(57)【要約】【課題】レーザー光を間欠的に発光させた場合に、対象物において励起した蛍光体による電気信号を最適にサンプリングして画像の劣化を抑える。【解決手段】レーザー走査型顕微鏡システムは、所定の周波数のレーザー光を出射するモードロックレーザー部と、前記モードロックレーザー部から出射されるレーザー光を所定の間欠発光周期で間欠発光させる間欠発光部と、間欠発光された前記レーザー光を受けて対象物から励起した光子を電気信号に変換する検出器と、前記電気信号を前記間欠発光周期と同期したサンプリング周期でサンプリングするＡ／Ｄ変換部と、を備える。【選択図】図１
2014232241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の周波数のレーザー光を出射するモードロックレーザー部と、
前記モードロックレーザー部から出射されるレーザー光を所定の間欠発光周期で間欠発光させる間欠発光部と、
間欠発光された前記レーザー光を受けて対象物から励起した蛍光体を電気信号に変換する検出器と、
前記電気信号を前記間欠発光周期と同期したサンプリング周期でサンプリングするＡ／Ｄ変換部と、
を備える、レーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項２】
前記サンプリング及び前記間欠発光に係る周波数及び位相が同一である、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項３】
前記モードロックレーザー部は、二光子励起のための前記レーザー光を出射する、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項４】
前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号と、前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号とが同一の信号である、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項５】
前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号を発生させるサンプリング信号発生部と、
前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号を発生させる間欠発光信号発生部と、を更に備え、
前記サンプリング信号と前記間欠発光信号とを同一のクロックに基づいて発生させる、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項６】
前記モードロックレーザー部又は前記間欠発光部は、前記レーザー光を所定の有効発光期間のみ前記対象物に入射させる、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項７】
前記レーザー光を前記対象物の表面の第１の方向へ走査する第１のガルバノミラーと、
前記レーザー光を前記対象物の表面の前記第１の方向と直交する第２の方向へ走査する第２のガルバノミラーと、
前記第１及び第２のガルバノミラーを制御するガルバノミラー制御部と、を備え、
前記ガルバノミラー制御部は、前記第１の方向への走査が完了すると、前記第１の方向の始点位置に前記レーザー光を戻すとともに、前記レーザー光の１ライン分だけ前記第２の方向への走査を行い、その後、再び前記第１の方向への走査を行い、
前記有効発光期間は、前記第１の方向へ走査を行う期間の少なくとも一部である、請求項６に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項８】
前記検出器から出力された前記電気信号を帯域制限して前記Ａ／Ｄ変換部へ入力するローパスフィルタを備え、
前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数に対してナイキストのサンプリング定理が成立するように前記帯域制限を行う、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【請求項９】
前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数の１／２以下となるように前記帯域制限を行う、請求項８に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、レーザー走査型顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば下記の特許文献１には、被検物を走査する走査機器を含む走査型顕微鏡であって、発振パルス周波数とサンプリング周波数との間の同調化を行う走査型顕微鏡が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５００７０９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年では、半導体レーザーを用いたＭＯＰＡ型の光源により１００Ｗ以上の高出力を有するものが開発されている。しかしながら、生体を測定対象とする場合、レーザー光のパワーが強いと、生体に対するダメージが大きくなる問題がある。
【０００５】
生体に対するダメージを抑えるためには、レーザー光の平均パワーを低くしてピークパワーを高くすることが有効である。このため、レーザー光を間欠的に発光させて、生体に対するダメージを抑えることが考えられる。
【０００６】
しかしながら、レーザー走査型顕微鏡においては、対象物において励起した蛍光体をＰＭＴ等の検出器で電気信号に変換するが、レーザー光を間欠的に発光させた場合、変換後のＡ／Ｄ変換のサンプリングによっては、取得した画像が劣化する問題がある。
【０００７】
上記特許文献１には、発振パルス周波数とサンプリング周波数との間の同調化を行うことが記載されているが、間欠発光を行った場合の間欠発光周期については何ら考慮されていない。また、特許文献１に記載された技術では、パルス発光に同期した高速サンプリングをしたとしても、分解能が向上することはあり得ず、信号量も増加することは困難である。
