(57)【要約】      （修正有）【課題】有用な生理活性物質を産生し、それを分泌及び／又は表面提示する細胞をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】以下の工程を含む、（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程１、（２）工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程３。【選択図】図Ａ
2014110785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示するタンパク質を産生する細胞のスクリーニング方法；
（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程１、
（２）工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程３。
【請求項２】
（４）前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２倍〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である請求項１〜３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含む、ポリアルキレングリコールである請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
以下の工程を含む疾患の診断方法；
［１］複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
［２］工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程３。
【請求項１０】
以下の工程を含む食品の安全性の検査方法；
〔１〕複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
〔２〕工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
〔３〕工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程３。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか１項に記載のスクリーニング方法における工程１、請求項９に記載の診断方法における工程１、及び請求項１０に記載の検査方法における工程１からなる群より選択される少なくとも１つの工程にて用いられるイムノチャンバー。
【請求項１２】
請求項１１に記載のイムノチャンバー並びにリンカー及び／又は生理活性物質に特異的に結合する分子を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の１細胞スクリーニング方法及びそれに用いられるイムノチャンバーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が有する機能を解析する為に、１細胞、すなわち単一細胞（Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ）レベルで機能を解析する技術が求められている。このような技術は、例えばハイブリドーマの選別のような細胞の交発現株のスクリーニング、疾患の有無を診断する為の基礎技術として研究が進められている。
【０００３】
この様な基礎技術として、例えば特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２に示すような、蛍光標識抗体を用いたスクリーニング方法、又はそれに用いられるデバイスが開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−０３４０４７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｔｏ  Ｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００４；２０（３）：８９７−９０４
【非特許文献２】Ｊｉｎ  Ａら，Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；１５（９）：１０８８−１０９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に示す１細胞スクリーニング方法は、細胞の脂質膜を介した修飾を行うことから、侵襲性を有しておりスクリーニング後の細胞の増殖等の育種の面で予期せぬ悪影響があるので好ましくない。
【０００７】
また、特許文献１及び非特許文献２に記載された、細胞侵襲性を示さない１細胞スクリーニング方法に関する記載は、ウェルの周囲を蛍光分子に基づいて光らせて、１細胞をスクリーニングする方法である。しかしながら、このような方法であれば、隣接する幾つかのウェルが光っていた場合、どのウェルに有用な生体分子を分泌産生する細胞が存在するかについて、機械的手法であっても、人為的手法であっても特定するのが困難であるという問題点がある。
【０００８】
そして、ウェルの周囲に蛍光分子に基づいて光らせるためにコーティングが必要となり、そのための部位を設ける必要があるため、１つのウェルに１個の細胞を格納させる効率が悪くなるという問題点も有している。
【０００９】
さらに、この様なコーティングについて、１細胞をスクリーニングした後に細胞の回収を目的とするのであれば、ウェル内壁の表面に親水性を付与しておかないと、細胞が吸着してしまう傾向となり、細胞回収時に細胞へ障害、ひいては破壊を引き起こしてしまう。
【００１０】
一方で、ウェル内壁の表面に疎水性を付与しておかないとウェル内での細胞の安定性を欠いてしまう傾向となる。すなわち、コーティングについては、親水性の付与と組成性の付与という面から高度に制御する必要があるという問題点も存在している。
【００１１】
本発明は、１細胞単位で有用な生理活性物質を産生し、それを分泌又は表面提示する細胞をスクリーニングする為に、効率よく１つのウェル内に１個の細胞を載置し、且つスクリーニングの対象とする１つの細胞を簡便且つ確実に特定する為の方法を提供することを目的とする。さらに、スクリーニングした細胞を細胞に損傷を与えることなく回収することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、細胞に侵襲性を与えることのない手段で、且つ特定のイムノチャンバーを用いる、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を選択する方法を開発した。
【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様を広く包含するものである。
【００１４】
項１  以下の工程を含む、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示するタンパク質を産生する細胞のスクリーニング方法；
（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程１、
（２）工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程３。
【００１５】
項２  （４）前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項１に記載のスクリーニング方法。
【００１６】
項３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１又は項２に記載のスクリーニング方法。
【００１７】
項４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ・クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１〜項３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００１８】
項５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項１〜項４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００１９】
項６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２倍〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項１〜項５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２０】
項７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項１〜項６の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２１】
項８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の略一定の傾斜角を有する、上記項１〜項７の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２２】
項９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である前記項１〜項８の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２３】
項１０  前記チャンバーにおける任意の隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項１〜項９の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２４】
項１１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項１〜項１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２５】
項１２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項１１に記載のスクリーニング方法。
【００２６】
項１３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含む、ポリアルキレングリコールである上記項１２に記載のスクリーニング方法。
【００２７】
項１４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項１３に記載のスクリーニング方法。
【００２８】
項１５  前記生理活性物質に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項１２〜項１４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２９】
項１６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項１３〜項１５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３０】
項１７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項１３〜項１６の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３１】
項１８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項１２〜項１７の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３２】
項１９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式１〜１０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１２〜項１８の何れか１項に記載のスクリーニング方法；
【００３３】
【化１】
2014110785.tif 000003
【００３４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３５】
【化２】
2014110785.tif 000004
【００３６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３７】
【化３】
2014110785.tif 000005
【００３８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３９】
【化４】
2014110785.tif 000006
【００４０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４１】
【化５】
2014110785.tif 000007
【００４２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４３】
【化６】
2014110785.tif 000008
【００４４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４５】
【化７】
2014110785.tif 000009
【００４６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【００４７】
【化８】
2014110785.tif 000010
【００４８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【００４９】
