(57)【要約】      （修正有）【課題】ステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および/または造血前駆細胞の増殖促進および/または動員剤の提供。【解決手段】下記一般式(I)もしくは(A)で表されるステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および/または造血前駆細胞の増殖促進および/または動員剤。2014062067.tif 000024【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）もしくは(A)で表されるステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤。
【化５】
2014062067.tif 000021
［式中、
Yは、置換基を有していてもよい低級アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルケニルを表し、
XaおよびXbは、同一または異なって、結合または-NRa-（式中、Raは、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよいアロイルを表す）を表し、
R1、R2、R3、R4、R7およびR8は、同一または異なって、水素原子またはヒドロキシを表すか、または
R1とR2、R3とR4、またはR7とR8が一緒になって=Oを表し、
R5およびR6は、同一または異なって、水素原子、ハロゲン、アジド、ヒドロキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルケニルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルキニルオキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい脂肪族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイルオキシ、置換基を有していてもよいアロイルオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルオキシまたは-NRbRc（式中、RbおよびRcは、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリールオキシカルボニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリールカルバモイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルバモイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルを表す）を表すか、または、R5とR6が一緒になってO=、RdON＝（式中、Rdは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよい脂肪族複素環基を表す）、またはReRfC=（式中、ReおよびRfは、同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルオキシまたは置換基を有していてもよいアロイルオキシを表す）を表し、
R9は、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニルまたは置換基を有していてもよいシクロアルキルを表すか、あるいは
R1とR3、R3とR5（但し、Xaが結合のときに限る）、R5とR7（但し、Xbが結合のときに限る）またはR7とR9が一緒になって結合または酸素原子を表し、
R10、R11およびR12は、R10およびR11が一緒になって結合または酸素原子を表し、R12が水素原子を表すか、またはR10およびR12が一緒になって結合または酸素原子を表し、R11が水素原子を表す］
【請求項２】
ステロール化合物が式（I）で表されるステロール化合物である請求項１記載の剤。
【請求項３】
R10およびR11が一緒になって結合を表し、R12が水素原子である請求項2記載の剤。
【請求項４】
XaおよびXbが結合である請求項2または3記載の剤。
【請求項５】
ステロール化合物が下記式(A)、(110)、(18)、(49)、(81)および(83)のいずれかで表される化合物である請求項1記載の剤。
【化６】
2014062067.tif 000022
【請求項６】
ステロール化合物が下記式(110)、(18)、(49)、(81)および(83)のいずれかで表される化合物である請求項1記載の剤。
【化７】
2014062067.tif 000023
【請求項７】
造血幹細胞の増殖促進剤である請求項1〜6のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
造血幹細胞の動員促進剤である請求項1〜6のいずれかに記載の剤。
【請求項９】
造血前駆細胞の増殖促進剤である請求項1〜6のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
造血前駆細胞の動員促進剤である請求項1〜6のいずれかに記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞を増殖させるおよび／または幹細胞からヒト組織や細胞を分化誘導する技術は、現在有効な根治療法がない心不全、肝不全、腎不全、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など）、心血管障害、脳血管障害、脊髄損傷、関節症、骨粗鬆症、糖尿病等に対する新しい治療法を提供するという観点から大きな注目を集めている。
幹細胞は自己複製能と様々な組織に分化できる多分化能を併せもつ細胞であり、自己複製能を有することから細胞の大量製造に応用することが可能である。幹細胞は採取部位から胚性幹細胞（ES細胞）、胎生幹細胞、成体幹細胞、臍帯血幹細胞および胎盤幹細胞の大きく５つに分類することができる。
【０００３】
このうち、成体幹細胞とは、様々な組織に存在する幹細胞であり、自己複製能力によって増殖および維持され、また分化能力によって前駆細胞に分化し、さらに機能を有する細胞へと分化する。例えば、造血幹細胞は成体では主に骨髄組織に存在し、造血前駆細胞に分化し、さらに分化することで赤血球、白血球、血小板およびリンパ球といった循環する血球に成熟する。このように血液細胞の生産は造血幹細胞から始まり、維持されている。同様に成体のそれぞれの組織の機能を担う細胞、例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞、腎糸球体細胞、腎尿細管細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞、気管上皮細胞などは、それぞれの組織の幹細胞や前駆細胞が存在し、組織を維持している。
【０００４】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞を末梢血へ動員する薬剤として、ケモカインやそのアナログ、各種抗体、サイトカインや成長因子などが知られている(Exp Hematology, 34, p.996-1009, 2006）。例えば、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)製剤は、造血幹細胞動員剤(Blood, 89(7), p.2233-2258, 1997)として、幹細胞の採取のために使用され、採取された幹細胞は、白血病、リンパ腫、およびその他の生命に関わる疾患の治療などに用いられている。また、G-CSF製剤は白血球増加剤(特許第2718426号)として、例えば、免疫不全患者の感染症、抗癌剤投与時の白血球減少症、再生不良性貧血などの治療に使用されている。加えて、CXCR4アンタゴニストであるAMD3100が、G-CSFによる造血幹細胞動員効果を増強させることが報告されている(Transfusion, 45, p.295-300, 2005)。さらに、マウスおよびサルにおいては、IL-８が骨髄から造血幹細胞および／または造血前駆細胞を動員することが報告されている(Blood, 85, p.2269-2275, 2005)。この他、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の動員に関係する物質として、ケモカインの一つであるSDF-1(Stromal cell derived factor-1)(Blood, 97, p.3354-3360,2001; Blood, 99, p.44-51, 2002)、血管新生因子であるVEGF(Vascular endothelial cell growth factor)やAngiopoietin-1(J Exp Med, 193, p.1005-1014, 2001)、ストロマ細胞に発現するVCAM-1(Vascular cell adhesion molecule-1)、ヒト造血幹細胞および／または造血前駆細胞に発現するVLA-4(Very late antigen-1)を中和する抗体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, p.9647-9651, 1995)、バクテリア由来DNAに特徴的なCpGモチーフをもったオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)(Journal of cellular physiology, 204, p.889-895, 2005)、プロスタグランジンI2誘導体（特開2007-269784）などが知られている。
【０００５】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖を促進する活性を有する薬剤として、糖尿病治療剤の一つGSK-3β阻害剤(Nature Medicine, 12, p.89-98, 2006)、骨粗鬆症治療剤の副甲状腺ホルモン(特許第512897号; Nature, 425, p.841-846, 2003)、プロスタグランジンE2誘導体（Nature, 447, p.1007-1011, 2007）などが知られている。また、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を生体外で増幅させる化合物(特開2012-65644)、造血幹細胞集団を増加させるための化合物（特表2012-507554）なども知られている。
