(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病（ＡＤ）と関連する新規な変異体およびＡＤを診断するための手段としてのキットにおけるそれらの使用、さらに、新規な治療薬を同定するための核酸分子または細胞／細胞系、同定手段の標識におけるそれらの使用法を提供する。【解決手段】アルツハイマー病の発病についての新規な危険指標であるＣＬＵ／ＡＰＯＪ、ＰＩＣＡＬＭ、ＡＢＣＡ７、ＣＲ１、もしくはＢＩＮ１遺伝子座またはＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおける変異体、それと共に、連鎖不平衡にある任意の一塩基多型（ＳＮＰ）、アルツハイマー病を発病する危険性またはその存在を診断するための方法、また、前述の座またはクラスターを含む新規なスクリーニングツール。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の発病し易さ、またはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験される個体の身体から抽出された組織試料を提供するステップであって、前記組織試料は、染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子を含む少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００が存在するかどうかを同定するために前記座を検査するステップ、および
（ｃ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００またはｒｓ３８５１１７９が存在する場合、試料を抽出した個体が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたは罹患していると結論するステップ、を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、クラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子への言及を、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターに置換すること、
ステップ（ｂ）において、任意の１つまたは複数の以下のＳＮＰ、ＣＲ１におけるｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３またはｒｓ３８１８３６１；ＢＩＮ１におけるｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３；ＡＢＣＡ７におけるｒｓ３７６４６５０；およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおけるｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１またはｒｓ１５６２９９０が存在するかどうかを知るために前記置換された座またはクラスターを検査すること、および、
前記ステップ（ｃ）において、前記置換された座において前記１つまたは複数のＳＮＰが存在する場合、試料を抽出した個体が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたは罹患していると結論すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、さらに、以下の群、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、および染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターから選択される少なくとも１つの座を含有する組織試料を提供すること、
ステップ（ｂ）において、さらに、任意の１つまたは複数の以下のＳＮＰ、ＣＲ１におけるｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３またはｒｓ３８１８３６１；ＢＩＮ１におけるｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３；ＡＢＣＡ７におけるｒｓ３７６４６５０；およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおけるｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１またはｒｓ１５６２９９０が存在するかどうかを知るために前記さらなる座を検査すること、および、
ステップ（ｃ）において、前記１つまたは複数のＳＮＰが存在する場合、試料を抽出した個体が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患していると結論するステップ、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）において、さらに、またはその代わりに、ｒｓ７９８２が存在するかどうかを同定するために前記座が検査され、
前記ステップ（ｃ）において、ｒｓ７９８２が存在する場合に、試料を抽出した個体が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたは罹患していると結論すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検査される遺伝子座またはクラスターに相補的な少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドが、前記ＳＮＰを検出するために使用され、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＳＮＰに結合することにより、検出する際に、前記ＳＮＰの存在を表す検出可能なシグナルを発する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織試料が、ステップ（ｂ）を実行する前にＰＣＲ増幅される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が、ステップ（ｂ）を実行する前に酵素により断片化される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記相補的オリゴヌクレオチドが、固相または基質に付着または結合し、前記組織試料が、ステップ（ｂ）を実行する前に前記固相に曝露される、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アルツハイマー病の発病し易さ、またはその存在についてスクリーニングするまたは診断するためのキットであって、
染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターを含む群から選択される少なくとも１つの座または遺伝子クラスターに相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の以下のＳＮＰ、ＣＬＵにおけるｒｓ１１１３６０００；ＣＲ１におけるｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３またはｒｓ３８１８３６１；ＢＩＮ１におけるｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３；ＡＢＣＡ７におけるｒｓ３７６４６５０；およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおけるｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１またはｒｓ１５６２９９０を検出することができ、
さらに、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＳＮＰに結合する際に検出可能なシグナルを発する標識を備える、キット。
【請求項１０】
アルツハイマー病の発病し易さ、またはその存在についてスクリーニングするまたは診断するためのキットであって、
染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターを含む群から選択される少なくとも１つの座または遺伝子クラスターに相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の以下のＳＮＰ、ＣＬＵにおけるｒｓ１１１３６０００；ＣＲ１におけるｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３またはｒｓ３８１８３６１；ＢＩＮ１におけるｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３；ＡＢＣＡ７におけるｒｓ３７６４６５０；およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおけるｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１またはｒｓ１５６２９９０を検出することができ、
さらに、前記キットが、前記オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用される標識手段を含み、それによって、前記ＳＮＰへのオリゴヌクレオチドの結合は、標識手段が前述の結合を検出することを可能にし、したがって、前記ＳＮＰの存在を表すシグナルを生成する、キット。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、固体担体上に固定される、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
アルツハイマー病の発病し易さ、またはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験される個体の身体から抽出された組織試料を提供するステップであって、前記組織試料は、染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子を含む少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）ＣＬＵにおける、それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００および／もしくはＳＮＰ  ｒｓ７９８２が存在するかどうかを同定するために前記座を検査するステップ、および
（ｃ）前記ＳＮＰのいずれか１つまたは複数が存在する場合に、試料を抽出した個体が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患していると結論するステップ、を含む方法。
【請求項１３】
染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターを含む群から選択され、さらに、任意の組み合わせを含む１つまたは複数の以下の変異体；ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００；ＳＮＰ  ｒｓ１４０８０７７；ＳＮＰ  ｒｓ６７０１７１３；ＳＮＰ  ｒｓ３８１８３６１；ＳＮＰ  ｒｓ７５６１５２８；ＳＮＰｒｓ７４４３７３；ＳＮＰ  ｒｓ７９８２；ＳＮＰ  ｒｓ３７６４６５０、ＳＮＰ  ｒｓ６７０１３９；ＳＮＰ  ｒｓ１５６２９９０、ＳＮＰ  ｒｓ６６７８９７、ＳＮＰ  ｒｓ６７６３０９、ＳＮＰ  ｒｓ５８３７９１、ＳＮＰ  ｒｓ６６２１９６、およびＳＮＰ  ｒｓ６１０９３２を含む、１つまたは複数の遺伝子座またはクラスターを含む核酸分子。
【請求項１４】
染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１上の膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターを含む群から選択され、１つまたは複数の以下のＳＮＰ、ＣＬＵにおけるｒｓ１１１３６０００；ＣＲ１におけるｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３またはｒｓ３８１８３６１；ＢＩＮ１におけるｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３；ＡＢＣＡ７におけるｒｓ３７６４６５０；およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおけるｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１またはｒｓ１５６２９９０をさらに含む、１つまたは複数の遺伝子座またはクラスターを含む、細胞または細胞系。
【請求項１５】
ＳＮＰ  ｒｓ７９８２をさらに含む、請求項１４に記載の細胞または細胞系。
【請求項１６】
機能的エンドサイトーシス経路、アポトーシス経路、補体経路、または自然免疫応答経路を含む、請求項１４または１５に記載の細胞または細胞系。
【請求項１７】
治療薬、標識、または同定手段が、ＡＤを治療する、ＡＤを標識する、または同定するために各々使用することができるかどうかを試験するための、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の細胞または細胞系の使用。
【請求項１８】
