(57)【要約】【課題】増幅中の高分子量生成物の形成は、防止されるか、又は部分的にもしくは完全に抑制すること。【解決手段】本発明は、アンプリコンを生成するためのプライマー対（ここで少なくとも１種のプライマーは、５’末端が標的配列に非相補的なポリＮ配列で修飾される）、及び該アンプリコンに特異的な検出可能なプローブ又はＤＮＡ結合色素を含んでなる、生物学的試料中に存在する可能性のある核酸標的を増幅し検出するための改良された方法に関する。本発明はさらに、適切に修飾されたプライマーと、増幅中の高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための及び核酸標的を検出するための該プライマーを含むキットとの、使用を提供する。【選択図】図１
2014083053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅の間において高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制される、試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、当該方法が、以下の：
ａ）当該試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーの少なくとも１種は、当該プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で一定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は５０サイクルより前には停止されない工程；及び
ｃ）該検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
【請求項２】
該ポリＮ配列は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、もしくはポリＧ配列、又はこれらの混合物からなり、かつ２〜１０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ポリＮ配列は、４〜６ヌクレオチドの長さからなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該標的核酸はウイルス核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ウイルス核酸はＨＣＶの核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該ポリＮ配列は、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）又はチミジン（Ｔ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的であり、インキュベーション工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法であって、少なくとも１種の該伸長フォワードプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号３）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号５）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号７）、
ＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号９）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１１）、
ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１３）、
ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１５）、
ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号１９）、
ＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２１）、及び
ＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号２３）、からなる群の１つの配列を含み、及び／又は、少なくとも１種の該伸長リバースプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号４）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号６）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号８）、
ＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１０）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１２）、
ＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１４）、
ＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６）、
ＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２０）、及び
ＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２２）、からなる群の１つの配列を含んでなる方法。
【請求項９】
少なくとも１種の該検出可能なプローブは、
（配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の１つの配列を含んでなる、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＲ増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、該方法は、
ａ）試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含む、工程；
ｂ）該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で所定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は５０サイクルより前には停止されないことを特徴とする、工程；及び
ｃ）該検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
【請求項１１】
該ポリＮ配列は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、もしくはポリＧ配列、又はこれらの混合物からなり、かつ２〜１０ヌクレオチドの長さである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ポリＮ配列は、４〜６ヌクレオチドの長さからなる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
該標的核酸はウイルス核酸である、請求項１１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該ウイルス核酸はＨＣＶの核酸である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程ｂ）は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法であって、少なくとも１種の該伸長フォワードプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号３）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号５）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号７）、
ＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号９）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１１）、
ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１３）、
ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１５）、
ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号１９）、
ＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２１）、及び
ＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号２３）、からなる群の１つの配列を含み、及び／又は、少なくとも１種の該伸長リバースプライマーは、
ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号４）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号６）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号８）、
ＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１０）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１２）、
ＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１４）、
ＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６）、
ＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２０）、及び
ＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２２）、からなる群の１つの配列を含んでなる方法。
【請求項１７】
少なくとも１種の該検出可能なプローブは、
（配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の１つの配列を含んでなる、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
５０サイクルより前には停止されないＰＣＲ増幅中に、高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための、各プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなるポリＮ配列を、それぞれが含んでなる、少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つの伸長リバースプライマーの使用。
【請求項１９】
増幅中の高分子量生成物の形成が防止又は抑制される、試料中の標的核酸を増幅し検出するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、
（ｂ）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、
（ｃ）ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、
（ｄ）少なくとも１種のアンプリコンを生成するための、少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つの伸長リバースプライマーと、及び
（ｅ）該アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ、又はＤＮＡ結合色素とを含んでなり、
少なくとも１種の該伸長フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、プライマーの５’末端に付加される４〜１０ヌクレオチドの長さの、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的なポリＮ配列を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
体外診断薬の分野に属する本発明は、アンプリコンを生成するための少なくとも１種のプライマー対を含む生物学的試料中に存在し得る核酸標的を増幅かつ検出するための改良された方法に関し、ここで、少なくとも１種のプライマーは、標的配列に相補的ではないポリＮ配列と、このアンプリコンに特異的な検出可能なプローブとで５’末端が修飾されている。この改良は特に、増幅中の、目的のアンプリコン以外の副産物、すなわち高分子量生成物、の形成が、部分的に又は完全に抑制されるという事実に基づく。本発明が診断型の用途で使用されるなら、偽陰性又は偽陽性の結果が避けられる。本発明はさらに、核酸標的の増幅と検出中の、高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための、適切に修飾されたプライマーと、このプライマーを含むキットとの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断学の分野において、核酸の増幅と検出は非常に重要である。核酸の増幅と検出の診断応用の例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のようなウイルスの検出、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、及び／又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在についての献血の日常的スクリーニングである。この増幅及び検出法はまた、細菌の核酸標的又は腫瘍マーカーなどの解析に適している。