【０００８】
そこで、レーザー光を間欠的に発光させた場合に、対象物において励起した蛍光体による電気信号を最適にサンプリングして画像の劣化を抑えることが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示によれば、所定の周波数のレーザー光を出射するモードロックレーザー部と、前記モードロックレーザー部から出射されるレーザー光を所定の間欠発光周期で間欠発光させる間欠発光部と、間欠発光された前記レーザー光を受けて対象物から励起した蛍光体を電気信号に変換する検出器と、前記電気信号を前記間欠発光周期と同期したサンプリング周期でサンプリングするＡ／Ｄ変換部と、を備える、レーザー走査型顕微鏡システムが提供される。
【００１０】
前記サンプリング及び前記間欠発光に係る周波数及び位相が一致するものであっても良い。
【００１１】
また、前記モードロックレーザー部は、二光子励起のためのレーザー光を出射するものであっても良い。
【００１２】
また、前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号と、前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号とが同一の信号であっても良い。
【００１３】
また、前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号を発生させるサンプリング信号発生部と、前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号を発生させる間欠発光信号発生部と、を更に備え、前記サンプリング信号と前記間欠発光信号とを同一のクロックに基づいて発生させるものであっても良い。
【００１４】
また、前記モードロックレーザー部又は前記間欠発光部は、前記レーザー光を所定の有効発光期間のみ前記対象物に入射させるものであっても良い。
【００１５】
また、前記レーザー光を前記対象物の表面の第１の方向へ走査する第１のガルバノミラーと、前記レーザー光を前記対象物の表面の前記第１の方向と直交する第２の方向へ走査する第２のガルバノミラーと、前記第１及び第２のガルバノミラーを制御するガルバノミラー制御部と、を備え、前記ガルバノミラー制御部は、前記第１の方向への走査が完了すると、前記第１の方向の始点位置に前記レーザー光を戻すとともに、前記レーザー光の１ライン分だけ前記第２の方向への走査を行い、その後、再び前記第１の方向への走査を行い、前記有効発光期間は、前記第１の方向へ走査を行う期間の少なくとも一部であっても良い。
【００１６】
また、前記検出器から出力された前記電気信号を帯域制限して前記Ａ／Ｄ変換部へ入力するローパスフィルタを備え、前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数に対してナイキストのサンプリング定理が成立するように前記帯域制限を行うものであっても良い。
【００１７】
また、前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数の１／２以下となるように前記帯域制限を行うものであっても良い。
【発明の効果】
【００１８】
本開示によれば、レーザー光を間欠的に発光させた場合に、対象物において励起した蛍光体による電気信号を最適にサンプリングして画像の劣化を抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本開示の一実施形態に係る顕微鏡システムの一例を示す模式図である。
【図２】光源の構成を詳細に示す模式図である。
【図３】間欠発光によりレーザーのピークパワーを高くした状態を示す特性図である。
【図４】顕微鏡本体の構成を示す模式図である。
【図５】ラスター・スキャン方式を利用した２次元画像の生成方法を示す模式図である。
【図６】サンプリング周期が間欠発光周期Ｔよりも短い場合を示す模式図である。
【図７】サンプリング周期が間欠発光周期Ｔよりも長い場合を示す模式図である。
【図８】サンプリング周期と間欠発光周期Ｔを一致させた場合を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に添付図面を参照しながら、本開示の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００２１】
なお、説明は以下の順序で行うものとする。
１・顕微鏡システムについて
２．光源の構成例
３．顕微鏡システムの構成例
４．サンプリング周期と間欠発光周期の関係
５．サンプリング周期と間欠駆動周期を一致させるための構成例
６．ローパスフィルタの構成
７．レーザー光の光パルスとレーザー光の変調との同期
８．光学的分解能とサンプリング周波数の関係
【００２２】
［１・顕微鏡システムについて］
まず、図１を参照しながら、本開示の一実施形態に係る顕微鏡システムについて説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡システムの一例を示す模式図である。この顕微鏡システムは、生体解析用のレーザー走査型顕微鏡であり、特に二光子励起の光源を有する顕微鏡システムである。図１に示すように、顕微鏡システム１０００は、顕微鏡本体１００と、光源２００と、制御部３００とを有して構成されている。
【００２３】
顕微鏡本体１００は、レーザー走査型顕微鏡として構成され、測定サンプルＳを、当該測定サンプルの縦方向、横方向奥行き方向の３次元に走査して、測定サンプルＳの拡大画像群に対応する画像データ群を生成する。このため、顕微鏡本体１００は、光電子増倍管（ＰＭＴ）とガルバノミラーを有して構成されている。顕微鏡本体１００の構成については、後で詳細に説明する。
【００２４】
