(57)【要約】【課題】不妊治療における体外受精に用いられる胚盤胞を含めた移植胚の新たな評価法や、評価に必要な新たなバイオマーカーを利用する移植胚の評価方法を提供すること。【解決手段】（ａ）対象から得られる、ヒト胚盤胞等の移植胚から放出されるノルエピネフリン（ノルアドレナリン）含有被検体、例えばヒト胚盤胞の培養液を準備する工程；（ｂ）該被検体中のノルエピネフリンを超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ等により定量的に分析する工程；（ｃ）得られた分析結果から、ノルエピネフリン量に基づいて移植胚の品質を予測する工程；を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体外受精における移植胚の評価方法であって、
１）対象から得られる、移植胚から放出されるノルエピネフリン含有被検体を準備する工程；
２）被検体中のノルエピネフリンを定量的に分析する工程；
３）得られた分析結果から、ノルエピネフリン量に基づいて移植胚の品質を予測する工程；
を含む方法。
【請求項２】
被検体が移植胚の培養液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植胚がヒト胚盤胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
定量的に分析する工程が、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、分析結果の多変量解析によってノルエピネフリン量をピーク面積値にて定量化する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
５１００ＣＰＵ（count per unit)を下回るノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、ヒト胚盤胞の発育が良好である状態を示し、２４００ＣＰＵ（count per unit)を下回るノルエピネフリンレベルが、胚盤胞移植後に妊娠する確率が高いことを示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
８５００ＣＰＵ（count per unit)を上回るノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、ヒト胚盤胞の発育が停止している状態、又は胚盤胞移植後に妊娠する確率が低いことを示す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外受精における移植胚の評価方法、より詳しくは、胚が分泌するノルエピネフリンの定量や、定量結果から着床率の高い胚を選別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「晩婚化」という現象が、単に生殖可能期間を縮めるだけでなく、妊娠・出産に関連する障害を増やす可能性もあると一般的に認知される一方で、日本における全出生の５２．６％を３０代・４０代の女性が担っている（厚生労働省「平成１６年人口動態統計」）。晩婚化に伴う出産年齢の高まりは、とどのつまり不妊化傾向を後押ししており、厚生労働省が発表する不妊治療患者の総数は、平成１４年度の時点で推計４６万人を超え、今後も増え続けることが予測される。不妊に対する有力な打開策である人工授精、体外受精、顕微授精などの生殖補助医療は、保険適用外であるにもかかわらず実施件数を年々伸ばし、日本産科婦人科学会・調査委員会の報告によれば、平成１６年の体外受精及び顕微授精の総患者数は７８，０００人以上であり、この数字は平成９年における同患者総数の２倍以上を示す。晩婚化の流れが簡単には変わらない様相を呈していることから、高齢で妊娠を望む男女の要望に応えることが少子化対策の重要な鍵を握ると考えられ、生殖補助医療に対する依存度は更に高まりを見せている。
【０００３】
平成１５年にまとめられた厚生労働省の資料によると、不妊原因の比率は、男女ともに５０％である。男性不妊の原因としては、造精機能障害が９０％以上を占め、残りの１０％は性交障害に起因する。造精機能障害とは、精子の数が基準より少ない、精子濃度が低い、精子運動率が悪い、精子の奇形率が高いなどを指し、その原因としては、加齢、環境ホルモンの影響、生活習慣病、食生活の乱れによる亜鉛不足、ストレス、喫煙等が知られるが、男性不妊の約６割は原因不明とされる。一方、女性の不妊原因としては、卵巣からの排卵が起こらない排卵障害、排卵後に卵管が詰まるなどして受精が妨げられる卵管障害、受精後に子宮へ着床できない着床障害の３種に大別される。
【０００４】
男性側に起因した不妊を主な対象に採られる比較的簡易な手法が人工授精であり、具体的には、採取した精子を選別したのち子宮腔内へ器具を用いて注入し、体内受精を目指すものである。卵管の閉塞や乏精子症・精子無力症などの様に、体内受精が難しいと考えられる場合に行う方法を体外受精と呼び、なかでも体外受精−胚移植は、現在、最も一般的に行われている方法である。
