(57)【要約】【課題】流路内への空気の混入を抑制し、血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行う。【解決手段】循環がん細胞捕捉装置によれば、選択手段により、フィルタユニットに対して供給する液体を選択し、その結果に基づいて、送液手段により、血液又は処理液をフィルタユニットに供給する構成を有することで、従来と比較して血液中の循環がん細胞の捕捉作業を効率よく進めることが可能となる。さらに、フィルタより上流側において、血液中の空気を捕捉して外部に排出するための脱気手段が設けられることで、空気が混入した状態の血液がフィルタを通過することを回避することができるため、空気の混入による処理効率の低下を抑制し、測定精度を高く維持することが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を収納する血液収納容器と；
前記血液又は前記血液中の循環がん細胞を処理するための処理液を内部に導入するための導入流路と、前記血液又は前記処理液を外部に排出するための排出流路と、複数の貫通孔が厚み方向に形成されて、前記導入流路と前記排出流路との間の流路上に前記血液又は前記処理液が該貫通孔を通過するように配置されたフィルタと、を備えるフィルタユニットと；
前記血液収納容器と前記フィルタユニットの前記血液導入流路とを接続する血液流路と；
前記フィルタを通過することで前記フィルタに捕捉された循環がん細胞を処理するための前記処理液を収納する処理液収納容器と；
前記処理液収納容器と前記フィルタユニットの前記導入流路とを接続する処理液流路と；
前記フィルタユニットに対して供給する液体を前記血液及び前記処理液から選択する選択手段と；
前記選択手段の選択結果に基づいて、前記血液収納容器からの血液又は前記処理液収納容器からの処理液を前記フィルタユニットに供給する送液手段と；
前記フィルタより上流側において、前記血液中又は前記処理液中の空気を捕捉して外部に排出するための脱気手段と；
を備える循環がん細胞捕捉装置。
【請求項２】
前記脱気手段は、前記血液流路又は前記処理液流路上に設けられた空気溜まりを含んで構成され、
前記血液流路又は前記処理液流路の前記空気溜まりより上流側は、前記空気溜まりの上部から前記空気溜まりの内部に前記血液又は前記処理液を供給し、
前記血液流路又は前記処理液流路の前記空気溜まりより下流側は、前記空気溜まりの下部から前記血液又は前記処理液を排出する請求項１記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項３】
前記脱気手段は、一方の端部は前記血液流路又は前記処理液流路に対して連通するように接続され、他方の端部に向かうにつれてその位置が徐々に上方となるように傾斜して取り付けられ、当該他方の端部は開放端とされている第１の脱気流路を含んで構成される請求項１記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項４】
前記脱気手段は、
第１の脱気流路の前記他方の端部に接続して前記第１の脱気流路からの血液を貯留する貯留容器と、
前記血液流路又は前記処理液流路上であって前記第１の脱気流路との接続位置よりも上流側に設けられて前記血液流路又は前記処理液流路上の開閉を行う第１流路バルブと、
を備え、
前記第１流路バルブを閉じた状態で前記送液手段を駆動させて前記貯留溶液に貯留された血液を前記フィルタユニットに送液する請求項３記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項５】
前記脱気手段は、前記フィルタユニットの前記導入流路より下流側で分岐して上方に伸びる第２の脱気流路を含んで構成される請求項１記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項６】
前記脱気手段は、前記フィルタユニットに対して接するように設置された圧電素子を用いた加振器をさらに備える請求項４記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項７】
前記処理液収納容器は複数設けられ、
前記処理液流路は、複数の前記処理液収納容器のそれぞれに対して一方の端部である第１の端部が接続する複数の上流側流路と、前記複数の上流側流路の前記第１の端部とは異なる端部である第２の端部のいずれかと、前記フィルタユニットの前記導入流路とを接続する下流側流路と、前記複数の上流側流路の前記第２の端部のうちのいずれかを選択して前記下流側流路と接続可能な選択バルブと、を含んで構成され、
前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記選択バルブを制御する請求項１〜６のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項８】
前記処理液収納容器は複数設けられ、
前記処理液流路は、前記処理液収納容器内の処理液を吸引する吸引ノズルと、当該吸引ノズルにより吸引された処理液を前記フィルタユニットの前記導入流路に対して供給するノズル管と、前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させる位置変更手段と、を含んで構成され、
前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記位置変更手段により前記吸引ノズルを移動させて、前記処理液収納容器内の処理液を吸引することで送液を行う請求項１〜６のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項９】
前記位置変更手段は、前記処理液収納容器を移動させることで前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させる請求項８記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１０】
前記位置変更手段は、前記吸引ノズルを移動させることで前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させる請求項８又は９記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１１】
前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置の変更は、所定の方向に沿ってのみ移動する直進移動台を用いて行われる請求項８〜１０のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１２】
