(57)【要約】【課題】  創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用する炭酸脱水酵素阻害剤のNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)、二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】  本発明の炭酸脱水酵素阻害剤のスクリーニング方法は、炭酸脱水酵素のうち金属配位に係るヒスチジンイミダゾール側鎖に由来するNMRシグナルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標として用いる。これにより、これまでのNMRスクリーニング手法にかかる曖昧さを低減した「創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用するNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)」を得られる。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸脱水酵素のうち金属配位に係るヒスチジンイミダゾール側鎖に由来するNMRシグナルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標として用いることを特徴とする炭酸脱水酵素阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
被験物質添加時のNMRスペクトルによって観察されたシグナルのケミカルシフトがpH非依存的になった場合に、金属配位に係るヒスチジンと当該被験物質とが結合していると判断することを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
炭酸脱水酵素単独時のHis64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTと、被験物質添加時のHis64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTとを比較して、少なくともいずれか一方の値が変化した場合(pKa≠7.2またはKT≠1.0、精度５％を加味した有意な変化の場合)に、当該被験物質が炭酸脱水酵素に結合している又は相互作用していると判断することを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記NMRスペクトルが、15N標識した炭酸脱水酵素の２次元15N-1H NMR相関スペクトルであることを特徴とする請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記金属が亜鉛であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られた炭酸脱水酵素阻害剤とその阻害剤で示される化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
利尿・降圧剤であることを特徴とする請求項６に記載の炭酸脱水酵素阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を行うためのスクリーニングキット。
【請求項９】
炭酸脱水酵素の触媒必須因子である亜鉛結合水、His64及びGlu106の各官能基を適宜配置することで被験物質を作成し、当該被験物質のうち亜鉛と結合したヒスチジンのNMRスペクトルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標として用いることを特徴とする二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項９記載のスクリーニング方法で得られた二酸化炭素水和触媒能を有する物質を樹脂に結合させることで得られる選択的二酸化炭素捕捉能を有する媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用する炭酸脱水酵素阻害剤のNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)、二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
NMR（核磁気共鳴）法は、溶液状態にある蛋白質の構造解析法として構造と機能の相関を得る上で欠かせない存在である。中でも、安定同位体標識法や分子生物学的遺伝子操作手法の発展に伴い、現在では1〜2万程度の比較的小さい分子量の蛋白質の立体構造決定法として既に確立されている。
しかし、蛋白質の立体構造を基盤として合理的な治療薬設計(Rational Drug Design)を目指す分野において、ターゲットとなる蛋白質の構造を決定する手段としてNMR法が使用されることは珍しく、むしろリガンド結合による局所構造の変化に関する情報を取得する手段として使われている。特に、1996年に「Structure-activity Relationships(SAR)
by NMR」という名前で初めて報告された低分子フラグメントを連結するスクリーニング戦略が脚光を浴び、最近ではFragment
