(57)【要約】【課題】新規ワクチン製剤の提供。【解決手段】本発明は、アルミニウム・アジュバントとともに、全地域的発生に関連するか又は全地域的発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザ・ウイルス株からの卵由来インフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量を含む１価インフルエンザ・ワクチンを提供する。本発明は、非経口と粘膜のインフルエンザ・ワクチンの併合物を含むワクチン・キットであって、この抗原の併合投与量が慣用の抗原投与量以下であるものをも提供する。上記ワクチンの製造方法をも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好適なアジュバントとともに、全地域にわたる発生に関連するか又は全地域にわたる発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザ・ウイルス株からのインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量であるインフルエンザ・ウイルス成分を含む１価インフルエンザ・ワクチン製剤であって、当該低抗原投与量が、投薬当り１５μｇ未満の血球凝集素又は併合したワクチン投薬当り１５μｇ以下であり、かつ、当該アジュバントが、水性担体中にスクアレン及びＴｗｅｅｎ  ８０TM（登録商標）を含む油／水エマルジョン担体である、前記ワクチン製剤。
【請求項２】
安定化剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
前記インフルエンザ・ウイルス抗原が、精製された全体の形態にあるか又はスプリット・インフルエンザ・ウイルスの形態にある、請求項１又は２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
前記低抗原投与量が、投薬当り又は併合したワクチンの投薬当り１０μｇ未満の血球凝集素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
前記抗原投与量が、投薬当り又は併合したワクチンの投薬当り０．１〜７．５μｇの間、又は１〜５μｇの間の血球凝集素である、請求項４に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
卵由来又は細胞培養由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
前記インフルエンザ・ウイルス抗原が、宿主細胞汚染物を実質的に含まない、請求項６に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
前記インフルエンザ・ウイルス成分は、非インフルエンザ・ウイルス・タンパク質を消化するためのプロテアーゼ・インキュベーション・ステップを含む方法により精製される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
以下の：
（ｉ）非経口投与のための請求項１〜７のいずれか１項に記載のアジュバントと配合されたインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量；及び
（ｉｉ）鼻内スプレー・デバイスの如き粘膜デリバリー・デバイスにおける粘膜投与のためのインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量；
を含むキットであって、
ここで、当該インフルエンザ・ウイルス成分は、全地域にわたる発生に関連するか又は全地域にわたる発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザ・ウイルス抗原であり、かつ、ここで、当該低抗原投与量は、投薬当り１５μｇ未満又は併合されたワクチン投薬当り１５μｇ以下の血球凝集素である、
前記キット。
【請求項１０】
前記併合された抗原投薬が、１０μｇ未満の血球凝集素である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記（ｉ）におけるインフルエンザ抗原が失活全ウイルスであり、かつ、前記（ｉｉ）におけるインフルエンザ抗原がスプリット・ウイルスである、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
世界的流行のためのインフルエンザ・ワクチンの製造方法であって、全地域にわたる発生に関連するか又は全地域にわたる発生に関連する潜在能力を有する単一のインフルエンザ・ウイルス株からのインフルエンザ・ウイルス抗原を、請求項１に記載のアジュバントと混合し、そして投薬当り１０μｇ未満のインフルエンザ血球凝集素抗原又は併合された投薬当り１５μｇ以下の血球凝集素を含むワクチンのロット又はワクチンのキットを提供することを含む前記製造方法。
【請求項１３】
前記抗原が、高く精製されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インフルエンザ・ウイルス抗原が、全体の形態又はスプリット・インフルエンザ・ウイルス粒子の形態にある、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ２Ｎ２の如きＨ２抗原及びＨ５Ｎ１の如きＨ５抗原から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ２Ｎ２の如きＨ２抗原及びＨ５Ｎ１の如きＨ５抗原から選ばれる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ２Ｎ２の如きＨ２抗原及びＨ５Ｎ１の如きＨ５抗原から選ばれる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
インフルエンザ・ウイルス感染に対する保護のためのワクチン・ロット又はワクチン・キットの製造における、請求項１に記載のアジュバントとの組み合わせにおける、全地域にわたる発生に関連する又は全地域にわたる発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザの単一株からの、１０μｇ未満、又は８μｇ未満、又は１〜７．５μｇ、又は１〜５μｇの卵由来インフルエンザ・ウイルス血球凝集素抗原の使用。
【請求項１９】
１回投与としての又は２回以上、例えば２回の投与のための、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
同時非経口及び粘膜投与のための２投薬ワクチンの製造における、全地域にわたる発生に関連し又は全地域にわたる発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザの単一株からの、１５μｇ以下の、又は１０μｇ未満の、又は８μｇ未満の、又は１〜７．５μｇの、又は１〜５μｇの卵由来インフルエンザ・ウイルス血球凝集素の使用であって、当該非経口投与のための血球凝集素が、請求項１に記載のアジュバントと配合されている、前記使用。
