(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた特性を有する新たなアルドヘキソースデヒドロケナーゼ（ＡＨＤＨ）及びそれを利用した技術を提供する。【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである、ＮＡＤ依存型アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ：（ａ）特定のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つ、ＡＨＤＨ活性を有するポリペプチド、（ｂ）前記アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列から成り、且つ、ＡＨＤＨ活性を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである、ＮＡＤ依存型アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ｐＨ４．５〜１１において安定である、請求項１に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
７０℃以下の温度で安定である、請求項１又は２に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
更に下記（Ａ）〜（Ｃ）の一つ以上の特性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ：
（Ａ）至適ｐＨ：６．９〜９．７
（Ｂ）Ｄ−マンノースに対するＫｍ値：２０〜５０ｍＭ
（Ｃ）Ｄ−マンノースを基質とした比活性が１５Ｕ／ｍｇ以上。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。 
【請求項６】
下記の（ｃ）〜（ｆ）のいずれかである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２の塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む形質転換体。 
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養液を精製する工程、を含む、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜４及びのいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼをＤ−マンノースを含む試料と接触させる工程を含む、Ｄ−マンノース濃度の測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含むプロダクト。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含むＤ−マンノース濃度測定用センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ、その製造方法、及び当該酵素の応用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１９）（以下、「ＡＨＤＨ」と称する場合もある）は、次式に示すように、Ｄ−アルドヘキソース及びそのアナログの可逆的な酸化反応を触媒する。
Ｄ−アルドヘキソース＋ＮＡＤ（Ｐ）  →  Ｄ−ヘキソン酸−δ−ラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋
（ここで、ＮＡＤは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示し、ＮＡＤＨは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示し、ＮＡＤＰは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を示し、ＮＡＤＰＨは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を示す。）
【０００３】
アルドヘキソースにはＤ−マンノースが含まれる。Ｄ−マンノースは、生体内では主に糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖合成に利用されており、糖タンパク質の生合成や分泌、さらには糖タンパク質の機能発現に重要な役割を果たしている。Ｄ−マンノースはヒト血中に存在し、例えば、血糖コントロール不良の糖尿病や真菌感染症の患者で、血中濃度が上昇するため、種々の疾患の診断に有用であることが示唆されている（特許文献１及び２）。
【０００４】
ＡＨＤＨは複数のバクテリアでその性質が明らかにされている。例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ由来のＮＡＤＰ依存性ＡＨＤＨが非特許文献１に記載されている。また、詳細な属種の分類は不明だが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ  ＭＳＵ−１という微生物由来のＮＡＤ依存性ＡＨＤＨが非特許文献２に記載されている。また、好熱好酸性アーキアであるサーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）にもＮＡＤ依存性ＡＨＤＨが存在することが知られている（非特許文献３）。  
【０００５】
ところで、ＮＡＤはＮＡＤＰより試薬として数倍安価なため、ＮＡＤ依存性であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ  ＭＳＵ−１由来とサーモプラズマ・アシッドフィラム由来のＮＡＤ依存性ＡＨＤＨは、ＮＡＤＰ依存性のものより産業利用の上で好ましい。しかし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ  ＭＳＵ−１由来ＮＡＤ依存性ＡＨＤＨは５５℃で熱処理したときの半減期が４０秒であり、酵素の安定性が求められる産業利用では必ずしも好適であるとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−８１０４５
【特許文献２】特開２００４−３３０７７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇａｄ  Ａｖｉｇａｄ，  Ｙａｉｒ  Ａｌｒｏｙ，  ａｎｄ  Ｓａｓｈａ  ＥｎｇｌａｒｄＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２４３（８）  １９６８  ｐｐ１９３６−１９４１
【非特許文献２】Ａ．  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄａｈｍｓ  ａｎｄＲｉｃｈａｒｄ  Ｌ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９７２  ２４７：  ２２２２−２２２７．
【非特許文献３】Ｎｉｓｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．  ６８  （２００４）  Ｎｏ．  １２  Ｐ  ２４５１−２４５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述するＡＨＤＨの用途との関係で、より優れた特性を有する新たなＡＨＤＨ及びそれを利用した技術を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく日夜研究を重ねた結果、思いかげず好熱性古細菌であるＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍから全く新規なＡＨＤＨを単離することに成功した。そして、このＡHＤHの特性を調べたところ産業上優れた特性(例えば、ｐＨ安定性及び熱安定性)を有することを見出した。本発明者等はかかる知見及び更なる発見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１０】
代表的な本発明は以下である。
項１．
下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである、ＮＡＤ依存型アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
項２．