Based NMR Screening(FBNS)又はFragment Based Drug
Descovery(FBDD)としてよく知られている。
【０００３】
これらの手法は、生体分子ターゲットの構造知識を基盤として新たな治療薬物を発見するものである。そこでは、1)ケミカルライブラリーに登録された化合物の数より遙かに少ない低分子化合物群の中から、ターゲット蛋白質と相互作用する化合物(分子フラグメント)を選出すること、2)蛋白質の異なる位置に相互作用する2つの分子フラグメントの方向性をバイオインフォマティクス解析、距離情報解析、相互作用解析法を用いて決定すること、3)分子フラグメントを修飾・連結することによって、より高い結合能をもつリード化合物を見出すことが行われ、この手法によりスクリーニングに要する手間は実質的に10-4程度になるとの試算が報告されている。
NMR法はこれら3つのプロセスのうち主にa)15N-1H
HSQC法（15N核-1H核相関Heteronuclear Single
Quantum Coherence）を用いて分子フラグメント結合による蛋白質アミドシグナルの変化を検出すること(相互作用の検出)、b)NOEに基づく距離・相対的配向情報を得ること等に用いられる。特にa)は一度の15N安定同位体標識蛋白質の調製によって省力的かつ安価に測定を行うことが可能であるため、簡便さに優れるという利点をもつ（例えば特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１１−５１３４９８号公報
【特許文献２】特表２００２−５１０３８４号公報
【特許文献３】特開２００５−１８１１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし同時に、A)分子フラグメントが相互作用する位置は側鎖であることが多いために、その結合に伴って変化するアミドシグナルの移動度は低いこと、B)芳香環位置・向きの僅かなずれといった局所構造の変化やpH変化、イオン強度変化によって分子フラグメント結合と相対的に同程度に移動したおびただしい数のシグナルの中から、正確なフラグメント結合を示すシグナルをピンポイントに特定することが難しいこと、C)CA（Carbonic Anhydrase：炭酸脱水酵素）のように29.3 k-Daの蛋白質となるとアミドシグナルの数は250を越えるためにさらにその特定を著しく困難なものにすること、といったNMR特有の問題にその発展が阻まれてきた。
また、炭酸脱水酵素阻害効果を有する利尿剤等に含まれるスルフォンアミド基は過敏症発生の問題が指摘されているため、スルフォンアミド基を含まない新規阻害剤の開発が期待されている。
また、炭酸脱水酵素阻害剤の開発手法として、水素イオンの初期濃度変化を測定するpH指示薬法が知られているが、濃度変化を正確に測定することが困難という問題がある。
【０００６】
本発明は、創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用する炭酸脱水酵素阻害剤のNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)、二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、活性部位に非常によくみられる機能性アミノ酸ヒスチジンに焦点を絞り、これまでの自身の研究において開発したヒスチジンNMR解析手法をSAR/FBNS/FBDD手法と組み合わせることによって、ヒスチジンに特化した新たなNMRスクリーニング手法を開発することが可能であると着想した。そして、ヒスチジンを活性部位に含むCAにこれを適用することによって、より合理的かつ迅速に利尿・高血圧治療薬を設計することを目的として研究を行い、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の炭酸脱水酵素阻害剤のスクリーニング方法は、炭酸脱水酵素のうち金属配位に係るヒスチジンイミダゾール側鎖に由来するNMRシグナルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標として用いることを特徴とする。
また、被験物質添加時のNMRスペクトルによって観察されたシグナルのケミカルシフトがpH非依存的になった場合に、金属配位に係るヒスチジンと当該被験物質とが結合していると判断することを特徴とする。
また、炭酸脱水酵素単独時のHis64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTと、被験物質添加時のHis64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTとを比較して、少なくともいずれか一方の値が変化した場合(pKa≠7.2またはKT≠1.0、精度５％を加味した有意な変化の場合)に、当該被験物質が炭酸脱水酵素に結合している又は相互作用していると判断することを特徴とする。
【０００９】
また、前記NMRスペクトルが、15N標識した炭酸脱水酵素の２次元15N-1H NMR相関スペクトルであることを特徴とする。
また、前記金属が亜鉛であることを特徴とする。
