(57)【要約】【課題】効率的に骨形成を行う手法を提供すること。【解決手段】ラクトフェリン及びＢＭＰを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン及びＢＭＰを含む組成物。
【請求項２】
骨誘導用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ラクトフェリン及びＢＭＰ並びに担体を含有する骨補填材。
【請求項４】
担体が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ゼラチン、及びコラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の骨補填材。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の組成物あるいは請求項３又は４に記載の骨補填材を備えた、
骨形成用、骨再生用、あるいは骨形成又は骨再生の補助用のキット。
【請求項６】
ラクトフェリンを含んでなる、ＢＭＰの骨誘導能増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリン及びＢＭＰ（骨形成タンパク質）を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭＰ（Bone Morphogenetic Protein；骨形成タンパク質）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属し、in vivoで骨を誘導するタンパク質であり、皮下組織や筋肉等に埋めることにより、骨を誘導する活性を有する。また、ＢＭＰは骨格形成、骨折治癒などのあらゆる生理的骨形成に必須の役割を担うことが明らかになっており、骨再生の分野では特に注目されている。ただし、臨床的に必要とされる骨量を誘導するためには、大量のＢＭＰが必要となるため、コストが高く、また、副作用の問題が生じるおそれもある。
【０００３】
ラクトフェリンは鉄トランスポーターファミリーに属する約８０ｋＤａの多機能タンパク質であり、母乳や牛乳などの乳や、涙、唾液等、粘膜からの分泌物に多く含まれる。これまでに、ラクトフェリンの機能として、抗菌・抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、抗疼痛作用、免疫調節作用等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Inubushi T et al., Journal of Biological Chemistry. 287(28):23527-36, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的に骨形成を行う手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべき事に、ラクトフェリンとＢＭＰを併用することにより、骨形成を著しく促進できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ラクトフェリン及びＢＭＰを含む組成物。
項２．
骨誘導用である、項１に記載の組成物。
項３．
ラクトフェリン及びＢＭＰ並びに担体を含有する骨補填材。
項４．
担体が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ゼラチン、及びコラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、項３に記載の骨補填材。
項５．
項１又は２に記載の組成物あるいは項３又は４に記載の骨補填材を備えた、
骨形成用、骨再生用、あるいは骨形成又は骨再生の補助用のキット。
項６．
ラクトフェリンを含んでなる、ＢＭＰの骨誘導能増強剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物又は骨補填材は、特に優れた骨誘導能を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ】ラクトフェリンのアルカリフォスファターゼ活性に与える影響を検討した実験において、吸光度を測定する直前のマイクロプレートの各ウェルの写真を示す。なお、図中、ＬＦ又はｂＬＦはウシラクトフェリンを表す（以下の図も同様）。
【図１ｂ】ラクトフェリンのアルカリフォスファターゼ活性に与える影響を検討した実験において、吸光度を測定して算出したアルカリフォスファターゼ活性をグラフ化した図を示す。なお、＊＊は、コントロールと比較して有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図２ａ】ラクトフェリンが、Smad2及びSmad3のリン酸化を促進することをウエスタンブロッティング法により確認した図である。なお、図中、Smad2、Smad3の頭についている「ｐ」は抗phospho-Smad2、もしくは、抗phospho-Smad3抗体により検出されたこと（すなわちリン酸化されているSmad）を示し、「ｔ」は抗Smad2、もしくは抗Smad3抗体により検出されたこと（すなわちリン酸化されているものも含めた全てのSmad）を示す。
