(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便に効率よく飼育ネズミのストレスを判定する方法及び判定材の提供。【解決手段】飼育ネズミの糞便のｐＨ変化に基づくマウスのストレス判定方法；呈色試薬を用いる、飼育ネズミのストレス判定方法；呈色試薬を含む、飼育ネズミのストレス判定材；前記飼育ネズミのストレス判定材、前記ストレス判定材を備えるディスポーザブルケージを用いる飼育ネズミのストレス判定方法。これにより、より簡便に効率よく飼育ネズミのストレスを判定することが可能となる。【選択図】図１
2014183807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
飼育ネズミの糞便のｐＨ変化に基づく飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項２】
さらに、糞便の臭気変化及び／又は糞便の細菌叢変化に基づく請求項１記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項３】
前記糞便のｐＨ変化において、指標ｐＨとの対比、測定開始時のｐＨとの対比、ｐＨの周期性、ｐＨの変動幅から選ばれる１種又は２種以上のものに基づく請求項１又は２記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項４】
前記糞便のｐＨ変化において、指標ｐＨと比較して糞便のｐＨが高い場合、前記飼育動物がストレス被曝したと判定する請求項１〜３の何れか１項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項５】
前記糞便の臭気変化において、臭気強度との対比及び／又は指標臭気との対比に基づく請求項２〜４の何れか１項項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項６】
前記糞便の臭気変化において、対照群の臭い強度と比較して臭い強度が増加した場合、前記飼育動物がストレス被曝したと判定する請求項２〜５の何れか１項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項７】
前記糞便の性質変化を、呈色試薬反応にて判断する請求項１記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項８】
前記呈色試薬が、ｐＨ指示試薬及び／又は気体検知試薬である請求項７記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【請求項９】
呈色試薬を含む、飼育ネズミのストレス被曝判定材。
【請求項１０】
ｐＨ指示試薬を含む床材及び気体検知試薬を含むフィルターから選ばれる１種又は２種以上である請求項９記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材を備えるディスポーザブルケージ。
【請求項１２】
請求項９又は１０記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材を用いる、飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼育ネズミのストレス被曝判定方法及び飼育ネズミのストレス被曝判定材に関する。
【背景技術】
【０００２】
非ヒト動物を飼育し、実験に利用することでヒト等の生体内の様々な生理学的な現象や動態等の生体情報を図り知ることができる。より精度の高い生体情報を得るためには飼育動物の品質維持が重要となってくる。この飼育動物として、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のネズミ上科（Muroidea）動物（以下、「ネズミ」という）がよく利用されている。飼育ネズミは、衛生的に管理的に飼育され、飼育環境のモニタリングが行われている。例えば、飼育ネズミを、温度及び湿度管理下で、床材を敷いてケージ内で衛生的に飼育したり（特許文献１）、必要に応じてケージ個別ごとに換気フィルターを備え、換気しながら飼育することもある。
しかしながら、衛生的に管理的に飼育されている飼育ネズミであっても、飼育中に予期し得ないストレスに被曝することがある。このストレス被曝によって、飼育ネズミの性質が大きく変化することが知られている（非特許文献１）。また、実験動物の動物倫理の観点からも、飼育ネズミの状況を把握することは重要である。ところが、現在用いられている手法は非科学的な手法と言わざるを得ない（非特許文献２）。
このため、より科学的な基準に基づき、より簡便に飼育ネズミのストレス被曝を判定することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１９４６０２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】M. Brown, L. et a.l; Report of the Working Group on Animal Distress in the Laboratory, Lab Anim, 35, 26-30 (2006)
【非特許文献２】W. Nicklas,et al. FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on Health Monitoring of Rodent and Rabbit Colonies), Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units, Lab Anim, 36, 20-42 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、斯かる実情に鑑み、飼育ネズミがストレスに被曝したことを簡便に効率よく判定できることを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者は、鋭意検討した結果、飼育ネズミの糞便のｐＨ変化がストレスを受けると変化することを見出した。そして、糞便のｐＨ変化に基づくことで、飼育ネズミがストレスに被曝したことをより簡便に効率よく判定できることを見出した。また、本発明者は、糞便の細菌叢変化、糞便の臭気変化、糞便のｐＨ変化等の糞便の性質変化のうちで何れか１つ又は２つ以上を組み合わせることによって簡便に効率よく判定できると考えた。糞便の性質変化を視覚的に判断できるようにすることで、飼育ネズミがストレスに被曝したことを簡便に効率よく判定できることを見出した。このようにして本発明者は、本発明を完成させた。
【０００７】
本技術は、飼育ネズミの糞便のｐＨ変化に基づく飼育ネズミのストレス被曝判定方法を提供するものである。
さらに、糞便の臭気変化及び／又は糞便の細菌叢変化に基づいてもよい。
前記これらの糞便の性質変化を、呈色試薬反応にて判断してもよい。前記呈色試薬が、ｐＨ指示試薬、気体検知試薬又は細菌検出試薬であってもよい。呈色試薬を用いることにより、視覚でも判定することができる。
【０００８】
本技術は、呈色試薬を含む、飼育ネズミのストレス被曝判定材を提供するものである。当該判定材は、ｐＨ指示試薬を含む床材及び／又は気体検知試薬を含むフィルターでもよい。
本技術は、前記飼育ネズミのストレス被曝判定材を備えるディスポーザブルケージを提供するものである。
本技術は、飼育ネズミのストレス被曝判定材を用いる、飼育ネズミのストレス被曝判定方法を提供するものである。呈色試薬を含むケージ部材及びこの周辺部材を用いることにより、簡便に視覚でも精度良く判定することができ、効率的である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、飼育ネズミがストレスに被曝したことを簡便に効率よく判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】科学的モニタリングによる実験結果をフィードバックさせる飼育動物のシステムを示す概略図である。本技術によるストレス被爆飼育ネズミの判定により、その飼育環境が飼育ネズミにとって好ましい環境であるか否かを判断し、より良い飼育環境の維持に利用することができる。
【図２】図２Ａは、コントロール群、振とうストレス群、床敷きなしストレス群の摂食量を示す図である。図２Ｂは、コントロール群、振とうストレス群、床敷きなしストレス群の排便量を示す図である。
【図３】図３Ａは、コントロール群、振とうストレス群、床敷きなしストレス群の乳酸菌数を示す図である。図３Ｂは、コントロール群、振とうストレス群、床敷きなしストレス群のLactobacillus属菌数を示す図である。
【図４】図４は、コントロール群（図４Ａ）、絶食ストレス群（図４Ｂ）、行動制ストレス群（図４Ｃ）、振とうストレス群（図４Ｄ）、床敷きなしストレス群（図４Ｅ）の各群の糞便の経時的（０〜６０時間）ｐＨの状態を示す図である。
