(57)【要約】【課題】二段階の反応が必要な検出を、高感度かつ簡便に行うことができ、必要に応じて自動化も可能な二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法を提供する。【解決手段】内部に第一試薬が固定された第一容器１０に試料液を導入して第一試薬と反応させる工程と、吸引吐出手段３０Ａにより、記第一試薬と反応後の試料液の一部を一定量、内部に第二試薬が固定された第二容器２０内に吸引した後、第一容器１０に戻し、前記試料液を第二試薬と反応させる工程と、第一容器１０内に戻され、前記第二試薬と反応後の試料液を、光学測定手段により光学的に測定する工程を順次行う測定システム。【選択図】図２
2014183765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、および
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引後、再度第一容器に戻す吸引吐出手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引吐出手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定されていることを特徴とする二段反応システム。
【請求項２】
上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、および
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引する吸引手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定されていることを特徴とする二段反応システム。
【請求項３】
上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引後、再度第一容器に戻す吸引吐出手段、および
前記第一容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引吐出手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定され、
前記第一容器に導入された試料と前記第一試薬とを反応させる工程と、
前記吸引吐出手段により、前記第一試薬と反応後の試料液を、前記第一容器に残存する試料液の液面が前記第二容器の下端側の開口を下回らない範囲で前記第二容器内に吸引した後、前記第一容器に戻し、前記第二試薬を、前記第一試薬と反応後の試料液と反応させる工程と、
前記第一容器内に戻され、前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の測定システム。
【請求項４】
上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引する吸引手段、および
前記第二容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定され、
前記第一容器に導入された試料と前記第一試薬とを反応させる工程と、
前記吸引手段により、前記第一試薬と反応後の試料液を、前記第一容器に残存する試料液の液面が前記第二容器の下端側の開口を下回らない範囲で前記第二容器内に吸引し、前記第二試薬を吸引した試料液と反応させる工程と、
前記第二容器内の前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の測定システム。
【請求項５】
内部に第一試薬が固定された第一容器に試料液を導入し、前記第一試薬と反応させる工程と、
前記第一試薬と反応後の試料液の一部を一定量、内部に第二試薬が固定された第二容器内に吸引した後、前記第一容器に戻し、前記試料液を前記第二試薬と反応させる工程と、
前記第一容器内に戻され、前記第二試薬と反応後の試料液を光学的に測定する工程とを備えることを特徴とする試料液の測定方法。
【請求項６】
上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入され、
前記第一容器の内側下端には、第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記第一容器に最初に導入された時点の試料液とは接しない位置であり、かつ該最初に導入された試料液を、該第二容器の下端側の開口から吸引した際に該吸引した試料液と接する位置には、第二試薬が固定され、
前記第一試薬は、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子と、ペプチドに発光基質が結合してなり、前記Ｃ因子が活性化されることにより該発光基質を遊離する発光合成基質とを含有する試薬であり、
前記第二試薬は、前記発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させる発光酵素を含有する試薬であることを特徴とする容器ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法に関する。特に、エンドトキシン、βグルカン等の微生物夾雑物の検出に適した二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシン、βグルカン等の微生物夾雑物を高感度で検出する方法として、試料液に、微生物夾雑物によって活性化する試薬、および活性化された試薬により発光基質を遊離する合成基質、を反応させる工程と、発光試薬を作用させて発光基質が遊離したか否かを検出する工程を順次行う技術が提案されている（特許文献１、２）。
この技術では、少なくとも発光基質を遊離させる工程と発光試薬の添加工程の各工程を順次行うことが求められ、少なくとも２〜３回のピペット操作が必要である。そのため、試料液に外部の微生物夾雑物の混入が起こるおそれがあり、高感度測定には不向きであると共に、操作も煩雑であった。また、発光試薬等は、時間経過と共に失活するため用時調製が必要であり、特許文献１、２のような測定方法は自動化も困難であった。
【０００３】
