(57)【要約】      （修正有）【課題】数塩基の変異を高い精度で解析する簡便、安価な核酸解析方法を提供する。【解決手段】以下の工程、第１または第２の塩基からなる変異部位を含む鋳型配列を増幅するプライマーセットを準備する、１つの反応槽においてプライマーセットにより検体について増幅反応を行って増幅産物を得る、標的配列に相補的な核酸プローブと増幅産物とを反応させる、生じたハイブリダイゼーション量を検出し、検体に含まれる核酸を解析することを含む。第１プライマーは、３’側に第１の塩基からなる変異部位に相補的な配列を含み、鋳型核酸の一部分に相補的な配列と、タグ配列とを含む。第２のプライマーは、３’側に第２の塩基からなる変異部位に相補的な配列を含み、鋳型核酸の一部分に相補的な配列と、タグ配列とを含む。【選択図】図１
2014180278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の解析方法であって、
（ａ）核酸を含む検体を準備する工程と、
（ｂ）第１の塩基若しくは配列または第２の塩基若しくは配列からなる変異部位を含む鋳型配列を増幅するためのプライマーセットを準備する工程であり、前記プライマーセットは、第１のプライマーと第２のプライマーと第３のプライマーとを含み、前記第１のプライマーは、前記鋳型配列に相補的な第１の配列と第２の配列とを前記第１のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含み、更に第１のプライマーは前記第１の配列と前記第２の配列の間に、当該鋳型配列とは異なり且つ相補的ではない配列からなる第１のタグ配列を含み、前記第１の配列は、前記変異部位の第１の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含み、前記第２のプライマーは、前記鋳型配列に相補的な第３の配列と第４の配列とを前記第２のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含み、更に第２のプライマーは前記第３の配列と前記第４の配列の間に、当該鋳型配列とは異なり且つ相補的ではない配列からなる第２のタグ配列を含み、前記第３の配列は、前記変異部位の第２の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含み、前記第３のプライマーは、前記第１のプライマーまたは前記第２のプライマーとの組み合わせにおいて当該鋳型配列を増幅するための配列を含む、工程と、
（ｃ）（ｂ）で準備された全ての前記プライマーセットを１つの反応槽内に持ち込み、前記検体について増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、
（ｄ）基体に固定化され、前記第１のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブと、前記基体に固定化され、前記第２のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第２の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブと、（ｃ）で得られた増幅産物とを反応させる工程と、
（ｅ）（ｄ）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、検体に含まれる核酸を解析する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、第１のタグ配列と第２のタグ配列とが異なる配列である方法。
【請求項３】
請求項１に記載の解析方法であって、前記増幅反応がＬＡＭＰ法であり、前記鋳型配列が、その5’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含み、前記変異部位が前記Ｆ２領域に含まれ、前記プライマーセットが、以下からなる群より選択される少なくとも１のプライマーセットを含む方法；
（１）ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共に当該ＦＩＰプライマーであり、第３のプライマーが当該ＢＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有するプライマーセット、
（２）ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーであり、第３のプライマーがＦＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有するプライマーセット、
（３）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共に当該ＦＩＰプライマーであり、第３のプライマーが当該ＢＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、前記Ｆ３プライマーは前記Ｆ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、前記Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有するプライマーセット。
（４）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーであり、第３のプライマーがＦＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有し、前記Ｆ３プライマーは前記Ｆ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、前記Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有するプライマーセット、
（５）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーおよび／またはＬＦｃプライマーおよび／またはＬＢｃプライマーを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共に当該ＦＩＰプライマーであり、第３のプライマーが当該ＢＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおける前記Ｆ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、前記Ｆ３プライマーは前記Ｆ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、前記Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有し、前記ＬＦｃプライマーは前記ＬＦ領域に相補的な配列ＬＦｃを有し、前記ＬＢｃプライマーは前記ＬＢｃ領域と同じ配列を有するプライマーセット。
（６）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含み、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーであり、第３のプライマーがＦＩＰプライマーであるプライマーセットであり、当該ＢＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、前記第１のタグ配列は、前記第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第２のタグ配列は、前記第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおける前記Ｂ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれ、前記第１のタグ配列と第２のタグ配列は互いに異なり、前記ＦＩＰプライマーは、その５’末端側に前記Ｆ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側に前記Ｆ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有し、前記Ｆ３プライマーは前記Ｆ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、前記Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有し、前記ＬＦｃプライマーは前記ＬＦ領域に相補的な配列ＬＦｃを有し、前記ＬＢｃプライマーは前記ＬＢｃ領域と同じ配列を有するプライマーセット。
【請求項４】
