(57)【要約】【課題】試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができる、試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬を提供する。【解決手段】本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法は、次の（ａ）〜（ｄ）の工程を含むものである。（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程  また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬は、第二の酸化還元物質、及び被酸化物質を含有するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、試料中の対象物質の酸化活性の測定方法。
（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程
（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程
（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程
（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程
【請求項２】
第二の酸化還元物質、及び被酸化物質を含有する、試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬。
【請求項３】
第一の酸化還元物質を含有する、請求項２記載の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができる測定方法及び測定試薬に関するものである。
【０００２】
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００３】
活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）については、老化や種々の疾患との関係が論じられている。
そして、生体内における酸化反応等が、この活性酸素種の産生に関わっていると考えられている。
このため、生体内における物質の酸化能力を測定することは、この活性酸素種による細胞障害等の予防、診断及び治療等の面で大変重要になってきている。
【０００４】
例えば、活性酸素種は、鉄や銅の存在により、フェントン反応（Ｆｅｎｔｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても生成する。
【０００５】
生体内に最も多く存在する金属元素である鉄は、細胞内の酸化還元反応やヘモグロビン合成等に関与している。
【０００６】
生体内の鉄の量は、複数の鉄代謝関連分子によって厳密に調節されており、過剰量の鉄が体内に蓄積されないよう、吸収と排泄が半閉鎖系を形成することで代謝のバランスを保っている。
【０００７】
しかしながら、長期間の輸血や鉄剤の投与等によって鉄過剰状態が容易に惹起されることが明らかになっており、このようなケースではトランスフェリンが鉄で飽和してしまい、トランスフェリン以外の鉄結合性物質に過剰な鉄が結合した非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ；Ｎｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｉｒｏｎ）が出現すると考えられている。〔なお、この非トランスフェリン結合鉄の内、不安定性血清鉄（Ｌａｂｉｌｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｒｏｎ；ＬＰＩ）〕を分けて考える考え方もあるが、本発明においては、特に言及しない限り、非トランスフェリン結合鉄は、この不安定性血清鉄を含めて考えるものとする。〕
【０００８】
鉄過剰状態において血液中に出現した非トランスフェリン結合鉄は、ペプチドや有機酸等の低分子、アルブミンのような巨大分子と弱いアフィニティーで結合して血中を循環する。
【０００９】
これまで、非トランスフェリン結合鉄が生体内の酸素や過酸化水素と連鎖的に反応することでオキソ架橋二核鉄（ＩＩＩ）が形成され、細胞障害を誘引する可能性が報告されてきた。
また、非トランスフェリン結合鉄が、その酸化活性により活性酸素種の産生を触媒することで酸化ストレスを亢進させるモデルが提唱されている。
【００１０】
以上のようなメカニズムにより、血中に非トランスフェリン結合鉄が存在すると、肝、内分泌腺又は心等の臓器において、脂質、タンパク質又はＤＮＡが損傷を受け、細胞死や変性疾患、癌化が促進されることが知られており、鉄過剰と細胞毒性の密接な関係性が示唆されつつある（非特許文献１、非特許文献２、及び、非特許文献３参照。）。
【００１１】
上述の通り、生体内の物質の酸化活性による反応等に由来して生成する活性酸素種については種々研究が行なわれているものの、その基となる生体内の物質の酸化活性の測定は、これまで煩雑なものであった。
【００１２】
例えば、従来、生体内の酸化活性を測定しようとする物質（対象物質）の酸化活性を測定する方法及び試薬としては、Ｃａｂａｎｔｃｈｉｃｋらによる、非トランスフェリン結合鉄の酸化活性に由来して産生された活性酸素種を酸化感受性蛍光プローブ「ジヒドロキシローダミン（ＤＨＲ）」の発する蛍光により測定する方法及び試薬が知られていた。
この測定方法及び測定試薬であるが、Ｃａｂａｎｔｃｈｉｃｋらによると、試料中の非トランスフェリン結合鉄は、還元剤（アスコルビン酸）及び空気中の酸素により、酸化（Ｆｅ３＋）、還元（Ｆｅ２＋）双方の形態を取り、フェントン反応を介して活性酸素種が産生され、産生した活性酸素種を酸化感受性蛍光プローブ「ＤＨＲ」の発する蛍光により測定するというものである。
そして、鉄キレート剤を用いると、鉄イオンを介した酸化還元産生サイクルが特異的に阻害されるので、この鉄キレート剤の有無による酸化感受性蛍光プローブ「ＤＨＲ」の蛍光量を比較して、鉄による活性酸素種の産生量から、試料中の不安定性血清鉄量を半定量的に算出するというものである（特許文献１、特許文献２、及び、非特許文献４参照。）。
【００１３】
しかしながら、この従来の測定方法及び測定試薬は、生成した活性酸素種を直接蛍光で測定する測定方法のため、温度調節機能付の蛍光プレートリーダー等の蛍光測定が可能な特別な装置が必要となる。
また、測定のための操作の数が多く、煩雑であり、また、測定時間も蛍光強度の測定に４０分以上必要とするものであった。
このように、従来の測定方法及び測定試薬は、対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができるようなものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開公報ＵＳ２００３／０１０４４９１
【００１５】
【特許文献２】国際特許出願国際公開公報ＷＯ２００４／０４０２５２
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５４巻，１１８〜１２３頁，２００５年
【００１７】
【非特許文献２】高後，臨床環境医学，１７巻，７３〜８１頁，２００８年
【００１８】
【非特許文献３】生田，透析会誌，４２巻，８１５〜８１７頁，２００９年
【００１９】
【非特許文献４】フナコシニュース，２０１２年６月１日号，６頁，２０１２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
前記のように、従来の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、その測定に、特別な装置を要し、また、測定のための操作の数が多く、煩雑であり、そして、測定に要する時間が長いものであった。
すなわち、従来の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができるようなものではなかった。
【００２１】
本発明者らは、この従来の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬が有する難点の解消を目指して鋭意検討を行った結果、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、以下の発明を包含するものである。
【００２３】
（１）  次の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、試料中の対象物質の酸化活性の測定方法。
（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程
（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程
（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程
（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程
（２）  第二の酸化還元物質、及び被酸化物質を含有する、試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬。
（３）  第一の酸化還元物質を含有する、前記（２）記載の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができるという効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度を測定した結果を示したグラフである。
【００２６】
【図２】試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定反応のタイムコースを示したグラフである。
【００２７】
【図３】試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度を測定した結果を示したグラフである。
【００２８】
【図４】キレート薬を添加した試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を測定した結果を示したグラフである。
【００２９】
【図５】キレート薬を添加した試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度を測定した結果を示したグラフである。
【００３０】
【図６】試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度を測定した結果を示したグラフである。
【００３１】
【図７】ウシ血清アルブミン水溶液とクエン酸鉄水溶液を混合した試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を測定した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法
１．総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法は、次の工程を含むものである。
（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程
（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程
（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程
（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程
【００３３】
そして、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法は、前記の構成により、試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することができる。
【００３４】
２．第一の酸化還元物質
（１）総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」、及び「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」を含む。
【００３５】
（２）第一の酸化還元物質
本発明において、第一の酸化還元物質とは、対象物質により酸化されることが可能であって、かつ、この酸化された第一の酸化還元物質が第二の酸化還元物質を酸化することが可能なものをいう。
このような物質であれば特に限定はない。
【００３６】
なお、本発明において、第一の酸化還元物質としては、例えば、金属、金属と結合している物質、又は金属を含む物質等を挙げることができる。
【００３７】
この金属としては、例えば、銅、鉄、又はコバルトなどの遷移金属等を挙げることができる。
【００３８】
金属と結合している物質又は金属を含む物質としては、例えば、金属と結合可能な又は金属を含むタンパク質、ペプチド、糖類、脂質、有機化合物、無機化合物、細胞、又は生体組織であって、金属が結合したもの等を挙げることができる。
【００３９】
この金属と結合している物質又は金属を含む物質として、より具体的には、例えば、金属を補欠分子族とするタンパク質等を挙げることができ、更に具体的には、銅を補欠分子族とするタンパク質、鉄を補欠分子族とするタンパク質等を挙げることができる。
【００４０】
この銅を補欠分子族とするタンパク質としては、例えば、セルロプラスミン、ヘモシアニン、チロシナーゼ、又はラッカーゼ等を挙げることができる。
また、この鉄を補欠分子族とするタンパク質としては、例えば、トランスフェリン又はフェリチン等を挙げることができる。
【００４１】
本発明において、第一の酸化還元物質としては、本発明の効果、すなわち試料中の対象物質の酸化活性の迅速かつ簡便な測定という効果の上から、銅と結合している物質又は銅を含む物質が好ましい。
【００４２】
なお、前記の本発明の効果の上から、銅を補欠分子族とするタンパク質がより好ましい。
【００４３】
そして、本発明の第一の酸化還元物質としては、前記の本発明の効果の上から、セルロプラスミン、ヘモシアニン、チロシナーゼ、又はラッカーゼが更に好ましく、セルロプラスミンが特に好ましい。
【００４４】
（３）第一の酸化還元物質の濃度
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法において、第一の酸化還元物質の濃度は、特に限定されないが、「（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において当該対象物質による酸化によって第一の酸化還元物質の全てが酸化されてしまうことがない十分な濃度で存在させればよい。
【００４５】
本発明において、第一の酸化還元物質の濃度は、前記の本発明の効果の上から、「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において、１．２５ｎＭ以上であることが好ましい。
【００４６】
なお、この第一の酸化還元物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において、より好ましくは０．０１μＭ以上であり、特に好ましくは０．０３μＭ以上である。
【００４７】
また、この第一の酸化還元物質の濃度であるが、「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」における濃度に特に上限はないが、コスト等のことを考えると、１ｍＭ迄で十分である。
【００４８】
なお、この第一の酸化還元物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において、より好ましくは０．５ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．１ｍＭ以下である。
【００４９】
なお、本発明における第一の酸化還元物質であるが、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第一の酸化還元物質が含まれる場合は、この試料に含まれる第一の酸化還元物質をそのまま本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用すればよい。
【００５０】
なお、この試料に含まれる第一の酸化還元物質をそのまま本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用する場合、測定しようとする試料に含まれる第一の酸化還元物質の濃度が前記の測定に十分な濃度ではない場合には、第一の酸化還元物質を添加して、前記の測定に十分な濃度としてやる必要がある。
【００５１】
なお、非常にまれではあるが、第一の酸化還元物質に関する遺伝子の欠損等により、測定しようとする試料に含まれる第一の酸化還元物質の濃度が低い場合があるので、必須ではないが、本発明による測定に当たっては、試料に含まれる第一の酸化還元物質を使用することを念頭におかず、第一の酸化還元物質の添加により前記の測定に十分な濃度とするか、又は前記の測定に十分な濃度となるような第一の酸化還元物質を含有する測定試薬を測定に用いることが好ましい。
【００５２】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において、前記の濃度となるような濃度の第一の酸化還元物質を存在させることが好ましい。
