(57)【要約】【課題】本発明の目的は、付着性細胞の生存率の低下、又は細胞の機能の低下を起こすことなく、分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する方法を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程を含む分子導入方法であって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が、多孔質体を含む分子導入方法によって、解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程を含む分子導入方法であって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が、多孔質体を含む分子導入方法。
【請求項２】
前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板であり、
（１）（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び
（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、
を含む、請求項１に記載の分子導入方法。
【請求項３】
前記細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板、そして前記電極用基板が硬質電極用基板であり、
（１）（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び
（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、
を含む、請求項１に記載の分子導入方法。
【請求項４】
前記硬質電極用基板が、プラスチック電極用基板、シリコン電極用基板又はガラス電極用基板である、請求項３に記載の分子導入方法。
【請求項５】
前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして前記細胞保持用基板が硬質細胞保持用基板であり、
（１）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び
（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、
を含む、請求項１に記載の分子導入方法。
【請求項６】
前記硬質細胞保持用基板が、プラスチック細胞保持基板、シリコン細胞保持基板、又はガラス細胞保持基板である、請求項５に記載の分子導入方法。
【請求項７】
前記多孔質体が、ゲルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子導入方法。
【請求項８】
前記ゲルが、ハイドロゲルである、請求項７に記載の分子導入方法。
【請求項９】
前記ハイドロゲルが、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、フィブリンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、ポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリNイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、及びポリスチレンスルホン酸ゲルからなる群から選択される１つ以上のハイドロゲルである、請求項８に記載の分子導入方法。
【請求項１０】
前記電極が、カーボン、酸化インジウムスズ、金、又は白金である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分子導入方法。
【請求項１１】
前記電極が、電極の表面に導電性高分子重合層を有する重合電極である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子導入方法。
【請求項１２】
前記導入される分子が、核酸、ペプチド、たんぱく質、又は薬剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子導入方法。
【請求項１３】
電極用基板上に電極が配設された基板電極体、及び細胞保持用基板若しくは細胞保持用基板の調製用試薬を含む、分子導入キットであって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が多孔質体を含む分子導入キット。
【請求項１４】
前記細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板であり、そして前記電極用基板が硬質電極用基板である、請求項１３に記載の分子導入キット。
【請求項１５】
前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして前記細胞保持用基板が硬質細胞保持用基板である、請求項１３に記載の分子導入キット。
【請求項１６】
前記多孔質体が、ゲルである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の分子導入キット。
【請求項１７】
前記ゲルが、ハイドロゲルである、請求項１６に記載の分子導入キット。
【請求項１８】
前記ハイドロゲルが、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、フィブリンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、及びポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリNイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、及びポリスチレンスルホン酸ゲルからなる群から選択される１つ以上のハイドロゲルである、請求項１７に記載の分子導入キット。
【請求項１９】
前記電極が、カーボン、酸化インジウムスズ、金又は白金である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の分子導入キット。
【請求項２０】
前記電極が、電極の表面に導電性高分子重合層を有する電極である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の分子導入キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子導入方法に関する。本発明によれば、付着性細胞の生存率を低下させることなく、ＤＮＡ又はＲＮＡなどを導入することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞にＤＮＡなどの分子を導入する方法には、リポフェクション法などの化学的方法、又は電気穿孔法（以下、エレクトロポレーションと称することがある）などの物理的方法がある。エレクトロポレーションは、細胞を含む懸濁液に対し、電気パルスをかけて細胞膜に一時的に小孔を形成することによって、分子導入を行う方法である。エレクトロポレーションは、物理的な手法であるためどのような細胞にも適用でき、操作が簡単であるという利点がある。一般的なエレクトロポレーションは、２本の平板電極が配置されたキュベットに、細胞懸濁液を入れて電場を印加する。従って、付着性細胞に分子を導入する場合には、細胞を基板から剥離して細胞懸濁液を調製し、細胞に電場を印加した後、再び基板上に播種して培養するという工程で行われる。しかしながら、細胞を剥離するためのトリプシンなどの酵素処理は、細胞膜や細胞膜表面にあるタンパク質および細胞骨格にダメージを与える。従って、エレクトロポレーション後の細胞の生存率の低下、又は細胞の機能への影響が問題となっている。
【０００３】