そこで、特許文献３では、容器内に試薬を固定し、導入した試料液で試薬を溶解して反応させる技術が提案されている。特許文献３では、発光基質を遊離させる工程と発光試薬の添加工程を順次行うため、隔膜で仕切られた複数の反応室を有する容器を用いることが提案されている（特許文献３の図８等）。そして、まず、発光基質を遊離させるために必要な試薬を固定した反応室に試料液を導入して反応させた後、隔膜に針等で孔を空け、この孔を通して試料液を発光試薬が固定された反応室に落下させて発光試薬と反応させることが記載されている。
【０００４】
特許文献３には、また、内部に微生物夾雑物によって活性化する試薬を固定した試薬収容カップを配置すると共に、天井部分に合成基質を、底部に発光試薬を各々固定した容器を用いることが提案されている（特許文献３の図１０等）。そして、まず、試薬収容カップに試料液を導入して反応させた後、天地を逆転させて、合成基質が固定された天井部分に試料液を移動させ、その後再度天地を逆転させて、発光試薬が固定された容器底部に試料液を移動させ、順次反応を進めることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０９／０６３８４０号
【特許文献２】特開２０１０−１８７６３４号公報
【特許文献３】特開２０１２−１３２８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献３の図８等の容器で使用される隔膜は、汚染物質を吸着しやすい性質がある。また、一般に熱による減菌処理も困難である。そのため、特許文献３の図８等の容器は、生産段階で、検出対象である微生物夾雑物で汚染される可能性があった。また、数１００μＬ程度の少量の試料液を用いる場合、隔膜に孔を空けても試料液が隔膜に付着等して孔から抜けきらない液量が無視できず、高感度検出に支障をきたすものであった。
また、特許文献３の図１０等の容器は、内部に試薬収容カップを設けるため、構造が複雑となる上、反応を進めるために転倒動作が必要であるため、自動化も困難であった。さらに、数１００μＬ程度の少量の試料液を用いる場合、容器を転倒させても試料液が試薬収容カップに付着等して移動しきれない液量が無視できず、高感度検出に支障をきたすものであった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、二段階の反応が必要な検出を、高感度かつ簡便に行うことができ、必要に応じて自動化も可能な二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、および
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引後、再度第一容器に戻す吸引吐出手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引吐出手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定されていることを特徴とする二段反応システム。
［２］上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、および
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引する吸引手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定されていることを特徴とする二段反応システム。
［３］上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引後、再度第一容器に戻す吸引吐出手段、および
前記第一容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引吐出手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定され、
前記第一容器に導入された試料と前記第一試薬とを反応させる工程と、
前記吸引吐出手段により、前記第一試薬と反応後の試料液を、前記第一容器に残存する試料液の液面が前記第二容器の下端側の開口を下回らない範囲で前記第二容器内に吸引した後、前記第一容器に戻し、前記第二試薬を、前記第一試薬と反応後の試料液と反応させる工程と、
前記第一容器内に戻され、前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の測定システム。
［４］上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入された容器ユニット、
前記第二容器の上端側の開口に接続され、前記第一容器から一定容積の試料液を前記第二容器内に吸引する吸引手段、および
前記第二容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記第一容器の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記吸引手段により前記第一容器から一定容積の試料液を吸引した際に該吸引した試料液と接する位置に、前記第一試薬と反応した後の試料液と反応させる第二試薬が固定され、
前記第一容器に導入された試料と前記第一試薬とを反応させる工程と、
前記吸引手段により、前記第一試薬と反応後の試料液を、前記第一容器に残存する試料液の液面が前記第二容器の下端側の開口を下回らない範囲で前記第二容器内に吸引し、前記第二試薬を吸引した試料液と反応させる工程と、
前記第二容器内の前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の測定システム。
［５］内部に第一試薬が固定された第一容器に試料液を導入し、前記第一試薬と反応させる工程と、
前記第一試薬と反応後の試料液の一部を一定量、内部に第二試薬が固定された第二容器内に吸引した後、前記第一容器に戻し、前記試料液を前記第二試薬と反応させる工程と、
前記第一容器内に戻され、前記第二試薬と反応後の試料液を光学的に測定する工程とを備えることを特徴とする試料液の測定方法。
［６］上端側に開口を有し、試料液が最初に導入される第一容器と、上端側と下端側の双方に開口を有する第二容器とからなり、前記第二容器の下端側が、該下端側の開口が前記第一容器の内側の下端近傍に位置するように前記第一容器内に挿入され、
前記第一容器の内側下端には、第一試薬が固定され、