【図２ｂ】ラクトフェリンが、Smad4の核内移行を促進することをウエスタンブロッティング法により確認した図である。なお、ＬａｍｉｎＢ１は内在性コントロールである。
【図３】ラクトフェリンが TGF-β receptorに結合するかを、ELISA 法を用いて検討した結果を示す。
【図４ａ】7 週齢雄性マウス頭蓋骨に直径3 mmの骨欠損を作製し、欠損部とほぼ同サイズのコラーゲンゲルディスク（AteloCell. KOKEN, Japan）に（i）ラクトフェリン（125 μg）、（ii）ヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）、（iii）ラクトフェリン（125 μg）+ヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）、をそれぞれ含有させ、これら３種のコラーゲンディスクあるいはコントロールとして何も含有させないコラーゲンディスクを前記欠損部に静置し、５週間経過した際の、骨形成状態を示す画像である。
【図４ｂ】図４ａの画像を基に、骨欠損部の新生骨量を定量し、グラフ化した図である。なお、グラフ中の１〜４は、それぞれ、Ｃｏｎｔがコントロール、ＬＦがラクトフェリン（125 μg）、ＢＭＰがヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）、ＢＭＰ＋ＬＦがラクトフェリン（125 μg）＋ヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）の結果を示す。また、当該グラフの縦軸は面積（μｍ３）を示す。
【図５】ラクトフェリンが、TGF−β受容体又はBMP受容体に与える影響について、RT（reverse transcription）-PCRにより、検討を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、ラクトフェリン及びＢＭＰを含む組成物に係る。
【００１２】
ラクトフェリンとしては、特に制限されず、天然のラクトフェリンを精製して用いることができる。また、遺伝子工学的な手法等により、人工的に製造したラクトフェリンを用いることもできる。より具体的には、乳から精製したラクトフェリンや、大腸菌や昆虫細胞、哺乳類由来細胞等で製造したラクトフェリン（組換えラクトフェリンを含む）を用いることができる。なかでも、哺乳類由来ラクトフェリン（具体的には、哺乳動物の乳等から精製されたラクトフェリンや哺乳動物細胞において製造されたラクトフェリン）が好ましく、ヒトラクトフェリンやウシラクトフェリン等が好ましく例示できる。特に、本発明の組成物は、高い骨誘導能を示すことから、骨誘導のために当該組成物を適用する生物由来のラクトフェリンを用いることが好ましい。例えば、ヒトの骨誘導のために本発明の組成物を用いる場合には、当該組成物に含まれるラクトフェリンはヒトラクトフェリンが好ましい。ラクトフェリンは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１３】
ＢＭＰ（骨形成タンパク質）としては、特に制限はされず、天然のＢＭＰを精製して用いることができる。また、遺伝子工学的な手法等により、人工的に製造したＢＭＰを用いることもできる。より具体的には、大腸菌や昆虫細胞、哺乳類由来細胞等で製造したＢＭＰ（組換えＢＭＰを含む）を用いることができる。なかでも、哺乳類由来ＢＭＰ（具体的には、哺乳動物から精製されたＢＭＰや哺乳動物細胞において製造されたＢＭＰ）が好ましく、ヒトＢＭＰやウシＢＭＰ等が好ましく例示できる。特に、本発明の組成物は、高い骨誘導能を示すことから、骨誘導のために当該組成物を適用する生物由来のＢＭＰを用いることが好ましい。例えば、ヒトの骨誘導のために本発明の組成物を用いる場合には、当該組成物に含まれるＢＭＰはヒトＢＭＰが好ましい。
【００１４】
ヒトＢＭＰとしては、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９等が例示でき、中でもＢＭＰ−２が好ましい。
【００１５】
ＢＭＰは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明のラクトフェリン及びＢＭＰを含む組成物は、優れた骨誘導作用を示す。よって、本発明は、ラクトフェリン及びＢＭＰを含む骨誘導用組成物を包含する。骨誘導作用には、骨形成作用、骨再生作用が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、ラクトフェリン及びＢＭＰ並びに担体を含有する骨補填材を包含する。上記の通り、ラクトフェリン及びＢＭＰを併用することにより、優れた骨誘導能が得られるため、当該骨補填材は優れた骨誘導能を有する。当該骨補填材としては、担体にラクトフェリン及びＢＭＰを含有させたものが好ましい。
