(57)【要約】【課題】本発明は、白金に対する結合能を有するペプチド又はポリペプチドを利用した白金結合剤を提供することを主な目的とする。【解決手段】アミノ酸配列ＹＫＲＧＹＫからなるペプチド、又は当該アミノ酸配列を含むポリペプチドは、白金結合能があり、白金結合剤として利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする、白金吸着剤：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の白金吸着剤：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の白金吸着剤が白金と結合されてなる、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の白金吸着剤を提示してなるファージ。
【請求項５】
請求項４に記載のファージが白金と結合されてなる、白金−ファージ複合体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の白金吸着剤又は請求項４に記載のファージを、白金と接触させる工程を含む、白金の結合方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の白金吸着剤を、白金表面に結合させる工程を含む、白金の改質方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の白金結合剤又は請求項４に記載のファージを、白金電極面上に配向させる工程を含む、白金の配向方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の白金吸着剤又は請求項４に記載のファージを、白金含有物と接触させる工程を含む、白金含有物から白金を回収する方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の白金結合剤又は請求項４に記載のファージを用いて基板上にパターンを作製し、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させる工程、或いは請求項３に記載の白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、又は請求項５に記載の白金−ファージ複合体を用いて基板上にパターンを作製する工程を含む、基板上に白金粒子を配置する方法。
【請求項１１】
下記(i)又は(ii)に示すペプチド：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
【請求項１２】
下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白金に対する結合能を有するペプチド又はポリペプチドを利用した白金結合剤に関する。更に、本発明は、当該白金結合剤を利用した、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、ファージ、白金−ファージ複合体、及び各種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の生体における機能は多種多様であり、様々な種類のタンパク質が存在している。例えば、酵素、生体構造を形成するタンパク質、生体内の情報のやり取りに関与するタンパク質、運動に関与するタンパク質等がある。これらのタンパク質が機能を発揮する上で最も重要な過程に、他の分子との特異的な会合が挙げられる。酵素及び抗体は、その基質及び抗原と特異的に会合することにより機能を発揮する。また、構造形成、運動や情報のやり取りも、タンパク質の特異的会合なしでは考えられない。この特異的会合は、基本的には二次〜四次元構造の形成と同様の原理に基づき、対象分子との間に複数の疎水結合、水素結合、イオン結合が作られ安定化することで実現される。
【０００３】
生体低分子と金属の結合に関しては１９９０年代から研究が始まっている。例えば、非特許文献１では酸化鉄に結合するペプチドが報告されている。その後、酸化鉄に結合するアダプター（非特許文献２）、酸化亜鉛に結合するアダプター（非特許文献３）等が見出されている。こうしたアダプターは、開発当初、環境中の毒性物質の除去や測定をするための研究結果として生み出されてきた。
【０００４】
一方で、２０００年に半導体の材料であるガリウム砒素に結合するペプチドが非特許文献４において報告されたことにより、ペプチドの応用範囲が広がり、半導体分野での応用も期待されるようになった。ガリウム砒素と結合するペプチドの成果によって、これまでと異なった視点から金属と結合するペプチドが注目を集めることとなった。その後、自然界の自己組織化に見られる炭酸カルシウム（非特許文献５）、シリカ（非特許文献６）、銀（特許文献１、非特許文献７）、チタン（特許文献１）といったバイオミネラリゼーションに関わる化合物に対して結合能を有するペプチドが見出された。また、コンピューターや触媒等の分野で工業的に広く利用されている金に対して結合能を有するアプタマーも見出されている（非特許文献８）。
【０００５】
しかしながら、金属に対して結合能を有するアプタマーは、二次構造を持ちながら金属と結合しているという報告はほとんど存在しない。タンパク質として立体構造を維持しながら金属と結合するナノブロックを作製できれば、高いレベルでの特異性、ナノサイズでの金属粒子の配置コントロールが可能になると期待される。更に、遺伝子改変によるタンパク質のデザインで無機材料との相互作用を制御する方法が確立できれば、各種バイオデバイスおよび医療材料の開発に寄与すると考えられる。
【０００６】
更に、白金は、各種バイオセンサの電極、触媒、抗菌剤等として利用されているが、白金に対して結合能を有するアプタマーは報告されていない。そこで、白金に対して結合能を有するアプタマーを開発できれば、白金を利用する技術分野において革新的な技術進歩をもたらし得ると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／１００３１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】PNAS  ８９（１８）、p８６５１-５、１９９２
【非特許文献２】FEMS  １７０（２）、p３６３-７１、１９９９
【非特許文献３】Appl Environ Microbiol  ６６（１）、p１０-４、２０００
【非特許文献４】Nature  ４０５（６７８７）、p６６５-８、２０００
【非特許文献５】Biotech Lett  ２２、p１２１１-６、２０００
【非特許文献６】J Nanosci Nanotechnol  ２（１）、p９５-１００、２００２
【非特許文献７】Nat Mater.  １（３）、p１６９-７２、２００２
