(57)【要約】【課題】ＢＡＦＦに対するレセプター、腫瘍壊死因子ファミリーのβ細胞活性化因子およびＢ細胞および免疫グロブリンの発現を阻害する方法を提供すること。【解決手段】ＴＮＦファミリーにおける新規のレセプターである、ＢＡＦＦ−Ｒを提供する。ＢＡＦＦ−Ｒに対するキメラ分子および抗体、ならびにそれらの使用方法もまた提供する。本発明はさらに、動物におけるＢ細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログからなる群より選択される、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＢＡＦＦに対するレセプター、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーのβ細胞活性化因子およびＢ細胞および免疫グロブリンの発現を刺激するか、または阻害のいずれかをする、そのブロッキング因子の使用に関する。このレセプターは、抗癌および免疫制御の適用、ならびにＨＩＶのような免疫抑制障害の処置のための使用を有する。さらに、このレセプターおよびそのブロッキング因子は、高血圧およびその関連する疾患の発達において役割を果たす。さらに、このレセプターに対する遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、腫瘍、リンパ腫、自己免疫疾患またはＢ細胞に関連する遺伝した遺伝的障害を処置するための遺伝子療法において使用され得る。組換え改変体またはレセプターに特異的な抗体のようなブロッキング因子は、免疫調節適用さえも有する。例えば、器官移植（例えば、骨髄移植）を受ける患者、ならびにＢ細胞の産生を刺激するための癌処置から回復している患者に対する使用を含む免疫抑制疾患についてのＢ細胞刺激因子としての、ＢＡＦＦに対するレセプターの使用が、意図される。およそ正常なレベルに対するＢ細胞のレベルをバーストおよび／または回復するためのアジュバントおよび／または共刺激因子としてのＢＡＦＦに対するレセプターの使用がまた、意図される。Ｂ細胞機能をブロックするＢＡＦＦに対する可溶性形態のレセプターはまた、Ｂ細胞媒介性疾患を阻害するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ＴＮＦファミリーの新規のレセプターに関する。新規のレセプターは、ＢＡＦＦ−Ｒ（または「ＢＣＭＡ」）と同定された。
【０００３】
ＴＮＦファミリーは、ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターと呼ばれる、リガンドおよびその特異的なレセプターのペアからなる（ＢａｚｚｏｎｉおよびＢｅｕｔｌｅｒ、１９９６）。このファミリーは、免疫系およびおそらく他の非免疫系の調節に関与する。この調節は、しばしば、「マスタースイッチ（ｍａｓｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ）」レベルにあり、ＴＦＮファミリーシグナル伝達は、ＴＮＦによって最も優れて代表される、多数の後の事象を生じ得る。ＴＮＦは、外からの侵入に対する器官の一般的な保護的炎症応答（細胞輸送に関与する接着分子の変化された提示、特定のコンパートメントへ特異的な細胞を駆動するためのケモカインの産生、および種々のエフェクター細胞のプライミングを含む）を開始し得る。それ自体、これらの経路の調節は、臨床的潜在性を有する。
【０００４】
このようなＴＮＦファミリーサイトカインによって媒介される種々の細胞応答の誘導は、それらの特異的細胞レセプターへの結合によって、開始されると考えられる。少なくとも２つの別のＴＮＦレセプター、およそ５５ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）および７５ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）が同定された［Ｈｏｈｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９）およびＢｒｏｃｋｈａｕｓら、ＰＮＡＳ，８７：３１２７−３１３１（１９９０）］。広範な多型性は、両方のＴＮＦレセプター遺伝子に会合した。両方のＴＮＦＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、細胞表面レセプターの代表的な構造を共有する。１型および２型ＴＮＦＲの細胞外部分は、４つのシステインリッチなドメイン（ＣＤＲ）の代表的なアミノ酸配列パターンを含む。ＣＤＲの類似の代表的なパターンは、例えば、ｐ７５神経成長因子レセプター、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０を含む、いくつかの他の細胞表面タンパク質に存在する。
【０００５】
レセプターは、免疫グロブリン融合タンパク質への容易な転換に起因して、生物学的経路を解明するための強力なツールである。これらの２量体可溶性レセプター形態は、分泌または表面結合リガンドによって媒介される事象の優れたインヒビターである。これらのリガンドへの結合によって、それらは、リガンドが、シグナル伝達し得る、細胞会合レセプターと相互作用することを妨げる。これらのレセプターＩｇ融合タンパク質が、実験的な意味で有用であるのみでなく、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチおよびＯＫＴ３投与を伴う急性の臨床的症候群を処置するために、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇの場合においても、臨床的に成功裡に使用されている（Ｅａｓｏｎら、１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９６；ｖａｎ  Ｄｕｌｌｅｍｅｎら、１９９５）。ＴＮＦファミリーのレセプターを介したシグナル伝達によって媒介される多くの事象の操作は、免疫ベースの疾患および免疫系の関与に起因する病理学的後遺症を有する広範なヒト疾患の処置において、広範な適用を有することが想像され得る。可溶性形態の最近に記載されたレセプターの、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）は、骨重量の欠損をブロックし得、従って、ＴＮＦファミリーレセプターシグナル伝達によって調節される事象は、免疫系調節に限定される必要はない。このレセプターに対する抗体は、リガンドの結合をブロックし得、従って臨床的適用を有し得る。このような抗体は、しばしば、非常に長期間機能し、そして、短い血液半減期を有する可溶性レセプターＩｇ融合タンパク質よりも有利であり得る。
【０００６】
レセプター媒介性経路の阻害は、これらのレセプターの多くの開発された治療適用を表し、本来は、臨床学的見込みを示すＴＮＦレセプターの活性化であった（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ＴＮＦレセプターの活性化は、標的細胞における細胞死を開始し得、従って腫瘍に対する適用は、なお魅力的であった（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら、１９９６）。このレセプターは、リガンドの投与によって、活性化され得る（すなわち、天然の経路）か、レセプターを架橋し得るまたはいくつかの抗体はまた、強力なアゴニストである。抗体は、腫瘍学において利点を有する。なぜなら、それらは、血液中で長時間持続し得るからである（一方、リガンドは一般的に血液中での寿命は短い）。これらのレセプターの多くは、腫瘍において、より選択的に発現され得るか、または細胞死または腫瘍の分化をシグナル伝達し得るのみであり、アゴニスト抗体は、癌の処置において、優れた兵器となり得る。同様に、多くのポジティブな免疫学的事象（例えば、宿主炎症性反応、抗体産生など）は、ＴＮＦレセプターを介して媒介され、従って、アゴニスト抗体は、他の非腫瘍学的適用において、有利な効果を有し得る。
【０００７】
逆説的に、経路の阻害は、腫瘍の処置において、臨床学的な利点を有し得る。例えば、Ｆａｓリガンドは、いくつかの腫瘍によって発現され、そしてこの発現は、Ｆａｓポジティブリンパ球の死を生じ得、従って腫瘍が免疫系を逃れる能力を容易にする。この場合、腫瘍のＦａｓ系の阻害は、免疫系が他の経路で腫瘍と反応することを可能にするので、アクセスを可能にする（ＧｒｅｅｎおよびＷａｒｅ，１９９７）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本出願人は、本出願において「ＢＡＦＦ−Ｒ」または「ＢＣＭＡ」と呼ばれる、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。このクローンは、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーに属する、腫瘍壊死因子ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）に結合する。ＢＡＦＦは、ＷＯ／９９１２９６４（本明細書中で参考として援用される）に以前に記載されたのと同じ分子である。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、ＢＡＦＦ−Ｒを使用する方法を提供する。このような方法に含まれるのは、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを使用して、動物における、Ｂ細胞増殖、樹状細胞誘導Ｂ細胞増殖および成熟を阻害する方法または免疫グロブリン産生を阻害する方法である。また含まれるのは、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを使用して、動物における、Ｂ細胞増殖、樹状細胞誘導Ｂ細胞増殖および成熟を刺激する方法または免疫グロブリン産生を刺激する方法、またはＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドおよび抗Ｔ抗体、ＣＤ４０リガンドまたは抗ＣＤ４０リガンドを使用して、動物における、Ｂ細胞増殖、樹状細胞誘導Ｂ細胞増殖および成熟、または免疫グロブリンの産生を同時刺激する方法である。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患、高血圧、心臓血管症癌、腎臓障害、Ｂ細胞リンパ増殖疾患、免疫抑制疾患、器官移植、およびＨＩＶの処置において、ＢＡＦＦ−Ｒを使用する方法を提供する。また含まれるのは、ＢＡＦＦ−Ｒとそのリガンドとの間のシグナル伝達経路に関与する免疫応答の処置、抑制、または変化のために因子を使用する方法、およびＢＡＦＦ−Ｒまたはそのエピトープに特異的な抗体の投与によって、炎症を阻害する方法である。
【００１１】
本発明の方法は、好ましくは、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド、異種アミノ酸配列に融合されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを含むキメラ分子、または抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログの治療有効量を投与することによって行われる。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンまたはエピトープタグ配列のＦｃ領域に融合されたＢＡＦＦ−Ｒを含む。
別の実施形態において、本発明は、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。必要に応じて、抗体は、モノクローナル抗体である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する：
（項目１）  動物におけるＢ細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、以下：（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２）  動物における免疫グロブリン産生を阻害する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３）  動物における樹状細胞誘導性Ｂ細胞の増殖および成熟を阻害する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４）  自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、以下：（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目５）  動物における高血圧を処置する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量のＢ細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、方法。
（項目６）  動物における腎障害を処置するための方法であって、該方法は、以下：（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量のＢ細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、方法。
（項目７）  Ｂ細胞リンパ増殖障害を処置する方法であって、該方法は、以下：（ａ）ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）異種アミノ酸配列に融合された、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、キメラ分子；および
（ｃ）抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログ、
からなる群より選択される、治療有効量のＢ細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、方法。
（項目８）  前記ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドが可溶性である、項目１〜７に記載の方法。
