(57)【要約】【課題】  蛍光色素等の機能性分子を含有するシリカナノ粒子の表面に抗体が結合してなる標識抗体の製造方法であって、イムノアッセイにおいて、非特異的な吸着を低減し、かつ、検出対象たる標的抗原の捕捉効率（標的抗原に対する結合効率）が高められた標識抗体を製造するための方法を提供する。【解決手段】  ａ）機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び  ｂ）前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程を含む、標識抗体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
ｂ）前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、標識抗体の製造方法。
【請求項２】
工程ａ）における溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項１に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項３】
非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−シクロヘキシルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドから選ばれる、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
リンカー分子の構造が、２価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを介してマレイミド基とアミノ基とが連結した構造である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
標識抗体の平均粒径が２０〜５００ｎｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びｐＨ感受性分子からなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子において、表面に存在するチオール基の密度が０．００２〜０．２個／ｎｍ２であり、該チオール基の量により抗体の結合量が制御される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
機能性分子を含有するシリカナノ粒子を標識粒子とし、その表面にリンカーを介して抗体が結合してなる標識抗体であって、
前記の機能性分子を含有するシリカナノ粒子と前記リンカーとがチオエーテル結合により連結し、前記抗体と前記リンカーとの連結構造が、＊−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（＊は抗体側を示す。）である、標識抗体。
【請求項９】
リンカーが、２価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを有する、請求項８に記載の標識抗体。
【請求項１０】
平均粒径が２０〜５００ｎｍである、請求項８又は９に記載の標識抗体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の標識抗体が分散媒中に分散してなるコロイド。
【請求項１２】
分散媒が緩衝液である、請求項１１に記載のコロイド。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の標識抗体を含む分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。
【０００３】
上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、蛍光色素等の機能性分子を含有するシリカナノ粒子（以下、機能性分子含有シリカナノ粒子ともいう。）の表面に抗体が結合してなる標識抗体の製造方法であって、イムノアッセイにおいて、非特異的な吸着を低減し、かつ、検出対象たる標的抗原の捕捉効率（標的抗原に対する結合効率）が高められた標識抗体を製造するための方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に抗体を結合させた標識抗体であって、イムノアッセイにおいて、非特異的な吸着を低減し、かつ、検出対象たる標的抗原の捕捉効率が高められた標識抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に抗体を結合させた標識抗体において、その標的抗原に対する結合能（標的抗原の捕捉能）が、当該シリカナノ粒子表面への抗体の結合様式により大きく変動することを見い出した。そして、抗体のカルボキシル基とシリカナノ粒子表面のチオール基とをリンカー分子を介して結合させた形態の標識抗体をイムノアッセイに用いると、非特異的な吸着が大幅に抑えられ、しかも標的抗原の捕捉能については大きく向上することを見い出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されるに至った。
【０００６】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
＜１＞ａ）機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
ｂ）前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、標識抗体の製造方法。
＜２＞工程ａ）における溶媒が非プロトン性溶媒である、前記＜１＞に記載の標識抗体の製造方法。
＜３＞非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−シクロヘキシルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドから選ばれる、前記＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞リンカー分子の構造が、２価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを介してマレイミド基とアミノ基とが連結した構造である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜５＞標識抗体の平均粒径が２０〜５００ｎｍである、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜６＞機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びｐＨ感受性分子からなる群から選ばれる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜７＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子において、表面に存在するチオール基の密度が０．００２〜０．２個／ｎｍ２であり、該チオール基の量により抗体の結合量が制御される、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜８＞機能性分子を含有するシリカナノ粒子を標識粒子とし、その表面にリンカーを介して抗体が結合してなる標識抗体であって、