試験物質に前記細胞を曝露するステップ、および、前記細胞のエンドサイトーシス経路、アポトーシス経路、補体経路または自然免疫応答経路に対する前記物質の効果、あるいは、前記試験物質が前記ＳＮＰを標識するもしくは同定することによって前記細胞を標識するもしくは同定する能力を観察するステップ、を含む、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の発病についての新規な危険指標であるＣＬＵ／ＡＰＯＪ、ＰＩＣＡＬＭ、ＡＢＣＡ７、ＣＲ１、もしくはＢＩＮ１遺伝子座またはＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおける変異体およびさらに、それと共に、連鎖不平衡にある任意の一塩基多型（ＳＮＰ）の同定に関し、本発明はまた、ＣＬＵ／ＡＰＯＪ、ＰＩＣＡＬＭ、ＡＢＣＡ、ＣＲ１、もしくはＢＩＮ１遺伝子座またはＭＳ４Ａ遺伝子クラスターにおける前述の変異体についてアッセイするステップを含む、アルツハイマー病を発病する危険性またはその存在を診断するための方法にも関し、本発明はまた、前述の座またはクラスターを含む新規なスクリーニングツールにも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な形態であり、それは、非常に遺伝的である（７６％までの遺伝率）が、遺伝的に複雑である。神経病理学的に、疾患は、β−アミロイド（Ａβ）を含有する細胞外老人斑および高リン酸化τタンパク質を含有する細胞内神経原線維変化によって特徴づけられる。４つの遺伝子が、その病因と決定的に関連した。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子ならびにプレセニリン１および２遺伝子（ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２）の突然変異は、普通早期発症を伴う、疾患のまれなメンデル形態を引き起こす。しかしながら、ＡＤのより一般的な形態では、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）だけが、感受性遺伝子として明解に確証された。新規なＡＤ座を同定することを目標として、少数のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）が、本研究に先立って行われた。すべて、ＡＰＯＥに対する関連についての強力な証拠を同定したが、他の遺伝子を関連づける証拠はそれほど説得力がなかった１〜８。この結果は、他の一般的な表現型のＧＷＡＳからの大多数の発見と一致している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
実際に、前のＧＷＡＳの失敗により、ＡＰＯＥ以外の任意の新規なＡＤ座を同定するための方法としてＧＷＡＳを避けて教示する偏見が当技術分野において生じた。こういった考えにもかかわらず、発明者らは、欧州および米国から共同研究コンソーシアムを設立し、発明者らは、ここから、１９，０００人までの対象の組み合わせの試料（精度管理前）を利用することができ、二段階の研究を行った。段階１において、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で１４，６３９人の対象の遺伝子型を同定した。５，７１５の試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄｃｈｉｐを使用して本研究用に遺伝子型を同定し９、残りの対象についての遺伝子型は、集団対照データセット（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄａｔａｓｅｔ）からまたは共同研究を通して発明者らに利用可能にし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０またはＨｕｍａｎＨａｐ３００  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ上で遺伝子型を同定した。関連分析に先立って、試料および遺伝子型はすべて、厳密な精度管理を行い、これにより、５３，３８３の常染色体ＳＮＰおよび２，８５０人の対象の排除がもたらされた。したがって、段階１において、発明者らは、１１，７８９人までの対象における関連について５２９，２０５の常染色体ＳＮＰを試験した（３，９４１人のＡＤ症例、７，８４８人の対照、このうちの２，０７８人は、高齢スクリーニング対照であった、表Ｓ１を参照されたい）。
【０００４】
ＡＰＯＥ座との既知の関連に加えて、ＧＷＡ分析はゲノムワイド有意水準で２つの新規な座を同定した（図１を参照）。
【０００５】
一方の新規なＳＮＰ、ｒｓ１１１３６０００は、染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）のイントロン内に位置し（ｐ＝１．４×１０−９、ＯＲ＝０．８４０）、他方のＳＮＰ、ｒｓ３８５１１７９は、染色体１１上のホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合体（ＰＩＣＡＬＭ）に対して８８．５ｋｂ  ５’側にある（ｐ＝１．９×１０−８、ＯＲ＝０．８４９）。そのため、明白に、どちらのＳＮＰもコード部位に位置せず、したがって、同定されたタンパク質における変化の原因となる。そのため、それらは、遺伝子発現のレベルで一時的にまたは空間的に影響をもたらすかもしれず、これは、次には、転写レベルに影響するかもしれない。
【０００６】
前の統計データは、説得力のある証拠を提供する。本明細書において同定された２つの新規な座およびそれらの対応するＳＮＰは、非常に高レベルの可能性でアルツハイマー病と関連する。これは、アルツハイマー病を発病する見込みまたは状態の早期の段階におけるアルツハイマー病の存在を診断するための有力な断定ツールとしてこれらのＳＮＰを使用することができることを意味する。
【０００７】
段階２の試料（２，０２３人のＡＤ症例、２，３４０人の対照）は、これらの新規な座の関連をさらに支援した（ＣＬＵ組み合わせ  ｐ＝８．５×１０−１０、ＯＲ＝０．８６；ＰＩＣＡＬＭ組み合わせ  ｐ＝１．３×１０−９、ＯＲ＝０．８６）。
【０００８】
関連の源を機能的変異体に帰するための事前の試みにおいて、発明者らは、前の新規なＳＮＰのどちらかと連鎖不平衡（ＬＤ）を通して相関したまたはもっともらしく機能効果を有するかもしれないそれぞれの座のさらなるＳＮＰを同定するために公的に入手可能なデータを使用した。これらのマーカーは、段階２の試料を通して遺伝子型を同定された。ＣＬＵ遺伝子における同義のＳＮＰ（ｒｓ７９８２）は、ゲノムワイド有意（ＧＷＳ）ＳＮＰと強力なＬＤにあり（ｒ２＝０．９５）、全試料においてＡＤとの関連について同様のレベルの証拠を示した（メタｐ＝８×１０−１０；段階１遺伝子型が帰属した）。このＳＮＰは、タンパク質のベータ鎖の一部をコードする、ＣＬＵ遺伝子のエクソン５中にあり、予測されるエクソンスプライシングエンハンサーに影響を及ぼすかもしれない。いくつかの潜在的に機能的なＳＮＰが、ＰＩＣＡＬＭ座で同定された。これらのうちの２つは、関連について好都合の証拠を示した；推定上の転写因子結合部位内にあるｒｓ５６１６５５および予測されるエクソンスプライシングエンハンサーに影響を及ぼすかもしれない、遺伝子のエクソン５中の同義のＳＮＰであるｒｓ５９２２９７。
【０００９】
クラスタリンの優性形態は、７５〜８０ｋＤａの分泌ヘテロ二量体糖タンパク質である。単一コピー遺伝子は、染色体８ｐ２１〜ｐ１２上に約１６ｋｂにわたり、４４９アミノ酸一次ポリペプチド鎖に翻訳される、約２ｋｂのｍＲＮＡをコード化する。クラスタリンは、すべての哺乳動物組織において発現され、クラスタリンレベルは、脳の傷害または慢性炎症を伴う、多くの病理学的状態において上昇するという強力な証拠がある。アルツハイマー病の脳において、クラスタリン発現は、ＡＤ症例の病変皮質分野において増加し、アミロイド斑および脳脊髄液中に存在することが報告されている。
【００１０】
クラスタリンは、多機能分子である。それは、疾患の動物モデルにおいてＡβの可溶性形態と相互作用し、特異的かつ可逆的な様式で可溶性Ａβに結合して、血液脳関門を横断することが示されている複合体を形成する。興味深いことには、ＡｐｏＥもまた、Ａβに対して分子シャペロンとして作用するように思われ、それが凝集し、沈着する場合に影響を及ぼし、Ａβのコンホーメーションおよび毒性に影響を及ぼす。同様の方法において、クラスタリンは、Ａβの毒性および不溶性形態への変換の両方を調節するように思われる。さらに、ＡｐｏＥおよびクラスタリンは、Ａβ沈着を抑制する際に協力することが示されており、ＡｐｏＥおよびクラスタリンは、血液脳関門でＡβクリアランスを決定的に修飾するかもしれず、アミロイド形成経路におけるクラスタリンについての役割を示唆する。ＡｐｏＥタンパク質のレベルは、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子量レベルに比例するように思われる、つまり、発現レベルは、ヘテロ接合体と比較して、ε４ホモ接合体において低下する。反対に、クラスタリンレベルは、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子量に比例して増加し、低ＡｐｏＥレベルを有する個人におけるクラスタリンの誘発を示唆する。したがって、ＡＤにおけるこの遺伝子の関与についての強力な統計的な証拠は、生物学的機能性の点からさらなる支援を有する。
【００１１】
ＡＤとの関連について説得力のある証拠を示すための第２の遺伝子座は、ＰＩＣＡＬＭである（ホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合体タンパク質；ＣＡＬＭ：クラスリン集合体リンパ性骨髄性白血病遺伝子としても知られている）。ＰＩＣＡＬＭは、ニューロンにおける顕著な発現と共にすべての組織型において広範に発現され、それは、シナプス前構造およびシナプス後構造に非選択的に分布する。ＰＩＣＡＬＭは、栄養素、増殖因子、および神経伝達物質などのようなタンパク質および脂質の細胞内輸送における本質的なステップであるクラスリン媒介性エンドサイトーシス（ＣＭＥ）に関与することが示された。ＡＤに対する関係のうちで、ＰＩＣＡＬＭは、ＶＡＭＰ２の輸送を指図するのに関与するように思われる。ＶＡＭＰ２は、ニューロンの機能にとって重大なプロセスである神経伝達物質放出においてシナプス前膜に対するシナプス小胞の融合に顕著な役割を果たすＳＮＡＲＥタンパク質である。ＡＤ脳は、シナプスの数の低下を示す。立体解析学的および生化学的分析は、シナプスの密度におけるこの低下が、斑の蓄積よりもいっそうよく、認知障害と相関することを示した。より最近の分析は、ＡＤ脳内のシナプスが、目に見えて変性する前でさえ、それらは、機能不全であるかもしれないことを示す。そのため、発明者らは、ＰＩＣＡＬＭ機能における遺伝的に指示された変化が、おそらくシナプス小胞サイクリングを通してシナプスで混乱をもたらし、それによってＡＤに対する危険性を増加させるということを仮定することができる。その代わりに、ＰＩＣＡＬＭは、Ａβレベルにおける変化をもたらすエンドサイトーシス経路を介してのＡＰＰプロセシングを通してＡＤの危険性に影響を及ぼす可能性がある。細胞培養実験は、完全長ＡＰＰが、ＣＭＥによって細胞表面から回収され、エンドサイトーシスの阻害が、ＡＰＰ内部移行を低下させて、Ａβ産生および放出を低下させることを示した。シナプス活性の増加は、シナプス小胞タンパク質のエンドサイトーシスの上昇に至ることが知られており、Ｃｉｒｒｉｔｏらは、その後、シナプス活性の増加によって引き起こされるＣＭＥの増加が、より多くのＡＰＰをエンドサイトーシスコンパートメントの中に送り、Ａβの産生および放出の増加をもたらすというｉｎ  ｖｉｖｏにおける証拠を提供した。したがって、クラスタリンに関して、ＡＤにおけるＰＩＣＡＬＭの関与についての強力な統計的な証拠は、生物学的機能性の点から支援を有する。
【００１２】
発明者らはまた、ＧＷＡＳにおいて観察された有意な関連の観察数が偶然期待されるものを超えるかどうかを試験した。ＡＰＯＥ、ＣＬＵ、およびＰＩＣＡＬＭ座内のＳＮＰを除去し（方法を参照されたい）、発明者らは、関連について最大の証拠を示したものに注目した（ｐ＜１×１０−５）。約１３の独立したシグナルが観察された；４未満は、偶然期待されたであろう（ｐ＝７．５×１０−６）。表２は、関連する座を示し、補体受容体１（ＣＲ１）遺伝子との関連について強力な証拠を提供する。シナプス小胞エンドサイトーシスに関与するタンパク質を産生するブリッジングインテグレーター（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）１（ＢＩＮ１）遺伝子もまた、注目に値する。したがって、これらのデータは、これらの遺伝子がＡＤと関連するという強力な証拠を提供する。
【００１３】
発明者らは、先に議論された段階２の試料を含む３，２６２人のＡＤ症例および５，０６４人の対照を含む独立した試料においてＡＤとの関連について最も有望な証拠を示したそれらのＳＮＰを試験しようとした９。４つのＧＷＡＳデータセットのメタ分析からＰ＜１×１０−５を示したＳＮＰ（６，９７８人までの症例、１３，９０３人の対照の組み合わせの試料）が、遺伝子型を同定のために選択された（方法を参照されたい）。独立した試料において関連について証拠を示したＳＮＰについては（Ｐ＜０．０５）、分散逆数重みづけメタ分析において、利用可能なＡＤ  ＧＷＡＳデータをすべて組み合わせるためにさらなる共同体に交渉した（方法を参照されたい）。４つのＳＮＰが、ＡＤとの関連についてＧＷＳの証拠を示した（表３を参照されたい）；ＡＢＣＡ７内のｒｓ３７６４６５０（Ｐ＝７．３×１０−１０、ＯＲ＝１．２２）、ＭＳ４Ａ遺伝子クラスターのｒｓ６７０１３９（Ｐ＝１．２×１０−９、ＯＲ＝１．１２）、ＢＩＮ１座のｒｓ７４４３７３（Ｐ＝２．１×１０−１２、ＯＲ＝１．１４）、およびＣＲ１座のｒｓ３８１８３６１（Ｐ＝１．９×１０−１２、ＯＲ＝１．１７）１０。
【００１４】
変異体ｒｓ３７６４６５０は、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）遺伝子のイントロン１３に位置する（図６）。ＡＢＣＡ７は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体をコード化し、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーは、細胞膜を横切って広範囲の基質を輸送する役割を有する。ＡＢＣＡ７は、脳において、特に海馬のＣＡ１ニューロンおよびミクログリアにおいて高度に発現される。ＡＢＣＡ７は、細胞からリポタンパク質粒子への脂質の流出に関与し、脳における主なリポタンパク質は、ＡＰＯＥであり、その後にＣＬＵが続き、したがって、遺伝子相互作用についての証拠はここで観察されなかったが、ＡＢＣＡ７は、それらの影響を調整する際に役割を有するかもしれない（表Ｓ１３を参照されたい）。さらに、ＡＢＣＡ７は、ＡＰを過剰発現する培養細胞において、ＡＰＰプロセシングを調節し、β−アミロイド分泌を阻害することが示された。
