(57)【要約】【課題】  低酸素領域への特異的集積性に優れ、生体内等における低酸素領域の効率的な検出、ひいては固形腫瘍の効率的な検出を可能とする化合物を提供すること。【解決手段】  放射性ヨウ素により標識された標識化合物であって、  前記標識化合物は、ＨＩＦ−１αの５５６〜５７４位のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、  前記ポリペプチドのＮ末端にポリリジンが結合しており、かつ、  前記ポリペプチドのＣ末端に、放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドが結合している、標識化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性ヨウ素により標識された標識化合物であって、
前記標識化合物は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドのＮ末端にポリリジンが結合しており、かつ、
前記ポリペプチドのＣ末端に、放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドが結合している、標識化合物。
【請求項２】
前記ポリリジンのリジンが全てＤ体である、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の標識化合物を含む、被検体における低酸素領域を検出するための組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の標識化合物を含む、被検体における固形腫瘍を検出するための組成物。
【請求項５】
固形腫瘍の診断に供されるデータを得るための方法であって、
被検体に投与された請求項１又は２に記載の標識化合物から放出されるガンマ線を検出し、前記被検体における前記標識化合物の濃度分布を画像化する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性ヨウ素により標識された標識化合物に関する。また、本発明は、前記標識化合物を含む、被検体における低酸素領域又は固形腫瘍を検出するための組成物に関する。さらに、本発明は、前記標識化合物を用いる、固形腫瘍の診断に供されるデータを得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は死亡原因の上位を占めており、患者数も欧米を中心に年々増加傾向にある。このようなことを背景として、癌の早期診断や治療方針の決定に役立てるため、種々の画像診断法が考案され、臨床において応用されている。中でもＰＥＴやＳＰＥＣＴ等をはじめとする核医学画像診断は、生体の機能を画像化できるといった他のモダリティには無い優れた特徴を有しているため、癌の診断に広く用いられている。
【０００３】
核医学画像は、放射性同位元素で標識された薬剤（以下、放射性医薬品とも称する）を被検者に投与してその分布を専用のカメラでとらえ、画像を再構成する事により得られる。核医学画像診断では、用いる放射性医薬品の化学的性質や生体との相互作用の違いに応じ、種々の生体機能を反映した画像を得ることができる。これまでに癌を標的とした種々の放射性医薬品が開発され、腫瘍診断剤として臨床応用されている。
【０００４】
ところで、固形腫瘍では、活発な細胞増殖に血管形成が追いつかず、血管からの酸素供給が不足する低酸素領域が内部に形成される場合がある。また、このような低酸素状態にある腫瘍細胞は、放射線治療や抗癌剤に対する耐性が比較的高いことが知られている。従って、低酸素状態にある癌の治療においては、照射する放射線量や抗癌剤の投与量を増やしたり、他の治療方法を選択することが必要となる。この様な観点から、固形腫瘍中の低酸素領域を特異的に検出し得る診断剤並びに診断方法の開発が求められているものの、実用化されていないのが現状である。
【０００５】
また、このような低酸素状態にある腫瘍細胞に特異的にみられる物質の一つとして、ＨＩＦ−１αが知られている（非特許文献１〜３）。ＨＩＦ−１αは、数百のアミノ酸残基によって構成される生体タンパク質である。ＨＩＦ−１αは、いわゆる通常の細胞状態の様な低酸素状態でない環境においては代謝されて体外に放出されるが、低酸素状態においては安定的に存在し、ＨＩＦ−１βと会合して二量体を形成することによって、酸素を必要としないエネルギー経路発現のための転写因子として働くことが知られている。
【０００６】
かかるＨＩＦ−１αの性質に着目して、本発明者らは、先に、ＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメイン（ＯＤＤ、ＨＩＦ−１αの５４８〜６０３位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を利用し、腫瘍中の低酸素領域を検出することを試みている（非特許文献４）。具体的には、リジン及び疎水性アミノ酸に富む細胞膜透過型ポリペプチド並びにストレプトアビジンを結合させた前記ＯＤＤと、放射性ヨウ素にて標識したビオチンとの複合体（１２３/１２５Ｉ−ＩＰＯＳ）を、生体内に投与し、１２３/１２５Ｉ−ＩＰＯＳが、腫瘍中の低酸素領域に集積する傾向にあることを見出している。
【０００７】
しかしながら、画像コントラストの指標となる１２３／１２５Ｉ−ＩＰＯＳの腫瘍血液比（腫瘍における放射能集積量／血中放射能量）が、１２３／１２５Ｉ−ＩＰＯＳ投与後２４時間を経過しないと１を超えないため、腫瘍を検出するためには１日以上待つ必要がある。また、いくつかの低酸素領域においては１２３／１２５Ｉ−ＩＰＯＳの集積が認められなかった。さらに１２３／１２５Ｉ−ＩＰＯＳは分子量３４ｋＤａのタンパク質であることから、化学的な合成が困難であり、また分子量が大きいことにより免疫原性を有する可能性もある。このように、１２３／１２５Ｉ−ＩＰＯＳは、腫瘍中の低酸素領域への集積性等の点において十分なものではなく、前述の通り、腫瘍中の低酸素領域を特異的に検出し得る診断剤等は未だ実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＫｅｉｔｈＢ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ．Ｓ．，Ｓｉｍｏｎ  Ｍ．Ｃ．、「ＨＩＦ１α  ａｎｄ  ＨＩＦ２α：ｓｉｂｌｉｎｇ  ｒｉｖａｌｒｙ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１１年１２月１５日、１２巻、１号、９〜２２ページ
【非特許文献２】Ｓｅｍｅｎｚａ  Ｇ．Ｌ．、「Ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ，ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１１年８月１１日、３６５巻、６号、５３７〜５４７ページ
【非特許文献３】Ｋｉｚａｋａ−Ｋｏｎｄｏｈ  Ｓ．，Ｋｕｃｈｉｍａｒｕ  Ｔ．，Ｋａｄｏｎｏｓｏｎｏ  Ｔ．、「Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｍａｌａｄｙ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１（ＨＩＦ−１）−ａｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１１年、１１５巻、４号、４４０〜４４５ページ