【０００３】
核酸標的の増幅と検出のための最も有名で広く使用されている方法は、ポリメラーゼ酵素を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＵＳ４，６８３，１９５号及びＵＳ４，６８３，２０２号）である。関連する重要な改良は、例えばＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）上の商業的アッセイで使用されるような、加水分解（ｈｙｄｒｏｌｉｚａｔｉｏｎ）プローブ又は５’ーヌクレアーゼプローブとして知られているレポーター基又は標識物を担持する修飾オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ中の増幅生成物のリアルタイム検出である（ＵＳ５，２１０，０１５号、及びＵＳ５，４８７，９７２号）。他の改良された増幅法及び検出法は、分子ビーコン技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＷＯ９５／１３３９９号）として知られている検出方法、又はマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）（ＭＧＢ）部分を含むオリゴヌクレオチドを使用する方法（ＷＯ０３／０６２４４５号、及びＷＯ２００６／１３５７６５号）である。
【０００４】
これらのプライマーの少なくとも１種の５’末端で高いＧＣ含量を有する添加されたオリゴヌクレオチドを含むプライマーの使用が増幅効率の改良を示すことが、さらに公知である（Ｑ．Ｌｉｕら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．７（１９９７），ｐ．３８９−３９８；  ＷＯ０１／９４６３８号；ＵＳ２００４／０１１０１８２号）。約１２〜４０サイクルのＰＣＲ後の増幅生成物の最終的量は、非修飾プライマーより、例えば５’末端にＧＧＡＣ単位が添加されているプライマーで顕著に高い。
【０００５】
Ａｆｏｎｉｎａら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．４３（３）（２００７），ｐ．１−３；ＷＯ２００６／１３５７６５号）は、リアルタイムＰＣＲ蛍光シグナルの増加を記載し、こうして５’末端にランダムに分散された短いアデニンとチミンリッチフラップとマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）蛍光ハイブリダイゼーションプローブとを有するプライマーを使用して、改良された増幅効率を得ている。
【０００６】
さらに、いくつかのＰＣＲアッセイでは、高分子量生成物の形成のような副産物は、増幅効率に大きな影響を与え、例えば偽陽性又は偽陰性の結果を生成するかも知れない。特に、低力価試料については、偽陰性の結果に至る高分子量増幅生成物の形成のために、検出シグナルの低下又は脱落が予測される。より多くのＰＣＲサイクルを行うほど、通常この増幅効率はより低下する。
【０００７】
定量的ＰＣＲ反応では、内部評価用定量標準物質が加えられ、同時増幅される。これは、調製法と増幅法とを制御し、阻害作用を補償する。内部標準物質の増幅中の高分子量生成物の形成は、シグナルの抑制と無効な標準物質を発生させることがあり、従って内部評価用定量標準物質により制御されるＰＣＲ反応が無効化される。しかし、先行技術（例えば、ＷＯ２００８／０６４６８７号又はＷＯ２０１２／０３２５１０号）に記載されたテイル含有プライマーは、増幅反応が行われる時間が長いほど又はより多くのＰＣＲサイクルが行われるほど、形成される高分子量のアンプリコン生成物が多いため、高分子量のアンプリコン生成物の形成を防止又は抑制するのには適していない。むしろ、記載されたテイル含有プライマーは、適用されるプライマーに基づいて非特異的増幅生成物の形成を低減させることができる。
【０００８】
偽陽性結果の原因は「キャリーオーバー汚染」であり、これは、その前のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物（アンプリコン）が次のＰＣＲアッセイを汚染させる。汚染物質は、技師、装置、又はさらにはエアロゾルにより伝搬されることがある。高分子量生成物は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＳ６，７１３，２９４号）のような汚染防止策に対して、単一のアンプリコンより抵抗性であり、従ってキャリーオーバー汚染のリスクを大きく上昇させる。標的核酸が存在しない真の陰性試料において、汚染物質は偽陽性結果を発生させる。標的核酸が存在する真の陽性試料において、汚染物質は真の標的と同時増幅される。このような同時増幅は、真の標的の正確な量を決定しなければならない定量アッセイの結果をゆがめることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って当該分野において、核酸標的の簡便で信頼できる増幅と検出のための方法を提供するニーズが存在する。特に、高分子量副産物を抑制することに焦点を当てた、適切な改良された方法を提供するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも１種のプライマーが、標的配列に対して非相補的なポリＮ配列で５’末端が修飾されるアンプリコンを生成するための少なくとも１種のプライマー対、及びこのアンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を含む生物学的試料中に存在し得る核酸標的を増幅し検出するための、新しい方法と用途とに関しする。この改良は特に、増幅中の高分子量生成物の形成が妨害されるか又は部分的もしくは完全に抑制されるという事実に基づき、従って例えば偽陰性結果又は偽陽性結果が避けられる。すなわち本発明の１つの主題は、以下である。
【００１１】
増幅中の高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制されることを特徴とする、生物学的試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、この方法は、
ａ）上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー又は伸長リバースプライマーの少なくとも１種は、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程；及び
ｃ）上記検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
【００１２】
本発明はさらに、アンプリコンを生成するための少なくとも１種のプライマー対を含む、生物学的試料中に存在し得る核酸標的を増幅及び検出するための新しい方法と使用とに関し、ここで、両方のプライマーは５’末端が、標的配列に非相補的であるポリＮ配列と、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とで、修飾されることを特徴とする。この改良は特に、増幅中の高分子量生成物の形成が妨害されるか又は部分的もしくは完全に抑制されるという事実に基づき、従って例えば偽陰性結果又は偽陽性結果が避けられる。すなわち本発明の１つの主題は、以下である。
【００１３】
増幅中の高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制されることを特徴とする、生物学的試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、この方法は、
ａ）上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマーと伸長リバースプライマーはそれぞれ、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程；及び
ｃ）上記検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
【００１４】
本発明のさらなる１つの主題は、
ＰＣＲ増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、この方法は、
ａ）生物学的試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーの少なくとも１種は、プライマーの５’末端に付加される、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程；及び
ｃ）上記検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
【００１５】
本発明の方法は、当該分野に多くの改良を加える：ＰＣＲ中の高分子量生成物の形成を防止又は抑制することにより、蛍光抑制が避けられるため、以後のアンプリコンの検出がより信頼できる。これは、標的及び／又は内部標準物質の両方の増幅に適用される。高分子量生成物は（アンプリコンではなく）、以後のＰＣＲ反応で蛍光抑制を引き起こす。本発明の方法は、少なくとも２０サイクルのＰＣＲを適用した時、核酸標的が存在しないか又は低力価量でのみ含まれる試料の検出のために、特に有効である。このような態様のいくつかでは、ＰＣＲサイクルは、３０サイクルを超えた後、時に４０サイクルを超えた後、好ましくは５０サイクルを超えた後、最も好ましくは６０サイクルを超えた後に停止される。これらの試料のほとんどについて、増幅反応は５０サイクル以前には停止されない。このようなＰＣＲ反応の抑制は、以前のＰＣＲ反応からの汚染が基礎的に低レベルである条件下で、より顕著である。
【００１６】
伸長プライマーの使用により高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための本発明の方法はまた、検出のためにプローブもＤＮＡ結合色素も必要ではない増幅法にも有用であり得る。
【００１７】
本発明の「ポリＮ配列」という表現は、５種の天然の塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）のすべて、又はこれらの天然の塩基の４種のみ、３種のみ、２種のみ、もしくは１種のみを含んでよいポリヌクレオチド配列をいう。本発明のポリＮ配列は、少なくとも２個もしくは多数の同一の塩基［例えば、（Ａ）ｍ，（Ｔ）ｍ、（Ｇ）ｍ、（Ｃ）ｍ、（Ｕ）ｍ、ここで、ｍは特に２〜１０の数である］、又は異なる塩基［例えば、（ＡＴ）ｎ，（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＡ）ｎ、（ＵＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、又は（ＣＧ）ｎ、ここで、ｎは特に１〜５の数である］（通常全部で５０ヌクレオチド以下である）を含む。好ましくはポリＮ配列は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなる。ポリＮ配列は、使用される少なくとも１種のプライマーに付加される。２種以上のプライマーに付加されるポリＮ配列は、同じであるかまたは異なってもよい。本発明のある態様において、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、同一のポリＮ配列を含む。
【００１８】
ある態様において本発明は、工程ａ）に記載されたポリＮ配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、又はポリＧ配列を含むことを特徴とする上記方法を提供する。アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチドの１００％又は２種の異なるヌクレオチドを有し、かつ全部で２〜１０ヌクレオチド又は４〜６ヌクレオチドの長さを有するポリＮ配列が、本発明で使用される。４〜６個の連続したアデニン塩基（Ａ）を含むポリＮ配列テイルが、特に本発明で使用される。ポリＮ配列テイルはまた、修飾オリゴヌクレオチド（プライマー）が、その相補体にハイブリダイズする能力、及び増幅反応で鋳型として機能する能力を有する限りは、Ｎ４−エチル−ｄＣ，Ｎ６−メチル−ｄＡ、又は２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドなどのアルキル化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含んでよい。
【００１９】
さらに本発明は、上記した方法のいずれかにより、生物学的試料中の標的核酸を増幅及び検出するためのキットを提供する。このようなキットは、少なくとも１種のポリメラーゼ（例えば熱安定性ポリメラーゼ）と、少なくとも４種の異なるヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種の伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーとを含み、ここで、上記伸長フォワードプライマーと伸長リバースプライマーの少なくとも１種は、プライマーの５’末端に付加されるアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリＮ配列と、上記アンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能なプローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む。本発明のキットは特に、上記ポリＮ配列が、２〜１０ヌクレオチドの長さのポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、ポリＧ配列を含むものである。ポリＮ配列は、使用されるプライマーの少なくとも１種に付加され得る。２種又はそれ以上のプライマーに付加されるポリＮ配列は、同じであるかまたは異なってもよい。本発明のある態様においてキットは、同じポリＮ配列を含有するフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。キットはさらに、追加のプライマーとプローブ、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼのような酵素、アプタマー、緩衝剤成分、及び洗浄剤などを含んでよい。