【０００５】
体外受精の施行は、大きく３つの工程に分けられる。まず初めに、効率よく排卵を起こさせるために各種ホルモン剤や排卵誘発剤などを女性患者に投与し、排卵を惹起させる。次に、経膣的な超音波エコーの画像で確認しながら卵胞に針を刺して成熟した卵子を吸引し、別途採取し精製した精子と、採取した卵子を培養液中で混和することで受精させる。精子の受精能力がかなり弱い場合には、顕微鏡下で人為的に精子を卵へ侵入させる顕微受精が行われる。最後の工程で、選別した受精卵（胚）を子宮内へ移植し、着床−妊娠を目指す。
【０００６】
受精卵が卵割を開始してからおよそ５〜６日目の段階まで育ったものを胚盤胞と呼び、自然妊娠の場合、この胚盤胞まで育った胚が子宮内膜に着床する。自然妊娠の着床のタイミングに近い培養段階で子宮に胚を移す胚盤胞移植は、受精から２〜３日目の分割期胚を用いた移植に比べ、一般的には妊娠率が向上すると考えられている。
【０００７】
１度に移植する胚の数については議論があり、妊娠の成功率を上げるために複数個の胚盤胞が移植されるケースもあるが、これは同時に多胎妊娠の可能性を高めてしまい、即ち流産や早産、障害の発生割合が高くなるほか、母体にとっても妊娠高血圧症候群や合併症の発生率が増加する大きなリスクを背負うことになる。平成２０年に発表された日本産科婦人科学会の見解によると、移植する胚は原則として単一とし、３５歳以上の女性、又は２回以上続けて妊娠不成立であった女性などについては、２胚移植が許容されている。
【０００８】
採卵の工程では、成熟した未受精卵が複数個採取できる可能性があり、その場合、受精から移植するまでに育った段階で、複数個の胚の中から着床に適したより良い胚盤胞を選択する必要があるが、形態学的な観察による評価が、現時点で用いられる唯一の方法である（図１、２）。
【０００９】
胚盤胞の選択が難しいことを示す臨床的な事例として、同一患者の同一周期に採卵した卵子由来かつ、体外培養液において同一の発育速度で、同一時間（体外受精から１２３時間目）に凍結した、良好な２個の胚盤胞が得られたケースで、１回目の移植用に選択した胚盤胞では妊娠せず、もう片方の胚盤胞を用いて２回目の移植を行った結果、妊娠成立したという様な例が、不妊治療の現場では数多く経験されている（図３）。２つの胚盤胞が全く同一の評価結果であったにもかかわらず、初回では妊娠せず、後者を着床せしめたことは、現行評価法の限界を示しており、妊娠率向上に相関した精度の高い評価法が待ち望まれている所以である。
【００１０】
胚盤胞を評価する上で最も望ましいのは、胚そのものを被検体とせず、非侵襲的に判定できることであり、培養液中に含まれる胚からの分泌物は、条件を満たす有力な検体である。ヒトとマウス胚の培養液中に含まれるタンパク質バイオマーカーについて、飛行時間型質量分析計を用いて調べた報告では、ユビキチンが同定されているが［非特許文献１］、妊娠率との関連性は何ら示されていない。同様の報告としては、受胎の直後から胎児の栄養膜合胞体層（胎盤の一部）で作られることが知られる、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βｈＣＧ）を調べた電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）による結果から、胚培養液中βｈＣＧ濃度と妊娠率の相関性が示唆されているが［非特許文献２］、発生の過程で受精卵及び胚が、ノルエピネフリンを分泌するという知見は皆無である。
【００１１】
体外受精における良好卵子の選別を簡便かつ有効に実施する例として、受精前の卵子における異常形態である屈折体を検出する方法が公開されているものの［特許文献１］、検出には、卵子に対し蛍光顕微鏡又は共焦点レーザー顕微鏡などからの励起光を当てることが必須となっている点で、卵子への侵襲性を否めない。
【００１２】
１回につき２５万〜８０万円以上の費用がかかるとされる、体外受精の患者に及ぼす経済的・精神的負担を考えれば、着床に最適な胚盤胞をより確実に選択し、少ない移植回数で妊娠を目指す意義は、非常に大きくかつ切実な課題である。胚盤胞を正確に評価する新たな技術が世に広まれば、臨床家にとっては、複数胚移植による多胎と妊娠率向上のジレンマから解放され、また一方では、妊娠成立までに掛かる体外受精の回数、即ちコスト削減が期待できることから、経済的理由で不妊治療を迷う患者にとって、治療開始を踏み出す契機となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００５−２２９９２３号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Katz-Jaffe MG, et al., (2006) Fertil Steril. Sep;86(3):678-85.
