(57)【要約】【課題】  アッセイ装置を提供する。【解決手段】  アッセイ装置は、液体サンプル区画と、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える、サンプル区画と流体連通する下流の試薬区画と、対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料及び、対称線からミラー位置に位置づけられた、実質的に同一の形及び体積を有する第２及び第３の試薬材料を含む、試薬セル内の試薬材料と、試薬区画と流体連通する検出区画と、検出区画と流体連通する、検出区画から流れてくる液体サンプルを受容する容量を有する吸上区画と、を含む。サンプル添加区画、検出区画、及び吸上区画が流体流路を画定する。【選択図】  図２
2014153366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイ装置であって、
液体サンプル区画と、
下流にあり、前記サンプル区画と流体連通し、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画と、
前記対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し、前記対称線からミラー位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、前記試薬セル内の試薬材料と、
前記試薬区画と流体連通する検出区画と、
前記検出区画から流れる液体サンプルを受容する容量を有する、前記検出区画と流体連通する吸上区画と、を含む、アッセイ装置であって、サンプル添加区画、前記検出区画及び前記吸上区画が流体流路を画定する、アッセイ装置。
【請求項２】
第１の試薬材料が、前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形状及び体積を有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項３】
第１の試薬材料が前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、前記第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、請求項２に記載のアッセイ装置。
【請求項４】
第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項５】
第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項６】
前記試薬区画が単一の試薬セルを有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項７】
前記試薬区画が、前記試薬区画に対称に配置されている少なくとも２つの試薬セルを有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項８】
前記検出区画が、基材、及び前記基材から実質的に垂直に延びている突起を有し、前記突起が、高さ、断面、及び前記基材表面と平行な毛管流を生じることができる前記突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項９】
前記試薬材料が標識された試薬材料を含み、前記検出区画はこれと結合する捕捉要素を有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項１０】
前記検出区画を通る前記流路の幅が、約０．５〜１．２ｍｍの範囲である、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項１１】
第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項１２】
前記第１、第２及び第３の試薬材料のうちの少なくとも１つが異なる組成物を有する、請求項１に記載のアッセイ装置。
【請求項１３】
前記第１の試薬材料が第１の組成物を有し、前記第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、請求項１２に記載のアッセイ装置。
【請求項１４】
試薬区画から流れ出てアッセイ装置の検出区画に流入する試薬プルームの幅を増加する方法であって、
液体サンプル区画を提供することと、
下流にあり、前記サンプル区画と流体連通する、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画を提供することと、
前記対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し前記対称線からミラー位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、前記試薬セル内の試薬材料を提供することと、
前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
捕捉区画から流れる液体サンプルを受容する容量を有する捕捉区画と流体連通する吸上区画を提供することであって、前記サンプル区画、前記検出区画及び前記吸上区画が流体流路を画定する、ことと、
前記サンプル区画にサンプルを添加することと、
前記サンプル区画から前記第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて前記サンプルを前記試薬区画に流すことであって、これによって、前記第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、前記試薬セルの縁に沿って第２及び第３の試薬プルームを形成し、前記第１の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、前記試薬セルの前記対称線に沿って第１の試薬プルームを形成する、ことと、
前記第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて前記サンプルを流すことであって、これによって、前記第１、第２及び第３の試薬プルームがともに合流して混合試薬プルームを形成する、ことと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記反応プルームの増加された幅が、前記試薬セルに配列された単一の試薬材料のみを有する試薬セルによって形成される反応プルームに比例したものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出区画が、基材、及び前記基材から実質的に垂直に延びている突起を有し、前記突起が、高さ、断面、及び前記基材表面と平行な毛管流を生じることができる前記突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
より広い前記試薬プルームが、前記検出区画の全幅にわたって延びる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第１の試薬材料が、それが前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形状及び体積を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
第１の試薬材料が前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、前記第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１、第２及び第３の試薬材料の少なくとも１つが異なる組成物を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の試薬材料が第１の組成物を有し、前記第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のアッセイ装置上で、１つ又は２つ以上の検体又は対照の存在又は濃度に関して液体サンプルのアッセイを実行する方法であって、
前記アッセイ装置のサンプル添加区画に関心の検体を含む液体サンプルを堆積させることと、
毛管現象により、流体流路を通じて、試薬区画に前記サンプルを移動させ、ここで１つ又は２つ以上の試薬を溶解させることと、
１つ又は２つ以上の試薬を含む溶解した試薬プルームを有する前記試薬区画から離れるように、かつ毛管現象により前記流体流路を通じて検出区画に前記サンプルを流すことであって、検体又は対照の存在又は濃度を示す信号が生成される、ことと、
前記検体又は対照の存在又は濃度を判定するために前記検出区画内で生成される前記信号を読取ることと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１３年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／７６３，６６２号の優先権を主張し、その開示は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、診断アッセイの分野、及びより具体的には、検出されるべき検体が生体サンプル中に存在する、側方流動アッセイに関連する。
【背景技術】
【０００３】
診断アッセイは幅広く普及しており、多くの疾患の診断、治療及び管理のための中心になっている。様々なタイプの診断アッセイが、血液、血清、血漿、尿、唾液、組織生検、便、痰、皮膚若しくは喉スワブ及び組織サンプル、又は処理した組織サンプルの検出を容易にするために、長年にわたって開発されてきた。これらのアッセイは多くの場合において、迅速で確実な結果を生じる一方で、使用方法が容易であり、製造が安価であることを期待される。当然、これら全ての要件を同一のアッセイで満たすことは困難である。実際には、多くのアッセイはその速度によって制限されている。別の重要なパラメータは感度である。アッセイ技術における最近の開発は、より高感度の試験へと繋がり、これは微量の検体を検出すること、及びサンプル内の疾患の兆候をできるだけ早い段階で検出することを可能にする。
