(57)【要約】【課題】  温度変化の高速化を実現すると共に、蛍光検出のための光学系を簡素化する温度調整ユニットを提供する。【解決手段】  薄板状反応容器を保持する保持部材の側面に隣接する温調素子を、その加熱冷却面と薄板状反応容器格納部の保持部材主平面が垂直になるように配置する。また、保持部材の底面と副平面に窓を設け、励起光照射及び蛍光検出を2方向から行う。本発明の温度調整ユニットを用いることで、一定以上の伝熱面積を有する保持部材で薄板状反応容器を挟み込むことができ、一般的なペルチェ素子で薄板状反応容器の主平面全面に迅速に熱が伝わり、温度変化の高速化が図れる。さらに熱伝導に関係しない薄板状反応容器の底面、副平面を励起光照射、蛍光検出に用いることで、温度変化の高速化を維持しつつ、簡素な光学系で高感度な蛍光検出が実現できる。【選択図】図１
2014232057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応容器を保持するための保持部材と、前記保持部材に隣接する、温度を調整する温調素子とを有してなる温度調整ユニットであって、
前記保持部材は水平方向断面が対向する2つの保持部材主平面と対向する2つの保持部材副平面と底面と開口部とを有して構成される略直方体形状の反応容器格納部を備え、前記保持部材主平面は前記保持部材副平面と比べて、面積が広く形成されており、前記温調素子の加熱冷却面が前記保持部材主平面に対して略垂直であることを特徴とする温度調整ユニット。
【請求項２】
請求項１記載の温度調整ユニットにおいて、開口部とは別に、少なくとも1つの窓部を備えることを特徴とした温度調整ユニット。
【請求項３】
請求項２記載の温度調整ユニットにおいて、前記反応容器格納部の水平方向断面の断面積は、前記反応容器格納部の底面から開口部に向けて大きくなることを特徴とする温度調整ユニット。
【請求項４】
請求項３記載の温度調整ユニットにおいて、前記保持部材の、前記温調素子の加熱冷却面に垂直な面の断面積が、少なくとも反応容器格納部を有する断面領域において反応容器格納部を隔てて左右同一であることを特徴とする温度調子ユニット。
【請求項５】
請求項４記載の温度調整ユニットにおいて、前記保持部材の前記温調素子の加熱冷却面とは反対側の面の角部が切除されていることを特徴とした温度調整ユニット。
【請求項６】
反応容器を保持するための保持部材と、前記保持部材に隣接する、温度を調整する温調素子と、前記保持部材に保持される反応容器を有してなる温度調整ユニットであって、
前記反応容器の水平方向断面が対向する2つの反応容器主平面と対向する2つの反応容器副平面と底面と開口部とを有して構成される略直方体形状であり、前記温調素子の加熱冷却面が前記反応容器主平面に対して略垂直であることを特徴とする温度調整ユニット。
【請求項７】
請求項６記載の温度調整ユニットにおいて、前記反応容器主平面の容器厚さが、前記反応容器副平面及び前記底面の容器厚さよりも小さいことを特徴とした温度調整ユニット。
【請求項８】
請求項７記載の温度調整ユニットにおいて、前記反応容器の水平方向断面の断面積は、前記反応容器の底部から開口部に向けて大きくなることを特徴とする温度調整ユニット。
【請求項９】
回転軸回りに回転可能なカローセルを有し、前記カローセルの円周状の縁に沿って少なくとも1つの、請求項1〜8いずれかに記載の温度調整ユニットを備え、かつ、励起光を照射し、蛍光を検出する為の検出器を少なくとも1つ備えることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１０】
請求項９記載の核酸分析装置において、励起光を反応容器の底面側から照射し、反応容器の側面側から蛍光を取得する検出器を備えることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１１】