また、上記スクリーニング方法によって得られた炭酸脱水酵素阻害剤とその阻害剤で示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であることを特徴とする。
また、上記炭酸脱水酵素阻害剤が利尿・降圧剤であることを特徴とする。
【００１０】
また、上記スクリーニング方法を行うためのスクリーニングキットであることを特徴とする。
また、本発明の二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法は、炭酸脱水酵素の触媒必須因子である亜鉛結合水、His64及びGlu106の各官能基を適宜配置することで被験物質を作成し、当該被験物質のうち亜鉛と結合したヒスチジンのNMRスペクトルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標として用いることを特徴とする。
また、上記スクリーニング方法で得られた二酸化炭素水和触媒能を有する物質を樹脂に結合させることで得られる選択的二酸化炭素捕捉能を有する媒体であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
蛋白質構造・ゲノムプロジェクトが終了し、それらの情報を基盤として1)創薬や2)環境科学といったライフサイエンスに実際に貢献する手法の開発を行うことが喫緊の課題である。
本願発明者は、1)についてアプローチするために、蛋白質の機能の発現にヒスチジンが多く見られることに着眼し、蛋白質中に分散的に存在するその挙動を追うことによって、これまでのNMRスクリーニング手法にかかる曖昧さを低減した「創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用するNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)」の開発が可能であることを着想した。
そして、ヒスチジンが機能発現に関わる蛋白質系において、誰もが容易に使うことが可能な研究手法を整理し、これまで1サンプルあたり数ヶ月以上かかっていた構造基盤型薬設計-スクリーニング手法を数時間から5日程度で行う本願発明の技術を開発した。
【００１２】
本願発明は、特に教科書レベルでみられる炭酸脱水酵素を例として用い本手法によるより合理的な新薬設計に取組むことによって利尿・降圧作用をもつ新薬の具体的創出を行い、最終的にヒスチジンが活性に関与する蛋白質全般に適用可能かつ簡便な新規スクリーニング技術に関する。
ヒスチジンを用いてこのようなスクリーニング手法が可能であることから、他のアミノ酸もまた同様に開発されることが可能であり、最終的にアミノ酸側鎖網羅型のスクリーニング手法の開発が視野に入る。
【００１３】
一方、2)についてアプローチするために、本研究で解明されるCAの触媒機構からその触媒必須因子を抽出、かつ複数の官能基を人工的に適宜配置することによって、酵素を模倣した二酸化炭素水和触媒を開発することが可能である。その機能的な配置は、ヒスチジンの挙動によって検出・確認することが可能であるため、ここでもまた申請者が見出した経験則を基盤とする「Histidine-based NMRスクリーニング法」によって探索することが可能である。
本研究をこのような触媒低分子化の方向に進めるならば、二酸化炭素水和技術によって、植物が光合成前段階で行う大気中二酸化炭素の取込みを模倣するバイオミメティックスがさらに現実味を帯びとなり、環境分野の課題解決に大きくアプローチすることが可能である。本発明は、生体分子の相互作用解明にかかる真の構造生命科学において構築されるスクリーニング技術を基盤とすることで、合理的創薬と二酸化炭素回収という2つの大きなライフサイエンス課題を解決に導く技術である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】炭酸脱水酵素と酵素阻害剤複合体のアミド領域の15N-1H HSQCスペクトル（ａ）及びイミダゾール領域の15N-1H HSQCスペクトル（ｂ）
【図２】ヒスチジンのイミダゾリウムカチオンの２つの互変異性体(Nδ1-H異性体とNε2-H異性体)の酸塩基平衡状態を示す図
【図３】pHに依存した15N核シグナルのケミカルシフトの挙動をシュミレーションした図
【図４】酵素阻害剤複合体のpHに依存したHis64の15N核シグナルのケミカルシフトの挙動とHis64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを示す図
【図５】酵素と酵素阻害剤複合体の金属配位に係るヒスチジンのpHに依存した15N核シグナルのケミカルシフトの挙動を示す図
【図６】ヒスチジンの酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTが表すものを説明するための図
【図７】CAの野生型及びY7F変異体の触媒機構を示す図
【図８】His64が２つの酸性基(亜鉛結合水とGlu106)と水素結合相互作用していることを含むCA触媒中におけるプロトン移動機構を示す図
【図９】阻害剤結合時の酸解離定数pKa、互変異性平衡定数KT及び水素結合の有無等を示す図
【図１０】阻害剤の化学構造を示す図
