(57)【要約】【課題】Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ種子の抽出物とその治療適用の提供。【解決手段】脂肪の合成を阻止すること、ＰＰＡＲ−アルファを活性化すること、血糖降下活性を増大させること、体重を減少させること、高インスリン血症にならないよう空腹時血漿インスリンレベルを調整すること、およびインスリン感受性を促進し、有益な急性のインスリン分泌効果を生じさせることによって、ヒトを含む対象の治療処置のために投与することができるＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物。Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物は、特に、単離された化合物である（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）メチルエステルなどを含む。【選択図】図５
2014012723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩ３またはオレオシドジメチルエステルを含むＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を含む、ＰＰＡＲ−アルファ受容体の活性化による状態の処置において使用するための組成物。
【請求項２】
前記処置が、
（ｉ）血糖降下活性を生じさせること、
（ｉｉ）高インスリン血症にならないように空腹時血漿インスリンレベルを調整すること、
（ｉｉｉ）インスリン感受性を促進し、有益な急性のインスリン分泌効果を生じさせること、
（ｉｖ）高インスリン血症を予防すること、
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記状態が、
（ａ）メタボリックシンドローム、または
（ｂ）２型糖尿病
である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ヒトに投与されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＰＡＲ−アルファ受容体の活性化による状態の処置において使用するための医薬の製造のための、請求項１に記載のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
２型糖尿病（Ｔｙｐｅ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＤＭ−２）は、インスリンの欠乏およびインスリンの非感受性を特徴とする広く知られた全世界的な疾病である。ＤＭ−２は、高罹患率および高死亡率と関連する健康上の問題を引き起こす重大な疾病であると考えられており、米国においては主な死因の６番目である［Ｍｉｎｉｎｏら、２００７，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，５５］。糖尿病患者の数は、２０２５年までに全世界で３億人にまで増加する可能性があると予測されている［Ｋｉｎｇら、１９９８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２１，１４１４−３１］。米国では人口の７パーセント−２，０８０万人の子供および大人−が糖尿病に罹患しており［Ｆｒｅｎｃｈ，２００７，Ｉｎｓｉｄｅ，１２，４６−７］、２００２年の米国での医療費および生産性の損失は概算で１，３２０億ドルに上っている。［Ｈｏｇａｎら、２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２６，９１７−３２］。ＤＭ−２の処置方法は、インスリン、インスリン類似体または修飾インスリンの使用を含み、インスリンの放出およびインスリンの作用を亢進し、肝臓のグルコース産生を抑制し、グルコースの取り込みを抑制する［Ｍｏｌｌｅｒ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，８２１−２７］。これらの治療薬のほかに、ＤＭ−２の処置には伝統薬も世界中で用いられている。ＤＭ−２の症状を処置するため、民族薬理学的にまたは実験的に１，２００種を超す生物が用いられてきた［Ｍａｒｌｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ，１９９６，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｊ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｍｅｄ．，１，８５−１３７］。
【０００２】
米国において急速に上昇している肥満症の罹患率は深刻な公衆ｈｅａｔｈ問題であると一般に認識されている。比較すると、１９８８年〜１９９４年に実施されたＮＨＡＮＥＳ
ＩＩＩの調査に記載されているように、米国の大人人口の５５．９％が過体重であったのに対し、１９９９−２０００  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ（ＮＨＡＮＥＳ）のデータによると、ほぼ３分の２（６４．５％）が過体重となっている。同時期に、肥満症の罹患率も２２．９％から３０．５％へと劇的に増加した。肥満の人々の数が増加すると、糖尿病を含む種々の肥満症に関連した疾病を発症するリスクが高くなる恐れがある。［Ｆｌｅｇａｌら、２００２，ＪＡＭＡ．２８８，１７２３−１７２７およびＫｕｃｚｍａｒｓｋｉら、１９９４，ＪＡＭＡ．２７２，２０５−２２１］。
【０００３】
Ｏｌｅａｃｅａｅ科の植物であるＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌ．は、温帯のアジアおよびヨーロッパの国々で、慣用的に“Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｓｈ”または“Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｈ”という名称で知られている［Ｇｉｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９９３，Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  ＳＴ−２６４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ］。この植物はさらに、モロッコの南東部の地域であるＴａｆｉｌａｌｅｔ全体にわたって広く生息し、そこでは“ｌ’ｓｓａｎｅ  ｌ’ｏｕｓｆｏｕｒ”という名で知られている。Ｔａｆｉｌａｌｅｔ地域はモロッコの諸地域の中でも植物療法の知識が最も発達している所であると考えられてきた［非特許文献１］。最近の研究により、Ｆ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）は抗菌作用および抗酸化作用を有することがわかっている。ＦＥのメタノール抽出物は、定性的なα，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（α，α−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−β−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ：ＤＰＰＨ）アッセイにおいて、ＲＣ５０が１．３５×１０−２という強力な抗酸化作用を示した。ＦＥのｎ−ヘキサン抽出物およびジクロロメタン抽出物も、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む試験された８つの種のグラム陽性およびグラム陰性の病原細菌に対し、１．２５×１０−１ｍｇ／ｍＬ以内の最小発育阻止濃度（ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）値で有効であった［非特許文献２］。正常圧のラットと自然発症高血圧のラットの両方に対するＦＥの降圧効果が報告された。ＦＥの種子の水溶性抽出物を毎日経口投与すると、両方のタイプのラットにおいて、収縮期血圧の有意な低下が起こり、排尿を有意に促した［非特許文献３］。ＦＥの種子の水溶性抽出物は、正常なラットおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病の（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ：ＳＴＺ）ラットにおいて、基礎血漿インスリン濃度に影響を及ぼすことなく強力な血糖降下および抗高血糖作用を示した［非特許文献４］。腎臓のグルコース再吸収を抑制するフロリジン様の効果は、ＦＥの血糖降下の効果に対する機序の１つである可能性がある［非特許文献５］。
