(57)【要約】      （修正有）【課題】抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法を提供する。【解決手段】組織片から残留薬剤を有機溶剤に組織片を浸漬して除去する工程、組織片をタンパク質分解酵素を用いて処理し、更に、ホモジナイズ処理を行って組織懸濁液を調製する工程、及び組織懸濁液を培地で培養する工程を含んでなる、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法。上記工程に加え、培地に形成された真菌のコロニー数を計数する工程を更に含んでもよい。薬剤の抗真菌活性を正しく評価することができる。抗真菌薬を投与された患者について、その治療結果を正確に検討することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法であって、
組織片から残留薬剤を有機溶剤により除去する工程、
組織懸濁液を調製する工程、及び
組織懸濁液を培地で培養する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
残留薬剤を除去する工程と組織懸濁液を調製する工程とを同一工程で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
残留薬剤を除去する工程が、水溶液と有機溶剤とを重層した容器中の水溶液層に組織片を浸漬することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
残留薬剤を除去する工程が、組織片を容器中の有機溶剤に浸漬することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記容器を静置、攪拌又は振盪することを含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
組織懸濁液を調製する工程が、タンパク質分解酵素を用いて組織片を処理することを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
組織懸濁液を調製する工程が、ホモジナイズ処理することを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
培地に形成された真菌のコロニー数を計数する工程を更に含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れか一項に記載の生存真菌の検出方法で使用するための組織残留薬剤除去用有機溶剤。
【請求項１０】
組織残留薬剤除去用有機溶剤及び真菌用培養培地を含む、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織片内の真菌の検出方法及びそれを用いた抗真菌薬の抗菌活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗真菌薬の創薬では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ  ｖｉｖｏ試験において抗真菌活性を測定し、薬効を評価する必要がある。特に、感染モデル動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、抗真菌薬の臨床効果を予知するために重要である。感染モデルでの治療効果の判定は、臨床症状改善度の評価に加えて、治療後の生体組織に残る生存真菌の培養成績に基づいて行なわれる。培養成績は、一般的には、組織片を培地上で直接培養し、組織片ごとの菌陰性化が評価される。その際、組織片に残存する薬剤が培養成績に影響を与えることが問題となる。残留薬剤の影響により、偽陰性となる組織片があれば、薬剤の治療効果を過大に評価することになる。
また、真菌症の治療の分野では、治療結果の確認のために、病理組織培養を行なって、生存真菌の有無を検査することがある。その際、真菌症患者に投与された抗真菌薬が患部組織に残留していると、生存真菌が患部組織に存在していても、患部組織培養では真菌の生育が抑制され、偽陰性となる。
特に近年の外用抗真菌薬は、患者の負担を軽減する目的から用法が１日１回投与のものが主流であり、そのため組織残留性及び抗真菌活性を増大させた薬剤が開発される傾向にあるので、残留薬剤の培養成績に与える影響は大きいと懸念される。
【０００３】
残留薬剤の培養成績への影響を排除するために休薬期間を設ける方法があるが、組織残留期間は薬剤や組織の状態により異なるため確実ではない。生体組織試料の培養試験を、薬剤不活化物質としてレシチンとポリソルベート８０を含有する培地を用いて実施することが提案されている。また、組織残留薬剤を除去する方法として、組織片に、透析処理と遠心洗浄処理を行って薬剤を除去し、さらにトリプシン処理とホモジナイザー処理で分散し、液状化して培養し、菌数を求める方法が提案されている。この技術は手技が複雑で、薬剤によっては除去が困難である。
【０００４】
【特許文献１】国際出願公報第２００２／０１０４４０号
【特許文献２】特開２０１０−００４８９３号公報
【発明の概要】
【０００５】
残留薬剤の影響を有効に排除する手段や組織試料から残留薬剤を充分に除去する手段を含む組織片内の生存真菌の検出方法が必要とされる。
【０００６】
本発明は、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片から残留薬剤を有機溶剤により除去する工程、組織懸濁液を調製する工程及び組織懸濁液を培地で培養する工程を含む、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法を提供する。一態様では、上記残留薬剤を除去する工程と上記組織懸濁液を調製する工程とを同一工程で実施してもよい。一態様では、上記残留薬剤を除去する工程が、水溶液と有機溶剤とを重層した容器中の水溶液層に組織片を浸漬することを含んでもよい。別の態様では、上記残留薬剤を除去する工程が、組織片を容器中の有機溶剤に浸漬することを含んでもよい。一態様では、上記容器を静置、攪拌又は振盪することを含んでもよい。一態様では、上記組織懸濁液を調製する工程が、タンパク質分解酵素を用いて組織片を処理することを含んでもよい。一態様では、上記組織懸濁液を調製する工程が、ホモジナイズ処理することを含んでもよい。一態様では、上記工程に加え、培地に形成された真菌のコロニー数を計数する工程を更に含む、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法を提供する。
【０００７】
本発明は、上記の検出方法で使用するための組織残留薬剤除去用有機溶剤を提供する。本発明は、組織残留薬剤除去用有機溶剤及び真菌用培養培地を含む、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出用キットを提供する。
【０００８】
本発明により、抗真菌薬の創薬において薬剤評価法が改善される。また、本発明により、真菌症の治療の分野では診断法が改善される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．用語の説明  
真菌症は、真菌によるヒト及び動物の感染症である。感染部位により、皮膚真菌症や脳、肺、心臓などの内部臓器に感染が及ぶ内臓真菌症などに分類される。皮膚真菌症には、表在性皮膚真菌症及び深在性皮膚真菌症等がある。皮膚真菌症は、原因菌の種類により、皮膚糸状菌症（白癬）、カンジダ症、癜風、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、スポロトリコーシス、クロモミコーシス、接合菌症、ヒストプラズマ症、コクシジオイデス症、ブラストミセス症、フサリウム症及びシュードアレシュリア症などがある。皮膚糸状菌症（白癬）の原因菌は、トリコフィトン（Trichophyton）属、ミクロスポルム（Microsporum）属及びエピデルモフィトン（Epidermophyton）属 の菌種である。感染部位によって足白癬、体部白癬、股部白癬などがあり、一般に水虫、いんきんたむしと呼ばれる症状が生じる。カンジダ症の原因菌はカンジタ（Candida）属の菌種である。癜風の原因菌はマラセチア（Malassezia）属の菌種である。クリプトコッカス症の原因菌はクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans）である。アスペルギルス症の原因菌はアスペルギルス（Aspergillus）属の菌種である。スポロトリコーシスの原因菌はスポロトリクス・シェンキ（Sporothrix schenckii）である。クロモミコーシスの原因菌はフォンセカイア（Fonsecaea）属の菌種である。接合菌症の原因菌は、リゾプス（Rhizopus）属、ムコール（Mucor）属、アブシジア（Absidia）属の菌種である。その他、感染症を起こす真菌には、ブラストミセス・デルマチヂス（Blastomyces dermatitidis）、ヒストプラズマ・カプシラータム(Histoplasma capsulatum)、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、シュードアレシェリア・ボイディ（Pseudallescheria boydii）などがある。