【００１５】
染色体１１上のＭＳ４Ａクラスターにおける遺伝子（ｃｈｒ１１：  ５９，５７０，８６３−５９，８６３，６８１  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９））（図６）は、膜貫通ドメインを含むファミリーの他のすべてのメンバーと共通のゲノム構造を有し、それらが細胞表面タンパク質のファミリーの一部であろうということを示す。ＭＳ４Ａ２は、高親和性ＩｇＥ受容体のベータサブユニットをコード化する。ＰＬＡＣ１Ｌを含む、ＬＤブロックにおける残る遺伝子は、知られている特異的な機能を有しない。
【００１６】
ＢＩＮ１（ＡＭＰＨ２、アンフィファイシンアイソフォーム２としても知られている）は、ＰＩＣＡＬＭと協力して、受容体媒介性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）において機能する。ＢＩＮ１発現は、脳特異的ではないが、脳において豊富な発現を有するいくつかのアイソフォームがある。哺乳動物ＢＩＮ１のノックダウンは、エンドソーム再利用を遅らせ、線虫における単一のアンフィファイシンアイソフォーム（ＡＭＰＨ１／ＡＭＰＨ２）オルソログの欠失変異株（Ａｍｐｈ−１）は、不完全なエンドソーム再利用を示す。
【００１７】
ＣＲ１は、主に、適応免疫に関与し、赤血球上に、とりわけ血管内の赤血球上に豊富に発現され、ニューロン上で検出されている。ＣＲ１は、補体が活性化されていることを認識すると、粒子および免疫複合体への細胞の結合を媒介する。ＣＲ１は、補体カスケードの負のレギュレーターとして作用し、免疫粘着および食作用を媒介し、古典的補体経路および補体第二経路の両方を阻害することができる。炎症のマーカーは、以前にＡＤと関連づけられており、炎症プロセスは、病原性の一因として提唱されている。ＡＤにおけるいくつかの推定上の炎症遺伝子（ＣＬＵ、ＣＲ１、ＡＢＣＡ７、およびおそらく、ＭＳ４Ａクラスターにおける遺伝子）の関与を示すデータは、疾患発病における炎症プロセスについての主要な役割を支援する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第１の態様によれば、そのため、アルツハイマー病を発病する見込みまたはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験されることとなる個人の人体から抽出された組織試料を提供するステップであって、組織試料は、染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子を含有する少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００が存在するかどうかを同定するために上述の座を検査するステップ、および
（ｃ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００が存在する場合、試料を抽出した個人が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患しているという結論を下すステップを含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、アルツハイマー病を発病する見込みまたはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験されることとなる個人の人体から抽出された組織試料を提供するステップであって、組織試料は、染色体１１上にＰＩＣＡＬＭ遺伝子を含有する少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９が存在するかどうかを同定するために上述の座を検査するステップ、および
（ｃ）ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９が存在する場合、試料を抽出した個人が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患しているという結論を下すステップを含む方法が提供される。
【００２０】
さらにまたはその代わりに、上記の方法のいずれかにおいて、染色体８上のクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子または染色体１１上のＰＩＣＡＬＭ遺伝子への言及を、染色体１上の補体受容体１遺伝子（ＣＲ１）、染色体２上のブリッジングインテグレーター１遺伝子（ＢＩＮ１）、染色体１９上のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー７（ＡＢＣＡ７）、または染色体１１  膜貫通４Ａ（ＭＳ４Ａ）遺伝子クラスターに置換し、かつ以下のＳＮＰ、ｒｓ１４０８０７７、ｒｓ６７０１７１３、またはｒｓ３８１８３６１（ＣＲ１について）；ｒｓ７５６１５２８またはｒｓ７４４３７３（ＢＩＮ１について）；ｒｓ３７６４６５０（ＡＢＣＡ７について）、およびＭＳ４Ａ遺伝子クラスターについてｒｓ６７０１３９、ｒｓ６１０９３２、ｒｓ６７６３０９、ｒｓ６６７８９７、ｒｓ６６２１９６、ｒｓ５８３７９１、またはｒｓ１５６２９９０のいずれか１つが存在するかどうかを知るために上述の座を検査し、上述のＳＮＰが存在する場合、試料を抽出した個人が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患しているという結論を下すことによって実施されてもよい。
【００２１】
本発明の第３の態様によれば、アルツハイマー病を発病する見込みまたはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験されることとなる個人の人体から抽出された組織試料を提供するステップであって、組織試料は、染色体８上にクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子を、または染色体１１上にＰＩＣＡＬＭ遺伝子を含有する少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００、またはｒｓ３８５１１７９が存在するかどうかを同定するために上述の座を検査するステップ、および
（ｃ）ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００、またはｒｓ３８５１１７９が存在する場合、試料を抽出した個人が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患しているという結論を下すステップを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００への言及は、位置ｃｈｒ８：２７５２０４３６−２７５２０４３６  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、クラスタリン遺伝子のイントロン３におけるＴからＣへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿００１８３１．２；転写変異体２  ＮＭ＿２０３３３９．１；転写変異体３  ＮＭ＿００１１７１１３８．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。このＳＮＰのマッピングを図２に示す。
【００２３】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９への言及は、位置ｃｈｒ１１：  ｃｈｒ１１：８５５４６２８８−８５５４６２８８  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子から８５．５ｋｂ上流のＴからＣへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿００７１６６．２；転写変異体２；ＮＭ＿００１００８６６０．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。このＳＮＰのマッピングを図３に示す。
【００２４】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ１４０８０７７への言及は、位置ｃｈｒ１：２０５８７０７６４−２０５８７０７６４  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＣＲ１遺伝子のイントロン３８におけるＣからＡへの塩基変化への言及である（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００２５】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ６７０１７１３への言及は、位置ｃｈｒ１：２０５８５２９１２−２０５８５２９１２  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＣＲ１遺伝子のイントロン３１におけるＧからＡへの塩基変化への言及である（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００２６】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ３８１８３６１への言及は、位置ｃｈｒ１：２０５８５１５９１−２０５８５１５９１  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＣＲ１遺伝子のイントロン２９におけるＧからＡへの塩基変化への言及である（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００２７】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ７５６１５２８への言及は、位置ｃｈｒ２：１２７６０６１０７−１２７６０６１０７  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＢｌＮ１遺伝子から２４．８ｋｂ上流のＧからＡへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿１３９３４３．１；転写変異体６；ＮＭ＿１３９３４８．１；転写変異体１０;ＮＭ＿１３９３５１．１；転写変異体２；ＮＭ＿１３９３４４．１；転写変異体３;ＮＭ＿１３９３４５．１；転写変異体８；ＮＭ＿００４３０５．２；転写変異体９;ＮＭ＿１３９３５０．１；転写変異体７;ＮＭ＿１３９３４９．１；転写変異体５；ＮＭ＿１３９３４７．１；転写変異体４;ＮＭ＿１３９３４６．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００２８】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ７４４３７３への言及は、位置ｃｈｒ２：１２７６１１０８５−１２７６１１０８５  （Ｂｕｉｌｄ  ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８）での、ＢｌＮ１遺伝子から２９．８ｋｂ上流のＡからＧへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿１３９３４３．１；転写変異体６；ＮＭ＿１３９３４８．１；転写変異体１０;ＮＭ＿１３９３５１．１；転写変異体２；ＮＭ＿１３９３４４．１；転写変異体３;ＮＭ＿１３９３４５．１；転写変異体８；ＮＭ＿００４３０５．２；転写変異体９;ＮＭ＿１３９３５０．１；転写変異体７;ＮＭ＿１３９３４９．１；転写変異体５；ＮＭ＿１３９３４７．１；転写変異体４;ＮＭ＿１３９３４６．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００２９】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ３７６４６５０への言及は、位置ｃｈｒ１９：１０４６５２０−１０４６５２０  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＡＢＣＡ７遺伝子のイントロン１３におけるＴからＧへの塩基変化への言及である（ＮＭ＿０１９１１２．３）（表Ｓ１６を参照されたい）。このＳＮＰのマッピングを図６に示す。
【００３０】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ１５６２９９０への言及は、位置ｃｈｒ１１：６００２３０８７−６００２３０８７  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子から２５ｋｂ上流のＣからＡへの塩基変化への言及である（転写変異体２；ＮＭ＿１４８９７５．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００３１】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ６６７８９７への言及は、位置ｃｈｒ１１：５９９３６９７９−５９９３６９７９  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ６Ａ遺伝子から２ｋｂ上流のＡからＧへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿１５２８５２．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００３２】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ７６３０９への言及は、位置ｃｈｒ１１：６０００１５７３−６０００１５７３  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ４Ｅ遺伝子から４ｋｂ上流のＡからＧへの塩基変化への言及である（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００３３】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ５８３７９１への言及は、位置ｃｈｒ１１：５９９４７２５２−５９９４７２５２  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ６Ａ遺伝子のイントロン３におけるＧからＡへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿１５２８５２．１；転写変異体２；ＮＭ＿０２２３４９．２；転写変異体３；ＮＭ＿１５２８５１．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００３４】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ６６２１９６への言及は、位置ｃｈｒ１１：５９９４２７５７−５９９４２７５７  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ６Ａ遺伝子のイントロン５におけるＧからＡへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿１５２８５２．１；転写変異体２；ＮＭ＿０２２３４９．２；転写変異体３；ＮＭ＿１５２８５１．１）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００３５】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ６１０９３２への言及は、位置ｃｈｒ１１：５９９３９３０７−５９９３９３０７  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ６Ａ遺伝子の３プライム非翻訳領域におけるＡからＣへの塩基変化への言及である（転写１；ＮＭ＿１５２８５２．１；転写２；ＮＭ＿０２２３４９．２）（表Ｓ１６を参照されたい）。このＳＮＰのマッピングを図６に示す。
