(57)【要約】      （修正有）【課題】治療上有効な量の抗体の活性を保持して高濃度の抗体でも凝集しない様に、緩衝剤を含む安定な水性製剤ならびに製剤を調製する方法、更に一定の容量を維持し、変わりやすい体重を有する患者に使用することができる高濃度の抗体を含む製剤の提供。【解決手段】免疫グロブリン（または他のタンパク質）と、リン酸緩衝液と、ポリソルベートと塩化ナトリウムとを含む安定な水性薬剤。好ましくは、ポリソルベートはポリソルベート８０であり、好ましくは約０．００１〜約２．０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する製剤。免疫グロブリンが約０．１〜約２００ｍｇ／ｍＬの量でｐＨが約３．０〜約７．０である水性薬剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンと、
リン酸緩衝液と、
ポリソルベートと、
塩化ナトリウムとを含むことを特徴とする安定な水性の製剤。
【請求項２】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ポリソルベート８０が約０．００１％〜約２．０％（ｗ／ｖ）の量で存在することを特徴とする請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ポリソルベート８０が約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在することを特徴とする請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンが約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記免疫グロブリンが約１．７ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが約５ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
前記免疫グロブリンが約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項５に記載の製剤。
【請求項９】
約３．０〜約７．０のｐＨを有することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
ｐＨが約５．５〜約６．５であることを特徴とする請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
ｐＨが約６．０±０．５であることを特徴とする請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記製剤が一定の容量であり、前記免疫グロブリンが約５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンがα−４インテグリンに結合していることを特徴とする請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンがナタリズマブであることを特徴とする請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
前記リン酸緩衝液のｐＨが６．０±０．５であり、前記ポリソルベートが約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在するポリソルベート８０であり、前記免疫グロブリンがナタリズマブであり、約２℃〜約８℃の温度で少なくとも６カ月間安定であることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
前記ナタリズマブが約２０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
等張であることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンがモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１から１４または１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体がナタリズマブであることを特徴とする請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記抗体が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１８または１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記抗体が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１９に記載の製剤。
【請求項２２】
前記抗体が約１．７ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
前記抗体が約１５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１８に記載の製剤。
【請求項２４】
前記抗体が約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項１８に記載の製剤。
【請求項２５】
さらにヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項２６】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であることを特徴とする請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
ある症状のために体重が変わりやすい患者を治療量の免疫グロブリンを用いて治療する方法であって、
前記患者に前記症状が投与により治療される請求項１に記載の製剤を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンがナタリズマブであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
リン酸ナトリウムと、
ポリソルベートと、
タンパク質と、
ＮａＣｌとを含み、
６．０±０．５のｐＨを有し、
約５℃〜８℃で６カ月を超える期間保存した場合に安定であることを特徴とする組成物。
【請求項３０】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であり、約０．００１％〜約２．０％（ｗ／ｖ）の量で存在することを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記タンパク質が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在する免疫グロブリンであることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であり、約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在し、前記ＮａＣｌが１５０ｍＭの量で存在し、前記リン酸緩衝液が１０ｍＭの量で存在し、前記免疫グロブリンがナタリズマブで、１．７ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項２９の組成物。
【請求項３３】
リン酸ナトリウムと、塩化ナトリウムと、ポリソルベートと、タンパク質とを混合する工程と、
前記混合物のｐＨをリン酸でｐＨ６．０±０．５に調整する工程と、
を含むことを特徴とする安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３４】
前記リン酸ナトリウムが約１０ｍＭの量で存在し、前記塩化ナトリウムが約１５０ｍＭの量で存在し、前記ポリソルベートがポリソルベート８０であって約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在し、前記タンパク質がナタリズマブであることを特徴とする請求項３３に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３５】
前記ナタリズマブが約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項３３に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３６】
