(57)【要約】      （修正有）【課題】二つの受容体を同時にブロックして、腫瘍の治療に用いるためのヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）と特異的に結合することができ、且つ／又は前記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる抗体の提供。【解決手段】特定の配列を有する３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む軽鎖及び特定の配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖からなる、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体ＩＧＦ−ＩＲと特異的に結合することができる単離された抗体、前記抗体を分泌するハイブリドーマ及び前記ハイブリドーマによって産生される抗体からなる化合物を有効成分として含む薬剤としての組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体ＩＧＦ−ＩＲに結合することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであって、配列番号１、２及び３の配列を有する３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む軽鎖を含み、かつ、配列番号４、５及び６の配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする、単離された抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項２】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むこと、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖をさらに含むことを特徴とする、１３Ｆ５と呼ばれる請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
【請求項４】
２００４年３月２５日にＣＮＣＭ（パリ、パスツール研究所）に番号Ｉ−３１９３で寄託された、請求項３に記載のマウスハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項４に記載のハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする抗体、又はその機能的断片の一つ。
【請求項６】
前記抗体がキメラ抗体であり、マウスとは異なる種の抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項７】
前記異なる種がヒトであることを特徴とする、請求項６に記載のキメラ抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項８】
請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマによって産生される抗体もしくはその機能的断片の一つから成る化合物を有効成分として含む組成物。
【請求項９】
同時の使用、別個の使用又は連続した使用を目的とした組合せ製品として、抗体、細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、並びに／又はＩＧＦ−Ｉ及び／もしくはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬剤としての請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現及び／もしくは異常な活性化に関連する疾患、並びに／又はＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２とＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化に関連する疾患の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマにより産生される抗体もしくはその機能的断片の一つ、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一つに記載の組成物の使用方法。
【請求項１２】
腫瘍特性を有する細胞への正常細胞の形質転換を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞の成長及び／又は増殖を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１４】
癌の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１５】
前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌又は結腸癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用方法。
【請求項１６】
乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１７】
ＩＧＦ−Ｉ受容体の異常な存在が疑われる生体試料から、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現又は低発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、前記生体試料を、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマにより産生される抗体と接触させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
ハイブリッド−ＲのアイソフォームＡ及び／もしくはアイソフォームＢと結合することができ、且つ／又はその天然リガンドの結合を阻害することができることを特徴とする、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体ＩＧＦ−ＩＲと特異的に結合することができ、且つ／又はそのＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる新規な抗体、特にキメラマウス及びヒト化マウスのモノクローナル抗体、並びにこれらの抗体をコードするアミノ酸配列及び核酸配列に関する。本発明はまた、ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する癌又は当該受容体の過剰発現に関連した病状の予防的処置及び／又は治療的処置を目的とした薬剤としての、並びにＩＧＦ−ＩＲの過剰発現に関連した疾患の診断のための方法又はキットにおける、これら抗体の使用を含む。最後に、本発明は、このような抗体と、抗ＥＧＦＲ抗体、及び／又は抗ＶＥＧＦ抗体、及び／又は腫瘍進行もしくは転移に関与する他の成長因子に対する抗体、及び／又は化合物、及び／又は抗癌剤、又は毒素と共役した物質とを組み合わせて含む、製品及び／又は組成物、並びに特定の癌の予防及び／又は治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−ＩＲと呼ばれるインスリン様成長因子Ｉ受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する、よく記載される受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。
【０００３】
これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって結合しており、細胞外のα―サブユニット及び膜貫通型のβ−サブユニットからなっている。ＩＧＦ−ＩＲは、極めて高い親和性（Ｋｄ≒１ｎＭ）でＩＧＦ１及びＩＧＦ２と結合するが、インスリンとも同様に１００〜１０００分の１の親和性で結合することができる。逆に、ＩＧＦは１００分の１の低い親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高い親和性によってインスリンと結合する。α−サブユニットに存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域があるが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンの各々に対するＩＧＦ−ＩＲとＩＲの相対的親和性の基となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、二つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらす。ＩＧＦ−ＩＲは細胞分裂促進作用、分化作用及び抗アポトーシス作用に介在するが、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用と関係している（Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３３２：  Ｆ１０５−１２６，  １９９７、  Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，  ２５３：  １−６，  １９９９）。
【０００４】
細胞質チロシンキナーゼタンパク質は、リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合することによって活性化される。キナーゼの活性化によって、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、Ｓｈｃ及びＧｒｂ１０をはじめとする、様々な細胞内基質の刺激が生じる（Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １２５：  １６６−１７３，  １９９９）。ＩＧＦ−ＩＲの二つの主要な基質はＩＲＳ及びＳｈｃであり、これらは数多くの下流のエフェクターの活性化によって、ＩＧＦのこの受容体への付着に関連した成長作用の大部分と分化作用とを仲介する。従って、基質の利用可能性がＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定することがある。ＩＲＳ−１が多い場合には、細胞は増殖し、形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが多い場合には、細胞は分化する傾向にある（Ｖａｌｅｎｔｉｎｉｓ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １２４２３−１２４３０，  １９９９）。アポトーシスに対する防御作用に主として関わる経路は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路であると考えられている（Ｐｒｉｓｃｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．，  ３１：  ８０−８９，  １９９９、  Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １２５：  １６６−１７３，  １９９９）。
【０００５】
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ１０年で集中的な調査の対象となってきている。この関心は、ＩＧＦ−ＩＲが、その細胞分裂促進性及び抗アポトーシス性に加えて、形質転換された表現型の確立及び維持に必要であると考えられるという事実の発見を受けてのものである。実際に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現又は構成的活性化が、幅広い種類の細胞において、ウシ胎児血清を含まない培地における補助に依存することなく細胞を成長させ、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成させるということが十分に確立されている。成長因子の多数の受容体を含む、幅広い種類の過剰発現した遺伝子の産物が、細胞を形質転換し得るため、このこと自体は固有の特徴ではない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割を明らかに立証した重要な発見は、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されたＲ細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質等の、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲ又はＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、又はこれら最後の二つの因子の組合せによっては全く形質転換しないということを立証してきている（Ｓｅｌｌ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９０：  １１２１７−１１２２１，  １９９３、  Ｓｅｌｌ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ３６０４−３６１２，  １９９４、  Ｍｏｒｒｉｏｎｅ  Ａ．Ｊ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  ６９：  ５３００−５３０３，  １９９５、  Ｃｏｐｐｏｌａ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ４５８８−４５９５，  １９９４、  ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １６４：  ２１４−２２１，１９９５）。
【０００６】
