(57)【要約】【課題】従来よりも高い含有量のエクオール含有組成物を高い収量で得る方法の提供を課題とする。【解決手段】エクオール産生微生物の培養物中のエクオールをスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に吸着させ、各種濃度の低級アルコールを用いて溶出することにより、エクオールを高い含有量で含む組成物を高い収量で得る方法を開発した。当該方法により、エクオールと他の水溶性物質（他のイソフラボンアグリコンを含む）との分離を容易に行うことが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクオールを含む溶液からエクオール濃度を高める工程において、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を用いることを特徴とする、エクオールの精製方法。
【請求項２】
スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂からエクオールを溶出させるのに、炭素数２〜３のアルコール（分岐アルコールも含む）の水溶液を用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エクオール溶出の前に、エクオールを溶出させるアルコール水溶液より低いアルコール濃度のアルコール水溶液で洗浄することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
エクオールを含む溶液が、ダイゼインあるいはダイゼインを含むイソフラボン混合物を原料とする発酵液であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
エクオールを含む溶液が、ダイゼインあるいはダイゼインを含むイソフラボン混合物を原料とし、ダイゼインからエクオールを生産する能力を持つ微生物を用いた発酵液であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、ラクトコッカス・エスピー（Lactococcus sp.）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ファーメンタムラム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ムコサ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）、スラッキア・イソフラビニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）、スラッキア・エクオリファシエンス（Slackia equolifaciens）、スラッキア・エスピー（Slackia sp.）、ストレプトコッカス・エスピー（Streptococcus sp.）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、バクテロイデス・エスピー（Bacteroides sp.）、エゲルテラ・エスピー（Eggerthella sp.）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、シャーペア・アザブエンシス（Sharpea azabuensis）、またはエンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）のうち少なくとも1種を用いた発酵液であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を用いたエクオールの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン作用）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。
【０００３】
イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitn）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA） 又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている。
【０００４】
エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。
【０００５】
これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜６）。しかしながら、エクオールを高い含有量で含む組成物を微生物培養物から効果的・実用的に精製する方法は明らかとなっていなかった。微生物を用いてエクオールを産生させる場合、発酵液には培地成分、界面活性剤、グルコースなど不純物が多く含まれるため、濃縮時に発泡トラブルを引き起こす要因となっていた。また、エクオールについては、食品用途への応用が考えられるため、酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を用いた精製プロセスを利用することは好ましくなく、さらに、単純に発酵液を乾燥する場合には、製品におけるエクオール含量が低くなり、不必要な不純物が多く含まれるという問題点があった。製品中のエクオール含量を高くするために、培地成分などの不純物をより効率的に除去する精製方法の確立が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０４２９６
【特許文献２】特表２００６−５０４４０９
【特許文献３】特開２００８−６１５８４
【特許文献４】特開２０１０−１０４２４１
【特許文献５】ＷＯ２００８−１５３１５８
【特許文献６】特開２０１２−１５８５４５
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Adlercreutz, H., The Lancet Oncol., 3, 364-373 (2002)
【非特許文献２】Duncan, A. M. et al., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 17, 253-271 (2003)
【非特許文献３】Wu, A. H. et al., Carcinogenesis, 23, 1491-1496 (2002)
【非特許文献４】Yamamoto, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 95,906-913 (2003)
