(57)【要約】【課題】MALDI質量分析において、測定対象物質やマトリックスの不均一性に起因する検出精度の低下を最小限に抑えることのできる測定基板を提供する。【解決手段】MALDI質量分析用測定基板１０を、上面を有するベース板１１と、前記上面の少なくとも一部に敷設された、配向方向が前記上面の面内にある高配向性グラファイトシートから成るカーボンシート１２で構成する。高配向性グラファイトシートは面内方向において高い熱伝導率を有し、それに垂直な方向には低い熱伝導率を有するため、レーザ照射によりマトリックス物質において生成された熱エネルギーは、前記高配向性グラファイトシートを通じて速やかに面内方向に伝達される。これにより、レーザ照射箇所において熱エネルギーは均一となり、マトリックス物質による測定対象試料の昇華及びイオン化の反応が均等に行われるようになって、検出精度の低下が防止される。【選択図】図１
2014232055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面を有するベース板と、
前記上面の少なくとも一部に敷設された、配向方向が前記上面の面内にある高配向性グラファイトシートと
を備えることを特徴とするMALDI質量分析用測定基板。
【請求項２】
前記高配向性グラファイトシートの表面に、10 nm〜1 μmの凹凸が存在することを特徴とする請求項１に記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項３】
前記ベース板が導電性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項４】
前記ベース板がステンレス鋼製であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項５】
前記ベース板と前記高配向性グラファイトシートが導電性粘着剤層により固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項６】
前記導電性粘着剤層の中に良導電板が介挿されていることを特徴とする請求項５に記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項７】
前記ベース板が透光性を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のMALDI質量分析用測定基板。
【請求項８】
上面を有するベース板の上面の少なくとも一部に、配向方向が前記上面の面内にある高配向性グラファイトシートを敷設し、その上にターゲットサンプルを載置することを特徴とするMALDI質量分析方法。
【請求項９】
前記高配向性グラファイトシートの表面に、10 nm〜1 μmの凹凸が存在することを特徴とする請求項８に記載のMALDI質量分析方法。
【請求項１０】
前記ベース板が導電性を有することを特徴とする請求項８又は９に記載のMALDI質量分析方法。
【請求項１１】
前記ベース板がステンレス鋼製であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載のMALDI質量分析方法。
【請求項１２】
前記ベース板と前記高配向性グラファイトシートを導電性粘着剤層により固定することを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のMALDI質量分析方法。
【請求項１３】
前記導電性粘着剤層の中に良導電板を介挿することを特徴とする請求項１２に記載のMALDI質量分析方法。
【請求項１４】
前記ベース板が透光性を有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載のMALDI質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質やペプチド、有機化合物などの分子の質量を測定するために広く用いられるMALDI質量分析装置において、質量分析を行うために測定対象物質をイオン化する部分の装置、特にその基板（測定基板）に関する。
【背景技術】
【０００２】
MALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法）による質量分析は、タンパク質（一般的には分子量が10000以上）やペプチド（一般的には分子量が1000以上）など比較的高分子量の物質を不所望に分解させることなくイオン化することができるため、これらの分析に広く用いられている。MALDIでは、レーザによって測定対象物質をイオン化する際に、レーザの光エネルギーを直接、対象物質が受け取る代わりに対象物質の周辺に存在するマトリックス物質が光エネルギーを熱エネルギーに変換し、この熱エネルギーを測定対象物質のイオン化エネルギーとすることで、測定対象物質を壊すことなくイオン化することができるとされている。
【０００３】
しかしながら、このとき測定対象物質を正しく（すなわち、壊さずに）イオン化できる量（もしくはイオン化効率）は、測定対象物質の種類、マトリックス物質の種類等の要因によって変化するため、測定対象によってマトリックス物質の選定、レーザ照射条件、サンプル準備の条件等の最適化が、その都度必要である。
