(57)【要約】【課題】  一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いてもＨＢＶ  ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマー、一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いたＨＢＶの検出方法および検出試薬を提供すること。【解決の手段】  試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する特定の塩基配列からなる第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する特定の塩基配列からなる第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットにより、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１、３、５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなり、
第二のプライマーが、配列番号１１または１２に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなる、
前記プライマーセット。
【請求項２】
第一のプライマーが配列番号１、３、５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１１または１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加されるプライマーが第一のプライマーであり、さらに配列番号５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである第三のプライマーを一つ以上含む、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
第三のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した、特定塩基配列を含む核酸を、前記特定塩基配列の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて、ＨＢＶ  ＤＮＡを検出する方法。
【請求項７】
インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５または１６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡの特定塩基配列を特異的に増幅可能なプライマーおよびそれを用いたＨＢＶ  ＤＮＡの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、４２ｎｍのウイルス粒子サイズを有する部分的二本鎖環状ＤＮＡウイルスであり、世界中で２０億以上の人々に感染してきたと推定されている。ＨＢＶは、軽度の潜伏性の感染から、慢性の活動的で劇症性の肝炎に至るまで、様々な病状を引き起こすことが知られている。４億人以上の人々、特に、子供と高齢者が、ＨＢＶに慢性的に感染している。Ｂ型肝炎ウイルスは、ＡＩＤＳウイルスより１００倍以上感染性が高いが、ワクチン接種によって予防することが可能である。このためＨＢＶ感染を管理する上で中心となる戦略は、汎用的なワクチン接種並びに感染個体の早期検出及び治療である。
【０００３】
ＨＢＶ検査においては、ＨＢＶ  ＤＮＡを標的としたＰＣＲ法を利用した検査が汎用されており、ＨＢＶ  ＤＮＡを高感度に検出することができる。またＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を経時的に測定するＫｉｎｅｔｉｃ  ＰＣＲ法も汎用されており、ＰＣＲ工程および測定工程を２０分以内に実施することができる。しかしながら前記方法は、プライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題があった。さらにＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００４】
一方で、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった一定温度で核酸を増幅する方法が知られている。これらの方法は反応温度の昇降が不要な点で簡便に核酸を増幅することができるため、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化に寄与することができる。しかしながら、これらの増幅方法はＲＮＡを増幅する方法であり、標的がＤＮＡの場合、増幅が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ウイルスにはＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスが存在しているため、両ウイルスを同じ増幅検出方法を用いて検出できるのが望ましい。しかしながら、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法では、ＤＮＡの増幅が困難であるため、ＤＮＡウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の検出は困難であった。
【０００８】
そこで本発明の目的は、一定温度で核酸増幅する方法を用いてもＨＢＶ  ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、一定温度で核酸増幅する方法を用いてもＨＢＶ  ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマーセットを見出し、本発明を完成するにいたった。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１、３、５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなり、
第二のプライマーが、配列番号１１または１２に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなる、
前記プライマーセットである。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、第一のプライマーが配列番号１、３、５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１１または１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第一の態様に記載のプライマーセットである。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一または第二の態様に記載のプライマーセットである。
【００１３】
また本発明の第四の態様は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加されるプライマーが第一のプライマーであり、さらに配列番号５、３９、４１、４３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである第三のプライマーを一つ以上含む、前記第三の態様に記載のプライマーセットである。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、第三のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第四の態様に記載のプライマーセットである。
【００１５】
さらに本発明の第六の態様は、前記第一から第五の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した、特定塩基配列を含む核酸を、前記特定塩基配列の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて、ＨＢＶ  ＤＮＡを検出する方法である。
【００１６】
また本発明の第七の態様は、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５または１６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第六の態様に記載の検出方法である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において特定塩基配列とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同的または相補的な塩基配列のことをいう。
【００１９】
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。
【００２０】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の１７８番目から２０４番目までの塩基配列）、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の３４７番目から３６６番目までの塩基配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の３０１番目から３２０番目までの塩基配列）、配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の２６５番目から２８４番目までの塩基配列）、配列番号４１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の２４５番目から２６４番目までの塩基配列）、配列番号４３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ５５４０１７の２２５番目から２４４番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなり、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の３０１番目から３２０番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の４５５番目から４８０番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなることを特徴としている。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列の相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。なお配列番号１、３、５、３９、４１、４３、１１、１２はいずれもＨＢＶの各遺伝子型（Ａ型からＨ型、配列番号２１から３７）に対して相同性の高い領域である（図１から２４）。このため本発明のプライマーセットは、ＨＢＶ  ＤＮＡの特定核酸配列を含む核酸を遺伝子型を問わず特異的に増幅することができる。
【００２１】
本発明のプライマーセットは、ＰＣＲ法など当業者が通常用いる核酸増幅法を利用したＨＢＶ  ＤＮＡの特定塩基配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列を含む核酸が合成されるため、当該核酸から、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法により、ＲＮＡを増幅させることができるため、好ましい。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（Ｔ７プロモーター）である配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２２】