【非特許文献８】Nat Biotechnol  １５（３）、p２６９-７２、１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前述する従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、白金に対する結合能を有するペプチド又はポリペプチドを利用した白金結合剤、及び当該白金結合剤を利用した各種技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、まず、白金に結合能を有するペプチドの探索に人工タンパク質を利用することを想起し、当該人工タンパク質のループ構造にランダム変異を導入した変異体ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法を用いたスクリーニングにより、白金結合能が格別に高い変異人工タンパク質として、ループ構造にアミノ酸配列ＹＫＲＧＹＫ（配列番号１）を有するポリペプチドを見出した。次に、得られた変異体人工タンパク質と白金表面との結合状態をフロー型水晶振動子マイクロバランス測定装置により測定したところ、当該変異体人工タンパク質は、前記ループ構造の領域が白金表面に配向して結合していることを見出した。三次構造を維持したタンパク質の白金表面への配向性のある結合は、本発明が初めての発見である。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする、白金吸着剤：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
項２．  下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の白金吸着剤：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
項３．  項１又は２に記載の白金吸着剤が白金と結合されてなる、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体。
項４．  項１又は２に記載の白金吸着剤を提示してなるファージ。
項５．  項４に記載のファージが白金と結合されてなる、白金−ファージ複合体。
項６．  項１又は２に記載の白金吸着剤又は項４に記載のファージを、白金と接触させる工程を含む、白金の結合方法。
項７．  項１又は２に記載の白金吸着剤を、白金表面に結合させる工程を含む、白金の改質方法。
項８．  項１又は２に記載の白金結合剤又は項４に記載のファージを、白金電極面上に配向させる工程を含む、白金の配向方法。
項９．  項１又は２に記載の白金吸着剤又は項４に記載のファージを、白金含有物と接触させる工程を含む、白金含有物から白金を回収する方法。
項１０．  項１又は２に記載の白金結合剤又は項４に記載のファージを用いて基板上にパターンを作製し、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させる工程、或いは項３に記載の白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、又は項５に記載の白金−ファージ複合体を用いて基板上にパターンを作製する工程を含む、基板上に白金粒子を配置する方法。
項１１．  下記(i)又は(ii)に示すペプチド：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
項１２．  下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ペプチド又はポリペプチドを利用して、白金を結合させることができるので、白金表面の改質、白金の回収、白金とペプチド又はポリペプチドが結合して複合化された各種複合材料の提供、基板上での白金粒子の配置コントロール等が可能になる。また、本発明によれば、白金結合能を有するループ構造のアミノ酸配列を各種機能性タンパク質に導入したポリペプチドを使用することによって、白金と機能性タンパク質の複合化材料を提供できるので、白金と機能性タンパク質の両特性を併せ持つ新たな機能性素材を提供することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アスペルギルス属由来グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）（配列番号４に示されるアミノ酸配列）の立体構造を模式的に示す。図下部の矢印は、配列番号４に示されるアミノ酸配列における２５５〜２６０位の領域で形成されるループ構造を示す。図上部の矢印は、当該グルコース酸化酵素の基質ポケット／活性中心の位置を示している。
【図２】Ａ及びＢは、野生型ＬＡＲＦＨの立体構造を示す図である。Ａには、野生型ＬＡＲＦＨサイズを示し、Ｂには、矢印にてＬＡＲＦＨのループ構造を示している。
【図３】野生型ＬＡＲＦＨ（ループ構造の領域がＳＧＱＧＧＳ）と変異型ＬＡＲＦＨ（ループ構造の領域がＹＫＲＧＹＫ）のアミノ酸配列のペアワイズアライメントを示す図である。
【図４】野生型ＬＡＲＦＨ（Ｗｉｌｄ  ＬＡＲＦＨ）を提示するファージ、変異型ＬＡＲＦＨ（ＹＫＲＧＹＫ  ＬＡＲＦＨ）を提示するファージ、未提示のファージ（Ｔ７  ｐｈａｇｅ）について、ファージ濃度と白金吸着の関係を示す図である。横軸は反応に使用したファージ数（ｐｆｕ）、縦軸は白金粒子に結合したファージ数（ｐｆｕ）を示す。
【図５】実施例で使用したフロー型水晶振動子マイクロバランス（ＦＱＣＭ）装置の模式図である。Ａはサンプル溶液のリザーバー、Ｂはキャリア溶液のリザーバー、Ｃは恒温ループ、Ｄは切替バルブ、Ｅはフローセル、Ｆはポンプ、Ｇはドレイン、ＨはＰＣ、Ｉは周波数カウンタ、二重線はインキュベーター、矢印は溶液の流れる方向を示す。
【図６】ＦＱＣＭ装置にて周波数の時間経過を測定した際に得られる結果の例を示す図である。ａには、キャリア溶液をフローセルに送液した際に得られ周波数の経時変化（ベースライン）の例を示し、ｂには、キャリア溶液、サンプル溶液、及びキャリア液の順でフローセルに送液した際に得られる周波数の経時変化の例を示す。
【図７】実施例で使用した水晶振動子のセットアップの模式図である。
【図８】実施例で使用したＦＱＣＭ装置の外観を撮影した写真図である。
【図９】白金表面ＦＱＣＭ測定を行った結果を示す図である。横軸には時間、縦軸には周波数変化ΔＦを示す。Ａには野生型ＬＡＲＦＨをサンプルとした測定結果を示し、Ｂには変異型ＬＡＲＦＨをサンプルとした測定結果を示す。
【図１０】ＱＣＭ測定より算出された計算値に基づく、野生型ＬＡＲＦＨ及び変異型ＬＡＲＦＨの白金電極表面への結合形態の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列表を除いた本明細書において、アミノ酸配列中の２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することもある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１５】
１．白金結合剤として使用されるペプチド及びポリペプチド
本発明の白金結合剤は、下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする。
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
【００１６】
以下、(i)及び(ii)に示すペプチド、並びに(iii)及び(iv)に示すポリペプチドについて詳述する。
【００１７】
(i)に示すペプチド
(i)に示すペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＹＫＲＧＹＫ）からなる。(i)に示すペプチドは、前記特定のアミノ酸配列に基づいて白金に対する結合能を備えることが可能になっていると考えられる。
【００１８】
(i)に示すペプチドは、前記アミノ酸配列に従って、液相法、固相法等の、一般的なペプチドの化学合成法により製造することができる。
【００１９】
(ii)に示すペプチド
