(57)【要約】【課題】膵癌の診断に有用な血液中のバイオマーカーを提供する。【解決手段】哺乳動物における膵癌を診断するための診断キットであって、その哺乳動物から得られた血液中のｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するためのｈＴＥＲＴ検出試薬を有し、そのｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の指標となる、診断キットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における膵癌を診断するための診断キットであって、
前記哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するためのＴＥＲＴ検出試薬を有し、
前記ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の指標となる、
診断キット。
【請求項２】
請求項１に記載の診断キットにおいて、
前記膵癌の病期分類がＴＳ１またはＴＳ２である、
診断キット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の診断キットにおいて、
前記ＴＥＲＴ検出試薬が、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な１組のプライマーを含む、
診断キット。
【請求項４】
請求項３に記載の診断キットにおいて、
前記哺乳動物がヒトであり、
前記ＴＥＲＴがｈＴＥＲＴであり、
前記１組のプライマーが、
（１）ＳＥＱ ＩＤ：１及びＳＥＱ ＩＤ：２、ＳＥＱ ＩＤ：３及びＳＥＱ ＩＤ：４、ＳＥＱ ＩＤ：５及びＳＥＱ ＩＤ：６、ＳＥＱ ＩＤ：７及びＳＥＱ ＩＤ：８のいずれかの組合せ、または
（２）（１）のいずれかの組合せとの間で８０％以上の塩基配列の同一性を有する組合せ、
のいずれかからなる、
診断キット。
【請求項５】
請求項４に記載の診断キットにおいて、
前記１組のプライマーが、蛍光色素を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いるための１組のプライマーである、
診断キット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の診断キットにおいて、
前記哺乳動物から得られた血液または唾液中のＣＡ１９−９を定量的に検出するためのＣＡ１９−９検出試薬をさらに有し、
前記ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量と前記ＣＡ１９−９の量とを含む総合指標を、膵癌の診断の指標として示す、
診断キット。
【請求項７】
請求項６に記載の診断キットにおいて、
前記ＣＡ１９−９検出試薬が、ＣＡ１９−９に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、
診断キット。
【請求項８】
哺乳動物における膵癌を検査するための検査方法であって、
請求項１〜７に記載の診断キットを用いて、前記哺乳動物から得られた血液または唾液中の膵癌の診断の指標を得る工程を含む、
検査方法。
【請求項９】
哺乳動物における膵癌を診断するための診断マーカーであって、
前記哺乳動物から得られた血液または唾液中のｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量を含む、
診断マーカー。
【請求項１０】
請求項９に記載の診断マーカーにおいて、
前記哺乳動物から得られた血液または唾液中のＣＡ１９−９の量をさらに含み、
前記ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量と前記ＣＡ１９−９の量とを含む総合指標を、膵癌の診断の指標として示す、
診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における膵癌を診断するための診断キット、それを用いた検査方法および診断マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌診療ガイドラインによると、膵癌治療開始前の確定診断が望ましいとされる。なかでも膵腫瘤に対する超音波内視鏡下穿刺吸引生検（以下ＥＵＳ−ＦＮＡ）は、正診率８５〜９１％とされているが、約１０％を正診できないことが課題である。またＥＵＳ−ＦＮＡ施行可能な施設は限られており、現行の膵癌に対するバイオマーカーの正診率は７０％程度と満足できるものではない。したがって、膵癌に対するサロゲートマーカーの開発が求められている。
【０００３】
本発明者のうち一部のメンバーは、ヒト血清中から微量のｍＲＮＡを抽出し、特定の遺伝子発現を定量化する方法を確立し、肝細胞癌のバイオマーカーとしてｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｍＲＮＡ（以下ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ）の臨床的有用性を報告してきた（特許文献１および非特許文献１）。
【０００４】
また、非特許文献２には、ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（以下ｈＴＥＲＴ）遺伝子の１塩基多型（ＳＮＰｓ）の膵癌との関係について解析した結果が報告されている。さらに、非特許文献３には、生検で入手した各種癌組織から顕微解剖して得られたサンプルについてｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した結果が報告されている。そして、非特許文献４および非特許文献５には、膵液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）で定量した結果が報告されている。また、非特許文献６には、アデノウイルスベクターでｈＴＥＲＴを発現させると、他の成分との相乗効果で抗腫瘍効果があることが報告されている。
【０００５】
一方、非特許文献７には、血清中のｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９（以下ＣＡ１９−９）の量が膵癌のバイオマーカーとして利用可能であることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４７６１０４６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＢＭＣ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１８；１０：４６，２０１０
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１，Ｖｏｌｕｍｅ６，Ｉｓｓｕｅ１１，ｅ２７９２１
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，ｖｏｌ．９９，ｎｏ．１１，２２４４-２２５１
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１１，２２８５-２２９２，Ｍａｒｃｈ  １５，２００５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７，１９７６-１９８１，Ｊｕｌｙ  ２００１
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，Ｍａｒｃｈ  ２０１０，ｖｏｌ．１０１，ｎｏ．３，７３５-７４２