従って、MALDI質量分析装置において、測定対象物質をイオン化する部分の装置は非常に重要なものとなる。
【０００４】
また、対象物質が低濃度しか含まれていない場合、この対象物質の検出のために従来より各種の方法が提案されている。たとえば、従来は1 fmol(フェムトモル)/μL(マイクロリットル)程度の物質濃度が検出限界であったが、これ以下の低濃度においても検出を可能にするために、対象物質の濃縮を行い、対象物質を密な状態にした上で測定基板に付着させ、測定感度を向上させるという方法が開発されている。たとえば非特許文献１では、マトリックス物質及び測定対象物質を吸着させる測定基板の素材をステンレス鋼（SUS）とし、その表面に撥水性領域と親水性領域に細分した領域を設けた基板を作製している。この測定基板上に液体サンプルを滴下し、乾燥すると、その間に測定対象物質が親水性領域の方に濃縮される。これにより、液体サンプル中における測定対象物質の濃度が希薄であっても、乾燥後のサンプルでは測定対象物質が濃縮されているため、測定が容易となる。
【０００５】
そして、特許文献１には、特定のタンパク質を測定基板に選択的にキャプチャーすることで、効率の良いタンパク質の検出を行う例が示されている。
更に、特許文献２には、測定基板の表面に微小な凸部（量子ドット）を形成することで効率の良いイオン化を行うことができることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許公開第2003/0173513号公報
【特許文献２】特開2006-329977号公報
【特許文献３】特公平1-018002号公報
【特許文献４】特公平7-023261号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】"μFocus Sample Plates for MALDI-TOF MS", [online], Hudson Surface Technology,[平成25年4月10日検索],インターネット<URL:http://www.maldiplate.com/sites/default/files/assets/uFocus%20Technology%202010-08-23%20hires.pdf>
【非特許文献２】西木直巳等,「柔軟性を有する結晶性グラファイトの開発と実用化」,[平成25年4月10日検索],インターネット<URL:http://panasonic.co.jp/ptj/award/2010/pdf/42nd_ichimura_01.pdf>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１に記載の方法では、液体サンプル乾燥中に濃縮が均一に行われることを前提としているが、乾燥条件や対象物質およびマトリックスの物理化学的性質によっては均一に濃縮されないことがある。また、特許文献１や特許文献２に記載の方法においては、マトリックス物質から対象物質に熱エネルギーを伝達するという方法であるため、対象物質の周辺に存在するマトリックスの濃度が均一でない場合、測定対象物質の検出精度を低下させる。
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、これらの測定対象物質やマトリックスの不均一性に起因する検出精度の低下を最小限に抑えることのできる装置及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明に係るMALDI質量分析用測定基板は、
上面を有するベース板と、
前記上面の少なくとも一部に敷設された、配向方向が前記上面の面内にある高配向性グラファイトシートと
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るMALDI質量分析用測定基板は上記構造を有することにより、前記上面の面内方向において高い熱伝導率を有し、それに垂直な方向（前記基板の深さ方向）には低い熱伝導率を有する（すなわち、異方性を持つ）。この特性により、レーザ照射によりマトリックス物質において生成された熱エネルギーは、前記高配向性グラファイトシートを通じて速やかに面内方向に伝達される。これにより、レーザ照射箇所において熱エネルギーは均一となり、マトリックス物質による測定対象試料の昇華及びイオン化の反応が均等に行われるようになって、検出精度の低下が防止される。また、後述するように、ベース板の状態に大きく左右されることなく高感度の測定を行うことができる等、その他の様々な効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例である質量分析用測定基板の概略斜視図(a)及び断面図(b)。
【図２】高配向性グラファイトシートの上面表面(a)及び断面(b)の拡大図。
【図３】高配向性グラファイトシートの面内方向（横方向）熱伝導率と面外方向（縦方向）熱伝導率の差異を示す説明図。
【図４】本発明の別の実施例である質量分析用測定基板の概略斜視図。
【図５】従来の測定基板と本発明の第１実施例の測定用基板を用いた場合のイオン生成量を比較したグラフ。
【図６】ベース板と高配向性グラファイトシートの間に薄い良導電板を介挿した場合の効果を示すグラフ。
