(57)【要約】【課題】腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、幹細胞／前駆細胞（癌幹細胞を含む）の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うための医薬の製造において使用される化合物に関する。【解決手段】本発明に係る化合物は、腫瘍細胞、幹細胞または前駆細胞に投与されるための下式に示す化合物である。2014028853.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うための医薬の製造における、一般式（Ｉ）の化合物の使用方法であって、
【化１】
2014028853.tif 000004
式中、Ａは、ＣまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、および、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族またはアリール脂環族のヒドロカルビル基から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で結合して脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義し、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３はＨ、または、１〜８個の主鎖炭素原子とＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンから選択される０〜３個のヘテロ原子とを含む脂肪族もしくはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である、方法。
【請求項２】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うことは、癌の治療または予防のための療法を含む、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節することは、奇形種の治療または予防のための療法を含む、請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記治療が後成的治療である、請求項２または３に記載の使用方法。
【請求項５】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うことは、ヒストンメチル化の阻害を含む、請求項４に記載の使用方法。
【請求項６】
前記ヒストンメチル化の前記阻害がヒストン３上のリシン２７のメチル化の阻害を含む、請求項５に記載の使用方法。
【請求項７】
前記ヒストンメチル化の前記阻害が、個々の細胞においてポリコーム抑制複合体を枯渇させることを含む、請求項５または６に記載の使用方法。
【請求項８】
前記ポリコーム抑制複合体がポリコーム抑制複合体２、ポリコーム抑制複合体３およびポリコーム抑制複合体４のうちの少なくとも１つである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリコーム抑制複合体を枯渇させることが、前記ポリコーム抑制複合体と腫瘍抑圧遺伝子との間で複合体の放出を生じさせる、請求項７または８に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記アポトーシスを誘導することが腫瘍抑圧遺伝子を再活性化させることによって達成される、請求項９に記載の使用方法。
【請求項１１】
前記腫瘍抑圧遺伝子がＦＢＸ０３２である、請求項１０に記載の使用方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が哺乳類から得られる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１４】
哺乳類が、ラット、マウス、ウシ、ブタおよびヒトから選択される、請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
所定の量の前記一般式（Ｉ）の化合物を前記腫瘍細胞と接触させることを含む、請求項１３または１４に記載の使用方法。
【請求項１６】
前記腫瘍細胞が培養される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が、細胞株ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄからなる細胞株より選択される、請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの異なる所定量の前記一般式（Ｉ）の化合物と、少なくとも第１のおよび第２の腫瘍細胞とを使用し、第１の腫瘍細胞が２つの所定の量の低い方に接触し、第２の腫瘍細胞が２つの所定の量の高い方に接触する、請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１９】
前記第１および第２の腫瘍細胞が同じ患者から得られる、請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞においてアポトーシスを判定することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記一般式（Ｉ）の化合物に対する患者の反応を個々に予測する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２２】
幹細胞または前駆細胞が、胚幹細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２３】
前記化合物が３−デアザネプラノシンである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２４】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うための医薬組成物であって、
（ａ）請求項１で規定される化合物またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）担体または賦形薬と
を含む医薬組成物。
【請求項２５】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤のうちの少なくとも一つを更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、５‐アザシチジン、デシタビン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、およびゼブラリンから選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＤＮＡ脱メチル化剤が、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、ｐｓａｍｍａｐｌｉｎ  Ａ、オリゴデオキシヌクレオチドＭＢ９８、および２−（１，３−Ｄｉｏｘｏ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−（ｌＨ−  インドール−３−イル）プロピオン酸（ＭＧ９８）から選択される、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ヒストン−デアセチラーゼ阻害剤が、酪酸塩、フェニル酪酸塩、バルプロ酸、ｍ−カルボキシである桂皮酸性のビスヒドロキシアミド酸（ＣＢＨＡ）、ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ、ＰＤＸ−１０１、ＭＳ−２７５、デプシペプチド、ｐｙｒｏｘａｍｉｄｅ、ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅヒドロキシアミン酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチン（ＴＳＡ）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＬＢＨ５８９、ａｐｉｃｉｄｉｎ、ＣＨＡＰ、ｔｒａｐｏｘｉｎ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｌｉｎｅおよびＭＳ−２７５から選択される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導する方法であって、前記方法は前記腫瘍細胞に一般式（Ｉ）の化合物を投与することを含み、
【化２】
2014028853.tif 000005
式中、
Ａは、ＣまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４とＲ５は、Ｈ、および、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族またはアリール脂環族のヒドロカルビルから独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で結合して脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義し、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３はＨ、または、１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である方法。
【請求項３０】
前記腫瘍細胞が培養される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２１の方法は、前記細胞があるＭＣＦ−７（ＭＢ−４６８（ＳＫ−ＢＲ−３）およびＴ４７Ｄ．）からなる細胞株から選択することができる前記細胞が、細胞株ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍細胞でアポトーシスを判定することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍細胞が哺乳類から得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍細胞が哺乳類に含まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳類がラット、マウス、ウシ、ブタおよびヒトから選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
一般式（Ｉ）の化合物の所定の量で前記腫瘍細胞を接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
一般式（Ｉ）の化合物の少なくとも２つの異なる所定量、および少なくとも第１のおよび第２の腫瘍細胞の使用を含む方法であって、第１の腫瘍細胞が２つの所定の量の低い方で接触し、第２の腫瘍細胞が２つの所定の量の高い方接触する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１および第２の腫瘍細胞が同じ患者から得られる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が患者の一般式（Ｉ）の化合物に対する反応を個々に予測する方法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が後成的方法である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導することが、ヒストンメチル化の阻害を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ヒストンメチル化の前記阻害が、ヒストン３の上でリシン２７のメチル化の阻害を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ヒストンメチル化の前記阻害が、それぞれの細胞でポリコーム抑制複合体を枯渇させることを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのポリコーム抑制複合体の少なくとも１つの成分のレベルを測定することを更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つのポリコーム抑制複合体の前記の少なくとも１つの成分のレベルの計測の結果を制御計測の場合と比較することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリコーム抑制複合体を枯渇させることが、前記ポリコーム抑制複合体と腫瘍抑圧遺伝子の間に複合体を放出する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
アポトーシスが腫瘍抑圧遺伝子を再活性化させることによって達成される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍抑圧遺伝子がＦＢＸ０３２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
個々の細胞でＦＢＸ０３２の発現を測定することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＦＢＸ０３２発現の計測の結果を制御計測の場合と比較することを更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節する方法であって、前記幹細胞または前駆細胞に一般式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法であり、
【化３】
2014028853.tif 000006
式中、Ａは、ＣまたはＮであり
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、または、Ｎ、Ｏ、ＳもしくはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族もしくはアリール脂環族のヒドロカルビル基から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で結合して脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義し、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３はＨ、または、１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよび、ハロゲンから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族またはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である、方法。
【請求項５３】
幹細胞または前駆細胞が胚幹細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
幹細胞または前駆細胞が奇形腫の細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞または前駆細胞が培養される、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞または前駆細胞が哺乳類から得られる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記幹細胞または前駆細胞が哺乳類に含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類が、ラット、マウス、ウシ、マカクおよびヒトから選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が後成的方法である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節する
ことが、ヒストンメチル化の阻害を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ヒストン３上でリシン２７のメチル化の阻害を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ヒストンメチル化の前記阻害が、前記細胞においてポリコーム抑制複合体を枯渇させることを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つのポリコーム抑制複合体の少なくとも１つの成分のレベルを測定することを更に含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つのポリコーム抑制複合体の前記少なくともある成分のレベルの測定結果を対照の測定の場合と比較することを更に含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリコーム抑制複合体がポリコーム抑制複合体２、ポリコーム抑制複合体３、およびポリコーム抑制複合体４のうちの少なくとも１つである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ポリコーム抑制複合体の成分を発現する細胞で遺伝子発現を調節する方法であって、前記方法は上記細胞に一般式（Ｉ）の化合物を投与することを含み、
【化４】
2014028853.tif 000007
式中、
Ａは、ＣまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、または、Ｎ、Ｏ、ＳもしくはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族もしくはアリール脂環族のヒドロカルビル基から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で結合して脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義し、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３はＨ、または、１〜８個の主鎖炭素原子およびＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族もしくはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である方法。
【請求項６７】
前記ポリコーム抑制複合体が、ポリコーム抑制複合体２、ポリコーム抑制複合体３およびポリコーム抑制複合体４のうちの少なくとも１つである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が幹細胞または前駆細胞または原始生殖細胞である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
幹細胞が胚幹細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
細胞が、ＦＢＸ０３２遺伝子のプロモータの制御下の標的遺伝子を含む組み換え細胞である、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
発現調節される標的遺伝子が、個々の細胞において、リポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「死」遺伝子）または望ましい発現を呈する他の遺伝子のいずれか１つである、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞でアポトーシスを誘導することにより癌の治療および予防を行う化合物と組成物を含む方法に関する。本発明はまた、幹細胞／前駆細胞（癌幹細胞を含む）の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節する方法、化合物および組成に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界的にも死亡の主な原因であり、先進諸国では死亡原因の第２位、例えば、オーストラリア、日本、韓国、シンガポールで、そして英国およびスペインでは男性の死亡原因の第１位である。癌を発症する人の数は、毎年増加している。
【０００３】
エビデンスの増加は、癌発症における後成的変化の重要な役割を示している。これらは、クロマチン修飾ならびにヒストンのメチル化や脱アセチル化等のＤＮＡの過剰メチル化を伴う。（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）７，２１〜３３参照）。腫瘍抑圧遺伝子の多くが、後成的機序によってサイレンシングされることがわかっている。遺伝子突然変異を抑制させる可能性を有する遺伝子と異なり、後成的にサイレンシングされた腫瘍抑圧遺伝子を再活性化させ、細胞をアポトーシスまたは老化に至らしめることができる。この特徴は、癌への治療的介入において理想的な標的となる後成的変異をもたらす。ＤＮＡメチル化の特異的抑制因子である５‐アザシチジンとそのデオキシ類似体、５−Ａｓａ−２’−デオキシシチジンが、ＤＮＡ依存的なメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）活性を抑制し、腫瘍抑圧遺伝子のサイレンシングを逆転させ、血液学的悪性疾患の治療に有用であることが示されている。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤等のヒストンを修飾する酵素に干渉する薬剤について、臨床試験が進行中である。
