(57)【要約】【課題】Sphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）が有するアルギン酸資化能を利用した、褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのピルビン酸生産方法の提供。【解決手段】アルギン酸を含む培地中でSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）を培養しアルギン酸からピルビン酸を産生させ、ピルビン酸を培地中に分泌させることを含む、ピルビン酸を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸を含む培地中でSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）を培養しアルギン酸からピルビン酸を産生させ、ピルビン酸を培地中に分泌させることを含む、ピルビン酸を製造する方法。
【請求項２】
培養開始時のアルギン酸濃度が２〜１０(w/v)％であり、培養開始時のSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）菌体量が濁度で表わした場合にA600が0.075〜1.25である、請求項１記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項３】
培地中の最大酸素溶存濃度が15％以上になる条件で培養を行う、請求項１又は２に記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項４】
培養を２〜３日行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項５】
振とう培養で、振とう数100spm以上で培養を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項６】
培養をpH6.0〜8.0で行う、請求項１〜５のいずれか1項に記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項７】
培養２日目の培地中に分泌されたピルビン酸濃度が、2.5g/l以上になる、請求項１〜６のいずれか1項に記載のピルビン酸を製造する方法。
【請求項８】
培養２〜３日目の培地中に分泌されたピルビン酸濃度が、5g/l以上になる、請求項１〜６のいずれか1項に記載のピルビン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸資化性細菌を用いたアルギン酸からピルビン酸を生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化防止の長期的対策や、世界の食料安全保障は、地球規模的な解決策が望まれている重要事項であり、2008年に行われた第34回主要国首脳会議でも議論され、声明が出された。その実現にあたっては自然エネルギーの有効活用や利用頻度の低い非食料系バイオマスの有効活用は不可欠であり、開発の重要性を纏めた報告書なども提出されている（非特許文献１）。
【０００３】
非食料系バイオマスには、大きく陸生と水生・海生の２つに分けられる。グルコースやデンプンといった陸生由来成分については、それらを基質としたエタノールや他の有用化合物の発酵生産が実用化された一方で、水生・海生のものについては、研究開発が遅れている。陸生由来の成分を利用する場合、食糧との競合問題や土地問題が避けられず、特に耕作面積が極めて狭隘な日本では無視できない問題となる。
【０００４】
それに対して、海洋国家である日本は広大な排他的経済水域を有し、そこで産出される海生バイオマスの量も莫大である。中でも大型褐藻類は藻体量の豊富さと生育速度の速さから特に有望なバイオマスである。
【０００５】
褐藻類の主成分の一つは酸性多糖アルギン酸であり、乾燥藻体の約30〜60％含まれる。その用途としてはアルギン酸自体を低分子化して精製したものを機能性素材（特許文献1）や医療用、食品用素材（特許文献2、3）として用いることなどが挙げられる。しかしそれらは活用の幅も狭く、また、使用に際して精製なども必要となる。
【０００６】
その他の用途としては、アルギン酸からバイオマスエネルギーを生産する方法として、エタノールを生産する方法が報告されている（特許文献4）。この技術はアルギン酸からバイオマスエネルギーを生成する画期的なものであり、基盤技術としての価値は高い。しかし事業収支の見込める、独立した産業となすためには、エタノールの単独生産だけではなく、同一、あるいは類似の原料や設備を用いて、エタノール以外の有用成分も併せて製造可能な技術を構築することが望ましい。
【０００７】
しかし、アルギン酸を原料として発酵法により有用化合物を生成する方法については、エタノール以外の化合物を生産する例は報告されていない。
【０００８】
ピルビン酸は、多様な化学物質や高分子合成の原料として、あるいは食品や医薬品への添加物やそれら成分として広く使用される重要な化合物である。現在、大腸菌、コリネ型細菌、および酵母などの微生物を用いたグルコースを基質とする発酵法が知られている。しかし、有望な炭素源である海生バイオマス由来のアルギン酸からのピルビン酸生産例は知られていない。
【０００９】
ピルビン酸の工業的製法としては、酒石酸の脱炭酸により得る方法等が一般的である。この製法では生成物と等モルのCO2 の生成、高温での長時間反応や硫酸塩の大量廃棄を伴うため、環境負荷が大きく、多量のエネルギーを必要とすることから、新たな製法が望まれている。
【００１０】
発酵法によるピルビン酸の生産法としては、上に記載したように、グルコースを原料としたSaccharomyces属、Candida属、Torulopsis属の微生物を利用した方法が報告されている（特許文献５〜７等）。
【００１１】