【非特許文献４】Ｋｕｄｏ  Ｔ．，Ｕｅｄａ  Ｍ．，Ｋｕｇｅ  Ｙ．，Ｍｕｋａｉ  Ｔ．，Ｔａｎａｋａ  Ｓ．，Ｍａｓｕｔａｎｉ  Ｍ．，Ｋｉｙｏｎｏ  Ｙ．，Ｋｉｚａｋａ−Ｋｏｎｄｏｈ  Ｓ．，Ｈｉｒａｏｋａ  Ｍ．，Ｓａｊｉ  Ｈ．、「Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＨＩＦ−１−ａｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ＨＩＦ−１−ａｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．、２００９年６月、５０巻、６号、９４２〜９４９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、低酸素領域への特異的集積性に優れ、生体内等における低酸素領域の効率的な検出、ひいては固形腫瘍の効率的な検出を可能とする化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、非特許文献４に記載のＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメイン（ＨＩＦ−１αの５４８〜６０３位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）よりも更に短いポリペプチド（ＨＩＦ−１αの５５６〜５７４位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を抽出し、当該ポリペプチドのＮ末側にポリリジンのみからなる細胞膜透過型ポリペプチドを結合させ、さらに当該ペプチドのＣ末側に放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドを結合させた標識化合物を調製した。
【００１１】
そして、前記標識化合物の生体内における分布を解析した結果、前記標識化合物は固形腫瘍特異的に集積することが明らかになった。特に、ポリリジンのリジンが全てＤ体である前記標識化合物においては、投与してから２時間で、腫瘍血液比（腫瘍における放射能集積量／血中放射能量）が１を超え、極めて短時間で固形腫瘍を画像化できることが明らかになった。
【００１２】
さらに、前記標識化合物は、通常酸素条件下におけるＨＩＦ−１αの分解様式を反映する化合物であることも明らかになり、また、内在性ＨＩＦ−１αが存在する腫瘍細胞内に前記標識化合物は移行することが可能であり、さらに、この移行性（細胞内への取り込み）は低酸素状態の方が、通常酸素状態と比して高いことも明らかになった。また、内在性ＨＩＦ−１αの局在や低酸素領域マーカーであるピモニダゾールの集積部位と、前記標識化合物の局在とは一致していることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞  放射性ヨウ素により標識された標識化合物であって、
前記標識化合物は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドのＮ末端にポリリジンが結合しており、かつ、
前記ポリペプチドのＣ末端に、放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドが結合している、標識化合物。
＜２＞  前記ポリリジンのリジンが全てＤ体である、＜１＞に記載の標識化合物。
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の標識化合物を含む、被検体における低酸素領域を検出するための組成物。
＜４＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の標識化合物を含む、被検体における固形腫瘍を検出するための組成物。
＜５＞  固形腫瘍の診断に供されるデータを得るための方法であって、
被検体に投与された＜１＞又は＜２＞に記載の標識化合物から放出されるガンマ線を検出し、前記被検体における前記標識化合物の濃度分布を画像化する工程を含む方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体内等における低酸素領域及び固形腫瘍を効率良く検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の標識化合物（［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０）をＨＰＬＣにて分析した結果を示す、クロマトグラムである。
【図２】本発明の標識化合物（［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０）、前記化合物のＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメインに変異が導入された標識化合物（［１２５Ｉ］ｍＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰ３０）及びポリリジンを有さないＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメイン（［１２５Ｉ］ＯＰ３０）と、ＨｅＬａ細胞溶解液とを、通常酸素条件下にてインキュベーションした後の、各標識化合物の分解をＨＰＬＣにて分析した結果を示すグラフである。図中、実線は、ＨｅＬａ細胞溶解液とのインキュベーション前の放射能（％）を示し、点線は、ＨｅＬａ細胞溶解液とのインキュベーション後の放射能（％）を示す。
【図３】［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＯＰ３０の、低酸素条件下における腫瘍細胞への取り込み率を分析した結果を示すグラフである。
【図４】［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０の、低酸素条件下又は通常酸素条件下における腫瘍細胞への取り込み率の経時変化を示すグラフである。
【図５】［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の、低酸素条件下又は通常酸素条件下における腫瘍細胞への取り込み率の経時変化を示すグラフである。
【図６】［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０投与２時間後の担がんマウスを、ガンマカメラにて撮影した結果を示すプラナー画像（図中左側）及び光学カメラにて撮影した結果を示す該マウスの体表の写真（図中右側）である。図中白円内は固形腫瘍を示す。
【図７】［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰに関し、腫瘍集積性とＨＩＦ−１転写活性との相関の有無について、分析した結果を示すグラフである。図中Ａのパネルは［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の結果を示し、図中Ｂのパネルは［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰ３０の結果を示す。
【図８】固形腫瘍内における、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０、ＨＩＦ−１α及び低酸素マーカーであるピモニダゾールの局在を示す画像である。図中、「ＡＲＧ」のパネルは［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の集積部位を検出した結果を示すオートラジオグラムであり、「ＨＩＦ−１α」のパネルはＨＩＦ−１αの局在を免疫組織染色にて検出した結果を示す写真であり、「ＰＩＭＯ」のパネルは、ピモニダゾールの集積部位を免疫組織染色にて検出した結果を示す写真である。また、図中の矢頭は、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の集積部位、ＨＩＦ−１αの局在及びピモニダゾールの集積部位が一致している部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜標識化合物＞