【００５３】
また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、当該測定試薬に第一の酸化還元物質を含有させる場合には、当該第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合し、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質を接触させ、当該第一の酸化還元物質が当該対象物質により酸化される時に、当該第一の酸化還元物質が前記の濃度となるような濃度の当該第一の酸化還元物質を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
【００５４】
（４）第一の酸化還元物質の対象物質による酸化
本発明において、「（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」は、特に限定されるものではなく、第一の酸化還元物質が対象物質により酸化されるものであればよい。
【００５５】
この「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」は、例えば、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合し、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質を接触させ、当該第一の酸化還元物質が当該対象物質により酸化されるものであってよい。
【００５６】
また、当該工程は、第一の酸化還元物質を試料に添加し、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質を接触させ、当該第一の酸化還元物質が当該対象物質により酸化されるものであってよい。
【００５７】
また、当該工程は、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第一の酸化還元物質が含まれる場合は、当該第一の酸化還元物質は、試料中における当該対象物質との接触によって、当該対象物質により酸化されるものであってよい。
【００５８】
また、当該工程は、例えば、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第一の酸化還元物質が含まれる場合、当該試料に含まれていた第一の酸化還元物質及び別途添加された第一の酸化還元物質が、試料に含まれていた当該対象物質により酸化されるもの等であってよい。
【００５９】
なお、本発明の「第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」において、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合等して、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質を接触させ、当該第一の酸化還元物質が当該対象物質により酸化されることであるが、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質との接触の時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。
【００６０】
また、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質との接触の際の温度は、当該第一の酸化還元物質と当該試料に含まれていた対象物質を含む溶液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると対象物質、又は反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、当該接触時の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、反応に係わる成分等が耐熱性の物質であれば、当該物質等が許容できる更に高い温度でもよい。
【００６１】
なお、本発明において、「（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」は、他の工程、すなわち前記の（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の工程と、同時に行なってもよい。
【００６２】
３．第二の酸化還元物質
（１）総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」、及び「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」を含む。
【００６３】
（２）第二の酸化還元物質
本発明において、第二の酸化還元物質とは、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されることが可能であって、かつ、この酸化された第二の酸化還元物質が被酸化物質を酸化することが可能なものをいう。
このような物質であれば特に限定はない。
【００６４】
なお、本発明において、第二の酸化還元物質としては、例えば、金属、金属と結合している物質、又は金属を含む物質等を挙げることができる。
【００６５】
この金属としては、例えば、鉄、銅、又はコバルトなどの遷移金属等を挙げることができる。
【００６６】
金属と結合している物質又は金属を含む物質としては、例えば、金属と結合可能な又は金属を含む無機化合物、有機化合物、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、細胞、又は生体組織であって、金属と結合しているもの等を挙げることができる。
【００６７】
この金属と結合している物質又は金属を含む物質として、より具体的には、例えば、鉄と結合している物質又は鉄を含む物質等を挙げることができ、更に具体的には、鉄と結合している又は鉄を含む、無機化合物、有機化合物、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、細胞、又は生体組織等を挙げることができる。
【００６８】
この鉄と結合している無機化合物又は鉄を含む無機化合物としては、例えば、フェロシアン化物等を挙げることができる。
【００６９】
このフェロシアン化物としては、例えば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化カルシウム、又はフェロシアン化ナトリウムなどの塩等を挙げることができる。
【００７０】
本発明において、第二の酸化還元物質としては、本発明の効果、すなわち試料中の対象物質の酸化活性の迅速かつ簡便な測定という効果の上から、鉄と結合している物質又は鉄を含む物質が好ましい。
なお、前記の本発明の効果の上から、鉄と結合している無機化合物又は鉄を含む無機化合物がより好ましい。
そして、本発明の第二の酸化還元物質としては、前記の本発明の効果の上から、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化カルシウム、又はフェロシアン化ナトリウム等のフェロシアン化物が更に好ましく、フェロシアン化カリウムが特に好ましい。
【００７１】
（３）第二の酸化還元物質の濃度
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法において、第二の酸化還元物質の濃度は、特に限定されないが、「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において当該第一の酸化還元物質による酸化によって第二の酸化還元物質の全てが酸化されてしまうことがない十分な濃度で存在させればよい。
【００７２】
本発明において、第二の酸化還元物質の濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において、１μＭ以上であることが好ましい。
【００７３】
なお、この第二の酸化還元物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは１ｍＭ以上である。
【００７４】
また、この第二の酸化還元物質の濃度であるが、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」における濃度は、２５ｍＭ迄で十分である。
【００７５】
なお、この第二の酸化還元物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００７６】
なお、本発明における第二の酸化還元物質であるが、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第二の酸化還元物質が含まれる場合は、この試料に含まれる第二の酸化還元物質をそのまま本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用すればよい。
【００７７】
なお、この試料に含まれる第二の酸化還元物質をそのまま本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用する場合、測定しようとする試料に含まれる第二の酸化還元物質の濃度が前記の測定に十分な濃度ではない場合には、第二の酸化還元物質を添加して、前記の測定に十分な濃度としてやる必要がある。
【００７８】
なお、あくまでも可能性としてではあるが、測定しようとする試料に含まれる第二の酸化還元物質の濃度が低い場合も考えられるので、本発明による測定に当たっては、試料に含まれる第二の酸化還元物質を使用することを念頭におかず、第二の酸化還元物質の添加により前記の測定に十分な濃度とするか、又は前記の測定に十分な濃度となるような第二の酸化還元物質を含有する測定試薬を測定に用いることが好ましい。
【００７９】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において、前記の濃度となるような濃度の第二の酸化還元物質を存在させることが好ましい。
【００８０】
また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、当該測定試薬に第二の酸化還元物質を含有させる場合には、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質と当該第二の酸化還元物質の接触により、当該第二の酸化還元物質が当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化される時に、当該第二の酸化還元物質が前記の濃度となるような濃度の当該第二の酸化還元物質を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
【００８１】
なお、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質と当該第二の酸化還元物質の接触は、例えば、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第二の酸化還元物質を含有する測定試薬を混合する方法、又は第一の酸化還元物質及び第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合する方法等の方法により適宜行なうことができる。
【００８２】
（４）酸化された第一の酸化還元物質による第二の酸化還元物質の酸化
本発明において、「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」は、特に限定されるものではなく、第二の酸化還元物質が、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化されるものであればよい。
【００８３】
この「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」は、例えば、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第二の酸化還元物質を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質と当該第二の酸化還元物質を接触させ、当該第二の酸化還元物質が当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【００８４】
また、当該工程は、例えば、第一の酸化還元物質及び第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質と当該第二の酸化還元物質を接触させ、当該第二の酸化還元物質が当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【００８５】
また、当該工程は、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第一の酸化還元物質及び第二の酸化還元物質が含まれる場合は、当該第二の酸化還元物質は、試料中における当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質との接触によって、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【００８６】
また、当該工程は、例えば、対象物質の酸化活性を測定しようとする試料に、この第二の酸化還元物質が含まれる場合、当該試料に含まれていた第二の酸化還元物質及び別途添加された第二の酸化還元物質が、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されるもの等であってよい。
【００８７】
なお、本発明の「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」において、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質と当該第二の酸化還元物質を接触させ、当該第二の酸化還元物質が当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質により酸化されることであるが、当該第二の酸化還元物質と当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質との接触の時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。
【００８８】
また、当該第二の酸化還元物質と当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質との接触の際の温度は、当該第二の酸化還元物質と当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質を含む溶液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると対象物質、又は反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、当該接触時の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、反応に係わる成分等が耐熱性の物質であれば、当該物質等が許容できる更に高い温度でもよい。
【００８９】
なお、本発明において、「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」は、他の工程、すなわち前記の（ａ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の工程と、同時に行なってもよい。
【００９０】
４．被酸化物質
（１）総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」、及び、「（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程」を含む。
【００９１】
（２）被酸化物質
本発明において、被酸化物質とは、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質により酸化されることが可能であって、かつ、この酸化された被酸化物質が測定可能なシグナルを生じさせることが可能なものをいう。
このような物質であれば特に限定はない。
【００９２】
なお、本発明において、測定可能なシグナルとしては、例えば、光学的特徴、電磁気的特徴、化学的特徴、物理的特徴、又は生物的特徴等の生成又は変化等を挙げることができる。
【００９３】
また、本発明において、酸化されることにより、その光学的特徴の生成又は変化等を生じさせることが可能な被酸化物質としては、例えば、酸化されることにより、その吸収スペクトル（吸収波長）を変化させる物質、その吸光度（若しくは透過率）を変化させる物質、その色を生じさせ若しくは変化させる物質、その蛍光強度などを変化させる物質、又はその発光強度などを変化させる物質等を挙げることができる。
【００９４】
なお、酸化されることにより、その光学的特徴の生成又は変化等を生じさせることが可能な被酸化物質としては、より具体的には、例えば、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせ、又は酸化されることにより発色する色素等を挙げることができる。