ＩＧＦ−ＩＲは、幅広い種類の腫瘍及び腫瘍株において発現し、ＩＧＦは、ＩＧＦ−ＩＲへの付着を介して腫瘍の成長を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割を支持するその他の論拠は、受容体に対するマウスモノクローナル抗体を用いた又はＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブを用いた研究から得られる。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対するマウスモノクローナル抗体は、数多くの細胞株の培養増殖及び腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を阻害する（Ａｒｔｅａｇａ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４９：  ６２３７−６２４１，  １９８９、  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍ．，  １９６：  ９２−９８，  １９９３、  Ｚｉａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４：  ２６９−２７５，  １９９６、  Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５８：  ４１２７−４１３１，  １９９８）。また、Ｊｉａｎｇらの研究（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：６０７１−６０７７，１９９９）においても、ＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブが腫瘍の増殖を阻害することができるということが示されている。
【０００７】
癌の病理は、細胞の成長が制御されていないことを特徴とする。幾つかの癌においては、成長因子は、それらの受容体と特異的に結合した後、成長シグナル、形質転換シグナル及び／又は生存シグナルを腫瘍細胞に伝達する。腫瘍細胞表面での成長因子受容体の過剰発現は、広く記載されている（Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｄ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  １９９５，  １９：  １８３、  Ｂｕｒｒｏｗ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １９９８，  ６９：  ２１、  Ｈａｋａｍ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １９９９，  ３０：  １１２８、  Ｒａｉｌｏ  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９４，  ３０：  ３０７、  Ｈａｐｐｅｒｆｉｅｌｄ  Ｌ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １９９７，  １８３：  ４１２）。この過剰発現、つまり異常な活性化は、細胞成長の調節機構を直接乱すものであり、古典的な化学療法や放射線治療によって誘導されるアポトーシスに対する細胞の感受性にも影響を与えることがある。
【０００８】
この数年間、腫瘍細胞表面に過剰発現したＥＧＦＲやＨｅｒ２／ｎｅｕ等の成長因子受容体を、それぞれヒト化（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））又はキメラ化した抗体（Ｃ２２５）によってターゲティングすると、患者における腫瘍成長が有意に阻害され、古典的な化学療法治療の有効性が有意に増大するということが示されている（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００１，  １（２）：  １１８、  Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ  Ｇ．  Ｎ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００１，  ２８：  ４３、  Ｈｅｒｂｓｔ  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００２，  ２９：  ２７）。ＩＧＦ−ＩＲ又はＶＥＧＦ−Ｒ等の他の受容体（血管内皮成長因子受容体）は、幾つかの前臨床試験において、標的の候補であると同定されている。
【０００９】
より詳細には、ＩＧＦ−ＩＲは、チロシンキナーゼ受容体の一部である。これは、二つのアイソフォームＡ及びＢの形で存在するインスリン受容体（ＩＲ）と高い相同性を示す。
【００１０】
ＩＲの配列、つまりアイソフォームＡ及びＢの配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋにそれぞれ寄託番号Ｘ０２１６０及びＭ１００５１として登録されている。ＩＲに関連する他のデータは、参照により本明細書に援用されるが、これらに限定されるものではない（Ｖｉｎｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ２４９−２５２、  Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７７：  ３９６８４−３９６９５、  Ｄｕｍｅｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ８９（７）：  ３５６１−３５６６）。
【００１１】
ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲは、ジスルフィド結合によって結合した二つの細胞外α−サブユニットと二つの膜貫通型β−サブユニットから成っている四量体の糖タンパク質である。リガンド結合部位を含む各α−サブユニットは約１３０〜１３５ｋＤａであり、一方、チロシンキナーゼドメインを含む各β−サブユニットは約９０〜９５ｋＤａである。これらの受容体は、アミノ酸配列全体では５０％を超える類似性があり、チロシンキナーゼドメインでは８４％の類似性がある。リガンドが結合すると、リン酸化された受容体は、インスリン受容体基質１タンパク質ファミリー（ＩＲＳ１）、Ｇａｂ１及びＳｈｃをはじめとするドッキングタンパク質を動員し、それらをリン酸化し（Ａｖｒｕｃｈ，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８２，  ３１−４８、  Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５３，  ５３７−５４３、  Ｗｈｉｔｅ，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８２，  ３−１１、  Ｌａｖｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９，  ８３０−８３７、  Ｃｈｅａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １６，  １１７−１４２）、様々な細胞内メディエーターを活性化する。ＩＲとＩＧＦ−ＩＲはいずれも同様に主要なシグナル伝達経路を活性化するが、双方の受容体の間では、特定のドッキングタンパク質の動員及び細胞内メディエーターに差異が存在する（Ｓａｓａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７，  ４４２７−４４３４、  Ｎａｋａｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  ２２，  ８１８−８３５、  Ｄｕｐｏｎｔ  ａｎｄ  Ｌｅ  Ｒｏｉｔｈ  ２００１，  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５５，  Ｓｕｐｐｌ．  ２，  ２２−２６、  Ｋｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３３０，  ９２３−９３２）。これらの差異は、ＩＲの活性化により代謝作用が主に誘発されること、そしてＩＧＦ−ＩＲの活性化により細胞分裂促進作用、形質転換作用及び抗アポトーシス作用が主に誘発されることの基となっている（Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７６６，  ３８８−４０１、  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｐｒｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  ３１，  ８０−８９、  Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．，  ８６，  ９７２−９７９）。インスリンが高い親和性でＩＲと結合する（ＩＧＦ−ＩＲよりも１００倍高い）一方で、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１及びＩＧＦ２）は、ＩＲよりも１００倍高い親和性でＩＧＦ−ＩＲと結合する。
【００１２】
ヒトＩＲは、二つのアイソフォームＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの形で存在し、これらは、ＩＲのα−サブユニットのカルボキシ末端の小さいエクソン（エクソン１１）にコードされる１２個のアミノ酸残基を除外するか又は含ませる、ＩＲ遺伝子の選択的スプライシングによって生じる。ＩＲアイソフォームの相対存在量は、組織特異的な未知の因子により調節される（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ３，  １２６３−１２６９、  Ｍｏｓｔｈａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ９，  ２４０９−２４１３）。ＩＲ−Ｂは、インスリンの代謝作用の主要な標的組織である正常な成人組織（脂肪組織、肝臓及び筋肉）における主なＩＲアイソフォームである（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９、  Ｍｏｓｔｈａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＩＲ−Ａは、胎児組織における主なアイソフォームであり、ＩＧＦ２に応じて胎児の成長を仲介し（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９，  ３２７８−３２８８）、このことはトランスジェニックマウスにおいて実施された遺伝的研究によっても示唆された（ＤｅＣｈｉａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，  ７８−８０、  Ｌｏｕｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １８９，  ３３−４８）。さらに、細胞が形質転換して悪性になる場合、脱分化はＩＲ−Ａの相対存在量の増加と関連することが多い（Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ２７７，  Ｎｏ．４２，  ｐｐ３９６８４−３９６９５）。
【００１３】
相同性が高いことを考慮すると、インスリン及び半ＩＧＦ−Ｉ受容体（一つのα−サブユニットと一つのβ−サブユニットから成る）はヘテロ二量体化し、インスリン／ＩＧＦ−Ｉハイブリッド受容体（ハイブリッド−Ｒ）を形成することができる（Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ２７０，  ３８３−３９０、  Ｋａｓｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，  １３５３１−１３５３６、  Ｓｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，  １６３５−１６４１、  Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３２７，  ２０９−２１５）。
【００１４】
ＩＲアイソフォームの双方は、同様にＩＧＦ−ＩＲとハイブリッドを形成することができる。しかしながら、ハイブリッド−Ｒは、異なる機能的特徴を有する。ハイブリッド−ＲｓＢは、ＩＧＦ１と、特にＩＧＦ２に対する親和性が低い。一方、ハイブリッド−ＲｓＡは、ＩＧＦ１に対する親和性が高く、生理的濃度の範囲でＩＧＦ２及びインスリンと結合する。ハイブリッド−ＲｓＡの発現は、二つの異なる機構、つまり、ｉ）ＩＧＦ１とＩＧＦ２の両方による（高い親和性での）結合及び活性化（これらはハイブリッド−ＲｓＢでは起こらない）、並びに、ｉｉ）インスリンの結合によるＩＧＦ−ＩＲ経路の活性化によって、ＩＧＦ系をアップレギュレートする。インスリンがハイブリッド−ＲｓＡに結合すると、ＩＧＦ−ＩＲのβ−サブユニットがリン酸化されＩＧＦ−ＩＲに特異的な基質（ＣｒｋＩＩ）が活性化し、それによりハイブリッド−ＲｓＡがインスリンをＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達に移行させる（Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【００１５】
肝臓、脾臓又は胎盤等の幾つかの組織において、ハイブリッド−ＲはＩＧＦ−ＩＲよりも多く見られる（Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。腫瘍細胞が過剰発現するか、又は異常な活性化を示すと、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲ−Ａの双方（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，  ２４７１−２４７９、  Ｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ５４，  １２１−１２４）、そしてハイブリッド−ＲｓＡは、甲状腺癌や乳癌をはじめとする様々なヒト悪性腫瘍において過剰発現し、ＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２による刺激だけでなく生理的濃度のインスリンによる刺激にも従うＩＧＦ−ＩＲ型のシグナル伝達によって応答することが可能な悪性細胞に、選択的増殖優位性を付与する可能性がある。（Ｂａｉｌｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７、  Ｐａｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５，  １９３５−１９４４、  Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  （Ｐａｒｉｓ）  ８１，  ４０３−４０７、  Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＭＣＦ−７モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価を示す図である。
【図２】ＤＵ１４５での抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価を示す図である。
【図３】ＤＵ１４５での抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価を示す図である。
【図４】ＩＧＦ−ＩＲを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