【００２０】
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語が以下に定義される。
【００２１】
「生物学的試料」は、天然起源の任意の試料でよい。「生物学的試料」は、例えばヒトから得られ、体液又は体の組織である。本発明のある態様において「生物学的試料」は血液である。
【００２２】
用語「ヌクレオシド」は、例えばリボース又はデオキシリボースのような糖のＣ−１’炭素に連結された塩基からなる化合物をいう。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基、例えばプリン又はピリミジンである。
【００２３】
用語「ヌクレオチド」は、モノマー単位としての又はポリヌクレオチド内の、ヌクレオシドのリン酸エステルをいう。「ヌクレオシド５’−三リン酸」は、糖の５’−炭素位置に結合した三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、時に「ＮＴＰ」又は「ｄＮＴＰ」及び「ｄｄＮＴＰ」と記載される。修飾ヌクレオシドは、典型的には塩基、糖、又はリン酸成分の修飾により化学的に修飾された任意のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、又はＣＴＰ）である。修飾ヌクレオシドは、特に限定されないが、例えばＮ４−エチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルアデニン又はＮ４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルシトシン、５−メチルシトシン、６ーメルカプトプリン、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル、及び６−チオグアニンのような塩基部分、又は２’−Ｏ−メチルリボース及び２’−フルオロ−又は２’−アミノ−２’−デオキシリボースのような糖部分などを含む。本明細書において用語「ヌクレオチド類似体」は、天然に存在しない任意のヌクレオチドをいう。
【００２４】
「他のヌクレオチドモノマー」という表現は、酵素的ポリヌクレオチド合成で使用することができる、標準的なヌクレオシド三リン酸以外のリン酸活性化ヌクレオシドをいい、例えばヌクレオシド四リン酸などをいう。
【００２５】
「標的核酸」及び「標的領域」という用語は、増幅、検出、又は分析すべき核酸の領域をいう。プライマー又はプローブがハイブリダイズする配列は、「標的配列」と呼ぶことができる。
【００２６】
「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、検出すべきプライマー、プローブ、及びオリゴマー断片をいい、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリンもしくはピリミジン塩基又は修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチドの、総称である。用語「核酸」と「オリゴヌクレオチド」との間に意図された差は無く、これらの用語は同義で使用される。これらの用語は、分子の１次構造のみについて言及する。すなわちこれらの用語は、２本鎖ＤＮＡ及び１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖ＲＮＡ及び１本鎖ＲＮＡ、ならびにＲＮＡとＤＮＡとの２本鎖を含む。
【００２７】
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多くの要因、及びそのオリゴヌクレオチドの最終的機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適切な配列のクローニング及び制限切断、及びＮａｒａｎｇら，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のホスホラミダイト法；及びＵＳ４，４５８，０６６号に記載された固相支持体法などの方法による直接化学合成を含む、任意の適切な方法により調製することができる。合成法の総説は、Ｃｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７に記載されている。
【００２８】
「増幅」、「増幅する」などの用語は一般的に、分子又は関連分子セットのコピー数の上昇をもたらす任意の方法をいう。ポリヌクレオチド分子に適用される時、増幅は、典型的には少量のポリヌクレオチド（例えば、ウイルスゲノム）から出発する、ポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド分子の一部の複数のコピーを産生させることを意味し、ここで増幅される物質（アンプリコン、ＰＣＲアンプリコン）は典型的には検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的及び酵素的方法を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（逆転写ＰＣＲ、ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応、転写性増幅（ＴＭＡ）反応、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）反応、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）中の、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ分子の１つ又は数個のコピーからの複数のＤＮＡコピーの生成は、増幅の形態である。増幅は、出発分子の厳密な複製に限定されない。例えば、逆転写ＰＣＲを使用する、試料中の限定量のウイルスＲＮＡからの複数のｃＤＮＡ分子の生成は、増幅の１形態である。さらに、転写プロセス中の単一のＤＮＡ分子からの複数のＲＮＡ分子の生成は、増幅の１形態である。
【００２９】
用語「アンプリコン」は、特定の標的核酸の増幅に従って産生されるポリヌクレオチド分子（又はまとめて複数の分子）をいう。アンプリコンを生成するために使用される増幅法は、任意の適切な方法でもよく、例えば最も典型的にはＰＣＲ法を使用して行われる。アンプリコンは、特に限定されないが、典型的にはＤＮＡアンプリコンである。アンプリコンは１本鎖又は２本鎖でもよく、又は任意の濃度比でその混合物中にあってもよい。
【００３０】
用語「高分子量生成物」は、アンプリコンのオリゴマー（又はポリマー又はコンカタマー）をいい、従ってプライマー、プローブ、及びＤＮＡ結合色素の複数の結合部位を含有する。約１，０００塩基対合〜１０，０００塩基対合を有するこのような高分子量生成物は、特にアンプリコンは非特異的にプライマーとして作用するため、ＰＣＲサイクルが多いほど多く形成される。
【００３１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的塩基対合による２つの１本鎖核酸による２本鎖構造の形成をいう。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間で、又は小さいミスマッチ部分を含む「実質的に相補的な」核酸鎖の間で起きることができる。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「厳密なハイブリダイゼーション条件」又は「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定な２本鎖形成は、あまり厳密ではないハイブリダイゼーション条件で行われる。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さと塩基対合濃度、イオン強度、及びミスマッチ塩基対合の頻度を含む多くの変数を考慮して、当該分野で示されている教示（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第２版、１９８９，Ｐａｒｔ  １−３，「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に従って、２本鎖の安定性を経験的に決定することができる。
【００３２】
一般に、厳密性条件は、一定のイオン強度とｐＨ値での特定の配列についての熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、２本鎖の５０％が解離している温度（一定のイオン強度とｐＨ値で）である。ハイブリダイゼーション条件の厳密性を緩和することは、配列ミスマッチを許容することを可能にする；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整により制御することができる。
【００３３】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下で、すなわち適切な緩衝剤中の４種の異なるヌクレオシド三リン酸と重合用の物質（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下と適切な温度で、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成の開始点として作用することができる、天然又は合成のオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは好ましくは、１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存するが、典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と充分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに、より低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要は無いが、鋳型とハイブリダイズするために充分に相補的でなければならない。プライマーは、標的配列への結合の特異性を上昇させる追加の特徴（例えば、ＥＰ０８６６０７１号及びＥＰ１２０１７６８号に記載された３’末端アルキル化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチド）、又はプライマーの検出又は固定化を可能にするが、プライマーの基本的性質（ＲＮＡ又はＤＮＡ使用の開始点として作用する）を変えない追加の特徴を含むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、増幅生成物のクローニングを促進するか、及び／又は本発明に従って高分子量生成物の形成を抑制もしくは防止を促進する追加の核酸配列を、５’末端に含んでよい。ハイブリダイズするために鋳型に充分に相補的なプライマーの領域は、本明細書においてハイブリダイズ領域と呼ばれる。
【００３４】
本発明において使用される用語「伸長プライマー」又は「ポリＮ伸長プライマー」は、５種の天然の塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）のすべて、又はこれらの天然の塩基の４種のみ、３種のみ、２種のみ、もしくは１種のみを含んでよい、５’末端で追加のポリヌクレオチド配列（ポリＮ）を含むプライマーをいう。特に本発明のポリＮ配列は、少なくとも２個もしくは多数の同一の塩基［例えば、（Ａ）ｍ，（Ｔ）ｍ、（Ｇ）ｍ、（Ｃ）ｍ、（Ｕ）ｍ、ここで、ｍは特に２〜１０の数である］、又は異なる塩基［例えば、（ＡＴ）ｎ，（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＡ）ｎ、（ＵＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、又は（ＣＧ）ｎ、ここで、ｎは特に１〜５の数である］（通常全部で５０ヌクレオチド以下である）を含む。例えばポリＮ配列は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、又はポリＧ配列を含む。アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、アデノシン−チミジン（ＡＴ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチドの１００％又は２種の異なるヌクレオチドを含み、かつ全部で２〜１０ヌクレオチドもしくは４〜６ヌクレオチドの長さを有するポリＮ配列が、多くの場合本発明に従って適用される。本発明に従って、少なくとも１種の適切に伸長されたプライマーが使用される。少なくとも２種の伸長プライマーに付加されるポリＮ配列は、同じであるかまたは異なってもよい。
【００３５】