【請求項２１】
前記油／水エマルジョンが、スパン８５（登録商標）及び／又はレシチンを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のワクチン製剤、キット、方法又は使用。
【請求項２２】
前記油／水エマルジョンが、スパン８５（登録商標）を含む、請求項２１に記載のワクチン製剤、キット、方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ワクチン製剤、その製造方法、及び予防又は治療におけるそれらの使用に関する。特に本発明は、全地域的流行の間の投与のためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ・ウイルスは、世界に存在する最も遍在的なウイルスの中の１つであり、規則的な一時的流行及び不規則的な全地域的流行の未だ予想できないパターンに従って、ヒトや家畜に感染する。
【０００３】
それはしばしばたいしたことのない病気であると考えられているけれども、インフルエンザは破滅的な影響をもつことができる。発生は歴史を通じて記録されてきた。３０を超える一時的流行又は全地域的流行が１５８０年以来発生したことが知られており、その中の４件は、今世紀におけるものである。
【０００４】
インフルエンザの通常の兆候は、咳、熱、頭痛、及び筋肉痛を含む。多くの罹患者は、合併症又は二次的な細菌感染に発展し、これはひじょうに重く、そしてさらに致死的でありうる。
【０００５】
全地域的流行期間の間においては、前の一時的流行からのウイルスに関連するインフルエンザ・ウイルスが流行する。上記ウイルスは、生涯の早い時機における感染からの免疫性のレベルのバラツキをもって、人々の間に拡がる。このような流行は、通常２〜３年の期間にわたり、一般集団の中で一時的流行を再び生じさせるために十分に変更されている新規株の選択を促し；このプロセスは、“抗原ドリフト（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ）”といわれる。“ドリフト変異体（Ｄｒｉｆｔ  ｖａｒｉａｎｔ）”は、いずれか１年に異なるコミュニティー、地域、国又は大陸内で異なる影響をもつことができる。但し、数年間にわたり、それらの全体的な影響は、しばしば類似のものとなる。
【０００６】
典型的なインフルエンザの一時的流行は、入院又は死亡率の上昇率により立証されるように、肺炎及び低呼吸性疾患の発症率における増加を引き起こす。老齢者や慣性疾患をかかえている者は、このような合併症を最も経験し易いが、若い小児も重篤な疾患にかかり易い。
【０００７】
予想できない間隔をもって、新規のインフルエンザ・ウイルスが、前のシーズンに流行した株との全く異なるサブタイプの主要表面抗原、血球凝集素をもって、出現する。この現象が“抗原シフト（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｈｉｆｔ）”といわれる。少なくとも過去において、異なる種からのインフルエンザ・ウイルス、例えば、トリ又はブタ・インフルエンザ・ウイルスがその種のバリアを超えたときに、全地域的流行が生じたと考えられている。このようなウイルスがヒトからヒトに拡がる能力を有する場合、それらは、数ヶ月〜１年以内に全世界に拡がって、全地域的流行をもたらすことができる。
【０００８】
全地域的発生を引き起こす能力をそれに与えるインフルエンザ・ウイルスの特徴は：それが現在流行している株における血球凝集素に比較して新規の血球凝集素を含み；そしてそれがヒトにとって病原性であるということである。新規な血球凝集素は、長い時間期間、たぶん何十年（ａ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｄｅｃａｄｅｓ）にわたり、ヒト集団において明らかではなかったもの、例えば、Ｈ２であることができる。又はそれは、トリにおいて発見された以前ヒト集団において流行していない血球凝集素、例えば、Ｈ５、Ｈ９又はＨ６であることができる。いずれの場合においても、ほとんどの、又は少なくとも高い割合の、又はさらに全集団は、上記抗原には先に遭遇しておらず、そしてそれに対して免疫学的に未経験である。
【０００９】
Ｈ２Ｎ２インフルエンザ・ウイルスは、それらがＨ３Ｎ２サブタイプにより置き代えられたときである１９５７〜１９６８年の間に流行し、これは、前世紀の最後の全地域的流行を引き起こした。今日、Ｈ２Ｎ２に先に晒された人々は３０歳を超えているようである。Ｈ２含有ウイルスは新たな全地域的流行を引き起こすかもしれない。なぜなら、１９６８年以降に生まれた世界人口の割合の増加が、免疫学的に未経験であると予想されるはずであるからである。Ｈ２免疫性に関する上記集団の上記の理論的二分は真実であるかどうかを調べるために、４００人の個体において血清−免学的試験が行われ、そしてＨ２に対する抗体が計測された。
【００１０】
上記試験はドイツにおいて行われ、そして上記抗体テストは、Ｈ２抗原に特異的なＨａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ＨＩＴ）を用いて、Ｓａｅｃｈｓｉｓｃｈｅ  Ｓｅｒｕｍｗｅｒｋ（Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行われた。上記力価は、血球凝集を阻害する最高血清希釈の逆数である。上記結果は、３０歳未満の者の免疫学的に未経験な（ｎａｉｖｅ）状態を確認した。なぜなら、２００個体中のたった７人が、１０〜２０の低い範囲内の計測可能な抗体力価をもっていたからである。
【００１１】
このデータは、３０歳を超える者のかなりの割合が、未だ、感染後３０年以上たっても、Ｈ２について血清保護性であるということをさらに示している。血清保護の数（ＨＩＴ≧１０）は９０％である。上記血清サンプルのいくつかの中では、抗−Ｈ２力価（ＨＩＴ）は、６４０と高く、そして３０歳を超える全血清保護試験参加者についての幾何平均力価（ＧＭＴ）は、６５であった。ＨＩＴ≧４０であることを、血清保護性であると考える。
【００１２】
上記の観察は、Ｈ２ウイルスが３０歳未満の集団内に拡がることができるという可能性を確認する。最近の人口統計、及び３０歳より若い人々が全世界集団の大きな部分を占めているという事実を考慮すれば、Ｈ２ウイルスが再び全地域的流行を引き起こすことができるということがいえる。全世界の集団における上記二分性は、年を経るにつれてさらに発展して、影響を受け易い人々のプールは増加するであろう。
【００１３】
２年前、トリ・インフルエンザ・ウイルスであるＨ５を有するインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）が、ホンコンにおいてヒトから単離された。しかしながら、このウイルスは、ヒトからヒトへ伝達せず、そしてそれ故、全地域的流行を引き起こす能力をもっていなかった。
