(57)【要約】      （修正有）【課題】内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療のための組成物の提供。【解決手段】疎水性表面特性を有する少なくとも１つの系の乳酸菌及び／又はビフィズス菌を含む、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療のための組成物。前記菌株は、ラクトバチルスアシドフィルスＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３）、ビフィドバクテリウムビフィダムＮＣＣ２３５（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３５）等から選択され、これらを生きた形又は不活性化させた形で使用する。前記組成物は、好ましくは、人又はペットの食品用組成物として提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療を目的とする組成物を調製するための、疎水性表面特性を有する少なくとも１つの株の乳酸菌及び／又はビフィズス菌の使用。
【請求項２】
乳酸菌又はビフィズス菌の疎水性率（％Ｈ）が少なくとも８０％、より好ましくは８５〜１００％である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
乳酸菌及びビフィズス菌が内毒素を結合する能力又はグラム陰性菌と共凝集する能力を有する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
乳酸菌株又はビフィズス菌株が、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  リューテリイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ラームノズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｈｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス  デルブルーキイ亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ｓｐｐ．（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記株がラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ２３５（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３５）、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）  ＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ−Ｉ−２１６８）、又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）（ＡＴＣＣ２７５３６）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
個体が利用可能な量が１日あたり約１０３〜１０１４ｃｆｕとなるように乳酸菌を用いる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
内毒素を結合する能力又はグラム陰性菌と共凝集する能力を対象として選択した、疎水性表面特性を有する乳酸菌又はビフィズス菌の単離された株。
【請求項８】
乳酸菌又はビフィズス菌が、腸管の内毒素含量に類似した濃度の溶液から少なくとも３０％の内毒素を結合する請求項７に記載の株。
【請求項９】
ラクトバチルス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  リューテリイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ラームノズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｈｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス  デルブルーキイ亜種  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ｓｐｐ．（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の株。
【請求項１０】
ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ２３５（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３５）、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）  ＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ−Ｉ−２１６８）、又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）（ＡＴＣＣ２７５３６）である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の株。
【請求項１１】
摂取可能な支持体又は薬剤基質と結合した、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の乳酸菌及び／又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を含む、人又はペットの食品組成物。
【請求項１２】
前記株を生きた形又は不活性化させた形で使用する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
乳酸菌株が、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  リューテニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ラームノズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｈｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス  デルブルーキイ亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ｓｐｐ．（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記株がラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＮＣＣ２３５（ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３５）、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）  ＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ−Ｉ−２１６８）、又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）（ＡＴＣＣ２７５３６）である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