前記吸引ノズルのうち、前記処理液収納容器に収納された処理液と接触する領域を洗浄する洗浄機構及び当該領域を交換する交換機構の少なくともいずれかをさらに備える請求項８〜１１のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１３】
前記フィルタユニットは複数設けられ、
前記複数のフィルタユニットに対応して、前記血液流路と、前記処理液流路とがそれぞれ設けられ、
前記選択手段は前記複数のフィルタユニットに対して供給する液体をそれぞれ選択し、前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記血液収納容器からの血液又は前記処理液収納容器からの処理液を前記複数のフィルタユニットのそれぞれに対して供給する請求項１〜６のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１４】
前記送液手段は、前記複数のフィルタユニットに対応するように複数設けられている請求項１３記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１５】
前記フィルタ上の捕捉された循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う循環がん細胞特定手段をさらに備える請求項１〜１４のいずれか一項に記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１６】
前記循環がん細胞特定手段として、
前記フィルタ上の循環がん細胞画像を取得する画像取得手段を備え、
前記画像取得手段により取得された画像に基づいて前記循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う請求項１５記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１７】
前記循環がん細胞特定手段として、
前記画像取得手段により取得された画像を出力する出力手段をさらに備える請求項１６記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１８】
前記複数のフィルタユニットにそれぞれ対応して前記フィルタ上の捕捉された循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う循環がん細胞特定手段をさらに備える請求項１３記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項１９】
前記複数のフィルタユニットは一体化されている請求項１３又は１８記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項２０】
前記送液手段は、送液ポンプを含んで構成される請求項１〜１９記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項２１】
前記送液ポンプは蠕動ポンプである請求項２０記載の循環がん細胞捕捉装置。
【請求項２２】
前記送液手段は、前記流路に対して接続する圧力可変の減圧タンクと、前記流路内の圧力を測定する流量計とを含んで構成され、当該流量計の測定値にしたがって、当該減圧タンクの圧力を変更する請求項１〜１９記載の循環がん細胞捕捉装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移がんの検査または抗がんの評価に用いるために血液中に進入した循環がん細胞をフィルタにより捕捉するための循環がん細胞捕捉装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
「悪性腫瘍」とも呼ばれるがんは進行した場合生体の生命維持に重大な支障をきたすため、治療方法について種々検討されている。がん患者の治療方針を決める際の目安になるものとして、がんの転移の有無がある。転移はがん細胞が血管中に侵入し、血液に乗って体中に広がって他の臓器にがん細胞が移り住むことによる。したがって、血中のがん細胞の有無及びその量の測定は、がんの転移予測をするに際して重要な情報となる。
【０００３】
転移を引き起こす血液中のがん細胞である循環がん細胞を捕える従来技術としては、例えば、特許文献１に示すように、血液中のがん細胞をフィルタで捕獲する方法が知られている。特許文献１では、フィルタの半導体技術を用いた製造方法、フィルタを収納したセルユニットの形状、および血液および処理液を流す流路の構造が示されていて、フィルタを収納したセルユニットにがん細胞を含んだ血液を流し、がん細胞を捕獲しようとするものである。フィルタ上に存在する細胞を染色によりがん細胞と同定する。また、特許文献２、３には、がん細胞および免疫細胞の少なくとも一方を含む細胞分散液を通過させて、前記がん細胞および前記免疫細胞の少なくとも一方に、物理的作用、化学的作用および生理活性作用の少なくとも一種を付与することができる細胞処理カートリッジを備える体液処理システムが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／００５３１５２号明細書
【特許文献２】特開２０１０−２２７０１１号公報
【特許文献３】特開２０１０−７５１９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１〜３記載の装置を用いた場合、血中のがん細胞を捕捉して測定にかかるまでの手間が非常に煩雑であり、多数の検体を処理することが困難である。また、装置の流路内に空気が混入した場合には検体の処理の効率を著しく低下させ、さらに測定精度が低下するという懸念もある。
【０００６】
本発明は上記を鑑みてなされたものであり、流路内への空気の混入を抑制し、血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる循環がん細胞捕捉装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明に係る循環がん細胞捕捉装置は、血液を収納する血液収納容器と；前記血液又は前記血液中の循環がん細胞を処理するための処理液を内部に導入するための導入流路と、前記血液又は前記処理液を外部に排出するための排出流路と、複数の貫通孔が厚み方向に形成されて、前記導入流路と前記排出流路との間の流路上に前記血液又は前記処理液が該貫通孔を通過するように配置されたフィルタと、を備えるフィルタユニットと；前記血液収納容器と前記フィルタユニットの前記導入流路とを接続する血液流路と；前記フィルタを通過することで前記フィルタに捕捉された循環がん細胞を処理するための処理液を収納する処理液収納容器と；前記処理液収納容器と前記フィルタユニットの前記導入流路とを接続する処理液流路と；前記フィルタユニットに対して供給する液体を前記血液及び前記処理液から選択する選択手段と；前記選択手段の選択結果に基づいて、前記血液収納容器からの血液又は前記処理液収納容器からの処理液を前記フィルタユニットに供給する送液手段と；前記フィルタより上流側において、前記血液中又は前記処理液中の空気を捕捉して外部に排出するための脱気手段と；を備えることを特徴とする。