【図５】イムノキャプチャーしたＨＲ−Ａでの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
【図６】イムノキャプチャーしたＨＲ−Ｂでの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
【図７】ＩＲ−Ａを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＮＳの排除を示す図である。
【図８】ＩＲ−Ｂを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＮＳの排除を示す図である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
二つの受容体を同時にブロックすることができるこのような「治療手段」の実現は、同一の腫瘍におけるＩＧＦ−ＩＲ及びハイブリッド−Ｒの発現又は異常な活性化が介在するエスケープ現象を回避させることができるので、特に関心が持たれている。
【００１８】
ＩＧＦ−ＩＲ、そしてより詳細には、ＩＧＦ−ＩＲに結合できる、つまりＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を阻害することができるモノクローナル抗体に対して深まる興味に関して、出願人らは、７Ｃ１０又はｈ７Ｃ１０（コード番号：Ｆ５００３５）と呼ばれるヒト化モノクローナル抗体を既に開発し、特性を明らかにしている。この抗体とその使用に関する国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０３／００１７８号が出願され、国際公開第０３／０５９９５１号パンフレットとして２００３年７月２４日に公開されている。この特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩＲを高い親和性で特異的に認識することができる、利用可能な他のマウスモノクローナル抗体、好ましくはキメラ化抗体又はヒト化抗体を得ることを可能にすることである。これらの抗体は、ＩＲとほとんど又は全く相互作用しない。これらが付着すると、ＩＧＦ１／ＩＧＦ−ＩＲ相互作用及びＩＧＦ２／ＩＧＦ−ＩＲ相互作用により活性化されたシグナル伝達経路と主に相互作用することによって、ＩＧＦ−ＩＲを発現する腫瘍の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することができる。これらの抗体は、胸部のエストロゲン依存性腫瘍及び前立腺の腫瘍をはじめとするＩＧＦ−ＩＲを発現する全てのタイプの腫瘍に対してｉｎ  ｖｉｖｏで活性であることが可能である。
【００２０】
本発明はまた、ハイブリッド−Ｒ及びＩＧＦ−ＩＲと結合することができ、またＩＧＦ１、ＩＧＦ２又はインスリンによるそれらの活性化をブロックすることもできる、高親和性の化合物、より詳細には抗体を作製することによって、ハイブリッド−Ｒ及びＩＧＦ−ＩＲ活性を共にブロックすることを可能にする。
【００２１】
また、本発明は、本発明による単離された抗体又はその断片の使用に関し、当該抗体又は断片は、ｉ）ヒトＩＧＦ−ＩＲと結合すること、並びに／又はその天然リガンド、好ましくはＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２の結合を阻害すること、並びに／又は上記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することが可能であり、且つ／又は、ｉｉ）ハイブリッド−Ｒと結合すること、並びに／又はその天然リガンド、好ましくはＩＧＦ１、ＩＧＦ２及び／もしくはインスリンの結合を阻害すること、並びに／又は上記ハイブリッド−Ｒのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することが可能である。
【００２２】
別の好ましい実施形態によると、上記抗体は、癌の治療、より詳細には乳癌の治療のために使用される。
【００２３】
実際に、乳房腫瘍細胞の表面には、ＩＧＦ−ＩＲだけでなく、多数のインスリン受容体が、そして結果として多数のハイブリッド−Ｒが特異的に見られることが知られている（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、  Ｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【００２４】
より詳細には、本発明は４つの異なる抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体に関する。
【００２５】
第一の態様において、本発明の主題は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体に特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらに、ＩＧＦ−ＩＲのリガンドであるＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２による本来の付着を阻害することができ、且つ／又は前記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであり、これは、配列番号１、２及び３のアミノ酸配列である相補性決定領域ＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号１、２及び３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む軽鎖を含むか、或いは、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は最適なアラインメントの後に配列番号４、５及び６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００２６】
本明細書及び対応する実施例において、この抗体を１３Ｆ５と称する。
【００２７】
本明細書において、「結合すること」と「付着すること」とは同じ意味を有し、互換的に用いられる。
【００２８】
本明細書において、抗体化合物又はそれらの配列に付着するポリペプチド、ポリペプチド配列、ペプチド、及びタンパク質という用語は、互換的に用いられる。
【００２９】
ここで、本発明が本来の形態の抗体に関するものではないこと、すなわち、それらの本来の環境にはないが、天然の材料からの精製によって単離すること又は得ることができ、或いは遺伝子組換え又は化学合成によって得ることができ、その結果、以下に記載される非天然アミノ酸を含み得るということを理解されたい。
【００３０】
ＣＤＲ領域又はＣＤＲとは、Ｋａｂａｔらによって定義された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を意味するものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ，  １９９１、及び以降の版）。３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲという用語は、本明細書において、場合によって、抗体とそれが認識する抗原又はエピトープとの親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の一つ又はいくつか、或いはこれらの領域の全てを示すために用いられる。
【００３１】
本発明に関して、二つの核酸配列間又はアミノ酸配列間の「同一性の割合」とは、比較される二つの配列間の、最良のアラインメント（最適なアラインメント）の後に得られる、同一ヌクレオチドの割合又は同一アミノ酸残基の割合を示すものであり、この割合は純粋に統計的であり、二つの配列間の差異はランダムに、且つそれらの全長にわたって分布している。二つの核酸配列間又はアミノ酸配列間の配列の比較は、従来どおりに、それらを最適な方法でアラインした後にこれらの配列を比較することによって実施され、この比較は、セグメント又は「比較ウィンドウ」ごとに実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動に加え、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］によって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の局所的相同性アルゴリズム［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３］によって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４］によって、これらのアルゴリズムを用いるコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、及びＴＦＡＳＴＡ、又はＢＬＡＳＴＮもしくはＢＬＡＳＴＰ比較ソフトウェア）によって、実施することができる。
【００３２】
二つの核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性の割合は、最適な方法でアラインしたこれらの二つの配列を比較することにより決定されるが、ここで、これら二つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列に対して、比較される核酸配列又はアミノ酸配列は付加又は欠失を有する場合がある。同一性の割合は、二つの配列間でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一である同一位置の数を求め、この同一位置の数を比較ウィンドウの全位置数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これらの二つの配列間の同一性の割合を得る。
【００３３】
例えば、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なＢＬＡＳＴプログラムである「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：  ２４７−２５０）を使用することが可能であり、使用するパラメーターはデフォルトで与えられるものであり(特に「ギャップ開始ペナルティー」パラメーターについては５、そして「ギャップ伸長ペナルティー」パラメーターについては２、選択されるマトリックスは、例えば、プログラムによって提示されるマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ６２」である)、比較する二つの配列間の同一性の割合はプログラムによって直接算出される。
【００３４】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対してある種の改変、特に、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、又は置換、トランケーションもしくは延長を有するものが好ましい。一つ又は複数の連続した又は不連続なアミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。「等価なアミノ酸」という表現は、本明細書において、基本構造のアミノ酸の一つと置換することができるが対応する抗体の生物活性を本質的には変化させない、後に特に実施例にて規定するようなアミノ酸を示すものである。これらの等価なアミノ酸は、それらが置き換わるアミノ酸との構造類似性、又は実施可能な異なる抗体間での生物活性の比較試験の結果のいずれかに応じて決定することができる。
【００３５】
一例として、改変された対応する抗体の生物活性に著しい改変をもたらすことなく実施することができる置換の候補を挙げる。例えば、ロイシンをバリン又はイソロイシンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、グルタミンをアスパラギンに、アルギニンをリジンに置き換えることができ、当然ながら、逆の置換も同じ条件下で考えられる。
【００３６】
第二の態様において、本発明の主題は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体に特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらに、ＩＧＦ−ＩＲのリガンドであるＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２による本来の付着を阻害することができ、且つ／又は上記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであり、これは、配列番号７、８及び９のアミノ酸配列である相補性決定領域ＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列番号７、８及び９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む軽鎖を含むか、或いは、配列番号１０、１１及び１２のアミノ酸配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列番号１０、１１及び１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００３７】
以下、明細書において、この抗体を１２Ｄ５と称する。
【００３８】
第三の態様において、本発明の主題は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体に特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらに、ＩＧＦ−ＩＲのリガンドであるＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２による本来の付着を阻害することができ、且つ／又は上記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであり、これは、配列番号１３、１４及び１５のアミノ酸配列である相補性決定領域ＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列番号１３、１４及び１５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む軽鎖を含むか、或いは、配列番号１６、１７及び１８のアミノ酸配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は、最適なアラインメントの後に配列番号１６、１７及び１８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％及び９８％の相同性を有する配列である少なくとも一つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００３９】