【０００４】
ＤＮＡメチル化やヒストン修飾等の類似の後成的変化は、幹細胞の維持、増殖と分化に関与していると考えられる。生物の種々の組織の成熟細胞は、前駆細胞から生じ、広範な発生能と複製能を有している。末梢血は、例えば、内皮細胞か脈管平滑筋細胞に分化可能な前駆細胞を含有する。前駆細胞は、幹細胞から順次発生し、それは大半の細胞においても確認される。幹細胞は、心細胞、肝細胞、脳細胞等のあらゆる成熟機能細胞に分化することが可能で完全には分化していない細胞であり、無限の増殖能を保持している。ＤＮＡのメチル化と脱メチル化が、生殖細胞発生時、受精から胚盤胞形成期、哺乳類の初期発生時に、転写状態を調節することは、知られている（例えば、Ｓａｎｔｏｓ，Ｆ．，ａｎｄ
Ｄｅａｎ，Ｗ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（２００４）１２７，６４３−６５１を確認）。
【０００５】
幹細胞の維持における後成的変化のエビデンスは、例えば、胚幹細胞培養の後期継代が、推定腫瘍抑圧遺伝子ＲＡＳＳＦ１のプロモータ領域のメチル化の差等、種々のクローン化ＤＮＡの変異を呈するという所見を示している。（Ｍａｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）３７，１０，１０９９−１１０３）。前駆細胞の後成的破裂は、癌進行の主たる決定因子であることが、さらに示唆されている。（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５、ｓｕｐｒａ）。
【０００６】
今日、癌治療は外科手術を伴うか、または細胞の悪性細胞への形質転換と関連した機能的または遺伝的な変化に焦点を当てている。理想的な抗癌剤とは、非癌細胞に影響を与えず、急速に増殖する癌細胞を選択的に死滅させるかまたは少なくとも抑制させるものでなければならない。最近の手法には、選択した癌細胞型のマーカに導かれる抗体を用いた免
疫療法（米国特許出願第２００５／０２４４４１７号等）、癌細胞の特定の型の上で表される受容体に対する作動薬の投与（米国特許出願第２００６／０１４７４５６号）、インターフェロン含有キトサン脂質粒子の投与（米国特許出願２００５／０２６６０９３）、ならびに未知の機序によって前立腺癌細胞の特定の型に対して細胞毒性薬として作用する化合物の投与（米国特許出願第２００５／０２４５５５９号）が含まれる。
【０００７】
癌細胞のＤＮＡメチル化の異常なパターンは２０年以上前から知られており、近年では、後成的癌治療のための研究も始まっている（概要については、例えば、Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ，  Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８，４（補足．）、Ｓ４３−Ｓ４８、またはＹｏｏ，ＣＢ．ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００６）５，１，３７−５０参照）。しかし、５‐アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ（商標））とデシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ（商標））の２種類のＤＮＡメチル−トランスフェラーゼ阻害剤のみが上市に至っているにすぎないが、これらは骨髄異形成症候群（「前白血病」として知られる血液学的症状）の治療薬として承認されている。それゆえ、急速に増殖する癌細胞を選択的に死滅させ、癌または腫瘍疾患を治療または予防するために、新規の化合物や組成物の開発のための技術が、今もなお必要とされている。
【０００８】
幹細胞の調節に関して、容易に分化する胚幹細胞の能力が、実際に大きな課題となっている。多能性状態で胚幹細胞を維持するには、取扱時と培養時の分化を阻止しなければならない。この理由から、胚幹細胞は、旧来よりフィーダー細胞層上で、ウシ胎仔血清の存在下で（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号および第６，０９０，６２２号参照）、または繊維芽細胞順化培地（ＣＭ）で培養される。しかし、綿密な管理条件下においてさえ、胚幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生殖の間、自然発生的な分化を受ける場合がある。白血病抑制因子、マウス胚幹細胞の自己複製媒介因子が、マウス胚幹細胞の分化をも抑制することも判っているが、ヒト胚幹細胞の分化阻止において、フィーダー細胞の代わりに用いることはできない。このため、多分化能および／または胚幹細胞の自己複製能を維持する方法は、幹細胞療法の商業的な可能性を十分に理解する上で、大きな役割を果たすことになる。
【０００９】
幹細胞は、２層以上の胎生層の混合からなる組織を生成する種々の組織（多くは精巣や卵巣である）のテラトーマと呼ばれる癌腫でも発見される。そのような癌腫の悪性型は、テラトカルシノーマとも呼ばれている。ネズミのテラトカルシノーマにおける幹細胞の発生は、正常な胎児での発生イベントと平行して起こる。テラトカルシノーマの存在により、化学療法が腫瘍再発を阻止することができず、しばしば腫瘍塊の大半を除去することになる理由を説明することができる（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４），２３，７１５０−７１６０）。また、幹細胞は乳癌や脳癌等の固形腫瘍の癌細胞の発生源であることが示唆されている。白血病は、少数の異種由来の白血病幹細胞より発生することが判っている（Ｐａｓｓｅｇｕｅ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ（２００３），１００，１１８４２−１１８４９）。従って、そのような腫瘍で幹細胞の多分化能および／または自己複製を停止させる方法は、概してそのような癌腫の永続的除去の前提条件となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、非癌細胞に影響を及ぼすことなく癌細胞を選択的に死滅させることができる方法ならびに化合物および組成物を提供することが、本発明の目的である。幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節する方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本発明は腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うための医薬の製造における化合物の使用に関する。化合物は、一般式（Ｉ）のものである。
【００１２】
【化１】
2014028853.tif 000002
式（Ｉ）において、Ａは、ＣまたはＮである。Ｒ1、Ｒ4およびＲ5は、Ｈ、または、Ｎ、
Ｏ、ＳもしくはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族もしくはアリール脂環族のヒドロカルビル基から独立して選択される。Ｒ4とＲ5は、任意選択で結合し、脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義する場合がある。Ｒ2
は、Ｈおよびハロゲン（Ｆ、ＣＬ、ＢＲまたはＩ）から選択される。Ｒ3は、Ｈ、または
、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＩおよびハロゲン（ＣＬ、Ｆ、ＢＲ、Ｉ）から選択される、１〜８個の主鎖炭素原子および０〜３個のヘテロ原子を含む、脂肪族もしくはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ2はＦまたはＣｌである。いくつ
かの実施形態において、また、Ｒ3（独立して、または、Ｒ2と同時に）は、ＦまたはＣｌであり得る。
【００１３】
別の態様では、本発明は、アポトーシスを誘導する方法と、腫瘍細胞で幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節する方法とを提供する。方法は、個々の細胞に上記化合物を投与することを含む。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかのすくなくともいずれかを行うための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、上記化合物または薬学的に許容されるその塩を含む。医薬組成物は、担体または賦形薬を更に含む場合がある。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は細胞における遺伝子形質発現を調節するための方法を提供する。個々の細胞は、ポリコーム抑制複合体の成分を表す。該方法は、上記細胞に一般式（Ｉ）の化合物を投与することを含む（上記参照）。
【００１６】
本発明は、非限定的な例および添付の図面と関連して考慮されるとき、詳細な記述を参照にすることにより、より良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】５μＭの３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）で４８時間および７２時間処理した場合と、ＤＺＮｅｐ処理（対照）をしていない場合のＨＣＴ１１６（左側）およびＭＣＦ−７細胞（右側）のウエスタンブロット分析を示す図である。ＰＲＣ２の成分ＳＵＺ１２、ＥＺＨ２、およびＥＥＤのタンパク質レベルは、劇的に減少した。Ｓｕｖ３９ｈ１発現レベルおよびＢｌｉｍ１発現レベルに対する効果は観測されなかった。ＤＮＡメチル化を介在するＤＮＡメチル−転移酵素ＤＮＭＴ１およびＤＮＭＴ３ｂのレベルは、影響を受けなかった。しかし、ヒストン３のリシン２７の（Ｈ３−Ｋ２７）トリメチル化は、大きく減少し、一方、ヒストンＨ３のリシン９（Ｈ３−Ｋ９）のメチル化に対する効果は観測されなかった。
【図１Ｂ】３−デアザネプラノシンで処理する前（−）および後（＋）の逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＰＲＣ２タンパク質ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、およびＥＥＤのｍＲＮＡレベルの分析を示す図である。ＨＣＴ１１６細胞を（ａ）の場合のように処理し、対照として作用するＲＴ−ＰＣＲ分析ＧＡＰＤＨのために、ＲＮＡ全体を隔離した。
【図１Ｃ】プロテオソーム阻害剤が存在する状態でのＥＺＨ２およびＳＵＺ１２のタンパク質レベルに対する３−デアザネプラノシンの効果を示す図である。ＭＣＦ−７細胞を３−デアザネプラノシンで１８時間処理し、続いて、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２（５μＭ）、ＬＬＮＬ（５０μＭ）、ＭＧ１１５（２０μＭ）、および（１０μＭ）を追加することによって８時間処理した。ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２のウエスタンブロット分析のために、細胞を収集した。
【図２−１】腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発するために使用され得る化合物の例示の構造を示す図。
【図２−２】図２−１に続き、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発するために使用され得る化合物の例示の構造を示す図である：Ａ：３−デアザネプラノシンＡ、５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｎｏ．１０２０５２−９５−９；Ｂ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（１−ヒドロキシエチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｎｏ．１４６４２４−８１−９；Ｃ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（１，１−ジヒドロキシプロピル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−６３−１；Ｄ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−［１−ヒドロキシ−２−プロペニル］−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−６１−９；Ｅ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−４−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−６７−５；Ｆ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−（２−プロペニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−５８−４；Ｇ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−メチル−３−シクロ−ペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．２２４４５３−１３−８；Ｈ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１１１００５−７１−１；Ｉ：５−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）−４−クロロ−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−６４−２；Ｊ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８８８２４−０６−０；Ｋ：４−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３ａ，６ａ−ジヒドロ−２，２−ジメチル−４Ｈ−シクロペンタ−１、３−ジオキソール−６−メタノール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８８８２４−０８−２；Ｌ：Ｎ−［９−［５−（アセチルオキシ）−４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン−１−イル］−９Ｈ−プリン−６−イル］−ベンズアミド、ＣＡＳ−Ｎｏ．８３８４４−３３−１；Ｍ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（メトキシ−メチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１３８５７１−４８−９；Ｎ：４−メチル−安息香酸［３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシ−５−［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−１−シクロペンテン−１−イル］メチルエステル、ＣＡＳ−Ｎｏ．１４２８８８−０７−１；Ｏ：５−（６−アミノ−２−フルオロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（ヒドロキシメチル）−３−���クロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．（塩酸塩）１３８６６０−０７−８；Ｐ：５−（６−アミノ−８−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−クロロ−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１２７８２８−７２−２；Ｑ：３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４，５−ジヒドロキシ−１−シクロペンテン−１−カルボン酸、ＣＡＳ−Ｎｏ．１７９９２９−２９−４；Ｒ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−プロピル−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８５１０７１−４９−３；Ｓ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（フルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．３０３９６４−１４−９；Ｔ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−（フルオロメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８０５２４５−５１−６；Ｕ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−（メルカプトメチル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．８０５２４５−５４−９；Ｖ：５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（１−ヒドロキシ−２−プロピニル）−３−シクロペンテン−１，２−ジオール、ＣＡＳ−Ｎｏ．１４１７９４−３６−７。
【図３Ａ】未処理の対照細胞（ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド）と比較した、３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）に暴露された際の様々な癌細胞の細胞死の検出を示す図である。乳癌ＭＣＦ−７細胞およびＭＢ−４６８細胞、結腸直腸ＨＣＴ１１６細胞、ＲＫＯ細胞およびＳＷ４８０細胞を５μＭの３−デアザネプラノシンで４８時間および７２時間処理し、ヨウ化プロポジウム（ｐｒｏｐｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ）染色およびフローサイトメトリー分析によって、細胞死を検出した。３つの独立した実験の平均を示す。
【図３Ｂ】染料５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチル−ヨウ化ベンズアミダゾロカルボシアニン（ＪＣ−１）で染色することによるＨＣＴ１１６細胞のミトコンドリア膜電位の検出を示す図である。細胞を３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）に暴露することにより、ミトコンドリア膜の電位は失われ（右側）、アポトーシスを示す。
【図３Ｃ】ＨＣＴ１１６細胞のアポトーシス（右側、図３Ｂのデータ）とＭＣＦ−７細胞のアポトーシス（左側）との比較を示す図である。
【図３Ｄ】アポトーシス中に起きる、３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ、右側）によるＨＣＴ１１６細胞のプロテアーゼカスパーゼ３の電位の活性化の検出を示す図である。
【図３Ｅ】カスパーゼの活性化のウエスタンブロット分析を示す図である。ＭＣＦ−７細胞およびＨＣＴ１６細胞を５μＭの３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）で４８時間および７２時間処理し、その後、細胞全体抽出物を分析した。カスパーゼおよびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（「ＰＡＲＰ」）の活性化を、３−デアザネプラノシンで処理した後に検出した。β−アクチン（「アクチン」）をローディング・コントロールとして使用した。
【図３Ｆ】ＭＣＦ−７細胞と非癌性胸上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞のアポトーシスを比較するＦＡＣＳ分析データのプロットを示す図である。細胞を５μＭの３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ、黒色の棒）で、図示された時間処理した。３−デアザネプラノシンで処理することにより、ＭＣＦ−７細胞ではアポトーシスが進行して顕著であったが、ＭＣＦ１０Ａ細胞では、明らかなアポトーシスは誘発されなかった。
【図３Ｇ】乳癌ＭＣＦ−７細胞および非癌性ＭＣＦ−１０Ａ胸上皮細胞に対する３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）の効果の比較を示す図である。３−デアザネプラノシン−誘発細胞死は、ＭＣＦ１０Ａ細胞ではごくわずかであったが、ＭＣＦ−７細胞では著しい形態的変化が検出された。
【図３Ｈ】ＣＣ３３Ｄ１次結腸上皮細胞と比較した、結腸直腸ＨＣＴ１１６細胞に対する３−デアザネプラノシンの効果の比較を示す図である。再び、３−デアザネプラノシンは、ＨＣＴ１１６細胞において著しい形態的変化を誘発したが、ＣＣ３３Ｄ細胞では、細胞死はほとんど観測されなかった。
【図３Ｉ】形質移入の４８時間後、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＭＣＦ−７細胞における個々のＰＲＣ２タンパク質ＥＥＤ、ＥＺＨ２、およびＳＵＺ１２の枯渇のウエスタンブロット分析を示す図である。非特異性（ＮＳ）信号はすべてのサンプルに存在する。