【非特許文献５】Onozawa, M. et al., Jpn. J. Cancer Res., 90, 393-398 (1999)
【非特許文献６】Ridges, L. et al., Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10, 204-211 (2001)
【非特許文献７】Schmitt, E. et al., Toxicol. In Vitro, 15, 433-439 (2001)
【非特許文献８】Sathyamoorthy, N. and Wang, T. T., Eur. J. Cancer, 33, 2384-2389 (1997)
【非特許文献９】Arai, Y. et al., J. Epidemiol., 10, 127-135  (2000)
【非特許文献１０】Setchell, K. D. et al., J. Nutr., 133, 1027-1035 (2003)
【非特許文献１１】Decroos、K. et al., Arch Microbiol., 183, 45-55 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも高い含有量のエクオール含有組成物を高い収量で得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。すなわち、本発明者らは、嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、エクオールの精製における好適な条件の検討を行った。
【００１０】
具体的には、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785を、複数種類の混合ガスからなる気相存在下で培養し、ダイゼインをエクオールへ発酵させ、吸着精製法を用いたエクオールの好適な精製条件の検討を行った。
【００１１】
その結果、エクオール産生微生物の培養物（発酵液）中のエクオールをスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に吸着させ、アルコール濃度を段階的に高めたアルコール水溶液を用いて当該樹脂を処理することにより、エクオールを高い含有量で含む組成物を高い収量で得られることを見出した。
【００１２】
即ち、本発明者らは、エクオールの好適な精製条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕エクオールを含む溶液からエクオール濃度を高める工程において、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を用いることを特徴とする、エクオールの精製方法。
〔２〕スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂からエクオールを溶出させるのに、炭素数２〜３のアルコール（分岐アルコールも含む）の水溶液を用いることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔３〕エクオール溶出の前に、エクオールを溶出させるアルコール水溶液より低いアルコール濃度のアルコール水溶液で洗浄することを特徴とする、〔２〕に記載の方法。
〔４〕エクオールを含む溶液が、ダイゼインあるいはダイゼインを含むイソフラボン混合物を原料とする発酵液であることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔５〕エクオールを含む溶液が、ダイゼインあるいはダイゼインを含むイソフラボン混合物を原料とし、ダイゼインからエクオールを生産する能力を持つ微生物を用いた発酵液であることを特徴とする、〔４〕に記載の方法。
〔６〕微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、ラクトコッカス・エスピー（Lactococcus sp.）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ファーメンタムラム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ムコサ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）、スラッキア・イソフラビニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）、スラッキア・エクオリファシエンス（Slackia equolifaciens）、スラッキア・エスピー（Slackia sp.）、ストレプトコッカス・エスピー（Streptococcus sp.）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、バクテロイデス・エスピー（Bacteroides sp.）、エゲルテラ・エスピー（Eggerthella sp.）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、シャーペア・アザブエンシス（Sharpea azabuensis）、またはエンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）のうち少なくとも1種を用いた発酵液であることを特徴とする、〔５〕に記載の方法。
【００１４】
また、本発明は、以下の工程を含む、エクオール含有組成物の製造方法にも関する。
（１）エクオールを産生する微生物を培養し、エクオールを含む発酵液を得る工程、
（２）前記発酵液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に接触させ、該樹脂にエクオールを吸着させる工程、
（３）エタノールなど炭素数２〜３のアルコール（分岐アルコールも含む）水溶液を用いて前記樹脂からエクオールを溶出させる工程。
【発明の効果】
【００１５】
嫌気性微生物の代謝によってイソフラボン発酵代謝産物が製造されることは、学術的にはかねてより知られていたものの、微生物により発酵生産されたエクオールを高い含有量で含む組成物を得る方法については、これまで確立されていなかった。
【００１６】
本発明によって、微生物由来のエクオールを高い含有量で含む組成物を得る方法が実現され、エクオールの工業的な精製技術が提供された。本発明の方法により精製されたエクオール含有組成物を、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を用いたエクオールの精製方法に関する。本発明のエクオールの精製方法は、エクオールを含む溶液からエクオール濃度を高める工程において、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を用いることを特徴とする。
