又は移動アッセイも用いて分析することができる。
ＥＭＴを減少させ、ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤をさらなる開発の候補として選択する。
【実施例４】
【０１２２】
ならし培地（ＣＭ）で処理した細胞のＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤の検定
ＣＨＯ細胞からのＣＭの調製
ＣＨＯ−Ｌｏｘｌ２細胞を容量２５ｍｌの培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、完全）を含むＴ１７５フラスコ中に播種した。４８時間後に、培地を２０ｍｌのＳＦＭＩＩ培地と交換した（細胞はこの時点に９０〜９５％集密）。培地を７２時間後に収集し、０．２２ｕＭポリエチレン・フィルターでろ過した。ろ過した培地をアミコン（１５ｋＤカットオフ）濃縮装置を用いて２０〜２５倍に濃縮した。２０ｍｌの培地の９〜１０フラスコを準備して、実験用の８ｍｌのならし培地を調製した。
ＣＭによる細胞の処理
ＭＣＦ−７細胞を、ＣＭで処理する１日前に８チャンバー・スライドのウエル当たり５００００細胞で播種した。細胞を完全培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、１ＸＬ−グルタミン）とともに播種した。Ｃｈｏ−Ｌｏｘｌ２細胞からの５００μｌの新鮮なならし培地をＭＣＦ−７細胞を含むチャンバーに加えた。細胞をＣＭとともに４８時間インキュベートした。ＭＣＦ７野生型細胞からのならし培地を陰性対照として用いた。ＣＭとともに４８時間インキュベートした後に細胞をローダミンファロイジンで染色した（図８）。
【実施例５】
【０１２３】
ならし培地（ＣＭ）で処理した細胞の抗ＬＯＸＬ２ｍＡｂブロッキング検定
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図９、１０、１２）又はＨｓ５７８ｔ細胞（図１１）をＴ７５フラスコ中に８０％集密で播種し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１ＸＬ−グルタミン中で培養した。これらの細胞を７２時間増殖させ、実験に用いるＣＭを得た。７２時間後に、ＣＭを短時間遠心分離して、死細胞及びデブリを除去し、８チャンバー・スライドのウエル当たり５００００細胞で以前に播種したＭＣＦ−７細胞（図１０、１１）又はＳＷ６２０細胞（図１２）上にのせた。ならし培地とともに４８時間インキュベートした後にＥＭＴ様表現型の変化が一般的に認められた。ＭＣＦ−７又はＳＷ６２０ＣＭを陰性対照として用いた。表皮間葉移行（ＥＭＴ）で起こる表現型の変化を阻害する抗ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓのブロッキング能力を実証するために、２つの独立した実験を実施した。
実験１：「プレインキュベーション」
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＨｓ５７８ｔ細胞からの１ｍｌのＣＭ（遠心分離して細胞デブリを除去した）を、ＭＣＦ７又はＳＷ６２０細胞に加える前に２μｇ又は４μｇ（最終濃度）の抗ｌｏｘｌ２とともに１時間及び３０分間プレインキュベートした。抗アクチンを陰性ｍＡｂ対照として用いた（図１０Ｅ）。次いで、ならし培地をＭＣＦ７又はＳＷ６２０細胞に加え、３７℃で５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＭＣＦ７又はＳＷ６２０細胞のアクチン細胞骨格をローダミンファロイジンで染色して、ＥＭＴ表現型の変化のブロッキングを分析した（図９）。
実験２：「プレインキュベートせず」
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＨｓ５７８ｔ細胞をＴ２５フラスコ中に８０％集密で播種し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１ＸＬ−グルタミン中で培養した。抗Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓ（４μｇ最終濃度）をそれぞれ各フラスコに加え、フラスコを培地とともに７２時間インキュベートした。抗アクチンを陰性ｍＡｂ対照として用いた（図１０Ｅ）。ならし培地を遠心分離して、細胞デブリを除去し、次いで、ＭＣＦ７又はＳＷ６２０細胞に加え、３７℃で５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＭＣＦ７又はＳＷ６２０細胞のアクチン細胞骨格をローダミンファロイジンで染色して、ＥＭＴ表現型の変化のブロッキングを分析した（図１１、１２）。
【実施例６】
【０１２４】
トランスフェクト細胞からのＣＭで処理した細胞の抗ＬＯＸＬ２ｍＡｂブロッキング検定
ｈＬＯＸＬ２ＭＣＤ安定細胞株の産生
ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈＬＯＸ２ＭＣＤ（最小触媒ドメイン、アミノ酸ＴＡＰＤＬＶＬＮＡＥ．．．読み枠＋Ｍｙｃ＋Ｈｉｓタグの末端へ）をＨｅｋ２９３細胞にトランスフェクトし、個々のクローンをハイグロマイシンＢ選択下で選択した。発現を抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットにより評価した（図２２参照）。
ＳＷ６２０細胞におけるＥＭＴ試験用ならし培地の調製
ｈＬＯＸＬ２ＭＣＤＨｅｋ２９３安定細胞株＃７を、３０ｍｌのｃＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＢＳ、無Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ）中１２Ｅ６細胞又は６Ｅ６細胞を用いてＴ１７５フラスコ中で平板培養した。細胞を７２時間増殖させ、下で述べるＳＷＥ６２０／ＥＭＴ実験用にならし培地を収集した。対照として、Ｈｅｋ２９３細胞を同じ密度でプレートから除去し、同様に処理した。
安定Ｌｏｘｌ２−ＭＣＤからのならし培地及びＥＭＴの誘導
ＳＷ６２０細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１ＸＬ−グルタミンを含む８チャンバー・スライドにウエル当たり５００００細胞で播種した。ヒトＬｏｘｌ２−ＭＣＤを発現する細胞からのならし培地を上述のようにＳＷＥ６２０／ＥＭＴ検定に用いるために収集した。各チャンバーに、５００μｌのならし培地を各ウエルに加えた。２９３細胞からのならし培地を陰性対照として用いた。ＥＭＴ様表現型の変化が一般的に７２〜９６時間後に認められた。（図１３）
ヒトＬｏｘｌ２−ＳＲＣＲドメイン１〜２及び３〜４を発現する安定クローンからのＣＭは、７２〜９６時間後にＥＭＴ様表現型の変化を誘導しなかった。
【実施例７】
【０１２５】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤と化学療法薬の検定
ＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進する実施例２、３又は４で示したＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を用いて、ＢＴ−５４９、Ｈｓ５７８８ｔ、ＭＢＡ−ＭＤ２３１又はＮＣＩ−Ｈ２２６腫瘍細胞株を、或いはＬＯＸ／ＬＯＸＬを発現するようにトランスフェクトした、又はＬＯＸ／ＬＯＸＬを発現する細胞からのＣＭで処理したＭＣＦ−７又はＳＷ６２０などの細胞株を処理する。
アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、ゲムシチビン）、アントラサイクリン（例えば、ドクソルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド）、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル）、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エリロチニブ又はゲフィチニブ）又はドクリタキセル、アントラサイクリン、５−フルオウラシルなどの他の薬剤のような化学療法薬を細胞にＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤による処理と同時に、又はその後に加える。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤及び化学療法薬で処理した細胞を、化学療法薬のみで処理した細胞と細胞生存能及びアポトーシス検定を用いて比較する。細胞生存能は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定し、アポトーシスは、Ａｐｏ−ＯＮＥ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定する、プロトコールは、製造業者のマニュアルに記載されている。
３つの複製試料を用いた実験条件（化学療法薬の用量の範囲、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤の用量、用量の数、投与の時間）の各組についての用量反応曲線をプロットする。細胞浸潤及び移動を減少させる点についてＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤と化学療法薬との間に相乗作用が認められるかどうかを判断するために、浸潤及び移動検定も分析のために用いる。
化学療法薬と相乗作用するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤は、化学療法薬のみで処理した細胞と比較して、細胞生存能の低下、アポトーシス細胞の数の増加及び／又は浸潤若しくは移動能力の低下を示すはずである。
化学療法薬と相乗作用するＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤をさらなる開発のために候補薬として選択する。
【実施例８】
【０１２６】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤の薬物感受性検定
９６ウエルプレートにウエル当たり７５００細胞で播種し、２４時間後に培地を、様々な濃度のシスプラチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、エルロチニブ（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、パクリタキセル（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）、メトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、β−アミノプロピオニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又は２５０ｎｇ／ウエル抗体を含む培地と交換した。連続曝露の５日後に、培養を洗浄し、生細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って測定した。各薬剤濃度は、細胞株当たり３つの試料を設けた。（図３６、３７、３８）
ｓｉＲＮＡ薬物感受性試験のために、薬物曝露の２４時間前に、細胞に２０μＭ  ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又は非標的Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＲＮＡｉバリデート済みｏｌｉｇｏｓを製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）に従ってＤｈａｒｍａｆｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて一時的にトランスフェクトした。薬物曝露後のノックダウン・レベルを定量的ＰＣＲにより確認した。安定ｓｈＲＮＡ細胞株は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて得た。ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２のノックダウンを定量的ＰＣＲにより確認した（図３５）。
【実施例９】
【０１２７】
ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２に対する抗体
ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２タンパク質を認識する抗体は、表１に示すペプチドでマウスを免疫処置することにより産生させる。配列番号１及び８を用いて抗体を産生させる。抗体がＬＯＸの非切断、非活性形、成熟、活性形、又は非切断及び切断形の両方を特異的に認識するかどうかを判断するために、産生させた抗体をスクリーニングする。
配列番号２〜６のペプチドは、成熟ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２酵素に基づいている。表１から選択されるペプチドを用いてマウスを免疫処置する。ＢＡＬＢ／ｃマウスに１６０ｍｇの精製ペプチドを注射する。最初の注射のために、ペプチドをフロイントの完全アジュバントと混合し（１：１）、皮下注射する。後に注射は、アジュバントの非存在下で腹腔内注射する。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２に対する血清抗体は、全長又は活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２タンパク質をポリスチレン・プレートに結合させた酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。少なくとも２カ月間の期間にわたる少なくとも２回の免疫処置の後に、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２に対する高い力価の抗体を含む１匹のマウスの脾臓を摘出し、Ｐ３Ｕ１マウス形質細胞腫細胞株の細胞と融合させる。得られたクローンを、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２又は両方に結合するそれらの能力について、全長並びに活性形を用いてＥＬＩＳＡ検定法でスクリーニングする。
【０１２８】
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２に対する抗体の特異性（個別又は交差反応性）をＥＬＩＳＡにより測定する。ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２と反応性のハイブリドーマ産生抗体を分離し、サブクローンする。このハイブリドーマを組織培養培地中並びに腹水中で増殖させて、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２抗体の源とする。
欧州特許第０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載されているようなヒトモノクローナル抗体を得るために、上述のマウスモノクローナルを、その相補性決定領域（ＣＤＲ）のヒトモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体フラグメント中への置換により改変する。ヒト重及び軽鎖Ｉｇ可変領域ドメインのＣＤＲをマウス可変領域ドメインの代替ＣＤＲで置換する。これらの改変Ｉｇ可変領域は、その後、ヒトＩｇ定常領域と合わせて、置換マウスＣＤＲを除いて組成が完全にヒトである抗体を作製する。ＣＤＲ置換抗体はかなり少ない非ヒト成分を含むため、そのようなＣＤＲ置換抗体はキメラ抗体と比較してヒト免疫応答を誘発する可能性が低いと予想されよう。ＣＤＲ「グラフティング」によりモノクローナル抗体をヒト化する方法は、「レシェーピング（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」と呼ばれている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁（１９８８年））。
【０１２９】
マウスＬＯＸ又はＬＯＸＬ２抗体ＣＤＲ（Ｂｕｒｂｅｌｏら、Ｃｏｌｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．、６巻、１５３〜１６２頁（１９８６年）に記載されているようなマウスモノクローナル抗体からのＣＤＲのような）の移植は、遺伝子工学により達成され、マウス重及び軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントをクローニングし、次に、部位特異的突然変異誘発により、対応するヒトＶ領域に導入することによって、ＣＤＲ  ＤＮＡ配列を決定する。この方法の最終段階において、所望のイソタイプ（通常、ＣＨについてはガンマＩで、ＣＬについてはカッパ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを加え、ヒト化重及び軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞中で共発現させて、可溶性ヒト化抗体を生成させる。
これらのＣＤＲのヒト抗体への導入により、この抗体に元のマウス抗体の抗原結合特性が付与される。マウス抗体における６つのＣＤＲがＶ領域「フレームワーク」領域上に構造的にマウントされる。ＣＤＲグラフティングが成功する理由は、マウス抗体とヒト抗体とのフレームワーク領域が、ＣＤＲが相互交換できるようなＣＤＲＳの類似した結合点を有する非常に類似した３Ｄ構造を有する可能性があることである。そのようなヒト化抗体相同物は、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、１００２９頁（１９８９年）及びＯｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、３８３３頁（１９８９年）に例示されているように調製することができる。
それにもかかわらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸は、ＣＤＲと相互作用して、全般的な抗原結合親和力に影響を及ぼすと考えられる。ヒトＶ領域フレームワークを修飾せずにマウス抗体のＣＤＲを直接導入して、ヒト化抗体を調製することにより、結合親和力が部分的又は完全に失われることが多い。したがって、結合活性を得るために、アクセプタ抗体のフレームワーク領域の残基を改変することが望ましいと言える。
【０１３０】
Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、１００２９〜１００３３頁（１９８９年）及び国際公開第９０／０７８６１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）は、マウスｍＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲをヒト免疫グロブリン・フレームワーク及び定常領域と組合せることによる、アクセプタ抗体のフレームワーク領域に修飾残基を含むヒト化抗体の調製を述べた。彼らは、ヒトＶ領域フレームワーク残基を修飾せずにＣＤＲを直接導入することにしばしば起因する結合親和力が失われるという問題の１つの解決策を示した。彼らの解決策は、次の２つの重要な段階を含む。第一に、ヒトＶ領域フレームワーク領域を、最初のマウス抗体、この場合、抗ＴａｃＭＡｂのＶ領域フレームワークとの最適タンパク質配列相同関係に関するコンピュータ解析により選択した。第二段階において、マウスＣＤＲと相互作用すると考えられるフレームワークアミノ酸残基を視覚化し、次に、これらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワーク上に重ね合わせるために、マウスＶ領域の三次構造をコンピュータによりモデル化する。推定マウス接触残基を含む相同ヒトフレームワークを用いる彼らのアプローチは、インターロイキン２受容体に対して特異的な抗体（Ｑｕｅｅｎら、１９８９年［前出］）、また、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）に対して特異的な抗体（Ｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、２８６９〜２８７３頁（１９９１年））に関して、最初のマウス抗体と類似の結合親和力を有するヒト化抗体をもたらした。
このヒト化法のさらなる詳細は、当技術分野で知られており、具体例としての調製を記述する目的のために参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｉｎｔｅｒらへの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｂｏｓｓらへの米国特許第４，８１６，３９７号並びにＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号及び米国特許第６，３３１，４１５号に示されている。
ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の両方を認識する抗体は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の間、例えば、配列番号１及び４の間、配列番号６及び７の間の非保存アミノ酸の無作為化アミノ酸を有するペプチドによる上述のようなマウスの免疫処置により産生される。産生される抗体はＬＯＸ及びＬＯＸＬ２に対して交差反応性であるはずである。
ＬＯＸ又はＬＯＸＬ２に対して特異的、或いはＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の両方に対して交差反応性であるＬＯＸ／ＬＯＸＬ２抗体をさらなる開発のための候補として選択する。
【０１３１】
【表１】
2014210785.tif 000002
【実施例１０】
【０１３２】
ＬＯＸ及びＬＯＸＬメンバーに対する交差反応性抗体の産生
ＬＯＸ及びＬＯＸＬメンバーに対する交差反応性抗体は、触媒ドメインも含む、ＬＯＸ／ＬＯＸＬタンパク質の高度に保存的なＣ末端領域由来のペプチドでマウスを免疫処置することにより産生させる。この領域に対して産生させた抗体は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬの活性形を認識する。
抗体を産生させるぺプチドが由来していてよいドメインは、触媒ドメイン、銅結合ドメイン、リシル−チルシルキノン補因子ドメイン及びサイトカイン受容体様ドメインである。銅結合ドメイン及び触媒ドメインの配列は、表２に示し、実施例９で述べたようにマウスを免疫処置するのに用いる。同様に、産生させた抗体の特異性は、ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４の全長及び処理形を対照としてＥＬＩＳＡにより測定する。
ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２及びＬＯＸＬ４の間の非保存的アミノ酸の無作為化アミノ酸を有するペプチドもＬＯＸ／ＬＯＸＬタンパク質の様々な形、例えば、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ、又は５つのＬＯＸファミリー・メンバーのすべてと交差反応性である抗体を産生させるためにマウスを免疫処置するのに用いる。マウスの免疫処置並びにマウス及びヒト抗体の産生については、実施例９で述べる。
ＬＯＸ及び種々のＬＯＸＬメンバーに対して交差反応性であるＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体をさらなる開発のための候補として選択する。
【０１３３】
【表２】
2014210785.tif 000003
【実施例１１】
【０１３４】
ＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進する活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを認識する抗体の産生
ＥＭＴ細胞は活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを分泌する。実施例９及び１０により産生させた抗体を実施例２、３又は４においてＥＭＴ細胞を処理するのに用いる。細胞のＥＭＴ又はＭＥＴ特性を実施例１で述べたように測定する。活性ＬＯＸ／ＬＯＸＬを認識する抗体は、細胞のＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進するはずである。
細胞のＥＭＴを減少させ／ＭＥＴを促進するＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体をさらなる開発のための候補として選択する。