【図５】図５は、コントロール群（図４Ａ）、絶食ストレス群（図４Ｂ）、行動制御ストレス群（図４Ｃ）、振とうストレス群（図４Ｄ）、床敷きなしストレス群（図４Ｅ）の各群の糞便の経時的（０〜６０日）ｐＨの状態を示す図である。
【図６】図６左は、種々の呈色試薬を含むフィルターを備えるディスポーザブルケージを示す。図６右は、ニンヒドリン試薬を含むフィルターを備えるディスポーサブルケージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．飼育ネズミのストレス被曝判定方法等
（１）糞便の性質変化
（２）ストレス被曝判定材及びこれを備える飼育ケージ
（３）ストレス被曝の判定
（４）糞便のｐＨ変化
（５）糞便の臭気変化に基づく判定
（６）糞便の細菌叢変化に基づく判定
【００１２】
１．飼育ネズミのストレス被曝判定方法
本技術は、飼育ネズミの糞便の性質変化に基づき飼育ネズミがストレスに被曝したことを判定する方法である。
本技術における「ストレス」とは、飼育ネズミの性質を変化させる外的な干渉をいう。
そのストレスとして、例えば、物理的ストレス、生理的ストレス、精神的ストレスが挙げられる。本技術では、主に物理的ストレス、生理的ストレスを判定することが好ましい。該当物理的ストレスとして、振とうストレス、床敷きなしストレス、行動制御ストレス等であり、生理的ストレスとしては、絶食ストレス等が挙げられる。
【００１３】
本技術で判定される対象動物の飼育ネズミは、ネズミ上科（Muroidea）動物であればよい。当該飼育ネズミとして、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が挙げられる。このうち、マウスが好ましい。健常な飼育ネズミにおけるストレス被曝判定が望ましい。
【００１４】
通常ストレスに被曝したことを判定する方法として、ストレス被曝により血中のホルモン等が変化するため、侵襲的に採血する血清学的手法（参考文献１及び２）がある。しかしながら、採血する際に固定や穿刺等によりストレスを受けることが知られ（参考文献３）、また採血をするには修練が必要となる。
また、飼育しているマウスの尿中に存在する揮発性有機物（VOCs）が、外部からの刺激により変化することが報告されており（参考文献４）、尿中に存在する揮発性有機物を非侵襲的なストレス被曝判定手法として利用することが考えられる。しかしながら、マウスの尿は採取量が少なく、また、腎臓による再吸収により、単位あたりの成分濃度が変化しやすい性質がある。
また、非侵襲的な手法として、唾液中のクロモグラニンＡを用いた手法が報告されている（参考文献５）が、唾液の採集は困難である。
また、非侵襲的な手法を用いても、採取又は測定する際に、飼育動物を捕まえたり、固定したり、強制的に行動を制限することは、飼育動物が何らかのストレスを受けていることと考える。
このように、従来の侵襲的及び非侵襲的な手法を用いたストレス被曝の判定方法では、上記した非特許文献１の手法よりも、客観性は得られるが、簡便で効率がいいとは言い難く、また精度の点でも改善が求められる。
【００１５】
そこで、本発明者は、飼育ネズミが外部から受けるストレスに対するシグナルを検出することを目標として種々検討した。その結果、全く意外にも、本発明者は、飼育している飼育ネズミがストレスに被曝すると、飼育ネズミの糞便の性質変化（例えば、細菌叢の変化、臭気の変化及びｐＨの変化等）が変化することを見出した。このことから、本発明者は、飼育ネズミの糞便の性質をモニタリングし、糞便の性質変化に基づき、飼育ネズミがストレスに被曝したか否かを判定できることを見出した。
【００１６】
参考文献１：V. Riley, Psychoneuroendocrine influences on immunocompetence and neoplasia, Science, 212, 1100-1109 (1981)．
参考文献２R.A. Sabbadini, R.J. Baskin, Active state of normal and dystrophic mouse muscle, Am. J. Physiol, 230, 1138-1147 (1976) ．
参考文献３：M. Cuoto, Report on the SCAW conference on pain, distress and stress in research animals. Current Standards and IACUC responsibility. May 18-19, 2000, Baltimore, MD, Contemp Top Lab Anim Sci, 39(4), 123-7 (2000) ．
参考文献４：M.L. Schaefer et al., Trevejo, Mouse Urinary Biomarkers Provide Signatures of Maturation, Diet, Stress Level, and Diurnal Rhythm, Chem. Senses, 35, 459-471 (2010) ．
参考文献５： M. Toda, S. Kusakabe, S. Nagasawa, K. Kitamura and K. Morimoto, Effect of laughter on salivary endocrinological stress marker chromogranin A, Biomedical Research, 28(2), 115-118 (2007) ．
【００１７】
（１）糞便の性質変化
本技術の「糞便の性質変化」は、特に限定されないが、当該「糞便の性質変化」として、例えば、糞便の細菌叢の変化、糞便の臭気の変化、糞便のｐＨの変化等から選ばれる１種又は２種以上を組み合わせて、ストレス被曝判定を行うことができる。
このうち、糞便のｐＨ変化を少なくとも選択することが、簡便にかつ精度よくストレス被曝判定を行うことができるので、好ましい。
さらに、糞便のｐＨ変化及び臭気変化を組み合わせることが、より精度が向上するので、好ましい。
複数を組み合わせるときには、高精度でストレス被曝ネズミを排除したい際には、ストレス被曝したとの判定が１つでもある場合には、ストレス被曝ありと判定する。通常は、糞便のｐＨ変化の判定結果を優先してストレス被曝を最終的に判定すればよい。
【００１８】
また、前記「糞便の性質変化」は、呈色試薬反応を使用してストレス被曝判定を行うことも可能である。このように呈色試薬反応を用いることにより肉眼で視認できるので、簡便に効率よくできる点で、好適である。前記呈色試薬として、例えば、ｐＨ指示試薬、気体検知指示薬及び細菌検出試薬等が挙げられる。
【００１９】
前記ｐＨ指示試薬として、公知のものを使用すればよく、入手可能な市販品を用いることが好ましい。
例えば、ｐＨ指示試薬として、特に限定されない。当該ｐＨ指示試薬は、酸性領域、中性領域、又は塩基性領域が判断可能な指示薬に分類することができる。
さらに、各分類の指示薬の例示を以下に挙げるが、このうちから１種又は２種以上を選択して、糞便のｐＨ変化を判断することが可能である。
【００２０】
酸性領域用のｐＨ指示試薬として、例えば、ゲンチアナバイオレット（メチルバイオレット）〔ｐＨ０．０−２．０〕、マラカイトグリーン〔ｐＨ０．０−２．０〕、チモールブルー〔ｐＨ１．２−２．８〕、メチルイエロー〔ｐＨ２．９−４．０〕、ブロモフェノールブルー〔ｐＨ３．０−４．６〕、コンゴーレッド〔ｐＨ３．０−５．０〕、メチルオレンジ（ＭＯ）〔ｐＨ３．１−４．４〕、ブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）〔ｐＨ３．８−５．４〕、メチルレッド（ＭＲ）〔ｐＨ４．４−６．２〕、メチルレッド／ブロモクレゾールグリーン〔ｐＨ４．５−５．２〕等が挙げられる。
中性領域用のｐＨ指示試薬として、例えば、リトマス〔ｐＨ４．５−８．３〕ブロモクレゾールパープル〔ｐＨ５．２−６．８〕、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）〔ｐＨ６．０−７．６〕、フェノールレッド〔ｐＨ６．８−８．４〕、ニュートラルレッド〔ｐＨ６．８-８．０〕、ナフトールフタレイン〔ｐＨ７．３−８．７〕、クレゾールレッド〔ｐＨ７．２−８．８〕等が挙げられる。
塩基性領域用のｐＨ指示試薬として、例えば、マラカイトグリーン〔ｐＨ１１．６-１４〕、チモールブルー〔ｐＨ  ８．０-９．６〕、フェノールフタレイン  （ＰＰ）〔ｐＨ８．３-１０．０〕、チモールフタレイン〔ｐＨ９．３-１０．５〕、アリザリンイエローＲ〔ｐＨ１０．２-１２．０〕等が挙げられる。
このうち、酸性領域用指示薬及び中性領域用指示薬が好ましく、さらにこのうち、ＢＣＧ試薬及びＢＴＢ試薬が好適である。このうち、ＢＴＢ試薬が好適である。
【００２１】
前記「気体検知指示薬」は、気体中の成分に指示薬が接触し、反応することで、色が変化するものである。市販品の気体検知指示薬を含む気体検知管を用いて飼育ネズミのストレス被曝判定を行うことも可能である。