（項目９）  前記可溶性ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドが、ＢＡＦＦ−Ｒ細胞外ドメインを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）  前記ＢＡＦＦ−Ｒ細胞外ドメインが、免疫グロブリンに融合される、項目９に記載の方法。
（項目１１）  項目１〜７に記載の方法であって、ここで前記ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含む単離されたネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含むネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含むネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜５１を含む単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基８〜４１を含む単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
（項目１２）  前記抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログが、モノクローナル抗体である、項目１〜７に記載の方法。
（項目１３）  前記抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体ホモログが、ＢＣＭＡ−ＩｇＧを含む、項目１〜７に記載の方法。
（項目１４）  前記動物が哺乳動物である、項目１〜７に記載の方法。
（項目１５）  前記哺乳動物がヒトである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  ＢＡＦＦ−ＲとＢＡＦＦとの間のシグナル伝達経路に関わる免疫応答を処置、抑制または変化する方法であって、該方法は、該ＢＡＦＦ−ＲとＢＡＦＦとの間の結合を妨げ得る、有効量の因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）  ＢＡＦＦ−Ｒに特異的な抗体またはその活性なフラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、炎症を阻害する方法。
（項目１８）  ＢＡＦＦ−Ｒに特異的な抗体またはそのエピトープの治療有効量を投与する工程を包含する炎症を阻害する方法。
（項目１９）  治療有効量の単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２０）  項目１９に記載の薬学的組成物であって、ここで前記単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含む単離されたネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含むネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜１８４を含むネイティブな配列のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜５１を含む、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基８〜４１を含む、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、
からなる群より選択される、組成物。
（項目２１）  前記ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドフラグメントが、免疫グロブリンに融合されたＢＡＦＦ−Ｒ細胞外ドメインを含む、項目１９に記載の薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ヒトＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＣＭＡ）のｃＤＮＡの核酸配列（配列番号２）およびその誘導されるアミノ酸配列（配列番号１）を示す。核酸残基２１９または２２８のいずれかでの潜在的な翻訳開始部位；配列番号２の核酸残基２４０〜３４１（配列番号１のアミノ酸残基８〜４１）でのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）；および配列番号２の核酸残基３７５〜４５９での潜在的な膜貫通領域。
【図２】図２は、以下のＢＡＦＦ−Ｒ−ＦｃをコードするプラスミドｐＪＳＴ５３８の核酸配列（配列番号４）およびその誘導されるアミノ酸配列（配列番号３）を示す：核酸残基１〜６９、マウスＩｇＧκシグナル配列；核酸残基７０〜２２２、ＢＡＦＦ−Ｒ（核酸残基１〜１５３）；核酸残基２２３〜９０６、ヒトＩｇＧ。
【図３】図３は、全長ヒトＢＡＦＦ−ＲをコードするプラスミドｐＪＳＴ５３５の核酸配列およびその誘導されるアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ＴＮＦ−Ｒ５５とＢＡＦＦ−Ｒとの間の構造比較を示す。
【図５】図５は、（ａ）ＣＨ２６９（１．０μｇ）または（ｂ）ｐＪＳＴ５３５（０．１μｇ）（全長ＢＡＦＦ−Ｒを発現するプラスミド）のいずれかでトランスフェクトし、そしてプレートアッセイ形式にて０．５μｇ／ｍｌのｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦで染色した２９３ＥＢＮＡ細胞を示す。
【図６ａ】図６ａは、ｐＪＳＴ５３５でトランスフェクトし、以下のように染色した、２９３ＥＢＮＡのＦＡＣＳオーバーレイを示す：リガンドなし（黒いヒストグラム）、１μｇ／ｍｌのｆｌａｇ−ｈＣＤ４０Ｌ（ピンク）またはｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ（緑）。次いで、全てのサンプルを、実施例２の方法に記載されるように、抗ｆｌａｇＭ２、およびその後に、ロバ抗マウスＩｇＧで染色した。
【図６ｂ】図６ｂは、同じ実験の統計学によるＦＡＣＳヒストグラムを示す。染色は、以下のとおりである：（１）未染色、（２）７ＡＡＤのみ、（３）第２工程および７ＡＡＤのみ、（４）９μｇ／ｍｌ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（５）３μｇ／ｍｌ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（６）１μｇ／ｍｌ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（７）０．３３μｇ／ｍｌ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（８）０．１１μｇ／ｍｌ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（９）ｆｌａｇ−ｈＣＤ４０Ｌ  １μｇ／ｍｌ。
【図７】図７は、実施例４の方法に記載されるようなＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃでの免疫沈降を示す。分子量スタンダード（ｋＤａ）は、図の左側に標記したとおりである。レーン（１）１２．５ｎｇ  ｆｌａｇ−ｈＴＷＥＡＫ、（２）１２．５ｎｇ  ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ、（３）０．５ｍｌ  ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ馴化培地によるｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦの免疫沈降、（４）０．５ｍｌＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ馴化培地によるｆｌａｇ−ｈＴＷＥＡＫの免疫沈降、（５）０．５ｍｌ  ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ馴化培地によるリガンドなしの免疫沈降、（６）トランスフェクトしていない２９３ＥＢＮＡからの０．５ｍｌ馴化培地によるｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦの免疫沈降、（７）トランスフェクトしていない２９３ＥＢＮＡからの０．５ｍｌ馴化培地によるｆｌａｇ−ｈＴＷＥＡＫの免疫沈降。
【図８】図８は、脾細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。ここで、マウス脾細胞に取り込まれるカウント／分（ＣＰＭ）を、添加したヒトＢＡＦＦの量（μｇ／ｍｌ）に対してプロットする。
【図９】図９は、Ｒａｊｉ細胞に結合するＢＡＦＦを分析するＢＡＦＦブロッキングアッセイの結果のプロットを示す。ここで、ＭＦＩ（平均蛍光強度）の読み取りを、Ｒ：ｈＩｇＧ１の量（ｎｇ／ｍｌ）に対してプロットする。
【図１０ａ】図１０ａは、実施例１１に記載されるような、ｈ−Ｉｇ（中パネル）またはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ（下パネル）を受けたＢａｆｆ  ＴｇマウスならびにＰＢＳ注射（上パネル）を受けた野生型同腹仔コントロールに対するＦＡＣＳ分析における、ＩｇＭ  対  ＣＤ１の発現のプロットを示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、実施例１１に記載されるような、ｈ−Ｉｇ（中パネル）またはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ（下パネル）を受けたＢａｆｆ  ＴｇマウスならびにＰＢＳ注射（上パネル）を受けた野生型同腹仔コントロールに対する、ＩｇＤ陽性集団に対してゲートすることによるＦＡＣＳ分析における、ＣＤ２１  対  ＩｇＭの発現のプロットを示す。
【図１０ｃ】図１０ｃは、実施例１１に記載されるような、ｈ−Ｉｇ（中パネル）またはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ（下パネル）を受けたＢａｆｆ  ＴｇマウスならびにＰＢＳ注射（上パネル）を受けた野生型同腹仔コントロールに対する、ＩｇＤ陰性集団に対してゲートすることによるＦＡＣＳ分析における、ＣＤ２１  対  ＩｇＭの発現のプロットを示す。
【図１１】図１１は、全ての群のＢａｆｆ  Ｔｇマウスについての脾細胞を示す（重量（ｍｇ）＋／−標準偏差で示す）。
【図１２】図１２は、ＰＢＳ、ｈＩｇ、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇで処置したＢａｆｆ  Ｔｇマウスおよび同腹仔コントロールに対する、蛋白尿（ｍｇ／ｄＬ）  対  注射数のプロットを示す。
【図１３】図１３は、Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスおよび野生型コントロールについての、平均した平均動脈圧（ｍｍＨｇ）のプロットを示す。
【図１４】図１４は、Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスおよび野生型コントロールについての、個々の平均動脈圧（ｍｍＨｇ）のプロットを示す。
【図１５】図１５は、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ（ＢＣＭＡ−Ｉｇ）、ＨｕＩｇＧまたはＰＢＳでの処置後の重篤な腎炎を提示する、ＳＮＦ１マウスのパーセンテージの棒グラフを示す。
【図１６】図１６は、２０μｇ  ＢＣＭＡ−Ｉｇ、５０μｇ  ＢＣＭＡ−Ｉｇ、ＨｕＩｇＧまたはＰＢＳでインビボにて処置したマウスについての、全ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ細胞数（百万）のグラフを示す。試験したＣＤ１１ｃ＋ＤＣ細胞集団は、：（１）ＣＤ８ａ−ＣＤ４−、（２）ＣＤ８ａ＋ＣＤ４−、および（３）ＣＤ８ａ−ＣＤ４＋であった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ＢＡＦＦ−Ｒ」および「ＢＣＭＡ」は、ネイティブ配列ＢＡＦＦ−ＲおよびＢＡＦＦ−Ｒの改変体（これらは、本明細書中でさらに定義される）を含む。ＢＡＦＦ−Ｒは、マウスまたはヒトの組織型のような種々の供給源あるいは別の供給源から単離され得るか、あるいは組換え方法または合成方法によって調製され得る。
【００１６】
「ネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒ」は、天然に由来するＢＡＦＦ−Ｒと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒは、天然から単離され得るか、あるいは組換え手段または合成手段によって調製され得る。ＢＡＦＦ−Ｒの天然に存在する短縮形態または分泌形態（例えば、可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン配列を含む））、天然に存在する改変体形態（例えば、選択的スプライシング形態）および天然に存在するＢＡＦＦ−Ｒの対立遺伝子改変体。本発明の１つの実施形態において、ネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜１８４を含む、成熟または全長のネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドあるいはそれらのフラグメントである。
【００１７】
