(57)【要約】      （修正有）【課題】毛管内空間および毛管外空間を有する複数本の中空繊維を備えたバイオリアクター内で細胞を移動させるための方法を提供する。【解決手段】中空繊維バイオリアクター内で細胞を移動させる方法であって、上記中空繊維は、毛管内空間および毛管外空間を有し、上記毛管内空間および上記毛管外空間の一方へ細胞を充填する工程と；細胞を収容している上記一方の毛管内空間或いは毛管外空間へ流体を流す工程と；上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の他方を流れる流体の圧力より大きい圧力を上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の一方を流れる流体へ与える工程と；を有する方法。【選択図】図１
2014012015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空繊維バイオリアクター内で細胞を移動させる方法であって、
上記中空繊維は、毛管内空間および毛管外空間を有し、
上記毛管内空間および上記毛管外空間の一方へ細胞を充填する工程と；
細胞を収容している上記一方の毛管内空間或いは毛管外空間へ流体を流す工程と；
上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の他方を流れる流体の圧力より大きい圧力を上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の一方を流れる流体へ与える工程と；
を有する方法。
【請求項２】
上記流体に圧力を与える工程は、上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の他方と比較して、細胞を収容している上記一方の空間を流れる流体の圧力を変える工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
上記細胞を収容している空間を流れる流体の体積を増加させることによって流体の圧力を増大させる工程をさらに有する、請求項２の方法。
【請求項４】
上記移動される細胞は、上記毛管内空間にある、請求項１の方法。
【請求項５】
上記中空繊維の表面へ細胞を移動させる工程をさらに有する、請求項１の方法。
【請求項６】
上記中空繊維は、複数の細孔を有する、請求項１の方法。
【請求項７】
上記流体を流す工程は、上記細胞を収容している空間から、上記中空繊維の上記複数の細孔を介して、上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の他方へ、上記流体の一部を流す工程をさらに有する、請求項６の方法。
【請求項８】
上記中空繊維の表面へ細胞を移動させる工程は、該表面へ細胞が付着することを許容する工程をさらに有する、請求項５の方法。
【請求項９】
上記流体の圧力を増大させる工程は、流体の流量を増やして流体の送り速度を速くする工程を有する、請求項３の方法。
【請求項１０】
上記流体を流す工程は、上記中空繊維の表面上に細胞を保持する工程を有する、請求項５の方法。
【請求項１１】
上記空間内で上記細胞を浮遊モードに維持する工程をさらに有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
上記中空繊維の表面から離れる方向に細胞を移動させる工程をさらに有する、請求項１の方法。
【請求項１３】
中空繊維バイオリアクター内に収容されている細胞を再供給する方法であって、
上記中空繊維は、毛管内空間および毛管外空間を有し、
上記中空繊維の壁から離れる方向に細胞を移動させるように選択された流れで、上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の一方に流体を流す工程と；
上記バイオリアクターの中から細胞を移動させる工程と；
上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の一方を通って細胞を収容した流体を流すことによって再供給される、上記除去された細胞を、上記バイオリアクターへ戻す工程と；
を有する方法。
【請求項１４】
上記中空繊維の壁から離れる方向に細胞を移動させる工程は、上記中空繊維の壁から細胞をはずす工程をさらに有する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
上記中空繊維の壁から細胞をはずす工程は、上記流体に分離化学剤を加える工程をさらに有する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
第１の面および第２の面を有するバイオリアクターの膜壁から付着した細胞をはずす方法であって、
上記細胞は、上記第１の面に付着され、