気体成分（気体検知指示試薬）として、例えば、アルデヒド（フェーリング試薬）；ホルムアルデヒド（シッフ試薬）；アルデヒド、ケトン（２，４−ジニトロフェニルヒドラジン試薬）；アミン（エーリッヒ（Van Urk）試薬）；アミン（ニンヒドリン試薬）；カルボン酸（ブロモグレゾールグリーン）；アルコール、アミン、スルフィド、メルカプタン（過マンガン酸カリウム試薬）；アルコール、フェノール（バニリン試薬）等が挙げられる。
【００２２】
前記「細菌検出試薬」は、細菌と反応し、色が変化するものであり、通常細菌検出を視覚で行う際に配合するｐＨ指示試薬や細菌染色剤等を配合してもよい。市販品の細菌検出培地や細菌染色剤を用いて飼育ネズミのストレス被曝判定を行うことも可能である。
細菌検出試薬（検出菌）として、例えば、ＭＲＳ培地組成物（乳酸菌）、ＬＢＳ培地組成物（Lactobacillus）、ＬＡ培地組成物（乳酸菌）、グラム染色剤（グラム陰性及び陽性）等が挙げられる。
【００２３】
（２）ストレス被曝判定材及びこれを備える飼育ケージ
前記呈色試薬を、飼育ネズミを飼育するための飼育ケージ（例えば、ディスポーザブルケージ等）に備える部材に含ませることで、ストレス被曝判定材として使用することが可能である。この前記呈色試薬を含む部材を使用することにより、前記部材に存在する呈色試薬が反応し、呈色した結果に基づき、飼育ネズミがストレスに被曝したか否かを判定することが可能である。この呈色結果を作業従事者が視認することにより、ストレス被曝の判定が簡便にかつ精度よくできる利点がある。また標準物質や標準変色表等の標準品を使用することで、熟練者でなくとも、より簡便でさらに精度を向上させることも可能である。
前記呈色試薬を含ませた部材として、フィルターは不織布や織布等が、床材としてはセルロース繊維等が挙げられる。この部材の素材として、フィルターは化学合成繊維（ナイロン、アクリル、ホモポリマー等）、木綿繊維、麻繊維等が挙げられる。この部材の素材として、床材はセルロース繊維（木材パルプ、木材チップ等）、さらに吸水性や吸湿性があるものが望ましい。
ストレス被曝判定材として、ｐＨ指示試薬を含む床材及び気体検知指示薬を含むフィルターが好ましい。当該床材は、糞便のｐＨ変化をみる際に適しており、当該フィルターは、ケージ内の気相変化をみる際に適している。このとき、ケージ内の気相変化の指標としてアミン類及びアルデヒド類等の臭気化合物が好適である。
また、飼育ケージの形状は、特に限定されず、実験目的や飼育動物に適合したものであればよい。飼育ケージの材質は、特に限定されず、ＰＥＴＥ樹脂等が挙げられ、飼育ケージ及びこれに備える部材の材質は、電子線滅菌できる材質であることが好ましい。
【００２４】
（３）ストレス被曝の判定
本技術の「ストレス被曝の判定」では、対象となる飼育ネズミ（以下、「飼育ネズミ」ともいう。）の糞便の性質を測定した値を、「対象基準（比較対象）」と比較することで、ストレスに被曝しているか否かを判定することができる。
また、「対象基準（比較対象）」として、例えば、飼育ネズミのモニタリング（測定）開始時の糞便の性質；ストレス被曝していない対照群の糞便の性質；判定用に予め設定された糞便の性質の所定値等が挙げられる。
一例として、飼育ネズミの糞便の性質を測定した値と、ストレス被曝していない対照の糞便の性質を測定した値と比較することで、飼育ネズミがストレスに被曝しているか否かを判定することも可能である。
また、ストレス被曝のモニタリング間隔は、特に限定されない。例えば、６〜２４時間間隔で行うことが好ましく、１２〜２４時間間隔で行うことが、精度及び作業効率の点からより好ましい。
【００２５】
この糞便の性質変化に着目したことで、ストレス被曝判定のための糞便の採集量を確保しやすい；飼育しているネズミに、糞便の性質変化を測定する際にストレスを与えにくい等の利点がある。さらに、糞便の細菌叢の変化、臭気の変化及びｐＨの変化等の糞便の性質変化は測定しやすいので、ユーザが種々の目的で飼育しているネズミのストレス被曝を判定することが簡便に効率よく行うことができる。
また、本技術は、糞便の性質変化を視覚的に見ることも可能であることから、さらに簡便に効率よく判定することができ、評価者のストレス被曝判定の差も少なくなるという利点もある。
本技術により、ストレスに被曝されていない飼育ネズミを選別することが簡便で効率よく行うことが可能となる。さらに、均一的な品質の飼育ネズミをユーザに提供することが可能となる。また、この飼育ネズミから得られた実験データの安定性や信頼性が高まるという利点もある。
【００２６】
（４）糞便のｐＨ変化に基づく判定
本技術は、飼育ネズミの糞便のｐＨ変化に基づき、飼育ネズミがストレスに被曝したか否かを判定することができる。
糞便は、そのまま又は粉末状、固形状、半固形状、懸濁状に処理した後にｐＨ測定を行うことが好ましい。糞便（そのまま又は固形状）を液体に懸濁し、その懸濁液のｐＨを測定することが好ましい。ｐＨ測定時期は、懸濁中、懸濁後の何れでもよい。
懸濁の液体として、特に限定されず、例えば、純水、希酸溶液、希アルカリ溶液及びｐＨ指示試薬混合溶液等が挙げられ、これらを１種又は２種以上使用してもよい。糞便を純水で懸濁後に、希酸、希アルカリを添加して懸濁してもよく、またｐＨ指示試薬を添加してもよい。さらに、希酸・希アルカリとｐＨ指示試薬とを混合させてもよい。希酸・希アルカリを使用した場合、この使用した分を中和することが望ましい。また、希酸及び希アルカリの濃度は、０．００１〜０．０４Ｍであることが好ましい。
使用する液体の量は、糞便を懸濁することが可能であれば特に限定されないが、糞便２０〜４０ｍｇに対して、好ましくは０．１〜１０ｍＬ、より好ましくは１〜３ｍＬである。懸濁時間は、特に限定されないが、好ましくは１分〜２時間、より好ましくは０．５〜１．５時間である。
糞便と液体の懸濁は、撹拌、超音波等の公知のホモジナイズ可能な手法を用いればよい。
飼育ネズミの糞便のｐＨ変化を測定する方法は、ｐＨが測定可能であれば特に限定されない。例えば、ｐＨ変化測定可能な方法として、ｐＨメーター等のｐＨ計測機器でｐＨ測定を行うこと；ｐＨ指示試薬を用いて行うこと等が挙げられる。ｐＨ指示試薬は上述の「１．飼育ネズミのストレス被曝判定方法」のとおりである。
【００２７】
〔ｐＨ変化判定方法ａ；指標ｐＨとの対比〕
好適には、前記糞便のｐＨ変化において、指標ｐＨと比較して、飼育ネズミの糞便のｐＨが高い場合、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。これにより、特に、絶食ストレスであると精度よく判定することができる。
指標ｐＨは、予め設定してもよく、所定値以上になったときは、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定するのが好適である。より精度を高めるため、糞便のｐＨが、好ましくはｐＨ７．７以上、より好ましくは８．０以上である。
さらに糞便のｐＨが所定値以上になったときから２０〜２８時間（好適には２４時間）前に、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定することが可能である。
〔ｐＨ変化判定方法ｂ；測定開始時ｐＨとの対比〕
また、好適には、前記糞便のｐＨ変化において、測定開始時の飼育ネズミの糞便のｐＨを指標ｐＨとし、２４〜４８時間飼育した後の糞便のｐＨが所定値以上に上昇していた場合、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。これにより、特に、絶食ストレスであると精度よく判定することができる。
前記所定値とは、（測定時の糞便のｐＨ−開始時の糞便のｐＨ）で求めることができる。前記所定値を、好ましくは＋０．２以上、より好ましくは＋０．３以上、さらに好ましくは＋０．３２以上と設定することが可能であり、このような設定によって、より精度の高いストレス被曝の判定ができる。
【００２８】
〔ｐＨ変化判定方法ｃ；ｐＨの周期性〕
また、好適には、前記糞便のｐＨ変化において、飼育ネズミの糞便がアルカリ性の強い傾倒を示した後に中性領域（６．５〜７．５程度の範囲）に戻るときには、強い傾倒（最も高いｐＨ値）が開始したときから２４〜４８時間前に飼育ネズミがストレスに被曝したと判定することができる。これにより、特に、絶食ストレスであると精度よく判定することができる。
また、好適には、前記糞便のｐＨ変化において、最大ｐＨ値を測定した時間から５０〜７０時間（好適には６０時間）前に、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。
〔ｐＨ変化判定方法ｄ；ｐＨの変動幅〕
また、好適には、前記糞便のｐＨ変化において、飼育ネズミの糞便のｐＨについて長期間モニタリングを行い、糞便のｐＨの振れ幅が所定値以上に大きい場合に、飼育ネズミがストレス被曝したと判定する。これにより、特に、振とうストレスであると精度よく判定することができる。
さらに、ｐＨの振れ幅の所定値が、モニタリング中、上限値と下限値の差が０．５以上のときに、飼育ネズミがストレス被曝したと判定するのがより好ましい。この長期モニタリングの期間は、１０〜６０日間程度であればよい。