「ＢＡＦＦ−Ｒ細胞外ドメイン」または「ＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤ」とは、ＢＡＦＦ−Ｒの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを本質的に含まない、ＢＡＦＦ−Ｒの形態をいう。通常、ＢＡＦＦ−Ｒ細胞外ドメインは、１％未満のこのような膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有し、そして好ましくは０．５％未満のこのようなドメインを有する。通常、ＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤは、配列番号１のアミノ酸残基８〜４１、配列番号１のアミノ酸残基４〜５１、または配列番号１のアミノ酸残基１〜５３を含む。本発明の好ましい実施形態において、ＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤは、配列番号１のアミノ酸残基１〜５１を含む。本発明のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドについて同定された膜貫通ドメインが、この型の疎水性ドメインを同定するための当該分野で慣用的に使用される基準に準じて同定されることが、当業者に理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、変化し得るが、ほぼおそらく、本明細書中に詳細に言及されるこのドメインのいずれかの末端で約５アミノ酸までで変化し得る。従って、ＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤは、必要に応じて、アミノ酸８〜４１（配列番号１）を含む。
【００１８】
「ＢＡＦＦ−Ｒ改変体」は、全長ネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒについて配列番号１に示される推定アミノ酸配列を有するＢＡＦＦ−Ｒとか、またはＢＡＦＦ−Ｒ  ＥＣＤ配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、以下に規定されるような活性なＢＡＦＦ−Ｒを意味する。このようなＢＡＦＦ−Ｒ改変体としては、例えば、１以上のアミノ酸残基が、配列番号１の配列の末端またはＣ末端で付加または欠失されている、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドが挙げられる。通常、ＢＡＦＦ−Ｒ改変体は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１９】
本明細書中で同定されるＢＡＦＦ−Ｒ配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように候補配列およびＢＡＦＦ−Ｒ配列ならびに導入ギャップ（必要な場合）を整列化（そして、この配列同一性の部分として、いかなる保存的置換も考慮しない）した後の、ＢＡＦＦ−Ｒ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列化は、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して、当業者の範囲内にある種々の方法で達成され得る。当業者は、整列化を測定するための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大の整列化を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定し得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープタグ化（した）」とは、「タグポリペプチド」に融合されたＢＡＦＦ−Ｒ（またはそのドメイン配列）を含む、キメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対して抗体が作製され得るかまたはある他の薬剤によって同定され得る、エピトープを提供するように、十分な残基を有するが、これはなお、ＢＡＦＦ−Ｒの活性を干渉しないように十分短い。好ましくは、タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、全く固有のものである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約８〜約５０の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜約２０残基）を有する。
【００２１】
本明細書中に開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、「単離（された）」とは、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の混入成分は、通常、このポリペプチドの診断用途または治療用途を干渉せず、これらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、（１）スピンカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）配列決定機の使用によって少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るに十分な程度にか、または（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用する、非還元条件または還元条件下のＳＤＳＰＡＧＥで均質なまでに、精製される。単離されたポリペプチドとしては、組換え細胞内のインサイチュのポリペプチドが挙げられる。これは、ＢＡＦＦ−Ｒの天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００２２】
用語「抗体」は、最も広範な意味で用いられ、そして特に単一のＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体組成物を包含する。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体、すなわち、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異以外は同一であるこの集団が含む個々の抗体をいう。
【００２３】
ポリペプチドの「精製された調製物」または「実質的に純粋な調製物」は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドとともに天然で存在する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはまた、このポリペプチドを精製するために用いられた他の物質（例えば、抗体、マトリックスなど）からも分離されている。
【００２４】
用語「処置する」「処置」および「治療」は、本明細書中で使用された場合、治癒的治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療および予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療をいう。
【００２５】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に用いられる。
【００２６】
「生物学的に活性な」は、本明細書中で用いられる場合、直接的または間接的に行われ得る、インビボまたはインビトロで活性を有することを意味する。ＢＡＦＦ−Ｒの生物学的に活性なフラグメントは、例えば、レセプターの活性部位と７０％アミノ酸相同性を、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％相同性を有し得る。レセプターに関する同一性または相同性は、候補配列中の、配列番号１のＢＡＦＦ−Ｒ残基と同一であるかまたは配列番号１中のアミノ酸残基の規定された部分と同一であるアミノ酸残基の百分率として本明細書中で定義される。
【００２７】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、これとしては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウスおよびネコが挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２８】
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学的、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、文献に記載される。
【００２９】
ここで、本発明のこの好ましい実施形態が詳細に参照される。本発明は、Ｂ細胞の増殖および成熟ならびに免疫グロブリンの分泌をもたらす、ＢＡＦＦ−ＲおよびＢＡＦＦ−Ｒ関連分子の使用に関する。本発明は、免疫関連障害によって必要となるような、免疫系の応答をもたらすためのＢＡＦＦ−ＲおよびＢＡＦＦ−Ｒ関連分子の使用に関する。さらに、本発明は、遺伝子治療法による、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＡＦＦ−Ｒ関連遺伝子の使用を通した癌および免疫障害の処置を包含する。
【００３０】
本発明の配列によって形質転換された宿主によって産生されるＢＡＦＦ−Ｒおよびそのホモログ、ならびに当該分野で公知のプロセスによって精製されたかまたは既知のアミノ酸配列から産生されたネイティブなＢＡＦＦ−Ｒは、抗癌適用、抗腫瘍適用および免疫調節適用のための種々の方法において有用である。これらはまた、他の疾患に対する治療および方法において有用である。
【００３１】
本発明の別の局面は、「アンチセンス」治療において、ＢＡＦＦ−Ｒをコードする単離された核酸によってコードされるポリペプチドの使用に関する。本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」治療とは、細胞条件下で、目的のリガンドをコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、それゆえ、すなわち、転写および／または翻訳を阻害することによって、コードされるタンパク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の投与またはインサイチュ生成をいう。結合は、従来の塩基対相補性によってであってもよく、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に対する結合の場合、二重らせんの主溝における特異的相互作用を通してであってもよい。一般に、「アンチセンス」治療とは、当該分野において一般的に用いられるある範囲の技術をいい、そしてオリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に依存する任意の治療を包含する。
【００３２】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写された場合、ＢＡＦＦ−リガンドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして送達され得る。あるいは、このアンチセンス構築物は、エキソビボで生成されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、内因性ヌクレアーゼに耐性であり、それゆえ、インビボで安定である、改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネートアナログである（例えば、５，１７６，９９６；５，２６４，５６４；および５，２５６，７７５を参照のこと）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、本明細書中に参考として得に援用される、Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６およびＳｔｅｉｎら（１９８８）Ｃｎａｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８：２６５９−２６６８によって概説されている。
【００３３】
本発明のＢＡＦＦ−Ｒは、上記で考察したように、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーである。このタンパク質、そのフラグメントまたはホモログは、広範囲の治療適用および診断適用を有し得る。
【００３４】
本発明のポリペプチドは特に、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９９／１２９６４に以前に記載されたポリペプチドであるＢＡＦＦと相互作用する。しかし、本明細書中に開示されるペプチドおよび方法は、ＢＡＦＦ−Ｒまたはそのフラグメントと特異的に相互作用する分子の同定を可能にする。
【００３５】
特定の実施形態における本願発明は、ＢＡＦＦに結合する能力を有する、ＢＡＦＦ−Ｒ由来ペプチドを用いる方法を包含する。ＢＡＦＦ−Ｒのフラグメントは、いくつかの方法で（例えば、組換えによって、ＰＣＲによって、タンパク質分解消化によって、または化学合成によって）産生され得る。ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、このポリペプチドをコードする核酸の一方の末端または両方の末端から１以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異誘発されたＤＮＡの発現は、ポリペプチドフラグメントを産生する。
【００３６】
本発明において使用するためのキメラ分子はまた、当該分野で公知の技術を使用して産生され得る。本発明は、異種アミノ酸配列（例えば、免疫グロブリンのＩｇＧ  Ｆｃドメイン）に融合されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド（またはその改変体）のキメラ分子の使用を意図する。好ましくは、このようなキメラ分子は可溶性であり、そして可溶性ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを含む。
【００３７】
ポリペプチドフラグメントはまた、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ化学として当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る。例えば、本発明のペプチド配列およびＤＮＡ配列は、フラグメントの重複なしに所望の長さのフラグメントへと任意に分割されてもよいし、所望の長さの重複するフラグメントへと分割されてもよい。これらのような方法は、以下でより詳細に記載される。