【０００４】
ＦＥは主としてクマリン類、セコイリドイド類、およびフェニルエタノイド類を含むと報告されている［非特許文献６］。ＦＥに含まれるセコイリドイド類はオレオシドから誘導される。このタイプのセコイリドイド類はＯｌｅａｃｅａｅ科の植物にのみ存在する［非特許文献７］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｄｄｏｕｋｓら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）８２，９７−１０３
【非特許文献２】Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．，（２００５）２，８１−６
【非特許文献３】Ｅｄｄｏｕｋｓら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００５）９９，４９−５４
【非特許文献４】Ｍａｇｈｒａｎｉら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００４）９１，３０９−１６
【非特許文献５】Ｅｄｄｏｕｋｓら、Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００４）９４，１４９−５４
【非特許文献６】ＫｏｓｔｏｖａおよびＩｏｓｓｉｆｏｖａ，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ（２００７）７８，８５−１０６
【非特許文献７】Ｅｇａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓ．Ｅｃｏｌ．，（２００４）３２，１０６９−７１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（慣用名Ａｓｈ）の種子の抽出物から単離された新規なセコイリドイド類に関する。この２つの化合物は、（１）（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）メチルエステルと同定され、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａと命名され、Ｃ２２Ｈ３２Ｏ１６（図１−１）の化学式を有するもの、および（２）（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルエステルと同定され、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂと命名され、Ｃ３０Ｈ４０Ｏ１７（図１−２）の化学式を有するものである。化合物は２つとも、環外の８，９−オレフィン官能性によって特徴づけられるオレオシド−タイプのセコイリドイドである。
【０００７】
本発明はさらに、単離されたＦＥ由来の組成物を得るプロセスに関する。組成物は独特の抽出および単離のプロセスによって得られる。種子は、溶媒が接触する表面積を増やし、抽出の効率を高めるために、すりつぶして粒子の大きさが０．１ｍｍ〜３０ｍｍの範囲の顆粒にする。このプロセスの一実施形態では、抽出の温度は２０℃〜１００℃の範囲である。好ましい実施形態では、抽出の温度は５０℃〜７０℃の範囲である。抽出プロセスに用いる溶媒混合物に対する植物原料の比は、グラム対ミリリットルの基準で１：１〜１：１０と様々である。このプロセスの一実施形態では、その比は１：３〜１：８である。植物材料が溶媒混合物と接触するインキュベーション時間は、約２時間〜約２４時間である。抽出溶媒は、水、水−アルコール混合物（水中に１％〜９９％のアルコール）、およびアルコールとすることができる。好ましいアルコールは、エタノール（ＥｔＯＨ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）である。植物材料および溶媒がインキュベートされた後、溶媒は残留した植物材料から分離され、抽出組成物は通常約１％〜３５％のＦ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒのセコイリドイド類を含む固形成分を有するようになるまで濃縮される。このセコイリドイド類は２つの新規なオレオシド−タイプの配糖体であるエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａおよびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂ、二量体のセコイリドイド類であるヌゼニド（ｎｕｚｈｅｎｉｄｅ）（３）（図１−３）、ＧＩ３（４）（図１−４）、およびＧＩ５（５）（図１−５）、ならびにリグストロシド、オレオシドジメチルエステル（６）（図１−６）、およびオレオシド−１１−メチルエステルを含む。他の成分はフェノール化合物類、サリドロシド（ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ）、クマリン類、およびフラボノイド類を含む。抽出物が完成した後、セコイリドイド類が単離される。セコイリドイド類は、クロマトグラフィーのプロセスによってＦＥ抽出物から単離することができる。
【０００８】
セコイリドイド類は、ＦＥの乾燥した粉末状の抽出物から単離される。粉末はアルコール中で溶解し、セコイリドイド類はアルコールによって粉末から抽出される。その後アルコールを蒸発させ、セコイリドイド類を含む残留物はＣ−１８逆相樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムに入れられる。種々の化合物を含む数個の分画が、一連の水および１０％のＭｅＯＨ／９０％の水、ならびにＭｅＯＨ系を用いて溶出される。分画は高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）分析によって比較され、同様のＨＰＬＣパターンを有する溶出物がまとめられる。まとめられた分画は、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離され、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、９０％、８０％のＣＨＣｌ３から始めて１００％のＭｅＯＨまでに至るＣＨＣｌ３−メタノール混合物で溶出し、数個の亜分画が得られる。亜分画はＨＰＬＣによって比較され、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａを含む分画、およびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂを含む分画が、それぞれまとめられる。まとめられた分画は、Ｃ−１８樹脂、ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ樹脂および／またはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０樹脂によるカラムクロマトグラフィーの組合せによってさらに精製され、純粋なエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａおよびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂが得られる。
【０００９】
エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａおよびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂの新規な化学構造が、核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）、紫外（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ：ＵＶ）、赤外（ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＩＲ）を含む分光法、および質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＭＳ）を用いて解明され、物理的性質も判定される。セコイリドイド類の既知の化学構造は、ＮＭＲスペクトルを文献に記載されているＮＭＲスペクトルと直接比較することによって同定されている。ＩＲスペクトルはＫＢｒ板を用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  １６００  ＦＴＩＲ分光光度計に記録した。ＮＭＲスペクトルは溶媒として重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いてＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ４００で得た。全ての２次元相関スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲソフトウェアの標準的な勾配パルスシーケンスを用いて得られた。相関スペクトルは、ＣＯＳＹ（相関分光法：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＴＣＯＳＹ（全相関分光法：Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＨＭＱＣ（異核間多量子コヒーレンス：Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＨＭＢＣ（異核間多結合相関：Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、およびＲＯＥＳＹ（回転座標系オーバーハウザー効果分光法：Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を含む。ＨＰＬＣ分析は、クォータナリポンプ、オートサンプラ、４チャンネルオンラインデガッサ、フォトダイオードアレイ検出器、およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００モデルＨＰＬＣシステムを用いて実施した。分子量はＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計のＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ／ＡＰＣＩモードを用いて測定した。ＵＶスペクトルはＳｃｈｉｍａｄｚｕのＵＶ−１７００紫外可視分光光度計で得た。
【００１０】
本発明はさらに、２種の二量体のセコイリドイド、すなわちＧＩ５（５）およびヌゼニド（３）の、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する抑制効果に関する。体重増加の主な原因は脂肪生成のプロセスによる体内の脂肪組織の堆積である。脂肪生成は、脂肪細胞の数および大きさの増加によって特徴づけられる。脂肪細胞の合成を抑えて脂肪生成を抑制し、脂肪細胞の数および大きさを減少させると、体重の調整につながる。
【００１１】
本発明は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）ならびにＦＥから単離されたセコイリドイド類であるオレオシドジメチルエステル（６）、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａ（１）およびＧＩ３（４）によるＰＰＡＲ−アルファの活性化に関する。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＰＡＲｓ）は、多くの細胞プロセスおよび代謝プロセスを調整する核内受容体である。ＰＰＡＲ−アルファは大部分が肝臓内に発現し、肝臓では脂肪酸の酸化の調整において重要な役割を有している［Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．，２１，１９３−２３０］。ＰＰＡＲ−アルファの活性化による脂肪酸の酸化の誘導によって、血漿脂質プロファイルが改善される。種々のマウスモデルでは、ＰＰＡＲ−アルファアゴニストは血漿トリグリセリドを低下させ、脂肪症を減少させ、肝臓および筋肉のｓｔｅａｏｓｉｓを改善し、その結果、インスリン感受性を改善し、血中グルコースを減少させる［Ｇｕｅｒｒｅ−Ｍｉｌｌｏら、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１６６３８−４２およびＫｉｍら、２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２，１７７０−８］。
【００１２】
本発明はさらに、ＤＭ−２に罹患している対象の血糖を減少させ、体重の減少を助け、インスリンレベルをバランスしてＤＭ−２患者の高インスリン血症、すなわちインスリン抵抗性による症状を予防して、メタボリックシンドロームを処置するのに有用である上記組成物に関する。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは高脂肪食を与えられると、肥満症、高血糖症、および高インスリン血症を発症する。有効な量のＦＥを投与することで、大幅に、マウスのグルコース値を低下させ、体重および体脂肪を減少させ、血漿インスリンレベルを低下させることができる。
【００１３】
ヒト臨床試験において、１６名の空腹の健康なボランティアに５０グラムのグルコースを与えて食後の血糖を誘導し、ＦＥまたはプラセボ（コムギフスマ）を投与した。ＦＥ抽出物グループは、プラセボと比較して、上昇食後血漿グルコース濃度が低かった。このグループは統計的に（Ｐ＝０．０２）血糖曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）が小さかった。ＦＥの種子の抽出物はさらに、グルコース投与の９０分後に有意な（Ｐ＝０．００２）インスリンの分泌を誘導した。
【００１４】
本発明のさらなる特色、利点および特徴は、添付の図面を参照してなされた以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な記述に鑑みれば当業者には明らかになるであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
重量で約１％〜約１５％のヌゼニドと、
重量で約１％〜約１７％のＧＩ３と、
重量で約０．５％〜約１％のオレオシドメチルエステルと、
重量で約０．０３％〜約０．１２％のエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂと、
重量で約０．１％〜約１．７％のＧＩ５と、
重量で約０．０８％〜約０．７％のサリドロシドと
を含むＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物。
（項目２）
（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）メチルエステルの単離された化合物。
（項目３）
（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルエステルの単離された化合物。
（項目４）
Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって対象を治療処置する方法。
（項目５）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって脂肪の合成を阻止する方法。
（項目６）
前記Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物がＧＩ５を含む項目５に記載の方法。
（項目７）
前記Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物がヌゼニドを含む項目５に記載の方法。
（項目８）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによってＰＰＡＲ−アルファを活性化する方法。
（項目９）
前記Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物がＧＩ３である項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物がオレオシドジメチルエステルである項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物がエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａである項目８に記載の方法。
（項目１２）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって血糖降下活性を生じさせる方法。
（項目１３）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって体重を減少させる方法。
（項目１４）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって体脂肪を減少させる方法。