【図３Ｊ】ＰＲＣ２タンパク質ＥＥＤ、ＥＺＨ２、およびＳＵＺ１２の１つがｓｉＲＮＡによって枯渇された（図３Ｅ参照）、ＭＣＦ−７細胞のアポトーシスの検出を示す図である。ＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析によって細胞死を測定した。各タンパク質それぞれのノックアウトに続いて、実質的なアポトーシス誘発を観測した。
【図４Ａ】乳癌において抑圧され、かつ３−デアザネプラノシンによって活性化されたＰＲＣ２標的を概略的に示す図である。タンパク質ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、およびＥＥＤは、ｓｉＲＮＡによって個々にノックダウンされた。イルミナ遺伝子発現ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して、≧２倍に上方調節された遺伝子を識別し、重なりについて検査した。
【図４Ｂ】１４０２の遺伝子が上方調節されていることが判明し、その９５の遺伝子は、すべての３つのｓｉＲＮＡ処理によって上方調節されていた。ＭＣＦ−７細胞をＤＺＮｅｐで７２時間処理することにより、少なくとも２倍に上方調節された７５０の遺伝子を識別することになり、その１４０の遺伝子が、候補ＰＲＣ２標的遺伝子であることが判明した。
【図４Ｃ】乳癌において特に表される候補ＰＲＣ２標的を決定したために、ＭＣＦ−７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞におけるこれらの１４０の遺伝子の発現プロファイルを遺伝子クラスター分析によって分析した。４５の遺伝子のクラスターが、ＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して、ＭＣＦ−７細胞において少なくとも２分の１である発現で識別された。推定ＰＲＣ２標的遺伝子の残りは、２つの細胞タイプの間で同様のレベルで発現し、またはＭＣＦ−７細胞においてより高いレベルでさえ発現した（左側のパネル）。ＰＲＣ２タンパク質を３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）で処理する、またはｓｉＲＮＡでノックダウンすることにより、ＭＣＦ−７細胞において再発現した（右側のパネル）。
【図４Ｄ】４７の遺伝子セットからの１０の無作為に選択された遺伝子の半定量ＲＴ−ＰＣＲは、各場合において、ＭＣＦ−７細胞では検出されない候補遺伝子がＭＣＦ１０Ａでは高度に発現することを示した。ＰＲＣ２タンパク質を３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）で処理する、またはｓｉＲＮＡで枯渇させることにより、ＭＣＦ−７細胞において再発現した。
【図４Ｅ】遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、ＴＧＦＢＩおよびＩＧＦＢＰ３など、これらの遺伝子の大多数が、成長阻害またはアポトーシスにおいて役割を果たすことを示した。これは、これらの４７のＰＲＣ２標的遺伝子が高レベルですでに発現しており（上方のパネル）、かつさらには誘発されなかった（下方のパネル）ＭＣＦ１０Ａ細胞とは極めて対照的である。
【図４Ｆ】２８件の１次乳癌サンプルと、４７個の癌特異性ＰＲＣ２抑制遺伝子を含んでいた９つの正常胸部組織とからなるデータセットに関する遺伝子発現分析は、ＰＲＣ２標的のこのサブセットが、１次ヒト乳癌において抑制された臨床的に適切なものであることを示した。
【図４Ｇ】このアフィメトリクス・アレイ・データ・セットに存在する３４の固有の探針が、腫瘍サンプルと正常サンプルを明確に分離した。１次乳癌（Ｔ）および正常胸部組織（Ｎ）のＰＲＣ２標的遺伝子の階層的クラスター化を示す。Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩは、別個の発現パターンを示す遺伝子のサブセットを表す。１７の遺伝子のサブセット（クラスタＩ）は、正常胸部組織と比較して乳癌において低い発現を示し、これは、予測されたように、より高いＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の発現と相関していた。
【図５Ａ】８つの候補ＰＲＣ２標的遺伝子の５’領域を概略的に示す図である。矢印は、転写開始部位を指す。垂直の棒は、ＣｐＧ部位を示す。ＰＣＲによって分析された領域を、底部の黒い棒によって示す。ＣｈＩＰ  ＰＣＲプライマーは、分析された遺伝子のコアプロモーター領域の上に配置されるように設計された。
【図５Ｂ】クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）による、上位候補ＰＲＣ２標的遺伝子プロモータへのＰＲＣ２結合の分析を示す図である。ＳＵＺ１２およびＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ抗体を使用すると、未処理細胞は、選択された上位ＰＲＣ２標的遺伝子プロモータへのＳＵＺ１２の強い結合を示し、一方、非特異性ＩｇＧまたはＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプルダウン・サンプルでは、背景結合または最小結合のみが検出された。３−デアザネプラノシンで処理する（＋）ことにより、これらのプロモータへのＳＵＺ１２の結合は劇的に減少したが、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩの結合は増大した。非特異性ＩｇＧまたはＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプルダウン・サンプルでは、背景結合または最小結合のみが検出された。
【図５Ｃ】ＰＲＣ２標的遺伝子発現に対する３−デアザネプラノシン、５−アザシチジン、およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡの影響を示す図である。Ｉ：３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）、５−アザシチジン（５−ＡｚａＣ）、または５−アザシチジンとトリコスタチンＡ（ＡＺＡ＋ＴＳＡ）の組合せで、ＭＣＦ−７細胞を処理せず、または処理し、ＲＮＡを遺伝子発現分析のために隔離した。１４０のＰＲＣ２標的の平均発現レベルを示す。５−アザシチジン単独での処理、またはトリコスタチンＡと組み合わせた処理は、３−デアザネプラノシン処理と比較して、全体的に、ＰＲＣ２標的を著しく再活性化しなかった。ＩＩ：ＰＲＣ２標的ＴＧＦβＩ、ＫＲＴＩ７、およびＦＢＸＯ３２は、リアルタイムＰＣＲによって測定され、１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現を使用して正規化されたように、３−デアザネプラノシンによって活性化されたが、５−アザシチジン単独またはトリコスタチンＡとの組合せでは活性化されなかった。ＩＩＩ：しかしながら、ＰＲＣ２標的ＡＮＸＡ８およびＤＬＸ２は、リアルタイムＰＣＲによって測定され、１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現を使用して正規化されたように、３−デアザネプラノシンおよび５−アザシチジン単独またはトリコスタチンＡとの組合せの両方によって活性化された。これらのデータは、３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２標的遺伝子の再活性化は、一般的なＤＮＡハイポメチル化に基づかないことを示す。これらのデータは、ＡＮＸＡ８およびＤＬＸ２などのあるＰＲＣ２標的遺伝子についてのみ、そのようなハイポメチル化が起きることが可能であることをさらに示す。これらの遺伝子について、ＰＲＣ２は、最近の研究（Ｖｉｒｅ’，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００６），４３９，１６，８７１−８７４）によって示唆されたように、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをプロモータに補充し、プロモータの発現を調節して抑制することが可能である。
【図６Ａ】５μＭの３−デアザネプラノシンのアポトーシス効果について乳癌細胞系統ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＢ−２３１、Ｔ４７Ｄ、およびＢＴ５４９の１２０時間にわたる分析を示す図である。ＦＡＣＳ分析によって細胞死を測定した。提示されたデータは、３つの独立した実験の平均である。ＭＣＦ−７細胞、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄ細胞は、３−デアザネプラノシンに対して高度に感受性であったが、ＭＢ−２３１、ＢＴ５４９は、ＭＣＦ１０Ａと共に、３−デアザネプラノシンでの処理によって影響を受けなかった、または３−デアザネプラノシンでの処理に対して高度に耐性であった。
【図６Ｂ】３−デアザネプラノシンで処理する前および後のこれらの乳癌細胞系統（ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄ感受性／ＭＣＦ１０Ａ、ＭＢ−２３１、ＢＴ５４９耐性）においてのアレイ分析の結果を示す図である。４５のＰＲＣ２標的の遺伝子クラスター化を分析することにより、ＰＲＣ２標的（２２の遺伝子）のサブセットが、耐性細胞系統において一貫して高レベルで発現したが（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＢ−２３１、およびＢＴ５４９）、図示された乳癌細胞系統の発現感受性細胞系統（ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄ）では、より低レベルで発現したことが明らかになった。太字で表された遺伝子は、感受性細胞系統に対して耐性細胞系統において高度に発現している。
【図６Ｃ】少なくとも３つの細胞系統において３−デアザネプラノシンによって上方制御された遺伝子を示す図である。図６Ｂにおいて分析された遺伝子の中で、４つの遺伝子ＦＢＸＯ３２、ＬＡＭＢ３、ＰＬＡＵ、およびＰＰＰ１Ｒ１５Ａが、４つのすべての感受性細胞系統においてＤＺＮｅｐによって共通して誘発されることが判明した。４つの追加の遺伝子（ＴＧＦＢＩ、ＩＧＦＢＰ３、ＴＮＳ３、およびＫＲＴ１７）は、４つの感受性細胞系統のうち３つにおいて誘発された。これらの遺伝子は、耐性細胞系統（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＢ−２３１、およびＢＴ５４９）においてすでに高度に発現しており（ＢＴ５４９のＬＡＭＢ３を除く）、３−デアザネプラノシンで処理した後、さらに顕著には誘発されなかった。
【図６Ｄ】定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）に暴露する前および後のＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３  Ｔ４７Ｄ、ＭＢ−２３１、ＢＴ５４９細胞における有効ＰＲＣ２標的の発現レベルの分析を示す図である。乳癌細胞系統ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ４７Ｄでは、遺伝子ＦＢＸＯ３２、ＬＡＭＢ３、ＰＬＡＵ、ＰＰＰＩＲ１５Ａの発現は、３−デアザネプラノシンによって活性化された。
【図６Ｅ】従来のＲＴ−ＰＣＲによる有効ＰＲＣ２標的ＦＢＸＯ３２、ＬＡＭＢ３、ＰＬＡＵ、およびＰＰＰ１ｒ１５ｐの発現レベルの分析を示す図である（上方）。細胞をＣの場合のように処理した。同様に、ＦＢＸ０３２、ＬＡＭＢ３、ＰＬＡＵ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの発現は抑制されたが、感受性乳癌細胞系統（ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ４７Ｄ）では、３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）によって再活性化された。ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２タンパク質レベルをウエスタン・ブロッティングによって決定した（下方）。図からわかるように、ＭＢ−２３１細胞は、より高レベルのＥＺＨ２タンパク質を発現したようであるが、多くのＰＲＣ２標的（上方）は、それにもかかわらず抑制されなかった。したがって、ＰＲＣ２標的の発現レベルは、ＰＲＣ２タンパク質のそれぞれのレベルによって常に反映されるとは限らず、ＤＮＡメチル−転移酵素およびヒストンデアセチラーゼなどの追加の因子を含むことを示す。
【図６Ｆ】非標的ｓｉＲＮＡ制御（ＮＣ）と比較した、３−デアザネプラノシンによるアポトーシス誘発に対するｓｉＲＮＡによるＭＣＦ−７細胞におけるＰＲＣ２標的の枯渇の影響を示す図である。図示されたｓｉＲＮＡのそれぞれをＭＣＦ−７細胞に２４時間形質移入し、続いて５μＭの３−デアザネプラノシンで７２時間処理した。ＦＡＣＳ分析によってアポトーシスを測定した。ＦＢＸＯ３２ｓｉＲＮＡのみが、３−デアザネプラノシンに対するアポトーシス応答を低下させることができた。
【図６Ｇ】異なるＦＢＸＯ３２ｓｉＲＮＡを使用するＦＢＸＯ３２（図６Ｆ参照）の効果の分析を示す図である。ＦＢＸＯ３２ｓｉＲＮＡ処理は、非標的ｓｉＲＮＡ制御（ＮＣ）と比較して、ＭＣＦ−７細胞において３−デアザネプラノシン（ＤＺＮｅｐ）誘発アポトーシスを阻害した。３つの独立した実験の結果を示す。結果は、ＦＢＸＯ３２誘発を阻害することにより、３−デアザネプラノシンによるアポトーシス誘発が著しく減衰することを確認した。
【図６Ｈ】ＦＢＸＯ３２がコロニー形成影響を与える能力を示す図である。ＭＣＦ−７細胞にプラスミドコードＦＢＸＯ３２または空（から）のベクターを形質移入した。細胞を選択し、クローン遺伝子サバイバルについて３重に検定した。ＦＢＸＯ３２を形質移入することにより、制御ベクターが形質移入された細胞と比較して、形成されるコロニーの数が大きく減少した。これらのデータは、潜在的な腫瘍サプレッサとしてＦＢＸＯ３２の機能的な役割を支持する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発し、かつ幹細胞または前駆細胞の多分化性および自己複製特性のうちの少なくともいずれか一方を調節する方法を提供する。アポトーシスは、プログラムされた細胞死であり、通常、望ましくない細胞を除去する多細胞生物における機構である。アポトーシスを受けるまたは開始する細胞の能力が損なわれる場合、または無効になる場合、損傷された細胞が無条件で増殖し、腫瘍細胞へと発育す
ることがある。アポトーシス細胞は特徴的な形態を示し、それによって、顕微鏡で識別することができる。
【００１９】
ヒトまたは動物の身体の細胞など、多くの細胞は、分化のプロセスにより生成される。細胞のこのプロセスは、多数のシグナリング・カスケードを含む。生物の様々な組織の成熟細胞は、広範な発育能および複製能力を有する前駆細胞から生じる。たとえば、抹消血は、内皮細胞または血管平滑筋細胞に分化することができる前駆細胞を含む。前駆細胞は幹細胞から生じ、幹細胞も、ほとんどの組織において特定されている。幹細胞は、心臓、肝臓、脳の細胞など、あらゆる成熟機能細胞に分化することができ、一方、無限に増殖する能力を保持する完全に未分化の細胞である。
【００２０】
Ｗｎｔ、ＴＧＦβ、ＦＧＦ、ノッチ、およびハリネズミのシグナリング経路のタンパク質など、幹細胞および分化特異性遺伝子を調節することが既知のいくつかの因子は、ポリコーム抑制複合体、たとえばポリコーム抑制複合体１またはポリコーム−抑制複合体２のタンパク質である（Ｂｒａｃｋｅｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（２００６）２０，１１２３−１１３６）。
【００２１】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発することによって、本発明による方法が、癌を処理または予防する治療として使用され得る。いくつかの実施形態では、それぞれの腫瘍細胞は、たとえば、乳癌細胞であることが可能である。いくつかの実施形態では、それぞれの腫瘍細胞が培養され得る。例示として、腫瘍細胞は、ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄなど、ヒト乳癌のカルシノーマ細胞系統の細胞であることが可能である。腫瘍細胞はまた、哺乳動物から得ることも可能である。他の実施形態では、腫瘍細胞系統は、たとえばラット、ウシ、ブタ、およびヒトなど、哺乳動物に含まれることが可能である。
【００２２】
胚幹細胞などの幹細胞は、神経成長因子およびレチノイン酸が存在する状態で、制御してたとえばニューロンに分化することができるが（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｒ．Ｒｅｓ．９１３，２０１−２０５）、容易に分化するその能力は、主要な実際上の課題を提示した。胚幹細胞を多分化状態において維持するために、培養において操作して成長させている最中の分化は防止されなければならない。この理由で、胚幹細胞は、従来、フィーダー細胞の層の上にウシ胎仔血清が存在する状態で培養され（たとえば、米国特許第５８４３７８０号および第６０９０６２２号参照）、または繊維芽細胞調節媒体（ＣＭ）において培養される。それにもかかわらず、慎重に制御した状況下でも、胚幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖中に自発的に分化することがある。マウス胚幹細胞の自己複製を介在する因子である白血病阻害因子（ＬＩＦ）が、マウス胚幹細胞の分化を阻害することも判明しているが、ヒト胚幹細胞の分化の防止についてフィーダー細胞の役割に代わることはない。したがって、当業者は、幹細胞の多分化性および自己複製特性のうちの少なくとも一方を維持することを含めて調節する方法を有意義な改良として理解するであろう。
【００２３】
成人幹細胞は、胚幹細胞のように多分化性ではないが、自己複製することができ、かつより未成熟の多分化性胚幹細胞と比較して、その発育能力を柔軟にすることができることが示されている。例として、成人幹細胞は、その元の組織とは異なる細胞系統に分化することができる。
【００２４】
本発明の多分化性および／または自己複製特性を修正する方法は、任意の幹細胞、前駆細胞、奇形腫細胞、またはそれらから派生した任意の細胞に適している。通常、それぞれの細胞は、少なくとも１つのポリコーム抑制複合体の成分を発現することができる（以下も参照）。例示として、任意の多分化性ヒト胚幹細胞またはそれぞれの細胞系統が、それ
ぞれの方法において使用され得る。そのような細胞の集団を得る手段は、当技術分野では十分に確立されている（たとえば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，［１９９８］，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７、またはＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，［２００４］，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３−１３５６参照）。さらに、たとえば、７１の独立したヒト胚幹細胞系統が存在することが知られており、ＧＥ０１、ＧＥ０９、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＴＥ０６、またはＷＡ０９など、その１１の細胞系統が、研究目的に利用可能である（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｅｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙＣｒｉｔｅｒｉａ．ａｓｐのＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ
Ｒｅｇｉｓｔｒｙ参照）。成人幹細胞は、たとえば、誕生後に残された胎盤およびへその緒、または成人幹細胞がいわゆる「サテライト細胞」として関連付けられる筋線維から隔離され得る（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，［２００５］，Ｃｅｌｌ  １２２，２８９−３０１、またＲａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．，［２００５］，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１，８，８２９−８３１参照）。
【００２５】
本明細書において使用される「幹細胞」という用語は、任意の幹細胞を指し、いわゆる癌幹細胞をも含む。多くのタイプの癌は、自己複製能および分化能によって特徴付けられるそのような癌幹細胞を含むことが判明している。広範な研究が、ほとんどの癌はクローンであり、腫瘍の成長を維持する能力を付与された単一の癌幹細胞の後代を表すことが可能であることを示す。Ｋｒｉｖｔｓｏｖら（Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４２，８１８−８２２）は、たとえば、前駆細胞に由来の白血病幹細胞が非常に豊富な細胞集団を精製し、遺伝子発現プロファイリングによってそれらを特徴付けた。Ｋｒｉｖｔｓｏｖらは、これらの細胞は、その前駆細胞に類似しているが、造血幹細胞では正常に発現する自己複製関連プログラムを発現することを報告している（同書）。
【００２６】
