(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスト細胞内の興味ある標的遺伝子の発現を調節するために有用なエクジソン受容体に基づく誘導性遺伝子発現システムの使用のための、ジアシルヒドラジンリガンドおよびキラルジアシルヒドラジンリガンドの提供。【解決手段】式１で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形又は非晶形。2014193875.tif 000107（Ａはアルコキシ基等；Ｂはアリール基等；Ｒ１及びＲ２はアルキル基等を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
2014193875.tif 000091
式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す；
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【請求項２】
式２
2014193875.tif 000092
式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＳである；
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【請求項３】
式３
2014193875.tif 000093
式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである；
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【請求項４】
少なくとも５０％の鏡像異性体過剰率を有する請求項２または３に記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも７５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも８５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも９５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
式中、Ａは−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＯＣＨ２Ｐｈ、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基を表し、Ｒ１は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または任意に置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基を表し、かつＲ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基または任意に置換されたアリール基を表す；
で表される請求項２または３に記載の化合物。
【請求項９】
Ａが任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表す、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
2014193875.tif 000094
式中、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄおよびＲ３ｅは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；または
Ｒ３ａおよびＲ３ｂはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成するか；またはＲ３ｂおよびＲ３ｃはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成し；
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、およびＲ６ｃは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；
ＸはＯまたはＳであり、Ｂは
2014193875.tif 000095
で表され；かつ
Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、およびＲ３ｊは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；または
Ｒ３ｆおよびＲ３ｇはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成するか；またはＲ３ｇおよびＲ３ｈはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成し；
式中、
Ｒｃは水素、ヒドロキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはアリールアルキルオキシ基を表し；
Ｒｄはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；
Ｒｅは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；
Ｒｆは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアミノ基を表し；
Ｒｇはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、またはアミノ基を表し；
Ｒｈは水素、アルキル基、アリール基、シアノ基、またはニトロ基を表す；
請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル基を表し；かつ
Ｒ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し；  
式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである；
請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
式中、Ａは
2014193875.tif 000096
で表され、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄおよびＲ３ｅは互いに独立して水素、ハロ基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で表され；かつ
Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、およびＲ３ｊは互いに独立して水素、ハロ基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基で表される；
請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも５０％の鏡像異性体過剰率を有する請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
少なくとも７５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
少なくとも８５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
少なくとも９５％の鏡像異性体過剰率を有する請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−ベンゾイル−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−フルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（２−ブロモ−ベンゾイル）−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，４−ジメトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジフルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メチル−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（ナフタレン−１−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（ナフタレン−２−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（チオフェン−２−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，５−ジメチル−フラン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（６−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；または
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−Ｎ−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド
から選択される請求項３に記載の化合物。
【請求項１８】
少なくとも９５％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、またはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【請求項１９】
少なくとも９９％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、またはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２２】
式４
2014193875.tif 000097
式中、Ａはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ２は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ２は−ＣＲ８Ｒ９ＣＨＲ１０ＣＲ１１Ｒ１２と同じではなく、かつＲ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基から選択され、式中、Ｒ２が付着する不斉炭素原子はＲまたはＳ異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である；
で表される化合物を調製するための方法であって、
ａ）式５
2014193875.tif 000098
で表される化合物と式６
Ｒ２ＨＣ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ７     式６
式中、ＸおよびＹは互いに独立してＯ、あるいはＲがアルキル基またはアリール基のＮＲであり、ＣａおよびＣｂは互いに独立してＳ立体配置の不斉炭素原子またはＲ立体配置の不斉炭素原子であり、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立してアルキル基またはアリール基であり、Ｒ１３はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはＯＳＯ２ＣＦ３であり、Ｒ７はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつＲ２、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は上記と同じ意味である；
で表される化合物を、式７
2014193875.tif 000099
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
ｂ）式８
2014193875.tif 000100
で表される化合物を形成するため、式７で表される化合物を還元する工程と、
ｃ）式９
2014193875.tif 000101
で表される化合物を形成するため、式８で表される化合物を、式Ｂ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程と、
ｄ）式１０
2014193875.tif 000102
で表される化合物を形成するため、式９で表される化合物のＲ７ＣＯ２−残基を除去する工程、および
ｅ）式４で表される化合物を形成するため、式１０で表される化合物を、式Ａ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法。
【請求項２３】
式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素を表す；
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
式中、ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；かつＣａおよびＣｂのそれぞれがＲ立体配置である；
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
式中、ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；かつＣａおよびＣｂのそれぞれがＳ立体配置である；
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２または３に記載の化合物を調製するための方法であって、
ａ）式１１
2014193875.tif 000103
で表される化合物と式１２
2014193875.tif 000104
で表される化合物のケトンを、式１３
2014193875.tif 000105
式中、Ｒ１およびＲ２は同じではない；
で表される化合物を形成するために反応させる工程と；
ｂ）式Ｓ−１４、または、式Ｒ−１４
2014193875.tif 000106
で表される化合物を形成するため、式１３で表される化合物をキラル触媒の存在下で還元する工程；および
ｃ）請求項２または３に記載の化合物を形成するため、式Ｓ−１４またはＲ−１４で表される化合物を、式Ｂ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法。
【請求項２７】
Ｂが３，５−ジ−メチルフェニル基である請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ａが２−エチル−３−メトキシフェニル基である請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ２がｔｅｒｔ−ブチル基である請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
ホスト細胞内で興味ある遺伝子の発現を調節する方法であって、該ホスト細胞が
ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、および
ｉｉ）グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の組み換え遺伝子発現カセット、および
ｉ）該ＤＮＡ結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ｉｉ）プロモーター、および
ｉｉｉ）該興味ある遺伝子
を含む第２の組み換え遺伝子発現カセットを含み、
該方法が該ホスト細胞を請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含み、ここで該興味ある遺伝子の発現が調節される方法。
【請求項３１】
リガンドを前記被験体の細胞内でエクジソン受容体複合体に接触させることを含む、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための方法であって、ここで前記細胞はさらに、リガンドと組み合わせたときの前記エクジソン受容体複合体に対するＤＮＡ結合配列を含み、かつエクジソン受容体複合体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列複合体の形成が遺伝子の発現を誘導し、かつ前記リガンドが請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物であり、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現が調節される方法。
【請求項３２】
前記エクジソン受容体複合体がキメラエクジソン受容体複合体であり、かつ前記ＤＮＡ結合配列がさらにプロモーターを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該被験体が植物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
該被験体が動物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
該被験体が哺乳類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
該被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が自己細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記自己細胞が前記エクジソン受容体複合体および該エクジソン複合体に対するＤＮＡ結合配列を含み、かつ前記細胞が前記被験体をトランスジェニックにするため前記被験体内へ移植される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記移植が注射による、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記注射が腫瘍内へ行なわれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リガンドが薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物の一部として前記トランスジェニック被験体へ投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記医薬組成物が経口投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記薬理学的に許容される担体が親油性溶媒を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
トランスジェニック被験体におけるトランス遺伝子発現の調節方法であって、ここで前記トランスジェニック被験体がトランス遺伝子発現の調節が可能な組み換えエクジソン受容体複合体を含み、該方法が前記被験体に請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項４５】
（ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
（ｉ）ホスト細胞内で発現可能な第１の組み換え遺伝子発現カセットであって、
（ａ）その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および
（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第１の組み換え遺伝子発現カセット、
（ｉｉ）該ホスト細胞内で発現可能な第２の組み換え遺伝子発現カセットであって、
（ａ）トランス活性化ドメイン、および
（ｂ）キメラレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第２の組み換え遺伝子発現カセット、および
（ｉｉｉ）ホスト細胞内で発現可能な第３の組み換え遺伝子発現カセットであって、
（ａ）第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント、
（ｂ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
（ｃ）その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第３の組み換え遺伝子発現カセットを含む工程、および
（ｂ）ホスト細胞内に請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物を導入し、ここでホスト細胞内の遺伝子発現が調節される工程を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項４６】
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物への曝露に実質的に非感受性であるホスト細胞を選択する工程、
（ｂ）ホスト細胞内へ
（ｉ）ＤＮＡコンストラクトであって、
（ａ）ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
（ｂ）該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、反応エレメント
を含むコンストラクト、および
（ｉｉ）エクジソン受容体複合体であって、
ａ）該反応エレメントに結合するＤＮＡ結合ドメイン、
ｂ）前記化合物の結合ドメイン、
ｃ）トランス活性化ドメインを含む複合体、を導入する工程、および
（ｃ）前記化合物へ該細胞を曝露し、ここでポリペプチドが産生される工程を含む、ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項４７】
前記エクジソン受容体複合体またはエクジソン受容体リガンド結合ドメインが変異を含む、請求項３１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、遺伝子工学、および医薬品化学の分野に関する。一実施形態によれば、本発明は遺伝子発現の分野に関する。別の実施形態によれば本発明は、天然および変異核内受容体に対するジアシルヒドラジンリガンドおよびキラルジアシルヒドラジンリガンドならびに核内受容体に基づく誘導性遺伝子発現システムにおけるそれらの使用に関し、かつ、これらのリガンドおよび誘導性遺伝子発現システムを用いた、ホスト細胞内での遺伝子発現の調節法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここに引用される様々な出版物の開示は、その全体が参照によりここに取り込まれる。しかしながら、ここにおけるいずれの参考文献の引用も、これらの参考文献が本発明に対する「先行技術」として入手可能であることの承認と解釈されてはならない。
【０００３】
遺伝子工学の分野における遺伝子発現の正確な制御は、発生およびその他の生理的過程を研究、操作、ならびに制御するための貴重な手段である。遺伝子発現は、幾つかの特異的なタンパク質‐タンパク質相互作用に関わる複雑な生物学的過程である。タンパク質合成における第一工程として必要なＲＮＡを産生する遺伝子発現を誘発するため、転写活性化因子は遺伝子の転写を制御するプロモーターの近傍に導かれなければならない。一般に転写活性化因子自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する、少なくとも１のＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質に会合する。従って遺伝子発現を起こすためには、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインから適切な距離に位置するトランス活性化ドメインを含むタンパク質が、遺伝子のプロモーター領域内の正しい位置に導かれなければならない。
【０００４】
伝統的なトランスジェニックアプローチは、設計されたトランス遺伝子の発現を駆動するため、細胞型特異的プロモーターを利用する。トランス遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、最初にホストゲノムに取り込まれる。転写活性化因子により誘発されたとき、所定の細胞型においてトランス遺伝子の発現が起こる。
【０００５】
細胞内で外来性遺伝子の発現を調節するための別の手段は、誘導性プロモーターを介する。このような誘導性プロモーターの使用例は、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物のリプレッサー‐オペレーターシステム、免疫抑制性イムノフィリンシステム、およびステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物の転写活性化システムを含み、以下これらについて述べる。
【０００６】
タバコ由来のプロモーターであるＰＲ１−ａプロモーターは、病原体の攻撃に続く全身性の後天的抵抗反応の間に誘導される。ＰＲ１−ａの使用は、これがしばしば内在性物質、ならびに病原体、ＵＶ−Ｂ照射、および汚染物質のような外来性因子に反応することにより制限され得る。熱ショック、インターフェロン、および重金属により誘導されるプロモーターに基づく遺伝子調節システムについて記述されている（Ｗｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４−５４１８（１９８６）；Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ６２：５１−６１（１９９０）；Ｆｉｌｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０−２７５６０（１９９２））。しかしながらこれらのシステムは、標的ではない遺伝子の発現におけるこれらの効果のために制限を有する。これらのシステムはまた漏出性である。
【０００７】
原核生物のリプレッサー−オペレーターシステムは、細菌性のリプレッサータンパク質およびそれらが結合する独特のオペレーターＤＮＡ配列を利用する。細菌である大腸菌由来のテトラサイクリン（“Ｔｅｔ”）およびラクトース（“Ｌａｃ”）リプレッサー−オペレーターシステムの両方は、遺伝子発現の制御のため植物および動物において使用されている。Ｔｅｔシステムにおいて、テトラサイクリンはＴｅｔＲリプレッサータンパク質に結合してオペレーターからのリプレッサータンパク質の放出を起こす立体構造変化を生じさせ、これが転写の起こる結果となる。Ｌａｃシステムにおいて、ｌａｃオペロンはラクトースまたはイソプロピル−ｂ−Ｄチオガラクトシドのような合成類似体の存在に反応して活性化される。残念ながら、このようなシステムの使用はリガンド、すなわちテトラサイクリンおよびラクトースの不安定な化学的性質、これらの毒性、これらが天然に存在すること、あるいは誘導または抑制のためには比較的高い濃度が必要とされることにより制限される。同様の理由から、動物におけるこのようなシステムの有用性は制限される。
【０００８】
ＦＫ５０６、ラパマイシン、およびシクロスポリンＡのような免疫抑制性分子は、イムノフィリンであるＦＫＢＰ１２、シクロフィリンなどに結合できる。この情報を用いて、単に２個のタンパク質それぞれにＦＫ５０６を配置するか、または１個にＦＫ５０６、もう１個にシクロスポリンＡを配置することにより、いずれの２個のタンパク質をも接合するための一般的戦略が考案されてきた。ＦＫ５０６の合成ホモ二量体（ＦＫ１０１２）、またはＦＫ５０６‐シクロスポリン（ＦＫＣｓＡ）の融合から生じた化合物はその後、これらの分子の二量体化を誘導するために使用できる（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−２４（１９９３）；Ｂｅｌｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：４６０４−７（１９９６））。ＦＫＢＰ１２と融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよびシクロフィリンと融合したＶＰ１６活性化ドメイン、ならびにＦＫＣｓＡ化合物が、ヘテロ二量体化およびＧａｌ４結合ドメインを含むプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の活性化を示すために使用された。残念ながら、このシステムは望まれない副作用を有し得る免疫抑制剤を含み、それ故に様々な哺乳類遺伝子スイッチ応用のための使用は制限される。
【０００９】
ステロイドホルモン受容体システムのような、高等真核生物の転写活性化システムもまた利用されている。ステロイドホルモン受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞に見出される。残念ながら、特に植物および哺乳類における遺伝子発現の制御のために受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、これらの生物における多数のその他の天然生物学的経路へのそれらの関与により制限される。このような困難を克服するため、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いる別のシステムが開発されている。
【００１０】
昆虫の成長、脱皮、および発生はエクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンにより調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９（１９９８））。昆虫におけるエクジソンの分子標的は、少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）からなる。ＥｃＲは、シグネチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインにより特徴付けられる核内ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，６７：５９−７７  （１９９１））。ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡのような幾つかのステロイド性化合物に反応性である。最近、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙによって世界的に発売されている市販の殺虫剤であるテブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含む、エクジステロイドアゴニスト活性を有する非ステロイド性化合物について記述されている（国際公開第９６／２７６７３号および米国特許第５，５３０，０２８号を参照のこと）。両類似体は、その他の生物において例外的な安全特性を有する。
【００１１】
昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）、哺乳類レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の昆虫相同体とヘテロ二量体化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体反応エレメントに結合してエクジソン反応性遺伝子の転写を活性化する。ＥｃＲ／ＵＳＰ／リガンド複合体は、昆虫の発生および生殖期間に重要な役割を果たす。ＥｃＲは５個のモジュール式ドメイン、Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロ二量体化およびトランス活性化）、およびＦ（トランス活性化）ドメインを有する。これらのドメインの幾つか、例えばＡ／Ｂ、Ｃ、およびＥは、他のタンパク質と融合したときもその機能を保持する。
【００１２】
堅固に調節された誘導性遺伝子発現システムまたは「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞におけるタンパク質の大量生産、細胞に基づくハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック植物および動物における形質の調節のような様々な応用に有用である。
【００１３】
ＥｃＲに基づく遺伝子スイッチの最初のバージョンはキイロショウジョウバエのＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）およびマウスのＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）を用い、これらの受容体がステロイド、ポナステロンＡの存在下で、哺乳類細胞株およびトランスジェニックマウスにおいてレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６３１４−６３１８（１９９２）；Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１（１９９６））。後日、Ｓｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９５：７９９９−８００４（１９９８）は、非ステロイド性エクジソンアゴニストのテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下でカイコＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を通し、哺乳類細胞におけるレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【００１４】
国際公開第９７／３８１１７号および国際公開第９９／５８１５５号は外因性遺伝子発現の調節方法を開示しており、ここで外来性遺伝子およびエクジソン反応エレメントを含むＤＮＡコンストラクトは、エクジソン受容体に対するリガンドの存在下、および任意に、サイレントパートナーとして作用することのできる受容体の存在下で、遺伝子発現を誘導するためにエクジソン反応エレメントに結合するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡコンストラクトによって活性化される。選択されたエクジソン受容体はキイロショウジョウバエから単離された。一般にこのようなシステムは、最適な活性化の提供のためにサイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳類細胞において、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化して、リガンド依存的な様式で標的遺伝子の発現を調節する。国際公開第９９／０２６８３号は、カイコガカイコより単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とすることなく哺乳類システムにおいて機能的であることを開示する。
【００１５】
米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号は、遺伝子発現システムにおける使用のため、受容体のステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの様々なメンバーが、少なくともＵＳＰの二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはその断片と組み合わせられることを開示する。米国特許第５，８８０，３３３号は、植物におけるキイロショウジョウバエＥｃＲとウルトラスピラクル（ＵＳＰ）とのヘテロ二量体システムを開示しており、ここでトランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは２個の異なるハイブリッドタンパク質に位置する。残念ながら、これらＵＳＰに基づくシステムは動物細胞においては恒常的であり、そのためレポーター遺伝子発現の調節には有効でない。
【００１６】
これらの各事例において、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン（国際公開第９９／０２６８３号の天然ＥｃＲ、または国際公開第９７／３８１１７の修飾ＥｃＲのいずれか）は単一の分子に取り込まれ、他方のヘテロ二量体化パートナー、ＵＳＰまたはＲＸＲのいずれか、は天然の状態で使用される。
【００１７】
上記のＥｃＲに基づく遺伝子調節システムの弱点は、リガンド非存在下でのかなりのバックグラウンド活性、ならびに植物および動物の両方における使用へのこれらのシステムの非適用性を含む（米国特許第５，８８０，３３３号を参照のこと）。従って当該技術分野においては、植物および動物の両方における外因性遺伝子の発現を正確に調整するための改善されたＥｃＲに基づくシステムが必要とされている。このような改善されたシステムは、遺伝子治療、タンパク質および抗体の大量生産、細胞に基づくハイスループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における形質の調節のような応用に有用であろう。遺伝子治療のようなある応用のためには、合成非ステロイドリガンドへ十分に反応し、同時に天然ステロイドには非感受性である誘導性遺伝子発現システムが望まれ得る。従って、単純、コンパクトで、かつ安価で入手しやすいリガンドに依存し、かつホストへの毒性が低い改善されたシステムが、生物学的システムを調節するために有用であることが証明されるであろう。
【００１８】
最近、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインが２個の異なるタンパク質に配置されることにより互いに隔てられ、リガンド非存在下でのバックグラウンド活性の大きな減少、およびリガンド存在下での活性のバックグラウンドを超えた著しい増大をもたらす、エクジソン受容体に基づく誘導性遺伝子発現システムが示された（参照によりその全体がここに取り込まれる、国際公開第０１／７０８１６Ａ１号を参照のこと）。この２−ハイブリッドシステムは、国際公開第９７／３８１１７号および国際公開第９９／０２６８３号に開示される２つのシステムに比較して、著しく改善された誘導性遺伝子発現調節システムである。この２−ハイブリッドシステムは、転写活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインに関してさらに好ましい位置に持ってくるために１組の相互作用するタンパク質の能力を活用しており、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子のＤＮＡ結合部位に結合するとき転写活性ドメインはプロモーターをさらに効果的に活性化する（例えば米国特許第５，２８３，１７３号を参照のこと）。簡単に述べると、この２−ハイブリッド遺伝子発現システムは、第１が核内受容体ポリペプチドと融合したＤＮＡ結合ドメインをコードし、第２が異なる核内受容体ポリペプチドと融合したトランス活性化ドメインをコードする、２個の遺伝子発現カセットを含む。リガンド存在下で、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に係留する。ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインが２個の異なる分子に属することから、リガンド非存在下でのバックグラウンド活性は大きく減少する。
【００１９】
２−ハイブリッドシステムはまた、ステロイド性リガンド、例えばポナステロンＡ（“ＰｏｎＡ”）またはムリステロンＡ（“ＭｕｒＡ”）に比較したとき、非ステロイド性リガンド、例えばジアシルヒドラジンに対する改善された感受性も提供する。すなわち、ステロイドに比べ、非ステロイド性リガンドはより低い濃度でより高い活性を提供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づく転写活性化はしばしば細胞株依存性であることから、各応用に対して最大のトランス活性化能力を得るために遺伝子スイッチシステムを調整することがより容易である。さらに、この２−ハイブリッドシステムは、無修飾のＲＸＲをヘテロ二量体受容体パートナーとして使用したときにしばしば起こるＲＸＲの過剰発現による幾つかの副作用を避ける。１つの２−ハイブリッドシステムにおいてＥｃＲおよびＲＸＲの天然のＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは除かれ、結果としてこれらのハイブリッド分子は細胞内に存在するその他のステロイドホルモン受容体と相互作用する機会が少ないことから、副作用は減少する。さらなる遺伝子スイッチシステムは以下に開示されるものを含み、これらはそれぞれが参照としてここに取り込まれる：米国特許第７，０９１，０３８号；国際公開第２００４０７８９２４号；欧州特許第１２６６０１５号；米国特許出願公開第２００１００４４１５１号；米国特許出願公開第２００２０１１０８６１号；米国特許出願公開第２００２０１１９５２１号；米国特許出願公開第２００４００３３６００号；米国特許出願公開第２００４０１９７８６１号；米国特許出願公開第２００４０２３５０９７号；米国特許出願公開第２００６００２０１４６号；米国特許出願公開第２００４００４９４３７号；米国特許出願公開第２００４００９６９４２号；米国特許出願公開第２００５０２２８０１６号；米国特許出願公開第２００５０２６６４５７号；米国特許出願公開第２００６０１００４１６号；国際公開第２００１／７０８１６号；国際公開第２００２／２９０７５号；国際公開第２００２／０６６６１２号；国際公開第２００２／０６６６１３号；国際公開第２００２／０６６６１４号；国際公開第２００２／０６６６１５号；国際公開第２００５／１０８６１７号；米国特許第６，２５８，６０３号；米国特許出願公開第２００５０２０９２８３号；米国特許出願公開第２００５０２２８０１６号；米国特許出願公開第２００６００２０１４６号；欧州特許第０９６５６４４号；米国特許第７，３０４，１６２号；米国特許第７，３０４，１６１号；メキシコ特許第２３４７４２号；韓国特許第１０−０５６３１４３号；オーストラリア特許第７６５３０６号；オーストラリア特許出願公開第２００２−２４８５００号；およびオーストラリア特許出願公開第２００２−３０６５５０号。
【００２０】
エクジソン受容体に基づく遺伝子調節システムの改良に伴う様々な応用でのそれらの使用の増加は、現在あるものよりもより高い活性を有するリガンドへの要求の増大をもたらす。米国特許第６，２５８，６０３Ｂ１号、米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３Ａ１号、および米国特許出願公開第２００６／００２０１４６Ａ１号（およびそれらが引用する特許）はジベンゾイルヒドラジンリガンドを開示する。しかしながら、改善された薬理学的特性を有するさらなるリガンドが必要とされている。出願者は、驚くべき生物学的活性と予想外の方法でトランス遺伝子の発現を調節する能力を有する、以前には記述されていないキラルジアシルヒドラジンリガンドを発見した。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、ホスト細胞内の興味ある標的遺伝子の発現を調節するために有用なエクジソン受容体に基づく誘導性遺伝子発現システムと共に使用するための、式１のジアシルヒドラジンリガンド、および式２または３のキラルジアシルヒドラジンリガンドを提供する。本発明のキラルジアシルヒドラジンリガンドは、Ｒ−またはＳ−立体異性体のいずれかの鏡像異性体が豊富である。出願者は、これら新規のキラルジアシルヒドラジンリガンドが驚くほど効果的であることを見出した。従って本発明は、遺伝子治療、タンパク質および抗体の大量生産、細胞に基づくスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、ならびにトランスジェニック生物における形質の調節のような、遺伝子発現レベルの制御が望ましい用途に有用である。本発明の利点は、遺伝子発現調節のため、および使用者の要求に適した発現レベルを調整するための手段を提供することである。
【００２２】
本発明は式１
2014193875.tif 000002
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す）
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００２３】
別の実施形態によれば、本発明は式２
2014193875.tif 000003
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＳである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００２４】
別の実施形態によれば、本発明は式３
2014193875.tif 000004
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００２５】
一実施形態によれば本発明は、少なくとも９５％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００２６】
別の実施形態によれば本発明は、少なくとも９５％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
本発明はまた、式４
2014193875.tif 000005
（式中、Ａはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ２は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ２は−ＣＲ８Ｒ９ＣＨＲ１０ＣＲ１１Ｒ１２と同じではなく、かつＲ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基から選択され、式中、Ｒ２が付着する不斉炭素原子はＲまたはＳ異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である）
で表される化合物を調製するための方法であって、
ａ）式５
2014193875.tif 000006
で表される化合物と式６
Ｒ２ＨＣ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ７     式６
（式中、ＸおよびＹは互いに独立してＯ、あるいはＲがアルキル基またはアリール基のＮＲであり、ＣａＣｂは互いに独立してＳ立体配置の不斉炭素原子またはＲ立体配置の不斉炭素原子であり、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立してアルキル基またはアリール基であり、Ｒ１３はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはＯＳＯ２ＣＦ３であり、Ｒ７はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつＲ２、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は上記と同じ意味である）
で表される化合物を、式７
2014193875.tif 000007
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
ｂ）式８
2014193875.tif 000008
で表される化合物を形成するため、式７で表される化合物を還元する工程と、
ｃ）式９
2014193875.tif 000009
で表される化合物を形成するため、式８で表される化合物を、式Ｂ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程と、
ｄ）式１０
2014193875.tif 000010
で表される化合物を形成するため、式９で表される化合物のＲ７ＣＯ２−残基を除去する工程、および
ｅ）式４で表される化合物を形成するため、式１０で表される化合物を、式Ａ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
【００２８】
本発明はまた、式１のジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３のキラルジアシルヒドラジンリガンドによる遺伝子発現調節システムを用いた、ホスト細胞における遺伝子発現の調節方法にも関する。
【００２９】
一実施形態によれば本発明は、減少したレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、かつμＭ以下の濃度のリガンドに反応する誘導性遺伝子発現システムにおける、式１のジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３のキラルジアシルヒドラジンリガンドの使用に関する。
【００３０】
別の実施形態によれば本発明は、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関し、ここで該ホスト細胞は
ｉ）トランス活性化ドメイン
ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、および
ｉｉｉ）グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、および
ｉ）該ＤＮＡ結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ｉｉ）該トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
ｉｉｉ）該標的遺伝子
を含む第２の遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該標的遺伝子の発現は調節される。
【００３１】
別の実施形態によれば、本発明は、リガンドを被験体の細胞内でエクジソン受容体複合体に接触させることを含む、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための方法に関し、ここで該細胞はさらに、リガンドと組み合わせたときのエクジソン受容体複合体に対するＤＮＡ結合配列を含み、かつエクジソン受容体複合体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列複合体の形成が該遺伝子の発現を誘導し、かつ該リガンドが式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドであり、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現が調節される。
【００３２】
別の実施形態によれば本発明は、
ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
ｉ）ホスト細胞内で発現可能な第１の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および
（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第１の遺伝子発現カセット、
ｉｉ）該ホスト細胞内で発現可能な第２の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）トランス活性化ドメイン、および
（ｂ）キメラレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第２の遺伝子発現カセット、および
ｉｉｉ）ホスト細胞内で発現可能な第３の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント、
（ｂ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
（ｃ）その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第３の遺伝子発現カセットを含む工程、および
ｂ）ホスト細胞内に式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入し、ここでホスト細胞内の遺伝子発現が調節される工程を含む、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。
【００３３】
別の実施形態によれば、本発明はポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ）式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドへの曝露に実質的に非感受性である細胞を選択する工程、
ｂ）細胞内へ
ｉ）ＤＮＡコンストラクトであって、
（ａ）ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
（ｂ）該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、該反応エレメント
を含むコンストラクト、および
ｉｉ）エクジソン受容体複合体であって、
（ａ）該反応エレメントに結合するＤＮＡ結合ドメイン、
（ｂ）該リガンドの結合ドメイン、
（ｃ）トランス活性化ドメインを含む複合体を導入する工程、および
ｃ）ポリペプチドが産生される、該リガンドへ該細胞を曝露する工程を含む方法に関する。
【００３４】
本発明のこの実施形態は、細胞によるポリペプチド産生を時間的に制御する利点を提供する。さらにこれらの事例において、このようなポリペプチドの蓄積が細胞を傷害し得る場合、該細胞を本発明の化合物に接触させることにより、ポリペプチドの発現は短期間に限定される可能性がある。このような制御は、外因性遺伝子が治療上の遺伝子である場合特に重要である。治療上の遺伝子は、糖尿病患者におけるインスリンの産生のような、必要な機能を制御するポリペプチドを産生するために所望されてよい。これらはまた、癌細胞に致死的であるような、傷害性または致死性のタンパク質までをも産生するために使用されてよい。このような制御はまた、トランスジェニック植物におけるように、産生されるタンパク質の量が成長または生殖における代謝性の排出を構成し得る場合に重要であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】スイッチコンストラクトＣＶＢＥ、およびレポーターコンストラクト６ＸＥｃＲＥ  ＬａｃＺの模式図。両コンストラクトに隣接するものは末端反復配列であり、Ｇ４１８およびピューロマイシンは選択マーカーであり、ＣＭＶはサイトメガロウィルスプロモーターであり、ＶＢＥはＶＰ１６トランス活性化ドメインの下流に挿入したカイコＥｃＲの２６−５４６のアミノ酸に対するコード配列であり、６ＸＥｃＲＥは６コピーのエクジソン反応エレメントであり、ｌａｃＺはレポーター酵素のβ‐ガラクトシダーゼをコードする。
