(57)【要約】【課題】液滴画像の被写界深度と蛍光強度を同時に確保することができる微小粒子測定装置の提供。【解決手段】オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射する第１の光源と、前記液滴に対して、該液滴の画像を取得するための照明光を照射する第２の光源と、前記励起光の照射により前記微小粒子から発生する蛍光を検出すると共に、前記液滴の画像を取得する受光素子と、前記液滴と前記受光素子との間に配置されたフィルタ部材と、を備え、前記フィルタ部材は、前記蛍光及び前記照明光を透過する第１の領域と、該第１の領域の周囲に設けられ、前記蛍光を透過する一方、前記照明光を遮断する波長選択性を有する第２の領域と、を備える微小粒子測定装置を提供する。【選択図】図１
2014020918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射する第１の光源と、
前記液滴に対して、該液滴の画像を取得するための照明光を照射する第２の光源と、
前記励起光の照射により前記微小粒子から発生する蛍光を検出すると共に、前記液滴の画像を取得する受光素子と、
前記液滴と前記受光素子との間に配置されたフィルタ部材と、を備え、
前記フィルタ部材は、前記蛍光及び前記照明光を透過する第１の領域と、該第１の領域の周囲に設けられ、前記蛍光を透過する一方、前記照明光を遮断する波長選択性を有する第２の領域と、を備える微小粒子測定装置。
【請求項２】
前記第１の領域は、前記フィルタ部材の中心部に設けられ、前記第２の領域は、前記フィルタ部材の周辺部に設けられる請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項３】
前記第１の領域は、前記フィルタ部材に設けられた貫通孔である請求項２記載の微小粒子測定装置。
【請求項４】
前記第１の領域は、透明部材で形成されている請求項２記載の微小粒子測定装置。
【請求項５】
前記第２の領域は、ショートパスフィルタで形成されている請求項３記載の微小粒子測定装置。
【請求項６】
前記第２の光源は、前記蛍光よりも波長の長い前記照明光を出射する請求項５記載の微小粒子測定装置。
【請求項７】
前記第２の光源がＬＥＤである請求項６記載の微小粒子測定装置。
【請求項８】
オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射し、該励起光が照射された微小粒子から発生される蛍光を、フィルタ部材の第１の領域及び第２の領域に透過させて受光素子にて検出する手順と、
前記液滴に対して照明光を照射し、前記液滴に照射された照明光を、前記フィルタ部材の第２の領域で遮断し、前記第１の領域のみに透過させて前記受光素子にて液滴画像を取得する手順と、
を含む、微小粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子測定装置及び微小粒子分析方法に関する。より詳しくは、オリフィスから吐出される液滴の蛍光強度と液滴画像の被写界深度とを共に確保する微小粒子測定装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞等の微小粒子の特性を光学的、電気的あるいは磁気的に検出し、所定の特性を有する微小粒子のみを分別して回収する微小粒子測定装置（例えばフローサイトメータ）が知られている。
【０００３】
フローサイトメータにおける細胞分別では、まず、フローセルに形成されたオリフィスから流体ストリーム（細胞を含むサンプル液とシース液の層流）を発生させ、オリフィスに振動を印加して流体ストリームを液滴化し、液滴に電荷を付与する。そして、オリフィスから吐出される細胞を含む液滴の移動方向を電気的に制御して、所望の特性を有する目的細胞とそれ以外の非目的細胞とを別々の回収容器に回収している。
【０００４】
例えば、特許文献１には、マイクロチップ型のフローサイトメータとして、「微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する二以上の容器と、を備える微小粒子分取装置」が開示されている。
【０００５】
