(57)【要約】【課題】試料中に含まれる複数の基質の濃度を簡便で安定的に測定する。【解決手段】バイオセンサ１００は、試料中の第一および第二の基質の濃度を測定するバイオセンサであって、絶縁性基板１１１、絶縁性基板１１１上に設けられた電極１１６、および電極１１６上に設けられた反応層１１４を有するセンサ部１０１と、時刻を計時する計時部１０３と、演算部１０５と、を有し、反応層１１４が、第一の基質を第二の基質に変換する第一の酵素と、第二の基質または第二の基質がさらに変換された変換体に作用する第二の酵素と、を含み、演算部１０５が、第一の時刻においてセンサ部１０１にて検出される第一の電流値と、第二の時刻においてセンサ部１０１にて検出される第二の電流値とに基づいて、試料中の第一の基質の濃度および第二の基質の濃度をそれぞれ算出する。【選択図】図１
2014153243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の第一および第二の基質の濃度を測定するバイオセンサであって、
基板、前記基板上に設けられた電極、および前記電極上に設けられた反応層を有するセンサ部と、
時刻を計時する計時部と、
演算部と、
を有し、
前記反応層が、
前記第一の基質を前記第二の基質に変換する第一の酵素と、
前記第二の基質または前記第二の基質がさらに変換された変換体に作用する第二の酵素と、
を含み、
前記演算部が、第一の時刻において前記センサ部にて検出される第一の電流値と、第二の時刻において前記センサ部にて検出される第二の電流値とに基づいて、前記試料中の前記第一の基質の濃度および前記第二の基質の濃度をそれぞれ算出する、バイオセンサ。
【請求項２】
前記電極が一つの作用極を有し、前記反応層が前記作用極上に設けられた、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記演算部が、前記第一の電流値に基づいて前記試料中の前記第二の基質の濃度を算出するとともに、前記第二の電流値と前記第一の電流値との差分に基づいて前記試料中の前記第一の基質の濃度を算出する、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記第二の酵素が酸化還元酵素である、請求項１乃至３いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記第一の酵素が前記第一の基質の加水分解酵素である、請求項１乃至４いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記第一の基質が、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロースからなる群から選択される一種であり、
前記第二の基質がグルコースであり、
前記第二の酵素が、グルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素である、請求項１乃至５いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記第二の基質がグルタミン酸であり、前記第二の酵素がグルタミン酸オキシダーゼである、請求項１乃至５いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記第一の基質が、コレステリルエステル、尿素、クレアチニン、シスタチオニンおよびラフィノースからなる群から選択される一種である、請求項１乃至５いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記反応層が、前記第一の酵素を含む第一の反応層と、前記第二の酵素を含む第二の反応層とを有する、請求項１乃至８いずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれか一項に記載のバイオセンサを用いて試料中の第一および第二の前記基質濃度を測定する方法であって、
前記第一の時刻において、前記センサ部にて検出される第一の電流値を取得するステップと、
前記第二の時刻において、前記センサ部にて検出される第二の電流値を取得するステップと、
前記第一および第二の電流値に基づいて、前記試料中の前記第一の基質の濃度および前記第二の基質の濃度をそれぞれ算出するステップと、
を含む、測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサおよびこれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサに関する技術として、特許文献１に記載のものがある。同文献には、試料中の基質と酸化還元酵素との反応を電気化学的に検知して基質濃度を測定するバイオセンサが記載されており、試料中に含まれる基質濃度の検量範囲を広範囲に設計することができ、かつ、精度よく基質濃度を測定することが可能となるとされている。
【０００３】
また、スクロースセンサに関する技術として、特許文献２〜４に記載のものがある。このうち、特許文献４には、グルコースとフルクトースとスクロースの合計量を検知する技術が記載されている。
【０００４】
コレステロールセンサに関する技術として、特許文献５〜１１に記載のものがある。このうち、特許文献６には、第一〜第三の電気化学的セルを設けることにより、試料中の総コレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールの含有量を測定することが記載されている。また、特許文献７には、ＨＤＬコレステロール試験を実施するための第一のセルと総コレステロール試験を実施するための第二のセルを用いることが記載されている。
【０００５】
特許文献１２および１３には、アルギニンセンサおよび尿素センサを具えたセンサを用いてアルギニンおよび尿素を含む試料に含まれるアルギニンを測定することが記載されている。
【０００６】
また、特許文献１４には、Ｎａ＋、グルコースおよび尿素を計測するセンサをそれぞれ個別に配置するマルチセンサに関する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−５４３７９号公報
【特許文献２】特開２００１−１７４４３２号公報
【特許文献３】特開平６−８８８０５号公報
【特許文献４】特開平９−２２９８９５号公報
【特許文献５】再公表ＷＯ０１／０３８８６２
【特許文献６】特表２００９−５２０９７４号公報
【特許文献７】特表２００９−５３７０２０号公報
【特許文献８】特開平１０−２３２２１９号公報
【特許文献９】特開平１１−５１８９６号公報
【特許文献１０】特開平１１−２６１８号公報
【特許文献１１】特開平２００５−８３９６５号公報
【特許文献１２】特開平８−３３８８２６号公報
【特許文献１３】特開平８−３３６３９９号公報