【００９５】
なお、この酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーであるが、この色原体は、前記の酸化縮合反応時に、水素を放出する水素供与体となる。
【００９６】
前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせの内の色原体であるが、これはこのような物質であれば特に限定なく用いることができるが、例えば、フェノール、フェノール誘導体、又はアニリン誘導体等を、この色原体として挙げることができる。
【００９７】
なお、このフェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００９８】
また、このアニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、若しくはＮ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシ−５−メチルアニリン（ＨＭＭＰＳ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００９９】
また、前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせの内のカップラーであるが、これはこのような物質であれば特に限定なく用いることができるが、例えば、４−アミノアンチピリン若しくはその誘導体、フェニレンジアミン、又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
【０１００】
また、前記の酸化されることにより発色する色素であるが、これはこのような物質であれば特に限定なく用いることができるが、例えば、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）又はこれらの塩等を挙げることができる。
【０１０１】
本発明において、被酸化物質としては、本発明の効果、すなわち試料中の対象物質の酸化活性の迅速かつ簡便な測定という効果の上から、酸化されることにより、その光学的特徴の生成又は変化等を生じさせることが可能なものが好ましい。
【０１０２】
なお、本発明において、被酸化物質としては、前記の本発明の効果の上から、前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせが、より好ましい。
【０１０３】
本発明において、この色原体としては、前記の本発明の効果の上から、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、若しくはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）又はこれらの塩が好ましく、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）又はこれらの塩がより好ましい。
【０１０４】
本発明において、このカップラーとしては、前記の本発明の効果の上から、４−アミノアンチピリンが好ましい。
【０１０５】
（３）被酸化物質の濃度
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法において、被酸化物質の濃度は、特に限定されないが、「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において当該第二の酸化還元物質による酸化によって被酸化物質の全てが酸化されてしまうことがない十分な濃度で存在させればよい。
【０１０６】
本発明において、被酸化物質の濃度は、前記の「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」、すなわち「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、０．００５ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１０７】
なお、この被酸化物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
【０１０８】
また、この被酸化物質の濃度であるが、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」における濃度に特に上限はないが、コスト等のことを考えると、５０ｍＭ迄で十分である。
【０１０９】
なお、この被酸化物質の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。
【０１１０】
なお、本発明において、被酸化物質として、前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせを用いる場合、前記の色原体の濃度は、特に限定されないが、前記の本発明の効果の上から、前記の「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、０．００５ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１１１】
なお、この色原体の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
【０１１２】
また、この色原体の濃度であるが、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」における濃度に特に上限はないが、コスト等のことを考えると、５０ｍＭ迄で十分である。
【０１１３】
なお、この色原体の好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。
【０１１４】
また、本発明において、被酸化物質として、前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせを用いる場合、前記のカップラーの濃度は、特に限定されないが、前記の本発明の効果の上から、前記の「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、０．００５ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１１５】
なお、このカップラーの好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
【０１１６】
また、このカップラーの濃度であるが、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」における濃度に特に上限はないが、コスト等のことを考えると、５０ｍＭ迄で十分である。
【０１１７】
なお、このカップラーの好ましい濃度は、前記の本発明の効果の上から、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。
【０１１８】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、前記の濃度となるような濃度の被酸化物質を存在させることが好ましい。
【０１１９】
また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、当該測定試薬に被酸化物質を含有させる場合には、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質の接触により、当該被酸化物質が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化される時に、当該被酸化物質が前記の濃度となるような濃度の当該被酸化物質を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１２０】
なお、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質の接触は、例えば、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第二の酸化還元物質を含有する測定試薬を混合し、その後これに被酸化物質を含有する測定試薬を混合する方法、第一の酸化還元物質及び第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質を含有する測定試薬を混合する方法、第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第一の酸化還元物質及び被酸化物質を含有する測定試薬を混合する方法、第一の酸化還元物質、第二の酸化還元物質及び被酸化物質（前記の色原体）を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質（前記のカップラー）を含有する測定試薬を混合する方法、又は、第一の酸化還元物質、第二の酸化還元物質及び被酸化物質（前記のカップラー）を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質（前記の色原体）を含有する測定試薬を混合する方法等の方法により適宜行なうことができる。
【０１２１】
（４）酸化された第二の酸化還元物質による被酸化物質の酸化
本発明において、「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」は、特に限定されるものではなく、被酸化物質が、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるものであればよい。
【０１２２】
この「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」は、例えば、第一の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第二の酸化還元物質を含有する測定試薬を混合し、その後これに被酸化物質を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質を接触させ、当該被酸化物質が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【０１２３】
また、当該工程は、第一の酸化還元物質及び第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質を接触させ、当該被酸化物質が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【０１２４】
また、当該工程は、第二の酸化還元物質を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに第一の酸化還元物質及び被酸化物質を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質を接触させ、当該被酸化物質が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【０１２５】
また、当該工程は、第一の酸化還元物質、第二の酸化還元物質及び被酸化物質（前記の色原体）を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質（前記のカップラー）を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質（前記の色原体及びカップラー）を接触させ、当該被酸化物質（前記の色原体及びカップラー）が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるものであってよい。
【０１２６】
また、当該工程は、例えば、第一の酸化還元物質、第二の酸化還元物質及び被酸化物質（前記のカップラー）を含有する測定試薬と試料を混合した後に、これに被酸化物質（前記の色原体）を含有する測定試薬を混合することにより、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質（前記の色原体及びカップラー）を接触させ、当該被酸化物質（前記の色原体及びカップラー）が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されるもの等であってよい。
【０１２７】
なお、本発明の「対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」において、当該対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質と当該被酸化物質を接触させ、当該被酸化物質が当該酸化された第二の酸化還元物質により酸化されることであるが、当該被酸化物質と当該酸化された第二の酸化還元物質との接触の時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。
【０１２８】
また、当該被酸化物質と当該酸化された第二の酸化還元物質との接触の際の温度は、当該被酸化物質と当該酸化された第二の酸化還元物質を含む溶液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると対象物質、又は反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、当該接触時の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、反応に係わる成分等が耐熱性の物質であれば、当該物質等が許容できる更に高い温度でもよい。
【０１２９】
なお、本発明において、「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」は、他の工程、すなわち前記の（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｄ）の工程と、同時に行なってもよい。
【０１３０】
５．シグナルの測定及び対象物質の酸化活性を求めること
（１）総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法においては、「（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程」を含む。
【０１３１】
（２）シグナルの測定及び試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求めること
本発明において、対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質により酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定することは、特に限定はない。
【０１３２】
なお、本発明において、前記の酸化された被酸化物質に由来するシグナルとしては、特に限定はないが、例えば、光学的特徴、電磁気的特徴、化学的特徴、物理的特徴、又は生物的特徴等の生成又は変化等を挙げることができる。
【０１３３】
また、本発明において、前記の酸化された被酸化物質に由来するシグナルが光学的特徴の生成又は変化等である場合、その具体例としては、例えば、その吸収スペクトル（吸収波長）の変化、その吸光度（若しくは透過率）の変化、その色の生成（発色）若しくは色の変化、その蛍光強度などの変化、又はその発光強度などの変化等を挙げることができる。
【０１３４】
本発明において、前記の対象物質により酸化された第一の酸化還元物質によって酸化された第二の酸化還元物質により酸化された被酸化物質に由来するシグナルは、前記の試料中の対象物質の酸化活性と比例するなど一対一で対応するので、このシグナルを測定することにより、試料中の対象物質の酸化活性を求めることができる。
【０１３５】
本発明においては、前記の酸化された被酸化物質に由来するシグナルの測定は、そのシグナルの特徴に応じ、適宜、適した方法により行なえばよい。
【０１３６】
例えば、前記の酸化された被酸化物質に由来するシグナルの測定を、吸光度（又は透過率）の測定により行なう場合、この吸光度（又は透過率）の測定は、一つの波長においてのみ吸光度（又は透過率）の測定を行う一波長法でもよく、又は、二つの波長（主波長及び副波長）においてそれぞれ吸光度（又は透過率）を測定し、主波長における吸光度（又は透過率）から副波長における吸光度（又は透過率）を差し引いて吸光度差を求める二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。
【０１３７】
なお、この吸光度（又は透過率）の測定を行う波長は、この吸光度（又は透過率）の測定を行う物（例えば、前記の色原体とカップラーの酸化縮合により生成した色素、又は前記の酸化により発色した色素等）の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
【０１３８】
また、この吸光度（又は透過率）の測定は、終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して行えばよい。
【０１３９】