【０００８】
上記の循環がん細胞捕捉装置によれば、選択手段により、フィルタユニットに対して供給する液体を選択し、その結果に基づいて、送液手段により、血液又は処理液をフィルタユニットに供給する構成を有することで、従来と比較して血液中の循環がん細胞の捕捉作業を効率よく進めることが可能となる。さらに、フィルタより上流側において、血液中の空気を捕捉して外部に排出するための脱気手段が設けられることで、空気が混入した状態の血液がフィルタを通過することを回避することができるため、空気の混入による処理効率の低下を抑制し、測定精度を高く維持することが可能となる。
【０００９】
ここで、上記作用を効果的に奏する構成として、具体的には、前記脱気手段は、前記血液流路又は前記処理液流路上に設けられた空気溜まりを含んで構成され、前記血液流路又は前記処理液流路の前記空気溜まりより上流側は、前記空気溜まりの上部から前記空気溜まりの内部に前記血液又は前記処理液を供給し、前記血液流路又は前記処理液流路の前記空気溜まりより下流側は、前記空気溜まりの下部から前記血液又は前記処理液を排出する態様が挙げられる。
【００１０】
ここで、上記作用を効果的に奏する他の構成として、具体的には、前記脱気手段は、一方の端部は前記血液流路又は前記処理液流路に対して連通するように接続され、他方の端部に向かうにつれてその位置が徐々に上方となるように傾斜して取り付けられ、当該他方の端部は開放端とされている第１の脱気流路を含んで構成される態様が挙げられる。
【００１１】
前記脱気手段は、前記第１の脱気流路の前記他方の端部に接続して前記第１の脱気流路からの血液を貯留する貯留容器と、前記血液流路又は前記処理液流路上であって前記第１の脱気流路との接続位置よりも上流側に設けられて前記血液流路又は前記処理液流路上の開閉を行う第１流路バルブと、を備え、前記第１流路バルブを閉じた状態で前記送液手段を駆動させて前記貯留溶液に貯留された血液を前記フィルタユニットに送液する態様とすることもできる。
【００１２】
また、前記脱気手段は、前記フィルタユニットの前記導入流路より下流側で分岐して上方に伸びる第２の脱気流路を含んで構成される態様とすることもできる。
【００１３】
また、前記脱気手段は、前記フィルタユニットに対して接するように設置された圧電素子を用いた加振器をさらに備える態様とすることもできる。
【００１４】
また、前記処理液収納容器は複数設けられ、前記処理液流路は、複数の前記処理液収納容器のそれぞれに対して一方の端部である第１の端部が接続する複数の上流側流路と、前記複数の上流側流路の前記第１の端部とは異なる端部である第２の端部のいずれかと、前記フィルタユニットの前記導入流路とを接続する下流側流路と、前記複数の上流側流路の前記第２の端部のうちのいずれかを選択して前記下流側流路と接続可能な選択バルブと、を含んで構成され、前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記選択バルブを制御する態様とすることができる。
【００１５】
また、前記処理液収納容器は複数設けられ、前記処理液流路は、前記処理液収納容器内の処理液を吸引する吸引ノズルと、当該吸引ノズルにより吸引された処理液を前記フィルタユニットの前記導入流路に対して供給するノズル管と、前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させる位置変更手段とを含んで構成され、前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記位置変更手段により前記吸引ノズルを移動させて、前記処理液収納容器内の処理液を吸引することで送液を行う態様都することもできる。
【００１６】
ここで、前記位置変更手段は、前記処理液収納容器を移動させることで前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させる態様としてもよい。また、前記位置変更手段は、前記吸引ノズルを移動させることで前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置を変更させるとすることもできる。さらに、前記処理液収納容器に対する前記吸引ノズルの位置の変更は、所定の方向に沿ってのみ移動する直進移動台を用いて行われる態様であってもよい。
【００１７】
前記吸引ノズルのうち、前記処理液収納容器に収納された処理液と接触する領域を洗浄する洗浄機構及び当該領域を交換する交換機構の少なくともいずれかをさらに備える構成とすることもできる。
【００１８】
また、前記フィルタユニットは複数設けられ、前記複数のフィルタユニットに対応して、前記血液流路と、前記処理液流路とがそれぞれ設けられ、前記選択手段は前記複数のフィルタユニットに対して供給する液体をそれぞれ選択し、前記送液手段は、前記選択手段の選択結果に基づいて、前記血液収納容器からの血液及又は前記処理液収納容器からの処理液を前記複数のフィルタユニットのそれぞれに対して供給する態様としてもよい。
【００１９】
また、前記送液手段は、前記複数のフィルタユニットに対応するように複数設けられている態様とすることもできる。
【００２０】
さらに、前記フィルタ上の捕捉された循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う循環がん細胞特定手段をさらに備える態様としてもよい。
【００２１】
また、前記循環がん細胞特定手段として、前記フィルタ上の循環がん細胞画像を取得する画像取得手段を備え、前記画像取得手段により取得された画像に基づいて前記循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う態様とすることもできる。
【００２２】
また、前記循環がん細胞特定手段として、前記画像取得手段により取得された画像を出力する出力手段をさらに備える態様としてもよい。
【００２３】
さらに、前記複数のフィルタユニットにそれぞれ対応して前記フィルタ上の捕捉された循環がん細胞の同定及び数量のカウントを行う循環がん細胞特定手段をさらに備える態様とすることもできる。
【００２４】
また、前記複数のフィルタユニットは一体化されている態様としてもよい。
【００２５】
さらに、前記送液手段は、送液ポンプを含んで構成される態様としてもよい。その場合、前記送液ポンプは蠕動ポンプである態様とすることもできる。
【００２６】