本発明の標識化合物は、放射性ヨウ素により標識された標識化合物であって、
前記標識化合物は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドのＮ末端にポリリジンが結合しており、かつ、
前記ポリペプチドのＣ末端に、放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドが結合している、標識化合物である。
【００１７】
本発明の標識化合物に含まれる「ポリペプチド」は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列、すなわち、ＨＩＦ−１αの５５６〜５７４位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明において「ＨＩＦ−１α」は、低酸素誘導因子１−α、ＭＯＰ１（ＰＡＳスーパーファミリーのメンバー１）とも称されるタンパク質であり、ヒトにおいて典型的には、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１５２１．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ＨＩＦ−１αは、低酸素でない通常の環境下において生じる酵素により分解・代謝されて体外に放出されるが、低酸素条件下においては安定的に細胞内に存在する性質を有していることが明らかになっており、本発明の標識化合物に含まれる「ポリペプチド」は、この分解・代謝に必須のリジン及び前記酵素に認識されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１８】
本発明の標識化合物において、前記ポリペプチドのＮ末端に結合している「ポリリジン」は、複数のリジンのみからなるポリペプチドを意味する。「ポリリジン」の一部又は全部は、Ｌ体のリジンであってもよく、Ｄ体のリジンであってもよいが、本発明の標識化合物の安定性の向上の観点から、ポリリジンのリジンは全てＤ体であることが好ましい。また、ポリリジンの長さとしては特に制限はないが、７〜１５アミノ酸であることが好ましく、９アミノ酸であることがより好ましい。ポリリジンの長さが前記下限未満では、本発明の標識化合物の細胞膜透過性を十分に担保できなくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、本発明の標識化合物全体の電荷が高くなり、生体内の挙動に影響が生じ易くなる傾向にある。
【００１９】
前記ポリペプチドのＮ末端と前記ポリリジンとの結合は、直接的なものであっても間接的なものであってもよいが、本発明の標識化合物の分子量を低く抑え、細胞膜透過性を向上させるという観点から、直接的な結合であることが好ましい。なお、間接的な結合としては、例えば、前記ポリペプチドのＮ末端と前記ポリリジンとの間に、リンカーポリペプチドが挿入されている様式が挙げられる。かかるリンカーポリペプチドの長さとしては、通常、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１２アミノ酸である。
【００２０】
本発明の標識化合物において、前記ポリペプチドのＣ末端に結合している「放射性ヨウ素により標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミド」は、Ｎ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミド中のヨウ素が、放射性ヨウ素に置換されている化合物を意味する。
【００２１】
本発明にかかる「放射性ヨウ素」は、ガンマ線を放出する核種であればよく、例えば、
１２３Ｉ（ヨウ素１２３）、１２５Ｉ（ヨウ素１２５）、１３１Ｉ（ヨウ素１３１）が挙げられるが、半減期等の観点から、イメージング剤としての扱いやすさを考慮すると、１２３Ｉが好ましい。
【００２２】
また、前記ポリペプチドのＣ末端と前記Ｎ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドとの結合としては特に制限はないが、マレイミド基の二重結合は、システイン中のチオール基との反応性に富むので、前記ポリペプチドのＣ末端と前記Ｎ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミドとの結合は、Ｃ末端がシステインであるリンカーポリペプチドを介した結合であることが好ましい。かかるリンカーポリペプチドとしては、通常、１〜２０アミノ酸からなるポリペプチドであり、好ましくは２〜１２アミノ酸からなるポリペプチドであり、より好ましくは、グリシン及びシステインの２アミノ酸からなるポリペプチドである。
【００２３】
＜標識化合物の製造方法＞
前記にて説明した本発明の標識化合物は、例えば、以下に示すステップ−１〜ステップ−３を用いる方法により合成することができる。
【００２４】
［ステップ−１］  標識前駆体の合成
標識前駆体であるポリペプチドは、公知の方法、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトオキシカルボニル）固相合成法を用い、市販のペプチド合成機にて合成することができる。このＦｍｏｃ固相合成法は、以下の手順にて実施される。先ず、保護基としてＦｍｏｃ基が結合された各アミノ酸（以下、Ｆｍｏｃアミノ酸という）を用意する。そして、合成対象ポリペプチドを構成するアミノ酸に対応したＦｍｏｃアミノ酸をＣ末端側から順次樹脂に結合させていき、Ｆｍｏｃ基の脱保護、アミノ酸の縮合、洗浄を順次繰り返してポリペプチド鎖を延長する。最後にポリペプチド鎖を樹脂から切り離した上で各官能基を脱保護し、精製することにより、目的とするポリペプチドを合成することができる。
【００２５】
目的とするポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等のペプチドの精製に一般に用いられている方法を用いることができ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せてもよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮、また必要に応じてさらに凍結乾燥して単離することもできる。
【００２６】
［ステップ−２］  放射性核種標識リンカー化合物の作製
ポリペプチドへ放射性核種を標識させるリンカー化合物として、放射性ヨウ素によって標識されたＮ−（ｍ−ヨードフェニル）マレイミド（以下、ＩＰＭという）が、好ましく用いられる。ＩＰＭは、標識前駆体化合物を定法に従って放射性ヨウ素で標識することによって得ることができる。
【００２７】
先ず、標識前駆体化合物としては、放射性ヨウ素の標識部位を放射性ヨウ素の前駆体化合物における官能基として通常用いられる官能基（例えば、トリアルキルスズ置換基、非放射性ヨウ素等）に置き換えた化合物を用いることができる。十分な比放射能の放射性ヨウ素体を得るといった目的からは、トリアルキルスズ置換基にて置換された化合物を用いることが好ましく、Ｎ−（ｍ−トリ−（ｎ−ブチル）スタンニルフェニル）マレイミドを用いることが、特に好ましい。Ｎ−（ｍ−トリ−（ｎ−ブチル）スタンニルフェニル）マレイミドは、公知の方法、例えば、文献（米国特許第４９９４５５７号明細書、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、１９巻、３号、２８９〜２９５ページ）に記載の方法に従って合成することができる。