個体が利用できる乳酸菌の量が１日あたり１０３〜１０１４ｃｆｕに対応する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患を軽減、予防、又は治療する請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療を目的とする食品組成物の調製における、疎水性の乳酸菌及び／又はビフィズス菌の使用に関する。本発明はまた、その調製した組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症を誘発させる毒素は、病原細菌、ウイルス、植物、毒液に関連していることが分かっている。よく記述されている細菌毒素には、グラム陰性菌の内毒素やリポ多糖（ＬＰＳ）がある。これらの分子は、すべてのグラム陰性菌の外膜に遍在する糖脂質であり、グラム陰性敗血症の原因であると考えられている。この種の敗血症は非常に起こりやすい状態であり、しばしば致命的となる。
【０００３】
敗血症を治療するいくつかの方法が試みられてきた。例を挙げると、これらには、ＬＰＳに対する抗体の使用、腫瘍壊死因子に対する抗体の使用、可溶性ＴＮＦ受容体の使用、可溶性インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体の使用が含まれる。それぞれの方法にはいくらかの有効性があるが、全体的な結果は期待はずれであった。
【０００４】
他の研究者によって、ＬＰＳ／内毒素を結合するタンパク質の設計及び研究が試みられ、これらの実例報告は、Ｒｕｓｔｉｃｉ，Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、２５９：３６１〜３６４、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｋ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、３２：１１７０４〜１１７１０、Ｈｏｅｓｓ，Ａ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９３、１２：３３５１〜３３５６、Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｐ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、５：１０３〜１０７に出ている。実際、ＬＰＳを血液に導入する際に、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）と呼ばれるタンパク質に結合することができる。内毒素に媒介される敗血症の治療には、例えば抗ＬＢＰ抗体を用いてＬＢＰを阻害することが治療的に有用であると提案されている（１９９０年７月３０日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０４２５０）。さらに、いくつかの研究室の研究により、血漿リポタンパク質、特に高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）がＬＰＳを結合して中和させること（Ｓｋａｒｎｅｓ他、１９６８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、９５：２０３１、Ｆｌｅｇｅｌ他、１９９３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６１（１２）：５１４０）、及びこれら粒子が血漿中のＬＰＳ中和活性を構成する可能性があることが明らかになった。
【０００５】
内毒素に媒介される及び／又は関連する疾病のこれまでの処置は遡及的であり（すなわち臨床疾患の発生後）、化学療法による介入に限られていた。このような処置では、予防対策は得られない。
【０００６】
したがって、敗血症及び敗血症性ショックの症状を予防又は軽減するために、グラム陰性内毒素（すなわちＬＰＳ）を中和するのに効果的な薬剤が当分野で必要とされている。
【０００７】
本発明の疎水性の乳酸菌及びビフィズス菌は、内毒素を結合してその影響を寛解／妨げる能力のある、さらなる化合物を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療を目的とする組成物を調製するための、疎水性表面特性を有する少なくとも１つの株の乳酸菌及び／又はビフィズス菌の使用法に関する。
【０００９】
実際、驚くべきことに、乳酸菌とビフィズス菌の一部、特に疎水性表面を有するものが、内毒素を結合する能力を有することが分かった。したがって、これらは、腸由来の内毒素性ショック及び敗血症、細菌移行、壊死性腸炎、炎症性腸疾患、腸管感染症、慢性内毒血症が関連する又は促進する異化性（ｃａｔａｂｏｌｉｃ）及び全身性炎症の予防に効果的な薬剤として使用可能になる。
【００１０】
好ましくは、疎水性の乳酸菌又はビフィズス菌の疎水性率（％Ｈ）は少なくとも８０、より好ましくは８５〜１００％Ｈである。
【００１１】
好ましい実施形態では、株は、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  リューテリイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ラームノズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｈｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス  デルブルーキイ亜種  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ｓｓｐ．（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）からなる群から選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、内毒素を結合する能力又はグラム陰性菌と共凝集する能力によって選択した、疎水性表面特性を有する乳酸菌又はビフィズス菌の単離株に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患を予防又は治療するための、摂取可能な支持体又は薬剤基質と結合した上記特質を有する乳酸菌及び／又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を含む、人又はペットの食品組成物を提供する。