一方、付着性細胞を細胞基板から剥離せずに、培地を含む培養容器中で平行固定電極を用いてＤＮＡを導入する方法が行われていた。しかしながら、この方法はＤＮＡの導入効率が低く、効率的な方法ではなかった。付着性細胞に対して効率的に電場をかけるには、電極を細胞に出来るだけ近づける必要がある。従って、付着性細胞に対して剥離操作を必要としないin situエレクトロポレーションとして、電極上で付着性細胞を培養し、その電極によってエレクトロポレーションを行う方法（非特許文献１及び２）が開示されている。また、ポーラス膜を培養基板とし、その培養基板の上下に２本の平板電極を配置して、エレクトロポレーションを行う方法が開示されている（非特許文献３）。しかしながら、これらの方法は、細胞培養基板に電極パターンを作成することが煩雑であったり、また細胞の培養環境が特殊で、培養が困難であるという問題があった。更に、付着性細胞上に平面電極を近づけてエレクトロポレーションを行う方法も開示されている（非特許文献４及び５）。しかしながら、この方法は、電極を細胞に近づけるための制御が困難であり、汎用的ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「ラブ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）」(英国)２０１１年、第１１巻、ｐ．１６３
【非特許文献２】「ラブ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）」(英国)２００７年、第７巻、ｐ．８６
【非特許文献３】「センサー・アンド・アクチュエイターＢ（Sensor and ActuatorsB）」(蘭国)２００７年、第１２７巻、ｐ．５−１１
【非特許文献４】「アナリティカル・ケミストリー（Analytical chemistry）」（米国）２００７年、第７９巻、ｐ．４４１０
【非特許文献５】「ジャーナル・オブ・メンブラン・バイオロジー（Journal of Membrane Biology）」（米国）２０１２年、第２４５巻、ｐ．６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、付着性細胞の生存率の低下、又は細胞の機能の低下を起こすことなく、分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、付着性細胞への分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）の導入方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、付着性細胞を、多孔質体を含む細胞保持用基板に付着させた細胞保持体の細胞面と、基板電極体の電極面とを接触させ、エレクトロポレーションを行うことにより、付着性細胞の生存率を低下させることなく、分子導入ができることを見出した。或いは、多孔質体を含む基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に付着させた細胞保持体の細胞面とを接触させ、エレクトロポレーションを行うことにより、付着性細胞の生存率を低下させることなく、分子導入ができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程を含む分子導入方法であって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が、多孔質体を含む分子導入方法、
［２］前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板であり、（１）（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、を含む、［１］に記載の分子導入方法、
［３］前記細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板、そして前記電極用基板が硬質電極用基板であり、（１）（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、を含む、［１］又は［２］に記載の分子導入方法、
［４］前記硬質電極用基板が、プラスチック電極用基板、シリコン電極用基板又はガラス電極用基板である、［３］に記載の分子導入方法、
［５］前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして前記細胞保持用基板が硬質細胞保持用基板であり、（１）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、を含む、［１］に記載の分子導入方法、
［６］前記硬質細胞保持用基板が、プラスチック細胞保持基板、シリコン細胞保持基板、又はガラス細胞保持基板である、［５］に記載の分子導入方法、
［７］前記多孔質体が、ゲルである、［１］〜［６］のいずれかに記載の分子導入方法、
［８］前記ゲルが、ハイドロゲルである、［７］に記載の分子導入方法、
［９］前記ハイドロゲルが、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、フィブリンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、ポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリＮイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、及びポリスチレンスルホン酸ゲルからなる群から選択される１つ以上のハイドロゲルである、［８］に記載の分子導入方法、
［１０］前記電極が、カーボン、酸化インジウムスズ、金、又は白金である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分子導入方法、
［１１］前記電極が、電極の表面に導電性高分子重合層を有する重合電極である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分子導入方法、
［１２］前記導入される分子が、核酸、ペプチド、たんぱく質、又は薬剤である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の分子導入方法、
［１３］電極用基板上に電極が配設された基板電極体、及び細胞保持用基板若しくは細胞保持用基板の調製用試薬を含む、分子導入キットであって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が多孔質体を含む分子導入キット、
［１４］前記細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板であり、そして前記電極用基板が硬質電極用基板である、［１３］に記載の分子導入キット、
［１５］前記電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であり、そして前記細胞保持用基板が硬質細胞保持用基板である、［１３］に記載の分子導入キット、
［１６］前記多孔質体が、ゲルである、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の分子導入キット、
［１７］前記ゲルが、ハイドロゲルである、［１６］に記載の分子導入キット、
［１８］前記ハイドロゲルが、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、フィブリンゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、ポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリＮイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、及びポリスチレンスルホン酸ゲルからなる群から選択される１つ以上のハイドロゲルである、［１７］に記載の分子導入キット、
［１９］前記電極が、カーボン、酸化インジウムスズ、金又は白金である、［１３］〜［１８］のいずれかに記載の分子導入キット、及び
［２０］前記電極が、電極の表面に導電性高分子重合層を有する電極である、［１３］〜［１９］のいずれかに記載の分子導入キット、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の分子導入法によれば、生存率を低下させることなく、付着性細胞に分子導入することができる。また、ＤＮＡ溶液などに細胞を懸濁せず、細胞転写体と電極との接触面に、少量のＤＮＡ溶液などを存在させることによって、エレクトロポレーションが可能である。従って、少量のＤＮＡでエレクトロポレーションを行うことができる。更に、電極表面に導電性高分子重合層を有する電極体を用いることにより、電極付近の気泡の発生及びｐＨの変化を防ぐことができ、細胞の生存率を上昇させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】付着性細胞の細胞培養基板から多孔質細胞保持基板（ハイドロゲル）への転写を模式的に示した図である。