【００１０】
真菌症の治療には、ポリエンマクロライド系、フルオロピリミジン系、アゾール系、キャンディン系、チオカルバメート系、アリルアミン系、ベンジルアミン系及びモルホリン系抗真菌薬などが使用される。ポリエンマクロライド系抗真菌薬は真菌の細胞膜障害作用を有し、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢリポソーム製剤、ナイスタチンなどの薬剤がある。フルオロピリミジン系抗真菌薬は核分裂阻害作用を有し、フルシトシンがある。アゾール系抗真菌薬はエルゴステロール合成阻害作用を有し、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ホスフルコナゾール、ボリコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、スルコナゾール硝酸塩、オキシコナゾール硝酸塩、クロコナゾール塩酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、ネチコナゾール塩酸塩、ラノコナゾール、ルリコナゾールなどがある。キャンディン系抗真菌薬はβ-Ｄ-グルカン合成阻害作用を有し、ミカファンギンナトリウムなどがある。アリルアミン系抗真菌薬にはテルビナフィン塩酸塩がある。チオカルバメート系抗真菌薬はエルゴステロール合成阻害作用を有し、トルナフタート、リラナフタートがある。ベンジルアミン系抗真菌薬には、ブテナフィン塩酸塩がある。モルホリン系抗真菌薬には、アモロフィン塩酸塩がある。その他の抗真菌薬にはグリセオフルビン、シクロピロクス・オラミンなどがある。
本明細書において「抗真菌薬」とは、真菌症の治療に使用できる全ての薬剤を意味し、上に列挙するものだけでなく、将来開発される薬剤を含む。
【００１１】
抗真菌薬の剤型は、外用剤、注射剤及び経口剤がある。表在性真菌症の治療には、主に外用剤のクリーム剤、軟膏及び液剤が使用され、経口剤も用いられることがある。内臓真菌症や深部皮膚真菌症などの治療には、全身投与のため経口剤や注射剤が使用される。
【００１２】
本明細書において「残留薬剤」とは、組織片の培養試験時に、組織片に残っている薬剤である。組織に貯留した薬剤が速やかに代謝や消失しなければ、その薬剤は組織への残留性が高い。組織残留性が高い薬剤が動物に投与された場合、一定の休薬期間後に生存真菌の培養試験を行なっても充分に薬剤が排除されず、残留薬剤により菌の発育が抑制され正しい薬効の評価はできない。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は抗菌薬の薬効の指標である。ＭＩＣの測定は一定量の微生物に対して抗菌薬を作用させ、所定時間培養後、発育の有無を調べる。ＭＩＣが非常に低い薬剤として、例えばルリコナゾールが知られている。このようなＭＩＣが低い薬剤はわずかな量が組織片中に残留していても、生存真菌のコロニー形成を阻害することがあり、正しい薬効の評価はできない。トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）及びトリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）に対するルリコナゾールのＭＩＣ値は、それぞれ０．０００１２〜０．００４μｇ／ｍＬ及び０．０００２４〜０．００２μｇ／ｍＬであり、ＭＩＣ９０はともに０．００１μｇ／ｍＬを示しラノコナゾールの１／４、塩酸テルビナフィンの１／３０、ビホナゾールの１／１０００以下であったとの報告がある（岸井2006、日薬理誌127：408-414）。
【００１３】
本明細書において「真菌感染動物」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に用いられる動物であればよく、特に限定されない。真菌感染モデルは、マウス、ラット及びモルモットなどの小動物を用いて作製されている。例えば、表在性真菌症治療薬の薬効評価のためのｉｎ  ｖｉｖｏ試験には、モルモット背部皮膚にトリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）を感染させた体部白癬モデルや、足底に感染させた足白癬モデル（Fujitaら1987、J Med Vet Mycol 25: 202-213）が確立されている。真菌感染動物はヒト患者であってもよい。
【００１４】
本明細書において「組織片」は、真菌が感染し、抗真菌薬によって処理された組織片であればよく、特に限定されない。例えば、真菌が感染した動物の皮膚、脳、肺、心臓などの臓器に抗真菌薬を処理し、その後、臓器から切り取った組織片である。皮膚という語は、表皮、真皮および皮下組織の３層を含み、付属器官として毛、爪、脂腺、汗腺、乳腺などを伴う組織を意味する。表皮は表面から順に角質層、淡明層、顆粒層、有棘層、および基底層の５層に区別され、角質層、淡明層および顆粒層は広義の角質層とされる。本明細書における角質とは、前記角質層の一部を表わすものとする。
【００１５】
本明細書において「抗真菌薬を投与された真菌感染動物」は、自然に真菌が感染した後に、又は真菌に適した手段で人為的に真菌を感染させた後に、抗真菌薬を投与された動物である。本明細書において「抗真菌薬を投与された真菌感染動物」は、予め抗真菌薬を投与した後に、自然に真菌が感染したか又は真菌に適した手段で人為的に真菌を感染させた動物であってもよい。抗真菌薬の投与量や投与スケジュールは、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の目的により、調整することができる。
【００１６】
本発明において「有機溶剤」は工業、化学、食品、医薬・化粧品の分野で使用される有機溶剤であれば何でもよい。本発明で残留薬剤を組織片から除去するために用いられる有機溶剤は、薬剤溶解性が高いものであればよく、特に限定されない。医薬用溶剤、化粧品用溶剤のほか、非イオン性界面活性剤、ポリエーテル、多価アルコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、長鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸トリグリセリド、植物油などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール（登録商標）４００等）、グリセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ-メチルピロリドン、クロタミトン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、トリカプリル酸グリセリル（トリカプリリン）、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、セバシン酸ジイソプロピル、クエン酸トリ２−エチルヘキシル、アジピン酸ジイソプロピル、モノカプリル酸プロピレングリコール、セバシン酸ジエチル、フタル酸ジエチル、イソステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸イソプロピル、リノール酸イソプロピル、リノール酸エチル、トリエチルヘキサノイン、ジカプリル酸プロピレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコール、エチルヘキサン酸ブチルエチルプロパンンジオール、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸ブチル、エチルヘキサン酸セチル、オレイン酸エチル、パルミチン酸エチルヘキシル、イソステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸エチルヘキシル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セバシン酸ジブチルオクチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ステアリン酸イソセチル、パルミチン酸イソステアリル、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オリブ油、アーモンド油、サフラワー油、ヒマシ油、コーン油、アボガド油、パーシック油、ククイナッツ油、ブドウ種子油、ピスタシオ種子油、ヘーゼルナッツ油、マカデミアナッツ油、メドウフォーム油、ローズヒップ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ホホバ油又はオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明で使用する「有機溶剤」は、水と相互に混和せず相分離するものであってもよい。