(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便な方法で、酸化を抑制しつつ代謝の進行を迅速に停止させながら、親水性の代謝物を効率的に抽出する。【解決手段】代謝物の抽出に際して、まず、水と任意に混合する有機溶媒（メタノール１４）を添加して、酸化を抑制しながら酵素を失活させる第１ステップと、次いで、水（超純水１６）を添加することにより、親水性の代謝物を液相に溶解させる第２ステップと、その後、液相を分取する第３ステップとを含む。ここで、第１ステップで添加する有機溶媒を、メタノール１４又はアセトニトリルとし、前記第２ステップで添加する水を超純水１６又は純水とすることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝物の抽出に際して、
まず、水と任意に混合する有機溶媒を添加して、酸化を抑制しながら酵素を失活させる第１ステップと、
次いで、水を添加することにより、親水性の代謝物を液相に溶解させる第２ステップと、
その後、液相を分取する第３ステップとを含むことを特徴とする代謝物の抽出方法。
【請求項２】
前記第１ステップで添加する有機溶媒が、メタノール又はアセトニトリルであることを特徴とする請求項１に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項３】
前記第２ステップで添加する水が超純水又は純水であることを特徴とする請求項１又は２に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項４】
前記第１ステップで添加する有機溶媒が、所定割合以下の水を含む第１の溶液とされていることを特徴とする請求項１又は２に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項５】
前記第２ステップで添加する水が、所定割合以下の有機溶媒を含む第２の溶液とされていることを特徴とする請求項１又は３に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項６】
前記第２の溶液中の有機溶媒の割合が、前記第１の溶液中の有機溶媒の割合よりも小さいことを特徴とする請求項５に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項７】
前記第１の溶液と前記第２の溶液の合計量に対する前記第１の溶液中の有機溶媒と前記第２の溶液中の有機溶媒の合計量の割合が所定値以上とされていることを特徴とする請求項５又は６に記載の代謝物の抽出方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の抽出方法を用いてチオール化合物を抽出することを特徴とする代謝物の抽出方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の抽出方法を用いて接着細胞から代謝物を抽出することを特徴とする代謝物の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝物の抽出方法に係り、特に、培養細胞や微生物中の親水性代謝物を定性・定量解析したり、生産物質を抽出する際に用いるのに好適な、酸化を抑制しながら代謝を迅速に停止させ、親水性物質を効率的に抽出することが可能な、代謝物の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボローム解析は、生体内の代謝物を網羅的に分析する手法であるが、代謝をより正確に把握するには、代謝を迅速に停止させ、且つ、酸化を抑制させ、効率的に代謝物を抽出する方法が必要である。
【０００３】
細胞中の代謝物を抽出する簡便な方法としては、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒もしくは有機溶媒と水の混液で抽出する手法がある（非特許文献１）。
【０００４】
また、メタノール・水・クロロホルムの３液を用いて液液抽出を行い、代謝物を抽出する方法もある（特許文献１〜３、非特許文献２）。
【０００５】
更に、非特許文献３には、メタノールで抽出した後、抽出残渣に水を加えて抽出を行う２段階での抽出法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１９２７４６号公報
【特許文献２】特開２００８−５７７８号公報
【特許文献３】特開２０１２−１４５３９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dietmair S et al., Anal Biochem. 2010 Sep 15;404(2):155-64.
【非特許文献２】Canelas AB et al., Anal Chem. 2009 Sep 1;81(17):7379-89.