【図２】（Ａ）ｒａｃ−、（Ｂ）（Ｒ）−および（Ｃ）（Ｓ）−３，５−ジメチル‐安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジドのキラルＨＰＬＣの比較。
【図３】マウスにおけるＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ遺伝子発現の誘導における、ｒａｃ−、（Ｒ）−および（Ｓ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのｉｎ  ｖｉｖｏでの比較を示すグラフ。黒丸はＳ鏡像異性体、黒三角はラセミ体、および白丸はＲ鏡像異性体を示す。
【図４】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体のサンプルロットの表。メタノール／水またはトルエン／ヘプタンからの迅速な結晶化／沈殿により得られたＲ鏡像異性体のサンプルは、同じ粉末でのＸ線回析パターン（データ未提示）をもたらし、互いに比較したとき、およびＣＨ３ＯＨ結晶化により得られた標準物（１６５．１℃−１６６．５℃）と比較したとき、基本的に同じ融点（［トルエン／ヘプタン］１６６．２℃−１６７．１℃、［ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ］１６６．５−１６７．４℃）を有していた。メタノール蒸発により得られたラセミ体の、別々の２調製によるサンプルは、実験エラーおよび純度におけるわずかな変動の範囲内で基本的に同じ融点（１７０−１７１℃、１６９−１７０℃）を示した。
【図５】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したＲ鏡像異性体の粒径分布を示す表。
【図６】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したラセミ体の粒径分布を示す表。
【図７】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したラセミ体およびＲ鏡像異性体の、バルクおよびタップ密度分析を示す表。
【図８】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したラセミ体およびＲ鏡像異性体の、熱重量分析／示差熱分析（ＴＧＡ／ＤＴＡ）分析（温度プロット）は異なる結晶形を示す。ロット番号ＲＥＨ−２８−９−１およびＲＥＨ−２８−４−２のサンプル重量は７．７１９９４ｍｇである。サンプル１ｍｇあたりのμＶの単位におけるシグナル出力（μＶ／ｍｇ）；熱重量分析−サンプルの重量変化のパーセンテージ（ＴＧ％）。両方の物質はＤＴＡ特性において吸熱現象を示した。Ｒ鏡像異性体の開始温度（１６３．６℃）はラセミ体のそれ（１７１．２℃）に比較して著しく低かった。Ｒ鏡像異性体の融合熱（５９．８ｕｖ．ｓ／ｍｇ）もまた、ラセミ体のそれ（８０．８ｕｖ．ｓ／ｍｇ）に比較して著しく低かった。
【図９】薬理学的賦形剤中の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の、医薬賦形剤中での定性比較溶解度試験を示す表。
【図１０】熱力学的平衡試験（９０℃５分間、または表示された時間；２回の処理）に続き、室温まで冷却し、薬理学的賦形剤中の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体を加えた結果を示す表。処理１は、室温で＜２．５時間攪拌した結果である。
【図１１】２０％ＰＥＧ１０００蒸留水溶液ｐＨ７．０中の、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の溶解度（μＭ）を示す表。
【図１２】水性ポリソルベート８０中の、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の溶解度を示す表。
【図１３】Ｃａｃｏ−２細胞の単層を通した、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の双方向性の透過率を示す表。ａ透過率の分類：（ＰａｐｐＡ→Ｂ）＜１．０Ｘ１０−６ｃｍ／ｓ＝低；（ＰａｐｐＡ→Ｂ）＞１．０Ｘ１０−６ｃｍ／ｓ＝高；ｂ有意な流出：流出＞３．０および（ＰａｐｐＢ→Ａ）＞１．０Ｘ１０−６ｃｍ／ｓ。
【図１４】ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞における、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の透過率を示す表。分類：Ａ−Ｂ  Ｐａｐｐ＞３．０および流出比＜３．０：高。Ａ−Ｂ  Ｐａｐｐ＞３．０および１０＞流出比＞３．０：中。Ａ−Ｂ  Ｐａｐｐ＞３．０および流出比＞１０：低。Ａ−Ｂ  Ｐａｐｐ＜３．０：低。
【図１５】ヒト肝臓ミクロソームにおける、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の安定性を示す表。
【図１６】Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ：Ｃｒｌマウスにおける、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体／Ｌａｂｒａｓｏｌ調製品の投与予定を示す表。ａ９日間（第１の雌１８匹／群）または１２日間（第２の雌１８匹／群）の投与量；ｂ交換の可能性があるものとして含まれる。
【図１７】２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体の非微粒子化および微粒子化サンプルの顕微鏡写真。注記、参照の縮尺は５０ミクロン。
【図１８】Ｌａｂｒａｓｏｌ中の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の４投与量（３、１０、３０および５０ｍｇ／ｋｇ／日）における投与後９日目の、その日の投与の数時間後の血清濃度を示す表。
【図１９】Ｌａｂｒａｓｏｌ中の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の４投与量（３、１０、３０および５０ｍｇ／ｋｇ／日）における投与後１２日目の、その日の投与の数時間後の血清濃度を示す表。
【図２０】ｐＣＭＶ／ＧＥＶＹ（ＤＥＦ）プラスミドの図表示。プラスミドｐＣＭＶ／ＧＥＦｙ（ＤＥＦ）は、Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ／Ｅ２７４Ｖ変異を有するトウヒシントメハマキのＥｃＲ由来で、かつ酵母ＧＡＬ４−ＤＢＤ（ａａ  １−１４７）の下流に融合されたＤ、Ｅ、およびＦドメインから構成され、ｐＢＩＮＤベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン、米国）のＣＭＶプロモーター、および下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下に配置される。ここに示されるＥｃＲのＤＥＦドメインは、５’および３’末端の２０−２５ｎｔ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて増幅した。５’および３’プライマーにはそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を加えた。ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、ｐＢＩＮＤベクター内へクローン化した。
【図２１】ｐＣＭＶ／ＶＰ１６−Ｈｓ−ＬｍＲＸＲベクターの図表示。ｐＣＭＶ／ＶＰ１６−Ｈｓ−ＬｍＲＸＲベクターは、ＶＰ１６活性化ドメインの下流に融合され、かつｐＢＩＮＤベクター内のＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる、ヒトＲＸＲβ（Ｅドメインのへリックス１−８）およびトノサマバッタＲＸＲ（Ｅドメインのへリックス９−１２）由来のキメラＲＸＲを含む。
【図２２】ｐ６ｘＧＡＬ４ＲＥ−ＴＴＲ−ＳＥＡＰレポーターベクターの図表示。誘導性ＳＥＡＰレポーターベクターであるｐ６ｘＧＡＬ４ＲＥ−ＴＴＲ−ＳＥＡＰは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの上流の６コピーのＧａｌ４反応エレメントからなる誘導性プロモーターの制御下に置かれた、ヒト分泌型アルカリフォスファターゼレポーター遺伝子を含む。
【図２３】Ｅ１およびＥ３領域が欠失し、かつＲＴＳ−ＩＬ１２構成要素がＥ１領域に取って代わった、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の図表示。
【図２４】Ａｄ．ＲｈｅｏＳＰ１−ｍＩＬ１２プラスミドを感染させたＢ１６細胞の注射、および０、３、１０、３０、５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量でのジアシルヒドラジンのＲ鏡像異性体およびラセミ体の投与後の、腫瘍および血清中のｍＩＬ１２ｐ７０の発現を示すグラフ。コントロール：リガンドを５０ｍｇ／ｋｇ／日のみで３日間投与される、形質導入されていないＢ１６関連マウス（Ｌｉｇａｎｄ５０）および未処置（リガンドなし）の腫瘍関連マウス（Ｔｕコントロール）。「Ｌ３日間、後中止３日間」：リガンドで３日間処置し、その後のさらなる３日間はリガンドを与えなかったマウス。
【図２５】Ａｄ．ＲｈｅｏＳＰ１−ｍＩＬ１２プラスミドを感染させたＢ１６細胞の注射、および０、３、１０、３０、５０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量でのジアシルヒドラジンのＲ鏡像異性体およびラセミ体の投与後の、腫瘍および血清中のｍＩＦＮ−γの発現を示すグラフ。コントロール：リガンドを５０ｍｇ／ｋｇ／日のみで３日間投与される、形質導入されていないＢ１６関連マウス（Ｌｉｇａｎｄ５０）および未処置（リガンドなし）の腫瘍関連マウス（Ｔｕコントロール）。「Ｌ３日間、後中止３日間」：リガンドで３日間処置し、その後のさらなる３日間はリガンドを与えなかったマウス。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は式１
2014193875.tif 000011
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す）
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００３７】
別の実施形態によれば、本発明は式２
2014193875.tif 000012
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＳである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００３８】
別の実施形態によれば、本発明は式３
2014193875.tif 000013
（式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、かつＲ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００３９】
別の実施形態によれば、本発明は式２または３
（式中、Ａは−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＯＣＨ２Ｐｈ、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基を表し、Ｒ１は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または任意に置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基を表し、かつＲ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基または任意に置換されたアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式２では主にＳであり、かつＲ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式３では主にＲである）
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４０】
別の実施形態によれば、本発明は式２または３
（式中、Ａは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基を表し、Ｒ１は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基または任意に置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基を表し、かつＲ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基または任意に置換されたアリール基を表すが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式２では主にＳであり、かつＲ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式３では主にＲである）
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４１】
別の実施形態によれば、本発明は式２または３
（式中、Ａは
2014193875.tif 000014
で表され、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄおよびＲ３ｅは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；または
Ｒ３ａおよびＲ３ｂはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成するか；またはＲ３ｂおよびＲ３ｃはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成し；
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、およびＲ６ｃは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；
ＸはＯまたはＳであり、Ｂは
2014193875.tif 000015
で表され；かつ
Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、およびＲ３ｊは互いに独立して水素、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から選択され；または
Ｒ３ｆおよびＲ３ｇはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成するか；またはＲ３ｇおよびＲ３ｈはまとまって、それらが付着する炭素原子と共に、シクロアルキル基または複素環基と融合した５、６、または７員環を形成し；
式中、Ｒｃは水素、ヒドロキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはアリールアルキルオキシ基を表し；
Ｒｄはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；
Ｒｅは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；
Ｒｆは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアミノ基を表し；
Ｒｇはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、またはアミノ基を表し；
Ｒｈは水素、アルキル基、アリール基、シアノ基、またはニトロ基を表し；
Ｒ１は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または任意に置換された（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基を表し；かつ
Ｒ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基、または任意に置換されたアリール基で表されるが、Ｒ１およびＲ２は同じではなく、
式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式２では主にＳであり、かつ
Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が式３では主にＲである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４２】
別の実施形態によれば、本発明は式２
（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅ、Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、Ｒ３ｊ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃおよびＸは上記と同じ意味であり、
Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル基を表し；かつＲ２は任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基を表し、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＳである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４３】
別の実施形態によれば、本発明は式３
（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅ、Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、Ｒ３ｊ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃおよびＸは上記と同じ意味であり、
Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル基を表し；かつＲ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表すがＲ１およびＲ２は同じではなく、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４４】
一実施形態によれば、本発明は式２
（式中、Ａは
2014193875.tif 000016
で表され、
Ｂは
2014193875.tif 000017
で表され、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅ、Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、およびＲ３ｊは互いに独立して水素、ハロ基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基から選択され、
Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル基を表し；かつＲ２は任意に置換された（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基を表し、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＳである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４５】
別の実施形態によれば、本発明は式３
（式中、Ａは
2014193875.tif 000018
で表され、
Ｂは
2014193875.tif 000019
で表され、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅ、Ｒ３ｆ、Ｒ３ｇ、Ｒ３ｈ、Ｒ３ｉ、およびＲ３ｊは互いに独立して水素、ハロ基、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ基から選択され、
Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、または（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル基を表し；かつＲ２は任意に置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表し、式中、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子における無水の立体配置が主にＲである）
で表される鏡像異性体の豊富な化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。
【００４６】
別の実施形態によれば本発明は、少なくとも５０％、７５％、８５％、９５％、または＞９９％のＳ異性体の鏡像異性体過剰率を有する、式２で示される鏡像異性体の豊富な化合物に関する。一実施形態によれば、式２で示される化合物は実質的にＳ異性体からなる。
【００４７】
別の実施形態によれば本発明は、少なくとも５０％、７５％、８５％、９５％、または＞９９％のＲ異性体の鏡像異性体過剰率を有する、式３で示される鏡像異性体の豊富な化合物に関する。一実施形態によれば、式３で示される化合物は実質的にＲ異性体からなる。
【００４８】
別の実施形態によれば本発明は、式１、２、または３で表される化合物を含む医薬組成物に関する。
【００４９】
一実施形態によれば本発明は、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形に関する。一実施形態によれば、該化合物は鏡像異性的に純粋である。
【００５０】
別の実施形態によれば本発明は、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形を含む医薬組成物に関する。一実施形態によれば、該化合物は鏡像異性的に純粋である。
【００５１】
鏡像異性的に純粋な（Ｒ）−３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジドは、それをｉｎ  ｖｉｖｏでの医薬品としての使用に独特に適応させる有利な特性の組み合わせをもつことが予期せず発見された。このような特性は、ラセミ体に比較した、より低い融点およびより低い融合熱（実施例６８）；ラセミ体に比較した、多数の液体医薬賦形剤中へのより良い溶解性（実施例６８）；ラセミ体に比較した、ある細胞におけるより良い透過性（実施例６９）；ラセミ体よりも血液脳関門を通過しやすいと思われること（実施例６９）；ラセミ体に比較した、肝細胞代謝に対するより良い安定性（実施例７０）；Ｌａｂｒａｓｏｌ溶液または懸濁液として経口投与した際、ラセミ体に比較して著しく高い血漿濃度を達成すること（実施例７１）；およびＥｃＲに基づく遺伝子スイッチの活性化により、ラセミ体に比較してより大きなｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現を達成すること（実施例７２）を含む。
【００５２】
本発明はまた、式４
2014193875.tif 000020
（式中、Ａはアリールアルキル基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ２は任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表すが、Ｒ２は−ＣＲ８Ｒ９ＣＨＲ１０ＣＲ１１Ｒ１２と同じではなく、かつＲ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は互いに独立して水素、アルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基から選択され、式中、Ｒ２が付着する不斉炭素原子はＲまたはＳ異性体のどちらかの鏡像異性体が豊富である）
で表される化合物を調製するための方法であって、
ａ）式５
2014193875.tif 000021
で表される化合物と式６
Ｒ２ＨＣ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ７     式６
（式中、ＸおよびＹは互いに独立してＯ、あるいはＲがアルキル基またはアリール基のＮＲであり、ＣａＣｂは互いに独立してＳ立体配置の不斉炭素原子またはＲ立体配置の不斉炭素原子であり、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立してアルキル基またはアリール基であり、Ｒ１３はハロ基、水素、アルキル基、アルコキシ基またはＯＳＯ２ＣＦ３であり、Ｒ７はアルキル基、アリールアルキル基またはアリール基であり、かつＲ２、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は上記と同じ意味である）
で表される化合物を、式７
2014193875.tif 000022
で表される化合物を形成するために反応させる工程と、
ｂ）式８
2014193875.tif 000023
で表される化合物を形成するため、式７で表される化合物を還元する工程と、
ｃ）式９
2014193875.tif 000024
で表される化合物を形成するため、式８で表される化合物を、式Ｂ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程と、
ｄ）式１０
2014193875.tif 000025
で表される化合物を形成するため、式９で表される化合物のＲ７ＣＯ２−残基を除去する工程、および
ｅ）式４で表される化合物を形成するため、式１０で表される化合物を、式Ａ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
【００５３】
別の実施形態によれば本発明は、式４（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素である）で表される化合物の調製方法に関する。
【００５４】
別の実施形態によれば、本発明は式４
（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素であり；ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；かつＣａおよびＣｂのそれぞれがＲ立体配置である）
で表される化合物の調製方法に関する。
【００５５】
別の実施形態によれば、本発明は式４
（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素であり；ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；かつＣａおよびＣｂのそれぞれがＳ立体配置である）
で表される化合物の調製方法に関する。
【００５６】
別の実施形態によれば、本発明は式４
（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素であり；ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；ＣａおよびＣｂのそれぞれがＳ立体配置であり；かつＢが３，５−ジ−メチルフェニル基である）
で表される化合物の調製方法に関する。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明は式４
（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素であり；ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；ＣａおよびＣｂのそれぞれがＳ立体配置であり；かつＡが２−エチル−３−メトキシフェニル基である）
で表される化合物の調製方法に関する。
【００５８】
別の実施形態によれば、本発明は式４
（式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が水素であり；ＸがＮＲであり、かつＲがメチル基であり；ＹがＯであり；Ｒ１４がメチル基であり；Ｒ１５がフェニル基であり；ＣａおよびＣｂのそれぞれがＳ立体配置であり；かつＲ２がｔｅｒｔ−ブチル基である）
で表される化合物の調製方法に関する。
【００５９】
本発明はまた、式２または３で表される化合物を調製するための方法であって、
ａ）式１１
2014193875.tif 000026
で表される化合物と式１２
2014193875.tif 000027
で表される化合物のケトンを、式１３
2014193875.tif 000028
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じではない）
で表される化合物を形成するために反応させる工程と；
ｂ）式Ｓ−１４、または、式Ｒ−１４
2014193875.tif 000029
で表される化合物を形成するため、式１３で表される化合物をキラル触媒の存在下で還元する工程；および
ｃ）式２または３で表される化合物を形成するため、式Ｓ−１４またはＲ−１４で表される化合物を、式Ｂ−ＣＯ−ＬＧで表され、ＬＧが脱離基である化合物と反応させる工程とを含む方法にも関する。
【００６０】
本発明の式１で表されるジアシルヒドラジンは、ｒａｃ−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル、またはｒａｃ−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを含むがこれらに限定されない。
【００６１】
式２または３で表される本発明のキラルジアシルヒドラジンは以下：
（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−ベンゾイル−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−フルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（２−ブロモ−ベンゾイル）−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−クロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，４−ジメトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジフルオロ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（４−メチル−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（ナフタレン−１−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（ナフタレン−２−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（チオフェン−２−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，５−ジメチル−フラン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（６−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
（Ｒ）−３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−Ｎ−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドを含むがこれらに限定されない。
【００６２】
式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンは、分子の他の部分（すなわち、Ｒ１およびＲ２に関連する不斉炭素原子においてではない）にキラル中心を含んでよい。全ての可能な鏡像異性体、ジアステレオマーおよび立体異性体は、本発明の範囲内に包含されることが企図される。
【００６３】
本発明はまた、式１のジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３のキラルジアシルヒドラジンリガンドによる遺伝子発現調節システムを用いた、ホスト細胞における遺伝子発現の調節方法にも関する。
【００６４】
一実施形態によれば本発明は、リガンド非存在下での減少したレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、かつμＭ以下の濃度のリガンドに反応する誘導性遺伝子発現システムにおける、式１のジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３のキラルジアシルヒドラジンリガンドの使用に関する。
【００６５】
別の実施形態によれば本発明は、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関し、ここで該ホスト細胞は
ｉ）トランス活性化ドメイン
ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、および
ｉｉｉ）グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、および
ｉ）該ＤＮＡ結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ｉｉ）該トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、および
ｉｉｉ）該標的遺伝子
を含む第２の遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該標的遺伝子の発現は調節される。
【００６６】
別の実施形態によれば本発明は、ホスト細胞内で興味ある遺伝子の発現を調節する方法に関し、ここで該ホスト細胞は
ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、および
ｉｉ）グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の組み換え遺伝子発現カセット、および
ｉ）該ＤＮＡ結合ドメインに結合可能な反応エレメント
ｉｉ）プロモーター、および
ｉｉｉ）該興味ある遺伝子
を含む第２の組み換え遺伝子発現カセットを含み、
該方法は該ホスト細胞を式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドと接触させることを含み、ここで該興味ある遺伝子の発現は調節される。
【００６７】
別の実施形態によれば、本発明は、リガンドを被験体の細胞内でエクジソン受容体複合体に接触させることを含む、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための方法に関し、ここで該細胞はさらに、リガンドと組み合わせたときのエクジソン受容体複合体に対するＤＮＡ結合配列を含み、かつエクジソン受容体複合体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列複合体の形成が該遺伝子の発現を誘導し、かつ該リガンドが式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドであり、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現が調節される。
【００６８】
一実施形態によれば、細胞は自己細胞である。すなわち該細胞は被験体から得られ、エクジソン受容体複合体およびＤＮＡ結合配列と共にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた該自己細胞はその後、後にリガンドで処置される被験体へ移植により戻される。該自己細胞は、点滴または注射（例えば直接注射）を含む幾つかの方法のいずれによっても移植されてよい。一実施形態によれば、自己細胞は腫瘍内注射により移植される。
【００６９】
別の実施形態によれば、本発明は、リガンドを被験体の細胞内でキメラエクジソン受容体複合体に接触させることを含む、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現を調節するための方法に関し、ここで該細胞はさらに、リガンドと組み合わせたときのエクジソン受容体複合体に対するＤＮＡ結合配列（プロモーターをさらに含む）を含み、かつエクジソン受容体複合体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列複合体の形成が該遺伝子の発現を誘導し、かつ該リガンドが式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドであり、トランスジェニック被験体における内在性または異種性遺伝子発現が調節される。
【００７０】
別の実施形態によれば、トランスジェニック非験体は植物、昆虫、動物、あるいは哺乳類、例えばヒトまたはウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌもしくはネコのような獣医学的動物である。
【００７１】
別の実施形態によれば、本発明はトランスジェニック被験体におけるトランス遺伝子発現の調節方法に関し、ここで該トランスジェニック被験体はトランス遺伝子発現の調節が可能な組み換えエクジソン受容体複合体を含む。該方法は、該被験体に有効量の式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを投与することを含む。
【００７２】
別の実施形態によれば本発明は、
ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程であって、該システムが
ｉ）ホスト細胞内で発現可能な第１の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および
（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第１の遺伝子発現カセット、
ｉｉ）該ホスト細胞内で発現可能な第２の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）トランス活性化ドメイン、および
（ｂ）キメラレチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、該第２の遺伝子発現カセット、および
ｉｉｉ）ホスト細胞内で発現可能な第３の遺伝子発現カセットであって、
（ａ）第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント、
（ｂ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、および
（ｃ）その発現が調節されるべき遺伝子
を含むポリヌクレオチド配列を含む、該第３の遺伝子発現カセットを含む工程、および
ｂ）ホスト細胞内の遺伝子発現が調節される、ホスト細胞内に式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程を含む、ホスト細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、
ａ）式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドへの曝露に実質的に非感受性であるホスト細胞を選択する工程、
ｂ）ホスト細胞内へ
ｉ）ＤＮＡコンストラクトであって、
（ａ）ポリペプチドをコードする外因性遺伝子、および
（ｂ）該遺伝子が反応エレメントの制御下にある、反応エレメント
を含むコンストラクト、および
ｉｉ）エクジソン受容体複合体であって、
ａ）該反応エレメントに結合するＤＮＡ結合ドメイン、
ｂ）前記化合物の結合ドメイン、
ｃ）トランス活性化ドメインを含む複合体、を導入する工程、および
ｄ）前記化合物へ該細胞を曝露し、ここでポリペプチドが産生される工程を含む、ポリペプチドを産生するための方法に関する。
【００７３】
別の実施形態によれば本発明は、エクジソン受容体複合体またはエクジソン受容体リガンド結合ドメインが変異を含む、方法に関する。
【００７４】
ここで用いられる略語は、他に記載のない限り、化学および生物学の技術分野におけるそれらの従来の意味を持つ。例えば、「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力の倍数を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、「ＤＭＥ」はジメトキシエタンを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりのポンドに関するものであり、かつ「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィー」を意味する。
【００７５】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アルキル基」との語は、１ないし１０の炭素、または指定された数の炭素（Ｃ１−Ｃ１０は１ないし１０の炭素を意味する）を有する、直鎖または分岐の脂肪族飽和炭化水素に関する。代表的なアルキル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、４，４−ジメチルフェニル基、ｎ−オクチル基、２，２，４−トリメチルペンチル基、ノニル基、デシル基などを含む。
【００７６】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたアルキル基」との語は、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲＣ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし３の置換基により任意に置換された、上に定義されたアルキル基に関する。代表的な置換アルキル基は、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３などを含む。
【００７７】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「ハロアルキル基」との語は、１ないし６のハロ置換基を有する、上に定義されたアルキル基に関する。代表的なハロアルキル基は、トリフルオロメチル基、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆなどを含む。
【００７８】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「ヒドロキシアルキル基」との語は、１ないし３のヒドロキシ置換基、一般的には１のヒドロキシ置換基を有する、上に定義されたアルキル基に関する。代表的なヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基などを含む。
【００７９】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アリールアルキル基」との語は、１ないし３のアリール置換基（該アリール置換基は下記のように任意に置換されてよい）、一般的には１または２のアリール置換基を有する、上に定義されたアルキル基に関する。代表的なアリールアルキル基は、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、４−フルオロフェニルエチル基、フェニルプロピル基、ジフェニルメチル基などを含む。
【００８０】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「シクロアルキル基」との語は、３ないし１２の炭素原子または指定された数の炭素を有する１ないし３の環を含む、飽和および部分的に不飽和（１または２の二重結合を含む）の環状炭化水素基に関する。代表的なシクロアルキル基は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、ノルボルニル基、デカリン基、アダマンチル基などを含む。
【００８１】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたシクロアルキル基」との語は、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし３の置換基により任意に置換された、上に定義されたシクロアルキル基に関する。代表的な、任意に置換されたシクロアルキル基は
2014193875.tif 000030
などを含む。任意に置換されたシクロアルキル基は、下記のように任意に置換されたアリール基を供給するためにアリール基へ融合されてよい。
【００８２】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アルケニル基」との語は、１ないし３の炭素−炭素二重結合、一般的には１または２の二重結合を含む、上に定義されたアルキル基に関する。代表的なアルケニル基は、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ３などを含む。
【００８３】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたアルケニル基」との語は、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし３の置換基により任意に置換された、上に定義されたアルケニル基に関する。代表的な任意に置換されたアルケニル基は、−ＣＨ＝ＣＨＰｈ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＰｈなどを含む。
【００８４】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アルキニル基」との語は、１ないし３の炭素−炭素三重結合、一般的には１または２の三重結合を含む、上に定義されたアルキル基に関する。代表的なアルキニル基は、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ≡ＣＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ、および−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＣＨ３などを含む。
【００８５】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたアルキニル基」との語は、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし３の置換基により任意に置換された、上に定義されたアルキニル基に関する。代表的な任意に置換されたアルキニル基は、−Ｃ≡ＣＰｈ、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＰｈなどを含む。
【００８６】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アリール基」との語は、フェニル基（Ｐｈと略される）、１−ナフチル基、および２−ナフチル基のような、６ないし１２の炭素原子を有する単環および二環の芳香環システムに関する。
【００８７】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたアリール基」との語は、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし５の置換基、一般的には１ないし３の置換基により任意に置換された、上に定義されたアリール基に関する。代表的な任意に置換されたアリール基は、２−メチルフェニル基、２−メトキシフェニル基、２−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−メチルフェニル基、３−メトキシフェニル基、３−クロロフェニル基、４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−クロロフェニル基、２，６−ジ−フルオロフェニル基、２，６−ジ−クロロフェニル基、２−メチル基、３−メトキシフェニル基、２−エチル基、３−メトキシフェニル基、３，４−ジ−メトキシフェニル基、３，５−ジ−フルオロフェニル基、３，５−ジ−メチルフェニル基、および３，５−ジメトキシ基、４−メチルフェニル基などを含む。任意に置換されたアリール基との語は、融合された任意に置換されたシクロアルキル基、および融合された任意に置換された複素環基環を有する基を含むことが意図される。例は
2014193875.tif 000031
などを含む。
【００８８】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「ヘテロアリール基」との語は、５ないし１４の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄から互いに独立して選択される１、２、３または４のヘテロ原子を有する、単環および二環の芳香環システムに関する。代表的なヘテロアリール基は、１−ピロリル基、２−ピロリル基、３−ピロリル基、２−イミダゾリル基、４−イミダゾリル基、ピラジニル基、２−オキサゾリル基、４−オキサゾリル基、５−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、４−イソオキサゾリル基、５−イソオキサゾリル基、２−チアゾリル基、４−チアゾリル基、５−チアゾリル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピリミジル基、４−ピリミジル基、５−ベンゾチアゾリル基、プリニル基、２−ベンゾイミダゾリル基、４−ベンゾイミダゾリル基、５−ベンゾイミダゾリル基、２−ベンゾチアゾリル基、４−ベンゾチアゾリル基、５−ベンゾチアゾリル基、５−インドリル基、５−インドリル基、３−インダゾリル基、４−インダゾリル基、５−インダゾリル基、１−イソキノリル基、５−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、５−キノキサリニル基、２−キノリル基、３−キノリル基、６−キノリル基などを含む。ヘテロアリール基との語は、可能性のあるＮ−酸化物を含むことが意図される。代表的なＮ−酸化物はピリジルＮ−酸化物などを含む。
【００８９】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換されたヘテロアリール基」との語は、いずれの利用可能な炭素原子も、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし４の置換基、一般的には１ないし２の置換基により任意に置換された、上に定義されたヘテロアリール基に関する。代表的な置換されたヘテロアリール基は
2014193875.tif 000032
などを含む。
【００９０】
従前に同定されたキラルジアシルヒドラジンリガンドの末端部分であるＡおよびＢについての、任意に置換されたアリール基および任意に置換されたヘテロアリール基の特異的な化学的性質は狭義には決定的でなく、記述のように広く多様な置換基が意図される。任意に置換されたアリール基および任意に置換されたヘテロアリール基に関する置換基は、好ましくは炭素およびヘテロ原子の総数が約２０を超えないもの、さらに好ましくは約１５を超えないものが選択される。
【００９１】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「複素環基」との語は、２ないし１２の炭素原子ならびに１もしくは２の酸素、硫黄、または窒素原子を有する１ないし３の環を含む、飽和および部分的に不飽和（１または２の二重結合を含む）の環状基に関する。該複素環基は、炭素原子または窒素原子を通して、分子の他の部分に任意に連結できる。代表的な複素環基は
2014193875.tif 000033
などを含む。
【００９２】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「任意に置換された複素環基」との語は、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、任意に置換されたアルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、任意に置換された複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アルキルチオ基、カルボキシアミド基、スルフォンアミド基、−ＣＯＲｃ、−ＳＯ２Ｒｄ、−Ｎ（Ｒｅ）ＣＯＲｆ、−Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｇまたは−Ｎ（Ｒｅ）Ｃ＝Ｎ（Ｒｈ）−アミノ基から互いに独立して選択される１ないし４の置換基、典型的には１ないし２の置換基により任意に置換された、上に定義された複素環基に関する。代表的な任意に置換された複素環基は