本発明の有機溶剤として、油性溶剤を用いてもよい。本発明で使用する油性溶剤は、水に溶解も混和もしない溶媒をいい、例えばエステル油、動植物油、炭化水素油、シリコーン油、高級脂肪酸、高級アルコール等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用する油性溶剤は、液体油であることが好ましい。液体油は２５℃で液体の状態である油である。液体油としては、例えば、トリカプリル酸グリセリル（トリカプリリン）、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、セバシン酸ジイソプロピル、クエン酸トリ２−エチルヘキシル、アジピン酸ジイソプロピル、モノカプリル酸プロピレングリコール、セバシン酸ジエチル、フタル酸ジエチル、イソステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸イソプロピル、リノール酸イソプロピル、リノール酸エチル、トリエチルヘキサノイン、ジカプリル酸プロピレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコール、エチルヘキサン酸ブチルエチルプロパンンジオール、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸ブチル、エチルヘキサン酸セチル、オレイン酸エチル、パルミチン酸エチルヘキシル、イソステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸エチルヘキシル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セバシン酸ジブチルオクチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ステアリン酸イソセチル、パルミチン酸イソステアリル、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オリブ油、アーモンド油、サフラワー油、ヒマシ油、コーン油、アボガド油、パーシック油、ククイナッツ油、ブドウ種子油、ピスタシオ種子油、ヘーゼルナッツ油、マカデミアナッツ油、メドウフォーム油、ローズヒップ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ホホバ油又はオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において「重層」とは、少なくとも２種類の互いに溶解や混和しない液体を１つの容器にいれること、あるいは容器内にいれた少なくとも２種類の液体が相分離している状態を意味する。２種類の液体が水と油である場合は、水層と油層に分離する。
【００１９】
本明細書において「培地」は、特に限定がない場合は真菌の培養に用いる培地を指す。通常の真菌培養や菌の分離培養に用いられるものであれば特に限定されない。例えば、真菌の培養培地は、サブロー・デキストロース（寒天）培地、グルコース・ペプトン（寒天）培地、ポテト・デキストロース（寒天）培地、ツァペック（寒天）培地、ＧＴＹ（寒天）培地、麦芽（寒天）培地、コーンミール（寒天）培地、イースト・モルフォロジー（寒天）培地、ＹＭ（寒天）培地等である。真菌の培養培地は、本発明により検出される真菌症の原因菌以外の汚染菌の発育を防止するために抗生物質を含んでもよい。汚染菌の発育を防止するための抗生物質は、本発明により検出する真菌の増殖に影響がないものであれば何でもよい。抗生物質の培地中濃度は、本発明により検出する真菌の増殖に影響がない範囲で調整することができる。抗生物質は、真菌症が皮膚糸状菌症であり、原因菌がトリコフィトン属の真菌である場合は、例えば、ゲンタマイシン硫酸塩、テトラサイクリン塩酸塩、フロモキセフナトリウム、ドリペネム及びシクロヘキシミドなどであるがこれらに限定されない。本発明において真菌の培養培地は、添加剤としてレシチン及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０）を含有してもよい。国際出願公報第２００２/０１０４４０号は、生体組織の断片をレシチン及びポリソルベート８０を含む培地で培養することにより、組織内に残留する薬剤の影響を除去できると記載している。本発明において真菌の培養培地は、組織片内の残留薬剤を不活化させる物質を含んでもよい。本実施例３に示すように組織片内の残留薬剤を不活化させる物質としてレシチンとポリソルベート８０を含んでもよい。本発明において真菌の培養培地は、植物油及び界面活性剤を含有してもよい。本実施例３に示すように残留薬剤を不活化させる物質としてオリブ油とポリソルベート８０を含んでもよい。本発明において真菌の培養培地は、中鎖脂肪酸トリグリセリド及び界面活性剤を含有してもよい。残留薬剤不活化物質を含有する培地は残留薬剤の影響を充分に排除できるわけではなく、組織片中の残留薬剤を充分に除去する手段と組合せる必要がある。中鎖脂肪酸トリグリセリドは、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリルであってもよい。本実施例３に示すように残留薬剤を不活化させる物質としてトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリルとポリソルベート８０を含んでもよい。界面活性剤は、ポリソルベート８０やポリソルベート２０のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであってもよい。
【００２０】
本明細書において「タンパク質分解酵素」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、タンパク質の分解を触媒する酵素であり、プロテアーゼともいう。本発明で用いるタンパク質分解酵素は、組織片を分解できるものであれば特に限定されない。例えば、ディスパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、パパイン、コラゲナーゼ又はケラチナーゼなどであるがこれらに限定されない。組織片が皮膚片である場合は、表皮や真皮を分解できる酵素が好ましいが、これに限定されない。本発明で用いるタンパク質分解酵素は組織片を分解するための充分量を用いることが好ましいが、組織中の生存真菌への影響がない範囲にしなければならない。タンパク質分解酵素は緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して用いてもよい。
【００２１】
本明細書において「組織懸濁液」は、細かく分散された組織や細胞を含む液体である。組織懸濁液を調製するために用いる組織片に真菌が含まれている場合は、組織懸濁液は真菌を含む。組織懸濁液は、液体中の組織片を酵素処理や化学処理で分解することにより調製することができる。組織懸濁液は、液体中の組織片を物理的な力により分散することにより調製することができる。組織懸濁液は、液体中の組織片を酵素処理や化学処理で分解し、且つ物理的な力により分散することにより調製することができる。具体的には、「組織懸濁液を調製する」にはタンパク質分解酵素を用いて組織片を処理してもよいし、組織片が入った液体をホモジナイズ処理してもよい。組織懸濁液は真菌の生存に影響がない方法で調整される。本明細書において「組織懸濁液」は、ホモジナイズ液ともいう。
【００２２】
本明細書において「ホモジナイズ処理」は、物理的な力により、液体中の組織片を細かく分散する処理をいう。ホモジナイズ処理は、ガラスホモジナイザーを使用して行ってもよいし、撹拌機を回転力として利用したガラスホモジナイザーを使用して行なってもよいし、乳鉢を使用して行なってもよい。あるいは、密封チューブ式ホモジナイザーで行なってもよい。例えば、角質化したケラチンは可塑性が低く脆いため，物理的な力により分散することができる。タンパク質分解酵素処理した組織片を更にホモジナイズ処理することができる。ホモジナイズ処理し、細かく分散された組織や細胞を含む液体を、本明細書ではホモジナイズ液ともいう。