【０００４】
一般的な種類の使い捨てアッセイ装置は、液体サンプルを受ける区画又は領域、試薬区画として既知のコンジュゲート区画、及び検出区画としても既知の反応区画を含む。これらのアッセイ装置は一般に、側方流動試験ストリップとして既知である。これらは、毛管流を支持し得る、流体流の経路を画定する多孔質材料、例えば、ニトロセルロースを利用する。実施例には、米国特許第５，５５９，０４１号、同第５，７１４，３８９号、同第５，１２０，６４３号、及び同第６，２２８，６６０号に示されるものが挙げられ、これらは本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。
【０００５】
サンプル添加区画は多くの場合において、サンプルを吸収することができ、血球の分離が所望される際には、また赤血球を効果的に捕捉する、より多孔質の材料からなる。このような材料の例は、紙、フリース、ゲル若しくは組織（例えば、セルロース、ウール、ガラス繊維、アスベスト、合成繊維、ポリマー又はこれらの混合物を含む）などの、繊維性材料である。
【０００６】
国際公開第２００７／０１２９７５号は、再懸濁チャンバに対して、より一体的な流体前部を向けることを助けるものとされている、分岐を有する毛管チャネルを含み、これによって物質の検出速度を増加させ、検出される結果の正確性を改善する、ハイブリッド装置を開示する。米国特許出願公開第２００９／０３１１８０５号は、コンジュゲート区画に堆積したコンジュゲートを有する、アッセイ装置を開示する。米国特許第６，２７１，０４０号は、乾燥又は凍結乾燥された粉末を含む反応チャンバ４を有するアッセイ装置を開示する。反応チャンバからの反応混合物の運動が乱れず、反応チャンバからの移動の結果として渦が形成されないような、反応チャンバの形状が開示される。
【０００７】
アッセイ装置の別の種類は、毛管流を含むべく突起を有する非多孔質アッセイである。このようなアッセイ装置の例としては、国際公開第２００３／１０３８３５号、同第２００５／０８９０８２号、同第２００５／１１８１３９号、及び同第２００６／１３７７８５号に開示される、開いた側方流動装置が挙げられ、これらは全て、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。
【０００８】
米国特許出願公開第２００９／０３１１８０５号は、毛細管流を誘導する突起を有するアッセイ装置を開示している。前記第２００９／０３１１８０５号は、基材区画の突起の間に物質（すなわち、試薬材料）を堆積させることができ、その基材区画を通じて流れるサンプルによってそれを溶解することができることもまた開示している。前記第２００９／０３１１８０５号は、更に、溶解速度を制御するために、及び／又は、溶解した物質を液体サンプルの流れにどのように分配するかを制御するために、物質が付加された区画の形状を適応させることができることを開示している。前記第２００９／０３１１８０５号は、更に、形状の例として、三角形、正方形、長方形、平行四辺形、ひし形、台形、四角形、多角形、円形、楕円形、及び半円形、半楕円形、半多角形のような切頭形、並びに円セグメントを挙げている。
【０００９】
既知の非多孔質アッセイ装置が図１に図示される。アッセイ装置１は、少なくとも１つのサンプル添加区画２、試薬区画３、少なくとも１つの検出区画４、及び少なくとも１つの吸上区画５を有する。区画は、サンプル添加区画から吸上区画までサンプルが流れる流路を形成する。任意により装置に堆積される（例えば、コーティングにより）検体に結合することができる、検出区画４内の抗体などの捕捉要素、及び試薬区画内で装置に堆積される検体の濃度の判定を可能にする試薬に関与することができる標識されたコンジュゲート物質をも含み、標識されたコンジュゲート物質は検出区画における検出のための標識を有する。サンプルが試薬区画を通じて流れる際に、コンジュゲート物質は溶解し、検出区画へと下流に流れる溶解した標識コンジュゲート物質及びサンプルのコンジュゲートプルームを形成する。コンジュゲートプルームが検出区画へと流れると、コンジュゲート物質が、例えばコンジュゲート物質と検体の複合体を介して（「サンドイッチ」アッセイにおいて）、又は直接的に（「競合」アッセイにおいて）捕捉要素により捕捉される。拘束されない溶解したコンジュゲート物質は、検出区画を通過して少なくとも１つの吸上区画５へと流される。
【００１０】
例えば、米国特許第２００６０２８９７８７（Ａ１）号、同第２００７０２３１８８３（Ａ１）号、同第７，４１６，７００号、及び同第６，１３９，８００号（これらは全て本明細書において参照によりその全体が組み込まれる）に開示される器具は、結合したコンジュゲート検体及び反応区画における標識を検出することができる。一般的な標識としては、蛍光染料を励起し、蛍光染料を感知することができる検出器を組み込む器具によって検出され得る、蛍光染料が挙げられる。このような器具は、典型的には約１ｍｍ（これは適切な幅のコンジュゲートプルームに供される、信号を読取るために十分な幅である）の幅を有する読み取りウィンドーを有する。
【００１１】
上記のものなどの既知のアッセイ装置における１つの欠点は、反応区画における溶解したコンジュゲートの流れが、多くの場合において器具の読み取りウィンドーよりも狭く、これがアッセイの感度及び変動性に悪影響を与え得ることである。これは特に、上記のような設計における懸念であり、コンジュゲート物質がコンジュゲート区画の中央に堆積し、サンプルが流れる際に、側方から溶解する。チャネルが読み取りウィンドーよりも広く作製される場合、溶解した試薬の幅が、読み取りウィンドーの寸法に適合し得るにもかかわらず、読み取りウィンドーの外側の流体サンプルが信号の不在を生じ、無駄になる。別の欠点は、溶解した試薬が、これが反応区画に到達するまでにサンプルと十分に混合せず、反応区画の中央においてより低い信号を生じることであり、これは溶解した試薬が局部的により高い濃度を有し、試薬から離れたサンプルと混合し、検体と結合するために拡散する必要があるためであり、よって器具の読み取りウィンドーによって読まれる信号がより低くなる。
【００１２】
図１に示されるように、このような典型的なアッセイ装置のサンプル量は、一般的に約２００μＬである。このようなサンプル量は、瀉血医などの医療専門家が静脈血を採取することを必要とする。いわゆる「指先穿刺」採血により採取可能な血液の量（２５μＬ以下）に適合する、遥かに小さなサンプル量で機能し得る、側方流動装置に対する必要性が高まっている。このような少量のサンプルとは、ランセットで指先を穿刺した後の、一滴の血液における血液量である。家庭用血糖計は典型的には、血液内の血糖値を測定するために、このような方法で得られた血液の液滴を使用する。このような、より少ないサンプルの量は、血液を採取するために医療専門家を必要とせず、分析用のサンプルを提供する患者に、より高い快適性をもたらす。
【００１３】
必要なサンプル量を低減させるために、より少量のサンプル量に適合するように、側方流動アッセイ装置の寸法が低減される。しかしながら、サンプル量及び装置の寸法を低減させることにより、検出区画における不十分なコンジュゲートがもたらされ、及びそれによって、器具によって読み取ることができる信号が弱まることが見出された。検出区画における不十分なコンジュゲートは、他の条件の中でもとりわけ、より少ないサンプル量、及び装置内のサンプルの非効率な使用によるものと考えられる。寸法の低減の別の欠点は、検出区画の幅もまた減少することであり、やはり器具によって読み取ることができる、利用可能な信号が少なくなることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、アッセイ装置（特に、コンジュゲート物質がコンジュゲート区画の中央に堆積し、かつ側方から溶解するような装置）において、検出区画により広い試薬プルームを提供することができ、溶解した試薬とサンプルをより良好に混合し、サンプルをより効率的に利用する、アッセイ装置に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上記の従来の問題の１つ又は２つ以上を緩和するアッセイ装置を対象とする。
【００１６】
本発明の一態様は、液体サンプル区画及び、このサンプル区画と流体連通する下流の試薬区画を含む、アッセイ装置を目的とする。この試薬区画は、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルと、試薬セル内の試薬材料と、を含む。試薬材料は、対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し対称線から反射鏡位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含み、検出区画は試薬区域と流体連通する。本装置は、検出区画から流れる液体サンプルを受ける能力を有する、検出区画と流体連通する吸上区画を更に含む。サンプル添加区画、検出区画及び吸上区画が流体流路を画定する。
【００１７】
