(57)【要約】【課題】より簡便かつ安全な方法で高い脱アセチル化度を有するキトサンを製造する方法を提供する。【解決手段】キチンまたはキトサンを塩基性アニオンのイオン液体および水に接触させて、アセチル基を脱アセチル化する工程を含むキトサンの製造方法に関する。イオン液体のアニオンのｐＫｂが１０以下であることが好ましい。また、イオン液体のアニオンが、酢酸イオンまたは炭酸水素イオンであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンまたはキトサンを塩基性アニオンのイオン液体および水に接触させて、アセチル基を脱アセチル化する工程を含むキトサンの製造方法。
【請求項２】
イオン液体のアニオンのｐＫｂが１０以下である請求項１に記載のキトサンの製造方法。
【請求項３】
イオン液体のアニオンが酢酸イオンまたは炭酸水素イオンである請求項２に記載のキトサンの製造方法。
【請求項４】
キチンまたはキトサンがイオン液体に溶解していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のキトサンの製造方法。
【請求項５】
脱アセチル化工程を４０℃以上の加熱条件下で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のキトサンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビ・カニの殻等のバイオマスを出発原料とし、抗菌性材料や機能性食品成分として利用されている多糖類高分子であるキトサンの製造方法に関し、より詳しくはキチンからキトサンを製造する方法、およびキトサンの残存するアセチル基をさらに脱アセチル化して高脱アセチル化したキトサンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンはエビやカニ等の甲殻類外皮の主要構成成分であるキチンを脱アセチル化することで得られる多糖類高分子である。脱アセチル化によって生成するアミノ基に起因する抗菌活性を示すことから、キトサンは創傷被覆材などの抗菌材料として実用化されている。また、キトサンをさらに低分子化して得られるｄ−グルコサミンは、機能性食品として幅広く応用されている。
【０００３】
工業的なキトサンの製造方法は、キチンを希塩酸や希酢酸等の希酸に一旦溶解させ、この溶液に高濃度の水酸化ナトリウムを加え、強アルカリ性条件下で加熱するものである（特許文献１）。この方法は、用いる薬剤が安価という利点から広く用いられている。
【０００４】
近年、前述した希酸に代わる新規な溶媒系として、イミダゾリウム型などのイオン液体が注目を集めており、イオン液体を用いてのキチン・キトサンの化学加工についての研究開発が国内外の研究者によって盛んに行われている（特許文献２および３）。国内ではとくに鹿児島大学の門川らの研究例が知られており、ハロゲン化物イオンをアニオンとして有するイミダゾリウム型イオン液体を用いてカニやエビの殻からキチンを溶解抽出することに成功している（特許文献２）。また、陰イオンとして酢酸イオンを持つ１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（ＢＭＩＭ−ＯＡｃ）もキチンおよびキトサンの良溶媒としては機能することが知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの溶媒系の利用はキチンないしキトサンの化学的変性を抑えながら繊維やフィルムに加工することを念頭に置いており、脱アセチル化によるキチンのキトサンへの変換やキトサンのアミノ基含有量増大を目的とするものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−４４１号公報
【特許文献２】特開２０１２−２１９２６０号公報
【特許文献３】特表２００８−５３５４８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．２３２１−２３２７（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来から行われてきた希酸および濃アルカリを用いるキトサンの脱アセチル化法は、安価な薬剤で実施可能である一方、以下のような問題を有している。
【０００８】
１）安全管理コスト
用いる酸やアルカリが劇物ないし強刺激性のため、製造装置の腐食・臭気の発生といった問題がある。とくにアルカリ性条件下での加水分解は４０重量％という極めて高濃度の水酸化ナトリウム水溶液中で行う必要があり、高粘性である濃アルカリ溶液の加熱による突沸を防止するために細心の注意を要する。
【０００９】
２）副生物の発生
脱アセチル化反応後は酸を再度添加して弱アルカリ性下でキトサンの回収を行うが、この際副生物として塩化ナトリウムや塩化アンモニウムなどの塩が多量に発生する。
【００１０】
３）反応の不均一性
キトサンは酸には可溶であるがアルカリには不溶である。このため脱アセチル化反応はキトサンが反応系中で懸濁した不均一条件下で行われ、反応効率には本質的な限界がある。キトサンの実用的機能である抗菌活性を高めるためには脱アセチル化度を可能な限り高める必要があり、このためには上記の脱アセチル工程を繰り返す必要がある。
