(57)【要約】【課題】高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく、細胞を穿孔して効率良く標的物質を導入できるようにする。【解決手段】標的物質の導入方法は、基板の細胞接着スポット１１２に標的物質１３１及び細胞１４１を固定する工程と、細胞１４１の外縁部で、細胞接着スポット１２２側の位置にパルスレーザ光を照射することにより、細胞接着スポット１２２に固定された標的物質１３１を細胞に導入する工程とを備えている。【選択図】図４
2014180254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の細胞接着スポットに標的物質及び細胞を固定する工程と、
前記細胞の外縁部で、前記細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光を照射することにより、前記細胞接着スポットに固定された標的物質を前記細胞に導入する工程とを備えている、標的物質導入方法。
【請求項２】
前記パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下である、請求項１に記載の標的物質導入方法。
【請求項３】
前記標的物質は、表面に第１の認識物質を有するマイクロセルに担持されており、
前記第１の認識物質を認識する第２の認識物質が、前記細胞接着スポットに固定されている、請求項１又は２に記載の標的物質導入方法。
【請求項４】
前記マイクロセルは、光ピンセットを用いて前記細胞接着スポットに固定する、請求項３に記載の標的物質導入方法。
【請求項５】
前記ナノ秒パルスレーザ光は、前記細胞の外縁部に沿って位置を移動しながら複数回照射する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。
【請求項６】
前記細胞接着スポットには、第１の温度領域において細胞接着性の状態となり、第２の温度領域において細胞非接着性の状態となる温度応答性ポリマーが固定されており、
前記細胞の前記細胞接着スポットへの固定は、前記第１の温度領域において行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。
【請求項７】
前記基板は、複数の前記細胞接着スポットを有し、
前記パルスレーザ光の照射は、複数の前記細胞接着スポットのそれぞれに対して順次行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。
【請求項８】
前記パルスレーザ光を照射する工程よりも前に、前記細胞接着スポットに固定された細胞の画像データを画像処理部に取り込む工程及び取り込んだ画像データを処理して前記パルスレーザ光の照射位置を決定する工程をさらに備えている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。
【請求項９】
細胞接着スポットに標的物質及び細胞が固定された基板を載置するステージと、
前記細胞接着スポットの光学像を取得する観察用光学系と、
パルスレーザ光源と、
前記パルスレーザ光源から出射されたパルスレーザ光を、前記細胞に照射する照射用光学系と、
前記光学像を画像処理し、前記細胞接着スポットに固定された細胞の形状を認識し、前記細胞の外縁部で、前記細胞接着スポット側の位置に前記パルスレーザ光が照射されるように、前記照射用光学系及び前記ステージを駆動する制御部とを備えている、標的物質導入装置。
【請求項１０】
前記パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下である、請求項９に記載の標的物質導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的物質導入方法及び標的物質導入装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に遺伝子をはじめとする標的物質を導入する方法として、トランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法等が知られている。トランスフェクション法、エレクトロポーレーション法等においては、標的物質の導入は確率に従い、ある特定の細胞のみを狙って標的物質を導入することは不可能である。マイクロインジェクション法は、ある特定の細胞のみを狙って標的物質を導入することができるが、大量処理は困難である。また、細胞にキャピラリーを挿入するため、細胞に大きなダメージを与えるという問題がある。
【０００３】