しかしグルコースの生産は食糧との競合が問題となり、さらにグルコース自体も食用を含めた様々な活用法がある。発酵法による生産はコスト高となりやすく、原料とするのであれば、未利用、あるいは利用頻度の低い資源を活用することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2000-313880号公報
【特許文献２】特許第3825069号公報
【特許文献３】特許第3505185号公報
【特許文献４】特許第4845070号公報
【特許文献５】特公昭51-34475号公報
【特許文献６】特公平3-5800号公報
【特許文献７】特公平3-58275号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】科学技術未来戦略ワークショップ  自然エネルギーの有効利用−材料からのアプローチ−微小生物を利用したバイオ燃料生産基盤技術報告書  独立行政法人科学技術振興機構  研究開発戦略センター  平成20年11月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、陸生バイオマスからではなく、利用頻度の低い海生バイオマスから、海生バイオマスに多量に含有されるアルギン酸を原料として発酵法によりピルビン酸を生産する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、利用頻度の低い海生バイオマスの中でも特に有望なものの1つである褐藻類について、その主成分；アルギン酸から、多様な化学物質や高分子合成の原料、さらには、食品及び医薬品添加物として広く活用できるピルビン酸を生産することに関する。発酵法によりアルギン酸からピルビン酸を生産する方法は、これまで開示されていない。
【００１６】
ピルビン酸は、菌株のエネルギー代謝系における中間代謝産物である。当該エネルギー代謝系は様々な代謝系と連動し、さらに生成物自体がホメオスタシスのシグナルとなる。これにより、エネルギー代謝系を含めた様々な重要代謝系が暴走しないように、厳格に制御されている。このような背景から、中間代謝産物は速やかに何らかの最終代謝産物に代謝され、通常、中間代謝物自体が長時間残存することはない。
【００１７】
中間代謝物を得る目的で何らかの手段により直前のエネルギー代謝系を遮断した場合、その中間代謝物は速やかに連動する他の代謝系で代謝される。中間代謝産物を得る目的でその後存在する複数の代謝経路を無理に止めた場合、生存に必要な代謝系が遮断されることで菌株自体が生存できなくなり、死滅する。
【００１８】
また、発酵法で何らかの有用物質を生産する方法を産業化する場合、生産された目的の有用物質を効率よく回収する方法を検討する必要がある。その目的物質が最終代謝産物であれば、多くの場合、菌体外に排出されるため、それを回収すればよい。例えば、エタノールは最終代謝産物となることから、このケースに該当する。しかしエネルギー代謝系の中間代謝物は連動する様々な代謝系で用いられるものであるため、通常、それが菌体外に排出されることはない。このような場合に目的物質を回収するためには、生産された目的物質を菌株ごと回収し、菌株を破壊して回収することになる。
【００１９】
これはすなわち、連続培養を行うことができないことを意味する。非常に生産性が悪く、さらに、その都度菌株を破砕し、目的物質を分離精製しなければならない。菌株を安定的に生育させるまでには、一定の培養期間を要することも多く、生産を安定させることは極めて難しい。安定的に生産できるか否かは、産業化を図る上では非常に大きな意味を持つ。たとえ未利用、あるいは利用度の低い資源を原料とできたとしても、生産自体が連続して行いうるものでなければ、産業としてはなりたたない。
【００２０】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、アルギン酸資化能を有するSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子を破壊し、さらに高酸素条件下で培養することで、微生物を死滅させること無く、エネルギー代謝系の中間代謝産物であるピルビン酸を菌体外に効率よく排出させうることを見出した。その結果、当該微生物を当該条件下で連続培養することで、発酵法によりアルギン酸からピルビン酸を生産し、生産したピルビン酸を菌株外に排出する菌株と、その菌株を連続培養することで、発酵法によりアルギン酸からピルビン酸を連続的に生産することを見出した。それら微生物を一定期間連続培養することで、発酵法により、連続的にアルギン酸からピルビン酸を効率よく、かつ、安定的に生産することができる。
【００２１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  アルギン酸を含む培地中でSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）を培養しアルギン酸からピルビン酸を産生させ、ピルビン酸を培地中に分泌させることを含む、ピルビン酸を製造する方法。
[２]  培養開始時のアルギン酸濃度が２〜１０（w/v)％であり、培養開始時のSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）菌体量が濁度で表わした場合にA600が0.075〜1.25である、[１]のピルビン酸を製造する方法。
[３]  培地中の最大酸素溶存濃度が15％以上になる条件で培養を行う、[１]又は[２]のピルビン酸を製造する方法。
[４]  培養を２〜３日行う、[１]〜[３]のいずれかのピルビン酸を製造する方法。
[５]  振とう培養で、振とう数100spm以上で培養を行う、[１]〜[４]のいずれかのピルビン酸を製造する方法。
[６]  培養をpH6.0〜8.0で行う、[１]〜[５]のいずれかのピルビン酸を製造する方法。
[７]  培養２日目の培地中に分泌されたピルビン酸濃度が、2.5g/l以上になる、[１]〜[６]のいずれかのピルビン酸を製造する方法。
