(57)【要約】      （修正有）【課題】昆虫細胞における組換えパルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）ベクターの生成用の核酸構築体、このような構築体を含む昆虫細胞、及びこれらの細胞を使用して組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法を提供する。【解決手段】昆虫細胞はパルボウイルスｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含むことが好ましく、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の翻訳の開始コドンは、昆虫細胞における発現後に部分的なエキソンスキッピングを行う次善の開始コドンである。昆虫細胞は、少なくとも１つのパルボウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、及びパルボウイルスカプシドタンパク質をコードする配列を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含む核酸構築体であって、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳の開始コドンが、昆虫細胞における発現後に部分的なエキソンスキッピングを行う開始コドンであり、昆虫細胞における発現のための発現制御配列が該オープンリーディングフレームに作動可能に連結しており、昆虫細胞において活性であるプロモーターを含む、上記核酸構築体。
【請求項２】
開始コドンがＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから成る群から選択される、請求項１に記載の核酸構築体。
【請求項３】
発現制御配列が多角体プロモーターを含む、請求項１又は２に記載の核酸構築体。
【請求項４】
昆虫細胞適合性ベクターである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の核酸構築体。
【請求項５】
昆虫細胞適合性ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項４に記載の核酸構築体。
【請求項６】
Ｒｅｐタンパク質をコードする配列において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２翻訳開始部位以外の、偽性と考えられる翻訳開始部位の１つ又は複数が除去された、請求項１から５までのいずれか一項に記載の核酸構築体。
【請求項７】
ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチドの配列を含む発現制御配列を更に含む、請求項６に記載の核酸構築体。
【請求項８】
ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む唯一の型のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞であって、請求項１から７までのいずれか一項に記載の第１の核酸構築体を含む上記昆虫細胞。
【請求項９】
ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
ｂ）昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結している配列をコードするＡＡＶカプシドタンパク質を含む第３のヌクレオチド配列と
をさらに含む、請求項８に記載の昆虫細胞。
【請求項１０】
ａ）請求項９の（ｂ）に記載の第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の第１の核酸構築体と、
ｂ）請求項９の（ａ）に記載の第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築体と
を含む、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１１】
第２の核酸構築体が昆虫細胞適合性ベクターである、請求項１０に記載の昆虫細胞。
【請求項１２】
昆虫細胞適合性ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項１１に記載の昆虫細胞。
【請求項１３】
第２のヌクレオチド配列が対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、前記対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌク
レオチド配列が、昆虫細胞において生成されるＡＡＶベクターのゲノムに組み込まれる、請求項８から１２までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
【請求項１４】
第２のヌクレオチド配列が２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列間に位置する、請求項１３に記載の昆虫細胞。
【請求項１５】
第３のヌクレオチド配列がＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含み、ＡＡＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択される、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
【請求項１６】
第３のヌクレオチド配列が、ＡＡＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチドの配列を含む発現制御配列を含む、請求項１５に記載の昆虫細胞。
【請求項１７】
第３のヌクレオチド配列が、１２ヌクレオチド位におけるＣ、２１ヌクレオチド位におけるＡ、及び２４ヌクレオチド位におけるＣから選択されるＡＡＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つの改変をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の昆虫細胞。
【請求項１８】
少なくとも１つの第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、及び第３のヌクレオチド配列が昆虫細胞のゲノムに安定して組み込まれている、請求項８から１７までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
【請求項１９】
請求項９、１３及び１４のいずれか一項に記載の第２のヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶビリオンを昆虫細胞において生成するための方法であって、
ａ）組換えＡＡＶビリオンが生成するような条件下で請求項８から１８までのいずれか一項に記載の昆虫細胞を培養するステップと、
ｂ）組換えＡＡＶビリオンを回収するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
抗ＡＡＶ抗体を使用する、ビリオンの親和性精製のステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗ＡＡＶ抗体が固定化抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗ＡＡＶ抗体が単鎖ラクダ抗体又はその断片である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）組換えＡＡＶビリオンの産生を許容する条件で請求項８から１８までのいずれか一項に記載の昆虫細胞を培養する段階；及び、
（ｉｉ）組換えＡＡＶビリオンを回収する段階
により生成された、組換えＡＡＶビリオン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスの生成、及び昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスベクターの生産性を増大させるウイルスｒｅｐタンパク質の発現及び安定性が改善されたアデノ随伴ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療用の最も有望なウイルスベクターの１つとして考えることができる。ＡＡＶは分裂及び非分裂ヒト細胞に効率よく感染する能力を有し、ＡＡＶウイルスのゲノムは宿主細胞のゲノム中の単一の染色体部位に組み込まれ、最も重要なことに、ＡＡＶは多くのヒトに存在するのに、それは如何なる疾患とも関連しない。これらの利点に鑑みて、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）はＢ型血友病、悪性メラノーマ、嚢胞性線維症、及び他の疾患に関する遺伝子治療の臨床試験において評価されている。
【０００３】
ＡＡＶの複製をｉｎ  ｖｉｔｒｏで持続させる宿主細胞は、いずれも哺乳動物細胞型に由来する。したがって、遺伝子治療において使用するためのｒＡＡＶは、これまで主に例えば２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、及び他の哺乳動物細胞系などの哺乳動物細胞系で生成されている（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号、米国特許第５，３８７，４８４号、米国特許第５，７４１，６８３号、米国特許第５，６９１，１７６号、米国特許第５，６８８，６７６号、ＵＳ２００２００８１７２１、ＷＯ００／４７７５７、ＷＯ００／２４９１６、及びＷＯ９６／１７９４７を参照）。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶの複製起点（逆方向末端反復即ちＩＴＲ）に隣接する治療遺伝子、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０に関する遺伝子、及びビリオン又は構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に関する遺伝子を含むＤＮＡプラスミドを提供することによって、このような哺乳動物細胞培養系において典型的には生成される。さらに、アデノウイルス由来の初期遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、ＶＡＲＮＡ）を含むプラスミドを提供してＡＡＶ遺伝子の発現を増大させ、ベクター収率を改善する（例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２７４５〜２７６０を参照）。しかしながら、大部分のこれらの哺乳動物細胞培養系では、細胞当たりで生じるＡＡＶ粒子の数は約１０４個の粒子である（Ｃｌａｒｋ、２００２、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６１（Ｓｕｐｐｌ．１）：９〜１５中で総説されている）。臨床試験用には、１０１５個を超えるｒＡＡＶの粒子が必要とされる可能性がある。この数のｒＡＡＶ粒子を生成するためには、１７５ｃｍ２フラスコの５，０００個の細胞に相当する、約１０１１個の培養ヒト２９３細胞を用いたトランスフェクション及び培養が必要とされる可能性があり、これは最大１０１１個の２９３細胞のトランスフェクションを意味する。したがって、臨床試験用の物質を得るための哺乳動物細胞培養系を使用したｒＡＡＶの大規模な生成は既に問題があることが証明されており、商業規模での生成はさらに現実的でない可能性がある。さらに、哺乳動物細胞培養において生成される臨床用途のベクターは、哺乳動物宿主細胞中に存在する望ましくない、おそらくは病原性の物質で汚染されるリスクが常に存在する。
【０００４】
哺乳動物生成系のこれらの問題を克服するために、近年、昆虫細胞を使用するＡＡＶ生成系が開発されてきている（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３５〜１９４３；ＵＳ２００３０１４８５０６及びＵＳ２００４０１９７８９５）。昆虫細胞におけるＡＡＶの生成には、３つのＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正確な化学量論値を得るためのいくつかの改変が必要で
あった、これは２つのスプライス受容部位の代替的使用と昆虫細胞によって正確に再現されないＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの次善的利用の組合せに頼るものである。昆虫細胞におけるカプシドタンパク質の正確な化学量論値を模倣するために、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）は、スプライシングを必要とせずに３つすべてのＶＰタンパク質を発現することができ、最上流開始コドンが次善の開始コドンＡＣＧによって置換されている、１つのポリシストロン性メッセンジャーに転写される構築体を使用する。同時係属出願（ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０５００１８）において、本発明者は、昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドタンパク質の化学量論値のさらなる最適化による生成に基づく、バキュロウイルス生成ＡＡＶベクターの感染性をさらに改良している。
【０００５】