前記第１のタグ配列および第２のタグ配列のそれぞれが、第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれの３’末端から４塩基目から８塩基目に含まれる請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のタグ配列および第２のタグ配列のそれぞれが、第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれの３’末端から５塩基目または６塩基目に含まれる請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該変異部位に相補的な塩基または配列が、前記第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれの３’末端から１塩基目から４塩基目に含まれる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該変異部位に相補的な塩基または配列が、前記第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれの３’末端から２塩基目または３塩基目に含まれる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のタグ配列および第２のタグ配列のそれぞれの塩基長が３塩基〜７塩基である請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のプライマーが前記変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅し、前記第２のプライマーが前記変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅する請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法において使用されるプライマーセットを含むアッセイキットであって、解析されるべき核酸が、第１の塩基若しくは配列または第２の塩基若しくは配列からなる変異部位を含む核酸であり、前記プライマーセットは、第１のプライマーと第２のプライマーと第３のプライマーとを含み、前記第１のプライマーは、前記鋳型配列に相補的な第１の配列と第２の配列とを前記第１のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含み、更に第１のプライマーは前記第１の配列と前記第２の配列の間に当該鋳型配列とは異なり且つ相補的ではない配列からなる第１のタグ配列を含み、前記第１の配列は、前記変異部位の第１の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含み、前記第２のプライマーは、前記鋳型配列に相補的な第３の配列と第４の配列とを前記第２のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含み、更に第２のプライマーは前記第３の配列と前記第４の配列の間に、第２のタグ配列を含み、前記第３の配列は、前記変異部位の第２の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含み、前記第３のプライマーは、前記第１のプライマーまたは前記第２のプライマーとの組み合わせにおいて当該鋳型配列を増幅するための配列を含むアッセイキット。
【請求項１１】
更に、基体上に固定化され、前記第１のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブと、前記基体上に固定化され、前記第２のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第２の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブとを具備する請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１２】
前記第１のプライマーが前記変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅するためのプライマーであり、前記第２のプライマーが前記変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅するためのプライマーである請求項９〜１１の何れか１項に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、核酸の解析方法およびそこにおいて使用されるアッセイキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
１つの生物種集団においても、ゲノム塩基配列には多様性がある。この多様性は、例えば、数塩基の変異によるものである。ゲノム塩基配列において１塩基が変異しているとき、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られる場合には、これを一塩基多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）と呼ぶ。これに対して、その変異が集団内で１％未満である場合、即ち、対立遺伝子頻度が１％未満である場合、これを突然変異と呼ぶ。
【０００３】
ＳＮＰなどの数塩基変異からは、目的とする生物の遺伝的背景を調べることができる。原因遺伝子がわかっている遺伝病については、その遺伝病の発生について将来的な危険率を診断することができる。ＳＮＰを利用した連鎖解析によって、疾患関連遺伝子の特定が行うことも期待されている。例えば、アルコールに対する強さなどの遺伝的な要因は、主にアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＬＤＨ２）のＳＮＰに依存することが知られている。
【０００４】
近年、臨床での応用が期待される遺伝子のＳＮＰが数多く見出されている。例えば、それは、薬剤代謝に関与する酵素チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリーや抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ−２）、経口抗凝固剤ワーファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９とＶＫＯＲＣ１などである。これらの遺伝子に、酵素活性を低下するＳＮＰがあり、更に薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれると、薬剤を投与された患者に薬剤の効果が必要以上に強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されることもある。他方、薬剤の活性化を阻害するＳＮＰがあると、投薬量の増加などの処置が必要となる。薬剤の投薬前に、このようなＳＮＰについて検査し、遺伝子の型を判定することにより、適切な薬剤の投薬量の決定ができる。それにより副作用の低減または回避が可能になる。また、それにより効率的に治療効果が得ることができる。
【０００５】
遺伝情報を利用することにより、患者個々の体質に応じて行う医療は、「テーラーメイド医療」、「オーダメイド医療」または「個別化医療」と呼ばれている。このような医療により、不適当な投薬が改善され、副作用も低減される。それにより、医療費削減も期待できる。
【０００６】
細菌やウィルスにおいては、１塩基多型や１塩基変異の存在により、特定の薬剤が効かないケースが存在する。このような場合には、細菌およびウィルスの遺伝子型を判別することにより、有効な治療法を選択することが可能となる。
【０００７】
産業分野においては、家畜やペット、さらには米の種判別にもＳＮＰ解析が有効である。遺伝子解析を利用して品種判定を行うことにより、育成者の知的財産権の保護、産地偽装の防止に役立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３９３７１３６号公報
【特許文献２】特許第３９４２６２７号公報
【特許文献３】特許第４７２１８０３号公報
【特許文献４】特開２００３−１５９１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
数塩基の変異を高い精度で解析する簡便、安価な核酸解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
実施態様による核酸の解析方法は、検体を準備する工程と、第１または第２の塩基からなる変異部位を含む鋳型配列を増幅するプライマーセットを準備する工程と、１つの反応槽においてプライマーセットにより検体について増幅反応を行って増幅産物を得る工程と、標的配列に相補的な核酸プローブと増幅産物とを反応させる工程と、生じたハイブリダイゼーション量を検出し、検体に含まれる核酸を解析する工程とを含む。プライマーセットは、第１および第２のプライマーと、これと対の第３のプライマーとを含む。第１プライマーは、３’側に第１の塩基からなる変異部位に相補的な配列を含み、鋳型核酸の一部分に相補的な配列と、タグ配列とを含む。第２のプライマーは、３’側に第２の塩基からなる変異部位に相補的な配列を含み、鋳型核酸の一部分に相補的な配列と、タグ配列とを含む。タグ配列は、第１および第２のプライマーが相補鎖に結合した際にループアウトする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態の概念図を示す図。
【図２】実施形態の概念図を示す図。
【図３】実施形態の概念図を示す図。
【図４】ＤＮＡチップの１例を示す図。
【図５】ＤＮＡチップの１例を示す図。
【図６】増幅試薬一体化ＤＮＡチップの例を示す図。
【図７】競合Ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ反応させた産物を制限酵素処理し、電気泳動した結果を示す図。
【図８】チップにより検出した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１３】
［定義］
「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。例えば、核酸は、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってよい。
【００１４】
「検体」とは、本実施形態に従い解析方法を行なうべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、検体は液体であってもよい。
【００１５】
