(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム系薬物送達システムの提供。【解決手段】脳腫瘍を含む腫瘍へのリポソームの送達に有用な、リガンド標的化（例えば、抗体標的化、または抗体フラグメント標的化）リポソームを調製する方法。送達される有効成分として、テモゾロミド、メルファラン、アトロピンなどを含む。本リポソームで治療可能なさらなる癌には、神経内分泌腫瘍、黒色腫、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、膵臓癌、網膜芽腫、および他の種類の癌が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法であって、
（ａ）  エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む、脂質溶液を調製すること、
（ｂ）  テモゾロミドの溶液を調製すること、
（ｃ）  前記脂質溶液を前記テモゾロミドの溶液と混合すること、
（ｄ）  脂質とテモゾロミドとの前記混合物を、水溶液に注入し、それによって、テモゾロミドのカチオン性リポソームを形成すること、
（ｅ）  前記テモゾロミドのカチオン性リポソームを、リガンドと混合して、前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソームを形成すること、ここで前記リガンドが、前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない
を含む、方法。
【請求項２】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記テモゾロミドの溶液が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質溶液が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記テモゾロミドの溶液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記テモゾロミドの溶液が、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約１：１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リガンド：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
リガンド：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法であって、
（ａ）  エタノール中に、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、脂質溶液を調製すること、
（ｂ）  テモゾロミドの溶液を調製すること、
（ｃ）  前記脂質溶液を前記テモゾロミドの溶液と混合すること、
（ｄ）  脂質とテモゾロミドとの前記混合物を水溶液に注入し、それによって、テモゾロミドのカチオン性リポソームを形成すること、
（ｅ）  前記テモゾロミドのカチオン性リポソームを抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）と混合し、前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を形成すること、ここで前記ＴｆＲｓｃＦｖが、前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない
を含む、方法。
【請求項１６】
前記テモゾロミドの溶液が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記テモゾロミドの溶液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記テモゾロミドの溶液が、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約１：１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者における癌を治療する方法であって、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含み、ここで前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体が、
（ａ）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（ｂ）  テモゾロミド、および
（ｃ）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、リガンド
を含む、方法。
【請求項２６】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記テモゾロミドが、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記テモゾロミドが、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約１：１である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、舌下（ＳＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽腫、卵巣癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、または血液の癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記脳腫瘍が、神経膠腫、星状細胞腫、または神経膠芽腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体と組み合わせて、前記患者に追加的治療を施すことをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記追加的治療が、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法を施すことを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸系療法が、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡを含むカチオン性リポソーム複合体の投与を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者における脳腫瘍を治療する方法であって、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を前記患者に投与することを含み、前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体が、
（ａ）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（ｂ）  テモゾロミド、および
（ｃ）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）
を含む、方法。
【請求項４４】
前記テモゾロミドが、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記テモゾロミドが、約１００ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミドのモル比が、約１：１である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、舌下（ＳＬ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記脳腫瘍が、神経膠腫、星状細胞腫、または神経膠芽腫である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
患者における癌を治療する方法であって、請求項１に記載の方法によって調製された標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
テモゾロミドが、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
テモゾロミドが、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
脂質：テモゾロミドのモル比が、約１：１である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
リガンド：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
リガンド：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、舌下（ＳＬ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
前記癌が、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽腫、卵巣癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、または血液の癌である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６７】
前記脳腫瘍が、神経膠腫、星状細胞腫、または神経膠芽腫である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体との組み合わせで、前記患者に追加的治療を投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
前記追加的治療が、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法の投与を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸系療法が、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡを含むカチオン性リポソーム複合体の投与を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法であって、
（ａ）  エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む脂質溶液を調製すること、
（ｂ）  メルファランの溶液を調製すること、
（ｃ）  前記脂質溶液を前記メルファランの溶液と混合すること、
（ｄ）  脂質とメルファランとの前記混合物を水溶液に注入し、それによって、メルファランのカチオン性リポソームを形成すること、
（ｅ）  前記メルファランのカチオン性リポソームを、リガンドと混合して、前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソームを形成すること、ここで前記リガンドが、前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない
を含む、方法。
【請求項７２】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記メルファランの溶液が、塩酸を加えた無水エタノール中に調製される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂質溶液が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記メルファランの溶液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記メルファランの溶液が、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
脂質：メルファランのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
脂質：メルファランのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
脂質：メルファランのモル比が、約１：１である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
リガンド：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項７１に記載の方法。
【請求項８３】
リガンド：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法であって、
（ａ）  エタノール中に、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む脂質溶液を調製すること、
（ｂ）  メルファランの溶液を調製すること、
（ｃ）  前記脂質溶液を前記メルファランの溶液と混合すること、
（ｄ）  脂質とメルファランとの前記混合物を水溶液中に注入し、それによって、メルファランのカチオン性リポソームを形成すること、
（ｅ）  前記メルファランのカチオン性リポソームを抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）と混合し、前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を形成すること、ここで前記ＴｆＲｓｃＦｖが、前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない
を含む、方法。
【請求項８６】
前記メルファランの溶液が、塩酸を加えた無水エタノール中に調製される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記メルファランの溶液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記メルファランの溶液が、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記メルファランの溶液が、約１４５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で調製される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
脂質：メルファランのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
脂質：メルファランのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
脂質：メルファランのモル比が、約１：１である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
患者における癌を治療する方法であって、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含み、前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体が、
（ａ）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（ｂ）  メルファラン、および
（ｃ）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、リガンド
を含む、方法。
【請求項９７】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記メルファランが、約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記メルファランが、約５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約１：１である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０６】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０８】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、舌下（ＳＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記癌が、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽腫、卵巣癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、または血液の癌である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体と組み合わせて、前記患者に追加的治療を施すことをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記追加的治療が、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法を施すことを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記核酸系療法が、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡを含むカチオン性リポソーム複合体の投与を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
患者における癌を治療する方法であって、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含み、前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体が、
（ａ）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（ｂ）  メルファラン、および
（ｃ）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）
を含む、方法。
【請求項１１５】
前記メルファランが、約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記メルファランが、約５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：メルファランのモル比が、約１：１である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、舌下（ＳＬ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２５】
患者における癌を治療する方法であって、請求項７１に記載の方法によって調製された標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１２６】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記メルファランが、約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
前記メルファランが、約５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
脂質：メルファランのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３２】
脂質：メルファランのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
脂質：メルファランのモル比が、約１：１である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
リガンド：脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３５】
リガンド：脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、舌下（ＳＬ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記癌が、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽腫、卵巣癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、または血液の癌である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体と組み合わせて、前記患者に追加的治療を施すことをさらに含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１４０】
前記追加的治療が、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法を施すことを含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記核酸系療法が、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡを含むカチオン性リポソーム複合体の投与を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
患者における脳腫瘍を治療する方法であって、前記患者に、
（ａ）  カチオン性リポソーム複合体であって、
（１）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（２）  野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡ、および
（３）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）
を含む、カチオン性リポソーム複合体、ならびに
（ｂ）  テモゾロミド
を投与することを含む、方法。
【請求項１４３】
前記テモゾロミドが、前記カチオン性リポソーム複合体と同時またはその後に投与される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記テモゾロミドが、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記テモゾロミドが、約１００ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２の用量で前記患者に投与される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、舌下（ＳＬ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
前記脳腫瘍が、神経膠腫、星状細胞腫、または神経膠芽腫である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４８】
患者における有機リン中毒を治療する方法であって、標的化されたアトロピンのカチオン性リポソーム複合体を、前記患者に投与することを含み、前記標的化されたアトロピンのカチオン性リポソーム複合体が、
（ａ）  １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、カチオン性リポソーム、
（ｂ）  アトロピン、ならびに
（ｃ）  前記カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない、リガンド
を含む、方法。
【請求項１４９】
前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記リガンドが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記アトロピンが、約１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で前記患者に投与される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５３】
前記アトロピンが、約２ｍｇ〜約６ｍｇの用量で前記患者に投与される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：アトロピンのモル比が、約０．１：１〜約５：１である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５５】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：アトロピンのモル比が、約０．５：１〜約２：１である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記カチオン性リポソーム中の脂質：アトロピンのモル比が、約１：１である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．０１：１〜約０．５：１である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５８】
リガンド：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３：１〜約０．４：１である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
ＴｆＲｓｃＦｖ：前記カチオン性リポソーム中の脂質の重量比が、約０．３３：１である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１６０】
前記投与が、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、舌下（ＳＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１６１】
前記リポソームが、前記血液脳関門を通過する、請求項１４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達の分野にあり、具体的には、カチオン性リポソーム系薬物送達の分野にある。実施形態において、本発明は、脳腫瘍を含む腫瘍へのリポソームの送達に有用な、リガンド標的化（例えば、抗体標的化、または抗体フラグメント標的化）リポソームを作製する方法を提供する。実施形態において、本リポソームは、原発性または転移性脳腫瘍の治療のために、血管脳関門を越えてテモゾロミドを送達する。本リポソームで治療することができるさらなる癌には、神経内分泌腫瘍、黒色腫、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、膵臓癌、網膜芽腫、多発性骨髄腫、および他の種類の癌が挙げられる。別の実施形態において、本リポソームは、多発性骨髄腫、血液腫瘍、または他の固形腫瘍の治療のために、メルファランを送達する。さらに他の実施形態において、本リポソームは、血液脳関門を越えて、アトロピン、ペメトレキセド、またはイリノテカン等の他の薬物を送達することができる。
【背景技術】
【０００２】
原発性脳腫瘍、特に神経膠腫は、治療が最も難しい癌のうちの１つである。原発性腫瘍に加えて、種々の主要な源（主に肺癌（６０％）、乳癌（２０％）、および黒色腫（１０％））からの転移性脳腫瘍は、１年間に１５０，０００人を超える患者において診断される（Ｎｅｗｔｏｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍａｌｋｉｎ  Ｍ（２０１０）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。したがって、脳腫瘍の治療法の改善に対して重大な必要性が存在し、ＮＣＩが、脳腫瘍を上位５つの資金拠出優先順位のうちの１つにしているという事実により裏付けられる。近年の創薬および標的療法の発展における進歩にも関わらず、ここ数年にわたり脳腫瘍を有する患者の予後に改善がないのは、治療薬に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力がないことが、大きな原因である（Ｂｌａｋｅｌｅｙ，Ｊ．（２００８）：Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ＆Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，８：２３５−２４１）。
