(57)【要約】【課題】  ｃ−Ｍｅｔ抗体およびＶＥＧＦ結合断片が連結された融合タンパク質の提供。【解決手段】  抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片が連結された融合タンパク質、前記融合タンパク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物、および抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結するステップを含む抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法。【選択図】  図２Ａ
2014193864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片と前記ＶＥＧＦ結合断片との間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーは、１〜１００個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦ結合断片は、抗ＶＥＧＦ抗体、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体または前記ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦ結合断片は、ベバシズマブ、ベバシズマブの抗原結合断片、配列番号１０９を含むＶＥＧＦ受容体、配列番号１１０を含むＶＩＧ２ポリペプチド、または配列番号１１０を含む配列番号１０９の１０２〜１３３８の連続するアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の連続する５以上のアミノ酸からなるエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸残基を含む連続する８〜１９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸残基を含む６〜１３個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、
からなる群から選択された少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸残基を含む配列番号８９の９〜１７個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、
からなる群から選択された１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含み、
前記配列番号４〜９は、それぞれ下記の一般式Ｉ〜ＶＩで表わされるアミノ酸配列である抗体または抗原結合断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質：
一般式Ｉ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｔｈｒ（配列番号５）、
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−Ｔｙｒ（配列番号６）、
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は存在しない、あるいは、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ２はＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０はＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２はＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３はＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６はＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【請求項８】
前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖と、
配列番号６８のアミノ酸配列、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、または配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖とからなる抗体である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号１１２または配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１１３または配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２からなる群から選ばれる、請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載のｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体を有効成分として含む、ｃ−ＭｅｔまたはＶＥＧＦ誘発疾病の予防または治療用組成物。
【請求項１７】
前記ｃ−ＭｅｔまたはＶＥＧＦ誘発疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性である、請求項１６に記載の予防または治療用組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載のｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体を含む、ｃ−ＭｅｔまたはＶＥＧＦ誘発疾病の診断用組成物。
【請求項１９】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦ結合断片は、配列番号１１０のＶＩＧ２、または配列番号１０９のアミノ酸のうち配列番号１１０のＶＩＧ２を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸からなるポリペプチドである、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程において、ｃ−Ｍｅｔ標的抗体またはその断片とＶＥＧＦ結合断片とがリンカーを介して結合する、請求項１９または２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記リンカーは、１〜１００個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項２１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片を含む融合タンパク質、前記融合タンパク質を含む二重特異性抗体、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物、および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする融合タンパク質および二重特異性抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔは、細胞の表面に存在する代表的な受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）であり、そのリガンドである肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）と結合して細胞内シグナル伝達を促して細胞の成長を促すだけではなく、がん細胞に過剰発現されて発がん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤、新生血管形成にも広範に関与する。ｃ−Ｍｅｔは、種々のがんにおいて過剰発現されており、特に、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現がある患者はがんの治療予後が悪い場合がほとんどである。
【０００３】
血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分泌されてその受容体であるＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成長に必要な栄養分が供給される。
【０００４】
この理由から、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦは両方とも抗がん剤の開発に際して標的としての重要性が高く、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする抗体およびこれらを用いるがん治療技術の開発が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２０１０００７６１７８
【特許文献２】ＵＳ２０１００２６０６６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ結合断片を含む融合タンパク質を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む、融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な二重特異性を有することから、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的としてがん細胞の成長と血管新生を効果的に阻害して、改善された抗がん効果および／または血管新生阻害効果を得ることができる。
【００１３】
前記ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な融合タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔを標的とすることによりがん細胞の成長自体を阻害することができ、同時にＶＥＧＦを標的とすることにより新生血管の形成を遮断し且つがん細胞の成長に欠かせない栄養分の供給を防いでがん細胞の成長をさらに阻害することにより、がん細胞成長の阻害および／または新生血管の形成の阻害に際してより一層増進された相乗効果を期待することができる。
【００１４】
本発明の実施形態において、ＶＥＧＦ結合断片と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体とが連結された融合タンパク質が提供される。本発明の他の例において、前記融合タンパク質を含む、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な二重特異性抗体（二重標的抗体とも言う）が提供される。具体的に、ＶＥＧＦ結合断片と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体とを含む融合タンパク質を含む、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの二重特異性抗体が提供される。
【００１５】
本発明のさらに他の実施形態においては、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドが取り込まれた形質転換体が提供される。前記形質転換体は、前記融合タンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。
【００１６】
本発明のさらに他の実施形態においては、前記融合タンパク質または二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物が提供される。前医薬学組成物は、ｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療効果を有するものであってもよく、例えば、抗がん剤または新生血管生成阻害剤であってもよい。
【００１７】
本発明のさらに他の実施形態において、前記二重特異性抗体の治療的な有効量を投与するステップを含むｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらに他の実施形態においては、前記形質転換体を培養して融合タンパク質を発現させたり、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片または前記抗体の変形体にＶＥＧＦ結合部位を連結する工程を含む、抗がんおよび新生血管抑制効能が改善されたｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体の製造方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体にＶＥＧＦ結合断片を連結して抗がん効能および／または新生血管形成抑制効能が増進されたｃ−Ｍｅｔ抗体を製造する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに他の実施形態において、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦの同時検出用組成物が提供される。
【００２１】
本発明のさらに他の実施形態において、前記融合タンパク質を有効成分として含むｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の診断用組成物が提供される。
【００２２】
前記血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）は正常細胞にも存在し、特に、がん細胞から分泌されてその受容体であるＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こし、がん細胞にはその新たな血管を介して成長に必要な栄養分が供給される。ＶＥＧＦの過発現は様々な疾病の原因となり、特に、発がんだけではなく、侵襲、転移などの悪い予後にも関与する。この理由から、ＶＥＧＦは抗がん療法に際して重要な標的となる。
【００２３】
前記ＶＥＧＦは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などをはじめとする哺乳類由来のものであってもよい。例えば、前記ＶＥＧＦタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２、ＮＭ＿００１０２５３６７．２、ＮＭ＿００１０２５３６８．２、ＮＭ＿００１０２５３６９．２、ＮＭ＿００１０２５３７０．２、ＮＭ＿００１０３３７５６．２、ＮＭ＿００１１７１６２２．１、ＮＭ＿００１１７１６２３．１、ＮＭ＿００１１７１６２４．１、ＮＭ＿００１１７１６２５．１、ＮＭ＿００１１７１６２６．１、ＮＭ＿００１１７１６２７．１、ＮＭ＿００１１７１６２８．１、ＮＭ＿００１１７１６２９．１、ＮＭ＿００１１７１６３０．１、ＮＭ＿００１２０４３８４．１、ＮＭ＿００１２０４３８５．１、ＮＭ＿００３３７６．５などに供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によってコードされたポリペプチドであってもよい。
【００２４】
前記「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」とは、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質はあらゆる種に由来のものであってもよく、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、アカゲザル、ＮＰ＿００１１６２１００）などの霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのげっ歯類由来のものなどであってもよい。前記タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００２４５に供されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００２３６に供されたポリペプチド配列によってコードされたタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、発がん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸潤、新生血管生成過程などの種々の機序に関与する。
【００２５】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体はｃ−Ｍｅｔを特異的に認識するタンパク質であり、ｃ−Ｍｅｔのみを認識する単一標的抗体であってもよく、この詳細については、後述する。
【００２６】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片は、後述する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲとＦｃ領域、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）２などよりなる群から選ばれたものであってもよく、この詳細については、後述する。
【００２７】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が用いられる場合、ＶＥＧＦ結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＣ−末端に好適なペプチドリンカーを介してまたは介さずに連結され得る。また、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片が用いられる場合、ＶＥＧＦ結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合断片のＮ−末端および／またはＣ−末端の両方に連結可能であり、好適なペプチドリンカーを介してまたは介さずに連結され得る。
