(57)【要約】      （修正有）【課題】溶解性、バイオアベイラビリティ、およびプロテアーゼ切断に対する血清中の抵抗性を高めるように設計されることによって、治療薬としての有効性を改善する、膵島形成促進性ペプチドの処方物、誘導体、および改変、ならびにそれらを使用する方法を提供する。【解決手段】最適化された修飾を有する膵島形成促進性ペプチドであって、前記最適化された修飾は、Ｎ−末端アセチル基、Ｃ−末端アミド基、およびＣ−末端システイン残基からなる群から選択されるものである、ペプチド。好ましくはＨＩＰ、ならびにそれを使用して１型および２型糖尿病ならびにその症状を含む損なわれた膵機能に関連する病状を処置する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
最適化された修飾を有する膵島形成促進性ペプチドであって、前記最適化された修飾は、Ｎ−末端アセチル基、Ｃ−末端アミド基、およびＣ−末端システイン残基からなる群から選択されるものである、ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドにおいて、前記最適化された修飾は、（ｉ）Ｎ−末端アセチル基およびＣ−末端アミド基、および（ｉｉ）Ｎ−末端アセチル基およびＣ−末端システイン残基からなる群から選択されるものである、ペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドにおいて、前記ペプチドは、修飾されたＨＩＰ１ペプチド、修飾されたＨＩＰ２ペプチド、または修飾されたＨＩＰ３ペプチドである、ペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドにおいて、前記ペプチドは、修飾されたヒトＲＥＧ３Ａペプチド、修飾されたヒトＲＥＧ３Ｇペプチド、修飾されたヒトＲＥＧ１Ａペプチド、修飾されたヒトＲＥＧ１Ｂペプチド、修飾されたヒトＲＥＧ４ペプチド、修飾されたハムスターＩＮＧＡＰペプチド、修飾されたハムスターＲＥＧ２ペプチド、修飾されたハムスターＲＥＧ３Ｇペプチド、修飾されたラットＲＥＧ１ペプチド、修飾されたラットＰＡＰ／ＲＥＧ３Ｂペプチド、修飾されたラットＰＡＰ３ペプチド、修飾されたラットＲＥＧ３Ｇペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ１ペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ２ペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ３Ａペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ３Ｂペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ３Ｇペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ３Ｓペプチド、修飾されたマウスＲＥＧ４ペプチド、修飾されたウシＰＴＰペプチド、ラットＲＥＧ３ペプチド、チンパンジーペプチド、イヌペプチド、またはヒツジペプチドである、ペプチド。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドにおいて、前記ペプチドは、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、配列ＩＤ番号１０、配列ＩＤ番号１１、配列ＩＤ番号１２、配列ＩＤ番号１３、配列ＩＤ番号１４、配列ＩＤ番号１５、配列ＩＤ番号１６、配列ＩＤ番号１７、配列ＩＤ番号１８、配列ＩＤ番号１９、配列ＩＤ番号２０、配列ＩＤ番号２１、配列ＩＤ番号２２、配列ＩＤ番号２３、配列ＩＤ番号２４または配列ＩＤ番号２５のアミノ酸配列を有するもものである、ペプチド。
【請求項６】
治療有効量で最適化された膵島形成促進性ペプチドを有する医薬組成物であって、前記ペプチドは最適化された修飾を有する膵島形成促進性ペプチドを有するものであり、前記最適化された修飾はＮ−末端アセチル基、Ｃ−末端アミド基およびＣ−末端システイン残基からなる群から選択されるものである、医薬組成物。
【請求項７】
請求項６記載の医薬組成物において、前記治療有効量は２０ｍｇおよび３０〜６０ｍｇからなる群から選択されるものである、医薬組成物。
【請求項８】
請求項６記載の医薬組成物において、前記治療有効量は、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および８〜２０ｍｇ／キログラムからなる群から選択される投与量と等しいものである、医薬組成物。
【請求項９】
請求項６記載の医薬組成物において、前記治療有効量は、４００〜８００ｍｇ／日、６０〜１８０ｍｇ／日、または６０〜１２０ｍｇ／日である、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項６記載の医薬組成物において、さらに、薬学的に許容可能な賦形剤を有するものである、医薬組成物。
【請求項１１】
膵島新生を刺激し、または膵島細胞再生を刺激するための方法であって、請求項１記載のペプチドを投与する工程を有する、方法。
【請求項１２】
その治療を必要とする対象における損なわれた膵機能に関連する病状を治療する方法であって、前記対象に請求項１記載のペプチドを投与する工程を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、前記ペプチドは治療有効量で投与されるものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、前記ペプチドは治療有効量で投与されるものである、方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法において、前記損なわれた膵機能に関連する病状は、１型糖尿病、初発１型糖尿病、２型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群／代謝異常症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害、無排卵性周期、および多嚢胞性卵巣症候群から選択されるものである、方法。
【請求項１６】
請求項１１記載の方法において、さらに、膵島細胞再生剤を投与する工程を有するものである、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記膵島細胞再生剤は、ヒト膵島形成促進性ペプチド、ヒト膵島形成促進性ペプチドアナログ、アミリン、プラムリンチド、エキセンディン−４、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、ハムスターＩＮＧＡＰペプチド、リラグルチド、およびジペプチジルペプチダーゼ阻害剤から選択されるものである、方法。
【請求項１８】
請求項１２記載の方法において、さらに、膵内分泌細胞を標的とする自己免疫細胞を阻害し、阻止し、または破壊する薬剤を投与する工程を有するものである、方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記膵島細胞を標的とする自己免疫細胞を阻害し、阻止し、または破壊する薬剤は、以下の薬剤：ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）（テプリズマブ）を含む抗ＣＤ−３抗体；免疫応答を標的にし、特に、１型糖尿病におけるベータ細胞の死を引き起こすＴ−リンパ球を阻止するＣｈＡｇｌｙＣＤ３；細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４であるＣＬＴＡ−４Ｉｇ（アバタセプト）；単独またはタクロリムス（ＦＫ５０６）若しくはＩＬ−２（ラパミューン）のいずれかとの併用でのシロリムス（ラパマイシン）；単独またはプロロイキン（アルデスロイキン）との併用でのラパミューン；熱ショックタンパク質６０（Ｄｉａｐｅｐ２７７）；抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン；リソフィリン、ＩＢＣ−ＶＳＯ、ワクチン、インターフェロン−アルファ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞ワクチン；糖尿病抑制性樹状細胞ワクチン、ＧＳＫ１８９０７５、ジアゾキシド、およびベータ細胞の機能を保存する薬剤として利用されるアトルバスタチンを含むスタチン薬、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル；抗ＣＤ２０薬剤であるリツキシマブ；キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン；ポリクローナル抗Ｔ−リンパ球グロブリン（ＡＴＧ／サイモグロブリン）、顆粒球コロニー刺激因子、ニューラスタ（ペグフィルグラスチム）、ビタミンＤ、２５ヒドロキシと１，２５ヒドロキシビタミンＤとの両方の補給；膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンであるＩＢＣ−ＶＳＯワクチン；インターフェロン−アルファ；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞、またはランゲルハンス島内のベータ細胞に対する免疫攻撃を抑制するように設計された任意の薬剤を用いるワクチン、プロキマル（ヒト成体幹細胞）、抗炎症性アナキンラ、および抗炎症剤、デオキシスペルグアリン、炎症促進性サイトカインの産生を阻止し、且つＴ細胞およびＢ細胞を阻害する抗炎症剤、のうちの１若しくはそれ以上から選択されるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／９６９０１９号（２００７年８月３０日付で出願）、米国仮出願第６０／９７９５２６号（２００７年１０月１２日付で出願）、米国仮出願第６０／９９１９６４号（２００７年１２月３日付で出願）、および米国仮出願第６１／０３１４７９号（２００８年２月２６日付で出願）の利益を主張するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本明細書中で開示される実施形態は、溶解性、バイオアベイラビリティ、およびプロテアーゼ切断に対する血清中の抵抗性（ｉｎ−ｓｅｒｕｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を高めるように設計されることによって、治療薬としての有効性を改善する、膵島形成促進性ペプチド（ｐｒｏｉｓｌｅｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の処方物、誘導体、および改変、ならびにそれらを使用する方法を提供する。
【０００３】
１つの実施形態において、膵島形成促進性ペプチドおよびその誘導体は、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。
【０００４】
１つの実施形態において、ＨＩＰ（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏＩｓｌｅｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）およびその誘導体は、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている（ＨＩＰ３ブロック型（配列ＩＤ番号５）、ＨＩＰ１ブロック型（配列ＩＤ番号６）、およびＨＩＰ２ブロック型（配列ＩＤ番号７））。そのような改変は、配列を、通常遊離末端を認識するプロテアーゼによる血清中でのプロテアーゼ切断を受けにくくすることによって、ペプチドのＴｍａｘおよびバイオアベイラビリティを効果的に高めるとみられる。この様式で改変されたペプチドが、高い有効性を示すことによって、例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳｕｂＱ、または腹腔内経路によって投与されるときに投薬量の減少が必要となる。
【０００５】
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドおよびその誘導体は、該ペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加することによって改変される。
【０００６】
別の実施形態において、ＨＩＰおよびその誘導体は、ＨＩＰ（ＨＩＰ３Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号８）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号９）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１０））のＣ末端にシステイン残基を付加することによって改変される。その結果、溶液中で二量体を形成することができる化合物（ＨＩＰ３Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１１）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１２）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１３））がもたらされる。そのような改変は、単量体型でのＨＩＰまたはＨＩＰＣｙｓバリアントを認識するプロテアーゼを回避することによってＨＩＰＣｙｓバリアントの安定性が高められるとみられる。
【０００７】
別の実施形態において、システイン膵島形成促進性ペプチドバリアントは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基によってブロックされる。
【０００８】
別の実施形態において、ＨＩＰＣｙｓバリアントは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基によってブロックされる（ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１４）、ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１５）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１６））。そのような改変は、該配列を、通常遊離末端を認識するプロテアーゼによる血清中でのプロテアーゼ切断を受けにくくし、その結果、溶液中で二量体を形成することができる化合物（ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１７）、ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１８）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１９））がもたらされることにより、単量体型のＨＩＰまたはＨＩＰＣｙｓブロック型バリアントを認識するプロテアーゼを回避することによってＨＩＰＣｙｓブロック型バリアントの安定性が高められるとみられる。
【０００９】
別の実施形態において、前記システイン膵島形成促進性ペプチドバリアントは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物をＣ末端のシステイン残基に共有結合することによって改変される。
【００１０】
別の実施形態において、ＨＩＰＣｙｓバリアントは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物をＣ末端のシステイン残基に共有結合することによって改変される（ＨＩＰ３ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２０）、ＨＩＰ１ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２１）、およびＨＩＰ２ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２２））。そのような改変は、血清中のＨＩＰＣｙｓの安定性を改善し、その結果、インビボにおいて膵島新生を刺激するためおよび糖尿病を逆転させるための治療ストラテジーにおいてＨＩＰＣｙｓバリアントのバイオアベイラビリティおよび投薬有効性が高まるとみられる。
【００１１】
別の実施形態において、Ｃｙｓブロック型膵島形成促進性ペプチドバリアントは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物を共有結合することによって改変される。
【００１２】
別の実施形態において、ＨＩＰＣｙｓブロック型バリアントは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物（ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型ＰＥＧ（配列ＩＤ番号２３）、ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型ＰＥＧ（配列ＩＤ番号２４）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型ＰＥＧ（配列ＩＤ番号２５））を共有結合することによって改変される。そのような改変は、血清中でのＨＩＰＣｙｓブロック型バリアントの安定性を改善し、その結果、インビボにおいて膵島新生を刺激するためおよび糖尿病を逆転させるための治療ストラテジーにおいてＨＩＰＣｙｓブロック型バリアントのバイオアベイラビリティおよび投薬有効性が高まるとみられる。
【００１３】
さらなる実施形態は、単独または膵島細胞の再生を刺激するための他の治療薬との併用での最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰｓ（配列ＩＤ番号５〜２５）を含む）を投与するための方法を提供する。様々な実施形態において、本明細書中に開示される方法は、単独、インスリンとの併用、インスリンおよび別の薬剤との併用、ならびにインスリン以外の１若しくはそれ以上の薬剤との併用での、治療有効量の最適化された膵島形成促進性ペプチドの投与によって実施され得る。
【００１４】
他の実施形態は、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰを含む）の医薬処方物および単位用量形態を提供する。１つの実施形態において、提供される医薬処方物は、単独でまたは１若しくはそれ以上の他の活性な医薬成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ：ＡＰＩｓ）とともに最適化されたＨＩＰを含む。１つの実施形態において、ＡＰＩは、選択される処方物に応じて、最適化されたＨＩＰを種々の経路（皮下、筋肉内、静脈内、および経口的さえも含む）によって投与できるようにする、可溶性のリポソーム調製物での薬剤である。１つの実施形態において、該処方物は、一般的な全身投与用のものであるが、他の実施形態では、該処方物は、被験体内の特定の位置、受容体、細胞、組織、器官、または器官系への標的化投与のための標的化剤を含む。
【００１５】
他の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰを含む）に加えて、膵島細胞の再生を刺激するための１若しくはそれ以上の薬剤を投与する工程を有し得る。この実施形態の１つの態様において、前記薬剤は、ＨＩＰまたは最適化されたＨＩＰ以外のＨＩＰ関連ペプチド、アミリン／プラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）（ＳＹＭＬＩＮ（商標））、エキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４（ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（商標））、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、ハムスターＩＮＧＡＰペプチド、および関連ペプチド、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（ＮＮ２２１１）、ならびにＧＬＰ−１の分解を阻止するジペプチジルペプチダーゼ阻害剤から選択される。
【００１６】
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、（１）血糖コントロールを強化する工程；（２）２５−ヒドロキシビタミンレベルを４０ｎｇ／ｍｌ超に維持するために経口ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）またはビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）を投与する工程；（３）新しい膵島細胞の形成を保護するために１若しくはそれ以上の免疫療法を施す工程（免疫抑制剤の投与を含む）；（４）最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰを含む）をインスリンと併用して投与するが、投与されるインスリンを時間とともに減少させる工程；および（５）最適化されたＨＩＰを投与する工程に加えて、選択される免疫療法に応じて３〜２４ヶ月を基礎として、好ましくは膵島を保護するための治療を繰り返し施す工程のうちの１若しくはそれ以上を有し得る。
【００１７】
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、以下の工程：（１）血糖コントロールを強化する工程；（２）２５−ヒドロキシビタミンレベルを４０ｎｇ／ｍｌ超に維持するために経口ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）を投与する工程；（３）最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰを含む）に加えて、膵島の再生を刺激するための薬剤（これに限定されるものではないが、ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰ以外のＨＩＰアナログを含む）を投与する工程；（４）アミリン／プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（商標））、エキセンディン−４（ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（商標）；ＢＹＥＴＴＡ（商標））、ガストリン、上皮成長因子および上皮成長因子アナログＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、ＩＮＧＡＰ、リラグルチド（ＮＮ２２１１）、ならびにＧＬＰ−１の分解を阻止するジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤から成る群から選択される薬剤を同時投与する工程；および（５）別の糖尿病治療の施与を減少するかまたは漸減させる工程のうちの１若しくはそれ以上を有し得る。
【００１８】
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。該方法は、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物を投与する工程に加えて、膵島を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する１若しくはそれ以上の薬剤を投与する工程を有し得る。そのような治療は、上記で「免疫療法」と呼ばれる。この実施形態の様々な態様において、膵島を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤は、個別に投与されるか、または互いに併用されて投与される以下のものから成る群から選択される。ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）（テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ））を含む抗ＣＤ−３抗体；免疫応答を標的にし、特に、１型糖尿病におけるベータ細胞の死を引き起こすＴ−リンパ球を阻止するＣｈＡｇｌｙＣＤ３；細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４であるＣＬＴＡ−４Ｉｇ（アバタセプト）；単独またはタクロリムス（ＦＫ５０６）若しくはＩＬ−２（ラパミューン（ｒａｐａｍｕｎｅ））のいずれかとの併用でのシロリムス（ラパマイシン）；単独またはプロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（アルデスロイキン）との併用でのラパミューン；熱ショックタンパク質６０（Ｄｉａｐｅｐ２７７）；抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン；糖尿病抑制性樹状細胞ワクチン、ＧＳＫ１８９０７５、ジアゾキシド、およびベータ細胞の機能を保存する薬剤として利用されるアトルバスタチンを含むスタチン薬、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル；抗ＣＤ２０剤であるリツキシマブ；キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；ポリクローナル抗Ｔ−リンパ球グロブリン（ＡＴＧ／サイモグロブリン（Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））、顆粒球コロニー刺激因子、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（ペグフィルグラスチム（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ））、ビタミンＤ、２５ヒドロキシと１，２５ヒドロキシビタミンＤの両方の補給；膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンであるＩＢＣ−ＶＳＯワクチン；インターフェロン−アルファ；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞またはランゲルハンス島内のベータ細胞に対する免疫攻撃を抑制するように設計された任意の薬剤を用いるワクチン、プロキマル（Ｐｒｏｃｈｙｍａｌ）（ヒト成体幹細胞）、抗炎症性アナキンラ、および抗炎症剤、デオキシスペルグアリン、炎症促進性サイトカインの産生を阻止し、Ｔ細胞およびＢ細胞を阻害する抗炎症剤。これらの薬剤または類似の薬剤は、直接またはインスリン産生細胞の破壊を停止する免疫療法の使用を介して制御性Ｔ細胞を利用する併用療法において使用され得る。
【００１９】
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法（ここで、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物の投与の結果として、損なわれた膵機能に関連する病状の少なくとも１つの症状が、処置されるか、または低減される）が提供される。この実施形態の１つの態様において、該症状は、低レベルのインスリンまたはインスリン活性、インスリン抵抗性、高血糖症、６．０％超のヘモグロビンＡ１Ｃレベル、頻尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少または体重増加、過体重、強い疲労、被刺激性、ぼやけた視野、性器のかゆみ、奇妙な痛みおよび疼痛、口渇、乾燥皮膚または痒い皮膚、不能、腟酵母菌感染、切り傷およびすり傷の治癒不良、過剰な感染または普通でない感染、血糖コントロールの喪失または悪化、血中グルコースの周期的変動、血中グルカゴンの周期的変動、および血中トリグリセリドの周期的変動、そして最終的には微小血管および大血管の合併症をもたらす高血糖症（失明をもたらす視覚的症状、透析および腎臓移植が必要となる腎不全をもたらし得る加速型腎臓機能障害、ならびに足潰瘍および足切断術に至るニューロパシーを含む）から選択される。さらに、最近の研究から、血糖コントロールが改善した１型糖尿病患者において微小血管と大血管／心臓血管の両方のリスクの低下が証明された。
【００２０】
別の実施形態において、損なわれた膵機能に関連する病状の処置が必要な被験体においてそのような処置を行う方法が提供される。損なわれた膵機能に関連する病状は、１型糖尿病、初発１型糖尿病、２型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群／代謝異常症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害、無排卵性周期、および多嚢胞性卵巣症候群のうちのいずれか１つである。
【００２１】
本開示の実施形態は、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物に選択的に結合する抗体も提供する。１つの実施形態において、該抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、該抗体は、ポリクローナル抗体である。そのような抗体は、本明細書中に提供される診断方法において使用され得、該方法は、哺乳動物の血清中または組織内の最適化されたＨＩＰレベルを検出する工程を有する。１つの実施形態において、該診断方法は、そのような治療を受けている患者において治療的に有効なレベルが達成されていることを確実にするために、最適化されたＨＩＰによる処置をモニターするために用いられる。
【００２２】
本開示の実施形態は、１型若しくは２型糖尿病または異常なインスリンレベル、グルコース代謝の乱れ、若しくはインスリン抵抗性が存在する他の状態を有する患者を処置するためのキットも提供し、該キットは、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物（最適化されたＨＩＰを含む）ならびに任意選択で、ＧＬＰ−１受容体を刺激するため若しくはＧＬＰ−１レベルを上昇させるため、ベータ細胞の再生、強い満腹、食物摂取の減少、および体重減少を促進するための少なくとも１つの薬剤、ならびにそれを使用するための指示書を同じ包装内または別個の包装内に含む。さらなる実施形態は、サンプル中の最適化されたＨＩＰのレベルを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物を測定するためのキットを提供し、該キットは、最適化されたＨＩＰ特異的抗体を含む最適化された膵島形成促進性ペプチド抗体、および任意選択で、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物、および任意選択で、標識手段を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
この特許の資料は、カラー仕上げの少なくとも１つの写真または図面を含む。カラーの図面または写真を含むこの特許のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁（Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）によって提供されるだろう。
【００２４】
本発明の性質および利点をさらに理解するために、添付の図面に関連させて、以下の詳細な説明を参照するべきである。
【図１】図１は、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、およびＨＩＰ３とともに、ヒト膵管組織を含む培養物をインキュベーションした後のインスリンレベルを表しているグラフである。
【図２】図２は、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、およびＨＩＰ３で処置されたマウスにおけるインスリン必要量を表しているグラフである。
【図３】図３は、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、およびＨＩＰ３で処置されたマウスにおける、ベースラインからのグルコースの平均の減少を表しているグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＩＰ２およびＨＩＰ３で処置されたマウスにおける膵島の数を表しているグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、プラセボ処置マウスおよびＨＩＰ処置マウスにおけるインスリン免疫染色の代表的な像を提供し、インスリン染色された膵島は、これらの構造を自家蛍光の血液細胞と区別するために黄色で輪郭が描かれている。スケールバー＝すべての像において５０μｍ。
【図５】図５は、ＨＩＰで処置されたマウス膵臓組織におけるインスリンに対する免疫蛍光染色である。
【図６】図６は、ラットにおいて筋肉内に送達されたＨＩＰの半減期を表しているグラフである。
【図７】図７は、ラットにおいて皮下に送達されたＨＩＰの半減期を表しているグラフである。
【図８】図８は、血漿中のＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂのインビトロでの経時的な安定性を表しているグラフである。
【図９】図９Ａは、様々なＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰとのインキュベーションに応答した、非還元条件下および還元条件下でのＰＡＮＣ−１細胞からのヒトインスリン発現を示しているウエスタンブロット解析である。図９Ｂは、様々なＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰとのインキュベーションに応答した、非還元条件下および還元条件下でのポンソー染色である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、４日間にわたってＨＩＰ２および最適化されたＨＩＰペプチドで処理されたＰＡＮＣ−１細胞を示しており、２００倍の倍率で第７日目に撮影された像である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、７日間にわたるＰＡＮＣ−１細胞の形態の変化の経過を示しており（コントロール、ＨＩＰ２、およびＨＩＰ２Ｂ）、２００倍の倍率で第１、２、３、５、および７日目に撮影された像である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、コントロールおよび最適化されたＨＩＰ（ＨＩＰ２二量体およびＨＩＰ２ＰＥＧ）で処理されたＰＡＮＣ−１細胞の形態学的な変化の経過を示している。
【図１１】図１１は、ＨＩＰ２Ｂ投与後の、ヒト膵臓細胞における核およびインスリンを示すＣＫ１９およびＤＡＰ１に対する染色である。
【図１２】図１２は、プラセボおよびリソフィリン（ＬＳＦ）、ＨＩＰ２およびＬＳＦ、ならびにＨＩＰ２ＢおよびＬＳＦで処置された後の３匹のＮＯＤマウスのグルコースレベルを表しているグラフである。
【図１３】図１３は、４８時間にわたって１５０μＭのＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰペプチドで処理された後のＰＡＮＣ−１細胞のＣｙ３二重抗体免疫組織化学的染色であり、ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰによる刺激において、ＰＡＮＣ−１細胞の細胞膜から細胞質へのＨＩＰ受容体のトランスロケーションを示している。
【図１４】図１４は、ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰ２Ｂペプチドを含むＳＦＭおよびＴＳＦＭ中の露光調整されたＰＡＮＣ−１細胞を示している。
【図１５】図１５は、免疫蛍光解析を用いた、ＰＡＮＣ−１細胞に対する最適化されたＨＩＰ２ペプチドの影響の反復評価を示しており、ＨＩＰ２Ｂが、ＨＩＰ受容体（ＥＸＴＬ）と相互作用し、ＨＩＰによる刺激においてＨＩＰ受容体が包み込まれ、細胞膜から細胞質内、そして核にもたらされることが示唆される。
【図１６】図１６は、最適化されたＨＩＰ２Ｂが、ＰＡＮＣ−１細胞における細胞膜から核へのＨＩＰ受容体（ＥＸＴＬ３）のトランスロケーション時間を増加させるというウエスタンブロットを示している。
【図１７】図１７は、ＨＩＰ２、ＨＩＰ２Ｂ、およびプラセボを投与した後のＳＴＺ−糖尿病マウスモデルにおける毎日の平均グルコースレベルを表しているグラフである。
【図１８】図１８は、ＨＩＰ２Ｂ処置群（緑色）およびコントロール群（紫色）およびプラセボ群のマウスにおける毎日のグルコースレベルを表しているグラフである。
【図１９】図１９は、介入の開始時および終了時における、ＨＩＰ２Ｂ（黄色）、ＨＩＰ２（緑色）、およびコントロール（青色）処置群のマウスにおけるグルコースレベルを表しているグラフである。
【図２０】図２０は、空腹時グルコースレベルを非糖尿病性の範囲およびＳＴＺ処置前のベースラインのグルコースレベルの範囲未満のレベルに回復させる最適化されたＨＩＰ２Ｂの影響を示している。
【図２１】図２１は、研究の終了時における処置群の耐糖能試験の結果を示しており、最適化されたＨＩＰ２Ｂ処置群において低いグルコースレベルが見られる。
【図２２】図２２は、最大の有効性をもたらす最小の可能投薬量を決定するために、マウスの糖尿病モデルにおいて様々な投薬量で送達されたときの、グルコースコントロールに対する最適化されたＨＩＰ２Ｂの作用を比較する、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスにおける最適化されたＨＩＰ２Ｂの用量反応解析研究を示している。
【図２３】図２３は、糖尿病の減弱に対する様々な濃度のＨＩＰ２Ｂの影響を示している。
【図２４】図２４は、４ｍｇ／ｋｇでＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに皮下投与および静脈内投与した後のＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰの薬物動態学的解析を示している。
【図２５】図２５は、皮下に送達された最適化されたＨＩＰ２Ｂの薬物動態学的解析を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本組成物および本方法を説明する前に、説明される特定のプロセス、組成物、または方法が変化し得るので、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。その説明において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態だけを説明する目的であること、および添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語のすべてが、当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイス、および材料が、ここで説明される。本明細書中で言及されるすべての刊行物は、その全体がこの参照により組み込まれる。本発明が先願発明によってそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるものは本明細書中に無い。
