(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギーおよび喘息の汎用的な治療が可能な新規な薬物候補の提供。【解決手段】ａ）ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害し、ｂ）遊離のＩｇＥおよび細胞に結合しているＩｇＥに結合し、かつｃ）アナフィラキシー性ではない特性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来するＩｇＧ１アイソタイプの抗ＩｇＥＦａｂ（抗体断片）、および、血中からＩｇＥ及びＩｇＥ保有細胞を枯渇することができ、アトピー症状を治療するためのＦａｂを含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害し、
ｂ）遊離のＩｇＥおよび細胞に結合しているＩｇＥに結合し、かつ
ｃ）アナフィラキシー性ではない
特性を有するＩｇＧ１アイソタイプの抗ＩｇＥ  Ｆａｂ（抗体断片）。
【請求項２】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来する請求項１に記載のＦａｂ。
【請求項３】
合成または組換えによって製造される請求項１に記載のＦａｂ。
【請求項４】
ヒト化フレームワーク領域を含む組換えＦａｂである請求項３に記載のＦａｂ。
【請求項５】
アトピー症状の治療用薬物を製造するための請求項１から４のいずれかに記載のＦａｂの使用。
【請求項６】
アトピー症状が急性アトピー症状である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
アトピー症状が慢性アトピー症状である請求項５に記載の使用。
【請求項８】
ＩｇＥおよびＩｇＥ保有細胞を血中から枯渇させる請求項５から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
使用が体外である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＩｇＥ保有細胞が細胞レベルでの治療介入の標的である請求項５から７のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーおよび喘息を治療するための新規な化合物に関する。より正確には、本発明は新規な抗ＩｇＥ  Ｆａｂ（抗体断片）およびその医学的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型アレルギーは、免疫性過敏症であり、世界の人口のほぼ２５％が罹患している［１］。アレルギー患者では、他の点では無害な抗原（花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、かびアレルゲン、毛／鱗屑アレルゲン）に対するＩｇＥ抗体の産生が不適正に増加する［１、２］。エフェクター細胞（例えば、肥満細胞、好塩基球）にＦｃεＲＩを介して結合しているＩｇＥ抗体がアレルゲンにより媒介されて架橋すると、生理活性なメディエイタ（ヒスタミン、ロイコトリエン）が即座に放出され、アトピー（例えば、アレルギー性鼻炎、結膜炎、喘息およびアナフィラキシーショック）の急性症状を引き起こす［３］。アレルゲンがプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、単球、樹状細胞）上のＩｇＥ−ＦｃεＲＩを介して提示されると、Ｔ細胞が活性化され、Ｔｈ２サイトカインが放出されて慢性の遅延型疾患症状（アトピー性皮膚炎、慢性喘息）をもたらす［４〜６］。
【０００３】
したがって、アレルゲンとアレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用は、アトピーおよび様々な形式の喘息において鍵となる病理機序である。ＩｇＥ抗体［７、８］およびＦｃεＲＩ［９］が同定されこれらの特性が明らかにされて以来、これらの相互作用ドメインの解析、特にアトピー性疾患の汎用的な治療法のためのこの相互作用の競合物質を同定するために多大な努力が払われてきた［１０］。ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩのα鎖の相互作用部位を決定しようとする試み［１１〜１４］としては、組換えタンパク質／ペプチド［１５〜１７］、突然変異タンパク質［１４］、化学合成したペプチド［１８、１９］のスクリーニング、および構造解析［２０］などがあった。また、ＩｇＥがＦｃεＲＩに結合するのを防止するために、ＩｇＥの受容体結合部位に対して自己抗体応答を誘導する試みがなされた［２１］。他の治療上の取り組みとしては、ＩｇＥ由来のペプチド［１５、１８、１９］、核酸［２２］およびヒト化抗ＩｇＥ抗体［２３〜２５］の開発がある。前記競合物質のほとんどは、高度な細胞アッセイの評価結果（例えば、好塩基球のヒスタミン放出）［２６］とあわせた手間のかかる構造的、理論的設計（ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅｓｉｇｎ）［１９］または広範なｉｎ  ｖｉｖｏでの試験［２７］から得られる。これまで多数の化合物が記述されてきたが、この分野ではまだ改良の必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明により、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用の新規な阻害物質／競合物質でありＦａｂ  １２と呼ばれる抗体断片である独特な化合物が同定された。