検体に含まれる核酸を「検体核酸」と称する。検体核酸のうち、プライマーにより増幅しようとする配列を「鋳型配列」と称す。鋳型配列を含む核酸を「鋳型核酸」または「鋳型」と称す。
【００１６】
「変異部位」とは、解析されるべき核酸において変異が存在する位置をいう。多様性に関連する数塩基の変異は、母集団における頻度の違いにより「多型」または「突然変異」と呼ばれるが、ここにおいては便宜上、「多型」および「突然変異」を総称して「変異」と呼ぶ。実施形態により、鋳型配列に存在する１つの変異部位を構成する数塩基、例えば、１塩基が、いずれの塩基であるか、または、２塩基または３塩基がどのような配列であるかが特定される。
【００１７】
「標的核酸」とは、鋳型核酸または鋳型配列を、プライマーセット、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅して得られた増幅産物をいう。標的核酸は、その一部に標的配列を含む。標的配列は、タグ配列と鋳型配列の一部の配列とからなる。また標的配列は、変異部位に対応する塩基または配列を含む。また、好ましくは標的配列は、鋳型配列由来の領域も含む。当該標的配列は、核酸プローブを用いて標的核酸を検出するために利用される。
【００１８】
鋳型配列由来の領域とは、プライマーによって増幅される領域のうち、プライマーが結合する領域以外の領域で鋳型の配列が反映される領域を意味する。ここで、鋳型の配列を反映している領域とは、鋳型に含まれる一部分の配列と同一な配列であるか、鋳型に含まれる一部分の配列に相補的な配列であればよい。「鋳型配列由来の領域」の配列を「鋳型配列由来の配列」または「鋳型配列に由来する配列」と称する。
【００１９】
２つの配列が「同一」とは、２つの配列がその全長に亘り、９０％以上、９５％以上、９８％以上または１００％で互いに等しい配列をいう。２つの配列が「相補的である」とは、２つの配列がその全長に亘り、９０％以上、９５％以上、９８％以上または１００％で互いに相補的な配列をいう。
【００２０】
「核酸プローブ」とは、標的配列に対して相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは、それ自身公知の固相に対して固定化されてもよい。好ましい核酸プローブは、基体表面に固定化されて使用される。そのような基体と、基体に固定化された核酸プローブとを含む装置は、一般的にＤＮＡチップにより行われてよい。
【００２１】
「ＤＮＡチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。ＤＮＡチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００２２】
１．核酸の解析方法
実施形態に従う核酸の解析方法は、数塩基の変異、例えば、１塩基または連続した２塩基若しくは連続した３塩基の変異について、その塩基の種類および配列を明らかにする方法である。数塩基の変異の検出を精度よく行うことは従来の方法では困難である。実施形態は、このような数塩基の変異を精度よく、且つ簡便に測定することを可能にする。
【００２３】
例えば、当該核酸の解析方法は、ある核酸について、その変異部位の塩基または配列が野生型であるか、または変異型であるかを判定することが可能である。
【００２４】
プライマーセットにより増幅される鋳型配列は、その一部分に変異部位を含む。変異部位には、１塩基、連続する２塩基または塩属する３塩基からなる変異が存在する。変異部位の塩基または配列により、その鋳型配列が野生型であるか、または変異型であるのかが判定される。即ち、この方法によれば、ある変異部位の塩基の種類または配列を特定することが可能である。
【００２５】
例えば、検体核酸が、野生型であるか、変異型であるかを判定する場合には、次のようなプライマーセットが用意される。野生型を増幅するための第１のプライマーと、変異型を増幅するための第２のプライマーと、第１のプライマーまたは第２のプライマーと共に鋳型配列を増幅するための第３のプライマーとを含むプライマーセットが使用される。例えば、ＰＣＲ法を使用する場合、第１のプライマーおよび第２のプライマーは、フォワードプライマーであり、第３のプライマーはリバースプライマーであってもよい。或いは、第１のプライマーおよび第２のプライマーはリバースプライマーであり、第３のプライマーはフォワードプライマーであってもよい。
【００２６】
第１のプライマーおよび第２のプライマーは、変異部位の塩基の種類および配列に依存した増幅効率を達成できるように、その３’末端付近に変異部位に相補的な塩基または配列を含む。更に、変異部位の塩基の種類および配列に依存した増幅効率をより精度よく達成するためにタグ配列を含む。第１のプライマーが含むタグ配列と、第２のプライマーがタ含むタグ配列の配列を互いに異なる場合、後述するハイブリダイズを利用する検出時に精度よく変異部位の型の識別を可能にするためにより有利である。
【００２７】
フォワードプライマーにタグ配列を導入する場合には、フォワードプライマーが第１のプライマーおよび第２のプライマーである。リバースプライマー第３のプライマーである。リバースプライマーにタグ配列を導入する場合には、リバースプライマーが第１のプライマーおよび第２のプライマーである。フォワードプライマーが第３のプライマーである。
【００２８】
第１のプライマーについては、第１のプライマーが伸長する方向である３’末端近傍に野生型の鋳型配列の変異部位の塩基または配列に相補的な塩基を含むように第１のプライマーは設計される。また、第１のプライマーには、この変異部位に対応する塩基または配列よりも５’側にタグ配列が含まれる。タグ配列は、鋳型配列に結合しないように、相補配列と異なる配列を有する。これにより、第１のプライマーが鋳型配列に結合した際には、この結合により生じた２本鎖核酸からタグ配列はループアウトする。また、言い換えると、第１のプライマーは、３つの部分、即ち、第１の配列と、第２の配列と、第１の配列と第２の配列との間に存在するタグ配列とを含む。第１の配列と第２の配列により、第１のプライマーは鋳型配列に結合し、タグ配列は鋳型配列に結合せずにループアウトする。
【００２９】
第２のプライマーの設計は、変異型の鋳型配列の変異部位の塩基または配列に相補的な塩基が第２のプライマーが伸長する方向である３’末端近傍に配置される。この構成以外は、第１のプライマーの設計と同様に行われる。
【００３０】
第３のプライマーは、第１のプライマーまたは第２のプライマーと共に鋳型配列を増幅する配列を有するプライマーである。即ち、第３のプライマーは、鋳型配列の相補鎖において、第１のプライマーが結合する配列に対応する領域よりも３’側に存在する。
【００３１】
プライマーセットを準備した後に、これらの第１のプライマー、第２のプライマーおよび第３のプライマーを用いて、１つの反応槽内で検体について増幅反応を行う。それにより反応槽内では、第１のプライマーと第３のプライマーとによって野生型の鋳型配列が増幅される第１の増幅反応と、第２のプライマーと第３のプライマーとによって変異型の鋳型配列が増幅される第２の増幅反応とが競合的に進行する。
【００３２】
その後、増幅反応により得られた増幅産物を核酸プローブセットを用いて検出する。核酸プローブセットは、野生型の鋳型配列に由来する増幅産物を検出するための第１の核酸プローブと、変異型の鋳型配列に由来する増幅産物を検出するための第２の核酸プローブとを含む。第１の核酸プローブは、野生型の変異部位に対応する配列を含む標的配列に相補的な配列である。第２の核酸プローブは、変異型の変異部位に対応する配列を含む標的配列に相補的な配列である。
【００３３】
例えば、第１の核酸プローブのための標的配列は、変異部位と鋳型配列由来の領域と第１のプライマーに由来するタグ配列を含む。第２の核酸プローブは、変異部位と鋳型配列由来の領域と第２のプライマーに由来するタグ配列を含む。
【００３４】
増幅産物と第１および第２の核酸プローブとのハイブリダイズ量を検出することにより、検体に含まれる核酸が野生型であるのか、変異型であるのか、或いはヘテロであるのかを判定する。
【００３５】
実施形態の核酸の解析方法は、上述したような遺伝子などの核酸について野生型および／または変異型を判定する以外にも、特定の変異部位についてその塩基の種類またはその配列の種類について判定することが可能である。そのような方法は、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む。
【００３６】
（ａ）鋳型核酸を含む検体を準備する工程
鋳型核酸を含む検体の準備は次のように行われる。まず、個体から採取される液体および／または固体であればよい。個体が動物である場合、例えば、血液、血清、白血球、リンパ液、髄液、腹腔液、唾液、精液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰および乳汁などの体液、尿および糞便などの排泄物を試料として採取する。その後、遠心、沈殿、抽出および／または分離などの処理を試料に行い、核酸の増幅およびハイブリダイゼーションに適切である状態にする。また、採取された試料が、そのままで核酸の増幅およびハイブリダイゼーションに適切である場合には、採取された試料を検体として使用してよい。検体は、動物に由来する試料のみならず、土壌、河川、湖沼、海および大気などから採取されてもよい。検体は、鋳型核酸を含む可能性があればよく、実施形態の核酸解析方法を行った結果、鋳型核酸を含まないと判定されることもある。
【００３７】