上記第１の面から細胞を移動させるために上記膜壁をいくらかの流体が通過するのに十分な圧力で上記第２の面に沿って流体を流す工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
優先権主張
本願は、２００７年３月５日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／８９２９０３、２００７年３月５日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／８９２９６２、２００７年３月５日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／８９２９８１、２００７年４月１２日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／９１１３９３、２００７年９月１１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／９７１４９４、および２００７年９月１１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／９７１５１１の優先権を主張する。
【０００２】
背景
少量のドナー細胞から培養された人間の幹細胞は、傷付けられた、或いは欠陥のある組織の修復、或いは置き換えに使用でき、疾病の広い範囲の処置のため広く臨床的に利用される。再生医療の分野における最近の進歩は、幹細胞が、自己再生能力、分化しない状態を維持できること、および特別な状態の下で多くの細胞に分化できること、などのユニークな特性を有することを明らかにしている。
【０００３】
再生医療の１つの重要な要素として、バイオリアクターや細胞拡散システムは、細胞の成長および拡散のための最適化された環境を与える役割を果す。バイオリアクターは、閉塞された無菌システムにて細胞の成長に影響する物理化学の環境を与えるとともに、細胞に栄養分を与えて代謝産物を除去する。細胞拡散システムは、幹細胞と同様な他のタイプの細胞の成長に利用できる。
【０００４】
現在、多くのタイプのバイオリアクターが利用できる。最も一般的な２つは、平板バイオリアクターと中空繊維バイオリアクターを含む。平板バイオリアクターは、広い複数の平面上での細胞の成長が可能である。一方、中空繊維バイオリアクターは、複数本の中空繊維の内側或いは外側のいずれかで細胞の成長が可能である。
【０００５】
中空繊維バイオリアクターを用いた場合、細胞が複数の中空繊維の全長および全幅に亘ってきちんと分布し、一端だけに片寄らないように、細胞を複数本の中空繊維内に詰めることが望ましい。本発明は、このような側面に向けられている。
【０００６】
発明の要約
この発明は、毛管内空間および毛管外空間を有する複数本の中空繊維を備えたバイオリアクター内で細胞を移動させるための方法に指向されている。この方法は、上記毛管内空間内へ細胞を充填する工程と、上記複数本の繊維の長さに沿って細胞を移動および分配するための流れ比圧力で上記毛管内空間或いは上記毛管外空間の一方へ流体を流す工程と、を有する。
【０００７】
また、この発明は、毛管内空間を有する複数本の中空繊維を備えたバイオリアクター内に収容された細胞を再供給するための方法に指向されている。この方法は、上記複数本の中空繊維の壁から離れる方向に細胞を移動させるための流れ比圧力で上記毛管内空間内へ流体を流す工程と、上記バイオリアクターの中から細胞を移動させる工程と、再供給される上記除去された細胞を上記バイオリアクターへ戻す工程と、を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、この発明に有用なバイオリアクターの概略図である。
【図２】図２は、本発明とともに使用される細胞拡散システムのフロー図である。
【０００９】
詳細な説明
上述したように、細胞を培養するためのいくつものバイオリアクターの形態がある。そして、この発明は、バイオリアクターが毛管内空間および毛管外空間を備えていることのみを要求するものであることに気付くべきである。
【００１０】
しかしながら、これに限定しない１つの実施例が図１に示す中空繊維バイオリアクターである。この発明で使用される細胞増殖モジュール、すなわちバイオリアクター１０は、ハウジング１４内に封入された中空繊維膜１２の束で形成されている。ハウジング、すなわちモジュール１４は、円筒形状に形成され、生体適合可能ないかなるタイプの重合材料でも形成される。上記の中空繊維は、一まとめにして膜組織と呼ばれる。中空繊維内の空間、すなわち管腔は、毛管内空間（ＩＣ空間）として規定され、複数本の中空繊維の外側を囲む空間は、毛管外空間（ＥＣ空間）として規定される。上述したように、上記細胞は、ＩＣ空間内で成長および分布される。代りに、上記細胞は、上記ＥＣ空間内で成長し、同様の原理を与えることができる。
【００１１】
