(57)【要約】【課題】本発明は、メラノーマ細胞を選択的に増殖抑制する薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体を有効成分として含有することを特徴とする、メラノーマ細胞増殖抑制剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体を有効成分として含有することを特徴とする、メラノーマ細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記γリノレン酸の誘導体がγリノレン酸エステルである、請求項１に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
前記γリノレン酸の誘導体がγリノレン酸トリグリセリドである、請求項１に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
前記γリノレン酸エステルがγリノレン酸メチルエステル又はγリノレン酸エチルエステルである、請求項２に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
前記γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体が、５０〜５００μＭの濃度で投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマ（悪性黒色腫）細胞の増殖を抑制するための化学療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノサイトは発生過程では神経堤細胞を起源とし、大きな移動によって、皮膚、口腔、咽頭、食道、子宮頚部、及び肛門の多重扁平上皮の最下層の基底細胞層に散発的に現れる。基底細胞から扁平上皮癌、メラノサイトからメラノーマ（悪性黒色腫）が発生する。そのため、メラノーマは皮膚の他、口腔、咽頭、及び食道などの消化管にも見られる。メラノーマ細胞の産生するメラニン顆粒は、もともと癌化する前のメラノサイトが産生するものであり、強すぎる太陽光、特に紫外線から生体を守るための防御反応に寄与している。そのため、放射線療法などは効果が低いとされている。また、化学療法としては、術後補助療法や手術不能例に対して、ダカルバジン、ニムスチン、ビンクリスチン、及びインターフェロンβを併用するDAV feron療法などが用いられてはいるものの、奏功率は30%と低く、完全寛解は稀である。従って、治療は原則的に外科的切除に頼ったものになっている。しかし、メラノーマは前述の発生の系譜から、近接リンパ節転移と同様に遠隔転移を起こすため、転移性が高く、外科的切除では治癒困難であり、その発生や進展を選択的に抑制する薬剤の開発が切望されている。
ＤＨＡやＥＰＡなどのω−３ＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）が発癌のリスクを低減すること、及び腫瘍性細胞の増殖を選択的に抑制することが報告されているが（特許文献１）、実験データに基づく科学的根拠に乏しい。
一方、γリノレン酸トリグリセリドは、特許文献２に示されるように表皮角化細胞の分化を促進する。また、特許文献３に示されるようにＰＰＡＲγ、αに作用する。さらに、多様な部位由来の扁平上皮癌細胞の増殖を抑制することも特許文献４に示されている。しかしながら、その効果は癌の種類に依存し、腺癌である胃癌などに対しては効果が低いことが示されている。そして、メラノーマは、上皮系の腫瘍ではなく、間質系の腫瘍であるため、γリノレン酸トリグリセリドにメラノーマの増殖抑制効果があるかどうかは全く未知であった。
【０００３】
特許文献５には、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）のがん細胞増殖抑制効果をリノレン酸などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が媒介することが記載されているが、効果の主成分はＴＧＦ−β１であり、リノレン酸単独の効果は示されていない。例えば実施例６（図７Ｂ）では、αリノレン酸のＢ１６メラノーマ細胞に対する増殖抑制効果を確認しているがγリノレン酸については記載がない。また、特許文献５では遊離のリノレン酸とＴＧＦ−β１の併用のみしか実施例がない。
【０００４】
このように、メラノーマ細胞の増殖を抑制するために、γリノレン酸のトリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリド形態、ならびにγリノレン酸の誘導体を単独で有効成分として使用することは記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／１２０１２０号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／１３２１７７号パンフレット
【特許文献３】特開２００９−９６７９９号公報
【特許文献４】特開２００９−１４９６１５号公報
【特許文献５】特開平５−２１３７７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、メラノーマ細胞の増殖を抑制する薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体が選択的なメラノーマ細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体を有効成分として含有することを特徴とする、メラノーマ細胞増殖抑制剤。
（２）前記γリノレン酸の誘導体がγリノレン酸エステルである、（１）に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
（３）前記γリノレン酸の誘導体がγリノレン酸トリグリセリドである、（１）に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
（４）前記γリノレン酸エステルがγリノレン酸メチルエステル又はγリノレン酸エチルエステルである、（２）に記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
（５）前記γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体が、５０〜５００μＭの濃度で投与されることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載のメラノーマ細胞増殖抑制剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、毒性、催奇原性がないため、副作用の少ない癌化学療法剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】メラノーマ細胞株（A2058）での本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤（ＧＬＡ−ＴＧ）の濃度依存的殺傷効果を示す（写真）。
