(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品（特に、抗体医薬品）の評価試験を有効に行える透明ゼブラフィッシュの作製方法、及び当該方法によって作製されたゼブラフィッシュを使用した生体イメージング評価法を提供する。【解決手段】縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１と、皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２とを交配することにより得られたことを特徴とする縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの作製方法、および前記方法によって作製されたゼブラフィッシュに対して、（１）異種癌細胞を移植する移植工程、（２）前記癌細胞に対する抗体を前記ゼブラフィッシュの体内に投与する投与工程、（３）前記移植工程と前記投与工程の後にゼブラフィッシュ体内の蛍光を観察する観察工程を備えたことを特徴とする生体イメージング評価法。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１と、皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２とを交配することにより得られたことを特徴とする縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの作製方法。
【請求項２】
請求項１によって得られた縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの系統を一方の親系統とし、適当な組織特異的に蛍光タンパク質を発現しているゼブラフィッシュの系統を他方の親系統として、これらを交配することで、前記組織特異的に蛍光タンパク質を発現すると共に、縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの系統を作製することを特徴とするゼブラフィッシュの作製方法。
【請求項３】
前記適当な組織とは、筋肉系、神経系、血管系、造血・リンパ系、呼吸器系、消化器系、その他の内臓、内分泌系、皮膚、視細胞からなる群から選択される少なくとも一つのものであることを特徴とする請求項２に記載のゼブラフィッシュの作製方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の作製方法によって作成されたゼブラフィッシュに対して、（１）異種癌細胞を移植する移植工程、（２）前記癌細胞に対する被験物質を前記ゼブラフィッシュの体内に投与する投与工程、（３）前記移植工程と前記投与工程の後にゼブラフィッシュ体内の蛍光を観察する観察工程を備えたことを特徴とする生体イメージング評価法。
【請求項５】
前記被験物質は、前記癌細胞を認識する抗体であることを特徴とする請求項４に記載の生体イメージング評価法。
【請求項６】
（４）前記投与工程の後であって、前記観察工程の前に、前記抗体を認識すると共に蛍光物質または発光を引き起こす発光物質を備えた第２の抗体を投与する第２投与工程を備えたことを特徴とする請求項５に記載の生体イメージング評価法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明ゼブラフィッシュの作製方法、及び当該方法によって作製されたゼブラフィッシュを用いた生体イメージング評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の増殖や遠隔転移を評価する方法として、免疫不全マウスやラットにヒト由来癌細胞を移植し、２〜６ヶ月の試験期間にて被験化合物の投与を行いながら、造影ＣＴや生体イメージング技術を併用するという方法が知られている。
一方、抗体医薬品について、臨床開発が急激に成功しており、世界における市場規模は２０１３年には５兆３９００億円程度とされており、今後も更に増加すると予想されている。しかしながら、現時点ではいくつかの問題があり、今後の抗体医薬品を開発する際の大きなボトルネックとなっている。中でも最大の問題は、バリデートされた創薬ターゲットの枯渇状況である。すなわち、各種の癌細胞において、選択的に発現が上昇している遺伝子は多数報告されているものの、これらが臨床的に有効な創薬ターゲットに成るか否かを判定するために、免疫不全マウスやラットを使用しなければならなかった（非特許文献１）。しかし、この方法では、検出力の問題や膨大な時間、コストの負担が著しいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Screening of specific binding peptide targeting blood vessel of human esophageal cancer in vivo in mice, Chin Med J (Engl). 124: 581-5, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、医薬品（特に、抗体医薬品）の評価試験を有効に行える透明ゼブラフィッシュの作製方法、及び当該方法によって作製されたゼブラフィッシュを使用した生体イメージング評価法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、生体イメージングの評価を有効に実施可能なゼブラフィッシュの作製を試みた結果、縞模様がなく、かつ透明なゼブラフィッシュの系統を作り出し、このゼブラフィッシュを用いれば明瞭な生体イメージング評価法を実施できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、第１の発明に係る縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの作製方法は、縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１と、皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２とを交配することにより得られたことを特徴とする。