【００２８】
前記抗体の変形体は、自然系に存在するヒトおよび動物抗体のアイソタイプ、および／またはヒンジを構成するアミノ酸が変形されたあらゆるヒトおよび動物抗体のＦｃを含むものなどであってもよく、この詳細については、後述する。本発明において、別途の断りのない限り、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、上述した変形体を含むものであると理解される。
【００２９】
前記融合タンパク質のＶＥＧＦ結合断片は、ＶＥＧＦと結合する分子、例えば、ＶＥＧＦ受容体、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦ結合タンパク質、または前記ＶＥＧＦ結合タンパク質のＶＥＧＦ結合部位を含む断片、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片またはＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位であってもよい。例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）であってもよく、前記抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片は前記抗ＶＥＧＦ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）または可変領域、ＣＤＲとＦｃ領域の組み合わせ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２などよりなる群から選ばれたものであってもよい。前記ＶＥＧＦ受容体は、例えば、ヒトのＶＥＧＦ受容体１（ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｐ１７９４８．２；配列番号１０９）、ヒトのＶＥＧＦ受容体２（ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；Ｐ３５９６８．２）、ヒトのＶＥＧＦ受容体３（ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｐ３５９１６．３）などであってもよい。なお、前記ＶＥＧＦ結合タンパク質のＶＥＧＦ結合部位を含む断片は、第２Ｉｇ様ドメイン２（ＶＩＧ２）またはＶＥＧＦ受容体のうちの前記ＶＩＧ２部位を含むポリペプチドであってもよい。例えば、ヒトのＶＥＧＦ受容体１のＶＥＧＦ結合部位を含む断片は、第２Ｉｇ様ドメイン２（ＶＩＧ２；例えば、Ｐ１７９４８．２のアミノ酸配列（配列番号１０９）の１２９番目から２２９番目までのアミノ酸配列（配列番号１１０））、または前記配列番号１０９のアミノ酸のうち前記ＶＩＧ２を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸を含むポリペプチドなどであってもよい。
【００３０】
このため、本発明の一態様において、前記ＶＥＧＦ結合断片は、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体、前記抗ＶＥＧＦ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲとＦｃ領域、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）２などよりなる群から選ばれた抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体（例えば、配列番号１０９）、または前記ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位（例えば、配列番号１１０のＶＩＧ２、または配列番号１０９のアミノ酸のうち配列番号１１０のＶＩＧ２を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸を含むポリペプチド）などであってもよい。
【００３１】
本発明の態様において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は、後述する抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体、その断片、または変形体のＦｃ部分にＶＥＧＦ結合断片、例えば、ＶＩＧ２を連結したものであってもよい（図１参照）。
【００３２】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体と、ＶＥＧＦ結合断片はリンカーによって連結されたものであってもよい。前記リンカーは、１〜１００個、好ましくは、２〜５０個、より好ましくは５〜３０個のアミノ酸長さのペプチドリンカーであってもよく、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどからなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸を含むものであってもよいが、これらに制限されない。本発明の一実施形態において、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎで表わされるものであってもよく、前記ｎは、（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１１６）単位体の繰り返し回数であり、二重特異性抗体の効能を考慮して１〜１０、好ましくは１〜５であってもよい。
【００３３】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその断片にＶＥＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２）を連結して二重特異性抗体として製作することにより、ｃ−Ｍｅｔ抗体の薬理学的な効果をより一層増進することを特徴とする。
【００３４】
前記融合タンパク質または二重特異性抗体に用いられる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、あらゆる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片であってもよい。特に、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔの特定の部位、例えば、ＳＥＭＡドメイン内の特定の部位を連続する５以上のアミノ酸からなるエピトープを特異的に認識し、結合し得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに作用して細胞内移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導するあらゆる抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００３５】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の３つの部分に分けられる。細胞外部位の場合、ジスルフィド結合を通してα−サブユニットとβ−サブユニットが連結された形であり、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ）およびＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆｏｌｄ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｐｌｅｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｏｍａｉｎ）からなる。ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含むものであってもよく、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであり、ＨＧＦと結合する部位である。ＳＥＭＡドメインの特異的な領域、例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）のアミノ酸配列の１０６〜１２４番目のアミノ酸残基の範囲に相当する、配列番号７１のアミノ酸配列を含む領域は、ＳＥＭＡドメインのエピトープを持つ２番目と３番目のプロペラ構造の間にあるループ領域である。この領域は、本発明に係る特異的な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープとして働く。
【００３６】
用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であり、抗体によって認識される抗原の一部分を意味するものであると解釈される。本発明の一実施形態によれば、前記エピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続する５以上のアミノ酸を含む部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４番目までに相当する配列番号７１内に位置する連続する５個〜１９個のアミノ酸を含むものであってもよい。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列のうち配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５〜１９個のアミノ酸からなるものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３７】
前記配列番号７２のアミノ酸配列を含むエピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の２番と３番のプロペラ構造のドメイン間のループ領域のうちの最外側に位置する部位に相当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を含むエピトープは、本発明の一実施形態による抗体が比較的に特異的に結合する部位である。
【００３８】
このため、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号配列番号７１のアミノ酸配列のうち配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００３９】
本発明の一態様によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸残基を含む連続する８〜１９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸残基を含む６〜１３個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、からなる群から選択された１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸残基を含む配列番号８９の９〜１７個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択された１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記配列番号４〜９は、それぞれ下記の一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表わされるアミノ酸配列であるものであってもよい：
一般式Ｉ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）、
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｔｈｒ（配列番号５）、
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−Ｔｙｒ（配列番号６）、
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は存在しないか、あるいは、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ２はＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０はＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２はＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３はＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６はＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【００４０】
本発明の一実施形態において、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００４１】
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変領域と、を含むものであってもよい。
【００４３】
所望の抗原を非免疫動物に免疫させて産生する動物由来の抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与するときに免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制するためにキメラ型抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ型抗体は、遺伝工学的な方法を用いて抗アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因となる動物由来の抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ型抗体は、動物由来の抗体に比べて抗アイソタイプ反応においてかなり改善されたが、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在しているため潜在的な抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を抱えている。このような副作用を改善するために開発されたものが、ヒト化抗体である。これは、キメラ型抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割を果たす相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格(フレームワーク、ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植（挿入）して製作される。
【００４４】
ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術に最も重要なのは、動物由来の抗体のＣＤＲ部位を最も上手に取り入れ得る最適化したヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかしながら、たとえ最適化したヒト抗体骨格に動物由来の抗体のＣＤＲ部位を移植するとしても、動物由来の抗体の骨格に位置して抗原結合に影響するアミノ酸が存在する場合があるため抗原結合力が保存できない場合が多く存在するため、抗原結合力を復元するためのさらなる抗体工学技術の適用は欠かせないものであるといえる。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、前記抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
【００４６】
完全な抗体は、２つの全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブカラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００４７】
「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」の用語は、抗原に特異性を与えるために十分な可変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジを含む全長重鎖およびこの断片をいずれも含む意味であると解釈される。また、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」の用語は、抗原に特異性を与えるために十分な可変領域配列を含むアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびこの断片をいずれも含む意味であると解釈される。
【００４８】
「相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」の用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高度可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを含んでいてもよい（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するに際して重要な接触残基（ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者にとって一般的に公知となっている意味と同じものであり、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的な反応をすることを意味する。
【００４９】
前記抗原結合断片は、免疫グロブリンの全体構造に関するその断片であり、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ＣＤＲ、ＣＤＲとＦｃ領域、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）２であってもよいが、これに限定されない。
