(57)【要約】      （修正有）【課題】既存の作用機序に基づいた美白作用に着目するだけでは困難な、新規な作用機序を有する美白剤、詳しくは、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤を見出す方法の提供。【解決手段】角化細胞の細胞接着抑制作用に注目し、角化細胞のインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜に対する接着抑制作用、角化細胞の上層移動促進作用等を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択することにより新規な作用機序を有する美白剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
角化細胞（ケラチノサイト、keratinocyte）の細胞接着抑制作用を指標とし美白剤を選択する、美白剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する工程を含む美白剤のスクリーニング方法であって、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞のインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、角化細胞の上層移動促進作用より選択される１種又は２種以上の作用を比較し、前記角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する、請求項１に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞接着促進因子を付与する工程を含む、請求項１又は２に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞接着促進因子が、メラニン及び／又はその関連物質である、請求項３に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記角化細胞のインテグリン産生抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用である、請求項１〜４の何れか１項に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現抑制作用である、請求項５に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記角化細胞のインテグリン産生抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用である、請求項１〜４の何れか１項に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記角化細胞の基底膜への接着抑制作用が、ラミニン−５（Laminin−５）に対する角化細胞の接着抑制作用である、請求項１〜４の何れか１項に記載の美白剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の美白剤のスクリ−ニング方法により選択された美白剤を含有する、美白用組成物。
【請求項１０】
皮膚外用剤である、請求項９に記載の美白用組成物。
【請求項１１】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、請求項９又は１０に記載の美白用組成物。
【請求項１２】
角化細胞の細胞接着抑制剤よりなる、美白剤。
【請求項１３】
前記角化細胞の細胞接着抑制剤は、角化細胞のインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、及び角化細胞の上層移動促進作用から選択される作用の１種又は２種以上を有する、請求項１２に記載の美白剤。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の美白剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項１５】
請求項１〜８の何れか１項に記載の美白剤のスクリ−ニング方法により選択された美白剤を含有する、美白用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料等に好適な、新規な作用機序を有する美白剤及びそのスクリ−ニング方法、当該美白剤を含有する美白用組成物、並びにその美白用組成物の製造方法に関するものである。尚、本発明の説明において、化粧料との用語は、医薬部外品を含むものとする。
【背景技術】
【０００２】
しみ、くすみ等の色素沈着、たるみ、しわ等の皮膚形状変化、肌のハリ、弾力の喪失等の皮膚構造変化などの皮膚老化症状は、紫外線暴露、乾燥などの長年に渡る皮膚刺激の蓄積により生じ、加齢と共に顕在化する。この様な皮膚老化症状の予防又は改善を目的とし、美白剤、抗老化剤、保湿剤等の開発が盛んに行われている。特に、しみ、くすみをはじめとする色素沈着症状を対象とした美白剤への注目度は非常に高く、これまでもアルブチン、アスコルビン酸グルコシドをはじめとする数多くの美白剤が開発されている。しかしながら、従来の美白剤には、一定の効果は認められるものの、使用者が望む様な高い美白効果、持続性が達成されているとは言い難い。このことは、従来の美白剤が有するメラニン産生抑制作用、メラニンの角化細胞（ケラチノサイト）への移送阻害、角化細胞へのメラニン取り込み抑制作用等の作用機序のみでは、色素沈着の作用機序を完全に説明することが困難であることに起因する。さらに、前述の美白剤には、安全性又は安定性に課題を有するものも存在する。このため、今尚、有効性及び安全性の高い美白剤が求められ、新規な作用機序を有する美白剤に関する研究開発が盛んに行われている。また、新規な作用機序を有する美白剤が見出せれば、既存の美白剤との併用による相加又は相乗効果が期待出来るため、新たな作用機序を有する美白剤の登場への期待は非常に高いと言える。
【０００３】
近年、しみ、くすみ等の色素沈着、たるみ、しわ等の皮膚形状変化、肌のハリ、弾力の喪失等の皮膚構造変化などの皮膚老化症状と、表皮基底膜（以下、基底膜と記載）の機能及び構造との関係に注目が集まっている。基底細胞層を構成する角化細胞の幹細胞及び色素細胞（メラノサイト）は、基底膜及び隣接する細胞と接着するためにデスモゾーム（desmosome）、裂隙接合（gap junction）、ヘミデスモゾーム（hemidesmosome）等の構造を有する。また、インテグリンα６／β４を主要な構成要素とするヘミデスモゾームは、基底細胞層の角化細胞を基底膜に係留し、角化進行による角化細胞の皮膚表面への移動を制御することにより角化細胞のターンオーバーを調整するほか、組織構造の維持、シグナル伝達等の多様な細胞機能発現（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）に深く関与する。さらに、細胞接着分子のインテグリンは、α鎖及びβ鎖より形成されるヘテロダイマ−であり、サブタイプの組合せ及び分布の違いにより、リガンド特異性及び発現機能等に大きな差異が生じる。皮膚の色素沈着、皮膚形状変化又は構造変化等の皮膚老化症状と、インテグリン分子との関連性としては、角化細胞のインテグリン分子が基底細胞層と基底膜の構造異常及び機能低下に関与し、たるみ、弾力性の低下等の皮膚構造変化を引き起こすこと（例えば、特許文献１を参照）が報告されている。この様な皮膚構造変化に対しては、インテグリンα２β１産生促進剤（例えば、特許文献２を参照）、セイヨウキズタなどの植物抽出物を含有するインテグリンα６β４産生促進用組成物（例えば、特許文献３を参照）等のインテグリン産生促進剤が有効とされている。また、しみ、くすみ等の色素沈着症状とインテグリン分子との関連性としては、しみ、くすみ等の皮膚部位におけるインテグリンβ４発現量が低下することが報告され、かかる知見を基に、レイシ及び／又はオウレン抽出物よりなるインテグリンβ４産生促進剤（例えば、特許文献４を参照）、塩素置換アルコ−ル（例えば、特許文献５を参照）等のインテグリンβ４産生促進剤が報告されている。この様に、従来技術における皮膚老化症状と基底膜の機能及び構造との関連性においては、インテグリンをはじめとする細胞接着分子の細胞接着機能を亢進させることが、皮膚老化症状を予防又は改善することに有効であるとされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−５３５３１０号公報
【特許文献２】特開２００９−２２７６２８号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２２５号公報
【特許文献４】特開２００６−０４５０８７号公報
【特許文献５】特開２００６−０４５０８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dawling J et. al.， J. Cell Biol.，１３４、５５９−５７２（１９９６）．
【非特許文献２】Mainiero F et. al.， EMBO J.，１６、２３６５−２３７５（１９９７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の様な状況を鑑みてなされたものであり、既存の作用機序に基づいた美白作用に着目するだけでは困難な、新規な作用機序を有する美白剤、詳しくは、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意努力を重ねた結果、しみ、くすみ等の色素沈着が認められる皮膚部位の表皮基底層においては、角層細胞の細胞接着能が亢進していることを見出した。即ち、本発明者は、通常の皮膚と比較し、しみ、くすみ等が認められる皮膚部位の表皮基底層に存在する角化細胞の細胞接着能の亢進、具体的には、角化細胞のインテグリンα６及びβ４蛋白発現量の増加を確認した。さらに、本発明者は、前述の角化細胞における細胞接着能亢進は、表皮基底層の色素細胞により産生され角化細胞に移送されるメラニン及びその関連物質の蓄積量の増加により引き起こされることを見出した。具体的には、角化細胞へのメラニン又はその関連物質の添加による、角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量の増加、角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の増加、角化細胞の基底膜に対する接着性の向上（角化細胞のラミニン−５（Laminin−５）に対する接着性の向上）を見出した。さらに、角化細胞におけるメラニン及びその関連物質の蓄積は、角化進行による角化細胞の上層移動を抑制することを見出した。かかる事実は、メラニン産生亢進による日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着が認められる皮膚部位においては、角化細胞におけるメラニン及びその関連物質の蓄積量が増加することにより角化細胞の細胞接着能が亢進し、角化細胞の基底膜への接着能が高まり、角化細胞の上層移動が抑制されていることを示している。さらに、前述の角化細胞の細胞接着能亢進により、角化細胞が基底膜に強力に係留されるため、角化細胞のターンオーバーが障害され、色素沈着症状をはじめとする皮膚老化現象が現れると考えられる。本発明者は、この様な事実を基に、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する成分が、美白剤となり得ることを明らかとした。本発明者が明らかにした事実は、従来の色素沈着症状をはじめとする皮膚老化症状と角化細胞の細胞接着能に関する知見とは大きく異なるものである。さらに、日焼け、しみ、くすみ等が認められる皮膚部位の基底細胞層における角化細胞の細胞接着能が亢進されていることが明らかにされていない以上、角化細胞の細胞接着抑制作用を指標とし、美白剤をスクリーニングする方法、かかる美白剤を含有する美白用組成物、及びその製造方法に関する検討も積極的に行われてこなかったと言える。従って、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する成分は、新たな作用機序を有する美白剤となり得る。
【０００８】
本発明者は、新規な作用機序を有する美白剤、即ち、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤を求め、さらに鋭意研究を重ねた結果、精度よく、効率的に新規な作用機序を有する美白剤をスクリーニングする方法を確立した。さらに、かかるスクリーニング方法により選択した美白剤を含有した美白用組成物が、優れた美白作用を発揮することを確認した、即ち、本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞  角化細胞（ケラチノサイト、keratinocyte）の細胞接着抑制作用を指標とし美白剤を選択する、美白剤のスクリーニング方法。
