(57)【要約】      （修正有）【課題】抗イヌＩｇＥ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及びこれらの可変領域を含む抗イヌＩｇＥ抗体を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び特定のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むイヌＩｇＥに結合する抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体又はイヌＩｇＥに結合するその機能的断片、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞、前記細胞による抗イヌＩｇＥ抗体の製造方法、並びに前記抗体を用いるイヌアレルギー疾患の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
【請求項２】
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
【請求項３】
抗体のクラスがIgG、IgA、IgE又はIgMである請求項１又は２に記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
【請求項４】
抗体のサブクラスがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である請求項３記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
【請求項５】
機能的断片がFab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(dsFv) 、二量体化V領域（diabody）、一本鎖Fv（scFv）及びCDRからなる群から選択されるペプチド断片である請求項１〜４のいずれか１項に記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
【請求項６】
配列番号２又は６で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域であるポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４又は８で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域であるポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１又は５で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号３又は７で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、又は請求項８に記載のポリヌクレオチドと請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含むカイコ。
【請求項１３】
配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌIgE抗体の製造方法。
【請求項１４】
配列番号５で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号７で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌIgE抗体の製造方法。
【請求項１５】
抗体の重鎖定常領域をコードするDNAが配列番号９で表されるDNA配列からなり、抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAが配列番号１１で表されるDNA配列からなる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
宿主動物がカイコである、請求項１３又は１４に記載の抗イヌIgE抗体の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片を含む、イヌアレルギー疾患の検出試薬。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片を用いてイヌから採取した血液、血清又は血漿中のIgE抗体を測定することを含む、イヌのアレルギー疾患を検出する方法。
【請求項１９】
請求項６又は７に記載のポリペプチドを含む、イヌアレルギー疾患の検出試薬。
【請求項２０】
請求項６又は７に記載のポリペプチドを用いてイヌから採取した血液、血清又は血漿中のIgE抗体を測定することを含む、イヌのアレルギー疾患を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイヌIgEに特異的に結合する抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域並びにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
IgEはアレルギー、特にI型アレルギーに関与している。近年、愛玩動物として飼育されているイヌにおいて、ヒトと同様にアレルギー疾患が増加している。
【０００３】
I型アレルギーの治療の方法として、血清中のIgEと結合し、IgEがマスト細胞に結合するのを抑制する化合物の利用が考えられ、このようなものとして、IgEのFc領域に結合する抗体が用い得ることが示唆されていた（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2006-151880号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドの提供を目的とし、さらに、これらの可変領域を含む抗イヌIgE抗体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、イヌIgEモノクローナル抗体の作製方法について鋭意検討を行い、イヌIgEを認識し、結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。さらに、該ハイブリドーマより抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNA及び軽鎖可変領域をコードするDNAをクローニングした。次いで、クローニングした重鎖可変領域をコードするDNA及び軽鎖可変領域をコードするDNAを重鎖定常領域をコードするDNA及び軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、ベクターに挿入し、宿主細胞又は宿主昆虫を形質転換し、リコンビナント抗イヌIgE抗体を産生させることに成功し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
[２]  配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
[３]  抗体のクラスがIgG、IgA、IgE又はIgMである[１]又は[２]のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
[４]  抗体のサブクラスがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である[３]記載のイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
[５]  機能的断片がFab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(dsFv)、二量体化V領域（diabody）、一本鎖Fv（scFv）及びCDRからなる群から選択されるペプチド断片である[１]〜[４]のいずれかのイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片。
