(57)【要約】【課題】ワクチンを含む組成物、並びに、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するワクチンを動物に接種する方法および動物におけるＣ型肝炎ウィルス感染を治療もしくは予防する方法を提供する。【解決手段】本発明は、直接ワクチンとして用いたり、または、動物においてＨＣＶに対する免疫応答を誘発するための酵母ベースのワクチンとともに用いたりすることができる様々な新規のＨＣＶ融合タンパク質を含む。本発明はまた、ＨＣＶ感染の検出および／または治療もしくは予防のためのあらゆる予防プロトコールもしくは治療プロトコールにおいて、本明細書で記載されるＨＣＶ融合遺伝子およびＨＣＶ融合タンパク質を使用することを含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部分に連結された、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部分を含む、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、概して、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するワクチンを動物に接種する組成物および方法、並びにＣ型肝炎ウィルスの動物への感染を予防もしくは治療する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔発明の背景〕
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、世界的に、急性慢性肝炎の主要な原因因子である。慢性的にＨＣＶに感染している人は、世界中に２億人おり、そのうち、４００万人がアメリカ合衆国に在住していると見積もられている。最も主要な感染源は、輸血や静脈注射麻薬（ＩＶ  ｄｒｕｇ）の使用を含む非経口的な経路を介するものである。現在の血液バンクの手順は、高度に安全であるにも関わらず、感染速度は上昇し続けている。これは、おそらく、静脈注射麻薬の使用およびその他の形態の被爆によるものである。
【０００３】
米国栄養調査ＮＨＡＮＥＳ  ＩＩＩ（Ｔｈｉｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ）のデータによれば、アメリカ合衆国におけるＨＣＶ感染患者の約７０％は、慢性的にＨＣＶに感染している。慢性的に感染している人のうち、多くの人は、慢性的なＨＣＶ感染による深刻な後遺症にさらされるであろう。上記後遺症には、肝硬変、肝臓代償不全（ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）、肝臓移植、肝細胞癌、および死への進行が含まれる。慢性的にＨＣＶに感染している患者についての後向きの長期追跡調査によれば、１０年〜２９年の範囲の追跡期間に、約２０％〜５０％の人が肝硬変に進行すると推定される（参考文献１〜４）。輸血後に慢性的にＨＣＶに感染した患者についての前向きの長期追跡調査によれば、８年〜１６年の範囲の追跡期間に、約１０％〜１５％の人が肝硬変に進行すると推定される（参考文献５〜８）。ウィルス感染後、肝硬変に進展する患者のうち、毎年、約１％〜３％の患者は、肝細胞癌に進展し、毎年の死亡率は、約２％〜６％である（参考文献９〜１０）。ＮＨＡＮＥＳ  ＩＩＩの血清有病率のデータ、および年齢特異的な発生率を用いた疫学モデルによれば、アメリカ合衆国において、肝硬変およびそれに関連する合併症に進行する危険のある人口のピークは、２０１５年である。また、近い将来、さらに悪化して、未だ遭遇していない医療が必要になると予測されている（参考文献１１）。肝硬変、肝細胞癌、および死に進行する速度を好転させるための一連の大きな流れとして、インターフェロンをベースとする投薬を用いて、慢性的なウィルス感染を防止することが、いくつか示されている（参考文献１２〜１４）。しかし、アメリカ合衆国で支配的な遺伝子型であることが知られている１型の慢性Ｃ型肝炎の治療に対する持続的なウィルス応答率は、リバビリンを含むペグ化されたインターフェロン−αの投薬で、約５０％に過ぎない。さらに、インターフェロンとリバビリンとをベースとする投薬は、うつ病、自殺思考、インフルエンザ様症状、および好中球減少を含め、安全性に重大な問題がある。治療の選択対象者は、現在、一部の治療効果を示す者、再発者、インターフェロンをベースとする治療に応答しない者に限定されている。
【０００４】
ＨＣＶは、フラビウィルス属のメンバーであり、エンベロープをもつ（＋）鎖ＲＮＡウィルスである。そのゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなり、侵入した細胞において、おおよそ３０００アミノ酸からなるポリタンパク質に翻訳される。細胞のプロテアーゼおよびＨＣＶに由来するプロテアーゼにより、翻訳と同時および翻訳後に、３つの構造タンパク質と、７つの非構造タンパク質とを生じる（表１）。ウィルスタンパク質のうち、いくつかについては、その役割は未だ明らかではない。一方、ＨＣＶ構造のＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１およびＥ２表面糖タンパク質、非構造タンパク質であるＮＳ２およびＮＳ３プロテアーゼ、並びにＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのようなウィルスタンパク質の多くは、ＨＣＶの生活環において必須の機能を果たすことが知られている。今までに単離されたウィルスゲノムの遺伝的多様性に基づくと、ＨＣＶは、６つの主要な遺伝子型、および１００以上のサブタイプをもつ。
【０００５】
遺伝子型１ａ型、１ｂ型、および２型は、北アメリカおよびヨーロッパで優勢であることが知られている。一方、南アメリカでは、ＨＣＶの遺伝子型は、１ａ型、１ｂ型、および３型が優勢である。遺伝子型４型、５型、および６型は、世界の残りの至る所で見られる（参考文献１９）。特定のＨＣＶ遺伝子型が地理的に優勢であるにもかかわらず、人口移動が増加しているため、ほとんどの遺伝子型が、世界中で同定されている。ＨＣＶの遺伝子型が異なると、現在推奨されているインターフェロン／リバビリン治療に対する応答性が異なる。具体的には、ＨＣＶ遺伝子型１型に感染した患者の〜５０％が、現在の治療投薬に対して無反応である。さらに、アフリカ系アメリカ人の患者におけるインターフェロン−αに対する応答率は、白色人種（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）家系よりも低い。これらのデータは、各個人に予め備えられている細胞性免疫応答を理想的に増大させるような選択的な治療方法が必要であることを示唆している。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
多くの研究によれば、ＨＣＶに感染している個体におけるウィルスの複製、ウィルス血症の程度、および慢性状態への進行は、並びにＣＤ４＋ヘルパー（ＴＨ）、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）によって媒介され、ＣｏｒｅおよびＮＳ３を含むウィルスの構造タンパク質および非構造タンパク質の両方に対して向けられたＨＣＶ特異的な細胞性免疫によって、直接的および間接的に影響を受けることが示唆されている（参考文献１５）。慢性的にＨＣＶが感染している人における事実上の免疫欠如は、さらに、他の遺伝子型のＨＣＶの重複感染の発生を伴うものである。細胞性免疫応答が強いこと、および寛容であることは、ＨＣＶ感染の自然経路に影響することが示唆されている。そのため、ウィルスに被爆した個体において、Ｔ細胞性免疫応答を刺激する免疫療法用製品の開発は、非常に重要である。
【０００８】
ヒトおよびチンパンジーの研究によって、血液および肝臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の開始前に、ＨＣＶは何週間も複製できることが明らかとなった。さらに、血液中に広がった後でさえも、ＣＤ８＋Ｔ細胞（および、おそらくＣＤ４＋Ｔ細胞も）による機能獲得に遅延が生じると考えられる。機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞の出現は、少なくともいくつかのケースでは、血清トランスアミナーゼの上昇を伴う。このことは、急性Ｃ型肝炎中の肝臓障害が、免疫病理学的であることを示唆している。血液、肝臓、もしくはその両方において、検出可能なウィルス特異的なＴリンパ球の応答を生じない人が、持続的なＨＣＶ感染で最も危険である。おそらく、最も重要なことに、細胞性免疫応答の発生は、必ずしも感染が持続的に制御されていることを保証するものではない。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、持続的な感染の再発および確立を防止するためにウィルス複製を明確に制御するとの観点を超えて、何週間もしくは何ヶ月も維持されているに違いない。
【０００９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および維持を助けることによって、ＨＣＶに対する免疫に必須の役割を果たしている。ＨＣＶの他の遺伝子産物に対する応答も報告されているが（参考文献２０〜２１）、保護性のＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５タンパク質のエピトープを優位に認識するように思われる。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を助けることに加えて、γ−インターフェロン、およびＴＨ２型サイトカインと対照的な他の炎症誘発性のＴＨ１を産生することが重要であるように思われる。それと同時に、慢性感染を制御するためには、ＨＣＶ特異的メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を確立することが重要である（参考文献２０、２２）。
【００１０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は自己限定的なＨＣＶ感染に共通するという発見は、それらが協同してウィルス血症を制御することを示唆している。Ｃ型肝炎感染を緊急に解消する間に初回刺激を受けたメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、チンパンジー、およびおそらくヒトでも、ウィルス持続性を長期間防止することができる。抗体を媒介とするメモリーＴ細胞の各サブセットの枯渇を通して、チンパンジーモデルは、急性Ｃ型肝炎の制御において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は重要であり、また、それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の援助に依存するという直接的な証拠を提供した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とは対照的に、急性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は共に、全てのＨＣＶタンパク質を同等に認識するように思われる。また、それらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、γ−インターフェロンを含む炎症誘発性のサイトカインを産生できることが重要であるかもしれない（参考文献１５）。
【００１１】
急性ＨＣＶ感染から慢性ＨＣＶ感染への遷移は、宿主の生存中には回復しないと思われるＨＣＶ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の実質的な減少に関連している。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性もまた、感染を解消するには不十分であるように、低下する。
【００１２】
免疫療法への実験的アプローチの多くは、一般的に、ＤＮＡ、組換えウィルス、および自己の樹状細胞に基づくワクチンストラテジーの使用を含む。ＤＮＡワクチンは、ヒトにおける初回刺激の免疫応答に有効である。しかし、免疫増強には不向きである。対照的に、組換えウィルスは、免疫増強には有効であるが、ベクターの中和の制限を受ける。最後に、樹状細胞をベースとするワクチンは、患者特異的で、作用が集中的である。したがって、ＨＣＶに対する効果的な免疫療法アプローチの技術が、依然必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル（ｙｅａｓｔ  ｖｅｈｉｃｌｅ）、および（ｂ）ＨＣＶ融合タンパク質を含むワクチンに関する。該ワクチンにおいて、酵母ビヒクルは、組換え的に上記融合タンパク質を発現する。上記ＨＣＶ融合タンパク質は、以下に述べるＨＣＶ融合タンパク質のいずれかから選択することができる。上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部分に連結された、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部分を含むことが特に好ましい。
【００１４】
したがって、ある局面では、上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部分に連結された、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部分を含む。上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、天然のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの触媒ドメインを欠失していることが好ましい。ある局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ３の全長タンパク質のＮ末端側の８８アミノ酸の後に続く２６２アミノ酸（配列番号２０の第１１１５位〜第１３７６位）からなる。ある局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの疎水性のＣ末端配列を欠失している。ある局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、本質的に、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの全長配列の第２位のアミノ酸から第１４０位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）からなる。別の局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の２つのアミノ酸を含むように付加されている。別の局面では、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むように付加されている。ある局面では、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、そのＮ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号２からなる。
【００１５】
別の局面では、上記融合タンパク質は、不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の全長を含む。ある局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、配列番号２０に関し、ＨＣＶ  ポリタンパク質配列の第１１６５位の残基に変異を含み、タンパク質のタンパク質分解活性が不活性化している。別の局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号４からなる。
【００１６】
さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に融合された、切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を含む。ある局面では、切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ１の第１位〜第１５６位のアミノ酸（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）からなる。さらに別の局面では、切断ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ２の第１位〜第３３４位のアミノ酸（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）からなる。さらに別の局面では、切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号６からなる。
【００１７】
別の局面では、上記融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質を含む。ある局面では、上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位のアミノ酸（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）と、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１７７位〜第２６１位のアミノ酸（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）とが連結されたアミノ酸配列からなる。さらに別の局面では、上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号８からなる。さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｅ２全長タンパク質に融合されたＨＣＶ  Ｅ１全長タンパク質に融合されたＨＣＶ  Ｃｏｒｅの全長タンパク質を含む。ある局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ全長タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１２からなる。
【００１８】
別の局面では、上記融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ１タンパク質と、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ２タンパク質とに融合された、切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を含む。ある局面では、上記切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の第２位〜第１４０位（配列番号２０の第２位〜第１４０位）からなる。別の局面では、上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質の第１位〜第１５６位（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）からなる。さらに別の局面では、上記切断ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の第１位〜第３３４位（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）からなる。さらに別の局面では、上記切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１４からなる。
【００１９】
別の局面では、上記融合タンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂに融合されたＨＣＶ  ＮＳ４ａに融合されたＨＣＶ  ＮＳ３を含む。該融合タンパク質では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは不活性化されている。また、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂは膜貫通ドメインを欠失している。ある局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＨＳ３の第１位〜第６３１位（配列番号２０の第１０２７位〜第１６５７位）からなる。該ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質において、配列番号２０の第１１６５位のセリンは、アラニンに置換されており、プロテアーゼが不活性化している。ある局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ４ａタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ａタンパク質の第１位〜第５４位（配列番号２０の第６３５位〜第６９１位）からなる。さらに別の局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１７７位〜第２６１位（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）に融合されたＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）からなる。別の局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１６からなる。
【００２０】
さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂタンパク質に融合されたＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質を含む。該融合タンパク質では、上記ＮＳ５ｂタンパク質は、ＮＳ５ｂのＣ末端が欠失しており、不活性化されている。ある局面では、ＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ５ａの第１位〜第４４８位（配列番号２０の第１９７３位〜第２４２０位）からなる。ある局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ５ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂの第１位〜第５３９位（配列番号２０の第２４２１位〜第２９５９位）からなる。さらに別の局面では、上記ＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている。さらに別の局面では、上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１８からなる。
【００２１】
一実施形態において、上記融合タンパク質の発現は、ＣＵＰ１のような誘導プロモーターの制御下にある。
本発明にかかる別の実施形態は、単離されたＨＣＶ融合タンパク質に関する。該ＨＣＶタンパク質は、上述したいずれかのタンパク質であり、具体的には、配列番号２、４、６、８、１２、１４、１６、および１８から選択される。
【００２２】
本発明にかかる別の実施形態は、上述した融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。一実施形態において、上記融合タンパク質の発現は、ＣＵＰ１のような誘導プロモーターの制御下にある。
【００２３】
本発明にかかる別の実施形態は、上記単離された核酸分子のいずれかを含む組換え組換え核酸分子に関する。一実施形態において、該組換え核酸分子は、ウィルスベクターである。
【００２４】
本発明にかかるさらに別の実施形態は、本明細書に記載の組換え核酸分子のいずれかが形質移入された組換え細胞に関する。そのような細胞には、腫瘍細胞や酵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明にかかる別の実施形態は、（ａ）上述したＨＣＶ融合タンパク質、および（ｂ）薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。
本発明にかかるさらに別の実施形態は、（ａ）樹状細胞、および（ｂ）上述したＨＣＶ融合タンパク質を含むワクチンに関する。そのようなワクチンは、さらに、上記樹状細胞に含まれる酵母ビヒクルを含んでいてもよい。
【００２６】
本発明にかかるさらに別の実施形態は、上述したようなＨＣＶ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むワクチンに関する。
本発明にかかる上述したワクチンは、いずれも、本発明にかかる単離されたＨＣＶ融合タンパク質を含むが、さらに、少なくとも１つの生物的応答の修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含んでもよい。
【００２７】
そのような生物学的な応答の修飾因子には、サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体、および低分子薬剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような生物学的な応答の修飾因子には、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０、アレムツズマブ、デニロイキンジフチトクス、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３ブロッキング剤、Ｆｌｔ−３リガンド、イミキモド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サルグラモスチム、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニスト、およびＴＬＲ−９アゴニストが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明にかかる別の実施形態は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染から動物を保護するための方法に関する。該方法は、ＨＣＶに既に感染している動物、もしくは、ＨＣＶに感染する危険がある動物に、本明細書に記載の本発明にかかるワクチンのいずれかを投与することを含む。また、該方法において、動物への上記ワクチンの投与は、ＨＣＶ感染、もしくは動物へのＨＣＶ感染によって生じる少なくとも１つの症状を軽減または抑制する。
【００２８】
本発明にかかるさらに別の実施形態は、ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発する方法に関する。該方法は、本明細書に記載の本発明にかかるワクチンのいずれかを動物に投与することを含む。
【００２９】
本発明にかかる別の実施形態は、ＨＣＶに既に感染している個体群において、ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる方法に関する。該方法は、上記個体群に、上述したワクチンのいずれかを投与することを含む。
【００３０】
本発明にかかるさらに別の実施形態は、ＨＣＶに感染する危険がある固体群を、ＨＣＶに対して免疫する方法に関連する。該方法は、上述したワクチンのうちのいずれかのワクチンを上記個体群に投与することを含む。
【００３１】
上記方法のいずれにおいても、上記ワクチンは、ＨＣＶ抗原をコードするウィルスベクターを含むワクチンに加えて、追加免疫として投与されうる。上記方法のいずれにおいても、上記ワクチンは、異なるＨＣＶワクチンで追加免疫する前に、上記の免疫系を初回刺激するために投与されうる。
【００３２】
本発明にかかる別の実施形態は、ＨＣＶ感染から動物を保護するための製剤における上述のいずれかのワクチンの使用に関する。
本発明にかかるさらに別の実施形態は、ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための製剤における上述のいずれかのワクチンの使用に関する。
【００３３】
本発明にかかる別の実施形態は、疾患もしくは異常を治療もしくは予防するための製剤における上述のいずれかのワクチンの使用に関する。本発明にかかるさらに別の実施形態は、ＨＣＶに感染する危険がある個体群を免疫するための製剤における上述のいずれかのワクチンの使用に関する。
【００３４】
本発明にかかる別の実施形態は、ＨＣＶに感染している個体群を治療するための製剤における上述のいずれかのワクチンの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質、および不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質、および不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３融合タンパク質の発現を示すクーマシー染色のデジタル画像である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断ＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、膜貫通（ＴＭ）ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。
【図２】図２は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンがＮＳ３およびＣｏｒｅに特異的なリンパ球増殖を誘導することを説明するグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンがＮＳ３に特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを説明するグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンがＮＳ３に特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを説明するグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンがＮＳ３に特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを説明するグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３またはＣｏｒｅをコードする組換えワクシニアウィルスに感染した腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを証明するグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３またはＣｏｒｅをコードする組換えワクシニアウィルスに感染した腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを証明するグラフである。
【図５】図５は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、マウス脾細胞による炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導することを説明するグラフである。
【図６】図６は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導されるリンパ球の増殖を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｄは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される炎症誘発性で、酵母特異的なサイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される炎症誘発性で、酵母特異的なサイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。
【図９】図９は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で、免疫および追加免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞におけるリンパ球増殖を説明するグラフである。