上記モジュール１４の各端部は、エンドキャップ、すなわちヘッダー１６、１８で閉塞されている。これらエンドキャップ１６、１８は、バイオリアクター内で成長する細胞と生体適合可能な材料であるところのポリカーボネートなどのいかなる適した材料でも形成される。
【００１２】
おおよそ９０００本の長さ約２９５ｍｍの繊維１２が、ポリウレタンポット（図示せず）とともに上記ハウジング１４内に保持される。これら繊維１２およびポットは、上記ＩＣ空間内へおよびこの空間からの流体の流れを許容するよう、その各端部で切断される。しかしながら、上記複数本の繊維の膜組織および長さは、その実施例としてのみ変更可能であることが理解される。
【００１３】
上記モジュール内へおよびモジュールからつながる少なくとも４つのポートがある。２つのポートは、上記毛管外空間に流体接続され、１つのポート３４は、例えば、上記中空繊維を囲む上記毛管外空間内へ流入する毛管外媒体のためのものであり、１つのポート４４は、上記モジュールから出る毛管外媒体のためのものである。また、２つのポートは、毛管内空間に流体接続され、１つのポート２６は、増殖される細胞の入口であるところの上記中空繊維の管腔内へ流入する毛管内媒体のためのものであり、１つのポート４２は、毛管内媒体の出口のため、および再循環され或いは上記バイオリアクターから除去される増殖された細胞のためのものである。これら図示した複数のポートは、入口、出口、或いは除去ポートである。流体を上述した方向と反対方向に流すことも可能であることが理解される。
【００１４】
上記バイオリアクター内で増殖される細胞は、上述した実施例において、上述した複数本の繊維の毛管内空間、すなわちＩＣ空間内へ流される。これら複数本の繊維は、ポンプを用いて細胞で満たされ、或いは、細胞は、容器から直接、上記複数の毛管内空間へ分配される。細胞は、限外濾過で使用された流体、或いは以下に説明する媒体によって複数本の繊維に与えられる。また、細胞は、バイオリアクターのＩＣ空間に直接的に無菌接続された細胞入力バッグ３０（図２参照）から、成長モジュール、すなわちバイオリアクター内へ導かれても良い。
【００１５】
複数本の繊維の間の空間（ＥＣ空間）は、細胞に栄養分を与えるとともに細胞の代謝副産物を除去するための媒体貯蔵部として利用される。細胞がＥＣ空間内で成長する場合、ＩＣ空間が、細胞に栄養分を与えるとともに細胞の代謝副産物を除去するための媒体貯蔵部として利用される。この媒体は、必要に応じて置き換えられる。媒体は、必要に応じて、ガス交換のため、酸素供給器４（図２参照）を通して循環される。成長媒体は、細胞とともに中空繊維空間内へ供給される。
【００１６】
上述した複数本の中空繊維は、透過可能で生体適合可能な重合材料により形成されている。使用可能なこのような重合材料の１つは、ポリアミド、ポリアリールエーテルスルホン、およびポリビニルピロリドンの混合物である。上記透過可能な膜組織は、ＥＣ空間とＩＣ空間との間の膜組織にある複数の細孔を通った、栄養分、排泄物、およびガスの透過を許容する。上記中空繊維膜の上述した分子の透過特性は、ＩＣ側、すなわち細胞側から、成長因子、シトキンなど、細胞の成長に必要な高価な反応物のロスを最小限にする一方、除去される代謝廃棄産物が、ＥＣ側、すなわち細胞を含まない側へ膜を拡散透過することを許容するよう選択される。
【００１７】
バイオリアクターにおいて、上述した材料のような半透膜は、拡散或いは伝達によって、ＩＣおよびＥＣ間の仕切りを通る分子の移動に使用される。
【００１８】
拡散は、半透膜を横切る濃度勾配を確立することによって成し遂げられる。分子は、濃度差および膜浸透性に起因した割合で高濃度側から低濃度側へ拡散する。
【００１９】
分子の伝達は、流体の流れが膜に押し付けられたときに起り、膜を通る一致する圧力低下を伴う。この流体の流れ、すなわち限外濾過の流れは、膜の細孔による拒絶のため、或いは廃棄生成物または膜のいずれかの表面電荷のため、膜を通過できない生成物を除く、いかなる廃棄生成物や媒体をも、膜を通過させて運ぶ。
【００２０】
限外濾過、すなわち膜を通る流体の流れは、複数本の繊維内における細胞の動き、および再分配を助けるためにも使用される。
【００２１】
膜内側（ＩＣ側）と膜外側（ＥＣ側）との間の流体の流れによって生じる圧力の差は、膜内外圧力（以下、ＴＭＰとする）と称される。中空繊維の内部圧力が繊維を囲む空間の圧力を超える場合、この圧力差は、繊維の膜壁を通って外側に向けて流体を付勢する。半透過性を有する中空繊維の壁は、極端に小さな複数の細孔を含む。これら複数の細孔は、細胞のように大きな粒子が通過するには小さすぎる。従って、細胞は、中空繊維の内部を通って流れ続ける。膜に含まれる複数の細孔を通過するのに十分小さい水やその他の成分は、上記膜の複数の細孔を通して種々の量で押し出される。細孔の径より小さな成分は、容易に繊維の膜を流通してＥＣ空間へ流れる。同様に、より大きな膜内外圧力は、例えばＥＣ空間への高い割合での限外濾過など、濾過の高い割合を生じる。中空繊維の内部を流れる流体の圧力がチャンバの外側の流体の圧力を大きく超えると、膜を通ってＥＣ空間へ成分を押す力が大きくなる。