前記第二容器の内側であって、前記第一容器に最初に導入された時点の試料液とは接しない位置であり、かつ該最初に導入された試料液を、該第二容器の下端側の開口から吸引した際に該吸引した試料液と接する位置には、第二試薬が固定され、
前記第一試薬は、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子と、ペプチドに発光基質が結合してなり、前記Ｃ因子が活性化されることにより該発光基質を遊離する発光合成基質とを含有する試薬であり、
前記第二試薬は、前記発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させる発光酵素を含有する試薬であることを特徴とする容器ユニット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法によれば、二段階の反応が必要な検出を、高感度かつ簡便に行うことができ、必要に応じて自動化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムで使用する容器ユニットの一例である。
【図２】本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムの第一実施形態を示す概略構成図である。
【図３】本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムの第二実施形態を示す概略構成図である。
【図４】本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムの第三実施形態を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［容器ユニット］
図１は、本発明の二段反応システムおよび測定システムに使用される容器ユニットの一例である。図１の容器ユニット１は、第一容器１０と、第一容器１０内に下端側が挿入された第二容器２０とから構成されている。
第一容器１０は、試料液が最初に導入される容器で、上端に開口１０ａを有する有底筒状の容器である。また、第一容器１０の側面には、空気孔１１が設けられている。
第一容器１０の内側下端には、試料液と最初に反応させる第一試薬Ｒ１が乾燥状態で固定されている。第一試薬Ｒ１は、たとえば、第一試薬Ｒ１の溶液を第一容器１０に入れた状態で凍結乾燥を行うことにより、乾燥状態で固定することができる。
第一容器１０は、必要に応じて減菌処理を施すことが可能な材質からなることが好ましい。また、後述の第一実施形態で用いる場合、光透過性の材質からなることが好ましい。減菌処理を施すことが可能で、かつ光透過性の材質としては、石英、ホウケイ酸ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂が挙げられる。その他、減菌処理を施すことが可能な材質としは、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂が挙げられる。
【００１１】
第二容器２０は、断面円形の第二容器本体２１と、第二容器本体２１内に上端側が挿入された吸入管２２とから構成されている。第二容器本体２１は、外径が第一容器１０の外径より大きい大径部２１ａと、大径部２１ａの下端側に設けられ、外径が第一容器１０の内径より若干小さい小径部２１ｂとから構成されている。
また、大径部２１ａには上端から下側に向けて柱状孔２４が設けられており、柱状孔２４の上端が、第二容器２０の上端側の開口２０ａとされている。また、小径部２１ｂの下端側から、吸入管２２を挿入するための挿入孔２５が設けられ、柱状孔２４と挿入孔２５との間には、両者をつなぐテーパー状の中間孔２６が設けられている。
【００１２】
第二容器２０における中間孔２６の下端側に、第一試薬Ｒ１と反応した後の試料液と反応させる第二試薬Ｒ２が乾燥状態で固定されている。
第二試薬Ｒ２を中間孔２６の下端側に固定する方法としては、たとえば、第二容器２０の下端側の開口２０ｂを封じて挿入管２２内に空気層を形成し、第二試薬Ｒ２の溶液を中間孔２６の下端側近傍に付着させた状態で凍結乾燥を行う方法が挙げられる。挿入管２２の内径が充分に小さければ、挿入管２２内に空気層が存在することにより、中間孔２６の下端側近傍に付着させた第二試薬Ｒ２の溶液が、凍結乾燥前に挿入管２２内に落下することを回避できる。
また、挿入管２２を中間孔２６に突き出すようにした状態で第二試薬Ｒ２の溶液を中間孔２６の下端側近傍に付着させ、その状態で凍結乾燥した後に挿入管２２を図１の位置に戻す方法も挙げられる。
第二試薬Ｒ２が固定される中間孔２６の下端側は、第一容器１０内に最初に試料液を導入した段階では、当該試料液から離間しており、後述の吸引吐出手段（吸引手段）により第一容器１０内の試料液を一定量吸引した際に、吸引した試料液に接することができる位置である。
【００１３】
第二容器本体２１は、柱状孔２４等を設けるため、加工が容易である材質が好ましい。また、必要に応じて減菌処理を施すことが可能な材質からなることが好ましい。また、後述の第二実施形態で用いる場合、光透過性の材質からなることが好ましい。加工が容易で、減菌処理を施すことが可能で、かつ光透過性の材質としては、石英、ホウケイ酸ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂が挙げられる。その他、加工が容易で、減菌処理を施すことが可能な材質としは、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂が挙げられる。
【００１４】
吸入管２２は、上端側の一部が挿入孔２５にその上端が挿入孔２５の上端に達するように挿入され、残部は小径部２１ｂの下端側に垂下されている。吸入管２２の下端側の開口は、第二容器２０の下端側の開口２０ｂとされており、開口２０ａと開口２０ｂとは、柱状孔２４、中間孔２６、および吸入管２２内側の孔により連通している。
吸入管２２は、細管に必要な強度を有する材質であることが好ましい。また、必要に応じて減菌処理を施すことが可能な材質からなることが好ましい。また、後述の第一実施形態で用いる場合、光透過性の材質からなることが好ましい。必要な強度を備え、減菌処理を施すことが可能で、かつ光透過性の材質としては、石英、ホウケイ酸ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂が挙げられる。その他、必要な強度を備え、減菌処理を施すことが可能な材質としは、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂が挙げられる。