＜２＞  角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する工程を含む美白剤のスクリーニング方法であって、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞のインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、角化細胞の上層移動促進作用より選択される１種又は２種以上の作用を比較し、前記角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する、＜１＞に記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜３＞  細胞接着促進因子を付与する工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜４＞  前記細胞接着促進因子が、メラニン及び／又はその関連物質である、＜３＞に記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜５＞  前記角化細胞のインテグリン産生抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用である、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜６＞  前記インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現抑制作用である、＜５＞に記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜７＞  前記角化細胞のインテグリン産生抑制作用が、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用である、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜８＞  前記角化細胞の基底膜への接着抑制作用が、ラミニン−５（Laminin−５）に対する角化細胞の接着抑制作用である。＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の美白剤のスクリーニング方法。
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞の何れかに記載の美白剤のスクリ−ニング方法により選択された美白剤を含有する、美白用組成物。
＜１０＞  皮膚外用剤である、＜９＞に記載の美白用組成物。
＜１１＞  化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、＜９＞又は＜１０＞に記載の美白用組成物。
＜１２＞  角化細胞の細胞接着抑制剤よりなる、美白剤。
＜１３＞  前記角化細胞の細胞接着抑制剤は、角化細胞のインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、及び角化細胞の上層移動促進作用から選択される作用の１種又は２種以上を有する、＜１２＞に記載の美白剤。
＜１４＞  ＜１２＞又は＜１３＞に記載の美白剤を含有する皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来明らかとされていなかった角化細胞の細胞接着抑制作用に基づいた新規な作用機序を有する美白剤を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトシミ部位におけるインテグリンα６蛋白発現量変化に関する図である。
【図２】ヒトシミ部位におけるインテグリンβ４蛋白発現量変化に関する図である。
【図３】ヒト正常角化細胞のメラニン添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化に関する図である。
【図４】ヒト正常角化細胞の脂化メラニン添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化に関する図である。
【図５】ヒト正常角化細胞のメラニン添加によるインテグリンα６及びβ４蛋白発現量変化に関する図である。
【図６】ヒト正常角化細胞のメラニン添加による基底膜成分（ラミニン−５）に対する角化細胞の接着性変化に関する図である。
【図７】ヒト正常角化細胞のメラニン添加による角化細胞の上層移動能変化を示す図である。
【図８】被験物質（ユズ抽出物（ユズセラミド、左図）又はチョウセンアザミ抽出物（アーティチョークエキス、図右））のヒト正常角化細胞におけるインテグリンα６mRNA発現抑制作用に関する図である。
【図９】被験物質（ユズ抽出物（ユズセラミド）又はチョウセンアザミ抽出物（アーティチョークエキス））のヒト正常角化細胞における基底膜成分（ラミニン−５）に対する角化細胞の接着抑制作用に関する図である。
【図１０】被験物質（ユズ抽出物（ユズセラミド）又はチョウセンアザミ抽出物（アーティチョークエキス））のヒト正常角化細胞における上層移動促進作用の評価結果に関する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態に関し詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【００１２】
＜本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する工程を含む美白剤のスクリーニング方法＞
本発明の美白剤のスクリーニング方法は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する、美白剤のスクリーニング方法である。本発明者は、通常の皮膚と、しみ、くすみ等が認められる皮膚部位とを比較した場合、しみ、くすみ等が認められる皮膚部位の基底細胞層に存在する角化細胞のインテグリンα６及びβ４蛋白発現量が増加すること、メラニン又はその関連物質添加により角化細胞のインテグリンα６及びβ４mRNA発現量及びインテグリンα６及びβ４蛋白発現量が増加すること、メラニン添加により基底膜に対する角化細胞の接着性（より詳しくは、ラミニン−５（Laminin−５）に対する角化細胞の接着性）が向上することを見出した。さらに、メラニン添加により角化進行による角化細胞の上層移動が抑制されることを見出した。かかる事実は、日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着が認められメラニン産生亢進が起こっている皮膚部位においては、メラニン及びその関連物質が角化細胞に過剰に移送され蓄積することにより、角化細胞の細胞接着能が亢進し、基底膜に対する角化細胞の接着能が高まり、角化細胞の上層移動が抑制されることを示している。このことは、角化細胞の細胞接着抑制作用が、日焼け、しみ、くすみをはじめとする色素沈着症状の発生又は悪化に深く関与することを示している。前述の事実に基づけば、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する成分には、角化細胞の細胞接着を抑制し、角化細胞のターンオーバーを正常化することによる美白作用が期待出来る。このため、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価することにより新規な作用機序を有する美白剤をスクリーニングすることが出来る。
【００１３】
本発明の美白剤のスクリーニング方法は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する、美白剤のスクリーニング方法である。さらに、本発明の美白剤のスクリーニング方法は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する工程を含む美白剤のスクリーニング方法であり、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、角化細胞の上層移動促進作用より選択される１種又は２種以上の作用を比較し、前記細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択することを特徴とする美白剤のスクリーニング方法であることが好ましい。本発明の美白剤のスクリーニング方法における角化細胞の細胞接着抑制作用の指標としては、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な、角化細胞の細胞接着抑制作用に係わる物理量であれば特段の限定なく適用することが出来る。また、本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用の評価においては、かかる物理量を測定し、その測定値又は該測定値より算出される値を比較し細胞接着抑制作用を評価することが出来る。ここで「比較する」とは、被験物質の細胞接着抑制作用を評価する上で、被験物質を添加しない角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の測定値又は該測定値より算出される値を基準とし、被験物質を添加した角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の測定値又は該測定値より算出される値と比較し、被験物質の細胞接着抑制作用を評価することを意味する。本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の内、好ましいものとしては、角化細胞のインテグリン産生抑制作用に関連するインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用に係る物理量、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用に係る物理量のほか、基底膜（より好ましくは、基底膜の主要な構成成分のラミニン−５）に対する角化細胞の接着抑制作用等の角化細胞と基底膜との細胞接着抑制作用に係る物理量、角化進行による角化細胞の上層移動促進作用等に関する物理量等が好適に例示出来る。さらに、前記インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量の内、さらに好ましいものとしては、インテグリンα６及び／β４mRNA発現量が好適に例示出来る。
【００１４】
本発明において「角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する」とは、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリン産生抑制作用、角化細胞の基底膜への接着抑制作用、角化細胞の上層移動促進作用より選択される１種又は２種以上の角化細胞の細胞接着抑制作用に係わる物理量を測定し、その測定値又は該測定値より算出される値を比較し、その比較結果を基に角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該細胞接着抑制作用を指標とし美白剤として選択することを意味する。具体的には、被験物質に角化細胞の細胞接着抑制作用が認められた場合、美白剤として選択され得ると判断するほか、角化細胞の細胞接着抑制作用に関し事前に評価基準を設けておき、その基準を超えた場合、該被験物質を美白剤として選択する等もこれに含まれる。さらに、複数の被験物質に関し細胞接着抑制作用を比較し、これらの作用を相対的に評価し、細胞接着抑制作用がより高い被験物質が、より優れた美白剤であると判定することも、本発明の「角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する」ことに含まれる。
【００１５】
本発明の美白剤のスクリーニング方法においては、角化細胞に細胞接着促進因子を適宜付与することが出来る。本発明における「細胞接着促進因子」としては、角化細胞の細胞接着能を向上させる作用を有する因子であれば特段の限定なく適用することが出来、より好ましくは、角化細胞の細胞接着能を向上させる作用を有する因子、角化進行による角化細胞の上層移動を抑制する作用を有する因子などが好適に例示出来る。本発明の角化細胞の細胞接着促進因子の内、好ましいものを挙げれば、メラニン及び／又はその関連物質が好適に例示出来る。前記の角化細胞の細胞接着促進因子の内、メラニンは、動物、植物、原生動物等において産生されるメラニン色素であれば特段の限定なく適用することが出来、より好ましくは、色素細胞より産生されるユーメラニン（eumelanin）、フェオメラニン（pheomelanin）等のメラニンが、さらに好ましくは、ユーメラニンが好適に例示出来る。一方、前記のメラニン関連物質としては、動物、植物、原生動物等のメラニン生合成過程において派生的に生じるメラニン関連物質が好適に例示出来、好ましいものとしては、生体構成成分の脂質と活性酸素より生じる過酸化脂質とメラニンが反応し生成する脂質化されたメラニン（脂化メラニン）が好適に例示出来る。脂化メラニンは、過酸化脂質とメラニンの反応により生じる物質の総称であり、単一の成分ではない。また、脂化メラニンを生成する生体成分の脂質としては、生体中に存在する脂質であれば特段の限定なく適用出来、より好ましくは、リン脂質が、さらに好ましくは、水酸化レシチンが好適に例示出来る。また、脂化メラニンは、紫外線暴露等により発生する活性酸素と脂質より生じる過酸化脂質とメラニンが生体内で反応することにより生じるほか、化学的に生成させることも出来る。脂化メラニンの産生方法としては、脂化メラニンが産生する方法であれば特段の限定なく適用出来、好ましい方法を具体的にあげれば、後述する製造例１及び２に記載の方法が好適に例示出来る。
【００１６】