【００２２】
流体の送りを速くして中空繊維を通る流れ或いは流れの割合を増大することで、繊維の内部圧力が上昇され、膜内外圧力が上昇される。
【００２３】
これら流れの原理は、複数本の中空繊維の全長にわたる細胞の分配のために利用され、或いは、再配置或いは増殖された細胞の収穫のために細胞を中空繊維の壁面から剥がすのを助けるために利用される。
【００２４】
以下の説明のため、正の流れが、ＥＣ側への流れを生じるＩＣ側の高い圧力として説明される。逆の流れは、ＩＣ側への流れを生じるＥＣ側の高い圧力として説明される。
【００２５】
１つの実施例として、これに限定するものではなく、上述した中空繊維バイオリアクターを含む細胞増殖システムにおいて、流体の流れは、上記システムの一部である種々のポンプおよび／或いはバルブを用いて調整可能である。可能な細胞増殖システムの概略図が図２に示されている。この発明で使用される可能性のある他の細胞増殖システムは、２００８年３月５日に出願された特許出願            に開示されており、その全体が参考としてここに組み込まれる。この発明の目的を成し遂げるために必要な図２の部分についてのみ説明される。
【００２６】
ＥＣ媒体バッグ１６はＥＣ媒体を収容し、この媒体は、バイオリアクター１０のＥＣ側を通って流れ、酸素供給器４のＥＣ入口ポート２０へフレキシブルチューブ（ＥＣ入口ライン）２８の部分を介して接続されている。上記ＥＣ入口ライン２８は、新鮮なＥＣ媒体を酸素供給器４へ導いて酸素供給する。ＥＣ媒体は、酸素供給器からＥＣ入口３４へ流れて、バイオリアクターを通って出口４４へ流れる。
【００２７】
ＩＣ媒体バッグ２２はＩＣ媒体を収容し、この媒体は、バイオリアクターのＩＣ側を通って流れ、バイオリアクター１０のＩＣ入口ポート２６へフレキシブルチューブ（ＩＣ入口ライン）２４の部分を介して接続されている。上記ＩＣ入口ライン２４は、新鮮なＩＣ媒体をバイオリアクターのＩＣ側へ導く。
【００２８】
細胞入口バッグ３０は、バイオリアクター１０内で増殖される細胞を収容している。この細胞入口バッグ３０は、ＩＣ入口ポート２６を介して中空繊維の管腔内へ細胞を運ぶＩＣ入口ライン２４に接続されている。
【００２９】
細胞の収穫の準備がなされると、これら細胞は、細胞収穫ライン３１を通してバイオリアクター１０のＩＣ出口ポート４２から細胞収穫バッグ３２へ排出される。
【００３０】
ＥＣ側からの廃棄物は、バルブＶ９およびライン５８を通って廃棄物バッグ６０へ送られる。
【００３１】
上記細胞成長システムは、ＩＣ循環ループ３６として機能するチューブの長さを含む。
上記ＩＣ媒体は、ＩＣ出口ポート４２を介してバイオリアクター１０から流出し、チューブのループ３６を通って、ＩＣ入口ポート２６を通してバイオリアクター内へ戻される。このループ３６は、中空繊維を通るＩＣ媒体の再循環に利用される。また、このループは、上記中空繊維の外に細胞を排出するために使用され、以下により詳細に説明するようなさらなる増殖のため、複数本の中空繊維の全長にわたる細胞の再配置／再分配に使用される。
【００３２】
同様に、ライン４０、４１、およびポンプＰ２を含むＥＣ再循環ループは、ＥＣ側における再循環のために設けられている。
【００３３】
バイオリアクター内における細胞の再配置／再分配のような特別な適用を可能にするために必要とされる追加のチューブライン６２が追加可能である。
【００３４】
以下に説明するように、上記バイオリアクターシステムは、当該システムの順応性を増大するための複数のポンプを使用可能である。
【００３５】
ＩＣ側で増殖される細胞とともに、栄養媒体がバイオリアクターのＥＣ側を通って循環する。細胞は、一定の栄養成分をＥＣ液体から消費し、ＥＣ媒体へ代謝廃棄生成物を放出する。栄養液体が十分な細胞培養を保証するために置き換えられることが重要である。この置き換えは、少なくとも１つのポンプＰ３によって達成される。
【００３６】
Ｐ３は、新鮮な置き換え媒体を置き換え媒体バッグ１６（ＥＣ媒体バッグ）からバイオリアクターのＥＣ側へ送り込む。１つの実施例において、Ｐ３は、約５００ｍＬの置き換え媒体を約５０ｍＬ／ｍｉｎの速度で上記システム内へ送り込む。媒体置き換えの周期は、バイオリアクター内における細胞の数や細胞によって製造された代謝廃棄生成物の量などのいくつかの要因に基づくが、媒体置き換えの平均値は、およそ２日おきである。
【００３７】
Ｐ３は、ユーザーによって定義可能である。すなわち、ユーザーは、安定した状態が必要である場合には、置き換え媒体の流れを制御できる。例えば、システムの洗浄或いは流出が望まれるのであれば、高速で多量の媒体を流すことがユーザーによって選択される。また、ＥＣ媒体の置き換え、或いは既にバイオリアクター内にある媒体への栄養の補充は、ゆっくりとした連続した流れによって生じる。例えば、約０．２ｍＬ／ｍｉｎの新鮮な媒体が、システム内へ連続して送り込まれる。Ｐ３の速度は、バイオリアクターのＥＣ側で負圧流を発生させるために増大され、ＩＣ液体がＥＣ側からＩＣ側へ膜を通って流れる。
