(57)【要約】      （修正有）【課題】スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ（ＳｐＡ）等の免疫グロブリン結合タンパク質の１つ以上のドメインをベースとするリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、及びこれらを使用する方法の提供。【解決手段】スタフィロコッカスのプロテインＡのＮ末端からの少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含む、Ｃドメイン、Ｂドメイン、または／およびＺドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンド。及び、固形担体と結合されている前記アフィニティークロマトグラフィーリガンドを含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＣドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも１つのＣドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項２】
１つ以上のスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）のＢドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも１つのＢドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項３】
１つ以上のスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）のＺドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも１つのＺドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項４】
少なくとも５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露後に、野生型対応物に比べて、低減した断片化を示す、請求項１、２または３に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項５】
固形担体と結合されている請求項１、２または３に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンドを含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項６】
固形担体と結合された時にリガンドが、５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露後に、野生型対応物に比べて、低減した断片化を示す、請求項５のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項７】
リガンドの１つ以上のドメインが位置２９に、Ｆａｂ結合を低減するアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項１、２または３に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項８】
アミノ酸突然変異が、リジンアミノ酸残基によるグリシンアミノ酸残基またはアラニンアミノ酸残基の置換を含む、請求項７のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項９】
アフィニティークロマトグラフィーリガンドが多点結合によって固形担体と結合されている、請求項５のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１０】
２、３、４、５、６、７つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）のＣドメインを含み、少なくとも１つのＣドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続したアミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４つの連続したアミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項１１】
２、３、４、５、６、７つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）のＺドメインを含み、少なくとも１つのＺドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続したアミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項１２】
２、３、４、５、６、７つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）のＢドメインを含み、少なくとも１つのＢドメインが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続したアミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項２に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項１３】
試料から１つ以上の標的分子をアフィニティー精製する方法であって、
（ａ）１つ以上の標的分子を含む試料を提供するステップ、
（ｂ）１つ以上の標的分子がマトリックスと結合するような条件下において試料を請求項５に記載のマトリックスと接触させるステップ、および
（ｃ）溶出によって１つ以上の結合されている標的分子を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での５時間の温置後に、その初期結合能の少なくとも９５％を保持する、請求項５のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１５】
０．１Ｍ  ＮａＯＨ中での２５時間の温置後に、その初期結合能の少なくとも９５％を保持する、請求項５のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１６】
構造式：
［（Ｘ）ｎ、（Ｙ）ｍ］ｎ＋ｍ
を含むアフィニティーリガンドであって、
式中、ＸがＳｐＡのＢドメイン、ＺドメインまたはＣドメインを表し、
ｎがゼロから（ｍ−１）の範囲のドメイン数を表し、
Ｙが、少なくとも３つの連続したアミノ酸をＮ末端から欠失している、ＳｐＡのＢドメインまたはＺドメインまたはＣドメインを表し、
ｍが１から８の範囲のＹドメイン数を表し、リガンドは多点結合によって固形担体と結合されている、アフィニティーリガンド。
【請求項１７】
アフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、２つ以上の、ＳｐＡのＢドメイン、または２つ以上の、ＳｐＡのＣドメイン、または２つ以上の、ＳｐＡのＺドメイン、または任意の順序における、Ｂ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、Ｂ、ＣまたはＺドメインの少なくとも１つが、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの少なくとも３アミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項１８】
５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露後に、いかなる欠失も含まないリガンドに比べて、低減した断片化を示す、請求項１７のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【請求項１９】
固形担体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレンならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５または請求項９に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項２０】
アルカリ安定性アフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも５つのＣドメインを含み、前記ドメインのそれぞれが、Ｆａｂ結合を低減する突然変異および位置１で始まる、Ｎ末端からの４アミノ酸の欠失を含む、アルカリ安定性アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている、２０１１年６月８日付で出願された米国仮特許出願第６１／４９４，７０１号の優先権の利点を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）などの免疫グロブリン結合タンパク質の１つ以上のドメインをベースとするリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、およびこれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するリガンドは、典型的に標的分子に対する高い選択性をもたらし、それによって標的分子の高い収率、高い純度、ならびに迅速および経済的な精製をもたらす。スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡベースの試薬およびクロマトグラフィーマトリックスは、抗原に対する免疫グロブリンのアフィニティーに著しく影響を与えずにＩｇＧと結合するその能力により、抗体およびＦｃ含有タンパク質の捕捉および精製のためのアフィニティークロマトグラフィーの分野において、ならびに分析規模の抗体検出法において広範囲の用途が見出されている。
【０００４】
したがって、プロテインＡ−リガンドを含む様々な試薬および媒体が開発されており、例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ  ＵｌｔｒａおよびＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）ならびにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸおよびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（商標）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）が市販されている。
【０００５】
ＳｐＡ結合クロマトグラフィーマトリックスなどの、リガンド結合固形担体を含むクロマトグラフィーリガンドの選択性を維持するため、マトリックスを洗浄しなければならず、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて、酸性またはアルカリ条件下において典型的には洗浄される。例えば、マトリックスの洗浄および復元に使用される標準的なプロセスは、ｐＨ範囲１２．７−１４．０をもたらす０．０５Ｍから１Ｍの範囲のＮａＯＨ濃度でのリガンド結合マトリックスの処理を典型的に含む、定置洗浄（ＣＩＰ）アルカリ手法である。典型的には、反復ＣＩＰサイクルへのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの曝露は、標的分子に対するマトリックスの結合能の著しい消失を経時的にもたらし、非常に高価であることが多い、マトリックスと結合するリガンドの多量の使用をプロセスを通じて必要とする。これは、より高価で長々とした精製プロセスをもたらすので、不経済であると同時に、望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の要旨）
アルカリ条件を用いた処理の後における標的分子に対する結合能の消失に低減を示すようである、プロテインＡベースのクロマトグラフィーマトリックスが当技術分野で以前に記載されている。例えば、５時間以上の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露の後でさえ最大９５％の初期結合能を示す、マトリックスと多点結合し、ＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＢまたはＺドメインを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを記載する、米国特許公開第２０１００２２１８４４号を参照。さらに、米国特許公開第２０１０００４８８７６号は、約５時間の０．５Ｍへの曝露の後に最大９５％の初期結合能を示すようである、ＳｐＡの野生型Ｃドメインおよびアミノ酸残基３から６の欠失を含有するＣドメインを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスを記載する。これらのリガンドは、マトリックスとのシステイン誘導単一点結合によって固定される。さらに、タンパク質の１つ以上のアスパラギン残基に突然変異を含有するプロテインＡドメインを取り込み、マトリックスがアルカリ条件への曝露の後に、野生型ＳｐＡに対する結合能の消失に低減を示すようであり、単一点結合によってマトリックスに固定されているようである、クロマトグラフィーマトリックスが記載されている。例えば、米国特許第６，８３１，１６１号を参照。
【０００７】
前述のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、苛性条件への曝露の後に、標的分子に対する結合能の消失に低減を示すようであるが、これらのマトリックスのいくつかは、苛性条件への曝露の後に、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して観察される高度のリガンド断片化を示すようである。このような断片化は望ましくない。高度のリガンド断片化は、標的分子から除去および分離するのが一層困難である、リガンドのより小さな断片が存在する結果となり、それによってこのようなおそらく免疫原性がある断片が治療標的分子と共に精製される可能性が高まるからである。さらに、高度の断片化は、標的分子に対するマトリックスの結合能の多大な消失をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はリガンドが、ドメインの位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの欠失を有する１つ以上のスタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ（ＳｐＡ）ドメインをベースとする、アフィニティークロマトグラフィーリガンドおよびこれらを取り込んだマトリックスを提供する。これらのリガンドおよびマトリックスは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはＳＥＣ技法によって証明されるように、前に記載したリガンドのいくつかに対して精製用途中に低減した断片化を示し、それによってこれらはアフィニティークロマトグラフィーにおける使用に一層魅力的で経済的な候補となる。
【０００９】
本発明による一態様において、欠失を有するＳｐＡの１つ以上のＢドメイン、欠失を有するＳｐＡの１つ以上のＣドメイン、または欠失を有するＳｐＡの１つ以上のＺドメインを含み、１つ以上のドメインが固形担体と結合されている、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００１０】
一実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは固形担体と結合されているリガンドを含み、リガンドはスタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ（ＳｐＡ）の１つ以上のＢドメインを含み、少なくとも１つのＢドメインはＮ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは固形担体と結合されているリガンドを含み、リガンドはスタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ（ＳｐＡ）の１つ以上のＣドメインを含み、少なくとも１つのＣドメインはＮ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは固形担体と結合されているリガンドを含み、リガンドはスタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ（ＳｐＡ）の１つ以上のＺドメインを含み、少なくとも１つのＺドメインはＮ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００１２】
さらに他の実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは固形担体と結合されているリガンドを含み、リガンドは、２つ以上のＢドメイン、２つ以上のＣドメイン、または２つ以上のＺドメイン、またはＢ、ＣおよびＺドメインの任意の組合せを含み、Ｂ、ＣまたはＺドメインの少なくとも１つはＮ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００１３】
本発明による様々な実施形態において、各リガンド上の２箇所以上の部位が固形担体と結合する（すなわち、多点結合）。
【００１４】
本発明による様々な実施形態において、リガンドは、少なくとも５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨへの、リガンドまたはリガンドを含有するマトリックスの曝露の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定して、その野生型対応物と比べて、低減した断片化を示す。
【００１５】
本発明によるいくつかの実施形態において、リガンドはＮ末端からの３アミノ酸の欠失、Ｎ末端からの４アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５アミノ酸の欠失を含み、リガンド上の２箇所以上の部位が固形担体と結合し、それによってアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを形成する。
【００１６】
特定の実施形態において、リガンドは配列番号１３−４２、配列番号５５−８４および配列番号９３−９４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明によるリガンドは、以下の構造：［（Ｘ）ｎ、（Ｙ）ｍ］ｎ＋ｍ（式中、ＸがＳｐＡのＢドメイン、ＺドメインまたはＣドメインを表し、ｎがゼロから（ｍ−１）の範囲のドメイン数を表し、ＹがＮ末端から欠失した少なくとも３つの連続アミノ酸を有するＳｐＡのＢドメインまたはＺドメインまたはＣドメインを表し、ｍが１から８の範囲のＹドメイン数を表す）を有し、リガンド上の２箇所以上の部位が固形担体（例えば、クロマトグラフィーマトリックス）と結合している。
【００１８】
本発明によるいくつかの実施形態において、リガンドは、ＳｐＡの、２つのＢドメインもしくは２つのＺドメインもしくは２つのＣドメイン、または１つのＢドメインと１つのＣドメイン、もしくは１つのＢドメインと１つのＺドメイン、もしくは１つのＣドメインと１つのＺドメインを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。様々なドメインを任意の順序で配置してよいことは理解される。
【００１９】
別の実施形態において、本発明によるリガンドは、３つのＢドメインまたは３つのＺドメインまたは３つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＣもしくはＺドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明によるリガンドは、４つのＢドメインまたは４つのＺドメインまたは４つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明によるリガンドは、５つのＢドメインまたは５つのＺドメインまたは５つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明によるリガンドは、６つのＢドメインまたは６つのＺドメインまたは６つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本発明によるリガンドは、７つのＢドメインまたは７つのＺドメインまたは７つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明によるリガンドは、８つのＢドメインまたは８つのＺドメインまたは８つのＣドメイン、または任意の順序でＢ、ＺもしくはＣドメインの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００２５】