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）により最初に開発されたＡＡＶ昆虫細胞発現系におけるＡＡＶＲｅｐタンパク質の発現用には、それぞれ別々の昆虫細胞プロモーター、それぞれΔＩＥ１及びＰｏ１Ｈプロモーターの制御下で、２つの独立したＲｅｐ発現単位（１つはＲｅｐ７８用であり１つはＲｅｐ５２用）を有する、組換えバキュロウイルス構築体が使用される。この系では、ΔＩＥ１プロモーター、Ｐｏ１Ｈプロモーターよりはるかに弱いプロモーターがＲｅｐ７８発現を促進するために選択されたが、これは、哺乳動物細胞中では、Ｒｅｐ５２と比較したＲｅｐ７８の少量の発現が高いベクター収率を助長することが知られているからである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：５２３６〜４３；Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、上記）。
【０００６】
しかしながら、さらに近年、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７〜２５）は、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌによって使用された２つのＲｅｐタンパク質の発現用のバキュロウイルス構築体は、固有の不安定性という欠点を有することを報告した。Ｕｒａｂｅの原型ベクターにおける２つのＲｅｐ遺伝子のパリンドローム配向を分離し、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８の発現用の２つの別個のバキュロウイルスベクターを設計することによって、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、上記）はベクターの継代安定性を増大させた。しかしながら、少なくとも５継代の間の昆虫細胞における２つの独立したバキュロウイルス−Ｒｅｐ構築体からＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２が一貫して発現されるにもかかわらず、ｒＡＡＶベクターの収率は、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）により設計された原型バキュロウイルス−Ｒｅｐ構築体と比較して５〜１０倍低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、昆虫細胞におけるＡＡＶベクターの大規模な（商業的）生成の、前述の重大な限界を克服する必要性が依然として存在する。したがって本発明の目的は、昆虫細胞におけるＡＡＶベクターの安定した高収率の（大規模な）生成をもたらす手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の説明
定義
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、機能的関係のポリヌクレオチド（又はポリペプチド）要素の連結を指す。それが他の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、核酸は「作動可能に連結している」。例えば、それがコード配列の転写に影響を与える場合、転写制御配列はコード配列と作動可能に連結している。作動可能な連結は、連結したＤＮＡ配列は典型的には隣接しており、必要な場合２つのタンパク質コード領域が接合して、隣接しリーディングフレーム内に存在することを意味する。
【０００９】
「発現制御配列」は、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列の発現を制御す
る核酸配列を指す。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するとき、発現制御配列はヌクレオチド配列と「作動可能に連結している」。したがって発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンを含み得る。用語「発現制御配列」は、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を少なくとも含むものとし、他の有利な構成要素も含み得る。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。この用語は、フレーム内外の望ましくない潜在的な開始コドンが配列から除去されているような核酸配列の設計も含み得る。この用語は、望ましくない潜在的なスプライス部位が除去されているような核酸配列の設計も含み得る。この用語は、ポリＡ尾部、即ちｍＲＮＡの３’端における一連のアデニン残基、ポリＡ配列と呼ばれる配列の付加を誘導する配列、即ちポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。それを設計してｍＲＮＡの安定性を増大させることも可能である。転写及び翻訳の安定性に影響を与える発現制御配列、例えばプロモーター、及び翻訳を行う配列、例えばコザック配列は、昆虫細胞において知られている。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが得られるように、作動可能に連結しているヌクレオチド配列を調節するような性質の配列でよい。
【００１０】
本明細書で使用する用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するために機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位、転写開始部位、及び転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位だけには限られないが、これらを含めた任意の他のＤＮＡ配列、及び直接的又は間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが当業者に知られている、任意の他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に確認される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、大部分の生理的条件及び発生条件下において大部分の組織中で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的誘導物質の適用によって、生理的又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の組織又は細胞中のみで活性がある。
【００１１】
用語「実質的に同一」、「実質的同一性」、又は「本質的に類似」又は「本質的類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、初期設定のパラメーターを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントをとるとき、本明細書の他の箇所で定義する少なくともある程度の割合の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの大域的アラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列のそれらの全長でアラインメントをとり、整合の数を最大にし、ギャップの数を最少にする。一般に、ＧＡＰ初期設定のパラメーター、及びギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）が使用される。ヌクレオチドに関しては、使用する初期設定のスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、及びタンパク質に関しては、初期設定のスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ８９、９１５〜９１９）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似しているか、或いはある程度の配列同一性を有すると言えるとき、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考えられることは明らかである。配列アラインメント及びパーセント配列同一性のスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１〜３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラム、又はオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（現バージョン２．７．１〜０７）を使用して決定することができる。或いは、パーセント類似性又は同一性は、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索することによって決定することができる。
【００１２】
本発明のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ適度、或いは好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下において、配列番号１０のヌクレオチド配列とハイブリダイズするそれらの能力によって定義することもできる。厳密なハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液、又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で約６５℃の温度において、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００及び最も好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列をハイブリダイズさせ、約０．１Ｍの塩、或いはそれ未満、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液、又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で６５℃において洗浄することが可能である条件として本明細書では定義する。ハイブリダイゼーションは一晩、即ち少なくとも１０時間実施することが好ましく、且つ洗浄は少なくとも１時間実施し、洗浄溶液は少なくとも２回交換することが好ましい。これらの条件は、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを通常可能にするはずである。
【００１３】
適度な条件は、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液、又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で約４５℃の温度において、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列をハイブリダイズさせ、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液、又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で室温において洗浄することが可能である条件として本明細書では定義する。ハイブリダイゼーションは一晩、即ち少なくとも１０時間実施することが好ましく、且つ洗浄は少なくとも１時間実施し、洗浄溶液は少なくとも２回交換することが好ましい。これらの条件は、５０％までの配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを通常可能にするはずである。当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件を改変して、５０％と９０％の間で同一性が異なる配列を特異的に同定することができるはずである。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞中の核酸の導入及び／又は発現用のベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、具体的には感染性のヒト又はサルＡＡＶなどのデペンドウイルス属、及びそれらの構成要素（例えば、動物パルボウイルスゲノム）の使用に関する。具体的には本発明は、昆虫細胞中での生成時のこのようなパルボウイルスベクターの生産性の改善に関する。
【００１５】
パルボウイルス科のウイルスは小さなＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス科、及び昆虫に感染するデンソウイルス科に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーは本明細書ではパルボウイルスと呼び、デペンドウイルス属を含む。その属の名称から推測することができるように、デペンドウイルスのメンバーは、それらが細胞培養中の増殖感染にアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を通常必要とする点で独特である。デペンドウイルス属は、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶ、及び他の温血動物（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）に感染する関連ウイルスを含む。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関する他の情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「パルボウイルス科：ウイルス及びそれらの複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄＥｄ．１９９６）中に記載されている。便宜上本発明は、ＡＡＶを参照することによって本明細書でさらに例示し記載する。しかしながら、本発明はＡＡＶに限られず、他のパルボウイルスに同様に適用することができることは理解される。
