(57)【要約】【課題】簡単な工程でセルラーゼ活性阻害物質を十分に除去することができ、且つ高収率で糖が得られる糖の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は、セルロース系バイオマスから糖を製造する方法であって、水にセルロース系バイオマスを加え、煮沸する煮沸工程と、煮沸した第１混合液を冷却する冷却工程と、冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第１分解工程と、第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する分離工程と、水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする接触工程と、該精製水可溶画分を、水不溶画分に加えて第２混合液とし、該第２混合液を、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第２分解工程と、を備え、接触工程において、水可溶画分を吸着担体に接触させることにより、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され該水可溶画分から除外される糖の製造方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系バイオマスから糖を製造する方法であって、
水にセルロース系バイオマスを加え、煮沸する煮沸工程と、
煮沸した第１混合液を冷却する冷却工程と、
冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第１分解工程と、
前記第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する分離工程と、
前記水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする接触工程と、
該精製水可溶画分を、前記水不溶画分に加えて第２混合液とし、該第２混合液を、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第２分解工程と、
を備え、
前記接触工程において、前記水可溶画分を吸着担体に接触させることにより、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され該水可溶画分から除外される糖の製造方法。
【請求項２】
前記第２分解工程後、前記第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する抽出工程を更に備える請求項１記載の糖の製造方法。
【請求項３】
前記第１分解工程と第２分解工程とが連続して施される請求項１又は２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
前記吸着担体が、セライト、珪藻土、ベントナイト、シリカゲル、活性炭、アルミナ及び炭酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項５】
前記吸着担体が、イオン交換樹脂である請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項６】
前記イオン交換樹脂が、弱塩基性イオン交換樹脂である請求項５記載の糖の製造方法。
【請求項７】
前記接触工程が、前記吸着担体をカラムに充填し、前記水可溶画分を該カラムに通すことにより行われる請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項８】
前記セルラーゼ活性阻害物質が、水酸基含有化合物及び／又はカルボン酸化合物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項９】
前記煮沸工程が不活性ガス雰囲気下、温度１００〜１５０℃、圧力０．１〜５ＭＰａの条件で行われる請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖の製造方法によって得られる糖に酵母を加えることにより、前記糖を生分解させエタノールとするエタノールの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖の製造方法によって得られる糖に乳酸発酵菌を加えることにより、前記糖を発酵させ乳酸とする乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法に関する。更に詳しくは、酵素阻害物質を除去する工程を経由する糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
およそ７割が森林で囲われている緑豊かな国土を持つ日本には、スギ、稲ワラ、麦ワラ等、未利用のセルロース系バイオマスが豊富に存在している。
このような未利用のセルロース系バイオマスは、非食量資源からのバイオマスエタノールの生産のみならず、石油資源枯渇後の食料原料や化学工業、発酵原料としての糖を生産するための地球上でもっとも重要な炭素源となりうることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
自然界に存在しているセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンが複雑に絡み合った構造を構成している。このため、一般に、糖化の際には、カッターミル等による物理的な粉砕、アルカリ処理によるリグニンとセルロース・ヘミセルロースの構造破壊（例えば、非特許文献２参照）等が施され、その後、糖酵素処理が行われる。
【０００４】
ところが、これらの工程を施してセルロース系バイオマスを糖化させた糖化液は、濃度（収率）が十分とはいえない。このため、該糖化液を用いてエタノール発酵等をしたとしても（例えば、特許文献１参照）、発酵効率の面で実際に利用できるレベルには至っていない（例えば、非特許文献３又は４参照）。
【０００５】
これは、セルラーゼによる糖化反応において、生産物であるセルロース由来のグルコース、セロビオース、ヘミセルロース由来のマンノース、ガラクトース、キシロースによって、β−グルコシターゼの活性が阻害されるだけでなく（例えば、非特許文献５参照）、副生産物であるキシラン、可溶性でんぷん、ペクチン等の多糖類、キシロース、アラビノース、グルクロン酸等の炭水化物、フルフラール、バニリン、シリンガアルデヒド、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸、４−ヒドロキシ安息香酸等によっても、セルラーゼ及びβ−グルコシターゼの活性が阻害されるためと考えられる（例えば、非特許文献６参照）。すなわち、これらの物質が加水分解反応中にセルロース系バイオマスから徐々に遊離し、セルラーゼの活性を阻害するので、糖の収率が不十分となる。
また、セルラーゼの活性が阻害されるため、加水分解するために、大量のセルラーゼが必要となる欠点がある。
【０００６】
これに対し、セルロース系バイオマスからの糖の製造工程において、セルラーゼの活性を阻害する物質を除去する方法が検討されている。