【００３６】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ６７０１３９への言及は、位置ｃｈｒ１１：  ５９９７１７９５−  ５９９７１７９５  （Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）での、ＭＳ４Ａ４Ｅ遺伝子から２１ｋｂ上流のＣからＡへの塩基変化への言及である（表Ｓ１６を参照されたい）。このＳＮＰのマッピングを図６に示す。
【００３７】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、上述の方法論は、その任意の組み合わせを含む、任意の１つまたは複数の以下の変異体を使用して試みられてもよい：
ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００；ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９；ＳＮＰ  ｒｓ１４０８０７７；ＳＮＰ  ｒｓ６７０１７１３；ＳＮＰ  ｒｓ３８１８３６１；ＳＮＰ  ｒｓ７５６１５２８；ＳＮＰ  ｒｓ７４４３７３；ＳＮＰ  ｒｓ７９８２；ＳＮＰ  ｒｓ５６１６５５；ＳＮＰ  ｒｓ５９２２９７；ＳＮＰ  ｒｓ３７６４６５０；ＳＮＰ  ｒｓ１５６２９９０；ＳＮＰ  ｒｓ６６７８９７；ＳＮＰ  ｒｓ６７６３０９；ＳＮＰ  ｒｓ５８３７９１；ＳＮＰ  ｒｓ６６２１９６；ＳＮＰ  ｒｓ６７０１３９およびＳＮＰ  ｒｓ６１０９３２。
【００３８】
好ましくは、本発明の上記の態様のいずれかにおいて、１つまたは複数の上述のＳＮＰを同定するステップは、遺伝子型を同定するための当業者らによく知られている従来の遺伝子スクリーニング技術の使用を含む。たとえば、限定を伴うことなく、前述の方法は、興味のあるＳＮＰに結合し、そのように検出する際に、上述のＳＮＰの存在を表す検出可能なシグナルを発する適切に標識されたオリゴヌクレオチドの使用によって実施されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドの設計のための方法は、当業者らによく知られており、ＤＮＡの同定および標識においてルーチン的に実施される。さらに、当業者らは、表Ｓ１６において提供される情報によって従来の様式でそのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。
【００３９】
本発明の前述の態様のいずれかにおいて、上述の組織試料は、上記のステップ（ｂ）を実行する前に増幅されてもよい。より好ましくは、さらに、上述の増幅された組織は、上記のステップ（ｂ）を実行する前に酵素により断片化されてもよい。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の相補的オリゴヌクレオチドは、固相または基質に付着されてもよくまたは結合されてもよく、上述の、任意選択で増幅され、断片化された組織試料は、上記の（ｂ）において言及される検出ステップを実行する前に上述の固相に曝露されてもよい。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の１つまたは複数の前述の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、前述の座の少なくとも１つに相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、対象とするＳＮＰへの結合の際に検出可能なシグナルを発する適切な標識と共に提供されるか、前記オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することができる標識手段が共に提供され、それによって、前記ＳＮＰへのオリゴヌクレオチドの結合は、標識手段が前述の結合を検出することを可能にし、したがって、前記ＳＮＰの存在を表すシグナルを生成する、キットが提供される。
【００４２】
好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、ビーズ、アレイ、または基質などの固体担体上に固定される。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、アルツハイマー病を発病する見込みまたはその存在についてスクリーニングするまたは診断するための方法であって、
（ａ）試験されることとなる個人の人体から抽出された組織試料を提供するステップであって、組織試料は、染色体８上にクラスタリン（ＣＬＵ、ＡＰＯＪとしても知られている）遺伝子を、または染色体１１上にＰＩＣＡＬＭ遺伝子を含有する少なくとも１つの座を含有するステップ、
（ｂ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００および／もしくはＳＮＰ  ｒｓ７９８２；または、それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９および／もしくはＳＮＰ  ｒｓ５６１６５５またはｒｓ５９２２９７が存在するかどうかを同定するために前記座を検査するステップ、ならびに
（ｃ）任意の１つまたは複数の前記ＳＮＰが存在する場合、試料を抽出した個人が、アルツハイマー病を発病する可能性が高いまたはそれに罹患しているという結論を下すステップを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ７９８２への言及は、２００６年３月ヒト参照配列（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１）の位置ｃｈｒ２ｃｈｒ８：２７５１８３９８−２７５１８３９８での、クラスタリン遺伝子のエクソン５におけるＡからＧへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿００１８３１．２）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００４５】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ５６１６５５への言及は、２００６年３月ヒト参照配列（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１）の位置ｃｈｒ１１：８５４７７９２７−８５４７７９２７での、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子から２０．２ｋｂ上流のＡからＧへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿００７１６６．２）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００４６】
本発明の前の態様のいずれかにおいて、ＳＮＰ  ｒｓ５９２２９７への言及は、２００６年３月ヒト参照配列（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１）の位置ｃｈｒ１１：８５４０３５８５−８５４０３５８５での、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子のエクソン５におけるＣからＴへの塩基変化への言及である（転写変異体１；ＮＭ＿００７１６６．２）（表Ｓ１６を参照されたい）。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、その任意の組み合わせを含む、１つまたは複数の以下の変異体；
ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００；ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９；ＳＮＰ  ｒｓ１４０８０７７；ＳＮＰ  ｒｓ６７０１７１３；ＳＮＰ  ｒｓ３８１８３６１；ＳＮＰ  ｒｓ７５６１５２８；ＳＮＰ  ｒｓ７４４３７３；ＳＮＰ  ｒｓ７９８２；ＳＮＰ  ｒｓ５６１６５５；ＳＮＰ  ｒｓ５９２２９７；ＳＮＰ  ｒｓ３７６４６５０；ＳＮＰ  ｒｓ１５６２９９０；ＳＮＰ  ｒｓ６６７８９７；ＳＮＰ  ｒｓ６７６３０９；ＳＮＰ  ｒｓ５８３７９１；ＳＮＰ  ｒｓ６６２１９６；ＳＮＰ  ｒｓ６７０１３９およびＳＮＰ  ｒｓ６１０９３２
を含む、任意の１つまたは複数の以下の座またはクラスター：ＣＬＵ／ＡＰＯＪ、ＰＩＣＡＬＭ、ＡＢＣＡ７、ＣＲ１、またはＢＩＮ１、ＭＳ４Ａを含む核酸分子が提供される。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの遺伝子座を含む、治療薬を同定するための研究ツール、標識手段、または同定手段であって、上述の座は、ＡＤと関連する、１つまたは複数の上記に言及される座、すなわち、ＣＬＵ、ＰＩＣＡＬＭ、ＣＲ１、ＢＩＮ１、ＡＢＣＡ７、またはＭＳ４Ａ座およびより好ましくは、それと関連して上記に述べられるＳＮＰを含む、治療薬を同定するための研究ツール、標識手段、または同定手段が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、潜在的な治療薬、標識手段、または同定手段が、ＡＤを治療するまたはＡＤと関連するマーカーを標識するもしくは同定するために使用することができるかどうかを試験するために使用される、１つまたは複数の本発明の遺伝子座および１つまたは複数の関連するＳＮＰを含む細胞または細胞系が提供される。
【００５０】
最も適切には、細胞または細胞系は、試験物質によるその修飾が、上述の物質の効能を決定するために使用することができる機能的なエンドサイトーシス経路、アポトーシス経路、補体経路、または自然免疫応答経路を含む。
【００５１】
続く請求項および本発明の先の記載において、文脈上、用語または必要な意味を表現することになる他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような変形は、包括的な意味で使用される、つまり、本発明の様々な実施形態において、さらなる特徴の存在または追加を不可能にするためではなく、指定される特徴の存在を明示するために使用される。
【００５２】
本明細書に引用される任意の特許または特許出願を含む参考文献はすべて、参照によってこれによって組み込まれる。いかなる参考文献も、先行技術を構成するという許可はなされない。さらに、先行技術のいずれも、当技術分野における共通の一般知識の一部を構成するという許可はなされない。
【００５３】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関して記載されるとおりであってもよい。
【００５４】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明白になるであろう。概して言えば、本発明は、本明細書（添付の請求項および図面を含む）において開示される特徴の任意の新規な特徴または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特徴、整数、特質、化合物、または化学成分は、それと互換性がないわけではない限り、本明細書において記載される任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されたい。
【００５５】
さらに、その他に述べられない限り、本明細書において開示されるあらゆる特徴は、同じまたは類似する目的を果たす代替の特徴と交換されてもよい。
【００５６】
本発明は、ここで、以下の受入番号および図に関して例証することとする。
受入番号
ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＬＵアイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１８３１．２；ＣＬＵアイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿２０３３３９．１；ＣＬＵアイソフォーム３  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１１７１１３８．１；ＰＩＣＡＬＭアイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００７１６６．２；ＰＩＣＡＬＭアイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１００８６６０．１；ＣＲ１アイソフォームＳ  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０００６５１．４；ＣＲ１アイソフォームＦ  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０００５７３．３；ＢｌＮ１アイソフォーム６  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４８．１；ＢｌＮ１アイソフォーム１０  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３５１．１；ＢｌＮ１アイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４４．１；ＢｌＮ１アイソフォーム３  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４５．１；ＢｌＮ１アイソフォーム８  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００４３０５．２；ＢｌＮ１アイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４３．１；ＢｌＮ１アイソフォーム９  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３５０．１；ＢｌＮ１アイソフォーム７  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４９．１；ＢｌＮ１アイソフォーム５  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４７．１；ＢｌＮ１アイソフォーム４  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９３４６．１；ＡＢＣＡ７  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０１９１１２．３；ＰＬＡＣ１Ｌ  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１７３８０１．３；ＭＳ４Ａ６Ｅ  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１３９２４９．２；ＭＳ４Ａ３アイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１０３１８０９．１；ＭＳ４Ａ３アイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００６１３８．４；ＭＳ４Ａ３アイソフォーム３  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１０３１６６６．１；ＭＳ４Ａ２アイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿００１１４２３０３．１；ＭＳ４Ａ２アイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０００１３９．３；ＭＳ４Ａ６Ａアイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１５２８５２．１；ＭＳ４Ａ６Ａアイソフォーム３  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１５２８５２．１；ＭＳ４Ａ６Ａアイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０２２３４９．２；ＭＳ４Ａ４Ａアイソフォーム２  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿１４８９７５．１；ＭＳ４Ａ４Ａアイソフォーム１  ｍＲＮＡ、ＮＭ＿０２４０２１．２。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】−ｌｏｇ１０  ＧＷＡＳ  Ｐ値（Ｙ軸）に対する染色体の位置（Ｘ軸）の散布図を示す図である。高度に有意な関連が、ＡＰＯＥ座の付近のＳＮＰ（たとえばｐ＝１．８×１０−１５７を有するｒｓ２０７５６５０）で観察されたが、Ｙ軸目盛は、９．２５（ｐ＝５．６×１０−１０）に制限されている。ゲノムワイド有意についての閾値（ｐ≦９．４×１０−８）は、赤色の水平線によって示される。ｐ≦１×１０−３を有する７６１のＳＮＰは、青色の水平線の上に位置する。プロットは、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ  ｖ４．０を使用して生成した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／）
【図２】ＣＬＵ転写変異体１に基づくＣＬＵ遺伝子を示す図である。メガベースでの染色体位置を図の上部に示す。遺伝子図；水平な矢印は、転写の方向を示し、黒色のボックスは、遺伝子エクソンを示し、灰色のボックスは、ＵＴＲを示し、薄灰色のボックスは、転写変異体２特異的ＵＴＲを示す。ＧＷＡ研究において遺伝子型を同定されたＳＮＰの−ｌｏｇ１０（Ｐ）をチャートグラフで示し、ＧＷＳ  ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００を示す。ＧＷＳ  ＳＮＰ  ｒｓ１１１３６０００およびｒｓ７９８２のメタｐ値を点線によって示す。ＣＥＵ  ＨａｐＭａｐデータによる、ＣＬＵ遺伝子および周囲の領域（ｃｈｒ８：  ２７，５０２，８１７−２７，５３５，９４４）のＤ’  ＬＤブロック構造を、遺伝子型を同定されたＳＮＰがそれぞれ示される場所を示す線と共に、図の下部に提供する。ＣＬＵ転写変異体２は、転写変異体１のエクソン１または５’ＵＴＲを含有せず、さらに、転写変異体２において、エクソン２の半分は、ＵＴＲであることに注意されたい。
【図３】ＰＩＣＡＬＭ転写変異体１に基づくＰＩＣＡＬＭ遺伝子を示す図である。メガベースでの染色体位置を図の上部に示す。遺伝子図；水平な矢印は、転写の方向を示し、黒色のボックスは、遺伝子エクソンを示し、灰色のボックスは、ＵＴＲを示し、薄灰色ボックスは、転写変異体２に特異的なエクソンを示す。ＧＷＡ研究において遺伝子型を同定されたＳＮＰの−ｌｏｇ１０（Ｐ）をチャートグラフで示しＧＷＳ  ＳＮＰ  ｒｓ３８５１１７９を示す。ＧＷＳ  ＳＮＰ（ｒｓ３８５１１７９）ならびにゲノムワイド有意性に近似する推定上の機能的変異体（ｒｓ５９２２９７およびｒｓ５６１６５５）のメタｐ値を点線によって示す。ＣＥＵ  ＨａｐＭａｐデータによるＰＩＣＡＬＭ遺伝子および周囲の領域（ｃｈｒ１１：  ８５，３２６，１３３−８５，６０５，６００）のＤ’  ＬＤブロック構造を、図の下部に提供する。
【図４】異なるセットの対照を比較する場合の分位数−分位数プロットの例を示す図である。この例において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄｃｈｉｐ上で遺伝子型を同定された英国およびアイルランドからのスクリーニング対照を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０上で遺伝子型を同定された、１９５８年英国出生コホートからの対照と比較する。観察された関連χ２検定統計量（Ｙ軸）を、ヌル期待値下で期待されたもの（Ｘ軸）に対してプロットした。より高い値が観察されたが、Ｙ軸は３０に制限した。同等性の実線を示す。１１の排除χ２閾値を使用した（点線の水平線によって示す）。
【図５】ヌル期待値下で期待されたもの（Ｘ軸）に対して５２９，２０５の観察されたゲノムワイド関連χ２検定統計量（Ｙ軸）の分位数−分位数（Ｑ−Ｑ）プロットを示す図である。同等性の実線を示す。λ＝１．０３７。Ｂ）ＡＰＯＥ座の１７０のＳＮＰの除去の後のＱ−Ｑプロット。５２９，０３５のＳＮＰが残る（λ＝１．０３７）。
【図６】（ａ）ＡＢＣＡ７遺伝子および（ｂ）ＭＳ４Ａ遺伝子クラスターのメンバーを有する染色体領域ｃｈｒ１１：５９．８１Ｍｂ−６０．１Ｍｂに関して報告された関連する変異体を示す図である。染色体位置は、図の上部に示す（Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）。遺伝子図：水平な矢印は、転写の方向を示し、黒色のボックスは、遺伝子エクソン／ＵＴＲを示す。段階１において分析したＳＮＰの−Ｌｏｇ１０（Ｐ）をチャートグラフで示す。ＳＮＰ  ｒｓ３７６４６５０（ＡＢＣＡ７）、ｒｓ６１０９３２（ＭＳ４Ａ６Ａ）、およびｒｓ６７０１３９（ＭＳ４Ａ４Ｅ）についての段階３の分散逆数重みづけメタ分析Ｐ値を示す。ＧＥＲＡＤ２試料において遺伝子型を同定されたＡＢＣＡ７座の非同義ＳＮＰ  ｒｓ３７５２２４６も示す（ｒｓ３７６４６５０とＤ’＝０．８９、ｒ２＝０．３６）。ＣＥＰＨ  ＨａｐＭａｐデータによるＡＢＣＡ７遺伝子および周囲の領域ならびにｃｈｒ１１：５９．８１Ｍｂ−６０．１ＭｂのＤ’  ＬＤブロック構造を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄ  ｃｈｉｐ上で遺伝子型を同定されたＳＮＰがそれぞれ示される場所を示す線と共に、それぞれの図の下部に提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
材料および方法
試料確認および診断基準
研究は、４，９５７人のＡＤ症例および９，６８２人の対照の段階１「発見試料」ならびに２，０２３人のＡＤ症例および２，３４０人の対照の段階２「追跡調査試料」を含んだ。この研究に含まれた個人は、欧州および米国から得た。個人はみなコーカサス人の家系であった。すべてのＡＤ症例は、高可能性（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ、ＤＳＭ−ＩＶ）または確定（ＣＥＲＡＤ）の基準を満たした。
【００５９】
ＡＤ．この研究は、「高齢スクリーニング対照」および「集団対照」を使用した。高齢対照は、認知機能低下またはＡＤの神経病理学的徴候についてスクリーニングした。「集団対照」は、入手可能なゲノムワイド関連データを有する大きな既存のコホートから得た。
段階１  発見試料：この後まとめて６１０群と呼ぶ、発見試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄ  ｃｈｉｐ上で、Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで遺伝子型を同定された４，１１３人の症例および１，６０２人の高齢スクリーニング対照を含んだ。これらの試料は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  （ＭＲＣ）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ＡＤ  （Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ）、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｕｓｔ  （ＡＲＴ）  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｔｏｌ；Ｑｕｅｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｅｌｆａｓｔ；ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｔｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｇｅｉｎｇ  （ＯＰＴＩＭＡ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ；ＭＲＣ  ＰＲＩＯＮ  Ｕｎｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ；Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  ＡＤ  ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＬＡＳＥＲ−ＡＤ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＮＩＭＨ）  ＡＤ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅが募集した。これらのデータは、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ；およびＭａｙｏ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋによって確認された８４４人のＡＤ症例および１，２５５人の高齢スクリーニング対照からのデータと組み合わせ、これらは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ３００  ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して遺伝子型を同定した。これらの試料は、ＡＤの前のＧＷＡＳにおいて使用された４。合計６，８２５人の集団対照が段階１に含まれた。これらは、１９５８年英国出生コホート（１９５８ＢＣ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂ５８ｃｇｅｎｅ．ｓｇｕｌ．ａｃ．ｕｋ）、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓのＮＩＮＤＳ資金提供神経遺伝学コレクション（Ｃｏｒｉｅｌｌ）（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｒ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ／を参照されたい）、ＫＯＲＡ  Ｓｔｕｄｙ１１、Ｈｅｉｎｚ  Ｎｉｘｄｏｒｆ  Ｒｅｃａｌｌ  Ｓｔｕｄｙ１２，１３、およびＡＬＳ対照を含む、入手可能なＧＷＡＳデータを有する大きな既存のコホートから得た。ＡＬＳ対照は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ３００  ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して遺伝子型を同定した。他のすべての集団対照は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０  Ｂｅａｄｃｈｉｐを使用して遺伝子型を同定した。発見試料の臨床的特徴���、表Ｓ１において知ることができる。