一方、フローサイトメータでは、照射系において、微小粒子から生じる散乱光や蛍光を効率良く検出するために、レーザ光をサンプル流に直角かつ焦点が合うように調整する光軸補正（キャリブレーション）が行われている。このキャリブレーションは、キャリブレーション用のマイクロビーズ（以下、「キャリブレーションビーズ」ともいう。）を流し、そのヒストグラムデータ等を見ながら集光レンズの位置やフォーカスを調整したり、光源の芯出しを行ったりして、レーザ光、サンプル流及び検出器の位置関係を最適化することにより行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１９０６８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
マイクロチップから射出される流体ストリームは、マイクロチップの個体差により射出角が個々に異なる。これは、観察光学系の深度方向に流体ストリームがずれることを意味し、液体ストリームが大きくずれた場合は、流体ストリーム画像（あるいは液滴画像）がぼけてしまう。ユーザは、流体ストリームのずれを目視にて確認し、ずれが生じている場合にはマニュアルで調整を行っているという実状がある。
仮に、液滴画像の情報を元にして、分取系のキャリブレーションを行う場合、液滴画像のぼけが少なく、かつ、キャリブレーションビーズの蛍光信号を可能な限り多く取得することが望ましい。しかしながら、キャリブレーションビーズの蛍光信号量を確保するためには、光学系の開口数（ＮＡ）を高くする必要がある。また、開口数（ＮＡ）を高くすると、背反として被写界深度が低下してしまう。
【０００８】
そこで、本技術は、液滴画像の被写界深度と蛍光強度を同時に確保することができる微小粒子測定装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本技術は、オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射する第１の光源と、前記液滴に対して、該液滴の画像を取得するための照明光を照射する第２の光源と、前記励起光の照射により前記微小粒子から発生する蛍光を検出すると共に、前記液滴の画像を取得する受光素子と、前記液滴と前記受光素子との間に配置されたフィルタ部材と、を備え、前記フィルタ部材は、前記蛍光及び前記照明光を透過する第１の領域と、該第１の領域の周囲に設けられ、前記蛍光を透過する一方、前記照明光を遮断する波長選択性を有する第２の領域と、を備える微小粒子測定装置を提供する。
この微小粒子測定装置は、蛍光及び照明光を透過する第１の領域と、蛍光を透過する一方、照明光を遮断する第２の領域とを有するフィルタ部材を液滴と受光素子との間である位置に配置することにより、蛍光は高い開口数（ＮＡ）で取得され、液滴画像は低い開口数（ＮＡ）で取得される。
この微小粒子測定装置において、前記第１の領域は、前記フィルタ部材の中心部に設けられ、前記第２の領域は、前記フィルタ部材の周辺部に設けられることが好ましい。
そして、前記第１の領域は、前記フィルタ部材に設けられた貫通孔であることが好ましく、また、透明部材で形成されていることも好ましい。
一方、前記第２の領域は、ショートパスフィルタで形成されていることが好ましい。
前記第２の光源は、前記蛍光よりも波長の長い前記照明光を出射することが好ましく、例えば、この第２の光源がＬＥＤであることが好ましい。
【００１０】
また、本技術は、オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射し、該励起光が照射された微小粒子から発生される蛍光を、フィルタ部材の第１の領域及び第２の領域に透過させて受光素子にて検出する手順と、前記液滴に対して照明光を照射し、前記液滴に照射された照明光を、前記フィルタ部材の第２の領域で遮断し、前記第１の領域のみに透過させて前記受光素子にて液滴画像を取得する手順と、を含む、微小粒子分析方法も提供する。
【００１１】
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。細胞には、動物細胞（血球系細胞など）および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１２】
本技術により、液滴画像の被写界深度と蛍光強度を同時に確保することができる微小粒子測定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本技術に係る微小粒子測定装置のソーティングの際のキャリブレーション用の光学系を説明するための模式図である。
【図２】本技術に係る微小粒子測定装置に用いられるフィルタ部材の一例の構成を説明する模式図である。