本発明の角化細胞の細胞接着促進因子の付与に関しては、その順番やその回数は特に限定されず、被験物質を添加した後に角化細胞の細胞接着促進因子を付与するものであっても、細胞接着促進因子を付与した後に被験物質を添加するものであっても、或いは、被験物質の添加と細胞接着促進因子の付与を同時に行うものであってもよい。さらに、細胞接着促進因子の添加は、角化細胞の培養条件等に応じ適宜設定されるべきものである。角化細胞の細胞接着促進因子の添加は、例えば、メラニンを添加する場合には、その添加量（複数回添加する場合には総量）として、通常１×１０−６（w／v％）以上、好ましくは、１×１０−５（w／v％）以上、より好ましくは、１×１０−４（ｗ／ｖ％）以上であり、通常、３×１０−１（w／v％）以下、好ましくは、３×１０−２（w／v％）以下、より好ましくは、３×１０−３（w／v％）以下である。また、脂化メラニン添加の場合には、その添加量（複数回添加する場合には総量）として、通常１×１０−５（w／v％）以上、好ましくは、１×１０−４（w／v％）以上、より好ましくは、１×１０−３（w／v％）以上であり、通常、３（w／v％）以下、好ましくは、３×１０−１（w／ｖ％）以下、より好ましくは、３×１０−２（w／v％）以下であることが好ましい。上記範囲内であれば、角化細胞のインテグリン産生促進作用（インテグリン遺伝子発現促進作用、インテグリン蛋白発現促進作用）、角化細胞の基底膜に対する接着性促進作用、角化進行による角化細胞の上層移動抑制作用を適度に発現することが出来る。尚、本発明の美白剤のスクリーニング方法、及びその検討に用いた細胞接着促進因子は、市販のメラニン（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）のほか、後述する製造例１及び２に記載の製造方法に従い調製された脂化メラニンを使用した。また、後述する製造例１及び２により製造される脂化メラニンは、懸濁液として使用されているが、必要に応じ更なる精製工程を加えもよい。
【００１７】
＜製造例１：  過酸化脂質溶液の調製方法＞
１（w／v％）レシノール SH５０水溶液（日本サーファクタント工業株式会社）を９０℃、１０分間加熱した後、室温に戻し、リポキシゲナーゼ（ナカライテスク株式会社）を最終濃度１（mg/mL）となるように添加し、３７℃で一晩振とうする。反応液を遠心分離（３０００rpm、１０分間）し、上清を回収し過酸化脂質溶液として使用した。
【００１８】
＜製造例２：  脂化メラニン懸濁液の調製方法＞
表１に記載の成分を含む脂化メラニン反応液を調製し、室温で２４時間静置した後、遠心分離（２００００g、１０分間）した。上清を除去した後、メタノール（和光純薬工業株式会社）を加え、数回ピペッティングし、沈殿物中の脂質及び過酸化脂質を除去した。メタノールによる脂質及び過酸化脂質の除去を再度繰り返した後、沈殿物をPBS（タカラバイオ株式会社）１（mL）にて懸濁し、脂化メラニン懸濁液を調製した。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
本発明の美白剤のスクリーニング方法には、通常の培養条件により培養した角化細胞を用いることも出来るし、角化細胞に細胞接着促進因子を添加し角化細胞の細胞接着能を向上させた角化細胞、具体的には、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現が促進された角化細胞、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現が促進された角化細胞、基底膜への接着性が向上した角化細胞、角化細胞の上層移動能が抑制された角化細胞などを用いることも出来る。本発明の美白剤のスクリーニング方法においては、角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の測定感度、精度等の面より、細胞接着促進因子を添加し細胞接着能を向上させた角化細胞を用いることがより好ましい。また、本発明の美白剤のスクリーニング方法における角化細胞の細胞接着抑制作用の比較に至る細胞培養条件においては、前記の角化細胞を培養するための通常の培地を使用することも出来るし、通常の培地に角化細胞の細胞接着促進因子を添加した培地を使用することも出来る。本発明の美白剤のスクリーニング方法に用いる培地としては、Humedia-KG２（ケラチノサイト増殖用培地、倉敷紡績株式会社）が好適に例示出来る。また、本発明の美白剤のスクリーニング方法においては、角化細胞の単独培養を用いることが好ましいが、角化細胞及び色素細胞の共培養系を用いることも出来る。
【００２１】
本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択される美白剤は、角化細胞の細胞接着抑制作用を有することを特徴とする。日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着症状が認められる皮膚部位の基底細胞層においては、色素細胞のメラニン産生が亢進され、又はメラニン産生亢進状態が持続し、メラニン及びその関連物質の産生量が高まっている。さらに、過剰に産生されたメラニン及びその関連物質は、角化細胞に移送され、蓄積することにより角化細胞の細胞接着能を亢進し、角化細胞を基底膜に強固に係留し、角化細胞のターンオーバーに障害を引き起こす。また、角化細胞のターンオーバー障害により、メラニン及びその関連物質を大量に包含する角化細胞は、基底層に強固に係留することになり、肌の黒色の色調及び色素沈着の原因となる。前述の通り、角化細胞の細胞接着能の促進は、色素沈着症状の発生、症状の定着、悪化に深く関与する。本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤は、メラニン及びその関連物質が角化細胞に過剰に移送され蓄積することにより高められた細胞接着能を低下させ、角化細胞のターンオーバーを正常化することにより美白効果を発揮する。このため、本発明の美白剤は、紫外線暴露等により既に形成された日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着症状を薄くする又は元の状態に戻す作用、将来的に形成される日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着症状を予防する作用を有し、かかる皮膚色素沈着症状に対し美白効果を発揮する。また、本発明の美白剤は、従来とは異なる作用機序を介する美白剤であるため、美白用組成物に含有することにより、優れた美白効果が期待出来る。さらに、本発明の美白剤は、従来の美白剤との併用により美白効果における相加又は相乗的な効果増強が期待出来る。
【００２２】
本発明の美白剤のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、化学物質又は動植物由来の抽出物等の混合物等の何れであってもよい。動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、精製物の溶媒除去物等の総称を意味するものである。また、植物由来の抽出物は、自生若しくは育成された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用い作製された抽出物、市販されている抽出物等が好適に挙げられる。抽出操作に用いる植物部位としては、特段の限定はなく、植物の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用すること出来る。また、かかる植物部位を予め粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することが出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００２３】
本発明の美白剤のスクリーニング方法における被験物質の添加量（複数回添加する場合には総量）は、スクリーニングに使用する角化細胞の種類又は培養条件等に応じて適宜設定されるべきものである。本発明の美白剤のスクリーニング方法における被験物質の添加量（複数回添加する場合には総量）としては、例えば、培地中に最終濃度として通常０．０００１（v／v％）以上、好ましくは０．００５（v／v％）以上、より好ましくは０．００１（v／v％）以上になるように添加するものであり、通常５０（v/v％）以下、好ましくは３０（v／ｖ％）以下、より好ましくは２０（v／ｖ％）以下になるように添加するものである。
【００２４】
１）本発明の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較するスクリ−ニング方法
本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する美白剤のスクリーニング方法の内、角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法に関し述べる。本発明の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法において評価される角化細胞のインテグリン産生抑制作用としては、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な角化細胞のインテグリン産生抑制作用であれば特段の限定なく適用することが出来る。前記の角化細胞のインテグリン産生抑制作用の内、好ましいものとしては、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用等が好適に例示出来る。また、前記インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用の内、より好ましいものとしては、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現抑制作用が好適に例示出来る。これは、角化細胞にインテグリンα６β４蛋白が発現すること、更には、しみ、くすみ等の皮膚部位におけるインテグリンα６及びβ４蛋白発現量の増加が確認され、インテグリンα６β４産生抑制作用と色素沈着との関係が示されているためである。また、前記インテグリン産生抑制作用を評価する際には、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量又は蛋白発現量と関連性が高い作用を代用してもよい。
【００２５】
本発明の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法は、角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較し、細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし、美白剤を選択することを特徴とする。本発明の美白剤のスクリーニング方法において「角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較する」とは、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞のインテグリン産生抑制作用に係る物理量を測定し、被験物質を添加しない角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の測定値又は該測定値より算出される値を基準とし、被験物質を添加した角化細胞の細胞接着抑制作用に係る物理量の測定値又は該測定値より算出される値と比較し、被験物質の細胞接着抑制作用を評価することを意味する。
【００２６】
また、インテグリンα６β４は、インテグリンα６及びβ４の２種類のサブユニットから形成される細胞接着分子である。このため、インテグリンα６又はβ４の２種類のサブユニットの内、一方又は両方の遺伝子発現量、蛋白発現量が減少することにより角化細胞の細胞接着能は低下する。従い、本発明のインテグリン産生抑制作用を比較し角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する場合には、インテグリンα６又はβ４の片方又は両方の遺伝子発現量又は蛋白発現量を測定し、その測定値又は該測定値より算出される値を比較し評価することが出来る。
【００２７】
角化細胞のインテグリン産生抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法における具体的な工程を以下に挙げる。
（i）評価に使用する角化細胞（活性化した状態又は活性化していない状態の何れでもよい）に、被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加しない角化細胞も用意する）。
（ii）被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリン産生抑制作用に係る物理量（例えば、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量など）を測定する。
（iii）測定したインテグリン産生抑制作用に係る物理量を比較し、被験物質の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する。
（iv）評価した角化細胞の細胞接着抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する。
【００２８】