前記の機能性分子を含有するシリカナノ粒子と前記リンカーとがチオエーテル結合により連結し、前記抗体と前記リンカーとの連結構造が、＊−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（＊は抗体側を示す。）である、標識抗体。
＜９＞リンカーが、２価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを有する、前記＜８＞に記載の標識抗体。
＜１０＞平均粒径が２０〜５００ｎｍである、前記＜８＞又は＜９＞に記載の標識抗体。
＜１１＞前記＜８＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の標識抗体が分散媒中に分散してなるコロイド。
＜１２＞分散媒が緩衝液である、前記＜１１＞に記載のコロイド。
＜１３＞前記＜８＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の標識抗体を含む分析試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の標識抗体の製造方法（以下、単に、本発明の製造方法ともいう。）によれば、イムノアッセイにおける非特異的な吸着がより抑えられ、かつ、標的抗原の捕捉能がより向上した標識抗体を得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量により抗体の結合量が制御されるため、当該シリカナノ粒子表面への抗体の結合量をより精密に制御することができる。
【０００８】
本発明の標識抗体は、イムノアッセイにおける非特異的な吸着がより少ない一方で、標的抗原の捕捉能がより高められている。また、本発明の標識抗体は、抗体がリンカー分子を介して機能性分子含有シリカナノ粒子表面と共有結合により強固かつ安定に結合しているため、機能性分子含有シリカナノ粒子から抗体が脱離しにくい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例で用いたイムノクロマト装置のテストストリップの構造を模式的に示した図である。図１中（ａ）は上面図、（ｂ）は縦断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明をその好ましい実施態様に基づき以下に詳細に説明する。
【００１１】
本発明の製造方法には、機能性分子を含有し、かつ、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子が用いられる。当該シリカナノ粒子は、いわゆる標識用粒子としての性能を備えたものである。本発明の製造方法では、上記シリカナノ粒子に、当該シリカナノ粒子表面のチオール基を介して特定のリンカー分子を共有結合させ、さらに、当該リンカー分子の別の部位に抗体が有するカルボキシル基を介して当該抗体を共有結合させる。これにより、上記シリカ粒子表面のチオール基の量に応じた量の抗体が結合した標識抗体が得られる。こうして得られる標識抗体は、各種診断試薬、検査試薬等の分析試薬に用いることができる。
【００１２】
上記機能性分子含有シリカナノ粒子における「機能性分子」に特に制限はないが、分析試薬等において検出指標となりうる標識分子を採用することが好ましい。当該機能性分子として、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子、ｐＨ感受性色素分子等を例示することができ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。
【００１３】
機能性分子含有シリカナノ粒子は、機能性分子とシランカップリング剤とを、共有結合、イオン結合その他の化学結合又は物理的吸着により結合させた生成物（機能性分子が結合したオルガノアルコキシシラン）を得、この生成物と１種又は２種以上のシラン化合物（シロキサン成分）とを、例えばアンモニア水含有溶媒中で、加水分解・縮重合させてシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
上記アンモニア水含有溶媒としては、例えば、水／エタノールを体積比で１／１０〜１／１とした混合液に、例えば２８％程度のアンモニア水を、アンモニア濃度が０．２〜３ｗｔ％になるように加えた溶液を用いることができる。
前記シラン化合物（シロキサン成分）に特に制限はなく、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシランのようなテトラアルコキシシランの他、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤も用いることができる。中でも、ＴＥＯＳを好適に用いることができる。
なお、上記シラン化合物としてＭＰＳ等のチオール基を有するものを使用すると、得られる機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にはチオール基が存在することになるため、後述する機能性分子含有シリカナノ粒子表面へのチオール基の導入操作は必ずしも必要なくなる。
【００１４】
機能性分子とシランカップリング剤とを共有結合させる場合には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する機能性分子と、これらの活性基と反応しうる官能基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等）を有するシランカップリング剤を用いることができる。
【００１５】
ＮＨＳエステル基を有する機能性分子において、当該機能性分子が蛍光分子である場合の好適な例としては、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式で表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル、下記式で表されるＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
【化１】
2014153057.tif 000002
【００１７】
【化２】
2014153057.tif 000003
【００１８】