請求項９記載の核酸分析装置において、励起光を反応容器の側面側から照射し、反応容器の底面側から蛍光を取得する検出器を備えることを特徴とする核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料に含まれる核酸を増幅することによって生物学的試料を分析するための温度調整ユニットの構造及びこれを用いた核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、血漿、組織片などの生物学的試料に含まれる核酸の分析は、生物学、生化学、医学などの学術研究ばかりでなく、診断、農作物の品種改良、食品検査といった産業など多岐の分野で行われている。核酸の分析方法としてもっとも広く普及している方法はPCR(Polymerase Chain Reaction)と呼ばれる、分析したい領域の核酸を塩基配列特異的に増幅させる技術である。PCRでは、核酸とそれを増幅させるための試薬を含む反応液を、95℃程度に加熱して核酸を熱変性させ、その後60℃程度まで冷却して核酸のアニーリングと伸長反応を進めるというサイクルが30〜40回繰り返される。分析したい核酸に蛍光ラベルを付加し、励起光を照射して経時的に蛍光強度を測定することで核酸を定量分析することも可能であり、特にこのようなPCRはリアルタイムPCRと呼ばれる。
【０００３】
現在主流のPCR装置では、反応液を含むディスポーザブルのプラスチック製反応容器を、熱伝導率の大きい金属製の保持部材に保持し、保持部材にペルチェ素子を配置して、ペルチェ素子の温度を上下させることで反応液に温度サイクルを与えている。
【０００４】
温度調整はペルチェ素子そのもの、反応液を含む反応容器、それを保持する保持部材を温めては冷やすことを繰り返すため、温度変化の高速化が分析時間の短縮に大きく貢献する。
【０００５】
PCR装置に関する背景技術として、例えば、特許文献１〜３がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-250714号
【特許文献２】特開2011-7642号
【特許文献３】特開2012-106242号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的なリアルタイムPCR装置は特許文献1にあるように、保持部材に蓋を備えたポリプロピレン等の樹脂製反応容器に反応液を収容し、保持部材底面側に配置されたペルチェ素子によって温度サイクルを与える。反応液の加熱、冷却はペルチェ素子から反応容器を保持する周辺の保持部材を介して伝達されることで行われる。一般に、保持部材は96個程度の複数の反応容器を保持できるように設計されており、必要に応じて出力の大きなペルチェ素子を準備することで温度変化の高速化を実現している。このような機構の場合は、励起光の照射及び蛍光強度の測定は、どちらも反応容器の上側から行われる。すなわち、波長の異なる励起光と蛍光を同一方向から照射、検出する必要があるため、励起光と蛍光を分離するためのハーフミラーを備える必要があるなど光学系が複雑になってしまうという課題がある。また、冷却時には容器蓋に反応液から蒸発した水分が結露して検出の妨げとなったり、蒸発に伴って反応液の試薬濃度が変化してしまうといった問題が生じたりするため、一般には結露防止のために容器蓋を加熱するヒートリッドとよばれる部材を設けなければならないといった課題がある。
【０００８】
特許文献2は、上記課題を解決する為、保持部材の底面から励起光を照射し、側面から蛍光を検出する構造としたものである。複雑な光学系を回避できる一方で、熱伝達が行われる反応容器の一部が外気に露出しているために、露出部分で温度変化が遅くなる懸念がある。
【０００９】
特許文献3は、温度変化の高速化のために反応容器形状を薄板状にして、薄板状の領域を通して加熱、冷却を行うようにしたものである。一般に反応液への熱伝導は、主に反応容器と反応液の接液面から、反応液の中心に向けて層状に伝達するため、反応液の中心付近が最も温度変化が遅くなる。反応容器形状を薄板状にすれば、反応容器と反応液の接液面から反応液中心への距離が小さくなるため、熱が反応液全体に伝わる速度を速くすることが可能となる。特許文献3は、このような薄板状反応容器を金属製の薄いプレートで挟み込み、反応容器を挿入する開口部周辺にスクリーン印刷した抵抗線から熱を伝達する構造となっている。一般的なペルチェ素子ではなく抵抗線を使用するのは、容器挿入のための開口部の存在によってペルチェ素子を開口部周辺に配置することが困難であるためと考えられる。ペルチェ素子を使用しなかったことで、抵抗線とは別に冷却機構を設ける必要があり、ファンによる空冷機構を付加する構造としている。このように、特許文献3では抵抗線と冷却ファンの複数の温調機構を備えなければならないという課題がある。さらに、薄板状反応容器を挟み込む金属製プレートが薄いため、熱源から迅速に熱が伝達されないという課題がある。