【００１４】
本発明の組成物は、小腸細菌過増殖を低減させ、またペットで見られる頻繁な障害であり、例えば下痢、栄養失調、腸管の炎症、全身性炎症の発症を引き起こす可能性がある、内毒素の腸から内部環境への漏出を減少させる利点を提示する。
【００１５】
最後の態様では、本発明は、摂取可能な支持体又は薬剤基質と結合した疎水性表面特性を有する乳酸菌及び／又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を含む組成物を人又は動物に与えるステップを含む、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患を予防又は治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＦＩＴＣ−ＬＰＳとの結合性を示すＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（以前はＣＩＤＣＡ５３６、ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）のヒストグラムプロットを示す図である。Ａ：ＦＩＴＣ−ＬＰＳなしの対照。Ｂ：５０μｌ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＬＰＳと一緒にインキュベーションしたもの。少なくとも１６０００事象を分析した。
【図２】乳酸菌及びビフィズス菌のＦＩＴＣ−ＬＰＳとの結合性に対するアルブミンの影響を示す図である。Ａ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ２００株（以前はＣＩＤＣＡ５３８、ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３４）。Ｂ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３株（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３）。Ｃ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（以前はＣＩＤＣＡ５３６、ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）。
【図３】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（以前はＣＩＤＣＡ５３６、ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）の増殖及びＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合の時間変化（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す図である。値は、２つの個別実験の平均である。
【図４】リポ多糖中の２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を測定するマイクロアッセイを用いて検出した、ビフィズス菌株によるＬＰＳとの結合性を示す図である。溶液の初期濃度は１００μｇ／ｍｌであった。バーは、溶液を疎水性ビフィズス菌株ＮＣＣ１８９及びＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６８）と一緒にインキュベートした後の最終濃度を、疎水性でないビフィズス菌株（ＮＣＣ２００（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３４））と比較したものを表す。
【図５】疎水性細菌を用いてＨＴ−２９ヒト上皮細胞上でプレインキュベートしたＬＰＳ溶液の炎症誘発活性（ＩＬ−８（ｎｇ／ｍＬ））を示す図である。対照試料ＤＭＥＭ、２％ヒト乳（ＨＭ）、ＬＰＳ（２．５μｇ／ｍｌ）を単独で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（１．５ｅ８  ｃｆｕ／ｍｌ）を単独で用いて背景刺激性活性を試験した。ＬＰＳ＋ヒト乳（ｓＣＤ１４源）試験溶液を、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（１．５ｅ８  ｃｆｕ／ｍｌ）でプレインキュベートした２．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ＋２％ＨＭと比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の説明中で、「ＮＣＣ」とはＮｅｓｔｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、スイス、ローザンヌ、Ｖｅｒｓ−ｃｈｅｚ−ｌｅｓ−Ｂｌａｎｃ）を表す。
【００１８】
本発明の第１の目的については、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患の予防又は治療を目的とする組成物を調製するために疎水性表面特性を有する乳酸菌及び／又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を使用することが関係している。
【００１９】
実際、驚くべきことに、乳酸菌及びビフィズス菌の一部、特に疎水性表面を有するものは、内毒素を結合する能力を有していることが分かった。
【００２０】
実際に、本発明による細菌株は、疎水性の細胞壁に内毒素を結合し、その結果、除去されなければ腸管内腔から血液中に移行して炎症性反応、非常に重症な場合には内毒性ショックを引き起こす、グラム陰性菌のこの炎症誘発性産物を除去する能力を有する。
【００２１】
本発明による乳酸菌又はビフィズス菌は、その疎水性率（％Ｈ）を考慮して、動物による摂取に適した株の中から、Ａ．Ｇ．Ｚａｖａｇｌｉａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、第６１巻７号、１９９８、ｐ．８６５〜８７３に記載のように選択した。
【００２２】
好ましくは、本発明による細菌株は少なくとも８０％Ｈ、より好ましくは８５〜１００％Ｈを有する。
【００２３】