鋳型核酸は、例えば個体のゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどであってよい。個体は、これらに限定されるものでないが、ヒト、ヒト以外の動物、植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物であってよい。微生物から直接抽出される。核酸の抽出は、これらに限定されないが、市販の核酸抽出キットであるＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）などを利用して実行することができる。
【００３８】
（ｂ）プライマーセットの準備
図１を参照しながら鋳型配列とプライマーセットの構成について説明する。鋳型核酸１は、プライマーセットにより増幅されるべき鋳型配列２を含む。鋳型配列２は、変異部位３を含む。第１のプライマー４は、鋳型配列２の一部分に相補的な配列を含む。第１のプライマー４は、その３’末端近傍に変異部位３に相補的な部位５を含む。
【００３９】
第１のプライマー４は、第１の配列６、第２の配列７、第１の配列６と第２の配列７の間に含まれるタグ配列８を含む。第１の配列６は、第１のプライマー４の３’側に存在し、第２の配列７は５’側に含まれる。第１の配列６と第２の配列７は、鋳型配列２に相補的な配列を有する。タグ配列８は、鋳型配列２の同一でもなく、また相補的でもない。このような構成により、第１のプライマー４は、鋳型配列２に対して第１の配列６と第２の配列７を介して結合する。第１のプライマーが鋳型核酸に結合した際には、タグ配列は結合により生じた二本鎖からループアウトする。
【００４０】
第３のプライマー９は、第１のプライマー４と共に、鋳型配列２を増幅するために使用される。第３のプライマー９は、鋳型核酸１の相補鎖１０に結合する。第３のプライマー９の相補鎖１０への結合部位は、鋳型核酸１を基準として、鋳型核酸１上の第１のプライマー４が結合する領域１１よりも５’側の鋳型核酸１上の領域１２に対応する相補鎖１０の領域１３である。従って、第３のプライマーは、相補鎖１０の配列に相補的であり、且つ鋳型核酸１上の領域１２と同じ配列を有する。
【００４１】
このように、鋳型核酸１は、鋳型配列２を有し、且つ第１のプライマー４が結合する領域１１と、第２のプライマーと同じ配列を有する領域１２と、領域１１と領域１２の間に存在する鋳型配列由来の領域１４とを有する。
【００４２】
タグ配列は、Ａ、Ｔ、Ｃおよび／またはＧからなる連続する塩基からなる配列で構成されてもよく、修飾されたそれ自身公知の核酸により構成されてもよく、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇおよび／または修飾塩基により構成されてもよい。タグ配列を構成する核酸の種類は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質であれば特に限定されない。
【００４３】
タグ配列の塩基数は、２塩基以上、３塩基以上、４塩基以上であればよく、例えば、２塩基〜１０塩基、好ましくは３塩基〜７塩基である。タグ配列に含まれる塩基の種類は、１種類、１種類以上、例えば、２種類、２種類以上、例えば、３種類、４種類、５種類、７種類などであってよい。
【００４４】
例えば、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからなる連続する４塩基でタグ配列を構成する場合には、４５となり１０２４通りの配列がタグ配列の候補となる。しかしながら、ミスマッチハイブリダイゼーションの危険性を避けるために、好ましくは連続する２塩基以上、より好ましくは連続する３塩基の長さの異なる塩基の組み合わせからなる配列をタグ配列として使用することが好ましい。タグ配列は、それを含む第１または第２のプライマーがその相補鎖である鋳型核酸に結合した際に、タグ配列は鋳型核酸には結合せずにループアウトように設計される。例えば、タグ配列は、鋳型配列およびその相補鎖の配列とは異なる配列を含む。
【００４５】
タグ配列の長さは、ループアウトすることが可能であり、且つそれを含むプライマーが鋳型核酸を増幅しうる範囲内であればいい。タグ配列は、連続する３塩基〜７塩基が好ましい。
【００４６】
第１および第２のプライマーの長さはタグ配列を除いて１３〜４０塩基、例えば、１５〜３０塩基であってよい。
【００４７】
タグ配列の第１および第２のプライマーへの挿入位置は、特異増幅に重要なポイントとなる。３’末端側に近すぎると増幅は不安定になり、３’末端側から遠すぎると特異性が低くなる。第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’末端から２塩基目〜１０塩基目であってよく、好ましくは、３’末端から４塩基目〜８塩基目であり、より好ましくは５塩基目または６塩基目である。第１のプライマーおよび第２のプライマーに含まれる変異部位に対応する塩基または配列の当該プライマーにおける位置も、同様に特異増幅に重要なポイントとなる。好ましくは、第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’末端側から１塩基目〜５塩基目であり、より好ましくは２塩基目または３塩基目である。
【００４８】
増幅法としてＰＣＲ法を利用する場合には、タグ導入野生型増幅用プライマーおよびタグ導入変異型増幅用プライマーはフォワードプライマー（Ｆプライマー）またはリバースプライマー（Ｒプライマー）のどちらであってもよい。
【００４９】
増幅法は、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＰＣＲ法）、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＩＣＡＮ法）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＮＡＳＢＡ法）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＳＤＡ法）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＲＣＡ法）などの方法を用いることができる。得られた増幅産物は、必要に応じて断片化されるか、１本鎖化される。１本鎖化する手段としては、例えば、熱変性、ビーズや酵素等を用いる方法、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行う方法がある。さらに１本鎖を形成するようなループ形成プライマーを用いても良い。
【００５０】
検体に含まれる核酸がＲＮＡの場合には、増幅前に例えば逆転写酵素によって相補鎖ＤＮＡに変換することができる。逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両方を同一チューブ内に添加し、逆転写とＤＮＡ増幅を同時に行ってもよい。
【００５１】
ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などによって増幅され、産物中に１本鎖領域が存在し、この１本鎖領域を標的配列とする場合には、そのままハイブリダイゼーション工程に供することができる。
【００５２】
この一本鎖化工程が不要となるため、増幅により得られた標的核酸はステム・ループ構造を有することが好ましい。ステム・ループ構造を有する増幅産物は、１本鎖であるループ部分の配列を核酸プローブとの反応に都合よく用いることができる。
【００５３】
標的核酸の増幅には、ＬＡＭＰ法（例えば、特許第３３１３３５８号を参照されたい）が好適に用いられる。ＬＡＭＰ法は、迅速かつ簡便な遺伝子増幅法であり、増幅産物中にステム・ループ構造を有している。ＬＡＭＰ法では、鋳型核酸の最大８つの領域を認識する６種類のプライマーと鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いる。鋳型核酸は、等温（６０〜７０℃）条件下で増幅される。
【００５４】
鋳型核酸の上記８つの領域について図２を用いて説明する。当該８つの領域は、鋳型核酸の５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域、Ｆ１領域、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域、及びＢ１ｃ領域と定義される。なお、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３領域はそれぞれ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃ領域の相補鎖における領域を示している。図２に示す８種のプライマーは、５’末端側にＦ１領域と相補的な配列Ｆ１ｃをもち３’末端側にＦ２領域と同じ配列Ｆ２をもつＦＩＰインナープライマー、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列Ｂ１ｃをもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列Ｂ２をもつＢＩＰインナープライマー、Ｆ３領域と同じ配列Ｆ３をもつＦ３プライマー、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列Ｂ３をもつＢ３プライマー、ＬＦ領域と相補的な配列ＬＦｃをもつＬＦｃプライマー、ＬＢｃ領域と同じ配列ＬＢｃをもつＬＢｃプライマーである。増幅反応に必須なのはＦＩＰインナープライマー（ＦＩＰプライマー）、ＢＩＰインナープライマー（ＢＩＰプライマー）であり、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、増幅効率を高めるために添加される。ＬＡＭＰ法による増幅産物中にはループ構造が形成され、Ｆ２領域、Ｂ２領域は１本鎖の領域となる。
【００５５】