【図２】転写された細胞の写真（Ａ及びＢ）、及び転写された細胞の模式図（Ｃ）である。
【図３】参考例１で得られたポリアクリルアミドゲルと金電極による多孔質基板電極体（ａ）、及びアガロースと金電極による多孔質基板電極体（ｂ）の写真である。
【図４】多孔質基板電極体及び多孔質細胞保持体を用いるエレクトロポレーションの模式図（Ａ及びＢ）及び写真（Ｃ）、並びに電極間の細胞の拡大写真（Ｄ）、細胞内に取り込まれたＰＩの蛍光を示した写真（Ｅ）、及びＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを生細胞に取り込ませ，ＰＩ由来の赤色蛍光と，Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ由来の緑色蛍光を同時に観察した蛍光写真（Ｆ）である。
【図５】電極面に導電性高分子重合層が付与された多孔質基板重合電極体の製造方法の模式図（Ａ）及び得られた多孔質基板重合電極体（Ｂ）の写真である。
【図６】多孔質基板重合電極体を用いた多孔質細胞保持体を用いるエレクトロポレーションの模式図（Ａ及びＢ）、及び電極間の細胞の拡大写真（Ｃ）、細胞内に取り込まれたＰＩの蛍光を示した写真（Ｄ）、及びＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを生細胞に取り込ませ，ＰＩ由来の赤色蛍光と，Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ由来の緑色蛍光を同時に観察した蛍光写真（Ｅ）である。
【図７】ＧＦＰの発現ベクターであるｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１ベクターを、本発明の方法により細胞へ導入したグレースケール（Ａ）及び蛍光顕微鏡（Ｂ）の写真である。
【図８】多孔質基板電極体を用いたヒトｉＰＳ細胞へのエレクトロポレーションの模式図である。
【図９】実施例４において、ヒトｉＰＳ細胞に、アガロースゲル基板電極体を用いて、ＰＩをエレクトロポレーションした場合の、グレースケールの写真（ａ）、ｉＰＳ細胞の転写の模式図（ｂ）、細胞内に取り込まれたＰＩの蛍光を示した写真（ｃ）、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液による生細胞の写真（ｄ）を示した図である、また、（ｅ）は、実施例５において、ヒトｉＰＳ細胞に、アガロースゲル基板電極体を用いて、ＧＦＰベクターを導入した場合のＧＦＰが発現した細胞を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１］分子導入方法
本発明の分子導入法は、電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程を含む分子導入方法であって、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が、多孔質体を含む。
本発明の分子導入法においては、電極用基板が多孔質体を含む多孔質電極用基板であるか、細胞保持用基板が多孔質体を含む多孔質細胞保持用基板であるか、又はその両方が多孔質体を含む多孔質電極用基板及び多孔質細胞保持用基板であることによって、基板電極体の電極面と細胞保持体の細胞面との接触面が、緊密に密着する。すなわち、基板電極体の電極面、細胞保持体の細胞面、又はその両方の面が柔軟性を有しているために、接触面が緊密に密着することができる。本発明の分子導入法においては、接触面にＤＮＡなどの導入分子を存在させるため、接触面が緊密に密着することによって、付着生細胞に効率よく分子を導入することができる。
【００１０】
本発明の分子導入方法は、
（Ａ）電極用基板が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質電極用基板であり、そして細胞保持用基板が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質細胞保持用基板の組み合わせ、
（Ｂ）電極用基板が硬質電極用基板であり、そして細胞保持用基板が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質細胞保持用基板の組み合わせ、
（Ｃ）電極用基板が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質電極用基板であり、そして細胞保持用基板が硬質細胞保持用基板の組み合わせ、
によって行うことができる。
【００１１】
前記組み合わせ（Ａ）又は（Ｂ）の場合、（１）（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、によって分子導入を行うことができる。
前記組み合わせ（Ｃ）の場合、（１）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって、細胞保持体を得る工程、及び（２）電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入する工程、によって分子導入を行うことができる。
すなわち、前記組み合わせ（Ａ）又は（Ｂ）の場合、工程（１）の細胞保持体は、（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写することによって、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養することによって得ることが可能であり、組み合わせ（Ｃ）の場合、細胞保持体は、細胞保持用基板上で細胞を培養することによって得ることが可能である。また、組み合わせ（Ａ）〜（Ｃ）の場合、導入工程（２）は、電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入することによって行うことができる。
【００１２】
（１）細胞保持体取得工程
細胞保持体取得工程は、細胞保持用基板が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質細胞保持用基板の場合、（ａ）細胞培養基板に付着した細胞を細胞保持用基板に転写する方法（以下、転写法と称することがある）、又は（ｂ）細胞保持用基板上で細胞を培養する方法（以下、培養法と称することがある）によって行うことができる。また、細胞保持用基板が、硬質細胞保持用基板である場合、細胞保持体取得工程は、培養法によって行うことができる。
【００１３】
《転写法》
転写法によれば、付着性細胞を多孔質細胞保持用基板に転写を用いて付着させることによって、多孔質細胞保持体を得ることができる。付着性細胞は、限定されるものではないが、細胞培養基板を用いて培養されることによって、細胞培養基板に付着している細胞が好ましい。
【００１４】
多孔質細胞保持基板に用いる多孔質は、柔軟性を有するものである限りにおいて、限定されるものではないが、生体親和性に優れたものが好ましく、例えばゲルを挙げることができ、特にはハイドロゲルが好ましい。
ハイドロゲルは、三次元網目構造中に溶媒として水を保持したゲルであり、非常に優れた吸水性を示す。天然又は合成を問わずゲルのほとんどが水を包含するので、通常ゲルといえばハイドロゲルを意味する。また、角膜、水晶体、硝子体、筋肉、血管、神経軸索、又は軟骨など、生体を構成する軟組織のほとんどは生体高分子の網目構造に６０〜８０％の水分を含む典型的なハイドロゲルである。更に、骨や歯などの硬組織に関しても、それ自体はハイドロゲルではないが、無機物であるハイドロキシアパタイトの隙間にコラーゲンなどのゲル状物質が充填された構造をとっていることが多い。従って、ハイドロゲルには生体由来のものや生体適合性に優れたものが数多く存在する。
ハイドロゲルとしては、特に限定されるものではないが、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリアクリルアミドゲル、フィブリンゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、ポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリＮイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、ポリスチレンスルホン酸ゲル又はこれらの２つ以上の混合物を挙げることができるが、特にはフィブリンゲル、アガロースゲル、又はコラーゲンゲルが、細胞親和性の点で好ましい。