【００１４】
一般に、特定のパーティーが、全地域的流行状況においてインフルエンザに感染するようになる高いリスクにある。老齢、慢性疾患、及び小さな子供が、特に受け易いが、多くの若く、かつ、見かけ上健康な人々も危険である。Ｈ２インフルエンザに関しては、１９６８年以降に生まれた集団の部分が高く危険である。上記グループは、できるだけ有効に、かつ、簡単な方法で保護されることが重要である。
【００１５】
高く危険である人々の他のグループは旅行者である。今日人々は以前よりもより多く旅し、そして最も新しいウイルスが出現する地域、中国及び東南アジアが近年における人気のある旅行目的地となっている。旅行パターンにおける上記の変化は、新規ウイルスが、月又は年よりも週単位で全世界に行き渡ることを可能にする。
【００１６】
従って、上記の人々のグループのために、全地域的流行状況又は潜在的な全地域的流行状況におけるインフルエンザに対して保護するためのワクチン接種の特別な必要性が在る。
【００１７】
かなりの努力が払われ、全地域的流行状況に反応するための有効な国際的戦略を形成しつつあり、そして世界保健機構はこの機関である。主要な手段は、全地域的流行ワクチン戦略の開発であり、そして今までのところこれは、インフルエンザの全地域的流行に届けるために要求される規模では達成されていない。
【００１８】
今般、驚ろくべきことに、全地域的流行において有用であるであろうワクチンが迅速かつ特別なやり方で配合されることができるということが発見された。特に、伝統的な担体でアジュバント化され、そして／又は古典的な方法で配合された精製ウイルスを含有する低投与量インフルエンザ・ウイルス・ワクチンであって、大規模での集団のワクチン接種を可能にするために十分に迅速かつ経済的に製造されることができるものが、ヒトにおいて有効であることが発見された。
【００１９】
過去においては、アルミニウム塩でアジュバント化された卵由来の、全失活インフルエンザ・ワクチンが、商業的に使用されてきた。しかしながら、この製品は、あまり精製されてなく、そしてむしろ反応原性であり、そしてこのアプローチは、１９７０年代後半に捨て去られた。
【００２０】
最近、より高く精製され、よりよく特徴付けされたスプリット・インフルエンザ・ワクチンが、成人及び年老いた人々における免疫原性を改良する企てにおいてアジュバントと併合されてきた。マウスにおける有意に増加した免疫応答にも拘らず、新世代アジュバントを用いた多くのアプローチが、ヒトにおいて確認されることができていない。上記試験の全てにおいて、標準的な１５μｇ含量の血球凝集素抗原が、上記配合ワクチンを製造するために使用されてきた。
【００２１】
最近のレポート（ｋｉｓｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）ｉｎ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｄｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ．Ｖｏｌ  ９８  ｐｐ１０１−１１０）は、霊長類における試験について記載しており、そこでは、Ａｌ（ＯＨ）3 と混合された３つのインフルエンザ株を含有する細胞培養由来ワクチンがチンパンジーに与えられた。これは、株当り標準的な１５μｇの血球凝集素におけるものと同様に良好に、株当り１．５μｇの血球凝集素の投与量において全身応答を引き起こした。この試験は、ヨーロッパ薬局方、ＷＨＯ、その他の、インフルエンザ・ウイルス・ワクチンのための規制機関の従来の要求を全て満たすＶｅｒｏ細胞由来インフルエンザ全ウイルス・ワクチンの開発のゴールに向けられていた。
【００２２】
日常的に使用される標準的なワクチンに関してはアジュバントとしてのアルミニウム塩の使用に関連した困難性が在る。インフルエンザ・ワクチンは、毎年使用されることを意図され、そしてＡｌ3+の繰り返しの注射は望ましくない。１世紀の間にたった数回起こるかもしれない全地域的流行状況がなければ、Ａｌ3+の使用は除外されてない。
【発明の概要】
【００２３】
それ故、本発明は、１の態様において、好適なアジュバントとともに、全地域的発生に関連した又は全地域的発生に関連する潜在能力を有する単一のインフルエンザ・ウイルス株からのインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量を含むワクチン製剤を提供する。
【００２４】
本発明のワクチンは、インフルエンザ感染を予防し、又はインフルエンザに対する保護を提供し、特にインフルエンザの罹患率又は死亡率に対する保護を提供するために有効な量で、提供される。
【００２５】
本発明のワクチン配合品は、好ましくは、上記抗原の免疫保護量を含有するであろう。本発明のワクチン配合物は、慣用技術により製造されることができる。
【００２６】
本発明のワクチン製剤は、単一投与量において投与されることができる。
【００２７】
低投与量の抗原の使用、及び単一インフルエンザ株の使用（すなわち、１価ワクチン）は、全地域的流行状況に対して反応するために要求されるスピードに寄与する。
【００２８】
本発明に係る製剤中のインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量は、ヨーロッパにおいてＥＭＥＡにより発行された規則の如き規則に従って、株当り１０〜１５μｇ通常１５μｇの、血球凝集素抗原であるヒト・インフルエンザ・ワクチンのための最近認められたワクチン投与量である抗原量である。
【００２９】
あるいは、本発明に係るワクチン製剤は、２以上の投薬において、好ましくは２の投薬において、そして好ましくは、異なる経路により同時に（同じ機会に）投与される２つの投薬において投与される。従って、本発明は、全身的と局所的（粘膜）の両者のワクチンの、好ましくは同時（１回の通院の間の）投与を含む２投薬養生法を提供する。粘膜ワクチンと非経口ワクチンの投与は、免疫応答、特にＩｇＡ抗体応答を強化し、これは、インフルエンザ感染からの保護に貢献する。
【００３０】
１の好ましい態様においては、ワクチン製剤は、非経口的に、例えば、筋中に、そして粘膜経路を介して、特に鼻内での両者を介して投与される。この態様においては、２つの異なる配合物、すなわち、非経口的デリバリーのための配合物と粘膜デリバリーのための配合物が、通常要求されるであろう。上記配合物は、例えば、異なるアジュバント、及び／又は異なる量の抗原を含むことができる。又はそれらは、単に、異なる容量の液体を含むことができる。
【００３１】
従って、本発明は、少なくとも以下の２つの成分：
（ｉ）非経口投与のために好適なアジュバントと配合されたインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量；及び
（ｉｉ）鼻内スプレー・デバイスの如き粘膜デリバリー・デバイス内の、粘膜投与のためのインフルエンザ・ウイルス抗原の低投与量；