タグ配列を含ませる第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＦＩＰプライマーまたはＢＩＰプライマーであればよい。タグ配列は、ＦＩＰプライマーまたはＢＩＰプライマーの伸長開始部分である３’末端近傍、即ち、配列Ｆ２または配列Ｂ２の中に含ませる。
【００５６】
上記８つの領域を有する鋳型核酸１は、第１のプライマーであるＦＩＰプライマーの３’側の配列Ｆ２が鋳型核酸１のＦ２ｃ領域に結合する。この結合は、配列Ｆ２に含まれる第１の配列６と第２の配列７により達成される。即ち、第１の配列６および第２の配列７は、鋳型核酸１のＦ２ｃ領域の配列に相補的である。第１のプライマーは、配列Ｆ２の第１の配列６と第２の配列７との間にタグ配列８を含む。タグ配列８は、タグ配列８は、鋳型配列２の同一でもなく、また相補的でもない。このような構成により、第１のプライマー４は、鋳型配列２に対して第１の配列６と第２の配列７を介して結合する。第１のプライマーが鋳型核酸に結合した際には、タグ配列は結合により生じた二本鎖からループアウトする。
【００５７】
第３のプライマー９は、第１のプライマー４と共に鋳型配列を増幅するために使用される。ＬＡＭＰ法を利用する場合、第３のプライマーは、ＢＩＰプライマーである。第３のプライマー９は、鋳型核酸１の相補鎖１０に結合する。第３のプライマー９の相補鎖１０への結合は、ＢＩＰプライマーの配列Ｂ２を介して行われる。即ち、第３のプライマー９の配列Ｂ２は、鋳型核酸１の相補鎖１０のＢ２ｃ領域に相補的である。
【００５８】
或いは、第１および第２のプライマーはＢＩＰプライマーであってもよい。その場合、第３のプライマーはＦＩＰプライマーである。この場合についてもＦＩＰプライマーと同様にプライマーを設計すればよい。
【００５９】
ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーと標的配列が重なる場合には、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーは添加しない方が好ましい。
【００６０】
プライマーセットの１例は、次のようにＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含むプライマーセットである。
【００６１】
第１のプライマーおよび第２のプライマーは共にＦＩＰプライマーである。第３のプライマーはＢＩＰプライマーであるプライマーセットである。ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。
【００６２】
上述のような第１のプライマー、第２のプライマーおよび第３のプライマーを含むプライマーセットを用いて、１つの反応槽において検体に含まれる核酸を増幅する。増幅反応は、選択する増幅方法およびそれ自身公知の各種条件に応じて、当業者が適宜選択してよい。
【００６３】
プライマーセットの１例は次の通りである。それは、第１の塩基若しくは配列または第２の塩基若しくは配列からなる変異部位を含む鋳型配列を増幅するためのプライマーセットである。第１のプライマーは、鋳型配列に相補的な第１の配列と第２の配列とを第１のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含む。更に第１のプライマーは第１の配列と第２の配列の間に鋳型配列と相補的ではない配列からなる第１のタグ配列を含む。第１の配列は、前記変異部位の第１の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含む。
【００６４】
第２のプライマーは、鋳型配列に相補的な第３の配列と第４の配列とを第２のプライマーの３’側および５’側にそれぞれ含む。更に第２のプライマーは第３の配列と第４の配列の間に、第２のタグ配列を含む。第３の配列は、変異部位の第２の塩基若しくは配列に相補的な塩基若しくは配列を含む。第１のタグ配列と第２のタグ配列は、一塩基以上互いに異なっている。
【００６５】
第３のプライマーは、第１のプライマーまたは第２のプライマーとの組み合わせにおいて当該鋳型配列を増幅する配列を含む。
【００６６】
また、ＬＡＭＰ法により鋳型核酸を増幅する場合のプライマーセットの１例は、以下の（１）〜（６）からなる群より少なくとも１選択されるプライマーセットを含んでよい。まず、プライマーセットに増幅しようとする鋳型配列は、その5’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む。変異部位はＦ２領域に含まれる。
【００６７】
（１）ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーは共にＦＩＰプライマーである。第３のプライマーはＢＩＰプライマーであるプライマーセットである。ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。
【００６８】
第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の前記変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。
【００６９】
ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。
【００７０】
（２）ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーである。第３のプライマーがＦＩＰプライマーである。ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。
【００７１】
（３）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーは共にＦＩＰプライマーである。第３のプライマーはＢＩＰプライマーである。第１、第２および第３のプライマーに加えて、更なるプライマーを含む。
【００７２】
ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。
【００７３】
第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。
【００７４】
ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。
【００７５】
Ｆ３プライマーはＦ３領域と同じ配列Ｆ３を有する。Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有する。
【００７６】
（４）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーである。第３のプライマーがＦＩＰプライマーである。ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。
【００７７】
ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。Ｆ３プライマーはＦ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有する。
【００７８】
（５）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーおよび／またはＬＦｃプライマーおよび／またはＬＢｃプライマーを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーが共にＦＩＰプライマーであり、第３のプライマーがＢＩＰプライマーである。ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。
【００７９】
第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＦＩＰプライマーにおけるＦ２配列中の変異部位に対応する部位よりも５’側に含まれ、第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。
【００８０】
ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有し、Ｆ３プライマーはＦ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有する。
【００８１】
ＬＦｃプライマーはＬＦ領域に相補的な配列ＬＦｃを有し、ＬＢｃプライマーはＬＢｃ領域と同じ配列を有する。
【００８２】
（６）ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、並びにＦ３プライマーおよび／またはＢ３プライマーを含むプライマーセット
第１のプライマーおよび第２のプライマーが共にＢＩＰプライマーである。第３のプライマーがＦＩＰプライマーである。ＢＩＰプライマーは、その５’末端側にＢ１ｃ領域の配列と同じ配列Ｂ１ｃを有し、３’末端側にＢ２ｃ領域の配列に相補的な配列Ｂ２を有する。第１のタグ配列は、第１のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第２のタグ配列は、第２のプライマーのためのＢＩＰプライマーにおけるＢ２配列中の変異部位に対応する部位よりも３’側に含まれる。第１のタグ配列と第２のタグ配列は一塩基以上互いに異なっている。ＦＩＰプライマーは、その５’末端側にＦ１領域の配列に相補的な配列Ｆ１ｃを有し、３’末端側にＦ２領域の配列と同じ配列Ｆ２を有する。Ｆ３プライマーはＦ３領域と同じ配列Ｆ３を有し、Ｂ３プライマーは、Ｂ３ｃ領域に相補的な配列Ｂ３を有する。ＬＦｃプライマーはＬＦ領域に相補的な配列ＬＦｃを有する。ＬＢｃプライマーはＬＢｃ領域と同じ配列を有する。
【００８３】
