(57)【要約】【課題】培養細胞の損傷を抑制し、目的物質の生産性を向上させることのできる細胞培養方法を提供する。【解決手段】本発明は、炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行う細胞培養方法であって、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段を前記培養液中に配し、前記細胞培養中、断続的又は継続的に前記気相部に前記空気混合ガスを通気させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行う細胞培養方法であって、
空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段を前記培養液中に配し、
前記細胞培養中、断続的又は継続的に前記気相部に前記空気混合ガスを通気させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記空気混合ガスが、窒素又は酸素のうちの少なくとも一種を空気と混合したガスであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記培養液のｐＨ又は溶存二酸化炭素濃度が予め設定された規定値を超えた場合に、前記気相部に前記空気混合ガスを通気させることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記二酸化炭素透過膜が、ポリテトラフルオロエチレン若しくはポリスルホンから成る多孔質膜、又はポリプロピレン、ポリエチレン、シリコーンゴム、ポリシロキサン若しくはポリオレフィンから成る膜であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行う細胞培養装置であって、
前記培養液を収容する培養槽と、
前記培養液中に配されるように設けられ、当該培養液中に酸素含有気泡を供給する散気手段と、
前記培養液中に配されるように設けられ、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段と、
少なくとも、前記気相部に前記空気混合ガスを通気させる通気手段と、を備えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
前記培養液のｐＨを検出するｐＨ検出手段と、これと接続された制御手段を更に有し、
前記通気手段は、前記ｐＨ検出手段により検出されたｐＨ値が、予め設定した既定値を超えたときに前記制御手段から発せられた制御信号に従って前記空気混合ガスの通気を行うことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記培養液の溶存二酸化炭素濃度を検出する溶存二酸化炭素濃度検出手段と、これと接続された制御手段を更に有し、
前記通気手段は、前記二酸化炭素濃度検出手段により検出された溶存二酸化炭素濃度の値が、予め設定した既定値を超えたときに前記制御手段から発せられた制御信号に従って前記空気混合ガスの通気を行うことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記空気混合ガスが、窒素又は酸素のうちの少なくとも一種を空気と混合したガスであることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬をはじめとする医薬品は、主成分として細胞が産生する物質を含有している。このような物質は、例えば動物細胞により分泌生産されるため、動物由来の細胞を培養し、培養液中に分泌された目的物質を分離精製することで得ることができる。動物由来の細胞を培養する場合においては、培養環境、すなわち培養槽内を培養に最適な条件に維持することが求められる。特に、細胞の代謝反応に適正なｐＨ範囲に維持すること、及び細胞の呼吸に必要な溶存酸素濃度を維持することが求められる。
【０００３】
細胞を高密度に培養する場合や培養装置を大型化する場合には、培養液表面に酸素付加空気を通気するのみでは溶存酸素濃度を維持することが困難であり、培養槽の底部に設置したスパージャ（ガス吹込み用分散管）を介して酸素ガスを直接通気する液中通気が不可避となる。