【００５０】
前記抗原結合断片のうちのＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。
【００５１】
Ｆａｂ'は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点でＦａｂとは相違点がある。
【００５２】
Ｆ（ａｂ'）２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体欠片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業者にとって周知である。
【００５３】
二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は非共有結合によって重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合によって連結されるか、あるいは、Ｃ末端において直結されているため、二重鎖Ｆｖのようにダイマーと同じ構造を有することができる。
前記抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ'）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を用いて製作することができる。
【００５４】
「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」の用語は、抗体の重鎖に含まれている領域であり、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性を提供する機能をする領域を意味する。
【００５５】
動物由来の抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジで置換されるが、動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２つの重鎖間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少してヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに異なる効果を示す。このため、ヒンジ領域の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ヒト化抗体の抗原結合効率性を増大させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形するためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者にとって周知である。
【００５６】
このため、本発明の一実施形態において、抗原結合効率性を増進するために、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片は１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が変形されたヒンジ領域を含むものであってもよい。例えば、前記抗体は、配列番号１００（Ｕ７−ＨＣ６）、配列番号１０１（Ｕ６−ＨＣ７）、配列番号１０２（Ｕ３−ＨＣ９）、配列番号１０３（Ｕ６−ＨＣ８）、配列番号１０４（Ｕ８−ＨＣ５）、または配列番号１０５（非修飾ヒトヒンジ領域）のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含むものであってもよい。
【００５７】
前記ＣＤＲ領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を除く重鎖不変領域および軽鎖不変領域は、全ての免疫グロブリンのサブタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域であってもよい。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片において、前記重鎖可変領域は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５９】
本発明の一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０であるハイブリドーマ細胞から産生される、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合するモノクローナルモノクローナル抗体であってもよい（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照；前記文献は本明細書に参照により取り込まれる）。
【００６０】
前記の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号に定義された抗体をいずれも含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２（これらの中で、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４（これらの中で、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、および配列番号６６（これらの中で、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６８（これらの中で、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号７０（これらの中で、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列または配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖と、からなる抗体であってもよい。
【００６２】
例えば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、または
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体であってもよい。
【００６３】
一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ３重鎖可変領域とヒトのカッパ不変領域を含む軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて３６番目（Ｋａｂａｔ番号付けによる、配列番号６８内の６２番目のアミノ酸位）のヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）がチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）で置換された形のポリペプチドである。前記置換によって、本発明の一実施形態による抗体の産生量が増大され得る。また、前記配列番号１０８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列のうち１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除く２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいてＫａｂａｔ番号付けによる２７ｅ位置（Ｋａｂａｔ番号付けによる、配列番号１０８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ１内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）で置換されたものであり、前記置換によって、本発明の一態様による抗体の活性（例えば、ｃ−Ｍｅｔへの結合親和度、ｃ−Ｍｅｔ分解活性およびＡｋｔリン酸化抑制活性など）がさらに増進され得る。
【００６４】
本発明の一実施形態において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は、上述した抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＦｃ部分または前記抗体の抗原結合断片のＮ末端またはＣ末端にＶＥＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２）を上述したリンカーを介してまたは上述したリンカーを介さずに連結したものであってもよい（図１参照）。
【００６５】
本発明の一態様において、前記融合タンパク質または二重特異性抗体は配列番号６２のアミノ酸配列、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６８、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０、配列番号７０のアミノ酸配列２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、または配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよい
前記ＶＥＧＦ結合断片（例えば、ＶＩＧ２またはこれを含むポリペプチドなど）は前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外の他の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と結合する場合にも抗体効能を増進させるだけではなく、副作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を顕著に減少させることが確認された（図５参照）。
【００６６】
具体的に、上述したように、ＶＥＧＦ結合断片が結合することにより抗体効能および副作用が改善され得るｃ−Ｍｅｔ抗体は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外のあらゆる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよく、例えば、配列番号１１２または配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１１３または配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよく、より具体的に、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１１３のアミノ酸を有する軽鎖を含むものであってもよく、あるいは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよい。
【００６７】
前記ＶＥＧＦ結合断片と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または前記抗体の抗原結合断片がリンカーを介して、または介さずに連結された融合タンパク質は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体の製造のための前駆体として使用可能である。前記医薬組成物は、前記二重特異性抗体の有効量と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤などを含むことができる。
【００６８】
前記医薬組成物に含まれる薬学的に許容可能な担体は、薬物の製剤化に汎用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれた１種以上であってもよいが、これに限定されない。前記混合剤または薬学的組成物は、前記成分に加えて、医薬組成物の製造に汎用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などよりなる群から選ばれた１種以上をさらに含むことができる。
【００６９】
前記医薬組成物は、経口または非経口で投与可能である。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などであってもよい。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは消化されることから、経口用組成物は活性薬剤をコーティング、または剤形化してもよい。なお、前記組成物は、活性物質を標的細胞に輸送可能な任意の装置を使用して投与することができる。
【００７０】
ここで用いられる薬学的な有効量の単語は、それぞれの活性成分が薬学的に最も影響を及ぼすことができる量のことを指す。
【００７１】
前記医薬組成物の投与対象は、ヒト、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳類であってもよい。
【００７２】
１回投与のための前記医薬組成物内の有効成分である二重特異性抗体の有効量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって種々に処方可能である。例えば、１回投与のための前記二重特異性抗体の有効量は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。前記１回投与のための有効量は、単位服用量の形態で一つの製剤に処方されてもよく、適切に分量して処方されてもよく、複数の投薬用容器内に充填して製造されてもよい。
【００７３】
前記医薬組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の剤形に剤形化されてもよく、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、精製またはカプセル剤などの剤形に剤形化されてもよく、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含んでいてもよい。
【００７４】
特に、前記医薬組成物は二重特異性抗体を含むため、免疫リポソームに剤形化されてもよい。抗体を含むリポソームは当業者に広く知られている方法により製造されてもよい。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール−誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であってもよく、逆相蒸発法によって製造可能である。例えば、抗体のＦａｂ''断片は、ジスルフィド交換反応を通じてリポソームに接合可能である。ドキソルビシンなどの化学治療剤がさらにリポソームに含まれ得る。
【００７５】
本発明において提案される医薬組成物は、ｃ−ＭｅｔおよびＶＥＧＦによって誘発される疾病、例えば、ｃ−Ｍｅｔの複製数の増加および／または発現量の増加および／またはＶＥＧＦ過発現によって誘発される疾病、代表的に、がんまたはがん転移の予防および／または治療に使用可能である。前記癌は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを過発現するものであってもよく、これに制限されないが、固形癌、例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳房癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌、骨肉腫などよりなる群から選ばれた１種以上であってもよい。本発明の一態様において、前記癌は、脳癌、胃腸癌、腎臓癌、または肺癌（例えば、扁平上皮癌、肺小細胞癌、非小細胞性肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など）であってもよい。前記癌は、原発性癌だけではなく、転移性癌も含む。さらに他の例において、前記ｃ−ＭｅｔおよびＶＥＧＦによって誘発される疾病は、がん、妊娠糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、湿性老人性黄斑変性（ｗｅｔ ＡＭＤ）など）などであってもよい。
【００７６】
さらに他の例は、前記二重特異性抗体の治療的な有効量をｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療を必要とする患者に投与するステップを含むｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療方法と関連するものである。前記予防および／または治療方法は、前記投与ステップ前にｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病の予防および／または治療を必要とする患者を確認するステップをさらに含んでいてもよい。前記予防および／または治療方法によって予防および／または治療可能なｃ−Ｍｅｔおよび／またはＶＥＧＦ誘発疾病は、上述した通りである。
【００７７】
また、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、代表的なＲＴＫ負調節因子であるＣｂｌに依存することなく、Ｃｂｌによって媒介されるプロテアソーム経路ではないリソソーム経路を介してｃ−Ｍｅｔ分解活性を示すことができる。このように、Ｃｂｌの突然変異、Ｃｂｌの発現量の減少、ｃ−ＭｅｔのＣｂｌ結合部位変異などの要因によってＣｂｌが正常に働かない患者に投与するときにも、Ｃｂｌと独立して働く他の負調節因子であるＬＲＩＧ１を介してｃ−Ｍｅｔを抑制することができるため、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ拮抗剤の併用投与はＣｂｌが正常に働かない患者に特に有効に適用され得る。
【００７８】
さらに、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこの抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。また、前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターが取り込まれた組換え細胞が提供される。前記ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞は、前記融合タンパク質または二重特異性抗体の産生に使用可能である。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこの抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片は、上述した通りである。