（項目１５）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって、高インスリン血症にならないように空腹時血漿インスリンレベルを調整するための方法。
（項目１６）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによってインスリン感受性を促進し、有益な急性のインスリン分泌効果を生じさせるための方法。
（項目１７）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによってメタボリックシンドロームを処置するための方法。
（項目１８）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって２型糖尿病を処置するための方法。
（項目１９）
対象を処置するのに有効な量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物を投与することによって高インスリン血症を予防するための方法。
（項目２０）
前記対象がヒトである項目４、５、８、または１２〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子をすりつぶして粒子にするステップと、
すりつぶした該粒子を溶媒混合物に接触させるステップと、
該溶媒混合物からすりつぶした該粒子を分離するステップと、
アルコール中で粉末を溶解するステップと、
該アルコールを蒸発させるステップと、
を含むプロセスによって、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子からセコイリドイドを抽出し、単離する方法。
（項目２２）
すりつぶした前記粒子が約０．１ｍｍ〜３０ｍｍの直径を有する項目２１に記載の方法。
（項目２３）
抽出の温度が２０℃〜１００℃である項目２１に記載の方法。
（項目２４）
抽出の温度が５０℃〜７０℃である項目２１に記載の方法。
（項目２５）
すりつぶした粒子  対  溶媒混合物の比が約１グラム対１ミリリットルから約１グラム対１０ミリリットルである項目２１に記載の方法。
（項目２６）
すりつぶした粒子  対  溶媒混合物の比が約１グラム対３ミリリットルから約１グラム対８ミリリットルである項目２１に記載の方法。
（項目２７）
すりつぶした前記粒子が前記溶媒混合物に約２時間〜約２４時間接触する項目２１に記載の方法。
（項目２８）
前記溶媒混合物が水、水−アルコール混合物、またはアルコールである項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記溶媒混合物がエタノールを含む項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記溶媒混合物がメタノールを含む項目２１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａの分子構造を図示する。
【図１−２】エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂの分子構造を図示する。
【図１−３】ヌゼニドの分子構造を図示する。
【図１−４】ＧＩ３の分子構造を図示する。
【図１−５】ＧＩ５の分子構造を図示する。
【図１−６】オレオシドジメチルエステルの分子構造を図示する。
【図２】１無処置、２、インスリン、３インスリンおよびＭｅＯＨ、４濃度０．００４％、０．０２％、０．０５％、および０．１％のヌゼニド、５濃度０．００４％、０．０２％、０．０５％、および０．１％のＧＩ５について、化合物ＧＩ５（５）およびヌゼニド（３）のグルコースの取り込み作用（ｃｐｍ）を図示する。
【図３】ＤＭＳＯ（対照条件）の効果との比較における、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌ．の種子の抽出物および１００μＭのフェノフィブラート（陽性対照）によるＧＡＬ４／ＰＰＡＲα融合受容体の相対的活性化を図示する（値は平均±ＳＤ（ｎ＝４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図４】低脂肪（ｌｏｗ−ｆａｔ：ＬＦ）処置、高脂肪（ｈｉｇｈ−ｆａｔ：ＨＦ）処置、およびＦｒａｘｉｎｕｓ（ＨＦ＋ＦＥ抽出物）処置されたマウスの、１６週間の処置後の空腹時血糖（ｍｇ／ｄＬ）の結果を図示する。
【図５】低脂肪（ＬＦ）処置、高脂肪（ＨＦ）処置、およびＦｒａｘｉｎｕｓ（ＨＦ＋ＦＥ抽出物）処置されたマウスの、処置の様々な週における平均体重（ｇ）の結果を図示する。
【図６】１０−５Ｍ〜１０−９Ｍの範囲の濃度での選択的合成ＰＰＡＲαアクチベーターＷＹ１４，６４３、ならびに、濃度１０−４Ｍおよび１：１０のＦＥの種子の抽出物の水溶液として、単離された化合物を用いたときの、受容体細胞株内での相対的なＰＰＡＲαの活性化能（％）を図示する。化合物のラベルは以下の通りである。ＦＥ１９０２８（ヌゼニド、３）、ＦＥ２００１５（ＧＩ３、４）、ＦＥ２００３１（オレオシドジメチルエステル、６）、ＦＥ２１００８（エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａ、１）、およびＦＥ２１０２３（ＧＩ５、５）。
【図７】ＬＦ（ｎ＝１０）グループ、ＨＦ（ｎ＝１０）グループ、およびＦＥの種子の抽出物グループの個々のマウスの大網脂肪の重量（ｇ）をそれぞれ図示する。
【図８】ＬＦ（ｎ＝１０）グループ、ＨＦ（ｎ＝１０）グループ、およびＦＥの種子の抽出物グループの個々のマウスの後腹膜脂肪の重量（ｇ）をそれぞれ図示する。
【図９】ＬＦ（ｎ＝１０）グループ、ＨＦ（ｎ＝１０）グループ、およびＦＥの種子の抽出物グループの個々のマウスの空腹時血漿インスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ図示する。
【図１０】図１０Ａは、５０ｇのグルコースを投与した健康なボランティアの血糖について、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌの種子の抽出物（ＦＥ）（１．０ｇ）と、対応するコムギフスマプラセボ（１．０ｇ）との比較（ｍｍｏｌ／Ｌ対時間）を図示し、個々の時点における上昇血糖を示す。値は平均±ＳＥＭで示す。対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１６）を用いた。図１０Ｂは、５０ｇのグルコースを投与した健康なボランティアの血糖について、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌの種子の抽出物（ＦＥ）（１．０ｇ）と、対応するコムギフスマプラセボ（１．０ｇ）との比較（ｍｍｏｌ／Ｌ対時間）を図示し、血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。値は平均±ＳＥＭで示す。＊Ｐ＝０．０２。対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１６）を用いた。
【図１１】図１１Ａは、５０ｇのグルコースを投与した健康なボランティアのインスリンレベルについて、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌの種子の抽出物（１．０ｇ）と、対応するコムギフスマプラセボ（１．０ｇ）との比較（ｍＵ／Ｌ対時間）を図示し、個々の時点における上昇血中インスリンを示す。値は平均±ＳＥＭで示す。＊＊Ｐ＝０．００２。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１６）を用いた。図１１Ｂは、５０ｇのグルコースを投与した健康なボランティアのインスリンレベルについて、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｌの種子の抽出物（１．０ｇ）と、対応するコムギフスマプラセボ（１．０ｇ）との比較（ｍＵ／Ｌ対時間）を図示し、血中インスリンの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。値は平均±ＳＥＭで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１６）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図面および以下の実施例に関して、Ｆｒａｎｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物についての本発明の好ましい実施形態がここで記載される。
【００１７】
（実施例１）