また、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加されるプライマーが第一のプライマーであり、さらに配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の３０１番目から３２０番目までの塩基配列）、３９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の２６５番目から２８４番目までの塩基配列）、４１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の２４５番目から２６４番目までの塩基配列）、４３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ５５４０１７の２２５番目から２４４番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである第三のプライマーを本発明のプライマーセットに一つ以上追加すると、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法におけるＨＢＶ  ＤＮＡの検出感度および／または検出時間が向上するため好ましい。なお、第三のプライマーは本発明のプライマーセットに複数種類追加してもよく、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加してもよい。さらに前記好ましい態様では、一定温度でＲＮＡを増幅する系に鎖置換酵素をさらに追加すると好ましく、好ましい鎖置換酵素の例としては、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼがあげられる。
【００２３】
本発明のプライマーセットを用いて増幅した、ＨＢＶ  ＤＮＡの特定塩基配列を含む核酸は、前記特定塩基配列の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを用いて検出すると、前記特定塩基配列を含む核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。特に好ましくは、前記核酸プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の２６２番目から２８３番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の３８１番目から３９９番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記核酸プローブを用いた検出である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のプライマーセットは、一定温度で核酸増幅する方法を用いてもＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡを特異的に増幅可能なプライマーセットであり、本プライマーセットにより、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いても、ＨＢＶ  ＤＮＡを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図３】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図４】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図５】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図６】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図７】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図８】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図９】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１０】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１１】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１２】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１３】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１４】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１５】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１６】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１７】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１８】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図１９】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２０】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２１】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２２】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２３】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２４】Ｂ型肝炎ウイルスの代表的な遺伝子型の塩基配列（配列番号２１から３７）およびアライメント結果、ならびに実施例３および４で使用したプライマー・プローブの位置関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号１５の相補鎖、Ｒ−１は配列番号１１の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１６の相補鎖、Ｒ−２は配列番号１２の相補鎖、Ｆ−３は配列番号７、Ｐｒｏｂｅ３は配列番号１７の相補鎖、Ｒ−３は配列番号１３の相補鎖、Ｆ−４は配列番号９、Ｐｒｏｂｅ４は配列番号１８の相補鎖、Ｒ−４は配列番号１４の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２５】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお、３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００２７】
実施例１  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡの調製
ＨＢＶのＤＮＡは、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出して得た。
【００２８】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（ＩＮＡＦプローブ）の作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号１５に記載の配列の５’末端から１７番目のＧと１８番目のＡの間、配列番号１６に記載の配列の５’末端から５番目のＴと６番目のＡの間、配列番号１７に記載の配列の５’末端から８番目のＴと９番目のＡの間、配列番号１８に記載の配列の５’末端から１２番目のＧと１３番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図２５）。
【００２９】
実施例３  等温増幅法を用いたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの検出
下記に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。なお第一のプライマーのうち、配列番号２は配列番号１の５’末端側に、配列番号４は配列番号３の５’末端側に、配列番号６は配列番号５の５’末端側に、配列番号８は配列番号７の５’末端側に、配列番号１０は配列番号９の５’末端側に、それぞれＴ７プロモータ配列（配列番号１９）を付加したものである。
（Ａ）第一のプライマー：配列番号２、第二のプライマー：配列番号１１、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１５
（Ｂ）第一のプライマー：配列番号４、第二のプライマー：配列番号１２、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１６
（Ｃ）第一のプライマー：配列番号６、第二のプライマー：配列番号１２、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１６
（Ｄ）第一のプライマー：配列番号８、第二のプライマー：配列番号１３、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１７
（Ｅ）第一のプライマー：配列番号１０、第二のプライマー：配列番号１４、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１８
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて１６７ＩＵ、８４ＩＵ、５５．７ＩＵ、１６．７ＩＵまたは１．６７ＩＵ（１ＩＵは約６コピー）／５μｌとなるよう希釈し、ウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
〔反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度〕
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
１９ｍＭ  塩化マグネシウム；
６１．７ｍＭ  塩化カリウム；
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．４ｍＭ  ＩＴＰ；
１μＭ  第一のプライマー；
１μＭ  第二のプライマー；
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）
１０．５％  ＤＭＳＯ；
（３）前述の反応液を、４６℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４６℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
〔酵素液の組成：５μＬ中の最終濃度〕
２５ｗｔ％  グリセロール；
４００ｍＭ  トレハロース；
２００ｍＭ  塩化カリウム；
６．４Ｕ／３０μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素；
１４２Ｕ／３０μＬ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）；
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