本発明において「ポリＮ配列」という表現は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう。ポリＮ配列は、少なくとも２個もしくは多数の同一の塩基［例えば、（Ａ）ｍ，（Ｔ）ｍ、（Ｇ）ｍ、（Ｕ）ｍ、（Ｃ）ｍ、ここで、ｍは特に２〜１０の数である］、又は異なる塩基［例えば、（ＡＴ）ｎ，（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＴＡ）ｎ、（ＵＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、又は（ＣＧ）ｎ、ここで、ｎは特に１〜５の数である］（通常全部で５０ヌクレオチド以下である）を含む。使用される２個又はそれ以上のプライマーに付加されるポリＮ配列は、同じであるかまたは異なってもよい。本発明の好適な態様において、フォワードプライマー及びリバースプライマーはポリＮ配列を含み、このポリＮ配列は同じであるかまたは異なってもよい。ポリＮ配列テイルはまた、修飾オリゴヌクレオチド（プライマー）が、その相補体にハイブリダイズする能力、及び増幅反応で鋳型として機能する能力を有する限りは、Ｎ４−エチル−ｄＣ，Ｎ６−メチル−ｄＡ、又は２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドなどのアルキル化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを含んでよい。ある態様において、１種のみのプライマー（フォワードプライマー又はリバースプライマー）が、このようなポリＮ配列テイルを含むことが有用なことがある。
【００３６】
ある態様において本発明は、工程ａ）に記載されたポリＮ配列が、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、又はポリＧ配列を含むことを特徴とする上記方法を提供する。アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、アデニン−チミジン（ＡＴ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチドの１００％又は２種の異なるヌクレオチドを含み、かつ全部で２〜１０ヌクレオチドの長さを有するポリＮ配列が、本発明で使用される。４〜６ヌクレオチドの長さを有するポリＮ配列を、本発明で使用してもよい。４〜６個の連続アデニン（Ａ）塩基を含む配列テイルが、特に本発明で使用される。
【００３７】
本明細書において「上流」プライマーは、その伸長生成物がコード鎖のサブ配列であるプライマーをいう。「下流」プライマーは、その伸長生成物が相補的非コード鎖のサブ配列であるプライマーをいう。
【００３８】
本明細書において「フォワード」プライマーは、ＰＣＲでアンチセンス鎖の３’末端の開始コドンから鋳型ＤＮＡ（核酸標的）の５’末端の終止コドンまで伸長しているプライマーを意味し、「リバース」プライマーは、センス鎖の５’末端の終止コドンから鋳型ＤＮＡの３’末端の開始コドンまで伸長しているプライマーをいう。フォワードプライマーは通常、開始コドンの上流の鋳型ＤＮＡにアニールするように設計され、リバースプライマーは、終止コドンの下流の鋳型ＤＮＡの領域にアニールするように設計される。
【００３９】
本明細書において用語「プローブ」は、相補的塩基対合により、標的核酸の配列とともに２本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドをいう。プローブは、標的核酸の検出又は捕捉用に使用される。プローブは好ましくは、１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プローブは典型的には、標的配列の領域に対応する、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３５ヌクレオチドからなる「ハイブリダイズ領域」からなるか、又はこれを含有する。
【００４０】
「対応する」は、指定の核酸又はその相補体に少なくとも実質的に相補的であることを意味する。プローブは、標的核酸の正確な配列を反映する必要は無いが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で、標的にハイブリダイズするのに充分に相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレオチドは、プローブの検出又は固定化を可能にするが、ハイブリダイズ領域のハイブリダイゼーション特性を大きく改変することはない追加の特徴を含有するか、又はこれに結合されることができる。例えばプローブは、１種以上の標識ヌクレオチドの取り込みにより、又は１種以上の別の検出可能な成分に結合されることにより、標識され得る。標識されたヌクレオチド又は検出可能成分は、例えば、特に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及びシアニンのような蛍光色素、又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔ，ＣＡからのＢＨＱ−２のようなＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓのような消光剤色素を含む。プローブは例えば、当業者に公知の加水分解プローブもしくは５’−ヌクレアーゼプローブ、分子ビーコンプローブ、マイナーグルーブバインダー結合プローブ、又はハイブリダイゼーションプローブなどでもよい。
【００４１】
本明細書においてオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと非標的配列との間に存在するミスマッチの数より小さい場合、標的配列に対して「特異的」である。ハイブリダイゼーション条件は、存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと非標的配列との間に存在するミスマッチの数以下である場合にのみ安定な２本鎖が形成される条件で選択することができる。そのような条件下では、標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列とのみ安定な２本鎖を形成することができる。すなわち、適切に厳密なハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プローブの使用は、特異的標的配列の検出を可能にする。同様に、適切に厳密な増幅条件下での標的特異的プライマーの使用は、標的プライマー結合部位を含む標的配列の特異的増幅を可能にする。
【００４２】
用語「熱安定性ポリメラーゼ酵素」は、熱に対して比較的安定であり、かつ標的配列の核酸鎖の１つと相補的であるプライマー伸長生成物を形成するヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。酵素に適用される用語「熱安定性」は、特に高温（例えば、５５℃又はそれ以上）で生物活性を保持する酵素、又は加熱と冷却の繰り返しサイクル後にその生物活性を保持する酵素をいう。ポリメラーゼ酵素は、プライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終わるまで鋳型の５’末端に向かう方向で進む。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素は、例えばＵＳ４，８８９，８１８号により詳細に記載されており、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ／Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。
【００４３】
ある核酸の「相補体」は、特に逆平行のポリヌクレオチド鎖を意味し、これは、その核酸と同じ長さを有し、その核酸に対して正確に相補的である核酸を意味する。例えば、配列５’−ＡＧＴＴＣ−３’は、配列５’−ＧＡＡＣＴ−３’と相補的である。用語「完全に相補的」又は「１００％相補的」などは、逆平行の鎖間の塩基の完全なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合（ポリヌクレオチド２本鎖中にミスマッチが無い）を有する相補的配列をいう。しかし相補性は完全である必要は無く、例えば安定な２本鎖は、ミスマッチの塩基対又は一致しない塩基を含有してもよい。「部分的相補性」、「部分的に相補的」、「不完全な相補性」、又は「不完全に相補的」などの用語は、１００％完全であることはない、逆平行のポリヌクレオチド鎖間の塩基の整列をいう（例えば、ポリヌクレオチド２本鎖中に、少なくとも１つのミスマッチ又は一致しない塩基がある）。すなわち核酸の相補体は、１本鎖のユニークに規定された配列をいう。
【００４４】
最も広い意味において用語「検出可能な」、「標識物」、又は「レポーター」は、検出可能であるか、又はこれに結合しているものの検出を可能にする任意の成分又は特性をいう。例えば、標識物を含むポリヌクレオチドは検出可能である（及び、ある形態においてプローブと呼ばれる）。理想的には、標識ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする。ある形態において、例えば標識物はポリヌクレオチドに結合（共有結合的に又は非共有結合的に）している。種々の形態において標識物は、代替的に又は組合せて、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する、（ii）第２の標識物と相互作用して、第２の標識物（例えば、ＦＲＥＴ）により提供される検出可能シグナルを修飾する、（iii）ハイブリダイゼーション、例えば２本鎖形成を安定化する、（iv）捕捉機能、例えば疎水性親和性、抗体／抗原、イオン的錯体形成、を付与する、又は（ｖ）物性（例えば、電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度、又はクロマトグラフィー的挙動）を変化させる。標識物は、その構造及び作用機構が広く変化する。
【００４５】
標識物の例は、特に限定されないが、蛍光標識物（例えば、消光剤又は吸光剤を含む）、非蛍光標識物、比色分析標識物、化学発光標識物、生物発光標識物、放射活性標識物、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含む）などを含む。さらに例示すると、蛍光標識物は、陰性荷電した色素（例えばフルオレセイン群の色素）、又は中性荷電の色素（例えばローダミン群の色素）、又は陽性荷電した色素（例えばシアニン群の色素）を含んでよい。フルオレセイン群の色素は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、及びＺＯＥを含む。ローダミン群の色素は、例えばテキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡは、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されており、テキサスレッドは、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から市販されている。シアニン群の色素は、例えばＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５、及びＣＹ７を含み、例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から市販されている。
【００４６】
「ＤＮＡ結合色素」又は「ＤＮＡ挿入色素」は、２本鎖核酸に結合することができて、結合すると蛍光シグナルを発生する色素分子をいい、例えばＳＹＢＲＧＲＥＥＮ  Ｉ及びＤＹＢＲＧＯＬＤがＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から、又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＲｅｓｏｌｉｇｈｔがＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
【００４７】
用語「ＦＲＥＴ」（蛍光共鳴エネルギー移動）及び同等の用語は一般に、ドナー分子から光子が発生することなく、ドナー分子からアクセプター分子にエネルギーが伝達される、２種の色素分子の電子状態間の動的距離依存性相互作用をいう。ＦＲＥＴの効率は、これらの色素間の分子間距離の逆数に依存し、生物学的巨大分子の大きさに匹敵する距離に対して有用となる。一般にＦＲＥＴは、従来の光学的顕微鏡の限界を超える空間的解像度をもって、単一の分子中の共局在化分子又はコンフォメーション変化のイメージング、動力学的分析、及び／又は定量を可能にする。一般にＦＲＥＴは、（ａ）ドナー分子とアクセプター分子は極めて接近していなければならない（典型的には、例えば１０〜１００Å）、（ｂ）アクセプターの吸収スペクトルは、ドナーの蛍光放射スペクトルと重複しなければならない、及び（ｃ）ドナーとアクセプターの遷移双極子配向は、ほぼ平行でなければならない。
【００４８】
多くのＦＲＥＴ用途で、ドナー色素とアクセプター色素は異なっており、この場合、ＦＲＥＴは、アクセプターの感作蛍光の出現又はドナー蛍光の消光により検出することができる。ある場合には、ドナーとアクセプターは同じであり、ＦＲＥＴは、生じる蛍光脱分極により検出することができる。ＦＲＥＴ系における単一のドナー／アクセプター分子の使用は、例えばＵＳ７，３１２，３０２号（Ｐａｃｋａｒｄ  ａｎｄ  Ｋｏｍｏｒｉｙａ）に記載されている。
【００４９】
ＦＲＥＴは、分子の近接性の変化を特徴とする種々の生物学的現象を研究するための重要な技術となっている。ＦＲＥＴ技術は現在多くの生物学的研究室に普及しており、様々な生物学的システム［特に限定されないが、核酸ハイブリダイゼーションの検出、リアルタイムＰＣＲアッセイ及びＳＮＰ検出、タンパク質の構造とコンフォメーション、タンパク質複合体の空間分布と集合、受容体／リガンド相互作用、イムノアッセイ、単一分子のプローブ相互作用、核酸の構造とコンフォメーション、突然変異を検出するためのプライマー伸長アッセイ、自動ＤＮＡ配列決定法、脂質の分布と輸送、膜融合アッセイ（膜融合体の脂質混合アッセイ）、膜電位検知、蛍光発生性プロテアーゼ基質、及びサイクリックAMPと亜鉛の指標を含む］で使用するために改変されている。