また、前記送液手段は、前記流路に対して接続する圧力可変の減圧タンクと、前記流路内の圧力を測定する流量計とを含んで構成され、当該流量計の測定値にしたがって、当該減圧タンクの圧力を変更する態様としてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、流路内への空気の混入を抑制し、血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる循環がん細胞捕捉装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本実施形態に係る循環がん細胞捕捉装置の構成を説明する図である。
【図２】図１の循環がん細胞捕捉装置におけるフィルタユニットについて説明する図である。
【図３】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図４】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図５】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図６】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図７】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図８】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図９】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図１０】循環がん細胞捕捉装置の変形例について説明する図である。
【図１１】図１０の循環がん細胞捕捉装置に用いられるノズルについて説明する図である。
【図１２】循環がん細胞特定手段を含む循環がん細胞捕捉システムについて説明する図である。
【図１３】循環がん細胞捕捉システムの変形例について説明する図である。
【図１４】循環がん細胞捕捉装置の脱気手段について説明する図である。
【図１５】循環がん細胞捕捉装置の脱気手段の変形例について説明する図である。
【図１６】循環がん細胞捕捉装置の脱気手段の変形例について説明する図である。
【図１７】循環がん細胞捕捉装置の脱気手段の変形例について説明する図である。
【図１８】循環がん細胞捕捉装置の吸引手段の変形例について説明する図である。
【図１９】循環がん細胞捕捉装置の吸引手段の変形例について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００３０】
（循環がん細胞捕捉装置）
図１は本実施形態に係る循環がん細胞捕捉装置の構成を説明する図である。循環がん細胞捕捉装置は、被検液となる血液をフィルタによってろ過することで血液中に含まれる循環がん細胞を捕捉する装置である。また、フィルタにより捕捉された循環がん細胞について、染色液等の処理液を用いて染色することで、循環がん細胞の特定及びがん細胞の個体数のカウント等が行われる。
【００３１】
図１に示すように、循環癌細胞捕捉装置１００は、循環がん細胞を捕捉するためのフィルタが内部に設けられたフィルタユニット１、フィルタユニット１に対して処理液（試薬）を供給するための軟質チューブからなる流路３（処理液流路／下流側流路）、フィルタユニット１に対して血液を供給するための軟質チューブからなる流路４（血液流路）が設けられている。流路３の上流側には、複数の処理液収納容器５に対して互いに異なる処理液（試薬）が入れられている。処理液収納容器５に投入される処理液としては、循環がん細胞を染色するための染色液、フィルタに捕捉された循環がん細胞等を洗浄するための洗浄液、リンス液等が挙げられる。これらの複数の処理液収納容器５に対してはそれぞれ軟質チューブ６が挿入されて個別の流路（処理液流路／上流側流路）を形成している。そして、これらの流路が選択バルブ８に対して接続されており、選択バルブ８（選択バルブ）を回転させることにより流路３に対して接続する処理液（処理液収納容器５）が選択される。
【００３２】
フィルタユニット１に対して接続する流路４には、内部に被検液として循環がん細胞を含んだ血液が納められた血液収納容器１０が接続されている。フィルタユニット１に対しては、処理液及び血液を同時に供給するのではなくいずれか一方を供給する構成となっているが、処理液及び血液のうちいずれの液体を供給するかの制御は流路３，４のそれぞれに対して取り付けられたバルブ１２，１３よって切り替える。例えば、血液をフィルタユニット１に対して供給する流す場合は、バルブ１２を閉とし、バルブ１３を開とする。バルブ１２，１３としては、軟質チューブを加圧変形させてその流れを遮断するピンチバルブを用いることができる。
【００３３】
また、フィルタユニット１に対して処理液及び血液のうちのいずれかの液体を供給する場合、フィルタユニット１の下流に設けられたポンプ１４（供給手段）によって吸引することで液体の供給が行われる。ポンプ１４は回転数変化により流路中の液体の流速を変えることが可能な構造となっている。ポンプ１４としては、例えば軟質チューブに対する加圧による蠕動点を順次移動させる蠕動ポンプ（ペリスタポンプ）を用いることができる。ポンプ１４の駆動により、試薬・血液等の液体は流路３又は流路４の内部をフィルタユニット１に向かう方向に流れフィルタユニット１に供給される。そして、フィルタユニット１を通過した液体は、廃液タンク１６に流れ込む構造となっている。これらの構造により、血液中の循環がん細胞がフィルタユニット１内の流路上に設けられたフィルタによって捕捉されると共に、染色液により循環がん細胞が染色される。
【００３４】
上記の各部の制御は、制御部４８（選択手段，送液手段）による制御により行われる。具体的には、選択バルブ８の制御は、制御部４８からの指示に基づいて選択バルブドライバ４９により行われる。また、バルブ１２，１３については、それぞれに対して接続された２つのバルブドライバ５０により制御が行われる。また、ポンプ１４の駆動についても、ポンプドライバ５１により制御が行われ、例えば、ポンプの回転数を変更させることで流量を可変とし、決められた最適な流量をフィルタユニット１に供給することで、血液中の循環がん細胞の捕捉、捕捉した循環がん細胞の染色を最適な流量条件で行うことを可能としている。制御部４８には、選択バルブ８、バルブ１２，１３、ポンプ１４のそれぞれについて駆動／停止等の制御を可能とするプログラムを入力するためのプログラム入力機能が備えられていて、これにより入力されたプログラムによって上記したように各機器を順に動作させる駆動機構が付加されている。
【００３５】
次に、フィルタユニット１について、図２を用いて説明する。図２（Ａ）は、フィルタユニットの上面図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のIIB−IIB矢視図に対して流路４に取り付けられる脱気手段を追加して示したものである。