前述の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較する美白剤のスクリーニング方法に関し、上記（i）の工程に用いられる角化細胞としては、細胞接着促進因子の添加等により細胞接着能が向上した角化細胞、或いは細胞接着能が向上していない通常の角化細胞の何れを用いてもよいが、細胞接着能が向上した角化細胞を用いることが測定感度及び精度の面より好ましい。角化細胞に添加する細胞接着促進因子としては、メラニン及びその関連物質（例えば、過酸化脂質及びメラニンより生成する脂化メラニンなど）が好ましい。
【００２９】
本発明の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を比較する方法の上記（ii）の工程により測定されるインテグリン産生抑制作用に係る物理量は、前述の角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量等の角化細胞のインテグリン産生抑制作用に係る物理量の内、１種類を測定、評価することに限定されず、複数種類の角化細胞のインテグリン産生抑制作用に係る物理量を測定し、その測定値又は当該測定値を基に任意の処理方法により角化細胞のインテグリン産生抑制作用を算出し、これらの値を比較することにより、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価してもよい。さらに、上記（iv）の工程の判定に用いる基準も特に限定されず、目的に応じて適宜設定することが出来る。上記（iv）の工程における判断基準（指標）としては、例えば、被験物質に角化細胞の細胞接着抑制作用があると評価された場合には美白剤として選択され得ると判断するほか、角化細胞の細胞接着抑制作用について事前に評価基準を設けておき、その基準を超えた場合、当該被験物質を美白剤として選択する等もこれに含まれる。さらに、複数の被験物質について角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、これらの作用を相対的に比べることにより、細胞接着抑制作用がより高い被験物質が、より優れた美白剤であると判定することなどが好適に挙げられる。かかる工程を経て判別又は選択された美白剤は、優れた美白効果を発揮する。
【００３０】
ここで前記のインテグリン産生抑制作用を比較する美白剤のスクリーニング方法の内、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用、より詳しくは、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量を比較する方法に関し述べる。現在、インテグリン遺伝子発現量を測定する方法としては、mRNA発現量を測定可能なノーザンブロット法（northern blotting）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法、リアルタイムPCR（Real time PCR）法、更には、リアルタイムPCR（Real time PCR）とRT−PCRを組み合わせた測定方法等が知られている。本発明におけるインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量の測定においては、前述の測定方法のほか、インテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量を測定する方法であれば特段の限定なく適用することが出来るが、測定感度及び測定の簡便性などの面より、リアルタイムPCR法によりインテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量を測定する方法が好ましい。前述のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量を測定する方法を用いることにより、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量、さらに詳しくは、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量を測定することが出来る。また、インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量は、市販の簡易測定キットを使用し簡便に測定することが出来る。かかる市販の簡易測定キットとしては、例えば、QIAGEN社より販売されているRNA精製キットが好適に例示出来、かかる市販の簡易測定キットを用い、総mRNAを抽出した後、SuperScriptR VILOTM ｃDNA  synthesis kit（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、１１７５４−２５０）を用い逆転写反応を行い、リアルタイムPCR解析システム（StepOnePlusTM  Real-Time PCR Systems、アブライドバイオシステムズ社）を用いPCR反応を行い、目的とするインテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量を測定することが出来る。また、本発明の角層細胞のインテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量を測定する方法の内、特に好ましい方法としては、後述する試験例３に記載の角層細胞のインテグリンα６及び／又はβ４mRNA測定方法が好適に例示出来る。
【００３１】
本発明の角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現抑制作用（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現抑制作用）を比較する美白剤のスクリーニング方法において美白剤として選択される成分としては、上記（iii）の工程における被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現抑制作用）を比較した場合、被験物質に角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量の低下（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量の低下）が認められる成分が、より好ましくは、被験物質を添加した角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量）に対し、被験物質を添加しない角化細胞における遺伝子発現量が２０％以上低下している成分が好適に例示出来る。かかる成分の内、好ましいものとしては、後述する実施例１に記載の美白剤のスクリーニング方法において、被験物質を添加しない角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量）に対し、被験物質を添加した角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量）の低下が認められる成分、より好ましくは、被験物質を添加した角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４遺伝子発現量（インテグリンα６及び／又はβ４mRNA発現量）に対し、被験物質を添加しない角化細胞における遺伝子発現量が２０％以上低下している成分が好適に例示出来る。
【００３２】
ここで前記インテグリン産生抑制作用を比較する測定する方法の内、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を比較する方法に関し述べる。現在、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定する方法としては、直接及び間接蛍光抗体法、標識抗体を使用するラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法等の抗体を利用する方法が用いられている。本発明におけるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の測定においては、前記の抗体を用いる測定方法のほか、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定することが出来る方法であれば特段の限定なく適用することが出来る。本発明のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の測定方法としては、測定感度及び測定の簡便性などの面より、間接蛍光抗体法によるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定する方法が好ましい。前述のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定する方法により、被験物質添加及び非添加の角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を精度よく、簡便に測定することが出来る。また、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白量は、市販の抗体等を利用し簡便に測定することが出来る。かかる市販の抗体としては、例えば、インテグリンα６蛋白質の一次抗体としては、Anti-human Integrin alpha ６ antibody（Mouse monoclonal）（abcam、商品番号：ab２０１４２）、インテグリンβ４蛋白質の一次抗体としては、Anti-human Integrin beta ４ antibody（abcam、商品番号：ab１１０１６７）、インテグリンα６蛋白質の二次抗体としては、Alexa Fluor ５５５ Goat Anti-mouse IgG（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、商品番号：A-２１４２２）、インテグリンβ４蛋白質の二次抗体としては、Alexa Fluor ４８８ goat anti-rat IgG（H+L）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、商品番号：A−１１００６）等が好適に例示出来る。さらに、後述する試験例４に記載の方法に従いインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定することが出来る。また、かかる抗体を利用しインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定（比較）する場合には、蛍光顕微鏡等を利用し目視により測定（比較）することも出来るし、蛍光強度を検出することにより半定量化することも出来る。本発明の角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定する方法の内、特に好ましい方法としては、後述する試験例４に記載の試験方法を基に、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞においてインテグリンα６又はβ４を認識する一次抗体、及び一次抗体と反応し蛍光検出を可能とする二次抗体を反応させた後、蛍光顕微鏡等によりインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を測定（比較）し、当該蛋白発現量の減少を確認する方法が好適に例示出来る。
【００３３】
本発明の角化細胞のインテグリン産生抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法の内、インテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法において美白剤として選択される成分とは、上記（iii）の工程における被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を比較した場合、被験物質に角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の低下が認められる成分が好適に挙げられる。本発明の角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現抑制作用を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とする美白剤のスクリーニング方法の内、好ましいものとしては、後述する試験例４に記載の方法を基に、被験物質を添加した角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量、及び被験物質を添加しない角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、当該作用を指標とし美白剤を選択する方法が好適に例示出来る。本発明の角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法において、美白剤として選択される成分としては、被験物質に角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の低下が認められる成分が好適に例示で出来、かかる成分としては、抗体を反応させ蛍光染色した角化細胞を蛍光顕微鏡で観察した場合、被験物質を添加した角化細胞に比較し、被験物質を添加しない角化細胞のインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の低下、即ち、蛍光発色の低下が認められる成分が好適に例示出来る。また、前述の蛍光発色は、蛍光顕微鏡等の装置を用いた目視の観察以外に、蛍光プレートリーダー、あるいは、画像解析ソフト等の装置を用い半定量的に測定することが出来、かかる手法によりインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の低下が認められる成分を美白剤として選択することも出来る。かかるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量を（半）定量的に評価する方法を用いる場合、本発明の美白剤として選択される成分としては、被験物質を添加しない角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量に対し、被験物質を添加した角化細胞におけるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量の低下が認められる成分、より好ましくは、前記蛋白発現量の低下が１０％以上、さらに好ましくは、前記蛋白発現量の低下が２０％以上である成分が好適に例示出来る。