【０００４】
液中通気は、形成される気泡の気液界面を介して酸素を拡散させるものであり、通気量を増加して気液界面の接触面積を増加することで、より多量の酸素を培養液に供給することができる。気液界面の接触面積を増加して効率的に酸素を供給させるためには、適切な孔径を有するスパージャを選定して、通気気泡を微細化することが好ましい。しかしながら、液中通気により生成された気泡は、培養細胞の一部を捕捉して培養液上面に泡沫層を形成して滞留し、細胞の壊死を生じて細胞濃度の低下を招くといった問題がある。さらに、液面付近に上昇した気泡が破裂、消滅する際に、細胞の死滅や損傷を及ぼすことが知られている。
【０００５】
また、培養液中には細胞の代謝反応によって各種の代謝成分が排出されるが、細胞が生成する乳酸の蓄積によって培養液のｐＨが酸性化して細胞の代謝反応に適正なｐＨ範囲に維持できなくなるといった問題がある。
【０００６】
これに対し、水酸化ナトリウム溶液や重炭酸ナトリウム溶液等のアルカリ剤が培養液を適正なｐＨ範囲に維持する目的で添加される。
【０００７】
水酸化ナトリウム等の強アルカリ剤の溶液を添加する場合には、局所的に添加した部位の周辺における培養液のｐＨが急激に上昇するため、その周辺における細胞の活性や代謝反応に阻害的な影響を生じる。
【０００８】
また、弱塩基溶液である重炭酸ナトリウム溶液、あるいは炭酸ナトリウム溶液を選択してｐＨ調整剤として添加される場合は、該塩基溶液が解離したＨＣＯ3-イオンとの平衡反応によって培養液を所定のｐＨ範囲に維持するために、溶存二酸化炭素の濃度が増加する。
【０００９】
さらに、細胞は呼吸作用によって培地中の炭素源等の栄養成分を代謝して二酸化炭素を生じるため、培養が進行するに伴って培養液中の溶存二酸化炭素濃度が増加する。
【００１０】
比較的小型の培養槽で培養する場合には、培養液面における気液の接触界面を介して溶存二酸化炭素が気相中に分散されるため、溶存二酸化炭素の濃度を減少させることができる。しかし、比較的大型の培養槽では、培養液面での気液接触界面の面積が相対的に小さくなるために、溶存二酸化炭素が蓄積し易くなる。
【００１１】
溶存二酸化炭素の蓄積は、解離によってＨＣＯ3-イオンを生ずると共に培養液のｐＨを低下させるため、アルカリ剤を添加して所定のｐＨ範囲に維持する必要がある。
また、培養液中の溶存二酸化炭素濃度の増大は、培養細胞の増殖や代謝活性に対して阻害的な影響を及ぼすことが知られている。通常、小型の培養槽では、培養液中の溶存二酸化炭素濃度は５〜１０％程度であるのに対し、大型の培養槽では、溶存二酸化炭素濃度が４０％という高濃度になることがある。溶存二酸化炭素濃度の影響は細胞の種別によって異なるが、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）系の細胞では、細胞の増殖速度や到達細胞濃度が１／２程度にまで阻害されるといった影響がある。
【００１２】
このような状況下、近年、培養細胞に損傷を与えないようにし、目的物質の生産性（収率）を向上させる技術が報告されている。
【００１３】
例えば、特許文献１には、哺乳類細胞培養プロセスにおいて、バイオリアクターにおける細胞培地の上面での表面ガス交換を介して溶存二酸化炭素を除去し、哺乳類細胞培養プロセスの増殖期及び生産期全体を通じて、細胞培地における溶存二酸化炭素を、約１０％未満の濃度の溶存二酸化炭素のレベルに維持するとともに、ｐＨを特定の細胞に対して最適な範囲に維持する旨が記載されている。
【００１４】
また、特許文献２には、第１の散気手段によって培養液中に気泡を供給し、培養液中に酸素を供給しながら細胞培養工程を行う細胞培養方法において、前記培養液には、前記気泡より大径の気泡を第２の散気手段によって供給する旨が記載されている。なお、この特許文献２には、第１の散気手段によって培養液中に酸素を供給し、比較的大径の気泡を生じる第２の散気手段によって二酸化炭素非含有ガスを通気する旨が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２０１１−１６０８０２号公報
【特許文献２】特開２００８−１８２８９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
