(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌剤及び、治療法の提供。【解決手段】対象内の非腫瘍原性および腫瘍原性の癌細胞を死滅させるように、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路阻害剤（例えば、抗-ＣＸＣＲ１抗体またはレペルタキシン）単独で、または追加の化学療法剤と併用して投与することによって、癌を治療する方法を提供する。また、（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の存在に基づいて）患者の固形腫瘍幹細胞の存在を検出し、それらを単離するための組成物および方法も提供する。【選択図】図１
2014037427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する対象を治療するための治療薬であって、ＣＸＣＲ１拮抗薬またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬である化合物を含んでおり、前記対象に化合物を投与するための、治療薬。
【請求項２】
前記化合物は、レパルタキシン（Ｒｅｐａｒｔａｘｉｎ）またはレパルタキシン誘導体である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記ＣＸＣＲ１拮抗薬またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項４】
前記腫瘍は、前立腺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、乳癌幹細胞、皮膚癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、小細胞肺癌幹細胞、および食道腺癌幹細胞からなる群から選択される癌幹細胞を含む、請求項１に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２００８年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１１３，４５８号に対する優先権を主張し、その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔連邦支援の調査または開発に関する記述〕
本発明は、ＮＩＨ（国立衛生研究所）付与の助成金番号ＣＡ６６２３３、ＣＡ１０１８６０、および５Ｐ３０ＣＡ４６５９２の下、政府支援を受けて行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
〔技術分野〕
本発明は、対象内の非腫瘍原性および腫瘍原性の癌細胞を死滅させるように、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路阻害剤（例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体またはレペルタキシン（Ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ））単独で、または追加の化学療法剤と併用して投与することによって、癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の存在に基づいて）患者の固形腫瘍幹細胞の存在を検出し、それらを単離するための組成物および方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
〔背景技術〕
癌はわが国における第２の死亡原因であり、毎年５００，０００人超が死亡している。検出および治療の発達にも関わらず、癌による死亡率は高いままである。分子基盤の癌の解明の著しい進歩にも関わらず、この知識は、未だ効果的な治療方針に活かされていない。
【０００５】
特に、乳癌は米国の女性にとって最も一般的な癌であり、一生涯のうち約９人に１人が乳癌を発症する。残念なことに、転移性乳癌は未だ不治の病である。転移性乳癌のほとんどの女性は、この疾病で死亡している。
【０００６】
従来の治療法（放射線療法、化学療法、およびホルモン療法）は有用ではあるが、治療抵抗性の癌細胞の発現によって制限されている。明らかに、転移性乳癌および癌一般の治療のための標的を特定する新アプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、対象内の非腫瘍原性および腫瘍原性の癌細胞を死滅させるように、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路阻害剤（例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体またはレペルタキシン）単独で、または追加の化学療法剤と併用して投与することによって、癌を治療する方法を提供する。本発明は、（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の存在に基づいて）患者の固形腫瘍幹細胞の存在を治療および診断するための組成物および方法も提供する。
【０００８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路拮抗薬および追加の化学療法剤を対象に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、癌幹細胞の少なくとも一部および非腫瘍原性の癌細胞の少なくとも一部が死滅する条件下で対象にレペルタキシンまたはその誘導体を投与することを含む、対象の癌幹細胞および非腫瘍原性の癌細胞を低減または排除する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、癌幹細胞の少なくとも一部および非腫瘍原性の癌細胞の少なくとも一部が死滅する条件下で対象にＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路拮抗薬および追加の化学療法剤を投与することを含む、対象の癌幹細胞および非腫瘍原性の癌細胞を低減または排除する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路拮抗薬および追加の化学療法剤を含む組成物またはキットを提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路拮抗薬は、ＩＬ８がＣＸＣＲ１に結合するのを特異的に遮断する作用因子を含む。幾つかの実施形態では、作用因子は、ＣＸＣＲ１に結合する（特異的である）が、ＣＸＣＲ２には結合しない。他の実施形態では、作用因子はＣＸＣＲ１に結合する。具体的な実施形態では、作用因子は抗ＣＸＣＲ１抗体または抗体フラグメントを含む。追加の実施形態では、作用因子はレペルタキシンまたはその誘導体を含む。さらなる実施形態では、追加の化学療法剤は抗有糸分裂化合物を含む。特定の実施形態では、抗有糸分裂化合物は、ドセタキセル、ドキソルビシン、パクリタキセル、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、コルヒチン、ポドフィロトキシン、ステガナシン、およびコンブレタスタチンからなる群から選択される。他の実施形態では、抗有糸分裂化合物は、ニチニチソウアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）；またはベンズイミダゾールカルバメート、例えばノコダゾール；またはコルヒチンもしくは関連の化合物、例えばポドフィロトキシン、ステガナシン、もしくはコンブレタスタチン；またはタキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルである。特定の実施形態では、追加の化学療法剤はドセタキセルを含む。
【００１０】
具体的な実施形態では、化学療法で治療される時、対象はＩＬ−８生成レベル（例えば、運動する癌幹細胞数の増加を引き起こす）が高くなるタイプの癌を有する。幾つかの実施形態では、対象は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、および食道腺癌からなる群から選択されるタイプの癌を有する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）対象の腫瘍から採取した試料、およびｉｉ）ＣＸＣＲ１タンパク質またはＦＢＸＯ２１タンパク質（または表１からの別のタンパク質）に対して特異的な、抗体または抗体フラグメント（または他の結合分子）を提供することと、ｂ）ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋固形腫瘍幹細胞の有無が検出される条件下で、組織試料を抗体または抗体フラグメントに接触させることと、を含む、固形腫瘍幹細胞を検出する方法を提供する。
【００１２】
具体的な実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、シグナル分子に接合している。さらなる実施形態では、シグナル分子は蛍光分子を含む。他の実施形態では、シグナル分子は、比色基質の存在下で発色反応を触媒することができる酵素を含む。特定の実施形態では、抗体または抗体フラグメントに対して特異的な試料を第２の抗体または第２の抗体フラグメントに接触させることを含む。他の実施形態では、第２の抗体または第２の抗体フラグメントは、シグナル分子を含む。具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１＋固形腫瘍幹細胞の有無を決定するために他のタンパク質または核酸が検定されない。追加の実施形態では、腫瘍は、前立腺癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、乳癌腫瘍、黒色腫、非小細胞肺癌腫瘍、小細胞肺癌腫瘍、および食道腺癌腫瘍からなる群から選択される。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ａ）切り離された細胞を生成するために固形腫瘍を切り離すこと、ｂ）切り離された細胞をＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１（または表１からの他のタンパク質）を結合する試料に接触させること、ｃ）固形腫瘍幹細胞の濃縮された集団が生成される条件下で試薬に結合する細胞を選択することと、を含む、固形腫瘍幹細胞集団を濃縮させる方法を提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、固形腫瘍幹細胞の濃縮された集団を生成するために用いられる追加の試薬はない。幾つかの実施形態では、腫瘍は、前立腺癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、乳癌腫瘍、黒色腫、非小細胞肺癌腫瘍、小細胞肺癌腫瘍、および食道腺癌腫瘍からなる群から選択される。さらなる実施形態では、試薬は抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）である。追加の実施形態では、試薬は蛍光色素または磁気粒子に接合される。他の実施形態では、細胞選択はフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類、選鉱、親和性カラム分離、または磁気選択によって実行される。
【００１５】
具体的な実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法によって単離される固形腫瘍幹細胞の濃縮された集団を提供する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、本発明は、ａ）腫瘍原性で、ｂ）ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋である、癌幹細胞の単離された集団を提供する。特定の実施形態では、癌幹細胞は、前立腺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、乳癌幹細胞、皮膚癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、小細胞肺癌幹細胞、および食道腺癌幹細胞、からなる群から選択される癌幹細胞である。他の実施形態では、集団は、少なくとも６０％の癌幹細胞および４０％未満の非腫瘍原性の腫瘍細胞を含む。さらなる実施形態では、癌幹細胞は、未分画の非腫瘍原性の腫瘍細胞と比較して少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、．．．、１０倍、．．．、１００倍、１０００倍）の濃度である。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本発明は、腫瘍から癌幹細胞および非腫瘍原性の腫瘍細胞を含む、少なくとも６０％が腫瘍原性の幹細胞であり、４０％以下が非腫瘍原性の腫瘍細胞である細胞組成を獲得するための、ａ）腫瘍から腫瘍細胞の切り離された混合物を獲得し、ｂ）腫瘍細胞の混合物を、少なくとも６０％の癌幹細胞および４０％以下の非腫瘍原性の腫瘍細胞を含む第１の分画と、癌幹細胞を枯渇した腫瘍細胞の第２の分画とに分離することであって、混合物をＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１に対する試薬と接触させて分離することと、ｃ）ｉ）第１の宿生動物への連続注射によって第１の分画が腫瘍原性であることと、第２の宿生動物への連続注射によって第２の分画が非腫瘍原性であることとを示すことと、を含む方法を提供する。特定の実施形態では、分離はフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、選鉱、親和性クロマトグラフィー、または磁気選択によって実行される。幾つかの実施形態では、分離は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析によって実行される。
【００１８】
具体的な実施形態では、本発明は、（ａ）患者から試料を獲得し、（ｂ）試料内のＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋固形腫瘍幹細胞の存在を特定し、（ｃ）ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋固形腫瘍幹細胞を標的とする患者のための治療法を選択（例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体または抗体フラグメントの使用を選択）することを含む、固形腫瘍を有する患者のための治療法を選択する方法を提供する。特定の実施形態では、ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋固形腫瘍幹細胞は、前立腺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、乳癌幹細胞、皮膚癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、小細胞肺癌幹細胞、および食道腺癌幹細胞からなる群から選択される癌幹細胞である。
【００１９】
幾つかの実施形態では、本発明は、ａ）抗腫瘍性化合物候補はＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１拮抗薬またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を含み、ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋癌幹細胞を含む試料をその抗腫瘍性化合物候補に触れさせることと、ｂ）化合物に応じて細胞内の変化を検出することと、を含む、化合物を選抜する方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、試料は非接着性マンモスフィアを含む。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ１もしくはＦＢＸＯ２１拮抗薬またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、抗体または抗体フラグメントを含む。幾つかの実施形態では、ＣＸＣＲ１拮抗薬は、レパルタキシン（Ｒｅｐａｒｔａｘｉｎ）の誘導体である。他の実施形態では、検出は腫瘍原性の乳腺細胞の細胞死を検出することを含む。さらなる実施形態では、方法は、腫瘍原性の細胞ならびに非腫瘍原性の癌細胞を死滅させることができる抗癌薬候補を特定することをさらに含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ａ）固形腫瘍幹細胞が、：ｉ）未分画の腫瘍細胞に比較して少なくとも２倍の濃度であり、ｉｉ）ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１を示す発現する、濃縮された固形腫瘍幹細胞を獲得し、ｂ）検査化合物に、固形腫瘍幹細胞の第２のセットではなく、第１のセットを触れさせ、ｃ）固形腫瘍幹細胞の第１のセットを第１の宿生動物に注射し、固形腫瘍幹細胞の第２のセットを第２の宿生動物に注射し、そしてｄ）検査化合物が腫瘍形成を阻害するかどうかを決定するために、もし存在する場合、第１の動物内の腫瘍を第２の動物に形成された腫瘍と比較すること、を含む固形腫瘍幹細胞の腫瘍形成を阻害するための検査化合物の能力を決定するための方法を提供する。具体的な実施形態では、検査化合物はＣＸＣＲ１もしくはＦＢＸＯ２１阻害剤、またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１阻害剤経路阻害剤である。
【００２２】
さらなる実施形態では、本発明は、ａ）少なくとも６０％の固形腫瘍幹細胞を含み、固形腫瘍幹細胞がＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１を発現する試料を獲得することと、ｂ）固形腫瘍幹細胞を第１および第２の宿生動物に注射することと、ｃ）検査化合物で第１の宿生動物を治療し、検査化合物で第２の宿生動物を治療しないことと、ｄ）検査化合物が腫瘍形成を阻害するかどうかを決定するために、もし存在する場合、第１の動物内の腫瘍を第２の動物に形成された腫瘍と比較することと、を含む固形腫瘍幹細胞の腫瘍形成を阻害するための検査化合物の能力を決定するための方法を提供する。他の実施形態では、検査化合物はＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１阻害剤またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９）からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞集団が、癌幹細胞特性を有することを示す。Ａ−Ｂ、Ｇ−Ｈ。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ａ−Ｂ）およびＳＵＭ１５９細胞（Ｇ−Ｈ）内のＡＬＤＨ酵素活性の代表的フローサイトメトリー分析。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定は以下の実施例１に記載のように実行された。（Ｃ、Ｉ）ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に当初の腫瘍の表現型の不均一性を繰り返した腫瘍を生成することができた。（Ｆ、Ｌ）腫瘍の成長曲線は、注射された細胞の様々な数（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３については５０，０００細胞、５，０００細胞、および５００細胞、ならびにＳＵＭ１５９については１００，０００細胞、１０，０００細胞、および１，０００細胞）、およびそれぞれの集団（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性、分離されていない）についてプロットした。腫瘍成長速度は、腫瘍形成の潜伏かつ規模ならびにＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞（Ｆ、Ｌ）の数に相関する。（Ｄ、Ｊ）腫瘍細胞の存在を明らかにする、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の注射部位（Ｄ：ＭＤＡ−ＭＢ−４５３  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の注射部位、およびＪ：ＳＵＭ５９  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の注射部位）のＨ＆Ｅ染色。（Ｅ、Ｋ）残留マトリゲル、アポトーシスを起こした細胞、およびマウスの組織のみが含まれたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞の注射部位（Ｅ：ＭＤＡ−ＭＢ−４５３  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞の注射部位、およびＫ：ＳＵＭ５９ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞の注射部位）。データは平均±標準偏差を表す。
【図２】「癌幹細胞シグネチャー」に基づく乳腺細胞株から単離されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団の分類を示す。図２Ａ４１３遺伝子発現シグネチャーに基づく１６試料の階層的構造形成。データマトリックスの各行は、１遺伝子を表現し、各列は、１試料を表現する。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性（下線有りの名称）と陰性試料（下線無しの名称）との間の１６中１５試料の４１３遺伝子での分離を記述。そのシグネチャーに含まれる幾つかの遺伝子は、「Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子」（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内で下方制御された遺伝子は緑に分類され、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内で上方調節された遺伝子は赤に分類される）で使用されるようなＨＵＧＯ略称によって称される。図２Ｂ−Ｃ。遺伝子発現結果を確認するために、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ表現型に分類された１セットの５乳癌細胞株内で、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団（ＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡ、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２およびＲＡＤ５１Ｌ１）内で過剰発現した５つの識別遺伝子の発現は、定量のＲＴ−ＰＣＲによって測定された。ＣＸＣＲ１およびＦＢＸＯ２１の定量のＲＴ−ＰＣＲ発現レベルは、この図で表現される。定量のＲＴ−ＰＣＲによって測定される遺伝子発現レベルは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団に比較してＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内でＣＸＣＲ１およびＦＢＸＯ２１ｍＲＮＡレベルの上昇によって、ＤＮＡマイクロアレイを使用して獲得される結果を裏付ける（ｐ＜０．０５）。
【図３】乳癌幹細胞の制御におけるＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸の役割を示す。Ａ．細胞発現ＣＸＣＲ１は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団に含まれる。４つの異なる乳腺細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＳＵＭ１５９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢｒＣａ−ＭＺ−０１）からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団は、ＦＡＣＳによって単離され、固定され、そして免疫染色およびＦＡＣＳ分析によってＣＸＣＲ１タンパク質の発現について分析される。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団に比較してＣＸＣＲ１陽性細胞内で高く濃縮された。Ｂ．３つの異なる細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＳＵＭ１５９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）の腫瘍球形成へのＩＬ８治療法の効果。ＩＬ８治療法は、用量依存的に第１および第２の腫瘍球の形成を増加させた。Ｃ．付着条件で培養された４つの異なる細胞株のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団へのＩＬ８治療法の効果。ＩＬ８は、４つの分析された細胞株のそれぞれで、用量依存的にＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を増加させた。（＊ｐ＜００５／＊＊ｐ＜００１、対象群と統計的に優位な差異）。
【図４】ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、増加した転移能を表示することを示す。Ａ．ＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸は、癌幹細胞浸潤を伴う。浸潤内のＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸の役割は、３つの異なる細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９）のための誘引物質として血清またはＩＬ８を使用するマトリゲル浸潤検定によって評価された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞より６〜２０倍高く浸潤する（ｐ＜００１）。ＩＬ８（１００ｎｇ／ｍＬ）を誘引物質として使用した時、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の著しい増加は、誘引物質としての血清と比較してマトリゲルを通して浸潤していることが観察された（ｐ＜００５）。対照的に、ＩＬ８は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団浸潤能には何も効果が無かった。Ｂ−Ｍ．ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、転移能の上昇を示した。Ｂ〜Ｄ．それぞれの群（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性、分離されていない）から１００，０００発光酵素感染細胞の接種に続いて、一週間間隔で測定された標準光子束の定量化。心臓内に投与されたＳＵＭ１５９細胞への接種に続いて、一週間間隔で測定された標準光子束の定量化を示す。Ｅ〜Ｊ．生物発光画像法ソフトウェアを利用した転移の検出（Ｅ、Ｇ、Ｉ：うつ伏せマウス；Ｆ、Ｈ、Ｊ：仰向けマウス）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞を接種されたマウスは、異なる部位に局在する種々の転移を発症し（骨、筋肉、肺、軟組織）、分離されていない細胞を接種されたマウスより高い光子束発散を示したが、分離されていない細胞を摂取されたマウスでは、１マウスあたりわずか１移転の発症だった。対照的に、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞を接種されたマウスは、たった１つの偶発的な小さい転移を発症したが、それはリンパ節に限定されていた。Ｋ−Ｍ．骨（Ｋ）、軟組織（Ｌ）および筋肉（Ｍ）内のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の注射に起因する転移のＨ＆Ｅ染色による組織学的確認。
【図５】腫瘍細胞生存能力（図５Ａ）上ならびに癌幹細胞生存能力（図５Ｂ）上のＣＸＣＲ１抑制効果を示す。
【図６】レペルタキシン治療法は、ＦＡＳ／ＦＡＳリガンドのシグナル伝達によって媒介されるバイスタンダー効果を誘導して、レペルタキシン治療法によって誘導された細胞成長抑制は、ＦＡＳ拮抗薬の追加によって部分的に救助され、ＦＡＳ作用薬で治療された細胞は、レペルタキシンで治療された細胞と同様の細胞成長抑制を示すことを特異的に示す。
【図７】レペルタキシン（７Ｂ）の存在下でのＦＡＫの活性化、ＡＫＴおよびＦＯＸＯＡ３のレペルタキシン治療（７Ａ）無しでの活性化を示す。
【図８】１つの乳癌細胞株（８Ａ、ＳＵＭ１５９）および異なる患者（８Ｂ、ＭＣ１、８Ｃ、ＵＭ２、および８Ｄ、ＵＭ３）から生成した３つの人体乳癌異種移植でのレペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用の効果を示す。
【図９】ＳＵＭ１５９（９Ａ）、ＭＣ１（９Ｂ）、ＵＭ２（９Ｃ）、ＵＭ３（９Ｄ）を含む種々の細胞株でＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定によって評価された癌幹細胞集団における、レペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用の効果を示す。
【図１０】第２のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に移植された第１の腫瘍（１０Ａ。ＳＵＭ１５９、１０Ｂ。ＭＣ１、１０Ｃ。ＵＭ２、１０Ｄ。ＵＭ３）の連続希釈法でのレペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用の効果を示す。
【図１１】レペルタキシン治療法は、ＳＵＭ１５９細胞株の転移能を低下させることを示す。図１１Ａは、心臓内に投与されたＳＵＭ１５９細胞での接種に続いて、一週間間隔で測定された標準光子束の定量化を示す。転移形成は、生物発光画像法を使用してモニターされた。（１１Ｂ：生理食塩水で処理されたマウス、１１Ｃ：レペルタキシンで処理されたマウス）。
【図１２】ＳＵＭ１５９細胞のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性サブ集団とＣＸＣＲ１陽性サブ集団（上位）またはＣＸＣＲ２陽性サブ集団（下位）との間の重複表現を示す。Ｂ−Ｃ．ＳＵＭ１５９細胞は、付着条件で培養され、レペルタキシン（１００ｎＭ）またはＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２に対する２つの特定の遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）（１０μｇ／ｍＬ）で処理される。３日後、癌幹細胞集団における効果は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定（Ｂ）を使用して分析され、細胞生存能力は、ＭＴＴ検定（Ｃ）を使用して処理５日後に評価された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団および細部生存能力の著しい低下が、レペルタキシンまたは抗ＣＸＣＲ１抗体での治療に続いて観察された。対照的に、抗ＣＸＣＲ２抗体では著しい効果は観察されなかった。Ｄ．治療から４日後、アポトーシスを起こした細胞の数は、ＴＵＮＥＬ検定を利用して評価された。ほとんどの生存細胞（青に染色）が存在した対照に比較して、３６％のアポトーシスを起こした細胞（緑に染色）が、レペルタキシン治療細胞で検出された。Ｅ−Ｆ．細胞死はバイスタンダー効果に媒介されたものかどうかを決定すること。ＣＸＣＲ１陽性およびＣＸＣＲ１陰性集団は、フローが分類され、種々の濃度のレペルタキシン（Ｄ）で治療されたそれぞれの集団であった。ＣＸＣＲ１陽性および分類されていない集団での細胞生存能力の低下が検出された一方で、ＣＸＣＲ１陰性集団（Ｅ）内では効果が観察されなかった。レペルタキシンで３日間治療されたＣＸＣＲ１陽性細胞からの透析培養（ｄＣＭ）は、分類されたＣＸＣＲ１陽性、ＣＸＣＲ１陰性、または分類されていない集団を治療するために利用された。透析培養の連続希釈が利用された（対照、ｄＣＭ１／４、ｄＣＭ１／２、ｄＣＭ３／４、ｄＣＭ）。治療の２日後、細胞生存能力は、ＭＴＴ検定を利用して評価された。細胞生存能力の大幅な低下が、ＣＸＣＲ１陰性および分離されていない集団の両方で観察された一方で、ＣＸＣＲ１陽性集団（Ｆ）内では、効果が観察されなかった。
【図１３】ＳＵＭ１５９細胞株からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性細胞集団の腫瘍形成能を示す。Ａ．腫瘍成長曲線は、接種された異なる細胞数（５０，０００細胞、５，０００細胞、１，０００細胞、および５００細胞）およびそれぞれの集団（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性）をプロットした。両方の細胞集団は、腫瘍を生成した。腫瘍成長速度は、腫瘍形成の潜伏かつ規模ならびに接種細胞の数に関連付けられる。Ｂ−Ｃ．ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性集団によって生成された腫瘍は、連続継代で当初の腫瘍の表現型の不均一性を再構成したが、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性集団はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性細胞のみを含む腫瘍を生じさせた。我々は、両細胞集団を３つの継代に移植した。
【図１４】腫瘍球形成におけるＣＸＣＲ１遮断の効果を示す。ＳＵＭ１５９およびＨＣＣ１９５４細胞は、付着条件で培養され、３日間、レペルタキシン（１００ｎＭ）、抗ＣＸＣＲ１遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）、または抗ＣＸＣＲ２遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）で処理された。処理の３日後、細胞は切り離されて懸濁液で培養された。培養から５日後に形成された腫瘍球の数が、評価された。レペルタキシンおよび抗ＣＸＣＲ１−処理条件で、対照と比較して第１および第２の腫瘍球形成の著しい低下という同様の結果が両方の細胞株で観察された。対照的に、抗ＣＸＣＲ２遮断抗体は、腫瘍球形成に何の効果も無かった。
【図１５】ＳＵＭ１５９、ＨＣＣ１９５４、およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株の細胞生存能力におけるレペルタキシン治療の効果を示す。３つの異なる細胞株（ＳＵＭ１５９、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）は、付着条件で培養され、レペルタキシン（１００ｎＭ）で処理された。細胞生存能力は、ＭＴＴ検定を使用した処理の１日、３日、および５日後に評価された。ＳＵＭ１５９およびＨＣＣ１９５４細胞株の処理の３日後に、細胞生存能力の低下が観察された。しかし、レペルタキシンは、ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞の生存能力に影響しなかった。
【図１６】インビトロのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団におけるＣＸＣＲ１遮断の効果を示す。Ａ−Ｂ．ＨＣＣ１９５４（Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ｂ）細胞は、付着条件で培養され、レペルタキシン（１００ｎＭ）、またはＣＸＣＲ１もしくはＣＸＣＲ２に対する２つの特定の抗体（それぞれ１０μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ）で処理された。３日後、癌幹細胞集団における効果は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定を使用して分析された。ＨＣＣ１９５４では、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団および細部生存能力の著しい低下が、レペルタキシンまたは抗ＣＸＣＲ１抗体での治療に続いて観察された。対照的に、抗ＣＸＣＲ２抗体（Ａ）では著しい効果は観察されなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３では、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団において何の効果も観察されなかった（Ｂ）。
【図１７】ＦＡＳ／ＦＡＳリガンドのシグナル伝達によって媒介されるバイスタンダー効果を誘導するレペルタキシン治療法を示す。Ａ．レペルタキシン治療法によって誘導されたバイスタンダー殺傷効果がＦＡＳ−リガンドによって媒介されたかを決定するために、培地の可溶性ＦＡＳリガンドのレベルが、ＥＬＩＳＡ検定を利用して測定された。治療法から４日後、治療していない対照に比較して、可溶性ＦＡＳリガンドの４倍を超える増加がレペルタキシンで治療した細胞の培養で検出された。Ｂ．ＦＡＳリガンドｍＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲで測定され、レペルタキシンでの治療法後に、ＦＡＳリガンドの産出が増加することが確認された。ＦＡＳシグナル伝達を活性化させるＦＡＳ作用薬で治療法の４日後に、対照と比較してＦＡＳリガンドｍＲＮＡの増加が５倍になるという同様の結果が観察された。Ｃ．ＳＵＭ１５９細胞は付着条件で培養され、レペルタキシン単独で、または抗ＦＡＳリガンドと併用して処理された。レペルタキシン処理で誘導される細胞成長抑制は、抗ＦＡＳリガンドの追加によって部分的に救助された。ＦＡＳ作用薬で処理された細胞は、レペルタキシン単独で処理された細胞と同様の細胞成長抑制を示した。Ｄ−Ｅ．ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団におけるレペルタキシン処理単独、または抗ＦＡＳリガンドと併用で、ならびに、ＦＡＳ作用薬の治療の効果が分析された。レペルタキシン治療法によって誘導されたＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団における大幅な減少は、抗ＦＡＳリガンドによって救助されず、ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団の割合をそれぞれ１０倍および３倍増加させた。
【図１８】ＣＸＣＲ１陽性およびＣＸＣＲ１陰性細胞におけるＦＡＳ作用薬の効果を示す。ＣＸＣＲ１陽性およびＣＸＣＲ１陰性集団はフローが分類され、各集団は種々の濃度のＦＡＳ作用薬で処置された。ＣＸＣＲ１陰性および分類されていない集団内の細胞生存能力の低下は検出されたが、ＣＸＣＲ１陽性集団内では何の効果も観察されなかった。
【図１９】正常乳腺幹／前駆集団でのＣＸＣＲ１タンパク質発現およびマンモスフィア形成におけるＩＬ−８治療法の効果の分析を示す。Ａ．整復乳房形成から単離された正常乳房上皮細胞からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団は、ＦＡＣＳによって単離され、固定され、そして免疫染色およびＦＡＣＳ分析によってＣＸＣＲ１タンパク質の発現について分析された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団に比較して、ＣＸＣＲ１陽性細胞内で高度に濃縮されていた。Ｂ−Ｃ．マンモスフィア形成におけるＩＬ８治療法の効果。ＩＬ８治療法は、用量依存的に、第１のマンモスフィアの形成（Ｂ）および第２のマンモスフィアの形成（Ｃ）を増加させた。
【図２０】正常乳房上皮細胞におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。Ａ．整復乳房形成から単離された正常乳房上皮細胞は、付着条件で培養され、レペルタキシン（１００ｎＭまたは５００ｎＭ）またはＦＡＳ作用薬（５００ｎｇ／ｍＬ）で処理された。処理の５日後細胞生存能力は、ＭＴＴ検定を使用して評価された。レペルタキシン治療法またはＦＡＳ作用薬は、高濃度のレペルタキシン（５００ｎＭ）が利用された時でさえ、付着条件で培養された正常乳房上皮細胞の生存能力に何の効果も無かった。Ｂ．可溶性ＦＡＳ−リガンドのレベルは、レペルタキシンで処理された正常乳房上皮細胞の培地内でＥｌｉｓａ検定によって評価された。処理の４日後、可溶性ＦＡＳ−リガンドの増加は、処理細胞から培養において検出された。Ｃ．ＦＡＣＳ分析による正常乳房上皮細胞内のＦＡＳ／ＣＤ９５発現の分析。ＦＡＳ／ＣＤ９５発現は、付着条件で培養された正常乳房上皮細胞内で検出されなかった。Ｄ．マンモスフィア形成におけるレペルタキシン治療法の効果。正常乳房上皮細胞は、付着条件で培養され、レペルタキシン（１００ｎＭ）で４日、８日、１１日、および１５日間処理された。レペルタキシン治療法の後、細胞は分離され、懸濁液内で培養された。マンモスフィアを引き起こす細胞の著しい減少は、レペルタキシン処理条件において観察された。