【００１８】
本発明のエクオールの精製方法は、
（１）エクオールを含む溶液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に接触させる工程、及び
（２）スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂へ吸着したエクオールを回収する工程
を少なくとも含むものである。
【００１９】
また、本発明のエクオールの精製方法は、
（１）エクオールを含む溶液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に接触させ、該樹脂にエクオールを吸着させる工程、
（２）洗浄液によりエクオールが吸着した前記樹脂を洗浄する工程、及び
（３）溶出液により該樹脂からエクオールを溶出させる回収工程
を含んでいてもよい。
【００２０】
また、本発明のエクオールの精製方法は、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂からエクオールを溶出させる溶出液として、炭素数２〜３の脂肪族アルコール（炭素骨格は直鎖であっても分岐していてもよい）の水溶液、例えばエタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどの水溶液を用いてもよい。さらに、本発明のエクオールの精製方法は、エクオール溶出に用いる溶出液のアルコール濃度を段階的に高めてもよい。
【００２１】
本発明の精製方法において、従来、他の水溶性物質（エクオール以外のイソフラボンアグリコンを含む）との分離精製が困難であったエクオールを高い含有量で精製回収することが可能となる。本発明において、エクオール以外のイソフラボンアグリコンは特に限定されるものではないが、好ましくはダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンを例示することができる。
【００２２】
本発明の精製方法により精製されるエクオール含有組成物におけるエクオール含有量は、好ましくは４５体積％以上、より好ましくは５０体積％以上、より好ましくは６０体積％以上、さらにより好ましくは７０体積％以上、特に好ましくは８０体積％以上、最も好ましくは９０体積％以上である。
【００２３】
本発明においては、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容したカートリッジ（又はカラム）を用いて精製を行うことができる。例えば、少なくとも二個の開口を有する容器内に該樹脂を収容したカートリッジの第一の開口より、エクオールを含む試料溶液、洗浄液又は溶出液を注入し、カートリッジの前記第一の開口に結合されたポンプなどを用いてカートリッジ内に、注入し各液を通過させ、他の開口より排出させる方法により精製を行うことができる。エクオールを含む試料溶液、洗浄液又は溶出液を加圧状態で該樹脂に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができる。加圧は、好ましくは10〜200 kPa、より好ましくは40〜100 kPakpaの程度で行われる。
【００２４】
前記のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容するカラム／カートリッジを用いる場合は、以下の工程でエクオールを分離精製することができる。
(ａ) エクオールを含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内にスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容したカラム／カートリッジの第一の開口より注入する工程、
(ｂ) 該カートリッジの前記第一の開口に結合されたポンプなどを用いて該カラム／カートリッジ内に、注入したエクオールを含む試料溶液を、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に通過させ、該カラム／カートリッジの他の開口より排出することによって、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂にエクオールを吸着させる工程、
(ｃ) 該カートリッジの前記第一の開口より洗浄液を注入する工程、
(ｄ) 該カートリッジの前記第一の開口に結合されたポンプなどを用いて該カラム／カートリッジ内に、注入した洗浄液を、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、他の開口より排出することによって、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を、エクオールが吸着した状態で、洗浄する工程、
(ｅ) 該カラム／カートリッジの前記第一の開口より溶出液を注入する工程、及び
(ｆ) 該カートリッジの前記第一の開口に結合されたポンプなどを用いて該カラム／カートリッジ内に、注入した溶出液を、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、他の開口より排出することによって、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂内からエクオールを溶出させ、該カラム／カートリッジ容器外に排出する工程。
【００２５】
以下、本発明のエクオールの分離精製方法に用いる試料溶液ならびに当該方法における各工程（吸着工程、洗浄工程、及び回収工程）について詳細に説明する。
【００２６】
〔エクオールを含む試料溶液〕
本発明において使用できる試料溶液は、エクオールを含むものであれば特に限定されるものではないが、好ましい例としては、嫌気性微生物によるエクオール発酵生産物を含む試料溶液を挙げることができる。本発明の試料溶液には、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものが含まれていてもよい。
【００２７】
本発明において、エクオールの発酵生産に用いられる嫌気性微生物は、エクオールの生産能を有する嫌気性微生物であり、好ましい例として、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌を例示することができる。
【００２８】
また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、嫌気性微生物として例示することができる。
コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