【００１８】
ここでの担体は、ラクトフェリン及びＢＭＰを含ませることができるものであれば、特に制限はされないが、生分解性の素材が好ましい。骨補填材として用いるのに好適だからである。
【００１９】
例えば、生体適合性ポリマーが好ましい。生体適合性ポリマーとは、生体に接着させた場合又は埋め込んだ場合に、異物反応が無い若しくは小さい（長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と平和共存できる）ポリマーをいう。生体吸収性ポリマーや生体分解性ポリマーが例示できる。
【００２０】
より具体的には、生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンクロリド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾル）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリウレタン、ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン（超高分子量ポリエチレン含む）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン（ポリビニリデンジフルオライド）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン並びにこれらの共重合体等の合成ポリマー、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム等の生体高分子とその誘導体が例示される。また、キチン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン）、ヒアルロン酸、セリシン、デキストラン、プルラン等も例示される。
【００２１】
これらのうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート及びポリシアノアクリレート、並びにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステル、ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネートなどの脂肪族ポリカーボネート、ゼラチン、コラーゲンを好ましい例として挙げることができ、更に好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲンが挙げられる。なかでもコラーゲンが特に好ましい。
【００２２】
担体は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２３】
本発明は、上記組成物又は骨補填材を備えたキットも包含する。当該キットは、骨形成用、骨再生用、あるいは骨形成又は骨再生の補助用として好ましく用いることができる。当該キットには、上記組成物又は骨補填材以外に、例えば骨補填材を骨欠損部位に埋め込むために必要な器具が備えられていてもよい。このような器具としては、手袋やピンセット等が例示できるが、特に限定されない。
【００２４】
また、本発明は、ラクトフェリンを含んでなるＢＭＰの骨誘導能増強剤も包含する。上記の通り、ラクトフェリン及びＢＭＰを併用することにより優れた骨誘導能が得られるところ、当該優れた骨誘導能は、ラクトフェリン単独の骨誘導能、又はＢＭＰ単独の骨誘導能に比べて著しく高い。限定的な解釈を望むものではないが、これはラクトフェリンがＢＭＰの骨誘導能を大きく増強しているためと考えられる。より具体的には、ラクトフェリンが、ＢＭＰ受容体の発現を亢進させることにより、ＢＭＰの骨誘導能を大きく増強しているものと考えられる。よって、本発明は、ラクトフェリンを含んでなるＢＭＰ受容体発現亢進剤をも包含する。
【００２５】
本発明のラクトフェリンを含んでなるＢＭＰの骨誘導能増強剤又はＢＭＰ受容体発現亢進剤は、ラクトフェリンのみからなるものであってもよいし、ラクトフェリン以外の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はされないが、薬学的又は食品衛生学的に許容される成分が好ましい。具体的には、例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等が例示される。本発明の骨誘導能増強剤には、例えば、ラクトフェリンが好ましくは０．１〜１００質量％、より好ましくは１〜１００質量％程度含有される。
【００２６】
本発明のラクトフェリンを含んでなるＢＭＰの骨誘導能増強剤又はＢＭＰ受容体発現亢進剤は、ＢＭＰと併用することが好ましい。
【００２７】