【００２３】
本明細書において「組織懸濁液を培地で培養する」とは、組織試料内の生存真菌を検出するために、培地を用いて組織懸濁液を培養することをいう。組織懸濁液中に生存真菌が含まれている場合には、培地で真菌の増殖が確認できる。組織懸濁液は、寒天培地に平板塗抹するか、又は混釈培養してもよい。
本明細書において培地に形成されたコロニー数（ｃｆｕ）から組織片内の生存真菌数を評価することができる。組織懸濁液を用いて培養を行なった場合は、コロニー数を生存真菌数として取り扱うことができる。
【００２４】
また、本明細書において「〜」を用いて数値範囲を表す場合、別段明記されない限り、その上限と下限を含むものとする。例えば、「Ａ〜Ｂ」なる記載は、Ａ 以上でありＢ以下であることを意味する。また、「を含有する」又は「を含む」には、「から実質的になる」及び「からなる」が含まれるものとする。「存在」には「残留」の意味を含む。
【００２５】
２．実施形態の説明
以下の実施形態において記載される方法は、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示するものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００２６】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究に取り組んだ結果、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片から、有効に残留薬剤を除去する手段を見出した。この残留薬剤除去手段を有する組織片内の生存真菌の検出方法により、薬剤の抗真菌活性を正しく評価することができる。また、この残留薬剤除去手段を有する組織片内の生存真菌の検出方法は、抗真菌薬を投与された患者について、その治療結果を正確に検討するために使用することができる。
【００２７】
本発明のある実施態様は、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片から残留薬剤を有機溶剤により除去する工程、組織懸濁液を調製する工程、及び組織懸濁液を培地で培養する工程を含んでなる、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。この検出方法は、残留薬剤を有機溶剤により除去する工程を含むため、残留薬剤の影響を排除した条件で組織片内の生存真菌を検出することができる。本発明において、組織片から残留薬剤を有機溶剤により除去する工程と組織懸濁液を調製する工程は何れを先に行なってもよいし、同時に行なってもよい。組織懸濁液を調製する工程を先に行なった場合は、有機溶剤による残留薬剤の除去処理は、分散された組織片を含む組織懸濁液に対して行なわれる。
本発明によれば、組織片内の生存真菌数を残留薬剤の影響を受けずに推定することが可能であり、薬剤の抗真菌活性を正しく評価することが可能となる。また、本発明によれば、患部に残留する治療薬の影響を受けずに生存真菌の有無を検査することが可能であり、抗真菌薬を投与された患者について、その治療結果を正確に検討することができる。
【００２８】
本発明に係る方法を用いて抗真菌活性を評価することができる「抗真菌薬」は、真菌症の治療に使用できる全ての薬剤を意味し、本明細書中に列挙するものだけでなく、将来開発される薬剤を含み、抗真菌薬の剤型は何れでもよく、投与経路は全身投与でも局所投与でもよい。
本発明により検出する真菌はヒト及び動物に感染するものであれば種類を問わない。本発明により検出する真菌は真菌症を生じる真菌が好ましい。具体的にはトリコフィトン属（Trichophyton）の菌種、ミルコスポルム属（Microsporum）の菌種、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Epidermophyton floccosum)、カンジダ属（Candida）の菌種、マラセチア属（Malassezia）の菌種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス属（Aspergillus）の菌種、スポロトリクス・シェンキ（Sporothrix schenckii）、フォンセカイア・ペドロゾイ（Fonsecaea pedrosoi）、リゾプス属（Rhizopus）の菌種、ムコール属（Mucor）の菌種、アブシジア属（Absidia）の菌種、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマチヂス（Blastomyces dermatitidis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、シュードアレシェリア・ボイディ（Pseudoallescheria boydii）、シタリジウム属（Scytalidium）の菌種、スコプラリオシス・ブレビカウリス（Scopulariosis breviacaulis）などがあるが、これらに限定されない。本発明により検出する真菌は、特に皮膚真菌症の原因菌となる真菌が好ましい。これは、皮膚真菌症の治療には皮膚残留性が高い薬剤が使用される傾向にあり、皮膚に残留した薬剤が培養成績に影響を与えることがあるためである。皮膚真菌症の原因菌となる真菌には、例えばトリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン・ベルコースム（Trichophyton verrucosum）、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ミクロスポルム・オーズイニ（Microsporum audouinii）、エピデルモフィトン・フロッコーサム、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカーリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、マラセチア・グロボーサ（Malassezia globosa）、マラセチア・ファーファー（Malassezia furfur）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、スポロトリクス・シェンキ、フォンセカイア・ペドロゾイ、ブラストミセス・デルマチヂス、フザリウム・ソラニ、シタリジウム・ジミジアツム（Scytalidium dimidiatum）、シタリジウム・ヒアリヌム（Scytalidium hyalinum）、スコプラリオシス・ブレビカウリス等があるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明に用いる「組織片」は、抗真菌薬が存在する組織片であるか、存在することが疑われる組織片であることが好ましい。本発明の方法によれば、残留薬剤の影響を排除することができるためである。本発明に用いる組織片は、動物から切り取った大きさのまま用いてもよいが、細かく切り分けてから使用してもよい。具体的には、１から１０ｍｍ角、２から６ｍｍ角、又は２から３ｍｍ角に切り分けてから使用してもよいが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明において「組織片から残留薬剤を有機溶剤により除去する工程」は、上に定義した有機溶剤を用いて、組織片を処理するものである。真菌感染動物に投与された薬剤に応じて、有機溶剤を選択し、処理時間を調整することができる。本発明に用いる「有機溶剤」は、水と混和せず二層になり、対象とする抗真菌薬に対する溶解性を有しているものを選択してもよい。本発明において「組織懸濁液を調製する工程」は、液体中で組織片を細かくする処理を行なうものである。組織片の種類や硬さに応じて、組織片を細かくする処理を選択し、処理時間を調整することができる。
本発明において「組織懸濁液を培地で培養する工程」は、真菌培養用の寒天培地を用いて、組織懸濁液を培養するものである。検出する真菌の種類により、培養条件を調整することができる。培養温度は、１０〜５０℃、又は２０〜４０℃であり、培養時間は１〜３０日間、又は１〜２０日間である。
【００３１】
本発明のある実施態様は、上記残留薬剤を除去する工程と上記組織懸濁液を調製する工程とを同一工程で実施する、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。本発明において「同一工程」とは、残留薬剤の除去と組織懸濁液の調整を、同じ容器中でほぼ同じ時期に併行して行うことを意味する。