【図１１】阻害剤のうち結晶構造が明らかになっているものを示す図
【図１２】阻害剤における各官能基の役割を示す図
【図１３】阻害剤のスクリーニング方法を示す図
【図１４】阻害剤のスクリーニング方法を示す図
【図１５】阻害剤のスクリーニング方法を示す図
【図１６】本発明に係るスクリーニング方法を他の酵素及び蛋白質にも適用可能であることを説明する図
【図１７】CAを模倣した二酸化炭素水和触媒の利用方法を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［本願発明と従来手法との比較］
発明者は、これまでの20年間の殆どを、NMR法を用いた酵素ヒスチジンの挙動解析に費やし、機能発現時にみられるヒスチジンの酸塩基平衡、互変異性平衡、回転、金属配位といった様々な化学特性がアミノ酸変異等によってどのような影響を受けるか又はどのようなシグナル変化を示すかを調べてきた。
その研究で発明者が開発したヒスチジン解析手法とSAR/FBNS/FBDD手法とを組み合わせてなる本発明のヒスチジンに特化した新たなNMRスクリーニング手法と従来手法との比較を図１に示す。
【００１６】
図１（ａ）は従来手法である15N標識した炭酸脱水酵素（ここではヒト由来炭酸脱水酵素II型(hCAII)）のうちアミド領域の15N-1H HSQCスペクトルである。灰薄色は酵素単独、黒は降圧・利尿薬として知られるフロセミドとCAの複合体に由来するシグナルである。フロセミド添加によって移動したアミドシグナルの数はあまりに多く、その中から結合によって移動したシグナルを特定するには多大な労力と時間が必要であることがわかる。
一方、図１（ｂ）は本願発明である、同じく15N標識したヒト由来II型(hCAII)のうちイミダゾール領域の15N-1H HSQCスペクトルである。黒は酵素単独、灰薄色はフロセミド-CA複合体のシグナルである。
Ｌ字型で結ばれたシグナルが一つのヒスチジンのそれを示しており、矢印で示すように顕著に移動した数個のヒスチジンが一目でわかる。このスペクトルを得るための時間は、図１（ａ）に示した従来手法と同等かそれより短いので、従来のSAR/FBNS/FBDD手法が有する簡便さに優れるという利点を保ったまま、フラグメントと直接相互作用する側鎖のシグナルをピンポイントに捉えることが可能であることが分かる。
【００１７】
次に、本発明に係るヒスチジン領域のNMRスペクトルを用いたスクリーニング法の効果を証明するべく、次の4つの項目について説明する。
1.ヒスチジンのシグナルから得られる情報
2.その情報が反映する構造・挙動(触媒機構)
3.阻害によって移動するシグナルが反映する構造・挙動(阻害機構)
4.これまでに報告されたCAを阻害する薬物の普遍的な相互作用原理
【００１８】
［1.ヒスチジンのシグナルから得られる情報(酸塩基平衡定数、互変異性平衡定数、金属配位)］
ヒスチジンのイミダゾリウムカチオンは２つの互変異性体(Nδ1-H異性体(1)とNε2-H異性体(3))と酸塩基平衡にある（図２）。そこではそれぞれとの平衡について微視的な定数K1、K2が与えられ、それらから巨視的な酸塩基平衡Ka(K1＋K2)と互変異性平衡定数KT(K1/K2)が得られる。ヒスチジンはこの３つの型の中でNMR時間軸上十分速く交換するため、観測されるケミカルシフトはその型の核の荷重平均で表される。イミダゾールを構成する1H、13C、15N核の中で、15Nのケミカルシフト変化はその交換に最も感受性が高く、水素が結合した15N核は167ppm付近に観測され、結合していないそれは250ppm付近に観測される。その差が82ppmあることから、他の環境変化に因るケミカルシフト差が2〜3ppmあるとしても、平衡定数の決定について5％に満たない誤差が保たれ、これは他の核と比較して精度が高い。
類似手法としてJ結合定数を用いた平衡定数決定手法が報告されているが、これと本手法を比較しても、簡便性と精度の両方について本手法の方が優れている。
イミダゾリウムカチオンのNδ1はおよそ179ppm、Nε2は181ppmに観測されることから、以下の式（数１）を用いてpHに依存した15N核シグナルの挙動をシュミレーションすると図３のようになる。
【数１】
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なお、実際は式１を用いてデータをフィッティングし、pKaと互変異性体の割合に関する情報を含むリミッティングシフト値(δacidic、δbasic)を求め、最終的にKTを算出する。
【００１９】
実際に上記方法を活性部位にHis64と亜鉛結合ヒスチジンがみられる炭酸脱水酵素(CA)に適用した。その結果、図４に示すように1)酵素単独時のHis64のpKa,KTが特徴的であること(それぞれ7.2,1.0)、図５に示すように2)亜鉛結合水のpKaを示す亜鉛結合ヒスチジンの挙動がpH依存的であること、3)図４に示すように触媒能が維持されるY7F変異体においてHis64のKTが0.67に変化すること、4)図４に示すように阻害剤結合時は酵素単独と比べてHis64のpKa,KTが変化すること及び図５に示すように阻害剤結合時は亜鉛結合ヒスチジンの挙動がpH非依存的となることが判る。中でも4)は本酵素の阻害新薬スクリーニングだけでなく触媒模倣スクリーニングにも有用である。