前記ナタリズマブが約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とする請求項３５に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の製剤中の前記タンパク質が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項３３に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３８】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であり、約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在し、前記タンパク質がナタリズマブであることを特徴とする請求項３７に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項３９】
さらにヒスチジンを含むことを特徴とする請求項３７に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項４０】
前記タンパク質が、５ｍＭヒスチジンと、２０ｍｇ／ｍＬスクロースと、０．０２％ポリソルベート８０とを含むｐＨ６の溶液中で凍結乾燥されており、かつ前記タンパク質が２０ｍｇ／ｍＬの濃度のナタリズマブであることを特徴とする請求項３３に記載の安定なタンパク質含有製剤を調製する方法。
【請求項４１】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の安定な製剤を保持する容器を含むことを特徴とする物品。
【請求項４２】
ある症状のために体重が変わりやすい患者を治療する方法であって、
請求項１から２４のいずれか一項に記載の製剤と、前記症状に対して有効な化合物または療法との治療上有効な組合せを前記患者に同時または逐次的に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の安定な製剤の使用方法であって、体重が変わりやすい症状の患者の症状を治療するために、前記症状の治療に有効である医薬品を調製することを特徴とする使用方法。
【請求項４４】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の安定な製剤の使用方法であって、体重が変わりやすい症状の患者の症状を治療するために、請求項１から２４のいずれか一項に記載の製剤と、化合物または療法との組合せであり、前記症状の治療に有効であるの医薬品を調製することを特徴とする使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の活性が保持され、また少量で投与することができ、それを必要とする体重の変わりやすい対象に投与することができる、ナタリズマブのようなタンパク質または抗体の安定な濃縮製剤を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
抗体およびタンパク質製剤は、当技術分野において知られている。しかし、化学的かつ生物学的に安定であるタンパク質製剤、例えば抗体製剤を調製することは、難問をはらんでいる。安定でありかつ高濃度のタンパク質、たとえば抗体を含んでいても小容量を維持し得る（すなわち、小容量の注入を可能とする）製剤を調製することもまた問題である。そのような製剤は必要とされている。例えば、一定容量中でタンパク質が濃縮されかつ安定である量は、体重が変わりやすい患者に特に有用であろう。例えば、体重の変わりやすい患者への液体の投与は、副作用をもたらす可能性がある。そのような製剤の開発は、非常に凝集し沈殿しやすいタンパク質または抗体自体によって阻まれてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、文献に以前に報告されたとはいえ、タンパク質および／または抗体を調製するための改善された方法が必要とされている。抗体またはタンパク質の活性が保持されている高濃度の抗体またはタンパク質を含む安定な製剤もまた必要とされている。また、一定容量を維持する濃縮されたタンパク質の安定な製剤が必要とされている。本出願人らは、抗体製剤、特に、推奨温度で保存したときに沈殿せずに安定である高濃度の抗体を含む製剤、を調製するためにさらに用いることができる安定な組成物を本明細書において開示する。高濃度に濃縮された安定な抗体製剤は、体重が変わりやすい対象の治療において医師の著しい助けとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様は、免疫グロブリン（または他のタンパク質）と、リン酸緩衝液と、ポリソルベートと塩化ナトリウムとを含む安定な水性薬剤を提供する。好ましくは、ポリソルベートはポリソルベート８０であり、好ましくは約０．００１％〜約２．０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。最も好ましくはポリソルベートは約０．０２％の量で存在する。他の実施形態において、免疫グロブリンまたは他のタンパク質は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在する。好ましくは製剤は、約３．０〜約７．０、最も好ましくは約６．０±０．５のｐＨに緩衝されている。製剤は、好ましくは等張である。製剤は、さらにヒスチジンを含んでいてよい。好ましくは、ヒスチジンはＬ−ヒスチジンである。
【０００５】
本発明の他の態様において、上の製剤の免疫グロブリンは、ナタリズマブのような抗α−４インテグリン抗体または他のヒト化抗体またはモノクローナル抗体である。この抗体は、標準的な量または濃縮された量、例えば約１５ｍｇ／ｍＬ以上の量で存在していてよい。好ましくは、ナタリズマブは約２０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。製剤が約１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在する場合、この製剤は、一定容量、例えば、約１２５ｍＬ中に維持される。
【０００６】
ある症状のために体重が変わりやすい患者を治療量の免疫グロブリンを用いて治療する方法であって、前記患者に、上記およびここに述べる製剤を投与することを含み、前記症状が前記製剤の投与により治療される方法を提供することが本発明のさらなる目的である。この症状がα−４インテグリンによって媒介されるものであり、そのような症状において、免疫グロブリンは、ナタリズマブのようにα−４インテグリンを認識し、結合するものであることが本発明のさらなる態様である。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、リン酸ナトリウム、ポリソルベート、タンパク質およびＮａＣｌを含み、６．０±０．５のｐＨを有し、５℃〜８℃で長期間保存した場合に安定である組成物を提供する。
【０００８】
本発明の他の態様は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベートおよびタンパク質を混合し、混合物のｐＨをリン酸で約ｐＨ６．０±０．５に調整することを含む安定なタンパク質含有製剤を調製する方法を提供する。
【０００９】
本発明の製剤中のタンパク質は、凍結乾燥されていてよい。ポリソルベートは好ましくは、約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在するポリソルベート８０ｋであり、タンパク質は好ましくはナタリズマブである。製剤は、さらにヒスチジンを含んでいてよい。
【００１０】
好ましくは、タンパク質は、５ｍＭヒスチジン、２０ｍｇ／ｍＬスクロースおよびｐＨ６の０．０２％ポリソルベート８０を含む溶液中で凍結乾燥されていて、２０ｍｇ／ｍＬの濃度のナタリズマブである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上およびここに述べる安定な製剤を保持する容器を含む物品を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、ある症状のために体重が変わりやすい患者を治療する方法であって、上およびここに述べる製剤と前記症状に対して有効な化合物または療法との治療上有効な組合せを患者に同時または逐次的に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
ある症状の治療のための前記症状の治療に有効な医薬品を調製するための本明細書に記載の安定な製剤のいずれかの使用を提供することが本発明のさらなる態様である。この医薬品は、前記症状を治療するための第２の化合物および療法をさらに含んでいてよい。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