【００６０】
段階２  追跡調査試料：追跡調査試料は、２，０２３人のＡＤ症例および２，３４０人の対照を含んだ。試料は、ＭＲＣ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ＡＤ、ＡＲＴ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ、Ａｒｉｓｔｏｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｓｓａｌｏｎｉｋｉ、Ｍｅｍｏｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、ＺＮＡ  Ｍｉｄｄｅｌｈｅｉｍ、Ａｎｔｗｅｒｐｅｎでの前向き臨床研究に由来するベルギー人の試料１４、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈから得た。追跡調査試料の臨床的特徴は、表Ｓ２において知ることができる。
さらなる段階２試料；さらなる段階２試料は、ＡＢＣＡ７およびＭＳ４Ａ座の遺伝子型同定に使用した１，２３９人のＡＤ症例および２，７２４人の対照を含んだ。試料は、ＡＤについてのＭＲＣ遺伝子資源、ＡＲＴ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ、およびＡｒｉｓｔｏｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｓｓａｌｏｎｉｋｉから得た。全段階２追跡調査試料の臨床的特徴は、表Ｓ３において知ることができる。
【００６１】
ＤＮＡ抽出および研究所精度管理
ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出によってそれぞれの参加者からの血液試料から得、その後、エタノール中での沈殿およびＴＥバッファー中での保管を続けた（いくらかのＤＮＡはＱｉａｇｅｎキットを使用して抽出した）。最初のＤＮＡ濃度は、ＵＶ分光光度法（μＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）、Ｂｅｄｓ、ＵＫ）またはＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＥ、ＵＳＡ）によって決定した。その後、それぞれの試料の濃度は、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔ．、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）において、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅ．）を使用して決定した。その後、試料はそれぞれ、５０ｎｇ／ｕｌに希釈し、４８時間、４℃で平衡化した。ＤＮＡの品質は、標準的な条件下でアガロースゲル電気泳動によって評価した。その後、分解が認められなかった試料は、メーカーのプロトコールに従って、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）およびｉＰｌｅｘ（登録商標）システム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、３０のＳＮＰのパネルにおいて遺伝子型を同定した。これにより、ＧＷＡＳのために試料を再配置した後に、性別をチェックすることが可能になり、試料の身元確認が可能になった。
【００６２】
段階１  遺伝子型同定（６１０群）
遺伝子型同定は、Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＫで実行した。精度管理（ＱＣ）を通過した、標準化された試料はすべて、９６ウェルプレートフォーマットの中にＢｉｏｍｅｋ（登録商標）  ＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標），  Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して、ＧＷＡＳのために再配置した。試料当たり２００ｎｇの入力ＤＮＡを使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（商標）システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して遺伝子型を同定するために調製した。初めから終わりまでメーカーのプロトコールに従った。手短かに言えば、ＤＮＡは、一晩、等温で増幅し、その後、酵素により断片化し、アルコール沈殿し、再懸濁した。この研究において、発明者らは、キャピラリーフロースルーチャンバーにおいてハイブリダイゼーションのために調製したＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ６１０−Ｑｕａｄ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。増幅し、断片化したＤＮＡ試料は、Ｔｅｃａｎロボットを使用してビーズチップにハイブリダイズし、酵素による塩基伸長を対立遺伝子特異性を付与するために使用した。チップは、続いて染色し、それぞれのビーズで蛍光を検出するためにｉＳＣＡＮリーダー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してスキャンした。データは、Ｂｅａｄｓｔｕｄｉｏにロードし、Ｘ、Ｙ、Ｘ−Ｒａｗ、およびＹ−Ｒａｗを含有する最終コールレポートが出力された。クラスター分析のためのＩｌｌｕｍｉｎｕｓアルゴリズムは、遺伝子型コールのために使用した１５。
【００６３】
段階１：個々の精度管理
４，１１３人のＡＤ症例および１，６０２人の対照を、本研究の一部として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄ  ｃｈｉｐ上で遺伝子型を同定した（６１０群）。さらに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０またはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ３００を使用して先に遺伝子型を同定された８４４人のＡＤ症例および８，０８０人の対照を分析に含めた。これらの遺伝子型は、７つの異なる研究の一部として生成し、合計で８つの別個の群を作製した：１）６１０；２）Ｍａｙｏ；３）１９５８年出生コホート（Ｓａｎｇｅｒ）；４）１９５８年出生コホート（Ｔ１ＤＧＣ）；５）ＡＬＳ対照；６）Ｃｏｒｉｅｌｌ対照；７）Ｈｅｉｎｚ  Ｎｉｘｄｏｒｆ  Ｒｅｃａｌｌ  （ＨＮＲ）研究；８）Ｋｏｒａ。発明者らが多数の供給源からの遺伝子型データを使用したために、データが組み合わされた場合に、群の間の特異な遺伝子型同定エラー率が偽性の関連をもたらし得るので、厳密なＱＣフィルターを適用することが重要であった１６，１７。これらのフィルターは、ＰＬＩＮＫ  ｖ１．０５において実行されるツールを使用して成績の悪い試料を除去するためにこれらの８つの群のそれぞれに別々に適用した（ｈｔｔｐ：／／ｐｎｇｕ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／〜ｐｕｒｃｅｌｌ／ｐｌｉｎｋ）１８。適用した特異的なＱＣ閾値および群ごとに排除された試料の内訳は、表Ｓ４およびＳ５中にそれぞれ示す。発明者らは、ミッシング遺伝子型同定率＞０．０１を有する１，４６９人の個人を除去した。発明者らはまた、平均常染色体ヘテロ接合性に基づいてフィルターを適用し、経験的に決定した閾値を上回るまたは下回る値を有する５７８人の個人を排除した。報告された性別および遺伝子型により決定した性別の間に矛盾を有する７１人の個人ならびに曖昧な、遺伝子型により決定した性別を有する２２人の個人は、除去した。これらのＱＣフィルターを通過したすべての個人は、ＰＬＩＮＫにおいて、個人のすべての可能性のあるペアについて家系による同一性（ＩＢＤ）の推定値を計算し、ＩＢＤ推定値≧０．１２５（近親について期待されるレベル）を有するそれぞれのペアのうちの一方を除去することによって、潜在的な遺伝子関連性について検査した。ＩＢＤ推定値は、遺伝子型ミッシングデータ率≦０．０１、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｐ≧１×１０−５、およびマイナー対立遺伝子頻度≧０．０１を有する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０、５５０、および３００チップに共通であったＳＮＰを使用して計算した。その結果、５０６人の個人を排除した（これがＣｏｒｉｅｌｌおよびＡＬＳ対照群の両方に含まれていた３１１人の個人を含むことに注目されたい）。
【００６４】
発明者らはまた、非ヨーロッパ人の家系を検出しようとした。この目的のために、すべてのコホートにおいて分類されたＳＮＰからの遺伝子型データを、ＨａｐＭａｐプロジェクトからの２１０人の無関係なヨーロッパ人（ＣＥＵ）、アジア人（ＣＨＢとＪＰＴ）、およびヨルバ族（ＹＲＩ）の試料からの同じＳＮＰの遺伝子型とマージした。広範囲な領域の連鎖不平衡におけるＳＮＰの除去に続いて（ｃｈｒ５：４４−５１．５  Ｍｂ；ｃｈｒ６：  ２５−３３．５  Ｍｂ；ｃｈｒ８：  ８−１２  Ｍｂ；ｃｈｒ１１：  ４５−５７  Ｍｂ）１９、５０−ＳＮＰウィンドウ内のいかなるペアも、ｒ２＞０．２を有する場合、発明者らはさらにＳＮＰを除去した。ゲノムワイド平均の状態による同一性（ＩＢＳ）の距離は、５７，９６６のＳＮＰ（すべて遺伝子型ミッシングデータ率≦０．０１、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｐ≧１×１０−５、および  マイナー対立遺伝子頻度≧０．０１を有する）に基づいて、結果として生じるデータセットにおけるそれぞれのペアの個人の間でＰＬＩＮＫにおいて計算した。ＩＢＳ距離の結果として生じるマトリックスは、Ｒ  ｖ２．７．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）における古典的多次元尺度構成法（ＭＤＳ）に入力として使用した。最初の二次元を抽出し、互いにプロットすると、３つのクラスターは、ヨーロッパ人の試料、アジア人の試料、およびヨルバ族の試料に対応して観察された。１６の試料が、ヨーロッパ人のクラスターからの人種的アウトライアーであるように思われ、さらなる分析から排除した。
【００６５】
発明者らは、遺伝的変異の連続的な軸を推論するために、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ２０において実行される主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、データ内の集団構造を評価した。固有ベクトルは、すべてのアレイに共通の５７，９６６のＳＮＰの先に記載されたＬＤ除去サブセットに基づいて計算した。ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴプログラムはまた、家系が、変異の上位１０の軸のうちの１つの平均値から少なくとも６標準偏差である個人として定義される遺伝子のアウトライアーをも同定する。その結果、１８８のアウトライアーを同定し、排除した。試料ＱＣの後に、３，９４１人のＡＤ症例および７，８４８人の対照が分析に含まれた。
【００６６】
段階１：ＳＮＰ精度管理
常染色体ＳＮＰのみがこの分析に含まれた。個人は、このプロジェクトの一部として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ６１０−ｑｕａｄ上で遺伝子型を同定したまたはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ５５０またはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨａｐ３００アレイ上で先に遺伝子型を同定し、遺伝子型を発明者らに入手可能にした。ＳＮＰは、この研究に含める前に、いくつかの群から既にフィルタリングされて外されていたことに注意されたい。さらに、同じアレイの異なるバージョンが使用される場合（たとえば、１９５８年出生コホート（Ｔ１ＤＧＣ）の遺伝子型を同定するために使用したＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３アレイと比較した、１９５８年出生コホート（Ｓａｎｇｅｒ）コホートの遺伝子型を同定するために使用したＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１）、両方のバージョンに共通のＳＮＰのみがそのアレイ上に存在するものとして考慮した。そのため、発明者らの分析に含まれたＳＮＰは、４つの異なるカテゴリーに分類された；１）３つのアレイすべてに共通で、すべての個人において遺伝子型を同定した２６６，７１４のＳＮＰ；２）６１０および５５０のアレイに共通しているが、３００アレイ上に存在しないまたは３００アレイ上で分類された個人における遺伝子型を有していない２０２，５１６のＳＮＰ；３）６１０および３００のアレイに共通しているが、５５０アレイ上に存在しないまたは５５０アレイで分類された個人における遺伝子型を有していない７，７４４のＳＮＰ；４）６１０のデータにのみ遺伝子型を有する１０５，６１４のＳＮＰ（表Ｓ６を参照されたい）。
【００６７】