【００３６】
フィルタユニット１は、複数の貫通孔６１を有するフィルタ５７を内部に空間が形成された上容器５８と下容器５９とで挟み込んだ構成とされている。フィルタ５７は例えば金属からなり、厚さ方向に貫通孔６１が複数形成されたものである。フィルタユニット１の上容器５８には、軟質チューブで形成された流路３に接続される流路３Ａ（導入流路）と、流路４に接続される流路４Ａ（導入流路）とが形成されると共に流路３Ａ，４Ａと連通してフィルタ５７の上方に形成される上空間６２とが設けられる。すなわち、本実施形態において「導入流路」とは、流路のうちフィルタユニット１の内部に設けられた流路３Ａ、４Ａを指す。また、「血液流路」「処理液流路」とは、フィルタユニット１の外部に接続される流路３、４を指す。
【００３７】
また、下容器５９には、フィルタ５７の下方に形成されて中央部の深さが周縁部よりも深くなっている下空間６３と、下空間６３に対して連通し、下空間６３の液体を外部に排出するための流路５９Ａ（排出流路）とが設けられる。上容器５８と下容器５９とにより挟み込まれるフィルタ５７に設けられた貫通孔６１は、捕捉目標となる循環がん細胞６５が通過できない程度の大きさとされる。これにより、貫通孔６１を血液が通過する際、循環がん細胞６５がフィルタ５７上に捕獲するわけである。ここで、捕獲した循環がん細胞を検出するための洗浄及び染色は血液のフィルタリングが終了した後、流路３Ａに接続されるチューブの流路３から洗浄液及び染色液を供給することで行われる。この作業によって、フィルタ５７を用いた循環がん細胞の捕獲及び処理液による染色が行われる。フィルタユニット１は、必要に応じて循環がん細胞の同定及び循環がん細胞数の数量計測等のために、流路３，４から取り外される。
【００３８】
なお、フィルタユニット１に対して血液を供給する流路４上には、流路４内に混入した空気を取り除くための脱気手段１５０が取り付けられる。この脱気手段は、本発明の循環がん細胞捕捉装置において特徴をなす部分であるが、その詳細は後述する。
【００３９】
上記の循環がん細胞捕捉装置１００では、制御部４８による制御によって、フィルタユニット１のフィルタ５７による血液中の循環がん細胞の捕捉と、捕捉された循環がん細胞の洗浄及び染色を一連の動作として行うことができる。したがって、従来と比較して、血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる。
【００４０】
（循環がん細胞捕捉装置の変形例）
次に、循環がん細胞捕捉装置の変形例について、図３〜図１１を用いて説明する。
【００４１】
（変形例１）
図３に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ａは、フィルタ５７を収容するフィルタユニット１が流路３，４に対して接続されている。そして、流路３の上流には、染色液、洗浄液、リンス液等の試薬を納めた複数の処理液収納容器５が設けられる。複数の処理液収納容器５のそれぞれに対して、流路６が取り付けられている。各流路６はフィルタユニット１に対して接続する流路３に対して接続するが、複数の流路６のそれぞれが流路３に対して合流する位置よりも上流側において選択バルブ１８が設けられている。すなわち、選択バルブ１８は複数の処理液収納容器５及びこれに対して取り付けられる流路６に対応するように配置されている。そして、選択バルブ１８の開閉により、流路に対して供給する液体の選択が行われる。また、図１の循環がん細胞捕捉装置１００と同様に、血液を供給する側の流路４においてもバルブ１３が取り付けられていて、これらの開閉により、フィルタユニット１に対して供給する液体が選択される。バルブの開閉により選択された液体の供給はポンプ１４の駆動により行われる。
【００４２】
複数の処理液収納容器５のそれぞれに対応して取り付けられる複数のバルブ１８及び血液を供給するための流路４に取り付けられるバルブ１３は、それぞれ制御部５２に対して接続されたバルブドライバ５０により制御される。また、ポンプ１４の駆動は、ポンプドライバ５１により制御される。これにより、制御部５２によって、バルブ１３，１８の開閉及びポンプ１４の駆動が行われ、所望の液体がフィルタユニット１に供給される。このため、図１に示す循環がん細胞捕捉装置１００と同様に図３に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ａにおいても血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる。
【００４３】
（変形例２）
図４に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｂにおいて、図１の循環がん細胞捕捉装置１００と相違する点は以下の点である。すなわち、各種試薬が収納された処理液収納容器５０のそれぞれに対して流路６を介して接続される選択バルブが２つ設けられている点である。処理液収納容器５から選択バルブ２４，２５までの流路６は途中で分岐する構造となっている。このため、１セットの処理液収納容器５を２個のフィルタセルユニットにおいて共有して使用可能な構造となっている。選択バルブ２４，２５はそれぞれ独立して駆動する。また、選択バルブ２４，２５の後段にある流路３，３’、フィルタユニット１，１’、血液収納容器１０，１０’、ポンプ１４，１４’はそれぞれ別個に設けられていて、独立運転が可能な構造となっている。なお、廃液タンク１６，１６’はフィルタユニット１，１’に対応してそれぞれ配置した構造を図４に示すが、共有化して１個を配置することも可能である。また、上記の循環がん細胞捕捉装置１００，１００Ｂと同様に、選択バルブ２４，２５、血液収納容器１０，１０’及びポンプ１４，１４’は、制御部によりその駆動が制御される。このように、図１に示す循環がん細胞捕捉装置１００と同様に図４に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｂにおいても血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる。さらに、図４の循環がん細胞捕捉装置１００Ｂでは、同時に２検体を処理することができる。
【００４４】
（変形例３）
図５に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｃでは、前述の循環がん細胞捕捉装置１００，１００Ａ，１００Ｂとは異なり、フィルタユニットに対して液体を供給するための流路が１つであり、この流路内に被検液である血液や循環がん細胞を判別するための試薬類を供給する構成となっている。循環がん細胞捕捉装置１００Ｃでは、フィルタ５７を内部に収容するフィルタユニット１に対して流路３が接続されている。流路３の上流側には試薬を流路３に供給するための供給管３２（ノズル管）が取り付けられている。フィルタユニット１の下流側にはポンプ１４が配置されており、供給管３２から供給されて流路３、フィルタユニット１を通過した溶液を廃液タンク１４に向かって流すことが可能な構造となっている。