以下、明細書において、この抗体を２Ｄ１０と称する。
【００４０】
最後に、さらに別の態様において、本発明の主題は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体に特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらに、ＩＧＦ−ＩＲのリガンドであるＩＧＦ１及び／又はＩＧＦ２による本来の付着を阻害することができ、且つ／又は上記ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであり、これは、２１Ｅ３と呼ばれる抗体を構成し、後述されるようにＣＮＣＭに登録されていることを特徴とする。
【００４１】
本発明による抗体、すなわち１３Ｆ５、１２Ｄ５、２Ｄ１０及び２１Ｅ３は、好ましくは特異的モノクローナル抗体、特に、マウス由来のモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体であり、これらは当業者に既知の標準的方法によって得ることができる。
【００４２】
一般に、モノクローナル抗体又はその機能的断片、特にマウス由来のものの調製については、特にマニュアル“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ｐｐ．  ７２６，  １９８８）に記載されている技術、又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）によって記載されたハイブリドーマからの調製技術を参照することができる。
【００４３】
本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、本発明による上記モノクローナル抗体が特異的に認識するエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つに対して免疫された動物細胞から得ることができる。上記ＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つは、特に、ＩＧＦ−ＩＲをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列で開始される遺伝子組換えによる、又はＩＧＦ−ＩＲのペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から開始されるペプチド合成による、一般的な操作方法に従って産生することができる。
【００４４】
本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、前記本発明によるモノクローナル抗体が特異的に認識するエピトープを含むＩＧＦ−ＩＲ又はその断片の一つが予め固定化されているアフィニティーカラムで精製することができる。より詳細には、前記モノクローナル抗体の精製においては、プロテインＡ及び／又はプロテインＧでのクロマトグラフィーを行い、その後、残ったタンパク質夾雑物並びにＤＮＡ及びＬＰＳを除去することを目的としたイオン交換クロマトグラフィーを行っても行わなくても良く、さらにその後、二量体又はその他の多量体の存在に起因する可能性のある会合体を除去するためのセファロースゲルでの排除クロマトグラフィーを行っても行わなくても良い。さらに好ましい方法では、これらの技術全てを同時に又は連続的に用いることができる。
【００４５】
キメラ抗体又はヒト化抗体もまた、本発明の抗体に含まれる。
【００４６】
キメラ抗体とは、所与の種の抗体に由来する天然の可変（軽鎖及び重鎖）領域と、  前記所与の種とは異なる種の抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域とを組み合わせて含む抗体を示すものである。
【００４７】
本発明によるキメラタイプの抗体又はその断片は、遺伝子組換え技術を用いて調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーター、及び本発明によるヒト以外の、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、及びヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はマウスＤＮＡ由来の可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡ由来の定常領域によって決定される。キメラ抗体の調製方法については、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎらの文献（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，８：７４，１９８８）を参照することができる。
【００４８】
ヒト化抗体とは、ヒト以外の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分が一つの（又はいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を示すものである。さらに、骨格（ＦＲと呼ばれる）のセグメントの残基のいくつかは、結合親和性を維持するよう改変されていてもよい（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：  ５２２−５２５，  １９８６、  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  １５３４−１５３６，  １９８８、  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：  ３２３−３２７，  １９８８）。
【００４９】
本発明によるヒト化抗体又はその断片は、当業者に既知の技術（例えば、文献、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５０：  ２８４４−２８５７，  １９９２、  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．，  １０：  １−１４２，  １９９２、  又はＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  １６９−１７５，  １９９２に記載されている技術）によって調製することができる。このような本発明によるヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断方法又はｉｎ  ｖｉｖｏでの予防的処置及び／又は治療的処置での使用に好適である。
【００５０】
本発明による抗体の機能的断片とは、特に抗体断片、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖の意味）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくは最小の二重特異性抗体、又はポリ（エチレン）グリコール等のポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ペグ化」）等の化学修飾によって半減期が伸びたあらゆる断片（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ、又はＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる、ペグ化した断片）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを意味する）もしくはリポソームへの組み込みによって半減期が伸びたあらゆる断片を示すものであり、前記断片は、本発明による配列番号１〜６、７〜１２又は１３〜１８の配列である特徴的なＣＤＲの少なくとも一つを有し、特に、それが由来する抗体の部分活性、例えば、特に、ＩＧＦ−ＩＲを認識し、それに結合し、必要に応じてＩＧＦ−ＩＲの活性を阻害する能力さえも通常に発揮し得る。
【００５１】
好ましくは、上記機能的断片は、それらが由来する抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域の部分配列から構成されるか、又はそれを含んでおり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、そして十分な親和性、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲに対する、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００と同等、より好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するのに十分なものである。このような機能的断片は、それが由来する抗体の配列のアミノ酸を最低でも５個含み、好ましくは、１０、１５、２５、５０及び１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００５２】
好ましくは、これらの機能的断片は、それらが由来する抗体と同じ結合特異性を一般に有する、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃタイプの断片又は最小の二重特異性抗体である。本発明によれば、本発明の抗体断片は、上記のような抗体から、ペプシンもしくはパパイン等の酵素による消化等の方法によって、及び／又は化学的還元によるジスルフィド架橋の切断によって得ることができる。別の手法では、本発明に包含される抗体断片を、同様に当業者に既知である遺伝子組換え技術によって、或いは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等の会社から提供されるもののような自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成によって得ることができる。
【００５３】
より詳細には、本発明は、遺伝子組換え又は化学合成によって得られる本発明による抗体又はその機能的断片、特にキメラ抗体又はヒト化抗体を包含する。
【００５４】
第一のアプローチにより、抗体をその重鎖の配列によって定義する。
【００５５】
第一の好ましい方法では、本発明は、本発明による抗体又はその機能的断片の一つに関し、これは、配列番号４〜６の配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号４〜６の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは三つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００５６】
第二の好ましい方法では、本発明は、本発明による抗体又はその機能的断片の一つに関し、これは、配列番号１０〜１２の配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１０〜１２の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは三つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００５７】
第三の好ましい方法では、本発明は、本発明による抗体又はその機能的断片の一つに関し、これは、配列番号１６〜１８の配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１６〜１８の配列と少なくとも８０％の同一性をそれぞれ有する配列である三つのＣＤＲのうちの少なくとも二つ、もしくは３つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする。
【００５８】
第二のアプローチにより、抗体をその軽鎖の配列によって定義する。
【００５９】
同様に好ましい第一の実施形態において、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号１〜３の配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１〜３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列であるＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする。
【００６０】
第二の実施形態において、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号７〜９の配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号７〜９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列であるＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする。
【００６１】
第三の実施形態において、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号１３〜１５の配列であるＣＤＲから選択される少なくとも一つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１３〜１５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列であるＣＤＲを含む軽鎖を含むことを特徴とする。
【００６２】
第三のアプローチにより、抗体をその軽鎖の配列及び重鎖の配列の双方によって定義する。
【００６３】
第一の好ましい方法においては、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号４〜６の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号４〜６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む重鎖を含むこと、そして、配列番号１〜３の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１〜３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６４】
第二の好ましい方法においては、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号１０〜１２の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１０〜１２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む重鎖を含むこと、そして、配列番号７〜９の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号７〜９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６５】