【図２】メラノーマ細胞株（A2058）での本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤（ＧＬＡ−ＴＧ）の１００μＭ及び２００μＭでの殺傷効果を示す（写真）。
【図３】メラノーマ細胞株（G361）での本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤（ＧＬＡ−ＴＧ）の１００μＭ及び２００μＭでの殺傷効果を示す。上段はギムザ染色の結果を示し、下段は倒立顕微鏡での観察の結果を示す（写真）。
【図４】メラノーマ細胞株（HMY-1）での本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤（ＧＬＡ−ＴＧ）の１００μＭおよび２００μＭでの殺傷効果を示す。上段はギムザ染色の結果を示し、下段は倒立顕微鏡での観察の結果を示す（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、γリノレン酸（ＧＬＡ）及び／又はγリノレン酸の誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
本発明で使用されるγリノレン酸は、遊離のγリノレン酸でもよいが、γリノレン酸の誘導体であることが好ましい。
γリノレン酸の誘導体としては、γリノレン酸のエステルが例示される。
γリノレン酸のエステルとしては、γリノレン酸トリグリセリド（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸）（ＧＬＡ−ＴＧ）、γリノレン酸ジグリセリド、及びγリノレン酸モノグリセリドのいずれの形態であってもよいが、トリグリセリドが好ましい。
【００１３】
なお、本発明で使用されるγリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸ジグリセリドは、グリセロールの少なくとも１つの水酸基がγリノレン酸とエステル結合していればよく、グリセロールのγリノレン酸が結合した水酸基以外の水酸基がγリノレン酸以外の脂肪酸とエステル結合したグリセリドも含むものである。
【００１４】
γリノレン酸トリグリセリドは、常法により合成できる。なお、市販品として、ＮＵ−ＣＨＥＫ−ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ社、出光興産株式会社などにより販売されている。また、微生物によって製造されたものでもよい（特開昭６３−２８３５８９号公報、特開平０３−０７２８９２号公報、特開平８−２１４８９２号公報）。
【００１５】
また、本発明で使用されるγリノレン酸は、γリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸ジグリセリド、及びγリノレン酸モノグリセリドのグリセリド混合物であってもよい。γリノレン酸グリセリド混合物は、γリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸ジグリセリド、及びγリノレン酸モノグリセリドを含有し、メラノーマ細胞にアポトーシスを誘導する活性を有するものであれば、各グリセリドの割合は特に制限されないが、好ましくは、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの割合として、グリセリド全量に対してそれぞれ１０〜７９質量％、２０〜７０質量％及び１〜７０質量％、より好ましくは、グリセリド全量に対してそれぞれ１０〜７０質量％、２５〜６０質量％及び３〜６５質量％である。
γリノレン酸グリセリド混合物は、γリノレン酸のトリグリセリドを酵素処理することにより切断された、モノ体、ジ体を含有した形態（いわゆる自己乳化型）を含むことが好ましい。γリノレン酸トリグリセリドの酵素処理物は、好ましくはリパーゼなどの酵素でγリノレン酸トリグリセリドを処理して得られたものである。処理の方法としては、特開２００５−１９８６４８号公報を参照して行うことができる。なお、酵素処理物は、γリノレン酸のトリグリセリドを高濃度、好ましくは２０質量％以上含む油脂を酵素処理したものでもよい。なお、遊離のγリノレン酸やその他の脂肪酸は高濃度で細胞毒性を有することがあるため、酵素処理後、遊離の脂肪酸を除いておくことが好ましい。
【００１６】
本発明で使用されるγリノレン酸のエステルの他の態様としては、γリノレン酸と直鎖又は分岐アルコール（グリセロール以外）のエステル体が挙げられ、好ましくは、γリノレン酸エチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸エチル）及びγリノレン酸メチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸メチル）である。
また、γリノレン酸の誘導体の他の態様としては、γリノレン酸の炭素数１〜４の低級アルキル化体も挙げられる。
これらのγリノレン酸のエステルやアルキル化体は、例えば、γリノレン酸をアルコールと脱水縮合させることにより、または、アルキル化剤で処理することにより得ることができる。
【００１７】
本発明の「メラノーマ細胞増殖抑制剤」とは、メラノーマ細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する活性（殺傷作用）を有する薬剤をいう。
【００１８】
メラノーマ細胞の種類としては、口腔、子宮、皮膚、リンパ節、肝臓のメラノーマ細胞が挙げられ、詳細には、ヒト口腔由来悪性黒色腫細胞株(例えば、HMG, PMP, MMN9及びMAA)、ヒト子宮由来悪性黒色腫細胞株(例えば、MVH-II)、ヒト皮膚由来悪性黒色腫細胞株(例えば、G361及びC32)、ヒトリンパ節転移由来悪性黒色腫細胞株(例えば、WM-266-4)、ヒト肝臓由来腺癌細胞株(例えば、SK-Hep-1)、ヒト由来悪性黒色腫細胞株（例えば、HMY-1）、リンパ節由来ヒト悪性黒色腫（例えば、A2058）が挙げられる。
【００１９】
本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公
知の手段に従って、γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して医薬とすることができる。
【００２０】
薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、添加剤、基剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えば、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えばジブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸、トコフェロール等が挙げられる。添加剤としては、ビタミンＥ等が挙げられる。基剤としては、ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール）類、グリセリン類等の親水性基剤が挙げられる。
なお、本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体を単独の有効成分としてもよいし、その他のメラノーマ細胞増殖抑制剤と併用してもよい。
【００２１】
本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、例えば、溶媒としてのメタノール、エタノール、またはジメチルスルホキシドに懸濁して用いることが好ましい。また、媒体中の薬剤の濃度を容量％で１％以下となるように調整することが好ましい。さらに、本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、上記添加剤、抗酸化剤、基剤を含むことが好ましい。製剤中のメラノーマ細胞増殖抑制剤の好ましい含有量は、製剤全量に対して１〜５０質量％であり、より好ましくは１〜２０質量％である。
【００２２】
本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤を含有してなる医薬は、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤、塗布剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、静脈内注射、経皮塗布等）に安全に投与することができる。なお、医薬には医薬部外品も含まれる。低濃度で吸収されるため、局所投与される外用剤が好ましい。特に、口腔、子宮、皮膚、リンパ節、肝臓などの部位に対して、塗布によって局所投与される外用剤が好ましい。
【００２３】
好ましい投与量は、投与対象、症状などにより異なり特に制限されないが、例えば、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。
【００２４】
なお、γリノレン酸及び／又はγリノレン酸を液剤として投与する場合、γリノレン酸及び／又はγリノレン酸の誘導体の濃度は、濃度が低すぎると効果が発現しないとの問題が生じる一方、濃度が高すぎると過酸化脂質による細胞毒性を引き起こすといった問題が生じるため、５０〜５００μＭで投与されることが好ましく、より好ましくは７５〜３００μＭ、更に好ましくは１００〜２００μＭである。
【００２５】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【実施例】
【００２６】
実施例１）γリノレン酸トリグリセリドのメラノーマ細胞A2058への殺傷効果
メラノーマ細胞株A2058（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手、資源番号IFO50276）を1ウェルあたり5ｘ105で各々6ウェルプレートに培養し、24時間後にγリノレン酸トリグリセリド（GLA-TG）を50μM、100μM、150μMおよび200μMの濃度で加えた。CO2インキュベーターにて5％CO2、37℃にて培養し、24時間後に倒立顕微鏡にて観察および写真撮影した（図１）。その結果、溶媒エタノールのみを加えた対照と比べて、濃度依存的に細胞殺傷作用を認め、200μMのγリノレン酸トリグリセリドでほとんどの細胞が死滅した。
【００２７】
実施例２）γリノレン酸トリグリセリドのメラノーマ細胞A2058への殺傷効果
メラノーマ細胞株A2058を1ウェルあたり1ｘ105、2ｘ105、5ｘ105で培養し、24時間後にγリノレン酸トリグリセリドを100μMと200μMの濃度で加えた。CO2インキュベーターにて5％CO2、37℃にて培養し、24時間後にPBS(−)で穏やかに洗浄し、ギムザ染色を行った（図２）。その結果、溶媒エタノールのみを加えた対照と比べて、200μMのγリノレン酸トリグリセリドでほとんどの細胞が死滅した。
【００２８】
実施例３）γリノレン酸トリグリセリドのメラノーマ細胞G361への殺傷効果
メラノーマ細胞株G361（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手、資源番号IFO50009）を1ウェルあたり1ｘ105、2ｘ105、5ｘ105で各々6ウェルプレートに培養し、24時間後にγリノレン酸トリグリセリドを100μMと200μMの濃度で加えた。CO2インキュベーターにて5％CO2、37℃にて培養し、24時間後に倒立顕微鏡にて観察および写真撮影した（図３の下段）。写真撮影後、6ウェルプレートをPBS(−)で穏やかに洗浄し、ギムザ染色を行った（図３の上段）。プレート乾燥後、6ウェル画像をスキャナーで取り込んだ。対照は溶媒エタノールをγリノレン酸トリグリセリドの代わりに加えた。その結果、溶媒エタノールのみを加えた対照と比べて、100μMおよび200μMのγリノレン酸トリグリセリドでほとんどの細胞が死滅した。
【００２９】
実施例４）γリノレン酸トリグリセリドのメラノーマ細胞HMY-1への殺傷効果
メラノーマ細胞株HMY-1（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手、資源番号JCRB1018）を1ウェルあたり1ｘ105、2ｘ105、5ｘ105で各々6ウェルプレートに培養し、24時間後にγリノレン酸トリグリセリドを100μMと200μMの濃度で加えた。CO2インキュベーターにて5％CO2、37℃にて培養し、24時間後に倒立顕微鏡にて観察および写真撮影した（図４の下段）。写真撮影後、6ウェルプレートをPBS(−)で穏やかに洗浄し、ギムザ染色を行った（図４の上段）。プレート乾燥後、6ウェル画像をスキャナーで取り込ん
だ。対照は溶媒エタノールをγリノレン酸トリグリセリドの代わりに加えた。その結果、溶媒エタノールのみを加えた対照と比べて、200μMのγリノレン酸トリグリセリドでほとんどの細胞が死滅した。
【００３０】
本発明のγリノレン酸トリグリセリドを含むメラノーマ細胞増殖抑制剤は、調査したメラノーマ細胞株のすべてに２００μMという比較的低濃度で効果を発揮した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、メラノーマ細胞に選択的な化学療法剤を提供することができる。本発明のメラノーマ細胞増殖抑制剤は、癌予防および治療の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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