2014193875.tif 000034
などを含む。任意に置換された複素環基は、上記のように任意に置換されたアリール基を供給するためにアリール基へ融合されてよい。
【００９３】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アルコキシ基」との語は、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、または末端酸素原子に付着した任意に置換されたアルキニル基に関する。代表的なアルコキシ基は、メトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２などを含む。
【００９４】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アリールオキシ基」との語は、末端酸素原子に付着した任意に置換されたアリール基に関する。代表的なアリールオキシ基は、フェノキシ基などを含む。
【００９５】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アリールアルキルオキシ基」との語は、末端酸素原子に付着したアリールアルキル基に関する。代表的なアリールアルキルオキシ基は、ベンジルオキシ基などを含む。
【００９６】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アルキルチオ基」との語は、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、または末端硫黄原子に付着した任意に置換されたアルキニル基に関する。代表的なアルキルチオ基は−ＳＣＨ３などを含む。
【００９７】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「ハロ基」もしくは「ハロゲン」との語は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基またはヨード基に関する。
【００９８】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「アミノ基」との語は、ＲａおよびＲｂが互いに独立して水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基であるか；またはＲａおよびＲｂがまとまって、それらが付着する窒素原子と共に４ないし７員複素環を形成する、式−ＮＲａＲｂで表される遊離基に関する。代表的なアミノ基は、−ＮＨ２、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ２Ｐｈなどを含む。
【００９９】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「カルボキシアミド基」との語は、式−ＣＯ−アミノ基で表される遊離基に関する。代表的なカルボキシアミド基は、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｈ）ＣＨ３、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｐｈなどを含む。
【０１００】
ここで、それ自体または他の基の一部として用いられる「スルフォンアミド基」との語は、式−ＳＯ２−アミノ基で表される遊離基に関する。代表的なスルフォンアミド基は、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、−ＳＯ２Ｎ（Ｈ）Ｐｈなどを含む。
【０１０１】
上記の任意に置換された基に関し、Ｒｃは水素、ヒドロキシ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはアリールアルキルオキシ基を表し；Ｒｄはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；Ｒｅは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し；Ｒｆは水素、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアミノ基を表し；Ｒｇはハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アリールアルキル基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、任意に置換されたヘテロアリール基、またはアミノ基を表し；Ｒｈは水素、アルキル基、アリール基、シアノ基、またはニトロ基を表す。
【０１０２】
本明細書を通じ、基およびその任意の置換基は、安定な成分および化合物を供給するように選択される。
【０１０３】
本発明の化合物は、これらの化合物を構成する原子の１以上において、原子同位元素を人為的な割合で含んでよい。例えば、化合物は例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、または炭素−１４（１４Ｃ）のような放射性同位元素により放射標識されてよい。本発明の化合物の全ての同位体的な変化は、放射性であるかどうかに関わりなく、本発明の範囲内に含まれることが企図される。
【０１０４】
本発明の化合物は、それらもまた本発明の範囲内である塩を形成してよい。ここで本発明の化合物への参照は、他に記載のない限り、その塩への参照を含むことが理解される。ここで用いられる「塩」との語は、無機および／または有機の酸および塩基により形成される、酸性および／または塩基性の塩を意味する。加えて、式１、２または３で表される化合物が塩基成分および酸成分の両方を含むとき、双性イオン（分子内塩）が形成されてよく、これらはここで用いられる「塩」との語に含まれる。例えば調製の間に用いられる可能性のある分離または精製工程においては、その他の塩もまた有用であるが、薬理学的に許容される（すなわち無毒性、生理学的に許容される）塩が好ましい。式１、２または３で表される化合物の塩は、例えば、塩が沈殿するような溶媒または水性溶媒中で、化合物を例えば同等量のようなある量の酸または塩基と反応させ、続いて凍結乾燥することにより形成されてよい。
【０１０５】
塩基成分を含む本発明の化合物は、様々な有機および無機酸により塩を形成してよい。代表的な酸付加塩は、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えばトリフルオロ酢酸により形成されるもの、）アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸により形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素酸により形成される）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸により形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸により形成される）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸により形成されるような）、スルホン酸塩（ここで述べられたような）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートのようなトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などを含む。
【０１０６】
酸成分を含む本発明の化合物は、様々な有機および無機塩基により塩を形成してよい。代表的な塩基性塩は、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、有機塩基（例えば有機アミン）による塩、例えばベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンにより形成される）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミン、およびアルギニン、リジンのようなアミノ酸による塩などを含む。
【０１０７】
本明細書中で使用される立体化学の用語および慣例は、他に記載のない限り、Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ  ６８：２１９３  （１９９６）に記載されたものと一致する。
【０１０８】
「鏡像異性体過剰率」または「ｅｅ」との語は、一鏡像異性体が他に比較してどれくらい存在するかの基準に関する。ＲおよびＳ鏡像異性体の混合物に対し、パーセント鏡像異性体過剰率は｜Ｒ−Ｓ｜＊１００と定義され、ここでＲおよびＳはそれぞれのモル、またはＲ＋Ｓ＝１であるような、混合物中の鏡像異性体の重量分率である。キラル物質の旋光度についての知識により、パーセント鏡像異性体過剰率は（［α］ｏｂｓ／［α］ｍａｘ）＊１００と定義され、ここで［α］ｏｂｓは鏡像異性体混合物の旋光度であり、［α］ｍａｘは純粋な鏡像異性体の旋光度である。鏡像異性体過剰率の決定は、ＮＭＲ分光法、キラルカラムクロマトグラフィー、または光学的旋光分析を含む、様々な分析方法を用いることにより可能である。
【０１０９】
「鏡像異性的に純粋」または「エナンチオピュア」との語は、その全ての分子（検出範囲内で）が同じ掌性方向を持つ、キラル物質のサンプルに関する。
【０１１０】
「鏡像異性体が豊富」または「エナンチオエンリッチ」との語は、その鏡像異性の比率が５０：５０よりも大きなキラル物質のサンプルに関する。鏡像異性体が豊富な化合物は鏡像異性的に純粋であり得る。
【０１１１】
「不斉炭素原子」との語は、４個の異なる原子または原子団に付着する、有機化合物の分子内の炭素原子に関する。
【０１１２】
「主に」との語は、５０：５０よりも大きな比率を意味する。
【０１１３】
「脱離基」または「ＬＧ」との語は、特定の反応における基質の残渣または主要部とみなされるものの中で、原子または集団から脱離する原子または集団に関する。アミド結合反応において、代表的な脱離基は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＣ６Ｆ５などを含む。
【０１１４】
本発明の目的のための「単離された」との語は、その最初の環境（それが自然に存在する環境）から除去された物質（例えば化学化合物、または核酸もしくはタンパク質のような生物学的物質）を示す。例えば、植物または動物内で自然な状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、自然に存在する隣接した核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」とみなされる。
【０１１５】
生物学的物質へ適用される「精製された」との語は、その物質が、他の化合物の存在に排他的である絶対的な純度を示す形で存在することを要求しない。これはむしろ相対的な定義である。
【０１１６】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合体、またはそのリン酸エステル類似体のいずれか、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルの、単鎖の形、または二重鎖へリックスに関する。二重鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子との語は、分子の一次および二次構造のみに関し、それを特定の三次構造のいずれかに限定するものではない。従って、この語は見出される二重鎖ＤＮＡ、とりわけ線状もしくは環状ＤＮＡ分子（例えば制限酵素断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡおよび染色体を含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する中で、ここでは配列は、転写されないＤＮＡ鎖（すなわちｍＲＮＡへの配列相同性をもつ鎖）に沿った５’から３’への方向における配列のみが与えられるという通常の慣習に従って記述されてよい。「組み換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けているＤＮＡ分子である。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含むがこれらに限定されない。
【０１１７】
「断片」との語は、参照核酸に比較した長さが短く、かつ共通部分にわたって、参照核酸に対し同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関する。本発明によるこのような核酸断片は、それが適切であるとき、構成物としてのより大きなポリヌクレオチドに含まれてよい。このような断片は、本発明による核酸の、長さが少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００または１５００の範囲の連続したヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれらから成る。
【０１１８】
ここで用いられる、「単離された核酸断片」は、任意に合成、非天然、または改変されたヌクレオチド塩基を含む、単鎖もしくは二重鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの重合体に関する。ＤＮＡ重合体の形である単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含んでよい。
【０１１９】
「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む、機能的分子（例えばポリペプチドまたはＲＮＡ）をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。「遺伝子」はまた、翻訳配列に先立ち（５’非コード配列）、かつ続く（３’非コード配列）調節性配列を含む、特定のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片に関する。「天然遺伝子」は、それ自体の調節性配列と共に天然に見出される遺伝子に関する。「キメラ遺伝子」は、天然において共には見出されない調節性および／またはコード配列を含む、天然遺伝子ではない遺伝子のいずれかに関する。従ってキメラ遺伝子は、異なる源由来の調節性配列およびコード配列、または同じ源由来であるが、天然に見出されるものとは異なる方法で配置された調節性配列および翻訳配列を含んでよい。キメラ遺伝子は、異なる源由来のコード配列および／または異なる源由来の調節性配列を含んでよい。「内在性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子に関する。「外来性」遺伝子または「異種性」遺伝子は、ホスト生物内に通常は見出されないが、遺伝子移入によってホスト生物内へ導入される遺伝子に関する。外来性遺伝子は、非天然生物内へ挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランス遺伝子」は形質転換方法によってゲノム内へ導入された遺伝子である。
【０１２０】
「異種性」ＤＮＡは、細胞内または細胞の染色体部位内に自然には位置していないＤＮＡに関する。好ましくは、異種性ＤＮＡは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。
【０１２１】
「ゲノム」との語は、染色体の、同様にミトコンドリアの、葉緑体、およびウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【０１２２】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、該核酸分子の単鎖形がその他の核酸分子とアニールできるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡのような別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（以下のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）中、特に１１章およびその中の表１１．１（全体が参照としてここに取り込まれる）に例証されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【０１２３】
ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物由来の相同性配列のような中程度に類似の断片から、近縁の生物由来の機能的酵素を複製する遺伝子のような高度に類似の断片までを選別するために調整できる。相同的な核酸の事前のスクリーニングのためには、５５゜のＴｍに相当する低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が使用できる（例えば、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件はより高いＴｍに相当する（例えば５ｘまたは６ｘＳＳＣと４０％ホルムアミド）。高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最も高いＴｍに相当する（例えば５０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＳＣ）。
【０１２４】
ハイブリダイゼーションには相補的配列を含む２つの核酸が必要とされ、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存するものの、塩基間のミスマッチがあり得る。「相補的」との語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関連性の記述に用いられる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って本発明はまた、ここに開示または使用された完全配列、同様に実質的に類似の核酸配列に相補的な、単離された核酸断片も含む。
【０１２５】
一実施形態によればポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍにおけるハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件を使用し、かつ上で説明した条件を利用することによって検出される。別の実施形態によればＴｍは６０℃であり；一実施形態によればＴｍは６３℃であり；別の実施形態によればＴｍは６５℃である。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション後の洗浄もまた、ストリンジェンシー条件を決定する。条件の一設定は、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分に始まり、続いて２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分を繰り返し、続いて０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分を２回繰り返す、一連の洗浄を用いる。ストリンジェント条件の一設定はより高い温度を用い、ここで洗浄は、最後の０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での３０分、２回の洗浄の温度が６０℃に増大することを除いては上記と同様である、。高度なストリンジェント条件の別の設定は、６５℃における０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での最後の２回の洗浄を用いる。
【０１２７】
核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、変化することが当該技術分野において公知である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間で相同性の類似の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順番で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドのためには、Ｔｍを算出するための式が得られる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ９．５０−０．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１１．７−１１．８を参照のこと）。
【０１２８】
本発明の一実施形態によればポリヌクレオチドは、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７摂氏温度におけるハイブリダイゼーション工程、ならびに少なくとも６３摂氏温度における２ｘＳＳＰＥ中での洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件を利用することによって検出される。一実施形態によればハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程に２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７摂氏温度を含む。別の実施形態によればハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の両方に、２ｘＳＳＰＥおよび６３摂氏温度を含む。
【０１２９】
別の実施形態によれば、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり；さらに好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さのような要素に従い、必要に応じて調整されてよいことを認識するであろう。
【０１３０】
「プローブ」との語は、二重鎖分子を形成するために相補的な単鎖標的核酸と塩基対になることのできる、単鎖核酸分子に関する。
【０１３１】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」との語は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズ可能な短い核酸に関する。オリゴヌクレオチドは、例えば３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドによって標識できる。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用できる。オリゴヌクレオチド（それらのうち一つ、または両方が標識されてよい）は、核酸の完全長または断片のクローニングのため、あるいは核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用できる。オリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡ分子と共に三重へリックスを形成するためにも使用できる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成的に、好ましくは核酸合成機において調製される。従ってオリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのような非自然発生のホスホエステル類似体結合により調製できる。
【０１３２】
「プライマー」は、適切な条件下でＤＮＡ合成の開始点となることのできる二重鎖核酸領域を作り出すために、標的核酸配列へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。このようなプライマーはポリメラーゼ連鎖反応に用いられてよい。
【０１３３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略され、特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。ＰＣＲは一連の温度サイクルの反復に関し、各サイクルが、標的分子の鎖を分離するための鋳型核酸の変性、単鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールしたプライマーの伸長の３段階を含む。ＰＣＲは標的分子の存在の検出のため、および定量的もしくは半定量的条件下で、核酸の出発プールの中での標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【０１３４】
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略され、１または複数のＲＮＡ分子由来の１または複数の標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に産生し、続いて特定の核酸配列または上記の１または複数の標的ｃＤＮＡ分子内の配列を酵素的に増幅するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。ＲＴ−ＰＣＲはまた、標的分子の存在の検出のため、および定量的もしくは半定量的条件下で、核酸の出発プールの中での標的分子の相対量を決定するための手段も提供する。
【０１３５】
ＤＮＡ「コード配列」は、ポリペプチドをコードし、かつ適切な調節性配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞内で転写およびポリペプチドに翻訳され得る二重鎖ＤＮＡ配列に関する。「適切な調節性配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列に関する。調節性配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでよい。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、原核生物の配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列までも含むことができるが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞内での発現を企図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常コード配列の３’に位置し得る。
【０１３６】
「翻訳領域」はＯＲＦと略され、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧのような開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻訳される、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡのいずれかである核酸配列の長さに関する。
【０１３７】
ここで「頭−頭」との語は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の方向性を表現するために用いられる。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接しており、これにより各ポリヌクレオチドの転写方向が、他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れて進行するとき、２つのポリヌクレオチドは頭−頭の方向性において位置する。「頭−頭」との語は、（５’）−（５’）と略されてよく、また、（←→）もしくは（３’←５’５’→３’）のシンボルによって示されてもよい。
【０１３８】
ここで「尾−尾」との語は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の方向性を表現するために用いられる。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接しており、これにより各ポリヌクレオチドの転写方向が、他方のポリヌクレオチドへ向かって進行するとき、２つのポリヌクレオチドは尾−尾の方向性において位置する。「尾−尾」との語は、（３’）−（３’）と略されてよく、また、（→←）もしくは（５’→３’３’←５’）のシンボルによって示されてもよい。
【０１３９】
ここで「頭−尾」との語は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の方向性を表現するために用いられる。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接しており、これにより各ポリヌクレオチドの転写方向が、他方のポリヌクレオチドの転写方向と同じ方向へ進行するとき、２つのポリヌクレオチドは頭−尾の方向性において位置する。「頭−尾」との語は、（５’）−（３’）と略されてよく、また、（→→）もしくは（５’→３’５’→３’）のシンボルによって示されてもよい。
【０１４０】
「下流」との語は、参照ヌクレオチド配列に対し、３’に位置するヌクレオチド配列に関する。特に、下流のヌクレオチド配列は一般に転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
【０１４１】
「上流」との語は、参照ヌクレオチド配列に対し、５’に位置するヌクレオチド配列に関する。特に、上流のヌクレオチド配列は一般にコード配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
【０１４２】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」との語は互換的に用いられ、二重鎖ＤＮＡ内の特異的なヌクレオチド配列内に結合し、かつ切断する酵素に関する。
【０１４３】
「相同組み換え」は、外来性ＤＮＡを別のＤＮＡ分子内へ挿入すること、例えば染色体内へのベクターの挿入に関する。好ましくは、相同組み換えのためにベクターは特異的な染色体部位を標的にする。特異的な相同組み換えのためにベクターは、相補的な結合およびベクターの染色体内への取り込みを可能にするため、染色体の配列に対する相同性領域を十分な長さで含むであろう。より長い相同性領域およびより大きな配列類似性の程度は、相同組み換えの効率を増大させるであろう。
【０１４４】
公知の幾つかの方法が、本発明のポリヌクレオチドを増殖するために用いられてよい。ひとたび適切なホストシステムおよび増殖条件が確立すれば、組み換え発現ベクターは増殖し、多量に調製できる。ここに述べるように、使用できる発現ベクターは、ほんの数例を挙げれば下記のベクター：ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのような、ヒトまたは動物ウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター、またはその派生物を含むがこれらに限定されない。
【０１４５】
「ベクター」は核酸のクローニングおよび／またはホスト細胞内への移入のためのいずれかのビヒクルに関する。ベクターは、そこへ別のＤＮＡセグメントが付着してよく、付着したセグメントの複製がもたらされるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下に複製可能な遺伝的要素（例えばプラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウィルス）のいずれかに関する。「ベクター」との語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に核酸を導入するための、ウィルス性および非ウィルス性両方のビヒクルを含む。当該技術分野において公知の多数のベクターが、核酸の操作、反応エレメントおよびプロモーターの遺伝子内への取り込みなどのために用いられてよい。可能なベクターは例えば、例えばラムダ派生物のようなバクテリオファージを含むプラスミドもしくは改変ウィルス、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド派生物のようなプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを含む。例えば、反応エレメントおよびプロモーターに相当するＤＮＡ断片の適したベクターへの挿入は、適切なＤＮＡ断片を、相補的な付着末端を有する選択されたベクターへ連結することにより達成できる。あるいは、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に改変されてよいか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより、どのような部位も作り出されてよい。このようなベクターは、マーカーを細胞ゲノム内に取り込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含むように設計されてよい。このようなマーカーは、これを取り込み、かつ該マーカーによりコードされるタンパク質を発現するホスト細胞の同定および／または選択を可能にする。
【０１４６】
ウィルス性ベクター、特にレトロウィルスベクターは、細胞内、同様に生きた動物被験体内での広く多様な遺伝子送達応用において使用されている。使用可能なウィルス性ベクターは、レトロウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポックス、バキュロウィルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン−バー、アデノウィルス、ジェミニウィルス、およびカリモウィルスベクターを含むがこれらに限定されない。非ウィルス性ベクターは、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、および生体高分子を含むがこれらに限定されない。核酸に加え、ベクターはまた、１以上の調節性領域、および／または選択、測定、および核酸移入結果の監視（どの組織に移入されたか、発現の持続など）に有用な選択マーカーも含んでよい。
【０１４７】
「プラスミド」との語は、しばしば細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を保有し、かつ通常は環状の二重鎖ＤＮＡ分子の形である染色体外エレメントに関する。このようなエレメントは、どのような源からも由来する、自律的複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、単鎖もしくは二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状、または超らせんであってよく、ここにおいて幾つかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内へ導入できる独特な構成へ連結されるかまたは組み換えられている。
【０１４８】
「クローニングベクター」は、連続的に複製され、複製開始点を含む核酸、好ましくはＤＮＡの単位の長さである「レプリコン」に関する。レプリコンは例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであり、そこへ別の核酸セグメントが付着してよく、付着したセグメントの複製がもたらされるクローニングベクターは、一細胞型において複製、かつ別の細胞型において発現することが可能であってよい（「シャトルベクター」）。
【０１４９】
「発現ベクター」との語は、ホスト細胞の形質転換に続き、挿入された核酸配列の発現を可能にするために設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルに関する。クローン化遺伝子、すなわち挿入された核酸配列は通常プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどのような制御エレメントの制御下に置かれる。望ましいホスト細胞内での核酸の発現を駆動するために有用な開始制御領域、またはプロモーターは多数存在し、当業者に公知である。実質的に、これらの遺伝子を駆動できるいずれのプロモーターも本発明に適しており、ウィルス性プロモーター、細菌性プロモーター、動物プロモーター、哺乳類プロモーター、合成プロモーター、恒常的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節性プロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼプロモーター（サッカロミセス属における発現に有用）；ＡＯＸ１プロモーター（ピキア属における発現に有用）；β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（大腸菌における発現に有効）；光調節性−、種子特異的−、花粉特異的−、卵巣特異的−、病原性または疾患関連−、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ、ＣＭＶ３５Ｓ最小、ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＣｓＶＭＶ）、葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸還元酵素、マンノピン合成酵素、ノパリン合成酵素、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現に有効）；ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター、アデノウィルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウィルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターおよび転写制御領域、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、治療的遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ型因子などの）、病原性または疾患関連プロモーター、および膵臓の腺房細胞内で活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域のような、組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物において利用されているプロモーターを含むがこれらに限定されない、公知の動物��よび哺乳類プロモーター；膵臓のベータ細胞内で活性があるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞内で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞内で活性があるマウス乳癌ウィルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓において活性があるＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡｌｌ制御領域、肝臓において活性があるアルファ−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓において活性があるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞において活性があるベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳の乏突起膠細胞において活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部において活性がある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸管タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。加えて、これらの発現配列はエンハンサーまたは調節性配列などの追加により改変されてよい。
【０１５０】
ベクターは当該技術分野において公知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって望まれるホスト細胞へ導入されてよい（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；および  １９９０年３月１５日に提出された、Ｈａｒｔｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ，カナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照のこと）。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによりｉｎ  ｖｉｖｏで導入することもできる。過去十年間に、核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソームを介したトランスフェクションによって遭遇する困難および危険を制限するために設計された合成陽イオン性脂質が、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームの調製に使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８５：８０２７−８０３１（１９８８）；および  Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４８（１９９３））。陽イオン性脂質の使用は、陰性に荷電した核酸の被包を促進する可能性があり、かつ陰性に荷電した細胞膜との融合も促進する（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７−３８８（１９８９））。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際公開第９５／１８８６３号、国際公開第９６／１７８２３号および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外因性遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで特定の臓器へ導入するためのリポフェクションの使用は、確実な実用的利点をもつ。リポソームの特定の細胞への分子ターゲティングは利点の一領域を表す。膵臓、肝臓、腎臓、および脳のような細胞の不均一性をもつ組織において、トランスフェクションを特定の細胞型へ方向付けることが特に好ましいであろうことは明らかである。脂質はターゲティングの目的のため、その他の分子に化学的に結合されてよい（上記、Ｍａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。標的にされたペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、あるいは非ペプチド分子はリポソームへ化学的に結合されてよい。
【０１５２】
陽イオン性オリゴペプチド（国際公開第９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（国際公開第９６／２５５０８号）、または陽イオン性重合体（国際公開第９５／２１９３１号）のようなその他の分子もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションの促進に有用である。
【０１５３】
ベクターをネイキッドＤＮＡプラスミドとしてｉｎ  ｖｉｖｏで導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号を参照のこと）。受容体を介したＤＮＡ送達アプローチもまた使用できる（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；および  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７））。
【０１５４】
「トランスフェクション」との語は、細胞による外因性もしくは異種性のＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みに関する。細胞は、外因性もしくは異種性のＲＮＡまたはＤＮＡを、このようなＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の内部に導入されたとき、「トランスフェクト」されている。細胞は、トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらすとき、外因性もしくは異種性のＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換するＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞のゲノムを作り上げる染色体ＤＮＡ内へ統合（共有結合）できる。
【０１５５】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、ホスト生物のゲノム内への核酸断片の移入に関する。形質転換核酸断片を含むホスト生物は、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【０１５６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞ホストにおける１以上の複製開始点、マーカー、または選択マーカーを含んでよい。
【０１５７】
「選択マーカー」との語は、同定因子、通常は抗生剤、または化学薬品抵抗性遺伝子に関する。選択マーカーはマーカー遺伝子の効果、すなわち抗生剤に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択可能であり、ここで該効果は、興味ある核酸の遺伝形質の追跡および／または興味ある核酸を受け継いだ細胞もしくは生物の同定のために用いられる。当該技術分野において公知かつ用いられている選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を提供する遺伝子；および表現型のマーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節性遺伝子、イソペンタニル転移酵素遺伝子などを含む。
【０１５８】
「レポーター遺伝子」との語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定可能な同定因子をコードする核酸に関する。ここで該効果は、興味ある核酸を受け継いだ細胞もしくは生物の同定のための、興味ある核酸の遺伝形質の追跡および／または遺伝子発現誘導または転写の測定に用いられる。当該技術分野において公知かつ用いられているレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択マーカー遺伝子もまた、レポーター遺伝子とみなされてよい。
【０１５９】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に用いられ、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列に関する。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子由来であってよいか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてよいか、もしくは合成ＤＮＡセグメントさえも含んでよい。当業者は、異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境的もしくは生理的条件への反応において遺伝子発現を導いてよいことを理解する。遺伝子をほとんどの細胞型においてほとんどの時点に発現させるプロモーターは、一般に「恒常的プロモーター」と称される。遺伝子を特定の細胞型において発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と称される。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階において発現させるプロモーターは、一般に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と称される。細胞の、プロモーターを誘導する薬剤、生物学的分子、化学薬品、リガンド、光などへの曝露またはそれらによる処置後に誘導されかつ遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」と称される。ほとんどの場合、調節性配列の正確な境界は完全に定義されないことから、異なる長さのＤＮＡ断片は同等のプロモーター活性を有してよいことがさらに認識される。
【０１６０】
プロモーター配列は、典型的にはその３’末端が転写開始部位付近に隣接し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むために上流（５’方向）へと伸展する。プロモーター配列の中には転写開始部位（都合よくは、例えばＳ１ヌクレアーゼによるマッピングにより定義される）、同様にＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出され得る。
【０１６１】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへ転写し、ｍＲＮＡが転移ＲＮＡによりスプライスされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるときに、細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【０１６２】
「転写および翻訳制御配列」は、ホスト細胞内でコード配列を発現するために提供される、プロモーター、エンハンサー、転写終結区などのようなＤＮＡ調節性配列に関する。
【０１６３】
「反応エレメント」との語は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、例えば第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を通して介される、プロモーターにおける反応性を与える１以上のシス作動性のＤＮＡエレメントに関する。このＤＮＡエレメントは、その配列が回文構造（完全または不完全）であってよいか、または配列モチーフ、もしくは不定数のヌクレオチドによって分離されるハーフサイトで構成されてよい。該ハーフサイトは同様または同一であることができ、直接もしくは反転した反復として、または単一ハーフサイトもしくは直列に隣接するハーフサイトの多量体として配置できる。反応エレメントは、該反応エレメントが取り込まれるであろう細胞または生物の性質に依存して、異なる生物から分離された最小プロモーターを含んでよい。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で反応エレメントのＤＮＡ配列に結合し、この反応エレメントの制御下で下流遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の反応エレメントに対するＤＮＡ配列の例は、ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（配列番号１６）（Ｃｈｅｒｂａｓ  ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１２０−１３１（１９９１）を参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ、ここでＮ（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであり得る（配列番号１７）（Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１３：１−９（１９９５）を参照）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（配列番号１８）（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：４４６５−４４７４（１９９４）を参照）を含む。
【０１６４】
「機能的に連結した」との語は、一方の機能が他方によって影響される、単一核酸断片における核酸配列の関連に関する。例えばプロモーターは、それがコード配列の発現に影響するとき、該コード配列に機能的に連結する（すなわち、該コード配列は該プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節性配列へ機能的に連結できる。
【０１６５】
ここで用いられる「発現」との語は、転写、ならびに核酸もしくはポリヌクレオチド由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの安定な蓄積に関する。発現はまた、ｍＲＮＡのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳にも関し得る。
【０１６６】