【００２６】
インスリンは、１９２２年以来、１型糖尿病およびインスリンの有効性または産生の不足または低下に関係する他の状態の処置のための、唯一の利用可能な治療ではないにしても、主要な治療である。しかしながら、インスリンが、欠損している膵機能および異常な膵機能の一部であるので、インスリンを受けている糖尿病患者は、正常なグルコース代謝を有しない。
【００２７】
現在までに、１型または２型糖尿病のいずれかの基礎をなす疾患メカニズムを処置するために首尾よく使用される単独療法または併用療法は存在しない。膵臓内のインスリン産生細胞の再生を刺激する好結果の処置の開発は、糖尿病を有する患者にとって重大な処置法のブレークスルーとなる。いくつかの文献が、ベータ細胞そのものまたは膵島全体を指すために、用語「膵島細胞」をまぎらわしく使用している。しかしながら、一部の処置選択肢が、ベータ細胞の数を増加させようとしているのに対し、内因的に膵島全体を置き換える利用可能な処置は、膵島移植以外にないので、ベータ細胞と膵島とを区別することは重要である。
【００２８】
数十年に及ぶ研究および１９７４年の膵島移植の出現および最近の膵島移植のＥｄｍｏｎｔｏｎプロトコルに起因する成功が主張されているにもかかわらず、これらのアプローチは、米国において大いに成功していない。例えば、移植の４年後において、膵島移植を受けた患者の１０％未満だけが、インスリン非依存性のままである。さらに、重篤な副作用の割合が１８％である。１型糖尿病の発症時において、患者は、すでに膵島の大部分を失っており、その膵島の数は、着実に減少し続けることが立証されている。しかしながら、最近の研究から、２型糖尿病の診断時には、患者は、少なくとも５０％の膵島の質量および数の喪失を示すことが見出された。膵島の数および質量は、自己免疫性攻撃からではないが、ベータ細胞が事実上「燃え尽きる」ようになるので、１型患者と同様に、減少し続ける。この減少は、１型患者ではより迅速に生じるが、２型患者でもなお１年あたり１０〜２０％減少する。
【００２９】
正常に機能している膵臓では、少数の膵島が、毎日自然に死に、制御下でグルコースレベルを維持するために必要であるので、置き換えられている。膵島新生として知られるこの再生プロセスは、平均して１ヶ月あたり約２％の割合で膵島を置き換える。非糖尿病患者では、既存の膵島内のベータ細胞の質量は、その個体のインスリンの必要性に応じて、拡大または収縮し得る。このプロセスは、「ベータ細胞増殖」と呼ばれ、１型糖尿病を有する患者では生じず、２型患者では限定的である。
【００３０】
膵島新生に関する研究は、新しいものではない。１９２０年に、閉塞性膵石（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｔｏｎｅ）では、ほとんどの膵臓の萎縮がもたらされたが、膵島が増加したことが報告された。そして、膵管を結紮すること（縛ること）によって、糖尿病の処置に有用であり得る物質が同定され得るという仮説が立てられた。新しい膵島を形成し得る物質の産生を期待して、外科医は、糖尿病小児の膵管を結紮した。これらの手順の正の作用は、長続きしなかったが、ヒトにおける膵島修復に対する可能性が証明された。
【００３１】
膵炎に対するハムスターモデルの作製を意図した膵管結紮研究によって、多くの新しい膵島が形成された。この研究によって、膵島新生関連（Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ペプチド、すなわちＩＮＧＡＰと呼ばれるハムスターペプチドが単離された。ＩＮＧＡＰの臨床開発において、新しいヒト膵島が、１型糖尿病を発症した数十年後であっても成人の膵臓全体に存在する幹細胞様の膵島前駆細胞から分化され得ることがさらに証明された。
【００３２】
管の結紮を用いて新しい膵島を産生するという概念とは別に、妊娠中の膵島の潜在的な再生に関する研究が行われた。膵島は、胚形成後期に形成されることが報告され、膵島集団は、周囲の管組織からの変態のプロセスを通じて出生後に成長し続けることが述べられた。
【００３３】
１型または後期２型糖尿病を有する患者が自身の疾患を管理する主要な方法は、皮下注射を介するかまたは皮下ポンプ注入を使用することによるインスリンの投与によるものである。インスリン治療は、明らかな生活様式の不都合の上に、身体の正常な制御機構と調和せず、ゆえにグルコースの周期的変動を完全に管理しない。添付の図表によって示されるように、最も良好に制御されている１型糖尿病患者でさえも、正常なグルコース代謝と同様の遠隔的なものを有しない。これは、インスリン分泌が、失っている膵機能の一部であることが理由である。
【００３４】
研究者らは、インスリンの内因性の産生が薬物処置によって刺激され得るか否かを評価してきた。例えば、過去数十年にわたって、グルコース代謝に関与するペプチドまたはそのようなペプチドのアナログを糖尿病患者に投与するいくつかの治療が研究されてきた。これらの治療は、グルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｅ−１：ＧＬＰ−１）のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有するペプチドの投与を含み、そのようなペプチドには：ＧＬＰ−１受容体アナログ、エキセンディン−４、アメリカドクトカゲ由来のエクセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）／ＢＹＥＴＴＡ（商標）、Ｊａｎｕｖｉａ（商標）、胃抑制性ペプチド／グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｐｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：ＧＩＰ）、ＧＬＰ−１に相同な化合物（例えば、リラグルチド（ＮＮ２２１１））、ＧＬＰ−１の分解を阻害するジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、ガストリン、上皮成長因子、および上皮成長因子アナログ、ならびにハムスター由来の膵島新生関連ペプチド（Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＩＮＧＡＰ）が含まれる。
【００３５】
これらの処置は、糖尿病の基礎をなすメカニズムを逆転させる際に有効であると証明されていない。新しい膵島の生成は、インスリンを産生するベータ細胞を形成するだけでなく、グルコース代謝に関与する他の細胞も形成する。その結果として、新しい膵島が十分に生成される場合、患者は、究極的には、血糖コントロールを回復することができる。ゆえに、膵島新生は、糖尿病を処置するだけでなく、糖尿病を実際に逆転させる可能性を示す。
【００３６】
有効な任意の膵島細胞新生剤について、膵臓は、新しい膵島細胞を生成する能力に関して「柔軟性」がなければならない。膵島の死またはアポトーシスに応答してその生涯を通じて新しい膵島が生成されることに関する膵臓の柔軟性の証明は、インスリンを産生する膵島構造物の数が、出生時に固定され、生涯を通じて維持されるという長きにわたって保持されていた概念に取って代わり、ベータ細胞が既存の膵島内で増殖する柔軟性および能力が十分に立証された。現在は、膵島新生が、膵臓の内分泌と外分泌の両方の部分に見られる前駆細胞の分化によって、前から存在する膵臓細胞から生じることが受け入れられている。データは、１型糖尿病の発症の数十年後であっても、膵島が再生され得ることを証明している。
【００３７】
例えば、１型糖尿病を有する患者は、妊娠中に正常レベルのＣ−ペプチドを産生することができる。いくつかのチームが、妊娠中のすべての１型患者の３分の１もの患者において、妊娠の第１三半期中にＣ−ペプチドレベルが奇妙にも正常範囲に上昇したことを見出した。このＣ−ペプチドの増加は、インスリン必要量の著しい減少を伴い、一部の患者は、妊娠の第１三半期中、一過性にインスリンを中断することができる。妊娠前にはＣ−ペプチドは測定不可能であったにもかかわらず、患者において１０週間の妊娠期間内に起きる妊娠中のＣ−ペプチドの増加は、機能する膵島構造物の回復を暗示する。妊娠中に起きる膵島新生は、内因性のステロイド産生と、胎児に対する免疫攻撃を防ぐ免疫系のダウンレギュレーションとが同時に生じることに起因するという仮説が立てられ、これもまた、膵島に対するリンパ球攻撃の抑制におそらく関与する。免疫抑制に加えて、妊娠中の母体のグルコース設定値の低下を補う妊娠中の母体の膵島成長促進因子がアップレギュレーションされることも推測される。動物モデルもまた、膵島新生が妊娠中のベータ細胞の拡大の進展に先行することを証明し、ヒト膵臓前駆細胞が膵島に分化することを証明した。同様に、腎臓移植のために長期間にわたって免疫抑制されていた患者において、インスリンを産生する膵島の再生が観察された。
【００３８】
過去１０年にわたって、膵臓のベータ細胞の破壊を停止し得るいくつかの免疫調節因子（ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）の影響を評価する臨床試験が行われてきた。この目的のために、免疫応答を標的にし、特に、１型糖尿病においてベータ細胞の死を引き起こすＴ−リンパ球を阻止する抗ＣＤ−３抗体（例えば、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）およびＣｈＡｇｌｙＣＤ３）が利用され、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、熱ショックタンパク質６０（ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標））、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ６５：ＧＡＤ６５）ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２０剤、ポリクローナル抗Ｔ−リンパ球グロブリン（Ａｎｔｉ−Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＡＴＧ）、リソフィリン、リツキシマブ、キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、ビタミンＤ、ＩＢＣ−ＶＳＯワクチン（膵臓ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである）、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞を用いるインターフェロン−αワクチン接種の投与を含む処置も利用された。これらの治療的なアプローチは、直接またはインスリン産生細胞の破壊を停止する免疫療法の使用を介して制御性Ｔ細胞を利用することを意図される。これらの治験の目的は、そのような薬剤が、膵臓の膵島のベータ細胞に対するさらなる免疫攻撃を防ぐことによって膵島の機能を保存する能力を判定することである。
【００３９】
さらに、最近の研究から、ビタミンＤが、１型糖尿病の予防において重要な免疫調節の役割を果たし得ることが見出された。米国の集団の最大５４．７％が、緯度に関係なく、低い２５ヒドロキシビタミンＤレベルを有する。ビタミンＤ欠乏は、１型糖尿病のリスクの上昇に関連し、１型診断の開始時に見られると証明されているだけでなく、１型と２型の両方の糖尿病患者に一般に見られる。４０ｎｇ／ｍｌ超にレベルを維持することが、正常な免疫機能を持続するために推奨されている。１０，０００ＩＵ／日までの用量では有害作用は見られていない。
【００４０】
以下の定義は、読み手を助けるために提供される。別段定義されない限り、技術の用語、表記および他の科学用語若しくは医学用語または本明細書中で使用される用語のすべてが、化学分野および医学分野の当業者が通常理解する意味を有すると意図される。いくつかの場合において、通常理解されている意味を有する用語が、明確にするためおよび／または迅速な参照のために本明細書中で定義され、本明細書中のそのような定義の包含は、当該分野で一般に理解されている用語の定義に対してかなりの相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。
【００４１】
本明細書中および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の指示物を含むことにも注意されなければならない。したがって、例えば、「線維芽細胞」（ａ"ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ"）という言及は、１若しくはそれ以上の線維芽細胞および当業者に公知のその等価物などの言及である。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、使用されている数の絶対値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。ゆえに、約５０％とは、４５％〜５５％の範囲を意味する。本明細書中で使用されるとき、「膵島形成促進性ペプチド」とは、膵島細胞新生を刺激するタンパク質またはそのようなタンパク質から得られるペプチドのことを指し、これに限定されるものではないが、ヒトＲＥＧ３Ａ（配列ＩＤ番号１）、ヒトＲＥＧ３Ｇ（配列ＩＤ番号２８）、ヒトＲＥＧ１Ａ、ヒトＲＥＧ１Ｂ、ヒトＲＥＧ４、ハムスターＩＮＧＡＰ（配列ＩＤ番号２７）、ハムスターＲＥＧ２、ハムスターＲＥＧ３Ｇ、ラットＲＥＧ１、ラットＰＡＰ／ＲＥＧ３Ｂ、ラットＰＡＰ３、ラットＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ１、マウスＲＥＧ２、マウスＲＥＧ３Ａ、マウスＲＥＧ３Ｂ、マウスＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ３Ｓ、マウスＲＥＧ４、ウシＰＴＰ、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、ならびにそのようなタンパク質またはそのホモログから得られるペプチドフラグメントを含む。そのような膵島形成促進性ペプチドのタンパク質配列は、公的に入手可能である。膵島形成促進性ペプチドは、ＲＥＧ３Ａ、ＩＮＧＡＰ、またはＨＩＰ２の活性な１４アミノ酸配列（または各ホモログに対する対応配列）を含むホモログタンパク質のフラグメントであるペプチドをさらに含み（下記の表１を参照のこと）、１５０アミノ酸未満、１２５アミノ酸未満、１００アミノ酸未満、７５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、または２５アミノ酸未満である。そのようなペプチド（活性な１４アミノ酸配列を提供する）の例は、これに限定されるものではないが、以下のものを含む。
【００４３】
【表１−１】
2014028825.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
2014028825.tif 000003
【００４５】
そのようなペプチドフラグメントは、これに限定されるものではないが、以下で同定される、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、ＨＩＰ３、ＩＮＧＡＰペプチド（配列ＩＤ番号２６）、およびそれらのホモログを含む。ラット遺伝子と類似のヒト遺伝子がヒトにおいて見られ（それは、Ｒｅｇ遺伝子と呼ばれる）、そしてＨＩＰが見出された遺伝子がヒトに存在し、ヒト膵島形成促進性ペプチドの種間および他の哺乳動物種間には高い相同性が存在する。以下の種相同性の図表は、ＨＩＰ関連配列が、進化を通じて精巧に保存されていることを示している。これらの配列の各々は、ヒトにおいていくらかの有効性を有する可能性があるが、厳密には、ヒトの活性なＨＩＰ配列と一致するものはない。
【００４６】
【表１−３】
2014028825.tif 000004
【００４７】
上の表は、他の種と比較されている１４アミノ酸ＨＩＰ２配列を含む１６アミノ酸長のヒトペプチドを比較している。
【００４８】
【表１−４】
2014028825.tif 000005
【００４９】
【表１−５】
2014028825.tif 000006
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、「最適化された膵島形成促進性ペプチド」とは、膵島形成促進性ペプチドのバリエーションのことを指し、これに限定されるものではないが、ヒトＲＥＧ３Ａ、ヒトＲＥＧ３Ｇ、ヒトＲＥＧ１Ａ、ヒトＲＥＧ１Ｂ、ヒトＲＥＧ４、ハムスターＩＮＧＡＰ、ハムスターＲＥＧ２、ハムスターＲＥＧ３Ｇ、ラットＲＥＧ１、ラットＰＡＰ／ＲＥＧ３Ｂ、ラットＰＡＰ３、ラットＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ１、マウスＲＥＧ２、マウスＲＥＧ３Ａ、マウスＲＥＧ３Ｂ、マウスＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ３Ｓ、マウスＲＥＧ４、ウシＰＴＰ、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、ならびにそのようなタンパク質またはそのホモログから得られるペプチドフラグメント、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、および／若しくはＨＩＰ３、またはそのようなペプチドのホモログ（配列ＩＤ番号３１〜９０）を含み、該ペプチドは、様々な実施形態において記載されるように、そのようなペプチドの安定性、溶解性、またはバイオアベイラビリティを高めるように改変されている。本開示の目的の場合、安定性とは、最適化されていない膵島形成促進性ペプチド、ＲＥＧ３Ａ、ＲＥＧ３Ｇ、ＩＮＧＡＰ、ＲＥＧ３Ｇペプチド、ＩＮＧＡＰペプチド、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、および／若しくはＨＩＰ３、またはそのようなペプチドのホモログを標的にし、分解する血清中のプロテアーゼによる分解に対するペプチドの抵抗性のことを指す。また、本開示の目的の場合、バイオアベイラビリティとは、該ペプチドがプロテアーゼによる分解および最適化されていない膵島形成促進性ペプチド、ヒトＲＥＧ３Ａ、ヒトＲＥＧ３Ｇ、ヒトＲＥＧ１Ａ、ヒトＲＥＧ１Ｂ、ヒトＲＥＧ４、ハムスターＩＮＧＡＰ、ハムスターＲＥＧ２、ハムスターＲＥＧ３Ｇ、ラットＲＥＧ１、ラットＰＡＰ／ＲＥＧ３Ｂ、ラットＰＡＰ３、ラットＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ１、マウスＲＥＧ２、マウスＲＥＧ３Ａ、マウスＲＥＧ３Ｂ、マウスＲＥＧ３Ｇ、マウスＲＥＧ３Ｓ、マウスＲＥＧ４、ウシＰＴＰ、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヒツジ、ならびにそのようなタンパク質のアナログおよびホモログ、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、および／若しくはＨＩＰ３、またはそのようなペプチドのホモログを分解した他の全身性経路による分解を回避する能力に基づいて標的細胞、経路および／または全身のメカニズムによるインビボでの治療的な使用に利用可能なペプチドの量のことを指す。好ましくは、最適化された膵島形成促進性ペプチドとは、ＲＥＧ３Ｇペプチド、ＩＮＧＡＰペプチド、ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／若しくはＨＩＰ２、またはＣ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基の付加によってブロックされているホモログ、ペグ化されているホモログ、ならびにそれらの組み合わせのホモログのことを指す。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、「最適化されたＨＩＰ」とは、ＨＩＰのバリエーションであるＨＩＰ１および／またはＨＩＰ２のことを指し、該ペプチドは、本明細書中の実施形態に記載されているようにＨＩＰ、ＨＩＰ１またはＨＩＰ２の安定性、溶解性、またはバイオアベイラビリティを高めるように改変されている。本開示の目的の場合、安定性とは、最適化されていないＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／またはＨＩＰ２を標的にし、分解する血清中のプロテアーゼによる分解に対するペプチドの抵抗性のことを指す。また、本開示の目的の場合、バイオアベイラビリティとは、該ペプチドがプロテアーゼによる分解および最適化されていないＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／またはＨＩＰ２を分解した他の全身性経路による分解を回避する能力に基づいて標的細胞、経路および／または全身のメカニズムによるインビボでの治療的な使用に利用可能なペプチドの量のことを指す。好ましくは、最適化されたＨＩＰとは、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基の付加によってブロックされ、ペグ化され、そしてそれらの組み合わせの、ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／またはＨＩＰ２のことを指す。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、状態または患者を「処置する」とは、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るための工程を行うことを指す。本開示の目的の場合、有益な臨床結果または所望の臨床結果は、これに限定されるものではないが、糖尿病の１若しくはそれ以上の症状の軽減または回復、疾患の程度の低下、疾患進行の遅延または低速化、疾患状態の回復、寛解、または安定化、および以下に記載される他の有益な結果を含む。糖尿病の症状は、低レベルまたは不適当なレベルのインスリンまたはインスリン活性、頻尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少、強い疲労、被刺激性、ぼやけた視野、性器のかゆみ、奇妙な痛みおよび疼痛、口渇、乾燥皮膚または痒い皮膚、不能、腟酵母菌感染、切り傷およびすり傷の治癒不良、過剰な感染または普通でない感染、高血糖症、血糖コントロールの喪失、食後血中グルコースの周期的変動、血中グルカゴンの周期的変動、血中トリグリセリドの周期的変動を含む。糖尿病は、当業者に周知の方法によって診断され得る。例えば、通常、糖尿病患者は、１２６ｍｇ／ｄＬよりも高いグルコースの血漿血糖結果を有する。本明細書中に開示される組成物および方法によっても処置され得る前糖尿病は、通常、１００と１２５ｍｇ／ｄＬと間のグルコースの血糖値を有する患者において診断される。他の症状もまた、糖尿病、関連する疾患および状態、ならびに膵機能の低下によって影響を受ける疾患および状態を診断するために使用され得る。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、症状の「減少」（およびこの句の文法上の等価物）は、症状の重症度若しくは頻度の低下、またはその症状の消失を意味する。
【００５４】
用語「阻害する」は、前記症状の発症を予防するため、前記症状を緩和するため、または前記疾患、状態若しくは障害を消失するための本開示の化合物の投与を含む。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、「損なわれた膵機能に関連する病状」は、その病状が、ホルモンおよび／またはサイトカインを産生および／または分泌する被験体の膵臓に対する被験体における能力の低下に関連する病状のことである。好ましくは、このホルモンまたはサイトカインは、インスリンである。損なわれた膵機能に関連する病状は、１型糖尿病、初発１型糖尿病、２型糖尿病、成人潜伏性自己免疫性糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、インスリン抵抗性症候群、代謝症候群、過体重、肥満症、高脂血症、高トリグリセリド血症、摂食障害および多嚢胞性卵巣症候群を含む。
【００５６】
本明細書中で使用されるとき、被験体に薬物若しくは治療薬を「投与する」または被験体への薬物若しくは治療薬の「投与」（およびこの句の文法上の等価物）は、直接投与（自己投与、標的組織中若しくは標的組織上への直接的なもの、または被験体に治療薬を投与することによって、その治療薬が標的にしている組織を積極的に攻撃することを含む）と間接投与（薬物を処方する行為を含む）の両方を含む。例えば、本明細書中で使用されるとき、薬物を自己投与するように患者に指示する医師および／または薬物についての処方を患者に提供する医師は、その患者に薬物を投与している。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「被験体」または「患者」は、哺乳動物、典型的にはヒトであるが、任意選択で、獣医学上重要な哺乳動物であり、これに限定されるものではないが、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびネコを含む。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、疾患の「徴候」とは、その疾患を有する被験体に特徴的な、症状、兆候、解剖学的状態（例えば、膵島細胞の欠如）、生理学的状態（例えば、グルコースレベル）、または報告（例えば、トリグリセリドレベル）のことを指す。
【００５９】
本明細書中で使用されるとき、薬物または薬剤の「治療有効量」は、疾患または状態を有する被験体に投与されるときの薬物または薬剤の量であり、意図される治療効果、例えば、その被験体におけるその疾患または状態の１若しくはそれ以上の徴候の軽減、回復、寛解、または消失を有する。完全な治療効果は、必ずしも１用量の投与によって生じず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、治療有効量は、１若しくはそれ以上の投与において投与され得る。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、薬物の「予防有効量」は、被験体に投与されるときに、意図される予防効果、例えば、疾患若しくは症状の発症（または再発）の予防若しくは遅延、または疾患若しくは症状の発症（または再発）の可能性の低下を有する薬物の量のことである。完全な予防効果は、必ずしも１用量の投与によって生じず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、予防有効量は、１若しくはそれ以上の投与において投与され得る。
【００６１】
「薬学的に許容可能な」とは、キャリア、希釈剤、または賦形剤が、その処方物の他の成分と適合性でなければならず、かつそのレシピエントに対して有害でないものでなければならないことを意味する。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、「ＴＩＤ」、「ＱＤ」、および「ＱＨＳ」は、それぞれ「１日３回」、「１日１回」、および「就寝前に１回」という通常の意味を有する。
【００６３】
薬剤の「併用」投与は、平行投与（ある期間にわたって患者に両方の薬剤を投与すること、例えば、１ヶ月間にわたって１日おきのモノクローナル抗体およびペプチドホルモン（例えば、インクレチンホルモンまたはアナログ）の投与）、同時投与（薬剤を、互いにほぼ同時に、例えば、およそ数分から数時間以内に投与すること）、および併用処方物（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（薬剤を経口、皮下または非経口投与に適した単回投与形態に混合するか、または調合すること）を含む。
【００６４】
「ＤＰＰ−４阻害剤」は、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤である。
【００６５】
「ハムスターＩＮＧＡＰ」は、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号２６）を有する非ヒト膵島新生関連ペプチドである。このペプチドは、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号２７）を有するハムスターＩＮＧＡＰタンパク質のフラグメントである。
【００６６】
「ＧＩＰ」は、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチドとしても知られる胃抑制性ペプチドである。
【００６７】
「ＧＬＰ−１」は、グルカゴン様ペプチド１である。
【００６８】
「ＨＩＰ３」（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列ＩＤ番号２））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。ＨＩＰ３は、約１５６４．６の分子量を有する。
【００６９】
「ＨＩＰ１」（Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号３））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
【００７０】
「ＨＩＰ２」（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号４））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。ＨＩＰ２は、約１４３５．５の分子量を有する。
【００７１】
ＨＩＰ３ブロック型すなわちＨＩＰ３Ｂ（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号５））は、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。ＨＩＰＢは、約１６０５．７の分子量を有する。
【００７２】
ＨＩＰ１ブロック型（Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列ＩＤ番号６））は、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
【００７３】
ＨＩＰ２ブロック型すなわちＨＩＰ２Ｂ（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号７））は、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。ＨＩＰ２Ｂは、約１４７６．６の分子量を有する。
【００７４】
ＩＮＧＡＰペプチドブロック型すなわちＩＮＧＡＰＢは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチドである。
【００７５】
ＨＩＰ３Ｃｙｓ（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）（配列ＩＤ番号８））は、さらなるＣ末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
【００７６】
ＨＩＰ１Ｃｙｓ（Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）（配列ＩＤ番号９））は、さらなるＣ末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
【００７７】
ＨＩＰ２Ｃｙｓ（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）（配列ＩＤ番号１０））は、さらなるＣ末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドである。
【００７８】
ＩＮＧＡＰペプチドＣｙｓすなわちＩＮＧＡＰＣｙｓは、さらなるＣ末端のシステイン残基を有する、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチドである。
【００７９】
ＨＩＰ３Ｃｙｓ二量体（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）２（配列ＩＤ番号１１））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
【００８０】
ＨＩＰ１Ｃｙｓ二量体（Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）２（配列ＩＤ番号１２））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
【００８１】
ＨＩＰ２Ｃｙｓ二量体（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）２（配列ＩＤ番号１３））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。ＨＩＰ２は、約１４３５．５の分子量を有する。
【００８２】
ＩＮＧＡＰＣｙｓ二量体は、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチド二量体（各単量体は、Ｎ末端のシステイン残基を含むように改変されている）である。
【００８３】
ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号１４））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。
【００８４】
ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型（Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号１５））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｃ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。
【００８５】
ＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号１６））は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。
【００８６】
ＩＮＧＡＰＣｙｓブロック型は、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチドであり、これは、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。
【００８７】
ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型二量体（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）２（配列ＩＤ番号１７）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
【００８８】
ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型二量体（Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）２（配列ＩＤ番号１８）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体（各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｃ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている）である。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
【００８９】
ＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型二量体すなわちＨＩＰ２ＢＣｙｓ二量体（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）２（配列ＩＤ番号１９）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。ＨＩＰ２ＢＣｙｓ二量体は、約３１５７．５という分子量を有する。
【００９０】
ＩＮＧＡＰＣｙｓブロック型二量体は、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチド二量体であり、各単量体は、Ｃ末端のシステイン残基を含むように改変されており、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされている。この二量体は、個別の単量体のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して形成される。
【００９１】
ＨＩＰ３ＣｙｓＰＥＧ（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ））（配列ＩＤ番号２０）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９２】
ＨＩＰ１ＣｙｓＰＥＧ（Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ））（配列ＩＤ番号２１）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９３】
ＨＩＰ２ＣｙｓＰＥＧ（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ））（配列ＩＤ番号２２）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９４】
ＩＮＧＡＰＣｙｓＰＥＧは、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチドであり、これは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９５】
ＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型ＰＥＧ（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ）−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号２３）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９６】
ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型ＰＥＧ（Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ）−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号２４）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。
【００９７】
ＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型ＰＥＧすなわちＨＩＰ２ＢＣｙｓ−ＰＥＧ（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ）−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号２５）は、精製型、合成型、または組換え型でのヒト膵島形成促進性ペプチドであり、これは、Ｎ末端のアセチル基およびＣ末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている。ＨＩＰ２ＢＣｙｓ（ＰＥＧ）は、約４４，７８２の分子量を有する。
【００９８】
ＩＮＧＡＰＣｙｓブロック型ＰＥＧは、精製型、合成型、または組換え型でのＩＮＧＡＰペプチド（Ｃ末端のアセチル基およびＮ末端のアミド基でブロックされており、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物に共有結合されているＣ末端のシステイン残基を含むように改変されている）である。
【００９９】
ＲＥＧ３Ｇは、配列ＭＬＰＰＭＡＬＰＳＶＳＷＭＬＬＳＣＬＩＬＬＣＱＶＱＧＥＥＴＱＫＥＬＰＳＰＲＩＳＣＰＫＧＳＫＡＹＧＳＰＣＹＡＬＦＬＳＰＫＳＷＭＤＡＤＬＡＣＱＫＲＰＳＧＫＬＶＳＶＬＳＧＡＥＧＳＦＶＳＳＬＶＲＳＩＳＮＳＹＳＹＩＷＩＧＬＨＤＰＴＱＧＳＥＰＤＧＤＧＷＥＷＳＳＴＤＶＭＮＹＦＡＷＥＫＮＰＳＴＩＬＮＰＧＨＣＧＳＬＳＲＳＴＧＦＬＫＷＫＤＹＮＣＤＡＫＬＰＹＶＣＫＦＫＤ（配列ＩＤ番号２８）を有するヒト再生膵島由来タンパク質３ガンマ前駆体である。ＲＥＧ３Ｇペプチドは、配列ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＳＥＰＤＧ（配列ＩＤ番号２９）を有する、ＲＥＧ３Ｇから得られるヒト再生膵島由来タンパク質３ガンマ前駆体ペプチドである。他のＲＥＧ３Ｇペプチドは、ＷＩＧＬＨＤＰＴＱＧＳＥＰＤＧ（配列ＩＤ番号５８）およびＩＧＬＨＤＰＴＱＧＳＥＰＤＧＤ（配列ＩＤ番号５９）である。
【０１００】
本開示の実施形態は、治療剤としての改善された用途のために、ＨＩＰを含む膵島形成促進性ペプチドの安定性および溶解性を最適化するための詳細なストラテジーを提供する。ＨＩＰは、２番染色体のロケーション２ｐ１２の位置７９２４００７５に位置する膵炎関連タンパク質前駆体（ＮＰ−００２５７１）としても知られるヒトタンパク質再生膵島由来３アルファタンパク質（ＲＥＧ３Ａ）（ＮＭ＿１３８９３７．１）のペプチドフラグメントである（配列ＩＤ番号１）。ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、およびＨＩＰ２は、膵臓内に存在する前駆細胞から膵島新生を誘導または刺激する。本開示の方法に従って使用されるこれらの新生剤は、ＨＩＰを含む最適化された形態の膵島形成促進性ペプチドをもたらし、それは、疾患を処置する治療剤として使用されるとき、インビボにおける高い安定性、溶解性、および有効性を証明している。これらの疾患は、これに限定されるものではないが、真性糖尿病（１型糖尿病）、２型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病およびインスリン要求性成人発症型糖尿病、小児期および青年期における糖尿病）、および成人潜伏性自己免疫性糖尿病（Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ：ＬＡＤＡ）を含む。
【０１０１】
本開示の実施形態は、医薬組成物を用いて１型および２型糖尿病を含む膵臓機能不全を処置するための組成物および治療も提供する。１つの実施形態において、これらの組成物は、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドを含む。別の実施形態において、これらの組成物は、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびグルコース代謝に影響を及ぼす他の薬剤を含む。膵島の新生に関与する薬剤および膵島細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤が、これらの他の薬剤に含められる。１つの実施形態において、本明細書中に開示される治療は、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することによって実施される。別の実施形態において、本明細書中に開示される治療は、治療的に有効な用量の最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）を、グルコース代謝に影響を及ぼす別の薬剤（例えば、ホルモンまたは化合物）と併用して、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与することによって実施され、その別の薬剤は、これに限定されるものではないが、ベータ細胞の再生、満腹、および胃内容物排出に関与するホルモンまたは化合物（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１受容体アナログ、ＧＬＰ−１アナログ、およびＧＬＰ−１の破壊を妨げるジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤）および膵臓細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤を含む。この後者の実施形態において、最適化されたＨＩＰおよび前記他の薬剤は、別々に投与されてもよいし、まず混合されて併用組成物を提供し、そして同時に投与されてもよい。
【０１０２】
ＮＯＤマウスにおける遺伝子発現のマイクロアレイ解析によって、特に膵島新生における、Ｒｅｇ遺伝子のアップレギュレーションが示された。さらに、Ｒｅｇ遺伝子は、胎児発生後期にアップレギュレーションされることにより、発生中のヒトの膵臓を集合させて（ｐｏｐｕｌａｔｅ）、分娩後のそれ自体のグルコース代謝を維持すると知られている。非内分泌膵臓上皮細胞（ｎｏｎ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ＮＥＰＥＣｓ）を含む胎児組織の同時移植は、ＮＥＰＥＣ集団から新しい膵島構造の刺激をもたらすと示されている。同時移植された胎児物質におけるＲｅｇのアップレギュレーションは、おそらくこの作用のための刺激だった。
【０１０３】
インビボ研究から、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、およびＨＩＰ３が、糖尿病マウスに導入されるとき、膵臓内の前駆細胞の新しい膵島構造への分化を刺激することが示された。
【０１０４】
膵島構造の新生においては有効であるが、治療剤としての投与に向けて、溶解性、安定性、およびバイオアベイラビリティを改善するためにＨＩＰバリアントを含む膵島形成促進性ペプチドを最適化する必要が残っている。プロテアーゼ分解の機会を減少させる、ＨＩＰバリアントを含む膵島形成促進性ペプチドに対する改変は、その有効性を高めることにより、正の治療効果に必要な投薬量を減少させる。これらの改変は、「最適化された膵島形成促進性ペプチド」または「最適化されたＨＩＰ」と表示されているものをもたらす。
【０１０５】
１つの実施形態において、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、本開示によって精製型、合成型、または組換え型で提供され、膵島の新生を誘導するために本明細書中に開示される方法に従って投与される。
【０１０６】
さらに、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、長時間にわたって安定に保存され得る。最適化されたＨＩＰは、等張性食塩水中、２０℃で保存されるとき、数ヶ月にわたって安定である。
【０１０７】
特定の実施形態において、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、機能的に非常に活性である、すなわち、ＲＥＧ３Ａ、他のＨＩＰペプチド、およびハムスターＩＮＧＡＰなどの非ヒトＨＩＰホモログに関連する機能活性のうちの１若しくはそれ以上のより高い活性を示すことができる。
【０１０８】
ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、最適化されたＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列をコードする種々のＤＮＡ配列が、最適化されたＨＩＰバリアントを含む最適化された組換え膵島形成促進性ペプチドを作製するための発現ベクターを調製するために本開示の実施において使用され得る。これらは、これに限定されるものではないが、その配列内の同じアミノ酸残基または機能的に等価なアミノ酸残基をコードする様々なコドンの置換（ゆえにサイレントな変化をもたらす）によって変更される、最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）の全部または一部を含む核酸配列を含む。その最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）およびその誘導体は、これに限定されるものではないが、変更された配列（機能的に等価なアミノ酸残基がサイレントな変更をもたらす配列内の残基に置換されている）を含む最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰバリアントを含む）のアミノ酸配列の全部または一部を１次アミノ酸配列として含むものを含む。例えば、その配列内の１若しくはそれ以上のアミノ酸残基は、サイレントな変更をもたらす、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得る。その配列内のアミノ酸に対する置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰ誘導体を含む）は、これに限定されるものではないが、変更された配列（アミノ酸残基が類似の化学特性を有する残基に置換されている）を含む膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）のアミノ酸配列の全部または一部を１次アミノ酸配列として含むものも含む。特定の実施形態では、最適化されたＨＩＰの１、２、３、４、または５アミノ酸が置換されて、最適化されたＨＩＰのアナログおよび／または誘導体がもたらされる。
【０１０９】
特定の実施形態において、キメラタンパク質または融合タンパク質が、本明細書中に開示される方法において使用され得る。本明細書中で使用されるとき、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非膵島形成促進性ペプチド若しくはＨＩＰポリペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体に作動可能に連結された、最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体を含む。融合タンパク質の中で、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰと非膵島形成促進性またはＨＩＰポリペプチドとが、「作動可能に連結される」、すなわち、互いにインフレームで融合される。非膵島形成促進性またはＨＩＰポリペプチドは、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。例えば、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む最適化されたＨＩＰであり得る。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加し得る。さらに別の例では、融合タンパク質は、最適化されたＨＩＰ配列が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合されている、最適化されたＨＩＰ−免疫グロブリン融合タンパク質である。その最適化されたＨＩＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み込まれ得、被験体に投与されることにより、本開示に記載の免疫学的応答を阻害し得る。
【０１１０】
本明細書中に開示される方法において使用するための、最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）−キメラタンパク質または融合タンパク質は、バイオアベイラビリティを改善する目的ならびに／または有効性、溶解性、および安定性を高める目的で化学的に改変され得る。例えば、そのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、またはさらなるポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）部分に共有結合され得るか、または非共有結合され得る。
【０１１１】
本明細書中に開示される方法において使用するための、最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰ−キメラタンパク質若しくは融合タンパク質は、本明細書中の教示および当該分野で公知の教示に従って、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来の手法に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端または粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化（必要に応じて付着末端を埋める）、望ましくない結合を回避するアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いることによって、インフレームで共にライゲーションされ得る。さらに、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の手法によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行われ得、そのオーバーハングは、その後アニールし、再増幅されることにより、キメラ遺伝子配列を生成し得る。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。最適化されたＨＩＰをコードする核酸は、その融合部分が、最適化されたＨＩＰにインフレームで連結されるようにそのような発現ベクターにクローニングされ得る。その融合タンパク質は、最適化された組換えＨＩＰの精製および検出を助けるか、または被験体における免疫応答を遮断するＨｉｓタグまたはエピトープタグ（例えば、Ｖ５）に融合された、最適化されたＨＩＰであり得る。最適化されたＨＩＰならびにそのアナログおよび誘導体の短いアミノ酸配列は、同様に、これらの価値あるペプチドの合成的な生成を容易に実施可能とし、ペプチド合成のための種々の自動装置が、市販されており、自動化を必要としないペプチド合成のための合成方法は、長く知られており、本明細書中の教示に従って使用されることにより、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体を調製することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、最適化された膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰ−キメラタンパク質または融合タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法を用いてインビボにおいて長い半減期を有するように改変され得る。例えば、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントまたは高分子量ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）などの不活性なポリマー分子は、タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合体化によってまたはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能リンカーを用いてまたは用いずに、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体に付着され得る。生物学的活性の最小の損失をもたらす直鎖状または分枝状ポリマーの誘導体化が使用され得る。結合体化の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって綿密にモニターされることにより、ＰＥＧ分子と、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体との適切な結合体化が確実になり得る。未反応のＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィによって、最適化されたＨＩＰ−ＰＥＧ結合体から分離され得る。ＰＥＧ誘導体化結合体は、当業者に公知の方法を用いてインビボ有効性について試験され得る。
【０１１３】
本開示の実施形態は、最適化された膵島形成促進性ペプチド処方物（最適化されたＨＩＰ処方物を含む）、ならびに最適化された膵島形成促進性またはＨＩＰに基づく治療、ならびに糖尿病および損なわれた膵機能に関与する他の様々な徴候を処置する際に最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰバリアントを送達するための方法を提供する。
【０１１４】
１つの実施形態において、膵島形成促進性ペプチドは、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによって、血清中のペプチドの遊離末端を認識して分解するプロテアーゼによるタンパク分解活性を効果的に阻止し、その結果、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物がもたらされることによって、最適化される。
【０１１５】
１つの実施形態において、ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／またはＨＩＰ２は、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによって、血清中のペプチドの遊離末端を認識して分解するプロテアーゼによるタンパク分解活性を効果的に阻止され、それにより最適化され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３ブロック型（配列ＩＤ番号５）、ＨＩＰ１ブロック型（配列ＩＤ番号６）、およびＨＩＰ２ブロック型（配列ＩＤ番号７）がそれぞれもたらされる。これらのブロック基は、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によって付加され、調製された。固相合成の基本的な前提は、鎖の一方の末端が不溶性の支持体に固着されながら、アミノ酸が任意の所望の配列のペプチドに組み立てられ得るということである。上で述べたように、実際のＳＰＰＳでは、ペプチドのカルボキシル末端が、ポリマーに結合される。アミノ酸の所望の配列が、支持体上に結合された後、試薬を適用することにより、そのペプチド鎖を支持体から切断し、その粗ペプチドを溶液中に遊離し得る。この合成に関与するすべての反応が、可能であれば完了するまで行われることにより、均一な生成物が得られる。
【０１１６】
ペプチドのＣ末端がアミドであるとき、誘導体は、ペプチドアミドである。多くの天然に存在するペプチドホルモンが、アミドとして存在するので、ペプチドアミドは、極めて重要な誘導体である。ペプチドアミドを合成するために、切断時にペプチドアミドを直接もたらす固相樹脂が開発された。Ｎ末端がアセチル基であるとき、該ペプチドは、Ｃ末端からＮ末端に組み立てられる。次いで、Ｎ末端は、塩基の存在下において無水酢酸を用いてアセチル化される。
【０１１７】
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドは、Ｃ末端のシステイン残基の付加によって改変され、その結果、Ｃｙｓ膵島形成促進性ペプチド化合物がもたらされる。これらの最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化された膵島形成促進性ペプチド化合物である膵島形成促進性ペプチドＣｙｓ二量体がもたらされる。
【０１１８】
別の実施形態において、ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、および／またはＨＩＰ２は、Ｃ末端のシステイン残基の付加によって改変され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号８）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号９）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１０）がそれぞれもたらされる。これらの最適化されたＨＩＰ化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１１）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１２）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓ二量体（配列ＩＤ番号１３）がそれぞれもたらされる。４グラムの粗ペプチドを２ｍｌの酢酸で湿らせ、約５００ｍｌのＤＩ水で希釈し、次いで、２０％ＮＨ４ＯＨ溶液を滴下することによってｐＨを約８．２に調整し、室温で一晩撹拌することによって、システイン残基が付加される。反応が一晩で完了しなかったので、黄緑色が持続するまで、フェリシアン化カリウム溶液を加えた。Ｅｌｌｍａｎ試験およびＨＰＬＣ解析によって測定したところ、この段階において反応が完了していた。次いで、その酸化溶液を１スパーテル分のＡＧ−１  Ｘ２（塩化物型）樹脂で３０分間処理し、Ｐ４漏斗で濾過し、最終的にｐＨを約５に調整した後、ＨＰＬＣ精製した。
【０１１９】
別の実施形態において、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによって、その化合物を、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解から保護することによって、Ｃｙｓ膵島形成促進性ペプチドがブロックされ、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物である膵島形成促進性ペプチドＣｙｓブロック型がもたらされる。さらに、これらの化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成される結果、最適化された膵島形成促進性化合物である膵島形成促進性ペプチドＣｙｓブロック型二量体がもたらされる。これらのブロック基は、上に記述したように付加される。
【０１２０】
別の実施形態において、ＨＩＰ３Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号８）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号９）、および／またはＨＩＰ２Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１０）は、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによってブロックされ、それにより、その化合物が血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解から保護され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１４）、ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１５）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型（配列ＩＤ番号１６）がそれぞれもたらされる。さらに、これらの化合物は、溶液中で二量体を形成することができ、個別の単量体のシステイン間にジスルフィド結合が形成され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１７）、ＨＩＰ１Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１８）、およびＨＩＰ２Ｃｙｓブロック型二量体（配列ＩＤ番号１９）がそれぞれもたらされる。これらのブロック基は、上に記述したように付加される。
【０１２１】
別の実施形態において、Ｃｙｓ膵島形成促進性ペプチドは、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物をＣ末端のシステイン残基に共有結合することによって最適化され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物である膵島形成促進性ペプチドＣｙｓＰＥＧがもたらされる。前記ＰＥＧ構築物は、精製された単量体型のＣＳ５０４ペプチド（１．１当量）を酢酸緩衝液（ｐＨ＝６．５）に溶解することによって、Ｃ末端のシステイン残基に共有結合され得る。ＰＥＧマレイミド（１当量）の溶液は、ＤＩ水中に調製され、撹拌しながら該ペプチド溶液に加えられ得る。得られる溶液のｐＨを、再度、希ＮＨ４ＯＨ溶液で約６．５に調整し、室温で３０分間撹拌し、数滴の酢酸で酸性化し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣで精製することができる。
【０１２２】
別の実施形態において、ＨＩＰ３Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号８）、ＨＩＰ１Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号９）、および／またはＨＩＰ２Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１０）は、二量体のマレイミド活性化型４０Ｋｄ  ＰＥＧ構築物をＣ末端のシステイン残基に共有結合することによって最適化され、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２０）、ＨＩＰ１ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２１）、およびＨＩＰ２ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２２）がそれぞれもたらされる。そのＰＥＧ構築物は、精製された単量体型のＣＳ５０４ペプチド（１．１当量）を酸性緩衝液（ｐＨ＝６．５）に溶解することによって、Ｃ末端のシステイン残基に共有結合される。ＰＥＧマレイミドの溶液（１当量）を、ＤＩ水中に調製し、撹拌しながらそのペプチド溶液に加えた。得られた溶液のｐＨを、再度、希ＮＨ４ＯＨ溶液で約６．５に調整し、室温で３０分間撹拌し、数滴の酢酸で酸性化し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１２３】
別の実施形態において、膵島形成促進性ペプチドＣｙｓＰＥＧは、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによって最適化され、それにより、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解からその化合物を保護し、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物である膵島形成促進性ペプチドＣｙｓＰＥＧブロック型がもたらされる。それらのブロック基は、上に記述したように付加される。
【０１２４】
別の実施形態において、ＨＩＰ３ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２０）、ＨＩＰ１ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２１）、およびＨＩＰ２ＣｙｓＰＥＧ（配列ＩＤ番号２２）は、Ｃ末端のアミド基およびＮ末端のアセチル基を付加することによって最適化され、それにより、血清中の遊離末端を認識するプロテアーゼによる分解からその化合物を保護し、その結果、最適化されたＨＩＰ化合物であるＨＩＰ３ＣｙｓＰＥＧブロック型（配列ＩＤ番号２３）、ＨＩＰ１ＣｙｓＰＥＧブロック型（配列ＩＤ番号２４）、およびＨＩＰ２ＣｙｓＰＥＧブロック型（配列ＩＤ番号２５）がそれぞれもたらされる。それらのブロック基は、上に記述したように付加される。
【０１２５】
本開示の最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療または併用療法は、ベータ細胞の機能の喪失若しくは低下、または最適化されたＨＩＰ化合物および処置方法を用いて前駆細胞からの新しい膵島構造の分化を介して被験体に提供され得るより多くのインスリン産生の必要性に起因するインスリンの産生または分泌の低下に関係する疾患、症状、または状態に苦しんでいる任意の哺乳動物（ヒトおよび動物を含む）を処置するために用いられ得る。そのような疾患および状態は、１型真性糖尿病、２型糖尿病、前糖尿病、空腹時血糖異常、空腹時高インスリン血症を含み、これに限定されるものではないが、１ａ型糖尿病を有する患者または抗体（抗ＧＡＤ６５抗体、抗膵島抗体、または抗インスリン抗体）を表し得る成人潜伏性自己免疫性糖尿病を有する患者、またはベータ細胞に対する自己免疫なしにインスリンが欠乏している１型糖尿病（１ｂ型糖尿病）を有する患者を含む。さらに、本開示の実施形態は、１型糖尿病を有すると新たに診断された患者、１型糖尿病を有する患者の同胞および一等親血縁者、ならびに１型糖尿病に対する偏向を示す陽性抗体および他の自己免疫性の状態を有する人々に対する治療的な利益によって実施され得る。１つの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、そのような処置を必要とする患者において１型糖尿病を逆転させるために実施される。
【０１２６】
前記併用療法ならびに関連する方法および組成物は、糖尿病を有する患者、ならびに管理不良の糖尿病を有する患者、低血糖に気づいていない患者、および１型糖尿病における反復性の低血糖症を有する患者におけるグルコースの変動を回復させるために、小児および成人における１型糖尿病のインスリン治療に対する補助的療法としても用いられ得る。
【０１２７】
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、新たに診断された２型糖尿病、高血糖症を伴う小児および成人における２型糖尿病（２型糖尿病は、インスリン、経口糖尿病治療または他の皮下糖尿病治療で同時に処置される）、および管理不良の２型糖尿病を有する患者を処置するために用いられ得る。本明細書中に開示される方法および組成物は、小児と成人の両方の一部の患者において、１型および２型糖尿病を逆転させ得る。本明細書中に開示される方法および組成物は、非定型の糖尿病を有する小児と成人の両方および食後の高血糖症の状態を有する患者を処置するためにも用いられ得る。
【０１２８】
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、体重減少、トリグリセリド、ＬＤＬコレステロールの減少を必要とする小児ならびに成人の患者である患者を処置するため（これに限定されるものではないが、体重減少を達成するため、または糖尿病を有する患者ならびに１型または２型糖尿病を有しない患者における肥満症、過体重を処置するためを含む）にも用いられ得る。１つの実施形態において、本明細書中に開示される方法および組成物は、病的肥満を有する患者を処置するために用いられる。他の実施形態において、本明細書中に開示される方法および組成物は、病的肥満を有する患者または食欲不振、過食症、若しくは他の摂食障害を有する患者を処置するために用いられる。
【０１２９】
単一の薬剤による最適化された治療ならびに関連する方法および組成物は、代謝異常症候群または代謝症候群を有する小児および成人、ならびにグルコース代謝の変化に続発する神経因性疼痛症候群の状態を示す患者および糖尿病を伴う高トリグリセリド血症および糖尿病を伴わない高トリグリセリド血症を有する患者ならびに、食後の高トリグリセリド血症を有する患者を処置するためにも用いられ得る。１つの実施形態において、これらの方法は、多嚢胞性卵巣症候群の処置を必要とする患者においてそのような処置を行うために実施される。
【０１３０】
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療および関連する方法の利益を享受し得る他の患者には、一般に空腹時高血糖症、前糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能障害、および高血糖状態などの状態を有すると診断されている小児患者および成人患者が含まれる。
【０１３１】
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物は、神経因性疼痛症候群およびニューロパシーを有する患者（その患者が糖尿病と診断されているか否かは関係ない）を処置するためにも用いられ得る。
【０１３２】
最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰまたはアナログまたは誘導体による治療ならびに関連する方法および組成物もまた、再発性の膵炎または膵癌を有する患者を処置するために使用され得、膵臓内の前駆細胞に由来する新しい膵島構造をもたらすことを目標とされるすべての様式において用いられ得る。
【０１３３】
１つの実施形態において、膵臓前駆細胞からインスリンを産生する膵島構造への膵島分化を刺激する薬剤は、最適化された膵島形成促進性ペプチド若しくはＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体から選択される。別の実施形態では、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと、膵島細胞新生を刺激する別の薬剤との組み合わせ。このさらなる薬剤は、例えば、アミリンおよび／またはアナログであり得、これに限定されるものではないが、プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（商標））、ＧＬＰ−１受容体アナログ、エキセンディン−４（ＥＸＥＮＡＴＩＤＥ（商標））、リラグルチド（ＮＮ２２１１）、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ハムスターＩＮＧＡＰ、他のインクレチン模倣ホルモン、ならびに／または同様に作用する化合物および薬剤、ならびに前述の化合物および薬剤のいずれか（例えば、ＧＬＰ−１の分解を遅延させるジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤）の半減期を延長するか、またはレベル若しくは活性を上昇させる薬剤を含む。ＧＬＰ−１受容体に対する直接的なアゴニスト活性を介して作用するかまたはＧＬＰ−１の分解を阻害することによって作用する数多くのＧＬＰ−１模倣物が存在する。これらの薬剤は、本開示のある特定の実施形態において有用である。ＧＬＰ−１模倣物は、ＨＩＰおよび／または１型糖尿病の処置のために標的化された免疫療法とともに使用され得、それらは、血糖コントロールを改善するため、満腹を高めるため、腸のグルコース吸収を遅延させるため、および１型糖尿病をもたらす基礎をなすメカニズムを逆転させるために用いられ得る。これらの薬剤および方法は、糖尿病における耐糖能障害の進行を妨げ得；前糖尿病、耐糖能障害への空腹時血糖異常の進行、および糖尿病を妨げ得；新たに診断された２型糖尿病を逆転させ得；２型糖尿病を処置し得、そして過体重、肥満症、多嚢胞性卵巣症候群、および神経因性疼痛症候群を処置し得るか、または予防し得る。
【０１３４】
成体の膵臓内の前駆細胞からの膵島の分化を達成するための本開示の実施において有用な方法、薬剤、および医薬処方物は、他の目的のために以下の参考文献（その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含む：Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２１：９５−１０４；Ｍａｒ．１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３９（３）：２５６−６２；Ｊｕｌ．１９９６，Ｐａｎｃｒｅａｓ  １３（１）：３８−４６；およびＮｏｖ．２００４，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４０（５）：８７５−８４；Ｖｉｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｕｎ．１９９７，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２９（６）：２７８−９３。膵島再生または膵臓前駆細胞の分化の刺激の成功は、被験体におけるインスリンの産生および／または分泌の増加によって示され得る。
【０１３５】