「タンパク質」は、免疫グロブリン、酵素、受容体およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されないことを意味する。製剤の議論は主として抗体または免疫グロブリンに関して記載するが、他のタンパク質は、開示した製剤中で交換可能と考えられる。
【００１５】
「免疫グロブリン」は、抗体および抗体フラグメント（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２）ならびに抗体の他の遺伝子工学的に処理した部分を含むが、これらに限定されないことを意味する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに帰属させることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、よく知られている。好ましくは、免疫グロブリンは、α−４インテグリンを認識し、そこに結合する。
【００１６】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、特に、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリペプチド特異性を有する抗体組成物および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、「ｐｒｅｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）」抗体および遺伝子工学により作製した他の抗体を含むことを意味する。
【００１７】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で用いているように、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量存在する可能性がある天然に存在する突然変異を除き、同じである。モノクローナル抗体は、単一抗原性部位に対して高度に特異的である。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一抗原決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、哺乳類細胞発現システムまたは形質転換技術により合成され、他の免疫グロブリンにより汚染されていない点が有利である。例えば、本発明により用いるべきモノクローナル抗体は、Ｂｅｈｂｏｏｄｉら（２００２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｏａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）およびＭｅａｄｅら（１９９９）、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｕｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｊ．Ｍ．  ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＪ．Ｐ．  Ｈｏｅｆｆｌｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにより記載のようにヤギにおいて発現させることができる。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を示すものであり、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明により用いるべきモノクローナル抗体は、Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）により記載された方法により調製することができる。
【００１８】
「モノクローナル抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であり、一方、鎖の残りは、他の種に由来または他の抗体クラスもしくはサブクラス、ならびに所望の生物学的活性、例えば、α−４インテグリンに結合する能力を示す限り、そのような抗体のフラグメントに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）も含む。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７頁に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等）抗体の「ヒト化」形は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列）である。概して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定部（ＣＤＲ）の残基が所望の特異性、親和性および容量を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも認められない残基を含んでいてよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改善し、最適化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ部が非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである、実質的にすべての少なくとも１つ、および一般的に２つの可変領域を含む。ヒト化抗体は、最適には、一般的にヒト免疫グロブリンのそれである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。
【００１９】
「線状抗体」という表現も一般的用語「抗体」に含まれ、抗原結合領域の対を形成する縦列Ｆｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）である。線状抗体は、二重特異性または単一特性であってよい。
【００２０】
「変異抗体」（一般的用語「抗体」にも含まれる）は、親抗体配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により、「親」抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子である。好ましい実施形態において、変異体は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域における少なくとも１つの置換、例えば、約１〜約１０、好ましくは約２〜約５つの置換を含んでいてよい。通常、変異体は、親抗体重または軽鎖可変領域配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書では、最大の割合の配列同一性を達成するために必要な場合、配列のアライメントをとり、ギャップを導入した後に、親抗体残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義する。Ｎ末端、Ｃ末端または内部拡張、欠失または抗体配列への挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼさないと解釈すべきである。
【００２１】
そのような特性を分析するために、本明細書に開示した生物学的活性検定において抗体のフォーマットがその活性に影響することが見いだされたので、例えば、変異体のＦａｂ型を親抗体のＦａｂ型と、または変異体の全長型を親抗体の全長型と比較すべきである。特に興味深い変異抗体は、親抗体と比較したとき、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、最も好ましくは少なくも約５０倍の生物学的活性の増大を示すものである。「親」抗体は、変異体の調製に用いられるアミノ酸配列によってエンコードされるものである。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であってよい。
【００２２】