【００１６】
すべての知られているＡＡＶ血清型のゲノムの構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満である線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質に独特なコードヌクレオチド配列と隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）はカプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ形状ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成することができるように構成されている。これらのヘアピン構造はウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体用のプライマーとして働く。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染の後、Ｒｅｐ遺伝子（即ち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がそれぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質がウイルスゲノムの複製において機能を有する。ＲｅｐのＯＲＦ中のスプライシング事象は、実際４つのＲｅｐタンパク質（即ち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡは、哺乳動物細胞中でのＡＡＶベクター生成に十分であることが示されてきている。昆虫細胞中でも、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター生成に十分である。
【００１７】
「組換えパルボウイルス又はＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、１つ又は複数の対象とするポリヌクレオチド配列、対象とする遺伝子、又はパルボウイルス又はＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）に隣接する「導入遺伝子」を含むベクターを本明細書では指す。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（即ち、ＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞中に存在するとき、このようなｒＡＡＶベクターを複製し感染性ウイルス粒子にパッケージ化することができる。ｒＡＡＶベクターが大きな核酸構築体（例えば、染色体中、或いはクローニング又はトランスフェクションに使用されるプラスミド又はバキュロウイルスなどの他のベクター）に組み込まれているとき、したがってｒＡＡＶベクターは典型的には「プロベクター」と呼ばれ、これはＡＡＶパッケージ化機能及び必要なヘルパー機能の存在下での複製及びカプセル化によって「レスキュー」することができる。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、動物のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列であって、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の翻訳の開始コドンが次善開始コドンであるヌクレオチド配列に関する。次善開始コドンは、部分的なエキソンスキッピングを行う開始コドンであることが好ましい。部分的なエキソンスキッピングは、少なくとも一部分のリボソームがさらに下流の開始コドンではなくＲｅｐ７８タンパク質の次善開始コドンで翻訳を開始せず、好ましくはさらに下流の開始コドンがＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンであることを意味すると本明細書では理解される。次善開始コドンは、昆虫細胞におけるヌクレオチド配列の発現後に部分的なエキソンスキッピングを行うことが好ましい。次善開始コドンは昆虫細胞中で部分的なエキソンスキッピングを行い、バキュロウイルス発現を使用し、好ましくは感染後約２０〜４０時間、より好ましくは感染後約３０〜４０時間で１：１０〜１０：１、１：５〜５：１、又は１：３〜３：１の範囲のＲｅｐ７８とＲｅｐ５２のモル比を昆虫細胞においてもたらすことが好ましい。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２のモル比は、好ましくはＲｅｐ７８とＲｅｐ５２両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、或いは実施例１．１．３中に記載した抗体を使用して、実施例１．１．３中に記載したのと同様にウェスタンブロッティングによって決定することができる。
【００１９】
用語「次善開始コドン」は、本明細書では３ヌクレオチドの開始コドン自体のみでなく、その状況も指す。したがって、次善開始コドンは、次善の状況、例えばコザックでない状況での「最適」ＡＴＧコドンからなっていてよい。しかしながら、より好ましいのは、３ヌクレオチドの開始コドン自体が次善、即ちＡＴＧではない次善開始コドンである。次
善は本明細書では、正常ＡＴＧコドンと比較して他の同一状況での翻訳の開始時に、コドンが有効性が低いことを意味すると理解される。次善コドンの有効性は、他の同一状況での正常ＡＴＧコドンの有効性の９０、８０、６０、４０又は２０％未満であることが好ましい。翻訳開始の相対的有効性を比較するための方法は、本質的に当業者に知られている。好ましい次善開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択することができる。より好ましくはＡＣＧである。
【００２０】
動物のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ十分である非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として本明細書では理解する。動物パルボウイルスのヌクレオチド配列はデペンドウイルスに由来することが好ましく、ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来することがより好ましく、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶに由来することが最も好ましい。動物のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一例は配列番号１０で与え、これはＲｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ血清型２の配列ゲノムの一部分を示す。Ｒｅｐ７８コード配列はヌクレオチド１１〜１８７６を含み、Ｒｅｐ５２コード配列はヌクレオチド６８３〜１８７６を含む。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の正確な分子量、及び翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルス間で異なる可能性があることは理解される。しかしながら当業者は、ＡＡＶ−２以外のパルボウイルス由来のヌクレオチド配列中の対応する位置の確認の仕方を知っているはずである。動物のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、したがって：
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１０の１１〜１８７６位のヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）遺伝コードの縮重のために（ｃ）の核酸分子の配列とその配列が異なるヌクレオチド配列
として定義することもできる。
【００２１】
ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ十分である動物のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードすることが好ましい。
【００２２】
本発明の他の好ましいヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチドの配列、又は配列番号７と実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を含む。配列番号７のヌクレオチド配列と実質的同一性を有し、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の発現の増大を助長するはずである配列は、例えば配列番号７の９ヌクレオチドの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を有する配列である。
【００２３】
他のパルボウイルスの、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２翻訳開始部位以外の、Ｒｅｐタンパク質コード配列中の偽性と考えられる翻訳開始部位の除去は、昆虫細胞において認識され得る推定スプライス部位の除去と同様に、当業者によって十分理解されているはずである。昆虫細胞中での正確な発現のための野生型パルボウイルス配列の様々な改変は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）「分子クローニング：研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎ
ｕａｌ）」（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中に記載された技術などの、よく知られている遺伝子工学技術の適用によって実施される。Ｒｅｐタンパク質コード領域の様々な他の改変は当業者に知られており、これらはＲｅｐタンパク質の収率を増大させ得る。これらの改変は本発明の範囲内にある。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義したパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築体に関する。構築体中では、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞中での発現用の発現制御配列と作動可能に連結していることが好ましい。これらの発現制御配列は、昆虫細胞中で活性があるプロモーターを少なくとも含むはずである。昆虫宿主細胞中で外来遺伝子を発現させるための当業者に知られている技術を使用して、本発明を実施することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子工学及び発現に関する方法は、例えばＳｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．「バキュロウイルスベクター及び昆虫培養手順に関する方法のマニュアル（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．、「バキュロウイルスベクターを用いた昆虫細胞における異種遺伝子のクローニング及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」「組換えＤＮＡ技術及び適用（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、９７〜１５２；Ｋｉｎｇ、Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、「バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、「バキュロウイルス発現ベクター（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」：「研究室用マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、ニューヨーク；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．、１９９５、「バキュロウイルス発現のプロトコル、分子生物学における方法（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｌｕｍｅ３９；米国特許第４，７４５，０５１号；ＵＳ２００３１４８５０６；及びＷＯ０３／０７４７１４中に記載されている。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、例えば多角体プロモーターである。しかしながら、昆虫細胞中で活性がある他のプロモーター、例えばｐｌ０、ｐ３５、ＩＥ−１又はΔＩＥ−１プロモーター、及び前述の参照文献中に記載された他のプロモーターが、当技術分野で知られている。
【００２５】
昆虫細胞におけるパルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現用の核酸構築体は、昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましい。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の生産的な形質転換又はトランスフェクションが可能である核酸分子であると理解される。代表的な生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子、及び組換えウイルスがある。それが昆虫細胞適合性である限り、任意のベクターを利用することができる。ベクターを昆虫細胞ゲノムに組み込むことはできるが、昆虫細胞中のベクターの存在は不変的である必要はなく、一時的なエピソームベクターも含まれる。ベクターは知られている任意の手段によって、例えば細胞の化学処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクタ
ーはバキュロウイルスであり、即ち、構築体はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらの使用法は、昆虫細胞の分子工学に関する前に引用した参照文献中に記載されている。
【００２６】
他の態様では、本発明は、１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む唯一の型のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞に関する。単一のオープンリーディングフレームは１つ又は複数のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードすることが好ましく、オープンリーディングフレームはパルボウイルスＲｅｐタンパク質のすべてをコードすることがより好ましく、オープンリーディングフレームは、好ましくは昆虫細胞において少なくともＲｅｐ５２とＲｅｐ７８タンパク質の両方がそこから発現され得る完全長Ｒｅｐ７８タンパク質をコードすることが最も好ましい。昆虫細胞は、例えば多コピーエピソームベクターでは、１つの型のヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含み得るが、これらは本質的に１つ及び同一の核酸分子、又は１つ及び同一のＲｅｐアミノ酸配列をコードする少なくともいくつかの核酸分子、例えば、遺伝コードの縮重のために相互間でわずかに異なる核酸分子の多コピーであることは、本明細書では理解される。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする唯一の型の核酸分子の存在は、昆虫細胞におけるパルボウイルス生成のレベル（安定性）に影響を与える欠陥Ｒｅｐ発現構築体を生成する可能性がある、Ｒｅｐ配列を含む異なる型のベクター中に存在し得る相同的配列間の組換えを回避する。好ましくは、昆虫細胞では、１つ又は複数のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列が核酸構築体の一部分であり、ヌクレオチド配列が昆虫細胞中での発現用の発現制御配列と作動可能に連結していることが好ましい。さらに好ましい昆虫細胞は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする、上記で定義したヌクレオチド配列、好ましくは上記で定義した次善開始コドンを有するコード配列、又は上記で定義した核酸構築体を、「第１の」ヌクレオチド配列として含み、或いは昆虫細胞は、このようなヌクレオチド配列を含む上記で定義した核酸構築体を、「第１の」核酸構築体として含む。
【００２７】
組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの複製を可能にし、培養中に維持することができる任意の昆虫細胞を、本発明によって使用することができる。例えば、使用する細胞系は、スポドプテラフルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエの細胞系、又は蚊細胞系、例えばアエデスアルボピクタス（Ａｅｄｅｓ
ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）派生細胞系由来であってよい。好ましい昆虫細胞又は細胞系は、例えばＳｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（米国特許第６，１０３，５２６号；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）を含めた、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種由来の細胞である。
【００２８】
本発明による好ましい昆虫細胞は、前に記載した「第１の」ヌクレオチド配列又は核酸構築体以外に、
ａ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列と、
ｂ）昆虫細胞における発現用の発現制御配列と作動可能に連結しているパルボウイルスＣａｐタンパク質コード配列を含む第３のヌクレオチド配列と
をさらに含む。
【００２９】
本発明の文脈では、「少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」領域とも呼ばれる、大部分が相補的であり、対称的に配列した配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解される。ＩＴＲは複製起点、複製にお
ける「シス」の役割を有する部位、即ち、パリンドローム配列及びパリンドロームに固有の特異的配列を認識する、例えばＲｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）などの複製タンパク質として作用するトランスの認識部位である部位として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外はＩＴＲの「Ｄ」領域である。それは独特である（１つのＩＴＲ内に相補配列を有していない）。一本鎖ＤＮＡの切断は、Ａ領域とＤ領域の間の接合部で起こる。それは新たなＤＮＡ合成が始まる領域である。Ｄ領域は通常パリンドロームの片側に位置し、核酸複製ステップに対する方向性をもたらす。哺乳動物細胞において複製するパルボウイルスは、２つのＩＴＲ配列を典型的には有する。しかしながら、結合部位がＡ領域の両鎖上に存在し、Ｄ領域は対称的に、１つがパリンドロームの各側に位置するように、ＩＴＲを工学処理することは可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミド）上では、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８支援核酸複製が次いで両方向に進行し、１つのＩＴＲは環状ベクターのパルボウイルス複製に十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列は本発明の文脈で使用することができる。しかしながら、２個又は他の偶数個の通常のＩＴＲを使用することが好ましい。２個のＩＴＲ配列を使用することが最も好ましい。好ましいパルボウイルスのＩＴＲはＡＡＶのＩＴＲである。安全上の理由で、細胞中への最初の導入後にさらに増殖することができない組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを構築することが望ましい可能性がある。レシピエント中の望ましくないベクター増殖を制限するためのこのような安全メカニズムは、ＵＳ２００３１４８５０６中に記載されたのと同様に、キメラＩＴＲを有するｒＡＡＶを使用することによって提供することができる。
【００３０】
組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成用に昆虫細胞中で利用する核酸構築体の数は、本発明中では無制限である。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、或いはそれより多くの別個の構築体を利用して、本発明の方法に従い昆虫細胞中でｒＡＡＶを生成することができる。５個の構築体を利用する場合、１個の構築体はＡＡＶＶＰ１をコードし、他の構築体はＡＡＶＶＰ２をコードし、さらに他の構築体はＡＡＶＶＰ３をコードし、さらに他の構築体は上記で定義したＲｅｐタンパク質をコードし、且つ最終構築体は少なくとも１個のＡＡＶＩＴＲを含む。５個より少ない構築体を利用する場合、構築体は少なくとも１個のＡＡＶＩＴＲ、及びＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＲｅｐタンパク質コード配列の様々な組合せを含むことができる。２個の構築体又は３個の構築体を使用することが好ましく、前に記載したのと同様の２個の構築体がより好ましい。２個の構築体を使用する場合、昆虫細胞は（ａ）上記で定義したＲｅｐタンパク質の発現用の第１の核酸構築体であって、上記の（ｂ）で定義した第３のヌクレオチド配列をさらに含む構築体（昆虫細胞中での発現のために少なくとも１個の発現制御配列と作動可能に連結しているパルボウイルスＣａｐタンパク質コード配列を含む；以下も参照）、及び（ｃ）上記の（ａ）で定義した第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築体（少なくとも１個のパルボウイルス／ＡＡＶＩＴＲヌクレオチド配列を含む）を含むことが好ましい。３個の構築体を使用する場合、カプシドタンパク質の発現とＲｅｐタンパク質の発現に別々の構築体を使用すること以外は、２個の構築体に使用するのと同じ形状を使用することが好ましい。それぞれの構築体における配列は、互いに対して任意の順序であってよい。例えば、１個の構築体がＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＩＴＲ及びＯＲＦを含む場合、ＩＴＲ配列間のＤＮＡの複製によって、ＶＰのＯＲＦが複製されるか或いは複製されないように、構築体上にＶＰのＯＲＦが局在する可能性がある。他の例では、Ｒｅｐコード配列及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、構築体上で任意の順序であってよい。さらに第２、第３及び他の核酸構築体は昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましく、前に記載したバキュロウイルスベクターであることが好ましいことが理解される。或いは、本発明の昆虫細胞では、１つ又は複数の第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列及び任意選択の他のヌクレオチド配列を、昆虫細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。当業者は、昆虫ゲノム中にヌクレオチド配列を安定して導入する方法、及びゲノム中にこのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法を
知っている。ゲノム中への組込みは、例えば昆虫ゲノムの領域と非常に相同性が高いヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって助長することができる。トランスポゾンなどの特異的配列の使用は、ゲノム中にヌクレオチド配列を導入する他の方法である。
【００３１】
本発明では、パルボウイルスカプシド（Ｃａｐ）タンパク質コード配列を含む第３のヌクレオチド配列は、３つのパルボウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１、−２及び−３のそれぞれをコードする配列を含むと本明細書では理解される。カプシドタンパク質コード配列を含む第３のヌクレオチド配列は、様々な形で存在してよい。例えば、カプシドタンパク質、ＶＰ１、−２及び−３のそれぞれに関する別個のコード配列を使用することができ、それぞれのコード配列は昆虫細胞中での発現のために発現制御配列と作動可能に連結している。しかしながら、より好ましくは、第３のヌクレオチド配列は、全３個の動物パルボウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする１個のオープンリーディングフレームを含み、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンは、例えばＵｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）によって記載されたのと同様のＡＴＧではない次善開始コドンである。ＶＰ１カプシドタンパク質に関する次善開始コドンは、Ｒｅｐ７８タンパク質に関して上記で定義したのと同様であってよい。ＶＰ１カプシドタンパク質に関するより好ましい次善開始コドンはＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧから選択することができ、この中ではＣＴＧ及びＧＴＧが最も好ましい。カプシドタンパク質の発現に好ましい第３のヌクレオチド配列は、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチドの配列又は配列番号７と実質的に相同的なヌクレオチドの配列を含む発現制御配列をさらに含む。配列番号７のヌクレオチド配列と実質的同一性を有し、ＶＰ１の発現の増大を助長するはずである配列は、例えば配列番号７の９ヌクレオチドの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を有する配列である。カプシドタンパク質の発現に好ましい他の第３のヌクレオチド配列は、１２ヌクレオチド位におけるＣ、２１ヌクレオチド位におけるＡ、及び２４ヌクレオチド位におけるＣ（翻訳開始コドンの第１のヌクレオチドである位置１を基準とする；配列番号１を参照）から選択されるＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つの改変をさらに含むことが好ましい。他の血清型のＶＰ１の翻訳の偽性と考えられる開始コドンの除去は、昆虫細胞において認識され得る推定スプライス部位の除去と同様に、当業者によって十分理解されているはずである。ＶＰコード領域の様々な他の改変は当業者に知られており、それらはＶＰ及びビリオンの収率を増大させるか、或いは指向性の変化などの他の望ましい影響を有するか、或いはビリオンの抗原性を低下させるいずれかの可能性がある。これらの改変は本発明の範囲内にある。好ましくは、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞中での発現のために発現制御配列と作動可能に連結しており、発現制御配列は昆虫細胞中で活性があるプロモーターを少なくとも含むはずである。昆虫宿主細胞中でパルボウイルスカプシドタンパク質を発現させるための、このような制御配列及び他の技術及び物質（例えばベクター）は、Ｒｅｐタンパク質について上記で既に記載している。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の昆虫細胞中に存在する第２のヌクレオチド配列、即ち少なくとも１つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲを含む配列は、対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、昆虫細胞において生成される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノムに組み込まれることが好ましい。対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞中での発現用の配列であることが好ましい。第２のヌクレオチド配列は２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列間に位置することが好ましい。それが２つの通常のＩＴＲの間に位置するか、或いは２