細胞に標的物質を導入する他の方法として、レーザ光を用いる方法がある。例えば、フェムト秒パルスレーザ光を用いて細胞膜に細孔を形成し、細孔から標的物質を導入する方法が検討されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】A. Yamaguchi, et al. "Nanoparticleinjection to single animal cells using femtosecond laser-induced impulsiveforce" Appl. Phys. A, 93巻, p39-43, 2008年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このようなパルスレーザ光を用いる標的物質の導入法は、フェムト秒パルスレーザ光を用いており、高価な装置を必要とする。また、穿孔した細胞内に標的物質が取り込まれるかどうかは、液相中の標的物質の濃度に依存する。しかし、液相中の標的物質の濃度には、分散・溶解性という観点からも、経済的な観点からも制約がある。このため、標的物質が細胞に導入される割合は通常１％未満である。フェムト秒パルスレーザ光により穿孔した後、キャピラリーを用いて標的物質を細胞内に直接インジェクションする方法も考えられるが、この場合には大量の細胞を処理することは困難である。
【０００６】
本発明の課題は、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく細胞を穿孔し、穿孔した細胞に効率良く標的物質を導入できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
標的物質導入方法の一態様は、基板の細胞接着スポットに標的物質及び細胞を固定する工程と、細胞の外縁部で、細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光を照射することにより、細胞接着スポットに固定された標的物質を細胞に導入する工程とを備えている。
【０００８】
標的物質導入方法の一態様において、パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下としてもよい。
【０００９】
標的物質導入方法の一態様において、標的物質は、表面に第１の認識物質を有するマイクロセルに担持されており、第１の認識物質を認識する第２の認識物質が、細胞接着スポットに固定されていてもよい。
【００１０】
標的物質導入方法の一態様において、マイクロセルは、光ピンセットを用いて細胞接着スポットに固定してもよい。
【００１１】
標的物質導入方法の一態様において、ナノ秒パルスレーザ光は、細胞の外縁部に沿って位置を移動しながら複数回照射してもよい。
【００１２】
標的物質導入方法の一態様において、細胞接着スポットには、第１の温度領域において細胞接着性の状態となり、第２の温度領域において細胞非接着性の状態となる温度応答性ポリマーが固定されており、細胞の細胞接着スポットへの固定は、第１の温度領域において行ってもよい。
【００１３】
標的物質導入方法の一態様において、基板は、複数の細胞接着スポットを有し、パルスレーザ光の照射は、複数の細胞接着スポットのそれぞれに対して順次行ってもよい。
【００１４】
標的物質導入方法の一態様は、パルスレーザ光を照射する工程よりも前に、細胞接着スポットに固定された細胞の画像データを画像処理部に取り込む工程及び取り込んだ画像データを処理してパルスレーザ光の照射位置を決定する工程をさらに備えていてもよい。
【００１５】
標的物質導入装置の一態様は、細胞接着スポットに標的物質及び細胞が固定された基板を載置するステージと、細胞接着スポットの光学像を取得する観察用光学系と、パルスレーザ光源と、パルスレーザ光源から出射されたパルスレーザ光を、細胞に照射する照射用光学系と、光学像を画像処理し、細胞接着スポットに固定された細胞の形状を認識し、細胞の外縁部で、細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光が照射されるように、照射用光学系及びステージを駆動する制御部とを備えている。
【００１６】
標的物質導入装置の一態様において、パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下としてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る標的物質導入方法によれば、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく細胞を穿孔し、穿孔した細胞に効率良く標的物質を導入できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】標的物質導入方法の一工程を示す断面図である。
【図２】標的物質導入方法の一工程を示す断面図である。
【図３】標的物質導入方法の一工程を示す断面図である。