【００５０】
用語「加水分解プローブ」又は「５’−ヌクレアーゼプローブ」は、本発明のほとんどの応用に使用され、ＰＣＲ反応、すなわちＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムで使用されるプローブを示す。このようなハイブリダイゼーション又は５’−ヌクレアーゼプローブは、通常２種の蛍光性成分で標識される１本鎖ハイブリダイゼーションプローブからなる。第１の蛍光性成分が、適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に従って、第２の蛍光性成分に移動される。第２の蛍光性成分は一般に、ＢＨＱ−２のような非蛍光性消光剤でもよい消光剤分子である。このフォーマットで使用される典型的な蛍光色素は、例えば、特にＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、Ｃｙａｎ５００、及びＣＹ５．５である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中に、標識ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅生成物）に結合し、以後の伸長期中に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又は例えば当業者に公知の他の適切なポリメラーゼ（例えばＺＯ５ポリメラーゼ）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、励起された蛍光性成分と消光剤成分は、互いに空間的に分離される。その結果、消光剤の非存在下で第１の蛍光性成分を励起すると、第１の蛍光性成分からの蛍光発生を検出することができる。両方の検出フォーマット（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）技術）において、発生されるシグナルの強度は、元々の標的核酸分子の数と相関することができる。
【００５１】
「Ｃ型肝炎ウイルス型」という表現は、そのゲノム構成（例えば、系統発生解析）に基づくＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分類をいう。ＨＣＶ分離株の特定の種類への分類は、他のＨＣＶ分離株へのゲノム的関連性及び他のＨＣＶ分離株への比較的小さい関連性を反映する。本発明で使用されるＨＣＶ型の命名は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（２００５）「Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の命名のための統一システムのための共同提案（Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes）」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４２，  Ｎｏ．４：９６２−９７３で改訂され提唱された広く採用されている命名法に一致している。Ｓｉｍｍｏｎｇｓら（２００５）のシステムは、既知のＨＣＶ分離株を、６つのＨＣＶ遺伝子型（すなわち、遺伝子型１〜６）の１つに入れる。各遺伝子型はさらに、同じ遺伝子型の株間の関連性を反映するサブタイプに分類される。ＨＣＶサブタイプは、遺伝子型の後に小文字のローマ字で書かれ、例えばサブタイプ１ａ、サブタイプ１ｃ、サブタイプ６ａなどとなる。個々の分離株内に存在する遺伝的変種は、類似種と呼ばれる。すべての６つの遺伝子型を含む約１００のＨＣＶサブタイプが世界的に知られており、サブタイプの数は止まっておらず、より多くのＨＣＶ分離株が研究・配列決定されており、追加のサブタイプ（及び遺伝子型の可能性の有り）が認識される可能性がある。
【００５２】
用語「ウイルス型」は、遺伝子型又はサブタイプをいう。本明細書において用語「ＨＣＶ型」は、ＨＣＶ遺伝子型又はＨＣＶサブタイプを意味し得ることに注意されたい。用語「ＨＣＶ型判定」は、実験的（例えば未知の型の）ＨＣＶを既知の遺伝子型（例えば、１、２、３、４、５、もしくは６、又はこれらのサブセット）に割り当てるか、又は実験的ＨＣＶを既知のサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃなど、又はこれらのサブセット）に割り当てることを意味する。これに対して、当該分野で一般的に使用されるように、用語「ＨＣＶ遺伝子型判定」は、最も頻繁には、あるＨＣＶを任意のＨＣＶサブタイプ、例えば最も典型的には１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃなどに割り当ていることをいう。しかし本明細書において用語「遺伝子型判定」は、１、２、３、４、５、又は６にのみ割り当てることをいう。
【００５３】
用語「キット」は、試料の処理、方法、アッセイ、解析、又は操作を促進する物品の組合せに関連して使用される。キットは、キット、方法に必要な化学的試薬又は酵素、プライマーとプローブ、ならびに他の任意の成分の使用法を説明する説明書を含んでよい。ある態様において本発明は、リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲを使用する「閉管」検出のためのキットを提供する。これらのキットは、例えば、特に限定されないが、試料採取（例えば、血液試料の採取）のための試薬、採取のための試薬、例えば血液からのＲＮＡ及び／又はＤＮＡの採取と精製のための試薬、増幅と検出（任意に逆転写酵素活性を含む）のための試薬、１種以上のアンプリコンを調製するための逆転写と第１鎖及び第２鎖ｃＤＮＡ合成に適したプライマー（しかし、少なくとも１つの伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つの伸長リバースプライマー）、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及び（デオキシリボ）ヌクレオシド三リン酸を含むことができる。ある態様において、逆転写酵素活性と熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素は同じ酵素であり、例えばＴｈｅｒｍｕｓ種Ｚ０５ポリメラーゼ又はサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼである。
【００５４】
分子生物学と核酸化学の従来技術（これらは当業者の技術の範囲内である）は、文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，第２版、１９８９，Ｐａｒｔ  １−３，「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズに、詳細に説明されている。
【００５５】
原理的には、本発明の方法により、すべての種類の核酸標的を増幅し検出することができる。しかしこの方法は特に、初期のＰＣＲサイクルで形成されるアンプリコンの重合によりＰＣＲ反応で高分子量生成物が生成される、高標的含有試料又は対照に適用される。本発明の高標的核酸の例は、ウイルス［例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）］の核酸、又はヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、及び／又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在についての輸血血液の通常のスクリーニングのために使用されるものの核酸である。しかし本発明の方法はまた、細菌標的、腫瘍マーカーなどの分析にも適している。
【００５６】
特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界的な懸念が増大している。ＨＣＶ感染症はしばしば持続性であり、慢性の肝疾患を誘発し、肝硬変や肝細胞癌として現れる。ＨＣＶは、アメリカ合衆国において肝臓移植の主要な原因である。世界的に毎年、約１００万例の新しいＨＣＶ感染症が報告されており、アメリカ合衆国だけでも、毎年４００万人が感染し、３万例の新しい感染症が発症していると推定される。
【００５７】
現在ＨＣＶは、アメリカ合衆国における毎年８，０００〜１０，０００の死亡例の原因である。改良された診断薬や治療薬が開発されないと、この数は、世界的に数年以内に劇的に増加すると予測されている。
【００５８】
ＨＣＶゲノムは多型性であり、多くの株（遺伝子型及びサブタイプ呼ばれている）が性状解析されている。異なるウイルス型は、異なる疾患帰結と、治療法に対する異なる応答性とに相関している。
【００５９】
ＨＣＶゲノム構造／構成は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の構造／構成に最もよく似ている。多くのフラビウイルスタンパク質の既知の機能に一致して、Ｎ末端ＨＣＶタンパク質はおそらく構造タンパク質［Ｃ（カプシド／コア）、Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質を含む］であり、Ｃ末端非構造タンパク質［ＮＳ２（メタロプロテアーゼ）、ＮＳ３（セリン−プロテアーゼ／ヘリカーゼ）、ＮＳ４とＮＳ５（ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼ）を含む］は、ウイルス複製で機能すると考えられている。
【００６０】
プロトタイプＨＣＶ分離株（現在はＨＣＶ１ａと呼ばれる）の同定と性状解析後、世界中から他の分離株が同定された（され続けている）。配列比較は、これらのユニークな分離株が、ＨＣＶゲノムの完全長に対して３５％ものヌクレオチド非同一性により、互いに異なることを証明している（Ｏｋａｍｏｔｏら、（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８：３３１−３４１）。ウイルスゲノムを通して配列の変動が観察され、一部の領域は他の領域より大きな変動を示している。例えば、一般に５’−ＵＴＲ領域で高い配列保存が観察され、逆にエンベロープ（Ｅ）領域を含む一部領域は、超可変ヌクレオチド配列を示す。
【００６１】
感染中に存在するウイルス遺伝子型（及び／又はサブタイプ）を知ることは、感染した患者の最適な治療コースを決定するための重要な指標を、臨床医に提供する。しかし、増加し続ける数の既知のＨＣＶ型を区別することができる簡便な診断法の開発が、課題となっている。
【００６２】
標的核酸（ここで、標的核酸はウイルス核酸、好ましくはＨＣＶである）を増幅し検出するための本発明の方法は、本発明の好適な態様である。
【００６３】
従って本発明は、今日まで知られているほとんどのＨＣＶ型のゲノム中に存在する高い配列保存性を有する領域（例えば、５’ＵＴＲ領域）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を可能にする、改良されたオリゴヌクレオチドプライマー（伸長プライマー）を提供する。本発明はまた、ハイブリダイゼーションによりＨＣＶ核酸の検出を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００６４】
本発明のプライマーの重要な利点は、非標的配列を同時に増幅することなく、すべてのＨＣＶ型の増幅を可能にすることである。すなわちこのプライマーは、世界のあらゆる地域から得られる試料からすべての型のＨＣＶを検出することを可能にするＨＣＶ検出アッセイを可能にする。
【００６５】
すなわち本発明の１つの目的は、増幅中の高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制されることを特徴とする、生物学的試料中の核酸標的、例えばＨＣＶの核酸、を増幅及び検出するための方法であって、この方法は、
ａ）上記試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマーは第１のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドであり、上記リバースプライマーは第２のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドであり、上記プライマーの少なくとも１種は、プライマーの５’末端に付加される、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的である、ポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程；及び
ｃ）上記検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
【００６６】
本発明の具体的な態様において、本方法は５’末端にポリＮ配列を含むプライマーを含み、このポリＮ配列は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、又はポリＧ配列を含む。アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、アデニン−チミジン（ＡＴ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）のような、１種の一定の選択されたヌクレオチドの１００％又は２種の一定の選択されたヌクレオチドを含み、かつ全部で２〜１０ヌクレオチドの長さであるポリＮ配列。４〜６ヌクレオチドの長さを有するポリＮ配列が、特に本発明で使用される。４〜６個の連続アデニン（Ａ）ヌクレオチドを含むポリＮ配列は、特に本発明で使用される。
【００６７】