(ii)に示すペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチドからなる。
【００２０】
(ii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸の数としては、１又は数個で、且つ白金に対する結合能を有する範囲で適宜設定される。例えば、アミノ酸の置換の場合には、１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の欠失の場合には、１又は２個、好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の挿入（配列番号１における１位のＹのＣ末端側から６位のＫのＮ末端側内へのアミノ酸の挿入）の場合には、１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の付加（配列番号１における１位のＹのＮ末端及び／又は６位のＫのＣ末端へのアミノ酸の付加）の場合には、１〜７個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。
【００２１】
なお、(ii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸の種類は、配列番号１に示されるアミノ酸配列によって形成されるループ構造がある程度維持されることを一つの指標として、当該アミノ酸配列によって備え得る白金結合能を保持できるように設定すればよい。例えば、アミノ酸の置換の場合であれば、置換前のアミノ酸残基の性質と置換後のアミノ酸残基の性質が異なる非保存的置換を行ってもよいが、側鎖官能基の性質に基づいて保存的置換を行うことが好ましい。保存的置換とは、もとのアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基が同一のカテゴリーに分類されるアミノ酸残基であることを指す。具体的には、配列番号１における１位及び／又は５位のチロシン（Ｙ）を置換する場合であれば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンの中のいずれか一つの非電荷アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における２位及び／又は６位のリジン（Ｋ）を置換する場合であれば、アルギニン及びヒスチジンの中のいずれか一つの塩基性アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における３位のアルギニン（Ｒ）を置換する場合であれば、リジン及びヒスチジンの中のいずれか一つの塩基性アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における４位のグリシン（Ｇ）を置換する場合であれば、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンの中のいずれか一つの非電荷アミノ酸に置換すればよい。なお、配列番号１における４位のグリシンは、ペプチドの立体構造の形成に大きく寄与していると考えられるため、(ii)に示すペプチドにおいて置換されていないことが好ましい。
【００２２】
(ii)に示すペプチドは、前記(i)に示すペプチドと同様、そのアミノ酸配列に従って、液相法、固相法等の、一般的なペプチドの化学合成法により製造することができる。
【００２３】
(iii)に示すポリペプチド
(iii)に示すポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、且つ白金に対する結合能を有するポリペプチドである。即ち、(iii)に示すポリペプチドは、前記(i)に示すペプチドが挿入されているポリペプチドである。
【００２４】
(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列おいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列が配置される位置については、白金に対する結合能を備えることを限度として、特に制限されず、Ｎ末端又はＣ末端に配置されていてもよく、また非末端部分に配置されていてもよい。
【００２５】
(iii)に示すポリペプチドにおける全アミノ酸数については、白金に対する結合能を備えることを限度として特に制限されないが、例えば、５０〜１０，０００個、好ましくは５０〜５，０００個、更に好ましくは５０〜１，０００個、より好ましくは５０〜５００個、特に好ましくは５０〜１００個が挙げられる。
【００２６】
(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列については、白金結合能を備えることを限度として特に制限されないが、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列によってループ構造が形成され、且つ当該ループ構造が３次元構造において表面に露出可能になるように設定すればよい。
【００２７】
また、(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列については、人工的に作製されたアミノ酸配列であってもよく、また生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列であってもよい。ここで、生物由来のタンパク質としては、動物、植物、微生物等のいずれに由来するものであってもよく、例えば、酵素、生理活性タンパク質、色素タンパク質、構造タンパク質、及びそれらの複合体等が挙げられる。
【００２８】
例えば、(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域を、人工的に作製されたアミノ酸配列にする場合（以下、人工型ポリペプチドと表記することもある）、その具体的態様として、人工的に作製されたアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に配列番号１に示されるアミノ酸配列を付加したポリペプチド；人工的に作製されたアミノ酸配列内に配列番号１に示されるアミノ酸配列を挿入又は置換したポリペプチドが挙げられる。
【００２９】
より具体的には、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、アミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを少なくとも１つ形成するアミノ酸配列が付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端にアミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを１つ形成するアミノ酸配列が付加されており、且つ配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端にアミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを１〜３つ（好ましくは２又３つ、更に好ましくは３つ）形成するアミノ酸配列が付加されているポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、人工タンパク質であるＬＡＲＦＨ（Ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｏｕｒ  ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ；配列番号３）における２１〜２６位のアミノ酸配列（ループ構造）を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したものであり、第１〜２０位のアミノ酸配列の領域において１つのαへリックスを形成し、２７〜９７位のアミノ酸配列の領域において３つのαへリックスを形成するように構成されている。