【００２８】
放射性ヨウ素による標識は、公知の方法にて行うことができ、例えば、酸化剤の存在下で標識前駆体化合物であるＮ−（ｍ−トリ−（ｎ−ブチル）スタンニルフェニル）マレイミドに放射性ヨウ素で標識されたヨウ化ナトリウムやヨウ化アンモニウム等を加え、反応させることにより、得ることができる。
【００２９】
［ステップ−３］  ポリペプチドの放射性ヨウ素標識化合物の合成
各ポリペプチドの放射性ヨウ素標識化合物は、溶媒に溶解した各ポリペプチドに、上記にて合成した放射性ヨウ素標識ＩＰＭ溶液を添加し、室温下で撹拌するといった方法により合成することができる。各ポリペプチドと放射性ヨウ素標識ＩＰＭとの量は、後で精製によって未反応体の除去を行えば良いので特に限定する必要はないが、放射性ヨウ素標識ＩＰＭとペプチドとが、モル比にして等量程度であればより好ましい。
【００３０】
以上、本発明の標識化合物の製造方法の好適な実施形態について説明したが、本発明の標識化合物の製造方法は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、標識前駆体であるポリペプチドの調製は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトオキシカルボニル）固相合成法等の化学合成の代わりに、当該ポリペプチドをコードする塩基配列に基づき、無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用い、遺伝学的手法により合成することもできる。また、本発明の標識化合物の具体的な製造方法は後述の実施例に示されているので、当業者であれば、上記の一般的な説明及び実施例の具体的な説明を参照しつつ、反応原料、反応試薬、反応条件（例えば、溶媒、反応温度、反応時間）、精製条件等を適宜選択しつつ、必要に応じてこれらの方法に適宜、修飾ないし改変を加えることにより、本発明の標識化合物を製造することは可能である。
【００３１】
＜低酸素領域又は固形腫瘍を検出するための組成物＞
後述の実施例において示す通り、前述の本発明の標識化合物は、低酸素領域、特に固形腫瘍中の低酸素領域への特異的集積性において優れている。従って、本発明は、
本発明の標識化合物を含む、被検体における低酸素領域を検出するための組成物、及び、本発明の標識化合物を含む、被検体における固形腫瘍を検出するための組成物
を提供するものである。
【００３２】
本発明において「低酸素領域」とは、ＨＩＦ−αが存在する領域及び低酸素マーカーであるピモニダゾールにて染色される領域を意味し、具体的には酸素分圧が４０ｍｍＨｇ以下である領域が挙げられる。また、生体内において、かかる低酸素領域が認められる部位としては、固形腫瘍内の他、例えば、虚血疾患（脳虚血、網膜虚血疾患、虚血性心疾患等）の病変部位が挙げられる。
【００３３】
本発明において「固形腫瘍」とは、血液癌（白血病、骨髄腫等）とは異なり、腫瘍細胞が充実性に増殖し、塊状を形成する腫瘍のことを意味し、例えば、食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、肉腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、皮膚癌、黒色腫が挙げられる。
【００３４】
本発明において、低酸素領域又は固形腫瘍の「検出」は、被検体に投与され、低酸素領域又は固形腫瘍に集積された本発明の標識化合物から放出されるガンマ線の検出を介して行うことができる。かかるガンマ線の検出は、ガンマ線カウンター、ガンマカメラ（シンチカメラ）、イメージングプレート（イメージングフィルム）等を用いた公知の手法により検出することができる。特に、ガンマカメラやイメージングプレートを用いることにより、被検体における本発明の標識化合物の濃度分布を画像化することができ、得られた画像（シンチグラムやオートラジオグラム）を通して、低酸素領域又は固形腫瘍を検出することもできる。
【００３５】
本発明の組成物は、例えば、診断のための医薬組成物又は試薬として用いることができる。本発明の組成物は、例えば、固形腫瘍や虚血疾患の診断に際して用いられる医薬組成物である。また、本発明の組成物は、例えば、研究目的で、生体内における低酸素領域又は固形腫瘍等を分析するための試薬である。
【００３６】
本発明の組成物は、例えば、本発明の標識化合物を、水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解した液として、調製することができる。本発明の標識化合物の水溶性が低い場合には、必要に応じて可溶化剤を添加するか、本発明の標識化合物を溶解させることができる液に溶解した後、生体認容性のある液と混合する。より具体的には、本発明の標識化合物をＤＭＳＯに溶解し、１０％ＤＭＳＯになるよう、水又は生理食塩水を加えていき、水溶液を作製するといった方法を用いることにより、また必要に応じて、安定化剤を配合することにより、本発明の組成物を調製することもできる。
【００３７】
本発明の組成物は、ヒトを含む動物を「被検体」として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルが挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明の組成物を試薬として利用する際には、これら動物の臓器、組織、細胞も被検体とすることができる。
【００３８】
本発明の標識化合物を含有する製品（例えば、医薬品、試薬）又はその説明書は、低酸素領域又は固形腫瘍等を検出するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。低酸素領域又は固形腫瘍等を検出するために用いられる旨の表示においては、本発明の標識化合物を投与することにより低酸素領域又は固形腫瘍等が検出される機序についての情報を含むことができる。
【００３９】
＜固形腫瘍の診断に供されるデータを得るための方法＞
後述の実施例において示す通り、前述の本発明の標識化合物は、固形腫瘍中の低酸素領域への特異的集積性において優れている。従って、本発明は、
固形腫瘍の診断に供されるデータを得るための方法であって、
被検体に投与された本発明の標識化合物から放出されるガンマ線を検出し、前記被検体における前記標識化合物の濃度分布を画像化する工程を含む方法
を提供するものである。
【００４０】
「固形腫瘍」及び「被検体」については前述の通りである。また、本発明の標識化合物の「投与」の形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与、輸液による投与、経口投与が挙げられる。また、これら投与は、公知の製剤学的方法により製剤化することにより、当業者であれば適宜達成し得る。
【００４１】
本発明の標識化合物の投与量は、被検体の年齢、体重、症状、健康状態、投与の形態（組成物の種類）、本発明の標識化合物から放出されるガンマ線の検出方法等に応じて、適宜選択されるが、体重６０ｋｇの成人を被検体とし、静脈投与を行い、後述のＳＰＥCＴにより、固形腫瘍の診断に供されるデータを得る際には、本発明の標識化合物の投与量は、通常、５０〜６００ＭＢｑである。
【００４２】
被検体に投与された本発明の標識化合物から放出されるガンマ線の検出においては、前述の通り、イメージングプレート（イメージングフィルム）、ガンマカメラ（シンチカメラ）等を用いた公知の手法により検出することができる。