【非特許文献２】Xiao-Yan C, et al., (2012) J Assist Reprod Genet. Dec 29. [Epub ahead of print]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、不妊治療における体外受精に用いられる胚盤胞を含めた移植胚の新たな評価法や、評価に必要な新たなバイオマーカーを利用する移植胚の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その過程において、胚盤胞培養後に廃棄される培養液を被検体として、超高速液体クロマトグラフィーを用いた解析により培養液中に特異的に含まれる成分の同定を行い、更にその定量を実施したところ、試行錯誤の末、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）が着目すべき成分であることを見いだした。更に鋭意調査を進めた結果、移植後に着床し妊娠が継続する胚盤胞の群が培養液中に分泌するノルエピネフリンの量と、移植をしても着床しない胚盤胞のノルエピネフリン分泌量に有意な差があることを発見した。
【００１７】
さらに、ヒト発育良好胚盤胞及び退行胚盤胞（正常に発育していない胚盤胞）を蛍光免疫組織化学的に検討した結果、ドーパミンからノルエピネフリンに変換する酵素であるドーパミンβハイドロキシラーゼが、良好胚盤胞では内部細胞塊及び栄養膜細胞のどちらにおいても、細胞内での発現が確認された。退行胚盤胞においては、分裂停止した割球において強発現が確認された他、細胞外での発現も確認された。
【００１８】
上記所見は、成体において脳幹や副腎皮質から分泌される神経伝達物質のノルエピネフリンが、発生の初期の段階の胚で産生されていることを示す初めての知見である。すなわち本発明者らは、上記手法によってヒトの胚盤胞を評価する新規バイオマーカーを見出し、形態学的に良好に発育した複数個の胚が得られた場合、優先的に移植する胚の選択を可能にする、新たなヒト胚盤胞評価法の確立に成功した。
【００１９】
すなわち、本発明は
［１］体外受精における移植胚の評価方法であって、
１）対象から得られる、移植胚から放出されるノルエピネフリン含有被検体を準備する工程；
２）被検体中のノルエピネフリンを定量的に分析する工程；
３）得られた分析結果から、ノルエピネフリン量に基づいて移植胚の品質を予測する工程；
を含む方法に関する。
【００２０】
また本発明は、
［２］被検体が移植胚の培養液である、上記［１］に記載の方法や、
［３］移植胚がヒト胚盤胞である、上記［１］又は［２］に記載の方法、
［４］定量的に分析する工程が、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせであり、分析結果の多変量解析によってノルエピネフリン量をピーク面積値にて定量化する工程を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］５１００ＣＰＵ（count per unit)を下回るノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、ヒト胚盤胞の発育が良好である状態を示し、２４００ＣＰＵ（count per unit)を下回るノルエピネフリンレベルが、胚盤胞移植後に妊娠する確率が高いことを示す、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法、
［６］８５００ＣＰＵ（count per unit)を上回るノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、ヒト胚盤胞の発育が停止している状態、又は胚盤胞移植後に妊娠する確率が低いことを示す、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によると、体外受精における発育良好胚の、より正確かつ非侵襲的な評価法が提供される。すなわち着床する可能性の高い胚が選び出されることで、妊娠が成立するまでの体外受精回数を抑えることが可能となるばかりでなく、妊娠率を上げたいが為に多胎の危険性を冒すことになる複数胚移植を制限する上で、臨床家にとって貴重な判断材料となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】形態学的胚盤胞グレードの分類を示す。ＩＣＭ／Inner Cell Mass（内部細胞塊)：細胞数が多く密であるほどグレードが高い。Trophectoderm（栄養膜細胞層）：細胞数が多く密であるほどグレードが高い。