【図２１】ＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＦＯＸＯ３ａ活性化におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。ＣＸＣＲ１下流シグナル伝達におけるレペルタキシン治療法の効果を評価するために、２つの異なるウイルス構築物が利用され、１つは、ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを通じてＰＴＥＮ発現をノックダウンし、もう１つはＦＡＫの過剰発現（Ａｄ−ＦＡＫ）を引き起こす。Ａ．ＳＵＭ１５９対照、ＳＵＭ１５９ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ、およびＳＵＭ１５９Ａｄ−ＦＡＫ細胞は、１００ｎＭのレペルタキシンが存在するまたは存在しない付着条件で２日間培養され、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の活性化は、ウエスタンブロット法によって評価された。ＰＴＥＮ欠失およびＦＡＫ過剰発現がＦＡＫおよびＡＫＴ活性におけるレペルタキシン治療法の効果を遮断したが、レペルタキシン治療法は、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応の減少を引き起こした。Ｂ．ＣＸＣＲ１陽性細胞において免疫蛍光染色を利用して、レペルタキシン治療法が、ホスホＦＡＫの消失（赤に膜質染色）およびホスホＡＫＴ発現（赤に細胞質染色）という結果になることを確認した。抗ＦＯＸＯ３Ａでの免疫蛍光染色は、未処理細胞内のＦＯＸＯ３ａの細胞質の位置を（赤に）明らかにし、一方で、レペルタキシン治療法が核へＦＯＸＯ３Ａの再度の位置決めを誘導した。対照的に、ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現の細胞は、レペルタキシン処理および未処理細胞の両方で、高レベルのホスホＦＡＫ、ホスホＡＫＴ、および細胞質ＦＯＸＯ３Ａの発現を示す。全ての試料で、核は、ＤＡＰＩで対比染色された（青に）。Ｃ−Ｄ．ＳＵＭ１５９ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡおよびＳＵＭ１５９Ａｄ−ＦＡＫ細胞生存能力、ならびに癌幹細胞集団におけるレペルタキシンの効果は、ＭＴＴおよびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定を利用して、それぞれ評価された。処理の３日後、ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現の細胞は、レペルタキシン（Ｃ）への抵抗力を向上した。レペルタキシン治療法は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性ＳＵＭ１５９ＰＴＥＮノックダウン細胞の割合を変更しなかった（Ｄ）。
【図２２】ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株内のＦＡＫ／ＡＫＴ活性におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。ＣＸＣＲ１下流シグナル伝達におけるレペルタキシン治療法の効果を評価するために、ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを通じてＰＴＥＮ発現をノックダウンする、レンチウイルス構築物を利用した。Ａ．ＨＣＣ１９５４対照およびＨＣＣ１９５４ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ細胞は、１００ｎＭのレペルタキシンが存在するまたは存在しない付着条件で２日間培養され、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の活性化は、ウエスタンブロット法によって評価された。ＰＴＥＮ欠失が、ＦＡＫおよびＡＫＴ活性におけるレペルタキシン治療法の効果を遮断したが、レペルタキシン治療法は、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応の減少を引き起こした。Ｂ．レペルタキシン治療法は、ＰＴＥＮ変異体を寄生させるＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株の細胞生存能力に何の影響も無かった。ウエスタンブロット分析を利用することで、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路は、レペルタキシン治療法によって摂動されなかったことを確認した。
【図２３】ＭＴＴ検定を利用して評価された、ＨＣＣ１９５４ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ細胞の生存能力におけるレペルタキシンの効果を示す。治療法の３日後、ＰＴＥＮ欠失の細胞は、レペルタキシンへの抵抗力を向上した。
【図２４】ドセタキセルまたはレペルタキシン治療法が定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定された後の、ＦＡＳ−リガンドおよびＩＬ−８ｍＲＮＡの発現を示す。Ａ−Ｂ．付着条件で培養されたＳＵＭ１５９細胞は、レペルタキシン（１００ｎＭ）、ＦＡＳ作用薬（５００ｎｇ／ｍＬ）またはドセタキセル（１０ｎＭ）で処理された。処理の３日後、細胞は収集され、ＲＮＡ抽出された。ドセタキセルは、ＳＵＭ１５９細胞内のＦＡＳ−リガンド（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）ｍＲＮＡを誘導した。ＩＬ−８ｍＲＮＡレベルの４倍の増加は、ＦＡＳ作用薬またはドセタキセル治療法（Ｂ）の後に検出された。
【図２５】３つの異なる乳癌異種移植のＰＴＥＮ／ＦＡＫ／ＡＫＴ活性の評価を示す。ウエスタンブロット分析は、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応で示されるように、両異種移植がＰＴＥＮの発現およびＦＡＫ／ＡＫＴ経路の活性化を提示することを明らかにした。
【図２６】インビボの乳癌幹細胞集団におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。Ａ−Ｃ．インビボで腫瘍の成長および癌幹細胞集団におけるレペルタキシン治療法の効果を評価するために、乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９）および異なる患者（ＭＣ１、ＵＭ２、ＵＭ３）から生成された３つのヒト乳癌異種移植が利用された。Ａ．試料それぞれにおいて、５０，０００細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化乳房脂肪体および観察された腫瘍サイズに注射された。腫瘍が約４ｍｍの時、レペルタキシンの皮下注射（１５ｍｇ／Ｋｇ）を１日に２回２８日間、または一週間に１度ドセタキセルの腹腔内注射（１０ｍｇ／Ｋｇ）、またはその併用（レペルタキシン／ドセタキセル）が開始された。グラフは、示された治療法（矢印は、治療法の開始）の事前、経過中それぞれの腫瘍サイズを示す。ドセタキセル単独で、またはレペルタキシン／ドセタキセルと併用して処置された群で、対照に比較して、それぞれの試料で統計的に優位な腫瘍サイズの縮小という、同様の結果が観察されたが、対照の腫瘍とレペルタキシン単独で処置された腫瘍の成長との間には違いが観察されなかった。Ｂ−Ｃ．ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定（Ｂ）、および第２のマウス（Ｃ）への再移植によって評価される、癌幹細胞集団におけるレペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらを併用した治療法の評価。ドセタキセル処理の腫瘍異種移植は、対照に比較して、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の同一または高い割合を示し、レペルタキシン治療法単独で、またはドセタキセルとの併用で、対照に比較して（Ｂ）、統計的に有意な減少である、癌幹細胞内のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の６５％〜８５％の減少を生じさせた（ｐ＜００１）。第１の腫瘍、未処理（対照）、および処理マウスから得られた細胞の連続希釈物は、さらなる処理が行われない第２のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体内に移植された。対照およびドセタキセル処置された第１の腫瘍は、全ての希釈において第２の腫瘍を形成し、レペルタキシンまたはドセタキセルとの併用で処置された第１の腫瘍から得られたより多い細胞のみが、腫瘍を形成することができた。さらに、腫瘍の成長は著しく遅延し、結果としてできた腫瘍は、対照またはドセタキセル処理された腫瘍（Ｃ）に比べ著しく小さかった。Ｄ．それぞれの群から異種移植片が収集され、免疫組織化学染色が、ホスホＦＡＫ、ホスホＡＫＴ、ＦＯＸＯ３Ａ、およびＡＬＤＨ１の発現を検出するために行われた。膜質のホスホＦＡＫ発現および細胞質のホスホＡＫＴ発現（矢印）は、対照およびドセタキセル処理された腫瘍内で検出されたが、レペルタキシン単独で、またはドセタキセルとの併用で処置された腫瘍内では何の発現も検出されなかった。細胞核ＦＯＸＯ３Ａの発現（茶色で）は、ドセタキセル、またはレペルタキシン単独で、またはそれらの併用で処置された細胞内で検出された。ＡＬＤＨ１発現（矢印）の減少は、対照およびドセタキセル処理された腫瘍と比較して、レペルタキシン単独で、または併用で処理された腫瘍内で検出された。
【図２７】インビボの乳癌幹細胞集団におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。Ａ−Ｃ．インビボの腫瘍の成長および癌幹細胞集団におけるレペルタキシン治療法の効果を評価するために、乳癌細胞株（ＳＵＭ１５９、Ａ）および３つのヒト乳癌異種移植片が異なる患者から生成された。それぞれの試料で、５０，０００細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化乳房脂肪体に注射され、腫瘍サイズを観察された。腫瘍が約４ｍｍの時、レペルタキシンの皮下注射（１５ｍｇ／Ｋｇ）を１日に２回２８日間、または一週間に１度ドセタキセルの腹腔内注射（１０ｍｇ／Ｋｇ）、またはその併用（レペルタキシン／ドセタキセル）が、開始された。グラフは、示された治療法（矢印は、治療法の開始）の事前、経過中それぞれの腫瘍サイズを示す。ドセタキセル単独で、またはレペルタキシン／ドセタキセルの併用で処置された群で、対照に比較して、それぞれの試料で統計的に優位な腫瘍サイズの縮小という、同様の結果が観察されたが、対照の腫瘍とレペルタキシン単独で処置された腫瘍の成長との間には違いが観察されなかった。癌幹細胞集団におけるレペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらを併用した治療法の評価は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定および第２のマウスへの再移植によって評価された。ドセタキセル処理の腫瘍異種移植片は、対照に比較して、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の同一または高い割合を示し、レペルタキシン治療法単独で、またはドセタキセルとの併用で、対照に比較して、統計的に有意な減少である、癌幹細胞内のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の６５％〜８５％の減少を生じさせた（ｐ＜００１）。第１の腫瘍、未処理（対照）、および処理マウスから得られた細胞の連続希釈物は、さらなる処理が行われない第２のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体内に移植された。対照およびドセタキセル処理した第１の腫瘍は、全ての希釈物において第２の腫瘍を形成したが、レペルタキシンまたはドセタキセルとの併用で処理された第１の腫瘍から得られたより多い細胞のみが、腫瘍を形成することができた。腫瘍の成長は著しく遅延し、結果としてできた腫瘍は、対照またはドセタキセル処理された腫瘍に比べ著しく小さかった。
【図２８】ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表現型によって評価される乳癌幹細胞集団におけるレペルタキシン治療法の効果を示す。Ａ−Ｂ．癌幹細胞集団における、レペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらの併用の治療法の評価は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞の存在によって評価された。ドセタキセル単独で処置された残留腫瘍において、我々は一貫してＣＤ４４＋／ＣＤ２４細胞の変化のないまたは上昇した割合を観察し、レペルタキシン治療法単独で、またはドセタキセルとの併用は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団の減少を引き起こした。Ａ．ＵＭ３異種移植片のフローチャート分析が示されている。Ｂ．ＭＣ１、ＵＭ２、およびＵＭ３で同一の結果が観察された。ほぼ全てのＳＵＭ１５９細胞は、全ての治療法条件の下でＣＤ４４＋／ＣＤ２４−である。
【図２９】レペルタキシン治療法は、全身転移の進行を低下させることを示す。転移形成ＨＣＣ１９５４（Ａ）、ＳＵＭ１５９（Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ｃ）におけるレペルタキシン治療法の効果を評価するために、乳癌細胞株は、発光酵素を発現するレンチウイルスに感染させられ、心臓内の注射を通じてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、２５０，０００の発光酵素感染細胞を接種された。マウスは、心臓内の注射の１２時間後に、２８日間、１日に２回、生理食塩水の皮下注射またはレペルタキシンの皮下注射（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理された。転移形成は、生物発光画像法を使用して観察された。接種に続いて一週間間隔で測定された標準光子束の定量化は、ＨＣＣ１９５４またはＳＵＭ１５９細胞を接種されるマウスの生理食塩水の対照に比較して、レペルタキシン内の転移形成において、統計的に有意な減少を明らかにした（Ａ〜Ｂ）。対照的に、レペルタキシン治療法は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を注射されたマウスについての転移形成において、何の効果も無かった（Ｃ）。レペルタキシンによって処置されないマウスから得られる骨および軟組織への転移について、Ｈ＆Ｅ染色法による組織学的確認（Ｄ）。
【図３０】化学療法単独で、またはレペルタキシンとの併用で処置された、癌幹細胞のＩＬ−８／ＣＸＣＲ１シグナル伝達を示す。Ａ．癌幹細胞の潜在ＩＬ−８／ＣＸＣＲ１細胞シグナル伝達の表現。ＩＬ−８結合に続くＣＸＣＲ１活性化は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化反応を誘導する。活性ＦＡＫはＡＫＴをリン酸化し、ＷＮＴ経路を活性化するが、幹細胞の自己再生および細胞生存を制御するＦＯＸＯ３Ａを制御する。 ＦＡＫの活性化は、ＦＡＳシグナル伝達の下流エフェクターであるＦＡＤＤを抑制することによるＦＡＳ−リガンド／ＦＡＳ媒介バイスタンダー効果から癌幹細胞を保護する。化学療法の存在において、大量の腫瘍細胞のみが、この処理に感受性があり、アポトーシスプロセス中、高レベルのＩＬ−８およびＦＡＳリガンドタンパク質を放出する。乳癌幹細胞は、ＩＬ−８媒介バイスタンダー効果を通じて刺激され、ＦＡＳリガンドを通じて媒介されるバイスタンダー殺傷効果に耐性がある。Ｂ．レペルタキシン治療法は、ＩＬ−８／ＣＸＣＲ１シグナルを遮断し、乳癌幹細胞自己再生および生存を抑制する。レペルタキシン治療法は、化学療法と併用される時、癌幹細胞は、ＦＡＳリガンドによって媒介されるバイスタンダー殺傷効果に感作される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔定義〕
本発明の理解を促すために、いくつかの用語およびフレーズを以下で定義する。
【００２５】
本明細書における、「抗癌剤」「先行抗癌剤」、または「癌治療薬」という用語は、（例えば、哺乳類の）癌の治療法に使用される、任意の治療薬（例えば、化学療法化合物および／または分子治療化合物）、放射線治療、または外科的処置を指す。
【００２６】
本明細書における、「薬」および「化学療法剤」という用語は、生理学システム（例えば、対象、または、インビボ、インビトロ、またはエクスビボの細胞、組織、および器官）での、疾病または病状の診断、処置、または予防に使用される薬理学的に活性な分子を指す。薬は、生体、組織、細胞、または薬が投与されているインビトロシステム内の生理機能を決定する作用をする。「薬」および「化学療法剤」という用語は、抗過剰増殖性および抗腫瘍性の化合物ならびに他の生体治療化合物を含むよう意図されている。
【００２７】
「有効量」は、薬効または所望の結果に十分な量である。有効量は、１つもしくは複数の投与で投与され得る。
【００２８】
本明細書における、「投与」という用語は、生理学的システム（例えば、対象、または、インビボ、インビトロ、またはエクスビボの細胞、組織、および器官）へ薬、プロドラッグ、抗体、または他の剤、または治療的処置を与える行為を指す。人体への典型的な投与経路は、眼（眼の）、口（口腔の）、肌（経皮性の）、鼻（鼻の）、肺（吸入抗原）、口腔粘膜（頬内の）、耳を通じて、注射（例えば、静脈に、皮下に、腫瘍内に、腹腔内に、等）および類似の方法であり得る。
【００２９】
「同時投与」は、生理学的システム（例えば、対象、または、インビボ、インビトロ、またはエクスビボの細胞、組織、および器官）への複数の化学剤または治療法（例えば、放射線療法）の投与を指す。それぞれの化学剤（例えば、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬および追加の化学療法）の「同時投与」は、同時に実行、または任意の時間的順序で、または物理的な併用であってよい。
【００３０】
本明細書における、「退行」という用語は、疾病の対象、細胞、組織、または器官が、基礎の非病原性の典型的な患者、細胞、組織、または器官に比較して、非病理、または病理まではいかない状態に戻ることを指す。例えば、腫瘍の退行は、腫瘤の縮小ならびに１つまたは複数の腫瘍の完全な消滅を含む。
【００３１】
本明細書における、「インビトロ」という用語は、人工環境および人工環境内で発生するプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養が含まれるがそれらに限定されない。「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で発生するプロセスまたは反応を指す。
【００３２】
本明細書で使用される、「細胞培養」という用語は、任意のインビトロ細胞培養を指す。この用語内には、連続的な細胞株（例えば、不死の表現型の）、第１の細胞培養、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、および卵母細胞および胚を含むインビトロで維持される、任意の他の細胞集団を含む。
【００３３】
本明細書で使用される、「対象」または「患者」という用語は、本発明の方法で処置される有機体を指す。かかる有機体は、人間および獣医動物（犬、猫、馬、豚、牛、羊、山羊、および類するもの）が含まれるがそれらに限定されない。本発明の文脈内では、「対象」または「患者」という用語は、概して治療法を受けるまたは受けた個人を指す。
【００３４】
本明細書で使用される、「診断された」という用語は、その兆候および症状、または遺伝分析、病理学分析、組織学分析、およびその類似のものによる疾病の認識を指す。
【００３５】
本明細書で使用される、「抗センスの」という用語は、特定のＲＮＡ配列（例えば、ｍＲＮＡ）と補完的な核酸配列（例えば、ＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ）を指す。本発明の定義内では、遺伝子発現、例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等、を制御する分子を含む、自然または合成の抗センスＲＮＡ分子が含まれる。本発明によって使用されるかもしれない抗センスの配列の１タイプは、ＣＸＣＲ１  ｍＲＮＡに対して特異的なタイプである。
【００３６】
用語「検査化合物」または「化合物候補」は、任意の化学物質、調剤、薬、および類するものであって、疾患、疾病、病気または身体機能の不調を治療または予防し、そうでなければ試料の生理学的状態または細胞の状態を変えるのに使用され得るものを指す。検査化合物は、既知および潜在治療化合物の両方を含む。検査化合物は、本発明のスクリーニング法を使用して治療的であるかを決定され得る。「よく知られた治療化合物」は、かかる治療法または予防法に効果的であることを示されている（例えば、動物実験または人体に投与する先行経験を通じて）治療化合物を指す。好適な実施形態では、「検査化合物」は、抗癌剤である。特に好適な実施形態では、「検査化合物」は、細胞にアポトーシスを誘導する抗癌剤である。
【００３７】
本明細書で使用される、「抗原結合タンパク質」という用語は、特定の抗原に結合するタンパク質を指す。「抗原結合タンパク質」は、多クローン性の、単クローン性の、キメラの、単一鎖の、およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリが含まれるがそれらに限定されない。先行技術でよく知られている種々の手続きは、多クローン性の抗体の生成に使用される。抗体の生成のために、ウサギ、マウス、ラット、羊、ヤギ、等が含まれるがそれらに限定されない種々の宿生動物は、所望のエピトープに応じたペプチド注射により免疫を与えられ得る。好適な実施形態では、ペプチドは、免疫原生担体（例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に接合される。フロイント（完全および不完全）、ゲル状鉱物、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコルネバクテリウム・パルバムが含まれるがそれらに限定されない種々のアジュバントは、宿主動物種に応じて免疫反応を増大させるのに使用される。
【００３８】
単クローン性の抗体の調製のために、培養内の連続的な細胞株によって抗体分子の生成を提供する任意の技術が、使用されてよい（参照例、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。これらは、当初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（参照例、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３））、およびヒト単クローン性の抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））を含むがそれらに限定されない。
【００３９】
本発明に関し、単一鎖の抗体の生成について記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号、参照によって本明細にその内容が組み込まれる）は、要望どおり特定の単一鎖の抗体を生成するために適合され得る。本発明の追加の実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のための当分野でよく知られた技術（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９））を使用して、所望の特異性をもつ単クローン性のＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に識別することを可能にする。
【００４０】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体フラグメントは、よく知られた技術によって生成され得る。例えば、かかるフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の低減によって生成され得るＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤で抗体分子を処置して生成され得るＦａｂフラグメントが含まれるがそれらに限定されない。
【００４１】
抗原−結合タンパク質をコードする遺伝子は、当分野でよく知られる方法によって単離され得る。抗体の生成において、所望の抗体のスクリーニングは当分野でよく知られる技術（例えば、放射性免疫分析、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）、「サインドイッチ」免疫学的検定、免疫放射定量測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散法検定、その場免疫学的検定（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位元素標的を使用して）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集反応（例えば、ゲル凝集反応、血球凝集反応等）、補体結合検定、免疫蛍光検査法、タンパク質Ａ検定、および免疫電気泳動法等）等によって完遂され得る。
【００４２】
本明細書で使用される、「調節する」という用語は、細胞機能面に作用する（例えば、促進または遅延させるために）化合物の活動を指し、細胞機能は、細胞成長、増殖、浸潤、血管形成、アポトーシス、および類するものが含まれるがそれらに限定されない。
【００４３】
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路阻害剤（例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体またはレペルタキシン）単独で、または追加の化学療法剤との併用で投与することで対象内の非腫瘍原性および腫瘍原性の癌細胞が死滅する癌治療法を提供する。本発明は、患者（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の存在に基づく）の固形腫瘍幹細胞の存在を治療し、診断する組成物および方法も提供する。
【００４４】
（Ｉ．腫瘍原性の癌細胞、ＡＬＤＨ、ＣＸＣＲ１、およびＣＸＣＲ１抑制）
正常細胞の完全に変態したものへの進行は、複数細胞プロセス（１、２）の脱制御を要求する。発癌の古典モデルによると、この現象は任意の細胞に生じ得る。対照的に、「癌幹細胞仮説」は、発癌性形質転換の選択的標的は、獲得した自己再生潜在能力（３−６）を有する組織幹または初期前駆細胞であることを支持する。これら「腫瘍形成細胞」または「癌幹細胞」（ＣＳＣ）は、次に、自己再生という、腫瘍細胞の不均質性に貢献する腫瘍形成および分化を駆動するプロセスを経験する能力によって特徴付けられる。癌幹細胞仮説を支持する最新の知見は、第１のヒト腫瘍の異種移植片を利用して生成された。これらの研究は、腫瘍は、癌幹細胞成分によって駆動される細胞階層で構成されることを示唆した。さらに、最新のデータは、マウスおよびヒト組織の両方から得られた不死化細胞株は、幹細胞特性を示す細胞集団も含むかもしれないことを示唆する。これらの研究の大部分は、クローン原生、球体形成、および多分化能（７−１０）を含むインビトロ特性に基づく。異種移植に不死化細胞株の機能移植を利用するさらに限定された研究は、かかる階層の存在も提示してきた。これらの研究は、一般的に、いわゆる「サイド集団」（ＳＰ）（７、９、１１）を識別するためにヘキスト色素の排除を利用してきた。さらに、第１の腫瘍異種移植片、例えばＣＤ４４およびＣＤ１３３等を使用して画定された細胞表面マーカーは、定着した細胞株（７、８）内の類似の集団を識別するのにも利用された。
【００４５】
下記実施例で記載されるように、幹細胞マーカー、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の発現は、ヒト乳癌および非形質転換乳腺細胞から得られた一連の３３の細胞株内で研究された。ＡＬＤＨは、細胞内アルデヒドの酸化に関与する解毒酵素であり、レチナールのレチノイン酸（１２、１３）への代謝を通じて幹細胞分化の役目を果たすと考えられている。蛍光ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定によって評価されるＡＬＤＨ活動は、複数の骨髄腫および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）内、ならびに脳腫瘍（１４−１６）から癌幹細胞を単離するのに首尾よく利用された。ＡＬＤＨ活動は、正常ヒト乳房組織および乳癌（１７）から幹細胞特性を表す細胞のサブ集団を単離するのに使用され得ることが、最近証明された。整復乳房形成組織から単離されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、ヒト化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に管状胞状構造を再構成することができる。さらに、ヒト乳癌から単離されたＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陽性細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの連続継代に腫瘍を再構築ならびに当初の腫瘍（１７）の表現型の不均一性を生成させる能力によって証明されたように幹細胞特性を有する。以下の実施例では、乳癌細胞株の大部分は、癌幹細胞特性を示す明確な分子プロファイルのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を含むことが証明されている。
【００４６】
以下の実施例に記載のように、本発明の実施形態の進展中に実施された作業は、ＣＸＣＲ１（炎症ケモカインＩＬ８の受容体である）を癌幹細胞マーカーとして識別した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内の細胞のみがＣＸＣＲ１を発現した。さらに、この受容体は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲおよび球状形成検定で決定されたように、組み換え型ＩＬ８が細胞株内の幹細胞割合を増加させることができる機能的役割を果たすことが証明された。ＩＬ８は、進行性乳癌に関連付けて報告されており、転移性疾患の女性の血清において高くなるが、本発明は、ＩＬ８と幹細胞のその受容体ＣＸＣＲ１との間の機能的結びつきを初めて示すと信じられる。
【００４７】
以下の実施例でさらに記載されるように、これらの細胞内のＣＸＣＲ１受容体を遮断することで、癌幹細胞を選択的に標的とすることができることが証明された。実施例で記載される１つのアプローチでは、乳癌細胞株は他のＩＬ８受容体ＣＸＣＲ２ではなくＣＸＣＲ１に対する単クローン性の抗体で処置される、。かかる処置は、縮小したＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団によって証明されたように癌幹細胞を選択的に標的とした。注目すべきことに、ＣＸＣＲ１は細胞のごくわずかな割合（例えば、１％未満）にのみ発現するが、ＣＸＣＲ１受容体のその遮断が、ＣＸＣＲ１受容体が欠けているという事実にもかかわらず、他の癌細胞の大部分に細胞死を誘導したということが判明した。癌幹細胞上のＩＬ効果を媒介し、他の細胞を殺傷するこのいわゆる「バイスタンダー効果」を説明する分子経路は、解明されてきている。ＩＬ８は、ＣＸＣＲ１に結合することで幹細胞自己再生を刺激し、ＣＸＣＲ１は次に焦点接着キナーゼＦａｋ経路を活性化する。これは、幹細胞自己再生を駆動するＡｋｔの活性化をもたらす。この経路が癌幹細胞内で遮断される時、Ａｋｔシグナル伝達の減少がＦａｓリガンドの合成の増加をもたらすＦｏｘｏ転写因子の細胞質の隔離を引き起こす。Ｆａｓリガンドは、癌幹細胞から分泌され、Ｆａｓ受容体を含む周囲の細胞に細胞死を誘導する。
【００４８】
本発明は、任意の具体的な機構に限定されるものではなく、機構の理解は本発明の実践に必要ではないが、ＣＸＣＲ１は、ＦａｋおよびＡｋｔを含む経路を通じて癌幹細胞自己再生を媒介し、この経路の遮断が癌幹細胞ならびに周囲の腫瘍細胞の細胞死を誘導すると信じられている。このように、特定の実施形態では、本発明は、癌を治療するためにＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路（例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体、抗ＦＡＫ抗体、または他の剤と共に）を分離させるための組成物および方法を提供する。
【００４９】
ＩＬ８は、組織炎症を伴うケモカインなので、従来の関心は、ＩＬ８シグナル伝達の阻害剤を開発することにあった。低分子阻害剤、レパルタキシンは、心筋梗塞および脳卒中の合併症を潜在的に減少させるための抗炎症性剤として開発されてきた。レパルタキシンは、フェーズＩおよびフェーズＩＩ臨床試験に導入され、ほぼ毒性がないことを示した。下記の実施例で示されるように、レパルタキシン（抗ＣＸＣＲ１抗体のように）は、癌幹細胞を標的にすること、ならびに、周囲の細胞においてバイスタンダー効果によってアポトーシスをｆａｓ媒介するＦａｓリガンドを誘導することができる。重要なことに、腫瘍異種移植片内でレパルタキシンは、化学療法の薬効を高める。さらに、化学療法が、選択的に腫瘍の分化した細胞を破壊して腫瘍幹細胞を温存するのと異なり、レパルタキシンは腫瘍幹細胞を標的にすることができる。実施例で示されるように、これは、レパルタキシン処置した腫瘍のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ集団の縮小、およびこれらの処置された腫瘍細胞のマウスにおける第２の腫瘍を形成する能力の減退によって証明された。転移遮断能力におけるレパルタキシンの効果も試験された。腫瘍細胞は、発光酵素で標識化され、実験的転移モデルの心臓内に注射された。腫瘍細胞が導入された１日後、１群の動物は、レパルタキシン単独で、他の群は、治療なしに置かれた。レパルタキシンは、著しく転移の進行を低下させた。
【００５０】
本発明は、癌幹細胞を処置する標的としてＩＬ８受容体ＣＸＣＲ１を識別した。低分子阻害剤レパルタキシンは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の両方を抑制する。実施例は、ＣＸＣＲ１は癌幹細胞の最も重要な受容体であることを証明した。さらに、実施例は、確立された癌を効果的に治療することへの細胞傷害性化学療法の失敗は、癌幹細胞を標的とするこの療法の不能のみだけによるものではないかもしれず、さらに、腫瘍細胞傷害性化学療法においてＩＬ８分泌の増加が確認されたことを示す。本実施例は、ＣＸＣＲ１阻害剤の使用は、癌幹細胞を特異的に標的にすることならびに細胞傷害性化学療法によって誘導されるこの細胞のＩＬ８刺激を遮断することを可能にする有利な効果を有していることを示す。
【００５１】
ＩＬ８−ＣＸＣＲ１経路を標的にすることは、乳癌に限定されるものではなく、それどころか任意のタイプの癌に用いられ得る。好ましくは、癌治療のタイプは、ＩＬ８生成の増加の証拠（例えば、化学療法と併せて）があるものである。化学療法剤は、癌細胞のＩＬ８転写を直接制御することを示してきた。パクリタキセルは、ＩＬ８転写および卵巣癌、乳癌および肺癌細胞株のＩＬ８転写および分泌を増加させる（Ｕｓｌｕ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１５：２４０−２４５、およびＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｃａｎ．Ｉｍｍ．Ｉｍｍｕｎｏ.，４９：７８−８４。両方とも参照により本明細書に組み入れられる）。また、乳癌細胞へのアドリアマイシンおよび５−フルオロ−２’ −デオキシウリジンの投与（ＤｅＬａｒｃｏ  ｅｔ
ａｌ．，２００１，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６１：２８５７−２８６１、参照により本明細書に組み入れられる）、口腔の癌細胞への５−ＦＵの追加投与（Ｔａｍａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｔ．，Ｊ．Ｃａｎ．，１０８：９１２：９２１、参照により本明細書に組み入れられる）、小細胞肺癌細胞へのドキソルビシン追加（Ｓｈｉｂａｋｕｒａ
ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．，１０３：３８０−３８６、参照により本明細書に組み入れられる）および黒色腫細胞へのダカルバジン投与（Ｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍｏｌ，Ｃａｎ．Ｔｈｅｒ．，２：７５３−７６３、参照により本明細書に組み入れられる）の全てで、ＣＸＣＬ８発現が増加する結果となっている。このように、特定の実施形態では、本発明は、ＩＬ−ＣＸＣＲ１を標的にするための、化学療法剤との併用で（例えば、上記参照で言及されたもの等）、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、および食道腺癌が含まれるがそれらに限定されない癌のタイプの対象を治療するための剤を提供する。
【００５２】
本発明は、治療される癌のタイプに限定されず、それどころか、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管内皮細胞肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、コロン癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄腹腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫が含まれるがそれらに限定されない。
【００５３】
（ＩＩ．固形腫瘍幹細胞癌マーカーの検出）
幾つかの実施形態では、本発明は、幹細胞癌マーカーの発現（例えば、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質）の検出のための方法を提供する。幾つかの実施形態では、発現は直接に測定される（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで）。幾つかの実施形態では、発現は組織試料（例えば、生検組織）内で検出される。他の実施形態では、発現は体液（例えば、血漿、血清、全血、粘液、および尿が含まれるがそれらに限定されない）で検出される。
【００５４】
本発明はマーカー検出のためのパネルとキットをさらに提供する。幾つかの実施形態では、幹細胞癌マーカーの存在は、対象に予後診断を提供するのに使用される。その提供された情報は、治療法の経過を管理するのにも使用される。例えば、対象が固形腫瘍幹細胞（例えば、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質）を示すマーカーを有することを発見される場合、追加の療法（例えば、放射線治療）が、より効果的と考えられる早い段階（例えば、転移前）で開始され得る。さらに、対象が特定の療法に応じない腫瘍を有することを発見される場合、かかる療法への支出および不都合が回避され得る。
【００５５】
幾つかの実施形態では、本発明は、複数のマーカーの分析のためのパネルを提供する（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の併用、およびＣＤ４４、ＣＤ２４、およびＥＳＡの少なくとも１つ）。パネルは、発癌および／または転移と関連させる複数のマーカーの同時分析を可能にする。対象によっては、最も可能性のある診断および予後診断を提供するために、パネルは単独で、または併用で分析され得る。下記の例示的な実施例で記載されているものを含むが、それに限定されないパネルに含まれるマーカーは、任意の好適な方法を用いて予測値をスクリーニングすることで選択される。
【００５６】
１．ＲＮＡの検出
幾つかの実施形態では、固形腫瘍幹細胞癌マーカーの検出は、組織試料中の対応するｍＲＮＡ発現を測定することで検出される。ｍＲＮＡ発現は、下記のものを含むがそれに限定されない任意の好適な方法によって測定され得る。ヒトＣＸＣＲ１核酸の受入番号は、ＮＭ＿０００６３４（参照により本明細書に組み入れられる）およびヒトＦＢＸＯ２１の受入番号は、ＮＭ＿０３３６２４（参照により本明細書に組み入れられる）である。これらの配列は、プライマーおよびプローブ（ならびにｓｉＲＮＡ配列）を設計するのに使用され得る。
【００５７】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、ノーザンブロット分析によって検出される。ノーザンブロット分析は、ＲＮＡの分離および相補的標識プローブの混成を伴う。