【００２９】
上述したｐＨ変化判定方法ａ〜ｄのように、指標ｐＨとの対比、測定開始時ｐＨとの対比、ｐＨの周期性、ｐＨの変動幅から選ばれる１種又は１種以上のものに基づき、ストレス被曝判定を行うことができる。さらに、これらｐＨ変化判定方法ａ〜ｄを必要に応じて２又は３種以上組み合わせて用いることにより、より精度を高めることが可能である。
【００３０】
本技術により、飼育ネズミの糞便のｐＨ変化を測定又は観察し、飼育環境モニタリングを行うことで、ストレス被曝が判定できるので、至って簡便な方法である。さらに呈色試薬を用いることで飼育ネズミの生理的な情報を短時間で視覚的に表すことができるので、より簡便かつ効率よくストレス被曝の判定を行うことができる。
【００３１】
（５）糞便の臭気変化に基づく判定
本技術は、飼育ネズミの糞便の臭気変化に基づき、飼育ネズミがストレスに被曝したか否かを判定することができる。当該臭気変化として、特徴な臭気成分又は臭気強度の増減が好ましい。これにより、特に、行動制御ストレスであると精度よく判定することができる。
糞便は、そのまま又は粉末状、固形状、半固形状、懸濁状に処理した後に臭気測定を行うことが好ましい。糞便（そのまま又は固形状）を加熱し、臭気を測定することが好ましい。加熱は、３０〜５０℃で０．５〜２時間程度であるのが好ましい。
飼育ネズミの糞便の臭気変化を測定する方法は、臭気が測定可能又は評価可能であれば特に限定されない。例えば、臭気変化測定可能な方法として、各気体成分を分析可能なＧＣ／ＭＳ分析装置で臭気成分測定を行うこと。；気体検出試薬を用いて行うこと；ヒトのパネラによって行うこと等が挙げられる。気体検出試薬は上述の「１．飼育ネズミのストレス被曝判定方法」のとおりである。
【００３２】
本技術は、飼育ネズミの糞便の特徴な臭気成分又は臭気強度が増加することで、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定することが望ましい。
〔臭気変化判定方法ａ；対照群の臭気強度との対比〕
好適には、前記糞便の臭気変化において、対照群の臭い強度と比較して、飼育ネズミの臭い強度が強いと判断した場合、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。
臭い強度の強弱については、指標となる臭気成分との臭気強度の対比；ヒトのパネラによる臭気全体の臭気強度の対比等により行うことが可能である。臭気強度は、測定機器による計測値及びパネラによる評価値の何れでもよい。
指標となる臭気として、例えば、アルデヒド類、硫黄化合物、アルコール類、アミン類、ケトン類、エステル類、脂肪酸類から選ばれる１種又は２種以上のものを指標とすることができる。
より具体的には、例えば、アセトアルデヒド、ヘキサナール、オクタナール、ノナナール、３−メチルブタナール、２−メチルブタナール、ヘプタナール、デカナール、ペンタナール、イソブタナール、ブタノール、ジメチルジスルフィド、ジメチルスルフィド、トリメチルアミン、２，３−ブタンジオン、酪酸エチル、イソ酪酸等から選ばれる１種又は２種以上のものを指標とすることができる。
このうち、アミン類（好適にはトリメチルアミン）及びアルデヒド類（好適にはアセトアルデヒド）を指標とするのが、後述する呈色反応にて判定することができるので好ましい。
【００３３】
〔臭気変化判定方法ｂ；指標臭気との対比〕
また、好適には、前記糞便の臭気変化において、対照群の糞便からの指標臭気の測定値と比較し、飼育ネズミの糞便からの臭気の測定値が高い場合、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。
また、好適には、飼育ネズミの糞便からの指標臭気を測定し、検出することで、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。さらに、指標臭気が所定値以上の場合に、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定することが好ましい。所定値とは、臭気変化測定開始時期の指標臭気と比較し、これより増加した場合等が挙げられる。
例えば、アセトアルデヒドを指標臭気とし、このアセトアルデヒド３．５ｐｐｂを所定値と設定した場合、アセトアルデヒドが３．５ｐｐｂ以上測定される際に、飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。
【００３４】
上述した臭気変化判定方法ａ〜ｂにように、臭気強度との対比、指標臭気との対比から選ばれる１種又は１種以上のものに基づき、ストレス被曝判定を行うことができる。さらに、必要に応じて２種以上組み合わせて用いることにより、より精度を高めることが可能である。
【００３５】
本技術において、日々のモニタリングの中で、「臭いを嗅ぐ」といった簡易な手法でも、ストレス被曝判定を行うことが可能である。この場合、特別な器具を用いる必要がないという利点である。
また、本技術において、１２種類の臭気成分を重要な臭気とし、これらを組み合わせて調香し、テスターを作成することが可能となった。この基本臭（テスター）を利用することで、作業者でも、ストレス被曝の判定が簡便にかつ精度よく行うことが可能である。
また、本技術において、糞便によって、ケージ内に化学的な気相変化が生じていることを明らかにした。さらに、その気相変化を、フィルター等のケージ部材に、その気相変化が判断可能な呈色試薬を含有させることで、視覚的に把握できることを実証できた。また、この気相変化成分として、偶然にも、アミン類（好適にはトリメチルアミン）及びアルデヒド類（好適にはアセトアルデヒド）の臭気成分を、指標とするのが可能であることが確認できた。
よって、ケージ部材に呈色試薬を含有させることで、この部材をストレス被曝判定用の部材として使用可能である。このように、ケージ本体に呈色反応を示す部材を予め備えることによって、作業者が特別な行動を起こさずとも、飼育ネズミの様子をモニターできる手法を提供できる。
【００３６】
（６）糞便の細菌叢変化に基づく判定
本技術は、飼育ネズミの糞便の細菌叢変化に基づき、飼育ネズミがストレスに被曝したか否かを判定することができる。当該細菌叢変化として、特定の腸内細菌の菌体数又はコロニー数の増減が好ましい。これにより、特に、振とうストレスと床敷きなしストレスであると精度よく判定することができる。
糞便は、そのまま又は粉末状、固形状、半固形状、懸濁状に処理した後に細菌数の測定を行うことが好ましい。糞便（そのまま又は固形状）を液体に懸濁し、その懸濁液の細菌数を又はその懸濁液を培養し、測定することが好ましい。
懸濁の液体として、特に限定されず、例えば、純水、希酸溶液、希アルカリ溶液及びｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられ、これらを１種又は２種以上使用してもよい。
糞便と液体の懸濁は、撹拌、超音波等の公知のホモジナイズ可能な手法を用いればよい。
飼育ネズミの糞便の細菌叢の変化を測定する方法は、細菌（コロニー）数が測定可能であれば特に限定されず、細菌の種類を判断できる方法が好ましい。例えば、細菌叢測定可能な方法として、顕微鏡観察を行うこと；細菌検出試薬を用いること；特定の細菌用培地組成を用いること；微生物検査装置又は光学測定装置を用いること等が挙げられる。細菌検出試薬は上述の「１．飼育ネズミのストレス被曝判定方法」のとおりである。
【００３７】
〔細菌叢変化判定方法ａ；対照群の菌数（コロニー数）との対比〕
好適には、前記糞便の細菌叢において、測定開始時の糞便中の乳酸菌数と比較し、糞便中の乳酸菌が減少した場合、前記飼育ネズミがストレスに被曝したと判定する。また、対照群の乳酸菌数と比較して判定してもよい。
前記飼育ネズミの細菌数が最も減少したときには、そのときから３０〜６０時間前（より４０〜５５時間前）に、飼育ネズミがストレス被曝したと判定することができる。
前記乳酸菌のうち、Lactbacillus属細菌が、細菌数の減少が容易に理解しやすいので、好ましい。
【００３８】
本技術における糞便の細菌叢変化から、日常起こりえるストレスの判定を行うことが可能となる。
【００３９】
本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
〔１〕  飼育ネズミの糞便の性質変化に基づく飼育ネズミがストレスに被曝したことを判定する方法。好適には、糞便のｐＨ変化である。
〔２〕  前記糞便の性質変化が、糞便のｐＨ変化、糞便の臭気変化、糞便の細菌叢変化から選ばれる１種又は２種のものである前記〔１〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【００４０】