【０００６】
一方、神経幹細胞増殖促進作用を有する化合物として、ペニシリウム・スピーシーズ(Penicillium sp.) CND1007株(FERM BP-10917)が産生する化合物(特許文献１参照)やステロール誘導体(特許文献2参照)が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2009/096445号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2011/010682号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の(1)〜(10)に関する。
（1）  下記一般式（I）もしくは(A)で表されるステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤。
【００１０】
【化１】
2014062067.tif 000002
【００１１】
［式中、
Yは、置換基を有していてもよい低級アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルケニルを表し、
XaおよびXbは、同一または異なって、結合または-NRa-（式中、Raは、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよいアロイルを表す）を表し、
R1、R2、R3、R4、R7およびR8は、同一または異なって、水素原子またはヒドロキシを表すか、または
R1とR2、R3とR4、またはR7とR8が一緒になって=Oを表し、
R5およびR6は、同一または異なって、水素原子、ハロゲン、アジド、ヒドロキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルケニルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルキニルオキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい脂肪族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイルオキシ、置換基を有していてもよいアロイルオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルオキシまたは-NRbRc（式中、RbおよびRcは、同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリールオキシカルボニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリールカルバモイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルバモイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルを表す）を表すか、または、R5とR6が一緒になってO=、RdON＝（式中、Rdは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよい脂肪族複素環基を表す）、またはReRfC=（式中、ReおよびRfは、同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルオキシまたは置換基を有していてもよいアロイルオキシを表す）を表し、
R9は、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニルまたは置換基を有していてもよいシクロアルキルを表すか、あるいは
R1とR3、R3とR5（但し、Xaが結合のときに限る）、R5とR7（但し、Xbが結合のときに限る）またはR7とR9が一緒になって結合または酸素原子を表し、
R10、R11およびR12は、R10およびR11が一緒になって結合または酸素原子を表し、R12が水素原子を表すか、またはR10およびR12が一緒になって結合または酸素原子を表し、R11が水素原子を表す］
(2)  ステロール化合物が式（I）で表されるステロール化合物である(1)記載の剤。
(3)  R10およびR11が一緒になって結合を表し、R12が水素原子である(2)記載の剤。
(4)  XaおよびXbが結合である(2)または(3)記載の剤。
(5)  ステロール化合物が下記式(A)、(110)、(18)、(49)、(81)および(83)のいずれかで表される化合物である(1)記載の剤。
【００１２】
【化２】
2014062067.tif 000003
【００１３】
(6)  ステロール化合物が下記式(110)、(18)、(49)、(81)および(83)のいずれかで表される化合物である(1)記載の剤。
【００１４】
【化３】
2014062067.tif 000004
【００１５】
(7)  造血幹細胞の増殖促進剤である(1)〜(6)のいずれかに記載の剤。
(8)  造血幹細胞の動員促進剤である(1)〜(6)のいずれかに記載の剤。
(9)  造血前駆細胞の増殖促進剤である(1)〜(6)のいずれかに記載の剤。
(10)  造血前駆細胞の動員促進剤である(1)〜(6)のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤などが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、「増殖促進」とは、細胞の種類に限らず細胞の増殖する能力を増強するまたは細胞の増殖する速度を加速させるという意味で使用する。例えば「造血幹細胞および／または前駆細胞が増殖促進する」とは造血幹細胞および／または前駆細胞の増殖速度が加速し、造血幹細胞および／または前駆細胞数が増加することを意味している。
また、本発明において、「動員」とは、細胞の種類に限らず他の部位から細胞が集積するという意味で使用する。例えば「造血幹細胞および／または前駆細胞が動員する」とは造血幹細胞および／または前駆細胞が骨髄から末梢血に集積することを意味する。本発明における造血幹細胞および／または前駆細胞の動員剤は、いいかえれば造血幹細胞および／または前駆細胞の骨髄から末梢血への動員剤である。
【００１８】
本発明の造血幹細胞および／または前駆細胞の増殖促進および／または動員剤は、式(I)または(A)で表されるステロール化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
以下、一般式(I)で表される化合物を化合物Iという。他の式番号の化合物についても同様である。
【００１９】
一般式(I)の各基の定義において、
低級アルキルならびに低級アルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルオキシ、低級アルキルカルバモイル、ジ低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルスルホニルの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数1〜10のアルキルがあげられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどがあげられる。ジ低級アルキルカルバモイルにおける２つの低級アルキルは同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
低級アルケニルおよび低級アルケニルオキシの低級アルケニル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数2〜10のアルケニルがあげられ、より具体的にはビニル、アリル、1-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなどがあげられる。
低級アルキニルおよび低級アルキニルオキシの低級アルキニル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数2〜10のアルキニルがあげられ、より具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどがあげられる。
【００２１】
シクロアルキルおよびシクロアルキルオキシのシクロアルキル部分としては、例えば炭素数3〜8のシクロアルキルがあげられ、より具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。
アリールならびにアリールオキシ、アロイル、アロイルオキシ、アリールオキシカルボニル、アリールカルバモイルおよびアリールスルホニルのアリール部分としては、例えば炭素数6〜14のアリールがあげられ、より具体的にはフェニル、ナフチル、アズレニル、アントリルなどがあげられる。
【００２２】
脂肪族複素環基、および脂肪族複素環オキシの脂肪族複素環基部分としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性脂肪族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基などがあげられ、より具体的にはアジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、ピペリジニル、アゼパニル、1,2,5,6-テトラヒドロピリジル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピラゾリニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、5,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、オキサゾリジニル、モルホリノ、モルホリニル、チオキサゾリジニル、チオモルホリニル、2H-オキサゾリル、2H-チオキサゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチオキサゾリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロ-2H-クロマニル、ジヒドロ-1H-クロマニル、ジヒドロ-2H-チオクロマニル、ジヒドロ-1H-チオクロマニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロキナゾリニル、ジヒドロベンゾジオキサニルなどがあげられる。