【００４３】
そして、本発明の標識化合物を投与された被検体にイメージングプレートをあてることにより、該プレート面に、前記標識化合物の濃度分布を示す画像（オートラジオグラム）を投影することができる。
【００４４】
また、本発明の標識化合物を投与された被検体をガンマカメラにて撮影することにより、前記標識化合物の濃度分布を示す画像（シンチグラム）を得ることができる。さらに、ガンマカメラにて被検体を複数の角度から多数撮影し、得られた多数のシンチグラムを公知の手法（例えば、コンピュータによるトモグラフィー再構成アルゴリズムを利用する方法）により再構成することにより、すなわち、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）により、前記標識化合物の濃度分布を示す断層像を得ることもできる。
【００４５】
また、ガンマ線の検出は、用いられる検出方法にもよるが、通常、本発明の標識化合物投与後０．５〜６時間に行われ、１〜３時間に行うことが好ましい。
【００４６】
そして、このようにして画像化される、被検体における本発明の標識化合物の濃度分布により、固形腫瘍内の低酸素領域を特定することができる。従って、かかる画像化されたデータは、被検体内における固形腫瘍の有無、固形腫瘍の局在部位の特定、固形腫瘍の転移の有無等の診断に利用できる。また、固形腫瘍の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、得られるデータに基づき、治療効果を評価することができる。さらに、低酸素状態にある腫瘍細胞は、放射線治療や抗癌剤に対する耐性が比較的高いことが知られているため、照射する放射線量や抗癌剤の投与量の決定、他の治療方法の選択等の指標としても、このデータを用いることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
本実施例において、実験に供する各ポリペプチドの名称及びそれらのアミノ酸配列を表１に示す。なお、表１に記載のアミノ酸は、三文字表記で記し、左側をＮ末端側、右側をＣ末端側として表記した。また、「ＤＬｙｓ」はＤ体のリジンであることを示す。
【００４９】
【表１】
2014037395.tif 000002
【００５０】
表１に記載の「ＯＰ３０」、「ＫＯＰ３０」及び「ｍＫＯＰ３０」のアミノ酸配列は、各々、配列番号：２、３及び４にも示す。また、「ＤＫＯＰ３０」及び「ＫＯＰ３０」は、本発明にかかるポリペプチドであり、「ｍＤＫＯＰ３０」及び「ｍＫＯＰ３０」は、該ポリペプチドのＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメインに各々変異が導入されたポリペプチドである。「ＯＰ３０」はポリリジンの代わりにＨＩＦ−αの５４７〜５５５位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。そして、これら表１に記載の非標識ポリペプチドは以下の通りに合成した。
【００５１】
（実施例１）
＜非標識ポリペプチドの合成＞
各ポリペプチドは、ペプチド自動合成機（ＰＳＳＭ−８型：島津社製）を用い、樹脂に固定したアミノ酸誘導体に、添付のソフトウエアーに従って１残基ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく公知の方法（固相合成法）によって合成した。以下にＤＫＯＰ３０を例に記載する。
【００５２】
（１）ＤＫＯＰ３０の保護ペプチド樹脂の合成
前記ペプチド自動合成機を用いたペプチド合成法により、ＤＫＯＰ３０の保護ペプチド樹脂の合成を行った。すなわち、Ｆｍｏｃ−ＮＨ―ＳＡＬ−ＰＥＧ−レジン（０．２３ｍｏｌ／ｇ、０．３２ｍｍｏｌ  ｓｃａｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常のＦｍｏｃ−ペプチド合成法に使われる各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウエアーに従って、活性化剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して反応槽に加え、また塩基としてＮ，Ｎ―ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。配列に従って逐次アミノ酸を延長してＦｍｏｃ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−ＤＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ‐ＳＡＬ―ＰＥＧ―Ｒｅｓｉｎ保護ペプチド樹脂を得た。
【００５３】
（２）ＤＫＯＰ３０の脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂を、トリフルオロ酢酸を用いる定法のＴＦＡ−エタンジチオール−Ｈ２Ｏ−ＴＩＳ（９５／２．５／２．５／１，ｖ／ｖ）脱保護条件で室温、２時間処理し脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時に行った。反応液から担体樹脂をろ別の後、ＴＦＡを留去した。残渣にエーテルを加えて得られる粗生成ペプチドの沈殿をろ取した。
【００５４】
（３）ＤＫＯＰ３０の単離精製
得られた粗生成ペプチドをアセトニトリルに溶解し、島津製ＬＣ−２０ＡＤのＨＰＬＣ分取装置（カラム：ＯＤＳ１０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水―アセトニトリル（以下、「アセトニトリル」を「ＭｅＣＮ」と表すことがある。）の系で分取精製し、目的のペプチドの分画を得て、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物をトリフルオロ酢酸塩として得た。そして、得られたペプチドが目的のものであることを確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＨＰＬＣの分析を行った。
【００５５】
［ＤＫＯＰ３０］
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（保持時間）  １７．２ｍｉｎ，純度  ９５％以上
ｍ／ｚ  ３５６６．９３（［Ｍ＋Ｈ］＋  ３５６７．３７），分子量  ３５６７．４。
【００５６】
その他のペプチドも、同様にして合成して同定した。それぞれの同定のためのＨＰＬＣ条件とリテンションタイム（保持時間）、そして、化学的純度及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析値とを以下に示す。
【００５７】
［ＯＰ３０］
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２０．６ｍｉｎ，純度  ９５％以上
ｍ／ｚ  ３４３２．５５（［Ｍ＋Ｈ］＋  ３４３２．７５）  分子量  ３４３２．７。
【００５８】
［ＫＯＰ３０］
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １７．１ｍｉｎ，純度  ９５％以上
ｍ／ｚ  ３５６６．９３（［Ｍ＋Ｈ］＋  ３５６７．５６）  分子量  ３５６７．６。
【００５９】
［ｍＫＯＰ］
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １６．９ｍｉｎ，純度  ９５％以上
ｍ／ｚ  ３５１４．９０（［Ｍ＋Ｈ］＋  ３５１５．４２）  分子量  ３５１５．４。
