(57)【要約】      （修正有）【課題】植物細胞のゲノム中に外来配列を標的導入するための組成物及び方法の提供。【解決手段】植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、（ａ）前記植物細胞を、第１、第２、及び第５のＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡベクターと接触させるステップ、第５の配列が導入されるべきＤＮＡベクターの外来配列を含み、ドナーＤＮＡベクターの第１及び第２配列の間挿入されており、ここで前記植物細胞の前記ゲノム中の第３及び第４の配列は、染色体ＤＮＡ配列でありるステップ、（ｂ）一対の融合タンパク質であり、各融合タンパク質は、Ｆｏｋ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの間の融合物であるヌクレアーゼを前記細胞内で発現させ、前記第３及び第４配列の間の１又はそれ以上の対応するターゲット部位で染色体ＤＮＡを切断するステップを含む外来配列を導入するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２ＤＮＡ配列を含み、
第１配列は第３配列に相同、かつ第２配列は第４配列に相同であり、
第３および第４配列は染色体ＤＮＡ配列であり、そして
第３および第４配列の近接端部が少なくとも１ヌクレオチド対によって隔てられている
、ドナーベクター。
【請求項２】
第３および第４配列が内在性配列である、請求項１のベクター。
【請求項３】
第１または第２配列の少なくとも一方が１００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１
または請求項２のベクター。
【請求項４】
さらに第５配列を含み、第５配列が
（ａ）第１配列と第２配列の間に挿入され、および
（ｂ）外来配列である、
請求項１から３のいずれか一項のベクター。
【請求項５】
第５配列が少なくとも１塩基対のサイズを有する、請求項４のベクター。
【請求項６】
第５配列が選択可能マーカーをコードする配列を含む、請求項４のベクター。
【請求項７】
選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−ア
ミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳ
Ｐシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼからなる群
より選択される、請求項６のベクター。
【請求項８】
第５配列が選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする配列を含む、請求項４のベ
クター。
【請求項９】
第５配列が１またはそれ以上の転写調節配列を含む、請求項４のベクター。
【請求項１０】
第５配列がタンパク質の一部をコードする配列を含む、請求項４のベクター。
【請求項１１】
タンパク質の一部をコードする配列が染色体配列に相同な配列を含む、請求項１０のベ
クター。
【請求項１２】
第５配列が突然変異型染色体配列の野生型対応物を含む、請求項４のベクター。
【請求項１３】
第５配列が野生型染色体配列の突然変異型対応物を含む、請求項４のベクター。
【請求項１４】
第１配列が第３配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、請求項１から１３の
いずれか一項のベクター。
【請求項１５】
第２配列が第４配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、請求項１から１４の
いずれか一項のベクター。
【請求項１６】
第２配列が第４配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、請求項１４のベクタ
ー。
【請求項１７】
植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、
（ａ）細胞を請求項１から１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクターと接触さ
せるステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞内で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第３または第４配列のどちらか一方の３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを切
断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【請求項１８】
１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと
操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であって、
（ａ）細胞を請求項８に記載のターゲティングベクターと接触させるステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第３または第４配列のどちらか一方の３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを切
断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【請求項２０】
１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと
操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
請求項１７、１８、１９または２０のいずれか一項の方法に従って得られるトランスジ
ェニック植物細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物。
【請求項２３】
細胞のゲノムにおける分子内相同組換えの方法であって、
（ａ）第２配列に相同な第１配列を含むＤＮＡセグメントを用意するステップ、および
（ｂ）前記ＤＮＡセグメントをヌクレアーゼと接触させ、そのヌクレアーゼがＤＮＡセグ
メントを第３配列で切断するステップ
を含む方法。
【請求項２４】
ＤＮＡセグメントが細胞にとって内在性である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
相同組換えが染色体で起こる、請求項２３または請求項２４の方法。
【請求項２６】
第１配列と第２配列の間にあるＤＮＡが染色体から削除される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
第３配列がゲノム中でユニークである、請求項２３、２４、２５または２６のいずれか
一項の方法。
【請求項２８】
細胞が植物細胞である、請求項２３から２６のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
ヌクレアーゼが一対の融合タンパク質であり、各融合タンパク質がＩＩＳ型制限エンド
ヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物であ
る、請求項２３から２８のいずれか一項の方法。
【請求項３０】
第３配列が第１配列から少なくとも１００塩基対である、請求項２３から２９のいずれ
か一項の方法。
【請求項３１】
第３配列が第２配列から少なくとも１００塩基対である、請求項２３から３０のいずれ
か一項の方法。
【請求項３２】
第３配列が第１配列と第２配列の間にある、請求項２３から３１のいずれか一項の方法
。
【請求項３３】
第１または第２配列の一方がその生物にとって外来である、請求項２３から３２のいず
れか一項の方法。
【請求項３４】
第１および第２配列の両方がその生物にとって外来である、請求項２３から３２のいず
れか一項の方法。
【請求項３５】
染色体から削除される配列が選択可能マーカーの全部または一部をコードする、請求項
２６の方法。
【請求項３６】
選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−ア
ミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳ
Ｐシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼからなる群
より選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
削除されるＤＮＡが外来配列で置き換えられる請求項２６の方法であって、
（ａ）第４および第５配列（第４配列は第１配列に近接する削除されない配列に相同であ
り、第５配列は第２配列に近接する削除されない配列に相同である）、ならびに
（ｂ）外来配列
を含むポリヌクレオチドを細胞中に導入すること
をさらに含む方法。
【請求項３８】
外来配列が選択可能マーカーである、請求項３７の方法。
【請求項３９】
選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−ア
ミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳ
Ｐシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼからなる群
より選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
外来配列が選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする、請求項２３から３９のい
ずれか一項の方法。
【請求項４１】
外来配列がＲＮＡをコードする、請求項２３から３９のいずれか一項の方法。
【請求項４２】
ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
（ａ）第１および第２コード配列、ならびに
（ｂ）第１、第２および第３ターゲット配列
を含み、
それらの配列が第１ターゲット配列、第１コード配列、第２ターゲット配列、第２コー
ド配列、第３ターゲット配列の順に配置されており、
さらに第１ターゲット配列が第１染色体配列に相同、かつ第３ターゲット配列が第２染
色体配列に相同である、ターゲティングベクター。
【請求項４４】
第１コード配列が選択可能マーカーをコードする、請求項４３のベクター。
【請求項４５】
第２コード配列が選択可能マーカーをコードする、請求項４３または請求項４４のベク
ター。
【請求項４６】
第１コード配列が選択可能マーカーではないタンパク質をコードする、請求項４３また
は請求項４５のベクター。
【請求項４７】
第２コード配列が選択可能マーカーではないタンパク質をコードする、請求項４３、４
４または４６のいずれか一項のベクター。
【請求項４８】
第１および第２染色体配列が内在性染色体配列である、請求項４３から４７のいずれか
一項のベクター。
【請求項４９】
第１ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、請求項４３から４８のい
ずれか一項のベクター。
【請求項５０】
第２ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、請求項４３から４９のい
ずれか一項のベクター。
【請求項５１】
第３ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、請求項４３から５０のい
ずれか一項のベクター。
【請求項５２】
植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、
（ａ）細胞を請求項４３から５１のいずれか一項に記載のターゲティングベクターと接触
させるステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染
色体ＤＮＡを切断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【請求項５３】
１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと
操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、請求項５２の方法。
【請求項５４】
植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であって、
（ａ）細胞を請求項４３から５１のいずれか一項に記載のターゲティングベクターと接触
させるステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染
色体ＤＮＡを切断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【請求項５５】
１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと
操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
請求項５２または請求項５３の方法に従って得られるトランスジェニック植物細胞。
【請求項５７】
請求項５６に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物。
【請求項５８】
トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を削除するための方法であって、
（ａ）請求項５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第１ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第２ターゲット配列内で切断
する方法。
【請求項５９】
トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を除去するための方法であって、
（ａ）請求項５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第２ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断
する方法。
【請求項６０】
トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を除去するための方法であって、
（ａ）請求項５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第１ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断
する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物におけるゲノム工学、遺伝子ターゲティング、標的染色体組み込みおよ
びタンパク質発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
農学における大きな関心領域は、とりわけ、いくつかの植物ゲノムで全ヌクレオチド配
列が決定されていることを考えると、ゲノム配列の標的変更である。特に、内在性植物配
列を変換することができれば、数多くの応用（例えば栄養価、収量、ストレス耐性、病原
体抵抗性、および農業用化学薬品に対する耐性に影響を及ぼす作物形質の最適化、および
／または医薬化合物もしくは工業用化学薬品を生産するための生物工場としての使用に対
する植物の適応など）が容易になる。
【０００３】
真核生物では、相同組換えという自然現象を利用して、培養細胞中のゲノム配列を変更
する試みがなされてきた。例えばCapecchi (1989) Science 244:1288-1292、米国特許第
６，５２８，３１３号および同第６，５２８，３１４号を参照されたい。変更しようとす
る配列を含有するゲノム領域に対して、あるポリヌクレオチドが十分な相同性を有する場
合は、相同組換えにより、そのポリヌクレオチドの配列の一部または全部で、ゲノム配列
を置き換えることが可能である。しかし、これらの状況における相同組換えの頻度は極め
て低い。そのうえ、配列相同性を欠くゲノム位置における外来ポリヌクレオチドの挿入の
頻度は、相同組換えの頻度を桁違いに上回る。
【０００４】
外来ポリヌクレオチドに対して相同性を有するゲノムの領域におけるゲノムＤＮＡへの
二本鎖切断の導入は、培養細胞において、その部位での相同組換えを数千倍刺激すること
が明らかにされている。Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106、Choulik
a et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973、Donoho et al. (1998) Mol. Cell. B
iol. 18:4070-4078。Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201およびYa
nez et al. (1998) Gene Therapy 5:149-159も参照されたい。これらの方法では、メガヌ
クレアーゼ（すなわち、認識配列が非常に大きいので、関心対象のゲノムにはその認識配
列が存在しないか、まれにしか存在しないエンドヌクレアーゼ）の認識部位を望ましいゲ
ノム領域中に挿入することによって、望ましいゲノム領域におけるＤＮＡ切断が達成され
た。
【０００５】
しかし、メガヌクレアーゼ切断が刺激する相同組換えは、変更しようとするゲノム領域
の近傍における適切なメガヌクレアーゼ認識部位の偶然の存在、または変更しようとする
ゲノム領域の近傍への適切なメガヌクレアーゼ認識部位の指向的挿入（directed insersi
on）に依拠している。メガヌクレアーゼ認識部位は典型的な植物ゲノムではまれである（
または存在しない）し、適切なメガヌクレアーゼ認識部位の挿入も、他のゲノム変更に伴
う困難と同じ困難に悩まされるので、これらの方法は広く応用できるわけではない。
【０００６】
従って、任意の植物ゲノムにおいて配列の標的変更を行うための組成物および方法、な
らびにゲノムへの外来配列の標的導入を行うための組成物および方法は、依然として必要
とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５２８，３１３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５２８，３１４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Capecchi (1989) Science 244:1288-1292
【非特許文献２】Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106
【非特許文献３】Choulika et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973
【非特許文献４】Donoho et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078
【非特許文献５】Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201
【非特許文献６】Yanez et al. (1998) Gene Therapy 5:149-159
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、植物細胞において、関心領域での細胞クロマチンの標的切断および／または
所定の関心領域における相同組換えを行うための組成物および方法を提供する。植物細胞
は単子葉植物種（単子葉植物）または双子葉植物種（双子葉植物）に由来することができ
、培養細胞、任意の発生段階にある植物中の細胞、および全植物体から取り出された植物
細胞であって、その細胞（またはその子孫）がその植物に戻されるものも包含する。
【００１０】
細胞クロマチン中の関心領域は、例えばゲノム配列またはその一部であることができる
。組成物には、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン（例えば新規な特異性を有する
ジンクフィンガー結合ドメイン）と切断ドメインとを含む融合ポリペプチド、および操作
されたジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメインとを含む融合ポリペプチドが
包含される。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えばさまざまな制限エンドヌ
クレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。
【００１１】
一態様として、第１および第２ＤＮＡ配列を含み、（ｉ）第１配列は第３配列に相同、
かつ第２配列は第４配列に相同であり、（ｉｉ）第３および第４配列は染色体ＤＮＡ配列
であり、（ｉｉｉ）第３および第４配列の近接端部（near edge）が、少なくとも１ヌク
レオチド対によって隔てられているベクターを本明細書に記載する。いくつかの実施形態
では、第３および第４配列が内在性配列である。
【００１２】
本明細書に記載するベクターのいずれにおいても、第１または第２配列の少なくとも一
方は１００ヌクレオチドの長さを有する。また、本明細書に記載するベクターはいずれも
、第５配列をさらに含んでもよく、その場合、第５配列は（ａ）第１配列と第２配列の間
に挿入され、かつ（ｂ）外来配列である。いくつかの実施形態では、第５配列が少なくと
も１塩基対のサイズを有するが、２２キロ塩基対ほどの大きさであってもよい。
【００１３】
ベクター（例えば第５配列）はタンパク質またはタンパク質の一部をコードする配列も
含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質コード配列が選択可能マーカー（例えば
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシン
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリ
ラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダ
ラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼ）をコードする。別の実施形態で
は、タンパク質コード配列（例えば第５配列）が、タンパク質またはタンパク質の一部、
例えば染色体配列に相同な配列をコードする。
【００１４】
さらに別の実施形態では、ベクター（例えば第５配列）が、１またはそれ以上の転写調
節配列を含む。さらなる実施形態では、ベクター（例えば第５配列）が突然変異型染色体
配列の野生型対応物を含むか、あるいは野生型染色体配列の突然変異型対応物を含み得る
。
【００１５】
本明細書に記載するベクターのいずれにおいても、第１配列は第３配列に対して少なく
とも３５％の相同性を持ち得る。同様に、本明細書に記載するベクターのいずれにおいて
も、第２配列は第４配列に対して少なくとも３５％の相同性を持ち得る。一部の実施形態
では、第１配列が第３配列に対して少なくとも３５％〜５０％、少なくとも５０％〜７０
％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜８５％、少なくとも８５％〜９０％
、少なくとも９０％〜９５％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％また
は１００％の相同性を有する。一部の実施形態では、第２配列が第４配列に対して少なく
とも３５％〜５０％、少なくとも５０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくと
も８０％〜８５％、少なくとも８５％〜９０％、少なくとも９０％〜９５％、少なくとも
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有する。
【００１６】
さらにもう一つの態様として、植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法で
あって、（ａ）細胞を上述したベクターのいずれかと接触させるステップ、および（ｂ）
１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞内で発現させ、その１またはそれ以上のヌクレア
ーゼが第３または第４配列のどちらか一方の０.４〜３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを
切断するステップを含み、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによ
るゲノムへのターゲティングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法を本明
細書に記載する。いくつかの実施形態では、上記１またはそれ以上のヌクレアーゼが、Ｉ
ＩＳ型（Type IIS）制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガ
ー結合ドメインとの融合物である。
【００１７】
さらにもう一つの態様として、植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であっ
て、（ａ）細胞を上述したベクターと接触させるステップ、および（ｂ）１またはそれ以
上のヌクレアーゼを細胞内で発現させ、その１またはそれ以上のヌクレアーゼが第３また
は第４配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを切断するステッ
プを含み、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのベ
クターの組み込みを刺激するようになっている方法が、本明細書に提供される。いくつか
の実施形態では、１またはそれ以上のヌクレアーゼが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ
の切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である。
【００１８】
もう一つの態様として、（ａ）第１および第２コード配列と、（ｂ）第１、第２および
第３ターゲット配列とを含み、それらの配列が、第１ターゲット配列、第１コード配列、
第２ターゲット配列、第２コード配列、第３ターゲット配列の順に配置され、さらに第１
ターゲット配列は第１染色体配列に相同であり、かつ第３ターゲット配列は第２染色体配
列に相同であるターゲティングベクターを本明細書に記載する。第１および／または第２
コード配列は選択可能マーカーをコードすることができ、あるいは第１および／または第
２コード配列は選択可能マーカーでないタンパク質をコードすることもできる。第１およ
び第２染色体配列は内在性染色体配列であることができる。さらにまた、ベクターは、第
１、第２および／または第３ターゲット配列の１またはそれ以上の反復を含んでもよい。
【００１９】
もう一つの態様として、植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって
、（ａ）細胞を前段落に記載のターゲティングベクターと接触させるステップ、および（
ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌク
レアーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染色
体ＤＮＡを切断するステップを含み、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同
組換えによるゲノムへのターゲティングベクターの組み込みを刺激するようになっている
方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記１またはそれ以上のヌクレアーゼが切
断ハーフドメインを含み、例えばヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断
ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である。
【００２０】
もう一つの態様として、植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であって、（
ａ）細胞を２段落上に記載のターゲティングベクターと接触させるステップ、および（ｂ
）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌクレ
アーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染色体
ＤＮＡを切断するステップを含み、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組
換えによるゲノムへのターゲティングベクターの組み込みを刺激するようになっている方
法が提供される。いくつかの実施形態では、１またはそれ以上のヌクレアーゼが、ＩＩＳ
型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインと
の融合物である。
【００２１】
さらにもう一つの態様として、本明細書に記載する方法のいずれかに従って得られるト
ランスジェニック植物細胞も提供される。
【００２２】
もう一つの態様として、本明細書に記載するようにして得られるトランスジェニック植
物細胞を含む植物が、本明細書に提供される。
【００２３】
また、第１および第２コード配列、ならびに第１、第２および第３ターゲット配列を含
み、それらの配列が、第１ターゲット配列、第１コード配列、第２ターゲット配列、第２
コード配列、第３ターゲット配列の順に配置されているトランスジェニック植物細胞のゲ
ノムから配列を削除するための方法であって、（ａ）本明細書に記載するようにトランス
ジェニック植物細胞を用意すること、および（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレア
ーゼを発現させることを含み、第１ヌクレアーゼが第１ターゲット配列内で切断し、第２
ヌクレアーゼが第２ターゲット配列内で切断する方法も提供される。
【００２４】
さらなる態様として、第１および第２コード配列、ならびに第１、第２および第３ター
ゲット配列を含み、それらの配列が、第１ターゲット配列、第１コード配列、第２ターゲ
ット配列、第２コード配列、第３ターゲット配列の順に配置されているトランスジェニッ
ク植物細胞のゲノムから配列を削除するための方法であって、（ａ）本明細書に記載する
ようにトランスジェニック植物細胞を用意すること、および（ｂ）その細胞内で第１およ
び第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレアーゼが第２ターゲット配列内
で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断する方法が、本明細書に開示
されている。
【００２５】
さらにもう一つの態様として、第１および第２コード配列、ならびに第１、第２および
第３ターゲット配列を含み、それらの配列が、第１ターゲット配列、第１コード配列、第
２ターゲット配列、第２コード配列、第３ターゲット配列の順に配置されているトランス
ジェニック植物細胞のゲノムから配列を削除するための方法であって、（ａ）本明細書に
記載するようにトランスジェニック植物細胞を用意すること、および（ｂ）その細胞内で
第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレアーゼが第１ターゲッ
ト配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断する方法が、本明細
書に提供される。
【００２６】
もう一つの態様として、細胞（例えば植物細胞）のゲノムにおける分子内相同組換えの
方法であって、（ａ）第２配列に相同な第１配列を含むＤＮＡセグメントを用意するステ
ップ、および（ｂ）前記ＤＮＡセグメントをヌクレアーゼと接触させ、そのヌクレアーゼ
がＤＮＡセグメントを第３配列で切断するステップを含む方法が提供される。いくつかの
実施形態では、ＤＮＡセグメントがその細胞にとって内在性である。いくつかの実施形態
では、例えば第１配列と第２配列の間にあるＤＮＡが染色体から削除される場合など、相
同組換えが染色体内で起こる。染色体から削除される配列は、例えば選択可能マーカーの
全部または一部をコードし得る。削除されるＤＮＡを外来配列で置き換えてもよく、例え
ばその場合、本方法は、（ａ）第４および第５配列（第４配列は第１配列に近接する削除
されない配列に相同であり、第５配列は第２配列に近接する削除されない配列に相同であ
る）ならびに（ｂ）外来配列（例えば、選択可能マーカー、選択可能マーカー以外のタン
パク質またはその一部、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡなど）を含むポリヌクレオチドを細胞
中に導入することをさらに含む。本明細書に提供される方法のいずれにおいても、選択可
能マーカーは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−ア
ミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳ
Ｐシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼであること
ができる。
【００２７】
どの方法においても、第３配列（すなわちヌクレアーゼによって切断される配列）は、
ゲノム中でユニークであることができ、および／またはヌクレアーゼは一対の融合タンパ
ク質（各融合タンパク質は切断ハーフドメイン（例えばＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ
の切断ドメイン）と操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である）である
ことができる。さらにまた、第３配列は第１配列と第２配列（すなわち相同配列）の間に
あることができ、および／または第１および／または第２配列から少なくとも１塩基対の
位置にあることができる。
【００２８】
本明細書に記載する方法のいずれにおいても、第１および第２配列の一方または両方は
、当該生物にとって外来であることができる。
【００２９】
従って本開示は、限定するわけではないが、番号付けされた以下の実施形態を包含する
。
１．第１および第２ＤＮＡ配列を含み、第１配列が第３配列に相同、かつ第２配列が第
４配列に相同であり、
第３および第４配列が染色体ＤＮＡ配列であり、そして
第３および第４配列の近接端部が少なくとも１ヌクレオチド対によって隔てられている
、ドナーベクター。
【００３０】
２．第３および第４配列が内在性配列である、１のベクター。
【００３１】
３．第１または第２配列の少なくとも一方が１００ヌクレオチドの長さを有する、１ま
たは２のベクター。
【００３２】
４．さらに第５配列を含み、第５配列が
（ａ）第１配列と第２配列の間に挿入され、および
（ｂ）外来配列である、
１〜３のいずれかのベクター。
【００３３】
５．第５配列が少なくとも１塩基対のサイズを有する、４のベクター。
【００３４】
６．第５配列が選択可能マーカーをコードする配列を含む、４のベクター。
【００３５】
７．選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α
−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、Ｅ
ＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼからな
る群より選択される、６のベクター。
【００３６】
８．第５配列が選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする配列を含む、４のベク
ター。
【００３７】
９．第５配列が１またはそれ以上の転写調節配列を含む、４のベクター。
【００３８】
１０．第５配列がタンパク質の一部をコードする配列を含む、４のベクター。
【００３９】
１１．タンパク質の一部をコードする配列が染色体配列に相同な配列を含む、１０のベ
クター。
【００４０】
１２．第５配列が突然変異型染色体配列の野生型対応物を含む、４のベクター。
【００４１】
１３．第５配列が野生型染色体配列の突然変異型対応物を含む、４のベクター。
【００４２】
１４．第１配列が第３配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、１〜１３のい
ずれかのベクター。
【００４３】
１５．第２配列が第４配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、１〜１４のい
ずれかのベクター。
【００４４】
１６．第２配列が第４配列に対して少なくとも３５％の相同性を有する、１４のベクタ