【図７】ベース板の背面に穴を設けた場合に、高配向性グラファイトシートを貼付することによる効果を示すグラフ。
【図８】ACTHをMALDI質量分析装置で測定した場合のマススペクトルであり、(a)が従来のSUSベース板上にターゲットサンプルを載置した場合、(b)が該SUSベース板上に高配向性グラファイトシートを貼付し、その上にターゲットサンプルを載置した場合の測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る質量分析用測定基板の一実施例について説明する。図１(a)は本実施例の質量分析用測定基板の斜視図であり、(b)はその断面図である。なお、図１(a)及び(b)は理解を容易にするために描いたものであり、その形状や詳細な構造、そして特に寸法比率は、実際のものを表すものではない。
【００１４】
本実施例の質量分析用測定基板１０は、基本的に、上面を有するベース板１１と、このベース板１１の上面に敷設されたカーボンシート１２から成る。ベース板１１は、対向電極との間にイオン放出用の電圧を印加するため、例えば、ステンレス鋼（SUS）や銅（Cu）、アルミニウム（Al）等の導電性を有する材料とすることが望ましい。熱伝導性や耐熱性、そして、溶媒との化学反応や熱による酸化等に対する耐性を考慮すると、ステンレス鋼（SUS）が適している。なお、ベース板１１自体は必ずしも導電性を有している必要はなく、例えば、カーボンシート１２と対向電極の間に放出電圧を印加するようにしても良い。
【００１５】
カーボンシート１２は高配向性グラファイトシートから成り、その配向方向はベース板１１の上面に平行な方向となるように設定されている。高配向性グラファイトシートは、図２(a)に示すように層状構造を有しており、層内（横方向）では炭素原子が結晶グラファイト構造を形成し、炭素原子同士が強固につながっている。一方、図２(b)に示すように、それに垂直な方向（縦方向）にはファンデルワールス力以外の結合を持っていない。このように、横方向での結晶構造が一方向に揃った配向性の高い構造であることにより、図３に示すように、横方向には熱伝導率が極めて高い。一方、縦方向の熱伝導率は低く、その比は50倍以上となっている。
【００１６】
このような高配向性グラファイトシートは、次のような方法で製造することができる（例えば、特許文献３、特許文献４、非特許文献２）。特定の高分子（ポリイミド等）から、無酸素状態で3000℃に加熱することにより水素、酸素、窒素を離脱させ、その後、残った炭素原子を焼鈍（アニール）することにより結晶化する。こうして得られたものは、上記の通り、層状構造を持つ。
【００１７】
カーボンシート１２は、ベース板１１の上面に導電性粘着剤１３により貼付する。導電性粘着剤層１３の中には、薄い良導電板１４を介挿させることが望ましい。これにより、カーボンシート１２上のターゲットサンプルへのイオン加速電圧の印加をより確実に行うことができる。例えば、導電性粘着剤層１３中に厚さ10μm程度の銀（Ag）の良導電板１４を介挿させることにより、ベース板１１とカーボンシート１２の間の抵抗値を概ね100Ω以下とすることができる。良導電板１４には銀（Ag）の他に、銅（Cu）、アルミニウム（Al）、プラチナ（Pt）等の他の金属を用いることができる。また、金属以外の良導電体でもよい。なお、この良導電板１４は本発明において必須のものではなく、無くても構わない。
【００１８】
本実施例の質量分析用測定基板がどのように作用するかを説明する。
本実施例の測定基板が対象とする質量分析装置は、ターゲットサンプルを測定基板上に乗せてレーザ照射を行い、発生した熱エネルギーによりサンプルの一部をイオン化させる。この基本的な仕組みはマトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析（MALDI-MS）やソフトレーザ脱離イオン化質量分析法として広く知られているものであり、基本的な動作は次のようなものである。
【００１９】
まず測定（検出）したい物質を含むサンプルを所定のマトリクス物質と混合する（これをターゲットサンプルと呼ぶ）。更に、必要に応じて、カチオン物質又はアニオン物質を加える。このとき、ターゲットサンプル中におけるマトリクス物質、カチオン物質、アニオン物質等の混合を均一に行うため、これらを溶媒に溶解した状態とすることもできる。
【００２０】
次に、こうして混合されたターゲットサンプルを所定量だけ測定基板のカーボンシート上の所定の場所に置く。ターゲットサンプルが前記のように溶媒に溶解した状態である場合には、溶媒が揮発してサンプルやマトリクス物質等が析出するのを待つ。
このようにしてターゲットサンプルを測定基板のカーボンシート上の所定位置に置いた後、測定基板を質量分析装置の所定の試料台にセットする。
【００２１】
質量分析装置は装置のプログラムに従い、前記試料台上の測定基板の所定位置にレーザ照射を行い、ターゲットサンプルからイオンを発生させる。発生したイオンは、測定基板に印加された加速電圧により測定基板から放出・加速され、装置内の電極間の所定距離を飛行した後、検出器で検出される。この飛行時間（タイム オブ フライト）を測定することで、発生したイオンの質量を知ることができる。なお、飛行時間測定以外にも種々の方法でイオンの質量を測定することができる。