表面疎水性の測定は、既に記載されているようにＭＡＴＨ法を使用して行った（Ｐｅｒｅｚ，Ｐ．Ｆ．他、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４：２１〜２６）。手短に述べると、１２０秒間渦攪拌することによって、２ｍｌの細菌懸濁液（約１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ＰＢＳ）を０．４ｍｌのキシレンを用いて抽出した。デカンテーションによって相を分離させ、水相のＡ６００を測定した。細胞表面疎水性（％Ｈ）を、式Ｈ％＝［（Ａ０−Ａ）／Ａ０］×１００によって計算し、式中Ａ０及びＡはそれぞれキシレンで抽出する前及び後の吸光度である。
【００２４】
好ましい実施形態では、細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｈｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓからなる群から選択される。
【００２５】
最も好ましい実施形態では、株は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９（以前はＣＩＤＣＡ５３６、ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ２３５（以前はＣＩＤＣＡ５３３、ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３５）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６８）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ２７５３６）でよい。
【００２６】
本発明に従って選択した様々な株のうち、ブダペスト条約に基づき、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、フランスに、例えば以下の株、すなわち２００１年２月２日にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３を受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３で、９９年１０月１２日にＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９とＮＣＣ  ２３５をそれぞれ受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−２３３３とＣＮＣＭ  Ｉ−２３３５で寄託した。９９年３月１５日にＢｉｄｉｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＮＣＣ  ２５１を受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６８で寄託した。
【００２７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ（Ｂｂ１２）（ＡＴＣＣ２７５３６）株は、Ｈａｎｓｅｎ（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ、１０−１２  Ｂｏｅｇｅ  Ａｌｌｅ、私書箱４０７、ＤＫ−２９７０、フアスホルム、デンマーク）から提供された。これは、８９％Ｈの疎水性を有する。
【００２８】
本発明による細菌株は、人や動物の健康状態の改善、特に内毒素に関連する人やペットの疾患の予防又は治療を目的とする組成物の調製に使用することができる。この細菌株は、例えば腸由来の内毒素性ショック及び敗血症、細菌移行、壊死性全腸炎、炎症性腸疾患、腸管感染症、慢性内毒血症が関連する又は促進する異化性及び全身性炎症の予防に効果的な薬剤として使用可能になる。の予防に効果的な薬剤として使用することができる。
【００２９】
本発明による細菌株は、生きた形で又は不活性化させた形で使用することができる。
【００３０】
好ましい実施形態では、乳酸菌株はそれが発酵された増殖培地の存在下で使用する。前記培地は、単独で、或いは例えば押出し成形又は噴霧乾燥した、冷蔵又は常温保存可能の食品と一緒に滅菌することができる。
【００３１】
細菌株を、個体が利用できる量が１日あたり約１０３〜１０１４ｃｆｕに相当するよう用いることができる。この量は、個体の体重に依存し、好ましくは人で１０９〜１０１２ｃｆｕ／日、ペットで１０７〜１０１０ｃｆｕ／日である。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、疎水性表面特性を有し、内毒素を結合する又はグラム陰性菌と共凝集する能力を有する乳酸菌又はビフィズス菌の単離株に関する。
【００３３】
本発明による細菌株が内毒素を結合する能力は、ＦＩＴＣ標識内毒素を用いて容易に測定することができ、ラジオ標識内毒素の細菌細胞への結合を測定すると、この場合、ＦＩＴＣと結合した後には分子が潜在的な改変を受ける可能性があるのに比べて、内毒素の分子構造は改変されていない（実施例参照）。
【００３４】
好ましくは、細菌株が、人の腸内に存在する内毒素の量を模倣した溶液から内毒素を取り除く能力を測定する。例えば、グラム陰性菌のリポ多糖の２−ケト−３−デオキシオクタン酸基を検出するマイクロアッセイを用いて、内毒素のレベルを検査した（Ｋａｒｋｈａｎｉｓ  Ｙ  Ｄ他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８、８５：５９５〜６０１）。これら溶液から３０％より多くの内毒素含有量を取り除く細菌を好んで選択した。このアッセイで試験した疎水性でない細菌は、内毒素の最初の含有量を変えることができなかった（実施例参照）。
【００３５】
このような細菌株を上記のように、また特に、例えば腸由来の内毒素性ショック及び敗血症、細菌移行、壊死性腸炎、炎症性腸疾患、腸管感染症、慢性内毒血症が関連する又は促進する異化性及び全身性炎症の予防に効果的な薬剤として使用することができる。
【００３６】
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも１つの乳酸菌及び／又はビフィズス菌の単離株を含む人又はペットの食品組成物に関し、前記株は上記特質を有し、摂取可能な支持体又は薬剤基質と結合している。
【００３７】
この株は、上記のように選択されることができる。
【００３８】
好ましくは、乳酸菌又はビフィズス菌を通常の食事のサプリメントとして、又は栄養的に完全な人又はペット食品の成分として投与することができる。
【００３９】
人又はペット食品組成物は、少なくとも乳酸菌及び／ビフィズス菌の株を、上記のように、個体が利用できる量が１日あたり約１０３〜１０１４ｃｆｕに相当するよう含むことができる。この量は、個体の体重に依存し、好ましくは人で１０９〜１０１２ｃｆｕ／日、ペットで１０７〜１０１０ｃｆｕ／日である。
【００４０】