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」の語は、特定の制限酵素部位において、または相同性組み換えによって、核酸またはポリヌクレオチドへ挿入できるＤＮＡのセグメントに関する。ＤＮＡのセグメントは興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限酵素部位は、転写および翻訳に適切な読み枠でカセットの挿入を確実にするよう設計される。「形質転換カセット」は、興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドに加え、特定のホスト細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターに関する。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、および形質転換カセットはまた、興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのホスト細胞内での増強された発現を可能にするエレメントも含んでよい。これらのエレメントは、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、反応エレメント、転写終結区配列、ポリアデニル化配列などを含んでよいが、これらに限定されない。
【０１６７】
本発明の目的のための「遺伝子スイッチ」との語は、プロモーターに会合する反応エレメントと、反応エレメントおよびプロモーターが取り込まれる遺伝子の発現を調節する１以上のリガンドの存在下でのＥｃＲに基づくシステムとの組み合わせに関する。
【０１６８】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅおよびｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」との語は、タンパク質もしくはポリペプチド産生の誘導、減少、または阻害をそれぞれもたらす、核酸もしくは遺伝子発現を誘導する、減少させる、または阻害することを意味する。
【０１６９】
本発明のプラスミドまたはベクターは、ホスト細胞内での遺伝子発現の駆動に適切な少なくとも１のプロモーターをさらに含んでよい。
【０１７０】
本発明の実施形態において用いられてよいエンハンサーは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウィルス遺伝子エンハンサーなどを含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
終結制御領域、すなわち転写終結区またはポリアデニル化配列もまた、好ましいホストにとって自然である様々な遺伝子由来であってよい。選択肢として、転写終結区部位は必要ではないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。本発明の一実施形態によれば、終結制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウィルス性転写終結区配列などから構成されてよいか、またはこれら由来であってよい。
【０１７２】
「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」との語は、コード配列の下流（３’）に位置するＤＮＡ配列に関し、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響可能な調節性シグナルをコードするその他の配列を含んでよい。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端のポリアデニル酸路の付加への影響により特徴付けられる。
【０１７３】
「調節性領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列に関する。調節性領域は、特定の核酸（相同性領域）の発現に必然的に関連する配列を含んでよいか、または異なるタンパク質もしくは合成タンパク質（異種性領域）の発現までにも関連する異なる起源の配列を含んでよい。特に配列は、特異的もしくは非特異的な様式、および誘導性もしくは非誘導性の様式において遺伝子の転写を刺激または抑制する、原核細胞、真核細胞、もしくはウィルス性遺伝子の配列、または派生配列であることができる。調節性領域は、複製開始点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へ導くシグナル配列を含む。
【０１７４】
「異種性の源」由来の調節性領域は、発現した核酸に自然には会合しない調節性領域に関する。異種性の源のうちに含まれるものは、異なる種由来の調節性領域、異なる遺伝子由来の調節性領域、ハイブリッド調節性配列、および自然発生しないが、当業者により設計される調節性配列である。
【０１７５】
「ＲＮＡ転写」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼにより触媒される転写からもたらされる産物に関する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、それは第１の転写物とみなされるか、または成熟ＲＮＡとみなされる、第１の転写物の転写後のプロセシング由来のＲＮＡ配列である可能性がある。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンをもたず、かつ細胞によってタンパク質へ翻訳できるＲＮＡに関する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、かつｍＲＮＡに由来する二重鎖ＤＮＡに関する。「センス」ＲＮＡは、細胞によってタンパク質へ翻訳できる、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物に関する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的となる第１の転写物もしくはｍＲＮＡの全体または部分に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物に関する。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のいずれの部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にもあってよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはまだ翻訳されていない、細胞の作用における効果を有するその他のＲＮＡに関する。
【０１７６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換的に用いられ、共有結合したアミノ酸残基により構成される重合化合物に関する。アミノ酸は以下の一般的構造
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を有する。
【０１７７】
「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」、または「単離されたタンパク質」は、自然な状態において普通はそれらと会合する化合物（例えばその他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質に関する。「単離された」とは、その他の化合物との人工的もしくは合成混合物、あるいは生物学的活性を妨害しない不純物の存在、および例えば不完全な精製、安定剤の添加、もしくは薬理学的に許容される製剤への調合により存在し得る不純物を除外することを意味しない。
【０１７８】
「置換変異体ポリペプチド」または「置換変異体」は、少なくとも１の野生型もしくは自然発生アミノ酸の、野生型もしくは自然発生ポリペプチドに比較して異なるアミノ酸による置換を含む変異体ポリペプチドを意味することが理解されるであろう。置換変異体ポリペプチドは、野生型もしくは自然発生アミノ酸の置換を１のみ含んでよく、「点変異体」または「単一点変異体」と称されてよい。あるいは、置換変異体ポリペプチドは、２以上の野生型もしくは自然発生アミノ酸の、野生型もしくは自然発生ポリペプチドに比較した２以上のアミノ酸による置換を含む。本発明によれば、置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、少なくとも１の野生型もしくは自然発生アミノ酸の、野生型もしくは自然発生グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに比較して異なるアミノ酸による置換を含む。
【０１７９】
ここで置換変異体ポリペプチドは、２以上の野生型もしくは自然発生アミノ酸の置換を含み、この置換は、該置換のために欠失した野生型もしくは自然発生アミノ酸と同数、すなわち２の野生型もしくは自然発生アミノ酸が２の非野生型もしくは非自然発生アミノ酸により交換されるか、あるいは該置換のために欠失した野生型アミノ酸と同数ではない、すなわち２の野生型アミノ酸が１の非野生型アミノ酸により交換されるか（置換＋欠失変異）、または２の野生型アミノ酸が３の非野生型アミノ酸により交換されるか（置換＋挿入変異）のいずれかを含んでよい。
【０１８０】
置換変異体は、アミノ酸残基、および参照ポリペプチド配列内で交換された数、および新規の置換されたアミノ酸残基を示すため、省略された命名法を用いて記述されてよい。例えば、ポリペプチドの２０番目のアミノ酸残基が置換された置換変異体は、「ｘ２０ｚ」と略されてよく、ここで「ｘ」は置換されるアミノ酸を表す。「２０」はポリペプチド内でのアミノ酸残基の位置または番号を表し、「ｚ」は新規に置換したアミノ酸を表す。従って、「Ｅ２０Ａ」または「Ｇｌｕ２０Ａｌａ」として互換的に略される置換変異体は、ポリペプチドの位置２０において、グルタミン酸（当該技術分野において、一般に「Ｅ」または「Ｇｌｕ」と略される）の代わりにアラニン（当該技術分野において、一般に「Ａ」または「Ａｌａ」と略される）残基を含むことを示す。
【０１８１】
置換変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１（１９７８）；Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ４４：１７７（１９８６）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７１０（１９８６））、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、制限酵素消化／断片の欠失および置換、ＰＣＲを介する／オリゴヌクレオチド−定方向突然変異誘発などを含むがこれらに限定されない、公知の突然変異誘発技術のいずれかを用いて作られてよい。ＰＣＲに基づく技術は、部位特異的突然変異誘発が好ましい（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，ｐｐ．６１−７０中の、Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，“Ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ＤＮＡ”を参照のこと）。
【０１８２】
本発明のポリペプチドの「断片」は、アミノ酸配列が参照ポリペプチドのそれよりも短く、全体の部分にわたって参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。このような断片は適切な場合、それが一部である、より大きなポリペプチド内に含まれる。本発明のポリペプチドのこのような断片は、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０、または３００の長さのアミノ酸を有してよい。
【０１８３】
ポリペプチドまたはタンパク質の「バリアント」は、ポリペプチドまたはタンパク質から由来し、該ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１の生物学的性質を保持する類似体、断片、派生物、または変異体のいずれにも関する。ポリペプチドまたはタンパク質の異なるバリアントは、天然に存在し得る。このようなバリアントは、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いにより特徴付けられる対立遺伝子変異であってよいか、または異なるスプライシングもしくは後翻訳修飾に関連してよい。当業者は、単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または交換を有するバリアントを産生できる。これらのバリアントはとりわけ、（ａ）１以上のアミノ酸残基が、保存された、または保存されていないアミノ酸により置換されるバリアント、（ｂ）１以上のアミノ酸が、ポリペプチドまたはタンパク質に付加されるバリアント、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含むバリアント、および（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が、血清アルブミンのような別のポリペプチドと融合するバリアントを含んでよい。これらのバリアントを得るための、遺伝学的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的、および酵素的技術を含む技術は当業者に公知である。バリアントポリペプチドは、好ましくは少なくとも約１４アミノ酸を含む。
【０１８４】
「相同性」との語は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリヌクレオチド部分の間での同一性のパーセントに関する。一部分からの配列の他方への対応は、公知の技術により決定できる。例えば相同性は、配列情報を整列し、かつ容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いることによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定できる。あるいは相同性は、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、それに続く単鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定により決定できる。
【０１８５】
ここで、その全ての文法型およびつづりの変化において用いられる「相同的」との語は、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質、および異なる種由来の相同的なタンパク質（ミオシン軽鎖など）を含む、「共通の進化的起源」をもつタンパク質間の関連性に関する（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ５０：６６７（１９８７））。このようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、それらの高度な配列類似性の反映としての配列相同性を有する。しかしながら、一般的な用法および本出願における「相同的」との語は、「高度に」のような副詞で修飾されるときには配列類似性に関するのであって、共通の進化的起源に関するのではない可能性がある。
【０１８６】
従って、その全ての文法型において用いられる「配列類似性」との語は、共通の進化的起源を共有し得るかまたはし得ない、核酸もしくはタンパク質のアミノ酸配列の間の同一性または対応の程度に関する（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５０：６６７（１９８７）を参照のこと）。一実施形態によれば、２つのＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の規定された長さにわたって少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０もしくは９５％）のヌクレオチドが一致するとき、「実質的に相同的」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準ソフトウェアを用いて、または例えばこの特定のシステムのために規定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、配列を比較することにより同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当該技術分野の範囲内である（例えば前記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９を参照のこと）。
【０１８７】
ここで用いられる「実質的に類似」は、１以上のヌクレオチド塩基の変化が１以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能的性質には影響しない核酸断片に関する。「実質的に類似」はまた、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術による遺伝子発現の変化を仲介するための核酸断片の能力に影響しない核酸断片にも関する。「実質的に類似」はまた、得られる転写物の機能的性質に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような、本発明の核酸断片の修飾にも関する。それ故、本発明は特定の例となる配列以上を包含することが理解される。提唱された修飾のそれぞれは、コードされる産物の生物学的活性の保持の判定のように、十分に当該技術分野の日常的な技術の範囲内である。
【０１８８】
さらに当業者は、本発明に包含される実質的に類似の配列はまた、ストリンジェントな条件下で（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに続く０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄）ここに例示される配列とハイブリダイズするそれらの能力によって定義されることも認識する。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのＤＮＡ配列がここに報告される核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一な核酸断片である。本発明の核酸断片は、そのＤＮＡ配列がここに報告される核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一な核酸断片を含む。その他の核酸断片は、ここに報告される核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。その他の核酸断片は、ここに報告される核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である。
【０１８９】
２つのアミノ酸配列は、約４０％を超えるアミノ酸が一致するか、または６０％を超えて類似するとき、「実質的に相同的」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同的な配列は、例えばＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ、バージョン７のプログラムマニュアル、マディソン、ウィスコンシン）パイルアッププログラムを用いたアラインメントにより同定される。
【０１９０】
ここで用いられる「相当する」との語は、類似性または相同性が測定される分子からの正確な位置が同一かまたは異なるかについての、類似または相同的な配列に関する。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含んでよい。従って、「相当する」との語は配列類似性に関し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けに関するものではない。
【０１９１】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な一部」は、当業者による手動での配列の評価、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３）；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）のようなアルゴリズムを用いたコンピュータ自動配列比較および同定のいずれかによってポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するために、十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、既知のタンパク質または遺伝子に相同的なポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するためには、１０以上の近接するアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０の近接したヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の配列依存性方法において用いられてよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおいて１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが増幅プライマーとして用いられてよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な一部」は、該配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。
【０１９２】
当該技術分野において公知の「パーセント同一性」との語は、配列の比較によって決定された、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関連性である。当該技術分野において「同一性」はまた、これら配列のひと続きの間の一致によって決定された可能性がある事例として、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）に記載されるものを含むが、これらに限定されない公知の方法によって容易に算出できる。同一性を決定するための方法は、試験される配列の間が最もよく一致するように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム内に体系化される。配列アラインメントおよびパーセント同一性の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行われてよい。配列の複数のアラインメントは、初期設定のパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）によるアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９））を用いて行なってよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアラインメントのための初期設定のパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５が選択されてよい。
【０１９３】
「配列解析ソフトウェア」との語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な、いずれのコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムにも関する。「配列解析ソフトウェア」は、市販されるかまたは自主的に開発されてよい。代表的な配列解析ソフトウェアは、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、マディソン、ウィスコンシン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  （１９９０））およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８サウスパークストリート、マディソン、ウィスコンシン、５３７１５  米国）を含む得るがこれらに限定されない。本出願の状況において、配列解析ソフトウェアは他に記載のない限り、解析結果がプログラムの参照する「初期設定の値」に基づくであろう解析に使用されることが理解され得る。ここで用いられる「初期設定の値」は、最初に初期化したときにソフトウェアにより本来ロードされる値またはパラメーターのいずれの設定も意味し得る。
【０１９４】
ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成された」は、成分ヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動での化学合成は、よく確立された方法を用いて達成され得るか、または幾つかの市販の装置の一つを用いた自動化学合成を行なうことができる。従って遺伝子は、ホスト細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づく、最適な遺伝子発現のために調整できる。当業者は、コドンの使用がホストに好ましいコドンへと偏っていれば、遺伝子発現は成功する可能性のあることを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能なホスト細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１９５】
ここで用いられる、２以上の個々に機能的な遺伝子調節システムは、ａ）所定の各システムの、それぞれのリガンドによる選択された濃度における調節が、そのシステムの遺伝子発現の規模において測定可能な変化をもたらすとき、およびｂ）該変化が、細胞、組織、または生物において同時に機能的なその他の全てのシステムの発現における変化に比べ、実際の調節の同時性および連続性に関わりなく統計学的に有意に異なるとき、「直交性」であると言える。好ましくは、個々に機能的な遺伝子調節システムそれぞれの調節は、遺伝子発現において、細胞、組織、または生物におけるその他の全ての機能的システムに比べ、少なくとも２倍大きな変化をもたらす。さらに好ましくは、該変化は少なくとも５倍大きい。さらになお好ましくは、該変化は少なくとも１０倍大きい。さらに一層好ましくは、該変化は少なくとも１００倍大きい。さらになお一層好ましくは、該変化は少なくとも５００倍大きい。理想的には、所定の各システムの、それぞれのリガンドによる選択された濃度における調節が、そのシステムの遺伝子発現の規模において測定可能な変化をもたらし、かつ細胞、組織、または生物において機能的なその他の全てのシステムの発現において測定可能な変化をもたらさない。このような事例において、複数の誘導性遺伝子調節システムは「完全に直交性」であると言える。本発明は、ここにその全体が参照として取り込まれる米国特許出願公開第２００２／０１１０８６１Ａ１号に記載されるような、直交的リガンドおよび直交的受容体に基づく遺伝子発現システムの探索に有用である。
【０１９６】
「調節する」との語は、外因性遺伝子のトランス活性化を誘導または抑制する所定のリガンド／受容体複合体の能力を意味する。
【０１９７】
「外因性遺伝子」との語は、被験体にとって外来性の遺伝子、すなわち形質転換過程、内在性の突然変異遺伝子の非突然変異バージョン、または内在性の非突然変異遺伝子の突然変異バージョンを通して被験体内へ導入された遺伝子を意味する。形質転換の方法は本発明にとって決定的ではなく、当該技術分野において公知である、被験体に適切ないずれの方法も使用されてよい。例えば、トランスジェニック植物は形質転換細胞からの再生によって得られる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはそのＴｉプラスミドを用いたアグロ感染、エレクトロポレーション、植物細胞およびプロトプラストの微量注入法、ならびに微粒子形質転換のような、多数の形質転換方法が文献により知られている。動物細胞の形質転換、およびこのような形質転換細胞のトランスジェニック動物における再生のための相補的な技術が知られている。外因性遺伝子は天然もしくは合成遺伝子のいずれかであることができ、かつ、ＤＮＡの媒介物を通して、例えば逆転写酵素により機能し得る、ＤＮＡもしくはＲＮＡの形で被験体へ導入される治療的遺伝子であることができる。このような遺伝子は標的細胞に導入でき、被験体へ直接導入でき、または形質転換細胞、例えば自己細胞の移入により被験体へ間接的に導入できる。「治療的遺伝子」との語は、このような遺伝子が発現するホスト細胞へ、有益な機能を分け与える遺伝子を意味する。
【０１９８】
「エクジソン受容体複合体」との語は、一般にステロイド受容体ファミリーの２つのメンバーであるエクジソン受容体（「ＥｃＲ」）およびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質からなるヘテロ二量体タンパク質複合体に関する（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４７６−４７９（１９９３））；Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２（１９９２）を参照のこと）。機能的なエクジステロイド受容体複合体はまた、イムノフィリンのようなさらなるタンパク質も含んでよい。転写因子として知られているステロイド受容体ファミリータンパク質のさらなるメンバー（例えば、ＤＨＲ３８、ベータＦＴＺ−１またはその他の昆虫ホモログ）もまた、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰのリガンド依存性または非依存性のパートナーであってよい。エクジソン受容体複合体はまた、エクジソン受容体タンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物ホモログ、レチノイン酸−Ｘ−受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質とのヘテロ二量体でもあり得る。エクジソン受容体タンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体もまた、ある状況下において機能的であり得る。
【０１９９】
エクジステロイド受容体複合体は、ＥｃＲを含むが複合体のその他のタンパク質を排除しない、複合体のタンパク質の一つに結合する、活性のあるエクジステロイドまたは非ステロイド性リガンドにより活性化できる。
【０２００】
エクジソン受容体複合体はステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含み、ここでは全てのメンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によって分離されるリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在により特徴付けられる。該ファミリーの幾つかのメンバーはまた、ＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してよい。ＤＢＤは、２つのアミノ酸モチーフであるＰ−ボックスとＤ−ボックスの間の２つのシステインジンクフィンガーの存在により特徴付けられ、これがエクジソン反応エレメントの特異性を与える。これらのドメインは天然型、改変型、または異種性受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってよい。
【０２０１】
外因性遺伝子、反応エレメント、およびエクジソン受容体複合体を作り上げるＤＮＡ配列は、古細菌、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌もしくはその他の腸内細菌、または真核細胞、例えば植物もしくは動物細胞内へ取り込まれてよい。しかしながら、遺伝子により発現される多数のタンパク質は、細菌においては不正確に処理されることから、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形であってよい。外因性遺伝子、反応エレメント、および受容体複合体のヌクレオチド配列はまた、ＲＮＡ分子、好ましくはタバコモザイクウィルスのような機能的ウィルスＲＮＡの形で取り込まれ得る。真核細胞に関しては、脊椎動物細胞が、エクジソン受容体に対する本発明のリガンドへの反応を与える分子を自然に欠いているため好ましい。結果として、それらは本発明のリガンドに対し「実質的に非感受性」である。従って本発明のリガンドは、形質転換細胞または生物全体に、無視できる程度の生理的またはその他の効果を有するであろう。従って細胞は、リガンドそれ自体の存在によって実質的に影響されることなく、増殖し、かつ望まれる産物を発現できる。
【０２０２】
「被験体」との語は、未変化の昆虫、植物、もしくは動物、または昆虫、植物もしくは動物由来の細胞を意味する。リガンドは、被験体が真菌または酵母の場合にも十分同等に作用するであろうことが予測される。被験体が未変化の動物であるとき、該動物は好ましくは脊椎動物であり、最も好ましくは哺乳動物である。
【０２０３】
本発明の式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドおよび式２もしくは３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、外因性遺伝子に連結する反応エレメントへ次々に結合するエクジソン受容体複合体と共に用いられるとき、外因性遺伝子の発現の外部からの時間的な調節手段を提供する。様々な成分が互いに結合する順番、すなわちリガンドから受容体複合体へ、および受容体複合体から反応エレメントへ、は決定的ではない。典型的には、外因性遺伝子の発現調節は、エクジソン受容体の特定のコントロール、または調節性ＤＮＡエレメントへの結合に対する反応内にある。エクジソン受容体タンパク質は、その他のステロイド受容体ファミリーメンバーのように少なくとも３つのドメイン、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを有する。この受容体はまた、ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、ヘテロ二量体化性質の原因である、あまりよく定義されていない領域も有する。ＵＳＰまたはＲＸＲタンパク質とのヘテロ二量体化の後の、エクジソン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、活性型二量体タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、反応エレメントへの結合を可能にすることから、外来性遺伝子の発現または抑制がもたらされる。このメカニズムは、ＥｃＲまたはＵＳＰのいずれかへのリガンド結合の可能性、および結果としての、活性のあるホモ二量体複合体の形成（すなわち、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）を除外しない。好ましくは、キメラ遺伝子スイッチの産生のため、１以上の受容体ドメインが異なり得る。典型的には、３つのドメインの１以上がその他のドメインの源とは異なる源から選択されてよく、それによりキメラ受容体は選択されたホスト細胞または生物におけるトランス活性化、リガンドの相補的結合、および特定の反応エレメントの認識を最適化される。さらに、反応エレメントそれ自体は、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−５６４  （１９８８）を参照のこと）または大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質（Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４３：７２９−７３６（１９８５）を参照のこと）のような、その他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインに対する反応エレメントをキメラエクジソン受容体複合体へ適合させることにより改変できる。キメラシステムのその他の利点は、望まれる最終的な結果に従い、外因性遺伝子の駆動に使用されるプロモーターを選択できることである。このような二重の制御は、発現のタイミングと同様に発現が起こる細胞を制御できることから、遺伝子治療の分野、特に細胞毒性タンパク質が産生される場合に特に重要である。適切なプロモーターに機能的に連結した外因性遺伝子が被験体の細胞に導入されるとき、該外因性遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在により制御される。プロモーターは恒常的または誘導的に調節されてよいか、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみに発現される）もしくは生物のある発生段階に特異的であってよい。
【０２０４】
様々なポリペプチドをコードする多数のゲノムおよびｃＤＮＡ核酸配列が公知である。本発明のリガンドに有用な外因性遺伝物質は、例えば、細胞から放出できる分泌タンパク質；基質を毒性物質から無毒性物質へ、または非活性物質を活性物質へ代謝できる酵素；細胞表面受容体などの、興味ある生物学的に活性のあるタンパク質をコードする遺伝子を含む。有用な遺伝子はまた、血液凝固因子、インスリン、副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン放出因子、アルファおよびベータ精液インヒビン、およびヒト成長ホルモンのようなホルモンをコードする遺伝子；存在しないときに異常状態を発生させる酵素のようなタンパク質をコードする遺伝子；インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子１、腫瘍壊死因子、およびエリスロポエチンのような、サイトカインまたはリンフォカインをコードする遺伝子；アルファ抗トリプシンのような阻害物質をコードする遺伝子、ジフテリアおよびコレラ毒素のような薬剤として作用する物質をコードする遺伝子などを含む。有用な遺伝子はまた、癌治療および遺伝疾患の治療のために有用なものも含む。当業者は実質的に全ての既知遺伝子の核酸配列情報へのアクセスを有し、公共のデポジトリー、配列を公表した施設から直接核酸分子を入手できるか、または該分子を調製するための日常的な方法を利用できる。
【０２０５】
一実施形態によれば外因性遺伝子は、ｅｘ  ｖｉｖｏでアデノウィルスにより自己樹状細胞へトランスフェクトされ、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）の制御下にあるｈＩＬ−１２である。
【０２０６】
遺伝子治療での使用のためには、ここに記載されるリガンドは単独、または薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物の一部として投与されてよい。一実施形態によれば、該医薬組成物は液剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、軟膏剤、エリキシル剤、または注射用組成物の形にある。
【０２０７】
薬理学的に許容される担体は、糖類、例えばラクトースもしくはシュクロース、マンニトールもしくはソルビトールのような賦形剤、セルロース製剤および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、同様に、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉を用いた澱粉ペーストのような結合剤、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンを含む。所望であれば、上記の澱粉、同様にカルボキシメチル澱粉、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩、のような崩壊剤が添加されてよい。助剤はフロー調節剤または潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムのようなその塩、および／またはポリエチレングリコールである。一実施形態によれば、糖衣コアが適切なコーティング（必要であれば胃液に抵抗性の）により提供される。この目的のため、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含む、濃縮糖液が用いられてよい。胃液に抵抗性のコーティングを産生するために、アセチルセルロースフタル酸塩またはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩のようなセルロース製剤に適した溶液が用いられる。例えば識別のため、または活性化合物の投与量を特徴付けるため、錠剤または糖衣コーティングに色素または顔料が添加されてよい。
【０２０８】
経口で使用できるその他の医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、同様にゼラチンで作られた柔らかい密封されたカプセル、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤を含む。押し込み型カプセルは、ラクトースのような賦形剤、澱粉のような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意に安定剤、と任意に混合されてよい顆粒またはナノ粒子の形において、有効化合物を含むことができる。一実施形態によれば、該可塑剤は、脂肪油、または液体パラフィンのような適した液体へ、任意に安定剤と共に溶解または懸濁される。
【０２０９】
脂肪油はモノ−、ジ−、またはトリグリセリドを含んでよい。モノ−、ジ−、およびトリグリセリドはＣ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびＣ２２酸由来のものを含む。代表的なジグリセリドは、特に、ジオレイン、ジパルミトオレイン、および混合カプリリン−カプリンジグリセリドを含む。好ましいトリグリセリドは植物油、魚油、動物性脂肪、水素化植物油、部分的水素化植物油、合成トリグリセリド、修飾トリグリセリド、分画トリグリセリド、中および長鎖トリグリセリド、構築トリグリセリド、およびそれらの混合物を含む。代表的なトリグリセリドは、アーモンド油；ババス油；ルリジサ油；カシス種油；キャノーラ油；ヒマシ油；ココナッツ油；トウモロコシ油；綿実油；月見草油；ブドウ種油；落花生油；辛子種油；オリーブ油；パーム油；パーム核油；ピーナッツ油；菜種油；サフラワー油；胡麻油；サメ肝油；大豆油；ヒマワリ油；水素化パーム油；水素化ヒマシ油；水素化ココナッツ油；水素化パーム油；水素化大豆油；水素化植物油；水素化綿実およびヒマシ油；部分的水素化大豆油、部分的大豆および綿実油；グリセリルトリカプリル酸塩；グリセリルトリカプリル酸塩；グリセリルトリカプリン酸；グリセリルトリウンデカン酸塩；グリセリルトリラウリン酸塩；グリセリルトリカプリル酸塩；グリセリルトリオレイン酸塩；グリセリルトリリノール酸塩；グリセリルトリリノレン酸塩；グリセリルトリカプリル酸塩／カプリン酸；グリセリルトリカプリル酸塩／カプリン酸／ラウリン酸；グリセリルトリカプリル酸塩／カプリン酸／リノール酸；およびグリセリルトリカプリル酸塩／カプリン酸／ステアリン酸を含む。
【０２１０】
一実施形態によれば、トリグリセリドは商品名ＬＡＢＲＡＦＡＣ  ＣＣで入手可能な中鎖トリグリセリドである。その他のトリグリセリドは中性油、例えば中性植物油、特にＭＩＧＬＹＯＬ  ８１０；  ＭＩＧＬＹＯＬ  ８１２；  ＭＩＧＬＹＯＬ  ８１８；およびＣＡＰＴＥＸ  ３５５を含む、商品名ＭＩＧＬＹＯＬで知られ、かつ市販されているような分画ココナッツ油を含む。その他のトリグリセリドは、ＭＹＲＩＴＯＬ  ８１３を含む、商品名ＭＹＲＩＴＯＬで知られ、かつ市販されているようなカプリル−カプリン酸トリグリセリドを含む。この種類のさらなるトリグリセリドは、ＣＡＰＭＵＬ  ＭＣＴ、ＣＡＰＴＥＸ  ２００、ＣＡＰＴＥＸ  ３００、ＣＡＰＴＥＸ  ８００、ＮＥＯＢＥＥ  Ｍ５およびＭＡＺＯＬ  １４００である。
【０２１１】
トリグリセリドを含む医薬組成物はさらに、水性溶媒への溶解によって透明な溶液を形成し得る、親油性および／または親水性界面活性剤を含む。このような界面活性剤の一つは、トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸（ビタミンＥ  ＴＰＧＳ）である。このような組成物の例は、米国特許第６，２６７，９８５号に記載されている。
【０２１２】
別の実施形態によれば、薬理学的に許容される担体は、ＰＥＧ−８カプリル／カプリン酸グリセリドであるＬａｂｒａｓｏｌ（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  ＳＡ）を含む。別の実施形態によれば、薬理学的に許容される担体は、ＰＬ９０Ｇ、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、およびＭｉｇｌｙｏｌ  ８１２Ｎを含む。このような処方の成分を表１に示す。
2014193875.tif 000036
【０２１３】
直腸性に使用できる可能性のある医薬製剤は、例えば坐薬基剤と共に１以上のリガンドからなる坐薬を含む。適切な坐薬基剤は、例えば天然または合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。加えて、リガンドと基剤の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルの使用もまた可能である。可能な基剤物質は、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素を含む。
【０２１４】
非経口投与に適した処方は、リガンドの水溶性の形での水溶液、例えば水溶性塩またはアルカリ溶液を含む。加えて、適切な油性注射用懸濁液としてのリガンドの懸濁液も投与されてよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレイン酸塩もしくはトリグリセリド、またはポリエチレングリコール４００を含む。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでよい。懸濁液はまた、任意に安定剤も含んでよい。
【０２１５】
局所用組成物は、適切な担体の選択により、油剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤などとして処方されてよい。適切な担体は、植物または鉱物油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分岐鎖脂肪または油、動物性脂肪または高分子量アルコール（Ｃ１２を超える）を含む。乳化剤、安定剤、保湿剤および抗酸化剤、同様に必要であれば色または芳香を与える薬剤もまた含まれてよい。さらに、これらの局所用処方には経皮浸透増強剤を用いることができる。このような増強剤の例は、米国特許第３，９８９，８１６号および第４，４４４，７６２号に見出すことができる。
【０２１６】
クリーム剤は、鉱物油、自己乳化蜜ろうおよび水の混合物から処方され、ここに少量のアーモンド油のような油に溶解したリガンドが混合される。このようなクリーム剤の代表的な例は、約４０部の水、約２０部の蜜ろう、約４０部の鉱物油、および約１部のアーモンド油を含むものである。
【０２１７】
軟膏剤は、アーモンド油のような植物油に懸濁したリガンドと温めた軟パラフィンを混合し、該混合物を冷却することにより処方されてよい。このような軟膏剤の代表的な例は、重量による約３０％のアーモンド油、および約７０％の白色軟パラフィンを含むものである。
【０２１８】
ローション剤は、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのような適切な高分子量アルコールに懸濁したリガンドの調製により、便利に調製されてよい。
【０２１９】
医薬組成物に添加されてよい抗酸化剤の例は、ＢＨＡおよびＢＨＴを含む。
【０２２０】
一実施形態によれば、医薬組成物は固形ゼラチンカプセルにおいて、１ｍＬのＬａｂｒａｓｏｌ中に３０ｍｇのリガンドを含む。別の実施形態によれば、該カプセルは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇのリガンドを含む。
【０２２１】
医薬組成物は重量により０．０１％から９９％のリガンドを含んでよい。組成物は単一または複数の用量形態であってよい。いずれの特定の医薬組成物中のリガンドの量も、有効量、すなわち望まれる遺伝子の発現または抑制の誘発に必要な量に依存するであろう。一実施形態によれば、０．１から７．５ｍｇ／ｋｇが被験体へ投与される。別の実施形態によれば、０．１から３ｍｇ／ｋｇが被験体へ投与される。別の実施形態によれば、０．１から３ｍｇ／ｋｇが投与される。
【０２２２】
該医薬組成物を投与するための適切な経路は、経口、経直腸、局所（経皮、経頬、および舌下を含む）、経膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、包膜内、腫瘍内および硬膜外を含む）および経鼻チューブを含む。当業者は、投与に好ましい経路は治療される状態に依存し、かつ受取者の状態のような因子によって異なる可能性のあることを理解するであろう。該医薬組成物は１日に１回以上投与されてよい。一実施形態によれば、該医薬組成物は、エクジソン受容体複合体およびＤＮＡ結合配列を含む細胞の投与前２４時間に始まって、毎日投与される。
【０２２３】
ここに記載される、本発明の式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドはまた、その他の薬理学的に活性のある化合物と組み合わせて投与されてもよい。ここに記載される、リガンドと組み合わせて使用される薬理学的に活性のある化合物は、受取者の有害作用、または化合物間の望まれない相互作用を避けるために選択され得ることが当業者により理解されるであろう。リガンドと組み合わせて使用されてよいその他の薬理学的に活性のある化合物の例は例えば、ＡＩＤＳ化学療法剤、アミノ酸誘導体、鎮痛剤、麻酔剤、校門直腸産物、制酸剤および整腸剤、抗生剤、抗凝固剤、解毒剤、抗線溶剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、解熱剤、防腐剤、抗痙攣剤および抗コリン剤、抗ウィルス剤、食欲抑制剤、関節炎薬、生物反応修飾剤、骨代謝調節剤、腸排出剤、心血管剤、中枢神経系刺激剤、大脳代謝増強剤、耳垢溶解剤、コリンエステラーゼ阻害剤、感冒および咳製剤、コロニー刺激因子、避妊薬、細胞保護剤、歯科製剤、脱臭剤、皮膚科製剤、解毒剤、糖尿病薬、診断薬、下痢薬、ドーパミン受容体アゴニスト、電解質、酵素および消化薬、麦角製剤、妊娠促進薬、繊維補助剤、抗真菌薬、乳汁漏出阻害剤、胃酸分泌阻害剤、胃腸運動促進剤、性腺刺激ホルモン阻害剤、育毛促進剤、増血剤、血行動態製剤、止血薬、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト、ホルモン、血糖上昇剤、脂質低下薬、免疫抑制剤、下剤、抗らい薬、白血球除去剤、肺界面活性剤、偏頭痛薬、粘液溶解薬、筋弛緩拮抗剤、筋弛緩剤、麻酔拮抗剤、点鼻薬、悪心薬ヌクレオシド類似体、栄養補助剤、骨粗しょう症治療剤、分娩促進剤、副交感神経遮断薬、副交感神経刺激薬、パーキンソン病治療薬、ペニシリンアジュバント、リン脂質、血小板阻害剤、ポルフィリン症薬、プロスタグランジン類似体、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害剤、そう痒症薬、向精神薬、キノロン、呼吸促進剤、唾液分泌促進剤、塩代用薬、硬化薬、皮膚創傷製剤、喫煙休止補助剤、スルフォンアミド、交感神経遮断薬、トゥレット症候群治療薬、抗振戦薬、抗結核剤、尿酸排泄促進薬、尿路製剤、子宮収縮剤、子宮弛緩剤、膣製剤、抗めまい薬、ビタミンＤ類似体、ビタミン、および医学画像対比薬剤を含む。幾つかの場合には、リガンドは薬剤療法の補助剤、例えば特定の薬剤を代謝する酵素を産生する遺伝子を「遮断する」ものとして有用であり得る。
【０２２４】
上記の応用に加え、農業への応用のため、本発明のリガンドはバチルスチューリンゲンシス（Ｂｔ）毒素のような殺虫性タンパク質の発現を制御するためにも用いられてよい。このような発現は組織または植物特異的であり得る。加えて、特に植物害虫の制御もまた必要なときには１以上の殺虫剤をここに記載するリガンドと組み合わせてよく、それにより、もし殺虫剤が別に散布されていればより少ない全散布数になることを含んださらなる利点と有効性が提供される。殺虫剤の混合物を利用するとき、組成物中の各成分の相対的割合は、相対的な有効性、ならびに作物、殺虫剤、および／または処理される雑草に関連した各殺虫剤の望まれる散布率に依存するであろう。当業者は、殺虫剤の混合物は、１種の殺虫剤の単独使用よりもより広い範囲の活性のような利点を提供し得ることを認識するであろう。ここに記載されるリガンドと共に該組成物中へ組み合わせられる殺虫剤の例は、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、殺ダニ剤、および殺菌剤を含む。
【０２２５】
ここに記載される本発明の式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、従来の高リットル水圧スプレー、低リットルスプレー、エアブラスト、および航空散布のような一般に利用される方法による水性のスプレーとして、植物の葉へ散布できる。希釈および散布率は、利用する機器の型、望まれる方法および散布頻度、ならびにリガンド散布率に依存し得る。スプレータンク内には追加のアジュバントを含むことが望ましいであろう。このようなアジュバントは界面活性剤、分散剤、展着剤、固着剤、消泡剤、乳化剤、およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，  ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  ’ｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（全てＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ニュージャージー）より毎年発行される）に記載されるその他の類似物質を含む。これらのリガンドはまた、散布前に肥料または肥料物質と共に混合することもできる。これらのリガンドおよび固形肥料物質はまた、混合または混和機器内で混合できるか、あるいは顆粒製剤中へ肥料と共に取り込むことができる。作物および処理される雑草に適した、肥料のいずれの相対的な割合も使用できる。ここに記載されるリガンドは、一般に５％から５０％の肥料組成物を含み得る。これらの組成物は、望まれる植物の迅速な成長を促進する肥料物質を提供し、同時に遺伝子発現を制御する。