【図２】Gardnerの胚盤胞の評価を示す。胚盤胞の育成の段階をグレードで表している。
【図３】移植した同一患者由来の胚盤胞を示す。移植には１回目、２回目共に凍結胚を用いた。Ａ：２回目の移植に使用し、着床−妊娠した。Ｂ：１回目の移植に使用したが、妊娠には至らなかった。ＡとＢは共に、同一患者の同一周期に採卵した卵子に由来し、体外培養液での同一の発育速度で、同一時間（体外受精から１２３時間目）に凍結、同じ直径（１６０μｍ）であった。
【図４】胚盤胞評価法の概略を示す。超高速液体クロマトグラフフィー  ｍａＸｉｓTM３Ｇ(Bruker Daltonics社製)を用いた。
【図５】胚盤胞を培養した培養液と、未培養の培養液（コントロール）のクロマトグラムを示す。Ａ：胚盤胞培養培地  Ｂ：胚盤胞未培養培地  Ｃ：ＡとＢのピーク差  ピーク５とピーク６に、顕著なピーク差が確認された。
【図６】同定された胚盤胞分泌成分を示す。ピーク５はロイシン酸、ピーク６はノルエピネフリンであった。
【図７】ピーク面積として定量化された、培養液中に分泌されたノルエピネフリンのクロマトグラムピーク波形を示す。control：胚盤胞を培養していない培養液
【図８】胚盤胞発育の可否並びに胚盤胞移植後の着床の有無で振り分けた、培養液中ノルエピネフリン値と血中ホルモン値を示す。妊娠・出産まで発育した症例と、着床しなかった症例では、培養液中に分泌されたノルエピネフリン値に顕著な差を認めた。
【図９】免疫蛍光染色法を用いて、ノルエピネフリン合成酵素のドーパミンβハイドロキシラーゼの発現を、マウス胚盤胞において示した図である。Ａ：拡張期胚盤胞  Ｂ：孵化中胚盤胞
【図１０】免疫蛍光染色法を用いて、マウス退行胚におけるドーパミンβハイドロキシラーゼの発現を示した図である。ドーパミンβハイドロキシラーゼが、分裂停止した割球において強発現している。
【図１１】免疫蛍光染色法を用いて、ドーパミンβハイドロキシラーゼの発現をラット拡張期胚盤胞において示した図である。
【図１２】免疫蛍光染色法を用いて、ヒト発育良好胚盤胞及び退行胚盤胞におけるドーパミンβハイドロキシラーゼの発現を示した図である。
【図１３】各濃度のノルエピネフリン条件下においてin vitro培養された体外受精マウス胚の体外発生率を示す図である。
【図１４】各濃度のノルエピネフリン条件下においてin vitro培養された体外受精マウス胚の顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、生殖の医学及び生物学の分野におけるバイオマーカーの同定に基づく。具体的には、ノルエピネフリン値を定量することで、体外受精−胚移植の結果を予測でき、特に受精卵生育の良し悪し、胚着床の成功又は失敗を予測する情報を提供する。加えて、このマーカーは、胚の生存能力の高さを数値化し、着床する確率の高い胚を選択するために有用である。
【００２４】
本発明の移植胚の評価方法（以下「本評価方法」という場合がある）としては、移植胚から放出されるノルエピネフリンを含有する可能性のある被検体の、ノルエピネフリン値を定量的に分析し、得られた分析結果から移植胚の品質を予測する方法であれば特に制限されず、上記ノルエピネフリン(Norepinephrine)は、ノルアドレナリン（Noradrenaline）としても知られている。
【００２５】
本評価方法において、ノルエピネフリン値を定量的に分析する方法としては、ノルエピネフリンを高感度かつ高選択的に定量できる方法であれば特に制限されないが、高速液体クロマトグラフィー・質量分析法や、クロマトグラフィー法、ＥＬＩＳＡ法、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ）などを挙げることができ、中でも超高速液体クロマトグラフィー・質量分析法を好適に例示することができる。
【００２６】