人の食品は、例えば栄養製剤、特殊調製粉乳、乳を主成分とした製品、乳製品、穀物を主成分とした製品の形にすることができる。このような食品製品又は組成物を調製するためには、例えばその製造中に、上記の細菌株を食品、例えば粉末穀物、粉末乳、ヨーグルトに組み入れることができる。
【００４１】
一実施形態では、タンパク質源と本発明による少なくとも１つの細菌株とを含む栄養製剤を調製することができる。タンパク質源として食事タンパク質を用いることが好ましい。この食事タンパク質は任意の適切な食事タンパク質でよい。例えば、動物性タンパク質（例えば乳タンパク質、食肉タンパク質、卵タンパク質）、植物性タンパク質（例えばダイズ、コムギ、イネ、エンドウマメのタンパク質）、遊離アミノ酸の混合物、又はそれらの組合せである。乳タンパク質、例えばカゼイン、乳清タンパク質、及び大豆タンパク質が特に好ましい。この組成物に、炭水化物源及び脂肪源を含めることもできる。
【００４２】
栄養製剤が脂肪源を含む場合、脂肪源は、好ましくは栄養製剤のエネルギーの約５％〜約５５％、例えばエネルギーの約２０％〜約５０％を供給する。脂肪源を構成する脂質は、任意の適切な脂肪又は脂肪の混合物でよい。植物性の脂肪が特に適しており、例えばダイズ油、ヤシ油、ココナツ油、ベニバナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、キャノーラ油、レシチンなどがある。所望する場合は、動物性の脂肪、例えば乳脂肪を加えてもよい。
【００４３】
栄養製剤が炭水化物源を含む場合、炭水化物源は、好ましくは栄養製剤のエネルギーの約４０％〜８０％を供給する。任意の適切な炭水化物、例えばショ糖、乳糖、ブドウ糖、果糖、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、又はそれらの混合物を使用することができる。
【００４４】
所望する場合は食物繊維を加えてもよい。多数種の食物繊維が利用可能である。適切な食物繊維源には、とりわけ、ダイズ、エンドウマメ、カラスムギ、ペクチン、グアーガム、アラビアゴムが含まれる。使用する場合、食物繊維は、好ましくは栄養製剤のエネルギーの約５％までを構成する。充当する指針を満たすために、通常の方法で適切なビタミンやミネラルを栄養製剤に含めることができる。所望する場合は、１種又は複数種の食品用乳化剤、例えばモノ−ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、レシチン、モノ及びジ−グリセリドを栄養製剤に組み入れることができる。同様に、安定な塩及び安定剤を含めることもできる。
【００４５】
栄養製剤は、好ましくは経腸投与が可能であり、例えば粉末、濃縮液、すぐに飲用可能な飲料の形である。
【００４６】
栄養製剤を任意の適切な方法で調製することができる。栄養製剤は、食事タンパク質源、炭水化物源、脂肪源を適切な比率で混ぜ合わせることによって調製することができる。乳化剤を使用する場合は混合物に含めてもよい。この段階でビタミン及びミネラルを加えてもよいが、熱分解を避けるために通常は後で加える。親油性ビタミン、乳化剤などがあれば、混合前に脂肪源に溶解させることができる。その後、水、好ましくは逆浸透水を混ぜ入れて液体混合物を形成することができる。水の温度は、成分の分散を補助するために約５０℃〜約８０℃が便利である。市販の液化剤を用いて液体混合物を形成してもよい。その後この液体混合物を、例えば２段階でホモジナイズする。
【００４７】
その後、液体混合物を熱処理して細菌負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｏａｄ）を減らすことができる。例えば、液体混合物を約８０℃〜約１５０℃の範囲の温度に、約５秒間〜約５分間、急速に加熱することができる。これは、蒸気噴射、オートクレーブ、熱交換器、例えばプレート熱交換器、によって実施することができる。その後この液体混合物を、例えばフラッシュ冷却によって約６０℃〜約８５℃まで冷却することができる。その後、液体混合物を再度ホモジナイズし、これは例えば１段階目は約７ＭＰａ〜約４０ＭＰａで、２段階目は約２ＭＰａ〜約１４ＭＰａの２段階で行うことができる。その後、熱に弱い成分、例えばビタミンやミネラルがあれば、それを加えるためにホモジナイズした混合液をさらに冷却することができる。ホモジナイズした混合物のｐＨ及び固形分をこの段階で都合良く標準化する。
【００４８】
粉末の栄養製剤の製造が望まれる場合は、ホモジナイズした混合物を適切な乾燥装置、例えば噴霧乾燥機や凍結乾燥機に移して粉末にする。この粉末は、５重量％未満の含水率を有するべきである。
【００４９】
液体製剤の製造が望まれる場合は、ホモジナイズした混合物を好ましくは無菌的に適切な容器に充填する。容器への無菌的充填は、ホモジナイズした混合物を予熱し（例えば約７５〜８５℃に）、その後ホモジナイズした混合物に蒸気を注入して温度を約１４０〜１６０℃、例えば約１５０℃に上げることによって行うことができる。その後、ホモジナイズした混合物を、例えばフラッシュ冷却により約７５〜８５℃の温度まで冷却することができる。その後、ホモジナイズした混合物をホモジナイズし、室温程度にまでさらに冷却し、容器に充填することができる。このような性質の無菌的充填を実施するのに適した装置が市販されている。液体製剤は、約１０〜約１４重量％の固形物含量を有するすぐに摂食できる製剤の形、又は濃縮物の形、通常は約２０〜約２６重量％の固形物含量でよい。便利で味のよい、すぐに飲用できる飲料の形の製剤を提供できるように、液体製剤に香料を添加することができる。
【００５０】
別の実施形態では、本発明による細菌株を用いて通常の食品製品を補強することができる。例えば、発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネット凝固させた乳、菓子バー、朝食用の穀物フレーク又はバー、飲料、粉末乳、ダイズベースの製品、乳を含まない発酵製品、臨床栄養のための栄養サプリメントである。
【００５１】
さらなる実施形態では、栄養的に完全なペット食品組成物を調製することができる。これは、粉末、ドライな形、セミモイスト又はウェット、冷蔵又は常温保存可能のペット食品製品にすることができる。また、ペットの食餌サプリメント又は薬剤組成物にすることもできる。これらペット食品は、従来のように製造することができる。細菌株以外には、これらペット食品はデンプン源、タンパク質源、脂質源から１種又は複数種を含むことができる。
【００５２】
適切なデンプン源は、例えば、穀物やマメ科植物例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ダイズ、及びこれらの混合物である。適切なタンパク質源は、任意の適切な動物性又は植物性タンパク質源、例えば肉及びミール、家禽類ミール、魚ミール、ダイズタンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどから選択することができる。高齢の動物向けには、タンパク質源は上質なタンパク質を含むことが好ましい。適切な脂質源には、肉、動物性脂肪、植物性脂肪が含まれる。さらに、他の様々な成分、例えば砂糖、塩、香辛料、調味料、ビタミン、ミネラル、香料剤、脂肪なども、必要に応じてペット食品に組み込むことができる。