ゼブラフィッシュには縞模様があるために、単に透明なゼブラフィッシュの系統を作製しただけでは、縞模様が観察の邪魔をしてしまい、正確な生体イメージング評価を行うことが困難であることが、本発明者の研究により分かった。そこで、本発明者は、縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１と、皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２とを交配することで、縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの系統を作製することに成功した。
本発明者は、長期間に渡って、多数のゼブラフィッシュの育種・増殖を行っている。ゼブラフィッシュは、自然発生的に所定の確率で突然変異体を発生する。そのような突然変異体を系統化したものを親系統１として使用できる。また、皮膚色素細胞が欠損した突然変異体を系統化したものを親系統２として使用できる。なお、親系統１、２は、ホモ接合体としておくことにより、その特徴を維持できることが多い。
【０００６】
上記発明において、縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの系統を一方の親系統とし、適当な組織特異的に蛍光タンパク質を発現しているゼブラフィッシュの系統を他方の親系統として、これらを交配することで、前記組織特異的に蛍光タンパク質を発現すると共に、縞模様がなくかつ透明なゼブラフィッシュの系統を作製することができる。このとき、適当な組織とは、筋肉系、神経系、血管系、造血・リンパ系、呼吸器系、消化器系、その他の内臓、内分泌系、皮膚、視細胞からなる群から選択される少なくとも一つのものであることが好ましい。その他の内臓としては、例えば腎臓、肝臓、胆嚢、生殖器などが含まれる。また、蛍光タンパク質は、一種類のものが、ある適当な組織で発光するようにしても良いし、二種類以上のものが、別々の組織で発光するようにしても良い。
第２の発明に係る生体イメージング評価法は、上記第１の発明によって作製されたゼブラフィッシュに対して、（１）異種癌細胞を移植する移植工程、（２）前記癌細胞に対する被験物質を前記ゼブラフィッシュの体内に投与する投与工程、（３）前記移植工程と前記投与工程の後にゼブラフィッシュ体内の蛍光を観察する観察工程を備えたことを特徴とする。
【０００７】
被験物質とは、癌細胞を認識する抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む）、抗体と別のタンパク質との融合タンパク質、受容体、低分子化合物などを意味する。このうち、特に癌細胞を認識する抗体であることが好ましい。
このとき、前記抗体には、前記ゼブラフィッシュが備えた蛍光とは異なる蛍光を発する蛍光物質を結合させておくことが好ましい。
また、（４）前記投与工程の後であって、前記観察工程の前に、前記抗体を認識すると共に蛍光物質または発光を引き起こす発光物質を備えた第２の抗体を投与する第２投与工程を備えることが好ましい。このようにすれば、癌細胞に対する抗体を標識する必要がない。また、癌細胞に対する抗体の種類（例えば、ヒト型、マウス型、ラクダ型など）が同じであれば、蛍光抗体は同じものを使用すれば足りる。発光物質とは、例えばルシフェラーゼやエクオリンのように所定の条件を与えることによって、発光を引き起こし、その発光を観察することによって、抗体の分布を観察できるものを意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ゼブラフィッシュを用いて、癌細胞に結合し得る被験物質が、実際に特定の癌細胞に対して、どの程度の結合能を有しているか、或いは致死的な作用を示すか否かなどのデータを容易に生体イメージデータとして得ることができる。ゼブラフィッシュは比較的に飼育が容易であり、成体になるまでの時間が短く、多産である。加えて、脊椎動物であるためヒトとの共通点も多いため、実験動物としての価値が高い。このため、免疫不全マウスやラットを使用することなく、癌細胞において選択的に発現が上昇している遺伝子が臨床的に有効な創薬ターゲットに成るか否かを生体イメージデータによって容易に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型ゼブラフィッシュ（fli1-AB）と、縞模様がなくかつ透明な系統（CLZ01（後に詳述））ゼブラフィッシュのそれぞれについて、明視野（上段）及び蛍光（下段）を観察した顕微鏡写真図である。
【図２】神経特異的GFP発現野生型ゼブラフィッシュと、神経特異的GFP発現透明系統（CLZ04（後に詳述））ゼブラフィッシュのそれぞれについて、明視野（上段）及び蛍光（下段）を観察した顕微鏡写真図である。