【０００３】
多発性膠芽腫（ＧＢＭ）に対する現在の標準的な治療法は、外科的切除、続いて放射線療法、およびテモゾロミド（ＴＭＺ）を用いた化学療法である。第２世代のアルキル化（メチル化）剤であるＴＭＺは、細胞毒性のＤＮＡ損傷をもたらし、未分化星状細胞腫（ＡＡ）の治療用にも認可されており、他の非ＣＮＳ固形腫瘍からの脳転移の治療のための臨床試験中である。作用機構および薬理学的特性が、近年検討されている（Ｔｅｎｔｏｒｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｚｉａｎｉ  Ｇ（２００９）Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：ｐｐ２４５−２５７、およびＭｒｕｇａｌａ  ＭＭ，Ａｄａｉｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋｉｅｍ  Ｈ  Ｐ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ｔｏｄａｙ  ４６：ｐｐ８３３−８４６）。ＴＭＺは、比較的耐容性が良好である（Ｊｉａｎｇ  Ｇ，Ｗｅｉ  Ｚ  Ｐ，Ｐｅｉ  Ｄ  Ｓ，Ｘｉｎ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｙ  Ｑ  ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇ  Ｊ  Ｎ（２０１１）Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＧＭＴ  ｂｙ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４０６：ｐｐ３１１−３１４）が、しかしながら、骨髄抑制、好中球減少、および血小板減少は、その副作用のうちであり、治療投与量がこれらによって制限される。ＴＭＺ投与レジメンの延長もまた、リンパ球減少症および日和見感染症を招くことがわかっている（Ｔｅｎｔｏｒｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｚｉａｎｉ  Ｇ（２００９）  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：ｐｐ２４５−２５７）。経口投与したＴＭＺの非腫瘍特異的な取り込みの結果である広範な組織分布が、これらの副作用の主要な原因である。したがって、腫瘍を標的化するＴＭＺの送達により、これらの有害事象の減少を助けることができる。
【０００４】
ＴＭＺは、ＧＢＭ患者の小集団において、延命効果を示しているが、この平均増加は、放射線単独と比較して、２．５ヶ月のみである（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＭＣ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０：ｐｐ１５３７−１５４４）。最近の研究はまた、ＧＢＭ患者の６０〜７５％およびＡＡ患者の５０％が、ＴＭＺから効果を得ないことを示している（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＭＣ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０：ｐｐ１５３７−１５４４）。化学療法の失敗は、循環血液中における短い半減期、ｐ−糖タンパク質による腫瘍からの薬物の排出、腫瘍の薬物耐性、および血液脳関門の通過の失敗を含む、多数の要因に起因する可能性がある。ＴＭＺ耐性の主要な機構は、Ｏ６−グアニン付加物の除去によりＴＭＺ誘発のＤＮＡ損傷を修復する、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の過剰発現である（Ｍｒｕｇａｌａ  ＭＭ，Ａｄａｉｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋｉｅｍ  Ｈ  Ｐ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ｔｏｄａｙ  ４６：ｐｐ８３３−８４６）。したがって、例えば、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の腫瘍特異的送達を介して、ＭＧＭＴ活性を下方調節する手段は、ＴＭＺの治療効果を強化するであろう。
【０００５】
したがって、脳および他の癌の治療のための新しい治療法の開発に、緊急な必要性が存在する。本発明は、テモゾロミドの送達のための、カチオン性リポソーム系の薬物送達システムを提供することによって、これらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
実施形態において、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。このような方法は、好適には、エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む脂質溶液を調製すること、テモゾロミドの溶液を調製すること、脂質溶液をテモゾロミドの溶液と混合すること、脂質とテモゾロミドの混合物を水溶液に注入し、それによってテモゾロミドのカチオン性リポソームを形成すること、およびテモゾロミドのカチオン性リポソームをリガンドと混合し、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソームを形成することを含み、リガンドは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【０００７】
好適には、リガンドは、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）等の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントを含む、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である。
【０００８】
好適には、テモゾロミド溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製される。好適には、テモゾロミド溶液は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で調製される。
【０００９】
実施形態において、脂質溶液は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００１０】
好適には、脂質：テモゾロミドのモル比は、約０．１：１〜約５：１、より好適には、約０．５：１〜約２：１または約１：１である。好適には、リポソームの濃度は、約１ｍＭ〜約２ｍＭ、または約２ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００１１】
実施形態において、リガンド：脂質の重量比は、約０．０１：１〜約０．５：１、より好適には約０．３：１〜約０．４：１である。実施形態において、ＴｆＲｓｃＦｖ：脂質の重量比は、約０．３３：１である。
【００１２】
好適には、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。実施形態において、本方法は、エタノール中に１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む脂質溶液を調製すること、テモゾロミドの溶液を調製すること、脂質溶液をテモゾロミドの溶液と混合すること、脂質とテモゾロミドの混合物を水溶液に注入し、それによってテモゾロミドのカチオン性リポソームを形成すること、テモゾロミドのカチオン性リポソームを抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）と混合して、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を形成することを含み、ＴｆＲｓｃＦｖは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【００１３】
別の実施形態において、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。実施形態において、本方法は、エタノール中に１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む脂質溶液を調製すること、メルファランの溶液を調製すること、脂質溶液をメルファランの溶液と混合すること、脂質とメルファランの混合物を水溶液に注入し、それによってメルファランのカチオン性リポソームを形成すること、メルファランのカチオン性リポソームを、例えば抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含むリガンドと混合して、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を形成することを含み、リガンド（例えばＴｆＲｓｃＦｖ）は、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【００１４】
さらなる実施形態において、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法を提供する。好適には、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、テモゾロミド、ならびにカチオン性リポソームと複合するが、化学的に結合されないリガンドを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法を提供する。好適には、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、メルファラン、ならびにカチオン性リポソームと複合するが、化学的に結合されないリガンドを含む。
【００１６】
実施形態において、投与は、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、舌下（ＳＬ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与であるか、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介する。
【００１７】
好適には、治療される癌は、脳腫瘍、例えば、神経膠腫または星状細胞腫である。
【００１８】
他の実施形態において、治療される癌は、転移性脳腫瘍、神経内分泌腫瘍、黒色腫、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、膵臓癌、網膜芽腫、多発性骨髄腫、および他の種類の癌である。
【００１９】
別の実施形態において、リポソームは、多発性骨髄腫の治療のためにメルファランを送達する。
【００２０】
さらに他の実施形態において、リポソームは、アトロピン、ペメトレキセド、もしくはイリノテカン、および／またはその誘導体等の他の薬剤を送達することができる。
【００２１】
実施形態において、本方法は、標的化されたテモゾロミド、メルファラン、アトロピン、ペメトレキセド、またはイリノテカンのカチオン性リポソーム複合体と組み合わせて、追加的治療を患者に施すことをさらに含む。好適には、追加的治療は、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法を施すことを含む。実施形態において、核酸系療法は、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡを含む、カチオン性リポソーム複合体の投与を含む。実施形態において、追加的治療は、癌細胞内のＭＧＭＴの作用を下方制御、修正、またはそうでなければ打ち消す、任意の分子の投与を含む。さらなる実施形態において、追加的治療は、アセチルコリンの生成、またはその受容体へのアセチルコリンの結合を妨げる任意の分子の投与を含む。
【００２２】
実施形態において、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における脳腫瘍を治療する方法を提供する。好適には、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、テモゾロミド、ならびにカチオン性リポソームと複合するが、化学的に結合しない抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含む。
【００２３】
好適には本明細書に記載の方法によって調製される標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法もまた提供する。
【００２４】
さらに他の実施形態において、標的化されたカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。好適には、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、メルファラン、ならびにカチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含む。
【００２５】
さらに他の実施形態において、標的化されたカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における任意の癌を治療する方法を提供する。好適には、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、メルファラン、ならびにカチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含む。
【００２６】
好適には、本明細書に記載の方法によって調製された標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法もまた、提供する。
【００２７】
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡ、およびカチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）、ならびにテモゾロミドを含む、カチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における脳腫瘍を治療する方法もまた、提供する。
【００２８】
さらなる実施形態、特徴、および実施形態の利点、ならびに種々の実施形態の構造および実行を、添付の図への参照とともに、以下により詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本明細書に記載のように、遊離型ＴＭＺおよびＴＭＺを含む３つのカチオン性リポソームの、濃度に対比したＵ２５１細胞生存率を示す。
【図２】本明細書に記載のように、遊離型ＴＭＺおよびＴＭＺを含むカチオン性リポソームの、ＴＭＺの濃度に対比したＵ８７細胞生存率を示す。
【図３Ａ】本明細書に記載のように、遊離型ＴＭＺおよびＴＭＺを含む標的化カチオン性リポソームの、ＴＭＺ濃度に対比したＴ９８Ｇ細胞生存率を示す。
【図３Ｂ】本明細書に記載のように、遊離型ＴＭＺおよびＴＭＺを含む標的化されたカチオン性リポソームの、ＴＭＺ濃度に対比したＫＭＳ−１１細胞生存率を示す。
【図４Ａ】Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）インビボ蛍光画像化システムを使用した、脳腫瘍の蛍光強度を示す。
【図４Ｂ】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺでの治療に応じた、Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２神経膠芽腫の腫瘍異種移植片の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）画像を示す。
【図５】遊離型ＴＭＺまたはｓｃＬ−ＴＭＺでの治療後にＭＲＩにより測定された脳腫瘍の寸法を示す。
【図６】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの生物発光画像を示す。
【図７】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの追加の生物発光画像を示す。
【図８】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの生物発光信号強度の定量化を示す。
【図９】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの生物発光信号強度の定量化を示す。
【図１０】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺでの治療中および治療後のマウスの体重測定を示す。
【図１１】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療した動物に対する長期生存率を示す、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図１２】異なる用量の遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療した動物の長期生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図１３】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺの効果を示す脳腫瘍の重量を示す。
【図１４】脳腫瘍から単離した単細胞を染色する開裂カスパーゼ３抗体により判定される、アポトーシスレベルのフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１５】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの腫瘍寸法を示す。
【図１６】遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの体重を示す。
【図１７】皮下Ｔ９８Ｇ異種移植腫瘍から単離したＣＤ１３３＋ＣＳＣおよびＣＤ１３３−非ＣＳＣのＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図１８】皮下のＴ９８Ｇ脳腫瘍からのＳＳＥＡ−１＋ＣＳＣを染色する開裂カスパーゼ３抗体により評価されるアポトーシスレベルを示す。
【図１９】本明細書に記載の遊離型ＴＭＺ、ｓｃＬ−ＴＭＺ、およびｐ５３遺伝子を発現する標的化カチオン性リポソームを伴う組み合わせｓｃＬ−ＴＭＺの、ＴＭＺ濃度に応じたＴ９８Ｇ細胞生存率を示す。
【図２０】全身投与したｓｃＬ−６ＦＡＭ−ＯＤＮの、Ｕ２５１異種移植脳腫瘍への腫瘍標的化された送達を示す。
【図２１】全身投与後にＵ２５１異種移植腫瘍から単離したＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−非ＣＳＣ細胞内のｓｃＬにより送達された６ＦＡＭ−ＯＤＮの取り込みのフローサイトメトリー分析を示す。
【図２２】全身投与後の、ｓｃＬにより送達されたＯＤＮによる脳内ＧＢＭ中のＣＳＣの腫瘍特異的な標的化を示す。
【図２３】細胞へのＴＭＺ添加後のＸＴＴアッセイおよびＩＣ５０値を示す。
【図２４】ＳＧＴ−５３＋ＴＭＺの組み合わせの相乗効果を示す、Ｘｅｎｏｇｅｎを使用したＵ８７脳内腫瘍の生物発光画像を示す。
【図２５】ＴＭＺを加えたＳＧＴ−５３の、脳内Ｕ８７ＧＢＭへの相乗効果を示す。
【図２６】全身投与したｓｃＬ−ｐ５３とＴＭＺとの組み合わせの相乗効果を示す。
【図２７】ＴＭＺ治療に対するＳＧＴ−５３感作が、脳内Ｕ８７ＧＢＭモデルにおいて、生存率を有意に増加させることを示す、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図２８】ＴＭＺ治療に対するＳＧＴ−５３感作が、脳内ＧＢＭのＴＭＺ耐性モデル（Ｔ９８Ｇ細胞）の生存率を有意に増加させることを明示する、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図２９】示されるような治療後のアポトーシス状態の腫瘍細胞の割合を示す。
【図３０】全身的な複合体ｐ５３遺伝子治療による、Ｔ９８ＧのＴＭＺ耐性脳腫瘍細胞およびＳＱ異種移植片腫瘍におけるＭＧＭＴ発現の下方調節を示す。
【図３１】全身的な複合体ｐ５３遺伝子治療による、Ｔ９８ＧのＴＭＺ耐性頭蓋内脳腫瘍におけるＭＧＭＴ発現の下方調節を示す。
【図３２】ｓｃＬ−ｐ５３の投薬スケジュール案を示す。
【図３３】本明細書に記載の遊離型ＭＥＬおよびＭＥＬを含む標的化されたカチオン性リポソームの、ＭＥＬ濃度に対応したＫＭＳ−１１細胞生存率を示す。
【図３４】標的化部分を含まないＬｉｐ／ＭＥＬ、および完全なｓｃＬ／ＭＥＬ複合体、ならびにリポソーム単体と、非封入型ＭＥＬの比較を示す。
【図３５】新たな、および凍結乾燥されたｓｃＬ／ＭＥＬ複合体と、非封入型ＭＥＬの比較を示す。
【図３６】標的化されたｐ５３治療法のＫＭＳ−１１細胞への効果を示す。
【図３７】遊離型（非封入型）ＭＥＬ単独、ｓｃＬ／ＭＥＬ単独、または遊離型（非封入型）もしくはｓｃＬ封入型ＭＥＬとｓｃＬ−ｐ５３との組み合わせの、ＫＭＳ−１１細胞への効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書に示され、記載される特定の実装は、例であり、それ以外には決して本出願の範囲を制限するように意図されるものではないことを認識されたい。
【００３１】
本明細書に参照される、公開された特許、特許出願、ウェブサイト、社名、および科学文献は、それぞれが、具体的および個別に参照によって組み込まれると示されるのと同程度に、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される任意の参照と本明細書の特定の教示との間のいかなる不一致も、後者を優先して解決されるものとする。同様に、用語または語句の当該技術分野で理解される定義と、本明細書で具体的に教示される用語または語句の定義との間のいずれの不一致も、後者を優先して解決されるものとする。
【００３２】
本明細書に使用される際、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に明確な指示がない限り、具体的には、それらが指す用語の複数形もまた、包含する。用語「約」は、おおよそ、範囲内、大体、または前後を意味して本明細書に使用される。用語「約」が、数値範囲と同時に使用される場合、境界を記載の数値の上下まで広げることによって、その範囲を修飾する。一般的に、用語「約」は、ある数値を、記載の数値の上下２０％の変動で修飾して本明細書に使用される。
【００３３】
本明細書に使用される技術および科学用語は、別段に定義されない限り、本出願が属する当該技術分野で当業者に広く理解される意味を有する。当業者に既知の種々の方法論および材料への参照が、本明細書においてなされる。
【００３４】
実施形態において、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。好適には、本方法は、エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む、脂質溶液を調製することを含む。テモゾロミドの溶液を調製する。脂質溶液を、テモゾロミドの溶液と混合する。カチオン性脂質とテモゾロミドとの混合物を、水溶液に注入し、それによって、テモゾロミドのカチオン性リポソームを形成する。テモゾロミドのカチオン性リポソームを、次にリガンドと混合して、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体を形成する。好適には、リガンドは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【００３５】
実施形態において、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。好適には、本方法は、エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む、脂質溶液を調製することを含む。メルファランの溶液を、好適にはメルファランの溶解を促進するのに十分な塩酸を含有する無水エタノール中に調製する。脂質溶液を、メルファランの溶液と混合する。カチオン性脂質とメルファランとの混合物を、水溶液に注入し、それによってメルファランのカチオン性リポソームを形成する。メルファランのカチオン性リポソームを、次にリガンドと混合して、標的化されたメルファランのカチオン性リポソーム複合体を形成する。好適には、リガンドは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【００３６】
実施形態において、標的化されたアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。好適には、本方法は、エタノール中に１つ以上のカチオン性脂質を含む、脂質溶液を調製することを含む。アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液を、無水エタノール、ＤＭＳＯ、水、またはリン酸緩衝液もしくはＨＥＰＥＳ緩衝液もしくはＴＲＩＳ緩衝液等の緩衝溶液等、適切な溶媒中に調製する。脂質溶液を、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液と混合する。カチオン性脂質と、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドとの混合物を、水溶液に注入し、それによって、カチオン性のアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのリポソームを形成する。アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソームを、次にリガンドと混合し、標的化されたアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソーム複合体を形成する。好適には、リガンドは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。
【００３７】
用語「複合体」、「ナノ複合体」、「リポソーム複合体」、および「カチオン性リポソーム複合体」は、本発明のカチオン性リポソームを指して、全体を通して互換的に使用される。
【００３８】
本明細書に記載のように、テモゾロミドは、細胞毒性のＤＮＡ傷害をもたらす第２世代のアルキル化（メチル化）剤であり、また未分化星状細胞腫（ＡＡ）の治療に認可されている。以下に示されるテモゾロミドの構造は、実験式：Ｃ６Ｈ６Ｎ６Ｏ２を有する。
【化１】
2014062084.tif 000002
テモゾロミド、分子量＝１９４．１５
実施形態において、テモゾロミドの塩、例えばＨＣｌ塩もまた、本明細書に記載の方法に使用可能である。
【００３９】
好適には、テモゾロミド（ＴＭＺ）の溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または他の適切な溶媒中に調製される。ＴＭＺの溶液は、任意の所望の濃度で調製可能である。実施形態において、溶液中のＴＭＺ濃度は、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好適には約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、もしくは約２００ｍＭである。