【実施例１２】
【０１３５】
抗体によるＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性の阻害
実施例９又は１０により産生させた抗体をＦｏｇｅｌｇｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８０巻、２４６９０〜２４６９７頁（２００５年）に記載されているＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性検定に用いる。簡単に述べると、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性検定の反応混合物は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．２）、１．２Ｍ尿素、４０μＭ  Ａｍｐｌｅｘレッド（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ）、０．１単位／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ及び１０ｍＭ  １，５−ジアミンペンタン（カダベリン）基質からなる。或いは、アンプレックス・レッド検定をｐＨ７．５のリン酸緩衝液などの生理的緩衝液中で行う。タンパク質であるＬＯＸ／ＬＯＸＬを実施例９又は１０の５００μＭ  ＢＡＰＮ又は抗体の存在下又は非存在下で反応混合物に加え、インキュベートする。蛍光の発生を５６０ｎｍで励起し、発光を５９０ｎｍで読み取る（例えば、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）。ＢＡＰＮの存在下でのＬＯＸ／ＬＯＸＬを陰性対照とし、一方、ＢＡＰＮの非存在を陽性対照とする。活性の尺度は、蛍光の量に基づく。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ活性を阻害するＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体をさらなる開発のための候補として選択する。
【実施例１３】
【０１３６】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体による他の細胞又は細胞外マトリックス成分に対するＬＯＸ／ＬＯＸＬの結合の阻害
実施例９又は１０により産生させた抗体をＥＣＭ結合検定に用いる。Ｆｏｇｅｌｇｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８０巻、２４６９０〜２４６９７頁（２００５年）に記載されているように固相結合検定を行う。高タンパク質結合ＥＩＡ／ＲＩＡマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウエルをトロポエラスチン、Ｉ型コラーゲン、可溶性血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）、不溶性細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）、ラミニン又はＢＳＡを４℃で一夜被覆する。ウエルをブロックし、洗浄し、次いで、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体の存在下又は非存在下でＬＯＸ／ＬＯＸＬのタグ標識形（例えば、ＧＳＴ−ＬＯＸ／ＬＯＸＬ）とともに一夜インキュベートする。ウエルを再び洗浄し、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ結合の量をＬＯＸ／ＬＯＸＬのタグに対する一次抗体（例えば、抗ＧＳＴ）、次いでペルオキシターゼ標識二次抗体により検出する。次いで、ペルオキシダーゼ活性を蛍光原性ペルオキシダーゼ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）で定量する。試料を３つ複製し、解離定数を統計ソフトウエア（例えば、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｉｎｃ製のＰｒｉｍ３）で計算する。試料は３連で実施し、解離定数は統計ソフトウエア（例えば、Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｉｎｃ製のＰｒｉｓｍ３）を用いて計算する。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬを用いてマイクロプレートウエルを被覆する結合検定も実施する。実施例９又は１０からの抗体を、トロポエラスチン、Ｉ型コラーゲン、ｐＦＮ、ｃＦＮ若しくはＢＳＡの前又は同時にウエルに加える。結合は、上述のように測定する。ここで、ＥＣＭタンパク質は、それらの各抗体により、或いは、ＥＣＭ結合の量を検出するために、ＥＣＭタンパク質のタグ形を用いる場合には、タグに対する抗体により検出する。
細胞受容体（例えば、取り込み受容体インテグリンβ１）、ＢＴＫ（バートンガンマグロブリンチロシンキナーゼ）又は他のインテグリンなどの他のタンパク質とＬＯＸ／ＬＯＸＬとの結合の検定も前述の検定を用いて実施し、この場合、ＥＣＭタンパク質の代わりに細胞受容体（例えば、取り込み受容体インテグリンβ１）、ＢＴＫ（バートンガンマグロブリンチロシンキナーゼ）又は他のインテグリンを用いる。
ＥＣＭタンパク質、細胞受容体及びインテグリンに対するＬＯＸ／ＬＯＸＬの結合を阻害するＬＯＸ／ＬＯＸＬ抗体をさらなる開発のための候補として選択する。
【実施例１４】
【０１３７】
ＬＯＸ活性の阻害
ＮＩＨ３Ｔ３の細胞上の特異的ＬＯＸ活性は明らかである。活性は、１，５−ジアミノペンタン基質を用いたＡｍｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄの酸化に基づく西洋ワサビ結合蛍光検定法により定量した。ＬＯＸ活性は、不可逆性小分子阻害剤ＢＡＰＮで、ＬＯＸペプチドに対して産生させたモノクローナル抗体で、またＬＯＸ  ｍＲＮＡを特異的に標的にするｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで阻害した。（図１５）
ＮＨ３Ｔ３細胞に１００ｎＭのＬＯＸ  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｔｅａｌｔｈ、ＨＳＳ１０６１１７、ＡＵＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＵＣＡＡＵＣＣＣＵＧＵ）又は非標的対照をトランスフェクトした。２５μｌのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（登録商標）＃３（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を１ｍｌのＯＰＴＩＭＥＮＩ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で５分間飽和させた（ｓａｔ）。次いで、５０μｌの２０μＭ  ｓｉＲＮＡを加え、混合し、トランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベートした。次いで、１ｍｌのトランスフェクション混合物を、１ｘ１０６細胞を含むトリプシン処理細胞懸濁液に加え、得られた混合物を１０ｃｍ２培養皿で平板培養した。トランスフェクションの６日後に細胞をトリプシン処理し、９６ウエルプレートに５００００細胞／ウエルで再度平板培養した。トランスフェクション後７日目に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌの次の反応混合物とともにインキュベートした：１００μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＭジアミノペンタン（Ｆｌｕｋａ）及びＰＢＳ中４μ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）。ジアミノペンタン及びＨＲＰの添加の直前に、ＢＡＰＮ及びＬＯＸｍＡｂをそれぞれ１ｍＭ及び１５μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。プレートを３７℃でＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５プレート・リーダーで読み取った。プレート・リーダーは、キネティクモードで蛍光（ｅｘ＝５４４ｎｍ、ｅｍ＝５９０ｎｍ）を約２．５時間にわたって読み取るように設定した。
【実施例１５】
【０１３８】
ＬＯＸＬ２活性の阻害
すべてのプレートをＣｏｒｎｉｎｇから入手した。二次抗体及びＰｉｃｏ基質は、Ｐｉｅｒｃｅから入手した。Ａｍｐｌｅｘレッド試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、１，５−ジアミノペンタン、消泡剤は、Ｓｉｇｍａから入手した。すべてのＰｒｏｔｅＯｎ試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手した。ＬＯＸＬ２はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。本試験に用いた抗体は、抗体溶液で、又はＡｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの腹水を経て調製した。他のすべての試薬は、可能な最高品質のものであった。
ＥＬＩＳＡによる結合
ＬＯＸＬ２への抗体の結合は、化学発光を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。白色Ｃｏｒｎｉｎｇプレートを５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中０．１μｇ／ｍＬのＬＯＸＬ２又は問題とする抗原で４℃で一夜被覆した。プレートをＢｉｏＴｅｋプレート・ウォッシャーを用いて洗浄し、ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）中５％スキムミルクで室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で洗浄し、直ちに使用するか、又は将来の使用に備えてデシケータ中に４℃で保存した。供試抗体を、ＰＢＳＴ（０．０１％トゥイーン２０）で連続希釈し、ウエル当たり１００μＬの各希釈物を加えた。プレートを被験物質とともに室温で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で洗浄した。検出抗体（抗マウスＨＲＰ複合体）をＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）中５％スキムミルクで１６０００倍に希釈し、ウエル当たり１００μＬを適用した。プレートを検出抗体とともに１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％ＰＢＳＴ）で洗浄した。シグナルは、Ｐｉｅｒｃｅ製のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  ｐｉｃｏ化学発光基質を用いて製造業者の指示に従って検出した。化学発光は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｍ５プレート・リーダーを用いて全波長捕捉５００ｍｓ積分時間で測定した。データはバックグラウンド補正し、抗体濃度に対する化学発光シグナルの依存性は、ＧｒａＦｉｔプログラムを用いてラングミュア等温式を用いて適合させた。抗体濃度が解離定数と同様であった場合、強力結合の二次式を用いた。これらの式への適合により報告解離値を得た。
【数１】
2014210785.tif 000004
強力結合式
【数２】
2014210785.tif 000005
【０１３９】
ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）による結合