【００２３】
芳香族複素環基ならびに芳香族複素環オキシ、芳香族複素環カルボニルオキシ、芳香族複素環オキシカルボニルおよび芳香族複素環カルバモイルにの芳香族複素環基部分としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性芳香族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性芳香族複素環基などがあげられ、より具体的にはフリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、イソインドリル、インドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピロロピリジニル、ピロロピリミジニル、イミダゾピリジニル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニルなどがあげられる。
【００２４】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルケニルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルキニルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイルおよび置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、
ハロゲン；ヒドロキシ；スルファニル；ニトロ；アジド；シアノ；カルボキシ；カルバモイル；ホルミル；C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
脂肪族複素環基；芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルコキシ；
C2-10アルケニルオキシ；
C3-8シクロアルコキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリールオキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキルオキシ；
C2-11アルカノイルオキシ；C7-15アロイルオキシ；C1-10アルキルスルホニルオキシ；トリフルオロメタンスルホニルオキシ；C6-14アリールスルホニルオキシ；p-トルエンスルホニルオキシ；
C1-10アルキルスルファニル；C6-14アリールスルファニル；
-NRXaRYa（式中、RXaおよびRYaは同一または異なって、水素原子；ホルミル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルキル；
C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC2-11アルカノイル；
C7-15アロイル；C1-10アルコキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；
C1-10アルキルカルバモイル、ジC1-10アルキルカルバモイル、C6-14アリールカルバモイル、C1-10アルキルスルホニル；トリフルオロメタンスルホニル；C6-14アリールスルホニルまたはp-トルエンスルホニルを表す）；
C2-11アルカノイル；C3-8シクロアルキルカルボニル；C7-15アロイル；脂肪族複素環カルボニル；芳香族複素環カルボニル；C1-10アルコキシカルボニル；C6-14アリールオキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；ヒドロキシ、ハロゲン、C1-10アルコキシ、アミノ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノ、C2-11アルカノイルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルアミノからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルキルカルバモイル；ヒドロキシ、ハロゲン、C1-10アルコキシ、アミノ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノ、C2-11アルカノイルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルアミノからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいジC1-10アルキルカルバモイルおよびC6-14アリールカルバモイル
からなる群から選ばれる置換基などがあげられる。
【００２５】
置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアロイルオキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリールカルバモイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシカルボニルおよび置換基を有していてもよい芳香族複素環カルバモイルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜5の、
ハロゲン；ヒドロキシ；スルファニル；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバモイル；C1-10アルキル；トリフルオロメチル；C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
脂肪族複素環基；芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルコキシ；
C3-8シクロアルコキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリールオキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキルオキシ；
C2-11アルカノイルオキシ；C7-15アロイルオキシ；C1-10アルキルスルホニルオキシ；トリフルオロメタンスルホニルオキシ；C6-14アリールスルホニルオキシ；ｐ−トルエンスルホニルオキシ；
C1-10アルキルスルファニル；C6-14アリールスルファニル；
-NRXbRYb（式中、RXbおよびRYbは同一または異なって、水素原子；ホルミル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルキル；
C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC2-11アルカノイル；
C7-15アロイル；C1-10アルコキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；C1-10アルキルスルホニル；トリフルオロメタンスルホニル；C6-14アリールスルホニルまたはｐ−トルエンスルホニルを表す）、
C2-11アルカノイル；C3-8シクロアルキルカルボニル；C7-15アロイル；脂肪族複素環カルボニル；芳香族複素環カルボニル；C1-10アルコキシカルボニル；C6-14アリールオキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；C1-10アルキルカルバモイル；ジC1-10アルキルカルバモイル；C6-14アリールカルバモイル；
C1-10アルキルスルホニルおよびC6-14アリールスルホニル
からなる群から選ばれる置換基などがあげられる。
【００２６】
置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシ、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基および置換基を有していてもよい脂肪族複素環オキシにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜5の、
オキソ；ハロゲン；ヒドロキシ；スルファニル；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバモイル；1〜3個のヒドロキシが置換していてもよいC1-10アルキル；トリフルオロメチル；C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
脂肪族複素環基；芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルコキシ；
C3-8シクロアルコキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリールオキシ；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキルオキシ；
C2-11アルカノイルオキシ；C7-15アロイルオキシ；C1-10アルキルスルホニルオキシ；トリフルオロメタンスルホニルオキシ；C6-14アリールスルホニルオキシ；ｐ−トルエンスルホニルオキシ；
C1-10アルキルスルファニル；C6-14アリールスルファニル；
-NRXcRYc（式中、RXcおよびRYcは同一または異なって、水素原子；ホルミル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC1-10アルキル；
C3-8シクロアルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC6-14アリール；
芳香族複素環基；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルコキシおよびトリフルオロメチルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC7-16アラルキル；
ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、C1-10アルコキシ、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノおよびC1-10アルコキシカルボニルからなる群から選ばれる1〜3個の置換基を有していてもよいC2-11アルカノイル；
C7-15アロイル；C1-10アルコキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；C1-10アルキルスルホニル；トリフルオロメタンスルホニル；C6-14アリールスルホニルまたはｐ−トルエンスルホニルを表す）、
C2-11アルカノイル；C3-8シクロアルキルカルボニル；C7-15アロイル；脂肪族複素環カルボニル；芳香族複素環カルボニル；C1-10アルコキシカルボニル；C6-14アリールオキシカルボニル；C7-16アラルキルオキシカルボニル；C1-10アルキルカルバモイル；ジC1-10アルキルカルバモイル；C6-14アリールカルバモイル；
C1-10アルキルスルホニルおよびC6-14アリールスルホニル
からなる群から選ばれる置換基などがあげられる。
【００２７】
ここで示したC1-10アルキルならびにC1-10アルコキシ、C2-11アルカノイルオキシ、C1-10アルキルスルファニル、C1-10アルキルアミノ、ジC1-10アルキルアミノ、C2-11アルカノイルアミノ、C1-10アルコキシカルボニルアミノ、C2-11アルカノイル、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル、ジC1-10アルキルカルバモイル、C1-10アルキルスルホニルおよびC1-10アルキルスルホニルオキシのC1-10アルキル部分としては、例えば前記低級アルキルの例示であげた基が例示される。ジC1-10アルキルアミノおよびジC1-10アルキルカルバモイルにおける２つのC1-10アルキルは同一でも異なっていてもよい。
【００２８】
C2-10アルケニルオキシのC2-10アルケニル部分としては、例えば前記低級アルケニルの例示であげた基が例示される。
C3-8シクロアルキルならびにC3-8シクロアルコキシおよびC3-8シクロアルキルカルボニルのC3-8シクロアルキル部分としては、例えば前記シクロアルキルの例示であげた基が例示される。
【００２９】
C6-14アリールならびにC6-14アリールオキシ、C7-15アロイルオキシ、C6-14アリールスルファニル、C6-14アリールスルホニル、C7-15アロイル、C6-14アリールオキシカルボニル、C6-14アリールカルバモイル、C6-14アリールスルホニルおよびC6-14アリールスルホニルオキシのC6-14アリール部分としては、例えば前記アリールの例示であげた基が例示される。
【００３０】
C7-16アラルキルオキシ、C7-16アラルキルおよびC7-16アラルキルオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば前記アリールの例示であげた基が例示され、アルキル部分としては、例えばC1-10のアルキレンがあげられ、より具体的には前記低級アルキルの例示であげた基から水素原子を１つ除いた基があげられる。
脂肪族複素環基および脂肪族複素環カルボニルの脂肪族複素環基部分、芳香族複素環基および芳香族複素環カルボニルの芳香族複素環基部分ならびにハロゲンとしては、それぞれ例えば前記脂肪族複素環基、前記芳香族複素環基および前記ハロゲンの例示であげた基が例示される。
【００３１】
化合物Iの具体例としては、例えば以下の化合物があげられる。
【００３２】
【表１】
2014062067.tif 000005
【００３３】
【表２】
2014062067.tif 000006
【００３４】
【表３】
2014062067.tif 000007
【００３５】
【表４】
2014062067.tif 000008
【００３６】
【表５】
2014062067.tif 000009
【００３７】
【表６】
2014062067.tif 000010
【００３８】
【表７】
2014062067.tif 000011
【００３９】
【表８】
2014062067.tif 000012
【００４０】
【表９】
2014062067.tif 000013
【００４１】
【表１０】
2014062067.tif 000014
【００４２】
【表１１】
2014062067.tif 000015
【００４３】
【表１２】
2014062067.tif 000016
【００４４】
【表１３】
2014062067.tif 000017
【００４５】
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖および／または動員の促進剤に有効成分として含有するステロール化合物としては、上記に例示した化合物の他、化合物Aがあげられるが、下記の化合物が好ましい。
【００４６】
【化４】
2014062067.tif 000018
【００４７】
中でも、化合物110, 18, 49, 81, 83などがより好ましく、化合物110などがさらにより好ましい。
化合物IまたはAの薬学的に許容される塩は、例えば薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。化合物IまたはAの薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。
【００４８】
また、化合物IおよびAならびにそれらの薬学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤に使用することができる。
化合物Iの中には、幾何異性体、光学異性体などの立体異性体、互変異性体などが存在し得るものもあるが、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤には、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を使用することができる。
【００４９】
化合物IおよびAならびにそれらの薬学的に許容される塩は、取得の由来も特に限定されず、天然から抽出、精製したものでもよく、化学的手法により合成したものであってもよい。例えばWO2009/096445またはWO2011/010682に記載の方法によって製造することができる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤は、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を、そのまま単独で使用することも可能であるが、各種の医薬製剤として使用することもできる。
【００５０】
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤の使用に当たっては、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を、そのまま単独でまたは各種の医薬製剤として、ヒトまたは動物に対し投与するなどの方法で実施することができる。また、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進剤の使用に当たっては、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を、そのまま単独でまたは各種の医薬製剤として、生体もしくは臍帯から取得した造血幹細胞および／または造血前駆細胞に生体外で接触させるなどの方法で実施することができる。
【００５１】
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬学的に許容される一種またはそれ以上の担体（例えば、希釈剤、溶剤、賦形剤など）と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００５２】
ヒトまたは動物に対し投与する場合の投与経路としては、本発明の実施に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤などは、乳糖などの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤などを用いて製造できる。
【００５３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤などは、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合液などの希釈剤または溶剤などを用いて製造できる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤は、ヒトまたは動物に対し投与することにより、骨髄および／または脾臓中における造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖を促進し、短期間に該細胞を増加させることができる。また、骨髄中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の末梢血中への動員を促進させることもできる。さらに、ヒトまたは動物の骨髄、臍帯血および／または末梢血から分画した造血幹細胞および／または造血前駆細胞に対し、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を接触させることにより、該細胞を短期間に増殖させることができる。
【００５４】
従って、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤は、例えば造血機能が減弱した患者、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の移植が必要な患者などの治療（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍、乳癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、膵癌、大腸癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、胚細胞腫瘍、ユーイング肉腫などの固形腫瘍、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、自己免疫疾患などの治療）に用いることができる。
