(57)【要約】【課題】病原性細菌に対し優れた増殖抑制効果を示し、同時に動物の成長を促進する新規な生菌剤を提供すること。【解決手段】健康な鶏の盲腸より、新規乳酸菌株エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）を分離した。これらの乳酸菌株の生菌体を家畜や家禽等の動物に給与することで、サルモネラ菌等の病原細菌の動物体内での増殖を抑制し、動物の体重増加を促進することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）及びエンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を有効成分として含有する生菌剤。
【請求項２】
動物体内に存在する病原性細菌の増殖抑制剤である請求項１記載の生菌剤。
【請求項３】
前記病原性細菌がサルモネラ属菌である請求項２記載の生菌剤。
【請求項４】
動物の体重増加の促進剤である請求項１記載の生菌剤。
【請求項５】
前記動物が家禽である請求項２ないし４のいずれか１項に記載の生菌剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の生菌剤を含む飼料。
【請求項７】
エンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）及びエンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を動物に給与することを含む、該動物体内の病原性細菌の増殖を抑制する方法。
【請求項８】
エンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）及びエンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を動物に給与することを含む、該動物の体重増加を促進する方法。
【請求項９】
エンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号NITE P-1529）。
【請求項１０】
エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号NITE P-1528）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物体内での病原性細菌の増殖抑制や動物の増体重促進に有用な、新規乳酸菌株及びそれを有効成分とする生菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属菌は、飼育家禽に感染症を引き起こす病原性細菌である一方、該家禽を原材料とする食品及びその加工品等を介してヒトへと感染する食中毒の原因となる菌である。該家禽体内でのこれら細菌の増殖を抑制することにより、該家禽の健康を維持することができ、さらには該家禽の畜産加工物等を経由した食中毒発生のリスクを低下させることが可能になる。
【０００３】
動物飼育の場で一般的に用いられる方法としては、抗生物質などの抗菌性物質を飼料に配合して投与することで細菌増殖を制御する方法が挙げられる。しかしながら、抗菌性物質を用いる方法では、過剰投与による、畜産物への該抗菌性物質の残留や、耐性菌の発現などの問題が指摘され、これらに代わる病原性細菌の増殖抑制法が求められている。
【０００４】
抗菌性物質に代わる病原性細菌の増殖抑制法としては、複数の乳酸菌等を経口投与等により摂取させ、家禽体内の病原性細菌数を減少させる方法や、別の乳酸菌等を生菌剤として家畜家禽の体内に存在する病原菌の繁殖を抑える方法が知られている（特許文献１等）。
【０００５】
しかしながら、依然として家禽体内の病原性細菌に起因する種々の問題が存在しており、優れた増殖抑制能を有する生菌剤が求められている。また、同時に動物体内の病原性細菌の増殖を抑制するのみならず、該動物の健康を改善し、成長を促進する機能を兼ね備えた生菌剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-4636号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かかる状況に鑑み、本発明は、病原性細菌に対し優れた増殖抑制効果を示し、同時に動物の成長を促進する新規な生菌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、エンテロコッカス・フェカリスに属するAPU-14株及びエンテロコッカス・ムンディティに属するAPU-27株が、サルモネラ属菌等の有害細菌に対して優れた増殖抑制効果を示すこと、該菌株の生菌体を家禽に給与することで、該家禽体内に存在する病原性細菌数が減少し、該家禽の体重増加が促進されることを実験的に確認して本願発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を有効成分として含有する生菌剤を提供する。また、本発明は、上記本発明の生菌剤を含む飼料を提供する。