特許文献１には具体的には、バイオリアクター容器に配置されたドラフト管内に配置された上方流動インペラを有するバイオリアクターシステムが言及されている。上方ポンピングインペラを用いて、細胞培養液又は培地をバイオリアクター容器の底部から、リアクターの上部、すなわち気液交換が生じている液表面に連続的且つ迅速に運ばれている。そして、酸素、窒素、空気、二酸化炭素又は他の好適なガス及びそれらの混合物からなるスイープガスがバイオリアクター容器内のヘッドスペースに導入され、ここで培養液の上面と相互作用して、溶存二酸化炭素の除去を行っている。
【００１７】
しかしながら、この場合、通常の攪拌培養において培養液中の細胞及び培地を均一に混合するために行う攪拌に比べて上下方向への攪拌強度が強くなる結果、攪拌に伴うせん断力によって細胞を損傷又は死滅させる懸念がある。また、商用生産規模の大型培養槽においては、槽径に応じて攪拌翼が大型化されているために攪拌速度を頻繁に上下させて制御するのは困難である。
【００１８】
また、特許文献２には、前記したように、比較的小径の気泡を生じる第１の散気手段によって培養液中に酸素を供給し、比較的大径の気泡を生じる第２の散気手段に二酸化炭素非含有ガスを通気することにより、培養液中の溶存二酸化炭素を気泡中に拡散させて培養液から除去することが記載されている。
【００１９】
しかしながら、大径の気泡では通気ガス容積あたりの気液界面での接触面積が相対的に小さく、ガス移動容量係数が十分には大きくないために、溶存二酸化炭素を効率的に除去するためには通気量を増大させる必要がある。この場合、上述したように、気泡通気量を増加させることによって、細胞の損傷を生じる可能性が増大する。
【００２０】
本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、培養細胞の損傷を抑制し、目的物質の生産性を向上させることのできる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記課題を解決した本発明は、炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行う細胞培養方法であって、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段を前記培養液中に配し、前記細胞培養中、断続的又は継続的に前記気相部に前記空気混合ガスを通気させることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は、炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液を収容する培養槽と、前記培養液中に配されるように設けられ、当該培養液中に酸素含有気泡を供給する散気手段と、前記培養液中に配されるように設けられ、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段と、少なくとも、前記気相部に前記空気混合ガスを通気させる通気手段と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、培養細胞の損傷を抑制し、目的物質の生産性を向上させることのできる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞培養方法を適用した細胞培養装置の一例を示す構成図である。
【図２Ａ】ガス交換手段の一例を示す正面図である。
【図２Ｂ】図２Ａの要部断面図である。
【図２Ｃ】ガス交換手段の他の一例を示す斜視図である。
【図２Ｄ】ガス交換手段の他の一例を示す斜視図である。
【図２Ｅ】ガス交換手段の他の一例を示す斜視図である。
【図３】気相の二酸化炭素分圧を５％（実線）と２０％（破線）としたときの、各ｐＨにおける溶存二酸化炭素濃度と炭酸イオン種の平衡濃度の関係を示すグラフである。なお、横軸はｐＨを示し、縦軸は濃度（Ｍ）を示す。
【図４Ａ】図２Ａに示すガス交換手段のＡｉｒ通気量（Ｌ／ｍｉｎ）と総括ガス移動容量係数ｋＬａ（ｈ-1）の特性を示す一例である。なお、攪拌翼の攪拌回転数は３０ｒｐｍである。
【図４Ｂ】攪拌翼の攪拌回転数（ｒｐｍ）と総括ガス移動容量係数ｋＬａ（ｈ-1）の特性を示す一例である。なお、Ａｉｒ通気量は１．２Ｌ／ｍｉｎである。