「分離抗体」は、その自然環境の成分から同定され、分離かつ／または回収されたものである。その自然環境の汚染物質成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨害するような物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様または非タンパク質様溶質などである。好ましい実施形態において、抗体を（１）ローリー法により測定したとき９５重量％を超えるまで、より好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネータを用いてＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマーシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同質になるまで精製する。分離抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、組換え細胞内でのｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体を含む。しかし、通常、分離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２３】
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部、一般的に完全な抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、単鎖抗体分子ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体などがある。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖に存在する抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００２４】
「二重特異性抗体」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを指す。短すぎて、同じ鎖上の２つのドメインの間の対を形成させることができないリンカーを用いることによって、ドメインは他の鎖の相補的ドメインと対を形成し、２つの抗原結合部位を作ることを余儀なくされる。抗体の投与経路は、既知の方法によるものであり、よく知られており、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病変内経路による、または持続性放出システムによる注射または注入を含む。抗体は、注入またはボーラス注射により連続的に投与することができる。治療用抗体組成物は一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通できる栓を有する静脈内液剤バッグまたはバイアルに入れる。「製薬上許容できる」医薬品添加剤（例えば、賦形剤、添加剤）は、用いる有効成分の有効量を供給するために対象哺乳類に合理的に投与することができるものである。「安定な」製剤は、その中のタンパク質が保存時にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。「安定な」も凝集および／または脱アミド化を含む不安定性の徴候をほとんどまたは全く示さない製剤を意味する。例えば、本発明により提供される製剤は、５〜８℃の温度で示されたように保存するとき、少なくとも２年間安定であり続けることができる。
【００２５】
タンパク質の安定性を測定する様々な分析法は、当技術分野において利用でき、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９１）およびＪｏｎｅｓ、１９９３  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９〜９０頁においてレビューされている。安定性は、示した実施例により例示されているように、選択した温度で、選択した期間にわたり測定することができる。安定な製剤の保存は、もし好ましくければ少なくとも６カ月間、より好ましくは１２カ月間、より好ましくは１２〜１８カ月間、より好ましくは２年またはそれを超える期間である。
【００２６】
抗体またはそのフラグメントのようなタンパク質は、色および／または透明度の目視検査で、あるいはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したとき、凝集、沈殿、脱アミド化および／または変性の徴候を示さなければ、製剤中で「その物理的安定性を保持している」。
【００２７】
所与の時点での化学的安定性が、タンパク質がその生物学的活性を依然として保持しているとみなされるものであるならば、タンパク質は製剤中で「その化学的安定性を保持している」。化学的安定性は、化学的に変化した形のタンパク質を検出し、定量することによって評価することができる。化学的変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス援用レーザー脱離イオン化／時間飛行質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて評価することができるサイズ修飾（例えば、クリッピング）を伴う。他の種類の化学的変化は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる電荷変化（例えば、脱アミド化として起こる）などである。所与の時点の抗体の生物学的活性が、例えば、抗原結合検定で測定したとき、製剤が調製された時点に示された生物学的活性の約１０％以内（検定の誤差範囲内）である場合、抗体は製剤中で「その生物学的活性を保持している」。
【００２８】
「等張」は、問題の製剤がヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、一般的に約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を用いて測定することができる。
【００２９】
本明細書で用いているように、「緩衝液」は、その酸塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の緩衝液は、約３．０〜約７．５の範囲のｐＨ、好ましくは約ｐＨ４．０〜約７．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約６．５、最も好ましくは約６．０±０．５のｐＨを有する。上の範囲の間のいずれかの点のｐＨも考えられる。
【００３０】
薬理学的意味では、本発明の状況においては、抗体の「治療上有効な量」は、抗体が有効である治療における障害の予防または治療に有効な量を指す。「障害」は、抗体またはタンパク質による治療から利益を得るようなあらゆる症状である。これは、哺乳類を問題の障害にかかりやすくする病的症状を含む慢性および急性障害または疾患を含む。
【００３１】
「治療」は、治療処置と予防的処置を指す。治療を必要とする者は、障害を既に有する者ならびに障害を予防しなければならない者を含む。
【００３２】
「保存薬」は、製剤中の細菌の作用を本質的に減弱させ、それにより、例えば、反復使用製剤の生産を促進するために製剤に含めることができる化合物である。可能な保存薬の例は、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）および塩化ベンゼトニウムなどである。他の種類の保存薬は、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールのような芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾールなどである。
【００３３】
「患者」または「対象」は、あらゆる哺乳類を含むことを意味する。治療の目的のための「哺乳類」は、ヒト、家畜および養殖動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園、スポーツまたは愛玩動物を含むが、これらに限定されない哺乳類と分類される動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３４】
「Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）」は、ＡＮ１００２２６（抗体コード番号）またはナタリズマブ（ＵＳＡＮ名）としても知られている抗体を含むことを意味する。ナタリズマブは、組換えヒト化抗α−４インテグリン抗体である。好ましくは哺乳類における治療される疾患または症状は、治療上有効な量のナタリズマブを投与したときに変化するものである。
【００３５】
「安定な」は、凝集および／または脱アミド化を含む不安定性の徴候をほとんどまたは全く示さない製剤を意味する。さらに、「安定な」は、示されたように保存したとき、２年またはそれを超える期間にわたり不安定性の徴候を示さない製剤も指す。
【００３６】
２．一般的説明
下の議論および続く実施例において、安定な抗体製剤に関する処方を開示する。開示した特定の安定な製剤は、高濃度の抗体を有するが、一定の容量を維持し、これらの製剤中の抗体は安定であり、抗体は溶液から沈殿または凝集しない。抗体以外のタンパク質も高濃度製剤用に考えられる。