【非特許文献７】Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００４；１０（１１）：１６７５−１６７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
【０００９】
第一に、特許文献１および非特許文献１に記載の技術では、肝細胞癌のバイオマーカーとしてｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡが臨床的有用性を有することについては実証しているが、膵癌のバイオマーカーとして有用かどうかは不明であった。
【００１０】
第二に、非特許文献２の技術では、単にｈＴＥＲＴ遺伝子の１塩基多型（ＳＮＰｓ）の膵癌との関係について解析しているだけであるため、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡが膵癌のバイオマーカーとして有用かどうかは不明であった。
【００１１】
第三に、非特許文献３の技術では、生検で入手した各種癌組織から顕微解剖して得られたサンプルについてｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量しているため、血液または唾液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの量が膵癌のバイオマーカーとして有用かどうかは不明であった。
【００１２】
第四に、非特許文献４または非特許文献５の技術では、膵液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量しているため、血液または唾液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの量が膵癌のバイオマーカーとして有用かどうかは不明であった。
【００１３】
第五に、非特許文献６の技術では、アデノウイルスベクターでｈＴＥＲＴを発現させると、他の成分との相乗効果で抗腫瘍効果があることが示されているだけであり、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡが膵癌のバイオマーカーとして有用かどうかは不明であった。
【００１４】
第六に、非特許文献７の技術では、他の診断マーカーと組み合わせた場合であっても膵癌のバイオマーカーとしての感度は７７％に過ぎず、特に膵癌の第一ステージ、第二ステージにおける感度は４０．０％、５８．３％と低いために実用には改善の余地があった。
【００１５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、膵癌の診断に有用な血液または唾液中のバイオマーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、哺乳動物における膵癌を診断するための診断キットであって、その哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するためのｈＴＥＲＴ検出試薬を有し、そのＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の指標となる、診断キットが提供される。
【００１７】
また、本発明によれば、哺乳動物における膵癌を診断するための診断マーカーであって、その哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量を含む、診断マーカーが提供される。
【００１８】
これらの診断キットまたは診断マーカーによれば、後述の実施例に示すように、血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の好適な指標となるため、医師などの医療関係者がヒトをはじめとする哺乳動物における膵癌を診断する際に生検などをしなくても血液または唾液を用いて容易に正確な診断ができる。
【００１９】
また、本発明によれば、上記の診断キットは、上記の哺乳動物から得られた血液または唾液中のＣＡ１９−９を定量的に検出するためのＣＡ１９−９検出試薬をさらに有し、そのＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量とそのＣＡ１９−９の量とを含む総合指標を、膵癌の診断の指標として示すことが好ましい。
【００２０】
また、本発明によれば、上記の診断マーカーは、上記の哺乳動物から得られた血液または唾液中のＣＡ１９−９の量をさらに含み、そのＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量とそのＣＡ１９−９の量とを含む総合指標を、膵癌の診断の指標として示すことが好ましい。
【００２１】
これらの診断キットまたは診断マーカーによれば、後述の実施例に示すように、血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量およびＣＡ１９−９の量を併せて用いることによって膵癌の診断のさらに好適な指標となるため、医師などの医療関係者がヒトをはじめとする哺乳動物における膵癌を診断する際に生検などをしなくても血液または唾液を用いて容易にさらに正確な診断ができる。
【００２２】
また、本発明によれば、哺乳動物における膵癌を検査するための検査方法であって、上記の診断キットを用いて、その哺乳動物から得られた血液中の膵癌の診断の指標を得る工程を含む、検査方法が提供される。
【００２３】
この方法によれば、後述の実施例に示すように、上記の診断キットを用いて血液または唾液中の膵癌の診断の指標の検査を行うため、医師などの医療関係者がヒトをはじめとする哺乳動物における膵癌を診断する際に生検などをしなくても血液または唾液を用いて容易に正確な診断ができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、医師などの医療関係者がヒトをはじめとする哺乳動物における膵癌を診断する際に生検などをしなくても血液または唾液を用いて容易に正確な診断ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例で行ったｈＴＥＲＴｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図２】実施例で用いたｈＴＥＲＴｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの検定線を示すグラフである。
【図３】実施例２で用いたＲＯＣ ｃｕｒｖｅを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２７】
＜用語の説明＞
「診断マーカー」とは、一般に「バイオマーカー」と呼ばれる概念を含み、ＮＩＨのバイオマーカーについての定義である「通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性」を含む概念である。
【００２８】
また、「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物を含み、ヒト、家畜用動物、ペット用動物、動物園用動物、又はスポーツ用動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギなどを含む。哺乳動物は、好ましくはヒトである。また、以下の実施形態に係るマーカー、試薬、またはキットを哺乳動物に適用する場合、哺乳動物は、膵癌に罹患していることが疑われる哺乳動物であってもよい。
【００２９】
また、「膵癌」は、膵臓から発生した悪性腫瘍を含む。膵癌の病期分類は、日本膵臓学会の膵癌取扱い規約に基づけば、ＴＮＭ分類をもとに、４段階の進行度（ステージ）に分けられる。
【００３０】
日本膵臓学会の膵癌取扱い規約（第１０版）