【００５３】
ドライペット食品には、押出し調理が適切なプロセスであるが、焼成や他の適切な方法を使用することもできる。押出し調理を行う場合、ドライペット食品は通常粗挽き穀物（ｋｉｂｂｌｅ）の形で提供される。プレバイオティックを使用する場合、プロセスを行う前にプレバイオティックをドライペット食品の他の成分と一緒に混ぜることができる。適切なプロセスはヨーロッパ特許出願第０８５０５６９号に記載されており、その開示を参照として組み込む。プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物を使用する場合、その生物をドライペット食品にコーティングする又は充填することが最も良い。適切なプロセスはヨーロッパ特許出願第０８６２８６３号に記載されており、その開示を参照として組み込む。
【００５４】
ウェットな食品には、米国特許第４，７８１，９３９号及び５，１３２，１３７に記載のプロセスを使用して擬似肉製品を製造することができる。これら特許の開示を参照として組み込む。チャンク（ｃｈｕｎｋ）タイプの製品を製造する他の方法、例えばスチームオーブンでの調理を用いることもできる。或いは、適切な肉材料を乳状にして肉乳状液を製造し、適切なゲル化剤を加え、肉乳状液を加熱してから缶又は他の容器に充填することによって、ローフ（ｌｏａｆ）タイプの製品を製造することができる。
【００５５】
ペット食品中のプレバイオティックの量は、好ましくは約２０重量％、特に約１０重量％である。例えば、このプレバイオティックはペット食品の約０．１〜約５重量％を占めることができる。プレバイオティックとしてチコリを使用するペット食品では、餌混合物の約０．５重量％〜約１０重量％、より好ましくは約１重量％〜約５重量％を占めるようにチコリを含めることができる。
【００５６】
プロバイオティック微生物を使用する場合、ペット食品は、好ましくはペット食品１グラムあたり約１０４〜約１０１０個のプロバイオティック微生物細胞、より好ましくはペット食品１グラムあたり約１０６〜約１０８個のプロバイオティック微生物細胞を含む。このペット食品に、混合物の約０．５重量％〜約２０重量％、好ましくは約１重量％〜約６重量％、例えば約３重量％〜約６重量％のプロバイオティック微生物を含めることができる。
【００５７】
このペット食品は、他の活性成分、例えば長鎖脂肪酸を含むことができる。適切な長鎖脂肪酸には、αリノール酸、γリノール酸、リノール酸、エイコサペンタン酸、ドコサヘキサン酸が含まれる。適切なエイコサペンタン酸源及びドコサヘキサン酸源は魚油である。適切なγリノール酸源はルリヂサ油、クロスグリ種子油、メマツヨイグサ油である。適切なリノール酸源はベニバナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、ダイズ油である。必要な場合は、ペット食品にミネラルやビタミンを補充して栄養的に完全にすることができる。
【００５８】
さらに、所望する場合は、細菌株を例えば糖基質、脂肪基質、多糖類基質のカプセルに入れることができる。
【００５９】
有益な効果を得るためにペットに消費させるべきペット食品の量は、ペットの大きさ、ペットの種類、ペットの年齢に依存する。しかし、通常は、乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を毎日１０３〜１０１４ｃｆｕの量を与える量のペット食品で十分である。好ましくは、例えば犬で約１０９〜１０１０ｃｆｕ／日、猫で１０７〜１０１０ｃｆｕ／日を投与する。
【００６０】
本発明による組成物は、特にグラム陰性菌、内毒素を生成する細菌、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ、に関連する感染症、及び小腸細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）の予防又は治療を特に目的とする。これらはすべて臨床的に下痢、腸管性又は全身性炎症症状、異化作用及び栄養失調として現れる可能性がある。
【００６１】
最後の態様によれば、本発明は、摂取可能な支持体又は薬剤基質と結合した疎水性表面特性を有する乳酸菌及び／又はビフィズス菌の少なくとも１つの株を含む組成物を人又は動物に与えるステップを含む、内毒素に媒介される及び／又は関連する疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【００６２】
本方法は、特にグラム陰性菌（内毒素を生成する細菌例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）に関連する感染症、及び小腸細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）の予防又は治療を特に目的とする。これらはすべて臨床的に下痢、腸管性又は全身性炎症症状、異化作用及び栄養失調として現れる可能性がある。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は例示の目的で示したものにすぎず、本出願の主題を限定するものと理解するべきでない。別段の指定がない限り、すべての割合は重量パーセントで示す。
【００６４】
［実施例１］
本発明による疎水性乳酸菌株の選択
疎水性細菌の選択は、まず有機（疎水性）相と水相間に分配する細菌細胞の％に基づいて行った。表面疎水性の測定は、既に記載されているようにＭＡＴＨ法を使用して行った（Ｐｅｒｅｚ，Ｐ．Ｆ．他、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４：２１〜２６）。手短に述べると、１２０秒間渦攪拌することによって、２ｍｌの細菌懸濁液（約１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ＰＢＳ）を０．４ｍｌのキシレンを用いて抽出した。デカンテーションによって相を分離させ、水相のＡ６００を測定した。細胞表面疎水性（％Ｈ）を、式Ｈ％＝［（Ａ０−Ａ）／Ａ０］×１００によって計算し、式中Ａ０及びＡはそれぞれキシレンで抽出する前及び後の吸光度である。
【００６５】
次いで、人の腸内に存在する内毒素の量を模倣した溶液から乳酸菌又はビフィズス菌が内毒素を取り除く能力によって選択した。グラム陰性菌のリポ多糖の２−ケト−３−デオキシオクタン酸基を検出するマイクロアッセイを用いて、内毒素のレベルを検査した（Ｋａｒｋｈａｎｉｓ  Ｙ  Ｄ他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８、８５：５９５〜６０１）。