【００３７】
抗体は一般的に対象（例えば、ヒト）に約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で投与される。より一般的には、抗体の濃度範囲は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬである。しかしながら、より高い濃度、例えば、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬおよび中間の整数値を患者に投与することを必要とする場合がある。
【００３８】
抗体製剤は、既知の方法に従ってタンパク質による治療を必要とする哺乳類に投与することができる。これらの方法は、ボーラスとしての、もしくはある時間にわたる持続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、鞘内、経口、局所または吸入経路を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、抗体製剤は、静脈内投与により哺乳類に投与する。
【００３９】
タンパク質の適切な用量は、例えば、治療する症状、症状の重症度および経過、タンパク質を予防目的または治療目的のために投与するのかどうか、これまでに施された療法、患者の臨床歴およびタンパク質に対する反応、用いるタンパク質の種類ならびに担当医の裁量に依存する。タンパク質は、１回または一連の治療中に患者に適切に投与され、診断以後のいずれの時点においても患者に投与することができる。タンパク質は、単独療法として、あるいは問題の症状の治療に有用な他の薬剤または療法と併用して投与することができる。本明細書で用いているように、２つの薬剤を同時に投与するとき、または薬剤が同時に作用するような方法で独立に投与するとき、２つ（またはそれを超える）薬剤は併用投与すると言われる。
【００４０】
本発明の方法を実施するに際して、本発明の化合物は、単独で使用もしくは併用、または他の治療薬と併用することができる。特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般的に受け入れられている医療に従ってこれらの症状に対して一般的に処方される他の化合物と併用投与することができる。例えば、本発明の製剤は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症およびクローン病の治療のための他の治療薬または理学療法と組み合わせて投与することができる。
【００４１】
２．１  抗体製剤を調製する方法
方法は、当業者に知られているように変更することができるが、一般的に以下のような手順に従うものであろう。問題の抗体またはタンパク質を生産する細胞を含む作業細胞バンクからアンプルを入手する。接種物を調製する。必要に応じて追加の栄養補給を行い、細胞を培養または発酵させる。遠心分離および／または濾過により細胞を収集／清澄化する。これは、例えば、回転濾過により細胞を１０倍濃縮することにより行うことができる。０．２μｍ中間濾過による濾過の後に、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（登録商標）（すなわち、アフィニティークロマトグラフィー）および逆溶出による精製を行う。次いで、抗体を含む組成物をｐＨ３．６〜３．７で処理する。次いで、混合物をウイルス濾過した後、濃縮／透析濾過工程に供する。次いで、組成物をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（登録商標）（陰イオン交換）により精製することができる。この工程は、複数回実施することができる。この時点から、組成物をさらに濃縮した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ＨＲ（登録商標）（すなわち、ゲル濾過クロマトグラフィー）システムを用いた精製工程に供する。ここで、用いた操作緩衝液はリン酸塩／ＮａＣｌである。所望により、高濃度製剤（例えば、２０ｍｇ／ｍＬ以上）を得るために抗体含有組成物をさらに濃縮することができる。抗体含有組成物にさらに緩衝剤を加え、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加えて濃度を調整する。次いで、この組成物を０．２μｍフィルターを用いた最終濾過にかけ、この時点に１００ｍＬ〜１０Ｌポリプロピレンびんに分注することができる。そのようにして得られた抗体または免疫グロブリンは、ＱＣ試験に供し、ＱＡリリースすることができる。
【００４２】
上のことを例えば、ナタリズマブについて、以下の流れ図に示すように行うことができる。
【００４３】
【表１】
2014028831.tif 000002
【００４４】
２．２  抗体製剤
本発明の一態様において、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０±０．５）および０．０２％ポリソルベート８０中約１．７、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０または５０．０ｍｇ／ｍＬの濃度の免疫グロブリンを調製する。必要な場合、リン酸を用いてｐＨを６．０±０．５に調整する。
【００４５】
種々の製剤のうちの一例を以下に示す。
【００４６】
【表２】
2014028831.tif 000003
【００４７】
上の製剤のいずれかを最適には滅菌バイアルに入れる。これらのバイアルは、例えば、アルミニウムシールを備えたＨｅｌｖｏｅｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｖ９１４５／ＦＭ１５７／１灰色ブチルゴム栓付きタイプＩ  ＥＰ中性ガラスバイアル（例えば、５．０または２０ｍＬ容バイアル）であってよい。しかし、他の適切な滅菌バイアルも考えられる。例えば、製剤は以下のようにびん詰めすることができる。
【００４８】
【表３】
2014028831.tif 000004
【００４９】
より具体的には、例えば、上記の手順により得られるナタリズマブは、次のようにびん詰めすることができる。ナタリズマブ２００Ｌおよび２０００Ｌ製剤は、バイアル洗浄、滅菌および発熱物質除去トンネルを装備した完全に自動化された充填ラインで充填することができる。栓、シールおよび充填装置は、使用前に洗浄し、滅菌する。この工程は、２０００Ｌ発酵により生産される量と一致した大規模充填操作を可能にする。
【００５０】
必要な場合、製剤処方緩衝液である約１０ｍＭリン酸塩、約１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨを６．０±０．５、約０．０２％ポリソルベート８０緩衝液をクラス１００００スイートで配合し、バルク製剤を最終濃度に希釈するのに用いることができる。濃度、ｐＨおよび密度の工程内規格は濾過の前に達成されることが好ましい。
【００５１】
製剤化されたナタリズマブまたは他の免疫グロブリンは、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルターを通して滅菌コア内部のステンレススチールサージタンク中に無菌濾過することができる。ナタリズマブの充填、施栓およびキャッピングは、完全に自動化されている。バルク無菌性の検査用工程内サンプルを採取し、充填操作中に充填重量およびヘッドスペース検査を行う。充填済み製剤を約２〜８℃の冷凍条件下で保存する。
【００５２】
充填は、完全にバリデートされたクラス１００無菌コア内で行われる。充填ラインは、５．０ｍＬおよび２０ｍＬ充填容量の予想される許容誤差範囲内の充填容量が得られることがバリデートされている。充填操作中、包括的環境モニタリングを実施し、この基準への継続的な適合を確認するために評価する。無菌的充填操作を裏付けるために、培地充填を四半期ごとに行う。
【００５３】
あるいは、生成した２００Ｌ薬剤物質を以下の実施例に従ってびん詰めすることができる。バイアル、充填針、濾過アセンブリおよびチューブは、使用前に準備し、滅菌する。栓は、供給者が準備することができる。次いで、栓は充填前に滅菌する。
【００５４】
ナタリズマブ製剤または他のタンパク質は、成分のバッチ調製、自動化充填、即時施栓および後続のキャッピング操作を含む、半自動充填ラインで充填される。この操作は、小バッチ規模操作に適している。
【００５５】
次いで、最終バルク溶液をクラス１００環境内で０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルターを通して滅菌ガラス受器中に無菌濾過する。定期的な較正および工程内検査により、充填許容誤差が±２％内に留まることが確保される。バイアルに直ちに施栓し、キャップを施す。充填済み製剤は、好ましくは２〜８℃で冷凍保存する。