を含むキットをも提供する。
【００３２】
鼻内スプレー・デリバリー・デバイス、例えば、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ＧｍｂＨの２投薬デリバリー・デバイスが、商業的に入手可能である。
【００３３】
このような２経路の投与スキームは、全身的免疫応答と局所的免疫応答の両者を提供するであろうし、後者は、好ましくは、感染の間のウイルスの正常な侵入部位（すなわち、鼻粘膜）におけるものである。
【００３４】
好ましくは、本発明の上記態様における上記２成分の併合抗原投与量は、株当り慣用の１０〜１５μｇ未満の血球凝集素抗原である。
【００３５】
従って、本発明に係る低投与量又は併合低投与量は、一般に、ワクチン投薬当り、１０μｇ未満の血球凝集素、好ましくは８μｇ未満の血球凝集素、より好ましくは０．１〜７．５μｇの間の血球凝集素、最も好ましくは１〜５μｇの間の血球凝集素である。好ましくは、上記投与量は、最近の投与量レベルにおける最近のインフルエンザ・ワクチンを用いて可能であろうものよりもかなり多量の、全地域的流行状況のためのインフルエンザ・ワクチンの製造を可能にするために、慣用のインフルエンザ・ワクチンよりも有意に少量である。等しく、抗原投与量は、十分な保護を提供するために十分に高いものである必要がある。
【００３６】
一般に、非経口経路を介して、例えば、筋中に投与される本発明に係るワクチンの容量は、約０．５mlであろうし、そして粘膜経路、例えば、鼻内投与されるワクチンの容量はより少量、好ましくは約０．２ml、例えば、鼻孔を介しては０．１mlであろう。
【００３７】
本発明に係るワクチン製剤中のインフルエンザ・ウイルス抗原は、全地域的流行ワクチンの要求に合致する迅速かつ効率的な方法により得られうる必要がある。最近、この好ましい方法は、卵内でインフルエンザ・ウイルスを増殖させ、そして収穫された尿膜液（ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｆｌｕｉｄ）を精製することによる。卵は、通知からの短時間に多数集められることができる。細胞培養方法、例えば、イヌ腎臓細胞系、例えば、ＭＤＣＫ又はＭＤＣＫ一様細胞系上、又はＶｅｒｏ細胞系上での上記ウイルスの増殖も好適であるが、本発明の文脈においては好ましくない。
【００３８】
上記ワクチン製剤中のインフルエンザ・ウイルスは、好ましくは全ウイルス粒子の形態であるが、あるいは、慣用の方法により調製されたスプリット・ウイルスであることもできる。
【００３９】
スプリット・ウイルス・ワクチンは、本分野において知られた方法、例えば、本明細書中に援用する特許第ＤＤ３００８３３号、及びＤＤ２１１４４４号中に記載する方法により、製造されることができる。伝統的には、スプリット・インフルエンザ（ｓｐｌｉｔ  ｆｌｕ）は、溶媒／洗剤処理、例えば、（“Ｔｗｅｅｎ−ｅｔｈｅｒ”スプリッティングとして知られる）Ｔｗｅｅｎ（商標）と併合されたトリーローブチル・ホスフュート、又はジエチルエーテルを用いて製造され、そしてこの方法は、未だ、いくつかの製造施設において使用されている。現在使用されている他のスプリッティング剤は、洗剤又は保護酵素又は胆汁酸塩、例えば、本明細書中に援用する特許第ＤＤ１５５８７５号中に記載されたようなナトリウム・デオキシコレートを含む。スプリッティング剤として使用されることができる洗剤は、カチオン洗剤、例えば、セチル・トリメチル・アンモニウム・ブロミド（ＣＴＡＢ）、他のイオン洗剤、例えば、ラウリルスルフェート、タウロデオキシコレート、又は非イオン洗剤、例えば、トリトンＸ−１００（例えば、Ｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２８，９５−１０３中に記載された方法中のもの）、及びトリトンＮ−１０１、又は２以上の洗剤の組合せ物を含む。
【００４０】
しかしながら、全地域的流行状況のためのスプリット・ウイルス・ワクチンを上廻る全ウイルス・ワクチンの利点は、それが、スプリット・ウイルス・ワクチンがインフルエンザ・ウイルスの新株のために首尾よく製造されることができるかについての不確実性を回避するということである。いくつかの株に関しては、上記スプリット・ウイルスを製造するために使用される慣用の洗剤は、上記ウイルスに傷を与え、そしてそれを使用不可にすることができる。スプリット・ワクチンを製造するために異なる洗剤を使用し、そして／又は異なる方法を開発する可能性が常にあるが、これは時間がかかり、それは全地域的流行状況において利用されることができない。
【００４１】
全ウイルス・アプローチによるより高い確実性に加えて、スプリット・ウイルスに関してよりもより高いワクチン製造能力も存在する。なぜなら、抗原のかなりの量が、好適なスプリット・ワクチンを製造するために必要な追加の精製ステップの間に、失われるからである。
【００４２】
しかしながら、ワクチンが鼻内及び非経口的の両者を介して投与されるところの併合アプローチに関しては、スプリット・ワクチンは、鼻内配合品のために好ましいものであることができ、一方、失活された全ウイルス・ワクチンは、非経口配合品のために好ましいものであることができる。
【００４３】
鼻内配合品のために特に好ましいものは、失活され又はスプリットされており、そして好ましくは、非イオン界面活性剤、例えば、オクチル−又はノニルフェノキシ・ポリオキシエタノール（例えば、商業的に入手可能なトリトン（商標）シリーズ）、及びポリオキシエチレン・ソルビタン・エステル（トウィーン（商標）シリーズ）、特にトリトンＸ−１００又はトウィーン８０又は両者の組合せ物から選ばれる洗剤であるワクチンである。
【００４４】
上記洗剤は、スプリッティング又は精製方法から残存する残存試薬であることができ、そして／又は、それらは、失活／スプリット・ウイルス配合品に添加され、又はそれらの濃度が調整される。
【００４５】
同様に、スプリッティング剤、例えば、コール酸誘導体、及び特にナトリウム・デオキシコレート（ＮａＤＯＣ）は、一般に微量で、本発明に係るワクチン製剤中で存在することができる。
【００４６】
本発明に係るワクチン製剤中でのアジュバントの使用は、慣用のワクチン中でよりもより低投与量のウイルス抗原の使用を許容する。
【００４７】
好ましくは、本発明に係る上記製剤中のアジュバントは、多量に容易に入手できるアジュバントである。本発明に係る非経口的に投与されるワクチンのために特に好ましいアジュバントは、少なくとも１のアルミニウム塩、最も好ましくは、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの併合物を含む。好ましくは、上記リン酸アルミニウムは、上記水酸化アルミニウムよりもワクチン投薬当り高い濃度において存在する。
【００４８】