[８]  培養２〜３日目の培地中に分泌されたピルビン酸濃度が、5g/l以上になる、[１]〜[６]のいずれかのピルビン酸を製造する方法。
【発明の効果】
【００２２】
海生由来のバイオマス、とりわけ褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのピルビン酸生産が可能となり、食糧との競合が不可避のグルコースを主体とした原料（セルロース質やデンプン質）ではなく、食糧と競合せず、且つ海域での再生産が可能でウロン酸を主体としたバイオマスを原料とした斬新なピルビン酸生産法を達成することになり、大きな社会的効果が期待される。
【００２３】
また生成物と等モルのCO2 の生成、高温での長時間反応や硫酸塩の大量廃棄といった大きな環境負荷、多量のエネルギー消費を伴わない、新たなピルビン酸生産方法を提供することができる。
【００２４】
さらに従来は難しいと考えられていた、微生物を死滅させること無く、エネルギー代謝系を効率よく遮断し、かつ、目的とする中間代謝物を菌体外に排出させる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】エタノール生産性Sphingomonas sp. A1  ldh株（MK3353株）によるアルギン酸からのエタノール生産経路を示す図である（Takeda et al. Energy Environ. Sci. 4:2575-2581 (2011). Fig. 1より転載）。
【図２】培地中ピルビン酸量のSphingomonas sp. A1  WT株と同ldh株の生育に対する影響を示す図である。各濃度のピルビン酸を含む0.8% (w/v)アルギン酸培地において24時間培養したときの各株の生育性を示す。
【図３】振とう培養の振とう数の培地中溶存酸素濃度、対照Sphingomonas sp. A1  ldh株(MK3567株)によるピルビン酸産生量、アルギン酸消費量及び同菌株増殖に対する影響を示す図である。
【図４】振とう培養の振とう数による産生化合物の差異をHPLCで分析した図である。図３における培養４日目の培養液上澄みをHPLCで分析した。
【図５】アルギン酸開始濃度のSphingomonas sp. A1  ldh株によるピルビン酸産生量、アルギン酸消費量及び同菌株増殖に対する影響ならびに同菌株によるアルギン酸の消費を示す図である。
【図６】乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子欠損のピルビン酸産生量、アルギン酸消費量、乳酸産生量及び菌株増殖に対する影響を示す図である。WT; Sphingomonas sp. A1  WT株.ldh；同ldh株。
【図７−１】開始アルギン酸濃度5〜10％の場合のSphingomonas sp. A1  ldh株の増殖を示す図である。
【図７−２】開始アルギン酸濃度2〜10％の場合のSphingomonas sp. A1  ldh株によるピルビン酸産生量を示す図である。
【図８】培養液中のpHがMK2651株のピルビン酸生産に与える影響を示す図である。
【図９】培養液のpHを6.5および7.5に制御した場合のMK2651株の培養結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、Sphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子を破壊し、原料としてアルギン酸を与え、高酸素下で連続培養することで、高度の環境負荷を与えることなく、利用頻度の低い海生バイオマスである褐藻類の多糖アルギン酸から、発酵法により、連続的、かつ、安定的にピルビン酸を生産する。
【００２７】
Sphingomonas sp. A1株は、Hisano, T. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 220, 979-982に記載されており、京都大学大学院農学研究科 村田幸作教授らにより単離されたものである。極めて厳しい栄養要求性を示し、炭素源としてアルギン酸やペクチンのようなウロン酸含有多糖を特異的に利用する（Hisano, T. et al, J. Ferment. Bioeng., 79, 538-544 (1995).）。
【００２８】
Sphingomonas sp. A1株は、ピルビン酸耐性を付与したもの（ピルビン酸耐性化又はピルビン酸寛容化されたもの）でもよい。例えば、ピルビン酸を含有する培地中で馴養培養、及び紫外線照射によりランダム変異を誘発することにより、ピルビン酸耐性株を得ることができる。本発明においては、このようにして単離した、ピルビン酸耐性株を用いればよい。また、ピルビン酸耐性化していないSphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)はある程度の濃度のピルビン酸に耐性であり、例えば、100mM、好ましくは150mMのピルビン酸に耐性である。
【００２９】
Sphingomonas sp. A1株は、アルギン酸存在下で細胞表層に体腔を形成し、アルギン酸を多糖のまま菌体内に取込み、分解するというアルギン酸資化能を有する。すなわち、Sphingomonas sp. A1株は多糖アルギン酸を体腔及びABCトランスポーターを介して細胞内へ取り込み、エンド／エキソ型アルギン酸リアーゼによって単糖まで分解する。単糖は非酵素的に開裂しケト酸になり、ケト酸代謝酵素群によってピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸（G-3-P）と変換され、その後速やかにTCAサイクルでエネルギー生産に用いられる。ごく一部はエタノールとなり、培地中に放出される。またピルビン酸、G-3-Pの一部はエタノールに変換される。
【００３０】
Sphingomonas sp. A1株の乳酸脱水素酵素を部分的に又は完全に遮断するためには、これらの物質の合成に関与する酵素をコードする遺伝子をノックアウトすればよい。遺伝子のノックアウトは公知の方法で行うことができ、例えば、相同組換えにより行うことができる。