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、温度変化の高速化を実現すると共に、蛍光検出のための光学系を簡素化する温度調整ユニットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する方法として、薄板状反応容器を保持する保持部材の側面に隣接する温調素子を、その加熱冷却面と薄板状反応容器格納部の保持部材主平面が垂直になるように配置する。また、保持部材の底面と副平面に窓を設け、励起光照射及び蛍光検出を2方向から行う。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の温度調整ユニットを用いることで、一定以上の伝熱面積を有する保持部材で薄板状反応容器を挟み込むことができる。このような構造にすることで、一般的なペルチェ素子を用いて薄板状反応容器の主平面全面に迅速に熱を伝えることが可能となり、温度変化の高速化が図れる。さらに熱伝導に大きく寄与する薄板状反応容器の主平面とは異なる、薄板状反応容器の底面、副平面を励起光照射、蛍光検出に用いることで、簡素な光学系で高感度な蛍光検出が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明を適用した温度調整ユニットの実施形態を示す、水平断面図である。
【図２】本発明を適用した温度調整ユニットの実施形態を示す、A-A’断面図である。
【図３】本発明を適用した温度調整ユニットの実施形態を示す、B-B’断面図である。
【図４（ａ）】温調素子の加熱冷却面に対して、保持部材主平面を垂直配置した場合、を示した熱伝導模式図である。
【図４（ｂ）】温調素子の加熱冷却面に対して、保持部材主平面を平行配置した場合、を示した熱伝導模式図である。
【図５（ａ）】本発明を適用した温度調整ユニットにおいて、薄板状反応容器の底面から励起光を照射し、薄板状反応容器の副平面側から蛍光を検出する場合、を示した模式図である。
【図５（ｂ）】本発明を適用した温度調整ユニットにおいて、薄板状反応容器の底面から励起光を照射し、薄板状反応容器の主平面側から蛍光を検出する場合、を示した模式図である。
【図６】底面から励起光を照射し、側面から蛍光を検出する公知例である。
【図７】本発明を適用した温度調整ユニットにおいて、薄板状反応容器の副平面側から蛍光を検出した場合と、薄板状反応容器の主平面側から蛍光を検出した場合の検出感度を比較した結果である。
【図８】本発明を適用した核酸分析装置の実施形態を示す上面図である。
【図９】本発明を適用した核酸分析装置の実施形態を示す側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に関わる温度調整ユニット及びこれを適用した核酸分析装置について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
図1は、本発明を適用した温度調整ユニットの実施形態を示す水平断面図、図2は図1のA-A’断面図、図3は図1のB-B’断面図である。温度調整ユニット1は、薄板状反応容器11を保持する保持部材2、熱源となるペルチェ素子7、保持部材2の温度を測定する温度センサ9とから構成される。
【００１６】
一般に、保持部材2は熱伝導性の良い材料で製造される。例えば、アルミニウム、銅などを用いることができる。
【００１７】
保持部材2は、対向する2つの保持部材主平面3と対向する2つの保持部材副平面4、保持部材開口部6、底面窓21、側面窓22とから構成される反応容器格納部5を備え、上面の保持部材開口部6から薄板状反応容器11を挿入可能な構造にしておく。そして、保持部材主平面3に対してペルチェ素子7の加熱冷却面8を垂直になるように配置する。
【００１８】
反応容器格納部5には、略同一の水平断面を有する薄板状反応容器11が挿入される。薄板状反応容器11は、対向する2つの反応容器主平面12と対向する2つの反応容器副平面13、反応容器底面14、反応容器開口部15とから構成され、その内部に反応液16及び蒸発防止用のオイル19を格納した後、反応容器開口部15は蓋20で封じられる。
【００１９】
