(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡに損傷を引き起こす作用を有する放射線治療及び現在使用されるほとんどの癌の化学療法薬とは異なる、正常な表皮基底層及び毛包の未分化細胞を含む正常な組織細胞を維持しながら、腫瘍細胞のアポトーシスを阻害するためにヘッジホッグ／スムーズンドシグナル信号伝達経路を使用する腫瘍を治療するための製薬組成物の提供。【解決手段】基底細胞癌（ＢＣＣ）の局所治療における、下記式のステロイドアルカロイドであるシクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。2014028835.tif 000004シクロパミンはユリ科のベラトラム  カリフォルニカム等の精製により取得される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底細胞癌の局所治療における、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン
塩の使用方法。
【請求項２】
基底細胞癌の局所治療に使用するために、シクロパミン、又は医学的に許容可能な化合
物を製造するためのシクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項３】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療における、シクロパミン、又
は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項４】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に使用のための医学的に許容
可能な化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩
の使用方法。
【請求項５】
基底細胞癌の局所治療における、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、
又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項６】
基底細胞癌の局所治療に使用のための、医学的に許容可能な化合物を製造するための、
シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法
。
【請求項７】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による、基底細胞癌の治療における、シクロパミン、
医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項８】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に使用のための医学的に許容
可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又
はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項９】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／
ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、シクロパミン、又は
医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項１０】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／
ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、医学的に許容可能な
化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用
方法。
【請求項１１】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／
ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、シクロパミン、医学
的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項１２】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／
ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、医学的に許容可能な
化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシク
ロパミン誘導体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常な表皮基底層及び毛包の未分化細胞を含む、正常な組織細胞を維持しな
がら、腫瘍細胞の分化、及びこれと同時にアポトーシス及びこれらの腫瘍細胞の除去を生
じることによって治療効果を達成するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの基底細胞癌（ＢＣＣ）へ
のシクロパミンの使用に関する。シクロパミンによりアポトーシスを引き起こすことは、
非遺伝毒性の機構によるものであり、従って、ＤＮＡに損傷を引き起こす作用を有する放
射線治療及び、現在使用されるほとんどの癌の化学療法薬とは異なっている。従来の癌の
化学療法薬により達成されなかった、これらの新規の効果により、癌治療に、さらにＢＣ
Ｃと、増殖の防止のため、及びアポトーシスのためのヘッジホッグ／スムーズンドシグナ