【００１１】
以上のようにキトサンの製造においては、酸・アルカリの添加を繰り返す煩雑な手順を繰り返す必要があることと副生物の処理コストが、価格を上昇させ、普及を妨げる要因となっている。そこで、本発明は、より簡便かつ安全な方法で高い脱アセチル化度を有するキトサンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、キチンまたはキトサンを塩基性アニオンのイオン液体および水に接触させて、アセチル基を脱アセチル化する工程を含むキトサンの製造方法に関する。
【００１３】
イオン液体のアニオンのｐＫｂが１０以下であることが好ましい。
【００１４】
イオン液体のアニオンが、酢酸イオンまたは炭酸水素イオンであることが好ましい。
【００１５】
キチンまたはキトサンがイオン液体に溶解していることが好ましい。
【００１６】
脱アセチル化工程を４０℃以上の加熱条件下で行うことが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、キチンまたはキトサンを塩基性アニオンのイオン液体に接触させるため、従来水酸化ナトリウムを用いて工業的に製造されてきたものと同程度の脱アセチル化度を有するキトサンを、より簡便に、かつ安全な条件で製造することができる。また、キトサン製造の副生物である塩化ナトリウムや塩化アンモニウムなどの無機塩の発生を大幅に低減することができる。さらには、キトサンから分離したイオン液体は、水分を除去することにより再利用可能であり、リサイクル使用により長期的な製造コストの低減が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１の工程の概要を示す図である。
【図２】図２は、比較例１の工程の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のキトサンの製造方法は、キチンまたはキトサンを塩基性アニオンのイオン液体および水に接触させて、アセチル基を脱アセチル化する工程を含む。
【００２０】
キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４−グリコシド結合により重合した構造を有する天然多糖である。一方、キトサンとは、キチンのアセトアミド基を加水分解して脱アセチル化することで得られる、Ｄ−グルコサミンがβ−１，４−グリコシド結合により重合した構造を有する多糖である。キチンは、節足動物の外皮、とくに甲殻類の甲殻の構成成分であり、これらの生物材料から単離することで得ることができる。
【００２１】
イオン液体とは、イオン性液体あるいは常温溶融塩とも呼ばれ、アニオンとカチオンから構成されている電解質であるにもかかわらず、常温で液体の状態を保つ物質である。イオン液体のカチオンはとくに限定されないが、４級アンモニウム、イミダゾリウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピロリニウム、ビラジニウム、ピリミジニウム、トリアゾニウム、トリアジニウム、トリアジン誘導体カチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、インドリニウム、キノキサリニウム、ピベラジニウム、オキサゾリニウム、チアゾリニウム、モルフォリニウム、ピペラジンなどが挙げられる。なかでも、多糖類に対する親和性の点で、イミダゾリウム、４級アンモニウム、またはそれらの誘導体が好ましい。
【００２２】
イオン液体のアニオンは塩基性のアニオンであればとくに限定されないが、アニオンのｐＫｂは１０以下が好ましく、９．５以下がより好ましい。また、ｐＫｂの下限は、０．２以上が好ましく、７．０以上がより好ましい。ｐＫｂが１０を超えると、アニオンの塩基としての能力が弱く加水分解が進行せず、０．２未満では、たとえばカチオンとしてイミダゾリウムカチオンを使用した場合、２位水素（２個の窒素の間の炭素に結合した水素）がプロトンとして引き抜かれ電荷が失われる傾向がある。具体的なアニオンとしては、酢酸イオン（ＣＨ３ＣＯＯ−）、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）、アルキルチオラートイオン（Ｒ−Ｓ−）、フェノキシドイオン（Ｃ６Ｈ５Ｏ−）、安息香酸イオン（Ｃ６Ｈ５ＣＯＯ−）などが挙げられる。なかでも、アセトアミド基に対する加水分解触媒能および市販品としての入手の容易さの点で、酢酸イオン、炭酸水素イオンが好ましい。
【００２３】
これらのイオン液体は、１種のみを使用することも、複数を組合せて使用することもできる。
【００２４】
イオン液体の使用量はとくに限定されないが、キチンまたはキトサン１００重量部に対して、９００〜１０００００重量部が好ましく、４９００〜１００００重量部がより好ましい。９００重量部未満では、キトサンのイオン液体への溶解が不完全となり、１０００００重量部を超えるとイオン液体に溶解した状態からのキトサンの回収が困難となる傾向がある。
【００２５】