【００６０】
［ｍＤＫＯＰ］
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １７．３ｍｉｎ，純度  ９５％以上
ｍ／ｚ  ３５１４．９０（［Ｍ＋Ｈ］＋  ３５１４．３８）  分子量  ３５１４．４。
【００６１】
そして、このようにして合成したペプチドを、以下に示す方法にて、放射性核種にて標識した。
【００６２】
（実施例２）
＜放射性核種標識化合物の作製＞
以下、ＤＫＯＰ３０放射性核種標識化合物（［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０）の作製を例にして記載する。また、放射性核種である１２３Ｉ及び１２５Ｉは同じヨウ素元素であるため、その化学的性質は同じである。従って、［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０は、それぞれ同様の方法にて合成した。
【００６３】
（１）放射性核種標識リンカー化合物の作製
ペプチドへ放射性核種を標識させるリンカー化合物として、Ｎ−（ｍ−［１２３／１２５Ｉ］ヨードフェニル）マレイミド（以下［１２３／１２５Ｉ］ＩＰＭとも称する）を以下の手順にて作製した。先ず、文献（Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２８９〜２９５ぺージ）に記載の方法にて合成したＮ−（ｍ−トリ−（ｎ−ブチル）スタンニルフェニル）マレイミド（０．１ｍｇ）を１％酢酸含有メタノール１００μＬに溶解させ、そこにＮ−クロロスクシンイミドのメタノール溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）、Ｎａ［１２５Ｉ］Ｉ（放射能濃度３７ＭＢｑ）あるいはＮＨ４［１２３Ｉ］Ｉ（放射能濃度３７０ＭＢｑ）を添加して室温で３０分間反応させた後、ＨＰＬＣ装置（カラム：ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ，ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）を用いて、溶離液（Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、組成（Ａ／Ｂ：５６／４４）の系にて精製を行った。また、放射化学的純度はＨＰＬＣ法にて確認を行った。
【００６４】
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
組成  Ａ／Ｂ：５６／４４（アイソクラティック）
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ２５４ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ９．０ｍｉｎ。
【００６５】
その結果、［１２３Ｉ］ＩＰＭに関し、放射化学的収率４０％、放射化学的純度９９％以上のアセトニトリル溶液を、［１２５Ｉ］ＩＰＭに関し、放射化学的収率８８％、放射化学的純度９９％以上のアセトニトリル溶液を得た。
【００６６】
（２）非標識ＤＫＯＰ３０の［１２３Ｉ］及び［１２５Ｉ］標識
実施例１において合成した非標識ＤＫＯＰ３０と、（１）にて作製した放射性核種標識リンカー化合物である［１２３／１２５Ｉ］ＩＰＭとを下記手順で反応させることにより、１２３／１２５Ｉ標識を行った。
【００６７】
［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０の作製では、先ず０．３ｍｇのＤＫＯＰ３０を室温のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、［１２３Ｉ］ＩＰＭ（３７ＭＢｑ）のアセトニトリル溶液と混和して室温にて１５〜３０分撹拌することで、標識反応を行った。
【００６８】
また、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の作製では、先ず０．３ｍｇのＤＫＯＰ３０を室温のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、［１２５Ｉ］ＩＰＭ（３．７ＭＢｑ）のアセトニトリル溶液と混和して室温にて１５〜６０分撹拌することで、標識反応を行った。
【００６９】
（３）ＤＫＯＰ３０の［１２３Ｉ］及び［１２５Ｉ］標識化合物（以下、それぞれ、［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０とも称する）の精製
（２）で得られた［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の各アセトニトリル溶液を、島津製ＬＣ−２０ＡＤのＨＰＬＣ分取装置（カラム：ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ，ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）を用いて、溶離液（Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、グラジエント（Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ）の系で分取した。目的の［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の分画を得て、アセトニトリルを留去した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ含有生理食塩液で希釈し、目的物を０．１％Ｔｗｅｅｎ含有生理食塩液溶液として得た。得られた［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の純度を確認するために、下記条件のＨＰＬＣ分析を行った。
【００７０】
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長  ２２０ｎｍ
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １８．７ｍｉｎ。
【００７１】
上記方法にて得られた［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の標識収率は、［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０では放射化学的収率２４％であり、放射化学的純度は９５％以上であった。また、図１に示す通り、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０では放射化学的収率７５％であり、放射化学的純度は９９％以上であった。
【００７２】
（４）ＯＰ３０、ＫＯＰ３０、ｍＫＯＰ及びｍＤＫＯＰの［１２５Ｉ］標識化合物の作製
ＯＰ３０、ＫＯＰ３０、ｍＫＯＰ及びｍＤＫＯＰの各［１２５Ｉ］標識化合物（以下、それぞれ、［１２５Ｉ］ＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ｍＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰ３０とも称する）の作製は、ＤＫＯＰ３０と同様の作製方法にて実施した。以下に、作製結果として、得られた標識化合物の分析結果を示す。
【００７３】
ＯＰ３０
［１２５Ｉ］標識化合物：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２１．６ｍｉｎ，純度  ９９％以上