【図３】神経特異的EGFP・血管特異的DsRed発現野生型ゼブラフィッシュと、神経特異的EGFP・血管特異的DsRed発現透明系統（CLZ12（後に詳述））ゼブラフィッシュのそれぞれについて、明視野（上段）及び蛍光（下段）を観察した顕微鏡写真図である。
【図４】心臓特異的EFP発現野生型ゼブラフィッシュと、心臓特異的EFP発現透明系統（CLZ09（後に詳述））ゼブラフィッシュのそれぞれについて、明視野（左側）及び蛍光（右側）を観察した顕微鏡写真図である。
【図５】ヒト慢性骨髄性白血病細胞K562を蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラべルした後に、血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュ（CLZ03）の卵黄嚢部位に移植した後、24時間後に明視野（左側）、赤色のがん細胞（中央）、緑色の血管系（右側）を観察した顕微鏡写真図である。
【図６】ヒト肝臓がん細胞HepG2を蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラべルした後に、血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュ（CLZ03）の卵黄嚢部位に移植した後、24時間後に明視野（左側）、赤色のがん細胞（右側）を観察した顕微鏡写真図である。
【図７】Alexa Fluor 647で標識した抗体（CAND1, MMP1, SOAT1, REN, ULBP1及びLDLRに対する抗体）を用いてDU145（ヒト前立腺癌細胞株）を染色し、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真図である。各顕微鏡写真の上側には、使用した抗体を示した。
【図８】血管系が緑色に光り、かつ縞模様がなく透明なゼブラフィッシュの卵黄嚢に対して、PKH26あるいはKusabira-Orangeで染色したDU145とAlexa Fluor 647でラベルしたDKK1抗体とを同時に投与した後、24時間後に緑色の蛍光（図中(A)）、赤色（PKH26あるいはKusabira-Orange）と黄緑（Alexa Fluor 647）の蛍光（図中(B)）を観察したときの写真図である。
【図９】血管系が緑色に光り、かつ縞模様がなく透明なゼブラフィッシュの卵黄嚢に対して、PKH26あるいはKusabira-Orangeで染色したDU145を移植した後、48時間後にAlexa Fluor 647でラベルした34β E12抗体を投与し、1時間後に緑色の蛍光（図中左列の三枚）、赤色（PKH26あるいはKusabira-Orange）の蛍光（図中中央列の三枚）、及び明視野（図中右列の三枚）での観察を行ったときの写真図である。
【図１０】受精から3日後のゼブラフィッシュ卵黄嚢にDU145を移植した後、Alexa Fluor 647でラベルした抗ヒトERBB2抗体を血管内に投与し、1時間後に明視野及びAlexa Fluor 647の蛍光を観察した写真図である。(A)は、緑色蛍光を示す血管系を、(B)は、明視野での観察状況を、(C)は、血管内投与した抗ヒトERBB2抗体の分布の様子をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
１．透明ゼブラフィッシュの作製方法
(1)ゼブラフィッシュの飼育方法
ゼブラフィッシュは、8cm×25cm×16cm程度の大きさの飼育槽に対して、約2リットルの水を溜め（或いは、0.6リットル／分程度の早さで水を循環させながら）、約28℃に保持しつつ、10匹〜20匹程度の割合で飼育している。交配はオス3匹、メス2匹を上記サイズの飼育槽に入れ、自然に交配させた。
本発明者は、上記飼育槽を約2000個〜2500個の範囲内で継続的に飼育しており、常時30000匹〜40000匹のゼブラフィッシュを飼育している。
【００１１】
(2)縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１の作製
上記１の条件に基づいて継続的にゼブラフィッシュを飼育した結果、約1年間の飼育期間中に、自然発生的に縞模様が欠損した複数の突然変異体を得た。これを選択し、互いに交配することで、縞模様が欠損したゼブラフィッシュの親系統１（以下、「PZ1」という）を得た。このPZ1は、ホモ接合体とすることにより、縞模様がない系統として維持できることがわかった。
(3)皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２の作製
上記１の条件に基づいて継続的にゼブラフィッシュを飼育した結果、約1年間の飼育期間中に、自然発生的に皮膚色素細胞が欠損した複数の突然変異体を得た。これを選択し、互いに交配することで、皮膚色素細胞が欠損したゼブラフィッシュの親系統２（以下、「PZ2」という）を得た。このPZ2は、ホモ接合体とすることにより、皮膚色素細胞がない系統として維持できることがわかった。
(4)縞模様が欠損し、かつ透明なゼブラフィッシュの作製
次いで、上記PZ1とPZ2とを交配し、適当な選択及び飼育を継続することで、縞模様が欠損し、かつ透明なゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ01」という）の作製を試みた。ここで、親系統PZ1とPZ2（野生型AB系統バックグラウンド）はともにホモ接合体であるため、この両者を交配させて最初にできる個体は、ともにヘテロ接合体であるため、野生型（縞がある）と全く同一の形態をしていた。このため、ゲノミックPCRやサザンブロット法によりこれらの個体群からヘテロ接合体を抽出し、交配可能な時期まで6ヶ月間生育させた。その後、交配して産生された魚は、稚魚の段階では、野生型も透明であるため、2〜3カ月間飼育を行い、その後透明なゼブラフィッシュを分離した。こうして得られた系統CLZ01は、ヘテロ接合体の親から約16分の1の確率で産生された。CLZ01を確立後に、CLZ01の雌雄を交配させることにより、この基本系統を確立した。