上記移植胚としては、分割し始めて２〜３日後の受精卵（胚）である分割期胚や、体外で５〜６日間培養した胚盤胞を挙げることができるが、高妊娠率の点で胚盤胞が好ましい。また、移植胚の由来としては、ヒトを好適に例示することができるが、その他にも、通常、実験動物、家畜、ペットとして一般的に使用される哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、サルなどを例示することができる。
【００２７】
上記被検体としては、受精卵（胚）を培地中で培養した移植胚の培養液やその処理物などを挙げることができる。また、上記培地としては、通常の組織培養に用いられる培地であればよく、Quinn’s Advantage Protein Plus Cleavage Medium (SAGE, IVF Inc, Trumbull, CT, USA)の他、HTF（Human Tubal Fluid Medium)、P1 medium、G1/G2 meidumを挙げることができる。
【００２８】
体外受精の方法としては、標準的ヒト体外受精（ＩＶＦ）の場合、例えば、Quinn’s Advantage Protein Plus Cleavage Medium５０μＬに培養されたМII期の１卵子あたり、１０万の精子と共培養されることが好ましい。その他の体外受精の方法として、顕微授精（ＩＣＳＩ）を好適に挙げることができる。
【００２９】
精子との共培養から１８〜２２時間の間に受精卵となるＩＶＦ、又は、顕微授精によって得られるヒト受精卵の培養方法として、受精から２日間はQuinn’s Advantage Protein Plus Cleavage Medium２０μＬで培養し、２日後から４細胞期までのQuinn’s Advantage Blastocyst Medium（ＢＭ）２０μＬで培養する間、受精後７６〜８０時間のタイミングで上記ＢＭ培養液を半量（１０μＬ）新しい培養液と交換し、以後、受精から８０〜１７０時間まで同一培養液にて培養する手法を一例として挙げることができる。
【００３０】
In vitroの胚培養環境としては、３７．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件を挙げることができる。
【００３１】
凍結融解胚移植は、新鮮胚移植に比べ高い着床率であることが臨床的に知られることから、生育した受精卵（胚）は、移植前に一度凍結保存することが好ましく、手法としてはガラス化保存法を好適に挙げることができる。
【００３２】
被検体としての培養液として、胚が凍結保存される際に破棄される上記培養液（上記培養方法では２０μＬ）を、また対照検体として、胚を培養していないＢＭ培養液を好適に挙げることができる。
【００３３】
好ましい態様において、被検体中のノルエピネフリンの定量的に分析する工程として、予測される被検体中のノルエピネフリン濃度に鑑みて、高選択性かつ高感度性を兼ね備えたクロマトグラフィーの原理を用いた分析法を用いることが好ましく、超高速液体クロマトグラフィーにより分離・検出する方法を用いることがより好ましい。超高速液体クロマトグラフィーの検出器として、例えば、光学的性質（吸光度、屈折率、蛍光）、電気化学的性質、質量分析法などを利用した装置を挙げることができる。
【００３４】
被検体中には非常に多くの夾雑物質及び大量の代謝物が混在していると予想されることから、被検体の解析法には、網羅的代謝産物解析（メタボローム解析）を用いることが好ましく、また、膨大な変量を同時に扱う上で、データの解析には多変量解析を用いることがより好ましい。種々の上記分析方法により得られたクロマトグラムデータは、多変量解析を行うため数値データに変換する必要があり、その手法として、初めにクロマトグラフィーにより観測したデータのピークの同定を行い、次に積分されたピーク面積を算出しピークリストを作成することが、一例として挙げられる。
【００３５】
超高速液体クロマトグラフィー ｍａＸｉｓTM３Ｇを用いた、胚盤胞培養液中のノルエピネフリン分析では、以下の所見を呈する。
（１）ヒト胚盤胞の培養液において、ノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、５１００ＣＰＵ前後から下回る場合、発育が良好であることを示す。
（２）ヒト胚盤胞の培養液において、ノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、２４００ＣＰＵ前後から下回る場合、その胚を移植した場合に着床及び妊娠する可能性が高いことを示す。