水を用いたＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒからのセコイリドイド類の抽出。合計２．５ｋｇのＦ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子を空気中で乾燥し、その後すりつぶして粒子の大きさが約１〜２ｍｍの粗い粉末にした。この粗い粉末を抽出器内の水中に８０〜９０℃で５時間浸漬し、水抽出物を抽出器から抜き取った。この抽出プロセスを３回繰り返した。水抽出物を全て一緒にまとめてロータリー真空エバポレーター内で濃縮した。水を蒸発させた後に、合計５５０グラムの乾燥した粉末状の抽出物が得られた。ＨＰＬＣ分析によると、この粉末状の抽出物は主なセコイリドイド類として２つ、すなわち１１．４％（重量／重量）のヌゼニドおよび６．２％のＧＩ３を含んでいたことを示している。この組成物はさらに０．１９％のオレオシド−１１−メチルエステル、０．４１％のエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂ、０．６３％のＧＩ５、０．２％のサリドロシド、それに加えて量の少ないセコイリドイド類として数種、たとえばリグストロシド、オレオシドジメチルエステル、およびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａなどを含んでいた。
【００１８】
（実施例２）
水、水−ＥｔＯＨ、およびＥｔＯＨを用いたＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒからのセコイリドイド類の抽出。５つの試料を調製し、各試料に５グラムのＦ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子を含めた。各試料を粉砕して粉末にし、それぞれを２００ｍＬずつの水、２５％のＥｔＯＨ／７５％の水、５０％のＥｔＯＨ／５０％の水、７５％のＥｔＯＨ／２５％の水、およびＥｔＯＨで溶媒抽出した。室温で（２２〜２４℃）２４時間抽出した後、溶媒を蒸発させて残留固形物をＨＰＬＣで分析した。セコイリドイドの内容およびサリドロシドが表１に記載されている。
【００１９】
【表１】
2014012723.tif 000003
（実施例３）
Ｆ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒからのセコイリドイド類の単離。３．５リットルのメタノールを加えて、これを実施例１で示した手順で得られた５００グラムの粉末状の抽出物と、室温で３時間混合した。濾過プロセスでメタノール溶液を粉末から分離した。同じプロセスをもう１度繰り返し、２つのメタノール抽出物をまとめて減圧下で濃縮し、合計で５４グラムの乾燥したメタノール抽出物を得た。このメタノール抽出物を水中で再溶解し、濾過して非水溶性の物質を取り除いた。濾液にはさらに、水、および水中に１０％のＭｅＯＨから１００％のＭｅＯＨまでの勾配のあるＭｅＯＨ−水溶媒系を加えたＣ−１８樹脂による逆相カラムクロマトグラフィー分離を実施した。合計７つの分画を採取した。カラムから溶出した各分画を真空下で蒸発させ、ＨＰＬＣ分析によってまとめた。分画２、３および７をシリカゲル樹脂で充填したクロマトグラフィーカラムに入れ、ＣＨＣｌ３から始めて、１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、２０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、１００％のＭｅＯＨに至るまでのクロロホルム−メタノール系で溶出した。シリカゲルカラムから採取した分画をＨＰＬＣ分析で比較し、分離した各溶出液にＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ樹脂および／またはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０樹脂によるカラムクロマトグラフィーを繰り返し実施し、１つの純粋な化合物が得られるまで水−メタノール系で溶出した。２つの新規な化合物、すなわちエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａおよびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂを、数個の既知の化合物、すなわちヌゼニド、ＧＩ３、ＧＩ５、リグストロシド、オレオシドジメチルエステル、オレオシド−１１−メチルエステル、およびサリドロシドとともに発見した。その化学構造を全て、分光法によって解明した。
【００２０】
（実施例４）
エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａおよびエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂの構造の解明。エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａ（１）は非晶質粉末として得られた。その分子式Ｃ２２Ｈ３２Ｏ１６はそのＭＳに基づいて判定し、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータ（表２）によって確証した。ＵＶスペクトルは、カルボニル基とコンジュゲートしたイリドイドのエノールエーテル系に由来する２３２（ｓｈ）ｎｍでの標準的な吸収を示した。ＩＲスペクトルは、ｖｍａｘ３４０１ｃｍ−１でヒドロキシル基、１７３４、１７１７ｃｍ−１でエステル基、１６２６ｃｍ−１でα，β−不飽和エステル基の諸官能基を示した。その１Ｈ，１３Ｃ−ＮＭＲの詳細な分析および２次元相関スペクトルはエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａがオレオシド−タイプのセコイリドイド配糖体成分を有していることを示し、このことはδＨ７．５１（ｓ，Ｈ−３）、５．９３（ｓ，Ｈ−１）、６．０８（ｑｄ，Ｊ＝７．２，０．８Ｈｚ，Ｈ−８）、１．７２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ３−１０）および４．８０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１’）でのプロトンシグナル、δＣ１５５．２（Ｃ−３）、９４．８（Ｃ−１）、１２４．７（Ｃ−８）、１３．６（Ｃ−１０）および１００．５（Ｃ−１’）での対応する炭素１３シグナルによって裏付けられた。δＨ３．６２（ＯＣＨ３，δＣ５１．９）および３．７０（ＯＣＨ３，δＣ５２．３）での２つのメトキシルシグナルは、それぞれｇＨＭＢＣスペクトルにおけるＣ−７（δＣ１７３．７）およびＣ−１１（δＣ１６８．６）と相関を示し、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａが７，１１−オレオシドジメチルエステルを１ユニット有することを意味する［Ｂｏｒｏｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｍｉｔｚ，１９９１，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５４，１１７３−２４６］。このほか、β−グルコピラノシル成分によるさらなるＮＭＲシグナルの発生（δＣ１００．６，７７．６，７７．８，７１．６，７５．３および７０．１）は、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａが、別のグルコシルを有する７，１１−オレオシドジメチルエステルであることを示唆した。このグルコシルの位置はオレオシド成分のＣ−６’で付着していると判定した。同じ位置の７，１１−ジメチルオレオシドのシグナルを有するエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａと比較したとき、Ｃ−６’でシグナルが７．５ｐｐｍ低磁場シフト、ならびにＣ−３’およびＣ−５’でそれぞれ０．５ｐｐｍおよび２．６ｐｐｍ高磁場シフトしたためである。この推論はｇＨＭＢＣ相関スペクトルによってさらに裏付けられた。ｇＨＭＢＣ相関スペクトルでは、δＨ４．３５ｐｐｍでＨ−１’’’とδＣ７０．１ｐｐｍでＣ−６’との間、およびＨ−６’（δＨ４．１５および３．８４ｐｐｍ）とＣ−１’’’（δＣ１０５．３ｐｐｍ）との間にクロスピークが観察された。メチル基は８，９−オレフィン結合でＥ−配置に位置し、Ｈ−１０（δＨ１．７２）とＨ−５（δＨ３．９６）との間に強い相関が観察されたＲＯＥＳＹスペクトルによって裏付けられた。この同じスペクトルにおいて、Ｈ−１（δＨ５．９３）とＨ−６（δ２．５１）との間の相関は、Ｃ−１でのグルコシルがβ−配置をとっていることを示した。これをも��にして、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａの構造を（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）メチルエステルと判定し、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａと命名した。完全な１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータの帰属を表２に示す。