【図４】標的物質導入方法の一工程を示す断面図である。
【図５】標的物質導装置の一例を示すブロック図である。
【図６】レーザ光照射による膜の穿孔例を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本実施形態の標的物質導入方法は、基板の細胞接着スポットに標的物質及び細胞を固定し、細胞接着スポットに固定された細胞の外縁部に、パルスレーザ光を照射する。これにより、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いなくても、核に大きなダメージを与えることなく細胞を穿孔できる。また、標的物質も細胞接着スポットに固定されているため、高効率で標的物質を細胞に導入できる。
【００２０】
図１〜図４は、本実施形態の標的物質導入方法を工程順に示している。まず、図１に示すような処理基板１０１を準備する。処理基板１０１は、基材１１１の表面に設けられた細胞接着スポット１１２を有している。図１において細胞接着スポット１１２は、基材１１１の上に堆積されたスポット形成材料１１３に設けられた開口部である。細胞接着スポット１１２の表面には、温度により細胞接着性の状態と、細胞非接着性の状態とをスイッチできる温度応答性ポリマー１２１と、抗体１２２とが固定されている。処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分には、細胞非接着性ポリマー１２５が固定されており、細胞非接着面となっている。
【００２１】
次に、図２に示すように、細胞接着スポット１１２に、標的物質である遺伝子を担持したマイクロセル１３１を固定する。マイクロセル１３１の表面には抗体１２２が特異的に認識する抗原が存在しており、マイクロセル１３１を細胞接着スポット１１２に容易に固定することができる。
【００２２】
次に、図３に示すように、マイクロセル１３１が固定された細胞接着スポット１１２に、細胞１４１を固定する。細胞１４１の固定は、温度応答性ポリマー１２１が細胞接着性の状態となる温度領域で行えばよい。次に、図４に示すように細胞接着スポット１１２に固定された細胞１４１にパルスレーザ光１５１を照射して細胞膜に細孔を形成する。これにより、細胞接着スポット１１２に固定されたマイクロセル１３１が細胞１４１に取り込まれる。
【００２３】
この後、必要に応じて培養等を行った後、温度応答性ポリマー１２１が細胞非接着性の状態となる温度領域とすることにより、標的物質を導入した細胞１４１を細胞接着スポット１１２から遊離させて回収する。
【００２４】
以下に、本実施形態の標的物質導入法に用いる処理基板１０１の構成について説明する。基材１１１の材質は特に限定されず、ガラス基板、シリコン基板、ダイヤモンド様カーボン基板、若しくはセラミクス基板等の無機性基板、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、若しくは金・チタン・クロム等の金属性基板、又は樹脂基板等の有機性基板等を用いることができる。中でも、ガラス等の透明な材料は、光学顕微鏡による観察が容易に行えるため好ましい。
【００２５】
細胞接着スポット１１２を形成するためのスポット形成材料１１３は、特に限定されないが、堆積及び加工が容易で、細胞に対する毒性が小さい材料が好ましい。例えば、金、若しくはクロムとチタンとの合金等の金属、ダイヤモンド様カーボン、又は樹脂等を用いることができる。なお、スポット形成材料１１３は、基材１１１と同じであってもよい。また、スポット形成材料１１３は積層材料であってもよい。
【００２６】
図１において、細胞接着スポット１１２は、基材１１１を露出する開口部であるが、処理基板１０１の他の部分よりもへこんでいれば、基材１１１が露出している必要はない。また、スポット形成材料１１３を堆積して凹部を形成するのではなく、基材１１１をエッチングして形成した凹部を細胞接着スポット１１２としてもよい。細胞接着スポット１１２は凹部ではなく、処理基板１０１の他の部分よりも突出した凸部としてもよい。細胞接着スポット１１２を凹部又は凸部とすることにより、細胞接着スポット１１２の位置を明確にすることができるが、細胞接着スポット１１２は処理基板１０１の他の部分と同じ平面に存在していてもよい。
【００２７】
細胞接着スポット１１２は、取り扱う細胞の大きさにもよるが、直径ｄを２０μｍ〜５００μｍ程度とすればよい。また、細胞接着スポット１１２同士の中心間の間隔ｐは直径ｄに応じて決めればよいが、３０μｍ〜５００μｍ程度のマトリックス状に配置すればよい。細胞接着スポット１１２が凹部の場合には、深さは数ｎｍから数十μｍとすることが好ましい。細胞接着スポット１１２が凸部の場合には、高さは数ｎｍから数μｍとすることが好ましい。
【００２８】