Ｉ期    −大きさが２ｃｍ以下で膵臓の内部に限局している。
ＩＩ期  −がんは膵臓の内部にとどまるが、大きさが２ｃｍ以上であるか、第１群のリンパ節に転移がある。
ＩＩＩ期−がんは膵臓の外へ少しでるが、リンパ節転移はないか、第１群までに限られている。または、がんは膵臓の内部にとどまるが、リンパ節転移は第２群まである。
ＩＶ期  −がんが膵臓の周囲の臓器・器官を巻き込んでいるか、離れた臓器まで転移がある。
【００３１】
なお、Ｔ分類については、以下のように規定されている。
Ｔ分類（膵局所進展度）
Ｔ１：ＴＳ１，浸潤部が膵内に限局
Ｔ２：ＴＳ２−４，浸潤部が膵内に限局
Ｔ３：ＣＨ，ＤＵ，Ｓ，ＲＰのいずれかに浸潤
ＣＨ（膵内胆管），ＤＵ（十二指腸浸潤），Ｓ（膵前方組織−膵被膜，膵に接する大網，小網，結腸間膜），ＲＰ（膵後面結合組織）
Ｔ４：ＰＶ，Ａ，ＰＬ，ＯＯのいずれかに浸潤
ＰＶ（門脈ＰＶｐ，上腸間膜静脈ＰＶｓｍ，脾静脈ＰＶｓｐ），Ａ（総肝動脈Ａｃｈ，上腸間膜動脈Ａｓｍ，脾動脈Ａｓｐ，腹腔動脈Ａｃｅ），ＰＬ（膵外神経叢浸潤，ＰＬｐｈＩ  膵頭神経叢第Ｉ部，ＰＬｐｈＩＩ  膵頭神経叢第ＩＩ部，ＰＬｓｍａ  上腸間膜動脈神経叢，ＰＬｃｈａ総肝動脈神経叢，ＰＬｈｄｌ  肝十二指腸間膜内神経叢，ＰＬｓｐａ  脾動脈神経叢，ＰＬｃｅ  腹腔神経叢），ＯＯ（下大静脈，腎，腎静脈，副腎，胃，大腸，脾臓）
【００３２】
また、ＴＳについては、以下のように規定されている。
ＴＳ（ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ）は、（浸潤部分の）最大径を意味する。
ＴＳ１＜＝２．０ｃｍ
２．０ｃｍ＜ＴＳ２＜＝４．０ｃｍ
４．０ｃｍ＜ＴＳ３＜＝６．０ｃｍ
ＴＳ４＞６．０ｃｍ
【００３３】
一方、膵癌の病期分類は、ＵＩＣＣの規約に基づけば、以下の４段階の進行度（ステージ）に分けられており、日本膵臓学会の膵癌取扱い規約（第１０版）とは若干異なっている箇所がある。
ＵＩＣＣ規約（第７版）
Ｉ期    −膵癌が膵臓の内部にとどまっており、リンパ節転移はない。
ＩＩ期  −膵癌は膵臓の周りにおよんでいるが、膵臓周囲の重要な血管にはおよばず、リンパ節転移はないか、第１群までに限られている。
ＩＩＩ期−癌が膵臓周囲の重要な血管におよんでいるが、離れた臓器には転移がない。
ＩＶ期  −膵臓から離れたところに転移がある。
なお、後述する実施例における膵癌の病期分類などは、いずれも日本膵臓学会の膵癌取扱い規約（第１０版）に基いており、本実施形態において日本膵臓学会の膵癌取扱い規約（第１０版）およびＵＩＣＣの規約が異なる場合には、日本膵臓学会の膵癌取扱い規約（第１０版）が優先するものとする。
【００３４】
＜ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡ単独の診断マーカー＞
本実施形態に係る診断マーカーは、哺乳動物における膵癌を診断するための診断マーカーである。また、本実施形態に係る診断マーカーは、その哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量を含む。
【００３５】
ここで、本実施形態に係る「ＴＥＲＴ」（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）は、哺乳動物において多くの悪性腫瘍において発現する悪性腫瘍（癌）特異的抗原（酵素）であるテロメレースの活性中心に位置するサブユニットの一つであるＴＥＲＴ（特にヒトのＴＥＲＴをｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と称する）を含む。本実施形態では、ＴＥＲＴとして、ＴＥＲＴポリペプチドの遺伝子多型体やスプライシングバリアントなどを用いることもできる。
【００３６】
また、本実施形態におけるＴＥＲＴをコードする「ｍＲＮＡ」は、必ずしも完全長である必要は無く、腫瘍の診断など、それぞれの使用目的に応じた鎖長と特異性とを有するｍＲＮＡを含む。なお、本実施形態において、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出する際には、ｍＲＮＡそのものを直接定量する代わりに、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡにしてからそのｃＤＮＡを定量してもよい。
【００３７】
また、本実施形態における血液は、哺乳動物の生体のいずれの箇所から採取されてもよく、動脈血、静脈血のいずれから採取されたものも含む。なお、本実施形態において、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出する際には、血液中で直接ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出する代わりに、血液から血清を分離した上で血清中でＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出してもよい。
【００３８】
本実施形態に係る診断マーカーは、後述する実施例に示すように、血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の好適な指標となるため、医師などの医療関係者がヒトをはじめとする哺乳動物における膵癌を診断する際に生検などをしなくても血液または唾液を用いて容易に正確な診断ができる。
【００３９】
従来は、膵腫瘤に対する超音波内視鏡下穿刺吸引生検（以下ＥＵＳ−ＦＮＡ）は、専門のトレーニングを受けた熟練した手技を有する医師でなければ難しく、診療所または市中病院では積極的に行われていない。これに対して、本実施形態に係る診断マーカーは、後述するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの装置さえあれば診療所または市中病院でも使用が容易である。そのため、膵癌が疑われる患者がいた場合には、診療所または市中病院で、後述するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの装置を用いてＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出した上で、膵癌の可能性が高い患者のみを大学病院などの高度な総合病院に紹介して、熟練した医師によるＥＵＳ−ＦＮＡを受けて確定診断をしてもらうことができる。
【００４０】
なお、本実施形態に係る診断マーカーは、膵癌の病期分類がＴＳ１またはＴＳ２である場合に特に有用である。膵癌の（浸潤部分の）最大径は、ＴＳ１＜＝２．０ｃｍ、２．０ｃｍ＜ＴＳ２＜＝４．０ｃｍであるため、膵癌の病期分類がＴＳ１またはＴＳ２である場合には膵癌の発見が非常に困難であった。そのため、このように膵癌のサイズが小さい段階で、後述するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの装置を用いてＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出して、膵癌の可能性の高い患者を発見できれば、膵癌の外科手術、化学療法、放射線治療などによる治癒の可能性が高まるために好ましい。
【００４１】
＜ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡ単独の診断マーカーのための診断キット＞
本実施形態に係る診断キットは、哺乳動物における膵癌を診断するための診断キットである。また、本実施形態に係る診断キットは、哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するためのＴＥＲＴ検出試薬を有する。
【００４２】