【特許文献１４】特開平１１−２７１２５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記文献記載の従来技術においても、試料中に含まれる複数の基質の濃度を簡便で安定的に測定するという点で、改善の余地があった。特許文献２〜４に記載のスクロースセンサを例に挙げると、グルコースおよびスクロースが含まれている試料について、これらのスクロースセンサにより、グルコースおよびスクロースのそれぞれの濃度を簡便に測定することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、
試料中の第一および第二の基質の濃度を測定するバイオセンサであって、
基板、前記基板上に設けられた電極、および前記電極上に設けられた反応層を有するセンサ部と、
時刻を計時する計時部と、
演算部と、
を有し、
前記反応層が、
前記第一の基質を前記第二の基質に変換する第一の酵素と、
前記第二の基質または前記第二の基質がさらに変換された変換体に作用する第二の酵素と、
を含み、
前記演算部が、第一の時刻において前記センサ部にて検出される第一の電流値と、第二の時刻において前記センサ部にて検出される第二の電流値とに基づいて、前記試料中の前記第一の基質の濃度および前記第二の基質の濃度をそれぞれ算出する、バイオセンサが提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、前記本発明におけるバイオセンサを用いて試料中の第一および第二の前記基質濃度を測定する方法であって、
前記第一の時刻において、前記センサ部にて検出される第一の電流値を取得するステップと、
前記第二の時刻において、前記センサ部にて検出される第二の電流値を取得するステップと、
前記第一および第二の電流値に基づいて、前記試料中の前記第一の基質の濃度および前記第二の基質の濃度をそれぞれ算出するステップと、
を含む、測定方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料中に含まれる複数の基質の濃度を簡便で安定的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態におけるバイオセンサの構成を模式的に示すブロック図である。
【図２】実施形態におけるバイオセンサのセンサ部の構成を示す断面図である。
【図３】実施形態におけるバイオセンサのセンサ部の構成を示す平面図である。
【図４】実施形態におけるバイオセンサのセンサ部の構成を示す断面図である。
【図５】実施形態におけるバイオセンサのセンサ部の構成を示す斜視図である。
【図６】実施例におけるバイオセンサを用いた電流値の測定結果を示す図である。
【図７】実施例におけるバイオセンサを用いた電流値の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１４】
（第一の実施形態）
図１は、実施形態におけるバイオセンサの構成を模式的に示すブロック図である。図１に示したバイオセンサ１００は、試料中の第一および第二の基質の濃度を測定するバイオセンサである。バイオセンサ１００は、センサ部１０１と、計時部１０３と、演算部１０５とを有する。
【００１５】
図２および図３は、センサ部１０１の構成を示す図である。
図３は、センサ部１０１の構成を示す平面図であり、図２は、図３のＡ−Ａ'断面図である。センサ部１０１は、基板（絶縁性基板１１１）、絶縁性基板１１１上に設けられた電極１１６、および電極１１６に設けられた反応層１１４を有する。
【００１６】
絶縁性基板１１１には、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用することができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド及びポリカーボネードなどの合成樹脂板を用いることができる。
【００１７】
電極１１６として、たとえば作用極１１２および対極１１３からなる二極系電極を採用することができる。作用極１１２および対極１１３は、導電性材料により形成される。導電性材料とは、炭素、またはパラジウム、銀、白金、金、銅、ニッケル、それらの合金等の金属材料である。
また、電極１１６として、図２および図３に示したような、作用極１１２、対極１１３および参照極１１５からなる三極系電極を採用することもできる。三極系電極を採用することで、安定に応答電流を得ることができ、測定精度を安定化させることができる。参照極１１５についても、作用極１１２および対極１１３と同様に、導電性材料により形成される。
各電極の材料は同じであってもよいし異なっていてもよい。電極は１種の導電性材料により形成されていてもよいし、２種以上の導電性材料により形成されていてもよい。これにより、安定した応答電流が得られ、精度がさらに安定化する。
作用極１１２、対極１１３および参照極１１５は、たとえばスクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法により絶縁性基板１１１に塗布することにより形成することができる。
【００１８】
また、電極１１６には、表面が絶縁膜１３０で覆われている絶縁領域と、反応層１１４で覆われている測定領域と、電圧を印加するための印加領域と、が設けられている。印加領域では、電極１１６の表面が露出している。
また、電極１１６は、一つの作用極１１２を有し、反応層１１４が作用極１１２上に設けられている。
【００１９】
反応層１１４は、第一の基質を第二の基質に変換する第一の酵素と、第二の基質または第二の基質がさらに変換された変換体に作用する第二の酵素と、を含む。図２および図３においては、反応層１１４は、電極１１６と接するように設けられている。
【００２０】
第一の酵素は、たとえば加水分解酵素である。また、第二の酵素は、たとえば酸化還元酵素である。第一および第二の酵素、第一および第二の基質の具体例ならびに組み合わせについては後述する。
また、反応層１１４が、第一および第二の酵素以外の酵素をさらに含んでいてもよい。たとえば、反応層１１４が、第二の基質をその変換体に変換する第三の酵素をさらに含み、第二の酵素が上記第二の基質の変換体に作用する構成とすることもできる。
反応層１１４中の第一および第二の酵素の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができる。
たとえば、第一の酵素としてインベルターゼを用いる場合、その含有量は、０．００１〜１０ユニット／μＬ度とすることが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で加水分解するために必要な加水分解酵素の量をいう。
また、第二の酵素として酸化還元酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を用いる場合、その含有量は、０．１〜５０ユニット／μＬが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させるために必要な、酸化還元酵素の量をいう。
【００２１】
また、反応層１１４の厚さは特に制限されないが、たとえば試料が血液である場合などのように測定に用いる試料の量をなるべく少なくする観点からは、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜５μｍにするとよい。