細胞接着スポット１１２を含む処理基板１０１の表面は平滑であってもよいが、周期が１μｍ〜５μｍ程度で、高さが１μｍ程度の周期的な凹凸構造を有していてもよい。処理基板１０１の表面に周期的な凹凸構造を設けることにより、細胞への標的物資の導入効率をさらに高めることができる。凹凸構造はどのようなものであってもよいが、例えば、円錐状、角錐状、円錐台状、角錐台状、円筒状又は角筒状等の凸部又は凹部とすることができる。これらの凸部又は凹部の表面にさらに周期的な凸部又は凹部が設けられた形状であってもよい。凹凸構造の形状、周期及び高さ等は特に限定されないが、周期が１μｍ以上、５μｍ以下程度で、高さが１μｍ以下程度の周期的な凹凸構造は、リソグラフィーを用いて容易に形成することができ好ましい。
【００２９】
凹凸構造は、細胞接着スポット１１２を含む処理基板１０１の全面に形成してもよく、選択的に形成してもよい。例えば、細胞接着スポット１１２である凹部又は凸部にのみ形成してもよく、細細胞接着スポット１１２以外の部分にのみ形成してもよい。
【００３０】
温度応答性ポリマー１２１は、細胞接着性のタンパク質及びペプチド等を補助物質として細胞を接着させる足場を形成でき、温度変化によって接着した細胞が表面から遊離する性質を有している。細胞の温度応答性ポリマーからの遊離は、温度変化によるポリマー鎖の媒体への溶解性の変化、ポリマー表面の親水性と疎水性との間の変化又はポリマー表面のイオン状態の変化等により引き起こすことができる。従って、これらの少なくとも１つの変化が生じるポリマーを温度応答性ポリマーとして用いることができる。細胞が温度応答性ポリマーから遊離する際に、タンパク質及びペプチド等の細胞接着の補助物質が共に遊離してもよく、補助物質が遊離しなくてもよく、補助物質の遊離が別のタイミングで生じてもよい。
【００３１】
例えば、高温において疎水性となり相分離し、低温において溶解する、いわゆる下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマーを用いることができる。ＬＣＳＴを示す温度応答性ポリマーの例としては、ポリ（Ｎ−置換アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−置換メタクリルアミド）、ポリエーテル類及びメチルセルロース等がある。また、低温において疎水性となり相分離し、高温において溶解する、いわゆる上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を示すポリマーを用いることもできる。ＵＣＳＴを示す温度応答性ポリマーの例としては、双極性高分子であるスルホベタインポリマー等がある。目的に応じてどちらのタイプの温度応答性ポリマーを用いてもよい。
【００３２】
温度応答性ポリマー１２１の細胞接着スポット１１２への固定はどのようにして行ってもよい。細胞接着スポット１１２がガラス又はシリコン等からなる場合には、例えばシリコンと反応するシランカップリング剤等を用いて固定すればよい。具体的には、末端にアミノ基又はカルボキシル基等を有する温度応答性ポリマー１２１を重合した後、温度応答性ポリマー１２１の末端をアルコキシルシラン等により修飾し、修飾した温度応答性ポリマー１２１を細胞接着スポット１１２と反応させればよい。また、細胞接着スポット１１２に予めω−アミノプロピルテトラアルコキシシラン等のシランカップリング剤をリンカーとして導入した後、導入したリンカーと温度応答性ポリマー１２１とを反応させることにより、温度応答性ポリマー１２１を固定してもよい。
【００３３】
さらに、シランカップリング剤を介在させて重合開始剤を、処理基板１０１の露出部分に導入した後、導入した重合開始剤を用いて温度応答性ポリマー１０３を重合してもよい。具体的には、まずリンカーとして３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を、細胞接着スポット１１２に導入する。この後、４，４’−アゾビス（２−シアノ吉草酸）クロライド等の酸クロライド基を有する重合開始剤をシランカップリング剤のアミノ基と反応させ、重合開始剤をカップリングする。カップリングされた重合開始剤によりＮ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性を発現するモノマーを重合して温度応答性ポリマー１２１を形成すればよい。リンカーのアミノ基と重合開始剤のカルボキシル基とを反応させる例を示したが、これに限らずどのようにしてリンカーと重合開始剤とを結合させてもよい。
【００３４】