【図１０】図１０は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で、免疫および追加免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓エフェクタ細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、誘導されたリンパ球増殖応答の持続性を証明するグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導されたリンパ球増殖応答の持続性を証明するグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞応答の持続性を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞応答の持続性を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびＮＳ３に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびＮＳ３に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびＮＳ３に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびＮＳ３に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｇ】図１４Ｇは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｈ】図１４Ｈは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１４Ｉ】図１４Ｉは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された炎症誘発性サイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された炎症誘発性サイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された炎症誘発性サイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。
【図１６】図１６は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質もしくは不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。
【図１７】図１７は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジに対して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。
【図１８】図１８は、防御されたマウス由来の脾臓細胞におけるリンパ球増殖活性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、防御されたマウス由来の脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ナイーブの腫瘍をもったマウスから単離された脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を刺激することを示すグラフである。
【図２１】図２１は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系のＢ細胞リンパ腫をもつＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系のＢ細胞リンパ腫をもつＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系のＢ細胞リンパ腫をもつＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ニュージーランドホワイトラビットのオス及びメスにおいて、酵母に特異的なリンパ球増殖を誘導することを示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ニュージーランドホワイトラビットのオス及びメスにおいて、酵母に特異的なリンパ球増殖を誘導することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
〔発明の詳細な記述〕
図１Ａおよび１Ｂは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質、および不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロット（図１Ａ）およびクーマシー染色（図１Ｂ）のデジタル画像である。図１Ｃは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、切断ＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。図１Ｄは、本発明にかかる酵母ビヒクルにおける、膜貫通（ＴＭ）ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロットのデジタル画像である。図２は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＮＳ３およびＣｏｒｅに特異的なリンパ球増殖を誘導することを説明するグラフである。図３Ａ〜３Ｃは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＮＳ３に特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを説明するグラフである。図４Ａおよび４Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３またはＣｏｒｅをコードする組換えワクシニアウィルスに感染した腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを証明するグラフである。図５は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、マウス脾細胞による炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導することを説明するグラフである。図６は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導されるリンパ球の増殖を示すグラフである。図７Ａ〜７Ｄは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。図８Ａおよび８Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、１、２、または３週間免疫されることによって誘導される、炎症誘発性で、酵母特異的なサイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。図９は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で免疫および追加免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞における、リンパ球増殖を説明するグラフである。図１０は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、異なる免疫方法で免疫および追加免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓エフェクタ細胞における、細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。図１１Ａおよび１１Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて、誘導されたリンパ球増殖応答の持続性を証明するグラフである。図１２Ａおよび１２Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞応答の持続性を示すグラフである。図１３Ａ〜１３Ｄは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された酵母およびＮＳ３に特異的なサイトカインを分泌する細胞の持続性を示すグラフである。図１４Ａ〜１４Ｉは、異���る量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を説明するグラフである。図１５Ａ〜１５Ｃは、異なる量の切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンを用いて誘導された炎症誘発性サイトカインを分泌する細胞を示すグラフである。図１６は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質もしくは不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。図１７は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞を用いたチャレンジに対して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、感染防御免疫を誘導することを示すグラフである。図１８は、防御されたマウス由来の脾臓細胞におけるリンパ球増殖活性を示すグラフである。図１９は、防御されたマウス由来の脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を示すグラフである。図２０は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、腫瘍をもったナイーブマウスから単離された脾臓細胞における細胞傷害性エフェクタ細胞の活性を刺激することを示すグラフである。図２１は、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系のＢ細胞リンパ腫をもつＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。図２２Ａおよび２２Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系のＢ細胞リンパ腫をもつＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、治療的な免疫を誘導することを示すグラフである。図２３Ａおよび２３Ｂは、切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する本発明のワクチンが、ニュージーランドホワイトラビット（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ）のオス及びメスにおいて、酵母に特異的なリンパ球増殖を誘導することを示すグラフである。
【００３７】
本発明は、概して、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するワクチンを動物に接種する組成物および方法、並びに、動物におけるＣ型肝炎感染を治療もしくは予防するための組成物および方法に関する。本発明は、特定の酵母ベースのワクチンの使用を含む。該特定の酵母ベースのワクチンは、酵母ビヒクルと、動物においてＨＣＶ感染に対する免疫応答を誘発させるために選択されるＨＣＶ抗原融合タンパク質とを含む。本発明はまた、あらゆるワクチンおよびワクチンプロトコールにおいて、本明細書に記載のＨＣＶ融合遺伝子およびタンパク質を使用することを含む。
【００３８】
臨床的な証明では、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）および制御は、細胞性免疫によって促進されることが示唆されている。また、慢性的に感染している個体において免疫を増強することは、治療的メリットがあることが示唆されている。本発明者らや他の者がこれまでに報告した研究では、組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母全体を、ワクチンや免疫療法のベクターとして用いる可能性が示されてきた（米国特許第５，８３０，４６３号（１９９８年１１月３日発効）、米国特許出願第０９／９９１，３６３号（２００１年１１月１５日出願）を参照。なお、これらはいずれも全体が参照として本明細書に組み込まれる）。本発明者らの酵母をベースとする免疫療法用製品は、様々な動物種に存在し、様々なウィルス抗原および腫瘍抗原を生体内で発現する標的細胞を殺傷することができる免疫応答を誘発することが示されている。また、該免疫応答は、ＣＤ８＋ＣＴＬが媒介する形態で誘発される（参考文献１６〜１７）。
【００３９】
本発明は、米国特許第５，８３０，４６３号（１９９８年１１月３日発効）および米国特許出願第０９／９９１，３６３号（２００１年１１月１５日出願）に述べられているような酵母をベースとする免疫療法用製品に関する技術を基盤に改良されたものである。本発明者らは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、樹状細胞によって貪欲に捕食され、樹状細胞を直接活性化する。そのとき、樹状細胞は、高い効率の方法で、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞に酵母に関連するタンパク質を提示する（Ｓｔｕｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：６２５−６２９，２００１、上記米国特許出願第０９／９９１，３６３号）。変異型のＲａｓ腫瘍性タンパク質を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、自然に肺癌を発症したモデルマウスにおいて、相同変異をもつ確立された腫瘍を特異的に除去することが示された（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：５０８４−５０８８，２００４）。また、このアプローチは、現在、膵臓癌、肺癌、および直腸癌の患者において、ヒトの臨床試験フェーズＩの試験がなされている。この基盤技術をベースとする免疫療法用製品は、生産の方向に進んでいる。また、該製品は、宿主の免疫応答によって中和されない。さらに、抗原特異的な免疫応答を増進するために繰り返し投与することができる。加えて、製造に患者特異的なアプローチが不要である。
【００４０】
より具体的には、一例として、本発明者らは、酵母をベースとするワクチンを開発した。該ワクチンは、新規のＨＣＶ融合タンパク質を発現する、熱により不活性化された組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。上記ＨＣＶ融合タンパク質は、一実施形態において、ＮＳ３タンパク質の配列およびＣｏｒｅタンパク質の配列の両方の一部を少なくとも含む。他の実施形態では、不活性化されたＮＳ３  ＨＣＶタンパク質の全長と、新規の切断Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質と、膜貫通ドメインが欠失した新規のＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質とを含む。本発明の他の実施形態は、本明細書に提供される開示に鑑みれば、明らかであるだろう。
【００４１】
ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質およびＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶが感染した細胞では多量に発現されている。また、これらのタンパク質は、ウィルスの複製には必須である。これらの特性を、高度な配列保存性と組み合わせることで、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質およびＮＳ３プロテアーゼを、免疫療法の優れた標的とすることができる。本発明のワクチンは、動物において、ＮＳ３抗原とＣｏｒｅ抗原との両方を発現するウィルス感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答に加えて、抗原特異的で増殖性のＴ細胞応答を共に生じさせ、ＨＣＶ抗原を発現する腫瘍から動物を保護する（実施例、および参考文献１８を参照）。上記ワクチンの投与は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質およびＣｏｒｅタンパク質に標的とされるＨＣＶ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強させることが期待される。これにより、ＨＣＶ感染個体において、ウィルス負荷が軽減され、最終的に、ウィルスが除去される。
【００４２】
本発明の酵母をベースとするワクチンの成分として用いられる新規のＨＣＶ融合タンパク質は、酵母において、異種抗原発現用の新規のコンストラクトを用いて製造される。上記ＨＣＶ融合タンパク質において、望ましい抗原タンパク質またはペプチドは、そのＮ末端に、（ａ）本明細書に記載の特定の合成ペプチド、もしくは、（ｂ）内在性の酵母タンパク質の少なくとも一部が融合されている。また、上記ＨＣＶ融合タンパク質において、融合相手は、いずれも、酵母における該タンパク質の発現の安定性を顕著に向上させる、および／または、酵母細胞による該タンパク質の翻訳後修飾を阻害する。また、上記融合ペプチドは、抗体のような選択剤によって認識されるように設計されうるエピトープを提供する。上記構成では、該融合ペプチドは、ワクチン接種する抗原に対する免疫応答に、負の影響を与えないと考えられる。そのような薬剤は、本発明に有用なタンパク質を同定、選抜、および精製するために有効である。
【００４３】
さらに、本発明は、抗原構造物のＣ末端に融合されるペプチドを使用する、特に、上記タンパク質を選抜および同定するために該ペプチドを使用することを意図する。そのようなペプチドには、ペプチドタグ（例えば、６×Ｈｉｓ）や、あらゆるその他の短いエピトープタグのような合成もしくは天然のペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明にかかる抗原のＣ末端に付加されたペプチドは、上述したＮ末端のペプチドの付加の有無に関係なく、用いることができる。最後に、本発明者らは、本明細書において、いくつかの異なる新規な融合タンパク質について述べる。
【００４４】
酵母ベースのワクチンに用いられるＨＣＶ抗原は、同じ構造物内に、１つ以上の抗原に由来する複数（２つ以上）の免疫原性のあるドメインを提供する。複数の免疫原性のあるドメインを含む代表的な融合タンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質およびＣｏｒｅタンパク質、または本明細書に記載されているそれらの免疫原性のある部分を含む融合タンパク質である。また、その他の融合タンパク質については、以下に述べる。
【００４５】
上述したように、ＮＳ３およびＣｏｒｅは、感染細胞において、多量に発現され、ウィルス複製に必要とされる。また、急性感染および慢性感染において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によって認識されるエピトープを含む。これらのタンパク質、特に、１種のワクチンで両方のタンパク質を標的とすることのさらなる利点、アミノ酸レベルで、高度に保存されている点である。Ｃｏｒｅタンパク質およびＮＳ３タンパク質はともに、米国において最も優勢なＨＣＶ株であるＨＣＶの遺伝子型１ａ型および１ｂ型間で高度に保存されている（表１）。上記Ｃｏｒｅタンパク質は、１ａ型と１ｂ型との間の配列同一性は、アミノ酸レベルで９８％である。また、１ａ型のＨＣＶのタンパク質配列と比較して、その他の５つの遺伝子型のＨＣＶの配列同一性は、８６〜９５％の範囲である。上記ＮＳ３タンパク質もまた、異なるＨＣＶ株間で高度に保存されている。具体的には、１ａ型と１ｂ型との間での配列同一性は、アミノ酸レベルで９２％である。また、１ａ型のＨＣＶのタンパク質配列と比較して、その他の遺伝子型のＨＣＶの配列同一性は、８１〜８６％である。様々な遺伝子型のＨＣＶ間において、上記Ｃｏｒｅタンパク質およびＮＳ３タンパク質が高度に保存されていることは、ウィルスの機能における特定の全般的なタンパク質ドメインの必須の性質を示すものである。本発明のワクチンの１つは、単一の製品にもかかわらず、ＮＳ３プロテアーゼおよびＣｏｒｅタンパク質の２つのウィルス抗原を標的とするように設計された。このアプローチは、他の必須で保存されたＨＣＶウィルスタンパク質のタンパク質配列を含むように、容易に拡張することができる。その結果、より一層広い細胞性免疫応答を生じさせることができる。そのような付加的な融合タンパク質およびワクチンは、本明細書において例示される。
【００４６】
ＨＣＶポリタンパク質遺伝子およびそれによりコードされるポリタンパク質の核酸配列、並びにアミノ酸配列は、従来知られている。例えば、Ｃ型肝炎ウィルスＨ７７株のポリタンパク質の遺伝子の核酸配列は、データベースアクセション番号ＡＦ０１１７５３（ｇｉ：２３２７０７４）に記載されている。また、配列番号１９に示されている。配列番号１９は、本明細書の配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する、ＨＣＶ  Ｈ７７株のポリタンパク質をコードする。配列番号２０において、ＨＣＶタンパク質は、以下の位置に含まれる；ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ（配列番号２０の第１位〜第１９１位）、ＨＣＶ  Ｅ１エンベロープ糖タンパク質（配列番号２０の第１９２位〜第３８３位）、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープ糖タンパク質（配列番号２０の第３８４位〜第７４６位）、ＨＣＶ  Ｐ７イオンチャネル（配列番号２０の第７４７位〜第８０９位）、ＨＣＶ  ＮＳ２金属プロテアーゼ（配列番号２０の第８１０位〜第１０２６位）、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ（配列番号２０の第１０２７位〜第１６５７位）、ＨＣＶ  ＮＳ４ａ  ＮＳ３プロテアーゼ補因子（配列番号２０の第１６５８位〜第１７１１位）、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂ（配列番号２０の第１７１２位〜第１９７２位）、ＨＣＶ  ＮＳ５ａ（配列番号２０の第１９７３位〜第２４２０位）、およびＨＣＶ  ＮＳ５ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号２０の第２４２１位〜第３０１１位）。上述したように、ＨＣＶの株は、高度なアミノ酸同一性を示す（表１を参照）。したがって、本明細書で提供するプロトコールを用い、例示のＨＣＶ株を参照すれば、当業者であれば、本発明の組成物およびワクチンにおいて用いるいかなるＨＣＶ株からも、様々なＨＣＶベースの融合タンパク質を容易に得ることができる。
【００４７】
ＨＣＶの制御および除去には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が必要であること、並びに、適切な細胞性免疫の欠如は、慢性感染の進行に関係していることは明らかである。したがって、慢性的に感染した個体において、存在するが、不十分なＨＣＶ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することは治療上有益であることを提案することを訴えている。理論による保証なしに、本発明者らは、理想的なＨＣＶ免疫療法は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示経路に、抗原を運搬し、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を刺激できる非病原性ベクターからなると信じている。このベクターはまた、他の治療製品と同様に、繰り返し投与できるはずである。本発明のワクチンおよび組成物は、これらの目的に理想的に適している。
【００４８】
本発明よりも以前に知られている、いくつかの免疫療法用ワクチン製剤は、樹状細胞およびマクロファージ（本明細書では、概して、抗原提示細胞もしくはＡＰＣと称される）によって形質膜陥入された精製ウィルスタンパク質からなる。飲み込まれた物質内にあるタンパク質は、（１０〜２０アミノ酸の）ポリペプチドに分解される。該ポリペプチドは、ＡＰＣにおいて、分化したエンドソームのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。その後、該ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体は、ＡＰＣの表面に提示される。抗原特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）は、ＭＨＣクラスＩＩとペプチドとの複合体に結合し、活性化され、リンホカインを産生する。
【００４９】
アジュバントなしに細胞外に投与された可溶性の抗原は、体液性免疫応答に導くＢ細胞上で作用するリンホカインを産生する２型ヘルパーＴ細胞（ＴＨ２）を刺激する傾向がある。ＴＨ２応答は、細胞性免疫の誘導に重要な１型ヘルパーＴ細胞（ＴＨ１）を阻害する傾向がある。標的とされるウィルス性抗原が、感染細胞の膜上にあれば、抗体を生じさせるアプローチが治療上有効である。しかし、標的とされるウィルス性抗原が感染細胞の内部に見つかれば、抗体は一般的に効果がほとんどない。さらに、ＴＨ２応答に対するバイアスのために、ＣＤ８＋ＣＴＬは、外因的に導入されたタンパク質抗原に応答して、正常に活性化されない。ＣＤ８＋ＣＴＬが慢性的なウィルス感染に対する予防に必要なのであれば、組換えタンパク質を用いるアプローチはうまくいかないと仮定することは、理にかなっている。
【００５０】
細胞外抗原とは対照的に、ＣＤ８＋ＣＴＬは、標的とされる細胞によって合成されている、いかなる抗原にも応答して誘導される。これらの抗原は、内因性抗原と呼ばれる。感染細胞によって合成されているウィルスタンパク質は、小胞体へのペプチド運搬と共役する細胞質のプロテアソームによって、（８〜１０アミノ酸の）ペプチドに消化される。小胞体におけるＭＨＣクラスＩ分子の適切なフォールディングは、感染細胞や腫瘍細胞の表面に輸送される前に、プロテアソームで生じるペプチドに結合することに依存している。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＣＨ  Ｉ受容体−ペプチド複合体の連係動作に応答し、ＩＦＮ−γを含むリンホカインを産生する。このことは、一般的に、感染細胞の殺傷を含む、細胞性免疫応答に導く。
【００５１】
ＣＴＬが効果的に活性化されるためには、ＩＬ−２およびＩＬ−１２が必要であると考えられている。ＣＤ８＋ＣＴＬは、ある程度のＩＬ−２を産生することができる。しかし、ＣＤ４＋ＴＨ１細胞が、ＣＴＬが媒介する応答におけるＩＬ−２の主要な供給源であることが一般的に受け入れられている。ＩＬ−１２は、樹状細胞およびマクロファージによって産生される。さらに、ＣＴＬを最大に活性化するために、樹状細胞による抗原の提示が必要であることは明らかである。このように、ＣＤ４＋ＴＨ１細胞については、ＣＴＬが、最大に活性化され、その後、ウィルス感染細胞に応答するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用することが必要である。
【００５２】
樹状細胞自体が感染されない限り、ウィルス感染細胞によって合成されている抗原のうち、どの程度が樹状細胞のＭＨＣクラスＩ経路にたどり着くかは不明である。しかし、最近のデータでは、樹状細胞は、感染の結果アポトーシスに至る感染細胞を認識できることが示されている。また、樹状細胞およびマクロファージによって飲み込まれる細胞／粒子に関連するタンパク質のいくつかが、ＭＨＣクラスＩ経路にたどり着くように、交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）（内因性抗原の提示経路への外因性抗原の運搬）が起こることが示されている（参考文献２３）。さらに、ある危険シグナル（後述）が、このプロセスを増強する（参考文献２５）。
【００５３】
免疫応答は、主として、細胞外液から外来性物質を取り込む樹状細胞およびマクロファージによって、開始される。これらの細胞が適切に抗原を提示する能力を向上させる方法は、Ｔ細胞が媒介する細胞性免疫を改善するはずである。この観点において、高度にグリコシル化された酵母は天然のアジュバント様の特性を有し、複数の抗原を発現するように容易に操作できる（参考文献１６、２７〜２９）という利点に加えて、組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母は免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）の粒子性の特徴（参考文献２６）を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞は、マクロファージおよび樹状細胞を含む、専らの抗原提示細胞によって貪欲に取り込まれる。酵母に関連するタンパク質は、ＭＣＨクラスＩおよびクラスＩＩの両方を経て、効果的に提示され、腫瘍細胞に対する予防的で抗原特異的なＣＴＬ媒介性免疫を引き起こす（参考文献１６〜１７）。
【００５４】
樹状細胞およびマクロファージは、その表面に、微生物によるパターン認識分子として作用する様々な受容体を有する。例えば、パターン認識分子は、グリコシル化パターン、リポタンパク質および核酸の組成の違いに基づいて、病原体を認識する。それゆえ、そのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、微生物のマンノタンパク質、ペプチドグリカン、グリカン、リポタンパク質、２本鎖ＲＮＡおよびＣＧ島含有ＤＮＡ（ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ）の受容体を有する（参考文献３０〜３２）。これらの受容体が関与することにより、「危険（ｄａｎｇｅｒ）」シグナルと称される、樹状細胞の成熟、活性化、増強されたファゴサイトーシス、および関与する物質と関連した抗原の効果的な提示が引き起こされる（参考文献３３）。
【００５５】
事実、樹状細胞およびマクロファージは、他のあらゆる微生物よりも酵母を認識する受容体をより多く有している。これらの受容体には、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−６、ＣＤ１４、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｄｅｃｔｉｎ−２、ＤＥＣ−２０５、およびマンノース受容体ファミリーが含まれる（参考文献３０、３４）。ザイモサン、つまり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母の細胞壁粗調製物を取り込むと、たくさんの炎症誘発性遺伝子がアップレギュレートされる（参考文献３５）。本発明者らのデータでは、マウスおよびヒトの樹状細胞およびマクロファージが酵母全体を取り込むと、その結果、ＴＮＦ−α、ＣＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２のような炎症誘発性ＴＨ１サイトカインの分泌促進に加えて、様々な細胞表面分子がアップレギュレートされることが示されている。上記細胞表面分子には、付着分子（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４）、同時刺激分子（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、およびＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子が含まれる。
【００５６】
酵母は、樹状細胞と直接相互作用することができることに加えて、免疫療法の理想的な基盤になりうる様々な他の特性を有する。まず、複数の抗原を、単一の酵母株内で発現させるように操作することができる（参考文献２９）。また、これらの製剤は、製造の容易性、および複数の抗原を標的とする能力を含め、ＤＮＡワクチンのもつ多くの利点を共有している。ＤＮＡワクチンと違って、酵母ベースの免疫治療用製剤は、潜在的に毒性のある不純物を除去するために、過度な精製を行う必要がない。以下、さらに詳細に述べるように、組換え酵母で発現された異種タンパク質は、インビトロおよびインビボにおいて、強力なＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性の免疫応答の抗原となる（参考文献１６〜１７）。治療処置に加えて、予防処置としての動物試験でも、該酵母製剤は、免疫された動物における腫瘍増殖の防止及び治療に成功した（参考文献１６〜１７）。これらの結果は、本発明のワクチンがＨＣＶの免疫療法剤として、薬効範囲の広い免疫応答を誘発させるのに有効であることを示唆している。
【００５７】
本発明において、本発明者らは、本明細書ではＧＩ−５００５と称される、新規な組換え酵母免疫療法剤を生み出した。該組換え酵母は、誘導プロモーターの制御下で、ＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現する。ＮＳ３特異的抗体またはＣｏｒｅ特異的抗体を用いた、ＧＩ−５００５細胞ライセートの免疫ブロット解析によって、４７ｋＤａのタンパク質が確認される。該ＧＩ−５００５酵母は、１０００万細胞あたり５μｇより多くのＨＣＶ融合タンパク質を生産する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスへのＧＩ−５００５酵母の注射は、ＮＳ３およびＣｏｒｅ抗原特異的ヘルパーＴ細胞性免疫応答および細胞傷害性Ｔ細胞性免疫応答を強力に誘導した。このことは、リンパ球増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、およびサイトカイン放出アッセイにより示された。ＧＩ−５０００シリーズの酵母をワクチン接種したマウスは、ＨＣＶ抗原を発現する同系の腫瘍細胞のチャレンジから保護された。治療の代理モデルにおける結果に加えて、免疫原性および腫瘍防御の結果もまた、本明細書に示されている。最後に、慢性的にＨＣＶに感染している患者におけるフェーズＩ試験が述べられている。