【００２２】
計時部１０３は、時刻を計時する。
演算部１０５は、計時部１０３にて計測された時刻を取得する。また、演算部１０５は、センサ部１０１で測定された電流値を取得する。そして、演算部１０５は、計時部１０３およびセンサ部１０１から取得したデータに基づき演算をおこなう。
すなわち、演算部１０５は、第一の時刻（Ｔ１）においてセンサ部１０１にて検出される第一の電流値（Ｉ１）と、第二の時刻（Ｔ２）においてセンサ部１０１にて検出される第二の電流値（Ｉ２）とに基づいて試料中の第一の基質の濃度および第二の基質の濃度をそれぞれ算出する。
具体的には、演算部１０５は、Ｉ１に基づいて試料中の第二の基質の濃度を算出するとともに、Ｉ２とＩ１との差分（Ｉ２−Ｉ１）に基づいて試料中の第一の基質の濃度を算出する。
【００２３】
測定試料として、血液、尿、唾液、汗、涙等の体液；
果汁、スープ等の食品；
細胞培養液；
発酵試料（食品または非食品）；
ポリアミノ酸、二糖〜多糖類等の工業製品や食品添加物；
を例示することができる。また固形の食品でも対象物を簡便に水溶液等で抽出できるものであれば測定対象となりうる。
【００２４】
次に、バイオセンサ１００を用いる測定方法の具体例について説明する。
本実施形態における測定方法は、たとえば、以下のステップを含む。
時刻Ｔ１において、センサ部１０１にて検出される電流値Ｉ１を取得するステップ、
時刻Ｔ２においてセンサ部１０１にて検出される電流値Ｉ２を取得するステップ、および
Ｉ１およびＩ２に基づいて、試料中の第一の基質の濃度および第二の基質の濃度をそれぞれ算出するステップ。
【００２５】
以下、グルコースおよびスクロースを含む試料中の、グルコースおよびスクロースの濃度の測定に用いることができるバイオセンサを例に、説明する。このとき、第一の基質がスクロースであって、第二の基質がグルコースである。
スキーム１は、第一の基質がスクロースであって、第二の基質がグルコースであるときの反応例を示す式である。なお、以下のスキーム中、「ＦＡＤ」はフラビンアデニンジヌクレオチドの略である。
【００２６】
【化１】
2014153243.tif 000003
【００２７】
スキーム１において、第一の基質であるスクロース（ショ糖）は、第一の酵素であるインベルターゼ（β−フルクトフルトシダーゼ）の作用により、グルコース（α−Ｄグルコース）とフルクトースに分解される。
【００２８】
さらに、α−Ｄ−グルコースは第三の酵素であるムタロターゼの作用によりβ−Ｄ−グルコースに変換される。α−Ｄ−グルコースの変換体であるβ−Ｄ−グルコースに第二の酵素であるグルコースオキシダーゼ（スキーム１中、「ＧＯｘ」と記載する。）が作用すると、以下の反応が生じる。
すなわち、作用極１１２に対して、直流電源（不図示）から直流電圧が印加されることで、グルコースオキシダーゼによりグルコースが酸化され、グルコノラクトンに変化するとともに、過酸化水素が発生する（式（Ｉ））。
【００２９】
グルコース（Ｃ6Ｈ12Ｏ6）＋Ｏ2→グルコノラクトン（Ｃ6Ｈ10Ｏ6）＋Ｈ2Ｏ2  （Ｉ）
【００３０】
ＧＯｘの触媒反応によりＧＯｘが還元されることで、反応式（Ｉ）に示したように、測定試料中のグルコースがグルコン酸に酸化される。そしてセンサ部１０１では、作用極１１２に電圧が印加されることで、ＧＯｘ（還元体）がＧＯｘ（酸化体）に酸化される。反応式（Ｉ）による電流の変化を検出することで試料中のグルコース量を測定することができる。
また、試料中に溶存する酸素によって生成された過酸化水素を電極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することによりグルコース濃度を求めることもできる。このとき、反応式（Ｉ）において発生する過酸化水素は作用極１１２上の電極反応により酸化され、電子が生成する（反応式（ＩＩ））。
【００３１】
Ｈ2Ｏ2→２Ｈ＋＋Ｏ2＋２ｅ−  （ＩＩ）
【００３２】
反応式（ＩＩ）中、過酸化水素反応により生じた電子により、作用極１１２から対極１１３に電流が流れる。そこで、これを電流検出回路（不図示）で検出し、演算部１０５で処理することで、試料中のグルコースの濃度を測定することができる。このとき、作用極１１２と参照極１１５との間の電位は、一定に保つように対極１１３の電位が制御される。
【００３３】
ここで、従来のセンサを用いて複数の基質濃度を測定しようとした場合、スクロースのような基質を測定するバイオセンサにおいては、一度酵素によって基質を分解し、分解によって生成された物質（グルコース、もしくはフルクトース）を測定することで、間接的に基質を測定する方法がとられることになる。しかし、この方法では、分解によって生成する物質が検体中に含まれる場合、電流値が合算値として検出されるため、基質を単独で測定することができなかった。たとえば、グルコースの場合、酵素反応により生成したグルコースまたはフルクトースと検体中にもともと含まれるグルコースまたはフルコースの合算値となる。このため、検体中にもともと含まれる物質、たとえば上記の例ではグルコースおよびフルクトースを別々に測定する必要がある。しかしながら、従来のバイオセンサでは、簡単に２種類の物質を同時に測定することはできず、それぞれの基質濃度を測定するために、別々のバイオセンサを用いる必要があった。
【００３４】
これに対し、本実施形態におけるバイオセンサ１００においては、同一のセンサ部１０１を用いて、異なる２つの時刻Ｔ１およびＴ２で測定をおこなうことにより、Ｔ１およびＴ２で得られた電流測定値の情報に基づいて、２種類以上の基質の濃度を求めることができるため、複数の基質濃度測定を簡便で安定的におこなうことができる。
【００３５】
たとえば、バイオセンサ１００を用いてグルコースを含む試料の測定をおこなった場合、測定開始（Ｔ０）後、時刻Ｔ１にてグルコース濃度に依存した電流値が得られる。また、スクロースを含む試料を測定した場合、Ｔ１よりさらに時間が経過した時刻Ｔ２にてスクロース濃度に依存した電流値が得られる。さらに、グルコースとスクロースを含む試料では、グルコースの応答電流値とは異なり、スクロースから生成されるグルコース分の電流値が合算される。
以上のことから、演算部１０５は、たとえば時刻Ｔ１にて測定される電流値Ｉ１を試料中にもともと含まれるグルコースに由来する電流値として、グルコース濃度を算出する。また、たとえば時刻Ｔ２における電流値をスクロースからグルコースに由来する電流値と試料中にもともと含まれるグルコースに由来する電流値との合算値として、試料中にもともと含まれるグルコースに由来する電流値との差分を算出することにより、試料中のスクロース濃度を算出する。
たとえば、演算部１０５は、スクロースを含む標準試料の測定値について、スクロース濃度と応答電流値との対応関係を第一の検量線データとして保持する。また、たとえば、演算部１０５は、グルコースを含む標準試料の測定値について、グルコースと応答電流値との対応関係を第二の検量線データとして保持する。このとき、演算部１０５は、時刻Ｔ１での電流値Ｉ１を第二の検量線データと対照してグルコース濃度を算出し、電流値の差（Ｉ２−Ｉ１）を第一の検量線データと対照してスクロース濃度を算出することができる。