ー。
【００４５】
１７．植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、
（ａ）細胞を１〜１６のいずれかに記載のターゲティングベクターと接触させるステップ
、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞内で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第３または第４配列のどちらか一方の３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを切
断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【００４６】
１８．１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメ
インと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、１７の方法。
【００４７】
１９．植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であって、
（ａ）細胞を８に記載のターゲティングベクターと接触させるステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第３または第４配列のどちらか一方の３キロ塩基対以内で染色体ＤＮＡを切
断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【００４８】
２０．１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメ
インと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、１９の方法。
【００４９】
２１．１７、１８、１９または２０の方法に従って得られるトランスジェニック植物細
胞。
【００５０】
２２．２１に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物。
【００５１】
２３．細胞のゲノムにおける分子内相同組換えの方法であって、
（ａ）第２配列に相同な第１配列を含むＤＮＡセグメントを用意するステップ、および
（ｂ）前記ＤＮＡセグメントをヌクレアーゼと接触させ、そのヌクレアーゼがＤＮＡセグ
メントを第３配列で切断するステップ
を含む方法。
【００５２】
２４．ＤＮＡセグメントが細胞にとって内在性である、２３の方法。
【００５３】
２５．相同組換えが染色体で起こる、２３または２４の方法。
【００５４】
２６．第１配列と第２配列の間にあるＤＮＡが染色体から削除される、２５の方法。
【００５５】
２７．第３配列がゲノム中でユニークである、２３、２４、２５または２６の方法。
【００５６】
２８．細胞が植物細胞である、２３〜２６のいずれかの方法。
【００５７】
２９．ヌクレアーゼが一対の融合タンパク質であり、各融合タンパク質がＩＩＳ型制限
エンドヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合
物である、２３〜２８のいずれかの方法。
【００５８】
３０．第３配列が第１配列から少なくとも１００塩基対である、２３〜２９のいずれか
の方法。
【００５９】
３１．第３配列が第２配列から少なくとも１００塩基対である、２３〜３０のいずれか
の方法。
【００６０】
３２．第３配列が第１配列と第２配列の間にある、２３〜３１のいずれかの方法。
【００６１】
３３．第１または第２配列の一方がその生物にとって外来である、２３〜３２のいずれ
かの方法。
【００６２】
３４．第１および第２配列の両方がその生物にとって外来である、２３〜３２のいずれ
かの方法。
【００６３】
３５．染色体から削除される配列が選択可能マーカーの全部または一部をコードする、
２６の方法。
【００６４】
３６．選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、
α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、
ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼから
なる群より選択される、３５の方法。
【００６５】
３７．削除されるＤＮＡが外来配列で置き換えられる２６の方法であって、
（ａ）第４および第５配列（第４配列は第１配列に近接する削除されない配列に相同であ
り、第５配列は第２配列に近接する削除されない配列に相同である）、ならびに
（ｂ）外来配列
を含むポリヌクレオチドを細胞中に導入すること
をさらに含む方法。
【００６６】
３８．外来配列が選択可能マーカーである、３７の方法。
【００６７】
３９．選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、
α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、
ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼから
なる群より選択される、３８の方法。
【００６８】
４０．外来配列が選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする、２３〜３９のいず
れかの方法。
【００６９】
４１．外来配列がＲＮＡをコードする、２３〜３９のいずれかの方法。
【００７０】
４２．ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、４１の方法。
【００７１】
４３．（ａ）第１および第２コード配列、ならびに
（ｂ）第１、第２および第３ターゲット配列
を含み、
それらの配列が第１ターゲット配列、第１コード配列、第２ターゲット配列、第２コー
ド配列、第３ターゲット配列の順に配置されており、
さらに第１ターゲット配列が第１染色体配列に相同、かつ第３ターゲット配列が第２染
色体配列に相同である、ターゲティングベクター。
【００７２】
４４．第１コード配列が選択可能マーカーをコードする、４３のベクター。
【００７３】
４５．第２コード配列が選択可能マーカーをコードする、４３または４４のベクター。
【００７４】
４６．第１コード配列が選択可能マーカーではないタンパク質をコードする、４３また
は４５のベクター。
【００７５】
４７．第２コード配列が選択可能マーカーではないタンパク質をコードする、４３、４
４または４６のベクター。
【００７６】
４８．第１および第２染色体配列が内在性染色体配列である、４３〜４７のいずれかの
ベクター。
【００７７】
４９．第１ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、４３〜４８のいず
れかのベクター。
【００７８】
５０．第２ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、４３〜４９のいず
れかのベクター。
【００７９】
５１．第３ターゲット配列の１またはそれ以上の反復をさらに含む、４３〜５０のいず
れかのベクター。
【００８０】
５２．植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、
（ａ）細胞を請求項４３〜５１のいずれかに記載のターゲティングベクターと接触させる
ステップ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染
色体ＤＮＡを切断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【００８１】
５３．１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメ
インと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、５２の方法。
【００８２】
５４．植物細胞中でタンパク質を発現させるための方法であって、
（ａ）細胞を４３〜５１のいずれかに記載のターゲティングベクターと接触させるステッ
プ、および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを細胞中で発現させ、その１またはそれ以上のヌ
クレアーゼが第１または第２染色体配列のどちらか一方の０.１〜３キロ塩基対以内で染
色体ＤＮＡを切断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへのターゲティ
ングベクターの組み込みを刺激するようになっている方法。
【００８３】
５５．１またはそれ以上のヌクレアーゼがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメ
インと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合物である、請求項５４の方法。
【００８４】
５６．５２または５３の方法に従って得られるトランスジェニック植物細胞。
【００８５】
５７．５６に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物。
【００８６】
５８．トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を削除するための方法であって、
（ａ）５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第１ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第２ターゲット配列内で切断
する方法。
【００８７】
５９．トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を除去するための方法であって、
（ａ）５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第２ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断
する方法。
【００８８】
６０．トランスジェニック植物細胞のゲノムから配列を除去するための方法であって、
（ａ）５６に記載のトランスジェニック植物細胞を用意すること、および
（ｂ）その細胞内で第１および第２ヌクレアーゼを発現させることを含み、第１ヌクレア
ーゼが第１ターゲット配列内で切断し、第２ヌクレアーゼが第３ターゲット配列内で切断
する方法。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Ａおよび１ＢはｐＤＡＢ１５８５と名付けられたターゲティングコンストラクトの概略図である。図１Ａはコンストラクトのさまざまなエレメントの直線的描写である。図１Ｂは環状コンストラクトの描写である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは代表的ＺＦＮとそれらのターゲット部位を表す。図２ＡはＺＦＮとその結合領域を表す。図２Ｂはターゲット部位を表す。
【図３】プラスミドｐＤＡＢ１４００の概略図である。
【図４】プラスミドｐＤＡＢ７８２の概略図である。
【図５】プラスミドｐＤＡＢ１５８２の概略図である。
【図６】プラスミドｐＤＡＢ３５４の概略図である。
【図７】プラスミドｐＤＡＢ１５８３の概略図である。
【図８】プラスミドｐＤＡＢ２４０７の概略図である。
【図９】プラスミドｐＤＡＢ１５８４の概略図である。
【図１０】プラスミドｐＤＡＢ２４１８の概略図である。
【図１１】プラスミドｐＤＡＢ４０４５の概略図である。
【図１２】プラスミドｐＤＡＢ１５７５の概略図である。
【図１３】プラスミドｐＤＡＢ１５７７の概略図である。
【図１４】プラスミドｐＤＡＢ１５７９の概略図である。
【図１５】プラスミドｐＤＡＢ１５８０の概略図である。
【図１６】プラスミドｐＤＡＢ３４０１の概略図である。
【図１７】プラスミドｐＤＡＢ１５７０の概略図である。
【図１８】プラスミドｐＤＡＢ１５７２の概略図である。
【図１９】プラスミドｐＤＡＢ４００３の概略図である。
【図２０】プラスミドｐＤＡＢ１５７１の概略図である。
【図２１】プラスミドｐＤＡＢ７２０４の概略図である。
【図２２】プラスミドｐＤＡＢ１５７３の概略図である。
【図２３】プラスミドｐＤＡＢ１５７４の概略図である。
【図２４】プラスミドｐＤＡＢ１５８１の概略図である。
【図２５】プラスミドｐＤＡＢ１５７６の概略図である。
【図２６】図２６Ａおよび２６ＢはｐＤＡＢ１６００と名付けられたターゲティングプラスミドベクターの概略図である。図２６Ａはプラスミドのさまざまなエレメントの直線的描写である。図２６Ｂは環状プラスミドの描写である。
【図２７】プラスミドｐＤＡＢ７００２の概略図である。
【図２８】プラスミドｐＤＡＢ７０２５の概略図である。
【図２９】プラスミドｐＤＡＢ１５９１の概略図である。
【図３０】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ１−Ｌ０−ＦｏｋＩの概略図である。
【図３１】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣＤ２７−Ｌ０−ＦｏｋＩの概略図である。
【図３２】プラスミドｐＤＡＢ１５９２の概略図である。
【図３３】プラスミドｐＤＡＢ１５９４の概略図である。
【図３４】図３４Ａ、ＢおよびＣは、プラスミドｐＤＡＢ１５９６およびｐＤＡＢ１５９８の概略図である。図３４Ａは線状化プラスミドの図である。図３４ＢはｐＤＡＢ１５９６を示す。図３４ＣはｐＤＡＢ１５９８を示す。
【図３５】プラスミドｐＤＡＢ１５７７の概略図である。
【図３６】プラスミドｐＤＡＢ１５７８の概略図である。
【図３７】図３７ＡおよびＢはプラスミドｐＤＡＢ１６０１の概略図である。図３７Ａはさまざまなエレメントを直線状に示している。図３７Ｂは環状プラスミドを示す。
【図３８】ＩＬ−１ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ融合物によって刺激される予想染色体間相同組換えを表す図である。
【図３９】Ｓｃｄ２７ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ融合物によって刺激される予想染色体間相同組換えを表す図である。
【図４０】組換え体のＰＣＲ解析を示す。１〜２０と名付けられたレーンは、ＳＣＤ２７−ＦｏｋＩ融合タンパク質コンストラクトによるＮＴ１−２４０の形質転換から得られる相同組換えイベントを示す。２１および２２と名付けられたレーンは、ＳＣＤ２７−ＦｏｋＩ融合タンパク質コンストラクトによるＮＴ１−２４０の形質転換から得られる相同組換えイベントを示す。対照レーンを左端の３レーンに示す。
【図４１】組換え体のサザンブロット解析を示す。１〜２０と名付けられたレーンは、ＳＣＤ２７−ＦｏｋＩ融合タンパク質コンストラクトによるＮＴ１−２４０の形質転換から得られる相同組換えイベントを示す。２１および２２と名付けられたレーンは、ＳＣＤ２７−ＦｏｋＩ融合タンパク質コンストラクトによるＮＴ１−２４０の形質転換から得られる相同組換えイベントを示す。対照レーンを左端の２レーンに示す。
【図４２】ＩＬ−１ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ融合物によって刺激される予想染色体内相同組換えを表す図である。
【図４３】ＩＬ−１−ＦｏｋＩ融合タンパク質を発現させる蛍光組織中でＧＦＰが再構成されることを裏付けるＰＣＲ解析である。
【図４４】プラスミドｐＳＢ１１の概略図である。
【図４５】プラスミドｐＳＢ１の概略図である。
【図４６】プラスミドｐＤＡＢ３８７２の概略図である。
【図４７】プラスミドｐＤＡＢ４３６５概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
詳細な説明
植物細胞クロマチンの標的切断、ならびに植物細胞ヌクレオチド配列の標的変更、例え
ば標的切断およびそれに続く染色体内相同組換えによるもの、または標的切断およびそれ
に続く外来ポリヌクレオチド（細胞ヌクレオチド配列に対して１またはそれ以上の相同性
領域を含むもの）とゲノム配列の間の相同組換えによるものに役立つ組成物および方法を
本明細書に開示されている。
【００９１】
ゲノム配列には、染色体中、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、
クロロプラスト）、人工染色体および細胞中に存在する他のあらゆるタイプの核酸、例え
ば増幅された配列、二重微小染色体ならびに内在性または感染細菌およびウイルスのゲノ
ムが包含される。ゲノム配列は正常（すなわち野生型）または突然変異型であることがで
き、突然変異型配列は、例えば挿入、欠失、転座、再配列、および／または点突然変異を
含むことができる。ゲノム配列はいくつかの異なる対立遺伝子の一つを含むこともできる
。
【００９２】
標的切断および標的組換えに役立つ組成物には、切断ドメイン（または切断ハーフドメ
イン）とジンクフィンガー結合ドメインとを含む融合タンパク質、これらのタンパク質を
コードするポリヌクレオチド、およびポリペプチドとポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドとの組合せが含まれる。ジンクフィンガー結合ドメインは１またはそれ以上のジ
ンクフィンガー（例えば２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィン
ガー）を含むことができ、任意のゲノム配列に結合するように操作することができる。従
って、その位置における切断または組換えが望まれる関心対象のターゲットゲノム領域を
同定することにより、本明細書に開示されている方法に従って、切断ドメイン（または切
断ハーフドメイン）と前記ゲノム領域中のターゲット配列を認識するように操作されたジ
ンクフィンガードメインとを含む１またはそれ以上の融合タンパク質を構築することがで
きる。そのような融合タンパク質（またはタンパク質）が細胞内に存在すると、融合タン
パク質の、その結合部位への結合と、前記ゲノム領域内での切断または前記ゲノム領域付
近での切断とが起こることになる。さらにまた、そのような細胞中に、ゲノム領域に相同
な外来ポリヌクレオチドも存在する場合には、ゲノム領域と外来ポリヌクレオチドの間で
相同組換えが高率に起こる。
【００９３】
一般論
本明細書に開示されている方法の実施ならびに本明細書に開示されている組成物の製造
および使用では、別段の表示がない限り、当分野の技術に含まれる分子生物学、生化学、
クロマチン構造およびクロマチン解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分
野における通常の技法を使用する。これらの技法は文献に詳しく説明されている。例えば
Sambook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 1989およびThird edition, 2001；Ausubel et al., CURRE
NT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期改
訂；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMAT
IN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHO
DS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, 「Chromatin」 (P.M. WassarmanおよびA.P.Wolffe eds.),
Academic Press, San Diego, 1999；ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119
, 「Chromatin Protocols」 (P.B. Becker ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照され
たい。
【００９４】
定義
「核酸」「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使
用され、線状または環状コンフォメーションで、一本鎖型または二本鎖型の、デオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用
語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきでない。これらの用語は、天然ヌクレオチ
ドの公知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および／またはリン酸基部分が改変された
ヌクレオチド（例えばホスホロチオエート主鎖）を包含することができる。一般に、特定
ヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有する。すなわちＡの類似体はＴと塩
基対を形成する。
【００９５】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語はアミノ酸残基のポリ
マーを指すために互換的に用いられる。この用語は、１またはそれ以上のアミノ酸が天然
に存在する対応アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適
用される。
【００９６】
「結合」とは、高分子間（例えばタンパク質と核酸の間）の配列特異的で非共有結合的
な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての
コンポーネントが配列特異的である必要はない（例えばＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接
触）。そのような相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特
徴づけられる。「アフィニティ」とは結合の強さを指し、結合アフィニティの増加はＫｄ
の低下と相関する。
【００９７】
「結合タンパク質」は、もう一つの分子に非共有結合的に結合することができるタンパ
ク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分
子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質
）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは自分自身に結合す
る（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができ、かつ／または１分
子もしくはそれ以上の異なるタンパク質もしくはタンパク質群に結合することができる。
結合タンパク質は、１タイプより多くの結合活性を有することができる。例えばジンクフ
ィンガータンパク質はＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有す
る。
【００９８】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１またはそれ
以上のジンクフィンガー（これは亜鉛イオンの配位によって安定化される構造を有する結
合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である）によって配列特異的な形でＤＮＡを結合する
タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ
結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略
記される。
【００９９】
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように、「操作
」することができる。ジンクフィンガータンパク質を操作するための方法の限定でない例
は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は天然には存在しな
いタンパク質であり、その設計／組成は主として合理的基準によってもたらされる。設計
のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データ
の情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適
用が含まれる。例えば米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同
第６，５３４，２６１号、および同第６，７８５，６１３号を参照されたい。また、国際
公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６
０号、国際公開第０２／０１６５３６号および国際公開第０３／０１６４９６号、ならび
に米国特許第６，７４６，８３８号、同第６，８６６，９９７号、および同第７，０３０
，２１５号も参照されたい。
【０１００】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、主として実験的プロセス、例えばファ
ージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などによってもたらされる
、天然には見出されないタンパク質である。例えば米国特許第５，７８９，５３８号、米
国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１
３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、米国特許第６，７３３，９７０号、米
国再発行特許第３９，２２９号、ならびに国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９
６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国
際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１
９７号および国際公開第０２／０９９０８４号を参照されたい。
【０１０１】
「配列」という用語は、あらゆる長さのヌクレオチド配列を指し、それはＤＮＡまたは
ＲＮＡであることができ、線状、環状または分岐状であることができ、一本鎖または二本
鎖であることができる。「ドナー配列」という用語は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチ
ド配列を指す。ドナー配列は、例えば２ヌクレオチド長〜２５，０００ヌクレオチド長（
またはその間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長〜
５，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００ヌク
レオチド長〜２，５００ヌクレオチド長の範囲にある任意の長さを有することができる。
【０１０２】
「相同配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有する第１の配列を指し、
その配列は第２の配列と同一であってもよい。「相同非同一配列」とは、第２の配列とあ
る程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２配列の配列とは同一でない第１配列を
指す。例えば、ある突然変異型遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その突然
変異型遺伝子の配列に対して相同かつ非同一である。いくつかの実施形態では、２つの配
列間の相同性の度合が、通常の細胞機構を利用して、それらの間での相同組換えを可能と
するのに十分である。２つの相同非同一配列は任意の長さであることができ、それらの非
相同性の度合は、１ヌクレオチドという小さなもの（例えばゲノムの点突然変異を標的相
同組換えによって修正するため）または１０キロ塩基もしくはそれ以上という大きなもの
（例えば染色体中の所定の部位に遺伝子を挿入するため）であることができる。相同非同
一配列を含む２つのポリヌクレオチドが同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０
，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外来ポリヌクレオチド（すなわちドナーポ
リヌクレオチド）を使用することができる。
【０１０３】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技法は当技術分野では公知である。通
例、そのような技法には、ある遺伝子に関してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定するこ
とおよび／またはそれがコードするアミノ酸配列を決定すること、ならびにそれらの配列
を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することが含まれる。ゲノム配列も
この方法で決定し、比較することができる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチ
ド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチドまたは
アミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはア
ミノ酸）は、その同一性百分率を決定することによって比較することができる。２つの配
列の同一性百分率は、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかを問わず、２つの整列され
た配列間の厳密な合致数を短い方の配列の長さで割り、１００をかけたものである。核酸
配列の近似アラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 
2:482-489(1981)の局所相同性アルゴリズムによって与えられる。このアルゴリズムは、D
ayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:3
53-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開
発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763(1986)によって標準化されたスコ
アリング行列を使って、アミノ酸配列に応用することができる。配列の同一性百分率を決
定するためのこのアルゴリズムの代表的な実装は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 
Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーテリティア
プリケーションになされている。この方法のためのデフォルトパラメータは、Wisconsin 
Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8(1995)（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能）に記載されて
いる。本開示との関連で同一性百分率を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌ
ｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが開発し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ 
Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（カリ
フォルニア州マウンテンビュー）が配布する、ＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用
することである。このパッケージスイートから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリ
ズムを使用することができ、その場合、スコアリングテーブルにはデフォルトパラメータ
を使用する（例えばギャップオープンペナルティー（gap open penalty）１２、ギャップ
エクステンションペナルティ（gap extension penalty）１、およびギャップ（gap）６）
。生成するデータから、「マッチ（Match）」値が、配列同一性を反映する。配列間の同
一性百分率または類似性百分率を算出するための他の適切なプログラムは、当分野におい
て広く公知であり、例えばもう一つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメー
タで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の
デフォルトパラメータを使って使用することができる。遺伝コード（genetic code）＝標
準（standard）；フィルター（filter）＝なし（none）；鎖（strand）＝両方（both）；
カットオフ（cutoff）＝６０；期待数（expect）＝１０；行列（Matrix）＝ＢＬＯＳＵＭ
６２；表示（Descriptions）＝５０配列；分類方法（sort by）＝高スコア（HIGH SCORE
）；データベース（Databases）＝非重複（non-redundant）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ
＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はインターネ
ット上に見出すことができる。本明細書に記載する配列に関して、望ましい配列同一性の
度合の範囲は約３５％〜１００％およびその間の任意の整数値である。通例、配列間の同
一性百分率は、少なくとも３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜
６０％、６０％〜７０％、７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５
〜９０％、さらに好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％
の配列同一性である。
【０１０４】
あるいは、安定な二重鎖の形成が相同領域間で起こり得るような条件下でポリヌクレオ
チドをハイブリダイズさせた後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、消化されたフラグ
メントのサイズ決定を行うことによって、ポリヌクレオチド間の配列類似性の度合を決定
することもできる。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が
、上記の方法を使って決定した場合に、その分子上の規定の長さにわたって、少なくとも
約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらに
好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示
すのであれば、互いに実質的に相同である。本明細書にいう実質的に相同は、指定したＤ
ＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同
なＤＮＡ配列は、例えばその特定の系ごとに定義されるストリンジェントな条件下で行わ
れるサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適当なハイブリダイゼ
ーション条件の定義は、当分野の技術の範囲内で行われる。例えば、Sambook et al., su
pra；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.
J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Pressを参照されたい。
【０１０５】
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは、次のように決定すること
ができる。２つの核酸分子間の配列同一性の度合は、そのような分子間で起こるハイブリ
ダイゼーションイベントの効率および強さに影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全
に同一な配列のターゲット分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害す
る。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野において周知のハイブ
リダイゼーションアッセイを使って評価することができる（例えばサザン（ＤＮＡ）ブロ
ット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambook et al.
, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989), Cold Spring Ha
rbor, N.Y.を参照されたい）。そのようなアッセイは、さまざまな度合の選択性を使って
、例えば低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで変化する条件を使って行う
ことができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合、非特異的結合の不在は、部
分的な配列同一性度さえ持たない二次プローブ（例えばターゲット分子との配列同一性が
約３０％未満であるプローブ）を使用して、非特異的結合イベントの不在下ではその二次
プローブがターゲットにハイブリダイズしないようにすることにより、評価することがで
きる。
【０１０６】
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合は、基準核酸配列に相補的な核
酸プローブが選ばれ、次に適当な条件を選択することにより、プローブと基準配列とが互
いに選択的にハイブリダイズ、または結合して、二重鎖分子を形成する。中等度にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で基準配列に選択的にハイブリダイズする能
力を有する核酸分子は、通例、選択した核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列
同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長のターゲット核酸配列の検出を可
能にするような条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件は、通例、選択した核酸プローブの配列と約９０〜９５％を上回る配列同一性を有
する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長のターゲット核酸配列の検出を可能にする。
プローブおよび基準配列が具体的な配列同一性の度合を有する場合、プローブ／基準配列
ハイブリダイゼーションに役立つハイブリダイゼーション条件は、当分野で公知であるよ
うに決定することができる（例えばNucleic Acid Hybridization: A Practical Approach
, editors B.D. Hames and SJ. Higgins (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Pressを
参照されたい）。
【０１０７】
ハイブリダイゼーションの条件は当業者には周知である。ハイブリダイゼーションスト
リンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチしたヌクレオチドを含有
するハイブリッドの形成を嫌う度合を指し、ストリンジェンシーの高さはミスマッチした
ハイブリッドに対する許容性の低さと関連づけられる。ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者には周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、お
よび有機溶媒（例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなど）の濃度が含まれる
が、これらに限るわけではない。当業者には公知のとおり、ハイブリダイゼーションスト
リンジェンシーは、高温、低イオン強度および低溶媒濃度によって増大する。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば以下の因子：配列
の長さおよび性質、さまざまな配列の塩基組成、塩類および他のハイブリダイゼーション
溶液コンポーネントの濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えばデ
キストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の存否、ハイブリダイゼーション反応温
度および時間パラメータなどを変化させると共に、洗浄条件を変化させることにより、数
多くの等価な条件を使って、ある特定ストリンジェンシーを確立できることは、当分野で
は周知である。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、当分野の標準的方
法に従ってなされる（例えばSambook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。
【０１０９】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報が交換されるプロセスを指す。
この開示に関して、「相同組換え（HR）」とは、例えば細胞において二本鎖切断の修復中
などに起こるそのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相
同性を必要とし、「ターゲット」分子（すなわち二本鎖切断を起こしたもの）のテンプレ
ート修復に「ドナー分子」を使用する。これはドナーからターゲットへの遺伝情報の移動
をもたらすので、「非交差遺伝子変換（non-crossover gene conversion）」または「シ
ョートトラクト遺伝子変換（short tract gene conversion）」として、さまざまな名称
で知られている。どの特定理論にも束縛されることは望まないが、そのような移動は、切
断されたターゲットとドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、お
よび／または、ターゲットの一部になる遺伝情報の再合成にドナーが使用される「合成依
存的鎖アニーリング（synthesis-dependent strand annealing）」、および／または関連
プロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配
列の一部または全部がターゲットポリヌクレオチドに組み込まれるような、ターゲット分
子配列の変更をもたらす。
【０１１０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合主鎖の破壊を指す。切断は、さまざまな方法で、
例えば、限定するわけではないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解
などによって、開始することができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が考えられ、二本
鎖切断は２つの別個の一本鎖切断イベントの結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は平滑末
端または付着末端の生成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、標的二本鎖ＤＮＡ切
断に融合ポリペプチドが使用される。
【０１１１】
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有する１またはそれ以上のポリペ
プチド配列を含む。切断ドメインは単一ポリペプチド鎖中に含まれ得るか、または２つ（
もしくはそれ以上）のポリペプチドの会合によって、切断活性がもたらされ得る。
【０１１２】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一なものまたは異なるもの）と共
同して切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配
列である。
【０１１３】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核
酸、主にＤＮＡ、およびタンパク質（ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む
）を含む。真核細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形で存在し、そこではヌクレ
オソームコアが、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む８量体
と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含んでおり、ヌクレオソームコア間にはリンカーＤ
ＮＡ（生物に依存して長さはさまざま）が張り渡されている。１分子のヒストンＨ１が一
般にリンカーＤＮＡと会合している。本開示に関して「クロマチン」という用語は、原核
生物のものも、真核生物のものも、あらゆるタイプの細胞核タンパク質を包含するものと
する。細胞クロマチンには染色体クロマチンとエピソームクロマチンの両方が包含される
。
【０１１４】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を構成するクロマチン複合体である。細
胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを構成する全染色体の集合であるその核型に
よって特徴づけられる。細胞のゲノムは１またはそれ以上の染色体を含むことができる。
【０１１５】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タ
ンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよび一定のウ
イルスゲノムがある。
【０１１６】
「アクセス可能領域（accessible region）」は、核酸中に存在するターゲット部位が
そのターゲット部位を認識する外来分子によって結合され得るような、細胞クロマチン中
の部位である。どの特定理論にも束縛されることは望まないが、アクセス可能領域は、ヌ
クレオソーム構造にパッケージされていない領域であると考えられる。アクセス可能領域
の独特な構造は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対する
その感受性によって検出することができる。
【０１１７】
「ターゲット部位」または「ターゲット配列」は、結合にとって十分な条件が存在すれ
ば結合分子が結合するであろう核酸部分を規定する核酸配列である。例えば配列５’−Ｇ
ＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのターゲット部位である。
【０１１８】
「外来（exogenous）」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１またはそれ以上の遺
伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入することができる分子で
ある。「通常は細胞内に存在」は、その細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決
定される。従って、例えば、筋の胚発生中にしか存在しない分子は、成体筋細胞について
は外来分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に
ついては外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全型内在性分子の機能型または正
常機能型内在性分子の機能不全型を含むことができる。
【０１１９】
外来分子は、とりわけ小分子、例えばコンビナトリアルケミストリープロセスによって
生成されるもの、または高分子、例えばタンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、
リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、または１またはそれ以上の上記分
子を含む任意の複合体であることができる。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、核酸
は一本鎖または二本鎖であることができ、線状、分岐状または環状であることができ、任
意の長さであることができる。核酸には、二重鎖を形成する能力を有するもの、ならびに
三重鎖形成核酸が含まれる。例えば米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２
２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロ
マチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、
デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラ
ーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが
含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１２０】
外来分子は、内在性分子と同じ分子タイプ、例えば外来タンパク質または外来核酸であ
ることができる。例えば、外来核酸は感染ウイルスゲノム、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス（Agrogacterium tumefacians）Ｔストランド、細胞中に導入されたプラスミ
ドもしくはエピソーム、またはその細胞中に通常は存在しない染色体を含むことができる
。細胞中に外来分子を導入するための方法は当業者には公知であり、脂質による導入（す
なわち中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注
入、細胞融合、パーティクルボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキ
ストランによる導入およびウイルスベクターによる導入などがあるが、これらに限るわけ
ではない。
【０１２１】
対照的に、「内在性（endogenous）」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階にあ
る特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は染色体、ミトコンドリ
ア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム
核酸を含み得る。他の内在性分子には、タンパク質、例えば転写因子および酵素を含める
ことができる。
【０１２２】
「融合」分子は、２つまたはそれ以上のサブユニット分子が（好ましくは共有結合的に
）連結された分子である。サブユニット分子は分子の化学タイプが同じであってもよいし
、分子の化学タイプが異なってもよい。第１のタイプの融合分子の例には、融合タンパク
質（例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインの間の融合物）、および融合核酸
（例えば上述の融合タンパク質をコードする核酸）などがあるが、これらに限るわけでは
ない。第２のタイプの融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドの間の融合物、
および副溝結合剤と核酸の間の融合物などがあるが、これらに限るわけではない。
【０１２３】
細胞における融合タンパク質の発現は、その細胞に融合タンパク質を送達することによ
って、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達し、そこでポリ
ヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質を生成することによって、
起こり得る。細胞におけるタンパク質の発現には、トランススプライシング、ポリペプチ
ド切断およびポリペプチド連結も関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプ
チド送達の方法については、この開示において項を改めて説明する。
【０１２４】
本開示に関して「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、およ
び遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を包含し、そのような調節配列がコード
および／または転写配列に隣接しているかどうかを問わない。従って遺伝子にはプロモー
ター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソ
ーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界（boundary）エレ
メント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずし
もこれらに限らない。
【０１２５】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産
物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮ
Ａ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他のあらゆるタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳
によって産生されるタンパク質であることができる。遺伝子産物には、キャッピング、ポ
リアデニル化、メチル化、およびエディティングなどのプロセスによって修飾されたＲＮ
Ａ、および例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、
ミリスチリル化、および糖鎖付加によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【０１２６】
遺伝子発現の「調整（modulation）」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調整に
は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含めることができるが、これらに限るわけではない
。
【０１２７】
「植物」細胞には、単子葉類植物（単子葉植物）または双子葉類植物（双子葉植物）の
細胞が含まれるが、これらに限るわけではない。単子葉植物の限定でない例には、穀類植
物、例えばトウモロコシ、イネ、オオムギ、エンバク、コムギ、モロコシ、ライムギ、サ
トウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ、およびココヤシが含まれる。双子葉植物の
限定でない例には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、サトウダイコン、ジャガイモ、レ
タス、メロン、ダイズ、セイヨウアブラナ（ナタネ）、およびアルファルファが含まれる
。植物細胞は、植物の任意の部分および／または植物発生の任意の段階に由来し得る。
【０１２８】
「関心領域」は、その中で外来分子を結合することが望まれる細胞クロマチンの任意の
領域、例えば遺伝子または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列である。結
合の目的は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えであることができる。関心領域は
染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリアゲノム、クロロプラスト
ゲノム）、または感染ウイルスゲノム中に存在することができる。関心領域は、遺伝子の
コード領域内、転写非コード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイン
トロン内、またはコード領域の上流または下流にある非転写領域内に存在し得る。関心領
域は長さが１ヌクレオチド対という小さなものから、２５，０００ヌクレオチド対、また
は任意の整数値のヌクレオチド対にまで及ぶことができる。
【０１２９】
「作動的連結（operative linkage）」および「作動的に連結（operatively linked）
」（または「作動可能に連結（operably linked）」）という用語は、２つまたはそれ以
上のコンポーネント（例えば配列エレメント）の並列であって、両コンポーネントが正常
に機能して、それらコンポーネントの少なくとも１つが、他のコンポーネントの少なくと
も１つに対して発揮される機能を媒介することが可能な状態を許すような形で各コンポー
ネントが配置されているものを指して、互換的に使用される。例として、プロモーターな
どの転写調節配列は、その転写調節配列が１またはそれ以上の転写調節因子の存在または
不在に応じてコード配列の転写レベルを制御するのあれば、そのコード配列に作動的に連
結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とはシスに、作動的に連結されるが
、コード配列に直接隣接している必要はない。例えばエンハンサーは、たとえ連続してい
なくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。
【０１３０】
融合ポリペプチドに関して言えば、「作動的に連結」という用語は、コンポーネントの
それぞれが、そのように連結されていない場合にそれが果たすであろう機能と同じ機能を
他のコンポーネントに連動して果たすという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ 
ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して言えば、
ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは、もし、その融合ポリペプチドにおいて、
ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がそのターゲット部位および／またはその結合部位を結
合することができ、それと同時に、切断ドメインがそのターゲット部位の近傍でＤＮＡを
切断することができるのであれば、作動的連結状態にある。
【０１３１】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的フラグメント」は、完全長タンパク質
、ポリペプチドまたは核酸とは同一でない配列を有するが、それでもなお完全長タンパク
質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは
核酸である。機能的フラグメントは、対応する天然分子より多い、少ない、または同じ残
基数を有することができ、および／または１もしくはそれ以上のアミノ酸置換もしくはヌ
クレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えばコード機能、他の核酸にハ
イブリダイズする能力）を決定するための方法は、当分野では周知である。同様に、タン
パク質機能を決定するための方法も周知である。例えばポリペプチドのＤＮＡ結合機能は
、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイなどによって決定す
ることができる。ＤＮＡ切断はゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ausube
l et al., supraを参照されたい。他のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、
例えば共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性（遺伝的相補性および生化学
的相補性の両方）によって決定することができる。例えばFields et al. (1989) Nature 
340:245-246、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５
０号を参照されたい。
【０１３２】
ターゲット部位
開示されている方法および組成物には、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と
ジンクフィンガードメインとを含む融合タンパク質が包含され、そのジンクフィンガード
メインは、細胞クロマチン中の配列（例えばターゲット部位または結合部位）に結合する
ことにより、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）の活性をその配列の近傍に向か
わせ、それゆえにターゲット配列の近傍における切断を誘発する。この開示の他の項で述
べるように、ジンクフィンガードメインは、事実上任意の所望の配列に結合するように操
作することができる。従って、その位置での切断または組換えが望まれる配列を含有する
関心領域を同定した後、１またはそれ以上のジンクフィンガー結合ドメインをその関心領
域中の１またはそれ以上の配列に結合するように操作することができる。ジンクフィンガ
ー結合ドメインと切断ドメインとを含む融合タンパク質（またはそれぞれにジンクフィン
ガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質）が細胞内で発
現することにより、関心領域における切断が達成される。
【０１３３】
ジンクフィンガードメインによる結合のための細胞クロマチン中の配列（例えばターゲ
ット部位）の選択は、例えば共有所有の（co-owned）米国特許第６，４５３，２４２号（
２００２年９月１７日）に開示されている方法に従って達成することができ、この米国特
許には、選択した配列に結合するようにＺＦＰを設計するための方法も開示されている。
ターゲット部位の選択にはヌクレオチド配列の簡単な目視検査も使用できることは、当業
者には明白である。従って、本願の方法では、ターゲット部位を選択するための任意の手
段を使用することができる。
【０１３４】
ターゲット部位は、一般に、複数の隣接ターゲットサブサイト（subsite）から構成さ
れる。ターゲットサブサイトとは、個々のジンクフィンガーによって結合される配列（通
常はヌクレオチドトリプレット、または隣接クアドラプレットと１ヌクレオチドがオーバ
ーラップし得るヌクレオチドクアドラプレット）を指す。例えば国際公開第０２／０７７
２２７号を参照されたい。ジンクフィンガータンパク質が最も接触する鎖をターゲット鎖
「主要認識鎖（primary recognition strand）」または「主要接触鎖（primary contact 
strand）」と呼ぶとすると、一部のジンクフィンガータンパク質は、ターゲット鎖中の３
塩基トリプレットおよび非ターゲット鎖上の第４の塩基に結合する。ターゲット部位は、
一般に、少なくとも９ヌクレオチドの長さを持ち、従って少なくとも３つのジンクフィン
ガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかし、例えば１２ヌク
レオチドターゲット部位への４フィンガー結合ドメインの結合、１５ヌクレオチドターゲ
ット部位への５フィンガー結合ドメインの結合または１８ヌクレオチドターゲット部位へ
の６フィンガー結合ドメインの結合も可能である。明白であるように、より長いターゲッ
ト部位への、より大きな結合ドメイン（例えば、７−、８−、９−フィンガーおよびそれ
以上）の結合も可能である。
【０１３５】
ターゲット部位が３ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、クロスストランド
（cross-strand）相互作用が起こる場合（例えば米国特許第６，４５３，２４２号および
国際公開第０２／０７７２２７号を参照されたい）は、マルチフィンガー結合ドメインの
個々のジンクフィンガーの１またはそれ以上が、オーバーラップしたクアドラプレットサ
ブサイトに結合することができる。結果として、３フィンガータンパク質は１０ヌクレオ
チド配列を結合することができ、その場合、１０個目のヌクレオチドは末端フィンガーに
よって結合されるクアドラプレットの一部であり、４フィンガータンパク質は１３ヌクレ
オチド配列を結合することができて、その場合、１３個目のヌクレオチドは末端フィンガ
ーによって結合されるクアドラプレットの一部である、というふうになる。
【０１３６】
マルチフィンガー結合ドメインにおける個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー
配列の長さおよび性質も、ターゲット配列への結合に影響を及ぼす。例えば、マルチフィ
ンガー結合ドメイン中の隣接ジンクフィンガー間にいわゆる「非標準型（non-canonical
）リンカー」「長い（long）リンカー」または「構造（structured）リンカー」が存在す
れば、これらのフィンガーは、すぐそばには隣接していないサブサイトを結合することが
可能になる。そのようなリンカーの非限定的例は、例えば米国特許第６，４７９，６２６
号および国際公開第０１／５３４８０号に記載されている。従って、ジンクフィンガー結
合ドメインにとってのターゲット部位では、１またはそれ以上のサブサイトを１、２、３
、４、５またはそれ以上のヌクレオチドによって互いに隔てることができる。一例として
、４フィンガー結合ドメインは、２つの連続する３ヌクレオチドサブサイト、１つの介在
ヌクレオチド、および２つの連続するトリプレットサブサイトを順に含む１３ヌクレオチ
ドターゲット部位に結合することができる。
【０１３７】
配列（例えばターゲット部位）間の距離は、互いに最も近い配列の端部から測定した、
２つの配列間に介在するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を指す。
【０１３８】
切断が別々のターゲット部位への２つのジンクフィンガードメイン／切断ハーフドメイ
ン融合分子の結合に依存するいくつかの実施形態において、それら２つのターゲット部位
は、反対のＤＮＡ鎖上に存在することができる。他の実施形態では、両方のターゲット部
位が同じＤＮＡ鎖上に存在する。
【０１３９】
ジンクフィンガー結合ドメイン
ジンクフィンガー結合ドメインは１またはそれ以上のジンクフィンガーを含む。Miller
et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614、Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65
、米国特許第６，４５３，２４２号。通例、単一のジンクフィンガードメインは約３０ア
ミノ酸長である。構造研究により、各ジンクフィンガードメイン（モチーフ）は、２つの
βシート（２つの不変システイン残基を含有するβターンに保持されている）と１つのα
ヘリックス（２つの不変ヒスチジン残基を含有する）とを含有し、それらが、前記２つの
システインおよび２つのヒスチジンによる亜鉛原子の配位を介して、特定コンフォメーシ
ョンに保持されている。
【０１４０】
ジンクフィンガーには、標準型（canonical）Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー（すなわち亜
鉛イオンが２つのシステイン残基および２つのヒスチジン残基によって配位されるもの）
と、非標準型ジンクフィンガー、例えばＣ３Ｈジンクフィンガー（亜鉛イオンが３つのシ
ステイン残基および１つのヒスチジン残基によって配位されるもの）およびＣ４ジンクフ
ィンガー（亜鉛イオンが４つのシステイン残基によって配位されるもの）の両方が含まれ
る。国際公開第０２／０５７２９３号も参照されたい。
【０１４１】
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するように操作することができ
る。例えばBeerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141、Pabo et al. (2001)
Ann. Rev. Biochem. 70:313-340、Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-6
60、Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637、Choo et al. (2000) C
urr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結
合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異
性を有することができる。操作方法には、合理的設計およびさまざまなタイプの選択が含
まれるが、これらに限るわけではない。合理的設計には、例えば、トリプレット（または
クアドラプレット）ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列とを含み、
各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列が、その特定トリプレットまた
はクアドラプレット配列を結合するジンクフィンガーの１またはそれ以上のアミノ酸配列
と関連づけられているデータベースを使用することが含まれる。例えば共有に係る米国特
許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。他の設計方
法が、例えば米国特許第６，７４６，８３８号、同第６，７８５，６１３号、同第６，８
６６，９９７号、および同第７，０３０，２１５号に開示されている。
【０１４２】
代表的な選択方法は、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含めて
、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８
８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６
号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第
９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、
国際公開第０１／８８１９７号および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている
。
【０１４３】
ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば共有に係る米国特
許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【０１４４】
個々のジンクフィンガーは３ヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接
するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチドがオーバーラップし得
る４ヌクレオチド配列）に結合するので、ジンクフィンガー結合ドメインがそこに結合す
るように操作される配列（例えばターゲット配列）の長さは、操作されたジンクフィンガ
ー結合ドメイン中のジンクフィンガーの数を決定することになる。例えば、フィンガーモ
チーフがオーバーラップしたサブサイトに結合しないＺＦＰの場合、６ヌクレオチドター
ゲット配列は、２フィンガー結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチドターゲット
配列は３フィンガー結合ドメインによって結合される、という具合である。本明細書に注
記するとおり、ターゲット部位において個々のジンクフィンガーにとっての結合部位（す
なわちサブサイト）は連続している必要はなく、マルチフィンガー結合ドメインにおける
ジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわちフィンガー間リンカー）の長さおよび性質
に依存して、１ヌクレオチドまたは数ヌクレオチド離れていることができる。
【０１４５】
マルチフィンガー型ジンクフィンガー結合ドメインでは、約５アミノ酸のアミノ酸リン
カー配列（いわゆる「標準型」フィンガー間リンカー）で、あるいは１またはそれ以上の
非標準型リンカーで、隣接するジンクフィンガーを隔てることができる。例えば共有に係
る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。３
個を超えるフィンガーを含む操作されたジンクフィンガー結合ドメインの場合は、それら
ジンクフィンガーのうち、いくつかの間に、より長い（「非標準型」）フィンガー間リン
カーを挿入することが好ましいことがある。なぜなら、そうすることにより、結合ドメイ
ンによる結合のアフィニティおよび／または特異性が増加し得るからである。例えば米国