【００３１】
さらに、ピルビン酸からの代謝経路を遮断することにより後代謝を改変してもよい。例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ反応経路を部分的に又は完全に遮断することにより、ピルビン酸がオキサロ酢酸へ変換されず、ピルビン酸はさらに高レベルで産生蓄積される。ピルビン酸カルボキシラーゼ反応経路を部分的に又は完全に遮断するためには、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をノックアウトすればよい。遺伝子のノックアウトは公知の方法で行うことができ、例えば、相同組換えにより行うことができる。
【００３２】
さらに、Sphingomonas sp. A1株が有するアルギン酸資化能を利用し、多糖アルギン酸を原料としてピルビン酸を生産する方法として、他種微生物にSphingomonas sp. A1株が有するアルギン酸資化能に関するタンパク質及び酵素をコードする遺伝子を導入し、該微生物にアルギン酸を取り込ませ、微生物体内でアルギン酸を原料にしてピルビン酸を産生させる方法が挙げられる。微生物としては、大腸菌(E.coli.)、Sphingomonas属微生物、Pseudomonas属微生物、Bacillus属微生物、Corynebacterium属微生物等が挙げられる。アルギン酸資化能に関するタンパク質及び酵素とは、アルギン酸の微生物体内への取込みに関わるタンパク質、アルギン酸を分解してα−ケト酸を生成する酵素及びケト酸からピルビン酸を形成するケト酸代謝酵素を含む。アルギン酸の微生物体内への取込みに関わるタンパク質としては、ABCトランスポーター及びアルギン酸結合タンパク質がある。
【００３３】
酵素としては、エンド型／エキソ型アルギン酸リアーゼがあり、ケト酸代謝酵素としては、NADH依存性α-ケト酸還元酵素(A1-R)、キナーゼ(A1-K)、アルドラーゼ(A1-A)を用いることができる。
【００３４】
アルギン酸取込みに関わる遺伝子及びアルギン酸の分解に関わる遺伝子群は、Sphingomonas sp. A1株ゲノム中でクラスターを形成している。ABCトランスポーターはヘテロ４量体（AlgM1-AlgM2/AlgS-AlgS） を形成しており、AlgM1、AlgM2及びAlgSをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１、２及び３に示す。アルギン酸結合タンパク質には、AlgQ1とAlgQ2が存在し、AlgQ1及びAlgQ2をコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号４及び５に示す。エンド型アルギン酸リアーゼ（Aly)は、分子内にA1-I、A1-II及びA1-IIIの3分子種を含む。エンド型アルギン酸リアーゼ（Aly)をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。エキソ型アルギン酸リアーゼ（A1-IV） をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に示す。ケト酸還元酵素（A1-R） をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【００３５】
これらの遺伝子の導入は、広宿主ベクター（IncP,IncQ,IncW型プラスミド）を用いて行うことができ、広宿主ベクターとして、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられ、pKS13、pJRD215、pUFR027等が挙げられる。それぞれの遺伝子を別々のベクターに挿入してもよいし、複数の遺伝子を１つのベクターに挿入してもよい。複数のベクターを用いる場合は、ベクター同士の不和合性に注意してベクターを選択する。微生物への組換えベクターの導入方法は、微生物にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング(tri-parental mating）法等が挙げられる。
【００３６】
微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、公知の培地にアルギン酸を添加すればよい。原料となるアルギン酸としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウムなどのアルギン酸塩、及びアルギン酸オリゴ糖を用いることができる。アルギン酸ナトリウムを用いる場合、２〜10（w/v)％、好ましくは３〜８(w/v)％、さらに好ましくは４〜７(w/v)％の濃度で添加し、アルギン酸オリゴ糖を用いる場合、5〜15 (w/v)％の濃度で添加すればよい。培養開始時のアルギン酸ナトリウム濃度が４〜５(w/v)％のとき微生物は最も良好に増殖し、ピルビン酸濃度産生量も最も高くなり、開始アルギン酸濃度が3〜8(w/v)％の範囲でピルビン酸産生について臨界的効果を奏する。また、経時的にアルギン酸をフィードしても良い。アルギン酸の定量は、例えばKnutson, C.A. et al., (1968) Anal. Biochem., 24, 470-481に記載の方法で行うことができる。
【００３７】