本発明によれば、組織片の酵素処理中に真菌が残留薬剤の影響により減少することを防止することができる。酵素処理中に残留薬剤を除去する処理を行うため、効率的に薬剤を除去することが出来得る。
【００３２】
本発明のある実施態様は、上記残留薬剤を除去する工程は、水溶液と有機溶剤とを重層した容器中の水溶液層に組織片を浸漬することを含む抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。本発明によれば、水溶液層に溶出した薬剤及び細かく分散された組織にある薬剤を有機溶剤により効率的に回収することができる。
本発明において、組織片を浸漬する「水溶液層」は、滅菌水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液、酵素溶液などである。組織片を浸漬する水溶液層は、特にリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水が好ましい。組織片を浸漬する水溶液層は、本発明により検出する真菌症の原因菌以外の汚染菌の発育を防止するために抗生物質を含んでもよい。抗生物質は、ゲンタマイシン硫酸塩、テトラサイクリン塩酸塩、フロモキセフナトリウム、ドリペネム及びシクロヘキシミドなどであるがこれらに限定されない。本発明の有機溶剤として、上に定義した油性溶剤を用いてもよいが、これらに限定されない。真菌の発育阻害作用のある有機溶剤であっても、水溶液に重層することにより使用できる場合がある。
本発明において、「水溶液と有機溶剤とを重層」すると、比重の差により、水溶液からなる水相と有機溶剤相のどちらが下層となるかが決まる。特に、有機溶剤として油性溶剤を使用する場合、比重が軽い油性溶剤が上層となり、水溶液が下層となることが多い。従って、容器に組織片を入れると、組織片は下層まで沈下し、水溶液中に浸漬することとなる。組織片が浮いて沈下しなかった場合は、力を加えて、水溶液中に組織片を浸漬させてもよい。組織片を水溶液層に浸漬してから有機溶剤を重層してもよいし、水溶液層に有機溶剤を重層してから組織片を水溶液層に浸漬してもよい。後者の場合、有機溶剤が上層であるならば、有機溶剤面に組織片を落下させてもよいし、ピンセットなどで水溶液層に組織片を加えてもよいし、遠心処理により組織片を沈殿させてもよい。
本発明において、水溶液は組織懸濁液であってもよく、その場合は、有機溶剤は組織懸濁液に重層される。有機溶剤は、タンパク質分解酵素処理により得られた組織懸濁液、ホモジナイズ処理により得られた組織懸濁液、あるいはタンパク質分解酵素処理とホモジナイズ処理により得られた組織懸濁液に重層してもよい。本発明で用いる水溶液の体積は、組織片が水溶液に浸漬するための充分量であることが好ましい。例えば組織片重量の１〜９９倍量、１〜４９倍量、１〜３９倍量、１〜２９倍量、１〜１９倍量、又は４〜１９倍量の水溶液（Ｗ／Ｖ）を用いることができる。容器内の水溶液層と有機溶剤層の容積比は、１：１から１：１０の範囲、１：１から１：５の範囲、又は１：１から１：３の範囲、あるいは１：１０から１：１の範囲、１：５から１：１の範囲、又は１：３から１：１の範囲であるが、これに限定されない。水溶液と有機溶剤とを重層処理する時間は、残留薬剤が有機溶剤に移行するために充分な時間であればよく、例えば１分から２４時間であるが、液量などの条件に応じて変更可能である。重層処理とタンパク質分解酵素処理を同一工程で実施する場合は、どちらかの条件に合わせて、処理時間を調製することができる。
【００３３】
本発明のある実施態様は、残留薬剤を除去する工程が、組織片を容器中の有機溶剤に浸漬することを含む抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。本発明において、有機溶剤は薬剤溶解性の高いものであれば、特に限定されない。有機溶剤は、真菌の生存に影響を及ぼさないものが特に好ましい。本発明の有機溶剤は、上に定義した油性溶剤であってもよいし、それ以外の有機溶剤であってもよい。本発明によれば、組織片を有機溶剤に浸漬することにより、有機溶剤に薬剤が移行し、残留薬剤の影響を排除した条件で組織片内の生存真菌を検出することができる。組織片を容器中の有機溶剤に浸漬する時間は、残留薬剤が有機溶剤に移行するために充分な時間であればよく、例えば１分から２４時間であるが、液量などの条件に応じて変更可能である。
【００３４】
本発明のある実施態様は、上記容器を静置、攪拌又は振盪することを含む抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。本発明において「静置」とは、容器に振動を与えず、あるいは容器の内容物を撹拌しないで、容器を一定時間、静止した状態におくことを意味する。本発明において「撹拌」とは、容器の内容物が混合されることを意味する。具体的には、撹拌は、撹拌棒等を使用して手動で行なってもよいし、マグネチックスターラや実験用ミキサーなど攪拌機を使用して実施されてもよい。本発明において「振盪」とは、容器を激しく振り動かされ、それにより容器の内容物が撹拌されることを意味する。具体的には、振盪は、容器を手で激しく振り動かしてもよいし、振盪機などを使用して実施されてもよい。振盪は、容器に封をして実施されてもよい。  本発明によれば、容器を静置、撹拌又は振盪することにより、薬剤が組織片から水溶液又は有機溶剤に移行することが促進される。容器を静置、撹拌又は振盪する時間は、水溶液と有機溶剤とを重層する処理や組織片を有機溶剤に浸漬する処理の時間に応じて決定されてもよい。容器が水溶液と有機溶剤を含むならば、撹拌又は振盪により両者が混じり合い、水溶液から有機溶剤への薬剤の移行が促進される。容器を静置、撹拌又は振盪後に遠心処理し、水溶液と有機溶剤との相分離を促してもよい。
【００３５】
本発明のある実施態様は、上記組織懸濁液を調製する工程がタンパク質分解酵素を用いて組織片を処理することを含む抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。タンパク質分解酵素による組織片の処理は、組織片と、タンパク質分解酵素を含む液体とを混ぜることによって行なわれてもよい。タンパク質分解酵素を含む液体は、滅菌水、滅菌脱イオン水、生理食塩水、緩衝液、特にリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水であるが、これらに限定されない。残留薬剤を除去する工程で使用する組織片を浸漬する水溶液に、タンパク質分解酵素を加えてもよい。タンパク質分解酵素を含む液体は、本発明により検出する真菌症の原因菌以外の汚染菌の発育を防止するために抗生物質を、検出する真菌の増殖に影響がない範囲で含んでもよい。抗生物質は、ゲンタマイシン硫酸塩、テトラサイクリン塩酸塩、フロモキセフナトリウム、ドリペネム及びシクロヘキシミドなどであるがこれらに限定されない。
【００３６】
本発明によれば、組織片をタンパク質分解酵素処理することにより、組織片が分解され、残留薬剤の除去効果が高まる可能性がある。本発明において使用するタンパク質分解酵素は、組織片が皮膚片である場合、角質（ケラチン）やコラーゲンを分解できるものが好ましい。特にコラゲナーゼ処理は真皮層が厚く組織の弾力性に富む体部の感染皮膚に有効である。タンパク質分解酵素の水溶液中濃度は、例えば０．１から１００００ｕｎｉｔ／ｍＬの間、１から９０００ｕｎｉｔ／ｍＬの間、１０から７０００ｕｎｉｔ／ｍＬの間、又は１００ｕｎｉｔ／ｍＬから５０００ｕｎｉｔ／ｍＬの間である。タンパク質分解酵素処理のため、使用するタンパク質分解酵素の至適温度により、組織片を分解させるための充分な時間インキュベートする。インキュベーションの温度は、２０から５０℃、又は２５から４５℃が好ましい。組織片をコラゲナーゼ処理する場合には、２５から４５℃で１時間から２４時間インキュベーションすることが好ましい。特にインキュベーションは、静置、撹拌又は振盪で実施されてもよく、特に連続振盪してもよいし、あるいは静置中に時々攪拌・振盪してもよい。タンパク質分解酵素処理のためインキュベーションをする間、タンパク質分解酵素を含む水溶液層に、有機溶剤を重層してもよい。これにより、残留薬剤の除去と組織懸濁液の調整を、同じ容器中でほぼ同じ時期に併行して行うことができる。これにより、酵素処理中の残留抗真菌薬による菌数減少を防止することができる。また、時間を要する処理を２つ同時に行なうことができ、迅速化が期待できる。物理的な力により組織片を細かく分散することができる場合は、タンパク質分解酵素処理はしなくてもよい。ホモジナイズ処理とタンパク質分解酵素処理と組み合わせて使用することも有効である。
【００３７】