本発明の別の態様は、試薬区画から流れ出てアッセイ装置内の検出区画に流入する試薬プルームの幅を増加させる方法を目的とする。この方法は、液体サンプル区画を提供することと、その下流にあるサンプル区画と流体連通する試薬区画を提供することと、を含む。この試薬区画は、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを含む。この方法は、更に、試薬セル内の試薬材料を提供することであって、試薬材料が、対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形及び体積を有する、対称線からミラー位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、ことと、試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、捕捉区画と流体連通し、捕捉区画から流れてくる液体サンプルを受容する容量を有する吸上区画を提供することと、を含む。サンプル区画、検出区画及び吸上区画が流体流路を画定する。この方法は、更に、サンプルをサンプル区画に添加することと、サンプル区画からサンプルを試薬区画に流し、第１、第２、及び第３の試薬材料を通り過ぎることと、を含む。第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルは、試薬セルの縁部に沿って第２及び第３の試薬のプルームを形成し、第１試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルは、試薬セルの対称線に沿って第１の試薬のプルームを形成する。サンプルは、第１、第２、及び第３の試薬のプルームがともになって混合試薬プルームを形成するように、第１、第２、及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れる。
【００１８】
本発明の別の態様により、上記のアッセイ装置上で、１つ又は２つ以上の検体又は対照の存在又は濃度に関しての液体サンプルのアッセイを実行する方法が提供される。本方法は、アッセイ装置のサンプル添加区画に目的の検体を含む液体サンプルを堆積させることと、毛管現象により、流体流路を通じて、試薬区画にサンプルを移動させ、ここで１つ又は２つ以上の試薬を溶解させることと、１つ又は２つ以上の試薬を含む溶解した試薬プルームを有する試薬区画から離れるように、かつ毛管現象により流体流路を通じて検出区画にサンプルを流すことであって、検体又は対照の存在又は濃度を示す信号が生成される、ことと、検体又は対照の存在又は濃度を判定するために検出区画内で生成される信号を読取ることと、を含む。
【００１９】
本発明の更なる目的、特徴及び利点が、以下の好ましい実施形態の詳細な考察から、当業者に明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】既知のアッセイ装置を図示する。
【図２】本発明とともに使用することができるアッセイ装置の概略図を示す。
【図３】本発明とともに使用することができるアッセイ装置の概略図を示す。
【図４Ａ】本発明の好ましい実施形態にしたがって試薬材料が試薬区画内に堆積されている、アッセイ装置の試薬区画の概略図を示す。
【図４Ｂ】本発明の好ましい実施形態にしたがって試薬材料が試薬区画内に堆積されている、アッセイ装置の試薬区画の概略図を示す。
【図５Ａ】それぞれ、二股試薬区画、セグメント化された試薬区画、逆セグメント化された試薬区画、及び対照区画を有するアッセイ装置を用いて実施したアッセイ中に、検出区画で捕捉された蛍光コンジュゲートから放出された蛍光を示す蛍光顕微鏡写真評価である。
【図５Ｂ】それぞれ、二股試薬区画、セグメント化された試薬区画、逆セグメント化された試薬区画、及び対照区画を有するアッセイ装置を用いて実施したアッセイ中に、検出区画で捕捉された蛍光コンジュゲートから放出された蛍光を示す蛍光顕微鏡写真評価である。
【図５Ｃ】それぞれ、二股試薬区画、セグメント化された試薬区画、逆セグメント化された試薬区画、及び対照区画を有するアッセイ装置を用いて実施したアッセイ中に、検出区画で捕捉された蛍光コンジュゲートから放出された蛍光を示す蛍光顕微鏡写真評価である。
【図５Ｄ】それぞれ、二股試薬区画、セグメント化された試薬区画、逆セグメント化された試薬区画、及び対照区画を有するアッセイ装置を用いて実施したアッセイ中に、検出区画で捕捉された蛍光コンジュゲートから放出された蛍光を示す蛍光顕微鏡写真評価である。
【図６】図４Ｂに示されるように、セグメント化された試薬区画からの信号応答、図４Ａに示されるように、逆セグメント化されたコンジュゲート区画からの信号応答、二股試薬区画からの信号応答、及び対照試薬区画からの信号応答を示す。
【図７Ａ】図４Ｂに示されるように、セグメント化された試薬区画を有する装置、図４Ａに示されるように、セグメント化された試薬区画を有する装置、二股試薬区画を有する装置、及び対照試薬区画を有する装置での、吸上区画の始まりまでの時間を示す。
【図７Ｂ】図４Ｂに示されるように、セグメント化された試薬区画を有する装置、図４Ａに示されるように、セグメント化された試薬区画を有する装置、二股試薬区画を有する装置、及び対照試薬区画を有する装置での、吸上区画の終わりまでの時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈において別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００２２】
説明及び請求項を通じて多くの値に関連して使用される用語「約」は、当業者にとって周知であり、許容され得る不正確性を示す。不正確性は好ましくは±１０％である。
【００２３】
本明細書における用語「サンプル」とは成分の存在又は不在、成分の濃度など、そのいずれかの特性を定性的又は定量的に判定されるべく意図された、液体、溶液又は懸濁液の容量を意味する。本発明の文脈における典型的なサンプルは、人間又は動物の体液、例えば血液、血漿、血清、リンパ、尿、唾液、精液、羊水、胃液、喀痰、痰、粘液、涙、便などである。他の種類のサンプルは、ヒト又は動物の組織サンプルに由来し、この組織サンプルは、検査のために特定の組織成分を明らかにするために、液体、溶液又は懸濁液へと加工されている。本発明の実施形態は、あらゆる身体的サンプルに適用可能であるが、好ましくは全血、尿又は痰のサンプルに適用される。
【００２４】
他の例において、サンプルは食物試験、環境試験、生物学的脅威又は生物汚染試験などに関連し得る。これは、本発明において使用され得るサンプルの僅かな例にすぎない。
【００２５】
本発明において、サンプルの側方流動、及びサンプル中に存在する成分と、装置内に存在するか、又は手順の間に装置に追加される試薬との相互作用、並びに定性的又は定量的なこのような相互作用の検出に基づく判定は、診断目的など、いずれかの目的のためであり得る。このような試験は多くの場合において、側方流動アッセイと称される。
【００２６】
診断判定の例としては、例えば、慢性的な代謝異常、例えば、血糖、血中ケトン、尿中ブドウ糖（糖尿病）、血中コレストロール（アテローム性動脈硬化症、肥満等）など、異なる疾患に特異的な検体（マーカーとも称される）、他の特定の疾患（例えば、急性疾患）のマーカー、例えば、冠状動脈感染マーカー（例えば、トロポニン−Ｔ，ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）、甲状腺機能のマーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモンの判定（ＴＳＨ））、ウイルス感染のマーカー（特定のウイルス抗体の検出のための側方流動イムノアッセイの使用）などの判定が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
更に別の重要な分野は、コンパニオン診断の分野であり、薬剤などの治療薬が、そのような薬剤を必要とする個人に投与される。薬剤がその所望の効果を有するかどうかを判定するための適切なマーカーの濃度を決定するために、その後、適切なアッセイが実行される。あるいは、薬がこれを必要とする個人を助けるかどうかを決定するために、治療薬の投与の前に、本発明のアッセイ装置が使用され得る。
【００２８】
更に別の重要な分野は、薬剤乱用を示す薬剤及び薬物代謝産物の容易かつ迅速な検出、例えば、尿サンプル内の特定の薬物及び薬物代謝産物（例えばＴＨＣ）の決定の分野である。
【００２９】
用語「検体」は、用語「マーカー」の同義語として使用され、定性的又は定量的に測定されるいずれかの化学又は生物学的物質を包含し、かつ小さな分子、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、ウイルス成分若しくは完全なウイルス、細菌成分又は完全な細菌、細胞成分又は完全な細胞、並びにこれらの複合体及び誘導体を含み得る。
【００３０】
用語「区画」、「領域」及び「部位」は、本記載、実施例及び請求項の文脈において、先行技術の装置又は本発明の実施形態による装置のいずれかにおける基材上の流体流路の部分を定義するために使用される。
【００３１】
用語「反応」は、基材上又は基材内のサンプル成分と少なくとも１つの試薬との間で、又はサンプル内に存在する２つ又は３つ以上の成分の間で生じるいずれかの反応を定義するために使用される。用語「反応」は特に、検体の定性的又は定量的な決定の一部として検体と試薬との間で生じる、反応を定義するために使用される。
【００３２】
用語「基材」とは、サンプルが添加され、その中で判定が行われるか、又は検体と試薬との間の反応が生じる、キャリア又はマトリックスを意味する。
【００３３】
本発明は、より狭い試薬プルーム又はより少ないサンプル量による、より弱い信号の問題を少なくとも部分的に解決する少なくとも１つの検体の存在又は量を判定する側方流動アッセイ装置を対象とする。図２は、本発明によるこのような装置の好ましい実施形態の概略図を図示する。アッセイ装置１０は、少なくとも１つのサンプル区画（サンプル添加区画とも称される）２０、少なくとも１つの試薬区画３０、少なくとも１つの検出区画４０、及び少なくとも１つの吸上区画５０を有する。区画は、サンプル添加区画から吸上区画までサンプルが流れる流路を形成する。