【００３４】
２）本発明の角化細胞の基底膜への接着抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法
本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を指標とする美白剤のスクリーニング方法の内、基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法に関し述べる。本発明の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法における基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用であれば特段の限定なく適用することが出来る。かかる基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用としては、基底膜の主要な構成成分であるラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用が好適に例示出来る。
【００３５】
本発明の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する美白剤のスクリーニング方法における具体的な工程を以下に挙げる。
（i）評価に使用する細胞（活性化した状態又は活性化していない状態の何れでもよい）に、被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加しない細胞も用意する）。
（ii）被験物質を添加した場合、及び被験物質を添加しない場合の角化細胞における基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用（基底膜成分のラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用）を測定する。
（iii）測定した基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用（ラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用）を比較し、被験物質の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する。
（iv）評価した角化細胞の細胞接着抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する。
【００３６】
前記の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する美白剤のスクリーニング方法に関し、上記（i）の工程においては、細胞接着促進因子の添加等により細胞接着能が向上した角化細胞、或いは細胞接着能が向上していない角化細胞の何れを用いてもよいが、細胞接着能が向上した角化細胞を用いることが測定感度及び精度の面より好ましい。添加する細胞接着促進因子としては、メラニン及びその関連物質（例えば、過酸化脂質及びメラニンより生成する脂化メラニンなど）が好ましい。
【００３７】
角化細胞は、基底膜の主要な成分であるラミニン−５と、細胞接着分子のインテグリンα６β４を介し接着することにより、細胞及び組織構造の維持、シグナル伝達等の生物活性を発現する。本発明の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法により選択される美白剤としては、基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用が認められる成分、より好ましくは、基底膜の構成成分であるラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用が認められる成分が好適に例示出来る。かかる成分は、角化細胞の基底膜に対する接着抑制作用により、角化細胞のターンオーバーを正常化し、美白効果を発揮する。従って、基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較することにより角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、美白剤を選択することが出来る。
【００３８】
上記（ii）の工程における基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用であれば特段の限定なく適用することが出来、好ましいものとしては、基底膜成分のラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用であることが好ましい。また、前記の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用に係る物理量は、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用に係る物理量を測定し、当該測定値又は該測定値より算出された値を比較することにより角化細胞の細胞接着抑制作用を評価することが出来る。本発明の基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する方法の内、好ましいものとしては、基底膜成分のラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する方法が好適に例示出来、例えば、実施例２に記載のラミニン−５によりコーティングされた培養容器を用いて角化細胞を培養し、Hoechst３３３４２等の蛍光試薬により細胞核を蛍光染色した後、プレートリーダー等の測定機器を用い接着細胞数を測定し接着細胞数の比率を算出し評価する方法が好適に例示出来る。
【００３９】
本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する美白剤のスクリーニング方法の内、基底膜に対する角化細胞の接着抑制作用（ラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用）を評価する美白剤のスクリーニング方法において美白剤として選択される成分とは、上記（iii）の工程における被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞における基底膜に対する接着抑制作用（ラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用）を比較した場合、被験物質に基底膜（ラミニン−５）に対する角化細胞の接着抑制作用が認められる成分が好適に例示出来る。本発明の基底膜（ラミニン−５）に対する角化細胞の接着抑制作用を比較する美白剤のスクリーニング方法としては、例えば、後述する実施例２に記載の美白剤のスクリーニング方法が好適に例示出来る。実施例２に記載の美白剤のスクリーニンング方法において美白剤として選択される成分としては、被験物質を添加しない角化細胞のラミニン−５に対する角化細胞の接着性に対し、被験物質を添加した角化細胞のラミニン−５に対する角化細胞の接着性に低下が認められる成分、より好ましくは、統計的に有意な差をもって前記ラミニン−５に対する角化細胞の接着性が低下する成分が好適に例示出来る。
【００４０】
３）本発明の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法
本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する工程を含む美白剤のスクリーニング方法の内、角化細胞の上層移動促進作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法に関し述べる。本発明の角化細胞の上層移動促進作用を比較する工程を含む美白剤のスクリーニング方法において比較される角化細胞の上層移動促進作用は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な角化細胞の上層移動促進作用であれば特段の限定なく適用することが出来る。本スクリーニング方法における具体的な工程を以下に挙げる。
（i）評価に使用する細胞（活性化した状態又は活性化していない状態の何れでもよい）に、被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加しない細胞も用意する）。
（ii）被験物質を添加した場合、及び被験物質を添加しない場合の角化細胞における上層移動促進作用を測定する。
（iii）測定した角化細胞の上層移動促進作用を比較し、被験物質の角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する。
（iv）評価した角化細胞の細胞接着抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する。
【００４１】
前記の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法に関し、上記（i）の工程においては、細胞接着促進因子の添加等により細胞接着能が向上した角化細胞、或いは細胞接着能が向上していない角化細胞の何れを用いてもよいが、細胞接着能が向上した角化細胞を用いることが測定感度及び精度の面より好ましい。添加する細胞接着促進因子としては、メラニン及びその関連物質（例えば、過酸化脂質及びメラニンより生成する脂化メラニンなど）が好ましい。
【００４２】
基底細胞層の角化細胞は、色素細胞により産生されるメラニン及びその関連物質を受け取り包含した後、角化進行により皮膚表面にまで押し上げられ最終的には垢となって皮膚から排出される。日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着が認められる皮膚部位においては、過剰に産生されたメラニン及びその関連物質が角化細胞に移送され、蓄積することにより角化細胞の上層移動が抑制され、角化細胞のターンオーバーに障害が起こる。本発明の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法により選択される美白剤は、角化細胞の上層移動を促進することにより角化細胞のターンオーバーを正常化し、美白効果を発揮する。従って、角化細胞の上層移動促進作用を比較することにより角化細胞の細胞接着抑制作用を評価し、美白剤を選択することが出来る。
【００４３】
本発明の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法の工程の内、上記（ii）の工程における角化細胞の上層移動促進作用は、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価可能な角化細胞の上層移動促進作用に係る物理量であれば特段の限定なく適用することが出来る。また、前記の角化細胞の上層移動促進作用は、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞の上層移動促進作用に係る物理量を測定し、測定値又は該測定値より算出された値を比較することにより角化細胞の細胞接着抑制作用を評価することが出来る。上記（iii）の工程における被験物質添加及び非添加の角化細胞の上層移動促進作用を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価する方法は、角化細胞の上層移動促進作用を比較し、角化細胞の細胞接着抑制作用を評価出来る方法であれば特段の限定なく適用することが出来る。また、本発明の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法としては、例えば、後述する実施例３に記載の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法が好適に例示出来る。実施例３に記載の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法においては、基底膜成分のラミニン−５をコーティングした培養容器を用い、カルシウムスイッチした培養条件で、被験物質を添加した角化細胞、及び被験物質を添加しない角化細胞を培養し、Hoechst３３３４２等にて核を蛍光染色した後、画像解析等により最下層より上層の角化細胞数を評価することにより角化細胞の上層移動促進作用を評価することが出来る。また、後述する実施例３に記載の角化細胞の上層移動促進作用を比較する美白剤のスクリーニング方法において美白剤として選択される成分としては、被験物質を添加した角化細胞の最下層より上層の角化細胞数が、被験物質を添加していない角化細胞の最下層より上層の角化細胞数に比較し増加している成分、より好ましくは、統計的に有意な差をもって被験物質を添加した角化細胞の最下層より上層の角化細胞数が増加している成分が好適に例示出来る。