【００３１】
また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の他の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜２５個、好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個が挙げられる。より具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列の領域において、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜６個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２７〜９７位のアミノ酸配列の領域において、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜１９個、好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜４個が挙げられる。また、アミノ酸の置換は、白金結合能を有することを限度として、非保存的置換であってもよく、また保存的置換であってもよい。アミノ酸は、「非極性アミノ酸」として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファン；「非電荷アミノ酸」として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン；「酸性アミノ酸」として、アスパラギン酸及びグルタミン酸；「塩基性アミノ酸」として、リジン、アルギニン、及びヒスチジンにそれぞれ分類されるため、保存的置換を行う場合であれば、置換後のアミノ酸が置換前のアミノ酸と同じ分類に属するように設定すればよく、非保存的置換を行う場合であれば、置換後のアミノ酸が置換前のアミノ酸と異なる分類に属するように設定すればよい。
【００３２】
また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の他の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列における２１〜２６位に対応する領域がＹＫＲＧＹＫであるアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、「同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ〔ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［ＮＣＢＩ］〕のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定して算出される。
【００３３】
また、例えば、(iii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域を、生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列にする場合（以下、天然型ポリペプチド改変体と表記することもある）には、その具体的態様として、これらのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に配列番号１に示されるアミノ酸配列を付加したポリペプチド、これらのアミノ酸配列内に配列番号１に示されるアミノ酸配列を挿入又は置換したポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合の一態様として、ループ構造（例えば、アミノ酸数が３〜２０個からなるループ構造）を有する、生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列において、当該ループ構造の領域を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３５】
(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合の具体例として、ループ構造を有する酵素のアミノ酸配列において当該ループ構造部分の領域を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合について、グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）を例に挙げてより具体的に説明する。グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）は、血糖測定用のグルコースセンサ等に利用される酵素であり、例えば、ＰＤＢ  ＩＤが１ＧＡＬで規定されるアスペルギルス属由来のグルコース酸化酵素はその一次構造と三次元立体構造が判明しており、その情報をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）より入手することができる。アスペルギルス属由来のグルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４に示されるアミノ酸配列の２５５〜２６０位にあたる６アミノ酸からなる領域が、立体構造表面に局在するループ構造を形成しており、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２５５〜２６０位のアミノ酸配列を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換することにより、白金結合能を有する変異型グルコース酸化酵素をデザインすることができる。なお、ここでは、グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）を例に挙げて、白金結合能を有する天然型ポリペプチド改変体のデザイン指針を示したが、本発明で使用される白金結合能を有する天然型ポリペプチド改変体は、当該グルコース酸化酵素に限定されるものではない。
【００３６】
(iii)に示すポリペプチドは、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法によって製造することができる。即ち、(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入して形質転換体を得て、これを培養することにより(iii)に示すポリペプチドを得ることができる。また、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いて形質転換体を得て、これを培養することにより得ることができる。
【００３７】