【００１５】
第二容器２０は、その吸入管２２を垂下した状態で小径部２１ｂを第一容器１０の上端に差し込み、大径部２１ａの下端側を第一容器１０の上端で係止して、第一容器１０に載置できるようになっている。このように、第二容器２０を第一容器１０に載置した際、第二容器２０の吸入管２２の下端（下端側の開口２０ｂ）は、第一容器１０の内側の下端近傍に位置するようになっている。
第一容器１０内に試料液を導入した際、吸入管２２の下端側には、第一容器１０の試料液の液面と同等のレベルまで、試料液が導入され得るが、後述の吸引吐出手段（吸引手段）による吸引吐出（吸引）が行われない段階で、第二試薬Ｒ２が固定される柱状孔２４下端側から中間孔２６の上端側の部分まで到達することはない。
【００１６】
各試薬が固定された容器ユニット１は、製造後の汚染を防ぐため、たとえばシュリンクフィルム等を用いて、全体を密封してもよい。その場合、シュリンクフィルムを除去せず、シュリンクフィルムを通して第一容器１０の空気孔１１に注射針を刺して第一容器に試料液を導入することにより、試料液導入後の容器ユニット１内の汚染をより確実に防止することができる。
なお、後述の吸引吐出手段（吸引手段）による吸引吐出（吸引）が可能な程度に、第一容器１０と第二容器２０との間に空気が流通する隙間を確保できるのであれば、第一容器１０の空気孔１１は必須ではない。その場合、試料液は、第二容器２０を外した状態で、開口１０ａから導入すればよい。
また、第二容器２０は、第二容器本体２１と吸入管２２とが一体成形されたものであってもよい。
【００１７】
［第一実施形態］
図２は、本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムの第一実施形態を示す概略構成図である。図２のシステム１００は、図１の容器ユニット１を複数用い、これと吸引吐出手段３０Ａとを組み合わせることにより、本発明の二段反応システムとされている。また、複数の容器ユニット１、吸引吐出手段３０Ａに加え、さらに光学測定手段４０Ａを備えることにより、本発明の測定システムとされている。
【００１８】
本実施形態の吸引吐出手段３０Ａは、シリンジポンプ３１と、複数の容器ユニット１に各々対応する複数の吸盤３２と、シリンジポンプ３１と複数の吸盤３２とを接続する分岐配管３３と、分岐配管３３の各分岐点より吸盤３２側に各々設けられた開閉弁３４とから構成されている。また、図示を省略する昇降手段により、各容器ユニット１に対応する吸盤３２は、個別に昇降できるようになっている。
【００１９】
吸盤３２は、第二容器２０の開口２０ａを覆う大きさとされ、昇降手段によって第二容器２０の上端に押しつけられることにより、開口２０ａと気密に接続されるようになっている。また、吸盤３２の中央には、分岐配管３３に連通する孔が設けられている。
光学測定手段４０Ａとしては、容器ユニット１の第一容器１０内から発せられる光（蛍光を含む）を検出する光（蛍光）検出装置、光源と、第一容器１０を透過した光を検出する受光装置とからなる吸光度検出装置、光源と、第一容器１０内で散乱された光を検出する受光装置とからなる散乱光検出装置等を適宜採用できる。
システム１００は、反応の進行を促進するため、容器ユニット１を適宜加温する加温手段を備えていてもよい。
【００２０】
システム１００の全体は、図示を省略する制御装置により、その動作が制御され、各容器ユニット１に対して、以下の工程を順次行うようになっている。
（ｉ）第一容器１０に導入された試料液と第一試薬Ｒ１とを反応させる工程（以下「第一反応工程Ａ」という。）。
（ii）第一試薬Ｒ１と反応後の試料液の一部を一定量、第二容器２０内に吸引した後、第一容器１０に戻し、第二試薬Ｒ２を、第一試薬Ｒ１と反応後の試料液と反応させる工程（以下「第二反応工程Ａ」という。）。
（iii）第一容器内に戻され、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する工程（以下「測定工程Ａ」という。）。
【００２１】
第一反応工程Ａは、試料液を導入した容器ユニット１をシステム１００にセッティングしてから、次の第二反応工程Ａを開始するまでの間の待機工程である。
第一反応工程Ａの待機時間は、第一容器１０に導入された試料と第一試薬Ｒ１との反応させるため、必要な反応時間を考慮して適宜設定する。試料と第一試薬Ｒ１との反応が速い場合は、システムの動作上物理的に必要な時間のみを待機時間として、次の第二反応工程Ａに移行すればよい。第一反応工程Ａでは、反応を促進するため容器ユニット１を適宜加温することができる。
第一容器１０への試料液の導入は、容器ユニット１の説明で述べたように、空気孔１１または開口１０ａから行うことができる。導入作業は、人手により行うことが好ましいが、図２のシステム１００にサンプリング機構を追加して自動化してもよい。第一容器１０に試料液を導入すると、導入した試料液によって第一試薬Ｒ１が溶解され、試料液と第一試薬Ｒ１とが反応可能となる。
【００２２】
第二反応工程Ａでは、まず、昇降手段によって、１つの吸盤３２を下降させて対応する第二容器２０の上端に押しつけ、吸引吐出手段３０Ａを開口２０ａに気密に接続する。なお、容器ユニット１の全体がシュリンクフィルム等を用いて密封されたものであり、シュリンクフィルムを除去することなく、シュリンクフィルムを通して第一容器１０の空気孔１１に注射針を刺して試料液を導入する場合は、吸盤３２内に下側を先端とした針を配置しておくとよい。これにより、吸盤３２の下降に伴い針も下降し、開口２０ａ上のシュリンクフィルムに孔を空けることができる。
【００２３】
次いで、開閉弁３４の内、開口２０ａに接続された吸盤３２とシリンジポンプ３１との間の開閉弁３４のみを開き、シリンジポンプ３１のピストンを引くことにより、一定量の空気を吸引する。これにより、分岐配管３３を通して第二容器２０内が引圧とされ、シリンジポンプ３１が吸引した空気量に対応する液量の試料液が第一容器１０から第二容器２０に吸い上げられる。