【００４０】
メルファランは、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤の分類に属する、抗腫瘍薬である。アルキル化剤は、ＤＮＡにアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）を添加する。それは、イミダゾール環の７位窒素原子において、アルキル基をＤＮＡのグアニン塩基に結合させる。以下に示されるメルファランの構造は、実験式：Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２を有する。
【化２】
2014062084.tif 000003
メルファラン、分子量＝３０５．２０
【００４１】
好適には、メルファランの溶液は、メルファランの溶解を促進するのに十分な塩酸を含有する無水エタノール、または他の適切な溶媒中に調製される。メルファランの溶液は、任意の所望の濃度で調製可能である。実施形態において、溶液中のメルファラン濃度は、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好適には約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、もしくは約２００ｍＭである。
【００４２】
好適には、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液を、無水エタノール、ＤＭＳＯ、水、またはリン酸緩衝液もしくはＨＥＰＥＳ緩衝液もしくはＴＲＩＳ緩衝液等の緩衝溶液等、適切な溶媒中に調製する。アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液は、任意の所望の濃度で調製可能である。実施形態において、溶液中のアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好適には約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、もしくは約２００ｍＭである。
【００４３】
広範な種類の脂質が、本明細書に記載の方法に有用である。公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５３２０号は、いくつかのカチオン性リポソームの調製について記載する。好適な脂質の例には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ならびにジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはコレステロール（ｃｈｏｌ）の混合物、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびＤＯＰＥおよび／またはｃｈｏｌの混合物が挙げられる。脂質の比率は、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、ペメトレキセド、またはイリノテカンのローディング効率、および特定の標的細胞種への取り込みを最適化するように変更することができる。リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質および１つ以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含んでもよい。カチオン性脂質（１つまたは複数）と中性またはヘルパー脂質（１つまたは複数）との望ましい比率は、約１：（０．５〜３）、好ましくは１：（１〜２）（モル比）である。本明細書に記載のカチオン性リポソームの調製に使用する例示的な脂質は、当該技術分野で周知であり、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。
【００４４】
本明細書に記載の方法の実施に有用な種々の脂質の比率の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
【００４５】
ＬｉｐＡ          ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ            モル比１：１
【００４６】
ＬｉｐＢ          ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ              モル比１：１
【００４７】
ＬｉｐＣ          ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ              モル比１：２
【００４８】
ＬｉｐＤ          ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ            モル比１：１
【００４９】
ＬｉｐＥ          ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ              モル比１：１
【００５０】
ＬｉｐＧ          ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ  モル比２：１：１
【００５１】
ＬｉｐＨ          ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ    モル比２：１：１
【００５２】
（ＤＯＴＡＰ＝１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、ＤＤＡＢ＝ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＰＥ＝ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ｃｈｏｌ＝コレステロール）。
【００５３】
本明細書に記載のように、脂質は、好適には、本明細書に記載の複合体の調製よりも前に、エタノール（例えば、無水エタノール）中に調製される。
【００５４】
複合体の脂質構成要素のエタノール中での可溶化に続いて、ＤＭＳＯまたは他の好適な溶媒中に溶解された、適切な量のＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを、脂質混合物に添加する。好適には、脂質混合物を、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの添加の前および最中、約５０〜６０℃の温度で維持する。
【００５５】
リポソームを調製するために、脂質およびＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液を、水溶液に注入し、リポソームを形成する。本明細書に使用される際の「注入」とは、脂質およびＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの溶液を、水溶液中に押し込むか、または詰め込むことを意味する。好適には、水溶液は水であるが、追加の緩衝剤および塩が、水溶液中に存在してもよい。実施形態において、水溶液は、内毒素を含まないＬＡＬ試薬水（好適には、０．００５ＥＵ／ｍｌ未満の内毒素含量を有する）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）である。好適には、シリンジまたは同様の装置を使用して注入を実行し、リポソームを生成する。実施形態において、水溶液を、脂質／ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセド溶液の添加中に急速に攪拌し、リポソームの形成を促進する。
【００５６】
本明細書に記載の方法に従って、所望の寸法およびゼータ電位特性を有するリポソームを形成するために、押出または超音波処理は必要ないことが、予想外に見出された。実施形態において、リポソームの超音波処理および／または押出は、開示される方法から、特に除外される。さらなる実施形態において、全体に記載の標的化されたカチオン性リポソームを調製する方法は、好適には、列挙される要素から構成されるか、または本質的に構成される。このような実施形態において、押出等の追加のステップは、このような方法への重大な改変であると見なされ、したがって、特に、本質的に列挙される要素から構成されるこのような方法から除外される。
【００５７】
脂質を（クロロホルム中で）共に混合し、蒸発乾固させ、溶液中において薬物を含有する水で再構成すること（薬物のリポソーム封入の一般的な手順）によるリポソームの調製では、均質的な集団を生成しなかった。光散乱による測定は、エラーに合致したキュムラントが高く、したがって、キュムラント分析のためにはデータ品質が乏し過ぎ、試料は、キュムラント分析には多分散し過ぎていたことを示す、品質報告を伴う乏しい結果をもたらした。この調製のＺ平均（ｄ−ｎｍ）は、７４３．９ｎｍであった（数平均）。
【００５８】
本明細書に記載の注入方法に従って形成されたテモゾロミド、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソームは、次に、リガンドと混合されて、標的化されたテモゾロミド、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソームを形成する。全体に記載されるように、リガンドは、カチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない。他の実施形態において、リガンドは、カチオン性リポソームと化学的に結合してもよい。
【００５９】
本明細書に使用される際、用語「リガンド」は、カチオン性リポソームと化学的に結合するか、または直接的に会合／複合するが化学的に結合しない、のいずれかであってもよい任意の好適な標的化部分を指す。リガンドがカチオン性リポソームと直接的に会合／複合する実施形態においては、リガンドをリポソームに複合するために使用される、リンカー、スペーサー、または他の架橋分子は存在しない。本発明の実施で用いる例示的なリガンドには、タンパク質（例えば、トランスフェリンまたは葉酸塩）、ペプチド（例えば、Ｌ−３７ｐＡ）、抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ’フラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を含む）、および糖類（例えば、ガラクトース）、ならびに他の標的化分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
例示的な実施形態において、抗体全体または抗体フラグメントを、リガンドとして使用して、本発明の複合体を作製することができる。好適な実施形態において、抗体のＦａｂフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、抗体フラグメントが使用される。１つの好適な抗体は、抗トランスフェリン受容体（抗ＴｆＲ）モノクローナル抗体であり、好適な抗体フラグメントは、抗ＴｆＲモノクローナルに基づくｓｃＦｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、このＭＡｂによって、おおよその分子量２６，０００の単一のポリペプチド鎖として認識される、ＴｆＲのエピトープのための完全な抗体結合部位を含有する。ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖からの構成要素ＶＨおよびＶＬの可変ドメインを、ＶＨ−ペプチド−ＶＬまたはＶＬ−ペプチド−ＶＨのいずれかの順序で、第１の可変領域のＣ末端および第２のＮ末端を架橋する、適切に設計されたペプチドと、それぞれ接続することによって形成される。全体に記載されるもの等の追加のリガンドもまた、本発明の実施に使用可能である。
【００６１】
一実施形態において、システイン部分が、ｓｃＦｖのＣ末端に追加される。理論に束縛されるものではないが、遊離スルフヒドリル基を供するシステインは、化学的結合および非化学結合の実施形態の両方において、抗体とリポソームとの間の複合体の形成を強化することができる。システインの有無に関わらず、タンパク質は、大腸菌封入体内に発現し、次いで再度折り畳まれ、活性形態の抗体フラグメントを生成することができる。
【００６２】
好適なリガンド、例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメントは、標的細胞の表面、好ましくは標的細胞上に異なった形で発現する受容体に、結合するようなものである。リガンドを、室温で、リガンド（例えば、タンパク質、抗体、または抗体フラグメント）：脂質の比率（重量：重量）が、約１：１０（０．０１：１）〜約１：５０、好適には約１：２０〜約１：４０（重量：重量）の範囲内で、カチオン性リポソームと混合する。好適には、リガンド：脂質の重量比は、約０．０１：１〜約０．５：１、約０．３：１〜約０．４：１、または約０．３３：１であり、これらの範囲内の任意の比率を含む。リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）およびリポソームを、室温で短時間、典型的には約１０〜１５分間、インキュベートさせる。
【００６３】
リポソーム複合体の寸法は、典型的に、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）ＮＡＮＯ−ＺＳを使用して、動的光散乱により測定した場合、約５〜１０００ｎｍの範囲内である。米国公開特許出願第２００３／００４４４０７号および米国特許出願第１１／５２０，７９６号を参照されたく、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。リポソームの寸法は、単一ピークにより示され、均質な寸法集団を表す。より好適には、リガンド添加前のリポソーム複合体の寸法は、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約６０ｎｍの範囲である。リガンド添加後のリポソーム複合体の寸法は、好適には、約５ ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約２００ｎｍである。
【００６４】
好適には、本明細書に記載のリポソームは、正のゼータ電位を有する。好適には、リガンドの添加前のリポソームのゼータ電位は、約１ｍＶ〜約２００ｍＶ、約１ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、または約３０ｍＶ〜約５０ｍＶである。リガンド添加後のリポソームの好適なゼータ電位は、約１ｍＶ〜約２００ｍＶ、約１ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、または約２５ｍＶ〜約５０ｍＶである。
【００６５】
実施形態において、本明細書に記載の複合体を形成するために使用されるリポソームは、立体的に安定したリポソームである。立体的に安定したリポソームは、ＰＥＧ、ポリ（２−エチルアクリル酸）、またはポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）等の親水性ポリマーが、中に統合されているリポソームである。このような修飾されたリポソームは、それほど修飾されていないリポソームと比較して、それらが、細網内皮系によって血流からそれほど迅速に除去されないため、特に有用な可能性がある。立体的に安定した本発明のリポソーム複合体を作製するために、テモゾロミド、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを含むカチオン性リポソームを、上述のように調製する。このリポソームに、ＰＥＧポリマーの溶液を、生理学的に許容される緩衝液に、約０．１：１００（ＰＥＧのｎｍｏｌ：リポソームのｎｍｏｌ）、好適には、約０．５：５０、例えば、約１：４０（ＰＥＧのｎｍｏｌ：リポソームのｎｍｏｌ）で、添加する。結果として得られた溶液を、リポソーム複合体にポリマーを統合するのに十分な時間、室温でインキュベートする。リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）を、次いで、室温で、リガンド（例えば、タンパク質）：脂質の比率約１：５〜約１：４０（重量：重量）で、安定化リポソーム複合体と混合する。
【００６６】
本明細書に記載のように、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）は、好適には、リガンドとリポソームとの間の相互作用（例えば、静電気、ファンデルワールス、または他の非化学的結合の相互作用）を介して、リポソームと直接的に会合する（複合する）。一般的に、非化学的結合の場合、リガンドおよびリポソームを結合させるために、リンカーまたはスペーサー分子（例えば、ポリマーまたは他の分子）を使用しない。
【００６７】
本明細書に記載のように、追加の実施形態において、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）は、例えば、マレイミジル基または他のスルフヒドリル反応基を含有するカチオン性リポソームと、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）上の硫黄原子との間の化学的相互作用を介して、カチオン性リポソームと化学的に結合する。直接的な化学結合のこのような方法は、２００１年１０月１日に出願された、米国特許出願第０９／９１４，０４６号に開示され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６８】
本方法およびリポソームでの使用に好適な脂質：テモゾロミドの比率は、全体に記載される。例示的な実施形態において、脂質：テモゾロミドのモル比は、約０．１：１〜約１：１００、約０．０５：１〜約１：５０、約１：１〜約１：２０、約２：１〜約１０：０．１、約０．５：１〜約２：１、または約１：１である。
【００６９】
本方法およびリポソームにおける使用に好適な脂質：メルファランの比率は、全体に記載される。例示的な実施形態において、脂質：メルファランのモル比は、約０．１：１〜約１：１００、約０．０５：１〜約１：５０、約１：１〜約１：２０、約２：１〜約１０：０．１、約０．５：１〜約２：１、または約１：１である。
【００７０】
本方法およびリポソームにおける使用に好適な脂質：アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの比率は、全体に記載される。例示的な実施形態において、脂質：アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのモル比は、約０．１：１〜約１：１００、約０．０５：１〜約１：５０、約１：１〜約１：２０、約２：１〜約１０：０．１、約０．５：１〜約２：１、または約１：１である。
【００７１】
ＴＭＺリポソームの封入効率は、好ましくは、封入されたＴＭＺが約２０％〜約１００％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、または約２０％〜約５５％の範囲である。これは、リポソーム内へＴＭＺを封入するためのエタノール注入方法の予期せぬ驚くべき結果である。
【００７２】
メルファランのリポソームに対する封入効率は、好ましくは、封入されたメルファランが、約２０％〜約１００％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、または約２０％〜約４０％の範囲である。これは、リポソーム内へメルファランを封入するためのエタノール注入方法の予期せぬ驚くべき結果である。
【００７３】
アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのリポソームに対する封入効率は、好ましくは、封入されたアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドが、約２０％〜約１００％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、または約２０％〜約４０％の範囲である。これは、リポソーム内へアトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを封入するための、エタノール注入方法の予期せぬ驚くべき結果である。
【００７４】
追加の実施形態において、リポソームはまた、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）製のＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（ＨＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）ペプチド等の、リポソームと会合するエンドソーム破壊ペプチドを含んでもよい。エンドソーム破壊ペプチドＨｏＫＣは、細胞の細胞質中で、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、ペメトレキセド、またはイリノテカンの放出を助けることができる。このような実施形態において、リポソームは、好適には、全脂質の５モルパーセントで、ＭＰＢ−ＤＯＰＥもまた含む。ＨｏＫＣペプチド（Ｋ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ）は、末端システインを担持するため、ペプチドのリポソームへの結合を可能にするために、ＭＰＢ−ＤＯＰＥが含まれる。Ｌｉｐ−ＨｏＫＣリポソームを、マレイミド基（Ｌｉｐ−ＭＰＢ）を担持するカチオン性リポソームとペプチドとの間のカップリング反応を使用して、調製した。システイン上に遊離チオール基を有するペプチドの０．１ ｍｍｏｌのアリコートを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の溶液中の２ｍｍｏｌのＬｉｐ−ＭＰＢに添加し、室温で２時間回転させた（２０〜３０ｒ．ｐ．ｍ．）。
【００７５】
本発明に従って調製されるリポソームの複合体は、インビボ投与のための薬理学的に許容される剤形として製剤化することができる。複合体を、薬理学的に適合性のあるビヒクルまたは担体と合わせることができる。組成物は、例えば、複合体中のＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの投与により利益を得るであろう哺乳動物、例えばヒト患者への静脈内投与用に、製剤化することができる。複合体を適切に寸法調整することにより、静脈内投与後に全身に分布される。あるいは、複合体は、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、舌下（ＳＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介して等、他の投与経路を介して送達されてもよい。このような方法を介する送達、およびこのような方法を使用する送達のための剤形の調製は、当該技術分野で周知である。
【００７６】
複合体は、脂質の選択および比率、リガンド（例えばタンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）とリポソームとの比率、リガンドおよびリポソームと、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドとの比率、ならびにリガンドの選択を通じて、標的細胞種に対して最適化することができる。
【００７７】
本発明の方法に従って作製された複合体は、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドの送達用のキットの形態で提供されてもよい。好適なキットは、別個の好適な容器内に、標的化されたＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのカチオン性リポソーム複合体（好適には、乾燥した凍結乾燥粉末）および好適な緩衝液を含むことができる。構成要素を、滅菌条件下において、適切な順序で混合し、一般的には調製後約３０分〜約２４時間の妥当な時間内で患者に投与することができる。リポソームは、好適には、適切な緩衝液、オスモル濃度制御剤等と共に、注入用滅菌水中に調製される。完全な複合体は、好適には、乾燥粉末（凍結乾燥）として製剤化される（例えば、米国公開特許出願第２００５／０００２９９８号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
本発明のカチオン性リポソーム複合体は、好適には、その表面上に、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体分子（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含む。この標的化分子が、血液脳関門を越える送達、および脳腫瘍細胞への標的化された送達を強化することがわかっている。標的化されたリポソームはまた、体内の他の癌の治療、および他の薬物の送達に使用することができる。
【００７９】
全体に記載される方法に従って調製されたカチオン性リポソーム複合体もまた、提供する。例えば、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、もしくは抗体フラグメント）、およびＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、ペメトレキセド、またはイリノテカンを含み、リガンドが、カチオン性リポソームと直接的に複合／会合するが、化学的に結合しない、リガンド標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、もしくは抗体フラグメント標的化）カチオン性リポソーム複合体を提供する。
【００８０】
ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドは、カチオン性リポソーム内に（すなわち、リポソームの親水性の水溶性内部に）封入されるか、カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域内に含有されるか、カチオン性リポソームの内側または外側の単分子層（例えば、頭部基領域）と結合してか、またはその任意の組み合わせで、封入することができる。好適には、本発明のカチオン性リポソームは、単層リポソーム（すなわち、単一の二重層）であるが、複数の同心円二重層を備える多重層リポソームもまた使用可能である。単一二重層の本発明のカチオン性リポソームは、中にＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを封入することができる内部が水溶性の容積を備える。それらはまた、中にＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを含有することができる、炭化水素鎖領域（すなわち、脂質の脂質鎖領域）を有する単一の二重層を備える。さらに、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドは、リポソーム膜（すなわち、脂質の頭部基領域）の内側単分子層および／または外側単分子層のいずれか、または両方と、複合または会合することができる。さらなる実施形態において、ＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドは、本発明のカチオン性リポソーム複合体のこれらの領域のうちのいずれかまたは全ての中に、封入／会合／複合することができる。
【００８１】