光源２００は、パルスレーザーを用いるものであり、外部共振器を備えたレーザー（Mode  Locked  Laser  Diode(以下、ＭＬＬＤと称する))と半導体光増幅アンプ（SOA)を有して構成されるＭＯＰＡ（Master  Oscillator  Power  Amplifier）型の光源である。近年では、半導体レーザーを用いたＭＯＰＡ型の光源により１００Ｗ以上の高出力を有するものが開発されている。この光源は、低価格且つ小型であるという特徴から、ミドルレンジの多光子顕微鏡への搭載が可能となれば、幅広い研究機関に用いられる可能性が広がり、医療や製薬の分野で大きな貢献が期待できる。本実施形態では、このようなＭＯＰＡ型の光源を用いた顕微鏡システム、特に二光子励起の光源を用いたシステムについて説明する。
【００２５】
制御部３００は、顕微鏡本体１００、および光源２００を制御する機能を有する。制御部３００の構成については後で詳細に説明する。
【００２６】
［２．光源の構成例］
図２は、光源２００の構成を詳細に示す模式図である。光源２００は、モードロック発振型レーザーと光アンプを組み合わせたＭＯＰＡ２１０と、波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０とから構成されている。ＭＯＰＡ２１０は、モードロックレーザー部(Mode  Locked  Laser  Diode)２２０と、光アイソレータ部２３０と、光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０とを有している。
【００２７】
また、図２の下段には、モードロックレーザー部２２０、光増幅器部２４０、波長変換モジュール２５０から出力されるそれぞれのレーザー光のパルス波形Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３と、後述する間欠駆動のためのパルス波形Ｐ１をそれぞれ示している。
【００２８】
モードロックレーザー部２２０は、半導体レーザー２２２と、半導体レーザー２２２から出射したレーザー光を通過させるレンズ２２４、バンドパスフィルタ２２６、ミラー２２８の各素子とを含んで構成されている。バンドパスフィルタ２２６は、ある波長範囲の光を透過させて、範囲外の光は通さないという機能を有する。そして、半導体レーザー２２２の後方端面のミラーと、ミラー２２８との間に、外部共振器（空間共振器）が構成され、この外部共振器の行路長により、モードロックレーザー部２２０から出射されるレーザー光の周波数が決まる。これにより、強制的に特定の周波数にロックさせることができ、レーザー光のモードをロックすることができる。
【００２９】
モードロックレーザー部２２０は、外部共振器を構成することにより、通常の半導体レーザーよりも長い周期（例えば、１ＧＨｚ程度）で短いパルスを同期させることができる。このため、モードロックレーザー部２１０から出力されるレーザー光Ｌ１は、平均パワーが低く、ピークが高いものとなり、生体に対するダメージが少なく、光子効率が高いものとなる。
【００３０】
光アイソレータ部２３０は、モードロックレーザー部２２０の後段に配置されている。光アイソレータ部２３０は、光アイソレータ２３２とミラー２３４とを含んで構成される。光アイソレータ部２３０は、後段の光学部品等において反射した光が、半導体レーザー２２２に入射することを防ぐ機能を有している。
【００３１】
光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０は、半導体レーザー２２２から出射されたレーザー光を増幅変調する光変調部として機能し、光アイソレータ部２３０の後段に配置されている。モードロックレーザー部２２０から出力されるレーザーは、そのパワーが比較的小さいため、光増幅器部２４０によって増幅される。この光増幅器部２４０は、ＳＯＡ（Semiconductor  Optical  Amp）、即ち、半導体光増幅器２４２と、半導体光増幅器２４２を制御するＳＯＡドライバ２４４とから構成されている。半導体光増幅器２４２は、小型かつ低コストの光増幅器であり、また、光をオン・オフする光ゲート、光スイッチとして用いることができる。本実施の形態においては、この半導体光増幅器２４２のオン・オフによって、半導体レーザー２２２から出射したレーザー光を変調する。
【００３２】
光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０では、制御電流（直流）の大きさに応じてレーザー光が増幅される。更に、光増幅器部２４０は、増幅の際に図２に示すパルス波形Ｐ１の制御電流で間欠駆動を行うことにより、パルス波形Ｌ１のレーザー光を所定の周期Ｔでオン・オフし、間欠的なレーザー光（パルス波形Ｌ２）を出力する。このように所望のタイミングと周期のパルス波形を生成する事により、システムが有する制御信号と同期させることができる。このように、例えばＭＯＰＡ型の光源の場合は、前段の発振部のパルスを増幅する後段部の半導体光増幅器２４２（Semiconductor  Optical  Amplifier略してSOAと記す。）において間欠駆動する事により、間欠駆動を実現する事が出来る。ＭＯＰＡ型の光源の場合、光増幅器部２４０（半導体光増幅器２４２）は、間欠発光部として機能する。
【００３３】
本実施形態ではＭＬＬＤを用いているため、半導体レーザー２２２から出力されるレーザー光の周波数は、一例として５００ＭＨｚ〜１ＧＨｚであり、パルス幅は０．５〜１．０［ｐｓ］程度である。後述するように、発振同期信号注入部３１６から発信同期信号を注入することにより、ＳＯＡ部による間欠駆動の同期に加えて半導体レーザー２２２から出力される発振パルスについてもシステムが有する制御信号と同期させることが可能である。なお、ＴｉＳａを用いる場合、レーザー光の発振周波数は４０ＭＨｚ〜８０ＭＨｚ程度、パルス幅は０．１〜０．２［ｐｓ］程度であるのに対して、ＭＬＬＤを用いることでより高い発振周波数のレーザー光を出力することが可能である。
【００３４】