１つの実施形態において、アミリンまたはアミリンのアナログ（例えば、Ｓｙｍｌｉｎ（商標）またはプラムリンチド）が、最適化されたＨＩＰの投与前または最適化されたＨＩＰとの併用投与において使用される。アミリンは、参考文献Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４：２８２−２９０（この参照により本明細書に組み込まれる）の教示に従って、膵島再生の前に投与され得、膵島再生期間を通じて投与が継続され得る。１つの実施形態において、アミリンおよび／またはアナログ（これに限定されるものではないが、プラムリンチドを含む）は、最適化されたＨＩＰの開始前に血糖コントロールを最適化するために皮下に投与され、次いで、単独または他の膵島刺激ペプチド（例えば、最適化されたＨＩＰまたは最適化されたＨＩＰアナログ若しくは誘導体）との併用で使用され得る。１つの実施形態において、アミリンまたはプラムリンチドは、０．３〜０．８マイクログラム／キログラム患者体重で投薬される。１つの実施形態において、この用量が、食事前、例えば、ＱＨＳおよび午前３時に皮下に投与される。１つの実施形態において、治療的に有効な用量は、皮下に、または注入デバイス／ポンプおよび／または経皮的、鼻腔内、頬側、マイクロニードルの送達系、経口カプセル法を介して送達される。別の実施形態において、治療的に有効な用量は、１週間に１回より多くない頻度、２週間に１回、または１ヶ月に１回の注射または他の送達方法による投与の必要な徐放処方物を利用して投与される。上で述べたように、いくつかの実施形態において、アミリンまたはプラムリンチドは、別の膵島刺激剤と同時投与される。
【０１３６】
１つの実施形態において、ＧＬＰ−１受容体アナログ（エキセンディン−４またはエキセンディン４のアナログを含む）が、最適化されたＨＩＰを用いる方法において５〜１０ｍｃｇの用量で食事と共に使用される。エキセンディン−４は、以下の参考文献（その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる）の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る：Ａｌｃａｎｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｆｕｎｃｔ．１６（１）：５１−６；Ｄｕｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８９（７）：３４６９−７３；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：８６−９３；およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：２２７０−７６。１つの実施形態において、エキセンディン−４は、５〜１０マイクログラムの範囲で食事前に投薬される。１つの実施形態において、エキセンディン−４は、単独でまたは最適化されたＨＩＰおよび／若しくは他の膵島刺激ペプチドと併用して皮下に投与される。１つの実施形態において、治療的に有効な用量が、皮下に投与される。別の実施形態において、エキセンディン−４の送達は、経皮的、頬側、経口カプセル法、鼻腔内、またはマイクロニードルの送達系を介する。別の実施形態において、治療的に有効な用量は、１週間に１回より多くない頻度、２週間に１回、または１ヶ月に１回の投与が必要な徐放処方物に含められる。１つの実施形態において、エキセンディン−４は、１型若しくは２型糖尿病を有する患者または肥満症、過体重、インスリン抵抗性症候群、空腹時血糖異常、前糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群、代謝症候群、または摂食障害を有する患者において、最適化されたＨＩＰまたは別の膵島細胞新生剤または前駆細胞形質転換剤と同時投与される。
【０１３７】
ＧＩＰおよびＧＬＰ−１は、成長ホルモンのインクレチンファミリーに属し（参考文献Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ，１９７９，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １６：７５−８５；Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  ａｎｄ  Ｅｂｅｒｔ，１９８５，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８：５６５−５７３；Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．２３４：７５−８５；およびＶｉｌｓｂｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｕｎ．２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８８（６）：２７０６−１３（この各々が、この参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、１つの実施形態において、最適化されたＨＩＰと同時使用するまたは使用しないインクレチンホルモンまたはアナログが、成体膵臓内の前駆細胞から膵島への分化を刺激する方法において使用される。
【０１３８】
様々な実施形態において、ＧＩＰまたはＧＩＰアナログは、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドとともに使用される。ＧＩＰは、以下の参考文献（その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる）の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る：Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６２：１５２−１６１；Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂ．１９８０，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２９（２）：１４０−５；Ｄｕｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．３７：８２６−８２８；Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９（３）：６７９−９８；Ｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３７：Ｅ１８５−Ｅ１９１および１９９４，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ５１（１）：６３−７４；Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｕｎ．１９８３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．５６（６）：１３０６−１２；Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３６（７）：６７７−８２；Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．２２３（５）：４３７−４１；Ｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＡＳＥＢ  １７：１９−９３；Ｍｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １０７：１−３；およびＮａｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７６（４）：９１２−７。
【０１３９】
１つの実施形態において、ＧＩＰは、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して静脈内または皮下に投与され、食事開始の３〜５分前、就寝前、および午前３時に静脈内送達または皮下送達によって３０分間の持続注入を提供する２〜１０ナノグラム／キログラム患者体重で投薬される。１つの実施形態において、ＧＩＰは、食事前、ＱＨＳ、および午前３時に皮下に投与される。１つの実施形態において、ＧＩＰは、経口的に、あるいは注入デバイス、または経皮的、頬側、鼻腔内、またはマイクロニードルの送達系を用いて投与される。別の実施形態において、１週間に１回より多くない頻度での投与、２週間に１回、または１ヶ月に１回の注射が必要な徐放処方物が使用される。本明細書中に開示される方法に従ってＧＩＰを投与するために適した組成物は、他の目的のために、参考文献Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，６  Ｎｏｖ．１９８９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．７（４）：２６３−９に記載されているものである。
【０１４０】
様々な実施形態において、ＧＬＰ−１若しくはアナログ、またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト、またはジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤は、前駆細胞からの膵島分化を刺激する方法において、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して使用され、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、およびＤＰＰ−４阻害剤は、以下の参考文献（その各々が、この参照により本明細書に組み込まれる）の教示に従って、本開示の目的のために製剤化され得、投与され得る：Ｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ５１（１）：６３−７４；Ｇｕｔｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １７：１０３９−４４；Ｋｒｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｌａｎｃｅｔ  ２：１３００−１３０４；Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５（Ｓｕｐｐｌ．２）：２３３Ａ（Ａｂｓｔｒａｃｔ）；Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２４（８）：１４１６−２１；Ｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．２８６（６）：Ｅ８７５−８１；Ｌｕｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３２：４２４−４２８；Ｍａｒｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．１９９８，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｆｕｎｃｔ．１６（１）：５１−６；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｃｈ  ２００４，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２（３）：８４８−８５１；Ｍｅｎｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２６：２８３５−４１；Ｎａｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３９（１２）：１５４６−５３；Ｔｈｏｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃ．１９９５，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２１（５）：３１１−８；Ｖｉｌｓｂｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８８（６）：２７０６−１３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３−２８８９；およびＺａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：８２４−３０。
【０１４１】
様々な実施形態において、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、またはＧＬＰ−１アナログは、皮下に投与されるか、またはＤＰＰ−４阻害剤は、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して経口的に投与され、８〜２０ｍｇ／キログラム患者体重において４００〜８００ｍｇ／日の範囲で投薬される。１つの実施形態において、ＧＬＰ−１は、食事前、ＱＨＳで経口的または皮下に投与される。１つの実施形態において、ＧＬＰ−１は、１〜３０ｎｇ／キログラム体重／分の速度での持続的な皮下注入デバイスを用いて、または食事開始の３〜５分前、就寝前、および午前３時に静脈内送達若しくは皮下送達のいずれかによって３０分間の持続注入を提供する経皮的、頬側、またはマイクロニードルの送達系を用いて、投与される。別の実施形態において、１週間に１回より多くない頻度での投与、２週間に１回、または１ヶ月に１回の注射が必要な徐放処方物が使用される。
【０１４２】
１つの実施形態において、リラグルチド（ＮＮ２２１１）は、１０〜４０マイクログラム／キログラム体重の用量で、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体と併用して皮下に投与される。別の実施形態において、リラグルチドは、食事前、ＱＨＳ、および午前３時に皮下に投与される。別の実施形態において、リラグルチドは、食事開始の３〜５分前、就寝前、および午前３時に静脈内送達または皮下送達によって３０分間の持続注入を提供する注入デバイスまたは経皮的、頬側、若しくはマイクロニードルの送達系を用いて投与される。別の実施形態において、１週間に１回より多くない頻度での投与、２週間に１回、または１ヶ月に１回の注射が必要な徐放処方物が使用される。
【０１４３】
併用療法の１つの実施形態において、リラグルチドまたはＮＮ２２１１は、約２０マイクログラム／ｋｇ患者体重の用量で毎日、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドと併用して投与される。この用量は、患者に、周期的変動の減少ならびに食後のグルコース、グルカゴン、およびトリグリセリドの減少とともに、食事前のボーラスインスリンを１０〜２０％減少させる能力を提供する。本明細書中に開示される方法に従ったリラグルチドの投与は、例えば測定されるときの血糖コントロール、これに限定されないが１型糖尿病におけるヘモグロビンＡ１Ｃを改善するため；糖尿病における耐糖能障害の進行を妨げるため；耐糖能障害および糖尿病への空腹時血糖異常の進行を妨げるため；新たに診断された２型糖尿病を逆転させるため；および２型糖尿病を処置するために使用され得る。
【０１４４】
併用療法の実施形態において、リラグルチドまたはＮＮ２２１１は、最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはＨＩＰの治療中、連続した３週間にわたって、朝、食物摂取の約４時間前、および就寝時に成人患者に約２０マイクログラム／ｋｇ患者体重の用量で投与される。約１．０ｎｇ／ｍＬより低いＣ−ペプチドレベルで処置を開始する患者の場合、Ｃ−ペプチドレベルをモニターし、それが０．５ｎｇ／ｍＬ超に上昇したら、連続した１２日間にわたって抗体ｈＯＫＴ３ｇ１（ａｌａ−ａｌａ）を投与する。
【０１４５】
前記併用療法では、エキセンディン−４若しくは合成エキセンディン−４または別のＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、またはジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤が、最適化されたＨＩＰ治療の開始前または開始中に血糖コントロールを改善するために、単独でまたは最適化された膵島形成促進性ペプチド若しくはＨＩＰまたは別の膵島分化剤とともに食事前に投与される。そのような薬剤は、食事前に送達されると、インスリンの必要性を少なくとも２０％低下させ得、インスリンおよび糖尿病薬剤の適切な漸減を行いながら、最適化されたＨＩＰが投与される。最適化されたＨＩＰおよび／または他の薬剤が、１型患者と２型患者の両方に送達されるとき、新しい膵島細胞が前駆細胞から分化されるので、低血糖症から保護するためにインスリンおよび他の糖尿病薬剤の慎重な漸減が行われる。最終的には、膵臓が新しい機能的な膵島で再配置されるので、インスリンおよび糖尿病薬剤（最適化されたＨＩＰを含む）は、漸減される。約１．０ｎｇ／ｍＬより低いＣ−ペプチドレベルで処置を開始する患者の場合、Ｃ−ペプチドレベルをモニターし、それが０．５ｎｇ／ｍＬ超に上昇したら、慎重なモニタリングおよび外因性インスリンの用量の漸減を行う。
【０１４６】
１型糖尿病を有する患者では、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドを開始する前に、および／または他のペプチド化合物（ＳＹＭＬＩＮ（商標）、ハムスターＩＮＧＡＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＧＬＰ−１アナログ、ＤＰＰ−４阻害剤が共に（その前、中、または後に）用いられ、免疫療法が、新たに形成される膵島を保護するために施される。例えば、抗体ｈＯＫＴ３ｇ１（ａｌａ−ａｌａ）が、連続した１２日間にわたって投与され、その有効性が、最初の処置終了後２４ヶ月まで証明されたのに対し、類似のヒト化モノクローナル抗体であるＣｈＡｇｌｙＣＤ３は、連続した６日間にわたって投与され得、次いで、年１回繰り返され得る。ＤｉａｍｙｄのＧＡＤ６５化合物は、１ヶ月間隔で２回の皮下注射で送達される。熱ショックタンパク質６０であるＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）は、研究の開始時、１ヶ月後および６ヶ月後に植物油中の４０ｍｇのマンニトールとともに１ｍｇの皮下注射を用いることにより、新たに診断された糖尿病患者において成功を証明した。選択される免疫調節因子に基づいて、処置の周期性が決定される。別の実施形態において、ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）、熱ショックタンパク質６０ワクチン、およびＩＢＣ−ＶＳＯワクチン（膵臓のベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである）、インターフェロン−アルファ、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞若しくは同様の薬剤を使用するワクチン接種が、前記併用療法において用いられる。別の実施形態において、免疫調節剤（これに限定されるものではないが、抗ＣＤ３免疫治療剤およびポリクローナル抗Ｔリンパ球グロブリンを含む）が、最適化されたＨＩＰと併用して使用される。そのような薬剤は：シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、熱ショックタンパク質６０（ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標））、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２０剤のリツキシマブ、キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、および／またはビタミンＤも含む。
【０１４７】
いくつかの自己免疫細胞は、膵ベータ細胞を標的にするので、本明細書中に開示される方法に従って処置可能な疾患および状態のいくつかにおいて原因となる役割を果たす。参考文献Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．１９：１３１−１６１；Ｌｅｒｎｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．２０（３）：５８９−６１７；およびＭａｔｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃ．２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１４（６８６５）：７９２−７９８（この各々がこの参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１４８】
１型糖尿病を有する患者への免疫剤（ｉｍｍｕｎｅ  ａｇｅｎｔｓ）の導入に関する先の処置方法は、免疫攻撃によってなおも破壊される膵島細胞だけを保護し、完全に機能的なベータ細胞を有する新しい膵島構造で膵臓を再配置させる必要性に対処していない。これらの方法は、ベータ細胞の破壊の減少を目的とした全般的な免疫調節および特定の免疫調節と、成体の膵臓内の前駆細胞から新しい膵島細胞を分化する方法とを組み合わせている。
【０１４９】
本開示の方法は、インスリン、アミリン、またはグルカゴンを産生する膵ベータ細胞を標的にする自己免疫細胞の活性を特異的に阻害するか、または自己免疫細胞を阻止するか、若しくは破壊する薬剤を使用し得る。そのような薬剤には、膵島細胞の破壊を停止する免疫調節性ペプチドが含まれる。例えば、１つのそのような薬剤は、膵島細胞の喪失の進行を遅延させ得るか、または１型糖尿病の発症を遅くし得るか、若しくは停止し得るモノクローナル抗体である。抗ＣＤ３抗体は、本明細書中に開示される方法において有用な薬剤の一般的なクラスを構成する。例えば、本開示の目的に適した抗ＣＤ３抗体は、ＴｏｌｅｒＲｘによって開発中のＴＲＸ４（Ａｌａ−ＡｌａおよびＣｈＡｇｌｙＣＤ３）抗体および参考文献Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，３０  Ｍａｙ  ２００２，ＮＥＪＭ  ３４６（２２）：１６９２−１６９８（この参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているヒト化抗ＣＤ３抗体を含む。１つの実施形態において、そのヒト化抗ＣＤ３抗体は、第１日目に１〜１．４２μｇ／ｋｇ、第２日目に５．６７μｇ／ｋｇ、第３日目に１１．３μｇ／ｋｇ、第４日目に２２．６μｇ／ｋｇ、および第５〜１４日目に４５．４μｇ／ｋｇの投薬量において１４日／年で静脈内に送達される。これらの治療は、新しい膵島細胞の形成が起きるので、インスリンを漸減させながら、最適化されたＨＩＰを使用した３〜６ヶ月後に毎年繰り返され得る。最適化されたＨＩＰ処置期間中、ビタミンＤおよびプラムリンチド／Ｓｙｍｌｉｎ（商標）の使用が継続され得る。ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびインスリンによる治療の中止後、免疫調節が、抗ＣＤ３抗体に対して毎年繰り返され得るが、最近の研究から、その有効性が２４ヶ月にもわたって継続することが見出された。
【０１５０】
別の実施形態において、前記免疫調節性の化合物は、膵島細胞の破壊を停止することができるか、または遅らせることができる熱ショックタンパク質である。そのようなタンパク質には、Ｄｅｖｅｌｏｇｅｎ  ＡＧによって開発中の熱ショックタンパク質であるＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）が含まれる。１つの実施形態において、ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）は、ベースラインおよび１ヶ月後、ならびに３ヶ月間隔で２回、皮下に植物油中の４０ｍｇのマンニトール中の１ｍｇを与えることによって皮下に送達される。併用療法の１つの実施形態において、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたは最適化されたＨＩＰのアナログ若しくは誘導体は、以下のとおりＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）と同時投与される。ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）が、まず、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはアナログまたは誘導体に基づく治療を開始する約３０日前に約１ｍｇの用量で皮下に投与される。次いで、ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）の２回目の投与を、最適化されたＨＩＰまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の開始時（最初の投与の９０日後）に行う。
【０１５１】
別の実施形態において、免疫調節性化合物は、ポリクローナル抗Ｔ−リンパ球グロブリン（Ａｎｔｉ−Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ：ＡＴＧ）である。４つの投薬量のＡＴＧ用量が投与される。ＡＴＧの第１の投薬量は、９ｍｇ／ｋｇ体重であり、次いで、３ｍｇ／ｋｇという３つの連続した用量が、４時間にわたって静脈内に投与される。第１のＡＴＧ投与の１時間前に、皮膚負荷試験（０．２ｍｌの最終溶液）を行う。併用療法の１つの実施形態において、ＡＴＧは、最適化されたＨＩＰまたは最適化されたＨＩＰアナログ若しくは誘導体を使用する前に、送達される。ＡＴＧの最後の投薬量は、最適化されたＨＩＰまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の開始の最低１４日前に送達される。ＡＴＧによる最初の処置の２４ヶ月後の自己免疫性攻撃を示唆する抗ＧＡＤ６５抗体および他の免疫マーカーの年４回の測定に基づいて、ＡＴＧの第２の投与が必要とされ得る。膵臓に対して産生された自己免疫性抗体の著しい増加がみられる場合、より早い処置が必要になり得る。
【０１５２】
ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体は、上に記載されたように、治療的に有効な用量での、皮下注射、肝臓を標的にしたベシクル若しくは他のリポソーマル（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）剤を介した経口的、または２４時間にわたる連続皮下注入を介して送達され得る。１つの実施形態において、１日量は、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重／２４時間である。１つの実施形態において、１日量は、約６００〜８００ｍｇである。最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはアナログまたは誘導体に基づく治療は、３〜６ヶ月間にわたって継続され、Ｃ−ペプチドの産生によって厳密にモニターされる。その免疫治療は、選択される免疫剤に基づいて、周期的に送達される。例えば、ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標）は、合計６ヶ月にわたって３ヶ月間隔で送達され、最適化されたＨＩＰまたはアナログまたは誘導体に基づく治療の３ヶ月前に最初に送達される。
【０１５３】
本明細書中に開示される方法において有用な免疫調節性薬剤は、当該分野で公知のとおり、または本明細書中に記載されるように、製剤化され得、投与され得、そして投薬され得る。医薬処方物ならびにさらなる投薬および本明細書中に開示される方法を実施するための投与プロトコルは、以下に説明される。
【０１５４】
ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の組成物、例えば、およびその薬学的に許容可能な塩およびエステルは、様々な他の化合物と組み合わされるとき、糖尿病または同様の障害を処置する際に前駆細胞を新しい膵島細胞に分化させるのに相乗的または付加的に有効である。これらの化合物は、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドおよびそのアナログまたは誘導体、アミリンおよび／またはアナログ（これに限定されるものではないが、Ｓｙｍｌｉｎ／プラムリンチド、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば、エキセンディン−４、リラグルチド（ＮＮ２２１１）、ＧＬＰ−１アナログ、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、ＧＩＰ、ハムスターＩＮＧＡＰ、および他のインクレチン模倣ホルモンを含む）、および／または同様に作用する化合物および薬剤、ならびに前述の化合物および薬剤のいずれかの半減期を延長するか、またはそのいずれかのレベル若しくは活性を増加させる薬剤、例えば、ＧＬＰ−１の分解を遅延させるジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、およびベータ細胞を標的にする自己免疫細胞を阻害するか、阻止するか、または破壊する薬剤（これに限定されるものではないが：抗ＣＤ−３抗体（ｈＯＫＴ３１（Ａｌａ−Ａｌａ）およびＣｈＡｇｌｙＣＤ３を含む）、ＡＴＧ、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、熱ショックタンパク質６０（ＤＩＡＰＥＰ２７７（商標））、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ワクチン、単独またはダクリズマブとの併用でのミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２０薬剤リツキシマブ、キャンパス−１Ｈ（抗ＣＤ５２抗体）、リソフィリン、およびビタミンＤ、ＩＢＣ−ＶＳＯワクチン（膵ベータ細胞の破壊を妨げるように設計された代謝的に不活性型の合成インスリンである）、ならびにＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞または膵臓のベータ細胞の破壊を妨げるように設計された類似の薬剤を使用するインターフェロン−αワクチン接種）を含む）を含む。この最後の実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋抗原特異的制御性Ｔ細胞または類似の薬剤を用いるインターフェロン−αワクチン接種が、直接または抗ＣＤ３免疫療法の使用を介して制御性Ｔ細胞を利用するための併用療法において用いられる。
【０１５５】
化合物（例えば、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、ＴＲＸ４抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体、ＤＹＡＭＩＤ（商標）抗ＧＡＤ６５抗体、およびＤＩＡＰＥＰ２７７（商標））もまた、糖尿病または同様の障害を処置する際に、最適化されたＨＩＰまたは前駆細胞を新しい膵島細胞に分化させる薬剤の用法に加えられるとき、相乗的または相加的に有効である。
【０１５６】
２若しくはそれ以上の薬剤の相互作用が、それらの併用作用が併用療法において使用される一方または両方の薬剤の有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ：ＡＥ）の発生率を低下させる結果である場合、薬物治療レジメンの改善が、治療効果を有する２つの薬剤の併用投与によってもたらされ得る。この有害作用の発生率の低下は、例えば、その併用療法において使用される一方または両方の薬剤のより低い用量の投与の結果であり得る。例えば、表示される用量で使用されるとき薬物Ａ単独の作用が２５％であり、かつ４５％という有害事象発生率を有する場合；および表示される用量で使用されるとき、薬物Ｂ単独の作用が２５％であり、かつ３０％という有害事象発生率を有する場合、その２つの薬物が各々の表示される用量よりも少ない用量で組み合わされるとき、全体的な作用が３５％であり、かつ有害事象発生率が２０％である場合、その薬物治療レジメンは改善される。本開示によって提供される併用療法は、そのような既存の改善を含む。
【０１５７】
医薬組成物、投薬、および投与
好ましい実施形態において、最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）は、約０．５〜約５ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で、より好ましくは、ヒトにおいて分割された皮下注射で送達される。したがって、６０ｋｇの個体は、潜在的に、２〜３回に分けられた６０ｍｇ／日を投与され得る（２０ｍｇの投薬量を食後に送達される）。他の好ましい実施形態において、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドは、約０．５〜約５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投薬量で経口カプセル法を介しても送達され得、好ましくは、食後に分割された投薬量で経口的に送達され得る。
【０１５８】
ＳＴＺ誘発（ｒｅｎｄｅｒｅｄ）糖尿病マウスにＩＰ送達される、１日２回の１０００マイクログラムから０．１マイクログラム／日の用量の範囲でのＨＩＰ２および最適化されたＨＩＰ２Ｂを使用する投薬量決定研究（実施例１３）に基づくと、ＨＩＰ２Ｂは、ハムスター由来ＩＮＧＡＰのヒト治験において使用される１０ｍｇ／ｋｇ（６００ｍｇ／日）という投薬量に対して、その約１０％の投薬量の約１ｍｇ／ｋｇというＨＩＰ２および等価物の投薬量で使用され得る（図２３）。
【０１５９】
例えば、いくつかの態様において、様々な実施形態は、上で定義されたような化合物および薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物または上で定義されたような化合物を含む有効量の医薬組成物に関する。
【０１６０】
本明細書中に開示される化合物は、それらが活性である任意の経路によって従来の様式で投与され得る。投与は、全身性、局所的、または経口であり得る。例えば、投与は、これに限定されないが、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、経口、頬側若しくは眼球の経路、または膣内、吸入、デポー注射、若しくは埋没物によるものであり得る。したがって、本開示の化合物のための投与様式（単独または他の医薬品との併用のいずれか）は、これに限定されないが、舌下、注射（皮下または筋肉内に注射される、短時間作用性、デポー、埋没物、および植込錠の形態を含む）、または膣クリーム、膣坐剤、ペッサリー、膣リング、直腸坐剤、子宮内デバイスの使用によるもの、ならびにパッチおよびクリームなどの経皮的形態であり得る。
【０１６１】
特定の投与様式は、適応症に依存する。特定の投与経路および投薬レジメンの選択は、最適な臨床反応を得るために、臨床医に公知の方法に従って臨床医によって調整されるか、または用量設定されるべきである。投与される化合物の量は、治療的に有効な量である。投与される投薬量は、処置される被験体の特徴、例えば、処置される特定の動物、年齢、体重、健康状態、もしあれば併用される処置のタイプ、および処置の頻度に左右され、当業者（例えば、臨床医）によって容易に決定され得る。
【０１６２】
本開示の化合物および適当なキャリアを含む医薬処方物は、固体剤形（これに限定されるものではないが、錠剤、カプセル、カシェ剤、植込錠、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む）；局所的剤形（これに限定されるものではないが、溶液、粉末、流動性エマルジョン、流動性懸濁液、半固体、軟膏、ペースト、クリーム、ゲル、およびゼリーならびに泡沫を含む）；および非経口剤形（これに限定されるものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、および乾燥粉末を含む）であり得；本開示の有効量のポリマーまたはコポリマーを含む。活性成分が、薬学的に許容可能な希釈剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性物質、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝剤、湿潤剤、湿潤剤、可溶化剤、保存剤などとともにそのような処方物に含められ得ることもまた、当該分野で公知である。投与するための手段および方法は、当該分野で公知であり、当業者は、手引きとして様々な薬理学の参考文献を参照することができる。例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｂａｎｋｅｒ  &  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９７９）；およびＧｏｏｄｍａｎ  &  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を調べることができる。
【０１６３】
本開示の化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化され得る。本化合物は、約１５分〜約２４時間にわたる持続注入によって皮下に投与され得る。注射用の処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中に、または保存剤が加えられた複数回用量の容器内に、入れられ得る。本組成物は、油性または水性のビヒクルにおける懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）（例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤）を含み得る。
【０１６４】
経口投与の場合、本化合物は、これらの化合物を当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのようなキャリアは、本明細書中に開示される化合物を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとしての製剤化を可能にする。経口用途用の医薬品は、固体賦形剤を加え、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、そして所望の場合、錠剤または糖衣錠のコアを得るために適当な補助剤を加えた後、その顆粒剤の混合物を処理することによって得られ得る。適当な賦形剤は、これに限定されるものではないが、糖（これに限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば、これに限定されるものではないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む）などの充填剤を含む。所望であれば、崩壊剤（例えば、これに限定されるものではないが、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を含む）が加えられ得る。