【化９】
2014110785.tif 000011
【００５０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【００５１】
【化１０】
2014110785.tif 000012
【００５２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【００５３】
項２０  以下の工程を含む疾患の診断方法；
［１］複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
［２］工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程３。
【００５４】
項２１  ［４］前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項２０に記載の診断方法。
【００５５】
項２２  前記疾患が、癌、転移性癌、免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心筋梗塞心疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、骨疾患、内分泌系疾患、皮膚疾患、脳疾患、脳梗塞からなる群より選択される、少なくとも一種である上記項２０又は項２１に記載の診断方法。
【００５６】
項２３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項２０〜項２２の何れか１項に記載の診断方法。
【００５７】
項２４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ・クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項２０〜項２３の何れか１項に記載の診断方法。
【００５８】
項２５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項２０〜項２４の何れか１項に記載の診断方法。
【００５９】
項２６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２倍〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項２０〜項２５の何れか１項に記載の診断方法。
【００６０】
項２７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項２０〜２６の何れか１項に記載の診断方法。
【００６１】
項２８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の傾斜角を有する、上記項２０〜項２７の何れか１項に記載の診断方法。
【００６２】
項２９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である上記項２０〜項２８の何れか１項に記載の診断方法。
【００６３】
項３０  隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項２０〜項２９の何れか１項に記載の診断方法。
【００６４】
項３１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項２０〜項３０の何れか１項に記載の診断方法。
【００６５】
項３２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項３１に記載の診断方法。
【００６６】
項３３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項３２に記載の診断方法。
【００６７】
項３４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項３３に記載の診断方法。
【００６８】
項３５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項３２〜項３４の何れか１項に記載の診断方法。
【００６９】
項３６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項３３〜項３５の何れか１項に記載の診断方法。
【００７０】
項３７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項３３〜項３６の何れか１項に記載の診断方法。
【００７１】
項３８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項３２〜項３７の何れか１項に記載の診断方法。
【００７２】
項３９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式１１〜２０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項３２〜項３８の何れか１項に記載の診断方法。
【００７３】
【化１１】
2014110785.tif 000013
【００７４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７５】
【化１２】
2014110785.tif 000014
【００７６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７７】
【化１３】
2014110785.tif 000015
【００７８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７９】
【化１４】
2014110785.tif 000016
【００８０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８１】
【化１５】
2014110785.tif 000017
【００８２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８３】
【化１６】
2014110785.tif 000018
【００８４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８５】
【化１７】
2014110785.tif 000019
【００８６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【００８７】
【化１８】
2014110785.tif 000020
【００８８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【００８９】
【化１９】
2014110785.tif 000021
【００９０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【００９１】
【化２０】
2014110785.tif 000022
【００９２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【００９３】
項４０  以下の工程を含む食品の安全性の検査方法；
〔１〕複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
〔２〕工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程３。
【００９４】
項４１  〔４〕前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項４０に記載の検査方法。
【００９５】
項４２  前記食品が、海産物及び／又は陸産物である上記項４０又は項４１に記載の検査方法。
【００９６】
項４３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項４０〜項４２の何れか１項に記載の検査方法。
【００９７】
項４４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ、クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項４０〜項４３の何れか１項に記載の検査方法。
【００９８】
項４５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項４０〜項４４の何れか１項に記載の検査方法。
【００９９】
項４６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項４０〜項４５の何れか１項に記載の検査方法。
【０１００】
項４７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項４０〜項４６の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０１】
項４８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の傾斜角を有する、上記項４０〜項４７の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０２】
項４９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である上記項４０〜項４８の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０３】
項５０  隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項４１〜項４９の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０４】
項５１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項４１〜項５０の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０５】
項５２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項５１に記載の検査方法。
【０１０６】
項５３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項５２に記載の検査方法。
【０１０７】
項５４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項５３に記載の検査方法。
【０１０８】
項５５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項５２〜項５４の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０９】
項５６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項５３〜項５５の何れか１項に記載の検査方法。
【０１１０】
項５７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項５３〜項５６の何れか１項に記載の検査方法。
【０１１１】
項５８  前記リンカーの分子長が、１０〜５０００Åである、上記項５２〜項５７の何れか１項に記載の診検査断方法。
【０１１２】
項５９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式２１〜３０記載にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項５２〜５８の何れか１項に記載の診断方法；
【０１１３】
【化２１】
2014110785.tif 000023
【０１１４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１５】
【化２２】
2014110785.tif 000024
【０１１６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１７】
【化２３】
2014110785.tif 000025
【０１１８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１９】
【化２４】
2014110785.tif 000026
【０１２０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２１】
【化２５】
2014110785.tif 000027
【０１２２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２３】
【化２６】
2014110785.tif 000028
【０１２４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２５】
【化２７】
2014110785.tif 000029
【０１２６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０１２７】
【化２８】
2014110785.tif 000030
【０１２８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０１２９】
【化２９】
2014110785.tif 000031
【０１３０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０１３１】
【化３０】
2014110785.tif 000032
【０１３２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０１３３】