さらに、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用する方法を本明細書で提供する。したがって、試料から１つ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）をアフィニティー精製する方法を提供し、この方法は、（ａ）１つ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を含む試料を提供するステップ、（ｂ）１つ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）がマトリックスと結合するような条件下において試料と本発明によるマトリックスを接触させるステップ、および（ｃ）例えば適切なｐＨなどの適切な条件下において、溶出によって１つ以上の結合されている標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を回収するステップを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での５時間の、または１０時間の、または１５時間の、または２０時間の、または２５時間の、または３０時間の温置の後に、標的分子に対するその初期結合能の少なくとも９５％を保持する。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での５時間の温置の後に、その初期結合能の少なくとも９５％を保持する。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中での２５時間の温置の後に、標的分子に対するその初期結合能の少なくとも９５％、０．３Ｍ  ＮａＯＨ中での２５時間の温置の後に、標的分子に対するその初期結合能の少なくとも８５％、または０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での２５時間の温置の後に、標的分子に対するその初期結合能の少なくとも６５％を保持する。
【００２９】
本明細書に記載する様々なリガンドによって結合可能である免疫グロブリンには、例えば、ＳｐＡと結合可能である、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ、または抗体および任意の抗体断片を含む任意の融合タンパク質がある。
【００３０】
本明細書に記載する様々なリガンドをコードする核酸分子、およびこのような核酸分子を含む宿主細胞も本明細書で提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ部分と結合する能力を保持しながら、野生型ＳｐＡリガンドと比較して免疫グロブリンのＦａｂ部分との変化した（増大したまたは低下した）結合を示す、ＳｐＡベースのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。一実施形態において、本発明によるＳｐＡベースのマトリックスは、野生型ＳｐＡと比較して免疫グロブリンのＦａｂ部分との低下した結合を示す。特定の実施形態において、クロマトグラフィーマトリックスは、（ＳｐＡのＢおよびＣドメインの場合）グリシンの代わりに、または（ＳｐＡのＺドメインの場合）アラニンの代わりに、位置２９にリジンを含むＳｐＡリガンドを取り込む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】配列番号１−６によって表される、ＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＩｇＧ結合ドメインおよびＺドメインに関するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図２】Ａ２９Ｋ突然変異を有するダイマーＺドメインリガンドをコードする核酸配列、配列番号８５で示すアミノ酸配列を含有するプラスミドｐＥＴ１１ａ（対照）、ならびにＡ２９Ｋ突然変異を有するダイマーＺドメインリガンドをコードする核酸配列、およびＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を含む第二ドメイン、配列番号７８で示すアミノ酸配列を含有するプラスミドｐＥＴ１１ａの概略を示す図である。リガンド構築物は、３’末端にヒスタグ配列をさらに含む。
【図３】２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬有りまたは無しでの遊離および固定ダイマーＺおよびＣリガンドの断片化パターンを分析するための、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＣＥゲルの様々なレーンの記載は以下の通りである。レーン１：分子量マーカー、レーン２：ダイマーＺドメインリガンド、苛性曝露無し（Ａ２９Ｋ欠失無し、配列番号８５で示す、対照として使用しヒスタグを含む）、レーン３：ダイマーＺドメインリガンド対照、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン４：ダイマーＺドメインリガンド対照、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン５：ダイマーＺドメインリガンド、第二ドメインのＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を有する（配列番号７８で示す欠失を有する第二ドメインがあるＡ２９Ｋおよびヒスタグ）、苛性曝露無し、レーン６：ヒスタグを有する配列番号７８のダイマーＺドメインリガンド、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン７：ヒスタグを有する配列番号７８のダイマーＺドメインリガンド、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン８：ダイマーＣドメインリガンド、欠失無し、対照として使用（配列番号９２で示すアミノ酸配列、およびヒスタグを有する）、苛性曝露無し、レーン９：ダイマーＣドメインリガンド対照、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン１０：ダイマーＣドメインリガンド、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン１１：ダイマーＣドメインリガンド、第二ドメインのＮ末端からの欠失を有する（配列番号３５で示すアミノ酸配列、およびヒスタグを有する）、レーン１２：配列番号３５のダイマーＣドメインリガンドおよびヒスタグ、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、ならびにレーン１３：配列番号３５のダイマーＣリガンドおよびヒスタグ、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す。
【図４】前の図３の記載中に要約したダイマーＺおよびＣリガンドのＳＥＣ分析のクロマトグラムを示す図である。ｘ軸は、分単位の保持時間およびより大きな分子の保持時間よりも長い保持時間を有するより小さな分子を示す。ｙ軸は、ｍＡＵ単位の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を表す。長時間の苛性浸漬（すなわち、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬）後の、第二ドメイン中にＮ末端欠失を有するダイマーＺおよびＣドメインリガンドに関する低減した断片化の証拠は、クロマトグラム上のボックスによって示し、ダイマーＺおよびＣドメイン対照に関する、より小さな断片の存在は矢印によって示す。
【図５】２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬有りまたは無しでの遊離と固定両方のペンタマーＺドメインリガンドの断片化パターンを分析するための、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＣＥゲルの様々なレーンの記載は以下の通りである。レーン１：分子量マーカー、レーン２：ペンタマーＺドメインリガンド、Ａ２９Ｋ突然変異および第一ドメイン以外の全てのＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を有する、そのアミノ酸配列は配列番号８４で述べる、苛性曝露無し、レーン３：配列番号８４のペンタマーＺドメインリガンド、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン４：配列番号８４のペンタマーＺドメインリガンド、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン５：配列番号９１のペンタマーＺドメインリガンド、対照として使用、苛性浸漬を施さず、レーン６：ペンタマーＺドメインリガンド対照、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す、レーン７：ペンタマーＺドメインリガンド対照、アガロースクロマトグラフィー樹脂上に固定、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬を施す。さらに、レーン８、９および１０はｒＳＰＡに同様の処理を施して見られた結果に関するものであり、レーン８はいかなる苛性浸漬も施していないｒＳＰＡを表し、レーン９は２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬に施したｒＳＰＡ、および２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬に施した固定ｒＳＰＡを表す。矢印によって示すように、バンドは断片化を表す。
【図６】前の図５の記載中に要約したペンタマーＺドメインリガンドのＳＥＣ分析のクロマトグラムを示す図である。ｘ軸は、分単位の保持時間およびより大きな分子の保持時間よりも長い保持時間を有するより小さな分子を示す。ｙ軸は、ｍＡＵ単位の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を表す。長時間の苛性浸漬後の、第一ドメイン以外の全てにおけるＮ末端欠失を有するペンタマーＺドメインリガンドの場合の、低減した断片化の証拠は、クロマトグラム上のボックスによって示し、ペンタマーＺドメイン対照で見られた、より小さな断片の存在は、断片を指す矢印によって示す。さらに、ｒＳＰＡに関して見られた多量の断片化は、ＳＥＣを使用して観察することもできる。
【図７】前の図５の記載中に要約した固定ペンタマーＺドメインリガンドのＳＥＣ分析のクロマトグラムを示す図である。ｘ軸は、分単位の保持時間およびより大きな分子の保持時間よりも長い保持時間を有するより小さな分子を示す。ｙ軸は、ｍＡＵ単位の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を表す。長時間の苛性浸漬後の、第二ドメイン中にＮ末端欠失を有する固定ペンタマーＺドメインリガンドの場合の低減した断片化の証拠は、クロマトグラム上のボックスによって示し、ペンタマーＺドメイン対照で見られた、より小さな断片の存在は、断片を指す矢印によって示す。さらに、固定ｒＳＰＡに関して見られた多量の断片化は、ＳＥＣを使用して観察することもできる。
【図８】長時間の苛性浸漬後の遊離ダイマーＺドメインリガンドのＳＥＣ分析のクロマトグラムを示す図であり、リガンドはダイマーリガンドの第二ドメインの最初の１つ（配列番号８７）、最初の２つ（配列番号８８）、最初の３つ（配列番号６９）または最初の４つ（配列番号７８）のＮ末端欠失を含む。ｘ軸は、分単位の保持時間およびより大きな分子の保持時間よりも長い保持時間を有するより小さな分子を示す。ｙ軸は、ｍＡＵ単位の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を表す。長時間の苛性浸漬後に第二ドメインのＮ末端から欠失した最初の３つまたは最初の４つのアミノ酸を有するダイマーリガンドの場合の低減した断片化の証拠は、ボックスによって示す。アミノ酸欠失がない（配列番号８５）または第二ドメインのＮ末端から最初の１つのアミノ酸が欠失したまたは最初の２つのアミノ酸が欠失したダイマーリガンドの長時間の苛性浸漬後に観察した断片化の存在は、クロマトグラム上の断片の存在を指す矢印によって示す。
【図９】反復した苛性曝露の後に固定Ｃドメインペンタマーリガンドの保持結合能の比較を示す図であり、１つのペンタマーリガンドは各ドメイン中に４アミノ酸のＮ末端欠失、各ドメイン中にＧ２９Ｋ突然変異、およびペンタマー中に正に第一のアミノ酸としてアラニンを含み（配列番号９３で示すアミノ酸配列）、他方のペンタマーリガンドはＧ２９Ｋ突然変異を有するその野生型対応物である（そのアミノ酸配列は配列番号９５で示す）。ｘ軸は、３０分毎の１６サイクルにわたる０．７Ｍ  ＮａＯＨへの、クロマトグラフィーマトリックスの累積曝露の時間を表す。ｙ軸は、結合能の保持割合を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、１つ以上のＳｐＡドメインをベースとするリガンドを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供し、これらのリガンドは、単独またはマトリックス上への固定時のいずれかで、精製プロセスにおける使用中に、対応する野生型ＳｐＡドメインに比べて、低減した断片化を示す。
【００３４】
以前に記載された例示的なＳｐＡベースのクロマトグラフィーリガンドには、例えば、ＳｐＡの野生型ＢおよびＺドメインを取り込み、リガンド上の２箇所以上の部位がクロマトグラフィーマトリックスと結合されている（すなわち、多点結合）クロマトグラフィーマトリックスを記載する米国特許公開第２０１００２２１８４４号中に記載されたクロマトグラフィーリガンド、いくつかの抗体のＦａｂ部分と結合可能であり末端カップリング基を使用して一部位において不溶性担体とカップリングするＳｐＡの野生型Ｃドメインベースのクロマトグラフィーリガンドを論じる、米国特許公開第２０１０００４８８７６号中に記載されたクロマトグラフィーリガンド、および１つ以上のアスパラギンアミノ酸残基が修飾されたＳｐＡベースアルカリベースのクロマトグラフィーリガンドを論じる、米国特許第６，８３１，１６１号中に記載されたクロマトグラフィーリガンドがある。
【００３５】
前に論じたように、これらのリガンドは、アルカリ条件への曝露の後に、結合能の消失に低減を示す一方で、いくつかのこれらのリガンド、例えば米国公開第２０１００２２１８４４号中に記載されたリガンドは、精製プロセスにおける使用中に断片化を示し、これは非常に望ましくない。他方で、本明細書に記載するリガンドは、タンパク質精製プロセスにおいて通常使用される再生および定置洗浄（ＣＩＰ）手法におけるアルカリ条件への曝露の後に、これらが低減した断片化を示す点において、以前に記載されたリガンドと比較してタンパク質精製に関してはるかに魅力的な候補である。
【００３６】
本開示をさらに容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。追加的な定義は詳細な説明を通じて述べる。
【００３７】
Ｉ．定義
本明細書で使用する用語「ＳｐＡ」、「プロテインＡ」または「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡ」は、細菌スタフィロコッカス・アウレウスから単離した４２Ｋｄａのマルチドメインタンパク質を指す。ＳｐＡは、Ｘドメインと呼ばれるそのカルボキシ末端細胞壁結合領域を介して細菌細胞壁と結合する。アミノ末端領域において、それは、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣと呼ばれる５つの免疫グロブリン結合ドメインを含む（Ｓｊｏｄｈａｌ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｐ  ７８（２）：４７１−９０頁（１９７７）；Ｕｈｌｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ  ２５９（３）：１６９５−７０２頁（１９８４）。これらのドメインのそれぞれは約５８アミノ酸残基を含有し、これらは６５−９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３８】
ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのそれぞれは異なるＩｇ結合部位を有する。一部位はＦｃγ（ＩｇのＩｇＧクラスの定常領域）用であり、他の部位は特定Ｉｇ分子のＦａｂ部分（抗原認識を担うＩｇの部分）用である。ドメインのそれぞれがＦａｂ結合部位を含有することは報告されている。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部分はＣ末端に位置し、Ｘ領域またはＸ−ドメインで表す。
【００３９】
ＳｐＡのＺドメインはＳｐＡのＢドメインを操作したアナログであり、位置１にアラニンの代わりにバリンおよび位置２９にグリシン残基の代わりにアラニンを含む（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．２、１０７−１１３頁、１９８７）。
【００４０】
ＳｐＡをコードする遺伝子のクローニングは、参照によりその全容が完全に本明細書に組み込まれている、米国特許第５，１５１，３５０号中に記載されている。
【００４１】
本発明は、ＳｐＡベースのリガンドを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供し、これらのリガンド（遊離と固定リガンドの両方）は、タンパク質精製プロセス中で通常使用される再生およびＣＩＰ手法の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣにより観察される低減した断片化を示す。
【００４２】
本発明によるいくつかの態様において、アフィニティーリガンドは１つ以上のＢドメインまたは１つ以上のＺドメインまたは１つ以上のＣドメイン、またはこれらの任意の組合せを含み、少なくとも１つのＢドメインまたは少なくとも１つのＺドメインまたは少なくとも１つのＣドメインは、位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００４３】
本発明によるいくつかの実施形態において、アフィニティーリガンドの２箇所以上の部位はクロマトグラフィーマトリックスと結合している（すなわち、多点結合）。特定の実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスと結合されているＳｐＡの１つ以上のＢドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、リガンドの２箇所以上の部位がマトリックスと結合し、少なくとも１つのＢドメインが、野生型Ｂドメイン配列の位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を有する、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスと結合されているＳｐＡの１つ以上のＺドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、リガンドの２箇所以上の部位がマトリックスと結合し、少なくとも１つのＺドメインが、野生型Ｚドメイン配列の位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を有する、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００４５】
さらに別の実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスと結合されているＳｐＡの１つ以上のＣドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、リガンドの２箇所以上の部位がマトリックスと結合し、少なくとも１つのＣドメインが、野生型Ｃドメイン配列の位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの５つの連続アミノ酸の欠失を有する、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明は、それぞれのドメインがＧ２９Ｋ突然変異および位置１で始まる、Ｎ末端から欠失した４アミノ酸を含むＳｐＡの５Ｃドメイン、ならびにタンパク質の同種の翻訳後プロセシングを容易にするための第一アミノ酸として追加のアラニンを含むペンタマー型を含む、アルカリ安定性アフィニティークロマトグラフィーリガンドを提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するＳｐＡリガンドは、（ＢおよびＣドメインの場合）リジンアミノ酸残基で置換された位置２９のグリシンアミノ酸残基、または（Ｚドメインの場合）リジンアミノ酸残基で置換された位置２９のアラニンアミノ酸残基をさらに含む。