【０２２６】
ホスト細胞および非ヒト生物
上記のように、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、ホスト細における遺伝子発現を調節するために使用されてよい。トランスジェニックホスト細胞における発現は、興味ある様々な遺伝子の発現に有用であり得る。本発明は、原核および真核ホスト細胞における遺伝子発現の調節のためのリガンドを提供する。
【０２２７】
トランスジェニックホスト細胞における発現は、ワクチンとして植物において産生される抗原；アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、およびキシラナーゼのような酵素；植物における昆虫、線虫、真菌、細菌、ウィルス、および非生物的ストレスに対する抵抗性の遺伝子；抗原；栄養補助食品；医薬品；ビタミン；アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒冷、干ばつ、および熱耐性を調節する遺伝子；工業製品；油、タンパク質、炭水化物；抗酸化剤；雄性の生殖不能な植物；花；燃料；その他の結果としての性質；状態、疾病、障害、機能不全、もしくは遺伝的欠陥の治療に使用され得る治療的ポリペプチドまたは産物、例えばモノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、凝固因子、その他の血液因子または成分；遺伝子治療のためのウィルス性ベクター；ワクチンのためのウィルス；創薬、機能的ゲノミクス、およびプロテオミクス解析ならびに応用のための標的；ホスト内に既に存在する経路の調節のための経路の介在物；これまでにホストの使用では不可能であった新しい産物の合成のための経路の介在物；細胞に基づくアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ；プロテオミクスアッセイなどを含むがこれらに限定されない、興味ある様々なポリペプチドの発現のために有用である。さらに遺伝子産物は、ホストのより高い増殖収率の付与、または用いられる別の増殖モードを可能にするために有用であろう。
【０２２８】
従って本発明は、単離されたホスト細胞において遺伝子発現を調節するため、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを提供する。一実施形態によれば、単離されたホスト細胞は原核ホスト細胞または真核ホスト細胞である。別の実施形態によれば、単離されたホスト細胞は無脊椎動物ホスト細胞または脊椎動物ホスト細胞である。好ましくはホスト細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚細胞、植物細胞、鳥細胞、動物細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される。さらに好ましくは、ホスト細胞は酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、雌ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。ホスト細胞の例は、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラのような真菌または酵母種、またはシネコシスティス、シネココッカス、サルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ロドコッカス、ストレプトミセス、エシェリキア、シュードモナス、メチロモナス、メチロバクテリウム、アルカリゲネス、アナベナ、チオバチルス、メタノバクテリウムおよびクレブシエラの属におけるような細菌種；リンゴ、シロイヌナズナ、トウジンビエ、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ケツルアズキ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、アワ、リョクトウ、カラスムギ、オクラ、キビ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウマメ、コショウ、キマメ、パイナップル、インゲンマメ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギから成る群より選択される植物種；動物；および哺乳類ホスト細胞を含むが、これらに限定されない。
【０２２９】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はサッカロミセス、ピキア、およびカンジダホスト細胞から成る群より選択される酵母細胞である。
【０２３０】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はシノラブディス・エレガンス線虫細胞である。
【０２３１】
別の実施形態によれば、ホスト細胞は昆虫細胞である。
【０２３２】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はリンゴ、シロイヌナズナ、トウジンビエ、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ケツルアズキ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、アワ、リョクトウ、カラスムギ、オクラ、キビ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウマメ、コショウ、キマメ、パイナップル、インゲンマメ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギ細胞から成る群より選択される植物細胞である。
【０２３３】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はゼブラフィッシュ細胞である。
【０２３４】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はニワトリ細胞である。
【０２３５】
別の実施形態によれば、ホスト細胞はハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、雌ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、およびヒト細胞から成る群より選択される哺乳類細胞である。
【０２３６】
ホスト細胞の形質転換は当該技術分野において公知であり、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウィルス性ベクターを介したトランスフェクション、アグロバクテリウムを介した形質転換、微粒子銃などを含むが、これらに限定されない様々な方法により達成されてよい。所望される遺伝子産物の発現は、適切な条件下で形質転換されたホスト細胞を培養すること、および形質転換遺伝子の発現を誘導することを含む。原核細胞および真核細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは、当該技術分野において公知である。細胞は回収されて、かつ遺伝子産物は該遺伝子産物に特異的なプロトコルに従って分離される。
【０２３７】
加えて、ホスト細胞は挿入したポリヌクレオチドの発現を調節するか、または望まれる特定の様式においてポリペプチド産物を修飾および加工するものが選択されてよい。異なるホスト細胞は、翻訳および後翻訳プロセシングならびに修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株またはホストシステムは、発現される外来性タンパク質の望まれる修飾およびプロセシングを確実にするために選択できる。例えば、細菌システムにおける発現はグリコシル化されないコアタンパク質産物の産生のために用いられる。しかしながら、細菌において発現するポリペプチドは正しく折り畳まれない可能性がある。酵母における発現はグリコシル化された産物を産生できる。真核細胞における発現は、異種性タンパク質の「天然」グリコシル化およびフォールディングの可能性を増大できる。さらに、哺乳類細胞における発現はポリペプチドの活性を再構成、または構成するための手段を提供できる。さらに、異なるベクター／ホスト発現システムは、タンパク質切断のようなプロセシング反応に異なる程度で影響するであろう。本発明の式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、単離されたホスト細胞を含む非ヒト生物において使用されてよい。一実施形態によれば、非ヒト生物は原核生物または真核生物である。別の実施形態によれば、非ヒト生物は無脊椎生物または脊椎生物である。
【０２３８】
好ましくは、非ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚、植物、鳥、動物、および哺乳類から成る群より選択される。さらに好ましくは、非ヒト生物は、酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、霊長類、サル、またはチンパンジーである。
【０２３９】
別の実施形態によれば、非ヒト生物は、サッカロミセス、ピキア、およびカンジダから成る群より選択される酵母である。
【０２４０】
別の実施形態によれば、非ヒト生物はシノラブディス・エレガンス線虫である。
【０２４１】
別の実施形態によれば、非ヒト生物は、リンゴ、シロイヌナズナ、トウジンビエ、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ケツルアズキ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、アワ、リョクトウ、カラスムギ、オクラ、キビ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウマメ、コショウ、キマメ、パイナップル、インゲンマメ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギから成る群より選択される植物である。
【０２４２】
別の実施形態によれば、非ヒト生物はマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である。
【０２４３】
遺伝子発現調節システム
本発明は、エクジソン受容体に基づく誘導遺伝子発現システムにおいて有用な、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。これらのジアシルヒドラジンリガンドは、原核および真核ホスト細胞の両方において、改善された誘導遺伝子発現システムを提供する。従って本発明は、遺伝子の発現を調節するために有用な、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。特に本発明は、グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むホスト細胞内で発現可能な、少なくとも１の遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節システムをトランス活性化する能力を有する、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドに関する。一実施形態によれば、グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体、偏在性受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用タンパク質１４、またはファルネソール受容体由来である。別の実施形態によれば、グループＨ核内受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体由来である。
【０２４４】
別の実施形態によれば、遺伝子発現調節システムは、トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現調節システムはさらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの、コードされるポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント；ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットの、コードされるポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む、第２の遺伝子発現カセットを含んでよい。
【０２４５】
別の実施形態によれば、遺伝子発現調節システムは、ａ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにｂ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン、および第１のポリペプチド断片が脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、もしくはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来であり、かつ第２のポリペプチド断片が異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、もしくはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン由来である、２つのポリペプチド断片を含むキメラリガンド結合ドメインから成る群より選択される第２の核内受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現カセット、を含む。遺伝子発現調節システムはさらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの、コードされるポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント；ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットの、コードされるポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；およびｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む、第２の遺伝子発現カセットを含んでよい。
【０２４６】
別の実施形態によれば、遺伝子発現調節システムは、その発現が調節されるべき遺伝子に結合する反応エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメインおよび核内受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、ならびにトランス活性化ドメイン、および核内受容体リガンド結合ドメインの１つが置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインである核内受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセットを含む。一実施形態によれば、第１のポリペプチドはトランス活性化ドメインを実質的に含まず、かつ第２のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的のための「実質的に含まない」は、問題のタンパク質が、活性化または結合活性を提供するための問題のドメインの十分な配列を含まないことを意味する。遺伝子発現調節システムはさらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される反応エレメント、ｉｉ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む、第３の遺伝子発現カセットを含んでよい。
【０２４７】
１つの核内受容体リガンド結合ドメインのみが置換変異を含むグループＨリガンド結合ドメインであるとき、もう１つの核内受容体リガンド結合ドメインは、置換変異を含むグループＨリガンド結合ドメインと二量体を形成するその他のいずれの核内受容体由来であってもよい。例えば、置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインが置換変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインであるとき、もう１つの核内受容体リガンド結合ドメイン（パートナー）は、エクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、あるいは脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰから成る群より選択される、少なくとも２の異なる核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核内受容体由来であってよい（その全体がここに参照として取り込まれる、国際公開第０１／７０８１６Ａ２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５号および米国特許出願公開第２００４／００９６９４２Ａ１号を参照のこと）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、さらに切断変異、欠失変異、置換変異または別の修飾を含んでよい。
【０２４８】
一実施形態によれば、脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、ミサキマメイタボヤ（Ｐｏｌｙａｎｄｒｏｃａｒｐａ  ｍｉｓａｋｉｅｎｓｉｓ）、またはクラゲ（Ｔｒｉｐｅｄａｌｉａ  ｃｙｓｏｐｈｏｒａ）ＲＸＲ由来である。
【０２４９】
一実施形態によれば、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ（Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ）ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、カブトムシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅類／非鱗翅目ＲＸＲホモログ由来である。
【０２５０】
一実施形態によれば、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチド断片から成る群より選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本発明における使用のためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２の異なる種のＲＸＲポリペプチド断片、または種が同じ場合には、ＲＸＲポリペプチド断片の種の２以上の異なるアイソフォーム由来であり得る２以上のポリペプチド断片を含んでよい。
【０２５１】
一実施形態によれば、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含む。
【０２５２】
別の実施形態によれば、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および１つの非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む。
【０２５３】
別の実施形態によれば、その発現が調節されるべき遺伝子はホスト細胞に対して相同遺伝子である。別の実施形態によれば、その発現が調節されるべき遺伝子はホスト細胞に対して異種性遺伝子である。
【０２５４】
下記のように、本発明における使用のための式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドは、遺伝子に連結する反応エレメントへ次々に結合する核内レセプターのリガンド結合ドメインと組み合わされるとき、遺伝子の発現の外部からの時間的な調節手段を提供する。例えばリガンド結合ドメインへのリガンド、反応エレメントへのＤＮＡ結合ドメイン、プロモーターへのトランス活性化ドメインなどの、互いに結合する本発明の様々な成分の結合機序または順番は決定的ではない。
【０２５５】
エクジソン受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、グループＨ（ここでは「グループＨ核内受容体」と称される）に分類される。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインにおいて４０−６０％のアミノ酸同一性を共有する（Ｌａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９７：１６１−１６３（１９９９））。エクジソン受容体に加え、この核内受容体サブファミリー１、グループＨのその他のメンバーは、偏在性受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、またはファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
【０２５６】
特定の例において、グループＨ核内受容体のリガンド結合ドメイン、およびその核内受容体のリガンド結合ドメインパートナーへのリガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能にする。この機序は、グループＨ核内受容体（ＧＨＮＲ）もしくはそのパートナーへのリガンド結合、および結果としての活性化ホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲ、またはパートナー＋パートナー）に対する可能性を除外しない。好ましくは、ハイブリッド遺伝子スイッチを作り出すために１以上の受容体ドメインが変化する。典型的には、ＤＢＤ、ＬＢＤ，およびトランス活性化ドメインの３つのドメインのうち１以上が他のドメインの源とは異なる源から選択されてよく、これによりハイブリッド遺伝子および結果としてのハイブリッドタンパク質は、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特定の反応エレメントの認識のために、選択されたホスト細胞または生物内で最適化される。加えて、ハイブリッド受容体を適合させるために、反応エレメントはそれ自体が修飾できるか、あるいは酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−５６４（１９８８）を参照）もしくは大腸菌由来のＬｅｘＡタンパク質（Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４３：７２９−７３６（１９８５）を参照）のようなその他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインの反応エレメント、またはこのような特異的相互作用のために設計、修飾、および選択されたタンパク質との標的となる相互作用に特異的な合成反応エレメント（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：３６１６−３６２０（１９９７）を参照）により置換できる。２−ハイブリッドシステムの別の利点は、望まれる最終結果に従った遺伝子発現を駆動するために、使用するプロモーターを選択できることである。このような二重の制御は、発現のタイミングと同様に発現が起こる細胞を制御できることから、遺伝子治療の分野、特に細胞毒性タンパク質が産生される場合に特に重要である。適切なプロモーターに機能的に連結した遺伝子が被験体の細胞に導入されるとき、該外因性遺伝子の発現は本発明のシステムの存在により制御される。プロモーターは恒常的または誘導的に調節されてよいか、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみに発現される）もしくは生物のある発生段階に特異的であってよい。
【０２５７】
ここに記載されるものは特に、置換変異を含むグループＨ核内受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現調節システムにおいて有用な、式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドならびに式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子発現システムは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが、１つのコードされるポリペプチド上にある遺伝子発現システムに基づく「単一スイッチ」であってよい。あるいは遺伝子発現調節システムは、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが、２つの異なる、コードされるポリペプチド上に位置する遺伝子発現調節システムに基づく「二重スイッチ」または「２ハイブリッド」であってよい。
【０２５８】
本発明における使用のためのエクジソン受容体に基づく遺伝子発現調節システムは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれかであってよい。機能的なＥｃＲ複合体は一般に、ステロイド受容体ファミリーの２メンバー、様々な昆虫から得られるエクジソン受容体タンパク質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）もしくはＵＳＰの脊椎動物ホモログであるレチノイドＸ受容体タンパク質から成るヘテロ二量体タンパク質に関する（Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４７６−４７９（１９９３）ａｎｄ  Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２（１９９２）を参照のこと）。しかしながら、以下に詳述するように複合体はホモ二量体であってもよい。機能的なエクジステロイド受容体複合体はまた、イムノフィリンのようなさらなるタンパク質も含んでよい。転写因子として知られているステロイド受容体ファミリータンパク質のさらなるメンバー（例えば、ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１）もまた、ＥｃＲ、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲのリガンド依存性または非依存性のパートナーであってよい。さらに、一般に共活性化因子（アダプターまたはメディエーターとも称される）として知られるタンパク質のようなその他の補助因子も必要とされ得る。これらのタンパク質はＤＮＡに配列特異的に結合せず、基本転写に関与しない。これらは転写活性化におけるその効果を、クロマチン構造への影響により、また活性化因子と開始因子複合体の相互作用により活性化因子のＤＮＡ結合を刺激することを含む、様々な機序を通して発揮する。このような共活性化因子の例は、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰ、同様にｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＢＰ／ｐ３００を含む（総説として、Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２２２−２３２（１９９７）を参照のこと）。また、一般に補助抑制因子として知られる（抑制因子、サイレンサー、またはサイレンシングメディエーターとしても知られる）タンパク質補助因子が、リガンド非存在下での転写活性化を効果的に阻害するために必要とされ得る。これらの補助抑制因子は、反応エレメントにおいて、活性を停止させるためにリガンドの結合していないエクジソン受容体と相互作用してよい。現在ある証拠は、リガンドの結合が受容体の立体構造を変化させ、これが補助抑制因子の放出および上記の共活性化因子の動員をもたらすことにより、サイレンシング活性を消失させることを示唆する。補助抑制因子の例は、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＡＲＴを含む（総説として、Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７−１１７７（１９９６）を参照のこと）。これらの補助因子は細胞もしくは生物内に内在するか、または調節性もしくは非調節性のいずれかの様式において発現されるトランス遺伝子として、外因的に加えられてよい。エクジソン受容体タンパク質、ＵＳＰ、またはＲＸＲのホモ二量体複合体もまた、ある環境下において機能的であり得る。
【０２５９】
エクジソン受容体複合体は、典型的には核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含み、ここでは一般に全てのメンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されるリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在により特徴付けられる。ここで用いられる「ＤＮＡ結合ドメイン」との語は、ＤＮＡ結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含み、これはＤＮＡ結合ドメインが特定の反応エレメントと結合するために機能する限り、ＤＮＡ結合タンパク質の全長までに至る。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、４または５のドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび幾つかのメンバーにおいてはＦの存在によっても特徴付けられる（米国特許第４，９８１，７８４号、およびＥｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８８９−８９５（１９８８）を参照のこと）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに相当し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに相当し、「Ｄ」はヒンジ領域に相当し、かつ「Ｅ」はリガンド結合ドメインに相当する。ファミリーの幾つかのメンバーは、「Ｆ」に相当するＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインもまた有してよい。
【０２６０】
ＤＢＤは、２つのアミノ酸モチーフであるＰ−ボックスとＤ−ボックスの間の２つのシステインジンクフィンガーの存在により特徴付けられ、これがエクジソン反応エレメントの特異性を与える。これらのドメインは天然型、改変型、または異種性受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってよい。ＥｃＲ受容体はまた、ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、ヘテロ二量体化性質の原因である、あまりよく定義されていない領域も有する。核内受容体のドメインは天然ではモジュール式であることから、ＬＢＤ、ＤＢＤ、およびトランス活性化ドメインは交換されてよい。
【０２６１】
遺伝子スイッチシステムは、エクジソン受容体複合体由来の成分を取り込むことが知られている。しかしながら、これらのシステムにおいてＥｃＲが使用されるいかなる時にも、それは同分子上の天然もしくは改変されたＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインと結合する。ＵＳＰまたはＲＸＲは典型的にはサイレントパートナーとして用いられる。これまでに、ＤＮＡ結合ドメインとトランス活性化ドメインが同分子上に存在する時、リガンド非存在下でのバックグラウンド活性は高く、このような活性は、ＤＮＡ結合ドメインとトランス活性化ドメインが異なる分子上に存在する時、すなわちヘテロ二量体またはホモ二量体複合体の２つのパートナーそれぞれに存在する時には劇的に減少することが示されてきた（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号を参照のこと）。
【０２６２】
遺伝子発現の調節方法
本発明はまた、本発明の遺伝子発現調節システムおよびリガンドを用いた、ホスト細胞における遺伝子発現の調節方法にも関する。特に本発明は、
ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程；および
ｂ）ホスト細胞内に式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程であって、ここで調節されるべき遺伝子が
ｉ）該遺伝子発現システムのＤＮＡ結合ドメインにより認識されるドメインを含む反応エレメント；
ｉｉ）該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；、および
ｉｉｉ）式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドのホスト細胞への導入によって遺伝子発現が調節される、その発現が調節されるべき遺伝子；を含む遺伝子発現カセットの構成成分である工程；
を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
【０２６３】
本発明は、
ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程；および
ｂ）ホスト細胞内に遺伝子発現カセットを導入する工程であって、ここで該遺伝子発現カセットが
ｉ）該遺伝子発現システム由来のＤＮＡ結合ドメインにより認識されるドメインを含む反応エレメント；
ｉｉ）該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；、および
ｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む工程；および
ｃ）ホスト細胞内に式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程であって；式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドのホスト細胞への導入によって遺伝子発現が調節される工程；
を含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法もまた提供する。
【０２６４】
本発明は、遺伝子発現調節システムの第１のハイブリッドポリペプチド由来のＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む反応エレメント；遺伝子発現調節システムの第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；およびその発現が調節されるべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、ホスト細胞内で遺伝子の発現を調節する方法もまた提供し、ここで該方法は、ａ）ホスト細胞内に遺伝子発現調節システムを導入する工程；および、ｂ）ホスト細胞内に式１で表されるジアシルヒドラジンリガンドあるいは式２または３で表されるキラルジアシルヒドラジンリガンドを導入する工程であって；リガンドのホストへの導入によって遺伝子発現が調節される工程を含む。
【０２６５】
ここに開示される方法を用いてホスト細胞内に発現させるための興味ある遺伝子は、内在性または異種性遺伝子であってよい。望まれる遺伝子またはタンパク質の、核酸またはアミノ酸配列の情報は、多数の公共アクセスデータベースのうちの一つ、例えばＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲ、あるいは多数の生物学関係学術雑誌出版物中に見出すことができる。従って、当業者は実質的に全ての既知遺伝子の核酸配列情報へのアクセスを有する。このような情報は、ここに記載される方法で使用される遺伝子発現カセット内に興味ある遺伝子を挿入するための、望まれるコンストラクトを構築するために使用できる。
【０２６６】
遺伝子発現／転写の測定
本発明の方法の有用な測定の一つは、ＲＮＡ，好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および存在量を含む転写状態に関するものである。このような測定は、存在する幾つかの遺伝子発現技術のいずれかによってｃＤＮＡの存在量を測定することにより、便利に行われる。
【０２６７】
核酸アレイ技術は、差動的なｍＲＮＡ発現を決定するために有用な技術である。このような技術は例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイを含む。このような手法は、固体担体に固定して、細胞、組織、もしくは生物全体から抽出され、ｃＤＮＡに変換された全ｍＲＮＡのプールから調製されたプローブとハイブリダイズさせる、種々の遺伝子またはｃＤＮＡに相当するＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドに依存する。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基板上に合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００遺伝子までの解析に使用できるチップが産生されている。ＤＮＡマイクロアレイは、典型的にはＰＣＲ産物であり、顕微鏡スライド上へロボットによりプリントされたＤＮＡサンプルのアレイである。各遺伝子は、完全または部分的な長さの標的ＤＮＡ配列により解析される。現在、１０，０００遺伝子までのマイクロアレイが日常的、商業的に調製されている。これら２つの手法の第１の違いは、オリゴヌクレオチドチップが短いＤＮＡ分子の断片化を可能にする２５ｍｅｒオリゴヌクレオチドを典型的に利用するのに対し、マイクロアレイの約１０００塩基対である比較的大きなＤＮＡ標的は、複雑なＤＮＡ混合物の断片化においてさらなる感度を提供し得ることである。
【０２６８】
本発明の方法の別の有用な測定は、細胞内に存在する構成タンパク質種の存在量を当該技術分野において公知の方法を用いて測定することにより、細胞の翻訳状態を決定することである。
【０２６９】
様々な生理的機能に関連する遺伝子の同定が望まれるとき、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、他細胞への結合、細胞の組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋形成、神経発生、および／または造血のような機能の変化が測定されるアッセイが利用されてよい。
【０２７０】
加えて、本発明を用いた遺伝子発現調節を測定するため、選択性マーカーまたはレポーター遺伝子の発現が使用されてよい。
【０２７１】
遺伝子発現産物を検出するためのその他の方法は当該技術分野において公知であり、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）、ウェスタンブロット（ポリペプチド検出）、およびＥＬＩＳＡ（ポリペプチド）分析を含む。あまり好ましくはないが、特定の核酸配列を検出するため、それにハイブリダイズする標識タンパク質が使用できる。
【０２７２】
幾つかの場合には、核酸配列の量を増幅することが必要である。これは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ］）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ］）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）、転写に基づく増幅などを含む幾つかの適した方法の１以上を用いて行われてよい。ＰＣＲは公知の手法に従って行われ、ここで例えば、核酸サンプルは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ハイブリダイズ可能な条件下で、１つのプライマーが１つの鎖の検出されるべき特定の配列にハイブリダイズする１組のオリゴヌクレオチドプライマーによって処理される。該プライマーは、各鋳型鎖の、それがハイブリダイズする特定の配列に対して十分に相補的である。各プライマーの伸長産物が合成され、それはハイブリダイズする核酸鋳型鎖に相補的である。各プライマーから合成された伸長産物はまた、同じプライマーを用いたさらなる伸長産物の合成のための鋳型としても役立つ。伸長産物の合成に十分な数の一巡の後、サンプルは、配列または検出されるべき配列が存在するかどうかを評価するため、上記のように分析されてよい。
【０２７３】
一般的方法
ここで用いられる標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング手法は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）により、および  Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）により、および  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により記述される。
【０２７４】
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当該技術分野において公知である。以下の実施例における使用に適した手法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））、または  Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）にその設定が見出されるであろう。全ての試薬、制限酵素、およびホスト細胞の増殖および維持のために用いられる材料は、他に記載のない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ミルウォーキー、ウィスコンシン）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（デトロイト、ミシガン）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ゲーサーズバーグ、メリーランド）、または  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（セントルイス、ミズーリ）から得た。
【０２７５】
遺伝配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．  （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、マジソン、ウィスコンシン）から入手できるプログラムスイートを用いて達成されてよい。ＧＣＧプログラムの「パイルアップ」を用いる際、ｇａｐクリエーションの初期設定値は１２、ｇａｐエクステンションの初期設定値は４が用いられてよい。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｎｅｆｉｔ」プログラムを用いる際、初期設定のｇａｐクリエーションペナルティーは５０、初期設定のｇａｐエクステンションペナルティーは３が用いられてよい。これら、またはその他のＧＣＧプログラムにおいて、ＧＣＧプログラムパラメーターが指示されないいずれの場合にも、初期設定値が用いられてよい。
【０２７６】
融点はガラス毛管内でＥｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ（登録商標）装置を用いて測定し、補正はされない。旋光度（［α］２５５８９）は、室温において１０ｃｍの長さの石英セル内でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３４１旋光計を用いて測定した。濃度はｇ／１００ｍＬで与えられた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＮＭＲを用い、３００ＭＨｚ、または４００．１３ＭＨｚにおいて記録した。他に記載のない限り、内部参照は溶媒であった。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＮＭＲにより、１００．６ＭＨｚにおいて記録した。他に記載のない限り、内部参照は溶媒であった。ＬＣ−ＭＳ分析はＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣスタックとＡｇｉｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｄマススペクトロメーターとの組み合わせを用いて行った。溶媒はＴ＝０．１５％ＢからＴ＝１０．９８％Ｂの勾配中の（Ａ）Ｈ２Ｏ／０．１％ギ酸、および（Ｂ）ＡＣＮ／０．１％ギ酸、および７５ｍｍＸ２．１ｍｍ  Ｃ１８カラム中でフローレート＝０．２ｍＬ／分の停止時間は２０分であった。正確なマス分析はＡｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ／ＴＯＦマススペクトロメーターへの直接注入により行った。Ｘ線結晶構造の決定は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＭＡＲＴ６０００を用いて行った。基本的な分析はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２４００  ＣＨＮアナライザーで行った。分析薄層クロマトグラフィーまたはＴＬＣは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｇｒａｍ（登録商標）  Ｓｉｌ  Ｇ／ＵＶ２５４  ０．２ｍｍプレートを用いて行った。ほとんどのプレートはＵＶ光により可視化した。幾つかはヨウ素またはリンモリブデン酸を用いて現像した。シリカゲルクロマトグラフィーはＡｌｄｒｉｃｈシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、６０Å）を用い、ガラスカラム中で約３０ｐｓｉのＮ２またはアルゴン上部圧力下で行った。分析ＨＰＬＣは、８１１Ｃダイナミックミキサー、３０６ＵＶ／ＶＩＳ  １５５検出器、および２１５液体ハンドラーを備えた、ＧｉｌｓｏｎＨＰＬＣシステムを用いて行った。ＵＶ吸光度は２２０ｎｍおよび２５４ｎｍにおいて測定し、統合は２５４ｎｍにおいて行った。フロー率は典型的には１ｍＬ／分にて行った。順相クロマトグラフィーは４．６ｍｍＸ２５ｃｍのＤｕＰｏｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＯＤＳカラムを用いて行った。逆相クロマトグラフィーはＡｌｌｔｅｃｈ  Ａｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ  ５ミクロン、４．６ｍｍＸ２５ｃｍ  Ｃ１８カラムを用いて行った。キラルＨＰＬＣはＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）５ミクロン、４．６ｍｍＸ２５ｃｍ  ＯＤ−Ｈカラム、ＣＨＩＲＡＫＰＡＫ（登録商標）５ミクロン、４．６ｍｍＸ２５ｃｍ  ＡＤ−Ｈカラム、または５ミクロン、  １００Å、４．６ｍｍＸ２５ｃｍ  Ｒｅｇｉｓ  Ｒｅｘｃｈｒｏｍ  （Ｓ，Ｓ）  ＵＬＭＯカラムを用いて行った。他に記載のない限り、溶媒は試薬グレードであった。無水溶媒は購入したものを使用した。
【０２７７】
一般合成法
Ａ、ＢおよびＲ２が上記のように定義され、かつＲ１がアルケニル基を表す、式２または式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物は、一般模式図１に記載される不斉合成を通して調製されてよい。
2014193875.tif 000037
【０２７８】
保護ヒドラジン１（例えばカルバジン酸ベンジルまたはカルバジン酸ｔ−ブチル）とアルデヒドＲ２ＣＨＯとの反応は２を産出する。２の不斉アリル化は、とりわけキラル試薬およびＲ２の選択に依存して、３または４のいずれかを鏡像異性体の豊富な形で供給する。不斉アリル化反応を行なうための方法は当該技術分野において公知であり、本発明の化合物を調製するために利用されてよい。不斉アリル化反応において特に有用なキラル試薬の合成は、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：９５９６  （２００３）および国際公開第０３／０７４５３４号に記載されている。３とカルボン酸塩化物Ｂ−ＣＯＣｌとの反応は５を与える。カルボン酸Ｂ−ＣＯ２Ｈもまた、３と共役して５を供給し得る。５の保護基の除去は６を与える。当業者は、ヒドラジンの脱保護のために、保護基の性質に依存した様々な方法があることを認識する。適切な保護／脱保護の戦略は“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（１９９９）において考察されている。７とカルボン酸塩化物Ａ−ＣＯＣｌまたはカルボン酸Ａ−ＣＯ２Ｈとの反応との反応は８、式２で表される化合物を与える。同様に、反応４は式３で表される化合物を導く。
【０２７９】
Ａ、Ｂ、Ｒ１およびＲ２が上記のように定義され、式２または式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物もまた、一般模式図２に記載される不斉還元を通して調製されてよい。
2014193875.tif 000038
【０２８０】
アシルヒドラジン１とケトンＲ１ＣＯＲ２との反応は、ヒドラジン２を供給する。２の不斉還元は、とりわけ還元試薬、Ｒ１およびＲ２の選択に依存して、３または４を鏡像異性体の豊富な形で供給する。米国特許第５，２５０，７３１号は、キラルホスホラン触媒複合体の存在下で光学的に活性のあるアシルヒドラジンを与える、アシルヒドラジンの不斉触媒水素化について記述している。当業者は、その他のキラルリガンドもまた使用されてよいことを認識するであろう。さらに当業者は、さらなる不斉還元方法も利用されてよいことを認識するであろう。この例において、３とＢＣＯＣｌの反応は５、式２で表される化合物を与える。同様に、反応４は式３で表される化合物を導く。
【０２８１】
加えて、式２または式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物は、キラル分割、あるいは不斉合成とキラル分割との組み合わせ、または不斉水素化とキラル分割との組み合わせを通して調製されてよい。一般模式図３に描写されるように、ラセミジアシルヒドラジンをキラルＨＰＬＣクロマトグラフィーへ供することは、式２または式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物を供給する。キラル分割における使用に適切なキラルカラムは、例えばＤａｉｃｅｌ  ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、Ｄａｉｃｅｌ  ＣＨＩＲＡＫＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈ、およびＲｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＬＭＯキラルカラムを含む。その他のキラル分割法もまた可能である。キラル分割方法における使用のためのラセミジアシルヒドラジンは、米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３Ａ１号および米国特許出願公開第２００６／００２０１４６Ａ１号に記載される方法論を用いて調製されてよい。
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【０２８２】
Ｒ１がアルケニル基を表す、式２または式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物は、標準の化学的形質転換を用いてさらに合成されてよい。一般模式図４に描写されている式３で表される鏡像異性体の豊富な化合物のように、アルケニル基は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、任意にシクロアルキル基で置換されたアルキル基、任意に複素環基で置換されたアルキル基、アルコキシ基で置換されたアルキル基、ハロアルキル基、およびその他の任意に置換されたアルキル基へ転換されてよい。当業者は、アルケンを本発明のその他の基へ転換するために使用されてよい、単一または複数工程の化学的形質転換の種類を認識するであろう。
2014193875.tif 000040
【実施例】
【０２８３】
本発明は、上記の一般合成法、および本発明の例としての、下記の限定されない実施例への参照によりより良く理解されるであろう。
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（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド
2014193875.tif 000042
【０２８４】
化合物１：カルバジン酸ベンジルは市販されている。
【０２８５】