【図３】本技術に係る微小粒子測定装置において、励起光が照射された微小粒子から発生される蛍光を検出する光学系の一例を表す模式図である。
【図４】本技術に係る微小粒子測定装置において、照明光が照射されて、液滴の画像を撮像する光学系の一例を表す模式図である。
【図５】フィルタ部材に設けられる貫通孔の径を説明するための図であり、マイクロチップのオリフィスから射出される流体ストリームの軌道のばらつきを表す模式図である。
【図６】微小粒子測定装置の受光素子により撮像される液滴画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置の構成
（１）マイクロチップ
（２）第１の光源（蛍光検出系）
（３）第２の光源（撮像系）
（４）フィルタ部材
（５）受光素子
（６）分取系
（７）制御部等
２．微小粒子測定装置の動作
【００１５】
１．微小粒子測定装置
図１は、マイクロチップ型フローサイトメータとして構成された本技術に係る微小粒子測定装置１（以下「フローサイトメータ１」とも称する）におけるソーティングの際のキャリブレーション用の光学系を説明する模式図である。
【００１６】
図１に例示するフローサイトメータ１では、ディスポーザブルユース（使い捨て）が可能なマイクロチップ２により流路系が構成されている。このマイクロチップ２により、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションを防止することが可能となっている。
【００１７】
フローサイトメータ１は、マイクロチップ２のオリフィス２１から吐出される、微小粒子を含む液滴Ｄに対して励起光Ｌ１を照射する第１の光源３と、その液滴Ｄに対して、液滴Ｄの画像を取得するための照明光Ｌ２を照射する第２の光源４とを備えている。
また、フローサイトメータ１は、励起光Ｌ１が照射された微小粒子（あるいは微小粒子に標識された蛍光物質）から発生する蛍光Ｆを検出すると共に液滴画像を取得する受光素子５と、液滴Ｄと受光素子５との間に配置されるフィルタ部材６と、を備えている。
まず、微小粒子を含む液滴Ｄを吐出するオリフィス２１を備えるマイクロチップ２について説明し、次いで、フローサイトメータ１のソーティングの際のキャリブレーション用の光学系（蛍光検出系及び撮像系）について説明する。
【００１８】
（１）マイクロチップ
マイクロチップ２には、測定対象とする被検微小粒子を含むサンプル液又は参照微小粒子（キャリブレーションビーズ）を含むキャリブレーション液が導入される流路（サンプル流路２２等）が形成されている。キャリブレーションビーズとは、キャリブレーション用に、均一な光学特性を示すように調製された微小粒子を意味する。
以下で述べる「サンプル液」には、サンプル液とキャリブレーション液の両方が含まれることとする。また、以下で述べる「微小粒子」には、被検微小粒子とキャリブレーションビーズの両方が含まれることとする。
【００１９】
マイクロチップ２は、流路（サンプル流路２２等）が形成された基板により構成される。基板は、例えば、ガラスやＰＣ、ＰＭＭＡ、ＰＥ、ＰＰ、ＰＳ、及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の各種樹脂材料により形成される。
基板への流路の形成は、例えば、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチング、熱可塑性樹脂材料の射出成形、樹脂製基板のナノインプリントや機械加工等によって行うことができる。また、マイクロチップ２は、流路を形成した基板を同じ材質又は異なる材質の基板で封止することで形成することができる。
【００２０】
マイクロチップ２の流路は、シース液層流の中央にサンプル液層流が位置された３次元層流が形成される構造とされる。図１に例示されるマイクロチップ２では、サンプル液は、送液コネクタ部からサンプルインレット２３に導入され、送液コネクタ部からシースインレット２４に導入されるシース液と合流して、サンプル流路２２を送液される。そして、シースインレット２４から導入されたシース液は、２方向に分かれて送液された後、サンプルインレット２３から導入されたサンプル液を２方向から挟み込むようにしてサンプル液に合流する。これにより、シース液層流の中央にサンプル液層流が位置された３次元層流が形成される。
【００２１】
なお、サンプル流路２２に詰まりや気泡が生じた際に、サンプル流路２２内に負圧を加えて流れを一時的に逆流させて詰まりや気泡を解消するための吸引流路２５が形成されていてもよい。この吸引流路２５の一端には、送液コネクタ部を介して真空ポンプ等の負圧源に接続される吸引アウトレット２５１が形成され、他端はサンプル流路２２に接続している。