アトポビウム（Atopobium）属
コリンゼラ（Collinsella）属
クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
エガセラ（Eggerthella）属
エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
ゴードニバクター（Gordonibacter）属
オルセネラ（Olsenella）属
パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
スラッキア（Slackia）属
【００２９】
より具体的には、本発明においてエクオールの発酵生産に用いられる嫌気性微生物として、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、ラクトコッカス・エスピー（Lactococcus sp.）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ファーメンタムラム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ムコサ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）、スラッキア・イソフラビニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）、スラッキア・エクオリファシエンス（Slackia equolifaciens）、スラッキア・エスピー（Slackia sp.）、ストレプトコッカス・エスピー（Streptococcus sp.）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、バクテロイデス・エスピー（Bacteroides sp.）、エゲルテラ・エスピー（Eggerthella sp.）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、シャーペア・アザブエンシス（Sharpea azabuensis）、またはエンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）を例示することができる。
【００３０】
したがって、これらの属に分類された微生物から選択され、嫌気発酵によってエクオールを生成する微生物は、本発明における好ましい嫌気性微生物である。中でも、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物は、本発明におけるエクオール産生能を有する微生物として好ましい。微生物がエクオールを生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。これらの定量は、当業者であれば、例えばWO2012/033150、特開2012-135217、特開2012-135218、特開2012-135219などの記載に基づき行うことができる。これらの定量方法の一例を以下に示す。
例えば、培養液に酢酸エチルを加えて、激しく攪拌した後遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同培養液に同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得ることができる。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとすることができる。高速液体クロマトグラフィーの条件は例えば以下のものを例示することができるがこれに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Phenomenox Luna ５ｕＣ１８、２．０mm×１５０mm（島津ジーエルシー）
移動相：水／メタノール［５５：４５，ｖ／ｖ］
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
保持時間：ジヒドロダイゼインが１３．８分、ダイゼインが１９．６分、グリシテインが２２．５分、エクオールが２５．６分、ゲニステインが３５．０分。
【００３１】
より具体的には、たとえば、以下の微生物を、本発明におけるエクオール産生能を有する微生物として利用することができる。
・アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450
・エンテロハブダス・ムコシコラ（Enterorhabdus mucosicola）DSM 19490
・スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）HE8（DSM 22006）
・スラッキア・エスピー（Slackia sp.）TM-30 FERM AP-20729号
・エゲルテラ・エスピー（Eggerthella sp.）KCCM-10490
・アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785
・ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）DSM 6783
【００３２】
特に以下に記載する微生物のいずれか又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。
・アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株
・スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）DSM 22006株
・アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株
【００３３】
上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
DSM  German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
FERM  特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
KCCM  Korean Culture Center of Microorganisms
【００３４】