本発明の組成物又は骨補填材における、ラクトフェリン及びＢＭＰの組み合わせ比率は、例えば、質量比で、ＢＭＰ：ラクトフェリンが、１：１〜１０００程度が好ましく、１：１０〜５００程度がより好ましく、１：２０〜２００程度がさらに好ましく、１：３０〜１００程度がよりさらに好ましい。また、本発明のＢＭＰの骨誘導能増強剤又はＢＭＰ受容体発現亢進剤は、ＢＭＰと併用する場合には、併用するＢＭＰの量と、当該剤に含まれるラクトフェリンの量とが、例えば、質量比で、１：１〜１０００程度が好ましく、１：１０〜５００程度がより好ましく、１：２０〜２００程度がさらに好ましく、１：３０〜１００程度がよりさらに好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下の検討において、マウス未分化間葉系幹細胞株C3H10T1/2細胞はRIKEN CELL BANK から購入したものを用いた。
＜ラクトフェリンの骨誘導能の検討＞
未分化間葉系幹細胞に対するラクトフェリンの骨芽細胞分化促進作用の検討
C3H10T1/2細胞を、10% ウシ胎児血清（Invitrogen, Grand Island, USA）および抗生剤（100 U/mL penicillin-streptomycin）(Invitrogen)含有Basal Medium Eagle（BME）中で37℃、5% CO2 存在下にて継代培養を行った。骨芽細胞分化促進作用の検討には  C3H10T1/2 細胞を 10% FBS, 10mMβ-glycerophosphate, 50μg/mL ascorbic acid and 1μM dexamethasone  を含有したα-MEM（alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium） にて培養を行い、ウシラクトフェリン（終濃度1, 10, 又は100 μg/mL）を投与した実験群と非投与のコントロール群でアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を比較検討した。アルカリフォスファターゼ活性の測定は (Inubushi T et al., Journal of Periodontology. 79(10):1984-90, 2008.) と同様の方法で行った。具体的には、培養細胞を PBS にて洗浄後、超音波ホモジナイザーにより、10 mM Tris-HCL buffer (pH 7.4, 500μl) 中で1分間細胞を破砕撹拌し、25 μlの細胞破砕後の溶液に ALP buffer（0.1 M carbonate buffer, pH 9.8, 6.7 mM p-nitrophenyl phosphate, 2 mM MgCl2）を加え、30分間、37℃でインキュベートした。0.2 N NaOH 125 μl を加えて反応を終了させた後、マイクロプレートリーダーを用いて 405 ｎｍにおける吸光度を測定した。これと並行して、細胞粉砕後の溶液中に含まれる DNA 量を測定し、1 μg DNA あたりのALP 活性を算出した。なお、ALP活性は骨形成マーカーの一つとして知られており、骨芽細胞の機能状態ひいては骨形成状態を知る指標になると考えられている。
【００２９】
結果を図１ａ及び図１ｂに示す。図１ａには、吸光度を測定する直前のマイクロプレートの各ウェルの写真を示す。図１ｂには、算出した1μg DNA あたりのALP 活性をグラフ化した図を示す。当該結果から、ラクトフェリンにはアルカリフォスファターゼ活性増強作用があること、ひいては骨芽細胞分化促進作用があることがわかった。
【００３０】
ラクトフェリン の TGF-β受容体を介した TGF-βシグナル活性化作用の検討
ラクトフェリンがＴＧＦ−β受容体を介してＴＧＦ−βシグナルを活性化していることを、以下のようにしてウエスタンブロッティング法により解析した。なお、ＴＧＦ−βシグナルが活性化されることにより、骨誘導が起こることが知られている。
【００３１】
ウシラクトフェリンを添加して（終濃度１００μｇ／ｍＬ）培養したC3H10T1/2細胞を、プロテアーゼインヒビター（0.1 mM NaVO4, 1 mM DTT, 0.1 mM leupeptin, 0.1 μg/mL soy bean trypsin inhibitor, 10 μg/mL L-1 Chlor-3-(4-tosylamido)-4 Phenyl-2-butanon, 10 μg/mL L-1 Chlor-3-(4-tosylamido)-7-amino-2-heptanon-hydrochloride, 10 μg/mL aprotinin 及び 50 μg/mL phenylmethylsulfonyl fluoride）を含有した Triton buffer (50 mM Tris; pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.1 % Triton-X-100, 1 mM EDTA, 50 mMNaF) を用いて溶解後、溶解液を回収し 30分間冷却後、遠心分離（20 分間、4℃、415,000 rpm）し、20 μg に相当するタンパク質の抽出を行った。