交配開始からCLZ01の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
【００１２】
次に、上記CLZ01を基本型として、臓器特異的に蛍光タンパク質を備えたゼブラフィッシュの作製を試みた。臓器特異的蛍光タンパク質発現透明ゼブラフィッシュ系統を構築するには、CLZ01系統のゲノムに、臓器特異的発現遺伝子のプロモーター配列に蛍光タンパク質（EGFPやKusabira-orangeなど）発現配列を結合させたDNAを導入した。一般的な遺伝子導入法（受精卵へのマイクロインジェクション）では注入されたDNAがゲノム内に導入される確率は0.1 - 5%であり、成立する数は非常に少ない。その後CLZ系統として確立するためには、交配可能な親世代まで6か月飼育後、その子孫に透明形質を維持しつつも目的の蛍光タンパク質が発現しているかを確認して系統を確立した。
またさらに、2種類の蛍光タンパク質を発現する系統（後述のCLZ010や012を参照）は、1種類の蛍光タンパク質を発現する系統を2種類構築し、CLZ01形質および蛍光タンパク質発現形質がすべてホモ接合体になるまで交配を続ける必要があり、1年以上の期間が必要であった。
(5)血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とTg（fli1-EGFP）（血管組織に緑系蛍光タンパク質EGFPを発現している系統）とを交配させることにより、縞が無く透明であり、かつ血管系が緑色に光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ03」という）を作製できた。交配開始からCLZ03の作製までには、約2年間程度の期間を要した。
(6)神経系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とTg(huc-GFP)（神経細胞に緑系蛍光タンパク質GFPを発現している系統）とを交配させることにより、縞が無く透明であり、かつ神経系が緑色に光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ04」という）を作製できた。交配開始からCLZ04の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
(7)胸腺が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とTg(lck-EGFP)（胸腺に緑系蛍光タンパク質GFPを発現している系統）とを交配させることにより、縞が無く透明であり、かつ胸腺が緑色に光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ05」という）を作製できた。交配開始からCLZ05の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
【００１３】
(8)透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とcasper（透明な系統のゼブラフィッシュ）とを交配させることにより、縞が無く透明であるゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ06」という）を作製できた。交配開始からCLZ06の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
(9)透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とpanther（皮膚色素細胞の突然変異を持つ系統）とを交配させることにより、縞が無く透明であるゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ07」という）を作製できた。交配開始からCLZ07の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
(10)視細胞が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
albino（色素欠損変異系統のゼブラフィッシュ）とhg/GFP（視細胞に緑系蛍光タンパク質GFPを発現している系統）とを交配させることにより、視細胞が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの系統（以下、「Z08」という）を作製できた。交配開始からZ08の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
【００１４】
(11)心臓が緑色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記PZ01とSAG4A/GFP（心臓特異的にGFPを発現している系統）とを交配させることにより、縞模様が無く心臓が緑色に光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ09」という）を作製できた。交配開始からCLZ09の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