【００５８】
＜本発明のワクチンおよび組成物＞
本発明の一実施形態は、ＨＣＶ感染もしくはそれを原因とする病気から動物を予防する方法、またはＨＣＶ感染の結果生じる少なくとも１つの症状を緩和する方法に用いることができる組成物（ワクチン）に関する。組成物またはワクチン。上記ワクチンは、（ａ）酵母ビヒクルと、（ｂ）該酵母ビヒクルによって発現される異種融合タンパク質とを含む。上述したように、本発明は、いくつかの改良されたＨＣＶ融合タンパク質を含み、該ＨＣＶ融合タンパク質は、本発明のワクチンにおいて抗原として用いられる。本発明において、上記ワクチンは、酵母ビヒクルを含むが、酵母ビヒクルを含まない他のワクチンもまた意図される（以下を参照）。特に、本発明は、（Ａ）酵母ビヒクルにおける異種タンパク質の発現を安定させる、（Ｂ）発現された異種タンパク質の翻訳後修飾を防止する、および／または、（Ｃ）本明細書に述べる酵母ビヒクルを含まないときに（すなわち、従来のワクチン組成物もしくは非酵母ベースのワクチン組成物において）ワクチン抗原として用いることができる、新しい融合タンパク質の構造物を提供する。また、ある実施形態において、上記新規な融合タンパク質は、単一のワクチンにおいて複数の選択された抗原を用いることによって、広範囲の細胞性免疫応答を引き起こす。本発明の実施形態では、上述したように、そのような融合タンパク質の１種もしくはそれ以上を、酵母ビヒクルに搭載したり、さもなければ、酵母ビヒクルと複合体化させたり、混合させたりして、本発明のワクチンを形成する。しかし、これらの融合タンパク質は、上記酵母ビヒクルと共同して、最も典型的には、該酵母ビヒクル（例えば、無傷酵母または酵母スフェロプラスト）によって組換えタンパク質として発現される。なお、無傷酵母または酵母スフェロプラストは、酵母の細胞質体、酵母ゴースト、または酵母膜もしくはその画分にさらに処理してもよい。
【００５９】
本発明において有効なそのような融合構造物の１つは、（ａ）少なくとも１つのＨＣＶ抗原（本明細書の他の箇所に記載された様々な融合タンパク質および複数の抗原構造物に加えて、免疫原性ドメインおよび全長抗原のエピトープを含む）と、（ｂ）合成ペプチドとを含む融合タンパク質である。
【００６０】
一実施形態において、ＨＣＶ抗原のＮ末端には、合成ペプチドが連結される。該合成ペプチドは、ＨＣＶ抗原とは非相同の少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、上記融合タンパク質の酵母ビヒクルにおける発現を安定化したり、発現した該融合タンパク質の翻訳後修飾を防止したりする。上記合成ペプチドと上記抗原のＮ末端部分とが連結して、次の要件を満たす融合タンパク質を形成する。
（１）該融合タンパク質の第１位のアミノ酸残基はメチオニンである。すなわち、上記合成ペプチドの１番目のアミノ酸はメチオニンである。
（２）該融合タンパク質の第２位のアミノ酸残基は、グリシンもしくはプロリンではない。すなわち、上記合成ペプチドの２番目のアミノ酸は、グリシンもしくはプロリンではない。
（３）該融合タンパク質の第２位〜第６位のアミノ酸残基は、メチオニンではない。すなわち、上記合成ペプチド、または、該合成ペプチドが６アミノ酸よりも短い場合には上記タンパク質の２番目〜６番目のアミノ酸は、メチオニンではない。
（４）該融合タンパク質の第２位〜第６位のアミノ酸残基は、リジンもしくはアルギニンではない。すなわち、上記合成ペプチド、または該合成ペプチドが５アミノ酸よりも短い場合には上記タンパク質の２番目〜６番目のアミノ酸は、リジンもしくはアルギニンではない。
【００６１】
上記合成ペプチドは、２アミノ酸と同じくらい短くてもよいが、少なくとも２〜６アミノ酸（３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸を含む）であることがより好ましい。また、上記合成ペプチドは、６アミノ酸よりも長くしてもよく、整数で約２００までのアミノ酸とすることができる。
【００６２】
一実施形態において、上記ペプチドは、Ｍ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｍはメチオニン；Ｘ２はグリシン、プロリン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ３はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ４はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ５はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ６はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸）というアミノ酸配列を含む。一実施形態において、上記Ｘ６残基は、プロリンである。ＨＣＶ抗原の酵母細胞における発現の安定性を向上させたり、該酵母における該タンパク質の翻訳後修飾を防止したりする代表的な合成配列は、Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号９）という配列を含む。上記発現産物の安定性の向上に加えて、本発明者らは、この融合相手は、上記構造物におけるワクチン抗原に対する免疫応答に負の影響を与えないと考えている。さらに、上記合成融合ペプチドは、抗体のような選択剤によって認識されうるエピトープを提供するように設計されうる。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、本発明に用いられる合成ペプチドの翻訳開始部位をコードする核酸は、Ｋｏｚａｋ翻訳配列ルールに従って、Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ（配列番号２１）である。なお、この配列のＡＴＧは最初の翻訳開始部位であり、Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号９）のメチオニンをコードする。
【００６４】
本明細書に記載されているように、本発明の様々な実施形態を組み合わせることができることは理解されうる。例えば、本発明の一局面において、上記合成ペプチドがＭ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号９）であるとき、このペプチドの開始部位をコードする核酸は、上述したように、Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ（配列番号１０）でありうる。本発明の実施形態の様々な他の組み合わせは、当業者には明らかであろう。
【００６５】
上記実施形態と同様であり、必須ではないが上記実施形態の限定を含む本発明の別の特定の実施形態は、（ｉｉｉ）ＨＣＶ抗原のＣ末端に連結されたペプチドを含む。該ペプチドは、ＨＣＶ抗原と非相同の少なくとも２つのアミノ酸からなり、融合タンパク質の酵母ビヒクルにおける発現を安定化させたり、発現された該融合タンパク質の翻訳後修飾を防止したりする。本発明の代表的な一局面では、上記ペプチドは、Ｅ−Ｄ（Ｇｌｕ−Ａｓｐ）というアミノ酸配列を含む。そのような配列は、疎水性を相殺するのに機能する。
【００６６】
本発明によれば、「非相同なアミノ酸」は、天然で特定のアミノ酸配列にフランキングすることが見出されていない（すなわち、生体内において天然では見られない）アミノ酸配列；特定のアミノ酸配列の機能に関連しないアミノ酸配列；または所定のアミノ酸配列の由来となる生物の標準コドン使用頻度を用いて、天然に起こる配列におけるヌクレオチドが翻訳されれば、遺伝子において見られるような特定のアミノ酸配列をコードする天然に起こる核酸配列にフランキングするヌクレオチドによってコードされないアミノ酸配列；である。したがって、ＨＣＶ抗原と非相同な少なくとも２つのアミノ酸残基は、天然でＨＣＶ抗原にフランキングすることが見出されていないあらゆる２つのアミノ酸残基である。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、ＨＣＶ感染もしくは該感染によって生じる症状から動物を保護するために用いることができる組成物に関する。該組成物は、（ａ）酵母ビヒクルと、（ｂ）該酵母ビヒクルによって発現された異種融合タンパク質とを含む。一実施形態において、上記融合タンパク質は、（ｉ）少なくとも１つのＨＣＶ抗原（本明細書の他の箇所に記載されているような様々な融合タンパク質および複数の抗原構造物に加えて、免疫原性ドメインおよび全長抗原のエピトープを含む）を含み、該ＨＣＶ抗原は、（ｉｉ）上記ＨＣＶ抗原のＮ末端に連結された酵母タンパク質に融合されている。また、該組成物において、上記酵母タンパク質は、内在性の酵母タンパク質の約２〜２００アミノ酸からなる。上記酵母タンパク質は、酵母ビヒクルにおける上記融合タンパク質の発現の安定性を顕著に向上させたり、該酵母細胞によって発現された該融合タンパク質の翻訳後修飾を防止したりする。さらに、上記内在性の酵母抗原は、上記合成ペプチドと同様に、上記構造物におけるワクチン抗原に対する免疫応答に負の影響を与えない。本発明のこの局面は、上述の本発明の他の実施形態とともに用いてもよい。
【００６８】
上記内在性の酵母タンパク質は、内在性の酵母タンパク質の約２〜２００アミノ酸（すなわち、最大で２２ｋＤａ）からなる。上記内在性の酵母タンパク質は、上記酵母ビヒクルにおける融合タンパク質の発現を安定化させたり、発現された該融合タンパク質の翻訳後修飾を防止したりする。本実施形態において用いられる好ましい内在性の酵母タンパク質、および特に好ましいタンパク質には、ＳＵＣ２（酵母インベルターゼで、同じプロモーターで、培地中の炭素源に依存して、細胞質で発現させたり、分泌経路に向けさせて発現させたりすることができるよい候補である。）；α因子シグナルリーダー配列（ａｌｐｈａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；ＳＥＣ７；ＣＰＹ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ１）、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）、およびトリースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）といった、グルコースで発現を抑制でき、細胞質に局在する遺伝子産物；細胞壁に局在し、保持されるＣｗｐ２；細胞が熱処理されたときに、発現が誘導され、より熱安定である、ヒートショックタンパク質ＳＳＡ１、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、およびＫＡＲ２；ミトコンドリアに輸送されるミトコンドリアタンパク質ＣＹＣ１；娘細胞の形成初期段階中の酵母細胞の出芽に局在するＢＵＤ遺伝子；アクチン束上にアンカーするためのＡＣＴ１が含まれる。
【００６９】
一実施形態において、本明細書の融合タンパク質に用いられる、内在性の酵母タンパク質および／またはペプチド、もしくは、合成ペプチドは、上記融合タンパク質を同定および精製するための抗体エピトープを含む。内在性の抗原に選択的に結合する抗原、または迅速に生じる抗体は、既に入手可能である。最後に、特定の細胞部位（例えば、分泌経路、ミトコンドリア、核）にタンパク質に移行させることを望むならば、そのときは、上記構造物は、上記酵母タンパク質の内在性のシグナルを用いることができる。これにより、確実に、細胞機構をその輸送システムに最適化することができる。上記融合相手に選択的に結合する抗体を用いる、もしくは製造することが好ましい。本発明によれば、「選択的に結合する」との表現は、抗体、抗原に結合する断片、または特定のタンパク質に好適に結合するための本発明の結合相手の能力を表す。より具体的には、「選択的に結合する」との表現は、あるタンパク質の別のタンパク質（例えば、抗体、抗体断片、または抗原への結合相手）への特異的な結合を表す。ここで、あらゆる標準的なアッセイによって測定したときの結合レベルは、該アッセイのバックグラウンドコントロールよりも、統計的に優位に高い。例えば、免疫アッセイを行ったとき、コントロールは、一般的に、抗体もしくは抗原結合断片のみを含む（すなわち、抗原を含まない）反応ウェル／チューブを含み、抗原が存在しないときの抗体もしくはその抗原結合断片による反応性の量（例えば、ウェルへの非特異的結合）はバックグラウンドであると考えられる。結合は、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡや免疫ブロットアッセイ）を含む技術の様々な標準的な方法を用いて測定することができる。
【００７０】
一実施形態において、本発明のワクチンは、ＨＣＶ抗原のＣ末端に連結されたペプチドを含みうる。該ペプチドにより、該ペプチドに対する抗体を用いて、該融合タンパク質を認識することができる。ある局面では、上記ペプチドは、Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。この実施形態は、単独で、もしくは、上述の融合タンパク質の他の局面とともに用いることができる。
【００７１】
上述したように、本発明のワクチンおよび組成物で用いられる融合タンパク質は、動物にワクチン接種するための少なくとも１つのＨＣＶ抗原を含む。上記組成物またはワクチンは、ＨＣＶ抗原を、１つ、２つ、数個、十数個、もしくは多数含む。該ＨＣＶ抗原には、１つもしくはそれ以上のＨＣＶ抗原の１つもしくはそれ以上の免疫原性ドメインが所望に含まれる。例えば、本明細書に記載されるあらゆる融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｅ１エンベロープ糖タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープ糖タンパク質、ＨＣＶ  Ｐ７イオンチャネル、ＨＣＶ  ＮＳ２金属プロテアーゼ、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ、ＨＣＶ  ＮＳ４ａ  ＮＳ３プロテアーゼ補因子、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂ、ＨＣＶ  ＮＳ５ａ、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列からなる群より選択される１つもしくはそれ以上のあらゆるＨＣＶタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態において、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列以外のＨＣＶタンパク質の部分は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部に連結されている。別の局面では、上記融合タンパク質は、１つもしくはそれ以上のＨＣＶ抗原の少なくとも１つもしくはそれ以上の免疫原性ドメインを含む。
【００７２】
本発明によれば、本明細書で一般的に用いられる用語「抗原」は、自然発生的に、もしくは合成的に得られるタンパク質（ペプチド、部分タンパク質、全長タンパク質）のあらゆる部分、細胞成分（全細胞、細胞ライセートまたは破壊細胞）、生物（生物全体、ライセートもしくは破壊細胞）、または炭水化物や他の分子もしくはその一部を表す。上記抗原は、抗原特異的な免疫応答（体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発したり、その代わりに、該抗原が投与される動物の細胞および組織内で遭遇する同一もしくは類似の抗原に対する免疫寛容原として作用したりする。
【００７３】
本発明の一実施形態において、用語「抗原」は、免疫応答を刺激することが望ましいとき、用語「免疫原」と交換可能に用いられる。また、本明細書では、（例えば、本発明のワクチンにより）動物に免疫原を投与することによって、該動物の組織内で遭遇する同一もしくは類似の抗原に対して抗原特異的な免疫応答を引き起こさせるような、タンパク質、ペプチド、細胞成分、生物、もしくは体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘発する（すなわち、免疫原性である）他の分子を記述するために用いられる。したがって、ある実施形態において、動物に特定の抗原に対するワクチンを接種することは、該抗原の投与の結果、抗原またはその免疫原性のある部分もしくは免疫寛容原性のある部分に対する免疫応答を誘発させることが意図される。ワクチン接種は、予防効果または治療効果をもたらすことが好ましい。その後の抗原（もしくは抗原源）被爆は、該抗原（もしくは抗原源）に対する免疫応答を誘発する。該免疫応答は、該動物における疾患もしくは異常を緩和もしくは予防する。ワクチン接種の概念は、従来公知である。本発明の治療用組成物の投与によって誘発される免疫応答は、ワクチンを投与していないときと比較して、免疫応答のあらゆる面（例えば、細胞性応答、体液性応答、サイトカイン産生）において、検出可能なあらゆる変化である。
【００７４】
「ワクチン接種する抗原」は、免疫原もしくは免疫寛容原でありうるが、ワクチンに用いられる抗原である。つまり、ワクチン接種する抗原に対する生物学的応答（免疫応答、免疫寛容の誘発）が誘発される。
【００７５】
所定の抗原の免疫原性ドメイン（部分、断片、エピトープ）は、動物に投与されたときに免疫原として作用する、少なくとも１つのエピトープを含む抗原（すなわち、ペプチド断片、サブユニット、抗体エピトープ、またはその他の立体配置的なエピトープ）のあらゆる部分でありうる。例えば、単一のタンパク質は、複数の異なる免疫原性ドメインを含む。免疫原性ドメインは、体液性免疫応答の場合には、タンパク質内に直線の配列を必要としない。本明細書においてエピトープは、免疫応答を誘発するのに十分な所定の抗原内にある単一の免疫原性の部位、または、免疫応答を抑制、除去、もしくは不活性化するのに十分な所定の抗原内にある単一の免疫寛容性の部位として定義される。当業者は、Ｔ細胞エピトープがＢ細胞エピトープとは異なるサイズおよび組成であること、および、ＭＨＣクラスＩ経路によって提示されるエピトープがＭＨＣクラスＩＩ経路によって提示されるエピトープと異なることは、分かっている。エピトープは、免疫応答のタイプに依存して直線配列のエピトープまたは立体配置的なエピトープ（保存された結合領域）でありうる。抗原は、単一のエピトープのように小さくてもよいし、より大きくてもよい。また、抗原には、複数のエピトープが含まれていてもよい。したがって、抗原の大きさは、約５〜１２アミノ酸（例えば、ペプチド）程度と小さくてもよいし、全長タンパク質ほど大きくてもよい。全長タンパク質には、多量体、融合タンパク質、キメラタンパク質、細胞全体、微生物全体、もしくはそれらの一部（例えば、細胞全体のライセートや、微生物の抽出物）が含まれる。さらに、抗原には、酵母ビヒクルや本発明の組成物に搭載されうる炭化水素が含まれる。ある実施形態（すなわち、抗原が、組換え核酸分子から、酵母ビヒクルによって発現される実施形態）では、該抗原は、細胞全体や微生物よりもむしろ、タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、またはそれらの断片であると理解される。好ましい本発明のＨＣＶ融合タンパク質は、本明細書で述べられている。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態では、上記ワクチンのＨＣＶ抗原の一部は、２つもしくはそれ以上の抗原を含む融合タンパク質として製造される。ある局面では、該融合タンパク質は、２つもしくはそれ以上の免疫原性ドメイン、または１つもしくはそれ以上の抗原（例えば、本明細書に記載のＨＣＶ  ＮＳ３配列およびＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列）の２つもしくはそれ以上のエピトープを含む。そのようなワクチンは、広い範囲の患者において、抗原特異的な免疫性を示す。例えば、本発明において有効な複数のドメイン融合タンパク質は、複数のドメインを有する。各ドメインは、特定のタンパク質由来のペプチドからなる。該ペプチドは、上記タンパク質のいずれかの末端にフランキングし、該タンパク質で見出された変異アミノ酸を含む少なくとも４つのアミノ酸残基からなる。該変異は、特定の疾患もしくは異常（例えば、ＨＣＶ感染）と関連している。
【００７７】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸配列は、いずれも、特定のアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにフランキングする少なくとも１〜２０の付加的な非相同なアミノ酸で作られる。その結果生じるタンパク質またはポリペプチドは、「本質的に、該特定のアミノ酸配列からなる」と称される。上述したように、本発明によれば、非相同なアミノ酸は、特定のアミノ酸配列にフランキングしているのが、天然には見いだされないアミノ酸配列（つまり、生体内では、天然に見出されないアミノ酸配列）、特定のアミノ酸配列の機能に関係しないアミノ酸配列、または、所定のアミノ酸配列の由来となる生物の標準コドン使用頻度を用いて、天然に起こる配列におけるヌクレオチドが翻訳されれば、遺伝子において見られるような特定のアミノ酸配列をコードする天然に起こる核酸配列にフランキングするヌクレオチドによってコードされないアミノ酸配列特定のアミノ酸配列をコードする天然に生じる核酸配列にフランキングするヌクレオチドによってコードされないアミノ酸配列である。同様に、「本質的に〜からなる」との表現は、本明細書において核酸配列に関して用いられる場合、少なくとも１つ、多くとも約６０の付加的な非相同なヌクレオチドが、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’末端および／または３’末端のそれぞれにフランキングされた特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す。上記非相同なヌクレオチドは、天然の遺伝子で起こるような特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列にフランキングすることが天然には見いだされない（つまり、生体内では天然に見出されない）。また、該タンパク質に何らかの付加的な機能を与えたり、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変化させたりするタンパク質をコードしない。
【００７８】
本発明の好ましい一局面では、上記ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよびＣｏｒｅ配列からなる。別の局面では、上記ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列に連結された、天然のＮＳ３タンパク質の触媒ドメインを欠失するＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質からなる。別の局面では、上記ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列に連結された、天然のＮＳ３タンパク質の最初のＮ末端の８８アミノ酸に続くＨＣＶ  ＮＳ３の２６２個のアミノ酸（すなわち、ＨＣＶ  ＮＳ３の第８９位〜第３５０位（配列番号２０））からなる。ある局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、疎水性のＣ末端配列を欠失する。別の局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、Ｃ末端のグルタミン酸およびアスパラギン酸の２つのアミノ酸を欠失する。好ましい局面では、上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、天然のＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の第２位〜第１４０位のアミノ酸からなる。
【００７９】
そのようなワクチンの例は、実施例１に記載されている。この実施例では、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、銅誘導プロモーターであるＣＵＰ１の制御下で、ＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するように操作された。該融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書では配列番号２に示されている融合タンパク質のアミノ酸配列を用いて括弧内に番号が付されているＨＣＶポリタンパク質（配列番号２０））において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号２の第１位〜第６位）
２）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼタンパク質の第８９位〜第３５０位（配列番号２０の第１１１５位〜第１３７６位）（配列番号２の第６位〜第２６８位）
３）クローニングにおいて導入された１つのスレオニンアミノ酸残基（配列番号２の第２６９位）
４）ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の第２位〜第１４０位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）（配列番号２の２７０位〜第４０８位）
５）Ｃｏｒｅ変異体の親水性を向上させるための配列Ｅ−Ｄ（配列番号２の第４０９位〜第４１０位）
本明細書において、配列番号２の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に示される。
【００８０】
本発明の別の好ましい局面では、上記ＨＣＶ抗原は、本発明にかかる融合タンパク質の一部である不活性化されたＨＣＶ  ＮＳ３全長である。そのようなワクチンの例は、実施例２に記載されている。この実施例では、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、銅誘導プロモーターであるＣＵＰ１の制御下で、不活性化された、全長のＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するように操作された。ＨＣＶ  ＮＳ３全長を含む該融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書では配列番号４に示されている融合タンパク質のアミノ酸配列を用いて括弧内に番号が付されているＨＣＶポリタンパク質（配列番号２０））において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号４の第１位〜第６位）
２）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼタンパク質の第１位〜第６３１位のアミノ酸（配列番号２０の第１０２７位〜第１６５７位）（配列番号４の第７位〜第６３７位）（但し、ＨＣＶポリペプチドの第１１６５位の残基は、タンパク質分解活性を不活性化するためにセリンからアラニンに置換されている。）
本明細書において、配列番号４の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に示される。
【００８１】
本発明の別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、切断ＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を含む。そのようなワクチンの例は、実施例３に記載されている。この実施例では、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６に示されており、括弧内に番号が付されているＨＣＶポリタンパク質）において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドとして、Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を発現するように操作されている。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号６の第１位〜第６位）
２）ＨＣＶタンパク質Ｅ１の第１位〜第１５６位のアミノ酸（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）（配列番号６の第７位〜第１６２位）
３）ＨＣＶタンパク質Ｅ２の第１位〜第３３４位のアミノ酸（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）（配列番号６の第１６３位〜第４４６位）
なお、この特定の融合タンパク質において、Ｅ１のＣ末端の疎水性の３６個のアミノ酸、およびＥ２のＣ末端の疎水性の２９個のアミノ酸は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために、欠失された。本明細書において、配列番号６の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号５に示される。
【００８２】
本発明のさらに別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質を含む。そのようなワクチンの例は、実施例４に記載されている。上記融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号８に示されており、括弧内に番号が付されているポリタンパク質）において、以下の配列要素がタンデムに配置された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号８の第１位〜第６位）
２）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位のアミノ酸（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）（配列番号８の第７位〜第７５位）
３）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂの第１７７位〜第２６１位のアミノ酸（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）（配列番号８の第７６位〜第１６０位）
複数の膜貫通ドメインを含む、ＮＳ４ｂの第７０位〜第１７６位（配列番号２０の第１７８１位〜第１８８７位）のアミノ酸に対応する１０７個のアミノ酸領域は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために欠失された。本明細書において、配列番号８の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７に示される。
【００８３】
本発明のさらに別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を含む。該融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１２に示されており、括弧内に番号が付されているポリタンパク質）において、以下の配列要素がタンデムに配置された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号１２の第１位〜第６位）
２）Ｃｏｒｅ、Ｅ１、およびＥ２タンパク質の全長をコードする修飾されていないＨＣＶポリタンパク質の第１位〜第７４６位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第７４６位）（配列番号１２の第７位〜第７５１位；第７位〜第１９６に延びたＣｏｒｅ、第１９７位〜第３８７位に延びたＥ１、および第３８８位〜第７５１位に延びたＥ２）
配列番号１２の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１１に示される。
【００８４】
本発明の別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、膜貫通ドメインを欠失したＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を含む。該融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１４に示されており、括弧内に番号が付されているポリタンパク質）において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）
２）ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の第２位〜第１４０位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）（配列番号１４の第７位〜第１４５位）
３）ＨＣＶタンパク質Ｅ１の第１位〜第１５６位のアミノ酸（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）（配列番号１４の第１４６位〜第３０１位）
