(57)【要約】【課題】骨再建能力を有効に導き出すための化学組成物を徐放する仕組みをもち、患部へのフィッティングを良好にする柔軟性のある、生体複合材料およびその製造方法を提供する。【解決手段】ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と、主にバテライト相である炭酸カルシウムとを主成分とする複合材料であり、この複合材料の製造方法は、ポリハイドロキシアルカノエートと炭酸カルシウムとを熱混練法により調製する工程と、エレクトロスピニング法を用いて複合材の不織布を形成する工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムとを主成分とする生体複合材料。
【請求項２】
ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体がポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）である請求項１に記載の生体複合材料。
【請求項３】
ポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）における４‐ハイドロキシブチレートの含有率が１０〜４０重量％である請求項２に記載の生体複合材料。
【請求項４】
炭酸カルシウムが主にバテライト相である請求項１〜３のいずれかに記載の生体複合材料。
【請求項５】
炭酸カルシウムがケイ素を含む請求項１〜４のいずれかに記載の生体複合材料。
【請求項６】
ケイ素含有炭酸カルシウムがこれを含む生体複合材料全体の１０〜４０重量％である請求項５に記載の生体複合材料。
【請求項７】
炭酸カルシウムにおけるケイ素の含有率は１〜１０重量％である請求項５または６に記載の生体複合材料。
【請求項８】
前記生体複合材料が不織布である請求項１〜７に記載の生体複合材料。
【請求項９】
ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムからなる複合材料を調製する工程と、エレクトロスピニング法を用いてポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムを主成分とする不織布を形成する工程とを含む生体複合材料の製造方法。
【請求項１０】
ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体がポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）である請求項９に記載の生体複合材料の製造方法。
【請求項１１】
炭酸カルシウムが主にバテライト相である請求項９または１０に記載の生体複合材料の製造方法。
【請求項１２】
炭酸カルシウムがケイ素を含む請求項９〜１１のいずれかに記載の生体複合材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨修復材料として有用な生体活性材料に関し、特に骨との親和性を高めるために炭酸カルシウムを含有する生体吸収性材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損部に埋入されると、骨と反応して直接化学結合する材料は生体活性材料と呼ばれ、さらに、反応が材料表面に限定される表面活性材料と、反応が材料の内部にまでおよび次第に骨と置き換えられていく生体吸収性材料に分けられる。表面活性材料としては水酸アパタイトセラミックス（たとえばＨＯＹＡ製の商品名アパセラム）、生体吸収性材料としてはβ型リン酸三カルシウムセラミックス（たとえばオリンパステルモバイオマテリアル製の商品名オスフェリオン）が実用化されている。これら人口材料の表面の生体活性の評価として、擬似体液（SBF）を用いた浸漬実験によりアパタイト生成能の有無を観察することが有用であることが知られている。（非特許文献１）
【０００３】
炭酸カルシウム（CaCO3）、石膏（CaSO4・2H2O）についても、生体吸収性であることが知られている。しかし、強度や靱性は低く機械的に加工することも容易ではない。一方、ポリ乳酸やポリグリコール酸、あるいはその共重合体、さらにはポリハイドロキシアルカノエートなどの生分解性高分子は機械加工が容易であるが、生体内で分解されて排出されるという形態の生体吸収性であり、骨形成性は示さない。また分解される過程で乳酸となるなど酸性化し、周囲組織に影響を及ぼすことがあるという報告も一部にはなされている。  
【０００４】
そこで、これらの無機化合物と有機化合物を複合して骨形成性と生体吸収性を持たせ、さらには機械的性質、機械加工性も向上させる研究がされてきた。たとえば、ポリ乳酸と炭酸カルシウムを複合して生体吸収性材料を作製する方法がある（特許文献１参照）。炭酸カルシウムの中でも水への溶解度が高いバテライトを主成分とするものとポリ乳酸等の生分解性高分子化合物を混合して生体吸収性材料を合成する方法が報告されている。ポリ乳酸が分解して酸性化しても炭酸カルシウムが溶解することで緩衝効果を発揮し、ｐＨは常に中性付近で保たれるという利点もあり、機械的性質、加工性の向上も達成されたが、生体組織とのフィッティングに必要な柔軟性の維持は困難であった。
【０００５】
ところで、ポリハイドロキシアルカノエート種は特定の菌種から生成される生分解性のポリエステルであり、単独重合体、共重合体を合わせて百種類以上のポリマーが属する。代表的なものとしてポリ（３‐ハイドロキシブチレート）があるが、引張試験での破断伸びは５％程度であり、柔軟性には乏しい。そのため、より柔軟にするために、他のモノマーとの共重合体が作製されている。中でもポリ（３‐ハイドロキシブチレート‐４‐ハイドロキシブチレート）共重合体は高い柔軟性を示し、４‐ハイドロキシブチレート含有率が１６重量％の時、およそ４５０％の破断伸びを示す（非特許文献２）。
【０００６】
超高齢化社会における健康維持において、咀嚼能力や運動能力の維持確保は極めて重要であり、骨欠損には一刻も早い治癒が望まれている。骨形成能を向上させるために生体吸収性膜に骨形成伝導剤（特許文献２参照）、成長因子または骨形態発生因子（特許文献３および４参照）を含有させる試みもあるが、このような因子を取り扱うことは容易ではない。骨の自己再生をより確実に早くさせる骨再建能力に優れた生体吸収性材料の開発が求められている。
【０００７】