ｐＨ４．５〜１１において安定である、項１に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
項３．
７０℃以下の温度で安定である、項１又は２に記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ。
項４．
更に下記（Ａ）〜（Ｃ）の一つ以上の特性を有する、項１〜３のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ：
（Ａ）至適ｐＨ：６．９〜９．７
（Ｂ）Ｄ−マンノースに対するＫｍ値：２０〜５０ｍＭ
（Ｃ）Ｄ−マンノースを基質とした比活性が１５Ｕ／ｍｇ以上。
項５．
項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。 
項６．
下記の（ｃ）〜（ｆ）のいずれかである、項５に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２の塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項７．
項５又は６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
項８．
項７に記載のベクターを含む形質転換体。 
項９．
項８に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養液を精製する工程、を含む、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項１０．
項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼをＤ−マンノースを含む試料と接触させる工程を含む、Ｄ−マンノース濃度の測定方法。
項１１．
項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含むプロダクト。
項１２．
項１〜４のいずれかに記載のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含むＤ−マンノース濃度測定用センサ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡＨＤＨは、Ｄ−マンノースを主な基質とし得ることが出来るため、試料（例えば、血中）のＤ−マンノース濃度を測定するために利用ことができる。また、本発明のＡＨＤＨは、グルコース及び／又はキシロースをも基質とし得るため、これらの濃度を測定するために利用することができる。更に、本発明のＡＨＤＨは、前記糖類を脱水素するあらゆる用途で利用することが出来る。本発明のＡＨＤＨは、ｐＨ安定性に優れ得る。例えば、ｐＨ４．５〜１１の範囲で高い活性を維持することが出来る。よって、このような幅広いｐＨ環境での使用に適しており、ｐＨ４．５〜６の範囲での使用が望まれるメディエーター（例えば、フェリシアン化物）と組み合わせた利用にも適している。本発明のＡＨＤＨは、温度安定性に優れ得るため、高温環境下での糖濃度の測定や測定用のセンサの製造にも適している。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の代表的なＡＨＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２】本発明の代表的なＡＨＤＨの各種糖に対する活性を測定した結果を示す。
【図３】本発明の代表的なＡＨＤＨの至適ｐＨを測定した結果を示す。
【図４】本発明の代表的なＡＨＤＨの温度安定性を測定した結果を示す。
【図５】本発明の代表的なＡＨＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図６】本発明の代表的なＡＨＤＨのＤ−マンノース濃度を変化させて測定した活性値を示す。
【図７】本発明の代表的なＡＨＤＨの反応速度とＤ−グルコース濃度との関係を示す。
【図８】本発明の代表的なＡＨＤＨの反応速度とＮＡＤ濃度との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性
本発明のポリペプチドは、下記の（ａ）又は（ｂ）であることが好ましい：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列から成り、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【００１４】
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性とは、電子受容体存在下でアルドヘキソースの水酸基を酸化する反応を触媒する活性を意味する。本書において、特に断りが無い限り、「酵素活性」、「活性」又は「ＡＨＤＨ活性」とは、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を意味する。アルドヘキソースとは、４個のキラル中心を有する任意の炭素数６の単糖を意味し、例えば、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−タロース、Ｄ−グロース及びＤ−イドース等を挙げることができる。糖尿病や真菌感染症の診断標識として利用可能であるという観点から、好ましいアルドヘキソースはＤ−マンノース及びＤ−グルコースである。一実施形態において、本発明におけるアルドヘキソースとは、Ｄ−マンノースであり得る。
【００１５】
前記電子受容体（メディエータ）としては、本発明のポリペプチドによるアルドヘキソースの脱水素反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されない。例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化物等を使用することができる。比較的低廉で汎用性が高いという観点で、好ましい電子受容体は、フェリシアン化物であり、例えば、フェリシアン化塩、特にフェリシアン化カリウムを挙げることができる。
【００１６】
２．ＡＨＤＨ活性の測定方法
ＡＨＤＨ活性は種々の公知の方法で測定することができる。本書では、ＡＨＤＨ活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。尚、ここではＤ−マンノースをアルドヘキソースとして記載するが、他のアルドヘキソース（例えば、ラクトース、マルトース及びシュークロース）についてもＤ−マンノースと置き換えて測定することができる。
＜試薬＞
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０
８０ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＤ＋水溶液
１．５Ｍ  Ｄ‐マンノース水溶液
酵素希釈溶液  ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸと０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
【００１７】
＜手順１＞
ＡＨＤＨ溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で０．８〜１．２Ｕ／ｍＬに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
【００１８】
＜手順２＞
上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２．６ｍＬ、Ｄ‐マンノース水溶液０．３ｍＬ、ＮＡＤ＋水溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃にて５分間予備加温したものを反応混液とする。
＜測定条件＞
反応混液３．０ｍＬに、酵素溶液０．０５ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、３４０ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その後直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈溶液を０．０５ｍＬ加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＡＨＤＨ活性を求める。ここでＡＨＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間にＮＡＤＨを生成する酵素量である。
【００１９】
ＡＨＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０５×希釈倍率］
／（６．２２×１．０×０．０５）
上記式に記載の数値は、下記を意味する。
３．０５：ＡＨＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２  ：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０    ：光路長（ｃｍ）
０．０５：添加するＡＨＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。
【００２０】
３．アミノ酸配列
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、後述する実施例に示される通り、好熱性古細菌であるＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＧＳＳ１株（以下、単に「Ｔｖ株」と称する場合もある。）から単離されたアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性（及び、好ましくは下記４〜１０に示す特性の少なくとも１つ）を有することが好ましい。前記同一性の程度としては、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％、更に好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。このような配列番号１のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、後述するような遺伝子工学的手法を用いて作成することができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を保持することを限度として、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても良い。ここで「数個」とは、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、２〜１００個、好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜６０個、更に好ましくは２〜５０個であり、より更に好ましくは２〜３０個、一層好ましくは２〜２０個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
【００２２】
上記変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は特に制限されないが、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドが有する表現型に顕著な影響を与えないという観点から「保存的アミノ酸置換」であることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。本書において「保存的アミノ酸置換」とは、上記に例示した同一のファミリー内でアミノ酸を置換することを意味する。
【００２３】
一又は数個の変異は、人為的に導入したものであっても本来的に存在するものであってもよい。人為的に導入する場合は、任意の手法で行うことが出来る。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置特異的突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、紫外線照射等を利用して導入することができる。一又は数個の変異が導入されたバリアント型アルドヘキソースデヒドロゲナーゼには、生物の個体差、種や属の違いに基づく場合の天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。変異を導入する領域は特に制限されないが、活性にネガティブな影響を与えないという観点から、触媒部位及び／又は基質結合部位に相当しない領域において導入することが好ましい。
【００２４】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、好ましくは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ。（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
【００２５】
４．ｐＨ安定性
本発明のポリペプチドは、少なくともｐＨ４．５〜１１の範囲で安定であることが好ましい。本明細書において、特定のｐＨ条件の下で安定であるとは、０．５ｍｇ／ｍＬの酵素を２５℃で１９時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは実質的に１００維持されていることを意味する。
【００２６】
５．温度安定性
本発明のポリペプチドは、少なくとも７０℃以下（０〜７０℃）の温度範囲において安定であることが好ましい。ここで、特定の温度条件の下で安定であるとは、特定の温度に設定した適当な緩衝液（例えば、リン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．０）中に１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を１５分間維持した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上であることを意味する。
【００２７】
６．至適ｐＨ
本発明のポリペプチドは、至適ｐＨが少なくとも６．９〜９．７であることが好ましい。至適ｐＨが６．９〜９．７であるとは、この範囲においてｐＨの値の幅が１を超えない間隔でＡＨＤＨ活性を測定した際に、該範囲内で最高の活性値を示すｐＨの活性を１００（％）としたときの相対活性（％）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上であることを意味する。至適ｐＨは任意の緩衝液を用いて測定することができるが、次の緩衝液を用いることが好ましい：ｐＨ４．０〜５．７（酢酸緩衝液）、ｐＨ５．８〜７．７（リン酸カリウム緩衝液）、ｐＨ７．３〜８．８（トリス塩酸緩衝液）、ｐＨ８．３〜９．７（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）。例えば、本発明のポリペプチドは、ｐＨ９．７（グリシン塩酸緩衝液）における活性を１００％として、少なくともｐＨ６．９〜９．７の範囲で８０％以上の相対活性を示すことが好ましい。後述する実施例に示す通り、Ｔｖ株由来のＡＨＤＨは、ｐＨ９．７（グリシン塩酸緩衝液）において最も高い活性を示し、且つ、ｐＨ７．３〜８．８を含むｐＨ６．９〜９．７が至適ｐＨ範囲に含まれる。
【００２８】
７．Ｄ−マンノースに対するＫｍ値
本発明のポリペプチドは、ＮＡＤを補酵素とした場合に、Ｄ−マンノースに対するＫｍ値が１００ｍＭ以下であることが好ましく、５０ｍＭ以下であることがより好ましい。一方で本発明のポリペプチドのＮＡＤを補酵素とした場合のＤ−マンノースに対するＫｍ値の下限は、特に制限されないが、例えば、好ましい下限は２０ｍＭであり、より好ましくは３０ｍＭであり、更に好ましくは４０ｍＭである。
【００２９】
８．基質特異性
本発明のポリペプチドは、Ｄ−マンノースに対する基質特異性に優れる。従来から知られる多くの糖脱水素酵素がＤ−グルコースに対する高い基質特異性を有し、Ｄ−マンノースに対する基質特異性が相対的に低いのに対し、本発明のポリペプチドは、Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して１０倍以上高い反応性を有し得る。
【００３０】
９．比活性
本発明のポリペプチドは、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を用いてＤ−マンノースへ反応させた場合、高い比活性を有していることが好ましい。比活性は、ポリペプチドが固体状（粉末状を含む）の場合は、その固体重量をタンパク質重量とみなし、酵素活性を測定して求めることができる。ポリペプチドが液体状の場合は、タンパク質重量を、例えば、Ａ２８０ｎｍの吸光度又はバイオラッド社のタンパク質定量試薬（商品名：バイオラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬）等を用いて測定し、酵素活性を測定して求めることができる。ポリペプチドが固体状であってＡＨＤＨ以外の成分を含むと思われる場合は、適当な溶液に溶解した上で液体状の標品として取り扱うことで比活性を求めることが出来る。