【００３４】
アッセイ装置の構成要素（すなわち、装置の他の部分からの別個の部品であってもなくても、装置の物理的構造）は、コポリマー、ブレンド、ラミネート、金属ホイル、金属フィルム又は金属から調製され得る。あるいは、装置構成要素は、コポリマー、ブレンド、ラミネート、金属ホイル、金属フィルム金属から、以下の材料の１つを堆積させて調整される：ポリオレフィン、ポリエステル、スチレン含有ポリマー、ポリカーボネート、アクリルポリマー、塩素含有ポリマー、アセタールホモポリマー及びコポリマー、セルロース類及びこれらのエステル、硝酸セルロース、フッ素含有ポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、硫酸含有ポリマー、ポリウレタン、シリコン含有ポリマー、ガラス並びにセラミック材料。あるいは、装置の構成要素は、プラスチック、エラストマー、ラテックス、シリコンチップ又は金属で作られる。エラストマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、シリコンエラストマー又はラテックスを含み得る。あるいは、装置の構成要素は、ラテックス、ポリスチレンラテックス又は疎水性ポリマーから調製され、疎水性ポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン又はポリエステルを含み得る。あるいは、装置の構成要素はＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリスチレン、ポリアクリレート、又はポリカーボネートを含み得る。あるいは、装置構成要素は、エンボス加工、ミリング又は射出成形され得るプラスチックから、又は銅、銀及び金のフィルムの表面から作製され、この上に様々な長鎖アルカンチオールが吸収され得る。ミリング又は射出成形され得る、プラスチックの構造は、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はポリアクリレートを含み得る。特に好ましい実施形態において、アッセイ装置は、例えば、商標名Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）で販売されるシクロオレフィンポリマーから射出成形される。好ましい射出成形技術は、米国特許第６，３７２，５４２号、同第６，７３３，６８２号、同第６，８１１，７３６号、同第６，８８４，３７０号、及び同第６，７３３，６８２号に記載され、これらは全て、本明細書において参照により全体が組み込まれる。
【００３５】
流路は、開いた又は閉じた経路、溝及び毛管を含み得る。好ましくは流路は、毛管流が流路を通じて維持されるような寸法、形状及び相互の間隔を有するように、突起に隣接する側方流動経路を含む。一実施形態において、流路は、底面及び側壁を有する基材内のチャネル内にある。この実施形態において、突起は、チャネルの底面から突出する。側壁は、液体の毛管機能に寄与しても、しなくてもよい。側壁が液体の毛管現象に寄与しない場合、液体が突起により画定される流路に収容された状態に維持するために、最外突起と側壁との間に間隙が提供され得る。図１は突起７を図示する。
【００３６】
一実施形態において、流路は少なくとも部分的に開いている。別の実施形態において、流路は完全に開いている。開いているとは、毛管距離において蓋又はカバーが存在しないことを意味する。流路に対する物理的保護として存在する場合、カバーは、流路内の毛管流に寄与しない。開いた側方流動は、以下の出願公開に記載され、これらは本明細書において参照としてその全体を組み込まれる：国際公開第２００３／１０３８３５号、同第２００５／０８９０８２号、同第２００５／１１８１３９号、同第２００６／１３７７８５号、及び同第２００７／１４９０４２号。突起は高さ（Ｈ）、直径（Ｄ）及び突起の間の距離（ｔ１、ｔ２）を有し、それによってこの区画における、血漿、好ましくはヒトの血漿の側方毛管流が達成される。これらの寸法は、米国特許出願公開第２００６／０２８５９９６号に図示され、これは本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。上記の高さ、直径、及び突起間の距離を最適化することに加え、突起は突起の表面を変性させることによって所望の化学的、生物学的又は物理的機能を付与され得る。一実施形態において、突起は、約１５〜約１５０μｍ、好ましくは約３０〜約１００μｍの範囲の高さ、約１０〜約１６０μｍ、好ましくは４０〜約１００μｍの直径、及び互いから約３〜約２００μｍ、好ましくは５〜約５０μｍ又は１０〜５０μｍの突起間の間隔を有する。流路は、約５〜約５００ｍｍ、好ましくは約１０〜約１００ｍｍの長さ、約０．３〜約１０ｍｍ、好ましくは約０．３〜約３ｍｍ、好ましくは約０．５〜１．５、及び好ましくは約０．５〜１．２ｍｍの幅を有し得る。
【００３７】
殆どの検出は、流体流路の検出区画部分において生じるが、装置の他の部分において検出が行われ得ることも可能である。例えば、非侵襲性、非反応性サンプルの一体性測定は、サンプル区画と試薬区画、又は試薬添加区画との間で、好ましくはフィルター要素（存在する場合）の後方で生じ得る。他の測定は、ブランク値、ＨｂＡ１ｃなどの判定のためのヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの両方を測定するための、二部分反応シーケンスの一方などを含み得る。
【００３８】
液体サンプル区画２０（液体サンプル添加区画とも称される）は、ピペットなどのサンプル分配器からサンプルを受け取る。サンプルは典型的には、区画の上へと堆積される。サンプル添加区画は、サンプルが反応区画に堆積される点から、任意のフィルター及び試薬添加区画を通じて、好ましくは毛管流を通じて、液体サンプルを移送することができる。毛管流を生じる構造は、ニトロセルロースなどの多孔質材料を含み、又は好ましくは、図１に図示されるように、マイクロピラーによる。指先穿刺量の血液を使用し得るこれらの装置において、サンプルは指から直接採取されるか、又は毛管ピペットによって採取され得る。
【００３９】
サンプルから粒子を濾過し、又は血液から血球を濾過し、装置を通じて血漿がより遠くまで移動できるように、サンプル添加区画内にフィルター材料（図示されない）が配置されてもよい。
【００４０】
サンプル追加区画と検出区画との間に、試薬区画３０が位置する。試薬区画は、分析要素と結合する試薬であり、一般的に反応において有用な試薬であり（免疫アッセイのための抗体又は抗原などの結合パートナー、酵素アッセイのための基材、分子診断アッセイのためのプローブ）、結合した試薬を安定化させる材料などの補助剤、反応への干渉を抑制する材料などを含み得る。一般的に反応において有用な試薬の１つが、以下に記載されるような、検出可能な信号を有する。いくつかの場合において、例えば、着色した又は蛍光分子などの、分光法を使用して検出可能な分子が挙げられるがこれらに限定されない、検出可能な信号を形成するために、試薬が検体と直接反応するか、又はカスケード反応を通じて反応する。１つの好ましい実施形態において、試薬区画は、コンジュゲート物質を含む。用語「コンジュゲート」とは、検出要素及び結合パートナーの両方を有するいずれかの部分を意味する。
【００４１】
検出要素は、その物理的分布及び／又はこれが生じる信号（発光分子（例えば、蛍光剤、リン発光性剤、化学発光性剤、生物発光剤など）、着色分子、反応の際に色を生成する分子、酵素、放射性同位体、特定の結合を呈するリガンドなどが挙げられるがこれに限定されない）の強度に関連して検出される薬剤である標識とも称される検出要素は、好ましくは、発色団、蛍光色素分子、放射能標識及び酵素から選択される。好適な標識が、抗体、タンパク質及び核酸の標識のための広範な染料を提供する供給元から市販される。例えば、実際に全可視及び赤外スペクトルに及ぶ蛍光色素分子が存在する。好適な蛍光剤又はリン光性標識は、例えば、フルオレセインＣｙ３、Ｃｙ５などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な化学発光性標識は、例えば、ルミノール、サイリュームなどであるが、これらに限定されない。
【００４２】
同様に、放射能標識は、市販されているか、又は検出要素がこれらが放射能標識を組み込むようにして合成され得る。好適な放射能標識は、例えば、放射性ヨード及びリン、例えば、１２５Ｉ及び３２Ｐである。
【００４３】
好適な酵素標識は、例えば、わさび大根ペルオキシターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。２つの標識は、これらが、互いに阻害、干渉又は抑制することなく、個別に検出され、かつ好ましくは同時に数量化され得るときに、「区別可能」である。多数の検体又はマーカーが検出される際、２つ又は３つ以上の標識が使用され得る。
【００４４】
結合パートナーは、検体の存在又は量を判定するために使用され得る複合体を形成し得る材料である。例えば、「サンドイッチ」アッセイにおいては、コンジュゲートの結合パートナーは、検体及びコンジュゲートを含む複合体を形成し、この複合体は、検出区画に組み込まれる、捕捉要素とも称される別の結合パートナーへと更に結合し得る。競合イムノアッセイにおいて、検体はコンジュゲートの内の結合パートナーの、検出区画に組み込まれた捕捉要素とも称される別の結合パートナーへの結合と干渉する。コンジュゲートに含まれる例の結合パートナーは、抗体、抗原、検体又は検体擬似体などを含む。
【００４５】
任意により、試薬区画の前又は後、かつ検出区画の前の流体流路には、試薬添加区画がある。試薬添加区画は、図３において３５として図示される。試薬添加区画は、装置の外部から試薬を添加することを可能にする。例えば、試薬添加区画は、サンプル、及び吸上区画への流体経路に存在する他の結合されていない成分を洗い流すために使用され得る中断試薬を追加するために使用され得る。好ましい実施形態において、試薬添加区画３５は、試薬区画３０の後に位置する。