１つの反応槽において、第１のプライマー、第２のプライマーおよび第３のプライマーを含むプライマーセットを用いて検体に含まれる核酸を増幅すると、第１のプライマーと第２のプライマーが、第３のプライマーを争い競合的に増幅反応が進む。従って、遺伝子形質がホモである検体のみならず、ヘテロである検体についても精度よく検出することが可能である。
【００８４】
例えば、鋳型配列が野生型の場合、野生型を増幅するためのプライマーのみから増幅が進行する。鋳型配列が変異型の場合、変異型を増幅するためのプライマーのみから増幅が進行する。ヘテロ型の場合には、野生型を増幅するためのプライマーおよび変異型を増幅するためのプライマーの両方から増幅が進行する。野生型を増幅するためのプライマーと変異型を増幅するためのプライマーは、等量ずつ混ぜて使用されてもよく、反応効率によって量比を変えてもよい。増幅産物は、そのままＤＮＡチップ上の核酸プローブとハイブリダイゼーションさせてよい。或いは、増幅産物を熱変性および／またはＳＳＣなどの塩の添加の後に、核酸プローブとハイブリダイゼーションさせてもよい。
【００８５】
更に、鋳型核酸が含む変異部位の配列が、３つ以上の種類の配列を取り得る場合には、使用する第１のプライマーおよび第２のプライマーに加えて、変異部位に対応する領域の配列を変更した更なるプライマーを使用すればよい。
【００８６】
（ｃ）核酸プローブによる検出
増幅産物と核酸プローブセットとを反応することにより、検体に含まれる核酸の変異部位の塩基の種類または配列についての情報を得ることができる。
【００８７】
核酸プローブセットは、第１のプライマーにより生じた増幅産物を検出するための第１の核酸プローブと、第２のプライマーにより生じた増幅産物を検出するための第２の核酸プローブとを含む。
【００８８】
核酸プローブの設計について、図３を用いて説明する。図３は、図１の鋳型核酸１およびその相補鎖１０、並びに第１のプライマー４および第２のプライマー９に加えて、核酸プローブ３１を記載した図である。
【００８９】
核酸プローブ３１は、増幅産物中の標的配列に相補的な配列を含む。標的配列は、タグ配列８と、変異部位３に同じ塩基または配列を含む（図３（ａ）を参照）。好ましくは、標的配列は、タグ配列８と、変異部位３に同じ塩基または配列と、鋳型配列由来の領域を含む（図３（ｂ）を参照）。
【００９０】
更に、鋳型核酸が含む変異部位の配列が、３つ以上の種類の配列を取り得る場合には、使用する第１のプライマーおよび第２のプライマーに加えて、変異部位に対応する領域の配列を変更した更なるプライマーを使用する。それに伴い、核酸プローブセットは、更なるプライマーから伸長されて生じた増幅産物を検出するための更なる核酸プローブを含んでよい。そのような更なる核酸プローブは、上述の核酸プローブと同様の構成であってよい。
【００９１】
核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲が好ましく、１０〜４０塩基の範囲がより好ましく、１５〜３５塩基の範囲がさらに好ましい。
【００９２】
核酸プローブは基体上に固定化されていることが好ましい。核酸プローブを固定化するための基体、即ち、固相は、一般的にＤＮＡチップのための固相として使用される何れかの基体であればよい。そのような基体は、ガラス、シリコン、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、又は光ファイバーなどによって構成されてよいが、これらに限定されない。これらの基体上に複数種の核酸プローブを固定化し、ＤＮＡチップを構成すればよい
核酸プローブと増幅産物との反応にＤＮＡチップを使用することも可能である。ＤＮＡチップの基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってよい。
【００９３】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００９４】
ＤＮＡチップの例を模式図として図４に示すが、これに限定するものではない。ＤＮＡチップ１００は、基体１０１に固定化領域１０２を具備する。核酸プローブ１０３は該固定化領域１０２に固定化される。このようなＤＮＡチップ１００は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１０１に配置される固定化領域１０２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。
【００９５】
ＤＮＡチップの他の例を図５に示す。図５のＤＮＡチップ２００は、基体２０１に電極２０２を具備する。核酸プローブ２０３は該電極２０２に固定化される。電極２０２は、パット２０４に接続される。電極２０２からの電気的情報はパット２０４を介して取得される。このようなＤＮＡチップ２００は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２０１に配置される電極２０２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。
【００９６】
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム又はタングステンのような金属単体及びそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素又はそれらの酸化物又は化合物を用いることができるが、それらに限定されない。
【００９７】
本例のようなＤＮＡチップは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられてよい。
【００９８】
上述したような増幅反応とＤＮＡチップにおけるハイブリダイズ反応を１つのデバイスにおいて連続し行ってもよい。その場合、ＤＮＡチップの核酸プローブ固定化領域の近傍にプライマーセットを固定化しておけばよい。プライマーセットに加えて、増幅反応に必要な増幅試薬をプライマーセットを固定化する領域と同じ領域および／またはその近傍に固定化してもよい。そのようなデバイスの例を図６に示す。このデバイスは、増幅試薬一体化ＤＮＡチップとも称する。
【００９９】
図６（ａ）は、増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００の平面図であり、図６（ｂ）は、図（ａ）の増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００は、ＤＮＡチップ３０１ａと蓋体３０１ｂとを備える。ＤＮＡチップ３０１ａは、核酸プローブ固定化領域３０２を備え、核酸プローブ固定化領域３０２の近傍または同一デバイス内にプライマーセット固定化領域３０３を備える。核酸プローブ固定化領域３０２には、核酸プローブ３０４が固定化されている。プライマー固定化領域３０２には、プライマーセット３０５が遊離可能に固定化されている。プライマー固定化領域３０２の近傍には、増幅試薬固定化領域３０６が配置されている。増幅試薬固定化領域３０６には、増幅試薬３０７が遊離可能に固定化されている。増幅試薬３０７は、例えば、増幅で必要となる酵素、基質、バッファー類であってよい。
【０１００】
プライマーセット３０５は、核酸プローブ３０４で検出される標的核酸を増幅するためのプライマーセットである。増幅後はダイレクトに核酸プローブ３０４で検出されるか、または増幅後、産物を熱変性し、ＳＳＣなどの塩を混合した後に核酸プローブ３０４で検出される。プライマーセット３０５はアガロース、寒天、ゼラチンなどのゲル化剤で固定化されてもよい。熱乾燥法、真空乾燥法、凍結乾燥などで固定化されてもよい。
【０１０１】
このような増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００を用いることにより、鋳型を含む液体を該増幅試薬一体化ＤＮＡチップに注入し、増幅から検出までを同一反応槽または同一基板上で行う。
【０１０２】
増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００が電気化学的検出を行う場合には、核酸プローブ３０４は、電極３０８上に固定化されればよい。電極３０８は、核酸プローブ固定化領域３０２に露出している。それ以外のＤＮＡチップ３０１ａの表面は絶縁体３２０により被覆されている。電極３０８は、パット３０９に接続される。電極３０８からの電気的情報はパット３０９を介して取得される。
【０１０３】