【０１６５】
糖衣錠のコアは、適当なコーティングとともに提供され得る。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／若しくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択で含み得る濃縮された糖溶液が使用され得る。識別のためまたは活性化合物の用量の様々な組み合わせを特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠のコーティングに加えられ得る。
【０１６６】
経口的に使用され得る医薬調製物は、これに限定されるものではないが、ゼラチンから作製された押し込み型カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製されたソフトカプセル、密閉カプセルを含む。押し込み型カプセルは、例えば、ラクトースなどの充填剤、例えば、デンプンなどの結合剤、および／または例えば、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに任意選択で安定剤の混合物中に活性成分を含み得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、適当な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）に溶解され得るか、または懸濁され得る。さらに、安定剤が加えられ得る。経口投与用のすべての処方物が、そのような投与に適した投薬量で存在するべきである。
【０１６７】
頬側投与の場合、本組成物は、従来の様式で製剤化される、例えば錠剤または舐剤の形態をとり得る。
【０１６８】
吸入による投与の場合、本開示に従って使用するための化合物は、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスを使用した、加圧型パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー形（ａｅｒｏｓｏｌ  ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬量の単位は、定量を送達するバルブを提供することによって確定され得る。本化合物と適当な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との混合粉末を含む、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【０１６９】
本開示の化合物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む直腸組成物（例えば、坐剤または停留浣腸）としても製剤化され得る。
【０１７０】
先に記載された処方物に加えて、本開示の化合物は、デポー調製物としても製剤化され得る。そのような長時間作用性の処方物は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内に）または筋肉内注射によって投与され得る。
【０１７１】
デポー注射は、約１〜約６ヶ月若しくはそれ以上の間隔で投与され得る。したがって、例えば、本化合物は、適当なポリマー性材料若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化され得る。
【０１７２】
経皮的投与では、本開示の化合物は、例えば、硬膏に適用され得るか、または結果的に生物に供給される経皮的な治療体系によって適用され得る。
【０１７３】
本化合物の医薬組成物は、適当な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤も含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例は、これに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、および例えばポリエチレングリコールなどのポリマーを含む。
【０１７４】
併用が、本明細書中に記載される方法の所望の作用を達成する際に望ましいとわかっているか、または有益であるとわかっている場合、本開示の化合物は、他の活性成分（例えば、佐剤、プロテアーゼ阻害剤、または他の適合性の薬物若しくは化合物）と併用しても投与され得る。
【０１７５】
最適化されたＨＩＰおよびそのアナログまたは誘導体を調製する方法
当該分野で公知の任意の手法は、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体を合成し、精製する際に用いられ得、その手法は、これに限定されるものではないが、沈殿、吸着（例えば、カラムクロマトグラフィ、膜吸着剤、半径流カラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ）またはゲル濾過による新規化学合成および精製、電気泳動、液相分画（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）、界面活性剤分画（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）、有機溶媒抽出、および限外濾過を含む。精製中、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の生物学的活性は、１若しくはそれ以上のインビトロアッセイまたはインビボアッセイによってモニターされ得る。最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の純度は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、これに限定されるものではないが、ゲル電気泳動を含む）によってアッセイされ得る。Ｓｃｏｐｅｓ，前出を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物において使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質ｍｇの８０〜１００パーセントの範囲、または総タンパク質ｍｇの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％であり得る。１つの実施形態において、組成物中に使用される最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体は、総タンパク質の少なくとも９９％である。別の実施形態において、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされると、明らかに均一に精製されている。１つの実施形態において、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドが、９５％超の純度に合成されＨＰＬＣによって試験される。
【０１７６】
当該分野で公知の方法が、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を組換え的に生成するために利用され得る。ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をコードする核酸配列が、宿主細胞内での増殖および発現のために発現ベクターに挿入され得る。
【０１７７】
本明細書中で使用されるとき、発現構築物とは、適切な宿主細胞において、最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現を可能にする１若しくはそれ以上の制御領域と作動可能に会合された、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をコードする核酸配列のことを指す。「作動可能に会合された」とは、発現される制御領域および最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体が、結合され、転写および最終的には翻訳を可能にするように位置される会合のことを指す。
【０１７８】
ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の転写に必要な制御領域は、発現ベクターによって提供され得る。その同族の開始コドンを欠いている最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列が発現される場合、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）もまた提供され得る。適合性の宿主−構築物系において、ＲＮＡポリメラーゼなどの細胞性の転写因子は、宿主生物においてＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドの配列の転写をもたらす発現構築物上の制御領域に結合する。遺伝子発現に必要とされる制御領域の正確な性質は、宿主細胞ごとに異なり得る。一般に、ＲＮＡポリメラーゼと結合することができ、作動可能に会合された核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが、必要である。そのような制御領域は、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含み得る。コード配列に対する非コード領域３’は、転写終結制御配列（例えば、ターミネーターおよびポリアデニル化部位）を含み得る。
【０１７９】
制御機能を有するＤＮＡ配列（例えば、プロモーター）を、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列に付着するため、あるいはＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、適切な適合性の制限酵素認識部位を提供するリンカーまたはアダプターが、当該分野で周知の手法によってｃＤＮＡの末端にライゲートされ得る。制限酵素による切断の後、ライゲーションの前に、一本鎖ＤＮＡ末端を消化して戻すか、または埋めることによって、平滑末端を形成する改変が行われ得る。あるいは、所望の制限酵素部位が、所望の制限酵素部位を含むプライマーを使用するＰＣＲを用いるＤＮＡの増幅によって、ＤＮＡのフラグメントに導入され得る。
【０１８０】
制御領域と作動可能に会合された、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の配列を含む発現構築物は、さらなるクローニングなしに、膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体の発現および産生に適切な宿主細胞に直接導入され得る。その発現構築物は、例えば、相同組換えを介した、宿主細胞のゲノムへの膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体の配列の組み込みを促進するＤＮＡ配列も含み得る。この場合、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を適切な宿主細胞において増殖し、発現するために、その宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを使用する必要がない。
【０１８１】
種々の発現ベクターが使用され得、それは、これに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または改変ウイルスを含む。そのような宿主発現系は、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の遺伝子のコード配列を生成し、続いて精製し得るビヒクルであるだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときにＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体をインサイチュで発現し得る細胞でもある。これらは、これに限定されるものではないが、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換される、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；膵島形成促進性ペプチド（最適化されたＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換え発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＴＭＶ））で感染されたか、あるいはＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）を含む。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞および真核細胞が、組換えの最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ＣＨＯ）など哺乳動物細胞が、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の配列を効率的に発現するために、サイトメガロウイルスの主要中間初期（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子由来のプロモーターエレメントを有するベクターと共に使用され得る。
【０１８２】
細菌系では、発現される最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体について意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量の最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体が産生されるとき、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが、望ましい場合がある。ベクターは、これに限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＩＮベクターなどを含む。ｐＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）、およびｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような一連のベクターを使用することによってもまた、ＦＬＡＧペプチド、ｍａｌＥ−、またはＣＢＤ−タンパク質との融合タンパク質として外来タンパク質が発現され得る。これらの組換えタンパク質は、正しいフォールディングおよび成熟のために細胞周辺腔に向けられ得る。融合される部分は、発現されたタンパク質の親和性精製のために使用され得る。エンテロキナーゼのような特定のプロテアーゼに対する切断部位が存在することにより、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の切断が可能になる。ｐＧＥＸベクターを使用することによってもまた、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来タンパク質が発現され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合に続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解された細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン切断部位またはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、クローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から遊離され得る。
【０１８３】
昆虫系では、外来遺伝子を発現する多くのベクターが、使用され得、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用され得る。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のような細胞内で成長する。ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列は、そのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１８４】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が利用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の目的のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入し得る。そのウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能であり、かつＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を、感染した宿主において発現することができる、組換えウイルスにおいて生じる。挿入された、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体のコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外因性の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然と合成の両方の種々の起源からのものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る。
【０１８５】
さらに、挿入される配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質生成物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、そのタンパク質の機能のために重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾にために特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセシングおよび遺伝子産物の翻訳後修飾、例えば、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞が、用いられ得る。そのような哺乳動物宿主細胞は、これに限定されるものではないが、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖も内因性に産生しないマウスミエローマ細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体の所望の活性に非必須である翻訳後修飾が見られる場合、細菌系または酵母系における発現が用いられ得る。
【０１８６】
適切にプロセシングされた、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を長期間にわたって高収率で産生するためには、細胞内での安定な発現が好ましい。ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを用いることによって操作され得る。例としては、これに限定されないが、発現構築物の導入後、操作された細胞を１〜２日間強化培地中で生育し、次いで、選択培地に切り替え得る。その発現構築物内の選択マーカーは、その選択に対する抵抗性を付与し、使用されるベクター構築物および宿主細胞に応じて、細胞が発現構築物をその染色体に安定に組み込ませること、および培養物中で成長すること、および細胞株に発展することを可能にし得る。そのような細胞は、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を持続的に発現しながら、長期間にわたって培養され得る。
【０１８７】
いくつかの選択系が用いられ得、それは、これに限定されるものではないが、抗生物質耐性（ジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）すなわちＧ−４１８に対する抵抗性を付与するＮｅｏ；Ｚｅｏｃｉｎに対する抵抗性のためのＺｅｏ；およびブラストサイジンに対する抵抗性のためのＢｓｄのようなマーカー）；代謝拮抗物質耐性（メトトレキサートに対する抵抗性を付与するＤｈｆｒのようなマーカー；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを含む。さらに、変異細胞株（これに限定されるものではないが、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞を含む）が、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン、またはアデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼに対応する遺伝子を有するベクターと組み合わせて使用され得る。組換えＤＮＡ技術の当該分野で通常公知の方法を日常的に適用することにより、所望の組換えクローンが１５０：１で選択され得る。
【０１８８】
その組換え細胞を、温度、インキュベーション時間、光学濃度、および培地組成に関して標準的な条件下で培養し得る。しかしながら、組換え細胞が成長するための条件は、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の発現のための条件と異なり得る。改変された培養条件および培地を使用することによっても、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体の産生が増強され得る。当該分野で公知の任意の手法を適用することにより、ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体を産生するための最適な条件が確立され得る。
【０１８９】
ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのフラグメントを組換え手法または天然源からの精製によって生成するのに対する代替方法は、ペプチド合成である。例えば、最適化されたＨＩＰ全体またはそのアナログ若しくは誘導体、あるいは最適化されたＨＩＰまたはそのアナログ若しくは誘導体の一部に対応するタンパク質は、ペプチド合成装置を使用することによって合成され得る。従来のペプチド合成プロトコルまたは当該分野で周知の他の合成プロトコルが使用され得る。
【０１９０】
ＨＩＰを含む最適化された膵島形成促進性ペプチドまたはそのアナログ若しくは誘導体あるいはそれらの一部のアミノ酸配列を有するタンパク質は、固相ペプチド合成によって合成され得る。合成中、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸が、そのＣ末端によって連結された成長中のポリペプチド鎖および不溶性のポリマー支持体、すなわち、ポリスチレンビーズに滴下される。そのタンパク質は、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化されたＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に連結することによって合成される。その活性化されたカルボキシルに遊離アミノ基が付着することによって、ペプチド結合が形成される。最もよく使用されるＮ−α−保護基には、酸不安定であるＢｏｃおよび塩基不安定Ｆｍｏｃが含まれる。適切な化学、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸および試薬の詳細は、当該分野で周知であるので、本明細書中では詳細に説明されない。
【０１９１】
得られる最適化された膵島形成促進性ペプチド（ＨＩＰを含む）またはそのアナログ若しくは誘導体の精製は、従来の手順（例えば、ゲル浸透、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィを用いる分取ＨＰＬＣ）を用いて達成される。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野で周知であるので、本明細書中では詳細に説明されない。
【０１９２】
本発明の試薬および方法の前述の詳細な説明とともに、以下の実施例が提供されることにより、本発明の様々な態様が例証される。
【実施例１】
【０１９３】
インビトロＨＩＰ活性。このインビトロ研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて行われた。ヒト膵島画分およびヒト膵管画分を１０日間培養し、次いで、盲検試験において処理した。ネガティブコントロールとしての機能を果たすスクランブルペプチド、ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、ＨＩＰ２、およびポジティブコントロールとしての機能を果たすハムスター由来ＩＮＧＡＰで処理したヒト膵臓培養物におけるインスリンレベルを、ラジオイムノアッセイ法を用いて測定した。ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅによって合成されたものである（９５％純粋、リサーチグレード）。
【０１９４】
２つ組の培養物を第１０日目および第１２日目に処理し、次いで、ＨＩＰペプチド、コントロールおよびＩＮＧＡＰでの処置の１週間後にインスリン含有量の検出のために溶解した。１０日間の培養中、インスリン産生は低下し、次いで、ＨＩＰペプチドで処置した後、再度インスリンが産生される。
【０１９５】
図１に示されるような管画分のグラフは、ヒト膵管組織を含む培養物のインキュベーション後の、ラジオイムノアッセイによって測定されたインスリンレベルをｙ軸に表している。膵島画分のグラフは、ヒト膵島組織におけるインキュベーション後のインスリンレベルを示している。ベースラインのインスリンレベルは、ベースライン時の管画分におけるレベルよりもベースライン時の膵島画分におけるレベルの方が著しく高い。
【０１９６】
Ｒｉｃｏｒｄｉ法を用いて、管組織および膵島組織を分離した。管細胞も膵島培養物も完全に均一では全くなかった。本研究は、ＨＩＰに対する標的である前駆細胞が、膵島培養物と管培養物の両方において見られることも示唆している。本研究を繰り返したところ、ＨＩＰ２とともに培養されたヒト管組織におけるラジオイムノアッセイによってインスリンレベルが４倍も増加したという以下の図表に示される同様の知見が得られた。
【０１９７】
繰り返された研究から、主にヒト管細胞培養物と膵島培養物の両方においてインスリンが増加し、ベースラインのインスリンレベルは、膵島培養物と比べてベースライン時の管培養物におけるレベルのほうが一貫して約１／３低く、同様にネガティブコントロールと比べてＨＩＰペプチドとのインキュベーション後のインスリン含有量が増加したことが確かめられた。
【実施例２】
【０１９８】
インビボ研究。ＨＩＰ３、ＨＩＰ１、およびＨＩＰ２が、マウスにおけるインビボ研究の対象である。研究から、これらのＨＩＰバリアントは、糖尿病マウスに導入されたときに、膵臓内の前駆細胞が新しい膵島構造に分化するのを刺激することが示された。糖尿病のモデルが、マウスにおいて開発されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００４）。被験体数は、この研究にとって十分な数の糖尿病の動物がもたらされるように選択し、動物を研究群にランダムに割り当てた。すべての動物に、連続した２８日間にわたって腹腔内注射を介して１日２回（午前および午後）投薬した。用量投与のタイミングは、投薬期間中、一定（±２時間）のままであった。そのマウスが糖尿病になったこと（少なくとも１週間にわたって１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ（３００ｍｇ／ｄＬ）を超える血糖を確認した後、マウスに投薬した。
【０１９９】
マウスを糖尿病にするために、連続した５日間にわたってクエン酸緩衝液，ｐＨ４．５中のストレプトゾシンを４０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。マウスは、糖尿病であるとみなされるために、少なくとも１週間にわたって１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ（３００ｍｇ／ｄＬ）を超える血糖を有していなければならなかった。任意の動物における血糖値が、４００ｍｇ／ｄＬ超に上昇したら、その動物をインスリンで処置した。３日おきに、各日同じ時間に、尾に切り目を入れて、１滴の血液を採取した。グルコースメーターを用いて、グルコース測定値を決定した。群の割り当ておよび用量レベルは、表１のとおりであった。
【０２００】
【表２】
2014028825.tif 000007
【０２０１】
研究のエンドポイントには、以下：グルコースの変化；インスリン必要量の変化；および死後の膵臓の組織学が含まれた。
【０２０２】
インスリン必要量の変化。インスリン必要量とインスリン必要量の減少速度の両方の著しい減少が、図２に示されるようにＨＩＰ処置マウスにおいてみられた。ＨＩＰ２処置マウスは、第２１日目までに完全にインスリンから離脱した。
【０２０３】
グルコースレベルの変化。ＨＩＰ処置群のすべてにおいて、グルコースがコントロールと比べてベースラインから平均して減少し、この減少は、図３に示されるようにすべてのＨＩＰ処置群において有意であった。ＨＩＰ１とコントロール間では平均グルコースが１４．７％低下し、ＨＩＰ２とコントロール間では平均グルコースが２９．４％低下し、ＨＩＰ３とコントロール群間では平均グルコースが５７．３％低下した。このデータは、コントロール糖尿病マウスと比べて、すべてのＨＩＰ処置マウス群間でのインスリン必要量の減少速度が著しく速いことを示唆している。マウス膵臓において観察された膵島の数は、ＨＩＰ処置後に著しく増加し、このことを、研究された各マウスについて区分し、再調査した。この膵臓は、検体について知らされていない組織学者によって評価され、そのデータを以下の表３に示す。
【０２０４】
【表３】
2014028825.tif 000008
【０２０５】
ＨＩＰとプラセボ間の膵島の数の差は、統計学的に有意だった（ｐ＝０．０２２）。ＨＩＰ処置マウスとプラセボ処置群間で、膵島面積のなおもより著明な増加があった。図４Ａに示されるように、ＨＩＰ２処置群における膵島面積は、プラセボ処置群における１４２，３９４μｍ（２）、ＨＩＰ３処置群における２８３，９１８μｍ（２）と比べて、３６０，２９７μｍ（２）だった（ｐ＝０．０５）。図４Ｂは、ＨＩＰ２Ｂが糖尿病マウスにおいて膵島の数を増加させることを示している。（ａ）プラセボ処置マウスおよびＨＩＰ処置マウスにおけるインスリン免疫染色の代表的な像。（ｂ）インスリン染色された膵島は、これらの構造を自家蛍光の血液細胞と区別するために黄色で輪郭が描かれている。
【０２０６】
マウスの膵臓においてもインスリンに対する蛍光免疫染色が行われ、図５に示されるように、ＨＩＰ処置マウスにおけるインスリン染色のほうが染色の程度が高いことが示されている。このマウス膵臓組織を回収し、４％ＰＦＡ中で固定し、ブロッキングし、切片にした。１０倍対物レンズ、１．６オプティバール（ｏｐｔｉｖａｒ）。
【実施例３】
【０２０７】
以下の実施例では、ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰを合成し、精製する例示的な方法を説明する。
【０２０８】
ＨＩＰペプチドの合成は、標準的なＦｍｏｃ保護化学（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５，１６１−２１４）を用いるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの一般的な固相手順（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）によるものであった。
【０２０９】
樹脂に結合した保護されたペプチドを切断し、スカベンジャーの存在下でのトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＦＡ）による処理によって脱保護することにより、粗生成物を得た。逆相高速液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）によって、精製されたペプチド生成物を得た。
【０２１０】
ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）を有するペプチドの誘導体化は、３００〜４３，０００という分子量範囲の別個のＰＥＧ単位の導入からなり得る。
【０２１１】
実施例Ａ：Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ−ＮＨ２（ＨＩＰ２Ｂ）（配列ＩＤ番号７）。４−［２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂であるＲｉｎｋアミド樹脂から出発し、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を連続的に導入し、ＨＯＢｔおよびＤＣＣ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびジシクロヘキシルカルボジイミド）を用いて結合させた。出発樹脂および各アミノ酸のＦｍｏｃ保護基のＦｍｏｃ脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて達成された。Ｎ末端アミノ酸のＩｌｅのＦｍｏｃ保護基を除去した後、樹脂に結合した保護されたペプチドを塩化メチレン中の２０％無水酢酸でアセチル化した。側鎖基の脱保護および樹脂からのペプチドの切断は、２．５％水および２．５％トリイソプロピルシランを含む９５％トリフルオロ酢酸を用いて達成された。１時間処理した後、そのペプチドを、ジエチルエーテルを含む切断溶液から沈殿させ、濾過し、乾燥させた。
【０２１２】
精製。水中の０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡをそれぞれ緩衝液ＡおよびＢとして使用するＣ−１８支持体における逆相高速液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）によって、粗生成物を精製した。緩衝液Ｂを徐々に増加させる勾配を用いることによって生成物を溶出した。残留ＴＦＡのアセテートとの交換は、生成物画分をＣ−１８ＨＰＬＣカラムに再度適用し、０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ水溶液で洗浄し、移動相として水およびアセトニトリル中の１％酢酸の勾配を用いて生成物を溶出することによって、達成された。純粋な生成物画分をプールし、凍結乾燥させた。ペプチドの同一性および均一性は、アミノ酸組成解析、分析用ＨＰＬＣ、および質量スペクトル解析によって確かめられた。
【０２１３】
実施例Ｂ：ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ（ＨＩＰ２）（配列ＩＤ番号４）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂から出発し、実施例Ａにおけるようにペプチド配列を組み立てた。ブロックされていない遊離アミノ末端および遊離カルボキシル末端を有するペプチドを提供するために、アミノ末端をアセチル化しなかった。精製された生成物を実施例Ａにおけるように単離した。
【０２１４】
実施例Ｃ：（Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ−ＮＨ２）２（ＨＩＰ２ＢＣｙｓ二量体）（配列ＩＤ番号１９）。遊離チオール型でのペプチドの合成は、実施例Ａに記載したとおりであった。約２ｇのペプチドを２ｍｌの酢酸で溶解し、約５００ｍｌの蒸留水で希釈し、２０％ＮＨ４ＯＨ溶液を滴下することによってｐＨを約８．２に調整することによって、粗生成物を酸化することにより二量体を形成した。その溶液を室温において一晩撹拌した。反応は、一晩で完了に達しなかった。その反応を完了させるために、黄緑色が持続するまで、フェリシアン化カリウムの１％溶液を加えた。Ｅｌｌｍａｎ試験およびＨＰＬＣ解析によって判定したところ、その反応は完了したと判断された。次いで、酸化されたペプチドの溶液を３〜５ｇのＡＧ−１  Ｘ２イオン交換（塩化物型）樹脂とともに３０分間撹拌し、濾過し、酢酸を用いてｐＨを約５に調整した後、ＨＰＬＣ精製した。
【０２１５】
実施例Ｄ：（ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ）２（ＨＩＰ２Ｃｙｓ二量体）（配列ＩＤ番号１３）。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇ樹脂から出発し、実施例２におけるようにペプチド配列を調製した。粗生成物のエーテル沈殿、二量体への酸化、およびＨＰＬＣ精製を、実施例Ｃに記載したように達成した。
【０２１６】
実施例Ｅ：Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ−ＮＨ２（ＨＩＰ２ＢＣｙｓ）（配列ＩＤ番号１６）。単量体の１次配列の合成および精製を実施例Ａにおけるように達成する。
【０２１７】
以下の実施例では、ブロックされたＨＩＰを調製する例示的な方法を説明する。ＨＩＰブロックされたペプチドを固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によって調製した。固相合成の基本的な前提は、鎖の一方の末端が不溶性の支持体に固着されながら、アミノ酸が任意の所望の配列のペプチドに組み立てられ得るということである。上で述べたように、実際のＳＰＰＳでは、ペプチドのカルボキシル末端が、ポリマーに結合される。アミノ酸の所望の配列が、支持体上に結合された後、試薬を適用することにより、そのペプチド鎖を支持体から切断し、その粗ペプチドを溶液中に遊離し得る。この合成に関与するすべての反応が、可能であれば完了するまで行われることにより、均一な生成物が得られ得る。
【０２１８】
ペプチドのＣ末端がアミドであるとき、誘導体は、ペプチドアミドである。多くの天然に存在するペプチドホルモンが、アミドとして存在するので、ペプチドアミドは、極めて重要な誘導体である。ペプチドアミドを合成するために、切断時にペプチドアミドを直接もたらす固相樹脂が開発された。Ｎ末端がアセチル基であるとき、そのペプチドは、Ｃ末端からＮ末端に組み立てられる。次いで、そのＮ末端は、塩基の存在下において無水酢酸を用いてアセチル化される。