【００４６】
液体サンプル区画、及び試薬区画の下流には、検出区画４０があり、これはサンプル添加区画と流体連通している。検出区画４０は、上記のもののような突起を含み得る。また上記のように、これらの突起は好ましくは、射出成形又はエンボス加工など、Ｚｅｏｎｏｒなどの光学プラスチック材料から基材へと一体的に成形される。検出区画の流路の幅は典型的に、従来的な大きさの装置において典型的に２ｍｍであるが、いくつかのより少ない体積の装置、例えば、上記のもの、及び２０１３年１月２０日に出願された「Ｌｏｗｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」と題する米国特許出願第１３／７４４，６１７号の同時係属出願（本明細書において参照としてその全体を組み込まれる）に記載のものなどでは、はるかに狭く、例えば、１．５ｍｍ以下であり、好ましくは０．５〜１．２ｍｍである。
【００４７】
検出区画は、いずれかの検出可能な信号が読み取られる場所である。検出区画内の突起に取り付けられた好ましい実施形態は、捕捉要素である。捕捉要素は、コンジュゲート、又はコンジュゲートを含む複合体のための結合パートナーを含み得る。例えば、検体が特定のタンパク質である場合、コンジュゲートは蛍光プローブなどの検出要素に連結された、このタンパク質と特異的に結合する抗体であり得る。捕捉要素は、ひいてはこのタンパク質にやはり特異的に結合する別の抗体であり得る。別の実施例において、マーカー又は検体がＤＮＡである場合、捕捉分子は合成オリゴヌクレオチド、その類似物又は特定の抗体であり得るが、これらに限定されない。他の好適な捕捉要素としては、検出される抗体に特異的な、抗体、抗体断片、アプタマー、及び核酸配列が挙げられる。好適な捕捉要素の非限定的な例は、ビオチン官能基を含有するコンジュゲートに結合するアビジン官能基を有する粒子である。検出区画は、多数の検出区画を含み得る。多数の検出区画は、１つ又は２つ以上のマーカーを含むアッセイのために使用され得る。多数の検出区画の場合において、捕捉要素は、第１及び第２捕捉要素などの多数の捕捉要素を含み得る。コンジュゲートは、例えば、試薬区画内のコーティングによりアッセイ装置に予め堆積されてもよい。同様に、捕捉要素は、検出区画のアッセイ装置上に予め堆積されてもよい。好ましくは、検出要素及び捕捉要素の両方が、それぞれ、アッセイ装置上で、検出区画及び検出区画上に予め堆積される。
【００４８】
サンプルがサンプル区画に供給された後、試薬区画に達する。サンプルが試薬区画を通じて流れ、これと相互作用、かつ試薬添加区画においてこれと光学的に相互作用した後、サンプル及び試薬プルームは、流体流内に含まれる。試薬プルームは、検出区画に溶解した試薬材料、又は試薬添加区画を通じて添加された試薬材料のいずれかを含み得る。試薬区画から流れるサンプル中の試薬は、試薬プルームとみなされる。試薬プルームは、検出要素及び結合パートナーの両方を有するコンジュゲートを含むことがあり、この場合これは、コンジュゲートプルームと称されることが多い。明細書全体を通じて示されるように、発明者が面する１つの課題は、試薬プルームをこれが検出区画に入る際になるべく広く維持することであった。
【００４９】
試薬区画を含むアッセイ装置を通り過ぎて流れる流体の流れは、一般に、乱流ではなく層流である。層流では、ほとんどの混合は、流体（つまりサンプル）を通じての溶質（つまり試薬材料）の拡散によって達成され、これは低速のプロセスである。従来のアッセイ装置の試薬区画では、単一の試薬材料区域が試薬区画の中央に置かれている。層流としてサンプル添加区画から流れてくる上流のサンプル流体が材料と接触し、材料は２つの異なったストリームに分離して、材料の側面に沿って流れる。この層流のために、サンプル流体中の流体と試薬材料との界面に、溶解した材料が高濃度で存在し、その界面からごく短い距離のところで、溶解した材料は流体中に低濃度で存在する。また、サンプル流体がアッセイシステムを通じて流れる時間が比較的短いことを鑑みると、流体全体にわたっての材料の拡散が不十分である。その結果、試薬区画で試薬材料の周囲を流れた後に流体ストリームが再び混ざるときに、溶解／懸濁した試薬材料のほとんどが主に流体流路の中央に位置づけられているために、サンプルの不十分な使用（つまり、材料を含まない又はその濃度が不十分なサンプルとなり、本質的に無駄になる）という問題及び望ましくない感度という問題につながる。
【００５０】
不十分な幅の試薬プルームの問題の１つの解決策は、参照により本明細書に全体が援用される、２０１３年１月１８日付出願の同時係属特許出願第１３／７４４，４４２号「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」に記載されており、これは、試薬区画内に複数の試薬セルを使用している。しかし、場合によっては、複数の試薬セルではなく単一の試薬セルを使用することが望ましいであろう。
【００５１】
本発明は、コンジュゲートセルを通じて流れるサンプルの流れが試薬材料と密接に接触するように、単一の試薬セルの内部で互いに対して及びサンプルの流れに対して位置づけられた複数のセグメント化された試薬材料を使用するものである本明細書に記載のアッセイ装置のようなアッセイ装置が、流体流路の実質的な部分にわたって（好ましくは流体流路の実質的に全幅にわたって）延在するように試薬セルを出ていく試薬プルームを作り出すことができるという驚くべき発見に部分的に基づくものである。したがって、単一の試薬セルを用いて、上述の同時係属特許出願に記載されているような複数の試薬セルによって生成される試薬プルームの幅に匹敵する幅を流体流路に有する試薬プルームを生成することが可能であり得る。
【００５２】
本発明の重要な特徴は、複数の試薬材料すなわちセグメントの、互いに対しての、及び試薬区画を通るサンプルの流れに対しての、数、サイズ、及び場所である。より具体的には、試薬セル３０は、図４Ａ及び４Ｂに示されるように、サンプルの流れの方向においてセルを実質的に等分に分割する対称軸Ｓを含む。第１の試薬材料Ａは、対称軸Ｓが材料Ａをほぼ等しい半分に分け、材料Ａが線Ｓの両側に位置づけられるように、試薬セルに位置づけられる。換言すると、それぞれの半分は、実質的に互いの鏡像である。
【００５３】
第１の試薬材料Ａに加えて、第２及び第３のセグメントの試薬材料Ｂ及びＣがある。試薬セル内のこれらの材料の位置は、均一で幅広い試薬プルームを確保するために重要である。具体的には、これらは材料Ａの上流又は下流に位置づけられる。また、これらは、左右対称になるように対称線Ｓの両側に位置づけられる。それらは全く同じ形状である必要はないが、実質的に同じ速度で実質的に同時に完全に溶解するように、同じ溶解特性を有するべきである。好ましくは、材料Ｂ及びＣは、線Ｓから見たときに同じであり互いの鏡像である。
【００５４】
材料Ａのセグメントの面積又は総体積のいずれか、及び材料Ｂ及びＣのセグメントに対するその場所は、それが材料Ｂ及びＣと同時に溶解するか、又はそれが最後に完全に溶解するようなものでなくてはならない。好ましい実施形態では、材料Ｂ及びＣのそれぞれに対する材料Ａのサイズの比は、３：１〜２：１の範囲内である。
【００５５】
それらの材料の形は、所望の溶解プロファイルを与えるように選択することができる。好ましくは、図に示されるように、材料Ａは流れの方向に対して垂直な長軸を有する長円形又は楕円形を有する。材料Ｂ及びＣは、好ましくは実質的に円形である。しかし、試薬区画を出て流れる所望の試薬プルームのプロファイルに基づいて他の形を選択してもよい。材料Ｂ及びＣは、好ましくは実質的に同形である。
【００５６】
試薬材料Ａ、Ｂ及びＣの組成物は同じであっても異なっていてもよい。例えば、材料Ａ、Ｂ及びＣは同じ組成物を有する場合がある。あるいは、材料Ａが１つの組成物を有し、材料Ｂ及びＣが、同じであるが材料Ａの組成物とは異なる組成物を有する場合がある。
【００５７】
上述したように、試薬区画内の流れを生成するためにマイクロピラーが使用されるこれらの実施形態では、好ましくは、インクジェット印刷などによって、試薬材料を液体形状で基材上に堆積し、乾燥させる。乾燥した時点で、全ての材料Ａ、Ｂ及びＣの試薬材料の高さは、好ましくはほぼ同じであり、試薬区画内のマイクロピラーのほぼ頂上まで、マイクロピラー同士の間の空間を充填することができる。
【００５８】
図４Ａ及び４Ｂは、２つの好ましい実施形態による試薬材料の配列及びフローストリームを示す。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、材料Ａはより大きく、左右対称である。材料Ａは、試薬セルの対称軸Ｓに位置づけられる。材料Ａを通り過ぎる流体の流れによって形成される試薬プルームは、セルの真ん中にある。材料Ｂ及びＣは材料Ａより小さい。両方の実施形態において、材料Ｂ及びＣは、サイズ及び溶解特性が実質的に同一である。それらは、図４Ａに示されるように材料Ａの上流又は図４Ｂに示されるように下流のフローセル内で、対称軸Ｓによって対称に分離され、位置づけられている。図４Ａの実施形態は、逆セグメント化された試薬セルと呼ばれ、図４Ａはセグメント化された試薬セルと呼ばれる。
【００５９】
図４Ａ及び４Ｂに示されるように、細線の矢印は、流体が試薬セル３０を通って流れる際のサンプル流体の速度ベクトルを表す。太線の矢印は、それぞれ対応する試薬材料から流れる試薬プルームを表す。試薬材料セグメントの間を流体が流れるように、試薬材料Ｂ及びＣの間に十分な空間が提供されることが重要である。材料Ｂ及びＣの間の分離は、材料Ｂ及びＣが生成する試薬プルームを、材料Ａ（中央）が生成するプルームから遠くに離れるように拡散させ、それにより、一つに合流した混合プルームの幅を広げる。一方、Ｂ及びＣの間の分離が大き過ぎると、材料Ｂ及びＣを通り過ぎるサンプルの流れが不十分になり、特に材料Ａが迅速に溶解する場合は、不完全な溶解を結果としてもたらす可能性がある。材料Ｂ及びＣは、２つの試薬プルーム２０及び２１を試薬セルの左側及び右側に形成することにより、材料Ａからの試薬プルーム２２とともに、試薬セル内に単一の試薬材料が堆積される試薬セルよりも広い幅の流体流路３１にわたって延在する試薬プルームに寄与する。