例えば、多糖類系バイオマスを加水分解し、得られた加水分解物を木質系炭化物で処理し、加水分解物に含まれる発酵阻害物または発酵を阻害するであろう物質を除去する加水分解物中の発酵阻害物の除去方法（例えば、特許文献２参照）や、糖と発酵阻害物質を含む溶液から発酵阻害物質をポリスチレン系の樹脂に吸着または保持させて糖溶液を得る方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
なお、この他にも、加水分解中に限外ろ過によってグルコースなどの低分子を分離することにより加水分解反応を促進する方法や（例えば、非特許文献７）、微生物による発酵阻害物質の除去方法（例えば、非特許文献８）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３３７０９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２７００５６号公報
【特許文献３】特開２０１１−７８３２７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Nowak等，「Composite structure of woodcellsin petrified wood.」，「Materials Science and Engineering」，２００５年，Ｃ，２５，ｐ．１１９−１３０
【非特許文献２】Y. Yamashita等，「Effective enzymesaccharification and ethanol production from Japanese cedar using variouspretreatment methods.」，「Journal of Bioscience and Bioengineering」，２０１０年，１１０，ｐ．７９−８６
【非特許文献３】木本浩介等，「木質系原料からのバイオエタノール製造プロセス」，三井造船技報，２０１０年，２０１，ｐ．２４−２９
【非特許文献４】朝野賢司等，「日本におけるバイオエタノールの生産コストとCO2削減コスト分析」［online］，２００７年７月，AIST/BTRC DISCUSSION PAPER，インターネット＜URL:https://unit.aist.go.jp/btrc/research_result/documents/DISCUSSIONPAPER.pdf＞
【非特許文献５】Z. Xiao等，「Effect of Sugar Inhibition on Cellulasesand β− Glucosidase During Enzymatic Hydrolysis ofSoftwood Substrates.」，「Applied Biochemistry andBiotechnology」，２００４年，１１３−１１６，ｐ．１１１５−１１２６
【非特許文献６】E. Ximenes等，「Inhibitor of cellulases byphenols.」，「Enzyme and Microbial Technology」，２０１０年，４６，ｐ．１７０−１７６
【非特許文献７】P. Andric’等，「Effect and Modeling of Glucose Inhibition and In Situ Glucose RemovalDuring Enzymatic Hydrolysis of Pretreated Wheat Straw.」，「Applied Biochemistry andBiotechnology」，２０１０年，１６０，２８０−２９７
【非特許文献８】N. Nichols等，「Bioabatement to Remove Inhibitorsfrom Biomass-Derived Sugar Hydrolysates.」，「Applied Biochemistryand Biotechnology」，２００５年，１２１−１２４，３７９−３９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述した特許文献２及び３に記載の方法では、発酵阻害物の除去が十分とはいえず、糖の収率が優れるとはいえない。なお、非特許文献７記載の方法では、グルコースと同時に発酵阻害物質も回収されてしまう欠点があり、非特許文献８記載の方法では、大量の微生物が必要であり、且つ発酵前にその微生物を除去する工程が必要となる欠点がある。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡単な工程でセルラーゼの活性を阻害する物質（以下「セルラーゼ活性阻害物質」という。）を十分に除去することができ、且つ高収率で糖が得られる糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、第１分解工程を施し、第１混合液のうちの水可溶画分に吸着担体に接触させ、その後、精製水可溶画分を元に戻して第２分割工程を施すことにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明は、（１）セルロース系バイオマスから糖を製造する方法であって、水にセルロース系バイオマスを加え、煮沸する煮沸工程と、煮沸した第１混合液を冷却する冷却工程と、冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第１分解工程と、第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する分離工程と、水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする接触工程と、該精製水可溶画分を、水不溶画分に加えて第２混合液とし、該第２混合液を、温度３０〜５０℃で撹拌することにより加水分解する第２分解工程と、を備え、接触工程において、水可溶画分を吸着担体に接触させることにより、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され該水可溶画分から除外される糖の製造方法に存する。
【００１４】
本発明は、（２）第２分解工程後、第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する抽出工程を更に備える上記（１）記載の糖の製造方法に存する。
【００１５】
本発明は、（３）第１分解工程と第２分解工程とが連続して施される上記（１）又は（２）に記載の糖の製造方法に存する。
【００１６】
本発明は、（４）吸着担体が、セライト、珪藻土、ベントナイト、シリカゲル、活性炭、アルミナ及び炭酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の糖の製造方法に存する。
【００１７】
本発明は、（５）吸着担体が、イオン交換樹脂である上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の糖の製造方法に存する。
【００１８】
本発明は、（６）イオン交換樹脂が、弱塩基性イオン交換樹脂である上記（５）記載の糖の製造方法に存する。
【００１９】
本発明は、（７）接触工程が、吸着担体をカラムに充填し、水可溶画分を該カラムに通すことにより行われる上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の糖の製造方法に存する。
【００２０】