４）ＨＣＶタンパク質Ｅ２の第１位〜第３３４位のアミノ酸（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）（配列番号１４の第３０２位〜第６３５位）
Ｃｏｒｅタンパク質のＣ末端の疎水性の５１個のアミノ酸、Ｅ１のＣ末端の疎水性の３６個のアミノ酸、およびＥ２のＣ末端の疎水性の２９個のアミノ酸は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために、欠失された。本明細書において、配列番号１４の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１３に示される。
【００８５】
本発明のさらに別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ融合タンパク質を含み、該ＮＳ３プロテアーゼは、不活性化されており、該ＮＳ４ｂは、膜貫通ドメインを欠失する。該ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１６に示されており、括弧内に番号が付されているポリタンパク質）において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号１６の第１位〜第６位）
２）全長のＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質（但し、第１３９位のセリン（配列番号２０の第１１６５位）はＮＳ３のタンパク質分解能を不活性化するためにアラニンに置換されている）に対応する第１位〜第６３１位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）（配列番号１６の第７位〜第６３４位）
３）ＮＳ４ａタンパク質の第１位〜第５４位のアミノ酸（配列番号２０の第１６５８位〜第１７１１位）（配列番号１６の第６３５位〜第６９１位）
４）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位のアミノ酸（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）（配列番号１６の第６９２位〜第７７６位）
５）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂの第１７７位〜第２６１位のアミノ酸（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）（配列番号１６の第７７７位〜第８４５位）
複数の膜貫通ドメインを含む、ＮＳ４ｂの第７０位〜第１７６位（配列番号２０の第１７８１位〜第１８８７位）のアミノ酸に対応する１０７個のアミノ酸領域は、酵母における細胞質への蓄積を促進させるために欠失された。本明細書において、配列番号１６の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５に示される。
【００８６】
本発明の別の好ましい局面では、上記酵母ワクチンは、ＮＳ５ｂのＣ末端が欠失して不活性化しているＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ融合タンパク質を含む。該ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ融合タンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端までのフレーム（本明細書で、融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１８に示されており、括弧内に番号が付されているポリタンパク質）において、以下の配列要素が融合された単一のポリペプチドである。
１）プロテアソームの分解に対して抵抗性を付与するための配列ＭＡＤＥＡＰ（配列番号９）（配列番号１８の第１位〜第６位）
２）第１位〜第４４８位のアミノ酸（配列番号２０の第１９７３位〜第２４２０位）に対応するＮＳ５ａタンパク質全体（配列番号１８の第７位〜第４５４位）
３）ＮＳ５ｂの第１位〜第５３９位のアミノ酸（配列番号２０の第２４２１位〜第２９５９位）（配列番号１８の第４５５位〜第９９３位）
ＨＣＶ複製にかかるＮＳ５ｂの活性に必要となるＣ末端の５２個の残基は、タンパク質を不活性化するために欠失された。本明細書において、配列番号１８の融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１７に示される。
【００８７】
本発明によれば、本明細書に記載された融合タンパク質は、いずれも、該融合タンパク質のＮ末端に連結されている、ＨＣＶ抗原に非相同な少なくとも２〜６個のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。ある局面では、該ペプチドは、Ｍ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｘ２はグリシン、プロリン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ３はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ４はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ５はメチオニン、リジン、またはアルギニンを除くいずれかのアミノ酸；Ｘ６はメチオニンを除くいずれかのアミノ酸）というアミノ酸配列を含む。ある局面では、Ｘ６は、プロリンである。別の局面では、上記ペプチドは、Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号９）というアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明の特定の局面では、上述の融合タンパク質は、２つのＨＣＶタンパク質（例えば、ＨＣＶ  ＮＳ３配列とＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列）の間に非相同なリンカー配列を含む。好ましい実施形態では、該非相同なリンカー配列は、１つの非相同なアミノ酸残基からなる。より好ましい実施形態では、該非相同なリンカー配列は、１つのスレオニン残基からなる。
【００８９】
本発明の上述した組成物（例えば、ワクチン）のいずれにおいても、酵母ビヒクルに関する以下の局面が発明に含まれる。一実施形態では、酵母ビヒクルは、酵母全体、酵母スフェロプラスト、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、および細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその画分から選択される。ある局面では、該酵母ビヒクルを調製するために用いられる酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストは、抗原が該酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストによって組換え的に発現されるように、抗原をコードする組換え核酸分子で形質転換される。この局面では、該抗原を組換え的に発現する酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストは、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、または細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその画分を含む酵母ビヒクルを製造するために用いられる。ある局面では、該酵母ビヒクルは、非病原性酵母に由来する。別の局面では、該酵母ビヒクルは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、およびＰｉｃｈｉａからなる群より選択された酵母に由来する。ある局面では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００９０】
通常、上記酵母ビヒクルおよび抗原は、本明細書に記載されたあらゆる技術によって連想することができる。ある局面において、上記酵母ビヒクルは、ＨＣＶと共に細胞内に搭載された。別の局面では、上記ＨＣＶ抗原は、酵母ビヒクルに共有結合的に、もしくは非共有結合的に結合された。さらに別の局面では、上記酵母ビヒクルおよびＨＣＶ抗原は、混合して結合された。別の局面では、上記抗原は、酵母ビヒクル、酵母細胞、もしくは該酵母ビヒクルが由来する酵母スフェロプラストによって、組換え的に発現される。
【００９１】
より具体的には、本発明によれば、酵母ビヒクルは、本発明のワクチンもしくは治療用組成物において、抗原と共に用いたり、アジュバントとして用いたりすることができる、あらゆる酵母細胞（例えば、細胞全体もしくは無傷細胞）またはその派生物（以下を参照）である。したがって、上記酵母ビヒクルには、生きている無傷の酵母微生物（すなわち、細胞壁を含む全ての成分を有する酵母細胞）、殺傷された（死滅した）無傷の酵母微生物もしくは酵母スフェロプラストを含む派生物（すなわち、細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母サイトプラスト（すなわち、細胞壁と核を欠く酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核、および細胞質を欠く酵母細胞）、または細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその画分（以前は、小細胞酵母粒子とも称した）を含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
酵母スフェロプラストは、通常、酵母細胞壁を酵素的に消化することによって製造される。そのような方法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，６６２−６７４に記載されており、これらは、参照として、全体が本明細書に組み込まれる。酵母サイトプラストは、通常、酵母細胞から核を除去することにより製造される。そのような方法は、例えば、Ｃｏｏｎ，１９７８，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．４８，４５−５５に記載されており、これらは、参照として、全体が本明細書に組み込まれる。酵母ゴーストは、通常、透過化もしくは溶解された細胞を再び封じることによって、製造される。これにより、細胞のオルガネラの少なくともいくつかを含むが、必ずしも必要ではない。そのような方法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，３６０８−３６１４  ａｎｄ  Ｂｕｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５３，１８５−１９６に記載されており、これらは、それぞれ、参照として、全体が本明細書に組み込まれる。細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその画分は、もともとの核や細胞質を欠く酵母膜を表す。該粒子は、もともとの酵母膜の大きさから、超音波処理や、当業者に知られたその他の膜破壊方法により製造された微粒子のサイズまでを含む。該膜抽出物もしくはその画分は、その後、再度、封じられる。細胞よりも小さい酵母膜抽出物の製造方法は、例えば、Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，６６２−６７４に記載されている。また、酵母膜部分を含む酵母膜抽出物の画分、および上記抗原が酵母膜の調製の前に該酵母によって組換え的に発現されたときには、該抗原を用いてもよい。
【００９３】
あらゆる酵母株を、本発明の酵母ビヒクルを製造するために用いることができる。酵母は、３つのクラスのうちの１つに属する単細胞微生物である。本発明によれば、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ，ＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  Ｗｈｉｌｅといった病原性酵母もしくはそれらの非病原性変異株を用いることができ、非病原性の酵母株であることが好ましい。酵母株の好ましい属には、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＣａｎｄｉｄａ（病原性）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓがより好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが特に好ましい。酵母株の好ましい種には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれる。これらの種の多くは、上述の種に含まれることが意図される、様々な亜種、類、亜類等を含むことは十分に理解されるべきである。より好ましい酵母種には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＳ．ｐｏｍｂｅが含まれる。扱いが比較的容易で、食品添加物として用いるの「Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ」、いわゆる「ＧＲＡＳ」である（ＧＲＡＳとは、１９９７年４月１７日にＦＤＡが提案したＲｕｌｅ６２ＦＲ１８９３８）ため、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、特に好ましい。本発明の一実施形態は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃｉｒＯ株のような特に高いコピー数にプラスミドを複製できる酵母株である。
【００９４】
一実施形態では、本発明の好ましい酵母ビヒクルは、該酵母ビヒクルおよび抗原（多くの実施形態では、抗原）が運搬される細胞種、例えば、樹状細胞もしくはマクロファージと融合される。これにより、該酵母ビヒクルの特に効果的な運搬に影響を与えることができる。本明細書で用いる場合、酵母ビヒクルの標的細胞種との融合は、酵母細胞膜もしくはその粒子が該標的細胞種（例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ）の膜と融合し、融合細胞の形成に至ることを表す。本明細書で用いる場合、融合細胞は、細胞を融合することによって製造される原形質の多核巨細胞のマス（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅ  ｍａｓｓ）である。多くのウィルス表面タンパク質（ＨＩＶ、インフルエンザウィルス、ポリオウィルス、およびアデノウィルスのような免疫不全ウィルスの表面タンパク質を含む）、および他の膜融合因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）（例えば、卵と精子との間の融合に関わる膜融合因子）は、２つの膜の間（すなわち、ウィルス膜と哺乳細胞膜との間、もしくは、哺乳細胞膜間）の融合に影響を及ぼしうることが知られている。例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０／ｇｐ４１異種抗原を表面上に産生する酵母ビヒクルは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球と融合することができる。しかし、該酵母ビヒクルへの標的部分の取り込みは、ある環境下では望ましいが、必ずしも必要ではないことを記載しておく。本発明者らは、すでに、本発明の酵母ビヒクルが、マクロファージのような他の細胞と同様に、樹状細胞によって容易に取り込まれることを示している。
【００９５】
酵母ビヒクルは、当業者に知られている数多くの技術を用いて、本発明の組成物に製剤化される。製剤には、患者に直接投与される製剤、および樹状細胞のような担体にまず、搭載されて患者に投与される製剤が含まれる。例えば、酵母ビヒクルは、凍結乾燥により乾燥されてもよい。また、酵母ビヒクルを含む製剤は、焼成操作や醸造操作で用いられる酵母のように、固形物やタブレット内に酵母を封入することによって製剤化されてもよい。さらに、樹状細胞もしくは抗原と投与される他の細胞種に搭載する前に、酵母ビヒクルを、宿主細胞によって許容される等張緩衝液のような薬学的に許容可能な賦形剤と混合してもよい。そのような賦形剤の例には、水、生理的食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、ハンク溶液、およびだの水系の生理学的に安定な塩溶液が含まれる。また、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、トリグリセリドのような非水溶性媒体を用いることもできる。他の有用な製剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グリセロール、もしくはデキストランのような増粘剤を含む懸濁剤が含まれる。また、賦形剤は、等張性や化学安定性を向上させる物質のような添加剤を少量含んでいてもよい。緩衝液の例として、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびＴｒｉｓ緩衝液を挙げることができる。一方、防腐剤の例として、チメロサール、ｍ−クレゾールもしくはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な製剤は、注射可能な液体、または懸濁剤もしくは注射用溶液として適切な液体になる固体のいずれかでありうる。このように、非液体の製剤では、上記賦形剤は、例えば、ブドウ糖、ヒト血清アルブミン、および／または防腐剤を含み、投与前に、滅菌水や生理的食塩水が添加される。
【００９６】
本発明によれば、用語「酵母ビヒクル−抗原複合体」、もしくは「酵母−抗原複合体」は、一般的に、抗原と酵母ビヒクルとのあらゆる結合を記載するために用いられる。そのような結合には、酵母（組換え酵母）による抗原の発現、酵母への抗原の導入、抗原の酵母への物理的な付着、および、例えば、緩衝液、その他の溶液、もしくは製剤内における酵母と抗原との混合が含まれる。これらのタイプの複合体の詳細は、後述している。
【００９７】
一実施形態において、上記酵母ビヒクルを調製するために用いられる酵母細胞は、抗原が酵母細胞によって発現されるように、抗原をコードする異種の核酸分子で形質転換される。そのような酵母もまた、本明細書では、組換え酵母もしくは組換え酵母ビヒクルという。その後、酵母細胞は無傷細胞、または死滅した酵母細胞として樹状細胞に搭載される。また、酵母細胞は、例えば、酵母スフェロプラスト、サイトプラスト、ゴースト、もしくは細胞より小さい粒子を形成するように調製され、その後、該調製物が樹状細胞に搭載されてもよい。また、抗原を発現する組換えスフェロプラストを作製するために、酵母スフェロプラストは、組換え核酸分子で直接形質移入されてもよい（例えば、酵母全体からスフェロプラストを作製し、その後、形質移入してもよい）。
【００９８】
本発明によれば、単離された核酸分子もしくは核酸配列は、自然環境から取り出された核酸分子もしくは核酸配列である。例えば、「単離された」とは、核酸分子の精製の程度を反映する必要はない。酵母ビヒクルに形質移入するのに有効な単離された核酸分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体が含まれる。単離された核酸分子は、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。本発明において有効な単離された核酸分子には、本発明の組成物において有効な少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質、もしくは該断片をコードする核酸分子が含まれる。
【００９９】
本発明の酵母ビヒクルに形質転換される核酸分子には、１つもしくはそれ以上のタンパク質またはその一部（断片、ドメイン、立体配置的なエピトープ）をコードする核酸配列が含まれる。そのような核酸分子は、部分的なもしくは完全なコード領域、制御領域、またはそれらの組み合わせを含む。酵母株の１つの利点は、多くの核酸分子を保持することができる能力、および多くの異種タンパク質を生産することができる能力を有することである。本発明の酵母ビヒクルによって製造される抗原の好ましい数は、酵母ビヒクルによって合理的に製造される抗原の数である。一般的には、少なくとも１つ〜少なくとも約５以上の範囲であり、約２〜約５の異種抗原が製造されることがより好ましい。
【０１００】
酵母ビヒクル内の核酸分子によってコードされるペプチドまたはタンパク質は、全長タンパク質であってもよいし、アミノ酸が欠失、（例えば、切断タンパク質）、挿入、逆位、置換、および／または誘導化（アセチル化、グリコシル化、リン酸化、グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによる付加）された機能的に同等のタンパク質であってもよい。そのような修飾されたタンパク質は、天然のタンパク質の生物学的活性と実質的に同等の生物学的活性を有するか、もしくは、天然のタンパク質と比較して機能が所望に亢進したり阻害されたりしている。修飾は、当技術分野で知られた技術によって実現することができる。具体的には、タンパク質への直接の修飾、または例えば、ランダムもしくはターゲティングされた変異をもたらす標準的な組換えＤＮＡ技術を用いたタンパク質をコードする核酸の修飾を含むが、これらに限定されるものではない。機能的に同等のタンパク質は、タンパク質の生物学的活性を測定するアッセイ系を用いて選抜することができる。好ましいＨＣＶ抗原は、上述した通りである。本発明の酵母ビヒクルにおける抗原の発現は、当業者に知られている技術を用いて実現できる。簡単に言えば、少なくとも１つの所望の抗原をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。このとき、該核酸分子は、宿主の酵母細胞に形質転換したときに、該核酸分子を恒常的に、もしくは制御されて発現させるために、転写制御配列に機能できるように連結されている。１つもしくはそれ以上の抗原をコードする核酸分子は、１つもしくはそれ以上の発現ベクター上で、１つもしくはそれ以上の転写制御配列に機能できるように連結されている。
【０１０１】
本発明の組換え分子において、核酸分子は、制御配列を含む発現ベクターに、機能できるように連結されている。該制御配列には、転写制御配列、翻訳制御配列、複製オリジン、および、酵母細胞に適合して、核酸分子の発現を制御する他の制御配列が含まれる。特に、本発明の組換え分子は、１つもしくはそれ以上の転写制御配列に機能できるように連結されている核酸分子を含む。「機能できるように連結されている」との表現は、宿主細胞に形質移入（すなわち、形質転換、形質導入、形質移入）したときに、核酸分子が発現できるように、転写制御配列に該分子を連結することを表す。
【０１０２】
産生するタンパク質の量を制御することができる転写制御配列には、転写の開始、伸張、および終結を制御する配列が含まれる。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよび上流の活性化配列のような転写の開始を制御する配列である。本発明には、あらゆる適切な酵母プロモーターを用いることができる。また、そのようなプロモーターの多様性は、当業者に知られている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に好ましいプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）ともいう）、ガラクトシキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース−１−リン酸ウリジル−トランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）、および酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）といった酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、より好ましくは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、ＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。中でも、細胞内のグルコース濃度を低くしたとき（例えば、約０．１％〜０．２％）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターは、特に好ましい。同様に、多くの上流の活性化配列（ＵＡＳ、エンハンサーともいう）が知られている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に好ましい上流の活性化配列には、ＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化される他のＵＡＳに加えて、ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０といったタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。中でも、ＡＤＨ２のＵＡＳが特に好ましい。ＡＤＨ２のＵＡＳは、ＡＤＲ１の遺伝子産物によって活性化されるため、異種遺伝子がＡＤＨ２のＵＡＳに機能できるように連結されたときにＡＤＲ１遺伝子を好適に過剰発現させる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に好ましい転写終結配列には、α−因子、ＧＡＰＤＨ、およびＣＹＣ１の遺伝子の終結配列が含まれる。
【０１０３】
メチロトローフの酵母（ｍｅｔｈｙｌｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ）において、遺伝子を発現させるのに好ましい転写制御配列には、アルコールオキシダーゼおよびギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域が含まれる。
【０１０４】
本発明にかかる酵母細胞への核酸分子の形質移入は、核酸分子を細胞内に投与する方法によって達成される。該方法には、拡散、能動輸送、浴超音波処理（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。形質移入された核酸分子は、酵母の染色体に組み込まれたり、当業者に知られた技術を用いて染色体外のベクター上に維持されたりする。そのような核酸分子を保持する酵母ビヒクルの例は、本明細書に詳細に記載されている。上述したように、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、および細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその画分は、無傷の酵母微生物、または所望の核酸分子をもつ酵母スフェロプラストに形質移入し、そこで、抗原を産生させ、その後、さらに、サイトプラスト、ゴースト、または細胞よりも小さい酵母膜抽出物もしくはその所望の抗原を含む画分を製造するための当業者に知られた技術を用いて、該微生物またはスフェロプラストを操作することによって組換え的に製造されうる。
【０１０５】
組換え酵母ビヒクルの製造および該酵母ビヒクルによる抗原の発現に有効な条件には、酵母株を培養する効果的な培地が含まれる。効果的な培地は、一般的には、適切な塩、ミネラル、金属、および、ビタミンや増殖因子のような他の栄養素に加えて、吸収可能な炭化水素源、窒素源、およびリン酸源を含む水溶性の培地である。該培地は、複雑な栄養素を含んでいてもよいし、確立された最小培地でもよい。本発明の酵母株は、バイオリアクター、三角フラスコ、試験管、マイクロリットル皿（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ  ｄｉｓｈｅｓ）、およびペトリ皿を含む様々な容器で培養することができるが、これらに限定されるものではない。培養は、該酵母株にとって適した温度、ｐＨ、および酸度濃度で行われる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内でうまく設定できる（例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照）。
【０１０６】
本発明の一実施形態では、酵母ビヒクルにおいて組換え的に抗原を発現させる代わりに、酵母ビヒクルを、タンパク質もしくはペプチド抗原、または炭化水素もしくは抗原として作用する他の分子とともに、細胞内に搭載させる。続いて、細胞内に抗原を含む酵母ビヒクルを、患者に投与するか、もしくは、樹状細胞のような担体に搭載させる（以下に述べる）。本明細書で用いられる場合、ペプチドは、約３０〜５０のアミノ酸と同じかそれよりも少ないアミノ酸配列を含む。一方、タンパク質は、約３０〜５０のアミノ酸よりも多いアミノ酸配列を含む。また、タンパク質は、多量体であってもよい。抗原として有効なタンパク質またはペプチドは、Ｔ細胞エピトープと同じ程度に小さい（すなわち、長さが５アミノ酸よりも長い）。また、複数のエピトープ、タンパク質断片、全長タンパク質、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質を含むものよりも大きい適切なサイズである。ペプチドおよびタンパク質は、天然由来であってもよいし、合成されたものであってもよい。また、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリセロホスファチジルイノシトールによる付加のような修飾を含んでいてもよい。なお、修飾は、上記に限定されるものではない。ペプチドおよびタンパク質は、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、ファゴサイトーシス、凍結融解サイクル（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅｓ）、および浴超音波処理のような当業者に知られる技術を用いて、本発明の酵母ビヒクルに直接挿入されてもよい。ペプチド、タンパク質、炭化水素、もしくは他の分子が直接搭載された酵母ビヒクルには、スフェロプラスト、ゴースト、もしくはサイトプラストに加えて、無傷酵母が含まれる。その場合、製造後で、樹状細胞に搭載される前に抗原が搭載される。これとは別に、無傷酵母に抗原を搭載し、その後、該無傷酵母からスフェロプラスト、ゴースト、サイトプラスト、または細胞よりも小さい粒子を調製してもよい。この実施形態においては、例えば、微生物、哺乳腫瘍細胞もしくはその一部を搭載することによって抗原を提供することで、酵母ビヒクルにあらゆる数の抗原、少なくとも１、２、３、４、もしくは数百もしくは数千までの整数個の抗原を搭載することができる。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、抗原は、上記酵母ビヒクルに物理的に結合される。抗原の酵母ビヒクルへの物理的な結合は、当技術分野における適切な方法によって達成できる。該方法には、共有結合させる方法および非共有結合させる方法が含まれる。具体的には、酵母ビヒクルの外側表面への抗原の化学的架橋、または抗体やその結合相手を用いることによる酵母ビヒクルの外側表面への抗原の生物学的な結合が含まれるが、これらに限定されるものではない。化学的架橋は、例えば、グルタルアルデヒド結合、光親和性ラベル、カルボジイミド処理、ジスルフィド結合を形成可能な化学物質処理、および当技術分野で標準的な他の架橋化学物質を含む方法で達成することができる。これとは別に、酵母膜の脂質二重膜の外側表面の電荷、もしくは細胞壁の組成を変化させる化学物質を、酵母ビヒクルと接触させてもよい。これにより、該酵母の外側表面は、特定の電荷特性を持つ抗原に融合したり、結合したりしやすくなる。抗体、結合ペプチド、可溶性受容体、および他のリガンドのような標的剤は、融合タンパク質として抗原に取り込まれてもよいし、さもなければ、上記酵母ビヒクルに抗原が結合するように抗原と結合してもよい。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、例えば、緩衝液や他の適切な製剤中で、上記酵母ビヒクルと抗原とを一緒に穏やかに混合することによって、上記酵母ビヒクルおよび抗原は、互いに、より受動的に、非特異的に、もしくは非共有結合機構によって結合してもよい。本発明の一実施形態では、上記酵母ビヒクルおよび抗原は共に、樹状細胞もしくはマクロファージのような担体の細胞内に搭載され、本発明の治療用組成物もしくはワクチンを形成する。これとは別に、本発明の抗原（すなわち、本発明の新規なＨＣＶ融合タンパク質）は、酵母ビヒクルの存在なしに、樹状細胞に搭載される。両方の成分を搭載することができる様々な形態の詳細は、後述する。本明細書において用いられる場合、用語「搭載される」およびその派生語は、成分（例えば、酵母ビヒクルおよび／または抗原）の細胞（例えば、樹状細胞）への挿入、導入、または侵入を表す。成分を細胞内に搭載することは、該細胞の細胞内小器官に（例えば、原形質膜を通して、少なくとも細胞質、ファゴソーム、リソソーム、もしくは細胞のある細胞内スペースに）該成分を挿入または導入することを表す。細胞に成分を搭載することは、上記成分を、例えば、エレクトロポレーションにより無理やり細胞に入れたり、あるプロセス（例えば、ファゴサイトーシス）により、該成分が十分に細胞に入りそうな環境に置いたりする（例えば、細胞に接触させたり、細胞近傍に置いたりする）あらゆる技術が意図される。搭載技術には、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、ファゴサイトーシス、および浴超音波処理が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態において、樹状細胞による上記酵母ビヒクルおよび／または抗原のファゴサイトーシスを含む受動的な機構のように、上記酵母ビヒクルおよび／または抗原を樹状細胞に搭載する受動的な機構が用いられる。