機能性分子がスクシンイミド基を有する場合には、アミノ基を有するシランカップリング剤と結合させることができる。アミノ基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。中でも、ＡＰＳを好適に用いることができる。
【００１９】
上述のように調製される機能性分子含有シリカナノ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状である。また、平均粒径は１〜１０００ｎｍであることが好ましく、２０〜５００ｎｍであることがより好ましい。
当該平均粒径は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識粒子の合計の投影面積から複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した複合粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）として算出することができる。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子は、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行うことで得ることができる。また、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿を回収することで得ることもできる。
【００２０】
続いて機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基を導入する方法について説明する。
【００２１】
シリカナノ粒子表面へのチオール基の導入は通常の方法により得ることができ、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）や、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載される方法を採用することができる。
例えば、機能性分子含有シリカナノ粒子を水とエタノールの混合溶媒に分散させ、チオール基を有するシランカップリング剤とアンモニア水とを添加して攪拌することで、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基を導入することができる。
チオール基を有するシランカップリング剤は、当該チオール基がアルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してケイ素原子に結合した構造であることが好ましい。当該アルキレン基又はアルキレンオキシ基の炭素数は、２〜１０が好ましく、２〜５がより好ましく、２〜４がさらに好ましい。このようなシランカップリング剤として、メルカプトアルキルトリアルコキシシランがより好ましく、その具体例としては、例えば、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、１１−メルカプトウンデシルトリメトキシシランが挙げられる。
上記の水とエタノールの混合溶媒は水／エタノールが体積比で１／１０〜１／１とすることが好ましい。また、機能性成分含有シリカナノ粒子の最終濃度は０．１〜２ｗｔ％とすることが好ましく、添加するチオール基を有するシランカップリング剤の量は、機能性分子含有シリカナノ粒子１ｇに対して、０．２〜２０ｍｍｏｌとすることが好ましい。また、アンモニア水の添加は、例えば２８％程度のアンモニア水を用いて、アンモニア濃度が０．２〜３ｗｔ％になるように加えることが好ましい。
【００２２】
上記のチオール基導入方法は、コアとなる機能性分子含有シリカナノ粒子を調製し、これを分離洗浄してからチオール基導入操作を行うために、時間と労力がかかる。また、チオール基を高い再現性で所望量導入することも難しい。通常は、高い再現性でチオール基を導入するために、チオール基を有するシラン化合物を十分に反応させる。しかし、この十分な反応は、機能性分子含有シリカナノ粒子表面に導入されるチオール基の量を過剰にし、粒子表面の疎水性が上昇して（すなわちゼータ電位の絶対値が低くなり）粒子同士の凝集が生じやすくなってしまう。
したがって、より簡便な方法で、しかもチオール基の導入量を自由に、かつ高い再現性で制御できる方法を用いて、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を調製することが好ましい。
このような調製方法として、例えば以下の工程を含む方法（連続法）が挙げられる。
【００２３】
（連続法）
機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び
上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するシランカップリング剤とテトラアルコキシシランを添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程。
【００２４】
上記のチオール基を有するシランカップリング剤と上記テトラアルコキシシランの添加割合を調節することで、導入されるチオール基の量を自由に調節することができる。当該テトラアルコキシシランとしてはＴＥＯＳが好適である。
上記連続法では、機能性分子含有シリカナノ粒子の調製からチオール基の導入を連続的に行うことができるため作業時間と労力も大幅に改善される。
【００２５】
チオール基が導入された機能性分子含有シリカナノ粒子のゼータ（ζ）電位の絶対値は２０〜７０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位の絶対値が上記範囲内である粒子は、凝集が抑制され、分散性がより高まる。
ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ  ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いて測定することができる。
【００２６】
機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量は、ＳＨ基に結合することで発色する試薬によって後述する方法で定量することができる。本発明に用いるチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子におけるチオール基の量は、シリカナノ粒子の単位表面積あたりの密度として、０．００２〜０．２個／ｎｍ２とすることが好ましい。表面のチオール基の密度が０．００２個／ｎｍ２より小さいと、リンカー分子を介して結合する生体分子の量が少なく、標識試薬として十分に機能しにくい場合がある。また、表面のチオール基の密度が０．０２個／ｎｍ２より多いと、シリカナノ粒子表面の疎水性が高まり過ぎて、疎水性相互作用による非特異的な吸着の増加、及び粒子の分散性の低下が生じやすい。本発明に用いるチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子におけるチオール基の量は、シリカナノ粒子の単位表面積あたりの密度が、０．００５〜０．１／ｎｍ２であることがより好ましく、０．０１〜０．０５／ｎｍ２であることがさらに好ましい。