さらなる実施形態において、全体に記載されるリガンド標的化されたカチオン性リポソーム複合体を含む薬学的組成物を提供する。好適な実施形態において、本薬学的組成物は、１つ以上の抗菌剤（例えば、アムホテリシンＢ、クロルテトラサイクリン、ゲンタマイシン、ネオマイシン）、１つ以上の保存剤（例えば、塩化ベンゼトニウム、ＥＤＴＡ、ホルムアルデヒド、２−フェノキシエタノール）、１つ以上の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム）、１つ以上の界面活性剤（ポリソルベート２０、８０）、１つ以上のタンパク質安定剤（例えば、アルブミン、ラクトース、グルタミン酸カリウム）、例えばスクロースまたはデキストロースである糖類、ならびにアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）からなる群から選択される、１つ以上の賦形剤をさらに含む。さらなる賦形剤は、当該技術分野で周知であり、本発明の実施において容易に使用可能である。
【００８２】
カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）、およびＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを含み、リガンドが、カチオン性リポソームと直接的に複合／会合するが、化学的に結合されない、第１のリガンド標的化カチオン性リポソーム複合体を含む薬学的組成物もまた、提供する。さらなる実施形態において、リガンドは、カチオン性リポソームに、化学的に結合してもよい。薬学的組成物はまた、好適には、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）、１つ以上の核酸分子（プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス核酸を含む）を含み、リガンドが、カチオン性リポソームと直接的に複合／会合するが、化学的に結合しない、第２のリガンド標的化カチオン性リポソーム複合体を含む。（米国特許第７，７８０，８２２号、および米国公開特許出願第２００７／００６５４４９号を参照されたく、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態において、本組成物はまた、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）、および１つ以上の小分子（米国公開特許出願第２００７／０２３１３７８号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、または１つ以上の造影剤（米国公開特許出願第２００７／０１３４１５４号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含み、リガンドが、カチオン性リポソームと直接的に複合／会合するが、化学的に結合しない、リガンド標的化カチオン性リポソーム複合体を含んでもよい。さらなる実施形態において、リガンドは、このような組成物中で、カチオン性リポソームと化学的に結合してもよい。
【００８３】
カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）、およびＴＭＺ、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドを含み、リガンドが、カチオン性リポソームと直接的に複合／会合するが、化学的に結合しない、第１のリガンド標的化カチオン性リポソーム複合体を含む薬学的組成物もまた、提供する。さらなる実施形態において、リガンドは、カチオン性リポソームに化学的に結合してもよい。本薬学的組成物はまた、好ましくは、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体、または抗体フラグメント）、ならびに１つ以上の核酸分子（プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス核酸を含む）、１つ以上の小分子、または１つ以上の造影剤（超常磁性酸化鉄、またはガドリニウムを含む）を含み、核酸分子、小分子、または造影剤が、癌細胞内で、ＭＧＭＴの作用を下方制御、修正、またはそうでなければ打ち消す、第２のリガンド標的化カチオン性リポソーム複合体を含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、患者における癌を治療する方法を提供する。好適には、このような方法は、本明細書に記載の標的化されたカチオン性リポソーム複合体を、患者に投与することを含む。好適には、本複合体は、全体を通じて記載される方法に従って調製される。
【００８５】
実施形態において、治療方法は、標的化されたテモゾロミドまたはメルファランのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含み、本カチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、テモゾロミドまたはメルファラン、ならびにカチオン性リポソームと複合するが、化学的に結合しない、リガンドを含む。
【００８６】
全体に記載されるように、リガンドは、好適には、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントを含む、抗体、抗体フラグメント、またはタンパク質である。例示的な実施形態において、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である。
【００８７】
標的化されたアトロピンのカチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者における有機リン中毒（すなわち、神経ガス中毒）を治療する方法もまた提供し、標的化されたアトロピンのカチオン性リポソーム複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、アトロピン、ならびにカチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しないリガンドを含む。例示的なリガンドは、本明細書に記載される。
【００８８】
好適には、テモゾロミドは、本明細書に記載の方法を利用して、約１ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の用量で、より好適には、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２、もしくは約５０ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２、約８０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２、または約５０ｍｇ／ｍ２、約６０ｍｇ／ｍ２、約７０ｍｇ／ｍ２、約８０ｍｇ／ｍ２、約９０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１１０ｍｇ／ｍ２、約１２０ｍｇ／ｍ２、約１３０ｍｇ／ｍ２、約１４０ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約１６０ｍｇ／ｍ２、約１７０ｍｇ／ｍ２、約１８０ｍｇ／ｍ２、約１９０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２１０ｍｇ／ｍ２、約２２０ｍｇ／ｍ２、約２３０ｍｇ／ｍ２、約２４０ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約２６０ｍｇ／ｍ２、約２７０ｍｇ／ｍ２、約２８０ｍｇ／ｍ２、約２９０ｍｇ／ｍ２、もしくは約３００ｍｇ／ｍ２の用量で、患者に投与される。
【００８９】
好適には、メルファランは、本明細書に記載の方法を利用して、約１ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量で、より好適には約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２、または約１ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２、約５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２、もしくは約６ｍｇ／ｍ２〜約１６ｍｇ／ｍ２、または約１ｍｇ／ｍ２、約２ｍｇ／ｍ２、約３ｍｇ／ｍ２、約４ｍｇ／ｍ２、約５ｍｇ／ｍ２、約６ｍｇ／ｍ２、約７ｍｇ／ｍ２、約８ｍｇ／ｍ２、約９ｍｇ／ｍ２、約１０ｍｇ／ｍ２、約１１ｍｇ／ｍ２、約１２ｍｇ／ｍ２、約１３ｍｇ／ｍ２、約１４ｍｇ／ｍ２、約１５ｍｇ／ｍ２、約１６ｍｇ／ｍ２、約１７ｍｇ／ｍ２、約１８ｍｇ／ｍ２、約１９ｍｇ／ｍ２、約２０ｍｇ／ｍ２、約２１ｍｇ／ｍ２、約２２ｍｇ／ｍ２、約２３ｍｇ／ｍ２、約２４ｍｇ／ｍ２、もしくは約２５ｍｇ／ｍ２の用量で、患者に投与される。
【００９０】
好適には、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドは、本明細書に記載の方法を利用して、約１ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の用量で、より好適には、約１０ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２、もしくは約５０ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２、約８０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２〜約２５０ｍｇ／ｍ２、または約５０ｍｇ／ｍ２、約６０ｍｇ／ｍ２、約７０ｍｇ／ｍ２、約８０ｍｇ／ｍ２、約９０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１１０ｍｇ／ｍ２、約１２０ｍｇ／ｍ２、約１３０ｍｇ／ｍ２、約１４０ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約１６０ｍｇ／ｍ２、約１７０ｍｇ／ｍ２、約１８０ｍｇ／ｍ２、約１９０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２１０ｍｇ／ｍ２、約２２０ｍｇ／ｍ２、約２３０ｍｇ／ｍ２、約２４０ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約２６０ｍｇ／ｍ２、約２７０ｍｇ／ｍ２、約２８０ｍｇ／ｍ２、約２９０ｍｇ／ｍ２、もしくは約３００ｍｇ／ｍ２の用量で、患者に投与される。
【００９１】
実施形態において、アトロピンは、本明細書に記載の方法を利用して、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で、より好適には約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、もしくは約１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約２ｍｇ〜約６ｍｇ、または約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、もしくは約２０ｍｇの用量で、患者に（好適には筋肉内）投与される。
【００９２】
本明細書に記載のように、実施形態において、本明細書に記載の方法での使用のためのカチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミド、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのモル比は、約０．１：１〜約５：１である。より好適には、カチオン性リポソーム中の脂質：テモゾロミド、メルファラン、アトロピン、イリノテカン、またはペメトレキセドのモル比は、約０．１：１〜約１：１００、約０．０５：１〜約１：５０、約１：１〜約１：２０、約２：１〜約１０：０．１、約０．５：１〜約２：１、または約１：１である。
【００９３】
本明細書に記載の方法での使用のための、リガンド：カチオン性リポソーム中の脂質の重量比は、好適には、約０．０１：１〜約０．５：１である。好適には、リガンド：カチオン性リポソーム中の脂質の重量比は、約０．０１：１〜約０．５：１、約０．３：１〜約０．４：１、または約０．３３：１であり、これらの範囲内のいずれの比率をも含む。
【００９４】
好適な投与方法には、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓａｌ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡的、局所的、筋肉内（ＩＭ）、舌下（ＳＬ）、皮内（ＩＤ）、眼球内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放性インプラント、もしくは皮下投与、または浸透圧もしくは機械式ポンプを使用する投与を介するものが挙げられるが、これらに限定されない。それらは、ボーラスとして、または注入として投与されてもよい。追加の実施形態において、リガンドは、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野で既知の種々の方法を使用して、カチオン性リポソームと化学的に結合することができる。
【００９５】
本明細書に記載の方法を使用して治療可能な例示的な癌には、頭頸部癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、神経膠芽腫および星状細胞腫を含む脳腫瘍、神経内分泌癌、子宮頸癌、肺癌、肝臓癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、黒色腫、網膜芽腫、卵巣癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、ならびに血液の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームは、血液脳関門を通過することができることが見出されている。一般的に、この関門は、脳の癌および他の疾患または症状を治療するように設計された治療、または薬物を脳に送達するように設計された他の治療に対して重大な障害である。したがって、実施形態において、本明細書に記載の方法は、神経膠腫を含む脳腫瘍の成功的治療、および一般的には、血液脳関門を越える薬物の送達において有用である。
【００９７】
別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、有機リン中毒の治療としても有用である。
【００９８】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームは、標準的な非封入型ＴＭＺに耐性のある標的腫瘍細胞へ、十分なＴＭＺを効果的に送達して、活性化ＭＧＭＴに起因する場合のあるそれら固有の耐性を克服することができ、これらの腫瘍細胞が、今度はＴＭＺに応答することをもたらすことが見出されている。
【００９９】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームは、標的化されたカチオン性リポソームなしで投与されたＴＭＺの致死効果に耐性の腫瘍細胞において、細胞死（アポトーシス）の誘発が可能であることが見出されている。
【０１００】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームは、腫瘍内の、癌幹細胞（ＣＳＣ）ならびに分化癌細胞（非ＣＳＣ）において、標的化されたカチオン性リポソームなしで投与されたＴＭＺに対するそれらの応答に関係なく、アポトーシスを誘発することができることが、見出されている。
【０１０１】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームによって誘発されたアポトーシスのレベルは、腫瘍内の分化癌細胞（非ＣＳＣ）よりも、癌幹細胞（ＣＳＣ）で、比例的に高いことがわかっている。
【０１０２】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームでの腫瘍の治療は、腫瘍増殖の阻害を誘発するだけでなく、腫瘍の退縮をももたらし、さらにこの応答は、治療を終えた後でさえも維持可能であることが見出されている。
【０１０３】
本明細書に記載のように、驚くべきことに、本開示の方法によって調製される標的化されたカチオン性リポソームでの腫瘍細胞の治療は、細胞増殖の阻害を誘発するだけでなく、腫瘍の退縮をももたらし、この応答は、治療を終えた後でさえも維持可能であることが見出されている。
【０１０４】
好適な実施形態において、本方法は、標的化されたテモゾロミドのカチオン性リポソーム複合体と組み合わせて、患者に追加的治療を施すことをさらに含む。利用可能な例示的な治療法には、化学療法剤、小分子、放射線療法、または核酸系療法を施すことが挙げられる。例示的な化学療法剤には、ドセタキセル、ミトキサントロン、ドキソルビシン、およびゲムシタビンが挙げられる。例示的な小分子には、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、塩酸エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））、リンゴ酸スニチニブ（ＳＵ１１２４８、ＳＵＴＥＮＴ（商標））、およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な核酸の酸系療法（腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡを含む）には、米国公開特許出願第２００７／００６５４９９号および米国特許第７，７８０，８８２号に記載のようなものが含まれ、それぞれの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。好適な実施形態において、核酸系療法は、米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように、ｗｔｐ５３遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを含み、ＴｆＲｓｃＦｖ（ｓｃＬ−ｐ５３）を介して標的化される、カチオン性リポソーム複合体の投与を含む。
【０１０５】
米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように、カチオン性リポソーム複合体を患者に投与することを含む、患者の脳腫瘍を治療する方法もまた提供する。好適には、複合体は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム、野生型ｐ５３を発現するプラスミドＤＮＡ、ならびにカチオン性リポソームと直接的に複合するが、化学的に結合しない抗トランスフェリン受容体単鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）を含む。本方法は、好適にはカチオン性リポソーム複合体の投与と同時に、またはその後に、テモゾロミドを投与することをさらに含む。
【０１０６】
本明細書に記載の方法および適用に対する他の好適な修正および適応が、本発明またはそのあらゆる実施形態の範囲から逸脱することなくなされてもよいことは、関連技術分野の当業者には容易に明らかであろう。これまで本発明を詳細に記載してきたが、同じことは、本明細書に例示の目的のみで含まれ、本明細書を制限することを意図するものではない、以下の実施例への参照により、より明確に理解されるであろう。
実施例１
テモゾロミドを含むカチオン性リポソームの調製
材料：
【０１０７】
ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、塩化物）
Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８９０８９０Ｅ、分子量６９８．５５
濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０１０８】
ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）
Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８５０７２５Ｅ、分子量７４４．０４
濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０１０９】
テモゾロミド（ＴＭＺ、分子量１９４．１５）、粉末
Ｓｉｇｍａから入手、Ｃａｔ．＃Ｔ２５７７-１００ｍｇ
ＴＭＺを、所望の濃度まで純粋ＤＭＳＯ中に溶解する。例えば、１９．４１５ｍｇ／ｍｌ＝１００ｍＭのＴＭＺ、２８ｍｇ／ｍｌ＝１４４．２１８ｍＭのＴＭＺ
【０１１０】
超高純度の、内毒素を含まないＬＡＬ試薬水（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｔ．＃Ｗ５０−５００、内毒素０．００５ＥＵ／ｍｌ未満）
【０１１１】
注入器：２２ゲージ針（ｐａｒｔ＃８１３６５）を有する１ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｇａｓｔｉｇｈｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＃８１２３０）
手順：
【０１１２】
１）新たなＴＭＺ溶液を、高速で５〜１０分間ボルテックスすることにより（透明になるはず）、ＴＭＺを所望の濃度までＤＭＳＯ中に溶解することによって、調製する。溶液を、脂質と混合するために使用するまで、室温で保管する。
【０１１３】
２）脂質溶液を、１０〜１５分間３７℃に設置する。脂質溶液を、次いで、６５℃の水浴内に、時折振動させて、５分間設置する。
【０１１４】
３）Ｌｉｐ−ＴＭＺの調製：５０℃〜６０℃に設定された熱板上に、攪拌棒を有する茶色のガラス瓶を設置する。飛散させることなく高速で攪拌しながら、脂質およびＴＭＺを、次の順序で瓶に加える。本明細書に記載の他の構成成分の比率および濃度は、以下に示されるものと同一のプロトコルを使用して調製可能であることに留意されたい。
【０１１５】
モル比０．５：１（Ｌｉｐ：ＴＭＺ）（製剤中２ｍＭのＴＭＺ）について
ＤＯＴＡＰ    ８７．５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝２．５μｍｏｌ、または１．７５ｍｇ
ＤＯＰＥ      ９３．７５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝２．５μｍｏｌ、または１．８７５ｍｇ
ＴＭＺ−ＨＣｌ溶液１００μｌ（１９．４１ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌを添加し、
【０１１６】
３つ全てを添加した後、３分間攪拌を継続する
【０１１７】
モル比１：１（Ｌｉｐ：ＴＭＺ）（製剤中２ｍＭのＴＭＺ）について
ＤＯＴＡＰ    １７５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．５ｍｇ
ＤＯＰＥ      １８７．５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．７５ｍｇ
ＴＭＺ−ＨＣｌ溶液１００μｌ（１９．４１ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌを添加し、
【０１１８】
３つ全てを添加した後、３分間攪拌を継続する
【０１１９】
モル比１：１（Ｌｉｐ：ＴＭＺ）（製剤中８ｍＭのＴＭＺ）について
ＤＯＴＡＰ    ５６０μｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）＝２０μｍｏｌ、または１４ｍｇ
ＤＯＰＥ      ６００μｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）＝２０μｍｏｌ、または１５ｍｇ
ＴＭＺ溶液２７７．３６μｌ（２８ｍｇ／ｍｌ）＝４０μｍｏｌを添加し、
【０１２０】
３つ全てを添加した後、３分間攪拌を継続する
【０１２１】
モル比２：１（Ｌｉｐ：ＴＭＺ）（製剤中２ｍＭのＴＭＺ）について
ＤＯＴＡＰ    ３５０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌ、または７ｍｇ
ＤＯＰＥ      ３７５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌ、または７．５ｍｇ
ＴＭＺ−ＨＣｌ溶液１００μｌ（１９．４１ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌを添加し、
【０１２２】
３つ全てを添加した後、３分間攪拌を継続する
【０１２３】
４）４ｍＬのＬＡＬ水を、攪拌棒を有する茶色のガラス瓶中で、水浴で６５℃まで温める。脂質−ＴＭＺ溶液の添加直前に、瓶を熱板（５０℃〜６０℃）に移動させる。飛散させることなく、水を数秒間高速で攪拌し、攪拌棒から気泡を除去する。
【０１２４】
５）水を熱板上に保持する。脂質の添加中、（飛散させることなく）水を高速で攪拌し続ける。脂質およびＴＭＺを上述のように混合した後、即座に、および可能な限り迅速に、注入用のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、熱板（５０℃〜６０℃）上の熱水に、混合物を渦の中心に直接注入する。脂質混合物の添加後、軽く蓋をしながら、１分間（飛散させることなく）高速で攪拌を継続する。
【０１２５】
６）ガラス瓶を、室温の攪拌プレートに移動し、軽く蓋をした溶液が、２０〜２５℃（室温）に冷めるまで、ゆっくりと攪拌を続ける。
【０１２６】
７）室温のＬＡＬ水で、体積を５ｍｌに調整する。
【０１２７】
８）必要であれば、０．２２μｍ細孔のＭｉｌｅｘ  ＧＶフィルタを使用して、溶液を濾過する。
【０１２８】
９）必要であれば、粒径およびゼータ電位を測定する。
【０１２９】
これらの調製方法の結果は、約２０〜６０ｎｍの粒径および約３０〜５０ｍＶのゼータ電位を有するＴＭＺおよびリポソームの、おおよそ少なくとも３０〜４０％の装填、好適には少なくとも５０〜５５％のローディングを示す。
実施例２
化学結合なしでの（単純な混合による）ｓｃＬ−ＴＭＺの調製
【０１３０】
実施例１に記載の手順に従って調製されたＴＭＺ含有のカチオン性リポソームを使用して、本明細書に記載のリガンド標的化されたＴＭＺのカチオン性リポソーム複合体を、構成成分の単純な混合によって、化学結合なしで調製する。複合体の調製は、次の一般手順に従った。
【０１３１】
リポソーム−水（または緩衝液）に、適切な量の標的部分を添加して、所望の比率を得、５〜１０秒の穏やかな反転により混合する。標的部分は、トランスフェリンもしくは葉酸、または他のタンパク質を含むがこれらに限定されない、リガンドであってもよい。それは、トランスフェリンまたはＨＥＲ−２受容体（例えば、ＴｆＲｓｃＦｖ）を含むがこれらに限定されない、細胞表面受容体を標的化する、抗体または抗体フラグメントであってもよい。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、５〜１０秒間、再度穏やかに反転させる）。所望の最終体積を得るためには、標的部分−Ｌｉｐ−ＴＭＺの混和物を、所望の体積を得るために必要な任意の体積（なしを含む）の水（好ましくは、脱イオン水）、またはトリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、もしくはリン酸緩衝生理食塩水を含むがこれらに限定されない任意のｐＨの緩衝液と混合し、５〜１０秒間穏やかに反転させて混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０１３２】
典型的に、インビトロアッセイにおける使用のためには、最終的な複合体中のＴＭＺの量は、１ウェルあたり約１μＭ〜３００μＭであることが望ましく、インビボ使用のためには、１回の注入につき、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇのＴＭＺを提供することが望ましい。インビボでの使用のために、デキストロースまたはスクロースを、最後に、約１〜５０％（Ｖ：Ｖ）のデキストロースまたはスクロース、好適には５％デキストロースまたは１０％スクロースの最終濃度まで添加し、５〜１０秒間穏やかな反転により混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０１３３】