【０１０９】
上述したＨＣＶ融合タンパク質は、いずれも、酵母におけるそのようなタンパク質の発現に特に有利なＮ末端および／またはＣ末端の修飾を１つも含まないワクチンに提供されてもよい。そのようなＨＣＶ融合タンパク質は、例えば、従来のアジュバントと、該融合タンパク質とを組み合わせたり、そんな融合タンパク質で樹状細胞をパルシングしたり、そのような融合タンパク質をコードする核酸分子を含むＤＮＡ、核酸、もしくはウィルスベクターを提供したり、または本発明の特定のＨＣＶ融合タンパク質（例えば、本発明のＥ１−Ｅ２融合タンパク質）からなる偽ウィルス粒子を構築したりするといった、他の非酵母ベースのワクチンに有用である。
【０１１０】
したがって、本発明のさらに別の実施形態は、動物を、ＨＣＶ感染もしくはそのような感染により生じる症状を予防するための組成物に関する。上記組成物（ワクチンであってもよい）は、（ａ）１つもしくはそれ以上の、上述したＨＣＶ融合タンパク質（本明細書に記載されるＮ末端およびＣ末端の修飾はあってもなくてもよい）のいずれかと、（ｂ）薬学的に許容可能な運搬手段（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）（薬学的に許容可能な賦形剤もしくはアジュバントを含む）とを含む。
【０１１１】
本発明のさらに別の実施形態は、ＤＮＡワクチンもしくはウィルスベクターワクチンのような核酸ベースのワクチンに関する。該ワクチンは、本明細書に記載されるようなＨＣＶ融合タンパク質（本明細書に記載されるＮ末端およびＣ末端の修飾はあってもなくてもよい）をコードする核酸構成物（例えば、ウィルスベクターもしくは他の核酸分子）を含む。該ワクチンは、さらに、薬学的に許容可能なあらゆる運搬手段（薬学的に許容可能な賦形剤もしくはアジュバントを含む）を含んでもよい。
【０１１２】
本発明の別の実施形態は、本発明の様々なＨＣＶ融合タンパク質、特に、本明細書に記載のＥ１−Ｅ２融合タンパク質、からなる偽ウィルス粒子に関する。この場合も、本発明のウィルスベースのワクチンに関連して、特に有効なＮ末端もしくはＣ末端の修飾は、含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０１１３】
本発明の一実施形態において、組成物もしくはワクチンはまた、生物学的応答の修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）化合物を含んでいたり、または、そのような修飾因子を製造する能力を有していたり（すなわち、そのような修飾因子をコードする核酸分子が形質移入されていたいり）してもよい。例えば、酵母ビヒクルは、少なくとも１つの抗原と、少なくとも１つの生物学的応答の修飾因子化合物とが形質移入されたり、または、該抗原と修飾因子とが搭載されたりしてもいてもよい。また、本発明のワクチンもしくは組成物は、少なくとも１つの生物学的応答の修飾因子と共に、投与されてもよい。なお、そのような修飾因子は、本発明にかかる免疫応答を誘発させるためには、必須ではない。生物学的応答の修飾因子には、免疫応答を調節する化合物（免疫原性化合物とも称される）が含まれる。ある生物学的応答の修飾因子は、保護的な免疫応答を刺激することができる。一方、別の生物学的応答の修飾因子は、他の有害な免疫応答を抑制することができる。また、ある生物学的応答の修飾因子は、細胞性免疫応答を好適に増強する。すなわち、体液性免疫と比べて細胞性免疫のレベルを向上させるように免疫応答を刺激することができる。一方、別の生物学的応答の修飾因子は、体液性免疫応答を好適に増強する。すなわち、細胞性免疫と比べて体液性免疫のレベルを向上させるように免疫応答を刺激することができる。細胞性免疫と体液性免疫とを区別して、免疫応答の刺激もしくは抑制を測定する方法は、当業者に、数多く知られている。
【０１１４】
適切な生物学的応答の修飾因子には、サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体、低分子薬剤、および他の増殖モジュレーターが含まれ、具体的には、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）ステロイド、プロスタグランジン、およびロイコトリエンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。酵母ビヒクルが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、および／またはＩＦＮ−γを発現（換言すれば、製造）し、おそらく分泌する能力は、細胞性免疫を好適に増強する。一方、酵母ビヒクルが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および／またはＩＬ−１０を発現し、おそらく分泌する能力は、体液性免疫を好適に増強する。他の適切な生物学的応答の修飾因子には、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、アレルギー性Ｔ細胞を放出する）、Ｔ細胞共刺激物質（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ）（例えば、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）、アレムツズマブ（例えば、ＣａｍＰａｔｈ（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３を遮断する（例えば、活性を無効にしたり、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ制御細胞を死滅させたりする）薬剤、Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（Ａｌｄａｒａ（商標））、ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニスト、もしくはＴＬＲ−９（例えば、樹状細胞、マクロファージ、および他の専らの抗原提示細胞の数、または活性状態を向上させる薬剤）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような生物学的応答の修飾因子は、当技術分野でよく知られており、公然に入手可能である。
【０１１５】
本発明の組成物および治療用ワクチンは、さらに、ＨＣＶ感染から対象物を保護するのに有効な他のあらゆる化合物、またはそのような感染のあらゆる症状を治療したり改善したりするあらゆる化合物を含む。上述したように、本発明はまた、例えば、あらゆる従来の組成物もしくはワクチン、または非酵母ベースの組成物もしくはワクチンのように、本発明の酵母ビヒクルを含まない組成物もしくはワクチンにおいて、本明細書に記載のあらゆるＨＣＶ融合タンパク質、またはそのようなＨＣＶ融合タンパク質をコードする核酸分子を使用する方法を含む。そのような組成物は、上記ＨＣＶ融合タンパク質に加えて、アジュバントのような薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。さらに、本発明の酵母ベースのワクチンは、薬学的に許容可能な担体と共に、提供されてもよい。
【０１１６】
本明細書において用いる場合、薬学的に許容可能な担体は、本発明の方法において、生体内もしくは生体外の適切な部位に、ＨＣＶ融合タンパク質を運搬するのに適したあらゆる物質もしくは媒体を表す。そのような担体には、アジュバント、賦形剤、またはあらゆるタイプの運搬手段もしくは担体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
本発明によれば、アジュバントは、一般的に、通常、動物の特定の抗原に対する免疫応答を増強する物質である。適切なアジュバントには、フロインドのアジュバント、他の細菌細胞壁成分、アルブミンベースの塩、カルシウムベースの塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清タンパク質、ウィルス外殻タンパク質、他の細菌由来の調製物、γインターフェロン、ハンタータイターマックス（Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  Ｔｉｔｅｒｍａｘ）アジュバントのようなブロック共重合体アジュバント（ＣｙｔＲｘ（商標）、Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴから入手可能）、並びにＱｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）のようなサポニンおよびその誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
担体は、一般的に、治療される動物における治療用組成物の半減期を向上させる化合物である。適切な担体には、高分子で放出が制御された製剤、生分解性移植物、リポソーム、オイル、エステル、およびグリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
本発明の治療用組成物は、１つもしくはそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。本明細書で用いられる場合、薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明の方法において、生体内もしくは生体外の適切な部位に、治療用組成物を有効に運搬するのに適切なあらゆる物質を表す。好ましい薬学的に許容可能な賦形剤は、組成物（または、酵母ビヒクルもしくは該酵母ビヒクルを含む樹状細胞）が、身体における標的細胞、標的組織、もしくは標的部位に到達し、該標的部位（なお、該標的部位は、全身であってもよい）で免疫応答を誘発することができる形態に、該組成物を維持することができる。本発明の適切な賦形剤には、ワクチンをある部位に輸送するが、特異的にはターゲティングさせない賦形剤または製剤（ｆｏｒｍｕｌａｒｉｅｓ）（本明細書では、非ターゲティング担体ともいう）が含まれる。薬学的に許容可能な賦形剤には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、血清含有溶液、ハンクス液、他の水溶性で生理学的にバランスのとれた溶液、オイル、エステル、およびグリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。水溶性の担体には、例えば、化学安定性、および等張性を向上させることによって、投与された者の生理学的な状態に近づけるために必要とされる適切な補助物質が含まれてもよい。適切な補助物質には、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、並びに、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および重炭酸緩衝液を製造するために用いられる他の物質が含まれる。また、補助物質は、チメロサール、ｍ−クレゾールもしくはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールのような防腐剤も含まれる。
【０１２０】
＜本発明の方法＞
本発明の別の実施形態は、動物をＨＣＶ感染、もしくはそれにより生じる疾患から保護するための方法に関する。該方法には、ＨＣＶ感染している、もしくはＨＣＶ感染する危険がある動物に、本明細書に記載した本発明のワクチンもしくは組成物を投与する工程を含む。これにより、該動物におけるＨＣＶ感染もしくは、ＨＣＶによって引き起こされる少なくとも１つの症状を軽減もしくは抑制する。
【０１２１】
本発明のさらに別の実施形態は、動物において、抗原特異的な体液性免疫応答および／または抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発する方法に関する。該方法は、本明細書に記載したような本発明のワクチンもしくは組成物を動物に投与することを含む。本発明の方法は、動物において、抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発することが好ましい。
【０１２２】
上記実施形態において、上記ワクチンもしくは組成物は、（１）（ａ）酵母ビヒクルと、（ｂ）１つもしくはそれ以上の、上述のＨＣＶ融合タンパク質のいずれかとを含む組成物、および／または（２）（ａ）１つもしくはそれ以上の、上述のＨＣＶ融合タンパク質のいずれかと、（ｂ）薬学的に許容可能な運搬手段（薬学的に許容可能な賦形剤もしくはアジュバントを含む、または、それらからなってもよい）と含む組成物、および／または（３）（ａ）単離された核酸分子（例えば、ＤＮＡ構築物、ベクター、ウィルスベクター）、および／または（４）（ａ）酵母ビヒクルと、（ｂ）１つもしくはそれ以上の、上述のＨＣＶ融合タンパク質のいずれかとを含む（でパルスされた）単離された樹状細胞（自己の樹状細胞）、および／または（５）本明細書に記載のＨＣＶ融合タンパク質を含むＥ１−Ｅ２のいずれかからなるＨＣＶ偽ウィルス粒子を含むことができる。
【０１２３】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載されて本発明のウィルスもしくは組成物は、従来のあらゆるワクチンもしくは組成物を含む、１つもしくはそれ以上の他のワクチンまたは免疫療法用組成物を投与することを含む方法で投与することができる。例えば、そのような他のワクチンまたは免疫療法用組成物には、ＨＣＶ抗原をコードするＤＮＡワクチン、もしくはＨＣＶ抗原を含む他のウィルスベクターのような、他のあらゆる抗原含有組成物、抗原をコードする組成物、または抗原を発現する組成物が含まれうる。ワクチン用のウィルスベクターは、当技術分野で知られており、ポックスウィルス（ワクシニア、カナリア、アビポックス）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、アルファウィルス（シンドビス、ＶＥＥ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質ベースのワクチンを含む、他のタイプのワクチンもまた、この実施形態に包含される。ある局面では、そのような従来のワクチン、本発明の一部ではないワクチン、または酵母ビヒクルを含まない本発明のワクチン（薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、本発明の新規なＨＣＶ融合タンパク質を含むワクチン、または、本発明の新規なＨＣＶ融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチン）は、ＨＣＶ抗原に対する対象物の免疫応答を初回刺激するために、該対象物に、最初に投与されうる。続いて、本発明のワクチンもしくは組成物、特に、本発明の酵母ベースのワクチン、は、免疫応答を追加免疫するために、該対象物に投与されうる。その代わりに、本発明のワクチンもしくは組成物、特に本発明の酵母ベースのワクチンを、免疫応答を初回刺激するために、該対象物に投与する。そして、他の従来のワクチンもしくは組成物（例えば、非酵母ベースのワクチン本発明の新規なＨＣＶ融合タンパク質、または本発明の新規なＨＣＶ融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチン）を、該免疫応答を追加免疫するために用いてもよい。
【０１２４】
本発明の治療用組成物もしくはワクチンを用いる方法は、動物において、免疫応答を誘発することが好ましい。これにより、該動物を、ＨＣＶ感染、またはＨＣＶ感染による引き起こされる疾患異常もしくは症状から保護する。本明細書において用いられる場合、「疾患から保護される」との表現は、疾患の症状の軽減、疾患の発生の抑制、および／または疾患の重症度の軽減を表す。動物を保護することは、動物に投与したとき、疾患が、疾患の症状、兆候、原因を引き起こすのを防止したり、治療したり、および／または緩和したりする、本発明の治療用組成物の能力を表す。したがって、動物を疾患から保護することは、疾患の発生の防止（予防処理、予防ワクチン）、および疾患を有する、もしくは疾患の初期症状を呈する動物の治療（治療処理、治療ワクチン）の両方を含む。特に、動物を疾患から保護することは、有益もしくは保護的な免疫応答を誘発することにより、該動物において免疫応答を誘発することによって、達成される。該有益もしくは保護的な免疫応答は、ある例では、過反応もしくは有害な免疫応答をさらに抑制（例えば、低減、阻害、または遮断）する。用語「疾患」は、動物の正常な健康から、なんらか逸脱していることを表し、逸脱が起こる状態（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝子欠損等）であるが、症状は明確ではない状態に加えて、疾患の症状が存在する状態を含む。
【０１２５】
一実施形態において、本発明のワクチンは、いずれも、ＨＣＶに感染している個体もしくは個体群に投与される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、いずれも、ＨＣＶに感染する危険がある個体もしくは個体群に投与される。そのような個体は、例えば、正常なもしくは無傷な個体群よりもＨＣＶ感染する危険が高いと同定された群を含む。そのような群は、あらゆる適切なパラメーターによって定義されうる。別の実施形態において、本発明のワクチンは、いずれも、ＨＣＶに感染していることが知られているか、感染状態が予測されているか、もしくは感受的であるかにかかわらず、あらゆる個体または個体群に投与される。
【０１２６】
より具体的には、本明細書に記載されるワクチンは、本発明の方法によって動物に投与されると、疾患の軽減（例えば、疾患の少なくとも１つの症状もしくは臨床的兆候の軽減）、疾患の排除、原発疾患の発生の結果生じる後遺症の軽減、疾患の予防、および疾患に対する細胞性免疫のエフェクタの刺激を引き起こす結果をもたらすことが好ましい。
【０１２７】
本発明は、本発明の組成物もしくはワクチンの動物への運搬を含む。投与過程は、生体外もしくは生体内で行われうる。生体外への投与は、例えば、酵母ビヒクルおよび抗原が細胞に搭載され、該細胞が患者に戻すことが可能な条件で、患者から取り出された細胞（樹状細胞）群に、本発明の組成物を投与するといった、患者の外側で、制御工程の一部を実行することを表す。本発明の治療用組成物は、患者に戻してもよいし、適した投与形態によって患者に投与してもよい。
【０１２８】
酵母ビヒクルおよび抗原が搭載された樹状細胞、酵母ビヒクルのみ、新規なＨＣＶ融合タンパク質を含む組成物、ＨＣＶ融合タンパク質のみ、または、本発明にかかる担体と組み合わせたＨＣＶ融合タンパク質を含む組成物もしくはワクチンの投与は、全身、粘膜、および／または標的部位の位置近傍（例えば、腫瘍近傍）である。好ましい投与経路は、予防もしくは治療する症状、用いる抗原、および／または標的細胞群もしくは組織に応じて、当業者には明らかである。好ましい投与方法には、静脈投与、腹腔内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、冠内投与、動脈内投与（例えば、頚動脈内投与）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、頭蓋内投与、脊髄内投与、眼内投与、耳内投与、鼻腔内投与、経口投与、肺内投与、カテーテル注入、および組織への直接注射が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい投与経路には、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）投与、筋肉内投与、経皮投与、吸引、鼻腔内投与、経口投与、眼内投与、関節内投与、頭蓋内投与、および脊髄内投与が含まれる。非経口送達には、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、心房カテーテル、およびｖｅｎａｌカテーテル経路が含まれる。耳送達には、点耳薬が含まれる。鼻腔送達には、点鼻薬また鼻腔内注射が含まれる。また、眼内送達には、点眼剤が含まれる。エアロゾル（吸入）送達は、当技術分野で標準的な方法（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １８９：１１２７７−１１２８１，１９９２を参照、なお、該文献は、参照として全体が本明細書に組み込まれる。）を用いて実施することができる。例えば、一実施形態において、本発明の組成物もしくはワクチンは、適切な吸入機器もしくは噴霧器を用いた噴霧送達に適した組成物に製剤化されうる。経口送達には、口を通して摂取されうる固体や液体が含まれる。また、経口送達は、粘膜の免疫性を発達させるのに有効である。酵母ビヒクルを含む組成物は、食品や飲料製品に製剤化されることに加えて、例えば、タブレットやカプセルとして、経口送達用に容易に調製できる。粘膜の免疫性を調節する他の投与経路は、ウィルス感染の治療に有効である。そのような経路には、気管支内経路、皮内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、他の吸入経路、直腸経路、皮下経路、局所経路、経皮経路、膣経路、および尿道経路が含まれる。
【０１２９】
上記の方法のいずれかの一実施形態において、上記ワクチンは、気道に投与される。別の実施形態では、上記ワクチンは、投与の非経口経路によって投与される。さらに別の実施形態では、上記ワクチンは、樹状細胞もしくはマクロファージをさらに含む。該ワクチンでは、上記融合タンパク質を発現する酵母ビヒクルは、細胞外で、樹状細胞もしくはマクロファージに送達される。また、該ワクチンにおいて、ＨＣＶ抗原を発現する酵母ビヒクルを含む上記樹状細胞もしくはマクロファージは、上記動物に投与される。本実施形態のある局面では、樹状細胞もしくは酵母ビヒクルには、フリーの抗原が付加的に搭載されている。ある局面では、上記ワクチンは、治療用ワクチンとして投与される。別の局面では、上記ワクチンは、予防ワクチンとして投与される。
【０１３０】
本発明によれば、効果的な投与プロトコール（すなわち、効果的な方法で、ワクチンもしくは治療用組成物を投与すること）は、疾患もしくは異常をもつ動物、または疾患もしくは異常にかかる危険がある動物において、免疫応答を誘発する結果を招く適切な投与パラメーターおよび投与様式を含む。効果的な投与パラメーターは、特定の疾患に関する技術で標準的な方法を用いて決定することができる。そのような方法には、例えば、生存率、副作用（すなわち、毒性）、および疾患の進行もしくは退行が含まれる。
【０１３１】
本発明によれば、一回の適切な投与量は、適切な期間にわたって、１倍もしくはそれ以上投与したときに、動物に抗原特異的な免疫応答を誘発させることができる投与量である。投与量は、治療される疾患もしくは異常に依存して変更することができる。例えば、一実施形態において、本発明の酵母ビヒクルの１回の投与量は、該組成物を投与される生物の体重１ｋｇあたり、約１×１０５〜５×１０７酵母細胞当量である。好ましい実施形態において、１投与あたりの酵母細胞は、生物の重量に調整されない。本実施形態では、本発明の酵母ビヒクルの１回の投与量は、１投与当たり、約１×１０４〜約１×１０９酵母細胞である。より好ましくは、本発明の酵母ビヒクルの１回の投与量は、１投与あたり（つまり、生物あたり）、約０．１Ｙ．Ｕ．（１×１０６細胞）〜約１００Ｙ．Ｕ．（１×１０９細胞）である。この中には、０．１×１０６細胞ずつ増加させたあらゆる中間の投与量（つまり、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６・・・）が含まれる。この範囲の投与量は、マウス、サル、ヒト等を含むあらゆる大きさのあらゆる生物において効果的に用いることができる。
【０１３２】
樹状細胞に上記酵母ビヒクルおよび抗原を搭載することによって、上記ワクチンを投与するとき、本発明のワクチンの１回の投与量は、個体あたり、約０．５×１０６〜約４０×１０６樹状細胞であることが好ましく、約１×１０６〜約２０×１０６樹状細胞であることがより好ましく、約１×１０６〜約１０×１０６樹状細胞であることがさらに好ましい。
【０１３３】
上記ワクチンが本発明の融合タンパク質および担体を含むとき、好ましい１回の投与量は、動物の体重１ｋｇあたり、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇであることが好ましく、約１μｇ〜約１０ｍｇであることがより好ましく、約５μｇ〜約７ｍｇであることがさらに好ましく、約１０μｇ〜約５ｍｇであることが特に好ましい。また、上記薬剤がエアロゾルによって送達される場合、動物の体重１ｋｇあたり、１回の投与量は、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇであることが特に好ましい。上記薬剤が非経口的に送達される場合、動物の体重１ｋｇあたり、１回の投与量は、約０．１μｇ〜約１０μｇであることが特に好ましい。
【０１３４】
治療用組成物の「追加免疫剤（ｂｏｏｓｔｅｒ）」もしくは「追加免疫（ｂｏｏｓｔ）」は、上記抗原に対する免疫応答が弱くなったとき、または、免疫応答を誘発したり、特定の抗原もしくは抗原群に対する記憶応答を誘導したりする必要があるときに、投与することが好ましい。追加免疫剤は、もともとの投与から、約２週間〜数年間投与されうる。一実施形態では、投与スケジュールは、約１ヶ月〜約６ヶ月の期間にわたって、個体の体重１ｋｇあたり、約１×１０５〜約５×１０７酵母細胞当量の組成物が、約１〜４倍投与されるものである。本発明の方法では、ワクチンおよび治療用組成物は、あらゆる脊椎動物を含む動物、特に、霊長類、家畜、および家庭用ペットを含む（これらに限定されない）脊椎動物網哺乳類のいずれかに、投与することができる。家畜には、食される動物、または有用な製品を生産する動物（例えば、ウール製品用の羊）を含む。保護する好ましい動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれるが、特に、ヒトであることが好ましい。本発明によれば、用語「患者」もしくは「被験体」は、本明細書に記載されているような診断、予防、もしくは治療の処置の対象である動物を記載するために用いられる。
【０１３５】
＜単離された融合タンパク質、核酸および細胞＞
本発明の別実施形態は、本明細書に記載されているように、ＨＣＶ抗原を含む単離された融合タンパク質のいずれかを含む単離されたタンパク質を含有する。また、本発明には、そのようなタンパク質のいずれかをコードする単離された核酸分子、そのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子、並びに、そのような核酸分子もしくは組換え核酸分子を含有する、またはこれら核酸分子が形質移入／形質転換された細胞、およびベクター（ウィルスベクターを含む）が含まれる。
【０１３６】
本明細書で用いられる場合、本発明における単離されたタンパク質もしくはポリペプチドの対象には、全長タンパク質、融合タンパク質、または、そのようなタンパク質のあらゆる断片、ドメイン、立体配置的なエピトープ、もしくはホモログが含まれる。より具体的には、本発明にかかる単離されたタンパク質は、自然環境から取り出された（すなわち、人に操作された）タンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）である。例えば、精製されたタンパク質、部分精製されたタンパク質、組換え的に製造されたタンパク質、および合成的に製造されたタンパク質が含まれる。このように、「単離された」とは、該タンパク質が精製された程度を反映するものではない。本発明の単離されたタンパク質は、組換え的に製造されることが好ましい。本発明によれば、用語「修飾」および「変異」は、特に、本明細書に記載されているタンパク質もしくは該タンパク質の一部のアミノ酸配列（または、核酸配列）の修飾／変異に関して、交換可能に用いられる。
【０１３７】
本明細書において用いられる場合、用語「ホモログ」は、天然に生じるタンパク質もしくはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」もしくは「野生型」タンパク質）にわずかな変異が導入された結果、該天然に生じるタンパク質もしくはペプチドとは異なるタンパク質もしくはペプチドが意図される。しかし、該ホモログは、該天然に生じる型の基本的なタンパク質構造および側鎖構造を維持している。そのような変化には、１もしくは数個のアミノ酸側鎖の変化、欠失（例えば、切断されたタイプのタンパク質もしくはペプチド）、挿入および／または置換を含む１もしくは数個のアミノ酸の変化、１または数個の原子の立体的配置の変化、および／または、あまり重要でない誘導体化が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記誘導体化には、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加が含まれるが、これらに限定されるものではない。ホモログは、天然に発生するタンパク質もしくはペプチドと比較して、強化された、減衰された、もしくは実質的に同一、のいずれかの特性を有する。ホモログは、タンパク質生産法として従来知られている技術を用いて製造することができる。該タンパク質生産法には、タンパク質のアゴニスト、またはタンパク質のアンタゴニストが含まれる。ホモログには、単離された、天然に生じるタンパク質への直接の修飾；直接のタンパク質合成；または、例えば、ランダムもしくはターゲティングされた変異の誘発に効果を示す古典的技術もしくは組換えＤＮＡ技術を用いた、タンパク質をコードする核酸配列への修飾；が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】
本発明のタンパク質および／または該タンパク質のホモログ、断片、もしくは他の部分の最小サイズは、ある局面では、必要な生物学的活性を有するのに十分な大きさである。例えば、本発明の融合タンパク質または組成物における抗原もしくは免疫原、または、インビトロアッセイの標的となりうる。一実施形態において、本発明のタンパク質は、長さが、少なくとも約８アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、約１２５アミノ酸、約１５０アミノ酸、約１７５アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約３５０アミノ酸、約４００アミノ酸、約４５０アミノ酸、約５００アミノ酸、約５５０アミノ酸、または約６００アミノ酸等である。整数（例えば、８、９、１０、・・・２５、２６、・・・１０２、１０３）であれば、８アミノ酸から本発明のタンパク質の全長、またはタンパク質または該タンパク質の一部を組み合わせた全長までの長さ、もしくはそれよりも長い長さなど、いかなる長さであってもよい。タンパク質の一部、機能ドメイン、もしくはそれらの生物学的活性を有する断片もしくは有用な断片、全長タンパク質、または必要に応じて付加配列が付加されたもの（例えば、融合タンパク質配列）を含め、タンパク質の最大のサイズは、現実的な限界を除いては、制限はない。本発明にかかる好ましい融合タンパク質は、本明細書に記載された融合タンパク質のいずれかを含む。本発明に包含される典型的な融合タンパク質には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、本質的に該アミノ酸配列からなる融合タンパク質、または該アミノ酸配列からなる融合タンパク質が含まれる。様々なＨＣＶタンパク質配列が当技術分野でよく知られているので、他の融合タンパク質配列は、本明細書に記載された手引きによれば、当業者には明らかであるだろう。
【０１３９】
本発明はまた、本明細書に記載された融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む核酸分子、本質的に該核酸配列からなる核酸分子、または該核酸配列からなる核酸分子を含む。本発明によれば、単離された核酸分子は、自然環境から取り去れた核酸分子（すなわち、人に操作された核酸分子）である。その自然環境は、核酸分子を天然に有するゲノムまたは染色体が存在する自然環境である。したがって、「単離された」とは、該核酸分子が精製された程度を反映するものではない。しかし、該分子は、該核酸分子を天然に有するゲノム全体もしくは染色体全体を含まないことを示す。単離された核酸分子には、遺伝子が含まれる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、該遺伝子と関連するコード領域および制御領域を含む。しかし、同一の染色体上に天然に見出される付加的な遺伝子ではない。単離された核酸分子はまた、天然では通常フランクしない付加的な核酸がフランクした特定の核酸配列を含んでいてもよい。すなわち、該配列の５’末端および／または３’末端に、天然では通常フランクしない付加的な核酸がフランクした特定の核酸配列（すなわち、異種配列）を含んでいてもよい。単離された核酸分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体（例えば、ｃＤＮＡ）を含んでいてもよい。「核酸分子」との表現は、本来、物質としての核酸分子をさす。また、「核酸配列」との表現は、本来、核酸分子におけるヌクレオチドの配列を指す。これら２つの表現は、特にタンパク質もしくはタンパク質のドメインをコードすることができる核酸分子または核酸配列に関しては、交換可能に用いられる。