０．５又は１mlのワクチン投薬当りのアルミニウム塩の合計量は、通常０．１〜２．０の範囲、好ましくは０．４〜１．０mgの範囲内にある。好ましいものは、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムを含むアジュバント組成物であって水酸化アルミニウムの量に対するリン酸アルミニウムの量が重量で少なくとも２：１、より好ましくは５：１、そして最も好ましくは少なくとも８：１又は９：１であるものである。
【００４９】
粘膜投与されるワクチンのためには、そのウイルス抗原のサイズが、粘膜透過に適したものであることを保証することが重要である。これは、その配合品中に既に存在する洗剤又はスプリッティング剤より考慮されることができる。あるいは、又はさらに、本分野において知られた好適な粘膜アジュバント、例えば、以下の一般式：
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n−Ａ−Ｒ
｛式中、ｎが１〜５０であり、Ａが結合又は−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲがＣ1-50アルキル又はフェニルＣ1-50アルキルである。｝により表されるポリオキシエチレン・エーテル又はエステルの如き吸収強化剤が、使用されうる。
【００５０】
式（Ｉ）に包含される好ましい界面活性剤は、式中、ｎが４〜２４より好ましくは６〜１２、そして最も好ましくは、９であり；Ｒ成分がＣ1-50、好ましくはＣ4 〜Ｃ20アルキル、そして最も好ましくはＣ12アルキルであるところの分子である。特に好ましい例は、Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ（１２thｅｄ：ｅｎｔｒｙ  ７７１７，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ  ０９１１９１０−１２−３）中に記載されているポリオキシエチレン−９−ラウリル・エーテル（ラウレス９（ｌａｕｒｅｔｈ９））である。ラウレス９は、酸化エチレンをドデシル・アルコールと反応させることにより形成され、そして平均９の酸化エチレン単位をもつ。
【００５１】
さらなる局面においては、本発明は、初回免疫化されていない個体又は集団におけるインフルエンザ・ウイルスに対してプライミング免疫応答を提供する方法であって、上記個体又は集団に、本明細書中に記載する低血球凝集素ワクチン又は併合ワクチンを投与することを含む前記方法を提供する。
【００５２】
他の局面においては、本発明は、全地域的流行状況のためのインフルエンザ・ワクチンの製造方法であって、全地域的発生に関連するか又は全地域的発生に関連する潜在能力を有する単一インフルエンザ・ウイルス株からのインフルエンザ・ウイルス抗原を、好適なアジュバントと混合し、そして投薬当り１０μｇ未満のインフルエンザ血球凝集素抗原、又は併合投薬当り１０μｇ未満のものを含有するワクチン・ロットを提供することを含む前記方法を提供する。
【００５３】
さらに他の局面においては、本発明は、ワクチン中で使用されるインフルエンザ・ウイルス抗原の精製方法であって、上記インフルエンザ・ウイルス抗原を含有する混合物をプロテアーゼで処理して、非インフルエンザ・ウイルス・タンパク質を消化するステップを含む前記方法を提供する。
【００５４】
上記精製は、培養物から収穫されたインフルエンザ・ウイルスの調製物について行われる。驚くべきことに、上記インフルエンザ・ウイルス粒子は、上記プロテアーゼ消化ステップに対して抵抗性である。上記方法において使用される好ましいプロテアーゼは、トリプシンであり、これは好ましくは、０．１〜１０μｇ／ｍｌ純トリプシンの濃度で使用される。使用されうる他のプロテアーゼ酵素は、プラスミンとキモトリプシンを含む。
【００５５】
通常、上記プロテアーゼ消化ステップは、上記インフルエンザ・ウイルス抗原が１以上の物理的分離ステップ、例えば、遠心分離及び濾過により部分的に精製された後に、行われる。望ましい製品が全ウイルス・ワクチンである場合、上記のプロテアーゼ消化ステップは、ウイルス失活ステップの前に行われる。
【００５６】
本発明に係る精製方法は、ワクチン中での使用のために好適である、汚染性宿主細胞タンパク質を実質的に含有しないスプリット又は全ウイルスの形態における精製されたインフルエンザ・ウイルス抗原を提供するために首尾よく使用されることができる。
【００５７】
用語“汚染性宿主細胞タンパク質を実質的に含有しない”とは、全タンパク質の１０％未満、好ましくは８％未満、そしてより好ましくは５％未満が、クーマシー染色ポリアクリルアミド・ゲルのスキャニングにより検出されるとき、宿主細胞タンパク質であるということを意味する。卵内で培養されるインフルエンザの場合、優勢な宿主タンパク質はオボアルブミンであって、これは、尿膜液の全タンパク質質量の約６０〜７０％を構成する。好ましくは、オボアルブミンは、染色されたゲルのスキャニングにより評価されるとき、全タンパク質の、１％未満、より好ましくは０．１％未満、そして最も好ましくはほんの約０．０５％の濃度で、精製されたインフルエンザ・ウイルス調製物中に存在する。
【００５８】
さらなる局面においては、本発明は、インフルエンザの予防のためのワクチンの製造における、全地域的発生に関連した又は全地域的発生に関連する潜在能力を有するインフルエンザの単一株からのインフルエンザ・ウイルス血球凝集素抗原の１０μｇ未満、又は８μｇ未満、又は１〜７．５μｇの、又は１〜５μｇの投与量又は併合投与量の使用を提供する。
【００５９】
本発明に係るワクチン製剤における使用のために好適な他のアジュバントは、ウイルス抗原に対する免疫応答を強化することができる一定範囲のアジュバントを含む。
【００６０】
３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ-ＭＰＬ）は、１のこのようなアジュバントである。これは、例えば、ＧＢ２２２０２１１（Ｒｉｂｉ）中に記載されている。化学的には、それは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡと、４，５又は６アシル化鎖の混合物であり、そしてＲｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｍｏｎｔａｎａにより製造されている。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡの好ましい形態は、ＥＰ０６８９４５４中に開示されている。３Ｄ-ＭＰＬの好ましい形態は、（ＥＰ０６８９４５４中に記載されているように）直径、１２０ｎｍ以下の、通常６０〜１２０ｎｍの、好ましくはおおよそ又は１００ｎｍ未満の粒子である。
【００６１】
３Ｄ-ＭＰＬは、通常、投薬当り、１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２５〜５０μｇの範囲内で存在するであろうし、ここでは、その抗原は、典型的には、投薬当り２〜５０μｇの範囲内で存在するであろう。
【００６２】