【００２７】
（シリカナノ粒子表面のチオール基量の定量法）
シリカナノ粒子表面のチオール基量は、ＤＮＴＢ（5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic  acid)）を試薬として用いて行うことができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives  of  Biochemistry  and  Biophysics,  82,  70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカナノ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線からチオール基量を定量することができる。
【００２８】
本発明に用いるリンカー分子は、分子内にマレイミド基とアミノ基とを有する限り特に制限はないが、当該マレイミド基とアミノ基とが、２価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせ介して連結している分子であることが好ましい。上記２価の脂肪族基の炭素数は１〜２０の整数が好ましく、２〜１０の整数がより好ましい。また、上記アリーレン基としては、フェニレンが好適である。
リンカー分子は、マレイミド基とアミノ基とをそれぞれ１つずつ有することが好ましい。
本発明に用いるリンカー分子の分子量は特に制限されないが、１５０〜５０００であることが好ましい。
分子内にマレイミド基とアミノ基を有するリンカー分子としては、例えば、Ｎ−（４−アミノフェニル）マレイミド、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩、Ｎ−アセチルアミノマレイミドが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の製造方法においては、まず、上記リンカー分子のマレイミド基と、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に導入されたチオール基との間にチオエーテル結合を形成させ、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る。
上記のマレイミド基とチオール基との反応は、用いるリンカー分子が塩酸塩などの塩である場合は水や緩衝液中で行うことができる。用いるリンカー分子が塩でない場合は非プロトン性溶媒中で行う。プロトン性溶媒を用いると、マレイミド基が溶媒分子と反応し、その結果チオール基との反応性が低下する場合があるため、非プロトン性溶媒を用いた方がマレイミドの反応性が高い。上記非プロトン性溶媒は、シリカナノ粒子が分散しうるものであれば制限はないが、極性溶媒であることが好ましい。この極性非プロトン性溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−シクロヘキシルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドが挙げられる。中でもＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好適である。
通常、生化学分野においては、マレイミド基とチオール基との反応は、抗体等の生体分子の活性低下を防ぐために、やむを得ず水系溶媒を用いて行われることが多い。しかし、本発明の製造方法では、マレイミド基は機能性分子含有シリカナノ粒子のチオール基と反応させればよく、抗体と反応させる必要がないため、マレイミド基とチオール基との反応を非プロトン系溶媒中で極めて効率よく行わせることができる。
【００３０】
上記反応においては、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の溶媒中における濃度は０．０５〜２質量％とすることが好ましく、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子１ｍｇに対し０．１〜５ｍｇのリンカー分子を反応させることが好ましい。反応温度は０〜６０℃であることが好ましく、０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は５分以上が好ましく、５〜１２０分であることがより好ましい。
【００３１】
上記のように調製した、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子に、当該リンカーを介して抗体を結合することで、抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が製造される。具体的には、上記抗体と、後述するカルボジイミドとを水系溶媒中に共存させて当該抗体のカルボキシル基を活性エステル化し、この活性エステルと、リンカー分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる。この結合反応も水系溶媒中で行われる。抗体とカルボジイミドとの混合による抗体が有するカルボキシル基の活性エステル化は、抗体とリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子との混合前に行ってもよいし、当該混合後に行ってもよいし、当該混合と同時に行ってもよい。
すなわち、本発明において「リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ」とは、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれの形態も包含する意味に用いる。
（ａ）リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを同時に水系溶媒中に混合する形態、
（ｂ）抗体とカルボジイミドとを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子とを混合する形態、
（ｃ）リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と抗体とを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、カルボジイミドとを混合する形態、
（ｄ）リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子とカルボジイミドとを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、抗体とを混合する形態。
【００３２】