【図５】溶存二酸化炭素濃度による培養細胞の増殖特性を示す一例である。横軸はＤＣＯ2（溶存二酸化炭素濃度）（％）を示し、第１縦軸はMaximum of Viable Cell density（生存細胞密度の最大値）（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を示し、第２縦軸はSpecific Growth Rate（比増殖速度）μ（ｈ-1）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、適宜図面を参照して本発明を実施するための形態（実施形態）について詳細に説明する。
〔細胞培養方法〕
本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、炭酸塩を含有する培養液中に酸素含有気泡を供給しながら細胞培養を行うものであって、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段をこの培養液中に配し、細胞培養中、断続的又は継続的に気相部に空気混合ガスを通気させるというものである。
【００２６】
このように、空気混合ガスを通気させる気相部を有する二酸化炭素透過膜製のガス交換手段を培養液中に配し、細胞培養中、断続的又は継続的に気相部に空気混合ガスを通気させるようにすれば、細胞培養時に生じる乳酸等により培養液が酸性化した場合に添加する重炭酸ナトリウム等のｐＨ調整用アルカリ剤の添加量を抑制することができる。そのため、重炭酸ナトリウム等を由来とする溶存二酸化炭素の蓄積を抑制することができる。溶存二酸化炭素の蓄積が抑制されると、細胞へのダメージを抑制することができ、効率的な培養が可能となる。その結果、目的物質の生産性を向上させることができる。つまり、従来の細胞培養方法のように、培養細胞が生成する乳酸によって酸性化した培養液を中性化する、重炭酸ナトリウム等のアルカリ剤を多量に添加する必要がなくなる。そのため、溶存二酸化炭素濃度が低減し、培養細胞の増殖が阻害されなくなる。
【００２７】
ここで、一実施形態に係る細胞培養方法によって培養される培養細胞の産生する目的物質としては、例えば、抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物及び高分子化合物等の生理活性物質を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
また、培養される細胞としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。一例として、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などが挙げられる。
なお、本発明においてはこれらの中でも、抗体や酵素等のタンパク質を産生する動物細胞が好適な培養対象として挙げることができる。つまり、本発明に係る細胞培養方法は、医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞を培養するのに適している。
【００２８】
炭酸塩を含有する培養液には、細胞培養を行う前に予め炭酸塩が添加された培養液及び培養途中に適時炭酸塩が添加された培養液のいずれもが含まれる。培養液は、培養する細胞に適したものであればどのようなものでも用いることができる。炭酸塩としては、細胞の培養が行われるｐＨ６からｐＨ８の範囲において炭酸イオンとして遊離することによってｐＨ緩衝能を有するものであれば特に問わない。例えば、重炭酸ナトリウム（炭酸水素ナトリウム）、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられるが、重炭酸ナトリウムが一般に使用される。
【００２９】
酸素含有気泡の供給は、後記する散気手段によって行うことができる。酸素含有気泡は、大気や、大気に高純度の酸素ガスを混合したガス、高純度の酸素ガスなどを用いたものであればよい。
【００３０】
ガス交換手段については後に詳述するが、空気混合ガスを通気させる気相部を有し、二酸化炭素を透過させる二酸化炭素透過膜でつくられたものであれば形態を問うことなく用いることができる。
【００３１】