本実施形態において、光増幅器部２４０から出力されるレーザー光の波長は、一例として４０５ｎｍである。４０５ｎｍの波長は比較的吸収が多い波長であるため、生体の奥に到達して高い密度で二光子の効果を生じさせる波長（９００ｎｍ〜１３００ｎｍ程度）に変換する。このため、光増幅器部２４０から出力されたレーザー光は、後段の波長変換モジュール２５０に入力され、波長変換モジュール２５０のＬＢＯ２５２によって波長変換される。
【００３５】
波長変換モジュール２５０のＬＢＯ２５２は、一例として、入力されたレーザー光（パルス波形Ｌ２）を２つの波長に変換する。そして、変換した２つの波長のうち、長波長のレーザー光（パルス波形Ｌ３）が波長変換モジュール２５０から出力される。なお、本実施形態において、光変換モジュール２５０は必須の構成ではなく、光増幅器部２４０から出力されるレーザー光を最終的な光として対象物（測定サンプルＳ）に照射することもできる。
【００３６】
ところで、生体のレーザー顕微鏡観察においては、対象物のダメージを少なくするために、レーザーの平均パワーを低くして、ピークパワーを高くすることが有効である。また、半導体レーザーを用いたＭＯＰＡ型光源を構成するレーザーチップは、小型であるが故に、高電力の負荷による発熱によって動作限界が定まることが考えられる。
【００３７】
本実施形態の光源２００においては、間欠的なレーザー光（パルス波形Ｌ２）を出力して間欠運転を行うため、間欠運転を行わない場合と比較すると、平均電力は同じであるにも関わらず、発光している際のピークを高めることができる。また、間欠運転を行うことにより、高電力の負荷による発熱も抑えることができる。
【００３８】
本実施形態では、二光子励起の光源２００として用いており、光源２００は２つの光子で蛍光体を励起する。特に二光子励起の光源を用いる顕微鏡においては、性能指数(Figure  of  Merit)としてＦＯＭ（＝（ピークパワー）２×パルス幅×周波数＝ピークパワー×平均パワー）が知られている。この性能指数によれば、ピークパワーと平均パワーの積に比例して、出力を増加させることができる。従って、生体のレーザー顕微鏡観察において、対象物のダメージを最小限に抑えて出力を高めるためには、平均パワーを低くしてピークパワーを高くすることが有効である。このため、本実施形態では、間欠運転を行うことでデューティ（ＤＵＴＹ＝パルス幅×周波数）比を低くして、ピークパワーを高くしている。
【００３９】
図３は、間欠発光によりレーザーのピークパワーを高くした状態を示す特性図である。図３の上段では一光子励起の場合の特性を示しており、上段の左側の特性は連続発光のピークパワーを、右側の特性はＤＵＴＹ比を５０％とした場合の間欠発光のピークパワーを示している。このように、間欠発光のＤＵＴＹ比を５０％とした場合、連続発光の信号強度（Ｉ０）に対して、間欠発光の場合は２倍の信号強度（２×Ｉ０）を出力することができる。
【００４０】
また、図３の中段は二光子励起の場合の特性を示しており、左側の特性は連続発光のピークパワーを、右側の特性はＤＵＴＹ比を５０％とした場合の間欠発光のピークパワーを示している。性能指数ＦＯＭによれば、二光子励起の場合はピークパワーの２乗で性能指数が高くなる。従って、間欠発光の場合、二光子励起の信号強度（＝４×Ｉ０２）は連続発光の信号強度（＝Ｉ０２）に対して４倍となる。また、パルス発光ポイントとパルス非発光ポイントの平均の信号強度においても、二光子励起の平均信号強度（＝２×Ｉ０２）は、連続発光の信号強度（＝Ｉ０２）に対して２倍となる。従って、本実施形態によれば、二光子励起の光源２００において間欠駆動を行うことにより、ピークパワーおよび平均信号強度を高めることが可能である。
【００４１】
図３の下段の特性は、中段の特性を帯域制限のローパスフィルタ（図１に示すローパスフィルタ（ＬＰＦ）３１８）に通過させた信号を示している。帯域制限のローパスフィルタによる処理をＡ／Ｄ変換前に入れるため、オン／オフのデューティ比が５０％（１／２）の場合、Ａ／Ｄ変換前の信号振幅は１／２となり、結果として、二光子励起の間欠発光では２倍の信号振幅を得ることができる。また、オン／オフのデューティ比が１／ｎの場合、ピークパワーがｎ倍になるのであれば、二光子励起で得られる信号振幅はｎ倍になるのでデューティは小さい方が望ましいが、実際には光源２００から得られるピークパワーには上限があるので、デューティ比は１以下の適切な値が選ぶことが好適である。
【００４２】
［３．顕微鏡システムの構成例］
次に、図４に基づいて、顕微鏡本体１００の構成について説明する。図４では、２種類のガルバノミラーを用いた共焦点蛍光顕微鏡の構成例を示している。顕微鏡本体１００は、対象サンプルＳに対して２つのガルバノミラーにより二次元にビーム走査を行なう。
【００４３】
光源２００から射出された励起光は、レンズ等の光学系及び共役位置に設けられたピンホールを透過した後に、励起光を透過させるとともに蛍光を反射させるダイクロイックミラーを透過する。ダイクロイックミラーを透過した励起光は、レンズ等の光学系を透過し、測定サンプルのＸ方向の走査を制御するＸ方向ガルバノミラー１２０によりＸ座標が制御された後に、Ｙ方向の走査を制御するＹ方向ガルバノミラー１３０によりＹ座標が制御され、対物レンズにより測定サンプルＳ上の所望のＸＹ座標に集光される。
【００４４】
測定サンプルから射出された蛍光は、Ｙ方向ガルバノミラー１３０及びＸ方向ガルバノミラー１２０によって反射されて励起光と同じ経路をたどり、ダイクロイックミラーによって反射される。ダイクロイックミラーにより反射された蛍光は、共役位置に設けられたピンホールを透過した後、光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器１１０へと導光される。
【００４５】
ここで、測定サンプル上の集光位置を制御するために用いられる２つのガルバノミラーは、図４に模式的に示したように、ミラーに回転軸が接続されたものである。ガルバノミラー１２０，１３０は、入力された電圧の大きさによって回転軸の回転量が制御され、ミラー面が向いている角度を高速かつ高精度に変更することができる。