悪性腫瘍は、単一の癌幹細胞またはその小集団が、自己複製の正常な限界を逸脱し、それにより、腫瘍の進行および成長の一因となる異常に分化した癌細胞を生じる異常臓器と見なすことができる。そのような癌幹細胞を根絶することは、任意の成功している抗癌治療の決定的部分であり、かつなぜ従来の癌治療が、しばしば腫瘍の苦しみを軽減することにおいてのみ有効で、治療効果がないのかを説明すると考えられる。幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節することは、たとえば、癌幹細胞などの幹細胞の分化を誘発することを含むことが可能である。これは、たとえば、ヒストンメチル化を阻害することにより実施され得る（以下も参照）。幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節するによって、本発明による方法が、たとえば、癌を処理または予防する治療となることが可能である。
【００２７】
幹細胞はまた、２つ以上の発生学的層の混合物からなる組織を生成する様々な組織（しばしば精巣および卵巣）のカルシノーマと呼ばれる奇形腫においても見られる。そのようなカルシノーマの悪性形態は、テラトカルシノーマとも呼ばれる。幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節することによって、本発明による方法は、相応して、たとえば、奇形腫を処理または予防する治療となることも可能である。幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節することは、たとえば、これらの多分化性および／または自己複製特性を維持し、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用について好適であることがある具体的には「健康な」幹細胞において、幹細胞／前駆細胞の分化を阻害することも含むことが可能である。
【００２８】
方法が、前駆細胞、すなわち、成熟体細胞を生じる細胞について使用されることを意図する場合、任意の前駆細胞が、本発明のこの方法において使用され得る。適切な前駆細胞の例には、非限定的に、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、乏突起神経膠前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞がある。前駆細胞を得る方法
は、当技術分野では周知である。２つの例示として、巨大核細胞前駆細胞を得る方法が、米国特許出願２００５年／０１７６１４２において開示されており、マウス肝臓前駆細胞系統を得る方法が、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（（２００５）Ｓｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０１０８）によって記載されている。
【００２９】
本発明による方法は、それぞれの腫瘍細胞またはそれぞれの幹細胞／前駆細胞に、以下の一般的な化学式（Ｉ）の化合物を投与することを含む。
【００３０】
【化２】
2014028853.tif 000003
この一般的な化学式（Ｉ）において、Ａは、ＣまたはＮを表す。Ｒ1、Ｒ4、およびＲ5は
、Ｈ、または独立に選択された脂肪族基、シクロ脂肪族基、芳香族基、アリール脂肪族基、およびアリールシクロ脂肪族ヒドロカルボニル基であってよく、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｅ、およびＳｉから選択された０〜６、いくつかの実施形態では０〜４、いくつかの実施形態では０〜３のヘテロ原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ4およびＲ5は、同一であってよい。いくつかの実施形態では、Ｒ4およびＲ5は、脂肪族ヒドロカルボニル架橋を定義するように連結され得る。それぞれのヒドロカルボニル架橋は、たとえば、１〜１２、いくつかの実施形態では２〜１０、およびいくつかの実施形態では２〜８の主鎖炭素原子を含み、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｅ、およびＳｉから選択された１〜５、いくつかの実施形態では１〜４、およびいくつかの実施形態では１〜３のヘテロ原子を含むことが可能である。Ｒ2は、Ｈ、またはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、もしくはＬなどのハロゲン原子であることが可能
である。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、ＦまたはＣｌである。Ｒ3は、Ｈ、または脂肪族基、シクロ脂肪族基、芳香族基、アリール脂肪族基、もしくはアリールシクロ脂肪族ヒドロカルボニル基であることが可能である。このヒドロカルボニル基は、１〜１２、いくつかの実施形態では１〜８、いくつかの実施形態では１〜４の主鎖炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｅ、Ｓｉ、およびＦまたはＣｌなどのハロゲンから選択された０〜３または０〜２などの０〜４のヘテロ原子を含むことが可能である。
【００３１】
「脂肪族」という用語は、断りのない限り、飽和またはモノ不飽和またはポリ不飽和であってよい直鎖炭化水素鎖または分枝炭化水素鎖を意味する。不飽和脂肪族基は、１つまたは複数の２重結合および／または３重結合を含む。炭化水素鎖の分枝は、線形鎖ならびに非芳香族環式要素を含むことが可能である。炭化水素鎖は、断りのない限り任意の長さであってよく、任意の数の分枝を含むことが可能である。主鎖ならびに分枝は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＳｉなど、ヘテロ原子をさらに含むことが可能である。
【００３２】
「脂環式」という用語は、断りのない限り、飽和またはモノ不飽和またはポリ不飽和であってよい非芳香族環式炭化水素成分を意味する。環式炭化水素成分は、非芳香族環式要素ならびに鎖要素で置換され得る。環式炭化水素成分の主鎖は、断りのない限り、任意の
長さであってよく、かつ任意の数の非芳香族環式要素および鎖要素を含むことが可能である。環式炭化水素成分ならびに環式置換基および鎖置換基の両方とも、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＳｉなど、ヘテロ原子をさらに含むことが可能である。
【００３３】
「芳香族」という用語は、断りのない限り、単一環であってよく、または複数の融合環もしくは共有結合環を含んでもよい、共役２重結合の平面環式炭化水素成分を意味する。環式炭化水素成分の主鎖は、断りのない限り、任意の長さであってよく、かつ、たとえばＮ、Ｏ、およびＳなど、任意の数のヘテロ原子を含むことが可能である。
【００３４】
「アリール脂肪族」という用語は、１つまたは複数のアリール基が１つもしくは複数の脂肪族基に結合される炭化水素、または１つまたは複数の脂肪族基上の置換基である炭化水素成分を意味する。したがって、「アリール脂肪族」という用語は、たとえば、２つ以上のアリール基が、メチレン基などの任意の長さの１つまたは複数の脂肪族鎖を介して結合される炭化水素成分を含む。
【００３５】
本明細書において使用される「脂肪族」、「脂環式」、「芳香族」、および「アリール脂肪族」という用語のそれぞれは、それぞれの成分の置換形態および非置換形態の両方を含むことを意図する。置換基は、任意の官能基であってよく、たとえば、非限定的に、アミノ、アミド、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、イソシアノ、ジチアン、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、オルガノメタル、オルガノボロン、セレノ、シリル、シラノ、スルホニル、チオ、チオシアノ、トリフルオロメチルスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ブロモベンゼンスルホニル、ニトロベンゼンスルホニル、およびメタンスルホニルである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発するか、または幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節するかの少なくともいずれかを行うための、上記の化学式の化合物の使用に関する。それぞれの使用は、たとえばその目的が医薬の製造であってよい。
【００３７】
いくつかの適切な化合物が、図２に示されている。図示された化合物は、アデノシンの類似物（部分的に炭素環類似物）として扱うことができる。例として、一実施形態では、化合物は、３−デアザネプラノシンである（図２Ａ参照）。他の例として、他の実施形態では、化合物は、ネプラノシンＡである（図２Ｋ参照）。
【００３８】
これらの化合物は、単純疱疹Ｉ型ウィルスまたはエボラウイルスの阻害など、広範な抗ウィルス効果についてこれまで知られていた（Ｔｓｅｎｇ，Ｃ．Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ（１９８９），３２，１４４２−１４４６；Ｇｌａｚｅｒ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８６），１３５，２，６８８−６９４；Ｄｅ  ＣｌｅｒｃＱ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９８９），３３，８，１２９１−１２９７；米国特許出願４９６８６９０；欧州特許出願第０５１０２６０号）。この効果は、酵素Ｓ−アデノシルホモシステイン合成酵素の阻害、ならびに宿主におけるインターフェロン生成の促進に起因していた（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、ｓｕｐｒａ；Ｂｒａｙ，Ｍｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２），５５，１，１５１−１５９）。それぞれの化合物は、抗ウィルス有効濃度では正常宿主細胞に対して毒性ではないことが、以前に報告されている（Ｄｅ  ＣｌｅｒｃＱ，Ｅ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００１），１４，２，３８２−３９７）。
【００３９】
したがって、本発明の方法は、医薬の製造に使用することを含めて、上記で定義された
化合物を使用することを含む。一態様では、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発し、および／または幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節するために、上記で確定された化合物を使用することにも関する。これに関して、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発し、および／または幹細胞／前駆細胞の多分化性および／または自己複製特性を調節するために、上記で確定された化合物を使用することにも関する。以上および以下の説明は、それぞれの使用および前記用途の化合物にも同様に適用されることを理解されたい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、後成的治療である。それぞれの方法は、たとえば、ヒストン３上のリシン２７のメチル化など、ヒストンメチル化の阻害−真核クロマチンにおける中心的後成修正を含む。例示として、本発明による方法は、それぞれの腫瘍細胞において、幹細胞または前駆細胞、ポリコーム抑制複合体を枯渇させることを含むことが可能である。ポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ）タンパク質は、２つの主要な別々の複合体に分割することが知られている（たとえば、Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２００４参照）。第１複合体は、ショウジョウバエｅｓｃおよびＥ（ｚ）遺伝子の同族体を含み、ヒストンデアセチラーゼ活性を有する。第２ＰｃＧ複合体（ショウジョウバエのｄＰＲＣ−１、マウスのｍＰＲＣ１、およびヒトのｈＰＲＣ−Ｈ）は、ショウジョウバエＰｃ、Ｐｓｃ、Ｐｈ、ＲＩＮＧ、およびＳｃｍ遺伝子の同族体であり、ＳＷＩ／Ｓｎｆ（「スイッチ／ショ糖非発酵」）クロマチンリモデリング機構に干渉し、転写の開始および追加の抑制活性の補充を遮断することによって、標的遺伝子の抑制を介在することができる。
【００４１】
本発明の方法は、たとえば、上述された第１複合体の範囲内に分類することができるポリコーム抑制複合体を枯渇させることを含むことが可能である。そのような複合体の例には、ポリコーム抑制複合体２、ポリコーム抑制複合体３、およびポリコーム抑制複合体４がある。例示として、ポリコーム抑制複合体２の成分は、たとえば、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、およびＲｂＡｐ４８を含む。他の例示として、ポリコーム抑制複合体３の成分は、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４６／４８、およびＥＥＤの分子量がより小さい２つのアイソフォームを含む（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００４），１４，２，１８３−１９３）。他の例示として、ポリコーム抑制複合体４の成分は、とりわけ、ＥＺＨ２およびＳＩＲＴ１を含む（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００５），１０２，６，１８５９−１８６４）。
【００４２】
選択されたポリコーム抑制複合体の任意の成分は、本発明の方法において枯渇され得る。当業者なら、ポリコーム抑制複合体の成分のタンパク質レベルは、複合体の他の成分の存在に部分的に依存することを認識するであろう（図３Ｅ参照、またたとえばＰａｓｉｎｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００４），２３，４０６１−４０７１参照）。したがって、ポリコーム抑制複合体の１つの成分を枯渇させることにより、通常、それぞれのポリコーム抑制複合体の他の成分のレベルも低下する。例示として、ＳＵＺ１２、ＥＺＨ２、またはＥＥＤのレベルを枯渇させることが可能である。
【００４３】
上述された主要なポリコーム−抑制複合体のいずれれも、胚幹細胞において遺伝子の大きなセットのプロモータ領域を共に占有することが判明しており（Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４１，３４９−３５３）、標的遺伝子のほとんどは、様々な発育プロセスにおいて重要な役割を有する転写因子である。胚の発達中に細胞運命を決定するホメオドメイン包含因子など、多数のこれらの転写因子は、発育において本質的な役割を担う。
【００４４】
ポリコーム群遺伝子は、発育を制御する発現パターンをサイレンシングすることを含む
維持に関わる１セットの調節タンパク質としてさらに知られている。ポリコーム群（ＰｃＧ）複合体は、クロマチン構造を変化させ、それにより遺伝子転写に必要な因子へのＤＮＡのアクセス性を変化させることによって、遺伝子の長期抑制の役割を担う（概述について、Ｓｐａｒｍａｎｎ，Ａ．，＆ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６，８４６−８５６参照）。ポリコーム群（ＰｃＧ）複合体は、ヒストンテールの脱アセチル化など、後成的修飾により、およびＡＴＰ依存クロマチンリモデリングを阻害することによって、作用する（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（２００４）２９，４７８−８５；Ｌｕｎｄ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ，Ｍ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００４）１６，２３９−４６）。例として、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）は、後成的抑制の開始に関与することが知られているタンパク質複合体である。ＰＲＣ２は、しばしば、ヒトの癌において過剰発現し、したがって、癌の後成的治療の有望な標的と見なされている。ポリコーム群タンパク質は、ショウジョウバエからヒトに高度に保存され、複数のポリコーム抑制複合体を形成する。ポリコーム抑制複合体の成分は、固有のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を含み、コア・ヒストンのメチル化により遺伝子抑制を維持する（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００２）１１１，１９７−２０８；Ｃａｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８，１０３９−１０４３；Ｍｉｌｎｅ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００２）１０，１１０７−１７；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００２）１０，１１１９−１１２８；Ｂｅｉｓｅｌ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１９，８５７−６２）
ＰｃＧタンパク質の中で、ポリコーム抑制複合体２は、あらかじめ幹細胞自己複製および癌に関連付けられている（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００６）１２５，３０１−３１３；Ｈｏｌｄｅｎ，Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２，３４９；Ｋａｍｍｉｎｇａ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０７，２１７０−２１７９）。低活性のｐ１６ＩＮＫ4Ａを有するヒト乳房上皮細胞では（腫瘍形成の早期
事象）、たとえば、ポリコーム抑制複合体２の２つの成分の上方調節が観測された（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００６）２８１，３４，２４７９０−２４８０２）。ポリコーム抑制複合体２は、３つのコア成分を含む：ＥＺＨ２（Ｚｅｓｔｅホモログのヒト・エンハンサ）、ＳＵＺ１２（ｚｅｓｔｅ１２ホモログのサプレッサ）、およびＥＥＤ（胚体外胚葉発育；たとえばＬｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、前掲参照）。ＥＺＨ２は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＰＲＣ２の活性成分であり（たとえば、Ｖｉｒｅ’，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００６），４３９，１６，８７１−８７４）、ＳＵＺ１２およびＥＥＤは、体細胞および幹細胞の両方においてこの活性のために必要である（Ｓｃｈｏｅｆｉｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００６）２５，３１１０−３１２２）。ＥＺＨ２は、ヒストンＨ３リシン−２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化に触媒作用を及ぼし、この酵素活性は、ＰＲＣ２−介在遺伝子サイレンシングに必要である（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００２），１１１，１９７−２０８；Ｃａｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２），２９８，１０３９−４３；Ｍｉｌｎｅ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００２），１０，１１０７−１７，Ｂｅｉｓｅｌ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００２），４１９，８５７−６２；Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００５），２８０，２３，２２４３７−２２４４４）。遺伝子抑制を維持することが示唆されているポリコーム抑制複合体１は、リシン−２７メチル化ヒストンＨ３を認識することができる。
【００４５】
ショウジョウバエでは、ポリコーム群タンパク質が、部位特異性ＤＮＡ結合タンパク質との相互作用により、標的部位に補充される。哺乳動物における標的遺伝子への正確な補充機構は、現在知られていない。しかし、ヒストンメチル化が、ヌクレオソーム（クロマチンの基本繰返し単位）の特性を変化させ、他のタンパク質とのヌクレオソームの相互作
用に影響を与えることが知られている。その結果、転写は抑制される。さらに、ヒストンメチル化は、クロマチン抑制においてＤＮＡメチル化と共同して機能すると考えられており、後成的抑制に関連する他の機構である。
【００４６】