培養は、通気振とう培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。振とう培養とは、培養容器を振り動かし、細胞と培地とを混ぜ合わせる培養法をいい、通気攪拌培養とは、通気しながら攪拌子や攪拌翼などによって、細胞と培地とを混ぜ合わせる培養法をいう。特に本発明の方法でピルビン酸を製造するには、酸素を十分供給する必要があるので、高い振とう数(spm:strokes per min)での振とう培養が好ましい。例えば、100spm以上、好ましくは120spm以上、さらに好ましくは130spm以上、特に好ましくは140spm以上、例えば145spmでの振とう培養を行えばよい。また、酸素分圧を上げた条件で培養してもよい。あるいは、酸素ガスを通気して高酸素溶存条件下で培養してもよい。上記培養方法により、培地中に酸素が溶け込む。例えば、100spm以上、好ましくは120spm以上、さらに好ましくは130spm以上、特に好ましくは140spm以上、例えば145spmでの振とう培養により、培養開始後培地中の溶存酸素は一旦低下するが、10数時間培養後溶存酸素量が上昇し、２〜３日で約20％になり、飽和に達する。一方、100spm未満、例えば、95spmや50spmの振とう培養では、溶存酸素濃度は培養中に上昇することはない。また、あらかじめ培地に酸素を溶存させておき、溶存酸素濃度が5％以上、好ましくは10％以上、さらに好ましくは20％以上で培養を行ってもよい。少なくとも、培養中の最大溶存酸素濃度が10％以上、好ましくは15％以上になるような培養条件で行えばよく、好ましくは培養２日後に培地中溶存酸素濃度が上記値になるような条件で培養すればよい。例えば、上記の振とう数での振とう培養で行えばよい。培養温度は、20〜40℃、好ましくは28〜32℃であり、pHは、pH6.0〜9.0、好ましくはpH6.0〜8.0、さらに好ましくはpH6.5〜7.5、さらに好ましくはpH6.5〜7.2、さらに好ましくはpH6.5〜7.0、特に好ましくはpH7.0である。培養期間は、数時間〜数日間、例えば２〜４日間、好ましくは２〜３日間、さらに好ましくは２日間行う。培養１〜３日の間にピルビン酸が多く産生され、培養４日目頃からピルビン酸が資化されるようになり、減少してしまうので、長期間の培養は好ましくない。培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。具体的にはHClまたはNaOHを用いて行えばよい。pHの調整は培養期間中に定期的に、例えば、12〜24時間毎、好ましくは24時間毎に行ってもよい。あるいは、培養期間中に連続的にpHの調整を行ってもよい。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
上記の条件での培養により、菌株からピルビン酸が分泌され、培地中にピルビン酸が蓄積する。
【００３９】
培養終了後、系内に蓄積したピルビン酸は常法により、単離採取することができる。例えば、培養液から菌体を分離除去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。酸性エーテル抽出、フェニルヒドラゾン化して沈澱単離する方法などを用いることもできる。
【００４０】
以下に具体的な培養条件を示すが、一例でありこの条件には限定されず、当業者ならば適宜条件を変更して行うことができる。
培養条件
（１） 培地組成：
(i) アルギン酸培地： ２〜10(w/v)% アルギン酸ナトリウム、0.1%硫酸アンモニウム、0.1%リン酸1カリウム、0.1%リン酸2ナトリウム、0.01%酵母エキス、0.01%硫酸マグネシウム7水和物
(ii) アルギン酸オリゴ糖培地： 5〜 15% アルギン酸オリゴ糖、0.1%硫酸アンモニウム、0.1%リン酸1カリウム、0.1%リン酸2ナトリウム、0.01%酵母エキス、0.01%硫酸マグネシウ
ム7水和物
（２） pH： pH 6.0〜9.0
（３） 培養温度：28〜37℃
（４） 培養方法： 振とう培養
（５） 振とう数： 静置〜145往復/分
（６） 培養時間： １〜３日
（７） 培養スケール：300ml三角フラスコ等の容器中で100mlスケールで培養、あるいは100ml三角フラスコ等の容器中で20mlスケールで培養。
【００４１】
培養開始時の菌体量は、濁度で表わした場合にA600が0.05〜2.0、好ましくは0.075〜1.25、さらに好ましくは0.1である。培養開始時のアルギン酸濃度は、２〜10(w/v)％が好ましく、３〜８(w/v)％がさらに好ましく、４〜７(w/v)％がさらに好ましく、４〜５(w/v)％が特に好ましい。
【００４２】
上記条件で培養を行ったとき、培養開始後からアルギン酸が消費され、ピルビン酸が産生され始める。ピルビン酸産生は培養２日で最大に達し、３日目まで上昇する。４日を超えるとピルビン酸の資化が始まり、培養上清中のピルビン酸濃度は低下する。培地中の酸素濃度は、培養開始直後に菌株の消費により低下するが、振とう培養により培地中に酸素が溶け込み、培養１日後から上昇を始め、培養２日目には溶存酸素濃度は約20％になり飽和に達する。
【００４３】
上記条件で培養したときのピルビン酸産生量は、培地中に分泌されるピルビン酸濃度が最大で2.0g/l以上、好ましくは2.5g/l以上、さらに好ましくは3.0g/l以上、特に好ましくは4.0g/l以上である。この産生量は好ましくは培養２日目で達成し得る。また、培地のpHを、好ましくはpH6.0〜8.0、さらに好ましくはpH6.5〜7.5、さらに好ましくはpH6.5〜pH7.2、さらに好ましくはpH6.5〜7.0、特に好ましくはpH7.0に調整することによりさらにピルビン酸産生量を向上させることができ、培地中に分泌されるピルビン酸濃度が5.0g/l以上、さらに好ましくは5.5g/l以上、特に好ましくは6.0g/l以上になる。この産生量は好ましくは培養２〜３日目で達成し得る。
【００４４】
乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子を破壊したSphingomonas sp. A1株を固定化して酵素反応を行い、ピルビン酸を生産することもできる。微生物の固定化には、包括法、架橋法、担体結合法等がある。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。
【実施例】
【００４５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４６】