【０１４０】
本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて製造されることが好ましい。単離された核酸分子には、天然の核酸分子およびそのホモログが含まれる。該ホモログには、天然のアリルの変種、および修飾された核酸分子が含まれる。該修飾では、修飾により所望の効果が得られるように、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または逆位されている。タンパク質のホモログ（例えば、核酸ホモログによってコードされるタンパク質）の詳細は、上述した。
【０１４１】
核酸分子のホモログは、当業者に知られた多くの方法を用いて製造することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。例えば、核酸分子は、部位特異的変異誘発、変異を誘発させるための核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素消化、核酸断片の連結、核酸配列の選択された領域のＰＣＲ増幅および／または変異誘発、オリゴヌクレオチドの合成、および核酸分子の混合物を調製ための混合物群の連結、並びにそれらの組み合わせのような、古典的な変異誘発技術、および組換えＤＮＡ技術を含む様々な技術を用いて修飾することができるが、該技術は上記に限定されるものではない。核酸分子のホモログは、核酸によってコードされるタンパク質の機能に基づくスクリーニング、および／または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによって修飾された核酸の混合物から選抜することができる。
【０１４２】
本発明の融合タンパク質を発現する組換え核酸分子は、本明細書に記載された１またはそれ以上の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列の少なくともいずれか１つを含む分子である。該核酸配列には、形質移入された細胞において、該核酸分子の発現を効果的に制御することができる、少なくともいずれか１つの転写制御配列が機能可能に連結されている。「核酸配列」との表現は、本来、核酸分子におけるヌクレオチドの配列を指す。これら２つの表現は、特にタンパク質もしくはタンパク質のドメインをコードすることができる核酸分子または核酸配列に関しては、交換可能に用いられる。さらに、「組換え分子」との表現は、本来、転写制御配列に機能できるように連結された核酸分子をさす。しかし、動物に投与される、「核酸分子」との表現と交換可能に用いることができる。
【０１４３】
組換え核酸分子には、あらゆる核酸配列、典型的には異種配列である組換えベクターが含まれる。該核酸配列には、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に機能可能に連結されている。また、該核酸配列は、上記融合タンパク質を組換え的に製造することを可能にする。また、該核酸配列は、本発明にかかる宿主細胞に該核酸分子を運搬することができる。そのようなベクターは、該ベクターに挿入されている単離された核酸分子の近傍には、天然に見出されない核酸分子を含む。該ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよい。また、原核型または真核型のいずれであってもよい。本発明では、該ベクターは、ウィルスまたはプラスミドであることが好ましい。組換えベクターは、クローニング、配列解読、および／または、さもなければ、核酸分子の操作に用いることができる。また、該ベクターは、例えば、ＤＮＡワクチンもしくはウィルスベクターベースのワクチンとして、そのような分子の運搬に用いることができる。組換えベクターは、核酸分子の発現に用いることが好ましい。つまり、該組換えベクターは、発現ベクターということもできる。好ましい組換えベクターは、形質移入された宿主細胞において発現することができる。
【０１４４】
本発明の組換え分子において、核酸分子は、発現ベクターに機能可能に連結されている。該発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製オリジン、および宿主細胞と適合し、本発明の核酸分子の発現を制御する他の制御配列を含む。特に、本発明の組換え分子は、１またはそれ以上の転写制御配列に機能できるように連結された核酸分子を含む。「機能できるように連結された」との表現は、宿主細胞に形質移入（形質転換、形質導入、または形質移入）されたときに、核酸分子が発現するように、該核酸分子に転写制御配列が連結されていることを指す。
【０１４５】
転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびレプレッサー配列のような転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明にかかる宿主細胞において、機能することができる、あらゆる転写制御配列を含む。様々な適切な転写制御配列が、当業者には知られている。
【０１４６】
本発明によれば、用語「形質移入」は、外来核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）が細胞に挿入されうるあらゆる方法を意図して用いられる。核酸分子を藻類、バクテリア、および酵母ような微生物の細胞、もしくは植物細胞に導入することを意図して用いられるとき、用語「形質転換」が、用語「形質移入」と交換可能に用いられる。微生物システムおよび植物システムでは、用語「形質転換」は、微生物または植物によって外来核酸が獲得されることによる遺伝変化を述べるために用いられ、本質的に、用語「形質移入」と同義語である。したがって、形質移入技術には、形質転換、細胞の化学処理、パーティクルガン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４７】
本発明の組換え核酸分子において有用な組換えベクターの１種は、組換えウィルスベクターである。そのようなベクターは、本発明の融合タンパク質をコードする組換え核酸配列を含む。該融合タンパク質は、投与後、動物内の宿主細胞内、もしくは生体外で発現させたウィルスコートにパッケージングされている。アルファウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、およびレトロウィルスに基づく組換えウィルスベクターを含め、多くの組換えウィルスベクターを用いることができるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいウィルスベクターは、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルスに基づくものである。遺伝子の運搬に適したウィルスベクターは、当技術分野ではよく知られており、当業者によって、本発明に用いるためのウィルスベクターは選択されうる。現在のウィルスベクターの詳細については、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９８，ｐｐ．５５５−５９０に記載されている。該文献は、参照として本明細書に完全に組み込まれる。
【０１４８】
本発明にかかる組換え核酸分子を形質移入するのに適した宿主細胞には、あらゆる動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）が含まれる。一実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の融合タンパク質が形質移入され、該融合タンパク質を発現している腫瘍細胞を含む動物細胞である。そのような細胞は、実施例に例示されており、例えば、本発明のワクチンもしくは組成物によって誘導される抗原特異的なＴ細胞応答を評価するために有効である。ＨＣＶ抗原に対して向けられた他のワクチンまたは組成物は、そのような形質移入された腫瘍細胞を試験することができる。
【０１４９】
以下の実験結果は、例証を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例〕
〔実施例１〕
以下の実施例はＧＩ−５００５、すなわち、本発明に係る切断ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明する。
【０１５０】
ＧＩ−５００５  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、銅誘導性プロモーターであるＣＵＰ１の制御下で、ＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するように設計された。ＨＣＶ遺伝子（遺伝子型  １ａ、Ｈ７７株、ｃＤＮＡはＮＩＨから提供された。）の２領域を、遺伝子産物を産生するためにＰＣＲで増幅した。ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（ＨＣＶ  ポリタンパク質の番号付けを括弧書きで示す。ここでは、配列番号２によって表される。）：１）プロテアソームの分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ；２）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼタンパク質のアミノ酸第８９位〜第３５０位（第１１１５位〜第１３７６位）；３）クローニングにおいて導入される単一のトレオニンアミノ酸残基；４）ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質のアミノ酸第２位〜第１４０位（第２位〜第１４０位）；および５）Ｃｏｒｅ変異体の親水性を向上させるための配列ＥＤ。
【０１５１】
ＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質の発現は、銅により誘導され、熱により不活性化されたＧＩ−５００５酵母からのライセートをウエスタンブロット法により分析することにより確認された。タンパク質の検出には、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ）またはＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ａｎｏｇｅｎ）を用いた（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。
【０１５２】
〔実施例２〕
以下の実施例はＧＩ−５００３、すなわち、本発明に係る不活性化ＮＳ３酵母ワクチンの設計について説明する。
【０１５３】
ＧＩ−５００３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、銅誘導性プロモーター、ＣＵＰ１の制御下で、不活性化された全長ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質を発現するように設計された。ＨＣＶ遺伝子（遺伝子型１ａ、Ｈ７７株、ｃＤＮＡはＮＩＨより提供された。）の１領域を、遺伝子産物を産生するためにＰＣＲで増幅した。不活性化されたＮＳ３タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（ＨＣＶ  ポリタンパク質の番号付けを括弧書きで示す。ここでは、配列番号４によって表される。）：１）プロテアソームの分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ；２）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼタンパク質のアミノ酸１〜６３１（１０２７〜１６５７）（ＨＣＶポリペプチド残基１１６５のアミノ酸は、タンパク質分解活性を不活性化するためにセリンからアラニンに変えられている。）
ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の発現は、銅により誘導され、熱により不活性化されたＧＩ−５００３酵母からのライセートをウエスタンブロット法により分析することにより確認された。タンパク質の検出には、ＨＣＶ  ＮＳ３に特異的なモノクローナル抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ）を用いた（図１Ａおよび図１Ｂ参照）。
【０１５４】
〔実施例３〕
以下の実施例は本発明に係るＧＩ−５０００シリーズ、すなわち、切断ＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質酵母ワクチンの設計について説明する。
【０１５５】
Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までインフレームで融合された以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（ＨＣＶ  ポリタンパク質の番号付けを括弧書きで示す。ここでは、配列番号６によって表される。）：１）プロテアソームの分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ；２）ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸１〜１５６（１９２〜３４７）；３）ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸１〜３３４（３８４〜７１７）、Ｅ１の３６のＣ末端疎水性アミノ酸、およびＥ２の２９のＣ末端疎水性アミノ酸が、酵母細胞質での蓄積を促進するために、融合タンパク質から除かれている。
【０１５６】
ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２融合タンパク質の発現は、銅により誘導され、熱により不活性化された酵母からのライセートをウエスタンブロット法により分析することにより確認された（図１Ｃ参照）。
【０１５７】
〔実施例４〕
以下の実施例は本発明に係るＧＩ−５０００シリーズ、すなわち、ＴＭドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質酵母ビヒクルの設計について説明する。
【０１５８】
ＮＳ４ｂ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までインフレームでタンデムに配列された以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（ポリタンパク質の番号付けを括弧書きで示す。ここでは、配列番号８によって表される）：１）プロテアソームの分解に対する耐性を付与する配列ＭＡＤＥＡＰ；２）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂのアミノ酸１〜６９（１７１２〜１７８０）；３）ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ｂのアミノ酸１７７〜２６１（１８８８〜１９７２）。ＮＳ４ｂアミノ酸７０〜１７６（１７８１〜１８８７）に相当し、複数の膜貫通ドメインを含有する１０７アミノ酸からなる領域が、酵母の細胞質の蓄積を促進するために、除かれている。
【０１５９】
ＨＣＶ  ＮＳ４ｂ融合タンパク質の発現は、銅により誘導され、熱により不活性化された酵母からのライセートをウエスタンブロット法により分析することにより確認された（図１Ｄ参照）。
【０１６０】
〔実施例５〕
以下の実施例では、ＨＣＶ抗原を発現するＧＩ−５００５酵母ビヒクル（ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭとも称される）を用いたマウスの非臨床薬理学試験：免疫原性テストを説明する。
【０１６１】
ＧＩ−５００５は、酵母発現プラスミドが安定に導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母（ＡＴＣＣから入手したＷ３０３株）からなる。酵母発現プラスミドは、実施例１で説明したように、銅誘導性プロモーター、ＣＵＰ１（配列番号２）の制御下で、ＨＣＶ遺伝子型１ａ由来の切断ＮＳ３遺伝子産物とＣｏｒｅ遺伝子産物との融合タンパク質をコードする。以下の試験では、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス、およびＢＡＬＢ／ｃＢｙ（Ｈ−２ｄ）マウスに、ＧＩ−５００５酵母を皮下注射する。ＧＩ−５００５酵母による抗原特異的なリンパ球の誘導を検出するインビボおよびインビトロでのアッセイを行った。これらのアッセイには、リンパ球増殖、細胞媒介性細胞傷害、サイトカイン分泌、および腫瘍からの保護が含まれる。これらの試験をサポートするために、以下の酵母株、細胞株、および組換えウィルスを生産し維持した：
・ＧＩ−５００３：ＨＣＶ−ＮＳ３タンパク質発現酵母株。ＧＩ−５００３は、触媒ドメインが単一の点変異によって不活性化されている全長ＮＳ３を発現する
・ＧＩ−５００５−Ｌ：５０ｎｇ／ＹＵより少ないＨＣＶ−ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するＧＩ−５００５酵母株
・ＧＩ−５００５−Ｍ：約５００ｎｇ／ＹＵのＨＣＶ−ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するＧＩ−５００５酵母株
・ＧＩ−５００５−Ｈ：約１４００ｎｇ／ＹＵのＨＣＶ−ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するＧＩ−５００５酵母株
・ＥＬ４−ＮＳ３：ＨＣＶ  ＮＳ３をコードするＤＮＡを安定に形質移入したＣ５７ＢＬ／６由来のＥＬ４リンパ腫細胞（Ｈ−２ｂ）
・Ａ２０−ＮＳ３：ＨＣＶ  ＮＳ３をコードするＤＮＡを安定に形質移入したＢＡＬＢ／ｃ由来のＡ２０リンパ腫細胞（Ｈ−２ｄ）
・Ｐ８１５−ＮＳ３：ＨＣＶ  ＮＳ３をコードするＤＮＡを安定に形質移入したＤＢＡ／２由来のＰ８１５白血病細胞（Ｈ−２ｄ）
・組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ）：β−ガラクトシダーゼをコードする組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ−ｌａｃ）、ＨＩＶ−１Ｇａｇをコードする組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ−Ｇａｇ）、ＨＣＶ  ＮＳ３をコードする組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ−ＮＳ３）、およびＨＣＶＣｏｒｅタンパク質をコードする組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ−Ｃｏｒｅ）。
【０１６２】
以下に説明する試験では、特に他に示さない限り、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスおよび／または雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（各群５匹；６−１０週齢）は、週に一度、５ＹＵ（５０００万）のＧＩ−５００５またはＧＩ−５００３を皮下注射し、最終の注射後７日目に屠殺した。各群からの脾細胞懸濁液は、１０％熱非働化ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、および２−メルカプトエタノールが添加されたＲＰＭＩ−１６４０組織培地中で調製され、所定のＨＣＶ抗原特異的刺激（典型的にはｒＶＶ−ＮＳ３および／またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅ）と、酵母抗原特異的刺激（典型的にはＧＩ−５００５）との両方を用いてインビトロで刺激（ＩＶＳ）した。ＧＩ−５００５の投与により誘導された免疫応答を評価するために標準的なアッセイを用いた。このアッセイには、３Ｈ−チミジン取り込みにより評価されるリンパ球増殖、５１Ｃｒでラベルしたターゲット細胞を用いる細胞媒介性細胞傷害アッセイ、サイトカイン分泌の定量、および腫瘍からの保護が含まれる。
【０１６３】
（ａ）ＧＩ−５００５による抗原特異的なリンパ球増殖の誘導
ＧＩ−５００５の免疫原性を評価する予備的な実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３週間、週に一度の頻度で５ＹＵ（５０００万）の熱非働化ＧＩ−５００５酵母細胞を注射した。マウスには免疫の付与による表面的な悪影響は見られなかった。最終免疫から７日後に脾細胞を採取し、単一の細胞懸濁液を、インビトロで、刺激しないか、あるいはＥＬ４リンパ腫細胞、ＥＬ−ＮＳ３（安定的にＨＣＶ  ＮＳ３を発現しているＥＬ４）、ｒＶＶ−ＮＳ３（ＨＣＶ  ＮＳ３をコードする組換えワクシニアウィルス）またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅで刺激した。５日間培養した後、リンパ球増殖を標準的なチミジン取り込みを用いて評価した。より具体的には、５ＹＵのＧＩ−５００５を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞を、９６ウエルのＵ型底部を有する組織培養プレート（４０００００細胞／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた：無刺激、マイトマイシンＣで処理したＥＬ４（１００００細胞／ウエル）、マイトマイシンＣで処理したＥＬ４−ＮＳ３（１００００細胞／ウエル）、ｒＶＶ−ＮＳ３（４０００００ｐｆｕ／ウエル）またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅ（４０００００ｐｆｕ／ウエル）。５日目に３ＨＴｄＲを添加し、その１８時間後にプレートから試料を採集した。結果を３つのサンプルの平均ＣＭＰ＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。図２に示される結果は、ＧＩ−５００５が、ＮＳ３特異的なリンパ球増殖およびＣｏｒｅ特異的なリンパ球増殖を誘導することを示している。
【０１６４】
（ｂ）ＧＩ−５００５による抗原特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞応答の誘導
＜ＧＩ−５００５による、安定的にＨＶＣ  ＮＳ３を発現している腫瘍細胞を殺傷する細胞傷害性エフェクタ細胞の誘導＞
図３は、ＧＩ−５００５による免疫の付与は、ＨＶＣ  ＮＳ３を発現している腫瘍細胞を殺傷することができる細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導することを示す。具体的には、３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５を注射したＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ（３０×１０６細胞／フラスコ（図３Ａ−３Ｂ））、または、２４ウエルの平底組織培養プレート（６×１０６／ウエル（図３Ｃ））のいずれかの各ウエルに入れた。脾細胞に６日間以下のインビトロ刺激（ＩＶＳ）を与えた：１ＹＵ（１０７酵母細胞）ＧＩ−５００５／フラスコ（図３Ａ）；無刺激、１ＹＵ  ＧＩ−１００１／フラスコ、または、１ＹＵ  ＧＩ−５００５／フラスコ（図３Ｂ）；または、６×１０６ｐｆｕ／ウエルｒＶＶ−ｌａｃ、または、ｒＶＶ−ＮＳ３（図３Ｃ）。ｒＶＶ−ｌａｃまたはｒＶＶ−ＮＳ３と培養された脾細胞は、さらに３日間、１０％のＴ細胞成長増殖因子源としてのＴ−ｓｔｉｍの存在下で培養を行った。６日（図３Ａ、３Ｂ）または９日（図３Ｃ）のＩＶＳ培養期間終了後、脾細胞培養物の２倍希釈物を５１Ｃｒでラベルした１００００個のＥＬ４細胞または５１Ｃｒでラベルした１００００個のＥＬ４−ＮＳ３細胞と混合した。Ｅ：Ｔ比は、エフェクタ：ターゲット比を示し、ＩＶＳ培養期間の初期のエフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を６時間後に９６ウエルのＶ底プレートから単離した同時培養された３つのサンプルの平均特異的溶解％＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。自然に放出されるクロムの割合は、ＥＬ−４に対しては１９％（図３Ａ）、ＥＬ４−ＮＳ３に対しては４０％（図３Ａ、図３Ｂ）、ＥＬ４−ＮＳ３に対して２９％（図３Ｃ）であった。
【０１６５】
図３Ａに示される結果において、ＧＩ−５００５で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞は、５１Ｃｒでラベルした形質移入されていないＥＬ４リンパ腫細胞または安定的にＨＣＶ−ＮＳ３を発現するＥＬ４細胞（ＥＬ４−ＮＳ３）について試験を行う前に、インビトロで、６日間、酵母の脾細胞に対する比を１：３として、ＧＩ−５００５酵母で刺激した。刺激された脾細胞はＥＬ４−ＮＳ３ターゲットを用量依存的に殺した。これと対照的に、刺激された脾細胞は、形質移入されていないＥＬ４細胞を僅かにしか殺さなかった。これらのデータは、ＧＩ−５００５による免疫は、ＮＳ−３特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を誘導するという証拠を提供することに加えて、ＧＩ−５００５酵母は、インビトロでＮＳ−３特異的な細胞傷害性エフェクタ細胞を再び刺激するために用いることができるということを示している。図３Ｂに示される結果は、さらに、上記知見に確証を与え、ＧＩ−５００５で免疫されたマウスの脾細胞のＧＩ−５００５によるインビトロ刺激（ＩＶＳ）が、無刺激またはベクターコントロール酵母（ＧＩ−１００１）によるＩＶＳと比較して、細胞障害性エフェクタ細胞のＥＬ４−ＮＳ３に対する細胞障害活性を増強することができることを示す。ＩＶＳ期間中に細胞障害性のエフェクタ細胞活性を活性化するためにＨＣＶ  ＮＳ３抗原に暴露する必要性を、ＮＳ３をコードする組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ−ＮＳ３；図３Ｃ）による刺激を用いてさらに調べた。これらのデータは、免疫されたマウスの脾臓に存在するＮＳ−３特異的な細胞障害性エフェクタ細胞は、ｒＶＶ−ｌａｃ（無関係な抗原β−ガラクトシダーゼをコードする組換えウィルス）によるＩＶＳと比較して、ｒＶＶ−ＮＳ３によるＩＶＳによって刺激されることを示している。
【０１６６】
＜ＧＩ−５００５による、ＨＣＶ  ＮＳ３またはＨＣＶ  Ｃｏｒｅをコードする組換えワクシニアウィルスに感染した腫瘍細胞を殺傷する細胞傷害性エフェクタ細胞の誘導＞
上記結果は、ＧＩ−５００５による免疫は、ＮＳ３を発現している同系の腫瘍細胞を殺傷することができる細胞障害性エフェクタ細胞を誘導することを示している。しかし、ＧＩ−５００５はＨＣＶ  Ｃｏｒｅ抗原をも発現する。安定的に形質移入されたＨＣＶＣｏｒｅタンパク質を発現する腫瘍細胞株を得る試みは成功しなかった。Ｃｏｒｅを発現するターゲット細胞の欠如を克服するために、図４に示す実験を行った。要するに、Ｈ−２ｄを有するＰ８１５白血病細胞を、免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を用いた標準的なクロム放出アッセイに用いる前に、一晩、ＨＣＶ  ＮＳ３またはＨＣＶ  Ｃｏｒｅをコードする組換えワクシニアウィルスに感染させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫は、ＧＩ−５００５またはＧＩ−５００３（全長ＨＣＶ−ＮＳ３を発現するがＣｏｒｅを発現しないＴａｒｍｏｇｅｎＴＭ）によって行い、インビトロでＧＩ−５００５の存在下５日間刺激した。より、詳しくは、３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５（ＧＩ５００５）または週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００３（ＧＩ５００３）を注射したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を２４ウエルの平底組織培養プレート（８×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０６／ウエル）により５日間刺激した。ＩＶＳ培養期間の終了後、脾細胞培養物の２倍希釈物を、一晩ＨＣＶ  ＮＳ３（図４Ａ）またはＨＣＶＣｏｒｅ（図４Ｂ）をコードする組換えワクシニアウィルスに感染させた、５１Ｃｒでラベルした１００００個のＰ８１５白血病細胞と混合した。Ｅ：Ｔ比は、エフェクタ：ターゲット比を示し、ＩＶＳ培養期間初期の脾臓エフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を６時間後に９６ウエルのＶ底プレートから単離した同時培養された３つのサンプルの平均特異的溶解％＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。自然に放出されるクロムの割合は、Ｐ８１５−ｒＶＶ−ＮＳ３に対しては２１％、Ｐ８１５−ｒＶＶ−Ｃｏｒｅ対しては４０％であった。
【０１６７】
図４Ａおよび図４Ｂは、ＧＩ−５００５はｒＶＶ−ＮＳ３（図４Ａ）またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅ（図４Ｂ）で感染させた腫瘍細胞を殺傷することができる細胞障害性細胞を誘導するが、ＧＩ−５００３によって誘導された腫瘍細胞の死滅はＮＳ３に対して制限されることを示す。要約すれば、図３および図４に示された結果は、ＧＩ−５００５による免疫はＮＳ３特異的細胞障害性エフェクタ細胞の活性化およびＣｏｒｅ特異的細胞障害性エフェクタ細胞の活性化を誘導する。
【０１６８】
（ｃ）ＧＩ−５００５による炎症促進サイトカイン分泌細胞の誘導
図５は、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＧＩ−５００５で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を、ＧＩ−５００５酵母とともに組織培養したときに、分泌されるサイトカインを示す。無細胞上清を培養開始から４８時間後に集め、サイトカイン濃度を、フローサイトメトリーをベースとするＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を用いて決定した。より具体的には、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウス、または、３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を、２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れた。脾細胞を、ＧＩ−５００５（１×１０６酵母細胞／ウエル）またはＰＭＡ（１５ｎｇ／ｍＬ）＋イオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。無細胞上清を培養開始から４８時間後に集め、サイトカインをコロラド大学ガンセンターフローサイトメーター施設により、フローサイトメーターＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を用いて定量した。ＩＦＮ−ｇはＩＦＮ−γを、ＴＮＦ−ａはＴＮＦ−αを表す。
【０１６９】
これらの結果は、ＧＩ−５００５の投与は、炎症促進サイトカインＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに加えて、ＩＬ−２およびＩＬ−５を分泌するＴ細胞をも発現させることを示している。免疫したマウスの脾細胞をインビトロで酵母に暴露した脾細胞のサイトカイン応答は、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスのＴ細胞をＰＭＡ＋イオノマイシンによりポリクローナルに刺激したものにその大きさにおいて匹敵したことに留意することが重要である。加えて、図５は、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞の酵母に対するサイトカイン応答をも示し、酵母に対する生得的反応は、個体群における単球および樹状細胞から分泌されると推定される、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの分泌を含むことを示唆している。未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスまたは免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞についても同様の結果が得られた（図８および図１１参照）。
【０１７０】
（ｄ）ＧＩ−５００５により誘導される免疫応答に対する反復投与の効果