【００７９】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」の用語は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファ-ジベクター、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクターおよびアデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用可能なベクターは、当業界において頻用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウィルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作可能であるが、本発明はこれに制限されない。
【００８０】
前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドはプロモータに作動可能に連結され得る。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモータ配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動的に連結」されることにより、他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節することができる。
【００８１】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築可能である。前記発現用ベクターは、当業界において、植物、動物または微生物において外来性タンパク質を発現するのに用いられる通常のものを用いることができる。前記組換えベクターは、当業界において公知の種々の方法によって構築可能である。
【００８２】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築可能である。例えば、用いられるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を行い得る強力なプロモータ（例えば、ｐＬλプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータなど）、翻訳の開始のためのリボゾーム結合位および転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞において作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これに限定されない。また、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウィルス由来のプロモータ（例えば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクチニアウィルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウィルスプロモータおよびＨＳＶのｔｋプロモータ）が使用可能であり、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００８３】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に取り込むことにより得られたものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的に且つ連続的にクローニングまたは発現させ得る細胞であり、当業界において公知のいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そしてネズミチフス菌、セラチアマルセッセンスおよび様々なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが使用可能であるが、これに制限されない。
【００８４】
前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への導入（トランスフェクション）は、当業界に周知の導入方法を用いて行うことができる。前記導入方法としては、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法またはエレクトロポレーション方法などが採用可能であり、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、リン酸カルシウム沈殿沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介トランスフェクション法および遺伝子ボンバードメント法などが採用可能であるが、これに限定されない。
【００８５】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現される表現型を用いて、当業者に周知の方法に従って容易に行うことができる。例えば、前記選択標識が特定の薬剤耐性遺伝子である場合には、前記薬剤が含有されている培地において形質転換体を培養することにより形質転換体を容易に選別することができる。
【００８６】
本発明の他の側面において、本発明は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片およびＶＥＧＦ結合断片を含む、融合タンパク質の製造方法を提供する。さらに、他の側面において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗体の変形体にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程を含む、ｃ−Ｍｅｔ抑制（抗癌効能）および／または新生血管形成抑制効能が増進されたｃ−Ｍｅｔ抗体の製造方法が提供される。前記連結は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはこの抗原結合断片とＶＥＧＦ結合断片が（リンカーを介してまたは介さずに）融合された融合タンパク質のアミノ酸配列またはこれをコードする核酸配列を合成するなどの適切な方法によって行われ得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片にＶＥＧＦ結合断片を連結する工程は、ｃ−Ｍｅｔ標的抗体またはその断片とＶＥＧＦ結合断片とがリンカーを介して結合する連結するものであってもよい。前記リンカーは、前述のように１〜１００個のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。
【００８７】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００８８】
既存の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦに結合可能な部分（例えば、ヒトＶＥＧＦ受容体１（例えば、配列番号１０９）のＩｇ様ドメイン２：ＶＩＧ２（例えば、配列番号１１０）または配列番号１０９のアミノ酸のうち配列番号１１０を含んで連続する１０２〜１３３８個のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を連結して二重特異性抗体として製作して両因子を一括して標的としたとき、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦのそれぞれを標的とする効果はそのまま維持しながら、相乗効果を示すことを確認した。
【００８９】
したがって、本発明において提案される二重特異性抗体の製作技術は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がん効能をより改善する方法であり得る。
【００９０】
このようにして製作された二重特異性抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に比べてがん細胞の成長をより有効に阻害することができ、各種の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて上述したような二重特異性抗体を製作する場合にも、単一抗体と比較して卓越した効能が現れることを確認して（実施例５参照）、本発明において提案される二重特異性抗体の製作方法が抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がん効能を増進させるのに一般的に使用可能であることを確認した。
【００９１】
前記二重特異性抗体は、既存の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がんおよび抗新生血管効能を含むｃ−Ｍｅｔ結合の相対的性質をそのまま維持することを確認した（実施例２参照）。また、前記二重特異性抗体はＶＥＧＦ結合部位を含むことにより、ＶＥＧＦの生物学的な機能を拮抗する効能を示すことを確認した（実施例３参照）。なお、前記二重特異性抗体の抗がん効能を動物モデルにおいて試験して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に比べて優れた抗がん効能を示すことを確認した（実施例４参照）。
【００９２】
また、様々な形式の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（リンカーの違い、長さの違い、修飾されたＦｃ部分、ＣＤＲの違いなど）の場合にもＶＩＧ２を連結して類似する効能を示すことを確認した（図４Ａ参照）。
【００９３】
このため、ＶＥＧＦ結合部位を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に結合させる方法は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がんおよび抗新生血管効能を増進させるのに一般的に使用可能であることが期待される。
【００９４】
さらに、前記融合タンパク質および／または二重特異性抗体は、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に検出することができるため、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦの同時検出用組成物およびｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦ誘発疾病の診断用途にも用いて好適である。
【発明の効果】
【００９５】
本発明において提供される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体にＶＥＧＦ結合部位を連結する技術は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗がん／新生血管抑制効能を増進することができるため、抗がん剤脳がん、肺がん、胃腸がんなどに適用可能な抗がん剤および新生血管生成機序による疾病の治療剤の開発に用いて好適であり、加えて、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路とＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与する他の疾病に対する治療剤の開発にも使用可能である。このように二重特異性抗体を用いることにより、関連薬物の併用投与時と比較して服用し易いだけではなく、優れた効能が得られることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】二重特異性抗体の一例を模式的に示すものである。
【図２Ａ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のｃ−Ｍｅｔ分解活性を示すグラフである。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が処理されていない対照群（ｍｅｄｉａ）の値を１００％とし、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後に得られる値は前記対照群に対する相対値として計算した。
【図２Ｂ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＡｋｔリン酸化抑制の度合いを示すグラフである（対照群（５Ｄ５）の値を１００％として計算する）。
【図２Ｃ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＭＫＮ４５細胞株の成長阻害の度合いを示すグラフである。
【図２Ｄ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株の成長阻害の度合いを示すグラフである。
【図２Ｅ】ＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。
【図３Ａ】ＶＥＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。
【図３Ｂ】ＶＥＧＦおよびＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制の度合いを示すグラフである。
【図３Ｃ】ＶＥＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ浸潤能阻害の度合いを示すグラフ（上）と写真（下）である。
【図３Ｄ】ＶＥＧＦおよびＨＧＦを添加したときの、本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＨＵＶＥＣ浸潤能阻害の度合いを示す結果であり、上の部分は各処理群の相対的な蛍光イメージ領域を示すグラフであり、下の部分は各処理群の蛍光イメージを示す写真である。
【図３Ｅ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体の細胞移動阻害の度合いを示すグラフである。
【図４Ａ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＵ８７−ＭＧ脳がん細胞に対する生体内抗がん効果を示す結果であり、上の部分は経時的な腫瘍の大きさ（体積）を示すグラフであり、下の部分は試験終了後の腫瘍の重さを示すグラフである。
【図４Ｂ】本発明の一実施例に従い製作された二重特異性抗体のＮＣＩ−Ｈ４４１肺がん細胞に対する生体内抗がん効果を示す結果であり、上の部分は経時的な腫瘍の大きさ（体積）を示すグラフであり、下の部分は試験終了後の腫瘍の重さを示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例に従いＶＩＧ２を融合した様々なｃ−Ｍｅｔ抗体のｃ−Ｍｅｔ分解活性をＶＩＧ２未融合のｃ−Ｍｅｔ抗体と比較して示すグラフである。
【実施例】
【００９７】
（参考例）１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の製作
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体「ＡｂＦ４６」の産生
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウスに１匹当たりに１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）と同量の完全フロインドアジュバント （Ｆｒｅｕｎｄ'ｓａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に注射した。２週後に、上記の方法と同様にして、前記抗原として用いられたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を先に注射した量の半分である５０μｇを同量の不完全フロインドアジュバントと混合してマウスの腹腔内に注射した。一週間後に最後の追加免疫が行われ、３日後に前記マウスの尻尾から採血して血清を得た後、１／１０００でＰＢＳに希釈してＥＬＩＳＡでｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価（ｔｉｔｅｒ）が増大されることを確認した。上記の結果をもって抗体の量が十分に得られるマウスを選別して下記の細胞融合過程を行った。
【００９８】
１．１．２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に５０μｇのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質混合物をＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻酔した後に身体の左側に位置する脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで磨って細胞を分離し、培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＧＩＢＣＯ、インビトロゲン社製）と混合して脾臓細胞懸濁液を作成した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１×１０８個と骨髓腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０８個を混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に懸濁し、３７℃で１分間ＤＭＥＭ中の４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍＬ）で処理した後、１ｍＬの培養培地（ＤＭＥＭ）に懸濁した。次いで、細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭに１０分間以上浸し、その後３７℃で５分間放置した。そして、ＤＭＥＭで５０ｍＬにし、再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）に約１〜２×１０５／ｍＬで再懸濁し、９６ウェルプレートに０．１ｍＬずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培養器において培養してハイブリドーマ細胞群を製作した。