他の好適なアジュバントは、ＱＳ２１であり、これは、南米の樹であるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮からのサポニンのＨＰＬＣ精製された、非毒性画分である。場合により、これは、場合により担体とともに、３Ｄ-ＭＰＬと混合されることができる。
【００６３】
ＱＳ２１の製造方法は、ＵＳ５，０５７，５４０中に記載されている。
【００６４】
ＱＳ２１を含有する非反応原性アジュバント配合物も、本発明に係るワクチン製剤中での使用に好適であり、そして例えば、ＷＯ９６／３３７３９中に記載されている。ＱＳ２１とコレステロールを含有するこのような配合物は、抗原と配合されるとき、首尾よいアジュバントであることが示されている。
【００６５】
異なるアジュバント、例えば、上述のものの組合せ物も、本発明における使用のために好適であるアジュバントを提供するものであることが企図されている。例えば、ＱＳ２１は、３Ｄ-ＭＰＬと配合されることができる。ＱＳ２１：３Ｄ-ＭＰＬの比は、典型的には、１：１０〜１０：１の；好ましくは１：５〜５：１の、そしてしばしば実質的に１：１のオーダーであるであろう。最適シナジーのために好ましい範囲は、２．５：１〜１：１の３Ｄ-ＭＰＬ：ＱＳ２１である。
【００６６】
有利には、本発明に係るワクチン製剤は、通常、上記の他のアジュバントの中の１とともに、担体と配合されることができる。上記担体は、例えば、油／水エマルジョン、又はアルミニウム塩であることができる。
【００６７】
好ましい油／水エマルジョンは、代謝性油、例えば、スクアレン、アルファ・トコフェロール、及びトウィーン８０（商標）を含む。さらに、上記油／水エマルジョンは、スパン８５（商標）、及び／又はレシチンを含むこともできる。
【００６８】
好ましい局面においては、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸アルミニウムは、免疫原性を強化するために、本発明の製剤に添加されるであろう。
【００６９】
典型的には、ヒト投与のためには、ＱＳ２１と３Ｄ-ＭＰＬは、投薬当り、１μｇ〜２００μｇの、例えば、１０〜１００μｇの、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲内でワクチン中に存在するであろう。典型的には、上記油／水エマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のアルファ・トコフェロール、及び０．３〜３％のトウィーン８０（商標）を含むであろう。好ましくは、スクアレン対アルファ・トコフェロールの比は、これがより安定なエマルジョンを提供するので、１に等しいか又は１未満である。スパン８５（商標）も１％のレベルで存在することができる。いくつかの場合、本発明のワクチンがさらに安定剤を含むであろうということも有利でありうる。
【００７０】
非毒性の油／水エマルジョンは、好ましくは、水性担体中に、非毒性の油、例えば、スクアラン又はスクアレン、乳化剤、例えば、トウィーン８０（商標）を含む。水性担体は、例えば、リン酸塩緩衝液化生理食塩水であることができる。
【００７１】
油／水エマルジョン中、ＱＳ２１、３Ｄ-ＭＰＬ、及びトコフェロールを含む特に強力な他のアジュバント配合品は、ＷＯ９５／１７２１０中に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】ワクチン・バルクの調製フロー・シート。
【図１Ｂ】任意的トリプシン・インキュベーション・ステップを含む精製プロセスのための一般化されたフロー・シート。
【００７３】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【００７４】
実施例
実施例１−  全インフルエンザ・ワクチンのための１価バルクの調製
ワクチン・バルクを、図１Ａ中に示すフロー・シートに従って調製した。図１Ｂは、任意的トリプシン・インキュベーション・ステップを含む、精製プロセスのための一般化されたフロー・シートを示す。
【００７５】
粗１価全ウイルスの調製
ウイルス接種物の調製
胚をもった卵の接種の日に、作業種母ロットを、０．５mg／mlで硫酸ゲンタマイシンと２５μg／mlでヒドロコルチゾンを含有するホスフェート・バッファーと混合することにより調製する（ウイルス株依存性）。
【００７６】
このウイルス接種物を２〜８℃で保つ。
【００７７】
胚をもつ卵の接種
９〜１１日齢の胚をもった卵を、ウイルス複製のために使用する。この卵を、製造プラントに到着する前農場においてインキュベートし、そしてその殻を殺菌した後に製造室に移す。卵を、自動卵接種装置上で、０．２mlのウイルス接種物で接種する。
【００７８】
接種された卵を、４８〜９６時間、適当な温度でインキュベートする（ウイルス株依存性）。このインキュベーション期間の終りに、その胚を、その卵を冷却することにより殺し、そして２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【００７９】
収穫
冷却された胚をもつ卵からの尿膜液を、適当な卵収穫機械により収穫する。通常、８〜１０mlの粗尿膜液を、卵ごとに集めることができる。この粗１価ウイルス・バルクに、０．１００mg／mlのチオメルサールを添加する（別法においては、チオメルサールを添加しない）。
【００８０】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮及び精製
１．清澄化
上記の収穫された尿膜液を、中程度の速度の遠心分離（レンジ：４０００〜１４０００ｇ）により、清澄化する。
【００８１】
２．吸着ステップ
上記清澄化されたウイルス・プール中にＣａＨＰＯ4 を得るために、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ2 ＨＰＯ4 と０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2 溶液を添加して、ウイルス株に依存して、１．５ｇ〜３．５ｇ  ＣａＨＰＯ4 ／力価のＣａＨＰＯ4 の最終濃度にする。
【００８２】
少なくとも８時間、沈降させた後、上清を除去し、そして上記インフルエンザ・ウイルスを含有する沈殿物を、使用するＣａＨＰＯ4 の量に依存して、０．２６ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−Ｎａ2 溶液の添加により再溶解させる。
【００８３】
３．濾過
再懸濁された沈殿物を、６μｍフィルター膜上で濾過する。
【００８４】
４．スクロース勾配遠心分離
上記インフルエンザ・ウイルスを、線形スクロース勾配（０．５５％）におけるアイソピクニック（ｉｓｏ  ｐｙｃｎｉｃ）遠心分離により濃縮する。流速は８〜１５リッター／時である。
【００８５】
遠心分離の終りに、ローターの内容物を３つの異なる画分に回収する（スクロースは屈折計内で計測される）。
【００８６】
−画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）１    ５５〜約５２％スクロース