結合親和力は、２５℃に温度調節したＢｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ機器を用いて測定した。結合親和力は、アミン結合を用いて２つの方法を用いて求めた。１つは、抗体を固定化し、抗原（ＬＯＸＬ２）を加え、他は、抗原（ＬＯＸＬ２）を固定化し、抗体を加えた。抗体又は抗原は、ＧＬＣチップ上にＰｒｏｔｅＯｎ固定化キットにより与えられるＮＨＳ対ＥＤＣの１：１の比を用いて固定化した。チップを最初に混合物であるＮＨＳ／ＥＤＣで活性化し、酢酸緩衝液ｐＨ４．５中１μｇ／ｍＬの抗原又は抗体を活性化表面上に流して、結合させた。これにより、一般的に約５００ＲＵの結合が生じた。次いで、活性化チップ表面を１Ｍエタノールアミンの添加により覆った。結合チップを４℃で保存し、５０ｍＭ水酸化ナトリウムで再生した。
解離定数は、ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）中抗原又は抗体の一連の希釈系列で結合チップをプローブして決定した。データは、非結合チャンネルを参照としてＰｒｏｔｅＯｎ上の利用可能な全６チャンネル上で取得した。補正データをＢｉｏ−Ｒａｄ製のＰｒｏｔｅＯｎ  ｍａｎａｇｅｒソフトウエアを用いて解析した。
【０１４０】
スクリーニング検定
抗体候補は、最初にＥＬＩＳＡポイント・テストに基づいて選択した。複数の抗原上のＥＬＩＳＡを抗体溶液により行い、問題とする抗原における強いＥＬＩＳＡシグナルを示した抗体を酵素検定におけるさらなる特性評価のために選択した。１，５−ジアミノペンタン基質が脱アミノ化され、酵素が再生されるときに、ＬＯＸＬ２は過酸化水素を発生した。
過酸化物（ＬＯＸＬ２により放出される）の生成をＨＲＰに関連させる生化学的検定を行い、アンプレックス・レッドの蛍光生成物への変換を測定して、酵素活性を阻害する抗体の能力を評価した。抗体ハイブリドーマ上清（１０μＬ）を４０μＬの酵素混合物（５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ８．０、５単位／ｍＬ  ＨＲＰ、１２５ｎＭ  ＬＯＸＬ２、１０ｐｐｍ消泡剤）に加え、９６ウエル全面黒色プレートで室温で１時間インキュベートした。５０μＬの基質溶液（６２．ｍＭホウ酸ナトリウム、１００μＭアンプレックス・レッド試薬、２０ｍＭ１，５−ジアミノペンタン、１０ｐｐｍ消泡剤）を加えて、酵素反応を開始させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５プレート・リーダーで３７℃で読み取った。プレート・リーダーは、キネティクモードで蛍光（ｅｘ＝５４４ｎｍ、ｅｍ＝５９０ｎｍ）を１時間にわたって読み取るように設定した。データは蛍反応対時間の勾配として記録した。これらの勾配を、ハイブリドーマ培地を酵素混合物に加えた対照と比較した。対照の勾配よりも小さい勾配は阻害剤と考えられた。
【０１４１】
ＩＣ５０の決定
選択した抗体についての用量反応を、上述の結合酵素検定を用いてＬＯＸＬ２に対して行った。ＰＢＳＴ（０．０１％トゥイーン２０）中は抗体の希釈系列を調製し、これの１０μＬを４０μＬの酵素混合物（５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ８．０、５単位／ｍＬ  ＨＲＰ、１２５ｎＭ  ＬＯＸ２、１０ｐｐｍ消泡剤）に加え、９６ウエル全面黒色プレートで室温で１時間インキュベートした。５０μＬの基質溶液（６２．５ｍＭホウ酸ナトリウム、１００μＭアンプレックス・レッド試薬、２０ｍＭ１，５−ジアミノペンタン、１０ｐｐｍ消泡剤）を加えて、酵素反応を開始させ、上述の条件を用いてＭ５プレート・リーダーで読み取った。時間の関数としての蛍光反応の勾配を抗体濃度に対してプロットし、データをＧｒａＦｉｔを用いて４パラメーター適合に適合させた。このプロットの中点が見かけのＩＣ５０であり、全反応の５０％が阻害される濃度である（例えば、図２０）。
阻害の様式
ＬＯＸＬ２に対する抗体の阻害の様式の評価を下記のモデルを用いて行った。これらの実験において、１，５−ジアミノペンタンの濃度に対する定常状態速度の依存性を抗体の漸増濃度下でモニターした。その目的は、基質のＫｍ、Ｋｃａｔ又は両方が抗体の存在下で変化するかどうかを評価することであった。収集データを、下の図に示すモデルを用いたＧｒａｆｉｔを用いて全体的に解析した。パラメーターαは、化合物又は基質の親和力の効果を記述する。１に等しいα値は、化合物が遊離酵素及び酵素−基質複合体に同等によく結合することを表す（非競合的阻害様）。１未満の値は、化合物が酵素−基質複合体に結合するという相互作用を表す（不競合的阻害様）。１を超える値は、化合物が酵素−基質複合体より遊離酵素によく結合することに相当する（競合的阻害様）。β値は、酵素の速度に対するモジュレーターの影響を表す。阻害剤は１未満の値（完全阻害剤の場合β＝０）を有し、活性化剤は１を超える値を有する。ＫＡは、化合物の解離定数であり、ＫＳは、基質のミカエリス定数であり、ｋは、酵素の触媒作用の速度である。定常状態は、上述のように時間の関数としての蛍光反応の勾配から判断した。データは、抗体のいくつかの固定濃度における基質（１，５−ジアミノペンタン）の濃度に対する定常状態速度の依存性としてプロットし、ＧｒａＦｉｔで解析した。（例えば、図２１Ａ、及び図２１Ｂに示すように直接的競合物質を用いる）。
【実施例１６】
【０１４２】
イムノブロット及び免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によるＬＯＸ／ＬＯＸＬの検出
イムノブロット（ウエスタンブロット）は、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣＬ、８Ｍ尿素、０．０５％トゥイーン２０、ｐＨ８．０；又はＥＤＴＡ、ＮＰ４０、トリス、ＮａＣｌ、ＰＭＳＦ及び「完全最少プロテアーゼ阻害剤カクテル」（Ｒｉｃｈｅ、＃１１８３６１５３００１）；又は「Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓＳＤＳ試料緩衝液、４Ｘ」（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、＃ＢＰ−１１０Ｒ）中で細胞を溶解することによって実施した。溶解物（一般的に総タンパク質１５〜２５μｇ）を４〜１２％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）又はＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ４〜１２％ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。サイズ分画化タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）又はＮｉｃｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に転移させた。
イムノブロットをＰＢＳ中２％ＢＳＡ、５％乾燥乳中で４℃で一夜ブロックした。抗ＬＯＸ／ＬＯＸＬ一次抗体（モノクローナル又はポリクローナル）とともにインキュベートした後、ブロットを、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ”（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ又はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ”（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）、又はＩＲＤｙｅ６８０結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩＲＤｙｅ６８０結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．）などの検出を可能にするための二次抗体とともに製造業者の推奨条件に従ってインキュベートした。化学発光シグナルが発生したので、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘ若しくはＰｉｃｏ  Ｍａｘ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｅｃｅ）を用いて、或いはＣｈｅｍｉｇｌｏｗ  Ｗｅｓｔ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いた検出によるＥＣＬ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。蛍光標識二次抗体を直接検出した。
【０１４３】
組織から調製したイムノブロットに加えて、一連の正常組織及び腫瘍組織から分離されたサイズ分画化タンパク質を含む市販のプレロードイムノブロット（例えば、ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＣＡ製）を正常組織及び腫瘍組織中のＬＯＸ／ＬＯＸＬの分子量分布の分析に用いた。
ＬＯＸ／ＬＯＸＬタンパク質の発現及び細胞局在化は、組織切片及び組織マイクロアレイ（例えば、Ｃｙｂｒｄｉ、Ｐｒｏ  Ｓｃｉ及び他の供給元から入手可能）に配置された組織の切片を用いて正常組織及び腫瘍組織において検出した。ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤスナイパー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用い、製造業者の指示に従って非特異的結合について組織試料をブロックした。組織切片中の頑健な検出を確認するために、種々の緩衝液、ｐＨ条件及び温度で抗原の回収を行った。ＬＯＸ／ＬＯＸＬに対する抗体（マウス又はウサギを用いて産生させたモノクローナル又はポリクローナル）のＩＨＣを腫瘍細胞株を用いて評価した。製造業者の指示に従って、適切な抗体を組織切片とともにインキュベートした（一般的に濃度１〜１０μｇ／ｍｌ、希釈緩衝液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）又はＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で希釈）。
【０１４４】
検出は、製造業者の指示に従って、Ｒａｂｂｉｔ−Ｐｒｏｂｅ  ＨＰＲポリマーキット（Ｂｉｏｃａｒｅ  ＭｅｄｉｃａｌによるＭＡＣＨ２若しくはＭＡＣＨ３又はＤＡＫＯによるＥｎＶｉｓｉｏｎ）或いはＭｏｕｓｅ−Ｐｒｏｂｅ  ＨＲＰポリマーキット（Ｂｉｏｃａｒｅ  ＭｅｄｉｃａｌによるＭＡＣＨ２若しくはＭＡＣＨ３又はＤＡＫＯによるＥｎＶｉｓｉｏｎ）を用いて行った。或いは、検出は、製造業者の指示に従って、抗マウス、ウサギ若しくはヤギＩｇＧに結合させた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ若しくはＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂ）、又はＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（抗マウス、ウサギ若しくはヤギ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又はＥｎＶｉｓｉｏｎキット（抗マウス及びウサギ、ＤＡＫＯ）を用いて行った。
【実施例１７】
【０１４５】
ＬＯＸＬ２の２つの形の検出
ＬＯＸＬ２を切断し、ウエスタンブロットにより、その分子量の変化により検出した（図１６、１７）。２つの形をクロマトグラフィーにより分離し（図１８）、両形の活性を試験した（図１９）。
【実施例１８】
【０１４６】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ２のインターナリゼーション及び取込み
Ｈｓ５７８ｔ細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｘグルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を８チャンバー・ガラス・スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に播種し、一夜付着させた。低集密の場合は、細胞をスライド当たり３０〜４００００細胞で播種した。低集密は、２４時間後の細胞質ゾル中のＬｏｘの検出のために用いた。高集密の場合は、細胞をスライド当たり１０００００細胞で播種した。高集密は、約４８〜７２時間後のマトリックス及びコラーゲンに結合したＬｏｘの検出のために用いた。