(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば部位特異的変異導入法等によって得ることができ、具体的には、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲに基づく手法、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットを利用する方法等によって調製できる。
【００３８】
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものを使用できる。ファージとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１等が例示される。また、プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＱＥ３０ＸａおよびコスミドであるＳｕｐｅｒ  Ｃｏｓ  Ｉ等が例示される。また、シュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２およびｐＣＮ５１等が例示される。
【００３９】
宿主としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌が挙げられる。これらの中でも、大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  大腸菌ＭＲＭ１５（ｐＲｅｐ４）株がより好ましい。
【００４０】
宿主への発現ベクターの導入方法は公知であり、宿主の種類等により適宜選択することができる。具体的には、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法等が挙げられる。
【００４１】
宿主に発現ベクターが導入された形質転換体は、組換えベクターが有するマーカー等を指標としてスクリーニングすることにより選択することができる。
【００４２】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じて従来公知の培養条件に基づいて行うことができる。形質転換体の培養は、好ましくは液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００４３】
形質転換体の培養に使用される培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものを使用でき。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜およびピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物および大豆粕アルカリ抽出物等が挙げられる。また、培地には、炭素源と窒素源の他に、必要に応じて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛等の塩類；アミノ酸、ビタミン等が添加されていてもよい。また、培地のｐＨは、形質転換体が発育し、形質転換体が(iii)に示すポリペプチドを産生する範囲で適宜すればよいが、通常ｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【００４４】
形質転換体の培養温度は、宿主が生育し、宿主が本発明に記載のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定すればよいが、通常１５〜３７℃程度である。培養は、(iii)に示すポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【００４５】
培養終了後、培養物から(iii)に示すポリペプチドを回収するには、培養物から(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を調製し、これを必要に応じて濃縮した後に、精製を行えばよい。培養液から(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を調製するには、例えば、培養した菌体を、超音波破壊、フレンチプレス等の機械的破壊、リゾチーム等の溶菌酵素による溶菌処理等によって可溶化すればよい。また、当該可溶化には、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素や、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を併用してもよい。また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した(iii)に示すポリペプチドを培養液中に分泌させることもできるので、このような場合には、培養液から遠心分離等によって菌体を除去することによって、(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を得ることもできる。(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分の濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトン等）による分別沈殿法により行うことができる。また、精製は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００４６】
斯して精製された(iii)に示すポリペプチドは、水溶液の状態で提供してもよいが、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等の乾燥工程を経て粉末化して提供してもよい。
【００４７】
(iv)に示すポリペプチド
(iv)に示すポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドである。即ち、(iv)に示すポリペプチドは、前記(ii)に示すペプチドが挿入されているポリペプチドである。
【００４８】
(iv)に示すポリペプチドの具体的態様、製造方法等は、前記(iii)に示すポリペプチドにおいて、前記(i)に示すペプチド部分が、前記(ii)に示すペプチドに置き換わっていること以外は、前記(iii)に示すポリペプチドの場合と同様である。
【００４９】
２．白金結合剤の用途、使用方法
本発明の白金結合剤は、白金に結合させる用途に使用される。本発明の白金結合剤において、結合対象となる白金としては、白金の微粒子又は白金の金属表面が挙げられる。
【００５０】
本発明の白金結合剤は、白金と接触すると、アミノ酸配列ＹＫＲＧＹＫ（配列番号１）、或いは当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列において白金を結合する。本発明の白金結合剤を白金に結合させる際の条件については、特に制限されないが、水、緩衝液等の水性溶媒中で行うことが好ましい。
【００５１】
本発明の白金結合剤は、ペプチド又はポリペプチドからなるものであり、ファージに提示させて使用することもできる。ペプチド又はポリペプチドをファージに提示させる方法は公知であり、本発明の白金結合剤を提示したファージは、従来公知の方法に従って製造される。
【００５２】