実施例１  Sphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)によるピルビン酸の生産
方法
Sphingomonas sp. A1株野生株（WT株）、同乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）、エタノール生産性Sphingomonas sp. A1 ldh株 (MK3353株：アルコール脱水素酵素(ADH)遺伝子とピルビン酸脱炭酸酵素(PDC)遺伝子をpKS13を介してldh株に導入した株)、対照Sphingomonas sp. A1  ldh株 (MK3567株： pKS13をldh株に導入した株)を使用した。MK3353株およびMK3567株使用時は、これらとプラスミドを有さない株（WT株、ldh株）とを区別するために、以下の実施例にこれらの株名（MK3353株、MK3567株）を明記した。培地は、以下のアルギン酸培地を用いた。
【００４７】
アルギン酸培地の組成は以下の通りである。0.1(w/v)% (NH4)2SO4、0.1(w/v)% KH2PO4、0.1(w/v)% Na2HPO4、0.01(w/v)% MgSO4・7H2O、0.01(w/v)%酵母エキス、及びアルギン酸ナトリウム（pH 8.0）。アルギン酸ナトリウムは、褐藻由来の分子量300kDa、M:G比3:1のもの（ナカライテスク社）を用いた。MK3353及びMK3567の培養には、20mg/lのテトラサイクリン及び25mg/lのカナマイシンを添加し、乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株）の培養には25mg/lのカナマイシンのみを添加した。また、固体培養は、0.5(w/v)％アルギン酸で寒天を1.5%加えた。固体培養で増殖させたA1株細胞を0.8(w/v)%のアルギン酸を含むアルギン酸培地に接種し、30℃で24時間145 strokes per min (spm)で振とう培養し、前培養を行った。振とう培養は、Personal Lt-10F（Taitec社）を用いて行った。本培養時は、24時間程度前培養した菌体を初期濁度(OD600)が0.1となるよう接種した。本培養は30℃で、振とう数は50、95、または145 spmとした。本培養は5% (w/v) アルギン酸MK3353株とMK3567株の培養時は100 mlの培養液を含む300 mlの三角フラスコを用い、5% (w/v)アルギン酸で行い、WT株とldh株の培養時は20 mlの培地を含む200 mlの三角フラスコを用い、0.8、2、3、4又は5% (w/v)アルギン酸で行った。培養後、20,000G、5分間、4℃で遠心分離を行い上清を得て分析を行った。ピルビン酸はピルビン酸定量キット（ロシュ）で定量した。メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社に依頼し、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析(CE-TOFMS)で行った。
【００４８】
培地中の溶存酸素濃度は、Fibox3 oxygen sensor (Presens社)及び三角フラスコの底に設置したoxygen sensor spot(Presens社)を用いて測定した。100%飽和した状態の培地中の相対酸素濃度は20％とした。このときの溶存酸素濃度は約7.5 mg/lである。
【００４９】
産生されたエタノール及びピルビン酸は、エタノールアッセイキット及びピルビン酸アッセイキット（Roche Diagnostics社）により測定した。アルギン酸濃度はカルバゾール硫酸法で測定した。
【００５０】
また、Aminex HPX-87H(300×7.8mm、Bio-Rad)及びRID-10A検出器を用いたHPLCで培養上清中の産生物を分析した。さらに、培養液をTLC glass plate silica gel 60F254(Merck)を用いたTLC（薄層クロマトグラフィー）により分析した。
【００５１】
結果
エタノール生産性Sphingomonas sp. A1 乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株（ldh株；MK3353株）、対照Sphingomonas sp. A1  ldh株（MK3567株）の培養液上澄みのメタボローム解析
エタノール生産性ldh株（MK3353株）と対照ldh株（MK3567株）を95 spmで１、２又は４日間、本培養し、培養上清に含まれる成分をメタボローム解析に供した。61の検出された化合物の中で、MK3567株の培養液上澄みに含まれるピルビン酸及び2-オキソグルタル酸の濃度は10mMを超えていた。すなわち、MK3567株の培養液上澄みに含まれるピルビン酸濃度は、１、２及び４日間の培養で、それぞれ1.2、20.2及び26.2 mM (0.11、1.78及び2.31 g/l)であった。MK3567株の培養液上澄みに含まれる2-オキソグルタル酸の濃度は、それぞれ0.09、1.6及び14.4 mM (0.01、0.23及び2.10 g/l)であった。ピルビン酸はアルギン酸代謝の中間代謝物ではあったが（図1）、ピルビン酸の培地中への分泌は予想外であった。この結果は、乳酸脱水素酵素遺伝子を欠損した株でピルビン酸を生産できることを示した。なお、Sphingomonas sp. A1  ldh株もSphingomonas sp. A1  WT株も最大で150 mM（13.2 g/l）のピルビン酸の存在下では生育阻害を受けなかった（図２）。代謝改変などにより少なくとも当該濃度のピルビン酸の生産は可能と期待された。また、エタノール生産性MK3353株はピルビン酸を培地中に分泌しなかったが（データ省略）。これは、PDCとADHの作用によりピルビン酸がエタノールの生産に消費されたからと推察された（図１）。
【００５２】