[６]  配列番号２又は６で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域であるポリペプチド。
[７]  配列番号４又は８で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域であるポリペプチド。
[８]  配列番号１又は５で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[９]  配列番号３又は７で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[１０]  [８]のポリヌクレオチド、[９]のポリヌクレオチド、又は[８]のポリヌクレオチドと[９]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[１１]  [１０]のベクターを含む細胞。
[１２]  [１０]のベクターを含むカイコ。
[１３]  配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌIgE抗体の製造方法。
[１４]  配列番号５で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号７で表されるDNA配列からなる、抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌIgE抗体の製造方法。
[１５]  抗体の重鎖定常領域をコードするDNAが配列番号９で表されるDNA配列からなり、抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAが配列番号１１で表されるDNA配列からなる[１４]の方法。
[１６]  宿主動物がカイコである、[１３]又は[１４]の抗イヌIgE抗体の製造方法。
[１７]  [１]〜[５]のいずれかのイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片を含む、イヌアレルギー疾患の検出試薬。
[１８]  [１]〜[５]のいずれかのイヌIgEに結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片を用いてイヌから採取した血液、血清又は血漿中のIgE抗体を測定することを含む、イヌのアレルギー疾患を検出する方法。
[１９]  [６]又は[７]のポリペプチドを含む、イヌアレルギー疾患の検出試薬。
[２０]  [６]又は[７]のポリペプチドを用いてイヌから採取した血液、血清又は血漿中のIgE抗体を測定することを含む、イヌのアレルギー疾患を検出する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体はイヌIgEに高い親和性で結合し、イヌのアレルギー疾患の治療等に好適に用いることができる。また、本発明の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを用いることにより、効率的に繰り返し、抗イヌIgEモノクローナル抗体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】モノクローナル抗体（マウス由来H5及びラット由来X1）の重鎖・軽鎖の可変領域のクローニングの概略を示す図である。
【図２】重鎖H5_VR及び重鎖X1_VRのラットIgG2b定常領域への連結の概略を示す図である。
【図３】軽鎖H5_VR及び軽鎖X1_VRのラットIgκ定常領域（CR）への連結の概略を示す図である。
【図４】FreeStyle 293F細胞を用いて産生した抗体の構造を示す図である。
【図５】FreeStyle 293F細胞を用いて産生した抗体について、抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロット解析による抗体産生の結果を示す図である。
【図６】FreeStyle 293F細胞を用いて産生した抗体について、抗HisTag抗体を用いたドット・ブロットによる濃度（発現量）予測の結果を示す図である。
【図７】FreeStyle 293F細胞を用いて産生した抗体について、ドット・ブロットによるイヌ、マウス、ヒトの各IgEタンパク質に対する産生抗体の反応性確認の結果を示す図である。
【図８】リコンビナント型抗イヌIgE抗体のカイコでの発現のために用いたBM030ベクターの構造を示す図である。
【図９】リコンビナント型抗イヌIgE抗体のpBM030ベクターへのクローニングに用いたDNAの構造を示す図である。
【図１０】BmN細胞上清及びカイコ体液中のリコンビナント型抗イヌIgE抗体の発現量を示す図である。
【図１１】H5ratCR-HisとX1ratCR-Hisについてカイコ体液に含まれる抗体量をウエスタンブロットで解析した結果を示す図である。
【図１２】BmN細胞上清及びカイコ体液中のリコンビナント型抗イヌIgE抗体のELISA測定の結果を示す図である。
【図１３】カイコ体液中に発現させた抗IgE抗体のイヌIgEに対する反応性を示す図である。
【図１４】カイコ体液より精製した抗イヌIgE組換え抗体の銀染色の結果を示す図である。
【図１５】カイコ体液より精製した抗イヌIgE組換え抗体のELISA法による反応性検定の結果を示す図である。
【図１６】カイコ体液より精製した抗イヌIgE組換え抗体の銀染色の結果を示す図である。
【図１７−１】カイコ体液より精製した抗イヌIgE組換え抗体のELISA法による反応性検定の結果を示す図であり、カイコ体液、HisTag eluate（溶出液）、イオン交換後(5〜50倍希釈まで)について検討した結果を示す。
【図１７−２】カイコ体液より精製した抗イヌIgE組換え抗体のELISA法による反応性検定の結果を示す図であり、イオン交換後の精製産物について更に希釈(20〜1000倍希釈)を進めて検討した結果を示す。
【図１８】凍結融解が抗イヌIgE組換え抗体の反応性に及ぼす影響を示す図である。
【図１９】プライマーの配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、動物IgEに特異的に結合する抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域、並びに該可変領域をコードするポリヌクレオチドである。さらに、本発明は該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む動物IgEに特異的に結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体である。本発明の抗イヌIgE抗体は、イヌIgE及びマウス等の他の哺乳動物のIgEを認識し結合し得る。本発明の抗体は、抗体の機能的断片又はその修飾物も包含する。例えば、抗体の機能的断片は、抗体の断片であって抗原に特異的に結合し得る断片である。機能的断片としては、Fab、F（ab'）2、Fv、1個のFabと完全なFcを有するFab/c、又はＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、DNAもRNAも包含する。
【００１１】