【０００５】
Ｆａｂ  １２は、血中ＩｇＥ抗体ならびにＩｇＥ保有細胞を枯渇させるために使用することができるので、アトピーおよび喘息の汎用治療用の候補分子となり得る。Ｆａｂ  １２は、主として、急性または慢性アトピーの治療、特にＩ型アレルギーおよび喘息の治療用薬物として使用することが意図される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、以下の諸特性を有する、すなわち、
ａ）ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害し、
ｂ）遊離のＩｇＥおよび細胞に結合しているＩｇＥに結合し、かつ
ｃ）アナフィラキシー性ではない
ＩｇＧ１アイソタイプの抗ＩｇＥ  Ｆａｂ（抗体断片）を提供する。Ｆａｂは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から誘導することができる。
【０００７】
あるいは、Ｆａｂは合成または組換えにより製造される。
【０００８】
好ましい一実施形態では、Ｆａｂはヒト化フレームワーク領域を含む組換えＦａｂである。
【０００９】
本発明のＭａｂ  １２およびＦａｂ  １２を産生するハイブリドーマ細胞系は、２００２年３月２７日に受託番号０２０３２７３４でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４  ＯＪＧ、ＵＫに寄託されている。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、アトピー症状の治療用薬物を製造するための本発明によるＦａｂの使用を提供する。アトピー症状は、急性アトピー症状でも慢性アトピー症状でもよい。また、本発明は前記Ｆａｂを使用してＩｇＥおよびＩｇＥ保有細胞を血中から枯渇させることにも関する。前記Ｆａｂは体外で使用することが好ましい。
【００１１】
本発明による別の使用は、細胞レベルでの治療介入のためにＩｇＥ保有細胞への標的化である。すなわち、エフェクター細胞、形質細胞（Ｂ細胞）および／または抗原提示細胞を不活性化するため、本発明によるＦａｂに、例えば誘導体化によって、例えば毒素を付与する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】電子顕微鏡写真。未反応キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥ分子の一視野の電子顕微鏡写真（ａ）。過剰モル（ｂ）または等モル（ｃ）のｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ’）２と複合体を形成したＩｇＥの電子顕微鏡写真ギャラリーおよび解釈図である。（ｄ）は過剰モルのｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ’）２と反応したＩｇＥである。ＩｇＥ  Ｆｃの上向きのＣ末端領域を斑点を付けて示す。矢印は、タンパク質がＺ軸方向で最も厚い領域を示す（ｄ）。すべての図で、横棒は２５ｎｍに相当する。解釈図の白抜きの図形はＩｇＥ、塗り潰した図形はｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ）２を表す。
【図１−２】電子顕微鏡写真。未反応キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥ分子の一視野の電子顕微鏡写真（ａ）。過剰モル（ｂ）または等モル（ｃ）のｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ’）２と複合体を形成したＩｇＥの電子顕微鏡写真ギャラリーおよび解釈図である。（ｄ）は過剰モルのｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ’）２と反応したＩｇＥである。ＩｇＥ  Ｆｃの上向きのＣ末端領域を斑点を付けて示す。矢印は、タンパク質がＺ軸方向で最も厚い領域を示す（ｄ）。すべての図で、横棒は２５ｎｍに相当する。解釈図の白抜きの図形はＩｇＥ、塗り潰した図形はｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ）２を表す。