【００３８】
（可溶性形態のＢＡＦＦ−Ｒの生成）
可溶性形態のＢＡＦＦ−Ｒはしばしば、効果的にシグナルを出し、それゆえ、天然の膜形態をここで模倣する薬物として投与され得る。本明細書中で請求されるＢＡＦＦ−Ｒが可溶性サイトカインとして天然に分泌されることが可能であるが、そうでない場合、分泌させるようにこの遺伝子を再度操作し得る。可溶性分泌形態のＢＡＦＦ−Ｒを作製するために、Ｎ末端膜貫通領域および茎（ｓｔａｌｋ）領域のいくつかの部分をＤＮＡレベルで除去して、そしてこれらを、選択された発現系における効率的なタンパク質分解性切断を可能にする、Ｉ型リーダー配列あるいはＩＩ型リーダー配列で置き換える。当業者は、分泌発現構築物中に保持された茎領域の量を変動させて、リガンド結合特性および分泌効率の両方を最適化し得る。例えば、全ての可能な茎長を含む構築物（すなわち、Ｎ末端短縮物）は、アミノ酸１で始まりアミノ酸５１までのタンパク質が生じるように調製され得る。最適な長さの茎配列は、この型の分析から生じる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、可溶性ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、以下である：配列番号１のアミノ酸残基１〜５１を含む、単離されたネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドもしくはそのフラグメント；配列番号１のアミノ酸残基１〜５１を含むネイティブ配列ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドと少なくとも８０％（そしてより好ましくは９０％）のアミノ酸配列同一性を有する単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドもしくはそのフラグメント；または配列番号１のアミノ酸残基８〜４１を含む、単離されたＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドもしくはそのフラグメント。
【００４０】
（ＢＡＦＦ−Ｒと反応性の抗体の生成）
本発明はまた、本願ＢＡＦＦ−Ｒまたはそのコレセプターと特異的に反応性の抗体を包含する。抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコルによって作製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、ＨａｗｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳動物は、免疫原性形態のペプチドで免疫され得る。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術としては、当該分野で周知の、キャリアに対する結合体化または他の技術が挙げられる。
【００４１】
ＢＡＦＦ−Ｒまたはそのコレセプターの免疫原性部分は、アジュバントを存在させて投与され得る。免疫の前進は、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイは、抗原としての免疫原とともに用いられて、抗体のレベルを評価し得る。
【００４２】
好ましい実施形態では、本願抗体は、ＢＡＦＦ−Ｒもしくはそのコレセプターの抗原決定基（例えば、配列番号１のポリペプチドの抗原決定基）または密接に関連したヒトもしくは非ヒト哺乳動物ホモログ（例えば、７０、８０または９０パーセント相同、より好ましくは少なくとも９５パーセント相同）に免疫特異的である。本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、抗ＢＡＦＦ−Ｒまたは抗ＢＡＦＦ−コレセプター抗体は、例えば、配列番号１に８０パーセント未満相同である、好ましくは配列番号１に９０パーセント未満相同である、そして最も好ましくは配列番号１に９５パーセント未満相同であるタンパク質に実質的に交差反応しない（すなわち、特異的に反応する）。「実質的に交差反応しない」によって、抗体が、配列番号１のタンパク質についての結合親和性の１０パーセント未満、より好ましくは５パーセント未満、そしてさらにより好ましくは１パーセント未満の結合親和性である、非相同タンパク質についての結合親和性を有することが意味される。
【００４３】
本明細書において使用される用語抗体とは、ＢＡＦＦ−Ｒまたはそのレセプターと特異的に反応性でもある、そのフラグメントをも含むことが意図される。抗体は、慣用技術を用いてフラグメント化され得、そのフラグメントは、抗体全体について上記されるのと同様の様式で有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメン
トは、ペプシンで抗体を処理することにより作製され得る。得られたＦ（ａｂ’）2フラ
グメントを処理して、Ｆａｂ’フラグメントを処理して、ジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂ’フラグメントを生成する。本発明の抗体はさらに、抗ＢＡＦＦ−Ｒまたは抗ＢＡＦＦ−コレセプター活性を有する二特異性およびキメラの分子を包含することが意図される。従って、ＢＡＦＦ−Ｒおよびそのコレセプターに対して指向されるモノクローナル抗体（Ａｂ）およびポリクローナル抗体（Ａｂ）の両方、ならびにＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）2のような抗体フラグメントを使用して、ＢＡＦＦ−Ｒおよびそのそれぞれのコレセ
プターの作用をブロックし得る。
【００４４】
種々の形態の抗体はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。（本明細書において参考として具体的に援用される、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１））。例えば、ヒト定常ドメインに動物抗体由来の抗原結合ドメインが結合したキメラ抗体が構築され得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、これは本明細書において参考として援用される）。キメラ抗体は、ヒト臨床処置において使用される場合、動物抗体によって惹起される、観察される免疫原性応答を減少し得る。
【００４５】
さらに、ＢＡＦＦ−Ｒまたはそのコレセプターを認識する、組換え「ヒト化抗体」が合成され得る。ヒト化抗体は、その領域が特異的抗原を担うヒトＩｇＧ配列のほとんどを含むキメラである。動物は、所望の抗原で免疫され、対応する抗体が単離され、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分が取り出される。次いで、動物由来の抗原結合領域が、抗原結合領域が欠失されたヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングされる。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種（すなわち、種間の）配列の使用を最小化し、従って、処置された被験体における免疫応答を惹起する可能性が低くなる。
【００４６】
異なるクラスの組換え抗体の構築はまた、異なるクラスの免疫グロブリンから単離された、可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む、キメラまたはヒト化の抗体を作製することによって達成され得る。例えば、抗原結合部位価が増加した抗体は、ヒト：鎖定常領域を有するベクター中に抗原結合部位をクローニングすることによって組換え産生され得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：１４３９−１４５０（１９９３）、これは、本明細書において参考として援用される）。
【００４７】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、抗原結合部位の付近のアミノ酸残基を変更することによってその抗原と組換え抗体との結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発により増加され得る（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９−３３（１９８９）、これは、本明細書により参考として援用される）。
【００４８】
（アナログの生成：変更されたＤＮＡおよびペプチドの配列の生成）
ＢＡＦＦ−Ｒのアナログは、天然に存在するＢＡＦＦ−Ｒとは、アミノ酸配列が異なり得るか、または配列を有しない点で異なり得るか、あるいはその両方であり得る。非配列改変には、ＢＡＦＦ−Ｒのインビボまたはインビトロの化学誘導体化が含まれる。非配列改変としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグリコシル化における変化が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４９】
好ましいアナログとしては、配列番号１に与えられる配列とは、１つ以上の保存的アミノ酸置換の分、または１つ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失もしくは挿入（であって、ＢＡＦＦリガンドの活性を除外しないもの）の分、その配列が異なる、ＢＡＦＦ−Ｒ、その生物学的に活性なフラグメントが挙げられる。保存的置換としては、代表的に、あるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸に置換することが挙げられる。例えば、以下の群の中での置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００５０】
（使用）
全長ＢＡＦＦ−Ｒ遺伝子（配列番号２）またはその部分は、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして用いられて、例えば、配列番号２に開示されるＢＡＦＦ−Ｒ配列と所望の配列同一性を有する、なお他の遺伝子を単離し得る。ＢＡＦＦ−Ｒをコードするヌクレオチド配列はまた、ＢＡＦＦ−Ｒをコードする遺伝子をマッピングするため、および遺伝子障害を有する個体の遺伝的分析のための、ハイブリダイゼーションプローブを構築するために用いられ得る。スクリーニングアッセイは、ＢＡＦＦ−Ｒの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すように設計され得る。そのようなスクリーニングアッセイとしては、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングに受け入れられるアッセイが挙げられ、これにより、そのアッセイが低分子薬物候補を同定するために特に適切となる。企図される低分子としては、合成有機化合物または無機化合物が挙げられる。ＢＡＦＦ−Ｒまたはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために用いられ得る。これは次いで、治療上有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用となる。
【００５１】
本明細書に記載されるように、本発明の１つの実施形態において、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを用いて、動物におけるＢ細胞増殖、樹状細胞誘導されたＢ細胞増殖および成熟または免疫グロブリン生成を刺激する方法、あるいはＢＡＦＦ−Ｒおよび抗Ｔ抗体、ＣＤ４０リガンドまたは抗ＣＤ４０リガンドを用いて動物における、Ｂ細胞増殖、樹状細胞誘導されたＢ細胞増殖および成熟または免疫グロブリン産生を同時刺激する方法が提供される。ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを用いて、Ｂ細胞増殖、樹状細胞誘導されたＢ細胞増殖および成熟または免疫グロブリン産生を阻害する方法もまた包含される。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患、高血圧、心臓血管障害、腎臓障害、Ｂ細胞リンパ増殖障害、免疫抑制疾患、臓器移植、炎症およびＨＩＶの処置においてＢＡＦＦ−Ｒを用いる方法を提供する。ＢＡＦＦ−Ｒとそのリガンドとの間のシグナル伝達経路を包含する免疫応答を、処置、抑制または変更するための因子を用いる方法もまた包含される。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。例えば、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドのための適切なキャリア、およびその処方物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｏｓｌｏ  ｅｔ  ａｌ編に記載されている。代表的には、薬学的に受容可能な塩の適切な量をその処方物に用いてその処方物の等張性を付与する。そのキャリアの例としては、生理食塩水のような緩衝液、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。その溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、そしてより好ましくは、約７．４〜約７．８である。さらなるキャリアとしては、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスのような徐放性調製物が挙げられる。このマトリクスは、成型された物品（例えば、リポソーム、フィルムまたは微粒子）の形態で存在する。当業者には、特定のキャリアが、例えば、投与されるＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドの投与経路および濃度に依存してより好ましくあり得ることは明白である。