〔３〕  前記糞便のｐＨ変化において、指標ｐＨとの対比、測定開始時のｐＨとの対比、ｐＨの周期性、ｐＨの変動幅から選ばれる１種又は２種以上のものに基づく前記〔２〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔４〕  前記糞便のｐＨ変化において、指標ｐＨと比較して糞便のｐＨが高い場合、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔２〕又は〔３〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔５〕  前記糞便の最大ｐＨ値を測定した時間から５０〜７０時間前に、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔６〕  前記糞便のｐＨ値の揺れ幅が大きい場合に、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【００４１】
〔７〕  前記糞便の臭気変化において、臭気強度との対比及び／又は指標臭気との対比に基づく前記〔２〕項記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔８〕  前記糞便の臭気変化において、対照群の臭い強度と比較して臭い強度が増加した場合、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔２〕又は〔７〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔９〕  前記糞便の臭気変化において、当該臭気のうち、デカナール、ヘプタナール、トリメチルアミン、ヘキサナール、酪酸エチレン、イソブタノール、２−メチルブタナール、オクタノール、ノナナール、アセトアルデヒド、２，３−ブタンジオン、３−メチルブタナールから選ばれる１種又は２種以上のものを指標として、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔２〕、〔７〕又は〔８〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【００４２】
〔１０〕  前記糞便の細菌叢変化において、対照群の菌数との対比に基づく前記〔２〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔１１〕  前記糞便の細菌叢変化において、Lactobacillus属が減少した場合、前記飼育ネズミがストレス被曝したと判定する前記〔２〕又は〔１０〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【００４３】
〔１２〕  前記糞便の性質変化を、呈色試薬反応にて判断する前記〔１〕又は〔２〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔１３〕  前記呈色試薬が、ｐＨ指示試薬、気体検知試薬又は細菌検出試薬である前記〔１２〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
〔１４〕  呈色試薬を含む、飼育ネズミのストレス被曝判定材。
〔１５〕  ｐＨ指示試薬を含む床材及び気体検知試薬を含むフィルターから選ばれる１種又は２種以上である前記〔１４〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材。
【００４４】
〔１６〕  前記〔１４〕又は〔１５〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材を備えるディスポーザブルケージ。
〔１７〕  前記〔１４〕又は〔１５〕記載の飼育ネズミのストレス被曝判定材を用いる、飼育ネズミのストレス被曝判定方法。
【実施例】
【００４５】
以下に、具体的な実施例等を説明するが、本発明（本技術）はこれに限定されるものではない。
【００４６】
＜実施例１：マウスの腸内細菌叢の乳酸菌（Lactobacillus属）における菌数変化＞
〔１−１：マウスの飼育方法〕
実験動物として供されたマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア株式会社）２０週齢の雌マウスを用いた。室温は２５℃±５℃でケージ１つ当たり１匹の飼育数で飼育した。ケージ内は１００ｇの床敷きを敷き詰め、水と固形試料（ＭＦ：オリエンタル酵母社）を自由摂食させた。その組成は、１００ｇ当たり、粗蛋白質２３．１ｇ、粗脂質５．１ｇ、粗灰分５．８ｇ、粗繊維２．８  ｇ、可溶性無窒素分５５．３ｇ、水分７．９ｇ．カロリー３５９ｋｃａｌである。また、明暗リズムはＡＭ９：３０〜ＰＭ９：３０を明期、ＰＭ９：３０〜ＡＭ９：３０を暗期とした。
〔１−２：ストレスの種類〕
本実施例１において、「振とうストレス」と「床敷きなしストレス」の２種類のストレスを与えた。
「振とうストレス群」は水平方向に３ｃｍの幅で円の軌道を描く振とう機上で飼育した。この時の回転数は１００ｒｐｍの速度で行い、７２時間（３日間）飼育した。また、「床敷きなしストレス群」は、１００ｇの床敷きを取り除き飼育した。
尚、コントロールマウスは上記〔１−１：マウスの飼育方法〕に示した方法で飼育した。
【００４７】
〔１−３：糞便の採取方法〕
２４時間ごとに３日間糞便を採取した。また糞便の採取方法は、尿に触れることなくマウス肛門から排出される糞便をバイアルに採取し直ちに重量を測定した。その後直ちにリン酸緩衝液により懸濁し菌数測定に用いた。尚、糞便排出に要する時間は数秒から１０分以内であった。また、固形試料の摂食量と糞便の排出量測定は２４時間ごとに３日間固形試料と糞便を採取した。また糞便の重量測定は糞便を乾燥させた乾燥重量を測定に用いた。
〔１−４：マウス糞便中における常在細菌叢の解析〕
財団法人日本食品分析センターにて通常飼育のマウス糞便における常在細菌叢の解析を行った。用いた方法は培養法を基本とする各種選択培地、カタラーゼ活性、顕微鏡下における形態的同定法を用い、菌の同定分析は属以上の分類にて行った。サンプル数はＮ＝１とした。
【００４８】
〔１−５：糞便中におけるLactic acid bacteriaやLactobacillus属の菌数測定〕
リン酸緩衝液により希釈し、段階希釈法により１０−５倍まで希釈した糞便懸濁液から１００μｌ採取しde Man, Rogosa, Sharoe （ＭＲＳ）寒天培地(Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD)、Lactobacillus Selection（ＬＢＳ）寒天培地(Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD)上に塗布した。尚、用いたプレート径は１０ｃｍであった。培養は嫌気チャンバー（三菱ガス化学社製）でアネロパック（三菱ガス化学社製）と共に３７℃で４８時間、嫌気的に培養した。培養後に出現したコロニー数を算定した。コロニー形成数測定は２４時間ごとに３日間行った。
〔１−６：本実施例１に用いたマウスの試行数〕
摂食量、糞便量の計測に用いたマウスの供試数は、コントロール群６匹、振とうストレス群４匹、床敷きなしストレス群では４匹用の計１４匹を用いた。また、Lactic acid bacteriaの菌数測定に用いたマウスの試行数はコントロール群３匹、振とうストレス群３匹、床敷きなしストレス群では３匹の計９匹、Lactobacillus属の菌数測定に用いたマウスの試行数はコントロール群６匹、振とうストレス群６匹、床敷きなしストレス群では３匹の計１５匹を用いた。
〔１−７：統計解析〕
得られた摂食量、糞便数、糞便中のLactic acid bacteria、Lactobacillus属の差はｔ検定による検定を行った。統計的有意水準は０．０５未満とした。
【００４９】
〔１−８：ストレス下における摂食量と排便量の変化〕
初めにストレスによる餌の摂食量の変化を分析した。
「振とうストレス群」において、２４時間後の摂食量が劇的に減少した。しかし、その後の計測においては「コントロール群」と同様の量にまで回復した。「床敷きなしストレス群」においては４８時間後まで「コントロール群」と同様の傾向を示しており、７２時間後に若干の増加が認められたが統計的な有意差は認められなかった（図２Ａ）。これらの傾向は排便量においても同様の傾向を示した。
「振とうストレス群」においては、２４時間後に劇的に減少し、その後「コントロール群」と同様の値を示し摂食量と同様の傾向を示した。一方、「床敷きなしストレス群」においては、４８時間までは摂食量と同様の傾向を示していたが７２時間後に摂食量が増加した（図２Ｂ）。
【００５０】
〔１−９：マウス糞便中における常在細菌叢の解析〕
腸内細菌を構成する細菌叢の解析を簡易的な培養法と形態的観察により大枠の構成を解析した。その結果、Lactobacillus属が最も菌数として優勢細菌であり、Enterobacteriaceae属、Actinomycetes属がそれらに続いた。また、別のカテゴリーであるグラム性細菌に関しては、嫌気性グラム陽性桿菌が嫌気性グラム陽性無芽胞桿菌よりも多く存在した。これらのことから、マウスの糞便に存在する優勢細菌はLactobacillus属であることが示唆された。