【０２１９】
Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を用いることにより、前記配列を構築する。アミノ酸の所望の配列を支持体上に結合した後、そのペプチドをアセチル化し、濾過し、そして乾燥させる。次いで、スカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＦＡ）を用いて、アセチル化されたペプチド樹脂を切断することにより、そのペプチドを支持体ならびにすべての保護基から遊離する。次いで、高速液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）を用いてその粗材料に対して精製を行う。
【０２２０】
実施例Ｆ：Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ（ＰＥＧ）−ＮＨ２（ＨＩＰ２ＢＣｙｓ−ＰＥＧ）（配列ＩＤ番号２５）。実施例５の精製された単量体型のペプチド（１．１当量）を酢酸塩緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝６．５）に溶解した。マレイミド誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧマレイミド）の溶液（１当量）を蒸留水中に調製し、撹拌しながら前記ペプチド溶液に加えた。得られた溶液のｐＨを、希ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて約６．５に調整し、室温で３０分間撹拌し、数滴の酢酸によって酸性化し、ＨＰＬＣによって精製した。
【０２２１】
実施例Ｇ：ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ（ＰＥＧ）（ＨＩＰ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ）（配列ＩＤ番号２２）。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇ樹脂から出発し、１次配列の合成および精製は、実施例Ｂに記載したとおりである。ＰＥＧマレイミドを用いた誘導体化後のＨＰＬＣ精製は、実施例Ｆにおけるとおりである。
【０２２２】
実施例Ｈ：（ＰＥＧ）−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ（ＰＥＧ−ＨＩＰ２）（配列ＩＤ番号９１）。樹脂に結合したペプチド１次配列を、実施例２におけるように調製した。Ｎ末端のＩｌｅのＦｍｏｃ脱保護の後、カップリング剤としてＨＯＢＴおよびＤＣＣを用い、保護されたペプチド樹脂を、ＰＥＧ−カルボン酸を用いて誘導体化した。その樹脂からの（ＰＥＧ）−ペプチドの切断および精製は、実施例Ａに記載したとおりだった。
【実施例４】
【０２２３】
以下の実施例では、ＨＩＰ２に切断されるＨＩＰ１の筋肉内投与および皮下投与の薬物動態を説明する。
【０２２４】
２０匹のラット（５匹のラット／投与経路）を用いたＨＩＰ送達の薬物動態を評価した。ハムスター由来ＩＮＧＡＰでの治験と同様に、筋肉内（ＩＭ）経路は、図６に示されるように、その材料のより良好な血中濃度を提供したが、半減期の測定値は、ＥＬＩＳＡ測定によって３０分短かった。
【０２２５】
図７に示されるように、投与の皮下（ＳＱ）経路は、わずかに長い半減期を示したが、ＥＬＩＳＡによって検出されたレベルは、ＩＭ経路よりも低かった。ＩＭ経路は、ＳＱよりもわずかに長い血中半減期を提供する。
【実施例５】
【０２２６】
以下の実施例は、凍結融解研究におけるＨＩＰ２Ｂペプチドの安定性を示している。
【０２２７】
実験の手順。この研究は、各群８つのサンプルの２群で開始された。２ヶ月間の安定性研究の一部として、一方の群は、４〜８℃で維持され、他方の群は、２５℃で維持される。各サンプルは、５マイクロリットルの蒸留水中に４．５７ミリグラムのＨＩＰ２Ｂを含む。ＬＣ／ＭＳ解析を行うまで、７日間おきに各温度群から１つのサンプルを取り出し、保存のためにマイナス２０℃の冷凍庫内に置いた。安定性研究において１、２、および３週間後に一連のサンプルを、その研究の開始時に調製され−２０℃で保存されたＨＩＰ２Ｂのコントロールサンプルに対して評価した。上に記載した各温度における安定性試験の３週間後、ＬＣ／ＭＳによって測定したところ、すべてのサンプルが変化していなかったことから、１、２、および３週間後は安定であると考えられる。この凍結融解安定性研究から、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で保存されるとき、ＨＩＰ配列内のＰｒｏ−Ａｓｎの接合点において炭素シフト（ｃａｒｂｏｎ  ｓｈｉｆｔ）が生じ、配列は、−２０℃の等張性食塩水中で保存されるとき、数ヶ月間安定のままであることが示唆される。
【実施例６】
【０２２８】
最適化されたＨＩＰは、インビトロにおいて血清プロテアーゼに対する経時的な（Ｔ）ペプチド安定性の増加を示す。
【０２２９】
前記ペプチドをヒト血漿中、３７℃においてインキュベートした。１時間にわたってサンプルのインキュベーションを行った。１、５、１０、３０、および６０分という個別の時点を用いて反応を追跡した。各時点における血漿プロテアーゼの非活性化は、サンプルを１００℃で１分間加熱することによって達成された。ワークアップ後、血漿処理サンプルを、逆相クロマトグラフィによって、質量分析計、ＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳで順次、コントロールサンプルに対して評価した。
【０２３０】
ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰペプチドで処理された血漿を１、５、１０、３０、および６０分にわたって評価した。各時点について、０．７０ｍｌの血漿を１０ｍｌ試験管にピペットで移した。各々に、リン酸緩衝食塩水中に調製されたＨＩＰまたは最適化されたＨＩＰペプチドの原液（１．６６ｍｇ／ｍｌ）０．３０ｍｌを加えた。その血漿／ペプチドサンプルを各時点にわたって３７℃でインキュベートした後、１００℃で加熱することにより、血漿プロテアーゼのタンパク分解活性を不活性化した。不活性化後、そのサンプルを１ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、遠心し、解析のために上清の液体を取り出した。
【０２３１】
緩衝液ＡとしてＨ２Ｏ中の０．０７％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．０７％ＴＦＡを用いるＣ−１８逆相カラム（５０ｍｍ×２．０ｍｍ）においてサンプルを解析した。１０分間にわたる９８％Ａ／２％Ｂから３０％Ａ／７０％Ｂに達する線形勾配を０．４ｍｌ／分という流速で用いた。２２０ｎｍの波長のＵＶおよび質量分析によって溶出液をモニターした。ペプチド参照サンプルおよび血漿コントロールに対する、血漿処理ペプチド（３７℃）のクロマトグラフィのプロファイルの比較を用いることによって、血漿処理に対するペプチドの相対的な安定性を判定した。
コントロール
Ｔ＝０：血漿（０．７ｍｌ）＋ペプチド原液（０．３ｍｌ）、１００℃で１分間加熱。１ｍｌのＨ２Ｏを加え、遠心。
血漿バックグラウンドコントロール：０．７ｍｌの血漿＋ＰＢＳ（０．３ｍｌ）、１００℃で１分間加熱、１ｍｌのＨ２Ｏを加え、遠心。
熱処理ありの参照ペプチド：ペプチド原液（０．３ｍｌ）＋０．７ｍｌのＰＢＳ、１００℃で１分間加熱、１ｍｌのＨ２Ｏを加える。
熱処理なしの参照ペプチド：ペプチド原液（０．３ｍｌ）＋０．７ｍｌのＰＢＳ＋１ｍｌのＨ２Ｏ。
結果。
ＨＩＰ２（ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ）（配列ＩＤ番号４）  
新しい成分の出現（約５％）によるタンパク質分解の証拠が、ＨＩＰ２インキュベーションのたった１分後に明らかである。その新しい成分は、経時的に増加し続ける。３０分後、それは、約５０％となり、６０分後、その濃度は、約７０％である。主要な代謝産物は、ＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ（配列ＩＤ番号９２）と同定され、このことから、Ｎ末端のイソロイシンが主に喪失されたことが示唆される。さらに、ＩＧＬの喪失に起因する少量のＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ（配列ＩＤ番号９３）の存在についても証拠がある。
【０２３２】
ＨＩＰ２Ｂ（Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号７）ＨＩＰ２のＮ−アセチル化Ｃ−アミド型は、３７℃でのインキュベーションの１時間後に、血漿プロテアーゼに対して完全に安定であるとみられる。
【０２３３】
ＨＩＰ３（ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＥ）（配列ＩＤ番号３）ＨＩＰ３のタンパク質分解は、ＨＩＰ２のタンパク質分解よりも遅い。６０分後、ＨＩＰ３の開始濃度は、約５０％である。同定された主要な代謝産物は、ＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧ（配列ＩＤ番号９３）であり、このことから、ＩＧの喪失が示唆される。
【０２３４】
ＨＩＰ３Ｂ（Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＥ−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号５）ＨＩＰ３のブロック型は、血漿インキュベーションの１時間まで完全に安定である。
【０２３５】
ＨＩＰ２ＢＣｙｓ−二量体（Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ−ＮＨ２）２（配列ＩＤ番号１９）
この化合物は、少なくとも１時間にわたって、血漿プロテアーゼに対して安定であるとみられる。しかしながら、インキュベートされたサンプルの１００℃の熱処理ならびにＴ＝０コントロールから、出発物質が、Ａｃ−ＩＧＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ（Ｃ）−ＮＨ２（配列ＩＤ番号９４）という構造を有するシスチン付加物に変換したことが示唆された。
【０２３６】
変換は、サンプルが１００℃に加熱されるときの、血漿からのシステインによる置換に起因するとみられる。
【０２３７】
ＨＩＰ２ＢＣｙｓ−ＰＥＧ（Ａｃ−ＩＧＬＨＤＰＴＱＧＴＥＰＮＧＣ（ＰＥＧ）−ＮＨ２）（配列ＩＤ番号２２）。この高分子構築物は、１時間まで血漿プロテアーゼに対して安定である。
【０２３８】
結果。血漿中のＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂペプチドのタンパク質分解を図８に示す。ＨＩＰ２の結果は、血漿中でのインキュベーションのたった１分後に新しい成分の出現（約５％）を示した。この新しい成分は、経時的に増加し続け、再提示し、そして主要な代謝産物は、第１にＮ末端のイソロイシンが喪失しており、第２に最初の３つのアミノ酸が喪失しているＨＩＰ２配列と同定される。ＨＩＰ２Ｂは、３７℃でのインキュベーションの１時間後に、血漿プロテアーゼに対して完全に安定であるとみられた。ＨＩＰ２ＢおよびＨＩＰ３Ｂと呼ばれるＨＩＰ２およびＨＩＰ３のブロック型は、１時間まで、ブロックされていない構造よりも血漿プロテアーゼに対して明らかに安定である。ＨＩＰ２Ｂの二量体およびＰＥＧ誘導体もまた非常に安定である。
【実施例７】
【０２３９】
ＰＡＮＣ−１として知られるヒト膵臓類上皮細胞由来の確立された不死化ヒト細胞株を生育する手法を利用して、インスリン産生に対するＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰの影響のインビトロでの影響を評価した。この細胞株は、適切なシグナル伝達において他の膵臓細胞タイプに分化する能力を証明している。ゆえに、膵臓の天然に存在する前駆細胞に対する代理としてＰＡＮＣ−１細胞を用いた。
【０２４０】
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地が入ったＴ７５フラスコにＰａｎｃ−１細胞を播種した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、次いで、１６７ｎＭという最終濃度のＨＩＰで処理した。この処理を１日に１回、４日間にわたって行った。第５日目に、細胞を破壊することにより、細胞溶解物を得た。これらの細胞抽出物において、総タンパク質レベルを測定し、５０マイクログラムの総タンパク質を使用して、ウエスタンブロット解析を行った。５０マイクログラムのタンパク質を含むサンプルを、５％の還元剤ベータ−メルカプトエタノールを含むか、または含まないローディング緩衝液に希釈し、ゲルの各ウェルに充填した。電気泳動およびニトロセルロース膜へのタンパク質の転写の後、１次抗体としてポリクローナルニワトリ抗インスリン抗体（ａｂ１４０４２，１／２０００希釈）および２次抗体としてウサギポリクローナル−ＨＲＰ結合体化抗ニワトリ（ＮＩＴゲルの場合１／１０００希釈およびＰＡＮＣ−１ゲルの場合１／２０００）を使用することによって、インスリンの存在を検出した。
【０２４１】
図９は、ＨＩＰ及び最適化されたＨＩＰとのインキュベーションに応答したＰＡＮＣ−１細胞からのヒトインスリンの発現を示しているウエスタンブロット解析である。Ａと表示されている下のパネルは、サンプルを非還元条件において充填したときのＰａｎｃ−１細胞におけるインスリンに対するバンドを示している。この結果は、ＨＩＰ２、ＨＩＰ２Ｂ、およびＨＩＰ２二量体型が、ＨＩＰ２ＰＥＧ化型またはコントロールよりも多くのインスリン産生を刺激することを示唆している。還元条件では、インスリン内の２本のポリペプチド鎖を接続しているジスルフィド結合が還元されるので、該鎖は分離し、この条件では、インスリン抗体は、インスリンと反応しない。非還元条件と対照的に、該インスリン分子は、完全であり、前記抗体によって認識される。
【０２４２】
図９Ｂは、図９Ａにおけるものと同じ膜に含まれている総タンパク質を示している。ポンソー染色を介する総タンパク質のレベルの測定は、様々なレーンが、同様の量のタンパク質を含んでいることを証明している。ＮＩＴ−１およびＰＡＮＣ−１細胞における総タンパク質レベルを測定し、５０マイクログラムの総タンパク質を使用して、ウエスタンブロット解析を行った。５０マイクログラムのタンパク質を含むサンプルを、５％の還元剤ベータ−メルカプトエタノールを含むか、または含まないローディング緩衝液に希釈し、ゲルの各ウェルに充填した。
【０２４３】
ポンソー染色は、インスリン発現の差が、様々なＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰに対応し、ウェルに充填されたタンパク質の量に関係しないことを証明している。インスリンに対するシグナルを欠いていること（例えば、還元条件における膜）もまた、タンパク質を欠いていることに起因しない。
【実施例８】
【０２４４】
ＰＡＮＣ−１細胞株の細胞形態に対するＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰペプチドの作用。前記細胞を、ＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰペプチドで４日間処理した。第７日目に２００倍の倍率で撮影された図１０Ａでは、コントロール条件と、組織学的に分化した細胞とともにＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰＳで処理された細胞との間に形態学的差異が、特に、ＨＩＰ２Ｂ処理細胞において見られる。図１０Ｂは、７日間にわたる細胞の形態の変化の経過を示しており、上段がコントロール、中段がＨＩＰ２、下段がＨＩＰ２Ｂである。写真は、第１、２、３、５、および７日目に２００倍の倍率で撮影された。コントロール処理細胞は、いかなる変化も起こさないとみられたが、ＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂで処理された細胞は、最初の様相から著しく逸脱している。図１０Ｃは、ＰＡＮＣ−１細胞培養中にＨＩＰ２二量体およびＨＩＰ２ＰＥＧを処理したときの、形態学的変化の経過を示している。全体的に見て、コントロール処理細胞は、いかなる著しい視覚的変化も起こさなかったが、ＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂで処理された細胞は、それらの最初の様相から著しく逸脱している。
【実施例９】
【０２４５】
ヒト膵臓組織培養物におけるＨＩＰ２Ｂ活性。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｌａｂは、ヒト膵管細胞培養物におけるＨＩＰおよび最適化されたＨＩＰペプチドの影響を証明した。ヒト膵臓細胞の管画分を、コラーゲンマトリックスにおいて１０日間培養し、次いで、ＨＩＰ２Ｂで１日おきに処理した。管組織に対するマーカーであるＣＫ１９ならびに核およびインスリンを示すＤＡＰＩ染色のために、細胞を二重抗体染色によって標識した。図１１に示されるように、細胞は、他のインスリン陰性細胞においてインスリン発現を誘導する形態学的変化を起こした。
【実施例１０】
【０２４６】
非肥満糖尿病モデルにおけるＨＩＰおよび最適化されたＨｉｐペプチドの影響のパイロットデータ。
【０２４７】
膵島の質量、面積および数の増加に関するＳＴＺ処置マウスにおけるデータ（上記）と一致して、パイロットＮＯＤマウスモデルは、３９日間のＨＩＰ処理の後のマウスにおいてＣ−ペプチドレベルによって判断される、膵島新生に関してより良好な有効性を提供する最適化されたＨＩＰに対する潜在能力の予備的な証拠を証明した。
【０２４８】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）モデルを、１型自己免疫性糖尿病に対するモデルとして使用する。この形態の糖尿病は、膵臓およびインスリン産生に対する根源的な損傷が、自己免疫性の攻撃に起因するという点で、最も困難である。ゆえに、この形態の糖尿病において決定的な膵島新生を示すために、ＨＩＰと併用して免疫寛容剤を使用しなければならない。ＮＯＤマウスの多くが、一過性に糖尿病になるだけで、緩解に入り得るのに対し、他は、重篤な糖尿病を発症するので、ＮＯＤマウスモデルは、極めて難しいモデルである。このトランスジェニックマウスモデルにおける介入のタイミングは、決定するのが困難である。
【０２４９】
免疫寛容剤である開発中のリソフィリン（ＬＳＦ）を利用する予備的研究において、糖尿病になった３匹のＮＯＤマウスをプラセボ＋ＬＳＦ、ＨＩＰ２＋ＬＳＦ、およびＨＩＰ２Ｂ＋ＬＳＦにランダム化した。図１２に示されるように、適切な時点にＬＳＦを投与された群のうち、この研究全体を通してグルコースが徐々に増加していたＬＳＦ単独で処置されたＮＯＤマウスに対して、ＨＩＰで処置された２匹は、この研究中、着実に改善されたグルコースレベルで反応した。統計学的に有意な研究ではないが、これらのデータは、１型糖尿病に対して免疫寛容剤とＨＩＰとの併用の研究に対して非常に有力な証拠を提供する。
【実施例１１】
【０２５０】
ＨＩＰ受容体に対するＨＩＰ２ＢおよびＨＩＰ２の影響。以下の研究セットは、ＨＩＰ２Ｂが、ＨＩＰに対する細胞膜受容体との相互作用および受容体から核への輸送においてＨＩＰ２と同程度に有効であることを証明している。ヒト膵島形成促進性ペプチドに対する受容体を、安定なヒト膵臓細胞株において二重抗体法を用いて標識した。１次抗体は、ウサギポリクローナルであり、２次抗体は、Ｃｙ３蛍光色素で標識されたヤギ抗ウサギであった。
【０２５１】
これらの細胞は、通常、無血清培地中で生育され、トリプシンで処理されると、不安定化し、発生的な変化を起こすのに適格性となる。ＨＩＰを含むおよび含まない無血清培地（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ：ＳＦＭ）中、ならびにトリプシンを含む無血清培地（ＴＳＦＭ）中で細胞を培養した。これは、単に不安定化することが、発生的な変化を活性化しないことを示すためである。
【０２５２】
安定な条件下においてＨＩＰで処理するとき、変化は生じない。発生的に適格性の条件下においてＨＩＰで処理すると、標識された受容体は、細胞膜によって被包され、分化に対するシグナルが受け取られる核膜に移動することによって、ＨＩＰの存在に反応する。
【０２５３】
安定な条件下においてＨＩＰで処理するとき、変化は生じない。発生的に適格性の条件下においてＨＩＰで処理すると、標識された受容体は、細胞膜によって被包され、分化に対するシグナルが受け取られる核膜に移動することによって、ＨＩＰの存在に反応する。
【０２５４】
図１３は、トリプシンで処理され、無血清培地中でインキュベートされたＰＡＮＣ−１細胞が膵島細胞凝集物に分化することを証明している。ＨＩＰ受容体は、ヒト膵臓細胞の分化中、アップレギュレートされ、ＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂと相互作用するとみられ、ＨＩＰ受容体と相互作用する。ＨＩＰ２および最適化されたＨＩＰ２Ｂは、細胞膜上のＨＩＰ受容体から、インスリンを産生する新しい膵島への膵臓前駆細胞の分化を刺激する細胞の核への輸送を刺激した。
【０２５５】
図１４は、４８時間にわたる（Ａ）ＴＳＦＭ単独および（Ｂ）１５０μＭ（最適化されたＨＩＰ２Ｂ）を含むＴＳＦＭにおける、Ｃｙ３で標識されたウサギ抗ヒトＨＩＰ受容体抗体を示している。ＨＩＰは、膜結合型の受容体タンパク質が細胞膜によって包み込まれて核膜に輸送されるように刺激する。
【０２５６】
図１５は、ＨＩＰ受容体（ＥＸＴＬ３）に対する最適化されたＨＩＰ２Ｂの影響に関する反復された免疫蛍光解析を示している。上のパネルは、ＥＸＴＬ３のＣｙ３蛍光免疫染色によって示されている（赤色）。下のパネルの像では、ＥＸＴＬ３のＣｙ３免疫染色が、核を染色しているＤＡＰＩ（青色）と重ね合わされている。細胞を、コントロールとして標準的な成長培地中で生育し、ＨＩＰの存在下または非存在下の無血清培地（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ：ＳＦＭ）中で生育された細胞と比較した。黄色の矢印は、標準的な成長培地中で成長したＥＸＴＬ３の表面での発現の例を示している。細胞の境界が、詳細に明らかにされ、原形質膜上でのＥＸＴＬ３の表面での発現が示唆される。黄色の矢印は、細胞の境界を表しており、核は、青色で示されている。真ん中の像は、ＳＦＭ中で成長した細胞である。ＥＸＴＬ３は、細胞質のＣｙ３染色によって示されるように細胞質に局在化している。緑色の矢印は、核の位置の染色を欠いていることを示している。ＳＦＭ中で成長した細胞の下段の像における緑色の矢印は、核にＥＸＴＬ３が存在しないことを示唆する核の強い青色のＤＡＰＩ染色を示している。ＳＦＭおよびＨＩＰ中で成長した細胞の上段の像において、青色矢印によって示されている核におけるＥＸＴＬ３免疫染色の存在は、核へのＥＸＴＬ３のトランスロケーションを示唆する。ＳＦＭおよびＨＩＰ中で成長した細胞の下段の像において、青色矢印は、核の位置を示している。下段の像では、ＥＸＴＬ３−Ｃｙ３染色と核のＤＡＰＩ染色が重ね合わされており、これは、ＥＸＴＬ３の核の局在化の確証となる（青色矢印）。スケールバー＝すべての像において２０μｍ。
【０２５７】
図１６は、最適化されたＨＩＰ２Ｂが、ＰＡＮＣ−１細胞において細胞膜から核へのＨＩＰ受容体（ＥＸＴＬ３）のトランスロケーションを増強することを示している。記載の時点において単離されたサイトゾルおよび核の画分中のＨＩＰ（ＥＸＴＬ３）レベルのウエスタンブロット解析。ウエスタンブロット解析は、ＨＩＰを含まないＳＦＭ中で培養した６時間後に、ＨＩＰ受容体（ＥＸＴＬ３）のより高い核レベルが観察されたことを証明している。培養液にＨＩＰ２およびＨＩＰ２Ｂを加えることによって、ＥＸＴＬ３の核へのトランスロケーションが増強され、これは、３０分後におけるこのタンパク質のより高い核レベルによって証明される。これらの比較は、ＨＩＰの存在下において細胞質の区画から核へのＥＸＴＬ３のトランスロケーション時間が増加すること、およびＥＸＴＬ３の核へのトランスロケーションが、ＨＩＰの両方の存在によって調節され得ることを証明する。ウエスタンブロットは、これらの細胞および時点を用いて、繰り返された結果である。
【実施例１２】
【０２５８】
プラセボに対するＨＩＰ２、ＨＩＰ２Ｂのランダム化プラセボ対照試験において、８０（８０）匹のマウスをＳＴＺで処置することにより、糖尿病を誘導した。糖尿病の発症と一致する高血糖症のレベルに達するまで、マウスをモニターした。介入マウスに対するベースラインのグルコースレベルは、平均３００＋／−６ｍｇ／ｄＬであり、ＨＩＰ介入群とプラセボ群間にグルコースレベルの統計学的有意差はなかった（ｐ＝０．３０１）。
【０２５９】
３６日後、すべてのＨＩＰ処置マウスが、インスリンから離脱し、グルコースは、プラセボ群と比べて有意に低下の傾向を示す。ランダムに選択されたマウスを、膵臓に対する免疫組織化学のために研究の経過中に屠殺した。血清に対するＣ−ペプチド解析は、進行中である。介入の３９日後、残りのマウスを、次の６０日間にわたって毎日グルコースレベルおよび全般的な健康状態について試験することにする。
【０２６０】
予備的な評価は、ＨＩＰ処置が、プラセボと比べて３８．７％の低下をもたらすこと（ｐ<０．０５）を証明している。さらに、ＨＩＰ２ＢをもたらすＨＩＰ２の安定化は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
【０２６１】
図１７に示されるように、ＨＩＰ処置は、プラセボよりも１１６ｍｇ／ｄＬ低いグルコースレベルをもたらした（↓３８．７％ｐ<０．０５）。すべてのＨＩＰ処置マウスが、インスリンから離脱した。ＨＩＰ処置マウスの５６％（９／１６）が、<２３０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有した。プラセボ処置マウスの９％（１／１１）が、<２３０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有した。ＨＩＰ２Ｂは、３７度の血清中のインビトロにおいて有意に安定である。ＨＩＰ２Ｂは、食塩水中でも長い半減期を有する。ＨＩＰ２Ｂを形成するＨＩＰ２に対する改変は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
【０２６２】
ＨＩＰ２Ｂの治療上の潜在能力を評価するために、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスモデルを利用した。糖尿病にするために、連続した５日間にわたって６０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、クエン酸緩衝液，ｐＨ４．５中のＳＴＺを５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。血糖値が連続した２日間にわたって≧２００ｍｇ／ｄｌとなったとき、マウスを研究にランダム化した。尾の先端に入れた切り目から採取された１滴の血液を用いて、血糖を毎日モニターした。グルコースメーターを用いて、グルコース測定値を決定した。任意の動物における血糖値が≧３２４ｍｇ／ｄＬに上昇した場合、血糖が３２４ｍｇ／ｄＬ未満に低下するまで、該動物をインスリンで処置した（１単位／日、グラルギンインスリン、筋肉内）。インスリン投薬の記録をつけたので、インスリン必要量の比較を行うことができた。さらに３匹の動物は、ＳＴＺで処置せず、非糖尿病のベースライン値を立証するために用いた。
【０２６３】
表４に示されるように動物を３つの群に割り当てた。糖尿病動物に、連続した３９日間にわたって１日２回（午前および午後）、ビヒクルコントロール、ＨＩＰ２（３００μｇ）、またはＨＩＰ２Ｂ（３００μｇ）を腹腔内注射した。各治療群（群１〜３）のマウスを第３９日目に屠殺した。屠殺する前の晩に、すべてのマウスを絶食させ、朝のグルコースレベルを屠殺の前に測定し、それを空腹時グルコースレベルとみなした。第４０〜６０日目は、医学的介入なしに残りの動物群を維持した。毎朝、それらの動物のグルコースを測定し、適切なときにインスリン投与した。研究のエンドポイントは、以下：１）血糖の変化および２）インスリン必要量の変化を含んだ。
【０２６４】
【表４】
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【０２６５】
この研究の間、ＨＩＰ２群とＨＩＰ２Ｂ群の両方の血糖値が、コントロール群から有意に低下した。しかしながら、２つのＨＩＰ群間に血糖値の差はなかった。図１７は、第３６日目まで、ＨＩＰ２Ｂを形成するＨＩＰ２に対する改変がインビボにおいて活性を低下させなかったことを証明している。ＨＩＰ処置は、プラセボより１１６ｍｇ／ｄＬ低いグルコースレベルをもたらした（↓３８．７％ｐ<０．０５）。すべてのＨＩＰ処置マウスが、インスリンから離脱した。ＨＩＰ処置マウスの５６（５６）％（９／１６）が、<２３０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有した。プラセボ処置マウスの９（９）％（１／１１）が、<２３０ｍｇ／ｄＬのグルコースレベルを有した。
【０２６６】
図１７は、ＨＩＰ２、ＨＩＰ２Ｂ、およびプラセボを投与した後のＳＴＺ−糖尿病マウスモデルにおける毎日の平均グルコースレベルを表しているグラフである。平均ベースライングルコースレベルは、３００ｍｇ／ｄＬ±２ｍｇ／ｄＬであり、プラセボ群とＨＩＰ処置群間に有意差はなかった（ｐ＝０．３０１）。
【０２６７】
図１８は、ＨＩＰ２Ｂ処置群（緑色）およびコントロール群（紫色）およびプラセボ群のマウスの毎日のグルコースレベルを表しているグラフである。各群の直線の傾き（図１８）は、グルコースレベルの変化の速度を表しており、これを本発明者らは「再生速度」と呼ぶ。ＨＩＰ２Ｂ処置は、第１〜３９日目の研究の間、＋０．３８１というグルコースの増加速度を有したプラセボ処置群内のレベルにおけるグルコースの増加速度と比べて、−０．６０２というグルコースレベルの低下速度（再生速度）をもたらした。
【０２６８】
図１９は、ＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびプラセボを比較する研究の第１日目と第３８日目間のグルコースの差を示している。図１９は、介入の開始時および終了時における、最適化されたＨＩＰ２Ｂレシピエント（黄色）、ＨＩＰ２（緑色）、およびコントロール（青色）処置群のマウスにおける改善されたグルコースコントロールを証明している。コントロール群は、ベースラインから３３４．６ｍｇ／ｄＬに２８．９ｍｇ／ｄＬだけ平均増加を有した。ＨＩＰ２Ｂ群およびＨＩＰ２群は、ＨＩＰ２Ｂ群において２３５．３ｍｇ／ｄＬという平均非空腹時グルコース（コントロールに対してｐ＝０．０２４）、ＨＩＰ２群において２３１．６ｍｇ／ｄＬ（コントロールに対してｐ＝０．０２９）というベースラインからの有意な低下を有した。
【０２６９】
図２０は、処置群間の研究終了時における空腹時グルコースレベルを示している。最適化されたＨＩＰ２Ｂ処置群は、研究の終了時に、２５８．００±８４．５ｍｇ／ｄＬという平均空腹時グルコースを有したプラセボ処置コントロールと比べて、１０６．７ｍｇ／ｄＬ±０．５８ｍｇ／ｄＬ（ｐ＝０．０４６）という空腹時グルコースを有した。ブロックされていないＨＩＰ２処置マウスは、プラセボ処置群と比べて、１１５．３ｍｇ／ｄＬ±１６．５ｍｇ／ｄＬ（ｐ＝０．０５０）という平均空腹時グルコースを有した。
【０２７０】
図２１は、処置の過程の後かつ屠殺の前の動物において行われた耐糖能試験の結果を示している。最適化されたＨＩＰ２Ｂは、３７度の血清中のインビトロにおいて有意に安定である。最適化されたＨＩＰ２Ｂは、食塩水中でも長い半減期を有する。ＨＩＰ２Ｂを形成するＨＩＰ２に対する改変は、インビボにおいて活性を低下させなかった。
【実施例１３】
【０２７１】
ＨＩＰ２Ｂの治療上の潜在能力および血糖コントロールを有意に改善するのに必要なＨＩＰ２Ｂの最低有効用量を評価するために、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスモデルを利用した用量反応研究を行った。
【０２７２】
図２２は、最大の有効性をもたらす最小の可能投薬量を決定するために、マウスの糖尿病モデルにおいて様々な投薬量で送達されたときの、グルコースコントロールに対する最適化されたＨＩＰ２Ｂの作用を評価および比較するために行われたＨＩＰ２Ｂの用量反応解析の結果を示している。本研究は、ＳＴＺ処置マウスモデルにおける、血糖コントロールおよび糖尿病の減弱に対する５つの濃度のＨＩＰ２Ｂの影響を決定するためのランダム化された試験だった。処置群は、１００μｌの等張性食塩水中、最大１０００マイクログラムのＢＩＤから、０．１マイクログラムのＢＩＤの範囲の最適化されたＨＩＰ２Ｂだった。６つの研究群を下記に列挙する。
【０２７３】
【表５】
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【０２７４】
マウスにおける摂食パターンとは無関係に、マウスのグルコースレベルをおよそ０９００〜１１００に毎日確認した。毎日のグルコース測定時間における潜在的なグルコースの変動が理由で、５日間の移動平均グルコース値を各処置群において毎日計算した。ＨＩＰ２Ｂ濃度の影響を１）平均グルコースレベルおよび２）コントロール群と比べて介入群間の、血糖可動域によって判定される様々な濃度のＨＩＰ２Ｂがグルコース毒性の発生を減弱する程度によって評価した。
【０２７５】
図２２は、ＳＴＺ処置マウスにおいて行われた用量反応研究を示しており、１０、１００、および１０００マイクログラムのＢＩＤで処置された糖尿病マウス間の有効性が、等しいことを確認している。１ｍｇ／ｋｇ未満の投薬（０．１および０．０１ｍｇ／ｋｇ用量レベルに対応する）では、マウスにおける有効性シグナルが低下した。
【０２７６】
最適化されたＨＩＰ２Ｂは、糖尿病を処置するためのインスリンなどの従来の治療と多くの方法において異なるものである。ＨＩＰ２Ｂは、膵島新生をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。反応の有効性がその即時のグルコース低下能力によって主に測定されるインスリンとは対照的に、任意の膵島新生剤の薬力学的反応は、数日および数週間にわたって測定される。したがって、ＨＩＰ２ＢおよびＩＮＧＡＰなどの膵島新生剤の有効性は、繰り返される毎日の投薬後の長期間にわたる血糖コントロールの回復によって評価され得るだけではなく、高血糖症の減弱および／または正常血糖が達成される速度によっても評価され得る。すべてのＨＩＰ処置群が、正常血糖に近づいた。
【０２７７】
用量減弱反応（ｄｏｓｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、糖尿病が減弱される最大の程度と等しい最大の達成可能な反応に伴う平均グルコース変化として計算された。この評価において、本発明者らは、コントロール群の血糖可動域の差と比べて、研究全体を通じての各処置群における最大の血糖可動域の差によって計算される単位用量あたりの反応の変化を報告する。コントロール群は、疾患の減弱が見られず、１００％の疾患誘導に達した。ＨＩＰ２Ｂ用量がこの作用を減弱させた程度は、プラセボ群に対する各処置群における疾患の％減弱として記載される。
【０２７８】
図２３は、様々な濃度のＨＩＰ２Ｂの、糖尿病の減弱に対する影響を示している。３つの最も高い処置レベルの各々は、同程度に糖尿病の重症度を減じた。ＨＩＰの最も低い２つの処置投薬量（０．１および１マイクログラム／日ＢＩＤ送達）は、それらより多い３つの投薬量と同じ最適な反応を示さなかった。
【０２７９】
０．１および１マイクログラムＢＩＤの投薬量レベルにおいて、ＨＩＰ２Ｂ反応は、プラセボに対して疾患の減弱を示した。ＨＩＰ２Ｂ濃度を１０マイクログラムＢＩＤに上昇させると、最も高い有効性および糖尿病の減弱がもたらされた。１０００、１００、および１０マイクログラムＢＩＤという用量レベルでは、糖尿病は、プラセボ群に見られる最大疾患状態の６０〜７０％に減弱した。これらの結果から、本発明者らは、最適な有効性をもたらすＨＩＰ２Ｂの最低用量レベルが、マウスでは１〜１０マイクログラムＢＩＤの範囲であるか、またはヒトでは０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇというヒトでの等価な用量（３０〜６０ｍｇＢＩＤ）であると結論づける。この用量は、第２Ｂ相ＩＮＧＡＰ治験において使用された投薬量（６００ｍｇ／日）の約１／１０である。
【実施例１４】
【０２８０】
最適化されたＨＩＰ２Ｂ構造によって達成されたバイオアベイラビリティの改善を確かめるために薬物動態学的研究に着手した。ＨＩＰ２（図２４）、最適化されたＨＩＰ２Ｂ、およびＩＮＧＡＰの静脈内および皮下への用量の投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、絶対的バイオアベイラビリティおよび薬力学的研究を行った。目的は、２つの異なる投与経路の後の雄ラットにおいて、ＨＩＰ２、最適化されたＨＩＰ２Ｂ、およびＩＮＧＡＰの吸収、絶対的バイオアベイラビリティ、および血漿レベルを測定することだった。
【０２８１】
５匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの６群に、下記の表におけるように、ＨＩＰ２、ＨＩＰ２Ｂ、またはＩＮＧＡＰを静脈内経路および皮下経路によって投与した。
【０２８２】
【表６】
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【０２８３】
１０個の連続した血漿サンプル（各０．０３ｍｌ）を、投薬の５、１０、１５、３０分、４５分、続いて、１、２、３、８、および２４時間後に、１群あたり５匹の動物から頚静脈カテーテルから回収した。血漿を、ＥＤＴＡを含むチューブに回収した。回収後、サンプルを冷パック上で冷却して維持した後、遠心分離し、−７０℃以下で保存するために、予めラベルを付けておいたマイクロチューブに移した。
【０２８４】