このとき、第二容器２０に吸引する試料液の液量は、第一容器内に残存する試料液の液面が、第二容器２０の吸入管２２の下端（下端側の開口２０ｂ）を下回らない範囲の液量とすることが必要である。第二容器２０に吸引する試料液の液量が過大で、開口２０ｂが試料液上の気相に露出してしまうと、試料液の急激な移動が生じ、試料液によって、吸引吐出手段３０Ａ内を汚染してしまう恐れがある。
また、第二容器２０に吸い上げる試料液の液量は、第二試薬Ｒ２が固定された位置まで、到達可能な程度に充分である必要がある。吸引した試料液が第二試薬Ｒ２の固定位置まで到達すると、吸引した試料液によって第二試薬Ｒ２が溶解され、試料液と第二試薬Ｒ２とが反応可能となる。
【００２４】
次いで、開閉弁３４の内、開口２０ａに接続された吸盤３２とシリンジポンプ３１との間の開閉弁３４のみを開いた状態のまま、シリンジポンプ３１のピストンを吸引前の状態に押し戻すことにより、一定量の空気を吐出する。これにより、第二容器２０内に吸引した試料液が第一容器１０に戻される。
吸引後、吐出を行う迄の時間は、吸引した試料液によって、第二試薬Ｒ２が溶解されるのに充分であればよく、第二試薬Ｒ２の溶解性が高ければ、吸引後、直ちに吐出を行うことができる。
たとえば、蛍光測定のように、試料液と第二試薬Ｒ２の反応開始後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系の場合、吸引後、直ちに吐出を行うことが好ましい。
吐出終了段階で、試料液と第二試薬Ｒ２とが既に充分に反応していれば、光学的な測定を直ちに行うことができる。吐出終了段階で、試料液と第二試薬Ｒ２との反応が充分でなければ、適宜の反応時間経過後、測定工程Ａに移行する。
【００２５】
測定工程Ａでは、第一容器内に戻され、光学測定手段４０Ａにより、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する。
光学的な測定の種類に特に限定はなく、蛍光検出、吸光度検出、散乱光検出等を適宜採用できる。
なお、測定工程Ａ終了後は、吸盤３２の容器ユニット１に対する接続を解除し、その後昇降手段によって吸盤３２を上昇させて当該容器ユニット１に対する測定動作を終了する。
【００２６】
以上の操作を、各容器ユニット１に対して順次行う。
本実施形態によれば、総ての試料について、第二反応工程Ａにおける吸引と吐出、および測定工程Ａを、所定のタイムテーブルに従って行うことにより、光学的測定の条件を容易に均一化できる。そのため、測定条件の変動による検出誤差を排除しやすい。
また、試料液は、測定工程Ａにおいて、ほぼ全量が第一容器内に戻されているため、少量の試料液を利用しても、高い精度で検出ができる。
【００２７】
［第二実施形態］
図３は、本発明の試料液の二段反応システムおよび測定システムの第二実施形態を示す概略構成図である。図３において、図２と同等の構成部材については、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
図３のシステム２００は、図１の容器ユニット１を複数用い、これと吸引手段３０Ｂとを組み合わせることにより、本発明の二段反応システムとされている。また、複数の容器ユニット１、吸引手段３０Ｂに加え、さらに光学測定手段４０Ｂを備えることにより、本発明の測定システムとされている。
【００２８】
本実施形態の吸引手段３０Ｂは、第一実施形態の吸引吐出手段３０Ａと同一の構成部材から構成されるが、後述のように、その動作は第一実施形態の吸引吐出手段３０Ａと相違する。
光学測定手段４０Ｂは、測定すべき対象が第一容器１０内の試料液ではなく、第二容器２０内の試料液である点を除き、光学測定手段４０Ａと同等である。すなわち、光学測定手段４０Ｂとしては、容器ユニット１の第二容器２０内から発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置、光源と、第二容器２０を透過した光を検出する受光装置とからなる吸光度検出装置、光源と、第二容器２０内で散乱された光を検出する受光装置とからなる散乱光検出装置等を適宜採用できる。
システム２００は、反応の進行を促進するため、容器ユニット１を適宜加温する加温手段を備えていてもよい。
【００２９】
システム２００の全体は、図示を省略する制御装置により、その動作が制御され、各容器ユニット１に対して、以下の工程を順次行うようになっている。
（ｉ）第一容器１０に導入された試料液と第一試薬Ｒ１とを反応させる工程（以下「第一反応工程Ｂ」という。）。
（ii）第一試薬Ｒ１と反応後の試料液の一部を一定量、第二容器２０内に吸引し、試料液と第二試薬Ｒ２とを反応させる工程（以下「第二反応工程Ｂ」という。）。
（iii）第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する工程（以下「測定工程Ｂ」という。）。
【００３０】
第一反応工程Ｂは、試料液を導入した容器ユニット１をシステム２００にセッティングしてから、次の第二反応工程Ｂを開始するまでの間の待機工程である。
第一反応工程Ｂの待機時間は、第一容器１０に導入された試料と第一試薬Ｒ１との反応させるため、必要な反応時間を考慮して適宜設定する。試料と第一試薬Ｒ１との反応が速い場合は、システムの動作上物理的に必要な時間のみを待機時間として、次の第二反応工程Ｂに移行すればよい。第一反応工程Ｂでは、反応を促進するため容器ユニット１を適宜加温することができる。
第一容器１０への試料液の導入は、容器ユニット１の説明で述べたように、空気孔１１または開口１０ａから行うことができる。導入作業は、人手により行うことが好ましいが、図３のシステム２００にサンプリング機構を追加して自動化してもよい。第一容器１０に試料液を導入すると、導入した試料液によって第一試薬Ｒ１が溶解され、試料液と第一試薬Ｒ１とが反応可能となる。
【００３１】
第二反応工程Ｂでは、まず、昇降手段によって、１つの吸盤３２を下降させて対応する第二容器２０の上端に押しつけ、吸引手段３０Ｂを開口２０ａに気密に接続する。なお、容器ユニット１の全体がシュリンクフィルム等を用いて密封されたものであり、シュリンクフィルムを除去することなく、シュリンクフィルムを通して第一容器１０の空気孔１１に注射針を刺して試料液を導入する場合は、吸盤３２内に下側を先端とした針を配置しておくとよい。これにより、吸盤３２の下降に伴い針も下降し、開口２０ａ上のシュリンクフィルムに孔を空けることができる。