【非特許文献３】Sellick CA et al., Nat Protoc. 2011 Jul 28;6(8) :1241-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、有機溶媒のみで抽出を行うと、ＡＴＰなど特に極性の高い親水性代謝物の抽出効率が悪い。又、有機溶媒と水の混液を最初から加えると、酵素が十分失活せず、代謝が十分に停止していない可能性がある。メタノール・水・クロロホルムの３液を用いて液液抽出を行い抽出する方法でも代謝が十分に停止していない可能性があり、酸化は抑制されず、更に操作が煩雑である。また、メタノールで抽出した後、更に抽出残渣に水を加えて抽出を行う２段階での抽出法も操作が煩雑であり細胞内の代謝物を複数定量する場合、抽出法における正確な回収率を求めることが困難となる等の問題点を有していた。
【０００９】
本発明は、前記従来の問題点を解決するべくなされたもので、簡便な方法で、酸化を抑制しつつ代謝の進行を迅速に停止させながら、親水性の代謝物を効率的に抽出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、代謝物の抽出に際して、まず、水と任意に混合する有機溶媒を添加して、酸化を抑制しつつ酵素を失活させる第１ステップと、次いで、水を添加することにより、親水性の代謝物を液相に溶解させる第２ステップと、その後、液相を分取する第３ステップとを含むことにより、前記課題を解決したものである。
【００１１】
なお、非特許文献３に記載された手法は、２段階の操作をするという点では本発明に類似しているが、溶媒を加えるごとに抽出を行っており、本発明のように２段階で溶媒を加えて１回で抽出するものではない。
【００１２】
ここで、前記第１ステップで添加する有機溶媒を、メタノール又はアセトニトリルとすることができる。
【００１３】
又、前記第２ステップで添加する水を超純水又は純水とすることができる。
【００１４】
又、前記第１ステップで添加する有機溶媒を、所定割合以下の水を含む第１の溶液とすることができる。
【００１５】
又、前記第２ステップで添加する水を、所定割合以下の有機溶媒を含む第２の溶液とすることができる。
【００１６】
又、前記第２の溶液中の有機溶媒の割合を、前記第１の溶液中の有機溶媒の割合よりも小さくすることができる。
【００１７】
又、前記第１の溶液と前記第２の溶液の合計量に対する前記第１の溶液中の有機溶媒と前記第２の溶液中の有機溶媒の合計量の割合を所定値以上とすることができる。
【００１８】
又、前記の抽出方法を用いてチオール化合物を抽出することができる。
【００１９】
又、前記の抽出方法を用いて接着細胞から代謝物を抽出することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、まず、有機溶媒を添加するので、酸化を抑制しながら酵素を確実に失活させ、代謝の進行を迅速に停止することができる。次いで、水を添加するので、有機溶媒に溶けにくい親水性代謝物を液相に溶解して、液相を回収することができる。特に、チオール基を有する様な酸化されやすい物質やアセチルＣｏＡ、ピルビン酸において改善効果が大きい。したがって、簡便な方法で、酸化を抑制しつつ代謝の進行を迅速に停止し、親水性代謝物を効率的に抽出することが可能となり、再現性も向上する。
【００２１】
更に、液液抽出を行わないため、操作が簡便で、多数の検体が処理可能である。
【００２２】
又、接着細胞から代謝物を抽出する際は、従来方法では、まず、シャーレから細胞を剥ぎ取るという操作を加える必要があるが、本発明では剥ぎ取る必要がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施形態の手順を示す流れ図
【図２】本発明の実施形態を実施している様子を示す図
【図３】本発明の実施例１と液液抽出法における抽出量及び再現性を比較して示す図
【図４】同じく実施例１とメタノール水溶液抽出法における抽出量及び再現性を比較して示す図
【図５】本発明の実施例２と液液抽出法における抽出量及び再現性を比較して示す図
【図６】本発明の実施例１、３及び４における抽出量及び再現性を比較して示す図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２５】
図１は本実施形態の手順を示す流れ図である。
【００２６】
細胞中の酵素は、有機溶媒により失活するため、まずステップ１１０で水と任意に混合する有機溶媒（例えばメタノール、アセトニトリルなど）（図２ではメタノール１４）を、図２（Ａ）に例示する如く、例えばシャーレ１２中の培養細胞１０に添加する。
【００２７】
添加する有機溶媒は１００％が望ましいが、例えば１０％程度、水が混合していてもよい。
【００２８】