なお、この測定した吸光度（若しくは透過率）又は測定した吸光度（若しくは透過率）の変化量〔変化量そのもの、若しくは、単位時間当たりの変化量（変化速度）など〕等より、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値等を求めることもできるが、前記の吸光度（又は透過率）の測定を行う物のモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又は、その酸化活性の値等が分かっている対象物質（標準物質又は標準液）を同様に測定して得た吸光度（若しくは透過率）と対比することにより算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。
また、本発明においては、前記の測定した吸光度（若しくは透過率）又は測定した吸光度（若しくは透過率）の変化量等の値を、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値として定めてもよい。
【０１４０】
なお、前記の酸化された被酸化物質に由来するシグナルの測定を、吸光度（又は透過率）の測定により行なう場合には、測定して得た吸光度（又は透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値等を求めることが好ましい。
【０１４１】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定の操作は、測定者自身が用手法により行ってもよいし、自動分析装置等の装置を使用して行ってもよいし、又は用手法と自動分析装置等の装置を使用する方法を組み合わせて行ってもよい。
例えば、本発明における（ａ）〜（ｄ）の工程の全てを自動分析装置等の装置により行なってもよく、又はこの（ａ）〜（ｄ）の工程の一部を自動分析装置等の装置により行なってもよい。
【０１４２】
また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬が、第１試薬及び第２試薬よりなり、場合により更に多くの試薬よりなる場合、すなわち２以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ１段階又は２段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中の対象物質の酸化活性の測定を行えばよい。
なお、この場合、本発明における（ａ）〜（ｄ）の工程を、前記の測定を行うのに必要な数の段階に振り分けて測定反応を行わせ、試料中の対象物質の酸化活性の測定を行えばよい。
【０１４３】
なお、本発明において、第１試薬及び第２試薬よりなる試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、前記の色原体とカップラーの酸化縮合により生成した色素又は前記の酸化により発色した色素等の吸光度（又は透過率）を測定することによって、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を測定する場合には、試料と第１試薬の混合液〔第１混合液〕に更に第２試薬を加えて調製した混合液〔第２混合液〕（最終反応液）の調製後のインキュベート中の一定時間内の第２混合液（最終反応液）の吸光度の変化量より単位時間当たりの吸光度の変化量（すなわち吸光度の変化速度）を求め、この単位時間当たりの吸光度の変化量（すなわち吸光度の変化速度）の値に基づいて試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値を求める又は定める方法（レート法）により行なうことが好ましい。
【０１４４】
６．試料、対象物質及びｐＨ等
（１）試料
本発明における試料は、対象物質を含む可能性がある試料であって、この対象物質の酸化活性を測定しようとするものである。
【０１４５】
前記の通りのものであれば、試料として特に限定はないが、例えば、試料として、生体試料、食肉、野菜、穀物、果物、水産物、加工食品、飲料、飲料水、井戸水、河川水、湖沼水、海水、土壌、空気、又は医薬品等を挙げることができる。
【０１４６】
例えば、生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等を挙げることができる。
【０１４７】
本発明においては、試料は液体であることが好ましい。
もし、対象物質を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、対象物質を液体中に含有させるようにしてもよい。
【０１４８】
なお、本発明において、試料としては生体試料が好ましく、血液、血清、血漿又は尿が試料としてより好ましく、血液、血清又は血漿が試料として更に好ましく、血清又は血漿が試料として特に好ましい。
【０１４９】
（２）対象物質
本発明における対象物質は、試料に含まれ、その酸化活性を測定しようとする物質である。
このようなものであれば、対象物質として特に限定はない。
【０１５０】
この対象物質としては、例えば、酸化活性を有する物質、すなわち他の物質を酸化する能力を有する物質等を挙げることができる。
【０１５１】
また、この対象物質としては、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に関わる物質等を挙げることができる。
【０１５２】
なお、この活性酸素種としては、例えば、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、アルコキシラジカル、ペルオキシラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、又はＯ２−等を挙げることができる。
【０１５３】
なお、この活性酸素種の産生に関わる物質としては、例えば、フェントン反応（Ｆｅｎｔｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による活性酸素種の産生に関わる物質、又はハーバー−ワイス反応（Ｈａｂｏｒ−Ｗｅｉｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による活性酸素種の産生に関わる物質などの遷移金属が関わる活性酸素種の産生に関わる物質等を挙げることができる。
【０１５４】
そして、このフェントン反応による活性酸素種の産生に関わる物質又はハーバー−ワイス反応による活性酸素種の産生に関わる物質としては、例えば、非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）等を挙げることができる。
なお、本発明においては、特に言及しない限り、この非トランスフェリン結合鉄は、不安定性血清鉄（ＬＰＩ）を含むものとする。
【０１５５】
本発明において、対象物質としては、活性酸素種の産生に関わる物質が好ましく、フェントン反応による活性酸素種の産生に関わる物質又はハーバー−ワイス反応による活性酸素種の産生に関わる物質がより好ましく、非トランスフェリン結合鉄が特に好ましい。
【０１５６】
（３）ｐＨ
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法において、ｐＨは特に限定されないが、試料に含まれる対象物質や当該測定の反応に係わる成分が変性、失活、変質又は分解等をせず、かつ対象物質の酸化活性の測定反応が進むｐＨであればよい。
【０１５７】
なお、この試料中の対象物質の酸化活性の測定反応時のｐＨは、当該測定反応の至適ｐＨ域又はその近辺にあることが好ましい。
【０１５８】
例えば、この試料中の対象物質の酸化活性の測定反応時のｐＨは、前記の本発明の効果の上から、ｐＨ６．０（２０℃）以上であることが好ましい。
【０１５９】
また、前記の本発明の効果の上から、この測定反応時のｐＨの下限は、より好ましくはｐＨ６．５（２０℃）以上であり、特に好ましくはｐＨ６．８（２０℃）以上である。
【０１６０】
そして、この測定反応時のｐＨは、前記の本発明の効果の上から、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましい。
【０１６１】
また、前記の本発明の効果の上から、この測定反応時のｐＨの上限は、測定反応時において、より好ましくはｐＨ８．５（２０℃）以下であり、特に好ましくはｐＨ８．０（２０℃）以下である。
【０１６２】
なお、本発明において、対象物質が非トランスフェリン結合鉄である場合は、試料中に含まれるトランスフェリンに結合している鉄が遊離しないことが好ましいという観点から、この試料中の対象物質の酸化活性の測定反応時のｐＨは、ｐＨ６．０（２０℃）以上であることが好ましい。
【０１６３】
また、前記の観点から、この測定反応時のｐＨの下限は、より好ましくはｐＨ６．５（２０℃）以上であり、特に好ましくはｐＨ６．８（２０℃）以上である。
【０１６４】
そして、この測定反応時のｐＨは、前記の観点から、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましい。
【０１６５】
また、前記の観点から、この測定反応時のｐＨの上限は、測定反応時において、より好ましくはｐＨ８．５（２０℃）以下であり、特に好ましくはｐＨ８．０（２０℃）以下である。
【０１６６】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、測定反応時に前記のｐＨ域のｐＨとなるように、当該測定試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１６７】
（４）緩衝剤
本発明においては、試料中の対象物質の酸化活性の測定反応時に、緩衝剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
【０１６８】
例えば、前記の「（３）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、測定反応時に存在させることができる。
【０１６９】
このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、リン酸、リン酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
【０１７０】
なお、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、測定反応時に前記の「（３）ｐＨ」に記載のｐＨ域のｐＨとなるように、当該測定試薬のｐＨを設定することが好ましい。
このため、前記の「（３）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、測定反応時に緩衝能を有する濃度において、この測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１７１】
（５）他の成分
本発明においては、測定反応時に、他の成分を、適宜必要に応じて存在させることができる。
【０１７２】
当該他の成分としては、例えば、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、試料に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、又は活性化剤等を挙げることができる。
【０１７３】
なお、これらを存在させる際の濃度は特に限定されるものではないが、測定反応時において、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【０１７４】
また、これらを存在させる際の濃度の下限は、測定反応時において、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１７５】
そして、これらを存在させる際の濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると１０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
【０１７６】
また、これらを存在させる際の濃度の上限は、測定反応時において、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは２．５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１７７】
なお、前記の各界面活性剤の具体例としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；アミン塩若しくは第４級アンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１７８】
また、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度の前記の成分を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
【０１７９】
７．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の例
本発明における試料中の対象物質の酸化活性の測定方法、及び試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬として、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を例に挙げて以下記載する。
【０１８０】
（１）試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法の具体例を以下述べる。
【０１８１】
（ｉ）第一の酸化還元物質が対象物質により酸化される工程
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法において、本発明の「（ａ）  第一の酸化還元物質が、対象物質により酸化される工程」として、例えば、「セルロプラスミンが、非トランスフェリン結合鉄により酸化される工程」等を挙げることができる。
【０１８２】
なお、この場合、セルロプラスミンが第一の酸化還元物質であり、非トランスフェリン結合鉄が試料に含まれていた対象物質である。
【０１８３】
当該工程により、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）が、測定試薬（又は試料）に含まれるセルロプラスミン（この銅は１価〔Ｃｕ＋〕）を酸化して、この銅を２価〔Ｃｕ２＋〕とする。
なお、これにより、非トランスフェリン結合鉄（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）は還元されて、この鉄は２価〔Ｆｅ２＋〕となる。
【０１８４】
ところで、この鉄が２価〔Ｆｅ２＋〕となった非トランスフェリン結合鉄は、その後、フェントン反応により自発的に酸素等により酸化されて、その鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕となる。
これにより、非トランスフェリン結合鉄の鉄は、元の３価〔Ｆｅ３＋〕に戻り、これが測定試薬（又は試料）に含まれるセルロプラスミン（この銅は１価〔Ｃｕ＋〕）を酸化して、この銅を２価〔Ｃｕ２＋〕とする。
そして、これにより、非トランスフェリン結合鉄（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）は還元されて、この鉄は２価〔Ｆｅ２＋〕となる。
【０１８５】
このように、この工程において、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄（対象物質）の鉄の還元及び酸化の反応と、測定試薬（又は試料）に含まれるセルロプラスミン（第一の酸化還元物質）の銅の酸化及び還元の反応とが、連続的なサイクリング反応として繰り返し回る（繰り返し起こる）ことになる。
すなわち、非トランスフェリン結合鉄（対象物質）が、セルロプラスミン（第一の酸化還元物質）を酸化する反応が、このような連続的なサイクリング反応として繰り返し回ることにより、当該反応が多数回起き、増幅されることになる。
この工程における当該反応の増幅により、次の工程における、酸化されたセルロプラスミン（第一の酸化還元物質）がフェロシアン化物（第二の酸化還元物質）を酸化する反応も増幅され、次いで、更に次の工程における、酸化されたフェロシアン化物（第二の酸化還元物質）〔すなわち、フェリシアン化物〕が、色原体とカップラー（被酸化物質）を酸化する反応も増幅され、この結果、酸化された被酸化物質に由来するシグナルの量も増幅されるので、この増幅されたシグナルの量より試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄（対象物質）の酸化活性を求めることになる。
【０１８６】
すなわち、以上のことにより、本発明においては、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を、高感度に測定することができる。
【０１８７】
（ｉｉ）酸化された第一の酸化還元物質が第二の酸化還元物質を酸化する工程
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法において、本発明の「（ｂ）  前記（ａ）において酸化された第一の酸化還元物質が、第二の酸化還元物質を酸化する工程」として、例えば、「試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄により酸化されたセルロプラスミンが、フェロシアン化物を酸化する工程」等を挙げることができる。
【０１８８】
なお、この酸化されたセルロプラスミンは、前記（ｉ）における、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄により酸化されたセルロプラスミンである。