【００４４】
＜試験例１：  ヒトシミ組織における細胞接着機能亢進に関する検討１＞
以下の手順に従い、ヒトシミ組織における細胞接着機能亢進（インテグリンα６蛋白発現量亢進）を確認した。ホルマリン固定パラフィン包埋シミ組織切片（BIOPREDIC  International社）を脱パラフィンおよび再水和処理した後、１０mMクエン酸緩衝液（pH６．０）に浸しオートクレーブで１２０℃、２０分間加熱し抗原賦活化を行った。３％BSA含有PBSで室温、１時間インキュベートして非特異反応のブロッキングを行い、１％BSA含有PBSで１００倍希釈した一次抗体（（Anti-human Integrin alpha ６ antibody（Mouse monoclonal）（abcam、商品番号：ab２０１４２））を試料に滴下した。３７℃で一晩インキュベートした後、PBSにて洗浄し、１％BSA含有PBSで１００倍希釈した二次抗体（（Alexa Fluor ５５５ Goat Anti-mouse IgG（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、商品番号：A-２１４２２））を試料に滴下した。３７℃で１時間インキュベートした後、PBSにて洗浄し、水系封入剤（Fluoromount； Diagostic BioSystems、 Cat. No. K０２４）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４５】
ヒトシミ組織の（蛍光）顕微鏡写真を図１に示す。図１において、左側の顕微鏡写真は、ヒトシミ組織の明視野像、右側の写真は、蛍光染色像である。図１の明視野像及び蛍光染色像において白丸部分は、それぞれメラニン量に差異が認められる部位を表す。図１の明視野像の各白丸部分における色調の違いにより、左上の白丸部分は、メラニン量が少ない皮膚部位であること、右下の白丸部分は、メラニン量が多い皮膚部位であることが分かる。また、図１の蛍光染色像により、左上の白丸部分は、右下の白丸部分と比較し蛍光強度が弱く、インテグリンα６蛋白発現量が低いことが分かる。また、図１の明視野像及び蛍光染色像を比較検討することにより、メラニン量が多い皮膚部位においては、角化細胞のインテグリンα６蛋白発現量が高いことが分かる。このため、メラニン量が多い皮膚部位においては、角化細胞の細胞接着性が亢進していると考えられる。
【００４６】
＜試験例２：  ヒトシミ組織における細胞接着機能亢進に関する検討２＞
以下の手順に従い、ヒトシミ組織における細胞接着機能亢進（インテグリンβ４蛋白発現量亢進）を確認した。シミ組織凍結切片（BIOPREDIC  International社）を室温で１０分間ホルマリン固定した後、PBS（タカラバイオ株式会社）で洗浄した。３％BSA含有PBSで室温、１時間インキュベートして非特異反応のブロッキングを行い、１％BSA含有PBSで１００倍希釈した一次抗体（Rat mAb to integrin b4（abcam、商品番号：ab１１０１６７））を試料に滴下した。４℃で一晩インキュベートした後、PBSにて洗浄し、１％BSA含有PBSで１００倍希釈した二次抗体（Alexa Fluor ４８８ goat anti-rat IgG（H+L）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、商品番号：A−１１００６））を試料に滴下した。３７℃で１時間インキュベートした後、PBSにて洗浄し、水系封入剤（Fluoromount； Diagostic BioSystems、 Cat. No. K０２４）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４７】
ヒトシミ組織の（蛍光）顕微鏡写真を図２示す。図２において、左側の顕微鏡写真は、ヒトシミ組織の明視野像、右側の写真は、蛍光染色像である。図２の明視野像及び蛍光染色像において白丸部分は、それぞれメラニン量に差異が認められる部位を表す。図２の明視野像の各白丸部分における色調の違いにより、右の白丸部分は、メラニン量が少ない皮膚部位であること、左の白丸部分は、メラニン量が多い皮膚部位であることが分かる。また、図２の蛍光染色像により、右の白丸部分は、左の白丸部分と比較し蛍光強度が弱く、インテグリンβ４蛋白発現量が低いことが分かる。また、図２の明視野像及び蛍光染色像を比較検討することにより、メラニン量が多い皮膚部位においては、角化細胞のインテグリンβ４蛋白発現量が高いことが分かる。このため、メラニン量が多い皮膚部位においては、角化細胞の細胞接着性が亢進していると考えられる。
【００４８】
＜試験例３：  ヒト正常角化細胞の細胞接着促進因子添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化に関する検討＞
以下の手順に従い、ヒト正常角化細胞における細胞接着促進因子添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化に関する検討を行った。尚、細胞接着促進因子としては、メラニン又は脂化メラニンを用いた。ケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い、新生児ヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）を１．０×１０５（cells/well）の密度で２４穴プレートに播種した。翌日、１０（w／v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度１．５×１０−３（w/v％））含有ジメチルスルホキシド溶液、又はジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度１．５×１０−２（w/v％））を添加したKG−２培地（１．０mL/well）に培地交換した。メラニン添加２４時間後、QIAGEN  RNeasy  Mini  Kit（QIAGEN社）のRLT  bufferにて細胞を回収し、インテグリンα６及びβ４mRNA発現量を解析した。インテグリンα６及びβ４mRNA発現量は、β−actinを内在性コントロールとして比較CT法により算出し、メラニン又は脂化メラニン非添加の角化細胞におけるインテグリンα６又はβ４mRNA発現量を「１」とした場合の相対値で示した。また、本試験に用いた脂化メラニンは、前述の製造例１及び製造例２に記載の手順に従い、角化細胞の細胞接着促進因子の脂化メラニン懸濁液を調整した後、前記の試験手順に従い、脂化メラニン添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量を測定した。尚、脂化メラニンの添加濃度は、培地１（mL）に対し、０．５（w／v％）の脂化メラニン懸濁液を１０（μL）添加した濃度（最終濃度５×１０−３（w／v％））であった。
【００４９】
結果を図３（メラニン添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化）及び図４（脂化メラニン添加によるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量変化）に示す。また、図３及び図４の縦軸は、メラニン又は脂化メラニン非添加の角化細胞におけるインテグリンα６又はβ４mRNA発現量を「１」とした場合のインテグリンα６及びβ４mRNA発現量の比率で表示されている。図３及び図４の結果より、メラニン又は脂化メラニン非添加の角化細胞におけるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量に比較し、メラニン又は脂化メラニン添加の角化細胞におけるインテグリンα６及びβ４mRNA発現量は顕著に増加していた。このことは、メラニン量又は脂化メラニン添加により角化細胞のインテグリンα６及びβ４mRNA発現量が増加し、角化細胞の細胞接着性が亢進していることを示唆している。
【００５０】
＜試験例４：  ヒト正常角化細胞における細胞接着促進因子添加によるインテグリンα６β４蛋白発現量変化に関する検討＞
以下の手順に従い、ヒト正常角化細胞における細胞接着因子添加によるインテグリンα６及び／又はβ４蛋白発現量変化に関する検討を行った。尚、細胞接着促進因子としては、メラニン又は脂化メラニンを用いた。８ウェルカルチャースライド（ファルコン社）にケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用いヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）を２．０×１０４（cells／well）の密度で播種した。翌日、１０（w／v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：１．５×１０−３（w／v％））含有ジメチルスルホキシド溶液、又はジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度１．５×１０−２（w／v％））を添加したKG−２培地（０．３５mL／ウェル）に培地交換した。メラニン添加２４時間後、PBS（タカラバイオ株式会社）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）により固定後、３％BSA含有PBSで室温、１時間インキュベートして非特異的反応のブロッキングを行った。１％BSA含有PBSで３０（mg／mL）に調整した一次抗体（インテグリンα６：Anti-human Integrin alpha ６ antibody（Mouse monoclonal）（abcam、商品番号：ab２０１４２）、インテグリンβ４：Anti-human Integrin beta ４ antibody（Mouse monoclonal）（abcam、商品番号：ab７８２６７））を試料に滴下し、室温で１時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、１％BSA含有PBSで２００倍希釈した二次抗体（インテグリンα６及びβ４共通：Alexa Fluor ５５５ Goat Anti-mouse IgG（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、商品番号：A-２１４２２））を試料に滴下した。室温で４５分間インキュベートした後、PBSにて洗浄し、水系封入剤（Fluoromount； Diagostic BioSystems、 Cat. No. K０２４）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００５１】
結果を図５に示す。尚、図５の左側（縦横各２枚の計４枚）は、インテグリンα６蛋白発現量に関する検討結果を、右側（縦横各２枚の計４枚）は、インテグリンβ４蛋白発現量に関する検討結果を示す。インテグリンα６蛋白発現量の検討結果において、左側上下の明視野像を比較した場合、メラニン添加により色調の濃い部分が認められ、角化細胞にメラニンが蓄積していることが分かった。また、明視野像及び蛍光染色像を比較することにより、明視野像の色調が濃く（暗く）メラニン量が高い部位においては、蛍光染色像の蛍光発色による色調も濃く（赤色が濃い）、インテグリンα６蛋白発現量が高いことが確認された。即ち、メラニン量が多い部位においては、インテグリンα６蛋白発現量が増加していることが分かる。一方、図５の右側のインテグリンβ４蛋白発現量に関する検討結果に関しても前記のインテグリンα６蛋白発現量と同様の結果が得られた。即ち、明視野像の色調が濃い（暗い）メラニン量が多い部位においては、蛍光染色像の蛍光発色による色調も濃く（赤色が濃く）、インテグリンβ４蛋白発現量が増加していることが確認された。この様に、明視野像及び蛍光染色像を比較することによりメラニン量が多い部位では、インテグリンα６及びβ４蛋白発現量が増加し、角化細胞の細胞接着能が向上していることが分かった。
【００５２】
＜試験例５：  ヒト正常角化細胞の細胞接着促進因子添加による基底膜に対する角化細胞の接着性に関する検討＞