（３）ヒト胚盤胞の培養液において、ノルエピネフリンレベル（ピーク面積）が、８５００ＣＰＵ前後から上回る場合、発育が不良又は発育が停止していることを示し、かつ、その胚を移植した場合に着床及び妊娠する可能性が低いことを示す。
【００３６】
評価方法は、被検体を得るまでの前工程を含んでよく、被検体は直接的に分析に使用でき、又は、凍結、精製、濃縮などの前処置にかけても良い。
【００３７】
胚盤胞移植の対象は、好ましくは、妊娠することを望む女性である。
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
以下の実施例において、胚盤胞及び胚盤胞培養液は、提供者である山下湘南夢クリニックにて体外受精を実施した患者の同意のもと、施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認を受けた研究目的で使用された。
１．採卵
卵巣刺激は、クエン酸クロミフェン（ＣＣ）（商標名：Clomid、塩野義製薬株式会社 日本）と、ヒト閉経期尿性ゴナドトロピン（ＨＭＧ）（商標名：Humegon、Organon International オランダ）もしくはリコンビナント卵胞刺激ホルモン（ｒ−ＦＳＨ）（商標名：Follistim、ＭＳＤ株式会社 日本）との組み合わせを用いて行った。ＣＣは、５０ｍｇ／dayの用量を、生理開始３日目から卵成熟誘導の前日まで投与し、ＨＭＧ又はｒ−ＦＳＨの投与は、７５ＩＵの用量を、生理開始８日目から２日間おきの間隔で行った。ＨＭＧ/ｒ−ＦＳＨの投与は、患者血清中の卵胞刺激ホルモン値及びエストラジオール（卵胞ホルモン）値、エコー画像診断の結果に応じて調整した。卵成熟の最終段階には、６００μｇの性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨアナログ）（商標名：Sprecur、Aventis Pharma 日本）の投与により、内在性ゴナドトロピンを急上昇させ、ＧｎＲＨアナログ投与から３４〜３５時間後に、経腟超音波画像で確認しながら、腟から卵巣内の卵胞に穿刺して卵を吸引・回収し培養に用いた。
【００４０】
２．体外受精
採取された卵子は回復を待って、臨床的な判断を基に、標準的体外受精（ＩＶＦ）もしくは顕微授精を行った。標準的体外受精では、卵子はQuinn’s Advantage Protein Plus Cleavage Medium５０μＬ中に培養し、МII期の卵子１個につき、別途採取した１０万の精子と共培養を行った。標準的ＩＶＦでは、精子との共培養から１８〜２２時間の間に受精卵となり、ＩＶＦ又は顕微授精によって得られたヒト受精卵は、受精から２日間はQuinn’s Advantage Protein Plus Cleavage Medium ２０μＬ中で培養を行った。受精２日後から４細胞期までの間はQuinn’s Advantage Blastocyst Medium（ＢＭ）２０μＬ中で培養を行い、受精後７６〜８０時間のタイミングで上記ＢＭ培養液を半量（１０μＬ）新しい培養液と交換し、以後、受精から８０〜１７０時間までの間、同一培養液にて培養を行った。全培養工程において、３７．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２の環境にて実施した。
【００４１】
３．凍結保存
培養した胚を凍結保存する前に、形態学的評価及び育成時間による胚の評価を行った。良好に育った胚は、形態学的グレードが２から３、胚盤胞までの育成時間は平均１１２時間、凍結保存時間は平均１２１時間であった。全ての胚は、ガラス化保存法により、移植に使用するまで凍結保存された。凍結保存の段階で、通常破棄される培養液は、本評価法の解析に使用するまで１．０ｍＬのエッペンドルフチュブに入れ−３０℃で保管された。
【００４２】
４．超高速液体クロマトグラフィー解析
４−１  実施法
上記により回収され保管された培養液の被検体は、超高速液体クロマトグラフィー ｍａＸｉｓTM３Ｇにより解析された。受精から５日後で胚盤胞に発育し、凍結保存した培養液を良好胚培養液区（Ｇ区）とし、受精から７日後でも胚盤胞に発育しなかった培養液を非良好胚培養液区（ＮＧ区）とした。胚培養していないＢＭ培養液を対照区（Ｃ区）とした。超高速液体クロマトグラフィーｍａＸｉｓTM３Ｇを用いたＬＣ−Ｈｙｂｒｉｄ−ＭＳ法により、Ｇ区、ＮＧ区及びＣ区のそれぞれ２０μＬに特異的に含まれる成分の同定及び定量を行った。（図４〜７）