【００３６】
つづいて、バイオセンサ１００の製造方法の一例について説明する。
まず、基板を準備し、基板にスクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法等、公知の方法により、作用極１１２を形成させる。ついで、基板上に絶縁性ペーストをスクリーン印刷して絶縁膜１３０を形成し、絶縁性基板１１１を得る。絶縁膜１３０は作用極１１２の外周を覆うように形成させる。そして、作用極１１２に並列するように、対極１１３および参照極１１５を設ける。
【００３７】
その後、第一および第二の酵素を含む反応層１１４を絶縁性基板１１１上に形成する。具体的には、第一および第二の酵素を水性溶媒に混合調製し、絶縁性基板１１１の表面に塗布した後、乾燥させる。乾燥は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下で行うと好ましい。以上の手順により、バイオセンサ１００が得られる。
【００３８】
つづいて、バイオセンサ１００を用いて試料液中に含まれる複数の基質濃度を測定する方法について説明する。
まず、測定試料を反応層１１４に添加する。測定試料の添加により反応層１１４が溶解し、試料中の基質と酸化還元酵素との反応が進行する。反応を進行させるため、バイオセンサ１００を所定時間放置した後、対極１１３に対して作用極１１２にアノード方向にパルス電圧（０〜＋０．３Ｖ）を印加する。応答電流が発生し、時刻Ｔ１およびＴ２における応答電流値が測定される。時刻Ｔ１およびＴ２においてセンサ部で測定された電流値Ｉ１およびＩ２を演算部１０５が取得し、第一の基質および第二の基質の濃度が算出される。演算部１０５は、第一の基質および第二の基質のそれぞれについて、あらかじめ既知の濃度の基質を含む標準試料を用いて作成された検量線データを参照し、応答電流値から各基質の濃度を算出する。検量線データは、たとえば、応答電流値が第一または第二の基質濃度および時刻と関連づけられたデータであってもよい。
【００３９】
バイオセンサ１００を用いることにより、試料中に含まれる複数の基質の濃度を一つのセンサを用いて簡便に求めることができる。
試料中に、第一および第二の基質が含まれており、第一の基質が第二の基質に変化する物質である場合、従来のセンサでは、第二の基質が重複して応答電流の測定値が重なってしまうため、試料中にもともと含まれている第二の基質の濃度と、第一の基質に由来して新たに生じた第二の基質とのそれぞれについて、一つのセンサを用いて濃度を測定することは困難であった。本実施形態におけるバイオセンサ１００を用いることにより、この点が解決され、第一および第二の基質の濃度を一度の測定で得ることが可能となる。
【００４０】
また、たとえばバイオセンサ１００を製造過程や保存過程において変化する成分について、経時変化を定量的に測定することも可能となる。このため、バイオセンサ１００を食品試料、医療用試料、工業用試料の測定に用いる場合、食品、医療品や工業製品等の製造工程中、保存中の品質管理に用いることも可能となる。
【００４１】
なお、バイオセンサ１００をグルコースセンサとする場合、酸化還元酵素として、グルコースオキシダーゼにかえてグルコースデヒドロゲナーゼを用いることもできる。
また、スキーム１において、第二の基質をフルクトースとすることもできる。このとき、第二の酵素として、グルコースの酸化還元酵素にかえて、フルクトースの酸化還元酵素を用いて、時刻Ｔ１およびＴ２におけるフルクトースの量を測定することにより、試料中に含まれるフルクトースとスクロースの量をそれぞれ算出することができる。フルクトース量を測定する場合、第二の酵素として用いる酸化還元酵素として、たとえばフルクトースオキシダーゼまたはフルクトースデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００４２】
また、バイオセンサ１００を用いて測定される第一の基質はスクロースに限られない。第一の基質として、たとえば糖類が挙げられ、具体的にはスクロース、マルトース、トレハロース、セルビオース等の２糖類；ラフィノース糖の３糖類；オリゴ糖；デンプン糖の多糖類が挙げられる。糖類を測定する際の酵素の組み合わせとしては、第一の酵素として２つ以上の結合している糖を単糖に切断する酵素を用いるとともに、第二の酵素として単糖を酸化することが可能な酵素（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼなど）を用いることができる。
【００４３】
第一の基質がマルトース、ラクトース、トレハロース、ラフィノースである場合の反応スキームの具体例をスキーム２〜５に示す。
【００４４】
【化２】
2014153243.tif 000004
【００４５】
【化３】
2014153243.tif 000005
【００４６】
【化４】
2014153243.tif 000006
【００４７】
【化５】
2014153243.tif 000007
【００４８】
また、第一の基質としては、ペプチド、タンパク質、アミノ酸重合体等のアミノ酸から構成されている物質も挙げられる。ペプチド系の物質を測定する際の酵素の組み合わせとしては、第一の酵素としてペプチド結合を切断してアミノ酸単位に分解する酵素を用いるとともに、第二の酵素としてアミノ酸を酸化することが可能な酵素（グルタミン酸オキシダーゼなど）を用いることができる。
【００４９】
ペプチド系の物質の例として、末端にグルタミン酸のあるペプチドの反応スキームをスキーム６に示す。
【００５０】
【化６】
2014153243.tif 000008
【００５１】
スキーム６により、末端がグルタミン酸残基であるペプチドを含む試料中の当該ペプチド中のグルタミン酸濃度と試料中に含まれる遊離のグルタミン酸濃度とを求めることができる。
スキーム６において、第一の酵素であるグルタミルアミノペプチダーゼの作用により、ペプチド末端のグルタミン酸残基が加水分解されてＬ−グルタミン酸が生じる。生じたＬ−グルタミン酸に第二の酵素であるグルタミン酸オキシダーゼの作用することにより、Ｌ−グルタミン酸の濃度に依存する電流が生じる。
時刻Ｔ１およびＴ２において、センサ部１０１が電流値Ｉ１およびＩ２を測定し、演算部１０５にてペプチド中のグルタミン酸濃度と遊離のグルタミン酸濃度とが算出される。そして、演算部１０５は、Ｉ１の値から遊離のグルタミン酸濃度を算出するともに、Ｉ２およびＩ１の値から、所定の演算（たとえばＩ２−Ｉ１）をおこない、ペプチド中のグルタミン酸濃度を算出する。
グルタミン酸濃度を定量するセンサは、うまみセンサ等として好適に用いられる。また、グルタミン酸濃度を定量するセンサは、うまみ物質の経時変化の測定に用いることもできる。
【００５２】
また、第一の基質として、コレステリルエステル等のステロールエステルも挙げられる。このとき、ステロールエステラーゼ等のステロールエステルをステロールおよび脂肪酸に分解する酵素を第一の酵素とし、コレステロールオキシダーゼ等のステロールの還元酵素を第二の酵素とすることができる。