カ所のＤ領域で工学処理したＩＴＲの片側に位置する場合、（哺乳動物細胞中での発現用の）対象とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞において生成される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれることが好ましい。
【００３３】
本明細書で上記で定義した第２のヌクレオチド配列は、昆虫細胞中で複製される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置する、昆虫細胞中での発現用の少なくとも１つの「対象とする遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列をしたがって含み得る。任意のヌクレオチド配列は、本発明の方法に従い生成した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでトランスフェクトした哺乳動物細胞中での、後の発現用に組み込むことが可能である。ヌクレオチド配列は例えばタンパク質をコードすることができ、それがＲＮＡｉ物質、即ちＲＮＡ干渉することができるＲＮＡ分子、例えばｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などを発現することができる。「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞中では無毒である短い長さの二本鎖ＲＮＡである小分子の干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４〜９８；Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９７４２〜４７）。好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は２つのヌクレオチド配列を含むことができ、それぞれが哺乳動物細胞中での発現用の対象とする１つの遺伝子産物をコードする。対象とする産物をコードする２つのヌクレオチド配列のそれぞれは、昆虫細胞中で複製される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置する。
【００３４】
哺乳動物細胞中での発現用の対象とする産物は、治療用遺伝子産物であってよい。治療用遺伝子産物は、標的細胞中で発現されると、例えば望ましくない活性の除去、例えば感染細胞の除去、又は例えば酵素活性の欠失を引き起こす遺伝的欠陥の補足などの望ましい治療効果をもたらす、ポリペプチド、又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は他の遺伝子産物であってよい。治療用ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ、因子ＩＸ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘ；ＷＯ０１／００２２０参照）、アポリポタンパク質Ａｌ、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅレギュレーター相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、及びサイトカイン又は例えばＩＬ−１０のようなインターロイキンがある。
【００３５】
代替的或いは追加的に、第２の遺伝子産物として、本明細書で上記で定義した第２のヌクレオチド配列は、細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。この目的に適したマーカータンパク質は、例えば蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能なマーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地における選択用）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢにおける選択用）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８における選択用）、及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（メトトレキセートにおける選択用）、ＣＤ２０、低親和性の神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源、及びそれらを使用するための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）「分子クローニング：研究室用マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中に示されている。さらに、本明細書で上記で定義した第２のヌクレオチド配列は、必要であると考えられる場合、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターで形質導入した細胞由来の対象を治癒することができるフェイルセーフ機構として働くことができる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。しばしば自殺遺伝子と呼ばれる、このようなヌクレオチド配列は、タンパク質が発現されるトランスジェニック細胞を死滅させることができる毒性物質にプロドラッグを変換する可能性が
あるタンパク質をコードする。このような自殺遺伝子の適切な例には、例えば大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子の１つがあり、この場合ガンシクロビルをプロドラッグとして使用して、対象中のトランスジェニック細胞を死滅させることができる（例えば、Ｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４〜８４９を参照）。
【００３６】
他の実施形態では、対象とする遺伝子産物の１つはＡＡＶタンパク質であり得る。特に、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能断片。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノム上に存在し、ベクターで形質導入した哺乳動物細胞中で発現される場合、形質導入した哺乳動物細胞のゲノムへの組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組込みを可能にする。ｒＡＡＶ形質導入又は感染哺乳動物細胞中でのＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８の発現は、ベクターによって細胞中に導入される対象とする任意の他の遺伝子産物の長期又は永続的な発現を可能にすることによって、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのいくつかの用途に関する利点をもたらす可能性がある。
【００３７】
本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでは、哺乳動物細胞中での発現用の対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの哺乳動物細胞適合性の発現制御配列、例えばプロモーターと作動可能に連結していることが好ましい。多くのこのようなプロモーターは、当技術分野で知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、２００１、上記を参照）。ＣＭＶプロモーターなどの、多くの細胞型において広範囲で発現される構成的プロモーターを使用することができる。しかしながら、より好ましいのは、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的であるプロモーターであるはずである。例えば、肝臓特異的な発現に関しては、α１−アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターからプロモーターを選択することができる。他の例には、腫瘍選択的、及び特に神経細胞腫瘍選択的発現用のＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒ
ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５〜９）、又は単核血液細胞において使用するためのＩＬ−２プロモーターがある（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；１８５：２１０１〜１０）。
【００３８】
ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０）及びＧｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２４４５〜２４５０）を参照。しかしながら、ヒト滑膜繊維芽細胞のＡＡＶ形質導入は同様のネズミ細胞中より著しく有効であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、３：１（２００１）、ＡＡＶの細胞指向性は血清型間で異なる。例えば、哺乳動物のＣＮＳ細胞指向性及び形質導入効率に関するＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５の間の違いを論じている、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：３４２８〜３４３２）を参照されたい。
【００３９】
昆虫細胞中で組換えＡＡＶベクターを生成するための本発明の方法において使用することができるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来してよい。一般に、ＡＡＶ血清型はアミノ酸及び核酸レベルで相当な相同性のゲノム配列を有し、一組の同一な遺伝的機能をもたらし、物理的及び機能的にほぼ等しいビリオンを生成し、実際同一であるメカニズムによって複製及び構築する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の総説に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢ
ａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ
ａｌ．（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３〜３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５〜６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９〜１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ
ａｌ．（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９〜３１９）；及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５〜４７）を参照。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明の文脈で使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。本発明の文脈で使用するためのＡＡＶのＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）コード配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。本発明の文脈で使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、しかしながら、任意の知られている４２の血清型から、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９、或いは例えばカプシドシャッフリング技術及びＡＡＶカプシドライブラリーによって入手される、新たに開発されたＡＡＶ様粒子から得ることができる。