【００４８】
本明細書で使用する用語「親分子」または「野生型（ｗｔ）対応物」または「野生型タンパク質」または「野生型ドメイン」は、本明細書で対照として一般に使用する、そのほぼ天然型の対応するタンパク質（ＳｐＡ）またはタンパク質のドメイン（例えば、ＳｐＡのＢ、ＺまたはＣドメイン）を指すものとする。そのほぼ天然型のＳｐＡドメインに対応する本明細書で使用する野生型対応物対照は、対応するＳｐＡドメインから１つのアミノ酸変化を含み、Ｆａｂ結合を改変し得る。しかしながら他は、対応する野生型ドメインと配列が同一である。本発明によるリガンドは、本明細書の実施例中に論じた実験により証明されたように、それらの野生型対応物（すなわち、完全に野生型またはＦａｂ結合を改変するための突然変異を含む）に比べて、低減した断片化を示す（遊離と固定型両方の場合）。様々な実施形態において、本発明によるＢドメインまたはＣドメインベースのリガンドの野生型対応物は、ＳｐＡの野生型ＢドメインまたはＳｐＡの野生型Ｃドメインであり、それらのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３および配列番号４で述べる。特定の実施形態において、Ｚドメインベースのリガンドの野生型対応物は、配列番号６で述べるＺドメインアミノ酸配列である。特定の実施形態において、Ｂ、ＣまたはＺドメインの野生型対応物は、ドメインのＦａｂ結合を改変するための位置２９における突然変異以外、前述のＢ、ＣまたはＺドメインの配列とほぼ同一である。したがって、特定の実施形態において、Ｂドメインベースのリガンドの野生型対応物は配列番号４５で述べるアミノ酸配列（Ｇ２９Ｋ）を含み、Ｃドメインベースのリガンドの野生型対応物は配列番号４６で述べるアミノ酸配列（Ｇ２９Ｋ）を含み、Ｚドメインベースのリガンドの野生型対応物は配列番号４８で述べるアミノ酸配列（Ａ２９Ｋ）を含む。さらに、本発明によるリガンドが２つ以上のドメインを含む場合、対応する野生型対応物は同数のドメインを含むが、しかしながらＦａｂ結合を改変するための突然変異を含み得る。したがって、特定の実施形態において、本発明によるペンタマーＣドメインリガンドの野生型対応物は、配列番号９５または配列番号９６で述べるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
用語「配列同一性」は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、デフォルトギャップ加重値を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントをとるとき、少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を共有することを意味する。配列比較用に、典型的には一配列が、試験配列と比較する参照配列（例えば、親配列）として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列と参照配列はコンピュータへの入力値であり、必要な場合は部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。したがって配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する（１つ以上の）試験配列の配列同一性百分率を計算する。
【００５０】
比較用配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の実行によって、または外観検査（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを一般に参照）によって実施することができる。配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）中に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公に利用可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮＣＢｌインターネットサーバを介して公にアクセス可能である）。典型的には、デフォルトプログラムパラメータを使用して配列比較を実行することはできるが、カスタマイズドパラメータを使用することもできる。アミノ酸配列用に、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【００５１】
本明細書で互換的に使用する用語「Ｅドメイン」、「ＳｐＡのＥドメイン」および「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＥドメイン」は、そのアミノ酸配列が配列番号１で述べられる、または例えば配列番号７で述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。「Ｅドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造にフォールディングする５１アミノ酸のポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃと、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂと結合することができる。
【００５２】
本明細書で互換的に使用する用語「Ｄドメイン」、「ＳｐＡのＤドメイン」および「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＤドメイン」は、そのアミノ酸配列が配列番号５で述べられる、または例えば配列番号１１で述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。「Ｄドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造にフォールディングする６１アミノ酸のポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃと、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂと結合することができる。
【００５３】
本明細書で互換的に使用する用語「Ａドメイン」、「ＳｐＡのＡドメイン」および「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＡドメイン」は、そのアミノ酸配列が配列番号２で述べられる、または例えば配列番号８で述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。「Ａドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造にフォールディングする５８アミノ酸のポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃと、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂと結合することができる。
【００５４】
本明細書で互換的に使用する用語「Ｂドメイン」、「ＳｐＡのＢドメイン」および「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＢドメイン」は、そのアミノ酸配列が配列番号３で述べられる、または例えば配列番号９で述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。「Ｂドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造にフォールディングする５８アミノ酸のポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃと、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂと結合することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明によるＢドメインベースのリガンドは、例えば配列番号１３で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの３アミノ酸の欠失を含む。他の実施形態において、本発明によるＢドメインベースのリガンドは、例えば配列番号２８で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの４アミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、本発明によるＢドメインベースのリガンドは、Ｎ末端からの５アミノ酸の欠失を含む（配列示さず）。
【００５６】
本明細書で互換的に使用する用語「Ｃドメイン」、「ＳｐＡのＣドメイン」、および「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＣドメイン」は、そのアミノ酸配列が配列番号４で述べられる、または例えば配列番号１０で述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。「Ｃドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造にフォールディングする５８アミノ酸のポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃと、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂと結合することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明によるＣドメインベースのリガンドは、例えば配列番号１４で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの３アミノ酸の欠失を含む。他の実施形態において、本発明によるＣドメインベースのリガンドは、例えば配列番号２９で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの４アミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、本発明によるＣドメインベースのリガンドは、Ｎ末端からの５アミノ酸の欠失を含む（配列示さず）。
【００５８】
本明細書で互換的に使用する用語「Ｚドメイン」、「ＳｐＡのＺドメイン」、および「プロテインＡのＺドメイン」は、プロテインＡのＢドメインの変異体である、３ヘリックス、５８アミノ酸のポリペプチドを指す。Ｚドメインのアミノ酸配列は配列番号６で述べ、核酸配列は配列番号１２で述べる。例示的なＺドメインは、その全容が参照により本明細書に組み込まれているＮｉｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒ．、１：１０７−１１３頁（１９８７）中に記載される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明によるＺドメインベースのリガンドは、例えば配列番号１５で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの３アミノ酸の欠失を含む。他の実施形態において、本発明によるＺドメインベースのリガンドは、例えば配列番号３０で述べるアミノ酸配列を有するＮ末端からの４アミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、本発明によるＺドメインベースのリガンドは、Ｎ末端からの５アミノ酸の欠失を含む（配列示さず）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するリガンドの２箇所以上の部位は固形担体と結合しており（すなわち、多点結合）、これらのリガンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣによって証明されるように、精製プロセスにおける使用中に低減した断片化を示す（遊離と結合リガンド両方の場合）。
【００６１】
本明細書で使用する用語「低減した断片化」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で見られるようにまたはＳＥＣによって、精製プロセス中のアルカリ条件への、遊離リガンド分子または固形担体上に固定されたリガンド分子の曝露の後に、リガンドの野生型対応物に比べて、リガンド断片の数および／または強度の低減を指す。いくつかの実施形態において、リガンドは多点結合によって固形担体上に固定する。断片化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における完全分子に対する低分子量バンドの存在によって、またはＳＥＣクロマトグラム上における異なる保持時間を有する異なるピークとして通常検出される。
【００６２】
本発明によるＳｐＡリガンドは低減した断片化を示し、これは以下のように検出することができる。例えば、遊離リガンドは２５時間０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨに直接曝すことができ、次に７．０にｐＨ調節し、標準的な手法を使用しＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣによってその後分析することができる。あるいは、クロマトグラフィーマトリックス上に固定したリガンドを２５時間０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨに曝すことができる。苛性上清はマトリックス（例えば樹脂）から後に分離し、ｐＨ７に中和する。次いでこの上清は、標準的な手法を使用しＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣによって分析することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、断片の相対光強度は目視で観察することができ、適切な対照（例えば、本明細書に記載するような、ＳｐＡの野生型ドメインまたは位置２９に突然変異を含有するＳｐＡドメイン）と比較することができる。ＳＥＣの場合、相対ピーク強度を観察することができ、適切な対照（例えば、本明細書に記載するような、ＳｐＡの野生型ドメインまたは位置２９に突然変異を含有するＳｐＡドメイン）と比較することができる。
【００６３】
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用する典型的な精製プロセスは、酸性またはアルカリ溶液、好ましくはアルカリ溶液を利用する用途の各サイクル後にマトリックスの再生を伴う。さらに、典型的なプロセスは、酸性またはアルカリ溶液、好ましくはアルカリ溶液を使用してマトリックスを消毒するＣＩＰステップも伴う。したがって、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、その寿命内で数サイクルの再生およびＣＩＰステップに曝され、それにより経時的に標的分子に対する結合能の著しい消失をもたらすと予想される。
【００６４】
本発明によるリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、再生およびＣＩＰステップ中にアルカリ条件への長時間の曝露の後に、それらが経時的に、標的分子に対する結合能の消失に低減を示す点で、精製プロセスにおける使用中に低減した断片化を示すことに加えて、アルカリ安定性である。
【００６５】
本明細書で使用する用語「アルカリ安定性の」、「アルカリ安定性」、「苛性安定性の」または「苛性安定性」は、その初期結合能を失わずにアルカリ洗浄を使用した反復再生およびＣＩＰサイクルに耐える、単独またはクロマトグラフィーマトリックス上への固定時いずれかの、本発明によるアフィニティーリガンドの能力を一般に指す。一般に、本発明によるリガンドが固定されたマトリックス自体は、最大３０時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中に浸漬した後に、安定性の５％未満の変化に貢献すると想定される。例えば、いくつかの実施形態において、本発明によるアフィニティーリガンドは、長時間の間の従来のアルカリ洗浄に耐えることができ、それによってこれらのリガンドは、特にその多くが治療分子である免疫グロブリンおよびＦｃ含有タンパク質のコスト効率のよい大規模精製に関する魅力的な候補となる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、アルカリ安定性は、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での５時間の、または１０時間の、または１５時間の、または２０時間の、または２５時間の、または３０時間の温置の後に、その初期結合能の少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％を保持する、本発明によるリガンドまたは本発明によるリガンドを取り込んだマトリックスの能力を指す。別の実施形態において、アルカリ安定性は、５時間または７．５時間または１０時間または１５時間または２０時間または２５時間または３０時間の、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いた処理後でさえ７０％未満、または６０％未満、または５０％未満、または４０％未満、または３０％未満の、リガンドの初期結合能の低下を指す。特定の実施形態において、本発明によるリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露の後に、その初期結合能の最大９５％を保持する。別の実施形態において、本発明によるリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、２５時間の０．１Ｍ  ＮａＯＨへの曝露の後に、その初期結合能の最大９５％を保持する。さらに別の実施形態において、本発明によるリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、２５時間の０．３Ｍ  ＮａＯＨへの曝露の後に、その初期結合能の最大８５％を保持する。さらなる実施形態において、本発明によるリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、２５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露の後に、その初期結合能の最大６５％を保持する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明によるＳｐＡベースのクロマトグラフィーマトリックスは、野生型ＳｐＡドメインを含むマトリックスと比較して、増大または改善したアルカリ安定性を示す。しかしながら、他の実施形態において、本発明によるＳｐＡベースのクロマトグラフィーマトリックスは、リガンドの野生型対応物を含むマトリックスほどアルカリ安定性ではない。１つのこのような例は、その野生型ペンタマーＣドメイン対応物ほどアルカリ安定性ではないＳｐＡのペンタマーＣドメインベースのリガンドである。特定の場合において、ＳｐＡドメインの野生型と変異体の両方がＧ２９Ｋ突然変異を含みＦａｂ結合を低減する可能性はあるが、しかしながら、このような突然変異自体はアルカリ安定性に対して影響がないことは理解される（データ示さず）。
【００６８】
アルカリ安定性は、通常の実験を使用しておよび／または本明細書に記載するように、当業者により容易に測定することができる。
【００６９】
本明細書で使用する用語「初期結合能」は、アルカリ条件にマトリックスを曝す前に単位体積のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス（すなわち、アフィニティーリガンドを含むマトリックス）によって捕捉され得る、標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）の量を指す。
【００７０】