【０１８９】
また、この場合、セルロプラスミンが第一の酸化還元物質であり、フェロシアン化物が第二の酸化還元物質である。
【０１９０】
当該工程により、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄により酸化されたセルロプラスミン（この銅は２価〔Ｃｕ２＋〕）が、測定試薬（又は試料）に含まれるフェロシアン化物（この鉄は２価〔Ｆｅ２＋〕）を酸化してフェリシアン化物（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）とする。
なお、これにより、セルロプラスミン（この銅は２価〔Ｃｕ２＋〕）は還元されて、この銅は１価〔Ｃｕ＋〕となる。
【０１９１】
（ｉｉｉ）酸化された第二の酸化還元物質が被酸化物質を酸化する工程
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法において、本発明の「（ｃ）  前記（ｂ）において酸化された第二の酸化還元物質が、被酸化物質を酸化する工程」として、例えば、「酸化されたフェロシアン化物（すなわちフェリシアン化物）が、色原体とカップラーを酸化する工程」等を挙げることができる。
【０１９２】
なお、この酸化されたフェロシアン化物（すなわち、フェリシアン化物）は、前記（ｉｉ）における、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄により酸化されたセルロプラスミンによって酸化されたフェロシアン化物（すなわち、フェリシアン化物）である。
【０１９３】
また、この色原体とカップラーは、前記の酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせである。
【０１９４】
なお、この場合、フェロシアン化物が第二の酸化還元物質であり、フェリシアン化物が酸化された第二の酸化還元物質であり、そして、色原体とカップラー（すなわち、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせ）が被酸化物質である。
【０１９５】
当該工程により、酸化されたフェロシアン化物、すなわちフェリシアン化物（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）が、測定試薬に含まれていた色原体とカップラーを酸化する。
この酸化により、色原体とカップラーは、酸化縮合して色素を生成する。
【０１９６】
なお、これにより、フェリシアン化物（この鉄は３価〔Ｆｅ３＋〕）は還元されて、フェロシアン化物（この鉄は２価〔Ｆｅ２＋〕）となる。
【０１９７】
（ｉｖ）シグナルを測定し対象物質の酸化活性を求める工程
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定方法において、本発明の「（ｄ）  前記（ｃ）において酸化された被酸化物質に由来するシグナルを測定し、このシグナルより、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求める工程」として、例えば、「生成した色素の吸光度を測定し、この吸光度より、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を求める工程」等を挙げることができる。
【０１９８】
なお、この生成した色素は、前記（ｉｉｉ）における、酸化されたフェロシアン化物（すなわち、フェリシアン化物）によって色原体とカップラーが酸化され、この色原体とカップラーが酸化縮合することにより生成した色素である。
【０１９９】
なお、この場合、生成した色素の吸光度が酸化された被酸化物質に由来するシグナルであり、色原体とカップラー（すなわち、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせ）が被酸化物質であり、そして、非トランスフェリン結合鉄が対象物質である。
【０２００】
当該工程により、生成した色素の吸光度を測定し、この吸光度より、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を求める。
なお、生成した色素の吸光度を測定し、この吸光度より、試料に含まれていた対象物質の酸化活性を求めることは、先に詳述した通りである。
【０２０１】
（２）試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬
本発明による試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬の具体例を以下述べる。
【０２０２】
（ｉ）測定試薬の具体例−１
本発明の試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬において、本発明の「第二の酸化還元物質、及び被酸化物質を含有する、試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬」として、例えば、「フェロシアン化物、及び色原体とカップラーを含有する、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬」等を挙げることができる。
【０２０３】
なお、この色原体とカップラーは、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせである。
【０２０４】
また、この場合、フェロシアン化物が第二の酸化還元物質であり、色原体とカップラー（すなわち、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせ）が被酸化物質であり、そして、非トランスフェリン結合鉄が対象物質である。
【０２０５】
（ｉｉ）測定試薬の具体例−２
本発明の試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬において、本発明の「第一の酸化還元物質、第二の酸化還元物質、及び被酸化物質を含有する、試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬」として、例えば、「セルロプラスミン、フェロシアン化物、及び色原体とカップラーを含有する、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定試薬」等を挙げることができる。
【０２０６】
なお、この色原体とカップラーは、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせである。
【０２０７】
また、この場合、セルロプラスミンが第一の酸化還元物質であり、フェロシアン化物が第二の酸化還元物質であり、色原体とカップラー（すなわち、酸化されることにより酸化縮合して色素を生成する色原体とカップラーの組み合わせ）が被酸化物質であり、そして、非トランスフェリン結合鉄が対象物質である。
【０２０８】
８．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の具体例
本発明における試料中の対象物質の酸化活性の測定方法、及び試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬の具体例を、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を例として以下記載する。
【０２０９】
（１）測定試薬の調製
（ｉ）酸化活性測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第１試薬を調製した。
【０２１０】
セルロプラスミン  ＜第一の酸化還元物質＞    ０．５μＭ
フェロシアン化カリウム  ＜第二の酸化還元物質＞    １ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０２１１】
（ｉｉ）酸化活性測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第２試薬を調製した。
【０２１２】
Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン  （ＣＥＭＢ）  ＜色原体＞    ２ｍＭ
４−アミノアンチピリン  ＜カップラー＞    ２ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０２１３】
（２）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。
【０２１４】
（３）試料
ヒトの血清を試料として用いた。
【０２１５】
（４）酸化活性の測定
（ｉ）第１段階
前記の試料と前記の「酸化活性測定用第１試薬」を混合し、試料と「酸化活性測定用第１試薬」の混合液（第１混合液）を調製し、これにより前記の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄（対象物質）と前記の「酸化活性測定用第１試薬」に含まれていたセルロプラスミン（第一の酸化還元物質）とフェロシアン化カリウム（第二の酸化還元物質）がそれぞれ接触する。
【０２１６】
この混合する、前記の試料の量、及び前記の酸化活性測定用第１試薬の量は、それぞれ、酸化活性測定用第２試薬の量、試料に含まれる対象物質の濃度及び酸化活性、測定反応に係わる成分の濃度、活性又は力価、吸光度等の測定を行なう物質の吸光係数など、測定波長、使用する分析装置の仕様など、並びに他の条件等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、前記の酸化活性測定用第１試薬に混合させる前記の試料の量は０．５〜１００μＬ、前記の酸化活性測定用第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０２１７】
前記の第１混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。
【０２１８】
また、インキュベートする際の温度は、前記の第１混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると対象物質又は測定反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、インキュベートする際の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる成分等が耐熱性の物であれば更に高温でもよい。
【０２１９】
この第１混合液の調製及びインキュベートにより、前記の試料と前記の「酸化活性測定用第１試薬」が混合され、これによって試料と「酸化活性測定用第１試薬」の混合液（第１混合液）を調製し、これにより前記の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄（対象物質）と前記の「酸化活性測定用第１試薬」に含まれていたセルロプラスミン（第一の酸化還元物質）及びフェロシアン化カリウム（第二の酸化還元物質）がそれぞれ接触し、前記の「セルロプラスミンが、非トランスフェリン結合鉄により酸化される工程」及び「試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄により酸化されたセルロプラスミンが、フェロシアン化物を酸化する工程」が行なわれる。
【０２２０】
（ｉｉ）第２段階
前記の第１段階で調製した第１混合液に、前記の酸化活性測定用第２試薬を混合し、混合液（第２混合液）を調製する。これを最終反応液とする。
【０２２１】
この混合する前記の酸化活性測定用第２試薬の量は、試料の量、酸化活性測定用第１試薬の量、試料に含まれる対象物質の濃度及び酸化活性、測定反応に係わる成分の濃度、活性又は力価、吸光度等の測定を行なう物質の吸光係数など、測定波長、使用する分析装置の仕様など、並びに他の条件等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、前記の酸化活性測定用第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０２２２】
前記の第２混合液（最終反応液）の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。
【０２２３】
また、インキュベートする際の温度は、前記の第２混合液（最終反応液）が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると対象物質又は測定反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、インキュベートする際の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。  なお、測定反応に係わる成分等が耐熱性の物であれば更に高温でもよい。
【０２２４】
この第２混合液（最終反応液）の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階における反応に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、前記の第１混合液に含まれていた酸化されたフェロシアン化物（すなわちフェリシアン化物）と、前記の酸化活性測定用第２試薬に含まれる色原体及びカップラーがそれぞれ接触し、前記の「酸化されたフェロシアン化物（すなわちフェリシアン化物）が、色原体とカップラーを酸化する工程」及び「生成した色素の吸光度を測定し、この吸光度より、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を求める工程」が行なわれる。
【０２２５】
すなわち、前記の第１混合液に含まれていた酸化されたフェロシアン化物（すなわちフェリシアン化物）と、前記の酸化活性測定用第２試薬に含まれる色原体及びカップラーとの接触によって、この色原体及びカップラーがフェリシアン化物により酸化され、酸化縮合して色素を生成する。
【０２２６】
この色素に由来するシグナルである吸光度の測定を、第２混合液（最終反応液）の吸光度を測定することにより行なう。
【０２２７】
なお、この吸光度の測定は、一つの波長においてのみ行う一波長法でもよく、又は、二つの波長（主波長及び副波長）においてそれぞれ吸光度を測定し、主波長における吸光度から副波長における吸光度を差し引いて吸光度差を求める二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。
【０２２８】
また、この吸光度の測定を行う波長は、この色素の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
【０２２９】
そして、吸光度（若しくは透過率）の測定は、終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して行えばよい。
【０２３０】
なお、本発明においては、前記の通り、測定した吸光度又は測定した吸光度の変化量等より、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値等を求めることもできるが、前記の色素のモル吸光係数を基に測定した吸光度より算出する方法、又は、その酸化活性の値等が分かっている対象物質（標準物質又は標準液）を同様に測定して得た吸光度と対比することにより算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。
また、本発明においては、前記の測定した吸光度又は測定した吸光度の変化量等の値を、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値として定めてもよい。
【０２３１】
なお、本発明においては、試料中の対象物質の酸化活性を測定して得た吸光度より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていた対象物質の酸化活性の値等を求めることが好ましい。
【０２３２】
なお、本発明において、試料中の対象物質の酸化活性の測定の操作は、測定者自身が用手法により行ってもよいし、自動分析装置等の装置を使用して行ってもよいし、又は用手法と自動分析装置等の装置を使用する方法を組み合わせて行ってもよい。
【０２３３】
なお、前記の通りの酸化活性測定用第１試薬、及び酸化活性測定用第２試薬を用いて、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行なう場合には、第２混合液（最終反応液）の調製後のインキュベート中の一定時間内の第２混合液（最終反応液）の吸光度の変化量より単位時間当たりの吸光度の変化量（すなわち吸光度の変化速度）を求め、この単位時間当たりの吸光度の変化量（すなわち吸光度の変化速度）の値に基づいて試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を求める又は定める方法（レート法）により行なうことが好ましい。
【０２３４】
また、色原体としてＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）を用い、カップラーとして４−アミノアンチピリンを用いた場合のこれらの酸化縮合物の色素（キノン色素）に由来するシグナルである吸光度の測定を行うときは、この吸光度の測定は、主波長５００ｎｍ〜６００ｎｍ、副波長６５０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲にて行なうことが好ましい。