【００４０】
ＡＡＶのＲｅｐ及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型の間で特に保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は例えば８９％を超えて同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６の間のゲノムレベルでの全体のヌクレオチド配列の同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）：９３９〜９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物中でのＡＡＶ粒子の生成において、他の血清型由来の対応する配列と効率よく相互補完する（即ち、機能的に置換する）ことが知られている。ＵＳ２００３１４８５０６は、ＡＡＶのＲｅｐ及びＩＴＲ配列は、昆虫細胞中の他のＡＡＶのＲｅｐ及びＩＴＲ配列とも効率よく相互補完することを報告している。
【００４１】
ＡＡＶＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞指向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間のＲｅｐタンパク質及び遺伝子ほど有意に保存されていない。他の血清型の対応する配列と相互補完するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力は、１つの血清型（例えば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質及び他のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型ｒＡＡＶ粒子の生成をもたらす。このような偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部分である。
【００４２】
改変「ＡＡＶ」配列も、例えば昆虫細胞においてｒＡＡＶベクターを生成するために、本発明の文脈で使用することができる。このような改変配列は、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のＩＴＲ、Ｒｅｐと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はそれより高いヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、或いはＶＰを野生型ＡＡＶのＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに使用することができる。
【００４３】
多くの点で他のＡＡＶ血清型と類似しているが、ＡＡＶ５は他の知られているヒト及びサルの血清型より、他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型と異なる。それを考慮すると、ｒＡＡＶ５の生成は昆虫細胞における他の血清型の生成と異なる可能性がある。本発明の方法を利用してｒＡＡＶ５を生成する場合、１つ又は複数の構築体は、２つ以上の構築体の場合をひとまとめにして、ＡＡＶ５ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５Ｒｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（即ち、ヌクレオチド配列はＡＡＶ５Ｒｅｐ７８を含む）を含むことが好ましい。このようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列を望むように改変して、昆虫細胞
におけるｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターの有効な生成を得ることができる。例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができ、ＶＰスプライス部位を改変又は除去することができ、且つ／或いはＶＰ１開始コドン及び隣接ヌクレオチドを改変して、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５ベクターの生成を改善することができる。
【００４４】
したがって、他の態様では、本発明は昆虫細胞において（上記で定義した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを生成するための方法に関する。この方法は、（ａ）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが生成するような条件下において本明細書で上記で定義した昆虫細胞を培養するステップと、（ｂ）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを回収するステップとを含むことが好ましい。この方法で生成される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター核酸を含む感染性パルボウイルス又はＡＡＶビリオンであることが好ましいことは、本明細書において理解される。培養中の昆虫細胞に関する増殖条件、及び培養中の昆虫細胞における異種産物の生成は当技術分野でよく知られており、例えば昆虫細胞の分子工学に関する前に引用した参照文献中に記載されている。
【００４５】
この方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を使用する、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）の親和性精製のステップをさらに含むことが好ましい。抗ＡＡＶ抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。特に適切な抗体は、例えばラクダ又はラマなどから入手可能な単鎖ラクダ抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７〜３０２を参照）。ｒＡＡＶの親和性精製用の抗体は、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープと特異的に結合する抗体であることが好ましく、エピトープは２つ以上のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープであることが好ましい。例えば抗体は、ＡＡＶ２カプシドとの特異的結合に基づいて産生又は選択することができるが、さらに同時に、抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５カプシドとも特異的に結合することができる。
【００４６】
他の態様では、本発明は、上記で定義した核酸構築体及び細胞を使用して、前に記載した本発明の方法において生成されるｒＡＡＶビリオンに関する。ｒＡＡＶビリオンは、そのゲノム中に対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことが好ましく、少なくとも１つのヌクレオチド配列は原型ＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論では、ＶＰ１の量は：（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１００、１０５、１１０、１２０、１５０、２００又は４００％であり、或いは（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも８、１０、１０．５、１１、１２、１５、２０又は４０％であり、或いは（ｃ）少なくとも（ａ）と（ｂ）の両方で定義した量である。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の量は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のそれぞれに共通であるエピトープを認識する抗体を使用して測定することが好ましい。ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３の相対量の定量化を可能にするはずである、様々なイムノアッセイが当技術分野で利用可能である（例えば、「抗体の使用（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ、１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照）。３つのカプシドタンパク質のそれぞれに共通であるエピトープを認識するのに適した抗体は、例えば（Ｐｒｏｇｅｎ、ドイツから市販されている）マウス抗ＣａｐＢ１抗体である。本発明による好ましいｒＡＡＶビリオンは、そのゲノム中に対象とする遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むビリオンであり、少なくとも１つのヌクレオチド配列は原型ＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンは１アミノ酸位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む。本発明によるさらに好ましいＡＡＶビリオンは上記で定義したカプシドタンパク質の比を有しており、１アミノ酸位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む。
【００４７】
本文書中及びその特許請求の範囲中において、動詞「含む」及びその活用は、その語句の後の項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されるわけではないことを意味するように、非限定的な意味で使用する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素に対する言及は、１つ及びただ１つの要素が存在することを状況が明らかに必要としない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外するわけではない。したがって不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を通常意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】Ｒｅｐ発現における野生型ＡＡＶゲノムの構成の図である。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２遺伝子は、それぞれＰ５及びＰ１９プロモーターから発現される。（それぞれＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２のスプライス変異体である）Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０の発現は示さない。両方の発現単位がＡＴＧ開始部位を含む。
【図１Ｂ】本発明の構築体が、１つのプロモーター（例えば、多角体（ＰｏｌＨ）プロモーター）の制御下でＲｅｐのＯＲＦを有することを示す図である。このプロモーターはＲｅｐ７８とＲｅｐ５２両方の発現を誘導するが、これは、Ｒｅｐ７８の開始コドンＡＴＧが他のＡＣＧ開始コドンに変換され、リボソームによって一部分がスキップされるからである。
【図１Ｃ】Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ（２００２、上記）による原型構築体は、２つの異なるプロモーター（それぞれΔＩＥ１及びｐｏｌＨ）から独立にＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２を誘導することを示す図である。
【図２】昆虫細胞で５回継代した組換えバキュロウイルスから発現された、Ｒｅｐタンパク質のウェスタンブロット分析の図である。Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計された原型バキュロウイルス（原型ＲＥＰ／Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）は、５回の継代でＲｅｐ７８／５２発現のゆっくりした低下をもたらす。バキュロウイルス骨格ＰＳＣ（原型ＲＥＰ／ＰＳＣ）に挿入した、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計されたＲｅｐ７８及び５２の発現単位も、昆虫細胞での継代後にＲｅｐ７８／５２発現の低下をもたらす。しかしながら、ＰＳＣ骨格中にＡＣＧ開始コドンを含むＲＥＰ発現単位を有するバキュロウイルス（ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ）は、少なくとも５回の継代でＲｅｐ７８／５２の安定した発現をもたらす。ウェスタンブロット分析は、実施例１．１．３中に記載したように実施した。
【図３】グラフ中にプロットした表１の結果の図である。
【図４】昆虫細胞における様々なｒＡＡＶ構築体の安定性の比較の図である。ＳＦ＋細胞におけるｒＡＡＶ生成は、実施例１中で前に記載したように実施した。すべての生成に関して、ＩＴＲ含有バキュロウイルスとカプシド遺伝子含有バキュロウイルスは同一であり、継代数はＲｅｐ遺伝子含有バキュロウイルスと同じであった。４つの異なるＲｅｐ遺伝子含有バキュロウイルスを使用した：１）ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ、２）ＳＬＲ：Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）による原型構築体、３）Ｒｅｐ５２＋Ｒｅｐ７８（Ｂ２Ｂ）：２つの別個のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス、１つはＲｅｐ７８遺伝子を含み、もう１つはＲｅｐ５２遺伝子を含む。４）Ｒｅｐ５２＋Ｒｅｐ７８（ＰＳＣ）：２つの別個のプロテインサイエンスのバキュロウイルス、１つはＲｅｐ７８遺伝子を含み、もう１つはＲｅｐ５２遺伝子を含む。