発明者らは、ＡＤとの真の関連を示すかもしれないマーカーを排除することなく、成績の悪いＳＮＰを除去することを目標として、ミッシングデータ率およびＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇフィルターの効果を評価した。４つのＳＮＰカテゴリーのそれぞれについて、マーカーは、症例または対照において、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）＜０．０１またはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｐ≦１ｘ１０−５を有した場合、排除した。それらが症例または対照において＞０．０３の遺伝子型ミッシング率を有した場合、ＭＡＦ≧０．０５を有するＳＮＰは排除した。０．０１および０．０５の間のＭＡＦを有するＳＮＰについて、０．０１のより厳密な遺伝子型ミッシング率閾値を使用した。この基礎的なＳＮＰ  ＱＣの結果、４３，５４２のＳＮＰを排除した。
【００６８】
先に記載されるように、１０の主成分（ＰＣ）は、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴを使用して抽出した。ＰＣが発明者らの試料内の集団構造を満たすかどうかを判断するために、発明者らは、共変数として０〜１０の上位のＰＣを連続して含めて、ＡＤとの関連についてロジスティック回帰テストを実行した。ＰＣを含むインパクトは、ゲノムの対照インフレーション因子、λを計算することによって評価した２１。発明者らは、共変数として最初の４つのＰＣを含むことがλに対する最大の影響を及ぼしたことを発見した（表Ｓ７を参照されたい）。
【００６９】
第１種過誤率のインフレーションをもたらす可能性があるチップ間およびコホート間差異を最小限にするために、マイナー対立遺伝子頻度は、先に記載されるように共変数として上位の４つのＰＣを組み込んで、ロジスティック回帰分析を使用して、異なる群において対照の間で比較した。比較は、同じ地理的地域（つまりイギリス諸島、ドイツ、または米国）からの個人の間でのみ実行し、１）１９５８年出生コホート（Ｓａｎｇｅｒ）対１９５８年出生コホート（Ｔ１ＤＧＣ）；２）１９５８年出生コホート（ＳａｎｇｅｒおよびＴ１ＤＧＣの組み合わせ）対６１０英国対照；３）１９５８年出生コホート（ＳａｎｇｅｒおよびＴ１ＤＧＣの組み合わせ対ＡＬＳ英国対照；４）６１０英国対照対ＡＬＳ英国対照；５）ＨＮＲコホート対Ｋｏｒａコホート；６）６１０ドイツ対照対ＨＮＲおよびＫｏｒａコホートの組み合わせ；７）Ｍａｙｏ対照対ＡＬＳ米国対照；８）Ｃｏｒｉｅｌｌコホート対ＭａｙｏおよびＡＬＳ米国対照の組み合わせ；９）６１０米国対照対ＭａｙｏおよびＡＬＳ米国対照の組み合わせ；１０）６１０の米国対照対Ｃｏｒｉｅｌｌコホートを含んだ。さらに、比較２、４、６、７、９、および１０の結果として、高齢スクリーニング対照は、非スクリーニング／集団対照と比較した。
【００７０】
それぞれの４つのカテゴリーのＳＮＰについて、分位数−分位数（Ｑ−Ｑ）プロットは、それぞれのコホート対照比較のために生成し、ＳＮＰを排除するために使用した有意性閾値は、観察されたχ２統計量がヌル期待値から外れた場所に基づくものとした（表Ｓ８および図４を参照されたい）。さらに９，８２８のＳＮＰをこれらの比較の結果として排除した。したがって、合計５２９，２１８のＳＮＰを本研究におけるＡＤとの関連について分析した。
【００７１】
段階１  統計分析
ＳＮＰは、加法モデルを仮定して、ロジスティック回帰を使用し、ＡＤとの関連について試験した。共変数は、地理的地域およびチップを考慮に入れるために、つまり、１）イギリス諸島からの個人、２）ドイツからの個人、３）６１０または５５０チップ上で分類された米国からの個人、４）３００チップ上に分類された米国からの個人を識別するために、ロジスティック回帰分析中に含めた。対照のみを５５０チップ上で遺伝子型を同定したので、それぞれのチップの共変数を含むことは可能でなかった。同様に、２つのみが症例および対照の両方を含んだので（６１０およびＭａｙｏ群）、８つの群のそれぞれについて共変数を含むことは可能でなかった。ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴから抽出した最初の４つのＰＣもまた、先に記載されるように、共変数として含めた。分析の後に、１３０のクラスタープロットを、ｐ値≦１×１０−４を有するＳＮＰについて視覚的に調査した。不十分なクラスターの形成を示す１３のＳＮＰは排除した。したがって、発明者らの分析は、５２９，２０５のＳＮＰに基づくものであり、０．０５／５２９２０５＝９．４×１０−８の控え目のゲノムワイド有意性閾値を使用した。試験結果のＱ−Ｑプロットを図５に示す。全体的なゲノムの対照インフレーション因子、λは、１．０３７であると計算された。結果は、表Ｓ９において、ｐ値≦１×１０−４を有するＳＮＰについて示す。症例および対照におけるマイナー対立遺伝子頻度の内訳を表Ｓ１０においてゲノムワイド有意ＳＮＰについて示す。
【００７２】
段階２  遺伝子型同定および統計分析
発明者らは、５つのヨーロッパ人のコホートからの症例および対照におけるＳＮＰの遺伝子型を同定した（表Ｓ２およびＳ３に記載される）。遺伝子型同定は、メーカーの推奨に従って、ＭａｓｓＡＲＲＡＹおよびｉＰｌｅｘＧＯＬＤシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、Ｃａｒｄｉｆｆで実行した。分析はすべて、３０の参照Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  Ｈｕｍａｉｎ  （ＣＥＰＨ）  親−子供トリオにおける最適化に基づいて使用に先立って検証した。試料プレートは、症例、対照、およびブランク試料を含有した。精度管理手段は、試料同一性に対して盲検のおよび他の評価者に盲検の独立二重遺伝子型同定ならびに入手可能な場合、ＨａｐＭａｐ（ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ）におけるものに対する発明者らのＣＥＰＨ遺伝子型の比較を含んだ。さらに、ＧＷＡＳに含まれた２３１人の個人もまた、Ｓｅｑｕｅｎｏｍプラットフォーム上で遺伝子型を同定した。発明者らは、両方のプラットフォーム上で分類された７つのＳＮＰについて平均一致率を９９％と計算した。すべての遺伝子型を同定したＳＮＰは、追跡調査試料において遺伝子型コール度数率＞９０％を有し、どのＳＮＰも、症例または対照においてＨＷＥ  Ｐ値≦０．０５を有していなかった。ＳＮＰは、加法モデルを仮定して、ロジスティック回帰を使用し、ＡＤとの関連について試験した。共変数は、それぞれのコホート、つまり、１）ベルギー、２）ＭＲＣ、３）ＡＲＴ、４）ボン、５）ギリシアを考慮に入れるためにロジスティック回帰分析に含めた。
【００７３】
ＣＬＵおよびＰＩＣＡＬＭメタ分析
発明者らは、ＣＬＵおよびＰＩＣＡＬＭ座のＳＮＰについてのメタ分析における段階１および２からの遺伝子型データを含めた。さらに、発明者らは、ＴＧＥＮ研究、公的に入手可能なＡＤ  ＧＷＡＳデータセットからの遺伝子型データを使用した。この試料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋチップ上で遺伝子型を同定した８６１人のＡＤ症例および５５０人の対照から構成される。対象とするＳＮＰが発明者らのＧＷＡＳまたはＴＧＥＮデータセットにおいて遺伝子型を同定されなかった場合、ＰＬＩＮＫにおいて遺伝子型を帰属させるための試みが、参照パネルとして６０のＨａｐＭａｐ  ＣＥＵ初代を使用してなされた。０．８を超える情報量計量値を有する帰属されたＳＮＰのみを分析に含めた（ＰＬＩＮＫウェブサイトを参照されたい）。ＳＮＰは、加法モデルを仮定して、ロジスティック回帰を使用し、ＡＤとの関連について試験した。共変数は、段階１における地理的地域およびチップならびに段階２におけるコホートについて考慮するためにロジスティック回帰分析に含めた。ＴＧＥＮ試料に含めた共変数は、オランダＢｒａｉｎ  Ｂａｎｋからの試料および米国からの試料を識別した。メタ分析の結果は、表１および表Ｓ１１に示す。
【００７４】
ＡＢＣＡ７およびＭＳ４Ａメタ分析
発見メタ分析
発明者らは、ＡＢＣＡ７およびＭＳ４Ａ座のＳＮＰについてのメタ分析における段階１および全段階２試料からの遺伝子型データを含んだ。さらに、発明者らは、加法モデルを仮定し、ＴＧＥＮ  ｓｔｕｄｙについて出身国共変数を含めて、ロジスティック回帰を使用して、ＡＤに対する関連について社内で分析した、共に公的に入手可能なＡＤ  ＧＷＡＳデータセットであるＴＧＥＮ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）２２およびＡＤＮＩ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）２３研究からの遺伝子型データを使用した１０。発明者らは、最初に、ＧＥＲＡＤ１、ＡＤＮＩ、およびＴＧＥＮデータセットの分散逆数重みづけ固定効果メタ分析を実行した。その後、このメタ分析からのＰ値は、フィッシャーの組み合わせ確率検定を使用して、ＥＡＤＩ１（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｓｔａｇｅ  １）２４研究からの公的に入手可能なＰ値と組み合わせた（ＥＡＤＩ１研究において遺伝子型を同定したすべてのＳＮＰについて、オッズ比および分散は公的に入手可能でなく、したがって、すべての４つのＧＷＡＳの分散逆数重みづけメタ分析を不可能にしたことに注目されたい）。組み合わせ分析は、４９６７６３の常染色体ＳＮＰを試験した。これらのＳＮＰは、発明者らの段階１試料ならびにＡＤＮＩおよびＥＡＤＩ１  ＧＷＡ研究のそれぞれにおいてＱＣを通過し、５２３９１のこれらのＳＮＰもまた、遺伝子型を同定し、ＴＧＥＮ  ＧＷＡＳ（他の研究と異なりＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ５００Ｋアレイを使用した）においてＱＣを通過した。組み合わせ分析において、６１のＳＮＰがＰ≦１×１０−５でＡＤと関連した（表Ｓ１４を参照されたい）。
【００７５】
すべての入手可能なデータの分散逆数重みづけメタ分析
発明者らの段階２試料において関連について証拠を示した５つのＳＮＰについて（Ｐ＜０．０５）、概略のデータ（オッズ比および分散を含む）は、ＣＨＡＲＧＥ（Ｃｏｈｏｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）２５およびＥＡＤＩ１研究から得、すべてのデータ（つまり発明者らの段階１＆２、ＥＡＤＩ１、ＡＤＮＩ、ＴＧＥＮ、およびＣＨＡＲＧＥ）は、分散逆数重みづけ固定効果メタ分析において組み合わせた（１１６０７人までの症例および３１８７１人の対照の全試料）。コクランのＱ−検定を実行し、Ｉ２は異質性を評価するために計算した。同じ方向の効果が、ＣＲ１  ＳＮＰ  ｒｓ３８１８３６１について分析したすべての研究において観察されたが、異質性のいくらかの証拠があった（コクランのＱ検定  Ｐ＝０．０２、Ｉ２＝６５％）。このＳＮＰのランダム効果メタ分析もまた、比較のために実行した（表Ｓ１５を参照されたい）。
【００７６】
第２の分析
発明者らはまた、発症の年齢（ＡＡＯ）との関係についてＧＷＳ  ＳＮＰをも試験した。この目的のために、発症の年齢（年）は、線形回帰分析における従属変数として使用し、加法モデルを仮定した。ＡＡＯデータは、２，８５６人のＡＤ症例について入手可能であった。共変数は、地理的地域およびチップを考慮するために、つまり、１）イギリス諸島からの症例、２）ドイツからの症例、３）６１０チップ上で分類された米国からの症例、４）３００チップ上で分類された米国からの症例を識別するために、ロジスティック回帰分析に含めた。結果は、表Ｓ１２に示す。
【００７７】
さらに、発明者らは、少なくとも１つのＡＰＯＥε４対立遺伝子の存在／不在に基づいて試料を層別化した。発明者らは、６０４５人の個人についてＡＰＯＥ遺伝子型データを有した；発明者らのε４−陽性試料は、２，２０３人のＡＤ症例および６３２人の対照から成り、発明者らのε４−陰性試料は、１，４４６人の症例および１，７６４人の対照から成った。発明者らは、それぞれの小口試料においてＡＤとの関連についてゲノムワイド試験を実行したが、どのＳＮＰも、ゲノムワイド有意性を達成しなかった（データ示さず）。
【００７８】
有意ＳＮＰの期待数
発明者らは、発明者らが、偶然期待されるよりも段階１でより有意なＳＮＰを観察したかどうかを決定するために発明者らの結果を評価した。発明者らは、最初、危険性ＳＮＰの両側５００ｋｂ以内のＳＮＰ、つまりｒｓ４２９３５８（ＡＰＯＥε４  ＳＮＰ）、ｒｓ１１１３６０００（ＣＬＵ）、およびｒｓ３８５１１７９（ＰＩＣＡＬＭ）を除去した。発明者らは、したがって、１７０の「ＡＰＯＥ」ＳＮＰ、２９０の「ＣＬＵ」ＳＮＰ、および２５７の「ＰＩＣＡＬＭ」ＳＮＰを排除した。５２８，４４８の残りのＳＮＰのうち、発明者らは、発明者らが（１５）において記載したアルゴリズムを使用して、３９７，２２４．７の「独立」検定を評価した。有意性レベルα＝１０−５の１６の有意なＳＮＰのうちで（ＡＰＯＥ、ＣＬＵ、およびＰＩＣＡＬＭ  ＳＮＰを排除）、発明者らは、１２．６「独立」検定を評価した。発明者らは、二項分布を使用して、α＝１０−５レベルで、有意差検定の期待数の平均値（Ｎ＊α＝３９７２２４．７＊１０−５≒４．０）および分散（Ｎ＊α＊（１−α）＝３．９７）を計算した。したがって、１２．６の有意差検定を観察する可能性はＰ＝７．５×１０−６である。
【００７９】
連鎖不平衡試験
新規なＧＷＳ座の予備的な分析：２つの関連する遺伝子領域（ＣＬＵおよびＰＩＣＡＬＭ）内の関係をさらに調査するために、発明者らは、それぞれからさらなるＳＮＰを選択し、これらは、どちらも段階１で関連についていくらかの証拠を示し（ｐ≦０．００１）、新規なＧＷＳヒットと連鎖不平衡にある、推定上の機能的なＳＮＰであった（Ｄ’＞０．３）（表Ｓ１１を参照されたい）。予測された機能的ＳＮＰは、ＰｕｐａＳｕｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｉｐｆ．ｅｓ／ｐｕｐａｓｕｉｔｅ／ｗｗｗ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を使用して同定した２６。これらは、独立した試料においてＡＤとの関連について試験し、さらに、ＴＧＥＮ  ＧＷＡＳにおいて関連についてチェックした。４つのさらなるＳＮＰをＣＬＵ座から選択し、１つは段階１でいくらかの証拠を示し（ｒｓ７０１２０１０；ｐ＝８×１０−４）、３つは推定上の機能的な有意性を有したが、段階１において分類されなかった（ｒｓ３０８７５５４、ｒｓ９３３１８８８、およびｒｓ７９８２、表Ｓ１１を参照されたい）。ｒｓ７０１２０１０は、本来の段階２試料において関連について証拠を示さず、ＴＧＥＮデータセット（ｐ＝０．０３３）においていくらかの証拠を示したが、ＧＷＳのメタ分析において有意レベルに達しなかった（ｐ＝１×１０−４）。残りのＳＮＰの２つは、関連について証拠を示さなかったのに対して、第３のｒｓ７９８２、クラスタリンにおいてＧＷＳ  ＳＮＰとの強力なＬＤにおける同義のＳＮＰ（ＨａｐＭａｐ  ＣＥＵ個人においてｒ２＝１；拡張試料においてｒ２＝０．９５）は、同様の大きさの効果で本来の段階２試料において関連を示した（メタｐ＝８×１０−１０；段階１遺伝子型が帰属した）。