【図２Ａ】ｍＡｂ  １２はヒト好塩基球を脱感作することができる。濃縮した好塩基球を、ｍＡｂ  １２、Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２、ＩｇＥとの反応性がない対照抗体（ｃｏ−ａｂ）または緩衝液単体とプレインキュベートした。次いで、細胞をいくつかの濃度のｍＡｂ  １２（ａ）またはＥ−１２４−２−８／Ｄε２（ｂ）（ｘ軸）に曝した。ｙ軸は、総ヒスタミンに対する遊離したヒスタミンの割合を示す。結果は３回繰返した平均である。
【図２Ｂ】ｍＡｂ  １２はヒト好塩基球を脱感作することができる。濃縮した好塩基球を、ｍＡｂ  １２、Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２、ＩｇＥとの反応性がない対照抗体（ｃｏ−ａｂ）または緩衝液単体とプレインキュベートした。次いで、細胞をいくつかの濃度のｍＡｂ  １２（ａ）またはＥ−１２４−２−８／Ｄε２（ｂ）（ｘ軸）に曝した。ｙ軸は、総ヒスタミンに対する遊離したヒスタミンの割合を示す。結果は３回繰返した平均である。
【図３】Ｆａｂ  １２は、アナフィラキシー活性がない。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２、ａｂ１２）およびＦａｂ  １２（ｘ軸）の濃度を増加させながら、ヒト好塩基球と共にインキュベートした。ｙ軸は、総ヒスタミンに対する遊離ヒスタミンの百分率である。結果は２回繰返し測定の平均である。
【図４】アトピー患者の血液から抗体１２を用いて精製した細胞のギムザ染色したサイトスピン試料である。図４は代表的な細胞調製物の全体像であり、図５は精製した好塩基球の近接写真である。
【図５】アトピー患者の血液から抗体１２を用いて精製した細胞のギムザ染色したサイトスピン試料である。図４は代表的な細胞調製物の全体像であり、図５は精製した好塩基球の近接写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を、実験の項ならびに添付の図面とあわせてより詳細に記述する。
【００１４】
実験
Ｉ．キメラＢｅｔ  ｖ  １特異的ＩｇＥ抗体Ｂｉｐ  １の生成および特性決定
主要アレルゲンとその対応するＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの分子モデルを確立するために、本発明者らは、主要なカバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １に対する特異性を有するキメラモノクローナルＩｇＥ抗体Ｂｉｐ  １を構築した［２８、２９］。
【００１５】
Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＢｉｐ  １ハイブリドーマ細胞［２９］からメッセンジャーＲＮＡを単離した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｍｏｕｓｅ  ＳｃＦｖ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて免疫グロブリンＨ鎖可変領域（ＶＨ）を特異的に増幅した。ヒトＶＨ−４リーダー配列（Ｌ）をＰＣＲで増幅し、その後Ｂｉｐ  １  ＶＨ領域にＰＣＲにより融合させた。ＬＶＨ断片の配列決定を、Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で実施した。Ｉｇプロモーター領域およびエンハンサー領域の制御下にある分泌された形のヒトＩｇＥをコードするゲノム領域を含むε発現プラスミドのＣｌａ  Ｉ／Ｓｐｅ  Ｉ部位にＬＶＨ断片をサブクローニングした。この構築物をＢｉｐ  １ハイブリドーマ細胞系にエレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ）により導入した。ゲネチシン（ｇｅｎｅｃｉｔｉｎ）を使用して安定なトランスフェクタントを培地中で選択した。ＳＰ２／０細胞への融合をＰＥＧを用いて実施した。ＩｇＥのみを産生するクローンをＥＬＩＳＡで同定し、サブクローニングしてモノクローナル細胞系を作製した。キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥを分泌する３種の異なるクローンのうち、クローン８５９をキメラＩｇＥの発現に優れる（１１μｇ／ｍｌ）ことから選択した。特異的なＩｇＥ全体を、血清無添加培地中で増殖したクローン８５９の上清について、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＰ  ＳｙｓｔｅｍおよびＵｎｉ  ＣＡＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の両方のシステムで試験した。
【００１６】