【０２３５】
〔２〕試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬
１．総論
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬は、第二の酸化還元物質及び被酸化物質を含有するものである。
【０２３６】
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬としては、前述の通り、第二の酸化還元物質及び被酸化物質に加え、更に第一の酸化還元物質を含有するものであることが好ましい。
【０２３７】
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬においては、前記の構成により、試料中の対象物質の酸化活性を、迅速かつ簡便に測定することが可能となる。
【０２３８】
２．第一の酸化還元物質
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬における第一の酸化還元物質については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「２．第一の酸化還元物質」に記載した通りである。
【０２３９】
３．第二の酸化還元物質
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬における第二の酸化還元物質については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「３．第二の酸化還元物質」に記載した通りである。
【０２４０】
４．被酸化物質
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬における被酸化物質については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「４．被酸化物質」に記載した通りである。
【０２４１】
５．シグナルの測定及び対象物質の酸化活性を求めること
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を使用して試料中の対象物質の酸化活性を測定する際のシグナルの測定及び対象物質の酸化活性を求めることについては、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「５．シグナルの測定及び対象物質の酸化活性を求めること」に記載した通りである。
【０２４２】
６．試料、対象物質及びｐＨ等
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬における試料、対象物質及びｐＨ等については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「６．試料、対象物質及びｐＨ等」に記載した通りである。
【０２４３】
７．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の例
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を使用して試料中の対象物質の酸化活性を測定する方法等の例については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「７．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の例」に記載した通りである。
【０２４４】
８．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の具体例
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を使用して試料中の対象物質の酸化活性を測定する方法等の具体例については、前記の「〔１〕試料中の対象物質の酸化活性の測定方法」の「８．試料中の対象物質の酸化活性の測定方法等の具体例」に記載した通りである。
【０２４５】
９．測定試薬の構成等
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬は、液状のものであってもよく、凍結乾燥されたものであってもよく、凍結されたものであってもよく、粉状や固形状などの固体状のものであってもよく、又はこれらを組み合わせたものであってよい。
【０２４６】
また、この本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用することができる。
【０２４７】
また、この本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬は、その他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の対象物質の酸化活性の測定に使用することもできる。
【０２４８】
前記のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０２４９】
また、この本発明の測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又は前記のその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
【実施例】
【０２５０】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等により限定されるものではない。
【０２５１】
〔実施例１〕（本発明による試料中の対象物質の酸化活性の測定−１）
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を行なった。
【０２５２】
〔１〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定
本発明により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行った。
【０２５３】
１．測定試薬の調製
（１）酸化活性測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第１試薬を調製した。
【０２５４】
フェロシアン化カリウム  ＜第二の酸化還元物質＞    １ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０２５５】
（２）酸化活性測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第２試薬を調製した。
【０２５６】
Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン  （ＣＥＭＢ）  ＜色原体＞    ２ｍＭ
４−アミノアンチピリン  ＜カップラー＞    ２ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０２５７】
２．精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。
【０２５８】
３．試料
試料として、次の通り調製した試料を用いた。
【０２５９】
（１）  凍結融解していないプール血清（いくつものヒト血清を混合して調製した血清）２０ｍＬを、１１０ｍｍのフィルターペーパー〔アドバンテック東洋社（日本国）〕でろ過した。
【０２６０】
（２）  鉄標準溶液（Ｆｅ  １０００）〔和光純薬工業社（日本国）〕を精製水にて鉄濃度が４００μＭとなるように希釈し、これをさらに精製水にて段階希釈し、鉄濃度が１００μＭ、２００μＭ、及び３００μＭである鉄溶液を１ｍＬずつ調製した。
また、精製水を、鉄濃度が０μＭの鉄溶液とした。
これらにより、鉄濃度が、０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、及び４００μＭの鉄溶液をそれぞれ用意した。
【０２６１】
（３）  前記（１）のろ過したプール血清と、前記（２）の鉄溶液のそれぞれを９：１の割合で混合し、当該プール血清に添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭとなるような試料を調製し、これらをそれぞれ次の通り試料ａ〜試料ｅとした。
【０２６２】
（ｉ）  試料ａ  〔添加された鉄の最終濃度：０μＭ〕
（ｉｉ）  試料ｂ  〔添加された鉄の最終濃度：１０μＭ〕
（ｉｉｉ）  試料ｃ  〔添加された鉄の最終濃度：２０μＭ〕
（ｉｖ）  試料ｄ  〔添加された鉄の最終濃度：３０μＭ〕
（ｖ）  試料ｅ  〔添加された鉄の最終濃度：４０μＭ〕
【０２６３】
４．測定
前記３の（３）の各試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を使用して行なった。
【０２６４】
（１）  前記の３の（３）の（ｉ）試料ａ〜（ｖ）試料ｅのそれぞれの１０μＬに、前記１の（１）の酸化活性測定用第１試薬の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２６５】
（２）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８７秒）の間に、前記１の（２）の酸化活性測定用第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２６６】
（３）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４１２秒）から３４ポイント（第１試薬添加後５８７秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５５０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。
【０２６７】
（４）  次に、前記（３）において測定した吸光度変化量について、１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）、すなわちこの吸光度の変化速度を求めた。
【０２６８】
（５）  次に、前記の２の精製水を試料として、前記（１）〜（４）と同様に操作を行い、精製水を試料とした場合の１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）〔吸光度の変化速度〕、すなわち試薬盲検（試薬ブランク）を求めた。
【０２６９】
（６）  次に、前記（４）で求めた各試料における吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）から、前記（５）で求めた試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、各試料における吸光度変化量の差の値（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を求めた。
ここで求めた吸光度変化量の差の値（Ａｂｓ／ｍｉｎ）が、各試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を示す。
【０２７０】
（７）  前記（６）で求めた、前記の３の（３）の（ｉ）試料ａ〜（ｖ）試料ｅに含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を図１に示した。
【０２７１】
（８）  また、前記の３の（３）の（ｉｉ）試料ｂ〜（ｖ）試料ｅの非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定について、測定に使用した自動分析装置に記録されている、前記（２）における酸化活性測定用第２試薬添加から５分間の間の吸光度差〔主波長５５０ｎｍ、副波長７００ｎｍ；試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの〕を図２に示した。
【０２７２】
〔２〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定
本発明者らが先に確立した試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行った。
【０２７３】
１．測定試薬の調製
（１）濃度測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、濃度測定用第１試薬を調製した。
【０２７４】
ニトリロ三酢酸  ＜キレート物質＞    ０．１ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２７５】
（２）濃度測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、濃度測定用第２試薬を調製した。
２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール  ＜キレート発色剤＞    ５００μＭ
Ｌ−アスコルビン酸  ＜還元剤＞    ０．２４％（ｗ／ｖ）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２０ｍＭ
【０２７６】
２．精製水
前記の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０２７７】
３．試料
前記の〔１〕の３の（３）の（ｉ）試料ａ〜（ｖ）試料ｅのそれぞれを、試料として用いた。
【０２７８】
４．測定
前記３の各試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を使用して行なった。
【０２７９】
（１）  前記の３の（３）の（ｉ）試料ａ〜（ｖ）試料ｅのそれぞれの１５μＬに、前記１の（１）の濃度測定用第１試薬の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２８０】
（２）  次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０秒）の吸光度それぞれを主波長７５０ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料盲検の吸光度の測定）
【０２８１】
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８７秒）の間に、前記１の（２）の濃度測定用第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０２８２】
（４）  次に、３３ポイント（第１試薬添加後５７０秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７秒）の吸光度それぞれを主波長７５０ｎｍ、副波長６００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度に応じた吸光度の測定）
【０２８３】
（５）  次に、試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記３の（３）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
【０２８４】
次に、その鉄の濃度が２００μｇ／ｄＬである市販の標準試料「Ｆｅ標準液（２００μｇ／ｄＬ）」〔シノテスト社（日本国）〕について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて吸光度差の値を求め、この標準試料の吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、前記の３の（３）の（ｉ）試料ａ〜（ｖ）試料ｅの非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値を得た。
【０２８５】
前記の通り求めた、各試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度についても図１に示した。
【０２８６】
〔３〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度の測定結果
前記〔１〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び前記〔２〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果について、以下述べる。
【０２８７】
１．酸化活性と濃度
前記〔１〕の４の（７）及び前記〔２〕の４の（５）に記載した図１は、この〔１〕及び〔２〕の３の各試料についての、〔１〕における非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び〔２〕における非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果を示したものである。
【０２８８】
この図において、横軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値（μＭ）を表し、縦軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値（Ａｂｓ／ｍｉｎ×１０４）を表す。