第三の好ましい方法においては、本発明による抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号１６〜１８の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１６〜１８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む重鎖を含むこと、そして、配列番号１３〜１５の配列である三つのＣＤＲ、又は最適なアライメントの後に配列番号１３〜１５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列である三つのＣＤＲを含む軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６６】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明による１３Ｆ５と呼ばれる抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む配列である重鎖を含むこと、そして配列番号１９のアミノ酸配列を含む配列である軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６７】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明による１２Ｄ５と呼ばれる抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含む配列である重鎖を含むこと、そして配列番号２１のアミノ酸配列を含む配列である軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６８】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明による２Ｄ１０と呼ばれる抗体又はその機能的断片の一つは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む配列である重鎖を含むこと、そして配列番号２４のアミノ酸配列を含む配列である軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００６９】
別の可能性、すなわち本発明の一部は、重鎖の三つのＣＤＲがそれぞれ１３Ｆ５、１２Ｄ５及び２Ｄ１０のＣＤＲから成る群において無作為に選択され、軽鎖の三つのＣＤＲがそれぞれ１３Ｆ５、１２Ｄ５及び２Ｄ１０のＣＤＲから成る群において無作為に選択される抗体である。
【００７０】
別の態様によれば、本発明の主題は、ヒトインスリン受容体ＩＲに付着しないか、又はヒトインスリン受容体ＩＲに有効に付着しないことを特徴とする、本発明による抗体又はその機能的断片の一つである。
【００７１】
好ましい方法においては、本発明による上記機能的断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、もしくは最小の二重特異性抗体、又は、化学修飾、特にペグ化あるいはリポソームへの組み込みによって半減期が伸びたあらゆる機能的断片から選択される。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ、特に、国立微生物培養物センター（ＣＮＣＭ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）（フランス、パリ、パスツール研究所）に寄託されたもののようなマウス由来のハイブリドーマに関する。
【００７３】
本明細書において１３Ｆ５と呼ばれる、ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３１９３で２００４年３月２５日に寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体、又はその機能的断片の一つは、当然ながら本発明の一部である。このハイブリドーマは、免疫されたマウス脾細胞と骨髄腫細胞株（Ｓｐ２０  Ａ
ｇ１４）との細胞融合を生じさせるマウスハイブリドーマである。
【００７４】
本明細書において１２Ｄ５と呼ばれる、ＣＮＣＭに番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３１９５で２００４年４月８日に寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体、又はその機能的断片の一つは、当然ながら本発明の一部である。このハイブリドーマは、免疫されたマウス脾細胞と骨髄腫細胞株（Ｓｐ２０  Ａｇ１４）との細胞融合を生じさせるマウスハイブリドーマである。
【００７５】
本明細書において２Ｄ１０と呼ばれる、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３２１４で２００４年５月１３日に寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体、又はその機能的断片の一つは、当然ながら本発明の一部である。このハイブリドーマも、免疫されたマウス脾細胞と骨髄腫細胞株（Ｓｐ２０  Ａｇ１４）との細胞融合を生じさせるマウスハイブリドーマである。
【００７６】
本明細書において２１Ｅ３と呼ばれる、ＣＮＣＭに番号Ｉ−３２４９で２００４年７月１日に寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体、又はその機能的断片の一つは、当然ながら本発明の一部である。このハイブリドーマも、免疫されたマウス脾細胞と骨髄腫細胞株（Ｓｐ２０  Ａｇ１４）との細胞融合を生じさせるマウスハイブリドーマである。
【００７７】
同様に特定の態様によれば、本発明は、本発明によるキメラ抗体又はその機能的断片の一つに関し、これは、上記抗体がさらにマウスとは異なる種、特にヒトの抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域を含むことを特徴とし、好ましくは、ヒト抗体由来の軽鎖及び重鎖の定常領域がそれぞれカッパ領域及びガンマ−１領域、ガンマ−２領域又はガンマ−４領域であることを特徴とする。
【００７８】
新たな態様によれば、本発明は、以下の核酸、
ａ）本発明による抗体又はその機能的断片の一つをコードする核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び
ｂ）ａ）で定義されたような核酸に相補的な核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。
【００７９】
核酸、核配列又は核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語は、本発明においては区別せずに使用され、修飾された又はされていないヌクレオチドの正確な連鎖を示すものであり、核酸の断片又は領域を規定することを可能にし、非天然ヌクレオチドを含んでも含まなくても良く、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡはもちろんのこと、当該ＤＮＡの転写産物に相当することもある。
【００８０】
ここで、本発明が、それらの本来の染色体環境における、すなわち天然の状態でのヌクレオチド配列に関するものではないことも理解されたい。本発明は、単離及び／又は精製されている配列に関し、すなわち、それらは直接的又は間接的に、例えばコピーによって選択されたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。よって、本明細書において、それは、例えば宿主細胞を用いた遺伝子組換えによって得られる、又は化学合成によって得られる、単離された核酸をも示すものである。
【００８１】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションでは、温度条件及びイオン強度条件は、相補的ＤＮＡの二つの断片間でのハイブリダイゼーションの維持を可能にするように選択される。例として、上記のポリヌクレオチド断片を規定することを目的としたハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は、有利には以下のものである。
【００８２】
ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、二つの工程で実施される。（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％のホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハルト液、５％の硫酸デキストラン、及び１％のサケ精子ＤＮＡを含有するリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中において、４２℃にて３時間のプレハイブリダイゼーションを行う、（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、プローブのサイズ＞１００ヌクレオチドの場合には４２℃）において２０時間の実際のハイブリダイゼーションを行い、その後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳで、２０℃における２０分の洗浄を２回行い、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで、２０℃における２０分の洗浄を１回行う。最後の洗浄を、プローブのサイズ＞１００ヌクレオチドの場合、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで、６０℃にて３０分間実施する。より大きなサイズ又はより小さなサイズのオリゴヌクレオチドの場合には、当業者ならば、所定のサイズのポリヌクレオチドのための上記の高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの教示（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）に従って適合させることができる。
【００８３】
本発明はまた、本発明による核酸を含むベクターに関する。
【００８４】
本発明は特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングベクター及び／又は発現ベクターに関する。
【００８５】
本発明によるベクターは、好ましくは、所定の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現及び／又は分泌を可能にするエレメントを含む。そのため、ベクターは、プロモーター、翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグナル、並びに転写調節のための適切な領域を含む必要がある。ベクターは安定した形で宿主細胞中に維持することが可能でなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指示する特定のシグナルを有していてもよい。これらの様々なエレメントは、用いる宿主細胞に応じて当業者により選択され、最適化される。この目的のために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主の自己複製ベクターに挿入してもよいし、又は選択された宿主の組込みベクターとしてもよい。
【００８６】
このようなベクターは、当業者によって現在使用されている方法によって調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、又は化学的方法等の標準的な方法によって、適切な宿主に導入することができる。
【００８７】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミド由来又はウイルス由来のベクターである。それらは、宿主細胞を形質転換して本発明によるヌクレオチド配列をクローニングする又は発現させるのに有用である。
【００８８】
本発明はまた、本発明によるベクターによって形質転換された、又は本発明によるベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００８９】
宿主細胞は、原核生物系又は真核生物系、例えば、細菌細胞や、同様に酵母細胞又は動物細胞、特に哺乳類細胞から選択することもできる。また、昆虫細胞又は植物細胞を使用することもできる。
【００９０】
本発明はまた、本発明に従って形質転換された少なくとも一つの細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
【００９１】
別の態様によれば、本発明の主題は、以下の工程を含むことを特徴とする、本発明による抗体又はその機能的断片の一つの作製方法である。
ａ）本発明による宿主細胞を培地内で適切な培養条件で培養する工程、及び
ｂ）このようにして生成された上記抗体又はその機能的断片の一つを、培養培地又は上記培養した細胞から回収する段階。
【００９２】
本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの調製方法に使用することができる。本発明によるベクター及び／又は本発明によるベクターによって形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え型の本発明によるポリペプチドの調製方法は、それ自体が本発明に包含される。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、前記組換えペプチドを回収する。
【００９３】
上述のように、宿主細胞は、原核生物系又は真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物系又は真核生物系における分泌を促進する本発明によるヌクレオチド配列を同定することができる。このため、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌させたい組換えタンパク質の作製に有利に用いることができる。実際には、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部にあるよりもむしろ細胞培養物の上清に存在することによって容易になる。
【００９４】
また、化学合成によっても本発明によるポリペプチドを調製することができる。このような調製方法もまた、本発明の対象である。当業者ならば、化学合成の方法、例えば、断片の縮合又は溶液中での古典的な合成による、固相を使用する技術（特に、Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１，  ２ｎｄ  ｅｄ．を参照）又は部分固相を用いる技術を知っている。化学合成によって得られた、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に包含される。