このＴＥＲＴ検出試薬は、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出することができる試薬であれば任意のものを用いることができるが、例えば、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な（または特異的にハイブリダイズ可能な）１組のプライマーを含んでいてもよい。本実施形態における「プライマー」とは、逆転写反応もしくは核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、逆転写反応もしくは核酸増幅反応を開始するのに必要な核酸を含む。逆転写反応もしくは核酸増幅反応において、標的の鋳型とハイブリダイズし、その後の反応を行えるように、好ましくは特異的な生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、より好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計されることが好ましい。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計されることが好ましい。
【００４３】
このようなプライマーは、プライマーのＧＣ（グアニン・シトシン）の比率や、融解温度などの当業者によく知られた技術常識、並びにＢＬＡＳＴ等の公知のプログラム及びデータベースを用いることにより、当業者には容易に設計可能である。また、各種プライマー設計ソフトウェアを用いてもよく、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＭ（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ）やＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（富士通株式会社；ＬＡＭＰ法用）を用いて設計することもできる。その際、プライマーの３'側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することも可能である。
【００４４】
また、例えば核酸増幅法としてＩＣＡＮ法を用いる場合などにおいては、プライマーはＤＮＡだけでなくＲＮＡを含むか、あるいは必要に応じてＲＮＡのみで構成されていてもよい。また、用いる核酸増幅方法／核酸検出方法に応じて、プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、ステムループ構造部位、制限酵素配列などの様々な機能配列を更に含んでもよい。特に本実施形態に好適なプライマーについては、後述する。
【００４５】
また、本実施形態において、「特異的にハイブリダイズする」とは、ある核酸に対し、別の核酸が水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべき核酸には同条件では結合しない状態を含む。必ずしも、「他の全ての核酸に対して結合しない」必要性は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡの検出においては、試料中に含まれる他のｍＲＮＡに対して無視できるほどにしか弱く結合しない核酸は、「特異的にハイブリダイズする」核酸であるということができる。
【００４６】
ハイブリダイズの条件は、その核酸の使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとしての核酸であれば、ＰＣＲでのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするものが選択される。
【００４７】
また、本実施形態における「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。また、ハイブリダイゼーション条件の温度については、用いる核酸増幅反応あるいはハイブリダイズ反応に応じて定めることができるが、例えば、４２℃、４３℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃である。
【００４８】
また、本実施形態における「核酸」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなる核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本実施形態における核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマー又はポリマーを含む。
【００４９】
また、本実施形態において、「核酸増幅」法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法あるいはその他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。特にＲＮＡを増幅する際には、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の核酸産物を増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法あるいはその他の核酸の協奏的ＲＮＡ増幅方法が用いられる。更に、核酸増幅法としては、上記のＬＡＭＰ法に加え、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法等を用いることもでき、当業者であれば、それぞれの方法の試薬やキット等の通常用いられる用い方に従って、これらの方法を実施することができる。
【００５０】
また、本実施形態に係る診断キットでは、上記の１組のプライマーが、蛍光色素を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いるための１組のプライマーであってもよい。ここで、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写反応と核酸増幅反応）の方式としては、例えば、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを用いることもできる。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲとは、ＲＴでのインキュベーションからＰＣＲでのサイクリングまで、チューブの開閉や試薬の添加を行うことなく、ワンステップで迅速かつ簡便にＲＴ−ＰＣＲを行うことができるＲＴ−ＰＣＲ法を含み、当該技術分野ではＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲのための様々なキット、プロトコールが使用可能であり（例えば、ＱＩＡＧＥＮのＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＭｉｘ、ＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳのＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔなど）、適宜それらを選択して実施することができる。
【００５１】