以下の手順に従い、ヒト正常角化細胞における細胞接着促進因子添加による基底膜に対する角化細胞の接着性（詳しくは、ラミニン−５に対する角化細胞の接着性）に関する検討を行った。尚、細胞接着促進因子としては、メラニンを用いた。７５（cm２）のフラスコにケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い播種したヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）をサブコンフルエントの状態とし、翌日、１．０（w/v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：６．０×１０−４（w/v％））含有ジメチルスルホキシド溶液、又はジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度６．０×１０−２（w/v％））を添加したKG−２培地（１０mL/フラスコ）に培地交換した。メラニン添加２４時間後、トリプシン処理により細胞を回収し、３．０×１０４（cells/well）の密度にてラミニン−５コートウェルへ播種した。翌日、１．８（mM）Ca２＋含有KG−２培地に交換した。培地交換２４時間後に、PBS（タカラバイオ株式会社）により洗浄し、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）により固定後、核染色剤のHoechst３３３４２（同仁化学研究所）にて蛍光染色し、蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer、 Wallac ARVO SX１４２０）により接着細胞数の割合を算出した。尚、接着細胞数の割合は、蛍光プレートリーダー（株式会社パーキンエルマージャパン）で蛍光強度を測定し（励起波長：３５５nm、蛍光波長：４６０nm）、メラニン非添加群の蛍光強度を「１」とし、メラニン添加時の蛍光強度をその割合として算出することにより接着細胞数の割合（細胞接着性比）とした。また、前記ラミニン−５コートウェルは、９６穴マルチウェルプレート（ファルコン社）を用意し、各ウェルにラミニン−５（株式会社リプロセル、カタログ番号：RCHEOT００４）含有PBS（１０μg/mL）を２７（μL/well）添加し、２時間、３７℃にて静置した後、PBS（タカラバイオ株式会社）にて洗浄し、その後、０．１％BSA（タカラバイオ株式会社）含有PBSを１００（μL／well）添加し３０分間室温にて静置することにより作製した。
【００５３】
結果を図６に示す。図６の縦軸は、細胞接着性比を表す。図６の結果より、メラニン（細胞接着促進因子）を添加することにより、接着細胞数の割合は増加し、基底膜の構成成分であるラミニン−５に対する角化細胞の接着性が高まることが確認された。このことは、メラニン量が高くなることにより、基底膜の構成成分であるラミニン−５に対する角化細胞の接着性が亢進し、角化細胞の細胞接着能が向上していることを示している。
【００５４】
＜試験例６：  ヒト正常角化細胞における細胞接着促進因子添加による角化細胞の上層移動に関する検討＞
以下の手順に従い、ヒト正常角化細胞の細胞接着促進因子添加による角化細胞の上層移動能に関する検討を行った。尚、細胞接着促進因子としては、メラニンを用いた。培養表皮細胞は、細胞密度がコンフルエントな状態でカルシウムスイッチを行うことにより、１２時間後から細胞が上層移動を開始することが報告されている。このため、その細胞数をカウントすることにより上層移動能を定量評価することが出来る（Mol Biol Cell．，２００９ Jan，２０（１）：４５２−６４）。７５（cm２）のフラスコにケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い播種したヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）をサブコンフルエントの状態とし、翌日、１．０（w/v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度６．０×１０−４（w／v％））含有ジメチルスルホキシド溶液、又はジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度６．０×１０−２（w／v％））を添加したKG−２培地（１０mL／フラスコ）に培地交換した。メラニン添加２４時間後、トリプシン処理により細胞を回収し、１．５×１０５（cells／well）の密度にてラミニン−５コートウェル（８ウェルカルチャースライド、ファルコン社）へ播種した。播種２４時間後にPBS（タカラバイオ株式会社）により洗浄し、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）により固定後、核染色剤のHoechst３３３４２（同仁化学研究所）にて蛍光染色し、PBSにて洗浄した。水系封入剤（Fluoromount； Diagostic BioSystems、 Cat. No. K０２４）にて封入後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて最下層から一層上層の写真を撮影し、画像解析ソフトImageJ（アメリカ国立衛生研究所）を用いて核の数を測定することにより、角化細胞の最下層より上層の角化細胞数を求めた。
【００５５】
角化細胞をカルシウムスイッチによる培養条件下おいて培養したところ、角化細胞の上層移動が確認された（データは、示していない）。ヒト正常角化細胞におけるメラニン（細胞接着促進因子）添加による角化細胞の上層移動能に関する結果を図７に示す。尚、図７の縦軸は、メラニン非添加群における角化細胞の最下層より上層の角化細胞数を「１」とした場合の角化細胞の最下層より上層の角化細胞数の比率（上層細胞数比）を表す。図７の結果より、細胞接着促進因子（メラニン）添加により角化細胞の上層移動が抑制されることが確認された。このことは、メラニン量が多い皮膚部位においては、角化細胞の細胞接着能が向上し、角化細胞の上層移動が抑制され、角化細胞のターンオーバーが障害されていることを示している。
【００５６】
＜本発明の美白剤を含有する美白用組成物及びその製造方法＞
前述の通り、本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を指標とする美白剤のスクリーニング方法により新規な作用機序を有する美白剤が精度よく効率的に選択することが出来る。また、本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を有する成分は、新規な作用機序を有する美白剤として有用であり、組成物に含有することにより、日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着症状を予防又は改善効果（美白効果）を発揮する。このため、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する成分をスクリーニングする方法は、優れた美白剤を選択するために活用することが出来る。本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択される美白剤を含有する美白用組成物（以下、「本発明の美白用組成物」と略す場合がある。）、及び本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択された美白剤を美白用組成物に配合する工程を含む美白用組成物の製造方法（以下、「本発明の美白用組成物の製造方法」と略す場合がある。）も、本発明の一態様である。以下、本発明の美白用組成物及び本発明の美白用組成物の製造方法について詳細に説明する。
【００５７】
本発明の美白剤は、単純な化学物質、動植物由来の抽出物等の混合組成物等の何れであってもよい。動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。植物由来の抽出物は、自生若しくは育成された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物（丸善製薬株式会社等）が好適に例示出来る。抽出操作は、植物部位は全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用すること出来、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ルなどのアルコ−ル類、１，３−ブタンジオ−ル、ポリプロピレングリコ−ルなどの多価アルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエ−テル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィ−等で分画精製する方法が挙げられる。
【００５８】
本発明の美白用組成物及び美白用組成物の製造方法は、前述した本発明の美白剤のスクリーニング方法によって選択された美白剤を含有する（配合する）ものであれば、美白剤の含有量（配合量）やその他の構成については特に限定されず、調製方法も特に限定されない。但し、本発明の美白用組成物における美白剤の含有量（配合量）は、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％である。これは、本発明の美白剤の含有量（配合量）が少なすぎると、目的とする効果が低下する傾向にあり、多すぎても効果が頭打ちになる傾向があり、この系の自由度を損なう場合があるためである。また、本発明の美白用組成物に含有させる美白剤の種類は、１種類に限定されず、２種類以上を選択し含有させてもよい。
【００５９】
本発明の美白用組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコール、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコ−ル類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
【００６０】
本発明の美白用組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などが好適に例示出来、日常的に摂取可能であることから、食品、化粧品等に適応することが好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与等の何れも投与経路も可能であるが、皮膚における美白効果を期待する場合には、皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用することが好ましい。
【００６１】
本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択された美白剤は、化粧料等に配合し美白用化粧料として活用することが出来る。また、本発明の美白剤は角化細胞の細胞接着抑制作用を有するため、かかる作用を基に、美白用以外の用途として、癌転移抑制剤、血小板凝集抑制剤、創傷治癒剤、動脈硬化抑制剤等に利用することも出来る。さらに、角化細胞の細胞接着抑制作用による角化細胞のターンオーバーを正常化することにより、シワ改善等の抗老化作用、肌荒れ予防又は改善等が期待出来る。
【００６２】
本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤としては、ミカン科ミカン属ユズ、キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミ（アーティチョーク）より得られる植物抽出物が好適に例示出来る。また、後述する実施例に記載のスクリーニング方法に用いた植物抽出物は、一丸ファルコス株式会社より購入した植物抽出物を使用した。ミカン科ミカン属ユズは、中国を原産地とし、日本においては、東北以南で広く栽培されている柑橘類の常緑小高木である。また、ユズの果汁は、日本料理等の調味料として食用に使用されるほか、血行促進作用等が知られている。ミカン科ミカン属ユズより得られる植物抽出物の内、好ましいものとしては、一丸ファルコス株式会社より購入出来るミカン科ミカン属ユズより得られる植物抽出物（商品名：ユズセラミドＢ）が好適に挙げられる。また、キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミ（アーティチョーク）は、地中海沿岸を原産地とする多年草である。キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミは、日本においては主に観賞用として栽培されるほか、一部、食用として利用される。キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物の内、好ましいものとしては、一丸ファルコス株式会社より購入出来るキク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物（商品名：バイオベネフィティ）が好適に挙げられる。
【００６３】
以下に、本発明に関し、実施例を挙げ更に詳しく説明を加えるが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００６４】
＜試験例７：  本発明の美白剤のスクリーニング方法１＞