シリコンと反応する部位を有する（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン又は２−フェニル−２−[（２，２，６，６−テトラメチルピペリジノ）オキシ]オクチルトリエトキシシラン等を用いれば、リンカーを用いることなく重合開始剤を細胞接着スポット１１２に導入できる。この場合には、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法等により温度応答性ポリマー１２１を形成すればよい。なお、ＡＴＲＰ法に限らず熱重合法、光重合法又は付加開裂移動型（ＲＡＦＴ）重合法等のどのような重合方法を用いてポリマーの重合を行ってもよい。さらに、導入する開始剤を適宜選択することによりアニオン重合又はカチオン重合を用いてもよい。
【００３５】
さらに、温度応答性ポリマー１２１は共有結合により細胞接着スポット１１２に固定されている必要はなく、アミノ基とカルボキシル基との間等に生じるイオン結合により固定されていたり、疎水結合等により固定されていたりしてもよい。また、細胞を遊離させる際に温度応答性ポリマー１２１も細胞接着スポット１１２から剥離する構成としてもよい。
【００３６】
なお、細胞接着スポット１１２に温度応答性ポリマー１２１を固定することにより、標的物質を導入した細胞の回収が容易となるが、細胞接着スポット１１２の表面に温度応答性ポリマー１２１が固定されている必要はない。単純に疎水性の表面としたり、細胞接着性のタンパク質を固定したりしてもよい。また、細胞の表面に特異的に存在する物質の認識物質を固定してもよい。例えば、細胞の表面抗原を認識する抗体を固定してもよい。
【００３７】
細胞非接着性ポリマー１２５は、基材１１１及びスポット形成材料１１３よりも細胞との相互作用が小さく、細胞の非特異的な接着が少ない材料であればどのような材料であってもよい。一般的に細胞は親水性の表面には接着しにくいため、細胞非接着性ポリマー１２５は、基材１１１及びスポット形成材料１１３よりも親水性が高いポリマーが好ましい。例えば、ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等の合成リン脂質系ポリマー、ポリ２−エトキシアクリレート又はポリエチレングリコール等とすればよい。合成リン脂質系ポリマーは、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−（メタ）アクリロイルオキシエチルイソシアネートとの共重合体等であってもよい。ポリエチレングリコールは、ポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール又はポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコールアルキルエステル等とすればよい。
【００３８】
また、ポリビニルアルコールと、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸の水溶性塩、ポリアクリル酸の水溶性塩、ポリグルタミン酸の水溶性塩及びポリビニルピロリドン等のうちの少なくとも１つとからなる混合高分子の含水ゲル成型物等を用いてもよい。ポリ（ＭＰＣ）等の双性構造イオンのポリマー、ポリ（Ｏ−メタクリロイル−Ｌ−セリン）等の両性イオン構造のポリマー並びにポリアクリル酸及びポリエチレンイミン等のポリイオンコンプレックスを用いてもよい。さらに、これらのポリマーセグメントに、ランダム、ブロック又はグラフト状に他の共重合セグメントが含まれている構成としてもよい。合成ポリマーに限らず細胞非接着性のタンパク質等の天然高分子を用いてもよい。細胞非接着性のタンパク質としては、例えばアルブミンを用いることができる。また、親水性にするのではなく、含フッ素ポリマー等を用いて高撥水性の表面とすることにより細胞非接着性を実現してもよい。この他、細胞又は微生物等を細胞接着スポット１１２以外の部分に吸着させることにより、細胞接着スポット１１２以外の部分をターゲット細胞が吸着しにくい表面としてもよい。
【００３９】
細胞非接着性ポリマー１２５の固定は、温度応答性ポリマー１２１の固定と同様に、リンカーを用いる方法、表面に導入した開始剤を用いて重合する方法等により行うことができる。また、イオン結合、又は疎水結合等により固定してもよい。
【００４０】
なお、処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分に細胞非接着性ポリマー１２５を固定することにより、細胞接着スポット１１２以外の部分へ細胞が接着しにくくできるが、必ずしも細胞非接着性ポリマー１２５を固定する必要はない。スポット形成材料をチタン合金又は酸化チタン等の細胞非接着性の材料としたり、界面活性剤等の低分子物質を利用したりして、処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分を細胞非接着性としてもよい。
【００４１】