【００５８】
さらなる実施形態で、ＲＮＡ（または対応するｃＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドプローブへの混成によって検出される。様々な混成および検出技術を使用する様々な混成検定が利用可能である。例えば、幾つかの実施形態では、ＴａｑＭａｎ検定（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、参照例、米国特許第５，９６２，２３３号および５，５３８，８４８号のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる）が利用される。この検定は、ＰＣＲ反応中に実行される。ＴａｑＭａｎ検定は、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。５’−レポーター色素（例えば、蛍光色素）を持つオリゴヌクレオチドで構成されるプローブおよび３’−消光色素は、ＰＣＲ反応に含まれている。ＰＣＲ中、プローブが標的に結合する場合、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼの５’−３’核酸分解活動は、レポーターと消光色素との間でプローブを開裂する。消光色素からのレポーター色素の分離は、蛍光の増加をもたらす。このシグナルは、ＰＣＲのそれぞれのサイクルで蓄積され、蛍光光度計で観察され得る。
【００５９】
まださらなる他の実施形態では、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡの発現を検出するのに使用される。ＲＴ−ＰＣＲ内で、ＲＮＡは、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡすなわち「ｃＤＮＡ」に酵素的に変換される。そして、ｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応のための鋳型として使用される。ＰＣＲ生成物は、任意の好適な方法によって検出され得、ゲル電気泳動およびＤＮＡ特異的染色による染色法または標識プローブへの混成が含まれるがそれらに限定されない。幾つかの実施形態では、米国特許第５，６３９，６０６号、第５，６４３，７６５号、および第５，８７６，９７８号（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）に記載された競争合鋳型法の規格化された混合物による定量的逆転写酵素ＰＣＲが利用される。
【００６０】
２．タンパク質の検出
他の実施形態では、幹細胞癌マーカーの遺伝子発現は、対応するタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質）の発現を測定することで検出される。タンパク質発現は、任意の好適な方法によって検出され得る。幾つかの実施形態では、タンパク質は、免疫組織化学によって検出される。他の実施形態では、タンパク質は、タンパク質に対して引き起こされた抗体に結合することで検出される。ヒトＣＸＣＲ１タンパク質の受入番号は、ＮＰ＿０００６２５（参照により本明細書に組み入れられる）であり、ヒトＦＢＸＯ２１の受入番号は、ＮＰ＿２９６３７３（参照により本明細書に組み入れられる）である。抗体の生成は後述する。
【００６１】
抗体結合は当分野でよく知られる技術（例えば、放射性免疫分析、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）、「サインドイッチ」免疫学的検定、免疫放射定量測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散法検定、その場免疫学的検定（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位元素標識を使用して）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集反応（例えば、ゲル凝集反応、血球凝集反応等）、補体結合検定、免疫蛍光検査法、タンパク質Ａ検定、および免疫電気泳動法等）等によって検出される。
【００６２】
１つの実施形態では、抗体結合は、第１の抗体上で標識を検出することで検出される。別の実施形態では、第１の抗体への第２の抗体または試薬の結合を検出することで検出される。さらなる実施形態では、第２の抗体は、標識化される。免疫学的検定の結合検出のための多くの方法は、当分野で知られており、本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
幾つかの実施形態では、自動検出検定が利用される。免疫学的検定を自動化する方法は、米国特許第５，８８５，５３０号、第４，９８１，７８５号、第６，１５９，７５０号、および第５，３５８，６９１号に記載されたものを含み、それぞれは参照により本明細書に組み入れられる。幾つかの実施形態では、結果の分析および提示も自動化されている。例えば、幾つかの実施形態では、癌マーカーに応じる一連のタンパク質の有無を基礎として予後診断を生成するソフトウェアが利用される。
【００６４】
他の実施形態では、免疫学的検定は米国特許第５，５９９，６７７号および第５，６７２，４８０号に記載されたものであり、それぞれは参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
３．ｃＤＮＡマイクロアレイ技術
ｃＤＮＡマイクロアレイは、ガラスの顕微鏡スライドのような固体担体上のよく知られた位置に染みをつけられた（通常ロボットスポッティングを使用）、複数の（通常何千もの）異なるｃＤＮＡで構成される。ｃＤＮＡは、通常、配列が知られている遺伝子のために、プラスミドのベクター主鎖部分またはその遺伝子自身に補完的なプライマーを使用して、プラスミドライブラリ挿入物のＰＣＲ増幅によって得られる。マイクロアレイの生成に好適なＰＣＲ生成物は、通常は０．５と２．５ｋＢとの間の長さである。ｃＤＮＡ全体、発現配列標識（ＥＳＴ）、または任意の関心ライブラリからランダムに選択されたｃＤＮＡが選択され得る。ＥＳＴは、例えば、Ｈｉｌｌｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，６：８０７−８２８に記載されるように部分的に配列されたｃＤＮＡである。いくつかのＥＳＴはよく知られた遺伝子に対応するが、高い頻度で、任意の特有のＥＳＴに関して、少量の３’および／または５’配列、および恐らく、ＥＳＴが由来した元のｍＲＮＡの組織を除いて、ごくわずかまたは全く情報が利用できない。当業者によって理解されるように、概してｃＤＮＡは、ヒトゲノム内の遺伝子を一意的に識別するのに十分な配列情報を含む。さらに、概してｃＤＮＡは、実験の混成条件の下で単一遺伝子から得られたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡに、選択的に、特異的に、または一意的に、雑種を作るのに十分な長さである。
【００６６】
典型的なマイクロアレイ実験で、マイクロアレイは２つの異なる試料から得られた特異的に標識化されたＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ集団で雑種が作られる。最も一般的なＲＮＡ（全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ）は、関心の細胞または組織から単離され、ｃＤＮＡを生み出すために逆転写される。標識化は、通常、反応混合物内で標識ヌクレオチドを組み込むことで、逆転写中に実行される。種々の標識が使用され得るが、最も一般的には、ヌクレオチドは、蛍光色素Ｃｙ３またはＣｙ５に接合されている。例えば、Ｃｙ５−ｄＵＴＰおよびＣｙ３−ｄＵＴＰが使用され得る。１つの試料（例えば、特有の細胞タイプ、組織タイプ、または成長条件を表す）から得られたｃＤＮＡは、１つの蛍光色素分子で標識化されるが、第２の試料（例えば、異なる細胞タイプ、組織タイプ、または成長条件を表す）から得られたｃＤＮＡは、第２の蛍光色素分子で標識化される。２つの試料からの同量の標識化材料が、マイクロアレイに共に雑種を作られる。試料が、Ｃｙ５（赤色の蛍光を発する）およびＣｙ３（緑色の蛍光を発する）で標識化されるマイクロアレイ実験の場合に、第１のデータ（定量的に蛍光強度を検出することが可能な検出器を使用してマイクロアレイをスキャンすることで得られる）は、蛍光強度の比率（赤色／緑色、Ｒ／Ｇ）である。これらの比率は、マイクロアレイ上に表されるｃＤＮＡに雑種を作られるｃＤＮＡ分子の相対濃度を表し、そのようにしてマイクロアレイ上に表されるそれぞれのｃＤＮＡ／遺伝子に対応するｍＲＮＡの相対発現レベルを反映する。
【００６７】
それぞれのマイクロアレイ実験は、何万ものデータポイントを提供することができ、それぞれが２つの試料の特有の遺伝子の相対発現を表す。データの適切な組織化および分析は、決定的に重要であり、標準統計ツールを組み込む種々のコンピュータプログラムが、データ分析を促進するように開発されてきた。遺伝子発現データを整理する１つの根拠は、同様の発現パターンの遺伝子を一緒の集団に群化することである。階層的クラスター分析を実行する方法およびマイクロアレイ実験から得られたデータの表示は、Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ９５：１４８６３−１４８６８に記載されている。そこに記載されているように、集団化は、それぞれのデータポイントが、定量的および定性的にそのデータポイントを表す色で表される、第１のデータの図的表現と併用され得る。データを大きい数値表からビジュアル様式に変換することによって、このプロセスは、データの直感的分析を促進する。数学的ツールおよび／または集団化アプローチそれ自体に関する追加の情報および詳細は、例えば、Ｓｏｋａｌ  ＆  Ｓｎｅａｔｈ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｙ，ｘｖｉ，３５９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６３；Ｈａｒｔｉｇａｎ，Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，ｘｉｉｉ，３５１，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５；Ｐａｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１：１０８８−９２；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：４４７−５１；ｖａｎ  Ｏｓｄｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６：１８５３−９、およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：３４３−９に見出され得る。
【００６８】
本発明で使用される実験的方法のさらなる詳細は、後述の実施例に見いだされる。マイクロアレイを製造し使用する方法を記載する追加の情報は、米国特許第５，８０７，５２２号に見出され、参照により本明細書に組み入れられる。市販されている部品を使用するマイクロアレイハードウェア（例えば、ａｒｒａｙｅｒｓおよびスキャナ）の構築のための説明。マイクロアレイ技術の追加の議論および試料調製のプロトコルおよびのマイクロアレイ実験の実行は、例えば、ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ
ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３０３：１７９−２０５，１９９９、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３０６：３−１８，１９９９；およびＭ．Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ）、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９９に見出される。
【００６９】
４．データ分析
幾つかの実施形態では、コンピュータベースの分析プログラムは、検出検定（例えば、存在、不在、または所与のマーカー（単数または複数）の量）によって生成された生データを臨床医のための予測値データに翻訳するのに使用される。臨床医は、任意の好適な手段を使用して予測データにアクセスすることができる。それ故に、幾つかの実施形態では、本発明は、臨床医で、遺伝学または分子生物学の訓練を受けそうにない者が、生データを理解する必要がないというさらなる利点を提供する。データは、最も有用な様式で臨床医に直接に渡される。その後、臨床医は、対象の治療に最大限に利用するために情報をすぐに利用することができる。
【００７０】
本発明は、検定を実施した研究所に、およびその研究所から、情報を受け取り、処理し、および伝達することが可能な任意の方法を考慮し、医療関係者および対象に情報を提供する。例えば、本発明の幾つかの実施形態では、試料（例えば、生検または血清または尿試料）は、対象から得られ、生データを生成するために、世界の任意の部分に位置する（例えば、対象が居住する国または情報が最終的に使用される国とは異なる国にある）、プロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、遺伝子プロファイリングビジネス等）に提出される。試料が組織または他の生物試料を含む場合には、対象は、採取されてプロファイリングセンターに送付される試料を有する医療センターを訪ねることができ、または患者が、自身で試料を収集し、直接プロファイリングセンターに送付することができる。試料が過去に決定された生物情報を含む場合には、情報は、対象からプロファイリングサービス（例えば、情報を含む情報カードはコンピュータでスキャンされ得、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピュータにデータが転送される）に直接送付され得る。プロファイリングサービスで一旦受け取られると、試料は処理され、対象の欲する診断または予後の情報に特化したプロファイル（例えば、発現データ）が作られる。
【００７１】
その後、プロファイルデータは、治療する臨床医によって解釈に好適な様式に調製される。例えば、生発現データ（例えば、多くのマーカーの試験）を提供するよりむしろ、調製された様式は、対象のための診断またはリスク評価を、具体的な治療法選択肢のアドバイスと共に表すことができる。データは、臨床医に任意の好適な方法で表示され得る。例えば、幾つかの実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医のために（例えば、治療のポイントで）印刷され得、または臨床医にコンピュータモニターで表示され得るレポートを生成する。
【００７２】
幾つかの実施形態では、情報は、治療のポイントで、または地域施設でまず分析される。その後、生データは、さらなる分析および／または生データを臨床医または患者に有用な情報に変換するために中央処理施設に送付される。中央処理施設は、プライバシー（全データは中央施設に均一のセキュリティープロトコルで格納される）、スピード、およびデータ分析の均一性の利点を提供する。その後、中央処理施設は、対象の治療法に続くデータの結末を管理することができる。例えば、電子通信システムを使い、中央施設は、臨床医、対象、または調査員にデータを提供することができる。
【００７３】
幾つかの実施形態では、対象は、電子通信システムを使用してデータに直接アクセスすることができる、対象は、結果に基づいてさらなる治療介入またはカウンセリングを選択することができる。幾つかの実施形態では、このデータが調査目的に使用される。例えば、このデータを使用して、疾病の特有の条件またはステージを示す有用な指標としてのマーカーの包含または排除をさらに最適化することができる。
【００７４】
５．キット
さらに他の実施形態では、本発明は、癌を検出し特徴付けるため（例えば、１つもしくは複数のマーカーを検出するため、または１つもしくは複数のマーカーによって発現したペプチドの活性を調節するため）のキットを提供する。幾つかの実施形態では、キットは、検出試薬およびバッファに加えて癌マーカーに特異的な抗体を含む、他の実施形態では、キットは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）の検出に特異的な試薬を含む。幾つかの実施形態では、キットは検出検定を実行するのに必須および／または十分な構成物の全てを含み、全対照、検定を実行する指示、および任意の分析のための必須ソフトウェアおよび結果の提示を含む。
【００７５】
本発明の別の実施形態は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の存在を試験するためのキットを含む。キットは、例えば、ポリペプチドを検出するための抗体またはポリヌクレオチドを検出するためのプローブを含む。さらに、キットは、参照または対照試料、試料を処理し、テストを実行し、および結果を解釈するための指示、および他のテストを実行するのに必要なバッファおよび他の試薬を含むことができる。他の実施形態では、キットは、固形腫瘍幹細胞遺伝子シグネチャーの１つもしくは複数の遺伝子の発現を検出するためにプライマーのペアを含む。他の実施形態では、キットは、固形腫瘍幹細胞遺伝子シグネチャーの１つもしくは複数の遺伝子の発現を検出するために、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレイを含む。
【００７６】
６．インビボイメージング
幾つかの実施形態では、インビボイメージング技術は、動物（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類）内の癌マーカーの発現を可視化するのに使用される。例えば、幾つかの実施形態では、癌マーカーｍＲＮＡ（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１ｍＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１タンパク質）は、癌マーカーに特異的な標識抗体を使用して標識化される。特異的な結合および標識抗体は、放射性核種イメージング、陽電子放射断層撮影、コンピュータ断層撮影、エックス線、または磁気共鳴イメージング法、蛍光検出、および化学発光による検出が含まれるがそれらに限定されないインビボイメージング法を使用して個体内で検出され得る。本発明の癌マーカーに抗体を生成する方法を後述する。
【００７７】
本発明のインビボイメージング法は、本発明の固形腫瘍幹細胞癌マーカーを発現する癌の診断に有用である。インビボイメージングは、癌を示すマーカーの存在を可視化するのに使用される。かかる技術は、不快な生検を使用しない診断を可能にする。本発明のインビボイメージング法は、癌患者への予後診断を提供するのにも有用である。例えば、癌幹細胞を示すマーカーの存在は検出され得る。本発明のインビボイメージング法は、体の他の部分の転移癌を検出するのにさらに使用され得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１に特異的な試薬（例えば、抗体）は、蛍光で標識化される。標識抗体は対象に導入される（例えば、経口または非経口で）。蛍光的に標識化された抗体は、任意の好適な方法を使用して、検出される（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９８，１０７号に記載の装置を使用）。
【００７９】
他の実施形態では、抗体は、放射能で標識化される。インビボ診断の抗体の使用は、当業者に公知である。Ｓｕｍｅｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ  １７：２４７−２５４  ［１９９０］は、標識としてインジウム１１１を使用する腫瘍の放射免疫シンチグラフィックイメージングのために最適化された抗体キレート剤について記載した。Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  ９：６３１−６４０  ［１９９１］）は、膵臓癌を有すると疑われる患者の腫瘍を検出するこの剤の使用を記載した。磁気共鳴イメージングのための標識として常磁性イオンでの同様の剤の使用が、当分野で知られている（Ｌａｕｆｆｅｒ，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２：３３９−３４２  ［１９９１］）。使用された標識は、選択された画像診断法に依存するだろう。放射能標識、例えば、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍ、またはヨウ素１３１は、平面スキャンまたは単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のために使用され得る。陽電子放出標識、例えばフッ素１９は、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）にも使用され得る。ＭＲＩのために、常磁性体イオン、例えばガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）等が使用され得る。
【００８０】
半減期が１時間から３．５日の間の放射性金属（例えば、スカンジウム４７（３．５日）、ガリウム６７（２．８日）、ガリウム６８（６８分）、テクニチウム９９ｍ（６時間）、およびインジウム１１１（３．２日））は、抗体に接合され、中でも、ガリウム６７、テクネチウム９９ｍ、およびインジウム１１１がガンマカメライメージングに好適であり、ガリウム６８が陽電子放出断層撮影法に好適である。
【００８１】
かかる放射性金属で抗体を標識化する有用な方法は、例えば、インジウム１１１ならびにテクネチウム９９ｍについてＫｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．およびＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ２１５：１５１１［１９８２］）に記載されたように、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）のような二官能性キレート剤を使用する（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：２９５［１９８０］）。他のキレート剤も使用され得るが、１−（ｐ−カルボキシメトキシベンジル）ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡのカルボキシカルボニック無水物が有利である、というのもその使用が、実質的に抗体の免疫活性に作用せずに接合することを可能にするからである。
【００８２】
タンパク質にＤＰＴＡを連結させる別の方法は、インジウム１１１でアルブミンを標識化することについてＨｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されているように（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．  ３３：３２７［１９８２］）、ＤＴＰＡの環状無水物の使用によるが、これは抗体の標識化に適用され得る。ＤＰＴＡでのキレート化を使用しないテクネチウム９９ｍで抗体を標識化する好適な方法は、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．の予備めっき法（米国特許第４，３２３，５４６号、参照により本明細書に組み入れられる）である。
【００８３】
テクネチウム９９ｍでの標識化免疫グロブリン法は、血漿タンパク質についてＷｏｎｇ
ｅｔ  ａｌ．によって記載され（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．，  ２９：２５１［１９７８］）、最近、抗体を標識化するために、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって成功裏に応用された（Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ２３：２２９［１９８１］）。
【００８４】
放射性金属を特定の抗体に接合する場合では、免疫特異性を破壊せずに抗体分子に可能な限り高い割合で放射性同位体での標識化を導入することが、同じく望ましい。抗体上の抗原結合部位が保護されることを確実にするためのさらなる改善は、本発明の特定の幹細胞癌マーカー存在下で放射性同位体を用いて標識化する効果によって達成され得る。
【００８５】
さらなる実施形態では、インビボでバイオフォトニックイメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ，  Ａｌｍｅｄａ，  ＣＡ）は、インビボイメージングのために使用される。このリアルタイムインビボイメージングは、発光酵素を利用する。発光酵素遺伝子は、細胞、微生物、および動物に組み込まれる（例えば、本発明の癌マーカーとの結合タンパク質として）。活性時、発光反応を引き起こす。ＣＣＤカメラおよびソフトウェアは、イメージを捕らえ、それを分析するのに使用される。
【００８６】
（ＩＩＩ．抗体および抗体フラグメント）
本発明は、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質に対する単離された抗体および抗体フラグメントを提供する。抗体または抗体フラグメントは、これらのタンパク質を特異的に認識する任意の単クローン性のまたは多クローン性の抗体であり得る。幾つかの実施形態では、本発明は、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質に特異的に結合する、単クローン性の抗体またはそのフラグメントを提供する。幾つかの実施形態では、単クローン性の抗体またはそのフラグメントは、これらのタンパク質を特異的に結合するキメラまたはヒト化抗体である。他の実施形態では、単クローン性の抗体またはそのフラグメントは、これらのタンパク質を特異的に結合するヒト抗体である。
【００８７】
ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質に対する抗体は、本明細書に記載の実験的診断および治療法の使用を見出す。特定の実施形態では、本発明の抗体は、生物試料、例えば、患者組織生検、胸水、または血液試料等での癌幹細胞マーカータンパク質の発現を検出するのに使用される。組織生検は、例えば、免疫蛍光検査法または免疫組織化学を使用して区分され、タンパク質検出され得る。代替として、試料からの個別の細胞は単離され、ＦＡＣＳ分析で固定または生細胞においてタンパク質発現を検出される。さらに、抗体は、例えば、腫瘍細胞上、細胞溶解物内、または他のタンパク質試料内で癌幹細胞マーカーの発現を検出するためにタンパク質アレイで使用され得る。他の実施形態では、本発明の抗体は、インビトロ細胞ベースの検定またはインビボ動物モデルのいずれかの腫瘍細胞で抗体に接触することで腫瘍細胞の成長を抑制するのに使用される。さらに他の実施形態では、抗体は、抗体を癌幹細胞マーカー（例えば、表１から）に対して治療的に有効量投与することでヒト患者の癌を治療するのに使用される。
【００８８】
多クローン性の抗体は任意のよく知られた方法によって調製されてよい。多クローン性の抗体は、安定的なエマルジョンを形成するために、無菌生理食塩水で希釈されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン等に選択的に接合され、およびアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）と併用された、関連抗原（精製ペプチドフラグメント、組み換え型タンパク質全体、融合タンパク質、等）の複数の皮下または腹腔内注射で、動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバ、等）に免疫を与えることで育てられ得る。そして、多クローン性の抗体は、十分に免疫をつけた動物の血液、腹水、および類するものから回収される。採取した血液は、凝固させられ、上澄みの血清は移され、遠心分離で澄まされ、抗体力価を検定される。多クローン性の抗体は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、等を含む先行技術の一般的な方法にしたがって血清または腹水から精製され得る。
【００８９】
単クローン性の抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製され得、かかる方法はＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５等に記載されている。ハイブリドーマ法を使用するために、マウス、ハムスター、または他の適切な宿生動物は、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球によって生成を導くよう、上述のように免疫を与えられる。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫を与えられる。免疫を与えるのに続き、その後で非融合リンパ球および骨髄腫細胞から選択され得るハイブリドーマ細胞を形成するために、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、リンパ球は単離されて、適切な骨髄腫細胞株と融合される。免疫沈降、免疫ブロット、またはインビトロ結合検定、例えば、放射性免疫測定（ＲＩＡ）または酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）で決定されるように選択された抗原に対して特異的に指示された単クローン性の抗体を産出するハイブリドーマは、標準的な方法を使用するインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）または動物内の腹水腫瘍としてインビボで繁殖され得る。そして、単クローン性の抗体は、上述の多クローン性の抗体で記載されたように培地または腹水から精製され得る。
【００９０】
代替として、単クローン性の抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組み換え型ＤＮＡ法を使用しても作られ得る。単クローン性の抗体をエンコードするポリヌクレオチドは、例えば、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をエンコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、単離され、これらの配列は、先行の手順を使用して決定される。重鎖および軽鎖をエンコードする単離されたポリヌクレオチドは、その後、好適な発現ベクターにクローンされ、宿生細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、ｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産出しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる時、単クローン性の抗体が、宿生細胞に生成される。また、組み換え型単クローン性の抗体または所望の種のそのフラグメントは、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８；およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７）に記載のファージ提示法ライブラリから単離され得る。
【００９１】
単クローン性の抗体をエンコードするポリヌクレオチドは、代替の抗体を生成するために組み換えＤＮＡ技術を使用する多くの異なる方法でさらに修正され得る。１つの実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖の定常領域、例えば、マウスの単クローン性抗体は、１）キメラの抗体を生成するために例えばヒト抗体のその領域に、または２）融合抗体を生成するために非免疫グロブリンポリペプチドに、代替され得る。他の実施形態では、定常領域は、単クローン性の抗体の所望の抗体フラグメントを生成するために、先端を切り取られるか、除去される。さらに、可変領域の部位特異的なまたは高密度の突然変異生成は、単クローン性の抗体の特異性、親和性、等を最適化するのに使用され得る。
【００９２】
本発明の幾つかの実施形態では、癌幹細胞マーカーに対する単クローン性の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、可変領域内の非ヒト（例えば、マウス）抗体からの最小配列を含む抗体である。ヒト対象に投与される時、かかる抗体は、治療的に抗原性およびＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を低減するのに使用される。実際には、ヒト化抗体は、非ヒト配列ではない最小限の典型的なヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒトによって産生された抗体またはヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。
【００９３】
ヒト化抗体は、当分野で知られる種々の技術を使用して産生され得る。抗体は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、等）のＣＤＲで、ヒト抗体のＣＤＲを代替することで、ヒト化し得る（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６）。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性、および／または能力を改良し最適化ために、Ｆｖフレームワーク領域内および／または置き換えられた非ヒト残留物内で、追加の残留物の置換によってさらに修正され得る。
【００９４】
ヒト抗体は、当分野で知られる種々の技術を使用して直接に調製され得る。免疫を与えられたインビトロまたは、標的抗原に対して指向された抗体を産生する免疫を与えられた個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球が生成され得る（参照、例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．  ７７  （１９８５）；  Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７  （１）：８６−９５、および米国特許第５，７５０，３７３号）。また、ヒト抗体はファージライブラリから選択され得、そのファージライブラリは、ヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ
ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：３０９−３１４；  Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  ＰＮＡＳ，  ９５：６１５７−６１６２；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１）。ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリン生成が生じない場合にヒト抗体の全レパートリーを産生する免疫付与が可能なヒト免疫グロブリン座を含む遺伝子組み換えマウスにも作成され得る。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載される。
【００９５】
本発明は、癌幹細胞マーカーを特異的に認識する二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識および結合可能な抗体である。
【００９６】
二重特異性抗体は、無傷の抗体または抗体フラグメントであり得る。二重特異性抗体を作成する技術は、当分野で一般的である（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１；  Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １２１：１２０；  Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３６５５−３６５９；  Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：２１７−２２５；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３；  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８、および米国特許第５，７３１，１６８号）。
【００９７】
本発明の特定の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増大させるために、無傷の抗体よりむしろ抗体フラグメントを使用することが望ましいかもしれない。種々の技術が抗体フラグメントの生成のために知られている。伝統的に、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解に由来する（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：８１）。しかし、これらのフラグメントは、現在、通常は上述のように組み換え型宿生細胞によって直接産生される。そのようなＦａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿生細胞内に発現して、そこから分泌され得、それ故に、これらのフラグメントの大部分の生成を可能にする。代替として、かかる抗体フラグメントは、上述の抗体ファージライブラリから単離され得る。抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載の線形抗体にもなり得、単一特異性または二重特異性にもなり得る。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者には明らかである。
【００９８】
特に抗体フラグメントの場合に、その血清半減期を増大させるために抗体を調節することがさらに望ましいかもしれない。これは、例えば、抗体フラグメントの適切な領域の変異によって抗体フラグメントにエピトープを結合するサルベージ受容体を組み込むことで、または端か中間で抗体フラグメントに融合されるペプチドタグにエピトープを組み込むことで（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）、達成されるかもしれない。
【００９９】
本発明は、キメラの、ヒト化されたおよびヒト抗体、または本明細書で設定されるその抗体フラグメントと実質的に同一のもののバリエーションおよび同等物をさらに包含する。これらは、例えば、先行の置換変異体、すなわち、類似のアミノ酸による１つもしくは複数のアミノ酸代替を含むことができる。例えば、先行の置換は、アミノ酸の同一の一般的クラス内の別のアミノ酸との置換を指し、例えば、別の酸性アミノ酸を有する１つの酸性アミノ酸、別の塩基性アミノ酸を有する１つの塩基性アミノ酸、または別の中性アミノ酸による１つの中性アミノ酸等である。先行のアミノ酸置換によって何が意図されるかは、当業者に公知である。
【０１００】
本発明は、細胞毒性薬に接合される抗体を含む免疫抱合体にも関連する。細胞毒性薬は、化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌性、真菌性、植物性、または動物由来の、またはそれらのフラグメントの酵素的に活性の毒素）、放射性同位体（すなわち、放射性結合体）、等を含む。かかる免疫抱合体の生成に有用な化学療法剤は、例えば、メトトレキサート、アドリアミシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤を含む。使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、結合されてないジフテリア毒の活性フラグメント、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む。様々な放射性核種は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅを含み放射接合した抗体の生成のために利用可能である。様々な二機能性タンパク質カップリング剤を用いて抗体および細胞毒素薬との抱合体を作成し、かかる試薬の実例は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアナート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）である。抗体の抱合体および１つもしくは複数のカリケアミシン、メイタンシノイド、トリコセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）およびＣＣ１０６５のような低分子毒素、およびこれらの毒素活性を有する毒素の誘導体も使用され得る。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、エフェクター機能、例えば、抗原依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増幅するために修飾されるヒト領域を含む。これは、抗体のＦｃ領域に１つもしくは複数のアミノ酸置換を導入することで達成され得る。例えば、システイン残留物は、補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を改善するために、この領域に鎖間ジスルフィド結合形成を可能にするＦｃ定常領域に導入され得る（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：１１９１−１１９５；  Ｓｈｏｐｅｓ，  １９９２，