【００４３】
４−２  結果
Ｇ区（ｎ＝４）及びＮＧ区（ｎ＝４）からノルエピネフリンが同定され、Ｃ区では検出されなかった。Ｇ区とＮＧ区で、ノルエピネフリンの定量を行った結果、positive modeで測定したピーク面積の平均結果はＧ区；３．９７Ｅ＋４ＣＰＵ，ＮＧ区；４．４２Ｅ＋４ＣＰＵ、negative modeで測定したピーク面積の平均結果はＧ区；１．４９Ｅ＋４ＣＰＵ，ＮＧ区；２．２０Ｅ＋４ＣＰＵであった。どちらのmodeでもＮＧ区のほうがノルエピネフリンの放出量が多い傾向を示した。また、ノルエピネフリンの発現量が妊娠に及ぼす影響を調べるため、発育良好胚のうち、胚盤胞移植後に妊娠継続した区と、非妊娠区でのノルエピネフリン量の比較を行ったところ、ヒト発育良好胚３７個中２３個（６２％）、発育停止胚では７個中７個（１００％）、ノルエピネフリンが検出された。ヒト発育良好胚でのノルエピネフリン量（ピーク面積）は、平均５１０１ＣＰＵであったのに対して、発育停止胚では平均８５０２ＣＰＵであった。また、妊娠継続した区（１１例）ではノルエピネフリン量が平均１４５８．８ＣＰＵであったのに対して、非妊娠区（８例）では平均８６１２．８ＣＰＵであった（図８）。
【００４４】
５．免疫蛍光染色
５−１  実施法
ノルエピネフリンが胚盤胞において発現しているかどうかを調べるため、ノルエピネフリン合成酵素であるドーパミンβハイドロキシラーゼ（ＤＢＨ）の免疫蛍光染色を、ヒト発育良好胚と発育停止胚、マウス発育良好胚と退行胚、ラット発育良好胚において実施した。それぞれの発育停止胚と胚盤胞は、０．１％ＰＶＡを含むＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳ−ＰＶＡに２％（ｗ／ｖ）paraformaldehyde (Sigma)、０．２％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ (Sigma)をそれぞれ添加し、常温で胚盤胞を６０分間固定し、その後１０％normal goat serum (ＮＧＳ)を含むＰＢＳで、４℃で４０分間ブロックした。ＰＢＳ−ＢＳＡにＰＢＳ−ＢＳＡ：１ｓｔ antibody （ＤＢＨ）＝１００：１となるように１ｓｔ antibodyを添加し、４℃でover night （１６時間以上）インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡにＰＢＳ−ＢＳＡ：２ｎｄ antibody （Alexa 488 anti rabbit IgG）＝１００：１となるように２ｎｄ antibodyを添加し、常温で６０分間静置した。核の染色は１μＭＰＩ（propidium iodide）で行った。次にVectashield(R)（Vector Laboratories，Burlingame，ＣＡ）を用いてスライドグラスに胚をホールマウントした。スライドを共焦点レーザー顕微鏡（Laica Co，Ltd., DMI6000B，TCS-SP5）にて、ＤＢＨの発現及び局在を観察した。ＤＢＨ（Alexa 488）及びＰＩにより免疫蛍光染色した各胚盤胞及び停止胚は、共焦点レーザー顕微鏡の波長：５００〜５３５ｎｍならびに波長：５５５〜７００ｎｍにより解析した。画像は赤道面に平行に２〜５μｍ間隔で収集した。
【００４５】
５−２  結果
マウス胚盤胞の蛍光免疫染色像では、分化の低い段階では内部細胞塊優位にＤＢＨが発現しているのに対し（図９Ａ）、分化が進むにつれ栄養膜でのＤＢＨ発現が確認できた（図９Ｂ）。また、良好に発育した胚では栄養膜細胞と内部細胞塊が密接し繋がった構造であるのに対して、微分干渉像及び染色像から、マウス退行胚は、ＤＢＨを強発現する分裂停止した割球が中心部に分離した構造であった（図１０）。ラット胚盤胞の染色像では、マウス同様、分化の進んだ良好胚盤胞では内部細胞塊及び栄養膜上でのＤＢＨ発現が確認された（図１１）。ヒト発育良好胚盤胞と退行胚盤胞の染色像では、マウス・ラットでの所見同様、良好胚盤胞では内部細胞塊及び栄養膜細胞のどちらにおいても、ＤＢＨ発現が確認できるのに対して、退行胚盤胞では分裂停止した割球において強発現が確認された他、細胞外での発現も確認された（図１２）。従って、ヒトを含めた哺乳動物の胚盤胞において、良好に発育している胚盤胞であれば、分化の進む段階で栄養膜細胞にＤＢＨが発現してくるのに対し、退行胚では分裂停止した割球においてＤＢＨが強発現することが示された。