項６０  上記項１〜１９の何れか１項に記載のスクリーニング方法における工程１、上記項２０〜３９の何れか１項に記載の診断方法における工程１、及び上記項４０〜５９の何れか１項に記載の検査方法における工程１からなる群より選択される少なくとも１つの工程にて用いられるイムノチャンバー。
【０１３４】
項６１  上記項６０に記載のイムノチャンバー並びにリンカー及び／又は生理活性物質に特異的に結合する分子を含む、キット。
【０１３５】
項６２  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項６１に記載のキット。
【０１３６】
項６３  前記リンカーが、その一方の末端にアミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項６１又は項６２に記載のキット。
【０１３７】
項６４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項６１〜項６３の何れか１項に記載のキット。
【０１３８】
項６５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項６１〜項６４の何れか１項に記載のキット。
【０１３９】
項６６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項６３〜項６５の何れか１項に記載のキット。
【０１４０】
項６７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項６３〜項６６の何れか１項に記載の診断方法。
【０１４１】
項６８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項６１〜項６７の何れか１項に記載のキット。
【０１４２】
項６９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式３１〜４０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項６１〜項６８の何れか１項に記載のキット；
【０１４３】
【化３１】
2014110785.tif 000033
【０１４４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４５】
【化３２】
2014110785.tif 000034
【０１４６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４７】
【化３３】
2014110785.tif 000035
【０１４８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４９】
【化３４】
2014110785.tif 000036
【０１５０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５１】
【化３５】
2014110785.tif 000037
【０１５２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５３】
【化３６】
2014110785.tif 000038
【０１５４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５５】
【化３７】
2014110785.tif 000039
【０１５６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０１５７】
【化３８】
2014110785.tif 000040
【０１５８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０１５９】
【化３９】
2014110785.tif 000041
【０１６０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０１６１】
【化４０】
2014110785.tif 000042
【０１６２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０１６３】
項７０  更に、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を含む上記項６１〜項６６の何れか１項に記載のキット。
【０１６４】
項７１  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項６１〜項７０に記載のキット。
【発明の効果】
【０１６５】
以下に、本発明の効果について記載する。ただし、本発明は、以下に示す効果の全てを発揮する発明に限定されず、少なくとも何れか１つの効果を発揮すればよい。
【０１６６】
本発明に係るスクリーニング方法は、例えば抗体や有用生体成分といった分泌タンパク質を高産生する細胞を非侵襲的に１細胞レベルでスクリーニングする方法として非常に有用である。
【０１６７】
本発明に係るスクリーニング方法は、例えば特定の抗原に対する抗体をスクリーニングするモノクローナル抗体の作製時におけるハイブリドーマの選別時に有用である。
【０１６８】
本発明に係る診断方法は、患者から得られる被検体に含まれる細胞数が少なくとも患者の疾患の有無の判定、又は疾患に罹患する可能性の有無、その大小を判定することができるので、被検体中の細胞濃度を高くする工程を必要としない診断方法として優れている。
【０１６９】
特に、細胞濃度を高くするための技術は、臨床現場では未だ容易には採用されることではなく更に、細胞の性質を変化させてしまう可能性もはらんでいる点からしても、本発明の診断方法は優れている。
【０１７０】
本発明に係る検査方法は、上述のような本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法に基づいた、１細胞レベルで検出する方法であるために、検体の量が少なくても、簡便に且つ確実に検査を行うことができるので優れている。
【０１７１】
本発明に係るイムノチャンバーは、上述のような優れたスクリーニング方法及び診断方法に好適に用いられ、優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図Ａ】本発明に係るイムノチャンバー、スクリーニング方法、及び診断方法の１態様を説明する図。
【図Ｂ】本発明のイムノチャンバーを作製するＬＩＧＡプロセスを示す図。
【図Ｃ】本発明の高集積イムノチャンバーのレイアウト等を説明する図。ウェルの深さは２０μｍ、ウェル径はφ３０μｍでウェル側壁の傾斜角は２０度である。
【図Ｄ】本発明の最密充填イムノチャンバーのレイアウト等（１クラスターあたり）説明する図。ウェルの深さは２０μｍ、ウェルは３０μｍ□であり、ウェル側壁の傾斜角は２５度である。
【図Ｅ】本発明の最密充填イムノチャンバーの各クラスターのレイアウトを説明する図。
【図Ｆ】ＬＩＧＡプロセスにおける、Ｘ線照射されたＰＭＭＡ、Ｎｉ電析によって形成されたＮｉ電鋳入子、及びポリスチレン射出形成品のレーザー顕微鏡像。
【図Ｇ】アミノ基付与処理後のウェルに対して行った水滴接触角実験結果。
【図１】表面処理濃度の最適化の検討方法を示す図。
【図２】画像解析処理の自動化を説明する図。
【図３】各ＮＨＳ濃度における蛍光輝度の結果を示すグラフ、横軸はＮＨＳ濃度を表し、縦軸は蛍光輝度値を表す。
【図４】ブラックフレームにパッキングされた本発明のイムノチャンバーへの反応液滴下した様子を示す写真像。
【図５】蛍光輝度解析した１５サブエリア（図中の四角で示す枠内）と１サブエリア内の８プロット（図中の丸で示す枠内）を示す。なお、プロットで示す位置については、図２で説明される自動解析を行った。
【図６】各スライドにおける蛍光輝度のばらつきを示す図。なお、ばらつきとは、測定した数値等が、平均値や標準値の前後に不規則に分布することを意味する。図中のグラフにおけるｂｇはガラス基板の自家蛍光、励起にばらつきがないかどうか確認する為に測定を行った。Ｄはポリスチレンスライドで何ら表面処理しておらず、基板の自家蛍光を測定する為のコントロールである。Ｂ及びＡはＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳで処理したポリスチレンスライドである。
【図７】イムノチャンバーにおけるアミノ基コートに依存的なビオチン化の蛍光可視化を示す図である。Ｓｌｉｄｅ  Ｄは、ポリスチレンスライドを示し、Ｓｌｉｄｅ  Ａは、ビオチン修飾したポリスチレンスライドを示す。
【図８】抗体修飾イムノチャンバーへの細胞導入を示す写真像。透過像はイムノチャンバーの像を示したものである。蛍光像は各細胞種の導入の様子を示したものである。
【図９】抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーの毒性評価を示す写真像。
【図１０】全自動１細胞単離解析装置を用いた抗体分泌細胞に由来するイムノチャンバーの蛍光観察像。ＨｙｂｒｉｄｏｍａとＣＨＯの個数をそれぞれ１：１００で混合したものである。
【図１１】全自動一細胞単離解析装置を用いる１細胞単離実験結果。Ａは細胞の回収前、Ｂは回収後を示す。丸で囲まれた部位は、装置によって細胞が認識された時に自動的に現れる。丸内部の細胞が回収されたことがわかる。
【図１２】回収した培養約１週間後の抗体分泌細胞のコロニーの写真像。
【図１３】回収した培養約４週間後の抗体分泌細胞の培地上清をＥＬＩＳＡ供した実験結果。用いた抗体分泌細胞はＩｇＧ１の抗体を分泌することから、精製ＩｇＧ１を用いてキャリブレーションをとり、単離した細胞の培地上清をＥＬＩＳＡ法に供し、絶対定量法により測定した。横軸番号は、輝度の順であり、縦軸は培地上清の抗体量から算出した１細胞あたりの１日あたりの抗体分泌量を示す。＊は、親株に対するｔ検定（ｐ＜０．０１）で有意なものを表す。ｎは測定回数を示す。
【図１４】共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を用いる抗体分泌細胞に由来するイムノチャンバーの蛍光観察像を示す。ＨｙｂｒｉｄｏｍａとＣＨＯの個数をそれぞれ１：１で混合したものである。各パネルの右下枠は各パネル中央左枠の拡大像である。
【図１５】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いたＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞の分析結果を示す図。  １は混合細胞のドットプロット（Ｗｈｏｌｅ  ｇａｔｅ）であり、縦軸がＳＳＣ−Ａで横軸がＦＳＣ−Ａである。２及び３は、それぞれＦＡＣＳによるＣＫｓ（ＰＥ）及びＣＤ４５（ＡＰＣ）を検出した際の結果であり、縦軸は共にＳＳＣ−Ａで、横軸はそれぞれＰＥ−Ａ及びＡＰＣ−Ａを示す。４はＣＫ１１＋及びＣＫ１９＋で、且つＣＤ４５ー細胞をクオドラントリージョンによってクローズアップしたものを示し、縦軸はＡＰＣ−Ａで、横軸はＰＥ−Ａを示す。５は４の各画分の統計を取った数値を示す。
【図１６】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いた、ＥｐＣＡＭ抗体処理イムノチャンバーへ播種したＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９細胞混合の観察例。写真像はイムノチャンバーの１つの区画を示している。
【図１７】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いた、抗体処理イムノチャンバーへ播種したＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９細胞混合からのＥｐＣＡＭ陽性細胞（Ａ５４９細胞）の単離例。
【図１８】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いて単離したＥｐＣＡＭ陽性細胞（Ａ５４９細胞）の育種後のＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いた分析結果を示す図。１はドットプロット（Ｗｈｏｌｅ  ｇａｔｅ）を示す。２及び３はそれぞれＦＡＣＳによるＣＫ１１及びＣＫ１９（ＰＥ）、並びにＣＤ４５（ＡＰＣ）の検出結果を示す。１〜３の縦軸は全てＳＳＣ−Ａを示し、横軸は１〜３に対してそれぞれＦＳＣ−Ａ、ＰＥ−Ａ、及びＡＰＣ−Ａを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７３】
以下に本発明について詳細に説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
【０１７４】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ５Ｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊｕｌｉａｎ  Ｌｅｗｉｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒａｆｆ；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２／Ｅ（ＬＡＮＧＥ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ｂｙ  Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｓｕｓａｎ  Ｍａｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｔｒｅｖｏｒ（Ｄｅｃ  １３，２０１１）等の文献を参照すればよい。
【０１７５】
＜スクリーニング方法＞
本発明に係るスクリーニング方法は、下記の工程１〜工程３を含む、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞のスクリーニング方法である。
【０１７６】
工程１