SDS 化した当該抽出タンパク質を10 % SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離後、ニトロセルロースメンブレン（Whatman, Dassel, Germany）上に転写した。メンブレンを 5 % スキムミルク（ナカライテスク）に浸漬し、30 分間室温で処理した後、１次抗体として1000倍希釈したラビット抗phospho-Smad 2 ポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology）もしくは1000倍希釈したラビット抗Smad 2 ポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology）を用いて、あるいは、1000倍希釈したラビット抗phospho-Smad 3 ポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology）もしくは1000倍希釈したラビット抗Smad 3 ポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology）を用いて、室温にて2 時間インキュベートした。メンブレンを wash buffer にて洗浄後、二次抗体として HRP 標識抗マウス抗体（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて同様に2 時間インキュベートした。その後、メンブレンを wash buffer にて十分に洗浄し、検出試薬 ECL Advanced Solution A and B （Amersham Pharmacia Biotech）を用いて化学発光させた。結果を図２ａに示す。
【００３２】
また、nuclear/cytoplasmic fractionation kit （Pierce）を用いて、核からのタンパク抽出を行い、上記と同様にしてウエスタンブロッティング法によりSmad4及びLaminB1の発現量を解析し、Smad 4 の核内への移行を検討した。核抽出液中のSmad 4は、ラビット抗Smad 4ポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology）を用いて上記と同様の方法にて検出した。結果を図２ｂに示す。
【００３３】
図２ａから、ラクトフェリンが、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化を促進することがわかった。また、図２ｂから、ラクトフェリンが、Ｓｍａｄ４の核内移行を促進することがわかった。以上のデータから、ラクトフェリンは、ＴＧＦ−βシグナルを活性化することがわかった。
【００３４】
ラクトフェリン の TGF-β受容体への結合の検討
ラクトフェリンが TGF-β receptorに結合するかを、ELISA 法を用いて検討した。まず、0.3 μg/mL ヒトリコンビナント TGF-b sRII/Fc（R and D systems）を 4 ℃にて一晩かけてELISA プレート（Costar High binding 3590）に吸着させた。その後、wash buffer にて洗浄後 5 % BSA 含有 ELISA buffer にて3時間ブロッキングを行い、ウシラクトフェリンを（終濃度10 ng/mL, 1 ng/mL, 又は0.1 ng/mL）加えて30分インキュベートした。その後、再び wash buffer にて洗浄し、ビオチン化したマウス抗ラクトフェリンモノクローナル抗体を加えて１時間インキュベートした後、再び wash buffer にて洗浄し、HRP-標識Streptoavidinにて30分間インキュベートし、wash buffer にて洗浄後、 HRP 標識 TMB (3,3', 5,5'-tetramethyl-benzidene) を加えて反応させた。反応は 1 M H2SO4を加えることで終了させ、マイクロプレートリーダーにて 450 nm における吸光度を測定した。
【００３５】
結果をグラフ化して図３に示す。なお、図３の縦軸は吸光度を示す。当該結果から、ラクトフェリンは濃度依存的にＴＧＦ−β受容体に結合することがわかった。
【００３６】
＜ラクトフェリンとBMPとの併用による骨誘導能の検討＞
以下の検討で用いたラクトフェリンは、いずれもウシラクトフェリンである。
ラクトフェリンとＢＭＰとの併用による骨誘導能の検討
上記の通り、ラクトフェリンには骨誘導能があることがわかったため、ＢＭＰとラクトフェリンとを併用した際の骨誘導能がどのようになるのかを検討した。
【００３７】