細胞接着スポット１１２に固定する抗体１２２は、標的物質を担持したマイクロセル１３１の表面に存在する抗原を特異的に認識するものであればよい。細胞接着スポット１１２に抗体１２２を固定し、マイクロセル１３１の表面に抗原を設ける例を示したが、細胞接着スポット１１２に抗原を固定し、マイクロセル１３１の表面に抗体を設ける構成としてもよい。また、特異的な認識をする物質であれば同様に用いることができ抗原と抗体に代えて、糖とレクチン、リガンドとレセプター等の組み合わせとしてもよい。
【００４２】
抗体１２２の固定は、既知の方法により行えばよい。例えば、２官能性のリンカー等を用いて固定することができる。また、温度応答性ポリマー１２１に反応性の官能基を導入して、これを用いて抗体を固定してもよい。抗体以外の認識物質を用いる場合も同様にして固定することができる。
【００４３】
標的物質を担持したマイクロセル１３１は、標的物質を担持でき、細胞に取り込まれればどのような構成としてもよい。例えば、遺伝子等の標的物質を導入した細胞をマイクロセル化して形成すればよい（Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37等を参照）。また、リポソーム等を用いることもできる。マイクロセルは、表面に認識物質を有していることが好ましい。本明細書において認識物質とは、特定の対となる認識物質を認識するか、特定の対となる認識物質により認識され、特異的に結合する物質である。認識物質と対となる認識物質との例としては、抗原と抗体との組み合わせ、糖鎖とレクチンとの組み合わせ、各種のリガンドとレセプターとの組み合わせ等が挙げられる。マイクロセルの素材は磁性微粒子、高分子微粒子、ウイルスベクター、高分子ミセル、高分子微粒子、ナノゲル等を用いることができる。なお、標的物質は、マイクロセル１３１の内部に包摂されていても、表面に固定されていてもよい。
【００４４】
マイクロセル１３１の大きさは特に限定されないが、ターゲット固定結合部位への結合、及びターゲット細胞への取り込みの観点から、０．１μｍ〜５μｍ程度が好ましく、０．５μｍ〜３μｍ程度がより好ましい。マイクロセル１３１をこの程度の大きさとすることにより、レーザ光ピンセットによる操作が容易であるという利点も有している。レーザ光ピンセットを用いることにより、マイクロセル１３１を細胞接着スポット１１２に集め、確実に固定することが容易にできる。レーザ光ピンセットはどのような構成としてもよいが、６００ｎｍ〜１１００ｎｍ程度の波長のものがレーザ装置の取り扱いの容易さやマイクロカプセルに光エネルーギーによるダメージが少ないことから好ましい。
【００４５】
マイクロセル１３１は特異的に認識させて細胞接着スポット１１２に固定する必要はなく、イオン結合、又は疎水結合等により細胞接着スポット１１２に固定してもよい。また、マイクロセル１３１の表面に存在するアミノ基又はカルボキシル基等を用いて、細胞接着スポット１１２に共有結合させてもよい。
【００４６】
標的物質は、遺伝子に限らず、細胞１４１に何らかの機能導入できる物質であればよい。例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＤＮＡベクター、染色体、染色体断片、染色体ベクター等を用いることができる。この場合、数ｋｂのＤＮＡ断片から数Ｍｂの染色体断片、数十Ｍｂの染色体まで細胞に導入することができる。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であてもよい。また、タンパク質、ペプチド、又はウイルスベクター等であってもよい。
【００４７】
これらの標的物質は、マイクロセルに担持させるのではなく、細胞接着スポット１１２に直接固定してもよい。この場合、細胞接着スポット１１２には、標的物質を特異的に認識する抗体等の認識物質を固定すればよい。また、標的物質が、細胞接着スポット１１２に、イオン結合又は疎水結合するような構成としたり、標的物質に存在する官能基を用いて共有結合する構成としたりしてもよい。
【００４８】
細胞１４１は特に限定されない。血球系の細胞、間葉系細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ（人工多能性幹細胞）細胞等のいずれも用いることができる。
【００４９】