本発明のＨＣＶ特異的プライマーは、例えばフォワードプライマーとして使用される配列ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１）とリバースプライマーとして使用される配列ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号２）のポリＮ含有プライマーのようなオリゴヌクレオチドである。３’末端でさらに修飾されている（例えばアデノシンの環外アミン基でアルキル化されている）プライマーもまた、本発明で使用し得る。
【００６８】
本発明の別の目的は、ＰＣＲ増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、この方法は、
ａ）生物学的試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、アンプリコンを生成するための伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーと、上記アンプリコンに特異的な検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、上記伸長フォワードプライマー及び上記リバースプライマーの両方は、測定すべき核酸標的（例えばＨＣＶ）に特異的であり、上記プライマーの少なくとも１種は、プライマーの５’末端に付加される、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的である、ポリＮ配列を含むことを特徴とする、工程；
ｂ）上記核酸を上記増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な時間かつ条件下でインキュベートする工程；及び
ｃ）上記検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素を介して上記アンプリコンを検出する工程、とを含む。
【００６９】
本発明のある態様において、本方法は５’末端にポリＮ配列を含むプライマーを含み、このポリＮ配列は、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、又はポリＧ配列を含む。アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、アデノシン−チミジン（ＡＴ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）のような、１種の一定の選択されたヌクレオチドの１００％、又は２種の一定の選択されたヌクレオチドを含み、かつ全部で２〜１０ヌクレオチドの長さであるポリＮ配列が、本発明で使用される。４〜６ヌクレオチドの長さを有する適切なポリＮ配列が、特に本発明で使用される。４〜６個の連続アデニン（Ａ）及び／又はチミン（Ｔ）塩基を含むポリＮ配列が、特に本発明で使用される。
【００７０】
本発明のＨＣＶ特異的プライマーは、例えばフォワードプライマーとして使用される配列ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１）とリバースプライマーとして使用される配列ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号２）のポリＮ含有プライマーのようなオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
特に本発明において、ＨＣＶ核酸の増幅のために一対のオリゴヌクレオチドプライマーが使用され、このプライマー対は、
ＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号３）とＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号４）、
ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号５）とＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号６）、
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号７）とＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号８）、
ＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号９）とＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１０）、
ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１１）とＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１２）、
ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１３）とＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１４）、
ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ（配列番号１５）とＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ（配列番号１６）、
ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号１９）とＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２０）、
ＡＴＡＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２１）とＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２２）、
及び、上記フォワードプライマーのいずれか（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、又は２１）と、上記リバースプライマーのいずれか（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、又は２２）との任意の組合せ、からなる群から選択される。
【００７２】
本発明のある態様において１種以上の追加のプライマー、例えば配列ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ（配列番号３２）を、ＨＣＶ増幅に使用されるプライマー対に加えてもよい。
【００７３】
特に、少なくとも、プライマー配列番号１とプライマー配列番号２、プライマー配列番号３とプライマー配列番号４、プライマー配列番号５とプライマー配列番号６、プライマー配列番号９とプライマー配列番号１０、又はプライマー配列番号１５とプライマー配列番号１６からなるプライマーの対が、本発明で使用される。さらに、特にプライマー配列番号１とプライマー配列番号２及び配列番号３２と、プライマー配列番号３とプライマー配列番号４及び配列番号３２と、プライマー配列番号５とプライマー配列番号６及び配列番号３２と、プライマー配列番号９とプライマー配列番号１０及び配列番号３２と、又はプライマー配列番号１５とプライマー配列番号１６及び配列番号３２と、からなるプライマーのセットが本発明で使用される。本発明で使用される５’−ポリＮ伸長プライマーの別の対は、配列ＡＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣ（配列番号２３）とＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号２４）のポリＮ含有プライマーを含む。本発明で使用される５’−ポリＮ伸長プライマーのさらに別の対は、配列ＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡ（配列番号２５）とＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴ（配列番号２６）とのポリＮ含有プライマーを含む。本発明のプライマー対は、少なくとも１種の追加のプライマー、特に第２の標的特異的リバースプライマーを含んでよい。これらのプライマーは、Ｎ４−エチル−ｄＣ，Ｎ６−メチル−ｄＡ、Ｎ４−ｔ−ブチルベンジル−ｄＣ、及びＮ６−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル−ｄＡ、ならびに２’−Ｏ−メチル−ｄＵなどのアルキル化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを、３’末端領域に含んでよい。
【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明のプライマーを使用して増幅される領域内に含有されるＨＣＶゲノムの領域とハイブリダイズする。このプローブは、１セットのハイブリダイゼーション条件下で、すべての種類からのＨＣＶ核酸の特異的検出を可能にする。本発明のプライマーを用いて増幅されるＨＣＶ核酸を検出するために使用される時、プローブの特異性はＨＣＶ検出の特異性をさらに上昇させ、こうして偽陽性の可能性を最小にする。
【００７５】
ある態様において本発明は、ＨＣＶ核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでこのポリヌクレオチドプローブは、ＨＣＶ特異的核酸配列、検出可能な標識物、例えば蛍光性成分、及び任意の消光剤成分を含む。本発明のプローブは、例えばＦＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＰ（配列番号２７）のサブ配列又はその相補体（ここで、Ｆは例えば６−カルボキシ−フルオレセインのような蛍光色素であり、Ｐは３’末端リン酸基である）、又は５’末端に結合した例えばＣＹ５のようなシアニン群の蛍光色素と３’末端リン酸基とを含む、ＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ（配列番号２８）のサブ配列又はその相補体、又はＦＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＱＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＰ（配列番号２９）のサブ配列又はその相補体（ここで、Ｆは例えば６−カルボキシ−フルオレセインのような蛍光色素であり、ＱはＢＨＱ−２のような非蛍光性消光剤であり、Ｐは３’末端リン酸基である）、又は少なくとも例えばＣＹ５及び／又はフルオレセイン（例えばＦＡＭ）のような蛍光色素と３’末端リン酸基とを含む、ＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号３０）のサブ配列又はその相補体、からなってよい。本発明の具体的な態様において、プローブは、少なくとも、例えばＣＹ５及び／又はフルオレセイン（例えばＦＡＭ）のような蛍光色素と３’末端リン酸基とを含む、ＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号３０）、少なくとも、例えばＣＹ５及び／又はフルオレセイン（例えばＦＡＭ）のような蛍光色素と３’末端リン酸基とを含む、ＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ（配列番号２８）又はその相補体、ＦＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＰ（配列番号２７）（ここで、Ｆは例えば６−カルボキシ−フルオレセインであり、Ｐは３’末端リン酸基である）、ＦＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＡＣＣＧＱＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＰ（配列番号２９）（ここで、Ｆは例えば６−カルボキシ−フルオレセインであり、ＱはＢＨＱ−２であり、Ｐは３’末端リン酸基である）、及びこれらのプローブ配列のそれぞれの相補体からなる群から選択される。
【００７６】
本発明のすべてのプローブ配列は、当業者に公知の色素の選択肢で標識されてもよく、オリゴヌクレオチドプローブの異なる位置で標識されてもよい。
【００７７】
本発明の別の形態は、少なくとも本発明の１種の伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーを使用してＰＣＲを実施することを含む、すべての既知のＨＣＶ型から遺伝子の領域を増幅し、増幅されたＤＮＡを本発明のタンパク質又はプローブの各相補体を使用して検出する方法に関する。本発明のプライマーとプローブ又はプローブの各相補体は、ＨＣＶ核酸の特異的検出のための特に簡便で迅速な方法を可能にする。
【００７８】
本発明の別の形態は、少なくとも２種の本発明のＨＣＶ特異的伸長増幅プライマーを含む、ＨＣＶ核酸を増幅し検出するためのキットに関する。このキットは、追加の試薬、例えば本発明のプローブを含むことができる。このキットはまた、１種以上の増幅試薬、例えばポリメラーゼ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、アプタマー、緩衝塩、洗浄剤、ヌクレオシド三リン酸、及び他の成分（例えば、グリセリン及び／又はＤＭＳＯ）を含むことができる。
【００７９】
本発明の方法のために通常適用される核酸技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは、核酸の特異的配列を増幅するための方法であり、以前は検出不可能なほど少量の試料中に存在する核酸の迅速な検出を可能にする（ＵＳ４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、４，９６５，１８８号）。増幅された核酸を検出するための好適な方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによる方法である（Ｓａｉｋｉら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６を参照）。