【００６６】
これら溶液から３０％より多くの内毒素含量を取り除く細菌を選択した。このアッセイで試験した疎水性でない細菌は、内毒素の最初の濃度を変えることができなかった。
【００６７】
［実施例２］
内毒素捕捉剤としての乳酸菌のｉｎ−ｖｉｔｒｏ効果
８０％Ｈより高い細菌及びいくつかの疎水性でない「陰性」対照を選択し、大腸菌由来のＬＰＳと様々な表面特性を有する乳酸菌との間の相互作用を調査し、蛍光標識内毒素との相互作用は流動細胞分析法を用いて実施した。
【００６８】
材料及び方法
細菌株及び増殖条件
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３株（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３）はＮｅｓｔｅｃコレクション（スイス、ローザンヌ）からのものであった。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（以前はＣＩＤＣＡ５３６、Ｉ−２３３３）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＮＣＣ２００株（以前はＣＩＤＣＡ５３８、（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３４））はＣｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  ｙ  Ｄｅｓａｒｒｏｌｌｏ  ｅｎ  Ｃｒｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ｄｅ  Ａｌｉｍｅｎｔｏｓ（アルゼンチン、ラプラタ）のコレクションからのものであった。１０％（体積／体積）のグリセロールで保存した凍結懸濁液（−８０℃）を、実験の前に一度ＭＲＳブロスで再活性化させた。すべての培養は、３７℃の嫌気的条件で行った（ＢＢＬ  ＧａｓＰａｋ  Ｐｌｕｓ）。
【００６９】
ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合
リポ多糖及びＦＩＴＣ標識リポ多糖は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ血清型０１１１：Ｂ４（Ｓｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｒ他、１９７９、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２３：２８７〜２９３）由来であり、Ｓｉｇｍａから購入した。１０００μｌ／ｍｌを含む原液を蒸留水中で調製し、適切に希釈した。
【００７０】
細菌培養物をＰＢＳで３回洗浄し、懸濁液を１０７ＣＦＵ／ｍｌに標準化した。４００μｌを様々な量のＦＩＴＣ−ＬＰＳ又はＬＰＳと混合し、反応混合物中の濃度範囲０〜５０μｇ／ｍｌを得た。４℃又は３７℃で３０分間のインキュベートを実施し、その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４℃で３０分の間に１％（体積／体積）パラホルムアルデヒドで固定した。青緑励起光（ＦＡＣＳｃａｎ（商標））を用いて流動細胞分析を行った。
【００７１】
表面疎水性
表面疎水性の測定は、既に記載されているようにＭＡＴＨ法を使用して行った（Ｐｅｒｅｚ，Ｐ．Ｆ．他、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４：２１〜２６）。手短に述べると、１２０秒間渦攪拌することによって、２ｍｌの細菌懸濁液（約１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ＰＢＳ）を０．４ｍｌのキシレンを用いて抽出した。デカンテーションによって相を分離させ、水相のＡ６００を測定した。細胞表面疎水性（％Ｈ）を、式Ｈ％＝［（Ａ０−Ａ）／Ａ０］×１００によって計算し、式中Ａ０及びＡはそれぞれキシレンで抽出する前及び後の吸光度である。
【００７２】
結果
調査中の株の表面疎水性を表１に示す。値は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３株（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）でそれぞれ９３及び９６％であったが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＮＣＣ２００株（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３４）は疎水性ではなく、約３％の値を示した。
【００７３】
【表１】
2014062104.tif 000002
【００７４】
ＮＣＣ１８９株を５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＬＰＳと一緒にインキュベートすることにより、細菌集団は明らかに蛍光領域に移行する。グラフの右側に位置する事象（マーカーＭ１）は、ゲートした集団の９０％を表す（図１Ｂ）。ＦＩＴＣ−ＬＰＳなしでインキュベートした懸濁液では、２％の事象のみが異なった結合能力の所に位置する。
【００７５】
表２（下記）は、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ結合性が用量依存性であることを示す。ＮＣＣ２００株では５及び１５％のＦＩＴＣ（＋）細胞が見受けられた。一方、ＮＣＣ１８９株では約９５％のＦＩＴＣ（＋）細胞を示す。約１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＬＰＳで飽和が起こる。脂質結合剤であるアルブミンを添加すると、調査中のすべての株でＦＩＴＣ（＋）比が明らかに減少する（図２）。しかし、ＣＩＤＣＡ５３６株では、０．４％のアルブミン及び５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＬＰＳの存在下で約３０％のＦＩＴＣ（＋）細胞を示す（図２Ｃ）。この株ではさらに、１０％のＦＩＴＣ（＋）細胞が３％ものアルブミン濃度を有することが分かった。二価の陽イオン（０．９ｍＭのＣａ２＋及び０．５ｍＭのＭｇ２＋）は、結合性を改変させなかった（データ示さず）。
【００７６】
【表２】
2014062104.tif 000003
【００７７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９株（以前はＣＩＤＣＡ５３６、ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）に対するＦＩＴＣ−ＬＰＳの結合性は、増殖期に強く依存していた（図３）。定常期に収集した細菌が示すＦＩＴＣ（＋）細胞の割合は高い。これらの値は誘導期に劇的に低下し、増殖中に次第に回復する。４℃及び３７℃での結合性に差は見られなかった。