多孔質体の含水率は、特に限定されるものではないが、６０〜９９．５％が好ましく、より好ましくは７０〜９９質量％であり、更に好ましくは８０〜９９質量％である。
【００１５】
付着性細胞の細胞培養基板から多孔質細胞保持基板への転写は、限定されるものではないが、例えば図１に示したように行うことができる。以下に、簡単に説明する。
ディッシュ等で適当な培地を用いて細胞を、例えば７０％〜１００％コンフルエントになるまで培養する。培地を除去し、ハイドロゲルの原料（例えば、フィブリノーゲン、アプロチニン、及びトロンビンを含んだ培地）をディッシュに添加する。ゲルが固化することにより、ゲルに細胞が付着する。ゲルをディッシュから剥離することにより、細胞の付着した多孔質細胞保持体を得ることができる。
【００１６】
多孔質体のゲル化は、公知の方法に従って、行うことができる。すなわち、それぞれの材料のゲル化方法に従って行うことができる。以下に、代表的な材料のゲル化方法の例を示す。
【００１７】
（アガロース）
アガロースは、例えば１００℃で、２．８重量％程度の濃度で緩衝液（例えば、培地）に溶解し、得られたゾルを冷却することによって、４０℃程度でゲル化することができる。
【００１８】
（グルコマンナン）
グルコマンナンは、２価の金属イオンを加えることで。配位結合で架橋されゲル化する。従って、例えばグルコマンナン粉末を１．５重量％程度で水又は培地に溶解させる。１０重量％のＮａ２ＣＯ３水溶液を、４．５重量％添加し、素早くかき混ぜ、枠に流し込む。８５℃で２時間加熱することによって、グルコマンナンゲルを得ることができる。
【００１９】
（ポリビニルアルコール）
ポリビニルアルコール粉末を、加熱した蒸留水又は培地に加えて溶解し、１０重量％の水溶液とする。その水溶液に３重量％となるようにグルタルアルデヒドを加えて十分に撹拌する。１、５００ｒｐｍで３分間遠心し脱泡する。１ＭのＨＣｌ水溶液を１：５０の割合で加えて素早く撹拌し、枠に流しこみ、１２時間静置することによってゲル化することができる。
【００２０】
（ポリアクリルアミド）
蒸留水にアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドをそれぞれ５００ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬになるように添加し、５０％（ｗ／ｖ）のモノマーストック溶液を調整する。ストック溶液を培地などで１０倍に希釈し、ＡＰＳ及びＴＥＭＥＤを、それぞれ０．４容量％及び０．１容量％になるように添加してよく混合する。枠に流し込み，室温で２時間静置することによりゲル化することができる。
【００２１】
（フィブリン）
フィブリノーゲンを任意の溶媒（水、培地、ＰＢＳ等）に加え、３０ｍｇ／ｍＬの溶液とする。トロンビンを任意の溶媒（水、培地、ＰＢＳ等）に加え、２０Ｕｎｉｔｓ／ｍＬの溶液とする。枠に等量ずつ流し込み、３７℃で２〜４時間インキュベートすることによって、ゲル化することができる。
【００２２】
これらの多孔質体原料を付着性細胞の付着した細胞培養基板上で、ゲル化することによって、多孔質細胞保持体を得ることができる。
【００２３】
更に、図１の方法以外にも、転写は以下のように行うことができる。細胞を、ディッシュ等で適当な培地を用いて、例えば７０％〜１００％コンフルエントになるまで培養する。前記のハイドロゲルの原料から、多孔質細胞保持基板を作製する。得られた多孔質細胞保持基板を、ディッシュ（シャーレ）又はプレートの細胞面と密着するように設置する。細胞が多孔質細胞保持基板に転写された後に、ディッシュ（シャーレ）又はプレートから剥離させることによって、多孔質細胞保持体を得ることができる。
【００２４】
細胞培養基板は、通常細胞の培養に用いられる付着性細胞が付着するものである限りにおいて限定されるものではない。素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、又はガラスを挙げることができる。また、形状としては、ディッシュ（シャーレ）、フラスコ、又はプレート（６ウェルプレート、１２ウェルプレート、又は２４ウェルプレートなど）を挙げることができるが、ディッシュ又はプレートが好ましい。
培養は、公知の方法を用いることが可能であり、細胞に合わせて、培養条件（培地、温度、時間、ＣＯ２濃度）を適宜、設定することができる。
【００２５】
《培養法》
培養法は、多孔質細胞保持基板上で付着性細胞を培養して、多孔質細胞保持体を得る方法、及び硬質細胞保持基板上で付着性細胞を培養して、硬質細胞保持体を得る方法がある。
【００２６】
（多孔質細胞保持体）
培養法の多孔質細胞保持体の取得方法によれば、付着性細胞を多孔質細胞保持用基板上で培養を用いて付着させることによって、多孔質細胞保持体を得ることができる。
多孔質細胞保持基板に用いる多孔質体は、前記転写法に用いる多孔質体と同じものを用いることができる。すなわち、多孔質体は、柔軟性を有するものである限りにおいて、限定されるものではないが、生体親和性に優れたものが好ましく、例えばゲルを挙げることができ、特にはハイドロゲルが好ましい。
例えば、ハイドロゲルの原料を用いて、多孔質細胞保持基板を作製し、多孔質細胞保持基板上で、付着性細胞を培養することによって、付着性細胞の付着した多孔質細胞保持体を得ることができる。
【００２７】
多孔質細胞保持体の作製の作製は、限定されるものではないが、例えば以下のように作製することができる。ディッシュ（シャーレ）、又はプレートにハイドロゲルの原料（例えば、フィブリノーゲン、アプロチニン、及びトロンビンを含んだ培地）を添加する。ゲルが固化することにより、多孔質細胞保持基板がディッシュ（シャーレ）又はプレート中に作製される。或いは、別に作製した多孔質細胞保持基板を、ディッシュ（シャーレ）又はプレートに設置してもよい。ディッシュ（シャーレ）又はプレートに細胞及び培地を添加し、細胞の培養条件に従って、培養を行う。細胞が増殖し、多孔質細胞保持基板の表面に付着する。ゲルをディッシュ（シャーレ）又はプレートから取り出し、細胞の付着した多孔質細胞保持体を得ることができる。
【００２８】
多孔質体のゲル化は、前記の「転写法」に記載のそれぞれの材料のゲル化方法に従って行うことができる。
【００２９】
（硬質細胞保持体）
培養法の硬質細胞保持体の取得方法によれば、付着性細胞を硬質細胞保持用基板上で培養によって付着させ、硬質細胞保持体を得ることができる。
硬質細胞保持用基板としては、付着性細胞の培養に用いることのできるものである限りにおいて、特に限定されるものではない。素材としては、熱可塑性樹脂又は熱硬化性樹脂などのプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、又はポリスチレン）、シリコン、又はガラスを挙げることができる。また、形状としては、ディッシュ（シャーレ）、フラスコ、又はプレート（６ウェルプレート、１２ウェルプレート、又は２４ウェルプレートなど）、細胞培養用のカバーグラス、又はカバーストリップを挙げることができるが、基板電極体と密着させるために、カバーグラス、又はカバーストリップの形状が好ましい。
培養は、公知の方法を用いることが可能であり、細胞に合わせて、培養条件（例えば、培地、温度、時間、ＣＯ２濃度）を適宜、設定することができる。
【００３０】
（２）導入工程
本発明の導入工程（２）においては、電極用基板上に電極が配設された基板電極体の電極面と、細胞保持用基板に細胞が付着した細胞保持体の細胞面とを接触させ、接触面に分子を存在させた状態で、前記分子を電気穿孔法により細胞に導入するものである。
本発明の導入工程（２）は、
（Ａ）基板電極体が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質基板電極体であり、そして細胞保持体が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質細胞保持体の組み合わせ、
（Ｂ）基板電極体が硬質基板電極体であり、そして細胞保持体が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質細胞保持体の組み合わせ、