親水性の代謝物質は有機溶媒に溶けにくいため、その後ステップ１２０で、図２（Ｂ）に示す如く、水、例えば超純水１６を添加することにより、親水性の代謝物が液相に溶解し易い状態にした後、ステップ１３０で液相を分取して回収する。
【００２９】
ここで添加する水は１００％が望ましいが、有機溶媒が混ざっていてもよい。更に、ここで加える水は、不純物の問題が無ければ、超純水に限定されず、純水や水道水でも良い。
【００３０】
なお、このステップ１２０で加える有機溶媒の比率は、ステップ１１０で添加した有機溶媒の比率よりも低く抑える必要がある。
【００３１】
次いで、ステップ１３０で液相を分取し、図２（Ｃ）に例示する如く、フィルタ１８を通して、例えば限外ろ過する。ここで、限外ろ過を行うのは、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）による測定に際して、タンパク質を完全に除くためであり、用途によっては、通常のフィルタによるろ過でも良い。
【００３２】
このようにして、抽出する溶媒を２段階に分けて培養細胞に加えることにより、酸化を抑制しつつ酵素を確実に失活させ、且つ、効率的に親水性の代謝物を抽出することができる。この際、液液抽出を行わないため、操作が簡便である。
【実施例１】
【００３３】
例えば直径９０ｍｍシャーレ上の接着状態にある２×１０7個の培養細胞にメタノールを８００μＬ加え、シャーレ上の培養細胞全体にメタノールを浸潤させ、酸化を抑制しながら酵素を失活させ、代謝を停止させた。
【００３４】
メタノールを浸潤させた後、水を５５０μＬ加え、メタノールと混合させながらシャーレ上の培養細胞全体に水を浸潤させ、親水性物質を抽出した。
【００３５】
混合液を１ｍＬ回収し、後は従来法と同様に、遠心分離した後、上澄みを限外ろ過し、ろ液を蒸発乾固させ、例えば５０μＬの水に溶解し、例えばＣＥ−ＭＳで測定を行った。
【００３６】
比較のため、同じ培養細胞に対して、メタノール１０００μＬ、クロロホルム１０００μＬ、水を４００μＬ及び超音波を用いた液液検出を行った。
【００３７】
それぞれの条件で３回繰り返し実験を行い、ばらつきも評価した。
【００３８】
抽出量及び再現性の液液抽出法との比較結果を図３に示す。
【００３９】
液液抽出法と比較して本発明法では、酸化が進んでおらず、還元型グルタチオン、ＣｏＡなど、チオール基を有する化合物の抽出量が高い。また、本発明法ではチオール基の酸化が抑えられ、チオール基を有する化合物が酸化してできるジスルフィド化合物が減少している。すなわち、チオールからジスルフィドへの変換が抑えられている。
【００４０】
本発明法と液液抽出法で差がある物質については、液液抽出法の方でばらつきが大きい。例えば酵素的な反応を続けていると考えられるアセチルＣｏＡやピルビン酸などである。
【００４１】
表１にＣｏＡとアセチルＣｏＡの定量値を示す。
【００４２】
【表１】
2014061459.tif 000003
【００４３】
液液抽出法ではアセチルＣｏＡの相対標準偏差ＲＳＤが大きいが、アセチルＣｏＡとＣｏＡの総和を取るとＲＳＤが小さくなる。すなわち、液液抽出法ではアセチルＣｏＡからＣｏＡへの変換が生じており、本発明法ではそれが抑えられているものと考えられる。
【００４４】
例えばＣｏＡには脂質代謝の際に消費され、アセチルＣｏＡが生成されるといった反応があり、液液抽出法では酵素が完全に失活せず、このような反応が生じているものと考えられる。代謝経路上、ピルビン酸はアセチルＣｏＡの直後の代謝物であり、ピルビン酸もその影響を受けているものと考えられる。
【００４５】
６０％メタノール水溶液抽出法と本発明の実施例１の抽出量及び再現性の比較結果を図４に示す。
【００４６】
メタノール水溶液抽出法は、同じ培養細胞に対して６０％メタノールを１３００μＬ添加することにより行った。
【００４７】
液液抽出との比較の際と同様、チオールの酸化が抑えられて、還元型グルタチオン、ＣｏＡなどのチオール化合物の抽出量が増加し、ジスルフィド化合物（システイングルタチオンジスルフィド）の抽出量が減少している。すなわち、化合物の酸化が抑えられている。
【００４８】
また、ＮＡＤＰＨの抽出量が増加し、ＮＡＤＰ＋の抽出量が減少している。ＮＡＤＰＨは酵素的にＮＡＤＰ＋へ酸化されるが、本発明法ではその反応が抑えられている。
【００４９】
また、本発明法では、Ｏ−アセチルホモセリン、チオプロリン、ピルビン酸、グリセロアルデヒド３−リン酸のＲＳＤが顕著に小さくなる。
【００５０】
以上から、本発明法では従来法と比較し、酸化や代謝を止めながら再現性の高い抽出が可能といえる。
【実施例２】
【００５１】
例えば直径９０ｍｍシャーレ上の接着状態にある２×１０7個の培養細胞に９０％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）８０μＬを加え、シャーレ上の培養細胞全体に９０％アセトニトリル水溶液を浸潤させ、酸化を抑制しながら酵素を失活させ、代謝を停止させた。