増幅試薬一体化ＤＮＡチップ３００は、基板３１１の表面に電極３０８およびパット３０９を適切な導電体により形成し、更に、電極３０８およびパット３０９を通電可能に接続する。その後、核酸プローブ固定化領域３０２を規定する円形窓およびパット３を除いた基板３１１の表面を絶縁体３２０で覆う。電極３０８に核酸プローブ３０４を核酸プローブ固定化領域３０２に固定化し、プライマーセット３０５をプライマー固定化領域３０３に遊離可能に固定化する。更に、プライマーセット３０５以外の反応試薬を試薬固定化領域３０６に固定化する。これをＤＮＡチップ３０１ａとする。次に、一面が開口した中空の直方体である蓋体３０１ｂで、ＤＮＡチップ３０１ａ上に固定化された全ての核酸プローブ、プライマーセットおよび増幅試薬を覆って固定する。反応のために、ＤＮＡチップ３０１ａと蓋体３０１ｂとで構成された反応部３１２に検体核酸を含む反応液を添加する。この添加は、例えば、針付きシリンジなどの手段により蓋体３０１ｂを穿刺することにより行ってよい。先に反応液の添加によりプライマーセット３０５および増幅試薬３０７が遊離し、反応液中の核酸（図示せず）と反応する。この反応は、増幅反応に適切な条件により行われる。次に、生じた増幅産物について、核酸プローブ３０４との反応を行う。それにより生じたハイブリダイゼーション量を検出する。検出されたハイブリダイゼーション量から、検体に含まれる核酸の型を判定すればよい。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション温度は、適宜設定すればよい。反応効率を高めるために塩を添加してもよい。また、増幅試薬一体化ＤＮＡチップを用いる場合には、ＤＮＡチップの近傍に塩を固定化し、遺伝子増幅後の液に塩を混ぜてもよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めてもよい。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを洗浄するための洗浄液は、イオン強度が０．０１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜９の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、ＳＳＣ溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、Ｔｗｅｅｎ２０溶液、又はＳＤＳ溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は、例えば１０℃〜７０℃の範囲で行う。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。
【０１０６】
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
【０１０７】
（ａ）蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または２次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
【０１０８】
（ｂ）電気化学的検出方式
当該分野で周知の２本鎖認識物質を用いる。２本鎖認識物質は、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの２本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
【０１０９】
２本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が０．００１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いることができる。
【０１１０】
測定は、例えば２本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、２本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、及びファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。
【０１１１】
２．アッセイキット
本実施形態は、アッセイキットの形態であってもよい。アッセイキットは、上述の核酸の解析方法を行うためのプライマーセット、並びに、核酸プローブ若しくはＤＮＡチップを含めばよい。更に、任意に、酵素、基質、バッファー、取扱説明書などを含んでもよい。
【０１１２】
アッセイキットに含まれるプライマーセットは、上述した何れの第１のプライマーと第２のプライマーと第３のプライマーとを含んでよい。
【０１１３】
アッセイキットは、第１のプライマーが変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅するためのプライマーであり、第２のプライマーが変異位置に存在する野生型の塩基または配列を増幅するためのプライマーであってもよい。
【０１１４】
更に、アッセイキットは、核酸プローブを含んでいてもよい。核酸プローブは、基体上に固定化されていてもよい。核酸プローブは核酸プローブセットとしてアッセイキットに好ましく含まれる。そのような核酸プローブセットは、基体上に固定化され、第１のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブと、基体上に固定化され、前記第２のタグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む第２の標的配列またはその相補配列に相補的な核酸プローブとを備える。
【０１１５】
実施形態により、数塩基の変異、例えば、１塩基または連続した２塩基若しくは３塩基の変異について、その配列を明らかにすることができる。従来の方法では、数塩基の変異の検出を精度よく行うことは困難である。実施形態によれば、このような数塩基の変異を精度よく、且つ簡便に測定することが可能となる。
【０１１６】
また、実施形態により、以下のような従来の一塩基変異の解析方法における種々の問題も解決することが可能である。
【０１１７】
一塩基変異または一塩基多型の検出法は、古くは制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ法）が用いられた。この方法は、操作が煩雑で長時間を要する上、ＳＮＰ部位近辺の塩基配列によっては解析不可能な場合がある。本実施形態によれば、より短い時間に簡便に目的とする核酸を解析することが可能である。
【０１１８】
近年では、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法、ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ、およびＤＮＡチップを用いる方法などが開発されている。ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲは、最も安価、簡便な方法である。しかしながら、この方法は、増幅の特異性が低く、精度が低い。また、この方法に、人為的に更に一ヶ所ミスマッチを入れる方法が提案されている。これは、厳密な条件設定が必要であり、また厳密な温度制御を行っても、配列によっては非特異増幅（即ち、ミス増幅）が発生する。本実施形態によれば、高い精度で、非特異的な増幅を伴うことなく、簡便に目的とする核酸を解析することが可能である。
【０１１９】
簡便、安価な等温増幅法としてＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が提案されている。この方法では、ＳＮＰ位置をフォワードプライマー（ＦＩＰプライマー）とリバースプライマー（ＢＩＰプライマー）の３’末端側（合成の起点）の重なる領域にＳＮＰを位置させる。また、ブロック核酸を導入することにより特異性を高めるという提案がある。しかしながら、これらの方法では、依然として非特異増幅（即ち、ミス増幅）が生じる。複数の一塩基変異または一塩基多型を解析する場合には、一塩基変異または一塩基多型毎に、反応槽および反応条件を変える必要がある。複数の変異または多型を解析するには手間と時間がかかる。本実施形態によれば、少ない反応系において（例えば、１つのチューブ内で）、簡便に且つ非特異的な増幅を伴わずに、より特異的に目的とする核酸を解析することが可能である。
【０１２０】
ＤＮＡチップを用いた方法では、一度に複数の一塩基変異または一塩基多型を解析することができる。この方法は、一塩基が違うターゲットによる非特異的なハイブリダイゼーションが生じる可能性があり、精度の高い検出は難しい。本実施形態によれば、高い精度で、非特異的な増幅を伴うことなく、簡便に目的とする核酸を解析することが可能である。
【０１２１】
［例］
例１  特異増幅が可能となるタグ挿入位置の検討
特異増幅が可能となるタグ挿入位置の検討を行った。
【０１２２】
＜プライマー＞
増幅法はＬＡＭＰ法を用いた。ヒトのＳＡＡ１遺伝子のプロモーター領域の多型Ｃ−１３Ｔを検出するためのプライマーセットを準備した。プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰＦプライマーおよびＢＩＰプライマーからなる。これらのプライマーのうちのＢＩＰプライマーを第１のプライマーおよび第２のプライマーとして使用した。即ち、ＢＩＰプライマーの３’末端側へのタグの組み込みによる増幅効率への影響を検討した。それと同時に、ＢＩＰプライマーに対して、タグを組み込む場合、タグを組み込む基本プライマー位置が増幅効率に影響するか否かを検討した。ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＰＦプライマーの配列を表１に記載する。ここでＦＩＰプライマーの３’末端から２０塩基が鋳型核酸と相補的な配列を有し、ＬＡＭＰ法の第一段階（最初）の増幅のためにプライマーとして機能する部位である。ＦＩＰプライマーの３’末端２０塩基がＦ２領域、５’末端１９塩基がＦ１領域である。
【表１】
2014180278.tif 000003
【０１２３】
使用したＢＩＰプライマーの配列を表２に示す。ＢＩＰプライマーのＢ２の領域が、鋳型核酸の変異部位に対応する塩基を含むように設計した。
【表２】
2014180278.tif 000004
【０１２４】
配列番号５および配列番号６のＢＩＰプライマーは、タグを含まない基本プライマーである。配列番号５および６の白四角で囲んだ塩基の位置が、鋳型核酸の変異部位の位置に対応している。この変異部位において、配列番号５は、鋳型核酸の野生型の塩基「Ｃ」に相補的な塩基「Ｇ」を有する。この変異部位において、配列番号６は、鋳型核酸の変異型の塩基「Ｔ」に相補的な塩基変異型の塩基「Ａ」を有する。この変異部位の塩基以外は、配列番号５と６は同じ配列を有している。
【０１２５】