好適な比率１：３０（抗体フラグメント：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１リポソーム：ＴＭＺ（モル比）での具体的な例は、次の通りである。おおよそ７００ｕＬの最終体積については、２５ｍｇ／ｋｇ／注入のＴＭＺ濃度で、３１９μＬのＬｉｐ：ＴＭＺ（８ｍＭストック）を３０５μＬの抗体フラグメントと、（抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント［ＴｆＲｓｃＦｖ］濃度０．２ｍｇ／ｍＬで）混合する。６μＬの水または緩衝液、ならびに最後のステップとして、７０μＬの５０％デキストロースまたは水もしくは緩衝液なし、および１４０ｕＬの５０％スクロースを添加する。
【０１３４】
好ましい比率１：３０（抗体フラグメント：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１のリポソーム：ＴＭＺ（モル比）での第２の具体的な実施例は、以下の通りである。おおよそ１．８ｍＬの最終体積に対して、２５ｍｇ／ｋｇ／注入のＴＭＺ濃度で、１２７６μＬのＬｉｐ：ＴＭＺ（２ｍＭストック）を、３０５μＬの抗体フラグメントと、（抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント［ＴｆＲｓｃＦｖ］の濃度０．２ｍｇ／ｍＬで）混合する。３９μＬの水または緩衝液を添加し、１８０μＬの５０％デキストロースを最後のステップとして添加する。
【０１３５】
好ましい比率１：３０（抗体フラグメント：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１のリポソーム：ＴＭＺ（モル比）での別の具体的な実施例は、以下の通りである。おおよそ４００μＬの最終体積に対して、５ｍｇ／ｋｇ／注入のＴＭＺ濃度で、２８０μＬのＬｉｐ：ＴＭＺ（２ｍＭストック）を、６４μＬの抗体フラグメントと、（抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント［ＴｆＲｓｃＦｖ］の濃度０．２ｍｇ／ｍＬで）混合する。１６．５μＬの水または緩衝液を添加し、４０μＬの５０％デキストロースを、最後のステップとして添加する。
【０１３６】
本方法によって調製される最終的な複合体の寸法（数平均）は、約１０〜８００ｎｍ、好適には約２０〜４００ｎｍ、最も好適には約２５〜２００ｎｍであり、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳを使用して、動的光散乱により測定されるゼータ電位は約１〜１００ｍＶ、より好適には１０〜６０ｍＶ、最も好適には２５〜５０ｍＶである。この寸法は、効果的に、腫瘍の毛細血管床を通過するか、または血液脳関門を通過し、腫瘍細胞に到達するのに十分小さい。
実施例３
テモゾロミドを含む標的化されたカチオン性リポソームのインビトロ効果
【０１３７】
ヒト多発性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞系Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｕ８７は、グレードＩＶの神経膠芽腫から誘導され、ｗｔｐ５３を担持する（Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ  ＥＧ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ，Ｔａｄａ  Ｍ，Ｌｉ  Ｈ，Ｄｉｓｅｒｅｎｓ  Ａ  Ｃ，Ｗｏｊｃｉｋ  Ｂ  Ｅ，Ｈｕａｎｇ  Ｈ  Ｊ  Ｓ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ，Ｄｅｔｒｉｂｏｌｅｔ  Ｎ  ａｎｄ  Ｃａｖｅｎｅｅ  Ｗ  Ｋ（１９９４）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ５３  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：ｐｐ６４９−６５２）。腫瘍の増殖および応答をＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｘｅｎｏｇｅｎにより監視する、インビボ研究での使用のために、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＵ８７ＭＧの変形を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ヒトＧＢＭ細胞系Ｕ２５１を、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ならびに各５０μｇ／ｍＬのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシン（ＰＳＮ）を補充した、修飾ＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、Ｕ８７およびＵ８７ＭＧ−ｌｕｃ２細胞）、ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、Ｔ９８Ｇ細胞）、またはＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｕ２５１細胞）において、５％ＣＯ２の大気中で、３７℃で維持した。細胞を、７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用したトリプシン処理をしてから次の継代またはさらなる実験をした。ナトリウム３′−［１−（フェニルアミノ−カルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸（ＸＴＴ）を、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から購入した。
【０１３８】
ヒト多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ−１１を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、ならびに各５０μｇ／ｍＬのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシン（ＰＳＮ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において、５％ＣＯ２の大気中で、３７℃で維持した。細胞を、７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させ、次の継代またはさらなる実験をした。これらの細胞は、懸濁液中で、単分子層としてではなく増殖する。
【０１３９】
Ｕ８７ＭＧは、ＴＭＺ感受性であるとして分類される（Ｐａｔｉｌ  Ｒ，Ｐｏｒｔｉｌｌａ−Ａｒｉａｓ  Ｊ，Ｄｉｎｇ  Ｈ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，Ｋｏｎｄａ  Ｂ，Ｈｕ  Ｊ  Ｗ，Ｗａｗｒｏｗｓｋｙ  Ｋ  Ａ，Ｓｈｉｎ  Ｐ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  Ｋ  Ｌ，Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  Ｊ  Ｙ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｏｌｙ（Ｂｅｔａ−Ｌ−Ｍａｌｉｃ  Ａｃｉｄ）．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：ｐｐ  ２３１７−２３２９）。これは、しっかりと確立されたＧＢＭの同所性マウスモデルである（Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌａｎｇ  Ｆ，Ｘｉｅ  Ｘ，Ｐｒａｂｈｕ  Ｓ，Ｘｕ  Ｊ，Ｓａｍｐａｔｈ  Ｄ，Ａｌｄａｐｅ  Ｋ，Ｆｕｌｌｅｒ  Ｇ  ａｎｄ  Ｐｕｄｕｖａｌｌｉ  Ｖ  Ｋ（２０１１）Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＲＡＩＬ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ  ２）。Ｕ８７ＭＧ細胞は、５×１０５個の細胞を無胸腺ヌードマウスの頭蓋内に注入した場合、１０日間以内に、腫瘍を再現性よく発達させる。マウスは、腫瘍負荷のために、３０〜４０日以内に死に至る。Ｔ９８Ｇもまた、ヒト神経膠芽腫から単離する。しかしながら、この細胞系は、ＴＭＺ耐性であることが既知であり（Ｐａｔｉｌ  Ｒ，Ｐｏｒｔｉｌｌａ−Ａｒｉａｓ  Ｊ，Ｄｉｎｇ  Ｈ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，Ｋｏｎｄａ  Ｂ，Ｈｕ  Ｊ  Ｗ，Ｗａｗｒｏｗｓｋｙ  Ｋ  Ａ，Ｓｈｉｎ  Ｐ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  Ｋ  Ｌ，Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  Ｊ  Ｙ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｏｌｙ（Ｂｅｔａ−Ｌ−Ｍａｌｉｃ  Ａｃｉｄ）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：ｐｐ２３１７−２３２９）、ｐ５３遺伝子からの突然変異型を担持する（Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ  ＥＧ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ，Ｔａｄａ  Ｍ，Ｌｉ  Ｈ，Ｄｉｓｅｒｅｎｓ  Ａ  Ｃ，Ｗｏｊｃｉｋ  Ｂ  Ｅ，Ｈｕａｎｇ  Ｈ  Ｊ  Ｓ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ，Ｄｅｔｒｉｂｏｌｅｔ  Ｎ  ａｎｄ  Ｃａｖｅｎｅｅ  Ｗ  Ｋ（１９９４）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ５３  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：ｐｐ６４９−６５２）。Ｔ９８Ｇ異種移植腫瘍を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）中の５〜１０×１０６個の細胞の皮下接種を介して、誘発する（Ｔｏｒｒｅｓ  Ｓ，Ｌｏｒｅｎｔｅ  Ｍ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｏｒｎｅｓ  Ｆ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｉｅｄｒａ  Ｓ，Ｓａｌａｚａｒ  Ｍ，Ｇａｒｃｉａ−Ｔａｂｏａｄａ  Ｅ，Ｂａｒｃｉａ  Ｊ，Ｇｕｚｍａｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｖｅｌａｓｃｏ  Ｇ（２０１１）Ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｍｏ��ｏｌｏｍｉｄｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｇｌｉｏｍａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０：ｐｐ９０−１０３）。両方の細胞系が、ＴｆＲ発現を高めた（Ｓａｎｇ  Ｈ，Ｋｅｌｌｅｙ  Ｐ  Ｙ，Ｈａｔｔｏｎ  Ｊ  Ｄ  ａｎｄ  Ｓｈｅｗ  Ｊ  Ｙ（１９８９）Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ７１：ｐｐ８３−９０）。
【０１４０】
標準的な遊離型（非封入型）ＴＭＺおよび非リガンド化ＴＭＺ含有リポソーム（Ｌｉｐ−ＴＭＺ）の効果を比較するために、研究を行った。Ｌｉｐ−ＴＭＺは、２ｍＭの濃度のリポソームを使用して、実施例１で上述の通りに調製した。Ｌｉｐ−ＴＭＺ分子のゼータ電位は、３５．６〜４０．１ｍＶの範囲に及んだ。使用したＴＭＺの濃度は、１〜約２５０ｕＭで変化した。リポソームのＴＭＺに対する比率は、０．５：１、１：１、または２：１（モル比）であった。
【０１４１】
ヒト脳腫瘍を誘導したＵ２５１細胞を、１ウェルあたり２×１０３個で、９６ウェルプレートに３組設置した。一晩のインキュベーションに続いて、培地を無血清培地に置き換え、１００μＬの指定濃度のＬｉｐ−ＴＭＺまたは遊離型ＴＭＺのいずれかを重ね、５時間インキュベートし、次いでウシ胎児血清を補充した。さらに９１時間インキュベートした後、細胞生存率を、前述のように、ＸＴＴアッセイにより判定した（Ｒａｉｔ  Ａ，Ｐｉｒｏｌｌｏ  ＫＦ，Ｒａｉｔ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１；８：７２８−３９．）。細胞生存率と相関するホルマザンの吸光度を、マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して４５０ｎｍで測定した。５０％の細胞死をもたらす薬物濃度であるＩＣ５０値を、薬物濃度対生存細胞の対数グラフから補間した。
【０１４２】
図１は、ヒト脳腫瘍（ＧＢＭ）細胞系Ｕ２５１において、遊離型ＴＭＺと比較して、本明細書に記載のリポソーム封入型ＴＭＺでのインビトロ治療が、ヒトＧＢＭ細胞のＩＣ５０値に有意な減少をもたらしたことを示す。一方で、細胞を治療するために使用するＴＭＺの濃度で、非封入型ＴＭＺは、事実上、細胞致死効果を有さず、リポソームに封入した場合には、細胞の５０％が、たった４６．３μＭ、２８．８μＭ、および１６μＭのＴＭＺ濃度で、それぞれＬｉｐ／ＴＭＺのモル比０．５：１、１：１、および２：１において、死に至った。ＴＭＺに対するＬｉｐの比率が高いほど、細胞致死効果の増加が大きく、より低いＩＣ５０値をもたらす。遊離非封入型ＴＭＺが、患者において腫瘍を治療するために最も一般的に使用される薬物の形態であることは、当業者には周知である。
【０１４３】
同様の結果を、ヒトＧＢＭ腫瘍細胞系Ｕ８７で、遊離型ＴＭＺと、ＴＭＺに対するリポソームのモル比１：１および２：１におけるＬｉｐ−ＴＭＺとを比較して、図２に示す。またもや、非封入型ＴＭＺは、事実上、これらの脳腫瘍細胞に細胞致死効果を有しない。対照的に、本発明の方法を使用して、１：１または２：１（Ｌｉｐ：ＴＭＺ）のモル比でリポソームに封入した場合は、たった１１．４および２１．５μＭのＴＭＺ濃度で、それぞれ有意な腫瘍細胞死をもたらした。
実施例４
遊離型（非封入型）ＴＭＺとの比較でのｓｃＬ−ＴＭＺの腫瘍細胞に対する効果の増加
【０１４４】
ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＴＭＺのモル比１：１（寸法＝４６．２ｎｍ、ゼータ電位＝４２．５ｍＶ）（リポソーム濃度＝２ｍＭ）およびリポソームに対するＴｆＲｓｃＦｖの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、実施例１〜２に上述したように調製した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体の寸法は、約２７．５ｎｍであった。ＴＭＺ耐性ヒト脳腫瘍細胞系Ｔ９８Ｇにおける、ｓｃＬ−ＴＭＺのインビトロ細胞致死能力を、ＸＴＴアッセイを使用して、遊離非封入型ＴＭＺと比較した。
【０１４５】
図３Ａは、腫瘍標的化ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体が、遊離型ＴＭＺと比較して、有意に改善された抗癌効果を有することを示す。遊離型ＴＭＺは、１０００μＭを超えるＩＣ５０値を有する。対照的に、本明細書に記載の方法に従って調製し、腫瘍標的化複合体を用いて腫瘍細胞に送達した場合、少なくとも２０倍少ないＴＭＺが、癌細胞を効果的に致死させる。これは、このＧＢＭ細胞系が、ＴＭＺの致死効果に耐性であることが当該技術分野で周知であるため、特に有意である。この耐性の逆転は、標的化リガンド（タンパク質、抗体、または抗体フラグメント）を、その受容体に細胞上で結合させ、消極的な方法または受容体媒介エンドサイトーシスのような積極的な移送機構を介してかのいずれかで、取り込みをトリガーすることによる、腫瘍細胞へのＴＭＺペイロードの効果的な送達および取り込みのためである。このプロセスは、ＴＭＺによって生じるＤＮＡ損傷を適切に修復するために腫瘍細胞が有する機構（ＭＧＭＴの上方制御等）および／またはＴＭＺを細胞外に送り出す機構を克服し、細胞を薬物で「充満」させる。したがって、細胞は死亡する。
【０１４６】
本明細書に記載の標的化されたカチオン性リポソームを介する、ＴＭＺの腫瘍標的化送達の結果として、多数の派生効果が存在する。
【０１４７】
１）    効果の増加は、抗腫瘍効果の改善を確認するために、患者に送達することが必要な薬物が、より少ないことを意味する。
【０１４８】
２）    腫瘍特異的送達（腫瘍選択性）は、薬物が、非標的細胞によって取り込まれないため、現在ＴＭＺと関連のある有害な副作用を減少させることになる。
【０１４９】
３）    腫瘍細胞へのＴＭＺの効果的な送達は、脳腫瘍（ＧＢＭおよび星状細胞腫）ならびに前立腺癌、多発性骨髄腫、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、胃癌、および黒色腫を含むがこれらに限定されない他の癌の種類の有意な集団に固有のＴＭＺ耐性を克服する。この耐性の逆転は、抗癌治療としてのＴＭＺの使用範囲を広げる。
【０１５０】
図３Ｂは、本発明の方法が、脳腫瘍細胞をＴＭＺに感作することに限定されないことを示す。多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ−１１におけるｓｃＬ−ＴＭＺの致死効果を、遊離型（非封入型ＴＭＺ）のものと比較した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体は、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＴＭＺのモル比１：１（リポソーム濃度＝８ｍＭ）およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、ＴＭＺ用量の異なる増加（０〜１００ｕＭのＴＭＺ）で上述のように調製した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体の寸法は、約１４３ｎｍであった。ｓｃＬ−ＴＭＺのインビトロ細胞致死能力を、多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ−１１において、遊離非封入型ＴＭＺと比較した。トランスフェクションを行い、トランスフェクション４８時間後のＫＭＳ−１１細胞の生存率を評価した。ＴＭＺは、以前には多発性骨髄腫を治療するために使用されておらず、したがって、ｓｃＬ複合体中への封入によるこれらの細胞へのＴＭＺの送達が、非常に低いＴＭＺ濃度（２５ｕＭ）でさえも、有意な細胞死をもたらしたことは、大変な驚きであった。
【０１５１】
上記と同一の方法論および手順を使用して、Ｌｉｐ−ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺを調製し、結果として得られたｓｃＬ−ＴＭＺナノ複合体もまた使用して、前立腺癌（ＤＵ１４５）、肺癌（Ａ５４９）、卵巣癌（Ｈｅｙ−Ａ８）、膵臓癌（ＰＡＮＣ−１）、および肝細胞癌（ＨＥＰ−Ｇ２）の細胞をトランスフェクトした。全ての事例において、ｓｃＬナノ複合体に封入された場合に、現在の標準的な送達方法である遊離型（非封入型）ＴＭＺと比較して、ＴＭＺに対する腫瘍細胞応答に有意な増加があった。
実施例５
血液脳関門を越えるＴｆＲｓｃＦＶリポソーム
【０１５２】
ＴｆＲｓｃＦｖ標的化リポソーム（ｓｃＬ）複合体（ｓｃＬ）が、静脈内注入後に、血液脳関門（ＢＢＢ）を越え、腫瘍を標的化するかどうかを判定するために、研究を行った。脳腫瘍を、５×１０５個のＵ８７細胞を頭蓋内に接種することにより、ヌードマウスに誘発させた。３週間後、マウスに、非複合化遊離型Ｃｙ５−ＯＤＮ、ｓｃＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮ、または非リガンド化Ｌｉｐ−Ｃｙ５−ＯＤＮ（標的化部分なし、ｕｎＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮ）を静脈内注入した（２５μｇ／マウス）（マウス２匹／群）。注入の２４時間後、マウスを安楽死させ、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）インビボ蛍光画像システムを使用して、担腫瘍脳を画像化した。脳腫瘍の蛍光強度を、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）のソフトウェアを使用して比較した。ｓｃＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮの静脈内注入は、脳腫瘍に特異的に強い蛍光信号をもたらした（図４Ａ）。対照的に、遊離型Ｃｙ５−ＯＤＮまたはｕｎＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮのいずれの注入後も、低いレベルの蛍光のみが、腫瘍内に観察された。この結果は、ｓｃＬが、ＢＢＢを越え、脳腫瘍にペイロードを効果的に送達する能力を示す。
実施例６
遊離非封入型ＴＭＺと比較して、脳腫瘍の動物モデルにおけるｓｃＬ−ＴＭＺの効果
【０１５３】
頭蓋内ＧＢＭ腫瘍を、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に担持するＵ８７ＭＧ−ｌｕｃ２細胞の定位接種により、５〜６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに誘発した。接種７〜１０日後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳインビボ画像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生物発光により腫瘍を評価し、マウスを治療群に均等に分割した。無作為化の日に治療を開始した（０日目）。動物に、５ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）のＴＭＺ単独またはＴｆＲｓｃＦｖ標的化されたＴＭＺのカチオン性リポソーム複合体（ｓｃＬ−ＴＭＺ）を、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＴＭＺのモル比１：１（リポソーム濃度＝２ｍＭ）およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、実施例１〜２で上述のように調製した。マウスに、週２回５週間、各試薬を注入した。対照動物（ビヒクル）は、リポソームのみを受容した（ＴＭＺなし、ＴｆＲｓｃＦｖなし）。この研究中にマウスに静脈内注入したｓｃＬ−ＴＭＺ複合体の寸法は、平均で約１００．５＋１４．７ｎｍ（数平均）（平均＋標準偏差）であることがわかった。
【０１５４】
インビボ効果の評価：治療に対するインビボ応答を、腫瘍の増殖、体重の変化、および全体的な生存率の変化に基づいて評価した。腫瘍増殖を、指定日における治療の前、最中、および後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳインビボ画像システムを使用して、生物発光画像（ＢＬＩ）によって監視した。Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２細胞は、基質ルシフェリンで処理した場合に生物発光信号の放出をもたらす、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように、遺伝子操作した。腫瘍寸法／増殖の尺度である、脳腫瘍の生物発光強度を測定し、治療群間で比較した。治療途中で（マウスが各試薬で３週間の治療を受けた後）、全ての動物を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で走査して、脳腫瘍を評価した。動物の画像化は、呼吸同期（ＢｉｏＰａｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）のＴ１強調２次元Ｔｕｒｂｏ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｌｉｃｅ  Ｍｕｌｔｉ−ｅｃｈｏ画像シーケンスを使用して、７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｐｓｉｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて行った。腫瘍の体積を、ＭＲＩスキャンから計算し、治療群間で比較した。体重の変化を、週毎に監視した。全体的な生存率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により記録およびプロットした。
【０１５５】
図４Ｂは、頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２神経膠芽腫異種移植に対する、ｓｃＬ−ＴＭＺおよび遊離非封入型ＴＭＺのインビボ抗腫瘍効果の比較を示す。脳腫瘍を、治療開始前、およびマウスが３週間の治療（６回の注入）を受けた後に再度、ＭＲＩを使用して画像化した。縁取りの領域は、神経膠芽腫の腫瘍を示す。この３週間の期間にわたり、対照マウスの腫瘍は、予想通り非常に大きく増殖した。この細胞系は、ＴＭＺに応答性であることが既知のため、いくらかの腫瘍増殖阻害が予想されており、遊離型ＴＭＺを受容したマウスにおいて明白であった。しかしながら、ｓｃＬ−ＴＭＺを受容した動物においては、腫瘍増殖の阻害が明白であっただけでなく、腫瘍の退縮も、この短期間の治療でさえも生じ、治療剤としてのｓｃＬ−ＴＭＺの効果の増加を示した。これは、予想外の結果であった。
【０１５６】
全３つの群の動物における腫瘍寸法の比較を、図５にグラフで示し、ｓｃＬ−ＴＭＺで治療したマウスの一貫した劇的な応答および小さな腫瘍寸法を示す。
【０１５７】
図６は、治療前から治療期間、および治療後に続く、各群からのそれぞれの動物のＸｅｎｏｇｅｎを介したＢＬＩ画像を示す。腫瘍細胞の寸法に相関する、生物発光信号の強度をカラーマップに示す。赤色＝より強い信号、紫色＝より弱い信号。脳腫瘍のための投与の現在の方法である遊離型ＴＭＺは、約２．５週間、腫瘍の増殖を制御することができた。しかしながら、治療が５週間後に終了すると、有意な腫瘍増殖が起こった。実際、再発は、治療の３１日目において明白でさえあった。対照的に、ｓｃＬ−ＴＭＺで治療した動物は、腫瘍増殖の阻害が治療中および治療後に維持されただけでなく、治療終了後少なくとも２週間続く、予想外の結果である腫瘍退縮（５１日目を参照）が観察された。図７は、さらなる比較結果を示す。図６のマウスからのＢＬＩ信号強度のグラフ表示を、図８に示す（グラフの底部の線は、治療期間を示す）。各群のマウスの全てに対する長期の信号強度の同様のプロットを、図９に提供する。ここでも再び、予想外の結果であるｓｃＬ−ＴＭＺ治療群の治療終了後の腫瘍再発の欠如が、明白である。これは、腫瘍の再発が、脳腫瘍を含む全ての種類の癌において、共通の問題であるため、予想外である。
【０１５８】
ｓｃＬ−ＴＭＺ治療の毒性の欠如は、治療中および治療後の体重測定により示される（図１０）。ビヒクル（２１日目）および遊離型ＴＭＺ（５１日目）の群の動物の急な体重減少が、病状の進行によりもたらされる。これらの他の群と比較して、ｃＬ−ＴＭＺで治療した動物は、実験中の間、体重の減少を示さず、最終的に体重の増加をも示した。これは、このアプローチの毒性の欠如を示す。
【０１５９】