翌日、１μｇ／ｍｌ（通常の増殖培地中の最終濃度）の抗ＬｏｘＭ６４又は抗Ｌｏｘｌ２Ｍ２０モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）をチャンバーに加えた。連続的取込みのために、ｍＡｂを細胞とともに異なる時点、例えば、３時間、８時間、２４時間（一夜）インキュベートした。適切な量の連続的取込みの後に、培地を除去し、チャンバーを１ＸＰＢＳで洗浄した。細胞を室温で２０分間４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定した。固定後、細胞を室温で５分間１ＸＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｍＭ塩化アンモニウム中で室温で１０分間失活させた。細胞を再び室温で５分間１ＸＰＢＳで洗浄した。
室温で２０分間サポニン緩衝液（ＰＢＳ中０．５％サポニン／１％ＢＳＡ）を加えることにより、細胞を透過化した。二次検出Ａｂ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）を室温でサポニン緩衝液中に加え、細胞を３０〜４５分間インキュベートした。次いで、細胞をサポニン緩衝液で３Ｘ洗浄した。スライドをｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ）でマウントした。
【０１４７】
コラーゲンを検出するために、細胞を４％ＦＦＡで固定する前に抗コラーゲン抗体（１：５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ抗コラーゲンＩ型ウサギポリクローナル、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を１時間インキュベートした。コラーゲンに対する二次Ａｂは、ロバ抗ウサギＣｙ３（ＩｍｍｕｎｏＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ）であった。
Ｈｓ５７８ｔ細胞中のＬｏｘ及びＬｏｘｌ２のｓｉＲＮＡノックダウン
Ｈｓ５７８ｔ細胞を１０ｃｍ組織培養プレートで１０％ＦＢＳ及び１ｘグルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養した。約７５％集密になるまで、細胞を増殖させた。細胞が約７５％集密に達した日に、トランスフェクション反応／混合物を準備した。次の２つの混合物を調製した。１つの１５ｍｌコニカル・チューブ中で、６０μｌの２０μＭのｓｉＲＮＡを１ｍｌのｏｐｔｉｍｕｍと混合した（最終ｓｉＲＮＡ濃度は１００ｎＭであった）。他の１５ｍｌコニカル・チューブ中で、３０μｌのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（商標）３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）トランスフェクション試薬を１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）と混合した。２本のチューブを室温で５分間インキュベートした。５分後に、両チューブの内容物を１つに混ぜ合わせた。混合物をピペットで注意深く上下し、室温で２０分間インキュベートした。
Ｈｓ５７８ｔ細胞をトリプシン処理し、１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、１０ｃｍ組織培養プレートに加えた。各ｓｉＲＮＡ状態について、２ｍｌの合わせたトランスフェクション混合物を１０ｃｍプレートに加えた。プレートを緩やかに回転させ、インキュベーター中に入れ、３７℃、５％ＣＯ２で一夜放置した。培地を交換する必要がなく、細胞上で数日間放置した。免疫蛍光試験（図２３、２４、３５）用に、トランスフェクションを少なくとも５日間続行して、十分なノックダウンを確保し、タンパク質レベルを低下させた。
【０１４８】
要約
結果から、低い細胞集密度では、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２は、細胞外マトリックス中に分泌される状態に留まらないが、その代わりに、腫瘍細胞により再取り込みされることができる（抗体がインターナライズされるとき）ことがわかる。これらの染色パターンの特異性（図２３、２４、２５）は、対応するｓｉＲＮＡノックダウン対照により裏づけられた。高い細胞集密度では、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２は、細胞外の細胞外マトリックスに絶えず検出され、明らかにほとんど再取り込みされない。染色パターンは、対応するｓｉＲＮＡノックダウン対照により裏づけられた。抗Ｌｏｘ及び抗Ｌｏｘｌ２ｍＡｂｓのインターナリゼーション及び取込み並びにコラーゲンとのそれらの共局在化の同様な結果は、ｓｉＲＮＡノックダウンの代わりの細胞のＬｏｘｌ２ｍＡｂｓ処理について得られた。
【実施例１９】
【０１４９】
ＬＯＸ／ＬＯＸＬ２インターナリゼーション及び取込みの時間経過
既に集密状態であった細胞において時間経過を開始した（０日目）。用いた細胞株は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ２の両方を発現する乳房腫瘍細胞株Ｈｓ５７８ｔであった。
ＩＨＣプロトコール（チャンバー・スライド上細胞；ＤＡＫＯのＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システム−ＨＲＰに基づく）
すべての段階はＲＴ（室温）で実施し、一次抗体濃度は、抗ＬＯＸでは５μｇ／ｍｌであり、抗ＬＯＸＬ２では１５μｇ／ｍｌであった。細胞をＰＢＳ（ｘ３）で洗浄した。次いで、ＰＢＳ（ｘ３）で再び洗浄する前にペルオキシダーゼブロック（５分）を行った。次いで、細胞を、１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６で希釈した一次抗体とともにインキュベートした（３０分）。それぞれＭ６４及びＭ２０、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２モノクローナル抗体（例えば、図２６を参照）を用いた。次いで、細胞を４％ＦＦＡで固定する（１０分）前にＰＢＳ（ｘ３）で洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ標識ポリマーを加える（３０分）前に細胞をＰＢＳ（ｘ３）で再び洗浄した。次いで、細胞をＰＢＳ（ｘ３）で洗浄した。基質−クロモゲン（１ｍＬの基質緩衝液当たり２０μＬのＤＡＢ）を５〜１０分間加えた。次いで、スライドをヘマトキシリンで対比染色する前に細胞を蒸留水で洗浄し（任意に時々）、脱水し、Ｅｎｔｅｌｌａｎで恒久的にマウントした。
Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓレッド（ＳｉｒｉｕｓレッドＦ３Ｂ）染色プロトコール：
Ｓｉｒｉｕｓレッド染色をコラーゲンの組織化学に用いた。細胞を４％ＰＦＡで固定した（１０分）が、固定は重要でない。次いで、細胞をＰｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓレッド（飽和ピコリン酸中Ｓｉｒｉｕｓレッド０．１％（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２６３５７−０２））でＲＴで１時間染色する。次いで、細胞を段階希釈系列のエタノールで脱水し、マウントする前に酸性化水（１Ｌの蒸留水中５ｍＬ酢酸）の２回の交換で洗浄する。
【０１５０】
結果
図２７に示すように、０日目にＬＯＸ及びコラーゲンＩは既に分泌され、マトリックスと結合していたが、ＬＯＸＬ２は細胞質ゾル中に局在化しており、まだ分泌されてもマトリックスと結合してもいなかった。５日目に、より多くのＬＯＸ及びコラーゲンＩが分泌され、ＬＯＸＬ２は分泌され／マトリックスと結合していた。９日目に、ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２、コラーゲンＩ及びＳｉｒｉｕｓレッドはすべて同様な染色パターンを示し、ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２及びコラーゲンＩが同じ領域に共局在化していたことが示唆された。１１日目に、ＬＯＸの染色パターンの変化が検出され、より少ないＬＯＸが分泌されかつ／又はマトリックスと結合していたことが示唆された。しかし、ＬＯＸＬ２、コラーゲンＩ及びＳｉｒｉｕｓレッド染色は、互いに同様であり、染色パターンの実際の変化は検出されなかった。１３日目及び１５日目のすべてのタンパク質の染色パターンは、１１日目と同様であった。これらの結果に基づいて、それぞれＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の分泌の時期のある程度の差があった。ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の分泌は、調節されており、細胞の集密度に関連していると思われる。分泌の時期は、次にコラーゲン架橋を開始する可能性がある、活性な細胞外ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の利用性を調節している可能性がある。
この実施例は、本明細書で開示する他の実施例とともに、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の分泌が高度に調節されていることを示している。低細胞密度では、本明細書で開示するデータは、分泌されたＬＯＸ及びＬＯＸＬ２は細胞により速やかに再取り込みされることを示している（特異的ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２抗体が細胞内に検出され、それらが効率よくインターナライズされることが示唆されるので）。高細胞密度では、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２はもはや再取り込みされないが、特異的ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２抗体の局在化によって判断されるように、コラーゲン・マトリックス（細胞外）に結合していることが認められる。腫瘍細胞及び肝線維症細胞のＩＨＣ分析により、ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の同様な調節が起こることがあり得、また疾患の部位における細胞内及び細胞外ＬＯＸ／ＬＯＸＬ２の分布が異なることが示されている。
【実施例２０】
【０１５１】
ＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の組織発現
用いたデクローキング・チャンバー及び溶液は、特に断らない限り、ＢｉｏＣａｒｅＭｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｃａ）製である。特に断らない限り、すべての処置を室温で実施した。
デクローキング・チャンバーに５００ｍｌの蒸留水（ｄｉＨ２０）を満たした。１つのスライド容器に２００ｍｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ抗原回収溶液を満たし、他のスライド容器に２００ｍｌのホット・リンス（Ｈｏｔ  Ｒｉｎｓｅ）を満たした。組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライド（Ｃｙｂｒｄｉ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、デクローキング溶液を含む容器に入れ、次にデクローキング・チャンバーに入れた。温度設定は、乳房ＴＭＡｓについて８０℃で３０分間に設定した。温度が９０℃に達したならば、スライドをデクローキング抗原回収溶液から取り出し、ホット・リンスを含む容器に入れた。ｄｉＨ２Ｏ容器中の温度が室温になるまで、２分毎にホット・リンスの１／３をｄｉＨ２０の１／３と交換することによってホット・リンス容器中の温度を徐々に下げた。次いで、スライドをｄｉＨ２Ｏで１回、０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳで１回洗浄した。
スライドをＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ−１で５分間処理し、ＰＢＳで２分間にわたり１回洗浄した。次いで、ＳＮＩＰＥＲを用いて５〜１０分間バックグラウンド・ブロックを行い、ＰＢＳで２分間にわたり１回洗浄した。一次抗体（Ａｂ）をＤａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈した。５μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗Ｌｏｘｌ２抗体及び３μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＬｏｘＭ６４を用いた。スライドを一次抗体とともに２時間インキュベートし、ＰＢＳ−トゥイーン２０で３回（毎回２分）洗浄した。Ｍａｃｈ３ポリマーキットを用い、マウス又はウサギプローブを２０分間加えることにより、抗原を検出した。次いで、スライドをＰＢＳ−トゥイーン２０で１回洗浄した後、マウス又はウサギポリマーを２０分間加えた。次いで、スライドをＰＢＳ−トゥイーン２０で５回（毎回２分）洗浄した。ＤＡＢクロマゲンをスライドに７分間加え、ｄｉＨ２０で１回洗浄した。ＤＡＢスパークル（ｓｐａｒｋｌｅ）をスライドに１分間加え、ｄｉＨ２０で１回洗浄した。次いで、スライドをヘマトキシリンで３０秒間〜１分間染色し、水で５分間洗浄した後、段階希釈アルコールで脱水した。スライドをｅｎｔｅｌｌａｎマウント剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、Ｐａ）でマウントした。組織発現を図２８及び２９に示す。
【実施例２１】
【０１５２】
肺腺癌におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬ２の発現
肺腺癌におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬ２のＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。分析は原発腫瘍において行ったが、一部は転移又は再発を伴っていた。データは、腫瘍と必ずしも完全には正常でない対応する隣接「正常」組織片との比であり、腫瘍及び正常組織の個別の転写データを図３１及び３２にプロットする。ＬＯＸＬ２は、１０個の腫瘍のうちの約４〜５個において過剰発現し、リンパ節転移又は他の再発／転移を伴うことが知られている腫瘍に関連する傾向がある（表３）。用いたプライマー及びプローブを表４に示す。
【表３】
2014210785.tif 000006
【０１５３】
【表４】
2014210785.tif 000007
【実施例２２】
【０１５４】
糖尿病性腎症／腎線維症の動物モデル
誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子を過剰発現するトランスジェニック・マウスは、重度の糖尿病を示し、糸球体肥大、糸球体基底膜肥厚及び硬化性病変を示す。これらのマウスは、糖尿病性腎症のモデルとして用いることができる。本明細書で述べる化合物は、このモデル系に投与し、腎症を予防し、治療し、かつ／又は改善するそれらの能力について分析することができる。
トランスジェニック・マウスは、動物実験に関する確立されたプロトコール及びガイドラインのもとで育成する。投与群の動物数、投与法及び対照は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤について以前に確認された用量及び投与時点に基づいて設定する。マウスは、組織学的及び生化学的分析のために、実験時間枠を通してあらかじめ決定した時点にモニターし、かつ／又は屠殺する。
組織学的分析は、腎臓切片の顕微鏡的及び免疫組織化学的分析などである。糸球体の表面積及び糸球体数は、確立された生化学的染色及び顕微鏡的分析により確認する。糸球体基底膜肥厚は、腎切片の電子顕微鏡検査の確立された方法により測定する。
血清及び尿検査項目についても腎臓活動／不全の判断のためにモニターする。血糖及び血中インスリン・レベルは、ＥＬＩＳＡ及びＨＰＬＣを含む確立された方法により測定する。クレアチニン及びアルブミンなどの血清蛋白も確立された分析法によりモニターする。尿試料は、アルブミン及びクレアチニンを含むタンパク質レベルを分析する。尿中タンパク質の検出にＥＬＩＳＡ及びＨＰＬＣを含む確立された分析法を用いる。
上述の糖尿病性腎症マウス・モデルのような動物モデル系を用いて、本明細書で開示する化合物は、腎線維症の予防、治療及び／又は改善について試験することができる。
【実施例２３】
【０１５５】
心筋虚血／梗塞線維症及びＥＣＭリモデリングの動物モデル
現行の動物の取扱いガイドライン及びプロトコールに従って、雄Ｗｉｓｔａｒラットを収容し、取り扱う。投与群の動物数、投与法及び対照は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤について以前に確認された用量及び投与時点に基づいて設定する。ラットを虚血／再潅流傷害を受けさせ、あらかじめ決定した時点にモニターし、かつ／又は屠殺した後、Ｘ線、マイクロＣＴ画像法、顕微鏡組織検査及び免疫組織化学的分析に供する。
【０１５６】
虚血／再潅流傷害プロトコール
ラットを麻酔し、人工換気を行う。心臓を外科的に露出させ、小型空気圧式冠動脈オクルダー（ｍｉｎｉ−ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｏｃｃｌｕｄｅｒ）（カテーテルに基づく閉塞システム）を所望の冠動脈の周囲に配置する。次いで、胸部を閉じ、閉塞器−カテーテル及び静脈チューブを肩甲骨の間から体外に出した。手術後、虚血／再潅流プロトコールを開始する前の５日間動物を回復させる。
【０１５７】
虚血
虚血は、少なくとも１回の２０秒間の前条件づけ閉塞の後の５分間の回復、並びに少なくとも１回の２分間の閉塞の後の５分間の回復を含むスケジュールに基づき閉塞器−カテーテルにより実現する。その後、閉塞時間を３０分まで延長することができる。虚血プロトコールの期間は、変化し得るものであり、一般的なプロトコールの期間は４週間である。虚血は週１回行い、プロトコールを通して心エコー検査により心臓機能をモニターする。プロトコールの終了時にラットを安楽死させ、心臓を摘出し、微小血管系、心腔サイズ及び機能、並びに線維症の程度を検査する。ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤は、虚血プロトコールを通してあらかじめ決定した時点及び用量で投与する。用量制限毒性及び有効性を確定するのに十分な群分けで、漸増用量及び漸増投与頻度で投与する。対照動物及びプロトコールを全プロトコールを通して維持する。
【０１５８】
解析
心室サイズは、プロトコール中の心エコー検査による心室短軸断面の記録により測定する。心周期における最小及び最大心室腔面積と定義される、拡張期及び収縮期面積を解析する。冠血流量及び摘出した心臓の微小血管系を、マイクロＣＴ及びＸ線を含む種々の映像及び染色技術により測定する。心腔の線維症は、心臓組織の切片作製及び三色染色又は心臓組織の他の確立された染色法により判断する。心室容積、サイズ及び心室壁厚減少の評価のために横断面顕微鏡検査及び組織学的分析も行う。
上記の心ＥＣＭリモデリング・システムのような動物モデル系を用いて、本明細書で開示する化合物は、心線維症及び心ＥＣＤリモデリングの予防、治療及び／又は改善について試験することができる。
【実施例２４】
【０１５９】
肺線維症及びＥＣＭリモデリングの動物モデル
ブレオマイシン誘発性肺線維症は、ＩＰＦ、間質性肺炎及びＡＲＤＳを含む肺線維症の評価のための標準的モデルである。動物の取扱いガイドライン及びプロトコールに従って、雄Ｗｉｓｔａｒラットを収容し、取り扱う。投与群の動物数、投与法及び対照は、ＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤について以前に確認された用量及び投与時点に基づいて設定する。ラットにブレオマイシンを確立された用量（一般的に５ｍｇ／ｋｇ）で気管内注射する。投与期間中、対照動物を維持する。
ブレオマイシンの投与後、試験群にあらかじめ決定したＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤を投与し、肺線維症の評価のためにあらかじめ決定した時点にモニターし、かつ／又は屠殺する。試験期間は、変化し得るものであり、具体例として試験期間は４週間である。屠殺後、ラットの肺を線維症及びコラーゲン含量について検査する。線維症の存在及び程度についての確立された染色法及び顕微鏡検査法によりラット肺切片を染色し、検査する。さらに、ラット肺のコラーゲン含量をヒドロキシプロリン検定法などの確立された検定法により測定する。
上記のブレオマイシン誘発性肺線維症動物モデルのような動物モデル系を用いて、本明細書で開示する化合物は、肺線維症の予防、治療及び／又は改善について試験することができる。
【０１６０】
例示的な実施形態
１．  有効な量の活性リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、
対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤又は転移を治療又は予防する方法。
２．  有効な量の活性リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、
対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を治療又は予防する方法。
３．  有効な量の活性リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、
対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの線維症を治療又は予防する方法。
４．  腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％減少させるような有効な量の活性リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を減少させる方法。
５．  腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態１に記載の方法。
６．  有効な量の活性リシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、
転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法。
７．  対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させる、実施形態６に記載の方法。
８．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態１、２、３、４又は６に記載の方法。
９．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である、実施形態１、２、３、４又は６に記載の方法。
１０．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２或いはＬＯＸＬ４の阻害剤である、実施形態１、２、３、４又は６に記載の方法。
１１．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する、実施形態１、２、３、４又は６に記載の方法。
１２．  活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬがプレプロタンパク質のタンパク質溶解処理後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形である、実施形態１、２、３、４又は６に記載の方法。
１３．  有効な量のリシルオキシダーゼの阻害剤及びリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、
対象における腫瘍浸潤又は転移をｉｎ  ｖｉｖｏで治療又は予防する方法。
１４．  腫瘍成長を少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％又は９５％減少させるような有効な量のリシルオキシダーゼの阻害剤及びリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍成長をｉｎ  ｖｉｖｏで減少させる方法。
１５．  腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態１４に記載の方法。