【００３８】
ポンプＰ５は、ＩＣ媒体バッグ２２から新鮮なＩＣ媒体を、および細胞入口バッグ３０から細胞を、バイオリアクターの複数本の中空繊維（ＩＣ空間）内へ送り込むために使用される。また、このポンプは、バイオリアクターのＩＣ空間にＩＣ媒体を詰め込むために使用され、増殖される細胞が複数本の繊維内に供給される前に上記繊維内にある空気を排出させる。また、ＩＣ媒体の置き換えが必要な場合、或いは異なる割合のシトキンまたは成長因子を含む新鮮なＩＣ媒体が所望される場合、このポンプが使用される。以下に説明するように、ＥＣ流体流れと比較してバイオリアクターのＩＣ側で正圧流を発生させるために、Ｐ５の速度が増大される。
【００３９】
代わりの実施例において、ＩＣ媒体および細胞を再循環するため、さらなるポンプが、基システムに追加可能である。以下に説明するように、ポンプＰ４は、ＩＣ媒体の再循環のため、および／或いはバイオリアクターを通してＩＣ媒体を流すため、毛管内ポンプとして使用される。また、Ｐ４は、ＩＣ空間内の細胞に剪断流れ率を生じるために使用でき、繊維表面から細胞を剥離してＩＣ空間内で再供給或いは再分配する。また、Ｐ４は、バイオリアクターから細胞を除去するために使用され、この細胞を、さらなる増殖のためにバイオリアクター内に戻して再供給し、或いは細胞収穫バッグ内へ集める。Ｐ４は、膜を通るＩＣ側からＥＣ側への正圧流或いは限外濾過流を生出させるために増大される。
【００４０】
複数のポンプＰ１−Ｐ４の動作速度、および複数のチューブの径は、これらポンプの動作中において、これらチューブを通る毎分０−１５０ｍＬの流れを生出するように、選択される。Ｐ５は、０−２５０ｍＬ／ｍｉｎの流れの割合を作ることができる。
【００４１】
例１
チューブライン３６および６２は、ＩＣ側で付着および浮遊した細胞を両方とも再分配および／或いは再循環するために使用可能である。
【００４２】
バイオリアクター内の複数の繊維を通して成長した細胞を再分配することが望まれる場合、バイオリアクター（特に、中空繊維バイオリアクター）内で成長する付着および浮遊した培養組織にとって好機である。付着した細胞が成長しない場合であっても、チューブおよびバイオリアクターを通して細胞を連続して再循環させることが望ましい。付着した細胞が成長する場合、これら付着した細胞は、まず最初に、一般に知られた技術を用いて膜から分離されなければならない。このような技術として、剪断率、負圧流（以下に説明する）、カルシウム濃度の変更、トリプシン、および／或いは冷却および加熱を含む他の化学的或いは物理的方法がある。
【００４３】
この処置において、再循環ライン（例えば、図２のチューブループ３６を参照）が設けられる。このパスは、出口４２を介して、ポンプＰ４の動作によりバイオリアクター１０から流出する細胞を受け入れる。そして、この細胞は、入口２６の近くの位置“Ａ”でＩＣ入口ライン２４に再入力される。また、細胞を逆流させるための媒体の供給源２２がある。新鮮な媒体の導入位置から、細胞は、以下に説明する両方向に流され、細胞が再循環ライン３６からバイオリアクターへ戻される。
【００４４】
バルブｖ６およびｖ８を閉じた状態で、ポンプＰ４は、細胞混合の所望する均一性が達成されるまで、結果として閉じたループ３６内で、バイオリアクター１０を通して細胞を循環させるために使用可能である。
【００４５】
細胞が効果的に混合された後、バルブｖ６が開かれるとともにバルブｖ８が閉じられて、ポンプＰ５が作動されて、ポンプＰ４がポンプＰ５より低速で動作するようセットされる。ポンプＰ５は、ＩＣ媒体をシステム内へ送り込む。ポンプＰ４は、バイオリアクター入口２６に向かう再循環された流れの一部を効果的に迂回させ、ライン６２および３６およびバルブＶ６を通る媒体の流れによって、残留物をバイオリアクター出口４２へ付勢する。両方のポンプは、効果的に、バイオリアクター内へ細胞を戻す。ＩＣ流体の流圧がＥＣ流体の流圧より高ければ、バイオリアクター内へ送り込まれる全ての過剰な流体は、限外濾過として中空繊維を通って付勢される。また、限外濾過は、中空繊維の壁に向けて細胞を押す。逆流ライン６２が再循環ライン３６に接続する位置（図２に合流点Ｃとして示す）およびこの合流点の両側での細胞の体積比は、どれだけ多くの細胞が再分配されて出口４２を通って戻されるかを決める。この接続位置は、可能であれば両方向に流れる媒体の必要性を排除して、効果的に全ての細胞がバイオリアクター入口２６を通って再分配されるように、バイオリアクターに近付けて配置することが可能である。
【００４６】
上記は、限外濾過および逆流を用いてバイオリアクターを通して細胞をどのようにして分配および再循環するかを示している。この方法は、付着した細胞が、上述した化学的分離剤や他の方法によって膜から分離された後、この分離された細胞にも適用できる。