【００４６】
なお、図４では一光子励起の場合を示している。二光子励起の場合、ガルバノミラーおよびピンホールを通す必要は無いので、測定サンプルから射出された蛍光を、対物レンズの後段に設けられた光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器へと導光してもよい。
【００４７】
図４に示したようなレーザー走査型の顕微鏡では、２つのガルバノミラー１２０，１３０の動作方法の組み合わせにより、測定サンプルのＸＹ平面を走査する際の励起光の移動の仕方が異なることとなる。以下では、図５を参照しながら、もっとも一般的な走査方式であるラスター・スキャン方式を利用した２次元画像の生成方法について説明する。ラスター・スキャン方式の場合は、水平方向にＸ方向のガルバノミラー１２０で走査し、折り返し近辺を除いた中心部で検出器１１０への戻り光をサンプリングして画像情報とする。
なお、以下の説明では、例えば図５に示した座標系が定義された測定サンプルＳのサンプル平面において、Ｘ方向の走査を制御するガルバノミラー１２０の動作速度が、Ｙ方向の走査を制御するガルバノミラー１３０の動作速度よりも早いものとする。
【００４８】
図５上段に示した図は、サンプル平面の左上部位を走査のスタート地点とした場合に、ＸＹ方向にどのように励起光が移動するかを模式的に示したものである。
ラスター・スキャン方式では、図５の測定サンプルＳのサンプル平面に示したように、Ｘ方向ガルバノミラー１２０が回転して励起光がサンプル平面の左端から右端に向けてＸ方向に移動している期間に、蛍光の検出（画像の取得）が行われる。ラスター・スキャン方式では、Ｘ方向ガルバノミラー１２０が動作している期間は、Ｙ方向ガルバノミラー１３０は静止している。
【００４９】
基本的には、励起光がサンプル平面の右端まで到達すると、蛍光の検出は中断され、Ｘ方向ガルバノミラー１２０は左端に対応する位置まで回転軸の回転角を変更する。この期間、Ｙ方向ガルバノミラー１３０は、１ライン分だけＹ軸正方向にステップ移動する。このような動作をライン数だけ繰り返し、励起光がサンプル平面の右下まで到達すると、Ｘ方向ガルバノミラー１２０及びＹ方向ガルバノミラー１３０は、それぞれ回転軸を大きく回転させて走査のスタート地点に位置を戻すことで、１枚の２次元画像（フレーム）が生成されることとなる。
【００５０】
このようなラスター・スキャン方式では、Ｘ方向ガルバノミラー１２０が動作している間はＹ方向ガルバノミラー１３０が静止しているため、生成される２次元画像を構成する単位（画像構成単位）の形状は、図５上段に示したような長方形となる。
【００５１】
図５下段に示したグラフ図は、時間経過とともにＹ座標がどのように変化するかを示したタイミング・チャートである。１フレームの画像を得るために必要な時間をＴｆｒａｍｅとすると、この時間は、図５下段のタイミング・チャートからも明らかなように、以下の式１１のように表される。ここで、下記式１１において、Ｔｓｃａｎは、走査周期を表しており、Ｎｙは、Ｙ方向のライン数を表しており、ＴＹ＿ａｌｌは、Ｙ方向の戻り時間を表している。
【００５２】
Ｔｆｒａｍｅ＝（Ｔｓｃａｎ）×Ｎｙ＋ＴＹ＿ａｌｌ  ・・・（式１１）
【００５３】
ここで、走査周期Ｔｓｃａｎと、有効走査時間Ｔｅｆｆ及び帰引時間Ｔｂａｃｋとの間には、以下の式１２で表される関係がある。また、Ｙ方向の戻り時間ＴＹ＿ａｌｌは、Ｙ方向の１ライン移動時間をＴｙと表すこととすると、以下の式１３のように表される。ここで、下記式１２における帰引時間Ｔｂａｃｋは、有効走査区間（例えば図５上段のサンプル平面において、Ｘ方向の実線で示した区間）の終わりから次の周期の有効走査区間の始まりまでの移動に要する合計時間を表している。
【００５４】
Ｔｅｆｆ＝Ｔｓｃａｎ−Ｔｂａｃｋ  ・・・（式１２）
ＴＹ＿ａｌｌ＝Ｔｙ×Ｎｙ  ・・・（式１３）
【００５５】
例えば、Ｘ方向ガルバノミラー１２０の走査周波数Ｆｓｃａｎが、７．８ｋＨｚである場合を考える。この場合、走査周期Ｔｓｃａｎは、走査周波数Ｆｓｃａｎの逆数として表されるため、Ｔｓｃａｎ＝１／Ｆｓｃａｎ＝１．２８×１０−４秒となる。また、このガルバノミラーの有効走査時間Ｔｅｆｆが、走査効率に基づいて｛走査周期Ｔｓｃａｎ×（１／３）｝で表される場合、有効走査時間は、４．２７×１０−５秒となり、帰引時間Ｔｂａｃｋは、１．２８×１０−４−４．２７×１０−５＝８．５３×１０−５秒となる。
【００５６】
また、Ｙ方向ガルバノミラー１３０におけるＹ方向の戻り時間Ｔｙが１×１０−６秒であり、Ｙ方向のライン数Ｎｙが５１２ラインであったとすると、上記式１１より、１フレームの撮影のために必要な時間Ｔｆｒａｍｅは、６．６２×１０−２秒となる。フレーム・レートは、Ｔｆｒａｍｅの逆数で表される値であるため、このような走査系では、Ｆｒａｍｅ＿ｒａｔｅ＝１５．１（ｆｒａｍｅ／ｓ）となる。
【００５７】
図５に示すラスター・スキャン方式では、図５上段のサンプル平面に示したように、Ｘ方向ガルバノミラー１２０が回転して励起光がサンプル平面の左端から右端に向けてＸ方向に移動している期間において、有効走査時間Ｔｅｆｆの間だけ光源２００を発光させる。つまり、Ｘ方向の往復スキャンのうち、画像を取得する有効走査期間Ｔｅｆｆのみ光源２００をオンとし、有効走査期間Ｔｅｆｆ以外の期間、方向転換の期間は光源をＯＦＦとする。この際、光源２００のオン／オフは、５０Ｈｚ〜１０ｋＨｚ程度の周波数で行われる。このため、上述したパルス波形Ｐ１による間欠駆動以外にも、有効走査期間Ｔｅｆｆのみ光源２００を発光させるために周期的な発光が行われるため、レーザーの平均パワーを低下させてピークパワーを高めることが可能である。
【００５８】
また、顕微鏡本体１００が画像取得モードでない場合には、光源２００はオフとされる。この際、光増幅器部２４０をオフにすることで光源２００をオフにしても良いし、ＭＬＬＤ自体をオフにしてもよい。
【００５９】
［４．サンプリング周期と間欠発光周期の関係］