空気混合ガスとしては、窒素又は酸素のうちの少なくとも一種を空気と混合したガスであるのが好ましく、二酸化炭素の濃度が低減されたガスであるのがより好ましく、二酸化炭素を実質的に含まないガスであるのがさらに好ましい。ここで、二酸化炭素を実質的に含まないとは、ガスの組成中に二酸化炭素を全く含まないか、含んだとしても不可避的に混入してしまう程度の極微量であることをいう。なお、気相部には必要に応じて二酸化炭素を含むガスを通気させることも可能である。
【００３２】
なお、本発明においては、当該ガス交換手段を培養液中に配する必要がある。この状態で、細胞培養中、ガス交換手段の気相部に空気混合ガスを断続的又は継続的に通気させることによって、培養液中に溶存する溶存二酸化炭素を濃度差により気相部内に引き込み、気相部内を通気する空気混合ガスにのせて速やかに除去することができる。すなわち、これにより培養液中の溶存二酸化炭素を低減することができる。また、培養液中の溶存二酸化炭素が低減するため、重炭酸ナトリウム等のｐＨ調整剤の添加量を抑制することができ、重炭酸ナトリウム等を由来とする溶存二酸化炭素の蓄積を抑制することができる。つまり、相乗的に溶存二酸化炭素の蓄積を抑制することが可能となるため、細胞へのダメージを抑制することができ、効率的な培養が可能となる。その結果、目的物質の生産性を向上させることができる。
【００３３】
〔細胞培養装置〕
次に、本発明の一実施形態に係る細胞培養方法を適用した細胞培養装置の一例について説明する。
（細胞培養装置１）
かかる細胞培養装置１は、図１に示すように、少なくとも、培養槽２と、散気手段３と、ガス交換手段４と、通気手段５と、を備えている。なお、細胞培養装置１は、通常の細胞培養装置が備えている調温装置やｐＨ調整剤供給装置、培養液供給装置などを備えていてもよい。
【００３４】
（培養槽２）
培養槽２は、炭酸塩を含有する培養液Ｍを収容する容器である。培養槽２は、例えばステンレスなどの金属材で形成することができる。培養槽２は、培養細胞以外の微生物が混入しない程度の密閉性を備えている。
【００３５】
（散気手段３）
散気手段３は、培養液Ｍ中に配されるように設けられ、当該培養液Ｍ中に酸素含有気泡を供給するものである。
散気手段３は、酸素含有気泡を供給するために、ポンプ等のガス供給装置（図示省略）及びこれのｏｎ／ｏｆｆ及び開度を操作する弁６を備えている。
【００３６】
（ガス交換手段４）
ガス交換手段４は、図１及び図２Ａに示されているように、培養液Ｍ中に配されるように設けられている。ガス交換手段４は、二酸化炭素透過膜で形成され、空気混合ガスを通気させる気相部４１（図２Ｂ参照）を有している。これにより、前記したように、培養液Ｍ中に溶存する溶存二酸化炭素を濃度差により気相部４１内に引き込み、気相部４１内を通気する空気混合ガスにのせて速やかに除去することが可能となる。すなわち、これにより培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素を低減することが可能となる。また、培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素が低減するため、重炭酸ナトリウム等のｐＨ調整剤の添加量を抑制することができ、重炭酸ナトリウム等を由来とする溶存二酸化炭素の蓄積を抑制することが可能となる。つまり、相乗的に溶存二酸化炭素の蓄積を抑制することが可能となるため、細胞へのダメージを抑制することができ、効率的な培養が可能となる。その結果、目的物質の生産性を向上させることができる。
【００３７】
二酸化炭素透過膜としては、二酸化炭素を透過させることができ、毒性溶解成分を含まないものであればどのようなものでも使用することができる。例えば、ポリテトラフルオロエチレン若しくはポリスルホンから成る多孔質膜、又はポリプロピレン、ポリエチレン、シリコーンゴム、ポリシロキサン、ポリオレフィン等の公知の二酸化炭素透過性の高い有機材料の膜が用いられる。二酸化炭素透過膜の厚さ、形状、集合化形態等は材料の種類、対象培養液、操作条件により適宜選択される。ガス交換手段４は、図２Ａに示すように管状とすることができるがこれに限定されるものではない。ガス交換手段４は、例えば、平膜（図２Ｃ）あるいは平膜の積層物（図２Ｄ）、中空糸モジュール（図２Ｅ）などとすることができる。