【００３１】
本発明のポリペプチドの比活性は５（Ｕ／ｍｇ）以上であることが好ましく、より好ましくは１０（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは１２（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは１５（Ｕ／ｍｇ）以上である。本発明のポリペプチドの比活性の上限は特に限定されないが、好ましくは５０（Ｕ／ｍｇ）以下、より好ましくは４０（Ｕ／ｍｇ）以下、さらに好ましくは３５（Ｕ／ｍｇ）以下、よりさらに好ましくは３０（Ｕ／ｍｇ）以下である。尚、本発明のポリペプチドの精製標品は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００３２】
１０．サブユニットの分子量
本発明のポリペプチドの単量体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約２７０００〜３３０００であることが好ましい。「約２７０００〜３３０００」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常２７０００〜３３０００の位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のポリペプチドを意味する。微生物によって生産された本発明のポリペプチドが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ポリペプチドに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ポリペプチドが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
【００３３】
１１．由来
本発明のポリペプチドの由来は特に限定されない。本発明のポリペプチドが由来する生物としては、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面又は内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物に由来するものを単離源とすることもできる。
【００３４】
典型的に、本発明のポリペプチドは微生物に由来する。微生物としては、例えば、超好熱性始原菌を挙げることができ、具体的にはパイロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｍ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属等を挙げることができる。好ましい微生物はサーモプラズマ属であり、より好ましくはサーモプラズマ・アシッドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）であり、更に好ましくはサーモプラズマ・ヴォルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）である。  
【００３５】
本発明のポリペプチドは、微生物から直接単離されるものだけでなく、単離されたポリペプチドを蛋白質工学的な方法により改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、前述の、サーモプラズマ属に分類される微生物等から取得した酵素を改変したものであってもよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、上記４〜１０で示す特性の少なくとも１つを満たすことが好ましく、より好ましくは少なくとも２つ、更に好ましくは少なくとも３つ、より更に好ましくは少なくとも４つ、一層好ましくは少なくとも５つ、より一層好ましくは少なくとも６つ満たすことが好ましい。上記４〜１０で示す特性を２つ以上満たす場合、その組合せは任意であるが、好ましくは上記４のｐＨ安定性及び上記５の温度安定性を含む。
【００３７】
１２．ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることが好ましい。 そのようなポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（ｃ）〜（ｇ）のいずれかを挙げることができる：
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２の塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、且つ、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３８】
本書において「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、それを発現させた場合に当該ポリペプチドが得られるポリヌクレオチド、即ち、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する。従って、コドンの縮重によって相違するポリヌクレオチドも含まれる。
【００３９】
配列番号２の塩基配列から成るポリヌクレオチドは、上述する実施例に示される通り、Ｔｖ株由来の配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、それがコードするポリペプチドがアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性（及び、好ましくは上記４〜１０で示す特性の少なくとも１つ）を有することを限度として、配列番号２の塩基配列と任意の同一性を有し得、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９５％以上、一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する。
【００４０】
塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、塩基配列の同一性の値（%）を算出することができる。
【００４１】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、それがコードするポリペプチドがアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ活性（及び、好ましくは上記４〜１０で示す特性の少なくとも１つ）を有し、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
【００４２】
具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ  ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。ストリンジェントな条件は、いわゆる高ストリンジェントな条件であることが好ましい。
【００４３】
このような条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、単離された状態で存在することが好ましい。ここで「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列等）等一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば、染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子等の遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液等を実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態は、好ましくは、ｄＮＴＰ等の前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。本発明のポリヌクレオチドには、上記（ｃ）〜（ｇ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであっても良い。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書又は添付の配列表の情報（特に、配列番号２）を基に任意の手法で得ることができる。例えば、化学的核酸合成法、遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法等を用いることにより、容易に調製することができる。化学的核酸合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用して行うことができる。