ｒＢｅｔ  ｖ  １  ５ｍｇをＡｍｉｎｏＬｉｎｋカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に結合させてアフィニティーカラムを調製した。キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥ抗体（２６００ｋＵ／ｌ  ＩｇＥ）を含有する細胞培養上清（１００ｍｌ／ラン）をＢｅｔ  ｖ  １アフィニティーカラムにかけた。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合したキメラＢｉｐ  １  ＩｇＥを５Ｍ  ＭｇＣｌ２で溶出させた。Ｂｉｐ  １  ＩｇＥを含有する溶出液を４℃でＰＢＳで透析し、凍結乾燥させた。キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥ抗体約９０μｇを精製することができた。精製した凍結乾燥キメラＩｇＥをリン酸緩衝食塩水に溶解した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのクーマシーブリリアントブルー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ、Ｕ．Ｋ．）染色、ならびにニトロセルロースにブロットしたキメラＢｉｐ  １  ＩｇＥの抗ヒトＩｇＥ抗体への曝露によって、キメラＢｉｐ  １  ＩｇＥの純度、濃度および質を分析した。キメラＢｉｐ  １は、１９０ｋＤａの１本のバンドとして移動して分解した徴候は見られず、抗ヒトＩｇＥ抗体と反応した（データ示さず）。
【００１７】
ＩＩ．組換えタンパク質および精製タンパク質の１２５Ｉ標識
組換えカバノキ花粉アレルゲンｒＢｅｔ  ｖ  １［２８］を既報［３０］の通りにＥ．ｃｏｌｉで発現させ、精製した。組換えバキュロウイルスで発現したヒトＦｃεＲＩのα鎖を精製した［１７］。同程度の量（３０μｇ）の精製タンパク質をクロラミンＴ法で１２５Ｉ標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。放射能標識したタンパク質の比活性を、γカウンター中の等量のアリコートをγカウントして決定した（Ｗａｌｌａｃｈ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）。
【００１８】
ＩＩＩ．抗ＩｇＥ抗体およびその断片
１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（ＲＡＳＴ）はＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。マウスモノクローナルＩｇＧ１抗カバノキプロフィリン抗体４Ａ６は記述されている［３１］。精製したＩｇＥ（ＮＤ）Ｆｃ０．５ｍｌを腹腔内に注射してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することにより、１パネル２５個のマウス抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を産生させた。初回は、ＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）で希釈して、７５μｇを注射し、その後３０、３３および３４日に生理食塩水で希釈して、５０μｇのブースター注射を実施した。ＳＰ２／０細胞系パートナー（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐａｒｔｎｅｒ）と融合させることによってハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのクローニングを限界希釈法により実施した。目視検査（ｏｃｕｌａｒ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）で判定して単一細胞起源のウェルからの培地を、受動的に吸着させたＩｇＥ（ＮＤ）を含むポリスチレンの９６ウェルフォーマットを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。アフィニティー精製したウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）を検出抗体として使用した。等電点電気泳動Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＢＩＡｃｏｒｅでの測定（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって、クローン性およびマウスＩｇＧ１アイソタイプを決定した。回転ボトル中のＤＭＥＭの血清無添加培地中でｍＡｂ  １２が産生した。得られた０．４５μｍフィルターろ過培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有するｍＡｂ  １２を、ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、１０ｃｍ  ＸＫ５０プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で３０ｃｍ／ｈの線流速で精製し、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝液で溶出させた。