本発明によるいくつかの実施形態において、本明細書に記載するリガンドを含む（すなわち、本明細書に記載するＮ末端欠失を含む１つ以上のＳｐＡのＢ、ＺまたはＣドメインを含有する）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、苛性条件への長時間の曝露の後、本明細書に記載した対応する野生型ＳｐＡドメイン対応物を含有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに対して、標的分子の初期結合能の５％未満、または６％未満、または７％未満、または８％未満、または９％未満、または１０％未満、または１２％未満、または１５％未満、または１７％未満、または２０％未満、または２５％未満、または３０％未満の消失を示す。いくつかの実施形態において、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、苛性条件への長時間の曝露の後、対応する野生型ＳｐＡドメイン対応物を含有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに対して、標的分子の初期結合能の少なくとも９５％、または少なくとも９０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８０％、または少なくとも７５％、または少なくとも７０％を保持する。しかしながら、いくつかの他の実施形態において、本発明によるクロマトグラフィーマトリックスは、苛性条件への長時間の曝露の後、リガンドの野生型対応物を含有するマトリックスと類似した結合能を示す。１つのこのような例示的クロマトグラフィーマトリックスは、５つ以上の、ＳｐＡのＣドメインを含むリガンドを含み、それぞれのドメインはＮ末端から欠失した４アミノ酸を含み、このリガンドはその野生型Ｃドメイン対応物ほどアルカリ安定性ではない。欠失型と野生型対応物の両方がＧ２９Ｋ突然変異を含有し得る。さらに、本明細書に記載する様々な実施形態において、ＳｐＡリガンドは、マルチマー中の唯一の第一ドメインのＮ末端に、アラニン、バリンまたはグリシンなどの一アミノ酸をさらに含む可能性があり、追加のアミノ酸は、同種の翻訳後プロセシングを容易にする。
【００７１】
標的分子に対するアフィニティークロマトグラフィーリガンドの結合能は、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている米国特許公開第２０１００２２１８４４号中に記載されたように、当技術分野で知られている方法および本明細書に記載する方法を使用して容易に測定することができる。
【００７２】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフィー」は、混合物中の他の分子から対象の標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を分離し、それを単離することができる動的分離技法を指す。典型的には、クロマトグラフィー法では、移動相（液体または気体）は、固定相（通常固体）媒体を越えてまたは介して対象の標的分子を含有する試料を運ぶ。移動相が異なる時間で異なる分子を運びながら、固定相への分配またはアフィニティーの差によって異なる分子を分離する。
【００７３】
本明細書で使用する用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、分離する標的分子を、標的分子と特異的に相互作用する分子（例えば、アルカリ安定性クロマトグラフィーリガンド）とのその相互作用によって単離する、クロマトグラフィーの形態を指す。一実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、本明細書に記載するＳｐＡベースのリガンドを表面上に有する固形担体への、標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を含有する試料の添加を伴う。
【００７４】
本明細書で使用する用語「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」は、ＳｐＡまたはプロテインＡリガンドが例えば固形担体上に固定された、本明細書に記載するリガンドなどのプロテインＡまたはＳｐＡベースのリガンドを使用する、物質の分離または単離を指す。当技術分野で知られているプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体／樹脂の例には、多孔性ガラス骨格上に固定されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＲＯＳＥＰ  Ａ（商標）およびＰＲＯＳＥＰ  ｖＡ（商標）媒体／樹脂（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ポリスチレン固相上に固定されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＯＲＯＳ  ５０Ａ（商標）およびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（商標）媒体／樹脂（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＩＮＣ．）、ならびにアガロース固形担体上に固定されたプロテインＡを有するもの、例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）またはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）媒体または樹脂（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）がある。
【００７５】
前述のマトリックス以外に、プロテインＡを親水性架橋ポリマー上に固定することも可能である。例えば、例示的な親水性架橋ポリマーを記載する、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００８０２１０６１５号を参照。理論によって縛られることは望まないが、本発明によって包含されるリガンドは、米国特許公開第２００８０２１０６１５号中に記載されたポリマーなどの、親水性架橋ポリマー上に固定することが可能であることは企図される。
【００７６】
本明細書で互換的に使用する用語「アフィニティーマトリックス」または「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、その上にアフィニティークロマトグラフィーリガンド（例えば、ＳｐＡまたはそのドメイン）が結合されているクロマトグラフィー担体を指す。リガンドは、アフィニティー相互作用を通して、混合物から精製または除去される対象の分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）と結合することができる。プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するための、当技術分野で知られている例示的なプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスには、多孔性ガラス骨格上に固定されたプロテインＡ、例えば、ＰＲＯＳＥＰ  Ａ（商標）およびＰＲＯＳＥＰ  ｖＡ（商標）樹脂、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、Ｕｌｔｒａ  ａｎｄ  ＰＲＯＳＥＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ポリスチレン固相上に固定されたプロテインＡ、例えば、ＰＯＲＯＳ  ５０Ａ（商標）樹脂およびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（商標）（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）、またはアガロース固相上に固定されたプロテインＡ、例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）もしくはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）がある。
【００７７】
（本明細書で互換的に使用する）用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」は、２本の重鎖と２本の軽鎖からなる基本４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、該タンパク質は抗原と特異的に結合する能力を有する。（本明細書で互換的に使用する）用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」は、１本の重鎖と１本の軽鎖からなる２本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、該タンパク質は抗原と特異的に結合する能力を有する。用語「ドメイン」は、例えばβ−プリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって安定化される、ペプチドループを含む（例えば、３−４ペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。「定常」ドメインの場合は様々なクラスメンバーのドメイン内の相対的な配列変異の欠如、または「可変」ドメインの場合は様々なクラスメンバーのドメイン内の有意な変異に基づいて、ドメインは本明細書ではさらに「定常」または「可変」と呼ぶ。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、当技術分野では抗体またはポリペプチド「領域」と互換的に呼ばれることが多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
【００７８】
免疫グロブリンまたは抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよく、モノマーまたはポリマー型、例えば、ペンタマー型で存在するＩｇＭ抗体、および／またはモノマー、ダイマーもしくはマルチマー型で存在するＩｇＡ抗体で存在してよい。用語「断片」は、無傷または完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。無傷または完全な抗体または抗体鎖の化学または酵素処理によって、断片を得ることができる。組換え手段によって断片を得ることもできる。例示的な断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖ断片がある。
【００７９】
用語「抗原結合断片」は、抗原と結合する、または抗原結合（すなわち、特異的結合）に関して無傷抗体と（すなわち、それらが由来した無傷抗体と）競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド部分を指す。結合断片は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。結合断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖、および単鎖抗体がある。
【００８０】
融合タンパク質の一部として抗体またはその断片を含む、融合タンパク質も包含される。
【００８１】
本明細書で互換的に使用する用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。これらの用語は、一本、二本もしくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的修飾型、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡまたはＤＮＡ中で典型的に見ることができるように）糖およびリン酸基、または修飾もしくは置換糖もしくはリン酸基を含むことができる。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成すること、および適切な条件下で鎖をアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼおよび適切なプライマーを使用してデノボで相補鎖を合成することのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。核酸分子は、多くの異なる型、例えば、遺伝子または遺伝子断片、１つ以上のエクソン、１つ以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーの型をとることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなど、ウラシル、他の糖および結合基、フルオロリボースおよびチオエート、ならびにヌクレオチド分枝などを含むことができる。本明細書で使用するように、「ＤＮＡ」または「ヌクレオチド配列」は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧを含むだけでなく、これらの塩基の任意のそれらのアナログまたは修飾型、メチル化ヌクレオチドなど、ヌクレオチド間修飾、非帯電結合およびチオエートなど、糖アナログの使用、ならびに修飾および／または改変骨格構造、ポリアミドなども含む。特定の実施形態において、本明細書に記載するように、核酸分子はＳｐＡの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
用語「Ｆｃ結合」、「Ｆｃ部分と結合する」または「Ｆｃ部分との結合」は、抗体の定常部分（Ｆｃ）と結合する、本明細書に記載するアフィニティーリガンドの能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明によるリガンドは、少なくとも１０−７Ｍ、または少なくとも１０−８Ｍ、または少なくとも１０−９Ｍのアフィニティーで抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）のＦｃ部分と結合する。
【００８３】
本明細書で使用する用語「Ｆａｂ結合」または「Ｆａｂ部分との結合」は、抗体または免疫グロブリン分子のＦａｂ領域と結合する、本明細書に記載するアフィニティーリガンドの能力を指す。用語「Ｆａｂ部分との結合の低減」は、対照（例えば、野生型ＳｐＡドメイン）に対する、本発明によるＳｐＡベースのリガンドによる免疫グロブリン分子のＦａｂ（またはＦ（ａｂ）２）部分との結合の任意の低下を指し、リガンドは１つ以上のアミノ酸の突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明によるリガンドおよびその（対照として使用する）野生型対応物は、位置２９にアラニンまたはトリプトファン以外のアミノ酸で置換されたグリシン残基を含む。特定の実施形態において、本発明によるリガンドは位置２９にリジン残基を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載するリガンドによる免疫グロブリン分子のＦａｂ部分との結合は、当技術分野の従来の技法および本明細書に記載する技法を使用して検出不能である。免疫グロブリン分子との結合は、本明細書に記載する技法、ならびに例えば、アフィニティークロマトグラフィーおよび表面プラズモン共鳴分析法だけには限られないがこれらを含む、よく知られている技法を使用して検出することができる。いくつかの実施形態において、本発明によって包含される免疫グロブリン結合タンパク質は、少なくとも１０−１０Ｍのアフィニティーで免疫グロブリン分子と結合する。
【００８４】
本明細書で使用する用語「Ｎ末端」は、図１中に示すような各ドメインのアミノ酸配列の位置１または位置２で始まるＳｐＡドメインのアミノ酸配列のアミノ末端を指す。しかしながら、配列中の第一アミノ酸は、メチオニンアミノ酸残基または例えばアラニン、グリシンもしくはバリンなど、タンパク質の同種の翻訳後プロセシングを容易にするための別のアミノ酸に先行され得ることは理解される。本明細書に記載するＳｐＡリガンドは、ＳｐＡドメインの（図１中に示すＢ、ＣまたはＺドメインアミノ酸配列の位置１または位置２で始まる）Ｎ末端からの少なくとも３つの、または少なくとも４つの、または少なくとも５つの連続アミノ酸の欠失を含む。言い換えると、このようなリガンドは、ＳｐＡドメインＢ、ＺもしくはＣの、連続アミノ酸１から３、もしくは連続アミノ酸１から４、もしくは連続アミノ酸１から５の欠失などを含み、またはこのようなリガンドは、ＳｐＡドメインＢ、ＺもしくはＣの、連続アミノ酸２から４、もしくは連続アミノ酸２から５、もしくは連続アミノ酸２から６の欠失などを含む（野生型Ｂ、ＣおよびＺドメインのアミノ酸配列は図１中に示し、これらは修飾されてＮ末端からの欠失を含む。）。特定の実施形態において、本発明によるリガンドは５つのＣドメインを含み、それぞれのドメインは、位置１で始まる、Ｎ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を含む。
【００８５】
Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失を含有するＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列は配列番号１３で示し、Ｎ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を含有するアミノ酸配列は配列番号２８で示す。さらに、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失を含有するＳｐＡのＣドメインのアミノ酸配列は配列番号１４で示し、Ｎ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を含有するアミノ酸配列は配列番号２９で示す。さらに、Ｎ末端からの３つの連続アミノ酸の欠失を含有するＺドメインのアミノ酸配列は配列番号１５で示し、Ｎ末端からの４つの連続アミノ酸の欠失を含有するアミノ酸配列は配列番号３０で示す。
【００８６】
一般に、本明細書に記載するマルチマー型のＳｐＡベースのリガンドの場合、モノマー型のリガンドのアミノ酸配列は望ましくは単に反復される。しかしながら、本発明によるいくつかのマルチマー型のリガンドの場合、全ドメインがＮ末端からの欠失を有する必要はないことに留意しなければならない。例えば、いくつかの実施形態において、リガンドはマルチマー型のリガンド中の第一ドメインのＮ末端における欠失を含有しないが、しかしながら、リガンド中の後のドメインは、Ｎ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの少なくとも４つの連続アミノ酸の欠失、またはＮ末端からの少なくとも５つの連続アミノ酸の欠失を含有する。
【００８７】
本発明によるＳｐＡベースのリガンドは、本明細書の実施例によって証明されるように、優れた予想外の性質、すなわち精製プロセスにおける使用中の低減した断片化を有する。特に、従来技術の教示は、このようなリガンドを作製および使用する意欲から離れて教示するようである。例えば、米国特許公開第２０１０００４８８７６号は、ＳｐＡのＣドメインのアミノ酸残基３から６における欠失を含むリガンドを論じるが、しかしながら、この刊行物の教示に基づくと（例えば、米国特許公開第２０１０００４８８７６号の図２を参照）、その中に記載された欠失突然変異体は、結合能の保持に関して、長時間の苛性曝露でＳｐＡの野生型Ｃドメインと比較してあまり機能しないようである。したがって、この参照文献の教示に基づくと、それがその野生型対応物に比べて、経時的に多くの結合能を消失するとき、ＳｐＡのＣドメインの欠失突然変異体の使用が望ましい可能性は低い。
【００８８】
便宜上、本出願中に言及する様々な配列を以下の表Ｉ中に要約する。
【００８９】
【表１】
2014193892.tif 000002
2014193892.tif 000003
2014193892.tif 000004
2014193892.tif 000005
【００９０】
ＩＩ．クロマトグラフィーリガンドとして使用するためのＳｐＡベース分子の生成
本発明によって包含されるＳｐＡベースのアフィニティークロマトグラフィーリガンドは、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して作製することができる。
【００９１】
例えば、初期ステップとして、標準的な遺伝子操作技法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓという表題の研究室用マニュアル中に記載された技法を、本明細書に記載するＳｐＡリガンド分子を発現する核酸の生成のために使用することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失を有するＳｐＡの１つ以上のドメインをコードする核酸分子を、適切な宿主細胞中での発現に適したベクターにクローニングすることができる。適切な発現ベクターは当技術分野でよく知られており、変異体ＳｐＡコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを典型的には含む。
【００９３】