（Ｃ）基板電極体が多孔質体を含む柔軟性のある多孔質基板電極体であり、そして細胞保持用基板が硬質細胞保持体の組み合わせ、
によって行うことができる。
接触面に分子を存在させる方法は、エレクトロポレーションを行うときに、接触面に分子が存在する限りにおいて、限定されるものではない。従って、接触面に分子を存在させる方法としては、例えば基板電極体の電極面と、細胞保持体の細胞面とを接触させる場合に、電極面又は接触面に分子を含む液を滴下（添加）してもよい。また、基板電極体の電極面と、細胞保持体の細胞面とを接触させた後に、注射針（注射器）又はピペットなどにより、接触面に分子を含む液を供給してもよい。更に、接触している基板電極体及び細胞保持体を、分子を含む液に浸漬することによって、接触面に分子を存在させてもよい。
【００３１】
《多孔質基板電極体》
基板電極体として多孔質基板電極体を用いることにより、細胞保持体が、多孔質細胞保持体であっても、又は硬質細胞保持用基板であっても、基板電極体の電極面と細胞保持体の細胞面との接触面が、緊密に密着する。
【００３２】
本発明に用いる多孔質基板電極体は、金属電極、又はカーボン電極が、電極基板である多孔質体に導電性高分子接着層によって接着しているものである。
多孔質基板電極体の導電体は、金属電極、又はカーボン電極が多孔質体によってサポートされており、電極及び多孔質体が、導電性高分子接着層により強固に接着されているものである。導電性高分子接着層の高分子重合体は、多孔質体の分子と強固に絡まり結合している。また、高分子重合体は電極上に電解析出しておりその結合は強固である。
【００３３】
（金属電極）
本発明の多孔質基板電極体に含まれる金属電極は、電極として用いることのできるものである限りにおいて、特に限定されるものではない。具体的には、金、白金、チタン、アルミニウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、又はタングステンを挙げることができるが、好ましくは、金、又は白金である。これらの金属は、安定で生体安全性に優れるからである。また、金はガラスを電極形成用基板として製造した場合、ガラス基板から剥離しやすい点で好ましい。
金属電極の導電率（σ（Ｓ／ｃｍ））は、限定されるものではないが、１０３〜１０６σ（Ｓ／ｃｍ）が好ましい。
【００３４】
（カーボン電極）
本発明の多孔質基板電極体に含まれるカーボン電極は、電極として用いることのできるものである限りにおいて、特に限定されるものではない。具体的には、グラフェンシート、カーボンナノチューブの凝集体、カーボン微粒子の凝集体、又はカーボン布を挙げることができる。
【００３５】
金属電極の電極パターンは、特に限定されるものではないが、例えば、図３に示した正極と負極とが交互に円形に配置された電極パターンは、細胞に遺伝子を導入するエレクトロポレーション用の電極のパターンとして、好適に用いることができる。
【００３６】
（多孔質体）
本発明の多孔質基板電極体に含まれる多孔質体は、前記多孔質細胞保持用基板に記載の多孔質体を用いることができる。すなわち、多孔質体は、柔軟性を有するものである限りにおいて、限定されるものではないが、生体親和性に優れたものが好ましく、例えばゲルを挙げることができ、特にはハイドロゲルが好ましい。
具体的には、ハイドロゲルとしては、アガロースゲル、コラーゲンゲル、グルコマンナンゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリアクリルアミドゲル、フィブリンゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、シリコーンハイドロゲル、ポリビニルピロリドンゲル、ポリエチレングリコールゲル、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、ポリＮイソプロピルアクリルアミドゲル、アクリル酸ゲル、ポリスチレンスルホン酸ゲル又はこれらの２つ以上の混合物を挙げることができる。例えば、ポリアクリルアミドゲル及びポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ゲルによるダブルネットワークゲルは強靭であるため大変形が可能である。
多孔質体は、本発明の効果が得られる限りにおいて、多孔質体を構成する材料以外の材料を含むことができる。具体的には、細胞、タンパク質（抗体、抗原、酵素、細胞成長因子など）、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、ペプチド分子、マイクロ・ナノ粒子、蛍光・りん光分子、酸化還元剤、等が挙げられる。例えば、細胞、タンパク質、ペプチド分子、核酸を含む多孔質体は、それらを薬剤とした薬剤投与システムとして利用できる。マイクロ・ナノ粒子は、それらを架橋点とすることで多孔質体を強靭化する。蛍光・りん光分子は、その化学応答性を利用し多孔質体にセンサ機能を付与するのに利用できる。また、酸化還元剤、酵素や抗体等のタンパク質は、その反応を利用した多孔質体の構造制御に利用できる。
多孔質体の含水率は、特に限定されるものではないが、５０〜９０％が好ましく、より好ましくは６０〜８０％である。
【００３７】
（導電性高分子接着層）
導電性高分子接着層は、前記金属電極、又はカーボン電極と、多孔質体とを結合させている層である。導電性高分子が電極から重合により多孔質体の内部に伸長することにより、前記電極と多孔質体とを強固に結合させている。
導電性高分子接着層に含まれる導電性高分子は、特に限定されるものではないが、ポリ（３，４エチレンジオキシチオフェン）（以下、ＰＥＤＯＴと称することがある）、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリビチオフェン、ポリイソチオフェン、ポリドデシルチオフェン、ポリイソナイトチオフェン、ポリ−３−ヘキシルチオフェン、ポリアニオン、ポリイソチアナフテン、ポリチアジル、ポリフェニレン、ポリフルオレン、ポリジアセチレン、ポリアセン、ポリパラフェニレン、ポリチエニレンビニレン、ポリフェニレスルフィド、又はその２つ以上の混合物を挙げることができ、好ましくはポリ（３，４エチレンジオキシチオフェン）、ポリピロールである。
【００３８】
例えば、前記ＰＥＤＯＴは、以下の式（１）で表される化合物である。
【化１】
2014193126.tif 000002
ＰＥＤＯＴは、ｔｈｉｏｐｈｅｎｅの３位と４位に電子供与性のアルコキシ鎖が導入されたモノマーから構成される導電性高分子である。ＰＥＤＯＴの重合度はそれほど大きくなく５〜１０くらいで、従って分子量も１０００〜２０００程度である。しかし、導電性は重合度の高いポリアニリンやポリピロールと比較して高いと言う性質を有している。
【００３９】
（導電性高分子重合層）
本発明の多孔質基板電極体は、電極表面に導電性高分子重合層を含んでもよい。導電性高分子重合層を有することによって、電極の分極が起こり難くなり、電気分解によるガス発生などが細胞や組織を傷害することを防ぐことができ、特にエレクトロポレーションにおいては、有効である。本明細書において、電極表面に導電性高分子重合層を有する多孔質基板電極体を「多孔質基板重合電極体」と称することがある。
本明細書において「電極表面」とは、電極が導電性高分子で接着されている導電性高分子接着層の反対側の面を意味する。
導電性高分子重合層に用いる導電性高分子は、前記の導電性高分子接着層に用いるものを、同様に用いることができ、具体的には、限定されるものではないが、ポリ（３，４エチレンジオキシチオフェン）、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリビチオフェン、ポリイソチオフェン、ポリドデシルチオフェン、ポリイソナイトチオフェン、ポリ−３−ヘキシルチオフェン、ポリアニオン、ポリイソチアナフテン、ポリチアジル、ポリフェニレン、ポリフルオレン、ポリジアセチレン、ポリアセン、ポリパラフェニレン、ポリチエニレンビニレン、ポリフェニレスルフィド、又はその２つ以上の混合物を挙げることができ、好ましくはポリ（３，４エチレンジオキシチオフェン）、ポリピロール、又はポリアセチレンである。
【００４０】
《硬質基板電極体》
基板電極体として硬質基板電極体を用いた場合は、細胞保持体として多孔質細胞保持体を用いることにより、基板電極体の電極面と細胞保持体の細胞面との接触面が、緊密に密着する。