リアルタイムＰＣＲを用いることで、ワンステップあるいは短いステップ数の工程で、簡便に、リアルタイムで、かつ定量的に、検出工程までを行うことが可能となる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとしては、例えば、各種蛍光ＰＣＲベースの技術を用いることが可能である。蛍光ＰＣＲベースの技術としては、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの各種の蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標：ロシュ社）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社）を用いる）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性及び専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限られない。
【００５２】
また、本実施形態において、増幅産物の検出法としては、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよい。例えば、増幅後の核酸を電気泳動して検出しても、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法を用いて検出してもよいが、多数検体処理、自動化、再現性や二次汚染等の点で有利なインターカレーター性蛍光色素（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなど）を用いてもよい。
【００５３】
増幅核酸の検出方法は、上記に限られず、例えば、ＬＡＭＰ法では、副産物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を指標に検出してもよく、増幅核酸を直接測定しない方法等であっても、それぞれの核酸増幅方法に適用可能な公知の増幅産物検出方法であれば、何れの方法でも用いることができる。
【００５４】
また、蛍光色素を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける定量方法は、コピー数を算出する絶対定量法であってもよく、相対値で発現を調べる相対定量法であってもよい。絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のＤＮＡを段階希釈し、希釈系列を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い検量線を書き、濃度不明のサンプルのＣｔ値を検量線にあてはめコピー数を計算するものである。一方で、相対定量法は、目的遺伝子とリファレンス遺伝子を同時に解析しリファレンス遺伝子に比べ、目的遺伝子がどれだけ発現しているかを相対的に比較したものである。
【００５５】
また、本実施形態に係る診断キットでは、上記の哺乳動物がヒトである場合には、上記のＴＥＲＴがｈＴＥＲＴであることが好ましい。そして、上記の１組のプライマーが、後述する実施例でヒトの血液または唾液中のｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量を正確に定量できることが実証されているＳＥＱ ＩＤ：１及びＳＥＱ ＩＤ：２、ＳＥＱ ＩＤ：３及びＳＥＱ ＩＤ：４、ＳＥＱ ＩＤ：５及びＳＥＱ ＩＤ：６、ＳＥＱ ＩＤ：７及びＳＥＱ ＩＤ：８のいずれかの組合せからなることが好ましい。
【００５６】
配列番号：１（gttcttccaa acttgctgat gaaat； TERT_NM_198253.2の3049-3071由来）及び２（gtgcaccaac atctacaaga tcc； TERT_NM_198253.2の3118-3142由来）は、本実施形態に好適なプライマーであり、配列番号：３（atttcatcag caagtttgga agaac； TERT_NM_198253.2の3049-3071由来）及び４（ggatcttgta gatgttggtg cac； TERT_NM_198253.2の3118-3142由来）は、それらのプライマーに対応するＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ上の配列（あるいは相補的配列）である。
【００５７】
また、配列番号：５（cggaagagtg tctggagcaa； TERT_NM_198253.2の1787-1806由来）及び６（ggatgaagcg gagtctgga； TERT_NM_198253.2の1913-1931由来）は、特許文献１において本発明者のうち一部のメンバーが開示している本実施形態に好適なプライマーであり、配列番号：７（ttgctccaga cactcttccg； TERT_NM_198253.2の1787-1806由来）及び８（tccagactcc gcttcatcc； TERT_NM_198253.2の1913-1931由来）はそれらのプライマーに対応するＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ上の配列（あるいは相補的配列）である。これらのプライマーは、ＴＥＲＴ遺伝子の配列（遺伝子データベース上では"TERT_NM_198253.2"である配列）を用いて設計された。
【００５８】
効果的な逆転写反応の可能なこれらの領域に対するプライマーを用いて逆転写反応及び核酸増幅を行うことにより、正確かつ安定な逆転写反応及び核酸増幅反応を行うことが可能となった。さらに、これらのプライマーは、その感度の高さから、膵癌の初期（ＴＳ１またはＴＳ２）において膵癌の存在証拠を血液または唾液中から検出する上でも極めて有効である。
【００５９】
なお、本実施形態に係る診断キットでは、１組のプライマーとして、上述のＳＥＱ ＩＤ：１及びＳＥＱ ＩＤ：２、ＳＥＱ ＩＤ：３及びＳＥＱ ＩＤ：４、ＳＥＱ ＩＤ：５及びＳＥＱ ＩＤ：６、ＳＥＱ ＩＤ：７及びＳＥＱ ＩＤ：８のいずれかの組合せだけでなく、これらの組合せの塩基配列との間の同一性がそれぞれ８０％、以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上あるいは９８％以上（１００％以下）である組合せからなる１組のプライマーを用いてもよい。あるいは、１組のプライマーとして、上記のいずれかの組合せの塩基配列に対し、それぞれ１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、又は数塩基の置換・欠失・挿入がなされた組合せからなる１組のプライマーを用いてもよい（同一性の定義の際と同様に、同一の塩基を有するＲＮＡとＤＮＡの置換は、ここでの置換・欠失・挿入には含めない）。
【００６０】
本実施形態における「同一性」とは、配列を比較することにより決定される、２以上の核酸の間の関係を含み、核酸の塩基配列間の適合によって決定されるような配列一致性の程度を含む。「同一性」に関するパラメーターは、既知の方法により容易に計算可能である。この際に、同一の塩基（チミンとウラシンも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義してもよい。同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、簡便には、ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算された値を用いることもできる。
【００６１】
本実施形態のプライマーセットを用いる核酸増幅は、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として、上述のプライマーセットのうちアンチセンスプライマー（ＳＥＱ ＩＤ：２、ＳＥＱ ＩＤ：４、ＳＥＱ ＩＤ：６、ＳＳＥＱ ＩＤ：８）によってｃＤＮＡを合成し、それと同時か或いはそれに引き続いて、上述のプライマーセットと適当なＤＮＡポリメラーゼ活性および／あるいはＲＮＡポリメラーゼ活性により連鎖的に実行される核酸増幅法によってなされる。以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は公知の核酸検出方法で検出することが可能である。