【００５４】
投与は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下内、筋肉内）によるか、または有効形態で血流に送達されることが確実になる、注入のような他の方法達成され得る。
【００５５】
本発明の実施では、そうでないと指示しない限り、当該分野の技術常識に入る、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の慣用技術を使用する。例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ），１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ）．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．），１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．），１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６。
【００５６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そして本発明を制限するとはみなされるべきではない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：プレートアッセイを使用してのＢＡＦＦ−Ｒに対するＢＡＦＦ結合の検出）
本実施例において、プレートアッセイを使用するＢＡＦＦのＢＡＦＦ−Ｒトランスフェクト細胞に対する結合が記載される。
【００５８】
全長ヒトＢＡＦＦ−Ｒを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩプレ増幅キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＢＪＡＢポリＡ＋ＲＮＡから生成し、ｃＤＮＡテンプレートを生成し、そしてＢＡＦＦ−Ｒの５’および３’コード配列に相補的なプライマーを使用してＰｆｕ１によって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＣＨ２６９（ｐＣＥＰ４の誘導体）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。得られるクローンをｐＪＳＴ５３５と命名した。ＥＢＮＡ−１遺伝子（２９３ＥＢＮＡ）を含有するヒト胚腎臓細胞を、フィブロネクチンでコートした６ウェルのプレートに播種し、そして種々の希釈のｐＪＳＴ５３５またはバックグラウンドコントロールとしてのＣＨ２６９のいずれかで、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトした細胞を、可溶性ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦ（アミノ酸Ｌ８３−Ｌ２８５）に結合するそれらの能力について、以下のようにアッセイした。全てのインキュベーションを室温で行った。馴化培地を、ウェルから吸引し、そして細胞をＢＨＡ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％  ＮａＮ3）で洗浄し、そして１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、
および０．１％  ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中において希釈した０．５μｇ／ｍｌのＦＬ
ＡＧ−ｈＢＡＦＦでインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、ＢＡＦＦ溶液を除去し、そしてその細胞をＢＨＡで洗浄した。その細胞を、次に、１μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ溶液中で３０分間インキュベートした。この溶液を吸引し、そしてその細胞をＢＨＡで洗浄した。次いで、その細胞を、アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆ（ａｂ）’２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈中で３０分間インキュベートした。この溶液を吸引し、そしてその細胞をＢＨＡで洗浄した。内因性アルカリホスファターゼに起因するバックグラウンド染色の量を減少するために、その細胞を、１５分間、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ９．５、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中にて希釈した２．５ｍＭのレバミソール（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。アルカリホスファターゼの色素生産性検出のために、インヒビター溶液を吸引し、そしてその細胞をファーストレッドおよびナフトールホスフェート（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液中でインキュベートした。染色を観察し、そして低出力顕微鏡で写真を撮った。
【００５９】
ファーストレッド色素の沈着を、ＢＡＦＦ−Ｒを発現するプラスミドｐＪＳＴ５３５でトランスフェクトした全てのウェルについて観察した。細胞中へトランスフェクトしたプラスミドの量として滴定されたシグナルの頻度は、減少した。コントロールの発現ベクターＣＨ２６９でトランスフェクトされた細胞について染色は観察されなかった。また、ＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦが染色プロトコルから排除された場合、または別のＴＮＦファミリーメンバーのリガンド、ＦＬＡＧタグ化ＬＩＧＨＴでｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦを置換した場合、いずれのトランスフェクトされた細胞についても、染色は観察されなかった。したがって、ＢＡＦＦ−Ｒトランスフェクト細胞のＢＡＦＦでの染色は、特異的であるようであった。
【００６０】
（実施例２：ＦＡＣＳ分析によるＢＡＦＦ−Ｒでトランスフェクトされた細胞に対するＢＡＦＦ結合）
この実施例は、ＦＡＣＳ分析を使用しての、ＢＡＦＦのＢＡＦＦ−Ｒトランスフェクト細胞への検出を記載する。
【００６１】
全長ＢＡＦＦ−ＲをコードするプラスミドであるｐＪＳＴ５３５を、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、２９３ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４または４８時間後に、細胞を５ｍＭのＥＤＴＡをＰＢＳ中で使用してプレートから除去し、そして計数した。その細胞を２回ＦＡＣＳ緩衝液（１０％の胎仔ウシ血清、０．１％ＮａＮ３、および１０μｇ／ｍｌのｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＰＢＳ）で洗浄し、次いで、２．５×１０5個の細胞を、１時間氷上で、ＦＡＣＳ緩衝液中に９μｇ／ｍｌから０
．０３７μｇ／ｍｌの範囲の濃度に希釈したＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦとともにインキュベートした。その細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２の５μｇ／ｍｌとともに３０分間氷上でインキュベートした。その細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして３０分間、氷上で、Ｒ−フィコエリスリン結合体化Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗マウスＩｇＧおよび１０μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤの１：１００希釈を含有する溶液中でインキュベートした。その細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、それらを、１％パラホルムアルデヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。続いてＦＡＣＳ分析を行い、そこで７−ＡＡＤ陽性（死）細胞が分別された。
【００６２】
ＦＡＣＳ分析の結果は、ＢＡＦＦ−Ｒでトランスフェクトした細胞の画分がＢＡＦＦに結合し得ることを示す。９μｇ／ｍｌのＢＡＦＦ濃度で、約２８％の細胞が、３６６の平均の蛍光強度（ＭＦＩ）でＢＡＦＦに結合する。ＰＥ標識ロバ抗マウス試薬単独を使用した場合、細胞の有意なシフトは存在しない。細胞の１．３％のみが、２３．５のＭＦＩ（全ての細胞の平均は５．５）を有する。ＢＡＦＦ−Ｒトランスフェクト細胞についてのシグナルは、ＢＡＦＦの漸減量で滴定される。１００ｎｇ／ｍｌで、８．７６％の細胞が、７８．９のＭＦＩを有する。
【００６３】
（実施例３：ＧＦＰマーカーを含むＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ相互作用のＦＡＣＳ分析）
この実施例において、ＢＡＦＦの、ＢＡＦＦ−ＲおよびＧＦＰレポータープラスミドと同時トランスフェクトした細胞に結合する能力が記載される。
【００６４】
２９３ＥＢＮＡ細胞を、ｐＪＳＴ５３５およびＧＦＰレポータープラスミドを用いて、実施例２に記載するようにトランスフェクトした。そのレポータープラスミドは、膜に結合したＧＦＰ分子をコードする。２つのプラスミドの同時トランスフェクションを使用して、本発明者らは、ＢＡＦＦに結合し得たトランスフェクトした細胞のパーセンテージを分析した。その細胞を、プレートから除去し、そしてＢＡＦＦ結合に供し、そして実施例２に記載されるように検出した。再び、７−ＡＡＤを死滅細胞を分別するために含めた。そのサンプルをＦＡＣＳによって分析し、そしてプロットした。その右上四半分は、結合したＢＡＦＦ（フィコエリスリン陽性）および発現するＧＦＰを有する細胞を表す。
【００６５】
ＧＦＰでトランスフェクトした細胞の全てがＢＡＦＦに結合するようには見えないが、有意な画分の細胞が、コントロールに比較して右上四半分に存在する。トランスフェクトされた細胞の３３パーセントは、８パーセントに比較して右上部にある。特定のレベルのＢＡＦＦ−Ｒ発現が、ＢＡＦＦがその細胞に結合するのに必要とされることであり得る。それはまた、同時レセプターが、高親和性相互作用に必要とされること、およびこのレセプターが、２９３ＥＢＮＡ細胞に限定されることが可能である。
【００６６】
（実施例４：ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ融合物によるｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦの免疫沈降）
この実施例は、ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦの、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＢＡＦＦ−Ｒのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）から構成される分子）との特定の相互作用を記載する。
【００６７】
ＢＡＦＦ−ＲのＣＲＤを、実施例１におけるように、３’プライマーとして、ｈＢＡＦＦ−Ｒコード配列のヌクレオチド１３２〜１５２に相補的なオリゴを使用して、ＢＪＡＢポリＡ＋ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって生成した。得られるＰＣＲフラグメントを、マウスＩｇＧカッパシグナル配列ＣＨ２６９の下流およびヒトＩｇＧのＦｃ部分の上流においてクローニングした。この構築物を、ｐＪＳＴ５３８と命名した。構築物ｐＪＳＴ５３８またはＣＨ２６９を、２９３ＥＢＮＡにリポフェクタミンによってトランスフェクトした。馴化培地および細胞抽出物を、トランスフェクションの２０時間後に収集した。細胞を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５％ＮＰ４０／０．５％デオキシコール酸中に可溶化し、遠心分離した。馴化培地および細胞抽出物のアリコートを、等容量の２×ＳＤＳ還元緩衝液と合わせ、煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタントランスファーに供した。発現を評価するために、その膜を、ＴＢＳＴ中の５％の脱脂乾燥乳中で、室温で３０分間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したマウス抗ヒトＩｇＧの１：３０００希釈でプローブし、そしてＴＢＳＴで洗浄した。ブロットをＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像し、フィルムに露光した。
【００６８】
免疫沈降を、ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦまたはｆｌａｇ−ｈＴＷＥＡＫのいずれかの２５ｎｇを、ｐＪＳＴ５３８またはＣＨ２６９のいずれかとともに、４℃で、１時間、攪拌しながら、トランスフェクトした２９３ＥＢＮＡ由来の０．５ｍｌの馴化培地とともにインキュベートし、その後３０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し、そして一晩攪拌を続けることによって行った。プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズをＰＢＳで２回洗浄し、そして２×ＳＤＳ還元サンプル緩衝液中で再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットトランスファーの後に、そのブロットを、５％脱脂乾燥乳中で、ＴＢＳＴ中の５μｇ／ｍｌの抗ｆｌａｇモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、そしてＴＢＳＴ中、５％脱脂乾燥乳中のヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈とともに、室温で３０分間インキュベートした。ブロットをＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で減増し、そしてフィルムに露光した。