【００９５】
本発明による方法によって得ることができる抗体又はその機能的断片の一つもまた、本発明に包含される。
【００９６】
第二の実施形態によれば、本発明は、さらに、ヒト上皮細胞成長因子受容体ＥＧＦＲと特異的に結合することができ、且つ／又は当該ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができることを特徴とする、上述の本発明による抗体に関する。
【００９７】
本発明はまた、好ましくは添加剤及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤と混合した、本発明による抗体又はその機能的断片の一つから成る化合物を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００９８】
本発明の別の相補的な実施形態では、同時の使用、別個の使用又は連続した使用を目的とした組合せ製品として、細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、並びに／又はＩＧＦ−Ｉ及び／もしくはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含む、上記のような組成物が提供される。
【００９９】
「同時の使用」とは、本発明による組成物の二つの化合物を単一及び同一の医薬形態で投与することと解釈される。
【０１００】
「別個の使用」とは、本発明による組成物の二つの化合物を異なる医薬形態で同時に投与することと解釈される。
【０１０１】
「連続した使用」とは、各々が異なる医薬形態の本発明による組成物の二つの化合物を連続的に投与することと解釈される。
【０１０２】
全般的に、本発明による組成物は癌の治療効果を大幅に高める。言い換えれば、本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の治療効果は、意外にも細胞傷害性物質の投与によって増強される。それに続き本発明による組成物によってもたらされるもう一つの重要な利点は、副作用、特に細胞傷害性物質の副作用が現れる危険性を回避する又は減少させることを可能にする、より低い有効用量の有効成分の使用の可能性に関する。
【０１０３】
さらに、本発明によるこの組成物は、期待される治療効果をより迅速に実現することを可能にするであろう。
【０１０４】
特に好ましい実施形態では、本発明による組合せ製品としての上記組成物は、上記細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質が、ＤＮＡと相互作用する物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤もしくはＩＩ阻害剤、又は紡錘体形成阻害剤もしくは紡錘体安定化物質、又は化学療法に用いることができる任意の物質から選択されることを特徴とする。このような細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質は、前記細胞傷害性物質のクラスの各々に関して、例えば、ＶＩＤＡＬの２００１年版の、癌腫学及び血液学の欄「細胞傷害性物質（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｓ）」に添付されたこの化合物のための頁に引用されており、当該文献に関して引用されたこれらの細胞傷害性化合物は好ましい細胞傷害性物質として本明細書に引用される。
【０１０５】
特に好ましい実施形態では、本発明による組合せ製品としての上記組成物は、上記細胞傷害性物質が、同時の使用のために上記抗体と化学的に結合していることを特徴とする。
【０１０６】
特に好ましい実施形態では、本発明による上記組成物は、上記細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質が、紡錘体形成阻害剤又は紡錘体安定化物質、好ましくはビノレルビン及び／又はビンフルニン及び／又はビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【０１０７】
上記細胞傷害性物質と本発明による上記抗体との結合を容易にするために、特に、結合する二つの化合物の間にポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレン）グリコール又はアミノ酸等のスペーサー分子を導入することができ、又は、別の実施形態では、前記本発明による抗体と反応することができる官能基を導入した前記細胞傷害性物質の有効な誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者に既知であり、本明細書では詳述しない。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、ＩＧＦ−Ｉに対する受容体のチロシンキナーゼ活性の上記阻害剤は、誘導された天然物質であるジアニリノフタルイミド、ピラゾロピリミジンもしくはピロロピリドピリミジン又はキナジリンから成る群から選択される。このような阻害剤は当業者に既知であり、文献（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ．，  Ｄｒｕｇｓ  ２０００，  Ｓｕｐｐｌ．  １，  ２５−３２）に記載されている。
【０１０９】
本発明のさらに別の実施形態によれば、上記のような組成物はまた、癌の、特に乳癌のような、特にＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体及び受容体ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する癌の予防及び治療を目的とした同時の使用、別個の使用又は連続の使用のための組合せ製品として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに対する他の抗体化合物を含んでもよい。
【０１１０】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を本発明による抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体と組み合わせることにおける予想外の効果については、特に、その妥当性を示すＡｌｂａｎｅｌｌらの文献（Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ９３（２４）：  １８３０−１８３１，  ２００１）及びＬｕらの文献（Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ９３（２４）：  １８５２−１８５７，  ２００１）を参照することができる。
【０１１１】
特に、本発明による組成物の上記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブと呼ばれる（ハーセプチンとも呼ばれる）抗体である。
【０１１２】
本発明は、別の態様において、少なくとも一つの上記抗体又はその機能的断片の一つが細胞毒素及び／又は放射性元素と共役していることを特徴とする組成物に関する。
【０１１３】
好ましくは、上記毒素又は上記放射性元素は、ＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞の少なくとも一つの細胞活性を阻害することができ、より好ましくは、前記細胞の成長又は増殖を抑制し、特に、前記細胞を完全に不活性化することができる。
【０１１４】
また、好ましくは、上記毒素は腸内細菌の毒素、特にシュードモナス属の外毒素Ａである。
【０１１５】
治療に使用する抗体と好ましく共役する放射性元素（又は放射性同位元素）は、ガンマ線を放つ放射性同位元素であり、好ましくは、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７及びアンチモン２１１である。ベータ線及びアルファ線を放つ放射性同位元素もまた治療に用いることができる。
【０１１６】
本発明による少なくとも一つの抗体又はその機能的断片の一つと共役した毒素又は放射性元素とは、特に、結合分子の導入があってもなくても良い、二つの化合物間の共有結合によって、前記毒素又は前記放射性元素を前記少なくとも一つの抗体に結合させることが可能な任意の手段を意味するものである。
【０１１７】
共役体の構成要素の全て又は一部の化学的（共有的）、静電的又は非共有的な結合を可能にする物質のうち、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より詳細には、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ−アセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する一つ又は複数のフェニルアジド基を有する架橋剤、好ましくは、Ｎ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を挙げることができる。
【０１１８】
特に放射性元素のもう一つの結合形式が、二価のイオンキレート剤の使用であり得る。
【０１１９】
これらのキレートのうち、金属、特に放射性金属、及び免疫グロブリンを結合するために開発された、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）由来のキレート又はＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）由来のキレートを挙げることができる。このように、リガンド−金属複合体の安定性及び剛性を高めるために、ＤＴＰＡ及びその誘導体は炭素鎖上で異なる基に置換することができる（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７、  Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１、  Ｇａｎｓｏｗ，  １９９１、米国特許第４，８３１，１７５号）。
【０１２０】
例えば、長い間、医学及び生物学において遊離した形態又は金属イオンとの複合体の形態のいずれかで広く用いられてきたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びその誘導体は、金属イオンと安定したキレートを形成し、治療又は診断のためのタンパク質、例えば、癌治療における放射性免疫複合体の開発のための抗体に結合するという、注目すべき特徴を備えている（Ｍｅａｓｅｓ  ｅｔ  al.,  １９８４、  Ｇａｎｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。
【０１２１】
また、好ましくは、本発明による上記共役体を形成する少なくとも一つの抗体は、その機能的断片、特に、そのＦｃ領域が切断された断片、例えばｓｃＦｖ断片から選択される。
【０１２２】
本発明はさらに、薬剤の調製のための、本発明による組成物の使用を包含する。
【０１２３】
より詳細には、別の実施形態によれば、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現及び／もしくは異常な活性化によって引き起こされる疾患、並びに／又はＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化に関連した疾患の予防又は治療を目的とした薬剤の調製のための、抗体もしくはその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用に関する。
【０１２４】
好ましくは、本発明による上記使用は、上記薬剤の投与が、インスリン受容体ＩＲの阻害に関連した副作用、すなわち、前記薬剤が存在することによる、特に前記薬剤のＩＲへの付着に関連した拮抗的阻害による、ＩＲ受容体のその天然リガンドとの相互作用の阻害に関連した副作用を引き起こさない、又はわずかしか引き起こさないことを特徴とする。
【０１２５】
本発明はさらに、腫瘍特性を有する細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、特にＩＧＦ１依存性及び／又はＩＧＦ２依存性細胞への正常細胞の形質転換を阻害することを目的とした薬剤の調製のための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用を包含する。
【０１２６】
本発明はまた、腫瘍細胞、好ましくはＩＧＦ依存性細胞、特にＩＧＦ１依存性及び／又はＩＧＦ２依存性細胞の成長及び／又は増殖を阻害することを目的とした薬剤の調製のための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体もしくはその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用に関する。
【０１２７】
全般的に、本発明の主題は、好ましくはＩＧＦ−ＩＲを発現する癌、及び／又は、好ましくは、ＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２のＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化、例えばＩＲＳ１の過剰発現等を示す癌の予防又は治療を目的とした薬剤の調製のための、本発明による、好ましくはヒト化された抗体又はその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用である。
【０１２８】
本発明の主題はまた、乾癬、つまり上皮細胞の過剰な増殖がＩＧＦ−ＩＲの発現もしくは過剰発現及び／又はＩＧＦ−ＩＲのその天然リガンドとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化と関連している可能性がある乾癬（Ｗｒａｉｇｈｔ  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０００，  １８（５）：  ５２１−５２６．  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．）の予防又は治療を目的とした薬剤の調製のための、本発明による、好ましくはヒト化した抗体もしくはその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用である。別の実施形態においては、本発明の目的は、アテローム性動脈硬化症の予防又は治療を目的とした薬剤の調製のための、本発明による、好ましくはヒト化した抗体もしくはその機能的断片の一つ及び／又は組成物の使用である。
【０１２９】