この実験における動物の長期生存率を、Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒプロット（図１１）に示す。ビヒクル群の全てのマウスは、３０日目までに死亡した。遊離型ＴＭＺは、対照群と比較して、これらのマウスの寿命を延ばしたが、ｓｃＬ−ＴＭＺでの治療後には、遊離型ＴＭＺ群と比較して、長期的生存率に有意な増加が見られた。
【０１６０】
第２の実験において、１週間につき異なる用量／回数での、本明細書に記載のように調製されたｓｃＬ−ＴＭＺの注入を比較した。Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２神経膠芽腫頭蓋内異種移植腫瘍を有するマウスの群に、ｓｃＬ−ＴＭＺを、２．５ｍｇ／ｋｇを１週間につき１回注入、５ｍｇ／ｋｇを１週間につき１回注入、または５ｍｇ／ｋｇを１週間につき２回注入で、５週間、尾静脈から静脈内注入し、生存率を判定した。図１２のＫａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒプロットは、用量依存性の応答、ならびに５ｍｇ／ｋｇの用量での単一の注入でさえも、頭蓋内脳腫瘍を有するマウスの寿命の延長が可能であることを示す。さらに、低用量でのＴＭＺ注入もまた、注入／週の回数が増加する場合、効果的な場合がある。
【０１６１】
結果の要約：遊離型ＴＭＺでの治療と比較して、ｓｃＬ封入型ＴＭＺでの静脈内治療は、ＭＲＩまたはＢＬＩのいずれかで監視される腫瘍増殖に対して強い阻害をもたらし、頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２ＧＢＭ腫瘍異種移植モデルの生存率を延ばした。しかしながら、ｓｃＬ−ＴＭＺで治療した動物には、遊離型ＴＭＺで治療した動物のものと比較して、体重の変化により評価される、毒性の有意な増加は観察されなかった。また、治療の終了後少なくとも２週間の腫瘍退縮を含む、腫瘍応答の維持は、予想外の結果であった。
実施例７
癌幹細胞および分化癌細胞におけるｓｃＬ−ＴＭＺによるアポトーシスのインビボ誘発
【０１６２】
頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２腫瘍を、上述のように、５〜６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに誘発した。接種の３週間後、担腫瘍マウスを、無作為に群分けし、治療を開始した。動物に、５ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）のＴＭＺ単独または腫瘍標的化リポソーム複合体に封入したＴＭＺを、尾静脈を介して静脈内注入した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＴＭＺのモル比１：１（リポソーム濃度＝２ｍＭ）およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、上述のように調製した。対照動物（ビヒクル）は、リポソームのみ（ＴＭＺなし、ＴｆＲｓｃＦｖなし）を受容した。上述のように調製した、この研究中にマウスに静脈内注入したｓｃＬ−ＴＭＺリポソームの寸法は、平均で８５．５＋４．９６ｎｍ（数平均）（平均＋標準偏差）であることがわかった。
【０１６３】
マウスを、１週間に２回治療した。３回の注入の受容後、全ての動物を安楽死させ、脳を摘出した。脳腫瘍を、正常な脳組織から注意深く解離し、計量した。インビボ抗腫瘍効果を、アポトーシスのレベルを評価することによって評価した。腫瘍を計量した後、単細胞浮遊液を、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および２ｍｍｏｌ／ＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を含有するハンクス平衡溶液中で、３７℃で１時間のコラゲナーゼ消化により腫瘍から得た。分画細胞を、７０μｍの細胞濾過器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を通過させ、ＰＢＳで洗浄した。アポトーシスのレベルを判定するために、単細胞を、開裂カスパーゼ３およびヒトＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）用の抗体で染色した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）。標識化細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメトリー装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で流体活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により分析した。
【０１６４】
インビボ効果の評価：抗腫瘍効果を、頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２脳腫瘍のアポトーシスの誘導を評価することによって評価した。ビヒクル（リポソームのみ、ＴＭＺなし、ＴｆＲｓｃＦｖなし）、遊離非封入型ＴＭＺ、またはｓｃＬ−ＴＭＺの３回の静脈内注入後の脳腫瘍の重量を、図１３に示す。予想外にも、たった３回の注入後でさえも、遊離型ＴＭＺとｓｃＬ−ＴＭＺとの間の腫瘍寸法の違いは、明らかである。
【０１６５】
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、しばしば、腫瘍の再発および化学療法への耐性に関与する。腫瘍増殖の阻害および退縮さえもが、ｓｃＬ−ＴＭＺ（遊離型ＴＭＺではないが）での治療終了後に観察されたという上述の予想外の発見のために、アポトーシスのレベルを、これらの腫瘍における癌幹細胞、ならびに分化癌細胞（非ＣＳＣ）において評価した。図１４は、脳腫瘍から単離した単細胞を染色する開裂カスパーゼ３抗体により判定される、アポトーシスのレベルについてのフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＧＢＭ癌幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーであるＣＤ１３３を使用して、分化癌細胞からのＣＳＣを識別した。ＣＳＣ集団（ＣＤ１３３＋）は、遊離型ＴＭＺと比較して、アポトーシスが進行する細胞の％の有意な増加を明白に示す。したがって、ｓｃＬ−ＴＭＺは、有意な細胞死をもたらすＣＳＣを標的化および効果的にトランスフェクトすることが可能である。
【０１６６】
結果の要約：頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２ＧＢＭ腫瘍異種移植モデルにおいて、ｓｃＬ−ＴＭＺでの静脈内治療は、遊離型ＴＭＺで治療したものと比較して、腫瘍の重量によって示される腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした。さらに、ｓｃＬ−ＴＭＺでの静脈内治療は、ＣＤ１３３−分化癌細胞だけでなく、ＣＤ１３３＋ＣＳＣにおいても、アポトーシス誘発の有意な増加をもたらした。
実施例８
ＴＭＺ耐性脳腫瘍細胞系Ｔ９８Ｇの皮下異種移植腫瘍におけるｓｃＬ−ＴＭＺのインビボ効果
【０１６７】
Ｔ９８Ｇ  ＧＢＭ腫瘍細胞は、ＴＭＺでの治療に耐性であることが既知である。ＴＭＺ耐性ＧＢＭ腫瘍モデルに対して、皮下Ｔ９８Ｇ異種移植片を使用した。Ｔ９８Ｇ異種移植腫瘍を、Ｔ９８Ｇ細胞またはＭａｔｒｉｇｅｌのコラーゲン基底膜に懸濁した腫瘍粒子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）をマウス１匹あたり尾の上部の腰背部２箇所に皮下注入することによって、雌の無胸腺ヌードマウスに誘発した。皮下Ｔ９８Ｇ腫瘍が、およそ１００〜３００ｍｍ３に達した際に、マウスを無作為に群分けし、２５もしくは６６ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）の遊離型ＴＭＺまたは２５ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）の腫瘍標的化複合体に封入したＴＭＺ（１：１のモル比）を静脈内注入した。ｓｃＬ−ＴＭＺ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＴＭＺのモル比１：１（リポソーム濃度＝８ｍＭ）およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、上述のように調製した。対照動物（ビヒクル）は、リポソームのみ（ＴＭＺなし、ＴｆＲｓｃＦｖなし）を受容した。上述の方法により調製した、この研究中にマウスに静脈内注入したｓｃＬ−ＴＭＺ複合体の寸法は、平均で１３０．８＋１３．５ｎｍ（数平均）（平均＋標準偏差）であることがわかった。マウスを、５日間連続して、１日１回治療した。最後の注入の４８時間後にそれらを安楽死させ、腫瘍を摘出した。治療は、０日目に開始した。
【０１６８】
インビボ効果の評価：遊離型ＴＭＺまたはｓｃＬ−ＴＭＺ複合体のいずれかでの治療に対する、Ｔ９８Ｇ皮下腫瘍のインビボ応答を、腫瘍増殖の変化、体重の変化、およびアポトーシスの誘発に基づいて評価した。各腫瘍の寸法を測定し、腫瘍の体積（Ｌ×Ｗ×Ｈ）ｍｍ３を、時間に対比してプロットした。体重の変化もまた、注入中に監視した。インビボ効果を、ＴＵＮＥＬアッセイまたはフローサイトメトリーで染色する開裂カスパーゼ３によりアポトーシスのレベルを評価することによって、さらに評価した。最後の注入の４８時間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。単細胞の単離を、上述のように実行した。アポトーシスのレベルを判定するために、単細胞を、ＴＵＮＥＬアッセイ用、または開裂カスパーゼ３、ヒトＣＤ１３３、およびＳＳＥＡ−１用の抗体で染色した。ＳＳＥＡ−１は、ＧＢＭ腫瘍内のＣＳＣのマーカーとして既知である。標識化細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１６９】
この短期間にわたる腫瘍の腫瘍寸法（ｍｍ３での体積）を図１５に示す。ここでもまた、有意な腫瘍増殖の阻害が見られる遊離型ＴＭＺおよびｓｃＬ−ＴＭＺ複合体を、いずれも２５ｍｇ／ｋｇで投与された受容した動物間に、これらのＴＭＺ耐性腫瘍の増殖に有意な差異が見られる。Ｔ９８Ｇ腫瘍は、ＴＭＺ耐性として既知であり、ＴＭＺが腫瘍増殖を制御可能であることは、新規かつ予想外である。インビトロでの使用について上述のように、この耐性の逆転は、標的化リガンド（タンパク質、抗体、または抗体フラグメント）を、その受容体に細胞上で結合させ、消極的な方法または受容体媒介エンドサイトーシスのような積極的な移送機構を介してかのいずれかで、取り込みをトリガーすることによる、腫瘍細胞へのＴＭＺペイロードの効果的な送達および取り込みのためである。このプロセスは、ＴＭＺによって生じるＤＮＡ損傷を適切に修復するために腫瘍細胞が有する機構（ＭＧＭＴの上方制御等）および／またはＴＭＺを細胞外に送り出す機構を克服し、細胞を薬物で「充満」させる。したがって、腫瘍細胞、および結果として腫瘍が死亡する。このインビボデータに基づいて、同一の機構がインビボで機能し、したがって、脳および現在ＴＭＺ耐性であるものを含む他の腫瘍のための抗癌剤としてのｓｃＬ−ＴＭＺ複合体の潜在的な使用を示す。静脈内投与したｓｃＬ−ＴＭＺの毒性の欠如は、この実験の短期間にわたる体重の微少な変化により示される（図１６）。
【０１７０】
６６ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）の遊離型ＴＭＺまたは２５ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹につき１回の注入あたり）の腫瘍標的化複合体に封入されたＴＭＺを静脈内注入した動物からの腫瘍におけるアポトーシスのレベルを、皮下Ｔ９８Ｇ異種移植腫瘍から単離したＣＤ１３３＋ＣＳＣおよびＣＤ１３３−非ＣＳＣのＴＵＮＥＬ染色により、注入の８時間後に評価した。図１７に示されるように、動物が、ｓｃＬに封入されたＴＭＺの量と比較して、２倍以上の用量の遊離型ＴＭＺで治療されたとしても、ｓｃＬ−ＴＭＺにより誘発されるアポトーシスのレベルは、非ＣＳＣにおいて５倍以上高く、ＣＳＣにおいては８倍以上高かった。
【０１７１】
アポトーシスのレベルを、同一の皮下Ｔ９８Ｇ脳腫瘍からのＳＳＥＡ−１＋ＣＳＣを染色する開裂カスパーゼ３抗体で評価した場合に、同様の結果が得られた（図１８）。ＣＳＣの別のマーカーであるＳＳＥＡ−１を使用して、分化癌細胞を識別した。ここでもまた、ｓｃＬ−ＴＭＺは、２倍以上の量の遊離型ＴＭＺを投与したにも関わらず、遊離型ＴＭＺよりも５倍（ＳＳＥＡ−１−）および９．５倍（ＳＳＥＡ−１＋）高いレベルのアポトーシスを誘発した。
【０１７２】
結果の要約：遊離型ＴＭＺでの治療と比較して、ｓｃＬ−ＴＭＺでの静脈内治療（同一またはより少ない用量のＴＭＺで）は、ＴＭＺ耐性Ｔ９８Ｇ腫瘍異種移植片に対する、有意に強化された増殖阻害をもたらした。しかしながら、ｓｃＬ−ＴＭＺで治療した動物には、遊離型ＴＭＺで治療された動物のものと比較して、体重の変化に基づく有意な毒性の増加は、観察されなかった。さらに、ｓｃＬ−ＴＭＺでの静脈内治療は、ＣＤ１３３−およびＳＳＥＡ−１−分化癌細胞だけでなく、ＣＤ１３３＋またはＳＳＥＡ−１＋ＣＳＣにおいてもまた、アポトーシスのレベルの有意な増加をもたらした。
【０１７３】
これらの結果は、ｓｃＬによるＴＭＺの送達が、膨大なアポトーシスを誘発し、この薬物に対する腫瘍細胞（脳、多発性骨髄腫、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、黒色腫、胃癌を含むがこれらに限定されない）の固有の耐性を克服することが可能であることを示す。
実施例９
ＴＭＺ耐性腫瘍のための組み合わせ治療
【０１７４】
ファーストラインの化学療法剤テモゾロミド（ＴＭＺ）は、脳腫瘍を有する患者において有益性を示しているが、それはまた、骨髄抑制を含む、有意な治療的用量制限毒性も有する（Ｖｉｌｌａｎｏ  ＪＬ，Ｓｅｅｒｙ  Ｔ  Ｅ  ａｎｄ  Ｂｒｅｓｓｌｅｒ  Ｌ  Ｒ（２００９）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６４：ｐｐ６４７−６５５）。したがって、ＴＭＺを腫瘍標的化にし、特異的かつ効果的に脳内の腫瘍細胞に送達し、それに取り込まれ、それによって非特異的毒性を減少させる方法は、この薬物の使用の現在の対象者である患者に非常に有効である。
【０１７５】
しかしながら、腫瘍細胞へ効果的に送達された場合でさえも、神経膠芽腫および他の脳腫瘍に対するＴＭＺの広範な使用の１つの重大な欠点は、腫瘍のかなりの割合が、ＴＭＺに耐性であることである。これは、主に、ＴＭＺ誘発のＤＮＡ損傷を、Ｏ６−グアニン付加物を除去することにより修復し（Ｍｒｕｇａｌａ  ＭＭ，Ａｄａｉｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋｉｅｍ  Ｈ  Ｐ（２０１０）Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ｔｏｄａｙ  ４６：ｐｐ８３３−８４６）、したがって、ＴＭＺの治療作用を打ち消す、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の過剰発現のためである。したがって、この耐性を克服する方法を開発することが不可欠である。
遺伝子治療のための腫瘍標的化ｓｃＬ−ｐ５３ナノ複合体
【０１７６】
その開示が、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７８０，８２２号に記載のように、ｗｔｐ５３遺伝子をコードし、ＴｆＲｓｃＦｖ（ｓｃＬ−ｐ５３）により標的化されるプラスミドＤＮＡを担持する送達システムの開発に成功している。ｓｃＬ−ｐ５３もまた、これらの標準的な治療法に対する腫瘍の応答を増加させるために、化学療法／放射線と組み合わせて使用するために開発された。
【０１７７】
ＴＭＺは、脳腫瘍治療のためのファーストラインの化学療法剤であるが、ＧＢＭ患者の一部のみが、この薬物に応答する。Ｓｔｕｐｐらの研究（Ｓｔｕｐｐ  Ｒ，Ｈｅｇｉ  Ｍ  Ｅ，Ｍａｓｏｎ  Ｗ  Ｐ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｎｔ  Ｍ  Ｊ，Ｔａｐｈｏｏｒｎ  Ｍ  Ｊ  Ｂ，Ｊａｎｚｅｒ  Ｒ  Ｃ，Ｌｕｄｗｉｎ  Ｓ  Ｋ，Ａｌｌｇｅｉｅｒ  Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂ，Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｋ，Ｈａｕ  Ｐ，Ｂｒａｎｄｅｓ  Ａ  Ａ，Ｇｉｊｔｅｎｂｅｅｋ  Ｊ，Ｍａｒｏｓｉ  Ｃ，Ｖｅｃｈｔ  Ｃ  Ｊ，Ｍｏｋｈｔａｒｉ  Ｋ，Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ  Ｐ，Ｖｉｌｌａ  Ｓ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  Ｅ，Ｇｏｒｌｉａ  Ｔ，Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｄ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ  Ｊ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｉｒｉｍａｎｏｆｆ  Ｒ  Ｏ（２００９）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ａｌｏｎｅ  ｏｎ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  Ｓｔｕｄｙ：５−Ｙｅａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＯＲＴＣ−ＮＣＩＣ  Ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０：ｐｐ４５９−４６６）、ならびにＨｅｇｉらのもの（Ｈｅｇｉ  ＭＥ，Ｄｉｓｅｒｅｎｓ  Ａ，Ｇｏｒｌｉａ  Ｔ，Ｈａｍｏｕ  Ｍ，ｄｅ  Ｔｒｉｂｏｌｅｔ  Ｎ，Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｋｒｏｓ  Ｊ  Ｍ，Ｈａｉｎｆｅｌｌｎｅｒ  Ｊ  Ａ，Ｍａｓｏｎ  Ｗ，Ｍａｒｉａｎｉ  Ｌ，Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  Ｊ  Ｅ  Ｃ，Ｈａｕ  Ｐ，Ｍｉｒｉｍａｎｏｆｆ  Ｒ  Ｏ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ  Ｊ  Ｇ，Ｊａｎｚｅｒ  Ｒ  Ｃ  ａｎｄ  Ｓｔｕｐｐ  Ｒ（２００５）ＭＧＭＴ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  Ｆｒｏｍ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５２：ｐｐ９９７−１００３）に基づいて、ＴＭＺ治療に対する応答に関して、より良好な予後を伴う下方制御されたＭＧＭＴプロモーターを有するもの、および悪化した予後を伴う活性ＭＧＭＴプロモーターを有するもの、の２つの異なる患者の群を識別した。
【０１７８】
したがって、ＭＧＭＴを下方制御する方法の開発は、ＴＭＺに応答する患者の数を増加させることになる。ｗｔｐ５３発現の効果が、ＭＧＭＴ等のＤＮＡ修復遺伝子の発現を下方制御し得ることを示す、多数の報告がなされている（Ｂｏｃａｎｇｅｌ  Ｄ，Ｓｅｎｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｍｉｔｒａ  Ｓ，Ｂｈａｋａｔ  Ｋ．Ｋ（２００９）Ｐ５３−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｇｅｎｅ  Ｏ６−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＭＧＭＴ）Ｖｉａ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐ１  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｒｒｉｓ  ＬＣ，Ｒｅｍａｃｋ  Ｊ  Ｓ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｐ  Ｊ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔ  Ｔ  Ｐ（１９９６）Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ  Ｐ５３  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｏ６−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：ｐｐ２０２９−２０３２、Ｓｒｉｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ＫＳ，Ｓｈｏｕ  Ｊ，Ｍｕｌｌａｐｕｄｉ  Ｓ  Ｒ  Ｓ，Ｌａｎｇ  Ｆ  Ｆ，Ｒａｏ  Ｊ  Ｓ  ａｎｄ  Ａｌｉ−Ｏｓｍａｎ  Ｆ（２００１）Ｅｎｆｏｒｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ  Ｐ５３  Ｃｕｒｔａｉｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ６−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：ｐｐ１３９８−１４０９）。原発性および転移性の腫瘍を効果的に標的化し、ＢＢＢを通過することが示されている、ｓｃＬ−ｐ５３ナノ複合体の使用は、かなりの割合のＧＢＭおよび他の腫瘍に観察される、ＭＧＭＴ誘発のＴＭＺ耐性を克服する効果的な方法であり、したがって、この薬物の適用を、原発性および転移性脳腫瘍を有する患者における使用に拡大し、その予後を改善するに違いない。さらに、ＴＭＺはまた、膵臓、神経内分泌、および気道消化器の癌を含む、脳以外の難治性または進行性の悪性腫瘍における使用についても、評価が行われているため（Ｔｅｎｔｏｒｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｚｉａｎｉ  Ｇ（２００９）Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：ｐｐ２４５−２５７．）、ｓｃＬ−ｐ５３での治療は、ＴＭＺが種々の癌に対する効果的な治療薬となる可能性を強化することになる。
ｓｃＬ−ＴＭＺおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせ療法
【０１７９】
ｓｃＬ−ＴＭＺおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせ使用について、本明細書に記載する。単剤療法としての使用のためのｓｃＬ−ＴＭＺの開発は、ＴＭＺ治療の現在の対象者である患者に有効である。しかしながら、組み合わせのアプローチは、さらに大きな治療可能性を有するであろう。ｓｃＬ−ＴＭＺの腫瘍標的化送達の結果である改善された特性を伴う、ｓｃＬ−ｐ５３のために減少した腫瘍の耐性は、現在ＴＭＺ非応答性脳腫瘍（および場合によっては他の癌）を応答性に変換することをもたらす。したがって、このアプローチは、ＧＢＭおよび他の癌の治療のための新規の低毒性でより効果的な治療レジメンに発展する可能性を有する。
実験的アプローチ
【０１８０】
実験を、単独およびｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせて使用した場合の両方でｓｃＬ−ＴＭＺの使用を伴う、新しく、より効果的なＧＢＭの治療レジメンの開発を実証するように設計する。
ヒト脳腫瘍細胞系およびインビボモデル
【０１８１】
ヒト脳腫瘍細胞系Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇについては、上に記載した。腫瘍の増殖および応答をＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｘｅｎｏｇｅｎにより監視する、インビボ研究での使用のために、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＵ８７ＭＧの変形を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
画像化プロトコル
【０１８２】
脳腫瘍のＭＲ画像化を、１００ ガウス／ｃｍのマイクロ画像化勾配で装備され、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェアにより起動される、２０ｃｍ口径を有する７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｐｓｉｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）の横型分光器／撮像器で行った。画像化プロトコルは、前述のように、高速強化３次元画像化シーケンスを用いたＴ１強調のターボ高速収集である（Ｈａｇｇｅｒｔｙ  Ｔ，Ｃｒｅｄｌｅ  Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｏ，Ｗｉｌｌｓ  Ｊ，Ｏａｋｓ  Ａ  Ｗ，Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｉｄｈｕ  Ａ（２０１１）Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｔａｕ  ｉｎ  ａｎ  Ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３３：ｐｐ１５９８−１６１０）。
ｓｃＬ−ＴＭＺ単独およびｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせてのインビボ効果の実証
【０１８３】
これらの研究において、Ｕ８７−Ｌｕｃ同所性頭蓋内（ＴＭＺ感受性）およびＴ９８Ｇ（ＴＭＺ耐性）の皮下腫瘍モデルを使用して、ｓｃＬ−ＴＭＺ単独およびｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせての、腫瘍の増殖および／または退縮に対する効果を試験する。Ｕ８７ＭＧは、野生型ｐ５３を有するが、Ｕ８７頭蓋内腫瘍を、ｓｃＬ−ｐ５３および遊離型ＴＭＺの組み合わせで治療した場合に、増加したインビボ応答が見られる。マウスの群（６匹のマウス／群／腫瘍モデル）は、遊離型ＴＭＺ単独、ｓｃＬ−ＴＭＺ単独、ｓｃＬ−ｐ５３単独、ｓｃＬ−ｐ５３に加えて遊離型ＴＭＺまたはｓｃＬ−ＴＭＺの静脈内（尾静脈）注入を受ける。未治療のマウスは、対照として機能する。ｐ５３の用量は、３０ｕｇ／マウス／注入であり、ＴＭＺは、５ｍｇ／ｋｇで使用する。いずれの治療も、週２回、５週間投与する。腫瘍増殖の阻害／退縮を、Ｔ９８Ｇの寸法によって、および腫瘍の体積がＭＲＩによって判定される頭蓋内腫瘍についてはＸｅｎｏｇｅｎを使用して評価する。Ｘｅｎｏｇｅｎ／ＭＲＩ画像化は、治療前、治療中１回／週、および治療終了の直後に行う。治療途中で、腫瘍および種々の正常な臓器および組織を、各群の３匹のマウスから取り、符号化する。各組織の半分を、Ａｉｍ  ＩＩに記載の分析に使用し、残りを、アポトーシスマーカー（Ｔｕｎｎｅｌ、カスパーゼ−３）および増殖マーカーＫｉ６７についての組織学により試験する。治療終了１日後、３匹のマウスを、人工的に安楽死させ、市販のＣＲＯ（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）により解剖し、ＴＭＺ関連の骨髄毒性効果およびリンパ球減少における差異について調査する。