【００４５】
血液が収容された血液収納容器１１及び試薬が収容された処理液収納容器５は、可動ピペット４０の回転台４３（位置変更手段）を中心とした環状に並べられ、可動ピペット４０が回転台４３を軸心として回転しさらに上下動した後に、血液収納容器１１及び処理液収納容器５から各液体を吸引し、吸引した液体を供給管３２上で吐出することで、可動ピペット４０内の液体が供給管３２に供給され、流路３を経てフィルタユニット１に送られる。また、血液収納容器１１及び処理液収納容器５が設けられる環上にはさらに可動ピペット４０のノズル４４（吸引ノズル）を交換するためのノズル交換機構４５（交換機構）が設けられている。ノズル交換機構４５は、軸心を中心に回転しながら、可動ピペット４０が供給管３２に対して供給する液体に応じたノズルと可動ピペット４０に取り付ける機能を有する。なお、交換機構に代えて、処理液等が付着するノズルを洗浄する洗浄機構を備えてもよい。
【００４６】
上記の循環がん細胞捕捉装置１００Ｃでは、制御部５３の指示により上記の動作が行われる。すなわちポンプ１４は、制御部５３の指示によりポンプドライバ５１により制御され、ポンプ１４の起動停止の制御及び流量可変のための回転数の変更が行われる。また、可動ピペット４０の回転位置制御及び上下位置制御は、回転駆動ドライバ５４と上下駆動ドライバ５５を介して制御部５３からの指示に基づき制御される。さらに、ノズル交換機構４５は、ノズル交換機構ドライバ５６を介して制御部５３によって制御される。すなわち、循環がん細胞捕捉装置１００Ｃでは、ポンプ１４、可動ピペット４０、ノズル交換機構４５を制御部５３により制御することで、血液中の循環がん細胞を自動的に捕獲する制御ができる。このように、図５に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｃにおいても血液中の循環がん細胞の捕捉作業をより効率よく行うことができる。
【００４７】
（変形例４）
図６に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｄでは、図５に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｃが回転台に取り付けられた可動ピペット４０と同様に、可動式のピペット７３を用いている。その他の構成は循環がん細胞捕捉装置１００と同様である。すなわち、フィルタユニット１に対しては、血液収納容器１０からの流路４と試薬供給管６７からの流路３とが接続されている。試薬供給管６７は、染色液等の試薬を収容する処理液収納容器５とは別に設けられている。そして、フィルタユニット１の下方には流路３，４からの液体をフィルタユニット１に流すためのポンプ１４及びその下流には排液タンク１６が配置されている。また、流路３，４には、それぞれバルブ７０，７１が取り付けられている。したがって、フィルタユニット１に対して血液を供給する場合は、バルブ７０を閉として、バルブ７１を開として使用する。処理液収納容器５に入れられた染色液等の試薬供給管６７への供給は、これらの上部に位置して水平方向に移動可能なピペット７３（吸引ノズル）を用いて行われる。ピペット７３は、上下方向にも合わせて移動可能な構造となっていて、ピペット移動機構７５の駆動により、試薬を選択し、フィルタユニット１内の金属フィルタ上に捕捉した循環ガン細胞の洗浄および染色作業を実施する。これらのピペット移動機構７５（位置変更手段／直進移動台）とポンプ１４は図示しない制御部によって制御されることで、予め定められた工程で循環がん細胞の捕捉と染色作業を効率よく行うことができる。
【００４８】
（変形例５）
図７に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｅでは、図６に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｄと比較して、試薬供給管６７に代えて可動ピペット７３と同様に駆動する吸い口７８からフィルタユニット１へと接続する流路７７が設けられている点が相違する。すなわち、試薬供給のための吸い口７８は、吸い口移動機構８１により水平方向及び上下方向に可動式とされ、吸い口７８の先端に設けられたカートリッジ８２を処理液収納容器５内の試薬に接触させ、ここから試薬を吸引する。試薬はそのまま流路７７を経由してフィルタユニット１に供給される。なお、血液容器１０からの血液の供給、ポンプ１４の駆動、流路上のバルブ７０，７１の開閉等に関しては、循環がん細胞捕捉装置１００Ｄと同様である。なお、複数の互いに異なる試薬が収容された処理液収納容器５に対して同じ吸い口７８を利用するためにその汚染が問題になる場合は、吸引工程ごとに吸い口のカートリッジ８２を交換するカートリッジ交換機構を取り付けることができる。また、吸い口移動機構８１及びポンプ１４の駆動、バルブ７０，７１の開閉は制御部によって制御されることで、予め定められた工程で循環がん細胞の捕捉と染色作業を効率よく行うことができる。
【００４９】
（変形例６）
図８に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｆでは、図７に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｅでは吸い口７８が吸い口移動機構により可動式になっていた構成と比較して、試薬を収容する処理液収納容器５が複数配置された試薬供給台８５が可動式となっている点が相違する。すなわち、図８に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｆにおいて、試薬供給台８５は試薬移動ステージ８６上に取り付けられており、試薬移動ステージ８６によって水平方向及び上下方向の移動を可能としている。一方、先端にカートリッジ８９が取り付けられた吸い口８４は図示しない固定台に取り付けられている。そして、フィルタユニット１に供給する試薬は、図示しない制御部の制御によって試薬移動ステージ８６が移動することで吸い口８４のカートリッジ８９と接することで吸い口８４から流路８３に対して試薬が導入される。なお、吸い口８４の汚染が問題になる場合は、吸引工程ごとに吸い口のカートリッジ８９を交換するカートリッジ交換機構を取り付けることができる。また、試薬移動ステージ８６及びポンプ１４の駆動、バルブ７０，７１の開閉は制御部によって制御されることで、予め定められた工程で循環がん細胞の捕捉と染色作業を効率よく行うことができる。