本発明において、エクオールの生産能を有する嫌気性微生物は、エクオールの生産に適した条件でイソフラボン類と接触させられ、培養される。本発明におけるエクオールの生産に適した条件とは、エクオールの生成活性を持つ嫌気性微生物の生存と活動が維持される条件を言う。より具体的には、嫌気性微生物の生存が可能な気相条件（嫌気性条件）が維持され、当該嫌気性微生物の活性と増殖を支持するための栄養素が与えられることを言う。嫌気性微生物の生存に適した種々の培地組成が公知である。したがって、先に示したエクオールの生産能を有する嫌気性微生物について、当業者は、適切な培地組成を選択することができる。たとえば、Ｄｉｆｃｏ社製のＢＨＩ培地や、実施例において用いた日水製薬社製のGAMブイヨン培地等を使用することができるがこれらに限定されない。
【００３５】
本発明において、嫌気性微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system)が好適である。
【００３６】
嫌気性微生物の培養においては、連続培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクが市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは基質ガスなどで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。
【００３７】
たとえば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を、嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。たとえば、嫌気培養ジャー内部に窒素などのガスを通気することにより内部を嫌気状態に維持することができる。
【００３８】
微生物の十分な生育のため、培養物のpHは3.0〜8.0が好ましく、4.5〜7.5（例えば6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5）がより好ましい。また、エクオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、37℃を好ましい温度として挙げることができる。
発酵時間は、エクオールの生成量、イソフラボン類の残存量等に応じて適宜設定できる。例えば８〜120時間、好ましくは12〜72時間、特に好ましくは16〜60時間を例示することができるがこれらに限定されない。
【００３９】
本発明においては、嫌気性微生物の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で行うことが好ましい。水素濃度は特に限定されない。
【００４０】
本発明において、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものを含む試料溶液を用いる場合には、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、又は、消泡剤により予め処理を行ってもよい。また、公知の方法を用いることにより嫌気性微生物と培養生成液を分離することもできる。好ましい分離の方法は、遠心分離および／またはホローファイバー型限外ろ過膜（UF膜）もしくは精密ろ過膜（MF膜）を利用する分離方法である。これらの処理により、不純物を取り除く効果が向上し、エクオールの回収率が向上するものと考えられる。
【００４１】
〔吸着工程〕
本発明のエクオールの精製方法は、エクオールを含む試料溶液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に接触させ、該樹脂にエクオールを吸着させる工程を含む。
【００４２】
本発明の精製方法に用いるスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂としては、例えば、三菱化学製吸着樹脂SP-700やHP-20が例示されるが、これらに限定されない。これらのスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂は、単独でまたは二種以上混合して使用できる。
【００４３】
本発明のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂の形状は特に限定されるものではないが、好ましくは球状を例示することができる。また、本発明のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂は、多孔性構造が望ましい。
【００４４】
スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に、エクオールを含む試料溶液を接触させる場合、試料溶液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に均一に接触させることが好ましい。スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂が、粉末状、粒状等である場合には、試料溶液にスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を添加し、均一となるよう攪拌させることにより、試料溶液をスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂に均一に接触させることができる。  
【００４５】
試料溶液にスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を添加する場合の、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂の添加量は特に限定されるものではないが、好ましくは試料溶液中に含まれるエクオール１ｇに対して、５０ｇ〜２００ｇのスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を添加することが好ましい。
【００４６】
〔洗浄工程〕
本発明のエクオールの精製方法は、エクオールが吸着した前記樹脂を洗浄液により洗浄する工程を含んでもよい。
【００４７】
洗浄を行うことにより、エクオールの回収量及び純度を向上させることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。濃度又は組成の異なる洗浄液を用いて複数回洗浄を行ってもよい。
【００４８】
洗浄工程においてスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容したカラム／カートリッジを用いる場合、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれと同じ機能をもつ供給手段を使用して、該カラム／カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、該カラム／カートリッジの第一の開口（エクオールを含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合されたポンプを用いて該カラム／カートリッジ内のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、第一の開口と異なる開口より排出させることができる。