光子を検出する光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器１１０はアナログの素子であり、導入された光子を光電変換して電気信号（電流値、電圧値）へ変換する。変換された電気信号は、所定のサンプリング周期でＡ／Ｄ変換される。Ａ／Ｄ変換された信号は、１ピクセルの画像情報に相当する。図６〜図８は、サンプリング周期とパルス波形Ｐ１による間欠発光の周期Ｔを示す特性図である。
【００６０】
図６は、サンプリング周期が間欠発光周期Ｔよりも短い場合を示している。換言すれば、図６は、サンプリング周波数が間欠発光の周波数よりも高い場合を示している。図６の下段の特性において、実線の特性は検出器１１０による光電変換後の電気信号を表しており、破線はサンプリング値を結んだ特性を示している。この場合、発光が行われていないタイミング、すなわち励起されていないタイミングでサンプリングが行われる場合があるため、得られた画像は、隣接するピクセルにおいて、明暗が交互に現れるような画像（斑模様のような、いわゆる歯抜けした画像）となる。
【００６１】
図７は、サンプリング周期が間欠発光周期Ｔよりも長い場合を示している。換言すれば、図７は、サンプリング周波数が間欠発光の周波数よりも低い場合を示している。図６と同様に、実線の特性は検出器１１０による光電変換後の電気信号を表しており、破線はサンプリング値を結んだ特性を示している。この場合、光電変換後の電気信号には、サンプリング周波数よりも高い周波数の電気信号が含まれているため、本来は一定レベルの信号であるにも関わらず、様々な値がサンプリングされることになり、エイリアシングの影響により、正しい波形を再現することができない。このように、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔが非同期の場合は、信号レベルが一定しない。また、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔが同期していれば本来信号レベルは一定だが、非同期の場合は不必要な励起による退色が発生する。また、生体観察の場合、不必要な励起、光毒性により観察対象の細胞等が死滅するなどの弊害も生じる。
【００６２】
図８は、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔを一致させた場合を示している。つまり、図８は、サンプリング周波数が間欠発光の周波数と同一である場合を示している。図８においては、間欠発光周期Ｔのピークでサンプリングが行われるように位相も一致させている。このように、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔが同期していれば、正しい信号が得られ、退色も最小限に抑えることができる。
【００６３】
サンプリング周波数ｆｓは、一例として１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ程度である。基本的には、顕微鏡システム１００側の仕様からサンプリング周波数ｆｓが定まり、サンプリング周波数ｆｓに対して間欠発光の周波数を一致させる。一方、最初に間欠発光の周波数を定め、間欠発光の周波数に対してサンプリング周波数を一致させても良い。
【００６４】
なお、上記以外のパルス発光、走査ビームのオン／オフ信号、または画像取得のオン／オフ信号に関しても、Ａ／Ｄ変換のサンプリング周期と同期していることが望ましいが、必ずしも同期していなくても良い。
【００６５】
サンプリング周期と間欠発光周期Ｔとを一致させるため、図１の光増幅器部２３０によるオン・オフの周期は、光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器１１０が検出した電気信号をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換回路のサンプリング周期と同一とされる。つまり、ＳＯＡドライバ２３４によるオン・オフのクロックと同じものをそのままＡ／Ｄ変換回路へ入力することで、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔとを確実に一致させることができる。これにより、サンプリング及び間欠発光に係る周波数及び位相を同一とすることができる。
【００６６】
なお、図２に示したように、波長変換モジュール２５０から出力されたレーザー光Ｌ３は、間欠発光の発光期間内においてパルス状に発光する。図８では、このパルスが見えない程度のローパスフィルタ（図１に示すローパスフィルタ３１８）で処理した後の発光を示している。この際、後で詳細に説明するが、ローパスフィルタの帯域制限はサンプリング周波数の１／２以下とすることが望ましい。例えば、サンプリング周波数が１ＭＨｚの場合、ローパスフィルタの帯域制限は最大で５００ｋＨｚとする。これにより、ナイキストのサンプリング定理を成立させることができる。従って、サンプリング周期と間欠駆動周期の位相ずれは許容されることになる。
【００６７】
［５．サンプリング周期と間欠駆動周期を一致させるための構成例］
次に、図１に基づいて、サンプリング周期と間欠駆動周期を一致させるための構成を説明する。図１に示すように、制御部３００は、タイミングジェネレータ３０２、サンプリング信号発生部３０４、Ａ／Ｄ変換部３０６、メモリ３０８、ガルバノビーム制御部３１０、ＤＡ変換部３１２、間欠発光信号発生部３１４、発振同期信号注入部３１６、ローパスフィルタ（ＬＰＦ）３１８を有して構成される。
【００６８】
図１に示すように、タイミングジェネレータ３０２はクロックＣＬＫを発生し、サンプリング信号発生部３０４は、クロックＣＬＫに基づいてサンプリング周波数ｆｓのサンプリング信号を発生させる。また、間欠発光信号発生部３１４は、クロックＣＬＫに基づいて間欠発光のための周期Ｔの間欠発光信号を発生させる。これにより、サンプリング信号発生部３４０が発生させるサンプリング信号と、間欠発光信号発生部３１４が発生させる間欠発光信号とを同期させることが可能となる。例えば、サンプリング信号発生部３０４がサンプリング周波数ｆｓとしてクロックＣＬＫをそのまま用い、間欠発光信号発生部３１４が間欠発光信号の周波数としてクロックＣＬＫをそのまま用いることで、サンプリング周期と間欠発光周期Ｔとが一致する。