１６．  有効な量のリシルオキシダーゼの阻害剤及びリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤をそれを必要とする対象に投与し、それにより、治療した対象の生存の可能性を特定の期間増加又は向上させる段階を含む、
転移性腫瘍を有する対象の生存の可能性を増加又は向上させる方法。
１７．  対象の生存を少なくとも１０日、１カ月、３カ月、６カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年又は１０年延長させる、実施形態１６に記載の方法。
１８．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
１９．  ＬＯＸ阻害剤とＬＯＸＬ阻害剤が異なる、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２０．  ＬＯＸ阻害剤とＬＯＸＬ阻害剤が異なり、それぞれＬＯＸとＬＯＸＬに特異的に結合する、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２１．  ＬＯＸ阻害剤又はＬＯＸＬ阻害剤が配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２２．  ＬＯＸ阻害剤とＬＯＸＬ阻害剤が、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの両方に対する結合親和力を有する単一抗体である、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２３．  ＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤である、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２４．  ＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤である、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２５．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤である、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２６．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する、実施形態１３、１４又は１６に記載の方法。
２７．  リシルオキシダーゼの阻害剤、
リシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤、及び
薬剤学的に許容できる担体
を含む組成物。
２８．  治療上有効な量の少なくとも１つのリシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤をＬＯＸ／ＬＯＸＬ阻害剤でない第２の治療薬と併用して宿主に投与する段階を含む、
異常な細胞増殖、異常な血管新生、局所組織及び／又は遠隔部位における異常な細胞浸潤又は移動、或いは線維症に関連する疾患を有する宿主を治療する方法。
２９．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態２７に記載の方法。
３０．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が配列番号１〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体である、実施形態２７に記載の方法。
３１．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４の阻害剤である、実施形態２７に記載の方法。
３２．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する、実施形態２７に記載の方法。
３３．  活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬがプレプロタンパク質のタンパク質溶解処理後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形である、実施形態３０に記載の方法。
３４．  第２の治療薬が化学療法薬である、実施形態２７に記載の方法。
３５．  第２の治療薬が治療用生物製剤である、実施形態２７に記載の方法。
３６．  第２の治療薬が放射線である、実施形態２７に記載の方法。
３７．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤と第２の治療薬が、宿主における罹患細胞を治療薬の抗増殖又はプロアポトーシス作用に対してより感受性にし、罹患細胞の生存能を低下させる、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害により疾患を相乗作用的に治療する、実施形態２７に記載の方法。
３８．  異常な細胞増殖に関連する疾患ががん、腫瘍又は再狭窄である、実施形態２７に記載の方法。
３９．  線維症が皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症、腎線維症、糖尿病性腎症、強皮症及び糸球体硬化症から選択される、実施形態２７に記載の方法。
４０．  少なくとも１つのリシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤、
少なくとも１つのリシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質でない第２の治療薬、及び
薬剤学的に許容できる担体
を含む組成物。
４１．  上皮間葉移行（ＥＭＴ）状態にある細胞をリシルオキシダーゼ又はリシルオキシダーゼ様タンパク質の阻害剤と接触させる段階、及び
細胞のＥＭＴ状態の変化を検出する段階
を含み、
ＥＭＴ状態の減少又はＥＭＴから間葉上皮移行（ＭＥＴ）への移行がＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤であることを示す、
腫瘍浸潤、血管新生又は転移の阻害剤を選択する方法。
４２．  細胞のＥＭＴ状態が陽性ビメンチン、陽性フィブロネクチン染色、低又は非検出可能レベルのＥ−カドヘリン染色、Ｆ−アクチンのファロイジン染色により示される伸長及びリモデリングされたアクチン細胞骨格から選択される特性を有する、実施形態４１に記載の方法。
４３．  細胞のＭＥＴ状態が低又は非検出可能レベルのビメンチン、低又は非検出可能レベルのフィブロネクチン染色、陽性又は高レベルのＥ−カドヘリン染色、Ｆ−アクチンのファロイジン染色により示される生理的に正常なアクチン細胞骨格から選択される特性を有する、実施形態４１に記載の方法。
４４．  ＥＭＴ状態の減少又はＥＭＴからＭＥＴ状態への移行が、ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤と接触させる前の細胞と比較した、ビメンチン又はフィブロネクチン染色の減少及び／又はＥ−カドヘリン染色の増加を測定又は検出することによって検出される、実施形態４１に記載の方法。
４５．  検出する段階が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏひっかき試験において細胞の浸潤性又は移動能を検出する段階を含む、実施形態４１に記載の方法。
４６．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態４１に記載の方法。
４７．  細胞が、ＢＴ−５４９、Ｈｓ５７８８ｔ、ＭＢＡ−ＭＤ２３１、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＭＣＦ−７及びＳＷ６２０細胞株から選択される腫瘍細胞株である、実施形態４１に記載の方法。
４８．  細胞をＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤の存在下でＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤でない治療薬と接触させる段階、及び
細胞の生存能の変化を検出する段階
をさらに含む、実施形態４１に記載の方法。
４９．  血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、
参照試料と比較した血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍の成長の存在を示す、
対象におけるがんの転移を診断する方法。
５０．  血液中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性が参照試料中より低いことががんの転移の存在又は増加を示す、実施形態４９に記載の方法。
５１．  腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性を評価する段階を含み、
参照試料と比較した腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性の変化が転移性腫瘍成長の存在を示す、
腫瘍を有する対象におけるがんの転移を診断する方法。
５２．  腫瘍中の活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベル又は活性が参照試料中より高いことががんの転移の存在又は増加を示す、実施形態４９又は５１に記載の方法。
５３．  評価する段階が、活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬに結合する抗体を用いて活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルを評価する段階を含む、実施形態４９又は５１に記載の方法。
５４．  評価する段階が、活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２又はＬＯＸＬ４に結合する抗体を用いて活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルを評価する段階を含む、実施形態４９又は５１に記載の方法。
５５．  評価する段階が、活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方に結合する抗体を用いて活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬレベルを評価する段階を含む、実施形態４９又は５１に記載の方法。
５６．  活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬが、プレプロタンパク質のタンパク質溶解処理後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形である、実施形態４９又は５１に記載の方法。
５７．  対象にＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターを投与した後の対象におけるＣ反応性タンパク質のレベルの変化を検出する段階を含み、
変化が、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターが対象に対する治療効果を有することを示す
疾患の治療におけるＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターを含む療法に対する対象の反応をモニターする方法。
５８．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬのモジュレーターがＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤である、実施形態５７に記載の方法。
５９．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤の投与前と比べた対象の血液試料中のＣ反応性タンパク質のレベルの低下がＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を用いた療法に対する対象の反応を示唆する、実施形態５８に記載の方法。
６０．  疾患が異常な細胞増殖に関連する疾患である、実施形態５８に記載の方法。
６１．  異常な細胞増殖に関連する疾患ががん、腫瘍又は再狭窄である、実施形態６０に記載の方法。