【００６０】
特に好ましい実施形態では、堆積されたコンジュゲート材料Ａは対称線Ｓに沿ってＡをわたって流体が流れるのを防ぎ、材料Ｂ及びＣのそばに流体を流すことにより、試薬材料Ａが最後に完全に溶解されることになる。このことは、２つのコンジュゲートの完全な溶解を保証することになる。
【００６１】
材料Ａが先に溶解すると、材料Ｂ及びＣから遠い対称軸Ｓに沿って、もっとも短いストリームラインができる。現在のフローセル設計では、流体はストリームラインに沿って流れる傾向があるので、Ｂ及びＣの近くの流れははるかに遅い。それは、２つのコンジュゲートの低速の溶解、又は更には、それらの不完全な溶解につながる。
【００６２】
複数の試薬プルームを用いれば、ともに合流した試薬プルームは、単一の試薬の堆積での場合より幅広くなり、感度の増加及びサンプルの無駄の低減につながる可能性がある。
【００６３】
上述のように、本発明により形成される試薬プルームは十分に幅広いので、単一の試薬セルを問題なく使用することができる。しかし、本発明は、上述の同時係属特許出願に記載のもの及び図３に示されるような複数の試薬セルを有するシステムにおいても、同等に良好に使用することができる。
【００６４】
本発明について、具体的には単一の試薬セル内に複数の試薬材料を、非多孔質の突起を参照して説明してきたが、複数の反応セルがニトロセルロースストリップ形式又は他のなんらかの多孔質材料で使用され得ることもまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、適切な流量要素は、熱的手段によって（すなわち、加熱されたダイセットでニトロセルロースを溶解させ、流量制御要素を形成する）又は流路及び流量制御要素を形成するために、不溶性バリアが配置される印刷技術により、形成される。
【００６５】
検出区画の下流に吸上区画があり、検出区画と流体連通している。吸上区画は、液体サンプル及び流路内の他のいずれかの物質（例えば、非結合試薬、洗浄流体など）を受ける容量を有する、アッセイ装置の領域である。吸上区画は、検出区画を通じて、その外へと液体サンプルを移動させ続ける毛管力を提供する。吸上区画は、ニトロセルロースなどの多孔質材料を含んでもよく、又は本明細書において記載される突起物などの非多孔質構造であってもよい。吸上区画は、例えば、蒸発性加熱又はポンプを使用する、非毛管流体駆動手段を含み得る。本発明によるアッセイ装置において使用される吸上区画の更なる詳細は、米国特許出願公開第２００５／００４２７６６号、及び同第２００６／０２３９８５９に見出され、そのいずれもが本明細書において参照により全体が組み込まれる。吸上区画はまた、参照によりその全体が組み込まれる、２０１３年１月１８日に出願された「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ」と題する同時係属特許出願第１３／７４４，６４１号にも記載されている。
【００６６】
好ましくは、サンプル添加区画、検出区画、及び吸上区画を含む流路全体は、基材との関係において実質的に垂直であり、流路内にサンプルの側方流動を生じることができる、高さ、直径及び相互の間隔を有する突起を含む。
【００６７】
上記の実施形態のいずれかにおいて、装置は好ましくは使い捨てアッセイ装置である。アッセイ装置は、取り扱い及び保護の容易性のためにハウジング内に収容され得る。アッセイ装置がこのようなハウジング内に収容される場合、ハウジングは好ましくはサンプルをアッセイ装置に添加するためのポートを含む。
【００６８】
本発明のアッセイ装置は、本発明のアッセイに実行された、アッセイ装置の結果を読むための装置（読み取り機）と共に使用され得る。読み取り機は、光検出器などの検出要素から発信されるか、又は反射される信号を読取るための手段、及び一体型の読み取り機又は別個のコンピュータ内に含まれ得るマイクロプロセッサなどの、信号を処理し結果を表示するための手段を含む。好適な読み取り機は、米国特許出願公開第２００７／０２３１８８３号、及び米国特許第７，４１６，７００号の実施例に記載され、これらは両方とも参照によりその全体が組み込まれる。
【００６９】
別の実施形態は、アッセイ装置で実行されるアッセイの結果を読み取るための装置であり、この装置は、アッセイ装置の既定される位置に存在する少なくとも１つの検出要素から発信又は反射される信号を読取ることができる検出器を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、読み取りは好ましくは、色、蛍光、放射能又は酵素活性の検出及び／又は数量化から選択される。
【００７０】
本発明の別の態様は、１つ又は２つ以上の関心の検体の検出のために、液体サンプルのアッセイを実行する方法を対象とする。目的の検体を含む液体サンプルは、例えば、装置のハウジングのポートを通じて、又は、指先穿刺採血の場合においてはサンプル区画に直接指を触れることによって若しくはサンプル区画と流体連通する毛管によって、アッセイ装置のサンプル区画に堆積される。サンプルは、任意のフィルターを通じて毛管作用により移動し、試薬区画に入り、そこで複数の試薬材料と接触する。サンプルは、第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れる。第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れる試薬材料は、試薬セルの縁に沿って第２及び第３の試薬プルームを形成する。第１の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルは、試薬セルの対称線に沿って第１の試薬プルームを形成する。第１、第２及び第３の試薬材料は試薬セルを出る際に混合して、混合試薬プルームを形成する。
【００７１】
次にサンプル及び試薬プルームは、毛管現象によって検出区画へと移動する。検体又は対照の存在又は濃度の信号表示が生成される。好ましい実施形態において、検出要素を有するサンプル、あるいは１つ又は２つ以上の試薬が、検出区画の表面上の抗体などによって捕捉され、検体又は対照の存在又は濃度を表す信号が生成される。
【００７２】
上記の読み取り機がその後、検体の存在又は濃度を判定するため、検出要素によって生成される信号を読取るために使用される。サンプルは、検出区画から吸上区画へと移動する。読み取り機は、検出区画を通じてサンプルが移動した直後又は少し後に信号を読取ることができる。また、検出区画から離れた、いずれかの非結合検出要素を洗浄するために、装置を通じてサンプルの後に１つ又は２つ以上の洗浄液が送達される。
【実施例】
【００７３】
シッフ塩基連結による、タンパク質の共有結合不動化のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ，Ｊａｐａｎ）で作製されたプラスチック基材チップが使用された。蛍光標識された抗プロカルシトニン（ＰＣＴ）モノクローナル抗体は、試薬区画を生成するために堆積させ、かつ乾燥させた。単一の試薬セル（すなわち図３に示したようなデュアル試薬セルではないもの）を有する対照については、この抗体を含有する試薬材料６１８ｎＬを１つの区域に堆積した。デュアル試薬セルを有する対照については、合計５２０ｎＬとなるように、この抗体を含有する試薬材料２６０ｎＬをそれぞれのセルの１つの区域に堆積した。セグメント化及び逆セグメント化された試薬セルについては、それぞれ、図４Ｂ及び４Ａにおよそ示すように、合計６１８ｎＬの試薬を堆積した。抗ＰＣＴ抗体は、試薬区画を生成するために堆積させ、かつ乾燥させた。より良好な毛管流のためにサンプルの湿潤性を増加させるために、装置に少量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５が堆積された。０．９７ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＣＴを有するサンプルを装置のサンプル区画に添加し、マイクロピラーアレイの毛管現象が、流路を通じて吸上区画にサンプルを分配した。この実施例の結果を図５〜７に示す。
【００７４】
図５Ａ〜５Ｄは、アッセイの完了後のアッセイ装置の流路におけるマイクロピラーを示す蛍光顕微鏡写真である。サンプル及び試薬プルームの流れの方向は左から右である。明るく光っているマイクロピラーは、ＰＣＴと複合した蛍光標識された抗ＰＣＴコンジュゲートが、検出区画において抗ＰＣＴによって捕捉されたことを示している。試薬プルームが周囲を通過した検出区画内のマイクロピラーだけが、蛍光コンジュゲート−ＰＣＴ複合体を捕捉することができる。捕捉された蛍光コンジュゲート−ＰＣＴ複合体を含有する検出区画の断面の多数のマイクロピラーは、したがって、より幅の広い試薬プルームを示している。より幅の広い蛍光パターンは、したがって、より幅の広いプルームがより効率的なサンプルの使用をもたらしていることを示している。換言すれば、試薬プルームの幅が広いほど、より多くのサンプルがシステムを単に通過するのではなく信号に寄与していることを意味する。図５Ａは、２０１３年１月１８日に出願された同時係属特許出願「Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」（出願第１３／７４４，４４２号）に記載のようなデュアル試薬セルを含む第１の対照装置を示す。この顕微鏡写真が示すように、明るく光っている列のマイクロピラーの幅全体によって実証されているように、試薬プルームは実質的に流路の幅全体にかけて延在している。図５Ｄは、本発明によるセグメント化及び逆セグメント化の試薬堆積パターンの試薬セルと同じ寸法を有する単一の試薬セルを含む別の対照装置を示す。図５Ｄが示すように、流路の幅の全体は明るく光っていない。実際、矢印Ａが示す列では、明らかに光っているマイクロピラーはわずか１０本である。図５Ｂは、本発明の一実施形態による装置の顕微鏡写真を示す。この図では、明るく光っているマイクロピラーの列のほとんどに関して、１２本のマイクロピラーの全て（流路の幅全体）が明らかに光っている。図５Ｃは、本発明の別の実施形態の顕微鏡写真を示す。この結果は図５Ｂの実施形態ほど劇的ではないが、明らかに識別可能な列において、多くの列が１２本のマイクロピラー全てを示している。