最近の生体関連材料の研究動向を見ると、材料と骨とを結合させるという材料設計から、骨を再生させるための材料設計に研究内容が移行している。骨形成に及ぼすケイ素の役割が注目されており、ケイ素含有を特徴とした材料設計が見られるようになった（非特許文献３参照）。例えば、ケイ素の徐放により細胞への遺伝子的働きかけが行なわれ、骨生成が促進されることが報告されている（非特許文献４参照）。また、３種の炭酸カルシウム（カルサイト、アラゴナイト、バテライト）とポリ乳酸の複合体を擬似体液（SBF）に浸漬させると、最も短時間で骨と類似した組成や形態をもつ水酸アパタイトが材料表面に生成するものはバテライトとポリ乳酸の複合体であることが示されている（非特許文献５参照）。これらのことから、ケイ素を徐放するバテライトを用いることが骨再建の速い材料を提供するための重要な手段となる。
【０００８】
骨欠損部充填材料の使用にあたっては、患部を切開し、患部を十分に埋める大きさの緻密質あるいは多孔質の材料を直接埋め込む、または顆粒状の材料を充填する、という方法がとられる。骨形成を確実にするためには、患部に隙間無く材料が埋入されていることが望ましいが、緻密質あるいは多孔質の材料の場合、患部の形状にあわせて加工するのは容易ではなく、一方顆粒状の材料を充填した場合には、術後に患部から脱落することが多く、それぞれ対策が必要であった。
【０００９】
一方、患部に充填する方法ではないが、骨形成に寄与しない細胞や組織の骨欠損部への侵入を防ぎ、骨の自己再生能力を活かし、骨を再建させるために欠損部を覆う遮蔽膜を用いる骨再生誘導法も知られている。これは、生体が本来もっている治癒力を利用して骨欠損を治癒するものであって、例えば、ケイ素溶出型炭酸カルシウム（バテライト）と生分解性樹脂とを主成分とする不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする不織布層との二層構造を有する骨再生誘導膜とその製造方法が記載されている（特許文献５参照）。この膜ではマウス由来骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1）の増殖性が良好で、兎の頭蓋骨に設けた骨欠損部を被覆した場合に、その膜内に旺盛な骨形成が見られたことが報告されている（非特許文献６参照）が、引張試験による破断伸びは小さく、骨欠損部充填材料として患部に丸めて挿入することや複雑な形状にフィッティングさせることは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−２９４６７３号公報
【特許文献２】特開平６−３１９７９４号公報
【特許文献３】特表２００１−５１９２１０号公報
【特許文献４】特開２００６−１８７３０３号公報
【特許文献５】特開２００９−６１１０９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】T. Kokubo and H. Takadama, “How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity”, Biomaterials, 27, 2907-2915 (2006)
【非特許文献２】Y. Doi, A. Sefawa and M. Kunioka “Biosynthesis and characterization of poly(3-hudroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophus”, Int. J. Biol. Macromol., 12 (1990)
【非特許文献３】都留寛治、小川哲朗、大串始、「生体関連材料の研究技術および標準化の動向」、セラミックス、41, 549-553 (2006）
【非特許文献４】H. Maeda, T. Kasuga and L. L. Hench, “Preparation of Poly(L-lactic acid)-Polysiloxane-Calcium Carbonate Hybrid Membranes for Guided Bone Regeneration”, Biomaterials, 27, 1216-1222 (2006)
【非特許文献５】H. Maeda, T. Kasuga, M. Nogami and Y. Ota, “Preparation of Calcium Carbonate Composite and Their Apatite-Forming Ability in Simulated Body Fluid”, J.Ceram.Soc.Japan, 112, S804-808 (2004)
【非特許文献６】T. Wakita, A. Obata and T. Kasuga, “New Fabrication Process of Layered Membranes Based on Poly(Lactic Acid) Fibers for Guided Bone Regeneration”, Materials Transactions, 50 [7], 1737-1741 (2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、骨再建能力を有効に導き出す新しいしくみのもとに、患部へのフィッティングを良好にする柔軟性のある生体材料およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Ｓｉ-ＣａＣｏ３）と高い柔軟性を有する生分解性樹脂とを主成分とする複合材料の不織布を利用して、細胞への養分供給のための連通孔を確保するとともに、患部とのフィッティング性を向上させて、前記課題を解決しうることを見出した。すなわち、本発明によれば、以下の生体複合材料およびその製造方法が提供される。
【００１４】
［１］ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムとを主成分とする生体複合材料。
【００１５】
［２］ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体がポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）である前記［１］に記載の生体複合材料。
【００１６】
ポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）における４‐ハイドロキシブチレートの含有率が１０〜４０重量％である前記［２］に記載の生体複合材料。
［３］
【００１７】
［４］炭酸カルシウムが主にバテライト相である前記［１］または［２］に記載の生体複合材料。
【００１８】
［５］炭酸カルシウムがケイ素を含む前記［１］〜［３］のいずれかに記載の生体複合材料。
【００１９】
［６］ケイ素を含む炭酸カルシウムがこれを含む生体複合材料全体の１０〜４０重量％である前記［４］に記載の生体複合材料。
【００２０】
［７］炭酸カルシウムにおけるケイ素の含有率は１〜１０重量％である前記［５］または［６］に記載の生体複合材料。
【００２１】
［８］前記生体複合材料が不織布である前記［１］〜［７］に記載の生体複合材料。
【００２２】
［９］ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムからなる複合材料を調製する工程と、エレクトロスピニング法を用いてポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムを主成分とする不織布を形成する工程とを含む生体複合材料の製造方法。
【００２３】
［１０］ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体がポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）である前記［９］に記載の生体複合材料の製造方法。
【００２４】
［１１］炭酸カルシウムが主にバテライト相である前記［９］または［１０］に記載の生体複合材料の製造方法。
【００２５】
［１２］炭酸カルシウムがケイ素を含む前記［９］〜［１１］のいずれかに記載の生体複合材料の製造方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る生体複合材料は引張試験による機械特性評価において高い破断伸びを示し、柔軟性に優れた生体複合材料と期待される。また、本発明に係る製造方法によれば、上記のような可能性を持った生体材料を容易かつ効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布の表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】比較例であるP(3HB-4HB)不織布の表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明のSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布と、比較例であるP(3HB-4HB)不織布の応力−ひずみ曲線である。
【図４】本発明のSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布のSBF浸漬後の表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】比較例のP(3HB-4HB)不織布のSBF浸漬後の表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】本発明のSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布のSBF浸漬後のＸ線回折パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。
【００２９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、ポリマー溶液にプラス高電圧を印加し、マイナスに帯電したコレクターにスプレーされる過程でファイバー化を起こさせるエレクトロスピニング法を用いることにより不織布材料を製造することができる。
【００３０】
本発明はポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムとを主成分とする生体複合材料であるが、ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体と炭酸カルシウムとの合計がこの複合材の９０重量％以上であることが好ましく、９７重量％であることがより好ましい。ポリハイドロキシアルカノエート種の共重合体がポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）、すなわち、P(3HB-4HB)であることが好ましい。また、いずれの組成のP(3HB-4HB)共重合体においても、ポリ（３‐ハイドロキシブチレート）単独重合体に比べて高い柔軟性を有し、柔軟な複合材の作製に用いることが可能であるが、好ましくは４‐ハイドロキシブチレートの含有率が１０〜４０重量％のものを用いることで患部へのフィッティングに必要な高い柔軟性を有することが期待できる。炭酸カルシウムは主にバテライト相であることが好ましく、またケイ素を含有することが好ましい。炭酸カルシウムに対するケイ素の配合率は１〜１０重量％であることが好ましい。ケイ素は炭酸カルシウムから骨等の生体内溶け出して、骨の修復あるいは再建に寄与する。なお、本発明の生体複合材料としては、フィルムに比して不織布のほうがより柔軟性が高く好ましい。
【００３１】
本発明の生体複合材料の作製にあたっては、P(3HB-4HB)をクロロホルム（CHCl3）、もしくはジクロロメタン（DCM）に溶解させて不織布材料作製用の紡糸溶液を用意する。良好な紡糸状態を維持するためにジメチルホルムアミド（DMF）、またはメタノール（CH3OH）をCHCl3やDCMに対して５０ 重量％まで適宜加えてもよい。次に、P(3HB-4HB)の紡糸溶液にSi-CaCO3を加え、複合材不織布作製用の紡糸溶液を用意する。複合材のSi-CaCO3含量が４０重量％、より好ましくは３５重量％以下になるように混合すると、引張試験において高い破断伸びを示すことができる。一方で、良好な骨形成促進のためには１０重量％、より好ましくは１５重量％以上の含有率を持つことが好ましい。上記の紡糸溶液作成法以外に、予め所定の割合のP(3HB-4HB)とSi-CaCO3を加熱ニーダーで混練して調製した複合体を溶媒に溶かして紡糸溶液としてもよい。Si-CaCO3は、例えば特開２００６‐１６１８１６号公報に記載される方法を用いて調製する。なお、Si-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材料には、生体用として問題のないリン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、塩化カルシウム等の無機物が含まれていてもよい。