（５）対照として、前記（Ａ）から（Ｅ）に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、第一のプライマーと第二のプライマーとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む１０μＬのＰＣＲ溶液に、配列番号２０に記載の配列からなるＨＢＶ  ＤＮＡを鋳型とした合成核酸５μＬを添加後、９４℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で２０秒からなるＰＣＲ反応を３０サイクルの条件で行ない、電気泳動を用いて増幅産物を確認した。
【００３０】
結果を表１に示す。今回検討した（Ａ）から（Ｅ）に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、（Ａ）から（Ｃ）の組み合わせを用いた場合は、等温増幅法により１６．７ＩＵ／テスト（１００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを検出することができた。一方（Ｄ）または（Ｅ）の組み合わせを用いた場合は、ＰＣＲ法では増幅産物を確認できたものの、等温増幅法では２５００ＩＵ／テスト（１．５×１０４コピー／テストに相当）のＨＢＶ  ＤＮＡであっても検出することができなかった。このことから、ＰＣＲ法によりＨＢＶ  ＤＮＡの検出が可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みても、必ずしもＨＢＶ  ＤＮＡを検出できるとはいえないことがわかる。
【００３１】
【表１】
2014140367.tif 000002
【００３２】
実施例４  ＰＣＲ法と等温増幅法とを組み合わせたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの検出
実施例３において等温増幅法によりＨＢＶ  ＤＮＡの検出が確認できた、前記（Ａ）から（Ｃ）に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法と等温増幅法とを組み合わせたＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）前記（Ａ）から（Ｃ）に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、第一のプライマーと第二のプライマーとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む１０μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、９４℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で２０秒からなるＰＣＲ反応を１サイクルまたは２サイクル実施した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
（反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．６５）；
１９ｍＭ  塩化マグネシウム；
９５ｍＭ  塩化カリウム；
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；
３．４ｍＭ  ＩＴＰ；
１μＭ  第一のプライマー；
１μＭ  第二のプライマー；
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ；
１０．５％  ＤＭＳＯ；
（４）（３）の反応液を、４６℃で５分間保温後、予め４６℃で２分間保温した、以下の組成の酵素液５μＬを添加した。
（酵素液の組成：５μＬ中の最終濃度）
２５ｗｔ％  グリセロール；
４００ｍＭ  トレハロース；
２００ｍＭ  塩化カリウム；
６．４Ｕ／３０μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素；
１４２Ｕ／３０μＬ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）；
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３３】
結果を表２に示す。（Ａ）から（Ｃ）に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ＰＣＲを１サイクル以上行ない、その後等温増幅を行なうことで、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを検出することができた。
【００３４】
【表２】
2014140367.tif 000003
【００３５】
実施例５  第三のプライマーの添加によるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ検出への影響（その１）
第三のプライマーの添加の有無によるＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈し、ウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３６】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１６）（実施例２で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（以下、必要に応じ添加）
０．１μＭ  第三のプライマー（配列番号６）
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。
【００３７】
開始液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
３．８ｗｔ％  グリセロール
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
１０．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲ用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００３８】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表３に示す。第三のプライマーの添加により、ＨＢＶ  ＤＮＡの検出時間が向上し、さらに鎖置換酵素を添加するとＨＢＶ  ＤＮＡの検出時間および検出感度がさらに向上することがわかる。
【００３９】
【表３】
2014140367.tif 000004
【００４０】
実施例６  第三のプライマーの添加によるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ検出への影響（その２）
実施例５に記載の第三のプライマーおよび鎖置換酵素を添加した系のうち、第三のプライマーを替えたことによるＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて３０コピー／５μＬとなるよう希釈し、ウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４１】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
０．１μＭ  第三のプライマー（配列番号５、６、３９から４４のいずれか）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１６）（実施例２で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例５（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例５（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００４２】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表４に示す。第三のプライマーとして、
配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号６（配列番号５の５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号１９）を付加）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号４０（配列番号３９の５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号１９）を付加）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
配列番号４１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号４２（配列番号４１の５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号１９）を付加）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、および
配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号４４（配列番号４３の５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号１９）を付加）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
が、それぞれ、ほぼ同様の結果（検出時間）であることから、Ｔ７プロモーター（配列番号１９）の有無による、第三のプライマーへの影響はないことがわかる。
【００４３】
【表４】
2014140367.tif 000005
【００４４】
実施例６  第三のプライマーの添加によるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ検出への影響（その３）
第三のプライマーを複数種類添加することによる、ＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて３０コピー／５μＬとなるよう希釈し、ウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４５】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
各０．０２５μＭから０．１μＭ  第三のプライマー（配列番号６、４０、４２および４４の中から組み合わせて使用）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１６）（実施例２で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
０．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例５（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例５（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００４６】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表５に示す。第三のプライマーを複数種類添加しても、検出性能への影響はほとんどないことがわかる。
【００４７】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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