本明細書に記載するＳｐＡ分子は、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）手法（例えば、米国特許第６，０６０，５９６号、同第４，８７９，３７８号、同第５，１９８，５３１号、同第５，２４０，６８０号を参照）などの固相ペプチド合成法を含めた当技術分野でよく知られている方法を使用して、断片としてアミノ酸前駆体から化学的に合成することもできる。
【００９４】
本明細書に記載するＳｐＡ分子の発現は、例えば、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞などの真核宿主細胞、ならびに原核宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌などの、様々な細胞型において実施することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ファージ表面上に提示される個々のＳｐＡ分子をコードするＤＮＡ配列をそれぞれのファージが含有するように、バクテリオファージの表面上でＳｐＡ分子を発現させることが可能である。免疫グロブリンに対するＳｐＡ分子のアフィニティーは、当技術分野の標準的技法および本明細書に記載する技法、例えばＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（商標）２０００標準設定（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、容易にアッセイすることができる。本明細書に記載するように、免疫グロブリンに対する本発明のＳｐＡ分子の結合アフィニティーは親分子のそれに少なくとも匹敵し、分子は使用中に低減した断片化を示すことが望ましい。
【００９６】
ＩＩＩ．クロマトグラフィーマトリックスの調製に使用する担体
いくつかの実施形態において、本発明によって包含されるＳｐＡリガンドを、担体、例えば固形担体または可溶性担体上に固定して、例えば、免疫グロブリンおよびＦｃ含有タンパク質などの生体分子の分離に適したアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを生成する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本発明によるリガンドは固形担体上に固定する。理論によって縛られることは望まないが、任意の適切な固形担体を、本発明によるリガンドの結合に使用することができることは企図される。例えば、固形担体マトリックスには、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレンならびにこれらの誘導体（例えば、これらの合金）があるが、これらだけには限られない。固形担体は、多孔質材料または非多孔質材料であってよい。
【００９８】
いくつかの実施形態において、固形担体は多孔質材料である。固形担体として使用される多孔質材料は、親水性化合物、疎水性化合物、疎油性化合物、親油性化合物、またはこれらの任意の組合せで構成され得る。多孔質材料は、ポリマーまたはコポリマーで構成され得る。適切な多孔質材料の例には、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、例えばナイロン、多糖、例えばアガロースおよびセルロースなど、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリビニリデンフルオリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリカーボネート、フルオロカーボンポリマー、例えばポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル））、ガラス、シリカ、ジルコニア、チタニア、セラミック、金属ならびにこれらの合金があるが、これらだけには限られない。
【００９９】
多孔質材料は、有機もしくは無機分子または有機分子と無機分子の組合せで構成されてよく、反応、例えばさらなる化学修飾の共有結合を形成して、タンパク質と共有結合するのに適した、１つ以上の官能基、例えばヒドロキシル基、エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボニル基、またはカルボン酸基で構成されてよい。別の実施形態において、多孔質材料は官能基を有し得ないが、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ酸基、カルボニル基、またはカルボン酸基などの官能基を有する材料の層でコーティングされ得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、例えば有機的性質であり、使用する水性媒体に親水性表面が露出した、すなわちそれらの外側表面、および存在する場合さらに内部表面の、ヒドロキシ（−−ＯＨ）、カルボキシ（−−ＣＯＯＨ）、カルボニル（−−ＣＨＯ、またはＲＣＯ−Ｒ’）、カルボキサミド（−−ＣＯＮＨ２、おそらくＮ−置換型）、アミノ（−−ＮＨ２、おそらく置換型）、オリゴ−またはポリエチレンオキシ基が露出した、ポリマーをベースとする、従来のアフィニティー分離マトリックスを使用する。一実施形態において、ポリマーは、デキストラン、スターチ、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖を例えばベースとするものであってよく、例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、アリルブロミド、アリルグリシジルエーテル、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素で有利に架橋されて、適切な多孔性および剛性をもたらす。別の実施形態において、固形担体は多孔質アガロースビーズを含む。本発明において使用する様々な担体は、例えばＨｊｅｒｔｅｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２）、３９３−３９８頁（１９６４）中に記載された例えば逆懸濁ゲル化などの、当技術分野で知られている標準的な方法に従い容易に調製することができる。あるいは、ベースマトリックスは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）などの市販の製品であってよい。いくつかの実施形態において、大規模分離に特に有利に、担体を適合させてその剛性を増大させ、したがってマトリックスは高流速により適したものとなる。
【０１０１】
あるいは、固形担体は、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの、合成ポリマーをベースとするものであってよい。ジビニルおよびモノビニル置換ベンゼンをベースとするマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックスの表面を親水状態にして、前に定義した親水基を周囲の水性液体に露出させることが多い。このようなポリマーは、標準的な方法に従い容易に生成することができる。例えば、Ａｒｓｈａｄｙ、Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９）、７０−７５頁（１９８８）を参照。あるいは、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）およびＰｏｒｏｓ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの市販の製品を使用することができる。
【０１０２】
さらに他の実施形態において、固形担体は、無機的性質の担体、例えばシリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、およびこれらの合金を含む。無機マトリックスの表面は、ＳｐＡおよびその変異体とのさらなる反応に適した反応基を含むように修飾することが多い。例にはＣＭ  Ｚｉｒｃｏｎｉａ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ−ＢｉｏＳｅｐｒａ（ＣＥＲＧＹＰＯＮＴＯＩＳＥ、フランス）およびＣＰＧ（登録商標）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）がある。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、固形担体は、例えば、反応基を含有するおよび／または苛性浸漬を維持するように修飾してリガンドにカップリングすることができる、多孔性ガラスの型のジルコニア、チタンまたはシリカをベースとするものであってよい。
【０１０４】
例示的な固形担体形式には、ビーズ（球状または不整）、中空ファイバー、中実ファイバー、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレートまたはモノリスがあるが、これらだけには限られない。
【０１０５】
マトリックスの形式に関して、一実施形態において、それは多孔質モノリスの型であり、例えばシリカなどの無機材料、または例えばポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリビニリデンフルオリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリカーボネートなどの有機材料を使用して作製することができる。モノリスの場合、それは重合を介して、または基質をコーティングすることにより形成することができる。
【０１０６】
代替的な実施形態において、マトリックスは、多孔質または非多孔質であってよいビーズまたは粒子型である。粒子は球状または非球状、ならびに磁性または非磁性であってよい。ビーズまたは粒子型のマトリックスは、充填層としてまたは縣濁型で使用することができる。縣濁型には膨張床および同質懸濁液として知られるものがあり、その中で粒子またはビーズは自由に移動する。モノリス、充填層および膨張床の場合、濃度勾配での従来のクロマトグラフィーに分離手順が一般に続く。同質懸濁液の場合、バッチワイズ形態が使用される。さらに、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルターなどの型の固形担体を使用することができる。
【０１０７】
マトリックスは膜カートリッジの型であってもよい。膜はフラットシート、スパイラル、または中空ファイバー形式であってよい。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明によるリガンドは、可溶性担体、例えば可溶性ポリマーまたは水溶性ポリマーと結合させる。例示的な可溶性担体には、バイオポリマー、例えばタンパク質または核酸などがあるが、これらだけには限られない。いくつかの実施形態において、例えば米国特許公開第２００８０１０８０５３号中に記載されたように、可溶性ポリマーとしてビオチンを使用することができる。例えば、ビオチンはリガンド、例えば本発明によるＳｐＡベースのリガンドに結合させることが可能であり、リガンドへの結合後、例えば粗製混合物中に存在する、対象のタンパク質、例えば抗体またはその断片を単離するのに使用することができ、対象のタンパク質は、可逆的または不可逆的形式のいずれかでビオチン−リガンド−タンパク質ポリマー複合体の沈殿によって単離または分離することができる。ポリマーは、例えば、負に荷電した基（カルボンまたはスルホン）、正に荷電した基（第四級アミン、第三級アミン、第二級または第一級基）、疎水基（フェニルまたはブチル基）、親水基（ヒドロキシル、またはアミノ基）または前述の任意の組合せを含有するポリマーなどだけには限られないが、これらを含めた、合成可溶性ポリマーであってもよい。例示的な合成可溶性ポリマーは、参照によりその教示の全容が本明細書に組み込まれている、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８０９１７４０号および米国公開第ＵＳ２００８０２５５０２７号中で見ることができる。ｐＨ、伝導性または温度などの１つ以上の条件の特異的物理的変化によって、これらのポリマーを使用して、可逆的または不可逆的形式のいずれかで沈殿により対象のタンパク質を精製することができる。合成可溶性ポリマーは単独で使用することができ、または本発明によるリガンドとカップリングさせ、可逆的もしくは不可逆的形式のいずれかで沈殿により、対象のタンパク質、例えば抗体もしくはその断片などの捕捉／精製に使用することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、リガンドはマルチウエルプレート形式で膜と結合する。さらに他の実施形態において、リガンドはキャピラリーまたはマイクロ流体デバイス中に取り込まれる。
【０１１０】
ＩＶ．担体にリガンドを結合させるための方法
任意の適切な技法を、担体、例えば当技術分野でよく知られており本明細書に記載する担体を含めた固形担体に、本明細書に記載するリガンドを結合させるために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、例えばリガンド中に存在するアミノおよび／またはカルボキシ基を使用する従来のカップリング技法によって、担体にリガンドを結合させることが可能である。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などが、よく知られているカップリング試薬である。いくつかの実施形態において、スペーサーを担体とリガンドの間に導入し、これによってリガンドの利用性を改善し、担体とリガンドの化学的カップリングを容易にする。
【０１１１】
本発明によって包含される様々な実施形態において、リガンド上の２箇所以上の部位をこのような固形担体と結合させ（すなわち、多点結合によって）、それによって長時間の苛性曝露時にリガンドの低減した断片化を示すアフィニティークロマトグラフィーマトリックスをもたらす（遊離リガンドと結合リガンド両方の場合）。
【０１１２】
固形担体へのＳｐＡベースのクロマトグラフィーリガンドの結合は、その大部分は当技術分野でよく知られている公知の多くの異なる方法、および本明細書に記載する方法によって実施することができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５１−１３６頁（１９９２）を参照。
【０１１３】
例えば、タンパク質リガンドは、固形担体またはタンパク質リガンドのいずれかの表面上の活性基、例えばヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニル、エポキシド、またはカルボン酸基などを介して、固形担体にカップリングさせることが可能である。結合は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル、エポキシ（ビスオキシラン）活性化、および還元的アミノ化の使用だけには限られないが、これらを含めた公知の化学的性質を使用して実施することができる。
【０１１４】
例えば、チオール誘導タンパク質カップリングが文献中に記載されている。例えば、Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  １８６、５５８−５６１頁（１９８９）を参照。この技法は以前に固形担体へのＳｐＡのカップリングに適用された。野生型ＳｐＡはチオール基を含有しないので、ＳｐＡのＣ末端にチオール含有システインを組換えにより挿入することによって結合を実施する。例えば、米国特許第６，３９９，７５０号を参照。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸなどの、いくつかの市販品がこの機構によって生成される。この末端システインのみが固形表面上のエポキシド基と反応し、それによって固形担体とＳｐＡの単一点結合をもたらすことが報告されている。例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６、４７３頁を参照。
【０１１５】
本発明によるいくつかの実施形態において、ＳｐＡベースのクロマトグラフィーリガンド上の２箇所以上の部位を、無差別、多点結合によって固形担体と結合させる。一般に、ＳｐＡは各ドメイン中に多数のリジン由来の多量の遊離アミノ基を含有する。多点結合による固形担体、例えばエポキシドまたはアルデヒド基を有するクロマトグラフィー樹脂とＳｐＡドメインの結合は、それぞれエポキシド開環または還元的アミノ化を介した、ＳｐＡ上のリジンのアミノ基の反応により実施することができる。特定の実施形態において、多点結合は、開環反応を介した、遊離ヒドロキシル基を有するＳｐＡ上の１つ以上の天然に存在するアミノ酸、例えばセリンおよびチロシンなどと、エポキシド基を含有する担体の反応により実施することができる。あるいは多点結合は、例えば、例えばＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを介した、遊離カルボン酸基を有するＳｐＡ上の天然に存在するアミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸などと、アミノ基を含有する担体の反応により実施することができる。担体とリガンドの多点結合は、前述の全ての機構の組合せにより実施することもできる。
【０１１６】
ＳｐＡベースのクロマトグラフィーリガンドは、会合機構を介して固形担体と結合させることも可能である。例えば会合基は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、または相互作用の組合せを介して非共有結合により対象のリガンドと相互作用し、それによって固形表面上の対象のリガンドと結合することができる。例えば参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，８３３，７２３号および同第７，８４６，６８２号中に記載されたように、これは固形マトリックスとリガンドの高効率のカップリングを容易にし、それによって会合基を含まない密度より高いリガンド密度をもたらす。本発明において使用するのに適した会合基には、イオン種などの荷電種、および疎水種などの非荷電種がある。会合基は、例えば固形担体と直接共有結合することによって、固形担体を修飾することができる。イオン種の適切な例は、第四級アミン、第三級アミン、第二級アミン、第一級アミン、スルホン酸基、カルボン酸、またはこれらの任意の組合せを含み得る。疎水種の適切な例は、フェニル基、ブチル基、プロピル基、またはこれらの任意の組合せを含み得る。混合形式の種を使用することができることも企図される。会合基は、タンパク質リガンドと相互作用することもできる。したがって、会合基とタンパク質リガンドの間の相互作用は、混合相互作用、例えばイオン種と疎水種で構成され得る。
【０１１７】
固形担体上の官能基と会合基上の官能基の反応によって、会合基を固形担体と共有結合させることが可能である。適切な官能基には、アミン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、イミン、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、アゾ、ニトリル、エポキシド、シアンおよび活性カルボン酸基があるが、これらだけには限られない。一例として、アガロースビーズは、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリドなどの正に荷電した会合基のエポキシド官能基と反応することができるヒドロキシル基を含有する。当業者は、少なくとも１つの二官能性会合基を使用する条件で、複数の会合基を固形担体とカップリングさせることが可能であることを理解している。したがって会合基は固形担体に直列にカップリングさせることが可能であり、または会合基は固形担体に個々に直接カップリングさせることが可能である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、介在リンカーを介して固形担体にカップリングすることができる、会合基および／またはタンパク質リガンドを提供する。リンカーは、連結部分とカップリングした少なくとも１つの官能基を含むことができる。連結部分は、官能基にカップリングすることができる任意の分子を含むことができる。例えば連結部分は、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基のいずれかを含むことができる。連結部分は、１から３０炭素原子の範囲の炭素鎖を含むことができる。いくつかの実施形態において、リンカーは３０を超える炭素原子で構成されてよい。連結部分は、窒素、酸素および硫黄などの少なくとも１つのヘテロ原子を含むことができる。連結部分は、分枝鎖、非分枝鎖または環状鎖で構成されてよい。連結部分は、２つ以上の官能基で置換することができる。
【０１１９】