本発明の抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列は、配列番号１又は５で表される配列からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２又は６で表される配列からなる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列にコードされ、配列番号６で表されるアミノ酸配列は配列番号５で表される塩基配列にコードされる。配列番号１及び配列番号２で表される重鎖可変領域はマウス抗イヌIgEモノクローナル抗体由来であり、配列番号５及び６で表される重鎖可変領域はラット抗イヌIgEモノクローナル抗体由来である。また、本発明の抗イヌIgE抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列は、配列番号３又は７で表される配列からなり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４又は８で表される配列からなる。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列にコードされ、配列番号８で表されるアミノ酸配列は配列番号７で表される塩基配列にコードされる。配列番号３及び配列番号４で表される軽鎖可変領域はマウス抗イヌIgEモノクローナル抗体由来であり、配列番号７及び８で表される軽鎖可変領域はラット抗イヌIgEモノクローナル抗体由来である。すなわち、本発明の重鎖可変領域は、配列番号２又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、本発明の軽鎖可変領域は、配列番号４又は８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１２】
本発明の抗イヌIgE抗体は、上記の重鎖可変領域を含む抗体又は上記の軽鎖可変領域を含む抗体である。好ましくは、上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む抗体又はその機能的断片である。本発明の抗イヌIgE抗体は、例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体であり、あるいは配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００１３】
本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、イヌIgEを認識し結合する抗体又は抗体断片の抗原認識部位に含まれるポリペプチドである。
【００１４】
本発明の動物IgEに特異的に結合する抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、イヌIgEを免疫原として用いて、マウスやラットの細胞を用いて、公知の方法により抗IgE抗体産生ハイブリドーマを取得し、該ハイブリドーマから重鎖可変領域をコードするDNA又は軽鎖可変領域をコードするDNAを単離し、該DNAを発現させることにより得ることができる。
【００１５】
また、該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む動物IgEに特異的に結合する抗イヌIgEモノクローナル抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインCH1、CH2及びCH3から構成されている。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であってもよいが、最も好適には、IgG1又はIgG4定常領域である。軽鎖定常領域は、１個のドメインCLで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
【００１６】
抗体をコードするDNAは、重鎖可変領域をコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAを連結し、さらに軽鎖可変領域をコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAを連結することにより重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAとして得られる。可変領域の由来生物種と定常領域の由来動物種は異なっていてもよく、本発明の抗イヌIgE抗体は、可変領域の由来生物種と定常領域の由来生物種が異なるキメラ抗体も含む。例えば、配列番号１で表されるDNAにコードされる重鎖可変領域及び配列番号３で表されるDNAにコードされる軽鎖可変領域はマウス由来であるが、これをラット由来の抗体の定常領域をコードするDNAと連結させてマウス由来の可変領域とラット由来の定常領域を含むキメラ抗体を作製することができる。ラット由来の抗体の定常領域として、例えば、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるIgG2b抗体の重鎖定常領域及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるIgκ鎖の軽鎖定常領域が挙げられる。配列番号１０で表わされるアミノ酸配列をコードするDNA塩基配列は配列番号９で表わされ、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列をコードするDNA塩基配列は配列番号１１で表わされる。
さらに、ヒト抗体の定常領域を有するキメラ抗体も包含する。
【００１７】
本発明の抗体は、例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域が連結した重鎖と配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域が連結した軽鎖を含み、２つの重鎖と２つの軽鎖からなるヘテロ４量体タンパク質である。また、本発明の抗体は、例えば、配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域が連結した重鎖と配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域が連結した軽鎖を含み、２つの重鎖と２つの軽鎖からなるヘテロ４量体タンパク質である。マウスH5モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１３に示し、ラットX1モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１５に示す。マウスH5モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１４に示し、ラットX1モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１６に示す。配列番号１３〜１６で表される配列は、3'側に６つのヒスチジン（His)からなるHisタグをコードする配列を含んでいる。
【００１８】
重鎖可変領域は配列番号２又は６で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。軽鎖可変領域は配列番号４又は８で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖可変領域の活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変流域も含む。重鎖定常領域は配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖定常領域の活性を有するタンパク質からなる重鎖定常領域も含む。軽鎖定常領域は配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖定常領域の活性を有するタンパク質からなる軽鎖定常領域も含む。
【００１９】
このような配列番号２、６、４、８、１０又は１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２、６、４、８、１０又は１２のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
【００２０】
このような配列番号２、６、４、８、１０又は１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２、６、４、８、１０又は１２のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
【００２１】
また、上記の配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される配列からなる塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有している塩基配列からなるDNAであって、抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域をコードするDNAに含まれる。