7 週齢雄性マウス頭蓋骨に直径3 mmの骨欠損を作製し、欠損部とほぼ同サイズのコラーゲンゲルディスク（AteloCell. KOKEN, Japan）に（i）ラクトフェリン（125 μg）、（ii）ヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）、（iii）ラクトフェリン（125 μg）+ヒトリコンビナント BMP-2（2.5 μg）、をそれぞれ含有させ、これら３種のコラーゲンディスクあるいはコントロールとして何も含有させないコラーゲンディスクを前記欠損部に静置した。5週間経過時にμCT (Skyscan, BE) にて撮影を行い、骨欠損部における骨形成量の評価を行った。撮影は0.5 mmのアルミフィルターを用いて50 kV、500μＡで行い、35μｍ間隔で撮像した。さらに、Nrecon（Skyscan）を用いて当該撮影画像の校正を行った後、CT-Analyser (Skyscan)で欠損部の新生骨量を測定することにより骨形成量の定量を行った。当該撮影画像を図４ａに、骨形成定量結果をグラフ化した図を図４ｂに、それぞれ示す。これらの結果から、ラクトフェリンとBMPとを併用することにより、これらを単独で用いる場合に比べ、劇的に骨誘導能が向上することがわかった。
【００３８】
ラクトフェリンの、BMPの骨誘導能向上作用についての検討
ラクトフェリンが、TGF−β受容体又はBMP受容体に与える影響について、RT（reverse transcription）-PCRにより、検討を行った。
【００３９】
マウス骨芽細胞株 MC3T3-E1の培地に、終濃度100μg/ml となるようラクトフェリンを加え、0h, 12h, 24h, 48h 経過後に細胞を回収し、TRIzol Reagent (Invitrogen) にて細胞を溶解し回収した後、マイクロ遠心チューブに移しクロロホルムを加えた。4℃、12000rpm で 20 分間遠心した後、採取した上清から total RNA を抽出した。その後DeoxyribonucleaseＩ(シグマアルドリッチジャパン、東京) を用いて total RNA を精製した。1 μg  の total RNA からReverTra Ace-a (東洋紡、大阪) を用いてcDNAを合成した。 KOD-plus-DNA polymerase (東洋紡) を使用してPCRを行い（PC701 termal cycler を使用） DNA を増幅した。PCRには、TGF−β受容体１（TGF−βR1）、TGF−β受容体２（TGF−βR２）、BMP受容体１（BMPR1）又はBMP受容体２（BMPR２）を特異的に増幅するPCRプライマーセットを用いた。また、コントロールとして、１８SリボソームRNAを特異的に増幅するPCRプライマーセットを用いた。具体的には、次に示すプライマーを用いた。
【００４０】
Mouse TGF−βR1 Forward:  GGCGAAGGCATTACAGTGTT
Mouse TGF−βR1 Reverse:  TGCACATACAAATGGCCTGT
Mouse TGF−βR2 Forward:  GCAAGTTTTGCGATGTGAGA
Mouse TGF−βR2 Reverse:  GGCATCTTCCAGAGTGAAGC
Mouse BMPR1 Forward:  AGGTCAAAGCTGTTCGGAGA
Mouse BMPR1 Reverse:  CTGTACACGGCCCTTTGAAT
Mouse BMPR2 Forward:  TGGCAGTGAGGTCACTCAAG
Mouse BMPR2 Reverse:  TTGCGTTCATTCTGCATAGC
Mouse 18s Forward:  TTGACGGAAGGGCACCACCAG
Mouse 18s Reverse:  CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 
【００４１】
各PCR反応液を 1.5% Agarose Me-gel (ナカライテスク、京都) で電気泳動後、ethidium bromide solution (シグマアリドリッチジャパン) にて可視化した。結果を図５に示す。当該結果から、ラクトフェリンは、TGF−β受容体の発現には影響を与えないこと、その一方でBMP受容体の発現を亢進させること、がわかった。このことから、ラクトフェリンの、BMPの骨誘導能強化作用は、BMP受容体の発現を亢進させることにより発現されている可能性が考えられた。
【図１ａ】
2014193820.tif 000002
【図１ｂ】
2014193820.tif 000003
【図２ａ】
2014193820.tif 000004
【図２ｂ】
2014193820.tif 000005
【図３】
2014193820.tif 000006
【図４ａ】
2014193820.tif 000007
【図４ｂ】
2014193820.tif 000008
【図５】
2014193820.tif 000009
【配列表】
2014193820000001.app