得られた、ｍＡｂを含むピークを、１．０Ｍ  ＮａＯＨで中和し、ＰＭ  ３０フィルターの付いたＡｍｉｃｏｎ限外ろ過セルで最終濃度５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その後ｐＨ７．４の０．０２Ｍリン酸緩衝食塩水で平衡にした１００ｃｍのＸＫ５０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でのサイズ排除クロマトグラフィにかけた。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）による測定で９５％を超えた。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてパパイン消化により、精製したｍＡｂ  １２からＦａｂ  １２を産生させた。Ｆａｂ  １２調製物の純度および分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００１９】
ＩＶ．抗ＩｇＥ抗体のスクリーニング
キメラＢｉｐ  １とα鎖の相互作用を阻害できる抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体のスクリーニングを重層競合実験により実施した。１パネル２５個のマウス抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体と、対照の目的で、アイソタイプが一致しヒトＩｇＥに対する特異性がないモノクローナル抗体４Ａ６［３１］、精製した組換えα鎖または緩衝液のみを、ニトロセルロースに結合したα鎖にキメラＢｉｐ  １  ＩｇＥが結合するのを阻害できるかどうかについて試験した。５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＥ抗体および対照試薬にキメラＢｉｐ  １  ＩｇＥを４時間４℃で前もって吸収させ、次いで組換えα鎖が点在するニトロセルロースに４℃で終夜曝露した。膜を洗浄し、１２５Ｉ標識ｒＢｅｔ  ｖ  １と共に終夜室温でインキュベーションして、結合したキメラＢｉｐ  １  ＩｇＥを検出した。
【００２０】
得られた遮断抗体の１つであるｍＡｂ  １２およびｍＡｂ  １２由来のＦａｂ断片は、独特な特性を示し、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を強く阻害し、α鎖ならびに好塩基球に結合したＩｇＥ抗体を認識した。
【００２１】
Ｖ．免疫電子顕微鏡法
モノクローナル抗体および免疫複合体の免疫電子顕微鏡法による分析を、既報［３２、３３］の逆染色法により実施した。ＩｇＥは単独で観察され、また、全体またはｍＡｂ  １２  Ｆ（ａｂ’）２断片との複合物として観察された。ｍＡｂ  １２をペプシン−アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）により終夜３７℃で製造者の指示にしたがって消化した。ＨＰＬＣによりＦ（ａｂ’）２画分を他の消化産物から分離した。（各約１ｍｇ／ｍｌの）反応物をホウ酸緩衝食塩水に混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物をカーボン膜に結合させ、ギ酸ウラニルで染色し、銅グリッド上に載せて分析した。ＪＥＯＬ  ＣＸ  １２００電子顕微鏡で１００，０００倍の倍率で電子顕微鏡写真を撮影した。
【００２２】
複合体を形成していないＩｇＥ分子の多くは、他の型の単量体Ｉｇに典型的な明瞭な３本腕の「Ｙ」形配置を示さなかった（図１ａ）。これは、Ｆａｂの付いたＩｇＥのＦｃが同様な配置を示した最近の報告［３４］と一致する。ｍＡｂ  １２全体と混合すると、様々な小さな複合体、鎖および環が観察されたが、ＩｇＧプローブとＩｇＥ標的分子を区別することが困難なため解釈はできなかった（図示せず）。したがって、本発明者らはｍＡｂ  １２をペプシンで消化してＦ（ａｂ’）２断片を得た。ＩｇＥをモル過剰のＦ（ａｂ’）２と混合すると、大部分の分子が、２対の長腕が２本または３本の短腕と直交する十字形の像を形成した（図１ｂ）。等モルで混合すると、分子の鎖および、これより少ない頻度で分子の環が観察された（図１ｃ）。より詳細に調べると、長腕はそれぞれ２つのセグメントからなることが判明した。本発明者らは、これらの画像が、ＩｇＥのＦｃの両側で分子の幾何的中央に極めて近い位置でエピトープと反応している２つのＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＥ（図１ｂで横方向に位置する長腕および図１ｃの鎖の連結分子）を示していると解釈している。このことから、以前に報告されたＩｇＥのモデルに基づいて、これらのエピトープがＣε２−３連結（ｊｕｎｃｔｕｒｅ）の近くに位置することになる。ＩｇＥの想定される３本の腕を明瞭に示す複合体は比較的少なかった（図１ｂおよび１ｃ）。それよりも大部分の複合体が、図１ｂおよび１ｃに図示したように、１本の狭い腕（Ｆｃ）および近接しまたは部分的に互いに重なった一対の腕のように見えるもの（Ｆａｂ）を示した。