【００５２】
９０％アセトニトリル水溶液を浸潤させた後、水を６００μＬ加え、９０％アセトニトリル水溶液と混合させながらシャーレ上の培養細胞全体に水を浸潤させ、親水性物質を抽出した。
【００５３】
混合液を１ｍＬ回収し、後は従来法と同様に、遠心分離した後、上澄みを限外ろ過し、ろ液を蒸発乾固させ、例えば５０μＬの水に溶解し、例えばＣＥ−ＭＳで測定を行った。
【００５４】
抽出量及び再現性の液液抽出法との比較結果を図５に示す。
【００５５】
チオール関連物質のばらつきが減少し、システイングルタチオンジスルフィドが減少しており、液液抽出法と比較し、実施例１と同様チオール化合物の酸化が抑えられている。アセチルＣｏＡのばらつきも減少しており、液液抽出法と比較し、実施例１と同様アセチルＣｏＡの代謝が抑えられている。
【実施例３】
【００５６】
例えば直径９０ｍｍシャーレ上の接着状態にある２×１０7個の培養細胞にメタノール６５０μＬを加え、シャーレ上の培養細胞全体にメタノールを浸潤させ、酸化を抑制しながら酵素を失活させ、代謝を停止させた。
【００５７】
メタノールを浸潤させた後、水を６５０μＬ加え、メタノールと混合させながらシャーレ上の培養細胞全体に水を浸潤させ、親水性物質を抽出した。
【００５８】
混合液を１ｍＬ回収し、後は従来法と同様に、遠心分離した後、上澄みを限外ろ過し、ろ液を蒸発乾固させ、例えば５０μＬの水に溶解し、例えばＣＥ−ＭＳで測定を行った。
【実施例４】
【００５９】
例えば直径９０ｍｍシャーレ上の接着状態にある２×１０7個の培養細胞にメタノール９００μＬを加え、シャーレ上の培養細胞全体にメタノールを浸潤させ、酸化を抑制しながら酵素を失活させ、代謝を停止させた。
【００６０】
メタノールを浸潤させた後、水を４００μＬ加え、メタノールと混合させながらシャーレ上の培養細胞全体に水を浸潤させ、親水性物質を抽出した。
【００６１】
混合液を１ｍＬ回収し、後は従来法と同様に、遠心分離した後、上澄みを限外ろ過し、ろ液を蒸発乾固させ、例えば５０μＬの水に溶解し、例えばＣＥ−ＭＳで測定を行った。
【００６２】
実施例１、３及び４における抽出量及び再現性の比較結果を図６に示す。実施例１（メタノールの割合８００／（８００＋５５０）≒６０％）と実施例３（メタノールの割合６５０／（６５０＋６５０）＝５０％）を比較すると、液液抽出の比較時程ではないがチオール関連化合物の再現性が悪化する傾向が見られた。それ以外の物質についてはほぼ同一の結果が得られた。実施例１、４（メタノールの割合９００／（９００＋４００）≒７０％）ではほぼ同じ結果となった。従って、抽出に用いる有機溶媒の最終的な割合が５０％以下の条件は好ましくない。
【００６３】
以上のように、液液抽出法と比較した場合、本発明法は、溶媒を問わず、チオールの酸化の抑制やアセチルＣｏＡに関連した物質の代謝の抑制が確認された。
【００６４】
又、メタノール水溶液抽出法と比較した場合、本発明法は、ばらつきの大きい物質について再現性が改善され、チオールの酸化の抑制、ＮＡＤＰＨの酸化の抑制が確認された。
【００６５】
以上、本発明法は、これまでの抽出法と比較し、物質の酸化を抑制しつつ代謝の進行を効率的に止めながら高い抽出効率を実現できた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明法により調製した試料は、ＣＥ、液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、ＭＳ、薄層クロマトグラフィ、核磁気共鳴、分光学的手法などを用いた分析などに適用できる。
【００６７】
又、本発明法により調製した試料は、酵素反応の基質としても利用することができる。
【００６８】
本発明は、更に、培養細胞や微生物を用いた物質生産におけるターゲット物質の効率的な抽出法としても利用できる。
【００６９】
本発明法は、大腸菌、酵母等の微生物、培養動物細胞、培養植物細胞、血球、精子、卵子、その他の単細胞試料や肝臓や脳、筋肉などの生体組織に適用することができる。
【符号の説明】
【００７０】
１０…培養細胞
１２…シャーレ
１４…メタノール
１６…超純水
１８…フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
2014061459.tif 000006
【図４】
2014061459.tif 000007
【図５】
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【図６】
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