【００２２】
また、上記の配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域をコードするDNAに含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50％ フォルムアミド、４×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×デンハルツ（Denhardt, s）溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるDNAである。
【００２３】
本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、重鎖可変領域をコードするDNA又は軽鎖可変領域をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより細胞に産生させることができる。
【００２４】
本発明の抗イヌIgEモノクローナル抗体は、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させることができる。この際、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを同じ発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよいし、重鎖をコードするDNAと軽鎖をコードするDNAを別々のベクターに挿入し、２つのベクターを用いて宿主細胞を形質転換すればよい。この際、特定のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードするDNAを予め挿入したベクターに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするDNAを挿入してもよい。また、該ベクターは宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするDNAを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするDNAと抗体をコードするDNAをインフレームで連結するようにする。抗体が産生された後にシグナルペプチドを除去し、抗体を成熟タンパク質として得ることができる。
【００２５】
この際、重鎖可変領域をコードするDNA、軽鎖可変領域をコードするDNA、重鎖可変領域をコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAを連結したDNA、軽鎖可変領域をコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAを連結したDNAをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。
【００２６】
プロモータ及びエンハンサーとしては、サイトメガロウイルス（CMV)、シミアンウイルス40(SV40）、アデノウイルス由来のプロモータ及びエンハンサーを用いることができる。
【００２７】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、公知のものを用いることができる。例えば、Flexi（登録商標）ベクター（プロメガ社）、pUC19、pTV118 N (宝酒造社製)、pUEX2（アマシャム社製）、pGEX-4T、pKK233-2(ファルマシア社製)、pMAM-neo（クロンテック社製）等が挙げられる。また、カイコを用いて可変領域や抗体を産生する場合は、カイコクローニングベクターであるpBM030、pBM034等を用いればよい。
【００２８】
発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキストラントランスフェクション法等がある。
【００２９】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、ヒト胎児腎細胞株である293細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（CHO）細胞、カイコ等の鱗翅目昆虫細胞であるSf 21細胞、Sf 9細胞やTN5細胞、サルCOS細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。また、本発明の可変領域又は抗体は、カイコ虫体を用いて産生することもできる。カイコ虫体を用いての産生は公知の方法により行うことができる。
【００３０】
発現、産生された抗体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。また、抗イヌIgE抗体をアフィニティータグ付きの状態で製造した後、アフィニティータグを利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。アフィニティータグ配列としては、例えば、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列が挙げられる。この場合、ニッケルをリガンドとしたニッケルキレートカラムクロマトグラフィーを利用することにより合成タンパク質を精製することができる。また、ポリヒスチジンに対する抗体をリガンドとして固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。その他、ヒスチジンを含む配列からなるHATタグ、HNタグ等も用いることができる。さらに、他のアフィニティータグとして、V5タグ、Xpressタグ、AU1タグ、T7タグ、VSV-Gタグ、DDDDKタグ、Sタグ、CruzTag09、CruzTag22、CruzTag41、Glu-Gluタグ、Ha.11タグ、KT3タグ等がある。本発明は、これらのタグが結合した抗イヌIgE抗体も包含する。
【００３１】
本発明の動物IgEに特異的に結合する抗イヌIgE抗体及びイヌIgEに結合するその機能的断片は、イヌIgEを認識し結合する。また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体及びイヌIgEに結合するその機能的断片はイヌIgE及びマウスIgEを認識し結合する。
【００３２】
本発明の抗イヌIgE抗体又はイヌIgEに結合するその機能的断片は、イヌ等のアレルギー疾患の治療薬として用いることができる。アレルギー性疾患は、IgE介在性のI型アレルギー疾患であり、IgE介在性のアレルギー疾患として、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、PIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群等が挙げられる。動物のIgEに特異的に結合する抗IgE抗体は、IgEがマスト細胞又は好塩基球に結合するのを阻止することにより、該動物におけるIgE介在性アレルギー疾患を予防又は治療することができる。
【００３３】
また、本発明の抗イヌIgE抗体及びイヌIgEに結合するその機能的断片は、アレルギー疾患の予防又は治療するためのDNAワクチンとしても用いることができる。
【００３４】
本発明の予防又は治療薬は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。該予防又は治療薬は、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内又は皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮又は皮内の各経路によって投与できる。
【００３５】
本発明の予防又は治療薬の投与量は、投与する動物種により変えることができるが、１回数十ng〜数mgである。単回投与でもよいし、2日から8週間間隔で数回にわたって投与してもよい。