【００８０】
発明者らは、ＰＩＣＡＬＭ座から追跡調査のために８つのさらなるＳＮＰを選択し、半分は、段階１において関連について有意な証拠を示し、半分はそれらの推定上の機能について選ばれた（表Ｓ１１を参照されたい）。最初の４つのＳＮＰのうちの３つは、本来の段階２およびＴＧＥＮの試料の両方において関連について証拠を示し、４番目のものは、ＴＧＥＮデータセットのみにおいて関連を示した。ｒｓ６７７９０９、ｐ＝３×１０−８；ｒｓ５４１４５８、ｐ＝５×１０−９；ｒｓ５４３２９３、ｐ＝１×１０−８；およびｒｓ７９４１５４１  ｐ＝３×１０−９のｐ値の組み合わせを生成しても、このうちのどれも、本来のＧＷＳ  ＳＮＰを超えたものはなかった。これらのＳＮＰはすべて、本来のＧＷＳ  ＳＮＰと高いＬＤにあった。関連について好都合の証拠を示した、唯一の潜在的に機能的なＳＮＰは、推定上の転写因子結合部位内にあるｒｓ５６１６５５および推定上のエクソンスプライシングエンハンサーに影響を及ぼすかもしれない遺伝子のエクソン５において同義のＳＮＰであるｒｓ５９２２９７であった。しかしながら、これらのＳＮＰのどちらも、ｒｓ３８５１１７９、ＧＷＳ  ＳＮＰについて観察された関連について証拠の強さを示さず、それぞれ、メタｐ＝１×１０−７およびｐ＝２×１０−７を生成した。
【００８１】
結論
発明者らの結果は、本明細書において記載される遺伝子がＡＤについての真の感受性遺伝子であるという説得力のある証拠を提供する。しかしながら、発明者らの発見のさらに印象的な暗示は、Ａβ蓄積にとどまらない、さらなる疾患メカニズムについての支援である。３つ、おそらく４つの最近同定されたＡＤ感受性の座（ＣＬＵ、ＣＲ１、ＡＢＣＡ７＆ＭＳ４Ａ遺伝子クラスター）は、免疫系、特に古典補体経路において知られている機能を有する。さらに、ＰＩＣＡＬＭおよびＢＩＮ１の両方は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与し、ＡＰＯＥ、ＣＬＵ、およびＡＢＣＡ７は、脂質プロセシングに関与する。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
【表２】
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【００８４】
【表３】
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【００８５】
【表４】
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【００８６】
【表５】
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【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【００８９】
【表８】
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【００９０】
【表９】
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【００９１】
【表１０】
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【００９２】
【表１１】
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【００９３】
【表１２】
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【００９４】
【表１３】
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【００９５】
【表１４】
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【００９６】
【表１５】
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【００９７】
【表１６】
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【００９８】
【表１７】
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【００９９】
【表１８】
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【０１００】
【表１９】
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参考文献
1. Abraham, R. A genome-wide association study for late-onset Alzheimer's disease using DNA pooling. BMC Med. Genomics 1, 44 (2008).
2. Beecham, G. Genome-wide association study implicates a chromosome 12 risk locus for late-onset Alzheimer disease. Am. J. Hum. Genet. 84, 35-43 (2009).
3. Bertram, L. Genome-wide association analysis reveals putative Alzheimer's disease susceptibility loci in addition to APOE. Am. J. Hum. Genet. 83, 623-632 (2008).
4. Carrasquillo, M. Genetic variation in PCDH11X is associated with susceptibility to late-onset Alzheimer's disease. Nat. Genet. 41, 192-198 (2009).
5. Coon, K. A high-density whole-genome association study reveals that APOE is the major susceptibility gene for sporadic late-onset Alzheimer's disease. J. Clin. Psychiatry 68, 613-618 (2007).
6. Grupe, A. Evidence for novel susceptibility genes for late-onset Alzheimer's disease from a genome-wide association study of putative functional variants. Hum. Mol. Genet. 16, 865-873 (2007).
7. Li, H. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch. Neurol. 65, 45-53 (2008).
8. Reiman, E. GAB2 alleles modify Alzheimer's risk in APOE epsilon4 carriers. Neuron 54, 713-720 (2007).
9. Harold, D. et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and PICALM associated with Alzheimer's disease. Nat Genet 41, 1088-1093 (2009).
10. Hollingworth, P. et al. Evidence that ABCA7 and MS4A are novel susceptibility loci for Alzheimer’s disease and further support for BIN1 and CR1. Nature Genetics Submitted, 
11. Wichmann, H., Gieger, C. & Illig, T. KORA-gen--resource for population genetics, controls and a broad spectrum of disease phenotypes. Gesundheitswesen 67 Suppl 1, S26-30 (2005).
12. Birnbaum, S. et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat. Genet 41, 473-477 (2009).
13. Hillmer, A.M. et al. Susceptibility variants for male-pattern baldness on chromosome 20p11. Nat. Genet 40, 1279-1281 (2008).
14. Brouwers, N. et al. Genetic variability in progranulin contributes to risk for clinically diagnosed Alzheimer disease. Neurology 71, 656-664 (2008).
15. Teo, Y.Y. et al. A genotype calling algorithm for the Illumina BeadArray platform. Bioinformatics 23, 2741-2746 (2007).
16. Clayton, D.G. et al. Population structure, differential bias and genomic control in a large-scale, case-control association study. Nat Genet 37, 1243-1246 (2005).
17. Moskvina, V., Craddock, N., Holmans, P., Owen, M.J. & O&rsquo;Donovan, M.C. Effects of Differential Genotyping Error Rate on the Type I Error Probability of Case-Control Studies. Hum Hered 61, 55-64 (2006).
18. Purcell, S. et al. PLINK: A Tool Set for Whole-Genome Association and Population-Based Linkage Analyses. The American Journal of Human Genetics 81, 559-575 (2007).
19. Price, A.L. et al. Long-Range LD Can Confound Genome Scans in Admixed Populations. The American Journal of Human Genetics 83, 132-135 (2008).
20. Price, A.L. et al. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat. Genet 38, 904-909 (2006).
21. Devlin, B. & Roeder, K. Genomic control for association studies. Biometrics 55, 997-1004 (1999).
22. Reiman, E.M. et al. GAB2 alleles modify Alzheimer's risk in APOE epsilon4 carriers. Neuron 54, 713-720 (2007).
23. Potkin, S.G. et al. Hippocampal atrophy as a quantitative trait in a genome-wide association study identifying novel susceptibility genes for Alzheimer's disease. PLoS ONE 4, e6501 (2009).
24. Lambert, J. et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat. Genet 41, 1094-1099 (2009).
25. Seshadri, S. et al. Genome-wide analysis of genetic loci associated with Alzheimer disease. JAMA 303, 1832-1840 (2010).
26. Conde, L. et al. PupaSuite: finding functional single nucleotide polymorphisms for large-scale genotyping purposes. Nucleic Acids Res 34, W621-625 (2006).
【図１】
2014012007.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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