さらに、本発明は、エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を動物に給与することを含む、該動物体内の病原細菌の増殖を抑制する方法を提供する。さらに、本発明は、エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株（受託番号：NITE P-1528）及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株（受託番号：NITE P-1529）から選択される少なくとも１種の乳酸菌株の生菌体を動物に給与することを含む、該動物の体重増加を促進する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生菌剤を家畜や家禽等の動物に給与することで、該動物体内のサルモネラ菌等の有害細菌の増殖が抑制され、これら有害細菌に起因する感染症の発生を低下させることで健康な飼育が可能となり、従って、畜産物への細菌感染を抑制することで食中毒のリスクを低減することも可能となる。さらには、動物の成長を促進することで家禽の増体や飼料要求率を改善することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株は、健康な鶏の盲腸内容物から分離されたグラム陽性の球菌であり、嫌気的条件下でホモ乳酸発酵を行なう。また、APU-14株及びAPU-27株は、遺伝学的性状として、１６ＳリボソームＲＮＡが、それぞれ配列番号１、２に示す塩基配列を部分配列として有する。これらの菌学的性質並びに配列番号１及び２に示す１６ＳリボソームＲＮＡの部分塩基配列より、これらの菌株がそれぞれエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・ムンディティに属することが同定された。なお、APU-14株、APU-27株は、１６ＳリボソームＲＮＡが、配列番号１、２に示す塩基配列を部分配列として有するが、該塩基配列は実質的にその病原性細菌に対する増殖抑制能が変化しない範囲内で、一部（好ましくは１個ないし数個）の塩基が置換、欠失又は付加等による変異を有してもよい。
【００１２】
APU-14株及びAPU-27株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにそれぞれNITE P-1528及びNITE P-1529の受託番号で寄託されている。
【００１３】
本発明の生菌剤は、エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株及びエンテロコッカス・ムンディティAPU-27株から選択される少なくとも１種の乳酸菌の生菌体を有効成分として含有する。生菌体は、給与された動物体内で生存して活動できる形態のものであればよい。例えば、菌株の培養液をそのまま、又は回収して適宜細菌数を調整したものを生菌剤として用いることができるし、あるいは、生存している菌体を乾燥させて休眠状態としたものであってもよい。
【００１４】
APU-14株、APU-27株の培養の詳細は特に限定されず、通常の乳酸菌の培養方法で培養することができる。一般的には、ペプトンや酵母エキスなどを成分とする培地を用い、温度が３０〜３７℃、ｐＨが６〜８の通性嫌気的条件下で、２４〜７２時間程度培養を行えばよい。菌体の回収は公知の方法により行なうことができ、培養液の遠心分離又はろ過などの一般的な方法により回収することができる。液体状の生菌剤として提供する場合、培養液をそのまま、あるいは回収した菌体を新鮮な培養液又は適当な緩衝液等に懸濁すればよい。菌体を乾燥させる場合の乾燥方法も公知であり、一般的には、回収された菌体を凍結乾燥、減圧乾燥、流動層乾燥などにより乾燥する方法が広く用いられる。乾燥させた菌体の菌数を調整する方法は特に限定されず、本発明の属する技術分野で公知となっている技術により可能であり、一般的に乳糖、デンプン、脱脂ヌカなどを用いて菌数を調整する方法が広く用いられる。
【００１５】
本発明の生菌剤は、上記した菌株のみからなるものであってもよいし、所望により、上記菌株の活性保持等に有用な他の成分をさらに含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の生菌剤は、直接経口投与して用いることもできるが、より簡便には、飼料又は飲水に添加して動物に給与することができる。飼料は市販されている一般的な飼料でよい。生菌剤を飼料や飲水に混合して用いる場合の使用量は、動物に対して病原性細菌（例えばサルモネラ属菌、大腸菌、クロストリジウム属菌等）の増殖抑制効果や増体重促進効果を得られる菌体数であればよく、特に限定されない。生菌剤の使用量は、飼料に添加する場合であれば飼料中菌体数として１０４〜１０９個/ｇ、例えば１０５〜１０７個/ｇ、飲水に添加する場合であれば飲水中菌体数として１０４〜１０９個/ｍL、例えば１０５〜１０７個/ｍLでよい。直接動物に経口投与する場合の使用量は、鶏であれば一羽当たり一日１０６〜１０１０個/羽、例えば１０７〜１０９個/羽でよく、鶏以外の動物に対してはこの使用量に準じて経口投与すればよい。上記した範囲で使用することで、病原性細菌の増殖抑制効果や増体重促進効果を得ることができる。
【００１７】