本発明は、（８）セルラーゼ活性阻害物質が、水酸基含有化合物及び／又はカルボン酸化合物である上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の糖の製造方法に存する。
【００２１】
本発明は、（９）煮沸工程が不活性ガス雰囲気下、温度１００〜１５０℃、圧力０．１〜５ＭＰａの条件で行われる上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の糖の製造方法に存する。
【００２２】
本発明は、（１０）上記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の糖の製造方法によって得られる糖に酵母を加えることにより、糖を生分解させエタノールとするエタノールの製造方法。
【００２３】
本発明は、（１１）上記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の糖の製造方法によって得られる糖に乳酸発酵菌を加えることにより、糖を発酵させ乳酸とする乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の糖の製造方法においては、煮沸工程、冷却工程、第１分解工程、分離工程、接触工程及び第２分解工程という簡単な工程で、糖を製造することができる。
本発明の糖の製造方法においては、第１分解工程を施し、第１混合液のうちの水可溶画分を吸着担体に接触させることで、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され、セルラーゼ活性阻害物質を十分に除去することができる。このことにより、セルラーゼの活性が持続することになるので、セルラーゼの使用量を従来よりも削減することができる。
【００２５】
本発明の糖の製造方法においては、セルラーゼ活性阻害物質が除外された精製水可溶画分を、元の水不溶画分と合わせて第２分割工程を施すことで、高収率で糖を得ることができる。なお、第１分解工程と第２分解工程とが連続して施される場合、より簡単に糖を製造することが可能となる。
【００２６】
本発明の糖の製造方法においては、第２分解工程後、第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する抽出工程を備える場合、より純度の高い糖を得ることができる。
【００２７】
本発明の糖の製造方法においては、吸着担体が、イオン交換樹脂である場合、生産効率が良く、セルラーゼ活性阻害物質との親和性に優れるという利点がある。
このとき、イオン交換樹脂が、弱塩基性イオン交換樹脂である場合、糖は通過させ、多種多様なセルラーゼ活性阻害物質を付着させることができるので、水可溶画分からセルラーゼ活性阻害物質を効果的に除去することができる。
また、セルラーゼ活性阻害物質が、水酸基含有化合物及び／又はカルボン酸化合物である場合、吸着担体により、セルラーゼ活性阻害物質を確実に除去することができる。
【００２８】
本発明の糖の製造方法においては、接触工程が、吸着担体をカラムに充填し、水可溶画分を該カラムに通すことにより行われる場合、接触工程を効率良く、簡単に行うことができる。
【００２９】
本発明の糖の製造方法においては、煮沸工程が不活性ガス雰囲気下、温度１００〜１５０℃、圧力０．１〜５ＭＰａの条件で行われる場合、セルロース系バイオマスを十分に解繊することができると共に、数十ｎｍオーダーの微細孔が形成される。これにより、糖の収率も向上させることができる。
【００３０】
本発明のエタノールの製造方法においては、上述の製造方法で得られた糖を用いるので、収率が飛躍的に向上したものとなる。
【００３１】
本発明の乳酸の製造方法においては、上述の製造方法で得られた糖を用いるので、収率が飛躍的に向上したものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、第１実施形態に係る糖の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、第２実施形態に係る糖の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】図３は、実施例１における糖化時間とグルコース生成速度又はグルコース濃度との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、比較例１における糖化時間とグルコース生成速度又はグルコース濃度との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例２、比較例２及びコントロールにおける発酵時間（ｈ）とエタノール濃度との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例３、比較例３及びコントロールにおける発酵時間（ｈ）と乳酸濃度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明においては、原料としてセルロース系バイオマスが用いられる。
ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロース及びヘミセルロースからなる多糖類がリグニンにより木化したものである。
かかるセルロース系バイオマスとしては、例えば、広葉樹、針葉樹等の農林水産物資源、又は、当該農林水産物資源の廃棄物が挙げられる。
より具体的には、セルロース系バイオマスとしては、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、木材繊維、木材チップ、単板くず、木粉、パルプ類、古紙類等が挙げられる。なお、さとうきび、テンサイ等の糖質資源、ばれいしょ、かんしょ、さといも等のでんぷん資源等、タンニン、リグニン含量が少ないもの、又は、リグニンが含まれないものもセルロース系バイオマスに含まれる。また、これらの原料は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００３４】
これらの中でも、セルロース系バイオマスは、ユーカリ木粉（広葉樹）、スギ木粉（針葉樹）、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房であることが好ましい。これらの場合、理由は定かではないが、解繊しやすく、比較的高収率で糖を得ることができる。
【００３５】
上記セルロースとは、グルコースがβ−１，４グルコシド結合により重合した重合体、それをカルボキシメチル化、アルデヒド化、エステル化等した誘導体等の混合物をいう。なお、本発明において、セルロースにおけるグルコースの重合度は、糖化率の観点から、２００以上であることが好ましい。
また、セルロースは、その部分分解物であるセロオリゴ糖、セロビオースを含んでもよく、結晶性であっても非結晶性であってもよい。なお、本発明において、セルロースは、結晶性セルロースであることが好ましい。
なお、セルロースは、上述したとおり、バイオマス由来のものであれば特に限定されず、植物由来、真菌由来、細菌由来であってもよい。
【００３６】
［第１実施形態］
図１は、第１実施形態に係る糖の製造方法を示すフローチャートである。