【００２２】
また、フローサイトメータ１は、サンプル流路２２で細胞の特性検出が行われるように構成することができる。例えば光学的検出では、不図示の光照射検出部によって、サンプル流路２２中を３次元層流の中心に一列に配列して送流される細胞に対してレーザ光が照射され、細胞から発生する散乱光や蛍光が光検出器によって検出される。
【００２３】
マイクロチップ２に形成されているサンプル流路２２の一端にはオリフィス２１が設けられており、３次元層流は、オリフィス２１から流体ストリームＳとなって排出される。図１中、オリフィス２１からの流体ストリームの排出方向をＹ軸正方向によって示す。
オリフィス２１から射出される流体ストリームＳは、ピエゾ振動素子等のチップ加振部により、マイクロチップ２の全体又はオリフィス２１に印加される振動によって液滴化される。
【００２４】
（２）第１の光源（蛍光検出系）
第１の光源３は、励起光Ｌ１を出射可能な光源であり、レーザダイオード（以下、「ＬＤ」と記す。）が好適に用いられる。ＬＤ以外にも、第１の光源３として、ＳＨＧ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）レーザ、固体レーザ、ガスレーザ、及び高輝度ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ：発光ダイオード）などを用いてもよい。
【００２５】
第１の光源（ＬＤ）３から出射されるレーザ光（励起光）Ｌ１は、集光レンズ７にて集光され、ミラー９及びフィルタ部材６を透過して、オリフィス２１から射出される流体ストリームＳ中の液滴Ｄに照射される。
液滴Ｄに照射されたレーザ光（励起光）Ｌ１によって、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から蛍光や散乱光が発せられる。ここで、蛍光及び必要な散乱光成分（例えば、後方散乱光や側方散乱光など）は、微小粒子の特性を得る上で重要な光成分である。
【００２６】
ＬＤ３からのレーザ光Ｌ１の照射により、微小粒子等から発せられる蛍光Ｆは、フィルタ部材６を透過し、ミラー９に反射されて、受光素子５にて検出される。ミラー９としては、励起光Ｌ１を透過する一方、蛍光Ｆを反射するダイクロイックミラーを用いることができる。
【００２７】
（３）第２の光源（撮像系）
第２の光源４は、流体ストリームＳ中の微小粒子を含む液滴Ｄに対して、液滴Ｄの画像を取得するための照明用の光（照明光）Ｌ２を照射する。図１では、第２の光源４から出射される照明光Ｌ２が、集光レンズ８を介して、流体ストリームＳ中の微小粒子を含む液滴Ｄに集光される例を示している。
【００２８】
第２の光源４としては、ＬＤに比べて、微小粒子を含む液滴Ｄを均一に照らすことができ、安価かつ長寿命である観点から、発光ダイオード（以下、「ＬＥＤ」と記す。）４を用いることが好ましい。後述するフィルタ部材６にショートパスフィルタを用いることができることからも、蛍光より波長の長い照明光を出射可能なＬＥＤ４を用いることが好ましい。
従来は、照明光としてもＬＤを用いることが多かったが、レーザ光では液滴Ｄを均一に照らし難いため、綺麗な液滴画像を取得し難かった。ところが、照明光としてＬＥＤ４を用いれば、微小粒子を含む液滴Ｄを均一に照らして、綺麗な液滴画像を取得することが可能となる。
【００２９】
また、ＬＥＤは種々の波長のものが市販されており、第２の光源４としてＬＥＤを用いることにより、照明光Ｌ２の波長の選択肢を広げることができる。本技術では、蛍光Ｆに近い波長の照明光を出射するＬＥＤ４を用いることが好ましい。
本技術の撮像系では、微小粒子の蛍光取得と、液滴画像の取得とは、共通の光学系（一つの受光素子５）にて行っている。そのため、蛍光Ｆの波長と照明光Ｌ２の波長との差が大きい場合には、色収差により、蛍光画像又は液滴画像のうちのどちらか一方の画像がぼけてしまうおそれがある。ところが、一般に、ＬＥＤはＬＤに比べて波長選択肢が広いことから、蛍光Ｆに近い波長の照明光Ｌ２を出射するＬＥＤ４を選択することで、このような問題を回避することが可能となる。
【００３０】
第２の光源（ＬＥＤ）４から出射される照明光Ｌ２が、微小粒子を含む液滴Ｄに照射されて、受光素子５によって液滴画像が撮像される。この際、照明光Ｌ２は、フィルタ部材６の貫通孔６１のみを透過し、貫通孔６１を除く残余の部分である周辺部６２で遮断されることで、深い被写界深度を確保することができる。次に、フィルタ部材６の構成について詳述する。