【図５】第８代までのＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣバキュロウイルス構築体の安定性の図である。ＳＦ＋細胞におけるｒＡＡＶ生成は、実施例１中で記載したように実施した。
【図６】Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）からの原型構築体及び本発明によるＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ構築体のｒｅｐタンパク質発現に対する、継代効果の影響の比較の図である。バキュロウイルスの継代及びウェスタンブロットは、実施例１中に記載したように実施した。ｒｅｐバキュロウイルスの正常な継代の間に、ＳＦ細胞にバキュロウイルスを加えた後４０時間でサンプルを採取し、ウェスタンブロットを実施した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
Ｒｅｐ構築体
１．１．材料及び方法
１．１．１  バキュロウイルスプラスミドの構築
１つの２シストロン性メッセンジャーＲＮＡからＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２を発現させるために、発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌＳＬＲ（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、上記）上に位置するＲｅｐ７８のＡＴＧ開始コドンをＡＣＧに転換した。使用した上流プライマーは以下の通りであった：
BamHI
5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3'
（配列番号８）
プライマー配列、正方向
【００５０】
ＰＣＲ反応中で使用した３’プライマーはＲＥＰ７８遺伝子に隣接しており、ＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含む：
XbaI
5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'
（配列番号９）
プライマー配列、逆方向
【００５１】
前述のプライマーセット間の配列を、以下のプロトコル：９５℃、５分間の１サイクル；９５℃、１５秒間の３５サイクル；５５℃、３０秒間；７２℃、２分間；７２℃、１０分間の１サイクル；４℃、恒久的を使用して、ＰＣＲ（反応体積５０μｌ；１×ＰｆＸ  Ａｍｐ．バッファー、０．３ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１５０ｍＭの正方向プライマー、１５０ｍＭの逆方向プライマー、２×エンハンサー溶液、鋳型５０ｎｇ（ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌＳＬＲ）、１ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））によって増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ平滑末端ＩＩ−ＴＯＰＯでクローニングした。Ｒｅｐ７８は制限部位ＳｐｅＩ及び×ｂａＩを使用してｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。突然変異Ｒｅｐ発現カセットは、（制限酵素ＢｓｔＺ１７１及びＡｖｒＩＩを使用して）、バキュロウイルス発現構築体（ＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで切断した）ｐＰＳＣ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）に最終的にクローニングした。構築体の配列分析は、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダによって確認した。
【００５２】
１．１．２  組換えバキュロウイルスの生成
オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスを、ＧｅｎｅＸｐｒｅｓｓ  ＢａｃｕｌｏＫＩＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して生成した。トランスフェクションは以下のように実施した：丸底１４ｍ１チューブ内で２００μｌのＧＲＡＣＥ培地を６μｌのセルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、エッペンドルフチューブ内で２００μｌのＧＲＡＣＥ培地を、５０μｌのウイルスＤＮＡ（プロテインサイエンス）及び２μｇのトランスファープラスミド（ＲＥＰ）と混合した。エッペンドルフチューブからの内容物をチューブに加え、注意深く混合した。室温で３０分間のインキュベーション後、１，３００μｌのＧＲＡＣＥをトランスフェクション混合物に加えた。Ｔ２５フラスコ中の昆虫細胞はＧＲＡＣＥ培地で洗浄し、トランスフェクション混合物は細胞層に一滴ずつ加えた。２８℃で６時間のインキュベー
ション後、１０％のＦＢＳを補ったＳＦ９００ＩＩ血清を注意深く加え、Ｔ２５フラスコは５日間２８℃のストーブ内に置き、その後組換えバキュロウイルスを採取した。
【００５３】
１．１．３  ウェスタンブロット分析
バキュロウイルス−ＲＥＰを用いて昆虫細胞（ＳＦ＋）を感染させた。細胞感染後１６、４０、及び６４時間でサンプルを採取し、０．１Ｖ１０×ＴＲＩＳ溶解バッファー（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴＲＩＳ、０．０１ＭのＭｇＣｌ、１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ｐＨ８．５、濾過滅菌済）を加えることによって細胞を溶かし、シェーカー（Ｉｎｎｏｖａ  ４４、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）内で２８℃において３０分間インキュベートした。３０分間３７℃でのベンゾナーゼとのインキュベーションによって、遊離ＤＮＡ及びＲＮＡを分解した。細胞溶解物は遠心分離にかけた（１，９００×ｇ；１５分間；４℃）。ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファー（４×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を上清のサンプルに加え、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１２０Ｖ）に載せた。タンパク質は、１０Ｖ（半乾燥ブロッティング）で３０分間ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）にブロッティングした。ウェスタンブロットによる免疫化学測定法を、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＰＢＳブロッキングバッファー（ＰＩＥＲＣＥ）で膜をブロッキングし、マウス抗Ｒｅｐ（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、ドイツ；希釈１：５０）及びウサギ抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ、希釈１：５００）と後にインキュベートすることによって実施した。ｌｕｍｉ−ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光染色によって、Ｒｅｐ−タンパク質を視覚化した。
【００５４】
１．２  結果
本発明の新たに設計したＲｅｐ−構築体（ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ）の成績を、１）ＰＳＣバキュロウイルス骨格と２）Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス骨格（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）の両方の原型Ｒｅｐ構築体と比較した。全３個の構築体を第５代まで連続して継代した。ＡＡＶ１−ＬＰＬ生成の実験は、それぞれ第２、３、４及び５代のＡＡＶ−ＬＰＬ及びＡＡＶ−Ｃａｐ組換えバキュロウイルスと組合せた、第２、３、４及び５代のＲｅｐ−構築体を使用して実施した（ここで使用したＡＡＶ−ＬＰＬ及びＡＡＶ−Ｃａｐ組換えバキュロウイルスは、実施例２中で以下に記載する）。ＡＡＶ１−ＬＰＬの生成収率はｑＰＣＲによって測定し、表１中に示す。Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計された原型バキュロウイルス（原型ＲＥＰ／Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）は、５回の継代でＡＡＶ生成の急速な低下をもたらす。バキュロウイルス骨格ＰＳＣ（原型ＲＥＰ／ＰＳＣ）に挿入した、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計されたＲｅｐの発現単位も、昆虫細胞での継代後にＡＡＶ生成の低下をもたらす。しかしながら、ＰＳＣ骨格中にＡＣＧ開始コドンを含むＲｅｐ発現単位を有するバキュロウイルス（ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ）は、少なくとも５回の継代で安定したＡＡＶ生成をもたらす。したがって、数回の継代（例えば、第２代〜第５代）におけるＡＡＶ−ＬＰＬの再現性のある生成収率は、ＲＥＰ−ＡＣＧ構築体を含むバキュロウイルスを使用してのみ得られた。
【００５５】
【表１】
2014012013.tif 000002
表１：数回継代したバキュロウイルス構築体を使用したｒＡＡＶビリオンの生成：Ｓｆ９細胞を、第２、３、４又は５代のＬＰＬ−ベクター単位、第２、３、４又は５代のＲｅｐ−発現単位、及び第２、３、４又は５代のＣａｐ−発現単位をコードする３つの組換えバキュロウイルスで感染させた。３日後に細胞を採取し、ＡＡＶ収率（１ｍｌ当たりのベクターゲノム；ｖｇ／ｍｌ）をｑＰＣＲによって測定した。
【００５６】
【表２】
2014012013.tif 000003
表２：昆虫細胞の継代（第２代〜第５代）後に様々なＢａｃ−Ｒｅｐ構築体で実施したＱ−ＰＣＲ。
【００５７】
表２は、組換えバキュロウイルスにおけるＲｅｐ−発現単位用、及び隣接するバキュロウイルスＯＲＦ用に設計した、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）アッセイの結果を示す（１ｍｌ当たりの遺伝子コピー数；ｇｃ／ｍｌ）。Ｑ−ＰＣＲの値の間の比は、Ｒｅｐ−バキュロ
ウイルス中の欠失の存在を決定する。１という比は、バッチ中のすべてのバキュロウイルスが組換えＲｅｐ７８又は５２配列を含むことを理論上意味する。Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計された原型バキュロウイルス（原型ＲＥＰ／Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）は、第５代での相当量の組換えバキュロウイルスがＲｅｐ配列中の欠失を有することを示す。バキュロウイルス骨格ＰＳＣ（原型ＲＥＰ／ＰＳＣ）に挿入した、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２によって設計されたＲｅｐ７８及び５２用の発現単位は、組換えバキュロウイルスの非常に初期の劇的な消失を示す。しかしながら、ＰＳＣ骨格中にＡＣＧ開始コドンを含むＲｅｐ発現単位を有するバキュロウイルス（ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ）（クローンＣ４及びＡ３）は、少なくとも５回の継代で安定した組換えバキュロウイルスを示す。
【００５８】
（実施例２）
Ｃａｐ構築体
２．１．１  バキュロウイルスプラスミドの構築
１つのポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡからＶＰ１、２、３を発現させるために、（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、上記）によって記載されたのと同様にバキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築体を設計した。簡単に言うと、ＶＰ１のＡＴＧ開始コドンをＡＣＧに突然変異させた。１１位の考えられるＡＴＧ開始コドンはＡＣＧに変わった。ＶＰ１開始コドンの下流のスプライス受容体部位を破壊した（２１及び２４位における突然変異）。突然変異Ｃａｐ発現カセットは、ＢａｍＨ１／ＳｔｕＩ制限部位を有するバキュロウイルス発現構築体；ｐｆａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）にクローニングした。このプラスミド（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）は、ＶＰ１用の他の開始コドンを導入するための出発物質であった。前述の突然変異を導入するためにＵｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）によって使用された正方向プライマーは、以下の通りであった：
BamHI        1         11       21 24