予防及び／又は治療することができる癌としては、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌もしくは結腸癌、又はＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するその他の癌が好ましい。
【０１３０】
さらに別の態様によれば、本発明の主題は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の異常な存在が疑われる生体試料から、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現又は低発現、好ましくは過剰発現に関連した疾患を、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにて診断する方法であり、これは、前記生体試料を本発明による抗体又はその機能的断片の一つと接触させることを特徴とし、前記抗体は必要に応じて標識することが可能である。
【０１３１】
好ましくは、上記診断方法において、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現に関連した上記疾患は癌である。
【０１３２】
別の特定の実施形態においては、本発明による抗体は、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現だけでなくハイブリッド−Ｒの過剰発現にも関連する疾患の治療、予防及び／又は診断のために用いることも可能である。
【０１３３】
より詳細には、本発明による抗体は、ハイブリッド−ＲのアイソフォームＡ及び／もしくはアイソフォームＢと結合することができ、そしてその天然リガンド、好ましくは本明細書においてＩＧＦ１及び／もしくはＩＧＦ２及び／もしくはインスリンと表されるものの結合を阻害することができ、且つ／又は前記ハイブリッド−Ｒのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができることを特徴とする。
【０１３４】
上記抗体又はその機能的断片の一つは、検出可能及び／又は定量可能なシグナルを得ることができるように、免疫複合体又は標識された抗体の形で存在してもよい。
【０１３５】
本発明による標識された抗体又はその機能的断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素と共役することができるか、又はビオチン、ジゴキシゲニンもしくは５−ブロモデオキシウリジン等の分子が共役することができる、免疫複合体と呼ばれる抗体等が挙げられる。また、蛍光標識を本発明による抗体又はその機能的断片に共役させてもよく、それらとしては、特に、フルオレセイン及びその誘導体、蛍光色素、ローダミン及びその誘導体、ＧＦＰ(ＧＦＰは「グリーン蛍光タンパク質」を意味する)、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。このような共役体では、本発明の抗体又はその機能的断片を当業者に既知の方法によって調製することができる。それらは、直接、又はスペーサー基もしくはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）等の結合基を介して、又は治療用共役体に関して上述したような結合剤の存在下で、酵素又は蛍光標識と結合させることができる。フルオレセインタイプの標識を有する共役体は、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。
【０１３６】
また、その他の共役体には、ルミノール及びジオキセタン等の化学発光標識、ルシフェラーゼ及びルシフェリン等の生物発光標識、又はヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９、ヨウ素１３１等の放射性標識が含まれる。治療用の放射性同位元素を直接又は上記のＥＤＴＡやＤＴＰＡ等のキレート剤を介して抗体に結合させるための、当業者に既知の方法を、診断で用いることができる放射性元素に用いることができる。また、クロラミンＴ法［Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｆ．  Ｃ．，  １９６２，  Ｎａｔｕｒｅ  １９４：  ４９５］によるＮａ［Ｉ１２５］での標識、又はＣｒｏｃｋｆｏｒｄらの技術（米国特許第４，４２４，２００号）によるテクネチウム９９ｍもしくはＨｎａｔｏｗｉｃｈ（米国特許第４，４７９，９３０号）によって記載されているようなＤＴＰＡを介して結合したテクネチウム９９ｍでの標識もまた挙げることができる。
【０１３７】
このように、本発明による抗体又はその機能的断片は、生体試料のＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現又は低発現、好ましくは過剰発現の、検出方法及び／又は定量方法に使用することができ、その方法は、
ａ）生体試料を、本発明による抗体又はその機能的断片の一つと接触させる工程、及び
ｂ）形成された可能性のあるＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体を明らかにする工程
を含むことを特徴とする。
【０１３８】
特定の実施形態では、本発明による抗体又はその機能的断片を、ＩＧＦ依存性の癌又は乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防的処置及び／又は治療的処置の効果をモニタリングするための、生体試料のＩＧＦ−Ｉ受容体の検出方法及び／又は定量方法に使用することができる。
【０１３９】
より一般的には、本発明による抗体又はその機能的断片は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の発現を定性的及び／又は定量的に観察する必要のある任意の状況で有利に使用することができる。
【０１４０】
好ましくは、生体試料は、血清等の体液、全血、細胞、組織試料又はヒト由来の生体組織から成る。
【０１４１】
このような検出及び／又は定量を実施するためには、任意の手順又は従来の試験を用いることができる。前記試験は、競合試験もしくはサンドウィッチ試験、又は抗体−抗原タイプの免疫複合体の形成に依存した当業者に既知の任意の試験であってよい。本発明に従った適用後に、抗体又はその機能的断片の一つを固定してもよいし、又は標識してもよい。この固定は、当業者に既知の数多くの担体上で行うことができる。これらの担体としては、特に、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、又は自然細胞もしくは改変細胞が挙げられる。これらの担体は、可溶性でも不溶性でもよい。
【０１４２】
例として、好ましい方法は、免疫蛍光による、ＥＬＩＳＡ技術に従った免疫酵素法、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術、又はそれと同等のものである。
【０１４３】
よって、本発明はまた、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現もしくは低発現によって引き起こされる疾患の診断方法を実施するため、又は生体試料のＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現もしくは低発現、好ましくは当該受容体の過剰発現の検出方法及び／又は定量方法を実施するために必要なキット又はセットを含み、前記キット又はセットは、以下の要素、
（ａ）本発明による抗体又はその機能的断片の一つ、
（ｂ）所望により、免疫学的反応に適した培地を形成するための試薬、
（ｃ）所望により、免疫学的反応によって生成したＩＧＦ−ＩＲ／抗体複合体を明らかにすることが可能な試薬
を含むことを特徴とする。
【０１４４】
本発明はさらに、癌、特に上記細胞障害性物質又は上記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が一般に処方される癌、特に腫瘍細胞がＩＧＦ−Ｉ受容体を発現又は過剰発現する癌の予防又は治療を目的とした薬剤の調製のための、本発明による組合せ製品としての組成物の使用に関する。
【０１４５】
本発明の主題はまた、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現又は過剰発現する細胞への生物活性のある化合物の特異的ターゲッティングを目的とした薬剤の調製のための、本発明による抗体の使用である。
【０１４６】
本明細書において、生物活性のある化合物とは、細胞の活性、特にその成長、その増殖、転写又は遺伝子翻訳を、調節、特に阻害することができる、あらゆる化合物を示すものである。
【０１４７】
本発明の主題はまた、好ましくは標識した、特に放射性標識した、本発明による抗体又はその機能的断片の一つを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断試薬、及び、特に細胞によるＩＧＦ−Ｉ受容体の発現又は過剰発現に関連した癌の検出を目的とした、医用画像におけるその使用である。
【０１４８】
本発明はまた、薬剤としての、本発明による組合せ製品としての組成物、又は抗ＩＧＦ−ＩＲ／毒素共役体もしくは放射性元素に関する。
【０１４９】
好ましくは、本発明による組合せ製品としての上記組成物又は上記共役体は、添加剤及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。
【０１５０】
本明細書において、薬学的に許容可能な賦形剤とは、医薬組成物の一部を構成する化合物又は化合物の組合せであり、二次反応を誘発せず、そして、例えば、活性化合物の投与を容易にし、体内でのその寿命及び／又はその効果を増大し、溶液へのその溶解度を高め、或いはまたその保存の改善を可能にするものである。これらの薬学的に許容可能な賦形剤は既知であり、選択された活性化合物の性質及び投与の様式に応じて当業者が適合させるであろう。
【０１５１】
好ましくは、これらの化合物は、全身投与、特に、静脈内投与、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下投与、又は経口投与される。より好ましくは、本発明の抗体を含む組成物を連続的に数回投与する。
【０１５２】
その投与の様式、用量及び最適な医薬形態は、患者に適合させた治療を確立させるにあたり一般に考慮する基準、例えば、患者の年齢又は体重、患者の全身状態の重篤度、治療に対する抵抗性及び確認されている副作用に従って決定することができる。
【０１５３】
続いて、本発明の他の特徴及び利点を、実施例及び以下の図面と共に明細書に示す。
−図１は、ＭＣＦ−７モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価を示す図である。
−図２及び３は、ＤＵ１４５での抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価を示す図である。
−図４は、ＩＧＦ−ＩＲを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
−図５は、イムノキャプチャーしたＨＲ−Ａでの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
−図６は、イムノキャプチャーしたＨＲ−Ｂでの［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１の排除を示す図である。
−図７は、ＩＲ−Ａを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＮＳの排除を示す図である。
−図８は、ＩＲ−Ｂを発現する無傷細胞での［１２５Ｉ］−ＩＮＳの排除を示す図である。
【実施例１】
【０１５４】
ＩＧＦ−１Ｒに対するモノクローナル抗体の作製
可溶性のα２−β２ヘテロ四量体組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄシステム、米国ミネアポリス）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞とＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株との融合によってハイブリドーマを作製した。得られたマウス抗体は、まずＭＣＦ−７細胞でのＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析によってスクリーニングした。その後、Ｓｆ９−ＩＧＦ−１Ｒ細胞とＳｆ９−ＩＲ細胞で最後のスクリーニングを行い、ＩＧＦ−１及びＩＲの両方を認識する抗体を除外した。選択されたＭＡｂ（ＥＬＩＳＡで陽性であり、ＭＣＦ−７細胞の野生型受容体を認識する）を、腹水として産生し、プロテインＡクロマトグラフィで精製した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで試験し、結果を表１にまとめた。
【０１５５】
【表１】
2014193862.tif 000002
【実施例２】
【０１５６】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
方法
ＡＴＣＣから入手したＭＣＦ−７細胞を、フェノールレッドフリーＲＰＭＩ培地（インビトロジェン社、英国、スコットランド）、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、１％Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社）中で常法により培養した。ＭＣＦ−７細胞を、９６ウェル組織培養プレートの無血清培地中に５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、最終濃度が５μｇ／ｍｌの各試験抗体の非存在下又は存在下で、ＩＧＦ１を１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の投与量で培地に添加した。３日後、０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジン（アマシャムバイオサイエンス  ＡＢ、スウェーデン国、ウプサラ）を細胞に１６時間パルスした。トリクロロ酢酸に不溶性のＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの量を、液体シンチレーション計数によって定量した。結果を増殖指数（細胞＋ＩＧＦ１＋抗体のｃｐｍ／細胞＋抗体のみのｃｐｍ）として表す。