【００３１】
（４）フィルタ部材
フィルタ部材６は、マイクロチップ２のオリフィス２１から射出される流体ストリームＳ（あるいは液滴Ｄ）と、受光素子５との間の光学経路上に配置される。
このフィルタ部材６は、第１の光源（ＬＤ）３から出射されるレーザ光（励起光）Ｌ１と、微小粒子から発生する蛍光Ｆを透過する一方、第２の光源（ＬＥＤ）４から出射される照明光Ｌ２を遮断する波長選択性を有する光学フィルタから構成されている。そして、図２に示すように、この光学フィルタ（フィルタ部材６）には貫通孔６１が設けられている。
【００３２】
フィルタ部材６の貫通孔６１の部位は、励起光Ｌ１、照明光Ｌ２、及び蛍光Ｆを透過する領域（以下、「第１の領域」という。）となっており、貫通孔（第１の領域）６１の周辺部６２は、上記波長選択性を有する光学フィルタの性質により、励起光Ｌ１及び蛍光Ｆを透過する一方、照明光Ｌ２を遮断する領域（以下、「第２の領域」という。）となっている（図２参照）。
【００３３】
本技術に係る光学系は回転対称であるのが望ましいことから、第１の領域（貫通孔）６１が中央部に設けられ、第２の領域（周辺部）６２が中央部６１を除く残余の部位（貫通孔６１の周囲の部位）に設けられていることが好ましい。
第１の領域６１及び第２の領域６２のそれぞれのフィルタ部材６に対する相対的な大きさ（面積）は特に限定されないが、画像鮮鋭度（ＭＴＦ）と被写界深度とのバランスからそれぞれの必要な面積を決定することが望ましい。
【００３４】
一般に、励起光Ｌ１は蛍光Ｆよりも波長が短いことから、蛍光波長よりも長い波長の照明光Ｌ２を出射するＬＥＤ４を用い、光学フィルタとしてショートパスフィルタを用いることが好ましい。ショートパスフィルタで構成されるフィルタ部材６により、そのフィルタ部材６の貫通孔（中央部）６１及び周辺部６２にて励起光Ｌ１及び蛍光Ｆを透過し、周辺部６２にて照明光Ｌ２を遮断することが可能となる。なお、第２の光源４の照明光Ｌ２の波長により、光学フィルタとして、ロングパスフィルタやバンドバスフィルタ等を用いることも可能である。
【００３５】
次に、第１の光源（ＬＤ）３と第２の光源（ＬＥＤ）４との開口数（ＮＡ）の違いについて、説明の便宜上、それぞれ別々の光学系として示した図３及び図４を用いて説明する。図３は、励起光が照射された微小粒子から発生される蛍光を検出する光学系の一例を表す模式図である。図４は、照明光が照射されて、液滴の画像を撮像する光学系の一例を表す模式図である。
なお、図３及び図４に示す光学系は、液滴Ｄ（あるいは流体ストリームＳ）とフィルタ部材６との間にコリメーターレンズ１０を配置し、フィルタ部材６と受光素子５との間に集光レンズ１１を配置した構成としてある。
【００３６】
図３に示すように、第１の光源（ＬＤ）３から出射される励起光Ｌ１が、液滴Ｄ中の微小粒子に照射され、励起された微小粒子から発せられる蛍光Ｆが、フィルタ部材６の照射面の全面を透過する。そのため、蛍光Ｆは、受光素子５にて高いＮＡで取得され、微弱な蛍光Ｆについても高感度に測定することが可能となる。
【００３７】
一方、図４に示すように、第２の光源（ＬＥＤ）４から出射される照明光Ｌ２は、フィルタ部材の貫通孔（第１の領域）６１のみを透過し、フィルタ部材６の貫通孔６１を除く周辺部６２で遮断される。そのため、照明光Ｌ２は、受光素子５にて低いＮＡで取得され、液滴画像の被写界深度を深くすることが可能となる。
以上のように、本技術では、液滴Ｄと受光素子５との間の光学経路上に配置されたフィルタ部材６により、液滴Ｄ中に含まれる微小粒子の蛍光強度と、液滴画像の被写界深度とを同時に確保することを可能としている。
【００３８】
なお、図１におけるＺ軸方向においても、オリフィス２１から射出される流体ストリームＳの射出角度（図５のθ参照）のずれが生じることがある。しかしながら、本技術における光学系では、上述の通り、目的に応じて実効ＮＡを切り替えることができるため、流体ストリームＳのＺ軸方向のずれに対しても、蛍光信号が明るく（蛍光強度が高く）、明視野画像はより明瞭に（焦点深度が深く）取得することが可能となる。
【００３９】
次に、フィルタ部材６に設けられる貫通孔６１の径について、図５及び図６を参照して説明する。図５は、マイクロチップ２のオリフィス２１から射出される流体ストリームＳの軌道のばらつきを表す模式図である。図６は、マイクロチップ２のオリフィス２１から吐出される液滴Ｄを受光素子５にて撮像した際の液滴画像の一例である。