【００６２】
それぞれのプライマーは、その目的に応じて、更に様々なものを付加して含んでもよいが、プライマーとしての有効性を考えると、その長さは少なくとも１５塩基以上、あるいは１８塩基以上、あるいは２０塩基以上である。長さの上限は、特に制限されるものではないが、プライマーが長すぎることによる核酸増幅反応の効率低下や各増幅反応に必要なプライマー長を考慮し、上限を、１００塩基以下、８０塩基以下、６０塩基以下、あるいは５０塩基以下としてもよい。
【００６３】
本実施形態の診断キットにおいては、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が膵癌の診断の指標となるため、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が高い場合は膵癌の疑いが高いと診断され、その基準（所定のカットオフ値）等は、当分野の医師などによる症例の比較などを通じて適宜設定することができる。
【００６４】
腫瘍の診断においては、例えば、血液１ｍｌ中における１個の腫瘍細胞の存在を検出することができれば、循環している血液全体では３０００個〜４０００個の細胞に匹敵し、これは腫瘍生着の動物実験における、生着可能となる腫瘍細胞の数に匹敵することになる。仮に、３０００個〜４０００個の循環細胞が腫瘍中の全細胞の０．０１％であると仮定しても、その段階での腫瘍には約４×１０７個の細胞しか含まれず、そのような数の細胞を含む腫瘍は、現在のいずれの方法によっても検出することが困難である。
【００６５】
したがって、腫瘍（癌）の初期の段階において腫瘍細胞が流出する場合、感度の高い検出方法が開発できれば、初期の段階の腫瘍（癌）でさえ検出することが可能となる。したがって、例えば、腫瘍細胞が腫瘍サイズといくらかの関連性を以って血液または唾液中に流出する場合、本実施形態に係る診断キットは効果的であり、腫瘍負荷を評価するための定量的試験としても有効となる。
【００６６】
さらに、流出した腫瘍細胞と生体内の免疫細胞との闘いの際に、腫瘍細胞や免疫細胞内の多種多様なＤＮＡやタンパク質やＲＮＡなどが血液中に流れ出ることでＲＮＡが検出されることもあるため、腫瘍特異的ＲＮＡの検出は、転移の最も早期での出来事を反映しているとも考えられる。
【００６７】
したがって、非常に高感度で安定した検出が可能な、本実施形態に係る診断キットは、通常の膵癌の診断キットとしても有用であるだけでなく、特に、膵癌の初期段階（ＴＳ１またはＴＳ２）での診断ではより一層有用である。この診断キットは、膵癌の初期段階（ＴＳ１またはＴＳ２）において癌細胞の存在証拠を血液または唾液中から検出することもできるので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中から癌関連遺伝子を検出する場合に比べ、癌細胞の有無をより正確に検出することも可能である。
【００６８】
＜ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９を組合せた診断マーカー＞
本実施形態に係る診断キットは、哺乳動物から得られた血液または唾液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量にくわえて、その哺乳動物から得られた血液または唾液中のＣＡ１９−９の量をさらに有することが好ましい。
【００６９】
ここで、本実施形態に係る「ＣＡ１９−９」（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９）は、１９７９年にＫｏｐｒｏｗｓｋｉらにより大腸癌培養株ＳＷ１１１６を免疫抗原として作製したモノクローナル抗体ＮＳ１９−９によって認識される糖鎖抗原を含む。この抗原の決定部位は、シアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩで、ルイス式血液型のルイスＡ（Ｌｅａ）の糖鎖をシアル化したシアリルＬｅａ抗原とされる。
【００７０】
ＣＡ１９−９は、正常組織中の唾液腺、胆管、気管支腺などに存在する。消化器癌、特に膵癌・胆嚢癌・胆管癌・大腸癌において高い陽性率を示すことから、これらの癌の診断補助、治療経過及び再発のモニターとして有効である。しかし、非特許文献７にも示されているように、他の診断マーカー（ＴＳＧＦ、ＣＡ２４２）と組み合わせた場合であっても膵癌のバイオマーカーとしての感度は７７％に過ぎず、特に膵癌の第一ステージ、第二ステージにおける感度は４０．０％、５８．３％と低いために実用には改善の余地があった。
【００７１】
これに対して、本実施形態では、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量とＣＡ１９−９の量とを総合して得られる指標を、膵癌の診断の総合指標として示す。具体的には、本実施形態では、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が所定のカットオフ値以上であるか、またはＣＡ１９−９の量が所定のカットオフ値以上である場合に、哺乳動物に膵癌の疑いがある（総合指標として陽性である）と判定することが好ましい。このようにして判定した場合には、所定のカットオフ値の設定にもよるが、例えば後述する実施例で示すように、膵癌のバイオマーカーとしての感度は１００．０％と高く、特に膵癌の第一ステージ、第二ステージにおける感度は１００．０％、１００．０％と高いために実用に適している。なお、膵癌の診断の総合指標としては、上記の判定基準に限定されるわけではなく、例えば、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量が所定のカットオフ値以上であり、かつＣＡ１９−９の量が所定のカットオフ値以上である場合に、哺乳動物に膵癌の疑いがあると判定してもよい。また、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの量およびＣＡ１９−９の量をそれぞれ正規化した上で所定の重み付けをした上で足しあわせて総合指標を計算し、その総合指標が所定のカットオフ値以上である場合に、哺乳動物に膵癌の疑いがあると判定してもよい。
【００７２】
＜ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９を組合せた診断マーカーのための診断キット＞
本実施形態に係る診断キットは、哺乳動物における膵癌を診断するための診断キットである。また、本実施形態に係る診断キットは、哺乳動物から得られた血液中のＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを定量的に検出するためのＴＥＲＴ検出試薬にくわえて、哺乳動物から得られた血液中のＣＡ１９−９を定量的に検出するためのＣＡ１９−９検出試薬をさらに有する。
【００７３】
このＣＡ１９−９検出試薬は、ＣＡ１９−９（の抗原決定部位であるアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ）を定量的に検出することができる試薬であれば任意のものを用いることができるが、例えば、ＣＡ１９−９に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含んでいてもよい。このような抗ＣＡ１９−９抗体としては、１９７９年にＫｏｐｒｏｗｓｋｉらにより大腸癌培養株ＳＷ１１１６を免疫抗原として作製したモノクローナル抗体ＮＳ１９−９が代表例として挙げられるが、特に限定されず、他のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いてもかまわない。