APU-14株及びAPU-27株の少なくともいずれか一方の生菌体を動物に給与することにより、該動物体内の病原細菌の増殖を抑制する方法、及び該動物の体重増加を促進する方法は、本発明の生菌剤を上記の通りに動物に給与させることで実施することができる。下記実施例に示すように、APU-14株及びAPU-27株は、いずれも動物体内の病原性細菌の増殖を抑制する効果及び動物の体重増加を促進する効果を兼ね備えており、本発明の生菌剤を動物に給与すれば、これら２つの効果は同時に発揮される。
【００１８】
本発明の生菌剤を給与する対象となる動物は特に限定されず、例えば牛、豚、馬、羊、山羊、ウサギ等の家畜や、鶏、アヒル、七面鳥、ウズラ、鴨、ダチョウ等の家禽、鯛、ひらめ、サザエなどの養殖魚介類、又は犬、猫、観賞用魚類などのペット類や、さらには動物園やサファリパーク等の施設で観賞用に飼育されるゾウ、キリン、ライオン等の動物等の飼料に添加することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２０】
１．エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・ムンディティ株の創製
エンテロコッカス・フェカリスAPU-14株、エンテロコッカス・ムンディティAPU-27株は、健康な鶏の盲腸から分離した。
【００２１】
分離した各菌株を、ＳＣＤブイヨン培地（組成：トリプトン１．７％、ソイペプトン０．３％、ブドウ糖０．２５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸２二カリウム０.２５％、ｐＨ７．３）中、３７℃で24時間培養した。このようにして得られた培養液を生菌剤とした（細菌数は5×108個/mL〜2×109個/mL）。
【００２２】
２．鶏での感染試験
初生ひなにAPU-14株又はAPU-27株を有効成分とする生菌剤を経口投与し（投与菌体量は2×108個/羽）、その翌日、サルモネラ・ティフィムリウム培養液を生理食塩水に懸濁し、ゾンデを用いて経口投与した。7日齢で、ひなの盲腸内容物を採取し、ＤＨＬ寒天培地を用いてサルモネラの菌数を測定した。試験は各区１０羽とし、２回反復して実施した。測定されたサルモネラ菌数を常用対数で表した結果を表１及び表２に示す。
【００２３】
【表１】
2014183751.tif 000002
【００２４】
【表２】
2014183751.tif 000003
【００２５】
表１及び表２に示す結果から、本発明に係るAPU-14株又はAPU-27株を有効成分とする生菌剤を鶏に給与することにより、該鶏の体内でのサルモネラの増殖を抑制できることが確認された。
【００２６】
３．APU-14株、APU-27株の遺伝学的性状の解析
16S/23S rRNA Sequencing In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp115- Ed.by E. Stackebrandt and M. Goodfellow (1991) John Wiley & Sons Ltd.に記載の方法に従い、APU-14株及びAPU-27株の１６ＳリボソームＲＮＡの部分塩基配列を解析した。
【００２７】
APU株の培養液からDNAを抽出して得られた染色体DNAを鋳型としたPCRによる増幅産物、又はコロニーPCR法にて得られた増幅産物を、アガロースゲルにて泳動後にゲルから精製し、配列解析用のサンプルとした。なお、PCR増幅には16S rRNA遺伝子を標的とした27f／1492rプライマーセット（表２）を使用し、PCR条件は94℃3分、94℃30秒−55℃30秒−72℃30秒を30サイクル、72℃7分、4℃∞とした。
【００２８】
配列解析は、表２のプライマーを用い、得られた配列結果を結合し修正して、APU-14株及びAPU-27株の１６ＳリボソームＲＮＡの部分塩基配列（それぞれ配列番号１及び２）を決定した。これらの部分塩基配列を用いて、NCBI BLASTにて一次検索を行った。次に、Ribosomal Database Project サイト(release 10、http://rdp.cme.msu.edu)にて、分類学的検索と標準株に対する相同性検索を行い、標準株の塩基配列を取得した。これと各APU株遺伝子とから遺伝子解析ソフトGenetyx ver.15（（株）ゼネティックス）にて相同性検索を行い、得られた相同性（identity、％）を各分離菌株の表に示した（表４及び表５）。
【００２９】
【表３】
2014183751.tif 000004
【００３０】
【表４】
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【００３１】
2014183751.tif 000006
【００３２】
グラム染色性等の菌学的性質及び同定された16SリボソームRNAの部分塩基配列により、APU-14株はエンテロコッカス・フェカリスに、APU-27株はエンテロコッカス・ムンディティに分類されることが明らかとなった。
【配列表】
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