本発明に用いる硬質基板電極体は、従来の公知の方法によって作製することが可能であり、金属電極、又はカーボン電極が、硬質な電極用基板に接着しているものである。
金属電極又はカーボン電極は、前記「多孔質基板電極体」に記載のものを使用することができる。硬質電極用基板としては、ガラス基板、シリコン基板、熱可塑性樹脂、又は熱硬化性樹脂などのプラスチック基板（具体的には、ポリスチレン基板、ポリエチレン基板、又はポリプロピレン基板）を用いることができる。
【００４１】
硬質基板電極体は、例えば以下のリフトオフ法で作製できる。リフトオフ法は、フォトリソグラフィにより形成したレジストパターンへ金属を蒸着後、アセトンでレジストを除去することで金属電極パターンが硬質基板上に作製される方法である。
AutoCAD2990（AutoDesk）を用いて電極パターンを設計する。レーザー描画装置（Heidelberg Instruments）を用い、エマルジョンマスク（2 inch、FUJIFILM）にパターンを描画し、現像してフォトマスクを得る。スライドガラスを適当なサイズに切り分け、アセトン、８６％エタノール−２−プロパノール蒸留水の順で１５分ずつ超音波洗浄し、２−プロパノール中に保管する。ガラス基板にポジ型フォトレジスト（ＡＺ１５００、３８ｃｐ、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）をスピンコート（４０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ）した。ガラス基板とフォトマスクを重ね、高圧水銀灯で露光（５０ｍＪ  ｃｍ−２）しレジストパターン基板を得る。専用現像液（ＡＺ  ３００ＭＩＦ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）で２分間現像した後、蒸留水で洗浄（３０ｓｅｃｘ２）する。スパッタ蒸着装置（Ｌ−３５０−Ｃ、ＡＮＥＬＶＡ）を用い、レジストパターン基板へＡｕを成膜する（厚さ３００ｎｍ）。アセトンへ基板を浸してフォトレジストを溶解してフォトレジスト上に成膜されたAuを除去し、ガラス基板表面にＡｕ電極パターンを作製することによって、硬質基板電極体を得ることができる。
【００４２】
硬質基板電極体は、前記多孔質基板電極体と同じように、電極表面に導電性高分子重合層を含んでもよい。導電性高分子重合層の材料としては、前記多孔質基板電極体に記載の材料を用い、例えば後述の参考例２の方法によって作製することができる。
【００４３】
《電気穿孔法》
エレクトロポレーションは、前記基板電極体の電極面及び細胞保持体の細胞面を接触させて、導入する分子を接触面において細胞に接触するように存在させて、電圧を印加することによって行う。
多孔質基板電極体及び多孔質細胞保持体を用いるエレクトロポレーションを、図４を用いて、説明する。多孔質基板電極体は、金属電極として金を用い、ハイドロゲルに電極幅１００μｍ、電極間距離５００μｍの円形の電極パターンを配設したものである。この多孔質基板電極体に、導入する分子としてＰＩ（Propidium Iodide)を含む溶液を１又は数滴、滴下する。付着性細胞が付着した多孔質細胞保持体の細胞面を、多孔質基板電極体の電極面と接触するように張り合わせる。多孔質基板電極体の金電極にエレクトロポレーションの電源を接続し、電気パルスを印加することによって、ＰＩが細胞内に導入される。
また、図５に示す電極面に導電性高分子重合層が付与された多孔質基板重合電極体を、エレクトロポレーションに用いた場合、図６に示すように、電極周辺の気泡の発生が抑えられる。
【００４４】
エレクトロポレーションにおける電圧、パルス時間、及びパルス数は特に限定されるものではなく適宜決定することができる。
電圧は、例えば１００Ｖｃｍ−１〜５０００Ｖｃｍ−１で行うことができ、好ましくは、３００〜２０００Ｖｃｍ−１であり、より好ましくは１０００〜２０００Ｖｃｍ−１である。
パルス時間は、例えば１００μｓｅｃ〜２０ｍｓｅｃで行うことができ、好ましくは、１００μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃであり、より好ましくは１００μｓｅｃ〜５００μｓｅｃである。
パルス数も、特に限定されるものではないが、１〜１０００回で行うことができ、好ましくは、１〜１００回であり、より好ましくは、１〜３０回である。
【００４５】
（導入分子）
本発明の分子導入法により、導入される分子は、細胞に導入できる分子であれば、限定されるものではないが、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、薬剤、ペプチド、タンパク質、又はマイクロ・ナノ微粒子を挙げることができる。薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば細胞染色剤、又は皮膚疾患等に対する経皮導入薬剤を挙げることができる。導入分子の分子量も、特に限定されるものではないが、例えば１００〜２０００万が好ましく、１００〜１０００万が好ましい。
エレクトロポレーション時の導入分子液の濃度は特に限定されるものではないが、例えばＤＮＡであれば、１〜５０００μｇ／ｍＬで用いることが可能であり、好ましくは１０〜２０００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００〜２０００μｇ／ｍＬである。
基板電極体及び細胞保持体の接触面に添加する導入分子液の量は、限定されるものではないが、１ｃｍ２あたり１〜１００μＬである。
【００４６】
本発明の分子導入法に用いられる付着性細胞は、特に限定されるものではないが、例えば骨膜細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞及びＥＳ細胞等を挙げることができる。付着性細胞は、株化された付着性細胞であってもよい。株化された付着性細胞として、例えば３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞由来）、正常ヒト繊維芽細胞、Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞由来）を挙げることができる。更に、多くの体性幹細胞又はｉＰＳ細胞も付着性細胞であり、本発明の分子導入法に好適に用いられることができる。
【００４７】
［２］分子導入キット
本発明の分子導入キットは、電極用基板上に電極が配設された基板電極体、及び細胞保持用基板若しくは細胞保持体の調製用試薬を含み、前記電極用基板及び／又は細胞保持用基板が多孔質体を含む。本発明の分子導入キットは、本発明の分子導入方法に用いることができる。
【００４８】
《基板電極体》
本発明の分子導入キットに含まれる基板電極体は、前記「分子導入方法」に記載の基板電極体を用いることができる。すなわち、本発明の分子導入キットは、多孔質基板電極体又は硬質基板電極体を含むことができる。
【００４９】
《細胞保持基板》
本発明の分子導入キットに含まれる細胞保持基板は、前記「分子導入方法」に記載の細胞保持基板を用いることができる。すなわち、本発明の分子導入キットは、多孔質細胞保持用基板、又は硬質細胞保持基板を含むことができる。多孔質細胞保持用基板、又は硬質細胞保持基板は、主として、分子導入方法の細胞保持体取得工程における「培養法」に用いることができる
【００５０】
《細胞保持用基板の調製用試薬》
本発明の分子導入キットに含まれる細胞保持用基板の調製用試薬は、多孔質細胞保持用基板を調製するために用いられる。すなわち、分子導入方法の細胞保持体取得工程における「転写法」又は「培養法」に用いられる。
具体的には、細胞保持用基板の調製用試は、多孔質体を調整するためのハイドロゲルの原料、及びゲル化のための化合物などを含む。
【００５１】
（組み合わせ）
本発明の分子導入キットは、限定されるものではないが、（Ａ）多孔質基板電極体、及び多孔質細胞保持用基板若しくは細胞保持用基板の調製用試薬、（Ｂ）多孔質基板電極体、及び硬質細胞保持基板、又は（Ｃ）硬質基板電極体、及び多孔質細胞保持用基板若しくは細胞保持用基板の調製用試薬、をこの組み合わせで含むことができる。
【００５２】
本発明の分子導入キットは、付着性細胞の分子導入用である旨を明記した使用説明書を含むことができる。付着性細胞の分子導入用である旨の記載は、分子導入キットの容器に付されていてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
《参考例１》