図１に示すように、第１実施形態に係る糖の製造方法においては、水にセルロース系バイオマスを加え、煮沸する煮沸工程Ｓ１と、煮沸した第１混合液を冷却する冷却工程Ｓ２と、冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、加水分解する第１分解工程Ｓ３と、第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する分離工程Ｓ４と、水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする接触工程Ｓ５と、該精製水可溶画分を、水不溶画分に加えて第２混合液とし、該第２混合液を、加水分解する第２分解工程Ｓ６と、第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する抽出工程Ｓ７と、を備える。
【００３７】
第１実施形態に係る糖の製造方法においては、煮沸工程Ｓ１、冷却工程Ｓ２、第１分解工程Ｓ３、分離工程Ｓ４、接触工程Ｓ５、第２分解工程Ｓ６及び抽出工程Ｓ７という比較的簡単な工程で、糖を製造することができる。
また、第１分解工程Ｓ３を施し、第１混合液のうちの水可溶画分を吸着担体に接触させることで、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され、セルラーゼ活性阻害物質を十分に除去することができる。このことにより、セルラーゼの活性が持続することになるので、セルラーゼの使用量を従来よりも削減することができる。
以下、各工程について更に詳細に説明する。
【００３８】
（煮沸工程）
煮沸工程Ｓ１は、水にセルロース系バイオマスを加えた第１混合液を煮沸する工程である。
煮沸工程Ｓ１を施すことにより、セルロース系バイオマスのリグニンとセルロース及びヘミセルロースとの交絡が解れ、繊維状となる。これにより、セルロース系バイオマスの表面積が増大し、後述する分解工程において、酵素が接触しやすくなる。
また、このとき同時にセルロース系バイオマスに含まれる水溶性の成分が溶出することになる。
【００３９】
煮沸工程Ｓ１において、第１混合液には、水溶性有機溶剤及び／又は有機酸が含まれていてもよい。この場合、比較的温和な条件であっても、セルロース系バイオマスを解繊させ、繊維状とすることが可能となる。
【００４０】
ここで、水溶性有機溶剤としては、メタノール、エタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコール等の多価アルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の非プロトン性極性溶剤等の水よりも比熱の低い水溶性有機溶剤が挙げられる。
これらの中でも、水溶性有機溶剤がアルコール類であることが好ましい。この場合、リグニンとセルロース及びヘミセルロースとの交絡をより一層解くことができる。また、アルコール類は人体にも無害であるため、安全性にも優れる。
【００４１】
有機酸としては、酢酸、シュウ酸、蟻酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
これらの中でも、酢酸、シュウ酸又はギ酸であることが好ましい。これらの有機酸は沸点が低いため、煮沸により容易に除去できる。
【００４２】
セルロース系バイオマスと、水との配合割合は質量比で、１：１〜１０であることが好ましい。この場合、リグニンとセルロース及びヘミセルロースとの交絡をより解くことができる。
【００４３】
また、水溶性有機溶剤及び有機酸を更に混合させる場合、水と水溶性有機溶剤と有機酸との配合割合が（水：水溶性有機溶剤：有機酸）、２〜３０質量％：６５〜９７．８質量％：０．２〜５質量％であることが好ましい。
有機酸の配合割合が、５質量％を超えると、有機酸の配合割合が上記範囲内にある場合と比較して、ヘミセルロース成分の過分解が起こる虞があり、水の配合割合が、３０質量％を超えると、水の配合割合が上記範囲内にある場合と比較して、ヘミセルロース成分の過分解が起こる虞がある。
【００４４】
水にセルロース系バイオマスを加えた第１混合液は、温度１００〜１５０℃で、１０〜６０分間煮沸される。
このとき、温度が１００℃未満であると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、第１混合液の煮沸が不十分となり、高い糖化率で糖が得られない。一方、温度が１５０℃を超えると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、一部の糖が分解してしまうため、高い糖化率で糖が得られなくなる。
【００４５】
煮沸工程は、耐圧容器内で行うことが好ましい。このときの耐圧容器内は、蒸気で飽和させることが好ましく、圧力が飽和蒸気圧の１〜５倍であることがより好ましい。
具体的には、耐圧容器内の圧力が、１〜５ＭＰａであることが好ましい。
圧力が、１ＭＰａ未満であると、圧力が上記範囲内にある場合と比較して、第１混合液を煮沸させるのに時間がかかる。
【００４６】
耐圧容器内は、予め不活性ガス雰囲気下としておくことが好ましい。かかる不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム等が挙げられる。この場合、酸化等によるセルロース系バイオマスの分解が抑制される。
【００４７】
なお、煮沸工程が不活性ガス雰囲気下、温度１００〜１５０℃、且つ、圧力０．１〜５ＭＰａの条件で行われる場合、第１混合液において、セルロース系バイオマスを十分に解繊することができると共に、数十ｎｍオーダーの微細孔が形成される。これにより、糖の収率を極めて向上させることができる。
【００４８】
（冷却工程）
冷却工程Ｓ２は、煮沸工程Ｓ１にて煮沸した第１混合液を冷却する工程である。
【００４９】
冷却工程Ｓ２は、第１混合液を室温まで空冷することにより行われる。なお、冷却方法は、空冷に限定されず、積極的に氷、冷蔵庫等で冷却してもよい。
【００５０】
（第１分解工程）
第１分解工程Ｓ３は、冷却工程Ｓ２にて冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、加水分解する工程である。
第１分解工程Ｓ３においては、酵素糖化法によりセルロース系バイオマスが加水分解される。
第１分解工程Ｓ３においては、セルロース系バイオマスの一部が糖化されることにより、水に溶出される。なお、このとき、セルラーゼ活性阻害物質もセルロース系バイオマスから遊離し、水に溶出されることになる。
【００５１】
加水分解酵素としては、セルラーゼが用いられる。
かかるセルラーゼは、セルロースをグルコース等にまで分解する酵素を意味している。
かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)菌、トリコデルマ属(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)菌、フザリウム属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)菌、ファネロケーテ属(Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ)菌、トレメテス属(Ｔｒｅｍｅｔｅｓ)菌、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)菌、フミコーラ属(Ｈｕｍｉｃｏｌａ)菌、アスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)菌、ムラキア属(Ｍｒａｋｉａ)菌、ムラキエラ属(Ｍｒａｋｉｅｌｌａ)菌等が挙げられ、これらの他にも、クロストリジウム属(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ)菌、シュードモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)菌、セルロモナス属(Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ)菌、ルミノコッカス属(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ)菌、バチルス属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)菌等の細菌、スルフォロバス属(Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ)菌、ストレプトマイセス属(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)菌、サーモアクチノマイセス属(Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ)菌等の放線菌が挙げられる。なお、これらの酵素は人工的に改変されていてもよい。また、これらの酵素は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。
また、セルラーゼは、一連の酵素群であってもよい。
かかる酵素群としては、エンドグルカナーゼ(ＥＣ ３．２．１．７４)、セロビオヒドロラーゼ(ＥＣ ３．２．１．９１)、β−グルコシナーゼ(ＥＣ ２３．２．４．１，ＥＣ ３．２．１．２１) 等が挙げられる。
なお、異なった微生物由来のセルラーゼを混合して用いることが好ましい。この場合、それらの相乗効果により、セルロースの糖化をより促進させることができる。
【００５２】
第１分解工程Ｓ３における加水分解は、加水分解酵素を加えた第１混合液を、緩衝剤でｐＨ３．５〜５．５に調整し、温度３０〜５０℃で１〜５０時間処理することによって行われる。
【００５３】
第１分解工程Ｓ３の加水分解反応は、回分式（バッチ式）で行ってもよいし、また固定化酵素を含むバイオリアクターを用いる連続式で行ってもよい。
また、第１分解工程Ｓ３に用いられる反応器としては、固定層反応器、流動層反応器、粉流相反応器等が挙げられ、固定層反応器が好ましく用いられる。
【００５４】
第１分解工程Ｓ３においては、加水分解酵素に加え、酸を第１混合液に添加してもよい。この場合、酸による加水分解も同時に行われることになる。すなわち、セルロース系バイオマスに対して、酵素糖化法と酸糖化法とが同時に施されることになる。このため、糖化がより促進される。なお、かかる酸の添加は、上述したｐＨ３．５〜５．５の範囲を逸脱しないことが好ましい。
【００５５】
（分離工程）
分離工程Ｓ４は、第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する工程である。このとき、水可溶画分には、糖とセルラーゼ活性阻害物質とが含まれる。なお、分離工程Ｓ４においては、水可溶画分と水不溶画分とを厳密に分離する必要は無い。すなわち、水不溶画分に、糖やセルラーゼ活性阻害物質が一部含まれていてもよい。
【００５６】
分離工程Ｓ４において、水可溶成分と、水不溶成分との分離方法は、特に限定されないが、例えば、ろ過、吸引ろ過、デカンテーション、遠心分離等で行われる。
【００５７】
（接触工程）
接触工程Ｓ５は、水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする工程である。すなわち、接触工程Ｓ５においては、水可溶画分を吸着担体に接触させることにより、セルラーゼ活性阻害物質が吸着担体に付着され該水可溶画分から除外される。
【００５８】
ここで、吸着担体としては、セライト、珪藻土、ベントナイト、シリカゲル、活性炭、アルミナ、炭酸カルシウム等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機担体が挙げられる。
【００５９】
これらの中でも、吸着担体は、セライト、珪藻土、ベントナイト、シリカゲル、活性炭、アルミナ及び炭酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、セライトであることがより好ましい。
また、吸着担体は、生産効率及びセルラーゼ活性阻害物質との親和性の観点から、イオン交換樹脂であることが好ましい。
【００６０】
ここで、イオン交換樹脂としては、弱塩基性イオン交換樹脂が好適に用いられる。この場合、糖を通過させ、多種多様なセルラーゼ活性阻害物質を付着させることができる。これにより、水可溶画分からセルラーゼ活性阻害物質を効果的に除去される。
弱塩基性イオン交換樹脂の具体例としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられる。
【００６１】
吸着担体の平均粒径は、反応速度を向上の観点から、３００μｍ未満であることが好ましい。
また、吸着担体は、多孔質であることが好ましい。吸着担体の形状としては、特に限定されないが、粒子状、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等が挙げられる。
【００６２】
上記セルラーゼ活性阻害物質としては、セルロース系バイオマスの成分を由来とする水酸基を含有する化合物（以下「水酸基含有化合物」という。）やカルボン酸化合物等が挙げられる。
例えば、セルロース、ヘミセルロース由来物質として、メリビオース、トレハロース、マルトース、アラビノース、イソシトール、ラムノース、ラクトース、イヌリン、澱粉、リビトール、キシラン、セロビオース、キシロース、プルラン、キシリトール、フコース、ラフィノース、マンノース、アラビトール等の水酸基含有化合物、蟻酸、グルクロン酸、グルコン酸等のカルボン酸化合物が挙げられる。
リグニン・タンニン由来物質として、バニリン等の水酸基含有化合物、バニリン酸、タンニン酸、カフェー酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、トリメシン酸、没食子酸、フェルラ酸、グリコール酸等のカルボン酸化合物が挙げられる。
針葉樹のリグニン由来物質として、メチルグアヤコール、エチルグアヤコール、ビニルグアヤコール、オイゲノール、プロピルグアヤコール、イソオイゲノール、アセトグアイアコン、プロピオグアイアコン、グアイアシルアセトン、ジヒドロコニフェニルアルコール等の水酸基含有化合物が挙げられる。
広葉樹（ユーカリ木粉）のリグニン由来物質として、シナピルアルコール、エチルシリンゴール、ビニルシリンゴール、プロピルシリンゴール、アリルシリンゴール、プロペニルシリンゴール等の水酸基含有化合物、酢酸、タンニン酸、没食子酸等のカルボン酸化合物が挙げられる。
また、水酸基含有化合物及びカルボン酸化合物以外にも、吸着担体は、リグノセルロース系バイオマスを加水分解すると生成するフルフラール等のフラン化合物も付着させることができる。
【００６３】
接触工程Ｓ５において、水可溶画分を、吸着担体に接触させる方法は、特に限定されないが、例えば、吸着担体をカラムに充填し、水可溶画分を該カラムに通すことにより行えばよい。この場合、接触工程Ｓ５を効率良く、簡単に行うことができる。