【００４６】
６．各濃度のノルエピネフリン条件下における体外受精マウス胚のin vitro培養
６−１  実施法
本実験を実施するにあたって、マウス卵母細胞の回収、体外受精及びin vitro培養を行った。雌雄のＩＣＲ系マウス（日本エスエルシー株式会社、静岡、日本）を使用し、全てのマウスは特定病原体不在の環境下において、水と市販実験用固形飼料の不断給餌と、管理された明暗環境（明環境；午前７時から午後９時）のもとで飼育された。本実施例の全ての動物実験は、麻布大学動物実験委員会により承認され、同委員会による指針に基づき行った。体外受精は、前述の手法により行った。卵母細胞採集の準備として、ＩＣＲ系メスマウスに７．５ＩＵの馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ；ＰＥＡＭＥＸ、日本全薬工業株式会社、福島、日本）を投与し、４８〜５０時間のちに７．５ＩＵのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；ノバルティスファーマ株式会社、東京、日本）を投与して、過排卵を誘導した。卵丘−卵母細胞複合体をＴＹＨ培養液に移し培養した。成熟したオスＩＣＲ系マウス尾部精巣上体より回収した精子を、ＴＹＨ培養液中に分散させ、３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキューベータで前保温した。受精前精子は、ＴＹＨ培養液中３×１０６個／ｍＬの最終濃度に調整した。体外受精後、２分割した前核を確認できた卵母細胞を、その後のin vitro培養に使用した。ＫＳＯＭ培養液中ノルエピネフリン濃度を、それぞれ０ｍＭ（コントロール）、０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭに振り分け、各条件下において受精卵を５日間培養した。全ての受精卵は、３７．５℃、５％ＣＯ２のインキュベータにて培養を行った。
【００４７】
６−２  結果
培養液中のノルエピネフリンが、受精卵の発生に著しく悪影響を及ぼすことが明らかとなった（図１３）。ノルエピネフリン無添加のコントロール培養液中で、４細胞期胚まで発生した胚は、全て胚盤胞まで発生したのに対し、０．０１ｍＭと低濃度でもノルエピネフリンが存在する条件下では、前核期胚から４細胞期胚まで育つ率（８９．５％）が、コントロール（８６．９％）よりやや高いものの、０．０１ｍＭのノルエピネフリン存在下では、４細胞期まで育った胚の約８０％しか胚盤胞まで発生しないことが示された（４１／５１＝胚盤胞数／４細胞期胚数）。更に高濃度では、より顕著な発生不良を呈し、０．０５ｍＭ以上の条件下では、受精卵が胚盤胞まで発生できないという結果を得た。各ノルエピネフリン濃度で培養された、胚盤胞の顕微鏡写真を図１４に示す。コントロール及びノルエピネフリン濃度０．０１ｍＭの培養条件では、胚盤胞を確認できたが、０．１ｍＭ及び１ｍＭの条件下では、退行胚盤胞のみが観察された。従って、受精卵から産生、分泌された内因性ノルエピネフリンのみならず、本結果が示すように、外因性ノルエピネフリンも、受精卵発生の可否を左右することが明らかとなった。これらの結果は、本発明におけるノルエピネフリンの定量が、受精卵発生の成否及び、移植胚の品質を予測する上で、重要な指標となることを裏付けるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、生殖補助医療のひとつである体外受精−胚移植療法において、既存の形態学的手法では不可能な精度で、かつ、非侵襲的に胚を評価するための新規バイオマーカーの提供が期待される他、より着床率の高い胚を選別するための技術の開発、ひいては不妊治療の患者費用負担軽減にも貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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