【００９９】
１．１．３．ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２に従い製造されたハイブリドーマ細胞群から、ｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質とヒトのＦｃタンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ分析方法を用いてスクリーニングした。
【０１００】
マイクロタイタープレートにヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を１ウェル当たりにそれぞれ５０μＬ（２μｇ／ｍＬ）ずつ加えてプレートの表面に付着させ、未反応抗原は洗い取った。ｃ−Ｍｅｔには結合しないがＦｃを認識するする抗体を選別して除去するために、ヒトＦｃタンパク質を上記の方法と同様にしてプレート表面に付着させた。
【０１０１】
前記参考例１．１．２において得られたハイブリドーマ細胞の培養液を前記準備されたマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに５０μＬずつ加えて１時間かけて反応させた後、リン酸緩衝溶液−ツイーン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄して未反応培養液を除去した。ここにヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて１時間かけて室温下で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼの基質溶液（オルトフェニレンジアミン；ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の度合いはＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定して確認した。
【０１０２】
上記の反応の度合いの確認によって、ヒトＦｃには結合せず、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終的に選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを２００９年１０月９日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である大韓民国ソウル特別市鍾路区蓮建洞に所在する韓国細胞株研究財団に寄託して受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０を与えられた（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照）。
【０１０３】
１．１．４．モノクローナル抗体の産生および精製
前記参考例１．１．３において得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地において培養し、培養液からモノクローナル抗体を産生および精製した。
【０１０４】
まず、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）入り培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍＬにおいて培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離して細胞沈殿物を２０ｍＬのＰＢＳで２回以上洗浄してＦＢＳが除去された状態で、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍＬに再懸濁させた後、３日間３７℃の二酸化炭素培養器において培養した。
【０１０５】
次いで、遠心分離により抗体を産生する細胞を除去し、使用前まで４℃で保存し、または直ちに、抗体の分離および精製に用いた。親和性カラム（プロテインＧアガロースカラム；米国ファルマシア社製）を装備したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥヘルスケア社製）を用いて前記準備された培養液５０ｍＬ〜３００ｍＬから抗体を精製した後、タンパク質凝集用フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＢＳで上澄み液を置換して精製された抗体を保管し、以下の実施例に用いた。
【０１０６】
１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６の製作
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入されたときに免疫拒絶反応を示す可能性が高い。そのため、これを解決するために、前記実施例１に従い製作されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原結合に関連する変異領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除く不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒトＩｇＧ１抗体の配列で置換したキメラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６を製作した。
【０１０７】
重鎖に相当するヌクレオチド配列は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から、軽鎖に相当するヌクレオチド配列は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３９）から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号３９）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることにより、キメラ型抗体の発現のための重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。
【０１０８】
前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ  ２９３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式で培養された。一過性一過性発現の前日に細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合にてＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ ＳＦＭ  ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％のＣＯ２及び１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。
【０１０９】
次いで、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地において３７℃、５％のＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳ未添加のＤＭＥＭ培地において４８時間３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１０】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌずつ取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳバッファに交換して最終的にキメラ型抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と命名する）を精製した。
【０１１１】
１．３．キメラ型抗体ｃｈＡｂＦ４６からのヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の製作
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙおよびＨ３−ｈｅａｖｙの２種のデザインのために、先ず、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介して前記参考例１．２において精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルにおいて８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１の骨格（フレームワーク）に取り込まれるようにデザインした。このとき、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元のマウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に復帰突然変異した。次いで、Ｈ１はさらに８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与えて最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構築した。
【０１１２】
Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのためにヒト抗体のフレームワーク配列を探ったところ、ＡｂＦ４６抗体のマウスフレームワーク配列と配列が非常に類似しているとともに、既存の最も安定的であると知られているＶＨ３サブタイプを用いてＫａｂａｔ番号付けで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を取り込んだ。これにより、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。
【０１１３】
１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）およびＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４）の２種のデザインのために、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルにおいて７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに取り込まれるようにデザインした。このとき、Ｈ１−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を復帰突然変異し、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個のみを復帰突然変異して構築した。
【０１１４】
Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を介してマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を分析したところ、前記ＶＫ４−１に加えてＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０はアミノ酸レベルにおいて６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ番号付けで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに取り込まれるようにデザインした。このとき、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を復帰突然変異して構築した。
【０１１５】
Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を探ったところ、既存の最も安定的であると知られているＶｋ１サブタイプを用いてＫａｂａｔ番号付けで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を取り込んだ。このとき、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸をさらに復帰突然変異して構築した。
【０１１６】
次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）をｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットに前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）の制限酵素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１１７】
前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ  ２９３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式で培養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ  ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。
【０１１８】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳバッファに交換して最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と命名する）を精製した。一方、以降の実施例において用いたヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせはＨ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）およびＨ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）である。
【０１１９】
１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを製作するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」の形にし、前記リンカーは「ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ」（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにしてデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（配列番号５５）をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターを配列番号５６に示す。
【０１２０】
次いで、前記ベクターから発現された結果物を分析して、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。
【０１２１】
１．５．親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の製作
１．５．１．標的ＣＤＲの選定およびプライマの製作
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟のために６個の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を前記製作されたマウス抗体ＡｂＦ４６から「Ｋａｂａｔ番号付け」によって定義し、それぞれのＣＤＲは下記の表１に示す通りである。
【０１２２】
【表１】
2014193864.tif 000003
【０１２３】
抗体ＣＤＲのランダムな配列の取り込みのために下記のようにしてプライマーを製作した。既存のランダムな配列の取り込み方式では、突然変異を与えたい部位に同じ割合の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が取り込まれるようにＮコドンを用いたが、この実施例においては、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダムに塩基を取り込むために、各ＣＤＲのアミノ酸をコードする３個の野生型ヌクレオチドのうち最初と２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ取り込むような方式を取った。なお、３番目のヌクレオチドは同様に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）が取り込まれるようにプライマーをデザインした。
【０１２４】
１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの製作およびｃ−Ｍｅｔへの結合力の確認
ＣＤＲのランダムな配列の取り込みを用いた抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参考例１．５．１などの方法により製作されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、図１に示す方法と同様にして２個のＰＣＲ断片を製作し、これをオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）方法を用いて、所望のＣＤＲのみがそれぞれ突然変異されたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して製作された６個のＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。