【００７８】
要約すると、疎水性が高い株は、ＮＣＣ１８９株では約９５％に達するＦＩＴＣ（＋）細胞を示す。疎水性でない株ＮＣＣ２００は、５％より高い値に達することはない。これらの結果は、ＬＰＳの結合性は表面疎水性と関連していることを示す。
【００７９】
結果から、疎水性細菌がＦＩＴＣ標識内毒素を結合して蛍光を発することが明確に示された。１０μｇ／ｍｌの内毒素濃度では、流動細胞法で検出すると９０％より多くの疎水性細胞培養が蛍光を発した。対照的に、同様の内毒素濃度で、疎水性でない細菌は１０％未満しか陽性にならなかった。
【００８０】
３０〜９０μｇ／ｍｌの濃度範囲で内毒素を含む培地に疎水性培養物を導入した場合、１ｍｌあたり１０７〜１０８個の細菌濃度である細菌培養物は、存在する内毒素の少なくとも２０％を取り除いた。このデータは、ラジオ標識内毒素を用いて確認した。
【００８１】
［実施例３］
ヒト免疫担当細胞における実験
疎水性系の培養システム中に存在する内毒素で誘発させたヒト免疫担当細胞の炎症誘発活性の抑止を、疎水性でない細菌と比較して調査した。
【００８２】
疎水性のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）と、疎水性でないＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＮＣＣ２００（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３４）を、ＫＤＯ方法（実施例１参照）で測定した、既定量の内毒素を含む溶液中でインキュベートした（図４）。
【００８３】
細菌懸濁液と一緒にインキュベートした後に存在する内毒素は、疎水性株によって明確に減少したが、疎水性でない株では変化は観察されなかった。
【００８４】
［実施例４］
疎水性細菌の機能調査
材料及び方法
洗浄した細菌をＤＭＥＭ−高グルコース（ＡＭＩＭＥＤ）に再懸濁し、最終濃度２．５μｌ／ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）と一緒にプレインキュベートした。遠心分離後、２００μｌの上清又は再懸濁細菌ペレットを用いてＨＴ−２９上皮細胞を刺激した。
【００８５】
３７℃で２０時間培養した後、ＥＬＩＳＡ法を用いてＨＴ−２９細胞培養上清中のＩＬ−８の存在を観察した。
【００８６】
結果
結果を図５に示す。ＬＰＳ溶液を疎水性細菌と一緒にプレインキュベートした場合、ＬＰＳの炎症誘発活性は有意に低下する。遠心分離の後、（ＬＰＳ刺激はｓＣＤ１４の存在に依存するので、ヒト乳の存在下で）ヒト上皮細胞培養物に加える上清は、疎水性細菌と一緒にプレインキュベートしていない上清に比べて有意に減少する。
【００８７】
［実施例５］
特殊調製粉乳
特殊調製粉乳を得るために、本発明者らは、１００ｍｌの調製物に以下の混合物を含む混合物を調製する。すなわち、０．５〜５％、好ましくは２％のペプチド、０．２〜１０％、好ましくは４％の脂肪、１〜２５％、好ましくは８％のレバンでない炭水化物（６５％乳糖、２０％マルトデキストリン、１５％デンプンを含む）、以下の株、すなわちＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ１８９（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３５、Ｂｉｄｉｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６８を少なくとも１０６ｃｆｕ／ｍｌ、ならびに毎日の必要量を満たすために微量のビタミンやオリゴ要素、及び０．０１〜２％、好ましくは０．３％のミネラル、並びに５０〜９０％、好ましくは７５％の水。
【００８８】
［実施例６］
本発明による疎水性乳酸菌の乳製品における使用法
発酵させたヨーグルト様乳製品を製造するために、本発明によるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６２３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＣ２３５（ＣＮＣＭ  Ｉ−２３３５）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＮＣＣ２５１（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６８）の１つ又は複数の株を使用することができる。
【００８９】
製造するために、２．８％の脂肪を含み２％のスキムミルク脱脂粉乳及び６％のショ糖を補充した乳製品１ｌを調製し、９６℃で３０分間低温殺菌してその後４２℃まで温度を下げる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの非濃厚化株（ｎｏｎ−ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの非粘性株（ｎｏｎ−ｖｉｓｃｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎ）を、１０％の還元粉乳及び０．１％の市販の酵母抽出物を含む無菌ＭＳＫ培養培地中で再活性化させる。
【００９０】
１つ又は複数の株の前培養も、１０％の還元粉乳及び０．１％の市販の酵母抽出物を含む培地中で、１％のショ糖を用いて再活性化させた。その後、低温殺菌した乳製品に、再活性化させた前培養物各１％を接種し、この乳製品を、ｐＨ４．５の値に達するまで３２℃で発酵させた。このようにして発酵させた乳のヨーグルト様製品を製造し、４℃で保管した。
【００９１】
［実施例７］
ドライドッグフード
餌混合物は、約５８重量％のトウモロコシ、約５．５重量％のトウモロコシグルテン、約２２％のチキンミール、約２．５％の乾燥チコリ、犬に対する相当量が約１０９〜１０１０ｃｆｕ／日となるようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ２４６３（ＣＮＣＭ−Ｉ  ２６２３））株の発酵乳から構成され、残りは塩、ビタミン、ミネラルから構成される。
【００９２】
餌混合物をプリコンディショナーに供給し、湿らせた。その後、湿らせた餌を押出し調理器に供給し、ゼラチン状にした。押出し成形機を出ていくゼラチン状にした基質を金型に通して押し出す。押出物を犬に与えるのに適切な小片に切り、約１１０℃で約２０分間乾燥させ、冷却してペレットを形成する。
【００９３】
このドライドッグフードはペットの健康状態を改善することができ、特に、内毒素に関連するペットの疾患を予防する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
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