【００３６】
さらに、本発明の抗イヌIgE抗体は、イヌ等のアレルギー疾患を検出するために用いることができる。本発明は、本発明の抗イヌIgE抗体、又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域を含むアレルギー疾患の検出するための検出試薬も包含する。例えば、イヌから血液、血清又は血漿試料を採取し、該試料中のIgE抗体を検出することによりアレルギー疾患を検出することができる。
【００３７】
また、ラットX1抗体由来の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体は、イヌIgEだけではなくマウスIgEにも結合する。従って、イヌ用の治療薬を前臨床データをとる際に、該抗体を用いてマウスの免疫反応を検討することによりイヌの免疫反応を知ることができ、イヌを被験体として用いることなく、イヌ用の治療薬を開発することが可能になす。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
[実施例１] リコンビナント型抗イヌIgE抗体（H5（CCH3-5）、X1）の作製
１．モノクローナル抗体（マウス由来H5及びラット由来X1）の重鎖・軽鎖の可変領域のクローニング
１）  抗イヌIgEモノクローナル抗体であるH5（CCH3-5）及びX1モノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマ細胞よりTotal RNAを抽出した（H5細胞RNA：115ng/μL、X1細胞RNA：225ng/μL）。
【００４０】
２）クロンテック社のSMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Cat.No.634293）を用いて、5'-RACE-Ready cDNAを合成した。鋳型として、H5モノクローナル抗体産生ハイブリドーマRNAは316ng、X1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマRNAは618ngを使用し、反応はマニュアルどおりに行った。合成後、100μLのTEを加えて希釈し、-30℃にて保存した。
【００４１】
３）H5モノクローナル抗体はマウスIgG1とκ、X1モノクローナル抗体はラットIgG2bとκの組み合わせでなる抗体分子である事がわかっているので、それぞれの定常領域（constant region、以下CRと略す）上に特異的なreverse primerを設計した。これと5'-RACE-Ready cDNAの5'末端に存在する共通配列に対するUniversal Primer（キットに含まれている、以下UPMと略す）を用いてPCR反応にかけ、可変領域（variable region、以下VRと略す）を増した。
【００４２】
図１にモノクローナル抗体（マウス由来H5及びラット由来X1）の重鎖・軽鎖の可変領域のクローニング方法の概略を示す。
【００４３】
プライマーは以下のものを用いた。
UPM
Long      5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（配列番号１７）
Short      5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（配列番号１８）
D2：Cgamma1（マウス、ラットのIgG1、2bに共通）
5'-AGGGAAATARCCCTTGACCAG-3'（配列番号１９）
D2：CkapPa1（マウス、ラットのIGKC1、2に内部の1-2塩基ミスマッチのみ含む）
5'-GCACCTCCAGATGTTAACTG-3'（配列番号２０）
【００４４】
４）電気泳動上、H5モノクローナル抗体、X1モノクローナル抗体ともに予想サイズのPCR産物を得たので、それぞれのcDNA断片を切り出し、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-up System（#A9282）を用いて精製した。
【００４５】
５）TOYOBOのTarget CloneTM-Plus-（No.TAK-201）を用いて、精製断片をpTA2ベクターにクローニングした。
【００４６】
６）５）でクローニングされた断片のシークエンス解析を行ない、得られた配列をIMGT(Immuno Gene Tics)のIMGT/V-QUEST（http://www.imgt.org/IMGT_vquest）にて検索した。結果を表１に示す。H5_HVRはマウス由来H5モノクローナル抗体の重鎖可変領域を、H5_KVRはマウス由来H5モノクローナル抗体の軽鎖（κ鎖）可変領域を、X1_HVRはラット由来X1モノクローナル抗体の重鎖可変領域を、X1_KVRはラット由来X1モノクローナル抗体の軽鎖（κ鎖）可変領域を示す。マウス由来H5モノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また、マウス由来H5モノクローナル抗体の軽鎖（κ鎖）可変領域の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。また、ラット由来X1モノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。さらに、はラット由来X1モノクローナル抗体の軽鎖（κ鎖）可変領域の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４７】
【表１】
2014180246.tif 000002
【００４８】
２．重鎖H5_VR（可変領域）及び重鎖X1_VR（可変領域）のラットIgG2b定常領域（constant region、以下CRと略す）への連結
図２に、重鎖H5_VR及び重鎖X1_VRのラットIgG2b定常領域への連結の方法の概略を示す。
【００４９】
１）前述のX1モノクローナル抗体RNAより合成した5'-RACE-Ready cDNAを鋳型として、X1重鎖のCRを、VR領域クローニングの際に含まれていたCR部分と重なるようにして増幅した。ラットのCR配列は既知であるので、それを参考にプライマー設計を行った（プライマー配列は図１９に示す。増幅cDNA断片を前述と同様に精製し、pTA2ベクターにクローニング後シークエンス解析を行ない、既知のラットIgG 2b配列であることを確認した（X1 HCRクローン）（図２A)。
【００５０】
２）X1 VRクローンとX1 CRクローンから、それぞれプライマー3、4、プライマー1、5を用いてcDNA断片を増幅、精製し、さらにそれらの混合物を鋳型としてプライマー3、5をもちいてPCR反応を行い、完全長ラットX1 IHC断片を得た（図２B)。
【００５１】
３）発現用ベクターへのクローニングと発現確認解析のために、プライマー6、7を用いて、5'側にSgfI siteと3'側にHis Tagを付加した断片を増幅した（図２C)。
【００５２】
４）H5 VRクローンより、プライマー8、9を用いてVR領域にラットCR配列を付加したH5 HVR cDNA断片を得た。また、２）で得られた完全長X1 IHC断片より、プライマー10、5を用いてラットIgG2b CR断片を得た（図２D)。
【００５３】
５）４）で得られたマウスH5 HVR cDNA断片とラットIgG2b CR cDNA断片の混合物を鋳型とし、プライマー8、5を用いて、マウスH5 HVR-ラットIgG2b CRのリコンビナントIHC断片をPCR増幅した（図２E)。
【００５４】
６）３）と同様に、プライマー11、7を用いて、5'側にSgfI siteと3'側にHis Tagを付加した断片を増幅した（図２F)。
【００５５】
７）組み込むベクターとして、pF4A CMV Flexi Vector （Promega、 #C8481）をSgfI/PmeI消化して精製した（SgfI/blunt endのPCR断片の挿入が可能になる。一連のPCR反応には、TOYOBO KOD Plus-ver.2 （#KOD-211、-A付加なし）を用いたので、SgfI/blunt endの挿入が可能になる）。