【００３２】
次いで、開閉弁３４の内、開口２０ａに接続された吸盤３２とシリンジポンプ３１との間の開閉弁３４のみを開き、シリンジポンプ３１のピストンを引くことにより、一定量の空気を吸引する。これにより、分岐配管３３をとおして第二容器２０内が引圧とされ、シリンジポンプ３１が吸引した空気量に対応する液量の試料液が第一容器１０から第二容器２０に吸い上げられる。
このとき、第二容器２０に吸引する試料液の液量は、第一容器内に残存する試料液の液面が、第二容器２０の吸入管２２の下端（下端側の開口２０ｂ）を下回らない範囲の液量とすることが必要である。第二容器２０に吸引する試料液の液量が過大で、開口２０ｂが試料液上の気相に露出してしまうと、試料液の急激な移動が生じ、試料液によって、吸引吐出手段３０Ａ内を汚染してしまう恐れがある。
また、第二容器２０に吸い上げる試料液の液量は、第二試薬Ｒ２が固定された位置まで、到達可能な程度に充分である必要がある。吸引した試料液が第二試薬Ｒ２の固定位置まで到達すると、吸引した試料液によって、第二試薬Ｒ２が溶解され、試料液と第二試薬Ｒ２とが反応可能となる。
【００３３】
第二反応工程Ｂでは、試料液を第一容器１０から第二容器２０に吸い上げた後、開閉弁３４を閉じる。これにより、第二容器２０に吸い上げた後試料液を、そのまま第二容器２０内に保持することができる。
第二容器２０内に試料液を保持する時間は、吸引した試料液によって、第二試薬Ｒ２が溶解され、かつ、試料液と反応するのに充分な時間とする。また、たとえば、蛍光測定のように、試料液と第二試薬Ｒ２が接触した後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系の場合、第二反応工程Ｂを短時間で終了し、直ちに測定工程Ｂに移行することが好ましい。
【００３４】
測定工程Ｂでは、開閉弁３４を閉じたまま、光学測定手段４０Ｂにより、第二容器２０内に保持された試料液を光学的に測定する。
光学的な測定の種類に特に限定はなく、発光検出、蛍光検出、吸光度検出、散乱光検出等を適宜採用できる。
なお、測定工程Ｂ終了後は、まず、開閉弁３４を開いてからシリンジポンプ３１のピストンを吸引前の状態に押し戻すことにより、第二容器２０内の引圧状態を解消する。次いで、吸盤３２の容器ユニット１に対する接続を解除し、その後昇降手段によって吸盤３２を上昇させて当該容器ユニット１に対する測定動作を終了する。
【００３５】
以上の操作を、各容器ユニット１に対して順次行う。
本実施形態によれば、総ての試料について、第二反応工程Ｂ、および測定工程Ｂを、所定のタイムテーブルに従って行うことにより、光学的測定の条件を、容易に均一化できる。そのため、測定条件の変動による検出誤差を排除しやすい。
また、試料液を第二試薬Ｒ２と接触させた直後に光学的測定を行うこともできるので、試料液と第二試薬Ｒ２が接触した後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系を利用する検出も高い精度で行うことができる。
【００３６】
［第三実施形態］
図４は、本発明の試料液の二段反応システムの第三実施形態を示す概略構成図である。
図４のシステム３００は、ピペットチップ５１と、ピペットチップ５１内に一定量の試料液を吸引可能なピペット本体５２と、ピペットチップ５１に嵌合して、少なくともその先端をカバーするキャップ５３とから構成されている。ピペット本体５２とピペットチップ５１は、たとえば、エッペンドルフ社製エッペンドルフ（登録商標）ピペット、ギルソン社製ピペットマン（登録商標）などの市販されているピペットを利用することができる。
本実施形態では、キャップ５３が本発明における第一容器に、ピペットチップ５１が本発明における第二容器に、ピペット本体５２が本発明における吸引吐出手段ないしは吸引手段に該当する。また、ピペットチップ５１にキャップ５３を嵌合させたものが本発明における容器ユニットに該当する。
【００３７】
キャップ５３は、上端が開口とされた有底筒状であり、その内側下端には、第一試薬Ｒ１が乾燥状態で固定されている。キャップ５３の上端側の内側には、ピペットチップ５１と嵌合した際に、ピペットチップ５１との間に空気が流通可能な隙間が生じるよう、凹凸を設けておくことが好ましい。これにより、ピペットチップ５１とキャップ５３とを嵌合させたまま、後述の吸引吐出手段（吸引手段）による吸引吐出（吸引）を行うことが容易となる。
第一試薬Ｒ１は、たとえば、第一試薬Ｒ１の溶液をキャップ５３に入れた状態で凍結乾燥を行うことにより、乾燥状態で固定することができる。
キャップ５３は、必要に応じて減菌処理を施すことが可能な材質からなることが好ましい。また、光透過性の材質からなることが好ましい。減菌処理を施すことが可能で、かつ光透過性の材質としては、石英、ホウケイ酸ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂が挙げられる。その他、減菌処理を施すことが可能な材質としは、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂が挙げられる。
【００３８】
ピペットチップ５１は、上端と下端に開口を有し、下端に向かうほど縮径するテーパー状の筒体とされている。そして、その内側中間近傍には、第二試薬Ｒ２が乾燥状態で固定されている。第二試薬Ｒ２は、たとえば、第二試薬Ｒ２の溶液を内側中間近傍に付着させた状態で凍結乾燥を行うことにより、乾燥状態で固定することができる。
第二試薬Ｒ２が固定されるピペットチップ５１の内側中間近傍は、試料液を導入したキャップ５３と嵌合させた段階では、当該試料液から離間しており、後述の吸引吐出手段（吸引手段）によりキャップ５３内の試料液を一定量吸引した際に、吸引した試料液に接することができる位置である。
【００３９】
ピペットチップ５１にキャップ５３と嵌合させた際、ピペットチップ５１の先端はキャップ５３の内側の下端近傍に位置するようになっている。
キャップ５３内に試料液を導入した際、ピペットチップ５１の下端側には、キャップ５３の試料液の液面と同等のレベルまで、試料液が導入され得るが、後述の吸引吐出手段（吸引手段）による吸引吐出（吸引）が行われない段階で、第二試薬Ｒ２が固定される内側中間近傍の部分まで到達することはない。