【０２８９】
この図より、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度が高いものほど、その酸化活性も高いものであることが分かる。
【０２９０】
このことより、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、対象物質の酸化活性を定量的に測定できるものであることが確かめられた。
【０２９１】
２．測定反応のタイムコース
前記〔１〕の４の（８）に記載した図２は、この〔１〕における３の（３）の（ｉｉ）試料ｂ〜（ｖ）試料ｅの非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定についての酸化活性測定用第２試薬添加から５分間の間の吸光度差〔主波長５５０ｎｍ、副波長７００ｎｍ；試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの〕を示したものである。
すなわち、この図２は、前記の試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定における第２試薬添加後の測定反応のタイムコースを示したグラフである。
【０２９２】
この図において、横軸は前記の第２試薬添加後の反応時間（分）を表し、縦軸は前記の試料における測定で求められた吸光度差を表す。
【０２９３】
そして、この図において、「◆」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｉ）試料ｂ（非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値：０．４７μＭ）における吸光度差の値を表し、「□」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｉｉ）試料ｃ（非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値：０．６７μＭ）における吸光度差の値を表し、「●」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｖ）試料ｄ（非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値：０．８０μＭ）における吸光度差の値を表し、「△」は前記〔１〕の３の（３）の（ｖ）試料ｅ（非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値：３．８５μＭ）における吸光度差の値を表す。
【０２９４】
この図より、本発明の試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定反応が、低値から高値にわたるいずれの試料においても、ほぼ直線的に進んでいることが分かる。
【０２９５】
このことより、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬においては、その測定反応が定量的であることが裏付けられた。
【０２９６】
〔実施例２〕（本発明による試料中の対象物質の酸化活性の測定−２）
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を行なった。
【０２９７】
〔１〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定
本発明により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行った。
【０２９８】
１．測定試薬の調製
（１）酸化活性測定用第１試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（１）の酸化活性測定用第１試薬を、本実施例における酸化活性測定用第１試薬として用いた。
【０２９９】
（２）酸化活性測定用第２試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（２）の酸化活性測定用第２試薬を、本実施例における酸化活性測定用第２試薬として用いた。
【０３００】
２．精製水
前記の実施例１の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３０１】
３．試料
試料として、次の通り調製した試料を用いた。
【０３０２】
（１）  凍結融解していない４種類のヒト血清について、それぞれの１０ｍＬを、１１０ｍｍのフィルターペーパー〔アドバンテック東洋社（日本国）〕でろ過した。
【０３０３】
（２）  鉄標準溶液（Ｆｅ  １０００）〔和光純薬工業社（日本国）〕を精製水にて鉄濃度が４００μＭとなるように希釈し、これをさらに精製水にて段階希釈し、鉄濃度が１００μＭ、２００μＭ、及び３００μＭである鉄溶液を１ｍＬずつ調製した。
また、精製水を、鉄濃度が０μＭの鉄溶液とした。
これらにより、鉄濃度が、０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、及び４００μＭの鉄溶液をそれぞれ用意した。
【０３０４】
（３）  前記（１）の４種類のヒト血清の各々と、前記（２）の鉄溶液のそれぞれを９：１の割合で混合し、当該各々のヒト血清に添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭとなるような試料を調製し、これらをそれぞれ次の通り試料１〜試料４とした。
【０３０５】
（ｉ）  試料１  〔添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭである５種類のヒト血清よりなる試料〕
（ｉｉ）  試料２  〔添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭである５種類のヒト血清よりなる試料〕
（ｉｉｉ）  試料３  〔添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭである５種類のヒト血清よりなる試料〕
（ｉｖ）  試料４  〔添加された鉄の最終濃度がそれぞれ、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、及び４０μＭである５種類のヒト血清よりなる試料〕
【０３０６】
４．測定
前記３の（３）の（ｉ）試料１〜（ｉｖ）試料４の計２０のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を、前記の実施例１の〔１〕の４の記載の通りに行なった。
【０３０７】
この測定により求めた、前記の３の（ｉ）試料１〜（ｉｖ）試料４の計２０の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を図３に示した。
【０３０８】
〔２〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定
本発明者らが先に確立した試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行った。
【０３０９】
１．測定試薬の調製
（１）濃度測定用第１試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（１）の濃度測定用第１試薬を、本実施例における濃度測定用第１試薬として用いた。
【０３１０】
（２）濃度測定用第２試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（２）の濃度測定用第２試薬を、本実施例における濃度測定用第２試薬として用いた。
【０３１１】
２．精製水
前記の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３１２】
３．試料
前記の〔１〕の３の（３）の（ｉ）試料１〜（ｉｖ）試料４の計２０のヒト血清よりなる試料のそれぞれを、試料として用いた。
【０３１３】
４．測定
前記３の（ｉ）試料１〜（ｉｖ）試料４の計２０のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を、前記の実施例１の〔２〕の４の記載の通りに行なった。
【０３１４】
この測定により求めた、前記の３の（ｉ）試料１〜（ｉｖ）試料４の計２０の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度を図３に示した。
【０３１５】
〔３〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度の測定結果
前記〔１〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び前記〔２〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果について、以下述べる。
【０３１６】
前記〔１〕の４及び前記〔２〕の４にて記載した図３は、この〔１〕及び〔２〕の３の各試料についての、〔１〕における非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び〔２〕における非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果を示したものである。
【０３１７】
この図において、横軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値（μＭ）を表し、縦軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値（Ａｂｓ／ｍｉｎ×１０４）を表す。
【０３１８】
そして、この図において、「△」は前記の〔１〕の３の（３）の（ｉ）試料１の５つの試料における各測定値を表し、「●」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｉ）試料２の５つの試料における各測定値を表し、「□」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｉｉ）試料３の５つの試料における各測定値を表し、「◆」は前記〔１〕の３の（３）の（ｉｖ）試料４の５つの試料における各測定値を表す。
【０３１９】
この図からも、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度が高いものほど、その酸化活性も高いものであることが分かる。
【０３２０】
このことより、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、対象物質の酸化活性を定量的に測定できるものであることが確かめられた。
【０３２１】
〔実施例３〕（本発明による試料中の対象物質の酸化活性の測定−３）
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を行なった。
【０３２２】
〔１〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定
本発明により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行った。
【０３２３】
１．測定試薬の調製
（１）酸化活性測定用第１試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（１）の酸化活性測定用第１試薬を、本実施例における酸化活性測定用第１試薬として用いた。
【０３２４】
（２）酸化活性測定用第２試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（２）の酸化活性測定用第２試薬を、本実施例における酸化活性測定用第２試薬として用いた。
【０３２５】
２．精製水
前記の実施例１の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３２６】
３．試料
試料として、次の通り調製した試料を用いた。
【０３２７】
（１）  約４５０ｍＬの精製水にホウ酸（６．２ｇ）と塩化カリウム（７．４５ｇ）を添加し、十分に溶解した後、精製水を加えて全体量を５００ｍＬとした。
【０３２８】
（２）  前記（１）の溶液の５０ｍＬに精製水を約１４０ｍＬ加え、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ９．０（２０℃）に合わせた後、精製水にて全体量を２００ｍＬとして、５０ｍＭホウ酸溶液を調製した。
【０３２９】
（３）  輸血による慢性鉄過剰症の治療薬（過剰鉄に対する経口キレート薬）であるデフェラシロクスの錠剤〔商品名：エクジェイド、１２５ｍｇ、ノバルティスファーマ社（スイス国）〕に、前記（２）の５０ｍＭホウ酸溶液の２００ｍＬを加え、緩やかに混和して、デフェラシロクスの混濁液を調製した。
この混濁液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。これは３．３ｍＭのデフェラシロクス溶液である。
【０３３０】
（４）  前記（３）の３．３ｍＭのデフェラシロクス溶液を更に、前記の５０ｍＭホウ酸溶液にて段階希釈し、０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１，０００μＭ、２，０００μＭ、及び３，０００μＭの各濃度のデフェラシロクス溶液をそれぞれ調製した。
【０３３１】
（５）  凍結融解していないプール血清（いくつものヒト血清を混合して調製した血清）１０ｍＬを、１１０ｍｍのフィルターペーパー〔アドバンテック東洋社（日本国）〕でろ過した。
次に、鉄標準溶液（Ｆｅ  １０００）〔和光純薬工業社（日本国）〕を精製水にて希釈し、鉄濃度が７５０μＭである鉄溶液を調製した。
この鉄溶液と前記のろ過したプール血清を１：９の比率で混和し、鉄過剰のプール血清を調製した。
【０３３２】
（６）  前記（４）の各濃度のデフェラシロクス溶液と、前記（５）の鉄過剰のプール血清とを、１：９の比率で混合し、添加されたデフェラシロクスの最終濃度が、０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、及び３００μＭであるプール血清の試料を各々調製し、これらをそれぞれ次の通り試料ｉ〜試料ｖｉとした。
【０３３３】
（ｉ）  試料ｉ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が０μＭであるヒト血清よりなる試料〕
（ｉｉ）  試料ｉｉ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が１０μＭであるヒト血清よりなる試料〕
（ｉｉｉ）  試料ｉｉｉ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が５０μＭであるヒト血清よりなる試料〕
（ｉｖ）  試料ｉｖ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が１００μＭであるヒト血清よりなる試料〕
（ｖ）  試料ｖ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が２００μＭであるヒト血清よりなる試料〕
（ｖｉ）  試料ｖｉ  〔添加されたデフェラシロクスの最終濃度が３００μＭであるヒト血清よりなる試料〕
【０３３４】
４．測定
前記３の（６）の（ｉ）試料ｉ〜（ｖｉ）試料ｖｉの計６のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を、前記の実施例１の〔１〕の４の記載の通りに行なった。
【０３３５】
この測定により求めた、前記の３の（ｉ）試料ｉ〜（ｖｉ）試料ｖｉの計６の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を図４に示した。
【０３３６】
〔２〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定
本発明者らが先に確立した試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行った。
【０３３７】
１．測定試薬の調製
（１）濃度測定用第１試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（１）の濃度測定用第１試薬を、本実施例における濃度測定用第１試薬として用いた。
【０３３８】
（２）濃度測定用第２試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（２）の濃度測定用第２試薬を、本実施例における濃度測定用第２試薬として用いた。
【０３３９】
２．精製水
前記〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３４０】
３．試料
前記の〔１〕の３の（６）の（ｉ）試料ｉ〜（ｖｉ）試料ｖｉの計６のヒト血清よりなる試料のそれぞれを、試料として用いた。
【０３４１】
４．測定
前記３の（ｉ）試料ｉ〜（ｖｉ）試料ｖｉの計６のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を、前記の実施例１の〔２〕の４の記載の通りに行なった。
【０３４２】