−画分２                        約５２〜２６％スクロース
−画分３                        ２６〜２０％スクロース
＊ウイルス株依存性
画分２をホスフェート・バッファーで希釈する。
【００８７】
このステップにおいて、生成物を、“１価全ウイルス濃縮物”という。
【００８８】
滅菌濾過
上記全ウイルス材料を、０．２μｍ膜で終わる複数のフィルター膜上で濾過する。この濾過の終りに、上記フィルターを、ホスフェート・バッファーで洗浄する。結果として、濾過された画分２の最終容量は、元の画分容量の５倍となる。
【００８９】
失活
上記の濾過された１価材料を、ホスフェート・バッファーで希釈して、その全タンパク質含量を最大２５０μｇ／mlまで低下させる。ホルムアルデヒドを添加して、２５０μｇ／mlの最終容量とし、そして失活を、少なくとも７２時間２０±２℃で行う。
【００９０】
最終滅菌濾過
上記失活材料のタンパク質濃度を、約５００μg／mlタンパク質に調整し、０．８μmで終わる複数の膜上で事前に濾過し、そして最後に、０．２μmで終わる複数の膜上で濾過する。
【００９１】
そのウイルス株に依存して、最後の濾過膜は０．８μｍであることができる。このステージにおいて、その生成物を“１価最終バルク”という。
【００９２】
保存
上記１価最終バルクを、最大１８ヶ月間、２〜８℃で保存する。
【００９３】
純度
純度を、クーマシー染色ポリアクリルアミド・ゲルのＯ．Ｄ．スキャニングにより測定したピークを手動で測定した。結果を以下の表中に与える：
【００９４】
【表１】
2014205726.tif 000002
【００９５】
トリプシン・ステップを含む別法
トリプシン消化
滅菌濾過ステップ後、滅菌材料を、トリプシン処理ステップにかける。純粋なトリプシン、例えば、１０，０００〜１５，０００ユニット／mgの比活性を有する商業的に入手可能なブタ・トリプシンを、０．１〜１０μｇ／mlの最終濃度で添加する。上記混合物を、緩やかに撹拌しながら、３７℃で２時間、インキュベートする。次に上記材料を、さらなる処理のために冷却する。
【００９６】
限外濾過
トリプシン消化の後、上記材料を、（先に記載したように）失活の前又は後のいずれかに限外濾過にかけることができる。このウイルス材料を、２０，０００〜５０，０００Ｄの平均排除限界をもつ膜上で限外濾過する。限外濾過の間、ホルムアルデヒドとスクロースの含量は、かなり低下する。
【００９７】
最初の４倍の容量低下の後、その容量は、
ホスフェート・バッファーとリン酸塩緩衝液化生理食塩水の添加により、限外濾過（ダイアフィルトレーション）の間、一定のままである。
【００９８】
結果
上記トリプシン方法に従って調製されたインフルエンザ全ウイルス・ワクチンを、クーマシー染色されたポリアクリルアミド・ゲル上で分析した。上記ウイルス・タンパク質は、トリプシン消化ステップを経験しなかったウイルス・タンパク質と同じ位置まで移動した。これは、そのウイルス・タンパク質がプロテアーゼ消化されていなかったことを示すものである。
【００９９】
実施例２−  バルク・ワクチンからのワクチン投与量の調製
最終ワクチンを、実施例中に記載したようにして調製された最終バルク・ワクチンを、目的の抗原含量が得られかつ投薬当り０．５ｍｇのＡｌ塩の濃度が達成されるような方法で、アジュバント・ミックスと最終バッファーと、混合することにより調製する。
【０１００】
使用されたバッファーは、以下に列記するいくつかの塩を含有する。上記アジュバントは、ＡｌＰＯ4 とＡｌ（ＯＨ）3のミックスであり、そして４mg／mlの保存溶液当り、３．６mgのＡｌＰＯ4 と０．４mgのＡｌ（ＯＨ）3の割合で使用される。
【０１０１】
バッファー組成；
蒸留水                              ０．８００ｌ
ＮａＣｌ                            ７．６９９ｇ
ＫＣＬ                              ０．２００ｇ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2 Ｏ                 ０．１００ｇ
Ｎａ2 ＨＰＯ4・１２Ｈ2 Ｏ           ２．６００ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4                         ０．３７３ｇ
蒸留水で１リッターの最終容量に調製する。
【０１０２】
その手順を以下に示す：
１．１０〜１５℃でアジュバント・ミックスを使用する。
【０１０３】
２．１５〜２０℃で最終ワクチン・バッファーを添加し、そしてマグネチッグ・スターラーで緩やかに混合する。
【０１０４】
３．５〜１０℃で適当なバルク・ワクチンを、混合しながら添加する。
【０１０５】
４．室温で１０〜３０分間、混合を続ける。
【０１０６】
５．吸着されたワクチンを室温まで冷却させて、充填を待つ。
【０１０７】
６．最終ワクチン容量は、投薬当り０．５mlである。
【０１０８】
実施例３−  臨床データ−アルミニウム塩でアジュバント化された低投与量スプリット・インフルエンザ・ワクチン
以下のデータは、臨床試験からのものであり、ここで、３価インフルエンザ・ワクチンは、商業的に入手可能なＦｌｕａｒｉｘ（商標）ワクチン（スプリット・フル・ワクチンである）のための一般製造概要に従って製造された。実際には、最終の３価バルク材料を、実施例２に記載されたようなアルミニウム・アジュンバントと混合した。いくつかの異なるＨＡ投与量を調製した。
【０１０９】
上記ワクチン・ロットを、株当り投薬当り１．８μｇ、及び株当り投薬当り３．７５μｇにおいて、２つの年齢集団、１８〜６０歳、及び＞６０歳においてテストした。５０人のボランティアを、各群においてワクチン接種した。
【０１１０】
株当り１．８と３．７５μｇの投与量に対応するデータを、以下の表中に提示する。
【０１１１】
フル−特異的血清Ａｂｓの血球凝集素阻害（ＨＡＩ）活性
血清（５０μｌ）を、３７℃で１６時間２００μｌのＲＤＥ（レセプター破壊性酵素）で処理する。この反応を、１５０μｌの２．５％クエン酸Ｎａで停止させ、そしてその血清を３０分間５６℃で失活させる。１：１０希釈物を、１００μｌＰＢＳの添加により調製する。次に、２倍の希釈シリーズを、２５μｌ血清（１：１０）を２５μｌＰＢＳで希釈することにより、９６ウェル・プレート（Ｖ底）内で調製する。２５μｌの参照抗原を、２５μｌ当り４血球凝集素ユニットの濃度で各ウェルに添加する。抗源と抗血清希釈物を、マイクロタイター・プレート振とう機を用いて混合し、そして室温で６０分間インキュベートする。次に、５０μｌのニワトリの赤血球細胞（ＲＢＣ）（０．５％）を添加し、そしてこのＲＢＣを室温で１時間沈降させる。ＨＡＩ力価は、ウイルス誘導血球凝集を完全に阻害する最終血清希釈の逆数に一致する。
【０１１２】
【表２】
2014205726.tif 000003
【０１１３】