【００４０】
図５に示すように、マイクロチップ２の個体差により、オリフィス２１から射出される流体ストリームの軌道Ｓｏは僅かに異なり、流体ストリームは、垂直方向に対して角度θ（例えば、０度〜±１度程度（一例：約±０．５度））のばらつきを有して射出されることがある。
この角度θと、マイクロチップ２の一端（オリフィス２１の開口端）から液滴が形成されはじめる位置（ブレーク・オフ・ポイント）までの距離ａ（例えば、０〜２０ｍｍ程度（一例：約１６ｍｍ））とから、液滴の観察部位での流体ストリームの軌道変位ｂは、ａ×ｔａｎθ（一例：約±０．１４ｍｍ）前後することになる。これを観察光学系の被写界深度仕様とする。
【００４１】
一方、図６に示すように、オリフィス２１から吐出された流体ストリームＳから液滴Ｄが形成される際、液滴Ｄよりも小さな（例えば、直径約２０μｍ程度の）サテライトドロップＤｓが観察される。
液滴形成は、このサテライトドロップＤｓの形状を確認し、管理することにより行われるため、サテライトドロップＤｓを解像できることが条件となる。フィルタ部材６の貫通孔６１の径は、上述の被写界深度及び解像度の二つの条件を満たすように設計した値（一例：約２ｍｍ）とされる。
【００４２】
なお、フィルタ部材６は、照明光Ｌ２及び蛍光Ｆを透過する第１の領域６１と、蛍光Ｆを透過する一方、照明Ｌ２を遮断する波長選択性を有する第２の領域６２とを備えていればよく、上述の光学フィルタに貫通孔６１が設けられた構成（図２参照）以外のフィルタ部材を用いることもできる。
例えば、第１の領域が透明部材で形成され、第２の領域がショートパスフィルタ等の波長選択性を有する光学フィルタで形成されるフィルタ部材としてもよい。この場合、透明部材には、例えば、透明ガラスやＰＭＭＡ、ＰＣ等の透明樹脂等が用いられる。
また、例えば、第１の領域と第２の領域とが、それぞれ異なる波長選択性を有する光学フィルタで構成されるフィルタ部材としてもよい。
フィルタ部材としては、安価で容易に作製することができる観点から、上述の光学フィルタに貫通孔６１を設けた構成（図２参照）とするのが好ましい。
【００４３】
フィルタ部材６の形状及び厚さは、特に限定されない。例えば、円形、楕円形、四角形、及び多角形等の形状で、０．５〜１０ｍｍ程度の厚みを取ることができる。第１の領域（貫通孔）６１の形状は、フィルタ部材の形状と合わせてもよいし、フィルタ部材の形状と異なっていてもよい。
【００４４】
（５）受光素子
受光素子５は、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発せられる蛍光Ｆを検出する「蛍光検出部」として機能すると共に、第２の光源４から照明光Ｌ２が液滴Ｄに照射されて液滴画像を取得する「ドロップレットカメラ」としても機能する。
【００４５】
受光素子５は、マイクロチップ２のオリフィス２１から射出される流体ストリームＳあるいはオリフィス２１から吐出される液滴Ｄを撮像する。受光素子５としては、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージセンサ等を用いることが好ましい。
受光素子５により撮像された画像は、ディスプレイ等の表示部に表示されて、ユーザがオリフィス２１における液滴の形成状況（液滴の大きさ、形状、間隔等）を確認するために利用される。また、撮像された液滴画像を画像処理することにより、液滴を求める形に形成していくためにも利用される。
【００４６】
また、フローサイトメータ１では、搭載されるマイクロチップ２の個体差によってオリフィス２１から射出される流体ストリームＳ（あるいは液滴Ｄ）の軌道が異なり、マイクロチップ２の交換の度に流体ストリームＳの位置が図１中Ｚ軸方向（及びＸ軸方向）に変化し得る。このような流体ストリームＳ（あるいは液滴Ｄ）のＺ軸方向（及びＸ軸方向）における位置変化を検出するためにも受光素子５を利用することが可能である。
【００４７】
さらに、フローサイトメータ１では、マイクロチップ２を新しいものに交換したり、外部の環境（気温等）が変化したりすることで、液滴形成のパラメータ（シース圧、液滴周波数、ピエゾ駆動圧等）を変更する必要が生じる場合がある。この場合、微小粒子が光照射検出部により検出されてから微小粒子を含有する液滴に電荷をかけるまでの時間（以下、当該時間をディレイタイムと記すこともある。）を調整する必要がある。このディレイタイムを決定するために、本技術に係る光学系により取得される蛍光を利用することが可能である。