【００７４】
具体的には、抗ＣＡ１９−９抗体は、常法に基づいて、ウサギ、ラット、マウス等の動物にＣＡ１９−９の抗原決定部位であるアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩを含む糖鎖（またはその糖鎖を含む物質）を免疫してポリクローナル抗体を作製する方法、また、常法に基づいて、例えばＣＡ１９−９の抗原決定部位であるアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩを含む糖鎖（またはその糖鎖を含む物質）で予め免疫された抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて得られる自律増殖能を持ったハイブリドーマが産出するモノクローナル抗体でもよい。さらに、抗原結合活性を有する限り、組換え抗体やこれらの抗体のフラグメント（例えばＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ領域等）でもよい。抗体フラグメントは、抗体をタンパク質分解酵素で分解し、精製することにより得られる。なお、これらの抗体を一種単独に用いてもよく、あるいは二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、抗ＣＡ１９−９抗体は、市販されているものを制限なく使用可能である。
【００７５】
また、このＣＡ１９−９検出試薬は、抗体に限定されず、ＣＡ１９−９（の抗原決定部位であるアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ）を定量的に検出することができるレクチンを用いてもよい。
【００７６】
ＣＡ１９−９の検出を容易にするため、予めＣＡ１９−９検出試薬（抗ＣＡ１９−９抗体など）を標識しておくことが好ましい。抗ＣＡ１９−９抗体の標識物質としては、検出方法に基づいて、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ユーロピウム、ナフチルアミン等の蛍光物質、ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光物質、フェノール、ナフトール、アントラセン等の紫外線吸収物質、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシルのスピンラベル化剤、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド等が使用可能である。
【００７７】
このＣＡ１９−９検出試薬は、例えば、以下のような２ステップサンドイッチ法を用いた化学発光酵素免疫測定法によってＣＡ１９−９を測定可能である。
（１）最初に添加したビオチン結合抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体が試料中のＣＡ１９−９と特異的に反応し、次いで添加したストレプトアビジン結合磁性粒子に結合する。
（２）未反応液を除去後、続いて添加したＡＬＰ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体が磁性粒子上のＣＡ１９−９と特異的に反応する。
（３）未反応液を除去後、さらに添加した発光基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒが磁性粒子上のＡＬＰにより分解され、生じた発光の強度を測定する。試料中のＣＡ１９−９濃度を反映して発光強度が増加するので、あらかじめ既知濃度のＣＡ１９−９を含む試料を測定して検量線を作成しておくことにより、試料中のＣＡ１９−９濃度を求めることができる。
【００７８】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００７９】
例えば、上記実施の形態ではＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９を組合せた診断マーカーのための診断キットについてまとめて説明したが、この診断キットは、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡ単独の検出試薬と、ＣＡ１９−９単独の検出試薬とにくわえて、さらに別の膵癌の診断の正確性を高めるのに役立つ診断マーカー（Ｓｐａｎ−１、ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ２、ＴＳＧＦなど）の検出試薬を有してもよい。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８１】
＜実施例１＞
鳥取大学医学部付属病院における膵癌疑い症例に対して、膵癌のバイオマーカーとしてｈＴＥＲＴｍＲＮＡの臨床的意義を以下のとおり検討した。
【００８２】
２０１１年１２月より２０１２年９月までに鳥取大学医学部附属病院で経験した膵癌疑い症例７２例（膵癌４５例、非膵癌２７例）について血液を採取し、血清を以下の実験に供した。患者の平均年齢は７０．１歳（３６歳〜８７歳）であった。
【００８３】
この試験を行うに際し、患者からインフォームドコンセントを得て、且つ、研究プロトコール（計画案）は、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理的ガイドラインに従ったものとし、鳥取大学の倫理委員会の承認の下、試験を行った。
【００８４】
本実施例では、最初に被験者（患者）の血液を採取し、次に血液中からＲＮＡを含む試料を得た。より具体的に説明すると、患者から採取した血液（約１〜２ｍＬ）について、１０℃で１０分間、３段階（８００ｘｇ、１０００ｘｇ、１５００ｘｇ）の遠心分離操作を行うことにより、リンパ球を減少させた血清を得、それを試験試料として用いた。リンパ球が効果的に取り除かれていることは、β２−マイクログロブリンを対照として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２及びＣＤ６８の発現量を調べることにより確認した。次いで、従来公知の方法で、血清からデオキシリボヌクレアーゼ処理を用いてＲＮＡを抽出した。血清２００μＬ中から抽出したＲＮＡを２００μＬのヌクレアーゼフリーの水に溶解した。
【００８５】
次に、得られた試料に対してＫＡＰＡ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳのＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用して以下のプロトコルでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、上述のＳＥＱ ＩＤ：１のＰｒｉｍｅｒ  Ｆ  （ｈＴＥＲＴ  Ｆ）およびＳＥＱ ＩＤ：２のＰｒｉｍｅｒ  Ｒ  （ｈＴＥＲＴ  Ｒ）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を図１に示す。ＰＣＲのコントロール試料としては、β２−マイクログロブリンＲＮＡを用いた。コントロールの検量線を図２に示す。
【００８６】
2014183839.tif 000003
【００８７】
2014183839.tif 000004
【００８８】
また、得られた試料に対してベックマン・コールター社製の癌抗原１９−９キット  アクセスＧＩモニターを用いて、キットに付属のプロトコルにしたがって化学発光酵素免疫測定法でＣＡ１９−９の定量試験（キットに記載されているカットオフ値：＜３５Ｕ／ｍｌ）を行った。
【００８９】