特許第６，４７９，６２６号および国際公開第０１／５３４８０号を参照されたい。従っ
て、マルチフィンガー型ジンクフィンガー結合ドメインを非標準型フィンガー間リンカー
の存在および位置に関して特徴づけることもできる。例えば、３つのフィンガー（２つの
標準型フィンガー間リンカーによって接合されたもの）、長いリンカーおよびさらに３つ
のフィンガー（２つの標準型フィンガー間リンカーで接合されたもの）を含む６フィンガ
ー型ジンクフィーガー結合ドメインは、２×３構成（configuration）と呼ばれる。同様
に、２つのフィンガー（その間に標準型リンカーを有するもの）、長いリンカーおよびさ
らに２つのフィンガー（標準型リンカーによって接合されたもの）を含む結合ドメインは
、２×２タンパク質と呼ばれる。３つの２フィンガーユニット（そのそれぞれにおいて２
つのフィンガーが標準型リンカーによって接合されたもの）を含むタンパク質であって、
各２フィンガーユニットが長いリンカーによって隣接する２フィンガーユニットに接合さ
れているものを３×２タンパク質という。
【０１４６】
長いまたは非標準型のフィンガー間リンカーが、マルチフィンガー結合ドメイン中の２
つの隣接するジンクフィンガー間に存在することにより、しばしば、それら２つのフィン
ガーは、ターゲット配列中ですぐそばには連続していないサブサイトに結合することが可
能になる。従って、ターゲット部位中のサブサイト間に、１またはそれ以上のヌクレオチ
ドのギャップが存在し得る。すなわち、ターゲット部位は、ジンクフィンガーによって接
触されない１またはそれ以上のヌクレオチドを含有することができる。例えば２×２ジン
クフィンガー結合ドメインは、１ヌクレオチドで隔てられた２つの６ヌクレオチド配列に
結合することができる。すなわち、これは１３ヌクレオチドターゲット部位に結合する。
Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436、Moore et al. (2001
b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441および国際公開第０１／５３４８０号も参
照されたい。
【０１４７】
先に述べたように、ターゲットサブサイトは、単一のジンクフィンガーによって結合さ
れる３−または４−ヌクレオチド配列である。いくつかの目的では、２フィンガーユニッ
トを結合モジュールと呼ぶ。結合モジュールは、例えばマルチフィンガータンパク質（一
般的には３フィンガー）において、特定の６ヌクレオチドターゲット配列を結合する２つ
の隣接フィンガーを選択することによって得ることができる。あるいは、個々のジンクフ
ィンガーの集合によって、モジュールを構築することもできる。国際公開第９８／５３０
５７号および国際公開第０１／５３４８０号を参照されたい。
【０１４８】
切断ドメイン
本明細書に開示されている融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレ
アーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来源になり得
る代表的エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌク
レアーゼがあるが、これらに限るわけではない。例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ（マサチューセッツ州ベバリー）の２００２〜２００３年版カタログおよびBelfor
t et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断する
酵素は他にも知られている（例えばＳ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵Ｄ
ＮアーゼＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼなど；Linn et 
al. (eds.), Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照されたい）
。これらの酵素（またはその機能的フラグメント）の１またはそれ以上を切断ドメインお
よび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【０１４９】
同様に、切断ハーフドメイン（例えばジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメ
インとを含む融合タンパク質）も、上述のように、切断活性に二量体化を要求する任意の
ヌクレアーゼまたはその一部に由来することができる。融合タンパク質が切断ハーフドメ
インを含む場合、一般に、切断には２つの融合タンパク質が要求される。あるいは、２つ
の切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することもできる。それら２つの切
断ハーフドメインは同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し
てもよいし、各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラ
グメント）に由来してもよい。また、２つの融合タンパク質のターゲット部位は、好まし
くは、それら２つの融合タンパク質がそれぞれのターゲット部位に結合した時に、切断ハ
ーフドメインが、例えば二量体化によって機能的な切断ドメインを形成し得るような空間
的配向を切断ハーフドメインが互いにとることになるように、互いに配置される。従って
、いくつかの実施形態では、ターゲット部位の近接端部が５〜８ヌクレオチドまたは１５
〜１８ヌクレオチドによって隔てられる。しかし、２つのターゲット部位間には、任意の
整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対（例えば２〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上
）が介在し得る。一般に、切断点はターゲット部位の間にある。
【０１５０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に（認
識部位で）結合して、結合部位またはその近くでＤＮＡを切断する能力を有する。いくつ
かの制限酵素（例えばＩＩＳ型）は認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能
な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えばＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖
ではその認識部位から９ヌクレオチドの位置、他方の鎖ではその認識部位から１３ヌクレ
オチドの位置における、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば米国特許第５，３５６，
８０２号、同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号、ならびにLi et 
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279、Li et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:2764-2768、Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8
83-887、Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照されたい。従っ
て、ある実施形態では、融合タンパク質が、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来す
る切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と１またはそれ以上のジンクフィンガー結
合ドメイン（操作されていても、操作されていなくてもよい）とを含む。
【０１５１】
結合ドメインから分離可能な切断ドメインを有する代表的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋ
Ｉである。この特定酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al. (1998) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。従って、本開示については、開示されている融
合タンパク質中に使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。
従って、ジンクフィンガー−ＦｏｋI融合物を使った細胞配列の標的二本鎖切断および／
または標的置換には、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク
質を使って、触媒的に活性な切断ドメインを再構成させることができる。あるいは、ジン
クフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含有する単一のポリ
ペプチド分子も使用することができる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使った標的
切断および標的配列変更のパラメータについては、この開示に項を改めて述べる。
【０１５２】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持している、または多量体化
（例えば二量体化して）機能的切断ドメインを形成する能力を保持している、タンパク質
の任意の部分であることができる。
【０１５３】
代表的なＩＩＳ型制限酵素を表１に列挙する。分離可能な結合ドメインおよび切断ドメ
インを含有する制限酵素は他にもあり、本開示ではそれらも考えられる。例えばRoberts 
et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照されたい。
表１：ＩＩＳ型制限酵素の一部
2014193179.tif 000002
2014193179.tif 000003
ジンクフィンガードメイン−切断ドメイン融合物
【０１５４】
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し構築するための
方法は、当業者には公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質（およびそれをコ
ードするポリヌクレオチド）を含む融合タンパク質を設計し構築するための方法は、共有
に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号に記載されてい
る。いくつかの実施形態では、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が構築される。これらのポリヌクレオチドはベクターに挿入することができ、そのベクタ
ーは細胞内に導入することができる（ベクターおよび細胞中にポリヌクレオチドを導入す
るための方法に関するさらなる開示については下記を参照されたい）。
【０１５５】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質がジンクフィンガ
ー結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素由来の切断ハーフドメインとを含み、２つのそのよう
な融合タンパク質を細胞内で発現させる。細胞における２つの融合タンパク質の発現は、
それら２つのタンパク質を細胞に送達すること、１つのタンパク質とそれらタンパク質の
１つをコードする１つの核酸とを細胞に送達すること、それぞれがそれらタンパク質の１
つをコードする２つの核酸を細胞に送達すること、または両方のタンパク質をコードする
単一の核酸を細胞に送達することによって起こり得る。さらなる実施形態では、融合タン
パク質が、２つの切断ハーフドメインとジンクフィンガー結合ドメインとを含む単一のペ
プチド鎖を含む。この場合は、単一の融合タンパク質が細胞内で発現され、理論に束縛さ
れることは望まないが、それが、切断ハーフドメインの分子内二量体を形成する結果とし
て、ＤＮＡを切断すると考えられる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に
最も近く、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近くなるように、融合タンパ
ク質（例えばＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合物）のコンポーネントが配置される。これは、ＤＮＡ
結合ドメインがアミノ末端に最も近く、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も
近いという、天然に存在する二量体化切断ドメイン中の切断ドメイン（例えばＦｏｋＩ酵
素に由来するもの）の相対的配向を反映している。これらの実施形態では、融合タンパク
質が反対のＤＮＡ鎖上の部位に結合して、結合部位の５’端が互いに近接することにより
、切断ハーフドメインの二量体化による機能的ヌクレアーゼの形成がもたらされる。
【０１５７】
さらなる実施形態では、切断ハーフドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く
、かつジンクフィンガードメインがカルボキシ末端に最も近くなるように、融合タンパク
質（例えばＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合物）のコンポーネントが配置される。これらの実施形態
では、融合タンパク質が反対のＤＮＡ鎖上の部位に結合して、結合部位の３’端が互いに
近接することにより、切断ハーフドメインの二量体化による機能的ヌクレアーゼの形成が
もたらされる。
【０１５８】
さらにもう一つの実施形態では、第１融合タンパク質がその融合タンパク質のアミノ末
端に最も近い切断ハーフドメインとカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメイン
とを含有し、第２融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインがその融合タンパク質の
アミノ末端に最も近く、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近くなるように
配置される。これらの実施形態では、両方の融合タンパク質が同じＤＮＡ鎖に結合して、
カルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含有する第１融合タンパク質の結
合部位は、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含有する第２融合タンパク
質の結合部位の５’側に位置することになる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、開示されている融合タンパク質において、ジンクフィンガー
ドメインと切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）の間のアミノ酸配列を「ＺＣリン
カー」と呼ぶ。ＺＣリンカーは、上述のフィンガー間リンカーとは区別されるべきである
。切断を最適化するＺＣリンカーの取得に関する詳細は、例えば米国特許出願公開第２０
０５００６４４７４号Ａ１および同第２００３０２３２４１０号、ならびに国際特許公報
国際公開第０５／０８４１９０号を参照されたい。
標的切断の方法
【０１６０】
開示されている方法および組成物は、細胞クロマチン中の関心領域で（例えばゲノム中
、例えば突然変異型または野生型遺伝子中の、所望の部位または所定の部位で）ＤＮＡを
切断するために使用することができる。そのような標的ＤＮＡ切断のために、所定の切断
部位またはその近くにあるターゲット部位を結合するようにジンクフィンガー結合ドメイ
ンが操作され、操作されたジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインとを含む融合タ
ンパク質が細胞中で発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分がターゲット部
位に結合すると、ＤＮＡは切断ドメインによりターゲット部位の近くで切断される。厳密
な切断部位はＺＣリンカーの長さに依存し得る。
【０１６１】
あるいは、それぞれがジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメインとを含む２
つの融合タンパク質を細胞中で発現させ、それが、機能的切断ドメインが再構成されてタ
ーゲット部位の近傍でＤＮＡが切断されるような形で並置されたターゲット部位に結合す
る。ある実施形態では、２つのジンクフィンガー結合ドメインのターゲット部位の間で切
断が起こる。ジンクフィンガー結合ドメインの一方または両方を操作することができる。
【０１６２】
ジンクフィンガー結合ドメイン−切断ドメイン融合ポリペプチドを用いる標的切断の場
合、結合部位は切断部位を包含するか、または結合部位の近接端部が切断部位から１、２
、３、４、５、６、１０、２５、５０ヌクレオチドもしくはそれ以上（１〜５０ヌクレオ
チドの間の任意の整数値）であることができる。切断部位に対する結合部位の厳密な位置
は、当該切断ドメインおよびＺＣリンカーの長さに依存する。それぞれがジンクフィンガ
ー結合ドメインと切断ハーフドメインとを含む２つの融合ポリペプチドが使用される方法
の場合、結合部位は一般に切断部位をまたぐ。従って、第１結合部位の近接端部は切断部
位の一方の側の１、２、３、４、５、６、１０、２５ヌクレオチドまたはそれ以上（また
は１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値）であることができ、第２結合部位は切断部
位の他方の側の１、２、３、４、５、６、１０、２５ヌクレオチドまたはそれ以上（また
は１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値）であることができる。インビトロおよびイ
ンビボでの切断部位をマッピングするための方法は、当業者には公知である。
【０１６３】
従って本明細書に記載する方法では、切断ドメインに融合された操作されたジンクフィ
ンガー結合ドメインを使用することができる。これらの場合、結合ドメインは、切断が望
まれる位置またはその近くにあるターゲット配列に結合するように操作される。融合タン
パク質またはそれをコードするポリヌクレオチドは植物細胞中に導入される。ひとたび細
胞中に導入され、または細胞中で発現されると、融合タンパク質はターゲット配列に結合
し、ターゲット配列またはその近くにおいて切断する。厳密な切断部位は切断ドメインの
性質および/または結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配列の有無および/または
性質に依存する。それぞれが切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用する
場合、結合部位の近接端部間の距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２
５ヌクレオチドまたはそれ以上（または１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値）であ
ることができる。また、切断の最適レベルは２つの融合タンパク質の結合部位間の距離（
例えばSmith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369、Bibikova et al. (2001
) Mol. Cell. Biol. 21:289-297を参照されたい）にも、各融合タンパク質中のＺＣリン
カーの長さにも依存し得る。米国特許出願公開第２００５００６４４７４号Ａ１および国
際特許公報国際公開第０５／０８４１９０号、国際公開第０５／０１４７９１号および国
際公開第０３／０８０８０９号も参照されたい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、切断ドメインが２つの切断ハーフドメインを含み、その両方
が、結合ドメイン、第１切断ハーフドメインおよび第２切断ハーフドメインを含む単一ポ
リペプチドの一部である。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能
する限り、同じアミノ酸配列を有することも異なるアミノ酸配列を有することもできる。
【０１６５】
切断ハーフドメインを別個の分子に用意することもできる。例えば、各ポリペプチドが
結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合ポリペプチドを細胞中に導入す
ることができる。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能する限り
、同じアミノ酸配列を有することも異なるアミノ酸配列を有することもできる。さらに結
合ドメインはターゲット配列（これは通例、融合ポリペプチドの結合時に２つの切断ハー
フドメインが（例えばハーフドメインの二量体化による）切断ドメインの再構成を可能に
する空間的配向で互いに提示されるような形で配置される）に結合し、それにより、ハー
フドメインが互いに機能的切断ドメインを形成するような位置に置かれて、結果として、
関心領域における細胞クロマチンの切断が起こる。一般に、再構成された切断ドメインに
よる切断は、２つのターゲット配列間に位置する部位で起こる。タンパク質の一方または
両方をそのターゲット部位に結合するように操作することができる。
【０１６６】
２つの融合タンパク質は関心領域において同じ極性または反対の極性で結合することが
でき、それらの結合部位（すなわちターゲット部位）は、任意の数のヌクレオチド（例え
ば０〜２００ヌクレオチドまたはその間の任意の整数値）で、隔てられていることができ
る。いくつかの実施形態では、それぞれにジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフド
メインとを含む２つの融合タンパク質の結合部位が、他方の結合部位に最も近い各結合部
位の端部から測定した場合に５〜１８ヌクレオチド離れて、例えば５〜８ヌクレオチド離
れて、または１５〜１８ヌクレオチド離れて、または６ヌクレオチド離れて、または１６
ヌクレオチド離れて位置することができ、切断はそれら結合部位の間で起こる。
【０１６７】
ＤＮＡが切断される部位は一般に２つの融合タンパク質の結合部位の間にある。ＤＮＡ
の二本鎖切断は、しばしば１、２、３、４、５、６ヌクレオチドまたはそれ以上ずれた２
つの一本鎖切断または「ニック」によってもたらされる（例えばネイティブＦｏｋＩによ
る二本鎖ＤＮＡの切断は４ヌクレオチドずれた一本鎖切断によってもたらされる）。従っ
て切断は必ずしも各ＤＮＡ鎖上の厳密に相対する部位で起こるわけではない。また、融合
タンパク質の構造およびターゲット部位間の距離も、切断が単一ヌクレオチド対に隣接し
て起こるか、それとも切断が数カ所の部位で起こるかに影響を及ぼし得る。しかし、多く
の応用例では、標的組換えおよび標的突然変異誘発（下記参照）を含めて、ある範囲のヌ
クレオチド内で切断が起これば一般に十分であり、特定塩基対間での切断は必要ない。
【０１６８】
上記のように融合タンパク質はポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして導
入することができる。例えば、それぞれが前述したポリペプチドの一方をコードする配列
を含む２つのポリヌクレオチドを細胞中に導入することができ、それらのポリペプチドが
発現されて、それぞれがそのターゲット配列に結合すると、ターゲット配列またはその近
くで切断が起こる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一のポ
リヌクレオチドが、細胞中に導入される。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤ
ＮＡおよび／もしくはＲＮＡの任意の修飾型もしくは類似体であることができる。
【０１６９】
切断特異性を強化するために、本明細書に記載する方法において、追加の組成物を使用
することもできる。例えば、単一の切断ハーフドメインは限られた二本鎖切断活性を示す
場合がある。それぞれが３フィンガー型ジンクフィンガードメインと切断ハーフドメイン
とを含む２つの融合タンパク質が細胞中に導入される方法では、どちらのタンパク質も約
９ヌクレオチドのターゲット部位を指定する。１８ヌクレオチドの集合ターゲット配列は
哺乳動物ゲノムにおいてはユニークでありそうだが、所与の任意の９ヌクレオチドターゲ
ット部位はヒトゲノム中に平均で約２３，０００回出現する。従って、単一ハーフドメイ
ンの部位特異的結合による非特異的切断が起こり得る。従って、本明細書に記載する方法
では、2つの融合タンパク質と一緒に細胞内で発現されるＦｏｋＩなどの切断ハーフドメ
インのドミナントネガティブ突然変異体（またはそれをコードする核酸）の使用が考えら
れる。ドミナントネガティブ突然変異体は二量体化する能力を有するが、切断することが
できず、それが二量体化したハーフドメインの切断活性も遮断する。ドミナントネガティ
ブ突然変異体を融合タンパク質に対してモル過剰に用意することにより、両方の融合タン
パク質が結合されている領域だけが、十分に高い機能的切断ハーフドメインの局所濃度を
持って、二量体化および切断が起こることになる。２つの融合タンパク質のうちの一方だ
けが結合されている部位では、その切断ハーフドメインがドミナントネガティブ突然変異
型ハーフドメインとの二量体を形成し、望ましくない非特異的切断は起こらない。
【０１７０】
ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン中の３つの触媒アミノ酸残基、Ａｓｐ４５０、Ａｓｐ４６
７およびＬｙｓ４６９が同定されている。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA 95:10,570-10,575。従って、これらの残基の一つにおける１またはそれ以上の
突然変異を使って、ドミナントネガティブ突然変異体を生成させることができる。さらに
、他のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒アミノ酸残基の多くが公知であり、かつ／また
は、例えばＦｏｋＩ配列との整列によって、および／もしくは突然変異体の生成と触媒活
性に関する試験とによって決定することができる。
切断ハーフドメインにおける二量体化ドメイン突然変異
【０１７１】
ＺＦＰと切断ハーフドメインとの融合物（例えばＺＦＰ／ＦｏｋＩ融合物など）の使用
を伴う標的切断の方法では、２つのそのような融合物分子を使用する必要があり、それら
はそれぞれが一般的には別個のターゲット配列に向けられる。２つの融合タンパク質のタ
ーゲット配列は、上述のように標的切断がゲノム中のユニーク部位に向けられるように選
択することができる。切断特異性が低下する潜在的原因は、２つのＺＦＰ／切断ハーフド
メイン融合物の一方のホモ二量体化に起因し得る。これは、例えば、２つのＺＦＰ／切断
ハーフドメイン融合物の一方にとってのターゲット配列の逆方向反復がゲノム中に存在し
、それらの配列が、機能的な二量体の形成を可能にする配向および間隔で２コピーの同じ
融合タンパク質が結合することを許すような位置にあることなどによって起こり得る。
【０１７２】
意図したターゲット部位以外の配列におけるこのタイプの異常切断が起こる確率を低下
させるための一つのアプローチでは、ホモ二量体化を最小限に抑えるか防止する切断ハー
フドメインの変異体を作製する。好ましくは、ハーフドメインのうち、その二量体化に関
与する領域中の１またはそれ以上のアミノ酸を変更する。ＦｏｋＩタンパク質二量体の結
晶構造では、切断ハーフドメインの構造が、ＦｏｋＩによるＤＮＡの切断時の切断ハーフ
ドメインの配置に類似していると報告されている。Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 95:10564-10569。この構造は、４８３位および４８７位のアミノ酸残基がＦ
ｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に重要な役割を果たすことを示している。この構造
は、４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９
６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基
がいずれも、二量体化界面に対して、二量体化に影響を及ぼすほど十分に近いことも示し
ている。従って、上述の位置の１またはそれ以上におけるアミノ酸配列の変更は、切断ハ
ーフドメインの二量体化特性をおそらく変更する。そのような変化は、例えば、これらの
位置に異なるアミノ酸残基を含有（またはコードする）ライブラリーを構築し、所望の特
性を有する変異体を選択することによって、または個々の突然変異体を合理的に設計する
ことによって導入することができる。ホモ二量体化を防止することに加えて、これらの突
然変異の一部は、切断効率を２つの野生型切断ハーフドメインによって得られる効率以上
に増加させ得る。
【０１７３】
従って、１対のＺＦＰ／ＦｏｋＩ融合物の一方が、望んでいない配列における切断につ
ながり得るホモ二量体化を起こすのを防止するために、二量体化に影響を及ぼす任意のア
ミノ酸残基におけるＦｏｋＩ切断ハーフドメインの変更を使用することができる。従って
、１対のＺＦＰ／ＦｏｋＩ融合物を用いる標的切断の場合は、自己二量体化を阻害するが
、切断が所望のターゲット部位で起こるように２つの融合タンパク質のヘテロ二量体化が
起こることは許容する、１またはそれ以上のアミノ酸変更を融合タンパク質の一方または
両方が含み得る。いくつかの実施形態では、変更が両方の融合タンパク質に存在して、そ
れらの変更が相加的な効果を有する。すなわち、異常な切断につながるどちらか一方の融
合物のホモ二量体化が最小限に抑えられるか消滅すると同時に、２つの融合タンパク質の
ヘテロ二量体化が、野生型切断ハーフドメインを使って得られるものと比較して容易にな
る。
ゲノム配列の標的変更および標的組換えの方法
【０１７４】
本明細書には、ゲノム配列（例えば細胞クロマチン中の関心領域）を相同非同一配列で
置き換える方法（すなわち標的組換えの方法）も記載する。特定の配列を置き換える従来
の試みでは、細胞を染色体領域に対して相同性を有する配列を含むポリヌクレオチド（す
なわちドナーＤＮＡ）と接触させた後、ドナーＤＮＡ分子がゲノム内への相同組換えを起
こしている細胞の選択が行われてきた。相同組換えの効率は低く、ドナーＤＮＡがターゲ
ット部位以外のゲノムの領域中に非特異的に挿入される頻度が高いため、これらの方法の
成功率は低い。
【０１７５】
本開示は、高い標的組換え効率および低い非特異的挿入イベント頻度を特徴とする、標
的配列変更の方法を提供する。これらの方法では、切断ドメイン（または切断ハーフドメ
イン）に融合された操作されたジンクフィンガー結合ドメインを作製し、それを使用して
、細胞ＤＮＡ中に１またはそれ以上の標的二本鎖切断を作る。細胞ＤＮＡにおける二本鎖
切断は、切断部位の近傍で細胞の修復機構を数千倍刺激するので、そのような標的切断は
、ゲノム中の事実上任意の位置における配列の（相同性指向的修復（homology-directed 
repair）による）変更または置換を可能にする。
【０１７６】
本明細書に記載する融合分子の他に、選択されたゲノム配列の標的置換には、置換（ま
たはドナー）配列の導入が必要である。ドナー配列は、融合タンパク質の発現に先だって
、または融合タンパク質の発現と同時に、または融合タンパク質の発現後に、細胞中に導
入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、ゲノム配列に対して、ドナーポリヌク
レオチドと相同性を有するゲノム配列との間で起こる相同組換え（または相同性指向的修
復）を支持するのに十分な相同性を含有する。ドナー配列とゲノム配列の間に約２５、５
０  １００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチ
ドまたはそれ以上（または１０〜２，０００ヌクレオチドもしくはそれ以上の間の任意の
整数値）の配列相同性があれば、それらの間の相同組換えが支持される。ドナー配列の長
さは１０〜５，０００ヌクレオチド（またはその間にある任意の整数値のヌクレオチド）
またはそれ以上の長さに及び得る。通例、ドナー配列が取って代わるゲノム配列と同一で
ないことは明白である。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分
な相同性が存在する限り、ゲノム配列と比較して、１またはそれ以上の一塩基変化、挿入
、欠失、反転または再配列を含有することができる。あるいは、ドナー配列は、２つの相
同性領域に挟まれた非相同配列を含有することもできる。さらにドナー配列は、細胞クロ
マチン中の関心領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。一般
に、ドナー配列の相同領域は、組換えられることが望まれるゲノム配列に対して、少なく
とも５０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、６０％、７０％、８０％、
９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポ
リヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の間の任意の値の配列同一性が存在し得
る。
【０１７７】
ドナー分子は、細胞クロマチンに対して、数個の不連続な相同性領域を含有することが
できる。例えば、関心領域中に通常は存在しない配列の標的挿入には、前記配列がドナー
核酸分子中に存在して、関心領域中の配列に対する相同性領域で挟まれていることができ
る。
【０１７８】
ドナー配列の挿入の成否を決定するためのアッセイ（例えばハイブリダイゼーション、
ＰＣＲ、制限酵素消化）を簡単化するために、ゲノム配列と比較していくつかの配列相違
をドナー配列中に存在させることができる。コード領域中に位置する場合、そのようなヌ
クレオチド配列相違は、好ましくは、アミノ酸配列を変えないか、サイレントなアミノ酸
変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響を及ぼさない変化）を起こす。ドナ
ーポリヌクレオチドは、相同組換えによって細胞クロマチン中に導入されているドナー配
列の切断を防止するために、関心領域中のジンクフィンガードメイン結合部位に対応する
配列中に、適宜、変化を含有することができる。
【０１７９】
ドナーポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであることができ
、線状または環状で細胞中に導入することができる。線状で導入する場合は、ドナー配列
の末端を当業者に公知の方法によって（例えばエキソヌクレアーゼ分解から）保護するこ
とができる。例えば、１またはそれ以上のジデオキシヌクレオチド残基を線状分子の３’
末端に付加し、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲー
トする。例えばChang et al. (1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:4959-4963、Nehls 
et al. (1996) Science 272:886-889を参照されたい。外来ポリヌクレオチドを分解から
保護するための他の方法には、末端アミノ基の付加、ならびに修飾ヌクレオチド間結合、
例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど、およびＯ−メチルリボースまたは
デオキシリボース残基の使用があるが、これらに限るわけではない。
【０１８０】
ポリヌクレオチドは、追加配列、例えば複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性を
コードする遺伝子などを有するベクター分子の一部として細胞中に導入することができる
。さらにまた、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として導入するか、リポソームもし
くはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入するか、または細菌もしくは
ウイルス（例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム属（Rhizobium sp.
）ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾ
ビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス、ジャガイモＸウイル
ス、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルス）によって送
達することができる。例えばChung et al. (2006) Trends Plant Sd. 11(1):1-4を参照さ
れたい。
【０１８１】
一つの理論に束縛されるわけではないが、細胞配列中の二本鎖切断の存在は、その切断
に隣接するまたはその切断を取り巻く領域に対して相同性を有する外来ＤＮＡ分子の存在
と相まって、ドナー分子から細胞（例えばゲノムまたは染色体）配列への配列情報の移動
によって（すなわち「遺伝子変換」とも呼ばれる相同性指向的修復のプロセスによって）
切断を修復する細胞機構を活性化するようである。本出願人の方法では、操作されたＺＦ
Ｐの強力なターゲティング能力を切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と有利に組
み合わせて、外来配列の挿入が望まれるゲノムの領域へと二本鎖切断を特異的にターゲテ
ィングする。
【０１８２】
ドナー配列のうちの十分な量がコピーされて所望の配列変更が達成される限り、染色体
配列の変更にとって、ドナーの配列全部が染色体中にコピーされる必要はない。
【０１８３】
相同組換えによるドナー配列の挿入の効率は、細胞ＤＮＡにおける二本鎖切断と組換え
を望む部位の間の距離と、逆の関係にある。言い換えると、二本鎖切断が組換えを望む部
位に近いほど、高い相同組換え効率が観察される。正確な組換え部位が予め定められてい
ない（例えば望ましい組換えイベントがゲノム配列のある区間にわたって起こり得る）場
合、ドナー核酸の長さおよび配列は、切断の部位と共に、所望の組換えイベントが得られ
るように選択される。所望のイベントがゲノム配列中の単一ヌクレオチド対の配列を変化
させるために設計される場合は、細胞クロマチンがそのヌクレオチド対の片側、１０，０
００ヌクレオチド以内で切断される。いくつかの実施形態では、切断が、変化させようと
する配列を有するヌクレオチド対の片側、１，０００、５００、２００、１００、９０、
８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、もしくは２ヌクレオチド以内、
または２〜１，０００ヌクレオチドの間の任意の整数値以内で起こる。
【０１８４】
上に詳述したように、それぞれにジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメイン
とを含む２つの融合タンパク質にとっての結合部位は、他方の結合部位に最も近い各結合
部位の端部から測定した場合に５〜８または１５〜１８ヌクレオチド離れて位置すること
ができ、切断はそれら結合部位の間で起こる。切断が結合部位の間の単一部位で起こるか
複数の部位で起こるかは重要でない。というのも、切断されたゲノム配列はドナー配列で
置き換えられるからである。従って、標的組換えによる単一ヌクレオチド対の配列の効率
のよい変更には、結合部位の間の領域の中間点が、そのヌクレオチド対の１０，０００ヌ
クレオチド以内、好ましくは１，０００ヌクレオチド以内、または５００ヌクレオチド以
内、または２００ヌクレオチド以内、または１００ヌクレオチド以内、または５０ヌクレ
オチド以内、または２０ヌクレオチド以内、または１０ヌクレオチド以内、または５ヌク
レオチド以内、または２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内、または関心対象
のヌクレオチド対にある。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、相同染色体がドナーポリヌクレオチドとして機能してもよい
。従って、例えばヘテロ接合体中の突然変異の修正は、一方の染色体上の突然変異型配列
に結合してそれを切断するが相同染色体上の野生型配列を切断しない融合タンパク質を操
作することによって達成することができる。突然変異保有染色体上の二本鎖切断は、相同
性に基づく「遺伝子変換」プロセスを刺激し、そのプロセスでは、相同染色体に由来する
野生型配列が切断された染色体中にコピーされ、よって２コピーの野生型配列を回復する
。
【０１８６】
標的組換えのレベルを強化し得る方法および組成物も提供する。これには、相同組換え
に関与する遺伝子、例えばＲＡＤ５２エピスタシス群（例えばＲａｄ５０、Ｒａｄ５１、
Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ５４Ｂ、
Ｍｒｅｌ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３）、上述の遺伝子産物と相互作用する産物（例えば
ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２）をもたらす遺伝子および／またはＮＢＳ１複合体中の遺伝子な
どの発現を活性化するための追加ＺＦＰ機能ドメイン融合物の使用が含まれるが、それら
に限るわけではない。例えばBoyko et al. (2006) Plant Physiology 141:488-497および
LaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(4):1148-1155を参照されたい。同様に、
非相同末端接合に関与する遺伝子（例えばＫｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、ポリ(ＡＤＰリ
ボース)ポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ４）の発現を抑制するために、ＺＦＰ機能ドメイ
ン融合物を本明細書に開示されている方法および組成物と組み合わせて使用することもで
きる。例えばRiha et al. (2002) EMBO 21:2819-2826、Freisner et al. (2003) Plant J
. 34:427-440、Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142を
参照されたい。ジンクフィンガー結合ドメインと機能ドメインとの融合物を使って遺伝子
の発現を活性化および抑制するための方法は、例えば共有に係る米国特許第６，５３４，
２６１号、同第６，８２４，９７８号および同第６，９３３，１１３号に開示されている
。他の抑制方法には、抑制されるべき遺伝子の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）の使用がある。
【０１８７】
相同組換えに関与する遺伝子産物の発現を活性化する代わりに、またはそれに加えて、
これらのタンパク質（またはその機能的フラグメント）と、関心領域を標的とするジンク
フィンガー結合ドメインとの融合物を使って、これらのタンパク質（組換えタンパク質）
を関心領域に動員し、その結果として、それらの局所濃度を増加させ、相同組換えプロセ
スをさらに刺激することもできる。あるいは、相同組換えに関与する上述のようなポリペ
プチド（またはその機能的フラグメント）が、ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ドメ
イン（または切断ハーフドメイン）および組換えタンパク質（またはその機能的フラグメ
ント）を含む三重融合タンパク質の一部であることもできる。遺伝子変換および組換え関
連クロマチンリモデリングに関与し、上述の方法および組成物において使用することがで
きる他のタンパク質には、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えばＥｓａ１ｐ、Ｔ
ｉｐ６０）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えばＤｏｔ１ｐ）、ヒストンキナー
ゼおよびヒストンホスファターゼがある。Bhat et al. (1999) Plant J. 33:455-469も参
照されたい。
【０１８８】
ジンクフィンガー／ヌクレアーゼ融合物分子およびドナーＤＮＡ分子を含む細胞におけ
る標的組換えの効率のさらなる増加は、相同性によって駆動される修復プロセスが最大限
に活性である細胞周期のＧ２期で細胞をブロックすることにより達成される。そのような
停止はいくつかの方法で達成することができる。例えば、細胞をＧ２期で停止させるよう
に細胞周期進行に影響を及ぼす薬物、化合物および／または小分子などで、細胞を処理す
ることができる。このタイプの代表的分子には、微小管重合に影響を及ぼす化合物（例え
ばビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、ＤＮＡと相互作用する化合物（例えば
ｃｉｓ−白金（ＩＩ）ジアミンジクロライド、シスプラチン、ドキソルビシン）および／
またはＤＮＡ合成に影響を及ぼす化合物（例えばチミジン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−ミモシ
ン、エトポシド、５−フルオロウラシル）などがある。組換え効率のさらなる増加は、ク
ロマチン構造を変更してゲノムＤＮＡを細胞の組換え機構により近づきやすくするヒスト
ンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）の使
用によって達成される。
【０１８９】
細胞周期停止の他の方法として、ＣＤＫ細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質
をそのタンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞中に導入することによって、またはそのタ
ンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する操作されたＺＦＰを細胞中に導入するこ
とによって過剰発現させることが挙げられる。細胞周期停止は、例えばＲＮＡｉ法を使っ
て（例えば米国特許第６，５０６，５５９号）、または細胞周期進行に関与する１もしく
はそれ以上の遺伝子、例えばサイクリンおよび／またはＣＤＫ遺伝子などの発現を抑制す
る操作されたＺＦＰを細胞中に導入することにより、サイクリンおよびＣＤＫの活性を阻
害することによっても達成される。遺伝子発現を調節するための操作されたジンクフィン
ガータンパク質の合成方法については、例えば、共有に係る米国特許第６，５３４，２６
１号を参照されたい。
【０１９０】
あるいは、いくつかの例では、標的切断がドナーポリヌクレオチドの非存在下に（好ま
しくはＳ期またはＧ２期で）行われ、組換えが相同染色体間で起こる。
【０１９１】
発現ベクター
１またはそれ以上のＺＦＰまたはＺＦＰ融合タンパク質をコードする核酸は、複製およ
び／または発現用の原核細胞または真核細胞中に形質転換するためのベクター中にクロー
ニングすることができる。ベクターは原核ベクター、例えばプラスミド、またはシャトル
ベクター、昆虫ベクター、または真核ベクターであることができる。ＺＦＰをコードする
核酸は、植物細胞に投与するために、発現ベクター中にクローニングすることもできる。
【０１９２】
ＺＦＰまたはＺＰＦ融合タンパク質を発現させるには、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合物をコ
ードする配列が、通例、転写を指示するためのプロモーターを含有する発現ベクターにサ
ブクローニングされる。適切な細菌および真核プロモーターは当分野で周知であり、例え
ばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed.
, 2001)、Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)、お
よびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra）に記載されて
いる。ＺＦＰを発現させるための細菌発現系は、例えば大腸菌（E. coli）、バチルス属
（Bacillus sp.）およびサルモネラ（Salmonella）で利用することができる（Palva et a
l., Gene 22:229-235 (1983)）。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺
乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核発現系は、当業者には周知であり、やはり市
販されている。
【０１９３】
ＺＦＰをコードする核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、その用途
に依存する。例えば、ＺＦＰの発現および精製には、通例、宿主細胞に適合した強い構成
的プロモーターが使用される。
【０１９４】
対照的に、ＺＦＰが植物遺伝子調節のためにインビボで投与される場合（後述する「植
物細胞への核酸送達」の項を参照）は、そのＺＦＰの特定用途に応じて、構成的プロモー
ターまたは誘導性プロモーターのどちらかが使用される。植物プロモーターの限定でない
例には、シロイヌナズナ（A. thaliana）ユビキチン−３（ｕｂｉ−３）由来のプロモー
ター配列（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）、アグロバクテリ
ウム・ツミファシエンス（A. tumifaciens）マンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）（Petoli
no et al., 米国特許第６，７３０，８２４号）、および／またはキャッサバ葉脈モザイ
クウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:112
9-1139）などがある。実施例も参照されたい。
【０１９５】
プロモーターの他に、発現ベクターは、通例、原核または真核宿主細胞における核酸の
発現に要求される追加エレメントを全て含有する転写単位または発現カセットを含有する
。従って典型的な発現カセットは、例えばＺＦＰをコードする核酸配列などに作動可能に
連結されたプロモーター、例えば転写物の効率のよいポリアデニル化、転写終結、リボゾ
ーム結合部位、または翻訳終結などに要求されるシグナルを含有する。カセットの他のエ
レメントには、例えばエンハンサー、および異種スプライシングシグナルなどが含まれ得
る。
【０１９６】
遺伝情報を細胞内に輸送するために使用される特定発現ベクターは、ＺＦＰの使用目的
、例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現などとの関連で選択される
（後述の発現ベクターを参照されたい）。標準的な細菌および動物発現ベクターは当分野
では公知であり、例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４号Ａ１および国際特
許公報国際公開第０５／０８４１９０号、国際公開第０５／０１４７９１号および国際公
開第０３／０８０８０９号などに詳述されている。
【０１９７】
標準的なトランスフェクション方法を使って、多量のタンパク質を発現させる細菌細胞
株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を作出することができ、次にそのタン
パク質を標準的な技法で精製することができる（例えばColley et al., J. Biol. Chem. 
264:17619-17622 (1989)、「Guide to Protein Purification」 in Methods in Enzymolo
gy, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990) を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転
換は標準的技法に従って行われる（例えばMorrison, J. Bact. 132:349-351 (1977)、Cla
rk-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983)
を参照されたい）。
【０１９８】
そのような宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手法はいずれも使
用することができる。それらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン
、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えばソノポレーション）
、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルス
ベクター（エピソーム型および組み込み型の両方）の使用、ならびにクローニングされた
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するた
めの他の任意の周知の方法が含まれる（例えばSambrook et al., supraを参照されたい）
。使用する特定の遺伝子操作手法が、選択したタンパク質を発現させる能力を有する宿主
細胞中に少なくとも１つの遺伝子をうまく導入することができさえすればよい。
【０１９９】
植物細胞への核酸送達
上述のように、ＤＮＡコンストラクトは、所望の植物宿主中（例えばそのゲノム中）に
、さまざまな従来の技法で導入することができる。そのような技法を概観するには、例え
ばWeissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Pres
s, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463、およびGrierson & Corey, Plant Molecular Biol
ogy (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9を参照されたい。
【０２００】
例えばＤＮＡコンストラクトは、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションお
よびマイクロインジェクションなどの技法を使って植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接導入
するか、バイオリスティック法、例えばＤＮＡパーティクルボンバードメントを使って、
ＤＮＡコンストラクトを植物組織に直接導入することができる（例えばKlein et al. (19
87) Nature 327:70-73を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡコンストラクトを適切なＴ−
ＤＮＡ隣接領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）宿主ベクターに導入してもよい。アグロバクテリウム・ツメファ
シエンスによる形質転換技法は、無害化（disarming）およびバイナリーベクターの使用
を含めて、科学文献に詳しく記載されている。例えばHorsch et al. (1984) Science 233
:496-498、およびFraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803を参照さ
れたい。
【０２０１】
さらに、非アグロバクテリウム細菌またはウイルス、例えばリゾビウム属ＮＧＲ２３４
、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ
、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイク
ウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどを使って、遺伝子導入を達成するこ
ともできる。例えばChung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4を参照されたい
。
【０２０２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のビルレンス機能は、バイナリーＴ ＤＮ
Ａベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または共培養法（Horsch et 
al. (1985) Science 227:1229-1231）を使って細胞をこの細菌に感染させた場合に、植物
細胞ＤＮＡへのコンストラクトおよび隣接マーカーの挿入を指示する。一般に、アグロバ
クテリウム形質転換系は、双子葉植物を操作するために使用される（Bevan et al. (1982
) Ann. Rev. Genet 16:357-384、Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641
）。アグロバクテリウム形質転換系は、単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを形質転換お
よび導入するためにも使用することができる。米国特許第５，５９１，６１６号、Hernal
steen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041、Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nat
ure 311:763-764、Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179、Boulton et al. (198
9) Plant Mol. Biol. 12:31-40、およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-43
4を参照されたい。
【０２０３】
代替的な遺伝子導入および形質転換方法には、カルシウム、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）またはエレクトロポレーションが媒介する裸のＤＮＡの取り込みによるプロトプ
ラスト形質転換（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722、Potrykus et al. (19
85) Molec. Gen. Genet. 199:169-177、Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. US
A 82:5824-5828、およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照されたい）および
植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505
）があるが、これらに限るわけではない。植物細胞形質転換のさらなる方法には、マイク
ロインジェクション、炭化ケイ素が媒介するＤＮＡ取り込み（Kaeppler et al. (1990) P
lant Cell Reporter 9:415-418）、およびマイクロプロジェクタイルバンバードメント（
Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309、およびGordon-Kamm et
al. (1990) Plant Cell 2:603-618を参照されたい）がある。
【０２０４】
開示されている方法および組成物は、植物細胞ゲノム中の所定の位置に外来配列を挿入
するために使用することができる。植物ゲノム中に導入された導入遺伝子の発現はその組
み込み部位に決定的に依存するので、これは有用である。従って、例えば栄養素、抗生物
質または治療用分子などをコードする遺伝子をその発現にとって有利な植物ゲノムの領域
に、標的組換えによって挿入することができる。
【０２０５】
上記形質転換技法のいずれかによって作出される形質転換された植物細胞を培養するこ
とにより、形質転換された遺伝子型を持ち、従って所望の表現型を有する、全植物体を再
生させることができる。そのような再生技法は組織培養成長培地中のいくつかの植物ホル
モンの操作に依拠し、典型的には、所望のヌクレオチド配列と共に導入されている殺生物
剤および／または除草剤マーカーに依拠する。培養プロトプラストからの植物再生は、Ev
ans et al., 「Protoplasts Isolation and Culture」 in Handbook of Plant Cell Cult
ure, pp.124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983、およびBinding, R
egeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp.21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985
に記載されている。再生は植物のカルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部から達
成することもできる。そのような再生技法は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant 
Phys. 38:467-486に概説されている。
【０２０６】
植物細胞に導入された核酸を使って、基本的にどの植物にでも、所望の形質を付与する
ことができる。本開示の核酸コンストラクトと上述した種々の形質転換方法とを使って、
本明細書に記載する所望の生理学的および作物栽培学的特徴が得られるように、多種多様
な植物および植物細胞系を操作することができる。好ましい実施形態では、操作のターゲ
ット植物および植物細胞に、単子葉植物および双子葉植物、例えば穀物作物（例えばコム
ギ、トウモロコシ、コメ、アワ（millet）、オオムギ）、果実作物（例えばトマト、リン
ゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜作物（例えば
ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えばレタス、ホウレ
ンソウ）、顕花植物（例えばペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えばマツ
、モミ、トウヒ）、ファイトレメディエーションに使用される植物（例えば重金属蓄積植
物）、油料作物（例えばヒマワリ、ナタネ）および実験用途に使用される植物（例えばア
ラビドプシス（Arabidopsis）を含む作物が含まれるが、これらに限るわけではない。従
って、開示されている方法および組成物は、例えば、限定するわけではないが、アスパラ
ガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、アブラナ属（Brassica）、ミカン属（Ci
trus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）
、ニンジン属（Daucus）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Ho
rdeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）
、マニホット属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（P
ersea）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（R
aphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、モロコシ属（Sorghum）、コム
ギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）、およびトウモロコシ属（Ze
a）に属する種など、広範囲にわたる植物に使用することができる。
【０２０７】
発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確
認されたら、それを有性交配によって他の植物体に導入できることは、当業者にはわかる
。いくつかある標準的育種技法はどれでも、交配させる種に応じて使用することができる
。
【０２０８】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物体は、形質転換ＤＮＡ上に存在する
マーカー遺伝子がコードする形質に関して、操作された植物材料を選択またはスクリーニ
ングすることによって同定し、単離することができる。例えば選択は、阻害量の抗生物質
または除草剤（形質転換遺伝子コンストラクトがそれに対する耐性を付与するもの）を含
有する培地上で、操作された植物材料を成長させることよって行うことができる。さらに
また、組換え核酸コンストラクト上に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えばβ−
グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニン
グすることにより、形質転換された植物体および植物細胞を同定することもできる。その
ような選択およびスクリーニング方法論は、当業者には周知である。
【０２０９】
挿入された遺伝子コンストラクトを含有する植物形質転換体または植物細胞形質転換体
を同定するために、物理的および生化学的方法も使用することができる。これらの方法に
は、１）組換えＤＮＡインサートを検出し、その構造を決定するためのサザン解析または
ＰＣＲ増幅、２）遺伝子コンストラクトのＲＮＡ転写物を検出して調べるためのノーザン
ブロット、Ｓ１ ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅、３）
酵素活性またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ（そのような遺伝子産物を
遺伝子コンストラクトがコードしている場合）、４）タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタ
ンブロット技法、免疫沈降、または酵素結合イムノアッセイ（遺伝子コンストラクト産物
がタンパク質である場合）などがあるが、これらに限るわけではない。他の技法、例えば
インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色も、特定の植物器官
または植物組織における組換えコンストラクトの存在または発現を検出するために使用す
ることができる。これらのアッセイを行うための方法はいずれも当業者には周知である。
【０２１０】
本明細書に開示されている方法を使った遺伝子操作の効果は、例えば関心対象の組織か
ら単離されるＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）のノーザンブロットなどによって観察することが
できる。通例、ｍＲＮＡの量が増加しているのであれば、対応する内在性遺伝子は、以前
より高率に発現されていると考えることができる。遺伝子および/またはＣＹＰ７４Ｂ活
性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質および反応生成物または副
生成物の増減を検出する方法に応じて、異なるタイプの酵素アッセイを使用することがで
きる。さらにまた、発現されるＣＹＰ７４Ｂタンパク質のレベルを免疫化学的に、すなわ
ちＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび当業者に周知の他の抗体に基づくアッセイ、例えば
電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングを伴うもの）で測定するこ
ともできる。導入遺伝子は、植物体の一部の組織で、または一部の発生段階で、選択的に
発現させることもできるし、実質的に全ての植物組織において、実質的にそのライフサイ
クル全体にわたって発現させることもできる。しかし、任意の組合せ発現（combinatoria
l expression）モードも適用できる。
【０２１１】
本開示は、上述したトランスジェニック植物の種子も包含し、その種子は導入遺伝子ま
たは遺伝子コンストラクトを有する。本開示はさらに、上述したトランスジェニック植物
の子孫、クローン、細胞株または細胞も包含し、前記子孫、クローン、細胞株または細胞
は導入遺伝子または遺伝子コンストラクトを有する。
【０２１２】
ＺＦＰおよびＺＦＰをコードする発現ベクターは、標的切断および/または標的組換え
のために、植物に直接投与することができる。
【０２１３】
有効量の投与は、ＺＦＰを処置されるべき植物細胞と最終的に接触させるために通常使
用される経路のいずれかによって行われる。ＺＦＰは任意の適切な方法で、好ましくは薬
学的に許容できる担体と共に投与される。そのような調整物質（modulator）を投与する
ための適切な方法は当業者には利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために
２以上の経路を使用することもできるが、多くの場合、ある特定の経路は、他の経路より
も、素早く効果的な反応をもたらし得る。
【０２１４】
担体も使用することができ、担体は、一つには、投与されるその組成物によって決まり
、また組成物を投与するために使用するその方法によっても決まる。従って、利用するこ
とのできる医薬組成物の適切な製剤は、広範囲にわたって種々存在する（例えばRemingto