【００４９】
また、洗浄液を第一の開口から供給し、同じ第一の開口より排出させることもできる。さらには、該カラム／カートリッジのエクオールを含む試料溶液を供給した第一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カラム／カートリッジの第一の開口から供給し、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、第一の開口と異なる開口より排出さる方法の方が、より洗浄効率が優れている。
【００５０】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
【００５１】
本発明の精製方法において、洗浄液は、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂にエクオールと共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂からエクオールは溶出させないが不純物（エクオール以外のイソフラボンアグリコンを含む）は溶出させる組成であることが必要である。本発明の精製方法に用いる洗浄液は、好ましくは水溶性有機溶媒及び/もしくは水溶性塩を含む溶液、又は脱イオン水である。
【００５２】
洗浄液に用いることができる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール、アセトン等を用いることができ、アセトニトリル又はアルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール等を挙げることができ、中でもメタノール、エタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、５０体積％未満であることが好ましく、５〜４５体積％であることがより好ましい。特に好ましくは、後述の回収工程で用いる溶出液よりもアルコール濃度の低いアルコール水溶液または脱イオン水であり、具体的には、アルコール濃度５０体積％未満、例えば３０〜４５体積％のアルコール水溶液または脱イオン水である。アルコール濃度を段階的に高めたアルコール水溶液を用いて複数回洗浄を行ってもよい。
【００５３】
〔回収工程〕
本発明のエクオールの精製方法は、溶出液を用いて前記樹脂からエクオールを溶出させる工程を含む。
【００５４】
回収工程においてスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容したカラム／カートリッジを用いる場合、溶出液は、ポンプなどを用いて、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を装着したカラム／カートリッジへ供給される。溶出液は、該カラム／カートリッジの第一の開口（エクオールを含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該カラム／カートリッジ内のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、第一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、溶出液を第一の開口から供給し、同じ第一の開口より排出させることもできる。さらには、該カラム／カートリッジのエクオールを含む試料溶液を供給した第一の開口と異なる開口より溶出液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カラム／カートリッジの第一の開口から供給し、スチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を通過させ、第一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れ、より好ましい。
【００５５】
本発明の精製方法に用いる溶出液は、好ましくは低級アルコール（炭素数１〜３のアルコール）水溶液であり、最も好ましくはエタノール水溶液である。
【００５６】
本発明の精製方法に用いる溶出液のアルコール濃度（V/V）は、用いるスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂によって適宜変更され得るが、１０％から９０％まで、例えば２０％から９０％まで、３０％から９０％まで、４０％から９０％まで、５０％から９０％まで、６０％から９０％まで、７０％から９０％まで、３０％から８０％まで、４０％から８０％まで、５０％から８０％まで、または６０％から８０％まで段階的に高めてもよい。
【００５７】
回収工程においては、エクオールの溶出液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが可能である。
【００５８】
また、回収工程において、回収したエクオールの分解を防ぐための安定化剤をエクオールの溶出液に添加しておくことも可能である。
【００５９】
溶出液の体積を当初のエクオールを含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたエクオールを含む溶出液を得ることができる。
【００６０】
溶出液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にエクオールを分離精製する場合は１回の溶出で実施するが、大量のエクオールを回収する場合等複数回にわたり溶出液を注入してもよい。
【００６１】
前記のスチレン-ジビニルベンゼン系吸着樹脂を収容したカラム／カートリッジとポンプなどを用いて、エクオールを含む試料溶液からエクオールを分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、エクオールを得ることが可能になる。
【００６２】
本発明の精製方法により得られるエクオール又はエクオール含有組成物は、医薬品、飲食物、化粧料等の素材として提供することが可能である。
【００６３】
エクオールを医薬品として提供する場合、その剤型は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明の精製方法により得られるエクオール又はエクオール含有組成物は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等の予防や治療のために使用することができる。