ル信号伝達経路を使用する他の腫瘍との治療において、シクロパミンの使用が、非常に望
ましいものとなった。
【背景技術】
【０００２】
基底細胞癌は、一般的な上皮腫瘍である。発病率は、加齢により上昇する。現在のＢＣ
Ｃの治療は、正常組織の縁と共に腫瘍を外科的に削除することと、手術の実現可能性がな
いか、又は望ましくない場合における、電離放射線又は他の手段による、腫瘍細胞の破壊
とを含む。潜在的な副作用として、傷及び美感を損なうことがあるが、腫瘍細胞を残さな
い外科的切除は、回復を実現する。放射線治療は、回復不可能なほどの大量のＤＮＡの損
傷を起こし、次に、腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにより、作用する。放射線
治療の作用の形態、すなわちＤＮＡの損傷に続く、アポトーシスは、癌治療に現在使用さ
れている多くの化学療法剤と同様である。しかし、放射線治療、及び細胞障害性の癌の化
学治療は、腫瘍細胞に加えて、患者の正常細胞内のＤＮＡ損傷を生じる可能性を有する。
その結果、癌治療におけるそれらの有効性及び実用性は著しく限定される。さらに、放射
線及び遺伝毒性癌の化学療法の使用に伴うジレンマとして、最初の腫瘍の治療が実現でき
たとしても、最初の腫瘍の治療中に被ったＤＮＡの損傷及び生じた変異により、患者の新
規癌の発生リスクが著しく上昇していくという、不安な要因がある。従って、非遺伝毒性
手段により、選択的に腫瘍細胞にアポトーシスを起こすことは、癌治療の分野において、
最適であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＢＣＣはしばしば、発生中に組織のパターニングに影響を与えることにより、最初に同
定されたヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質に対する受容体として作用する、
膜貫通型のタンパク質をエンコードするパッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）遺伝子の非活性変異
を示している。ヘッジホッグによってリガンドされない場合、パッチドタンパク質は、他
の膜貫通タンパク質スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）による細胞内情報伝達を抑制
するように作用する。ヘッジホッグとパッチドの結合は、この抑制の緩和を生じる。スム
ーズンドによって緩和された細胞内情報伝達は、次に、ヘッジホッグ標的遺伝子の発現、
及び細胞内の役割の変性を最終的に生じる一連の細胞内の事象を開始する。ヘッジホッグ
／スムーズンド経路の情報伝達の一般的な形態は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ）で同定され、ショウジョウバエからヒトまで多様な生体組織へ受け継がれている。
しかし、経路は、より進化した組織では、より複雑である（ヒトにおいては、ショウジョ
ウバエの単一パッチド遺伝子に非常に類似を示す一つ以上の遺伝子が存在する等）。パッ
チドの非活性変異は、ヘッジホッグ／スムーズンド経路を経由する構造的な（リガンドな
しの）信号伝達を生じることが見出された。ヘッジホッグ／スムーズンド経路の過活性は
、パッチド及び／又は更に下流の経路の要素の変異により生じ、全てのＢＣＣ内で見出さ
れる。母斑性基底細胞癌症候群（ＮＢＣＣＳ）は、パッチドのハプロ不全により生じる。
ＮＢＣＣＳの患者は、全ての細胞が既に変異パッチドのため、老化するにつれ、複数のＢ
ＣＣを発生させる。
【０００４】
ステロイドアルカロイドである、シクロパミンは、以下に示す化学式である。
【０００５】
【化１】
2014028835.tif 000002
シクロパミンは、ユリ科のベラトラム  カリフォルニカム（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）により見出され、ベラトラム  カリフォルニカム及び他のソースか
ら精製により取得され得る。シクロパミンによるヘッジホッグ／スムーズンド経路の抑制
は、鶏の胚及びマウスの培養細胞により見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、基底細胞癌の局所治療における
、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法を提供する。
請求項２に記載の発明は、基底細胞癌の局所治療に使用するために、シクロパミン、又
は医学的に許容可能な化合物を製造するためのシクロパミン、又は医学的に許容可能なシ
クロパミン塩の使用方法を提供する。
【０００７】
請求項３に記載の発明は、腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に
おける、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法を提供する。
請求項４に記載の発明は、腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に
使用のための医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に
許容可能なシクロパミン塩の使用方法を提供する。
【０００８】
請求項５に記載の発明は、基底細胞癌の局所治療における、シクロパミン、医学的に許
容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法を提供する。
請求項６に記載の発明は、基底細胞癌の局所治療に使用のための、医学的に許容可能な
化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシク
ロパミン誘導体の使用方法を提供する。
【０００９】
請求項７に記載の発明は、腫瘍内注射を含む、非局所的手段による、基底細胞癌の治療
における、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体
の使用方法を提供する。
【００１０】
請求項８に記載の発明は、腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に
使用のための医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容
可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法を提供する。
【００１１】
請求項９に記載の発明は、増殖の防止、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化のための、ヘッジホッグ／スムーズンド信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法を提供する。
【００１２】
請求項１０に記載の発明は、増殖の防止、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化のための、ヘッジホッグ／スムーズンド信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシ
クロパミン塩の使用方法を提供する。
【００１３】
請求項１１に記載の発明は、増殖の防止、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化のための、ヘッジホッグ／スムーズンド信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、
シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法
を提供する。
【００１４】
請求項１２に記載の発明は、増殖の防止、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化のための、ヘッジホッグ／スムーズンド信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、
医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロ
パミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法を提供する。
【００１５】
局所適用のため、シクロパミンは、エタノール又は、他の適した溶剤、及び適したもと
となる（ベース）クリーム、軟膏、又はゲルの混合物により溶解され得る。シクロパミン
は、ハイドロゲル、又は放出制御可能な医学的に適用可能な形態により取り込まれ得、且
つ皮膚班において吸収され得る。図１Ａ〜図１Ｄ、図２Ａ〜図２Ｆ、図３Ａ〜図３Ｇ、図
４Ａ〜図４Ｄに示される効果は、クリーム内に最終濃度が１８ｍＭのシクロパミンを得る
ために、エタノール内のシクロパミンの溶液をベースクリームと混合することにより取得
されたクリーム調合液により得られてきた。使用したベースクリームは、重パラフィンオ
イル（１０重量％）、ワセリン（１０重量％）、ステアリルアルコール（８重量％）、ポ
リオキシルステアレス−４０（３重量％）及び水（６８重量％）から主に製造されるが、
他の適切に調合したベースクリームがさらに可能である。最適な投薬量として医学的に適
用可能な形態のシクロパミンの最適な濃度及び投与のスケジュールは、特定の医学的に適
用可能な形態、局在化、腫瘍を含む皮膚の特性（表皮の厚さ等）、及び腫瘍の大きさ等の
因子により、明らかに影響を受け得る。しかしこれは、周知の公開された最適化の方法に
従って、判定され得る。図１Ａ（鼻唇溝上のＢＣＣ、表面に約４×５ｍｍ）及び図１Ｃ（
額のＢＣＣ、表面に約４×４ｍｍ）に示される腫瘍に従った、投薬量及び投与のスケジュ
ールは、以下の通りである。１０±２μｌのクリームが、約午前９時から開始して、約３
時間半の間隔で一日に４回、鉄へらを使用して、ＢＣＣ上に直接塗布された。睡眠中に患
者の皮膚からシーツへ、クリームを失う可能性のために避けられた、夜間の塗布は、適切
な皮膚班に対して実施され得る。本発明に記載された、シクロパミンへの露出による、正
常な上皮細胞及び毛包細胞の未分化細胞の維持は、水溶液を直接腫瘍内に注射、水溶液又
は、リポソームに取り込まれたシクロパミンの全身投与等の他の可能な投薬形態により耐
容投薬量についての情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】治療前の、左鼻唇溝に位置するＢＣＣ。
【図１Ｂ】局所シクロパミン治療が５日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図１Ｃ】治療前の、額に位置するＢＣＣ。
【図１Ｄ】局所シクロパミン治療が６日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図２Ａ】残留腫瘍細胞が無いことを示す腫瘍細胞小隗が消失した位置に対応する真皮内の大きな嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｂ】シクロパミン治療前はＢＣＣを含んでいるが、治療後はＢＣＣを含まなくなった他の表皮領域内の同様な嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｃ】残留細胞と、細胞の間の多数の小型の嚢胞が結合することによる大型の嚢胞の形成とを示す図１ＤのＢＣＣ領域の低出力画像（倍率１００倍）。