キチンまたはキトサンは、イオン液体と接触させればよく、イオン液体に懸濁させても、溶解させても良いが、加水分解反応の効率を高める点で溶解させることが好ましい。また、必要に応じて溶解させるために加熱することもできる。
【００２６】
アセチル基を脱アセチル化する工程において、キチンまたはキトサンの塩基性アニオン懸濁液または溶液に、水を添加する必要がある。水の添加量は、特に限定されず、キチンまたはキトサン１００重量部に対して、０．１〜１００００重量部の範囲で添加することができる。より好ましくは、反応系に含まれるキチンまたはキトサンにおいて、これらの多糖の繰り返し単位がすべて無水Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基からなると考えた場合に含まれる繰り返し単位１．０モルに対して、１．０〜５００モルが好ましく、１０〜３００モルがより好ましい。５００モルを超えると、キトサンの溶解性が低下して反応系の不均一性が増大し、加水分解反応効率が低下することとなり、１．０モル未満では加水分解反応が進行せず脱アセチル化度が向上しない傾向がある。
【００２７】
水の使用量はイオン液体中のキチンまたはキトサンの濃度にも影響される。キチンまたはキトサンのイオン液体中の濃度が０．１〜５．０重量％であれば、キチンまたはキトサン中において、これらの多糖の繰り返し単位がすべて無水Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基からなると考えた場合に含まれる繰り返し単位１．０モルに対して、１．０〜５００モルが好ましく、１０〜３００モルがより好ましい。キチンまたはキトサンのイオン液体中の濃度が５．０〜１０重量％であれば、キチンまたはキトサンにおいて、これらの多糖の繰り返し単位がすべて無水Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基からなると考えた場合に含まれる繰り返し単位１．０モルに対して、１．０〜１００モルが好ましく、１０〜５０モルがより好ましい。
【００２８】
アセチル基を脱アセチル化する工程において、加熱することもできる。加熱温度はとくに限定されず、水の沸点やキトサンの熱安定性を考慮して、適宜選択可能であるが、４０℃以上が好ましく、８０℃以上がより好ましい。４０℃未満では、加水分解反応が進行しない傾向がある。また、上限は、１３０℃以下が好ましく、１００℃以下がより好ましい。１３０℃を超えると、キトサンが熱分解を受け分子量低下や着色を起こす傾向がある。また、加熱時間もとくに限定されないが、０．１〜５時間が好ましく、１〜３時間がより好ましい。５時間を超えると、キトサンが熱分解を受け分子量低下や着色を起こすこととなり、０．１時間未満では加水分解反応が進行しない傾向がある。
【００２９】
アセチル基を脱アセチル化した後のキトサンは、透析あるいはイオン液体が可溶な液体中でキトサンを再沈殿させる方法により、イオン液体から回収することができる。これらの方法には、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール等のアルコール類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒を用いることができる。回収したキトサンは、洗浄後、乾燥させることにより精製できる。キトサンの洗浄に用いる溶媒としてはとくに限定されないが、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。
【００３０】
キトサンの脱アセチル化度は、ＦＴ−ＩＲ法（Ａ．Ｋ．Ｔａｎｖｅｅｒ，Ｋ．Ｐ．Ｋｏｋ  ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．Ｈｕｎｇ， Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ, Ｖｏｌ．５,Ｎｏ．３，ｐｐ.２０５−２１２（２００２））、１Ｈ−ＮＭＲ法（Ｍ. Ｌａｖｅｒｔｕ, Ｚ. Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ,Ｖｏｌ．３２,Ｎｏ．６，ｐｐ．１１４９−１１５８（２００３））、コロイド滴定法（Ｔｏｅｉ, Ｋ. ａｎｄ Ｔ. Ｋｏｈａｔａ, Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ, Ｖｏｌ．８３, ｐｐ．５９−６５（１９７６））などの公知の方法によって測定することができる。なかでも、高い脱アセチル化度のキトサンに対しても正確な脱アセチル化度を算出することが可能な１Ｈ−ＮＭＲ法およびコロイド滴定法が好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
スターラーチップを入れた１００ｍＬナスフラスコに１−ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ＢＭＩＭ−ＯＡｃ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を９．９ｇと市販キトサン（キトサン５０、和光純薬工業(株)製）を０．１０ｇを加えナスフラスコに三方コックを取り付けた。三方コックの一端と真空ポンプをつなげ、ナスフラスコをオイルバスに入れ、オイルバスの温度を１００℃に設定し真空ポンプで減圧しながら３時間加熱・撹拌することで完全に溶解させた。