この測定により求めた、前記の３の（ｉ）試料ｉ〜（ｖｉ）試料ｖｉの計６のヒト血清よりなる試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度を図５に示した。
【０３４３】
〔３〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度の測定結果
前記〔１〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び前記〔２〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果について、以下述べる。
【０３４４】
前記〔１〕の４にて記載した図４は、この〔１〕の３の各試料についての、〔１〕における非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果を示したものである。
【０３４５】
この図４において、横軸は当該試料に添加されたデフェラシロクスの最終濃度（μＭ）を表し、縦軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値（Ａｂｓ／ｍｉｎ×１０４）を表す。
【０３４６】
また、前記〔２〕の４にて記載した図５は、この〔２〕の３の各試料についての、〔２〕における非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果を示したものである。
【０３４７】
この図５において、横軸は当該試料に添加されたデフェラシロクスの最終濃度（μＭ）を表し、縦軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値（μＭ）を表す。
【０３４８】
まず、図４より、過剰鉄に対するキレート薬であるデフェラシロクスの添加量が多く、その濃度が高いほど、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値が低下していることが分かる。
【０３４９】
また、図５より、デフェラシロクスの添加量が多く、その濃度が高いほど、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値も低下していることが分かる。
【０３５０】
すなわち、試料中の非トランスフェリン結合鉄が、過剰鉄に対するキレート薬であるデフェラシロクスによってキレートされ、ブロックされて、この非トランスフェリン結合鉄としての性質の発揮が抑制されるにつれ、本発明による非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値も低下することが分かる。
つまり、本発明による非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値は、非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を反映しているものであることが分かる。
【０３５１】
これらのことより、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、対象物質の酸化活性を把握することができるものであることが確かめられた。
【０３５２】
〔実施例４〕（本発明による試料中の対象物質の酸化活性の測定−４）
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を行なった。
【０３５３】
〔１〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定
本発明により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行った。
【０３５４】
１．測定試薬の調製
（１）酸化活性測定用第１試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（１）の酸化活性測定用第１試薬を、本実施例における酸化活性測定用第１試薬として用いた。
【０３５５】
（２）酸化活性測定用第２試薬
前記の実施例１の〔１〕の１の（２）の酸化活性測定用第２試薬を、本実施例における酸化活性測定用第２試薬として用いた。
【０３５６】
２．精製水
前記の実施例１の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３５７】
３．試料
凍結融解していない、患者の血清（計１７５検体）を試料として用いた。
【０３５８】
４．測定
前記３の計１７５のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を、前記の実施例１の〔１〕の４の記載の通りに行なった。
【０３５９】
この測定により求めた、前記の３の計１７５のヒト血清よりなる試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を図６に示した。
【０３６０】
〔２〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定
本発明者らが先に確立した試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行った。
【０３６１】
１．測定試薬の調製
（１）濃度測定用第１試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（１）の濃度測定用第１試薬を、本実施例における濃度測定用第１試薬として用いた。
【０３６２】
（２）濃度測定用第２試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（２）の濃度測定用第２試薬を、本実施例における濃度測定用第２試薬として用いた。
【０３６３】
２．精製水
前記の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３６４】
３．試料
前記の〔１〕の３の凍結融解していない、患者の血清（計１７５検体）を試料として用いた。
【０３６５】
４．測定
前記３の計１７５のヒト血清よりなる試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を、前記の実施例１の〔２〕の４の記載の通りに行なった。
【０３６６】
この測定により求めた、前記の３の計１７５のヒト血清よりなる試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の濃度を図６に示した。
【０３６７】
〔３〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度の測定結果
前記〔１〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び前記〔２〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果について、以下述べる。
【０３６８】
前記〔１〕の４及び前記〔２〕の４にて記載した図６は、この〔１〕及び〔２〕の３の各試料についての、〔１〕における非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び〔２〕における非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果を示したものである。
【０３６９】
この図において、横軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値（μＭ）を表し、縦軸は試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値（Ａｂｓ／ｍｉｎ×１０４）を表す。
【０３７０】
この計１７５の患者の血清の測定結果を示した図からも、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度が高いものほど、その酸化活性も高いものであることが分かる。
【０３７１】
このことより、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法及び測定試薬は、対象物質の酸化活性を定量的に測定できるものであることが、多数の患者の試料の測定においても確かめられた。
【０３７２】
〔実施例５〕（本発明による試料中の対象物質の酸化活性の測定−５）
本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定試薬を用い、本発明の試料中の対象物質の酸化活性の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の酸化活性の測定を行なった。
【０３７３】
〔１〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定
本発明により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を行った。
【０３７４】
１．測定試薬の調製
（１）酸化活性測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第１試薬を調製した。
【０３７５】
セルロプラスミン  ＜第一の酸化還元物質＞    ０．５μＭ
フェロシアン化カリウム  ＜第二の酸化還元物質＞    １ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０３７６】
（２）酸化活性測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．８（２０℃）に調整して、酸化活性測定用第２試薬を調製した。
【０３７７】
Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン  （ＣＥＭＢ）  ＜色原体＞    ２ｍＭ
４−アミノアンチピリン  ＜カップラー＞    ２ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ＜緩衝剤＞    ２００ｍＭ
【０３７８】
２．精製水
前記の実施例１の〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３７９】
３．試料
試料として、次の通り調製した試料を用いた。
【０３８０】
（１）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の５％（ｗ／ｖ）水溶液を調製した。
そして、この５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン水溶液の鉄含量を、市販の血清鉄測定試薬（体外診断用医薬品）である「クイックオートネオ  Ｆｅ」〔シノテスト社（日本国）〕を用い、その添付文書等の記載に従い、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を使用して測定し、０．９μＭの濃度で鉄が含まれていることを確認した。
【０３８１】
（２）  次に、鉄濃度が前記（１）で調製したウシ血清アルブミン水溶液と同じである、０．９μＭのクエン酸鉄水溶液を調製した。
【０３８２】
（３）  次に、前記（１）の５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン水溶液と、前記（２）の０．９μＭのクエン酸鉄水溶液を、それぞれ、１０：０、７：３、５：５、３：７、及び０：１０の比率で混合して試料を調製し、これらをそれぞれ次の通り試料〔１〕〜試料〔５〕とした。
【０３８３】
（ｉ）  試料〔１〕  〔５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が１０：０である試料〕
（ｉｉ）  試料〔２〕  〔５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が７：３である試料〕
（ｉｉｉ）  試料〔３〕  〔５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が５：５である試料〕
（ｉｖ）  試料〔４〕  〔５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が３：７である試料〕
（ｖ）  試料〔５〕  〔５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が０：１０である試料〕
【０３８４】
なお、これらの５種類の試料（試料〔１〕〜試料〔５〕）は、いずれも、その鉄の濃度は０．９μＭである。
【０３８５】
４．測定
前記３の（３）の（ｉ）試料〔１〕〜（ｖ）試料〔５〕の計５の試料の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定を、前記１の（１）の酸化活性測定用第１試薬及び前記１の（２）の酸化活性測定用第２試薬を用いて、前記の実施例１の〔１〕の４の記載の通りに行なった。
【０３８６】
この測定により求めた、前記の３の（ｉ）試料〔１〕〜（ｖ）試料〔５〕の計５の試料に含まれていた非トランスフェリン結合鉄の酸化活性を図７に示した。
【０３８７】
〔２〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定
本発明者らが先に確立した試料中の非トランスフェリン結合鉄の測定方法により、試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を行った。
【０３８８】
１．測定試薬の調製
（１）濃度測定用第１試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（１）の濃度測定用第１試薬を、本実施例における濃度測定用第１試薬として用いた。
【０３８９】
（２）濃度測定用第２試薬
前記の実施例１の〔２〕の１の（２）の濃度測定用第２試薬を、本実施例における濃度測定用第２試薬として用いた。
【０３９０】
２．精製水
前記〔１〕の２の精製水を、試薬盲検（試薬ブランク）を測定するための対照として用いた。
【０３９１】
３．試料
前記の〔１〕の３の（３）の（ｉ）試料〔１〕〜（ｖ）試料〔５〕の計５の試料のそれぞれを、試料として用いた。
【０３９２】
４．測定
前記３の（ｉ）試料〔１〕〜（ｖ）試料〔５〕の計５の試料の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定を、前記の実施例１の〔２〕の４の記載の通りに行なった。
【０３９３】
〔３〕試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性及び濃度の測定結果
前記〔１〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果、及び前記〔２〕における試料中の非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定結果について、以下述べる。
【０３９４】
前記〔１〕の４にて記載した図７は、この〔１〕の３の各試料についての、〔１〕における非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定結果を示したものである。
【０３９５】
この図７において、横軸は測定を行った試料（前記３の試料）の別、すなわち５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液と０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率を表し、縦軸は前記の〔１〕の３の（３）の（ｉ）試料〔１〕の試料中の非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値（Ａｂｓ／ｍｉｎ×１０４）を１００％としたときの他の試料における当該測定値の相対比率を表す。
【０３９６】
なお、前記〔２〕の４にて測定を行った前記〔２〕の３の各試料についての非トランスフェリン結合鉄の濃度の測定値は、（ｉ）試料〔１〕においては０．８４μＭ、（ｉｉ）試料〔２〕においては０．７６μＭ、（ｉｉｉ）試料〔３〕においては０．８７μＭ、（ｉｖ）試料〔４〕においては０．７４μＭ、そして（ｖ）試料〔５〕においては０．８３μＭであった。
【０３９７】
図７より、０．９μＭのクエン酸鉄水溶液の混合比率が高い試料ほど、すなわち、ウシ血清アルブミンに比べクエン酸鉄の比率が高い試料ほど、非トランスフェリン結合鉄の酸化活性の測定値が増加する傾向にあることが分かる。
【０３９８】
ところで、測定を行った（ｉ）試料〔１〕〜（ｖ）試料〔５〕の計５の試料は、いずれもその鉄濃度は０．９μＭであって同じであり、また、その非トランスフェリン結合鉄の濃度は前記の通りほぼ一定の範囲内のものである。
【０３９９】
これらのことより、タンパク質という高分子物質に結合している鉄（非トランスフェリン結合鉄）よりも、低分子化合物であるクエン酸に結合している鉄（非トランスフェリン結合鉄）の方が、よりその酸化活性が高く、生体に対する毒性がより強く出る可能性が示された。
【図１】
2014153226.tif 000002
【図２】
2014153226.tif 000003
【図３】
2014153226.tif 000004
【図４】
2014153226.tif 000005
【図５】
2014153226.tif 000006
【図６】
2014153226.tif 000007
【図７】
2014153226.tif 000008