【００２３】
ＶＩ．ヒト好塩基球のトルイジンブルー／免疫蛍光複合染色
好塩基球に結合したＩｇＥへの抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の結合を既報［３５］のトルイジンブルーおよび間接免疫蛍光法を用いた二重染色技術によって分析した。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体１２、抗ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）、モノクローナル抗体９Ｆ５（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と、また、対照の目的で抗ヒトＩｇＭ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）または緩衝液のみと共に、２人の健常人ボランティアの末梢血から濃縮した単核細胞を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、単核細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、次いでフルオレセイン標識したヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧに４℃で３０分間曝露した。細胞を０．０２５％グルタルアルデヒド溶液で１分間固定し、トルイジンブルー（０．０１２５％）と室温で１２分間インキュベートした。洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｖｉｅｎｎａ）で分析した。
【００２４】
ｍＡｂ  １２は、ヒトＩｇＥがＦｃεＲＩに結合するのを阻止するその能力、およびヒトＩｇＥのＦｃεＲＩ結合領域に対するその反応性にもかかわらず、α鎖および好塩基球に結合したＩｇＥ抗体を認識できたので、既報の抗ヒトＩｇＥ抗体（例えば、ＢＳＷ１７）［３６、３７］とは実質的に異なる。これに対する最も可能性が高い説明は、ｍＡｂ  １２がヒトＩｇＥの受容体結合部位そのものまたはそのごく近傍と相互作用し、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用の化学量論が１：１である［３８、３９］ためにＩｇＥ定常ドメインの１つに結合する一方、第２のドメインがα鎖と相互作用できるというものである。この仮説は、２通りの実験から得られた結果、すなわち、１）ｍＡｂ  １２由来のＦａｂは、受容体に結合したＩｇＥと反応しＩｇＥが受容体に結合するのを阻止するにもかかわらずヒト好塩基球からのヒスタミンの遊離を誘導しなかった、２）逆染色免疫電子顕微鏡からｍＡｂ  １２Ｆ（ａｂ’）２がＩｇＥのＦｃの両側のＣε２−３連結近傍で結合したことが示されたことから支持される。
【００２５】
ＶＩＩ．ヒスタミン遊離実験
ヒスタミン遊離実験を、抗ヒトＩｇＥ抗体Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ｍＡｂ  １２ならびにＦａｂ  １２を用いて、健常人ボランティアの末梢血多形核白血球（ＰＭＮ）で実施した。ＰＭＮを、ヘパリン添加血液試料からＤｅｘｔｒａｎ  Ｔ７０を用いて濃縮し［４０］、洗浄し、ヒスタミン遊離用緩衝液（ＨＲＢ）に再懸濁した。２５ｍＭトリス（ｐＨ＝７．６）、５ｍＭ  ＫＣｌ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌおよびヒト血清アルブミン０．３３ｍｇ／ｍｌを含有するＨＲＢを使用して細胞を洗浄した。０．６ｍＭ  Ｃａ２＋および１ｍＭ  Ｍｇ２＋を補給した同じ緩衝液をヒスタミン遊離実験に使用した。ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ抗体が架橋することによって抗ヒトＩｇＥ抗体が好塩基球ヒスタミンの遊離を誘導できるかどうか、既報［４０］のように、いくつかの濃度の抗ヒトＩｇＥ抗体に３７℃で３０分間ＰＭＮを曝し、遊離したヒスタミンを測定して試験した。抗ＩｇＥによって誘導されるヒスタミン放出に対する抗ヒトＩｇＥ抗体Ｅ−１２４−２−８／Ｄε２およびｍＡｂ  １２の脱感作効果を、以下のように分析した［４１］。簡潔に述べると、まず、ＰＭＮを、ｉ）０．０１Ｍ  ＥＤＴＡを含有するＨＲＢ、ｉｉ）０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよびＥ−１２４−２−８／Ｄε２（１μｇ／ｍｌ）を含有するＨＲＢ、ｉｉｉ）０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよびｍＡｂ  １２（１μｇ／ｍｌ）を含有するＨＲＢ、またはｉｖ）０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび抗ヒトＩｇＭ抗体（１μｇ／ｍｌ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有するＨＲＢのいずれかと共に３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＨＲＢで希釈した異なる濃度のＥ−１２４−２−８／Ｄε２（０．