【００４７】
代りに、細胞は、始めにバイオリアクターおよびチューブから除去して細胞収穫バッグ３２内へ回収することによって、バイオリアクター内へ再供給することができる。細胞を再供給するため、収穫バッグ３２は、細胞の充填のときと同様の方法で、バイオリアクターの入口ポート２６に取り付けられる。
【００４８】
さらに代りに、細胞は、バイオリアクターから除去されて細胞収穫バッグ３２内へ回収される。そして、バイオリアクター内にいくらか残った細胞は増殖される。この工程は、連続して繰り返し可能である。
【００４９】
さらに、図２に示すように、ＥＣ再循環ループ４０は、バイオリアクターのＥＣ側の媒体が再循環されるのを許可する。このＥＣ再循環ループ４０は、ＥＣ媒体がＥＣ出口ポート４４を介してバイオリアクターから出てＥＣ入口ポート３４を介してバイオリアクター内へ戻る流れを許容する。このループは、複数本の中空繊維の周りにあるＥＣ媒体の再循環に使用され、バイオリアクターの１つの部分から他の部分へ栄養分を運ぶ。ＥＣ流体の流れをＩＣ流体の流れより少なく保持することにより、ＩＣ流体の流圧は、ＥＣ流体の流圧より高くなり、ＩＣ流体の流れが膜を通って流れることを許可し、正圧での流体の流れを生出する。
【００５０】
代りに、ＥＣ側での細胞の成長が望まれる場合、ＥＣ流体の流れは、ＩＣ側の流体の流れより大きくでき、ＥＣ側からＩＣ側へ流体を付勢し、負圧での流体の流れを生出する。この流れは、ポンプＰ３およびＰ２の付勢力に基づく。Ｐ３がＰ２より強い場合、ＥＣ側における再供給を助けるため、出口４４で逆流が生じることができる。
【００５１】
細胞の成長にともなう代謝破壊生成物を含むＩＣおよびＥＣ媒体は、チューブ５８を介してシステムから除去されて廃棄物バッグ６０内へ送られる。
【００５２】
例２
実質的に精製されたＭＳＣｓの膜への付着をアシストするための正圧限外濾過の使用
間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）のような付着細胞が中空繊維バイオリアクター内で増殖される場合、この細胞は、その通常の成長サイクルを開始するため、始めに、複数本の繊維の表面に付着しなければならない。この付着を増加／促進するため、ＩＣ側で増加された流体の流れによって生じる正圧が与えられ、細胞側区画（ＩＣ側）内における圧力が非細胞側（ＥＣ側）内における圧力より高くされる。上述した細胞増殖システムにおいて、正圧流は、ポンプの速度を上げてＩＣ側における流体の流れ或いは流圧を高めることにより達成される。これは、バイオリアクターの中空繊維内へのＩＣ媒体の流れをコントロールするポンプＰ５の速度を上げることでなされる。
【００５３】
上述したように、流体の増大された流れは、複数本の繊維を通る流体の流れを生じ、繊維の壁へＭＳＣｓを引き込む助けをする正圧流を生じる。このような流れは、細胞繊維表面の全ての部位へ細胞を引き込むことから効果的である。これに対し、バイオリアクター内で細胞を分配する際に重力のみを使用した場合、細胞は、バイオリアクターヘッダー１６（図１参照）内、或いは短い距離でのみ複数本の繊維内へ優先的に置かれ、複数本の繊維の全長にわたっておよびその周囲全体に置かれることはない。
【００５４】
正圧限外濾過および正圧流は、細胞が付着されるまで、可能であれば数時間或いは数日の間、繊維表面でＭＳＣｓを保持するため、（可能であれば減少されたレベルで）続けて与えられる。
【００５５】
この方法は、バイオリアクターへ加えられる前に実質的に精製された増殖される細胞に最も便利である。この例の目的のため、実質的に精製された１つの細胞種が他の細胞種と比較して細胞浮遊の点で優位である。
【００５６】
付着が終わった後、実質的に流体の流れがない、複数本の繊維を通る僅かな負圧流が、膜に付着されなかった細胞がバイオリアクターから除去されるように使用される。この負圧流は、ＩＣ流れ割合の圧力がＥＣ側の圧力と比較して下落させることにより生出可能である。
【００５７】
中空繊維バイオリアクター内で付着する細胞が成長しない場合、古いＩＣ媒体が新鮮なＩＣ媒体に置き換えられるときにバイオリアクターから細胞が排出されることのないように、正圧流が、繊維の壁に細胞を保持するために使用される。
【００５８】
例３
細胞浮遊モードを生出するための負圧流或いは逆限外濾過の使用
負圧流体の流れ或いは逆限外濾過は、細胞を浮遊モードに保持する助けに使用可能である。例えば、負圧流は、ＥＣ側からＩＣ側への流体の流れを生出する。複数本の繊維内への流体の流れは、壁から引き離すように細胞を押す。上述した細胞増殖システムにおいて、負圧流は、バイオリアクターへのＥＣ流体の流れをコントロールするポンプＰ２の速度を増大し、バルブｖ９を閉じ、クランプｃ２を開くことによって、達成される。加えて或いは代りに、Ｐ３の速度がＰ２の速度より速く或いは等しくなるように、バルブｖ７を開いて、ポンプＰ３の速度を増大する。