【００６９】
ローパスフィルタ３１８には、検出器１１０が光電変換して得た電気信号が入力される。ローパスフィルタ３１８は、上述したように、ナイキストのサンプリング定理が成立するように入力された信号を帯域制限し、Ａ／Ｄ変換部３０６へ出力する。Ａ／Ｄ変換部３０６は、入力された信号をサンプリング周波数ｆｓでＡ／Ｄ変換する。ＳＯＡドライバ２４４は間欠発光信号の周波数でレーザー光（パルス波形Ｌ１）をオン・オフし、間欠的なレーザー光（パルス波形Ｌ２）を出力する。
【００７０】
また、ガルバノビーム制御部３１０は、タイミングジェネレータ３０２からクロック信号ＣＬＫの入力を受け、ガルバノミラー１２０，１３０を制御するためのガルバノミラー制御信号を生成する。ガルバノミラー制御信号は、Ｄ／Ａ変換部３１２によってＤ／Ａ変換され、Ｄ／Ａ変換されたガルバノミラー制御信号によってガルバノミラー１２０，１３０が制御される。これにより、ガルバノミラー１２０，１３０もクロックＣＬＫに基づいて制御することができる。上述したようにラスター・スキャン方式では、有効走査時間Ｔｅｆｆの間だけ光源２００を発光させる。このため、間欠発光信号発生部３１４は、クロックＣＬＫに基づいて、間欠発光信号をラスター・スキャンの有効走査時間Ｔｅｆｆの間だけ発生させ、有効走査時間Ｔｅｆｆ以外の間は間欠発光信号をオフとする。同様に、サンプリング信号発生部３０４は、クロックＣＬＫに基づいて、サンプリング信号を有効走査時間Ｔｅｆｆの間だけ発生させる。従って、サンプリング信号及び間欠発光信号は、ガルバノミラーの動作周期に同期することになる。このように、サンプリング信号及び間欠発光信号を有効走査時間Ｔｅｆｆ以外の間はオフとすることによって、平均パワーを低下させることができ、ピークパワーを高めることができる。
【００７１】
［６．ローパスフィルタの構成］
Ａ／Ｄ変換部３０６の前段に設けられたローパスフィルタ３１８は、検出器（ＰＭＴ）１１０の出力をナイキストのサンプリング定理を満たす周波数に帯域制限する。より具体的には、ローパスフィルタ３１８は、検出器１１０の出力をサンプリング周波数の１／２〜１／３の周波数に帯域制限する。例えば、サンプリング周波数が１ＧＨｚである場合、検出器１１０の出力は３００〜５００ｋＨｚ程度に帯域制限される。サンプリング周波数が可変である場合には、ローパスフィルタ３１８の帯域もサンプリング周波数に比例して変更する。
【００７２】
検出器１１０の出力をナイキストのサンプリング定理を満たす周波数に帯域制限することで、サンプリング結果に不要な信号が含まれてしまうことを確実に抑止することができ、画像の再現性を確実に向上させることが可能となる。
【００７３】
［７．レーザー光の発振光パルスとレーザー光の変調との同期］
次に、レーザー光の発振光パルスと間欠発光信号の周期との関係について説明する。本実施形態では、レーザー光の光発振パルスについても、タイミングジェネレータ３０２のクロックＣＬＫと同期させることができる。
【００７４】
モードロックレーザー部２２０から出射されるレーザー光の発振周波数は、光の速度と上述した外部共振器の行路長で決定される。タイミングジェネレータ３０２から注入する信号も共振器の周波数とほぼ同じとされるが、発振同期信号注入部３１６からの発信同期信号の注入によって、システムが有する位相情報を与えることで、システムが有する位相情報を外部共振器と同期させることができる。
【００７５】
このため、発振同期信号注入部３１６は、タイミングジェネレータ３０２のクロック信号ＣＬＫに基づいて、クロックＣＬＫと同期した発振同期信号をバイアスＴｅｅのコンデンサに送る。この発振同期信号は、半導体レーザー２２２用のゲイン電流ＩｇのＡＣ成分として供給される。
【００７６】
そして、クロックＣＬＫと同期した発振同期信号が、半導体レーザー２２２用のゲイン電流ＩｇのＡＣ成分として供給されるため、半導体レーザー２２２から出射されるレーザー光の発振光パルスをクロックＣＬＫと同期させることができる。
【００７７】
以上のように、発振同期信号注入部３１６から、クロックＣＬＫに同期した発振同期信号が半導体レーザー２２２に供給される。これにより、半導体レーザー２２２から出射されるレーザー光の発振光パルスと、クロックＣＬＫとを同期させることが可能となる。
【００７８】
また、上述のように間欠発光信号発生部３１４は、クロックＣＬＫに基づいて間欠発光のための間欠発光信号を発生させ、間欠発光信号によって光増幅器２４０を駆動させるので、光増幅器２４０がクロック信号ＣＬＫと同期してオン・オフ駆動され、クロックＣＬＫと同期してレーザー光が変調される。従って、半導体レーザー２２２から出射されるレーザー光の発振光パルスと、レーザー光の変調とを同期させることができる。これにより、非常に高いパルス光周波数を有するレーザー光であっても、レーザー光の発振光パルスとレーザー光の変調とを容易に同期させることができ、所望の画像を取得することが可能となる。
【００７９】
なお、発振同期信号注入部３１６によるレーザー光の発振光パルスの同期は任意であり、同期を行わなくても良い。特にレーザー光の発振光パルスの周期と間欠発光信号の周期とが大きく相違している場合は、同期を行うことなく所望の画像を取得することができる。
【００８０】
［８．光学的分解能とサンプリング周波数の関係］
レーザー走査顕微鏡の分解能は、励起光源の波長λ［ｍ］に比例する光学的分解能によって決定される。光学的分解能ｄｏは、λ／２または０．６１＊λで見積もられるが、簡単のためにλ／２を使うと、λ＝１０００ｎｍでは光学的分解能ｄｏ＝５００ｎｍとなる。光電変換素子の帯域に制約が無い場合、電気的な分解能ｄｅは、ビーム速度ｖ［ｍ／ｓ］とサンプリング周波数ｆｓ［１／ｓ］によって決定される。
【００８１】
電気的な分解能ｄｅは、ナイキストのサンプリング定理により、サンプリング間隔［ｍ］＝ｖ／ｆｓの１／２になるので、電気的な分解能ｄｅ＝ｖ／（２＊ｆｓ）として計算できる。