【００２２】
ターゲットサンプルにレーザ照射を行った際、レーザエネルギーはマトリクス物質において熱エネルギーに変換され、照射点の温度を上昇させる。ターゲットサンプルはこの熱上昇の過程で固体から気体へ昇華し、同時にマトリクス物質が持っている一部のH+イオン(＝陽子）がサンプルへ移動することで、サンプルがイオン化する。この反応はマトリクス物質が転換する熱エネルギー下で行われているため、マトリクス物質が変換した熱エネルギーが一部の領域に滞留すると熱エネルギー分布が不均一となり、イオン化効率に不均一性が生じる恐れがある。このため、マトリクス物質が変換した熱エネルギーは一部領域に滞留することなく速やかに周辺領域へ伝達されるべきである。
【００２３】
ここではマトリクス物質がH+をサンプルへ受け渡す例を示したが、別途カチオン物質やアニオン物質を添加した場合には、これら物質から受け取ったイオンによりサンプルがイオン化するが、これらの反応も同じく熱エネルギーの下で行われるため、ターゲットサンプル中の熱エネルギー分布は同様に重要である。
なお、上記の質量分析装置の動作手順はMALDI-TOF法の一例によるものであり、本発明の使用装置・方法の範囲を限定するものではない。
【００２４】
本発明に係る質量分析用測定基板は既に説明したように面内方向（横方向）への熱伝導率が大きく、面外方向（深さ方向、縦方向）には小さいという異方性を有している。このことにより、レーザ照射によって発生した熱エネルギーは速やかに横方向へ優先的に流れるため、エネルギー分布は均一となり、マトリクス物質によるサンプルの昇華及びイオン化の反応が均一に行われる。
【００２５】
次に、本発明に係る質量分析用測定基板の性能を従来の質量分析用測定基板のそれと比較するために行った試験の結果を以下に示す。
まず、従来の、単なるSUSのみの測定基板（厚さ0.5 mm）と、それをベース板としてその上に本発明による10μm、25μm、75μmの厚さを有する高配向性グラファイトシート（図中ではPGSと表記）を載置した場合のイオン生成量を測定した試験の結果を図５に示す。なお、高配向性グラファイトシートは、Apiezon（米国Edwards社の商標）高真空グリースを用いてベース板に接着した。
【００２６】
図５の試験におけるイオン化の条件は次の通りである。
サンプル：ACTHペプチド断片（m/z＝2465.20）
サンプル量：1 pmol/well（測定基板のサンプル載置凹部1個中1 pmol）から開始する、2倍希釈系列を作製（1 pmol, 500 fmol, 250 fmol, 125 fmol, 63 fmol, 31 fmol, 16 fmol, 8 fmol, 4 fmol, 2 fmol, 1 fmol, 500 amol, 250 amol, 125 amol, 63 amol, 31 amol, 16 amol, 8 amol, 4 amol, 2 amol, 1 amol/well）
MALDIマトリックス：5 mg/ml CHCA(0.1% TFA + 50% MeCN）
質量分析装置：AXIMA CFRplus MALDI-TOF MS（株式会社島津製作所製）
測定モード：線形陽イオンモード（Linear positive ion mode）
測定範囲：m/z 1400 - 5000
MALDIターゲット分析範囲：1 x 1 mm, 50 μm/点, 441点
レーザ波長：337 nm（紫外レーザ）
レーザ照射条件：出力70（相対値）、2 ショット/点
Pulsed Extraction： m/z 4000
ACTH：adrenocorticotropic hormone（副腎皮質刺激ホルモン）
CHCA：alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid（アルファシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）
TFA：trifluoroacetic acid（トリフルオロ酢酸）
MeCN：acetonitrile（アセトニトリル）
【００２７】
図５より、従来のSUS製の測定基板上では約1.6 fmol/wellが測定限界となっているが、ターゲットサンプルとSUSベース板の間に高配向性グラファイトシートを介挿した場合、測定限界は約0.32 amol/wellとなっていることが分かる。すなわち、本発明に係る測定基板を用いることにより、MALDI質量分析装置における感度が大幅に上昇することが明らかとなった。
【００２８】
次に、SUSベース板と高配向性グラファイトシートの間に薄い良導電板を介挿した場合の効果を調べた結果を図６に示す。図６において、SUSベース板と高配向性グラファイトシートの間に厚さ約9μmの銅板を介挿した場合、0.001〜100 fmolのほぼ全てのACTH量のサンプルにおいて、銅板（良導電板）を介挿しない場合よりも生成イオン量が多いことが明らかとなった。なお、図５の場合と同様、高配向性グラファイトシートを用いた測定基板は単なるSUS板のみの測定基板の場合よりも生成イオン量が多いことは明らかに示されている。
【００２９】