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２）。抗腫瘍活性を増幅されたホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５に記載のようにヘテロ二機能クロスリンカーを使用しても調製され得る。代替として、デュアルＦｃ領域を有する抗体が設計され得る（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０）。
【０１０２】
（ＩＶ．薬剤スクリーニング）
幾つかの実施形態では、本発明は、薬剤スクリーニング検定（例えば、抗癌剤を選抜するために）を提供する。本発明のスクリーニング法は、本発明の方法を使用して識別された幹細胞癌マーカー（例、ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、ＴＢＰ、および表１からの他のタンパク質）を利用する。例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１の発現、または活性を変更する（例えば、増大または低減）化合物のためのスクリーニング法を提供する。幾つかの実施形態では、化合物候補は、癌マーカーに対して指向されたアンチセンスの剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態では、化合物候補は、特異的に本発明の幹細胞癌マーカーに結合する抗体である。特定の実施形態では、低分子の化合物のライブラリは、本明細書に記載の方法を使用して選別される。
【０１０３】
１つのスクリーニング法では、化合物候補は、幹細胞癌マーカーを発現させる細胞に組成物を接触させ、その後、発現上の化合物候補の効果を検定することで幹細胞癌マーカー発現を変更する能力について評価される。幾つかの実施形態では、癌マーカー遺伝子の発現における候補化合物の効果は、細胞によって発現された癌マーカーｍＲＮＡのレベルを検出することによって検定される。ｍＲＮＡ発現は、任意の好適な方法によって検出される。他の実施形態では、癌マーカー遺伝子の発現における化合物候補の効果は、癌マーカーによってエンコードされたポリペプチドのレベルを測定することで検定される。発現されたポリペプチドのレベルは、任意の好適な方法を使用して測定され得、本明細書に記載の方法を含むがそれに限定されない。幾つかの実施形態では、細胞生物学の他の変更（例えば、アポトーシス）が検出される。
【０１０４】
具体的には、本発明は、調節剤、すなわち、シグナリングまたは本発明の癌マーカーに関する機能に結合、もしくはそれを変更し、例えば、幹細胞癌マーカー発現または癌マーカー活性への阻害（または促進）効果を有し、もしくは、例えば、癌マーカー基質の発現または活性において促進または阻害する効果を有する候補または検査化合物または剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、低分子または他の薬剤）を識別するためのスクリーニングは、方法を提供する。このように認識される化合物は、標的遺伝子産物（例えば、幹細胞癌マーカー遺伝子、例えばＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１）の生物機能を合成するために、または正常な標的遺伝子作用を妨害する化合物を識別するために、治療プロトコル内で直接的または間接的に、標的遺伝子産物の活性を調節するのに使用され得る。癌マーカーの活性または発現を抑制する化合物は、増殖性疾患、例えば、癌、特に転移癌の治療法、または癌のリスクを予防または低減するために腫瘍幹細胞を排除または管理することに有用である。
【０１０５】
１つの実施形態では、本発明は、癌マーカータンパク質またはポリペプチドまたはその生体活性部分の基質である候補または検査化合物をスクリーニングするための検定を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌マーカータンパク質またはポリペプチドまたはその生体活性部分の活性に結合するか、調節する候補または検査化合物をスクリーニングするための検定を提供する。
【０１０６】
本発明の検査化合物は、当該技術分野でよく知られるコンビナトリアルライブラリ法の多くのアプローチのいずれかを使用して得られ、このライブラリは、生物ライブラリ、ペプチドライブラリ（ペプチドの機能性を有しているが、酵素分解に対して耐性でありそれでもなお生物活性を保持している新規で非ペプチド骨格を有している分子のライブラリ（例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７: ２６７８−８５［１９９４］参照）、空間的にアドレス可能な平行固相または液体相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ、一ビーズ一化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ方法を含む。生物ライブラリおよびペプトイドライブラリアプローチは、ペプチドライブラリの使用に好適であるが、その他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドのオリゴマーまたは低分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１０７】
分子ライブラリの合成方法の例は当該技術分野、例えば、：  ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６９０９［１９９３］、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１１４２２［１９９４］、  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８［１９９４］、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３［１９９３］、Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３．２０５９［１９９４］、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０６１［１９９４］、および  Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：１２３３［１９９４］中に見出すことができる。
【０１０８】
化合物のライブラリは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１［１９９２］）、またはビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４［１９９１］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６［１９９３］）、細菌または胞子（米国特許第５，２２３，４０９号、参照により本明細書に組み入れられる）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１８６５１８６９  ［１９９２］）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０［１９９０］；Ｄｅｖｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６［１９９０］；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  ＮａｔＩ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２［１９９０］；  Ｆｅｌｉｃｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１［１９９１］）上で提示され得る。
【０１０９】
１つの実施形態では、検定は、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分を発現する細胞が、検査化合物に接触され、癌マーカー活性を調節する検査化合物の能力が決定される、細胞ベースの検定である。幹細胞癌マーカー活性を調節する検査化合物の能力を決定することは、例えば、酵素活性の変化を観察することで達成され得る。細胞は、例えば、哺乳類由来のものであり得る。
【０１１０】
化合物、例えば、幹細胞癌マーカー基質に結合する癌マーカーを調節するための検査化合物の能力も、評価され得る。これは、化合物、例えば基質の癌マーカーへの結合が複合体において標識化合物、例えば基質を検出することにより測定できるように、例えば化合物、例えば基質と放射性同位体標識または酵素標識とを結合することにより達成できる。
【０１１１】
代替として、幹細胞癌マーカーは放射性同位体または酵素の標識と結合し、複合体の癌マーカー基質に結合する癌マーカーを調節する検査化合物の能力を観察する。例えば、化合物（例えば、基質）は直接的または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識化でき、放射性同位体は放射放出の直接計数によりまたはシンチレーション計数により検出される。代替として、化合物は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または発光酵素で酵素標識化でき、酵素標識は適切な基質から産物への変換を決定することにより検出される。
【０１１２】
反応体のいずれかを標識してまたは標識せずに、幹細胞癌マーカーと相互作用する化合物（例えば、幹細胞癌マーカー基質）の能力が評価され得る。例えば、化合物または癌マーカーのいずれかを標識せずに癌マーカーと化合物の相互作用を検出するためにマイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）が使用され得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２［１９９２］）。本明細書で使用されるように、「マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））」は、細胞が光でアドレス可能な電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いてその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は化合物と癌マーカーとの間の相互作用の指標として用いられ得る。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、無細胞検定が提供され、癌マーカータンパク質またはその生体活性部分が検査化合物に接触され、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分に結合する検査化合物の能力が評価される。本発明の検定で使用される癌マーカータンパク質の生体活性部分は、基質または他のタンパク質、例えば高い表面確率点（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を有するフラグメントとの相互作用に参加するフラグメントを含む。
【０１１４】
無細胞検定は、２つの構成物が相互作用ならびに結合でき、それ故に除去および／または検出され得る複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で標的遺伝子タンパク質および検査化合物の反応混合物を調製することを伴う。
【０１１５】
二分子間の相互作用も、例えば蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，６３１，１６９号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９６８，１０３号参照、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）を用いて検出できる。蛍光標識は、第一供与分子の放出する蛍光エネルギーが第二「受容」分子の蛍光標識により吸収され、次に吸収エネルギーにより蛍光を発することができるように、選択される。
【０１１６】
代替として、「供与」タンパク質分子は単にトリプトファン残留物の自然蛍光エネルギーを利用することができる。「受容」分子の標識が「供与体」の標識と識別され得るように、異なる波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関係するため、前記分子間の空間関係が見極められ得る。分子間の結合が起きる状況で、１５の検定における「受容」分子の標識の蛍光発光が最大であるべきである。ＦＲＥＴ結合事象は当技術分野においてよく知られる標準的な蛍光検出手段を通じて（例えば、蛍光光度計を使用して）簡便に測定され得る。
【０１１７】
別の実施形態では、幹細胞癌マーカータンパク質の標的分子に結合する能力を測定することは、リアルタイムのＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）を用いて達成され得る（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３：２３３８−２３４５［１９９１］およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．
５：６９９−７０５［１９９５］を参照）。「表面プラズマ共鳴」または「ＢＩＡ」は、いずれの反応体（例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ）も標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。結合表面の質量（結合事象を示す）の変化は表面近くの光の屈折率の変動をもたらし（表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る検出シグナルをもたらす。
【０１１８】
１つの実施形態では、標的遺伝子産物または検査物質は固相に固定される。固相に固定された標的遺伝子産物／検査化合物の複合体は反応の終わりに検出され得る。標的遺伝子産物は固相に固定でき、検査化合物（固定されていない）は本明細書で論じられる検出可能な標識で直接的または間接的に標識され得る。
【０１１９】
タンパク質の１つまたは両方の非複合形態から複合形態の分離を促進するため、ならびに検定の自動化に適応するため、幹細胞癌マーカー、抗癌マーカー抗体またはその標的分子を固定することが望ましいかもしれない。幹細胞癌マーカータンパク質への検査化合物の結合、または化合物候補の存在下および不在下での標的分子と癌マーカータンパク質との相互作用は、反応体を含むのに好適な任意の容器中で達成され得る。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心分離管を含む。１つの実施形態では、タンパク質の１つまたは両方が基質に結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−癌マーカー融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され得、その後、これらは、検査化合物、または検査化合物と非吸着標的タンパク質もしくは癌マーカータンパク質のいずれかと混合され、混合物は複合体形成に寄与する条件下で（例えば、塩およびｐＨの生理条件で）インキュベートされる。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは洗浄され、いずれの非結合構成物、ビーズの場合は固定された基質も取り除き、複合体は、例えば上述のように、直接的または間接的に決定される。
【０１２０】
代替として、複合体は基質から解離され得、癌マーカーの結合または活性のレベルは標準的技術を使用して測定され得る。癌マーカータンパク質または標的分子のいずれかを基質に固定する他の技術は、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合を使用することを含む。ビオチン化癌マーカータンパク質または標的分子は、当技術分野において知られる技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＥＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定される。
【０１２１】
検定を行うために、非固定構成物は固定構成物を含む被覆表面に付加される。反応が終了した後、形成されるいずれの複合体も依然固体表面に固定されているような条件下で、未反応構成要素が（例えば、洗浄により）取り除かれる。固体表面に固定される複合体の検出は幾つかの方法で達成できる。予め固定されていない構成物が予め標識化される場合、表面に固定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。予め固定されていない構成物が予め標識化されない場合、表面に固定される複合体を検出するために、例えば固定構成物に特異的な標識抗体を使用して（抗体は、次いで、直接的に標識され得るまたは例えば標識抗ＩｇＧ抗体で間接的に標識され得る）、間接標識が使用され得る。
【０１２２】
この検定は、幹細胞癌マーカータンパク質または標的分子と反応するが、その標的分子への幹細胞癌マーカータンパク質の結合を妨げない抗体を用いて実施される。かかる抗体はプレートのウェルに誘導体化され得、結合していない標的または癌マーカータンパク質は抗体接合によりウェルに捕捉される。ＧＳＴで固定される複合体について上述する方法に加えて、かかる複合体を検出する方法は、癌マーカータンパク質または標的分子と反応する抗体を使用して複合体の免疫検出、ならびに癌マーカータンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合検定を含む。
【０１２３】
代替として、無細胞検定は液相で行える。かかる検定において、反応産物は、分画遠心（例えば、Ｒｉｖａｓ  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２８４−７［１９９３］を参照）、クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ
ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）、および免疫沈降（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）を含むが、これらに限定されない幾つかの標準的技術のいずれかにより、未反応の構成物から分離される。かかる樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者に知られている（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１：１４１−８［１９９８］；  Ｈａｇｅａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ａｐｐ１  ６９９：４９９−５２５［１９９７］を参照）。その上、蛍光エネルギー移動も、本明細書に記載するように、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するのに簡便に利用され得る。
【０１２４】
検定は、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分と癌マーカーに結合するよく知られた化合物とを接触させて検定混合物を形成すること、検定混合物と検査化合物を接触させること、および癌マーカータンパク質と相互作用する検査化合物の能力を決定することを含み、ここで、癌マーカータンパク質と相互作用する検査化合物の能力を決定することは、よく知られた化合物と比べて、癌マーカーもしくはその生体活性部分に選択的に結合する検査化合物の能力、または標的分子の活性を調節する化合物の能力を決定することを含む。
【０１２５】
幹細胞癌マーカーがタンパク質などの１つまたは複数の細胞高分子または細胞外高分子とインビボで相互作用し得る範囲内で、このような相互作用の阻害剤が役立つ。阻害剤を同定するために、同種の検定が用いられ得る。
【０１２６】
例えば、標的遺伝子産物と、相互作用する細胞または細胞外の結合相手産物との予め形成される複合体は、標的遺伝子産物またはそれらの結合相手のいずれかが標識化されるように調製されるが、標識により生成されるシグナルは複合体形成により消光される（例えば、免疫検定にこのアプローチを利用する米国特許第４，１０９，４９６号を参照、参照により本明細書に組み入れられる）。予め形成する複合体から得る種の１つと競合し置換する検査物質の付加は、バックグラウンドを上回るシグナルの生成をもたらす。このような方法で、標的遺伝子産物と結合する相手の相互作用を妨害する検査物質が同定できる。代替として、癌マーカータンパク質は、癌マーカーと結合または相互作用し（「癌マーカー結合タンパク質」または「癌マーカーｂｐ」）ならびに癌マーカーの活性に関与する他のタンパク質を同定するために、２ハイブリッド検定または３ハイブリッド検定で「おとりタンパク質」として使用され得る（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２［１９９３］、  Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６８．１２０４６−１２０５４［１９９３］、  Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４［１９９３］；  Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６［１９９３］、およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。かかる癌マーカーｂｐは、例えば癌マーカーが媒介するシグナル伝達経路の下方要素として、癌マーカータンパク質または標的によるシグナルの活性剤または阻害剤であり得る。
【０１２７】
癌マーカー発現の調節剤も同定できる。例えば、細胞または無細胞混合物は候補化合物と接触し、癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、候補化合物の不在下の幹細胞癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比べて、評価される。癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその候補化合物の不在下より存在下で高い場合、候補化合物は癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激剤として同定される。代替として、癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の不在下より存在下で低い（即ち、統計的に有意に低い）場合、候補化合物は癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の阻害剤として同定される。癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは癌マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質を検出する本明細書に記載の方法により測定できる。
【０１２８】
本発明はさらに上述するスクリーニング検定（例えば、癌治療の下記の記載を参照）により同定される新規剤に関する。従って、このような剤を用いた治療の有効性、毒性、副作用、または作用機構を決定するために、適切な動物モデル（本明細書に記載するものなど）で、本明細書に記載する同定された剤（例えば癌マーカー調節剤、アンチセンス癌マーカー核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子、癌マーカーに特異的な抗体、または癌マーカーの結合相手）をさらに使用することは本発明の範囲内である。さらに、上述するスクリーニング検定により同定された新規剤は、例えば本明細書に記載するような治療に（例えば癌を患うヒトの患者を治療するために）使用され得る。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明は、スクリーニングＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１シグナル伝達経路拮抗薬のための方法を含む種々のスクリーニング手続きのための非接着性マンモスフィアを採用した。非接着性マンモスフィアは、球形構造として懸濁液内で増殖する能力に基づいて、未分化の状態で第１のヒト乳房上皮幹細胞および前駆細胞の増殖を可能にするインビトロ培養システムである。非接着性マンモスフィアは、過去にＤｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００３  Ｍａｙ  １５；１７（１０）：１２５３−７０、およびＤｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４；６（６）：Ｒ６０５−１５に、記載され、その両方が参照により本明細書に組み入れられる。これらの参照は、全体の参照によって組み込まれ、非接着性マンモスフィアの構築および使用について具体的に示唆する。Ｄｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるように、マンモスフィアは、自己再生および多系列分化が可能な幹細胞および前駆細胞から構成されるよう特徴付けられてきた。Ｄｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．はまた、マトリゲル中の再構成された３Ｄ培養システム内でクローン的に複合機能性管状胞状構造を生成する能力を持つ細胞を含むことも記述している。
【０１３０】
特定の実施形態では、次の典型的なスクリーニング法が採用される。インビトロ研究において、未処理細胞対処理細胞で比較される腫瘍球形を形成するために、３日間アデノウイルス構築物発現対照またはＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１候補ｓｉＲＮＡ（感染多重度１０〜１００）のいずれかで細胞を処理するか、３日間低分子候補（例えば、ＰＨＡ６６５７５２誘導体）（０、１〜０、５ｕＭ）で処理し、ＣＸＣＲ１＋またはＦＢＸＯ２１＋細胞の能力を比較するかもしれない。インビボ研究において、腫瘍成長を観察するためにヒト乳癌細胞をレンチウイルス発現発光酵素に感染させることが可能である。ルシフェラーゼ発現癌細胞は、各群５動物の、定着しうるおおよそ０、５〜０、７ｃｍのサイズの乳房組織および腫瘍に注射することが可能である。そして、腫瘍が定着した動物は、候補ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１阻害剤（毎日、静脈内注射３０ｍｇ／ｋｇ／日、７日間）または賦形剤対照のいずれかで治療され得る。平行研究は、アデノウイルス発現対照または候補ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１ｓｉＲＮＡでの感染（感染多重度１００または５００を７日間）を使用して実行され得る。動物は、腫瘍サイズを測定するために、７、１４、２１、および２８日目に撮影され得、その後、犠牲にされ得る。腫瘍組織構造を測定するために、腫瘍サイズは、解剖で、そして染色された腫瘍部分をさらに測定され得る。残りの腫瘍は、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１陽性およびＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１陰性細胞の割合を測定するために収穫され、分類され得る。候補ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１阻害剤および候補ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１ｓｉＲＮＡアデノウイルス感染の投与が、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１シグナル伝達機能を抑制していることを検証するために、Ｇａｂ１およびＥＲＫなどの下流のメディエーターのリン酸化反応は検査され得る（Ｃｈｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００３；  ６３：７３４５−７３５５を参照し、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１３１】
（Ｖ．癌療法）
幾つかの実施形態では、本発明は癌のための療法を提供する。幾つかの実施形態では、療法は、癌マーカーを標的にする（例えば、ＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１およびＣＸＣＲ１またはＦＢＸＯ２１シグナル伝達経路内のタンパク質を含むが、それに限定されない）。幾つかの実施形態では、任意のよく知られたまたは後に開発された癌幹細胞療法が使用されるかもしれない。例えば、癌幹細胞治療薬は、米国特許第６，９８４，５２２号および第７，１１５，３６０号、国際出願ＷＯ０３／０５０５０２、ＷＯ０５／０７４６３３、およびＷＯ０５／００５６０１に記載され、参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【０１３２】
抗体療法
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の幹細胞癌マーカーを発現する標的腫瘍の抗体を提供する。いずれの好適な抗体（例えば、単クローン性の、多クローン性の、または合成の）が、本明細書に記載の治療法で利用され得る。幾つかの実施形態では、癌療法のために使用される抗体は、ヒト化抗体である。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，５８５，０８９号、第６，０５４，２９７号、および第５，５６５，３３２号を参照、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、治療抗体は、本発明の幹細胞癌マーカーに対して生成される抗体を含み、抗体は細胞毒性薬と接合する。かかる実施形態では、正常細胞を標的にしない、腫瘍に特異的な治療薬が生成されるため、従来の化学療法の有害な副作用の多くを軽減する。特定の適用では、治療薬は、抗体への付着に有用な剤として機能する治療薬、具体的には内皮細胞を死滅するもしくは細胞の増殖または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性剤または他の抗細胞剤であることが想定される。本発明は、抗体に接合し、活性形態で送達され得る任意の薬剤の使用を考慮する。典型的な抗細胞剤は化学療法剤、放射性同位体、および細胞毒素を含む。本発明の治療抗体は、放射性同位体（例えば、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、レニウム１８８、レニウム１８６、ガリウム６７、銅６７、イットリウム９０、ヨウ素１２５、またはアスタチン２１１）、ステロイドなどのホルモン、シトシンなどの代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デメコルシン；エトポシド；ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファランなどの抗腫瘍アルキル化剤を含むが、これらに限定されない様々な細胞毒性部分を含み得る。他の実施形態は、凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細胞内毒素、または細胞内毒素の脂質Ａ部分などの剤を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、治療剤は、植物、菌類、または細菌に由来する毒素、ほんの数例を挙げると、例えば、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、リストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素または緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素等を含む。幾つかの実施形態では、脱グリコシル化リシンＡ鎖が利用される。
【０１３４】
あらゆる事象において、これらのような剤は、所望ならば、公知の結合技術（例えば、Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ９３：２８０［１９８３］を参照）を使用して必要に応じて標的腫瘍細胞の部位の血液構成物への標的化、内在化、放出または提示を可能にする様式で、抗体に首尾よく接合され得ることが提案される。
【０１３５】
例えば、幾つかの実施形態では、本発明は本発明の幹細胞癌マーカーを標的とする免疫毒素を提供する。免疫毒素は、毒素部分などの細胞毒性薬と、特異的な標的化剤、通常は腫瘍指向性抗体またはフラグメントとの抱合体である。標的化剤は標的抗原を携える細胞に毒素を導き、それによって選択的に前記細胞を死滅させる。幾つかの実施形態では、治療抗体は高いインビボ安定性を提供する架橋剤を採用する（Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４８：６３９６［１９８８］）。
【０１３６】
他の実施形態では、特に固形腫瘍の治療法に伴う場合、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することにより、腫瘍血管系に対して細胞毒性効果または他の抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は腫瘍が局在する血管の虚脱をもたらし、腫瘍細胞、特に血管系末端の腫瘍細胞から酸素および栄養を奪い、最終的に細胞死および腫瘍壊死に導くことを意図する。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、抗体に基づく治療は下記に記載するような薬学的組成物として策定される。幾つかの実施形態では、本発明の抗体組成物の投与は癌の測定可能な減少をもたらす（例えば、腫瘍の減少または排除）。
【０１３８】
（ＶＩ．治療組成物および投与）
本発明による腫瘍形成の制御因子を含む薬学的組成物は、任意の効果的な方法で投与され得る。例えば、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬、またはＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル変換／反応経路内のタンパク質の拮抗薬を働かせる他の治療薬が、任意の効果的な方法によって投与され得る。本発明の特定の実施形態では、治療薬は、レペルタキシンまたはその誘導体を含む。
【０１３９】
特定の実施形態では、生理学的に適切な溶液は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬の有効濃度を含み、局所的に、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または任意のほかの効果的な手法で投与され得る。特に、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬剤は、標的組織の腫瘍細胞を処置するのに効果的な量を注射で標的癌または腫瘍に（例えば、乳房組織に）直接に接種されてよい。代替として、眼、消化管、尿生殖路（例えば、膀胱）、肺および気管支系および類似のもの内のような体腔に存在する癌または腫瘍は、注射またはカテーテルまたは管腔器官を苦しめる癌または腫瘍に設置された他の送達管での直接接種を通じ、有効濃度のＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を含む生理学的に適切な組成物（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液のような溶液、懸濁液、またはエマルジョン、で無菌のもの）を受け取ることができる。例えば、Ｘ線、超音波画像、または光ファイバー可視化システムのような任意の効果的なイメージングデバイスが、標的組織の位置を特定し、注射またはカテーテル管を誘導するのに使用されてよい。別の代替手段では、有効濃度のＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を含む生理学的に適切な溶液は、直接に到達されなかった、または解剖学的に分離されなかった癌または腫瘍を処置するために全身的に血液循環に投与され得る。
【０１４０】
かかる操作は、拮抗薬が腫瘍細胞に接触し（剤の特性に依存して）、形質導入し、または形質移入できるように標的腫瘍に十分接触するようにＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を設置する共通の目的を有する。１つの実施形態では、管腔器官の上皮内層に存在する固形腫瘍は、中空を体液で満たされた器官に懸濁液を注射し、または中空を空気で満たされた器官にスプレーまたは噴霧することで処置されてよい。それ故に、腫瘍細胞（例えば、固形腫瘍幹細胞）は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬に接触しやすい、肺の気管支樹の内膜、消化管内膜、女性生殖管内膜、尿生殖路、膀胱、胆嚢および任意の他の臓器組織の上皮組織内またはその中に存在するかもしれない。別の実施形態では、固形腫瘍は、例えば、脊髄、脊髄神経根、または脳等の中枢神経系の内膜上に位置づけられるかもしれず、脳脊髄液に注射されたＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、その空間の固形腫瘍の細胞に接触し、形質導入する。腫瘍学分野の当業者は、拮抗薬は、腫瘍内で腫瘍細胞に接触し作用するように腫瘍に直接接種することによって固形腫瘍に投与され得ることが理解されよう。
【０１４１】
本発明で同定される腫瘍原性の細胞は、抗癌細胞抗体を育てるのにも使用され得る。１つの実施形態では、この方法は、腫瘍原性の細胞の濃縮された集団、または分離された腫瘍原性の細胞を得、細胞複製を防ぐために集団を処置し（例えば、照射によって）、そして固形腫瘍幹細胞に免疫反応を誘導するために有効な量で、ヒトまたは動物対象に処置細胞を投与することを伴う。注射または経口投与される細胞の有効な一回の投与量に関する指針としては、米国特許第６，２１８，１６６号、第６，２０７，１４７号、および第６，１５６，３０５号を参照のこと、これは参照により本明細書に組み入れられる。別の実施形態では、当方法は、固形腫瘍幹細胞の濃縮された集団または単離された固形腫瘍幹細胞を得、抗体が育てられたヒト対象または宿生動物からの免疫エフェクター細胞とインビトロ培養で幹細胞を混合し（当技術分野で公知の免疫学的方法に従って）、培養から免疫エフェクター細胞を除去し、そして動物の免疫反応を刺激するのに効果的な投与量で宿生動物に免疫エフェクター細胞を移植することを伴う。
【０１４２】
本発明の幾つかの実施形態では、本発明の抗腫瘍原性の治療薬（例えば、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬）は、他の抗腫瘍療法と同時投与される。幅広い種類の治療薬が、本発明で使用を見出す。本発明の剤と同時投与され得、または本発明の剤と関連し得る任意の治療薬は、本発明の方法による使用に好適である。
【０１４３】