タンパク質リガンドと固形担体のカップリングに適したバッファー条件の選択は、十分当業者の能力の範疇にある。適切なバッファーには、例えば、１０ｍＭから５Ｍの範囲の濃度での、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど、または前述の任意の組合せがある。いくつかの実施形態において、塩の濃度は０．１Ｍから１．５Ｍの範囲である。
【０１２０】
他の適切なバッファーには、炭酸、重炭酸、硫酸、リン酸および酢酸バッファーなどの任意の非アミン含有バッファー、または前述の組合せがある。会合の化学的性質を使用するとき、バッファーの塩濃度は使用する会合基に依存する。例えば、塩濃度は５ｎＭ−１００ｍＭの範囲であってよい。荷電種を使用する場合、塩濃度は少なくとも５ｎＭただし０．１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭただし０．０１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭただし０．００１Ｍ未満であってよい。特定の実施形態において、塩濃度は０．０１Ｍであってよい。疎水種を使用する場合、高い塩濃度が通常望ましい。したがって、塩濃度は０．００１Ｍ超、０．０１Ｍ超、または０．１Ｍ超であってよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、会合の化学的性質を使用するとき、０℃から９９℃の範囲の温度で反応を実施する。特定の実施形態において、反応法は６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満、または１０℃未満の温度で実施する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は約４℃の温度で実施する。他の実施形態において、本発明の方法は２０℃の温度で実施する。
【０１２２】
Ｖ．リガンドの低減した断片化に関するアッセイ
本発明は、１つ以上のＢ、ＺまたはＣドメインベースのＳｐＡリガンドを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供し、１つ以上のドメインは位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つのまたは４つのまたは５つの連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＡベースのリガンド上の２箇所以上の部位がクロマトグラフィーマトリックスと結合する。
【０１２３】
本発明は、本明細書に記載するリガンド、遊離型と固形担体（例えば、クロマトグラフィーマトリックス）上の固定時の両方で、精製プロセスにおける使用中に長時間の苛性条件への曝露の後に、低減した断片化を示すという、予想外の驚くべき発見に基づく。前に論じたように、このような断片化は望ましくない。それが、おそらく治療標的タンパク質に行き着くＳｐＡドメインのおそらく免疫原性断片をもたらすからである。さらに、プロセス中により多くのリガンドの使用を必要とするため、断片化は精製プロセスをより高価なものにする。
【０１２４】
アフィニティーリガンドの断片化は、当技術分野で知られている方法および本明細書に記載する方法を使用して、容易に検出することができる。このような方法には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣがあるが、これらだけには限られない。
【０１２５】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、タンパク質の分子量解析に一般に使用される。ＳＤＳはタンパク質を解離しアンフォールディングする洗浄剤である。ＳＤＳはポリペプチドと結合し、ほぼ一定の電荷質量比で複合体を形成する。したがってゲル中の電気泳動移動度は、複合体の大きさによってのみ決定される。知られている分子量のマーカータンパク質を同時に施用することによって、分子量を決定する。典型的にはゲルを染色し、異なる分子量の生体分子の存在を目に見える状態にすることができる。
【０１２６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子をそれらの大きさによって分離する方法である。それは通常、タンパク質および産業用ポリマーなどの巨大またはマクロ分子複合体に施用する。異なる分子種の検出は、典型的にはＵＶ−Ｖｉｓによってまたは光散乱によって実施する。ＵＶ−Ｖｉｓの場合、特定種の検出に特異的な波長を選択する。クロマトグラムで観察する特定分子種が溶出する順序、および対応するピークの強度は、種型および相対量に関する情報を与える。
【０１２７】
本明細書に含まれる実施例によって実証されるように、本発明によるＳｐＡリガンドは、苛性条件への曝露の後に、それらの野生型対応物に比べて、低減した断片化を示す。低減した断片化を示すための例示的な実験では、本明細書に記載するＮ末端欠失を有するＳｐＡリガンド、およびその野生型対応物の両方を２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨに曝す。次いで溶液を、酸を用いてｐＨ７に中和する。分析および比較用に、中和溶液はＳＥＣに注入する、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填する。
【０１２８】
低減した断片化を示すための別の例示的な実験では、本明細書に記載する（多点結合により固定し）固形担体と結合されているＮ末端欠失を有するリガンドを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックス、および（多点結合により固定し）固形担体と結合されているその野生型対応物を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの両方を２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨに曝す。苛性溶液およびマトリックス（例えば、樹脂の型）を分離し、すぐに酸を用いてｐＨ７に中和する。分析および比較用に、中和溶液はＳＥＣに注入する、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填する。
【０１２９】
ＶＩ．リガンドのアルカリ安定性に関するアッセイ
精製プロセスにおける使用中に低減した断片化を示すこと以外に、本明細書に記載するリガンドはさらにアルカリ安定性である。本明細書に記載するＳｐＡベースのリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスの生成後、リガンドを含有するマトリックスのアルカリ安定性は、当技術分野で標準的な技法および本明細書に記載する技法を使用してアッセイすることができる。
【０１３０】
例えば、マトリックス上に固定されたリガンドのアルカリ安定性は、例えば本明細書および、参照によりその全容が完全に本明細書に組み込まれている米国特許公開第２０１００２２１８４４号中に記載されたように、約０．５Ｍの濃度でＮａＯＨを用いる通常の処理を使用してアッセイすることができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、アルカリ安定性ＳｐＡ分子およびこれらを取り込んだマトリックスは、「増大した」または「改善された」アルカリ安定性を示し、分子およびこれらを取り込んだマトリックスは、それらの野生型対応物に比べて、長時間の間アルカリ条件下において安定性があること意味する。以前に、ＳｐＡの野生型Ｂ、ＣもしくはＺドメインベースまたは１つ以上のアスパラギン残基の突然変異を有するＳｐＡリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスは、ｐＨが約１０を超える、最大約１３または１４などの条件下において、改善されたアルカリ安定性をもたらすことが報告されている。しかしながら、これらのリガンドのいくつかは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の断片の存在またはＳＥＣにより観察して、使用中に、特にＣＩＰのサイクルを繰り返した後に断片化を示すようである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明によるリガンドおよびこれらを取り込んだマトリックスは、それらの野生型対応物ほどアルカリ安定性ではないが、それにもかかわらず、それらは低減した断片化を示す。本明細書に記載する１つのこのようなリガンドは、各ドメイン中にＮ末端欠失を含み各ドメイン中にＧ２９Ｋ突然変異を含むペンタマー型のＣドメインリガンドである。このようなリガンドは、タンパク質の同種の翻訳後プロセシングを容易にするために、ペンタマー中の正に第一のアミノ酸としてアラニンをさらに含み得る。
【０１３３】
本発明は、苛性条件（例えば、２５時間以上０．１Ｍ  ＮａＯＨ）への長時間曝露後に初期結合能の少なくとも９５％を保持することに加えて、以前に記載されたリガンドのいくつかに対して精製プロセスにおける使用中に低減した断片化を示す、（遊離型とクロマトグラフィーマトリックスへの固定時の両方）新規なＳｐＡリガンドという、驚くべき予想外の発見に基づく。いくつかの実施形態において、リガンド上の２箇所以上の部位が固形担体と結合し、これらのリガンドはＳｐＡのＢ、ＣまたはＺドメインをベースとし、リガンドは位置１または位置２で始まる、Ｎ末端からの３つの、４つのまたは５つの連続アミノ酸の欠失を有する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、それぞれのサイクルが０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いた１５分間の処理を含む１００サイクル後、本明細書に記載するＳｐＡリガンド（例えば、１つ以上のＢ、ＣまたはＺドメイン、およびこれらの任意の組合せを含み、Ｂ、ＣまたはＺドメインの少なくとも１つがＮ末端からの少なくとも３つの連続アミノ酸の欠失を含むリガンド）の保持結合能の割合は、野生型対応物のそれの少なくとも１．２５倍超、１．５倍超、２．０倍超、２．５倍超、または３倍超である。
【０１３５】
一実施形態において、経時的にＩｇＧ結合能の保持によりアッセイする固定リガンドのアルカリ安定性は、以下のように測定する。Ｑｄ５０％と呼ばれる結合能を、初期ＩｇＧ濃度の５０％のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度に基づく濃度に充填するＩｇＧ体積を得ることによって測定する。クロマトグラフィーマトリックス（例えば、カラム中に充填された樹脂）の初期Ｑｄ５０％を最初に測定する。クロマトグラフィーマトリックス（例えば、前に記載した樹脂）を、０．８ｍＬ／分での０．５Ｍ  ＮａＯＨの１５分間曝露の約１０サイクルに次いで曝す。Ｑｄ５０％を再度測定する。クロマトグラフィーマトリックスが合計約１００サイクルの０．５Ｍ  ＮａＯＨに曝されるまで、このプロセスを繰り返す。Ｑｄ５０％を最後に一度測定し、本明細書に記載するリガンドを含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックス（例えば、リガンドを固定したクロマトグラフィー樹脂）からの結果は、ＳｐＡのそれぞれの野生型ドメインと比較する。
【０１３６】
別のアッセイでは、マトリックスの苛性またはアルカリ安定性は、マトリックスの静的浸漬によって測定する。軽く回転させながら２５時間０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中に測定量のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス（例えば、樹脂形式）を浸漬し、ＮａＯＨ浸漬前後にＩｇＧ結合能を測定することによって、ＩｇＧに対するマトリックスの結合能の保持によるアルカリ安定性を決定することができる。
【０１３７】
ＶＩＩ．本発明のクロマトグラフィーマトリックスを使用する標的分子の精製法
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用して、混合物から標的分子を精製する方法を提供する。標的分子は、本明細書で提供するアフィニティーリガンドにより認識される任意の分子であってよく、リガンドは固形担体（すなわち、クロマトグラフィーマトリックス）にカップリングする。標的分子の例は、免疫グロブリンおよびＦｃ含有タンパク質を含む。免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらの機能性断片であってよい。機能性断片は、固形担体にカップリングしたタンパク質リガンドと特異的に結合するその能力を同時に保持しながら、その抗原に依然として特異的に結合する可変領域を含む免疫グロブリンの任意の断片を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用して対象の標的分子を単離する方法は、（ａ）配列番号１３−４２、配列番号５５−８４および配列番号９３−９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する固定ＳｐＡベースクロマトグラフィーリガンドを含む固形担体と、標的分子を含む混合物を、標的分子がリガンドと特異的に結合するような条件下において接触させるステップ、ならびに（ｂ）標的分子がリガンドにもはや結合しないように条件を改変し、それによって標的分子を単離するステップを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、改変ステップは、標的分子がリガンドにもはや結合しないようなｐＨの改変を含む。特定の実施形態において、それがステップ（ａ）中のｐＨ条件より酸性であるような形式でｐＨを改変する。例えば、一実施形態において、ステップ（ａ）は中性ｐＨ、または約６から約８の範囲のｐＨで実施することができ、ステップ（ｂ）は酸性ｐＨ、例えば約１から約５の範囲のｐＨで実施することができる。
【０１４０】
別の実施形態において、ステップ（ｂ）は、標的分子がリガンドにもはや結合しないような、使用中のバッファーの塩濃度の改変を含む。例えば、一実施形態において、例えば０．１Ｍを超える高い塩濃度をステップ（ａ）中で使用することができ、例えば０．１Ｍ未満の低い塩濃度をステップ（ｂ）中で使用することができる。逆に、いくつかの実施形態において、例えば０．１Ｍ未満の低い塩濃度をステップ（ａ）中で使用することができ、高い塩濃度をステップ（ｂ）中で使用することができる。さらに他の実施形態において、バッファーのｐＨと塩濃度の両方をステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間で改変することができる。
【０１４１】
当業者は、標的分子とリガンドの結合に適した条件を決定し、したがってリガンドと分子の結合を妨害するために条件を改変することが容易に可能である。
【０１４２】
一般に、本明細書に記載するリガンドは、天然ＳｐＡおよび組換えＳｐＡを典型的に使用する任意の精製プロセスまたは一連の精製プロセスにおいて、使用することができることが企図される。言い換えると、当技術分野の現行プロセスにおける（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から単離した）天然ＳｐＡおよび組換えＳｐＡ（例えば、組換えにより発現した野生型ＳｐＡ）と本明細書に記載するリガンドを置換して、全体的コストを低減し、潜在的治療分子と共に精製される潜在的免疫原性ＳｐＡ断片のリスクを軽減することが一般に望ましい。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製する方法に関するものであり、この方法は、以下の：プロセスフィードと本発明によるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを接触させて、フィード中の１つ以上の抗体を結合させるステップ、場合による洗浄ステップ、マトリックスから結合されている抗体を放出するのに適した溶出バッファーを加えるステップ、および溶出物から１つ以上の抗体を回収するステップを含む。本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、培養液、上清および発酵ブロスから抗体を単離するのに使用することもできる。発酵ブロスの場合、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの使用によって、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、細胞培養培地の１つ以上の構成成分、例えば消泡剤および抗生物質、ならびに産物関連不純物、ミスフォールディング種および凝集体などからの抗体の分離が可能である。
【０１４４】
具体的な実施形態において、それが本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと接触する前に、フィードに機械的濾過を施し、したがって移動相は浄化細胞培養ブロスである。吸着に適した条件は当業者にはよく知られている。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明は、抗体を精製するためのマルチステッププロセスに関するものであり、このプロセスは、本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用する捕捉ステップ、次に抗体の中間精製および／または最終精製のための１つ以上の後のステップを含む。特定の実施形態において、捕捉ステップに、結合溶出またはフロースルー式で、疎水性相互作用および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／または弱分配クロマトグラフィーを続ける。代替的なステップでは、捕捉ステップに、結合溶出またはフロースルー式で、マルチモードアニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィーおよび／または弱分配クロマトグラフィーを続ける。
【０１４６】
別の実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスからの任意の浸出ＳｐＡベースリガンドを、許容可能なレベルまで、例えば天然プロテインＡリガンドに許容可能であるとみなされるレベルまで、後の精製ステップによって除去することができる。
【０１４７】
一般に、本明細書に記載するリガンドは、プロテインＡリガンドを典型的に利用する任意のプロセスにおいて使用することができることは企図される。
【０１４８】
本発明を、限定的として解釈すべきではない以下の実施例によってさらに例示する。本出願、および図面を通じて引用する、全ての参照文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０１４９】
[実施例１]
４つの連続したアミノ酸のＮ末端欠失を有する１つ以上のドメインを含むＳｐＡリガンドの生成
以下のタンパク質をコードする合成遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）から得た。２つのＺドメインであって、それぞれのドメインが位置２９にＦａｂ結合を低減または排除するための突然変異（Ａ２９Ｋ）を含有するドメインを含有するＳｐＡダイマータンパク質（配列番号８５で示すアミノ酸配列）、および２つのＺドメインであって、それぞれのドメインがＡ２９Ｋ突然変異を含有し、第二ＺドメインがＮ末端から４つの連続したアミノ酸を欠失する欠失を含有するドメインを含有するＳｐＡダイマータンパク質（配列番号７８で示すアミノ酸配列）。
【０１５０】
それぞれの合成遺伝子の５’末端は開始メチオニンコドンを含み、３’末端はＮｉＮＴＡカラムを使用して後に精製する６つのヒスチジンコドン（配列番号８６）を含む。それぞれの遺伝子の５’末端および３’末端は、それぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有する。これらの合成遺伝子、および使用する発現ベクター、すなわちｐＥＴ１１ａ（ＥＭＤ）はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で消化し、ＤＮＡ断片は０．７％アガロースＴＡＥゲル上で分離し、適切なＤＮＡ断片を切除し、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）からのゲル抽出キットを使用して精製する。精製した挿入物は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、ｐＥＴ１１ａまたは任意の他の適切な発現ベクターの骨格に連結させる。
【０１５１】