【００６９】
ｐＪＳＴ５３８の２９３ＥＢＮＡ細胞へのトランスフェクションの際に、約４３ｋＤａのタンパク質の発現が、両方の細胞抽出物および馴化培地において、ウエスタンブロット分析によって、マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）検出され、これは、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ融合物が効率的に発現され、そして分泌されたことを示す。
【００７０】
免疫沈降において、バンドを、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃおよびｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦのインキュベーションの結果としてのみ観察した。このバンドは、ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦの直接ロードしたサンプルと同時に移動した。その他のレーンのいずれも、シグナルを生成しなかった。これは、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃとｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦとの間の相互作用が、特異的であることを示す。
【００７１】
（実施例５：可溶性レセプター形態の生成）
ヒトにおける使用のためのレセプターインヒビターを形成するために、当業者は、細胞外ドメインのヒトレセプターｃＤＮＡ配列を必要とする。マウスの形態が公知である場合、ヒトｃＤＮＡライブラリーは、マウスｃＤＮＡ配列を使用してスクリーニングされ、そしてそのような操作は、当該分野で慣用的に行われる。ヒトｃＤＮＡ配列を用いて、当業者は、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの非存在下で、レセプターの細胞外ドメインのＰＣＲ増幅を行い得る。代表的には、１つは、最後のジスルフィド連結した「ＴＮＦドメイン」と膜貫通ドメインとの間のほとんどのアミノ酸を含む。当業者は、得られる可溶性レセプターの効力を最適化するように含まれる「柄」の領域の量を変化させ得る。この単純化した部分は、種々のＣ末端Ｉｇ融合キメラベクターにクローニングし得るように、適切な制限部位を含むように操作される。あるいは、当業者は、３’末端に終結シグナルを挿入し得、そして、レセプターの可溶性形態をＩｇ融合キメラアプローチの使用に頼ることなしに、作成し得る。得られるベクターを、酵母、昆虫細胞、細菌、および哺乳動物を含むバイオテクノジーにおいて使用されるほとんどの系において発現し得、全ての発現の型についての例が存在する。種々のヒトＦｃドメインは、所望のように、ＦｃＲを最適化するかまたは排除するために、または相互作用を相補するために、結合され得る。あるいは、これらのＦｃドメインの変異形態は、ＦｃＲ選択的に除去するため、またはＦｃドメインへの相互作用またはＮ連結糖の付着（これは特定の利点を有する）を相補するために使用され得る。
【００７２】
（実施例６：アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体の生成）
上記の可溶型レセプターを用いて、従来の方法によってマウスを免疫し、そしてモノクローナル抗体を作成し得る。ＥＬＩＳＡ法によって同定される、得られた組換えｍＡｂは、種々のインビトロ細胞性アッセイにおいて、可溶性抗体またはプラスチック上へ固定された抗体のいずれかとして、アゴニスト活性についてさらにスクリーニングされ得る。しばしば、ＨＴ２９細胞株の死亡は、都合の良いシステムであり、多くのＴＮＦレセプターを通じたシグナル伝達に感受性である。この株が目的のレセプターを保有しない場合、その全長レセプターは、ＨＴ２９株中に安定にトランスフェクトされ得、ここで細胞障害性アッセイを行うことを可能にする。あるいは、このような細胞を、細胞センサー装置に用いて、レセプターの活性化がｐＨ変化（シグナル伝達事象の指標である）を惹起し得るか否かを評価し得る。このような様式およびこの方法において、ＴＮＦファミリーレセプターシグナルウェルは、このレセプターによって誘引される実際の生物学的事象を知るには必要のないものである。アゴニストｍＡｂは、臨床使用のために「ヒト化」される。この手順はまた、アンタゴニストｍＡｂを規定するためにも用いられ得る。このようなｍＡｂは、アゴニスト活性の欠損およびレセプター−リガンド相互作用を阻害する能力（ＥＬＩＳＡ、古典的結合方法またはＢＩＡコア方法によってモニターされる場合）によって規定される。最終的に、アゴニスト抗体に応答する、種々の細胞によるケモカイン分泌の誘導は、スクリーニングアッセイを形成し得る。
【００７３】
（実施例７：レセプター−リガンド相互作用のインヒビターのスクリーニング）
レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、当業者は、レセプターに直接結合し得る分子についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、これらの分子は、レセプター−リガンド相互作用を阻害する能力について、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質および可溶型のリガンドを用いて、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイにおいて、試験され得る。このＥＬＩＳＡは、阻害性化合物について、種々の天然産物ライブラリーなどをスクリーニングするために直接用いられ得る。このレセプターは、ＨＴ２９株のような細胞株中にトランスフェクトされ、生物学的アッセイ（この場合細胞毒性）を形成し、次いでスクリーニングアッセイを形成し得る。
【００７４】
（実施例８：ＢＡＦＦ−Ｒ−ＩｇＧは、正常マウスにおいてＢ細胞数の減少を起こす）
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。８日前、５日前、１日前および２日後、ＰＢＳ、４００μｇのヒトＢＡＦＦ−Ｒ−ｈｕＩｇＧ１（ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質（Ｔｅｒｅｓａ  Ｃａｃｈｅｒｏ，Ｂｉｏｇｅｎより供給）、または４００μｇの精製ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のいずれかを、マウス（１群に３匹）に、腹腔内投与した。０日目に、マウスに、１０％ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を１００μｌ投与した。
【００７５】
屠殺時に、心臓穿刺を介してＥＤＴを含有するチューブに血液を収集し、そして赤血球を低張緩衝液中に溶解した。血液をまた、血清調製のためのＥＤＴＡなしに収集した。単一細胞懸濁液を脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から調製し、そして赤血球を低張性緩衝液に溶解した。ＰＥ結合体化抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、抗シンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）／ＣＤ１３８および抗Ｂ７．２、ならびにＦＩＴＣ結合体化抗ＩｇＭおよび抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０を用いて、フローサイトメトリーを実施した。全てのｍＡｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。簡略には、Ｆｃレセプターを、氷上で１５分間１０μｇ／ｍｌのＦｃ  Ｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてブロックし、続いてＰＥ結合体化ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂを添加し、そして氷上で２０〜３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、そして０．５％パラホルムアルデヒドに懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒTMフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において細胞蛍光データを得、そしてＣＥＬＬＱｕｅｓｔTMソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００７６】
ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇを用いる処理後、試験した末梢血液および末梢リンパ器官において、Ｂ細胞数は、ほぼ５０％減少していた。Ｂ２２０高ＩｇＭ低（Ｂ２２０highＩｇＭlow）Ｂ細胞は、ＰＢＳ処理マウスおよびＨｕＩｇＧ処理マウスにおいて、それぞれ、細胞
の２３．４％および２１．５％とみなされたが、一方、この集団は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスにおいては、細胞のわずか９．９％であった。血漿細胞（シンデカン（ｓｎｄｅｃａｎ）／ＣＤ１３８＋）は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスにおける３．９％と比較して、ＰＢＳ処理マウスおよびＨｕＩｇＧ処理マウスの血液中で、それぞれ、５．７％および４．８％程度までわずかに減少するようであった。Ｂ７．２分子は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスにおける１．９％と比較して、ＰＢＳ処理マウスおよびＨｕＩｇＧ処理マウスにおいて、それぞれ、Ｂ２２０＋細胞の３．１％および４．５％に上方制御された。
【００７７】
脾臓Ｂ２２０高（Ｂ２２０high）Ｂ細胞は、ＰＢＳ処理したマウスおよびＨｕＩｇＧ処理したマウスにおける、それぞれ３６．７％および４０％と比較して、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスでは１８．８％と顕著な減少であった。この低下は、ＩｇＭ高（ＩｇＭhigh）およびＩｇＭ低（ＩｇＭlow）の両方の小集団において観察された（表８Ａを参照の
こと）。脾臓において、新しく形成されたＢ細胞区画（Ｂ２２０低（ＩｇＭ高）には変化は観察されなかった（データ示さず）。血漿細胞（シンデカン／ＣＤ１３８＋）は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理したマウスにおける、２．４％と比較して、ＰＢＳ処理したマウスおよびＨｕＩｇＧ処理したマウスの脾臓において、それぞれ３．３％および３．４％と減少がわずかであるようであった。
【００７８】
ＭＬＮは、ＰＢＳ処理したマウスおよびＨｕＩｇＧ処理したマウスにおける、それぞれ２６．７％および３５．８％と比較して、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスでは１４．１％と、Ｂ２２０＋Ｂ細胞の減少を示した。データを、表８Ａにまとめる。
【００７９】
【表１】
2014037434.tif 000002
ＳＲＢＣを用いた免疫後のｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理マウスの血液および脾臓中の血液細胞および血漿細胞におけるＢ７．２＋Ｂ細胞のパーセンテージは低下しており、このことは、Ｂ細胞活性化および／または成熟の阻害、ならびに活性化Ｂ細胞の潜在的に増大した排除が存在することを示唆する。非常に少ない割合の抗原特異的Ｂ細胞が、活性化され、そして任意の抗原（この場合、ＳＲＢＣ）に応答した。ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処理は、試験した全ての組織においてＢ細胞の割合のそのような劇的な減少（約５０％）を生じたので、ｈＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇの活性は、また得られた成熟Ｂ細胞を標的するようである。
【００８０】
従って、ＢＡＦＦ−Ｒ融合タンパク質は、Ｂ細胞媒介疾患において臨床適用を有する治療薬として用いられ得る。疾患としては、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーヴズ病、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性結節性動脈炎、および急速進行性糸球体腎炎のような本質的に自己免疫である疾患が挙げられる。治療剤はまた、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、原発性アミロイドーシスまたは免疫細胞関連アミロイドーシス、および重度不定単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）のような血漿細胞障害において適用を有する。腫瘍学の標的としては、Ｂ細胞癌腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
【００８１】
（実施例９：可溶性ＢＡＦＦ−Ｒを用いた、インビトロでのＢＡＦＦ誘導性Ｂ細胞増殖のブロック）
本実施例において、本発明者らは、可溶性ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１融合タンパク質が、マウス脾細胞におけるＢＡＦＦ誘導性Ｂ細胞増殖をブロックし得ることを示す。