振とう培養の振とう数とピルビン酸産生量
対照Sphingomonas sp. A1  ldh株 (MK3567株)を300ml三角フラスコ中で100mlの5(w/v)％アルギン酸含有培地で4日間、50、95及び145 spmで振とう培養し、酸素濃度、ピルビン酸濃度、アルギン酸濃度及び菌株の増殖を測定した。145spmの培養では十分に通気がされ、95spmの培養では中程度、50spmではわずかに通気された。50spm及び95spmでは、酸素濃度は培養中に最低レベルを維持し、145spmの培養では酸素濃度は上昇し、20％飽和濃度となった（図3A）。図3B、3C及び3Dに、それぞれピルビン酸産生量、アルギン酸量及び菌株の増殖を示す。145spmで最大ピルビン酸濃度が得られ、95spmでは145spmより低く、50spmではピルビン酸は産生されなかった。菌株の増殖は産生されたピルビン酸濃度に相関していた。アルギン酸消費量は50spmでの培養で最も低く、95spm及び145spmの培養では同程度の消費量であった。４日間培養後の培養液上澄みをHPLCで分析したところ、ピルビン酸濃度は、145spm、95spm及び50spmの培養で、それぞれ3.33, 0.49, 及び 0 g/lであった。2-オキソグルタル酸濃度は、145spm、95spm及び50spmの培養で、それぞれ0.87, 0.14, 及び 0 g/lであり、ピルビン酸濃度より著しく少なかった（図４）。
【００５３】
アルギン酸開始濃度とピルビン酸産生量
Sphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)を100ml三角フラスコ中で20mlの0.8、2、3、4及び5(w/v)％アルギン酸含有培地で6日間、145 spmで振とう培養し、ピルビン酸濃度、アルギン酸濃度及び菌株の増殖を測定した(図5)。図5A、5B及び5Cは、それぞれピルビン酸産生量、アルギン酸量及び菌株の増殖を示す。生産性(mg/l/h)、消費アルギン酸に対するピルビン酸の産生量（g/g）及び理論的収率を得られたデータから算出した。理論的収率は100gのアルギン酸から100gのピルビン酸が生産されたときを100％とした。算出結果を表１に示す。
【００５４】
表１に示すように、0.8(w/v)％開始アルギン酸濃度では、ピルビン酸産生量は少なかったが、ピルビン酸濃度(g/l)及び生産性(mg/l/h)は5(w/v)％開始アルギン酸濃度で最大であり、消費アルギン酸に対するピルビン酸の産生量（g/g）及び理論的収率は、4(w/v)％開始アルギン酸濃度で最大であった。２日目の増殖率は、2及び3(w/v)％開始アルギン酸濃度で大きかった。図５Dは培養上清のTLC（薄層クロマトグラフィー）の結果を示す。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子破壊のピルビン酸濃度に対する影響の確認
Sphingomonas sp. A1株野生株とSphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)を5(w/v)％アルギン酸培地を用いて、145spmの振とう培養で培養し、ピルビン酸産生量を比較した。結果を図６に示す。図６A、６B、６C及び６Dは、それぞれピルビン酸産生量、アルギン酸量、乳酸量及び菌株の増殖を示す。アルギン酸消費量及び増殖は、両株で同程度であったが、ピルビン酸産生量はldh株で野生株より多かった。さらに、野生株ではピルビン酸濃度はすぐに低下した。野生株はD-乳酸を産生したが、ldh株はD-乳酸を殆ど生産しなかった（野生株とldh株ともにL-乳酸を産生しなかった）。この結果は、LDH遺伝子の欠損がピルビン酸産生を促進することを示した。
【００５７】
Sphingomonas sp. A1株によるピルビン酸の資化
図３B、図５A及び図６Aに示すように、ピルビン酸濃度が最大になった後、急減した。特に野生株で著しい。この結果は、Sphingomonas sp. A1が炭素源としてピルビン酸を用いることを示し、確かに、Sphingomonas sp. A1野生株がピルビン酸を炭素源として利用することを明らかにした。すなわち、Sphingomonas sp. A1株は、アルギン酸を利用し、ピルビン酸を分泌し、アルギン酸利用を停止した後も分泌したピルビン酸を再利用していることが示唆された。
【００５８】
実施例２  アルギン酸開始濃度とピルビン酸産生量（2〜10(w/v)％アルギン酸）
アルギン酸開始濃度を2〜10(w/v)％として、実施例１と同様の方法でSphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)の培養を行った。培養期間は、６日間であった。
【００５９】
図７−１にアルギン酸開始濃度5〜10％のときのSphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株(ldh株)の増殖を示し、図７−２にアルギン酸開始濃度2〜10％のときの産生されたピルビン酸量を示す。図７−１に示すように、菌株の増殖はアルギン酸開始濃度が５％のときに最大となり、５％を超えるとアルギン酸開始濃度が高くなるほど低下した。また、図７−２に示すように、産生ピルビン酸量はアルギン酸開始濃度が5％のときに最大となり、それより低くても、高くても低下した。アルギン酸開始濃度が2％、9％及び10％のときのピルビン酸産生量は非常に低かった。また、菌株の増殖、ピルビン酸産生量ともに、培養２〜３日で最大となった。
【００６０】
実施例３  Sphingomonas sp. A1乳酸脱水素酵素欠損株（A1Δldh）株（MK2651株）によるピルビン酸生産に対するpHの影響
方法
菌株および培地