薄板状反応容器2も熱伝導性の良い金属材料で製造することが望ましいが、核酸分析の分野では、試料間のコンタミネーションを嫌うため、薄板状反応容器11はディスポーザブルであることが求められる。そのため、コスト的に見合うポリプロピレンなどの樹脂材料による一体成型品が用いられる。樹脂材料は一般に熱伝導率が小さいため、熱伝導性を向上させるためには材料の厚さを小さくすることが望ましいが、材料の厚さを小さくすると材料強度が低下してしまうという課題がある。そこで、熱伝導を行いたい領域の材料厚さを小さく、熱伝導を期待しない領域の材料厚さを大きくすることで、薄板状反応容器11としての材料強度を維持することができる。すなわち、薄板状反応容器11の主平面12の厚さt1はできるだけ小さく、具体的には0.25 mm程度以下になるように設計する。その一方で、薄板状反応容器11の副平面13の厚さt2及び反応容器底面14の厚さt3は、材料強度を維持するためにやや大きく、具体的には0.4mm程度以上になるように設計する。
【００２０】
なお、保持部材主平面3及び保持部材副平面4の垂直方向にテーパをつけて、水平方向断面の断面積を、保持部材底面窓側から保持部材開口部6に向けて大きくなるように設計し、併せて、反応容器主平面12及び反応容器副平面13の垂直方向にテーパをつけて、水平方向断面の断面積を、反応容器底面14から反応容器開口部15に向けて大きくなるように設計することで、製造上の断面積のばらつきを許容できるようになると共に、反応容器格納部5への薄板状反応容器11の挿入、排出を容易にすることができる。
【００２１】
次に、図4を用いてペルチェ素子7の加熱冷却面8に対して、保持部材主平面3が垂直になるように配置した場合の効果について説明する。図4(a)は、ペルチェ素子7の加熱冷却面8に対して保持部材主平面3が垂直になるように配置した場合、図4(b)は、ペルチェ素子7の加熱冷却面8に対して保持部材主平面3が水平になるように配置した場合で、それぞれ熱伝導の様子を模式的に示したものである。
【００２２】
簡単のために、dxの距離にdTの温度差があった場合の定常熱伝達を考えると、熱伝達は、温度勾配に比例した熱流束(単位時間に単位面積を横切るエネルギー量)を生じる現象であり、フーリエの法則として以下の式で表される。
【００２３】
【数１】
2014232057.tif 000003
【００２４】
保持部材2の熱伝導率kは一定なので、伝熱面積Aに比例して伝熱量は大きくなる。従って、迅速な熱伝達を行うためには伝熱面積をできるだけ大きくする必要がある。しかしながら、実際はペルチェ素子7の大きさ及び保持部材2の大きさによって、伝熱面積は制約を受ける。例えば図4(a)、(b)において、ペルチェ素子7の加熱冷却面8の面積が同じであれば、反応容器格納部5を熱が伝達する際に、図4(a)の方が図4(b)よりも伝熱面積を大きくできることが分かる。また、ペルチェ素子7から保持部材2へ与えられる熱の一部は保持部材2を熱するために消費される。従って、保持部材2の体積をできるだけ小さくして、保持部材2を熱するために消費される熱量を小さくする(一般には熱容量を小さくする、と言われる)ことが望ましい。そのために、保持部材2の熱の流れで大きな影響を与えない、ペルチェ素子7とは反対側にある保持部材2の角部24を切除しても構わない。
【００２５】
熱伝達による熱移動は、ペルチェ素子7からの熱が、保持部材2及び保持部材と密接している薄板状反応容器主平面12を経て反応液16、オイル19に伝達する。反応液16、オイル19への熱伝達は、材料厚さt1が小さい薄板状反応容器主平面12で行われ、薄板状反応容器11と反応液16の接液面17から反応液16の中心面18に向けて層状に伝わる。従って、迅速な熱伝達を実現する為には反応液16全体へ均一に熱伝達することが重要であり、保持部材2の厚さt4は反応液16の中心面18に対して対称となるよう設計する。
【００２６】
次に、図5を用いてPCRにおける蛍光検出について説明する。図5(a)は反応容器底面14側から励起光を照射し、反応容器副平面側13から蛍光を検出する場合、図5(b)は反応容器底面14から励起光を照射し、反応容器主平面12から蛍光を検出する場合について、それぞれ励起光の照射系、蛍光の検出系を示した模式図である。どちらの場合もレンズ23aを介して反応液16への励起光照射が行われ、かつ反応液16から発生する蛍光をやはりレンズ23bを介して受光する。このような例としては、図6に示した前述の公知例がある。しかし、図6の場合は反応容器の容器厚さが均一なため、熱伝達が行われる反応容器の一部が外気に露出しているために、露出部分で温度変化が遅くなる懸念がある。一方で図5(a)は、薄板状反応容器副平面13の厚さt2及び反応容器底面14の厚さt3は、材料強度を維持するために大きく設計されており、熱伝導への寄与は極めて小さい。すなわち、図6の場合に比べてより効率的な熱伝導が実現できる。図5(b)は熱伝導への寄与を期待している薄板状反応容器主平面12に保持部材2の側面窓22があるため、図5(a)ほどの効率的な熱伝導は期待できない。