【００５１】
〔１−１０：ストレスによるLactic acid bacteria、Lactobacillus属における菌数変化〕
Lactic acid bacteriaにおける菌数変化は図２Ａ及び図２Ｂと同様の傾向を示し、「振とうストレス群」における２４時間後の菌数が減少した（図３Ａ）。２４時間後におけるLactobacillus属のコロニー数の変化においても同様の傾向を示したが、予想に反して４８時間後の振とうストレス、床敷きなしストレスにおいて劇的な現象を示した。７２時間後においてはコントロールと同様の数値を示した（図３Ｂ）。
【００５２】
実験動物の品質を保証する観点、飼育環境下における動物福祉の観点から、実験動物が飼育環境においてストレス受けていないことを検証することは非常に重要である。
日常的に起こりえるストレスを模した「振とうストレス」、「床敷きなしストレス」をマウスに与えた。「振とうストレス群」において、２４時間後に摂食量と排便量が減少し、コントロールと同様の傾向までの回復を示した。これらの現象はマウスにおけるストレスの順応性を表していると考えられる。また、「床敷きなしストレス群」において、摂食量に対して排便量が増加したことはストレスによる消化運動効率の向上を示唆するものであった。これらのことから、２つのストレスは腸内における環境を著しく変化させる効果を持ち、腸内細菌への環境変化を引き起こし、糞便の性質を変化させる可能性を示唆した。
また、マウス糞便中における常在細菌叢の解析の結果、Lactobacillus属が優勢であることが示唆された。そこでLactobacillus属に着目しストレス付加実験を行った。その結果、「振とうストレス群」において、ＬＢＳ選択培地上で、腸内細菌のLactobacillusのコロニー形成数が減少した。このことは、摂食量とその結果減少する排便量の変化によるLactobacillusのコロニー数への減少変化への影響を示すものであった。
しかしながら、摂食量、排便量が減少しなかった「床敷きなしストレス群」における菌数減少はこのセオリーに当てはまらず、摂食量以外の経路による腸内細菌叢への影響を示した。また総じて腸内細菌叢の変化は腸管内の環境を変化させ、代謝物構成やその結果のpHも変化させる可能性も示唆できる。
【００５３】
よって、飼育環境下におけるストレスを模したこれら２つのストレスによりLactobacillus属のコロニー数が減少することが明らかになった。特に、ストレス付加（開始時）から４８時間後に、Lactobacillus属のコロニー数は著しく減少し、コントロール群と比較しても著しく減少していた。
そして、Lactobacillus属のコロニー数は飼育されているマウスのストレスに対するバイオインディケーターとしての潜在的利用価値があることが明らかとなった。
【００５４】
＜実施例２：ストレスを与えることによる糞便臭気の変化＞
〔２−１：マウスの飼育方法〕
上記〔１−１：マウスの飼育方法〕に従った。
〔２−２：ストレスの種類〕
上記＜実施例１＞において実行したストレスに加え、血糖値測定等において頻繁に用いられる「絶食ストレス」、マウスの密飼いや不適切なケージ使用による１匹あたり行動面積を制限した「行動制御ストレス群」を追加した。但し、ストレス時間を６０時間とした。具体的には、絶食ストレスは２４時間の絶食の後、給餌を復帰させ３６時間後に糞便を採取した。また、「行動制御ストレス群」は１５ｃｍ×１５ｃｍの透明なプラスチック製の箱にて飼育した。
〔２−３：本実施例２に用いたマウスの試行数〕
糞便臭気の定量解析に用いたマウスの供試数は、コントロール群６匹、床敷きなしストレス群３匹、振とうストレス群３匹、絶食ストレス群３匹、行動制御ストレス群３匹の計１８匹を用いた。
〔２−４：糞便の採取方法〕
上記〔１−３：糞便の採取方法〕に従った。
【００５５】
〔２−５：臭気成分分析〕
採取された糞便を直ちに重量を測定し、密閉バイアルに封入しＧＣ／ＭＳによるにおい分析まで４℃にて保存した。におい分析は、住化分析センター大分事業所に依頼した。
〔２−６：ヒト嗅覚によるにおい評価〕
６名（男性３名、女性３名）によるにおい評価を行った。本方法は、においの強度を５段階（０＝未検出，１＝認識強度（嗅覚閾値），２＝弱く臭う，３＝はっきりと臭う，４＝強烈に臭う）にて評価し、集計した強度はストレス群の平均値として算出した。また、においの表現も行い、その表現方法は被験者における自由な表現方法とした。また、サンプルはブラインド試験により糞便における情報は明かさずに、においの評価を行った。
〔２−７：におい物質の定量解析〕
２０ｍｇの糞便をヘッドスペース分析のためのバイアルへ移し、４０℃で１時間加熱した。糞便からの揮発性物質はマイクロスケールパージトラップＧＣ／ＭＳ( micro scale purge and trap gas chromatography-mass spectrometry: MPT-GC/MS) (MPT : Entech Instrument Inc., Simi Valley, CA, USA; GC/MS : Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)により分離された。
検出ピークの特定は、WILEY/NIH libraryによる２７５，０００物質のデータベースを参照し物質の同定を行った。また、それぞれの物質の濃度は各物質に対する機器の検出感度がトルエンと同様であるとの仮定のもと、トルエン換算により算定した。従って、トルエンのピークエリアと各物質のピークエリアを比較し濃度決定を行った（ｖｏｌ  ｐｐｍ）。
【００５６】
〔２−８：統計解析〕
ＡＮＯＶＡ解析はヒト嗅覚によるにおい評価とＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳの結果に対して行った。
ヒト嗅覚によるにおい評価におけるＡＮＯＶＡ解析において、グループ数はコントロールと他４ストレスの計５グループ、グループ間の自由度は４、グループ内の自由度は２５であった。ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳにおけるＡＮＯＶＡ解析において、グループ数はコントロールと他４ストレスの計５グループ、グループ間の自由度は４、グループ内の自由度は１３であった。本実験における統計的な有意差は０．０５以下であった。
【００５７】
〔２−９：ストレスに特異的な物質の定量解析〕
検出された物質の濃度は各物質特有の嗅覚閾値（ＴＬ）濃度と比較した。嗅覚閾値以下の場合、０点、そのほかは下記の通りのスコアリングを行い、ＴＬ値との相対的な比較を行った。
スコアリング
０  ＝  ［＜ＴＬ］
１  ＝  ［ＴＬ≦，  ＜３×ＴＬ］
２  ＝  ［３×ＴＬ≦，  ＜１０×ＴＬ］
３  ＝  ［１０×ＴＬ≦，  ＜３０×ＴＬ］
４  ＝  ［３０×ＴＬ≦，  ＜１００×ＴＬ］
５  ＝  ［１００×ＴＬ≦，  ＜３００×ＴＬ］
６  ＝  ［３００×ＴＬ≦］
【００５８】
〔２−１０：ヒト嗅覚によるにおい評価〕
表１に嗅覚評価のにおい強度、においの表現を示した。コントロール群と比較し、絶食ストレス群以外の全てのストレス群においてにおい強度が増加した。また、ＡＮＯＶＡ解析の結果、コントロール群と床敷きなしストレス群、コントロール群と行動制御ストレス群、絶食群と行動制御ストレス群において統計的な有意差が見られた。
【００５９】
【表１】
2014183807.tif 000003
【００６０】
〔２−１１：ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳによるにおい物質の定量〕
ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳにより物質の特定を行い、におい閾値の高い１７種類の物質を選出した。その結果、１０種類のアルデヒド類、２種類の硫黄化合物の他、アルコール類、アミン類、ケトン類、エステル類、脂肪酸類が検出された（表２）。これらの物質の中で、最も高い濃度を示していたのはアセトアルデヒドであり、３．７ｐｐｂから２６．３ｐｐｂの範囲で検出された（表３）。また、２番目に高い値を示していたトリメチルアミンであり、トリメチルアミンは我が国において悪臭防止法による規制対象の一つに指定されている。トリメチルアミンの臭気は強烈悪臭で、濃度によっては魚臭、あるいはアンモニア状臭を呈する。
本におい閾値の高い１７種類の物質は、床敷きなしストレス群、絶食ストレス群において検出された。
【００６１】
【表２】
2014183807.tif 000004
【００６２】
【表３】
2014183807.tif 000005
【００６３】
〔２−１２：ストレスによるにおい物質濃度の統計解析〕
ＡＮＯＶＡ解析により各ストレスにおける１７種類の統計的有意差を求めた。その結果ヘプタナール、ヘキサナール、ペンタナールにおいて統計的な有意差が確認された。更にＴｕｋｅｙ法を用いて多重比較を行った。