細胞１４１を穿孔するパルスレーザ光１５１は特に限定されないが、ナノ秒パルスレーザ光でよい。但し、パルス幅がさらに短いピコ秒パルスレーザ光又はフェムト秒パルスレーザ光を用いてもよい。本明細書において、ナノ秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｎ秒（１×１０-9秒）以上、１μ秒（１×１０-6秒）未満のパルスレーザ光であり、ピコ秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｐ秒（１×１０-12秒）以上、１ｎ秒（１×１０-9秒）未満のパルスレーザ光であり、フェムト秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｆ秒（１×１０-15秒）以上、１ｐ秒（１×１０-12秒）未満のパルスレーザ光である。特に、パルス幅が５×１０-11秒〜５×１０-7秒程度のものが好ましく、１×１０-10秒〜１×１０-7秒程度のものがより好ましく、１×１０-9秒〜×１×１０-8秒程度のものがさらに好ましい。
【００５０】
パルスレーザ光１５１の照射は、１点に１回の照射でもよいが、複数回照射してもよい。この場合、細胞１４１の外縁に沿って位置をずらしながら照射してもよい。複数回の照射をする場合には、細胞１４１への熱ダメージを抑えるために、ある程度の間隔をおいて照射することが好ましい。例えば、数ｍ秒から数百ｍ秒の間隔をおいて照射を行うことが好ましい。
【００５１】
パルスレーザ光１５１の波長は特に限定されないが、細胞膜の穿孔性という観点からは、波長がある程度短い方がよい。一方、核へのダメージを低減する観点から波長がある程度長い方が好ましい。但し、レーザ光のスポット径を小さくする観点からは波長が長すぎないことが好ましい。具体的には、３００ｎｍ〜６８０ｎｍ程度の波長範囲のレーザ光を用いることができる。例えば、紫外レーザを用いることができる。具体的には、波長が３３７ｎｍの窒素レーザ、３４９ｎｍのＮｄ（ネオジウム）：ＹＬＦ（イットリウム−リチウム−フロライド）レーザ、３５５ｎｍのＮｄ（ネオジウム）：ＹＡＧ（イットリウム−アルミニウム−ガーネット）レーザ等を用いることができる。また、紫外レーザ光に限らず、青紫色、青色、緑色、赤色等のレーザ光を用いることもできる。
【００５２】
パルスレーザ光１５１は、細胞接着スポット１１２に固定された細胞１４１の外縁部に集光して照射することが好ましい。このようにすれば、ナノ秒パルスレーザを用いても、細胞１４１の核はほとんどダメージを受けない。また、パルスレーザ光１５１は、細胞接着スポット１１２と細胞１４１との界面近傍に焦点を合わせて照射することが好ましい。細胞接着スポット１１２側の細胞膜の外表面に焦点を合わせることがより好ましい。パルスレーザ光１５１の照射は、長焦点の対物レンズの使用等により、観察用光学系３１１と同軸に又は切り替えて、処理基板１０１の上部から照射してもよい。しかし、細胞接着スポット１１２と細胞１４１との界面がある処理基板１０１側から照射することにより、核へのダメージをより小さくすることができる。
【００５３】
パルスレーザ光１５１のスポット径は、融合効率を高くするためには、小さくすることが好ましい。波長が３４９ｎｍ程度の場合には、２μｍ以下としてよく、１μｍ程度又はそれ以下にまで集光してもよい。但し、集光による細胞へのダメージを避けるという観点からは、細胞全体を照射する程度までパルスレーザ光１５１のスポット径を広げることも可能である。細胞全体を照射する程度までパルスレーザ光１５１のスポット径を広げることにより、レーザ光の集中による細胞へのダメージを抑えることができる。この場合にも、細胞１４１に標的物質を導入することが可能である。
【００５４】
パルスレーザ光の出力は、照射により細胞が破壊されない強さに設定する。パルスレーザ光のスポット径を１μｍ〜２μｍ程度に集光する場合には、パルスレーザ装置の出力（パルスエネルギー）を２９μＪ以下とすればよく、１５μＪ以下としてもよく、６μＪ以下としてもよい。細胞を短時間で確実に穿孔するためには、パルスエネルギーをある程度高くすることが好ましいが、パルスエネルギーが低い場合には照射するパルス数を増やせばよい。
【００５５】
図５に示すように、観察用光学系３１１とカメラ３１２を有する顕微鏡３０１と、パルスレーザ光源３０２と、制御部３０３とを組み合わせた自動導入装置３００を用いることにより、標的物質の導入を自動化することができる。
【００５６】
以下に、本実施形態の自動導入装置３００の動作を説明する。細胞接着スポットにマイクロセルと細胞とが固定された処理基板１０１をチャンバー３１３内にセットする。まず、ステージ３１４を駆動して、最初の細胞接着スポットについて光学像をデータとして制御部３０３に取り込む。細胞接着スポットに細胞が固定されていない場合には、スキップして次の細胞接着スポットに移動する。細胞接着スポットに細胞が固定されている場合には、画像処理により細胞接着スポットにおける細胞の外縁部の位置を把握し、レーザ光のＸ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向（焦点深さ）の照射位置を決定する。次に、ステージ３１４及び照射用光学系３２１を駆動して、レーザ光の焦点位置を決定した位置に合わせ、パルスレーザ光源３０２を駆動して、パルスレーザ光１５１を照射する。パルスレーザ光１５１の照射位置は、照射用光学系３２１を駆動することにより細胞の外縁に沿って移動させることができる。次に、ステージ３１４を駆動して、次の細胞接着スポットに移動し同様の操作を行う。