【００８０】
この検出法は、特に限定されないが、２本鎖ＤＮＡ間に挿入され以後の蛍光を変化させる、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ、又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０のような特異的色素の結合又は挿入を含んでよい。特に検出工程はリアルタイムで行われる。市販のリアルタイムＰＣＲ装置（例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）又はＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標））を使用して、ＰＣＲ増幅と増幅生成物の検出とを、単一の閉じたキュベット中で劇的に短いサイクリング時間で組合せることができる（例えば、ＥＰ０９１２７６０号、ＥＰ１０３３４１１号、ＥＰ０５４３９４２号、ＥＰ０９１９５６５号）。検出は増幅と同時に起きるため、このリアルタイムＰＣＲ法は、増幅生成物の操作を不要にし、増幅生成物間の交差汚染のリスクを低下させる。リアルタイムＰＣＲは所用時間を大きく低下させ、臨床検査室において従来のＰＣＲ法に対して、魅力的な代替法である。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術（例えば、ＥＰ０９１２７６０号、ＥＰ１０３３４１１号）で使用されるリアルタイムＰＣＲの代替法として、本発明では加水分解プローブ又は５’−ヌクレアーゼプローブ技術が好ましくは適用される。ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用して実現されるこの技術は、２種類の蛍光性成分で標識された１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１の蛍光性成分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に従って第２の蛍光性成分に移動される。第２の蛍光性成分は一般に、ＢＨＱ−２のような非蛍光消光剤でもよい消光剤分子である。このフォーマットで使用される典型的な蛍光色素は、例えば、特にＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、Ｃｙａｎ５００、及びＣＹ５．５である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中に、標識ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅生成物）に結合し、以後の伸長期中に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、又は例えばＺＯ５ポリメラーゼのような当業者に公知の他の適切なポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、励起された蛍光性成分と消光剤成分は、互いに空間的に分離される。その結果、消光剤の非存在下で第１の蛍光性成分を励起すると、第１の蛍光性成分からの蛍光発生を検出することができる。両方（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）及びＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アナライザー）の検出フォーマットにおいて、発生されるシグナルの強度は、元々の標的核酸分子の数と相関することができる。本発明では、加水分解プローブ又は５’−ヌクレアーゼプローブが特に使用される。
【００８１】
ＦＲＥＴに対する代替法として、増幅生成物は、蛍光性ＤＮＡ結合色素（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）  から入手できるＳＹＢＲＧＲＥＥＮ  Ｉ（登録商標）もしくはＳＹＢＲＧＯＬＤ、又はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手できるＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｒｅｓｏｌｉｇｈｔ）のような２本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して検出することができる。２本鎖核酸と相互作用すると、このような蛍光性ＤＮＡ結合色素は、適切な波長の光で励起後に、蛍光シグナルを発生する。核酸挿入性色素のような２本鎖ＤＮＡ結合色素を使用することもできる（上記したように）。２本鎖ＤＮＡ結合色素が使用される時、融解曲線は通常、増幅生成物の存在の確認のために行われる。
【００８２】
本発明の別の態様において、初期のＰＣＲ反応から発生するアンプリコン及び高分子量生成物（重合アンプリコン）のような増幅生成物のキャリーオーバー汚染が防止される。キャリーオーバー汚染を防止するための一般的で有効な方法は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ類（「ＵＤＧ」又は「ＵＮＧ」と略期される）（ＥＣ３．２．２．３）の使用を含む。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含むこれらの酵素は、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ中に存在するウラシルを認識し、ウラシル塩基とデオキシリボースとの間のＮ−グリコシド結合を切断して、非塩基性部位を残す（例えばＵＳ６，７１３，２９４号を参照）。これらの酵素は、サイズの小さいウラシル含有アンプリコンをよく分解するが、サイズの大きいウラシル含有高分子量生成物（重合アンプリコン）はあまり効率的に分解しない。すなわち、汚染されると、高分子量生成物は以後のＰＣＲ反応の標的となることがあり、陰性試料で偽陽性結果を与えたり、陽性試料で正しくない力価を与える可能性がある。さらに、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼによる汚染と不完全な分解は、以後のＰＣＲ反応においてシグナル抑制を招くことがあり、従って、多種多様のプライマー及びプローブ結合配列がプライマーやプローブの反応混合物を流し去り、偽陰性結果又は正しくない試験結果を与えることがある。従ってＰＣＲにおいて高分子量生成物の防止は、標的陰性試料や標的陽性試料において正しい試験結果を得るために極めて重要である。
【００８３】
しかし、生物学的試料中の標的核酸を増幅し検出するための本発明の方法は、特にウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの存在下で行われる。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの存在下では、前のＰＣＲ反応からの高分子量生成物による防止又は抑制がさらに改良される。本発明に特に適しているのは、多数のアデノシン（Ａ）及び／又はチミジン（Ｔ）ヌクレオチドを含有するポリＮテイルを含む少なくとも１種のプライマーと組合せたウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの使用である。
【００８４】
増幅反応におけるキャリーオーバー汚染の制御用に最適化されたウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）の調製は、例えばＵＳ６，１８７，５７５号に開示されている。キャリーオーバー汚染を防止するためのＵＮＧの使用も記載されており、Ｌｏｎｇｏら「ポリメラーゼ連鎖反応におけるキャリーオーバー汚染を制御するためのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの使用」（１９９０）Ｇｅｎｅ，９３：１２５−１２８を参照されたい。ＵＮＧを使用するキャリーオーバー汚染を制御するための最新の方法は、ＵＳ６，２８７，８２３号と６，５１８，０２６号、及びＵＳ２００３／００７７６３７号に記載されている。
【００８５】
一般にこの方法は２つの工程を含む。第１に、キャリーオーバー汚染物質である可能性があるアンプリコンがウラシルを含むように、ＰＣＲアッセイはｄＵＴＰを含まなければならない。この方法は、増幅反応で一部の又はすべてのｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを代用することを含む。あるいは（又は、さらに）、１種以上のウラシル塩基が増幅プライマー中に取り込まれてもよい。しかし、プライマー中のウラシルが５’末端に近すぎる場合、この方法は以後の増幅を防止するのにあまり効率的ではないことに注意すべきである。ｄＵＴＰの使用はＰＣＲアッセイを妨害しない。ウラシル含有アンプリコンが生成された後、これは、チミンの代わりにウラシルが存在するにもかかわらず、標準的方法により検出され分析されることができる。
【００８６】
次に、ウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼは以後のＰＣＲに付加される。便利にはＵＮＧは、ＰＣＲのすべての成分を含有する標準的反応混合物中で活性がある。これは、組み立てられたＰＣＲ反応物に又はさらにはＰＣＲマスターミックスに、ＵＮＧを加えることを可能にする。熱サイクリングの開始前に、反応混合物は、ＰＣＲマスターミックス（約４０℃〜５０℃）の状況内で又はＵＮＧが活性である温度範囲内で、ＵＮＧ活性に最適な温度でインキュベートされる。前の反応からのウラシル含有汚染物質が存在する場合、ＵＮＧはウラシルを分解除去し、非塩基性部位を残す。非塩基性部位を有するＤＮＡは、高ｐＨ条件下の高温で不安定であることが知られている。熱サイクリングが始まると、このようなＤＮＡが分解される。高温はまたＵＮＧ酵素を不活性化し、ウラシルを含有する新しいＤＮＡアンプリコンを生成することを可能にする。
【００８７】
本発明において特に適用されるのは、少なくとも１種のフォワードプライマー及び／又は１種のリバースプライマーが３’末端にポリＮテイルを含むプライマーと組合せた、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む酵素の使用であり、このテイルは複数のアデノシン（Ａ）及び／又はチミジン（Ｔ）ヌクレオチドを含有し、２〜１０ヌクレオチドの長さである。
【００８８】
本発明の別の態様は、上記した方法のいずれかにより、生物学的試料中の標的核酸を増幅し検出するためのキットである。このキットは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素と、逆転写酵素活性を含む任意の酵素と、少なくとも４種の異なるヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも１種のアンプリコンを生成するための少なくとも１種のポリＮ配列伸長フォワードプライマー及び／又は少なくとも１つのポリＮ配列伸長リバースプライマー（この伸長フォワードプライマー及び／又は伸長リバースプライマーは、プライマーの５’末端に付加された、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、又はグアノシン（Ｇ）から誘導される１種のヌクレオチド又は２種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に対して非相補的である、ポリＮ配列を含む）と、及びこのアンプリコンに特異的な少なくとも１種の検出可能プローブ又はＤＮＡ結合色素と、ならびに各緩衝剤とを含む。このキットはさらに、試料調製のための試薬と、内部対照と、追加のプライマー及びプローブと、アプタマーと、洗浄剤と、及び緩衝剤成分などとを含んでよい。本発明に従って使用されるアプタマーは、短い１本鎖ＤＮＡ−又はＲＮＡ−オリゴヌクレオチド（２５〜７０塩基）であり、これは３Ｄ構造（例えば、Ｃ．Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｌ．ＧＯｌｄ：指数的増殖によるリガンドの体系的進化：バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌｕｍｅ  ２４９，１９９０，ｐ．５０５−５１０）を介して特異的分子（すなわち、タンパク質、ＺＯ５  ＤＮＡポリメラーゼ）に結合する。
【００８９】
特に適しているのは、ポリＮ配列が、２〜１０ヌクレオチドの長さである、ポリＡ、ポリＴ、ポリＡＴ、ポリＵ、ポリＣ、ポリＧ配列を含むキットである。ポリＮ配列は、５’末端で少なくとも１種のプライマーに結合されてもよく、２種又はそれ以上の５’末端と伸長プライマーが使用される場合、ポリＮ配列は同じであるかまたは異なってもよい。本発明の具体的な態様は、５’末端で同じポリＮ配列を含むプライマーを使用することである。特に４〜６個の連続アデニン（Ａ）塩基を含むポリＮ配列が本発明で使用される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】非伸長参照プライマーの結果：６０及び３０〜６０ＰＣＲサイクル後の高陽性対照（ＨＰＣ）についてのＰＣＲ反応物中の高分子量生成物（ＨＭＷＰ、重合アンプリコン、４％アガロースゲルへの移動がほとんど又は全く無い）の生成；アガロースゲル分析は、６０サイクル後の１２重測定のＨＰＣ、又は３０、４０、５０、及び６０サイクル後の３重測定物を分析するＰＣＲ反応で行なわれた；使用したプライマー：配列番号１と２（４％アガロースゲル）。