【図２Ｄ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｅ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの周辺領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｆ】腫瘍の典型的な腫瘍細胞、及びアポトーシスが無い偽薬治療後のＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図３Ａ】シクロパミン治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が染色されないことを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｂ】図３Ａと対照的に、偽薬治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が非常に強く染色されていることを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｃ】ＢＣＣ細胞、又は正常皮膚の基質層細胞を通常、標識しないが、分化後の上層細胞を標識するこのレクチンにより検出される工程までずっと同一のＢＣＣ細胞の分化を示す、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型を使用したシクロパミン治療後のＢＣＣの残留細胞の異質の標識を示している免疫組織化学解析（倍率１０００倍）。
【図３Ｄ】シクロパミン治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現の減少を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｅ】図３Ｄと比較して、偽薬治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｆ】シクロパミン治療後により観察される、腫瘍細胞の増殖の停止に関すると公知の形態である、基質からのＢＣＣの一貫した収縮を示している免疫組織化学解析（矢印は収縮を示す）（倍率１００倍）。
【図３Ｇ】偽薬治療後により、収縮が観察されないことを示している免疫組織化学解析（基質からの収縮に関してシクロパミン治療後のＢＣＣと偽薬治療後のＢＣＣの違いは、更に３Ｄ、２Ｃ対３Ｂ、３Ｅにおいても観察される）（倍率１００倍）。
【図４Ａ】シクロパミン治療後の表皮の基底層細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識（倍率４００倍）。
【図４Ｂ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｃ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｄ】Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用した正常標識を示しているシクロパミン治療後の毛包の高出力画像（倍率１０００倍）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、シクロパミンへの露出によりＢＣＣの急速な
臨床的退行を示している。シクロパミンの露出の一週間以内の幾つかの腫瘍領域の視覚的
な消失の他に、図１Ｂと図１Ａ、図１Ｄと図１Ｃの比較により見られるように、典型的な
半透明の外観が失われる。
【００１８】
図２Ａ〜図２Ｆは、シクロパミンの投与から５、６日目の正常組織縁と共に外科削除の
対象となった、腫瘍領域の顕微鏡による外観を示し、ＢＣＣが、ほとんどの前治療領域で
消失されるが、ほんの一部の領域で、高さの著しい減少はあるが、完全には未だ消失して
おらず、従って、顕微鏡観察の対象の残留腫瘍細胞を有している。
【００１９】
図２Ａ及び図２Ｂは、組織切片上で、視覚的に消失した腫瘍の小結節に対応した皮膚領
域を示している。腫瘍は、非常に少量の物質の内部と、検出不可能な腫瘍細胞とを含む嚢
胞性の構造を残して、消失したように観察され得る。
【００２０】
図２Ｃは、ｉｎＶｉｖｏにおいて、依然として可視的なＢＣＣが含まれる皮膚領域の顕
微鏡の外観を示している。これらの領域は、腫瘍の中心内の巨大な嚢胞を示す残留ＢＣＣ
、及び外周に向かう、様々な大きさにより、残留ＢＣＣ細胞の間に位置した小さな嚢胞構
造が含まれることが観察される。
【００２１】
図２Ｄ及び図２Ｅは、残留ＢＣＣの、内部と柵状化した周囲の領域の１０００倍の外観
を示し、腫瘍領域には関係なく、残留ＢＣＣ細胞の間の大規模なアポトーシス活性の存在
を示している。高倍率は、アポトーシスの形態、及び、図２Ｄにおいて実証されたように
、アポトーシス性の中隔細胞の除去により、三つの小さな嚢胞が、大きな嚢胞に近接結合
する、細胞のアポトーシス性の除去による、嚢胞構造の形成を示すＢＣＣ細胞の非常に増
加した頻度を示している。
【００２２】
図２Ｆは、偽薬のクリーム（即ち、偽薬中に、シクロパミンが存在しないことを除けば
、シクロパミンクリームと同一の調合のクリーム）による治療後のＢＣＣを示し、対照的
に、腫瘍性ＢＣＣ細胞とアポトーシス活性が検出されないことを示している。
【００２３】
アポトーシスとなった細胞はマクロファージ、及び正常組織内の近隣の細胞により除去
されることが公知であり、ヘマトキシリン  エオジン染色済みの切片上の形態学的な基準
によるアポトーシス活性の定量は、過小評価を提供することが公知である。それにも関わ
らす、表１に示される定量データは、残留ＢＣＣ細胞間にシクロパミンにより生じたアポ
トーシス活性の著しい上昇を示している。
【００２４】
シクロパミン治療されたＢＣＣ内の透過性の喪失は、シクロパミンの影響による、興味