種々のクラスの抗腫瘍性（例えば、抗癌）剤が、本発明の特定の実施形態における使用のために考慮される。本発明による使用に好適な抗癌剤は、アポトーシスを誘導する剤、アデノシンデアミナーゼ機能を阻害する、ピリミジン生合成を阻害する、プリン環生合成を阻害する、ヌクレオチド相互変換を阻害する、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する、チミジンモノホスフェート（ＴＭＰ）合成を阻害する、ジヒドロフォレート還元を阻害する、ＤＮＡ合成を阻害する、ＤＮＡとの付加体を形成する、ＤＮＡを損傷する、ＤＮＡ修復を阻害する、ＤＮＡとインターカレートする、アスパラギン類をデアミネートする、ＲＮＡ合成を阻害する、タンパク質合成または安定性を阻害する、微小管合成または機能を阻害する剤およびそれに類するものを含むが、これらに限定されない。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物および方法の使用に好適な代表的な抗癌剤としては、１）微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシンなど）、微小管安定化剤（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、およびドセタキセルなど）を含むアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）など）などのトポイソメラーゼ阻害剤を含むクロマチン機能阻害剤、トポイソメラーゼＩを標的とする剤（例えば、カンプトテシンおよびイシリノテカン（ＣＰＴ−１１）など）、２）ナイトロジェンマスタード類（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびブスルファン（ＭＹＬＥＲＡＮ）など）、ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチンなど）、および他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトマイシンなど）などの共有結合性ＤＮＡ結合剤（アルキル化剤）、３）核酸阻害剤（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）など）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシンおよびセルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシン（イダマイシン）など）、アントラセンジオン類（例えば、ミトキサントロンなどのアントラサイクリンアナログ）、ブレオマイシン類（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）など、およびプリカマイシン（ミトラマイシン）などの非共有結合性ＤＮＡ結合剤（抗腫瘍抗生物質）、４）葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキサート、ＦＯＬＥＸ、およびＭＥＸＡＴＥなど）、プリン代謝拮抗薬（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、２−クロロデオキシアデノシン（ＣｄＡ）、および２’−デオキシコフォルマイシン（ペントスタチン）など）、ピリミジンアンタゴニスト（例えば、フルオロピリミジン類（例えば、５−フルオロウラシル（ＡＤＲＵＣＩＬ）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）（フロクスウリジン））など）、およびシトシンアラビノシド類（例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ（ａｒａ−Ｃ）およびフルダラビンなど）などの代謝拮抗薬、５）Ｌ−アスパラギナーゼ、およびヒドロキシ尿素などの酵素、６）グルココルチコイド類、抗エストロゲン類（例えば、タモキシフェンなど）、非ステロイド系抗アンドロゲン類（例えば、フルタミドなど）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）など）などのホルモン類、７）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、８）抗癌剤、毒素、および／または放射性核種と接合した単クローン性抗体など、９）生体応答調整物質（例えば、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮ−αなど）およびインターロイキン類（例えば、ＩＬ−２など）など）、１０）養子免疫療法、１１）造血成長因子、１２）腫瘍細胞分化を誘導する剤（例えば、オール−トランス−レチノイン酸など）、１３）遺伝子療法技術、１４）アンチセンス療法技術、１５）腫瘍ワク���ン、１６）腫瘍転移に対する療法（例えば、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）など）、１７）血管形成阻害剤、１８）プロテオソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ）、１９）アセチル化阻害剤および／またはメチル化阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）、２０）ＮＦκＢの調節剤、２１）細胞分裂周期調節阻害剤（例えば、ＣＤＫ阻害剤）、２２）ｐ５３タンパク質機能の調節剤、および２３）放射線、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
癌療法の文脈で日常的に使用される任意の腫瘍融解剤が、本発明の組成物および方法における使用を見出される。例えば、米国食品医薬品局は、米国での使用に承認された腫瘍崩壊性剤の処方を支持している。Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．に対応する国際政府機関は、同様の処方を支持している。表３は、米国における使用に関して承認された代表的な抗癌薬のリストを提供している。米国で承認された全ての化学療法に対して求められる「製品ラベル」が、代表的な薬剤に関して承認された効能や効果、投薬情報、毒性データ、および類するものが記載していることを当業者は理解されるであろう。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２】
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【０１４８】
【表３】
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【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
【表９】
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【０１５５】
【表１０】
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【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
【表１２】
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【０１５８】
【表１３】
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【０１５９】
【表１４】
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【０１６０】
抗菌治療薬もまた、本発明の治療薬として使用されてよい。微生物体の機能を殺す、阻害する、またはそうでなければ減弱することができる任意の剤、ならびにそのような活性を有するように考慮される任意の剤が使用されてよい。抗菌剤は、天然および合成抗生物質、抗体、阻害性タンパク質（例えば、デフェンシン）、アンチセンス核酸、膜破壊性剤、および類するものを含むが、それに限定されず、単独でまたは併用で使用される。実際、限定されるわけではないが、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および類するものを含むが、それに限定されない、抗生物質の任意の型が使用されてよい。
【０１６１】
なおさらなる態様では、本発明は、特有の細胞タイプ（例えば、腫瘍細胞）を特異的に標的化することができる標的化剤と関連した本発明の化合物（および任意の他の化学療法剤）を提供する。一般的に、標的化剤と関連した治療化合物は、標的化剤の細胞表面部分との相互作用を通して新生物性細胞を標的化し、受容体媒介性エンドサイトーシスを通して細胞へ取り入れられる。
【０１６２】
標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に位置していることが知られている任意の部分が、本発明で使用を見出す。例えば、かかる部分に対して指向性の抗体は、本発明の組成物をその部分を含む細胞表面へ標的化する。代替として、標的化部分は、細胞表面上に存在する受容体へ向けられるリガンド、または逆であってよい。同様に、ビタミンもまた、本発明の治療用物質を特有の細胞へ標的化するために使用されてよい。
【０１６３】
本明細書に使用されるように、「標的化分子」という用語は、治療化合物を細胞、組織および器官へ標的化するのに有用な化学的成分およびその部分を指す。種々のタイプの標的化分子が本発明での使用を考慮され、シグナルペプチド、抗体、核酸、毒素、および類するものを含むが、それに限定されない。標的化部分は、追加として、関連する化学化合物（例えば、低分子）の結合、または標的化される細胞、組織および器官への化合物の侵入を促進するかもしれない。好ましくは、標的化部分は、特定の細胞下の位置および細胞小器官を含む対象、組織または細胞内の標的化される部位へ付着した化合物を選択的に送達する際に、それらの特異性、親和性、および効力に従って選択される。
【０１６４】
種々の効率の問題は、全ての薬物、および特に高細胞毒性薬物（例えば、抗癌薬）、の投与に影響する。特に重要な１つの問題は、投与された剤が、標的化された細胞（例えば、癌細胞）、組織または器官のみに影響を及ぼすことを保証することである。高細胞毒性剤の非標的細胞への非特異的または非意図的送達は、深刻な毒性問題を引き起こし得る。
【０１６５】
非特異的薬物送達に関連した問題に取り組むために、薬物標的化スキームを考案するように多数の試みがなされた。（例えば、Ｋ．Ｎ．  Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ａ．Ａ．  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９：６０６−６１４  （１９９９）；  Ｙ．Ｊ．  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ７８：６７−７９  （２００２）；  Ｒ．Ｖ．Ｊ．  Ｃｈａｒｉ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．，  ３１：８９−１０４  （１９９８）；およびＤ．  Ｐｕｔｎａｍ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｋｏｐｅｃｅｋ，  Ａｄｖ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．，  １２２：５５−１２３  （１９９５）を参照）。抗体およびリガンドペプチド（例えば、内皮細胞のためのＲＤＧ）のような薬物分子へ結合している接合標的化部分は、特定の薬物に関連したいくつかの副次的な毒性問題を軽減するために使用された。
【０１６６】
化合物および抗癌剤は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含むがそれに限定されない、任意の滅菌した、生体適合性の薬学的担体において投与されてよい。幾つかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、１つの剤（例えば、抗体）を含んでよい。他の実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも２つの剤（例えば、抗体および１つもしくは複数の通常の抗癌剤）の混合物を含む。なおさらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物は、次の条件、異なる周期現象において、異なる持続期間において、異なる濃度において、異なる投与経路による、などの条件の１つもしくは複数の下で患者へ投与される少なくとも２つの剤を含む。幾つかの実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、第２の抗癌剤の前に、例えば、抗癌剤の投与の０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１２時間、または１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、または６日、１週間、２週間、３週間、または４週間前に、投与される。幾つかの実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、第２の抗癌剤の後に、例えば、抗癌剤の投与から０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１２時間、または１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、または６日、１週間、２週間、３週間、または４週間後に、投与される。幾つかの実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬および第２の抗癌剤は、同時投与されるが、異なるスケジュールで投与され、例えば、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬化合物は、毎日投与され、一方、第２の抗癌剤は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、投与される。他の実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、週に１回、投与され、一方、第２の抗癌剤は、毎日、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。
【０１６７】
処置される状態に依存して、本薬学的組成物の好適な実施形態は、製剤化されて、全身的または局所的に投与される。製剤化および投与についての技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．）の最新版に見出され得る。好適な経路は、例えば、経口または経粘膜的投与、ならびに非経口送達（例えば、筋肉内、皮下、脊髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与）を含み得る。
【０１６８】
本発明は、治療化合物、および幾つかの実施形態において、１つもしくは複数の通常の抗癌剤を、許容される薬学的送達方法および調製技術に従って投与することを考慮する。例えば、治療化合物および好適な抗癌剤は、生理食塩水のような薬学的に許容される担体において対象へ静脈内に投与され得る。薬学的剤の細胞内送達についての標準的方法が考慮される（例えば、リポソームによる送達）。かかる方法は、当業者に周知である。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、本発明の製剤は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脊髄内、および腹腔内）に有用である。いくつかの考慮された抗癌剤（例えば、治療ポリペプチド）の治療的同時投与はまた、遺伝子治療試薬および技術を用いて達成され得る。
【０１７０】
本発明の幾つかの実施形態では、治療化合物は、対象へ、単独で、または１つもしくは複数の通常の抗癌剤（例えば、ヌクレオチド配列、薬剤、ホルモン、等）と併用で、または成分が任意で賦形剤もしくは他の薬学的に許容される担体と混合されている薬学的組成物において投与される。本発明の好適な実施形態では、薬学的に許容される担体は生物学的に不活性である。好適な実施形態では、本発明の薬学的組成物は経口投与に好適な投薬量で当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を用いて製剤化される。かかる担体は、薬学的組成物が、対象によるそれぞれの経口的なまたは経鼻摂取のために、錠剤、ピル、カプセル、糖衣錠、液体、ゲル、シロップ、スラリー、溶液、懸濁液、および類するものとして製剤化されることを可能にする。
【０１７１】
経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、その結果生じた混合物を任意ですりつぶし、錠剤または糖衣錠のコアを得るために必要に応じて好適な補助剤を加えた後に、混合物を顆粒へ加工することにより得られ得る。好適な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム、およびゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質のような炭水化物またはタンパク質である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤が添加されてよい。
【０１７２】
好適な実施形態では、投与量および投与レジームは、治療効果の所望のレベルおよび得られる治療効果の実際的レベルを含むがそれに限定されない、周知の薬理学的および治療的考慮に基づいて、臨床医または薬理学的分野に熟練した他の者により作成される。一般的に、化学療法剤を投与するための周知の薬理学的原則に従うことが賢明である（例えば、一度に、および３〜４の剤半減期ごと以内に、５０％より多く、用量を変化させないことが一般的に賢明である）。用量関連毒性の考慮すべき問題を比較的、ほとんどまたは全くもたない組成物について、最大効力（例えば、癌細胞の破壊）が望まれる場合、平均の必要とされる用量を超える用量はまれではない。投薬量のこのアプローチは、一般的に、「極量」ストラテジーと称される。特定の実施形態では、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬は、１日１〜４０ｍｇの投与量で（例えば、４〜６週間）対象に投与される。特定の実施形態では、対象は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を１５〜７０ｍｇ間の負荷用量で投与される。特定の実施形態では、対象は、ＩＬ８−ＣＸＣＲ１シグナル伝達経路拮抗薬を約３５〜４５ｍｇの負荷用量で（例えば、皮下に）投与され、毎日約１０ｍｇの投与量で（例えば、皮下に）約４〜６週間投与される。
【０１７３】
追加の投薬の考慮すべき問題は、投与されている剤についての適切な標的レベルを計算すること、剤の蓄積、および潜在毒性、抵抗性の刺激、効力の欠損、および剤の治療指数の範囲を記載することに関する。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明は、剤の投与を日常的に滴定法する方法を使用することを考慮する。投与についての１つの一般的なストラテジーは、対象における剤についての妥当な標的レベルを設定することである。幾つかの好適な実施形態において、剤レベルは、対象の血漿において測定される。適切な投与量レベルおよび頻度は、その後、剤についての所望の定常状態標的レベルを達成するように設計される。対象における剤の実際の、または平均のレベルは、用量レベルまたは頻度が標的レベルを維持するように調整され得るように、観察される（例えば、１時間ごとに、毎日、毎週など）。もちろん、投与されている特定の剤の薬物動態学および薬物動力学（例えば、生物学的利用能、クリアランスまたは生体蓄積、生体内分布、薬物相互作用など）は、何が熟慮された妥当な標的レベルであるかに潜在的に影響を与え、それに従って、投与量レベルまたは頻度に影響を与える可能性があり得る。
【０１７５】
標的レベル投薬方法は、典型的には、対象における剤についての望ましい範囲（または治療範囲）に関して定められる妥当な治療目標を確立することに依存する。一般的に、治療範囲の下限値は、最大可能治療効果の約５０％を提供する剤の濃度とおおよそ等しい。治療範囲の上限値は、通常、剤の毒性により確立され、それの効力によって確立されない。本発明は、特定の剤についての治療範囲の上限値は、対象の５％未満または１０％未満が毒性副作用を示す濃度であることを考慮する。幾つかの実施形態では、治療範囲の上限値は、下限値より約２倍、またはそれ未満である。当業者は、これらの投薬の考慮すべき問題が極めて変わりやすく、ある程度、個別的である（例えば、遺伝性素因、免疫学的考慮、耐性、抵抗性、および類するものに基づいて）ことを理解しているものと思われる。従って、幾つかの実施形態では、特定の対象における剤についての有効な標的投薬レベルは、別の対象における最適よりも１、．．．５、．．．１０、．．．１５、．．．２０、．．．５０、．．．７５、．．．１００、．．．２００、．．．Ｘ％高いかもしれない。逆に、いくつかの対象は、対象の一部または大部分において最適な治療レベルを典型的に生成するものよりはるかに低い（１、．．．５、．．．１０、．．．１５、．．．２０、．．．５０、．．．７５、．．．１００、．．．２００、．．．Ｘ％）投薬レベルまたは頻度で健康問題に関連した重大な副作用および毒性を受けるかもしれない。より具体的な情報を欠く場合、標的投与レベルは、しばしば、治療範囲の中間に設定される。
【０１７６】
好適な実施形態では、臨床医は、公知の薬理学的原則および方程式に基づいて個別化された投与レジームを合理的に設計する。一般的に、臨床医は、Ｆ（用量の分画生物学的利用能）、Ｃｐ（血漿における濃度）、ＣＬ（クリアランス／クリアランス速度）、Ｖｓｓ（定常状態での薬物分布の容量）、Ｃｓｓ（定常状態での濃度）、およびｔ１／２（薬物半減期）、ならびに剤の吸収および分配の速度についての情報を含みそれに限定されない、剤の種々の薬理学的および薬物動態学的特性の知識に基づいて個別化された投与計画を設計する。当業者は、これらの変数のさらなる説明について、および個別化される投与計画の計算を例証する完全な方程式について、周知の薬理学的テキスト（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  第１０版，  Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ２００１）のいくつでも参照する。当業者はまた、個々の対象においてこれらの変数における潜在的変動を予想することができるものと思われる。例えば、Ｆ、ＣＬおよびＶｓｓについて観察された値における標準偏差は、典型的には、それぞれ、約２０％、５０％、および３０％である。個々の対象において幅広く変動する潜在パラメータの実際的効果は、対象においてＣｓｓが達成された時点の９５％が、標的レベルのそれの３５％と２７０％の間であることである。低い治療指数を有する薬物について、これは望ましくない幅広い範囲である。しかしながら、当業者は、一旦、剤のＣｐ（血漿における濃度）が測定されたならば、Ｆ、ＣＬ、およびＶｓｓの値を直接的に推定することは可能であることを認識しているものと思われる。これは、臨床医が特定の対象の投与計画を効果的に微調整することを可能にする。
【０１７７】
さらに他の実施形態では、本発明は、継続的治療薬観察技術が、個々の投薬方法および計画をさらに調整するために使用されることを考慮する。例えば、１つの実施形態では、Ｃｓｓデータは、ＣＬ／Ｆの推定をさらに正確にするために、およびその後、公知の薬理学的原則および方程式を使用して所望の剤の標的レベルを達成するために個々の維持投薬を継続的に調整するために用いられる。治療薬観察は、投薬スケジュール中の実際にいつでも行われることができる。好適な実施形態では、観察は、投薬中の複数の時点において、特に間欠投与を施している時に実施される。例えば、薬物観察は、採用される投薬方法（例えば、間欠投与、負荷量、維持投薬、ランダム投薬、または任意の他の投薬方法）に関わらず、剤の投与の１秒に満たない時間内、数秒内、数分内、数時間内、数日内、数週間内、数ヶ月内などに、同時に行われ得る。しかしながら、剤投与に続く迅速な試料採取の時、剤の血漿濃度における変化は遅れるかもしれない（例えば、分配の遅い速度または他の薬物動力学的因子のせいで）ため、剤効果および動力学における変化は、容易には観察できないかもしれないことを当業者は認識しているものと思われる。従って、剤投与直後に得られた対象試料は、制限されたまたは減少した値を有するかもしれない。
【０１７８】
投与の予想された定常状態目標レベル中に対象から生物試料を収集することの第１の目的は、その後、剤のＣＬ／Ｆ比の改訂された推定値を計算することに基づいて個体の投与計画を修正することである。しかしながら、初期の吸収後薬物濃度は、典型的には、剤クリアランスを反映しないことを当業者は認識しているものと思われる。初期の吸収後薬物濃度は、剤の吸収速度、剤分布の、定常状態よりむしろ中心の容量、および分配速度により原則的に決定される。これらの薬物動態学的性質のそれぞれは、治療長期維持投与計画を計算する場合、制限された値を有する。
【０１７９】
従って、幾つかの実施形態では、目的が治療長期維持投薬である場合、生物試料は、前の用量が投与されてからかなり後に、およびいっそうより好ましくは、次の計画された用量が投与される直前に、対象となる対象、細胞、または組織から得られる。
【０１８０】
さらに他の実施形態では、治療剤が投与間の間欠期において対象によりほとんど完全に排除される場合、本発明は、前の投与後種々の時点において、および最も好ましくは、用量が投与された直後に、対象から生物試料を収集することを考慮する。
【０１８１】
（ＶＩＩ．レペルタキシンおよび他の低分子ＣＸＣＲ１阻害剤）
特定の実施形態では、本発明の方法、キット、および組成物は、ＣＸＣＲ１の低分子阻害剤を採用する。１つの典型的な剤は、レパルタキシンである。特定の実施形態では、インビボレパルタキシン用量は、１キロあたり３〜６０ｍｇである（例えば、３．．．３０．．．５０．．．６０ｍｇ／ｋｇ）。具体的な実施形態では、レパルタキシン用量は、１キロあたり約３０ｍｇである。レパルタキシンの化学式は、次のとおりである。
【０１８２】
【化１】
2014037427.tif 000017
【０１８３】
他の実施形態では、レペルタキシンの誘導体が採用される。他の低分子ＣＸＣＲ１拮抗薬は、ＳＢ２６５６１０（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；  Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  １５１：１９６−１９７）、ならびにＳＣＨ５２７１２３（２−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛２−［［（Ｒ）−１−（５−メチルフラン−２−イル）プロピル］アミノ］−３，４−ジオキソシクロブト−１−エニルアミノ｝ベンザミド（ＳＣＨ５２７１２３）は、経口投与可能なＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ１受容体拮抗薬（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）である）を含む。他の低分子阻害剤は、上述のスクリーニング法によって同定され得る。
【実施例】
【０１８４】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を実証かつさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８５】
（実施例１）
ＣＸＣＲ１の癌幹細胞同定
この実施例は、ＣＸＣＲ１、ならびに癌幹細胞マーカーとしての他のタンパク質（例、ＦＢＸＯ２１）の同定を記載する。
【０１８６】
細胞培養。乳腺細胞株（ＢＣＬ）は、ＡＴＣＣ（“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．”に続いて“ｌｇｃｐｒｏｍｏｃｈｅｍ−ａｔｃｃ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｏｎ／ｃａｔａｌｏｇ／ｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＩｎｄｅｘ．ｃｆｍ”）から、またはＤｒｓ．  Ｓ．  Ｅｔｈｉｅｒの研究所で開発された収集品（“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．”に続いて“ａｓｔｅｒａｎｄ．ｃｏｍ／ａｓｔｅｒａｎｄ／ＢＩＯＲＥＰＯＳＩＴＯＲＹ／ｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ａｓｐｘ，  ＳＵＭ４４，  ＳＵＭ５２，  ＳＵＭ１４９，  ＳＵＭ１５９，  ＳＵＭ１８５，  ＳＵＭ１９０，  ＳＵＭ２２５，  ＳＵＭ２２９”で現在利用可能）、Ｖ．Ｊ．  Ｍｏｅｂｕｓ  （ＢｒＣａ−ＭＺ−０１）、およびＶ．  Ｃａｔｒｏｓ  （Ｓ６８）から得られた。試験された全ＢＣＬは、線維嚢胞性疾患から得られたＭＣＦ１０Ａを除き、上皮性悪性腫瘍、および正常乳房組織から得られたＨＭＥＣ由来１８４Ａ１から得られた。細胞株は、望ましい培養条件を使用して育成された。全実験は、成長の指数関数的なフェーズのやや集密的な細胞で行われた。
【０１８７】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定およびＦＡＣＳによるＡＬＤＨ陽性集団の分離。ＡＬＤＨ活性は、ヒト乳癌の主要な分子亜類型を表現する３３ＢＣＬで評価された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｕｒｈａｍ，  ＮＣ，  ＵＳＡ）は高ＡＬＤＨ酵素活性で集団を単離するのに使用された（１７）。トリプシン処理後にやや集密的な細胞株から、または解離されたばかりの異種移植片から得られた細胞は、ＡＬＤＨ基質（１ｘ１０６細胞あたりＢＡＡＡ、１μｍｏｌ／ｌ）を含むＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定緩衝液で懸濁され、４０分間３７°Ｃで培養された。それぞれの実験で、細胞の試料は、負の対照として、特定のＡＬＤＨ阻害剤である、ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）５０ｍｍｏｌ／Ｌで、同一条件下で染色された。フローサイトメトリー分類は、ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実行された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ蛍光は、４８８ｎｍで励起され、標準フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）５３０／３０バンドパスフィルタを使用して検出された。異種移植された腫瘍において、抗Ｈ２Ｋｄ抗体（ＢＤバイオサイエンス、１／２００，２０分氷上）で培養することに続くフェコエリスリンでの第２の抗体標識化（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ，１／２５０，２０分氷上）、は、マウス由来の細胞を排除するために使用された。分類ゲートは、生存力についてのＰＩ染色細胞、ＤＥＡＢ処置されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ染色細胞、および第２の抗体単独で染色されたものを使用して確立された。ＲＮＡプロファイリングまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス注射の前に、分類された集団の純度は、ＢｒＣａ−ＭＺ−０１およびＳＵＭ１５９細胞株内の１０，０００のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞の二重の分類を使用してチェックされた。両細胞株にとって、分類されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞を９８％以上含み、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団内ではＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は検出されなかった。
【０１８８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内の腫瘍形成能。ＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陽性、陰性、および分離されていないＳＵＭ１５９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＢｒＣａ−ＭＺ−０１細胞の腫瘍形成能は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内で評価された。脂肪パッドは、思春期前の生育３週間で上皮を取り除かれ、（１７）に記載のように、ヒト繊維芽細胞（１：１照射：無照射、５０，０００細胞／１００μＬマトリゲル／脂肪パッド）を注射されてヒト化された。研究における脊椎動物の使用のための規制に従い、腫瘍が最大直径で１．２ｃｍの時、動物は安楽死させられた。脂肪パッドそれぞれの部分は、組織学分析のために、ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれた。別の部分は、、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定によって評価され、分類および連続移植が続いた。
【０１８９】
足場非依存性培養。１８４Ａ１、ＳＵＭ１４９、およびＳＵＭ１５９からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性、陰性、および分離されていない細胞は、低密度（５０００生存細胞／ｍＬ）で、極低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に単細胞として固定された。細胞は、（１８）に記載のように、無血清乳腺上皮の基礎の培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）で３〜７日間増殖された。球形を形成する細胞の能力は、培地に加えられた異なる用量のＩＬ８（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で処理後、定量化された。
【０１９０】
ＲＮＡ抽出。全ＲＮＡは、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ａｌｌ  Ｐｒｅｐ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを使用して凍ったＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞から、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従い抽出された。８つのＢＣＬ、すなわち１８４Ａ１、ＢｒＣａ−ＭＺ−０１、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＵＭ１４９、およびＳＵＭ１５９が、転写分析に使用された。ＲＮＡ完全性は、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動およびミクロ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を変性させることで管理された。
【０１９１】
ＤＮＡマイクロアレイでの遺伝子発現プロファイリング。遺伝子発現分析は、３８，５００個の十分に特徴付けられたヒト遺伝子を含む４７，０００超の転写産物および変異体を含むアフィメトリクスＵ１３３プラス２．０ヒトオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した。ｃＲＮＡの調製、混成、洗浄、および検出は、提供者に推薦されたように実施された（“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．”に続いて“ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ａｆｆｘ”）。発現データは、（２０、２１）に記載のように、バイオコンダクタおよび関連パッケージ（１９）を使用するＲにおいて、ＲＭＡ（ロバストマルチチップ平均）方法によって分析された。ＲＭＡは、１遺伝子あたり１１のオリゴヌクレオチドのバックグラウンド補正、変位値標準化、および要約化を行った。
【０１９２】
分析前に、ろ過過程は、データセットから２５，２８５遺伝子／ＥＳＴを保持する全ての１６試料中で１００ユニットに劣る発現値で画定されるように、低および不完全に測定された発現の遺伝子を取り除いた。標準偏差（ＳＤ）の強度に基づく第２のフィルタは、分析を通じ、低発現変異を示す遺伝子を排除するために監視されていない分析に適用された。標準偏差は、ログ２変換データ上で計算されたが、最低値は１００ユニットの最小値、すなわち、０．５以上の標準偏差の１３，５５０遺伝子／ＥＳＴを保持するバックグラウンド強度にまず張られた。監視されていない分析は、１３，５５０遺伝子上の１６のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性、陰性細胞で行われた。階層クラスタリング前にフィルタされたデータは、ログ２変換され、遺伝子上のデータメジアン中心、類似性測量および重心結合クラスタリングとしてのピアソン相関を使用するクラスタプログラム（２２）に伝送された。結果は、ツリー表示プログラム（２２）を使用して表示された。遺伝子区別できるＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団を区別する遺伝子を同定し位置づけるために、マン−ホイットニーのＵテストが、２５，２８５遺伝子／ＥＳＴに適用され、誤った発見率（ＦＤＲ）（２３）は、仮説の複数テストを正すのに使用された。識別特性の分類能力は、階層クラスタリングによって試料を分類することで例証された。ＬＯＯＣＶは、同定された分子シグネチャーおよび監視された分析の妥当性の予測の正確性を推定するのに適用され、それぞれの試料は、無排除試料上で画定されたモデルを使用して、１つずつ排除され、線形判別分析（ＬＤＡ）（２４）で分類された。
【０１９３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。異なる細胞株からＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団が分類された後、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離され、３８４ウェル遮断モジュールおよび自動アクセサリ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標登録）７９００ＨＴ配列検出システムのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）検定のために利用された。Ｔａｑｍａｎシステムのためのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍｓのウェブサイトから選択された。ＰＣＲプライマーペアの配列およびＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１、およびＴＢＰに使用される蛍光発生プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍｓのウェブサイトで利用可能である（ＣＸＣＲ１検定ＩＤ：Ｈｓ＿００１７４１４６＿ｍｉ；ＦＢＸＯ２１検定ＩＤ：Ｈｓ＿００３７２１４１＿ｍｉ，ＮＦＹＡ検定ＩＤ：Ｈｓ＿００９５３５８９＿ｍｉ，ＮＯＴＣＨ２検定ＩＤ：Ｈｓ＿０１０５０７１９＿ｍｉ，ＲＡＤ５１Ｌ１検定ＩＤ：Ｈｓ００１７２５２２＿ｍｉ，ＴＢＰ検定ＩＤ：Ｈｓ＿００４２７６２０＿ｍｉ）。ＣＸＣＲ１、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＲＡＤ５１Ｌ１の相対発現ｍＲＮＡレベルは、既に（２５）に記載のように、ＲＮＡの質および入力ｃＤＮＡ量の変化を標準化するために、内部標準ＴＢＰ遺伝子に関してコンピュータ計算された。
【０１９４】
浸潤検定。検定は、１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）のための８ｕｍ孔ポリカーボネートフィルタ挿入物でトランスウェルチェンバ内で、３重で行われた。フィルタは、１時間３７°Ｃで培養されたＤＭＥＭ／Ｆ１２内の、氷のように冷たい１：６基底膜抽出物（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３０ｕｌで被覆された。細胞は、無血清培地の２００ｕｌの上部チェンバに付加された。浸潤検定において、５０００細胞は、マトリゲル被覆フィルタ上に播種され、下部チェンバは、１０％ヒト血清（Ｃａｍｂｒｅｘ）で補われた培地６００ｕｌまたはＩＬ８（１００ｎｇ／ｍＬ）で補われた無血清培地６００ｕｌで満たされた。４８時間培養した後、フィルタ底面の細胞は、光学顕微鏡を使用して計数された。相対浸潤は、血清条件の下、未分離の対応する細胞株に標準化された。
【０１９５】
レンチウイルス感染。発光酵素遺伝子導入において、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＳＵＭ１５９からの７０％集密的細胞は、培地のレンチウイルスの上澄みであるレンチＬＵＣ−ＶＳＶＧ（ベクターコア，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ）１：３沈殿混合物で、一晩、培養された。次の日、細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡによって収穫され、１：６の比率でサブ培養された。１週間培養した後、細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ表現型に従って分類され、発光酵素発現は、それぞれの分類された集団（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性）で、培地に２ｍＬのＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ０．０００３％（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を付加し、素子カメラシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）によって光子束を数えることによって検証された。