本発明の白金結合剤は、白金と結合できるので、白金とペプチド又はポリペプチドが結合して複合化された複合材料の提供に利用できる。このような複合材料としては、具体的井は、前記(i)又は(ii)に示すぺプチド、或いは前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドに、白金が結合した白金−ペプチド又はポリペプチド複合体；(i)又は(ii)に示すぺプチド、或いは前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを提示するファージに、白金が結合した白金−ファージ複合体が挙げられる。このような複合材料は、本発明の白金結合剤が持つ機能性と白金の機能性を併せ持つことができる。例えば、前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチド又は当該ポリペプチドを提示するファージと白金を結合させた複合材料は、当該ポリペプチドが有する機能性と、白金が有する機能性（例えば、電極物質としての機能、触媒機能、抗菌機能等）を併せ持つことができる。
【００５３】
また、本発明の白金結合剤は、白金表面の改質、白金の回収、白金粒子の基板上での配置等にも利用できる。
【００５４】
本発明の白金結合剤を白金表面の改質に使用する場合であれば、改質対象となる白金表面に本発明の白金結合剤を結合させればよい。例えば、本発明の白金結合剤として前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを使用し、白金と結合させることにより、白金表面に当該ポリペプチドが備える機能性を付与することができる。例えば、白金電極を利用したバイオセンサ（グルコースセンサ等）等に、前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを結合させると、白金電極を利用したバイオセンサ等に前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドが有する機能性（例えば、酵素としての機能等）を備えさせることが可能になる。例えば、白金電極に、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２５５〜２６０位のアミノ酸配列を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなる変異型グルコース酸化酵素を、白金電極に結合させることによって、白金電極に、グルコース酸化作用を備えさせることができる。通常、白金電極への酵素を含むポリペプチドの結合は非特異吸着であり、吸着したポリペプチド全てが十分な触媒能を発揮しないといった課題があるが、本発明により白金電極表面への配向性を有するポリペプチドの結合が可能であるため、センサーの高感度化への寄与が期待できる。
【００５５】
また、本発明の白金結合剤を白金の回収方法に使用する場合であれば、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージを、必要に応じて担持体に担持させて、金属廃液等の白金含有物と接触させればよい。本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージが、白金含有物中の白金に結合するので、白金含有物から白金を回収することができる。また、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージによって結合された白金は、例えば、１Ｍ以上の濃度の塩化ナトリウム水溶液に懸濁することによって、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージから遊離させることができ、更に、濾過等に供することにより白金を分離することができる。
【００５６】
また、本発明の白金結合剤を白金粒子の基板上での配置に使用する場合であれば、例えば、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージを用いて基板上にパターンを作製した後、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させればよい。また、本発明の白金結合剤に白金粒子を結合させた白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、或いは本発明の白金結合剤を提示するファージに白金粒子を結合させた白金−ファージ複合体を基板上に配置することによって、白金粒子を基板上に配置することもできる。このように、本発明の白金結合剤を使用することにより、基板上に白金粒子を精密に配置することができるので、本発明の白金結合剤は、白金粒子を利用したデバイスや回路の精密設計にも有用である。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明の実施例をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
（１）変異型ＬＡＲＦＨの作製
ＬＡＲＦＨ（Ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｏｕｒ  ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は赤沼らによって作製された人工タンパク質である（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７（３）、p３７１-３７９、２０１０）。Ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒはテトラマー構造を形成し、各サブユニットのＣ末端の４本のα-ヘリックスが束になった構造（４―ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ）をとる。２本の逆平行α-ヘリックスを模倣し人工的に連結したものに、更に２本のα-ヘリックスをループでつなぎ、１本鎖の４―ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅタンパク質として作製されたのが野生型ＬＡＲＦＨである。図２Ａに示すように、野生型ＬＡＲＦＨ単分子の大きさは約５ｎｍ×３ｎｍである。
【００５９】
野生型ＬＡＲＦＨのアミノ酸配列（配列番号２）において、配列番号１の２１番目から２６番目のアミノ酸配列「ＳＧＱＧＧＳ」がＬＡＲＦＨ分子表面でループを形成することが判明している（図２Ｂの矢印部分参照）。このループ構造の領域のランダム変異体ライブラリをスクリーニング母体として選択した。
【００６０】
ＬＡＲＦＨ遺伝子のＳ２１をコードするコドンＡＧＣ、Ｇ２２をコードするコドンＧＧＧ、Ｑ２３をコードするコドンＣＡＧ、Ｇ２５をコードするコドンＧＧＴ、Ｓ２６をコードするコドンＡＧＣを、それぞれＮＶＳ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ；Ｖ＝Ａ、Ｇ、又はＣ；Ｓ＝Ｇ又はＣ）にＰＣＲを用いた部位特異的変異導入により変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子ライブラリーを構築した。予想ライブラリーサイズは７．９６×１０６であった。
【００６１】
白金結合能を有する変異型ＬＡＲＦＨの選抜
白金結合能を有する変異体ＬＡＲＦＨの探索には、公知のＴ７  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した。Ｔ７ファージのキャプシドタンパク質をコードする遺伝子に先に作製した変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子ライブラリーを連結し、変異体ＬＡＲＦＨをファージ表面に提示させて、以下の条件で白金と相互作用させた。