【００３２】
エレクトロスピニング装置を用いることで、ノズルから出た電荷を帯びたSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合体不織布作製用の紡糸溶液は、電界中で溶媒を揮発させながらファイバーとなってマイナス電極のコレクターに向かい、コレクター上で多数のファイバーからなる層を形成する。紡糸条件（紡糸溶液の濃度、溶媒の種類、供給速度、紡糸時間、印加電圧、あるいはノズルとコレクターの距離など）を変えることによって所望の不織布材料にすることが可能である。また、得られた不織布をプレスすることで緻密化や膜厚を調整することもできる。なお、ファイバー径としては１〜５０μｍ、５〜２０μｍであることがより好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明に係るSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合体不織布の製造方法の実施例について説明する。以下の実施例についての説明は本発明をより深く理解するためのものであって、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３４】
各実施例では以下に示す原料を使用した。
・ケイ素溶出型炭酸カルシウム（Si-CaCO3）：消石灰（ミクロスターT 純度96%以上 矢橋工業株式会社）、メタノール（特級試薬 純度99.8%以上 キシダ化学株式会社）、γ‐アミノプロピルトリエトキシシラン（TSL8331 純度98%以上 GE東芝シリコーン株式会社）、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス 純度99.9% 大洋化学工業株式会社）を用いて調製されたＳｉ２．９重量％を含むバテライト相炭酸カルシウム
・ポリ（３−ハイドロキシブチレート−４−ハイドロキシブチレート）（P(3HB-4HB)：PURE PHA POWDER、PHA-0600、分子量約110万Da、 G5 JAPAN株式会社）
・クロロホルム（CHCl3）：特級試薬純度99.0%以上 キシダ化学株式会社
【００３５】
（実施例）
P(3HB-4HB)とSi-CaCO3を加熱ニーダーで110℃、10分間混練してSi-CaCO3を30重量％含有するSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合体を調製した。そして、Si-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合体とクロロホルムとを混合して紡糸溶液を作製した。また、比較用の試料として、P(3HB-4HB)をクロロホルムと混合して紡糸溶液を作製した。本実施例では、複合材試料、比較用試料共に、P(3HB-4HB)をクロロホルムに対して6 重量%となるように溶液を作製した。作製した溶液の粘度は、複合体試料で約2500 [mPa・s]、比較用試料で約3000 [mPa・s]であった。
【００３６】
これらの紡糸溶液を用いて、エレクトロスピング法によりSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材の不織布およびP(3HB-4HB)の不織布を作製した。不織布作製条件として、紡糸溶液供給速度が約0.200 ml/min、印加電圧が10 kV、ノズルとコレクターの距離が80 mm、ノズルを100 mm/minで左右（5-6 cm幅）に移動、コレクターはコンベア式（コンベア速度：2 m/min、接地）、紡糸時間は180分であった。
【００３７】
Si-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布、P(3HB-4HB)不織布の表面微構造の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真をそれぞれ図１、図２に示す。Si-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布ではP(3HB-4HB)ファイバーに粒状のSi-CaCO3が含有されていることが確認できる。
【００３８】
5mm×40 mmサイズに切り出したSi-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布、およびP(3HB-4HB)不織布を5 mm/minで引張試験を行った際の応力‐ひずみ曲線を図３に示す。Si-CaCO3/P(3HB-4HB)複合材不織布はP(3HB-4HB)不織布に比べて高い引張強度と、100 %を超える破断伸びを示し、高い柔軟性を有していると言える。
【００３９】
Si-CaCO3/ P(3HB-4HB)複合材不織布を擬似体液（SBF：人間の体液（血漿）と類似したイオン濃度を持つ緩衝溶液（Ca2+；2.5，Mg2+；1.5，Na+；142.0，K+；5.0，Cl-；148.8，HCO3-；4.2，HPO42-；1.0 mmol/L））に浸漬（37 ℃で1日間）後のＳＥＭによる観察写真を図４に示し、SBF浸漬前後のX線回折パターンを図６に示す。なお、比較のため、P(3HB-4HB)不織布を前記擬似体液に同条件で浸漬した後のＳＥＭによる観察写真を図５に示す。図４および図６により、浸漬後の複合材表面には水酸アパタイトが生成され、優れた生体活性を持つことを示している。一方、P(3HB-4HB)不織布では、同様の試験において水酸アパタイトの生成は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の複合材料は、生体用、特に骨再建用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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