【０１２５】
このようにして製作されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔへの結合力を確認し、それぞれのライブラリーは野生型に比べてｃ−Ｍｅｔへの結合力が総じて下がる傾向を示したが、ｃ−Ｍｅｔへの結合力が保たれる一部の突然変異を確認した。
【０１２６】
１．６．製作されたライブラリーからの親和度が改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔへのライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列はそれぞれ下記の表２に示す通りであり、これをＩｇＧ形式に変換した。下記のクローンのうちから、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から産生された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。
【０１２７】
【表２】
2014193864.tif 000004
【０１２８】
１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から構成され、重鎖の場合、親和性成熟後に抗体のアミノ酸が変更されなかったため、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま用いた。但し、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジではないＵ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）で置換した。軽鎖は「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成し、親和性成熟後に選別された前記４種の抗体の軽鎖可変領域を含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をバイオニア社に依頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（Ｌ３−１由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号６１）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）の制限酵素を用いてクローニングすることにより、親和性成熟された抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１２９】
前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ  ２９３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式により培養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＦＭ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。
【０１３０】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液を各１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳバッファに交換して最終的に親和性成熟された４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５由来）と命名する）を精製した。
【０１３１】
１．８．不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
前記参考例１．７において選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が最も高く、Ａｋｔリン酸化およびｃ−Ｍｅｔ分解の度合いが最も低く測定されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象として、ヒンジ領域または不変領域およびヒンジ領域が置換された抗体を製作した。
【０１３２】
ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）と命名し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）と命名し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）と命名した。なお、前記３種の抗体は、産生量の増大のためにヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の３６番のヒスチジンをいずれもチロシンで置換した。
【０１３３】
前記３種の抗体を製作するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなるポリペプチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒスチジンがチロシンで置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）をバイオニア社に依頼して合成した。次いで、インビトロゲン社製のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットに前記重鎖に相当する塩基配列を含むＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１３４】
前記構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ２９３発現システム（インビトロゲン社製）を用いて行われた。用いられた細胞株は２９３−Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３発現培地を培地として浮遊培養方式により培養された。一過性発現の前日に細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして準備した後、２４時間が経過して細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬（インビトロゲン社製）を用いたリポソーマル試薬法により形質移入（トランスフェクション）を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合にてＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（インビトロゲン社製）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ＭＡＸ試薬１００μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ  ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）を混合して１５分間インキュベーションした後、前日に準備した細胞に混合液を徐々に混ぜ加えた。形質移入が完了した後、３７℃、８０％の湿度、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍのインキュベータにおいて５日間培養した。
【０１３５】
前記培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、Ｉｇ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳバッファに交換して最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ））を精製した。これらの中で、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の代表例としてｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）を選択して下記の実施例に供し、便宜上、前記抗体を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙと命名した。
【０１３６】
実施例１：融合タンパク質の製造
前記参考例１において製作された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を基に重鎖Ｃ末端にリンカーが連結されるように融合した。次いで、リンカーの末端にＶＥＧＦ受容体１を構成するアミノ酸のうちＩｇ２ドメイン、すなわち、１２９番目から２２９番目までのアミノ酸を連続して融合してｃＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な抗体を製作した（図１参照）。
【０１３７】
ＶＥＧＦ受容体１（Ｐ１７９４８．２；配列番号１０９）を構成する１３３８個のアミノ酸のうち、ＶＥＧＦ結合に最も重要であると知られているＩｇ２ドメインを構成する１２９番目から２２９番目までの１０１個のアミノ酸をコードする遺伝子配列をＮＣＢＩデータベースから確保した。
【０１３８】
Ｉｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）アミノ酸配列（配列番号１１０）：
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩ
Ｉｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）塩基配列（配列番号１１１）：
ＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣ
前記製作されたｃ−Ｍｅｔ抗体の重鎖とＩｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）を連結するために、ＧＧＧＧＳが繰り返される構造の「ＧＧＧＧＳ」（Ｇ４Ｓ）（配列番号１１６）、「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（（Ｇ４Ｓ）２）（配列番号１１７）、または「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号１１８）の３種類のリンカーをデザインし、これをｃ−Ｍｅｔ抗体とＶＥＧＦ受容体１のＩｇ２ドメイン（ＶＩＧ２）との間に位置させた。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の軽鎖をコードする遺伝子、および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の重鎖、前記リンカー、および前記ＶＥＧＦ結合断片をコードする遺伝子をバイオニア社に依頼して合成し、このとき、最終遺伝子の最後に終止コドン（ＴＧＡ）を挿入した。このようにして合成された遺伝子をｐＯｐｔｉｖｅｃベクター（インビトロゲン社）にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩクローニングサイトを用いて重鎖発現ベクターを製作した。軽鎖発現ベクターは、前記Ｌ３−１Ｙの製作時に用いられたベクターをそのまま用いた。
【０１３９】
構築されたベクターはそれぞれＱｉａｇｅｎマキシプレップキット（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、前記重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターは４：１の割合（８０μｇ：２０μｇ）にて２９３Ｔ細胞（２．５×１０７）に２Ｍ  ＣａＣｌ２を３６０μｌ添加してトランスフェクションした。次いで、１０％のＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地において３７℃、５％のＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳ未添加のＤＭＥＭ培地において４８時間かけて３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。
【０１４０】
培養された細胞を遠心分離して上澄み液各１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。ＡＫＴＡプライムにプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０４０５−０３）を設けて培養液を５ｍｌ／分の流速で流した後、Ｉｇ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳバッファに交換して最終的にｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦに同時に結合可能な抗体を精製した。
【０１４１】
このようにして製作された抗体を下記表３にまとめて示す。
【０１４２】
【表３】
2014193864.tif 000005
【０１４３】
実施例２：融合タンパク質のｃ−Ｍｅｔ標的および分解活性
２．１．親和性検査
前記製作された二重特異性融合タンパク質の結合速度をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００インスツルメント（ＧＥヘルスケア社製）を用いて分析した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥヘルスケア社製）をＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００５−３０）の表面に製造者の説明書に従って固定化した。約９０〜１２０ＲＵのＬ３−１ＹまたはＭＶ１０ＡＹを捕獲し、様々な濃度のｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５８−ＭＴ／ＣＦ）を前記捕獲された抗体に注入した。ここに１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた。結合速度を測定するために、前記実験において得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥヘルスケア社製、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて適用した。
【０１４４】
前記ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア用いて得られた結果を下記表４に示す。
【０１４５】
【表４】
2014193864.tif 000006
【０１４６】
ＭＶ１０ＡＹのｃ−Ｍｅｔへの親和性は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のバックボーンアイソタイプ（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）とは無関係にＬ３−１Ｙ（ＫＤ＜０．０１ｎＭ）と類似していた。
【０１４７】
２．２．ｃ−Ｍｅｔ分解ＥＬＩＳＡ（ＭＫＮ４５）
相対的なｃ−Ｍｅｔの総量は、抗体がｃ−Ｍｅｔに結合した場合、抗体の内在化によって、ｃ−Ｍｅｔの分解が起こることを利用して、ｃ−Ｍｅｔの総量の増減を把握して抗体の影響を評価するものである。ｃ−ＭｅｔとＨＧＦの結合ががん細胞の成長を促すことは既に知られており、したがって、合計のｃ−Ｍｅｔ量が減少すれば、がん細胞の成長も低下することに着目したものである。
【０１４８】
ｃ−Ｍｅｔ量は定量的なＥＬＩＳＡ方法により測定し、この場合には、ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いてＭＫＮ４５胃がん細胞株（ＪＣＲＢ０２５４；ヘルス・サイエンス・リサーチ・リソース・バンク（ＨＳＲＲＢ）、日本国新宿））において実験した。２００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を５μｇ／ｍｌの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と混ぜて２４時間かけて培養（培地：１０％のウシ胎児血清入りＲＰＭＩ）した後にＥＬＩＳＡ実験を行った。最終的にＳｕｐｅｒ  Ａｑｕａｂｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて反応させ、比色信号(ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ)は４５０ｎｍ波長におけるＯＤ値で測定した。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理しない比較群（ｍｅｄｉａ）の値を１００％として、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理した後の値を前記比較群に対する相対値として計算した。
【０１４９】
前記得られた結果を図２Ａに示す。図２Ａから明らかなように、二重特異性抗体であるＭＶ１０ＡとＭＶ１０ＡＹはそれぞれのｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、単一標的抗体とも言う。）であるＬ３−１およびＬ３−１Ｙに比べて有意的にｃ−Ｍｅｔ分解能が向上している。すなわち、ＭＶ１０Ａのｃ−Ｍｅｔ分解能（７６％）は単独標的抗体Ｌ３−１の分解能（６８％）に比べて有意的に向上され（一元配置分散分析法(Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  ＶＡｒｉａｎｃｅ；  Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ)による分析結果、ｐ＜０．０１）、ＭＶ１０ＡＹの場合にも分解能（７２％）が単独標的(ｓｉｎｇｌｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ)抗体Ｌ３−１Ｙの分解能（６６％）よりも向上していた（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０．０５）。