なお、培養液Ｍ中に溶存する二酸化炭素（ＣＯ2）を含んだ空気混合ガスは、気相部４１内を通ってガス交換手段４外、延いては細胞培養装置１外に排気される（図１、図２Ａ〜図２Ｅ参照）。
【００３８】
（通気手段５）
通気手段５は、少なくとも、気相部４１に空気混合ガスを通気させる。通気手段５は、ポンプ等のガス供給装置（図示省略）及びこれのｏｎ／ｏｆｆ及び開度を操作する弁７を備えている。通気手段５は、制御手段８からの制御信号に従って当該ガス供給装置の出力の調整と弁７の開閉度の調整を行う。
【００３９】
（制御手段８）
制御手段８は、少なくとも前記した散気手段３による酸素含有気泡の供給、ガス交換手段４の気相部４１に通気する空気混合ガスの通気量、及び培養液Ｍを攪拌する攪拌翼９を回転駆動する駆動用モータ１０を制御する。つまり、制御手段８は、弁６を制御することで散気手段３からの酸素含有気泡の供給量（総通気量）を制御し、弁７を制御することで、ガス交換手段４に通気する空気混合ガスのガス組成（例えば、空気供給量、酸素供給量、炭酸ガス供給量、窒素供給量）、及び通気量を制御する。また、制御手段８は、駆動用モータ１０の回転数を制御することで培養液Ｍの攪拌スピードを制御する。制御手段８は、その他にも、計測したｐＨ値に従って、重炭酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤を図示しないｐＨ調整剤供給装置から、適宜のｐＨ調整剤供給量をもって供給する制御を行う。
【００４０】
（ガス供給装置１１）
細胞培養装置１は、培養液Ｍの上面に酸素含有ガスを供給するためのガス供給装置１１を備えている。制御手段８は、このガス供給装置１１を制御して、培養液Ｍの上面に供給する酸素含有ガスの流量（総通気量）を制御している。ガス供給装置１１は、空気、窒素、酸素及び二酸化炭素の各ガスについての流量制御機能と供給量計測機能を備えているのが好ましい。なお、図１、図２Ａ、Ｃ〜Ｅに示すように、細胞培養装置１は、ガス供給装置１１で供給したガスと同等量のガス、つまり、培養液Ｍ中に溶存する二酸化炭素を含む空気混合ガスを細胞培養装置１外に排気する排気機構も有している。細胞培養装置１におけるかかる排気機構は、公知の細胞培養装置に用いられているものを適用することができる。
【００４１】
（計測装置１２）
さらに、細胞培養装置１は、培養液Ｍの各種状態を計測するための計測装置１２を有している。計測装置１２は、より具体的には、培養液Ｍ中の酸素濃度を測定する溶存酸素濃度測定器（溶存Ｏ2計）、培養液Ｍ中の二酸化炭素濃度を測定する溶存二酸化炭素濃度測定器（溶存ＣＯ2計）及び培養液ＭのｐＨを測定するｐＨ測定器（ｐＨ計）を備えている。これらの機器は、それぞれ別個に培養槽２に取り付けられていてもよい。また、培養液Ｍの温度を測定する温度計やその他の培養液Ｍの性状を測定するための各種機器を備えていてもよい。
【００４２】
計測装置１２からの出力は、それぞれの計測値として制御手段８へ入力される。制御手段８は、入力された計測値の値に基づいて、少なくともガス交換手段４に供給する空気混合ガスの通気量を制御し、好ましくは、散気手段３からの酸素含有気泡の供給、及びガス供給装置１１からのガスの供給を制御する。
【００４３】
ここで、図３に、気相の二酸化炭素（ＣＯ2）分圧を５％と２０％としたときの、各ｐＨにおける溶存二酸化炭素濃度と炭酸イオン種（ＨＣＯ3-、ＣＯ32-）の平衡濃度の関係を示す。なお、横軸はｐＨを示し、縦軸は濃度（Ｍ）を示す。図中、実線は気相のＣＯ2分圧を５％としたときの結果を示し、破線は気相のＣＯ2分圧を２０％としたときの結果を示す。
【００４４】
ｐＨ調整剤として重炭酸ナトリウム等の炭酸塩を添加した際にも同図の平衡関係が維持されるため、培養液ＭへのｐＨ調整剤の添加量に応じて、培養液ＭのｐＨのほか溶存二酸化炭素濃度が増加する。溶存二酸化炭素濃度はｐＨに対する依存性が無いので、気相部４１の二酸化炭素分圧を制御することによって、培養液ＭのｐＨを維持したままで、培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素濃度の増加を抑制することができる。本発明では、前記したように、二酸化炭素透過膜を介することによって、気相部４１の二酸化炭素分圧を制御することにより溶存二酸化炭素濃度を培養に適正な領域に維持することができる。