各試薬が固定されたピペットチップ５１とキャップ５３とは、製造後の汚染を防ぐため、両者を嵌合させた状態で、たとえばシュリンクフィルム等を用いて、全体を密封してもよい。
【００４０】
システム３００は、たとえば以下の第一の使用方法、または第二の使用方法に示す工程を順次行うように使用することができる。
（第一の使用方法）
（ｉ）キャップ５３内に試料液を導入し、試料液と第一試薬Ｒ１を反応させる工程（以下「第一反応工程Ｃ」という。）。
（ii）第一試薬Ｒ１と反応後の試料液の一部を一定量、ピペットチップ５１内に吸引した後、キャップ５３に戻し、第二試薬Ｒ２を、第一試薬Ｒ１と反応後の試料液と反応させる工程（以下「第二反応工程Ｃ」という。）。
（iii）キャップ５３内に戻され、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する工程（以下「測定工程Ｃ」という。）。
【００４１】
第一反応工程Ｃでキャップ５３内に試料液を導入してから、次の第二反応工程Ｃを開始するまでの時間は、キャップ５３に導入された試料と第一試薬Ｒ１との反応させるため、必要な反応時間を考慮して適宜設定する。試料と第一試薬Ｒ１との反応が速い場合は、速やかに、次の第二反応工程Ｃに移行すればよい。第一反応工程Ｃでは、反応を促進するためキャップ５３を適宜加温することができる。
キャップ５３への試料液の導入は、ピペットチップ５１とキャップ５３とが嵌合されている場合、ピペットチップ５１を外してから行う。
【００４２】
第二反応工程Ｃでは、まず、ピペット本体５２にピペットチップ５１を取り付ける。その後試料液が導入されたキャップ５３を、ピペットチップ５１に嵌合する。
次いで、ピペット本体５２で吸引動作を行うことにより、設定した液量の試料液がキャップ５３からピペットチップ５１に吸い上げられる。
このとき、ピペットチップ５１に吸引する試料液の液量は、キャップ５３内に残存する試料液の液面が、ピペットチップ５１の下端（下端側の開口）を下回らない範囲の液量とすることが必要である。ピペットチップ５１に吸引する試料液の液量が過大で、ピペットチップ５１下端の開口が試料液上の気相に露出してしまうと、試料液の急激な移動が生じ、試料液によって、ピペット本体５２内を汚染してしまう恐れがある。
また、ピペットチップ５１に吸い上げる試料液の液量は、第二試薬Ｒ２が固定された位置まで、到達可能な程度に充分である必要がある。吸引した試料液が第二試薬Ｒ２の固定位置まで到達すると、吸引した試料液によって第二試薬Ｒ２が溶解され、試料液と第二試薬Ｒ２とが反応可能となる。
【００４３】
次いで、ピペット本体５２で吐出動作を行うことにより、吸引した液量（ピペット本体５２で設定した液量）の試料液がキャップ５３に戻される。
吸引後、吐出を行う迄の時間は、吸引した試料液によって、第二試薬Ｒ２が溶解されるのに充分であればよく、第二試薬Ｒ２の溶解性が高ければ、吸引後、直ちに吐出を行うことができる。
たとえば、蛍光測定のように、試料液と第二試薬Ｒ２の反応開始後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系の場合、吸引後、直ちに吐出を行うことが好ましい。
吐出終了段階で、試料液と第二試薬Ｒ２とが既に充分に反応していれば、光学的な測定を直ちに行うことができる。吐出終了段階で、試料液と第二試薬Ｒ２との反応が充分でなければ、適宜の反応時間経過後、測定工程Ｃに移行する。
【００４４】
測定工程Ｃでは、キャップ５３内に戻され、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する。測定時は、光学的測定手段の測定部にピペットチップ５１から外したキャップ５３を配置して測定すればよい。また、ピペットチップ５１が光透過性であれば、ピペット本体５２にとりつけたピペットチップ５１に嵌合させたままのキャップ５３を、光学的測定手段の測定部に配置して測定すればよい。その場合、ピペット本体５２を持って、キャップ５３を移動させることができるので、キャップ５３の光学的測定手段への移動が容易である。
光学的な測定の種類に特に限定はなく、蛍光検出、吸光度検出、散乱光検出等を適宜採用できる。
【００４５】
（第二の使用方法）
（ｉ）キャップ５３内に試料液を導入し、試料液と第一試薬Ｒ１を反応させる工程（以下「第一反応工程Ｄ」という。）。
（ii）ピペット本体５２に取り付けたピペットチップ５１に、試料液が導入されたキャップ５３を嵌合した状態でピペット本体５２を動作させ、キャップ５３内の試料液の一部を一定量ピペットチップ５１内に吸引し、試料液と第二試薬Ｒ２とを反応させる工程（以下「第二反応工程Ｄ」という。）。
（iii）第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する工程（以下「測定工程Ｄ」という。）。
【００４６】
第一反応工程Ｄは、前記第一反応工程Ｃと同様である。第二反応工程Ｄでは、試料液をキャップ５３からピペットチップ５１に吸い上げた後、そのままピペットチップ５１内に保持する。
ピペットチップ５１内に試料液を保持する時間は、吸引した試料液によって、第二試薬Ｒ２が溶解され、かつ、試料液と反応するのに充分な時間とする。また、たとえば、蛍光測定のように、試料液と第二試薬Ｒ２が接触した後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系の場合、第二反応工程Ｄを短時間で終了し、直ちに測定工程Ｄに移行することが好ましい。
【００４７】
測定工程Ｄでは、ピペットチップ５１内に保持され、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液を光学的に測定する。測定時は、光学的測定手段の測定部に、ピペット本体５２にとりつけたままのピペットチップ５１を、キャップ５３から外して配置して測定すればよい。また、キャップ５３が光透過性であれば、ピペットチップ５１にキャップ５３を嵌合させたまま、光学的測定手段の測定部にピペットチップ５１を配置して測定すればよい。その場合、ピペットチップ５１から試料液がたれ落ちて光学的測定手段を汚染してしまうことを防止できる。
いずれの場合も、ピペット本体５２を持って、ピペットチップ５１を移動させることができるので、ピペットチップ５１の光学的測定手段への移動が容易である。
【００４８】