更に、基本プライマーに対してタグ配列「ＴＴＴＴＴ」を導入したＢＩＰプライマーを準備した。それらの配列は、配列番号７〜２２に示す。タグ配列の導入は、ＢＩＰプライマーの３’末端から３塩基目、４塩基目、５塩基目、６塩基目、７塩基目、８塩基目、９塩基目、１０塩基目に行った。組み込まれたタグ配列の塩基数は何れも５塩基（ＴＴＴＴＴ）であった。
【０１２６】
これらのプライマーについて、野生型増幅用のプライマーと変異型増幅用のプライマーを各々設計した。増幅は、野性型増幅用のプライマーセットと、変異型増幅用のプライマーセットをそれぞれに用いて、個別の反応容器内で行った。即ち、配列番号１〜４と、配列番号５〜２２のうちの何れか１種類とを１つのプライマーセットとして用いて、競合反応させずに、それぞれ単独で増幅反応を行った。
【０１２７】
＜増幅＞
表３の組成で増幅試薬を調製した。
【表３】
2014180278.tif 000005
【０１２８】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析およびシークエンス解析で型判別した２種類のｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｃ／Ｃ型とＴ／Ｔ型を用い、Ｎ＝２で増幅した。増幅装置はリアルタイム濁度測定装置（テラメックス社製）を用い、濁度の立ち上がり時間を増幅速度の指標とした。
【０１２９】
＜結果＞
結果を表４に示す。
【表４】
2014180278.tif 000006
【０１３０】
表４に示すように、タグ配列を挿入していないものは、完全マッチと一塩基ミスマッチで殆ど増幅速度に差が見られなかった。この結果から、タグ配列を挿入しないプライマーの場合には特異的な増幅ができないことが示された。ＦＩＰの３’末端から３塩基目にタグ配列を挿入した場合には、増幅が遅くなった。ＦＩＰの３’末端から９塩基目、１０塩基目の場合には特異性が低下することが示された。ＦＩＰの３’末端から４塩基目から８塩基の結果が良好であった。ＦＩＰの３’末端から５塩基目、６塩基目が完全マッチと一塩基ミスマッチの増幅速度の差が３０分以上となった。
【０１３１】
例２  変異位置の検討
特異増幅が可能となる変異位置の検討を行った。
【０１３２】
＜プライマー＞
表５に記載のプライマーを使用した。変異部位は、ＢＩＰプライマーの３’末端から１塩基目、２塩基目、３塩基目、４塩基目または５塩基目に含まれるようにプライマーを設計した。タグ配列の位置は、ＦＩＰプライマーの３’末端から６塩基目と８塩基目とした。例１と同様に野生型増幅用プライマーと変異型増幅用プライマーを各々設計した。これらについて、競合反応させずにそれぞれ単独で増幅反応を行った。
【表５】
2014180278.tif 000007
【０１３３】
＜増幅＞
例１と同様の方法で行った。
【０１３４】
＜結果＞
表６に示すようにプライマーの変異部位に対応する位置は、ＦＩＰプライマーの３’末端から５塩基目では特異性が低い結果となった。ＦＩＰプライマーの３’末端から１塩基目から４塩基目が好ましい結果が得られた。より特異性が高いのはＦＩＰプライマーの３’末端から２塩基目または３塩基目であった。
【表６】
2014180278.tif 000008
【０１３５】
例３  タグ配列の塩基数の検討
プライマーへ挿入可能なタグ配列の塩基数について検討を行った。
【０１３６】
＜プライマー＞
表７に記載のプライマーを使用した。タグ配列の塩基数について、３塩基から９塩基を検討した。タグ配列の位置は、ＢＩＰプライマーの３’末端から６塩基目とした。変異部位は、ＢＩＰプライマーの３’末端から２塩基目となるように設計した。例１と同様に野生型増幅用プライマーと変異型増幅用プライマーを各々設計し、競合反応させずにそれぞれ単独で増幅させた。
【表７】
2014180278.tif 000009
【０１３７】
＜増幅＞
例１と同様の方法で行った。
【０１３８】
＜結果＞
表８に示すようにタグ配列の塩基数が９塩基の場合に、増幅が不安定になった。タグ配列の塩基数が３塩基から８塩基の場合には増幅が安定しており、特異性も高かった。
【表８】
2014180278.tif 000010
【０１３９】
例４  タグ配列の検討
タグ配列の検討を行った。
【０１４０】
＜プライマー＞
表９、表１０、表１１にそれぞれ示すヒトのＳＡＡ１  Ｃ−１３Ｔ、ＮＡＴ２  ５９０Ａ、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔを検出するためのプライマーを準備した。タグ配列を挿入する位置はＦＩＰプライマーまたはＢＩＰプライマーの３’末端から６塩基目とした。変異部位は、ＦＩＰプライマーまたはＢＩＰプライマーの３’末端から２塩基目とした。タグ配列は、互いに４塩基以上の配列が異なる８種類をタグ配列として設計した（１．ＣＴＣＴＧ、２．ＴＧＡＣＣ、３．ＧＴＧＣＡ、４．ＣＣＴＣＴ、５．ＡＧＴＧＧ、６．ＧＡＣＧＴ、７．ＧＣＡＡＧ、８．ＡＣＧＴＣ）。これをタグ配列として使用した。
【表９】
2014180278.tif 000011
【０１４１】
【表１０】
2014180278.tif 000012
【０１４２】
【表１１】
2014180278.tif 000013
【０１４３】
＜増幅＞
例１と同様の方法で行った。
【０１４４】
＜結果＞
表１２、表１３、表１４の結果から、８種類のタグ配列の中で特異性が高いプライマーを選択した。ＳＡＡ１  Ｃ−１３ＴについてＣ型増幅用のタグプライマーはタグ１、Ｔ型増幅用のタグプライマーはタグ２を選択した。ＮＡＴ２  Ｇ５９０ＡについてＧ型増幅用のタグプライマーはタグ６、Ａ型増幅用のタグプライマーはタグ３を選択した。ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７ＴについてＣ型増幅用のタグプライマーはタグ１、Ａ型増幅用のタグプライマーはタグ２を選択した。
【表１２】
2014180278.tif 000014
【０１４５】
【表１３】
2014180278.tif 000015
【０１４６】
【表１４】
2014180278.tif 000016
【０１４７】
例５  競合ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ反応
競合ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ反応の結果
＜増幅＞
例４で選択したプライマーを用い、表１５、表１６に記載の組成で競合増幅を行った。
【表１５】
2014180278.tif 000017
【０１４８】
【表１６】
2014180278.tif 000018
【０１４９】
＜電気泳動＞
増幅後、ＲＦＬＰを行い増幅産物の解析を行った。ＳＡＡ１  Ｃ−１３ＴはＭｗｏＩ、ＮＡＴ２  Ｇ５９０ＡはＴａｑＩとＴｆｉＩを混合したもの、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７ＴはＳｐｅＩとＰｌｅＩを混合したもので処理した。
【０１５０】
＜結果＞
結果を図７に示す。ＬＡＭＰ−ＲＦＬＰ解析の結果、３遺伝子共に野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型において特異的な増幅ができていることが確認できた。
【０１５１】
例６  増幅試薬一体化ＤＮＡチップでの検出
＜増幅試薬一体化DNAチップの作製＞
ＳＡＡ１  Ｃ−１３Ｔ、ＮＡＴ２  Ｇ５９０Ａ、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔを検出するための核酸プローブを表１７に記載した。
【表１７】
2014180278.tif 000019
【０１５２】
ネガティブコントロールとして上記３遺伝子と無関係な配列を示す核酸プローブを準備した。以上の核酸プローブは、金電極に固定化するために３’末端側をチオール修飾した。核酸プローブの固定化は、チオールと金との強い共有結合性を利用して行った。終濃度１００μＭメルカプトヘキサノール溶液を含む３μＭの核酸プローブ溶液を金電極上１００ｎＬずつスポットし、乾燥させた。同一プローブは各４電極にスポットした。乾燥後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極を得た。さらに、ＤＮＡチップの同一基板上にプライマーと酵素をスポットし、熱乾燥法にて固定化した。プライマーおよび酵素は、４μＬの溶液中に完全に溶出した時に表１５および１６に示す濃度となるように固定化した。
【０１５３】
＜増幅〜検出＞
プライマー、酵素以外の増幅試薬および鋳型を含む液をＤＮＡチップ上に注入し、６２℃で１時間増幅反応を行った。その後、９５℃５分熱をかけた。その後、５５℃で１０分間静置させて、ＬＡＭＰ産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション反応を行った。その後、核酸プローブ固定化電極を０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄し、挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むＰＩＰＥＳ緩衝液中に１分間浸漬した。その後、ヘキスト３３２５８溶液の酸化電流応答を測定した。
【０１５４】
＜結果＞
図８に示すようにチップ検出の結果、クリアな型判別が可能であった。
【図１】
2014180278.tif 000020
【図２】
2014180278.tif 000021
【図３】
2014180278.tif 000022
【図４】
2014180278.tif 000023
【図５】
2014180278.tif 000024
【図６】
2014180278.tif 000025
【図７】
2014180278.tif 000026
【図８】
2014180278.tif 000027
【配列表】
2014180278000001.app