コレステリルエステルの反応スキームをスキーム７に示す。
【００５３】
【化７】
2014153243.tif 000009
【００５４】
また、第一の基質の他の例として、ウレア、クレアチニン、シスタチオニン等が挙げられる。これらの反応スキームの具体例をスキーム８〜１０に示す。
【００５５】
【化８】
2014153243.tif 000010
【００５６】
【化９】
2014153243.tif 000011
【００５７】
【化１０】
2014153243.tif 000012
【００５８】
バイオセンサ１００における各酵素および各基質の組み合わせとして、たとえば以下のものが挙げられる。
たとえば、第一の基質が、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロースからなる群から選択される一種であり、第二の基質がグルコースであり、第二の酵素が、グルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素であってもよい。
また、第二の基質がグルタミン酸であり、第二の酵素がグルタミン酸オキシダーゼであってもよい。
また、第一の基質が、コレステリルエステル、尿素、クレアチニン、シスタチオニンおよびラフィノースからなる群から選択される一種であってもよい。
以下の実施形態においては、第一の実施形態と異なる点を中心に説明する。また、各実施形態の態様は、適宜組み合わせて用いることができる。
【００５９】
（第二の実施形態）
第一の実施形態において、センサ部の反応層１１４が、第一の酵素を含む第一の反応層と、第二の酵素を含む第二の反応層とを有する構成としてもよい。
図４は、本実施形態におけるセンサ部の構成を示す断面図である。図４において、センサ部１２１の反応層１２４は、電極１１６に上に接する第一の反応層１２３と第一の反応層１２３に接する第二の反応層１２５とが積層された構成である。
反応層１２４において、たとえば第一の酵素が第二の反応層１２５中に存在し、第二の酵素が第一の反応層１２３中に存在する構成とすることができる。
本実施形態のセンサ部１２１を用いることにより、第一および第二の酵素の性質に応じて酵素の固定化方法を変えることができる。
【００６０】
（第三の実施形態）
以上の実施形態において、センサ部は以下の構成とすることもできる。図５は、本実施形態におけるセンサ部の構成を示す斜視図である。
【００６１】
図５に示したセンサ部１３１においては、ガラス基板１３７上に、作用極（白金電極）１３２、対極（白金電極）１３３および参照極（銀／塩化銀電極）１３５が設けられている。対極１３３および参照極１３５は、作用極１３２の外周の異なる位置において、作用極１３２を取り囲むように設けられている。
また、ガラス基板１３７上に、電極を覆う接着層１３８、選択透過層１３９、酵素層１３４および制限透過層１４０が基板側からこの順に設けられている。
【００６２】
接着層１３８は、その上部の層と、下部に形成されたガラス基板１３７および各電極との密着性を向上させる。また、ガラス基板１３７の表面の濡れ性を改善し、酵素層１３４を形成する際の膜厚の均一性を向上させる効果もある。さらには、電極での過酸化水素の反応に干渉するアスコルビン酸、尿酸およびアセトアミノフェンに対する選択透過性もある。
接着層１３８を構成する材料として、たとえばシランカップリング剤が挙げられる。シランカップリング剤の種類としては、アミノシラン、ビニルシラン、エポキシシランが挙げられるが、このうち、密着性、選択透過性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００６３】
選択透過層１３９は、センサ部１３１の電極表面における電気化学的反応にあずかる、最終的な測定対象物質以外の物質の透過を阻止する機能を有しており、その機能は、編み目構造により大きな分子量を有する分子の透過を阻止したり、さらには、静電的な反発力によりイオンの侵入を阻止したりする膜構造によって発現される。選択透過層１３９は、たとえばアセチルセルロース類およびイオン交換樹脂から選ばれる材料により構成される。
【００６４】
制限透過層１４０は、被測定成分の拡散速度を制限し、また、干渉物質や妨害物質の影響を低減する役割を果たし、これにより、測定精度の向上、測定可能範囲の拡大に寄与する。制限透過層１４０には、たとえばポリジメチルシロキサンやポリカルボン酸のフルオロアルコールエステルが好ましく用いられる。ここで、ポリカルボン酸のフルオロアルコールエステルとは、ポリカルボン酸のカルボキシル基の一部、または全部をフルオロアルコールでエステル化したものである。また、フルオロアルコールとは、アルコール中の水素のすべて、または少なくとも１つをフッ素に置換したものである。タンパク質や尿素化合物等の汚染物質の付着を効率的に抑制でき、長期間使用した場合にも安定した出力特性を示す測定装置が得られる。また、フルオロアルコールエステル基は、ほとんどの非フッ素系溶剤や界面活性剤等の洗剤に溶けることがないため、耐薬品性においても良好な酵素センサが得られる。制限透過層１４０は特定構造のポリマーにより構成されるが、構造や分子量の異なる２種以上のポリマーの混合物により構成されていてもよい。
【００６５】
グルコースセンサなど、バイオセンサ１００が測定対象とする測定試料溶液は、血液や尿、排水など、測定対象物質以外の種々の夾雑物質を含むことが多い。このような測定試料の場合、これらの夾雑物質に因る影響、妨害や干渉を防ぐ観点から、選択透過層１３９や制限透過層１４０を設けることにより、このような厳しい環境においても、より一層安定した特性を維持し、高い定量性を発揮できるようになる。
【００６６】
（第四の実施形態）
以上の実施形態において、演算部１０５は、Ｉ１およびＩ２を用いて各基質濃度を求める際に電流値を補正する補正部を備えていてもよい。
補正部は、たとえば、時刻Ｔ１においては、第一の基質の濃度がゼロであるとみなすように電流値Ｉ２を補正する。
また、補正部が、Ｔ１およびＴ２とは異なる時刻Ｔ３における電流値をベース電流値とし、各測定値から差し引く補正をおこなってもよい。
また、補正部は、ミカエリスメンテンの式に関連する式等の所定の演算式に基づいて、第一または第二の基質の濃度の測定値を補正してもよい。
また、補正部は、高速フーリエ変換、ウェーブレット変換等の所定の方法により、センサ部１０１にて経時的に測定される電流値についてノイズ分離処理をおこなってもよい。これにより、シグナル／ノイズ比を高めることができるため、試料中の各成分の濃度をより確実に求めることができる。たとえば、四反田功他３名、「ウェーブレット変換を用いるアンペロメトリックバイオセンサーの電流応答解析」、ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ、２００８年、Ｖｏｌ．５７、Ｎｏ．３、１８３−１８９ページに記載の方法を用いてもよい。
【００６７】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