【０１５０】
２．３．Ａｋｔリン酸化（Ｃａｋｉ）（抗体のアゴニズム試験）
治療用抗体における安全性と効能をメカニズム基盤実験で検証した。安全性を調べるために、ＡＫＴというキナーゼのリン酸化の度合いを定量的ＥＬＩＳＡ方法により測定した。ＡＫＴによって調節されている細胞作用は、細胞増殖、細胞生存、細胞の大きさの調節、可用栄養分への反応性、中間代謝過程、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、組織浸潤浸潤（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）などを含む。これらのあらゆる過程はがんの特徴を代表するものであり、数多くの腫瘍発生タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と腫瘍発生抑制物質（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）はＡＫＴ経路上において相互交差的に影響を及ぼし、シグナル伝達と古典的な代謝調節の連結点において細胞の作用を微細に調節する機能を行う。このため、ＡＫＴの活性型であるリン酸化されたＡＫＴの度合いが高いほど、がん細胞が一層高い活性を示し、この実施例においては、抗体が陽性対照抗体５Ｄ５を処理したときに比べてＡＫＴのリン酸化をどれほど阻害できるかについて検証した。
【０１５１】
ＡＫＴのリン酸化部位はＳｅｒ４７３であり、セルシグナリング社製のＰａｔｈＳｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡキットを用いた。前日に２００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで培養したＣａｋｉ−１細胞株（腎明細胞がん細胞株）（ＨＴＢ−４６；アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス）に無血清ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、インビトロゲン社製）に５μｇ／ｍｌの抗体を混ぜて３０分間処理した後、ＥＬＩＳＡキットを用いて実験した。結果は、パーキンエルマー社製の機械で測定して得た。ＡＫＴのリン酸化の度合いを計算するときには、陽性対照群である５Ｄ５（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス）によるリン酸化の度合いを１００％とし、その値と比較して他の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および二重特異性抗体のリン酸化誘導の度合いを表示した。
【０１５２】
前記得られた結果を図２Ｂに示す。図２Ｂから明らかなように、二重特異性抗体（ＭＶ１０Ａ、ＭＶ１０ＡＹ）は両方ともそれぞれに対応するｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体（Ｌ３−１、Ｌ３−１Ｙ）よりもＡＫＴリン酸化を有意的に一層強力に阻害する。すなわち、ＭＶ１０ＡのＡＫＴリン酸化阻害能（５Ｄ５対照群に比べて７９％）は単独標的抗体Ｌ３−１の阻害能（６９％）に比べて有意に向上され（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０．０１）、ＭＶ１０ＡＹの場合にも阻害能（７４％）が単独標的抗体Ｌ３−１Ｙの分解能（６３％）よりも向上した（一元配置分散分析法による分析結果ｐ＜０．０１）。
【０１５３】
２．４．ＭＫＮ４５成長阻害試験（抗体効能試験）
ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５（ＪＣＲＢ０２５４）をヘルス・サイエンス・リサーチ・リソース・バンク（ＨＳＲＲＢ、日本、新宿）から入手した。前記細胞株を１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１６０００−０４４）と１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１５４１０−１２２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．＃１１８７５−１１９）において培養した。細胞株を５％のＣＯ２を含む湿潤大気下の３７℃において培養し、細胞が培養容器内で過密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になる前に継代培養した。ＣＥＤＥＸ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて細胞数を測定した。抗体処理（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）による腫瘍細胞の増殖を調べるために、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ：プロメガ社製）発光分析法（ルミネセンス測定法）を用いた。
【０１５４】
前記分析法は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りＲＰＭＩ１６４０培地内のＭＫＮ４５細胞をブラック９６ウェルプレート（コーニング社製、Ｃａｔ．＃Ｃｏｓｔａｒ ３６０３）の上に１ウェル当たりに１×１０４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、１０％のＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、最終濃度０．００８μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬに希釈された抗体で処理した。７２時間インキューベーティング後に、ＣＴＧ溶液１００μＬを各ウェルに添加した後、室温下で３０分間インキューベーティングした。前記得られた発光信号をＥｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４マルチラベルリーダ（パーキンエルマー社製、米国マサチューセッツ州ウオルサム）を用いて記録した。
【０１５５】
前記得られた結果を図２Ｃに示す。図２Ｃから明らかなように、二重特異性抗体ＭＶ１０Ａ（■）はそれに対応するｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体Ｌ３−１（□）に比べて０．０４μｇ／ｍＬ以上の濃度において有意的に優れたＭＫＮ４５がん細胞株成長抑制効果を有する（平均と標準偏差表示、二元配置分散分析法（２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）による分析；ボンフェローニの多重比較検定により得られたｐ値を各濃度点の下に示す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。
【０１５６】
２．５．ＮＣＩ−Ｈ４４１成長試験（抗体のアゴニズム試験）
ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体がｃ−Ｍｅｔに結合する場合、ｃ−Ｍｅｔによる不所望のアゴニズム（拮抗）現象が見られる。これは抗体の安全性と関連するため、二重特異性を有することに伴い、ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体の不所望のアゴニズム性質が増大されるか否かを評価するためにＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株を用いて試験した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株は、ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体の投与時に、下記の特定の条件下でアゴニズムによる細胞分裂を示すという性質がある。
【０１５７】
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１７４）を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に２００、０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで希釈して１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに分注した後に２４時間かけて３７℃で５％のＣＯ２の条件下で培養した後、１０μｇ／ｍｌの濃度から１／５系列希釈して６個の濃度勾配で抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理した。２１時間かけて３７℃で５％のＣＯ２の条件下で培養した後、５−ブロモ−２'−ジオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２'−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、ＢｒｄＵ）を添加して細胞に取り込み、３時間さらに培養した後、ＢｒｄＵアッセイ（ロシュ社製、インディアナ州インディアナポリス）を行った。細胞をプレート上において変性／固定した後に抗−ＢｒｄＵ抗体を入れて１時間後に基質を添加して３７０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡ  ｓｐｅｃｔｒａＭａｘリーダ（モレキュラーデバイス社製、カリフォルニア州サニーベール）で発色反応を測定した。最終的にＢｒｄＵを取り込んでいない細胞の値をバックグラウンドコントロールとして制限した後、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を処理しなかった比較群の値を１００％に換算（Ｙ軸）して相対値を計算した。陰性対照群としてはマウスのＩｇＧを用い、作動薬（ａｇｏｎｉｓｔ）としてよく知られている５Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．＃ＨＢ１１８９５ハイブリドーマ細胞から分離精製）を陽性対照群として用いた。
【０１５８】
前記得られた結果を図２Ｄに示す。図２Ｄから明らかなように、ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体Ｌ３−１に比べて二重特異性(bispecific)抗体であるＭＶ１０ＡまたはＭＶ１０ＡＹはアゴニズム性質が増大されていなかった。すなわち、抗体安全性に変化がなかった。
【０１５９】
２．６．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＨＧＦ）（血管新生阻害（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）試験）
ＨｕＶＥＣ細胞株（ＡＴＣＣ）をＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌとともにＥＧＭ２ ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｃａｔ．ＣＣ−３１６２）において培養した。細胞を５％のＣＯ２を含む湿潤大気下の３７℃でインキューベーティングした後に細胞が培養容器内で過密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になる前に継代培養した。ＣＥＤＥＸ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて細胞数を測定した。抗体処理（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）による腫瘍細胞成長阻害の度合いを確認するためにＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ロシュ社製）を用いてリアルタイム細胞分析法を行った。前記分析法は製造者の説明書に従って行った。略述すると、前記培養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プレートの上に１ウェル当たりに１×１０４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にインキュベーション培地を除去し、無血清培地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗体（１００ｕＬ、最終的な抗体濃度１０μｇ／ｍＬ）を処理した。発生するインピーダンス値をリアルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、４８時間かけて行った。
【０１６０】
前記得られた結果を図２Ｅに示す。前記試験結果をもって、ＨＵＶＥＣの成長へのＨＧＦの影響を単独／二重特異性抗体が抑制可能な度合いをテストすることができた。図２Ｅから明らかなように、ＨＧＦを抑制できないベバシズマブ（韓国ロシュ社製、同量処理）は、陰性対照群（ＨＧＦ単独）と同様に、ＨＧＦの効果に全く影響しなかった。それにも拘わらず、ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲの二重特異性抗体ＭＶ１０Ａは、その母体であるｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体Ｌ３−１に比べて一層強力なＨＧＦへの拮抗効果がある（ＭＶ１０Ａは６４％抑制、Ｌ３−１は４５％抑制；ＨＧＦ単独群に比べて、一元配置分散分析法によるｐ値表示：＊、ｐ＜０．０５；ＮＳ、有意性なし）。
【０１６１】
実施例３：融合タンパク質のＶＥＧＦ標的および抑制活性
３．１．親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）検査
ＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体の結合動態をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００インスツルメント（ＧＥヘルスケア社製）を用いるＳＰＲ方法によって測定した。ｈＶＥＧＦ（ＧＥヘルスケア社製、２８−９５８３−２５）をＣＭ５チップの表面に製造者の説明書に従って固定化した。約９０ＲＵの様々な濃度（６種類の濃度）のＭＶ１０ＡＹを捕獲した。１Ｍ  ＮａＣｌ＋３０ｍＭ  ＮａＯＨを３０μｌ／分の流速で６０秒間注入することにより、前記表面を再生した。結合動態を決定するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥヘルスケア社製）を用いて前記実験において得られたデータをフィットした（ＫＤ＝０．４５ｎＭ）。  
前記得られた結果を表５に示す。
【０１６２】
【表５】
2014193864.tif 000007
【０１６３】
３．２．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＶＥＧＦ）
Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザ（ロシュ社製）を用いて抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるＨＵＶＥＣ増殖の度合いを調べて血管新生抑制効果を調べてみた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、ＨｕＶＥＣ細胞株（ＡＴＣＣ）をＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌとともにＥＧＭ２  ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｃａｔ．ＣＣ−３１６２）において培養した。前記培養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プレートの上に各ウェル当たりに１×１０４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にインキュベーション用培地を除去し、無血清培地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗体（１００μＬ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を処理した。発生するインピーダンス値をリアルタイムにて測定した。リアルタイム分析は９６時間かけて行った。
【０１６４】
前記得られた結果を図３Ａに示す。図３Ａから明らかなように、本発明による抗体と陽性対照群として用いられたベバシズマブ（韓国ロシュ社製、同量処理）は両方ともＶＥＧＦに依存的な細胞増殖を示し、ＭＶ１０Ａは陽性対照群であるベバシズマブと比較して顕著な細胞増殖抑制効果を示した（ＭＶ１０Ａは８６％抑制、ベバシズマブは６１％抑制；ＶＥＧＦ単独群に比べて、一元配置分散分析法によるｐ値表示：＊、ｐ＜０．０５；ＮＳ、有意性なし）。
【０１６５】