【００４６】
遺伝子工学的手法としては、本発明のポリペプチドが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる。ｃＤＮＡライブラリーを調整するための微生物は、本発明のポリペプチドを発現する微生物であれば特に制限れないが、好ましくは上記「由来」の項で記載した微生物を挙げることができる。
【００４７】
微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング、塩基配列の決定等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
【００４８】
ポリヌクレオチドの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０，１３５０（１９８５）〕又はその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法等の採用が好適である。ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーも配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計して合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えば、ゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等を用いて行うことができる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドを使用することにより、本発明のポリペプチドを容易且つ効率的に、安定して製造することができる。
【００５０】
１３．ベクター
本発明のベクターは、上記の「ポリヌクレオチド」の項で説明する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００５１】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８等）等）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００５２】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１．８４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照することができる。
【００５３】
１４．形質転換体
本発明の形質転換体は、任意の宿主細胞に本発明のポリヌクレオチドが発現可能な状態で導入された形質転換体であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記「ベクター」の項で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを発現して本発明のポリペプチドを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。中でも大腸菌、枯草菌、糸状菌が好ましく、より好ましくは大腸菌である。
【００５４】
宿主が大腸菌の場合、特にＫ−１２由来株が好ましく、ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＢ４，ＢＭ２５．５，ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ，ＢＷ３１３，Ｃ−ｌａ，Ｃ６００，ＣＪ２３６，ＤＨ１，ＤＨ５，ＤＨ５α，ＤＨ１０Ｂ，ＤＰ５０ｓｕｐＦ，ＥＤ８６５４，ＥＤ８７６７，ＥＲ１６４７，ＨＢ１０１，ＨＭＳ１７４，ＨＳＴ０２，ＨＳＴ０４ｄａｍ−／ｄｃｍ−，ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ，ＪＭ８３，ＪＭ１０１，ＪＭ１０５，ＪＭ１０６，ＪＭ１０７，ＪＭ１０８，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，Ｋ８０２，Ｋ８０３，ＬＥ３９２，ＭＣ１０６１，ＭＶ１１８４，ＭＶ１１９３，ＮｏｖａＢｌｕｅ，ＲＲ１，ＴＡＰ９０，ＴＧ１，ＴＧ２，ＴＨ２，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ，Χ−１７７６，γ−１０８８，γ−１０８９，γ−１０９０等を用いることができる。その場合のベクターとしては、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ２２ｂ，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９８，ｐＨＳＧ３９９，ｐＲＩＴ２Ｔ，ｐＵＥＸ１〜３，ｐＫＫ２２３−３，ｐＩＮIII １，ｐＴＴＱ１８，ｐＧＥＭＥＸ−１，ｐＧＨ−Ｌ９，ｐＫＫ２３３−２等が挙げられる。
【００５５】
宿主が枯草菌の場合は、バチルス・スブチルス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・チョウシネンシスなどが例として挙げられる。その場合のベクターとしてはｐＴＢ５３又はその改変体、ｐＨＹ３００ＰＬＫ又はその改変体、ｐＡＬ１０，ｐＡＬ１２、ｐＨＴ０１、ｐＨＴ０８、ｐＨＴ０９、ｐＨＴ１０、ｐＨＴ４３、ｐＮＹ３２６、ｐＮＣＭＯ２等が挙げられる。
【００５６】
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンデイダ属、ピキア属、クリプトコッカス属等が挙げられる。これらの属に属する具体的な宿主としては、各々サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、及びクリプトコッカス・エスピー等が挙げられる。この場合のベクターとしては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２等が挙げられる。
【００５７】
昆虫細胞を宿主とする場合は、ベクターとして、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が挙げられる。哺乳類細胞を宿主とする場合は、ベクターとして、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができる。
【００５８】
宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、コレトトリカム属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・レセイ、コレトトリカム・ヒエマリス等を例示することができる。
【００５９】
また、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００６０】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション又はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎ法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法等を利用して実施することができる。
【００６１】
本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のポリペプチドを製造することが可能となる。
【００６２】
１５．ポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記「由来」の項に示す野生型の微生物及び上記「形質転換体」の項に示す形質転換体を好適に利用することができる。
【００６３】
培養方法及び培養条件は、本発明のポリペプチドが生産される限り特に限定されない。即ち、本発明のポリペプチド生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００６４】
培地は、使用する微生物が生育可能であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュークロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加することができる。