たとえば、以上の実施形態において、反応層１１４が電子受容体を含む構成としてもよい。反応層１１４に電子受容体を添加しておくことで、溶存酸素や干渉物質の影響を低減させて、シンプルな構造で基質量を精度よく測定することができる。
【００６８】
反応層１１４に含ませる電子受容体は、酵素との間で電子授受を行うものであれば特定する必要はない。例えば、フェリシアン化カリウム（フェロシアン化カリウム）、フェロセンおよびその誘導体、オスミウム錯体およびその誘導体（モノマー、ポリマー）、ルテニウム錯体などの金属錯体およびその誘導体、キノン類、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ジクロロインドフェノール、メチレンブルーなどの酸化還元色素類、テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）およびその誘導体、テトラシアノキノジメタン等から選択することができる。
【００６９】
また、反応層１１４は、安定化剤を含んでいてもよい。安定化剤としては、トレハロース、スクロース、ラフィノースといった糖類、アルギニン、グルタミンといったアミノ酸、ポリマー類などが挙げられる。
【００７０】
また、反応層１１４は、界面活性剤を含むことができる。電子受容体は、水に対する溶解度が低い。そのため、測定試料中に含まれる水によって電子受容体が反応層上に析出することがある。そこで、反応層に界面活性剤を含ませることにより、水に対する溶解性を向上させることができる。
【００７１】
界面活性剤としては、たとえば、レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、トライトン−Ｘ１００（登録商標）、Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（登録商標）、ＤＫ−エステル（登録商標）、ＢＩＧＣＨＡＰ（登録商標）、ＤｅｏｘＣＨＡＰ（登録商標）、ラウリル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate、ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアクリル酸およびＴｗｅｅｎ２０（登録商標、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を用いることができる。トライトン−Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎ２０を用いると特に好ましい。
【００７２】
また、以上の実施形態において、第一の酵素として用いられる酵素の例を以下に示す。
（１．１）エステルの加水分解酵素
EC:3.1.1のカルボン酸エステル加水分解酵素、EC:3.1.2の3価アルコールエステル加水分解酵素、EC:3.1.3の1価リン酸エステル加水分解酵素、EC:3.1.4のリン酸ジエステル加水分解酵素、EC:3.1.5の三リン酸モノエステル加水分解酵素、EC:3.1.6の硫酸エステル加水分解酵素、EC:3.1.7の二リン酸モノエステル加水分解酵素、EC:3.1.8のリン酸トリエステル加水分解酵素、EC:3.1.11の5'-リン酸モノエステル産生エンドデオキシリボヌクレアーゼ、EC:3.1.13の5'-リン酸モノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ、EC:3.1.14の3'-リン酸モノエステル産生エキソリボヌクレアーゼ、EC:3.1.15のリボ核酸またはデオキシリボ核酸に作用する、5'-リン酸モノエステル産生エキソヌクレアーゼ、EC:3.1.21の5'-リン酸モノエステル産生エンドデオキシリボヌクレアーゼ、EC:3.1.22の3'-リン酸モノエステル産生エンドデオキシリボヌクレアーゼ、EC:3.1.25のサイト特異性を有する代替塩基特異性エンドデオキシリボヌクレアーゼ、EC:3.1.26の5'-リン酸モノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ、EC:3.1.27の3'-リン酸モノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ、EC:3.1.30のリボ核酸またはデオキシリボ核酸に作用する、5'-リン酸モノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ、EC:3.1.31のリボ核酸またはデオキシリボ核酸に作用する、3'-リン酸モノエステル産生エンドリボヌクレアーゼ等が挙げられ、好ましくは、以下のものが挙げられる。
EC:3.1.1.13：ステロールエステラーゼ。コレステリルエステルを加水分解して脂肪酸とコレステロールを生成。コレステロールオキシダーゼにより測定可（スキーム７参照）。対象例：血清。
EC:3.1.1.21：レチニル-パルミテートエステラーゼ。レチノールエステルをレチノールと脂肪酸に加水分解する。レチノールデヒドロゲナーゼにより測定可。対象例：血漿。
EC:3.1.1.28：アシルカルニチンヒドロラーゼ。O-アシルカルニチンをL-カルニチンと脂肪酸に加水分解。脂肪酸デヒドロゲナーゼにより測定可。対象例：血漿、尿。
EC:3.1.3.25：イノシトール-ホスフェートホスファターゼ。1L-myo-イノシトール1-ホスフェートをmyo-イノシトールとホスフェートに加水分解。イノシトールデヒドロゲナーゼにより測定可。対象例：血清。
EC:3.1.6.4：N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼ。N-アセチルガラクトサミン-6-スルフェートユニット（硫酸コンドロイチン）をN-アセチルガラクトサミンユニット（硫酸コンドロイチン）とスルフェート加水分解。EC:3.2.1.49とアシルヘキソサミンオキシダーゼの組合せにより測定可。対象：関節液。
【００７３】
（１．２）糖加水分解酵素
EC:3.2.1の配糖体結合加水分解酵素または糖加水分解酵素、EC:3.2.2のN-グリコシル化合物加水分解酵素等が挙げられ、好ましくは、以下のものが挙げられる。
EC:3.2.1.1：α-アミラーゼ。デンプン（あるいはグリコーゲン）のα-1,4-グルコシド結合（麦芽糖の結合状態）を加水分解して低分子化する酵素。オリゴ糖、マルトース、グルコースを生成。グルコースオキシダーゼやマルターゼ＋グルコースオキシダーゼの組合せにより測定可。
EC:3.2.1.2：β-アミラーゼ。可溶性デンプン（アミロース）からマルトースを生成。マルターゼ＋グルコースオキシダーゼの組合せにより測定可。
EC:3.2.1.4：セルラーゼ。セルロース、リケニン、穀類β-グルカンなどのβ-1,4-グルコシド結合（乳糖の結合状態（ガラクトースでなくグルコースであるが））を加水分解してβ-グルコースを生成。
EC:3.2.1.14：キチナーゼ。キチンやキチンオリゴ糖のβ-1,4-グルコシド結合を分解してN-アセチルグルコサミン、グルコサミンを生成。N-アシルヘキソサミンオキシダーゼにより測定可。