各２００μｌのラット血漿サンプルを、１ｍｌのアセトニトリル（０．０７％トリフルオロ酢酸，ＴＦＡ）が入った微小遠心管に加え、ボルテックスミキサーを用いて１分間撹拌した後、遠心分離することにより、沈殿した血漿タンパク質を除去した。上清溶液を取り出し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃを用いて乾燥するまで蒸発させた。その乾燥したペレットが入っている微小遠心管に、２００μｌの２０：８０アセトニトリル：水（０．０７％ＴＦＡを含む）を加えた。そのサンプルを遠心することにより、任意の不溶性物質を除去し、上清溶液をＬＣ／ＭＳＭＳ解析のための分析用バイアルに移した。質量分析計を較正して、ＨＩＰ２Ｂ（Ｍ＝２８６．０）、ＨＩＰ２（Ｍ＝２８７．１）、およびＩＮＧＡＰ（Ｍ＝２１２．２、３５６．１、３７３．９）のそれぞれの参照サンプルの各々に対して観察される最も豊富な娘イオンを検出した。最適化されたＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰ血漿サンプルを、緩衝液ＡとしてＨ２Ｏ中の０．０７％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．０７％ＴＦＡを用いるＣ−１８逆相カラム（５０ｍｍ×２．０ｍｍ，Ｖａｒｉａｎ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  ＸＲＳ３）において解析した。９分間にわたる９８％Ａ／２％Ｂから１００％Ｂに達する線形勾配を０．４ｍｌ／分という流速で用いた。
【０２８５】
以下の血漿コントロールを、上に記載したように処理し、標準的な濃度曲線を確立するために用いた：
１．バックグラウンドコントロールとしてブランク血漿
２．６．７×１０４、６．７×１０３、６．７×１０２、６７および６．７ｎｇ／ｍｌのＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰを含む５つの標準的な血漿サンプル。
【０２８６】
最適化されたＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰの保持されていた投薬サンプルもまた、注射時点の各々の濃度を決定するためにＬＣ／ＭＳＭＳによって解析した。解析によって、２ｍｇ／ｍｌであるという実験誤差内の濃度が確認された。すべての動物が、投薬後のすべての時点において、および各経路の投与後において正常であると見られた。ＨＩＰ２およびＩＮＧＡＰ：ＨＩＰ２の静脈内投与または皮下投与の後、投薬の５分後のみ非常に低レベルのＨＩＰ２が観察され、その後のすべてのサンプルは、定量限界未満だった。ＩＮＧＡＰの静脈内投与または皮下投与の後、測定されたすべての血漿サンプルが、定量下限未満だった。結果として、静脈内投与および皮下投与の後のＨＩＰ２およびＩＮＧＡＰに対する血漿の薬物動態学的パラメータを計算することができなかった。
【０２８７】
ＨＩＰ２Ｂの静脈内投与後、ＨＩＰ２Ｂ血漿濃度は、一相性の様式で低下し、平均消失相（ｍｅａｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｈａｓｅ）血漿半減期は、０．１９時間（１１分）だった。平均Ｃｍａｘは、最初のサンプリング時間である５分において生じた８２３７ｎｇ／ｍｌだった。平均Ｃ０は、１８８０５ｎｇ／ｍｌであると推定された。平均ＡＵＣ０−∞は、２２３１ｎｇ＊ｈｒ／ｍｌだった。見かけの平均血漿クリアランスは、１．９ｌ／時／ｋｇであり、見かけの平均分布容積は、０．４８ｌ／ｋｇだった。
【０２８８】
最適化されたＨＩＰ２Ｂの皮下投与の後、吸収されたＨＩＰ２Ｂは、一相性の様式で低下し、平均消失相血漿半減期は、０．３４時間（２０分）だった。平均ＡＵＣ０−∞は、１９３２ｎｇ＊時／ｍｌだった。見かけの平均Ｃｌ／Ｆは、２．１ｌ／時／ｋｇであり、見かけの平均Ｖ２／Ｆは、１ｌ／ｋｇだった。ＨＩＰ２Ｂの絶対的皮下バイオアベイラビリティは、８７％だった。図２５は、最適化されたＨＩＰ２Ｂの皮下投与の薬物動態である最適化されたＨＩＰ２Ｂ血漿レベルが、２時間まで検出可能であり、ｔ１／２，ｅが、約２０分であったことを示している。
【０２８９】
ＩＮＧＡＰの血漿濃度は、いずれの時点においても検出不可能だったことから、ＩＮＧＡＰが、迅速にクリアランスおよび／または代謝されることが示唆される。最適化されたＨＩＰ２Ｂの血漿レベルは、皮下投与後、ＨＩＰ２またはＩＮＧＡＰよりも有意に高い。観察されたマルチピークのＬＣ／ＭＳクロマトグラフィ血漿プロファイルに基づくと、最適化されたＨＩＰ２Ｂは、インビボにおいてＨＩＰ２およびＩＮＧＡＰよりも迅速に代謝される可能性は非常に低い。ＨＩＰ２Ｂのバイオアベイラビリティは、８７％である。
【０２９０】
図２４は、ＰＫ解析の一部としての、ラット血漿から得られた最適化されたＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰサンプルのＬＣ／ＭＳＭＳ解析を示しており、ここで、ＨＩＰ２Ｂ、ＨＩＰ２、およびＩＮＧＡＰは、皮下にまたは静脈内注射を介して４ｍｇ／ｋｇで投与された。
【０２９１】
皮下投与の後、ＨＩＰ２Ｂレベルは、１．５時間まで検出可能だった。Ｔ１／２は、約０．５時間である。非常に低レベルのＨＩＰ２が、５分後に検出され、５分後の後は、検出されなかった。観察されたマルチピークのＬＣ／ＭＳクロマトグラフィプロファイルに基づくと、最適化されたＨＩＰ２Ｂは、インビボにおいてＨＩＰ２よりも迅速に代謝されない。
【０２９２】
ＩＮＧＡＰの濃度は、いずれの時点においても検出不可能だったことから、迅速にクリアランスおよびまたは代謝されると示唆される。下記の表にこのデータをまとめた。
ＰＫ解析の比較
【表７】
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【０２９３】
本発明者らは、最適化されたＨＩＰ２Ｂの血漿レベルが、皮下投与後にＨＩＰ２またはＩＮＧＡＰよりも有意に高いと結論づける。ＨＩＰ２Ｂ血漿レベルは、ＩＶ投与後に、ＨＩＰまたはＩＮＧＡＰよりも有意に高い。静脈内注射の後、最適化されたＨＩＰ２Ｂは、４５分まで、検出不可能な濃度での時間依存的枯渇を示す。Ｔ１／２は、約９分である。ＨＩＰ２は、５分後の時点でのみ観察され、ＩＮＧＡＰは、いずれの時点においても検出不可能だったことから、両方が、迅速にクリアランスおよびまたは代謝されると示唆される。
【０２９４】
本発明のある特定の好ましい実施形態を参照して、かなり詳細に本発明を説明してきたが、他の変形例もありうる。ゆえに、添付の請求項の精神および範囲は、本明細書内に含まれる説明および好ましい変形例に限定されるべきでない。
【図１】
2014028825.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2014028825.tif 000018
【図６】
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【図７】
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【図８】
2014028825.tif 000021
【図９】
2014028825.tif 000022
【図１０Ａ】
2014028825.tif 000023
【図１０Ｂ】
2014028825.tif 000024
【図１０Ｃ】
2014028825.tif 000025
【図１１】
2014028825.tif 000026
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2014028825.tif 000030
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2014028825000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月8日(2013.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／９６９０１９号（２００７年８月３０日付で出願）、米国仮出願第６０／９７９５２６号（２００７年１０月１２日付で出願）、米国仮出願第６０／９９１９６４号（２００７年１２月３日付で出願）、および米国仮出願第６１／０３１４７９号（２００８年２月２６日付で出願）の利益を主張するものである。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
(先行技術文献)
(特許文献)
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００３５８０３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０２１２０００号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／０１３２６４４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００８４４４９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２４９８０６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／０１９８８３９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／０１８４５０４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００８／０３００１９０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００９／００６８１４５号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９／０１４２３３８号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１０／００９３６０５号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１１／０１７１１７８号明細書
【特許文献１３】米国特許第４４４４８８７号明細書
【特許文献１４】米国特許第４７１６１１１号明細書
【特許文献１５】米国特許第４７５７０６０号明細書
【特許文献１６】米国特許第４８１６３９７号明細書
【特許文献１７】米国特許第４８１６５６７号明細書
【特許文献１８】米国特許第５２２３４０９号明細書
【特許文献１９】米国特許第５２２５５３９号明細書
【特許文献２０】米国特許第５４０３４８４号明細書
【特許文献２１】米国特許第５４２７９０８号明細書
【特許文献２２】米国特許第５４３６１６９号明細書
【特許文献２３】米国特許第５５１６６３７号明細書
【特許文献２４】米国特許第５５３０１０１号明細書
【特許文献２５】米国特許第５５６５３３２号明細書
【特許文献２６】米国特許第５５７１６９８号明細書
【特許文献２７】米国特許第５５８０７１７号明細書
【特許文献２８】米国特許第５５８０８５９号明細書
【特許文献２９】米国特許第５５８５０８９号明細書
【特許文献３０】米国特許第５６３１２２４号明細書
【特許文献３１】米国特許第５６５８７２７号明細書
【特許文献３２】米国特許第５６９８４２６号明細書
【特許文献３３】米国特許第５７３３７４３号明細書
【特許文献３４】米国特許第５７５０７５３号明細書
【特許文献３５】米国特許第５７６６８８６号明細書
【特許文献３６】米国特許第５７８０２２５号明細書
【特許文献３７】米国特許第５８０７７１５号明細書
【特許文献３８】米国特許第５８２１０４７号明細書
【特許文献３９】米国特許第５８３４５９０号明細書
【特許文献４０】米国特許第５８４０５３１号明細書
【特許文献４１】米国特許第５９５９０８６号明細書
【特許文献４２】米国特許第５９６９１０８号明細書
【特許文献４３】米国特許第６３１１４１５号明細書
【特許文献４４】米国特許第６４０７２１３号明細書
【特許文献４５】米国特許第６６４５９３４号明細書
【特許文献４６】米国特許第６９４６１５１号明細書
【特許文献４７】米国特許第７１６６４３９号明細書
【特許文献４８】米国特許第７３９３９１９号明細書
【特許文献４９】米国特許第７７１４１０３号明細書
【特許文献５０】米国特許第７９８９４１５号明細書
【特許文献５１】米国特許第ＲＥ３９０６２号明細書
【特許文献５２】米国特許第ＲＥ３９２９９号明細書
【特許文献５３】欧州特許第１３２９４５８号明細書
【特許文献５４】欧州特許第２３９４００号明細書
【特許文献５５】欧州特許第５１９５９６号明細書
【特許文献５６】欧州特許第５９２１０６号明細書
【特許文献５７】国際公開第１９９０／００２８０９号
【特許文献５８】国際公開第１９９１／０１６４２８号
【特許文献５９】国際公開第１９９１／０９９６７号
【特許文献６０】国際公開第１９９１／１０７３７号
【特許文献６１】国際公開第１９９１／１０７４１号
【特許文献６２】国際公開第１９９２／０１０４７号
【特許文献６３】国際公開第１９９２／１８６１９号
【特許文献６４】国際公開第１９９２／２２３２４号
【特許文献６５】国際公開第１９９３／１１２３６号
【特許文献６６】国際公開第１９９３／１７１０５号
【特許文献６７】国際公開第１９９５／１５９８２号
【特許文献６８】国際公開第１９９５／２０４０１号
【特許文献６９】国際公開第１９９６／１９２３６号
【特許文献７０】国際公開第１９９６／２６２１５号
【特許文献７１】国際公開第１９９６／３３７３５号
【特許文献７２】国際公開第１９９６／３４０９６号
【特許文献７３】国際公開第１９９７／１３８４４号
【特許文献７４】国際公開第１９９８／１６６５４号
【特許文献７５】国際公開第１９９８／２４８９３号
【特許文献７６】国際公開第１９９８／４６６４５号
【特許文献７７】国際公開第１９９８／５０４３３号
【特許文献７８】国際公開第２００３／０９４９５８号
【特許文献７９】国際公開第２００３／１０５８９７号
【特許文献８０】国際公開第２００６／０９６５６５号
【特許文献８１】国際公開第２００６／１２８０８３号
【特許文献８２】米国特許出願公開第２００７／０８７９７１号明細書
【特許文献８３】欧州特許第０３０３２３３号明細書
【特許文献８４】国際公開第０３／０３３８０８号
【特許文献８５】米国特許出願公開第２００７／００８７９７１号明細書
【特許文献８６】米国特許出願公開第２０１１／００８２０８０号明細書
【特許文献８７】米国特許第７，５７６，１２１号明細書
【特許文献８８】欧州特許出願公開第０３０３２３３号明細書
【特許文献８９】欧州特許出願公開第２５５９７００号明細書
【特許文献９０】国際公開第２００３／０３３８０８号
【特許文献９１】国際公開第２００５／０３５７６１号
【特許文献９２】国際公開第２００６／０５９１０６号
【特許文献９３】国際公開第２００６／１２８０８２号
【特許文献９４】国際公開第２００７／１０２５２６号  （非特許文献）
【非特許文献１】ＡＧＡＲＤＨ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ＧＡＤ６５  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ−ｏｎｓｅｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｊ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （２００５）  １９（４）：２３８−２４６
【非特許文献２】ＡＭＥＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｆａｂｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｔｏ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９５）  １８４：１７７−１８６
【非特許文献３】ＡＮＤＥＲＳＥＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （１９７８）  ６２：１５２−１６１
【非特許文献４】ＡＴＨＥＲＴＯＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８９）  （ＴＯＣ）
【非特許文献５】ＡＵＳＵＢＥＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ  （２００８）  （ＴＯＣ）
【非特許文献６】ＡＵＳＵＢＥＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ  （１９９２）  （ＴＯＣ）
【非特許文献７】ＢＡＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９７）  ２７２（１６）：１０６７８−１０６８４
【非特許文献８】ＢＡＣＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｓｌｅｔ  Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎ．  （２００１）  １９：１３１−１６１
【非特許文献９】ＢＥＴＴＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８８）  ２４０：１０４１−１０４３
【非特許文献１０】ＢＩＲＯＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ３１０−Ｈｅｌｉｘ  ｉｓ  Ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ  ｂｙ  ａ  １３−Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｏｎ  ｇｐ４１，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００２）  ４１（４２）：１２６８７−１２６９６
【非特許文献１１】ＢＩＴＴＥＲ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７）  １５３：５１６−５４４．
【非特許文献１２】ＢＯＮＤＡＮＳＺＫＹ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  （１９９３）  （ＴＯＣ）
【非特許文献１３】ＢＯＮＮＥＲ−ＷＥＩＲ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００４）  ５  （Ｓｕｐｐｌ  ２）：１６−２２
【非特許文献１４】ＢＲＩＮＫＭＡＮＮ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９５）  １８２：４１−５０
【非特許文献１５】ＢＵＲＴＯＮ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９４）  ５７：１９１−２８０
【非特許文献１６】ＢＵＳＥ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｙｌｉｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｒａｍｌｉｎｌｉｄｅ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ：  Ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｌｌｉｎ．  Ｄｉａｂ．  （２００２）  ２０：１３７−１４４
【非特許文献１７】ＣＡＬＤＡＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｅｍｉ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ＣＤ１８  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  （２０００）  １３（５）：３５３−３６０
【非特許文献１８】ＣＡＳＴＥＥＬＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｏｂｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｌａｔｅ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉｃ  Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  １，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｏｎｏｌｏｇｙ  （１９９８）  １３９（１）：９５−１０２
【非特許文献１９】ＣＯＣＫＥＴＴ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９０）  ８：６６２−６６７
【非特許文献２０】ＣＯＬＢＥＲＥ−ＧＡＲＡＰＩＮ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８１）  １５０：１−１４
【非特許文献２１】ＣＯＵＴＯ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ＢＡ４６  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｃ３：  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （１９９５，）  ５５（８）：１７１７−１７２２
【非特許文献２２】ＣＯＵＴＯ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （１９９５）  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ
【非特許文献２３】ＣＲＥＵＴＺＦＥＬＤＴ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＧＩＰ）  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （１９８０）  ２９（２）：１４０−１４５
【非特許文献２４】ＣＲＥＵＴＺＦＥＬＤＴ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｐｔ，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （１９８５）  ２８：５６５−５７３
【非特許文献２５】ＣＲＥＵＴＺＦＥＬＤＴ、Ｔｈｅ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  Ｔｏｄａｙ，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （１９７９）  １６：７５−８５
【非特許文献２６】ＤＡＶＩＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＨＤＶ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｏｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｊ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐ．  （２００１）  １５（５）：２２７−２３３
【非特許文献２７】ＤＥＬＯＶＩＴＣＨ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｎｏｎｏｂｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ：  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ＮＯＤ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （１９９７）  ７：７２７−７３８
【非特許文献２８】ＤＩＣＥＳＡＲ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｓ  Ｍｏｒｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｔｈａｎ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （Ｊａｎ．  ２００６）  ２９（１）：１７４
【非特許文献２９】ＤＵＰＲＥ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｓｔｃｉｂａｌ  Ｇｌｙｃｅｍｉｃ  Ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （２００４）  ８９（７）：３４６９−３４７３
【非特許文献３０】ＤＵＰＲＥ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （１９７３）  ３７：８２６−８２８
【非特許文献３１】ＥＢＥＲＴ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｃｌｉｎ．  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  （１９８０）  ９（３）：６７９−６９８
【非特許文献３２】ＥＤＷＡＲＤＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １  Ｈａｓ  ａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （１９９９）  ４８：８６−９３
【非特許文献３３】ＥＬＡＨＩ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  α−  ａｎｄ  β−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＧＩＰ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍａｎ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９７９）  ２３７：Ｅ１８５−Ｅ１９１
【非特許文献３４】ＥＬＡＨＩ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＩＰ）  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  （７−３７）  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ，  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  （１９９４）  ５１（１）：６３−７４
【非特許文献３５】ＦＯＥＣＫＩＮＧ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｇｅｎｅ  （１９８６）  ４５：１０１−１０５
【非特許文献３６】ＧＩＬＬＩＥＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｄ  ｃＤＮＡ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８９）  １２５：１９１−２０２
【非特許文献３７】ＧＲＡＮＴ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，  Ｐｒｏｇ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （Ｆｅｂ．  ２８，  ２００６）  ９２：６５−７９
【非特許文献３８】ＧＵＴＮＩＡＫ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １  Ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  Ｇｌｙｃｅｍｉａ  ｉｎ  ＮＩＤＤＭ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （１９９４）  １７（９）：１０３９−１０４４
【非特許文献３９】ＨＡＩＮＥＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）  ４（１３）
【非特許文献４０】ＨＡＩＮＥＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）  ３（１２）
【非特許文献４１】ＨＡＭＭＥＲＬＩＮＧ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ＮＹ  （１９８１）  （ＴＯＣ）
【非特許文献４２】ＨＡＯ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００６）  １２（３）：３１０−３１６
【非特許文献４３】ＨＡＲＬＯＷ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８８）  （ＴＯＣ）
【非特許文献４４】ＨＥＡＮＥＹ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ２５−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｏｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ１−３，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  （２００３）  ７７：２０４−２１０
【非特許文献４５】ＨＥＲＯＬＤ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈＯＫＴ３γ１  （Ａｌａ−Ａｌａ）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｔ  Ｌｅａｓｔ  ２  Ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  Ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００５）  ５４（６）：１７６３−１７６９
【非特許文献４６】ＨＥＲＯＬＤ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｎｅｗ−Ｏｎｓｅｔ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｉｔｕｓ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  （Ｍａｙ  ２０，  ２００２）  ３４６（２２）：１６９２−１６９８
【非特許文献４７】ＨＯＬＩＣＫ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｉｎａｄｅｑｕａｃｙ  ａｍｏｎｇ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｗｏｍｅｎ  Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  （２００５）  ９０（６）：３２１５−３２２４
【非特許文献４８】ＨＯＬＩＣＫ、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｉｎａｄｅｑｕａｃｙ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒｏｃ．  （Ｍａｒ．  ２００６）  ８１（３）：３５３−３７３
【非特許文献４９】ＨＯＬＳＴ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  −  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （２００１）  ６１（Ｓｕｐ．  ２３４）：７５−８６
【非特許文献５０】ＨＯＰＰ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８（６）：３８２４−３８２８
【非特許文献５１】ＩＬＩＣ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓ  ｔｈｅ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｄｒｏｐ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｗｏｍｅｎ？，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （２０００）  ４３：１３２９−１３３０
【非特許文献５２】ＩＮＯＵＹＥ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｐ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｐｐ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８５）  １３（９）：３１０１−３１０９
【非特許文献５３】Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ／Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２８，  ２００５，  Ｖｏｌ．  ２０，  Ｎｏ．  １，  ｐ．６９−７４
【非特許文献５４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｄａｔｅｄ  ２／２６／２００７  （ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２０６４４）
【非特許文献５５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｄａｔｅｄ  ８／２２／２００８  （ＰＣＴ／ＵＳ２００７／８５３７８）
【非特許文献５６】ＪＡＭＡＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  （Ａｐｒ．  ８，  ２００５）  １２：７０２−７１２
【非特許文献５７】ＪＯＮＥＳ、ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＧＩＰ）  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｅａｌ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  β  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒｅｃｔ．  （Ｎｏｖ．  ６，  １９８９）  ７（４）：２６３−２６９
【非特許文献５８】ＪＯＶＡＮＩＣ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌａｔｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００１）  ２４：１１３０−１１３６
【非特許文献５９】ＫＥＴＴＬＥＢＯＲＯＵＧＨ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９４）  ２４：９５２−９５８
【非特許文献６０】ＫＲＡＲＵＰ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  Ｉｍｍｕｍｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｍｅａｌ  ｉｎ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｔｙｐｅ  １  （Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）  Ｄｉａｂｅｔｉｃｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （Ｊｕｎ．  １９８３）  ５６（６）：１３０６−１３１２
【非特許文献６１】ＫＲＡＲＵＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  β−ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  （１９８７）  ３６（７）：６７７−６８２
【非特許文献６２】ＫＲＡＲＵＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｋｅｔｏｔｉｃ  Ｔｙｐｅ  １  （Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）  Ｄｉａｂｅｔｉｃｓ，  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．  Ｓｃａｎｄ．  （１９８８）  ２２３（５）：４３７−４４１
【非特許文献６３】ＫＲＥＹＭＡＮＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ７−３６：  Ａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｉｎ  Ｍａｎ，  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）  ２：１３００−１３０４
【非特許文献６４】ＫＲＩＥＧＬＥＲ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９０）  （ＴＯＣ）
【非特許文献６５】ＬＡＲＳＥＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｍｕｓｔ  ｂｅ  Ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｆｏｒ  ２４  ｈ／ｄａｙ  ｔｏ  Ｏｂｔａｉｎ  Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  Ｇｌｙｃｅｍｉａ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｈｏ  Ａｒｅ  Ｐｏｏｒｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｏｎ  Ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｕｒｅａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００１）  ２４（８）：１４１６−１４２１
【非特許文献６６】ＬＡＲＳＥＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｅ−Ｗｅｅｋ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＰ−１（７−３７）  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃａｅｍｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ＮＩＤＤＭ，  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ５６ｔｈ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （１９９６）  ４５（Ｓｕｐｐｌ．  ２）：８６０：２３３Ａ  （Ａｂｓｔｒａｃｔ）