化合物２：カルバジン酸ベンジル（３００ｇ、１．８１モル）は、還流冷却器、温度計、マグネチックスターラー、および５００ｍＬの添加漏斗を備えた３Ｌの四首フラスコ中で、１．２Ｌのメチルアルコールに溶解した。４５℃の温度にした混合物へ、氷酢酸（５ｍＬ）を加えた。ピバルアルデヒド（２４８．８ｇ溶液、２．１７モル、ｔ−ブタノール中で約７５％）を３０分にわたり部分的に加えた。ＴＬＣでモニターする間、反応を還流により３０分間熱した。混合物を室温に近い温度まで冷却し、全用量が約７００ｍＬになるまで回転式エバポレーターにより濃縮した。約７ｇの活性炭を約３０℃において加えた。混合物を一夜攪拌し、ポアサイズ「Ｃ」のガラスフリットブフナー漏斗中のセライトパッドを通して濾過した。溶媒を真空中で除去し、残った浅黄色油を結晶皿に注ぎ、スパーテルを用いた操作により結晶化を誘導した。材料を顆粒化し、残りの溶媒を室温にて空気中で数日間蒸発させ、４２０．４ｇの未精製産物を残した。３００ｍＬの酢酸エチルと１Ｌのヘキサンを最初に沸騰させた混合物からの室温での再結晶化により、３６３．２ｇのオフホワイト固体である（Ｅ）−Ｎ’−（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを生じた。４３．１ｇの２番目の収穫物および同等の融点は、約１５０ｍＬのヘキサンと４５ｍＬの酢酸エチルとの混合物から得られた。総収率：９６．１％。Ｒｆ＝０．３２（２：１  ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝７４〜７４．５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．０（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．４−７．３（５Ｈ、ｍ）、７．１  （ＩＨ、ｓ）、５．２０（２Ｈ、ｓ）、１．１（９Ｈ、ｓ）。
【０２８６】
化合物３：（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：９５９６  （２００３）および国際公開第０３／０７４５３４号の改変法を用いて調製した。全体の手順は、最小化された短い瞬間大気に曝す、無水の閉鎖システム化で行った。乾燥機で乾燥した、ガス口、攪拌器、および添加漏斗を備えた５Ｌの四首フラスコへ、最初にアリルトリクロロシラン（４１９．５ｇ、２．３９モル）、次に２Ｌの無水ＣＨ２Ｃｌ２を負荷した。溶液は氷／塩浴内でアルゴン下において０℃まで冷却した。トリエチルアミン（４８５ｇ、４．７９モル）を添加漏斗を通して加え、温度を０℃に保った。この時点で、反応は透明な琥珀色であった。２時間にわたり、内部温度を＜１５℃に保って、Ｓ，Ｓ−プソイドエフェドリン（３５９ｇ、２．１７モル）を固体添加漏斗を用いて部分的に加えた。添加漏斗は２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で反応中へ洗い流した。時間が経過すると、ペースト様の半顆粒固体が形成された（Ｅｔ３ＮＣｌ）。薄茶色の粘調のスラリーを氷上で約２時間攪拌し、その後氷浴を取り外すことにより、数時間かけて反応を室温にした。システムをアルゴン下に保ち、約１２時間後、ほとんどのＣＨ２Ｃｌ２を蒸留により取り除いた。１Ｌの無水ヘキサンを加え、溶媒を再び蒸留した。その後１Ｌの無水ペンタンを加え、混合物をアルゴン下で約１時間室温にて攪拌した。初めにＣＨ２Ｃｌ２中で形成された以前のペースト様のスラッジは、最初にヘキサンの添加により、次に、特にペンタンの添加の後さらに顆粒状になった。溶液の色は明るい琥珀色であった。部分的に、および穏やかなアルゴン圧の使用により、ペンタンおよび可溶性産物は反応フラスコの外へ、ガラスウールフィルターおよびＰＦＡチューブを通り、蒸留ヘッドおよびマグネチックスターラーを備えた、２番目の乾燥した１Ｌ，三首丸底フラスコ内へ移動した。溶液移動と交互に、濃縮された油性産物を後に残し、ペンタンを第２のフラスコから留去した。この過程を繰り返し、残余のＥｔ３ＮＣｌを２回、各５００ｍＬのペンタンで洗浄し、洗浄液をアルゴン雰囲気下で２番目のフラスコへ移した。約１０ｔｏｒｒの真空度での蒸留により、留分中の産物を集めた。約３％までのアリルトリクロロシランを含むと考えられる前留分において、約５６．３ｇ（９．７％）が回収された。主要な留分、精製された（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは４１３．３ｇ（７１％）の量、ｂｐ＝１４０〜１４４＠約１０ｔｏｒｒ、回収時にはやや粘調の浅黄色であるが、セプタム／パラフィルムにより固く密閉して数日間にわたり冷蔵するとオレンジ色になる。この材料は冷蔵保存され、その特性は示されておらず、かつ続くアリル化反応においてさらに精製することなく使用された。
【０２８７】
化合物４：温度計およびマグネチックスターラーを備えた５Ｌの四首フラスコを乾燥機で乾燥させ、２Ｌの無水ＣＨ２Ｃｌ２、続いてＮ’−（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（２２０ｇ、９３９ｍｍｏｌ）を加える間、アルゴン下に維持した。混合物は、大きな、約１０ガロンの氷／塩水浴中で２〜３℃において冷却および攪拌した。（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジン（３６３ｇ、１．３５５モル）を、約３０分にわたり、カニューレを用いて穏やかなアルゴン圧の補助によりフラスコ内へ加えた。温度を２〜３℃に保つ間、最初に淡黄色であった溶液は、透明な明るいオレンジ色になった。反応を室温で自然に室温まで温め、ＣＨ２ＯＨ中の少量の分割量の反応停止をモニターし、かつＴＬＣ（２：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により分析した。開始から３６時間後、ＴＬＣ分析は約９０％の完了を示した。混合物を５℃に冷却し、さらなる４６ｇ（０．１７９ｍｍｏｌ）のオキサザシロリジンを加え、混合物を室温にまで温めた。約８時間後、反応を再び５℃に冷却し、予め冷却した１００ｍＬの脱イオン水中の１００ｇのＫ２ＣＯ３溶液により約１時間にわたって反応を停止させた。反応停止の間、発熱が温度を１７℃くらいまで上昇させた。約１００ｍＬのさらなる脱イオン水を加えた。溶液の外見は透明の青緑色になった。反応または反応停止の間、明らかなガスの発生する時間はなかった。室温での攪拌の４日後、溶液は明るい黄色になり、５日後有機相はゲル化したが色はなお明るい黄色であった。混合物を約１５℃に冷却し（後にこれは必要でないことが明らかになる）、約１．２５Ｌのヘキサンを加え、ゲルは部分的に崩壊し、かつ攪拌によって破壊された。上清を吸い出し、ガラスウールを通して濾過する一方、フラスコに残った白色ゲルに約１Ｌの一部分を加えた。プソイドエフェドリンを白色個体として沈殿させ、残ったいずれのゲルも崩壊させるため、さらなるヘキサンもまた上清へ加えた。ヘキサン抽出物を合わせ、溶媒を真空中で除去した。全体的に、ゲルの抽出、ヘキサンにより誘導されるプソイドエフェドリンの沈殿、ならびにガラスウールおよびガラスフリットブフナー漏斗を通し、黄色油としての未精製のアリルヒドラジドを得るために約５〜６Ｌのヘキサンが使用された。バッチにおいて、この未精製の材料を３倍量のヘキサンで処理し、室温に静置し、沈殿したプソイドエフェドリンからデカントし、別の漏斗へ移した。産物溶液を、１．４ＮのＨＣｌをそれぞれ約２５ｍＬずつ用いて２回洗浄し（ほとんどの色が除かれる）、続いて１０％Ｋ２ＣＯ３および塩水で洗浄することにより、残りのプソイドエフェドリンから分離した。未精製産物のヘキサン溶液は固体無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、明るい黄色の粘性の油を与えるために溶媒を真空中で除去した。ＴＬＣ（２：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）は、Ｒｆ＝０．４に望まれる産物を示し；０．２５および０．３１において２つの不純物が見られ（各５〜１０％、そのうちの１つはおそらく出発物質））、かつＲｆ＝０．４の上に幾つかの顕著な不純物が見られた。以前、基線に検出されたプソイドエフェド��ンは、現在消失した。真空ポンプの微量の溶媒を除去した後、総量１９６．８ｇ（７５．８％）の（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを琥珀色の油として検出した。現在いくらか濃縮され顆粒状である最初のゲルを、約２Ｌの沸騰したヘキサンで濃縮した。固体を濾過し、ヘキサンを除去し、沈殿したプソイドエフェドリンから油をデカントすると、約１８ｇを生じた。この材料と、上記の最初の産物のバッチからの残基（約３〜４ｇ）を合わせ、以前のように１．４ＮのＨＣｌ、Ｋ２ＣＯ３水溶液、および塩水により洗浄した。ヘキサンの除去により、２０．６ｇのさらなる産物が琥珀色の油として生じ、これはＴＬＣにより最初のバッチと同一と見られた。（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルの一部１０．１ｇをシリカゲル上で定量的なクロマトグラフィーを行なうと、８．８８ｇ（クロマトグラフィーによる８８％の収率）の透明なオフホワイトの油である純粋な産物を生じた。Ｒｆ＝０．４３（２：１  ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４（５Ｈ、ｂｒ  ｓ）、６．２（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、６．０（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．１５（２Ｈ、ｓ）、５．１（２Ｈ，  ｓ）、４．１（１Ｈ、ｂｒ）、２．７（１Ｈ、ｍ）、２．４（１Ｈ、ｂｒ  ｄ）、２．０（１Ｈ、ｍ）、０．９５（９Ｈ、ｓ）；ｅｅ＝９８．１％、ＡＤ−Ｈカラム；［α］２５５８９−４２．５°（ｃ２．１８、ＣＨ３ＯＨ）。
【０２８８】
化合物５：（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（１１０ｇ、３９８ｍｍｏｌ）および５００ｍＬの塩化メチレンを、温度計およびマグネチックスターラーを備えた２Ｌの丸底フラスコに加えた。続いてＫ２ＣＯ３溶液（８２．５１ｇ、２００ｍＬの脱イオン水中で５９７ｍｍｏｌ）を加え、フラスコを約１０℃まで冷却した。その後２０分間にわたり、未希釈の３，５−ジメチルベンゾイル塩化物（７３．８２ｇ、４３７．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。残余の酸塩化物をフラスコ内へすすぎ入れ、反応混合物を希釈するために１Ｌの塩化メチレンを用いた。添加の間、温度が１５℃を超えないようにした。最初は氷浴中、次に室温において、反応を一夜攪拌した。約１６時間目のＴＬＣ分析は、残余の酸塩化物により反応が終了したことを示し；混合物は全部で約４０時間攪拌した。反応混合物を２Ｌの分液漏斗へ注いだ。有機層を回収し、水層の少量の逆流ＣＨ２Ｃｌ２と合わせた。有機相をもう一度１０％Ｋ２ＣＯ３で洗浄し、塩水で洗浄し、その後固体のＭｇＳＯ４／Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。混合物を塩から濾過し、溶媒を真空中で除去して顆粒状の明るいベージュ色の固体を得た。未精製産物を３００ｍＬの２：１ヘキサン：エーテル中に懸濁して攪拌し、ブフナー漏斗で濾過して、残余の３，５−ジメチルベンゾイル塩化物を実質的に除去した。回収した固体を、全量約１２００ｍＬの組み合わせた２：１ヘキサン：エーテルで４回以上洗浄することにより、白色の顆粒状固体が得られた。産物を回収して空気中で乾燥させ、１４４．５５ｇの（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを得た。収率＝８８．９％。３０ｇのサンプルを２０５ｍＬの沸騰させたメタノールに溶解し、室温で結晶化させた。結果としてできた凝集材料をブフナー内で５０ｍＬのＣＨ３ＯＨにて洗浄し、２２．２ｇ、ｍｐ＝１４６℃、（ｅｅ＞９９．９％）を得た。（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルの分析サンプルは、この材料を沸騰したＣＨ３ＯＨから２度再結晶化し、続くクーゲルロール短経路蒸留および固体として回収された、純粋な白色の材料として得られた：ｍｐ＝１４５．５〜１４７℃。Ｒｆ＝０．１２（１０：１  ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．５−７．２（ｍ、９Ｈ、ψ＋ＮＨ）、７．２−６．８（ｍ）、６．４（Ｓ）、６．３（Ｓ）、５．９５（ｂｒ、５Ｈ、ベンジリック＋Ｃ＝Ｃ）、５．４−４．６（ｍ、９Ｈ、アリルのＮ−ＣＨ、ψ−ＣＨ３）、３．６５（ｂｒ）、２．５（ｍ）、２．３５（Ｓ）、２．３（Ｓ）、１．２−０．８（ｍ、９Ｈ、−Ｃ（ＣＨ３）３）；［α］２５５８９−１２．８°（ｃ２．０１、ＣＨＣｌ３）。
【０２８９】
化合物６：（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（１３．５ｇ、３３ｍｍｏｌ）を室温で１００ｍＬの氷酢酸に懸濁した。木炭上の１０％パラジウム（０．２４ｇ）をスラリーとして４．４ｇの酢酸中に加えた。灰色の懸濁物をＰａｒｒ水素添加装置上で１０−３０ｐｓｉにて９０分間振とうし、反応をＴＬＣでモニターした。触媒を処理させ、反応液をピペットで除去し、波状濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、５９７  １／２、直径１２５ｍｍ）に通した。残余の触媒を酢酸で洗浄し、洗浄液を濾紙に通して、酢酸と産物を合わせた質量が１５６ｇになるようにした。混合物を氷上で冷却し、約６００ｍＬの脱イオン水を加えた。３０分間にわたって産物の油を除去し、その後結晶化させた。これを、紙を通して濾過し、空中で乾燥させ、紙上から７．９ｇの明るい黄色の固体を回収した。数時間にわたり濾液からさらなる０．５２ｇの産物を沈殿させ、総収量８．４２ｇ（９２．２％）の（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジドを得た；Ｒｆ＝０．５（１：１  ヘキサン：酢酸エチル）；［α］２５５８９＋７．６３（ｃ１．９８、ＣＨ３ＯＨ）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５（１Ｈ、ｓ）、７．０２（２Ｈ、ｓ）、４．６＋３．５（１Ｈ、２ｄ）、４．１（２Ｈ、ｓ、ＮＨ２）、２．３８＋２．３７（６Ｈ、２ｓ）、１．１−２．１（４Ｈ、ｍ）、１．０＋０．９（９Ｈ、２ｓ）、１．０＋０．９８（３Ｈ、２ｔ）、２つの異なる構造異性体。
【０２９０】
化合物７（タイトル化合物）：（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド（３５ｇ、１２６．６ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備えた５００ｍＬの丸底フラスコ中で１００ｍＬの塩化メチレンに溶解した。水溶性Ｋ２ＣＯ３（２６．２５ｇ、１８９．９ｍｍｏｌ、７５ｍＬの脱イオン水溶液）を加え、混合物を氷上で攪拌した。固体の２−エチル−３−メトキシベンゾイル塩化物（２７．６７ｇ、１３９．３ｍｍｏｌ）を加え、２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いてフラスコ内へすすぎ込んだ。混合物を氷上で約４０時間攪拌し、浴槽を室温まで温めた。操作の補助の必要に応じ、さらなる塩化メチレンおよび水を加えた。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。約５ｇの活性炭を加え、紙を通した濾過で塩および炭素を除去した。溶媒を真空中、最初は回転式エバポレーターで、次に高度の真空中で蒸発させ、わずかなＣＨ２Ｃｌ２を含む５７．８ｇの未精製産物を得た。未精製材料をフリットガラスブフナー漏斗（ポアサイズＡＳＴＭ４０−６０Ｃ、Ｐｙｒｅｘ）中で、最初は３ｘ１００ｍＬ分のエーテル（２％エタノール）により、次に１ｘ１００ｍＬ部の１：１ヘキサン：エーテルにより粉砕した。産物をその後２ｘ２００ｍＬの脱イオン水と混合することにより洗浄し、空気中で乾燥させた。（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド（（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドとも呼ばれる）を、明るい白色の粉状固体（３６．５１ｇ、６５．７％の収率、極めて純粋かつＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによる高いｅｅ、ＴＬＣによる１スポット、１：１ヘキサン：エーテル）として回収した。合わせた有機洗浄液の蒸発は約２０ｇの材料を生じ、これをフリットガラスブフナー漏斗、ポアサイズＡＳＴＭ４０−６０Ｃ中で、最初は２００ｍＬの２：１ヘキサン：エーテルにより、次に２ｘ１００ｍＬの２：１ヘキサン：エーテルにより粉砕した。材料を３ｘ１００ｍＬの脱イオン水と混合することにより洗浄し、空気中で乾燥させた。２番目の産物を白色粉末（１２．９８ｇ、２３．４％の収率、極めて純粋、かつＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによる高いｅｅ）として回収した。３番目の産物を同様の方法で、オフホワイトの固体（１．５２ｇ、２．７％、９８％の純度、＞９９％のｅｅ）として得た。最後のサンプルを温かいメタノールに溶解し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターを通して大きな結晶皿へ濾過することにより調製した。材料を回収し、スパーテルで微粉砕し、一定の重量になるまで乾燥機中で５０〜５８℃において熱した。ＨＰＬＣ分析は９９．３％の化学的純度、および＞９９．９％ｅｅ、Ｒｆ＝０．２８（１：１  ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝１６２．２〜１６２．８℃；［α］２５５８９＋１２．９（ｃ２．０４、ＣＨ３ＯＨ）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ７．０−７．１（４Ｈ、ｍ）、６．９（１Ｈ、ｄ）、６．１−６．４（１Ｈ、２ｄ）、４．５−４．７（１Ｈ、２ｄ）、３．７８（３Ｈ���ｓ）、２．３（６Ｈ、ｓ）、２．３（１Ｈ、ｍ）、１．９（２Ｈ、ｍ）、１．５５（３Ｈ、ｍ）、１．１−１．１５（９Ｈ、２ｓ）、０．９−１．０（６Ｈ、ｍ）を示した。
【０２９１】
実施例２ないし２９は、実施例１に記載される方法論を用いて調製した。パーセント鏡像異性体過剰率（ｅｅ）はキラルＨＰＬＣにより決定された。表２は実施例２ないし２９の分析データを提供する。
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【０２９２】
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（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（Ｓ）−［２−（６−メトキシ−ナフタレン−２−イル）−プロピオニル］−ヒドラジド
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【０２９３】
化合物１：（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジドは、実施例１に記載されている通りに調製した。
【０２９４】
化合物２：化合物２は相当するカルボン酸から調整した。マグネチックスターラーを備えた丸底フラスコ内の、８．２ｍＬのクロロホルム中の（Ｓ）−（＋）−２−（６−メトキシナフタレン−２−イル）−プロピオン酸（Ｎａｐｒｏｘｅｎ、２ｇ、８．６９ｍｍｏｌ）溶液に、塩化チオニル（１．２４ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＭＦの液滴を加え、混合物を３時間還流した。塩化メチレンを加える間、クロロホルムおよび余剰の塩化チオニルを反応混合物から蒸留した。余剰の溶媒の蒸発は、（Ｓ）−２−（６−メトキシ−ナフタレン−２−イル）−プロピオニル塩化物（１．９１８ｇ、８８．８％の収率）を生じた。Ｒｆ＝０．２（１：１  ヘキサン：酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ９．９８（ｂｒ、１Ｈ）、７．７８（ｔ、２Ｈ）、７．３６（ｄ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、１Ｈ）、７．１４（ｍ、２Ｈ）、４．２５（ｑ、１Ｈ）、３．９３（ｓ、３Ｈ）、１．６８（ｄ、３Ｈ）。
【０２９５】
化合物３（タイトル化合物）：（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド（前駆体に基づく推定ｅｅは＞９９％、１．１ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬの塩化メチレン中に溶解した。水溶性Ｋ２ＣＯ３溶液（２．５ｍＬ中、０．９０７ｇ、６．５７ｍｍｏｌ）を反応溶液に加えた。（Ｓ）−２−（６−メトキシ−ナフタレン−２−イル）−プロピオニル塩化物（１．０９ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）を加え、反応を２４時間攪拌し、ＴＬＣによりモニターした。操作の補助の必要に応じ、さらなる塩化メチレンおよび水を加えた。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去して未精製産物を得た：ｍｐ＝９８℃（ガラス）−１２３℃。未精製材料を２：１ヘキサン：エーテルにより２回粉砕し、１．５５４ｇ、収率８０．１％の（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（Ｓ）−［２−（６−メトキシ−ナフタレン−２−イル）−プロピオニル］−ヒドラジド、ｍｐ＝９８℃（ガラス）−１２２℃を得た。粉砕された材料を３５℃においてイソプロパノールから結晶化して結晶化産物を得た。３つのロットの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは全て同等であった。Ｒｆ＝０．１５（１：１  ヘキサン：エチルエーテル）；ｍｐ＝１５８〜１６０℃（加熱は１５０℃において開始した）；ｍｐ＝１５６〜１６４℃（加熱は２５℃において開始した）；［α］２５５８９＋９５．８゜（ｃ２．０２、ＣＨ３ＯＨ）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９６＋９．８２（ＮＨ、２ｓ）、７．７１＋７．５８（２Ｈ、２ｄ）、７．６３（１Ｈ、ｓ）、７．４９＋７．３１（１Ｈ、２ｄ）、７．２６（１Ｈ、ｓ）、７．１３＋６．７７（１Ｈ、２ｄ）、７．０６（２Ｈ、ｓ）、６．６８＋６．３０（１Ｈ、２ｓ）、４．３１（ｍ、１Ｈ）、３．８８＋３．８５（３Ｈ、２ｓ）、３．５８（１Ｈ、ｍ）、２．３０＋１．８３（６Ｈ、２ｓ）、１．６４−１．０３（４Ｈ、ｍｍ）、１．００（３Ｈ、ｍ）、０．８７＋０．８４（９Ｈ、２ｓ）、０．６３（３Ｈ、ｔ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７３．９、１７２．２、１５７．８、１３７．３、１３３．７、１３０．８、１２９．１、１２８．８、１２７．４、１２５．９、１２５．８、１２３．７、１２３．３、１１９．２、１１９．１、１０５．５、６２．７、５５．３、４５．１、３５．０、２８．５、２７．６、２６．９、２１．２、１７．５、１４．２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ３１Ｈ３９Ｎ２Ｏ３［Ｍ−Ｈ］−についての計算値：４８７．２９６６、測定値：４８７．２９４９、Ｃ３１Ｈ４０ＣｌＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｃｌ］−についての計算値：５２３．２７３３、測定値：５２３．２７１８、Ｃ３１Ｈ４０Ｎ２Ｏ３についての分析的計算値：Ｃ、７６．１９；Ｈ、８．２５；Ｎ、５．７３；Ｏ、９．８；測定値：Ｃ、７６．０１；Ｈ、８．３５；Ｎ、５．７０。
【０２９６】
実施例１における不斉アリル化反応の立体化学的経路を決定するため、（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（Ｓ）−［２−（６−メトキシ−ナフタレン−２−イル）−プロピオニル］−ヒドラジドのＸ線結晶構造を決定した。この実験は、Ｒで表されるｔｅｒｔ−ブチル基およびｎ−プロピル基に関連する炭素の無水の立体配置を確立した。
【０２９７】
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（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド
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【０２９８】
化合物１：（Ｅ）−Ｎ’−（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例１に記載された通りに調製された。
【０２９９】
化合物２：（Ｒ，Ｒ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは、Ｒ，Ｒ−プソイドエフェドリンを用い、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。
【０３００】
化合物３：（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。分析データ：Ｒｆ＝０．４６（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝６９〜７１℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４（ｂｒ  ｓ、５Ｈ）、６．２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、５．１５（ｓ、２Ｈ）、５．１（ｓ、２Ｈ）、４．１（ｂｒ、１Ｈ）、２．７（ｍ、１Ｈ），２．４（ｂｒ  ｄ、１Ｈ）、２．０（ｍ、１Ｈ）、０．９５（ｓ、９Ｈ）；ｅｅ＝９８．２％、ＡＤＨカラム；［α］２５５８９＋３９．３°（ｃ＝２．０３、ＣＨＣｌ３）。
【０３０１】
化合物４：（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。分析データ：Ｒｆ＝０．４３（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝１５０〜１５１．５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４５−６．８８（ｍ、７Ｈ）、６．４４＋６．２８（２ｓ、１Ｈ）、５．９６（ｂｒ、１Ｈ）、５．３８−４．６８（ｍ、５Ｈ）、３．６９（ｂｒ、１Ｈ）、２．６８−２．４３（ｍ、２Ｈ）、２．３６＋２．２９（２ｓ、６Ｈ）、１．１３＋１．０２＋０．９４（３ｓ、９Ｈ）；［α］２５５８９＋１２．５°（ｃ＝２．０１、ＣＨＣｌ３）。
【０３０２】
化合物５：（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジドは、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。分析データ：Ｒｆ＝０．５（１：１ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝１１２〜１１２．８℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５（ｓ、１Ｈ）、７．０２（ｓ、２Ｈ）、４．６＋３．５（２ｄ、１Ｈ）、２．３８＋２．３７（２ｓ、６Ｈ）、１．２−２．１（ｍ、４Ｈ）、１．１＋１．０（２ｓ、９Ｈ）、１．０５＋０．９８（２ｔ、３Ｈ）２つの異なる構造異性体；［α］２５５８９−７．９７（ｃ２．１４、ＣＨ３ＯＨ）。
【０３０３】
化合物６（タイトル化合物）：（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジドは、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。分析データ：Ｒｆ＝０．２８（１：１ヘキサン：酢酸エチル）；ｍｐ＝１５６．５〜１５７．５℃；［α］２５５８９−１３．３９°（ｃ２．０５、ＣＨ３ＯＨ）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．４＋１０．２６（ｓ、１Ｈ）、７．１８−７．１４（ｍ、３Ｈ）、７．０８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０３（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．３４＋６．２１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５７＋４．３８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．２９（ｓ、６Ｈ）、２．２７−２．２３（ｍ、１Ｈ）、１．８９−１．７９（ｍ、２Ｈ）、１．５９−１．３８（ｍ、３Ｈ）、１．０９＋１．０６（ｓ、９Ｈ）、０．９５＋０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．４０、１６８．２４、１５７．６４、１３７．１８、１３６．９８、１３６．５０、１３０．８９、１３０．７３、１３０．２０、１２６．９６、１２５．２８、１２４．８３、１１９．３７、１１８．９５、１１２．４１、６２．２９、５６．１１、３５．４５、２８．７１、２７．５６、２１．２４、２０．１５、１５．１５、１４．６８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２７Ｈ３９Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４３９．２９５５、測定値：４３９．２９５、Ｃ２７Ｈ３８ＮａＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４６１．２７７４、測定値：４６１．２７６５；Ｃ２７Ｈ３８Ｎ２Ｏ３についての分析的計算値：Ｃ、７３．９４；Ｈ、８．７３；Ｎ、６．３９；Ｏ、１０．９４、測定値：Ｃ、７３．８７；Ｈ、８．９４；Ｎ、６．３８；ｅｅ：＞９９．９％；Ｒｅｇｉｓ（Ｓ，Ｓ）ＵＬＭＯ、１ｍＬ／分のフローレートにおける９８：２のヘキサン：メタノールの混合物。
【０３０４】
実施例３２ないし４７は、実施例３１に記載される方法論を用いて調製した。パーセント鏡像異性体過剰率（ｅｅ）はキラルＨＰＬＣにより決定された。
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【０３０５】
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（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
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【０３０６】
化合物１：カルバジン酸ｔ−ブチルは市販されている。
【０３０７】
化合物２：ピバルアルデヒド（５２．１ｇ、４５４ｍｍｏｌ、約７５％のｔ−ブタノール溶液）を、還流冷却器、温度計、および添加漏斗を備えた１Ｌの三首丸底フラスコ中で、１２０ｍＬのメタノールに溶解した。氷酢酸（１ｍＬ）を加え、続いて反応熱を逃すことなくカルバジン酸ｔ−ブチル（５０ｇ、３７８ｍｍｏｌ）を制御しながら添加した。ＴＬＣによりモニターしながら混合物を４時間攪拌した。反応の完了に従って溶媒を真空中で除去し、残渣をペンタン中に採取し、ペンタンを蒸発させた。得られた油を静置により結晶化して、Ｎ’−（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７５．７ｇ、９３％）を得た。Ｒｆ＝０．４２（２：１ヘキサン：酢酸エチル、１％酢酸）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、７．１（ｓ、１Ｈ）、１．５（ｓ、９Ｈ）、１．１（ｓ、９Ｈ）ｐｐｍ。
【０３０８】
化合物３：（Ｒ，Ｒ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは、Ｒ，Ｒ−プソイドエフェドリンを用い、実施例１に記載された方法論を用いて調製された。
【０３０９】
化合物４：Ｎ’−（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２ｇ、５９．９ｍｍｏｌ）を、乾燥した、温度計、マグネチックスターラー、および窒素雰囲気を備えた１Ｌの三首丸底フラスコへ負荷した。無水塩化メチレン（２００ｍＬ）を、カテーテルを用いてフラスコ内へ負荷した。混合物を氷浴中で０℃に冷却した。続いて（Ｒ，Ｒ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジン（２４．０７ｇ、８９．８７ｍｍｏｌ）を不活性化状態でフラスコへ加えた。数分以内に、最初の明るい黄色の溶液は透明な暗い黄色へ変化した。ＴＬＣによりモニターしながら、反応を０℃で６時間攪拌し、その後室温に温め、一夜攪拌した。反応を約２５ｍＬのメタノールの添加により停止させ、これにより色は明るくなった。溶液を濃縮し、残渣を１００ｍＬの酢酸エチルおよび１００ｍＬの水で希釈した。相を分離し、水層を酢酸エチルにより２回抽出した。有機相を合わせ、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮した。得られた油を、ヘキサン中の１０％酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製された（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを油として得た（２．８７ｇ、２４．４％の収率）。不純な画分もまた回収した（３．１７ｇ）。Ｒｆ＝０．４４（５：１ヘキサン：酢酸エチル、Ｉ２可視化）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．０７（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、５．８５（ｍ、１Ｈ）、５．０（ｄｄ、２Ｈ）、２．６（ｍ、１Ｈ）、２．３３（ｍ、１Ｈ）、２．３（ｍ、１Ｈ），１．４（ｓ、９Ｈ）、０．９（ｓ、９Ｈ）。
【０３１０】
化合物５：（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．３４ｇ、９．６５ｍｍｏｌ）をＰａｒｒビン中でメタノール（５０ｍＬ）に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ（７０ｍｇ）を水（１．６ｍＬ）中のスラリーとして加え、混合物をＰａｒｒ水素添加装置で４．５時間、開始の圧力５５ｐｓｉで振とうした。圧力の低下を反応の進行の測定としてモニターし、３０分後におそらく反応が完了したことが示された。触媒を実質的に処理させ、上清をピペットで除去し、０．４５ミクロンのシリンジフィルターに通し、ＴＬＣで分析した。溶媒を真空中で除去し、かすかな淡黄色の油としての（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。Ｒｆ＝０．４８（５：１ヘキサン：酢酸エチル、Ｉ２可視化）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．０（ｂｒ、１Ｈ）、４．０（ｂｒ、１Ｈ）、２．５（ｄ、１Ｈ）、１．５（ｓ、９Ｈ）、１．１（ｍ、２Ｈ）、１．６（ｂｒ、２Ｈ）、０．９４（ｓ、９Ｈ）、０．９４（ｔ、３Ｈ）。
【０３１１】
化合物６（タイトル化合物）：（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備えたバイアル内で約３ｍＬの塩化メチレンに溶解した。約２ｍＬの０．８ｇＫ２ＣＯ３水溶液（５．７９ｍｍｏｌ）、続いて０．８１ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）の３，５−ジメチルベンゾイル塩化物を加えた。反応を最初は氷上で、次に室温まで温め、一夜攪拌した。その後、それぞれ数ｍＬの水および塩化メチレンを加え、全ての固体を溶解した。水層を除去し、有機層を固体ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ＴＬＣは反応が約９５％完了したことを示した。混合物を幾つかのガラスウールを通してバイアル中へ濾過した。溶媒を３：１ヘキサン：エーテルおよびペンタンで追跡するＮ２の流れにより蒸発させた。残渣をスパーテルで操作して結晶化を開始させ、凝固が完了した後、小さなフリットガラス漏斗内で２〜３ｍＬのペンタンにより３回粉砕した。空中で乾燥した後、３００ｍｇ（１９．５％）の（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。ＴＬＣはこれが極めて純粋であることを示し、キラルＨＰＬＣはｅｅ＝９３．３％を示した。融点決定のために、産物を５０℃の真空乾燥機で乾燥させた。Ｒｆ＝０．４２（４：１ヘキサン：酢酸エチル、ＵＶ（強）、Ｉ２（弱）可視化）；ｍｐ＝１１５．５〜１１７．５℃；［α］２５５８９−３０．１８（ｃ２．０２、ＣＨ３ＯＨ）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１５−７．０３（ｍ、３Ｈ）、６．０７＋６．００（ｓ＋ｄ、１Ｈ）、４．５２＋４．４０（２ｄｄ、１Ｈ）、２．３２＋２．２８＋２．２３（３ｓ、６Ｈ）、１．８５−０．８９（ｍ、２５Ｈ）。
【０３１２】
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（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
2014193875.tif 000064
【０３１３】
化合物１：（Ｒ）−Ｎ’３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドは、実施例１に記載された通りに調製された。
【０３１４】
化合物２（タイトル化合物）：ＴＨＦ（１０ｍｌ）中の（Ｒ）−Ｎ’３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド（４００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）溶液をｔ−ｂｏｃ無水物（６２９ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ）へ加えた。反応を４０時間還流し、冷却し、エーテル（２０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏで洗浄して無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーで精製して、白色固体としての（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４５．７ｍｇ、４．１％の収率）を得た。Ｒｆ＝０．３９（１：３ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；［α］２５５８９＋２６．２５（ｃ２．０９、ＣＨ３ＯＨ）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１５−７．０３（ｍ、３Ｈ）、６．０７＋６．００（２ｄ、１Ｈ）、４．５９＋４．５０（２ｄｄ、１Ｈ）、２．３７＋２．３４（２ｓ、６Ｈ）、１．８５−０．８９（ｍ、２５Ｈ）ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２２Ｈ３７Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３７７．２８０４、測定値：３７７．２７９５、Ｃ２２Ｈ３６Ｎ２ＮａＯ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：３９９．２６２４、測定値：３９９．２６１８。
【０３１５】
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（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メトキシ−２−フェニル−プロピオニル）−ヒドラジド
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【０３１６】
化合物１：３−メトキシ−２−メチル−安息香酸ヒドラジドは、米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３  Ａ１号に記載の方法論を用いて調製した。
【０３１７】
化合物２：ピバルアルデヒド（１３．４５ｇ、１５６ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内で３００ｍＬのメタノールに溶解した。３−メトキシ−２−メチル−安息香酸ヒドラジド（２６．６ｇ、１４７．６ｍｍｏｌ）および１００滴の氷酢酸を加え、混合物をＴＬＣでモニターしながら約８時間還流にて熱した。反応の完了に従って溶媒を真空中で除去し、産物を冷ヘキサン中でスラリー化し、ブフナー漏斗で濾過して２４．４ｇ（６６％）の３−メトキシ−２−メチル−安息香酸（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジドを得た。Ｒｆ＝０．１９、（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４２＋７．４１（３ｓ、１Ｈ）、７．１（ｔ、１Ｈ）、６．９（ｄ、１Ｈ）、６．８２（ｄ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．２＋２．１（２ｓ、３Ｈ）、１．０７＋１．０（３ｓ、９Ｈ）、複数の立体構造、おそらくＥ／Ｚ混合物。
【０３１８】
化合物３：（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは実施例１に記載の通りに調製した。
【０３１９】
化合物４：３−メトキシ−２−メチル−安息香酸（２，２−ジメチル−プロピリデン）−ヒドラジド（１０．８４ｇ、４３．３１ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下に保持した、乾燥した１Ｌの丸底フラスコ内に負荷した。３５０ｍＬの無水塩化メチレンをカテーテルにより加えた。フラスコを氷浴中で約５℃まで冷却した。（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジン（１７．４ｇ、６５ｍｍｏｌ）をシリンジにより加えた。数分以内に最初の明るい混合物は暗い透明な黄色に変化し、約５℃の窒素下で攪拌を続けた。４時間後、ＴＬＣは完全な反応を示した。約２５ｍＬのメタノールを穏やかな混合で加えることにより、反応を停止させた。暗い色は散逸した。溶液を濃縮し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）で希釈した。相を分離し、水層を酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を塩水で１回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、デカントし、濃縮し、静置により結晶化した暗い黄色の油を得た（１３．６６ｇ、７２．４％の収率）。未精製材料は、おそらくプソイドエフェドリンである不溶性の粉状残渣を除去する一方、４：１ヘキサン：酢酸エチルから結晶化した。１回の結晶化の後、純化された材料は、Ｍｏｓｈｅｒ分析の決定によりＲ−異性体を支持する、約８０％のｅｅを示した。３回の結晶化の後、６．６５ｇの（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド（３５．２％）を固体結晶として回収したが、ｅｅのさらなる改善はみられなかった。Ｒｆ＝０．３８（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．２２（ｔ、１Ｈ）、７．１１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．９５（ｄ、１Ｈ）、６．１５（ｍ、１Ｈ）、５．２（ｄ、１Ｈ）、５．１５（ｄ、１Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、２．８０（ｄ、１Ｈ）、２．５０（ｄｍ、１Ｈ）、２．３３（ｓ、３Ｈ）、２．２（ｄｔ、１Ｈ）、１．０８（ｓ、９Ｈ）。
【０３２０】
化合物５（タイトル化合物）：（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド（１００ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−（＋）−アルファ−メチル−アルファ−（トリフルオロメチル）−フェニルアセチル塩化物（１０４ｍｇ、０．４１３ｍｍｏｌ）をバイアル内で１．５ｍＬの塩化メチレンに溶解した。約０．５ｍＬのＫ２ＣＯ３水溶液（９５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温にて一夜攪拌し、ＴＬＣでモニターした。相を分離し、操作の補助の必要性に応じてさらなる塩化メチレンおよび／または水を加えた。塩化メチレン層をＭｇＳＯ４上またはＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去し、油性の固体としての未精製産物を得た。この残渣を、結晶化が始まるとすぐにヘキサン／エーテルにより粉砕した。結晶化をさらに妨害することなく進行させた。母液からの分離により、Ｘ線結晶構造を得られたものから８３ｍｇ（１６．４％）の結晶性（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メトキシ−２−フェニル−プロピオニル）−ヒドラジドが得られた。Ｍｐ＝１２８−１２９℃；［α］２５５８９＋６６．４°（ｃ２．００、ＣＨ３ＯＨ）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．５（ｄ、２Ｈ）、７．２−７．３（ｍ、４Ｈ）、７．０７（ｍ、１Ｈ）、６．９（ｄ、１Ｈ）、６．６＋６．２（ｂｒ、１Ｈ）、５．２（ｄ、１Ｈ）、５．１（ｄ、１Ｈ）、４．８（１Ｈ、ｂｒ）、３．８５（ｓ、３Ｈ）、３．８（ｓ、３Ｈ）、２．５５（ｂｒ、１Ｈ）、２．３５（ｂｒ、２Ｈ）、１．５（３Ｈ）、１．０５（ｂｒ  ｓ、９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１６８．１、１５８．３、１３８．７、１３４．０、１２９．４、１２８．０、１２６．５、１２６．４、１２６．３、１２４．９、１２２．１、１１８．０、１１７．０、１１２．２、５７．３、５５．７、３５．８、３２．０、２８．１、１２．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚＣ２７Ｈ３４Ｆ３Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：５０７．２４７１、測定値：５０７．２４６３、ｍ／ｚＣ２７Ｈ３３Ｆ３Ｎ２ＮａＯ４［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：５２９．２２９０、測定値：５２９．２２８４。Ｃ２７Ｈ３３Ｆ３Ｎ２Ｏ４についての分析的計算値：Ｃ、６４．０２；Ｈ、６．５７；Ｆ、１１．２５；Ｎ、５．５３；Ｏ、１２．６３。測定値：Ｃ、６３．８７；Ｈ、６．７１；Ｎ、５．５２。
【０３２１】
実施例５０における不斉アリル化反応の立体化学的経路を決定するため、（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メトキシ−２−フェニル−プロピオニル）−ヒドラジドのＸ線結晶構造を決定した。この実験は、Ｒで表されるｔｅｒｔ−ブチル基およびｎ−プロピル基に関連する炭素の無水の立体配置を確立した。
【０３２２】
2014193875.tif 000067
（Ｒ）−３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド
2014193875.tif 000068
【０３２３】
化合物１：（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドは実施例５０に記載された通りに調製した。
【０３２４】
化合物２：（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド（３．０５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解した。木炭上のパラジウム（１％、２４０ｍｇ）を注意深く加え、混合物をＰａｒｒ水素添加装置で２．５時間、開始圧力５５ｐｓｉにて振とうした。圧力の低下を反応の進行の測定としてモニターし、１．５時間後に水素の取り込みが停止した。混合物はセライトパッドを通して濾過し、溶媒を真空下で除去した。数種の溶媒を用いたＴＬＣによる分析は２つのヒドラジドスポットの区別においてほとんど成功しなかったが、３：１ヘキサン：酢酸エチル（Ｒｆ＝０．２８）が辛うじて成功であった。未精製産物を２：１ペンタン：ヘキサンから２回結晶化し、＞０．６ｇの（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジドを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５（ｔ、１Ｈ）、６．７９（ｄ、１Ｈ）、６．７６（ｄ、１Ｈ）、３．７（ｓ、３Ｈ）、２．３７（ｍ、１Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、１．７−１．１（ｍ、４Ｈ）、０．９０（ｓ、９Ｈ）、０．８２（ｔ、３Ｈ）。
【０３２５】
化合物３（タイトル化合物）：（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−ヒドラジド（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）および３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル塩化物（９０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を１ｍＬの塩化メチレンに溶解した。１．５当量の約２５％Ｋ２ＣＯ３溶液を加え、反応混合物を室温で攪拌し、ＴＬＣによりモニターした。完了に従って相を分離し、操作の補助の必要性に応じてさらなるＣＨ２Ｃｌ２および／または水を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２相をＭｇＳＯ４またはＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空中で除去して油性の固体を得た。これを１：１ヘキサン：エーテルにより粉砕し、空気中で乾燥させて（Ｒ）−３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドを得た。Ｒｆ＝０．２９（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．１（ｔ、１Ｈ）、７．０（ｓ、ＮＨ  １Ｈ）、６．９（ｄ、１Ｈ）、６．７（ｓ、２Ｈ）、６．３（ｄ、１Ｈ）、４．７８（ｍ、１Ｈ）、３．９５（ｓ、３Ｈ）、３．８５（２ｓ、６Ｈ）、２．２（ｓ、３Ｈ）、２．０５（ｍ、１Ｈ）、１．９５（ｓ、３Ｈ）、１．８（ｍ、１Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、１．２＋１．１＋１．０５（３ｓ、９Ｈ）、１．０５（ｍ、３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２７Ｈ３９Ｎ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４７１．２８５９、測定値：４７１．２８５０、Ｃ２７Ｈ３８ＮａＮ２Ｏ５［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４９３．２６７０、測定値：４９３．２６７８。
【０３２６】
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（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド
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【０３２７】
化合物１：カルバン酸ベンジルは市販されている。
【０３２８】
化合物２：カルバン酸ベンジル（２５ｇ、１５０．４４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、マグネチックスターラーを備えた丸底フラスコ内で２００ｍＬのエタノールに溶解した。シクロヘキサンカルバルデヒド（１７．７ｇ、１５８ｍｍｏｌ）および酢酸（１ｍＬ）を溶液に加え、混合物を室温で８時間攪拌した。得られた固体沈殿を濾過し、ヘキサンで洗浄し、酢酸エチルから結晶化し、開放された実験台で一夜乾燥させ、２８．８７ｇ（７３．７％の収率）の白色結晶であるＮ’−シクロヘキシルメチレン−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを得た。Ｒｆ＝０．６７（１：３ヘキサン：酢酸エチル）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．８（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．４（５Ｈ、ｍ）、７．１（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．３（２Ｈ、ｓ）、２．４（１Ｈ、ｍ）、１．７−１．９（４Ｈ、ｍ）、１．３（６Ｈ、ｍ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１５Ｈ２１Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：２６１．１６０３、測定値：２６１．１５９２、Ｃ１５Ｈ２０ＮａＮ２Ｏ２［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：２８３．１４２６、測定値：２８３．１４１７。