深いＢＣＣの分化の可能性を上昇する。ＢＣＣの免疫組織化学分析によって検査され得る
、この可能性は、本発明の事例において、見出せられ得る。正常な表皮では、基底層細胞
から上皮層細胞への分化は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４モノクローナル抗体を使用した標識の喪失に
付随して実現される。さらに、Ｂｅｒ−Ｅｐ４はＢＣＣ細胞を標識し、それらの新生物に
対するマーカとして公知である。図３Ａ、図３Ｂ、及びテーブル１の定量データは、Ｂｅ
ｒ−Ｅｐ４が、偽薬治療後の全ての周縁柵状細胞と、ＢＣＣの内部細胞の９０％以上を強
力に標識するが、シクロパミン治療後の残留周辺細胞、又は内部細胞が、Ｂｅｒ−Ｅｐ４
により、標識されないことを示している。シクロパミンの影響によるＢＣＣの分化は、今
まで他の手段は知られておらず、免疫組織化学の基準によるｉｎ  Ｖｉｔｒｏ及び全ての
細胞で実現するため、非常に例外的な、癌の治療の独立した価値を有する。
【００２５】
他の分化のマーカ、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型は、ＢＣＣ又は正常表
皮の基底層細胞を通常標識しないが、分化後の上層細胞を標識する。図３Ｃは、レクチン
を使用して、シクロパミン治療後のＢＣＣの残留細胞の異質の標識を示し、Ｂｅｒ−Ｅｐ
４により検出される分化の工程から、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型により
検出される工程までずっと、ＢＣＣ細胞の分化の一部を示している。
【００２６】
Ｐ５３は、ＤＮＡ損傷に対する細胞の反応の主要な調整因子である。このタンパク質の
量は、遺伝子毒性剤への細胞の露出により細胞核内に増加することが公知である。ＤＮＡ
損傷が、閾値を越えて増加した場合、ｐ５３は細胞にアポトーシス性の死を引き起こす。
現在一般的に公知のガンの放射線治療、及び遺伝子毒性の癌の化学療法は、この機構によ
り、即ち、ＤＮＡの損傷により生じるアポトーシスを引き起こすことにより、大部分が作
用する。モノクローナル抗体ＤＯ−７は、正常形態及びミスセンス変異形態（非機能的な
）のｐ５３の双方に結合し得、ＤＮＡ損傷剤に露出した細胞内のｐ５３の増加を検出する
能力を有することが公知である。
【００２７】
図３Ｄ、図３Ｅ及びテーブル１の定量データは、ＤＯ−７標識強度、及び標識細胞の頻
度が、偽薬治療後のＢＣＣと比較して、シクロパミン治療後のＢＣＣでは顕著に減少され
ていることを示している。従って、シクロパミンは、シクロパミン治療後のＢＣＣ細胞の
核内のｐ５３を増加させないだけではなく、むしろ減少を生じさせる。ｐ５３の発現が、
分化による表皮細胞の減少であると公知であるため、シクロパミン治療後のＢＣＣのＤＯ
−７標識の減少は、ＢＣＣ細胞のシクロパミン−誘発分化のために生じる可能性が高い。
いかなる場合においても、ｐ５３の発現の顕著な減少にも関わらず、シクロパミン治療後
のＢＣＣの大量のアポトーシス活性は、シクロパミン−誘発した腫瘍細胞のアポトーシス
が非遺伝毒性によるものであることを意味する。
【００２８】
ＢＣＣの増殖の停止は、基質からの収縮に関連することが公知である。基質からの収縮
が、不適切な固定及び組織の処理により人工的に生じ得るが、公知の技術的な詳細の遵守
は、このような影響の回避を保証する。図３Ｆ及び図３Ｇに示すように、偽薬治療ではな
いが、シクロパミン治療後のＢＣＣでは、一貫して基質から収縮される。従って、シクロ
パミンへのＢＣＣの露出は、さらに、増殖の停止に関連することは明白である。
【００２９】
図４Ａ〜図４Ｄは、シクロパミン治療後のＢＣＣ上及び周囲に見出される通常の皮膚組
織のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示している。シクロパミンを使用して治療した、異なる表皮領
域が、図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示されることにより、Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用して標
識した通常のパターン、即ち基底層細胞の標識を表示する。同様に図４Ｄは、シクロパミ
ンに露出した毛包に対する通常のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示している。従って、通常表皮及
び毛包の未分化細胞は、ＢＣＣと同様の、同一のスケジュール及び量のシクロパミンに露
出されるにもかかわらず、維持される。
【００３０】
未分化組織細胞を維持する量において、シクロパミンによるｉｎ  Ｖｉｖｏの腫瘍細胞
の高効率の分化、及びアポトーシスの発生は、非遺伝子毒性のシクロパミンの作用とあわ
せて、ＢＣＣだけでなく、増殖の抑制と、アポトーシスの及び／又は、分化にヘッジホ
ッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路を利用する、他の内部の腫瘍へのシクロパミンの使用を
支持する、従来未知の功績である。
【００３１】
【表１】
2014028835.tif 000003
図１Ａ〜図１Ｄは、一週間未満の期間内で、消失した腫瘍領域（矢印で示される）、皮
膚の表面から高さの顕著な減少及び、透光性の消失によって示されるように、シクロパミ
ン治療後のＢＣＣの急速な退行の顕微鏡外観である。
【００３２】
図２Ａ〜図２Ｆは、シクロパミン誘引の大量のアポトーシス、及び腫瘍細胞の除去、及
び腫瘍細胞が無い嚢胞空間を残した腫瘍小塊の消失を示す、シクロパミン治療後のＢＣＣ
、及び偽薬治療後のＢＣＣの顕微鏡の外観である。通常組織の縁と共に、ＢＣＣの前治療
の位置に対応する皮膚領域が、シクロパミンの露出の５日目及び６日目に、外科的削除さ