【００５５】
具体的には、例えばドナー（提供者）から採取した造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む骨髄細胞、末梢血、臍帯血などをレシピエント（移植を受ける患者）に移植し、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤を上記に従い投与することにより、レシピエントに移植された造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増加させ、レシピエントに生着させ、末梢血への動員も促進され、結果として血球の回復を促進させることができる。
【００５６】
また、ドナーに本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤を投与することにより、ドナーの骨髄中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増加させ、末梢血への該細胞の動員も促進させ、ドナーの骨髄および／または末梢血から採取できる造血幹細胞および／または造血前駆細胞の収量を増加させることができる。これにより移植に必要な造血幹細胞および／または造血前駆細胞を十分量確保できる。
【００５７】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞が骨髄から末梢血へ動員された場合には、該細胞を得るために血液試料を分離することができる。これらの細胞は直ちに移植することができるが、分離した血液試料から、「造血幹細胞および／または造血前駆細胞」の特徴を有する細胞についてさらに濃縮することができる。濃縮する方法は、例えば、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を、より分化した子孫細胞も多く含む試料から取り出す工程を含む。造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む試料は、CD34陽性細胞で選択することによって濃縮することができる。造血幹細胞および／または造血前駆細胞を取り出す工程は、例えば、市販の磁気抗CD34ビーズ（Dynal, Lake Success, NY）を用いて達成することができる。
【００５８】
さらに、ドナーから採取した骨髄細胞、末梢血、臍帯血などから造血幹細胞および／または造血前駆細胞に富む細胞集団を分離し、これを本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤を添加して培養することにより、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖を促進させ、該細胞数を増加させることができ、移植に必要な造血幹細胞および／または造血前駆細胞を十分量確保できる。
【００５９】
造血幹細胞および／または造血前駆細胞数を解析するには様々な手法があり、培養法、フローサイトメトリー法、移植法、組織化学的解析法などがある。培養法では造血幹細胞および／もしくは造血前駆細胞ならびに／または造血幹細胞および／もしくは造血前駆細胞を含む細胞を、液体培地で培養し、細胞数の増加を定量する方法、半固形培地に播種し、形成されるコロニーの数を測定するcolony-forming cell (CFC;コロニー形成細胞)アッセイ法、ストロマ細胞と共に培養し、出現する血球細胞を回収しCFCアッセイを行なうLong-term culture-initiating cells (LTC-IC）アッセイ法などがある(造血幹細胞の今と医療への展開  羊土社  p.125-142)。また蛍光標識抗体とフローサイトメトリー機器を使用することで、造血幹細胞および／または造血前駆細胞数を定量することができる。例えばマウスの造血幹細胞および／または造血前駆細胞数の場合は、c-kit陽性、Sca-1陽性かつ細胞系（lineage）マーカー（CD3, Gr-1, Mac-1, B220, ter-119）陰性の細胞集団に該細胞が高い頻度で存在する。また、ヒトの造血幹細胞および／または造血前駆細胞数の場合は、CD34および／またはCD133陽性細胞の細胞集団に該細胞が高い頻度で存在する。
【００６０】
また造血幹細胞および／もしくは造血前駆細胞ならびに／または造血幹細胞および／もしくは造血前駆細胞を含む細胞集団を、X線などで免疫系を抑制させたマウスに移植し、一定期間、例えば2週間〜3ヶ月後に上記の手法を組み合わせることで移植細胞由来の血液細胞、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の存在率を定量する手法がある（中辻 憲夫  「幹細胞・クローン研究プロトコール」  p.117-124, 138-144, 2001）。
【００６１】
このような手法により、骨髄組織、末梢血、脾臓、その他各種組織に存在する造血幹細胞および／または造血前駆細胞を評価することができる。
造血幹細胞および／または造血前駆細胞は、通常骨髄に存在し、増殖や分化を繰り返し、生体の造血系を維持していると考えられている。骨髄組織の造血幹細胞および／または造血前駆細胞数の定量的評価により増殖促進活性を評価することもできる。また末梢血や脾臓の造血幹細胞および／または造血前駆細胞数を定量することで、骨髄組織から末梢血または脾臓への動員活性を評価することができる。
【００６２】
上記の手法および評価法または上記手法に類似する手法により、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤の効果を検証することができる。
本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤は、例えば他の造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増殖または動員させる薬剤、上皮増殖因子受容体（EGFR）シグナルを阻害する薬剤（Nature Medicine, 16, p.1141-1146. 2010）、免疫抑制剤などと共に用いることもできる。具体的には、例えば、プレリキサフォル（plerixafor）、G-CSF製剤［例えば、フィルグラスチム（filgrastim）、ナルトグラスチム（Nartograstim）、レノグラスチム（Lenograstim）など］、エルロチニブ（Erlotinib）、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）、シクロスポリンなどがあげられる。
【００６３】
化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度などにより異なるが、通常経口の場合、成人一人あたり、0.01〜10000mg、好ましくは0.05〜100mgの範囲で、1日1回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人あたり0.001〜10000mg、好ましくは0.01〜100mgを1日1回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００６４】
化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を採取した造血幹細胞および／または造血前駆細胞を培養する際に添加する場合、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩を例えばジメチルスルホキシドなどの適当な溶媒に溶解した後、培地中での化合物Iの濃度が10 nmol/L〜10 mmol/L、好ましくは100 nmol/L〜1 mmol/L、より好ましくは1 μmol/L〜100 μmol/Lとなるように培地中に添加すればよい。
【００６５】
次に、本発明の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤の効果について試験例により具体的に説明する。
なお各試験は、特に記載のない限り、以下の方法により行った。
被験化合物
各試験に用いた化合物A, 110, 18, 49, 81および83は、WO2009/096445またはWO2011/010682に記載の方法により得た。組換えヒトG-CSFは協和発酵キリン株式会社で調製されたもの（ナルトグラスチム；J Pharmacol Exp Ther, 273, p.1114-1122, 1995）を、リン酸緩衝液（PBS；ギブコ）に 100 μg/mLの濃度になるように溶解して使用した。
実験動物
試験例2の実験動物には、8週齢のDBA/2マウスの雄（日本エスエルシー）を用いた。該マウスは7〜14日間、検疫と馴化を兼ねて飼育した後に、投与を開始した。
【００６６】
実施例3〜5の実験動物には、8週齢のC57BL／6-CD45.2マウスの雄（日本エスエルシー）およびC57BL/6-CD45.1マウス（三共ラボサービス）の雄を用いた。該マウスは7日間、検疫と馴化を兼ねて飼育した後に、実験を開始した。
投与方法
腹腔内から投与する場合、被験化合物は、被験化合物をN,N-ジメチルアセトアミド（DMA；ナカライテスク）に溶解した後、クレモフォア イーエル（Cremophor EL；和光純薬工業）を添加して混合攪拌し、生理食塩水（大塚製薬）を加えて混合攪拌して調製した溶液として用いた。この際、DMAは10 vol%、Cremophor EL は15 vol%、生理食塩水は75 vol%をそれぞれ最終濃度とした。また、被験化合物を含まず、10 vol% DMA、15 vol% Cremophor ELおよび75 vol% 生理食塩水からなる溶媒を以下ではDMA溶媒と呼び、DMA溶媒を投与した群を陰性コントロール（Negative Control；N.C.）とした。
【００６７】
経口で投与する場合、被験化合物は、被験化合物を乳鉢で均一に粉砕した後、被験化合物の濃度が、25 mg/mLになるように投与媒体（0.5 w/v% メチルセルロース；和光純薬工業）で懸濁し、よく攪拌し、懸濁液として用いた。
骨髄細胞の採取