（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程。
【０１７７】
工程２
（２）上記工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０１７８】
工程３
（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程。
【０１７９】
本発明のスクリーニング方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を包含していてもよい。
【０１８０】
工程４
（４）前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０１８１】
以下に、本発明に係るスクリーニング方法について詳述する。
【０１８２】
前記生理活性物質とは、細胞外に分泌されるものであっても、細胞表面に提示されるものであってもよく、これらのどちらであっても、他の細胞を標的として生理機能を誘起するものであれば特に限定はされない。このような生理活性物質としては例えば、タンパク質、ポリペプチド、糖鎖、脂質等が挙げられる。
【０１８３】
このようなタンパク質又はポリペプチドは、特に限定はされないが、アミノ酸のみからなるタンパク質又はポリペプチドであっても、それに糖鎖、脂質等といった生体に由来する成分が付加されていてもよく、翻訳後修飾が施されたものであってもよい。
【０１８４】
具体的な生理活性物質としては、例えば、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０等が挙げられる。
【０１８５】
なお、上述の生理活性物質において、細胞外に分泌されるものは、細胞表面に提示された後に、プロテアーゼ等といった他の生体分子によって切断されて分泌されるものも含まれる。
【０１８６】
上述した生理活性物質の中でも、サイトカイン、サイトケラチン、イムノグロブリン、エンドトキシン、ウイルス性抗原、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５４、ＣＤ６２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３３、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０等が、本発明のスクリーニング方法において好適である。
【０１８７】
前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞とは、特に限定はされないが、例えば、上述の分泌タンパク質を発現する細胞であればハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ、クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞等が挙げられる。
【０１８８】
この様な細胞の中でも、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、２９３Ｆ細胞胚性幹細胞、ＣＴＣ、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞等が好ましい。
【０１８９】
これらの細胞は、上述の生理活性物質がタンパク質又はポリペプチドである場合、これらを過剰産生すること等を目的に、当該タンパク質又はポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸、例えばプラスミド等で形質転換されていてもよい。このような細胞を作製する方法は、公知の技術を用いればよい。
【０１９０】
また、従来は、細胞からの分泌能を有さないタンパク質又はポリペプチドであっても、上述の核酸に細胞外分泌シグナルペプチド又は膜移行シグナルペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適用することによって、細胞外に分泌させるか、又は細胞表面に提示させることも可能である。このような方法についても、公知の技術を用いればよい。
【０１９１】
工程１について
本発明に係るスクリーニング方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程である。
【０１９２】
工程１におけるイムノチャンバーは、複数のウェルを有するものである。ウェルの個数は特に限定されず、通常は７００００個以上程度とすればよい。
【０１９３】
上記イムノチャンバーのウェルの形状は、例えば、錐台、逆錐台等の形状が挙げられ、特に限定はされないが、好ましくは錐台の形状である。本発明に係るスクリーニング方法におけるイムノチャンバーのウェルの形状が錐台とは、開口部の方が底面よりも大きいことを意味し、逆錐台とは底面の方が開口部よりも大きいことを意味する。
【０１９４】
このような錐台及び逆錐台等は、円錐台（略円錐台も含む。）、逆円錐台（略逆円錐台も含む。）であっても、角錐台（正角錐台、略正錐台等を含む。）、逆角錐台（正逆角錐台、略正逆錐台等を含む。）であってもよい。このような錐台及び逆角錐台は、１組の平行な平面を必ずしも有していなくてもよい。
【０１９５】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの開口部の大きさは、その直径又は開口部に最密する内接円の直径として、例えば、上述の前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径に対して、通常は１〜２倍程度とすればよく、１．２〜１．５倍程度とすることが好ましい。
【０１９６】
具体的な、開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径は上述の範囲内であれば特に限定はされないが、通常は２〜６０μｍ程度とすればよい。このような範囲の中でも、好ましい下限値は６μｍ程度、より好ましくは７μｍ程度、さらに好ましくは８μｍ程度である。また、好ましい上限値は３４μｍ程度、より好ましくは３３μｍ程度、さらに好ましくは３２μｍ程度、さらに好ましくは３１μｍ程度、最も好ましくは３０μｍ程度である。
【０１９７】
開口部の直径は、開口部の形状には影響されず、略多角形の形状であっても、略円形の形状であっても、その中心を通る最も長い距離を直径と定義すればよい。また、開口部が多角形の形状である場合には、当該多角形に最も接近する内接円の直径を上述の開口部の直径と同様に定義してもよい。なお、用語『内接円』とは、必ずしも多角形の全ての辺に接している必要はなく、少なくとも２つの辺に接していればよい。
【０１９８】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの開口部から該ウェルまでの距離、換言すると、該ウェルの深さは、上述のウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径に対して、通常は０．６倍〜１．４倍程度とすればよく、０．８倍〜１．２倍程度とすることが好ましい。
【０１９９】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの内壁側面は、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して通常は１０度〜４５度程度とすればよく、１５度〜４０度程度の略一定の傾斜角を有することが好ましい。このような角度は上述した錐台又は逆錐台から復元される円錐の頂角の半分の角度でとほぼ同じである。
【０２００】
本発明のイムノチャンバーにおける任意の隣接するウェル間に形成される、ウェルの開口部以外の領域の面積は、該ウェルの一つの開口部に対して、２倍以下程度とすればよく、１倍以下程度とすることが好ましく、０．３倍以下とすることがさらに好ましい。。なお、この様な数値範囲の下限値は０が好ましいが、これは限りなく０であることを意味しており、実質的には０より大きい限りなく小さな数値である。
【０２０１】
本発明のイムノチャンバーにおける任意の隣接する２つウェルにおける該ウェル間のそれぞれの中心間の距離は、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の通常は１倍〜２．５倍とすればよい。
【０２０２】
このようなイムノチャンバーの材質は、特に限定はされないが、例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、環状オレフィンポリマー、ポリエーテルイミド等の透明性を有する熱可塑性ポリマーが挙げられる。
【０２０３】
一方、透明性を有さないポリマーであっても、ポリプロピレン、ポリアセタール、ポリフェニレンサルファイド、液晶ポリマー等といった射出成形可能なポリマーであれば、上述のイムノチャンバーの材質とすることができる。
【０２０４】
このような素材の中でも、各種培養液に対する耐薬品性；透明性；溶融温度、寸法精度等による易射成形性の観点から、ポリスチレンが好ましい。
【０２０５】
上述のイムノチャンバーの作製は、公知の方法を用いて作製することができる。例えば、図Ｂに示すような、ＬＩＧＡ法を用いることによって、上述のような構造を有するイムノチャンバーを製造すればよい。より好ましくは、後述する製造例の記載に従い、適宜、設計変更することによって作製することができる。
【０２０６】
本発明のイムノチャンバーは、ウェルの少なくとも内壁表面がアミノ基を有していてもよく、当該チャンバーにおけるその他の部位についてはアミノ基を有さず、ウェルの内壁表面のみがアミノ基を有していることがより好ましい。
【０２０７】
用語『内壁表面がアミノ基を有する』とは、表面がアミノ化処理されたと同意である。
【０２０８】
具体的には、ウェル内壁に対して公知の親水化処理を行った後、シランカップリング剤等のコーティング剤を用いて処理することによってアミノ基による修飾が可能となる。なお、内壁とは、ウェル内の側面及び底面を含むものである。
【０２０９】
具体的な親水化処理としては、特に限定はされないが、例えば、酸素プラズマ処理、スパッタ処理、プラズマ放電処理、コロナ放電処理、遠紫外線、プラズマ紫外光エキシマレーザー等の乾式処理と硫酸浸漬による湿式処理等が挙げられる。
【０２１０】
具体的なコーティング剤としては、公知のものを適宜採用すればよいが、例えば、３−アミノプロピルエトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３―アミノプロピルトリメトキシシラン、３―アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３―ジメチルーブチリデン）プロピルアミン、Ｎーフェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ビニルベンジル）―２−アミノエチルー３−アミノプロピルトリメトキシシラン、又はこれらの塩酸塩等が挙げられる。
【０２１１】
本発明のイムノチャンバーは、上述のアミノ基に対し、リンカーを介して、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子が結合していてもよい。
【０２１２】
上述の生理活性物質に特異的に結合する分子とは、特に限定はされないが、例えば、生理活性物質に対する抗体が挙げられる。
【０２１３】
ここで、抗体とはイムノグロブリンに限定されず、そのＦａｂ化抗体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ等）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ等）等の抗体断片、斯かる断片を適宜組み合わせた多価化抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ等）等であってもよい。
【０２１４】
上記イムノグロブリンのサブタイプ、サブクラス等は、特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ等が挙げられる。
【０２１５】
上記抗体の由来は、特に限定はされず、例えばヒト、マウス、ラット、ラクダ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ダチョウ、ニワトリ、ラマ、アルパカ、ロバ等が挙げられ、適宜選択して用いればよい。
【０２１６】
上述の抗体以外に生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質が糖鎖そのものか、或いは糖鎖修飾されている場合、斯かる糖鎖に対して特異的に結合するレクチンを上記分子としてもよい。
【０２１７】
上述のリンカーは、特に限定はされないが、例えば、リンカーの一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に上述の生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールが挙げられる。
【０２１８】
低級アルキル基とは、特に限定はされないが、通常は炭素数が２個〜６個程度のアルキル基が挙げられる。
【０２１９】
上述の官能基としては、特に限定はされないが、例えばマレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基等が挙げられる。中でも、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基等が好ましい。
【０２２０】
上述の官能基が、上述の低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、又はカルボアミド基を有している場合、これらの化学結合の様式は特に限定されない。
【０２２１】