【０１９６】
心臓内接種。生後６週間のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、２％イソフルラン／空気混合物で麻酔され、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋欠失無菌ダルベッコＰＢＳ１００μＬ内の１００，０００細胞を左心室に注射された。３つの細胞株それぞれ（ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９）およびそれぞれの集団（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性、および未分類）に対し、３動物が注射された。
【０１９７】
生物発光検出。接種およびその後の各週の接種の前に、基準値生物発光が評価された。マウスは、２％イソフルラン／空気混合物で麻酔され、ＰＢＳ中１５０ｍｇ／ｋｇ  Ｄ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の量の単回腹腔内投与が与えられた。そして、Ｄ−ルシフェリンの投与の６分後、動物は再度麻酔された。光子束を数えるために、電荷結合素子カメラシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）が、ノーズコーンイソフルラン送達システムおよび体温維持のための加熱段階で使用された。Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングシステムで提供される生存イメージソフトウェアを使用して２〜１２分露出した後、結果が分析された。シグナル強度は、データ後処理中に手作業で配置された関心のある均質領域内で、検出された全光子束数の合計として定量された。標準化された光子束は、接種後の各週に検出される光子束および接種前に検出される光子束の割合を代表する。
【０１９８】
統計的分析。結果は、それぞれの群の少なくとも３つの繰り返しの個別実験に対し、平均±標準偏差として表される。統計的分析は、ＳＰＳＳソフトウェア（１０．０．５版）を使用した。試料群と分子パラメータの間の相関関係は、フィッシャー抽出テストまたは独立系試料のワンウェイ分散分析で計算された。ｐ値＊０．０５は、有意と考えられた。
【０１９９】
乳腺細胞株の大部分は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を含む。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定（１７）は、多様な分子亜類型および乳癌の特徴を表す３３ＢＣＬからＣＳＣを単離するのに使用された（２０）。３３細胞株中２３が、０．２からほぼ１００％に近い範囲のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞集団を含むことが発見された。１２中７の管腔ＢＣＬが、いずれの検出可能なＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞（ｐ＝０．０００６、フィッシャー抽出テスト）も含まないのに対し、１６基底／間葉ＢＣＬは全て、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を含んでいた。
【０２００】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、腫瘍球形成能力を有する。乳房上皮幹細胞および前駆細胞は、足場非依存性条件で生存し増殖することが可能で、マンモスフィアと呼ばれる浮遊球形コロニーを形成することが以前に報告されていた（１８）。乳腺腫瘍ならびに細胞株からのデータは、癌幹のような細胞または癌発動細胞は、同様の検定において「腫瘍球」として単離または増殖もされ得ることを証明した（２６）。正常なヒト乳腺のマンモスフィアを引き起こす全細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内に含まれている（１７）。ＢＣＬからのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を特徴付けるために、１８４Ａ１、ＳＵＭ１４９、およびＳＵＭ１５９からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団の腫瘍球を形成するための能力が比較された。それぞれの細胞株で、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞に比較して増大した腫瘍球形成能力を示した。
【０２０１】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性ＢＣＬ細胞は、インビボに癌幹細胞特性を有する。ＢＣＬの階層的組織を決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９、およびＢｒＣａ−ＭＺ−０１細胞株のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団の幹細胞特性が、分析された。これらの３つのＢＣＬのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団は、全細胞集団の３．５４±１．７３％〜５．４９±３．３６％間に構成された（図１Ａ〜Ｂ、Ｇ〜Ｈ、図２Ａ〜Ｂ）。図１Ｆ、Ｌに示すように、腫瘍形成のサイズおよび潜伏は、注射されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の数に関連付けられた。注目すべきことに、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３からの５００のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞およびＳＵＭ１５９からの１，０００のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は腫瘍を形成することができた。腫瘍生成能力は、これらの細胞の自己再生能力を証明する連続継代を通じて維持された。対照的に、５０，０００のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞が注射された時に、限定的な成長が産出されたが、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞は、腫瘍を生成しなかった。脂肪パッド切片のＨ＆Ｅ染色法が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞によって形成された腫瘍が悪性細胞を含むことを確認したが、残留マトリゲル、アポトーシスを起こした細胞、およびマウスの組織のみがＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陰性細胞注射の部位で見られた（図１Ｅ、Ｋ）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団が癌幹細胞特性を有する事実と一致して、この集団によって生成された腫瘍は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞と同一の割合で当初の腫瘍の表現型の不均一性を繰り返した。（図１Ｃ、Ｉ）。これは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞が、自己再生でＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞を生成することが可能で、分化でＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞を生成することが可能であることを示した。
【０２０２】
ＢｒＣａ−ＭＺ−０１細胞が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性構成物に分離された時、両方とも腫瘍生成可能であった。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団によって生成された腫瘍は、当初の腫瘍の表現型の不均一性を繰り返すＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞の両方から構成された。対照的に、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞によって生成された腫瘍は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞のみを含む成長の遅い腫瘍を生じさせた。連続的に移植されるＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の能力とは対照的に、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性腫瘍の連続継代は、３つの経過に続いて成長しないことで腫瘍を成長の低下させた。これは、ＢｒＣａ−ＭＺ−０１細胞のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性構成物は、幹細胞特性をもつ細胞を含むが、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞は、限定的に成長を実行することはできるが自己再生はしない前駆細胞を含むことを示唆する。
【０２０３】
ＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陽性および陰性細胞集団の遺伝子発現プロファイリング。異なるＢＣＬから分離されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞が、「癌幹細胞」遺伝子の共通セットを発現したかを決定するために、８つのＢＣＬ（１８４Ａ１、ＢｒＣａ−ＭＺ−０１、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＢＲ−７、ＳＵＭ４９、およびＳＵＭ１５９）から分離されたＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞集団は、アフィメトリクス全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して分析された。１６試料に適用される監視されていない階層クラスタリングおよび１３，５５０のろ過された遺伝子／ＥＳＴは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団を分離しなかった。代わりに、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団は、親細胞株でクラスター化された。これは、クローン細胞株間のｍＲＮＡ転写産物の違いが、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性とＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞との間の違いに取って替わることを示唆する。これは、限定的な数の遺伝子のみが、差次的に推定癌幹細胞とその子孫との間に発現することをさらに提示した。
【０２０４】
どの遺伝子が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団を区別するのかを決定するために、マン−ホイットニーのＵテストが全遺伝子に適用されたが、低および不完全に測定された発現、すなわち２５，２８５プローブセットをもつものであった。ＦＤＲ補正後、このテストは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞集団を区別した４１３遺伝子／ＥＳＴを同定し、位置づけた。独自の遺伝子に対応する２８の過剰発現した遺伝子を表１に示し、最も頻繁に低発現した遺伝子を表２に示す。
【０２０５】
【表１５】
2014037427.tif 000018
【０２０６】
【表１６】
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【０２０７】
【表１７】
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【０２０８】
【表１８】
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【０２０９】
【表１９】
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【０２１０】
【表２０】
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【０２１１】
この識別シグネチャーの分類力は、１６のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性試料を、４１３の差次的に発現された遺伝子／ＥＳＴを分類することで例証された。階層クラスタリングは、１６試料中１５をランク付けした（図２Ａ）。
【０２１２】
幹細胞生物学の役割を果たすことが知られているＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、ＰＣＮＸ、ＲＢＭ１５、ＳＴ３ＧＡＬ３、およびＴＰＲＸＬを含む多くの遺伝子が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団（表１）で、上方制御された。例えばＡＲＩＤ１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｌ１、およびケモカイン受容体ＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡのような他の遺伝子は、幹細胞機能、で、推定または特徴付けられていない役割を有するタンパク質をエンコードする（２７）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内で低発現される遺伝子は、細胞分化、アポトーシス、ＲＮＡスプライシング、およびミトコンドリアの代謝に関与する。
【０２１３】
分析の厳密さを向上させるため、マン−ホイットニー分析の閾値は、０．５リスクに上げられ、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団を区別する４９遺伝子／ＥＳＴのリストを得た（表１〜２のアスタリスクのある遺伝子）。このリストで、ＳＫ−ＢＲ−７からのものを除く、全ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、共にクラスター化された。これらの４９遺伝子／ＥＳＴ中、４５が同定された独自の遺伝子に対応し、これら４５中たった３がＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性群内で過剰発現し、一方、４２が低発現であった。特徴付けられた過剰発現した遺伝子は、Ｆボックスタンパク質ＦＢＸＯ２１およびＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡをコードする。低発現遺伝子は、ミトコンドリアのタンパク質（ＭＲＰＬ４１、ＭＲＰＬ４２、ＭＲＰＬ４７、ＭＲＰＬ５４、ＭＲＰＳ２３、ＩＭＭＰ１Ｌ）のコード化、および分化（ＮＡＣＡ）およびプレｍＲＮＡスプライシング因子（ＬＳＭ３、プレｍＲＮＡプロセッシング因子ＰＲＰＦ３９およびＰＲＰＦ４Ｂ）を含む。０．５％リスクのＬｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ交差検定（ＬＯＯＣＶ）は、同定分子シグネチャーの予想の正確性を推定し、試料の８８％は、監視された分析を確認するこの「癌幹細胞シグネチャー」で右のクラスに予想された。
【０２１４】
定量ＲＴ−ＰＣＲ評価は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞内のＣＸＣＲ１およびＦＢＸＯ２１の重大な増加を確認した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内の過剰発現した５つの識別遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析（ＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡ、ＦＢＸＯ２１、ＮＦＹＡ、ＮＯＴＣＨ２、およびＲＡＤ５１Ｌ１）が実行された。プロファイリング分析に使用された３細胞株（ＢｒＣａ−ＭＺ−０１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９）および２つの追加の管腔細胞株（ＭＣＦ７、Ｓ６８）は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定で分類され、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析でそれぞれ処理された。ＣＸＣＲ１およびＦＢＸＯ２１の定量ＲＴ−ＰＣＲ発現レベルは、図２ＢおよびＣに表される。定量ＲＴ−ＰＣＲで測定される遺伝子発現レベルは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団に比較したＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団でＣＸＣＲ１およびＦＢＸＯ２１  ｍＲＮＡレベルが上昇する、ＤＮＡマイクロアレイを使用して得られた結果を確認した（ｐ＜０．０５）。
【０２１５】
ＩＬ８は、癌幹細胞自己再生を促進する。プロファイリング研究は、ＩＬ８受容体ＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡが、一貫してＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞集団に発現したことを示唆した。この関連を確認するために、ＣＸＣＲ１／ＩＬ８ＲＡのタンパク質発現は、フローサイトメトリーによってＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団内で測定された。異なる４つの細胞株からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性集団は、ＦＡＣＳによって単離され、固定されて、フィコエリスリンで標識化されたＣＸＣＲ１単クローン性の抗体と染色された。図３Ａに示すように、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＣＸＣＲ１陽性細胞内に、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団に比較して非常に豊富に含まれた。
【０２１６】
ＩＬ８シグナル伝達が、幹細胞機能において重要かどうかを決定するために、４つのＢＣＬが、腫瘍球形成およびＡＬＤＨ酵素活性によって測定された癌幹細胞集団上へのその効果を決定するために、ヒト組み換えＩＬ８で処置された。図３Ｂに示すように、ＩＬ８の付加は、用量依存的に第１および第２の腫瘍球形成を増大した。さらに、ＩＬ８は、分析された４つのＢＣＬのそれぞれでＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を用量依存的に増大させた（図３Ｃ）。これは、幹細胞機能で役割を果たすかもしれない経路を同定する「ＣＳＣシグネチャー」の力を例証する。
【０２１７】
ＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸は癌幹細胞浸潤に関与する。ＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸は、癌幹細胞浸潤の役割を果たすと報告されてきた（２８、２９）。３つの異なる細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＵＭ１５９）からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞集団の浸潤能力を検証するために、誘引物質として血清を使用して、マトリゲル浸潤検定が利用された。図４Ａに示すように、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団よりマトリゲルを通じて６倍〜２０倍高い浸潤を証明した（ｐ＜０．０１）。化学誘引物質として使用されるとき、ＩＬ８（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の浸潤を増大させた（ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞への影響とは対照的に、ＩＬ８は、ＡＬＤＥＬＦＬＵＯＲ陰性細胞の浸潤能には何の影響もなかった。これらの結果は、癌幹細胞が浸潤行動を示し、さらに、ＩＬ８がこのプロセスを促進することを示した。
【０２１８】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、転移能を増大させた。ＣＳＣが、癌転移において重大な役割を果たすことが提唱されてきた（３０、３１）。上記の実験は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞に比較して浸潤能を増大させたことを証明した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性と転移能力との関係を決定するために、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＳＵＭ１５９は、発光酵素レンチウイルスレポーターシステムに感染された。ルシフェラーゼ感染細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定を使用して分類され、心臓内の注射によってＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに導入された。それぞれの集団からの１００，０００細胞の懸濁液が注射され、転移は、生物発光のイメージングによって評価された。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞を接種されたマウスは、異なる部位に転移を発達させ、分離されていない細胞を接種されたマウスで、１マウスあたり１転移以下を発達させたマウス、またはＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞を培養されたマウスで、リンパ節に限定した偶発の転移のみを発達させたマウス、より高い光子束の放出を示した（図４Ｂ〜Ｊ）。組織学的切片は、これらの部位に転移の存在を確認した（図４Ｋ〜Ｍ）。このように、ＢＣＬの転移能は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団に含まれるＣＳＣによって支配的に媒介される。
【０２１９】
腫瘍がＣＳＣによって駆動される細胞階層内で組織化されるという仮説は、癌生物学における基礎的意味、ならびに癌の初期検出、予防法および治療法における臨床の意味を有する。ＣＳＣの証拠は、大きく第１および初期経過異種移植モデルに依存する（３２〜３４）。しかしながら、乳腺腫瘍異種移植の確立の成功は、特に一部の分子亜類型では低下かった。第１の腫瘍とは対照的に、細胞株は、制限なしの量で利用可能であり、正常な組織および間質無しの分子分析のための癌性集団のみを提供する。乳癌においては、第１のヒト乳癌で発見された異なる分子亜類型を代表する大部分の不死化細胞株が産出された（２、２０）。しかしながら、これらの細胞株は、どれだけ密接にヒト乳癌の生物学を繰り返すことが可能かに関する基礎的疑問は、残っている。
【０２２０】
細胞株内の幹細胞のためのインビボ証拠。最近の研究は、細胞株はクローン的に由来されるかもしれないが、細胞分化の様々なステージを代表する細胞階層を含むことを示唆した。幾つかの研究は、乳癌細胞株内のＣＳＣを同定するためにＣＤ４４＋／ＣＤ２４−等のマーカーを利用した。しかしながら、その利便性は、頻繁に細胞株内の大部分の細胞がこの推定幹細胞マーカーを発現することが観察されることから、限定的である。例えば、基礎の乳癌細胞株の９０％を超える細胞は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表現型を表す。実際、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表現型は、これらの細胞株の腫瘍原性の集団を単離しなかった（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。代替的アプローチは、細胞株からのＳＰを使用してきた。しかしながら、ヘキスト染色法を利用する機能的研究は、剤の毒性によって限定されている（３５）。機能的幹細胞活性は、ＳＰ内に含まれない証拠もある（３６）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定によって評価されるＡＬＤＨ活性は、種々の癌から幹細胞特性を有する細胞を単離する（１４、３７）。この実施例によって、３３中２３のＢＣＬ（支に基底細胞株）が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を含むことが証明された。いくつかの管腔ＢＣＬ内のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団の欠失が、これらの管腔ＢＣＬは、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性前駆細胞から得られたことを示すかもしれない。
【０２２１】
この実施例は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団の幹細胞特性を証明するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのインビボ検定を利用した。自己再生は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの連続継代によって証明され、分化は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞ではなく、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の当初の腫瘍の細胞の不均質性を再生成する能力によって証明された。
【０２２２】
乳癌幹細胞シグネチャー。８個の乳腺細胞株を利用することで、この実施例は、その遺伝子の発現がＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性および陰性細胞を区別する４１３遺伝子を同定した。このシグネチャーは、幹細胞生物学の役割を果たすことで知られる多くの遺伝子を含んだ。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内で過剰発現した遺伝子は、乳腺幹細胞（１８、３８）の自己再生および分化を規制するＮｏｔｃｈホモログ２（ＮＯＴＣＨ２）、幹細胞の自己再生および分化を制御することで知られるＮＦＹＡ（３９、４０）、造血幹細胞の多面的な役割を果たし（４１）、ＮＯＴＣＨシグナル伝達を通じて骨髄分化に作用する（４２）ｐｅｃａｎｅｘホモログＰＣＮＸであるＲＢＭ１５／ＯＴＴ、胚性発達を伴うホメオボックス様因子ＴＰＲＸＬ、ステージ特異的な胚性抗原４シンセターゼをコード化し、致命的な発達および腎臓および胃の発癌に関連付けられた（４３）ＳＴ３ＧＡＬ３、を含む。著しく、ステージ特異的な胚性抗原４タンパク質（ＳＳＥＡ−４）は、ヒト臍帯血および静止状態の乳腺幹細胞内のＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋／ｌｉｎ幹細胞等の幹細胞集団に発現される（４４）。
【０２２３】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団の低発現した遺伝子は、細胞分化、アポトーシス、およびミトコンドリアの酸化に関与する。それらは、新生ポリペプチド関連複合体アルファサブユニットＮＡＣＡをコードする遺伝子、プログラムされた死亡タンパク質ＰＤＣＤ５ならびにＰＤＣＤ１０、ミトコンドリアのリボソーマルタンパク質Ｌ４１（ＭＲＰＬ４１）であって、ＢＣＬ２ならびにカスパーゼを通じてＰ５３依存ならびに非依存の方法でアポトーシスを誘導するタンパク質、および、例えば、酸化リン酸化反応（ＮＤＵＦＡ２、ＡＴＰ５Ｊ２、ＩＭＭＰ１Ｌ）およびミトコンドリア内のタンパク質合成（ＭＲＰＬ４２、ＭＲＰＬ４７、ＭＲＰＬ５４、ＭＲＰＳ２３）のような、ミトコンドリアのプロセスに関与するタンパク質を含む。ＣＳＣのアポトーシス遺伝子の下方制御は、放射線および化学療法へのこれらの細胞の抵抗の役割を果たすかもしれない（４５、４６）。ＡＬＤＨ１Ａ１は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性シグネチャー内に差次的に発現した遺伝子として同定されなかった。しかしながら、個別ＢＣＬの遺伝子発現プロファイルの検査は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内のＡＬＤＨ１Ａ１の差次的発現を示すものがある一方で、この集団の異なるＡＬＤＨアイソフォームであるＡＬＤＨ１Ａ３の差次的発現を示すものがあったことを明らかにした。これは、異なるＡＬＤＨアイソフォームの発現が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性表現型に貢献し得ることを示唆する。
【０２２４】
ケモカインから「ステモカイン（ｓｔｅｍｏｋｉｎｅ）」に。ＩＬ８の受容体であるＣＸＣＲ１の発現は、様々な癌で増大する（４７〜５０）。ＩＬ８発現は、ＥＲ陰性乳癌と関連する（５１）が、このケモカインは、幹細胞機能の役割を果たすことは以前には報告されていなかった。成長および転移の制御におけるその意味は、アンドロゲン非依存性前立腺癌に十分定着されている（５２）。さらに、ＩＬ８の発現レベルは、ＶＥＧＦ生成および血管形成を通じた腫瘍形成能および転移と関連している（５３、５４）。遺伝子発現データは、３方法で検証された。第１に、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析は、プロファイリング分析ではなく、両方が細胞株からのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性内で培養されたＣＸＣＲ１ｍＲＮＡの著しい増大を確認した。第２に、ＣＸＣＲ１含有細胞が、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内に排他的に発見されることがフローサイトメトリーを使用して証明された。第３に、組み換えＩＬ８は、ＢＣＬ内のマンモスフィア形成およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の割合を増大させた。したがってＩＬ８／ＣＸＣＲ１軸は、そのように乳腺幹細胞増殖または自己再生を制御するように思われる。内皮および間質細胞はＩＬ８を分泌するので、このケモカインは、腫瘍幹細胞と腫瘍微小環境との間で媒介作用の役割を果たすと思われる。
【０２２５】
最新の研究は、ＣＳＣの制御におけるインターロイキン／ケモカインの役割を示唆している（５５、５６）。これは、乳房ＣＳＣのＩＬ６および結腸ＣＳＣの化学療法抵抗性を媒介するＩＬ４の役割を含む（５６〜５９）。これらの因子は、炎症と癌の間の関係に関わるかもしれない。これはまた、間葉幹細胞によって分泌されたケモカインであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）の役割を含み、それはパラ分泌因子として働き、乳癌細胞運動性、浸潤、および転移を増強する（５５）。
【０２２６】
転移の根。ＣＳＣは、腫瘍転移の媒介に関与しているかもしれない。ＣＳＣと転移とのリンクは、比較上の転移のプロファイルを使用して生成された１１遺伝子シグネチャーの幹細胞遺伝子および前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルおよび癌患者（６０）内の第１の腫瘍の同定でまず示唆された。このシグネチャーは、様々な癌タイプの疾患再発、療法後の死亡、および遠隔転移の強力な予測因子でもあった。この実施例は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性細胞より多く転移し、過去に腫瘍転移の役割を果たすと報告されていたＩＬ８は、選択的にＩＬ８受容体ＣＸＣＲ１を発現する癌幹細胞の浸潤および走化性を促進することを証明した。細胞株から転移癌幹細胞を単離する能力は、腫瘍転移を媒介する癌幹細胞によって分子機構の研究を促進せねばならない。
【０２２７】
（実施例２）
ＣＸＣＲ１抑制および併用療法
この実施例は、ＣＸＣＲ１抑制、ならびに抗有糸分裂剤（ドセタキセル）を併用するＣＸＣＲ１抑制を併用した場合の腫瘍細胞上の効果をテストするために採用された種々の方法を記載する。
【０２２８】
細胞成長およびＳＵＭ１５９細胞株のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団上のＣＸＣＲ１抑制効果
ＳＵＭ１５９細胞株は、付着条件で培養され、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２阻害剤レペルタキシンまたはＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２のための２つの特定の遮断抗体を使用して細胞を処理された。治療法の４日後、細胞成長への影響はＭＴＴ検定（図５Ａ）を使用して、癌幹細胞集団への影響はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定（図５Ｂ）を使用して分析された。細胞成長抑制の９５％以上が、レペルタキシンまたはＣＸＣＲ１遮断抗体で処置された細胞で観察され、ＣＸＣＲ２遮断抗体で処置された細胞では何の効果も観察されなかった（図５Ａ）。興味深いことに、同様の効果が、レペルタキシンおよびＣＸＣＲ１遮断抗体のそれぞれで処置された細胞のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団の８０％および５０％低下したＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団上で観察された（図５Ｂ）。
【０２２９】
レペルタキシン治療法は、ＦＡＳ／ＦＡＳリガンドのシグナル伝達によって媒介されたバイスタンダー効果を誘導する
ＳＵＭ１５９細胞株細胞は、付着条件で培養されて、レペルタキシン単独で、またはＦＡＳ拮抗薬との併用で処置された。興味深いことに、レペルタキシン処置によって誘導された細胞成長抑制は、ＦＡＳ拮抗薬（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ｃａｔ＃５５６３７１）からの抗／Ｆａｓリガンド）の追加によって部分的に救助された。さらに、ＦＡＳ作用薬で処置された細胞は、レペルタキシンで処置された細胞よりも同様の細胞成長抑制を示した。これらの結果は、レペルタキシン治療法が、ＦＡＳ／ＦＡＳリガンドのシグナル伝達によって媒介されるバイスタンダー効果を誘導することを示唆する。
【０２３０】
ＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＦＯＸＯＡ３活性へのレペルタキシン治療法の効果
ＣＸＣＲ１下流シグナル伝達上のレペルタキシン治療法の効果を評価するために、ＳＵＭ１５９細胞は、レペルタキシン１００ｎＭの存在の有無の付着条件で２日間培養され、抗体剤ｐ−ＦＡＫ、ｐ−ＡＫＴ、およびＦＯＸＯＡ３に対する抗体で免疫蛍光によって染色された。無処置の細胞（図７Ａ）において、ｐ−ＦＡＫを発現する細胞の３０％およびｐ−ＡＫＴを発現する細胞の１０％が、不活性化を示した一方で、レペルタキシン処置された細胞が、ｐ−ＦＡＫおよびｐ−ＡＫＴの完全な不活性化を示した（図７Ｂ）ことが検出された。無処置のＳＵＭ１５９細胞は、ＦＯＸＯＡ３の細胞質内で細胞陽性の８０％を表した。興味深いことに、レペルタキシン処置されたＳＵＭ１５９細胞は、ＦＯＸＯＡ３の核内の細胞陽性の８０％を表した。細胞質から核へのＦＯＸＯＡ３細胞局在の変更は、ＦＯＸＯＡ３タンパク質の活性を示す。
【０２３１】
レペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用での治療法に続く腫瘍成長曲線
レペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用の効果は、１つの乳癌細胞株（８Ａ、ＳＵＭ１５９）および異なる患者（８Ｂ、ＭＣ１；８Ｃ、ＵＭ２；および８Ｄ、ＵＭ３）から生成された３つの人間乳癌異種移植片を使用して評価された。試料のそれぞれで、５０，０００細胞は、腫瘍サイズを観察されるＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体に注射された。腫瘍サイズが約４ｍｍの時に、注射が開始された。レペルタキシンは、１日２回２８日間または一週間に１度注射され（１５ｍｇ／Ｋｇ）、ドセタキセルの腹腔内注射（１０ｍｇ／Ｋｇ）、またはその併用（レペルタキシン／ドセタキセル）が採用された。図８は、示された治療法（矢印は、治療法の開始）の事前、経過中の腫瘍サイズを示す。ドセタキセル単独で、またはレペルタキシン／ドセタキセルと併用で処置されたときに、対照に比較して（ｐ＜０．０１）、それぞれの試料（ＳＵＭ１５９、ＭＣ１、ＵＭ２、ＵＭ３）で統計的に優位な腫瘍サイズの縮小という、同様の結果が観察されたが、対照の腫瘍とレペルタキシン単独で処置された腫瘍の成長との間には違いが観察されなかった。
【０２３２】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定により評価される、癌幹細胞集団におけるレペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらを併用した治療法の効果
ＡＬＤＨ活性は、レペルタキシン、ドセタキセル、またはその併用で処置されたそれぞれの腫瘍（９Ａ。ＳＵＭ１５９、９Ｂ。ＭＣ１、９Ｃ。ＵＭ２、９Ｄ。ＵＭ３）の癌幹細胞集団サイズを分析するＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定によって評価された。同様の結果が、それぞれの試料で観察される。ドセタキセル処理の腫瘍異種移植片は、対照に比較して、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の同一または高い割合を示し、レペルタキシン治療法単独で、またはドセタキセルとの併用で、対照に比較して、統計的に有意な減少である、癌幹細胞内のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の６５％〜８５％の減少を生じさせた（ｐ＜００１）。
【０２３３】
第２のマウスの移植により評価される、癌幹細胞集団におけるレペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらを併用した治療法の効果
未処理（対照）、およびレペルタキシン、ドセタキセル、またはそれらの併用で処理した第１の腫瘍（１０Ａ。ＳＵＭ１５９、１０Ｂ。ＭＣ１、１０Ｃ。ＵＭ２、１０Ｄ。ＵＭ３）から得られた細胞の連続希釈物が、第２のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体内に移植された。対照およびドセタキセル処置された第１の腫瘍は、全ての希釈において第２の腫瘍を形成し、レペルタキシンまたはドセタキセルとの併用で処置されたより高い濃度の第１の腫瘍のみが、対照またはドセタキセル処理された腫瘍より著しく小さいサイズの遅延した第２の腫瘍を形成することができた（ｐ＜０．０１）。さらに、１０００および１００個の第１の併用処置された細胞は、４中３試料で第２の腫瘍（ＳＵＭ１５９、ＵＭ２、ＵＭ３）を形成しなかった。
【０２３４】
レペルタキシン治療法は、ＳＵＭ１５９細胞株の転移能を低下させる
ＳＵＭ１５９細胞株は、発光酵素を発現するレンチウイルスに感染させられ、２５０，０００の発光酵素感染細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの心臓に接種された。マウスは、２群に組織化された。２群のマウスは、心臓内の注射の１２時間後に、１日に２回、２８日間、生理食塩水の皮下注射またはレペルタキシンの皮下注射（１５ｍｇ／ｋｇ）を処置された。転移形成は、生物発光画像法を使用して観察された（１１Ｂ：生理食塩水処置されたマウス、１１Ｃ：レペルタキシン処置されたマウス）。接種に続いて一週間間隔で測定された標準光子束の定量化は、レペルタキシン（１１Ａ）で処置されたマウスの群に比較して、生理食塩水で処置されたマウスの群の転移形成において、統計的に有意な増加を明らかにした。