図６、７、および８に示されている結果は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの両方に施された１回、２回または３回の週ごとのＧＩ−５００５による免疫を比較した実験の結果である。図６はＮＳ３特異的なリンパ球増殖およびＣｏｒｅ特異的なリンパ球増殖を調べ、図７はＮＳ３特異的な細胞障害性細胞活性およびＣｏｒｅ特異的な細胞障害性細胞活性の誘導を示し、図８はサイトカイン分泌のプロファイルを示す。全体的に、これらの結果は、ＧＩ−５００５の１回の注射は弱い応答を誘導し、その応答は追加的な投与により顕著に増強されることを示している。
【０１７１】
図６は、１回、２回または３回の週ごとのＧＩ−５００５による免疫を施されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞について行われたリンパ球増殖アッセイの結果を示す。具体的には、１回、２回または３回の週ごとの５ＹＵのＧＩ−５００５の注射を施されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を９６ウエルのＵ型底部を有する組織培養プレート（４０００００細胞／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた：無刺激、ｒＶＶ−ＮＳ３、ｒＶＶ−Ｃｏｒｅ、または、ｒＶＶ−ｒａｓｔａｆａｒ（１０００００ｐｆｕ／ウエル）。５日目に３ＨＴｄＲを添加し、その１８時間後にプレートからから試料を採集した。結果を３つのサンプルの平均ＣＭＰ＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。ＨＣＶ  ＮＳ３特異的なリンパ球の応答およびＣｏｒｅ特異的なリンパ球の応答は免疫の回数に比例して増加し、算出された刺激指数は１回の免疫に対して、３回の免疫では、ｒＶＶ−ＮＳ３では１．８から２．８に、ｒＶＶ−Ｃｏｒｅでは６．５から８．６に増加した。ｒＶＶ−ｒａｓｔａｆａｒ（ヒトのＲａｓをコード）では刺激は観察されなかったことから、ＧＩ−５００５によって誘導された免疫応答の抗原特異性が確認された。
【０１７２】
図７は、１回、２回または３回の週ごとのＧＩ−５００５による免疫を施されたＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞について行われたクロム放出アッセイの結果を示す。具体的には、１回、２回または３回の週ごとの５ＹＵのＧＩ−５００５の注射を施されたＣ５７ＢＬ／６マウス（図７Ａおよび図７Ｂ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（図７Ｃおよび図７Ｄ）の脾細胞を２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０６／ウエル）により５日間刺激した。ＩＶＳ培養期間の終了後、脾細胞培養物の２倍希釈物を、一晩ＨＣＶ  ＮＳ３（図７Ａおよび図７Ｃ）またはＨＣＶ  Ｃｏｒｅ（図７Ｂおよび図７Ｄ）をコードする組換えワクシニアウィルスに感染させた、５１Ｃｒでラベルした１００００個のＥＬ４リンパ腫細胞（図７Ａおよび図７Ｂ）またはＰ８１５白血病細胞（図７Ｃおよび図７Ｄ）と混合した。Ｅ：Ｔ比は、エフェクタ：ターゲット比を示し、ＩＶＳ培養期間初期の脾臓エフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を６時間後に９６ウエルのＶ底プレートから単離した同時培養された３つのサンプルの平均特異的溶解％＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。自然に放出されるクロムの割合は、ＥＬ−４−ｒＶＶ−ＮＳ３に対しては１０％、ＥＬ−４−ｒＶＶ−Ｃｏｒｅに対しては１０％、Ｐ８１５−ｒＶＶ−ＮＳ３に対しては１２％、Ｐ８１５−ｒＶＶ−Ｃｏｒｅ対しては１１％であった。図７に示される結果は、図４に示されている知見を確認するとともに、ｒＶＶ−ＮＳ３またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅに感染した同系の腫瘍細胞ターゲットの死滅は、免疫の回数に比例して増加する用量依存性の死滅であることを示す。
【０１７３】
図８に示される結果は、１回、２回または３回の週ごとのＧＩ−５００５による免疫を施されたＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞が、ＧＩ−５００５によるインビトロ刺激に応答して分泌するサイトカイン分泌のプロファイルを示す。具体的には、１回、２回または３回の週ごとの５ＹＵのＧＩ−５００５の注射を施されたＣ５７ＢＬ／６マウス（上段）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（下段）の脾細胞を２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０６／ウエル）により刺激した。無細胞上清を培養開始から４８時間後に集め、サイトカインをコロラド大学ガンセンターフローサイトメーター施設により、フローサイトメーターＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を用いて定量した。ＩＦＮ−ｇはＩＦＮ−γを、ＴＮＦ−ａはＴＮＦ−αを表す。これらの結果は、免疫したマウスの細胞の酵母抗原に対するサイトカイン応答は、主にＴＨ１様の炎症を促進する種類であり、ＴＨ１全範囲のサイトカイン応答が誘導されるためには１回より多くの免疫付与が必要であることを示している。ＴＨ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０が検出されなかったことは、本発明の酵母ビヒクルが主として体液性免疫よりもむしろ細胞性免疫を誘導することを示していることに留意することが重要である。
【０１７４】
上記データは、ＧＩ−５００５によって誘導される免疫応答は、週ごとの反復投与によって増強されることを示している。ＧＩ−５００５による免疫応答の追加免疫による増強を探求するために、表２に概要を示す実験を行った。要するに、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに週ごとのＧＩ−５００５の注射を５回行い、その後、追加免疫を行わないか、または、１週ごと、２週ごと、１月ごと、若しくは、２月ごとの間隔で追加免疫を行った。最後の追加免疫の１６日後にマウスを屠殺した。その結果、重要なことには、週ごとの反復投与は、中和および／または免疫寛容を誘導しなかった。週ごとの注射を１２回施した後でさえ、その後に続く投与によって、結果として、リンパ球増殖および細胞媒介性細胞傷害アッセイで測定される増強が見られたにとどまった。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
図９は、表２に記載の免疫スケジュールでＧＩ−５００５を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞について行ったリンパ球増強アッセイの結果を示す。要するに、表２に記載のスケジュールで５ＹＵのＧＩ−５００５を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、９６ウエルのＵ型底部を有する組織培養プレート（４０００００細胞／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた：無刺激（Ｂｋｇｄ）、ＧＩ−５００５（３２００００または２００００酵母細胞／ウエル）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；２．５μｇ／ｍＬ）、または、リポ多糖類＋硫酸デキストラン（ＬＰＳ＋ＤＳ；２５μｇ／ｍＬ  および２０μｇ／ｍＬ）。３日目に３ＨＴｄＲを添加し、その１８時間後にプレートからから試料を採集した。結果は、３つのサンプルの平均ＣＭＰ＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。図９は酵母に関連する抗原に対する応答を追加免疫により増強することができることが明白であること、および明白な免疫寛容は誘導されないことを示している。
【０１７７】
図１０は、免疫を付与され、表２に記載されているように追加免疫を付与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓エフェクタ細胞について行われたクロム放出アッセイの結果を示す。要するに、表２に記載のスケジュールで５ＹＵのＧＩ−５００５を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０６／ウエル）により５日間刺激した。ＩＶＳ培養期間の終了後、脾細胞培養物の２倍希釈物を、５１Ｃｒでラベルした１００００個のＰ８１５白血病細胞と混合した。Ｅ：Ｔ比は、エフェクタ細胞：ターゲット（標的）細胞の比である。結果を６時間後に９６ウエルのＶ底プレートから単離した同時培養された３つのサンプルの平均特異的溶解％＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。自然に放出される５１クロムの割合は、Ｐ８１５−ＮＳ３に対しては１２％であった。図１０に示される結果は、図９に示されている知見を確認するとともに、安定的にＨＣＶ  ＮＳ３を発現している同系の腫瘍細胞を、用量依存的に殺傷することができることを示すとともに、ＧＩ−５００５によって誘導されたＣＴＬ応答の追加免疫による増強可能性だけでなく持続性をも示している。
【０１７８】
（ｅ）ＧＩ−５００５により誘導された免疫応答の持続性
ＧＩ−５００５の免疫により誘導される細胞性免疫応答の堅牢性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を評価するために、ＧＩ−５００５を週一度の頻度で３回投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスを、投与後１月目および２月目に屠殺した。図１１は、酵母特異的なリンパ球増殖の持続性を試験した結果を、図１２はＮＳ３特異的な細胞障害性細胞活性およびＣｏｒｅ特異的な細胞障害性細胞活性の持続性を試験した結果を、図１３はＮＳ３特異的なサイトカイン分泌および酵母特異的なサイトカイン分泌のプロファイルを示す。全体的に、これらの結果は、ＧＩ−５００５の投与は、持続する堅牢な（ｒｏｂｓｔｅｒ）メモリーＴ細胞応答を誘導することを示唆している。
【０１７９】
＜ＧＩ−５００５により誘導されたリンパ球増殖応答の持続性＞
図１１に示される結果は、酵母抗原に対する増殖反応は、週一度の頻度で３回免疫を付与した後少なくとも２月間持続する。要するに、未処置または３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５で免疫し、その後５週（１月の持続性）または９週（２月の持続性）おいて屠殺したＣ５７ＢＬ／６マウス（図１１Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（図１１Ｂ）の脾細胞を、９６ウエルのＵ型底部を有する組織培養プレート（４０００００細胞／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで以下の刺激を与えた：無刺激（Ｂｋｇｄ）、ＧＩ−５００５（４０００００酵母細胞／ウエル）。５日目に３ＨＴｄＲを添加し、その１８時間後にプレートからから試料を採集した。結果は、３つのサンプルの平均ＣＭＰ＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。これらの結果は、図２および図６に示されるＨＣＶ  ＮＳ３特異的な増殖反応またはＣｏｒｅ特異的な増殖反応と対照的に、酵母特異的な増殖反応を試験していることに留意することが重要である。これらの特別な試験において酵母抗原に対する刺激指数は約１１〜７７の範囲であった。
【０１８０】
＜ＧＩ−５００５により誘導された細胞障害性エフェクタ細胞応答の持続性＞
図１２に示すように、リンパ球増殖応答に関する結果と同様に、ＧＩ−５００５によって誘導された細胞障害性エフェクタ細胞活性の持続性は少なくとも２月であった。要するに、未処置または３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５で免疫し、その後５週（１月の持続性）または９週（２月の持続性）おいて屠殺したＣ５７ＢＬ／６マウス（図１２Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（図１２Ｂ）の脾細胞を、２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０６／ウエル）により５日間刺激した。ＩＶＳ培養期間の終了後、脾細胞培養物の２倍希釈物を、５１Ｃｒでラベルした１００００個のＥＬ４−ＮＳ３リンパ腫細胞（図１２Ａ）、または、５１Ｃｒでラベルした１００００個のＰ８１５−ＮＳ３白血病細胞（図１２Ｂ）と混合した。Ｅ：Ｔ比は、エフェクタ：ターゲット比を示し、ＩＶＳ培養期間の初期のエフェクタ細胞の濃度に基づいている。結果を６時間後に９６ウエルのＶ底プレートから単離した同時培養された３つのサンプルの平均特異的溶解％＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。自然に放出されるクロムの割合は、ＥＬ４−ＮＳ３に対しては１１％、Ｐ８１５−ＮＳ３に対して１１％であった。
【０１８１】
＜ＧＩ−５００５により誘導されたサイトカイン分泌応答の持続性＞
図１３は、３週間、週に一度の頻度でＧＩ−５００５による免疫を施されたＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞が、ＧＩ−５００５と、ｒＶＶ−ＮＳ３によるインビトロ刺激に応答して分泌するサイトカイン分泌のプロファイルを示す。要するに、未処置または３週間、週に一度の頻度で５ＹＵのＧＩ−５００５で免疫し、その５週間後（１ヶ月間の持続性）または９週間後（２ヶ月間の持続性）に屠殺したＣ５７ＢＬ／６マウス（図１３Ａおよび図１３Ｂ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）の脾細胞を、２４ウエルの平底組織培養プレート（１０×１０６／ウエル）の各ウエルに入れ、インビトロで、ＧＩ−５００５（１×１０７／ウエル）またはｒＶＶ−ＮＳ３（１×１０７ｐｆｕ／ウエル）により刺激した。無細胞上清を培養開始から４８時間後（ＩＶＳ  ｗ／  ＧＩ−５００５）または１２０時間後（ＩＶＳ  ｗ／  ｒＶＶ−ＮＳ３）に集めた。サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を用いて定量した。ＩＦＮ−ｇはＩＦＮ−γを、ＴＮＦ−ａはＴＮＦ−αを表す。これらの結果は、ＧＩ−５００５による免疫で誘導されるサイトカイン分泌細胞の持続性は少なくとも２月であることを示している。サイトカインの酵母特異的なプロファイルと対照的に、これらのデータは、また、刺激としてｒＶＶ−ＮＳ３を用いた、抗原特異的な（すなわち、ＮＳ３特異的な）応答は、主としてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γに限られることを示している。
【０１８２】
（ｆ）種々の用量でのＧＩ−５００５投与の比較
図１４および１５に要約した結果は、ＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭによる、異なる量の抗原を発現する細胞傷害性エフェクタ細胞およびサイトカイン分泌細胞の誘導を比較する。本研究は、有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）アッセイの開発の一部として理解される。
【０１８３】
簡単には、およそ１４００ｎｇ／ＹＵ、５００ｎｇ／ＹＵおよび５０ｎｇ／ＹＵ未満のＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅ融合タンパク質を発現するＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを生成した。このことを、誘導期間に存在する銅の量を変化させることにより達成した。３種のＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを、ＧＩ−５００５−Ｈ（１４００ｎｇ／ＹＵ；０．０２ｎｇタンパク質／ｎｇ総タンパク質）、ＧＩ−５００５−Ｍ（５００ｎｇ／ＹＵ；０．００８ｎｇタンパク質／ｎｇ総タンパク質）およびＧＩ−５００５−Ｌ（５０ｎｇ／ＹＵ未満；０．００１ｎｇ未満タンパク質／ｎｇ総タンパク質）と名付けた。これら３種の異なるＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを３種の用量（０．１ＹＵ、１ＹＵおよび１０ＹＵ）で、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス５匹の群を毎週免疫した。３週目の注入の７日後にマウスを屠殺し、脾細胞を、記載のインビトロ刺激（ＩＶＳ）に供した。
【０１８４】
図１４において、免疫したマウスからの脾細胞を群ごとにプールし、３種の異なるＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭのいずれかとともに、別々にＩＶＳに配置した。ＨＣＶ  ＮＳ３を安定的に発現するＨ−２ｄ保持Ｐ８１５細胞に対する、ＩＶＳ培養物の細胞媒介性細胞傷害性活性を、評価した。簡単には、０．１ＹＵ、１ＹＵまたは１０ＹＵのＧＩ−５００５−Ｈ（図１４Ａ−１４Ｃ）、ＧＩ−５００５−Ｍ（図１４Ｄ−１４Ｆ）またはＧＩ−５００５−Ｌ（図１４Ｇ−１４Ｉ）のいずれかの、３週間にわたる毎週の注入を受容したＢＡＬＢ／ｃ細胞からの脾細胞を、２４ウエル平底組織培養プレートの個々のウエルに置き（１０×１０６脾細胞／ウエル）、示したＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭ（２×１０６酵母細胞／ウエル）で５日間インビトロ刺激（ＩＶＳ）した。ＩＶＳ培養期間の終了時に、二倍希釈した脾細胞培養物を、１０，０００個の５１Ｃｒ標識化Ｐ８１５−ＮＳ３白血球と混合した。Ｅ：Ｔ比は、ＩＶＳ培養期間の開始時での脾臓エフェクタ細胞濃度に基づいた、エフェクタ細胞：ターゲット細胞の比をいう。結果を、９６ウエルのＶ底プレートでの同時培養の６時間後に単離した三連のサンプルについての、特異的溶解％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．として表す。自発的な５１Ｃｒ放出％はＰ８１５−ＮＳ３について１２％であった。各図の説明における１０ＹＵ、１ＹＵおよび０．１ＹＵは、免疫に使用したＧＩ−５００５の量をいう。データは、単一パラメータに基づいた明瞭な用量依存性を示す。すなわち、多量のＨＣＶ抗原が免疫またはインビトロ刺激に使用したＴａｒｍｏｇｅｎＴＭに発現した。同様の結論が、図１５に示されるデータから導かれ得る。
【０１８５】
図１５は、酵母特異的抗原に応じて分泌されたＩＬ−６  対  ＨＣＶ  ＮＳ３特異的抗原に応じて分泌されたＧＭ−ＣＳＦのレベルを示す。詳細には、０．１ＹＵ、１ＹＵまたは１０ＹＵ（Ｘ軸）のＧＩ−５００５−Ｈ（図１５Ａ）、ＧＩ−５００５−Ｍ（図１５Ｂ）またはＧＩ−５００５−Ｌ（図１５Ｃ）のいずれかの、３週間にわたる毎週の注入を受容したＢＡＬＢ／ｃ細胞からの脾細胞を、２４ウエル平底組織培養プレートの個々のウエルに置き（１０×１０６脾細胞／ウエル）、ＧＩ−５００５−Ｈ（２×１０６酵母細胞／ウエル）またはｒＶＶ−ＮＳ３（１００×１０６ｐｆｕ／ウエル）のいずれかでインビトロ刺激（ＩＶＳ）した。培養開始後７２時間（ＩＶＳｗ／ＧＩ−５００５）または１２０時間（ＩＶＳｗ／ｒＶＶ−ＮＳ３）の時点で、細胞を含まない上清を回収した。サイトカインを、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて定量した。簡単には、これらのデータは、ＩＬ−６分泌細胞の誘導が免疫に使用されるＴａｒｍｏｇｅｎＴＭの数に依存するが、ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭにおいて発現するＨＣＶ抗原の量には依存しないことを示す。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する細胞の誘導は両者に依存する。図１４および１５に示されたデータに基づいて、最低限５００ｎｇの融合タンパク質／ＹＵまたは０．００８ｎｇタンパク質／ｎｇ総タンパク質が、抗原特異的応答を示すに必要とされる。
【０１８６】
〔実施例６〕
以下の実施例は、ＨＣＶ抗原を発現するＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを使用する、マウスでの非臨床的な薬理学的試験（腫瘍保護試験および治療試験）を示す。
【０１８７】
ＨＣＶに対する保護および治療のインビボでの動物モデルが利用可能ではないので、本発明者らは、ＨＣＶ抗原を保有する腫瘍に対する保護および治療を用いてＧＩ−５００５の活性を示した。
【０１８８】
（ａ）ＧＩ−５００５は、ＮＳ３を発現する腫瘍細胞に対する保護免疫を誘導する
上記の実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＧＩ−５００５の免疫原性を示す。ＧＩ−５００５酵母の注入が保護免疫を惹起するか否かを決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．１ＹＵ、０．７ＹＵまたは５ＹＵの、ＧＩ−５００５またはＧＩ−５００３（ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのみを発現するＴａｒｍｏｇｅｎＴＭ）のいずれかを、あるいは、５ＹＵのＧＩ−４０１４（変異したＲａｓタンパク質を発現するＴａｒｍｏｇｅｎＴＭ）をネガティブコントロールとして、あるいは何も用いることなく、週に一度、３週間にわたって皮下注射した。最終免疫の１週間後、マウスを、同系のＡ２０腫瘍細胞を皮下注射することによってチャレンジした。この細胞はｍＨＣＶ  ＮＳ３（Ａ２０−ＮＳ３）で安定に形質移入されている。チャレンジの２１日後に腫瘍容量を測定した。図１６に示されるデータは、ＨＣＶ  ＮＳ３抗原、ＧＩ−５００５またはＧＩ−５００３を発現するＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを用いて免疫したマウスが、Ａ２０−ＮＳ３腫瘍細胞でのチャレンジから保護されたことを示す。一方、免疫しなかったマウスまたはＧＩ−４０１４を用いて免疫したマウスは保護されなかった。結果を、平均腫瘍容量＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。これらの結果は、ＧＩ−５００５は、容量依存的および抗原依存的な免疫応答を誘導することを示す。この応答は、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞からマウスを保護する。
【０１８９】
本実験を、ＧＩ−５００５を３週間にわたって毎週注射し、その後７日間ＥＬ４−ＮＳ３リンパ球を皮下でチャレンジしたＣ５７ＢＬ／６に反復した。簡単には、Ｃ５７ＢＬ／６（一群あたり５匹）に、何もなし（未処置）または５ＹＵ  ＧＩ−５００５を３週間にわたって毎週皮下注射した。皮下注射した５×１０４個のＡ２０−ＮＳ３での最終免疫の７日後に、マウスをチャレンジした。チャレンジ後の示した日に腫瘍を測定した。結果を、平均腫瘍容量＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。数値は、測定可能な腫瘍を有する動物の数をいう（＊免疫したマウスから摘出した腫瘍はもはやＮＳ３を発現しないことがわかった）。図１７に示した結果は、ＧＩ−５００５を注射したマウスがＥＬ４−ＮＳ３でのチャレンジから保護されるが、未処置のマウスは保護されないことを示す。ＧＩ−５００５の注射は、ＥＬ４単独でのチャレンジからマウスを保護しない。このことは、保護免疫が抗原特異的であることを示す（データは示さず）。免疫したマウスにおいて成長する腫瘍がなおＨＣＶ  ＮＳ３を発現するか否かを決定するために、ＧＩ−５００５免疫したマウス２匹および未処置のマウスコントロール５匹から、腫瘍を摘出し、抗生物質Ｇ４１８を含む組織培養培地中に置いた。ＥＬ４−ＮＳ３において、ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する哺乳動物発現ベクターもまた、ネオマイシンアナログＧ４１８の存在下で形質転換体が増殖することを可能にするネオマイシン耐性遺伝子を含み、これによりＨＣＶ  ＮＳ３の安定的な発現を維持する。未処置のマウスから摘出したＥＫ４−ＮＳ３腫瘍細胞はＧ４１８の存在下で増殖するが、ＧＩ−５００５を用いて免疫したマウスからの腫瘍は増殖しなかった。この観察は、形質移入した抗原の発現を排除する免疫学的な圧力が存在することを示唆する。これらの結果は、ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞でのチャレンジに対するインビボでの保護免疫をＧＩ−５００５が誘導することを示す。
【０１９０】
（ｂ）「保護された」マウスにおける免疫応答
ＨＣＶ  ＮＳ３を発現する同系の腫瘍細胞を拒絶した「保護」マウスの利用可能性は、保護免疫の準備（ｓｅｔｔｉｎｇ）における抗原特異的免疫応答を試験する機会を提供した。ＥＬ４−ＮＳ３腫瘍細胞を拒絶した上記のマウス５匹からの脾細胞をプールし、９６ウエルのＵ底組織培養プレートの個々のウエルに置き（４×１０５細胞／ウエル）、刺激なし、あるいはＧＩ−１００１（２×１０５酵母細胞／ウエル）、ＧＩ−５００５（２×１０５酵母細胞／ウエル）、ｒＶＶ−Ｇａｇ（１×１０５ｐｆｕ／ウエル）、ｒＶＶ−ＮＳ３（１×１０５ｐｆｕ／ウエル）、またはｒＶＶ−Ｃｏｒｅ（１×１０５ｐｆｕ／ウエル）のいずれかで刺激した。３ＨＴｄＲを５日目に添加し、その１８時間後に細胞を回収した。結果を四連のサンプルについての平均ＣＰＭ＋／−Ｓ．Ｄ．として示す。図１８は、酵母特異的刺激、ＨＣＶ  ＮＳ３特異的刺激およびＨＣＶ  Ｃｏｒｅ特異的刺激に対して保護されたマウス由来の脾細胞の、増殖性の応答を示す。図１９は、これらの細胞傷害性エフェクタ細胞活性を試験する。この実験において、ＥＬ４−ＮＳ３腫瘍細胞を拒絶した免疫化マウス５匹からの脾細胞、または未処置のマウスからの脾細胞を一緒にプールして、２４ウエルの平底組織培養プレートの個々のウエルに置き（８×１０６脾細胞／ウエル）、ＧＩ−５００５（１×１０６細胞／ウエル）またはｒＶＶ−ＮＳ３（８×１０５ｐｆｕ／ウエル）のいずれかで５日間インビトロ刺激（ＩＶＳ）した。ＩＶＳ培養期間の最後に、脾細胞培養物の二倍希釈物を、ｒＶＶ−ＮＳ３で一晩感染した１０，０００個の５１Ｃｒ標識化ＥＬ４ターゲット細胞と混合した。Ｅ：Ｔ比は、ＩＶＳ培養期間の開始時での脾臓エフェクタ細胞濃度に基づいた、エフェクタ細胞：ターゲット細胞の比をいう。結果を、９６ウエルのＶ底プレートでの同時培養の５時間後に単離した三連のサンプルについての、特異的溶解％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．として表す。自発的な５１Ｃｒ放出％はＥＬ４−ｒＶＶ−ＮＳ３について３３％であった。同時に、これらの知見は、保護されたマウス、すなわち、ＮＳ３を発現する腫瘍細胞を拒絶した免疫化マウスが、上記実施例５に示したような単純に免疫したマウスと比較して、ＨＣＶ  ＮＳ３に対する免疫応答を増強したことを示唆する。
【０１９１】
（ｃ）ＧＩ−５００５は、未処置の腫瘍保有マウスから単離した脾細胞中の細胞傷害性エフェクタ細胞活性を刺激する
上記にて示した結果は、ＨＣＶ抗原の二次的供給源（すなわちＨＣＶ  ＮＳ３を発現する腫瘍細胞）へのＧＩ−５００５マウスの曝露が、増強された増殖および細胞傷害性エフェクタ細胞応答によって裏付けられるような追加免疫効果（ブースト効果）を生じる事を示唆する。ＧＩ−５００５酵母が抗原保持マウスからのＴ細胞活性をさらに刺激し、その結果、慢性のＨＣＶ感染患者におけるＴ細胞活性を模倣することができるか否かを決定するために、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＬ４−ＮＳ３腫瘍細胞を皮下注射した。３週間後、腫瘍容量は約２５００ｍｍ３に達し、マウスを屠殺し、脾細胞をベクターコントロール（ＧＩ−１００１）またはＧＩ−５００５酵母のいずれかとインキュベートした。ＥＬ４ターゲット細胞を感染したｒＶＶ−ＮＳ３に対する細胞傷害性エフェクタ細胞活性を、インビトロ刺激開始６日後に評価した。詳細には、２１日前にＥＬ４−ＮＳ３腫瘍細胞を注射した未処置のマウス５匹からの脾細胞を一緒にプールし、２４ウエルの平底組織培養プレートの個々のウエルに置き（８×１０６脾細胞／ウエル）、ＧＩ−１００１またはＧＩ−５００５（１×１０６酵母細胞／ウエル）のいずれかで６日間インビトロ刺激（ＩＶＳ）した。ＩＶＳ培養期間の終了時に、脾細胞培養物の二倍希釈物を、ｒＶＶ−ＮＳ３を一晩感染した１０，０００個の５１Ｃｒ標識化ＥＬ４ターゲット細胞と混合した。Ｅ：Ｔ比は、ＩＶＳ培養期間の開始時での脾臓エフェクタ細胞濃度に基づいた、エフェクタ細胞：ターゲット細胞の比をいう。結果を、９６ウエルのＶ底プレートでの同時培養の５時間後に単離した三連のサンプルについての、特異的溶解％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．として表す。自発的な５１Ｃｒ放出％はＥＬ４−ｒＶＶ−ＮＳ３について３３％であった。図２０に示した結果は、ＧＩ−５００５が、ＨＣＶ−ＮＳ３を発現する腫瘍を保有するマウス由来の細胞傷害性エフェクタ細胞を刺激し得ることを示す。
【０１９２】
（ｄ）ＧＩ−５００５はＮＳ３を発現する腫瘍細胞に対する治療活性を誘導する
図２０に示した結果は、ＧＩ−５００５が、ＥＬ４−ＮＳ３を発現する腫瘍を保持するＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞からのＮＳ３特異的細胞傷害性エフェクタ活性を再度刺激し得ることを示す。このことは、治療効果もまた達成され得ることを示唆する。この可能性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（一群あたり５匹）に、ＨＣＶ  ＮＳ３をコードするＤＮＡで安定的に形質移入した同系のＡ２０−ＮＳ３  Ｂリンパ球１．２５×１０５個を、皮下注射した。腫瘍移植の７日後に開始して、マウスを３週間にわたって週１回、ＰＢＳまたはＹＵ  ＧＩ−５００５のいずれかを用いて免疫した。腫瘍増殖をモニタリングし、腫瘍移植２８日後にマウスを屠殺した。このとき、ＰＢＳ群における腫瘍は２５００ｍｍ３に達した。図２１における結果は、平均腫瘍容量＋／−Ｓ．Ｄ．として示され、数値は、測定可能な腫瘍を有する動物の数をいう（＊腫瘍を保有する全てのマウスから摘出した腫瘍はなおＮＳ３を発現していることがわかった）。
【０１９３】
図２１は、ＧＩ−５００５の治療的投与が腫瘍寛解を生じることを示す。簡単には、ＰＢＳで処置した腫瘍保有マウス５匹全てが腫瘍増殖を示したが、ＧＩ−５００５で処置した５匹中３匹のみが腫瘍増殖を示し、処置した動物において生じる腫瘍ははるかに遅く増殖するようである（ＰＢＳ処置群における腫瘍保有マウスでの平均腫瘍容量２４８８＋／−６３６ｍｍ３  対  ＧＩ−５００５処置群における腫瘍保有マウスでの平均腫瘍容量１２６４＋／−５４８ｍｍ３）。しかし、上述したＥＬ４−ＮＳ３を用いて得られた結果とは対照的に、Ａ２０−ＮＳ３腫瘍保有マウスからの腫瘍の全てにおいてＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質はなお発現していた（データは示さず）。
【０１９４】
ＧＩ−５００５の免疫療法的な特性は、図２２に示すような、移植された腫瘍細胞の数を変化させた第２の試験において確認された。簡単には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（一群あたり５匹）に、２．５×１０４個、５．０×１０４個、または１×１０５個のＡ２０−ＮＳ３  Ｂリンパ球を皮下注射した。マウスを、腫瘍から離れた皮膚部位での皮下注射によって、ＰＢＳまたは１０ＹＵ  ＧＩ−５００５を用いて腫瘍移植の７日後、１４日後および２１日後に治療的に免疫した。治療開始後の示した日に腫瘍容量を測定した。治療開始２４日後の結果を、平均腫瘍容量＋／−Ｓ．Ｄ．として示し（図２２Ａ）、腫瘍保有マウスのパーセントで示す（図２２Ｂ）。
【０１９５】
〔実施例７〕
以下の実施例は、本発明の酵母ワクチンを用いた毒性試験を記載する。
上記のように、ＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを、多くの異なる試験において現在までに３００匹より多くのマウスに投与し、検出可能な著しい毒性は示されなかった。酵母ベースのワクチンプラットフォームを用いる他の関連製品を、観察可能な主要な毒性を有していないマウス、ラット、ウサギ、ブタ（ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ）およびマカク（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）ザルに投与した。他の酵母ベースの製品のＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭとの類似性、すなわち安全性データの妥当性のために、これら他のＴａｒｍｏｇｅｎＴＭを用いた多くの非臨床的安全性評価は、ＧＩ−５００５の毒性データに続いて詳述される。
【０１９６】