【００５９】
正圧流と負圧流の組み合わせは、バイオリアクター内への細胞の充填のために使用可能である。負圧流は、細胞浮遊を維持できないバイオリアクター内の正圧流の領域（例えば、付着モード）に続くバイオリアクターの入口において浮遊モードを生出するために使用可能である。このような正圧および負圧流の組み合わせを利用することにより、バイオリアクターの第１の領域における細胞の堆積を防止でき、第２の領域における細胞の堆積を増すことができる。
【００６０】
例４
中空繊維バイオリアクターから付着していない細胞を分配および除去するための正圧および負圧流体の流れの使用
例２で説明したように、中空繊維バイオリアクター内で増殖される細胞は、バイオリアクター内へ装填される前に、始めに精製可能である。しかしながら、健康な骨髄などの精製されていない細胞は、中空繊維バイオリアクター内へ直接的に充填することもできる。正圧流は、始めに、健康な骨髄の付着細胞部分が複数本の繊維へ付着するのを助けるために使用可能であり、その後、負圧流を与えることにより、赤血球、白血球、および血小板などの健康な骨髄の付着しない細胞部分が複数本の中空繊維から流れることを助ける。
【００６１】
５０ｍＬの健康な骨髄（一般に、単一の骨髄引きから引かれる量）が、細胞入口バッグ３０（図２参照）からＩＣ入口ポート２６を通って複数本の中空繊維内へ直接的に流される。ＩＣ出口ポート４２は、正圧流の流れを生出させることに加えて細胞ロスを防止するため、装填中はクランプされる。一度装填されると、骨髄は、骨髄内の付着細胞が複数本の繊維へ付着する時間を許容する約１−４日の間、培養される。代りに、正圧限外濾過或いは流体の流れは、細胞の付着を助けるための膜への細胞の引き込みを助けるため、付与可能である。
【００６２】
負圧流は、出口４２を開いた後、膜へ付着されなかった全ての余分な細胞をバイオリアクターの外へ押し出すために付与可能である。これは、Ｐ３を用いることによってなされ、バイオリアクターを通るＥＣ媒体の流量を増大する。Ｐ２およびＰ３は、バイオリアクター内で負圧流を生じ、バイオリアクターの複数本の繊維に付着した細胞だけを残して、付着しなかった細胞を複数本の繊維から剥がし、この剥がした細胞を複数本の繊維から排出する。
【００６３】
例５
濃度勾配を用いた中空繊維内における選択的分配。
【００６４】
バイオリアクターのＩＣ空間およびＥＣ空間は、イニシャル状態で濃度ｄ１を有する媒体で満たされている。バイオリアクター内で成長される細胞は、濃度ｄ２（ｄ２＞ｄ１）を有する媒体内で浮遊されており、この媒体がバイオリアクターのＩＣ空間内へ充填される。バイオリアクターが水平に保持されて細胞をゆっくりとした流速で送り込むと、（より重い媒体内の）細胞は、バイオリアクター入口ヘッダーの底に落ち、そして、バイオリアクターの底にある複数本の繊維にだけ流れる。また、粘度（μ１、μ２）および流速の使用は、複数本の繊維に対する細胞の位置決めに役立つ。
【００６５】
例６
分裂細胞を中空繊維に沿って分配するための流体の流れの使用
細胞分裂、すなわち有糸分裂の間、付着した細胞は、その細胞が付着された膜から引き剥がされる傾向にあり、或いは少なくともよりゆるく付着するようになる。
【００６６】
本実施の形態において、細胞は、膜のＩＣ側で成長され、媒体の流れは、複数本の中空繊維を通って押し付けられる。この複数本の中空繊維を通る流体の流れは、細胞に剥ぎ取る力を与える。この力は、有糸分裂した細胞を膜から剥ぎ取る助けとして使用され、剥ぎ取った細胞を媒体の流れを伴って中空繊維から排出する。
【００６７】
膜を通る流体の流れは、剥ぎ取った細胞が媒体の流れから外れて落ちる程度に十分にゆっくりにしなければならない。一旦媒体の流れから外れると、細胞は、より下流側の位置で膜に再付着し、繊維に沿ったより多くの位置で、細胞の再分配および成長を促進する。
【００６８】
流量可変の複数のポンプの組み合わせを選択することは、複数本の繊維を通る流体の流れを調節するために使用可能である。このようなポンプの組み合わせは、膜から細胞を離すための高い剥離の時期を生出し、その後に、細胞を膜に置いて再付着することを許容するための低い剥離の時期を生出するために使用可能である。
【００６９】
このような方法は、複数本の中空繊維への入口を介して、増殖される細胞をバイオリアクター内へ始めて充填するために使用でき、複数本の繊維を通して細胞を移動させる間欠的な流れに使用できる。
【００７０】
上述した複数の例は、本発明の主題に沿って適用可能な実施例のいくつかであり、添付した請求の範囲によって規定されたものとして本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
2014012015.tif 000003
【図２】