【００８２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスからマウス脾細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を単離し、そして１０
％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した、１００μｌのＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する９６ウェルプレート中で培養した。次いで、種々の量のヒトＢＡＦＦ、１０μｇ／ｍｌのヒトＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１またはヒトＩｇ、ならびに１０μｇ／ｍｌの抗マウス表面μ重鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。３７℃での培養４８時間後、１μＣｉ／ウェル［メチル−3Ｈ］チミジン（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ）を用いて細
胞を２４時間パルスし、そしてＴｏｍｔｅｃ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）細胞ハーベスターを用いて収集した。Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で放射活性を測定した。
【００８３】
図８は、脾細胞増殖アッセイ（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）の結果を示す。添加されたヒトＢＡＦＦ試薬の量に対する、マウス脾臓細胞に取り込まれたカウント毎分（ＣＰＭ）を示す。抗μまたは融合タンパク質またはコントロールｈＩｇＧのレベルは、１０μｇ／ｍｌで一定に保つ。黒四角は、ＢＡＦＦのみで誘導された増殖のレベルを示す。黒丸は、ＢＡＦＦおよび抗μを用いた、細胞の増殖を示す。白三角の曲線は、ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１ＢＡＦＦを抗μ＋ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１とともに添加した場合に観察された阻害を示す。白菱形は、コントロールのヒトＩｇを用いて観察された阻害を示す。
【００８４】
ＢＡＦＦプラス抗μの添加は、インビトロにおいてマウス脾細胞の増殖を生じる。細胞に取り込まれた3Ｈチミジンのレベルは、ＢＡＦＦ単独または抗μ単独のいずれかを脾細
胞に添加したときに得られたレベルよりも有意に高い。ＢＡＦＦ単独での脾細胞の処理は、非常に高い濃度でのみ、3Ｈチミジン取り込みを生じる。抗μ単独の添加は、増殖を生
じない。漸増する量のＢＡＦＦおよび１０μｇ／ｍｌの抗μとともに、脾細胞に１０μｇ／ｍｌのコントロールヒトＩｇを添加した場合、増殖のレベルにおいて穏やかな減少が存在した。対照的に、同じ条件下で、１０μｇ／ｍｌのヒトＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１融合タンパク質を、このアッセイに添加した場合、増殖の程度は、ＢＡＦＦ単独処理について観察されたレベルへ減じる。このことは、ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１融合タンパク質がＢＡＦＦおよび抗μによって誘導される脾細胞の増殖を阻害し得ることを示す。
【００８５】
（実施例１０：ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１を用いた、Ｒａｊｉ細胞に対するＢＡＦＦの結合のブロック）
本実施例においては、Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫株に結合するＢＡＦＦの減少を生じる、ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１融合タンパク質とのＢＡＦＦのプレインキュベーションを記載する。
【００８６】
このＦＡＣＳアッセイでは、２０μｇ／ｍｌ〜３９ｎｇ／ｍｌにわたる２倍稀釈で、ヒトＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１またはヒトＬＴβＲ：ｈＩｇＧ１とともに、または融合タンパク質なしのいずれかで、２００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧ標的化ヒトＢＡＦＦを、氷上で３０分間、プレインキュベートした。Ｃａ2+もＭｇ2+も含まず、そして１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ）および０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを含有するＦＡＣＳ緩衝液中でインキュベーションを行った。プレインキュベーション後、ＢＡＦＦ融合タンパク質混合物を５×１０6Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ）細胞／ｍｌに添加した。このインキュベーションを、３
０分間氷上に置き、次いで４℃で２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を洗浄した。結合したＢＡＦＦを検出するため、５μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を細胞に添加し、３０分間氷上でインキュベートした。この細胞を再度上記のように洗浄し、次いで１：１００稀釈のＰＥ結合体化ロバ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を再度洗浄した後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＦＡＣＳ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）で読み取った。
【００８７】
図９は、ＢＡＦＦブロッキングアッセイの結果を示す。Ｒａｊｉ細胞に対するＢＡＦＦ結合を試験するＦＡＣＳ（登録商標）分析から得たＭＦＩ（平均蛍光強度）の読み取りを示す。黒四角は、細胞への結合の前にＢＡＦＦとともにヒトＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１をプレインキュベートする場合のデータを示す。丸は、ＢＡＦＦに対する非特異的融合タンパク質であるヒトＬＴβＲ：ｈＩｇＧ１の添加によって得られた曲線を示す。ｘ軸は、細胞とのインキュベーション前に２００ｎｇ／ｍｌまでＢＡＦＦに添加された融合タンパク質の量を示す。
【００８８】
融合タンパク質をヒトＢＡＦＦとともにプレインキュベートしないとき、サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は８０であった。ヒトＬＴβＲ：ｈＩｇＧ１をＢＡＦＦとともにプレインキュベートするときは、２０μｇ／ｍｌでさえ、Ｒａｊｉ細胞に対するＢＡＦＦ結合の検出は変化しない。しかし、ヒトＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１をＢＡＦＦとともにプレインキュベートするとき、６２５ｎｇ／ｍｌの融合タンパク質でさえ２０〜２５まで、ＭＦＩは実質的に減少する。この実験についてのバックグラウンドＭＦＩは７である。従って、ＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＩｇＧ１は、ＲａｊｉＢ細胞に対するＢＡＦＦ結合をブロックするのに非常に効果的である。
【００８９】
（実施例１１：ＢＡＦＦ−Ｒ−ＩｇＧは、トランスジェニックマウスにおいて狼瘡様自己免疫障害を減弱する）
本実施例は、末梢Ｂ細胞プールを減じ、そして巨脾腫症および腎炎の発生を阻害するＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇの効果を記載する。
【００９０】
５ヶ月齢のＢＡＦＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）および年齢の適合する同腹仔を、本実験に用いた。ＢＡＦＦ  Ｔｇマウスは、リンパ性障害および全身性エリテマトーデスに類似の自己免疫の表現型を表す（Ｍａｃｋａｙら、１９９９）。この表現型は、増大した末梢性Ｂ細胞集団を含み、この集団は、移行性（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  １）（Ｔ１）および２（Ｔ２）、成熟（Ｍ）、帯域（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ）（ＭＺ）およびＣＤ１high／ＩｇＭhighのＢ細胞を含んだ。
【００９１】
ＰＢＳ、４００ｍｇの精製したヒトＩｇＧ（ｈＩｇ）（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（３／群）、または４００μｇのＣＨＯ由来ヒトＢＡＦＦ−Ｒ−ｈｕＩｇＧ１（ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ）融合タンパク質（２／群）を、０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目、２５日目、２８日目、３２日目、３５日目に、このマウスに腹腔内投与し、４０日目に屠殺した。
【００９２】
屠殺の時点で脾臓重量を測定し、そして低張性緩衝液中での赤血球溶解後、単一細胞懸濁液を調製した。ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ２１／ＣＤ３５、ＰＥ結合体化抗ＩｇＤおよび抗ＣＤ１、ｃｙｃｈｒｏｍｅ結合体化抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、およびビオチン結合体化抗ＩｇＭを用いて、フローサイトメトリーを実施した。全てのｍＡｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。簡略には、Ｆｃレセプターを氷上で１０分間１０μｇ／ｍｌ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてブロックし、続いて氷上で３０分間ビオチン結合体化ｍＡｂを添加し、細胞を１回洗浄し、続いて、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ結合体化Ａｂ、ストレップ−アビジンＡＰＣおよび１０μｇ／ｍｌ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋを添加した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、そして０．５％パラホルムアルデヒドに懸濁した。細胞蛍光データをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で得て、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００９３】
尿分析用のＭｕｌｔｉｓｔｉｘ  １０  ＳＧ試薬片（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてマウス尿中のタンパク質の存在を測定した。
【００９４】
結果を以下の表１１Ａおよび１１Ｂに示す：
【００９５】
【表２】
2014037434.tif 000003
３ヶ月齢Ｂａｆｆ  Ｔｇマウス（ｎ＝３）および年齢の適合した同腹仔（ｎ＝２）の脾臓を単離し、そして材料および方法に記載のようにＦＡＣＳ分析に供した。Ｔ１、Ｔ２、ＭおよびＭＺ細胞を、以下の表面マーカーの発現によって規定した（ｈｉ：ｈｉｇｈ（高）．，ｌｏ：ｌｏｗ（低）．，ｉｎｔ：ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（中間））：
Ｔ１：ＩｇＤ-、ＩｇＭhigh、ＣＤ２１lo
ＭＺ：ＩｇＤ-、ＩｇＭhi、ＣＤ２１
Ｔ２：ＩｇＤ+、ＩｇＭhi、ＣＤ２１hi
Ｍ：ＩｇＤ+、ＩｇＭlo、ＣＤ２１int
【００９６】
【表３】
2014037434.tif 000004
１０ヶ月齢Ｂａｆｆ  Ｔｇマウス（ｎ＝３）および年齢の適合した同腹仔（ｎ＝３）を、表１に記載のようにＦＡＣＳ分析に供した。
Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスへのｈ  ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇの投与後、脾臓中のＴ１、Ｔ２、Ｍ、ＭＺ集団およびＣＤ１high／ＩｇＭhighＢ細胞は、ＰＢＳおよびｈＩｇで処理したＢＡｆｆ  Ｔｇマウスに比べて、有意に低下した。Ｔ１、Ｔ２、Ｍ、ＭＺおよびＣＤ１high／ＩｇＭhighのＢ細胞の総数は、ＰＢＳで処理したコントロールの同腹仔のレベルと同程度かまたは低いレベルまで減じた（図１０ａ、１０ｂ、１０ｃ）。
【００９７】
Ｂａｆｆ  ＴｇマウスのＢＡＦＦ−Ｒ  Ｉｇ処置は、ＢＡＦＦ−Ｒ処置マウスが正常サイズの脾臓を有した一方で、コントロール処置Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスが巨脾腫を示したという観察により証明されるように、Ｂａｆｆ媒介性自己免疫疾患の低減を生じた（図１１）。さらに、タンパク尿の発症、腎不全の徴候がＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処置マウスにおいて阻害されたのに対し、コントロール処置Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスでは、タンパク尿レベルの増加により決定されるように、腎炎を発症した（図１２）。
【００９８】