本参考例では、電極形成用基材としてスライドガラスを用い、多孔質体としてポリアクリルアミドを用い、そして電極材料として金を用いて多孔質基板電極体を作製した。
（１）電極パターンの形成（電極形成工程）
ＡｕｔｏＣＡＤ  ２９９０（ＡｕｔｏＤｅｓｋ）を用いて電極パターンを設計した。レーザー描画装置（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、エマルジョンマスク（２  ｉｎｃｈ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にパターンを描画し、現像してフォトマスクを得た。スライドガラスを適当なサイズに切り分け、アセトン、８６％エタノール  、イソプロパノール、蒸留水の順で１５分ずつ超音波洗浄し、２−プロパノール中に保管した。スパッタ蒸着装置（Ｌ−３５０−Ｃ、ＡＮＥＬＶＡ）を用いて、Ａｕ（３００ｎｍ）を成膜した。Ａｕを成膜したガラス基板にポジ型フォトレジスト（ＡＺ１５００、３８ｃｐ、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）をスピンコート（４０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ）した、ガラス基板とフォトマスクを重ね、高圧水銀灯で露光（５０  ｍＪ  ｃｍ−２）した。専用現像液（ＡＺ  ３００ＭＩＦ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）で２分間現像した後、蒸留水で洗浄（３０ｓｅｃ×２）した。ガラス基板を金エッチング液（ＡＵＲＵＭ−３０２、関東化学株式会社）に浸し、電極パターン以外のＡｕを除去した。アセトンに浸してフォトレジストを除去し、ガラス基板表面に電極パターンを得た。
【００５５】
（２）多孔質体形成工程
前記電極パターンを形成したガラス基板の上に、電極パターンを囲むように厚さ２ｍｍのシリコーンシートで作製した四角形の枠を設置した。
一方、アクリルアミド溶液は、以下のように調製した。蒸留水にアクリルアミドを５００ｍｇ／ｍＬ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを２５ｍｇ／ｍＬになるように添加し、５０％（ｗ／ｖ）のモノマーストック溶液を調整した。ストック溶液を１０倍に希釈し、ＡＰＳとＴＥＭＥＤをそれぞれ０．４容量％，０．１容量％になるように添加してよく混合した。混合液を前記の枠に流し込み、室温で２時間静置することによって、アクリルアミドを重合させ、アクリルアミドゲルを形成させた。
【００５６】
（３）導電性高分子接着層の形成（接着工程）
蒸留水中に、ＥＤＯＴモノマー５０ｍＭ、及びＬｉＣｌＯ４（ドーパントイオン）１００ｍＭとなるように添加し、重合溶液を調整した。重合溶液を多孔質体に、０．２ｍＬ滴下し、Ａｕの電極と重合溶液とに、１．０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加して、１５分、電解酸化重合を行った。
【００５７】
（４）剥離工程
ＰＥＤＯＴ重合の終了後に、アクリルアミドゲルを基板から剥離し、金がパターニングされたアクリルアミドゲル基板電極体を得た。
【００５８】
《参考例２》
本実施例では、金を電極材料とした多孔質基板電極体を用い、電極表面を導電性高分子ＰＥＤＯＴで被覆した。実施例１の工程後に以下の操作を行った。
（１）導電性高分子重合層形成工程
重合溶液は、蒸留水中にＥＤＯＴモノマーを５０ｍＭ、及びＬｉＣｌＯ４（ドーパントイオン）を１００ｍＭ添加して調製した。重合溶液を多孔質基板電極体のＡｕ電極表面に１００μＬ滴下し、電極と重合溶液とに１．０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加して、５分間、電解酸化重合を行い、導電性高分子重合層を電極表面に形成した。
【００５９】
《実施例１》
本実施例では、多孔質体基板電極体及び多孔質細胞保持体を用いて蛍光試薬Propidium Iodide（ＰＩ）をエレクトロポレーションで導入した。ＰＩは胞膜不透過性の蛍光試薬である。
（１）細胞ゲルシートの作製（細胞保持体取得工程）
ＦＢＭ培地にフィブリノーゲンとアプロチニンをそれぞれ３０ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、フィブリノーゲン溶液を調整した。ＦＢＭ培地にトロンビンを２０Ｕｎｉｔｓ／ｍＬになるように添加し、トロンビン溶液を調整した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ株を、培養用培地（ＦＢＭ培地（タカタバイオ株式会社）５００ｍＬに、ｈＦＧＦ−Ｂを０．５ｍＬ、ＦＢＳを１０ｍＬ、ＧＡ−１０００（５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）を０．５ｍＬ添加）を用いて、２４ウェルプレートで、コンフルエントになるまで培養した。細胞を傷つけないように注意しながらプレート内の培地を抜いた。ピペットを用いてＰＢＳ（−）を静かに注ぎ，細胞を洗浄した。ＰＢＳ（−）を抜いた後，細胞上に前記のフィブリノーゲン溶液及びトロンビン溶液を等量添加した。４時間、３７℃でインキュベートし，ゲル化およびゲル表面への細胞の付着を促した。細胞培養基板（２４ウェルプレート）からフィブリンゲルを剥離し、細胞が表面に固定化され多孔質細胞保持体（細胞ゲルシート）を得た。
【００６０】
（２）ＰＩの導入（導入工程）
ＰＩ溶液は、エレクトロポレーション用バッファ（Hyposmolar buffer、eppendorf）にＰＩを１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加することによって作製した。得られたＰＩ溶液は、使用までアルミホイルで遮光して３７℃のウォーターバス内で保温した。
前記参考例１で得られた多孔質体基板電極体（ハイドロゲル基板電極）を、ＦＢＭ培地（タカラバイオ株式会社）に浸漬し、３７℃で２時間インキュベートした。多孔質体基板電極体上に、前記ＰＩ溶液を、数滴、滴下した。その上から、前記工程（１）で得られた多孔質細胞保持体（細胞ゲルシート）の細胞面が、多孔質体基板電極体の電極面に密着するように貼り合わせた。エレクトロポレーター（ＣＵＹ２１ＥＤＩＴII、株式会社ベックス）電極体の金電極に接続し、８０Ｖ、０．１ｍｓｅｃ、及び３０パルス（１Ｈｚ周期）の条件で、電気パルスを印加した。
生細胞を染色するために、細胞ゲルシート上からＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液を滴下し、インキュベータ内で１時間培養した。蛍光顕微鏡を用いて細胞の蛍光観察を行い、ＰＩの取り込みの評価と生細胞判定を行った。結果を図４に示す。
【００６１】
図４（Ｅ）に示すように、電極間の細胞にPI由来の赤色蛍光が観察され、ＰＩが細胞内に取り込まれたことが分かる。図４（Ｆ）は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを生細胞に取り込ませ，ＰＩ由来の赤色蛍光と，Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ由来の緑色蛍光を同時に観察した蛍光写真である。電極と電極の中間に位置する細胞に、赤色蛍光及び緑色蛍光が確認され、生細胞にＰＩを導入されたことが分かる。
但し、電極付近の細胞、及び図４（Ｄ）に見られる気泡に近い細胞は、緑色蛍光が弱く、死細胞であると考えられる。細胞の生存率は約５０％程度であった。
【００６２】
《実施例２》
本実施例では、参考例２で製造した、多孔質基板重合電極体を用いて、付着細胞へのＰＩの導入を行った。
参考例１で製造された多孔質基板電極体に代えて、参考例２で製造された多孔質基板重合電極体を用いたこと、及びパルス条件を６０Ｖ、０．１ｍｓｅｃ、及び３０パルス（１Ｈｚ周期）としたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図６に示す。
電極間の細胞にPI由来の赤色蛍光が観察され、ＰＩが細胞内に取り込まれた。また図６（Ｃ）の写真から分かるように電極付近での、気泡の発生がなかった。また、図６（Ｅ）は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを生細胞に取り込ませ、ＰＩ由来の赤色蛍光とＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ由来の緑色蛍光を同時に観察した蛍光写真である。PIが導入された細胞のほとんどが生細胞であった。生存率は８０％を超えていた。すなわち、多孔質基板重合電極体を用いることにより、細胞の生存率を更に上昇させることができる。