以下、「コントロール群」を（Ｃ）、「床敷きなしストレス群」を（Ｎ）、「振とうストレス群」を（Ｓ）、「絶食ストレス群」を（Ｆ）、「行動制御ストレス群」を（Ｍ）とした。
ヘプタナール；  Ｃ  ａｎｄ  Ｍ、Ｎ  ａｎｄ  Ｍ、Ｓ  ａｎｄ  Ｍ、Ｆ  ａｎｄ  Ｍ、ヘキサナール；  Ｎ  ａｎｄ  Ｓ、Ｎ  ａｎｄ  Ｍ、ペンタナール；  Ｃ  ａｎｄ  Ｓ、Ｎ  ａｎｄ  Ｓ、Ｆ  ａｎｄ  Ｓ、Ｍ  ａｎｄ  Ｓのペアにて有意差が見られた。
これらから、コントロールと全てのストレスに共通した物質における有意差は見られなかった。
【００６４】
〔２−１３：ストレスによるにおい物質出現パターン解析〕
表３に示した物質の濃度とＴＬとの相対的な分類によりスコアリングを行った（表４）。イソ酪酸、ペンタナール、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ブタノールはＴＬより低い値を示した。また、トータルのスコアはＣ；  ２０、Ｎ；  ３４、Ｓ；  １２、Ｆ；  ２３、Ｍ；  １４であった。
【００６５】
【表４】
2014183807.tif 000006
【００６６】
ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳによるにおい物質の選定により１７種類の化合物をリストアップした。特に悪臭指定物質のトリメチルアミンは嗅覚閾値が低く、「床敷きなしストレス群」と「絶食ストレス群」において検出された物質である。しかしながら、検出された濃度とヒト嗅覚によるにおい評価によるにおい強度の値とは相関は認められなかった。
また、ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳによる各物質の検出濃度を各ストレス間にてＡＮＯＶＡ解析を行った結果、ヘプタナール、ヘキサナール、ペンタナールにおいて有意差が認められた。しかし、Ｔｕｋｅｙ法による多重統計解析を行った結果、ストレスにおける共通な物質の検出には至らなかった。
これらのことからも、糞便のにおいは、高濃度一つのにおい物質により決めることは難しいと考えられる。そこで検出されたにおい物質やその濃度そのものではなく、ＴＬとの比較を考察すべきと考えた。
表４では、１７種類のにおい物質をＴＬにより選別し、ＴＬ以下の物質を棄却した。表４では、また、スコアリングによる物質による総合的なにおい強度とそのにおいパターンを示した。つまり、物質の濃度解析とＴＬ選別、におい強度解析、パターン解析の方法によりストレスに曝されているマウスを検出できる可能性を示した。
例えば、ＴＬ以上のトリメチルアミンとヘキサナールを同時に検出した場合は、「床敷きがない」又は「餌を食べていない」のストレスを受けている可能性がある。
また、ＴＬ以上のデカナールとヘプタナールが同時に検出された場合は、「行動制御」のストレスを受けている可能性がある。
また、ＴＬ以上のアセトアルデヒド、２，３−ブタンジオン、３−メチルブタナールが同時に検出され、イソブタナール、オクタナール、ノナナールが検出されなかった場合、「振とうストレス」のストレスを受けている可能性がある。
【００６７】
よって、ストレスに曝されたマウスから得られた糞便のヒトの嗅覚及びＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳによる定量解析により、糞便からの臭気が変化することが明らかになった。また、ＭＰＴ−ＧＣ／ＭＳによる定量解析によるＴＬとの相対的な比較によるスコアリング方法は、ストレスに曝されたマウスを検出するのに重要な１２種類のにおい物質（表３参照）を明らかにした。
【００６８】
＜実施例３：ストレスを与えることによる糞便ｐＨの変化＞
〔３−１：マウスの飼育方法〕
＜実施例１＞に従った。但し、用いたマウスは１５週齢から３０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスを実験に用いた。
〔３−２：ストレスの種類〕
＜実施例２＞に従った。
〔３−３：実験に用いたマウスの試行数〕
糞便ｐＨ変化の解析に用いたマウスの供試数は、コントロール群６匹、床敷きなしストレス群６匹、振とうストレス群６匹、絶食ストレス群６匹、行動制御ストレス群６匹の計３０匹を用いた。また、継時的な糞便ｐＨモニタリングに用いたマウスはコントロール群３匹、床敷きなしストレス群３匹、振とうストレス群３匹、絶食ストレス群３匹、行動制御ストレス群３匹の計１５匹を用いた。尚、継時的な糞便の採取は上記ストレスを与え終わった日を０ｄとした。
〔３−４：糞便の採取方法〕
＜実施例１＞に従った。
〔３−５：糞便ｐＨの測定方法〕
得られた糞便を完全にホモジェナイズし、蒸留水にて１００倍希釈した（Ｗ／Ｖ）。得られた懸濁液をｐＨメーター(DKK-TOA CORPORATION., Tokyo.)にて測定した。
このとき、糞便の重量は２０〜４０ｍｇ程度に対し、溶液量２ｍｌを添加した。この添加量によって、ｐＨ指示試薬を目視により的確に判断することができた。
〔３−６：ｐＨ指示試薬の調整〕
ブロモクレゾールグリーン(Tokyo Chemical Undustry CO., LTD. Tokyo.)４０ｍｇをエタノール(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo.)１００ｍｌに懸濁しＢＣＧ溶液とした。
また、ＢＴＢ溶液でも、ＢＣＧ溶液のように、呈色反応が生じ、肉眼で識別することが可能であった。
【００６９】
〔３−７：ストレスによる糞便ｐＨの変化〕
各ストレス群におけるｐＨの変化を確認したところ、全てのストレスの群において共通して２４時間後にｐＨの上昇がみられた（図４Ｂ−Ｅ）。また、「絶食ストレス群」においては４８時間後に更にそのｐＨは上昇し最も高い値を示した（図４Ｂ）。また、共通して２４時間から４８時間後にアルカリ性への強い傾倒を示し、６０時間後ではストレス前のｐＨへ戻る傾向にあった。また、６０時間後ｐＨの値がストレスを与える前と比較して高い。これらのことからストレスに対する順応性が観察されたことと、その順応性は６０時間以内では元に戻らないことが示された。
〔３−８：ストレス後の糞便ｐＨ変化の長期的な変化〕
図５Ａ−Ｅに示すように、糞便のｐＨ測定を１０日ごとに、６０日間計測を行った。「コントロール群」は、最大７．５５、最小７．００であり、日ごとのｐＨの振れ幅はなだらかなものであった（図５Ａ）。これに対し、「行動制御ストレス群」（最大７．７５、最小６．７５）、「振とうストレス群」（最大８．０５、最小６．７０）、「床敷きなしストレス群」（最大７．６９、最小６．８０）において、日ごとの振れ幅が大きいことが明らかになった（図５Ｂ−Ｅ）。特に、「行動制御ストレス群」は６０日目まで値が乱れ続け、「振とうストレス群」は実験終了直後から値のばらつきが見られた（図５Ｃ−Ｄ）。「床敷きなしストレス群」において、実験終了後は安定していたが、２０日目に大きくばらついた（図５Ｅ）。
【００７０】
〔３−９：ストレスマウスから得られた糞便におけるｐＨ指示試薬による呈色反応〕
振とうストレスを与え、６０時間後の糞便とコントロール糞便をｐＨ指示試薬であるＢＣＧ溶液に浸透させ反応させた。その結果、反応させて直ちに「コントロール群」の糞便と「振とうストレス群」の糞便とで、色の違いが見られ、前者のコントロール群はやや黄色であるのに対し後者のストレス群は緑色であった。
【００７１】
糞便のｐＨ変化は、ストレスを与えている最中だけでなく、長期間その変化が持続することが示された。このｐＨ変化を利用することにより、マウスの状態を簡便に日々モニタリングすることができる。実験動物の飼育作業におけるより簡便な検出方法と言える。
例えば、ｐＨ指示試薬に糞便を浸透させることにより、生理的な変化を色として呈色することができる。また、この簡便性は多くの実験動物が存在するネズミ飼育室において、瞬時に飼育ネズミの状況判断に利用できることから、飼育ネズミのモニタリングにおけるファーストスクリーニングとして活用することが考えられる。また、ｐＨ指示試薬を含ませた床材を利用すれば、糞便のｐＨ変化を簡便にモニタリングできる。
【００７２】
よって、各ストレスの被曝によって飼育ネズミの糞便のｐＨは変化し、その変化は共通した変化のパターンが見られた。ストレスを与えてから２４時間から４８時間の内にｐＨのアルカリ性への傾向を示し、６０時間後にはｐＨが無ストレス時に近くなった。また、これらのストレスが終了した後、継時的な糞便ｐＨ変化を測定したところ、「コントロール群：と比較し不安定になることが明らかになった。またＢＣＧ溶液による「振とうストレス群」と「コントロール群」の糞便の呈色反応は明らかな色の違いが確認できた。
また、無ストレスマウス糞便は中性付近であったが、これと比較してストレスマウスは塩基性に傾く傾向が認められた。このため、ＢＴＢ溶液の方が、ＢＣＧ溶液と比較して、肉眼で識別することが容易であった。
これらのことから、実験動物における糞便のｐＨを利用した非侵襲的モニタリング方法を提供できる。
【００７３】
＜実施例４：ケージ内気相を利用した実験動物自動モニタリングシステムの開発＞