ＫＯＰ３０
［１２５Ｉ］標識化合物：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １８．９ｍｉｎ，純度  ９９％以上
ｍＫＯＰ
［１２５Ｉ］標識化合物：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １９．２ｍｉｎ，純度  ９７％以上
ｍＤＫＯＰ
［１２５Ｉ］標識化合物：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １９．７ｍｉｎ，純度  ９９％以上。
【００７４】
（実施例３）
ＤＫＯＰ３０放射性核種標識化合物が、目的とするＨＩＦ−１αの分解を反映するかどうか、すなわち、当該標識化合物が、ＨＩＦ−１αが分解する条件にて分解されるかどうかを明らかにするために、フラクションII  ＨｅＬａ分解キット（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ社製）を用いてＤＫＯＰ３０放射性核種標識化合物（［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０）の分解を通常酸素条件下のインビトロ分析系で評価した。すなわち、キットに同梱されたＨｅＬａ細胞溶解液（８ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ）に担体無添加状態の［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０（７５ｋＢｑ）を０．０１５ｍＬ添加して３７℃で１時間インキュベートし、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）０．１ｍＬとトリクロロ酢酸０．０３ｍＬとを添加して反応を停止させた後、上清を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
【００７５】
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ＯＤＳ，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  ２５℃
溶離液  Ａ液：Ｗａｔｅｒ／０．１％ＴＦＡ、Ｂ液：ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ
グラジエント  Ａ／Ｂ：９０／１０→３０／７０、０→３０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ
流速  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長  ２２０ｎｍ。
【００７６】
インキュベート開始１時間後に上記条件のＨＰＬＣにて測定した結果、図２に示す通り、陽性対照である［１２５Ｉ］ＯＰ３０、ＯＰ３０のＮ末９残基のアミノ酸をリジンで置換した［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の３種のペプチドにおいて、それらの未変化体のピークの殆どは消失することが明らかになった。ＨＰＬＣピーク面積から求めた未変化体の残存率は、［１２５Ｉ］ＯＰ３０：２．３±０．３％、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０：１０±１％、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０：２０±８％であった。
【００７７】
一方、ＤＫＯＰ３０及びＫＯＰ３０配列中に存在するＨＩＦ−１α分解に関与するプロリン残基を各々置換したｍＫＯＰ及びｍＤＫＯＰでは、未変化体は７０％以上存在しており、代謝抵抗性を示すことが明らかになった。
【００７８】
従って、本発明の標識化合物である、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０は、通常酸素条件下においてＨＩＦ−１αの分解様式を反映する化合物であることが明らかになった。
【００７９】
（実施例４）
＜腫瘍細胞への放射能取り込み実験＞
ＨＩＦ−１αが存在する細胞内へ、本発明の標識化合物が侵入することが可能であるか、またその侵入は酸素濃度依存的であるか否かを、腫瘍細胞を用いて分析した。ここで、実施例３にて明らかになった通り、通常酸素条件下ではＨＩＦ−１α同様に、本発明の標識化合物は分解を受けるため、細胞内取り込み実験は、ＨＩＦ−１αが安定に存在する低酸素条件下（酸素濃度：０．１％以下）にて行った。
【００８０】
すなわち、腫瘍細胞であるＨｅＬａ細胞を、低酸素条件下（酸素濃度：０．１％以下）、ＤＭＥＭ培地中にて、３７℃、１８時間培養し、担体無添加状態の［１２５Ｉ］ＯＰ３０（１８．５ｋＢｑ）、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０（１８．５ｋＢｑ）、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０（１８．５ｋＢｑ）を１ｍＬ加えてさらに１時間培養し、各標識化合物の細胞移行性を比較検討した。
【００８１】
さらに、ＨｅＬａ細胞を通常酸素条件下又は低酸素条件下（酸素濃度：０．１％以下）で１８時間培養し、担体無添加状態の［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０（１８．５ｋＢｑ）、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０（１８．５ｋＢｑ）を加えて、通常酸素条件下又は低酸素条件下で、１５、３０、６０、１２０分間培養して、各標識化合物の取り込みの経時変化を調べた。得られた結果を図３〜５に示す。
【００８２】
図３に示す通り、ＨＩＦ−１αと同様の分解が確認された本発明の標識化合物を含む３種類の標識化合物のうち、［１２５Ｉ］ＯＰ３０処置群は細胞内取り込みが認められなかったが、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０処置群では、ＨｅＬａ細胞への放射能集積が認められた。さらに、図４及び５に示す通り、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０処置群の細胞内放射能は、評価したすべてのタイムポイントで、通常酸素条件下に比べ低酸素条件下で有意に高い値を示し、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０及び［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０は低酸素条件下にて安定に存在することが明らかになった（［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０処置群の結果については図４参照、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０処置群の結果については図５参照）。
【００８３】
（実施例５）
＜担がんマウス体内分布動態実験＞
（１）ＦＭ３Ａ腫瘍マウスモデルの作製
２．５％イソフルラン麻酔下にて、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雌性マウス（１６〜２１ｇ、５週齢）の右下肢の皮下にＦＭ３Ａ細胞懸濁液（５×１０６個、ＰＢＳ）を注入して移植した。移植後１４日目にて腫瘍生長の確認された個体を実験に供した。群設定は体重による無作為抽出法にて３群に各３〜４匹の割り付けを行った。