ここで、培養液Ｍ中に溶解する重炭酸イオン、あるいは炭酸イオンを、ガス交換手段４を構成する二酸化炭素透過膜を介して、培養液Ｍ側からガス交換手段４の気相部４１にガス状の二酸化炭素として放出するためには、培養液Ｍ中に溶解する溶存二酸化炭素の分圧より低い分圧の空気混合ガスを気相部４１に通気する必要がある。このときのガス交換速度は、総括ガス移動容量係数ｋＬａの値によって決まる。図４Ａ及び図４Ｂに示した一例のように、二酸化炭素透過膜の特性、及び構成したガス交換手段４の構造によって、空気混合ガスの通気量、及び攪拌機９の攪拌回転数に依存している。なお、空気混合ガスの通気量、及び攪拌機９の攪拌回転数は、図４Ａ及び図４Ｂを参考に適宜設定することができる。
【００４５】
以上の構成を有する細胞培養装置１では、制御手段８は、計測装置１２によって得られる培養液ＭのｐＨ値、又は溶存二酸化炭素濃度の計測値と、攪拌機９の攪拌回転数の入力値から、ガス交換手段４の気相部４１に通気する空気混合ガスの総通気量とガス組成の適正値を算出し、弁７を操作してガス交換手段４の気相部４１に対する空気混合ガスの通気を制御する。これによって、培養細胞の増殖、又は代謝反応に適正な培養液ＭのｐＨ、又は溶存二酸化炭素濃度を維持することができる。図５に、一例としてＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞において培養実験から得られた細胞増殖速度、及び到達細胞濃度における溶存二酸化炭素濃度の依存性を示す。なお、目的細胞の培養における溶存二酸化炭素濃度の規定値は、予め設定しておくことが好ましい。例えば、図５に示す特性を有する細胞の場合、細胞の増殖速度、又は到達細胞濃度が１／２に低下する溶存二酸化炭素濃度の値として４０％を規定値とすることができる。さらに溶存二酸化炭素濃度の規定値を低く設定して、例えば２０％とすることで、細胞の培養を効率的に行い、目的物質の生産性を向上させることが可能となる。
【００４６】
前記した散気手段３の構造については図示しないが、多孔質材料から形成された筒状部材を有するものを例示することができる。ここで、多孔質材料としては、例えば、金属焼結体、有機高分子多孔質体、四フッ化エチレン樹脂、ステンレス、スポンジ又は軽石を使用することができる。多孔質材料としては、約１０〜２００μｍの内径を有する孔が形成された材料を使用するのが好ましい。散気手段３は、比較的に小径の気泡を培養液Ｍに供給することで、培養液Ｍと気泡の接触面積を大とすることができ、培養液Ｍ中に効率的に酸素を供給することができる。このように、散気手段３は、培養液Ｍへ酸素を供給するための気泡を発生すればよいため、前記したような構成に限定されるものではない。例えば、散気手段３としては、複数枚のメッシュを重ね合わせた部材から構成してもよい。この場合、複数枚のメッシュを重ね合わせた部材を介して気泡が形成され、培養液Ｍへ気泡を供給することができる。
【００４７】
なお、本発明に係る細胞培養装置１は、図１には図示していないが、一般的な細胞培養装置に含まれる各種の設備を備えるものであってもよい。このような各種の設備としては、例えば、空気、酸素、窒素及び炭酸ガス等のガス供給設備、温水冷水供給設備、蒸気供給設備、給排水設備及び排気装置を例示することができる。
【００４８】
（細胞培養装置１での細胞培養の一例）
次に、細胞培養装置１での細胞培養の一例を説明する。
以上のように構成された細胞培養装置１では、培養液Ｍを培養槽２に充填した後、培養対象の細胞を播種して培養を開始する。このとき、培養液Ｍは、駆動用モータ１０により駆動される攪拌翼９で撹拌されて均一に混合される。培養に必要な酸素は、酸素含有ガスを槽底部に配置された散気手段３から供給される液中通気法と、ガス供給装置１１から培養槽２の上部気相領域（ヘッドスペース）に通気する上面通気法の二つの方法により供給される。
【００４９】
液中通気の場合、気泡径が小さいほど体積当たりの気液界面が大きくなって必要な酸素供給量を得るための通気量が少なくなる。このことから酸素供給のためには、主として、散気手段３によって形成される小さな気泡を用いて通気を行うことが好ましい。ここで、散気手段３に通気する酸素含有ガスとしては、酸素に空気や炭酸ガスを混合して用いてもよいが、酸素分圧が低下することにより通気量の増加を招き、結果的に泡沫層を拡大させるため、酸素を用いる方が好ましい。