【００８２】
ビーム速度ｖ［ｍ／ｓ］は、走査ビームの往復周波数と走査範囲から計算できるので、代表的な数字として往復周波数５００Ｈｚ、走査範囲１ｍｍとして計算すると、１ｍｍの範囲を周期２ｍｓの半分１ｍｓで走査することにより、ｖ＝１［ｍ／ｓ］となる。
【００８３】
この結果、電気的分解能ｄｅは、ｆｓ＝１ＭＨｚではｄｅ＝１［ｍ／ｓ］／（２＊１Ｅ＋６［１／２］）＝５００ｎｍとなり、これは光学的分解能ｄｏと一致する。
【００８４】
以上より、ビーム速度を１０倍に速くする場合であっても、サンプリング周波数としては１０ＭＨｚあれば十分であり、これ以上サンプリング周波数を高くするメリットは存在しないことがわかる。従って、前述した特許文献１からは、本実施形態で説明したような効果を得ることは困難であり、パルス発光に同期した高速サンプリングをしたとしても、分解能が向上することはなく、信号量を増やすことも困難である。
【００８５】
以上説明したように本実施形態によれば、光源２００からのレーザー光を間欠発光させ、間欠発光の周期と検出器１１０から得られた画像の電気信号のサンプリング周期を一致させるようにした。これにより、斑模様、歯抜けした画像が得られることを確実に抑止することができ、また、エイリアシングの影響により正しい波形が再現できなくなることを確実に抑止できる。更に、レーザー光の不必要な励起を抑えることができ、光毒性により観察対象の細胞等が死滅するなどの弊害も抑止することができる。
【００８６】
以上、添付図面を参照しながら本開示の好適な実施形態について詳細に説明したが、本開示の技術的範囲はかかる例に限定されない。本開示の技術分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本開示の技術的範囲に属するものと了解される。
【００８７】
なお、以下のような構成も本開示の技術的範囲に属する。
（１）所定の周波数のレーザー光を出射するモードロックレーザー部と、
前記モードロックレーザー部から出射されるレーザー光を所定の間欠発光周期で間欠発光させる間欠発光部と、
間欠発光された前記レーザー光を受けて対象物から励起した蛍光体を電気信号に変換する検出器と、
前記電気信号を前記間欠発光周期と同期したサンプリング周期でサンプリングするＡ／Ｄ変換部と、
を備える、レーザー走査型顕微鏡システム。
（２）前記サンプリング及び前記間欠発光に係る周波数及び位相が同一である、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（３）前記モードロックレーザー部は、二光子励起のための前記レーザー光を出射する、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（４）前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号と、前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号とが同一の信号である、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（５）前記Ａ／Ｄ変換部に対して前記サンプリング周期を与えるサンプリング信号を発生させるサンプリング信号発生部と、
前記間欠発光部に対して前記間欠発光周期を与える間欠発光信号を発生させる間欠発光信号発生部と、を更に備え、
前記サンプリング信号と前記間欠発光信号とを同一のクロックに基づいて発生させる、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（６）前記モードロックレーザー部又は前記間欠発光部は、前記レーザー光を所定の有効発光期間のみ前記対象物に入射させる、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（７）前記レーザー光を前記対象物の表面の第１の方向へ走査する第１のガルバノミラーと、
前記レーザー光を前記対象物の表面の前記第１の方向と直交する第２の方向へ走査する第２のガルバノミラーと、
前記第１及び第２のガルバノミラーを制御するガルバノミラー制御部と、を備え、
前記ガルバノミラー制御部は、前記第１の方向への走査が完了すると、前記第１の方向の始点位置に前記レーザー光を戻すとともに、前記レーザー光の１ライン分だけ前記第２の方向への走査を行い、その後、再び前記第１の方向への走査を行い、
前記有効発光期間は、前記第１の方向へ走査を行う期間の少なくとも一部である、前記（６）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（８）前記検出器から出力された前記電気信号を帯域制限して前記Ａ／Ｄ変換部へ入力するローパスフィルタを備え、
前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数に対してナイキストのサンプリング定理が成立するように前記帯域制限を行う、前記（１）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
（９）前記ローパスフィルタは、前記サンプリングの周波数の１／２以下となるように前記帯域制限を行う、前記（８）に記載のレーザー走査型顕微鏡システム。
【符号の説明】
【００８８】
１０００    顕微鏡システム
１１０    検出器
２２０    モードロックレーザー部
２４０    光増幅器部（ＳＯＡ部）
３０６    Ａ／Ｄ変換部
【図１】
2014232241.tif 000003
【図２】
2014232241.tif 000004
【図３】
2014232241.tif 000005
【図４】
2014232241.tif 000006
【図５】
2014232241.tif 000007
【図６】
2014232241.tif 000008
【図７】
2014232241.tif 000009
【図８】
2014232241.tif 000010