【００６３】
《実施例３》
前記ＰＩに代えて、ＧＦＰの発現ベクターであるｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１ベクターを用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１溶液は、エレクトロポレーション用バッファに、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１ベクターを１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加することによって、作製した。
なお、ＧＦＰの発現及び生細胞の修復を行うために、細胞ゲルシート上からFBM培地を滴下し、インキュベータ内で２４時間培養した。蛍光顕微鏡を用いて細胞の蛍光観察を行い、ＧＦＰの発現を確認した。結果を図７に示す。
電極間の細胞において、ＧＦＰ由来の緑色蛍光が観察され（図７Ｂ）、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１ベクターが導入されたことが確認された。
【００６４】
《実施例４》
本参考例では、多孔質基板電極体を用いたヒトｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）細胞へのエレクトロポレーションによる分子、遺伝子導入を行った。多孔質基板電極体として、ＰＥＤＯＴ被覆金電極がパターンされたアクリルアミド基板重合電極体を用いた。
【００６５】
（１）ヒトｉＰＳの細胞保持体の作製
（１−１）フィーダー細胞培養基板の作製
培養基板にはプラスチック基板（Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ、Ｎｕｎｃ）を用いた。プラスチック基板を直径６０ｍｍのシャーレに設置し、ＲｅｐｒｏＣｏａｔ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）を２ｍＬ滴下した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分処理し、基板のフィーダー細胞接着性を向上させた。
フィーダー細胞は、マウス胎仔繊維芽細胞（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）を用いた。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に、ウシ胎児血清を１０体積％、抗生物質ペニシリンを５０Ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシンを５０μｇ／ｍＬ添加して調整した。細胞懸濁液は、前記の培養液にフィーダー細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ添加して調製した。前記のシャーレからＲｅｐｒｏＣｏａｔを除去した後、フィーダー細胞懸濁液を４ｍＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、フィーダー細胞培養基板を得た。
【００６６】
（１−２）ヒトｉＰＳ細胞培養基板の作製
ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７株（理化学研究所）を用いた。ｉＰＳ細胞培養液は、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）にｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）を５μｇ／Ｌ、ペニシリンを５０Ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシンを５０μｇ／ｍＬ添加して調整した。
前記のフィーダー細胞培養シャーレから培養液を除き，ｉＰＳ細胞培養液を３ｍＬ加えた。そこへｉＰＳ細胞を懸濁した培養液を１ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日培養することでｉＰＳ細胞培養基板を得た。
【００６７】
（２）ＰＩの導入（導入工程）
ＰＥＤＯＴ被覆Ａｕ電極対がパターンされたアガロースゲル基板重合電極体は、ヒトｉＰＳ細胞培養液に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩インキュベートすることでゲルの溶媒を培地に置換した。導入分子には、蛍光色素Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いた。導入分子溶液は、エレクトロポレーション用緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｈｙｐｏｏｓｍｏｌａｒ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に、ＰＩを１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、調製した。
アガロースゲル基板電極体をｉＰＳ細胞培養液から回収し、水分を除去した。前記の導入分子溶液を１０μＬ、電極パターン上に滴下後、ヒトｉＰＳ細胞培養基板を、細胞と電極が対向するように貼り合わせた。電気式遺伝子導入装置（ＣＵＹ２１ＥＤＩＴII−ＮＩ、ベックス）を用い、ＰＥＤＯＴ被覆Ａｕ電極対に、モノポーラの矩形電圧パルス（電圧８０Ｖ、パルス幅０．１ｍｓ、周期１Ｈｚ、印加パルス数３０回）を印加し、分子導入を行った。
【００６８】
エレクトロポレーション終了後、ヒトｉＰＳ細胞培養基板をアガロースゲル基板電極体から剥離した。細胞へ生細胞染色蛍光色素Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間培養することで，細胞膜の修復と生細胞染色を同時に行った。蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察し、ＰＩの細胞内導入と細胞の生死を評価した。
得られた蛍光画像を図９（ｃ）及び（ｄ）に示す。ヒトｉＰＳ細胞にＰＩが導入されてことが分かる。
【００６９】
《実施例５》
本実施例では、ヒトｉＰＳへのＧＦＰベクターの導入を行った。
前記ＩＰに代えて、蛍光タンパク質Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）発現プラスミドｐＥＦ１α−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ１（タカラバイオ）を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
【００７０】
エレクトロポレーション終了後、ヒトｉＰＳ細胞培養基板の貼りついたアガロースゲル基板電極体をｉＰＳ細胞培養液に浸漬し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１晩培養することでＧＦＰの発現を促した。蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察し、ＧＦＰの発現を評価した。
得られた蛍光画像を図９（ｅ）に示す。ｉＰＳ細胞に発現プラスミドｐＥＦ１α−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ１が導入されたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の分子導入方法は、付着性細胞へのエレクトロポレーションによる分子（核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、薬剤、ペプチド、タンパク質、又はマイクロ・ナノ微粒子）の導入に用いることができる。付着性細胞として、ヒトｉＰＳ細胞への分子の導入も可能であり、再生医療に用いることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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