5'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
（配列番号１）
【００５９】
出発物質としてｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、上記）を使用して発現構築体を作製するために、以下の正方向プライマーを使用した：
5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
（配列番号２）
5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
（配列番号３）
5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
（配列番号４）
5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'
（配列番号５）
【００６０】
前述の正方向プライマーと共にＰＣＲ反応中で使用した逆方向プライマーは、ＶＰ１開始コドンの下流２３０ｂｐまでの位置を対象とし、特有のＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ）を含む。
5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3'
（配列番号６）
【００６１】
ＰＣＲにより正方向と逆方向プライマー対の前述のセットを用いて断片を増幅した。Ｂ
ａｍＨＩ及びＳｔｕＩを用いたＰＣＲ産物の消化後、ＰＣＲ産物はｐＦＢＤＡＡＶ１ｖｐｍ１１のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローニングし、様々な試験用バキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築体を生成した。ＤＮＡ構築体はＢａｓｅｃｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダでの配列分析によって確認した。
【００６２】
２．１．２  組換えバキュロウイルスの生成
オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成した。０．１のｍｏｉで１ｍｌ当たり２×１０６個のＳｆ９細胞を感染させることによってｒＢａｃ−Ｃａｐを増幅した。感染後３日で細胞を遠心し、ウイルスを含む上清を回収した。
【００６３】
２．１．３  組換えＡＡＶの生成
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２による３つの組換えバキュロウイルスを使用してｒＡＡＶバッチを生成した。しかしながら、この試験に関しては、１つのバキュロウイルスはＬＰＬＳ４４７Ｘ−導入遺伝子の発現構築体を有していた。この導入遺伝子から発現される治療活性物質は、ヒトリポタンパク質リパーゼの天然に存在する変異体、４４８アミノ酸の単鎖ポリペプチドである。ＬＰＬＳ４４７Ｘの変異体は、タンパク質のＣ末端に２アミノ酸の欠失を有する。第２のバキュロウイルスはＡＡＶ複製遺伝子、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２の発現構築体を有していた。第３のバキュロウイルスはＡＡＶ１カプシド配列及びＶＰ１のＡＣＧ又はＴＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ開始コドンのいずれかを有していた。
【００６４】
プラスミド−トランスフェクション系を用いて生成した哺乳動物ｒＡＡＶのバッチは、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８（「組換えアデノ随伴ウイルスベクターを生成及び精製するための新規のツール（Ｎｏｖｅｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｄｅｃ１０；９（１８）：２７４５〜６０）に従い生成した。
【００６５】
２．１．３  ウェスタンブロット分析
バキュロウイルス−Ｃａｐを用いて昆虫細胞を感染させた。感染後３日で、細胞を遠心分離にかけた（３，０００ｇ；１５分間）。上清は０．２２ｕｍのＭｉｌｌｅｘフィルターを介して濾過した。ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を上清のサンプルに加え、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１２０Ｖ）に載せた。ゲルは１００Ｖで施した。タンパク質は１時間、１００Ｖ、３５０ｍＡでニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）にブロッティングした。ウェスタンブロットによる免疫化学測定法を、１％マーヴェル、乾燥スキムミルクで膜をブロッキングし、マウス抗Ｃａｐ（Ｐｒｏｇｅｎ、ドイツからのＢ１；希釈１：５０）及びウサギ抗マウス−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、希釈１：１００）と後にインキュベートすることによって実施した。発光及びウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光染色によって、ＶＰ１、２及び３を視覚化した。
【００６６】
２．１．４  生化学的測定
放射性トリオレオイルグリセロールエマルジョン基質を使用して以前に記載されたのと同様に（Ｎｉｌｓｓｏｎ−Ｅｈｌｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｔｚ、１９７６）、ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘの活性をアッセイした。ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘの免疫反応体を、ニワトリＩｇＹ及びマウス５Ｄ２抗ｈＬＰＬ抗体（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｔ．、２０００）を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。血漿トリグリセリドレベルは、製造者のプロトコル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、＃４５００３２）に従い市販のキットを使用することによって測定した。
【００６７】
２．２  結果
２．２．１  組換えバキュロウイルスの構築
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）により設計されたバキュロウイルスプラスミド中でのＶＰ１の発現用の異なる他の開始コドンを導入するために、ＢａｍＨＩ制限部位及びＶＰ１のＡＣＧ開始コドンの代わりにＴＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ又はＣＴＧコドンのいずれかを含む一連の上流プライマーを設計した。ＳｔｕＩ部位を含む下流プライマーと組合せてこれらのプライマーを使用したＰＣＲによって、いくつかの増幅断片を生成し、これらはｐＦＢＤＶＰｍ１１（Ｂａｃ−Ｃａｐ）のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローニングした。生成したバキュロウイルスプラスミドは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系を使用する組換えバキュロウイルスの調製に使用した。調製した組換えバキュロウイルスは昆虫細胞に感染させて、ＡＡＶカプシドを生成した。感染後３日で、異なるバキュロウイルスバッチのウイルスタンパク質の発現を、ウェスタンブロットで測定した。ウェスタンブロットから、ＶＰ１のＴＴＧ開始コドンを含むバキュロウイルス構築体は、以前に使用したＡＣＧ開始コドンと比較して高いレベルで、このタンパク質を発現したことが明らかになった。ＴＴＧコドンを使用したＶＰ１とＶＰ２の間の比は、野生型ＡＡＶに関して報告される比と同様に１：１であったことが分かった（示さず）。
【００６８】
２．２．２  培養中の細胞におけるｒＡＡＶバッチの感染
ＴＴＧ開始コドンを有する組換えバキュロウイルス由来のＡＡＶカプシドの感染性を調べるために、ｒＡＡＶを作製した。さらにｒＡＡＶバッチを、哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクションによって作製した。両ｒＡＡＶバッチのベクターゲノム力価をｑＰＣＲによって測定した。この力価を使用して、高いｍｏｉでマイクロタイタープレート中のＨＥＫ２９３細胞を感染させた。感染後２日で、導入遺伝子産物（ＬＰＬＳ４４７Ｘ）に関する定量アッセイ（ＬＰＬＳ４４７Ｘ−質量アッセイ）を、感染細胞の培地で実施した。このアッセイは、バキュロウイルス生成ｒＡＡＶによって生成したＬＰＬＳ４４７Ｘの量は、プラスミド生成ｒＡＡＶによって生成したＬＰＬと同等であったことを示した（示さず）。
【００６９】
２．２．３  マウスにおけるｒＡＡＶバッチの注射
バキュロウイルス生成系、及び従来の哺乳動物プラスミド生成系によって生成したｒＡＡＶバッチをマウスの筋肉内に注射して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＬＳ４４７Ｘ−タンパク質活性及びトリグリセリド非摂取を追跡した。注射後第３日、第７日及び第２週で、血液サンプルを採取し評価した。ウイルス投与後第３日と第７日の間に、哺乳動物ｒＡＡＶを注射した両マウス及びバキュロｒＡＡＶを注射した１マウスからサンプル採取した血液−血漿は、乳濁状から完全に透明な状態に変わった。１匹のバキュロｒＡＡＶ注射マウス由来の血液血漿は依然として比較的乳濁状であったが、しかしながら脂肪レベルは明らかに低下した。トリグリセリドレベルは、すべての治療マウスのそれぞれで低下した（示さず）。第１４日に、両方の哺乳動物ｒＡＡＶ及びバキュロウイルス−（ＴＴＧ）−ＡＡＶ治療マウスにおけるＴＧレベルは、ＴＧレベルが９６％低下した。ウイルス投与後２週間で採取した血漿サンプルは、バキュロウイルス−ＡＡＶと哺乳動物−ＡＡＶで治療したマウスのＬＰＬＳ４４７Ｘ−活性は、同等であったことを示した（示さず）。
【００７０】
（実施例３）
昆虫細胞における改変型Ｒｅｐ７８開始コドンを有するｒＡＡＶ構築体の安定性
３．１  昆虫細胞における様々なｒＡＡＶ構築体の安定性の比較
ＳＦ＋細胞におけるｒＡＡＶ生成は、実施例１中に前に記載したのと同様に実施した。すべての生成に関して、ＩＴＲ含有バキュロウイルスとカプシド遺伝子含有バキュロウイルスは同一であり、継代数はＲｅｐ遺伝子含有バキュロウイルスと同じであった。４つの異なるＲｅｐ遺伝子含有バキュロウイルス：１）ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ、２）ＳＬＲ：
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）による原型構築体、３）Ｒｅｐ５２＋Ｒｅｐ７８（Ｂ２Ｂ）：１つがＲｅｐ７８遺伝子を含みもう１つがＲｅｐ５２遺伝子を含む、２つの別個のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス、４）Ｒｅｐ５２＋Ｒｅｐ７８（ＰＳＣ）：１つがＲｅｐ７８遺伝子を含みもう１つがＲｅｐ５２遺伝子を含む、２つの別個のプロテインサイエンスのバキュロウイルスを使用した。
【００７１】
結果は図４中に示す。５回目のバキュロウイルス継代したｒＡＡＶ生成は、原型Ｒｅｐ構築体と比較して、及び分岐Ｒｅｐ構築体と比較して、本発明によるＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣを使用して１０倍を超えて既に改善されている。
【００７２】
３．２  第８代までのバキュロウイルス構築体の安定性
ＳＦ＋細胞におけるｒＡＡＶ生成は、実施例１中に記載したのと同様に実施した。すべての生成に関して、ＩＴＲ含有バキュロウイルスとカプシド遺伝子含有バキュロウイルスは同一であり、継代数はＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣバキュロウイルスと同じであった。結果は図５中に示す。ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣバキュロウイルスは少なくとも第８代まで安定性がある。ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣのｒＡＡＶ生成力価は、少なくとも第８代のバキュロウイルスまで安定している。
【００７３】
３．３  ｒｅｐタンパク質発現に対する継代の影響
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記）からの原型構築体Ｒｅｐタンパク質の発現に対する継代数の影響を、本発明によるＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ構築体と比較した。バキュロウイルスの継代及びウェスタンブロットは、実施例１中に記載したように実施した。ｒｅｐバキュロウイルスの正常な継代の間に、ＳＦ細胞にバキュロウイルスを加えた後４０時間でサンプルを採取し、ウェスタンブロットを実施した。図６は、原型Ｕｒａｂｅ構築体（ＳＬＲ）の初期継代と比較した多数回継代の低下したＲｅｐ発現を明らかに示すが、一方ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ構築体におけるＲｅｐ発現は、少数回の継代と比較して多数回の継代で同じ状態である。
【図１】
2014012013.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【配列表】
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