【００３３】
一旦、ナスフラスコから三方コックを取り外しキトサンが析出しない程度に脱イオン水を２ｇ（キトサン１００重量部に対し２０００重量部に相当、またキトサン中の繰り返し単位がすべてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基からなると考えた場合に含まれる繰り返し単位１．０モルに対し、２２４モルに相当）加え、還流管の下部に取り付けた。窒素の入った風船を１つつけた三方コックを還流管の上部に取り付け、三方コックのもう一端と真空ポンプをつなげて還流管とフラスコ内を真空状態にした。真空ポンプを取り外し、風船内の窒素で還流管とフラスコが満たされるよう、三方コックを開けた。この窒素雰囲気の下１００℃で１時間撹拌しながら還流を行った。
【００３４】
還流管からナスフラスコを取り外しナスフラスコに三方コックを取り付け、コックの一端と真空ポンプをつなげた。ナスフラスコをオイルバスに入れ、オイルバスの温度を１００℃に設定し真空ポンプで減圧しながら２時間加熱・撹拌した。
【００３５】
室温まで冷却後、溶液をナスフラスコから透析膜に移し入れ脱イオン水で満たされた３Ｌビーカーに沈めた。２日間にわたって外液である脱イオン水を数回交換することで透析を行い試料を析出させた。吸引濾過により試料を回収し１Ｌビーカーに試料を入れ、そこに５００ｍＬの脱イオン水を加え１５分撹拌することで試料を洗浄し吸引濾過により回収した後、もう一度同様の操作により洗浄した。この脱イオン水による洗浄は合計３回行った。脱イオン水による洗浄と同様の操作でメタノールによる洗浄を合計３回行った。同じように、アセトンによる洗浄を合計３回行った。試料を１日ドラフト内で風乾し、その後真空乾燥（６０℃、１８ｈ）することで高脱アセチル化キトサンを得た。実施例１の工程の概要を図１に示す。
【００３６】
（比較例１）
０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１６０ｍＬに市販キトサン（キトサン５０、和光純薬工業(株)製）２．０ｇを加え、２４時間攪拌して溶解させた後、ろ過して不純物を除去した。ろ液に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬ、水素化ホウ素ナトリウム１．０ｇを添加した。さらに、氷浴下で水酸化ナトリウム９０．２ｇを添加し、次いで酢酸ナトリウム１３６ｇを添加した。水浴下（１５℃）で１２時間攪拌し、窒素雰囲気の下１００℃で３時間攪拌しながら還流し、脱アセチル化反応を行った。
【００３７】
脱アセチル化反応液に６ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加して弱塩基（ｐＨ７〜８）に中和して反応終了させ、脱イオン水で１Ｌにメスアップし、ろ過して希アンモニア水溶液を添加した。メタノールによる洗浄、及びアセトンによる洗浄をそれぞれ３回行い、風乾し、その後真空乾燥（６０℃、１８ｈ）することで脱アセチル化キトサンを得た。比較例１の工程の概要を図２に示す。
【００３８】
（脱アセチル化度の評価）
文献（キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサン実験マニュアル」、技報堂出版）を参考に、以下の手順によるコロイド滴定からキトサンの脱アセチル化度を算出した。
【００３９】
市販キトサン、実施例１で得たキトサン、および比較例１で得たキトサンを、それぞれ０．０５ｇを５重量パーセント濃度酢酸水溶液に溶解させ、各々のキトサン溶液１０ｇを用意した。得られたキトサン溶液１．０ｇを三角フラスコに取り、脱イオン水３０ｍＬで希釈した後、指示薬としてトルイジンブルー指示薬溶液を２滴加え、Ｎ／４００ポリビニル硫酸カリウム標準溶液で滴定した。脱アセチル化度（ＤＤ）は以下の（１）式を用いて算出した。なお、測定は各キトサン溶液につき３回行い平均値を算出した。
【００４０】
【数１】
2014193946.tif 000002
式中、Ｘ、Ｙ、ｖ及びｆは以下の通りである。
【数２】
2014193946.tif 000003
【数３】
2014193946.tif 000004
ｖ＝Ｎ／４００ポリビニル硫酸カリウム標準溶液の滴定値（ｍＬ）
ｆ＝Ｎ／４００ポリビニル硫酸カリウム標準溶液のファクター（１．００）
【００４１】
ＤＤの算出結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2014193946.tif 000005
【００４３】
比較例１では、酢酸イオンを塩基として使用し、水溶液中で脱アセチル化を行ったが、原料として使用したキトサンの脱アセチル化度とほとんど同じであって、脱アセチル化はほとんど起こらなかった。一方、同じ酢酸イオンを塩基として使用し、イオン液体中で脱アセチル化を行うと、実施例１に示すように、１０％も脱アセチル化が進行した。
【図１】
2014193946.tif 000006
【図２】
2014193946.tif 000007