【表３】
2014205726.tif 000004
【０１１４】
１８〜６０歳群に関するＥＵ基準は、以下の通りである：
−血清変換係数            ＞２．５
−血清変換率              ＞４０％
−ワクチン接種後の保護率  ＞７０％
上記表中のデータから、血清変換係数、血清変換率、及び保護率に関するＥＵ基準は、インフルエンザのＡ株に対してテストされた２つの異なる投与量に関する上記２つの年齢集団において、凌駕されていると結論することができる。
【０１１５】
Ｂウイルスに対する保護率は、上記２つの試験群においてワクチン接種前、それぞれ、８０％と９０％を上廻るものであった。Ｂ株に対するこのワクチン接種前の血清陽性は、このワクチン応答に、ネガティブに影響を及ぼす。これにも拘らず、Ｂ株に対する抗体は、ワクチン接種後に２倍になり、１００％に近い保護率をもたらした。
【０１１６】
従って、株当り４μｇ未満のＨＡ及びアルミニウム・アジュバントと配合されたワクチンは、許容できる反応原性特性を有し（データを示さず）、そして上記２つの試験集団における３つのＥＵ基準の全てに完全に適合する免疫応答を誘導することができる。上記試験において行われた観察に基づき、低投与量の吸着されたワクチンが、全地域的流行状況における使用のために好適であると結論することができる。
【０１１７】
実施例４−  精製され、そしてアルミニウム塩上に吸着された、低投与量１価全ウイルス・ワクチンの反応原性特性
全インフルエンザ１価バルクを、実施例、及び図１に従って調製し（非トリプシン法）、そして１価インフルエンザ・ワクチンを実施例２に従って配合した。
【０１１８】
上記全ウイルスを精製するための精製段階において、一般に通用されるスクロース勾配遠心分離に加えて、選択されたウイルスに富む画分をペレット化して、より効率的に卵由来汚染物を除去した。
【０１１９】
（ナトリウム・デオキシコレート（ＮａＤＯＣ）と５０μｇ／mlにおけるホルムアルデヒドへの暴露との組合せにより達成されるスプリット・ワクチンのための失活方法に比較して）全ウイルスを、２５０μｇ／mlの濃度においてホルムアルデヒドで失活させた。
【０１２０】
一旦、精製され、かつ、失活されれば、抗原は、投薬当り、０．５mgと０．４５mgの濃度で、それぞれ、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムのミックスに吸着された。
【０１２１】
その純度は、プレイン尿膜又は希釈尿膜液が使用されていた過去の全ウイルス・アジュバント化ワクチンの純度よりもかなり優れたものであった。
【０１２２】
この全ウイルスの抗原含量は、７．５μｇ／投与量Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７であった。この投与量は、反応原性の上限を調べるために、（全地域的流行１価ワクチンのために選択されるかもしれない最高の抗原投与量として）最悪ケースのシナリオとして選択された。
【０１２３】
実施例３における観察、及び全ウイルスがスプリットのワクチンと少なくとも同程度に免疫原性であるという事実に基づき、より低い抗原投与量が使用されるであろう。
【０１２４】
上記反応原性の統計学的比較、主にワクチン接種後に観察される局所的事件は、Ｆｌｕａｒｉｘ、すなわちｔｈｅ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのスプリット・インフルエンザ・ワクチンについてのデータを用いて行われた。
【０１２５】
局所的反応を上記比較のために選択した。なぜなら、それらは、正確に計測されることができ、そしてそれらは、アルミニウム・アジュバント含有ワクチン後の局所反応に関して最も指標になるからである。
【０１２６】
【表４】
2014205726.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2014205726.tif 000006
【０１２８】
Ｔｈｅ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストは、２つの集団を比較するための統計的テストであり、そして２つの集団の結果が同一の分布をもつという帰無仮説をテストすることは、上記２つの分布関数が、それが存在する場合、位置（メジアン）に関してのみ粗違するという対立仮説に対立する。
【０１２９】
上記１価低投与量全ウイルス・アジュバント化ワクチンの反応原性と、１９９６年、１９９７年、及び１９９９年におけるＦｌｕａｒｉｘ（商標）についての臨床試験の結果との比較結果は、Ｐ０．０５レベルにおいて有意差がないことを示す。
【０１３０】
この観察は、インフルエンザに対して高い保護率を誘導するために十分なものである投与量よりも高い抗原投与量においてさえ、全ウイルス・アジュバント化ワクチンの使用を支持する。
【０１３１】
実施例５−  非初回免疫化集団におけるアルミニウム塩でアジュバント化された低投与量１価全ウイルス・ワクチンの免疫原性
全インフルエンザ・ウイルス・ワクチンを、実施例１、及び図１（非トリプシン法）に従って調製し、そして異なる量のＨＡを含有する１価インフルエンザ・ワクチンを実施例２に記載したように配合した。
【０１３２】
この試験において使用した抗原は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）から調製した。このＨ２Ｎ２サブタイプは、１９６８年以降ヒトにおいて流行しておらず、≦３０歳の試験参加者は、上記抗原に対し免疫学的にナイーブであった。その免疫状態と免疫応答を、血清サンプル中の血球凝集素阻害力価として計測した。
【０１３３】
１０日目及び２１日目における免疫応答は、真の初回免疫応答であると考えることができ、一方、他の値の全ては、追加免疫応答を表している。この結果は、対応の試験群の幾何平均力価（ＧＭＴ）を示す。
【０１３４】
【表６】
2014205726.tif 000007
【０１３５】
上記表中に提示する結果は、１．９μｇ／投薬と同程度に低いＨＡ抗原含量をもつ１価全ウイルス・ワクチンが、非初回免疫化試験群（≦３０歳、ｄ＝１０，２１）において、対照群（１５μｇＨＡ／投薬、アルブミンなし）と等価な免疫応答を顕出することを証明するものである。
【０１３６】
上記ＨＩ力価は、１の免疫感作後の保護レベル未満であるけれども、保護力価（≧１：４０）は、２回の免疫感作後に全ての群内で達成される。ブースター応答のために開発された基準が、初回免疫応答の評価において十分に適用できるかどうかは、確実に確立されてはいない。インフルエンザ・ウイルスによる感染の場合、“非保護的”力価の値は、評価されずに残った。
【０１３７】
以上の結果は、全地域的流行状況における非初回免疫化集団の最初の免疫化のための低投与量全ウイルス・アルミニウム吸着インフルエンザ・ワクチンの使用を支持するものである。
【図１Ａ】
2014205726.tif 000008
【図１Ｂ】
2014205726.tif 000009