【００２７】
図5(a)及び図5(b)では、レンズ23a、23bで励起光や蛍光が一点に集束するように示したが、例えば、励起光としてLEDを用いた場合などでは、発光点のばらつきなどから照射方向に厚さをもって集光する。特にLEDを用いた場合は、励起光が照射される領域は、保持部材2の底面窓21の開口面積と、反応液16の高さt5で計算される体積に近似しても構わないほどである。同様に、蛍光検出領域についても、保持部材2の側面窓22の開口面積と、反応液16の厚さt6で計算される体積に近似できる。蛍光検出感度は励起光照射領域と蛍光検出領域が重なった部分で決まるため、励起光照射領域が同じであれば、蛍光検出領域が大きい、すなわち反応液16の厚さt6がより大きい、図5(a)の方が蛍光検出感度は大きくなる。
【００２８】
図8は、蛍光検出感度の実際の測定結果を示したものである。100 nM、1000 nM、5000 nMに調整した蛍光色素を薄板状反応容器11に入れ蛍光を検出した結果、図5(a)に示した配置(垂直配置)の方が、図5(b)に示した配置(水平配置)よりも検出感度が2倍以上高くなっていることが分かる。
【００２９】
図8は本発明を適用した核酸分析装置の実施形態を示す上面図、図9は図8の側面図である。図8、図9に示した核酸分析装置は、回転軸31回りに回転可能なカローセル32と、カローセル32の円周状に沿って配置される温度調整ユニット1を複数備えている。少なくとも1個の検出器41が、カローセル32の外側に配置され、カローセル32が回転して検出機41を横切る際に、励起光照射、蛍光検出が行われる。検出器41の内部には、励起光を照射する光源ユニット42、蛍光を検出する受光ユニット43、励起光フィルタ44、蛍光フィルタ45、レンズ46が内蔵されている。光源ユニット42としてはレーザや発光ダイオードを用いることができる。受光ユニット43としてはホトダイオードや光電子増倍管などの光検出素子を用いることができる。光源ユニット42から放出された光は、レンズ46aで平行光になり、バンドパスフィルタである励起光フィルタ44を通って所望の波長帯の光だけが透過する。その後、励起光はレンズ46bを通して薄板状反応容器11内の反応液16に集光される。反応液16に励起光が照射されると、反応生成物の量に応じた蛍光が放出される。放出された光は、レンズ46cで平行光になり、バンドパスフィルタである蛍光フィルタ45を通って所望の波長帯の光だけが透過する。その後、蛍光はレンズ46dを通して受光ユニット43に取り込まれることになる。検出器41はカローセル外側に複数あっても良く、互いに異なる波長の励起光を発生する光源ユニットと、互いに異なる波長の蛍光を検出する為の受光ユニットを有していれば、1度の反応で複数の異なる反応生成物の蛍光を検出可能である。
【００３０】
以上のように、保持部材主平面3に対してペルチェ素子7の加熱冷却面8を垂直に配置することで、温度変化の高速化が図ると共に、簡素な光学系で高感度な蛍光検出が行える核酸分析装置が実現できる。
【符号の説明】
【００３１】
1…温度調整ユニット、2…保持部材、3…保持部材主平面、4…保持部材副平面、5…反応容器格納部、6…保持部材開口部、7…ペルチェ素子、8…加熱冷却面、9…温度センサ、11…薄板状反応容器、12…反応容器主平面、13…反応容器副平面、14…底面、15…容器開口部、16…反応液、17…接液面、18…中心面、21…底面窓、22…側面窓、23a・23b…レンズ、31…回転軸、32…カローセル、41…検出器、42…光源ユニット、43…受光ユニット、44…励起光フィルタ、45…蛍光フィルタ、46a・46b・46c・46d…レンズ
【図１】
2014232057.tif 000004
【図２】
2014232057.tif 000005
【図３】
2014232057.tif 000006
【図４（ａ）】
2014232057.tif 000007
【図４（ｂ）】
2014232057.tif 000008
【図５（ａ）】
2014232057.tif 000009
【図５（ｂ）】
2014232057.tif 000010
【図６】
2014232057.tif 000011
【図７】
2014232057.tif 000012
【図８】
2014232057.tif 000013
【図９】
2014232057.tif 000014