【００７５】
図６は、図５Ａ〜５Ｄを参照して説明した異なる４つの装置のそれぞれについての信号応答を示す。最も左の棒グラフは、デュアル試薬セル設計のものであり、最高の信号を有している。最も右のグラフは、本発明によるセグメント化及び逆セグメント化の試薬セルと同じ寸法を有するが単一の堆積によるものである、単一の試薬セルを含む別の対照装置のものである。２番目及び３番目の棒グラフは、それぞれ、セグメント化された試薬セル及び逆セグメント化された試薬セルのものである。セグメント化されたセルと逆セグメント化されたセルは、対照の図５Ｄと比べて図５Ｂ及び５Ｃの試薬プルームが増加していることによって示されるように、フローストリームをはるかに効率的に使用しているが、実際には図６に示された応答はより少なくなっている。これは、応答が試薬プルームの幅及び反応時間の両方に依存するためであると考えられる。反応時間の概念は、「Ｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ」と題する、２０１３年１１月１５日に出願された、参照により全体が本明細書に援用される同時係属特許出願第１４／０８１，１５８号に説明されている。反応時間は試薬の溶解時間に依存する。本発明では、試薬の溶解時間は３．５〜５．５分の範囲であったが、対照の両方については試薬の溶解時間は６〜６．５分であり、これは、本発明の複数の試薬堆積パターンによってはるかに大きい湿潤と乾燥の界面が可能となったためである。試薬の溶解時間を増加し、したがって反応時間を増加するために、複数の試薬材料の試薬セルに堆積する試薬の合計量を増加することができる。
【００７６】
最後に、図７Ａ及び７Ｂは、図５Ａ〜５Ｄを参照して説明した４つの異なる装置のそれぞれに関しての、コンジュゲートプルームが吸上区画の始まりと終わりに到達するまでの時間を示す。これは、流量又は総フロー時間の指標である。図７Ａ及び７Ｂが示すように、同一の試薬セルを有するそれらの設計による試薬分布は、評価可能なほどの影響を総流量又はフロー時間に与えない。
【００７７】
本発明の実施形態による方法、アッセイ、装置及び読み取り機は、より良好な免疫化学反応の検出動力学、及びより良好なアッセイ感度に主に関連する、多くの利益を有する。
【００７８】
本発明は本明細書において示される特定の実施形態に限定されないことが理解される。
【００７９】
追加の実施形態
アッセイ装置であって、液体サンプル区画と、下流にあり、サンプル区画と流体連通し、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画と、対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し、対称線からミラー位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、試薬セル内の試薬材料と、試薬区画と流体連通する検出区画と、検出区画から流れる液体サンプルを受容する容量を有する、検出区画と流体連通する吸上区画と、を含む、アッセイ装置であって、サンプル添加区画、検出区画及び前記吸上区画が流体流路を画定する、アッセイ装置。
２．第１の試薬材料が、それが流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形状及び体積を有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
３．第１の試薬材料が流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、実施形態２に開示したアッセイ装置。
４．第１の試薬材料が第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、実施形態１に開示したアッセイ装置。
５．第１の試薬材料が第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、実施形態１に開示したアッセイ装置。
６．試薬区画が単一の試薬セルを有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
７．試薬区画が、試薬区画に対称に配置される少なくとも２つの試薬セルを有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
８．検出区画が、基材、及び基材から実質的に垂直に延びている突起を有し、それらの突起が、高さ、断面、及び基材表面と平行な毛管流を生じることができる突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
９．試薬材料が標識された試薬材料を含み、検出区画はこれと結合する捕捉要素を有する、実施形態１に開示されるアッセイ装置。
１０．検出区画を通じた流路の幅は、約０．５〜１．２ｍｍの範囲である、実施形態１に開示されるアッセイ装置。
１１．第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
１２．第１、第２及び第３の試薬材料のうちの少なくとも１つが異なる組成物を有する、実施形態１に開示したアッセイ装置。
１３．第１の試薬材料が第１の組成物を有し、第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、実施形態１２に開示したアッセイ装置。
１４．アッセイ装置において試薬区画から検出区画内に流れる試薬プルームの幅を増加する方法であって、液体サンプル区画を提供することと、下流にあり、サンプル区画と流体連通する、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画を提供することと、対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料及び、対称線からミラー位置に位置づけられた、実質的に同一の形及び体積を有する第２及び第３の試薬材料と、を含む、試薬セル内の試薬材料を提供することと、試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、検出区画と流体連通する、検出区画から流れてくる液体サンプルを受容する容量を有する吸上区画を提供することであって、サンプル区画、検出区画、及び吸上区画が流体流路を画定する、ことと、サンプルをそのサンプル区画に添加することと、サンプル区画からその第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎてサンプルをその試薬区画に流すことであって、これにより、その第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、その試薬セルの縁に沿って第２及び第３の試薬プルームを形成し、その第１の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、その試薬材料の対称線に沿って第１の試薬プルームを形成する、ことと、その第１、第２及び第３の試薬材料を流すことであって、これによって、その第１、第２及び第３の試薬プルームがともに合流して混合試薬プルームを形成する、ことと、を含む、方法。
１５．反応プルームの増加された幅が、試薬セルに配列された単一の試薬材料のみを有する試薬セルによって形成される反応プルームに比例したものである、実施形態１４に開示した方法。
１６．検出区画が、基材、及び基材から実質的に垂直に延びる突起を有し、突起が、高さ、断面、及び基材表面と平行な毛管流を生じることができる突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、実施形態１４に開示した方法。
１７．より広い試薬プルームが、検出区画の全幅にわたって延在する、実施形態１４に開示した方法。
１８．第１の試薬材料が、それが流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形及び体積を有する、実施形態１４に開示したアッセイ装置。
１９．第１の試薬材料が、流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、実施形態１８に開示したアッセイ装置。
２０．第１の試薬材料が第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、実施形態１５に開示したアッセイ装置。
２１．第１の試薬材料が第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、実施形態１４に開示したアッセイ装置。
２２．第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、実施形態１４に開示したアッセイ装置。
２３．第１、第２及び第３の試薬材料の少なくとも１つが異なる組成物を有する、実施形態１４に開示したアッセイ装置。
２４．第１の試薬材料が第１の組成物を有し、第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、実施形態２３に開示したアッセイ装置。
２５．実施形態１に記載のアッセイ装置上で、１つ又は２つ以上の検体又は対照の存在又は濃度に関して液体サンプルのアッセイを実行する方法であって、アッセイ装置のサンプル添加区画に関心の検体を含む液体サンプルを堆積させることと、毛管現象により、流体流路を通じて、試薬区画にサンプルを移動させ、ここで１つ又は２つ以上の試薬を溶解させることと、１つ又は２つ以上の試薬を含む溶解した試薬プルームを有する試薬区画から離れるように、かつ毛管現象により流体流路を通じて検出区画にサンプルを流すことであって、検体又は対照の存在又は濃度を示す信号が生成される、ことと、検体又は対照の存在又は濃度を判定するために検出区画内で生成される信号を読取ることと、を含む、方法。
【００８０】
当業者は、本発明及び本明細書において記載されるその実施形態は、具体的に記載されたもの以外の変化形態及び修正を含むことを理解する。本発明は全ての変化形態及び修正を含むものとして理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において参照される全てのこと及び特徴を個別に、又は包括的に、かつ工程又は特徴のいずれかの２つ又は３つ以上のうちのいずれか及び全ての組み合わせを含む。
【００８１】
〔実施の態様〕
（１）  アッセイ装置であって、
液体サンプル区画と、
下流にあり、前記サンプル区画と流体連通し、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画と、
前記対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し、前記対称線からミラー位置（mirror locations）に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、前記試薬セル内の試薬材料と、
前記試薬区画と流体連通する検出区画と、
前記検出区画から流れる液体サンプルを受容する容量を有する、前記検出区画と流体連通する吸上区画と、を含む、アッセイ装置であって、サンプル添加区画、前記検出区画及び前記吸上区画が流体流路を画定する、アッセイ装置。
（２）  第１の試薬材料が、前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形状及び体積を有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（３）  第１の試薬材料が前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、前記第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、実施態様２に記載のアッセイ装置。
（４）  第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（５）  第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、実施態様１に記載のアッセイ装置。
【００８２】
（６）  前記試薬区画が単一の試薬セルを有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（７）  前記試薬区画が、前記試薬区画に対称に配置されている少なくとも２つの試薬セルを有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（８）  前記検出区画が、基材、及び前記基材から実質的に垂直に延びている突起を有し、前記突起が、高さ、断面、及び前記基材表面と平行な毛管流を生じることができる前記突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（９）  前記試薬材料が標識された試薬材料を含み、前記検出区画はこれと結合する捕捉要素を有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（１０）  前記検出区画を通る前記流路の幅が、約０．５〜１．２ｍｍの範囲である、実施態様１に記載のアッセイ装置。
【００８３】
（１１）  第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（１２）  前記第１、第２及び第３の試薬材料のうちの少なくとも１つが異なる組成物を有する、実施態様１に記載のアッセイ装置。
（１３）  前記第１の試薬材料が第１の組成物を有し、前記第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、実施態様１２に記載のアッセイ装置。
（１４）  試薬区画から流れ出てアッセイ装置の検出区画に流入する試薬プルームの幅を増加する方法であって、
液体サンプル区画を提供することと、
下流にあり、前記サンプル区画と流体連通する、流体の流れの方向に対称線を有する試薬セルを備える試薬区画を提供することと、
前記対称軸に位置づけられた左右対称の第１の試薬材料と、実質的に同一の形状及び体積を有し前記対称線からミラー位置に位置づけられた第２及び第３の試薬材料と、を含む、前記試薬セル内の試薬材料を提供することと、
前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
捕捉区画から流れる液体サンプルを受容する容量を有する捕捉区画と流体連通する吸上区画を提供することであって、前記サンプル区画、前記検出区画及び前記吸上区画が流体流路を画定する、ことと、
前記サンプル区画にサンプルを添加することと、
前記サンプル区画から前記第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて前記サンプルを前記試薬区画に流すことであって、これによって、前記第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、前記試薬セルの縁に沿って第２及び第３の試薬プルームを形成し、前記第１の試薬材料を通り過ぎて流れるサンプルが、前記試薬セルの前記対称線に沿って第１の試薬プルームを形成する、ことと、
前記第１、第２及び第３の試薬材料を通り過ぎて前記サンプルを流すことであって、これによって、前記第１、第２及び第３の試薬プルームがともに合流して混合試薬プルームを形成する、ことと、を含む、方法。
（１５）  前記反応プルームの増加された幅が、前記試薬セルに配列された単一の試薬材料のみを有する試薬セルによって形成される反応プルームに比例したものである、実施態様１４に記載の方法。
【００８４】
（１６）  前記検出区画が、基材、及び前記基材から実質的に垂直に延びている突起を有し、前記突起が、高さ、断面、及び前記基材表面と平行な毛管流を生じることができる前記突起間の毛管空間を画定する互いの間の距離を有する、実施態様１４に記載の方法。
（１７）  より広い前記試薬プルームが、前記検出区画の全幅にわたって延びる、実施態様１４に記載の方法。
（１８）  第１の試薬材料が、それが前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料となるような形状及び体積を有する、実施態様１４に記載の方法。
（１９）  第１の試薬材料が前記流体の流れによって完全に溶解される最後の試薬材料になるように、前記第１の試薬材料がより大きい形状又は体積を有する、実施態様１８に記載の方法。
（２０）  第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の上流に位置づけられる、実施態様１５に記載の方法。
【００８５】
（２１）  第１の試薬材料が前記第２及び第３の試薬材料の下流に位置づけられる、実施態様１４に記載の方法。
（２２）  第１、第２及び第３の試薬材料が同じ組成物を有する、実施態様１４に記載の方法。
（２３）  前記第１、第２及び第３の試薬材料の少なくとも１つが異なる組成物を有する、実施態様１４に記載の方法。
（２４）  前記第１の試薬材料が第１の組成物を有し、前記第２及び第３の試薬材料が異なる第２の組成物を有する、実施態様２３に記載の方法。
（２５）  実施態様１に記載のアッセイ装置上で、１つ又は２つ以上の検体又は対照の存在又は濃度に関して液体サンプルのアッセイを実行する方法であって、
前記アッセイ装置のサンプル添加区画に関心の検体を含む液体サンプルを堆積させることと、
毛管現象により、流体流路を通じて、試薬区画に前記サンプルを移動させ、ここで１つ又は２つ以上の試薬を溶解させることと、
１つ又は２つ以上の試薬を含む溶解した試薬プルームを有する前記試薬区画から離れるように、かつ毛管現象により前記流体流路を通じて検出区画に前記サンプルを流すことであって、検体又は対照の存在又は濃度を示す信号が生成される、ことと、
前記検体又は対照の存在又は濃度を判定するために前記検出区画内で生成される前記信号を読取ることと、を含む、方法。
【図１】
2014153366.tif 000003
【図２】
2014153366.tif 000004
【図３】
2014153366.tif 000005
【図４Ａ】
2014153366.tif 000006
【図４Ｂ】
2014153366.tif 000007
【図５Ａ】
2014153366.tif 000008
【図５Ｂ】
2014153366.tif 000009
【図５Ｃ】
2014153366.tif 000010
【図５Ｄ】
2014153366.tif 000011
【図６】
2014153366.tif 000012
【図７Ａ】
2014153366.tif 000013
【図７Ｂ】
2014153366.tif 000014
【外国語明細書】
2014153366000001.pdf