また、官能基に対する上述の低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、又はカルボアミド基の結合位置も特に限定はされないが、例えば、上記官能基がマレイミジル基又はスクシンイミジル基である場合、該基に含まれる窒素原子と結合していることが好ましい。また、ビオチニル基である場合には該基に含まれるカルボニルオキシ基に結合していることが好ましい。
【０２２２】
また、スクシンイミジル基、マレイミジル基はその２位がスルホ基又はその塩で置換されていてもよい。
【０２２３】
ポリアルキレングリコールとは、特に限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０２２４】
上記リンカーの分子量は、特に限定はされないが、必要に応じて重量平均分子量として通常は１３０〜５００００程度とすればよく、４００〜３００００程度とすることが好ましい。
【０２２５】
また、このようなリンカーの分子長は、特に限定はされないが、通常は通常は１０Å〜５０００Å程度とすればよく、３０Å〜３０００Å程度とすることが好ましい。
【０２２６】
上述の具体的なリンカーとして、例えば、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈ
ｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ等が挙げられる。
【０２２７】
また、具体的なリンカーとして、下記の化学式４１〜５０にて表わされるものも挙げられる。
【０２２８】
【化４１】
2014110785.tif 000043
【０２２９】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３０】
【化４２】
2014110785.tif 000044
【０２３１】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３２】
【化４３】
2014110785.tif 000045
【０２３３】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３４】
【化４４】
2014110785.tif 000046
【０２３５】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３６】
【化４５】
2014110785.tif 000047
【０２３７】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３８】
【化４６】
2014110785.tif 000048
【０２３９】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２４０】
【化４７】
2014110785.tif 000049
【０２４１】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０２４２】
【化４８】
2014110785.tif 000050
【０２４３】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０２４４】
【化４９】
2014110785.tif 000051
【０２４５】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０２４６】
【化５０】
2014110785.tif 000052
【０２４７】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０２４８】
また、上述の生理活性物質が上述のようなイムノグロブリンに代表される抗体である場合、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子は、斯かる抗体に対する抗原であってもよい。このような抗原は、例えばアビジン化合物及びビオチンの複合体等をさらに介して上述のリンカーに結合していてもよい。
【０２４９】
なお、上述のイムノチャンバーは、イムノデバイス、イムノプレート、イムノウェル、イムノスライド、イムノチップ、イムノセンサーチップ、イムノセンサースライド、イムノセンサーウェル、イムノセンサーチャンバー等とも称される。
【０２５０】
生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団は公知の方法で入手することができる。例えば、例えば生理活性物質が抗体である場合、斯かる抗体を産生するハイブリドーマ（例えばＢ細胞及びミエローマ細胞を融合したハイブリドーマ等が挙げられる。）を上記細胞集団とすればよい。
【０２５１】
その他にも、例えば、任意の分泌タンパク質が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列によって形質転換された細胞も、上記細胞集団とすることができる。
【０２５２】
また、本発明の細胞集団は、生体から定義採取したものであってもよい。例えば、個体の任意の組織から細胞集団を、公知の方法で採取したもの、個体の血液、組織、リンパ液等から公知の方法で細胞集団を採取したもの等が挙げられる。
【０２５３】
更に、食品材料から得られた抽出物と、任意の細胞を接触させたものであってもよい。
【０２５４】
このようにして得られた細胞集団は、本発明の工程１に供する前に、適宜洗浄工程に供してもよい。具体的な洗浄方法は、特に限定はされないが、例えば、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いて洗浄すればよい。
【０２５５】
このような洗浄工程に関して、細胞に不必要な障害を与える危険性や、余分な工程が必要となる点から、このような工程を含まないものが好ましいことは明らかである。
【０２５６】
用語『播種』とは、シード（Ｓｅｅｄ）と同意であり、細胞を播くという行為を表す。すなわち、免疫分野にて用いられる「Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ」の意味とも、ガンの分野で用いられる「Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａｔｉｏｎ」の意味とも異なるものである。ここで、播種された細胞は、必ずしも増殖する必要はなく、死滅さえしなければよい。
【０２５７】
用語『細胞集団』とは、同種の細胞の集団であっても、異種の細胞の集団であってもよい。同種の細胞の集団とは、必ずしも同一の遺伝学的性質を有する細胞の種類には限定されず、同一の遺伝学的性質を有していたとしても、細胞内の成分が異なる細胞の集団を含んでいたとしても、同種の細胞集団とみなしてもよい。
【０２５８】
上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を、上述のイムノチャンバーに播種することによって、該イムノチャンバーの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を構成する１個の細胞が載置される。状況に応じて、播種の後のイムノチャンバーを遠心工程に供してもよい。
【０２５９】
用語『載置』とは、単に存在することを意味し、格納されて保持されることとも換言される。用語『保持』とは、必ずしも不可逆的にウェル内に保持されている必要はなく、積極的に除去する行為によって保持されない状態とならない限り特に限定されない。用語『積極的な除去』とは、例えば、マニュピュレーター等で細胞が除去されることが挙げられる。
【０２６０】
用語『１個の細胞』とは、単一の細胞であることも意味する。
【０２６１】
工程１において、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団のうち、上述のウェルに載置されない細胞の割合の上限値は、細胞集団全体の５０％程度であり、より好ましくは２０％程度、更に好ましくは５％程度である。また、下限値は、０％であることが好ましい。
【０２６２】
工程１の後、上述のような前記ウェルに載置されない細胞を除去する工程に供してもよい。具体的には、イムノチャンバーを洗浄工程に供すればよく、浸漬法、流水法等によって洗浄すればよい。洗浄する際には、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いればよい。なお、上述のイムノチャンバーに細胞集団を播種した後、洗浄工程に供するまでの時間は、特に限定はされないが、通常は１分〜４８時間程度とすればよい。
【０２６３】
工程２について
本発明に係るスクリーニング方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０２６４】
生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子とは、生理活性物質に特異的に結合する分子に、公知の蛍光分子が結合していれば良く、特に限定はされない。
【０２６５】
生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質に対する抗体に蛍光分子が結合した蛍光標識抗体が挙げられる。
【０２６６】
ここで、抗体とはイムノグロブリンに限定されず、そのＦａｂ化抗体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ等）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ等）等の抗体断片、斯かる断片を適宜組み合わせた多価化抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ等）等であってもよい。
【０２６７】
上記イムノグロブリンのサブタイプ、サブクラス等は、特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ等が挙げられる。
【０２６８】
上記抗体の由来は、特に限定はされず、例えばヒト、マウス、ラット、ラクダ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ダチョウ、ニワトリ、ラマ、アルパカ、ロバ等が挙げられ、適宜選択して用いればよい。
【０２６９】
上述の抗体以外に生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質が糖鎖そのもの又は糖鎖修飾されている場合、斯かる糖鎖に対して特異的なレクチンを上記分子とすることができる。
【０２７０】
上記蛍光分子は、特に限定されることはなく、公知のものを適宜採用すればよいが、例えば、ローダミン、フルオロセイン、ＦＩＴＣ、各種Ｃｙ色素、量子ドット（Ｑドット〔登録商標〕）、ＡＭＣＡ、ＡＰＣ、Ａｌｅｘａ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＰＥ、ＴＲＩＴＣ等が挙げられる。
【０２７１】
これらの蛍光分子と、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子を結合させる方法は、公知の方法を適宜組み合わせて採用すればよい。
【０２７２】
工程２において上記ウェルに蛍光分子を添加する前に、ウェルに対してブロッキング剤を添加していてもよい。ブロッキング剤とは、特に限定はされないが、例えばアルブミン、スキムミルク等が挙げられる。
【０２７３】
工程２の後、イムノチャンバーを洗浄工程に供してもよい。具体的な洗浄方法としては、浸漬法、流水法等によって洗浄が挙げられ、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の含有の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いればよい。
【０２７４】
工程３について
本発明に係るスクリーニング方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程である。
【０２７５】
工程３では上述の工程２にて用いた蛍光分子に基づく蛍光を発するウェルを特定し、斯かるウェルに載置された細胞を、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定すればよい。ウェルを特定する方法として、例えば蛍光顕微鏡を用いて、イムノチャンバー全体を観察し、必要に応じてその写真像を入手した後に、決定することができる。また、公知の全自動１細胞単離解析装置を用いて、斯かる装置のマニュアルに沿った自動的な解析に基づいて決定してもよい。このような装置として、例えばアズワン社より販売される、ＡＳ  Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｃｋｉｎｇ  システム等が挙げられる。
【０２７６】
また工程３によって決定されるウェルにおいて、高い強度の蛍光を発するウェルに含まれる細胞が、上述の生理活性物質を著量分泌する又は著量表面に提示するといった傾向を示すと決定することもできる。このような決定に基づいて、上述の生理活性物質の高産生細胞と決定してもよい。
【０２７７】
工程４について
本発明に係るスクリーニング方法において、工程３の後に含まれていてもよい工程４は、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程である。
【０２７８】
具体的に細胞を回収する方法は、公知のマニュピュレーターを採用すればよく特に限定はされない。また、上述の公知の全自動１細胞単離解析装置を用いてもよい。
【０２７９】
このようにして回収された細胞は、適宜公知の培養方法に供して更に育種することができる。このようにして培養した細胞は、そのまま生理活性物質の分泌生産に使用することが可能である。
【０２８０】
また、斯かる細胞を更に種々の実験、疾患の診断、又は食品の安全性の検査用途に供することも可能である。
【０２８１】
以上に詳述した本発明に係るスクリーニング方法は、疾患の診断方法及び食品の安全性の検査方法に好適に用いることができる。