(12)血管系が赤色に光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とTg(fli1-dsRed)（血管組織特異的に赤色系蛍光タンパク質dsRedを発現している系統）とを交配させることにより、縞模様が無く血管組織が赤色に光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ10」という）を作製できた。交配開始からCLZ10の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
(13)特定の遺伝子を欠損させた透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とfgf3 mutant（fgf3遺伝子の発現が阻害されている系統）とを交配させることにより、fgf3遺伝子が欠損した透明なゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ11」という）を作製できた。このCLZ11は、耳石の発生が遅いという特徴があった。交配開始からCLZ11の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
【００１５】
(14)神経細胞系と血管系がそれぞれ同色または別色で光る透明なゼブラフィッシュの作製
上記CLZ01とCLZ10とを交配させたゼブラフィッシュの系統を作製した。更に、この系統と、神経細胞にKaedeという蛍光タンパク質を発現させたゼブラフィッシュの系統とを交配させることにより、血管系が赤色で、神経細胞系が緑または赤で光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ12」という）を作製できた。この系統では、紫外線を当てることにより、神経細胞を緑か赤、血管を赤色で視認できる。CLZ01とCLZ10の交配開始からCLZ12の作製までには、約2年間程度の期間を要した。
(15)神経細胞が緑または赤で光る透明なゼブラフィッシュの作製
albino（色素欠損変異系統）と、神経細胞に蛍光タンパク質Kaedeを発現している系統とを交配させることにより、神経細胞系が緑または赤で光るゼブラフィッシュの系統（以下、「CLZ13」という）を作製できた。交配開始からCLZ13の作製までには、約1年間程度の期間を要した。
【００１６】
２．透明ゼブラフィッシュの効果確認
野生型ゼブラフィッシュに存在する縞は黒色であり、明視野画像の解像度を低下させるだけではなく、蛍光波長を吸収する特性がある。図１に示すように、血管に蛍光タンパク質を導入したCLZ03の場合、野生型（fli1-AB）に比べて血管由来蛍光のシグナルがS/N比よく解析できた。
また、CLZ04（神経特異的GFP発現透明系統）の場合、図２に示すように、野生型では皮膚に存在する縞模様で検出できない頭部の神経系における蛍光シグナルが、本透明系統では検出できた。
さらに、図３に示すように、CLZ012（神経特異的EGFP・血管特異的DsRed発現透明系統）でも同様に、野生型では縞模様のために消失している蛍光シグナル（矢印で示した領域の神経（EGFP）と血管（DsRed）の蛍光シグナル）が、本系統ではS/N比よく解析できた。
また、CLZ09（心臓特異的EFP発現系統）の場合も同様に、図４に示すように野生型の心臓にGFPを発現している場合では、黒い縞（斑点）による蛍光シグナルの欠損（矢印部）が認められた。心臓の生体イメージングにおけるこの欠損は、心臓の動態解析などにおいてアーチファクト、ノイズとなるが、透明系統を用いた場合は、縞がないためにこの問題がないことが分かった。
このように、縞模様がなく、かつ透明なゼブラフィッシュ系統では、従来のゼブラフィッシュに比べると、S/N比が良好に生体イメージング評価を行い得ることが分かった。
【００１７】
３．透明なゼブラフィッシュを用いた生体イメージング評価法
(1)ヒト慢性骨髄性白血病細胞K562の移植と成体イメージング
ヒト慢性骨髄性白血病細胞K562をRPMI1640培地に10%FBSを加えた培地を用いて、25cm2フラスコ内で培養し、蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラべルした後に、約200個をMatrigel（日本BD）と混合し、血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュ（CLZ03）稚魚（受精後48時間齢）の卵黄嚢部位に移植した。その後、32℃環境下で飼育を行い、24時間後にMZ16F蛍光倒立顕微鏡（ライカ社製）を用いて画像取得した。
結果を図５に示した。ゼブラフィッシュの卵黄嚢に癌細胞が集中していることが観察された。
(2)ヒト肝臓がん細胞HepG2の移植と成体イメージング
ヒト肝臓がん細胞HepG2をDMEM培地に10%FBSを加えた培地を用いて、25cm2フラスコ内で培養し、蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラべルした後に、約200個をMatrigel（日本BD）と混合し、血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュ（CLZ03）稚魚（受精後48時間齢）の卵黄嚢部位に移植した。その後、32℃環境下で飼育を行い、24時間後にMZ16F蛍光倒立顕微鏡（ライカ社製）を用いて画像取得した。