EC:3.2.1.20：α-グルコシダーゼ。別名：マルターゼ（スキーム２参照）
EC:3.2.1.21：β-グルコシダーゼ。別名：ゲンチオビアーゼ、セロビアーゼ。β-D-グルコシド（ゲンチオビオース（β-1,6-結合）、セロビオース（β-1,4-結合）ともにグルコースが二つ結合した二糖類）をD-グルコースに加水分解。
EC:3.2.1.22：α-ガラクトシダーゼ。別名：メリビアーゼ。α-D-ガラクトシド（ラフィノース（スキーム５参照。三糖類）、スタキノース（ガラクトース-ガラクトース-スクロースの4糖類））のα-1,6-ガラクトシド結合を加水分解してD-ガラクトースを生成。ガラクトースオキシダーゼで測定可。スクロースの分解を組合せても測定可。
EC:3.2.1.23：β-ガラクトシダーゼ。別名：ラクターゼ（スキーム３参照）
EC:3.2.1.24：α-マンノシダーゼ。α-D-マンノシドを加水分解してD-マンノースを生成。アルドヘキソースデヒドロゲナーゼによって測定可。
EC:3.2.1.25：β-マンノシダーゼ。β-D-マンノシドを加水分解してD-マンノースを生成。アルドヘキソースデヒドロゲナーゼによって測定可。
EC:3.2.1.26：β-フルクトフラノシダーゼ。別名：インベルターゼ（スキーム１参照）。
EC:3.2.1.28：α,α-トレハラーゼ（スキーム４参照）。
EC:3.2.1.91：セルロース1,4-β-セロビオシダーゼ。セルロース、セロテトラオースを加水分解し、セロビオースを生成。EC:3.2.1.21との組合せにより測定可。
EC:3.2.1.108：ラクターゼ。ラクトースを加水分解してD-ガラクトースとD-グルコースを生成（スキーム３参照）。
【００７４】
（１．３）エーテル・チオエーテル加水分解酵素
EC:3.3.1のチオエーテル・トリアルキルスルホニウム加水分解酵素、EC:3.3.2のエーテル加水分解酵素等が挙げられる。
【００７５】
（１．４）ペプチド結合加水分解酵素
EC:3.4.11のアミノペプチターゼ、EC:3.4.13のジペプチターゼ、EC:3.4.14のジペプチジルペプチターゼ・トリペプチジルペプチターゼ、EC:3.4.15のペプチジルジペプチターゼ、EC:3.4.16のセリン性カルボキシペプチターゼ、EC:3.4.17の金属プロテアーゼ、EC:3.4.18のシステイン性カルボキシペプチターゼ、EC:3.4.19のオメガペプチターゼ、EC:3.4.21のセリンエンドペプチターゼ、EC:3.4.22のシステインプロテアーゼ、EC:3.4.23のアスパラギン酸プロテアーゼ、EC:3.4.24のその他のペプチターゼ、EC:3.4.25のスレオニンエンドペプチターゼ等が挙げられ、好ましいものとして以下のものが挙げられる。
EC:3.4.11.7：グルタミルアミノペプチダーゼ。EC:3.4.11.1と同様。グルタミン酸、アスパラギン酸（スキーム６参照）。
EC:3.4.13.7：Glu-Gluジペプチダーゼ。EC:3.4.13.3と同様。グルタミン酸。
EC:3.4.17.11：グルタメートカルボキシペプチダーゼ。EC:3.4.17.1と同様。グルタミン酸。
EC:3.4.17.21：グルタメートカルボキシペプチダーゼＩＩ。EC:3.4.17.1と同様。グルタミン酸。
EC:3.4.19.9：γ-グルタミルヒドロラーゼ。EC:3.4.19.1と同様。
EC:3.4.19.11：γ-D-グルタミル-meso-ジアミノピメレートペプチダーゼ。EC:3.4.19.1と同様。
EC:3.4.21.82：グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ。EC:3.4.21.1と同様。
【００７６】
（１．５）ペプチド以外のCN結合加水分解酵素
EC:3.5.1の鎖状アミドに作用するもの、EC:3.5.2の環状アミドに作用するもの、EC:3.5.3の鎖状アミジンに作用するもの、EC:3.5.4の環状アミジンに作用するもの、EC:3.5.5のニトリルに作用するもの、EC:3.5.99のその他の化合物に作用するもの等が挙げられ、好ましいものとして以下のものが挙げられる。
EC:3.5.1.2：グルタミナーゼ。Lグルタミンをl-グルタミン酸に加水分解。グルタミン酸オキシダーゼ他により測定可。
EC:3.5.1.5：ウレアーゼ。ウレアを二酸化炭素とアンモニアに加水分解。アンモニアモノオキシゲナーゼ他により測定可（スキーム８参照）。
EC:3.5.1.35：D-グルタミナーゼ。D-グルタミンをL-グルタミン酸とアンモニアに加水分解。グルタミン酸オキシダーゼ、アンモニア3-モノオキシゲナーゼにより測定可。
EC:3.5.1.38：グルタミナーゼ（アスパラギナーゼ）。L-グルタミン（もしくはL-アスパラギン）をL-グルタミン酸（もしくはL-アスパラギン酸）に加水分解。グルタミン酸オキシダーゼ（もしくはアミノ酸オキシダーゼ）により測定可。
EC:3.5.1.55：長鎖脂肪酸アシル-グルタメートデアシラーゼ。N-長鎖脂肪酸アシル-グルタメートを長鎖脂肪酸とL-グルタミン酸に加水分解。グルタミン酸オキシダーゼにより測定可。
EC:3.5.1.63：4-アセトアミドブチレートデアセチラーゼ。4-アセトアミドブタノエートを4-アミノブタノエートと酢酸に加水分解。EC:2.6.1.19:4-アミノブチレートトランスアミナーゼとグルタミン酸オキシダーゼの組合せにより測定可。
EC:3.5.1.68：N-ホルミルグルタメートデホルミラーゼ。N-ホルミル-L-グルタメートをL-グルタミン酸とホルメートに加水分解。グルタミン酸オキシダーゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼにより測定可。
EC:3.5.1.c：β-シトリル-グルタメートヒドロラーゼ。β-シトリル-グルタメートをクエン酸とL-グルタミン酸に加水分解。グルタミン酸オキシダーゼにより測定可。
EC:3.5.2.9：5-オキソプロリナーゼ。5-オキソ-L-プロリンをL-グルタミン酸とADPに加水分解。グルタミン酸オキシダーゼ他（ヌクレアーゼ＋ヌクレオチダーゼ＋ヌクレオシダーゼなどの組合せ）により測定可。
EC:3.5.2.10：クレアチニナーゼ。クレアチニンをクレアチンに加水分解。EC:7.5.3.3のザルコシンオキシダーゼにより測定可。対象例：尿。
EC:3.5.3.3：クレアチナーゼ。クレアチンをザルコシンとウレアに加水分解。ザルコシンオキシダーゼ、EC:3.5.1.5により測定可（スキーム９参照）。対象例：尿。
EC:3.5.4.21：クレアチニンデアミナーゼ。クレアチニンをN-メチルヒダントインとアンモニアに加水分解。EC:3.5.2.14との組合せ、アンモニア3-モノオキシゲナーゼにより測定可。対象例：尿。
【００７７】
（１．６）酸無水物に作用する加水分解酵素
EC:3.6.1のリン含有酸無水物に作用するもの、EC:3.6.2のスルホニル含有酸無水物に作用するもの、EC:3.6.3の酸無水物に作用・物質の膜輸送を触媒するもの、EC:3.6.4の酸無水物に作用・細胞または細胞小器官の運動に関与するもの、EC:3.6.5のGTPに作用・細胞または細胞小器官の運動に関与するもの等が挙げられる。