【００５６】
８）３）と６）で得られたcDNA断片を、sgfI酵素で消化後、７）で用意したベクターにライゲーションし、One Shot Max Efficiency DH10B T1 Phage Resistant Competent Cell（Life Technologys、 #12331-013）にトランスフォームした。
【００５７】
９）コロニーPCRで陽性クローンのスクリーニングを行い、プラスミド精製後シークエンス解析による配列確認を行った。マウスH5モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１３に示し、ラットX1モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１５に示す。また、ラットIgG2b定常領域の塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００５８】
３．軽鎖H5_VR（可変領域）及び軽鎖X1_VR（可変領域）のラットIgκ定常領域（CR）への連結
図３に、軽鎖H5_VR及び軽鎖X1_VRのラットIgκ定常領域（CR）への連結の方法の概略を示す。
【００５９】
１）重鎖同様、X1 RNAより合成した5'-RACE-Ready cDNAを鋳型として、X1軽鎖CR cDNA断片をプライマー12、13を用いてPCR増幅し、上記２．と同様にcDNA断片の精製、pTA2ベクターへのクローニング、シークエンス解析を行ない、既知のラットIgκ配列であることを確認した（X1 KCRクローン）（図３A)。
【００６０】
２）H5 KVRクローン及びX1 KVRクローンより、それぞれプライマー14、15、プライマー16、17を用いて、VR領域にラットKCR配列を付加したH5 KVR cDNA及び1 KVR cDNA断片を得た。また、１）で得られたX1 KCRクローンより、プライマー18、19を用いてラットIgK CR断片を得た（図３B)。
【００６１】
３）２）で得られたH5 KVR cDNA断片とX1 KVR cDNA断片をそれぞれラットIgK CR cDNA断片とミックスし、これらを鋳型としてプライマー14、19、プライマー16、19を用いてPCR反応にかけ、マウスH5 KVR-ラットIgK CRのリコンビナントIKCと、完全長のラットX1 IKCを増幅した（図３C)。
【００６２】
４）重鎖と同様に、プライマー20、21とプライマー22、21を用いて、それぞれマウスH5リコンビナントIKCと、完全長のラットX1 IKCの5'側にsgf I site、3'側にHis Tagを付加した（図３D)。
【００６３】
５）以降、重鎖と同様にSgfI消化、ライゲーション、トランスフォーメーション、シークエンス解析を行ない、当該クローンを得た。マウスH5モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１４に示し、ラットX1モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものの塩基配列を配列番号１６に示す。また、ラットIgκ定常領域の塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００６４】
４．FreeStyle 293F細胞における発現と解析
１）マウスH5_HVR-ラットIgG2b_CR、マウスH5_KVR-ラット IgKCR、ラットX1_IHC、ラットX1_IKCの各プラスミドを精製し、1μg/μLに調整した。
【００６５】
２）FreeStyle 293 Expression System（Life Technologies）を用いて、3mLの培養系でリコンビナントH5モノクローナル抗体、X1モノクローナル抗体を発現、分泌させ、トランスフェクションの2日後に培養上清を回収した。用いたサンプルを表２に示す。表２中、サンプル名のH5_ratCRは、マウスH5モノクローナル抗体の可変領域とラット抗体の定常領域を連結したものを示し、プラスミド名のH5_HCはマウスH5モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものを示し、H5_KCはマウスH5モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものを示す。また、サンプル名のX1_ratCRは、ラットX1モノクローナル抗体の可変領域とラット抗体の定常領域を連結したものを示し、プラスミド名のX1_HCはラットX1モノクローナル抗体の重鎖可変領域とラットIgG2b定常領域を連結したものを示し、X1_KCはラットX1モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とラットIgκ定常領域を連結したものを示す。H5_ratCRで表される抗体はマウスH5モノクローナル抗体の可変領域とラット抗体の定常領域を有する抗体であり、X1_ratCRで表される抗体はラットX1モノクローナル抗体の可変領域とラット抗体の定常領域を有する抗体である。
【００６６】
【表２】
2014180246.tif 000003
【００６７】
３）分泌された抗体の性状解析を行った。性状解析は、抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロット解析、抗HisTag抗体を用いたドット・ブロットによる濃度予測及びドット・ブロットによるイヌ、マウス、ヒトの各IgEタンパク質に対する反応性について行った。
【００６８】
産生された抗体の構造（丸は糖鎖修飾を示す）を図４に示す。
抗HisTag抗体を用いたウエスタンブロット解析による抗体産生の結果を図５に示す。抗HisTag抗体を用いたドット・ブロットによる濃度（発現量）予測の結果を図６に示す。ドット・ブロットによるイヌ、マウス、ヒトの各IgEタンパク質に対する産生抗体の反応性確認の結果を図７に示す。図７の左のパネルは、シグナルを増幅した結果を示す。産生抗体量としては、H5の可変領域を有する抗体はX1の可変領域を有する抗体より低く、コントロールタンパク質を指標に換算してみると、H5の可変領域を有する抗体は0.04μg/mL、X1の可変領域を有する抗体は0.2μg/mLであった。しかしイヌIgE抗原に対する反応性はH5の可変領域を有する抗体でのみ観察された。
【００６９】
[実施例２]  リコンビナント型抗イヌIgE抗体（H5（CCH3-5）、X1）のカイコでの発現
１.リコンビナント型抗イヌIgE抗体のpBM030ベクターへのクローニング
１）リコンビナント型抗イヌIgE抗体をカイコで発現させるために、pBM030ベクターへのクローニングを行った。ベクターのEcoRIとXbaI認識部位の間に、H5 HVR-rat IgG2b CR、X1 HVR-rat IgG2b CR、H5 KVR-rat IgK CR、及びX1 KVR-rat IgK CRを導入するために、EcoRI又はXbaIの認識配列を含むプライマー（23/24、25/24、26/24、27/24の組み合わせ）でDNA断片を増幅し、EcoRIとXbaIで切断した後にアガロースゲルで泳動し、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-up System（#A9282）で精製したものをライゲーションに用いた(図９A)。PCR反応には変異導入率の低いTaKaRaのPrimeSTARを用いた。pBM030のベクターが11kb以上と大きいため、ライゲーシヨン反応はTaKaRa DNA Ligation Kit LONG（#6024）を用いて行い、形質転換には長鎖プラスミドDNAに有効である宿主大腸菌HST08 Premiumを用いた。用いたpBM030ベクターの構造を図８に示す。
【００７０】
２）リコンビナント抗体のカイコでの発現分泌がうまくいかない場合を想定して、ポリヘドリンのシグナルペプチドを含むリコンビナント抗体発現ベクターを作製した。ベクターは日本全薬株式会社が調製したシグナルペプチドを含むpBM030ベクター（シグナル）を用いてEcoRIとXbaIの間にリコンビナント抗体に含まれるシグナルペプチドを除いたDNA断片をPCRで増幅し（プライマー；28/24、29/24、30/24、31/24の組み合わせ）クローニングを行った(図９B)。