【非特許文献６７】ＬＥＲＮＭＡＲＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  （１９９１）  ２０（３）：５８９−６１７
【非特許文献６８】ＬＥＶＥＴＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  ｏｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ  Ａｍｏｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｕｍｐｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００３）  ２６（１）：１−８
【非特許文献６９】ＬＥＶＥＴＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｅｍｉｃ  Ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ，  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ６１ｓｔ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００１）  ５０（Ｓｕｐｐｌ．  ２）：２１０５−ＰＯ：Ａ５０１  （Ａｂｓｔｒａｃｔ）
【非特許文献７０】ＬＥＶＥＴＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ４  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｕｍｐｓ，  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ６２ｎｄ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｊｕｎｅ  ２００２）  ５１（Ｓｕｐｐｌ．  ２）：４２９−Ｐ：Ａ１０６  （Ａｂｓｔｒａｃｔ）
【非特許文献７１】ＬＥＶＥＴＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｇｌｕｅａｇｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ４  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｕｍｐｓ，  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ６２ｎｄ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｊｕｎｅ  ２００２）  ５１（Ｓｕｐｐｌ．  ２）：４７４−Ｐ：Ａ１１７  （Ａｂｓｔｒａｃｔ）
【非特許文献７２】ＬＥＷＩＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｎｏｎｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｏｂｓｔｅｔ．  &  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  （１９７６）  ４８（３）：２６０−２６７
【非特許文献７３】ＬＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｌｅｔ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  （２０００）  １６５：９３−９９
【非特許文献７４】ＬＩＳＴ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌｓ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （２００４）  ２８６（６）：  Ｅ８７５−Ｅ８８１
【非特許文献７５】ＬＯＧＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｌａｔｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９８４）  ８１：３６５５−３６５９
【非特許文献７６】ＬＵＤＶＩＧＳＳＯＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＡＤ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ−Ｏｎｓｅｔ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ３０，  ２００８）  ３５９（１８）：１９０９−１９２０  （ｆｏｒｍｅｒｌｙ  １−１２）
【非特許文献７７】ＬＵＧＡＲＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １  （７−３６  Ａｍｉｄｅ）  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  （２０００）  ３２：４２４−４２８
【非特許文献７８】ＬＹＮＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＧＩＰ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  β  ｃｅｌｌｓ，  ＦＡＳＥＢ  （２００３）  １７：９１−９３
【非特許文献７９】ＭＡＲＱＵＥＺ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｏｓｉｔｏｌｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃａｎｓ  Ｐｏｓｓｉｂｌｙ  Ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１  （７−３６）  ａｍｉｄｅ  ｏｎ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｆｕｎｃｔ．  （１９９８）  １６（１）：５１−５６
【非特許文献８０】ＭＡＴＨＩＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  β−Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｄｅｃ．  ２００１）  ４１４（６８６５）：７９２−７９８
【非特許文献８１】ＭＥＩＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｍａｒｃｈ  ２００４）    ３２（３）：８４８−８５１
【非特許文献８２】ＭＥＮＥＩＬＬＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ３  Ｍｏｎｔｈｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｉｎ  Ｅｌｄｅｒｌｙ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００３）  ２６（１０）：２８３５−２８４１
【非特許文献８３】ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （１９６３）  ８５：２１４９−２１５４
【非特許文献８４】ＭＩＳＨＲＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  α−Ｈｅｌｉｘｅｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９８）  ３７（２８）：１０３１３−１０３２４
【非特許文献８５】ＭＯＲＥＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０００）  ２０（３）：２６７−２７９
【非特許文献８６】ＭＯＲＧＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９３）  ６２：１９１−２１７
【非特許文献８７】ＭＯＲＲＩＳＯＮ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８５）  ２２９：１２０２−１２０７
【非特許文献８８】ＭＵＬＬＩＧＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｎ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８（４）：２０７２−２０７６
【非特許文献８９】ＭＵＬＬＩＧＡＮ，  Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９３）  ２６０：９２６−９３２
【非特許文献９０】ＭＵＬＬＩＮＡＸ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆａｂ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｏｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｐ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （１９９２）  １２（６）：８６４−８６９
【非特許文献９１】ＮＡＵＣＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１−（７−３６）  Ａｍｉｄｅ  Ｉｎｆｕｓｅｄ  ａｔ  Ｎｅａｒ−Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （１９９３）  ７６（４）：９１２−９１７
【非特許文献９２】ＮＡＵＣＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  （ＧＬＰ−１  ［７−３６  ａｍｉｄｅ］）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＮＩＤＤＭ，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （１９９６）  ３９（１２）：１５４６−１５５３
【非特許文献９３】ＯＧＡＷＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００４）  ５３（７）：１７００−１７０５
【非特許文献９４】ＯＨＡＲＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８（３）：１５２７−１５３１
【非特許文献９５】ＯＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （１９８６）  ４（３）：２１４−２２２
【非特許文献９６】ＰＡＤＬＡＮ，  Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｈｉｌｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９１）  ２８（４／５）：４８９−４９８
【非特許文献９７】ＰＥＤＥＲＳＯＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｖ  Ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９４）  ２３５（３）：９５９−９７３
【非特許文献９８】ＰＥＲＳＩＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，  Ｇｅｎｅ  （１９９７）  １８７：９−１８
【非特許文献９９】ＰＯＺＺＩＬＬＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｏｗ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ａｎｄ  １，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  （２００５）  ３７（１１）：６８０−６８３
【非特許文献１００】ＲＡＢＩＮＯＶＩＴＣＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  Ｍｉｃｅ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００２）  ５１：６３８−６４５．
【非特許文献１０１】ＲＡＦＡＥＬＯＦＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＮＧＡＰ）  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （Ｍａｙ  １９９７）  ９９（９）：２１００−２１０９
【非特許文献１０２】ＲＡＺ，  ｅｔ  ａｌ．，  β−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｗ−ｏｎｓｅｔ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＤｉａＰｅｐ２７７）：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ，  Ｌａｎｃｅｔ  （Ｎｏｖ．  ２００１）  ３５８（９２９５）：１７４９−１７５３
【非特許文献１０３】ＲＥＩＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．  （２００５）  ３１：３１８−３２５
【非特許文献１０４】ＲＩＡＣＨＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  １，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （Ｆｅｂ．  ２００６）  １１（２）：１５１−１５９
【非特許文献１０５】ＲＩＥＣＨＭＡＮＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８８）  ３３２：３２３：３２７
【非特許文献１０６】ＲＩＧＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｏｎ  ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｉｕｒｎａｌ  ｒｈｙｔｈｍ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｅｓｉｄｕａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  （１９８０）  １３６：５３７−５４４
【非特許文献１０７】ＲＯＧＵＳＫＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  （Ｏｃｔ．  １９９６）  （１０）：８９５−９０４
【非特許文献１０８】ＲＯＧＵＳＫＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ，  ＰＮＡＳ  （１９９４）  ９１：９６９−９７３
【非特許文献１０９】ＲＯＮＩＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＩＮＧＡＰ）  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ，  Ｊ．  ＣＬｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （Ｍａｙ  １９９７）  ９９（９）：２１００−２１０９．
【非特許文献１１０】ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｍｉｃｅ，  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００４）  ２４０（５）：８７５−８８４
【非特許文献１１１】ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｉｓｌｅｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｆｕｒｔｈｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ａ  Ｄｕｃｔｕｌａｒ  Ｏｒｉｇｉｎ，  Ｐａｎｃｒｅａｓ  （Ｊｕｌｙ  １９９６）  １３（１）：３８−４６
【非特許文献１１２】ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｌｅｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍｏｇｌｙｃａｅｍｉａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｌｏｃａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｓ），  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （Ｍａｒｃｈ  １９９６）  ３９（３）：２５６−２６２
【非特許文献１１３】ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｏｐｈｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｔｕｌａｒ−Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｘｉｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９２）  ３２１：９５−１０４
【非特許文献１１４】ＳＡＮＤＨＵ  ，  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｇｅｎｅ  （１９９４）  １５０（２）：４０９−４１０
【非特許文献１１５】ＳＡＮＴＥＲＲＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｇ４１８  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｇｅｎｅ  （１９８４）  ３０：１４７−１５６
【非特許文献１１６】ＳＡＷＡＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｒｍ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  ＡＪＲＩ  （１９９５）  ３４：２６−３４
【非特許文献１１７】ＳＣＯＰＥＳ  ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＮＹ  （１９９４）  （ＴＯＣ）
【非特許文献１１８】ＳＴＵＤＮＩＣＫＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｔａｉｎ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＣＤＲ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （１９９４）  ７（６）：８０５−８１４
【非特許文献１１９】ＴＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＮＧＡＰ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｎｅｒｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  （Ｓｅｐｔ．  ２，  ２００４）  １８（４）：１−２３
【非特許文献１２０】ＴＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  ’Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ’  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２８，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２００２）  １６９：１１１９−１１２５
【非特許文献１２１】ＴＨＯＲＥＮＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．  （１９９５）  ２１（５）：３１１−３１８
【非特許文献１２２】ＴＯＬＳＴＯＳＨＥＶ  ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  （１９９３）  ３２：５７３−５９６
【非特許文献１２３】ＶＡＮ  ＨＥＥＫＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８９）  ２６４（１０）：５５０３−５５０９
【非特許文献１２４】ＶＩＥＴＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｎｔａｋｅ  ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｓｔ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ  １−３，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  （２００１）  ７３：２８８−２９４
【非特許文献１２５】ＶＩＬＳＢＯＬＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅａｌ  Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｐｅｏｐｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （２００３）  ８８（６）：２７０６−２７１３
【非特許文献１２６】ＶＩＮＩＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  （Ｊｕｎｅ  １９９７）  ２９（７）：２７８−２９３
【非特許文献１２７】ＶＵＫＫＡＤＡＰＵ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  β−ｃｅｌｌ    ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  β−ｃｅｌｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｕｎ  ｕｐ  ｔｏ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＯＤ  ｍｏｕｓｅ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  （２００５）  ２１（２）：２０１−２１１
【非特許文献１２８】ＷＡＮＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  Ｃａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｅ  Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  （Ｊｕｎｅ  １９９７）  ９９（１２）：２８８３−２８８９
【非特許文献１２９】ＷＡＮＴ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ４  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｕｍｐｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｊｕｎｅ  １４，  ２００２）  ５１（ｓｕｐｐｌ．  ２）：４７４−Ｐ
【非特許文献１３０】ＷＩＧＬＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （Ｊｕｎｅ  １９８０）  ７７（６）：３５６７−３５７０
【非特許文献１３１】ＷＵ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄａｐｔｅｒｓ，  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７）  １５２：３４３−３４９
【非特許文献１３２】ＷＵ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  （１９９１）  ３（１）：８７−９５
【非特許文献１３３】ＸＵ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｂｏｔｈ  β−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  β−Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒａｔｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｄｅｃ．  １９９９）  ４８：２２７０−２２７６
【非特許文献１３４】ＹＡＭＡＯＫＡ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  （２００３）  ３（３）：４２５−４３３
【非特許文献１３５】ＹＯＯＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  β−Ｃｅｌｌ  Ｌｏｓｓ  ａｎｄ  α−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  （Ｍａｙ  ２００３）  ８８（５）：２３００−２３０８
【非特許文献１３６】ＹＯＵＮＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｙｌｉｎ’ｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （１９９７）  ４（４）：２８２−２９０
【非特許文献１３７】ＺＡＮＤＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ６−ｗｅｅｋ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｏｎ  ｇｌｙｃａｅｍｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ，  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，  ａｎｄ  β−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ：  ａ  ｐａｒａｌｌｅｌ−ｇｒｏｕｐ  ｓｔｕｄｙ，  Ｌａｎｃｅｔ  （Ｍａｒ．  ２００２）  ３５９：８２４−８３０
【非特許文献１３８】ＭＥＩＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：  ｔｈｅ  ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ，  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  （２００２）  １０７：１−１３
【非特許文献１３９】ＡＮＤＥＲＳＥＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  Ｄｉｆｆｅｒｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  Ａｇｅ  ｏｆ  ３５  Ｙｅａｒｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２０１０）  ３３（９）：２０６２−２０６４
【非特許文献１４０】ＢＵＴＬＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  β−Ｃｅｌｌ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  β−Ｃｅｌｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００３）  ５２（１）：１０２−１１０
【非特許文献１４１】ＤＥＬＰＲＡＴＯ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｔａ−  ａｎｄ  Ａｌｐｈａ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  （２００４）  ３６（１１−１２）：７７５−７８１
【非特許文献１４２】ｄｅＰＲＩＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２−２５Ｋ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｉｎ  Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｊａｎｕａｒｙ  ２００７）  ３４（１）：１０−１９
【非特許文献１４３】ＤＵＳＥＴＴＩ  ｅｔ  ａｌ．  "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＡＰ）  Ｇｅｎｅ"  １９９４，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：１０８−１１４．
【非特許文献１４４】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｄａｔｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２９，  ２０１３  ｆｏｒ  ＥＰ１２１８３６７４
【非特許文献１４５】ＦＩＮＥＢＥＲＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｈａｌｅｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  ｏｒ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ：  Ａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ａｎｄ  ＩＩＩ  Ｉｎｈａｌｅｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  （Ｅｘｕｂｅｒａ）  Ｔｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ａ  Ｔｗｏ−Ｙｅａｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  （２００５）  ９０（６）：３２８７−３２９４
【非特許文献１４６】ＧＡＮＮＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＮＦ６  ｉｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  Ｉｓｌｅｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （２０００）  １２７（３）：２８８３−２８９５
【非特許文献１４７】ＩＧＡＲＡＳＨＩ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＧＬＰ−１，  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ／Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２８，  ２００５，  Ｖｏｌ．  ２０，  Ｎｏ．  １，  ｐ．  ６９−７４
【非特許文献１４８】ＫＡＰＵＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ−Ｔｅｒｍ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＮＧＡＰ  ａｎｄ  Ｒｅｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  β−Ｃｅｌｌｓ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｉｃｅ，  Ｉｓｌｅｔｓ  （２０１２）  ４（１）：４０−４８
【非特許文献１４９】ＬＥＶＥＴＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８）  １４（９）：１０７５−１０８３
【非特許文献１５０】ＭＡＲＺＢＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＮＨ２−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｉｓｌｅｔ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ＰＣ２  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ａｕｇｕｓｔ  ２００６）  ５５（８）：２１９２−２２０１
【非特許文献１５１】ＰＡＬＭＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓ  Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｒ  Ｊｕｓｔ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｔ  ａｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ａｇｅ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００５）  ５４（Ｓｕｐｐ  ２）：Ｓ６２−Ｓ６７
【非特許文献１５２】ＰＡＬＭＥＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｈａｔ’ｓ  ｉｎ  ａ  Ｎａｍｅ  Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔｓ，  Ｔｙｐｅ１．５，  Ａｄｕｌｔ−Ｏｎｓｅｔ，  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００３）  ２６（２）：５３６−５３８
【非特許文献１５３】ＲＥＥＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｎｅｗ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ：  ｔｈｅ  Ｆａｔ−ｆｅｄ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  Ｒａｔｅ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０００）  ４９（１１）：１３９０−１３９４  （ａｂｓｔｒａｃｔ）
【非特許文献１５４】ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  （２０００）  ２：１６５−１７２
【非特許文献１５５】ＳＩＧＡＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ／Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  （２００４）  ２７（１０）：２５１８−２５３９
【非特許文献１５６】ＷＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，  ＹＡＣ／ＢＡＣ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｒｏｕｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｒａｃｉｌｅ  Ａｘｏｎａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  （ｇａｄ）  Ｌｏｃｕｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｕｃｈｌ１，  Ｐｍｘ２ｂ，  Ａｔｐ３ａ２，  ａｎｄ  Ｈｉｐ２  Ｇｅｎｅｓ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  （２０００）  ６６：３３３−３３６
【非特許文献１５７】ＹＡＭＡＧＡＴＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−１α  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｕｓｅｓ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  β−Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２）  ５１（１）：１１４−１２３
【非特許文献１５８】ＺＵＬＥＷＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎｅｓｔｉｎ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｏ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，  Ｅｘｏｃｒｉｎｅ，  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （Ｍａｒｃｈ  ２００１）  ５０（３）：５２１−５３３
【外国語明細書】
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