【００７８】
（１．７）炭素-炭素結合に作用する加水分解酵素
EC:3.7.1のケトン類に作用するもの等が挙げられる。
（１．８）ハロゲン結合に作用する加水分解酵素
EC:3.8.1のC-ハロゲン化合物に作用するもの等が挙げられる。
（１．９）リン-窒素結合に作用する加水分解酵素
EC:3.9.1の酵素等が挙げられる。
（１．１０）硫黄-窒素結合に作用する加水分解酵素
EC:3.10.1の酵素等が挙げられる。
（１．１１）炭素-リン結合に作用する加水分解酵素
EC:3.11.1の酵素等が挙げられる。
（１．１２）硫黄-硫黄結合に作用する加水分解酵素
（１．１３）炭素-硫黄結合に作用する加水分解酵素
EC:3.13.1の酵素等が挙げられる。
【００７９】
（２．１）リアーゼ
EC:4.1.1のカルボキシル基の付加脱離酵素、EC:4.1.2のアルデヒド基の付加脱離酵素、EC:4.1.3のオキソ酸の付加脱離酵素、EC:4.1.99のその他の炭素-炭素リアーゼ類等が挙げられる。
【００８０】
（２．２）炭素-酸素リアーゼ類
EC:4.2.1のデヒドラターゼ類、EC:4.2.2の多糖に作用するリアーゼ、EC:4.2.3のリン酸基の付加脱離、EC:4.2.99のその他の炭素-酸素リアーゼ等が挙げられる。
【００８１】
（２．３）C-Nリアーゼ
EC:4.3.1のアンモニアの付加脱離、EC:4.3.2のアミジンの付加脱離、EC:4.3.3のアミンリアーゼ類、EC:4.3.3のアミンリアーゼ類等が挙げられる。
【００８２】
（２．４）C-Sリアーゼ類
EC:4.4.1のものが挙げられ、好ましいものとして、以下が挙げられる。
EC:4.4.1.8:シスタチオニンβ-リアーゼ。シスタチオニンをL-ホモシステインとピルビン酸とアンモニアに変換。各種酵素、ピルビン酸オキシダーゼ、アンモニアモノオキシゲナーゼにより測定可（スキーム１０参照）。対象例：血中。
【００８３】
（２．５）C-ハロゲン化物リアーゼ類
EC:4.5.1のものが挙げられる。
（２．６）P-Oリアーゼ類
EC:4.6.1のものが挙げられる。
（２．７）その他のリアーゼ
EC:4.99.1のものが挙げられる。
【実施例】
【００８４】
本実施例では、スクロースおよびグルコースを測定するセンサを作製した。
（バイオセンサの作製方法）
本実施例では、図１に示した構成を有するバイオセンサを作製した。図１中、センサ部１０１としては、図５に示したセンサ部１３１を簡略化し、接着層１３８および選択透過層１３９を有しない他は図５に準じた構成のものを作製した。
作用極（白金電極）１３２、対極（白金電極）１３３および参照極（銀／塩化銀電極）１３５が設けられたガラス基板１３７を準備した。
また、ＧＯｘ、インベルターゼ、ムタロターゼおよびＢＳＡ（牛血清アルブミン）を水に溶解し、良く混合した後、冷やしておいた。この酵素溶液にグルタルアルデヒドを添加し、混合後、速やかに電極上に塗布しスピンコートすることによって酵素層１３４を形成した。
さらに酵素層１３４への吸着物などを防ぐために、酵素層１３４上にフッ素樹脂をコーティングして制限透過層１４０を形成し、酵素層１３４を被覆した。
【００８５】
（電気化学測定）
標準サンプルとして、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したグルコース溶液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したスクロース溶液、ならびに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したグルコース・スクロース混合溶液を用意した。サンプル５μＬを反応層１１４にそれぞれ添加し、サンプル添加後１０秒後に、対極１１３に対して作用極１１２にアノード方向に電圧（＋０．３Ｖ／ｖｓ）を印加し、応答電流の測定を開始した。開始後１０秒後〜２４０秒後の電流値を測定した。
【００８６】
標準サンプルを用いた測定結果を表１および図６に示す。図６は、グルコースのみを含む標準サンプル、スクロースのみを含む標準サンプル、およびグルコースとスクロースとを含む標準サンプルについて、グルコースまたはスクロース濃度の変化による応答電流の変化を示した応答曲線である。表１は、測定開始後の各時間の応答電流値を示すものであり、図６において、測定開始から１０秒後、２０秒後、３０秒後および６０秒後の電流値をまとめたものである。また、表１においては、グルコースの濃度が０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭおよび４０ｍＭのそれぞれの場合について、スクロース濃度が０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭおよび４０ｍＭであるときの電流値を示した。
また、図７は、表１の数値より得られた時間−応答電流値のグラフである。
【００８７】
【表１】
2014153243.tif 000013
【００８８】
表１および図７より、グルコースのみを含む標準サンプル、スクロースのみを含む標準サンプルのそれぞれについて、０〜４０ｍＭの濃度範囲で検量線が得られた。
また、グルコースとスクロースとを含む標準サンプルについては、測定開始１０秒後では、スクロース濃度の変化に伴う電流値の変化量は小さく、試料中にもともと含まれているグルコースに由来する応答電流値が測定されている。一方、測定開始２０秒後以降で電流値が増加するとともに、電流値がスクロース濃度に応じて直線的に増加している。
よって、グルコースとスクロースとを含む標準サンプルについて、たとえば測定開始１０秒後の電流値から、グルコースのみを含む標準サンプルによって作成された検量線を用いて、グルコース濃度を求めることができる。また、グルコースとスクロースとを含む標準サンプルについて、測定開始２０秒後以降の電流値、たとえば３０秒後の電流値から、スクロースのみを含む標準サンプルによって作成された検量線を用いて、スクロース濃度を求めることができる。
【符号の説明】
【００８９】
１００  バイオセンサ
１０１  センサ部
１０３  計時部
１０５  演算部
１１１  絶縁性基板
１１２  作用極
１１３  対極
１１４  反応層
１１５  参照極
１１６  電極
１２１  センサ部
１２３  第一の反応層
１２４  反応層
１２５  第二の反応層
１３０  絶縁膜
１３１  センサ部
１３２  作用極
１３３  対極
１３４  酵素層
１３５  参照極
１３７  ガラス基板
１３８  接着層
１３９  選択透過層
１４０  制限透過層
【図１】
2014153243.tif 000014
【図２】
2014153243.tif 000015
【図３】
2014153243.tif 000016
【図４】
2014153243.tif 000017
【図６】
2014153243.tif 000018
【図７】
2014153243.tif 000019
【図５】
2014153243.tif 000020