本発明の別の実施態様は、組織懸濁液を調製する工程は組織片が入った水溶液層をホモジナイズ処理することを含む抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出方法である。組織片が入った水溶液層をホモジナイズ処理することにより、組織片が分散される。タンパク質分解酵素処理した組織片を更にホモジナイズ処理をしてもよい。コラーゲンは弾力性に富むため，物理的な力を加えても組織を分散できないので、コラーゲンに富む組織の断片を試験試料とする場合は、コラゲナーゼ処理により組織片の真皮層を消化することにより、物理的な力（ホモジナイズ処理）による分散が可能になる。組織懸濁液を培養に用いて培地に形成されたコロニー数を計数するので定量的に評価することができる。
【００３８】
本発明のある実施態様は、上記工程に加え、寒天培地に形成された真菌のコロニー数を計数する工程を更に含む組織片内の生存真菌の検出方法である。平板塗抹法又は混釈培養法の何れを用いてもよいが、平板塗抹法は必然的に供試量が少なく、試料中の真菌が少ない時には検出できないことがあるため、混釈培養法の方が有効である。本発明の組織懸濁液は、残留薬剤の影響を除去するための処理が施されているので、平板塗抹法に比べ供試量が多くなる混釈培養に用いることが可能である。本発明によれば、残留薬剤の影響を排除した条件で組織片内の生存真菌数を推定することができる。寒天培地に形成された真菌のコロニー数を計数することにより、組織片内の生存真菌数を定量的に評価することができる。従来法では細かく切り分けた複数の皮膚片を寒天培地の上で培養し、皮膚片に菌の発育が観察されない場合を菌陰性とする定性的方法がある。薬剤の抗真菌活性を評価するため及び真菌症患者の診断を詳細に行なうためには、組織内の生存真菌数を定量化できた方がよい。
本発明のある実施態様において、植物油及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する真菌培養培地を用いて組織懸濁液を培養してもよい。本発明のある実施態様において、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する真菌培養培地を用いて組織懸濁液を培養してもよい。
【００３９】
本発明のある実施態様は、上記生存真菌の検出方法で使用するための組織残留薬剤除去用有機溶剤である。本発明によれば、組織残留薬剤除去用有機溶剤により、効率的に薬剤を除去することができる。
本発明のある実施態様は、組織残留薬剤除去用有機溶剤及び真菌用培養培地を含む、抗真菌薬を投与された真菌感染動物から得られた組織片内の生存真菌の検出用キットである。本発明の検出用キットに含有される真菌用培養培地は、不活化剤を含有した培地であってもよいが、不活化剤を含有した培地は不透明に混濁しコロニーが判別し難くなるという欠点がある。これに対して本キットに含まれる真菌用培養培地は、不活化剤を添加する必要がなく計測し易くなる。本発明によれば、簡便且つ正確に薬剤の抗真菌活性を正しく評価することができる。本発明のキットは、更に、容器、組織片を浸漬する水溶液、タンパク質分解酵素及び使用説明書からなる群から選択される１つを含んでもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらはそれぞれ一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において言及する試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明もしくは定法に従い使用した。
【００４１】
実施例１
１．接種菌液の調整
接種菌はTrichophyton mentagrophytes IFM40769、Trichophyton mentagrophytes IFM40995若しくはTrichophyton rubrum IFM45626を用いた。接種菌は、ＧＴＹ寒天培地(０．１％グルコース（和光純薬）、０．１％トリプチケースペプトン（Difco）、０．０５％酵母エキス（Difco）、２％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Difco）、ｐＨ５．８；Jpn. J. Med. Mycol.Vol. 34, 185-192, 1993)を用いて２７℃で２週間以上培養した後、培養表面を掻き取り０．０５％ （Ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、和光純薬）加滅菌生理食塩水に入れて撹拌した。これを滅菌ガーゼで濾過して菌塊を除き、分生子浮遊液を得て接種菌液とした。
２．コラゲナーゼ溶液の調製
コラゲナーゼ(和光純薬)をＰＢＳ溶液(日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ(−))に５００ｕｎｉｔ／ｍＬ又は１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるよう溶解した。更に白癬菌以外の汚染菌の発育を防止するためにゲンタマイシン硫酸塩(和光純薬)、テトラサイクリン塩酸塩(和光純薬)、フロモキセフナトリウム(塩野義製薬)を各々２５μｇ／ｍＬ力価およびシクロヘキシミド（ナカライテスク）を４００μｇ／ｍＬになるよう加え、コラゲナーゼ溶液を作成し、実施例２で使用した。実施例４及び６では、フロモキセフナトリウムを２５μｇ／ｍＬ力価、ドリペネム(塩野義製薬)を１２．５μｇ／ｍＬ力価およびシクロヘキシミドを４００μｇ／ｍＬになるよう加えたコラゲナーゼ溶液を使用した。
３．寒天培地の調整
白癬菌を組織片懸濁液から培養する寒天培地には、サブロー・デキストロース寒天（ＳＤＡ）培地（２％グルコース、１％ポリペプトン（日本製薬）、１．５％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）を用いた。実施例３で使用する１．０％レシチン（和光純薬）と０．７％ポリソルベート８０を添加したＳＤＡ培地（ＬＰ−ＳＤＡ培地）、及び実施例７と８で使用する０．５％オリブ油（和光純薬）と２％ポリソルベート８０を添加したＳＤＡ培地（ＯＰ−ＳＤＡ培地）のほか、オリブ油・レシチン・ポリソルベート８０を添加していないＳＤＡ培地（ＳＤＡ培地）を調整した。いずれの培地も、白癬菌以外の汚染菌の発育を防止するためにゲンタマイシン硫酸塩、テトラサイクリン塩酸塩、フロモキセフナトリウムを各々２５μｇ／ｍＬ力価およびシクロヘキシミドを４００μｇ／ｍＬ含有する。
【００４２】
実施例２
油性溶剤重層処理実験１
１．クリーム薬剤塗布皮膚片の調整
０．２ｇのゼフナート（登録商標）クリーム２％（鳥居薬品株式会社、一般名リラナフタート）あるいは０．２ｇのルリコン（登録商標）クリーム１％(株式会社ポーラファルマ、一般名ルリコナゾール）を、摘出したモルモットの背部皮膚片（約３×３ｃｍ、剃毛済み）に塗布した。薬剤塗布皮膚片は、加湿のため蒸留水１．０ｍＬで湿らせた濾紙(直径５５ｍｍ)を敷いたシャーレ(直径９０ｍｍ)に入れて、１５℃で４日間静置した。その際、薬剤塗布皮膚片は、湿らせた濾紙の上に重ねて敷いたアルミホイル上に置き、シャーレの上蓋はパラフィルムでシールした。静置後、薬剤塗布皮膚片は滅菌蒸留水（温度５０〜５５℃）で流水洗浄した。洗浄した薬剤塗布皮膚片はハサミで数ミリ角（２から３ｍｍ程度）に切り分けて以下の試験に供した。
２．油性溶剤の重層とコラゲナーゼ処理
プラスチック試験管内で数ミリ角に切り分けた薬剤塗布皮膚に９倍量（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼ溶液を加え、T. mentagrophytes IFM40769の接種菌液を最終分生子数が４×１０４／ｍＬとなるように接種し、試験溶液とした。
試験溶液に、油性溶剤としてジカプリル酸プロピレングリコール (日光ケミカルズ社製、Sefsol-228)又はオリブ油を、試験溶液と等量（Ｖ／Ｖ）重層し、若しくは重層せずコラゲナーゼ処理（３０℃、１５時間振盪）した。重層した油性溶剤はコラゲナーゼ処理後に取り除いた。
３．菌数の測定
コラゲナーゼ処理後の試験溶液は、簡易型攪拌機(アズワンＫ−１ＲＮ)を回転動力に利用したガラスホモジナイザーに入れて分散しホモジナイズ液とした。
各ホモジナイズ液は滅菌生理食塩水で希釈し、ＳＤＡ培地を用いて混釈培養した。２７℃で培養後、形成されたコロニー数を計数し、ホモジナイズ液から得られた生存菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を算出した（表１）。
表１
2014180236.tif 000002
表１から、コラゲナーゼ処理時に Sefsol-228やオリブ油を用いて重層処理した場合の方が、重層処理しない場合より回収された菌数は多く、重層処理によって残留抗真菌薬が原因の菌数減少が抑制されたことが確認された。
【００４３】