【００６４】
（第２分解工程）
第２分解工程Ｓ６は、接触工程Ｓ５で得られた精製水可溶画分を、分解工程Ｓ４で分離した水不溶画分に加えて第２混合液とし、該第２混合液を加水分解する工程である。
第２分解工程Ｓ６においては、酵素糖化法によりセルロース系バイオマスが加水分解される。
【００６５】
ここで、加水分解酵素は一般に水不溶性であるので、分解工程Ｓ４で分離した水不溶画分には、第１分解工程Ｓ３で加えた加水分解酵素が含まれる。すなわち、第２分解工程Ｓ６においては、精製水可溶画分と、水不溶画分とを合わせるだけで、加水分解酵素が含まれており、該加水分解酵素をそのまま用いることができる。このことから、第１実施形態に係る糖の製造方法においては、加水分解酵素の使用量を減らすことができる。
なお、当然、第２分解工程Ｓ６において、別途、新たに加水分解酵素を添加してもよい。この場合も加水分解酵素としては、セルラーゼが用いられる。
【００６６】
第２分解工程Ｓ６においては、未分解のセルロース系バイオマスが糖化されることにより、水に溶出される。なお、セルラーゼ活性阻害物質の多くは、第１分解工程Ｓ３で既にセルロース系バイオマスから遊離しており、第２分解工程Ｓ６においては、殆ど水に溶出されない。
【００６７】
第２分解工程Ｓ６における加水分解は、第２混合液を、緩衝剤でｐＨ３．５〜５．５に調整し、温度３０〜５０℃で２４時間以上処理することによって行われる。
【００６８】
第２分解工程Ｓ６の加水分解反応は、回分式（バッチ式）で行ってもよいし、また固定化酵素を含むバイオリアクターを用いる連続式で行ってもよい。
また、第２分解工程Ｓ６に用いられる反応器としては、固定層反応器、流動層反応器、粉流相反応器等が挙げられ、固定層反応器が好ましく用いられる。
【００６９】
第２分解工程Ｓ６においては、酸を第２混合液に添加してもよい。この場合、酵素糖化法と酸糖化法とが同時に施されることになるので、糖化がより促進される。なお、かかる酸の添加は、上述したｐＨ３．５〜５．５の範囲を逸脱しないことが好ましい。
【００７０】
第１実施形態に係る糖の製造方法においては、セルラーゼ活性阻害物質が除外された精製水可溶画分を、元の水不溶画分と合わせた第２混合液に対して第２分割工程Ｓ６を施すことで、高収率で糖化液を得ることが可能となる。
【００７１】
得られる糖化液は、バイオ技術による有用物資生産のための培地原料あるいは炭素源として用いることができる。
また、糖化液中の糖類を化学的に、化成品や高分子原料、生理活性物質等の有用物質に変換して用いることができる。
具体的には、エタノールの原料、乳酸の原料、バイオエタノールの原料、バイオディーゼル製造等の用途に好適に用いることができる。
【００７２】
（抽出工程）
抽出工程Ｓ７は、第２分解工程Ｓ６で得られた第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する工程である。
抽出工程Ｓ７を施すことにより、より純度の高い糖を得ることが可能となる。
【００７３】
糖を抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、吸引ろ過により、不純物をろ別することにより、ろ液として糖化液が得られる。
そして、得られた糖化液は乾固させ、乾固した成分から水で抽出することにより糖が得られる。
ちなみに、こうして得られる糖には、ヘミセルロースの加水分解により得られる五単糖からなるオリゴ糖が含まれる。オリゴ糖は精製後、機能性食品素材として利用可能である。
【００７４】
（エタノールの製造方法）
第１実施形態に係る糖の製造方法により得られる糖は、発酵法によりエタノールに変換することができる。
具体的には、得られた糖に酵母を加え、３０℃程度の恒温槽内で反応させることにより、糖を生分解させエタノールとすることができる。
エタノールの製造方法によれば、上述の糖の製造方法で得られた糖を用いるので、収率が飛躍的に向上したものとなる。
【００７５】
得られるエタノールは、精製することにより、化成品原料、溶媒あるいは自動車用燃料に用いることができる。また、エタノールを含む水溶液は、アルコール系飲料とすることもできる。
【００７６】
（乳酸の製造方法）  第１実施形態に係る糖の製造方法により得られる糖は、乳酸発酵菌を加え、３０℃程度の恒温槽内で反応させることにより、糖を発酵させ乳酸とすることができる。
乳酸の製造方法によれば、上述の糖の製造方法で得られた糖を用いるので、収率が飛躍的に向上したものとなる。
【００７７】
［第２実施形態］
図２は、第２実施形態に係る糖の製造方法を示すフローチャートである。
図２に示すように、第２実施形態に係る糖の製造方法は、第１分解工程Ｓ３ａと分離工程Ｓ４ａと第２分解工程Ｓ６ａとが連続して同じ系内で施されること以外は、第１実施形態に係る糖の製造方法と同じである。すなわち、第２実施形態に係る糖の製造方法は、煮沸する煮沸工程Ｓ１と、煮沸した第１混合液を冷却する冷却工程Ｓ２と、冷却した第１混合液に加水分解酵素を加え、所定の系内で加水分解する第１分解工程Ｓ３ａと、第１分解工程Ｓ３ａが施されている最中に、系内の第１混合液を、水可溶画分と水不溶画分とに分離する分離工程Ｓ４ａと、水可溶画分を、吸着担体に接触させ、精製水可溶画分とする接触工程Ｓ５ａと、該精製水可溶画分を、元の系に戻した（水不溶画分に戻した）第２混合液を、加水分解する第２分解工程Ｓ６ａと、第２混合液から糖化液を分取し、糖を抽出する抽出工程Ｓ７と、を備える。
【００７８】
第２実施形態に係る糖の製造方法においては、第１分解工程Ｓ３ａと第２分解工程Ｓ６ａとが連続して施されるので、より簡単に糖を製造することが可能となる。なお、第２分解工程における加水分解酵素は、第１分解工程Ｓ３ａのときに用いたものが引き続き用いられる。また、当然、第２分解工程Ｓ６ａにおいて、別途、新たに加水分解酵素を添加してもよい。この場合も加水分解酵素としては、セルラーゼが用いられる。
【００７９】
第２実施形態に係る糖の製造方法において、分離工程Ｓ４ａと、接触工程Ｓ５ａとは、連続して施すことが好ましい。水可溶画分を、これらの工程に循環させることにより、セルラーゼ活性阻害物質をより除外することができると共に、セルロース系バイオマスの糖化反応がより効率よく行うことができる。
【００８０】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００８１】
例えば、本実施形態に係る糖の製造方法においては、接触工程Ｓ５が、吸着担体をカラムに充填し、水可溶画分を該カラムに通すことにより行われているが、セルロース系バイオマスを含む水溶液に添加し、溶液全体を攪拌しながらセルラーゼ活性阻害物質を吸着担体に付着させてもよい。
【００８２】
本実施形態に係る糖の製造方法においては、抽出工程Ｓ７を施しているが、抽出工程Ｓ７は必ずしも必須の工程ではない。すなわち、第２分解工程Ｓ６で得られた第２混合液をそのまま用いてもよい。
【００８３】
本実施形態に係る糖の製造方法においては、煮沸工程Ｓ１で用いられるセルロース系バイオマスの直径が１０ｍｍ以下であることが好ましく、５ｍｍ以下であることがより好ましく、２ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