【０３２９】
化合物３：（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは実施例１に記載された通りに調製した。
【０３３０】
化合物４：マグネチックスターラーを備えた丸底フラスコに、窒素雰囲気下で、７５ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ３中の５ｇ（１９．２１ｍｍｏｌ）のＮ’−シクロヘキシルメチレン−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを負荷した。混合物を０℃に冷却し、シリンジを用いて溶液に（Ｓ，Ｓ）−オキサザシロリジン（５．６６ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）を加えた。約３０分後に氷浴を取り除き、反応を室温にて一夜攪拌した。水溶性Ｎａ２ＣＯ３を加え、反応を停止させた。有機層を除き、水相をＣＨＣｌ３で抽出した。合わせた有機相を数回水で逆洗し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、回転式エバポレーターを用いて溶媒を除いた。得られた未精製産物をカラムクロマトグラフィーで精製し、２．３１ｇ、収率３９．８％の、明るい黄色の粘性油である（Ｒ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを得た。Ｒｆ＝０．４１（３：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４（５Ｈ、ｍ）、６．３（１Ｈ、ｂｒ）、５．９（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．２５（２Ｈ、ｓ）、５．２（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．９５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．３５（１Ｈ、ｂｒ  ｄ）、２．１７（１Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．８（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．７５（２Ｈ、ｂｒ  ｄ）、１．５５（１Ｈ、ｂｒ  ｔ）、１．０−１．４（６Ｈ、ｍ）ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１８Ｈ２７Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３０３．２０７２、測定値：３０３．２０７９、Ｃ１８Ｈ２６ＮａＮ２Ｏ２［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：３２５．１８９２、測定値：３２５．１８９９。
【０３３１】
化合物５：（Ｒ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（２．２０ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備えたバイアル内で２ｍＬの塩化メチレンに溶解した。Ｋ２ＣＯ３水溶液（１．５１ｇ、４ｍＬ中に１０．９１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を氷上で冷却した。未希釈の酸塩化物をゆっくりと加え、約１ｍＬの塩化メチレンを追跡およびすすぎに使用した。混合物をＴＬＣによりモニターしながら、最初は氷上で、次に室温にて一夜攪拌した。操作の補助のため、水および／またはＣＨ２Ｃｌ２を反応混合物に加え、有機層を回収した。水層をＣＨ２Ｃｌ２により１回抽出し、有機層を合わせて固体Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、残渣を２：１ヘキサン：エーテルにより粉砕して、２．９３ｇ（９２．７％）の、白色固体としての（Ｒ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを得た。Ｒｆ＝０．３３（３：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．８＋９．６５（０．５Ｈ、ＮＨ，２ｓ）、７．１−７．５（３．５Ｈ、ｍ）、６．９−７．１（５Ｈ、ｍ）、６．０５（０．５Ｈ、ｍ）、５．９（０．５Ｈ、ｍ）、５．２（１Ｈ、ｍ）、５．０（２Ｈ、ｍ）、４．８（１Ｈ、ｍ）、４．３５（１Ｈ、ｍ）、２．３５（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、２．２５（６Ｈ、ｓ）、０．８−２．０（１１Ｈ、ｍ）；ＨＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２７Ｈ３５Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４３５．２６４７、測定値：４３５．２６５９、Ｃ２７Ｈ３４ＮａＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４５７．２４６７、測定値：４５７．２４７０。
【０３３２】
化合物６：（Ｒ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（２．９１ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を約５０ｍＬの氷酢酸中に懸濁した。１０２ｍｇの木炭上の１０％パラジウムを、数ｍＬの酢酸中にスラリーとして加えた。混合物を酢酸で７５ｍＬに希釈し、Ｐａｒｒ水素添加装置で９０分間２０〜３０ｐｓｉにおいて振とうした。懸濁物を２日間静置し、炭素を沈殿させた。上清を０．４５ミクロンのシリンジフィルターを通して再結晶皿へ濾過し、溶媒を蒸発させて２．０６ｇ（１０２％の物質収支）の（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−ヒドラジドを、赤褐色の粘性油として得た。Ｒｆ＝０．２４（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５（１Ｈ、ｓ）、７．０（２Ｈ、ｓ）、４．５５＋３．３５（１Ｈ、２ｔ）、２．４（６Ｈ、ｓ）、０．８−１．９（１５Ｈ、ｍ）、０．９（３Ｈ、ｔ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１９Ｈ３１Ｎ２Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３０３．２４３６、測定値：３０３．２４４１、Ｃ１９Ｈ３０Ｎ２ＮａＯ［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：３２５．２２５６、測定値：３２５．２２６２。
【０３３３】
化合物７（タイトル化合物）：（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−ヒドラジド（０．１４ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備えたバイアル内で１ｍＬの塩化メチレンに溶解した。Ｋ２ＣＯ３水溶液（０．１ｇ、０．６９ｍｍｏｌ、２．７７ｍＬ）を加えた。フラスコを氷上で冷却し、未希釈の酸塩化物を加えた。約０．８ｍＬのさらなる塩化メチレンを追跡およびすすぎに使用した。反応をＴＬＣによりモニターしながら、混合物を最初は氷上で、次に室温にて一夜攪拌した。操作の補助のため、水およびＣＨ２Ｃｌ２を反応混合物に加え、水層をＣＨ２Ｃｌ２により１回抽出した。有機層を合わせ、固体Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、未精製産物をクロマトグラフィーで精製して、１４３ｍｇ（収率６７．９％）の（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジドを、赤褐色の粘性油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．４（１Ｈ、２ｓ）、７．０−７．２５（５Ｈ、ｍ）、６．２（１Ｈ、ｍ）、４．４５（１Ｈ、ｍ）、３．８（３Ｈ、ｓ）、２．３５（６Ｈ、ｓ）、２．０−２．２（２Ｈ、ｍ）、０．９−２．０（１５Ｈ、ｍ）、０．９（６Ｈ、ｍ）。
【０３３４】
実施例５３ないし５５は、実施例５２に記載される方法論を用いて調製した。パーセント鏡像異性体過剰率（ｅｅ）はキラルＨＰＬＣにより決定された。
2014193875.tif 000071
【０３３５】
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（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド
2014193875.tif 000073
【０３３６】
化合物１：Ｎ’−シクロヘキシルメチレン−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例５２に記載された通りに調製した。
【０３３７】
化合物２：（Ｒ，Ｒ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは、Ｒ，Ｒ−プソイドエフェドリンを用いて、実施例１に記載の方法論により調製した。
【０３３８】
化合物３：（Ｓ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例５２に記載の方法論を用いて、収率６９％の明るい黄色の粘性油として調製した。分析データ：Ｒｆ＝０．４１（３：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．６５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、７．４（５Ｈ、ｍ）、５．８５（１Ｈ、ｂｒ）、５．１（４Ｈ、ｍ）、４．２（１Ｈ、ｓ）、２．７（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．１（１Ｈ、ｂｒ  ｍ）、２．０（１Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．８（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．６５（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．４５（１Ｈ、ｂｒ  ｍ）１．０−１．２（６Ｈ、ｂｒ  ｍ）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４（５Ｈ、ｍ）、６．３（１Ｈ、ｂｒ）、５．９（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．２５（２Ｈ、ｓ）、５．２（２Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．９５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、２．３５（１Ｈ、ｂｒ  ｄ）、２．１７（１Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．８（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、１．７５（２Ｈ、ｂｒ  ｄ）、１．５５（１Ｈ、ｂｒ  ｔ）、１．０−１．４（６Ｈ、ｍ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１８Ｈ２７Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３０３．２０７２、測定値：３０３．２０５７、Ｃ１８Ｈ２６ＮａＮ２Ｏ２［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：３２５．１８９２、測定値：３２５．１８７３。
【０３３９】
化合物４：（Ｓ）−Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、収率８４．８％の白色固体として、実施例５２に記載の方法論を用いて調製した。分析データ：ｅｅ＞８０％、Ｒｆ＝０．３４（３：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．８＋９．６５（０．５Ｈ、ＮＨ、２ｓ）、７．１−７．５（３．５Ｈ、ｍ）、６．９−７．１（５Ｈ、ｍ）、６．０５（０．５Ｈ、ｍ）、５．９（０．５Ｈ、ｍ）、５．２（１Ｈ、ｍ）、５．０（２Ｈ、ｍ）、４．８（１Ｈ、ｍ）、４．３５（１Ｈ、ｍ）、２．３５（２Ｈ、ｂｒ  ｍ）、２．２５（６Ｈ、ｓ）、０．８−２．０（１１Ｈ、ｍ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２７Ｈ３５Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４３５．２６４７、測定値：４３５．２６５５、Ｃ２７Ｈ３４ＮａＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４５７．２４６７、測定値：４５７．２４６９。
【０３４０】
化合物５：（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−ヒドラジドは、実施例５２に記載の方法論を用いて調製した。分析データ：Ｒｆ＝０．２４（２：１ヘキサン：酢酸エチル）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．０５＋６．９５（１Ｈ、ｓ）、７．０＋６．８５（２Ｈ、２ｓ）、４．５５＋４．０５（２Ｈ、２ｓ）、４．３＋３．１５（１Ｈ、２ｔ）、２．３（６Ｈ、２ｓ）、０．６−１．９（１５Ｈ、ｍ）、０．９＋０．８（３Ｈ、２ｔ）；（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５（１Ｈ、ｓ）、７．０（２Ｈ、ｓ）、４．５５＋３．３５（１Ｈ、２ｔ）、２．４（６Ｈ、ｓ）、０．８−１．９（１５Ｈ、ｍ）、０．９（３Ｈ、ｔ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１９Ｈ３１Ｎ２Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３０３．２４３６、測定値：３０３．２４４０、Ｃ１９Ｈ３０Ｎ２ＮａＯ［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：３２５．２２５６、測定値：３２５．２２６０。
【０３４１】
化合物６（タイトル化合物）：（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジドは、実施例５２に記載の方法論を用い、３７％のｅｅにおいて調製した。
【０３４２】
実施例５７ないし５９は、実施例５６に記載される方法論を用いて調製した。パーセント鏡像異性体過剰率（ｅｅ）はキラルＨＰＬＣにより決定された。表３は実施例５７ないし５９の分析データを提供する。
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【０３４３】
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（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド
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【０３４４】
化合物１：３−メトキシ−２−メチル−安息香酸ヒドラジドは、実施例５０に記載された通りに調製した。
【０３４５】
化合物２：１０．０ｇ（５５．５ｍｍｏｌ）の３−メトキシ−２−メチル−安息香酸ヒドラジドを、２００ｍＬの無水エチルアルコールに溶解した。シクロヘキサンカルバルデヒド（６．８５ｇ、６１．０ｍｍｏｌ）および氷酢酸（３ｍＬ）を加え、反応混合物をＴＬＣでモニターしながら１８時間攪拌した。沈殿物を濾過により回収し、ヘキサンで洗浄した。産物３−メトキシ−２−メチル−安息香酸シクロヘキシルメチレン−ヒドラジドを白色固体として得た（９．３６ｇ、収率６１％）：Ｒｆ＝０．２０（３：１ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１１．１７（ｓ、１Ｈ）、７．９１（ｓ、１Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、１．９２−１．６２（ｍ、５Ｈ）、１．３８−１．１４（ｍ、６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１６Ｈ２３Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：２７５．１７６０、測定値：２７５．１７５２、Ｃ１６Ｈ２２Ｎ２ＮａＯ２［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：２９７．１５７９、測定値：２９７．１５６８。
【０３４６】
化合物３：（Ｓ，Ｓ）−２−アリル−２−クロロ−３，４−ジメチル−５−フェニル−［１，３，２］オキサザシロリジンは、実施例１に記載された通りに調製した。
【０３４７】
化合物４：３−メトキシ−２−メチル−安息香酸シクロヘキシルメチレン−ヒドラジド（２．８ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）および無水ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）を、スターラーおよび窒素口を備えた丸底フラスコへ加えた。（Ｓ，Ｓ）−オキサザシロリジン（３．２８ｇ、１２．２０ｍｍｏｌ）を液滴として加えた。反応を５０℃で６時間、その後室温で１８時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）を加え、反応を停止させた。ＣＨＣｌ３層を分離し、水層をＣＨＣｌ３（２ｘ３０ｍＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３溶液を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させ、未精製混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドを白色固体（１．７４ｇ、収率５４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ９．６９（ｓ、１Ｈ）、７．２４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．９２（ｍ、１Ｈ）、５．１５（ｄｄ、Ｊ＝１．６、１７．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０８（ｄｄ，Ｊ＝１．６、１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９１（ｄｄ，Ｊ＝３．６、６．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３（ｓ、３Ｈ）、２．７５（ｍ、１Ｈ）、２．２６−２．２２（ｍ、１Ｈ）、２．１６（ｓ、３Ｈ）、２．１４−２．０８（ｍ、１Ｈ）、１．８１−１．０８（ｍ、１１Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ１９Ｈ２９Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：３１７．２２２９、測定値：３１７．２２２１、ｍ／ｚ、Ｃ１９Ｈ２９Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｎａ］＋Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２ＮａＯ２についての計算値：３３９．２０４８、測定値：３３９．２０３７。
【０３４８】
化合物５（タイトル化合物）：（Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−安息香酸Ｎ’−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド（１．３ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（５ｍＬ）へ、Ｋ２ＣＯ３（２．２７ｇ、１６．４４ｍｍｏｌ）Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）、および最後に３，５−ジメチルベンゾイル塩化物（７２７ｍｇ、４．３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応を室温で２４時間攪拌した。操作の補助のため、さらなるＣＨ２Ｃｌ２およびＨ２Ｏを加え、ＣＨ２Ｃｌ２層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２溶液を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドを白色固体（１．４５ｇ、収率７８％）として得た。Ｒｆ＝０．２１（３：１ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．４７＋１０．３９（２ｓ、１Ｈ）、７．２０−７．０１（ｍ、５Ｈ）、６．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２−５．８９（ｍ、１Ｈ）、５．１８（ｄｄ、１Ｈ）、５．０２（ｄｄ、１Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、３．７９（ｓ、３Ｈ）、２．４４−２．３４（ｍ、２Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、２．０２−１．５３（ｍ、８Ｈ）、１．２６−１．０２（ｍ、３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２８Ｈ３７Ｎ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４４９．２８０４、測定値：４４９．２７９３、Ｃ２８Ｈ３６Ｎ２ＮａＯ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４７１．２６２４、測定値：４７１．２６１５。
【０３４９】
2014193875.tif 000078
（Ｒ）−４−メトキシ−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド
【０３５０】
合成
（Ｒ）−４−メトキシ−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−シクロヘキシル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドは、実施例６０に記載の方法論を用い、収率７１％で調製した。分析データ：Ｒｆ＝０．１４（１：３ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．４６＋１０．３８（２ｓ、１Ｈ）、７．２１−６．４２（ｍ、５Ｈ）、６．１６−５．９３（ｍ、１Ｈ）、５．２３（ｄｄ、１Ｈ）、５．０１（ｄｄ、１Ｈ）、４．４５（ｍ、１Ｈ）、３．７９（ｓ、３Ｈ）、３．７７（ｓ、６Ｈ）、２．４２−２．２８（ｍ、２Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、１．８８−１．０５（ｍ、１４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２９Ｈ３８Ｎ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４９５．２８５９、測定値：４９５．２８４８、Ｃ２９Ｈ３８Ｎ２ＮａＯ５［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：５１７．２６７８、測定値：５１７．２６６７。
【０３５１】
2014193875.tif 000079
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−Ｎ−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド
2014193875.tif 000080
【０３５２】
化合物１：４−エチル−安息香酸ヒドラジドは市販されている。
【０３５３】
化合物２：４−エチル−安息香酸ヒドラジド（１０ｇ、６０．９ｍｍｏｌ）を３２ｍＬのメタノールに溶解した。酢酸（１ｍＬ）を加え、混合物を還流し、ヒドロシンナムアルデヒド（５．７７ｇ、６７ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。反応混合物を１０時間還流し、ＴＬＣによりモニターした。沈殿物を濾過により回収し、ヘキサンで洗浄した。４−エチル−安息香酸（３−フェニル−プロピリデン）−ヒドラジドを、白色固体として得た（９．３４ｇ、収率５４．７％）。Ｒｆ＝０．３６（１：１ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．８７（ｓ、１Ｈ）、７．７２−７．２４（ｍ、１０Ｈ）、２．８７（ｔ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．７９−２．５７（ｍ、４Ｈ）、１．２４（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ、３Ｈ）。
【０３５４】
化合物３：（Ｒ）−（＋）−メチルρ−トリルスルホキシド（０．５ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムトリフェニル−ジフルオロケイ酸塩（ＴＢＡＴ）（０．１２ｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）を、窒素下およびマグネチックスターラーで攪拌しながら、０．０３８ｍＬの２−メチル−２−ブテンおよび２．４ｍＬの無水塩化メチレンに溶解した。アリルトリクロロシラン（０．２３ｍＬ、１．６１ｍｍｏｌ）を−７８℃で加え、反応を１５分間攪拌した。４−エチル安息香酸（１−メチル３−フェニル−プロピリデン）ヒドラジド（０．３ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を１１．６ｍＬの無水塩化メチレンに溶解し、３０分間にわたって反応に加えた。ＴＬＣでモニターしながら、反応混合物を窒素下で−７８℃から−７０℃に保持して５時間攪拌した。その後塩水を加え、混合物を室温に戻した。有機層を除去し、３つの塩化メチレン抽出物を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、未精製混合物を２：１および１：１ペンタン：酢酸エチルの段階勾配を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。精製した（Ｒ）−４−エチル−安息香酸Ｎ’−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドを透明な油として得た（０．１４５ｇ、収率５７．６％、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤＨ上のキラルＨＰＬＣによるｅｅ５７．６％）。Ｒｆ＝０．５０（１：１ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．６４−７．１３（ｍ、９Ｈ）、５．９１（ｍ、１Ｈ）、５．１５（ｔ，Ｊ＝２８．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．７６−２．６３（ｍ、４Ｈ）、２．３８−２．２４（ｍ、２Ｈ）、１．８８−１．７４（ｍ、２Ｈ）、１．２３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、３Ｈ）。
【０３５５】
化合物４（タイトル化合物）：（Ｒ）−４−エチル−安息香酸−Ｎ’−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジド（０．１ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、０．４７ｍＬの塩化メチレンにマグネチックスターラーで攪拌しながら溶解した。０．７ｍＬの脱イオン水中の炭酸水素カリウム（０．０６４ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）および３，５−ジメチルベンゾイル塩化物（０．０６３ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。反応混合物を最初は氷上で、次に室温まで温め、週末の間ＴＬＣでモニターしながら攪拌した。有機層を除去し、水層を塩化メチレンで３回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、未精製混合物を２：１ヘキサン：酢酸エチルを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。精製した（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−Ｎ−（１−フェネチル−ブト−３−エニル）−ヒドラジドを黄色の油として得た（０．１０２ｇ、収率７２．９％、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤＨ上のキラルＨＰＬＣによるｅｅ５１．２％）。Ｒｆ＝０．３４（２：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．８−７．０２（ｍ、１２Ｈ）、５．９９（ｂｒ、１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝２４．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．７３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、２．３１（ｓ、６Ｈ）、２．１２−２．０３（ｍ、２Ｈ）、１．８７（ｓ、１Ｈ）、１．６１（ｓ、２Ｈ）、１．２９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ３０Ｈ３５Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４５５．２６９９、測定値：４５５．２６８５、Ｃ３０Ｈ３４Ｎ２ＮａＯ２［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４７７．２５１８、測定値：４７７．２５０５。
【０３５６】
2014193875.tif 000081
（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル
2014193875.tif 000082
【０３５７】
化合物１：化合物１は実施例３１に記載の通りに調製した。
【０３５８】
化合物２（タイトル化合物）：（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブト−３−エニル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル（２００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液へ、ジメチルスルフィドボラン（ＴＨＦ中で２Ｍ、１２５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を０℃において加えた。混合物を室温で１６時間攪拌した。余剰のボランおよびＴＨＦを真空中で除去し、さらなるＴＨＦ（３ｍＬ）、続いてＨ２Ｏ２（６１マイクロリットル、０．５４ｍｍｏｌ）および３Ｎ  ＮａＯＨ（９０マイクロリットル、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。５０〜５５℃において１時間攪拌した後、さらに水を加え、混合物をエーテルで抽出し、エーテル層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、（Ｓ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルを白色固体（１２８ｍｇ、収率６１％）として得た。Ｒｆ＝０．３０（１：１ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７１＋９．６３（２ｓ、１Ｈ）、７．４４−６．８８（ｍ、８Ｈ）、５．０６（ｄｄ、Ｊ＝３．６、１２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７９（ｄｄ、Ｊ＝１２．４、２５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．４７（ｍ、２Ｈ）、２．２７（ｓ、６Ｈ）、１．８６−１．２１（ｍ、４Ｈ）、１．０１（ｓ、９Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、Ｃ２５Ｈ３５Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋についての計算値：４２７．２５９７、測定値：４２７．２５８７、Ｃ２５Ｈ３４Ｎ２ＮａＯ４［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値：４４９．２４１６、測定値：４４９．２４０７。
【０３５９】
2014193875.tif 000083
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステル
【０３６０】
合成
（Ｒ）−Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジンカルボン酸ベンジルエステルは、実施例６３に記載の方法論を用い、＞９９％のｅｅにおいて調製した。
【０３６１】
実施例６５
この実施例は、本発明の化合物の鏡像異性体過剰率（ｅｅ）の決定に使用される分析法を説明する。
【０３６２】
図２Ａ〜Ｃに示すように、ｒａｃ−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド（実施例１６）、（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジドおよび（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジド（実施例４１）のためのキラルＨＰＬＣクロマトグラムは、鏡像異性体過剰率の決定に使用される方法を説明する。ｒａｃ−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジドは、５０％のＲ−異性体（約１６分におけるピーク１）および５０％のＳ−異性体（約１９分におけるピーク２）を含む。（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジドの鏡像異性体の豊富なサンプルは、＞９９％のｅｅにより、Ｓ−異性体を実質的に含まない。（Ｓ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２，６−ジクロロ−ベンゾイル）−ヒドラジドの鏡像異性体の豊富なサンプルは、＞９９％のｅｅにより、Ｒ−異性体を実質的に含まない。この実験で、データは２．０ｍＬ／分のフローレートにおいて、４．６ｍｍＸ２５ｃｍのＲｅｇｉｓ  Ｒｅｘｃｈｒｏｍ  （Ｓ，  Ｓ）  ＵＬＭＯカラムを用い、ヘキサン中の２％メタノールを溶媒として用い、２０μＬの注入量で作成された。式２または３で表されるその他の化合物の鏡像異性体過剰率は、他に記載のない限り同様の様式において決定された。
【０３６３】
実施例６６
この実施例は、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を例証する。
【０３６４】
遺伝子発現カセット
ＧＡＬ４  ＤＢＤ（ｌ−１４７）−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）／ＶＰ１６ＡＤ−βＲＸＲＥＦ−ＬｍＵＳＰＥＦ：トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＢＤ  １−１４７」；配列番号２）へ融合し、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（「ＰＧＫ」；配列番号３）の制御下に配置した。ヒトＲＸＲβ（「ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ」；配列番号４のヌクレオチド１−４６５）由来のＥＦドメインのヘリックス１から８、およびトノサマバッタウルトラスピラクルタンパク質（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号５のヌクレオチド４０３−６３０）のＥＦドメインのへリックス９から１２を、ＶＰ１６由来のトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号６）へ融合し、伸長因子−１αプロモーター（「ＥＦ−１α」；配列番号７）の制御下に配置した。５つのコンセンサスＧＡＬ４反応エレメント結合サイト（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号８を含むＧＡＬ４ＲＥの５コピーを含む）を、合成ＴＡＴＡ最小プロモーター（配列番号９）へ融合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（拝謁番号１０）の上流に配置した。
【０３６５】
安定化細胞株
ＧＡＬ４ＤＢＤ（１−１４７）ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）およびＶＰ１６ＡＤ  βＲＸＲＥＦ−ＬｍＵＳＰＥＦに対する転写カセットを、ＣＨＯ細胞へ一過性にトランスフェクトした。これらは単一のプラスミド上で、広範に活性のある細胞プロモーター（それぞれＰＧＫおよびＥＦ−１α）の制御下にある。安定的にトランスフェクトされた細胞は、ゼオシン抵抗性によって選択した。個々に単離されたＣＨＯ細胞クローンに、ＧＡＬ４ＲＥ−ルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ  Ｌｕｃ）を一過性にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを用いて２７〜６３クローンを選択した。
【０３６６】
キラルジアシルヒドラジンリガンドによる処理
細胞をトリプシン処理し、１ｍＬあたり２．５ｘ１０４の濃度に希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ２下で３７℃において２４時間培養した。リガンド保存液はＤＭＳＯ中で調製し、全ての処理のために３００倍希釈した。用量反応試験は、３３μＭないし０．０１μＭの範囲の８濃度で構成された。
【０３６７】
レポーター遺伝子アッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現は、ＰｒｏｍｅｇａからのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｅ２６５０）を用い、細胞の処理から４８時間後に測定した。発光はＤｙｎｅｘ  ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
【０３６８】
安定化細胞株
Ｓｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：７９９９−８０４  （１９９８）に記載のＣＶＢＥおよび６ＸＥｃＲＥを含む、安定的に形質転換された細胞の集団を得た。ＨＥＫ−２９３細胞とも呼ばれるヒト２９３腎臓細胞へ、最初にスイッチコンストラクトＣＶＢＥ、次に６ＸＥｃＲＥ  ＬａｃＺレポーターコンストラクトをコードするレトロウィルスベクターを連続的に感染させた。スイッチコンストラクトは、インフレームでＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＶＢＥ）の下流へ挿入された、カイコＥｃＲ（ＢＥ）（Ｉａｔｒｏｕ）由来のアミノ酸２６〜５４６のコード配列を含んだ。合成ＡＴＧ開始コドンを、サイトメガロウィルス（ＣＶＢＥ）前初期プロモーターの制御下で、末端反復配列（ＬＴＲ）に隣接して配置した。レポーターコンストラクトは、ＬａｃＺの上流に配置され、両端にＬＴＲ配列が隣接する、６コピーのエクジソン反応エレメント（ＥｃＲＥ）結合部位（６ＸＥｃＲＥ）を含んだ。
【０３６９】
個々のクローンを分離するため希釈クローニングを用いた。クローンは４５０μｇ／ｍＬのＧ４１８および１００ｎｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選択した。個々のクローンは、試験リガンドの存在下および非存在下でのそれらの反応に基づいて評価した。スクリーニングおよびＳＡＲの目的のため、クローンＺ３を選択した。
【０３７０】
ＣＶＢＥおよび６ＸＥｃＲＥ  ＬａｃＺにより安定的に形質転換されたヒト２９３腎臓細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ２６１４０−０８７）、４５０ｇｕｍ  Ｇ４１８（Ｍｅｄｉａｔｅｓ，  ３０−２３４−ＣＲ）、および１００ｇｎｏｍｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ，  Ｐ−７２５５）を含む最小必須培地（Ｍｅｄｉａｔｅｓ，  １０−０１０−ＣＶ）中で、３７℃において５％ＣＯ２を含む雰囲気中で維持し、それらが７５％コンフルエンスに達したときに継代培養した。
【０３７１】
キラルジアシルヒドラジンリガンドによる処理
Ｚ３細胞を９６ウェル細胞培養プレートへ１ウェルあたり２．５ｘ１０３の濃度でまき、５％ＣＯ２下で３７℃において２４時間培養した。リガンドの保存液はＤＭＳＯ中で調製した。リガンドの保存液を培地で１００倍希釈し、この希釈されたリガンド溶液（３３μＭ）の５０μＬを細胞に加えた。ＤＭＳＯの最終濃度はコントロール群および処理群の両方で０．０３％に維持した。
【０３７２】
レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子発現は細胞の処理後４８時間に評価し、β−ガラクトシダーゼ活性をＴｒｏｐｉｘ  （ＧＳＹ１０００）のＧａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（商標）生物発光レポーター遺伝子アッセイシステムを用いて測定した。誘導倍率活性は、リガンド処理細胞の相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞のＲＬＵで割ることにより算出した。発光はＤｙｎｅｘ  ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
【０３７３】
スイッチコンストラクトＣＶＢＥ、およびレポーターコンストラクト６ＸＥｃＲＥ  ＬａｃＺの模式図。両コンストラクトに隣接するものは末端反復配列であり、Ｇ４１８およびピューロマイシンは選択マーカーであり、ＣＭＶはサイトメガロウィルスプロモーターであり、ＶＢＥはＶＰ１６トランス活性化ドメインの下流に挿入したカイコＥｃＲの２６−５４６のアミノ酸に対するコード配列であり、６ＸＥｃＲＥは６コピーのエクジソン反応エレメントであり、ｌａｃＺはレポーター酵素のβ‐ガラクトシダーゼをコードする。
【０３７４】
遺伝子発現カセット
ＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）／ＶＰ１６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＥ：トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１）をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＢＤ  １−１４７」；配列番号２）へ融合し、ｐＭベクター（ＰＴ３１１９−５，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のＳＶ４０ｅプロモーターの制御下に配置した。マウスＲＸＲ（「ＭｍＲＸＲ−ＤＥ」；配列番号１１）由来のＤおよびＥドメインをＶＰ１６（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号６）由来のトランス活性化ドメインへ融合し、ｐＶＰ１６ベクター（ＰＴ３１２７−５，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のＳＶ４０ｅプロモーターの制御下に配置した。
【０３７５】
安定化細胞株
ＣＨＯ細胞に、ＳＶ４０ｅプロモーターにより制御されるＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）およびＶＰ  １６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＥの転写カセットを一過性にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを用い、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。個々に単離されたＣＨＯ細胞株に、ＧＡＬ４  ＲＥ−ルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ−Ｌｕｃ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）を一過性にトランスフェクトした。ゼオシンを用い、１３Ｂ３クローンを選択した。
【０３７６】
キラルジアシルヒドラジンリガンドによる処理
細胞をトリプシン処理し、１ｍＬあたり２．５ｘ１０４細胞の濃度に希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル細胞プレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ２下において３７℃で２４時間培養した。リガンド保存液はＤＭＳＯ中で調製し、全ての処理のために３００倍希釈した。用量反応試験は、３３μＭないし０．０１μＭの範囲の８濃度で構成された。
【０３７７】
遺伝子スイッチアッセイ−工学的ＥｃＲ：ＵＳＰ／ＰＸＲシステム
細胞の遺伝子スイッチアッセイは、以下のコンストラクトをマウス胚性繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）へ一過性にトランスフェクトすることにより行った。トウヒシントメハマキのＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン、あるいはそれらのＶ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ／Ｅ２７４Ｖ変異体をＧＡＬ４−ＤＢＤへ融合し、ｐＢＩＮＤベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン、米国）のＣＭＶプロモーターの制御下に配置した。示されるＥｃＲのＤＥＦドメインは、５’および３’末端における２０〜２５ｎｔ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて増幅された。制限酵素部位ＥｃｏＲ  Ｉ／ＢａｍＨ  ＩおよびＸｂａ  Ｉを、５’および３’プライマーそれぞれに加えた。ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、ｐＢＩＮＤベクターへクローン化した。ｐＢＩＮＤベクターへクローン化したＥｃＲ  ＬＢＤを、シークエンシングにより検証した。ＶＰ１６−ＡＤへ融合し、ＳＶ４０ｅプロモーターの制御下に配置した、ヒトＲＸＲβおよびトノサマバッタＲＸＲのキメラＲＸＲは、以前に記述されたように構築した（Ｋｕｍａｒ  Ｐ  ＆  Ｋａｔａｋａｍ  Ａ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ  Ｊ，  ｅｄｓ，  ｐｐ．  ６４３−６５１  （２００７），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）。誘導性ルシフェラーゼレポータープラスミドのｐＦＲＬｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ラホヤ、カリフォルニア、米国）は、５コピーのＧＡＬ４反応エレメントおよび合成最小プロモーターを含む。
【０３７８】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補ったダルベッコ変法イーグル培地（両方ともＭｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、マナッサス、バージニアから得た）中で、３７℃、５％ＣＯ２において維持した。細胞を９６ウェルプレートへ、５０μＬの増殖培地中に２，５００細胞／ウェルの濃度でまいた。次の日、細胞を最初に、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ；コントロール）またはリガンドを含むＤＭＳＯ溶液を含んだ、３５μＬの無血清ＤＭＥＭで処理した。その後細胞へ、１ウェルあたり１５μｌの、０．０４μｇのＥｃＲコンストラクト、０．０４μｇのＲＸＲコンストラクト、および０．１６μｇのルシフェラーゼレポーターコンストラクトを含むＤＭＥＭを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、バレンシア、カリフォルニア、米国）を用い、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。リガンドは、コントロールおよび処理ウェルの両方で０．０１〜３３μＭの８用量において、ＤＭＳＯの最終濃度０．３３％で試験された。処理およびトランスフェクション培養の４８時間後に、細胞のルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン、米国）を用い、製造者の指示に従ってアッセイした。ＥＣ５０値は、最小限に二重測定した。
【０３７９】
レポーター遺伝子アッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現は、ＰｒｏｍｅｇａからのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｅ２６５０）を用い、細胞の処理から４８時間後に測定した。発光はＤｙｎｅｘ  ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーターを用い、室温で検出した。
【０３８０】
各アッセイは２つの異なるウェル内で行い、２つの値を平均した。誘導倍率は、リガンド処理細胞の相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞のＲＬＵで割ることにより算出した。ＥＣ５０は、３−パラメーターロジスティックモデルを用いた用量反応データから算出した。相対的Ｍａｘ  ＦＩは、いずれかの濃度において観察されるＧＳ（商標）−Ｅリガンド（３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）の最大誘導倍率に相対的な、いずれかの濃度において観察される試験リガンド（本発明の実施形態）の最大誘導倍率として決定した。
【０３８１】
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【０３８２】
実施例６７
この実施例は、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を例証する。本発明のキラルジアシルヒドラジンリガンドによるレポーター酵素のｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導は、遺伝子スイッチを含むＣ５７ＢＬ／６マウスモデルシステムにおいて評価した。
【０３８３】
遺伝子発現カセット
トウヒの青虫であるトウヒシントメハマキのＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１）を［Ｖ１０７（ｇｔｔ）→Ｉ１０７（ａｔｔ）およびＹ１２７（ｔａｃ）→Ｅ１２７（ｇａｇ）］に変異させ、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＢＤ  １−１４７」；配列番号２）へ融合した。ヒトＲＸＲβ（「ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ」；配列番号４のヌクレオチド１−４６５）由来のＥＦドメインのヘリックス１から８、およびトノサマバッタウルトラスピラクルタンパク質（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号５のヌクレオチド４０３−６３０）のＥＦドメインのへリックス９から１２を、６ｘＧＡＬ４反応エレメント（配列番号１３）およびトランスサイレチンプロモーター（配列番号１４）の制御下に配置されるレポーター遺伝子であるヒト分泌型アルカリホスファターゼ（「ＳＥＡＰ」、配列番号１２）を制御する、ＶＰ１６由来のトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号６）へ融合した。遺伝子スイッチの各エレメントは別々のプラスミド上に存在した。受容体発現は、ＣＭＶプロモーター（配列番号１５）の制御下にあった。誘導は、リガンド存在下で発現したレポータータンパク質量で評価した。
【０３８４】
遺伝子スイッチのエレクトロポレーション
マウス血清中のＳＥＡＰ発現は、マウス四頭筋へ遺伝子スイッチをエレクトロポレーションした後に評価した。マウスはケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｍＬ）の混合物２μＬ／ｇにより麻酔した。その後動物の毛を剃り、２ｘ５０μＬ量のポリグルタミン酸（１２ｍｇ／ｍＬ水）中のＤＮＡベクターを筋肉内に注入し、電極伝導性ゲルを適用し、電極キャリバー（１ｃｍｘ１ｃｍ；モデル３８４）を後肢に配置した。筋肉を１秒間隔の２０ｍ秒／パルスで、２００Ｖ／ｃｍ、８回、エレクトロポレーションした。動物がパルスの半分を受けた後、横電場方向を逆にした。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＳｙｓｔｅｍｓのＥＣＭ８３０エレクトロポレーターで行った。
【０３８５】
キラルジアシルヒドラジンリガンドによる処置
幾つかの実験において、マウスは遺伝子スイッチのエレクトロポレーション後３日間、５０μＬのＤＭＳＯ中の２，６μｍｏｌのリガンドを、腹腔内注射（ＩＰ）された。別の実験においては、リガンドの濃度を２６ｎｍｏｌ／５０μＬのＤＭＳＯ／マウスに減少させた。ＳＥＡＰ発現はリガンド投与後２〜１１日評価した。他の実験において、リガンドはげっ歯類用固形試料において投与された。固形試料は、２ｇのリガンドを２０ｍＬのアセトンに溶解し、これをオートクレーブ可能な固形試料であるＰｕｒｉｎａ  ＭｉｌｌｓのＬａｂＤｉｅｔ  ５０１０、１ｋｇに加えることにより調製した。これをＨｏｂａｒｔミキサー中でよく混合し、その後Ｃｒｏｓｓ  Ｂｌｅｎｄミキサー中でさらに１５分間混合した。動物は固形試料を１、２、または３日間自由に摂取した。全ての値は４動物からの平均である。リガンドを加えていないベクター単独により処置された動物からの血清中のバックグラウンドＳＥＡＰは０〜１１ｎｇ／ｍｌ血清であった。
【０３８６】
レポーターアッセイ
マウス血清は、微小ガラスキャピラリー管を用いて後眼窩からの出血を採取した血液を遠心することにより得た。ＳＥＡＰ定量は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｇｒｅａｔ  Ｅｓｃａｐｅケミルミネセンスキットを用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＥＡＰ標準物質との比較により決定した。
【０３８７】
（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド（実施例１）の、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）遺伝子発現誘導に対する相対的なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価するため、１２匹のＣ５７ＢＬ６マウスに以下のベクター；ｐＣＭＶ／ＧＥＶＹ（ＤＥＦ）、ｐＣＭＶ／ＶＰ１６−Ｈｓ−ＬｍＲＸＲおよびｐ６ＸＧＡＬ４ＲＥ−ＴＴＲ−ＳＥＡＰをエレクトロポレーションした。プラスミドｐＣＭＶ／ＧＥＦｙ（ＤＥＦ）は、Ｖ３９０Ｉ／Ｙ４１０Ｅ／Ｅ２７４Ｖ変異を有するトウヒシントメハマキのＥｃＲ由来で、かつ酵母ＧＡＬ４−ＤＢＤ（ａａ  １−１４７）の下流に融合されたＤ、Ｅ、およびＦドメインから構成され、ｐＢＩＮＤベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ウィスコンシン、米国）のＣＭＶプロモーター、および下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下に配置される。ここに示されるＥｃＲのＤＥＦドメインは、５’および３’末端の２０−２５ｎｔ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて増幅した。５’および３’プライマーにはそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を加えた。ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、ｐＢＩＮＤベクター内へクローン化した（図２０）。ｐＣＭＶ／ＶＰ１６−Ｈｓ−ＬｍＲＸＲベクターは、ＶＰ１６活性化ドメインの下流に融合され、かつｐＢＩＮＤベクター内のＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる、ヒトＲＸＲβ（Ｅドメインのへリックス１−８）およびトノサマバッタＲＸＲ（Ｅドメインのへリックス９−１２）由来のキメラＲＸＲを含む（図２１）。誘導性ＳＥＡＰレポーターベクターであるｐ６ｘＧＡＬ４ＲＥ−ＴＴＲ−ＳＥＡＰは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの上流の６コピーのＧａｌ４反応エレメントからなる誘導性プロモーターの制御下に置かれた、ヒト分泌型アルカリフォスファターゼレポーター遺伝子を含む（図２２）。マウス四頭筋へのプラスミドＤＮＡのエレクトロポレーションから３日後、３種のリガンド調製品を、２６ｎｍｏｌ／マウス（１１．４μｇ／マウス、約５７０μｇ／ｋｇ）の率において、腹腔内注射によりマウスへ投与した。リガンド投与後、続いてマウス血清中のヒト分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現を１７日間モニターした。（Ｓ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド（実施例３１）、およびｒａｃ−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの相対的なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を、比較のために評価した。図３に示すように、（Ｓ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド（●−●）はＲＴＳ遺伝子レポーター発現を誘導しなかった。ｒａｃ−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドは、中等��のＲＴＳ遺伝子レポーター発現を誘導した（▲‐‐▲）。（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド（○−○）は、実質的なＲＴＳ遺伝子レポーター発現を誘導した。
【０３８８】
実施例６８
２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の物理的特性：
【０３８９】
形態：固体サンプルロットは図４で報告した。Ｒ鏡像異性体に関して、メタノール／水またはトルエン／ヘプタンからの迅速な結晶化／沈殿により得られたサンプルは、同じ粉末でのＸ線回析パターン（データ未提示）をもたらし、互いに比較したとき、およびＣＨ３ＯＨ結晶化により得られた標準物（１６５．１℃−１６６．５℃）と比較したとき、基本的に同じ融点（［トルエン／ヘプタン］１６６．２℃−１６７．１℃、［ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ］１６６．５−１６７．４℃）を有する。ラセミ体に関して、メタノール蒸発により得られた、別々の２調製によるサンプルは、実験エラーおよび純度におけるわずかな変動の範囲内で基本的に同じ融点（１７０−１７１℃、１６９−１７０℃）を示した。２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体およびＲ鏡像異性体の形態は最も典型的であるとみえる。
【０３９０】
微粒子化および粒径：粒径を標準化するため、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体それぞれを２０メッシュを通して前選別し、微粒子化した。粒径は、約２０ｍｇの試験物質を１５ｍＬのファルコンチューブへ量り入れることにより決定した。１０ｍＬの脱イオン水を粉末に加えた。懸濁液を混合し、２０分間超音波処理し、その後直ちにＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒデバイスを用いたレーザー光回析により粒径を解析した。粒径分布を図５および６に示す。ラセミ体は全体としてＲ鏡像異性体よりもわずかに大きな粒径を有するように見えるが、２つのサンプルはきわめて同様である。
【０３９１】
バルクおよびタップ密度分析：２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したＲ鏡像異性体およびラセミ体のバルク密度を、測定された重量および１０ｍＬメスシリンダー内の体積を用いて算出した。微粒子化した材料のタップ密度は、材料の重量およびタップ体積を用いて算出した。タップ体積はタップ密度分析計（モデル：ＪＥＬのＳｔａｍｐｆｖｏｌｕｍｅｔｅｒ，ＳＴＡＶ２００３）を用いて測定し、タップ体積が一定になったときにこれを記録した（図７）。Ｒ鏡像異性体はやや低いバルク密度およびタップ密度を有する。両方の物質は綿状であった（低バルク密度）。
【０３９２】
熱重量分析／示差熱分析（ＴＧＡ／ＤＴＡ）分析：２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの、微粒子化したＲ鏡像異性体およびラセミ体を、熱重量分析／示差熱分析により分析した。熱重量プロットを図８に示す。両方の物質はＤＴＡ特性において吸熱現象を示した。Ｒ鏡像異性体の開始温度（１６３．６℃）はラセミ体のそれ（１７１．２℃）に比較して著しく低かった。Ｒ鏡像異性体の融合熱（５９．８ｕｖ．ｓ／ｍｇ）もまた、ラセミ体のそれ（８０．８ｕｖ．ｓ／ｍｇ）に比較して著しく低かった。これは２物質が異なる結晶形であることを例証する。Ｒ鏡像異性体のより低い融点およびより低い融合熱は、異なる溶解度特性を反映する。
【０３９３】
１５０℃を超えて熱することにより、Ｒ鏡像異性体は総重量の０．４％を失い、ラセミ体は総重量の０．８％を失った（図８）。２物質中の水分含有量（熱により除去可能な水分）はわずかに異なる。
【０３９４】
動的水蒸気吸着分析：乾燥状態に曝露したとき（２０％ＲＨ）、ラセミ体はどのような有意の重量減少も示さなかったが、Ｒ鏡像異性体は、おそらくサンプルの移動または貯蔵の間に獲得した緩く結合する水分に相当する、総重量の０．９％を失った（データ未提示）。乾燥状態下での脱水の後、２物質は低（３０〜４０％ＲＨ）、中（５０〜６０％ＲＨ）、および高（７０〜８０％ＲＨ）湿度へ曝露することにより、同程度の重量増加を示した。７０％ＲＨにおいて、Ｒ鏡像異性体の重量増加は６．３％であり、ラセミ体の重量増加は６．３％であることから（データ未提示）、両物質の中程度の吸湿性が示される。
【０３９５】
医薬賦形剤における溶解度：アッセイ１：微粒子化された２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の溶解度を、市販の賦形剤中で定性的に評価した（図９）。ガラスバイアル内の１０ｍｇ／ｇ（試験物／賦形剤）の、最初の溶液／懸濁液は、５分間隔で３０秒回転させながら室温で１５分間超音波処理し、続いて３分間隔で３０秒回転させながらアルミニウムブロック内において１２分間５０℃で加熱することにより調製した。この最初の１０ｍｇ／ｇ賦形剤サンプルの外観に基づき、２〜４点の連続濃度を、以下の点：５、１０、１５、２０、３０、５０ｍｇ／ｇ（試験物／賦形剤）の何点かにおいて上昇または下降のサンプリングにより走査した。Ｒ鏡像異性体およびラセミ体が同程度に可溶性であるとみえるとき、未希釈のポリソルベート８０を除く全ての試験された医薬賦形剤において、Ｒ鏡像異性体はラセミ体よりもさらに可溶性であった（図９を参照）。いずれのサンプルにも色の変化はみられなかった。透明なガラスバイアル内の幾つかの調製品の写真を撮った（未提示）。
【０３９６】
アッセイ２：各賦形剤につき、図９のアッセイにおいて２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体またはラセミ体が不溶性である最低濃度を同定した。この同じ濃度における、両物質の懸濁液をバイアル内に調製した。各サンプルを室温で＜２．５時間攪拌した（処理１）。別の実験として、試験物／賦形剤の組み合わせをアルミニウムブロック内で５分間９０℃で、または図１０に示すように必要に応じてより長く熱し、室温まで冷却し、同じ微粒子化された物質の少量をまいた（処理２）。物理的外観を７２時間目、または示された時間（図１０）に記録した。全ての事例において、色の変化は見られなかった。この溶解度アッセイは、最初の粒径および形態には無関係に、完全に溶解した状態から操作された。結晶ラセミ体のどのような形態も有する過飽和の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのラセミ体溶液をまくことによって沈殿／結晶化が観察されるが、Ｒ鏡像異性体は完全に溶解している（特に加熱なしで）ことから、試験された濃度におけるラセミ体とＲ鏡像異性体の間の溶解度の違いが示唆される。透明なガラスバイアル内の調製品の写真を撮った（アッセイ１の条件で９０℃に加熱しなかったＲ鏡像異性体、および９０℃処理後、冷却してまいたラセミ体、未提示）。
【０３９７】
アッセイ３：２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体を、１ｍＬあたり１〜２ｍｇの粉末の、蒸留水中の２０％ＰＥＧ１０００、ｐＨ７．０と混合した。混合物を３７℃でインキュベートし、室温で約２時間ボルテックスし、室温でさらに１２時間静置した。溶液を濾過または遠心し、最小限４点の検量線による一般的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いた、二重のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ注入により濃度を定量した（図１１）。Ｌｏｂｅｎｂｅｒｇ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｉｎ：Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂ．Ｄｒｅｓｓｍａｎ（Ｅｄ），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，２０００およびＭａｄｅｒ  ＷＪ，Ｇｒａｄｙ  ＬＴ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５  ｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１，Ｐａｒｔ  Ｖ，Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．Ａ．，Ｒｏｓｓｉｔｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１を参照のこと。
【０３９８】
アッセイ４：処方賦形剤および生物学的液体の平衡溶解度は薬剤の生物学的利用能に影響を与え、溶解の動態学もまた生物学的利用能の決定における限定要因であり得る。２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の溶解度を薬理学的界面活性剤ポリソルベート８０の水性調製品中において定量的に確立し、圧縮された試験物質の内因性の溶解率を観察した。０．５％、１％、および１．５％ポリソルベート８０溶液中のラセミ体とＲ鏡像異性体の混合物は、２ｍＬのエッペンドルフバイアルに２０＋／−１ｍｇの試験物質、続いて５００ｍｇのポリソルベート溶液を加えることにより調製した。混合物をビーズで１２０秒間打ち、２５℃で１６から２４時間振とうし、Ｓｐｉｎ−Ｘ（０．２μＭ）を用いて濾過した。濾液のｐＨを記録した。濾液中の試験物質の濃度を、定量的ＨＰＬＣ分析により測定した（図１２）。１．０および１．５％ポリソルベート８０溶液中で、Ｒ鏡像異性体は２〜３倍、さらに可溶性である。脱イオン水および０．５％ポリソルベート８０中で、ラセミ体およびＲ鏡像異性体の溶解度は同程度である。
【０３９９】
次に、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の内因性溶解特性を、以下の試験条件に従い、１％ポリソルベート８０蒸留水溶液中の圧縮ペレット（直径７ｍｍ、１００ｍｇ）を用いて３７℃で決定した。
容器：１０００ｍＬ
溶媒：１％ポリソルベート８０蒸留水溶液（０．８μＭフィルターを通し、真空濾過した）
溶媒量：１０００ｍＬ
速度：１００ＲＰＭ
温度：３７℃
サンプリング点：１５、３０，４５、６０、９０および１２０分
サンプリング量：１ｍＬ（３０ミクロンを通して濾過）
分析：ＨＰＬＣ（各ロットから標準溶液を作製）
サンプルサイズ：ｎ＝２ペレット／試験物質
【０４００】
ラセミ体およびＲ鏡像異性体の放出は１２０分までにはＨＰＬＣの検出限界未満であった。１２０分後には、両物質のペレットは溶媒中で未変化のままであった。
【０４０１】
実施例６９
２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の細胞膜透過性特性：
【０４０２】
Ｃａｃｏ−２細胞の単層を通した双方向性の透過率（Ｓａｍｂｕｙ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００５  Ｊａｎ；２１（１）：１−２６  および  Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｃｏ−２  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００１  Ｍａｒ  １；４６（ｌ−３）：２７−４３を参照のこと）：
【０４０３】
データを図１３に示す。試験化合物は最大ＤＭＳＯ濃度＜１％において、ＨＢＳＳｇ中の５μＭとして調製した。２１から２８日目のＣａｃｏ−２細胞のコンフルエントな単層を準備した。受け取りウェルを１％ＢＳＡ改変ハンクス緩衝液ＨＢＳＳｇにより準備し、Ｃａｃｏ−２細胞の頂端および基底側をｐＨ７．４±０．２に維持した。単層は双方向において投与された（Ｎ＝２）：頂端側は（Ａ→Ｂ）評価のために投与され、基底側は（Ｂ→Ａ）評価のために投与された。試験化合物濃度は、最小限４点の検量線による一般的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用い、１２０分の時点において頂端および基底側の両方について測定した。図１３の値は：Ｃａｃｏ−２細胞単層を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ウェルからの試験化合物のパーセント回収率；双方向における見かけ上の透過率（Ｐａｐｐ）；流出率（ＰａｐｐＢ→Ａ）／（ＰａｐｐＡ→Ｂ）；低または高のいずれかに分類される試験化合物の吸収可能性；流出の分類は、流出＞３．０および（ＰａｐｐＢ→Ａ）＞１．０ｘ１０−６ｃｍ／ｓのときに有意であること、を表す。双方向において、Ｒ鏡像異性体はラセミ体よりもさらに透過性である。また、Ｒ鏡像異性体の流出率はより低い。
【０４０４】
ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞を用いた血液脳関門透過の可能性の決定（Ｔａｕｂ  ＭＥ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ−ｇｐ）ｐｒｏｂｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐ−ｇｐ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．２００５  Ｎｏｖ；３３（１１）：１６７９−８７  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＤＲ−ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２００５  Ｊａｎ  ２０；２８８（２）：３４９−５９．（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．広報より改訂）を参照のこと）：
【０４０５】
データを図１４に示す。試験化合物は最大ＤＭＳＯ濃度＜１％において、５μＭＨＢＳＳｇ溶液として調製した。７から１１日目のＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞のコンフルエントな単層を準備した。受け取りウェルを１％ＢＳＡ改変ハンクス緩衝液（ＨＢＳＳｇ）により準備し、頂端および基底側をｐＨ７．４±０．２に維持した。単層は双方向において投与された（Ｎ＝２）：頂端側は（Ａ→Ｂ）評価のために投与され、基底側は（Ｂ→Ａ）評価のために投与された。試験化合物濃度は、最小限４点の検量線による一般的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用い、１２０分の時点において頂端および基底側の両方について測定した。図１４に報告された値：ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞単層を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ウェルからの試験化合物のパーセント回収率；双方向における見かけ上の透過率（Ｐａｐｐ）；流出率（ＰａｐｐＢ→Ａ）／（ＰａｐｐＡ→Ｂ）；および血液脳関門透過の可能性の分類。ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞におけるＡ→ＢおよびＢ→Ａ双方向で、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体はラセミ体よりもさらに透過性である。また、Ｒ鏡像異性体はより低い流出率を示す。Ｒ鏡像異性体は血液脳関門を中程度に透過すると分類されるが、ラセミ体は低度と分類される。高度の血液脳関門透過は、中枢神経システム（ＣＮＳ）の透過が必要とされる医療適用のための重要な利点である。
【０４０６】
実施例７０
２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体のミクロソーム代謝（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２００１  Ａｕｇ−Ｓｅｐ；３１（８−９）：５９１−８  および  Ｌｉｎ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．１９９７  Ｄｅｃ；４９（４）：４０３−４９を参照のこと）。
【０４０７】
試験化合物は、ＤＭＳＯ（濃度は０．２５％未満）、メタノールまたはアセトニトリルの５μＭ溶液として調製した。性別の混ざったヒト肝臓ミクロソームを＞１０ドナーからプールし、１ｍＭのＮＡＤＰＨと共にインキュベートした。試験化合物を、１．０ｍｇ／ｍＬのミクロソームタンパク質と１ｍＭのＮＡＤＰＨを含む緩衝液中で３７℃においてインキュベートした。０および６０分に混合物をサンプリングし、試験化合物に相当するピーク領域の１０〜１００％範囲をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりモニターした。アッセイは二重に行った（Ｎ＝２、別々のインキュベーション）。図１５に報告したデータは、テストステロン標準物質の残留パーセントおよび試験物質の残留パーセントである。Ｒ鏡像異性体は、ヒト肝臓ミクロソームでの代謝に対してラセミ体よりもわずかに、より安定である。
【０４０８】
実施例７１
２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の生物学的利用能
【０４０９】
Ｌａｂｒａｓｏｌ中の化合物をＣ５７ＢＬ／６Ｎ：Ｃｒｌ（野生型）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）へ、ヒトにおいて意図される投与経路である経管栄養法により投与した。投与量は３、１０、３０、または５０ｍｇ／ｋｇ／日および２．５ｍＬ／ｋｇ／用量として設定した（図１６）。用量は９日間（第１の雌１８匹／群）または１２日間（第２の雌１８匹／群）投与した（図１６）。９日および１２日の時点で血液を採取した。濃度を逆相ＨＰＬＣにより定量した。
【０４１０】
各濃度に対し、サンプルは、ビーカー内の固体のＲ鏡像異性体またはラセミ体へＬａｂｒａｓｏｌを加えること、目に見える凝集を破壊するため超音波処理すること、および均一な外観になるまでマグネチックスターラーで攪拌することにより調製した。混合物をメスシリンダーへ移し、要求される体積まで、ビーカーをラブラソールですすいだ液を継ぎ足した。シリンダーの内容を反転して混合し、投与までマグネチックスターラーで攪拌した。
【０４１１】
これらのＬａｂｒａｓｏｌ投与調製品は微粒子化されたＲ鏡像異性体を利用したが、微粒子化されていないラセミ体は利用していない。微粒子化されていないラセミ体試料がそのＬａｂｒａｓｏｌ中での溶解を偏らせるかもしれない可能性に取り組むため、独立の実験を行った。この実験において、微粒子化、および非微粒子化ラセミ体の２０ｍｇ／ｍＬ調製品の溶解度および概観が試験された。微粒子化ラセミ体（ロットＲＥＨ−２８−９−１／ＰＹＡＰ−２−８−２−２Ｍ）、非微粒子化ラセミ体（ロット＃ＰＹＡＰ−２−８−２−２）、および微粒子化Ｒ鏡像異性体（ロット＃ＲＥＨ−２８−４−２）をそれぞれラブラソールに懸濁し、手動で回転させ、その後Ｂｒａｎｓｏｎ  ２１００卓上超音波処理器で２５〜２８℃において３ｘ５分間隔、および１ｘ１０分間隔で、手動による回転を組み入れながら超音波処理した。Ｒ鏡像異性体は容易に溶解したが、微粒子化ラセミ体混合物および非微粒子化ラセミ体混合物は、懸濁した微細な粒子により濁ったままであった（写真は未撮影）。視覚的な検査によると、微粒子化および非微粒子化ラセミ体サンプル中の不溶性物質の量は実質的に同じであった。顕微鏡観察（図１７）により、微粒子化および非微粒子化ラセミ体懸濁液両方における大部分の粒子は２５ミクロン未満であることが明らかにされた（図１７）。幾つかの大きめの結晶性断片が非微粒子化サンプル中に残っていた。微粒子化および非微粒子化ラセミ体サンプル両方が同様の量の不溶性物質をもたらすことから、Ｒ鏡像異性体およびラセミ体のＬａｂｒａｓｏｌ調製品の主要な違いは、溶質の最初の粒径よりも内因性の溶解度であると考えられる。
【０４１２】
時間的な作用としてのマウス血清濃度は定量的ＨＰＬＣにより測定した。Ｌａｂｒａｓｏｌ中のＲ鏡像異性体は、高めの用量である３０および５０ｍｇ／ｋｇ／日（１２および２０ｍｇ／ｍＬＬａｂｒａｓｏｌ投与）において著しく高めの血清濃度を達成する。ラセミ体の血清濃度は著しく低めのままであった（＜４〜５倍のＡＵＣ）（図１８および１９）。ラセミ体とＲ鏡像異性体の間の最初の粒径の違いは、血清濃度の違いの一部分を説明する可能性がある。Ｌａｂｒａｓｏｌ中における、ラセミ体を超えるＲ鏡像異性体のより大きな内因性溶解度もまた、血清濃度の違いの一部分を説明する可能性がある。さらに、血清濃度の違いは細胞膜透過性（Ｃａｃｏ−２細胞およびＭＤＣＫ細胞の実験について；図１３および１４）、吸収、分布、または排泄の違いによる可能性がある。
【０４１３】
実施例７２
遺伝子改変腫瘍細胞からのトランス遺伝子ＩＬ−１２産生のｉｎ  ｖｉｖｏ誘導に対する、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体の比較。
【０４１４】
本実施例で試験されたトランス遺伝子は、ＲＴＳの制御下にあるマウスＩＬ−１２である。マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６）に、ＲＴＳの制御下にあるマウスＩＬ−１２トランス遺伝子を保有するアデノウィルスベクター、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２を形質導入した。これらの細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６細胞に組織適合性）皮下注射し、マウスを異なる用量の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体およびラセミ体により３日間処理した。コントロール群は、形質導入されていないＢ１６細胞および高めの用量のリガンドを投与されたマウス、ならびに形質導入されたＢ１６細胞を投与され、かつリガンドを投与されていない別の群を含んだ。リガンドにより直接誘導されるトランス遺伝子の発現を評価するため、皮下注射から７２時間後に各群の半分のマウスから腫瘍および血清を回収した。腫瘍抽出物および血清を準備し、ＩＬ−１２をＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０４１５】
残りのマウスは、さらなる７２時間にリガンド投与が中止されたときのトランス遺伝子の遮断を試験するために用いられた。結果は、リガンドのＲ鏡像異性体およびラセミ体で処置したマウスの腫瘍および血清中のトランス遺伝子ＩＬ−１２発現における違いを示唆する。リガンド投与の中止は、全ての群においてトランス遺伝子の遮断を同様の様式でもたらした。
【０４１６】
材料および方法：Ｂ１６細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄ．−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２（ＭＯＩ＝１００）に感染させた。４８時間後、５ｘ１０５（Ｂ１６、右側腹部）細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した（１０マウス／群）。Ｒ鏡像異性体およびラセミ体リガンドをＬａｂｒａｓｏｌ中で、１０ｍｇ／ｍＬの混合物を５０℃で５分間加熱することにより溶解した。視覚的な検査に基づくと、両リガンドはＬａｂｒａｓｏｌ中に溶解した。活性化リガンドは、以下の用量（０ｍｇ／ｋｇ；３ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日、３日間、経管栄養法により投与した。さらなるコントロールは、リガンドのみを投与されたＢ１６関連マウスを含んだ（５０ｍｇ／ｋｇ／日、３日間、および無処置の腫瘍関連マウス）。腫瘍病変部および末梢血を分離するため、５マウス／群を回収した。組織を、全量１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中でホモジナイズした。ライセート／血清を−８０℃で凍結保存した。代わりの５マウス／群を、さらなるリガンドの投与なしでさらに７２時間そのままにした。これら後者の５マウス／群を、腫瘍病変部および末梢血を分離するために回収した。組織を上記のようにホモジナイズして凍結保存し、ライセート／血清を−８０℃で凍結保存した。検体を水浴中で３７℃において解凍し、ｍＩＬ−１２ｐ７０について、また腫瘍へのＣＴＬ輸送に重要なＩＬ−１２依存性サイトカインと推定されるＩＦＮ−γについても、特異的ＥＬＩＳＡ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて分析した。
【０４１７】
結果：腫瘍内のトランス遺伝子ＩＬ−１２発現、同様に血清濃度は、両リガンドの量依存性パターンに従った（図２４および２５）。しかしながら発現レベルは、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのＲ鏡像異性体により処置されたマウスにおいて２．５から３倍高めであった。このパターンは腫瘍抽出物および血清において観察された。形質導入されていないＢ１６細胞およびリガンドの最大用量を投与された、あるいは形質導入されたＢ１６細胞を投与されかつリガンドを投与されなかったコントロール群は、どのようなＩＬ−１２発現も示さなかった。リガンド処置を３日間中止された群では、発現レベルは全ての処置群と同じ比率まで降下し、このことはリガンドが除去されたこと、およびＲＴＳ活性化はリガンドが取り除かれたときには可逆的であることを示す。腫瘍および血清中のＩＦＮ−γ濃度をアッセイしたとき、Ｒ鏡像異性体群は明らかに増大した発現を示した。
【０４１８】
実施例７３
２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドを含む医薬組成物
【０４１９】
表１は２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド、ＰＬ９０Ｇ、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ＢＨＴ，およびＭｉｇｌｙｏｌ  ８１２Ｎを含む医薬組成物を示す。ＰＬ９０Ｇはダイズ由来の高度に精製されたホスファチジルコリンである。ＰＬ９０Ｇの製造者はＬｉｐｏｉｄの子会社のＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＤ  ＧｍｂＨである。ビタミンＥ  ＴＰＧＳはＧＲＡＳ（安全であると一般に認識される）化合物であり、現在の国民医薬品集（ＮＦ）研究書の全ての要件に従う。Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１２Ｎは分画された植物Ｃ８およびＣ１０脂肪酸のトリグリセリドを含む。Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１２Ｎの製造に用いられる脂肪酸はＧＲＡＳに分類され、中鎖トリグリセリドに対する現在のＮＦおよびＥＰ研究書の要件に合致する。ＢＨＴ［ＭｅＣ６Ｈ２（ＣＭｅ３）２ＯＨ］は、抗酸化食品添加物として広く用いられている親油性（脂溶性）フェノールである、有機化合物である。この処方は硬質ゼラチンカプセル内に分注された。
【０４２０】
実施例７４
疾患の動物モデルにおける有効性
【０４２１】
ＲＴＳおよびｍＩＬ−１２もしくはｈＩＬ−１２をコードするアデノウィルスベクターをそれぞれ形質導入されたマウスまたはヒト樹状細胞（ＤＣ）は、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで量依存性にサイトカインを発現した。２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの非存在下では、ＩＬ−１２発現は基礎レベルであった。
【０４２２】
マウスインターロイキン−１２ｐ７０（ＤＣ−ＳＰ１（ＩＬ−１２ｐ７０））をコードするアデノウィルスベクターを形質導入された腫瘍内送達ＤＣの抗腫瘍有効性における、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの様々な投与経路および用量の比較分析を、Ｂ１６メラノーママウスモデルにおいて行った。結果は、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、経管栄養法または食物混合により投与された２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドとの組み合わせによる（ＤＣ−ＳＰ１（ＩＬ−１２ｐ７０））治療により、抗腫瘍有効性が示されたことを示唆した。至適な抗腫瘍効果は、＞３０ｍｇ／ｋｇの２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの用量を（ＤＣ−ＳＰ１（ＩＬ−１２ｐ７０））と共に投与する治療において生じた。
【０４２３】
処置開始前にマウスに腫瘍を接種した（腫瘍を形成するため、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＢ１６細胞を皮下注射した）マウスＢ１６メラノーマモデルにおいて、腫瘍内に注射されたマウスＩＬ−１２遺伝子を保有する形質導入ＡｄＤＣは、ＡｄＤＣの注射後４８時間以内の２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの全身投与に依存して、腫瘍の完全な退縮および動物の生存の延長を仲介した。この薬剤依存性効果は：腫瘍およびＤＬＮ内のトランス遺伝子発現；腫瘍微小環境内でのＡｄ−ＤＣ生存の延長；ＤＬＮ内でのＡｄＤＣの遊走および残留；ならびに抗Ｂ１６ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導と関連していた。
【０４２４】
上記のマウスＢ１６メラノーマモデルにおいて、２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドによる１３日間の処置と組み合わせた１０７ＡｄＤＣの注射から構成される腫瘍内治療は、腫瘍特異的な防御免疫を示した。腫瘍が取り除かれた動物に再負荷すると、５０日目（腫瘍接種後）にこれらの動物はＢ１６メラノーマに対して抵抗性になったが、ＭＣ３８大腸癌の進行に対してはそうでなかった。
【０４２５】
実施例７５
複製能力のない、ＲＴＳおよびｈＩＬ−１２を有する組み換えアデノウィルス
【０４２６】
図２３は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失し、かつＲＴＳ−ＩＬ１２構成要素がＥ１領域に取って代わった、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の図表示である（図２３は縮尺通りに描かれていない）。図２３で使用される用語は以下の意味を持つ：
ＲＴＳ−ＩＬ−１２：ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍの制御下にあるヒトＩＬ−１２
Ｐｒｅｇ：活性化薬剤により調節される、ＩＬ１２発現を駆動するプロモーター
ｈＩＬ−１２：ＩＲＥＳ配列により分離される、ヒトＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットのコード配列  
ｐｏｌｙＡ：ポリアデニル化シグナル
ＰｕｂＣ：ユビキチンＣプロモーター
ＶＰ１６−ＲＸＲ：ＶＰ１６転写活性化ドメインおよびキメラＲＸＲとの融合タンパク質
ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位  
Ｇａｌ４−ＥｃＲ：Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインの融合タンパク質
Ａｄ：Ｅ１およびＥ３遺伝子欠失を含むアデノウィルス−５骨格
【０４２７】
組み換えアデノウィルスベクターＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ４：  １０３４−１０３８（２０００）に記載の通りに調製した。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２ベクターは以下の様式により産生した。ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）により分離される受容体融合タンパク質、ＶＰ１６−ＲＸＲおよびＧａｌ４−ＥｃＲのコード配列を、ヒトユビキチンＣプロモーター（恒常的プロモーター）の制御下にアデノウィルスシャトルベクター内へ挿入した。続いて、合成誘導プロモーターの制御下に置かれた、ＩＲＥＳにより分離されるヒトＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットのコード配列を、ユビキチンＣプロモーターおよび受容体配列の上流に挿入した。シャトルベクターは、Ｅ１配列が欠失し、かつＲＴＳおよびＩＬ１２配列に取って代わられたもの（ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２）由来の左末端からｍｕｌ６までのアデノウィルス血清型５配列を含む。ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を保有するシャトルベクターは、リガンド依存性のＩＬ−１２発現のために、ＨＴ−１０８０細胞への一過性トランスフェクションにより試験された。その後シャトルベクターを、ＨＥＫ２９３細胞への共トランスフェクションによってＥ３欠失アデノウィルス骨格と再結合し、組み換えアデノウィルスＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を得た。臨床グレードのアデノウィルスベクターはｃＧＭＰ施設で産生した。
【０４２８】
実施例７６
ｈＩＬ−１２トランス遺伝子を含むアデノウィルスおよびＲｈｅｏｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍによる自己未熟樹状細胞の形質導入
【０４２９】
白血球除去によるＰＢＭＣの回収：被験者はＨｉｌｌｍａｎ  ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ  ＣＴＲＣにおいて９０〜１２０分の白血球除去を受けた。白血球除去の手順は、片方の腕の静脈からの血液の採取；血液をその成分が分離され１以上の成分が除かれる遠心（細胞分離器）を通過させること；残りの成分を被験者の同じかまたは別の腕の静脈へ戻すことを含む。細胞分離装置を通した血液の処理のいずれの１回においても、被験者の全血量の１５％を超える量は採取されなかった。細胞分離器内で、血液は血漿、血小板、白血球、および赤血球に分離された。白血球（ＷＢＣ）は除かれ、その他の全ての成分は被験者の循環中へ戻された。この手順のための２つの末梢ＩＶラインを用いるために、全ての試みが行われた。それが不可能な場合、中央ラインが必要とされ得る。白血球除去を受けるため、被験者は医師による検査を通過しなければならず、かつ手順に先立ちバイタルサイン（血圧を含む）について日常的にスクリーニングした。
【０４３０】
処理：採取後、ｌｅｕｋａｐａｃｋを用手でＣＰＬへ送り、直ちにＥＬＵＴＲＡ（商標）での遠心エルトリエーションにより処理した。これは臨床用途のために検証された閉鎖システムである。単球分画を回収し、細胞の回収および生存率が確立された後、これらをＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で６日間培養するためにＡａｓｔｒｏｍカートリッジへ移した。全ての処理および洗浄手順は無菌状態下で行われた。
【０４３１】
最初のプレーティング：単一のｌｅｕｋａｐａｃｋから回収された単球を、生存細胞の数を決定するためトリパンブルー色素存在下で計数した。単球の純度をフローサイトメトリーにより評価した。単球を、ＳＯＰ−ＣＰＬ−０１６６あたり１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４および１，０００ＩＵ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含む無血清および無抗生物質のＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地に再懸濁し、Ａａｓｔｒｏｍカートリッジに配置した。カセットの接種には、５０ｍｌの最小負荷量および最小細胞数が必要とされる。
【０４３２】
培養：Ａａｓｔｒｏｍカートリッジを、完全に閉鎖されｃＧＭＰに適合した未熟ＤＣ発生のための自動化培養装置である、Ｒｅｐｌｉｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ内のインキュベーター内に配置した。
【０４３３】
未熟ＤＣの回収：６日目にＡａｓｔｒｏｍカートリッジをインキュベーターから取り除き、未熟ＤＣを回収した。細胞を１，５００ｒｐｍの遠心により回収し、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地で洗浄し、トリパンブルー色素存在下で計数し、かつ形態および表現型の特徴を調べた。
【０４３４】
生存率：トリパンブルー存在下での血球計算板による細胞計数を行って決定した。一般に、回収された細胞の＞９５％は生存、すなわちトリパンブルー色素を排除する。生存率が７０％未満であれば、未熟ＤＣは廃棄され得る。
【０４３５】
表現型の決定：培養において発生した細胞を血球計算板上で顕微鏡観察により計数し、トリパンブルー色素を用いた予備的な区別の数値（ＤＣ対リンパ球）を得た。区別の数値の確認は、ＤＣ対リンパ球にゲートをかけ、未熟ＤＣの高い前方および側方散乱をそれらの同定の判断基準として用いるフローサイトメトリーにより行った。未熟ＤＣは、樹状細胞の形態およびＤＣ表現型を有する細胞を日常的に＞８０％含む。
【０４３６】
ＩＬ−１２ｐ７０力価アッセイ：成熟ＤＣはＩＬ−１２ｐ７０を自発的に、あるいはＣＤ４０Ｌによる活性化によって自然免疫シグナル（例えばＬＰＳ）の追加ありまたは追加なしで、ＩＬ−１２ｐ７０を産生する能力をもつことは確立されている。標準化されたＩＬ−１２ｐ７０産生アッセイが最近確立され、これは少量のサンプルまたは様々な条件下で産生されたＤＣワクチンの大きなロットに適用できる。現在の力価アッセイは２つの異なる工程から構成され、第１は、反応者としてのＤＣと、ヒトＣＤ４０リガンド遺伝子を安定的にトランスフェクトされた刺激者としてのＪ５８８リンパ腫細胞との共インキュベーションに関する。第２の工程は、これらの共培養からの上清を、Ｊ５５８／ＣＤ４０Ｌ＋／−ＬＰＳで刺激されたＤＣにより分泌されたＩＬ−１２ｐ７０の濃度についてＬｕｍｉｎｅｘシステム中で試験することに関する。この力価アッセイは、アッセイ間で１８．５％（ｎ＝３０）のＣＶおよび広いダイナミックレンジを有し、これはＩＬ−１２ｐ７０産生の大いに異なる濃度により特徴付けられる様々なＤＣ産物の評価を促進する。１３人の正常ドナーの単球から産生されたＤＣ産物を用いて確立されたアッセイの正常範囲は８〜９９９ｐｇ／ｍＬ、平均２７０ｐｇ／ｍＬである。
【０４３７】
実施例７７
未熟ＤＣのアデノウィルス形質導入
【０４３８】
未熟ＤＣを回収し、計数して生存率について試験した。約６〜７ｘ１０７ＤＣへ、至適ウィルス吸着時間（２時間ないし４時間、未確定）に対する至適感染効率（至適ＭＯＩ、５００ないし１０００、未確定）においてアデノウィルスベクターにより形質導入した。形質導入後、吸着されなかったいずれのウィルス粒子も除去するため、細胞を繰り返し洗浄した。一定分量を無菌性、エンドトキシン、マイコプラズマ、ＤＣ表現型およびＩＬ−１２トランス遺伝子誘導アッセイのために取っておいた。放出試験が完了するまで、５ｘ１０７細胞の標的用量は生理食塩水中で４℃において保持される。
【０４３９】
全ての放出試験に合格した、形質導入されたＤＣ（ＡｄＤＣ）は下記のように患者への投与のためクリニックへ届けられる。
【０４４０】
形質導入されたＡｄＤＣによるＩＬ−１２トランス遺伝子誘導のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、結果を得るまでに最低２日間必要であり、それ故に（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドへの反応におけるＩＬ−１２産生は、ＡｄＤＣの腫瘍内注射に対する放出の判断基準にはなり得ない。しかしながら、３人の健常志願者由来のＡｄＤＣによる予備調査に基づき、（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドへの反応における誘導されたＩＬ−１２産生は、２４時間以内に百万細胞あたり８０ないし３００ｎｇＩＬ−１２の標的範囲内を達成した（３つのＡｄＤＣ調製品のうち２つにおいて、８０ｎｇ／百万細胞／２４時間の発現レベルが観察された）。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１２誘導結果は治療成績の分析に用いられる。形質導入されたＡｄＤＣそれ自体は、ウィルス形質導入および洗浄後の注射に使用される。残った未形質導入および形質導入ＤＣのいずれも、必要に応じた将来の分析のために凍結保存した。
【０４４１】
ＡｄＤＣの患者への投与：１回の注射量１５０マイクロリットルあたり５ｘ１０７細胞（または試行の被験者からの、ＤＣ収量の約９０％）を含む、０．９％生理食塩水溶液中のＡｄＤＣの単回腫瘍内注射。被験者は、１回の注射あたり５ｘ１０７細胞を超えない、可能な最大用量のＡｄＤＣを投与されなければならない。
【０４４２】
実施例７８
ステージＩＩＩおよびＩＶメラノーマの被験者において、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）の制御下でｈＩＬ−１２を発現するように操作され、アデノウィルスにより形質導入された自己樹状細胞のヒトへの投与。
【０４４３】
コホート１は１２被験者で構成され得り、コホート２は２８被験者で構成され得る。全ての被験者は、最初に（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドを投与されてから約２４時間後に、形質導入された自己ＡｄＤＣの単回腫瘍内注射を受けることになる。コホート１の被験者は、段階的に増大する（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの用量を投与されるため、３被験者ずつ４群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に配置された。コホート２では、被験者は（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの最大耐容性の経口用量（コホート１から決定された）を受けることになる。ＡｄＤＣの注射後直ちに、被験者は（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドでさらなる１３日間処置されるであろう。コホート１の各群の全ての被験者に対し、被験者が次により高い用量の（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの投与に登録される前、ＡｄＤＣの注射後１か月までに、安全性、耐性、およびトランス遺伝子の機能について評価されるであろう。コホート１が入院患者処置段階を完了してから３０日後、かつ形質導入された自己樹状細胞の腫瘍内注射から少なくとも６ないし８週間に、もし被験者が再処置を希望し、かつ被験者が再処置に対する判断基準に適合すれば、（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの連続１４日間の投与と共にＤＣが追加で注射されるであろう。（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドの用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇまたは１０．０ｍｇ／ｋｇ）は、コホート１からの最大許容量であり得る。
【０４４４】
患者は身体検査（ＥＣＯＧ活動指標を含む）により、バイタルサイン、血清化学、尿検査、血液学、有害事象、抗体、ならびにアデノウィルスベクターおよびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍの成分に対する細胞免疫反応について評価されるであろう。また、（Ｒ）−２−エチル−３−メトキシ−安息香酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジドおよびその主要な代謝物の経口投与における、一用量および定常状態の薬物動態／ＡＤＭＥ；標的腫瘍および／または流入領域リンパ節の組織診におけるｈＩＬ−１２レベルの測定を通したトランス遺伝子機能の解析；標的腫瘍、流入領域リンパ節および末梢循環の組織診における細胞免疫反応（Ｔ細胞）の測定による免疫効果の評価、も評価されるであろう。
【０４４５】
前記の実施形態および例証はどのような観点においても本発明の範囲を限定しようと意図するものではなく、かつここに提示する請求項は、全ての実施形態および例証を明らかに提示されているか否かに関わらず包含しようと意図することが理解されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月7日(2014.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
【化１】
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式中、Ａはアルコキシ基、アリールアルキルオキシ基、またはアリールオキシ基を表し、Ｂは任意に置換されたアリール基または任意に置換されたヘテロアリール基を表し、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して任意に置換されたアルキル基、アリールアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ハロアルキル基、任意に置換されたシクロアルキル基、任意に置換されたアルケニル基、任意に置換されたアルキニル基、任意に置換された複素環基、任意に置換されたアリール基、または任意に置換されたヘテロアリール基を表す；
で表される化合物、あるいはその薬理学的に許容される塩、水和物、結晶形または非晶形。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【外国語明細書】
2014193875000001.pdf