【００２０】
［2.その情報が反映する構造・挙動(触媒機構)］
NMR法によって得られるヒスチジン情報pKaとKTは、それぞれ環境の酸性度と水素結合相互作用を反映する数値である。特に、発明者はKTと水素結合相互作用の間に規則性があり(図６)、そこではδ1窒素と酸性基の間の水素結合相互作用が高まるとKTが上昇するという経験則があることを見出した。
これを上記1.の1)から3)に当てはめると、野生型、Y7F変異体のHis64のKT（1.0、0.7）は、酸性基と水素結合(HB)を形成したり切れたりすること(部分的にHB形成すること)を表していることが分かった。そして、これまで広く受け入れられているメカニズムと結晶構造にその変化を組み合わせて検討したところ、図７のような触媒機構が得られた。さらに量子化学的計算の結果と併せたところ、図８のようにHis64は２つの酸性基(亜鉛結合水とGlu106)と水素結合相互作用することで、His64のpKaとKTが決定される様子が露となり、妥当なエネルギーダイアグラムを作成するに至った。
【００２１】
［3.阻害によって移動するシグナルが反映する構造・挙動(阻害機構)］
阻害剤の添加によって亜鉛結合ヒスチジンの挙動がpH非依存的となったことは、阻害剤が水の代わりに亜鉛に結合したことを意味している。その時のHis64に注目すると、アセタゾラミドの場合、図４に示すようにKTは0.74となり酵素単独と比べて若干下がった。図６に示したように、経験則によるとこの値は部分的な水素結合形成を示唆しており、これらを図８の機構に当てはめると、His64と亜鉛結合水の間の水素結合形成が崩壊したことによりKTが減少し、His64とGlu106の間の水素結合において結合が繋がったり切れたりしているものと考えられる。
一方、フロセミドの場合、結晶構造解析においてフロセミドのカルボン酸とHis64 Nε2が水素結合を形成する様子が報告されており、図６に示した経験則に基づくとHis64のKTは酸性基と相互作用する値となることが予想される。そして、図４に示すようにKTの実測値は0.20であり、図６に示した経験則に基づいて導き出したKTと水素結合相互作用との規則性の正しさが証明された。
すなわち、図９にも示すように、阻害剤を添加していない状態、すなわち酵素単独の状態から阻害剤としてアセタゾラミドを添加した状態ではKTは1.0から0.74へと僅かにしか小さくならない。これは、アセタゾラミドはその構造中にスルフォンアミド基のみが存在しており、カルボキシル基のような酸性基が存在していないため、このスルフォンアミド基とCA中の亜鉛とが結合することで両者間の水素結合は崩壊したものの、His64とGlu106の間の水素結合は依然として残っているためである。
【００２２】
一方、酵素単独の状態から阻害剤としてフロセミドを添加した状態ではKTは1.0から0.20へと大幅に小さくなった。これは、フロセミドはその構造中にスルフォンアミド基とカルボキシル基の両者が存在しており、スルフォンアミド基がCA中の亜鉛と結合することで両者間の水素結合が崩壊し、更にカルボキシル基がCA中のHis64と結合することで両者間の水素結合が崩壊したため、フロセミドと結合した状態のCA中に含まれる水素結合が大幅に減少した結果がKTの大幅減少に表れたと判断できる。KTの大幅減少は2,4-Dichloro-5-sulfamoylbenzoic acid にも見られる。
以上から、スルフォンアミド基とカルボキシル基の位置がフロセミドと同様の位置に存在する点や、CAと阻害剤との結合時に酵素単独の状態に比べてKTが小さくなる点を、高い炭酸脱水酵素阻害能を持つ被験物質のスクリーニングを行う際の指標として用いることができることが分かる。酵素単独の状態に比べてKTが大きくなる場合もまた同様と考えられる。
なお、フロセミドのアミノメチルフラン基を塩素に置換すると、亜鉛結合とHis64結合を表すｐH依存性とKTは変化しないが、酵素に対する親和性がフロセミドより10倍程度高くなりアセタゾラミドと同等になる。この阻害剤が一般に使用されない理由は、フロセミドより疎水度が低いため、灌流・血流が顕著な腎臓であっても、細胞・組織に移行しないとの理由によると考えられる。したがって、当該部位の修飾により薬物分布を調節することが可能となる。
【００２３】
［4.これまでに報告されたCAを阻害する薬物の普遍的な相互作用原理］
フロセミドやアセタゾラミドとCAの間の相互作用に係るNMR構造情報を基に、それら低分子の化学構造式と臨床登録されているすべての阻害剤(ループ利尿薬・チアジド系利尿薬・チアジド類似利尿薬・ベンザミド)を照らし合わせて比較した。
すると図１０中に丸印で囲んだ箇所に示すように、そのすべてに亜鉛と結合するスルフォンアミド基が存在することが分かった。また、His64と相互作用するための酸性基または水素結合ドナーが存在するフロセミドタイプの阻害剤が8割で、存在しないアセタゾラミドタイプの阻害剤が残り2割であることがわかった(図１０中の●印は図１１の結晶構造と一致することを確認済み)。
【００２４】
これにより、図１２に示すように、I)亜鉛結合基、II)His64相互作用基、III)それらの間を連結するリンカーの疎水度(これは相互作用よりむしろ薬物の生体分布に重要と考えられる)、IV)相互作用の方向性を決定する基というように阻害剤における各官能基の役割が明確になった。