３．３．ＨＵＶＥＣ増殖抑制試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザ（ロシュ社製）を用いて抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）によるＨＵＶＥＣの増殖度合いを調べて血管新生抑制効果を調べてみた。前記分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すると、細胞（ＨｕＶＥＣ、ＡＴＣＣ）１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦＲのリガンドであるＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌとＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）０．４μｇ／ｍｌを処理してＥＧＭ２  ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｃａｔ．ＣＣ−３１６２）において培養した。前記培養されたＨｕＶＥＣ細胞を１６−ウェルＥ−プレートの上に１ウェル当たりに１×１０４ｃｅｌｌｓの濃度で分注し、２４時間後にインキュベーション用培地を除去し、無血清培地（ＥＢＭ培地、ロンザ社製）で希釈された抗体（１００μＬ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を処理した。発生するインピーダンス値をリアルタイムにて測定した。リアルタイム分析は、４８時間かけて行った。
【０１６６】
前記得られた結果を図３Ｂに示す。図３Ｂから明らかなように、単一標的（ｃ−Ｍｅｔ）抗体であるＬ３−１Ｙ抗体の単独投与およびベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ；ＶＥＧＦ単一標的）抗体の単独投与時には、有意なＨｕＶＥＣ細胞増殖抑制効果が得られなったのに対し、二重特異性抗体であるＭＶ１０ＡＹはｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とすることにより、ＨＧＦ−およびＶＥＧＦ−に依存的なＨＵＶＥＣ細胞増殖に対して顕著な相乗的抑制効果を示す。すなわち、ベバシズマブの単独使用時に２７％抑制、Ｌ３−１Ｙの単独使用時に１６％抑制に留まったが、二重特異性抗体であるＭＶ１０Ａは７２％抑制効果を示して、単独抗体の使用時に比べて二重特異性抗体の使用時に顕著な相乗的抑制効果が認められる（ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法検定(１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ)による有意性表示。棒グラフの上端にＨＧＦ＋ＶＥＧＦ単独群に比べてｐ値表示（＊＊＊、ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意性なし）、各処理群間の差分はグラフの上端に表示）。
【０１６７】
３．４．ＨＵＶＥＣの浸潤能（ｉｎｖａｓｉｏｎ）阻害試験（＋ＶＥＧＦ）
抗体処理（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能分析用プレート（ＢｉｏＣｏａｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ；ＢＤサイエンス社製、Ｃａｔ＃．３５４４８３）を用いて細胞浸潤能（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を試験した。分析は、製造者の説明書に従って行った。略述すれば、上部チャンバにはＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ；５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注し、下部チャンバには抗体（１０μｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃で培養した（ＶＥＧＦは、下部チャンバに添加、０．４μｇ／ｍｌ）。２４時間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセインで染色して蛍光顕微鏡（ツァイス社製）で観察した。
【０１６８】
前記得られた結果と蛍光イメージを図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、上部は各抗体処理群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。ＶＥＧＦのみを処理した場合に起こる浸潤を１００％とした相対的な値を示す。図３Ｃの下端は、実際の蛍光イメージを示す写真である（白色が浸潤を引き起こした細胞である）。図３Ｃに示すように、ＭＶ１０ＡＹ二重特異性抗体はＶＥＧＦ単一標的抗体であるベバシズマブに比べて顕著な浸潤能抑制効果を示すことが確認された（ＭＶ１０ＡＹは１００％抑制、ベバシズマブは７０％抑制）。
【０１６９】
３．５．ＨＵＶＥＣの浸潤能阻害試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
抗体処理（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）による細胞浸潤能の阻害有無を確認するために、上部チャンバと下部チャンバに分けられて上部チャンバにコラーゲンがコードされた細胞浸潤能分析用プレート（ＢｉｏＣｏａｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ；ＢＤサイエンス社製、Ｃａｔ＃．３５４４８３）を用いて細胞浸潤能を試験した。分析は、製造者の説明書に従って行った。
【０１７０】
略述すると、上部チャンバにはＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ；５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注し、下部チャンバには抗体（１０μｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃で培養した（ＨＧＦ＋ＶＥＧＦは下部チャンバに添加、それぞれ０．４μｇ／ｍｌずつ）。２４時間後に、上部チャンバのコラーゲン層を貫いて下部チャンバに下降した細胞をカルセインで染色して蛍光顕微鏡（ツァイス社製）で観察した。
【０１７１】
前記得られた結果と蛍光イメージを図３Ｄに示す。図３Ｄにおいて、上部は各抗体処理群の相対的な蛍光イメージの広さを示すグラフである。ＶＥＧ＋ＨＧＦを処理した場合に起こる浸潤を１００％とした相対的な値を示す。値が低いほど、浸潤があまり起きていないことが分かる。平均と標準偏差を表示し、一元配置分散分析法による分析結果、ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ処理群と比較したときのｐ値を各グラフの上端に示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。図３Ｄの下端は、実際の蛍光イメージを示す写真である（黒色が浸潤を引き起こした細胞である）。図３Ｄに示すように、ＶＥＧＦとＨＧＦの存在下において、二重特異性抗体ＭＶ１０ＡＹはｃ−Ｍｅｔ単一標的抗体であるＬ３−１Ｙ抗体に比べてＨｕＶＥＣ細胞浸潤に対して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認することができる（ＭＶ１０ＡＹは９２％抑制；Ｌ３−１Ｙは７９％抑制；ベバシズマブは８３％抑制）。
【０１７２】
３．６．ＨＵＶＥＣ転移能（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）阻害試験（＋ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ）
ｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦは両方とも細胞成長だけではなく、がんの転移にも関連する因子である。それぞれの阻害剤を併用投与するときにがん細胞転移能と関連する細胞の移動に相乗効果を示すか否かを試験した。抗体処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）による転移能阻害能を評価するために下記の実験を行った。細胞の移動はがんの転移に直接的に関与するため、下記の分析法は細胞の転移能を評価する方法として汎用される方法である。
【０１７３】
Ｏｒｉｓ９６ウェルプレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ、ＯｒｉｓＴＭ細胞移動アッセイ）方法を行った。ストッパーが内蔵された９６ウェルプレートの各ウェルにＨｕＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）を１００００個ずつ接種し、無血清培地（ＥＢＭ、ロンザ社製）においてＨＧＦ０．４μｇ／ｍｌとＶＥＧＦ０．４μｇ／ｍｌを処理し、２４時間をかけて培養した後にストッパーを除去した。ストッパーは円形のゴム物質であり、ストッパーがあった箇所には細胞が成長できないため、２４時間後にストッパーを除去すれば、その個所にのみ円形の空間が生成される。
【０１７４】
ストッパーの除去後に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ、ＭＶ１０ＡＹ抗体を様々な濃度（０．０５〜５μｇ／ｍｌ）で処理した後、２４時間後に蛍光物質であるカルセインＡＭ（ＢＤ）で染色すれば細胞のみが染色され、細胞がない部分は空間として残る。このため、細胞移動が阻害されるほど、未染色空間が大きくなり、未染色空間を観察することにより、細胞移動の度合いを測定することができる。蛍光信号の強さは、マルチラベルリーダ（パーキンエルマー社製、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で読み取り、これによって得られた値をＶＥＧＦ＋ＨＧＦ処理群の信号強さ１００％として換算して図３Ｅに示す。各濃度における平均と標準誤差を示し、ＶＥＧＦ＋ＨＧＦ群に比べての統計学的有意性を各濃度点の上端に示す（ボンフェローニの多重比較検定を用いた二元配置分散分析法；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１７５】
試験された全範囲の抗体の処理量において、二重特異性抗体であるＭＶ１０ＡＹはｃ−Ｍｅｔ単一標的抗体（Ｌ３−１Ｙ）またはＶＥＧＦ単一標的抗体ベバシズマブ処理時または前記単一標的抗体の併用処理時と比較して顕著に優れた阻害効果を示すことを確認することができる（相乗作用の確認）。これは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に抗ＶＥＧＦ機能を加えたＭＶ１０ＡＹ抗体の優越性を確実に示す結果である。
【０１７６】
実施例４：融合タンパク質の抗がん効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦとＶＥＧＦをそれぞれ抑制するときに抗がん効果が得られると知られているＵ８７−ＭＧ脳がん細胞株を用いて、生体内抗がん効果試験を行った。Ｕ８７−ＭＧ脳がん細胞株（中国科学院の細胞銀行から購入；ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−１４）２．５×１０６個（１００μＬ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄性、６−７週齢、２０−２５ｇｒａｍ）に皮下注射した後、１週間が経過した後に治療群（ＭＶ１０ＡＹ（■）、ＭＶ１０ＡＹ  Ｕ３  ＨＣ９／ＩｇＧ１（□）、またはＭＶ１０ＡＹ Ｕ３  ＨＣ９／ＩｇＧ２（○）；投与量：それぞれ０．２ｍｇ／ｋｇ（点線）または１ｍｇ／ｋｇ（実線）；投与時期：３−４日おきにまたは１０日おきに；投与経路：静脈注射）と対照群（ビヒクル：ＰＢＳ ０．２ｍＬ、週１回静脈注射で投与）に分けて薬物投与を始めた。各群あたりのマウスは１５匹にした。腫瘍の大きさを１週につき２回測定し、腫瘍の大きさ（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は｛（長径（ｍｍ））×（短径（ｍｍ））２｝／２によって計算した。治療を始めてから３０日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、腫瘍の重さを測定して、前記測定された腫瘍の大きさとともに抗がん効果の評価に用いた。
【０１７７】
前記得られた結果を図４Ａに示す。図４Ａの上部は、経時的な腫瘍の大きさを示し、下部は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さ（ｔｕｍｏｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示す。図４Ａから明らかなように、投与を始めてから２週後から全ての治療群において顕著な腫瘍抑制効果を示した。また、前記３種類の二重特異性抗体間の治療効果には大差なく、投与量および投与回数を増やした群において一層強力な抑制効果を示した。１ｍｇ／ｋｇを３〜４日ごとに注射した群においては腫瘍がほとんど観察されない程度に完璧な抗がん効能を示した。（上部グラフは、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により繰り返し測定した結果を示し、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）；下部グラフは、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法(１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  Ｄｕｎｎｅｔｔ''ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ)によるビークル群（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｇｒｏｕｐ）に対する分析結果を示す、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．０００１））
ｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体に比べてｃ−ＭｅｔとＶＥＧＦを同時に標的とする二重特異性抗体がより向上した抗がん効果を示すか否かを調べるために、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞株を用いて生体内抗がん効果実験を行った。ＮＣＩ−Ｈ４４１は、ｃ−Ｍｅｔ標的による抗がん効果とアゴニズム効果を両方とも示す細胞株であり、包括的な抗がん効果を示すのに最適な細胞株であると決定した。ＮＣＩ−Ｈ４４１肺がん細胞株（ＡＴＣＣから購入、Ｃａｔ．＃ ＨＴＢ−１７４）５×１０６個（１００ｕＬ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄性、５−６週齢、２０−２５ｇ）に皮下注射した後、１週間が経過した後に治療群（単独標的抗体Ｌ３−１Ｙ、二重特異性抗体それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、週１回投与）と対照群（ビヒクル：ＰＢＳ  ０．２ｍＬ、週１回静脈注射で投与）に分けて薬物投与を始めた。各群当たりのマウスは１５匹にした。腫瘍の大きさを１週につき２回測定し、腫瘍の大きさは｛（長径（ｍｍ））×（短径（ｍｍ））２｝／２により計算した。治療を始めてから２６日後にマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出し、腫瘍の重さを測定して、前記測定された腫瘍の大きさとともに抗がん効果評価に用いた。
前記得られた結果を図４Ｂに示す。図４Ｂの上部は、経時的な腫瘍の大きさを示し、下部は、実験終了後に最終的に摘出された腫瘍の重さを示す。図４Ｂに示すように、投与を始めてから１週間後から両治療群においていずれも統計的に有意的な抗がん効果が観察された。特に、Ｌ３−１Ｙに比べてＭＶ１０ＡＹ治療時よりも強力な抗がん効果が得られた（上部グラフは、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により繰り返し測定した結果を示し、＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）、下部グラフは、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  Ｄｕｎｎｅｔｔ''ｍｕｌｔｉｐｌｅ  cｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）によるビークル群に対する分析結果を示す、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊＊（ｐ＜０．０００１））。
【０１７８】
実施例５：様々な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む融合タンパク質
ＶＩＧ２を融合した場合、上記の例において示すＬ３−１やＬ３−１Ｙ、Ｌ３−１ＹＩｇＧ２に加えて他のＣＤＲを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能も改善されるか否かを確認した。
【０１７９】
抗ｃＭｅｔ抗体の効能は、前記実施例２．２の方法と同様にして、ｃ−Ｍｅｔ分解の度合いを試験して測定され、このときに用いられた抗体を下記表６にまとめて示す。
【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
前記得られた結果を図５に示す。図５から明らかなように、二重特異性抗体であるＡｂ１−ＶＩＧ２とＡｂ２−ＶＩＧ２は、それぞれのｃ−Ｍｅｔ単独標的抗体であるＡｂ１およびＡｂ２に比べてｃ−Ｍｅｔ分解能が向上した。すなわち、Ａｂ１−ＶＩＧ２のｃ−Ｍｅｔ分解能（８３．２％）は、単独標的抗体Ａｂ１の分解能（８１．７％）に比べて向上し、Ａｂ２−ＶＩＧ２の場合にも分解能（８１．９％）が単独標的抗体Ａｂ２の分解能（７０．４％）よりも向上した（ｔ検定析結果ｐ＜０．０１）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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