また、得られた試料に対して市販のキットを用いて、キットに付属のプロトコルにしたがってＤＵＰＡＮ２、ＣＥＡ、Ｓｐａｎ−１の定量試験（キットの推奨値をカットオフ値として採用した）を行った。
【００９０】
その結果、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡによる膵癌診断能は、ＲＯＣ曲線解析でカットオフ値を９０３（ｃｏｐｙ／血清１０μｌ）と設定した場合、感度９７．８％（４４／４５）、特異度６５．４％（１７／２６）、陽性的中率８３．０％（４４／５３）、陰性的中率９４．４％（１７／１８）、正診率８３．０％（４４／５３）と良好な成績であった。なお、結果を下記の表１にまとめて示す。
【００９１】
【表１】
2014183839.tif 000005
【００９２】
また、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡによる膵癌における腫瘍径、Ｔ因子による感度は、ＴＳ１／ＴＳ２／ＴＳ３で（ＴＳ４症例はなし）、９０．０％（９／１０）／１００％（２６／２６）／１００％（９／９）、Ｔ１／Ｔ２／Ｔ３／Ｔ４で１００％（２／２）／１００％（３／３）／１００％（９／９）／９６．８％（３０／３１）と、ＴＳ１症例や膵内に限局するＴ１／Ｔ２症例などの切除可能症例でも良好な感度を確認した。なお、結果を下記の表２に示す。
【００９３】
【表２】
2014183839.tif 000006
【００９４】
また、ＣＡ１９−９による膵癌診断能は、キットに記載のとおりＣＡ１９−９のカットオフ値を３５Ｕ／ｍｌと設定した場合、感度７５．６％（３４／４５）、特異度９２．６％（２５／２７）、陽性的中率９４．４％（３４／３６）、陰性的中率６９．４％（２５／３６）、正診率８１．９％（５９／７２）とやや改善の余地のある成績であった。なお、結果を上記の表１にまとめて示す。
【００９５】
また、ＣＡ１９−９による膵癌診断能は、膵癌における腫瘍径、Ｔ因子による感度は、ＴＳ１／ＴＳ２／ＴＳ３で（ＴＳ４症例はなし）９０％（９／１０）／１００％（２６／２６）／１００％（９／９）、Ｔ１／Ｔ２／Ｔ３／Ｔ４でと、ＴＳ１症例や膵内に限局するＴ１／Ｔ２症例などの切除可能症例でも良好な感度を確認した。なお、結果を下記の表３に示す。
【００９６】
【表３】
2014183839.tif 000007
【００９７】
これに対して、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９による総合的な膵癌診断能は、ＲＯＣ曲線解析でｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのカットオフ値を９０３（ｃｏｐｙ／血清１０μｌ）と設定し、キットに記載のとおりＣＡ１９−９のカットオフ値を３５Ｕ／ｍｌと設定して、下記の表４に示すように、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはＣＡ１９−９のいずれかがカットオフ値以上である場合に総合指標として陽性であると判定したところ、感度１００．０％（４５／４５）と良好な成績であった。
【００９８】
また、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９による総合的な膵癌診断能は、膵癌における腫瘍径、Ｔ因子による感度は、ＴＳ１／ＴＳ２／ＴＳ３で（ＴＳ４症例はなし）、１００．０％（１０／１０）／１００％（２６／２６）／１００％（９／９）、Ｔ１／Ｔ２／Ｔ３／Ｔ４で１００％（２／２）／１００％（３／３）／１００％（９／９）／９６．８％（３１／３１）と、ＴＳ１症例や膵内に限局するＴ１／Ｔ２症例などの切除可能症例でも良好な感度を確認した。なお、結果を下記の表４に示す。
【００９９】
【表４】
2014183839.tif 000008
【０１００】
＜実施例２＞
腫瘍径の異なる膵癌患者（ＴＳ１：１０例、ＴＳ３：９例）に対して、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＣＡ１９−９による総合的な膵癌診断を行った。このときのｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡによる膵癌診断の診断能は、ＲＯＣ曲線解析でカットオフ値を、９２４．５（ｃｏｐｙ／血清１０μｌ）に設定して行った。ＲＯＣ ｃｕｒｖｅを図３に示す。その他の診断条件（血液の採取、定量試験等の条件）は、実施例１と同様の条件で行った。そして、１９例について診断した結果、感度は１００％であり非常に良好な成績であった（表５）。
【０１０１】
【表５】
2014183839.tif 000009
【０１０２】
＜結果の考察＞
上記の実施例１〜２の実験結果から、血清中ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ測定は、早期膵癌の診断にも有用で、現行の膵癌に対する腫瘍マーカーを凌駕することが示された。また、血清中ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ測定と、血清中ＣＡ１９−９測定とを組み合わせると、早期膵癌の診断にも有用で、現行の膵癌に対する腫瘍マーカーをはるかに凌駕することが示された。すなわち、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはＣＡ１９−９のいずれかがカットオフ値以上の場合はそれを「陽性」とすれば、膵癌の第一ステージ、第二ステージにいても感度をほぼ１００％にすることができるため、診療所および市中病院のようなＥＵＳ−ＦＮＡを実施することが困難な医療機関であっても、膵癌の患者をほぼ見落とすことがない。そのため、診療所および市中病院は膵癌が疑われる患者をほぼ見落としなく大学病院のような高度医療機関に紹介することができ、高度医療機関でＥＵＳ−ＦＮＡを行なって擬陽性の患者を排除できるため、高度医療機関で膵癌患者を膵癌の第一ステージ、第二ステージにおいて治療することが可能になる。
【０１０３】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１０４】
たとえば、上記実施例では、ＲＯＣ曲線解析でカットオフ値を９０３（ｃｏｐｙ／血清１０μｌ）と設定し、キットに記載のとおりＣＡ１９−９のカットオフ値を３５Ｕ／ｍｌと設定したが、特に限定されるわけではなく、目的に応じてカットオフ値は適宜調整することができる。具体的には、さらに多くの症例が集まることによって、これらのカットオフ値を最適化できることは当業者には容易に理解できる。
【０１０５】
また、上記実施例では、血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを測定したが、特に限定されるわけではなく、目的に応じて唾液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを測定してもよい。本発明者らは、唾液から抽出したＲＮＡを用いて、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを検出できることを確認している。そのため、血清中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡだけでなくて唾液中のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの場合でも膵癌に対する腫瘍マーカーとして活用できることは当業者には容易に理解できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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