ヒストンメチル化とＤＮＡメチル化の直接的な関連が指摘されている。一例として、ヒストンＨ３のメチル化リシン−２７は、他のタンパク質を補充する固定点として作用する。さらに、ＥＺＨ２は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに結合し、これらの酵素と共にその標的遺伝子のプロモータに結合し（Ｖｉｒｅ’ｅｔ  ａｌ．２００６、前掲）、それにより、標的遺伝子のプロモータをメチル化し、その後のこれらの遺伝子を抑制する。したがって、ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２の上方調節は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの強化、多くの座のＤＮＡメチル化、およびヒストンＨ３のリシン−２７のメチル化と同時に起きることが判明した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。ＥＺＨ２の枯渇に続いてであるが、ＥＺＨ２およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼがプロモータに結合されている間ではなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータへの結合が起こった（Ｖｉｒｅ’，ｅｔ  ａｌ，２００６、前掲）。
【００４７】
ヒトＥＺＨ２、およびその関連するＨ３−リシン−２７メチルトランスフェラーゼ活性は、癌に関連付けられ、かつ、前立腺癌および乳癌の後期において過剰発現することが判明しており（Ｓａｒａｍｄｋｉ，Ｏ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ（２００６），４５，６３９−６４５）、たとえば、ＥＺＨ２の発現量およびタンパク質レベルは、１次未処理腫瘍より転移ホルモン不応性前立腺癌において高いことが判明した。ＥＺＨ２に加えて、ＰＲＣ２複合体の他の成分であるＳＵＺ１２も、結腸、胸、および肝臓の腫瘍を含む、いくつかのヒト腫瘍において上方調節されることも判明した（Ｋｉｒｍｉｚｉｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００３）２，１１３−１２１；Ｋｉｒｍｉｚｉｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００４）１８，１５９２−１６０５）。
【００４８】
ＤＮＡメチル化自体は体細胞の生存に必須であるが、未分化状態で胚幹細胞を維持することについては重要な役割を果たさない。それにもかかわらず、胚幹細胞においてＰＲＣ１およびＰＲＣ２によって占有された遺伝子は、同様に、メチル化ヒストンＨ３リシン−２７が増強されることが報告されている（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。さらに、このヒストンのメチル化リシンは、プローブにより、それぞれの遺伝子転写開始部位に密接に関連付けられた。Ｂｏｙｅｒらのデータは、胚幹細胞では、ポリコーム群タンパク質の結合が遺伝子を直接サイレンシングし、かつこれらの遺伝子の活性化が分化および多分化性の損失と相関されることを示唆する。
【００４９】
ポリコーム抑制複合体２成分ＥＥＤは、早期マウス胚細胞ならびに栄養膜の幹細胞および前駆細胞においてメス哺乳動物の不活性Ｘ染色体について増強することによって、未分化細胞におけるサイレンシングに寄与することが知られている。ＥＥＤがない場合、分化は、親Ｘ染色体の再活性化を誘発する（Ｋａｌａｎｔｒｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００６），８，２，１９５−２０２）。ＥＥＤはまた、不活性Ｘ染色体についてＰＲＣ２複合体の形成、ならびに未分化および栄養膜幹細胞におけるヒストンＨ３のリシン−２７のメチル化に必要であることも判明した（同書、およびＳｃｈｏｅｆｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。２つのタンパク質Ｅｚｈ２およびＳｕｚ１２に関して、これらのタンパク質が失われることにより、内細胞塊における細胞増殖が顕著に失われ、かつ早期胚の致死となることが判明した。
【００５０】
転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇは、細胞の分化状況の全般的な制御ならびに多分化成細胞の正常な発育および／または多分化性細胞の状態の調節について重要であると特定
されており（たとえばＮｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９５，３７９−３９１；およびＭｉｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３，６３１−６４２）、胚幹細胞における低レベルのヒストン３のリシン−２７のメチル化に関連することが知られている（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。ＰＲＣ２複合体タンパク質ＳＵＺ１２は、Ｏｃｔ４によっても調節されるいくつかの遺伝子を調節することがさらに示されている（Ｓｑｕａｚｚｏ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）１６，８９０−９００）。ｓｉＲＮＡによってＯｃｔ４をノックダウンすることにより、いくつかの標的プロモータからＳＵＺ１２が失われることになる（同書）。さらに、ヒト胚細胞では多分化性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇに関連付けられた遺伝子と、識別されたＰｃＧ標的遺伝子との間の著しい相関が報告されている（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲、補足）。４５の標的遺伝子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＰｃＧタンパク質（同書）によって共に占有されることが判明した。これらの発見は、細胞分化の調節および幹細胞の多分化状態の維持へのｐｒｃ２タンパク質の統合を示す。
【００５１】
本発明の方法により、ポリコーム抑制複合体２、ポリコーム抑制複合体３、またはポリコーム抑制複合体４の成分を枯渇させることにより、さらに、ヒストン３のリシン２７は脱メチル化されることになる（Ｈ３−Ｋ２７；図１Ａ参照）。これらのポリコーム抑制複合体は、ヒストンＨ３のリシン２７をｉｎ  ｖｉｖｏでトリメチル化し、ヒストンＨ１のリシン２６をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトリメチル化することが知られている。したがって、本発明による方法のいくつかの実施形態では、ヒストン３のリシン２７のメチル化状況が決定され得る。これは、たとえば、ポリコーム抑制複合体の枯渇を確認するために望ましいことがある。
【００５２】
所望であれば、制御測定は、他の既知の手段によって、たとえば核酸分子によって、ポリコーム抑制複合体の成分を枯渇させることを含むことが可能である。それぞれの核酸分子は、たとえばアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（ＷＯ  ０１／９２６５５において記載）など、たとえば非コーディング核酸分子であってよい。非コード核酸分子は、ｎｃ−ＲＮＡ分子であることも可能である（たとえば、天然ｎｃ−ＲＮＡ分子に関する導入について、Ｃｏｓｔａ，ＦＦ，Ｇｅｎｅ［２００５］，３５７，８３−９４参照）。ｎｃ−ＲＮＡ分子の例には、非限定的に、アンチセンス−ＲＮＡ分子、Ｌ−ＲＮＡＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、サイレンサ−ＲＮＡ分子（２重らせんニューロン選択的サイレンサ要素（Ｎｅｕｒｏｎ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔ））、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、ショート・ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）分子、または反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子がある。
【００５３】
低分子干渉ＲＮＡ、ショート・ヘアピン、およびミクロＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するツールとなった。これは、転写後レベルにおいて生じ、かつｍＲＮＡの劣化を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による、遺伝子の抑制または遺伝子の抑制を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機構を表す。ＳｉＲＮＡ分枝およびｍｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘発沈化黙複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるものを形成するために、ｓｉＲＮＡを複数の酵素複合体と関連付けることによって、相補ＲＮＡの劣化を介在する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣの一部になり、後に開裂される相補ＲＮＡ種を標的とする。ｓｉＲＮＡは、対応する相補らせんに完全に対になった塩基であり、一方、ｍｉＲＮＡ２重鎖は、不完全に対になる。ＲＩＳＣの活性化により、それぞれの遺伝子の発現は失われる（簡潔な概述について、Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ，Ｈａｌｅｙ，Ｂ  Ｓｃｉｅｎｃｅ［２００５］，３０９，１５１９−１５２４参照）。最も強い抑制が、２次構造を形成しない配列で生じることが観測された（Ｐａｔｚｅｌ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．［２００５］２３，１４４０−１４４４）。したがって、当業者
なら、通常、たとえばループを形成することが既知の配列を使用することを避ける。これは、選択された塩基を、標的配列とウォブル対を依然として形成することができる塩基に交換することによって行うことができる（Ｐａｔｚｅｌ，Ｖ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ技法は、たとえば、米国特許出願２００５／０１９１６１８に開示されているように、ＨＩＶ  ＲＮＡの開裂など、寄生ＤＮＡ配列のサイレンシングに適用されている。
【００５４】
それぞれのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ分子は、たとえば、誘発プロモータまたは構成プロモータの制御下のベクターによって、対象細胞内（微生物および動物の一部である細胞を含む）で直接、合成または発現され得る。また、それぞれの細胞内に導入される、および／またはそれぞれの細胞に送達されることも可能である。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子をｉｎ  ｖｉｖｏで選択細胞に送達する１つの例示は、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）の融合タンパク質および核酸結合タンパク質プロタミンへの非共有結合である（Ｓｏｎｇ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５），２３，６，７０９−７１７）。ｓｉＲＮＡ分子を選択細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する他の例示は、リポソームへのカプセル化である。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５），２３，８，１００２−１００７）は、たとえば、ポリエチレングリコール−脂質接合体でコーティングされた、安定な核酸−脂質−粒子を使用して、静脈内投与についてリポソームを形成した。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを送達するためにナノ粒子を適用することが望ましい場合、細胞特異性標的化に適切な手法が、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒらによって記述されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５），２３，１１，１４１８−１４２３）。しかし、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子を選択された標的細胞に送達する他の例は、それぞれの核酸分子を含む細菌またはウィルスなどの生物学的ビヒクルを使用する。Ｘｉａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００６），２４，６，６９７−７０２）は、たとえば、プラスミド、とりわけおよびインベーシンの両方から転写された細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与することにより、哺乳類細胞への進入と、その後の該細胞内での遺伝子サイレンシングを可能にすることによって、この手法を使用した。
【００５５】
ｓｉＲＮＡ分子の例示が、図３Ｉおよび図３Ｊに示されている。
本発明による方法のいくつかの実施形態では、ポリコーム抑制複合体を枯渇させることにより、前記ポリコーム抑制複合体と腫瘍サプレッサ遺伝子との間において複合体が放出される。これらの実施形態のいくつかでは、腫瘍サプレッサ遺伝子は、それによって再活性化され、それぞれの細胞においてアポトーシスを生じる。本発明者は、ＦＢＸ０３２がそれぞれの腫瘍遺伝子の例であることを発見した（たとえば、図６Ｂおよび６Ｄ〜６Ｈ参照）。ＦＢＸ０３２は、プロテアソームにおけるタンパク質加水分解について特定のタンパク質を標的とすることが知られている（ＦＢＸ０３２という名前の）ユビキチンリガーゼをコードする。ＦＢＸ０３２は、筋肉の発達に重要な遺伝子であるとこれまで考えられてきた。ＦＢＸ０３２の例には、非限定的に、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入れ番号Ｑ９６９Ｐ５を有する３５５のアミノ酸のヒト・タンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入れ番号Ｑ９ＣＰＵ７を有する３５５のアミノ酸のマウス・タンパク質、またＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入れ番号Ｑ９１Ｚ６２を有する３５０のアミノ酸のラット・タンパク質がある。それぞれの遺伝子の例示は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース受入れ番号ＢＣＯ２４０３０、ならびにＥＭＢＬ受入れ番号ＢＣ１２０９６３およびＢＣ１２０９６４の配列のｍＲＮＡを転写するヒト遺伝子である。他の例として、ブタのＦＢＸ０３２遺伝子も、マッピングおよび配列された（Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）３６，５，４５１−４５２）。
【００５６】
当業者なら、本発明の方法は、癌細胞においてアポトーシスを優先的に誘発させること
を理解するであろう（たとえば、図３Ａ参照）。通常、時間依存細胞死応答が腫瘍細胞において観測される。それぞれの腫瘍細胞は、たとえば、培養され得る。たとえば、ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−Ｂｒ−３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、またはＳＷ４８０などの細胞系統の細胞であることが可能である。いくつかの実施形態では、それぞれの腫瘍細胞は、哺乳動物から得られることが可能である。他の実施形態では、それぞれの腫瘍細胞は、哺乳動物に含まれることが可能である。腫瘍細胞は、たとえば乳癌細胞など、任意のタイプの腫瘍であることが可能である。
【００５７】
所望であれば、腫瘍細胞におけるアポトーシスの進行は、たとえば、ヨウ化プロポジウム染色またはフローサイトメトリー分析（図３Ａ参照）、ミトコンドリア機能不全（ＪＣ−１染色）、またはカスパーゼ３活性化（たとえば図３Ｂおよび３Ｄ参照）によって監視され得る。これらの例から推測することができるように、本発明の方法は、一般に、ミトコンドリアの破壊およびカスパーゼの活性化を含むアポトーシス細胞死応答をトリガする。これらの例はまた、ＭＣＦ１０Ａ細胞および正常１次結腸上皮ＣＣ３３Ｄ細胞などの非癌性細胞が、あるとしてもごくわずかな細胞死応答を示すことも示す（図３Ｄも参照）。それぞれの細胞のアポトーシスを決定することに加えて、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、それぞれの細胞における細胞の生存度を決定することも含むことが可能である。それぞれの方法は、当技術分野において十分に確立されている。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腫瘍細胞、幹細胞、または前駆細胞など、それぞれの細胞を一般的な化学式（Ｉ）（上記参照）の所定の量の化合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、一般的な化学式（Ｉ）の少なくとも２つの異なる所定の量の化合物が使用される。これらの実施形態のいくつかでは、少なくとも第１腫瘍細胞および第２腫瘍細胞が使用される。第１腫瘍細胞は、２つの所定の量の少ない方と接触され、第２腫瘍細胞は、２つの所定の量の多い方と接触される。それぞれの実施形態は、たとえば、スクリーニング検定、細胞毒試験、または投与／応答曲線の決定であってよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、第１腫瘍細胞および第２腫瘍細胞は、同じ患者から得られる。そのような方法は、たとえば、一般的な化学式（Ｉ）の化合物に対する患者または動物の個々の応答を予測する方法であってよい。単一ヌクレオチドの多形性および遺伝子発現における個々の相違により、通常、投与される化合物に応答する患者間に個々の相違が生じる。例として、ＦＢＸ０３２遺伝子の単一ヌクレオチド多形性が検出された（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、前掲）。いくつかの実施形態では、本発明のそれぞれの方法は、化学式（Ｉ）の化合物に対する患者の応答に影響を与える遺伝子変異体を識別する方法とすることも可能である。通常、動物または患者に薬剤として加えられる化合物の効果は、多くのタンパク質によって決定され、それにより、非遺伝因子と結合された複数の遺伝子の複合遺伝的多形性が、化合物に対する応答を決定する。したがって、本発明のそれぞれの方法は、たとえば、悪影響を最小限に抑えて最大効率を保証するために患者の遺伝子型を決定する方法とすることも可能である。
【００６０】
上記で示されたように、本発明の１つの方法は、細胞における遺伝子発現を調節する方法である。方法は、一般的な化学式（Ｉ）の化合物をそれぞれの細胞に投与することを含む（上記参照）。任意の細胞が、本発明の方法において使用され得る。例示として、胚幹細胞または始原生殖細胞を含めて、幹細胞／前駆細胞が使用され得る。本発明の方法が内因性細胞成分に対するその作用のためにアポトーシス効果を示すことを回避するために、非癌細胞を使用することが望ましいことがある。正常組織に対してではなく、癌細胞に対する化学式（Ｉ）の化合物の選択的作用のために（以下およびたとえば図３Ｆ参照）、本発明は、一方では、正常細胞について特によく適している。
【００６１】
ポリコーム抑制複合体の成分を発現する細胞は、いかなるものを使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、機能的に活性の内因性ポリコーム抑制複合体を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの細胞は、幹細胞または前駆細胞である。本発明の方法において使用され得る幹細胞の例には、非限定的に、胚幹細胞、栄養膜幹細胞、および胚外幹細胞がある。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態では、ヒトを源とする胚幹細胞、すなわちヒト胚幹細胞を使用することが可能である。他の実施形態では、細胞は前駆細胞である（上記参照）。他の実施形態では、細胞は癌細胞である（上記参照）。他の実施形態では、内因性ポリコーム抑制複合体は機能的に不活性である。これらの実施形態のいくつかでは、たとえばＨＥＫ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＲＥ、ＭＴ４、ＤＥ（アヒルの胚）、ＱＦ（ウズラの線維肉腫）、ＮＳ０、ＢＨＫ、Ｓｆ９、ＰＣ１２、またはＨｉｇｈ５など、確立された真核細胞系統の任意の細胞が選択される。他の実施形態では、それぞれのポリコーム抑制複合体の成分をコードする１つまたは複数の外因性遺伝子が、組換え体技術によって、たとえばそれぞれの遺伝子を搬送するベクターによって導入される。
【００６２】
選択された細胞は、それぞれのポリコーム抑制複合体の標的遺伝子、または少なくともそのプロモータをさらに含む。それぞれの標的遺伝子の例はＦＢＸ０３２遺伝子である。いくつかの実施形態では、選択された標的遺伝子、またはその機能断片は、本発明の方法を実施するのに十分な量で内因的に発現する。他の実施形態では、選択された転写因子は、細胞のプロテオームからほぼまたは完全に欠如している。どちらの場合でも、それぞれの標的遺伝子、またはその機能的断片は、所望の標的遺伝子をコードする遺伝子を含む１つまたは複数の組換え体ベクターによって細胞内に導入される。通常であって、必ずしもではないが、それぞれの遺伝子は、活性プロモータ、または外部刺激によって好都合に活性化することができるプロモータの制御下にある。