上記抗体としては、免疫グロブリン（whole抗体）や、それを酵素分解して得られるＦ（ａｂ’）２やＦａｂ、重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）とをリンカーを介してタンデムに連結したｓｃＦｖやｓｃ（Ｆｖ）２、ＶＨとＶＬがリンカーを介して連結したユニット２つからなるダイアボディー、人工的に化学合成した、ＶＨ及びＶＬを含むポリアミノ酸、大腸菌や酵母等を発現系として用いて作製された、ＶＨ及びＶＬを含む組換えタンパク質ないし組換えポリアミノ酸を含む。すなわち、本発明において「抗体」とは、ＶＨ及びＶＬを有する分子ないしユニットを意味し、ＶＨ及びＶＬを有する限り、その形態は限定されない。
【００３３】
上記水系溶媒に特に制限はないが、緩衝液であることが好ましく、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液等の通常の水系緩衝液を好適に用いることができる。
【００３４】
上記カルボジイミドとしては特に制限はなく、カルボキシル基の活性エステル化のために通常用いられるものを採用することができる。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどを用いることができる。また、カルボジイミドと共に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドやスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド等を共存させ、カルボジイミドにより生じた活性エステル基を、より安定な活性エステル基に誘導化してもよい。
【００３５】
機能性分子含有シリカナノ粒子表面に結合したリンカー分子と抗体とのアミド結合による連結に際しては、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子１ｍｇに対して、抗体を５〜５００μｇ共存させて反応させることが好ましい。
反応温度は０〜６０℃であることが好ましく、１０〜４０℃であることがより好ましい。また、反応時間は５分以上が好ましく、５〜６００分であることがより好ましい。
【００３６】
上述の各工程を経ることにより、水系溶媒中に、抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子、すなわち標識抗体が得られる。
上記で得られた標識抗体に残存する活性エステルの反応性を無くすために、さらに、ウシ血清アルブミンやカゼイン等を加えて混合しても良い。
【００３７】
本発明の製造方法で製造された標識抗体において、機能性分子含有シリカナノ粒子表面への抗体の結合量は通常の方法で測定することができる。例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で定量することができる。
【００３８】
本発明の製造方法で製造された標識抗体は、平均粒径が１〜１０００ｎｍであることが好ましく、２０〜５００ｎｍであることがより好ましい。
当該平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めた値である。
前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
【００３９】
本発明の製造方法で製造された標識抗体の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下であることが好ましく、８％以下であることがより好ましい。
【００４０】
本発明の製造方法で製造された標識抗体においては、機能性分子含有シリカナノ粒子表面への抗体の結合量が、機能性分子含有シリカナノ粒子に導入されたチオール基の量と正の相関関係を示すため、チオール基の導入量を制御することで、抗体の結合量を精密に制御することができる。例えば、特定の同じ条件で作製したチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子であれば、粒子表面のチオール基の量は一定であるから、常に一定量の抗体を結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得ることができる。これにより、抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を所望の検出試験や分析試験に用いた際に、得られる出力値（例えば蛍光強度）のばらつきを大幅に抑えることができ、定量性及び信頼性に優れた試験を行うことが可能となる。また、機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量を測定しておくことで、抗体の結合量を見積もることができる。したがって、チオール基の結合量を変えた機能性分子含有シリカナノ粒子を複数作製しておけば、目的に応じて抗体が所望量結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を調製することができる。
【００４１】
本発明の製造方法では、抗体は、自身が有するカルボキシル基を介して、機能性分子含有シリカナノ粒子表面に結合する。すなわち、機能性分子含有シリカナノ粒子表面には、抗体のアミノ酸配列におけるカルボキシル末端（Ｃ末端）と、リンカー分子のアミノ基とがアミド結合しているものが多く存在することになる。これにより、抗体の可変領域がシリカ粒子側とは反対側（シリカ粒子の外側）に配向しやくなるなどして、標的抗原の捕捉能が向上すると考えられる。
標的抗原の捕捉能の向上は、より低分子の抗体を用いた場合により顕著になる。例えば、抗体として、Ｆ（ａｂ’）２抗体やＦａｂ抗体などのフラグメント抗体、ｓｃＦｖやｓｃ（Ｆｖ）２などの一本鎖抗体、ＶＨ及びＶＬを含むポリアミノ酸を用いた場合により顕著である。
【００４２】
本発明の製造方法では、表面にチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を用いるが、このチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を用いることにより、はじめて抗体と機能性分子含有シリカナノ粒子とを、簡便かつ均質に結合させることが可能になる。機能性分子含有シリカナノ粒子と抗体とをリンカー分子を介して強固かつ安定に結合させる方法としては、例えば、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基ではなく、アミノ基を導入し、リンカー分子が有する活性エステル基と当該アミノ基を共有結合させ、さらにリンカー分子が有するマレイミド基と、抗体に導入したチオール基とを共有結合させる方法等も考えられる。しかし、実際には、表面にアミノ基を導入した機能性分子含有シリカナノ粒子は凝集しやすく、実用性に劣る。これは、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子に比べて、表面にアミノ基を有するシリカナノ粒子は、疎水性がより高まることが原因と考えられる。