【００２１】
エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂ（２）は無色の非晶質粉末として単離された。その分子式はＭＳによってＣ３０Ｈ４０Ｏ１７と判定し、ＮＭＲデータによって確証した。２のＵＶスペクトルにおいて、カルボニル基とコンジュゲートしたイリドイドのエノールエーテルの２３０ｎｍでの標準的な吸収に加えて、２７５ｎｍおよび２８３ｎｍでのさらなる吸収によってフェノールの存在が示された。ＩＲはｖｍａｘ３４００ｃｍ−１でヒドロキシル、１７０１ｃｍ−１、１６３６ｃｍ−１でα，β−不飽和エステル、および１５１８ｃｍ−１で芳香環を示した。エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂの１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃスペクトルは、オレオシド成分による標準的なシグナルを示した。すなわちδＨ７．５０（ｓ，Ｈ−３）、δＣ１５５．２（Ｃ−３）でのオレフィンシグナル、δＨ５．９４（ｓ，Ｈ−１）、δＣ９４．７（Ｃ−１）でのアリルアセタール、δＨ４．８２（ｄ，Ｈ−１’）、δＣ１００．３（Ｃ−１’）でのグルコシルによるアノマーのシグナル、δＨ６．０５（ｄ，Ｈ−８）、δＣ１２４．８（Ｃ−８）でのエチリデン基によるオレフィンプロトン、およびδＨ１．６１（ｄ，Ｈ３−１０）、δＣ１３．６（Ｃ−１０）でのエチリデンによるメチルである。フェニルエタノイドシグナルならびにδＨ６．７１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ）およびδＨ７．０２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ）での芳香環内のＡＡ’ＢＢ’スピン系が観察されたことにより、パラ置換型のフェニルエタノイドであることがわかった。ｇＨＭＢＣにおいてδＨ４．２６ｐｐｍでのＨ−１’’とδＣ６７．０ｐｐｍでのＣ−７との間に長距離の１Ｈ−１３Ｃ相関が見られたことで、フェニルエタノールはＣ−７の位置で付着していることがわかり、このことはエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂの構造をリグストロシド、ｐ−ヒドロキシフェニルエタノールメチルオレオシドエステルに関連づけた［Ｔａｋｅｎａｋａら、２０００，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５，２７５−８４］。エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａと同様に、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂ内では明らかなさらなるβ−グルコピラノシルのユニットがＣ−６’で付着していることがわかった。このことは、リグストロシドの磁場との比較において、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）ＢのＣ−６’でのＣ−１３シグナルによる７．３ｐｐｍの低磁場化学シフト、ならびにＣ−３’およびＣ−５’での、それぞれ０．７ｐｐｍおよび２．９ｐｐｍの高磁場シフトによって確証された。このような結合のさらなる確証は、δＨ４．３１（Ｈ−１’’’およびδＣ７０．１（Ｃ−６’）でのグルコシルによるアノマーのシグナル間の強い相関のｇＨＭＢＣスペクトルにおいて観察された。ｇＨＭＢＣスペクトルにおいてδＨ３．６９（ＯＣＨ３）およびδＣ１６８．７（Ｃ−１１）でのシグナルに長距離相関のクロスピークが観察されたため、メチル基の位置をＣ−１１に割り当てた。こうして化合物エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂを（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）２Ｈ−ピラン−４−酢酸−３−エチリデン−２−［（６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−３，４−ジヒドロ−５−（メトキシカルボニル）２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルエステルとして指定し、エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ｂと命名した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータの帰属を表２に示す。
【００２２】
【表２−１】
2014012723.tif 000004
【００２３】
【表２−２】
2014012723.tif 000005
化学シフトδは標準試料としてのテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ：ＴＭＳ）に対する百万分率（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ：ｐｐｍ）で表している。シグナルの多重度は、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ：ｓ）、ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ：ｄ）、トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ：ｔ）、カルテット（ｑｕａｒｔｅｔ：ｑ）、ダブルダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ：ｄｄ）、ダブルカルテット（ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｑｕａｒｔｅｔ：ｄｑ）、およびマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ：ｍ）として報告している。括弧内の結合定数はＨｚで表している。ＮＭＲスペクトルを得るために用いた溶媒はＣＤ３ＯＤである。
【００２４】
（実施例５）
未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞に対するＧＩ５（５）およびヌゼニド（３）の抑制効果。体重増加の主な原因は脂肪生成のプロセスによる体内の脂肪組織の堆積である。脂肪生成は、脂肪細胞の大きさおよび数の増加によって特徴づけられる。Ｆ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒから単離したセコイリドイド類であるＧＩ５およびヌゼニドは、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞から分化した脂肪細胞への経路を遮断することによって、かなりの、および穏やかな脂肪生成の抑制作用をそれぞれ示し、体重の調整および体脂肪の減少に対する効果を発揮した。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化を、メチルイソブチルキサンシン、デキサメタゾン、およびインスリン（ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ：ＭＤＩ）ホルモンカクテルを用いて、化合物含有または不含で誘導した。分化誘導の１０日後に、処置した細胞に対して、それぞれのグルコースの取り込み作用についてのアッセイを実施した。これは分化（脂肪生成）の間接的な測定となる。なぜなら、前脂肪細胞はインスリンに誘導されたグルコース輸送−４（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ−４：ＧＬＵＴ４）仲介によるグルコースの取り込みができないのに対して、完全に分化した脂肪細胞はこの取り込みができるからである。化合物ＧＩ５およびヌゼニドは、４つの異なる濃度で用いた。すなわち０．００４％、０．０２％、０．０５％、および０．１％である。無処置の（未分化の）細胞を陰性対照として用い、一方インスリンを陽性対照として用いた。化合物の溶媒であるメタノール（ＭｅＯＨ）を対照として用いた。結果は、Ｆ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒから単離したＧＩ５およびヌゼニドは、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞から分化した脂肪細胞への経路を遮断することによって、かなりの、および穏やかな脂肪生成の抑制作用をそれぞれ有し、体重の調整および体脂肪の減少に対する効果を発揮することを示した（図２を参照）。