【００６５】
市販のＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｉ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍ９培地（Ｍ９ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＣＹＭ培地（ＮＺＣＹＭ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＹＭ培地（ＮＺＹＭ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＮＺＭ培地（ＮＺＭ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＳＯＢ培地（ＳＯＢ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）、２ＸＹＴ培地（２ＸＹＴ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いることができる。
【００６６】
サーモプラズマ属に分類される微生物を培養して本発明のポリペプチドを製造する場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００６７】
培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約４〜９、好ましくは約６〜８程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００６８】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体より本発明のポリペプチドを回収することが好ましい。ポリペプチドを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。
【００６９】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してポリペプチドを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００７０】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００７１】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００７２】
培養液からのＡＨＤＨ活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）は、ＡＨＤＨ活性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行うことができる。
【００７３】
各精製工程ではＡＨＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進むことが好ましい。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。
【００７４】
組換えタンパク質として本発明のポリペプチドを得る場合、種々の修飾が可能である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと他の適当なポリヌクレオチドとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチド又はポリペプチドが連結された組換えタンパク質である本発明のポリペプチドを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００７５】
１６．プロダクト
本発明のプロダクトは、本発明のポリペプチドを含有する。本書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部又は全部を構成する製品であって、本発明のＡＨＤＨを含むものを意味する。例えば、本発明のプロダクトは、本発明のポリペプチドを含む組成物又はセンサの形態であってもよい。
【００７６】
本発明のプロダクトは、種々の用途に適用することができ、特に限定されるものではないが、典型的には以下の２つの原理のうちいずれかを利用するものが例示できる。
（Ｉ）ＡＨＤＨによりＤ−マンノースなどの基質の量（濃度）を測定すること。
（ＩＩ）ＡＨＤＨによる酵素反応により電流を発生させること。
【００７７】
上記の（Ｉ）の原理を用いるものとしては、体外診断の用途（例えばＡＨＤＨが基質とする糖の測定）が挙げられる。例えば、単糖であるＤ−マンノースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＨＤＨを用いて、Ｄ−マンノースの量又は濃度を測定することができる。
【００７８】
以下、Ｄ−マンノースを測定する場合を例に説明する。
【００７９】
本発明のＡＨＤＨを用いてＤ−マンノースの濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、Ｄ−マンノースや、他の任意の共役酵素の助けによりＤ−マンノースを生成しうる物質（例えば、共役酵素としてＤ−マンノースイソメラーゼを作用させることによりＤ−マンノースを生成させうるフルクトース）などの生体成分等を測定するための試薬、キット、センサなど種々の形態が例示できる。
【００８０】
Ｄ−マンノース測定用組成物の場合は、ＡＨＤＨ反応により生じたＮＡＤＨが、ＡＨＤＨを介して、ＤＣＰＩＰなどの電子受容体を還元させて自身はＮＡＤに戻り、ＤＣＰＩＰの構造が変化することによって生じる吸光度の差を比色定量することにより、Ｄ−マンノースの濃度を求めることができる。Ｄ−マンノースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。
【００８１】
Ｄ−マンノース測定用組成物は、キットの形態であってもよい。該キットは、例えば、本発明のポリペプチドを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含み、典型的には、アッセイに必要な緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのＤ−マンノース標準溶液、ならびに使用の指針を含み得る。本発明のＡＨＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００８２】
本発明のプロダクトは、常法に従ってセンサとすることができる。センサの形態でのＤ−マンノース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＡＨＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）及び参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、Ｄ−マンノースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のＤ−マンノース濃度を計算することができる。
【００８３】
電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエータとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、ＡＨＤＨを、グルタルアルデヒドを用いてカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８４】
上記の（ＩＩ）の原理を用いるものとしては、酵素電極（固定化電極であっても良い）、酵素センサ、燃料電池、さらには一つ又は複数の燃料電池を有する電子機器など種々の形態が例示できる。  
【００８５】
ＡＨＤＨを用いたＤ−マンノースの酸化反応により電子を取り出す燃料電池は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＨＤＨを用いて、燃料電池を作製し稼動させることができる。燃料電池の態様は特に制限されないが、例えば、以下のような手段により電池として稼動させることができる。まず、本発明のＡＨＤＨをバイオ燃料電池の負極において、ＡＨＤＨ、オスミウム錯体などの電子メディエータなどとともに固定化する。一方、正極において、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、ラッカーゼ、及びアスコルビン酸オキシダーゼ等から選択される酸化還元酵素と、ヘキサシアノ鉄酸イオン等のメディエータを固定化する。更に、負極と正極とを電子伝導性を持たずプロトンのみ伝導する電解質層を介して対向した構造を構築し、負極では、燃料として供給されたＤ−マンノースを本発明のポリペプチドにより分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ＋）を発生させる。正極では、負極から電解質層を通って輸送されたプロトンと負極から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成させる。Ｄ−マンノースを含有する燃料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。