【００５０】
（変形例７）
図９に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｇでは、図８に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｆを処理能力向上のために複数セット並列配置したものである。具体的には、排液タンク１６を１つにまとめた以外は、図８に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｆの構成、すなわち、可動式の試薬移動ステージ８６に取り付けられた試薬供給台８５の上に処理液収納容器５が取り付けられている構成である。並列配置された４つのフィルタユニット１への血液及び試薬の供給等は、それぞれ独立して行うことができる。このように、循環がん細胞捕捉装置１００Ｇでは、複数個、最大４個の検体を同時に扱うことが可能となり、処理数を増加させることを可能となる。なお、並列配置する数は適宜変更することができる。
【００５１】
（変形例８）
図１０に示す循環がん細胞捕捉装置１００Ｈでは、平面板内に金属フィルタ１Ａが複数配置され、複数の金属フィルタ１Ａのそれぞれに対して吸い口１０７が取り付けられたマルチフィルタユニット１Ｂが用いられている。複数の金属フィルタ１Ａのそれぞれに対して独立した流路１０８が接続されていて、これらはお互いに混合しないようにされている。また、複数の流路は全てポンプ１０９の駆動により吸引が可能となっている。
【００５２】
マルチフィルタユニット１Ｂは上下移動台１１０に取り付けられていて、上下方向に移動可能な構造となっている。マルチフィルタユニット１Ｂの下部には回転移動台１１２が設けられている。回転移動台１１２上には、複数の血液収納容器１０が複数の金属フィルタ１Ａの配置に対応して配置された血液供給ユニット１１のほか、複数の処理液収納容器５が複数の金属フィルタ１Ａの配置に対応して配置された試薬ユニット７が配置されている。試薬ユニット７は、試薬の種類に応じて複数種類配置される。
【００５３】
金属フィルタ１Ａが複数取り付けられたマルチフィルタユニット１Ｂについて、図１１を用いて説明する。図１１はマルチフィルタユニット１Ｂの略断面図で、フィルタ１Ａが４個配置されている例を示している。フィルタ１Ａの上下には流体を流すための上空間１１４と下空間１１５が配置されており、処理液などは吸い口１０７で吸引された後に下方から上方へ向かって流れ金属１フィルタ１Ａを通過する。ここで血液が金属フィルタ１Ａを通過する際に血液中の循環がん細胞が捕獲される。なお、図１１では、吸い口１０７がチューブ１１７を介してマルチフィルタユニット１Ｂに取り付けられた構造を示す。この構造を採用した場合は、フィルタユニット１Ｂを図１０に示す上下移動台１１０へ固定する必要がなくなる。この構造を採用することで移動部品の小型化が可能となり、循環がん細胞捕捉装置の小型化が達成できる。
【００５４】
上記の構成を有することで、金属フィルタ１Ａの数だけ検体の同時処理が可能となる。したがって、循環がん細胞の捕捉と染色作業を効率よく行い且つその処理数を増加させることができる。
【００５５】
（捕捉後の循環がん細胞の観察について）
上記の循環がん細胞捕捉装置によって捕捉された循環がん細胞は、数量計測等のために観察工程に進められる。図１２は、捕捉された循環がん細胞を観察するための観察装置２００の一例を示す。観察装置２００は、顕微鏡９６、ステージ９７、モニタ１０１（出力手段）、コンピュータ１０２、及びステージドライバ１０３を含んで構成される。
【００５６】
上記の循環がん細胞捕捉装置によって血液中の循環がん細胞を捕捉した後に染色処理が行われたフィルタユニット１を顕微鏡９６のステージ９７に搭載することで、染色した循環がん細胞を視認することができる。フィルタユニット１を搭載したステージ９７にはモータ９８が取り付いていて可動式となっている。これにより、フィルタユニット１内のフィルタの全面を顕微鏡９６の視野でスキャンすることができる。顕微鏡９６には、接眼レンズ９９による目視のほかにカメラを取り付けることでモニタ１０１にその画像を映し出すことも可能とされている。また、カメラ（画像取得手段）により撮像された画像情報をコンピュータ１０２に送信することで、コンピュータ１０２を用いて循環がん細胞の特徴を判定してその評価を行うことも可能とされている。また、コンピュータ１０２とステージ９７がステージドライバ１０３を介して連動することにより、フィルタ上にがん細胞の位置の特定することも可能とされる。上記のような構成を有することで、本実施形態に係る観察装置２００では、捕捉された循環がん細胞数を自動計数することも可能となる。
【００５７】
さらに、図１３において観察装置２００と循環がん細胞捕捉装置とを組み合わせた例を示す。循環がん細胞観察システム２００Ａでは、循環がん細胞捕捉装置１００（変形例の循環がん細胞捕捉装置１００Ａ〜１００Ｈでもよい）が５台配置されており、これに対して図１２で示した循環がん細胞の観察装置２００が１台接続されている。ここで観察装置２００は循環がん細胞を捕捉したフィルタユニットを各循環がん細胞捕捉装置１００から取り込んで、そのフィルタユニット内の金属フィルタに捕捉された循環がん細胞を同定及びカウントする構成とされている。ここで、循環がん細胞捕捉装置１００における循環がん細胞の捕捉に係る所要時間と観察装置２００における循環がん細胞の計数に係る処理時間とを考慮して、観察装置２００に対して接続する循環がん細胞捕捉装置１００の台数を決めている。循環がん細胞観察システム２００Ａでは、循環がん細胞の捕捉時間が捕捉細胞の同定及びカウントに係る時間と比較して約５倍の長さであるので、観察装置１台に対して、捕捉装置５台を接続する構造としている。これによって、装置の待ち時間がなく無駄のない循環がん細胞捕捉観察システムを構成することができる。
【００５８】
（脱気手段）
次に、本発明の特徴をなす部分の１つであるフィルタユニットに対して取り付けられる脱気手段について図１４を用いて説明する。図１４は、本実施形態に係る循環がん細胞捕捉装置１００におけるフィルタユニット１近傍を拡大したものである。
【００５９】
図１４では、フィルタユニット１に対して接続する流路４に設けられた脱気手段について説明する。脱気手段には、流路４から分岐するように一方の端部が取り付けられ他方の端部側に向かうにつれてその位置が上方となるように傾斜して取り付けられた分岐流路（第１の脱気流路）１３１と、この流路１３１の他方の端部に取り付けられた容器１３２（貯留容器）と、当該容器の上方に設けられたバルブ１３３とが含まれる。分岐流路１３１及び容器１３２が流路４に対して上方に取り付けられることで、流路４内を流れる気泡６７は、流路４から分岐する容器１３２側に移動する。そして、容器１３２に取り付けたバルブ１３３の開閉によって、気泡として流路４内を流れていた空気は容器１３２の外に排出される。すなわち、バルブ１３３が開放されている場合には、この分離流路１３１の端部は開放端となり当該端部から気泡６７が排出される。