Ｂａｆｆについてのトランスジェニックマウスは、末梢Ｂ細胞の数が非常に増加しており、そして本発明者らの分析により、これらのマウスにおいてＴ１、Ｔ２、ＭＺ  Ｂ細胞亜集団が主に増大していることが示された。Ｂ細胞発生（Ｔ１およびＴ２）の移行段階は、チェックポイントであり、この段階において、自己反応性Ｂ細胞はおそらく除去されている。ＣＤ１hi／ＩｇＭhigh  Ｂ細胞（これは、周辺領域に存在する傾向にある）はまた、Ｂａｆｆ  Ｔｇマウスにおいて非常に増加していた。この後者のＢ細胞集団は、ＮＺＢ／ＮＺＷ狼瘡マウスにおいて自己抗体生成の主要な供給源であることが示された。Ｂａｆｆ  ＴｇマウスをＢＡＦＦ−Ｒ  Ｉｇで処置することにより、Ｔ１、Ｔ２、ＭＺおよびＣＤ１hi  Ｂ細胞集団が、野生型同腹仔コントロールにおいて見出されたレベルと同様以下のレベルまで減少した。
【００９９】
ＢＡＦＦ−Ｒ  Ｉｇは、末梢Ｂ細胞プールを減少し、そして巨脾症および腎炎の発症を阻害するように機能する。従って、全身エリテマトーデス、ループス腎炎におけるその有用性に加え、ＢＡＦＦ−Ｒ  Ｉｇの作用はまた、本質的に自己免疫疾患であるＢ細胞媒介性疾患（例えば、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ヴェーゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および急速進行性糸球体腎炎）においても同様に有用である。この治療薬剤はまた、プラズマ細胞障害（例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、原発性または免疫担当細胞関連アミロイド−シス、および意味未決定の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ））において適用を有する。腫瘍学の標的としては、Ｂ細胞癌腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
【０１００】
（実施例１２：ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおける平均動脈圧）
この実験は、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスにおける血圧の測定を記載する。ＢＡＦＦトランスジェニックマウスの表現型評価の間に行われた観察により、マウスにおける高血圧についての可能性が示された。
【０１０１】
上記のＢａｆｆ  Ｔｇマウスを、ケタミンで麻酔した。左頸動脈を頸部切開により露出させた。血圧および心拍数を測定するために、頸動脈にカテーテルを挿入した。このカテーテルを圧力変換器に接続し、そして血圧をＧｏｕｌｄデータ取得システム（Ｐｏ−Ｎｅ−Ｍａｈ  Ｄａｔａ  Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍおよびＧｏｕｌｄ  ｐｏｌｙｇｒａｐｈ）を用いて測定した。拍動圧波形から、収縮期血圧、拡張期血圧、平均血圧および心拍数を導出した。２つの群のマウスを用いた：ＢＡＦＦトランスジェニック（ｎ＝８）および野生型コントロール（ｎ＝９）。
【０１０２】
図１３は、２群を平均した平均動脈圧（ＭＡＰ（ｍｍＨｇ））を示す。示されるように、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、１０２±８ｍｍＨｇという平均ＭＡＰを有した。コントロールマウスは、９２±６ｍｍＨｇという平均ＭＡＰを有した。従って、ＢＡＦＦマウスは、コントロールに対して、ＭＡＰが１０ｍｍＨｇ増加していることを示すが、統計的有意には達しなかった（ＡＮＯＶＡ）。
【０１０３】
データのより詳細な分析を図１４に示す。この図において、個々の動物からの結果を示す。野生型コントロール（ＢＡＦＦ−）において、データ分布は、代表的な二項分布になった。対照的に、ＢＡＦＦトランスジェニックマウス（ＢＡＦＦ＋）における血圧は、それらが２群に分類されるかのように現れた。一方の群は、１２０〜１３０ｍｍＨｇ範囲であり、もう一方の群は、８０〜９０ｍｍＨｇ範囲であった。
【０１０４】
集団として、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、ネガティブコントロールマウスと比較して、高血圧の傾向を有する。動脈圧の個々のレベルの分析により、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスが２つの亜集団、すなわち、一方は、高血圧、もう一方は正常血圧に分けられる。従って、可溶性ＢＡＦＦ−Ｒ、融合タンパク質または抗体ホモログの投与は、高血圧の効果を改善し得る。
【０１０５】
（実施例１３：確立された疾患を有するＳＮＦ1マウスのＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処置は、
重篤な腎炎への進行を遅らせる）
雌性狼瘡易発性（ＳＷＲ×ＮＺＢ）Ｆ１（ＳＮＦ1）マウス（２１週齡であり、中程度
の腎炎（３０〜１００ｍｇ／ｄｌ  タンパク尿）を示す）に、２００μｇの融合タンパク質（ヒトＢＡＦＦ−Ｒ−ｈｕＩｇＧ１（ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ））、ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）（Ｓａｎｄｏｚ）または２００μｌのＰＢＳを１週間に１回、８週間にわたり、腹腔内で与えた。各マウスの尿をＡｌｂｕｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｅｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を用いてタンパク尿について１週間に１回モニターした。１００ｍｇ／ｄｌを超えるタンパク尿を、重篤な腎炎とスコアリングした。ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇを一過性にトランスフェクトしたＥＢＮＡ  ２９３細胞から生成した。ｈＢＣＭＡ−Ｉｇを過剰発現する２９３細胞由来の馴化培地を、プロテインＡカラムにロードした。タンパク質を２５ｍＭ  リン酸  １００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．８を用いて溶出し、続いて、１／２０容量の０．５Ｍ  ＮａＰＯ4  ｐＨ８．６を用いて中和した。ＯＤ２８０に基づいて選択し
た画分を、還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロットに供して、精製タンパク質を同定した。
【０１０６】
処置の３週間後、ＨｕＩｇＧおよびＰＢＳを与えたマウスのそれぞれ７５％および８７．５％と比較して、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇで処置したマウスの５０％が重篤な腎炎を示したという結果になった（図１５を参照のこと）。これらのデータは、可溶性ＢＡＦＦレセプター、ＢＣＭＡ−ＩｇがＢ細胞媒介性自己免疫疾患（例えば、ループス腎炎）をブロックするように機能し得、疾患進行において顕著な遅延を生じる。
【０１０７】
（実施例１４：正常マウスのＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ処置は、脾臓樹状細胞（ＤＣ）の数の減少および異型の脾臓局在を生じる）
７週齡の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（３匹／群）に、２０μｇまたは５０μｇのヒトＢＡＦＦ−Ｒ−ＩｇＧ１（ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ）、５０μｇのヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）または１００μｌのＰＢＳのいずれかを、１週間に１回、４週間にわたり、腹腔内で与えた。ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質を、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株の培養上清から精製した。脾臓を最後に注射してから８日後に得て、そして３７℃で１時間、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｃ−５１３８）で消化した。単一細胞の懸濁物を調製し、高浸透圧緩衝液中でＲＢＣを溶解し、そして細胞を３回、ＰＢＳで洗浄した。脾細胞を、抗ＣＤ１１ｃ−ビオチン、続いて、ストレプトアビジン−ＡＰＣ、抗ＣＤ８ａ−ｃｙｃｈｒｏｍｅ、および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色することによりフローサイトメトリー分析用に調製して、ＤＣ集団を評価した。
【０１０８】
別の実験において、雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｎ＝３）マウスに、１００μｇ  ｈＢＣＭＡ−Ｉｇを１週間に１回、４週間にわたり腹腔内で与えた。その後、脾臓を、ＣＯ2で冷却し
た２−メチルブタンを用いてＯＣＴ中に急速凍結した。低温切片を切り出し、そしてアセトン固定した。切片を、ＤＣを可視化するために抗ＣＤ１１ｃ−ビオチン、続いてストレプトアビジン−ＡＰ、そして基質ＢＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに、好金属性マクロファージを可視化するためにｍＡｂ  ＭＯＭＡ−１、続いて抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）そして基質３，３’ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ．＃Ｄ−１２９３）とともに、濾胞性樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（ＦＤＣ）を可視化するために抗ＣＤ３５−ビオチン、続いてストレプトアビジン  ＡＰ、そして基質（アルカリホスファターゼ基質キットＩ，Ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｔ＃ＳＫ−５１００）とともにインキュベートした。
【０１０９】
２０μｇまたは５０μｇのＢＣＭＡ−Ｉｇのいずれかで１週間に１回、４週間にわたりインビボで処置したマウスは、ＨｕＩｇＧおよびＰＢＳ処置コントロールと比較して、脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおいて有意な減少を示した（ステューデントｔ検定によりｐ＜０．０５）。この減少は、試験した全てのＣＤ１１ｃ＋  ＤＣ集団について見られた：ＣＤ８ａ−ＣＤ４−、ＣＤ８ａ＋ＣＤ４−、およびＣＤ８ａ−ＣＤ４＋（図１６、表１４Ａ）。
【０１１０】
【表４】
2014037434.tif 000005
脾臓ＤＣ（これは、重要な抗原提示細胞である）におけるこの減少は、Ｂ細胞活性化、成熟および体液性免疫に影響を及ぼし得る。
【０１１１】
凍結脾臓切片を、材料および方法において記載したように、マウスから得た。ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスは、抗ＣＤ１１ｃで染色した場合に、異型のＤＣホーミングパターンを示した。ＤＣは、通常は、チャネルにまたがる周辺領域における濃度で、白色脾髄のＴ細胞領域内および周辺領域内に局在する。しかし、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウス由来のＤＣが見出され、これは、周辺領域の周界を取り囲んでおり、そして白色脾髄内にさらに移動し得ることはほとんどないようである（データは示さず）。従って、可溶性ＢＡＦＦレセプターとのＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ相互作用のブロッキングは、抗原提示細胞として機能するそれらの能力に影響を及ぼし得るＤＣのホーミングパターンを妨害し、それによりＢ細胞活性化、成熟および体液性免疫に影響を及ぼすようである。さらに、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスの脾臓は、免疫組織化学により決定されるように、ＣＤ３５＋ＦＤＣを欠いていた（データは示さず）。ＦＤＣは、胚中心（ＧＣ）内のＢ細胞に抗原を提示するように機能するので、このような細胞の欠如は、ＧＣ構造およびＢ細胞親和性成熟に対して好ましくない影響を有し得る。
【０１１２】
本発明のポリペプチド、組成物および方法において、本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく種々の改変および変化が行われ得ることは当業者に明らかである。従って、本発明は、本発明の改変および変化が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入る場合は、これらの改変および変化を包含する。
【図１】
2014037434.tif 000006
【図２】
2014037434.tif 000007
【図３】
2014037434.tif 000008
【図４】
2014037434.tif 000009
【図５】
2014037434.tif 000010
【図６ａ】
2014037434.tif 000011
【図６ｂ】
2014037434.tif 000012
【図７】
2014037434.tif 000013
【図８】
2014037434.tif 000014
【図９】
2014037434.tif 000015
【図１０ａ】
2014037434.tif 000016
【図１０ｂ】
2014037434.tif 000017
【図１０ｃ】
2014037434.tif 000018
【図１１】
2014037434.tif 000019
【図１２】
2014037434.tif 000020
【図１３】
2014037434.tif 000021
【図１４】
2014037434.tif 000022
【図１５】
2014037434.tif 000023
【図１６】
2014037434.tif 000024
【配列表】
2014037434000001.app
【外国語明細書】
2014037434000001.pdf