実施例３
抗真菌薬不活化剤の検証
レシチンとポリソルベート８０とを含有する培地は抗真菌薬を不活化する効果を有することが報告されている。本実施例では、さらにオリブ油とポリソルベート８０を含有する培地およびトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリルとポリソルベート８０を含有する培地が、抗真菌薬を不活化する効果を有するか検証する。この検証にあたっては、寒天平板希釈法により、抗真菌薬の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
１．寒天平板希釈法に使用する寒天培地平板の調整
寒天平板希釈法に使用するＳＤＡ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、１．５％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）は、抗真菌薬及び抗真菌薬の不活化剤を含有する。不活化剤として０.１％レシチンと０．７％ポリソルベート８０、１％レシチンと０．７％ポリソルベート８０、０．５％オリブ油と１％ポリソルベート８０、０．５％トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル(ミグリオール８１２、ミツバ貿易株式会社)と１％ポリソルベート８０、あるいは１％ポリソルベート８０を、ＳＤＡ培地に添加した。抗真菌薬としてルリコナゾールを使用するため、市販のルリコン（登録商標）液１％より抽出精製したルリコナゾール原末をＤＭＳＯに溶解して希釈系列を作製して、ＳＤＡ培地および各不活化剤を添加したＳＤＡ培地に添加した。
２．菌接種
T. mentagrophytes IFM40995の接種菌液（分生子数１０５／ｍＬ）５０μＬを各平板上に接種した。２７℃で７日間培養し、菌の発育が認められない最小濃度をＭＩＣとした（表２）。
表２
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不活化剤無添加のＳＤＡ培地と比較して、オリブ油とポリソルベート８０を添加した培地、およびミグリオール８１２とポリソルベート８０を添加したＳＤＡ培地ではＭＩＣの値が大きい。これは、オリブ油とポリソルベート８０を添加した培地及びミグリオール８１２とポリソルベート８０を添加した培地が、ルリコナゾールの抗菌活性を不活化することを示す。このことからレシチンとポリソルベート８０の組合せのみでなく、オリブ油とポリソルベート８０の組合せ及びミグリオール８１２とポリソルベート８０の組合せも薬剤不活化作用を有することが確認された。実施例７と８では薬剤不活化作用に優れるオリブ油とポリソルベート８０を添加した培地を使用した。
【００４４】
実施例４
油性溶剤重層処理実験２
１．外用液薬塗布皮膚片の調整
摘出したモルモット背部皮膚片（約３×３ｃｍ、剃毛済み）を用意し、ゼフナート（登録商標）外用液２％（鳥居薬品株式会社、一般名リラナフタート）、ルリコン（登録商標）液１％（株式会社ポーラファルマ、一般名ルリコナゾール）あるいはラミシール（登録商標）外用液１％（ノバルティス ファーマ株式会社、一般名テルビナフィン塩酸塩）を摘出皮膚重量１ｇあたり５０μＬ塗布した。薬剤塗布皮膚片は、加湿のため蒸留水１．０ｍＬで湿らせた濾紙(直径５５ｍｍ)を敷いたシャーレ(直径９０ｍｍ)に入れて、１０℃で１日間静置した。その際、薬剤塗布皮膚片は、湿らせた濾紙の上に重ねて敷いたアルミホイル上に置き、シャーレの上蓋はパラフィルムでシールした。静置後、薬剤塗布皮膚片は滅菌蒸留水（温度５０〜５５℃）で洗浄した。洗浄した薬剤塗布皮膚片はハサミで数ミリ角（２から３ｍｍ程度）に切り分けて、以下の試験に供した。
２．油性溶剤の重層とコラゲナーゼ処理
切り分けた薬剤塗布皮膚に皮膚重量の９倍量（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼ溶液を加え、T. mentagrophytes IFM40769の接種菌液を分生子数が５×１０５／ｍＬとなるように接種し、試験溶液とした。試験溶液にトリカプリル酸グリセリル（トリカプリリン、シグマ)あるいはSefsol-228を等量（Ｖ／Ｖ）重層し、若しくは重層せずコラゲナーゼ処理（３５℃、１２時間振盪）した。重層した油性溶剤はコラゲナーゼ処理後に取り除いた。 
３．菌数測定
コラゲナーゼ処理後の試験溶液は、簡易型攪拌機を回転動力として利用したガラスホモジナイザーに入れて分散しホモジナイズ液とした。各ホモジナイズ液は滅菌生理食塩水で希釈し、２種類のＳＤＡ寒天培地（レシチン・ポリソルベート８０添加有り：ＬＰ−ＳＤＡ、及びレシチン・ポリソルベート８０添加なし：ＳＤＡ）を用いて混釈培養した。２７℃で培養後、発育したコロニーを計数し、ホモジナイズ液から得られた生存菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を算出した。（表３）
【００４５】
表３
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油性溶剤の重層なしの場合、抗真菌薬の塗布群では、無塗布群に比べ、生存菌数が減少した。これは、皮膚に残留していた抗真菌薬の影響であると考えられる。コラゲナーゼ処理時にSefsol-228やトリカプリリンを重層した場合は菌数減少が抑制された。抗真菌薬の塗布群と無塗布群の比較から、組織片に残留する抗真菌薬による菌数減少作用を確認した。さらに重層の有無の比較から、重層処理により、残留抗真菌薬による菌数減少が抑制されることを確認した。また、重層処理をしない場合、不活化剤を添加した培地でも生存菌数が減少していた。一方で、重層処理によって薬剤不活化剤を添加した培地と添加しない培地とで同等の生存菌数が回収された。
【００４６】
実施例５
重層処理効果の検証
１．ホモジナイズ液中の薬剤濃度
実施例４で使用した油性溶剤を重層しなかったホモジナイズ液及びトリカプリリン重層したホモジナイズ液を用いた。各ホモジナイズ液０．５ｍＬを遠心(３０００ｒｐｍ、５分間)し、沈殿物および上清に分けて、それぞれ凍結乾燥させた。凍結乾燥した沈殿物および上清にアセトン０．５ｍＬを加えて超音波により攪拌し、２５℃で６時間振盪後、遠心(３０００ｒｐｍ、５分間)し、アセトン層を回収した。残渣に再度アセトン０．５ｍＬを加え超音波で攪拌し、２５℃で１４時間振盪後、遠心(３０００ｒｐｍ、５分間)し、回収したアセトン層を一回目の抽出液と合わせてアセトン抽出液とした。各抗真菌薬濃度を阻止円法により定量するため、各アセトン抽出液をメタノールで１０倍及び１００倍希釈し、アセトン抽出液５０μＬ、１０倍希釈液５０μＬ及び１００倍希釈液５０μＬを各々ペーパーディスク(８ｍｍ厚)に浸み込ませ、乾燥させた。
阻止円測定用培地平板は、ＳＤＡ培地（０．７５％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）にT. mentagrophytes IFM40769の試験菌液を分生子数が５×１０４／ｍＬとなるように接種して、シャーレ（直径９０ｍｍ）に９ｍＬ分注し水平に固化させた。
阻止円測定用培地平板に、上で調整したペーパーディスクを載せ、２７℃で６日間培養し、阻止円直径を計測した。各抗真菌薬の濃度と阻止円直径の近似式を得るために、既知濃度のゼフナート（登録商標）外用液（リラナフタート）、ルリコン（登録商標）液（ルリコナゾール）又はラミシール（登録商標）外用液（テルビナフィン塩酸塩）をメタノールに溶解して希釈列を作製し、上記のとおり阻止円直径を計測した。得られた近似式を用い、アセトン抽出液の阻止円直径から抗真菌薬濃度を換算し、ホモジナイズ液中に残留する抗真菌薬濃度とした（表４）。
２．油性溶剤中の薬剤濃度
油性溶剤(トリカプリリン、Sefsol-228など)中の抗真菌薬は阻止円測定用培地平板にはほとんど拡散しないため、油性溶剤に移行した残留薬剤濃度を阻止円直径から計測することができない。そこで、阻止円法を応用した方法で薬剤濃度を測定することを考え、重層処理に用いた油性溶剤を薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)プレートに吸着させ溶媒で展開し、油性溶剤と抗真菌薬を分離した。そして、ＴＬＣプレートの発育阻止帯を測定することにより、油性溶剤に移行した抗真菌薬の濃度を測定した。