マウスを頚椎脱臼し、全身を70%エタノールで消毒した後に、ハサミとピンセットを使って片足または両足の大腿骨を採取した。大腿骨に付着している筋肉・骨膜を取り除き、骨端を切り落とした。骨髄内に21 G針付きシリンジ（テルモ）を差し込み、PBSの流圧により骨髄を押し出して回収した。21 G針付きシリンジを用いて吸引と溶出を繰り返して骨髄をほぐし、骨髄細胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液に、全量が5 mLになるようにPBSを加えた後、骨片や細胞凝集塊を除くため、40 μmセルストレイナー（ベクトン・ディッキンソン）に通して試験に用いる骨髄細胞を細胞懸濁液として得た。細胞懸濁液の生細胞数は、トリパンブルー（ギブコ）またはチュルク染色液（ナカライテスク）と混合して測定した。
末梢血細胞の採取
ジエチルエーテルにより麻酔したマウスの眼底から、数μLのヘパリン（清水製薬）を付けたパスツールを使って、末梢血数十μLを採取し、0.5 vol%ヘパリンPBS溶液500 μLと混合した。単核球細胞を分離するため、この混合液をNycoprepTM 1.077A（第一化学薬品）に重層し、室温にて毎分2000回転で30 分遠心して、上清（血漿）と沈殿（赤血球）の中間層（単核球細胞）を回収した。次に、回収した単核球細胞に10 vol% ウシ胎児血清（FBS；ギブコ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）（DMEM）培地（ギブコ）を10 mL加えて混合し、4℃にて毎分1700回転で8分遠心して上清を廃棄した。この操作を2回行って細胞を洗浄した。遠心後の細胞ペレットに10 vol% FBSを含むDMEM培地を300 μL加え、懸濁して、試験に用いる末梢血細胞を得た。なお、細胞数は、トリパンブルー（ギブコ）またはチュルク染色液（ナカライテスク）と混合して測定した。
統計学的解析
以下の試験例1-4の結果は、平均値±標準偏差で示した。統計学的解析には、統計処理ファイルystat2000（version 2000、医学図書出版）を用いた。2群間の比較はアンペアドt検定（Unpaired t-test）を用いて検定し、危険率5%未満を有意とした。
【００６８】
試験例5で示したマウスの生存率(%)の統計学的解析には、統計処理SASリリース(9.1.3)を用いた。2群間の比較はフィッシャー（Fisher）の直接確率計算法を用いて検定し、危険率5%未満を有意とした。
試験例1   Colony-forming cell（CFC）アッセイ
造血幹細胞および／または造血前駆細胞は、メチルセルロースなどの半固形培地にて増殖を繰り返し、血球コロニーを形成する。この血球コロニーは１細胞レベルから形成されることから、以下の方法で血球コロニー数を計測することにより、コロニー形成能を有する血球コロニー形成細胞［Colony-forming cell（CFC）］の数を定量することができる。
【００６９】
末梢血CFCアッセイの場合は、末梢血単核球300,000細胞を10 vol% FBSを含むDMEM培地300 μLに懸濁したサンプルを、骨髄CFCアッセイの場合は、骨髄細胞18,000細胞を10 vol% FBSを含むDMEM培地300 μLに懸濁したサンプルを使用した。これらの細胞懸濁液300 μLを、4種類のサイトカイン（Stem Cell Factor、IL-3、IL-6およびErythropoietin）入りメチルセルロース培地MethoCult GFa M3434（ステム・セル・テクノロジー；2.7 mL）に加え、よく懸濁した。なお、末梢血CFCアッセイの場合は、サイトカイン添加メチルセルロース培地MethoCult GFa M3434にストレプトマイシン（10,000 μg/mL）・ペニシリン（10,000 units/mL）溶液（ギブコ）を30 μL（1/100量）添加した。1 mLマイクロシリンジを使って、得られた懸濁液の1 mLを吸い取り、3.5 cm 培養皿に播種した。マウス一匹あたり2 培養皿をセットし、37℃ CO２インキュベーターにて培養した。7〜10日後に出現した血球コロニー数を顕微鏡下（TE2000-U；ニコン）でカウントし、2培養皿のコロニー数の平均値を算出した。末梢血CFCアッセイの場合は末梢血単核球細胞100,000細胞当たりのCFC数で、骨髄CFCアッセイの場合は骨髄細胞6,000細胞あたりのCFC数で示した。
(1)腹腔内投与による化合物Iの骨髄CFC増殖促進活性
化合物A（100 mg/kg）または化合物110（100 mg/kg）をDBA/2マウスの腹腔内へ、1日1回、5日間にわたって反復投与した。陰性コントロール（N.C.群）の骨髄CFC数47±7個に対し、化合物Aを投与した群では58±6個と有意に増加した（N=5；N.C.群に対する骨髄CFCの増加率：1.23倍（p<0.05））。また、化合物110を投与した群では68±16個で、N.C.群の43±2個と比べて、有意に増加した（N=4；N.C.群に対する骨髄CFCの増加率：1.58倍（p<0.05））。本結果より、化合物Iが骨髄中の造血幹細胞および／または前駆細胞を増殖促進させる活性を有することが示された。
(2)腹腔内投与による化合物Iの末梢血CFC動員活性
化合物A (100 mg/kg)または化合物110（100 mg/kg）を、DBA/2マウスの腹腔内へ1日1回、5日間にわたって反復投与した（N=4）。105の末梢血細胞あたりの CFC数は、化合物Aを投与した群では65±17個で、N.C.群の12±4個に比べて、有意に増加した（5.4倍；p<0.05）。また、化合物110を投与した群も、N.C.群と比べて、CFC数が有意に増加した（8.7倍；p<0.05）。本結果より、化合物Iが造血幹細胞および／または前駆細胞を骨髄から末梢血へ動員させる活性を有することが示された。
(3) 経口投与による化合物110、18、49、81および83の骨髄CFC増殖促進活性評価
化合物110、18、49、81および83のそれぞれ100 mg/kgをDBA/2マウスに1日1回、5連日経口投与し、最終投与から3時間後もしくは6時間後に骨髄細胞を採取し、骨髄CFC数を定量した（N=5）。結果を表に示した。
【００７０】
【表１４】
2014062067.tif 000019
【００７１】
試験例2  化合物110とG-CSFの併用試験
化合物110（100 mg/kg）を1日1回、10日間（1〜10日目）、DBA/2マウスに経口投与した。N.C.群として、メチルセルロース溶媒を同様に投与した。6日目から10日目の5日間は、G-CSF（100 μg/kg）を1日1回皮下投与した。化合物110とG-CSFの同日投与の場合は先に化合物110を投与し、約1時間後にG-CSFを投与した。5日目、9日目または11日目に、化合物110＋G-CSF群、N.C.＋G-CSF群の両群に対して眼底から末梢血を採取した。
【００７２】
採取した末梢血（60 μL）を溶血液BD Pharｍ LyseTM lysing solution（ベクトン・ディッキンソン；15 mL）に懸濁し、室温にて5〜15分間静置した。細胞懸濁液が透明であることを確認した後、室温にて毎分1700回転で8分間遠心し、上清を除去した細胞ペレットに10 vol% FBSを含むDMEM培地を270 μL加え、懸濁した。
上記細胞懸濁液（270 μL）を、サイトカイン（Stem Cell Factor、IL-3、IL-6およびErythropoietin）入りメチルセルロース培地（MethoCult GFa M3434）2.7 mLに加え、よく懸濁した。懸濁液にストレプトマイシン（10,000 μg/mL）・ペニシリン（10,000 units/mL）溶液を30 μL（1/100量）添加し、よく懸濁した。1 mLマイクロシリンジを使って、得られた懸濁液の1 mLを吸い取り、3.5 cm培養皿に播種した。一匹あたり2 培養皿をセットし、37℃のCO２インキュベーターにて培養した。7〜10日後に出現した血球コロニーを顕微鏡（TE2000-U；ニコン）下でカウントし、2培養皿のコロニー数の平均値を算出し、末梢血20 μLあたりのCFC数で示した。
【００７３】
投与9日目において、化合物110群の末梢血CFCが、N.C.群に対して1.6倍と有意(p<0.05)に増加した。
試験例3  in vivo移植実験
(1)連続移植競合的骨髄再構築法［Serial Transplantation Competitive Reconstitution Assay (Serial Transplantation)］
化合物110（100 mg/kg）を1日1回、5連日経口投与し、最終投与の6時間後に採取した骨髄細胞をドナーとして用いて、連続移植時における骨髄再構築の競合度合いを測定する連続移植競合的骨髄再構築法（Serial Transplantation Competitive Reconstitution Assay）を以下の方法に従い実施した。
【００７４】
X線照射装置（MBR-1505R；日立メディコ）を用いて、レシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に線量9.5 Gyで全身照射した。照射4〜8時間後のレシピエントマウスに対して、移植用に調製した骨髄細胞を静脈内から移植した。移植に用いた骨髄細胞の調製と連続移植の方法は、文献（Current Protocols in Immunology. 22B.2.1-31, 2008; Cell Stem Cell. 1(1), 101-12, 2007）を参考に、以下に詳述する通りに実施した。
1次移植実験：メチルセルロース溶媒（N.C.）または化合物110を投与したC57BL/6-CD45.1マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり4 x 105）と、競合細胞（Competitor）としてC57BL/6-CD45.2マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり4 x 105）を混合し、それぞれをレシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に移植した（１次移植マウス）。移植10週後の１次移植マウスから骨髄細胞を回収し、フローサイトにより、CD45マーカー陽性の全骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞［c-kit陽性かつSca-1陽性かつ細胞系マーカー（CD3, Mac-1, Gr-1, Ter-119およびB220）陰性である細胞(KSL細胞)］中に存在するCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した。なお、キメリズムは、CD45.1陽性細胞数／（CD45.1陽性細胞数＋CD45.2陽性細胞数）の式によって算出した。