【００２５】
（実施例６）
Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒのＰＰＡＲ−アルファの活性化。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲｓ）は、多くの細胞プロセスおよび代謝プロセスを調整する核内受容体である。ＰＰＡＲ−アルファは大部分が肝臓内に発現し、肝臓では脂肪酸の酸化の調整において重要な役割を有している（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．，２１，１９３−２３０）。ＰＰＡＲ−アルファの活性化による脂肪酸の酸化の誘導によって、血漿脂質プロファイルが改善される。種々のマウスモデルでは、ＰＰＡＲ−アルファアゴニストは血漿トリグリセリドを低下させ、脂肪症を減少させ、肝臓および筋肉のｓｔｅａｏｓｉｓを改善し、その結果、インスリン感受性を改善し、血中グルコースを減少させる［Ｇｕｅｒｒｅ−Ｍｉｌｌｏら、２０００，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１６６３８−４２およびＫｉｍら、２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２，１７７０−８］。
【００２６】
実施例２に記載した溶媒として水を用いることによって得られたＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒの種子の抽出物（ＦＥ抽出物）が、ＰＰＡＲ−アルファを活性化することを実証した。ＤＭＳＯ（対照条件）との比較におけるＦＥ抽出物およびフェノフィブラート（陽性対照）によるＰＰＡＲ−アルファの相対的な活性化を、ＧＡＬ４／ＰＰＡＲ−アルファ受容体をトランスフェクトした細胞とともにインキュベーションした後の活性化合物から得られたルシフェラーゼ（遺伝子レポーター）の発光シグナルとして算出した。最初に、ＣＯＳ−７細胞（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養）に融合タンパク質ＧＡＬ４／ＰＰＡＲ−アルファおよびルシフェラーゼを有するＤＮＡ構築物を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションでは、まず、ＧＡＬ４（酵母転写因子）のＤＮＡ結合部位の５つのコピーをｐＴＫ−ｐＧＬ３プラスミドのチミジンキナーゼプロモーターの前に挿入することによってプラスミドｐＧＡＬ５−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。その後、ｈＰＰＡＲ−アルファＤＥＦドメイン（ａａ１８０−４６４）をＰＣＲ増幅することによって、プラスミドｐＧＡＬ４−ｈＰＰＡＲ−アルファを構築した。得られたＰＣＲ産物をｐＢＤ−ＧＡＬ４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）でクローン化し、引き続いてキメラをｐＣＤＮＡ３ベクターにサブクローン化した。トランスフェクションした後、ＣＯＳ−７細胞を０μｇ／ｍＬ（対照条件）、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、および１，０００μｇ／ｍＬのＦＥ抽出物、または１００μＭのフェノフィブラート（陽性対照）で２４時間インキュベートした。溶媒としてＤＭＳＯを用いた。インキュベーションの後、細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイを実施した。ＦＥ抽出物およびフェノフィブラートによるＰＰＡＲ−アルファの活性化はルシフェラーゼの発現およびそれによって生じる発光シグナルの増大という結果をもたらした。これはＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｅｃａｎ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定した。結果は、対照（ＤＭＳＯ）の発光作用との比較におけるＦＥ抽出物およびフェノフィブラートの結果として、発した発光のシグナルに比例するＧＡＬ４／ＰＰＡＲ−アルファの相対的な活性化として表した。結果は各試験につき４回の試行の平均±ＳＤで報告している（図３）。グループ間の差異はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ＸＬＳＴＡＴ２００８，Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ（商標），ＵＳＡ）を用いて算出した。ＦＥ抽出物によるＰＰＡＲ−アルファの活性化の結果は図３に示されている。ＦＥ抽出物は１．０００μｇ／ｍＬで１８％のＰＰＡＲ−アルファの活性化を達成した。この結果は、基準化合物として用いたＰＰＡＲ−アルファのアクチベーターであるフェノフィブラートに対するパーセンテージで表したものである。
【００２７】
ＰＰＡＲ−アルファを活性化するＦＥ抽出物の能力によって、動物実験で観察された血糖低下の効果をある程度説明することができるであろう。
【００２８】
（実施例７）
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＦＥ抽出物の血糖降下活性（ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３つのグループに分けた。すなわち１）陰性対照グループで、２０匹のオスのマウスに１日当たりの摂取量が約１０ｋｃａｌの低脂肪食（ＬＦ）を与えた；２）陽性対照グループで、２０匹のマウスに１日当たりの摂取量が約６０ｋｃａｌの高脂肪食（ＨＦ）を与えた。高脂肪給餌が原因で、このマウスのグループは肥満症、高血糖症、および高インスリン血症を発症した；３）０．５％のＦＥ抽出物グループで、１０匹のオスのマウスにグループ２のマウスと同じく高脂肪食を与えたが、その餌にはさらに０．５％のＦＥ抽出物を混合した。食物および液体の摂取量ならびに体重を毎週測定した。異常および場合によってはあり得る毒性の兆候をモニターした。血液を尾静脈から試料採取し、血糖測定器を用いて空腹時血糖値を測定した。基礎データを実験前に測定した。３つのグループの間に統計的な差異はなかった。
【００２９】
１６週間の処置の後、ＦＥ抽出物で処置したグループのマウスは、高脂肪対照グループのマウスより空腹時血糖値が有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これにより、ＦＥ抽出物の強力な血糖降下の効果が示された（図４）。
【００３０】
（実施例８）
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＦＥ抽出物による体重減少作用。実施例７と同じグループの個々のマウスの体重を測定した。基礎体重について、３つのグループの間に統計的な差異はなかった。１６週間の処置の後、高脂肪の処置をしたグループ（グループ２および３）のマウスは全て、低脂肪の処置をしたグループのマウスより有意に体重が増えた。しかしＦＥグループの体重増加の程度は陽性対照グループと比較して非常に低く、このことは体重の調整に対するＦＥ抽出物の作用を示すものである（図５）。
【００３１】
（実施例９）
エクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａ（１）、ＧＩ３（４）、およびオレオシドジメチルエステル（６）によるＰＰＡＲ−アルファの活性。ＰＰＡＲ−アルファの活性について、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）の種子の水抽出物から単離された５種の単一化合物を試験した。このアッセイでは合成の選択的なＰＰＡＲアルファアクチベーターであるＷＹ１４，６４３を陽性対照とし、これらの化合物を溶解するために用いたＤＭＳＯを陰性対照とした。５つの純粋なセコイリドイドは濃度１０−４Ｍである程度有効であった。化合物のエクセルシド（ｅｘｃｅｌｓｉｄｅ）Ａ、オレオシドジメチルエステルおよびＧＩ３では良好な活性を示した（図６）。