図９にリコンビナント型抗イヌIgE抗体のpBM030ベクターへのクローニングに用いたDNAの構造を示す。
【００７１】
２．BmN細胞上清及びカイコ体液中のリコンビナント型抗イヌIgE抗体の発現量の比較及び抗体活性の評価
１）リコンビナント型抗イヌIgE H5ratCR-His抗体の発現量を調べるために、適当量に希釈したカイコ体液及びFreeStyle 293F細胞とBmN細胞の培養上清をSDS-PAGEで分離し、抗イヌIgE H5ratCR-His組換え抗体に対して抗6x His（HRP）抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い各抗体のおおまかな定量を行った。定量しやすいようにカイコ体液では還元状態での泳動も行ったが、FreeStyle細胞培養上清は量が少なく、BmN細胞培養上精は夾雑物によりH鎖のバンドが検出できないので、これらの量的な比較は非還元状態のNative型の抗体のシグナルの強さで比較した。2本のH鎖とK鎖をもつNative型はHisタグを4つ持つことになる。カイコ体液とBmN細胞上清に見られるH5ratCR-His抗体は、K鎖が余計に発現しているが、大まかな抗体量は抗体濃度として、カイコ体液で約20μg/ml、BmN細胞上清で約0.1μg/ml、FreeStyle上清では約0.02μg/mlであった。抗体発現量の測定の結果を図１０に示す。
【００７２】
H5ratCR-HisとX1ratCR-Hisについてカイコ体液に含まれる抗体量を同様にウエスタンブロットで解析した結果を図１１に示す。図１１に示すように、H5ratCR-HisとX1ratCR-Hisとで同程度の量が発現していた。なお、ポリヘドリンのシグナルペプチド付きのH5ratCR-HisとX1ratCR-Hisについて、BmN細胞の培養上清での発現は確認できなかった。
【００７３】
２）イヌIgEに対する組換え抗体活性を評価するために、段階希釈した適当量のカイコ体液及びFreeStyle 293F細胞とBmN細胞の培養上清を用いて、H5ratCR-His及びX1ratCR-HisのイヌIgEに対するELISA実験を行った。コントロールとして、段階希釈したBethyl社のヤギ抗イヌIgE抗体を用いたELISA実験を同時に行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、H5ratCR-Hisに関してはカイコ体液で2000倍希釈、FreeStyle培養上清では2倍希釈で、BmN細胞上清では20倍希釈で同程度の発色が見られた。X1ratCR-Hisに関してはカイコ体液の2倍希釈でのみ発色が見られ、H5ratCR-Hisと比べると100倍以上活性が弱かった。組換え抗体はanti-6X His（HRP）で、抗イヌIgE抗体の活性はanti-Goat IgG（HRP）で解析しているので直接の比較はできないが、200倍希釈したカイコ体液中のH5ratCR-Hisと0.1ng/μLの濃度の抗イヌ1gE抗体で同程度の発色をしており、ともに濃度は0.1ng/μLであった。
【００７４】
３）カイコ体液中に発現させた抗IgE抗体のイヌIgEに対する反応性を確認するために、50ng/well（50μL）から24pg/wellまで段階希釈したBethyl社のイヌIgEを固相化したプレートを用いたELISA実験を行った。結果を図１３に示す。図１３に示すように、H5ratCR-Hisは抗原量に応じた反応性を示したが、X1ratCR-Hisは抗原がないウェルでもバックグラウンドの値が高かった。カイコ体液の2倍希釈のサンプルでは、夾雑タンパク質の影響で非特異的な吸着があるものと考えられるが、いずれにしてもX1ratCR-HisのイヌIgEに対する親和性はH5ratCR-Hisより低かった。
【００７５】
[実施例３]  カイコ体液からの抗イヌIgE組換え抗体（H5_ratFc-HisTag）の精製（その１）
（１）HisTagとイオン交換カラムによる抗イヌIgE組換え抗体の精製
組換え抗体精製のパイロットテストとして、1 mlのカイコ体液からTALON resinのバッチ吸着によるHisTag精製を行った。カイコ体液は粘性が高いことからPBSで10倍希釈して使用し、50μl  (column vol.)のTALON resinと反応させた。10 column vol. (500μl)のPBSTで3回の洗浄を行い、4 column vol. (200μl)の250 mMイミダゾールを含むPBSTでの溶出を8回行った。
【００７６】
溶出画分（約1.6 ml）をプールし、ウエスタンブロッティングにより回収率を見積もったところ、inputの80％近くが回収されていた。銀染色により純度を確認したところ、抗体とそれより分子量の低い、夾雑タンパク質が確認された。この夾雑タンパク質は還元条件での電気泳動でも同じところに確認されたことから、分解産物ではなく材料であるカイコ体液に由来する夾雑物と考えられた。
【００７７】
最初に、この夾雑タンパク質を除くために、Protein G agaroseによる精製を検討した。しかしながら、この抗イヌIgE組換え抗体のFc領域がrat IgG2bを使用しているため、Protein Gへの結合性がそれほど高くなかった。Protein GはProtein Aに比べてrat IgG2bへの結合性は高いが、結果として、unbound画分に残存する組換え抗体が多く認められ、回収率はHisTag精製物のおおよそ25％であった。Protein Gによる精製は、回収率の観点から実用には適さないと考えられるうえ、その溶出には酸を利用することから、抗体活性に悪影響を及ぼすことも懸念された。
【００７８】
このようなことから、HisTag精製した組換え抗体にイオン交換カラムでの精製を併用し、純度の向上について検討した。精製にはHiTrap CM sepharose (1 ml)カラムを用いた。HisTag精製で得られた溶出画分おおよそ１ mlをイオン交換カラムに添加した。溶出は100 mM Na-PO4buffer (pH 6.0)を用い、100 mM-1 M NaClによる濃度勾配で行った。280 nmの吸光を指標として、タンパク質が含まれる画分を特定し、電気泳動及び銀染色による純度の確認を行った。また得られたタンパク質溶液をプール（約2.5 ml）した。さらにHisTagを利用して10倍(250μl)に濃縮し、銀染色により純度を確認した。
【００７９】
結果を図１４に示す。図１４には、1000倍希釈したカイコ体液(1μl)、HisTag精製 (1.2μl)、イオン交換精製（2μl）、HisTag再濃縮画分（2μl）非還元、還元条件で電気泳動し、銀染色を行った結果を示す。図１４中、矢印は組換え抗体を、＊はその重鎖と軽鎖を示す。図１４に示すように、濃縮したサンプルにおいて30 kDa前後の低分子領域にわずかに夾雑タンパク質が認められるが、対照として泳動したBetyl社製の抗体とほぼ遜色ない程度にまで精製することができた。ウエスタンブロッティングによりタンパク量を定量したところ1 mlのカイコ体液（約30 mgタンパク質）から、イオン交換カラムの精製後おおよそ25μgの抗体を回収した。このことから、日本全薬から提供されているカイコ体液の残り全量（約45 ml）を使用して精製を行った場合に1 mg程度の抗体が回収できると見積もられる。
【００８０】
（２）精製した抗イヌIgE組換え抗体の活性評価