【００５６】
ガラス受器は、任意の数のバイアルであってよいが、例えば、Ｅｐｓｏｍ  ＧｌａｓｓもしくはＡＭＩＬＣＯにより供給される例えば５．０または２０ｍＬ中性ガラスバイアルタイプＩ（ＥＰ）または例えば、ＫｉｍｂｌｅもしくはＷｈｅａｔｏｎにより供給される５．０ｍＬまたは２０ｍＬ  ＵＳＰタイプＩホウケイ酸ガラスバイアルであってよい。これらのバイアルは、適切な閉鎖の手段を用いることができる。バイアル閉鎖具は、１３ｍｍ  Ｈｅｌｖｏｅｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｖ９１４５／ＦＭ１５７／１灰色ブチルゴム栓または１３ｍｍおよび２０ｍｍ  Ｈｅｌｖｏｅｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｖ９１４５／ＦＭ１５７／１灰色ブチルゴム栓または１３ｍｍおよび２０ｍｍ  Ｗｅｓｔ４４３２／５０灰色ブチルゴム栓を含むが、これらに限定されない。次いで、ゴム栓をしたびんを、最も一般的には、Ｗｅｓｔにより製造されたようなアルミニウムシールを用いてシールする。
【００５７】
本発明は以下の実施例に関連して詳細に記述したが、様々な修正は、本発明の精神から逸脱することなく行うことができ、当業者に容易に知られることが理解される。
【００５８】
［実施例］
（実施例１）
ポリソルベート８０の選択
ナタリズマブを投与する一般的な方法は、静脈内である。静脈内投与は、最終製剤が等張性であることを必要とする。５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中ＡＮ１００２２６（ナタリズマブ）５ｍｇ／ｍＬの製剤を最初に選択した（製剤番号１）。第ＩＩ相試験中に、抗体のタンパク質の沈殿が、ナタリズマブの希釈および臨床投与装置内への導入中に認められた。認められたタンパク質の沈殿を解消するために、ポリソルベート８０を製剤（製剤番号２）に導入した。好ましくは、本発明用のポリソルベートは、過酸化物が低いもの、すなわち、Ｓｉｇｍａ製のポリソルベート、製品番号Ｐ６４７９、ロット番号０７１Ｋ７２８３である。
【００５９】
ＡＮ１００２２６抗体の沈殿を加速することが示された２つの因子は、微量のシリコーン油の存在と空気−液体界面における変性である。シリコーン油は、シリコーン処理ゴム栓を装着した標準潤滑ポリプロピレン注射器の使用時に製品中に導入された。シリコーン油の導入は、緩やかな撹拌および室温保存時に製剤番号１中の識別できる抗体の沈殿を引き起こすのに十分である。空気−液体界面における変性によって引き起こされる凝集、脱アミド化およびその後の沈殿は、薬剤がより多くの臨床施設に輸送されることに伴ってより識別できる問題になった。タンパク質の沈殿の両原因は、０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０の添加によって解消された。
【００６０】
製剤番号２は、製品輸送中および臨床での取り扱い中の安定性の増加をもたらすと同時に、すべてのタンパク質特性確認検定においてヒスチジン／ＮａＣｌ製剤（製剤番号１）と同等の安定性を示している。
【００６１】
製剤へのポリソルベート８０の添加は、より高いタンパク質含量を有する製剤を調製する場合の抗体の沈殿または凝集の問題も克服する。最初の試験は、５０ｍｇ／ｍＬを含む高たんぱく質濃度での撹拌誘発性凝集に重点を置いた。ボルテックス型混合器を用いて物質を撹拌に供することによって、凝集種がサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により検出された。このモデルによって、ポリソルベート８０が凝集の有効な阻害物質であることが確認されたが、スクロースおよび他の緩衝成分はほとんど有用な効果を示さなかった。
【００６２】
５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度での撹拌誘発性沈殿の予防における０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の添加の有効性を、ナタリズマブ（ロット番号ＡＮ１００２２６−０００３）のバイアルへの１０μＬの１０％ポリソルベート８０溶液の添加後に評価した。バイアルを製剤番号１中ナタリズマブの数個のバイアルとともに横にして水平面内で１分間に１５０回振とうした。室温でのこの処理の３時間以内に、製剤番号１のバイアルは粒子が蓄積し、混濁して見えたが、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むバイアルは透明のままであり、粒子は存在しなかった。
【００６３】
ポリソルベート８０の非存在下でＡＮ１００２２６を完全に満たしたバイアルを長時間振とうした場合にはさらなる粒子の生成は誘発されなかったことから、認められた凝集は空気−液体界面により引き起こされたと推定される。
【００６４】
０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０が微量のシリコーンによって促進されるタンパク質の沈殿を抑制する能力の評価を行った。ナタリズマブ（ロット番号ＡＮ１００２２６−０００３）のバイアルを０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０に調整し、市販の潤滑６０ｍＬポリプロピレン注射器中に吸引した。物質を室温で数時間放置した。バイアルの視察により、沈殿が発生しなかったことが確認された。次いで、物質を０．２μｍフィルターを通して５ｍＬバイアル中に濾過し、視察したところ、数日後に粒子が実質的に存在しないことが認められたが、ポリソルベート８０の非存在下で同様に処理したバイアル（製剤番号１）は粒子が蓄積していた。
【００６５】
（実施例２）
リン酸緩衝液の選択
ヒスチジンプラセボ（０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０を含む）の放出試験中、新しい微量不純物が検出された。これらの不純物は、明らかに金属イオンとヒスチジンが関与した酸化反応によるポリソルベート８０の分解から生じた。活性ナタリズマブ製剤については、これらの微量不純物は高温（例えば、２５℃および４０℃）で保存した後にのみ検出された。したがって、プラセボを改良し、緩衝液中のヒスチジンの代わりにリン酸塩を用いる決定をくだした。製品プラセボに用いたヒスチジンのロットは、活性ナタリズマブ製剤ロットＡＮ１００２２６−００４およびＡＮ１００２２６−００５に用いたものと異なっていた。ポリソルベート８０の分解に対するヒスチジン供給源の影響を以下でより詳細に述べる。
【００６６】
プラセボの試験中に、微量不純物がヒスチジン／ＮａＣｌ／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０プラセボ（製剤番号２）中に検出された。これらの不純物は、低波長紫外領域におけるそれらの吸光度により検出された。５℃、２５℃および４０℃で１カ月間保存したプラセボの２００〜４００ｎｍの吸光度プロファイルを測定した。これらのデータから、不純物は温度の関数として増加することがわかる。
【００６７】
抗体凝集をモニターするために用いたサイズ排除ＨＰＬＣ法を、微量不純物の検出の感度を増加させるためにカラム負荷を５倍の１００μＬに増加させて改良し、サンプルを１０倍希釈でなく、未希釈で導入した。さらに、不純物の吸光度極大を反映させるために、吸光度を２６０ｎｍでモニターする。抗体は溶出プロファイルにおいてはるかに早期に出現するので、この方法はプラセボおよび製品中のこれらの微量不純物の存在を評価するためのツールである。
【００６８】
製剤番号１および２として調剤したプラセボおよびナタリズマブ最終製剤は、上記のＳＥＣ−ＨＰＬＣ法により分析した。０．０２％（ｗ／ｖ）となるようにポリソルベート８０をスパイクした製剤番号１のプラセボの分析をクロマトグラフィーの直前に行った。これは、微量不純物の非存在下では、ポリソルベート８０、ヒスチジンおよび塩のＵＶ吸光度を示す。１６分における広いピークはポリソルベート８０に関連し、約２６〜２７分におけるピークはヒスチジンおよび塩に帰属される。５℃で２カ月間保存したヒスチジン／ＮａＣｌ／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０プラセボ（製剤番号２）は、これらの不純物の生成におけるポリソルベート８０の関連性を示唆する後期溶出ピークの著しい増加を示す。さらに、１６分における溶出が消失し、ポリソルベート８０が分解したことが示唆される。
【００６９】