連結反応物は製造者の説明書に従いＤＨ５αコンピテントＥ．コリ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＴｅｃｈｎｏｖａ  ＬＢプレート上に播種し、３７℃で一晩増殖させる。精製ＤＮＡを得るために、個々のコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢにおいて一晩培養で採取する。ＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）からのスピンミニ調製キットを使用して精製する。組換えプラスミドの同一性は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して制限消化分析により確認する。Ｚドメインダイマー構築物の２つの挿入遺伝子を含むプラスミドに関するプラスミドマップは図２中に示す。
【０１５２】
さらに、５つのＺドメインであって、それぞれのドメインがＡ２９Ｋ突然変異を含有するドメインを含有するペンタマー型のＳｐＡリガンド（配列番号９１に記載のアミノ酸配列）、および５つのＺドメインであって、それぞれのドメインがＡ２９Ｋ突然変異を含有し、第一ドメイン以外の全てがＮ末端から４つの連続したアミノ酸の欠失を含有するドメインを含有するペンタマー型のＳｐＡリガンド（配列番号８４で述べるアミノ酸配列）を発現する構築物を生成する。
【０１５３】
さらに、Ｃドメインを含有するダイマーＳｐＡリガンド構築物も生成する。そのアミノ酸配列を配列番号９２で述べるＣドメインリガンドを発現するダイマー構築物を生成し、第二ＣドメインのみがＮ末端から４つの連続したアミノ酸の欠失を含み、そのアミノ酸配列を配列番号３５で述べる２Ｃドメインリガンドを発現するダイマー構築物を生成する。これらのＣドメインダイマーリガンドは位置２９に突然変異を有していない。
【０１５４】
[実施例２]
ＳｐＡベースのリガンドの発現および精製
前に論じたように、任意の適切な細菌発現系を、本明細書に記載する様々なＳｐＡリガンドの発現に使用することができる。例えば、ｐＥＴ１１ａ（ＥＭＤ）などのｐＥＴベクターを使用して、株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）などのエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｉｌ）株において、タンパク質を発現させることが可能である。
【０１５５】
単一コロニーをプレートから選択し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地において３７℃で一晩増殖させる。一晩培養物は１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する新たなＬＢ培地に１００倍希釈し、６００ｎｍにおける光学濃度が約０．８であるような細胞密度まで増殖させる。１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えた後、細胞はさらに２時間増殖させる。発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロッティングによって確認する。
【０１５６】
細胞は遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって採取し、２０ｍＭのイミダゾールを含有する３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に再縣濁させる。細胞は超音波処理によって溶かし、細胞残骸は遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）によってペレット状にする。ＳｐＡリガンドは、３−ｍＬカラム当たり２５−３０ｍＬの細胞溶解物を施しＮｉＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製する。カラムは２０ｍＭのイミダゾールを含有する３０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で二回洗浄し、２００ｍＭのイミダゾールを含有するリン酸緩衝生理食塩水の３ｍＬ分画中にＳｐＡを溶出させる。ＳｐＡは１８メガオームのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、次に１０ｍＭのＮａＨＣＯ３に一晩透析する。タンパク質の濃度は、理論上の消光係数に基づきＵＶ分光計を使用して確認する（Ｐａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：２４１１（１９９５））。
【０１５７】
[実施例３]
固形担体へのＳｐＡベースのリガンドの結合
実施例１および２中に記載したような様々なリガンドの生成および発現の後、それらを多点結合により固形担体に固定した。
【０１５８】
例示的な実験では、アガロース樹脂（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を、以前に記載された方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５１：４７９（１９７９））に従いエピクロロヒドリンを使用して架橋させる。アガロース樹脂は、以下の方法に従い、正に荷電した会合基、例えばカチオンと後に反応させる。１０ｍＬの樹脂に、５ｍＬの７５重量％グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）、５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）および０．２５８ｇの５０重量％水酸化ナトリウムを加える。反応バイアルは、室温で一晩Ｔｅｃｈｎｅ  ＨＢ−１Ｄハイブリダイザー（ＢＩＢＢＹ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）内で回転させる。次いで樹脂を濾過し、３×１０ｍＬ体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で洗浄する。
【０１５９】
樹脂（１０ｍＬ、濾過ケーク）は３ｍＬの４．６Ｍ  ＮａＯＨを含有するジャーに加える。混合物はスラリー状にし、次いで４ｍＬのブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）を加える。この混合物は約２時間３５℃で回転させる。次いで樹脂を５×１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で洗浄し、２×１０ｍＬの１０ｍＭのＮａＨＣＯ３で平衡状態にする。
【０１６０】
前述のＢＵＤＧＥ活性化ステップの直後に、５ｍＬの濾過ビーズケークに、２．５および２．３ｍｇ／ｍＬ濃度のＡ２９Ｋ突然変異を含有するダイマーＺドメインリガンド（配列番号８５）または第二Ｚドメイン中にＮ末端欠失を含有するダイマーＺドメインリガンド（配列番号７８）を含有する１０ｍＭのＮａＨＣＯ３の１０ｍＬ溶液を加える。ガラスバイアル中で混合物に蓋をし、バイアルは約２時間３７℃で回転させる。２時間後、樹脂を１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水で３回洗浄する。濾過ビーズケーク（１０ｍＬ）を、１ｍＬのチオグリセロールならびに０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３および０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む９ｍＬのバッファー溶液で構成される１０ｍＬ溶液を含有するジャーに加える。混合物はスラリー状にし、室温で一晩回転させる。次いで樹脂を１０ｍＬの以下のバッファー、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８）および５０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．５）を含む０．１Ｍ  トリスバッファーで３回洗浄する。これに、１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水および１０ｍＬの２０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）を用いた樹脂のリンスを続ける。最終樹脂はさらに使用する前に２０％アルコール水溶液（ｖ／ｖ）中で保存する。ダイマーＣドメインリガンドと固形担体をカップリングさせる方法は、ダイマーＺドメインリガンドに関して本明細書に記載する方法と同様である。
【０１６１】
前に記載した５ドメインリガンド（配列番号９１および８４）とアガロースベースの樹脂をカップリングさせる方法は、１５ｍｇ／ｍＬのリガンドをカップリングステップ中に使用すること以外、前述のプロセスと同様である。Ｚドメインペンタマーリガンドはヒス−６タグを含有しない。
【０１６２】
[実施例４]
遊離または固定リガンドの苛性浸漬後に回収した上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
長時間の苛性曝露後の、本明細書に記載する遊離および固定リガンドの断片化を検出するのに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法は以下に記載する。
【０１６３】
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水、中和苛性浸漬リガンド溶液、および中和樹脂浸漬溶液（それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する。）中のＳｐＡをＬａｅｍｍｌｉバッファー（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で１：１比で希釈する。試料は５分間７０℃において温置して、タンパク質が完全に変性したことを確実にする。１０μＬのそれぞれの試料は、ＡｎｙＫＤゲル（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）または１５％トリス−ＨＣｌ  Ｒｅａｄｙゲル（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に充填する。ゲル電気泳動は、３０分間２００ボルトで、１×トリス−グリシン−ＳＤＳランニングバッファー（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において実施する。次いでＳＤＳゲルは１時間Ｇｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で染色し、一晩Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水中で脱色する。
【０１６４】
[実施例５]
遊離または固定リガンドの苛性浸漬後に回収した上清のＳＥＣ分析
前に記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析以外に、長時間の苛性浸漬後の遊離および固定リガンドの断片化分析に、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）を使用することもできる。ＳＥＣ実験は以下に記載する。
【０１６５】
ＳＥＣはＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステム（ＡＧＩＬＥＮＴ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）において実施する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水、中和苛性浸漬リガンド溶液（約０．５ｍｇ／ｍＬ）、および中和樹脂浸漬溶液中のＳｐＡ対照は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析前に１０分間１３５００ＲＰＭで遠心分離する。試料はＳＥＣカラム（ＳＥＰＡＸ  Ｚｅｎｉｘ７．８ｍｍ×３００ｍｍ、ＳＥＰＡＸ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）に２０μＬ注入する。リン酸ナトリウムバッファー（２００ｍＭ、ｐＨ７．０）は、１ｍＬ／分の流速で移動相として使用する。ＡｇｉｌｅｎｔからのＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアは、２３０ｎｍと２８０ｎｍの両方でＳＥＣデータ収集および分析に使用する。
【０１６６】
[実施例６]
リガンドの苛性浸漬
実施例２中に記載したリガンドの発現後、リガンドはアルカリ条件に曝す。
【０１６７】
１ｍＬの前に記載した各リガンドに（１ｍｇ／ｍＬの濃度で）、１ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨを０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび０．５ｍｇ／ｍＬリガンドの最終濃度まで加える。試料は２５時間穏やかに回転させる。次いでこの溶液を、３２μＬの氷酢酸を使用してｐＨ約７に中和する。
【０１６８】
苛性浸漬有りまたは無し後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した、ＺドメインおよびＣドメインダイマーリガンドの断片化分析を図３中に示す。図３中で観察されるように、ダイマーＺドメインリガンド（Ａ２９Ｋ欠失無し、配列番号８５で示す、対照として使用する）は、スメアの存在および約７ＫＤａのより小さな断片の存在によって実証されるように、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後に有意な断片化を示す（レーン３参照）。対照的に、Ａ２９Ｋ突然変異および第二ドメイン中に４つの連続したアミノ酸の欠失を有するダイマーＺドメインリガンド（配列番号７８のアミノ酸配列）は、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後に大部分は完全な状態であるようである（レーン６参照）。
【０１６９】
同様に、欠失を有していないダイマーＣドメインリガンド（配列番号９２で述べるアミノ酸配列、対照として使用する）は、そのアミノ酸配列を配列番号３５で述べる第二ドメインのＮ末端から４つの連続したアミノ酸の欠失を含むダイマーＣドメイン構築物に対して（レーン１２参照）、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のスメアおよび約７ＫＤａのより小さな断片の存在を示す（レーン９参照）。
【０１７０】
ダイマーＺおよびＣドメインリガンドのそれぞれがヒス−６タグをさらに含む。苛性浸漬に曝されないリガンドは、レーン２（ダイマーＺドメイン対照）、レーン５（Ｎ末端欠失を有するダイマーＺドメインリガンド）、レーン８（ダイマーＣドメイン対照）およびレーン９（Ｎ末端欠失を有するダイマーＣドメインリガンド）中に示す。
【０１７１】
長時間の苛性浸漬後のＮ末端欠失を有するダイマーＺおよびＣドメインリガンドの低減した断片化は、ＳＥＣによってさらに証明される。代表的なＳＥＣ実験の結果は、ＳＥＣクロマトグラムの形で図４中に示す。図４中に見られるように、（配列番号８５で述べるアミノ酸配列を有する）Ｚドメインリガンドおよび（配列番号９２で述べるアミノ酸配列を有する）Ｃドメインリガンドの対照は、図４中のクロマトグラム上の矢印によって指定される有意な断片化を示す。対照的に、（Ｚドメインリガンドアミノ酸配列を配列番号７８で述べ、Ｃドメインリガンドアミノ酸配列を配列番号３５で述べる。）第二ドメイン中にＮ末端欠失を有するダイマーＺおよびＣドメインリガンドは、図４中のクロマトグラム上のボックスによって指定される低減した断片化を示す。
【０１７２】
さらに、前に記載したペンタマー型のＺドメインリガンド（すなわち、対照を表し配列番号９１のアミノ酸配列を有するペンタマーＺドメインリガンド、および第一ドメイン以外の全てにおいて４つの連続したアミノ酸のＮ末端欠失を有するペンタマーリガンドを表し、配列番号８４のアミノ酸配列を有するペンタマーＺドメインリガンド）も、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより断片化に関して分析する。
【０１７３】
図５中に見られるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルデータによって証明されるように、（そのアミノ酸配列を配列番号８４で述べる。）第一ドメイン以外の全てにおいてＮ末端から４つの連続したアミノ酸の欠失を有するペンタマー型のＺドメインリガンドは、そのアミノ酸配列を配列番号９１で述べるペンタマーＺドメインリガンド対照に対して（レーン６参照）、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中でのリガンド浸漬後に、はるかに低度の断片化を示す（レーン３参照）。前に論じたように、両型のペンタマーリガンドがＡ２９Ｋ突然変異を有する。浸漬していないリガンドは完全な状態であるようである（レーン２および５）。
【０１７４】
レーン８−１０は、精製プロセスにおいて通常使用する組換えＳｐＡリガンド（ｒＳＰＡ）で観察された断片化を示す。ｒＳＰＡリガンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での付近のタンパク質の消失によって観察されるように、Ｚドメイン対照に対して、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後により一層高度な断片化を示すようである（レーン９参照）。苛性条件に曝していないｒＳＰＡリガンドはレーン８中に存在する。
【０１７５】
この結果は、本明細書に記載するＮ末端欠失を有するＺドメインベースのリガンドは、例えばｒＳＰＡなどの通常使用されるＳｐＡリガンドよりはるかに優れた候補であることを示唆するようである。
【０１７６】
Ｎ末端欠失を有するペンタマーＺドメインリガンドで観察された、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での苛性浸漬後の断片化の低減はＳＥＣを使用してさらに確認され、１つのこのような代表的な実験の結果は図６中に示す。
【０１７７】
図６中のクロマトグラムによって実証されるように、アミノ酸欠失を有していないペンタマー型のＺドメイン対照（配列番号９１）は、より低分子量の十分に分離したピークを示し、より小さな断片の存在が示される。対照的に、Ｎ末端欠失を有するペンタマー型のＺドメイン（配列番号８４）は、低い強度で有意に少ない異なるピークを示し、対照に対してはるかに低度の断片化が示される。
【０１７８】
通常使用されるＳｐＡリガンド、ｒＳＰＡは、完全な分子が全く残らない最も高度の断片化または分解を示す。特に、ＳＥＣのクロマトグラムは図５中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果と一致し、苛性条件（すなわち、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中の浸漬）への長時間の曝露後に、ｒＳＰＡリガンドは多量に分解され、したがってＳＥＣのクロマトグラムにおいて有意な断片を観察することができないことがさらに証明される。
【０１７９】
[実施例７]
樹脂上に固定されたリガンドの苛性浸漬
前述の実施例中に記載した様々なリガンドを、固形担体（例えば、アガロースクロマトグラフィー樹脂）とのそれらの結合後に、苛性曝露後の断片化に関して評価する。
【０１８０】
対象のそれぞれの樹脂に関して、５ｍＬの使い捨てクロマトグラフィーカラム（ＥＶＥＲＧＲＥＥＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）中の１ｍＬの樹脂を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を使用して測定する。すぐに２ＣＶ（２ｍＬ）の０．５Ｍ  ＮａＯＨを含むカラムにおいて樹脂を条件付けし、再度スラリー状にし真空吸引する。ＮａＯＨ条件をもう一回繰り返した後、真空吸引した樹脂のウエットケークは４ｍＬの試験管（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に移す。２ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨを（底部を密封した）カラムに加え、相当する樹脂を含む試験管にすぐに移す。密封した試験管はローテーター上に置き、２５時間試験管を回転させる。苛性浸漬の最後に、試験管の中身を使い捨てカラムに注ぎ、濾過物を回収する。１．５ｍＬ中の濾過物は５０μＬの氷酢酸で中和し、ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる分析用に用意する。
【０１８１】
長時間の苛性浸漬（例えば、２５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬）後の固定ダイマーＺおよびＣドメインリガンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３中に示す。一般に、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、アガロース樹脂）上へのその固定後にリガンドが苛性安定性である場合、それはいかなる有意な断片化も示さないことは予想される。