結果を図６に示した。がん細胞が、ゼブラフィッシュの体内で発光する様子が観察された。
【００１８】
(3)蛍光標識抗体を用いた生細胞の染色試験
(i)蛍光ラベル化ヒト抗体の調整
各種抗原に対する市販抗体（CAND1, MMP1, SOAT1, REN, ULBP1及びLDLRに対する抗体）をAlexa Fluor 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit（Life Technologies社）を用いて蛍光色素Alexa Fluor 647と結合させた。Alexa Fluor 647結合抗体はアミコンウルトラ遠心式フィルター（Merk Millopore社）にて精製・濃縮した。
(ii)生細胞の染色と観察
蛍光標識抗体を生体に投与する前に、プレートに培養した生細胞に蛍光標識抗体を混合し、その結合の様子を蛍光顕微鏡で観察した。ヒト前立腺癌細胞株DU145をOPTI-MEM培地中にてプレート上に培養した。Alexa Fluor 647でラベルした抗体を12.5μg/mlとなるように培養液中に混合し、インキュベーションした。60分後に蛍光顕微鏡（Observer Z1(Carl Zeiss））を用い、Cy5用蛍光フィルタを使用して観察した。
結果を図７に示した。図に示すように、細胞株DU145に発現していると考えられている抗原について、細胞が蛍光染色されていることが確認された。
(4)ゼブラフィッシュへの異種癌細胞と抗体の同時移植
DU145を蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラベルした後に、約2000〜3000個のDU145をMatrigel（日本BD）と混合し、血管系が緑色に光る透明なゼブラフィッシュ（CLZ03）の卵黄嚢に移植した（移植工程）。この移植と同時に、Alexa Fluor 647でラベルしたDKK1抗体を卵黄嚢に投与した（投与工程）。その後、32℃環境下で飼育を行い、移植から24時間後に緑色の蛍光またはAlexa Fluor 647の蛍光を観察した（観察工程）。
結果を図８に示した。図に示すように、DU145の蛍光とAlexa Fluor 647の蛍光は、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に集中していることが分かった。
【００１９】
(5)血管内への抗体投与による生体イメージング評価法−１
DU145を蛍光色素（PKH26あるいはKusabira-Orange蛍光タンパク質の強制発現）でラベルした後に、約2000〜3000個のDU145をMatrigel（日本BD）と混合し、透明ゼブラフィッシュ（CLZ03：受精から3日後）の卵黄嚢に移植した（移植工程）。その後、32℃環境下で飼育を行い、移植から48時間後に、Alexa Fluor 647でラベルした34β E12抗体（25μg/ml）を血管内に投与した（投与工程）。抗体投与から1時間後に緑色の蛍光またはAlexa Fluor 647の蛍光を観察した（観察工程）。
結果を図９に示した。図に示すように、Alexa Fluor 647の蛍光によって観察される34β E12抗体は、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に観察された。
(6)血管内への抗体投与による生体イメージング評価法−２
(i)蛍光ラベル化ヒト抗体の調整
抗ヒトERBB2抗体をAlexa Fluor 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit（Life Technologies社）を用いて蛍光ラベルした。ラベルした抗ヒトERBB2抗体はアミコンウルトラ遠心式フィルター（Merk Millipore社）にて精製・濃縮した。
(ii)ゼブラフィッシュを用いた生体イメージング
透明ゼブラフィッシュ（CLZ03：受精から3日後）の血管内に、Alexa Fluor 647でラベルした抗ヒトERBB2抗体（1mg/ml）を、ガラスキャピラリー（GD-1、ナリシゲ社製）を装着した微量インジェクターを用いて（フェムトジェット、エッペンドルフ社製）、10nl血管内に投与した。抗体投与から1時間後に明視野およびAlexa Fluor 647の蛍光を観察した。
結果を図１０に示した。図に示すように、Alexa Fluor 647の蛍光によって観察される抗ヒトERBB2抗体は、血管系全体、及び卵黄嚢に観察された。
【００２０】
このように本実施形態によれば、癌細胞に結合し得る被験物質が、実際に特定の癌細胞に対して、どの程度の結合能を有しているか、或いは致死的な作用を示すか否かなどのデータを容易に生体イメージデータとして得ることができた。ゼブラフィッシュは比較的に飼育が容易であり、成体になるまでの時間が短く、多産である。加えて、脊椎動物であるためヒトとの共通点も多いため、実験動物としての価値が高い。このため、免疫不全マウスやラットを使用することなく、癌細胞において選択的に発現が上昇している遺伝子が臨床的に有効な創薬ターゲットに成るか否かを透明ゼブラフィッシュによる生体イメージデータを用いて容易に判定できるシステムを提供できた。
【図１】
2014083008.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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