2次移植実験：１次移植マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり6 x 105）を2次のレシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に移植した（2次移植マウス）。移植12週後の2次移植マウスから骨髄細胞を回収し、フローサイトにより、CD45マーカー陽性の全骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞（KSL細胞）中に存在するCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析し、上記と同様にドナー（CD45.1）のキメリズムを算出した。
3次移植実験：2次移植マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり6 x 105）を3次のレシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に移植した（3次移植マウス）。移植10週後の3次移植マウスから骨髄細胞を回収し、フローサイトにより、CD45マーカー陽性の全骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞（KSL細胞）中に存在するCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析し、上記と同様にドナー（CD45.1）のキメリズムを算出した。
【００７５】
なお、フローサイトメトリーによる解析は以下の方法で行った。
移植マウスの骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞のそれぞれのCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析することで、キメリズムを解析した。即ち、移植マウスから骨髄細胞を採取し、骨髄細胞107当たり、Fcレセプターブロッキング用に抗CD16/32抗体 10 μLを添加し、4℃で10分間反応させた。次に、FITC標識抗マウスCD45.2（Ly5.2）抗体、PE標識抗マウスCD45.1（Ly5.1）抗体、ビオチン標識抗マウス細胞系マーカー（CD3,Mac-1,Gr-1,Ter-119, B220）抗体、PE-Cy7標識抗マウスc-kit抗体およびAPC標識抗マウスSca-1抗体を、それぞれ10 μLずつ添加し、4℃で30分間反応させた。ウシ胎児血清（FBS；ギブコ）を5 vol%含むPBS（5% FBS/PBS）を添加し、4℃にて毎分1700回転で8分遠心し、上清を除去して、骨髄細胞を回収した（以後、この操作を細胞洗浄操作とよぶ）。5% FBS/PBSに細胞を懸濁した後に、PerCP-Cy5.5標識アビジンを骨髄細胞107当たり30 μL添加し、4℃で15分間反応させた。塩化ナトリウム溶血剤（ベクトン・ディッキンソン；1 mL）を加えて溶血させた後に、フローサイトメーターFACSCantoIIまたはFACSAria（ベクトン・ディッキンソン）にて、骨髄細胞中のCD45.1陽性細胞/CD45.2陽性細胞の割合と、KSL細胞の領域をゲーティングしてCD45.1陽性細胞/CD45.2陽性細胞の割合を解析した。
【００７６】
表15には1次、2次、3次移植したマウスから採取したCD45陽性の全骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞を意味するKSL細胞（c-kit陽性／Sca-1陽性／細胞系マーカー陰性細胞）中のCD45.1陽性ドナー細胞の割合（キメリズム）を示した。キメリズムが高いほど、ドナー細胞が優位に競合したことを意味する。化合物110を前投与したマウス由来の骨髄細胞をドナーとして移植した群では、N.C.を投与した群と比べて、全骨髄細胞ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞のCD45.1陽性ドナー細胞のキメリズムが有意に高いことが示された。
【００７７】
【表１５】
2014062067.tif 000020
【００７８】
(2) 限界希釈競合的骨髄再構築法［Limiting Dilution Competitive Repopulating Unit Assay (LDA)］
化合物110 (100 mg/kg)をC57BL/6-CD45.1マウスに1日1回、5連日経口投与し、最終投与の6時間後に採取した骨髄細胞をドナーとして用いて、段階希釈した細胞を移植した際の非生着率から、機能的造血幹細胞数（CRU: Competitive Repopulating Unit）を算出するアッセイを以下の方法で実施した。陰性コントロール(N.C.)として、メチルセルロース溶媒を用いた。
【００７９】
X線照射装置（MBR-1505R；日立メディコ）を用いて、レシピエントマウス(C57BL/6-CD45.2)に線量9.5 Gyを全身照射した。照射4〜8時間後のマウスに、移植用の骨髄細胞を静脈内に移植した。移植に用いた骨髄細胞の調製と連続移植の方法は、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p.8736-8740, 1990）を参考に、以下の通りに実施した。
即ち、メチルセルロース溶媒（N.C.）または化合物110を投与したC57BL/6-CD45.1マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり9 x 104, 3 x 104, 1 x 104, 3 x 103および1 x 103の5群）と、競合細胞としてC57BL/6-CD45.2マウス由来の骨髄細胞（1匹あたり1 x 105）を混合し、それぞれをレシピエントマウス(C57BL/6-CD45.2)に移植した。移植18週後の移植マウスから末梢血を回収し、フローサイトメトリーにより、T細胞（CD3陽性細胞）、B細胞（B220陽性細胞）および骨髄球系細胞（Mac-1陽性細胞およびGr-1陽性細胞）中に存在するCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析した。
【００８０】
T細胞、B細胞および骨髄球系細胞のそれぞれの細胞集団において、CD45.1陽性細胞が1%以下のキメリズムであった個体を非生着と判定した。非生着個体数の割合（%）とC57BL/6-CD45.1マウス由来の移植細胞数のデータから、限界希釈競合的骨髄再構築法用統計ソフトL-Calc（ステム・セル・テクノロジー）を用いて、CRU Frequencyを算出した。
なお、フローサイトメトリーによる解析は以下の方法で行った。
【００８１】
移植マウスの末梢血のT細胞（CD3陽性細胞）、B細胞（B220陽性細胞）および骨髄球系細胞（Mac-1陽性細胞およびGr-1陽性細胞）のCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析することで、キメリズムを解析した。移植マウスより、末梢血約60 μlを回収し、Fcレセプターブロッキング用に抗CD16/32抗体 5 μLを添加し、4℃で10分間反応させた。次にFITC標識抗マウスCD45.2（Ly5.2）抗体、PE標識抗マウスCD45.1（Ly5.1）抗体をそれぞれ5 μL添加した。サンプルを3つに分け、(a)ビオチン標識抗マウスCD3抗体 5 μLを添加したサンプル、(b)ビオチン標識抗マウスB220抗体5 μLを添加したサンプル、ならびに(c)ビオチン標識抗マウスMac-1抗体5 μLおよびビオチン標識抗マウスGr-1抗体 5 μLを添加したサンプルをそれぞれ作成し、各サンプルを4℃で30分間反応させた。5% FBS/PBSで細胞洗浄した後に、APC標識アビジンを5 μL添加し、4℃で15分間反応させた。塩化ナトリウム溶血剤（ベクトン・ディッキンソン；1 mL）を加えて溶血させた後に、フローサイトメーターFACSCantoII（ベクトン・ディッキンソン）またはFACSAria（ベクトン・ディッキンソン）にて、末梢血細胞の(a)T細胞（CD3陽性細胞）、(b)B細胞（B220陽性細胞）および(c)骨髄球系細胞（Mac-1陽性細胞およびGr-1陽性細胞）のCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合をそれぞれ解析した。抗体関連試薬は全てベクトン・ディッキンソン社のものを使用した。
【００８２】
CRU Frequencyを算出した結果、N.C.マウス由来の骨髄細胞のCRU frequencyは1/15,261であった。これに対して、化合物110投与マウス由来の骨髄細胞のCRU frequencyは1/8,116であった。
試験例4  体外増幅培養(Ex vivo expansion)実験
4種のサイトカイン（マウスSCF、マウスTPO、マウスIGF-IIおよびヒトFGF-1）を含むStemspan SFEM培地に、化合物110（1 nmol/L）または同濃度のジメチルスルホキシド（DMSO；N.C.）を添加し、KSL細胞をex vivoで培養した。培養細胞を回収し、下記の方法でCFCアッセイおよび移植実験を行うことで、体外増幅法における化合物110のCFCまたはCRUに対する増殖促進効果を評価した。
(1) 細胞系（lineage）マーカー陰性細胞の分離
マウスの造血幹細胞および／または造血前駆細胞を濃縮するため、ベクトン・ディッキンソン社の磁気細胞分離装置BD IMagnetTMとMouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set -DMを用いたBD IMagTM Cell Separation Systemにより、細胞系マーカー（CD3e, CD11b, CD45R/B220, Ly-6GおよびLy6CならびにTER-119）陽性細胞を除去し、細胞系マーカー陰性細胞を取得した。
【００８３】