【０２８２】
＜診断方法＞
本発明に係る診断方法は、以下の工程１〜３を含む疾患の診断方法である。
【０２８３】
工程１
［１］複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程。
【０２８４】
工程２
［２］工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０２８５】
工程３
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程。
【０２８６】
本発明の診断方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を含んでいてもよい。
【０２８７】
工程４
［４］前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０２８８】
以下に、本発明に係る診断方法について詳述する。
【０２８９】
本発明に係る診断方法における疾患とは、特に限定はされないが、例えば、癌、転移性癌、免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心筋梗塞、脳梗塞、脳疾患、心疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、骨疾患、内分泌系疾患、皮膚疾患等が挙げられる。これらの中でも、転移性癌、免疫疾患等が、本発明の診断方法において好適である。
【０２９０】
用語『診断』とは、上述の疾患に罹患しているかどうかを判定する為の指標を与えるものであり、上述の疾患に罹患する可能性が高いかどうかを決定する為の指標を与えることも、本発明における『診断』に含まれる。
【０２９１】
工程１について
本発明に係る診断方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程である。
【０２９２】
用語『ヒト患者』とは、上述の疾患に罹患している患者であり、疾患に罹患しているかどうか判断できないが、疾患に罹患する可能性が高いヒトも『ヒト患者』に含まれる。
【０２９３】
用語『被検体を接触させ』とは、例えば、イムノチャンバーに被検体を添加することによって実施できる。
【０２９４】
工程１におけるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９５】
用語『生理活性物質』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法に詳述したとおりとすることができる。
【０２９６】
用語『細胞集団』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述した生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を含む集団であり、その余についても、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９７】
ヒト患者からの生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体の採取方法は、特に限定はされず、例えば、ヒト患者の血液、リンパ液、所望の組織から、外科的手段、注射器を用いた手段、内視鏡を用いた手段等の公知の方法を用い採取すればよい。
【０２９８】
用語『１個の細胞を載置する』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９９】
工程２について
本発明に係る診断方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０３００】
工程２は、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程２にて詳述した工程と同様にすることができる。
【０３０１】
工程３について
本発明に係る診断方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程である。
【０３０２】
前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程は、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程３にて詳述した工程と同様にすることができる。
【０３０３】
疾患の判定は、被検体に含まれる総細胞に対する、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の割合を基に決定すればよい。所定の割合よりも高い数値であれば、上述の疾患に罹患していると決定すればよい。
【０３０４】
所定の割合とは、健常者から得られる被検体における割合を基に決定すればよい。
【０３０５】
以下に、本発明に係る診断方法の一例を示す。
【０３０６】
被検体として、乳がんの患者からインフォームドコンセントのもと採取した７．５ｃｃの末梢血を用いる。或いはヒトでは末梢血７．５ｃｃ中に赤血球を除く細胞数として約５ｘ１０７個程度であることから、マウス末梢血７．５ｃｃを採取し、そこにＡ５４９細胞の生細胞を５細胞スパイクしたものを被検体としてもよい。
【０３０７】
次いで、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び／又は抗ＨＥＲ２抗体の一方で、少なくともウェル内壁を、適宜リンカーを介して修飾した最密充填イムノチャンバーに、前記細胞を含む血しょうを１．２ｃｃ滴下し、５０ｘｇで１分間遠心し、その上清を取り除いて、すぐに被検体を再度１．２ｃｃマイクロチャンバーに滴下する。そして、再度先の条件で遠心を行い、該操作を被検体がなくなるまで繰り返す。
【０３０８】
更に、血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換し、４℃で１５分静置して、イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換する。これによって、本発明に係る診断方法の工程１を実施することができる。
【０３０９】
そして、例えば、ＰＥ標識抗サイトケラチン８、ＰＥ標識抗サイトケラチン１８抗体、ＰＥ標識抗サイトケラチン１９抗体、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＰＥ標識抗ＨＥＲ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を上述のイムノチャンバーに添加し、４℃で１５分静置する。イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に同ＰＢＳの１．２ｍｌ又は血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換する。これによって、本発明の診断方法における工程２が実施できる。
【０３１０】
そして、蛍光イメージアナライザー又は蛍光顕微鏡等で上述の工程２を施したイムノチャンバーを観察し、ＰＥに基づく蛍光シグナルを検出する。
【０３１１】
このような工程を１２回程度行うと、バックグラウンドに比べて有意に蛍光シグナルを発するウェルが、それぞれ２、５、５、６、５、４、５、４、３、４、３、及び５細胞程度となる。
【０３１２】
この様なウェル数を健常者から得られたものと比較して、多ければ多いほど乳ガンに罹患している可能性、罹患する可能性又は乳がん患者がガンの転移を引き起こす可能性が高い傾向になっていると判断することができる。これによって、本発明に係る診断方法における工程３が実施できる。
【０３１３】
また、本発明に係る診断方法における工程３の一つの実施態様として、以下に説明する方法も採用できる。
【０３１４】
ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体及び／又はＰＥ標識抗ＨＥＲ２抗体を工程２によって得られるイムノチャンバーに添加し、４℃で１５分静置する。次いで、イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換し、蛍光イメージアナライザー又は蛍光顕微鏡等で観察し、ＰＥに基づく蛍光シグナルを検出する。この様な工程を１２回程度行うとバックグラウンドに比べて有意に蛍光シグナルを発するウェルが、それぞれ２、４、０、３、４、５、５、３、４、３、４、４細胞程度となる。
【０３１５】
また、蛍光顕微鏡観察下、蛍光シグナルを発するウェルに含まれる細胞を手動で回収することができ、７日間培養したところ、回収細胞の９０％（４１細胞中３７細胞）程度となる。このような上述の本発明に係る診断方法における工程４も実施可能である。
【０３１６】
以上より、本発明に係る診断方法は、被検体に含まれる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞数が希少である被検体を用いても、疾患の審査断が可能であり、しかも検出する細胞が生細胞としての回収ができることから極めて優位な診断方法である。
【０３１７】
＜検査方法＞
本発明に係る検査方法は、以下の工程１〜３を含む食品の安全性の検査方法である。
【０３１８】
工程１
〔１〕複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させて、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程。
【０３１９】
工程２
〔２〕工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０３２０】
工程３
〔３〕工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程。
【０３２１】
本発明の検査方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を含んでいてもよい。
【０３２２】
工程４
〔４〕前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０３２３】
以下に、本発明に係る検査方法について詳述する。
【０３２４】
本発明に係る診断方法における食品とは、特に限定はされないが、例えば、魚類、貝類、海藻類等の海産物；肉類、山菜類、キノコ類等の陸産物等が挙げられる。
【０３２５】
用語『安全性』とは、上述の食品の摂取に基づいて摂取者が健康被害を生じる可能性を示すものである。例えば、安全性が低いとは、上記健康被害を生じる可能性が高いことを意味する。
【０３２６】
工程１について
本発明に係る検査方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程である。
【０３２７】
用語『被検体を接触させ』とは、例えば、イムノチャンバーに被検体を添加することによって実施できる。
【０３２８】
食品の抽出物とは、上述の食品を公知の方法によって抽出したものである。必要に応じて固液分離工程に供し、それによって得られる液体画分を更にフィルタリング工程に供したものを抽出物としてもよい。
【０３２９】
この様な抽出物を、上述の本発明に係るスクリーニング方法にて詳述した生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞に接触させたものを含む集団を、本発明の検査方法における工程１の細胞集団とすればよい。ここでの用語『接触させ』とは、単に上述の抽出物と生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を、公知の条件下に混合することによって実施できる。
【０３３０】
なお、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団は、前記チャンバーに被検体を接触させる前に、食品の抽出物と接触させていても、細胞集団を前記チャンバーに接触させた後に、食品の抽出物と接触させてもよい。
【０３３１】
用語『生理活性物質』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３２】
工程１におけるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は上述の本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３３】
用語『１個の細胞を載置する』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３４】
工程２について
本発明に係る診断方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０３３５】
工程２は、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程２に詳述したようにすればよい。
【０３３６】
工程３について
本発明に係る診断方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程である。
【０３３７】
前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程は、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は診断方法における工程３で詳述したものと同様にすればよい。
【０３３８】
安全性の決定は、被検体に含まれる総細胞に対する、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の割合を基に決定すればよい。所定の割合よりも高い数値であれば、上述の安全性が低いと決定すればよい。
【０３３９】