本発明の製造方法では、リンカー分子として炭素鎖の長さの異なるものや芳香環を含むものを選択することができ、リンカー分子の構造を適宜選択することによって、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に結合する抗体の標的抗原捕捉能をより効果的に引き出すことができる。
【００４３】
本発明の標識抗体は、上述した本発明の製造方法により得られうる粒子である。本発明の標識抗体は、機能性分子を含有するシリカナノ粒子を標識粒子とし、その表面にリンカーを介して抗体が結合している。機能性分子を含有するシリカナノ粒子とリンカーとはチオエーテル結合により連結し、前記抗体と前記リンカーとの連結構造は、＊−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−＊＊（＊は抗体側を示し、＊＊はリンカー側を示す。）で表される。
別の表現をすれば、本発明の標識抗体は、機能性分子を含有するシリカナノ粒子が有するチオール基と、リンカー分子が有するマレイミド基とが、チオエーテル結合により結合した構造、及び、該リンカー分子が有するアミノ基と、抗体が有するカルボキシル基とが、アミド結合により結合した構造を有する。
チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子、リンカー分子、抗体は、上述の本発明の製造方法で説明したものと同義である。
【００４４】
本発明の標識抗体は、標識試薬として使用することができ、後述する各種の分析試薬に標識試薬として含有させることができる。
本発明の標識抗体は、標的抗原の捕捉能に優れる。加えて、抗原抗体反応に基づく結合でない、いわゆる非特異的吸着がより抑えられる。本発明の標識抗体を含む分析試薬を用いた分析結果は、後述する実施例に示されるように、高感度で、かつ信頼性に優れる。
【００４５】
本発明のコロイドは、本発明の標識抗体を分散媒中に分散してなる。
【００４６】
上記分散媒に特に制限はなく、本発明の標識抗体を均一に分散しうるものであればよいが、親水性の溶媒であることが好ましい。親水性溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、水とメタノールの混合溶媒、水とエタノールの混合溶媒、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のコロイドには、本発明の標識抗体の非特異的な吸着をさらに防止する観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、血清アルブミン（ＢＳＡ）などの任意のブロッキング剤を含有させてもよい。また、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含有させてもよい。
【００４８】
本発明のコロイド中には、本発明の標識抗体が安定に存在しており、抗体の標的抗原捕捉能を維持しながら長期保存することが可能である。
本発明のコロイドは、標識試薬液として用いることができる。また、分析試薬に含まれる標識試薬の調製に用いることができる。
【００４９】
本発明の分析試薬は、本発明の標識抗体を含む。本発明の分析試薬は、抗体が認識しうる標的抗原を検出するための検出試薬、該標的抗原を定量するための定量試薬、該標的抗原を分離するための分離試薬、該標的抗原を単離して回収するための回収試薬、該標的抗原を標識する標識試薬等として使用される。
上記標的抗原に特に制限はなく、通常の分析・検査・診断における検出対象となる分子等が挙げられる。その一例として、ウイルス抗原、食物アレルゲン、血液検査等における各種マーカー、毒素、細胞膜タンパク質、細胞膜糖鎖、免疫グロブリン等が挙げられる。
本発明の分析試薬の好適な例として、コンジュゲートパッドに本発明の標識抗体が保持されたテストストリップを有するイムノクロマトグラフィー装置等が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
［参考例１］  チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の調製−１
（機能性分子含有シリカナノ粒子の調製）
機能性分子として蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有するシリカナノ粒子を調製した。
【００５１】
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）３１ｍｇを１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１２μＬのＡＰＳ（信越シリコーン社製）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
得られた５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した機能性分子含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子含有シリカナノ粒子１．６５ｇを得た。収率約９４％。
【００５２】
（チオール基の導入）
上記で得た粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）を１．５ｍＬ加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を１０ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａと呼ぶ。）を得た。
【００５３】
（チオール基の定量分析）
上記のチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ５００ｍｇを用いて、ＤＮＴＢによるチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
【００５４】
［参考例２］  チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の調製−２
１４質量％のアンモニア水をエタノールで５倍希釈して１７５ｍＬのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）１．５ｍＬ（６．７５ｍｍｏｌ）と、参考例１で調製した５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）１．５ｍＬとを添加して、４０℃で３０分攪拌することで蛍光分子を含有するコア粒子が形成された溶液（以下、コア蛍光粒子含有溶液と呼ぶことがある。）を得た。
【００５５】