【０２３５】
（実施例３）
ＣＸＣＲ１遮断による癌幹細胞の治療法
本実施例は、インビトロ検定およびマウスモデルの両方を通じて、腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ１抑制の効果を証明する。
【０２３６】
乳腺組織の解離。整復乳房形成からの正常な乳房組織１００〜２００ｇは、小刀で刻まれ、酵素的に解離され、単細胞は、マンモスフィアを生成するために懸濁液内か、細胞分化を誘導するために付着条件でコラーゲン基層上に培養された（Ｄｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １７：１２５３−１２７０、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０２３７】
細胞培養。乳癌細胞株は、推奨された培養条件を使用して生育された（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：１３０２−１３１３。参照により全体が本明細書に組み入れられる）。乳癌細胞株は、レペルタキシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ヒトＣＸＣＲ１マウス単クローン性の抗体（クローン４２７０５、Ｒ＆Ｄシステム）、抗ヒトＣＸＣＲ２マウス単クローン性の抗体（クローン４８３１１、Ｒ＆Ｄシステム）、ＦＡＳシグナル伝達作用薬として利用される抗ヒトＣＤ９５マウス単クローン性の抗体（クローンＤＸ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＡＳシグナル伝達拮抗薬として利用される抗ヒトＦＡＳリガンドマウス単クローン性の抗体（クローンＮＯＫ−１、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ，Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）を使用して付着条件で処置された。
【０２３８】
細胞の生存。ＭＴＴ検定において、細胞は、１ウェルにつき５，０００細胞の９６−ウェルプレートに付着条件で播種された。１日後、レペルタキシンでの治療法が、開始された。細胞生存能力上のレペルタキシン治療法の効果は、それぞれのウェルにＭＴＴ溶液（ＰＢＳ内で５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを付加することで異なる時点で推定された。そして、細胞は、それぞれのウェルにＤＭＳＯ５０μＬを付加した後、１時間３７°Ｃで培養された。吸光度は、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ，Ｔｅｃａｎ）において５６０ｎｍで測定された。ＴＵＮＥＬ検定において、細胞は、１ウェルにつき５０，０００細胞の６−ウェルプレートに付着条件で播種された。１日後、レペルタキシンでの治療法が、開始された。アポトーシスを起こした細胞の数は、治療法の４日後推定された。細胞は、３．７％ホルムアルデヒドで固定され、ＴＡＣＳ  ＴｄＴキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して染色された。核は、ＤＡＰＩ／ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色された。切片は、緑で検出されたアポトーシスを起こした細胞について蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｂａｎｎｏｃｋｂｏｒｎ，ＩＬ，ＵＳＡ）で検査された。
【０２３９】
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、既に記述されたように（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照により全体が本明細書に組み入れられる）、ＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して高ＡＬＤＨ酵素活性を有する集団を単離するのに使用された。異種移植された腫瘍からのマウス由来の細胞を排除するために、、細胞集団は、抗Ｈ２Ｋｄ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１／２００，２０分氷上）で染色され、続いてフィコエリスリン（ＰＥ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ，１／２５０，２０分氷上）で標識化された第２の抗体で染色された。
【０２４０】
ＥＬＩＳＡ検定。レペルタキシン処置された、またはされなかった細胞の培地において可溶性ＦＡＳリガンド分泌のレベルを測定するために、ヒトｓＦＡＳリガンドＥｌｉｓａ（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）が利用された。吸光度は、第１の波長として４５０ｎｍを使用して分光光度計上で読み取られた。
【０２４１】
ウエスタンブロット法。細胞は、電気泳動用（ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液に溶解され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に載せた。ブロットは、４℃で一晩または室温で２時間、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および２％ＢＳＡを含む）で希釈されたそれぞれの第１の抗体で培養された。ブロットは、洗浄され、適切な第２の抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ）で培養され、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出された。
【０２４２】
免疫染色。免疫蛍光染色において、分類されたＣＸＣＲ１陽性細胞は、−２０°Ｃで１０分間、９５％メタノールで固定された。細胞は、ＰＢＳで再水和され、室温で１時間、それぞれの抗体と培養された。使用された第１の抗体は、Ｐ−ＦＡＫ（１：５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐ−ＡＫＴ（１：３００、Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＦＯＸＯ３ａ（１：２５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。スライドは、その後洗浄され、ＰＥ接合した第２の抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）と３０分間培養された。
【０２４３】
核は、ＤＡＰＩ／ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびカバーガラスを被せて対比染色された。切片は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，  Ｂａｎｎｏｃｋｂｏｒｎ，  ＩＬ，  ＵＳＡ）で検査された。ＡＬＤＨ１（１：１００，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐ−ＦＡＫ、Ｐ−ＡＫＴ、ＦＯＸＯ３ａ発現の検出のための免疫組織化学は、パラフィン切片（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １６１：１２２３−１２３３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）上で実施された。染色は、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎプラスキット（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を利用して実施された。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）または３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、色素原として使用され、切片は、ヘマトキシリンで対比染色された。
【０２４４】
動物モデル。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性ＳＵＭ１５９細胞の腫瘍形成能は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内で評価された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＳＵＭ１５９細胞株および３人の異なる患者（ＭＣ１、ＵＭ２、ＵＭ３）から生成された３個の第１のヒト乳癌異種移植片は、腫瘍の成長におけるレペルタキシン治療法の有効性を決定するために利用された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。これらの腫瘍からの細胞は、インビトロ培養無しで、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化除去された脂肪パッド内で同所的に移植された。脂肪パッドは、既に記載されたように調整された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。それぞれの異種移植片からの５０，０００細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化脂肪パッドに注射され、腫瘍の成長を観察された。腫瘍サイズがおおよそ４ｍｍの時に、レペルタキシン単独（皮下注射、１５ｍｇ／Ｋｇ、１日２回、２８日間）、ドセタキセル単独（腹腔内、１０ｍｇ／Ｋｇ、１週間に１回、４週間）、併用で（レペルタキシン／ドセタキセル）の治療、または生理食塩水を注射された対象群（腹腔内を１週間に１回および皮下注射を１日２回）が、開始された。腫瘍の壊死を避けるため、および研究における脊椎動物の使用のための規制に従い、腫瘍が最大直径でおおよそ１．５ｃｍの時、動物は安楽死させられた。注射された脂肪パッドそれぞれの部分は、組織学分析のために、ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれた。腫瘍細胞の残りは、第２のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに再移植された。細胞の連続希釈物は、それぞれ処置された腫瘍に１０，０００、１，０００、および１００細胞を注射して再移植するために利用された。
【０２４５】
足場非依存性培養。レペルタキシン（１００ｎＭ）、抗ＣＸＣＲ１抗体（１０μｇ／ｍＬ）、または抗ＣＸＣＲ２（１０μｇ／ｍＬ）で付着条件で処置されたＢＣＬは、解離され、低密度（５０００生存細胞／ｍＬ）で、極低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に単細胞としてプレーティングされた。細胞は、既に記載のように成育された（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。第１の腫瘍球の解離後に続く培養は、５，０００生存細胞／ｍＬの密度で、極低付着プレートにプレーティングされた。腫瘍球を形成する細胞の能力は、第１の（第１の腫瘍球）および第２の（第２の腫瘍球）継代の後、定量化された。
【０２４６】
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ。ＳＵＭ１５９細胞が処置された後、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離され、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標登録）７９００ＨＴ配列検出システムのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）検定のために利用された。Ｔａｑｍａｎシステムのためのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓウェブサイトから選択された（ｗｗｗ
ｄｏｔ  ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｄｏｔ  ｃｏｍ）（ＦＡＳリガンド検定ＩＤ：Ｈｓ＿００８９９４４２＿ｍｉ；ＩＬ８検定ＩＤ：Ｈｓ＿００１７４１０３＿ｍｉ，ＴＢＰ検定ＩＤ：Ｈｓ＿００４２７６２０＿ｍｉ）。ＦＡＳリガンドおよびＩＬ８の相対発現ｍＲＮＡレベルは、既に記載のように、ＲＮＡの質および入力ｃＤＮＡ量の変化を標準化するために、内部標準ＴＢＰ遺伝子に関してコンピュータ計算された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：４５３３−４５４４、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０２４７】
フローサイトメトリー分析。ＣＤ４４／ＣＤ２４／Ｌｉｎ染色法が実行された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５５−５６７、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＣＤ９５／ＦＡＳ染色法は、抗ＣＤ９５標識ＡＰＣ（１：２０，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行された。ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２染色法において、第１の抗体抗ＣＸＣＲ１（１：１００、クローン４２７０５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＣＸＣＲ２（１：１００、クローン４８３１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に続いて、ＰＥ（希釈度１：２５０，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で標識化された第２の抗体抗マウスで染色法が行われた。新鮮な細胞は、５分間、１μｇ／ｍＬ  ＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で、生存性のために染色された。
【０２４８】
ウイルス感染。２つの異なるレンチウイルス構築物は、ルシファラーゼ遺伝子（レンチＬＵＣ−ＶＳＶＧ）（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）の発現およびＰＴＥＮ発現（レンチＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ−ＤｓＲｅｄ）（Ｋｏｒｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇ．  ７：ｅ１０００１２１、参照により全体が本明細書に組み入れられる）の抑制のために、それぞれ産生された。全てのレンチウイルス構築物は、ミシガン大学ベクターによって調製された。ＦＡＫ（Ａｄ−ＦＡＫ−ＧＦＰ）の過剰発現用のアデノウイルス構築物も、利用された（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：４６６−４７４、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。異なるベクターでの細胞感染は、既に記載のように実行された（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。感染の効率性は、ＤｓＲｅｄまたはＧＦＰ発現細胞の割合を測定することで検証された。
【０２４９】
心臓内接種。生後６週間のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、２％イソフルラン／空気混合物で麻酔され、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋欠失無菌ダルベッコＰＢＳ１００μＬ内の２５０，０００細胞を左心室に注射された。３細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＳＵＭ１５９）およびそれぞれの治療法（生理食塩水またはレペルタキシン）について、６動物が注射された。心臓内の注射の１２時間後、マウスは、１日２回、レペルタキシン注射または対照には生理食塩水注射を開始された。
【０２５０】
生物発光検出。接種およびその後の各週の接種の前に、基準値生物発光が評価された。生物発光検出手順は、既に記載のように実行された（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ
ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。標準化された光子束は、接種後の各週に検出される光子束および接種前に検出される光子束の割合を代表する。
【０２５１】
ＣＸＣＲ１発現は、癌幹細胞集団を細分する。癌幹細胞（ＣＳＣ）を制御する細胞シグナル伝達経路を同定することは、細胞集団の潜在治療標的を提供する。乳房ＣＳＣ制御経路に潜在的に関与する複数の遺伝子を含む遺伝子発現プロファイリンに基づく乳房ＣＳＣシグネチャーが、同定された（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。乳房ＣＳＣ集団内で過剰発現した遺伝子内で、炎症性のケモカインＩＬ−８／ＣＸＣＬ８を結合するＣＸＣＲ１ａ受容体は、組み換えＩＬ−８が、乳房ＣＳＣの自己再生を刺激したため、有望な候補であると思われた（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。フローサイトメトリーを利用して、ＣＸＣＲ１タンパク質発現は、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＳＵＭ１５９内でＡＬＤＥＬＦＵＯＲ検定によって評価されるように、乳房ＣＳＣ集団内で測定された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片の機能的幹細胞特性を有する細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞集団内に含まれた（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＣＸＣＲ１陽性集団は、集団全体の２％未満を代表し、ほぼ排他的にＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内に含まれた（図１２Ａおよび表４参照）。
【０２５２】
【表２１】
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【０２５３】
ＣＸＣＲ２発現もまた評価された。ＣＸＣＲ１に比較して低い親和性であるが、ＣＸＣＲ２は、ＩＬ−８／ＣＸＬ８も結合できる受容体である。ＣＸＣＲ１陽性細胞とは対照的に、ＣＸＣＲ２陽性細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性とＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性集団との間に等しく分配された（図１２Ａ参照）。ＣＸＣＲ１発現にしたがって癌幹細胞集団の階層的組織を決定するために、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性細胞集団は分類され、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射された（図１３参照）。両細胞集団は、腫瘍を生成した。腫瘍成長速度は、腫瘍形成の潜伏かつ規模ならびに注射された細胞の数に相関した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陽性集団によって生成された腫瘍は、連続継代において当初の腫瘍の表現型の不均一性を再構成したが、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性集団は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性／ＣＸＣＲ１陰性細胞のみを含む腫瘍を生じさせた。これらの結果は、ＣＳＣ細胞階層は、ＣＸＣＲ１発現にしたがって組織化されることを示唆するが、しかしながら、両細胞集団が、同様の腫瘍原性の能力を示した。
【０２５４】
ＣＸＣＲ１遮断は、インビトロ乳癌幹細胞集団を低下させる。３つの異なる細胞株は、乳房ＣＳＣ集団上のＣＸＣＲ１遮断の効果を評価するために、レペルタキシン（１００ｎＭ）、ＣＸＣＲ１／２阻害剤で処置された（Ｂｅｒｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ  Ａ  １０１：１１７９１−１１７９６、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＳＵＭ１５９について、治療法の３日後、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の割合の５倍の低下が観察された（図１２Ｂ参照）。同様の効果が、抗ＣＸＣＲ１遮断抗体でのＳＵＭ１５９細胞の治療法後に観察された。対照的に、抗ＣＸＣＲ２遮断抗体での治療法後は何の効果も観察されず、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団上のレペルタキシン効果が、ＣＸＣＲ１によって媒介されたことを示唆する。
【０２５５】
乳腺腫瘍ならびに細胞株からのデータは、癌幹のような細胞または癌発動細胞は、懸濁液培養において「腫瘍球」として単離も増殖もされ得ることを証明する（Ｐｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：５５０６−５５１１、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。レペルタキシンまたは抗ＣＸＣＲ１遮断抗体での治療法の３日後、細胞が、脱離されて、懸濁液で培養された時、第１のおよび第２の腫瘍球形成の８倍の低下が対照に比較して観察された。対照的に、抗ＣＸＣＲ２遮断抗体は腫瘍球形成に何の効果も無かった（図１４参照）。
【０２５６】
驚くべきことに、レペルタキシンでの治療法の５日後、我々は、ＭＴＴ検定で評価された細胞集団全体の生存能力において、生存可能であり続ける細胞はたった３％であるという、大規模な低下を観察した（図１２Ｃ参照）。類似の結果が、抗ＣＸＣＲ１遮断抗体で観察されたが、抗ＣＸＣＲ２遮断抗体では観察されず、よって、この効果がＣＸＣＲ１遮断に依存していることを示した。レペルタキシンのこの効果は、治療法の３日後に開始する細胞生存能力の欠失で遅延された（図１５Ａ参照）。レペルタキシン治療法は、ＨＣＣ１９５４乳癌細胞株上に類似の効果を誘導したが、ＰＴＥＮ変異体を宿すＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞においては何の効果も観察されなかった（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：１９５−２０１、参照により全体が本明細書に組み入れられる）（図１４、１５Ｂ〜Ｃ、および１６参照）。
【０２５７】
ＴＵＮＥＬ検定を利用して、ＳＵＭ１５９細胞は、治療法の４日後、レペルタキシンで染色され、レペルタキシン治療法後に検出された３６％のアポトーシスを起こした細胞でのアポトーシスの誘導による、細胞の生存能力の大規模な低下が、観察された（図１２Ｄ参照）。結果は、ＣＸＣＲ１遮断が、乳房ＣＳＣ集団の低下をもたらし、続いて残存する腫瘍集団全体において大規模なアポトーシスを誘導すること、を示唆する。
【０２５８】
ＣＸＣＲ１遮断は、バイスタンダー効果を通じてＣＸＣＲ１陰性細胞の細胞死を誘導する。ＣＸＣＲ１陽性集団は総細胞集団の２％未満を表すという事実にもかかわらず、レペルタキシンまたは抗ＣＸＣＲ１遮断抗体が、大規模な細胞死を誘導したという観察は、ＣＸＣＲ１陽性細胞のＣＸＣＲ１遮断は、バイスタンダー効果を通じてＣＸＣＲ１陰性細胞死を誘導することを示唆した。分類されたＣＸＣＲ１陽性およびＣＸＣＲ１陰性集団は、レペルタキシンで処置された（図１２Ｅ参照）。レペルタキシンは、３日以内にＣＸＣＲ１陽性集団の細胞生存能力を低下させたが、ＣＸＣＲ１陰性集団では何の効果も観察されなかった。レペルタキシンは、分離されていない細胞に大規模な細胞死を誘導した。分離されていないおよびＣＸＣＲ１陽性集団の細胞生存能力におけるレペルタキシンの効果は、用量依存的であった（図１２Ｅ参照）。この結果は、バイスタンダー効果を通じてＣＸＣＲ１陰性細胞死を次に誘導するＣＸＣＲ１陽性集団を標的化するレペルタキシン治療法と一致している。
【０２５９】
この効果が、レペルタキシンによって誘導される可溶性因子によって媒介されたかどうかを決定するために、調整済みの培地は、レペルタキシン治療法の３日後にＣＸＣＲ１陽性集団から収集され、分子を３．５ＫＤａより大きく保持しながら、培地からレペルタキシンを取り除くために３．５ＫＤａ排除の膜を利用してこの培地を透析した。透析され調整済みの培地は、ＣＸＣＲ１陰性および分離されていない集団の両方で細胞生存能力の大規模な低下を誘導したが、ＣＸＣＲ１陽性集団では誘導しなかった（図１２Ｆ参照）。これらの結果は、ＣＸＣＲ１陽性集団内のＣＸＣＲ１遮断が、可溶性がある透析不可能な因子を通じてＣＸＣＲ１陰性集団に細胞死を誘導することを証明した。ＣＸＣＲ１陽性集団は、レペルタキシンに感受性があるが、透析可能な死亡因子に耐性がある。
【０２６０】
ＣＸＣＲ１遮断によって誘導されるバイスタンダー効果は、ＦＡＳリガンド／ＦＡＳシグナル伝達によって媒介される。  ＦＡＳリガンド／ＦＡＳ相互作用は、例えば乳腺退縮等の様々な生理学的状態、または化学療法によって誘導されるものを含む組織障害の状態で活性化される（Ｃｈｈｉｐａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０１：６８−７９、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：１２０９−１２２０、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。レペルタキシンで処置したＳＵＭ１５９細胞の培地における可溶性ＦＡＳリガンド培養のレベルは、ＦＡＳリガンド／ＦＡＳ相互作用のＣＸＣＲ１遮断により誘導されるアポトーシスバイスタンダー効果を媒介することにおける役割を評価するためにＥＬＩＳＡ検定を使用して測定された。処置なし細胞に比較して、４日間レペルタキシンで処置された細胞培地で可溶性ＦＡＳリガンドの５倍を超える増加が、観察された（図１７Ａ参照）。ＦＡＳリガンドｍＲＮＡレベルを測定することによってレペルタキシン治療法によるＦＡＳリガンドの転写制御は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図１７Ｂ参照）。レペルタキシン処理された細胞のＦＡＳリガンドｍＲＮＡレベルの４倍の増加が、処置なし細胞に比較して観察された。ＦＡＳシグナル伝達を活性化するＦＡＳ作用薬での治療法後に、ＦＡＳリガンドが、陽性フィードバックループを生成するＦＡＳシグナル伝達の標的であることを示すという同様の結果が観察された。フローサイトメトリーによって決定されるように、ＳＵＭ１５９細胞の１００％が、ＦＡＳタンパク質を発現した。ＦＡＳ作用薬でのＳＵＭ１５９細胞の治療法は、細胞生存能力の大規模な低下がレペルタキシン治療法で観察された殺傷効果を再産生した（図１７Ｃ参照）。細胞生存能力におけるレペルタキシン治療法の効果は、抗ＦＡＳリガンド遮断抗体によって部分的に逆となり、レペルタキシンおよび抗ＦＡＳリガンド抗体での治療後、レペルタキシン単独ではたった３％であったのに比較して、細胞の４４％生存可能のままであった（図１７Ｃ参照）。結果は、レペルタキシンによって誘導される大規模な細胞死は、ＦＡＳリガンド／ＦＡＳ経路によって媒介されるバイスタンダー効果によることを示唆する。
【０２６１】
ＦＡＳ作用薬でのＳＵＭ１５９細胞の治療法は、ＣＸＣＲ１陽性およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞のそれぞれの割合の１０倍および３倍の増加をもたらした（図１７Ｄ／Ｅおよび１８参照）。両集団のレペルタキシンの効果は、抗ＦＡＳリガンドによって救助されず（図１７Ｄ／Ｅ参照）、ＣＸＣＲ１陽性集団を含むＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団が、これらの細胞によってＦＡＳリガンド生成を次に誘導するＣＸＣＲ１遮断に直接的に感受性があるが、ＦＡＳリガンド／ＦＡＳプロアポートシスシグナル伝達に耐性があることを示唆する。対照的に、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性大量細胞集団は、ＣＸＣＲ１を発現しないが、ＦＡＳリガンド媒介細胞死に感受性がある。
【０２６２】
ＦＡＳリガンド／ＦＡＳシグナル伝達は、乳腺退縮中に重要な役割を果たす（Ｓｏｎｇ
ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：１２０９−１２２０、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。整復乳房形成から得られたヒト正常乳房上皮細胞におけるＣＸＣＲ１遮断の効果が、検査された。乳癌細胞株で観察されるように、ＣＸＣＲ１陽性正常乳腺細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内にほぼ排他的に含まれた（図１９Ａ参照）。ＩＬ−８シグナル伝達が、正常乳腺幹／前駆機能に重要かどうかを決定するために、懸濁液中に培養された正常乳房上皮細胞は、ヒト組み換えＩＬ−８で処置され、マンモスフィアの形成によって測定されるようにそのＣＳＣ集団の効果を決定された（Ｄｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １７：１２５３−１２７０、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＩＬ−８の追加は、用量依存的に第１のおよび第２のマンモスフィアの形成を増大させ（図１９Ｂ参照）、ＩＬ−８／ＣＸＣＲ１軸は、正常乳腺幹／前駆細胞増殖または自己再生の制御に関与するかもしれないことを示唆した。レペルタキシンまたはＦＡＳ作用薬での治療法は、高濃度のレペルタキシン（５００ｎＭ）が利用された（図１６Ａ参照）時でさえ、付着条件で培養された正常乳房上皮細胞の生存能力に何の効果もなかった。しかしながら、乳癌細胞株で観察されるように、可溶性ＦＡＳリガンドの増加が、レペルタキシンで処置された正常乳房上皮細胞の培地で検出された（図２０Ｂ参照）。この観察は、これらの条件下で培養された正常な上皮細胞のＦＡＳ発現の不在によって説明されるかもしれない（図２０Ｃ参照）。これは、授乳に続く退縮プロセス中のみに、乳腺内のＦＡＳの発現が発生することを証明する研究と一致する（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：１２０９−１２２０、参照により全体が本明細書に組み入れられる）。正常な乳房上皮細胞の大量集団上の効果の欠失とは対照的に、レペルタキシンは、これらの細胞によるマンモスフィア形成を著しく低下させた（図２０Ｃ参照）。
【０２６３】
これらの結果は、ＩＬ−８／ＣＸＣＲ１軸が、正常なおよび悪性の乳房上皮幹細胞／前駆細胞集団の制御および生存に重要な役割を果たすことを示唆する。バイスタンダー効果を媒介するＦＡＳリガンドを通じて大量の細胞集団に作用する能力は、これらの細胞のＦＡＳ発現のレベルに関連するかもしれない。
【０２６４】
癌幹細胞上のＣＸＣＲ１障害効果は、ＦＡＫ／ＡＫＴ／ＦＯＸＯ３Ａ経路によって媒介される。  ＣＸＣＲ１は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化反応を含むシグナル伝達経路を介して作用し、ＡＫＴの活性化をもたらす（Ｗａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：６７３５−６７４１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦＡＫおよびＡＫＴ活性化におけるＣＸＣＲ１障害の影響を評価するために、３つの異なる細胞株において、ＦＡＫおよびＡＫＴリン酸化タンパク質のレベルをウエスタンブロット法によって測定した。ＳＵＭ１５９およびＨＣＣ１９５４に関して、レペルタキシンで治療された細胞において、未治療の細胞と比較して、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応の低下を検出し、レペルタキシン効果は、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路によって媒介され得ることを示した（図２１Ａおよび２２を参照）。ＭＤＡ−ＭＢ４５３がレペルタキシン治療に耐性があるという観察は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化するＰＴＥＮ変異体（９１９Ｇ＞Ａ）の存在によって説明され得る（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：１９５−２０１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＭＤＡＭＢ４５３細胞株におけるレペルタキシン治療後、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応における修飾は検出されなかった（図２２を参照）。ＣＸＣＲ１障害の効果を媒介する際のＦＡＫ／ＡＫＴ経路の機能的役割を確認するために、２つのウイルス構築物を使用し、一方はＰＴＥＮ  ｓｈＲＮＡを介してＰＴＥＮ発現をノックダウンし、もう一方はＦＡＫ過剰発現に導いた。ＰＴＥＮは、その脂質ホスファターゼを介して、ＰＩ３−Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を拮抗する（Ｖｉｖａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４８９−５０１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＰＴＥＮノックダウンは、ＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応の増大によって証明されるように、ＡＫＴ活性化をもたらした（図２１Ａおよび２２を参照）。ＰＴＥＮノックダウンは、ＦＡＫおよびＡＫＴ活性におけるレペルタキシン治療の効果を阻止した。ＦＡＫ過剰発現はまた、レペルタキシンの効果を阻止し、ＦＡＫ  Ｔｙｒ３９７およびＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化反応の増大する発現によって測定されたＦＡＫおよびＡＫＴの活性化を誘発した。これらの結果は、ＣＸＣＲ１障害効果がＦＡＫ／ＡＫＴシグナル伝達によって媒介されることを示す。
【０２６５】
ＣＸＣＲ１陽性細胞で免疫蛍光染色を利用することは、レペルタキシン治療が、未治療の細胞と比較して、ホスホＦＡＫおよびホスホＡＫＴ発現の劇的な減少をもたらすことを確認した（図２１Ｂを参照）。ＡＫＴは、リン酸化反応事象を介してフォークヘッド転写因子ＦＯＸＯ３Ａの活性を制限し、細胞質ＦＯＸＯ３Ａ隔離をもたらす（Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１：９５２−９６５．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。対照的に、ＦＯＸＯ３Ａの非リン酸化型は、ＦＡＳリガンドの合成を制御する転写因子の機能を果たす核に移行する（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：６６６−６７１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。レペルタキシンは、ＦＡＳリガンドが媒介するバイスタンダー効果を介して細胞死を誘発し、このシグナル伝達経路上でのレペルタキシンの効果を、免疫蛍光染色で検査した。ＦＯＸＯ３Ａは、未治療の細胞内の細胞質内の位置に存在したが、レペルタキシン治療時に核に往来させられた（図２１Ｂを参照）。これは、ＣＸＣＲ１障害が、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の阻害を介してＦＯＸＯ３Ａ活性を誘発することを示す。ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現を伴う細胞は、ホスホＦＡＫおよびホスホＡＫＴ発現の高いレベルを示し、レペルタキシン治療および未治療の細胞の両方において免疫蛍光検査法で検出された。レペルタキシン治療は、ＦＯＸＯ３Ａの細胞質の位置で示されるように、ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現を伴う細胞ではＦＯＸＯ３Ａ活性化を誘発しなかった（図２１Ｂを参照）。
【０２６６】
ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の構成的活性化の結果として、ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現を伴う細胞は、レペルタキシン治療への耐性を示した。ＰＴＥＮ欠失またはＦＡＫ過剰発現を伴う細胞は、レペルタキシン治療を伴う細胞生存能力において、少しも減少を示さなかった。ＡＫＴシグナル伝達は、ＣＳＣの生物学において重要な役割を果たすと提唱されている（図２１Ｂおよび２２を参照）（Ｄｕｂｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．  Ｓ  Ａ１０６：２６８−２７３．、Ｋｏｒｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇ．  ７：ｅ１０００１２１．、Ｙｉｌｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：４７５−４８２．、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。阻害剤での治療後に、ＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陽性集団の維持によって示されるように、ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の活性化は、ＣＳＣ集団でレペルタキシン効果を阻止した（図２１Ｂを参照）。全ての結果は、ＣＸＣＲ１障害がＦＡＫ／ＡＫＴ／ＦＯＸＯ３Ａ経路に直接的に影響を及ぼすことを示す。レペルタキシン治療は、ＣＳＣ活性に不可欠であるＡＫＴシグナル伝達を阻害し、続いて、ＣＳＣ産生ＦＡＳリガンドによって媒介されるバルク腫瘍細胞上でバイスタンダー効果を誘発する。
【０２６７】
レペルタキシン治療は、インビボで乳癌幹細胞集団を減少させる。  最新の知見は、胸部ＣＳＣが化学療法および放射線療法に比較的耐性があり、治療後の腫瘍再増殖に寄与し得ることを示す（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９８：１７７７−１７８５．、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １３１：１１０９−１１２３．、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１００：６７２−６７９．、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＳＣの概念は、臨床転帰における著しい改善が、ＣＳＣ集団の有効な標的化を必要とすることを示す（Ｒｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：１０５−１１１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。バルク腫瘍細胞が化学療法によって標的化されるとき、アポトーシスプロセス中に、いくつかの因子が合成および分泌される。これらの因子の間で、ＦＡＳリガンドは、バイスタンダー殺傷効果を媒介することによって化学療法効果を増幅する（Ｃｈｈｉｐａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０１：６８−７９．  参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。化学療法はまた、損傷細胞におけるＩＬ−８生成を誘発し得る。一般に利用される化学療法剤、ドセタキセルは、ＳＵＭ１５９細胞内のＩＬ−８およびＦＡＳリガンドｍＲＮＡの両方を誘発する（図１０ａ／Ｂを参照）。我々はまた、ＦＡＳ作用薬治療後に、ＩＬ−８  ｍＲＮＡレベルの４倍の増加を検出した（図１０Ｂを参照）。我々は、ＩＬ−８がＣＳＣ集団を制御する能力があることを示した。これは、細胞毒性化学療法に対するレペルタキシンの添加が、この効果を阻止し、癌幹細胞集団を標的とし得ることを示す。