【００３２】
（実施例１０）
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）の種子の抽出物による脂肪の減少。１６週間の処置の後、実験の終了時（実施例７からの）に、全てのグループのマウスを麻酔して屠殺した。個々のマウスの大網脂肪および後腹膜脂肪を採取し重量を測定した。結果によると、ＦＥの種子の抽出物は大網脂肪の増加を１８．３％、後腹膜脂肪の増加を１７．８％、それぞれ減少させた（図７および８）。
【００３３】
（実施例１１）
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）の種子の抽出物による空腹時血漿インスリンレベルの低減。実験の終了時（実施例７からの）に、マウスＥｌｉｓａキットを用いて空腹時血漿インスリンレベルを測定した。Ｆｒａｘｉｎｕｓの種子の抽出物で処置したマウスは高脂肪対照グループのマウスの値と比較して空腹時血漿インスリンレベルが有意に低かった。（Ｐ＜０．０５）（図９）。
【００３４】
（実施例１２）
ヒトにおけるＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）の種子の抽出物の血糖低下作用。ヒトにおける本発明の組成物の効果を評価するために、無作為、二重盲検、プラセボ対照、かつクロスオーバーデザインの試験をヒトに対して実施した。合計１６名の健康な個体（男性１１名および女性５名）をインドで採用した。対象には、年齢が２５〜５５歳であること、ボディ・マス・インデックスが２６±２．２ｋｇ／ｍ２であること、空腹時血糖が４．４±０．０９ｍｍｏｌ／Ｌであることを条件とした。ＦＥの種子の抽出物を処置グループに用い、コムギフスマの粉末をプラセボグループに用いた。この試験において１人１日当たりの投与量はＦＥの種子の抽出物１ｇとした。対象には、血糖反応の評価のためのグルコースチャレンジ（１００ｍＬの水中に５０ｇ）の前に、２カプセルのＦＥの種子の抽出物（各５００ｍｇ）、または２カプセルのプラセボ（各５００ｍｇのコムギフスマ）のどちらか一方を経口の単回投与で摂取するように指示した。１週間のウォッシュアウト期間の後、この２つのグループを交換した。試験期間中、指穿刺による血液試料を、０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分および１２０分の時点で採取した。試験用の抽出物／プラセボは、空腹時の血液を採取した後０分で速やかに１００ｍＬの水で与えた。その後対象は５〜８分以内にグルコース飲料を摂取した（１００ｍＬの水中に５０ｇ、Ｄ−グルコース、Ｑｕａｌｉｇｅｎｓ  Ｃｏ．，Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｄｉａ）。この時点でタイマーをスタートさせた。追加の指穿刺による血液試料を、グルコース飲料の摂取から１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後および１２０分後に採取した。グルコース濃度はＢａｙｅｒのｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒおよびＥｓｓｅｎｔｉａのｇｌｕｃｏｔｒｉｐを用いて毛細血管中の全血液中で測定した。プラセボグループとＦＥで処置したグループの両方について、種々の時間間隔での血糖濃度に対して正上昇（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。グループ間の有意差は、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いて算出した。分析はＸＬＳＴＡＴ２００８ソフトウェア（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ（商標）、ＵＳＡ）を用いて実施した。統計的な有意性はＰ＜０．０５に設定した。全てのデータは平均±ＳＥＭで報告している。
【００３５】
上昇血糖のグラフを対比較すると、１５分（２．０±０．２６ｍｍｏｌ／Ｌ対１．７±０．２１ｍｍｏｌ／Ｌ）から、３０分（４．０±０．４１ｍｍｏｌ／Ｌ対３．７±０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ）、４５分（４．２±０．４１ｍｍｏｌ／Ｌ対３．７±０．４７ｍｍｏｌ／Ｌ）、６０分（３．４±０．４６ｍｍｏｌ／Ｌ対３．４±０．４１）、９０分（１．８±０．３８ｍｍｏｌ／Ｌ対１．６±０．３１ｍｍｏｌ／Ｌ）、１２０分（０．５８±０．２９ｍｍｏｌ／Ｌ対０．２１±０．２７ｍｍｏｌ／Ｌ）に至るまでの実験時間の間、対応するコムギフスマプラセボと比較してＦＥの種子の抽出物による食後のグルコース値が低いことがわかった。（図１０Ａ）。対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、平均ＡＵＣについての、処置（ＦＥ対プラセボ）の効果における差異（２９９．８±２８．８ｍｉｎ．ｍｍｏｌ／Ｌ対２７３．２±２５．２ｍｉｎ．ｍｍｏｌ／Ｌ）は統計的に有意である（Ｐ＝０．０２）ことが示された。結果は図１０Ｂに記載している。
【００３６】
（実施例１３）
ヒトに対するＦｒａｘｉｎｕｓ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ（ＦＥ）の種子の抽出物の急性のインスリン分泌効果。この組成物のインスリン分泌効果を、実施例１２に記載した臨床試験のさらなる目的として評価した。ＦＥ／プラセボ試験における０分、３０分、６０、９０分および１２０分の時点で、処置した健康な対象の静脈の血液の試料（７〜８ｍＬ）を採取して血清分離管に入れた。血液は１５分放置して凝固させ、その後１０分間１，５００×ｇで遠心分離した。その後、得られた血清で、電気化学発光免疫測定法（ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＣＬＩＡ）を用いてインスリンを分析した。プラセボで処置されたグループおよびＦＥで処置されたグループの両方について種々の時間間隔でのインスリンレベルに対する正上昇（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）血中インスリン曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。グループ間の有意差は、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いて算出した。分析はＸＬＳＴＡＴ２００８ソフトウェア（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ（商標）、ＵＳＡ）を用いて実施した。統計的な有意性はＰ＜０．０５に設定した。全てのデータは平均±ＳＥＭで報告している。ＦＥ（５５．５±４．６ｍＵ／Ｌ）はプラセボ（４３．５±５．０ｍＵ／Ｌ）と比較して、９０分の時点で有意な（Ｐ＝０．００２）インスリンの分泌を示した（図１１Ａ）。ＦＥで処置したグループ（６，０４１．６±３４０．５ｍｉｎ．ｍＵ／Ｌ）は、プラセボ（５，９９６．３±５９４．５８ｍｉｎ．ｍＵ／Ｌ）と比較して、平均血中インスリンＡＵＣ（０〜１２０分）には有意差が見られなかった（図１１Ｂ）。
【００３７】
９０分時点でのインスリン分泌の刺激は、膵島細胞へのＦＥの直接的な作用であると考えられ、試験終了時（１２０分）には平常に戻った。これは、このようなケースにおいてインスリン抵抗性を減少させ、インスリン感受性を改善する可能性がある。さらには、処置とプラセボの間で平均血中インスリンＡＵＣに有意差がないので、抽出物を使用しても、処置後の数時間に高インスリン血症がそれによって起こることはなく、安全である。
【００３８】
当然のことながら当業者には周知であるように、ＦＥ抽出物の有効な量は処置を受ける動物またはヒトの体重によって変更可能である。さらには、ＦＥ抽出物はあらゆる従来の媒体によって、一般用医薬品および栄養補助品に通常用いられているような増量剤、添加剤、結合剤、賦形剤、香料および同類のものと一緒に、液体、粉末、または、カプレット、タブレットもしくはカプセル、あるいは他の従来の薬物の形状などの剤形で送達されてもよい。
【００３９】
本発明は、記載された実施形態ならびに所与の数量および数値の範囲以外によって保護されうることを当業者なら理解できるであろう。これらは説明する目的で供給されているのであり、限定する目的ではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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