【００６３】
それぞれの標的遺伝子のプロモータのコピーまたは完全標的遺伝子をさらに、すなわちそれぞれの細胞の内因性遺伝子の他に、対象細胞に含むことが望ましい場合、これは、同様に組換え体ベクターによって達成され得る（たとえば、Ｋａｗａｔａｂａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。また、プロモータの活性化を容易にするために（内因性の源または外因性の源であるかに関係なく）、それぞれのプロモータを含むベクターを細胞内に導入することも有利である可能性がある。さらに、たとえばタンパク質を得るために、標的遺伝子のプロモータを使用して外因性遺伝子を発現させることが望ましい可能性がある。この場合、通常、標的遺伝子のプロモータの制御下にある所望の外因性遺伝子を含むベクターが選択される。このために、任意の所望の遺伝子の配列が、それぞれのベクターに含まれることが可能である。当業者なら、それぞれに転写されたタンパク質が、本発明の方法において使用される細胞内において転写後修正をも受けることが望ましい場合、追加の酵素を共発現することが必要とされることがあることを認識するであろう。
【００６４】
標的遺伝子のプロモータの制御下において本発明の方法において使用され得る外因性遺伝子の例には、非限定的に、レポータ遺伝子、耐薬剤遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「死」遺伝子）、またはそれぞれの細胞における所望の発現を有するあらゆる他の遺伝子がある。いくつかの実施形態では、それぞれの遺伝子は、対象タンパク質をコードすることも可能である。そのような場合、本発明の方法は、それぞれのタンパク質を発現させ、かつそれを得るために使用することが可能である。標的遺伝子のプロモータの制御下の遺伝子がアポトーシス遺伝子である場合、本発明は、たとえば、多分化性細胞を組織から排除するために使用することが可能である。
【００６５】
本明細書において記述された化合物、またはその薬学的に許容される塩は、それ自体として、または、組合せ治療の場合のように他の活性材料、または適切な担体もしくは希釈剤と混合され得る医薬組成物として、使用することができる。これに関して、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発し、および／または幹細胞／前駆細胞の多分化性お
よび／または自己複製特性を調節する医薬組成物にも関する。
【００６６】
それぞれの医薬組成物は、たとえば、タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）などの細胞毒剤、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））または（グリベック）Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）などのチロシンキナーゼ阻害剤、インターロイキン−１１もしくはインターフェロン−α−２ｂおよびインターロイキン−２などの（組換え体）成長因子、ラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）（登録商標）などのチミジレート合成酵素阻害剤、またはリツキマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））またはセツキマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などの単一クローン抗体を含むことが可能である。上述された化合物は、たとえば、後成的治療において使用される化合物と組み合わせて適用することが可能であり（たとえば、概述についてＰｅｅｄｉｃａｙｉｌ，Ｊ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ（２００６）１２３，１７−２４参照）、それぞれの医薬組成物は、そのような化合物を含有することが可能である。例示として、本発明による医薬組成物は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、および／またはヒストン−デアセチラーゼ阻害剤を含むことが可能である。
【００６７】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の例には、非限定的に５−アザシチジン、デシタビン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、およびゼブラリン（１−（β−ｄ−リボフラノシル）−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オン）がある。ＤＮＡ脱メチル化剤の例には、非限定的に、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン（−）−エピガロカテキン−３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）、サマプリン（ｐｓａｍｍａｐｌｉｎ）Ａ、オリゴデオキシヌクレオチドＭＢ９８、および２−（１，３−ジオキソ−１、３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロピオン酸（ＭＧ９８）がある。ヒストン−デアセチラーゼ阻害剤の例には、非限定的に、ブチレート、フェニルブチレート、バルプロ酸、ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサン酸（ＣＢＨＡ）、オキサムフラチン、ＰＤＸ−１０１、ＭＳ−２７５、デプシペプチド、ピロキシアミド、スクリプタイド、スベロイルアニリドヒドロキシアミド酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチン（ＴＳＡ）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＬＢＨ５８９、アピシジン、ＣＨＡＰ、トラポキシン、Ｎ−アセチルジナリン、およびＭＳ−２７５がある。
【００６８】
本発明の成分を備える医薬組成物は、たとえば従来の混合、溶解、顆粒化、糖剤作成、研和、エマルジョン化、カプセル化、エントラッピング、または凍結乾燥のプロセスによって、それ自体が既知の方式で製造され得る。
【００６９】
したがって、本発明により使用される医薬組成物は、医薬として使用できる製剤へと活性化合物を加工するのを容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方式で調合され得る。適切な調合物は、投与の選択経路に依存する。
【００７０】
それぞれの化合物または医薬組成物の例示的な投与経路には、経口、経皮、および腸管外の送達がある。適切な投与経路は、たとえば、デポー、経口、直腸、経粘膜、または腸管の投与；粘膜内、皮下、静脈内、髄内の注射、ならびにクモ膜下、直接心室内、腹膜内、鼻腔内、または眼内の注射を含む腸管外送達を含むことが可能である。たとえば、デポーまたは持続性調合物においてなど、化合物を充実性主要に直接注射することにより、化合物または医薬組成物を全身的ではなく、局所的に投与することも可能である。さらに、それぞれの化合物または医薬組成物は、ターゲット薬剤送達システムにおいて、たとえば腫瘍特性抗体でコーティングされたリポソームにおいて、使用され得る。そのようなリポソームは、たとえば、腫瘍を標的とし、腫瘍によって選択的に取り上げられることが可能
である。
【００７１】
例示として、注射のために、本発明による化合物または医薬組成物は、水溶液、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液などの好ましくは生理学的に親和性の緩衝液において、調合され得る。経粘膜投与では、通常、浸透される障壁に適切な浸透剤が、調合物において使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に既知である。
【００７２】
経口投与のために、それぞれの化合物または医薬組成物は、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と活性組成物を組み合わせることによって容易に調合することができる。そのような担体により、処理される患者が経口摂取するように、本発明の化合物を、タブレット、ピル、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スリラー、懸濁液などとして調合することが可能になる。
【００７３】
経口使用のための薬剤製剤を、固体の賦形剤を追加し、結果として得られる混合物を随意選択で粉砕し、所望であればタブレットまたは糖剤のコアを得るために適切な補助剤を追加した後、顆粒の混合物を処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、具体的には、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；たとえばとうもろこしデンプン、小麦デンプン、米デンプン、じゃがいもデンプン、ゼラチン、ゴム、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩など、崩壊剤が追加され得る。
【００７４】
経口的に使用することができる医薬組成物は、非限定的に、ゼラチンで作成された押込み嵌めカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作成され柔軟封止カプセルを含むことができる。押込み嵌めカプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに随意選択で安定剤との混和物において活性組成物を含むことが可能である。柔軟カプセルでは、化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど、適切な液体に溶解または懸濁させることが可能である。さらに、安定剤が追加され得る。経口投与されるすべての調合物は、そのような投与に適切な投与量にあるべきである。
【００７５】
頬投与では、それぞれの医薬組成物は、従来の方式で調合されたタブレットまたはトローチ剤の形態を取ることが可能である。
吸入による投与では、本発明により使用される医薬組成物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など、適切な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザからエアロゾル噴霧提示の形態で送達されることが好都合なことがある。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計測量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器において使用されるゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジが、化合物の粉末混合物および乳糖またはデンプンなどの適切な粉末ベースを含んで調合され得る。
【００７６】
それぞれの医薬組成物が、注射による、たとえば大量注射または連続注入による腸管外投与のために調合され得る。注射される調合物は、追加された保存剤と共に、たとえばアンプルまたは複数投与容器において、単位投与量形態で提示され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ることが可能であり、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの調合剤を含むことが可能である。
【００７７】
腸管外投与される薬剤調合物は、水溶性形態の活性混合物の水溶液を含む。さらに、活性組成物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として準備することが可能である。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームがある。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘性を増大させる物質を含むことが可能である。随意選択で、懸濁液は、高度に濃縮された溶液を準備することを可能にするように、化合物の溶解度を増大させる適切な安定剤または作用剤を含むことも可能である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、上述された化合物などの活性成分は、使用前に、発熱物質のない滅菌水など、適切なビヒクルを有する構成の粉末形態にあることが可能である。
それぞれの医薬組成物は、座薬または持続性浣腸などの直腸組成物として調合されることも可能であり、たとえば、ココア・バターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬ベースを含む。
【００７９】
前述された調合物の他に、化合物は、デポー製剤として調合されることも可能である。そのような長期作用調合物は、埋め込む（たとえば皮下または筋肉内に）ことによって、または筋肉内注射によって、投与され得る。したがって、たとえば、化合物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（たとえば許容される油におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂で、または低可溶性誘導体として、たとえば低可溶性の塩として、調合され得る。
【００８０】
本発明が容易に理解され、かつ実施されるように、ここで、以下の非限定的な例によって特定の実施形態について記述する。
実施例
細胞と薬剤処理
これらの実施例で用いられる細胞株は、米国菌培養収集所（バージニア州、マナッサス）から購入した。細胞は、ＤＭＥＭ（ドゥルベコ（ダルベッコ）変法イーグル培地）にグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した１０％ウシ胎児血清を補充して維持した。薬剤処理に供するため、細胞は薬剤処理の前日に播種した。細胞を、５μＭの３−Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａまたは２ΜのＭ５−Ａｓａ−２’−デオキシシチジン（５−ＡｚａＣ；Ｓｉｇｍａ）で７２時間、１００ｎＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ；Ｓｉｇｍａ）で２４時間処理した。５−ＡｚａＣとＴＳＡとの併用では、細胞に、５−Ａｚａを４８時間添加し、その後ＴＳＡを２４時間添加した。
【００８１】
ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２およびＥＥＤメッセンジャーＲＮＡを特異的な標的とするｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドについては、先に説明している（Ｃａｏ，Ｒ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｍｏｉ  Ｃｅｌｌ（２００４）１５，５７−６７；Ｂｒａｃｋｅｎ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．（２００６）２２，５３２３−５３３５）。Ｂｒａｃｋｅｎらは、ＳＵＺ  １２を標的とするステムループＲＮＡを生成する際に、２つのオリゴヌクレオチドを用いた。それらは、５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＴＣＧＣＡＡＣＧＧＡＣＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＣＧＴＴＧＣＧＡ  ＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（配列番号１）、および５’−ＴＣＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＧ  ＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＣＧＴＴＧＣＧＡＣＧＧＧ−Ｓ’（配列番号２）であった。ＣＡＯ  および  ＺＨＡＮＧは、ＥＺＨ２にオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴ−Ｓ’（配列番号３）を、そして、ＥＥＤにオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号４）を用いた。選択されたＰＲＣ２標的と非標的対照のＳｍａｒｔｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ二重鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（コロラド州、ラファイエッ
ト）から購入した。Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ社から購入したＦＢＸＯ３２  ｓｉＲＮＡは、以下の配列を標的としている：５’−ＧＴＣＡＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡ−Ｓ  ’（配列番号５）。細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ｉｎ  ｖｉｔｒｏゲン）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、ｓｉＲＮＡ二重鎖を最終濃度５０ｎＭでトランスフェクトした。
【００８２】
ウエスタンブロット解析
細胞ペレットは、タンパク質すべてを放出させるために組織ホモジナイザーを用いて更に音波破砕する前に、まず、ｐＨ  ７．６のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ、ＮａＣＬ  １５０ｍＭ、１％ノニデット−Ｐ  ４０（ＮＰ−４０）、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ナトリウムドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）の水溶液からなる放射標識免疫沈降（ＲＩＰＡ）用緩衝液で溶解した。等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。ブロットは、以下に列挙抗体において調べた：ＥＥＤ（０７−３６８）、ＳＵＺ１２（０７−３７９）、ＳＵＶ３９Ｈ１（０７−５５０）、ＢＭＩＬ（０５−６３７）、トリメチル化Ｈ３−Ｋ２７（０７−４４９）、トリメチル化Ｈ３−Ｋ９（０７−４４２）およびＡｃｅｔｙｌ−Ｈｉｓｔｏｎｅ
Ｈ３（０６−５９９）、ブロットは、Ｕｐｓｔａｔｅ社から購入した。ＥＺＨ２（ＡＣ２２）およびＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（３Ｈｌ）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入した。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴＬおよびＤＮＭＴ３Ｂに対する抗体は、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。
【００８３】
フローサイトメトリー解析
細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールで定着し、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳ分析に供するために処理した。カスパーゼ３活性アッセイおよびミトコンドリア膜電位を検出するため、細胞は、製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の使用説明書に従い、抗活性カスパーゼ３とＪＣ−Ｉで、それぞれ、染色した。
【００８４】
マイクロアレイ解析と定量リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏゲン）を用いて細胞株から分離し、ＲＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｃＤＮＡに変換した。マイクロアレイハイブリッド形成法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行い、データ解析をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを用いて行った。正常な試料および初期乳房腫瘍の試料の遺伝子発現は、製造業者の使用説明書に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ  １３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州、サンタクララ）を用いて実施した。個々の配列からの遺伝子発現データは、中央値によるセンタリングによって正規化し、平均リンケージ階層クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗ社（ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｓｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍ）のソフトウェアを用いて行った。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＲＩＳＭ  ７９００  配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。試料は、１８ＳのリボソームＲＮＡのレベルに正規化した。