実施例４で重層処理に使用したトリカプリリン５μＬをＴＬＣプレート(メルク：ＨＰＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４)にスポットし、展開溶媒(ヘキサン：アセトン：酢酸エチル＝８：１：１)で展開後、ＴＬＣプレートを１１〜１５ｍｍの幅で短冊状に切断した。T. mentagrophytes IFM40769の試験菌液を分生子数が５×１０４／ｍＬとなるように接種して、角シャーレ（ニッスイ各シャーレ１号）に２０ｍＬ分注して水平に固化させＴＬＣ阻止円測定用培地平板を作製した。短冊状のＴＬＣプレートをＴＬＣ阻止円測定用培地平板に載せ、２７℃で５日間培養し、ＴＬＣプレートの両脇に形成された阻止帯の幅を計測した。油性溶剤中の各抗真菌薬の濃度と阻止帯の幅との近似式を得るために、ゼフナート（登録商標）外用液（リラナフタート）、ルリコン（登録商標）液（ルリコナゾール）又はラミシール（登録商標）外用液（テルビナフィン塩酸塩）を油性溶剤で希釈して２倍希釈系列を調製し、上記のとおりＴＬＣプレートで展開し、阻止帯の幅を計測した。ＴＬＣプレートを用いて作成した各抗真菌薬の濃度と阻止帯の近似式を用い、ＴＬＣプレートの阻止帯の幅から抗真菌薬濃度を換算し、油性溶剤中の濃度とした（表４）。
【００４７】
表４
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重層処理に使用したトリカプリリン中の抗真菌薬濃度は、重層処理をしなかったホモジナイズ液中の抗真菌薬濃度と同程度であった。一方、トリカプリリン重層処理後のホモジナイズ液中の抗真菌薬濃度は、ゼフナート（登録商標）外用液とラミシール（登録商標）外用液で検出限界以下であり、ルリコン（登録商標）液では重層処理なしのホモジナイズ液中の抗真菌薬濃度に比べ１／１００未満であった。以上の結果から、重層処理により組織片中の残存薬剤の殆どが油性溶剤に移行していることを確認した。
【００４８】
実施例６
油性溶剤重層処理実験３
１．白癬感染背部皮膚片の調整
Ｉｎ  ｖｉｖｏモルモット背部白癬治療試験は井上ら (Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 34, 193-197, 1993) の方法に従って実施した。７週齢Hartley系雄性モルモットの背部を剃毛し、３ｃｍ四方の皮膚に、T. mentagrophytes IFM40769の接種菌液（分生子数１０８／ｍＬ）１０μＬを塗布して感染させた。３種類の市販外用抗真菌薬、すなわち０．２ｇのゼフナート（登録商標）クリーム２％、０．２ｇのルリコン（登録商標）クリーム１％、及び０．２ｇのラミシール（登録商標）クリーム１％（ノバルティスファーマ株式会社、一般名テルビナフィン塩酸塩)を背部感染部位に、菌接種日後７日目より１日１回、７日間連日塗布した。対照試験として、リラナフタートを含まないクリーム基剤を同様の方法により塗布した。薬剤塗布最終日の翌日に背部皮膚部位（約３ｃｍ×３ｃｍ）を摘出した後、数ミリ角に切断し、９倍量（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼ溶液を加え試験溶液とした。
２．油性溶剤の重層とコラゲナーゼ処理
試験溶液に、トリカプリリン、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン（NIKKOL Trialan308、日光ケミカルズ株式会社）およびSefsol-228を試験溶液の等量（Ｖ／Ｖ）重層し、若しくは重層せずコラゲナーゼ処理（３５℃、１２時間振盪）した。重層した油性溶剤はコラゲナーゼ処理後に取り除いた。
３．ホモジナイズ液の菌数測定
コラゲナーゼ処理後の試験溶液は、ガラスホモジナイザーに入れ、簡易型攪拌機で分散しホモジナイズ液とした。
各ホモジナイズ液は原液および滅菌生理食塩水で希釈した希釈液を、ＳＤＡ培地を用いて混釈培養した。２７℃で培養後、発育したコロニーを計数し、感染皮膚片中の生存菌数を算出した（表５）。
【００４９】
表５ 
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重層処理による残留抗真菌薬の除去により、重層処理をしなかった場合に得られた生存菌数よりも多くの生存菌数が得られた。このことからｉｎ  ｖｉｖｏのモルモット背部白癬治療試験における感染皮膚でも、重層処理により、休薬期間を設けることなく本来生存している白癬菌を検出できることを確認した。
【００５０】
実施例７
直接ホモジナイズ法での重層化による残留薬剤除去効果
足白癬モデルの感染部位である足底は、背部皮膚に比べ可塑性が低く、コラゲナーゼ処理せずに、ホモジナイザーにより直接分散しホモジナイズ液（直接ホモジナイズ液）を調整することができる。本実施例では、直接ホモジナイズ液を調整した後、油性溶剤を重層して薬剤除去を行なった。
７週齢Hartley系雄性モルモットの後肢足底に少量の滅菌脱脂綿を長さ約３ｃｍの絆創膏で仮止めした後、T. rubrum IFM45626の接種菌液（分生子数１０８／ｍＬ）１００μＬを接種し、ハイドロコロイド・ドレッシング材（バンドエイド  キズパワーパッド（登録商標）、ジョンソン＆ジョンソン）と５ｃｍ×７．５ｃｍの絆創膏（エラストポア（登録商標）、ニチバン）で密封固定し、１週間後に密封を解除した。０．２ｍＬのルリコン（登録商標）液あるいは０．２ｇのルリコン（登録商標）クリーム１％を感染させた足底に、菌接種日後２１日目より１日１回、１４日間連日塗布した。薬剤塗布終了後、７日目に足底皮膚片を摘出した。その後、数ミリ角に細切し、ガラスホモジナイザーに入れて、足底皮膚片の１９倍量（Ｗ／Ｖ）のＰＢＳを加え、簡易型攪拌機を回転動力として利用したガラスホモジナイザーを用いて分散し、足底皮膚片の直接ホモジナイズ液を調整した。このホモジナイズ液にミグリオール８１２を等量（Ｖ／Ｖ）重層し、直接ホモジナイズ液とミグリオール８１２を充分に攪拌（室温、１分以上）した後、遠心(３０００ｒｐｍ、５分間)により直接ホモジナイズ液とミグリオールを分離させ、油性溶剤を除去した。重層処理した足底皮膚片の直接ホモジナイズ液と、重層処理しない足底皮膚片の直接ホモジナイズ液を、それぞれＯＰ−ＳＤＡ培地を用いて、２７℃で培養後、形成されたコロニーを計数し、足底中の生存菌数を算出した（表６）。
表６
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薬剤無処理群（１群５匹１０足）の菌接種４１日目の足底生存菌数は、幾何平均２．５×１０５であった。
７日間の休薬期間を設け、薬剤不活化剤添加培地を用いても、ルリコナゾールでは残留抗真菌薬の影響により、白癬菌が検出されなかった。一方、薬剤不活化剤添加培地のみでは白癬菌が検出されない場合でも、直接ホモジナイズ液を重層処理することにより白癬菌が検出された。このことから、直接ホモジナイズ液の培養でも、重層処理により、本来生存している白癬菌を検出できることを確認した。
【００５１】
実施例８
油性溶剤浸漬処理による残留抗真菌薬の除去効果の検証
本実施例では、皮膚片の油性溶剤への浸漬が皮膚片中の残留薬剤を除去する効果を有するか検証する。
１．薬剤塗布皮膚の浸漬処理
実施例２と同様にしてルリコン（登録商標）クリーム塗布皮膚を調整した。プラスチック試験管内で数ミリ角に切り分けた薬剤塗布皮膚に９倍量（Ｗ／Ｖ）のトリカプリリン（パナセート８００、日油）を添加し振盪（１０℃、１４時間）した。その後、油性溶剤を取り除き浸漬処理皮膚片とした。
２．コラゲナーゼ処理
浸漬処理皮膚片もしくは無浸漬処理皮膚片に皮膚重量の９倍量（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼ溶液を加え、T. mentagrophytes IFM40769の分生子数が４×１０４／ｍＬとなるように接種し、コラゲナーゼ処理（３５℃、１４時間振盪）した。
３．菌数測定
コラゲナーゼ処理後の試験溶液は、簡易型攪拌機を回転動力として利用したガラスホモジナイザーに入れて分散しホモジナイズ液とした。各ホモジナイズ液は滅菌生理食塩水で希釈し、薬剤不活化剤添加および無添加のＳＤＡ培地（ＯＰ−ＳＤＡ及びＳＤＡ）を用いて混釈培養した。２７℃で培養後、発育したコロニーを計数し、ホモジナイズ液中の生存菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を算出した（表７）。
表７
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油性溶剤への浸漬なしの場合、抗真菌薬の塗布群では、無塗布群に比べ、生存菌数が減少した。これは、皮膚に残留していた抗真菌薬の影響であると考えられる。コラゲナーゼ処理前にトリカプリリンに浸漬した場合は菌数減少が抑制された。抗真菌薬の塗布群と無塗布群の比較から、組織片に残留する抗真菌薬による菌数減少作用を確認した。また、浸漬処理をしない場合、不活化剤を添加した培地でも生存菌数が減少していた。一方で、浸漬処理をした場合は、薬剤不活化剤を添加した培地と添加しない培地とで同等の生存菌数が回収された。