これまでマウスに対してストレスを加えることにより、生理的な変化を糞便の性質を通して捉えることができた。特に、糞便の腸内細菌叢の変化、糞便の臭気の変化、糞便のｐＨの変化により捉えることができた。これらの糞便の性質変化をより簡便に、より非侵襲的な３つのモニタリングシステムの開発を行った。
上記＜実施例１＞より、ケージ内における糞便は１日約３ｇ程度排出され、これらのケージは２週間程度ケージを交換することはない。その為、糞便は、ケージ内における気相の性質を決定する大きな要因と言える。先ほども示した通り、ストレスによる糞便の性質は変化することから、この気相の特徴を捉えることによりその変化を捉えることが出来ると考えられる。そこで、ケージ内気相の特徴をモニタリングするためにケージにフィルターを装着できる個別換気方式の動物飼育ラックを用い、その気流とフィルターとの呈色反応によりケージ内気相を視覚化するモニタリング方法の開発を行った。
【００７４】
〔４−１：マウスの飼育方法〕
＜実施例３＞に従った。但し、飼育に用いた飼育ケージ、飼育ラックはイノバイブ個別換気システム(Innovive Inc. San Diego, USA)を用い、飼育ケージの排気口に本研究にて設計したフィルターを装備した。
尚、マウス飼育ケージ(Innovive Inc. San Diego, USA)は、使い捨て可能な飼育ケージである。当該ケージは、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)樹脂により整形され、ケージは製造時にγ線照射により滅菌され、供給されるものである。
また、飼育ラックは、1つのラックで１６８ケージ収納が可能なものがある。給排気システムを利用すると、ＨＥＰＡ(highly efficient particulate removing air)フィルターを通した清浄度の高い空気を各ケージに供給することが可能である。また、床敷き交換頻度は２週間に１度で行うことが可能であり、交換の際には、床敷き交換チャンバーで行うことが可能であり、当チャンバー内で床敷きの廃棄を行うことが可能である。
【００７５】
〔４−２：ストレスの種類〕
＜実施例３＞に従った。但し、汎用的なストレスを更に加味するため、採血時の保定や、胃潰瘍モデルとして用いられている拘束ストレスを加えた。本ストレスは直径３ｃｍ、長さ１０ｃｍの筒状のチューブにて保定し、３時間静置するものである。
〔４−３：実験に用いたマウスの試行数〕
ニンヒドリンフィルターを用いた飼育に用いたマウスの供試数は、コントロール３匹、拘束ストレス３匹、床敷きなしストレス３匹、振とうストレス３匹、絶食ストレス３匹、行動制御ストレス３匹の計１８匹を用いた。それぞれ、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３とした。
〔４−４：モニタリング用フィルターの製作〕
＜実施例２＞より、糞便から放出される揮発性物質は様々な性質を持つことが明らかになった。例えば、トリメチルアミンのアミン類、アセトアルデヒドなどのアルデヒド類などを放出していることを示した。そこで、これらの物質を元に検出フィルターの種類を選定した（表５）。
ニンヒドリン試薬は、ニンヒドリン（０．３ｇ）を酢酸（３ｍｌ）、ｎ−ブタノール（１００ｍｌ）と混和し溶液とした。
また、Ｖａｎ  Ｕｒｋ試薬は、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．８ｇ）、濃硫酸（１０ｍｌ）、エタノール（９０ｍｌ）を混和し溶液とした。
塩化鉄（III）試薬は、塩化鉄（III）（１．０ｇ）を５０％メタノール（１００ｍｌ）と混和した。
これら作製した各種溶液に、不織布を３０分間浸透させ、乾燥させたものを各種フィルターとした。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
〔４−５：モニタリング用フィルターを挿入したケージによる飼育〕
これら作製した各種フィルターを装着したカートリッジを作製し、このカートリッジが装着されたケージ内で５日間、コントロール群のマウスを飼育した。
また、２４時間ごとに写真を撮影し、フィルターの変化を視覚的にとらえた。
また、２ｃｍ×２ｃｍ四方に切り取られたニンヒドリンフィルターが装着されたケージ内で１６８時間（７日間）、各種ストレスを与えたマウスを飼育した。
【００７８】
〔４−６：各種フィルターを装着したカートリッジの呈色反応〕
「コントロール群」のマウスにおいて、モニタリング用フィルターにおける呈色反応を検証した。その結果、４８時間までは呈色反応を示さなかったが、７２時間後にニンヒドリンフィルターが、若干、紫色変化を呈した。その後、１２０時間後まで、その他のフィルターは呈しなかった。
〔４−７：ストレスによるニンヒドリンフィルターの呈色反応の変化〕
上記に示した様々な飼育ストレスによるニンヒドリンフィルターの変化を検証した。「コントロール群」において、上記の通り７２時間頃に薄く呈色反応を示し、その後１６８時間にかけてその色が紫色呈色反応を示した。これに対し、「拘束ストレス群」Ｎｏ．１のフィルターはフィルター装着後の２４時間後に既に呈色反応を示した。「絶食ストレス群」のＮｏ．１、３のフィルターにおいて、１４４時間後に強力に色付き、「絶食ストレス群」のＮｏ．３において、紫色呈色反応ではなく黄色を呈した。また、「床敷きなしストレス群」のＮｏ．１において、コントロールと比較し濃い紫色呈色反応を示した。
１８日後における各種フィルターの呈色反応を検証した。その結果、「拘束ストレス群」のＮｏ．１の他、Ｎｏ．３にも黄色の呈色反応を示していた。また、「床敷きなしストレス群」のＮｏ．１と、「絶食ストレス群」の紫色に呈色したＮｏ．２のフィルターの一部に黄色い呈色を示していた。
１６８時間後において変化が見られなかった、「行動制御ストレス群」においては、Ｎｏ．１のフィルターが「コントロール群」よりも濃い紫色を呈した。
【００７９】
本研究では、ケージ気相内の物質を検知することにより非侵襲的にマウスの状態をモニタリングするシステムの開発の検討を行った。その結果、本実験の飼育環境下においてニンヒドリンフィルターが反応を示した。また、その結果はストレスにより色の濃さと、色の違いに変化が現れた。
ニンヒドリン反応はアミノ酸とニンヒドリン２分子が縮合してルーヘマン紫という青紫色の色素とアミノ酸が還元されて出来るアルデヒドが生成するものによると考えられる。また、アミノ酸がプロリンの場合、ニンヒドリン１分子としか反応しないため黄色の呈色反応を示す。
本研究において作成したニンヒドリンフィルターの呈色反応は紫色と黄色の反応を示していることから、ストレスによる気相が変化していることが示唆される。しかしながら、同じストレスにおいてもフィルターが同様に変化しない場合もあるため、マウスによってストレスを受ける影響が異なる可能性も考えられる。また、最終的な反応の判断に長時間かかることなどからニンヒドリンの濃度を上昇させ反応時間を短く、また、本フィルターへの流入風速を上げることにより更に短期間で反応が確認できると考えられる。
＜実施例２＞より、「床敷きなしストレス群」と「絶食ストレス群」において、糞便からトリメチルアミンの放出が見られた。アミン系の物質としては唯一トリメチルアミンだけであった。今回のフィルターの変色が著しかった「絶食ストレス群」において、また、一部ではあるが「床敷きなしストレス群」のＮｏ．１も反応していたことから、これらのストレスとトリメチルアミンに何らかの関係性が示唆される。
【００８０】
本フィルターによりケージ内気相をモニタリングすることに成功した。また、ケージ内気相はストレスにより変化することが本研究におけるフィルターの呈色反応により明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本技術によれば、飼育時における不意のストレスにより飼育ネズミの生体内で起きている反応を非侵襲的にモニタリングする方法と、その結果起きるケージ内環境変化のモニタリング手法を提供することができる。特にストレスに被曝した飼育ネズミの糞便の臭気変化、ｐＨ変化を定量的に行うことができるので、飼育ネズミの管理・モニタリングシステムの構築が可能となり、このようなことは従来行われていなかった。
また、これら管理、モニタリングシステムは、飼育動物のミクロ環境としての飼育動物自身の状況及びそれに付随する飼育ゲージ内雰囲気の両方のモニタリング、並びに施設の適正なシステム運用に利用することができる。これらモニタリングシステムの結果から、フィードバックされることにより、元ある飼育環境の是正も行うことが可能となる。本技術により、このようなフィードバックシステム可能な動物飼育施設を構築することも可能である。
このように本技術により、研究・実験精度の向上や実験動物の福祉の向上を図ることが可能となるので、本技術は産業上、非常に有益である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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