n's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985））。
【０２１５】
応用例
開示されている標的切断のための方法および組成物は、ゲノム配列中に突然変異を誘発
するために使用することができる。標的切断は、遺伝子ノックアウトを作出するため（例
えば機能ゲノミクスまたはターゲット検証（target validation）のため）およびゲノム
への配列の標的挿入（すなわち遺伝子ノックイン）を容易にするためにも使用することが
できる。挿入は、相同組換えを介した染色体配列の置換によるか、または染色体中の関心
領域に相同な配列に挟まれた新しい配列（すなわち関心領域中には存在しない配列）が所
定の標的部位に挿入される標的組み込みによることができる。同じ方法を使って、野生型
配列を突然変異型配列で置き換えること、または一つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子に
変換することもできる。
【０２１６】
感染植物病原体または組み込まれた植物病原体の標的切断は、例えばその病原体のゲノ
ムをその病原性が低減または排除されるような形で切断することにより、植物宿主におけ
る病原性の感染を処置するために使用することができる。また、植物ウイルスに対する受
容体をコードする遺伝子の標的切断を使ってそのような受容体の発現を阻止し、それによ
ってその植物におけるウイルス感染および／またはウイルス拡散を防止することもできる
。
【０２１７】
代表的な植物病原体には、植物ウイルス、例えばアルファモウイルス、アルファクリプ
トウイルス、バドナウイルス、ベータクリプトウイルス、ビジェミニウイルス（Bigemini
viruses）、ブロモウイルス、ビモウイルス、カピロウイルス、カルラウイルス、カルモ
ウイルス、カリモウイルス、クロステロウイルス、コモウイルス、ククモウイルス、シト
ラブドウイルス、ディアンソウイルス、エナモウイルス、ファバウイルス、フィジーウイ
ルス、フロウイルス、ホルデイウイルス、ハイブリジェミニウイルス（Hybrigeminivirue
s）、イダエオウイルス、イラルウイルス、イポモウイルス、ルテオウイルス、マクロモ
ウイルス、マクルラウイルス（Macluraviruses）、マラフィウイルス、モノジェミニウイ
ルス（Monogeminivirues）、ナナウイルス（Nanaviruses）、ネクロウイルス、ネポウイ
ルス、ヌクレオラブドウイルス、オリザウイルス、ウルミアウイルス、フィトレオウイル
ス、ポテックスウイルス、ポティウイルス、リモウイルス、サテライトＲＮＡ、サテリウ
イルス（satelliviruses）、セキウイルス、ソベモウイルス、テヌイウイルス、トバモウ
イルス、トブラウイルス、トンブスウイルス、トスポウイルス、トリコウイルス、ティモ
ウイルス、アンブラウイルス、ヴァリコサウイルスおよびワイカウイルス；真菌病原体、
例えば黒穂病菌（例えばクロボキン目（Ustilaginales））、さび病菌（サビキン目（Ure
dinales））、麦角病菌（麦角菌（Clavicepts pupurea）およびうどん粉病菌；カビ（卵
菌類）、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）（ジャガイ
モ疫病）；細菌病原体、例えばエルウィニア属（Erwinia）（例えばエルウィニア・ヘル
ビコーラ（E. herbicola））、シュードモナス属（Pseudomonas）（例えばシュードモナ
ス・エルギノーサ（P. aeruginosa）、シュードモナス・シリンゲ（P. syringae）、シュ
ードモナス・フルオレセンス（P. fluorescense）およびシュードモナス・プチダ（P. pu
tida））、ラルストニア属（Ralstonia）（例えばラルストニア・ソラナセラム（R. sola
nacearum））、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）およびキサントモナス属（Xanth
omonas）、回虫（線虫類（Nematoda））；ならびにフィトミクサ（Phytomyxea）（ポリミ
キサ（Polymyxa）およびプラスモディオフォラ（Plasmodiophora））があるが、これらに
限るわけではない。
【０２１８】
開示されている標的組換えの方法は、任意のゲノム配列を相同非同一配列で置き換える
ために使用することができる。例えば突然変異型ゲノム配列をその野生型対応物で置き換
えることによって、植物疾病を処置するための方法とすること、植物病原体に対する抵抗
性を付与すること、作物収量を増加させることなどができる。同様にして、本明細書に開
示されている標的組換えの方法を使って、ある遺伝子の一方の対立遺伝子を異なる対立遺
伝子で置き換えることができる。
【０２１９】
これらの例の多くでは、関心領域が突然変異を含み、ドナーポリヌクレオチドが対応す
る野生型配列を含む。同様に、野生型ゲノム配列を突然変異型配列で置き換えることも、
それが望ましいのであれば可能である。例えば、がん遺伝子の過剰発現は、その遺伝子を
突然変異させるか、その制御配列を低い非病理学的発現レベルを支持する配列で置き換え
ることによって、逆転させることができる。実際、特定のゲノム配列に何らかの形で依存
する病変は、本明細書に開示されている方法および組成物を使って修正または軽減するこ
とができる。
【０２２０】
標的切断および標的組換えは、遺伝子産物の発現レベルを変更する目的で、非コード配
列（例えば調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、イニシエーター、ターミネー
ター、スプライス部位）を変更するためにも使用することができる。そのような方法は、
例えば治療目的、機能ゲノミクスおよび／またはターゲット検証研究などに使用すること
ができる。
【０２２１】
共有に係る国際公開第０１／８３７９３号に開示されているクロマチン構造の標的改変
を使って、細胞クロマチンへの融合タンパク質の結合を容易にすることができる。
【０２２２】
さらなる実施形態では、標的組換えを容易にするために、ジンクフィンガー結合ドメイ
ンとリコンビナーゼ（またはその機能的フラグメント）との１またはそれ以上の融合物を
本明細書に開示されているジンクフィンガー−切断ドメイン融合物に加えて、またはその
代わりに使用する。例えば共有に係る米国特許第６，５３４，２６１号およびAkopian et
al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691を参照されたい。
【０２２３】
さらなる実施形態では、開示されている方法および組成物を使って、ＺＦＰ結合ドメイ
ンと、その活性に二量体化（ホモ二量体化またはヘテロ二量体化のどちらか）を必要とす
る転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインとの融合物を得る。これらの例では、融合
ポリペプチドがジンクフィンガー結合ドメインと機能的ドメイン単量体（例えば二量体型
の転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインから得られる単量体）とを含む。適切な位
置にあるターゲット部位に２つのそのような融合ポリペプチドが結合すると、機能的な転
写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインが再構成されるような二量体化が可能になる。
【０２２４】
さらにまた、上に開示したとおり、本明細書に説明する方法および組成物は、細胞のゲ
ノム中の関心領域への外来配列の標的組み込みにも使用することができ、例えばその細胞
では、相同性依存的な機構による挿入（例えば、所定のゲノム配列（すなわちターゲット
部位）と同一であるか、または相同あるが同一ではない１またはそれ以上の配列と一緒に
外来配列を含むドナー配列の挿入）が、切断によって強化される。
【０２２５】
ドナー配列は、通例、ゲノム配列中の二本鎖切断の相同性指向的修復を支持し、それに
よってそのゲノムターゲット部位で外来配列を挿入するのに十分な相同性の外来配列を挟
む領域中に含有する。従ってドナー核酸は、相同性依存的修復機構（例えば相同組換え）
による外来配列の組み込みを支持するのに十分であるような任意のサイズを持ち得る。ど
の特定理論にも束縛されることは望まないが、外来配列を挟む相同性領域は、切断された
染色体末端に、二本鎖切断の部位で遺伝情報を再合成するためのテンプレートを提供する
と考えられる。いくつかの実施形態では、２つの同一配列または２つの相同であるが同一
でない配列（またはそれぞれの一つ）が、外来配列を挟んで存在する。外来配列（または
外来核酸もしくは外来ポリヌクレオチド）は、関心領域中に通常は存在しないヌクレオチ
ド配列を含有するものである。
【０２２６】
代表的な外来配列には、ｃＤＮＡ、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープ
タグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位およびさまざまなタイプの発現コンストラクト
があるが、これらに限るわけではない。例えば米国特許第６，８３３，２５２号を参照さ
れたい。他の代表的ホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ-
ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ
Ｉ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩお
よびＩ−ＴｅｖＩＩＩがある。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，
０３２号、Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388、Dujon et al. (1
989) Gene 82:115-118、Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127、Jas
in (1996) Trends Genet. 12:224-228、Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-1
80、Argast et al. (1998) J. Mol. Biol 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。
【０２２７】
マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ
４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色また
は蛍光または発光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤
色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、および強化された細胞成長およ
び／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコー
ドする配列があるが、これらに限るわけではない。従って代表的なマーカー遺伝子には、
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ
（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテ
コールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシ
フェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（
ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアン
トラニル酸シンターゼが含まれるが、これらに限るわけではない。いくつかの実施形態で
は、標的組み込みを使って、ＲＮＡ発現コンストラクト、例えばマイクロＲＮＡまたはｓ
ｉＲＮＡの調節された発現を担う配列が挿入される。上述のように、プロモーター、エン
ハンサー、および他の転写調節配列も、ＲＮＡ発現コンストラクトに組み入れることがで
きる。
【実施例】
【０２２８】
実施例１  ターゲットベクターの設計および作製
Ａ．ターゲット配列の全体構造
タバコ（双子葉植物）用のターゲットコンストラクトは、図１に示すように、次の７つ
のコンポーネントを含んだ：ｉ）アグロバクテリウム・ツミファシエンスオープンリーデ
ィングフレーム−２４（ｏｒｆ−２４）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Gelvin et al., 198
7, 欧州特許第２２２４９３号）で終わる大腸菌ＨＰＴ遺伝子（Waldron et al., 1985, P
lant Mol. Biol. 18:189-200）を駆動するシロイヌナズナ（A. thaliana）ユビキチン−
３（ｕｂｉ−３）プロモーター（Callis et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-1249
3）を含むハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）発現カセット；ｉｉ）
タバコ（N. tabacum）ＲＢ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）（Thompson et al., 1997,
国際公開第９７２７２０７号）を含む相同配列−１；ｉｉｉ）改変アグロバクテリウム
・ツミファシエンスマンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）プロモーター（Petolino et al.,
米国特許第６，７３０，８２４号）によって駆動される５’緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）遺伝子フラグメント（Ｅｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロ
シア・モスクワ）；ｉｖ）アグロバクテリウム・ツミファシエンスノパリンシンターゼ（
ｎｏｓ）３’ＵＴＲ（DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573）で終
わるＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）を駆動するキ
ャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター（Verdaguer et al., 1996, 
Plant Molecular Biology 31 :1129-1139）を含むβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現
カセット；ｖ）アグロバクテリウム・ツミファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ（Huang e
t al., J. Bacteriol. 172:1814-1822）で終わる３’ＧＦＰ遺伝子フラグメント（Ｅｖｒ
ｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロシア・モスクワ）；ｖｉ）シロイ
ヌナズナ４−クマロイル−ＣｏＡシンターゼ（４−ＣｏＡＳ）イントロン−1（ローカス
Ａｔ３ｇ２１３２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ００３０７４）を含む相同配列−２、および
ｖｉｉ）アグロバクテリウム・ツミファシエンスＯＲＦ−２５／２６ ３’ＵＴＲ（Gelvi
n et al., 1987, 欧州特許第２２２４９３号）で終わるストレプトミセス・ビリドクロモ
ゲネス（S. viridochromogenes）ホスフィノトリシンホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＴ
）（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）３’遺伝子フラグメント。
【０２２９】
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位（ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１）（
Urnov et al., 2005, 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号）をＣｓＶＭＶプ
ロモーター（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）の下流
に挿入し、ＧＵＳコード配列（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）と
Ｎ−末端で融合した。２コピーの第２ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部
位（Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１）（Urnov et al., 2005, 米国特許出願公開第２００５
／００６４４７４号）は、５’および３’ＧＦＰ遺伝子フラグメント（Ｅｖｒｏｇｅｎ 
Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロシア・モスクワ）に隣接した。各結合部位は
、各結合部位が約２００ｂｐのサイズになるように、特定ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融
合タンパク質の認識配列の４つの縦列反復を含有した（図２ａ）。これは、複雑なクロマ
チン環境においてジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質に認識配列がアクセス可能
であることを保証するために設計した。各認識配列は逆方向反復配列を含み、そこに単一
のジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質がホモ二量体として結合して、二本鎖ＤＮ
Ａを切断した（図２ｂ）。５’および３’ＧＦＰ遺伝子フラグメントは５４０ｂｐがオー
バーラップしてターゲット配列内に相同性をもたらし、ターゲット配列からの機能的ＧＦ
Ｐ翻訳が起こらないことを保証するために、５’ＧＦＰフラグメントの３’端に停止コド
ンが挿入された。ターゲット配列を含む形質転換ベクターを以下に述べる多段階クローニ
ングプロセスによって作製した。
【０２３０】
Ｂ．ＨＰＴバイナリーベクター（ｐＤＡＢ１５８４）の構築
アグロバクテリウム・ツミファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ（Huang et al., J. Bacter
iol. 172:1814-1822）で終わるＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep.
5:387-405）を駆動するシロイヌナズナｕｂｉ−３プロモーター（Callis, et al., 1990
, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）を含むＧＵＳ発現カセットを含有するベクターｐＤ
ＡＢ１４００を出発基礎コンストラクトとして使用した（図３）。
【０２３１】
ターゲットコンストラクト中の不必要な反復調節エレメントを避けるために、ｐＤＡＢ
１４００中のアグロバクテリウム・ツミファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ（Huang et al.,
J. Bacteriol. 172:1814-1822）をｐＤＡＢ７８２（図４）からＳａｃＩ／ＸｂａＩフラ
グメントとして切り出されてｐＤＡＢ１４００中の同じ部位にクローニングされたアグロ
バクテリウム・ツミファシエンスｏｒｆ−２４ ＵＴＲ（Gelvin et al., 1987, 欧州特許
第２２２４９３号）で置き換えた。その結果生じたコンストラクトは、アグロバクテリウ
ム・ツミファシエンスｏｒｆ−２４ ＵＴＲ（Gelvin et al., 1987, 欧州特許第２２２４
９３号）で終わるＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）
を駆動するシロイヌナズナｕｂｉ−３プロモーター（Callis, et al., 1990, J. Biol. C
hem. 265-12486-12493）を含有し、ｐＤＡＢ１５８２（図５）と名付けられた。
【０２３２】
ＨＰＴコード配列（Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200）をｐＤＡ
Ｂ３５４プラスミド（図６）から、プライマーＰ１およびＰ２を使って、ＰＣＲ増幅した
。ＢｂｓＩ部位をプライマーＰ１の５’端に付加し、ＳａｃＩ部位をプライマーＰ２の３
’端に保持した。ＨＰＴＩＩ ＰＣＲフラグメントをＢｂｓＩ／ＳａｃＩで消化し、Ｎｃ
ｏＩ−ＳａｃＩで消化したｐＤＡＢ１５８２にクローニングすることにより、ＧＵＳ遺伝
子をＰＣＲフラグメント由来のＨＰＴ遺伝子で置き換えた。その結果生じたプラスミドを
ｐＤＡＢ１５８３（図７）と名付けた。
【０２３３】
次に、シロイヌナズナｕｂｉ−３／ＨＰＴ／アグロバクテリウム・ツミファシエンスｏ
ｒｆ−２４フラグメントをｐＤＡＢ１５８３からＮｏｔＩ消化によって切り出し、Ｔ４ 
ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を生成させた。その平滑末端処理ＨＰＴ発現カセ
ットをバイナリー基礎ベクターｐＤＡＢ２４０７（図８）のＰｍｅＩ部位にクローニング
することにより、プラスミドｐＤＡＢ１５８４（図９）を得た。
【０２３４】
Ｃ．相同配列およびＳｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位を含
むベクター（ｐＤＡＢ１５８０）の構築
ターゲットベクター中の反復調節配列を避けるために、ｐＤＡＢ２４１８（図１０）中
のアグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ（Huang et al., J. Bacter
iol. 172:1814-1822）をアグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ ＵＴ
Ｒ（Gelvin et al., 1987, 欧州特許第２２２４９３号）で置き換えた。ＵＴＲを交換す
るために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ ＵＴＲ（Gelvin et
al., 1987, 欧州特許第２２２４９３号）をｐＤＡＢ４０４５プラスミド（図１１）から
、プライマーＰ３およびＰ４を使ってＰＣＲ増幅した。Ｓｍａ１およびＡｇｅ１部位をＰ
ＣＲフラグメントの３’端に付加し、ＳａｃＩ部位を５’端に保持した。アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ（Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-18
22）およびタバコ（N. tabacum）ＲＢ７ ＭＡＲ配列（Thompson et al., 1997, 国際公開
第９７２７２０７号）で終わるＰＡＴ遺伝子（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37
）を駆動するシロイヌナズナユビキチン−１０（ｕｂｉ−１０）プロモーター（Callis, 
et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）を含むＰＡＴ遺伝子発現カセットを含
有するｐＤＡＢ２４１８プラスミドＤＮＡをＳａｃＩおよびＡｇｅＩで消化し、最も大き
い２つのフラグメントを回収した。これらのフラグメントをＳａｃＩおよびＡｇｅＩで消
化したアグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ ＵＴＲ（Gelvin et al.
, 1987, 欧州特許第２２２４９３号）ＰＣＲ産物とライゲートした。その結果生じたプラ
スミドをｐＤＡＢ１５７５（図１２）と名付けた。タバコＲＢ７ ＭＡＲ（Thompson et a
l., 1997, 国際公開第９７２７２０７号）はターゲットベクター中の相同配列−１として
機能する。
【０２３５】
ターゲットベクター中の相同配列−２として機能するように、シロイヌナズナ４−Ｃｏ
ＡＳ（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ００３０７４）のイントロン
−１を選択した。ＰＡＴ遺伝子（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）コード配列
を解析して、適当な５’および３’スプライス部位が形成されるようにイントロンを挿入
するための部位として、開始コドンの２９９／３００ｂｐ下流が同定された。次に、完全
長イントロンを３’部分ＰＡＴコード配列の２５３ｂｐと、ＤＮＡ合成によって融合した
（Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ.，ＬＬＰ、テキサス州ヒューストン）。ＮｏｔＩおよび
ＳａｃＩ部位をそれぞれＤＮＡフラグメントの５’および３’端に付加した。次に、合成
されたＤＮＡフラグメントをＮｏｔＩ／ＳａｃＩで消化し、ｐＤＡＢ１５７５の同じ部位
に挿入して、完全長ＰＡＴコード配列を置き換えた。その結果生じたコンストラクトをｐ
ＤＡＢ１５７７（図１３）と名付けた。
【０２３６】
Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１の４縦列反復を含有する２４１ｂｐ ＤＮＡフラグメント
（図２）をそのフラグメントの５’端と３’端の両方にＳｍａ１部位を付加して合成した
（Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ.，ＬＬＰ、テキサス州ヒューストン）。次に、合成され
たジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位含有フラグメントをＳｍａ１で消化し、ｐＤＡＢ
１５７７のＭｓｃＩ部位に挿入した。その結果生じたベクターをｐＤＡＢ１５７９（図１
４）と名付けた。次に、第２のＳｍａＩ消化ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位含有フ
ラグメントをｐＤＡＢ１５７９のＳｗａＩ部位に挿入した。その結果生じたコンストラク
トをｐＤＡＢ１５８０（図１５）と名付けた。このベクターは、相同配列１および２（そ
れぞれタバコＲＢ７ ＭＡＲおよびシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン１）と、２つ
の合成Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位（それぞれがＳｃｄ２７−Ｌ０−
Ｆｏｋ１認識部位の４縦列反復を含有するもの）とを含有する。
【０２３７】
Ｄ．部分的に重複した２つの非機能的ＧＦＰフラグメントを含有するベクター（ｐＤＡＢ
１５７２）の構築
ＧＦＰ遺伝子ＣｏｐＧＦＰをＥｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ
（ロシア・モスクワ）から購入し、プライマーＰ５およびＰ６を使って完全長コード配列
をＰＣＲ増幅した。ＢｂｓＩおよびＳａｃＩ部位をＰＣＲ産物のそれぞれ５’端および３
’端に付加した。次に、ＣｏｐＧＦＰ ＰＣＲ産物をＢｂｓＩ／ＳａｃＩで消化し、アグ
ロバクテリウム・ツミファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ（Huang et al., J. Bacterio
l. 172:1814-1822）で終わるＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5
:387-405）を駆動する改変アグロバクテリウム・ツミファシエンスΔｍａｓプロモーター
（Petolino et al., 米国特許第６７３０８２４号）を含むｐＤＡＢ３４０１（図１６）
のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングして、ＧＵＳ遺伝子を置き換えた。その結果生
じたベクターをｐＤＡＢ１５７０（図１７）と名付けた。
【０２３８】
部分的に重複した２つの非機能的ＧＦＰフラグメントを作製するために、ＣｏｐＧＦＰ
のコード配列の大部分を含有し５’端に４７ｂｐの欠失を有するＤＮＡフラグメントをプ
ライマーＰ９およびＰ１０を使ってＰＣＲ増幅した。ＡｐａＩ部位を５’端と３’端の両
方に付加し、５’端、ＡｐａＩ部位の下流に、ＳｔｕＩ部位を追加した。次に、そのＰＣ
Ｒ産物をＡｐａＩで消化し、ｐＤＡＢ１５７０のＡｐａＩ部位に挿入することにより、同
じベクター中に５４０ｂｐの重複した配列を有する２つの非機能的ＧＦＰフラグメントを
作出した。得られたコンストラクトをｐＤＡＢ１５７２（図１８）と名付けた。
【０２３９】
Ｅ．ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位／ＧＵＳ遺伝子融合物
を含有するベクター（ｐＤＡＢ１５７３）の構築
ＩＬ−１＿Ｌ０−Ｆｏｋ１認識部位の４縦列反復を含有する２３３ｂｐのＤＮＡフラグ
メント（図２）は、ＮｃｏＩおよびＡｆｌＩＩＩ部位をそれぞれ５’端および３’端に付
加して、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ.，ＬＬＰ（テキサス州ヒューストン）によって合
成された。次に、合成されたフラグメントをＮｃｏＩ／ＡｆｌＩＩＩで消化し、ＣｓＶＭ
Ｖプロモーター（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）に
よって駆動されアグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ（Huang e
t al., J. Bacteriol. 172:1814-1822）で終わるＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant
Mol. Biol. Rep. 5:387-405）を含有するｐＤＡＢ４００３（図１９）のＮｃｏＩ部位に
挿入した。次にＩＬ−１＿Ｌｏ−Ｆｏｋ１結合部位とＧＵＳコード配列とのＮ末端融合物
を作製した。その結果生じたベクターをｐＤＡＢ１５７１（図２０）と名付けた。
【０２４０】
ターゲットベクター中の反復３’ＵＴＲエレメントを避けるために、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスｎｏｓ ３’ＵＴＲ（DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Gene
t. 1:561-573）をｐＤＡＢ７２０４（図２１）から、ＳａｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントと
して切り出し、ＳａｃＩ／ＮａｅＩで消化したｐＤＡＢ１５７１中にクローニングして、
アグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ（Huang et al., J. Bact
eriol. 172:1814-1822）を置き換えた。その結果生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５７３（
図２２）と名付けた。
【０２４１】
Ｆ．最終ターゲットベクター（ｐＤＡＢ１５８５）の構築
最終ターゲットベクターにするために、ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質ターゲット
部位が挿入されているＧＵＳ発現カセットをｐＤＡＢ１５７３からＮｏｔＩ消化によって
切り出し、平滑末端処理し、ｐＤＡＢ１５７２のＳｔｕＩ部位に挿入した。得られた中間
体ベクターをｐＤＡＢ１５７４（図２３）と名付けた。改変Δｍａｓプロモーター（Peto
lino et al., 米国特許第６７３０８２４号）、５’部分重複ＧＦＰ配列（Ｅｖｒｏｇｅ
ｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロシア・モスクワ）、ＣｓＶＭＶプロモー
ター (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）、ＩＬ−1−
Ｆｏｋ１融合タンパク質ターゲット配列、ＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. 
Biol. Rep. 5:387-405）コード領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｎｏｓ３’
ＵＴＲ（DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573）、３’部分重複Ｇ
ＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロシア・モスクワ）お
よびアグロバクテリウム・ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ（Huang et al., J. 