【００６０】
このように、脱気手段を備えることで、流路４の気泡６７を外部に排出することができ、流路内に空気が残留した状態を低減させ、測定の精度を向上させることができる。なお、本実施形態における循環がん細胞捕捉装置１００における脱気手段とは、流路に混入して血液又は処理液等と一緒に流れる空気等の除去を目的とする。流路内に空気等が混入すると、流路内の液体の体積が減る（流速に対して運搬できる液体の体積が減る）ことや、同じポンプの回転数であっても空気が混入する場合には想定流量の液体を移動させることが困難となること等の影響を受けて、流路内の液体（例えば血液）を想定通りの体積分移動させることができないという問題が生じ、この結果、循環がん細胞の捕捉後に細胞数をカウントしたとしても正確な値を得ることが困難となる。したがって、このように脱気手段を備えることで、流路４内に混入する空気を除去し、より高い精度で循環がん細胞の捕捉及びその後の計測を行うことができる。なお、図１４では流路４に脱気手段となる容器１３２が接続されている構成を示しているが、試薬を供給するための流路３に脱気手段が設けられていてもよい。また、流路３及び流路４の双方に脱気手段を設けることも可能である。
【００６１】
（脱気手段の変形例）
次に、脱気手段の変形例について数例説明する。まず、図１５を用いて、脱気手段の第１の変形例について説明する。図１５では、フィルタユニット１に対して接続する流路４上に設けられた脱気手段について説明する。脱気手段１５０Ａには、空気溜まりとして機能する容器１３４が含まれる。流路４は、容器１３４の上流側では、容器１３４の上部から容器内部に血液を供給する。また、下流側においては、流路４Ｃに対して容器１３４の下側から血液が排出される。このとき、流路４内を流れる気泡６７は、流路４から容器１３４に排出されたときに容器の水面付近或いは容器１３４内の気体と混ざる。そして、バルブ１３３が開放されている場合には、この容器１３４の上方が開放されここから気泡が排出される。そして、下流側の流路４Ｃには、気泡６７が除去された血液が送られる。このような構成を有することで、流路４の気泡を外部に排出することができ、流路内に空気が残留した状態を低減させ、測定の精度を向上させることができる。
【００６２】
次に、図１６を用いて、脱気手段の第２の変形例について説明する。図１６では、フィルタユニット１自体に第２の脱気流路となる配管とバルブとが設けられて脱気手段として機能する。具体的には、図１６に示すように、フィルタユニット１をフィルタ５７が上下方向となるように配置し、導入流路４Ａよりも下流側において、フィルタユニット１配置時に上方となる側の端部に上方に延びる配管１４１（第２の脱気流路）とバルブ１４２とを取り付ける。これにより、流路４からフィルタユニット１内に流れ込んだ気泡１３９は上方に移動し、フィルタユニット１内の上方に形成される空間１４０に停留する。そして、上部に取り付けられたバルブ１４２を開放することで、フィルタユニット１内の空間１４０の気泡を外部に排出することができる。このように脱気手段を備えることで、流路４内に混入する空気を除去し、より高い精度で循環がん細胞の捕捉及びその後の計測を行うことができる。
【００６３】
次に、図１７に示す変形例では、図１６に示す第２の脱気流路に加えて、フィルタユニット１を圧電素子により振動させる構成が付加されている。この構成では、圧電素子１４５を用いた微小振動発生ステージ１４４上にフィルタユニット１を固定し、圧電素子１４５により例えば曲線１４６で示すような上下振動をフィルタユニット１に付加する。そして、この振動によりフィルタユニット１内の気泡を上方に誘導させ、配管１４１を経て外方に排出するものである。すなわち、図１６に示す構成によれば、圧電素子１４５による運動量で、気泡を振動させて、フィルタユニット１への排出を容易とする。
【００６４】
次に、図１８に示す変形例では、図１４に示す構成に加えて容器１３２に貯留する液体と、流路上に設けられたバルブ１５１（流路バルブ）とを利用して流路中の気体、特にフィルタユニット１内に流れた空気を排出する構成について説明する。図１８に示す構成では、流路４に気泡排出を目的とした流体を収納した容器１３２を取り付けておく、そしてバルブ１４９とバルブ１５１とを切り替えた後にポンプ１４を駆動させることで、容器１３２内の液体をフィルタユニット１に導き、フィルタユニット１内の気泡をポンプ３３方向に排出することができる。このとき、ポンプ３３による流量を多くすることで運動量を高め、排出効果を高めることができる。この操作により効果的にフィルタユニット１内の気泡の排出が可能となる。
【００６５】
（送液手段の変更について）
最後に図１９を用いて、減圧ポンプを利用した流路の構成について説明する。図１９に示す構成では、フィルタユニット１よりも下流側のチューブ１２４に流量計１２５が取り付けてられていて、これはチューブ１２４内の血液の流量を計測することができる。また、チューブ１２４の下流側には減圧タンク１２６が接続されていて、真空発生器１２７で減圧タンク内１２６の圧力を制御できる構造となっている。すなわち、減圧タンク１２６内の圧力を下げる場合、圧縮空気の圧力を可変するレギュレータ１２８によって圧縮空気供給管１２９で供給される圧縮空気の流量を増大させ、真空発生器１２７の吸引能力を上昇させる。減圧タンク１２６内の圧力は圧力ゲージ１３０で計測できる。この装置を用いて血液中の循環がん細胞の捕捉を行う際、例えば、循環がん細胞を捕捉することで、フィルタ５７の抵抗により大きくなった場合、フィルタ５７を流れる流量を確保して、その捕獲能力を維持するため、流量計１２５によりチューブ１２４内の血液流量を計測し、この値が一定となるように減圧タンク１２６による圧力調整を行うことで、フィルタ５７における循環がん細胞の捕捉をより高精度に行うことができる。
【００６６】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、種々の変更を行うことができる。例えば、脱気手段は上記構成に限定されず他の構成とすることもできる。また、上記実施形態では、血液流路に脱気手段を設ける構成について説明をしたが、フィルタユニット１に脱気手段を設けない場合は、例えば処理液流路に脱気手段を別途設ける構成としてもよい。
【符号の説明】
【００６７】
１…フィルタユニット、３，４…流路、５…処理液供給容器、１０…血液供給容器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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