所定の割合とは、例えば、工程１にて用いる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞において、食品の抽出物を接触させない細胞を含む被検体における割合を基に決定すればよい。
【０３４０】
以下に、本発明に係る検査方法の一例を示す。
【０３４１】
バキュロウイルス発現系を用いてＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞に発現させた、例えばヒトノロウイルスキャプシド（ウイルス様粒子）精製物（Ａ）を得て、これを本発明に係る検査方法におけるキャリブレーションとして用いることができる。
【０３４２】
例えば、市販の生ガキを５６ロット程度入手し、これらの各ロットの０．１ｇを、１ｍｌのＰＢＳ中で公知の方法にてすりつぶして遠心し、その上清を回収してカキ検体とする。また、これらの検体を一つにまとめたものをバックグラウンド（Ｂ）と準備すればよい。
【０３４３】
また、（Ａ）／（Ｂ）タンパク量比が０／１、１／２，１／１０，１／１００，１／１０００，１／１万，１／１０万、１／１００万、１／１０００万、１／１億の割合となるように混合したサンプル液１００μｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃ）を調製した。これらの（Ａ）〜（Ｃ）の何れかを、適宜、本発明に係る検査方法の工程１における食品の抽出物とすればよい。
【０３４４】
また、抗ＩＬ−１２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＩＮＦ−γ抗体（１３０−０９５−７２９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−２抗体（１３０−０９５−７３６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＴＮＦα抗体（１３０−０９５−７２５；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−４抗体（１３０−０９５−７１５；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−５抗体（１３０−０９５−７１２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−６抗体（１３０−０９６−１３０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、又は抗ＩＬ−１２抗体（５０５３０４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の何れかで、少なくともウェル内壁を修飾した最密充填イムノチャンバーをそれぞれ作製すればよい。これを本発明に係る工程１にて用いるイムノチャンバーとすることができる  Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌：６〜８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）の脾臓より、公知の方法に基づいて、ＭＡＣＳ（登録商標）テクノロジー（ミルテニーバイオテク株式会社）に用いて脾臓細胞群（Ｄ）を得て、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｎａｃａｌａｉ、３０２６４−１４）に例えば２５万細胞／１．２ｍｌとなるよう懸濁したものを準備すればよい。
【０３４５】
本発明の検査方法に係る工程１では、上述のイムノチャンバーに、上述の（Ｄ）に示す細胞群をそのまま接触させて、イムノチャンバー内のウェルに細胞を載置した後に上述の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかを、適宜接触させてもよく（態様Ｉ）、上述のイムノチャンバーに上述の（Ｄ）に示す細胞群を接触させる前に、予め上述の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかと接触させた後に、上述のイムノチャンバーに接触させて、細胞を載置してもよい（態様ＩＩ）。
【０３４６】
上記Ｉ又はＩＩの何れの態様であっても、イムノチャンバーには（Ｄ）に示す懸濁された細胞を１．２ｍＬ程度イムノチャンバーに接触させればよく、上記（Ｄ）と、（Ａ）〜（Ｃ）の何れかとを接触させた後は、５％程度のＣＯ２環境下で、４時間〜４０時間程度インキュベートすればよい。このようにして、本発明に係る検査方法の工程１を実施することができる。
【０３４７】
この様にして得られたイムノチャンバーに対して、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌを用いた洗浄工程に供し、次いで血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地１．２ｍｌにて置換し、各抗体に対応する蛍光標識抗体として、ＰＥ標識抗ＩＮＦ−γ抗体（１３０−０９２−３４６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−２抗体（１３０−０９２−３０２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＦＩＴＣ標識抗ＴＮＦα抗体（１３０−０９２−２４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−４抗体（１３０−０９５−７０９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−５抗体（１３０−０９５−７１０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体（１３０−０９６−１３９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−１２抗体（５０５２０４：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を作用させた。これによって、本発明に係る検査方法における工程２が実施できる。
【０３４８】
その後、所定の時間チャンバーをインキュベーションした後に、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、ＰＥに基づく蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等の装置を用いた公知の手段でイメージングすれば、（Ａ）／（Ｂ）タンパク量比減少に伴い、例えばサイトカイン群の分泌（特に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等）に由来するＰＥの蛍光シグナルを発するチャンバー中のウェル数の減少が観察される。これは、例えば、上記食品の抽出物に含まれるノロウイルスの量について、依存的なデジタル検出系の構築が可能となる。
【０３４９】
次に、上述のカキ検体の５６ロットのそれぞれ１０μｌを、新たに上記（Ｂ）と同様に作製したものの１ｍｌを用いて、全てのカキ検体ロットを希釈したカキ検体群（Ｆ）を作製して、そのそれぞれ１０μｌを上記態様Ｉと同様に、予め細胞を載置したイムノチャンバーに滴下し、ＣＯ２インキュベータ内で４時間〜４０時間培養する。
【０３５０】
そして、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地１．２ｍｌに置換し、上述の通り作製した、各イムノチャンバーを修飾した抗体に対応する、ＰＥ標識抗体を各イムノチャンバーに作用する。これを、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、ＰＥに基づく蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等の公知の中断によってイメージングすれば、カキの数ロットについては、新たに上記（Ｂ）と同様に作製した被検体と比べてよりＰＥに基づく蛍光シグナルを発するウェルが多く観察でき、かつ定量化できる。この様な数ロットについては、更に他のロット観察結果に基づいて比較検定することにより、再度陽性と判定することもできノロウイルス等がカキ中に存在していた可能性が強いと判断できる。当然、この様な可能性が大きいほど、食品の安全性は低く見積もられる。
【０３５１】
＜イムノチャンバー＞
本発明に係るイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法における工程１、及び本発明に係る検査方法の工程１からなる群より選択される少なくとも１つの工程にて用いられるイムノチャンバーである。
【０３５２】
具体的なイムノチャンバーについては、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１、本発明に係る診断方法における工程１、又は本発明に係る検査方法における工程１にて詳述したとおりとすることができる。
【０３５３】
このような本発明に係るイムノチャンバーは、後述する本発明に係るキットの構成要素の１つとして有用である。
【０３５４】
＜具体例＞
以下に、本発明のイムノチャンバー及び、本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法の１つの態様について、図Ａに示す概略図を基に説明する。
【０３５５】
本発明に係るイムノチャンバーは、上述のように、ウェルの内壁側面は、前記開口部面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の略一定の傾斜角を有していてもよく、図Ａのａ又はｂに示すウェルの縦断面図におけるΘの角度を意味する。また、略一定の角度とは、開口部から底面にかけて略一定の角度の斜面を有しているとも説明できる。
【０３５６】
また、本発明に係る生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法における１態様について、ａにて説明する。本発明のイムノチャンバーの一つのウェルには、細胞が１個載置される。載置された細胞が分泌する生理活性物質は、ウェルのアミノ基でコーティングされた内壁表面にリンカーを介して結合する「生理活性物質に結合する分子」に結合し、斯かる生理活性物質は、後の工程にて「生理活性物質に結合する蛍光物質」と結合して複合体を形成する。
【０３５７】
このような複合体がウェル内で形成されることによって、生理活性物質を分泌する細胞が載置されるウェルを、前記蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出することによって決定できる。また、斯かる蛍光強度は、分泌したタンパク質の量に基づいて変化するという効果を発揮する。本発明に係るスクリーニング方法が、ウェル内部にて蛍光シグナルを検出できることから、隣接するウェルの強度の差を区別しやすくなる。
【０３５８】
さらに、ａに図示されるように、本発明に係る生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法では、斯かる細胞そのものに処理を与えることのない方法であるため、細胞への悪影響を限りなく減少される。
【０３５９】
このように蛍光シグナルを発するウェルを決定した後、必要に応じて斯かるウェルに載置される細胞を、生理活性物質を分泌する細胞として回収することが可能となる。
【０３６０】
本発明に係る生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法における１態様について、図Ａのｂを用いて説明する。本発明のイムノチャンバーの１つのウェルには、細胞が１個載置される。載置された細胞が表面提示する生理活性物質は、ウェルのアミノ基でコーティングされた内壁表面にリンカーを介して結合する「生理活性物質に結合する分子」に結合し、斯かる生理活性物質は、後の工程にて「生理活性物質に結合する蛍光物質」と結合して複合体を形成する。
【０３６１】
このような複合体がウェル内で形成されることによって、生理活性物質を表面提示する細胞が載置されるウェルを、前記蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出することによって決定される。また、斯かる蛍光強度は、表面提示された生理活性物質の量に基づいて変化するという効果を発揮する。これは、本発明に係るスクリーニング方法が、ウェル内部にて蛍光シグナルを検出できることから、隣接するウェルの強度の差を区別しやすくなることに基づいている。
【０３６２】
さらに、図Ａのｂに図示されるように、本発明に係る生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法では、ウェルに細胞を安定に保持することも可能であるために、斯かる細胞がウェルから離脱する可能性が少ないという点で、特に上述の本発明の診断方法及び検査方法として用いる場合に優れている。
【０３６３】
このように蛍光シグナルを発するウェルを決定した後、上述のように必要に応じて斯かるウェルに載置される細胞を回収することが可能となる。
【０３６４】
なお、本発明に係る診断方法及び検査方法においても、これらの生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法又は生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法と同様に説明される。
【０３６５】
＜キット＞
本発明に係るキットは、上述の本発明に係るイムノチャンバー並びにリンカー及び／又は生理活性物質に特異的に結合する分子を含む。
【０３６６】
本発明のキットに含まれるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１にて詳述したとおりとすることができる。
【０３６７】