次に、本発明に係る質量分析用測定基板が、従来の測定基板よりも外乱に対して頑強（robust）であることを示す試験結果を示す。図７は、上記同様の従来のSUS製のベース板（SUS）と、背面に穴を設けたSUSベース板にカーボンシートを貼付したもの（PGS hole＋）、その粘着層の内部に銅板を介挿したもの（PGS-Cu hole＋）、そして、穴を設けないSUSベース板に銅板とカーボンシートを積層したもの（PGS-Cu hole−）について、サンプル量と生成イオン量を測定したものである。これによると、カーボンシートを貼付したものは、ベース板背面の穴の有り無しにかかわらず、高いイオン生成率を示している。従来の質量分析用測定基板では、測定用基板に変形や傷等が存在すると、ベース板と対向電極の間に印加される電圧による電場が歪み、測定用基板からイオンが正常に放出されないという問題があったが、本発明に係る高配向性グラファイトシートを貼付した測定基板は、ベース板の状態にかかわらず、良好なイオン化を行うことができることが示された。これも、ターゲットサンプルにスポット的に入射されたレーザエネルギーを効率よくその全体に伝達するという高配向性グラファイトシートの効果によるものであり、全体としてイオン化効率が高い上、該高配向性グラファイトシートの下に存在するベース板の状態に大きく影響されることがないという特長につながっている。
【００３０】
なお、高配向性グラファイトシートは、その表面に10 nm〜1 μm程度の凸凹が形成されていることが好ましい。このような微小な凸凹があることで、サンプルへのイオン（陽子、カチオン等）の供与が促進される。
【００３１】
本発明に係る質量分析用測定基板の別の効果を示す試験結果を図８に示す。通常、生体分子は金属付加イオンのピークが検出されやすい。ところが、このような金属付加イオンのピークの存在は、多くの生体分子自体の測定感度の低下を招く。図８は、ACTHをMALDI質量分析装置で測定した結果を示し、(a)が従来のSUSベース板上にターゲットサンプルを載置した場合、(b)が該SUSベース板上に高配向性グラファイトシートを貼付し、その上にターゲットサンプルを載置した場合の測定結果である。この図から明らかなように、ACTHに金属付加イオンが存在するにもかかわらず、(b)ではそのピークが現れていない。これは、高配向性グラファイトシートによる熱流の効率化により、有意にプロトン付加イオンの検出を促進し、相対的に金属付加イオンの強度が低下して、目的サンプル測定の高感度化に寄与しているものと考えられる。
【００３２】
以上説明した通り、高精度なSUS基板を用意しなくとも、高配向性グラファイトシートを用いることで、MALDI質量分析測定の飛躍的な高感度化が可能となる。これにより、材料費の大幅なコストダウンも期待される。
【００３３】
また、本発明に係る質量分析用測定基板は、イメージングマス解析においても多大な効果を挙げることが期待される。サンプルの微小領域毎に質量分析を行い、各微小領域における分析結果をサンプル中における各微小領域位置に合わせてイメージ化するイメージングマス解析においては、夾雑物の多さによるイオン化阻害効果により、高感度分析が難しいという問題がある。そこで本発明に係る質量分析用測定基板を用いることにより、感度の大幅な底上げが期待でき、高精度なイメージング解析が可能となる。
【００３４】
なお、高配向性グラファイトシートは様々なスライドグラスへの貼り付けが可能であるため、高感度、ハイスループット解析に向いており、特に病理切片など数の多い臨床サンプルの解析に極めて有用なツールとなる。
【００３５】
本発明に係る質量分析用測定基板の別の実施例を図４に示す。第１の実施例の測定基板１０と異なる点は、ベース板２１が光透過性を有している点である。本実施例に係る質量分析用測定基板２０では、透過性を有するベース板２１の一部に高配向性グラファイトシートであるカーボンシート２２を貼付する。
【００３６】
測定分析したいサンプルを含むターゲットサンプル２５をカーボンシート２２上とベース板２１の両方にまたがるように載せることで、カーボンシート２２上のサンプルを高精度に質量分析するとともに、同じ由来のサンプルをベース板２１の上でも顕微鏡等を用いて観測できる。これによって、一つの検体から多項目検査ができる。たとえばベース板２１の上では透過顕微鏡を用いた光学的観測による組織分布、カーボンシート２２上では質量分析による組織質量分布、という統合分析が実現できる。具体的には、病理切片の連続切片などをカーボンシート２２上とベース板２１の境界部分に乗せることで、組織病理学的解析とマスイメージング解析を同一の切片で行うことが可能となる。
【符号の説明】
【００３７】
１０、２０…質量分析用測定基板
１１、２１…ベース板
１２、２２…カーボンシート
１３…導電性粘着剤（層）
１４…良導電板
２５…ターゲットサンプル
【図１】
2014232055.tif 000003
【図２】
2014232055.tif 000004
【図３】
2014232055.tif 000005
【図４】
2014232055.tif 000006
【図５】
2014232055.tif 000007
【図６】
2014232055.tif 000008
【図７】
2014232055.tif 000009
【図８】
2014232055.tif 000010