【００８５】
クロマチン免疫沈降解析（ＣＨＩＰ）
前述のように、ＣｈＩＰアッセイを行った。ＭＣＦ−７細胞は、３−デアザネプラノシン（５μＭ）を用いる場合と用いない場合とで、４８時間処理した。ＭＣＦ−７細胞は、６ウェルプレートに３０％コンフルエントに播種し、３−デアザネプラノシン（５μＭ）を用いる場合と用いない場合とで、４８時間処理した。細胞は、Ｉｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１度洗浄し、その後、３７℃で１０分間、ＰＢＳにおいて１％ホルムアルデヒドを用いて処理し、続いて最終濃度が０．１２５Ｍになるまで５分間グリシンを添加
した。細胞を、その後、氷上に擦り付けて、４℃で５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳで洗浄の後、細胞ペレットを冷溶解緩衝液１  ｍｌで再懸濁し、（ｐＨ  ７．５
ＨＥＰＥＳ  １０  ｍＭ、ｐＨ  ８．０  ＥＤＴＡ  １  ｍＭ、ＮａＣＬ  ４００  ｍＭ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、フェニルメチルスルホニルフッ化物  ０．５  ＭＭ、およびプロテアーゼ阻害剤［ベンズアミジン  １  ｍＭ、ロイペプチン  ３
ｍｇ／ｍＬ、のバシトラシン  ０．１  ｍｇ／ｍＬ、マクログロブリン  １  ｍｇ／ｍＬ］）続いて微量遠心機にて４０℃で５分間、１１，５００ｒｐｍで遠心分離を行い、クロマチンと架橋結合していないタンパク質を除去した。得られたペレットをその後、冷溶解緩衝液で再び再懸濁し、Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製Ｗ−２２０超音波処理器を用いて出力２０％で計２分間（パルス：３０秒ＯＮ／３０秒ＯＦＦ）超音波分解した。得られた溶液を、４℃で１０分間、微量遠心機にて、４℃で１０分間、最高速度で遠心分離し清澄化した。この時点で、溶液を５％取り出し、−２０℃でクロマチンのインプット試料として保存した。クロマチン溶液は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の５０％スラリー８０μＬで、２〜４時間事前に清澄化した。
【００８６】
２ｘ１０７  ＭＣＦ７細胞から事前に清澄化したクロマチンを、剪断したサケ精子ＤＮＡ（０．３  ｍｇ／ｍＬ）とＢＳＡ（１  ｍｇ／ｍＬ）で４°Ｃで一晩予備遮断して免疫沈降を行い、その後、抗ＳＵＺ１２抗体（０７−３７９、Ｕｐｓｔａｔｅ社）５μｇ、抗ＲＮＡポリメラーゼII（ｓｃ−８９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）５μｇと非特異的ＩｇＧ（ｓｃ−２０２７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）５μｇで培養した。免疫沈降は、４℃で一晩行った。免疫複合体は、溶離緩衝液（ＰＨ  ８．０の５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％ＳＤＳ、ｐＨ  ８．０のＥＤＴＡ  １０  ｍＭ）７５μＬを添加して、ビーズから溶出し、６５℃で１０分間加熱した。溶出は２回行い、溶出液をプールした。架橋結合は、その後、溶離緩衝液で希釈（１：４）した架橋結合した５％の全細胞抽出試料とともに、溶出液を６５℃に一晩置いて反転させ、クロマチンのインプット試料を生成した。ＤＮＡを、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲを用いて精製し、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いてＰＣＲを実施した。プライマーの最終濃縮は、０．５μＭであった。クロマチンインプット試料約１％とＣｈＩＰ試料１０％を、各反応のテンプレートとして用いた。反応混合液を、まず、９４℃で５分間溶解し、その後９４℃／３０秒間、５６℃／１分間、７２℃／１分間を２７サイクル行い、最後は７２℃で７分間延長して溶解した。アンプリコンは、すべて１５０〜３００  ｂｐの範囲内である。試料は、臭化エチジウムを含む３％アガロースゲル上で溶解した。用いたプライマーの配列は以下の通りであった：ＴＧＦＢＩ：フォワードプライマー  ５’−ＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＣ−３’（配列番号６）およびリバースプライマー  ５’−ＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号７）。ＩＧＦＢＰ３：フォワードプライマー５’−ＴＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号８）およびリバースプライマー５’−ＴＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣ  ＴＴＴＣＣ−３’（配列番号９）。ＫＲＴ１７：フォワードプライマー５’−ＡＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１０）およびリバースプライマー５’−ＡＡＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧ−３’（配列番号１１）。ＦＢＸＯ３２：フォワードプライマー５’−ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１２）およびリバースプライマー５’−ＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１３）。ＬＡＭＢ３：フォワードプライマー５’−ＧＣＡＧ  ＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１４）およびリバースプライマー５’−ＴＣＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡ  ＡＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１５）。ＡＮＸＡ８：フォワードプライマー５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号１６）およびリバースプライマー５’−ＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧ−３’（配列番号１７）。ＴＥＮＳ１：フォワードプライマー  ５’−ＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣ
−３’（配列番号１８）およびリバースプライマー  ５’−ＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１９）。ＰＬＡＵ：フォワードプライマー  ５’−ＧＧＡ  ＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＣ−３’（配列番号２０）およびリバースプライマー  ５’−ＡＴＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２２）。
【００８７】
ＰＲＣ２タンパク質の枯渇および３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮＥＰ）によるＨ３−Ｋ２７メチル化の抑制
ウエスタンブロット解析（図１Ａ）で示すように、ＨＣＴＬ  １６細胞またはＭＣＦ−７細胞を、３−デアザネプラノシン５ΜＭで４８時間および７２時間処理した結果、ＰＲＣ２の成分であるＳＵＺ１２、ＥＺＨ２およびＥＥＤのタンパク質レベルは劇的に低下した。したがって、リシン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストン３のトリメチル化は、３−デアザネプラノシンによって強く低下した。対照的に、リシン９（Ｈ３−Ｋ９）でのヒストンＨ３メチル化は、３−デアザネプラノシン処理の影響を受けなかった。この結果は、Ｈ３−Ｋ２７がＰＲＣ２ヒストンメチルトランスフェラーゼの特異的基質であり、一方、Ｈ３−Ｋ９のメチル化は、ＳＵＶ３９ＨＬメチルトランスフェラーゼによりしばしば媒介される、というこれまでの所見と一致している。したがって、Ｓｕｖ３９ｈｌのタンパク質レベルが、３−デアザネプラノシンに影響されていないことがわかった。加えて、３−デアザネプラノシン処理は、ヒストンアセチル化に影響を及ぼさず、５−ＡｚａＣやＺｅｂｕｌａｒｉｎｅ等のＤＮＭＴ阻害剤によって枯渇することが知られているＤＮＭＴ１またはＤＮＭＴ３Ｂのタンパク質形質発現に変化を及ぼさなかった。逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）でＰＣＲ法で測定されるＰＲＣ２タンパク質の各々のｍＲＮＡ濃度は、しかしながら、３−デアザネプラノシン処理（図１Ｂ）後、変化せず、このことは、ＰＲＣ２成分の減少がタンパク質レベルで起こり、転写抑制によらないことを示唆する。
【００８８】
ＰＲＣ２タンパク質の安定度がプロテオソーム媒介性機序を通して調節されるとこれまで報告されている。このため、３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２タンパク質の枯渇がタンパク質分解から生じるかどうかを調べた。ＭＣＦ−７細胞は、３つの個々のプロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２、ＬＬＮＬおよびＭＧ１１５の存在下または非存在下で３−デアザネプラノシンで処理し、これらの処理が３−デアザネプラノシン誘導性のＰＲＣ２枯渇を救済するかどうかを調べた。図１Ｃで示すように、各プロテオソーム阻害剤を用いた処理は、３−デアザネプラノシンに応じた、ＥＺＨ２およびＳＵＺ  １２のタンパク質レベルのダウンレギュレーションを阻止した。これらの結果は、３−デアザネプラノシンが、タンパク質分解の進行により、ＰＲＣ２タンパク質を低下させることを証明した。
【００８９】
３−デアザネプラノシンは、癌細胞で選択的にアポトーシスを誘導する
３−デアザネプラノシンが、細胞死を誘導することが可能であるとわかった。５μＭの３−デアザネプラノシンは、ｐｒｏｐｏｄｉｕｍヨウ化物（ＰＩ）染色およびフローサイトメトリー（図３Ａ）による判定では、４８時間で２５％の細胞死、そして７２時間で４５％の細胞死を誘導することが可能であることが確認された。５μＭの３−デアザネプラノシンも、乳癌ＭＢ−４６８細胞、結腸直腸癌ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ細胞およびＳＷ４８０細胞を含む種々の他の癌細胞株で、明らかな細胞死を誘導した。
【００９０】
３−デアザネプラノシンが細胞死を誘導する機序を解明するため、フローサイトメトリーを用いて、３−デアザネプラノシン処理後の、ＭＣＦ−７細胞およびＨＣＴＬ  １６細胞でミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の低下について分析した（図３Ｂおよび３Ｃ）。３−デアザネプラノシンは、より低いΔΨＭで細胞の割合の顕著な増加を誘導し、３−デアザネプラノシン処理後これらの細胞でミトコンドリア損傷が認められた。カスパーゼ９の開裂および３−デアザネプラノシン処理細胞のｐｏｌｙ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）も、容易に検出可能であった（図３Ｄ）。これらの結果は、３−デアザネプ
ラノシンがミトコンドリア機能障害およびカスパーゼ活性化を伴うアポトーシス細胞死反応を誘導することを示す。
【００９１】
３−デアザネプラノシンが癌細胞で選択的にアポトーシスを誘導するかどうか判定するため、ＭＣＦ−７細胞と非癌胸部上皮ＭＣＦＬＯＡ細胞との間のアポトーシス誘導を、種々の期間において比較した。３−デアザネプラノシン処理はＭＣＦ−７細胞で結果として進行性かつ顕著なアポトーシスを誘導するが、ＭＣＦ１０Ａ細胞では、３−デアザネプラノシン処理後９６時間まで、顕著なアポトーシス誘導は認められなかった（図３Ｆ）。また、顕微鏡検査による評価では、ＭＣＦ１０Ａ細胞等の正常な原発性大腸上皮ＣＣ３３Ｄ細胞もまた、結腸直腸癌ＨＣＴ１１６細胞と比較して、３−デアザネプラノシン処理に対して抵抗性であった（図３Ｇおよび３Ｈ）。従って、３−デアザネプラノシンは、癌細胞において選択的にアポトーシスを誘導した。
【００９２】
３−デアザネプラノシンに誘導されたアポトーシスがＰＲＣ２タンパク質の枯渇に起因しているかどうか判定するため、ＰＲＣ２タンパク質（ＥＺＨ２、ＥＥＤおよびＳＵＺ  １２）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドでＭＣＦ−７細胞を処理して、個々に直接ノックダウンし、それらのアポトーシス誘導能を調べた。ｓｉＲＮＡ処理したＭＣＦ−７細胞をウエスタンブロット解析し、ノックダウン効率を確認した（図３Ｉ）。特に、ＰＲＣ２タンパク質各々のノックダウンは結果として、他の２つの成分のダウンレギュレーションをもたらし、結果は、ＰＲＣ２成分のタンパク質レベルが、複合体の他の部分の存在に依存しているというこれまでの所見と一致していた。ＰＲＣ２ノックダウンで予想される結果として、ヒストンＨ３−Ｋ２７のトリメチル化は、著しく低下し、一方Ｈ３−Ｋ９のトリメチル化は変化しない。ＰＡＲＰ開裂の誘導は、これらの条件下では明らかであり（図３Ｉ）、ＰＲＣ２  ｓｉＲＮＡで個々に処理した細胞は、顕著なアポトーシスを示した（図３Ｊ）。このように、３−デアザネプラノシン誘導性アポトーシスは、少なくとも一部には、ＰＲＣ２複合体を枯渇させる能力により媒介され、関連のあるヒストンＨ３−Ｋ２７のメチル化を抑制する。
【００９３】
ＰＲＣ２の特定は、３−デアザネプラノシンにより乳癌において遺伝子およびその再活性を抑制した
ＰＲＣ２は、その標的遺伝子の発現を抑制するために作用する。このため、３−デアザネプラノシンによりＰＲＣ２を枯渇させると、結果としてそれらの再発現が予想される。３−デアザネプラノシン活性化されたＰＲＣ２標的を判定するには、ＰＲＣ２により抑制される推定標的遺伝子を同定する必要があった。ＰＲＣ２成分ＥＺＨ２およびＳＵＺ１２が胸部腫瘍で過剰発現することが報告されているため、本実施例では乳癌細胞に着目する。（Ｋｉｒｍｉｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、前掲；Ｋｉｒｍｉｚｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、前掲）。ｓｉＲＮＡは、ＭＣＦ−７細胞において、ＰＲＣ２（ＥＺＨ２、ＳＵＺ  １２およびＥＥＤ）の３つのコア成分のノックダウンを個々に用いた。遺伝子発現の効果をＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐを用いて解析した。データ解析により、ＥＺＨ２、ＥＥＤ、ＳＵＺのｓｉＲＮＡ処理後、それぞれ７０８個、６８４個、５７２個の遺伝子が２倍以上アップレギュレートしたことが明らかになった。図４Ａは、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ条件でアップレギュレートした４５０個の遺伝子とｓｉＲＮＡ試験の３件すべてでアップレギュレートした９５個の遺伝子との重複を示す（２つおよび３つの条件の重複にて、ｐ＜０．０００１）。全体として、３つのＰＲＣ２タンパク質のうち少なくとも１つが枯渇している場合、１４０２個の遺伝子の発現が増加した。その後の解析を包括すると、１４０２個の遺伝子すべてが、ＰＲＣ２標的遺伝子となりうると考えられた。
【００９４】
さらに、アレイ解析を行い、３−デアザネプラノシンによりアップレギュレートされた遺伝子を同定した。ＭＣＦ−７細胞を３−デアザネプラノシンで７２時間処理した結果、
７５０個の遺伝子が２倍以上アップレギュレートされた。３−デアザネプラノシンでアップレギュレーされたＰＲＣ２標的遺伝子を同定するため、３−デアザネプラノシンで誘導可能な７５０個の遺伝子を、１４０２個の候補ＰＲＣ２標的遺伝子と比較した。１４０個の遺伝子（ｐ＜０．０００１、図４Ｂ）の重複が同定された。これらの重複遺伝子は、３−デアザネプラノシンで発現が活性化できる候補ＰＲＣ２標的遺伝子である。
【００９５】
３−デアザネプラノシンは、非癌ＭＣＦＬＯＡ細胞と比較して、ＭＣＦ−７で選択的にアポトーシスを誘導したため、ＰＲＣ２標的遺伝子が、癌細胞と非癌細胞との間では異なるように発現している可能性がある。特に乳癌細胞で抑制されるＰＲＣ２標的を同定するため、ＭＣＦ−７細胞およびＭＣＦ１０Ａ細胞における推定１４０個のＰＲＣ２標的遺伝子の発現プロファイルは、遺伝子クラスタリング解析により比較した（図４Ｃ）。本解析により、ＭＣＦ１０Ａ細胞と比較してＭＣＦ−７細胞で少なくとも２倍少なく発現した１４０個の遺伝子のうち４７個のセットを同定したが、残りの推定ＰＲＣ２標的遺伝子のいずれもが、２つの細胞型において同程度であるか、またはＭＣＦ−７細胞において、より高い発現を呈した（図４Ｃ、左パネル）。ＰＲＣ２タンパク質の３−デアザネプラノシンでの処理またはｓｉＲＮＡでのノックダウンは、結果としてＭＣＦ−７細胞において再発現をもたらした（図４Ｃ、右パネル）。遺伝子配列データの信頼性を検証するため、４７−遺伝子セットから無作為に選択した１０個の遺伝子の半定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した（図４Ｄ）。どの場合も、候補遺伝子はＭＣＦ１０Ａ細胞で高度に発現したが、ＭＣＦ−７細胞では、低い発現または検出不可能な発現もあった。ＰＲＣ２タンパク質の３−デアザネプラノシン処理またはＰＣＲタンパク質のｓｉｄＮＡ枯渇は、結果としてＭＣＦ−７細胞において再発現をもたらした。
【００９６】
そのような厳密判定基準を用いることにより、ＰＲＣ２標的遺伝子のコホートが、乳癌細胞で特に抑制されることが明らかとなった。遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析により、ＴＧＦＢＩおよびＩＧＦＢＰ３で見られるように、これらの遺伝子では成長抑制またはアポトーシスにおける役割が顕著に高められていることが、わかった（図４Ｅ）。このため、これらの遺伝子は、乳癌でＰＲＣ２により後成的にサイレンシングまたは抑制される悪性の表現型に対する推定腫瘍抑制因子と考えられる。また、ＭＣＦ−７細胞でＰＲＣ２により高度に抑制された遺伝子は、３−デアザネプラノシンにより選択的に再活性化される。これは、これら遺伝子が既に高度に発現し、更なる誘導を受けなかったＭＣＦ１０Ａ細胞とは正反対である（図４Ｆ）。このことは、３−デアザネプラノシン処理に反応してＭＣＦ１０Ａ細胞の感受性が欠如することを説明し、３−デアザネプラノシンの癌選択性が、癌細胞におけるＰＲＣ２抑圧遺伝子の選択的再活性に依存することを意味している。
【００９７】
さらに、遺伝子発現解析は、２８個の初期胸部腫瘍試料と９つの正常胸部組織からなるデータセット上で行った。４７個の癌に特異的なＰＲＣ２抑圧遺伝子と、ＥＺＨ２、ＳＵＺ  １２およびＥＥＤとが共に、解析に用いられた。監視されていないクラスター解析により、このＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ配列データセットに存在する３４個の固有のプローブが明確に腫瘍と正常試料とを分離することがわかった（図４Ｇ）。１７個の遺伝子（クラスターＩ）のサブセットは、正常な胸部組織と比較して胸部腫瘍で低次の発現を呈し、それは、予想通りで、ＥＺＨ２およびＳＵＺＬ２の高度の発現と相関していた。このデータは、ＰＲＣ２標的遺伝子のこのサブセットが、初期のヒト乳癌で抑制されるＰＲＣ２標的遺伝子と臨床的に関連していることを示す。残りの遺伝子では、腫瘍組織か正常組織であるか（クラスターＩＩ）、または腫瘍においてさえ高度に発現するか（クラスターＩＩＩ）を区別することはさらに困難であった。このため、これらの遺伝子は、初期の腫瘍のＰＲＣ２によって媒介される後成的変化を反映しない場合がある。
【００９８】
薬理学的解析、ゲノム解析および機能的解析により、推定臨床的に関連するＰＲＣ２標的のグループを、このようにして特定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究とｉｎ  ｖｉｖｏ研究
の統合することで、原発性胸部腫瘍に関連する遺伝子とＰＲＣ２標的リストとの有意な対合が可能になった。例えば、ＰＬＡＵおよびＤＵＳＰ４  および１０を、ＭＣＦ−７細胞においてサイレンシングしたが、実際には、正常組織と比較して初期腫瘍試料で高度に発現することがわかった。これが癌細胞株と原発性乳癌細胞との基本的な相違を反映する場合があるにもかかわらず、これらの「一致しない」遺伝子（例えば、ＰＬＡＵおよびＤＵＳＰ４  および１０）の発現が、マクロファージ、脈管細胞成分および間質細胞等、原発性腫瘍の非癌成分に起因するとも、同様に考えられる。この選択を通して、しかし本願発明者は、発現が、正常な胸部組織と比べて原発性胸部腫瘍で一貫してダウンレギュレートされる、臨床的に関連したＰＲＣ２標的のグループを特定した。多くのＰＲＣ２抑制された標的遺伝子（例えばＴＧＦＢＩ、ＩＧＦＢＰ３およびＰＰＰＩＲ１５Ａ）が成長抑制またはアポトーシスで機能を有することが知られており、推定腫瘍抑圧遺伝子としてのそれらの潜在的役割を示唆している。これらの遺伝子の再発現は、３−デアザネプラノシン誘導性アポトーシスに、集合的に関与する場合がある。
【００９９】
ＰＲＣ２およびＲＮＡポリメラーゼＩＩによるＰＲＣ２標的プロモータ占有に関する３−デアザネプラノシンの効果
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いて、ＰＲＣ２がその推定標的遺伝子プロモータと結合するかどうか、また、この結合が３−デアザネプラノシン処理により影響を受ける可能性があるか否かを判定した。さらに、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩとＰＲＣ２が排他的な方法で遺伝子プロモータと結合するので、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ）の結合について解析した（Ｖｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２の枯渇が、ＰＲＣ２標的遺伝子プロモータへのＲＮＡ  Ｐｏｌ
ＩＩの補充を増強させると推論された。ＣｐＧアイランドを有する場合と有さない場合とで、１ｋｂ以内の転写開始点でＰＲＣ２結合部位の９５％が以前に見つかったことから、８個の候補ＰＲＣ２標的遺伝子のコアプロモーター領域中のＣｈＩＰ  ＰＣＲプライマーをデザインした。（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）（図５Ａ）。ＳＵＺ１２およびＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ抗体を用いて行われるＣｈＩＰ解析により立証されるように、未処理のＭＣＦ−７細胞は、試験を行ったＰＲＣ２標的遺伝子プロモータに、ＳＵＺ  １２の強い結合を示したが、バックグラウンドまたは最小の結合のみが非特異的ＩｇＧまたはＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩの引き抜き試料で検出された（図５Ｂ）。３−デアザネプラノシンによる処理後、これらのプロモータと結合しているＳＵＺ  １２は顕著に減少したが、ＲＮＡ  ＰＯＬ  ＩＩの結合は増加した。３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２枯渇後のＰＲＣ２標的遺伝子の再発現と合わせて、これらの所見は、これらＰＲＣ２標的遺伝子プロモータと結合しているＰＲＣ２が転写抑制のために必要とされることを確認した。３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２タンパク質の破壊は、この結合を減少させ、結果としてＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩのさらなる補充とＰＲＣ２標的遺伝子プロモータの活性化をもたらした。
【０１００】
３−デアザネプラノシンによりＰＲＣ２抑制された標的の再活性は、ＤＮＡメチル化を抑制した結果ではない
３−デアザネプラノシンがＡｄｏＨｙｃヒドロラーゼ活性を抑制して、間接的に一般的なメチル化反応を抑制するため、ＰＲＣ２標的遺伝子の３−デアザネプラノシン媒介性の再活性が、ＤＮＡ低メチル化の結果と考えられる可能性がある。そのために、ＤＮＡ脱メチル化剤である５−アザ−２’デオキシ−シチジン（５−ＡｚａＣ）で、またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）と併用での、ＭＣＦ−７細胞の処理により、ＰＲＣ２標的遺伝子を活性化させることができるかどうかをテストした。アレイ解析は、５−ＡｚａＣ単独またはＴＳＡと併用のいずれかで処理したＭＣＦ−７細胞で行った。これまでに確認された１４０個のＰＲＣ２標的遺伝子の発現プロフィールを、３−デアザネプラノシンで処理したＭＣＦ−７細胞と比較した。図５Ｃ（Ｉ）は、上記の処理が３−デアザネプラノシン処理の場合に比べて、結果的にＰＲＣ２標的遺伝子を顕著
に再活性させなかったことを示す。１４０個のＰＲＣ２標的遺伝子のうち、１３個の遺伝子（約１０％）のみが、５−ＡｚａＣおよびＴＳＡ（例えばＡＮＡＸ８やＤＬＸ２）を併用治療後、３倍以上の誘導を示した。このことは、ＰＲＣ２標的のいくつかにおいて、３−デアザネプラノシンがＤＮＡ脱メチル化反応の結果としてＰＲＣ２標的遺伝子の発現を増強させる場合があることを示唆している。配列結果を、代表的なＰＲＣ２標的に行うリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて更に確認した。ＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ１７およびＦＢＸ０３２等の遺伝子は、ＴＳＡの有無にかかわらず、３−デアザネプラノシンにのみ誘導され、５−ＡｚａＣには誘導されなかった（図５Ｃ、ＩＩ）。ＡＮＸＡ８およびＤＬＸ２の発現は、しかし、３−デアザネプラノシンの場合と５−ＡｚａＣとＴＳＡの併用の場合に活性化された（図５Ｃ、ＩＩＩ）。３−デアザネプラノシンによるＰＲＣ２標的遺伝子の再活性は、一般のＤＮＡ低メチル化の結果ではなかったが、ＡＮＸＡ８やＤＬＸ２等の特定のＰＲＣ２標的遺伝子に関して例外がみられる場合がある。これらの遺伝子については、最近の研究で示唆されるように、ＰＲＣ２は、それらのプロモータにＤＮＭＴ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）を補充する場合があり、同等にそれらの発現を抑制する場合がある（Ｖｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６、前掲）。
【０１０１】
３−デアザネプラノシンへの細胞感受性と関連するＰＲＣ２標的遺伝子の同定
ＭＣＦ−７細胞で見られる知見を評価するため、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＢ−２３１、Ｔ４７ＤおよびＢＴ５４９を含む付加的な乳癌細胞株のスクリーニングを行った。時間経過的にアポトーシス反応を解析した結果、採取した乳癌細胞株の３−デアザネプラノシンに対する感受性が様々に変化することがわかった。ＭＣＦ−７細胞と同様に、ＭＢ−４６８細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＴ４７Ｄ細胞は、３−デアザネプラノシン誘導性の細胞死に非常に影響されやすかった。対照的に、ＭＢ−２３１細胞およびＢＴ−５４９細胞は、ＭＣＦＬＯＡと共に、３−デアザネプラノシン処理に、高い耐性を示した（図６Ａ）。３−デアザネプラノシンに対する細胞感受性と関連するＰＲＣ２標的遺伝子を特定するため、アレイ解析を、３−デアザネプラノシン処理の前後に乳癌細胞株で行い、４７個のＰＲＣ２標的遺伝子の発現のプロファイルを特定した。いくつかのＰＲＣ２標的遺伝子が、感受性細胞株と抵抗性細胞株との間で差次的に発現し、それが３−デアザネプラノシンに対する明確な感受性を与える場合があることを説明した。遺伝子クラスタリング解析により、ＰＲＣ２標的遺伝子（２２個の遺伝子）のサブセットが、抵抗性細胞株に対して一貫して高レベルに発現するが（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＢ−２３１およびＢＴ５４９）感受性細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３およびＴ４７Ｄ）では、発現が低レベルであることが分かった（図６Ｂ）。この遺伝子群（４つの遺伝子）のうち：ＦＢＸＯ３２、ＬＡＭＢ３、ＰＬＡＵおよびＰＰＰ１Ｒ１５Ａが、４つの感受性細胞株すべてにおいて、同様に、３−デアザネプラノシンにより誘導され、別の遺伝子（ＴＧＦＢＩ、ＩＧＦＢＰ３、ＴＮＳ３およびＫＲＴ１７）では、４つの感受性細胞株のうち３つで誘導された。抵抗性細胞株（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＢ−２３１およびＢＴ５４９）では、しかし、これらの遺伝子は、（ＢＴ５４９におけるＬＡＭＢ３以外）すでに高度に発現しており、３−デアザネプラノシン処理の後、さらに顕著には誘導されなかった。リアルタイム解析と従来のＲＴ−ＰＣＲ解析の両方で、４つの遺伝子セットの配列データを確認した（図６Ｄおよび６Ｅ）。このことから、これらの遺伝子発現の抑制および３−デアザネプラノシンによる遺伝子誘導の程度は、３−デアザネプラノシンに対する細胞感受性と関連すると考えられた。しかし、特に、ＰＲＣ２標的遺伝子の発現レベルは、ＰＲＣ２タンパク質のレベルと必ずしも関係していなかった。たとえば、ＥＺＨ２タンパク質を高度に発現すると考えられたＭＢ−２３１細胞では、多くのＰＲＣ２標的が、必ずしも抑制されるというわけではなかった（図６Ｅ、下パネル）。これは、これらの細胞において、ＥＺＨ２は、これらの遺伝子の後成的制御を確立し維持する上で機能的ではなく、ＤＮＭＴおよびＨＤＡＣ等の付加的因子を必要とする場合があることを示唆している。
【０１０２】
３−デアザネプラノシン誘導性アポトーシスにおいて上記のＰＲＣ２標的遺伝子の機能
的役割を判定するため、ｓｉＲＮＡを用いて、３−デアザネプラノシン反応に関係する７つのＰＲＣ２標的遺伝子の誘導を阻止し、アポトーシス誘導における３−デアザネプラノシンの効果を評価した。ＦＢＸＯ３２  ｓｉＲＮＡ処理だけが、３−デアザネプラノシンへのアポトーシス反応を低下させた。別の６つのＰＲＣ２標的遺伝子を標的としている残りのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３−デアザネプラノシン誘導性アポトーシスを抑制しているとは考えられなかった（図６Ｆ）。ｓｉＲＮＡの的外れな効果を排除するため、異なるＦＢＸＯ３２  ｓｉＲＮＡをさらに用いた。ＦＢＸＯ３２誘導の抑制が３−デアザネプラノシンによるアポトーシス誘導を有意に軽減させることが確認され（図６Ｇ）。類似の結果が、ＭＢ−４６８およびＴ４７Ｄ細胞でも観察された（データ表示せず）。これらの試験は、特定されたＰＲＣ２標的遺伝子のうち、乳癌細胞において３−デアザネプラノシン誘導性アポトーシスを媒介する主たる作用因子として、ＦＢＸＯ３２について確認する。このことから、乳癌細胞のＦＢＸＯ３２のサイレンシング状態および３−デアザネプラノシンによる再活性は、３−デアザネプラノシン反応の重要な決定因子であると考えられる。さらに、潜在的な腫瘍抑圧遺伝子としてのＦＢＸＯ３２の機能的役割は、コロニー形成に影響を及ぼすその能力によって、更に裏付けられた。図６Ｈは、ＭＣＦ−７細胞のＦＢＸＯ３２の形質移入により、調節ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、形成されるコロニー数が大幅に低下したことを示す。
【０１０３】
理論または上記の例に拘束されることなく、３−デアザネプラノシンは、ＡｄｏＨｃｙヒドロラーゼ阻害剤として、ＡｄｏＭｅｔ−ＡｄｏＨｃｙ代謝に干渉して、メチル化反応を低下させることができる（Ｇｌａｚｅｒ，ＲＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８６），１３５，２，６８８−６９４）。ＤＮＭＴを減少させる５−アザ−２’デオキシ−シチジンやゼブラリン等のＤＮＡ低メチル化剤とは異なり、この化合物はＤＮＭＴ上で効果を有しないと考えられたが、ＰＲＣ２タンパク質の効果的な枯渇とそれに関連するヒストン−Ｈ３Ｋ２７のメチル化を誘導した。Ｓｕｖ３９ｈｌまたは関連のＨ３−Ｋ９メチル化に関して効果を有しなかったことから、ＰＲＣ２の上の３−デアザネプラノシンの効果は、選択的なものであると考えられた。３−デアザネプラノシン処理がｍＲＮＡ濃度に影響を及ぼさなかったことから、３−デアザネプラノシン処理の後のＰＲＣ２タンパク質の枯渇は、転写抑制を通しては達成されない。一方、プロテオソーム阻害剤は、タンパク質発現を再開させることができるため、プロテオソームの分解を通して進行する。ＤＮＡに取り込んでＤＮＭＴを枯渇させ、置換ＤＮＡに酵素を閉じ込める５−ＡｚａＣやゼブラリンとは異なり（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、前掲）、３−デアザネプラノシンはリン酸化されず、ＤＮＡには取り込まれない（ｇｌａｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。このため、３−デアザネプラノシンが類似の機序を通してＰＲＣ２タンパク質を枯渇させることは、ほとんど考えられない。この複合体の完全性は、各成分の存在に依存し、１成分のノックダウンは、他のタンパク質のダウンレギュレーションをもたらすと報告されている。（Ｐａｓｉｎｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００４）２３，４０６１−４０７１）。３−デアザネプラノシンによりＰＲＣ２タンパク質のうちの３つすべてを効果的に枯渇させると、３−デアザネプラノシンは、主に１つの成分に影響を及ぼし、それが、結果として他の成分のダウンレギュレーションをもたらす可能性がある。あるいは、ヒストンＨ３−Ｋ２７に対するＳアデノシル−メチオニン取り込みを抑制することで、ＰＲＣ２タンパク質のクロマチンへの結合を低減し、安定性に影響を及ぼすことが可能である。
【０１０４】
３−デアザネプラノシンに対し感受性または抵抗性を示す乳癌細胞株を採集する遺伝子発現解析を通して、発明者は、３−デアザネプラノシンに対する細胞性応答にかかわる可能性が高いＰＲＣ２標的を規定することが可能である。遺伝子のこの小さいセットは代用マーカとして用いられ、将来ＰＲＣ２を標的とした治療において、乳癌細胞で３−デアザネプラノシンの応答を予測し、乳癌患者のサブセットの選択を導く可能性がある。さらに
、ＲＮＡ干渉を用いた更に機能的解析は、Ｆ−ボックスタンパク質３２をコードするＦＢＸＯ３２の再発現が、少なくとも部分的には３−デアザネプラノシンのアポトーシス応答に寄与するということを、明らかにしている。腫瘍抑圧遺伝子としてのその潜在的機能は、細胞発育およびコロニー形成を抑制するその能力により更に裏付けられた。重要なことに、ＦＢＸＯ３２が、正常組織と関連して原発性胸部腫瘍により強く抑制されていることが確認される。このため、正常組織ではなくヒト乳癌細胞におけるＰＲＣ２による潜在的腫瘍抑圧遺伝子の一部の選択的な抑制およびＰＲＣ２標的因子による効果的な反転は、腫瘍細胞に対する腫瘍細胞の優先的死滅をもたらす新規の治療手法を示している。
【０１０５】
ＰＲＣ２がＤＮＭＴとの相互作用を通して直接ＤＮＡメチル化を制御すると最近報告された（Ｖｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、前掲）。３−デアザネプラノシンがすべてのメチル化反応を抑制する場合があるにもかかわらず、ＰＲＣ２抑制された遺伝子を活性化する能力が一般的に起こり得るＤＮＡメチル化抑制と関連していないことがわかった。しかし、５’−ＡｚａＣおよびＴＳＡで処理することで発現が増強され得るＰＲＣ２の小さい部分が、遺伝子（約１０％）を標的とすることがわかった。このことは、ＰＲＣ２が、これらの遺伝子のために、ＤＮＭＴに発現を制御するように要求する場合があることを示唆している。そのために、３−デアザネプラノシンは、ＤＮＭＴやＨＤＡＣ阻害剤等のクロマチンリモデリング因子とは区別され、ＰＲＣ２の調節や関連のヒストンメチル化により遺伝子発現を再活性化させることができるこれまでの最初の化合物と考えられている。今日まで、３−デアザネプラノシンは、抗ウィルス薬治療を意図して研究されたものであり（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９８９）３３，８，１２９１−１２９７）、ｉｎ  ｖｉｖｏで軽微な毒性を有することが示されている。正確な機序にもかかわらず、本研究で最初に述べられている癌細胞における興味深いアポトーシス活性は、それが作用を及ぼす重要な癌経路と共に、抗癌治療の有望な薬剤候補となっている。また、新規の抗腫瘍化合物としての可能性に加え、３−デアザネプラノシンは、後成的研究に有効なツールとして用いることもできる。
【０１０６】
この明細書の先に公表されている文書のリストまたは考察について、かかる文書が必ずしも技術水準の一部であるか、通常の一般的知識であるという認識として取り扱われる必要は無い。
【０１０７】
本明細書中に例証的に説明された本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない１または複数の任意の要素や１または複数の限定がなくても、好適に実施することが可能である。したがって、例えば、用語「備える」、「含む」、「含有する」は、包括的に読むべきであり、限定的に読むべきものではない。さらに、本明細書中に使用される用語および表現は、説明のための用語として用いられたものであり、限定のためのものではない。また、該用語および表現を、図示および説明した特徴またはその一部のいかなる等価物を除外するために使用することを意図したものではなく、特許請求の範囲に記した本発明の範囲内において種々の修飾が可能であると理解される。したがって、本発明が好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてはいるが、開示された本明細書中に具体化された本発明の修飾および変更が当業者によってなされることも可能であり、そのような修飾および変更は本発明の範囲内であると考えられる。
【０１０８】
本発明は、本明細書中に大まかに、かつ総称的に記述されている。一般的な開示の範囲内においてより狭く種および亜種に分類された各々についても、本発明の一部を形成するものである。このことは、除かれた内容が本明細書中に具体的に詳述されるかどうかに関わらず、任意の対象が属から除かれる条件付または消極的な限定付きの本発明の一般的な記述を含む。
【０１０９】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内にあり、また本発明の特徴または態様がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの言葉で説明されている場合、本発明がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの任意の個々の構成要素または下位群（サブグループ）の構成要素でも記載されることが当業者には理解される。
【図１Ａ】
2014028853.tif 000009
【図１Ｂ】
2014028853.tif 000010
【図１Ｃ】
2014028853.tif 000011
【図２−１】
2014028853.tif 000012
【図２−２】
2014028853.tif 000013
【図３Ａ】
2014028853.tif 000014
【図３Ｂ】
2014028853.tif 000015
【図３Ｃ】
2014028853.tif 000016
【図３Ｄ】
2014028853.tif 000017
【図３Ｅ】
2014028853.tif 000018
【図３Ｆ】
2014028853.tif 000019
【図３Ｇ】
2014028853.tif 000020
【図３Ｈ】
2014028853.tif 000021
【図３Ｉ】
2014028853.tif 000022
【図３Ｊ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
2014028853.tif 000029
【図５Ｂ】
2014028853.tif 000030
【図５Ｃ】
2014028853.tif 000031
【図６Ａ】
2014028853.tif 000032
【図６Ｂ】
2014028853.tif 000033
【図６Ｃ】
2014028853.tif 000034
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
2014028853.tif 000038
【図６Ｈ】
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【配列表】
2014028853000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月11日(2013.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するか、または幹細胞または前駆細胞の多分化能および自己複製能のうちの少なくとも一方を調節するかの少なくともいずれかを行うための医薬の製造における、一般式（Ｉ）の化合物の使用方法であって、
【化１】
2014028853.tif 000040
式中、Ａは、ＣまたはＮであり、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、および、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＳｉから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族またはアリール脂環族のヒドロカルビル基から独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で結合して脂肪族ヒドロカルビル架橋を定義し、
Ｒ２は、Ｈおよびハロゲンから選択され、
Ｒ３はＨ、または、１〜８個の主鎖炭素原子とＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンから選択される０〜３個のヘテロ原子とを含む脂肪族もしくはアリール脂肪族のヒドロカルビル基である、方法。