製剤番号１中でバルク薬剤物質として５℃で約５カ月間保存したＡＮ１００２２６をクロマトグラフィーの直前に０．０２％（ｗ／ｖ）となるようにポリソルベート８０をスパイクした後に分析した。抗体は、これらの過負荷条件を用いた場合、１６〜１８分に溶出した。プロファイルの残りは、ポリソルベート８０をスパイクしたプラセボと類似している。ナタリズマブロット番号ＡＮ１００２２６−００４の２カ月安定性サンプルもこの方法により分析した。５℃ナタリズマブサンプルの溶出プロファイルは、別のピークの非存在および約２６〜２７分におけるヒスチジン／塩ピークの同等なレベルを示している。微量の不純物が２５℃サンプルに２カ月目に検出され、高いレベルが２カ月４０℃サンプルに存在している。したがって、これらの不純物は、５℃で保存される臨床供給品には検出されなかった。これらの微量不純物の出現は、ナタリズマブ中よりもプラセボ中にはるかに速やかに起こる。
【００７０】
プラセボ中のこれらの不純物の生成を避けるために、プラセボ製剤中のヒスチジンの代わりに無機緩衝成分を用いた。臨床試験用のプラセボ製剤は、ｐＨ６．０の０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む滅菌等張リン酸緩衝液である。ヒスチジンの代わりにリン酸を用いることにより、ポリソルベート８０の分解の速度が有意に低下したことが示された。１００μＬのリン酸塩／ＮａＣｌ／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０プラセボ製剤を６０℃で０時間および３日後に２６０ｎｍでモニターするサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。このインキュベーションの結果としてＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルにほとんど変化は認められない。６０℃でわずか２日後のヒスチジン／ＮａＣｌ／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０製剤のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルは、ポリソルベート８０の分解に関連する有意なレベルの微量不純物を示している。これらのデータは、プラセボ製剤中のヒスチジンの代わりにリン酸塩を用いることによりポリソルベート８０の分解が有意に妨げられることを示している。
【００７１】
（実施例３）
ポリソルベート８０とヒスチジンとを併せて含むナタリズマブ製剤
これらの微量不純物が生成されるメカニズムは、ポリソルベートの金属触媒酸化によると考えられている（Ｄｏｎｂｒｏｗら、１９７８  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６７（１２）：２８頁）。Ｄｏｎｂｒｏｗは種々のタイプのポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）において、保存中に自己酸化が起こることを述べている。光、温度および金属イオンも自己酸化に影響を及ぼす。Ｄｏｎｂｒｏｗら（１９７８）。この反応が有意な速度で進行するにはヒスチジンとポリソルベート８０の両方が必要であることが確認された。味の素社は、製剤に用いられる１つのヒスチジン供給源である。しかしながら味の素社から供給されたロットの間に反応速度の有意な差が認められた。
【００７２】
反応の加速に役割を果たすさらなる因子は、金属の存在である。これは、５０ｍＭヒスチジン（ロット番号Ｒ０１６Ａ００８）および２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むガラス容器中で６０℃で５日間反応を行うことによって立証された。これらの条件下では、このヒスチジンロットにおいて最小限のレベルの微量不純物が生成した。次に、反応を次の３つの容器に分割した。（１）対照として最初の容器のままとした、（２）灰色ブチル容器閉鎖栓（栓）を第２の容器に加えた、（３）ステンレススチール針を第３の容器に加えた。これらの反応を６０℃で４日間行い、２００〜４００ｎｍのＵＶスキャンにより分析した。反応は、針の存在下ではこの時間を超えてさらに進行した。
【００７３】
（実施例４）
不純物の評価−マウス単回投与限度試験
これらの不純物の潜在的毒性をマウス単回投与限度試験において評価した。４０℃で６週間保存した製剤番号２のヒスチジンプラセボおよびナタリズマブサンプルを用いた。その理由は、これらのサンプルは最大量の不純物をもたらすからである。不純物に起因した毒性の徴候はなかった。予備的データは、申請書の非臨床セクションに記載されている。
【００７４】
マウス単回投与限度試験に用いたサンプルの１００μＬ注入のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを測定した。分析前にポリソルベート８０をスパイクした製剤番号１のナタリズマブサンプルは、２０分後に溶出する２６０ｎｍ吸収物質をほとんど有さない。３４分に溶出するピークがポリソルベート８０を添加しないこのロットのナタリズマブに認められ、したがって、ポリソルベート８０の分解を示さない。これに対して、４０℃で６週間保存した製剤番号２のプラセボは、曲線下総面積が１２．８百万μＶ・秒であったので、完全な分解を示した。製剤番号２の４０℃で６週間保存したナタリズマブサンプルは、完全に満たない分解を示した。分析により、４０℃で保存し、マウス単回投与限度試験において試験したサンプルには分解したポリソルベート８０が含まれていることが確認される。
【００７５】
（実施例５）
不純物規格の設定
部分的に分解したポリソルベート８０が依然として抗体凝集を防止することができるかどうかを評価するために、すべてのポリソルベート８０を最大レベルの不純物に変換するために、製剤番号２を針の存在下で６０℃で３日間加熱した。反応はすべてのポリソルベート８０を分解させたことがＳＥＣおよび逆相ＨＰＬＣによって確認した。この物質を製剤番号２中ＡＮ１００２２６の１０ｍｇ／ｍＬ溶液で１対１に希釈し、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０および５０％の最大レベルの分解ポリソルベート８０を含む溶液を得た。これらの抗体溶液を振とうおよびシリコーン処理注射器に数時間曝露させたところ、抗体の凝集が防止された。同じ条件に曝露させたが、ポリソルベート８０を含まない対照サンプルは、有意な沈殿を示した。
【００７６】
この試験から、５０％以下のポリソルベート８０が分解される限り、この物質は抗体凝集を妨げる適切な環境を提供すると結論される。
【００７７】
活性製剤中では非常にわずかなポリソルベート分解が起こっているが、この製剤が抗体の機能を損なわないことを確認するために、等電点電気泳動（ＩＥＦ）パターンのモニタリングを行う。５℃、２５℃および４０℃保存条件における６週間の安定性評価時点のＩＥＦプロファイルを測定した。５℃および２５℃サンプルは、対照標準と同等であり、タンパク質の全体的充填の変化の証拠はない。４０℃サンプルは、ポリソルベート８０の存在下または非存在下で液剤中のこの製品に特有なより酸性の種への変化を示した。
【００７８】
ポリソルベート８０の分解の程度とＳＥＣ−ＨＰＬＣによるピーク面積との関係を確立するために、０〜５０％の分解ポリソルベート８０の６濃度の希釈系列を評価した。製剤番号２を針とともに６０℃で３日間加熱し、１００％分解されることがＳＥＣおよび逆相ＨＰＬＣによって確認した。次いで、反応混合物を、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を新たにスパイクした製剤番号１のＡＮ１００２２６精製バルクで希釈し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。ＳＥＣプロファイルは、２６０ｎｍでモニターした。
【００７９】
この希釈系列からのデータを、分解ポリソルベート８０の比の関数としての約２４分後の吸光度プロファイルの積分した総ピーク面積（μＶ・秒）によってプロットした。このプロットは、５百万μＶ・秒未満の面積は分解生成物へのポリソルベート８０の約５０％消失を表すことを示している。クロマトグラムにおける後期に溶出するピークについて、添加した酸化ポリソルベート８０の量とピーク面積との間の直接的関係が存在する。
【００８０】
ナタリズマブ中のこれらの微量不純物の予備的限度は、マウス単回投与限度試験、５０％分解ポリソルベート８０を含む抗体溶解度データおよびポリソルベート８０分解の程度の推定に基づいて確立された。方法は進行中の安定性プログラムに含められ、限度が確立された。ヒスチジン緩衝液を含む別のロットを製造する場合、これらの限度は、リリースの時点にも適用されるであろう。
【００８１】
限度：約２４分後のピーク下総面積は、４×１０６μＶ・秒を超えてはならない。
【００８２】
（実施例６）