【０１８２】
図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって観察されるように、対照固定ダイマーＺとＣドメインリガンドの両方（それぞれ配列番号８５および９２で述べるアミノ酸配列、ならびにそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン４および１０によって表す）ならびに第二ドメイン中にＮ末端欠失を含有するダイマーＺおよびＣドメイン固定リガンド（それぞれ配列番号７８および３５で述べるアミノ酸配列、ならびにそれぞれレーン７および１３によって表す）は、２５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬後にいかなる検出可能な断片化も示さないようであり、それらがいずれも苛性安定性であることを示唆する。
【０１８３】
長時間の苛性浸漬（例えば、２５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬）後の固定ペンタマーＺドメインリガンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図５中に示す。図５中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって観察されるように、第一ドメイン以外の全てにおいてＮ末端欠失を含有するペンタマーＺドメインリガンド（配列番号８４で述べるアミノ酸配列、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン４によって表す）は、その野生型ペンタマーＺドメイン対照と比較してはるかに低度の断片化を示す（配列番号９１およびレーン７）。この結果は、Ｎ末端欠失を有する固定ペンタマーＺドメインリガンドは、このような欠失を有していない固定ペンタマーＺドメインと比較してより苛性安定性であることを示唆する。
【０１８４】
さらに、通常使用するリガンド（すなわちｒＳＰＡ）の断片化も、アガロースクロマトグラフィー樹脂上へのその固定、ならびにリガンド付きの樹脂を２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中の長時間浸漬に施した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べる。図５のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン１０において見られるように、固定ｒＳＰＡは２５時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬後に有意な断片化を示し、ペンタマーＺドメインリガンドに比べて、それがさほど苛性安定性ではないことを示唆する（レーン４および７）。
【０１８５】
図５におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果に基づいて、Ｎ末端欠失を有する固定ペンタマーＺドメインリガンドには長時間の苛性曝露後に最も低度の断片化があり、したがって、固定ペンタマーＺドメイン対照リガンドおよび固定ｒＳＰＡと比較して、最も苛性安定性であると結論付けることができる。
【０１８６】
固定ペンタマーＺドメインリガンドとｒＳＰＡリガンドに関するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果のさらなる確認は、ＳＥＣ分析によって得る。代表的な実験の結果は、図７中に示すクロマトグラムにおいて示す。図７中に見られるように、配列番号８４の固定Ｚドメインリガンドは、クロマトグラム上で分離したより低分子量のピークを示す配列番号９１のその野生型対応物に比べて、ボックスによって示すように、長時間の苛性浸漬後に低減した断片化を示す。さらに、予想通り、固定ｒＳＰＡは、クロマトグラム上の広域および非分離のピークにより観察されるように、長時間の苛性浸漬後に大規模な断片化を示す。
【０１８７】
[実施例８]
２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露前後の免疫グロブリンに対するクロマトグラフィーマトリックスの静的結合能の測定
前に記載したアフィニティークロマトグラフィーマトリックス（すなわち、多点結合によって固定樹脂をその上に有する樹脂）を、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露前後の、それらの静的結合能に関してさらに試験する。
【０１８８】
一実験において、０．１、０．３もしくは０．５Ｍ  ＮａＯＨのいずれかに曝した、またはＮａＯＨへの曝露無しの、前に記載したダイマーまたはペンタマーＺまたはＣドメインリガンドと固定したクロマトグラフィーマトリックスのそれぞれ（１ｍＬ体積）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中１０％スラリーにする。１ｍＬの各スラリーを１０ｍＭのリン酸生理食塩水バッファー中ポリクローナルＩｇＧ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ、１ｍｇ／ｍＬ））１５ｍＬに加え、室温で４時間回転させる。２８０ｎｍにおけるＵＶの低下を使用して、苛性結合能前後の結合能を計算する。保持されたＩｇＧ結合能の割合は、苛性曝露後のＩｇＧ結合能を苛性曝露無しのそれで割ることによって計算する。表ＩＩは１つのこのような実験の結果を要約する。表ＩＩ中に要約されるように、配列番号７８のダイマーＺドメインリガンドは、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での長時間苛性浸漬後に、その野生型対応物（すなわち、配列番号８５のダイマーＺドメインリガンド）に対して高い保持結合能を示す可能性がある。
【０１８９】
同様に、以下の表ＩＩ中にさらに要約されるように、配列番号３５のダイマーＣドメインリガンドは、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での長時間苛性浸漬後に、配列番号９２のその野生型対応物より高い保持結合能を示す可能性がある。
【０１９０】
【表２】
2014193892.tif 000006
【０１９１】
さらなる実験では、ペンタマーＺドメインリガンドのＩｇＧ結合能を、２５時間０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での長時間苛性浸漬後に評価する。１つのこのような実験の結果は以下の表ＩＩＩ中に要約する。
【０１９２】
表ＩＩＩは、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３Ｍ  ＮａＯＨまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中にマトリックスを浸漬した後の、Ａ２９Ｋ突然変異を含有し第一ドメイン以外の全てがＮ末端から４つの連続したアミノ酸の欠失を含むペンタマー型のＺドメインリガンド（配列番号８４で示すアミノ酸配列）がその上に固定されたマトリックスの、保持されたＩｇＧ結合能の割合を示す。以下に要約するように、ペンタマーＺドメインＮ末端欠失リガンドを有するマトリックスは、２５時間の０．１Ｍ  ＮａＯＨ浸漬後に初期結合能の最大９５％、２５時間の０．３Ｍ  ＮａＯＨ浸漬後に初期結合能の最大８５％、および２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ浸漬後に初期結合能の最大６５％を示す。
【０１９３】
【表３】
2014193892.tif 000007
【０１９４】
[実施例９]
０．５Ｍ  ＮａＯＨへの曝露前後のＩｇＧのＳｐＡ捕捉
この実験では、第一ドメイン以外の全てが４つの連続したアミノ酸の欠失を有するＺドメインリガンドのペンタマーが固定されたマトリックスを使用して、無ＣＨＯ−Ｓフィードにおけるポリクローナル免疫グロブリンの精製を、組換えにより合成したＳｐＡ（ｒＳＰＡ）を有するそれと共に調べて、本発明によるリガンドは不純物を除去する際に組換えＳｐＡと同程度に働くことを実証する。
【０１９５】
ｒＳＰＡ（ＲＥＰＬＩＧＥＮ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、およびＺドメインペンタマーリガンド（配列番号８４で示すアミノ酸配列）を固定した樹脂試料を、１ｃｍ径および５ｃｍ充填床高を有するクロマトグラフィーカラムにそれぞれ充填する。リン酸生理食塩水バッファー（１０ｍＭのリン酸ナトリウム）による平衡化後、充填樹脂は、５０ｃｍ／時間の流速の、ポリクローナルｈＩｇＧ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ、５ｍｇ／ｍＬ）を含む無ＣＨＯフィードの曝露に施す。５％ブレイクスルーの９０％での充填後、樹脂はＰＢＳバッファーおよび５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で洗浄する。結合されているＩｇＧは５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ３で後に溶出させる。分画を回収し、不純物の分析用に分析する。次いで充填樹脂は、無ＣＨＯフィード中のポリクローナルｈＩｇＧと再度接触させる前に、（流速１００ｃｍ／時間）１５分間０．５Ｍ  ＮａＯＨに曝す。次いで樹脂はＰＢＳバッファーおよび５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で洗浄し、ＩｇＧはさらなるアッセイ用に溶出させる。
【０１９６】
この苛性曝露およびフィードランサイクルを繰り返して、後のカチオン交換ステップに十分なＩｇＧを回収する。浸出プロテインＡは、製造者からの説明書に従いｎ−プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ（ＲＥＰＬＩＧＥＮ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して定量化する。宿主細胞タンパク質は、製造者の説明書に従い３Ｇ  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（ＣＹＧＮＵＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ、ＮＣ）を使用して検出する。ＤＮＡはＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して検出する。１つのこのような代表的実験の結果は表ＩＶ中に示す。
【０１９７】
[実施例１０]
カチオン交換およびアニオン交換クロマトグラフィーを使用した、浸出ＳｐＡリガンドの排除ならびにＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質のさらなる除去
本発明によるＳｐＡリガンドまたは組換えＳｐＡ、ｒＳＰＡを含有するリガンド（ＲＥＰＬＩＧＥＮ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のいずれかを取り込んだクロマトグラフィーアフィニティーマトリックスの溶出プールからの、浸出リガンドの排除ならびに宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡのさらなる除去を以下のように調べる。
【０１９８】
実施例８中に記載した実験の数回反復からの溶出プールの組合せは、カチオン交換クロマトグラフィーを使用する、浸出リガンドおよび他の不純物のさらなる排除のためのフィードを提供する。
【０１９９】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、１．０ｃｍ（ｉ．ｄ．）×７ｃｍ（床高）の床寸法を有するカラムに充填する。カラムは５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５、４ｍＳ／ｃｍで平衡状態にし、１４０ｃｍ／時間でプロテインＡ溶出物からプールしたＩｇＧを充填する。ＥＱバッファーでのカラム洗浄後、２０カラム体積（直線勾配）の０．５Ｎ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ中でＩｇＧを溶出させる。溶出プールは１０ｍＬ分画において回収し、浸出リガンド、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質に関して分析する。
【０２００】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−カラムからの分画をさらにプールし、１２ｍＳ／ｃｍでｐＨ７．６に調節する。このフィードを、１ｍＬ／分の流速で、予め平衡状態にした（トリス、２５ｍＭ、ｐＨ７．６、約１ｍＳ／ｃｍ）ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂデバイス（０．０８ｍＬ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に充填する。実施例８中に記載したように、１８７毎のカラム体積で分画を回収し、浸出リガンドおよび宿主細胞タンパク質に関してさらに分析する。
【０２０１】
以下の表ＩＶ中に要約するように、浸出ＳｐＡリガンドと、第一ドメイン以外の全てが４つの連続したアミノ酸のＮ末端欠失を有するペンタマー型のＺドメイン（配列番号８４で示すアミノ酸配列）の両方を、カチオン交換およびアニオン交換クロマトグラフィー後に１ＰＰＭ未満に排除することができる。さらに、以下の表中にも要約するように、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの除去は業界標準に見合うものであり、いずれの場合もおおむね等しいものである。
【０２０２】
【表４】
2014193892.tif 000008
【０２０３】
[実施例１１]
長時間の苛性浸漬後のリガンドの断片化に対するＮ末端アミノ酸欠失数の影響
別の実験では、１、２、３または４つのアミノ酸残基を、位置１で始めダイマーＺドメインリガンドの第二ドメインのＮ末端から欠失させ、長時間の苛性浸漬後のリガンドの断片化に対する１、２、３または４つのアミノ酸欠失の影響を、対照ダイマーＺドメインリガンド（Ａ２９Ｋ）と比較して決定した。
【０２０４】
１つのこのような実験の結果は、図８中に示すクロマトグラムにおいて示す。図８中で実証されるように、ダイマーＺドメインリガンドの第二ドメインのＮ末端から欠失したアミノ酸残基数の断片化に対する影響は、実施例５中に記載したように、２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での各リガンドの長時間の苛性浸漬後、次にＳＥＣ分析後に観察することができる。
【０２０５】
２５時間０．５Ｍ  ＮａＯＨ中にリガンドを浸漬した後、対照リガンド（配列番号８５）、第一アミノ酸のみが第二ドメインのＮ末端から欠失したリガンド（配列番号８７）、最初の２つのアミノ酸が第二ドメインのＮ末端から欠失したリガンド（配列番号８８）のそれぞれが、より低分子量において矢印により示される断片を示し、断片化が証明される。一方、最初の３つのアミノ酸が第二ドメインのＮ末端から欠失したリガンド（配列番号６９）、および最初の４つのアミノ酸が第二ドメインのＮ末端から欠失したリガンド（配列番号７８）は、より低分子量においてクロマトグラム中のボックスにより示される有意な低断片化を示し、低減した断片化が証明された。
【０２０６】
これらの結果は、プロテインＡの１つ以上のドメインをベースとし１つ以上のドメインのＮ末端から欠失した少なくとも３つのアミノ酸を有するアフィニティーリガンドは、長時間の苛性曝露後に低減した断片化を示し、したがって、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用するのに優れた候補であることを示唆する。
【０２０７】
[実施例１２]
いずれも非Ｆａｂ突然変異（Ｇ２９Ｋ）を有するＮ末端欠失と野生型Ｃドメインペンタマーの保持結合能の比較
この実験では、ポリビニルアルコールベースのクロマトグラフィーマトリックスに固定された２つのＣドメインペンタマーリガンド、５ドメインそれぞれにおいて４アミノ酸の（位置１で始まる）Ｎ末端欠失、同種の翻訳後プロセシングを容易にするためのペンタマー配列の正に第一のアミノ酸としてアラニンおよびＧ２９Ｋ突然変異を有する１つのリガンド（そのアミノ酸配列は配列番号９３で示す）、およびＧ２９Ｋ突然変異を有するその野生型対応物に相当するもう１つのリガンド（そのアミノ酸配列は配列番号９５で示す）の保持結合能を調べる。
【０２０８】
多点結合によってポリビニルアルコールベースのアフィニティークロマトグラフィー樹脂にリガンドを固定し（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５１−１３６頁（１９９２）参照）、反復ＮａＯＨ曝露によって保持された動的結合能に関して試験する。
【０２０９】
一実験では、クロマトグラフィーマトリックスをカラム（０．６６ｃｍ  ｉ．ｄ．×１．０ｃｍ床高）に充填し、６０ｃｍ／時間での平衡化、次に３０ｍｇポリクローナルヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の施用を用いた標準的なクロマトグラフィー操作を施す。平衡化バッファー（１０ｍＭのリン酸バッファー生理食塩水）を用いた非結合タンパク質の広範囲の洗浄除去後、結合ＩｇＧは６０ｃｍ／時間で溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３）を用いて溶出させる。これに３０分間０．７Ｍ  ＮａＯＨを用いた定置洗浄（ＣＩＰ）を続ける。カラムを再度平衡状態にし、操作は１６回より多く繰り返す（８時間０．７Ｍ  ＮａＯＨへの累積曝露）。保持結合能は、経時的に溶出したＩｇＧの合計量（ＵＶ２８０で測定したＩｇＧ濃度を掛けた溶出体積）を決定することにより測定する。相対的保持能力はＮａＯＨへの０分曝露での第一操作に対してプロットし、図９中に示す。この実験は３回繰り返し、類似した結果である。図９中で実証されるように、欠失有りおよび無しの両方のＣドメインペンタマーリガンドが、経時的にＮａＯＨへの長時間曝露後、類似した保持結合能を示す。さらに、別の実験では、アラニンを含まずＧ２９Ｋ突然変異を有するＣドメインペンタマーリガンド（そのアミノ酸配列は配列番号８０で示す）の保持結合能を、Ｇ２９Ｋ突然変異を有するその野生型対応物（そのアミノ酸配列は配列番号９５で示す）と比較し、類似した結果である（データ示さず）。
【０２１０】
本明細書は、参照により本明細書に組み込む本明細書内に引用した参照文献の教示に照らして、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は本発明における実施形態の例示となり、その範囲を限定するものとして解釈すべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって包含されることを容易に認識する。全ての刊行物および発明はそれらの全容を参照により本明細書に組み込む。参照により本明細書に組み込む内容が本明細書に反するかまたは一致しない範囲では、本明細書は任意のこのような内容に取って代わる。本明細書中の任意の参照文献の引用は、このような参照文献が本発明に対する従来技術であることを認めるものではない。
【０２１１】
特に他に示さない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書中で使用する成分、細胞培養、処理条件などの量を表す全ての数値は、用語「約」により、全ての場合において修正されるものと理解される。したがって、特に逆の記載がない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明により得ようとする所望の性質に応じて変わり得る。特に他に示さない限り、一連の要素の前にある用語「少なくとも」は、一連の各要素を指すと理解されたい。当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識する、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【０２１２】
当業者には明らかであるように、本発明の多くの変更形態および変形は、その精神および範囲から逸脱せずに作製することができる。本明細書に記載する具体的な実施形態は単なる例によって与え、決して限定的であることを意味するものではない。本明細書および実施例は単なる例示的なものとして考えられ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2014193892000001.app
【外国語明細書】
2014193892000001.pdf