れ、及び従来法による固定の対象とされ、切開削除、顕微鏡解析のためにヘマトキシリン
エオジン染色したものである。
【００３３】
図３Ａ〜図３Ｇは、シクロパミンに露出に付随した、シクロパミンの影響と、ＢＣＣ内
のｐ５３発現の減少により、全ての残留ＢＣＣ細胞の分化を示すシクロパミン治療、及び
偽薬治療後のＢＣＣの免疫組織化学解析である。全ての免疫組織化学標識は、ビオチン標
識の二次抗体と結合したストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼを使用した。
【００３４】
図３Ａ及び図３Ｂは、シクロパミン治療後のＢＣＣ内の全ての残留細胞が、Ｂｅｒ−Ｅ
ｐ４により、検出される工程に向けて、又は工程を越えて分化されることを示している。
Ｂｅｒ−Ｅｐ４は、正常の表皮基底層、及び毛包の未分化細胞と同様に、ＢＣＣ細胞を染
色するが、正常表皮の分化後の上層細胞は染色しない、公知の分化マーカである。
【００３５】
図３Ｄ及び図３Ｅでの、ｐ５３の発現は、表皮基底細胞の分化、及び培養後のケラチノ
サイトの分化を減少することが公知である。細胞が遺伝毒性剤に露出された場合に、ＤＯ
−７で検出可能なｐ５３の量が細胞内で増加することは周知である。
【００３６】
図３Ｆ及び図３Ｇで示された切片は、過ヨウ素酸シッフ、及びアルシアンブルーを使用
して染色された。
図４Ａ〜図４Ｄは、ＢＣＣと同じように、シクロパミンの同一のスケジュール及び投薬
量に露出したにもかかわらず、正常の表皮及び毛包の未分化細胞が維持されることを示し
ている。免疫組織化学検出の手順は、図３Ａ，図３Ｂと同様であり、標識は茶色で示され
る。
【００３７】
免疫組織化学のデータ及び知見が、グレースケールよりカラーの方が最適に伝達し得る
ため、１２ページと同一の図のカラープリント（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ，図１Ｄ、図２
Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ，図２Ｅ，図２Ｆ、図３Ａ，図３Ｂ，図３Ｃ，図３Ｄ，図３Ｅ，図３
Ｆ，図３Ｇ，図４Ａ，図４Ｂ，図４Ｃ，図４Ｄ）を、１２ａページとして加えた。出願人
は、特許庁によりこの事実を考慮され及び、１２ａページを特許出願の一部として扱われ
ることを要求する。しかしながら、ページ１２ａは、特許庁により必要であるとみなされ
た場合、本特許出願より除去され得る。
【図１Ａ】
2014028835.tif 000005
【図１Ｂ】
2014028835.tif 000006
【図１Ｃ】
2014028835.tif 000007
【図１Ｄ】
2014028835.tif 000008
【図２Ａ】
2014028835.tif 000009
【図２Ｂ】
2014028835.tif 000010
【図２Ｃ】
2014028835.tif 000011
【図２Ｄ】
2014028835.tif 000012
【図２Ｅ】
2014028835.tif 000013
【図２Ｆ】
2014028835.tif 000014
【図３Ａ】
2014028835.tif 000015
【図３Ｂ】
2014028835.tif 000016
【図３Ｃ】
2014028835.tif 000017
【図３Ｄ】
2014028835.tif 000018
【図３Ｅ】
2014028835.tif 000019
【図３Ｆ】
2014028835.tif 000020
【図３Ｇ】
2014028835.tif 000021
【図４Ａ】
2014028835.tif 000022
【図４Ｂ】
2014028835.tif 000023
【図４Ｃ】
2014028835.tif 000024
【図４Ｄ】
2014028835.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月18日(2013.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロパミンまたはヘッジホッグ／スムーズンドシグナル伝達を選択的に抑制する他の分子を含む、癌細胞のアポトーシスの抑制にヘッジホッグ／スムーズンドシグナル伝達が利用されるヒトの癌を治療するための医薬品であって、シクロパミンまたは前記他の分子は、前記ヒトの癌細胞のアポトーシスを誘導し、前記癌のサイズを縮小させるか消失させる投薬に十分な量である、医薬品。
【請求項２】
モノクローナル抗体Ber-EP4でラベル化されることにより特定される前記ヒトの正常細胞が、前記投薬により保持される、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
前記他の分子がシクロパミンの誘導体である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
ヘッジホッグ／スムーズンドシグナル伝達は、癌細胞の分化の抑制にも利用され、前記投薬は分化を誘導する、請求項１に記載の医薬品。
【請求項５】
前記投薬によるアポトーシスの誘導は非遺伝毒性である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項６】
前記医薬品は局所投与用または全身投与用または癌内投与用である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項７】
前記医薬品が、制御放出可能な医薬品剤型またはリポソーム製剤である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項８】
前記医薬品が、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ハイドロゲル剤または皮膚パッチの形態である、請求項１に記載の医薬品。