【００５７】
細胞接着スポット内におけるパルスレーザ光の照射位置の調整は、例えばミラーを用いたシステムにより行うことができる。
【００５８】
なお、基板へのマイクロセルの固定操作、細胞の固定操作等も行えるように、レーザ光ピンセット、細胞の供給部等を設けてもよい。また、導入操作後の細胞の培養、細胞の基板からの剥離等も行えるように、細胞の回収機構等を設けてもよい。
【００５９】
以下において、パルスレーザ光の強度について検討した結果を示す。ガラス基板の表面にＵ９３７細胞を吸着させて、ガラス基板側から、波長３４９ｎｍで１０００Ｈｚのパルスレーザ光をＵ９３７細胞に照射した。パルスレーザ装置（spectra-physics社製：EXPL-349-60-EK1-W）からのパルスレーザ光をスポット径が約２μｍとなるように集光し、１パルスの照射を行った。パルスレーザ光のパルスエネルギーが３０μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が３．０Ａ）の場合には、細胞の破壊が生じた。パルスエネルギーが１６．５μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が２．５Ａ）の場合には、細胞の破壊が生じる場合と、生じない場合が認められた。パルスエネルギーが６μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が２．０Ａ）の場合には細胞の破壊は認められなかった。
【００６０】
次に、パルスレーザ光の焦点の精度について検討した結果を示す。厚さが０．２１ｍｍのガラス基板の表面に、ローダミンを含む水不溶性のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）樹脂層を形成した。ＰＩＣ樹脂層は、ローダミンを含むポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）水溶液を、バーコーターを用いてロール塗装した後、１４５℃で３分間焼き付けた後、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５０００）水溶液を、同様にしてロール塗装し、１４５℃で３分間焼き付けることにより形成した。走査型プローブ顕微鏡測定から求めた、得られたＰＩＣ樹脂層の厚さは１μｍであり、３０μｍ×３０μｍの領域における高低差は３０ｎｍ以下であった。
【００６１】
得られたＰＩＣ樹脂層を疑似細胞膜として、図５に示す装置により、ＸＹステージを走査しながら、４ｎｓのパルスレーザ光を１パルスずつ照射した。パルスレーザ光の波長は３４９ｎｍとし、レーザ光のパルスエネルギーは３０μＪとし、レーザ光径は約１μｍとした。図６に示すように、Ｚ軸方向の位置決め精度が高く、ＰＩＣ樹脂層とガラス基板との界面（焦点高さ±０）及びＰＩＣ樹脂層側に＋０．５μｍ及び＋１．０μｍの位置に焦点を合わせた場合には、ＰＩＣ樹脂膜に径が約１μｍの開口部を形成できた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係る、標的物質導入方法は、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく、細胞を穿孔して効率良く標的物質を導入でき、細胞への遺伝子の導入等に有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１０１      処理基板
１０３      温度応答性ポリマー
１１１      基材
１１２      細胞接着スポット
１１３      スポット形成材料
１２１      温度応答性ポリマー
１２２      抗体
１２５      細胞非接着性ポリマー
１３１      マイクロセル
１４１      細胞
１５１      パルスレーザ光
３００      自動導入装置
３０１      顕微鏡
３０２      パルスレーザ光源
３０３      制御部
３１１      観察用光学系
３１２      カメラ
３１３      チャンバー
３１４      ステージ
３２１      照射用光学系
【図１】
2014180254.tif 000003
【図２】
2014180254.tif 000004
【図３】
2014180254.tif 000005
【図４】
2014180254.tif 000006
【図５】
2014180254.tif 000007
【図６】
2014180254.tif 000008