また、セルロース系バイオマスの直径が１０ｍｍより大きい場合、煮沸工程Ｓ１を施す前に、メカノケミカル工程を施すことが好ましい。
【００８４】
ここで、メカノケミカル工程は、セルロース系バイオマスを粉砕し、直径１０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下とする工程である。
メカノケミカル工程において、セルロース系バイオマスを粉砕することにより、セルロース系バイオマスの表面積が大きくなる。そうすると、煮沸工程Ｓ１において、セルロース系バイオマスが薬液に浸漬させやすくなる。
【００８５】
メカノケミカル工程は、粉砕機械を用いて行われる。
かかる粉砕機械としては、例えば、カッターミル、振動ボールミル、回転ボールミル、遊星型ボールミル、ロールミル、ディスクミル、高速回転羽根型ミキサー、ホモミキサー等が挙げられる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８７】
（実施例１）
加水分解反応容器内に、メカノミケミカル処理したユーカリ木粉（セルロース系バイオマス）２００ｇに、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）８００ｍｌを加え、１２１℃で３０分間加熱した（煮沸工程）。
室温まで冷却した後（冷却工程）、セルラーゼ（天野エンザイム株式会社製、Ｔ−４）３ＦＰＵ／ｇと、β−グルコシターゼ（ジェネンコア社製、Ｏｐｔｉｍａｓｈ  ＢＧ）６μｌ／ｇとを加え、３７℃で２４時間攪拌（１２０ｒｐｍ）を行い、加水分解反応を行った（第１分解反応）。
加水分解反応後、反応液を回収し、吸引ろ過によって水可溶画分と水不溶画分とに分離した（分離工程）。
水可溶画分は、イオン交換樹脂（ダウケミカル株式会社、ダウエックス・マラソンＷＢＡ、吸着担体）を充填したカラムを通過させ、セルラーゼ活性阻害物質を除去した（接触工程）。
イオン交換樹脂を通過した精製水可溶画分と、上記水不溶画分とを再び加水分解反応容器に戻し、さらにセルラーゼ６ＦＰＵ／ｇとβ−グルコシターゼ１２μｌ／ｇとを添加し加水分解反応を９６時間継続させた（第２分解工程）。
加水分解反応終了後、再び吸引ろ過によって残渣を分離し、糖化液を得た（抽出工程）。
【００８８】
（比較例１）
水可溶画分をイオン交換樹脂で処理しない（接触工程を施さない）こと以外は、実施例１と同様にして糖化液を得た。
【００８９】
（評価）
実施例１及び比較例１において、反応開始直後から２４時間ごとに反応液の一部を採取し、３分間煮沸処理して完全に酵素を失活させた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行うことにより水可溶画分を回収した。
そして、回収した水可溶画分について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりグルコース濃度を測定し、グルコース生成速度を算出した。
なお、グルコースの定量条件は、検出器：東ソーＲＩ−８０２０、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ−３０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ、移動相：イオン交換水、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃とした。
実施例１における糖化時間とグルコース生成速度又はグルコース濃度との関係を示すグラフを図３に、比較例１における糖化時間とグルコース生成速度又はグルコース濃度との関係を示すグラフを図４に示す。
図３中、実施例１の条件にてセルラーゼ活性阻害物質の除去後、加水分解反応を行った際のグルコース生成速度を「○」、グルコース濃度を「△」で示す。
図４中、比較例１の条件にて加水分解反応を行った際のグルコース生成速度を「○」、グルコース濃度を「△」で示す。
【００９０】
図３に示す結果より、実施例１のイオン交換樹脂を通過させた反応液は、反応開始４８時間後においてもグルコース生成速度の低下が確認されず、この条件では反応終了後、グルコース濃度が約４．５％（ｗ／ｖ）の糖化液を得た。
一方、図４に示す結果より、比較例１でイオン交換樹脂を通過させなかった反応液は、反応開始４８時間以降、セルラーゼ活性が大きく低下することが確認され、この条件では反応終了後、グルコース濃度が約３．２％（ｗ／ｖ）の糖化液を得た。
これらのことから、本発明に係る糖の製造方法によれば、糖化液中のグルコース濃度が従来よりも約１．４倍増えることが確認された。
【００９１】
（実施例２）
実施例１で得られた糖化液を凍結濃縮し、グルコース濃度が２０％（ｗ／ｖ）となるように調整した。そして、この糖化液に５％（ｗ／ｖ）となるように酵母エキスと麦芽エキスをそれぞれ添加し、この溶液にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを１白金耳（１０μｌ）加え、２７℃で撹拌（１２０ｒｐｍ）して培養することにより、エタノールを得た。
【００９２】
（比較例２）
実施例１で得られた糖化液を用いる代わりに、比較例１で得られた糖化液を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、エタノールを得た。
【００９３】
（コントロール）
実施例１で得られた糖化液を用いる代わりに、２０％（ｗ／ｖ）の市販のグルコースを用いたこと以外は、実施例２と同様にして、エタノールを得た。
【００９４】
（評価）
実施例２、比較例２及びコントロールにおいて、培養開始から２４時間後毎に採取した培養溶液を、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、０．２μｍのフィルターに通して菌体を完全除去し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてエタノール濃度を測定した。
エタノール定量条件は、検出器：東ソーＲＩ−８０２０、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ−３０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ、移動相：イオン交換水、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃とした。
実施例２、比較例２及びコントロールにおける発酵時間（ｈ）とエタノール濃度との関係のグラフを図５に示す。
図５中、実施例２で得られたエタノール濃度を「△」、比較例２で得られたエタノール濃度を「□」、コントロールで得られたエタノール濃度を「●」で示す。
【００９５】
図５に示す結果より、実施例２の糖化液を利用したエタノール発酵は培養開始４８時間目に最大となった。
また、培養４８時間目のエタノール濃度測定の結果、比較例２の糖化液を利用したエタノール発酵ではコントロールとの比で約３７．３％の発酵効率であったに対し、実施例２の糖化液を利用したエタノール発酵ではコントロールとの比で約８４．４％の発酵効率であった。
さらに、実施例２及び比較例２のエタノール発酵でのエタノール生成量を比較すると、実施例２の糖化液を利用したエタノール発酵は、比較例２の糖化液を利用したエタノール発酵に比べ、約２．２６倍のエタノール量が得られた。
【００９６】
（実施例３）