Bacteriol. 172:1814-1822）を含有するカセット全体をｐＤＡＢ１５７４から切り出して
、ｐＤＡＢ１５８０のＮｏｔＩ部位に挿入した。その結果生じたプラスミドをｐＤＡＢ１
５８１（図２４）と名付けた。次に、ｐＤＡＢ１５８１のＡｇｅＩフラグメントをｐＤＡ
Ｂ１５８４のＡｇｅＩ部位に挿入することにより、最終ターゲットコンストラクトｐＤＡ
Ｂ１５８５（図１）を作製した。
【０２４２】
実施例２  組み込まれたターゲット配列を有するトランスジェニック細胞株の作出
２つの異なるタバコ細胞懸濁培養物を使用して、そこに実施例１のターゲット配列をア
グロバクテリウム形質転換によって安定に組み込んだ。ＮＴ１と呼ぶ第１の培養物はワシ
ントン大学（米国ワシントン州シアトル）のＡｒｎｏｌｄ Ｂｅｎｄｉｃｈから入手した
。この培養物は２０〜３０の細胞塊で直径１５〜２０μの細胞として約４８時間の倍加時
間で増殖する。ＮＴ１細胞懸濁培養物は、ＭＳ基礎塩類（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｌａｂｓ Ｍ５２４）、１３７．４ｍｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、３０ｇ／Ｌ スクロース、
２．２２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１ｍｇ／Ｌ チアミン−ＨＣＬ、１００ｍｇ／Ｌ ミオイ
ノシトールおよび０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳを含有する培地中、５．７のｐＨで維持した。Ｎ
Ｔ１細胞は、１ｍＬのパック細胞容積（packed cell volume）（ＰＣＶ）に対して４０ｍ
Ｌの新鮮ＭＳ系培地を加えることによって、７日ごとに継代した。
【０２４３】
使用した第２のタバコ細胞培養物は、ＢＹ２と呼ばれ、日本たばこ産業（日本国静岡県
磐田市）のＪｕｎ Ｕｅｋｉから入手した。この培養物は、１００〜１５０の細胞塊で直
径５〜１０μの細胞としておよそ１８時間の倍加時間で増殖する。ＢＹ２細胞懸濁培養物
は、ＬＳ基礎塩類（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ Ｌ６８９）、１７０ｍｇ
／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３０ｇ／Ｌ スクロース、０．２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄおよび０．６
ｍｇ／Ｌ チアミン−ＨＣＬを含有する培地中、６．０のｐＨで維持した。ＢＹ２細胞は
、０．２５ｍＬのＰＣＶに対して５０ｍＬのＬＳ系培地を加えることによって、７日ごと
に継代した。ＮＴ１およびＢＹ２細胞懸濁培養物はどちらも、ロータリーシェーカー上の
２５０ｍＬフラスコ中、２５℃および１２５ＲＰＭで維持した。
【０２４４】
組み込まれたターゲット配列を有するトランスジェニックＮＴ１およびＢＹ２細胞培養
物を作出するために、継代４日後のタバコ懸濁物のフラスコを１０〜１２の４ｍＬアリコ
ートに分割し、それらを１００×２５ｍｍペトリディッシュで、１００μＬのアグロバク
テリウムＬＢＡ４４０４株（ｐＤＡＢ１５８５を内包し、ＯＤ６００が約１．５になるま
で終夜成長させたもの）と共培養した。ディッシュをパラフィルムで包み、振とうせずに
２５℃で３日間インキュベートした後、過剰の液体を除去し、５００ｍｇ／Ｌ カルベニ
シリンを含有する１１ｍＬの基礎培地（ＮＴ１およびＢＹ２について、それぞれＭＳ系ま
たはＬＳ系）で置き換えた。
【０２４５】
タバコ細胞の再懸濁後に、１ｍＬの懸濁液を５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンおよび２
００ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンを含有し８ｇ／Ｌ ＴＣ寒天で固化した適当な基礎培地の
１００×２５ｍｍプレートに分注し、包まずに暗所、２８℃でインキュベートした。これ
により、一つの処置につき１２０〜１４４の選択プレートがもたらされた。播種の１０〜
１４日後に個々のハイグロマイシン耐性分離株が出現し（表１）、それらを個別の６０×
２０ｍｍプレート（１プレートにつき１分離株）に移し、そこで、解析およびその後の再
形質転換実験に必要になるまで、１４日継代培養スケジュールで、カルスとして維持した
。
（表１）
表１．トランスジェニックターゲット細胞培養物作製の要約
2014193179.tif 000004
【０２４６】
実施例３  ターゲットトランスジェニックイベントのスクリーニングおよび特徴づけ
ＢＹ２またはＮＴ１タバコ細胞培養物へのターゲットベクターの形質転換によって生じ
たハイグロマイシン耐性トランスジェニックイベント（実施例２で説明したもの）を次の
ように解析した。
【０２４７】
これらのトランスジェニックイベントをスクリーニングするために行った最初の解析に
は、ターゲット配列のアクセス可能性を示すためのＧＵＳ発現解析、ターゲットベクター
の存在および完全性を確認するための部分および完全長ターゲット配列のＰＣＲ解析、な
らびに組み込まれたターゲット配列のコピー数を決定するためのサザンブロット解析を含
めた。ＧＵＳ発現を示したトランスジェニックイベントのサブセットは単一コピーの完全
長ターゲット配列を含有し、後に行う再形質転換用にターゲット株を生成させる目的で懸
濁培養物を再樹立するために、それらを選択した。これら再樹立したターゲット株にはさ
らなる特徴づけも行い、それには、より徹底的なサザンブロット解析、ターゲットインサ
ート全体の配列決定確認および隣接ゲノム配列解析を含めた。
【０２４８】
選択したイベントから開始されたトランスジェニックタバコカルス組織または懸濁培養
物を５０ｍｇの試料を１５０μＬのアッセイ緩衝液中、３７℃で２４〜４８時間インキュ
ベートすることによって、ＧＵＳ活性について解析した。アッセイ緩衝液は、０．２Ｍ 
リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、各０．１ｍＭのフェリシアン化カリウムおよびフェロ
シアン化カリウム、１．０ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、０．５ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドイル−β−グルクロニドおよび０．６％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ 
Ｘ−１００からなった（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）。青色領
域の出現をＧＵＳ遺伝子発現の指標として使用した。これにより、ターゲット配列挿入は
転写的に活性であり、従って局所ゲノム環境においてアクセス可能であることが示された
。
【０２４９】
ＧＵＳを発現するトランスジェニックイベントは、ターゲット配列の５’端にあるＨＴ
Ｐ発現カセットの３’ＵＴＲからターゲット配列の３’端にある部分ＰＡＴ遺伝子カセッ
トの３’ＵＴＲまで伸びる１０ｋｂ ＤＮＡフラグメントの増幅をもたらすプライマー対
Ｐ１５／Ｐ１６を使って、ＰＣＲによってアッセイした。イベントは全てハイグロマイシ
ン選択下で得られたので、ＨＰＴ発現カセットは全てのターゲットイベントにおいて無傷
であると考えられた。従って完全長ＰＣＲ解析ではＨＰＴ発現カセットの３’ＵＴＲだけ
をカバーした。イベントのサブセットには、ターゲット配列の５’端および３’端の完全
性を決定するために、それぞれプライマー対Ｐ１５／Ｐ１７およびＰ１８／Ｐ１９を用い
るＰＣＲアッセイも行った。組み込まれたターゲット配列のコピー数を決定するために、
ＰＣＲ解析で確認された全てのターゲットイベントをさらにサザンブロット解析でアッセ
イした。
【０２５０】
ＧＵＳ発現のスクリーニングと完全長ＰＣＲに合格した全てのターゲットイベントにつ
いて、サザンブロット解析を行った。１０μｇのゲノムＤＮＡをターゲット配列内のユニ
ークカッター（unique cutter）であるＮｓｉＩで消化した。消化されたゲノムＤＮＡを
０．８％アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に転写した。ターゲット配列
の５’端のコピー数を決定するために、架橋後に、メンブレン上の、転写されたＤＮＡを
ＨＰＴ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。次に、同じブロットをストリッピングし
、ターゲット配列の３’末端のコピー数を決定するために、ＰＡＴ遺伝子プローブと再ハ
イブリダイズさせた。
【０２５１】
ＧＵＳ発現を示し、単一コピーの完全長ターゲット配列を含有する３つのイベントを選
択して、さらに特徴づけた。この特徴づけには、より徹底的なサザンブロット解析、全タ
ーゲット配列確認および隣接ゲノム配列解析を含めた（表２）。これら３つのイベントは
、ＢＹ２−３８０、ＮＴ１−２４０およびＮＴ１−２６０だった。ドナーＤＮＡおよびジ
ンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子を含むベクターによる以後の再形質転換
に備えて、これら３つのイベントから懸濁培養物を再樹立した。
（表２）
表２．選択されたトランスジェニックターゲット細胞培養物の特徴づけ
2014193179.tif 000005
＊ターゲットの３’末端に挿入を有する
【０２５２】
ターゲットイベントＢＹ２−３８０、ＮＴ１−２４０およびＮＴ１−２６０から樹立さ
れた３つの懸濁培養物が予想どおり完全なターゲット配列を含有することを保証するため
に、ターゲット配列の５’端にあるＨＴＰ発現カセットの３’ＵＴＲからターゲット配列
の３’端にある部分ＰＡＴ遺伝子カセットの３’ＵＴＲまでの主要ターゲット配列をプラ
イマー対Ｐ１５／Ｐ１６を使ってＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングした。ＴＯＰＯベクターに
挿入されたＰＣＲ産物は、Ｌａｒｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（テキサス州ヒュ
ーストン）によって配列決定された。配列結果は、ＢＹ２−３８０およびＮＴ１−２４０
がどちらも予想どおりに完全なターゲット配列を持ち、ＮＴ１−２６０が５４７５ｂｐの
ＤＮＡ挿入を有することを示した。挿入は３’部分ＰＡＴ配列の３’端の２７ｂｐ上流に
位置した。興味深いことに、この挿入には２８８３ｂｐのｏｒｆがあった。このｏｒｆを
ＮＢＣＩデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索したところ、アグロバクテリウムからのト
ランスポゾンと合致することが示された。このターゲット株ＮＴ１−２６０はＰＡＴ選択
可能マーカー遺伝子内に余分な挿入配列が存在するので染色体間相同組換え実験には適さ
ないが、それでもなお、ターゲットベクター内に設計されたＧＦＰレポーター系を用いる
染色体内相同組換えの試験には使用することができる。
【０２５３】
隣接ゲノム配列を得るために、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉ
ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使って、３つの株の全て
をさらに解析した。簡単に述べると、２．５μｇのゲノムＤＮＡを別々の反応において、
３つの平滑末端制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩおよびＳｔｕＩで消化した。消化されたＤ
ＮＡをフェノール／クロロホルム抽出によって精製し、ＢＤ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ
Ａｄａｐｔｏｒとライゲートした。そのライゲーションをテンプレートとし、一次ＰＣ
Ｒ反応にはプライマーＰ２０（ターゲット配列挿入の５’端の上流をウォーキング）およ
びＰ２１（ターゲット配列挿入の３’端の下流をウォーキング）を使用し、二次ネステッ
ドＰＣＲ反応にはプライマーＰ２２（ターゲット配列挿入の５’端の上流をウォーキング
）およびＰ２３（ターゲット配列挿入の３’端の下流をウォーキング）を使用して、ネス
テッドＰＣＲ増幅を行った。二次ＰＣＲ反応から得られる増幅されたフラグメントをｐＣ
Ｒ２．１ ＴＯＰＯまたはｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングし、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリ
フォルニア州フラートン）を使って配列決定した。このプロセスにより、３つのターゲッ
ト株の全てから、隣接ゲノム配列を得た。次に、その隣接ゲノム配列に基づいてプライマ
ーを設計し、それを使って全ターゲット配列を増幅した。これらのターゲット株から得ら
れる増幅されたフラグメントは予想されるサイズだった。増幅されたフラグメントの両端
を配列決定によって確認した。
【０２５４】
実施例４  ドナーＤＮＡベクターの設計および作製
ドナーＤＮＡコンストラクトは、相同配列−１（タバコＲＢ７ ＭＡＲ）（Thompson et
al., 1997, 国際公開第９７２７２０７号）、完全長シロイヌナズナｕｂｉ１０プロモー
ター（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）、２９９ｂｐの５’部
分ＰＡＴ遺伝子コード配列（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）および相同配列
−２（シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１）（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ ＮＣ００３０７４）を含んだ。ドナーベクター中の相同配列−１および相
同配列−２は、ターゲットベクター（ｐＤＡＢ１５８５）中の対応する相同配列−１およ
び相同配列−２と同一だった。
【０２５５】
ドナーベクターを構築するために、２９９ｂｐの５’部分ＰＡＴコード配列が、Ｐｉｃ
ｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ.，ＬＬＰ（テキサス州ヒューストン）により、ＤＮＡ合成で、完
全長シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ ＮＣ００３０７４）に融合された。そのフラグメントの５’端および３’端に
それぞれＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を付加した。次に、この合成されたＤＮＡフラグメ
ントをＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化し、ｐＤＡＢ１５７５の同じ部位に挿入して、完全長Ｐ
ＡＴ遺伝子コード配列およびその３’ＵＴＲを置き換えた。その結果生じたコンストラク
トをｐＤＡＢ１５７６（図２５）と名付けた。
【０２５６】
次に、ｐＤＡＢ１５７６をＡｇｅＩで消化し、相同配列−１および相同配列−２で挟ま
れた５’部分ＰＡＴ発現カセットを含有するフラグメント全体をバイナリー基礎ベクター
ｐＤＡＢ２４０７の同じ部位に挿入した。得られたコンストラクトはｐＤＡＢ１６００と
名付けられ、植物細胞再形質転換用のドナーベクターのバイナリー版だった（図２６）。
【０２５７】
実施例５  ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現ベクターの設計および作製
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子は、ＣｓＶＭＶプロモーターおよび
５’ＵＴＲ（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）によっ
て駆動された。カセットにはタバコオスモチン５’および３’ＵＴＲ（Merlo et al., 米
国特許出願公開第２００５１０２７１３号）も含めた。これらのベクターを作製するため
に、ｐＤＡＢ７００２（図２７）中のＰＡＴを駆動するＣｓＶＭＶプロモーターおよび５
’ＵＴＲを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩフラグメントを、ＧＵＳを駆動するＣｓＶＭＶ
プロモーターおよび５’ＵＴＲならびにタバコ５’ＵＴＲを含むフラグメント（ｐＤＡＢ
７０２５（図２８）からＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩで切り出したもの）で置き換えた。得
られたプラスミドをｐＤＡＢ１５９１（図２９）と名付けた。
【０２５８】
ＩＬ１−Ｌ０−Ｆｏｋ１およびＳｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１コード配列をそのオリジナ
ルベクターｐＣＤＮＡ３．１−ＩＬ１−Ｌ０−ＦｏｋＩ（図３０）およびｐＣＤＮＡ３．
１−ＳＣＤ２７ａ−Ｌ０−ＦｏｋＩ（図３１）から、それぞれプライマー対Ｐ１１／Ｐ１
２およびＰ１３／Ｐ１４を使って、ＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲフラグメントの５’端お
よび３’端に、それぞれＢｂｓＩおよびＳａｃＩ部位を付加した。ｐＤＡＢ１５９１中の
ＰＡＴ遺伝子をＳａｃＩ／ＮｃｏＩクローニングにより、ジンクフィンガー融合タンパク
質遺伝子ＰＣＲフラグメントで置き換えた。得られたプラスミドをＩＬ−１−ＦＯｋ１お
よびＳｃｄ２７−Ｆｏｋ１について、それぞれｐＤＡＢ１５９２（図３２）およびｐＤＡ
Ｂ１５９４（図３３）と名付けた。
【０２５９】
ｐＤＡＢ１５９２およびｐＤＡＢ１５９４からジンクフィンガー融合タンパク質遺伝子
発現カセットをＰｍｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして切り出し、末端を埋め、ｐＤＡＢ
２４０７のＰｍｅＩ部位にクローニングすることにより、これらのベクターのバイナリー
版を構築した（図３４Ａ）。得られたプラスミドは、ＩＬ−１ ＺＦＮおよびＳｃｄ２７ 
ＺＦＮについて、それぞれｐＤＡＢ１５９６（図３４Ｂ）およびｐＤＡＢ１５９８（図３
４Ｃ）と名付けられ、ジンクフィンガー融合タンパク質遺伝子ベクター植物細胞再形質転
換のバイナリー版だった。
【０２６０】
実施例６  陽性対照ベクターの設計および作製
非正統的組換え頻度を見積もり、陽性対照として役立つように、ＰＡＴ遺伝子発現カセ
ットを含有するベクターを使用した。最終組換え体と比較できるように、シロイヌナズナ
４−ＣｏＡＳイントロン−１（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ００
３０７４）をＰＡＴコード配列（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）の２９９／
３００ｂｐに挿入した。このコンストラクトを作製するために、ｐＤＡＢ１５７６由来の
２５５９ｂｐ ＳｗａＩ／ＣｌａＩフラグメントを同じ制限酵素で消化したｐＤＡＢ１５
７７（図３５）のバックボーンフラグメントとライゲートした。その結果生じたベクター
は、ＰＡＴコード配列（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）の中央部に挿入され
たシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、ＧｅｎＢ
ａｎｋ ＮＣ００３０７４）の１７４３ｂｐを有するＰＡＴ遺伝子発現カセットを含有し
た。このベクターをｐＤＡＢ１５７８（図３６）と名付けた。
【０２６１】
ｐＤＡＢ１５７８のバイナリー版を作製するために、シロイヌナズナイントロン−１（
ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ００３０７４）を有するＰＡＴ遺伝
子発現カセットをＰｍｅＩ／ＸｈｏＩでｐＤＡＢ１５７８から切り出した。フラグメント
の３’端を平滑末端処理した後、それをバイナリー基礎ベクターｐＤＡＢ２４０７のＰｍ
ｅＩ部位に挿入した。その結果生じたベクターはｐＤＡＢ１６０１（図３７）と名付けら
れ、これは、シロイヌナズナｕｂｉ１０プロモーター（Callis, et al., 1990, J. Biol.
Chem. 265-12486-12493）によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｏ
ｒｆ２５／２６ ３’ＵＴＲ（Gelvin et al., 1987, 欧州特許第２２２４９３号）で終わ
る、シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（ローカスＡｔ３ｇ２１３２０、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ ＮＣ００３０７４）配列を含有するＰＡＴ遺伝子（Wohlleben et al., 1988, G
ene 70:25-37）を含んだ。
【０２６２】
実施例７  ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子およびドナーＤＮＡ配列によるターゲッ
ト細胞培養物の再形質転換
ターゲット配列の、組み込まれた単一完全長コピーを含有する３つの独立したハイグロ
マイシン耐性トランスジェニック細胞培養物（ＮＴ１−２４０、ＮＴ１−２６０およびＢ
Ｙ２−３８０）を選択し、それらを使って、約２５０〜５００ｍｇのカルス組織を１００
ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含有する４０〜５０ｍＬの基礎培地（ＮＴ１およびＢＹ２用
にそれぞれＭＳ系またはＬＳ系）に入れ、上述のように７日ごとに継代することによって
、懸濁培養を再開した。再形質転換の前に、ハイグロマイシンを含まない基礎培地に、懸
濁培養物を移した。
【０２６３】
ターゲット細胞培養物のアグロバクテリウムによる形質転換は上述のように行った。各
実験につき、１０枚の共培養プレートを以下のように作成した。１枚のプレートはｐＤＡ
Ｂ１６００（ドナーＤＮＡ）を内包する１００μＬのアグロバクテリウム株と共培養した
細胞を含んだ。１枚のプレートはｐＤＡＢ１６０１（ＰＡＴ選択可能マーカー）を内包す
る１００μＬのアグロバクテリウム株と共培養した細胞を含んだ；４枚のプレートはｐＤ
ＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を内包する５０μＬのアグロバクテリウム株およびｐＤＡ
Ｂ１５９６（ＩＬ−１ ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を内包する２５０μＬのアグロバクテリウム
株と共培養した細胞を含んだ；そして４枚のプレートはｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ
）を内包する５０μＬのアグロバクテリウム株およびｐＤＡＢ１５９８（Ｓｃｄ２７ａ 
ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を内包する２５０μＬのアグロバクテリウム株と共培養した細胞を含
んだ。上述の方法を使った共培養後に、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンとＮＴ１または
ＢＹ２についてそれぞれ１０ｍｇ／Ｌまたは１５ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓ（登録商
標）とを含有する基礎培地培地（ＮＴ１およびＢＹ２についてそれぞれＭＳ系またはＬＳ
系）に、細胞を播種した。播種の２〜４週間後に個々のＢｉａｌａｐｈｏｓ（登録商標）
耐性分離株が出現し（表３）、それらを個別の６０×２０ｍｍプレート（１プレートにつ
き１分離株）に移し、そこで、解析に必要になるまで、１４日継代培養スケジュールで、
カルスとして維持した。
（表３）
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子およびドナーＤＮＡによるターゲット
細胞培養物の再形質転換の要約
2014193179.tif 000006
【０２６４】
実施例８  相同組換えの確認
Ａ．染色体間相同組換え
実施例１〜７に記載の代表的タバコ系におけるジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパ
ク質促進染色体間相同組換えについて、２つの戦略を開発し、試験した。
【０２６５】
戦略１では、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質（ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１
）にとっての結合部位をターゲットコンストラクトの中央に含めた（図３７）。この戦略
では、結合部位の両側に約３ｋｂの非相同配列が隣接し、その上流および下流に、それぞ
れ相同配列−１（タバコＲＢ７ ＭＡＲ）および相同配列−２（シロイヌナズナ４−Ｃｏ
ＡＳイントロン−１)が続いている（図３８）。ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融
合タンパク質の存在下では、ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１結合配列が認識され、この特異的
部位で二本鎖ＤＮＡ切断が誘発されて、それが内在性ＤＮＡ修復プロセスを刺激すること
になるという仮説を立てた。ターゲット配列中の相同配列と同一な相同配列を含有するド
ナーＤＮＡの存在下では、５’部分ＰＡＴ遺伝子がそのプロモーターと共に、ターゲット
中の相同配列間の約６ｋｂのＤＮＡフラグメント全体と、相同組換えによって置き換わる
。このプロセスにより、シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１が間に挿入された２
つの部分ＰＡＴ遺伝子配列が、機能的なＰＡＴ遺伝子を再構成して、ＰＡＴ発現および除
草剤耐性表現型をもたらす。
【０２６６】
戦略２では、２つのジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位（Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ
Ｉ）をターゲットベクターに含めた。一方はタバコＲＢ７ ＭＡＲのすぐ下流、そして他
方はシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン１のすぐ上流（図３９）。２つのジンクフィ
ンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位の間には約６ｋｂの配列があり、この配列は、
５’ＧＦＰフラグメント、ＧＵＳ発現カセットおよび３’ＧＦＰフラグメントを含んだ。
Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質の存在下では、２つの結合配列が
認識され、二本鎖ＤＮＡ切断が両方の位置で誘発され、それがこれら2つの結合配列の間
にある約６ｋｂのＤＮＡフラグメントを除去して、内在性ＤＮＡ修復プロセスを刺激する
ことになるという仮説を立てた。戦略１と同様に、ターゲット配列中の相同配列と同一な
相同配列を含有するドナーＤＮＡの存在下では、５’部分ＰＡＴ遺伝子がそのプロモータ
ーと共に、ターゲット配列中の、二本鎖切断が誘発された部位に、挿入される。このプロ
セスにより、シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１が間に挿入された２つの部分Ｐ
ＡＴ遺伝子配列が、機能的なＰＡＴ遺伝子を再構成して、ＰＡＴ発現および除草剤耐性表
現型をもたらす。
【０２６７】
除草剤（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ（登録商標））選択後に得られた全ての分離株をまず、Ｐ
ＣＲにより、再構成されたＰＡＴ遺伝子をまたぐＤＮＡフラグメントを増幅するプライマ
ー対Ｐ２４／Ｐ２５を使って解析した。プライマーＰ２４はドナーＤＮＡ中のＰＡＴコー
ド配列の５’端に相同であり、プライマーＰ２５はターゲットＤＮＡ中のＰＡＴコード配
列の３’端に相同だった。２つの部分ＰＡＴコード配列が相同組換えによって接合される
と、２．３ｋｂのＰＣＲフラグメントが生じる。図４０に示すように、解析した分離株の
多くから、２．３ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。これらの分離株は、ＩＬ−１ジンクフィ
ンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡおよびＳｃｄ２７ジンクフィンガ
ー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡの同時トランスフェクションのどちら
からも得られた。ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１およびＳｃｄ２７ジンクフィンガ
ー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子形質転換によって導かれる分離株を代表する複数の独
立した分離株から得た２．３ｋｂのＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、ｐＣＲ２．
１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にク
ローニングした。次に、ＴＯＰＯベクターに挿入された２．３ｋｂ ＰＣＲ産物をＤｙｅ 
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ）を使って配列決定した。その配列決定結果により、ＴＯＰＯベクターにクロ
ーニングされたＰＣＲ産物の全てが、５’および３’部分ＰＡＴ遺伝子配列ならびに介在
するタバコ４−ＣｏＡＳイントロン−１を含めて、予想どおり組換えられた配列を含有す
ることが裏付けられた。これらの結果により、試験したどちらの戦略についても、予想さ
れる染色体間組換えが確認され、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子発現
による遺伝子ターゲティングが例証された。
【０２６８】
１対の試料をＰＣＲにより、組み換えられた領域全体にわたるＤＮＡフラグメントを増
幅するプライマー対Ｐ２６／Ｐ２５を使って、さらに解析した。プライマーＰ２６は、タ
ーゲット配列中のＨＰＴ遺伝子コード領域の３’端に相同であり、プライマーＰ２５はタ
ーゲット配列中のＰＡＴ遺伝子コード領域の３’端に相同であった。ターゲット配列とド