上記コア蛍光粒子含有溶液に、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）１．５ｍＬ（６．７５ｍｍｏｌ）と、１０ｍＭの濃度になるようにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、和光純薬社製）に溶解した５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ５５０μＬ（５．５μｍｏｌ）とを追添し、４０℃で３０分攪拌することでコア蛍光粒子にシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第１蛍光シリカナノ粒子と呼ぶことがある。）を含む溶液を得た。
【００５６】
上記第１蛍光シリカナノ粒子含有溶液にＴＥＯＳ５００μＬ（２．２６ｍｍｏｌ）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ２６５μＬ（２．６５μｍｏｌ）とを追添し、４０℃で３０分攪拌して第１蛍光シリカナノ粒子にさらにシェル層を形成させた粒子（以下、第２蛍光シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液を得た。
【００５７】
第２蛍光シリカナノ粒子の表面にメルカプトプロピル基を導入するために、上記第２シリカナノ粒子含有溶液に、表１の条件１の混合比で調製したＭＰＳ（和光純薬株式会社製）とＴＥＯＳの混合液（ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液）１ｍＬを追添した。室温で３０分攪拌することで、表層にヒドロキシル基とメルカプトプロピル基とを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂと呼ぶ。）を含む溶液を得た。同様に、表１の条件２及び３の混合比で調製したＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液を添加して調製した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、それぞれ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄと呼ぶ。）を含む溶液も調製した。
ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液は追添の直前に調製した。
【００５８】
【表１】
2014153057.tif 000004
【００５９】
（チオール基の定量分析）
条件１〜３で得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂ〜Ｄをそれぞれ５００ｍｇ用いてＤＮＴＢによるチオール基の定量分析を行った。その結果、粒子表面のチオール基の密度は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂが０．０１２個／ｎｍ２、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃが０．０５６個／ｎｍ２、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄが０．０７２個／ｎｍ２であった。
【００６０】
［比較例１］  標識抗体の製造（抗体のアミノ基を介した結合−１）
参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ（平均粒径２６０ｎｍ）の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として３−マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
【００６１】
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子（標識抗体）１ｇあたり８．５ｍｇであった。
【００６２】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（以下、比較例のコロイドＡと呼ぶ。）を得た。
【００６３】
［比較例２］  標識抗体の製造（抗体のアミノ基を介した結合−２）
参考例２で調製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂ〜Ｄを用いて、比較例１と同様の方法で抗体の結合処理を行い、粒子が分散した各コロイドを得た。タンパク定量の結果、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子（標識抗体）１ｇあたりの抗体の結合量は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂを用いた場合は３．７ｍｇ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃを用いた場合は９．２ｍｇ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄを用いた場合は１２．８ｍｇであった。
【００６４】
続いて、上記各コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（上記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂ〜Ｄに対応して、以下、比較例のコロイドＢ〜Ｄと呼ぶ。）を得た。
【００６５】
［実施例１］  標識抗体の製造（抗体のカルボキシル基を介した結合−１）
参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを用いて、以下の方法で抗体を結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−(４−アミノフェニル)マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、７．９ｍｇであった。
【００６６】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、本発明のコロイドＡと呼ぶ。）を得た。
【００６７】
［実施例２］  標識抗体の製造（抗体のカルボキシル基を介した結合−２）
参考例２で調製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂ〜Ｄを用いて、実施例１と同様の方法で抗体の結合処理を行い、粒子が分散した各コロイドを得た。タンパク定量の結果、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂを用いた場合は４．２ｍｇ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃを用いた場合は８．８ｍｇ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄを用いた場合は１１．３ｍｇであった。