６２．  疾患が線維症である、実施形態５８に記載の方法。
６３．  線維症が皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症、腎線維症、糖尿病性腎症、強皮症及び糸球体硬化症から選択される、実施形態６２に記載の方法。
６４．  有効な量のリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における病的心血管状態又は疾患を治療する方法。
６５．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性形を阻害する、実施形態６４に記載の方法。
６６．  病的心血管状態又は疾患が高血圧、高血圧性心疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄である、実施形態６４に記載の方法。
６７．  病的心血管状態又は疾患が心血管線維症に関連しており、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を心血管線維症の部位に局所的に投与する、実施形態６６に記載の方法。
６８．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤をステントを介して投与する、実施形態６７に記載の方法。
６９．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がステントに被覆されている、実施形態６８に記載の方法。
７０．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤をカテーテルを介して心血管線維症の部位に局所的に投与する、実施形態６７に記載の方法。
７１．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を病的心血管状態の発症の前に投与する、実施形態６４に記載の方法。
７２．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を病的心血管状態の発症の後に投与する、実施形態６４に記載の方法。
７３．  病的心血管状態が心筋梗塞であり、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を心筋梗塞から少なくとも１、２、３、５若しくは１０時間後、又は心筋梗塞から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日後に投与する、実施形態７２に記載の方法。
７４．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態６４に記載の方法。
７５．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤が配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、実施形態６４に記載の方法。
７６．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤が活性ＬＯＸ、ＬＯＸＬ２或いはＬＯＸＬ４の少なくとも１つの阻害剤である、実施形態６４に記載の方法。
７７．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤が活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する、実施形態６４に記載の方法。
７８．  活性ＬＯＸ又はＬＯＸＬが、ＬＯＸ又はＬＯＸＬのプレプロタンパク質形のタンパク質溶解処理後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形である、実施形態６４に記載の方法。
７９．  有害心血管事象の前に、それと同時に、又はその後に有効な量のリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を対象に投与する段階を含む、対象における病的心血管状態又は疾患を予防する方法。
８０．  有害心血管事象が心筋梗塞である、実施形態７９に記載の方法。
８１．  有害心血管事象が急性心筋梗塞である、実施形態７９に記載の方法。
８２．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を心筋梗塞から少なくとも１、２、３、５若しくは１０時間後、又は心筋梗塞から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日後に投与する、実施形態７９に記載の方法。
８３．  リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を含むコンポーネントを含む、対象における病的心血管状態又は疾患を予防又は治療するための用具。
８４．  前記コンポーネントがステントである、実施形態８３に記載の用具。
８５．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤が５００ダルトン未満の分子量を有する、実施形態８３に記載の用具。
８６．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がステントに被覆されたβ−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）である、実施形態８５に記載の用具。
８７．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤を有害心血管事象によって引き起こされる線維症の部位に局所的に送達するためのカテーテルをさらに含む、実施形態８３に記載の用具。
８８．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤及び薬剤学的に許容できる賦形剤を含む薬剤組成物、並びに薬剤組成物を用いて病的心血管状態又は疾患をどのように予防又は治療するかの指示書を含むキット。
８９．  有効な量のリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）又はリシルオキシダーゼ様タンパク質（ＬＯＸＬ）の阻害剤を対象に投与する段階を含み、線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚瘢痕化及びケロイド形成、並びにアルツハイマー病から選択される、対象における線維症に関連する疾患を治療する方法。
９０．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬの活性形を阻害する、実施形態８９に記載の方法。
９１．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤がＬＯＸ又はＬＯＸＬに対する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ＬＯＸ又はＬＯＸＬの小分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ或いはＬＯＸ又はＬＯＸＬに対するアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態８９に記載の方法。
９２．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬ阻害剤が配列番号１〜１８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸ又はＬＯＸＬの領域に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、実施形態８９に記載の方法。
９３．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬの阻害剤が活性ＬＯＸ及び活性ＬＯＸＬ２の両方を阻害する、実施形態８９に記載の方法。
９４．  ＬＯＸ又はＬＯＸＬが、プレプロタンパク質形のタンパク質溶解処理後のＬＯＸ又はＬＯＸＬの成熟形である、実施形態８９に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ−Ｄ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ−Ｂ】
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【図３５Ｃ−Ｄ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ−Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ−Ｃ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月4日(2014.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）のインヒビターを含有する、線維症を治療するための医薬であって、ＬＯＸＬ２のインヒビターが抗ＬＯＸＬ２抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスポリヌクレオチドである、医薬。
【請求項２】
線維症が、心線維症、皮膚瘢痕形成、ケロイド、肝線維症、肺線維症、珪肺症、石綿症、腎線維症、糖尿病性腎症、強皮症、糸球体硬化症およびアルツハイマー氏病から選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
心線維症が、高血圧、高血圧性心疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症又は再狭窄と関連する、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
線維症が、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール症、住血虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞、毒素への曝露又は代謝障害の合併症として起こる、請求項１又は２のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
線維症が肺線維症である、請求項２に記載の医薬。
【請求項６】
肺線維症が、特発性肺線維症、特発性間質性肺炎、急性呼吸促迫症候群、特発性線維化肺胞炎、慢性線維化間質性肺炎、間質性肺疾患、及びび漫性実質性肺疾患から選択される、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
肺線維症が特発性肺線維症である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
インヒビターが抗ＬＯＸＬ２抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
抗ＬＯＸＬ２抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３、５、７、１１及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＯＸＬ２の領域に特異的に結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
インヒビターがＬＯＸＬ２の非競合的インヒビターである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
ＬＯＸＬ２がタンパク質分解処理から生じるＬＯＸＬ２の成熟型である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
医薬が抗腫瘍性生物製剤と組み合わせて用いられる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
医薬が化学療法薬と組み合わせて用いられる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１５】
医薬が血管新生阻害薬と組み合わせて用いられる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１６】
医薬が抗線維症薬と組み合わせて用いられる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬。