(57)【要約】【課題】新規な核酸抽出用装置を提供すること。【解決手段】  本発明の核酸抽出器具は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、第４のオイルからなる第７プラグを、この順で内部に備えたチューブと、チューブに核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、を備えた核酸抽出用器具と、チューブに磁力を印加するための磁力印加器具と、を備えた核酸抽出用装置とする。【選択図】  図３
2014083041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のオイルからなる第１プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、
第２のオイルからなる第３プラグ、
オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、
第３のオイルからなる第５プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、
第４のオイルからなる第７プラグ、
を、この順で内部に備えたチューブと、
前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、
を備えた核酸抽出用器具と、
前記チューブに磁力を印加するための磁力印加器具と、
を備えた核酸抽出用装置。
【請求項２】
前記チューブの長手方向に沿って、前記チューブと前記磁力印加器具の位置関係を相対的に変化させるための磁力印加器具移動装置または核酸抽出用器具移動装置を備える、請求項１に記載の核酸抽出用装置。
【請求項３】
前記チューブの第４プラグ及び／又は第６プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備える、請求項１または２に記載の核酸抽出用装置。
【請求項４】
前記チューブが、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液からなる第１０プラグ、及び
オイルからなる第１１プラグ、
を、さらに備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。
【請求項５】
前記溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。
【請求項６】
前記タンクと、前記チューブが着脱可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。
【請求項７】
前記チューブの第７プラグ側の端が開放している開放端であって、
前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。
【請求項８】
前記タンクが、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有することを特徴とする、請求項１〜７までのいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な核酸抽出用装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態の核酸抽出用装置は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、第４のオイルからなる第７プラグ、を、この順で内部に備えたチューブと、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、を備えた核酸抽出用器具と、前記チューブに磁力を印加するための磁力印加器具と、を備えた核酸抽出用装置である。  前記チューブの長手方向に沿って、前記チューブと前記磁力印加器具の位置関係を相対的に変化させるための磁力印加器具移動装置または核酸抽出用器具移動装置を備えてもよい。前記チューブの第４プラグ及び／又は第６プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備えてもよい。前記チューブが、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液からなる洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグ、を、さらに備えてもよい。前記溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含有してもよい。前記タンクと、前記チューブが着脱可能であってもよい。前記チューブの第７プラグ側の端が開放している開放端であって、前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有してもよい。前記タンクが、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有してもよい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によって、新規な核酸抽出用装置を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の一実施例における核酸抽出用器具の構成の模式図である。
【図２】本発明の一実施例における核酸抽出用器具の構成の模式図である。
【図３】本発明の一実施例における核酸抽出用装置の構成の模式図である。
【図４】本発明の一実施例の核酸抽出方法において、矩形磁石の使用方法を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、１段階溶出用キャピラリー（1-step）と２段階溶出キャピラリー（2-step）について、それぞれで得られた核酸含有溶出液を用いてＰＣＲを行った場合の検出感度の経時変化を比較して示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、１段階溶出用キャピラリー（1-step）と２段階溶出キャピラリー（2-step）について、それぞれで得られた核酸含有溶出液を用いてＰＣＲを行った場合の検出感度を比較して示す図である。
【図７】本発明の一実施例の２段階溶出キャピラリー（2-step）において、逆転写反応液プラグの後に、さらに洗浄液からなるプラグを設けない場合と設けた場合について、それぞれで得られた核酸含有溶出液を用いてＰＣＲを行った場合の検出感度を比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【０００９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１０】
＝＝核酸抽出用器具＝＝
（１）タンク
本発明の核酸抽出用器具は、単数または複数のチューブに核酸結合性固相担体を導入するためのタンクを備える。
【００１１】
タンクは、内部に液体を収容することができ、外部から内部に物質を導入できる開口を有する。タンクにおける開口の位置は特に限定されず、開口を複数有してもよい。開口には、着脱可能な蓋を有していてもよい。
【００１２】
タンクの内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。タンクの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、タンクの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、タンクの外部から内部を観察することができるので、より好ましい。なお、タンクと各チューブは、一体成形されていても、着脱可能になっていても構わない。タンクの材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用すると、タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることにより、タンクの内部を加圧することができる。それにより、チューブの内部から外部へと、チューブの先端側からチューブの内容物を押し出すことができる。
【００１３】
また、タンクは、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有しているのが好ましく、チューブとともに振とうすることができ、タンク内の液体を十分に撹拌することができる。
【００１４】
溶解液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。
【００１５】
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００１６】
チューブを重力の方向と平行になるように設置したとき、タンクはチューブの上方に位置するように構成される。タンクの中に試料を入れ、振とうした上で、再度、チューブを重力の方向と平行になるように設置する。タンク内には、溶解液以外に、空間を残しておくのが好ましい。それによって、この核酸抽出用器具を逆さまにしたりして軽く振とうするだけで、タンク内の液体を、容易に混ぜることができるからである。
【００１７】
チューブが複数ある場合は、チューブが重力の方向と平行になるように設置されたとき、全て同じ高さで平行に並ぶように構成されている。タンクは、核酸結合性固相担体を含む液体を各チューブに分配するための液体分配部を備え、核酸結合性固相担体を含む液体をタンクに入れると、液体は液体分配部で核酸結合性固相担体とともに分配され、核酸結合性固相担体が、液体を介して、各チューブに入っていく様に構成されている。液体分配部は、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁を有してもよい。この隔壁によって、チューブごとに、各チューブと連続するタンクの底面を区切ることが可能になる。そして、底面が重力の方向に垂直に広がり、隔壁が底面に対し垂直であれば、各チューブに繋がる底面の面積の比が、各チューブに分配される核酸結合性固相担体の比と一致する。例えば、各チューブに繋がる底面の面積が等しければ、各チューブに分配される核酸結合性固相担体も等しく分配される。タンクの中に試料を入れ、振とうした上で、再度、チューブを重力の方向と平行になるように設置すると、この設置状態で、タンク内の液体を隔壁より高くすることができる。これによって、複数のチューブに均等に液体が流れるようにできる。
【００１８】
核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定されない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。
【００１９】
また、これらの核酸結合性固相の形態としては、塊、粒子、粉体等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましくは１〜１０μｍである。
【００２０】
核酸結合性固相担体は、溶解液より密度が大きい方が好ましい。例えば、分散液の密度が１．１〜１．２ｇ／ｍＬであれば、核酸結合性固相担体の密度は、１．５〜２．０ｇ／ｍＬなどとすればよい。
【００２１】
（２）チューブ
本発明の核酸抽出用器具は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、および第４のオイルからなる第７プラグを、この順で内部に備える、単数のチューブ、または平行に配置された、同様の形状を有する複数のチューブと、を備える。チューブが複数の場合、お互いに平行に配置されさえすれば、全体には、直線上に配置されても、環状に配置されても構わない。直線上の配置は、複数のチューブを全体に同時に制御しやすくするが、環状の配置は、器具全体の小型化を可能にする。ここで、プラグとは、チューブ内において、一種類の液体が一区画を占める場合の液体を指すものとする。
【００２２】
チューブは、内部に空洞を有し、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状を有するものであって、キャピラリーと呼ばれるものであってもよい。チューブは、長手方向に、屈曲してもよいが、直線状であるのが好ましい。チューブの内部の空洞は、液体がチューブ内でプラグの形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ内の空洞の大きさや、長手方向に対して垂直な断面の形状は、チューブの長手方向に沿って、一定であることが好ましいが、変化していてもよい。
【００２３】
チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されないが、円であるか、円に近い楕円であることが好ましい。チューブの肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されないが、均一であることが好ましい。チューブが円筒状の場合、その内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。
【００２４】
チューブの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、チューブの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、チューブの外部から空洞内を観察することができるので、より好ましい。また、チューブの材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブに磁性粒子を通過させる場合などに、チューブの外部から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるため好ましい。なお、チューブの材質は、タンクの材質と同じにしても構わない。
【００２５】
チューブの第７プラグ側の端は、開放している開放端であってもよいが、開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有することが好ましい。栓は、例えば、ゴムやエラストマー、樹脂等により作製することができる。栓は脱着自在であるが、その機構は特に限定されない。例えば、栓の一部がチューブ部の内部に挿入されて固定されてもよく、栓はキャップ状であってもよい。
【００２６】
プラグの中やプラグ間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸結合性固相担体がプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。
【００２７】
オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを抑制する機能を有する。
【００２８】
オイルは、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させた場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００２９】
チューブの長手方向に対する、オイルからなるプラグの長さは、プラグが形成可能な範囲であれば、いずれも特に限定されないが、具体的には、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であってもよく、核酸結合性固相担体の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。
【００３０】
第２プラグは、チューブ内の第１プラグと第３プラグとの間の位置に配置され、第１洗浄液からなる。
【００３１】
第１洗浄液は、第１プラグを構成するオイル及び第３プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第１洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まない溶液であれば特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。
【００３２】
第２プラグの体積は、特に限定されず、核酸結合性固相担体の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合には、第２プラグの体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第２プラグの体積が、この範囲であれば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合に核酸結合性固相担体の洗浄を十分に行うことができる。なお、核酸結合性固相担体の洗浄には、第２プラグの体積は、より大きいことが好ましいが、チューブの長さや太さ、これに依存する第２プラグのチューブの長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定することができる。
【００３３】
第２プラグは、オイルのプラグによって分割されて任意の数の複数のプラグから構成されてもよい。第２プラグが複数のプラグからなる場合、各プラグの液体は、同じであっても異なっていても構わない。その中に、少なくとも１つの第１洗浄液のプラグがあれば、他のプラグの液体は特に限定されないが、全てのプラグが第１洗浄液であることが好ましい。第２プラグが分割される数は、例えば、チューブの長さや洗浄の対象等を考慮して適宜設定すれることができる。
【００３４】
第４プラグは、チューブ内の第３プラグと第５プラグとの間の位置に設けられ、逆転写反応液からなる。
【００３５】
逆転写反応液は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含む。溶媒は、水であることが好ましく、逆転写反応液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まない溶液が好ましい。また、逆転写酵素用バッファーとなるように、塩を含有することが好ましい。バッファーに含まれる塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。逆転写反応液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる逆転写酵素について適した濃度にすればよいが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。キャリアとして、ＢＳＡまたはゼラチンなどを含有させてもよいが、その濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させてもよい。
【００３６】
第４プラグの体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第４プラグの体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。第４プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、十分逆転写反応を行わせることができる。
【００３７】
第６プラグは、チューブ内の第５プラグと第７プラグとの間の位置に設けられ、溶出液からなる。
【００３８】
溶出液とは、核酸結合性固相担体に吸着した核酸を、担体から液中に溶出させる液体のことを言う。溶出液も特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液が好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。低塩濃度水溶液の場合、バッファーであることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。バッファーにするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられ、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）が最も好ましい。なお、第１洗浄液と溶出液は、同じであっても異なっていてもよい。
【００３９】
溶出液は、さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいても良く、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品がある。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。
【００４０】
溶出液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いるＤＮＡポリメラーゼについて適した濃度にすればよいが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。キャリアとして、ＢＳＡまたはゼラチンなどを含有させてもよいが、その濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、重合反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させてもよい。
【００４１】
第６プラグの体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第６プラグの体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。第６プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、十分逆転写反応を行わせることができる。
【００４２】
溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含んでいる場合は、溶出後の溶出液を、直接ＤＮＡポリメラーゼ反応に用いることができる。この際、チューブ内で反応を行ってもよいが、溶出液をチューブから外に出して、新たにＤＮＡポリメラーゼ反応用容器に移して反応を行ってもよい。チューブ外でＤＮＡポリメラーゼ反応を行う際には、溶出液の一部または全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーで希釈するのが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いてもよいが、塩濃度が適正に調節されていることが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。
【００４３】
この核酸抽出用器具には、第１〜第７プラグ以外に、目的に応じて、任意の場所にプラグを設けてもよい。オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを抑制することを考えると、オイルからなるプラグと水溶性のプラグは、交互に配置されるのが好ましく、水溶性のプラグを追加した場合、隣の水溶性のプラグとの間に、オイルからなるプラグを設ければよい。
【００４４】
例えば、第３プラグと第４プラグとの間に、第３プラグ側から順に、オイルと混和しない第２洗浄液からなる第８プラグ、及びオイルからなる第９プラグを有していてもよい。この場合、第２洗浄液は、第３プラグを構成するオイル及び第９プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第２洗浄液は、第１洗浄液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよいが、第８プラグの基本的な構成の選択の仕方は、第２プラグに準じる。
【００４５】
このように、逆転写反応液プラグの前に、洗浄液からなるプラグを複数設ける場合、上流側の洗浄液にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、第２プラグの第１洗浄液にグアニジン塩酸塩を含有させると、第２プラグにおいて、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。第２プラグにグアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。そして、第８プラグの第２洗浄液を、水又は緩衝液とすることで、第２プラグにおいて、粒子等に吸着した核酸をより安定して吸着させるとともに洗浄を行うことができ、かつ、第８プラグにおいて、カオトロピック剤を除去しつつ担体をさらに洗浄することができる。
【００４６】
また、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと混和しない第３洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグを有していてもよい。この場合も、第３洗浄液は、第５プラグを構成するオイル及び第１１プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第３洗浄液は、第１洗浄液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよいが、第１０プラグの基本的な構成の選択の仕方は、第２プラグに準じる。
【００４７】
このように、逆転写反応液プラグの後に、洗浄液からなるプラグを設ける場合、特に、第７プラグでＤＮＡポリメラーゼ反応を行う場合に、ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液への逆転写反応液の持込が少なくなるので、ＤＮＡポリメラーゼ反応の効率が上がるという効果がある。
【００４８】
＝＝核酸抽出用装置＝＝
本発明の核酸抽出用装置は、上述した核酸抽出用器具と、チューブと、必要な場合はタンクにも、磁力を印加するための磁力印加器具と、を有する。チューブが複数の場合、チューブの対応部に、同時に磁力を印加することができるように磁力印加器具を構成することが好ましい。磁力印加器具は特に限定されないが、例えば、永久磁石、電磁石等が例示できるが、発熱等を生じない点で、永久磁石がより好ましい。核酸抽出の際には、磁力印加器具を移動させる必要があるので、磁力印加器具を自動的に移動させるための磁力印加器具移動装置を備えていてもよい。あるいは、磁力印加器具に対し、核酸抽出用器具のほうを移動させてもよく、その場合、核酸抽出用器具移動装置を備えていてもよい。
【００４９】
また、本発明の核酸抽出用装置は、逆転写反応液からなる第４プラグ、及びチューブの溶出液からなる第６プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備えてもよい。ここで、第４プラグと第６プラグを制御する加熱装置を設けてもよいが、それぞれ別個に制御する複数の加熱装置を設けてもよい。加熱装置は特に限定されないが、例えば、ヒートブロック、ヒーター、電磁加熱などを例示することができる。
【００５０】
なお、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液と、磁性体を有する核酸結合性固相担体と、核酸抽出用器具を核酸抽出用キットとしてもよい。それによって、この核酸抽出用装置で用いるうちの、使い捨てにできる部分だけをキット化できる。
【００５１】
＝＝核酸抽出方法＝＝
上述した核酸抽出用装置は、本発明の核酸抽出方法に、好適に用いることができる。核酸を抽出するための試料は、核酸を含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細胞塊などの生体試料、ウイルス、合成核酸、一旦単離した核酸に不純物や夾雑物が混入した試料などであってもよい。
【００５２】
まず、上述した核酸抽出用器具を、単数又は複数のチューブの長手方向が重力方向と平行になるように固定器具に設置する。
【００５３】
次に、磁性体を有する核酸結合性固相担体と、溶解液と、核酸を抽出するための試料をタンクに投入する。投入する順序は限定されず、具体的な方法は、例えば下記工程を含んでもよいが、その場合、各工程を行う順序は、特に限定されない。  
（１）溶解液に試料を投入し、溶解液を混合する工程と、
（２）溶解液に、磁性体を有する核酸結合性固相担体を添加する工程と、
（３）核酸抽出用器具のタンクに、試料を混合した溶解液を投入する工程と、
（４）溶解液中で、核酸と結合した核酸結合性固相担体を均一にする均一工程
【００５４】
例えば、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液に試料及び核酸結合性固相担体を投入して混合し（１）（２）、ホモジェナイザーやヴォルテックス・ミキサーなどによって試料を溶解させた（４）あと、この粉砕物をタンクに入れてもよい（３）。あるいは、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相担体を別々にタンクに入れ（２）（３）、核酸抽出用器具の開口部に蓋をして、十分混合してもよい（４）。または、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相担体を混ぜて（２）、十分混合し（４）、混合物をタンクに投入してもよい（３）。この工程で、試料中の核酸が、核酸結合性固相担体に吸着する。
【００５５】
なお、タンクに、すでに磁性体を有する核酸結合性固相担体及び／又は溶解液が入っていれば、そこに核酸を抽出するための試料を投入すればよく、担体又は溶解液が欠けていれば、それを一緒に投入すればよい。
【００５６】
複数のチューブを設けた場合、核酸抽出用器具は、チューブの長手方向が重力方向と平行になるように固定器具に設置されているので、全てのチューブに均等に担体が入って行くようになる。タンク内に、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁が設けられている場合は、試料溶解物と担体を含んだ溶解液は、隔壁より高くすることによって、各チューブに均等に担体が入って行く。
【００５７】
その後、核酸結合性固相担体は、磁性体を有しているので、単数又は複数のチューブの対応部に同時に磁力を印加できる磁力印加器具を用いて、第１プラグから第６プラグの方向へ、磁力を印加し、核酸結合性固相担体をタンク内から第６プラグに移動させることができる。その際、永久磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動かして行ってもよいし、磁力印加器具移動装置等を利用して行ってもよい。核酸結合性固相担体が各プラグを通過するときの各プラグにおける滞在時間は特に限定されない。なお、磁力印加器具は、同一プラグ内でチューブの長手方向に沿って往復するようにして移動させてもよい。また、磁力印加器具を進行方向に対して角度をもった方向に（例えば、ほぼ垂直に）振動させてもよい。この振動は、いずれのプラグでも与えることは可能だが、例えば、洗浄液からなる第２プラグでそのような振動を与えることによって、洗浄効果を増強させることができる。
【００５８】
第２プラグで洗浄された核酸結合性固相担体を第４プラグに移動させたとき、そこで、逆転写反応をさせる。反応は、用いる逆転写酵素に適した条件で行えばよい。例えば、逆転写反応液を、３０〜５０℃、好ましくは４２〜４５℃に加熱し、その中で核酸結合性固相担体を一定時間保持することで、ＲＮＡを担体に結合させたままで、逆転写反応を起こさせることができる。加熱方法としては、特に限定されないが、例えば、チューブの第４プラグに対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる方法や、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができる。保持時間も、実施者が適時選択できるが、１０秒〜５分、好ましくは３０秒から１分、保持すればよい。この段階で合成されたｃＤＮＡは、ＲＮＡと結合したままの状態で、固相担体に結合している。
【００５９】
その後、核酸結合性固相担体を第６プラグの溶出液中に移動させる。ここで、核酸結合性固相担体から核酸、特にｃＤＮＡを効率よく遊離させるために、第６プラグを加熱するのが好ましい。加熱方法としては、特に限定されないが、第４プラグの加熱で用いるのと同様の方法を用いることができる。加熱温度は、４０℃より高ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、７０℃以下であることが好ましく、６５℃以下であることがより好ましく、６０℃以下であることがさらに好ましく、６０℃であることが最も好ましい。
【００６０】
核酸結合性固相担体から核酸を遊離させた後、磁力印加器具を用いて、核酸結合性固相担体を第６プラグから上方に移動させる。第６プラグの溶出液に混入していなければ、どこに移動させても構わない。
【００６１】
その後、第６プラグの溶出液に遊離した核酸を回収する。例えば、タンクの材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用した場合、チューブの先端の栓を外し、タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることによってタンクの内部を加圧すると、チューブの先端からチューブ内部の溶液が吐出される。まず、第７プラグのオイルが吐出され、その後、第６プラグの溶出液が吐出される。
【００６２】
このようにして溶出したｃＤＮＡは、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、ＰＣＲなどの酵素反応に直接使用することができる。なお、溶出液からｃＤＮＡを単離してもよく、例えばＲＮＡを除去するためには、得られた溶出液にＲＮａｓｅを添加してもよいが、あらかじめＲＮａｓｅを溶出液に含有させてもよい。例えば、溶出液にRibonuclease Aを１０〜２０μｇ／ｍＬ含有させることで、効率よくＲＮＡを分解させることができる。通常、ＲＮａｓｅが含まれたままで、ＰＣＲなどの操作を行うことができるが、ＲＮａｓｅを除去したい時には、本発明の方法を再度繰り返すか、その他公知の方法によって、ｃＤＮＡを精製してもよい。
【００６３】
一方、溶出液に、予めＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含ませることも可能である。それにより、第６プラグから回収した溶液そのものをもちいて、直接ＰＣＲを行うことができる。
【００６４】
なお、第６プラグの溶出液に遊離した核酸を回収せず、チューブに保持したまま第６プラグ内でＰＣＲを行ってもよい。この場合、溶出液に、予めＰＣＲ酵素、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含ませておく必要がある。ＰＣＲのための加熱方法としては、特に限定されないが、第４プラグの加熱で用いるのと同様の方法を用いてもよく、昇降ＰＣＲ法を用いてもよい。ＰＣＲ反応後、増幅したｃＤＮＡを回収すればよいが、回収方法は特に限定されず、増幅せずに回収する場合と同様の方法を用いることができる。
【実施例】
【００６５】
（１）核酸抽出用器具の構成  Ｉ
図１に核酸抽出用器具の組み立て前の分解図（図１Ａ）および組み立て後の完成図（図１Ｂ）を示す。
【００６６】
この器具は、１本のキャピラリー１００と、そのキャピラリー１００に液体を注入するためのタンク１２０を有する。このキャピラリー１００とタンク１２０とは、核酸抽出用器具組み立て用キット１３０を構成できる。
【００６７】
キャピラリー１００は栓１１０を有し、内部には、第１〜第７プラグが設けられ、それぞれ順に、オイル１０、洗浄液２０、オイル３０、逆転写反応液４０、オイル５０、溶出液６０、オイル７０が充填されている。オイルは、各水溶液を分離するための役割を有している。
【００６８】
タンク１２０は、開口部１２１、開口部１２１に対する着脱可能な蓋１２２、空間１２３、溶解液１２４を有する。また、溶解液１２４中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性ビーズ１２５が含まれている。
【００６９】
キャピラリー１００とタンク１２０は、それぞれ、栓１１０と蓋１２２を外して、図１Ｂのように接続することができる。
【００７０】
（２）核酸抽出用器具の構成  ＩＩ
図２の装置は、複数のキャピラリー１００、及びそのキャピラリー１００に液体を注入するためのタンク２２０、矩形磁石２６０を有する。
【００７１】
タンク２２０は、開口部２２１、開口部２２１に対する着脱可能な蓋２２３、空間２２３、溶解液２２４、液体分配部の隔壁２４０、タンク２２０の内壁および隔壁２４０によって囲まれたコンパートメント２５０を有する。また、溶解液２２４中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性ビーズ２２５が示されている。
【００７２】
複数のキャピラリー１００は、互いに独立で、平行に、かつ直線状の配列になるように、設けられている。キャピラリー１００を直線的な配列にすることで、互いに正対する矩形磁石２６０は、容易に複数のキャピラリー１００を挟み込み、上下運動のような単純作業によって同時に複数のキャピラリー１００の対応部に、同時に磁力を印加することができる。それによって、複数のキャピラリー１００内で、磁性ビーズ２２５に対し、同一の動きをさせることが容易になり、自動化装置の単純化が可能になる。なお、キャピラリー１００の内部には、第１〜第７プラグが設けられ、それぞれ順に、オイル１０、洗浄液２０、オイル３０、逆転写反応液４０、オイル５０、溶出液６０、オイル７０が充填されている。
【００７３】
（３）核酸抽出用装置の構成
本発明の核酸抽出用装置３０００は、（１）の核酸抽出用器具２０００を装着して核酸の抽出を行う装置である（図３）。この装置３０００は、キャピラリー２００で支持しながら核酸抽出用器具２０００を装着するための装着部３００と、装着部３００に核酸抽出用器具２０００が装着された場合に、キャピラリー２００及び必要に応じてタンク１２０の側面から磁力を印加するための磁力印加部４００と、装着部３００及び磁力印加部４００の相対的な配置を、キャピラリー２００の長手方向に沿って変化させるための移動機構５００と、キャピラリー２００の一部を過熱するための加熱部６００を有する。そして、装着部３００と磁力印加部４００との相対的な位置関係を変化させることによって、核酸抽出用器具２０００内の磁性粒子をその内部で移動させることができる。
【００７４】
装着部３００は、キャピラリー２００が沿うように配置される添え板３１０を有している。この添え板３１０によって、キャピラリー２００の振動等を抑制することができる。また、装着部３００は、クリップ機構３２０を有しており、これによりキャピラリー２００を２箇所で固定する。
【００７５】
装着部３００は、磁力印加部４００との位置関係が、キャピラリー２００の長手方向に対して相対的に変化することができるように構成される。本実施例では、磁力印加部４００の移動を行わずに装着部３００を磁力印加部４００に対して相対的に移動させるように設計されているため、装着部３００を移動させる移動機構５００が設けられている。なお、装着部３００には、ヒンジ３３０、ガイドレール３４０、駆動ベルト３５０、モーターが設けられている。
【００７６】
磁力印加部４００は、タンク１２０及びキャピラリー２００を挟んで対向して設けられた一対の矩形磁石４１０を有している。一対の矩形磁石４１０は、キャピラリー２００の外径よりも大きい間隔で離れて位置している。また、磁力印加部４００は、一対の矩形磁石４１０の一方がキャピラリー２００に接近すると他方がキャピラリー２００から離間するように配置され、モーター４２０によって、一対の矩形磁石４１０がキャピラリー２００に接近したり離れたりするように揺動させることができるようになっている（詳しくは後述）。モーター４２０は、タンク１２０やキャピラリー２００のどの位置に磁力を印加する場合でも、必要に応じて駆動することができる。
【００７７】
加熱部６００は、装着部３００にキャピラリー２００が装着された場合に、キャピラリー２００の第４プラグと第６プラグを加熱することができ、独立に制御される２個のヒーターを備える。
【００７８】
核酸抽出装置３０００は、第２プラグ２０の第１洗浄液及び第６プラグ６０の第２洗浄液の少なくとも一方による洗浄によって、磁性粒子Ｍに吸着した核酸の量が減少している場合でも、第４プラグ４０の溶出液に対して、十分な量の核酸を溶出させることができる。これにより、洗浄効果を高めることができるとともに、ＰＣＲのために十分な濃度の核酸を溶出液に対して溶出させることができる。
【００７９】
（４）矩形磁石の使用方法
図４は、核酸抽出用装置のうち、キャピラリー２００と矩形磁石４１０、及び矩形磁石４１０の使用方法が示されている。
【００８０】
互いに正対する矩形磁石４１０は、容易にキャピラリー２００を挟み込み、上下運動のような単純作業によってキャピラリー２００に、磁力を印加し、キャピラリー２００内の磁性ビーズ１２５を上下させることができる。それによって、自動化装置の単純化が可能になる。
【００８１】
また、例えば、Ａのように、両側に２つある矩形磁石４１０のうち、左側をキャピラリー２００にちかづけることで、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００の左側に固まり、右側をキャピラリー２００にちかづけることで、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００の右側に固まる。また、Ｃのように、両方の矩形磁石４１０ともに、キャピラリー２００から離すことによって、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００内で、散在するようになる。従って、同じ場所で、矩形磁石４１０を左右に動かすことで、Ａの状態とＢの状態を繰りかえすことができ、磁性ビーズ１２５を揺動させることができる。
【００８２】
（５）核酸抽出方法
以下、１本のキャピラリー２００を有する核酸抽出用装置３０００を用いた核酸抽出方法を示す。
【００８３】
インフルエンザの診断において、綿棒で咽頭内の粘膜から採取された検体を、タンク１３０の蓋１２２を外した後、溶解液１２４を含むタンク１３０内に挿入し、溶解液１２４に検体を採取した綿棒を浸すことで、ウイルスを溶解液１２４中に採取する。溶解液１２４内には、表面がシリカでコーティングされた磁性ビーズ１２５が入っており、蓋１２１を閉め、タンク１３０を振とうすることによって、磁性ビーズ１２５に核酸を吸着させる。
【００８４】
次に、再度、タンク１３０の蓋１２２を外し、キャピラリー１００の上栓１１０を外して、タンク１３０とキャピラリー１００を接続し、キャピラリーを重力方向に平行に設置する。
【００８５】
その後、矩形磁石４１０を用い、キャピラリー１００に沿って、重力方向に動かすことによって、磁性ビーズ１２５を各プラグ内に通してゆく。途中で、図４に示したように、左右の矩形磁石４１０を交互に用いることによって、磁性ビーズ１２５を左右に振動させてもよい。
【００８６】
磁性ビーズ１２５を、予めヒートブロックで４５℃に加熱した第４プラグまで移動させた後、３０秒間静止させ、逆転写反応を行う。
【００８７】
その後、さらに、磁性ビーズ１２５を、予めヒートブロックで８０℃に加熱した第６プラグまで移動させ、３０秒間、矩形磁石４１０を揺動させて、磁気ビーズ上のｃＤＮＡを溶出させる。
【００８８】
最後に、キャピラリー１００の下栓１１０を外し、タンク１２０を指で両側から押してへこませることで、タンク１２０内を加圧し、キャピラリー１００の下端からオイル７０及び溶出液６０を押し出すことで、溶出させたｃＤＮＡを含む溶出液６０を別の容器に受け取ることが可能である。
【００８９】
あるいは、第６プラグ内で、ＰＣＲ反応を行なってもよい。
【００９０】
（６）１段階溶出と２段階溶出の比較
内径１．０ｍｍ、長さ１００ｍｍのキャピラリー及び１０ｍＬのタンクを用いて、第１〜第７プラグを有する核酸抽出用器具（２段階溶出用）を作製した。ここで、第２プラグは２５μＬ、第４及び第６プラグは２μＬとした。また、各オイルプラグの長さは、１２．５ｍｍとした。各プラグの溶液は、以下のものを用いた。  
第２プラグ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液
第４プラグ：
０．２ｕ／μＬ    ＡＭＶ逆転写酵素（日本ジーン）
０．８ｍＭ        ｄＮＴＰ
０．５μＭ        プライマー（reverse）
２．０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
ｘ１              バッファー (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
第６プラグ：
０．０５ｕ／μＬ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ  ＰＣＲ酵素（日本ジーン）
０．５ｍＭ        ｄＮＴＰ
０．５μＭ        プライマー（forward）
０．５μＭ        プライマー（reverse）
０．２５μＭ      プローブ（Taq man）
２．０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
ｘ１              バッファー  (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
【００９１】
対照として、第６〜第７プラグを有さず、第４プラグにＰＣＲ用試薬が混合されている以下の溶液が入っているキャピラリー（１段階溶出用）を用いた。  
第４プラグ：
０．２ｕ／μＬ      ＡＭＶ逆転写酵素（日本ジーン）
０．１２５ｕ／μＬ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ  ＰＣＲ酵素（日本ジーン）
０．５ｍＭ          ｄＮＴＰ
１．０μＭ          プライマー（forward）
１．０μＭ          プライマー（reverse）
０．５μＭ          プローブ（Taq man）
４．０ｍｇ／ｍＬ    ＢＳＡ
ｘ１                バッファー(MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
【００９２】
オリゴヌクレオチド配列：
プライマー（forward）：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C  （配列番号１）
プライマー（reverse）：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA  （配列番号２）
プローブ（Taq man）：FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA  （配列番号３）
【００９３】
これらのキャピラリーについて、作製した直後のもの、１週間４℃保存のもの、６ヵ月間４℃保存のもの、の３種類を以下の実験に用いた。
【００９４】
タンクに、３５０μＬの溶解液[５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）］及び２μＬの磁性ビーズ分散液を入れて、検体を採取した綿棒を浸し、蓋を閉めて、３０秒間、約１００回振ることにより混合した。この磁性ビーズ分散液として、３０体積％の磁性シリカ粒子（ＮＰＫ−４０１、東洋紡績社）を含む３０質量％塩化ナトリウム水溶液を用いた。
【００９５】
このようにして準備したタンクを、キャピラリーに接続し、重力と平行になるように核酸抽出用器具を設置した。そして、容器側面に磁石を接触させ、上述の方法によって、洗浄、逆転写、溶出の工程を行い。溶出液をキャピラリーの外に放出した。得られた溶出液２μＬ全量を昇降式ＰＣＲ装置（特願２０１０−２６８０９０明細書・実施例１に記載の装置）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。図５は、ＰＣＲサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。
【００９６】
図５より、対照の１段階溶出では、キャピラリー作製後１週間で、すでに検出感度が落ちており、６ヶ月経つと、ほとんど検出できなくなったのに対し、本発明の２段階溶出では、キャピラリー作製後６ヶ月経っても、ほとんど検出感度の現象は観察されなかった。
【００９７】
また、キャピラリー作製直後で比較しても（図６）、本発明の２段階溶出のほうが、対照の１段階溶出より、検出感度が高かった。
【００９８】
（７）洗浄プラグを増やした場合
さらに、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと混和しない洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグを有したキャピラリーを作製し、作製直後に実験を行った。第１０プラグは第２プラグと同じプラグとし、第１１プラグは他のオイルプラグと同じプラグとした。なお、キャピラリー以外は、（２）と同様に実験を行った。図７は、ＰＣＲサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。
【００９９】
（３）で行ったように、洗浄プラグの無い場合と結果を比較すると（図７）、洗浄プラグを増やした場合のほうが、ＰＣＲによる増幅効率が良かった。
【符号の説明】
【０１００】
１０〜７０  第１〜第７プラグ
１００  キャピラリー
１１０  栓
１２０  （装着後の）タンク
１２１  開口部
１２２  蓋
１２３  空間
１２４  溶解液
１２５  磁気ビーズ
１３０  （装着前の）タンク
２００  キャピラリー
２２０  タンク
２２１  開口部
２２２  蓋
２２３  空間
２２４  溶解液
２２５  磁気ビーズ
３００  装着部
３１０  添え板
３２０  クリップ機構
３３０  ヒンジ
３４０  ガイドレール
３５０  駆動ベルト
４００  磁力印加部
４１０  矩形磁石
４２０  モーター
５００  移動機構
６００  加熱部
２０００  核酸抽出器具
３０００  核酸抽出装置
【図１】
2014083041.tif 000003
【図４】
2014083041.tif 000004
【図２】
2014083041.tif 000005
【図３】
2014083041.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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