【００６４】
エクオールを飲食物又は食品添加物として提供する場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等として使用できる。食品の形態としては、本発明の方法によって得られるエクオール又はエクオール含有組成物を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。
【００６５】
エクオールを化粧料素材として提供する場合、当該組成物等を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状、粉末、顆粒およびブロック状などの固体状、クリームおよびペーストなどの半固体状、ゲル状等の各種所望の形態の化粧料に調製することができる。このような化粧料は、洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品、口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等の各種化粧料として有用である。本発明の精製方法により得られるエクオール又はエクオール含有組成物を含有する化粧料は、美白用化粧料、ニキビ改善用化粧料として使用することができる。
【００６６】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６７】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されるものではない。
【００６８】
〔実施例１〕
GAMブイヨン培地（日水製薬製）5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管（三紳工業製）に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして１１５℃、１５分間滅菌した。
この培地に−８０℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を２分間以上置換した後（水素の分圧パーセント濃度 １００％）、３７℃、２５０ ｓｐｍで１６時間振とう培養を行い、種培養液を調製した。
【００６９】
オートマチックシステムリサーチ社製2L容ミニジャーに表１に示すエクオール生産培地1.0Lを調製後、１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した。これに上記種培養液20 mLを植菌し、水素/N2混合ガス（水素2%／窒素98%、V/V）を0.1 L/minで通気しながら３７℃、５００ ｒｐｍ、０．０５ ＭＰａで培養を行った。
【００７０】
【表１】
2014083020.tif 000002
【００７１】
４８時間培養後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量したところ、2.95 g/Lのエクオールが生成してていた。培養終了後、１０５℃、１分間加熱殺菌し、冷却後、遠心分離にて菌体および不溶物を除去した。この上清について、スペクトラム社製MFろ過膜（0.2 μm、ポリエーテルサルホン、MiniKrosサンプルモジュール）を用いてろ過を行い、清澄なろ過液約900 mLを得た。これにはエクオール1.50 g、ダイゼイン 0.07g、ジヒドロダイゼイン 0.02 g、 グリシテイン 0.04 g 、ゲニステイン 0.004 gが含まれていた。
【００７２】
三菱化学製吸着樹脂SP-700を脱イオン水に懸濁してカラムに充填し、樹脂量100 mLとした。樹脂を充填したカラムにエタノールを通液したあと、脱イオン水で平衡化した。平衡化したカラムに上記MFろ過液550 mL（エクオール含量1.50 g）を空間速度（SV）＝1で負荷した。次いで、脱イオン水をSV＝1で充分量通液して非吸着物を洗い流した。続いて、エタノール水溶液を、エタノール濃度（V/V）を３０％から９０％まで段階的に高めてSV＝1で通液し、イソフラボンアグリコンを溶出させた。定量分析の結果、エクオールは７０％以上９０％以下のエタノール水溶液画分に９２％が含まれていた。ダイゼイン、グリシテインはともに約７０％の回収率であった。エクオールと他の水溶性物質（エクオール以外のイソフラボンアグリコンを含む）との分離を容易に行うことができた。
【００７３】
上記７０〜９０％エタノール画分を集め、４５℃で減圧下に濃縮し、一旦乾固させた。当該乾固物をエタノールにより再結晶させ、精製結晶１．２６ ｇを得た。結晶のエクオール含量は９３．９％、晶析の収率は８５．６％であった。
【００７４】
〔実施例２〕
三菱化学製吸着樹脂SP-700をエタノールに懸濁してカラムに充填し、樹脂量100 mLとした。樹脂を充填したカラムにエタノールを通液したあと、脱イオン水で平衡化した。平衡化したカラムに実施例1と同様に調製したMFろ過液550 mL（エクオール含量1.50 g）をSV＝1で負荷した。次いで、脱イオン水でSV＝1で充分量通液して非吸着物を洗い流した。続いて、エタノール水溶液を、エタノール濃度（V/V）を３０％から８０％まで段階的に高めてSV＝1で通液し、イソフラボンアグリコンを溶出させた。定量分析の結果、エクオールは５０％以上８０％以下のエタノール水溶液画分にほぼ全量が溶出された。
【００７５】
〔実施例３〕
三菱化学製吸着樹脂HP-20をエタノールに懸濁してカラムに充填し、樹脂量100 mLとした。樹脂を充填したカラムにエタノールを通液したあと、脱イオン水で平衡化した。平衡化したカラムに実施例1と同様に調製したMFろ過液550 mL（エクオール含量1.50 g）をSV＝1で負荷した。次いで、脱イオン水をSV＝1で充分量通液して非吸着物を洗い流した。続いて、エタノール水溶液を、エタノール濃度（V/V）を３０％から８０％まで段階的に高めてSV＝1で通液し、イソフラボンアグリコンを溶出させた。定量分析の結果、エクオールは５０％以上８０％以下のエタノール水溶液画分に８９％が含まれていた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、エクオールを高い含有量で含む組成物の精製方法、および当該方法により得られるエクオールを高い含有量で含む組成物が提供された。このような組成物は、更年期障害（更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症）、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び/又は改善などに有用である。