この試験の目的は、毎週１回で最大で連続１３週間にわたる固定容量１ｍＬでの皮下注射投与（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、５７日目、６４日目、７１日目、７８日目、８５日目および９２日目の投与）を行い、引き続く特異的回復／検視間隔をおいた後の、ニュージーランドホワイトラビット（雄または雌）におけるＧＩ−５００５の毒性効果を決定することである（表３）。以前の研究から利用可能なデータを基にして、用量レベルを選択した。皮下経路は、ヒトでの本試験品の投与経路が意図される。３つの処置群（グループ２〜４）の５匹の雄または５匹の雌のニュージーランドホワイトラビットに、試験品を用量レベル１ＹＵ、１０ＹＵおよび１００ＹＵで投与した。コントロール群（グループ５）の雌雄別で１０匹ずつの動物は、ビヒクルＰＢＳを受容した。グループ５カラにおいて、試験品またはビヒクルを、１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、５７日目、６４日目、７１日目、７８日目、８５日目および９２日目に一度投与した。グループ５〜８の雌雄別で５匹ずつの動物を、９４日目に屠殺した。雌雄別で残りの５匹の動物を、回復期間約２３日間にわたって維持した。
【０１９７】
【表３】
2014012679.tif 000005
【０１９８】
罹患率、死亡率、傷害、ならびに食物および水の利用度について、全ての動物を１日２回観察した。詳細な臨床実験、注射部位の炎症評価、検眼鏡実験、ならびに体重および食物消費の測定を、実験の経過中に行った。臨床病理学的評価（血液学、臨床化学、および尿検査）を、生存する動物の全てに対して、投与前、各投与の次の日に行い、グループ１〜４の動物に対して３１日目の検視時に行った。さらなる血液サンプルを、全ての生存する動物から、血清抗体分析のために投与前および投与１時間後に収集し、血清抗体分析のためにグループ１〜４の動物に対して３１日目の検視時に収集した。３１日目、９７日目および１２０日目の検視時に、適切な群における全ての動物を安楽死させ、器官重量測定と称されるプロトコルとともに、巨視的実験および微視的実験を行った。
【０１９９】
生存、臨床的知見、食物消費、眼科、または器官重量に対する、処置に関連した影響は、観察されなかった。微視的には、処置に関連した変化が、雌雄いずれにおいても注射部位にて、全ての用量レベルで観察された。これは、線維形成、亜急性炎症およびネクローシスを含んだ。さらに、肉芽腫性炎症もまた、全てではないがいくつかの注射部位で観察された。これらの知見の発生率および重篤度は一般に用量に関連した。１ＹＵでの雌ならびに１０ＹＵおよび１００ＹＵでの雌雄両方の骨髄における顆粒球の過形成、ならびに濾胞性リンパ球の過形成および／または１０ＹＵでの雌および１００ＹＵでの雌雄両方の脾臓における過敏性赤色髄／間質細胞の過形成を、注射部位で観察した炎症に対する二次応答とみなした。これらの知見は、注射部位での組織肥厚の微視的知見と相関する。処置に関連した炎症は紅斑および浮腫の両方からなり、これを１００ＹＵでの雌雄両方の注射部位で観察した。最小限の知見もまた、１０ＹＵでの雌雄両方において見られた。このことは、処置の関連を示唆する。注射部位のいずれかでの投与に続く回復の何らかの徴候を示すものはなかった。効果は穏やかであったが、体重の減少が１００ＹＵでの雌雄両方において見られた。このことは、ＧＩ−５００５での処置に対する関連を示唆する。
【０２００】
血液学および臨床化学における処置に関連した効果を観察し、注射部位で観察した局所性炎症応答に対して二次的であるとみなした。好中球の数の増加を反映する、処置に関連した白血球数の増加が、ＧＩ−５００５処置群の全てで見られた。このことの開始および重篤度は一般に用量に関連する。好中球レベルのいくらかの回復が、次の投与の前に見られた。処置に関連したグロブリン値の増加が観察された。このことの開始および重篤度は一般に用量に関連する。これらの増加は、時間とともに進行する傾向があり、回復の徴候は示さない。
【０２０１】
本研究の条件および知見に基づけば、雄および雌のウサギに対する、用量レベル１ＹＵ、１０ＹＵおよび１００ＹＵでのＧＩ−５００５の投与は、明白な全身性の毒性を何ら生じなかった。予備的な処置に関連した知見は、注射部位での線維形成、亜急性炎症およびネクローシスの局所的な効果に限定された。これは、最も高い用量で試験した場合を除いて穏やかであり、低度〜中程度であった。注射部位での反応は、臨床設定において潜在的な用量限定効果を示し得る。局所性炎症応答に対して二次的であるとみなされた好中球数およびグロブリン値が付随した増加する。
【０２０２】
ウサギ毒性試験においてＧＩ−５００５の免疫原性、すなわち試験の免疫毒性学関連性を示すために、リンパ球増殖アッセイを行った。ウサギでのリンパ球増殖をアッセイするための標準化された方法は存在しないが、酵母タンパク質に対するリンパ球増殖の非最適化アッセイを行った。これは、５回の免疫（３１日目）の２日後に収集した腸骨リンパ節および腋窩リンパ節から単離したリンパ球を用いる。個々のウサギからのリンパ節細胞懸濁物を、示された数の加熱にて殺傷したＧＩ−５００５酵母細胞とともに組織培養の９６ウエルのＵ底プレートに置いた（４×１０５個／ウエル）。１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−ＴｄＲで１８時間パルスすることにより培養の３日目にリンパ球増殖を決定した。雄のリンパ節細胞（図２３Ａ）対雌のリンパ節細胞（図２３Ｂ）を用いて得られた平均刺激指数を図２３に示す（結果を、各用量グループ内の個々のウサギからの評価可能なリンパ節細胞について得られた平均刺激指数＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。）。総合的には、データは、ビヒクル（ＰＢＳ）で免疫した１０匹のウサギのうちの１匹のみが、ＧＩ−５００５酵母に対して１０より大きな刺激インデックスを示し、１ＹＵ  ＧＩ−５００５で免疫したウサギ１０匹のうちの９匹が、１０ＹＵ  ＧＩ−５００５で免疫したウサギ１０匹のうちの７匹が、１００ＹＵ  ＧＩ−５００５で免疫したウサギ１０匹のうちの８匹が、１０より大きな刺激インデックスを示した。雄のリンパ節細胞での応答と雌のリンパ節細胞での応答との間で差異は識別できず、用量投与応答効果が現れなかった。
【０２０３】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＭＰＩ研究９６２−００３の一部としてＧＩ−５００５を注入したウサギの血清中の抗Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ抗体（ＡＳＣＡ）を検出しかつ滴定した。試験した血清サンプルを１日目（最初の注入の前）および２９日目（第５週の注入の前）に得た。全てのウサギが、試験の開始時には１：１００未満のＡＳＣＡ力価を示した（表４）。対照的に、ＧＩ−５００５を受容したウサギの全てが４週間の注入投与の後に増大したＡＳＣＡ力価を示した。しかし、この力価は低く、１：１０，０００未満であり、用量応答効果は観察されなかった。
【０２０４】
【表４】
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【０２０５】
ＰＢＳあるいは１ＹＵ、１０ＹＵまたは１００ＹＵのＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭで５週間にわたって毎週免疫したウサギにおいて生成されたＨＣＶ−ＮＳ３特異的血清抗体およびＣｏｒｅ特異的血清抗体の存在を、ウエスタンブロット分析によって定量的に評価し、このＴａｒｍｏｇｅｎＴＭに含まれる異種タンパク質に対して誘導された体液性の抗体応答についてのよりよい理解を得た。免疫前の動物から得られた血清には、ＨＣＶ特異的抗体は観察されなかった。対照的に、ＮＳ３タンパク質およびＣｏｒｅタンパク質と特異的に反応する抗体を、用量１００ＹＵのＧＩ−５００５を５週間受容した後の３１日目の試験ウサギ９匹中７匹からの血清サンプル中、および用量１０ＹＵ群における３匹中１匹からの血清サンプル中に検出した。ＰＢＳ群または１ＹＵ群の３１日目からの血清サンプル中には、ＨＣＶ特異的抗体が検出されなかった。この分析は、ＧＩ−５００５に含まれる異種性のＨＣＶ  ＮＳ３−Ｃｏｒｅタンパク質に対する血清抗体の用量依存的な誘導が、ウサギにおいてこのＴａｒｍｏｇｅｎＴＭの皮下注射の結果として生じることを示す。
【０２０６】
予備的な９７日目および１２０日目の臨床病理学および全ての観察データは、３１日目の集団からの知見と一致する。雄および雌のウサギへの、用量レベル１ＹＵ、１０ＹＵおよび１００ＹＵのＧＩ−５００５の１３週間の投与は、明らかな全身性の毒性を何ら生じなかった。第一の処置に関連した知見は、一般に用量に関連する徴候および重篤度とともに局所部位反応に限定された。しかし、１００ＹＵ用量群において、より重篤な肉芽腫性の変化、線維形成およびネクローシスが、注射部位反応において観察され、臨床設定における潜在的な用量限定効果を示す。この９７日集団の組織病理学的分析はまだ利用可能ではない。処置に関連した白血球数の増加（好中球数の増加を反映する）およびグロブリン値の増加もまた、両方の効果について一般に用量に関連する開始および重篤度とともに、観察された。これらの増加は、時間とともに進行する傾向があり、回復の徴候は示さない。
【０２０７】
ＧＩ−５００５  ＴａｒｍｏｇｅｎＴＭシリーズ製品およびプロトタイプを注射した３３１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスからの安全性評価の全ては、約５％の動物における注射部位で遅延型過敏症と一致する、未処置に関連した死および低度〜中程度の毛髪の喪失およびまれに腫瘍形成を伴う炎症を示した。注射部位反応性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに限定された。このマウスは、典型的に、皮膚外傷により感受性であり、群のハウジング条件により生じる身づくろいの振る舞いに二次的であり得る。他の全体的な臨床的な異常または副作用は観察されなかった。
【０２０８】
【表５】
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【０２０９】
本明細書中に記載または列挙される刊行物の各々は、その全体が参考として本明細書に援用される。
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本発明の種々の実施形態が詳細に記載されているが、これらの実施形態の変更および適合が当業者になされ得ることは明らかである。しかし、このような変更および適合が、添付の特許請求の範囲に従って本発明の範囲内であることは、明らかに理解されるべきである。
【０２１０】
以下、上記の実施形態から把握できる技術的思想を付記する。
（付記１）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部分に連結された、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部分を含む、ワクチン。
（付記２）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、天然のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの触媒ドメインを欠失している付記１に記載のワクチン。
（付記３）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、本質的に、ＮＳ３全長タンパク質のＮ末端の８８アミノ酸の後に続く、２６２アミノ酸（配列番号２０の第１１１５位〜第１３７８位）からなる付記１に記載のワクチン。
（付記４）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの疎水性のＣ末端配列は切断されている付記１に記載のワクチン。
（付記５）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、本質的に、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの全長配列の第２位〜第１４０位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）からなる付記５に記載のワクチン。
（付記６）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の２つのアミノ酸を含むように付加されている付記１に記載のワクチン。
（付記７）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列は、アミノ酸配列Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ（配列番号１０）を含むように付加されている付記１に記載のワクチン。
（付記８）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記１に記載のワクチン。
（付記９）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号２からなる付記１に記載のワクチン。
（付記１０）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記融合タンパク質は、不活性化された、全長のＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質を含む、ワクチン。
（付記１１）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、配列番号２０のＨＣＶ  ポリタンパク質配列の第１１６５位の残基に変異を含み、タンパク質分解活性が不活性化している付記１０に記載のワクチン。
（付記１２）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記１０に記載のワクチン。
（付記１３）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号４からなる付記１０に記載のワクチン。
（付記１４）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、切断ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に融合された、切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を含む、ワクチン。
（付記１５）
上記切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ１の第１位〜第１５６のアミノ酸（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）からなる付記１４に記載のワクチン。
（付記１６）
上記ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ２の第１位〜第３３４位のアミノ酸（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）からなる付記１４に記載のワクチン。
（付記１７）
上記切断ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記１４に記載のワクチン。
（付記１８）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号６からなる付記１４に記載のワクチン。
（付記１９）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質を含む、ワクチン。
（付記２０）
上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位のアミノ酸（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）と、第１７７位〜第２６１位のアミノ酸（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）とが連結されている付記１９に記載のワクチン。
（付記２１）
上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記１９に記載のワクチン。
（付記２２）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号８からなる付記１９に記載のワクチン。
（付記２３）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  Ｅ２全長タンパク質に融合されたＨＣＶ  Ｅ１全長タンパク質に融合されたＨＣＶ  Ｃｏｒｅ全長タンパク質を含む、ワクチン。
（付記２４）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ全長タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記２３に記載のワクチン。
（付記２５）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１２からなる付記２３に記載のワクチン。
（付記２６）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ１タンパク質と、膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ２タンパク質とに融合された、切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を含む、ワクチン。
（付記２７）
上記切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の第２位〜第１４０位（配列番号２０の第２位〜第１４０位）からなる付記２６に記載のワクチン。
（付記２８）
上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質の第１位〜第１５６位（配列番号２０の第１９２位〜第３４７位）からなる付記２６に記載のワクチン。
（付記２９）
上記膜貫通ドメインが欠失したＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の第１位〜第３３４位（配列番号２０の第３８４位〜第７１７位）からなる付記２６に記載のワクチン。
（付記３０）
上記切断ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９（ＭＡＤＥＡＰ）に示されるアミノ酸配列が連結されている付記２６に記載のワクチン。
（付記３１）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１４からなる付記２６に記載のワクチン。
（付記３２）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂに融合されたＨＣＶ  ＮＳ４ａに融合されたＨＣＶ  ＮＳ３を含み、
該ＨＣＶ  ＮＳ３は、不活性化されており、
該ＨＣＶ  ＮＳ４ａは、膜貫通ドメインを欠失している、ワクチン。
（付記３３）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＨＳ３の第１位〜第６３１位（配列番号２０の第１０２７位〜第１６５７位）からなり、
配列番号２０の第１１６５位のセリンがアラニンに置換され、プロテアーゼが不活性化している付記３２に記載のワクチン。
（付記３４）
上記ＨＣＶ  ＮＳ４ａタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ａタンパク質の第１位〜第５４位（配列番号２０の第６３５位〜第６９１位）からなる付記３２に記載のワクチン。
（付記３５）
上記ＨＣＶ  ＮＳ４ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１７７位〜第２６１位（配列番号２０の第１８８８位〜第１９７２位）に融合されたＨＣＶ  ＮＳ４ｂの第１位〜第６９位（配列番号２０の第１７１２位〜第１７８０位）からなる付記３２に記載のワクチン。
（付記３６）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９に示されるアミノ酸配列（ＭＡＤＥＡＰ）が連結されている付記３２に記載のワクチン。
（付記３７）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１６からなる付記３２に記載のワクチン。
（付記３８）
（ａ）酵母ビヒクルと、
（ｂ）該酵母ビヒクルによって組換え的に発現されたＨＣＶ融合タンパク質とを含み、
上記ＨＣＶ融合タンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂタンパク質に融合されたＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質を含み、
上記ＮＳ５ｂタンパク質は、ＮＳ５ｂのＣ末端が欠失しており、不活性化されている、ワクチン。
（付記３９）
上記ＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ５ａの第１位〜第４４８位（配列番号２０の第１９７３位〜第２４２０位）からなる付記３８に記載のワクチン。
（付記４０）
上記ＨＣＶ  ＮＳ５ｂタンパク質は、本質的に、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂの第１位〜第５３９位（配列番号２０の第２４２１位〜第２９５９位）からなる付記３８に記載のワクチン。
（付記４１）
上記ＨＣＶ  ＮＳ５ａタンパク質は、Ｎ末端に、配列番号９に示されるアミノ酸配列（ＭＡＤＥＡＰ）が連結されている付記３８に記載のワクチン。
（付記４２）
上記融合タンパク質は、本質的に、配列番号１８からなる付記３８に記載のワクチン。
（付記４３）
上記融合タンパク質の発現は、誘導プロモーターの制御下にある付記１〜４２にいずれか１項に記載のワクチン。
（付記４４）
上記誘導プロモーターは、ＣＵＰ１である付記４３に記載のワクチン。
（付記４５）
樹状細胞をさらに含み、
該樹状細胞は、ＨＣＶ融合タンパク質を組換え的に発現する酵母ビヒクルが、細胞内に搭載されている付記１〜４２のいずれか１項に記載のワクチン。
（付記４６）
少なくとも１つの生物学的応答の修飾因子をさらに含む付記１〜４５のいずれか１項に記載のワクチン。
（付記４７）
上記生物学的応答の修飾因子は、サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体、および低分子薬剤からなる群より選択される付記４６に記載のワクチン。
（付記４８）
上記生物学的応答の修飾因子は、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０、アレムツズマブ、デニロイキンジフチトクス、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３の遮断薬、Ｆｌｔ−３リガンド、イミキモド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サルグラモスチム、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニスト、およびＴＬＲ−９アゴニストからなる群より選択される付記４６に記載のワクチン。
（付記４９）
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法であって、
ＨＣＶ感染から、動物を保護する製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。
（付記５０）
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法であって、
ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。
（付記５１）
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法であって、
疾患もしくは異常を治療または予防するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。
（付記５２）
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法であって、
ＨＣＶに感染する危険がある個体群を免疫するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。
（付記５３）
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンの使用方法であって、
ＨＣＶに感染している個体群を治療するための製剤において、上記ワクチンを使用する使用方法。
（付記５４）
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染から動物を保護する方法であって、
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンを、ＨＣＶに感染している動物もしくは、ＨＣＶに感染する危険がある動物に投与することを含み、
該ワクチンの該動物への投与により、ＨＣＶ感染もしくは該動物へのＨＣＶ感染の結果生じる少なくとも１つの症状を、軽減または抑制する、方法。
（付記５５）
ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる方法であって、
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンを動物に投与することを含む、方法。
（付記５６）
ＨＣＶに感染している個体群において、ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発させる方法であって、
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンを、該個体群に投与することを含む、方法。
（付記５７）
ＨＣＶに感染する危険がある個体群を、ＨＣＶに対して免疫する方法であって、
付記１〜４８のいずれか１項に記載のワクチンを該個体群に投与することを含む、方法。
（付記５８）
上記ワクチンは、ＨＣＶ抗原をコードするウィルスベクターを含むワクチンに加えて、追加免疫として投与される、付記５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
（付記５９）
上記ワクチンは、異なるＨＣＶワクチンで追加免疫する前に、上記の免疫系を初回刺激ために投与される、付記５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
（付記６０）
ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ配列の少なくとも一部分に連結された、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部分を含み、
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、天然のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの触媒ドメインが欠失している、単離されたＨＣＶ融合タンパク質。
（付記６１）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、本質的に、ＮＳ３全長タンパク質のＮ末端の８８アミノ酸に後に続くＨＣＶ  ＮＳ３の２６２アミノ酸（配列番号２０の第１１１５位〜第１３７６位）からなる付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６２）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの疎水性のＣ末端配列は、切断されている付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６３）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの配列は、本質的に、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの全長配列の第２位〜第１４０位のアミノ酸（配列番号２０の第２位〜第１４０位）からなる付記６２に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６４）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの配列は、グルタミン酸およびアスパラギン酸の２つのアミノ酸を含むように付加されている付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６５）
上記ＨＣＶ  Ｃｏｒｅの配列は、Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈのアミノ酸配列（配列番号１０）を含むように付加されている付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６６）
上記ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、Ｎ末端に、配列番号９に示されるアミノ酸配列（ＭＡＤＥＡＰ）が連結されている付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６７）
本質的に、配列番号２からなる付記６０に記載の単離された融合タンパク質。
（付記６８）
本質的に、配列番号４、６、８、１２、１４、１６、および１８からなる群より選択される核酸配列からなる核酸配列によってコードされる、単離された融合タンパク質。
（付記６９）
付記６０〜６８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
（付記７０）
付記６９に記載の単離された核酸分子を含む、組換え核酸分子。
（付記７１）
ウィルスベクターである付記７０に記載の組換え核酸分子。
（付記７２）
付記７１に記載の組換え核酸分子が導入された、組換え細胞。
（付記７３）
腫瘍細胞である付記７２に記載の組換え細胞。
（付記７４）
酵母細胞である付記７２に記載の組換え細胞。
（付記７５）
（ａ）付記６０〜６８のいずれか１項に記載のＨＣＶ融合タンパク質と、
（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む、ワクチン。
（付記７６）
付記６０〜６８のいずれか１項に記載のＨＣＶ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む、ワクチン。
（付記７７）
ＨＣＶ抗原から動物を保護するための製剤において、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを使用する方法。
（付記７８）
ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための製剤において、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを使用する方法。
（付記７９）
ＨＣＶに感染する危険がある個体群を免疫するための製剤において、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを使用する方法。
（付記８０）
ＨＣＶに感染している個体群を治療するための製剤において、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを使用する方法。
（付記８１）
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染から動物を保護する方法であって、
ＨＣＶに感染している動物、またはＨＣＶに感染する危険がある動物に、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含み、
上記ワクチンの上記動物への投与により、ＨＣＶ感染もしくは該動物へのＨＣＶ感染により生じる少なくとも１つの症状を軽減または抑制する、方法。
（付記８２）
ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを動物に投与することを含む、方法。
（付記８３）
ＨＣＶに感染している個体群において、ＨＣＶ抗原に対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための方法であって、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを上記個体群に投与することを含む、方法。
（付記８４）
ＨＣＶに感染する危険がある個体群をＨＣＶに対して免疫する方法であって、付記６０〜６８のいずれか１項に記載のワクチンを、上記個体群に投与することを含む、方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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