【０２６８】
３人の異なる患者（ＭＣ１、ＵＭ２、ＵＭ３）から生じたＳＵＭ１５９細胞株および３つの一次ヒト乳癌異種移植片を、腫瘍の成長においてのレペルタキシン治療の効率を調査するために使用した。これらの腫瘍からの細胞を、インビトロ培養なしで、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化され除去された脂肪パッド内に同所性移植した。これらの異種移植片の各々について、ＣＳＣ集団は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内に排他的に含有された（Ｇｉｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ１：５５５−５６７．、Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３．、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。腫瘍の各々において、ＣＸＣＲ１陽性集団は、このＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団（表５を参照）内にほぼ排他的に含有され、ＰＴＥＮ／ＦＡＫ／ＡＫＴ経路は、活発化された（図２５を参照）。
【０２６９】
【表２２】
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【０２７０】
各異種移植片からの５０，０００個の細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒト化脂肪パッドに注入し、腫瘍の成長を監視した。腫瘍の大きさが約４ｍｍであったとき、レペルタキシン単独（１５ｍｇ／Ｋｇ、１日に２回、２８日間）、ドセタキセル単独（１０ｍｇ／Ｋｇ、１週間に１回、４週間）、または両薬物の組み合わせで治療を開始した。腫瘍の成長を、生理食塩水注入対照と比較した。各異種移植片に関して、ドセタキセル治療またはレペルタキシン／ドセタキセルの組み合わせによって誘発された腫瘍の成長の著しい阻害を観察した（図２６Ａおよび２７を参照）。レペルタキシン治療単独では、腫瘍の成長に中等度の影響を与えた。治療の４週間後に、動物を屠殺し、残存腫瘍をＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定を利用して分析した。ドセタキセル単独で治療された残存腫瘍は、未治療の対照と比較して、不変または割合の増加したＡＬＤＥＬＦＵＯＲ陽性細胞のいずれか一方を含有した（図２６Ｂおよび２７を参照）。対照的に、レペルタキシン治療単独またはドセタキセルとの組み合わせは、７５％を超えてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団を減少させた（図２６Ｂおよび２７を参照）。結果は、異なる異種移植片におけるＡＬＤＨ１発現の免疫組織化学で確認された。ＡＬＤＨ１陽性細胞における減少は、未治療の腫瘍と比較して、レペルタキシンで治療された腫瘍内で検出され、ＡＬＤＨ１陽性細胞の割合は、ドセタキセル単独で治療された腫瘍において不変または増加した（図２６Ｄを参照）。
【０２７１】
これらの腫瘍内のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞の存在を評価した。マーカーが乳癌幹細胞内で発現されることが以前に示されている（Ａｌ  Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ  Ａ  １００：３９８３−３９８８．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−表現型とＣＸＣＲ１発現との間の重複部分を測定した。ＣＸＣＲ１陽性細胞は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団およびＣＤ２４またはＣＤ４４陰性を発現する細胞集団内に存在した（表６を参照）。
【０２７２】
【表２３】
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【０２７３】
ドセタキセル単独で治療された残存腫瘍において、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞の不変または増加割合のどちらか一方を観察し、レペルタキシン治療単独またはドセタキセルとの組み合わせは、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団の減少をもたらした（図２８を参照）。
【０２７４】
治療腫瘍から二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの細胞の再移植から成る機能的なインビボ検定は、治療後、残存ＣＳＣの腫瘍開始および自己再生能力を評価する直接試験を提供した。対照またはドセタキセルで治療された動物由来の腫瘍細胞は、二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、全ての希釈物で同様の腫瘍再増殖を示した。対照的に、ドセタキセル有無に関わらないレペルタキシン治療は、二次レシピエントにおける腫瘍の成長を減少させた（図２６Ｃを参照）。同等の数の細胞を注入したとき、レペルタキシンで治療された動物からの細胞は、対照またはドセタキセルで治療された動物からの細胞と比較して、腫瘍の成長において２〜５倍の減少を示した（図２６Ｃを参照）。各異種移植モデルでは、レペルタキシンおよびドセタキセルの組み合わせで治療された動物から得られた１０００または１００個の腫瘍細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける任意の二次腫瘍を形成しなかった（図２６Ｃ、２７、および表７を参照）。これらの研究は、レペルタキシン治療が、特にＣＳＣ集団を標的化および減少させることを証明する。
【０２７５】
【表２４】
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【０２７６】
レペルタキシン治療は、ＦＡＫ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害し、インビボでＦＯＸＯ３Ａを活性化する。ホスホＦＡＫおよびホスホＡＫＴの発現を、治療後、異種移植片の各々において、免疫組織化学で検査した。膜状ホスホＦＡＫ発現を、対照およびドセタキセルで治療された腫瘍からの細胞の５０％で検出した一方、ホスホＦＡＫ発現は、レペルタキシン単独またはドセタキセルとの組み合わせで治療された腫瘍内で破壊された（図２６Ｄを参照）。未治療の腫瘍でホスホＡＫＴを発現する７０％の細胞、ドセタキセルで治療された腫瘍内の２０％のホスホＡＫＴ陽性細胞、およびレペルタキシン単独またはドセタキセルとの組み合わせで治療された腫瘍におけるホスホＡＫＴ発現の完全阻害を用いて、ホスホＡＫＴ発現に対して、同様の結果が観察された（図２６Ｄを参照）。細胞核のＦＯＸＯ３Ａは、ドセタキセル単独、レペルタキシン単独、およびレペルタキシン／ドセタキセルの組み合わせで治療された腫瘍からの細胞内で検出された。これらのインビボデータはインビトロデータと一致し、レペルタキシン治療がＦＡＫ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害し、ＦＯＸＯ３Ａを活性化することを確認する。
【０２７７】
レペルタキシン治療は、全身転移の進行を減少させる。レペルタキシンが全身転移を減少させるかを決定するために、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＳＵＭ１５９乳癌細胞株を、発光酵素レンチウイルスレポーターシステムで感染させ、その細胞を心腔内注射でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に導入した。各細胞株に対して２５０，０００個の細胞の懸濁液を注入し、転移形成を生物発光イメージングで１週間に１回観察した。心腔内注射の１２時間後、対照のために、マウスをレペルタキシン注入または生理食塩水で、１日に２回治療した。ＨＣＣ１９５４およびＳＵＭ１５９細胞を注入されたマウスにおけるレペルタキシン治療は、未治療のマウスと比較して、治療されたマウスにおいて、光子束の低放射で転移形成を著しく減少させた（図２９Ａ／Ｂを参照）。組織学的切片は、未治療の動物のいくつかの部位で、転移の存在を確認した（図２９Ｄを参照）。レペルタキシン治療は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を注入されたマウスにおいて、転移形成に少しも効果を有さなかった（図２９Ｃを参照）。光子束の放射および転移が進行した動物の数は、レペルタキシン治療および未治療群の両方において類似した。この結果は、ＰＴＥＮ変異体の存在により、レペルタキシンに耐性がある細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−４５３を説明したデータと一致した。これらの結果は、レペルタキシン等の薬剤を伴うＣＸＣＲ１障害が、ＣＳＣ集団によって媒介される転移を減少させることができ得ることを示す（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２７８】
本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、幹細胞特性をもつ細胞小成分が腫瘍の成長および転移を駆動することを示す（Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ８：７５５−７６８．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。現在の治療法に対するそれらの相対抵抗のおかげで、これらの細胞は、治療抵抗および再発に寄与し得る（Ｒｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：１０５−１１１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明は、癌幹細胞集団を効果的に標的化し、治療結果を改善するために、乳癌幹細胞上で発現されるＣＸＣＲ１サイトカイン受容体を阻止することに基づくアプローチを提供する。多くのシステムでの本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、サイトカインネットワークが、腫瘍形成において重要な役割を果たすことを証明している。これらのサイトカインのいくつかは、幹細胞行動を制御し得るという証拠が存在する。ＩＬ−４は、膵臓癌幹細胞の自己再生を制御する能力があり、ＩＬ−６は、結腸癌および乳癌において癌幹細胞を制御する能力がある（Ｔｏｄａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ１：３８９−４０２．、Ｓａｎｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：３９８８−４００２．、参照により本明細書に組み込まれる）。腫瘍浸潤および転移を媒介する際のＩＬ−８の役割は、以前に証明されている（Ｗａｕｇｈ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：６７３５−６７４１．、Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６：２１０４−２１１９．、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、ＩＬ−８は、脳内での創傷治癒中に神経幹細胞の自己再生を増進させる（Ｂｅｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １８４：１９８−２０８．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。肺癌幹細胞は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ１を発現するとして説明された（Ｌｅｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．３：ｅ３０７７．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、ＣＸＣＲ１陽性集団が、乳癌細胞株および一次異種移植片、ならびに正常な乳腺細胞におけるＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性集団内に、ほぼ排他的に含有されることを証明した。ケモカイン受容体は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性の乳癌細胞集団内で過剰発現される（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。乳癌において、ＩＬ−８は、炎症細胞、血管内皮細胞、腫瘍に関連する繊維芽細胞、および間葉幹細胞を含む多くの細胞型によって、腫瘍内微小環境で産生される（Ｗａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：６７３５−６７４１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。サイトカインネットワークは、これらの細胞型の間の相互作用を媒介し、したがって、癌幹細胞を、ＩＬ−８受容体ＣＸＣＲ１の障害を介して標的化することができる。
【０２７９】
インビトロ検定を利用することによって、ＣＸＣＲ２（代替ＩＬ−８受容体）ではなくＣＸＣＲ１障害が、乳癌幹細胞集団を減少させたことが証明された。これには、ＣＸＣＲ１発現を欠如する全体の残存細胞集団におけるアポトーシスの誘発が続いた。ＣＸＣＲ１遮断抗体に加えて、実施形態の開発中に行われた実験は、レペルタキシン、ＣＸＣＲ１／２阻害剤は、ＣＸＣＲ１陽性集団を標的化することによって同様の効果を誘発したことを証明する。ＣＸＣＲ１−発現癌幹細胞集団におけるその直接的効果とは対照的に、レペルタキシンは、ＣＸＣＲ１発現を欠如するバルク腫瘍細胞集団上で、直接的効果を有さなかった。これは、ＣＸＣＲ１陽性細胞内のＣＸＣＲ１障害が、バイスタンダー効果を介して、ＣＸＣＲ１陰性細胞内で細胞死を誘発したことを示す。本明細書に記載の実験は、ＦＡＳリガンド／ＦＡＳ経路がこのバイスタンダー殺傷効果の媒介物であると証明する。この現象は、ＣＸＣＲ１陽性集団が１％未満の細胞集団を表すという事実にもかかわらず、全細胞集団内で大規模なアポトーシスを誘発するレペルタキシン治療の有効性を説明する。ＦＡＳリガンドの役割は、抗ＦＡＳリガンド抗体によるバイスタンダー殺傷の効果的な阻止によって証明された。
【０２８０】
本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、同様のサイトカイン相互作用が、細胞毒性化学療法に曝露された腫瘍内で発生し得ることを示す。化学療法は、分化された腫瘍細胞内で細胞アポトーシスを直接的に誘発し得、ならびにＦＡＳ媒介バイスタンダー効果を介して、周囲の腫瘍細胞内でアポトーシスを次に誘発するこれらの死亡細胞によって、ＦＡＳリガンドの生成を誘発し得る。ＦＡＳリガンドの生成と同時に、これらの損傷細胞はまた、乳腺退縮または創傷治癒に類似する過程において、増加レベルのＩＬ−８を分泌する。退縮乳腺の場合と同様に、このＩＬ−８は、乳癌幹細胞を刺激し得、ならびにそれらをアポトーシスから保護し得る。これは、前臨床モデル（４）およびネオアジュバント臨床検定（５）における化学療法後に観察される癌幹細胞における相対的増加に寄与し得る。腫瘍内のアポトーシスおよび自己再生経路における化学療法の効果は、図３０に示される。
【０２８１】
ＣＸＣＲ１障害がインビボで乳癌幹細胞を標的化できるかを決定するために、細胞毒性薬ドセタキセルの効果を、癌幹細胞コンパートメントにおける、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの腫瘍の成長における、レペルタキシンと比較した。ドセタキセルは、乳癌を有する女性を治療するために現在使用される最も効果的な化学療法剤の１つである。癌幹細胞集団を、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ検定で、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける連続移植で評価した。これらの検定を利用して、化学療法治療単独が、癌幹細胞集団において、不変または相対的増加のいずれかをもたらすと決定された。対照的に、レペルタキシン治療単独または化学療法と併用のレペルタキシン治療は、癌幹細胞集団を著しく減少させた。腫瘍開始集団における著しい減少にもかかわらず、レペルタキシン単独の使用は、腫瘍の著しい縮小をもたらさなかった。化学療法とレペルタキシンの組み合わせは、腫瘍の大きさ、ならびに癌幹細胞集団における著しい減少をもたらした。癌幹細胞およびバルク腫瘍細胞集団の両方を標的化するためにこれらの薬剤を併用することは、これらの治療法の有効性を最大化する。
【０２８２】
レペルタキシンの作用機構を解明するために、ＣＸＣＲ１からの下流の経路を分析した。ＣＸＣＲ１、ＦＡＫ、およびＡＫＴの間の相互作用が確認された。ＣＸＣＲ１障害は、特にＦＡＫおよびＡＫＴ活性化を介して作用する。本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、ＡＫＴ活性化が、ＷＮＴ経路の活性化をもたらすＧＳＫ３βのリン酸化反応を介して、正常および悪性乳腺幹細胞の自己再生を制限することを示す（Ｋｏｒｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇ．  ７：ｅ１０００１２１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの結果は、なぜＰＴＥＮノックダウンを伴う細胞がレペルタキシンに耐性があるかを示す。ＡＫＴの追加機能は、フォークヘッド転写因子ＦＯＸＯ３Ａのリン酸化反応を介する細胞生存の制御である。ＦＯＸＯ３ＡのＡＫＴリン酸化反応は、その細胞質隔離をもたらす。対照的に、ＣＸＣＲ１障害は、核内のＦＯＸＯ３Ａの転位をもたらすＡＫＴ活性化の減少に導き、そこで、それはＦＡＳリガンドを含む多くの遺伝子を誘発する（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：６６６−６７１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。次にＣＸＣＲ１障害を介して誘発されるＦＡＳリガンドは、観察されるバイスタンダー殺傷効果の原因となる（図３０を参照）。
【０２８３】
ＣＸＣＲ１シグナル伝達におけるその役割に加えて、ＦＡＫは、インテグリン受容体を介して、細胞外基質成分を伴う細胞の相互作用を媒介する（Ｗａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：６７３５−６７４１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦＡＫシグナル伝達は、遺伝子導入モデルにおいて、正常および悪性マウス乳腺幹細胞の自己再生を制御する役割を果たす（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：４６６−４７４．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦＡＫ活性化はまた、ＦＡＤＤおよびＲＩＰ媒介アポトーシスを阻止することによって細胞生存を促進する（Ｋｕｒｅｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２４：４３６１−４３７１．、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３０５９７−３０６０４．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これは、ＦＡＳ／ＦＡＳリガンド誘発アポトーシスに対する癌幹細胞集団の抵抗に対する説明を提供する。
【０２８４】
乳癌幹細胞は、腫瘍浸潤および転移において重要な役割を果たすことが証明されている（Ｃｒｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００８、Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：１３０２−１３１３．、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＩＬ−８およびＣＸＣＲ１はまた、これらの過程においても重要な役割を果たすことが本明細書に示される。ＣＸＣＲ１障害の効果を、実験的転移の形成においてレペルタキシンを利用して分析した。ＣＸＣＲ１障害は、乳癌細胞の心腔内注射の後に投与されるときに、転移の進行を減少させることが証明された。
【０２８５】
レペルタキシンを利用する臨床研究は、毒性の欠如を証明している。ＩＬ−８およびＣＸＣＲ１等のサイトカイン制御ループを妨害することを図る戦略は、乳癌幹細胞を標的化するための方法を示す。
【０２８６】
〔参考文献〕
次の参考文献は、本明細書に完全に示しているかのように、参照により全体が本明細書に組み入れられる。
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ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｌ−５１  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００７；  ３０６：  ２０１−２１２．
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１１．  Ｐａｔｒａｗａｌａ  Ｌ，  Ｃａｌｈｏｕｎ  Ｔ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｂｒｏｕｓｓａｒｄ  Ｒ，  Ｚｈｏｕ  Ｊ，  Ｃｌａｙｐｏｏｌ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｔａｎｇ  Ｄ  Ｇ．  Ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ，  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｗｈｅｒｅａｓ  ＡＢＣＧ２＋  ａｎｄ  Ａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５；  ６５：  ６２０７−６２１９．
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ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２００８．
２９．  Ｉｔｏｈ  Ｙ，  Ｊｏｈ  Ｔ，  Ｔａｎｉｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−８  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００５；  ２９：  ２７５−２８２．
３０．  Ｇｕｐｔａ  Ｇ  Ｐ，  Ｐｅｒｋ  Ｊ，  Ａｃｈａｒｙｙａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．
ＩＤ  ｇｅｎｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｌｕｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００７；  １０４：  １９５０６−１９５１１．
３１．  Ｌｉ  Ｆ，  Ｔｉｅｄｅ  Ｂ，  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｋａｎｇ  Ｙ．  Ｂｅｙｏｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００７；  １７：  ３−１４．
３２．  Ａｌ  Ｈａｊｊ  Ｍ，  Ｗｉｃｈａ  Ｍ  Ｓ，  Ｂｅｎｉｔｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ  Ｍ  Ｆ．  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００３；  １００：  ３９８３−３９８８．
３３．  Ｌｉ  Ｃ，  Ｈｅｉｄｔ  Ｄ  Ｇ，  Ｄａｌｅｒｂａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；  ６７：  １０３０−１０３７．
３４．  Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  Ｌ，  Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｄ  Ｇ，  Ｐｉｌｏｚｚｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ
ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ−ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．
Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；  ４４５：  １１１−１１５．
３５．  Ｍｏｎｔａｎａｒｏ  Ｆ，  Ｌｉａｄａｋｉ  Ｋ，  Ｓｃｈｉｅｎｄａ  Ｊ，  Ｆｌｉｎｔ  Ａ，  Ｇｕｓｓｏｎｉ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ  Ｌ  Ｍ．  Ｄｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇ  ＳＰ  ｃｅｌｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，  ｙｉｅｌｄ，  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｒｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００４；  ２９８：  １４４−１５４．
３６．  Ｓｔｉｎｇｌ  Ｊ，  Ｅｉｒｅｗ  Ｐ，  Ｒｉｃｋｅｔｓｏｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；  ４３９：  ９９３−９９７．
３７．  Ｍａｔｓｕｉ  Ｗ，  Ｈｕｆｆ  Ｃ  Ａ，  Ｗａｎｇ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；  １０３：  ２３３２−２３３６．３８．  Ｆａｒｎｉｅ  Ｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ  Ｒ  Ｂ．  Ｍａｍｍａｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−−ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ
ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．  ２００７；  ３：  １６９−１７５．
３９．  Ｋｒｓｔｉｃ  Ａ，  Ｍｏｊｓｉｎ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ  Ｍ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＯＸ３  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＮＦ−Ｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２００７；  ４６７：  １６３−１７３．
４０．  Ｚｈｕ  Ｊ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｊｏｅ  Ｇ  Ｊ，  Ｐｏｍｐｅｔｔｉ  Ｒ，
ａｎｄ  Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｓ  Ｇ．  ＮＦ−Ｙａ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  （ＨＳＣ）  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＨＳＣ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００５；  １０２：  １１７２８−１１７３３．
４１．  Ｒａｆｆｅｌ  Ｇ  Ｄ，  Ｍｅｒｃｈｅｒ  Ｔ，  Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｔｔ１（Ｒｂｍ１５）  ｈａｓ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｏｌｅｓ
ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００７；  １０４：  ６００１−６００６．
４２．  Ｍａ  Ｘ，  Ｒｅｎｄａ  Ｍ  Ｊ，  Ｗａｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｂｍ１５
ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｎｏｔｃｈ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００７；  ２７：  ３０５６−３０６４．
４３．  Ｐｅｉｆｆｅｒ  Ｉ，  Ｅｉｄ  Ｐ，  Ｂａｒｂｅｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００７；  ２１：  ７１４−７２４．
４４．  Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ  Ｒ，  Ｆｒｉｄｒｉｋｓｄｏｔｔｉｒ  Ａ  Ｊ，  Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００７；  １７７：  ８７−１０１．
４５．  Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ  Ｄ，  Ｂｅｃｈｅｒ  Ｏ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｅ  Ｃ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２００８；  ７．
４６．  Ｊａｇａｎｉ  Ｚ  ａｎｄ  Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ  Ｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．  ２００８；  ６１５：  ３３１−３４４．
４７．  Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｐ  Ｊ，  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｒ，  Ｓｅａｔｏｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  ＨＩＦ−１  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７；  ２６：  ７３３３−７３４５．
４８．  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｃ，  ＭｃＧｕｒｋ  Ｍ，  Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎａｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８，  ＣＸＣＲ１，  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５；  １１：  ４１１７−４１２７．
４９．  Ｔｒｅｎｔｉｎ  Ｌ，  Ｍｉｏｒｉｎ  Ｍ，  Ｆａｃｃｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｓｈｏｗ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２００７；  １３８：  ５９４−６０２．
５０．  Ｖａｒｎｅｙ  Ｍ  Ｌ，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｓ  Ｌ，  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ
Ｒ  Ｋ．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＬ８  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＸＣＲ１  ａｎｄ  ＣＸＣＲ２  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ａｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．  ２００６；  １２５：  ２０９−２１６．
５１．  Ｆｒｅｕｎｄ  Ａ，  Ｃｈａｕｖｅａｕ  Ｃ，  Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ  Ｊ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３；  ２２：  ２５６−２６５．
５２．  Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，  Ｓｌａｔｏｎ  Ｊ  Ｗ，  Ｅｖｅ  Ｂ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００；  ６：  ２１０４−２１１９．
５３．  Ｂａｌｂａｙ  Ｍ  Ｄ，  Ｐｅｔｔａｗａｙ  Ｃ  Ａ，  Ｋｕｎｉｙａｓｕ  Ｈ
ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｏｆ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９９；  ５：  ７８３−７８９．
５４．  Ｋｉｍ  Ｓ  Ｊ，  Ｕｅｈａｒａ  Ｈ，  Ｋａｒａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｍｃｃａｒｔｙ  Ｍ，  Ｓｈｉｈ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  Ｉ  Ｊ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｌａｎｔｅｄ
ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．
２００１；  ３：  ３３−４２．
５５．  Ｋａｒｎｏｕｂ  Ａ  Ｅ，  Ｄａｓｈ  Ａ  Ｂ，  Ｖｏ  Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．
Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｔｒｏｍａ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；  ４４９：  ５５７−５６３．
５６．  Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｚ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅ  Ｊ  Ｓ．  ＩＬ−６  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；  １１７：  ３６６０−３６６３．
５７．  Ｔｏｄａｒｏ  Ｍ，  Ａｌｅａ  Ｍ  Ｐ，  Ｄｉ  Ｓｔｅｆａｎｏ  Ａ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｃｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７；  １：  ３８９−４０２．
５８．  Ｌａｎｄｉ  Ｓ，  Ｂｏｔｔａｒｉ  Ｆ，  Ｇｅｍｉｇｎａｎｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ．  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；  ４３：  ７６２−７６８．
５９．  Ｓａｎｓｏｎｅ  Ｐ，  Ｓｔｏｒｃｉ  Ｇ，  Ｔａｖｏｌａｒｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−６  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｄｕｃｔａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；  １１７：  ３９８８−４００２．
６０．  Ｇｌｉｎｓｋｙ  Ｇ  Ｖ，  Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａ  Ｏ，  ａｎｄ  Ｇｌｉｎｓｋｉｉ  Ａ  Ｂ．  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ
ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００５；  １１５：  １５０３−１５２１．
６１．  Ｇｏｌｕｂ  Ｔ  Ｒ，  Ｓｌｏｎｉｍ  Ｄ  Ｋ，  Ｔａｍａｙｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｌａｓｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；
２８６：  ５３１−５３７。
【０２８７】
上記の明細書において挙げられた全ての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられている。本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変ならびにバリエーションは、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者にとって明らかであると考えられる。本発明は、特定の好適な実施形態に関して記載されているが、主張されているような本発明が、かかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、関連分野の業者にとって明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
【図１】
2014037427.tif 000028
【図２】
2014037427.tif 000029
【図３】
2014037427.tif 000030
【図４】
2014037427.tif 000031
【図５】
2014037427.tif 000032
【図６】
2014037427.tif 000033
【図７】
2014037427.tif 000034
【図８】
2014037427.tif 000035
【図９】
2014037427.tif 000036
【図１０】
2014037427.tif 000037
【図１１】
2014037427.tif 000038
【図１２】
2014037427.tif 000039
【図１３】
2014037427.tif 000040
【図１４】
2014037427.tif 000041
【図１５】
2014037427.tif 000042
【図１６】
2014037427.tif 000043
【図１７】
2014037427.tif 000044
【図１８】
2014037427.tif 000045
【図１９】
2014037427.tif 000046
【図２０】
2014037427.tif 000047
【図２１】
2014037427.tif 000048
【図２２】
2014037427.tif 000049
【図２３】
2014037427.tif 000050
【図２４】
2014037427.tif 000051
【図２５】
2014037427.tif 000052
【図２６】
2014037427.tif 000053
【図２７】
2014037427.tif 000054
【図２８】
2014037427.tif 000055
【図２９】
2014037427.tif 000056
【図３０】
2014037427.tif 000057