【００６８】
続いて、上記各コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（上記チオール基導入シリカナノ粒子Ｂ〜Ｄに対応して、以下、本発明のコロイドＢ〜Ｄと呼ぶ。）を得た。
【００６９】
［試験例１］  イムノクロマト法試験
【００７０】
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍのＡ型インフルエンザ用テストラインとして、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
【００７１】
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＫＰ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は３ｍｍとした。
前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。
【００７２】
（検出装置）
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）で受光する機構を有する。
【００７３】
（インフルエンザ核タンパク質の迅速判定）
表２に示す組成で、Ａ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。続いて同混合液１００μＬと、比較例のコロイドＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬの混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。比較例のコロイドＢ〜Ｄ、本発明のコロイドＡ〜Ｄについても同様に試験を実施した。１５分後、上記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
2014153057.tif 000005
【００７５】
表２に示すように、同じチオール基導入蛍光シリカナノ粒子を使用したコロイドを比較すると、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が含まれないサンプル（０ｎｇ／ｍＬ）では比較例のコロイドに比べて本発明のコロイドはテストライン強度が抑えられ、非特異的な吸着がより少ないことがわかった。一方、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が含まれるサンプル（２０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）では、比較例のコロイドに比べて本発明のコロイドはテストライン強度が大幅に高められていた。
【００７６】
［比較例３］  標識抗体の製造（抗体のアミノ基を介した結合−３）
機能性分子含有シリカ粒子として参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを用い、抗体としてＦａｂ化した抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体を用いて比較例１と同様の方法でシリカ粒子と抗体を結合させた。得られたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり７．１ｍｇであった。
【００７７】
続いて、上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、Ｆａｂ化した抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（以下、比較例のコロイドＡ’と呼ぶ。）を得た。
【００７８】
［実施例３］  標識抗体の製造（抗体のカルボキシル基を介した結合−３）
機能性分子含有シリカ粒子として参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを用い、抗体として、比較例３で用いたのと同一のＦａｂ化した抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体を用いて、実施例１と同様の方法でシリカ粒子と抗体を結合させた。得られたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり８．５ｍｇであった。
【００７９】
続いて、上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、Ｆａｂ化した抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（以下、本発明のコロイドＡ’と呼ぶ。）を得た。
【００８０】
［試験例２］  イムノクロマト法試験
試験例１と同様の方法で、イムノクロマト試験を実施した。結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
表３に示すようにＡ型インフルエンザ核タンパク質が含まれないサンプル（０ｎｇ／ｍＬ）では、比較例３のコロイドに比べて実施例３のコロイドはテストライン強度が顕著に抑えられていた。しかも、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が含まれるサンプル（２０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）では、比較例３のコロイドに比べて実施例３のコロイドはテストライン強度がより大幅に高められていた。表２の結果と表３の結果を比較すると、通常の抗体（ホール（whole）抗体）を結合させた場合に比べて（表２）、フラグメント抗体を用いた場合（表３）は、抗体のアミノ基を介してシリカ粒子と結合させたものと、抗体のカルボキシル基を介してシリカ粒子と結合させたものとの間で、後者（表３）の方がテストライン強度の差が大きくなることがわかった。一般に、血液サンプル等の生検体をサンプルとした場合には、ホール抗体よりもフラグメント抗体の方が非特異的な吸着が少なく検出感度が良好となることが知られている。そのため、フラグメント抗体を用いた場合においてより一層の利点を有する本発明の標識抗体は、実際の検査の現場においてより有用な検査ツールとなりうる。
【符号の説明】
【００８３】
１    テストストリップ
２    サンプルパッド
３    コンジュゲートパッド
４    抗体固定化メンブレン
４１  判定部（テストライン）
４２  コントロールライン
５    吸収パッド
６    バッキングシート
【図１】
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