ナーＤＮＡの間で相同組換えが起これば、予想される５．２ｋｂのＰＣＲ産物が得られる
。非組換えターゲットは約１０ｋｂのＰＣＲ産物をもたらす。解析したどちらの試料から
も５．２ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。解析した試料の一方から得た５．２ｋｂ ＰＣＲ
産物をアガロースゲルから精製し、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングした。次に、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ、カリフォルニア州フラートン）を使って、ＰＣＲ産物を配列決定した。その配列決定
結果により、ＰＣＲ産物は、（５’から３’に向かって）ＨＰＴコード領域の３’端（タ
ーゲット配列由来）、シロイヌナズナｏｒｆ−２４ ３’ＵＴＲ（ターゲット配列由来）
、タバコＲＢ７ ＭＡＲ（相同配列−１）、シロイヌナズナｕｂｉ−１０プロモーター（
ドナーＤＮＡ由来）、５’部分ＰＡＴ遺伝子（ドナーＤＮＡ由来）、シロイヌナズナ４−
ＣｏＡＳイントロン−１(相同配列−２）、３’部分ＰＡＴ遺伝子（ターゲット配列由来
）を含む、組換えられた配列を含有することが裏付けられた。この結果により、ＰＣＲ産
物が染色体間相同組換えによってもたらされることが、さらに裏付けられた。
【０２６９】
組換え体をゲノムレベルでさらに解析するために、ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ
１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡ形質転換とＳｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ
１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡ形質転換の両方から選択した２２の分離株のセッ
トを使って、サザンブロット解析を行った。試料はいずれも組換え体であることがＰＣＲ
解析によって確認された。各試料から得た１０μｇのゲノムＤＮＡをＢａｎＩＩで消化し
た。消化されたゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレンに
転写した。メンブレン上で架橋した後、ＤＮＡを３’ＰＡＴプローブとハイブリダイズさ
せた。予想される組換え体は２０７９ｂｐのバンドをもたらし、非組換えターゲット配列
は３０１８ｂｐのバンドをもたらす。結果は、解析した２２の試料のうち１８の試料が、
約２ｋｂという予想されるサイズのバンド（これはこれらのイベントが２つの部分ＰＡＴ
フラグメントの近傍での相同組換えによって起こったことを示す）を有することを示した
（図４１）。２つの試料は予想外のサイズのバンドを示し（一つはターゲット対照より大
きく、一つはターゲット対照より小さい）、これら２つの試料では組換えが完全に相同性
依存的ではなかったこと、または追加の配列再配列が組換え中または組換え後に起こった
ことが示唆された。別の２試料はターゲット対照と同じバンド（約３ｋｂ）を示し、この
ことは、これらの試料が除草剤選択からのエスケープであるか、サザンブロット解析の検
出レベルを下回るごく一部だけが相同組換えに由来している混合細胞集団であることを示
している。これらの試料はＰＣＲで解析した場合には相同組換えに対応する予想される増
幅産物を示したので、おそらく後者であった。予想される組換えバンドを示した１８試料
のうち、４試料は、ターゲット対照と同じサイズを有する追加のバンドを持っていたこと
から、これらの試料は一部の細胞が組換え体でない混合細胞集団であることが示された。
別の４試料はさまざまなサイズの追加バンドを有することから、これらの試料は非相同性
依存的イベントを起こした細胞を部分的に含む遺伝子キメラであることが示された。２２
試料のうち１０試料は、少なくとも、２つの部分ＰＡＴフラグメントが関与する領域では
、予想どおり相同組換えを起こしていることが、サザンブロット解析によって確認された
。
【０２７０】
Ｂ．染色体内相同組換え
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１促進染色体内相同組換えを試験するために、図４２で説明
するように、５４０ｂｐのオーバーラップ配列を有する２つの非機能的ＧＦＰフラグメン
トをターゲットベクターに含めた。これら２つのフラグメントの間にはＧＵＳ遺伝子発現
カセットがあった。ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合配列をＧＵＳコード配列とそ
のＮ末端で融合した。ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質の存在下では、ＩＬ−１ ＺＦ
Ｎ結合配列が認識され、二本鎖ＤＮＡ切断が誘発されて、それが内在性ＤＮＡ修復プロセ
スを刺激するという仮説を立てた。ドナーＤＮＡが存在しなければ、２つの部分的に相同
なＧＦＰフラグメントが染色体内相同組換えプロセスを起こして、機能的ＧＦＰ遺伝子が
再構成される。
【０２７１】
２つのターゲット株、ＢＹ２−３８０およびＮＴ１−２６０を上述のアグロバクテリウ
ム媒介形質転換により、プラスミドｐＤＡＢ１５９６（ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク
質遺伝子バイナリーベクター）で形質転換した。ドナーＤＮＡ（ｐＤＡＢ１６００）とＰ
ＡＴ対照ＤＮＡ（ｐＤＡＢ１６０１）の両方を別個の対照処置として含めた。形質転換後
に細胞を非選択培地に播種した。構成された機能的ＧＦＰ遺伝子の明白な発現が、形質転
換の約５〜８日後に、目に見える蛍光をもたらした。表４に要約するように、ＩＬ−１−
Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子コンストラクト（ｐＤＡＢ１５９６）で形質転換した各プ
レートには、約５０の蛍光部位が観察された。試験した２つのターゲット株の間に有意な
差は観察されなかった。ドナーＤＮＡまたはＰＡＴ遺伝子コンストラクトで形質転換され
た陰性対照では、わずかなバックグラウンドを上回る感知可能な蛍光は観察されなかった
。
（表４）
ＩＬ−１−Ｆｏｋ１ジンクフィンガー融合タンパク質が刺激する染色体内相同組換えによ
る機能的ＧＦＰの構成
2014193179.tif 000007
【０２７２】
緑色蛍光部位が機能的ＧＦＰ遺伝子の再構成に起因することを確認するために、ＧＦＰ
発現組織の分子解析を行った。細胞は全て非選択培地に播種されたので、ＧＦＰ発現に関
して均質な細胞集団を得ることは困難だった。いくつかの蛍光組織セグメントをプレート
から単離し（解剖顕微鏡を利用）、数代の選択的継代培養によって濃縮した。視覚的に濃
縮されたこれらの組織からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲにより、プライマー対Ｐ２７／
Ｐ２８を使ってアッセイした。プライマーＰ２７はターゲットＤＮＡ配列中の５’部分Ｇ
ＦＰフラグメントの５’端に相同であり、プライマーＰ２８はターゲットＤＮＡ配列中の
３’部分ＧＦＰフラグメントの３’端に相同だった。これら２つの部分ＧＦＰフラグメン
ト間での染色体内相同組換えによってＧＦＰ遺伝子が再構成されている場合は、予想され
る０．６ｋｂのＰＣＲ産物が得られる。非組換えターゲットは４．１ｋｂのＰＣＲ産物を
与える。図４３に示すように、蛍光組織から濃縮された試料の全てが、予想される０．６
ｋｂのＰＣＲ産物を持ったことから、これらの組織では機能的ＧＦＰ遺伝子が再構成され
ていることが示された。他にも４．１ｋｂのＰＣＲ産物が、これらの濃縮試料の全てに観
察されたことから、非組換え細胞集団の存在が示された。これらの試料は蛍光を指標とし
て視覚的選択によって濃縮されたにすぎないので、これは意外なことではなかった。ＰＣ
Ｒ産物を０．８％アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレン上に転写し、ＧＦＰ遺伝
子コード配列でプローブした。結果は、０．６ｋｂと４．１ｋｂの２つのＰＣＲ産物がＧ
ＦＰ配列を含有することを示し、これにより、蛍光は、再構成されたＧＦＰ遺伝子の発現
に起因することが裏付けられた。
【０２７３】
実施例９  単子葉植物中の遺伝子を標的とするジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク
質の設計
単子葉植物（例えばトウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、イネ）における相同
性指向的修復を促進するためのジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下のように設計され
、合成される。関心対象の遺伝子（この遺伝子は、好ましくは、アミノ酸置換の標的にす
ることができる少なくとも１つのコドンを含む）を選択する。選択した遺伝子の関連部分
をクローニングし、そのクローンのヌクレオチド配列を決定する。
【０２７４】
そのようにして得た配列を適宜、個々のジンクフィンガーとそれらのターゲット部位の
一覧および／または２フィンガーモジュールとそれらのターゲット部位の一覧を含むコン
ピュータプログラムを使用して、５〜６ヌクレオチド対離れた１対のターゲット配列（こ
の場合、各ターゲット配列は３−、４−、５−または６−フィンガー型ジンクフィンガー
タンパク質によって結合され得る）についてスキャンする。例えば米国特許第６，７８５
，６１３号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第０１／５３４８０号および米国
特許出願公開第２００３／００９２０００号を参照されたい。ＺＦＰ設計のためのさらな
る方法が、例えば米国特許第５，７８９，５３８号、同第６，０１３，４５３号、同第６
，４１０，２４８号、同第６，７３３，９７０号、同第６，７４６，８３８号、同第６，
７８５，６１３号、同第６，８６６，９９７号、同第７，０３０，２１５号、国際公開第
０１／０８８１９７号、国際公開第０２／０９９０８４号、および米国特許出願公開第２
００３／００４４９５７号、同第２００３／０１０８８８０号、同第２００３／０１３４
３１８号および同第２００４／０１２８７１７号に開示されている。
【０２７５】
先のステップで同定された各ターゲット配列について、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインと
そのターゲット配列に結合するジンクフィンガータンパク質との融合物をコードする遺伝
子を合成する。例えば米国特許第５，４３６，１５０号、国際公開第２００５／０８４１
９０号および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号を参照されたい。次に、各
融合タンパク質をそれがそのターゲット配列に結合する際のアフィニティについて、ＥＬ
ＩＳＡアッセイを使って、例えばBartsevich et al. (2003) Stem Cells 21:632-637に記
載されているように試験する。所定の閾値を超えるターゲット配列結合アフィニティを有
するタンパク質を細胞に基づくレポーターアッセイでのさらなる試験に付す。
【０２７６】
場合によっては、上述した１またはそれ以上の融合タンパク質の結合特異性を評価し、
必要であれば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載の方法を使って改善することがで
きる。
【０２７７】
細胞に基づく試験は、例えばUrnov et al. (2005) Nature 435:646-651および米国特許
出願公開第２００５／００６４４７４に記載されているように行われる。簡単に述べると
、上述のように同定されたターゲット配列対を適当な細胞株中のドキシサイクリン誘導性
プロモーターの転写制御下にある欠損染色体緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に挿入
する。２つのジンクフィンガー／ＦｏｋＩ融合タンパク質（それぞれがターゲット配列の
一方に結合するもの）をコードする核酸と、欠損染色体ＧＦＰ遺伝子の相同性指向的修復
のためのテンプレートとして機能するならば機能的ＧＦＰ遺伝子を再構成することになる
であろう配列を含有する核酸とで、細胞をトランスフェクトする。相同性指向的修復が起
こった細胞は、ドキシサイクリンによる誘導後に蛍光活性化細胞選別を行うことによって
、同定し、定量することができる。
【０２７８】
実施例１０  単子葉植物のためのドナーＤＮＡベクターの設計および作製
ドナーＤＮＡコンストラクトは、選択した遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）およびそのＣ
ＤＳの上流および／または下流にあるゲノム配列を含む。ＣＤＳおよび／またはゲノム配
列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースおよび／またはＰｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔ
ａｂａｓｅから入手する。部分配列と公知配列の間の「コンティグ」マッチを使って、そ
れらの配列が、選択した単子葉植物ゲノム中の同じ遺伝子座に由来することを確認するこ
とができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合配列が組換え後に繰り返し切断されるこ
とを避けるために、コードされるアミノ酸配列に変化を引き起こさない２つの単一ヌクレ
オチド突然変異をドナーＤＮＡ中のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）結合配列内
に作ってもよい。それら突然変異の一方または両方が、後の分子的特徴づけを容易にする
制限酵素部位を生み出してもよい。
【０２７９】
ドナーＤＮＡベクターを構築するために、ＣＤＳの一部と下流配列とをカバーするＤＮ
Ａフラグメントを選択した単子葉植物のゲノムＤＮＡから、適切なプライマーを使ってＰ
ＣＲ増幅する。好ましくは、制限部位（例えばＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ部位）をＰＣＲ
フラグメントの５’端および３’端にそれぞれ付加する。ＰＣＲ産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎ
ｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）
にクローニングする。
【０２８０】
所望の位置における突然変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向的突然
変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って、１また
はそれ以上の選択したヌクレオチドを置き換えることによって導入することができる。上
述のように、追加の単一サイレント突然変異（例えば２、３またはそれ以上の単一突然変
異）を同様の方法で、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向的突然変異誘発キッ
ト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って、ジンクフィンガー−
Ｆｏｋ１結合配列に導入することもできる。置換突然変異および追加のサイレント単一突
然変異を有するＰＣＲフラグメントをｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクターから、
適当な消化によって単離し、ｐＳＢ１１（図４４）の同じ部位にクローニングする。次に
、得られたプラスミドＤＮＡをｐＳＢ１プラスミド（図４５）を保有するアグロバクテリ
ウム株に形質転換して、相同組換えによる植物細胞形質転換用のスーパーバイナリードナ
ーベクターを形成させる。
【０２８１】
実施例１１  形質転換用の単子葉植物ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子
ベクターの設計および作製
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子は、適切な単子葉植物プロモーター
（例えばトウモロコシ（Z. mays）ｕｂｉ１プロモーター（Quail et al., 米国特許第５
６１４３９９号））によって駆動される。カセットはトウモロコシペルオキシダーゼ−５
（ｐｅｒ５）３’ＵＴＲ（Ainley et al., 国際公開第９８５６９２１号）も含み得る。
このベクターを作るために、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子をその一
次供給源ベクターからＮｃｏＩ／ＳａｃＩ消化によって単離し、ｐＤＡＢ３８７２（図４
６）の同じ部位にクローニングする。トウモロコシｕｂｉ−１プロモーター、ジンクフィ
ンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子およびトウモロコシｐｅｒ−５ ３’ＵＴＲを含
む発現カセットを上で作製した中間体ベクターから、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＭｓｃＩ消化によ
って単離し、ｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｍｅＩ部位に挿入する。次に、得られたプ
ラスミドを、ｐＳＢ１プラスミドを保有するアグロバクテリウム株に形質転換して、相同
組換えにより、スーパーバイナリーベクターｐＤＡＢ４３６５を形成させる（図４７）。
ｐＤＡＢ４３６５は、植物細胞形質転換用のジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質
遺伝子発現ベクターのスーパーバイナリー版である。
【０２８２】
実施例１２  ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子およびドナーＤＮＡによるトウモロコ
シ細胞の形質転換ならびに細胞培養物の作製
「Ｈｉｇｈ ＩＩ」Ｆ１雑種の種子（Armstrong, et al., 1991, Maize Genet. Coop. N
ews Lett. 65:92-93）を市販の土壌ミックス（Ｃｏｎｒａｄ Ｆａｆａｒｄ，Ｉｎｃ.、ス
プリングフィールド；Ｓｏｉｌ Ｍｉｘ ＃３）が入っている５ガロン鉢に、直接蒔くこと
ができる。植物を温室にて、約１，５００フィートカンデラ（ft-candle）の照明をもた
らす高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプの併用によって補った１６時間の
光周期で成長させる。日中および夜間温度は２７／２０±２℃に維持する。植物には、標
準的肥料タンクミックスを使って、必要に応じて撒水する。
【０２８３】
未熟胚を得るために、管理受粉（同胞（sibs）または自家）を行うことができる。受精
および結実が最大限になるように、受粉の前日に絹糸を刈り込んで絹糸のフルブラシ（fu
ll brush）を作ることにより、開花期の植物に受粉の準備を行う。受粉の日に、盛んに花
粉飛散している雄穂を袋に入れ、新鮮な花粉を集めて、絹糸上に注意深く適用する。発生
中の胚が１．０〜１．２ｍｍサイズに達したら（受粉の９〜１０日後）、雌穂を切除して
、表面滅菌する。簡単に述べると、雌穂を７０％エタノールに２〜５分間および２０％市
販漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）に３０〜４５分間浸漬した後、滅菌蒸留水中
で３回すすぐ操作にかける。滅菌後に未熟胚を単離することができる。
【０２８４】
２つの異なるアグロバクテリウム株を形質転換に使用する。第１の株は、実施例９〜１
１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子コンストラクトを内包し、第２の株は置
換突然変異を含むドナーＤＮＡ配列を内包する。米国特許第５，５９１，６１６号に記載
されている日本たばこ産業株式会社の「スーパーバイナリー（Super Binary)」ベクター
系を使用することができる。 
【０２８５】
アグロバクテリウム懸濁液を調製するために、ストリークプレート（５ｇ／Ｌ 酵母エ
キス、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、５０ｍｇ／Ｌ スペ
クチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌ テトラサイクリンおよび１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ寒天を含
有するもの）から、１〜２白金耳の細菌を５ｍＬの「浸透」培地に入れる。「浸透」培地
は、ＬＳ基礎塩類（Linsmaier et al., 1965, Physiol. Plant.）、Ｎ６ビタミン類（Chu
et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、６８．５ｇ／
Ｌ スクロース、３６ｇ／Ｌ グルコース、６ｍＭ プロリンからなり、濾過滅菌前にｐＨ
５．２に調節される。その混合物を均一な懸濁液が得られるまでボルテックスする。細菌
濃度はＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ光電比色計を使って、溶液の密度を読み取ること
によって決定することができる。溶液をＫｌｅｔｔ ２００（約１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ
）の濃度に調節し、最終濃度が１００μＭになるようにアセトシリンゴンを加える。
【０２８６】
２ｍＬの「浸透」培地が入っている微量遠心チューブ中に未熟胚を直接単離する。約１
００個の胚を含有する各チューブを３〜５秒間ボルテックスする。培地を除去し、同じ組
成の新鮮な液体培地で置き換え、ボルテックスを繰り返す。液体培地を再び除去し、濃度
がＫｌｅｔｔ２００である１ｍＬのアグロバクテリウム溶液（８００μＬのジンクフィン
ガーヌクレアーゼ株および２００μＬのドナーＤＮＡ株）で置き換える。そのアグロバク
テリウムおよび胚混合物を３０秒間ボルテックスする。室温で５分間インキュベートした
後、胚を「共培養」培地に移し、胚軸を下にして、暗所、２５℃で、５日間のせておく。
「共培養」培地は、ＬＳ基礎塩類（Linsmaier et al., 1965, Physiol. Plant.）、Ｎ６
ビタミン類（Chu et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−
Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、６ｍＭ プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ 硝酸銀、１００μＭ 
アセトシリンゴン、３ｇ／Ｌ ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）からなり、濾過滅菌前にｐＨ
５．８に調節した。
【０２８７】
実施例１３  相同組換え体の選択
ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子カセットおよびドナーＤＮＡをそれぞれ内包する
２つのアグロバクテリウム株の５：１混合物との共培養後に、胚を「カルス」培地（これ
はアグロバクテリウムのさらなる成長を停止させるコンポーネント（例えば２５０ｍｇ／
Ｌ セフォタキシムおよび／または５００ｎＭ Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標））を含んでも
よい）に移動させる。「カルス形成」培地は、ＬＳ基礎塩類（Linsmaier et al., 1965, 
Physiol. Plant.）、Ｎ６ビタミン類（Chu et al., 1975, Sci. Sinica 18:659-668）、
１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、３０ｇ／Ｌ スクロース、６ｍＭ プ
ロリン、１ｍｇ／Ｌ 硝酸銀、８ｇ／Ｌ ＴＣ寒天（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カンザス州ショーニーミッション）からなり、オートクレーブ
する前にｐＨ５．８に調節した。選択相の全体を通して、胚は暗所、２８℃で培養する。
【０２８８】
植物再生のために、カルス培養物を「誘導」培地に移し、２７℃において、白色蛍光灯
により、１週間は低光量（１３μＥ／ｍ２／ｓ）下、次の１週間は高光量（４０μＥ／ｍ
２／ｓ）下に、１６／８明／暗光周期でインキュベートする。「誘導」培地は、ＭＳ基礎
塩類およびビタミン類（Murashige et al., 1962, Physiol. Plant. 15:473-497）、３０
ｇ／Ｌ スクロース、５ｍｇ／Ｌ ６−ベンジルアミノプリン、０．０２５ｍｇ／Ｌ ２，
４−Ｄ、２．５ｇ／Ｌ ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）から構成され、ｐＨはオートクレー
ブ前に５．７に調節される。この２週間の誘導期間後に、カルスを「再生」培地に移し、
高光量（４０μＥ／ｍ２／ｓ）下、２７℃でインキュベートする。「再生」培地は、ホル
モン類を欠く点以外は「誘導」培地と同一である。カルスは苗条が出現するまで２週間ご
とに新鮮な「再生」培地に継代することができる。
【０２８９】
小植物体が約３〜５ｃｍの長さに達したら、それらをオートクレーブ前にｐＨを５．８
に調節したＳＨ基礎塩類およびビタミン類（Schenk et al., 1972, Can. J. Bot. 50:199
-204）、１０ｇ／Ｌ スクロース、１ｇ／Ｌ ミオイノシトールおよび２．５ｇ／Ｌ ＧＥ
ＬＲＩＴＥ（登録商標）が入っている１５０×２５ｍｍ培養管に移す。苗条が管の最上部
に到達したら、約０．２５ｋｇの市販土壌ミックス（Ｃｏｎｒａｄ Ｆａｆａｒｄ，Ｉｎ
ｃ.、スプリングフィールド；Ｓｏｉｌ Ｍｉｘ ＃３）が入っている１０ｃｍ鉢に小植物
体を移し、十分に湿らせ、透明なプラスチックカップで２〜４日間覆う。３〜５葉段階で
、植物体を５ガロン鉢に移植し、成熟するまで成長させる。
【０２９０】
標的切断、標的組換えおよび標的組み込みに関する追加情報は、米国特許出願公開公報
第２００３−０２３２４１０号、同第２００５−００２６１５７号、同第２００５−００
６４４７４号、同第２００５−０２０８４８９号および同第２００７−０１３４７９６号
に見出すことができ、その開示は、あらゆる目的で、参照により、そのまま本明細書に組
み入れられる。
【０２９１】
本明細書で言及した全ての特許、特許出願および刊行物は、あらゆる目的で、参照によ
り、そのまま本明細書に組み入れられる。
【０２９２】
明解に理解できるように、例を挙げて多少詳しく開示したが、本発明の要旨および範囲
から逸脱することなく、さまざまな改変態様および変更態様を実施できることは、当業者
には明白である。従って、上記の説明および例を限定であるとみなしてはならない。
【図１】
2014193179.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014193179.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
2014193179.tif 000049
【図４３】
2014193179.tif 000050
【図４４】
2014193179.tif 000051
【図４５】
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【図４６】
2014193179.tif 000053
【図４７】
2014193179.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月9日(2014.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞のゲノム中に外来配列を導入するための方法であって、
（ａ）前記植物細胞を、第１、第２、および第５のＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡベクターと接触させるステップであって、
前記第５の配列が、導入されるべき前記ＤＮＡベクターの外来配列を含み、前記ドナーＤＮＡベクターの前記第１および第２の配列の間に挿入されており、
前記第１の配列が、前記植物細胞の前記ゲノム中の第３の配列に対して少なくとも９０％から９５％の相同性を有し、前記第２の配列が、前記植物細胞の前記ゲノム中の第４の配列に対して少なくとも９０％から９５％の相同性を有し、ここで、前記植物細胞の前記ゲノム中の前記第３および第４の配列は、染色体ＤＮＡ配列であり、前記第３および第４の配列の近接端部は少なくとも１ヌクレオチド対によって隔てられている、ステップ、
および
（ｂ）１またはそれ以上のヌクレアーゼを前記細胞内で発現させるステップであって、前記１またはそれ以上のヌクレアーゼがそれぞれ一対の融合タンパク質であり、各融合タンパク質は、Ｆｏｋ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと操作されたジンクフィンガー結合ドメインとの間の融合物であり、１またはそれ以上のヌクレアーゼが前記第３および第４配列の間の１またはそれ以上の対応するターゲット部位で染色体ＤＮＡを切断し、前記１またはそれ以上のヌクレアーゼが、前記植物細胞中の前記ゲノム中の前記第３または第４配列のいずれかの０．４〜３キロ塩基対内の位置で染色体ＤＮＡを切断するステップ
を含み、
ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノムへの前記第５のＤＮＡ配列の組み込みを刺激するようになっており、
前記外来配列は選択可能マーカーであってもよく、該選択可能マーカーは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニル酸シンターゼからなる群より選択されてもよく、
前記第５の配列は、１またはそれ以上の転写調節配列を含んでいてもよく、
前記第５の配列は、タンパク質またはタンパク質の一部をコードする配列を含んでいてもよく、または
前記第５の配列は、突然変異型染色体配列の野生型対応物、もしくは野生型染色体配列の突然変異型対応物を含んでいてもよい、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014193179000001.app
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2014193179.tif 000055
【外国語明細書】
2014193179000001.pdf