【０１５７】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価は、細胞分裂促進活性に関するＭａｂの第一のスクリーニングであった。これらの分析は、腹水として産生された、作製された抗体を、ＩＧＦ１と同時にＭＣＦ−７細胞に添加し、市販のαＩＲ３Ｍａｂと比較して、その抗体と少なくとも同等に有効である抗体を選択することによって行った。先の結果の表２＊中で（＋）と記載されている陽性のＭａｂ（５つのＭａｂ）は、最も高い投与量のＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍｌ）で細胞を刺激したときに増殖指数＜５を示すものである。図１は、６つの強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害剤のうちの４つ（２Ｄ１０、１２Ｄ５、１２Ｂ１、１３Ｆ５）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す。２Ｆ２及び２１Ｅ３のＭａｂは、（±）＊Ｍａｂ（最も高いＩＧＦ１濃度の場合に５＜増殖指数＜１５）であると考えられ、７Ｇ３及び２Ｂ１０は、非中和抗体（増殖指数＞１５）であると考えられた。２１Ｅ３がＩｇＧ２アイソタイプのＭａｂにすぎないことは興味深い。
【実施例３】
【０１５８】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
方法
ＡＴＣＣから入手したＤＵ１４５細胞を、ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社、英国、スコットランド）、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、１％Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社）中で常法により培養した。細胞を移植の二日前に分割して、対数増殖期となるようにした。ＰＢＳ中の２００万個のＤＵ１４５細胞をＳｗｉｓｓヌードマウスに移植した。移植の一日後、マウスを６頭の群に分割した。１週間に３回、２００μｇの各試験抗体で、腫瘍と反対の位置においてマウスを皮下注射処理した。コントロール群は、最初のスクリーニングにおいてマウスのアイソタイプのコントロール（ＥＣ２）で処理するか、又は続くスクリーニングにおいてＰＢＳで処理するとしたが、これは、最初の実験においてマウスのこれら２つの群の間で腫瘍成長の差異が観察されなかったことが示されたためである。腫瘍の体積を一週間に一度測定し、次の式によって算出した：π／６×長さ×幅×高さ。
【０１５９】
結果
三つのｉｎ  ｖｉｖｏでの実験を、Ｍａｂパネルを試験するために行った。図２及び図３は、１３Ｆ５、２Ｄ１０及び６Ｅ５が、ＤＵ１４５細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を有意に阻害することを示す。統計分析（マンホイットニー検定）の結果を表２に示す。
【０１６０】
【表２】
2014193862.tif 000003
【実施例４】
【０１６１】
２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５の、ＩＧＦ−ＩＲ及びハイブリッド−Ｒへの結合能力の評価
この研究に用いた細胞を以下に列挙する。
・Ｒ＋：ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）のｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたＲ−繊維芽細胞、
・Ｒ−／ＩＲ−Ａ：インスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）のｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたＲ−繊維芽細胞、
・Ｒ−／ＩＲ−Ｂ：インスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）のｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたＲ−繊維芽細胞、
・Ｒ＋／ＩＲ−Ａ：ＩＧＦ−Ｉ及びインスリン受容体アイソフォームＡのｃＤＮＡを安定的にコトランスフェクトし、それによりハイブリッド受容体Ａ（ハイブリッド−ＲｓＡ）を発現するＲ−繊維芽細胞、
・Ｒ＋／ＩＲ−Ｂ：ＩＧＦ−Ｉ及びインスリン受容体アイソフォームＢのｃＤＮＡを安定的にコトランスフェクトし、それによりハイブリッド受容体Ａ（ハイブリッド−ＲｓＢ）を発現するＲ−繊維芽細胞。
【０１６２】
実施例４−１：ＩＧＦ−ＩＲでの、２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５及びαＩＲ−３による［１２５Ｉ］ＩＧＦ１の排除の分析
【０１６３】
漸増濃度の非標識リガンド（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはインスリン）又は抗体（２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５）の存在下又は非存在下で、［１２５Ｉ］ＩＧＦ１（２０，０００ｃｐｍ）を、Ｒ＋無傷細胞に４℃で１６時間結合させた。結果を最大特異的結合の割合としてプロットし、図４に示す。
【０１６４】
２Ｄ１０及び１３Ｆ５のいずれも、ナノモルに満たない親和性でＩＧＦ１を有効かつ十分に排除し、本実施例では、対照抗体αＩＲ３（ＩＣ５０：０．０５ｎＭ）と比較して、それぞれ０．１５及び０．２０ｎＭのＩＣ５０を示した。これらの親和性は、天然のＩＧＦ−ＩＲのリガンドであるＩＧＦ１（本実施例では２．２ｎＭ）及びＩＧＦ２（本実施例では１５ｎＭ）の親和性よりも高い。
【０１６５】
実施例４−２：ハイブリッド−ＲｓＡでの、２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５及び４７−９による［１２５Ｉ］ＩＧＦ１の排除の分析
【０１６６】
Ｒ＋／ＩＲ−Ａ細胞溶解物由来のハイブリッド−ＲｓＡを、抗ＩＲ抗体８３−７で被覆したＭａｘｉｓｏｒｂプレートにおいてイムノキャプチャーした。
【０１６７】
その後、漸増濃度の非標識リガンド（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはインスリン）又は抗体（２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５、４７−９、９Ｇ４）の存在下又は非存在下で、［１２５Ｉ］ＩＧＦ１（図５）を、イムノキャプチャーした受容体と結合させた。結果を最大特異的結合の割合としてプロットし、図５に示す。
【０１６８】
２Ｄ１０及び１３Ｆ５は、非常に類似した、ナノモルに満たない親和性で、標識したＩＧＦ１を有効かつ十分に排除し、本実施例ではＩＣ５０がそれぞれ０．２及び０．３５ｎＭである。比較すると、４７−９では０．１８ｎＭのＩＣ５０値が得られた（図５）。
【０１６９】
これらの親和性は、天然のハイブリッド−ＲｓＡのリガンドであるＩＧＦ１（本実施例では２．０ｎＭ）及びＩＧＦ２（本実施例では１２ｎＭ）の親和性よりも高い。
【０１７０】
実施例４−３：ハイブリッド−ＲｓＢでの、２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５及び４７−９による［１２５Ｉ］ＩＧＦ１の排除の分析
【０１７１】
Ｒ＋／ＩＲ−Ｂ細胞溶解物由来のハイブリッド−ＲｓＢを、８３−７抗体で被覆したＭａｘｉｓｏｒｂプレートにおいてイムノキャプチャーした。
【０１７２】
その後、漸増濃度のＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インスリン又は抗体（２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５、４７−９、９Ｇ４）の存在下又は非存在下で、［１２５Ｉ］ＩＧＦ１（図６）を、イムノキャプチャーした受容体と結合させた。結果を最大結合の割合としてプロットする。
【０１７３】
２Ｄ１０及び１３Ｆ５は、非常に類似した、ナノモルに満たない親和性で、標識されたＩＧＦ１を有効かつ十分に排除し、本実施例ではそれぞれ０．０４及び０．１５のＩＣ５０を示した。比較すると、４７−９はＩＣ５０値が０．４０ｎＭであり、あまり有効でなかった（図６）。
【０１７４】
実施例４−４：インスリン受容体Ａ（ＩＲ−Ａ）及びインスリン受容体Ｂ（ＩＲ−Ｂ）での、２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５及びＭＡ−１０による［１２５Ｉ］インスリンの排除の分析
【０１７５】
漸増濃度の非標識リガンド（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはインスリン）又は抗体（２Ｄ１０、１２Ｄ５、１３Ｆ５）の存在下又は非存在下で、［１２５Ｉ］インスリン（４０，０００ｃｐｍ）をＲ−／ＩＲ−Ａ又はＲ−／ＩＲ−Ｂ無傷細胞と４℃で１６時間結合させた。結果を最大特異的結合の割合としてプロットし、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂについてそれぞれ図７及び８に示す。
【０１７６】
対照抗体ＭＡ−１０（ＩＣ５０：ＩＲ−Ａ（図７）及びＩＲ−Ｂ（図８）の場合、それぞれ０．９０ｎＭ及び１．５ｎＭ）と対照的に、２Ｄ１０も１２Ｄ５も１３Ｆ５のいずれもインスリンを排除しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１７７】
【特許文献１】国際公開第０３／０５９９５１号公報
【図１】
2014193862.tif 000004
【図２】
2014193862.tif 000005
【図３】
2014193862.tif 000006
【図４】
2014193862.tif 000007
【図５】
2014193862.tif 000008
【図６】
2014193862.tif 000009
【図７】
2014193862.tif 000010
【図８】
2014193862.tif 000011
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月10日(2014.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子Ｉ受容体ＩＧＦ−ＩＲに結合することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであって、配列番号１、２及び３の配列を有する３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む軽鎖を含み、かつ、配列番号４、５及び６の配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖を含むことを特徴とする、単離された抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項２】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むこと、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖をさらに含むことを特徴とする、１３Ｆ５と呼ばれる請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
【請求項４】
２００４年３月２５日にＣＮＣＭ（パリ、パスツール研究所）に番号Ｉ−３１９３で寄託された、請求項３に記載のマウスハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項４に記載のハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする抗体、又はその機能的断片の一つ。
【請求項６】
前記抗体がキメラ抗体であり、マウスとは異なる種の抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項７】
前記異なる種がヒトであることを特徴とする、請求項６に記載のキメラ抗体又はその機能的断片の一つ。
【請求項８】
請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマによって産生される抗体もしくはその機能的断片の一つから成る化合物を有効成分として含む組成物。
【請求項９】
同時の使用、別個の使用又は連続した使用を目的とした組合せ製品として、抗体、細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、並びに／又はＩＧＦ−Ｉ及び／もしくはＥＧＦに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬剤としての請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現及び／もしくは異常な活性化に関連する疾患、並びに／又はＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２とＩＧＦ−ＩＲとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化に関連する疾患の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマにより産生される抗体もしくはその機能的断片の一つ、及び／又は請求項８〜１０のいずれか一つに記載の組成物の使用方法。
【請求項１２】
腫瘍特性を有する細胞への正常細胞の形質転換を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞の成長及び／又は増殖を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１４】
癌の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１５】
前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌又は結腸癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用方法。
【請求項１６】
乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１７】
ＩＧＦ−Ｉ受容体の異常な存在が疑われる生体試料から、ＩＧＦ−Ｉ受容体の過剰発現又は低発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析する方法であって、前記生体試料を、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体又は請求項３もしくは４に記載のハイブリドーマにより産生される抗体と接触させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
ハイブリッド−ＲｓＡ及び／もしくはハイブリッドＲｓＢと結合することができ、且つ／又はその天然リガンドの結合を阻害することができることを特徴とする、請求項１、２、５、６及び７のいずれか一つに記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014193862000001.app