本実施例では、実施例１および２で用いたSphingomonas属細菌A1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損ldh株（この株をMK2651株とした）を使用した。本株の培養には、アルギン酸培地を使用した。アルギン酸培地（pH7.9）の組成は、0.5、0.8および5%(w/v)アルギン酸ナトリウム[Eisenia bicyclis由来、平均110 kDa、（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）]、0.1%（w/v）(NH4)2SO4、0.1%（w/v）KH2PO4、0.1%（w/v）Na2HPO4、0.01%（w/v）MgSO4・7H2O、0.01%（w/v）yeast extract（Nacalai Tesque）とした。なお、以下では0.5、0.8、および5.0%（w/v）のアルギン酸ナトリウムを含むアルギン酸培地を各々0.5、0.8、および5.0%アルギン酸培地と表記した。固体培地の場合には寒天（Nacalai Tesque）を1.5%（w/v）となるように添加した。また、各アルギン酸培地にはカナマイシン（Km）（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）を終濃度25μg/mlとなるように添加した。
【００６１】
培養およびpH調整
前培養では、0.5%アルギン酸固体培地上で2〜3日間前々培養したMK2651株を、0.8%アルギン酸培地3mlに植菌し、振とう数145 strokes per min（spm）、30℃で約24時間振とう培養した。本培養では、前培養したMK2651株を初期濁度（A600）が0.1となるように5%アルギン酸培地20 ml（200 ml三角フラスコ）に添加し、30℃、145 spmにて振とう培養した。本培養の開始後、24時間毎に培養液のpHを5.0、6.0、6.5、7.0、7.5および8.0に調整した。pHの測定には、pHメーターF-21（Horiba, Kyoto, Japan）を使用し、pHの調整には、5N HClおよび5N NaOHを使用した。また、各培養液のサンプリングは、pH調整の前に行った。なお、特に言及しない限り、培養液のpHの測定およびpHの調整は、培養液の全量を50 mlファルコンチューブに移して行い、その後再び培養液を200 ml三角フラスコに戻して培養を続けた。なお、pHの測定操作の対照実験は以下の二通りの方法で行った。一方ではファルコンチューブに移さずに200 ml三角フラスコに入れたままの培養液にpHメーターを浸し、pHを測定した。またもう一方では、培養液をファルコンチューブに移したが、培養液にはpHメーターを浸さず、培養液のpHを測定しなかった。
【００６２】
ピルビン酸定量
サンプリングした各培養液を遠心分離（4℃、20,000 g、5分）し、得られた上澄み液中のピルビン酸濃度を、F-キット（Roche Diagnostics）を用いて測定した。なお、検量線は各測定毎に作成した。
【００６３】
結果
5%アルギン酸培地（pH7.9）中でMK2651株の培養を開始し、24時間毎に培養液のpHを5.0、6.0、7.0、および8.0に調整し、pHを制御しながら培養を続けた。また、これらの対照として、24時間毎に培養液をファルコンチューブに移してpHの測定のみを行いながら、MK2651株を培養した。図８に結果を示す。図８には、MK2651株の培養液の（A）ピルビン酸濃度、（B）濁度（A600）、および（C）pHを示す。図８中、＊はpH5.0を、●はpH6.0の結果、◆はpH7.0の結果、■はpH8.0の結果である。また、▲はpHを調整せずに培養した結果（培養液の全量をファルコンチューブに移し、pHを測定した後に、再び三角フラスコに戻した）を示す。図中には以下に示すn回の培養で得られた結果の平均値および最大値および最小値を示す（培養1〜4日目はn=2、培養5日目はn=1）。なお、各培養液のpH調整前のpHの測定値の平均値（n=1の場合には測定値）は、1日（▲：7.58、■：7.39、●：7.32、◆：7.21、■：7.35）、2日（▲：7.94、■：5.03、●：5.85、◆：6.41、■：7.53）、3日（▲：8.40、■：5.05、●：6.02、◆：6.63、■：7.99）、4日（▲：8.94、■：5.10、●：7.27、◆：8.12、■：8.31）、および5日（▲：9.20、■：5.11、●：8.07、◆：8.80、■：9.04）であった。図８に示すように、24時間毎にpH7.0に調整した系で培養3日目に最大6.0 g/lのピルビン酸が得られた。
【００６４】
次に、MK2651株の培養開始後24時間毎に、培養液のpHを6.5および7.5に調整し、pH 7.0よりもピルビン酸生産に適するかどうかを調べた。図９に結果を示す。図９には、MK2651株の培養液の（A）ピルビン酸濃度、（B）濁度（A600）、および（C）pHを示す。図９中、○はpH6.5の結果、◇はpH7.5の結果である。図中には以下に示すn回の培養で得られた結果の平均値および最大値および最小値を示す（培養1〜3日目はn=2、培養4日目はn=1）。なお、各培養液のpH調整前のpHの測定値の平均値（n=1の場合には測定値）は、1日（○：7.30、◇：7.20）、2日（○：5.93、◇：8.08）、3日（○：6.63、◇：8.20）、および4日（○：6.53、◇：7.49）であった。図９に示すように、24時間毎にpH6.5および7.5に調整した場合の培養液中のピルビン酸濃度は、pH7.0に調整した系の培養液中のピルビン酸濃度よりも小さかった。従って、MK2651株のフラスコスケールにおけるピルビン酸生産においては、24時間毎に培養液をpH7.0に調整することによって、高濃度のピルビン酸が得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の方法により、褐藻類の多糖アルギン酸からピルビン酸を産生することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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