即ち、骨髄細胞107当たり、Fcレセプターブロッキング用に抗CD16/32抗体（ベクトン・ディッキンソン；10 μL）を添加し、4℃で10分間反応させた。次にビオチン標識マウス細胞系ディプリーションカクテル抗体（Biotin Mouse Lineage Depletion Cocktail） (キット付属)を骨髄細胞107当たり50μl添加し、4℃で15分間反応させた後、5% FBS/ダルベッコ・リン酸緩衝液（D-PBS) 10 mLを添加して細胞洗浄操作を行った。細胞ペレットに、5% FBS/D-PBSを2 mL添加し、細胞をよく懸濁し、磁気ビーズ標識ストレプトアビジン（Imag Streptavidin；キット付属）を骨髄細胞107当たり50μL添加し、4℃で混和しながら15分間反応させた後、5% FBS/D-PBS 10 mLを添加して細胞洗浄操作を行った。細胞ペレットに、5% FBS/D-PBSを2 mL添加し、細胞をよく懸濁した。細胞懸濁液をBD IMagnetTMにセットし、8分間静置した後に、細胞懸濁液（細胞系マーカー陰性細胞）をパスツールで回収した。この回収操作を2回行った。回収した細胞系マーカー陰性細胞に対して細胞洗浄操作を2回行って5% FBS/D-PBSに懸濁して試験に用いた。ソーティングフローサイトメーターにより造血幹細胞および／または造血前駆細胞を分離する場合は、5% FBS/D-PBSで懸濁した後、蛍光標識抗体を反応させて試験に用いた。
(2) FACSによるマウスの造血幹細胞および／または造血前駆細胞の分離
マウスの細胞系マーカー陰性細胞からの造血幹細胞および／または造血前駆細胞（KSL細胞）の分離には、FACSAria（ベクトン・ディッキンソン）を用いた。
【００８４】
即ち、細胞系マーカー陰性細胞107当たり、PE標識抗マウスSca-1抗体、ビオチン標識抗マウス細胞系マーカー（CD3e, CD11b, CD45R/B220, Ly-6GおよびLy6CならびにTER-119）抗体およびAPC標識抗マウスc-kit抗体を10 μLずつ添加し、4℃で30分間反応させた。細胞洗浄操作後に、5% FBS/D-PBSで懸濁し、PE-Cy7標識アビジンを骨髄細胞107当たり10 μL添加し、4℃で20分間反応させた。細胞洗浄後、細胞懸濁液にヨウ化プロピジウム（propidium iodide；インビトロジェン）を終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaを用いて、生細胞であるヨウ化プロピジウム陰性細胞中のKSL細胞をゲーティング分離した。
(3) 体外増幅法（Ex vivo expansion）における細胞培養
分離したKSL細胞を、サイトカインと化合物110を添加した無血清培地Stemspan SFEM（ステム・セル・テクノロジー）でex vivo培養した後、CFCアッセイおよび移植実験を行うことで、ex vivo expansionにおける化合物110のCFCまたはCRUに対する増殖促進効果を評価した。
【００８５】
Ex vivo培養は、Stemspan SFEMに10 ng/mL マウスSCF（＃455-MC；R&D システムズ）、20 ng/mL マウスTPO（＃488-TO；R&Dシステムズ）、20 ng/mL マウスIGF-II （＃792-MG；R&Dシステムズ社）および10 ng/mL ヒトFGF-1（＃PHG0014；インビトロジェン）をそれぞれ添加した培地を用時調製して使用した。96 well plateにKSL細胞2x103cells／100 μL／wellとなるように播種し、1時間後に被験化合物を添加した。
【００８６】
CFCアッセイは培養3日後に、移植実験は培養4日後にex vivoで培養した細胞を回収して行なった。
(4) Ex vivo培養細胞のCFCアッセイ
Ex vivo培養3日後のKSL細胞を回収し、サイトカイン入りメチルセルロース培地上での培養によるCFCアッセイを行った。即ち、被験化合物添加もしくはDMSO溶媒添加条件でex vivo培養した96 well プレートから、ピペッティングで培養細胞を回収した。回収した細胞懸濁液の1/10、1/30および1/50容量を、それぞれ10 vol% ウシ胎児血清（FBS；ギブコ社）を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）培地（ギブコ；300 μL）に懸濁した。ここに、サイトカイン（Stem Cell Factor、IL-3、IL-6およびErythropoietin）入りメチルセルロース培地（MethoCult GFa M3434；ステム・セル・テクノロジー；2.7 mL）を加え、よく懸濁した。1 mLマイクロシリンジを使って、得られた懸濁液の1/3量の1 mLを吸い取り、3.5 cm 培養皿各2枚に播種し、37℃の CO２インキュベーターにて培養した。7〜10日後に出現した血球コロニーを顕微鏡（TE2000-U；ニコン）下でカウントし、2 培養皿のコロニー数の平均値を算出し、細胞懸濁液中の全CFC数を換算した。
【００８７】
試験の結果、化合物110を添加した条件下で3,000個のKSL細胞を3日間培養することで、KSL細胞数がN.C.添加群の3600±375個に対して4640±262個と有意に増加した（N.C.添加群に対するCFCの増加率：1.29倍（P<0.05, N=3)）。
(5) Ex vivo培養細胞の移植実験
C57BL/6-CD45.1マウス由来の3,000個のKSL細胞を化合物110 1 nmol/Lもしくは同濃度のDMSO添加条件（N.C.）下で4日間培養した。競合細胞としてC57BL/6-CD45.2マウス由来の骨髄細胞3x105と共に、X線照射したレシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に移植した。移植8週間後にマウス末梢血を回収し、フローサイトメトリーにより、血球細胞中のCD45.1陽性細胞とCD45.2陽性細胞の割合を解析し、キメリズムを算出した。その結果、化合物110を添加した培地中で培養した細胞を移植したマウスにおいて、キメリズムが高い傾向にあった。
【００８８】
この結果から、化合物110は、生着能を有する造血幹細胞および／または造血前駆細胞をex vivoでも増加させることが示された。
試験例5  骨髄移植モデルマウスを用いた造血幹細胞および／または造血前駆細胞の生着評価実験
下記に従い、X線を照射した骨髄移植のモデルマウスを用いて、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の生着をマウスの生存率で評価する生着評価実験を行なった。
【００８９】
X線照射装置（MBR-1505R；日立メディコ）を用いて、レシピエントマウス（C57BL/6-CD45.2）に線量10 Gyを全身照射した（Day0）。翌日（Day1）に骨髄単核球細胞（1.6 x 105 cells/匹）を静脈内投与して移植し、さらに翌日(Day2)から、化合物110（50 mg/kg）または溶媒コントロール（メチルセルロース溶媒投与）を1日1回、14連日経口投与した。X線照射から30日間、マウスの生存を評価した。
【００９０】
その結果、化合物110の投与によって、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の生着が促進され、7〜9日目から移植マウスの生存率の有意な向上が確認された（移植30日目の生存率は、メチルセルロース溶媒投与群では10% であるのに対し、化合物110群では45%（N=20; p<0.05）であった。）
上記の試験により、化合物IもしくはAまたはその薬学的に許容される塩、とりわけ化合物A, 110, 18, 49, 81, 83が造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および／または動員剤として有用であることが示された。
【００９１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００９２】
錠剤(化合物110)
常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。化合物110、40g、乳糖286.8gおよび馬鈴薯澱粉60gを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロースの10%水溶液120gを加える。得られた混合物を常法により練合し、造粒して乾燥させた後、整粒し打錠用顆粒とする。これにステアリン酸マグネシウム1.2gを加えて混合し、径8mmの杵をもった打錠機(菊水社製RT-15型)で打錠を行って、錠剤(1錠あたり活性成分20mgを含有する)を得る。
処方  化合物110                       20    mg
乳糖                            143.4  mg
馬鈴薯澱粉                       30    mg
ヒドロキシプロピルセルロース      6    mg
ステアリン酸マグネシウム          0.6  mg 
200    mg
【実施例２】
【００９３】
注射剤(化合物110)
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。化合物110、1gを注射用蒸留水に添加して混合し、さらに塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を添加してpHを7に調整した後、注射用蒸留水で全量を1000mLとする。得られた混合液をガラスバイアルに2mLずつ無菌的に充填して、注射剤(1バイアルあたり活性成分2mgを含有する)を得る。
処方  化合物110                         2    mg
塩酸                                適量
水酸化ナトリウム水溶液              適量
注射用蒸留水                        適量      
2.00  mL
【実施例３】
【００９４】
常法により、化合物18のDMSO溶液（0.1 mmol/L）を調製し、化合物18を含む造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明により、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖促進および/または動員剤を提供することができる。