【００８６】
本発明の燃料電池は電力が必要なものであれば任意の用途に利用することができ、大きさも制限されない。具体的には、この燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明を実施例及び試験例を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されない。 
【００８８】
実施例１  Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ由来ＡＨＤＨのクローニング
Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＧＳＳ1株を、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇ／Ｌ、グルコース  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．３２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３７２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４７ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０７４ｇ／Ｌ、１０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １．９３ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１８ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ０．４５ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ  ４・２Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ、ＶＯＳＯ  ４・２Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ）を加え、硫酸でｐＨを１．３に調節した培地で５８℃、二晩振とう培養した。その後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分間）により集菌した。Ｔｖ株は、(独)製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより入手可能である（ＮＢＲＣ番号１５４３８）。
【００８９】
遠心チューブ内に残存する培養液をキムワイプで拭き取った後、細胞１ｇあたり２０％シュークロース、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳを含んだ溶液１５ｍＬに懸濁し、１５０μＬのプロテアーゼK溶液(１０ｍｇ／ｍＬ)と１５０μＬのＲＮＡｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）とを加え、３７℃で１２時間維持した。これを等量のクロロホルム／フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取する操作を３回繰り返した。 
【００９０】
得られた水層に６００μＬの５Ｍ ＮａＣｌを加え混合した後、０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後に出現するＤＮＡを硝子棒に巻き付け精製ＤＮＡ標品とした。この精製ＤＮＡを５ｍＬの１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液（以下、ＴＥと略記する）に再溶解し、２００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを加え混合した後０．８倍量のイソプロピルアルコールを加え再抽出したＤＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄後、風乾の後１ｍＬのＴＥ（トリス塩酸−ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。
【００９１】
配列番号３に示す３７塩基からなるセンスプライマーと配列番号４に示す３４塩基からなるアンチセンスプライマーを合成し、このプライマーセットとＰｆｕｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼとを用い、実施例１で得られたＤＮＡを鋳型として、以下のサイクルでＰＣＲを行った。 
【００９２】
ステップ１：９４℃、１分間 
ステップ２：５０℃、１分間 
ステップ３：７２℃、２．５分間（３０サイクル） 
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて泳動すると、０．７８ｋｂの大きさの特異的バンドが認められた。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、このＤＮＡ断片を同じくＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化することにより得られたベクターｐＥＴ２８の開環物とライゲーションした。このようにして、組み換えベクターｐＥＴ／Ｔｖを得た。この組み換えベクターによりエシェリヒア・コリＸＬ１／Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。 
【００９３】
ｐＥＴ／Ｔｖの約０． ８ｋｂｐの挿入ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）及びＡＢＩ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列のオープンリーディングフレーム及びこれに対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号１に示した。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は２７０００〜３３０００であった。 
【００９４】
実施例２  形質転換体の作製 
エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のコンピテントセルをｐＥＴ／Ｔｖで形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）を得た。 
【００９５】
実施例３  形質転換体からのＴｖ株由来精製ＡＨＤＨの製造 
ＬＢ培地１００ｍＬを５００ｍＬフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した２０ｍｇ／ｍＬカナマイシン、３４ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社）０．１ｍＬを添加した。この培地にＬＢ培地で予め３７℃、１５時間振とう培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）の培養液１ｍＬを接種し、３７℃で８時間通気攪拌培養した。 
【００９６】
ＬＢ培地９００ｍＬを３Ｌフラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した２０ｍｇ／ｍＬカナマイシン及び３４ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．９ｍＬを添加した。この培地に８時間培養したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（ｐＥＴ／Ｔｖ）の培養液１００ｍＬを接種し、３０℃で１５時間通気攪拌培養した。培養終了時の培養液１ｍＬ中に含まれる菌体中のＡＨＤＨ活性は約４Ｕ／ｍＬであった。 