【００８４】
（２）体内分布・動態の確認
ＦＭ３Ａ腫瘍マウスに［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０（３７ｋＢｑ）又は［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０（３７ｋＢｑ）を各液量０．１ｍＬ、尾静脈より投与して、１５分、１時間、２時間後に２．５％イソフルラン麻酔下の脱血にて屠殺し、各臓器の重量及び集積した放射能を測定した。放射能測定はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のガンマ線カウンター（Ｗｉｚａｒｄ１４８０）にて実施した。得られた結果を表２及び３に示す。
【００８５】
【表２】
2014037395.tif 000003
【００８６】
【表３】
2014037395.tif 000004
【００８７】
［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０について体内分布を検討した結果、いずれの標識化合物も固形腫瘍に集積することが明らかになった（表２、３  参照）。特に［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の投与例においては、血中放射能が固形腫瘍への放射能集積より低く、固形腫瘍への高い集積性が検出された（表３  参照）。さらに、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０は、［１２５Ｉ］ＫＯＰ３０に比べて高い腫瘍筋肉比、腫瘍血液比を示し、特に腫瘍血液比は投与２時間後に１を上回り、画像コントラストの点で優れていることが示唆された（表３  参照）。また、公知のＨＩＦ−１αの酸素依存的分解ドメインを含む標識化合物においては、腫瘍血液比が１を上回るのは投与２４時間後であり（非特許文献４  参照）、本発明の標識化合物は、公知の標識化合物よりも好ましい体内動態を有することが明らかになった。
【００８８】
（実施例６）
＜ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング＞
実施例５と同様に作製したＦＭ３Ａ腫瘍マウスに［１２３Ｉ］ＤＫＯＰ３０（３７ＭＢｑ）を０．２ｍＬ投与し、投与２時間後に、２．５％イソフルラン麻酔下、低エネルギー高分解コリメータ（ウインドウ幅３０％、エネルギーピーク１６０ｋｅＶ、フォーマット１２８×１２８）を装着したガンマカメラ（ＳＰＥＣＴ−２０００Ｈスキャナ、日立メディコ社製）にて平面画像を１０分間収集することによりシンチグラムを得た。得られた結果を図６に示す。
【００８９】
図６に示す通り、投与２時間後のプラナー画像において、腫瘍非移植側の下肢筋肉に比べて腫瘍移植側に高い放射能集積が認められ、腫瘍が明瞭に描出された。従って、本発明の標識化合物は、一般的に低酸素状態にある固形腫瘍に集積性を示し、また、当該標識化合物を用いることにより、それを画像化することが可能であることが明らかになった。
【００９０】
（実施例７）
＜腫瘍集積とＨＩＦ−１転写活性との比較実験＞
実施例６にて明らかになった、本発明の標識化合物の腫瘍集積性が、固形腫瘍内のＨＩＦ−１転写活性と相関するかを調べた。すなわち、先ず、２．５％イソフルラン麻酔下、ＨＩＦ−１依存的にルシフェラーゼを発現するＳｕｉｔ２／ＨＲＥ−ルシフェラーゼ細胞をＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ雌性マウス（１６〜２１ｇ、５週齢）の両下肢に２×１０６個（ＰＢＳ懸濁下）移植した（ＨＲＥ−Ｌｕｃ腫瘍マウス）。これらＨＲＥ−Ｌｕｃ腫瘍マウスに［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０又は［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰ（３７ｋＢｑ）を尾静脈より０．１ｍＬ投与し、１時間４０分後にルシフェリン（２ｍｇ：１０ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内へ投与した。さらに２０分後にＨＲＥ−Ｌｕｃ腫瘍マウスを、２．５％イソフルラン麻酔下で生体発光イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いてルシフェラーゼ発光を撮像した。撮像後、２．５％イソフルラン麻酔下にて腫瘍を摘出し、放射能を測定した。放射能測定は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ガンマ線カウンター（Ｗｉｚａｒｄ１４８０）を用いた。得られた結果を図７に示す。
【００９１】
図７に示す通り、投与２時間後における［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の腫瘍集積と、ルシフェラーゼ発光、すなわちＨＩＦ−１転写活性とは、有意な正の相関を示した（図７のＡ  参照）。一方、［１２５Ｉ］ｍＤＫＯＰの腫瘍集積と、ＨＩＦ−１転写活性とは相関が認められなかった（図７のＢ  参照）。
【００９２】
（実施例８）
＜ｅｘ  ｖｉｖｏオートラジオグラフィー及び免疫組織学的検討＞
実施例５と同様に作製したＦＭ３Ａ腫瘍マウスに、低酸素マーカーであるピモニダゾール（１．３ｍｇ：６ｍｇ／ｍＬ、溶媒：生理食塩液）を腹腔内へ投与し、２時間後に［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０（１８ＭＢｑ、溶媒：０．１％Ｔｗｅｅｎ含有生理食塩液）を尾静脈投与し、さらに２時間後に断頭して屠殺した。腫瘍を摘出後にドライアイス−ヘキサン（−８０℃）にて凍結し、切片を作製してイメージングプレート（富士フイルム社製、ＢＡＳ−ＳＲ）に４日間露光させ、オートラジオグラムを得た。ＨＩＦ−１αの組織分布を比較確認するために、抗ＨＩＦ−１α一次抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８標識二次抗体とを用いる免疫組織染色を、隣接切片に対して行った。また、ピモニダゾールの組織内分布を比較確認するために、ＦＩＴＣ標識抗ピモニダゾール抗体を用いる免疫組織染色を、隣接切片に対して行った。得られた結果を図８に示す。
【００９３】
図８に示す通り、投与２時間後における［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０の腫瘍内放射能局在は不均一であり、受動拡散による非特異的な分布ではないことが確認された。また、ＨＩＦ−１αの染色部位や低酸素領域マーカーであるピモニダゾールの集積部位と、当該固形腫瘍内放射能局在とが一致したことから、［１２５Ｉ］ＤＫＯＰ３０は、ＨＩＦ−１αの存在する低酸素領域を反映した集積を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
以上説明したように、本発明によれば、低酸素領域の検出が可能となる。したがって、本発明の標識化合物は、低酸素領域への特異的集積性に優れるため、低酸素領域が生じる、固形腫瘍や虚血疾患の診断等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号２〜４
＜２２３＞  人工的に合成されたポリペプチドの配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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