本実施形態によれば、第一の使用方法、第二の使用方法共に、１回のピペット操作で総ての反応を行うことができる。また、隔膜のように、高精度検出に支障をきたす部材を使用していない。そのため、高感度の検出を、簡便に行うことが可能である。
【００４９】
［他の実施形態］
第一実施形態、第二実施形態では、吸引吐出手段（吸引手段）としてシリンジポンプを用いたが、吸引吐出手段（吸引手段）は、一定容積の試料液を送液できるものであれば、シリンジポンプに限られない。たとえば、圧電ポンプ、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプ等を使用できる。これらのポンプの送液量は、稼働時間をコントロールすることにより、所定の送液量とすることができる。また、第一容器内の試料液の液面を液面センサで検知し、第一容器内の試料液の液面が所定の高さまで下がった際に、ポンプの送液を停止するようにしてもよい。
【００５０】
上記各種のポンプを、第一実施形態の吸引吐出手段とする場合、吸引工程と吐出工程で、送液の方向を逆転させる必要がある。チューブポンプでは、チューブをしごく方向を逆転させればよい。圧電ポンプやダイヤフラムポンプのように、それ自体の送液方向を変更しがたいポンプの場合は、たとえば、開閉弁３４を、一つのポートが大気解放可能である三方弁に変更し、当該三方弁の操作により、第二容器２０内の引圧状態を大気圧に解放するなどにより、第二容器２０内に吸引されていた試料液を第一容器１０に戻すことができる。
また、第一実施形態、第二実施形態では、吸引吐出手段３０Ａ（吸引手段３０Ｂ）と第二容器２０との接続を吸盤３２に行うこととしたが、この接続の方法は、吸盤に限られない。たとえば、分岐配管３３の先端に、開口２０ａの内側に気密に嵌合する接続プラグを設けてもよい。
【００５１】
［エンドトキシンの測定］
本発明の二段反応システム、試料液の測定システム、および試料液の測定方法を、エンドトキシンの測定に適用する場合、容器ユニットに固定する第一試薬Ｒ１としては、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質を含有する試薬を用いる。また、第二試薬Ｒ２としては、発光酵素および発光反応に必要な他の化合物を含有する試薬を用いる。
【００５２】
エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子を含有する試薬としては、カブトガニ血球抽出成分（リムルス試薬）を好適に使用できる。
ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質は、前記Ｃ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素のいずれか１種の作用により、前記発光基質と前記ペプチドとの結合が切断される構造を有するものである。
発光基質としては、アミノルシフェリンが好適に使用でき、発光基質と結合するペプチドとしては、該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素のいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。
なお、試料液中の塩分濃度に起因する誤差を解消するため、第一試薬Ｒ１中に、ＮａＣｌを添加しておいてもよい。
発光酵素は、前記発光合成基質から遊離される発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させる酵素である。発光基質がアミノルシフェリンである場合の発光酵素はルシフェラーゼであり、発光反応に必要な他の化合物は、ＡＴＰおよび２価金属イオンである。
【００５３】
具体的な容器ユニットの構造、二段反応システム、測定システムの構成、および測定方法の具体的手順は、上記第一実施形態から第三実施形態で説明したものを、好適に適用できる。
エンドトキシンの測定のように、発光を利用する測定では、第二試薬Ｒ２を固定した第二容器に試料液を導入してから、発光反応を光学的に検出するまでの時間は短い方が好ましい。そのため、第二試薬Ｒ２を固定した第二容器に試料液を導入する吸引動作は、光学測定手段により発光反応の検出が可能な位置に容器ユニットを配置してから行うことが好ましい。また、第二試薬Ｒ２を固定した第二容器に試料液を導入する吸引動作は、安定した吸引が行える範囲で、できるだけ速やかに行うことが好ましい。
また、第一実施形態と第三実施形態の第一の使用方法を適用する際は、吸引動作後、速やかに吐出動作に移行し、吐出動作も、安定した吐出が行える範囲で、できるだけ速やかに行うことが好ましい。
【００５４】
第一試薬Ｒ１がカブトガニ血球抽出成分（リムルス試薬）とペプチドにアミノルシフェリンが結合している合成基質との混合試薬であり、第二試薬Ｒ２がルシフェラーゼとＡＴＰおよび２価金属イオンを含む混合試薬である場合、第一試薬Ｒ１を固定した第一容器に試料液を最初に導入した後、３７℃で１５〜３０分間程度インキュベートすることが好ましい。
その後、試料液を、第二試薬Ｒ２を固定した第二容器に、その下端側の開口から吸引して試料液を導入してルシフェリンとルシフェラーゼの発光反応を行わせる。発光反応の際の温度は、たとえば室温（２５℃）とすることができる。また、発光反応の反応時間、すなわち、第二試薬Ｒ２を固定した第二容器に試料液を導入してから、発光反応を光学的に検出するまでの時間は、０秒から１０秒とすることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、エンドトキシン、βグルカン等の微生物夾雑物の検出に好適に使用できる。
【符号の説明】
【００５６】
１…容器ユニット、１０…第一容器、２０…第二容器、３０Ａ…吸引吐出手段、
３０Ｂ…吸引手段、４０Ａ…光学測定手段、４０Ｂ…光学測定手段、
５１…ピペットチップ、５２…ピペット本体、５３…キャップ、
１００…システム、２００…システム、３００…システム、
Ｒ１…第一試薬、Ｒ２…第二試薬
【図１】
2014183765.tif 000003
【図２】
2014183765.tif 000004
【図３】
2014183765.tif 000005
【図４】
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