【００９７】
培養液中の菌体を遠心分離により集菌し、３００ ｍＭ ＮａＣｌ, 1 ｍｇ/ｍｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む５０ｍＭ  Ｎａ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波で破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を６０℃で６０分間熱処理し、遠心分離を行い、上清液を得た。 
【００９８】
上清液をＨＩＳ−ＳＥＬＥＣＴ (ｓｉｇｍａ) に吸着させ、５０ ｍＭ Ｎａ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ ６．０, ３００ ｍＭ ＮａＣｌ, １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むバッファーで洗浄後、０〜４００ ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔにて分離、精製を行った。次に、ＡＨＤＨが多く含まれる画分を回収し、透析（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５, ２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を行い、精製酵素標品を得た。本方法により得られたＡＨＤＨ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりほぼ単一なバンドを示した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，０００ダルトン）、アルブミン（６６，０００ダルトン）、オバルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）、α−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に示す。
【００９９】
実施例４  Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの基質特異性 
実施例３で得られた精製ＡＨＤＨを用いて、種々の糖に対する活性を、補酵素としてＮＡＤを用いて測定した。結果を図２及び下記の表１に示す。その結果、本酵素は、Ｄ−マンノースと２−デオキシ−Ｄ−グルコースに対しても高い活性を有することが判明した。また、これら２つの基質に対する活性よりも低いが、本酵素はＤ−グルコースに対しても活性を有し、二糖であるラクトースにも反応することが判明した。 
【０１００】
【表１】
2014180223.tif 000002
【０１０１】
実施例５  Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの至適ｐＨ
実施例３で得られた精製ＡＨＤＨ（２Ｕ／ｍＬ）についての至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．７、図中◆印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．８〜７．７、図中■印でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３〜８．８、図中▲印でプロット）、１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（８．３〜９．７、図中●でプロット）、を用いた。それぞれのｐＨにおいて、温度２５℃で酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図３に示す。Ｔｖ株由来ＡＨＤＨは残存活性８０％以上を示すｐＨ範囲はｐＨ６．９〜９．７であった。Ｔａ由来は残存活性８０％以上を示すｐＨ範囲はｐＨ８．４〜９．７であった。Ｔｖ株由来ＡＨＤＨは残存活性９０％以上をしめすｐＨ範囲はｐＨ６．９〜９．７であった。Ｔａ由来は残存活性９０％以上をしめすｐＨ範囲はｐＨ７．３〜９．７であった。このことから、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨが広い至適ｐＨ範囲をもつことが分かる。
【０１０２】
実施例６  Ｔｖ株由来精製ＡＨＤＨの熱安定性
実施例３により得られたＡＨＤＨ酵素液（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例３により得られたＡＨＤＨ酵素液を各温度（４℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃）で１５分間処理した後、活性残存率を測定した。結果を図４に示す。Ｔｖ株由来ＡＨＤＨは７０℃で残存活性９５．９％、８０℃で２３．６％であった。このことから、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨが熱安定性に優れていることが確認された。
【０１０３】
実施例７  Ｔｖ株由来の精製ＡＨＤＨのｐＨ安定性
実施例３により得られたＡＨＤＨ酵素液（０．５ｍｇ／ｍＬ）について、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０、図中◆印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝、液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図中■印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−ｐＨ９．０：図中▲印でプロット）、１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−１１．０、図中●でプロット）を用い、２５℃、１９時間処理した後の活性の残存率を測定した。結果を図５に示す。その結果、少なくともｐＨ４．５〜１１．０の範囲で酵素活性が９０％以上維持され、安定であることが判明した。
【０１０４】
実施例８  Ｔｖ株由来の精製ＡＨＤＨのＤ−マンノースに対するＫｍ値の測定
上記１−１記載の活性測定法において、基質であるＤ−マンノースの濃度を変化させて活性測定を行った。測定結果を図６に示す。図６からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＤ−マンノースに対するＫｍ値は、４４ｍＭであることが判明した。
【０１０５】
実施例９  Ｄ−グルコースに対するＫｍ値の測定
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨについて、Ｄ−グルコースの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図７）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、８９５ｍＭであることが判明した。Ｔａ株由来のＡＨＤＨのＤ−グルコースに対するＫｍ値は、特開２００４−３３０７７号公報に開示される通り、２０８ｍＭである。
【０１０６】
実施例１０  ＮＡＤに対するＫｍ値の測定
Ｔｖ株由来のＡＨＤＨについて、ＮＡＤの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図８）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、Ｔｖ株由来ＡＨＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値は、０．１５ｍＭであることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により製造したアルドヘキソースデヒドロゲナーゼはＤ−マンノース測定用試薬、センサ並びにＤ−マンノース濃度定量キット、燃料電池の原料としての供給が可能である。
【図１】
2014180223.tif 000003
【図２】
2014180223.tif 000004
【図３】
2014180223.tif 000005
【図４】
2014180223.tif 000006
【図５】
2014180223.tif 000007
【図６】
2014180223.tif 000008
【図７】
2014180223.tif 000009
【図８】
2014180223.tif 000010
【配列表】
2014180223000001.app