2014012015.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月20日(2013.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖システム内に細胞を充填する方法であって、
毛管内空間および毛管外空間を有した中空繊維を含むバイオリアクターを用意する工程；
毛管内空間内に細胞を充填する工程；
毛管内媒体バッグから毛管内空間へ流体を流す工程；
毛管外媒体バッグから毛管外空間へ流体を流す工程；
毛管内空間の第１の領域において負圧流を生じさせ、第１の領域の細胞を中空繊維の表面より引き離す工程；そして
毛管内空間の第２の領域において正圧流を生じさせ、第２の領域の細胞を中空繊維の表面へ細胞を移動させる工程；
を含む上記方法。
【請求項２】
第１の領域はバイオリアクターの入口を有し、そして負圧流が浮遊モードを生出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が接着細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
正圧流が付着モードを生出する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
更に、
毛管内循環ループ内で、毛管内媒体バッグから送り出された流体を毛管内空間へ再循環させる工程；及び
毛管外循環ループ内で、毛管外媒体バッグから送り出された流体を毛管外空間へ再循環させる工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
正圧流を生じさせる工程が、毛管内循環ループ内の流体を再循環させる１以上のポンプの速度を増加させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞増殖システム内で精製されていない細胞を移動させる方法であって、
毛管内空間および毛管外空間を有した中空繊維を含むバイオリアクターを用意する工程；
毛管内空間内に、付着細胞部分と非付着細胞部分を含む、精製されていない細胞を充填する工程；
毛管内媒体バッグから毛管内空間へ流体を流す工程；
毛管外媒体バッグから毛管外空間へ流体を流す工程；
正圧流を生じさせ；中空繊維の表面へ精製されていない細胞を移動させて、精製されていない細胞の付着細胞部分が中空繊維の表面へ接着するようにする工程；及び
負圧流を生じさせ；精製されていない細胞の非付着細胞部分を中空繊維バイオリアクターから排出する工程；
を含む上記方法。
【請求項８】
精製されていない細胞が、骨髄細胞全体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
精製されていない細胞の非付着細胞部分が赤血球、白血球、および血小板からなる群から選択される１以上のものを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
精製されていない細胞の付着細胞部分が中空繊維バイオリアクター内で増殖する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
正圧流が、毛管外流体の流圧より大きい毛管内流体の流圧を有することにより生じる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
更に
毛管内循環ループ内で、毛管内媒体バッグから送り出された流体を毛管内空間へ再循環させる工程；及び
毛管外循環ループ内で、毛管外媒体バッグから送り出された流体を毛管外空間へ再循環させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
正圧流を生じさせる工程が、毛管内循環ループ内の流体を再循環させる１以上のポンプの速度を増加させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞増殖システムの中空繊維バイオリアクター内で付着細胞を移動させる方法であって；
毛管内空間および毛管外空間を有した中空繊維を含む中空繊維バイオリアクターを用意する工程；
毛管内空間内に細胞を充填する工程；
毛管内空間へ流体を流す工程；
付着期間中、毛管外空間内の流体の流圧より大きい流体の流圧を毛管内空間に生じさせ、細胞を中空繊維の表面へ押す工程；
付着期間後、毛管外空間内の流体の流圧を増加させて毛管内空間の流体の流圧より大きくし、細胞を中空繊維の表面から除去する工程；そして
細胞収穫バッグ内に細胞を集める工程；
を含む上記方法。
【請求項１５】
付着期間中、細胞が中空繊維バイオリアクター内で増殖する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
付着細胞が間葉系幹細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】
2014012015000001.pdf