【図２】２個のＧを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中の大きく低下したＨＭＷＰ；使用したプライマー：配列番号１３と１４、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図３】４個のＴを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中の大きく低下したＨＭＷＰ；使用したプライマー：配列番号３と１０、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図４】４個のＡを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの欠如；使用したプライマー：配列番号３と４、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図５】６個のＡを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの欠如；使用したプライマー：配列番号５と６、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図５−２】６個のＡを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの欠如；使用したプライマー：配列番号５と６、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図６】８個のＡを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの欠如（しかし、わずかなプライマーダイマーの生成）；使用したプライマー：配列番号７と８、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図７】２個のＡＴを有する５’伸長プライマーについての結果：３０、４０、５０、及び６０サイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの欠如；使用したプライマー：配列番号１５と１６、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【図８】３又は４個の異なる塩基を有する５’末端（いわゆる、混合オーバーハング変種、例えばＧＡＣＴＴＡ及びＣＴＣＴＡＡ）で伸長されたプライマーについての結果：５０〜６０ＰＣＲサイクル後の高陽性対照についてのＰＣＲ反応物中のＨＭＷＰの中程度の生成；３０、４０、５０、及び６０サイクル後のＰＣＲ反応物について、アガロースゲル分析が行われた；使用したプライマー：配列番号１７と１８、それぞれ３’末端でｔｅｒｔ−ブチルベンジル（ｔＢｕ−Ｂｎ）で修飾されている（４％アガロースゲル）。
【実施例】
【００９１】
すべての実験は、同等の実験条件下で行われた（すなわち、同じマスターミックス組成物、同じプライマー濃度、同じ試料調製プロフィール、同じ熱サイクリングプロフィールが使用され、ゲル当たり同じ量のアンプリコンが分析された）。従って実験は以下のように行なわれた：マスターミックス中で、参照プライマーは本発明の修飾プライマーにより置換された。図中で特に明記しない場合は、ＨＰＣは一般に５重測定で試験され、ＰＣＲサイクルは３０、４０、５０、６０サイクル後に停止された；増幅生成物は４％アガロースゲルで分析された。
【実施例１】
【００９２】
試料材料：
実験に使用されたＨＰＣ（高陽性対照）は、陰性ヒト血漿中に外装（aremored）ＨＣＶ  ＲＮＡ材料を含む約５Ｅ＋０６ＩＵ／ｍＬの高力価試料から構成された。外装ＲＮＡは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ベンダー、すなわちＡｍｂｉｏｎ）に封入された標的領域の非感染性のインビトロ転写されたＨＣＶ  ＲＮＡからなり、ＨＣＶプライマーとプローブ結合領域とを含む。このヒト血漿は、ＨＣＶ  ＲＮＡ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ、及びＨＢＶ  ＤＮＡに対して非反応性である。高力価のＨＣＶ陽性患者試料が使用された場合、同様の結果が得られる。
【００９３】
核酸抽出
１反応当たり、核酸抽出のために１ｍＬの試料材料が使用された。一般に、図で特に明記しない場合は、実験条件について５重の試料材料が試験された。核酸抽出法は最新であり、当業者に公知である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第２版、１９８９，Ｐａｒｔ  １−３，「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照］。あるいは市販の核酸抽出キット、すなわち高純粋ウイルス核酸キット（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）又はＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ総核酸単離キット（Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＴＮＡＩ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することができる。
【００９４】
ここに記載した実験において、核酸抽出はＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ総核酸単離キット（Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＴＮＡＩ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に基づいた。試料調製試薬は、磁性ガラス粒子懸濁物、溶解試薬、プロテアーゼ試薬、溶出緩衝剤、及び洗浄試薬から構成される。核酸抽出の前に、定量標準ＲＮＡが試料に加えられた。外装ＨＣＶ粒子と定量標準ＲＮＡ外装粒子は、プロテアーゼと、核酸を放出し放出されたＨＣＶ  ＲＮＡを血清又は血漿中のＲＮＡａｓｅから防御するカオトロピック溶解／結合緩衝液とともにインキュベートすることにより溶解される。次にＨＣＶ  ＲＮＡと定量標準ＲＮＡは、磁性ガラス粒子に結合される。塩、タンパク質、及び他の細胞不純物のような非結合物質は、磁性粒子を洗浄することにより除去される。吸着された核酸は、高温で水性緩衝液を用いて溶出される。
【００９５】
ＰＣＲ反応混合物
マスターミックス中で、参照プライマーは、本発明の修飾プライマーにより置換された。フォワードプライマー及びリバースプライマーの無いマスターミックスが、大きなバッチで調製された。各実験について、この不完全なマスターミックスは、図１〜８に特定された伸長プライマー又は参照プライマーで補足された。
【表１】
2014083053.tif 000003
【００９６】
溶出液を含む５０μｌの核酸が、ＰＣＲチューブ中の３５μｌのマスターミックスと１８ｍＭ酢酸マンガン１５μｌとに加えられ、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）４８アナライザーにのせられた。
【００９７】
ＰＣＲ反応
【表２】
2014083053.tif 000004
【００９８】
アガロースゲル分析
アガロースゲル分析は、当業者に公知により行われた［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第２版、１９８９，Ｐａｒｔ  １−３，「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照］。５μｌのアンプリコンが、５μｌのアガロースゲルローディング緩衝液と混合され、４％アガロースゲルに適用された。ＤＮＡは、臭化エチジウム染色後にＵＶ下で視覚化された。得られた写真は、以下の図１〜８に示される。
【実施例２】
【００９９】
提示された結果はまた、以下の操作により達成される：高陽性キット対照からＨＣＶ  ＲＮＡを抽出するために、市販のアッセイ、例えばＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶ  Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）が使用される。試料調製は、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ装置を使用して自動化され、増幅／検出は例えばＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アナライザー又はＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）４８アナライザーを使用して自動化される。試験は３つの主要なプロセスに基づく：（１）ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ装置上の２次チューブ中に提供されるヒトＥＤＴＡ血漿又は血清と対照からＲＮＡを単離するための試料調製；（２）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するための、標的ＲＮＡと定量標準物質／内部対照ＲＮＡの逆転写、及び（３）標的ＤＮＡと定量標準物質／内部対照ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅と、標的及び定量標準物質／内部対照に対して特異的な二重標識検出プローブの切断による、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アナライザー上の生成されたアンプリコンの同時検出。
【０１００】
試料調製試薬は、磁性ガラス粒子懸濁物、溶解試薬、プロテアーゼ試薬、溶出緩衝液、及び洗浄試薬から構成される。ＨＣＶ粒子と定量標準／内部対照粒子粒子は、プロテアーゼと、核酸を放出し放出されたＨＣＶ  ＲＮＡを血清又は血漿中のＲＮＡａｓｅから防御するカオトロピック溶解／結合緩衝液とともにインキュベートすることにより溶解される。次にＨＣＶ  ＲＮＡと定量標準ＲＮＡは、磁性ガラス粒子に結合される。塩、タンパク質、及び他の細胞不純物のような非結合物質は、磁性粒子を洗浄することにより除去される。吸着された核酸は、高温で水性緩衝液を用いて溶出される。試料又は対照溶出液はマスターミックスに加えられ、増幅と検出のためにＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎアナライザー（登録商標）又はＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）４８アナライザーに移される。
【０１０１】
ここに示した実験のために、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶ  Ｔｅｓｔマスターミックスは、下記の情報に従って伸長プライマーを用いて修飾され、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ装置上で修飾マスターミックスを有する試薬カセットが使用される。マスターミックスは、ＨＣＶ  ＲＮＡと定量標準／内部対照ＲＮＡとの両方に特異的なプライマーとプローブ対を含有する。プライマー結合部位は、ＨＣＶ標的と定量標準／内部対照とにより共有される。プライマーと標的プローブは、ＨＣＶゲノムの５非翻訳領域の高度に保存された部分に位置している。ＨＣＶ標的と定量標準物質の検出は、標的特異的かつ定量標準物質特異的二重標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して行われ、このプローブは、ＨＣＶ標的アンプリコンとＨＣＶ定量標準物質アンプリコンの独立した同定を可能にする。ＨＣＶ定量標準物質は、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐにより既知のコピー数で各試料に自動的に添加され、ＨＣＶ標的とともに、試料調製、逆転写、増幅、及び検出工程の全工程を通して行われる。力価測定を可能にするには、定量標準物質は、ＨＣＶ標的陰性及び陽性試料で陽性のシグナルを与えなければならない。部分的に抑制又は阻害された反応では、定量標準物質は標的と同様に影響を受け、従って正しい力価測定を可能にする。最後に、定量標準物質は、阻害作用についてＨＣＶ標的陰性反応物をモニターするが、その比較的高濃度のために、モニタリングは厳密ではない。
【表３】
2014083053.tif 000005
【０１０２】
フォワードプライマーとリバースプライマーの無いマスターミックスは、大きなバッチで調製される。各実験について、この不完全なマスターミックスは、グラフに示されるように伸長プライマーで補足される。これらの補足されたマスターミックス変種は、試薬カセット中に充填され、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐにのせられる。
【０１０３】
ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶ  ＴｅｓｔキットのＨＰＣは、試料として試験される。抽出及び増幅／検出の自動化プロセスは、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）上で開始される。必要に応じてＰＣＲは、３０、４０、５０、又は６０サイクル後に停止され、５μｌの増幅生成物が４％アガロースゲル上で分析される。
【図１】
2014083053.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
2014083053.tif 000013
【図８】
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【配列表】
2014083053000001.app
【外国語明細書】
2014083053000001.pdf