【００５０】
散気手段３の制御においては、培養液Ｍ中の溶存酸素濃度を制御量とし、酸素通気量を操作因子とする。すなわち、計測装置１２で得られた酸素濃度に関する計測値は、制御手段８に電子データとして伝送される。制御手段８においては、計測値と予め設定された目標値とを比較して、動作信号を弁６、７に伝達してそれぞれの開度を操作する。これにより、散気手段３から供給される酸素含有気泡によって培養液Ｍに対して酸素が供給されることとなる。この場合、制御手段８は、散気手段３への通気量を制御することによって、酸素濃度に関する測定値が目標値に収束するよう制御動作を実行する。
【００５１】
このようにして細胞培養を継続すると、培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素濃度が上昇する。そのため、細胞培養装置１では、計測装置１２で測定した溶存二酸化炭素濃度が設定値に達したときに、ガス交換手段４に空気混合ガス（窒素又は酸素のうちの少なくとも一種を空気と混合したガス）、好ましくは二酸化炭素非含有ガス（低濃度の二酸化炭素を含有することがあってもよい）を通気することが好ましい。培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素は、ガス交換手段４を構成する二酸化炭素透過膜を介して、気相部４１中の空気混合ガス中に拡散することとなり（図２Ｂ参照）、培養液Ｍから溶存二酸化炭素を除去することができる。なお、前記した溶存二酸化炭素濃度の設定値としては、図５に示した溶存二酸化炭素濃度に対する依存性を示すグラフにおいて細胞増殖が阻害され難いと考えられる値、例えば、飽和ガス濃度に対して２０％などとすることができるがこれに限定されるものではない。
【００５２】
このように、本発明に係る培養装置１は、空気混合ガス（好ましくは前記した二酸化炭素非含有ガス）を用いてガス交換手段４から気泡を発生させることなく、溶存二酸化炭素濃度を除去することができる。これによって、散気手段３から供給する気泡の通気量に対して制限することが無いので、細胞の培養に必要な酸素の供給量を制限することが無く、良好な培養を行うことができる。なお、培養液Ｍ中の溶存二酸化炭素濃度は、培養液ＭのｐＨ値を測定してこの値を用いて適正な制御値を算出してもよい。ｐＨの設定値としては、例えば、一般にｐＨ６から８、より好適にはｐＨ７．０から７．５などとすることができるがこれに限定されるものではない。
【００５３】
以上、本発明の一実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置について詳細に説明したが本発明の主旨はこれに限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
また、前記した各構成、機能、処理部、処理手段、制御手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（Solid State Drive）等の記録装置、又は、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。
また、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。
【符号の説明】
【００５４】
１      細胞培養装置
２      培養槽
３      散気手段
４      ガス交換手段
５      通気手段
６、７  弁
８      制御手段
９      攪拌翼
１０    駆動用モータ
１１    ガス供給装置
１２    計測装置
Ｍ      培養液
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2014018174.tif 000006
【図２Ｅ】
2014018174.tif 000007
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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