精製した組換え抗体のイヌIgEに対する反応性をELISA法により調べた。50 ngのイヌIgE (Betyl社)又はBSA ELISAプレートに結合させたものに対して、イオン交換カラムに添加する前の試料を10倍と20倍に希釈したものと、イオン交換カラムの溶出画分を2〜20倍 (4.8〜0.48μg/ml)に段階希釈したものを100μl添加した。対照としてBetyl社の抗イヌIgE抗体を0.5〜0.01μg/mlになるように添加した。検出は、抗rat IgG-HRP又は抗goat IgG-HRP抗体をPBST/caseinでそれぞれ1000倍希釈し、TMBZを基質として行った。また二次抗体による非特異的反応の確認のため、一次抗体を加えていないサンプルの解析も行った。結果を図１５に示す。図１５は、ELISAプレートに抗原であるイヌIgE又はBSAをそれぞれ50 ng添加、固相化し、組換え抗体との反応性を確認した結果を示す。図１５に示すように、組換え抗体のイヌIgEに対する特異的結合を確認した。イオン交換精製後の組換え抗体は、Betyl社の抗体と比較して二次抗体は異なるもののELISAでの活性はおおよそ1/3程度であった。希釈したカイコ体液を用いた場合のELISAでの活性もまたBetyl社の1/3程度であったことから精製過程での活性消失の危険性は最小限にとどまっていると思われる。また、二次抗体による非特異的結合は認められないことも確認した。
【００８１】
まとめ
HisTagとイオン交換カラムの精製を組み合わせたことにより抗イヌIgE組換え抗体(H5_ratFc-HisTag)を、市販の抗体と同程度まで精製することができた。1 mlのカイコ体液から、最終産物として高純度に精製された抗体が25 μg程度回収された。
またBetyl社の抗体と比較して活性は1/3程度と見積もられた。
【００８２】
[実施例４]  カイコ体液からの抗イヌIgE組換え抗体（H5_ratFc-HisTag）の精製（その２）
（１）HisTagとイオン交換カラムによる抗イヌIgE組換え抗体の精製
カイコ体液からの抗イヌIgE組換え抗体の精製について、パイロットテストで検討した方法を参考に大量調製を行った。10倍希釈したカイコ体液（約 500 ml）をバッチ吸着によって2.5 mlのTALONレジンと反応させた後、ポリプロピレンカラムに流し込むことでレジンを回収した。回収したレジンに対してPBST（20 ml）で3回の洗浄を行い、4 mlの250 mMイミダゾールを含むPBSTで10回の溶出を行った。回収されたタンパク質についてSDS-PAGEを行い、銀染色によってバンドを確認したところ、これまでと同様1回目の溶出(Fr.1)で大部分が溶出されていた。
【００８３】
組換え抗体の大部分が回収されていたFr.1についてウエスタンブロッティングを行い、コントロールタンパク質のシグナル強度に基づいて濃度を見積もった結果、おおよそ200μg/ml程度と見積もられ、回収量は4 ml分で約800μgと見積もられた。
【００８４】
HisTag精製より得られたタンパク質（Fr.1）についてCM sepharoseカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製を行った。HiTrap CM sepharose (1 ml: GE社)をAKTA primeクロマトグラフィーシステムに接続し精製を行った。サンプルのカラムへの添加は2 mlのサンプルループで行ったので、１回の精製にはFr.1の約半分量である1.8 mlを使用し、２回の精製を行った。残った約400μlは後の評価用として冷蔵保存した。緩衝液としては100 mM Na-PO4buffer (pH 6.0)を使用し、100 mM-1 M  NaClによる濃度勾配で溶出を行った。280 nmの吸光を指標として電気泳動を行い、銀染色による純度の確認を行った。
【００８５】
結果を図１６に示す。図１６は、2000倍希釈したカイコ体液(1.5μl)、HisTag精製(1.5μl)、イオン交換精製（3μl）を、非還元、還元条件で電気泳動し、 銀染色を行った結果を示す。図１６中、矢印は組換え抗体を、＊はその重鎖と軽鎖を示す。濃縮したサンプルにおいて30 kDa前後の低分子領域にわずかに夾雑タンパク質が認められたが、パイロットテストで行った時と同程度の純度の組換え抗体が精製できた（図１６）。SDS-PAGEを行いウエスタンブロッティングによりコントロールタンパク質のシグナル強度に基づいて濃度を見積もった結果、おおよそ80μg/mlと推定され、全体(約7 ml)で560μg程度が回収されたと推定される。
【００８６】
（２）精製された抗イヌIgE組換え抗体のELISAアッセイによる結合評価
50 ngのイヌIgE (Betyl社)又はBSAをELISAプレートに添加し、4℃で一晩結合させた。上清を除去し、200μlのPBSTで1回洗浄後、1x casein (Vector lab.社)を含むPBSTを200μl添加し、37℃で1時間ブロッキングを行った。これを200μlのPBSTで3回洗浄後、カイコ体液(50倍及び100倍希釈)、HisTag精製物(10倍及び20倍希釈)、イオン交換精製物（5倍、10倍、20倍、50倍希釈）したものをそれぞれ100μl添加した。対照としてBetyl社の抗イヌIgE抗体を0.5μg〜10 ng/mlに調製して100μl添加した。37℃で90分反応し、200μlのPBSTで3回洗浄後、HRP標識された抗ラット又は抗ヤギ二次抗体を1000倍希釈し、100μl添加した。37℃で90分反応後、200μlのPBSTで3回洗浄しTMBZを基質としたクエン酸緩衝液を100μl添加した。室温で10〜15分反応後50μlの2N硫酸を添加し反応を停止した。450 nmの吸光測定にはMolecluar Devices社のSpectraMax M2プレートリーダーを利用した。
【００８７】
その結果を図１７−１及び１７−２に示した。図１７−１は、カイコ体液、HisTag eluate（溶出液）、イオン交換後(5〜50倍希釈まで)について検討した結果を示す。TMBZとの反応は15分行った。図１７−２は、イオン交換後の精製産物について更に希釈(20〜1000倍希釈)を進めて検討した。TMBZとの反応は10分間行った。調製した組換え抗体は50倍希釈においても高い結合活性を示した。このため、さらに希釈を進めてELISAアッセイを行った結果、1000倍希釈した場合においても有意なシグナルが確認された。また、HisTag精製物とイオン交換後のサンプルで、同程度の量のタンパク質を使用したELISAアッセイの結果、450 nmの吸光値に差が認められないことから、精製過程における活性消失は殆ど生じていないと思われる。
【００８８】
（３）保存方法に関する検討
抗体溶液の凍結融解が、抗原との反応性に与える影響について検討した。抗体溶液を少量-80℃で一晩凍結後、翌日融解し20倍又は50倍に希釈して50 ngのイヌIgE又はBSAに対してELISAアッセイを行った。対照としては4℃で保存した抗体溶液を使用した。検出はHRP標識されたrat IgG二次抗体と、TMBZを基質として用いた。ELISAアッセイはそれぞれの希釈について2セット行いTMBZとの反応は10分間行った。結果を図１８に示す。図１８は２セット行った実験の平均値を示す。図１８示すように、凍結融解を１回行った抗体の反応性について、冷蔵保存した抗体と比べ、著しい低下は認められなかった。
【００８９】
まとめ
約50 mlのカイコ体液からHisTagとイオン交換カラムを用いた精製を行い、最終的に80μg/mlの抗体溶液が7 ml調製され、約560μgの組換え抗体を得ることができた。この精製抗体のイヌIgEに対する結合活性をELISAアッセイにより評価した結果、約1000倍希釈した抗体を用いても有意なシグナルが確認された。また、凍結融解による抗体の抗原への反応性について検討した結果、凍結融解を行うことでその結合活性を大きく損ねることはなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の抗イヌIgE抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域をコードするDNAを用いて、完全抗体である抗イヌIgE抗体を作成することができる。得られた抗イヌIgE抗体は、イヌのアレルギー疾患の治療等に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１３〜１６  合成
配列番号１７〜５１  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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