下記に記載の試験方法に従い、本発明の美白剤のスクリーニングを実施した。尚、本スクリーニング方法において比較される角化細胞の細胞接着抑制作用は、インテグリンα６mRNA発現抑制作用である。また、細胞接着促進因子としては、メラニンを用いた。ケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い、新生児ヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）を１．０×１０５（cells/well）の密度で２４穴プレートに播種した。翌日、ジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度：１．５×１０−２（w／v％）、１０（w／v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：１．５×１０−３（w/v％））含有ジメチルスルホキシド溶液、１０（w／v％）メラニン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：１．５×１０−３（w/v％））含有ジメチルスルホキシド溶液及び被験物質（最終濃度：１×１０−２v/ｖ％）（メラニン添加及び被験物質添加群）を添加したKG−２培地（１．０mL/well）に培地交換した。メラニン添加２４時間後、QIAGEN  RNeasy  Mini  Kit（QIAGEN社）のRLT bufferにて細胞を回収し、インテグリンα６mRNA発現量を解析した。尚、被験物質には、一丸ファルコス株式会社より購入したミカン科ミカン属ユズより得られる植物抽出物（商品名：ユズセラミドB）、キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミ（アーティチョーク）より得られる植物抽出物（商品名：バイオベネフィティ）を使用した。また、インテグリンα６mRNA発現量は、β−actinを内在性コントロールとして比較CT法により算出し、メラニン添加群のインテグリンα６mRNA発現量を「１」とした場合の比率として表示した。
【００６５】
結果を図８に示す。図８の縦軸は、メラニン添加群のインテグリンα６mRNA発現量を「１」とした場合の比率として表示した。図８の結果より、細胞接着促進因子（メラニン）の添加によりインテグリンα６mRNA発現量は増加し、スクリーニング系が成立していることが確認された。さらに、被験物質のミカン科ミカン属ユズ又はキク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、細胞接着促進因子の添加により増加したインテグリンα６mRNA発現量を顕著に低下させた。図８の結果によれば、ミカン科ミカン属ユズ又はキク科ショウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、角化細胞のインテグリンα６mRNA発現抑制作用（コントロール群に比較し２０％以上のインテグリンα６mRNA発現量の低下）を示し、角化細胞の細胞接着抑制作用を有することが明らかとなった。このため、ミカン科ミカン属ユズ又はキク科ショウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、本発明の美白剤として選択することが出来る。
【実施例２】
【００６６】
＜試験例８：  本発明の美白剤のスクリーニング方法２＞
下記に記載の試験方法に従い、本発明の美白剤のスクリーニングを実施した。尚、本スクリーニング方法において比較される角化細胞の細胞接着抑制作用は、ラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用である。また、細胞接着促進因子としては、メラニンを用いた。７５（cm２）のフラスコにケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い播種したヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）をサブコンフルエントの状態とし、トリプシン処理により細胞を回収した後、２５（cm２）のフラスコに７．５×１０５（cells/フラスコ）の密度で播種した。翌日、ジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度：６．０×１０−２（w/v％））、１．０（w／v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度６．０×１０−４（w/v％））、１．０（w／v％）メラニン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度６．０×１０−４（w/v％）及び被験物質（最終濃度：１．０×１０−２（v/v％））（メラニン添加及び被験物質添加群）を含有するKG−２培地（３．３mL／フラスコ）に交換し、２４時間後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を３×１０４（cells/ウェル）の密度にてラミニン−５コートウェル（調製方法に関しては、製造例１及び２を参照）へ播種し、１時間後、PBS（タカラバイオ株式会社）により洗浄した。４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）により固定後、核染色剤のHoechst３３３４２（同仁化学研究所）にて蛍光染色し、蛍光プレートリーダー（Perkin  Elmer、Wallac  ARVO  SX１４２０）により接着細胞数の割合を算出した。尚、接着細胞数の割合は、蛍光プレートリーダー（株式会社パーキンエルマージャパン）で蛍光強度を測定し（励起波長：３５５nm、蛍光波長：４６０nm）、メラニン非添加群の蛍光強度を「１」とした場合の、メラニン添加時、メラニン及び被験物質添加時の蛍光強度をその割合として算出することにより接着細胞数の割合（細胞接着性比）とした。
【００６７】
結果を図９に示す。図９の縦軸は、メラニン非添加群の蛍光強度を「１」とした場合の、メラニン及び被験物質添加の蛍光強度をその割合として算出することにより接着細胞数の割合（細胞接着性比）として表示した。図９の結果より、メラニン添加によりラミニン−５に対する角化細胞の接着性（細胞接着性比）は高まり、本試験系が成立していることが確認された。また、被験物質のミカン科ミカン属ユズ及びキク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、メラニン添加により亢進したラミニン−５に対する角化細胞の接着性を顕著に低下させた。図９の結果によれば、ミカン科ミカン属ユズ又はキク科ショウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、ラミニン−５に対する角化細胞の接着抑制作用を示し、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する。このため、前記の被験物質は、本発明の美白剤として選択することが出来る。
【実施例３】
【００６８】
＜試験例９：  本発明の美白剤のスクリーニング方法３＞
下記に記載の試験方法に従い、本発明の美白剤のスクリーニングを実施した。尚、本スクリーニング方法において比較される細胞接着抑制作用は、角化細胞の上層移動促進作用である。また、細胞接着促進因子としては、メラニンを用いた。７５（cm２）のフラスコにケラチノサイト増殖用培地（Humedia−KG２、以下、KG−２培地、倉敷紡績株式会社）を用い播種したヒト正常ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）をサブコンフルエントの状態とし、トリプシン処理により細胞を回収した後、２５（cm２）のフラスコに７．５×１０５（cells/フラスコ）の密度で播種した。翌日、ジメチルスルホキシド（メラニン非添加群、和光純薬工業株式会社、最終濃度：６．０×１０−２（w／v％））、１．０（w／v％）メラニン（メラニン添加群、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：６．０×１０−４（w/v％））、１．０（w／v％）メラニン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、最終濃度：６．０×１０−４（w/v％））及び被験物質（最終濃度：１．０×１０−２（v/v％））（メラニン添加及び被験物質添加群）を含有するKG−２培地（３．３mL／フラスコ）に交換し、２４時間後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、１．５×１０５（cells/ウェル）の密度にてラミニン−５コートウェル（８ウェルチャンバースライド、調製方法に関しては、製造例１及び２参照）へ播種した。翌日、１．８（mM Ca２＋）含有KG−２培地に交換した。培地交換２４時間後、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）により固定し、核染色剤のHoechst３３３４２（同仁化学研究所）により核を蛍光染色、PBSにて洗浄した。水系封入剤（Fluoromount； Diagostic BioSystems、 Cat. No. K０２４）にて封入後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて最下層から一層上層の写真を撮影し、画像解析ソフトImageJ（アメリカ国立衛生研究所）を用いて核の数を測定することにより、角化細胞の最下層より上層の角化細胞数を求めた。
【００６９】
結果を図１０に示す。尚、図１０の縦軸は、メラニン非添加群の角化細胞の最下層より上層の角化細胞数を「１」とした場合の比率として表す。図１０の結果によれば、メラニン添加により角化細胞の最下層より上層の角化細胞数は減少し、本スクリーニング系が成立していることが確認された。さらに、被験物質のミカン科ミカン属ユズ又はキク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、メラニン添加により減少した角化細胞の最下層より上層の角化細胞数を顕著に増加させた。図１０の結果によれば、ミカン科ミカン属ユズ又はキク科ショウセンアザミ属チョウセンアザミより得られる植物抽出物は、角化細胞の上層移動促進作用を示し、角化細胞の細胞接着抑制作用を有する。このため、前記の被験物質は、本発明の美白剤として選択することが出来る。
【実施例４】
【００７０】
＜本発明の美白剤を含有する美白用組成物の製造方法１（皮膚外用剤）＞
以下の手順に従い、本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択された美白剤を含有する美白用組成物（皮膚外用剤）を作製した。即ち、表２の処方成分（A）に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分（Ｂ）に記載された各成分を室温下に溶解し、（B）を（A）に記載された処方成分の混合物に加え可溶化し、本発明の美白剤を含有する美白用組成物（皮膚外用剤）を作製した。尚、表２の処方成分中、「本発明の美白剤」としては、ミカン科ミカン属ユズより得られる植物抽出物（皮膚外用剤１）、キク科チョウセンアザミ属チョウセンアザミ（アーティチョーク）より得られる植物抽出物（皮膚外用剤２）を使用した。また、表２の処方成分中、「本発明の美白剤」を「水」に置換した比較例１も作製した。
【００７１】
【表２】
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【実施例５】
【００７２】
＜本発明の美白用組成物の美白効果試験＞
実施例４に記載の方法に従い製造された本発明の美白用組成物（皮膚外用剤１及び２）及び比較例１に関し、以下の手順に従い色素沈着抑制作用を評価した。自由意思で参加したパネラ−の上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を合計４ケ所設けた。設けた部位に最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を１日１回、３日連続して３回照射した。試験１日目の紫外線照射終了時（一回目照射終了後）より、１日２回３５日連続して皮膚外用剤１及び２、比較例１を５０μL塗布した。４部位のうち１部位は無処置部位とした。３５回の塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ-３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、処理部位のＬ＊と無処理部位Ｌ＊の差（ΔＬ＊＝処理部位のＬ＊−無処理部位Ｌ＊）を算出した。Ｌ＊値は、色素沈着の程度が強いほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きいほど、色素沈着が改善されたと判断することが出来る。結果を表３に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤１及び２は、比較例１に比べ高い値を示し、優れた色素沈着改善効果（美白効果）を有することが分かる。これは、皮膚外用剤１及び２に含有される本発明の角化細胞の細胞接着抑制作用を有する美白剤による美白効果である。
【００７３】
【表３】
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【実施例６】
【００７４】
＜本発明の美白剤を含有する美白用組成物の製造方法２（食品）＞
以下の手順に従い、本発明の美白剤のスクリーニング方法により選択された美白剤を含有する美白用組成物（食品）を作製した。即ち、表４に記載の処方成分を１０質量部の水と共に転動相造粒（不二パウダニル株式会社製「ニューマルメライザー」）し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。尚、表中の数値の単位は質量部を表す。
【００７５】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、食品、医薬品、化粧料等に応用出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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