実施例１で得られた糖化液を凍結濃縮し、グルコース濃度が５％（ｗ／ｖ）となるように調整した。そして、この糖化液に２．５％（ｗ／ｖ）となるように酵母エキスを添加し、ジャーファンメーターに入れ、アルゴンガス雰囲気下、温度３０℃、ｐＨ９．０とした。この溶液に前培養したＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  Ｌ−１２０株を添加し、ｐＨ９．０、３０℃で７２時間撹拌（１８０ｒｐｍ）して培養することにより、乳酸を得た。
【００９７】
（比較例３）
実施例１で得られた糖化液を用いる代わりに、比較例１で得られた糖化液を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、乳酸を得た。
【００９８】
（コントロール）
実施例１で得られた糖化液を用いる代わりに、５％（ｗ／ｖ）の市販のグルコースを用いたこと以外は、実施例３と同様にして、乳酸を得た。
【００９９】
（評価）
実施例２、比較例２及びコントロールにおいて、培養開始から２４時間後毎に採取した培養溶液を、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、０．２μｍのフィルターに通して菌体を完全除去し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて乳酸濃度を測定した。
乳酸定量条件は、検出器：日立ハイテク社製２４２０  ＵＶ−ＶＩＳ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（４４０ｎｍ）、カラム：ＧＬ−Ａ１８０−Ｓ＋  ガードカラム、溶離液：３ｍＭＨＣｌＯ３、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、反応液：ＢＴＢ溶液、流速:０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃とした。
実施例３、比較例３及びコントロールにおける発酵時間（ｈ）と乳酸濃度との関係のグラフを図６に示す。
図６中、実施例３で得られた乳酸濃度を「△」、比較例３で得られた乳酸濃度を「◇」、コントロールで得られた乳酸濃度を「●」で示す。
【０１００】
図６に示す結果より、実施例３の糖化液を利用した乳酸発酵は培養開始４８時間目に最大となった。
また、培養４８時間目の乳酸濃度測定の結果、比較例３の糖化液を利用した乳酸発酵ではコントロールとの比で約７３．３％の発酵効率であったに対し、実施例３の糖化液を利用した乳酸発酵ではコントロールとの比で約９６．１％の発酵効率であった。
さらに、実施例３及び比較例３の乳酸発酵での乳酸生成量を比較すると、実施例３の糖化液を利用した乳酸発酵は、比較例３の糖化液を利用した乳酸発酵に比べ、約１．３１倍の乳酸量が得られた。
【０１０１】
以上より、本発明によれば、セルロース系バイオマスを原料とし、比較的温和な条件であっても、十分高い糖化率で糖を製造でき、それを用いることにより、十分高い収率でエタノール及び乳酸が製造できることが確認された。
【０１０２】
（参考実験）
１．セルラーゼ活性阻害の確認
表１に示すセルロース活性阻害物質がセルラーゼ活性に及ぼす影響を調査した。
２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルグルコピラノシドを含む１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、表１に示す酵素を加え、表１に示すセルロース活性阻害物質の濃度が６％（ｗ／ｖ）となるように加え、３０℃で１０分間酵素反応を行った。なお、対照区として６％（ｗ／ｖ）の滅菌蒸留水を用いた。
そして、以下に示すように相対活性を算出した。
相対活性（％）＝化合物におけるｐ−ニトロフェノール生成量（μｍｏｌ／ｍｌ）×１００／滅菌蒸留水におけるｐ−ニトロフェノール生成量（μｍｏｌ／ｍｌ）
なお、表１中、「T4(Amano)」は、セルラーゼ（天野エンザイム株式会社製、Ｔ−４）であり、「Ctec(Novozyme)」は、セルラーゼ（Novozymes A/S社製、Cellic Ctec）であり、「A3(Amano)」は、セルラーゼ（天野エンザイム株式会社製、Ａ−３）である。
得られた結果を表１に示す。
【０１０３】
（表１）
2014083003.tif 000003
【０１０４】
表１に示すように、各セルラーゼは、特に、タンニン酸、トリメシン酸、没食子酸、グルコン酸、グリコール酸、酢酸等のカルボン酸化合物によって強く酵素活性が阻害されることがわかった。
【０１０５】
２．実施例１及び比較例１にて生成したセルラーゼ活性阻害物質
実施例１及び比較例１の加水分解反応において、反応液中に含まれるタンニン酸、トリメシン酸、没食子酸の経時的な定量を行った。なお、実施例１においては、２４時間後にイオン交換樹脂で処理（接触工程）している。
芳香族カルボン酸の定量は、検出器：日立ハイテク社製２４２０  ＵＶ−ＶＩＳ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（２５４ｎｍ）、カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ８  ＲＳ＋  ガードカラム、移動相：アセトニトリル−５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ４．０）（１０：９０）、流速:１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃で行った。
実施例１の糖化液に含まれるセルラーゼ活性阻害物質の定量結果を表２に、比較例１の糖化液に含まれるセルラーゼ活性阻害物質の定量結果を表３にそれぞれ示す。
【０１０６】
（表２）
2014083003.tif 000004
【０１０７】
（表３）
2014083003.tif 000005
【０１０８】
表３に示すように、セルラーゼ活性阻害物質であるタンニン酸、トリメシン酸、没食子酸は、加水分解反応の経過に従い、継続的に溶出していることがわかった。
それに対し、表２に示すように、実施例１のイオン交換樹脂で処理した後（４８時間後以降）は、セルラーゼ活性阻害物質の量が大きく減少することが確認された。すなわち、吸着担体の処理により、糖化液中の３化合物の含量が約６０〜９０％減少できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の糖の製造方法は、バイオ技術による有用物資生産のための培地原料あるいは炭素源となる糖の製造に用いることができる。
上記糖の製造方法によれば、簡単な工程でセルラーゼ活性阻害物質を十分に除去することができ、且つ高収率で糖が得られる。
【符号の説明】
【０１１０】
Ｓ１・・・煮沸工程
Ｓ２・・・冷却工程
Ｓ３，Ｓ３ａ・・・第１分解工程
Ｓ４，Ｓ４ａ・・・分離工程
Ｓ５，Ｓ５ａ・・・接触工程
Ｓ６，Ｓ６ａ・・・第２分解工程
Ｓ７・・・抽出工程
【図１】
2014083003.tif 000006
【図２】
2014083003.tif 000007
【図３】
2014083003.tif 000008
【図４】
2014083003.tif 000009
【図５】
2014083003.tif 000010
【図６】
2014083003.tif 000011