インビトロ結果
【０１８４】
ｓｃＬｐ５３での治療が、ＭＧＭＴ活性を下方制御し、ＴＭＺ耐性の脳腫瘍をこの薬物に対して感作することができるという仮説を試験するために、事前のＸＴＴ細胞生存率アッセイを実行した。ＴＭＺ耐性のＴ９８Ｇ細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０３個設置し、ｓｃＬ−ｐ５３を遊離型ＴＭＺまたはｓｃＬ−ＴＭＺのいずれかと組み合わせて、トランスフェクトした。また、遊離型ＴＭＺのみまたはｓｃＬ−ＴＭＺのみを、細胞にトランスフェクトした。ＸＴＴアッセイを、９０時間後に実行し、ＩＣ５０値（５０％の増殖阻害を生み出す濃度）を判定した。遊離型またはｓｃＬ複合化ＴＭＺのいずれかと組み合わせてのｓｃＬ−ｐ５３のトランスフェクトは、この既知のＴＭＺ耐性細胞系において、単剤ＴＭＺと比較して、応答レベルの増加をもたらした（Ｐａｔｉｌ  Ｒ，Ｐｏｒｔｉｌｌａ−Ａｒｉａｓ  Ｊ，Ｄｉｎｇ  Ｈ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，Ｋｏｎｄａ  Ｂ，Ｈｕ  Ｊ  Ｗ，Ｗａｗｒｏｗｓｋｙ  Ｋ  Ａ，Ｓｈｉｎ  Ｐ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  Ｋ  Ｌ，Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  Ｊ  Ｙ  （２０１０）  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｏｌｙ（Ｂｅｔａ−Ｌ−Ｍａｌｉｃ  Ａｃｉｄ）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：ｐｐ２３１７−２３２９）（図１９）。さらに、遊離型ＴＭＺ単独と比較して、ｓｃＬ−ＴＭＺナノ複合体のトランスフェクションは、薬物に対して有意なレベルの化学増感をもたらした。
実施例１０
マウス脳腫瘍モデルにおけるｓｃＬ複合体の全身投与による癌幹細胞のインビボ標的化
【０１８５】
ヒト脳腫瘍異種移植を、Ｕ２５１細胞の皮下接種によりヌードマウスに誘発した。３週間後、マウスに、６ＦＡＭ−ＯＤＮ（１００μｇ／マウス）を、非複合化遊離型６ＦＡＭ−ＯＤＮ、ｓｃＬ−６ＦＡＭ−ＯＤＮ（ｓｃＬ−ＯＤＮ）、または非リガンド化Ｌｉｐ−６ＦＡＭ−ＯＤＮ（標的化部分なしのリポソーム）（ＬＩＰ−ＯＤＮ）のいずれかとして、静脈内注入した。注入の２４時間後、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）インビボ発光画像化システムを使用して、腫瘍を画像化し、腫瘍における発光レベルを判定した。Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）での画像化後、単細胞を、酵素消化法により腫瘍から単離し、ＣＤ１３３＋（癌幹細胞（ＣＳＣ））およびＣＤ１３３−（非ＣＳＣ）細胞中の６ＦＡＭ−ＯＤＮ取り込み量を分析し、ＦＡＣＳにより定量化した。遊離型６ＦＡＭ−ＯＤＮおよび非リガンド化Ｌｉｐ−ＯＤＮ両方の全身投与は、腫瘍の発光をほとんどもたらさなかった。対照的に、ｓｃＬ−ＯＤＮナノ複合体を受容したマウスからの腫瘍には、強い蛍光信号が明らかに見られた（図２０）。
【０１８６】
さらに重要なことに、この重大な差異はまた、ＣＳＣのトランスフェクション効果にも反映された（図２１）。遊離型または非リガンド化６ＦＡＭ−ＯＤＮをトランスフェクトされたのは、ＣＳＣおよび非ＣＳＣ細胞の１０％未満であったが、ＣＳＣおよび非ＣＳＣ細胞集団の両方の６０％超が、静脈内注入後にペイロードの存在を示した。灰色のヒストグラムは、未治療対照を表す。これらの発見により、本明細書に記載のｓｃＬ送達システムは、全身投与によりペイロードを標的化し、それをインビボでＣＳＣに効果的に送達することができることを裏付ける。
実施例１１
ｓｃＬにより送達されたＯＤＮによる頭蓋内ＧＢＭにおける全身投与後のＣＳＣの腫瘍特異的標的化
【０１８７】
図２２は、頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２多発性膠芽腫（ＧＢＭ）脳腫瘍の動物モデルにおける、腫瘍標的化複合体、非標的化複合体、および送達システムなしでペイロード自体によって送達される、ペイロードのインビボ送達効果の比較を示す。蛍光標識化（Ｃｙ５）オリゴヌクレオチド（Ｃｙ５−ＯＤＮ）を、腫瘍標的化された複合体（ｓｃＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮ）（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）、または腫瘍標的化リガンドなしの複合体（Ｌｉｐ−Ｃｙ５−ＯＤＮ）に封入した。２５マイクログラムのＣｙ５−ＯＤＮ（遊離型、または標的化部分ありもしくはなしで封入された）を、Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２頭蓋内腫瘍を有する各動物に静脈内注入した。注入の６０時間後、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出して、癌幹細胞用マーカーである、いずれも一般的なＣＳＣ（ＣＤ１３３＋）および脳腫瘍内のＣＳＣ（ＳＳＥＡ−１＋）のマーカーとして当業者に既知のＣＤ１３３およびＳＳＥＡを使用して、フローサイトメトリーによってこれらの頭蓋内腫瘍中の癌幹細胞（ＣＳＣ）への送達効果を評価した。単細胞を脳腫瘍から単離し、ＣＳＣマーカー抗体（ＣＤ１３３＋またはＳＳＥＡ−１＋）で染色した後、ＦＡＣＳ分析を受けさせた。図２２の各ヒストグラムの曲線における偏移は、癌幹細胞内へのＣｙ５−ＯＤＮの取り込みを表す。ｓｃＬ−Ｃｙ５−ＯＤＮを受容したマウスから単離されたＣＳＣを表す曲線だけが、有意な偏移を示し、遊離型Ｃｙ５−ＯＤＮまたはＬｉｐ−Ｃｙ５−ＯＤＮ（標的化部分なし）のいずれも、脳腫瘍内のＣＳＣに効果的にトランスフェクトしなかったことを示す。
実施例１２
ｓｃＬ−ｐ５３による脳腫瘍細胞のテモゾロミド（ＴＭＺ）に対するインビトロ感作
【０１８８】
ｓｃＬにより送達されたｗｔｐ５３が、脳腫瘍細胞をファーストラインの化学療法剤ＴＭＺに感作する能力を評価するために、ヒト脳腫瘍由来のＵ８７およびＵ２５１細胞を、ＴＭＺ単独でか、またはＴＭＺに加えてｓｃＬ−ｐ５３（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）と組み合わせて、治療した。また、対照として、ＴＭＺとｐＳＣＭＶｐ５３プラスミドを構成する際に使用されたのと同一のベクターではあるが、ｐ５３の挿入のないベクターを担持するｓｃＬ送達システム（ｓｃＬ−ｖｅｃ）とを組み合わせて、細胞を治療した。細胞を、９６ウェルプレートに設置し、２４時間後にｓｃＬ−ｐ５３またはｓｃＬ−ｖｅｃで治療した。トランスフェクションの６時間後、ＴＭＺを漸増濃度で添加した。ＸＴＴアッセイを、ウェルへのＴＭＺ添加の１４４時間後に実行し、ＩＣ５０値（５０％の増殖阻害を生み出す濃度）を判定した。これらの２つの細胞系は、ＴＭＺ感受性であることが既知のため、ＴＭＺ単独に対していくらかの応答があったことは、予想外ではなかった。しかしながら、図２３に示されるように、両方の細胞系について、ＴＭＺ単独と比較して、ｓｃＬ送達システムによって細胞にｗｔｐ５３をトランスフェクトした際、ＴＭＺに対する感作に有意な増加が見られる。最小から全くなしの感作（それぞれ、Ｕ８７およびＵ２５１）が、空のベクターを有する複合体に観察され、その作用は、ｐ５３によるものであり、送達システムによるものではないことを示す。
【０１８９】
しかしながら、脳腫瘍患者の一部だけがＴＭＺに応答するため、ｓｃＬ−ｐ５３がＴＭＺ耐性の腫瘍をこの化学療法剤に対して感作する能力を評価することは、より重要であった。したがって、ｓｃＬにより送達されたｗｔｐ５３が、ＴＭＺ耐性の脳腫瘍細胞を、このファーストラインの化学療法剤に対して感作する能力を評価するために、ヒト脳腫瘍誘導のＬＮ−１８およびＴ９８Ｇ細胞をＴＭＺ単独でか、またはＴＭＺに加えてｓｃＬ−ｐ５３を組み合わせて治療した（図２３）。対照として、また、ＴＭＺとｐＳＣＭＶｐ５３プラスミドを構成する際に使用されたのと同一のベクターではあるが、ｐ５３の挿入のないベクターを担持するｓｃＬ送達システム（ｓｃＬ−ｖｅｃ）とを組み合わせて、細胞を治療した。細胞を９６ウェルプレートに設置し、２４時間後にｓｃＬ−ｐ５３またはｓｃＬ−ｖｅｃで治療した。トランスフェクションの２４時間後、ＴＭＺを漸増濃度で添加した。ＸＴＴアッセイを、ウェルへのＴＭＺ添加の７２時間後に実行し、ＩＣ５０値（５０％の増殖阻害を生み出す濃度）を判定した。図２３にＬＮ−１８細胞で示されるように、ｓｃＬ−ｐ５３でのトランスフェクション後、これらのＴＭＺ耐性細胞は、今では非常に低い用量のＴＭＺに対してでさえも応答する。５０％を超える細胞が、約１０００ｕＭの用量まで有意な細胞死が観察されないＴＭＺ単独と比較して、約５０ｕＭ程度の低い用量のＴＭＺで死に至る。Ｔ９８Ｇ細胞（図２３）では、ｓｃＬ−ｐ５３での治療後、ＬＮ−１８ほどＴＭＺに応答性ではないが、これらの高耐性細胞もまた、この薬物の致死効果に感作される。ＴＭＺへの露出前にｓｃＬ−ｐ５３で治療した細胞は、ＩＣ５０が６００ｕＭであり、一方でＴＭＺのみを受容したものは、ＴＭＺ用量がおよそ２０００ｕＭになるまでＩＣ５０に達しない。上述のように、対照ｓｃＬ−ｖｅｃをトランスフェクトした後、ＴＭＺに対する細胞の応答への効果は、最小または全くなく、これらの耐性細胞系における応答は、ｗｔｐ５３の存在によるものであることを示す。
実施例１３
全身投与されたｓｃＬ−ｐ５３によるテモゾロミド（ＴＭＺ）に対する脳腫瘍細胞のインビボ感作
ｓｃＬ−ｐ５３に加えてＴＭＺを組み合わせての全身治療により誘発される、脳腫瘍の頭蓋内（ＩＣ）マウスモデルにおける腫瘍退縮
【０１９０】
米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製されたｓｃＬ−ｐ５３の全身投与によってＩＣ脳腫瘍のＴＭＺへの感作によって誘発される、腫瘍増殖の阻害を検査するために、実験を行った。Ｕ８７ＭＧ−Ｌｕｃ異種移植脳腫瘍を、Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ細胞を頭蓋内に接種することにより、ヌードマウスに誘発した。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したこの細胞系は、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するように改変されている。接種の１０日後、担腫瘍動物に、ＴＭＺ単独（５．０ｍｇ／ｋｇ／注入）、ｓｃＬ−ｐ５３単独（３０ｕｇ  ＤＮＡ／マウス／注入）、またはｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせてのＴＭＺを、尾静脈から静脈内注入した。対照として、１つの群は、ＰＢＳ（ビヒクル）を受容した。全ての静脈内注入を、２回／週で、合計１０回の注入で投与した。腫瘍応答を評価するために、生物発光画像化（ＢＬＩ）を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ’ｓ  Ｘｅｎｏｇｅｎを使用して実行した。図２４は、種々の群のインビボ抗腫瘍効果の比較である。腫瘍寸法と相関する生物発光信号を、カラーマップに示す。赤色（スケールバーの上部）：より強い信号、紫色（スケールバーの底部）：より弱い信号。腫瘍寸法／増殖の尺度である脳腫瘍の生物発光強度を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、郡間で比較し、図２５に時間と共にプロットする。水平バーは、治療の期間を示す（最後の治療＝２４日目）。
【０１９１】
ＴＭＺ単独およびｓｃＬ−ｐ５３単独では、治療中ＩＣ腫瘍増殖にいくらかの最小効果を有したが、いずれの群の腫瘍も、治療の終了後、急速に寸法が増加した。対照的に、ｓｃＬ−ｐ５３とＴＭＺとの組み合わせを受容したマウスの群における腫瘍は、治療中に、腫瘍増殖の阻害だけでなく、腫瘍の退縮も示した。より重要なことに、この退縮は、治療の終了後２０日間を超えて継続した。
【０１９２】
生物発光の発見を裏付けるために、マウスが３週間の治療を受ける前および後に、造影剤なしでＭＲＩによってもまた、マウスを画像化した。生物発光によって組み合わせ治療群に観察された腫瘍の退縮は、ここでも観察された。図２６において、縁取りは、神経膠芽腫の腫瘍を示す。単剤治療群に明らかであるような治療後の寸法増加の代わりに、ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの両方を受容したこれらの動物においては、いずれの残存腫瘍もほとんど検出不可能であったことは、明らかである。したがって、この実験は、ｓｃＬにより送達されたｗｔｐ５３が、ＧＢＭ腫瘍をＴＭＺに感作し、単に腫瘍増殖の阻害だけでなく、有意な腫瘍応答（退縮）を導くことができることを示す。
ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせでの治療後に有意に増加した、頭蓋内ＧＢＭ腫瘍を有するマウスの生存率
【０１９３】
上述の実験が、治療後の退縮を含む有意な腫瘍応答を示したため、この組み合わせ治療の、生存率に対する効果を、次に評価した。Ｕ８７ＭＧ−Ｌｕｃ異種移植脳腫瘍を、上述のようにヌードマウスに誘発した。接種の１０日後、担腫瘍動物に、ＴＭＺ単独（２５．０ｍｇ／ｋｇ／注入）、ｓｃＬ−ｐ５３単独（３０ｕｇ  ＤＮＡ／マウス／注入）（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）、またはｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせてのＴＭＺを尾静脈から静脈内注入した。対照として、１つの群がＰＢＳ（ビヒクル）を受容した。全ての静脈内注入は、２回／週で、合計１０回の注入で投与した。動物を２〜３回監視し、瀕死のときに安楽死させた。Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法による分析結果を、図２７および以下の表１に示す。図２７の灰色のバーは、治療の期間を示す。ＴＭＺ単独で、このＴＭＺ応答性の細胞系において、生存率を一定期間延ばすことができたが、全てのマウスが、平均生存期間１１２日で、およそ１５５日目までに腫瘍により死に至った。しかしながら、ｓｃＬ−ｐ５３を治療レジメンに加えることによって、生存期間は大幅に延長された。これらの動物においては、マウスの６０％が、２１０日目でも依然として生存していた。したがって、この組み合わせレジメンを受容したマウスの生存延長％は、未治療マウスのものの７４０倍を超え、ｓｃＬ−ｐ５３単独のものの５００倍、ＴＭＺ単独のもののほぼ２倍であった。したがって、ＴＭＺでの治療へのこのｓｃＬ−ｐ５３の追加は、長期生存率の有意な増加をもたらす。
【表１】
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ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせでの治療後に有意に増加した、ＴＭＺ耐性の頭蓋内ＧＢＭ腫瘍を有するマウスの生存率
【０１９４】
上述のインビトロ研究は、ＴＭＺ耐性脳腫瘍細胞のトランスフェクションは、ｓｃＬ−ｐ５３のトランスフェクションにより、ＴＭＺに感作することができることを示した。したがって、ＴＭＺ耐性ヒトＧＢＭ細胞系Ｔ９８Ｇから誘導した頭蓋内腫瘍を有するマウスの生存率を評価するために、実験を行った。無胸腺ヌードマウスに、Ｔ９８Ｇヒト神経膠芽腫細胞系を頭蓋内接種した。接種の１０日後、動物をＭＲＩにより画像化し、３つの群に均等に分割した。治療を、画像化の直後に開始した。動物を、１４日間連続１日１回１００ｍｇ／ｍ２のＴＭＺで静脈内治療するか、ｓｃＬ−ｐ５３（３０ｕｇ  ＤＮＡ／注入）（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）を週２回２週間静脈内投与するか、または両方の治療の組み合わせを行った。生存率を監視した。Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法による分析結果を、図２８に示す。１４日目におけるマウスの生存数／群を、各群に対して示す。この２週間の期間の治療にわたり、かなりの数の動物が、ＴＭＺまたはｓｃＬ−ｐ５３を単剤として受容した２つの群において、それらの疾患のために死に至った。対照的に、組み合わせ治療を受容した５匹のマウス中４匹は、依然として生存していた。したがって、この小さな有効性実験は、インビトロデータを裏付け、ｓｃＬ−ｐ５３での治療が、以前に耐性であったＧＢＭ腫瘍をＴＭＺに感作することができることを示す。
実施例１４
ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせによる頭蓋内脳腫瘍におけるアポトーシスの強化
【０１９５】
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、アポトーシス経路に関与することが既知である。ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせで観察される、腫瘍細胞応答の増加および動物生存率の増加の原因となる機構の評価を開始するために、種々の治療後に、頭蓋内Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２脳腫瘍に誘発されるアポトーシスのレベルを、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびフローサイトメトリーを使用して、判定した。Ｕ８７ＭＧ−ｌｕｃ２脳腫瘍を、上述のように誘発した。細胞の接種の１０日後、ＴＭＺ単独（１匹のマウスにつき１回の注入あたり５ｍｇ／ｋｇ、週２回の注入）、ｓｃＬ−ｐ５３単独（１匹のマウスにつき１回に注入あたり３０ｕｇ  ＤＮＡ、週２回の注入）（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）、またはｓｃＬ−ｐ５３および遊離型ＴＭＺの組み合わせのいずれかで、マウスを治療した。各動物は、合計３回の注入を受け、その後動物を安楽死させ、単細胞集団を腫瘍から単離し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイを受けさせた。
【０１９６】
図２９に示されるように、ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせでの治療後、アポトーシス状態の腫瘍細胞の割合は、いずれの単独治療と比較しても、有意に増加する。したがって、これらの結果は、全身投与されたｓｃＬ−ｐ５３のＩＣ腫瘍による取り込みが、化学療法剤ＴＭＺに対するアポトーシス応答の強化をもたらすことを示す。
実施例１５
ｓｃＬ−ｐ５３でのＴＭＺ耐性ＧＢＭ腫瘍の治療が、インビトロおよびインビボのＭＧＭＴ発現の下方調節をもたらす
【０１９７】
ＴＭＺ耐性の主要機構は、Ｏ６−グアニン付加物を除去することによりＴＭＺ誘発ＤＮＡ損傷を修復する、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の過剰発現である。したがって、ＭＧＭＴ活性を下方調節する方法が、ＴＭＺの治療効果を強化することになる。多数の報告が、ｗｔｐ５３発現を増加させることが、ＭＧＭＴ等のＤＮＡ修飾遺伝子の発現を下方制御し、ＴＭＺ等のアルキル化剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることができることを示している。上の実施例に記載のインビトロおよびインビボのデータは、ｓｃＬ−ｐ５３での治療が、脳腫瘍細胞において、ＴＭＺへの耐性を逆転させることができることを示した。この感作のための１つの可能性のある機構は、ｐ５３依存性のＭＧＭＴの下方調節である。ｓｃＬにより送達されるｗｔｐ５３の取り込みを、それが、インビトロのＴＭＺ耐性Ｔ９８Ｇヒト神経膠芽腫細胞およびインビボ皮下異種移植腫瘍における、ＭＧＭＴ発現レベルに影響するかどうかを判定するために検査した。Ｔ９８Ｇ細胞に、ｓｃＬ−ｐ５３（米国特許第７，７８０，８８２号に記載のように調製）をトランスフェクトした。トランスフェクションの１６および２４時間後、細胞を摘出し、タンパク質を単離し、４０ｕｇマイクログラムの全タンパク質を、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  Ｐｒｅｃａｓｔの４〜１２％の勾配ゲルを使用して電気泳動的に分画し、ニトロセルロース膜に移動させ、ＭＧＭＴおよびＧＡＰＤＨの発現をウエスタンブロッドアッセイによりプローブした。信号を、ＥＣＬ試薬により検出した（図３０）。
【０１９８】
図３０に示されるインビボ実験については、ｓｃＬ−ｐ５３（３０ｕｇ  ＤＮＡ／注入／マウス）を、２４時間以上にわたって、３回静脈内注入した。最後のｓｃＬ−ｐ５３治療の１６および２４時間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、タンパク質を抽出した。各時点において、４匹のマウスを摘出した。対照として、１つの群は、ＳＧＴ−５３を受容しなかった。４０ｕｇ  マイクログラムの全タンパク質を、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  Ｐｒｅｃａｓｔ４〜１２％の勾配ゲルを使用して電気泳動的に分画し、ニトロセルロース膜に移動させ、ＭＧＭＴおよびＧＡＰＤＨの発現をウエスタンブロット分析によりプローブした。信号を、ＥＣＬ試薬により検出した。
【０１９９】
インビトロでは、１６時間までにＭＧＭＴ発現の下方調節が完了し、トランスフェクションの２４時間後まで続いた。同様に、インビボ研究においても、２つの動物においてタンパク質の事実上の排除を伴って、１６時間でＭＧＭＴ発現の有意な減少が明らかであった。最後の注入の２４時間後までに、ＳＧＴ−５３で治療したマウスの全てに、事実上完全なＭＧＭＴの下方調節が、明らかに見られた。ＧＡＰＤＨタンパク質の一定した発現は、同等のタンパク質ローディングを示した。ＴＭＺによってこれらの腫瘍に誘発された、ＤＮＡの損傷を修復するためのＭＧＭＴの欠如は、外因性ＳＧＴに送達されたｗｔｐ５３の、アポトーシス経路への好ましい影響を伴って、ＴＭＺの致死効果に対するＴ９８Ｇの耐性を克服する役割を果たす傾向にある。
【０２００】
より重要なことに、同様の結果が、Ｔ９８Ｇを有する頭蓋内腫瘍モデルにおいて観察された（図３１）。この実験において、ｓｃＬ−ｐ５３（３０ｕｇ  ＤＮＡ／マウス）を、１回のみ静脈内注入した。ｓｃＬ−ｐ５３注入の１６〜７２時間後の種々の時点で、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、タンパク質を抽出した。対照としての１つの群（ＵＴ）は、ＳＧＴ−５３を受容しなかった。４０ｕｇ  マイクログラムの全タンパク質を、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  Ｐｒｅｃａｓｔの４〜１２％勾配ゲルを使用して電気泳動的に分画し、ニトロセルロース膜に移動させ、ｐ５３、ＭＧＭＴ、およびＧＡＰＤＨの発現についてウエスタンブロット分析によりプローブした。信号を、ＥＣＬ試薬により検出した。
【０２０１】
単回ｓｃＬ−ｐ５３静脈内注入の１６および２４時間後において、ｐ５３タンパク質のレベルの増加は、外因性ｐ５３の存在を示すＵＴ動物と比較して、明らかである。４３および７２時間までに、この信号は、ＵＴ対照のものと同様のレベルまで減少し戻った。さらに、重要なことには、皮下腫瘍に観察されるように、これらの頭蓋内腫瘍において、ＭＧＭＴの発現の有意な減少が、ｓｃＬ−ｐ５３での治療の４３および７２時間後の両方において観察された。観察されたＭＧＭＴ信号の減少のこの時期は、ＤＮＡ修復機構を妨げることによって細胞をＴＭＺに感作することにおける、ｐ５３の作用機構と一貫している。
実施例１６
神経膠芽腫または神経膠肉腫を有する患者における、ｓｃＬ−ｐ５３およびＴＭＺの組み合わせ治療
【０２０２】
テモゾロミドの標準的な投与は、２１日間毎日テモゾロミド投与を要する。ｓｃＬ−ｐ５３の可能な化学増感の有効性を最適化するために、好ましい実施形態において、ｓｃＬ−ｐ５３治療は、テモゾロミド治療の１日前に開始する。前臨床研究は、ｓｃＬ−ｐ５３複合体により送達されるｗｔｐ５３腫瘍抑制遺伝子が、腫瘍を化学療法剤に感作するように機能し、薬物に対してより応答性にすることを示した。したがって、ｓｃＬ−ｐ５３の効果を得るためには、テモゾロミドが投与される際に、ｐ５３が発現することが、重要である。図に示されるスケジュール案を使用して、ｓｃＬ−ｐ５３を、テモゾロミド治療の開始時に発現させる。
【０２０３】
代替の実施形態において、２回のｓｃＬ−ｐ５３治療を、テモゾロミド治療の開始前に行う。ここで、ｓｃＬ−ｐ５３は、図３３の表に示されるものと同一の日程で、１日目で開始して、投与する。しかしながら、最初のＴＭＺ治療は、６日目まで行わない。テモゾロミドは、２１日間（６日目〜２６日目）、毎日（週末を含む）１００〜２５０ｍｇ／ｍ２で経口投与する。
実施例１７
メルファラン（ＭＥＬ）を含む標的化されたカチオン性リポソームの調製
材料：
【０２０４】
ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、塩化物）
−Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８９０８９０Ｅ、分子量６９８．５５
−濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０２０５】
ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）
−Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８５０７２５Ｅ、分子量７４４．０４
−濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０２０６】
塩酸メルファラン（Ｍｅｌ）、粉末（分子量＝３４１．７）
−Ｓｉｇｍａから入手、Ｍ２０１１−１００ｍｇ、
−無水エタノール中で、希釈を助けるために１０〜１５ｕｌの６Ｎ  ＨＣｌを用いて５０ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈する
【０２０７】
超高純度の、内毒素を含まないＬＡＬ試薬水（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｔ．＃Ｗ５０−５００、内毒素０．００５ＥＵ／ｍｌ未満）
【０２０８】
注入器：２２ゲージ針（ｐａｒｔ＃８１３６５）を有する１ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｇａｓｔｉｇｈｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ＃８１２３０）
手順：
【０２０９】
１．    新しいＭｅｌ溶液を、溶解するまで（透明になるはず）、高速でボルテックスすることにより、６Ｎ  ＨＣｌ（およそ１０〜１５ｕＬ）を添加して、Ｍｅｌを無水エタノール中に５０ｍｇ／ｍｌ（１４６．３ｍＭ）の濃度まで溶解することによって、毎回調製する。脂質を混合するために使用するまで、室温で保管する（以下のステップ３）。
【０２１０】
２．    脂質溶液を、１０〜１５分間３７℃で設置し、それに続いて、脂質溶液を、時折振動させながら、５分間６５℃の水浴に設置する。
【０２１１】
３．    Ｌｉｐ−Ｍｅｌの調製：５０℃〜６０℃に設定された熱板上に、攪拌棒を有する茶色のガラス瓶を設置する。飛散させることなく高速で攪拌しながら、脂質およびＭｅｌを、次の順序（重要）で瓶に加える。
【０２１２】
１：１（Ｌｉｐ：Ｍｅｌ）のモル比
ＤＯＴＡＰ                  １７５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．５ｍｇ