０１、０．１または１．０μｇ／ｍｌ）またはｍＡｂ  １２（０．０１、０．１または１．０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、細胞を含まない上清を回収した。細胞を含まない上清中に放出されたヒスタミンをラジオイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）で測定し、（細胞および細胞外の）総ヒスタミンに対する百分率として計算した。
【００２６】
ＥＤＴＡ含有ＨＲＢで希釈したｍＡｂ  １２またはＥ−１２４−２−８／Ｄε２と共に濃縮したヒト好塩基球をプレインキュベーションすると、ＩｇＥに依存する細胞のその後の活性化に対する脱感作が起きた（図２ａおよび２ｂ）。特に、続いてｍＡｂ  １２またはＥ−１２４−２−８／Ｄε２のいずれかに曝露すると、ＨＲＢとＥＤＴＡのみで希釈したヒト好塩基球または対照抗ヒトＩｇＭ抗体を含有するＨＲＢとＥＤＴＡで希釈したヒト好塩基球のプレインキュベーションよりも、ヒスタミン遊離応答が著しく減少した（図２ａおよび２ｂ）。ＥＤＴＡ含有ＨＲＢで希釈した抗ヒトＩｇＥ抗体と好塩基球のインキュベーションによってメディエイタが放出される可能性は、プレインキュベーション後に顆粒球から得られた培養上清中にヒスタミンが存在しないことから排除された（図示せず）。
【００２７】
本発明者らは、精製抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（ｍＡｂ  １２またはＥ−１２４−２−８／Ｄε２）の濃度を増加させながらヒトＰＭＮをインキュベートすると、ｍＡｂ  １２がＥ１２４−２−８／Ｄε２よりも極めて少ない（約５０％の減少）ヒスタミン放出を誘導することを見出した（図３）。ヒトＩｇＥがα鎖に結合するのを阻害し、α鎖に結合したＩｇＥと反応したｍＡｂ  １２由来のＦａｂとまったく同じ調製物は、濃度５μｇ／ｍｌまでヒスタミン放出を誘導しなかった（図３）。
【００２８】
Ｆａｂ  １２は、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用に対するやや低分子量の非アナフィラキシー性競合物質である。ヒト化フレームワーク領域を含有する組換えＦａｂ断片として生成されると、血中ＩｇＥと複合体を形成してそれを除去するためにｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５などのようにアトピー患者に投与することができる［２３〜２５、４２］。既報の抗ヒトＩｇＥ抗体（ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５）［２３〜２５、４２］と比べ、Ｆａｂ  １２は重要な利点を有すると本発明者らは考えている。すなわち、アナフィラキシー活性の欠如に加え、Ｆａｂ  １２は、ＦｃεＲＩを介して好塩基球に結合しているＩｇＥ抗体と反応し、したがっておそらくＦｃεＲＩに結合したＩｇＥを含有する肥満細胞、好酸球、および抗原提示細胞に結合しているＩｇＥ抗体とも反応する。したがって、Ｆａｂ  １２は、血中からＩｇＥ抗体を枯渇させるのに使用できるだけでなく、細胞レベルの治療介入のためにアトピーのエフェクター細胞および誘導細胞を標的とすることもできる。選択的体外血漿分離交換法に使用すると、Ｆａｂ  １２は患者へ投与することなくＩｇＥ抗体およびＩｇＥ保有細胞を枯渇させることができる［４３］。
【００２９】
ＶＩＩＩ．アレルギー患者のヘパリン添加血液から精製したヒト好塩基球
アレルギー患者および非アトピー患者から採取したｍＡｂ  １２ヘパリン添加血液試料を用いて全血から分離したＩｇＥ保有細胞を、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１回洗浄し、ｍＡｂ  １２（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプが同じ対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）と室温で３０分間静かに撹拌しながらインキュベートした。前処理した細胞を８００×ｇで１５分間遠心分離して収集し、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで２回洗浄して結合していない抗体を除去した。ＤＮＡリンカーを介して付着しているヒト抗マウスＩｇＧを含有するＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って洗浄し、前処理した細胞と４℃で３０分間転倒回転（ｅｎｄ  ｏｖｅｒ  ｅｎｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）させてインキュベートした。