１．７ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
１．７ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．２ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８３】
（実施例７）
５．０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
５．０ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．２ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８４】
（実施例８）
２０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
２０．０ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．２ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８５】
（実施例９）
５０．０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
５０．０ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．２ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８６】
（実施例１０）
５．０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
５．０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．０２％ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）
１０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨをリン酸で６．０±０．５に調整する。最適には、製剤を約５℃〜約８℃で保存する。
【００８７】
（実施例１１）
１０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
１０．０ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．２ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８８】
（実施例１２）
１０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
１０．０ｍｇナタリズマブ
１．４ｍｇリン酸ナトリウム、ＵＳＰ
８．２ｍｇ塩化ナトリウム、ＵＳＰ
０．１ｍｇポリソルベート８０、ＮＦ
ｐＨをリン酸、ＮＦで６．０±０．５に調整する。１ｍＬ定容にする。好ましい保存５〜８℃。
【００８９】
（実施例１３）
２０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ製剤
２０．０ｍｇ／ｍＬナタリズマブ
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．０２％ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）
１０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨをリン酸で６．０±０．５に調整し、容量を１２５ｍＬにする。最適には、製剤を約５℃〜約８℃で保存する。
【００９０】
（実施例１５）
凍結乾燥ナタリズマブ製剤
２０〜２００ｍｇ／ｍＬの高濃度の抗体のさらなる液体製剤は、３．０〜７．０のｐＨ範囲で緩衝作用を有するように２〜５０ｍＭｌの濃度範囲のリン酸塩または他の適切な緩衝剤（ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩またはコハク酸塩など）から構成されていてよい。最も好ましくは、ｐＨは６．０＋／−０．５である。安定性を維持し、等張溶液とするために、塩化ナトリウムとともに様々な量のポリオール（ソルビトールおよびマンニトールなど）、二糖（スクロースまたはトレハロースなど）およびアミノ酸（グリシンなど）を添加することができる。ポリソルベートのような、またこれに限定されない界面活性剤の使用は、０．００１〜２％の範囲で用いるとき安定性を加える。液体製剤を調製するために、ナタリズマブを約０．０６％ポリソルベート８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６中６５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。得られる溶液は、わずかに乳光性であったが、粒子状物質を含んでいなかった。サンプルは、ＳＥＣにより、９９％を超える単量体を含み、高分子量凝集物または低分子量種は含まれていなかった。
【００９１】
安定な凍結乾燥製剤が得られる。リン酸緩衝液は凍結時にｐＨ変化を受けるので、リン酸塩の代わりに他の緩衝剤を用いる必要がある。この緩衝液は、３．０〜７．０のｐＨ範囲で、最も好ましくは６．０＋／−０．５の範囲で効果的に緩衝することができるヒスチジン、クエン酸塩またはコハク酸塩から構成されていてよい。
【００９２】
ポリオール（マンニトールなど）および糖（スクロースなど）の使用は、凍結および分散防護を与えるのに必要である。これらのポリオールは、安定性を与え、張性を調節するために単独または組み合わせて用いることができる。さらに、１０〜１０００ｍＭの濃度のアミノ酸（グリシンなど）は凝集を防止するために用いることができる。
【００９３】
ポリソルベートまたはポロキサマーのような界面活性剤は、凍結乾燥前および再構成の後の安定性を与え、より早い再構成時間を得るために０．００１％〜２．０％の濃度で用いることができる。
【００９４】
タンパク質は、最終精製工程の後に、濃縮のための限外濾過および緩衝剤交換のための透析濾過を用いて製剤化することができる。タンパク質はまた、緩衝剤交換のためのカラムクロマトグラフィーを用いて製剤化することができる。これらの技術のある種の組合せも用いることができる。
【００９５】
さらに、最終の所望タンパク質濃度は、所望の値より低いタンパク質および添加剤濃度で充填し、より小さい容量で再構成して得ることができる。例えば、４０ｍｇ／ｍＬ溶液の２．５ｍＬ充填容量を用いた後、１ｍＬを用いて再構成して１００ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。
【００９６】
例えば、５ｍＭヒスチジン、２０ｍｇ／ｍＬスクロースおよび０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６を含む溶液中の２０ｍｇ／ｍＬの濃度のナタリズマブを凍結乾燥した。溶液を１０ｍＬホウケイ酸ガラスバイアルにバイアル当たり５ｍＬで充填し、灰色ブチルゴム凍結乾燥栓を取り付けた。凍結乾燥は、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｓｉｓモデル凍結乾燥装置を用いて行った。製品を−６０℃のたな温度で１０時間凍結し、次いで、たな温度を−４０℃に上昇させた。一次乾燥は、−１０℃のたな温度、１００ｍトールのチャンバー圧力で２０時間行った。二次乾燥は、２５℃のたな温度、１００ｍトールのチャンバー圧力で１０時間行った。バイアルに真空下で栓をした。
【００９７】
次いで、バイアルを１ｍＬの滅菌ＷＦＩを用いて再構成して、１００ｍＬ／ｍＬのナタリズマブを含む製剤を得た。凍結乾燥の直後および凍結乾燥した形態で４０℃で２週間保存した後にサンプルを分析した。両方の場合に、再構成時間は即時であった。再構成した溶液は透明かつ無色であり、粒子状物質は存在しなかった。サンプルは、ＳＥＣにより、９９％を超える単量体を含み、高分子量凝集体も低分子量種も存在しなかった。４０℃で２週間保存した後に、サンプルは対照標準と比較して９４％の効力を示した（規格８０〜１２５％）。
【００９８】
本出願において言及したすべての引用特許および刊行物は、すべての目的のためにそれらの全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月1日(2013.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンと、
リン酸緩衝液と、
ポリソルベートと、
塩化ナトリウムとを含むことを特徴とする安定な水性の製剤。
【外国語明細書】
2014028831000001.pdf