ＤＯＰＥ                  １８７．５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．７５ｍｇ
Ｍｅｌ溶液        ６８．３μｌ（５０ｍｇ／ｍｌ）＝１０μｍｏｌを添加し、
３つ全てを添加した後、３分間継続的に攪拌する
【０２１３】
４．  一方で、４，５６９ｕＬのＬＡＬ水を、攪拌棒を有する茶色のガラス瓶中で、水浴で６５℃まで温める。脂質−Ｍｅｌ溶液の添加直前に、瓶を熱板（５０℃〜６０℃）に移動させる。飛散させることなく、水を数秒間高速で攪拌し、攪拌棒から気泡を除去する。
【０２１４】
５．  水を熱板上に保持する。脂質の添加中、（飛散させることなく）水を高速で攪拌し続ける。脂質およびＭｅｌを上述（ステップ２）のように混合した後、即座に、および可能な限り迅速に、注入用のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、混合物を熱板（５０℃〜６０℃）上の熱水に、渦の中心に直接注入する。脂質混合物の添加後、軽く蓋をしながら、１分間（飛散させることなく）高速で攪拌を継続する。
【０２１５】
６．  ガラス瓶を、室温の攪拌プレートに移動させ、軽く蓋をした溶液が、２０〜２５℃（室温）に冷めるまでゆっくりと攪拌を継続する
【０２１６】
７．  室温のＬＡＬ水で、体積を５ｍｌに調整する。
【０２１７】
８．  ０．２２μｍ細孔のＭｉｌｅｘ  ＧＶフィルタを使用して、溶液を濾過する。
【０２１８】
９．  必要であれば、粒径およびゼータ電位を測定する。
【０２１９】
これらの調製方法の結果は、リポソームが、約２０〜６０ｎｍの粒径および約１０〜５０ｍＶのゼータ電位を有することを示す。
実施例１８
化学結合なしの（単純な混合による）メルファランを含有する標的化されたカチオン性リポソーム（ｓｃＬ／ＭＥＬ）の調製
【０２２０】
上述の手順に従って調製されたＭＥＬ含有のカチオン性リポソームを使用して、本明細書に記載のリガンド標的化されたＭＥＬのカチオン性リポソーム複合体を、構成成分の単純な混合によって、化学結合なしで調製する。複合体の調製は、次の一般手順に従った。
【０２２１】
リポソーム−水（または緩衝液）に、適切な量の標的部分を添加して、所望の比率を得、５〜１０秒の穏やかな反転により混合する。標的部分は、トランスフェリンもしくは葉酸、または他のタンパク質を含むがこれらに限定されない、リガンドであってもよい。それは、トランスフェリンまたはＨＥＲ−２受容体（例えば、ＴｆＲｓｃＦｖ）を含むがこれらに限定されない、細胞表面受容体を標的化する、抗体または抗体フラグメントであってもよい。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。所望の最終体積を得るためには、標的部分−Ｌｉｐ−ＭＥＬ混合物を、所望の体積を得るために必要な任意の体積（なしを含む）の水（好ましくは、脱イオン水）、またはトリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、またはリン酸緩衝生理食塩水を含むがこれらに限定されない任意のｐＨの緩衝液と混合し、５〜１０秒間穏やかに反転させて混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０２２２】
典型的に、インビトロアッセイでの使用のためには、最終的な複合体中のＭＥＬの量は、１ウェルあたり約１μＭ〜３０μＭであることが望ましく、インビボ使用のためには、１回の注入につき、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇのＭＥＬを提供することが望ましい。インビボでの使用のために、デキストロースまたはスクロースを、最後に、約１〜５０％（Ｖ：Ｖ）のデキストロースまたはスクロース、好適には５％デキストロースまたは１０％スクロースの最終濃度まで添加し、５〜１０秒間穏やかな反転により混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０２２３】
好適な比率１：３０（抗体フラグメント：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１リポソーム：ＭＥＬ（モル比）でのインビトロトランスフェクションの具体的な例は、次の通りである。おおよそ６００ｕＬの最終体積については、２５０μＬのＬｉｐ：ＴＭＺ（２ｍＭストック）を、５６．７μＬの抗体フラグメントと（抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント［ＴｆＲｓｃＦｖ］の濃度０．２１ｍｇ／ｍＬで）混合する。２９３．３μＬの水または緩衝液を添加する。
【０２２４】
本方法によって調製される最終的な複合体の寸法（数平均）は、約１０〜８００ｎｍ、好適には約１５〜４００ｎｍ、最も好適には約２０〜２００ｎｍであり、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳを使用して、動的光散乱により測定されるゼータ電位は、約１〜１００ｍＶ、より好適には５〜６０ｍＶ、最も好適には１０〜５０ｍＶである。この寸法は、効果的に、腫瘍の毛細血管床を通過するか、または血液脳関門を通過し、腫瘍細胞に到達するのに十分小さい。
【０２２５】
上述のように調製した、デキストロースまたはスクロース（１〜５０％、体積対体積）を含有する複合体はまた、凍結乾燥させて、室温、２〜８℃、または−２０〜−８０℃で保管することができる。試料は、使用の前に水で再構成する。再構成後の最終的な凍結乾燥複合体の寸法（数平均）は、約１０〜８００ｎｍ、好適には約１５〜４００ｎｍ、より好適には約２０〜２００ｎｍ、最も好適には５０〜１５０ｎｍであり、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳを使用して動的光散乱により測定されるゼータ電位は、約１〜１００ｍＶ、より好適には５〜６０ｍＶ、最も好適には１０〜５０ｍＶである。これらの複合体は、元の生物活性の少なくとも８０％を保持する。
実施例１９
遊離型（非封入型）ＭＥＬと比較して、腫瘍細胞に対するＬｉｐ／ＭＥＬ効果の増加
【０２２６】
ｓｃＬ／ＭＥＬナノ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＭＥＬのモル比１：１および０．７５：１（寸法＝それぞれ３０および２５ｎｍ）（リポソーム濃度＝２ｍＭ）、およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、上述のように調製した。ｓｃＬ／ＭＥＬナノ複合体の寸法は、それぞれ、４５および５７ｎｍであった。ｓｃＬ／ＭＥＬのインビトロでの細胞致死能力を、ＫＭＳ−１１細胞において、遊離非封入型ＭＥＬと比較した。
【０２２７】
これらのインビトロ細胞生存率研究については、ヒト多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ−１１を使用した。これらは、非接着性細胞であり、浮遊状態で増殖する。２．６ｍｌの無血清培地中の４×１０５個の細胞を、滅菌の５０ｍｌ遠心分離管中で、４００ｕｌのｓｃＬ／ＭＥＬ（いずれかの比率で）または非封入型ＭＥＬと共に、１時間インキュベートした。このインキュベーションに続き、培地に、最終濃度１０％（０．３ｍｌ／管）までウシ胎児血清を補充した。さらに４７時間インキュベートした後、細胞生存率を、トリパンブルーの細胞計数により判定した。これを達成するために、１部のトリパンブルー溶液を、１部の細胞懸濁液（１：１希釈）と、２ｍＬのエッペンドルフチューブ中で混合する（例えば２００μＬのトリパンブルーを、２００μＬの細胞懸濁液と混合する）。血球計および顕微鏡を使用して、生存細胞（無染色）および死亡細胞（染色）の数を数える。０．１ｍｍ３あたりの平均細胞数を計算し、ｍＬあたりの細胞数を判定する。生存細胞の割合は、以下のように計算する。
生存細胞％＝（生存細胞数／細胞数）×１００
【０２２８】
結果をプロットし、５０％および３０％の細胞死をもたらす薬物濃度であるＩＣ５０およびＩＣ３０値を、それぞれ、薬物濃度対生存細胞率のグラフから補間した。
【０２２９】
図３３は、中でＭＥＬがリポソームに封入される、腫瘍標的化ｓｃＬ／ＭＥＬナノ複合体が、非封入型ＭＥＬと比較して、抗癌効果を有意に改善したことを示す。非封入型ＭＥＬは、１７．６ｕＭのＩＣ５０値を有する。対照的に、本発明の方法を介して、リポソーム対ＭＥＬのモル比１：１でリポソーム中に封入し、本発明の腫瘍標的化ナノ複合体を用いて、おおよそ２倍低いＭＥＬで腫瘍細胞に送達した場合、ＭＥＬは、癌細胞を効果的に致死させる（９．６ｕＭのＩＣ５０）。それほど劇的ではないが、Ｌｉｐ／ＭＥＬをリポソーム：Ｍｅｌの比率０．７５：１（モル比）で調製した場合、非封入型ＭＥＬとｓｃＬ／ＭＥＬとの間のＩＣ５０値にも、３０％の減少があった。リポソーム単独でのトランスフェクションは、いかなる有意な細胞死（ＩＣ５０＞３３μＭ）ももたらさず、ｓｃＬ／ＭＥＬで観察された感作は、リポソームによる非特異的な細胞死の結果ではないことを示す。したがって、本発明の方法に使用される場合のリポソーム対メルファランの種々の異なるモル比は、単純な混合によって化学結合なしに本発明の方法を使用して標的化部分と複合する場合、多発性骨髄腫細胞に対する予想外に強化された効果を有する複合体をもたらす化合物をもたらすことになる。
【０２３０】
同様の結果が、非封入型ＭＥＬを、本明細書に記載の標的化部分なしのＬｉｐ／ＭＥＬ、および完全なｓｃＬ／ＭＥＬナノ複合体、ならびにリポソームのみと比較して、図３４に示される。Ｌｉｐ／ＭＥＬおよびｓｃＬ／ＭＥＬを、リポソーム対ＭＥＬのモル比１：１（リポソーム濃度＝２ｍＭ）で、実施例１および２に記載のように調製した。抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として、ＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、使用した。またもや、リポソームのみは、これらの多発性骨髄腫細胞に対して、事実上、細胞死効果を有さなかった。対照的に、標的化部分なしでさえも、本明細書に記載の方法を使用してモル比１：１（Ｌｉｐ：ＭＥＬ）でリポソーム中に封入した場合、遊離型（非封入型）ＭＥＬと比較して、ＩＣ５０値に有意な減少があった。この感作レベルは、完全なｓｃＬ／Ｍｅｌ複合体を使用した場合、さらに大きかった（ほぼ２倍）。本発明の方法を介してリポソーム中に封入した後の、このレベルの多発性骨髄腫細胞の感作は、予想外である。
実施例２０
凍結乾燥および再構成後のｓｃＬ／ＭＥＬの生物活性の維持
【０２３１】
スクロース（最終濃度＝１０％）を含有するｓｃＬ／ＭＥＬ複合体を、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＭＥＬのモル比１：１（寸法＝２１ｎｍ）（リポソーム濃度＝２ｍＭ）およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、上述のように調製した。この複合体を、次に凍結乾燥させ、試料を２〜８℃でデシケーター内に保管した。１週間の保管後、凍結乾燥したｓｃＬ／Ｍｅｌ複合体を、内毒素を含まない水で再構成し、ＫＭＳ−１１細胞を上述のようにトランスフェクトするために使用した。再構成したｓｃＬ／ＭＥＬの寸法は、５６ｎｍ（数平均）であり、本発明の方法によって調製する複合体を新たに調製した場合の好ましい寸法範囲内であった。したがって、凍結乾燥は、複合体の寸法を有意に変化させなかった。凍結乾燥／再構成されたｓｃＬ／ＭＥＬの細胞致死能力を、新たに調製したｓｃＬ／ＭＥＬおよび遊離型（非封入型）ＭＥＬと比較した。結果を、図３５に示す。新たに調製および凍結乾燥のｓｃＬ／ＭＥＬナノ複合体のＩＣ５０およびＩＣ２０値はいずれも、事実上同一である。したがって、この凍結乾燥した複合体もまた、その生物活性の少なくとも８０％を維持することができる。
実施例２１
ｓｃＬ／ＭＥＬおよび腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の組み合わせ療法
【０２３２】
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３経路の復元または活性化は、多発性骨髄腫細胞において、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘発することを示している（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｈ，Ｂｅｋｓａｃ  Ｍ，Ｂｌａｄｅ  Ｊ，Ｂｏｃｃａｄｏｒｏ  Ｍ，Ｃａｖｅｎａｇｈ  Ｊ，Ｃａｖｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ＭＭ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ：ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ２０１０；１５（１）：６−２５、Ｈｕｒｔ  ＥＭ，Ｔｈｏｍａｓ  ＳＢ，Ｐｅｎｇ  Ｂ，Ｆａｒｒａｒ  ＷＬ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｐ５３  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｐ５３  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６；５：１１５４−６０）。さらに、多発性骨髄腫疾患の原因となる分子を調査する研究は、骨髄腫細胞が、しばしば、健康な（すなわち、未変異の）ｐ５３遺伝子を有するが、ｐ５３タンパク質が非常に少ないことを示している。ｐ５３レベルの復元は、多発性骨髄腫細胞の増殖を遅延させ、それらの死をもたらす。したがって、ｐ５３遺伝子治療は、多発性骨髄腫に対する論理的な治療戦略である。
遺伝子治療のための腫瘍標的化ｓｃＬ−ｐ５３ナノ複合体
【０２３３】
その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７８０，８２２号に記載のように、ｗｔｐ５３遺伝子をコードし、ＴｆＲｓｃＦｖ（ｓｃＬ−ｐ５３）を介して標的化されるプラスミドＤＮＡを担持する送達システムの開発が成功している。ｓｃＬ−ｐ５３の全身投与は、多数の異なる腫瘍型において、高レベルのｗｔｐ５３発現をもたらす。ｓｃＬ−ｐ５３はまた、化学療法／放射線と組み合わせて使用して、アポトーシスを誘発することによりこれらの標準的な治療法に対する腫瘍応答を増加させるために開発された。
【０２３４】
原発性および転移性腫瘍の両方を効果的に標的化し、ｗｔｐ５３を効果的に送達することを示したｓｃＬ−ｐ５３ナノ複合体の使用は、多発性骨髄腫細胞内のｐ５３タンパク質のレベルを増加させる効果的な方法であるに違いない。
ｓｃＬ／ＭＥＬおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせ療法
【０２３５】
ｓｃＬ／ＭＥＬおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせ使用について、本明細書に記載する。現在の治療に使用される形態である、非封入型ＭＥＬと比較して、ｓｃＬ／ＭＥＬでの治療後に、多発性骨髄腫の細胞死の予想外に高い増加を我々が示したので、単剤療法として使用するためのｓｃＬ／ＭＥＬの開発は、患者にとって有益であろう。しかしながら、多発性骨髄腫細胞におけるｐ５３の発現を増加させることもまた、治療的可能性を有するため、組み合わせのアプローチは、さらに大きな治療的可能性を有することになる。
実験的アプローチ
【０２３６】
ｓｃＬ−ｐ５３と組み合わせて使用する際の、ｓｃＬ／ＭＥＬの使用による新規のより効果的な多発性骨髄腫の治療レジメンを開発するために、実験を設計した。
インビトロ結果
【０２３７】
ｓｃＬ−ｐ５３での治療が、多発性骨髄腫の細胞死をもたらし得るという仮説を検証するために、予備的な細胞生存率アッセイを、上述のように実行した。上述のヒト多発性骨髄腫細胞系ＫＭＳ−１１を、ｓｃＬ−ｐ５３単独でトランスフェクトした。ｓｃＬ−ｐ５３は、米国特許第７，７８０，８２２号に記載の所定の順序で構成要素を単純に混合することによって、調製した。複合体を、正常なヒトｗｔｐ５３遺伝子をコードするプラスミドの漸増用量で調製した。プラスミドＤＮＡ用量は、０〜１．３ｕｇ  ＤＮＡの範囲であった。ＫＭＳ−１１細胞を、上述のものと同一の手順を使用してトランスフェクトした。生存細胞率をトランスフェクションの２４時間後に測定し、ＩＣ５０およびＩＣ２０値を判定した。ｓｃＬ−ｐ５３でのトランスフェクションは、用量依存性の細胞死レベルをもたらし、多発性骨髄腫細胞におけるｗｔｐ５３の発現を、それ自体によって増加させることが、有意なレベルの細胞死につながることを示す（図３６）。これは、多発性骨髄腫におけるｐ５３の発現の調節に関する当該技術分野の報告は、全てが、追加の活性化剤か、または間接的、非直接的に、他のタンパク質の発現を妨害することによりｐ５３を作用させるかのいずれかを採用していたため、予想外である。
【０２３８】
いずれもが細胞死のレベルをそれら自身で増加させることが示されたｓｃＬ／ＭＥＬおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせを、同時にトランスフェクトして、この組み合わせ療法に対するＫＭＳ−１１細胞の応答を評価した。ＫＭＳ−１１細胞を、上述の手順を使用してトランスフェクトした。ｓｃＬ／ＭＥＬを、抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を標的化部分として使用して、Ｌｉｐ：ＭＥＬのモル比１：１（リポソーム濃度＝２ｍＭ）、およびＴｆＲｓｃＦｖ対リポソームの比率１：３０（ｗ：ｗ）で、上述のように調製した。細胞（１チューブあたり４×１０５個）を、漸増用量のＭＥＬを含有する、異なるｓｃＬ／ＭＥＬ複合体でトランスフェクトした。ｓｃＬ−ｐ５３を、前述（米国特許第７，７８０，８２２号）のように調製した。全てのトランスフェクションに使用したＤＮＡ用量は、０．２ｕｇ／４×１０５細胞であった。この用量は、ＩＣ２０がおおよそ０．２ｕｇの用量であったことがわかった、図３６からのデータに基づく。ＩＣ２０を使用して、２つの治療の相加または相乗効果の検出を可能にした。ＫＭＳ−１１細胞を、遊離型（非封入型）ＭＥＬ単独、ｓｃＬ／ＭＥＬ単独、または遊離型（非封入型）もしくはｓｃＬ封入型ＭＥＬに加えてｓｃＬ−ｐ５３を組み合わせて、トランスフェクトした（図３７）。
【０２３９】
遊離型ＭＥＬ単体と比較して、ｓｃＬ／Ｍｅｌ複合体でのトランスフェクションは、薬物に対する有意なレベルの化学増感をもたらした。さらに、遊離型またはｓｃＬ複合化ＭＥＬのいずれかと組み合わせて使用した場合、ｓｃＬ−ｐ５３の追加は、この化学療法剤に対するＫＭＳ−１１細胞の応答を有意に改善することができ、ｓｃＬ／ＭＥＬおよびｓｃＬ−ｐ５３の組み合わせが、最も効果的であった。治療薬として使用する標準形態である、非封入型ＭＥＬのＩＣ５０と比較して（ＩＣ５０＝１０．９）、ｓｃＬ／ＭＥＬに加えてｓｃＬ−ｐ５３のＩＣ５０は、４．５７であり、細胞死において２倍を超える増加であった。
【０２４０】
これらの研究は、インビトロで実行されたが、同様の結果（多発性骨髄腫の細胞死の増加）が、ｓｃＬ／ＭｅｌおよびｓｃＬ−ｐ５３が、組み合わせで、ヒト患者に全身投与された場合に生じるであろうこともまた、十分に予想される。ｓｃＬ−ｐ５３の用量は、週２回、５週間の注入で、２．４〜３．６ｍｇ／注入であることが予想される。ｓｃＬ／ＭＥＬは、６〜１６ｍｇ／ｍ２の用量の単回静脈内注入として、２週間間隔の４回投与で投与されるであろう。
【０２４１】
ここで観察された組み合わせの予想外のレベルの強化は、ヒト患者における多発性骨髄腫の治療のための新しい治療法としての、この組み合わせアプローチの可能性を示す。
【０２４２】
実施例２２
アトロピンを含むカチオン性リポソームの調製
材料：
【０２４３】
ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、塩化物）
−Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８９０８９０Ｅ、分子量６９８．５５
−濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０２４４】
ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）
−Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から入手、Ｃａｔ．＃８５０７２５Ｅ、分子量７４４．０４
−濃度：２５ｍｇ／ｍＬエタノール溶液
使用前に、無水エタノールで脂質を２０ｍｇ／ｍｌまで希釈する
【０２４５】
アトロピン、粉末（分子量＝２８９．３７）
−Ｓｉｇｍａから入手
−無水エタノール中で、１００ｍＭの濃度まで溶解する。
【０２４６】
超高純度の、内毒素を含まないＬＡＬ試薬水（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｔ．＃Ｗ５０−５００、内毒素０．００５ＥＵ／ｍｌ未満）
【０２４７】
注入器：２２ゲージ針（ｐａｒｔ＃８１３６５）を有する１ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｇａｓｔｉｇｈｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ＃８１２３０）
手順：
【０２４８】
１．  アトロピンを、無水エタノール中で、溶解するまで（透明になるはず）高速でボルテックスにより、１００ｍＭの濃度に溶解することによって、新しいアトロピン溶液を、毎回調製する。脂質を混合するために使用するまで、室温で保管する（以下のステップ３）。
【０２４９】
２．  脂質溶液を３７℃で１０〜１５分間設置し、それに続いて、脂質溶液を、時折振動させながら、５分間６５℃の水浴に設置する。
【０２５０】
３．  Ｌｉｐ−アトロピンの調製：５０℃〜６０℃に設定された熱板上に、攪拌棒と共に茶色のガラス瓶を設置する。飛散させることなく高速で攪拌しながら、脂質およびアトロピンを、次の順序（重要）で瓶に加える。
【０２５１】
モル比１：１（Ｌｉｐ：アトロピン）
ＤＯＴＡＰ                  １７５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．５ｍｇ
ＤＯＰＥ                    １８７．５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）＝５μｍｏｌ、または３．７５ｍｇ
アトロピン溶液                １００μｌ（１００ｍＭ）＝１０μｍｏｌを添加し、
３つ全てを添加した後、３分間継続的に攪拌する
【０２５２】
４．  一方で、４，５６９ｕＬのＬＡＬ水を、攪拌棒を有する茶色のガラス瓶中で、水浴で６５℃まで温める。脂質−アトロピン溶液の添加直前に、瓶を熱板（５０℃〜６０℃）に移動させる。飛散させることなく、水を数秒間高速で攪拌し、攪拌棒から気泡を除去する。
【０２５３】
５．  水を熱板上に保持する。脂質の添加中、（飛散させることなく）水を高速で攪拌し続ける。脂質およびアトロピンを上述（ステップ２）のように混合した後、即座に、および可能な限り迅速に、注入用のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、混合物を熱板（５０℃〜６０℃）上の熱水に、渦の中心に直接注入する。脂質混合物の添加後、軽く蓋をしながら、１分間（飛散させることなく）高速で攪拌を継続する。
【０２５４】
６．  ガラス瓶を、室温の攪拌プレートに移動させ、軽く蓋をした溶液が、２０〜２５℃（室温）に冷めるまでゆっくりと攪拌を継続する
【０２５５】
７．  室温のＬＡＬ水で、体積を５ｍｌに調整する。
【０２５６】
８．  ０．２２μｍ細孔のＭｉｌｅｘ  ＧＶフィルタを使用して、溶液を濾過する。
【０２５７】
９．  必要であれば、粒径およびゼータ電位を測定する。
これらの調製方法の結果は、リポソームが、約２０〜１００ｎｍの粒径および約１０〜５０ｍＶのゼータ電位を有することを示す。
実施例２３
化学結合なしで（単純な混合による）アトロピンを含有する標的化されたカチオン性リポソームの調製
【０２５８】
上述の手順に従って調製したアトロピンを含むカチオン性リポソームを使用して、本明細書に記載のリガンド標的化アトロピンのカチオン性リポソーム複合体を、構成要素の単純な混合により、化学結合なしに調製する。本複合体の調製は、以下の一般手順に従った。
【０２５９】
リポソーム−水（または緩衝液）に、適切な量の標的部分を添加して、所望の比率を得、５〜１０秒の穏やかな反転により混合する。標的部分は、トランスフェリンもしくは葉酸、または他のタンパク質を含むがこれらに限定されない、リガンドであり得る。それは、トランスフェリンまたはＨＥＲ−２受容体（例えば、ＴｆＲｓｃＦｖ）を含むがこれらに限定されない、細胞表面受容体を標的化する、抗体または抗体フラグメントであってもよい。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。所望の最終体積を得るためには、標的部分−Ｌｉｐ−アトロピン混合物を、所望の体積を得るために必要な任意の体積（なしを含む）の水（好ましくは、脱イオン水）、またはトリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、またはリン酸緩衝生理食塩水を含むがこれらに限定されない任意のｐＨの緩衝液と混合し、５〜１０秒間穏やかに反転させて混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０２６０】
インビボでの使用のために、デキストロースまたはスクロースを、最後に、約１〜５０％（Ｖ：Ｖ）のデキストロースまたはスクロース、好適には５％デキストロースまたは１０％スクロースの最終濃度まで添加し、５〜１０秒間穏やかな反転により混合する。この混合物を、室温で１０〜１５分保持する（おおよそ５分後に、再度５〜１０秒間穏やかに反転させる）。
【０２６１】
本方法によって調製される最終的な複合体の寸法（数平均）は、約１０〜８００ｎｍ、好適には約１５〜４００ｎｍ、最も好適には約２０〜２００ｎｍであり、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳを使用して、動的光散乱により測定されるゼータ電位は約１〜１００ｍＶ、より好適には５〜６０ｍＶ、最も好適には１０〜５０ｍＶである。この寸法は、効果的に、腫瘍の毛細血管床を通過するか、または血液脳関門を通過するのに十分小さい。
【０２６２】
本明細書に記載の方法および適用に対する他の好適な修正および適応が、いずれの実施形態の範囲からも逸脱することなくなされてもよいことは、関連技術分野の当業者には容易に明らかであろう。
【０２６３】
特定の実施形態が、本明細書に例示および記載されるとはいえ、特許請求の範囲は、特定の形態、または記載および示された部分の配置に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において、例示的な実施形態を開示しており、特定の用語が採用されるが、それらは、一般的で記述的な意味でのみで、制限する意図はなく使用される。実施形態の修正および変形が、上述の教示の範囲内で可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載されるもの以外にも、実施することが可能であることを理解されたい。
【０２６４】
本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、各個別の出版物、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれることを具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2014062084.tif 000041
【図３６】
2014062084.tif 000042
【図３７】
2014062084.tif 000043
【外国語明細書】
2014062084000001.pdf