ビーズと標的細胞の比は、少なくとも５：１であった。Ｄｙｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｌ）により標的細胞を管壁に付着させ、上清を廃棄した。ロゼット細胞（ｒｏｓｅｔｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を２回ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで洗浄した。最後の洗浄を行なった後、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および１％ＦＣＳを含み３７℃に予熱されたＲＰＭＩ  １６４０培地にロゼット細胞を静かに再分散させた。ＤＮアーゼを含有する遊離用緩衝液（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｄｙｎａｌ）を室温で２０分間添加して細胞からビーズを除去した。試料中の細胞数を測定した後、サイトスピン調製物をギムザ染色して単離細胞を同定した。
【００３０】
結果：ヒト好塩基球の１段精製に抗体１２を使用することができる。ＩｇＥ保有細胞を枯渇させるのに抗体１２を使用できるかどうかを試験するために、アトピー患者由来のヘパリン添加血液試料を、抗体１２、およびヒト抗マウスＩｇＧを含むＤｙｎａｂｅａｄｓと共にインキュベートした。図４に例示するように、８０％を超える純粋な好塩基球を１段精製操作でアトピー患者の血液から直接単離することができた。好塩基球に加え、少量の割合の他のＩｇＥ保有細胞（単球、リンパ球：図４および好酸球：図示せず）が同時精製された。図５の近接写真は精製した好塩基球を示す。
【００３１】
ＩＸ．患者の血清のＩｇＥ濃度の減少
患者Ａの全血清ＩｇＥ濃度はＣＡＰ測定で１２６２０ｋＵ／Ｌで、患者Ｂは１６１４ｋＵ／Ｌであった。ＣｎＢｒで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合しているゲル体積１０ｍｌの抗体１２を含むアフィニティーカラムに各血清５０ｍｌをかけた。血清をカラムにかけた後、患者Ａの場合は全血清ＩｇＥが２７２ｋＵ／Ｌに減少し、患者Ｂの場合は１２ｋＵ／Ｌに減少した。全ＩｇＥの測定値は、測定を２回繰返した結果である。これらの結果から、抗体１２は、ＩｇＥ濃度が高いアレルギー患者の血清／血漿から９５％を超えるＩｇＥを枯渇させることができると考えられる。
【００３２】
【表１】
2014012683.tif 000002
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月4日(2013.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害し、
ｂ）遊離のＩｇＥおよび細胞に結合しているＩｇＥに結合し、かつ
ｃ）アナフィラキシー性ではない
特性を有するＩｇＧ１アイソタイプの抗ＩｇＥ  Ｆａｂ（抗体断片）。
【請求項２】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来する請求項１に記載のＦａｂ。
【請求項３】
合成または組換えによって製造される請求項１に記載のＦａｂ。
【請求項４】
ヒト化フレームワーク領域を含む組換えＦａｂである請求項３に記載のＦａｂ。
【請求項５】
受託番号０２０３２７３４としてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体に由来する請求項１に記載の抗ＩｇＥ  Ｆａｂ。
【請求項６】
受託番号０２０３２７３４としてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体に由来するＦａｂのフレームワーク領域がヒト化されている、組換え抗ＩｇＥ  Ｆａｂ。
【請求項７】
血中からＩｇＥ及びＩｇＥ保有細胞を枯渇することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＩｇＥ  Ｆａｂ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＩｇＥ  Ｆａｂを含む、アトピー症状を治療するための医薬組成物。
【請求項９】
アトピー性症状が急性アトピー症状である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アトピー性症状が慢性アトピー症状である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
患者の血液又は血漿に投与される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
選択的体外血漿分離交換法に使用される請求項８に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2014012683000001.pdf