【００４８】
（６）分取系
オリフィス２１から射出される流体ストリームＳ中の微小粒子を分取する構成については、従来の微小粒子測定装置（微小粒子分取装置やセルソータを含む）と同様に構成することができる。具体的には、オリフィス２１から吐出される微小粒子を含む液滴Ｄに電荷を付与する荷電部と、オリフィス２１から吐出される液滴Ｄの移動方向に沿って配設され、該液滴Ｄを挟んで対向して配置される一対の偏向板と、微小粒子を含む液滴Ｄを受け入れる複数の回収容器と、を備えて構成することが可能である。
【００４９】
一対の偏向板は、荷電部にて液滴に付与された電荷との電気的な作用力によって、液滴Ｄの移動方向を制御する電極を含んで構成される。また、偏向板は、オリフィスから射出される流体ストリームＳの軌道も流体ストリームＳに付与された電荷との電気的な作用力によって制御する。オリフィス２１から吐出される液滴Ｄは、偏向板との間の電気的な作用力の有無又はその大小によって、複数の回収容器のうちのいずれか一つに誘導され、回収される。
【００５０】
（７）制御部等
フローサイトメータ１は、上述の構成に加え、通常のフローサイトメータが備える、細胞の光学特性検出のための光照射検出部、特性判定のためのデータ解析部、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部及び上述した各構成を制御するための制御部等を備える。
【００５１】
制御部は、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成でき、ハードディスク内にはＯＳと後述する微小粒子分析方法を実行するプログラムなどが格納されている。
【００５２】
また、光照射検出部は、ＬＤと、細胞に対してレーザ光を集光・照射する集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、ＬＤの照射によって細胞から発生する測定対象光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子等によって構成される。
【００５３】
光照射検出部の検出系により検出される測定対象光は、測定光の照射によって細胞から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。これらの測定対象光は電気信号に変換され、制御部に出力され、細胞の光学特性判定に供される。
【００５４】
なお、フローサイトメータ１は、磁気的あるいは電気的に細胞の特性を検出するものであってもよいものとする。この場合には、マイクロチップ２のサンプル流路２２に微小電極を対向させて配設し、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、あるいは、磁化、磁界変化、磁場変化等を測定する。
【００５５】
２．微小粒子測定装置の動作
続いて、本技術の微小粒子測定装置１により、微小粒子を分析する方法（微小粒子分析方法）について説明する。
【００５６】
本技術の微小粒子測定装置１は、マイクロチップ２のオリフィス２１から吐出される液滴Ｄに向けて、第１の光源（ＬＤ）３から励起光Ｌ１を出射し、液滴Ｄに対して励起光Ｌ１を照射する（図１参照）。このとき、励起光Ｌ１が照射された液滴Ｄ中の微小粒子等から蛍光Ｆや散乱光が発せられる。
【００５７】
一方、オリフィス２１から吐出される液滴Ｄの画像を取得するために、その液滴Ｄに向けて、第２の光源（ＬＥＤ）４から照明光Ｌ２を出射し、液滴Ｄに対して照明光Ｌ２を照射する（図１参照）。
【００５８】
そして、本技術の微小粒子測定装置１では、一つの受光素子５にて、微小粒子から発せられる蛍光Ｆを検出すると共に、オリフィス２１から吐出される液滴Ｄの画像を取得する。
【００５９】
微小粒子等から発せられる蛍光Ｆ等の信号強度は非常に小さいため、精度よく検出するためには、蛍光強度を確保したまま、検出する必要がある。
また、液滴Ｄの形成状況の確認や、流体ストリームＳの位置変化の検出等を効率的に行えるよう、被写界深度の深い液滴画像を取得する必要がある。
そこで、本技術の微小粒子測定装置１では、照明光Ｌ２及び蛍光Ｆを透過する第１の領域６１と、蛍光Ｆを透過する一方、照明光Ｌ２を遮断する第２の領域６２とを有するフィルタ部材６を液滴Ｄと受光素子５との間に配置して用いている。この第１の領域６１及び第２の領域６２を有するフィルタ部材６については、上述の通りである。
【００６０】