これらのI)からIV)を分子フラグメントと捉え、図１３に示すように、薬物フラグメントライブラリーからその役割に適合するフラグメントを選択し、その分子フラグメントを置換した物質を化学合成し、上記1.の1)の手法によって酵素単独時のHis64のKTを測定して水素結合相互作用を確認する。
例えば、I)亜鉛結合基の候補としては、低分子アニオンとしてmM桁の阻害が知られるCl−, Br−, I−,NO3−,SO42−, NCO−, SCN−等を置換の第一対象とすることが可能である。
【００２５】
また、I)亜鉛結合基とII)His64相互作用基の間の距離が重要と考えられるため、設計した低分子化合物については先に量子化学(QM)計算手法を用いた構造最適化計算手法を適用して、コンピュータシミュレーション上で予めその距離を見積もることによって実際に合成する前にある程度の絞り込みが可能と考えられる(側鎖の回転も考慮)。
発明者はこれまでにGaussian09搭載NECSX-9を用いた密度汎関数(DFT)計算による酵素の挙動解析系を確立しており、この装置を用いてその距離の見積もりを行うことが可能である。
【００２６】
以上のように、環境の酸性度と水素結合相互作用の変化を示すpKaとKTの数値の変化を追うことによって新たな阻害剤を探索することができること（図１４参照）、ここでは金属配位に係るヒスチジンのNMRスペクトルのpH依存性と、His64の酸解離定数pKa及び互変異性平衡定数KTを指標にしてCA阻害剤のスクリーニングを行うことができることが具体的に見出された。
なお、NMR測定に必要な15N標識CAは、15N塩化アンモニウムを含む培地を用いたT7系大腸菌組換え発現システムとカルボジイミド(WSC)を介して酵素阻害剤を結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行う系を確立しており、これにより1L培養あたり50〜100mgの精製標品を得ることが可能である。実際の測定・解析は、Bruker Avance III 500MHzNMR装置を使用し、すでにLinux（登録商標）OSマシンに搭載したNMRPipeソフトウェアを用いてシグナル解析を行い(図１５)、Windows（登録商標）OSマシン搭載KareidaGraph、Exellソフトウェアによって定数等の算出を行った。これらを使って、1サンプルを数時間でラフ解析する手法及び5日間で詳細解析する手法を確立している。
【００２７】
[発明の将来展望]
ヒスチジンは、古来より生理的pH付近においてpKaをもつ唯一のアミノ酸側鎖として注目されており、酸塩基触媒や金属配位といった蛋白質の機能発現に重要な役割を担うことが知られている。
炭酸脱水酵素(CA)のように活性部位ヒスチジンがそのような発現に関与する場合、ヒスチジンシグナルを効果的な創薬プローブとして適切にモニターするならば、相互作用を検出するための手段として非常に有用であり、将来、多くの蛋白質に適用される可能性が極めて高いと考えられる。
【００２８】
発明者は既に遺伝子クローニング(mRNA抽出型・遺伝子合成型を含む)・発現系構築技術を有しており、かつバイオインフォマティクス技術をヒスチジンが機能する蛋白質探索に適用し、そこで確立された手法を他の蛋白質に適用することが可能である（図１６参照）。
ヒスチジンを用いてこのようなスクリーニング手法が可能であることを示すならば、他のアミノ酸もまた同様に開発されることが可能であり、最終的にアミノ酸側鎖網羅型のスクリーニング手法が視野に入るため、その波及効果は絶大である。
【００２９】
一方、本研究で解明されるCAの触媒機構からその触媒必須因子（亜鉛結合水、His64、Glu106）を抽出、かつそれらの官能基を人工的に適宜配置することによって、酵素を模倣した二酸化炭素水和触媒を開発することが可能である（図１７参照）。その機能的な配置は、ヒスチジンの挙動によって検出・確認することが可能であるため、ここでもまた発明者が見出した経験則を基盤とする「Histidine-based NMRスクリーニング法」によって探索することが可能である。
本研究をこのような触媒低分子化の方向に進めるならば、二酸化炭素水和技術によって、植物が光合成前段階で行う大気中二酸化炭素の取込みを模倣するバイオミメティックスがさらに現実味を帯び、環境分野の課題解決に大きくアプローチすることが可能である。
このように、相互作用の解明にかかる真の構造生命科学によるスクリーニング技術を基盤とすることで、合理的創薬と二酸化炭素回収という2つの大きなライフサイエンス課題を解決できる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、創薬効果的プローブとして機能性アミノ酸ヒスチジンの挙動を利用する炭酸脱水酵素阻害剤のNMRスクリーニング法(Histidine-based NMRスクリーニング法)、二酸化炭素水和触媒能を有する物質のスクリーニング方法等に関するものであり、産業上利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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