【００６２】
１．５ｍｌチューブに０．１ｍｇの白金粒子を入れ、溶液Ａ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ、０．２％ＢＳＡ）を０．５ｍｌ添加し、４℃で１０分間インキュベートした。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。予め調整した変異体ＬＡＲＦＨライブラリーを表面に提示させたファージ液０．２５ｍｌと溶液Ａ０．２５ｍｌを添加して懸濁し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。洗浄を３回繰り返した後、溶液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２Ｍ尿素、１％ＳＤＳ）２５μｌを加えて懸濁し、１０分間超音波処理した。５Ｍ  ＮａＣｌ溶液１００μｌと溶液Ａ３７５μｌを添加して懸濁した後に、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。この超音波処理を含む洗浄操作を６回繰り返した。遠心分離後の沈殿に溶液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２５μｌを添加して懸濁した。２０分間室温で静置した後、５Ｍ  ＮａＣｌ溶液１００μｌと溶液Ａ３７５μｌを添加して懸濁、大腸菌に感染させた。大腸菌のプラークから白金に結合する変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子を単離した。単離した変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子のＤＮＡシーケンシングにより、変異体ＬＡＲＦＨのループ構造の領域である２１番目から２６番目のアミノ酸配列が「ＹＫＲＧＹＫ」であることが判明した。ＤＮＡシーケンシングの結果得られた該変異体ＬＡＲＦＨのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示す通りであった。野生型と変異型ＬＡＲＦＨとの相違点を明確にするため、図３にアミノ酸配列のペアワイズアライメント図を示す。
【００６３】
ＬＡＲＦＨ提示ファージ濃度依存的な白金の結合
変異型ＬＡＲＦＨの白金への吸着力を相対評価すべく、以下の実験を行った。Ｔ７ファージ、野生型ＬＡＲＦＨを提示したＴ７ファージ、変異型ＬＡＲＦＨを提示したＴ７ファージ液をそれぞれ調整し、１×１０-１１までの希釈系列を作製した。白金微粒子にファージ液と０．２５ｍｌと溶液Ａ０．２５ｍｌを添加して懸濁した後に、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清画分を回収した。溶液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２Ｍ尿素、１％ＳＤＳ）２５μｌを加えて懸濁し、１０分間超音波処理した。０．２％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ、１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液０．４５ｍｌを添加し、沈殿画分とした。それぞれの上清溶液と沈殿溶液をプラークアッセイに供した。
【００６４】
得られた結果を表１に示す。また、図４に、表１から計算したファージ濃度依存的な白金結合能をグラフを示す。濃度が増加するとＴ７ファージ及び野生型ＬＡＲＦＨ提示ファージの非特異的な結合も増加するが、変異型ＬＡＲＦＨ提示ファージはおおむねそれらに比べて白金結合能が強く、１０４〜１０６ｐｆｕの範囲では１０〜１００倍の白金結合能を示した。この結果から、変異型ＬＡＲＦＨは白金粒子に強力に結合することが示された。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
ＬＡＲＦＨタンパク質の精製
ＬＡＲＦＨ遺伝子あるいは変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子をｐＱＥ３０Ｘａベクター（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローニングし、大腸菌Ｍ１５（ｐＲｅｐ４）株を形質転換して寒天培地上で培養し、組換え大腸菌の単コロニーを得た。１５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン、２５ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地に組換え大腸菌の単コロニーを植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００が０．６〜０．８になった時点でＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、更に６時間培養した。遠心分離により菌体を回収して、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁して菌体を超音波破砕した。菌体破砕液を１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上清を回収した。上清を６０℃で２０分間、熱処理し、遠心分離により上清を回収した。熱処理後の遠心上清をＨｉｓＴｒａｐＨＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）ニッケルアフィにティーカラムにより精製した。吸着緩衝液には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、溶出緩衝液には５００ｍＭイミダゾールと１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を使用し、イミダゾールのリニアグラジエントにより溶出させた。ＬＡＲＦＨを含む溶出画分を回収し、５０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【００６７】
得られたＬＡＲＦＨ含有溶液にＦａｃｔｏｒＸａプロテアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加して４℃で一晩処理した。ＨｉＴｒａｐＱ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）とＨｉｓＴｒａｐＨＦをタンデムにつないで先の処理溶液を素通りさせて回収し、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。この溶液をＬＡＲＦＨ溶液あるいは変異体ＬＡＲＦＨ溶液として使用した。
【００６８】
フロー型水晶振動子マイクロバランス装置の構築
使用したフロー型水晶振動子マイクロバランス（ＦＱＣＭ）装置は、独自に開発した装置である。装置の構成について詳細に述べる。
【００６９】