微小粒子測定装置１では、受光素子５にて、フィルタ部材６の第１の領域６１及び第２の領域６２を透過した蛍光Ｆを検出する。この際、蛍光Ｆはフィルタ部材６で遮られることなく、高いＮＡで取得される（図３参照）。そのため、蛍光強度を確保することが可能となる。
また、受光素子５にて、フィルタ部材６の第１の領域６１のみを透過した照明光Ｌ２による液滴画像を取得する。照明光Ｌ２はフィルタ部材６の第２の領域６２で遮断され、低いＮＡで液滴画像が観察される（図４参照）。そのため、液滴画像の被写界深度を深くすることが可能となる。
【００６１】
以上説明したように、フローサイトメータ１では、液滴Ｄと受光素子５との間に配置された上記フィルタ部材６を用いることで、受光素子５により、液滴中の微小粒子から発生する蛍光の信号強度をほとんど低下させずに検出することが、かつ、被写界深度の深い液滴画像を取得することができる。
そのため、フローサイトメータ１では、従来、液滴（あるいは流体ストリーム）の画像の被写界深度が浅く、当該画像のぼけに対して、ピント調整機構によりマニュアルで行っていたピント調整を不要とでき、簡便に精度の高い測定及び分析が可能である。また、ピント調整機構を不要とできることから、装置サイズもコンパクトになり、安価にすることが可能となる。
【００６２】
本技術に係る微小粒子測定装置は以下のような構成をとることもできる。
（１）オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射する第１の光源と、前記液滴に対して、該液滴の画像を取得するための照明光を照射する第２の光源と、前記励起光の照射により前記微小粒子から発生する蛍光を検出すると共に、前記液滴の画像を取得する受光素子と、前記液滴と前記受光素子との間に配置されたフィルタ部材と、を備え、前記フィルタ部材は、前記蛍光及び前記照明光を透過する第１の領域と、該第１の領域の周囲に設けられ、前記蛍光を透過する一方、前記照明光を遮断する波長選択性を有する第２の領域と、を備える微小粒子測定装置。
（２）前記第１の領域は、前記フィルタ部材の中心部に設けられ、前記第２の領域は、前記フィルタ部材の周辺部に設けられる上記（１）に記載の微小粒子測定装置。
（３）前記第１の領域は、前記フィルタ部材に設けられた貫通孔である上記（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）前記第１の領域は、透明部材で形成されている上記（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（５）前記第２の領域は、ショートパスフィルタで形成されている上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の微小粒子測定装置。
（６）前記第２の光源は、前記蛍光よりも波長の長い前記照明光を出射する上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の微小粒子測定装置。
（７）前記第２の光源がＬＥＤである上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の微小粒子測定装置。
（８）オリフィスから吐出される、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射し、該励起光が照射された微小粒子から発生される蛍光を、フィルタ部材の第１の領域及び第２の領域に透過させて受光素子にて検出する手順と、前記液滴に対して照明光を照射し、前記液滴に照射された照明光を、前記フィルタ部材の第２の領域で遮断し、前記第１の領域のみに透過させて前記受光素子にて液滴画像を取得する手順と、を含む、微小粒子分析方法。
【符号の説明】
【００６３】
１：微小粒子分取装置（フローサイトメータ）
２：マイクロチップ
２１：オリフィス
３：第１の光源（ＬＤ）
４：第２の光源（ＬＥＤ）
５：受光素子
６：フィルタ部材
６１：第１の領域（貫通孔）
６２：第２の領域（周辺部）
６３：照射面
Ｓ：流体ストリーム
Ｄ：液滴
Ｌ１：励起光（レーザ光）
Ｌ２：照明光
Ｆ：蛍光
【図１】
2014020918.tif 000003
【図２】
2014020918.tif 000004
【図３】
2014020918.tif 000005
【図４】
2014020918.tif 000006
【図５】
2014020918.tif 000007
【図６】
2014020918.tif 000008