まず、フロー測定系について述べる。送液ポンプはペリスタリックポンプ（ＲＥＧＲＯ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＩＳＭ  ５９７  ４ｃｈ／ＩＳＭＡＴＥＣ）を使用した。ポンプチューブはＴＹＧＯＮ２７６５-１７５  ＩＤ：０．７６ｍｍを使用した。流路の切り替えバルブは低圧スイッチバルブ（Ｖ-１１０１Ｄ-ＤＣ／ＵＰＣＨＵＲＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用した。流路関連部品はテフロンチューブ（ＩＤ：０．７５ｍｍ）、フランジフェラル（ＥＴＦＥ）、フランジナット（ＥＴＦＥ）、ショートフランジナット（ＥＴＦＥ）、コニカルアダプタ、マイクロタイトアダプタは、全てＵＰＣＨＵＲＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製のものを使用した。ＥＴＦＥとは熱可塑性フッ素樹脂で、テトラフルオロエチレンとエチレンの共重合体であり、低摩擦性、非粘着性、撥水性などの表面特性に信頼性が高く、フロー測定系を構築する上で最適である。流路は、サンプル溶液用とキャリア溶液用の２系列である。図５の模式図のように、上流からリザーバー、恒温ループ、切り替えバルブ、フローセル、送液ポンプ、ドレインの順に連結した。恒温ループ、切り替えバルブ、フローセルは±１℃の精度で温度制御可能な恒温インキュベーター内に設置した。恒温ループはアルミ製の円筒にテフロンチューブを各流路１ｍを巻き付けて作製した。切り替えバルブと発信器が一体となったＦＱＣＭ装置を設計し作製した。装置をＰＣへと接続し、流路切り替えをＰＣで制御した。ＦＱＣＭ装置に接続された周波数カウンタ（５３１３１Ａ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した周波数変化をＰＣへ出力するようにした。キャリア溶液は切り替えバルブ、フローセル、ドレインの順に流れる（流路１）。一方、サンプル溶液は切り替えバルブ、ドレインの順に流れる（流路２）。流路を切り替えると、キャリア溶液は切り替えバルブからドレインへ送液され、サンプル溶液が切り替えバルブからフローセルへ送液される。サンプル溶液の反応を観測し、任意時間にバルブを切り替えると再び最初の流路１に戻る。周波数の時間経過を測定した例を図６に示す。流路１の場合、キャリア溶液がフローセルへ送液され、図６ａのような安定したベースラインを得る。バルブを切り替える（流路２）と、図６ｂのようにサンプルが金属板に吸着することで周波数が減少し始め、その後平衡状態となり周波数は一定となる。これによりベースラインとのΔＦを求めることがきる。さらに流路１に戻すとサンプルの離脱による周波数回復が見られ、もとのベースラインに戻る（図６ｂ）。
【００７０】
次に、水晶振動子のセットアップについて述べる。凹状の発信器にパッキン、水晶振動子、スペーサー、フローセルの順に設置する。セットアップの状態を図７に示す。ねじを締めると発信器の側の電極と水晶振動子側の電極が接触し、共振周波数が得られる。スペーサー素材にはシリコンラバーを使用した。フローセルを重ねたときにできるスペースの容積は５．６μｌであり、これをフローセル容積とした。９ＭＨｚの水晶振動子（ＡＴカット水晶素板、下地金属：チタン、蒸着金属：白金、白金電極面積：０．１９６ｃｍ２）を使用した。構築したＦＱＣＭ装置を図８に示す。
【００７１】
白金表面ＦＱＣＭ測定
送液サンプルは、送液バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．０  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）に１μＭの野生型又は変異型ＬＡＲＦＨを溶解させたものを使用した。キャリアには送液バッファーを使用した。流速は１００μｌ／分、インキュベーター内の温度は２５℃とした。キャリア溶液を送液し応答が安定した時間を０秒とし、サンプルを６００秒間送液して野生型又は変異型ＬＡＲＦＨを吸着させた。その後、６００秒間キャリア溶液を送液することにより離脱過程を測定した。非特異的吸着の影響を観察すべく、送液サンプルおよび送液バッファーに尿素２Ｍを添加した条件でも実験を行った。
【００７２】
得られた結果を図９に示す。図９Ａに示す通り、野生型ＬＡＲＦＨの応答は約３２Ｈｚ（尿素添加条件では約２８Ｈｚ）であった。これに対して、図９Ｂに示す通り、変異型ＬＡＲＦＨの応答は約５０Ｈｚ（尿素添加条件では約４５Ｈｚ）であり、最大の結合能を示した。周波数の減少傾向が観察される尿素添加条件の結果を加味しても、ループ配列「ＹＫＲＧＹＫ」を有する変異型ＬＡＲＦＨは白金に特異的に強力に結合することが判明した。
【００７３】
変異体ＬＡＲＦＨの白金表面における吸着形態の解明
野生型又は変異型ＬＡＲＦＨ単分子あたりの占有面積を計算することにより、野生型又は変異型ＬＡＲＦＨの金属表面への結合形態を調べることができる。先ず、ＦＱＣＭ測定の質量変化と周波数変化の関係式について以下に述べる。ΔＦを初期状態からの周波数変化、Δｍを質量変化（ｎｇ）、Ｆ０を水晶振動子の基本発振周波数（９ＭＨｚ）、Ａを金電極表面積（０．１９６ｃｍ２）、ρｑを水晶の密度（２．６５g／ｃｍ３）μｑを水晶の定数（２．９５×１０１１ｄｙｎ／cm２）とすると、下記のＳａｕｅｒｂｅｒの式が得られる。
【００７４】
【数１】
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【００７５】
よって、Δｍは次式により求めることができる。
【００７６】
【数２】
2014205626.tif 000004
【００７７】
また、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの分子量Ｍ（１．２×１０４Ｄａ）、アボガドロ数ＮＡ（６．０２×１０２３ｍｏｌ-１）、白金表面の表面積ＳＰｔ（０．１９８ｃｍ２）とすると、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨ１分子あたりの占有面積Ｓ（ｎｍ２）は、次式により求めることができる。
【００７８】
【数３】
2014205626.tif 000005
【００７９】
また、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨ単分子の大きさは約３ｎｍ×５ｎｍであるから、得られたΔＦのデータから、野生型又は変異型ＬＡＲＦＨの白金表面への結合方向を見積もることができる。
【００８０】
上記の計算式から、サンプルを６００秒間送液後の飽和吸着時の応答をもとに野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの専有面積を計算したところ、野生型ＬＡＲＦＨの占有面積は１３ｎｍ２、変異型ＬＡＲＦＨの占有面積は７．９ｎｍ２と算出された。
【００８１】
野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの大きさを約３ｎｍ×５ｎｍの長方形に近似すると、図１０に示すように野生型ＬＡＲＦＨは横向き（約１５ｎｍ２）、変異型ＬＡＲＦＨの結合形態は縦向き（約９ｎｍ２）に結合していることが判明した。これらの結果から、アミノ酸配列「ＹＫＲＧＹＫ」を含む変異型ＬＡＲＦＨはそのループ部分で結合しており、当該配列が白金表面へ変異型ＬＡＲＦＨを配向させていることが示された。即ち、本結果から、アミノ酸配列「ＹＫＲＧＹＫ」からなるペプチド、当該アミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの変異体は、白金に対する結合能を有しており、白金結合剤として有用であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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