本発明のキットに含まれるリンカーは、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述したとおりとすることができる。
【０３６８】
本発明のキットに含まれる生理活性物質に特異的に結合する分子は、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述したとおりとすることができる。
【０３６９】
本発明に係るキットを用いる事によって、上述した本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法において好適に用いられるイムノチャンバーを作製することができる。このようなイムノチャンバーの具体的な製造方法は、上述の本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述した通りとすることができる。
【０３７０】
本発明に係るキットには、さらに生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を含んでいてもよい。ここで、生理活性物質とは、上述の本発明のキットに含まれる分子が特異的に結合する生理活性物質と同じものとすることができる。具体的な生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子は、上述の本発明のスクリーニング方法、本発明の診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程２にて詳述したものと同様にすることができる。
【０３７１】
このような、生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子も含む態様の本発明に係るキットは、上述した本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、及び本発明に係る検査方法からなる群より選択される少なくとも１つの方法に有用に用いられる。
【実施例】
【０３７２】
以下に示す実験例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明が以下に示す実験例に限定されないのは言うまでもない。
【０３７３】
＜製造例＞
〔イムノチャンバーの作製〕
１．チャンバーの作製
チャンバーの製造は、ＬＩＧＡプロセスに基づいて実施した。具体的なＬＩＧＡプロセスを図Ｂに示す。
【０３７４】
射出成型にはポリスチレンを採用した。ウェルのレイアウトは、高集積（７１，４１５ウェル）チャンバーと（図Ｃ）、最密充填（２７３，３７５ウェル）チャンバー（図Ｄ及び図Ｅ）の２種類を作製した。
【０３７５】
なお、ＬＩＧＡプロセスにおけるＸ線の照射時には、図Ｂに示すＸ線照射マスクを移動させながらＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリル酸）に対するＸ線の照射量をコントロールして、ウェルに任意の傾斜角を設けることが可能である。このような方法は、具体的には特許３３８０８７８号に記載の方法を採用して行った。
【０３７６】
また、図Ｄに示すレイアウトは、最密充填チャンバーの一つのクラスターにおけるレイアウトを示しており、このクラスターを図Ｅに示すように載置したものを、本実施例における最密充填チャンバーとした。クラスター間には１７０μｍのギャップが設けられている。
【０３７７】
このようにして製造した最密充填チャンバーの図Ｂにて示すＸ線照射後のＰＭＭＡ、Ｎｉによる電析を行った後のＮｉ電鋳入子、及びそれを用いたポリスチレン射出形成品のレーザー顕微鏡観察像を図Ｆに示す。
【０３７８】
この結果から、ウェルの形状は、上述のパターン通りに形成されていることが明らかとなった。
【０３７９】
２．チャンバーへの化学修飾
次いで、上記方法にて得られたチャンバーへ、各種物質で化学修飾する為の表面処理剤の使用濃度の最適化を検討した。
【０３８０】
具体的には、上述の高集積チャンバー及び最密充填チャンバーへの化学修飾を行うにあたり、ウェル内壁に対してアミノ基付与処理を行う際に用いたシランカップリング剤の濃度の最適化を行い、その処理の均一性を評価した。
【０３８１】
まず、ウェルに対し酸素プラズマを照射した。具体的には、ヤマトマテリアル(株)社製ＰＤＣ２１０のプラズマ装置を用いて、酸素ガス１００ｃｃ、ＲＦ出力３００Ｗで処理時間１０秒で行った。ついで、シランカップリング剤である、３−アミノプロピルエトキシシランを０．１重量％及び１．０重量％の濃度で酸素プラズマ処理後のチャンバーに添加し、アミノ化処理を行った。次いで、乾燥、冷却の工程に供し、蒸留水でディッピング洗浄の後、細胞培養時に物理吸着したシランカップリング剤が培養液中に溶出し細胞毒性を示さない程度に蒸留水による流水による水洗（例えば、各チャンバーあたり蒸留水５０ｍｌ使用）を行った。
【０３８２】
洗浄工程の後に、乾燥、冷却工程を行って、ウェル内壁をアミノ基付与処理したイムノチャンバーを作製した。得られたイムノチャンバー表面（０．１重量％で処理したもの）の親水性について、純水の水滴接触角試験を用いて検討した。その結果を、図Ｇに示す。
【０３８３】
未処理のチャンバー表面と比較して、０．１重量％の３−アミノプロピルエトキシシランで処理したチャンバーは、アミノ基が付与され、十分に親水性を示すことが明らかとなった。
【０３８４】
２−１：表面処理濃度の最適化
ＣＦ４８８Ａ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ
（ＮＨＳ化合物）（Ｅｘ４８８／Ｅｍ５１５）蛍光物質（ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｃａｔ．＃  ９２１２０）を用い、上述のアミノ基処理剤の濃度を１．０％（ｗ／ｖ）として、アミノ基でウェル内がコートされたチャンバー（Ｓｌｉｄｅ  Ａ）及び０．１％（ｗ／ｖ）でウェル内がコートされたチャンバー（Ｓｌｉｄｅ  Ｂとする）に、どの程度の量のＮＨＳ化合物が結合するかを可視化した。
【０３８５】
濃度幅（１ｍｇ／ｍｌ（１．６７ｍＭ）を起点として４倍系列希釈）を設け、サブエリアを覆うように０．５μｌの上述の蛍光物質をスポットし、次いで、ＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳを含むＮａＰＢ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む〔ｐＨ８．０〕）を図１に示すように２５℃、１時間作用させ、反応させた。
【０３８６】
次いで１００ｍｌの滅菌水で流水洗浄を行い、１つのサブエリアについて、８カ所のプロット（図２の丸で囲んだ領域）を蛍光測定した。結果を図３及び表１に示す。
【０３８７】
【表１】
2014110785.tif 000053
【０３８８】
図３に示したように、Ｓｌｉｄｅ  Ａでは０．０６２５ｍｇ／ｍｌ（約０．１ｍＭ−ＮＨＳ）、Ｓｌｉｄｅ  Ｂでは０．２５ｍｇ／ｍｌ（約０．４ｍＭ−ＮＨＳ）の濃度で蛍光が飽和しており、この濃度でチャンバーのウェル内が好適に修飾されることが示唆された。
【０３８９】
２−２：表面処理濃度の均一性評価
高集積（７１，４１５ウェル）チャンバー及び最密充填（２７３，３７５ウェル）チャンバーの化学修飾を行うにあたり、上述のアミノ基でコートされたチャンバーに均一に処理できるかどうかを評価した。ＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳを０．０７ｍｇ／ｍｌ（０．１ｍＭ）の濃度で含むＮａＰＢの０．８６ｍｌを図４のように作用（２５  ℃，１時間）させた。その後、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄し、各チャンバーの図５の四角枠に示す１５つのサブエリアにおける、８カ所のプロット（図５の丸で囲んだ領域）を蛍光測定した。
結果を図６及び表２に示す。
【０３９０】
【表２】
2014110785.tif 000054
【０３９１】
図６に示したように、標準偏差を見たところ，バラつきはおおよそ１０％以内であると判明し、上述のチャンバーのウェル内は、均一にアミノ基によってコートされていることが示唆された。
【０３９２】
３−１：抗体の化学修飾
上記チャンバーに抗体を共有結合させることにより、例えば、以下に列記したスクリーニング又は疾患の診断方法の提供が可能となる。
【０３９３】
１）抗体を著量分泌するハイブリドーマの再セレクション。
２）所望の抗体、サイトカイン、分泌タンパク質等を分泌する遺伝子組み換えＣＨＯ細胞等のスクリーニング。
３）所望の抗体、サイトカイン、及び分泌タンパク質等を分泌する１）と２）に挙げた以外の細胞群等のスクリーニング。
４）表面抗原タンパク質の発現量の有無又はその発現量を指標とした疾患の診断方法。
【０３９４】
このようなスクリーニングを達成するにあたり、イムノチャンバーに対する抗体修飾のための架橋剤の検討を行った。
【０３９５】
３−１−１：Ｂｉｓ−ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）試薬を介する抗体修飾
上述のチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、Ｂｉｓ−ＮＨＳ（ＮＨＳ―リンカー―ＮＨＳ）試薬を用い、上述のチャンバー内壁に修飾されたアミノ基を介して抗体を架橋した。
【０３９６】
抗体として抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ｐｉｅｒｃｅ（ｔａｋａｒａ）Ｃａｔ．＃  ３１１６８）又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いた。架橋剤として用いたＢｉｓ−ＮＨＳ試薬は表３に示す製品である。
【０３９７】
【表３】
2014110785.tif 000055
【０３９８】
０．００１２ｍＭの上記の各種Ｂｉｓ−ＮＨＳ及び２９５ｎＭの上記抗体を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを、図４に示すように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させた。
【０３９９】
３−１−２：ＮＨＳ−ＭＡＬ（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）試薬を介する抗体修飾
ナノチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、ＮＨＳ−ＭＡＬ（ＮＨＳ―リンカー―ＭＡＬ）試薬を用い、イムノチャンバーのアミノ基と抗体のチオール基を架橋した。
【０４００】
抗体には上述の抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いた。架橋剤として用いたＮＨＳ−ＭＡＬ試薬は表４に示す製品である。
【０４０１】
【表４】
2014110785.tif 000056
【０４０２】
０．４ｍＭの上記各種各ＮＨＳーＭＡＬ試薬を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４０３】
ついで、イムノチャンバーに２９５ｎＭの上記抗体を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で作用させ、０．０５ｍＭのシステインを含む３ｍｌのＮａＰＢで洗浄し、抗体修飾イムノチャンバーを得た。
【０４０４】
３−１−３：ビオチン−ＮＨＳ試薬を介する抗体修飾
イムノチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、イムノチャンバーと抗体それぞれに対して、ビオチン−ＮＨＳ（ビオチン−リンカー−ＮＨＳ）試薬を用いてビオチン標識し、次いで、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅを用いて抗体修飾イムノチャンバーを作製した。比較実験として、アミノ基を有さない単なるチャンバーに対して同様の実験を行った。
【０４０５】
イムノチャンバーにビオチンが標識されているかどうかは、Ｃｙ３標識したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを用いて、蛍光による可視化で確かめた。０．４ｍＭの各ビオチン−ＮＨＳを含む、０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ１００ｍｌの滅菌水で流水洗浄後、０．００１ｍｇのＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎを含む、５ｍｌのＮａＰＢを該ビオチン標識チャンバーに２５℃、１時間作用させて蛍光を観察した。その結果を図７に示す。
【０４０６】
図７に示したとおり、アミノ基の無いポリスチレン基板をビオチン−ＮＨＳとＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎで処理した時に比べ、アミノ基のあるＳｌｉｄｅ  Ａをビオチン−ＮＨＳとＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎで処理した時では、強い蛍光が観察された。この結果から、アミノ基コート依存的にビオチンがコートされたことが示唆された。
【０４０７】
イムノチャンバーをビオチン化できることが示されたので、抗体として上述の抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用い、架橋剤として用いたビオチン−ＮＨＳ試薬は、表５に示す製品である。
【０４０８】
【表５】
2014110785.tif 000057
【０４０９】
先ず、０．４ｍＭの上記各種ビオチン−ＮＨＳ試薬（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４１０】
一方、０．０１３３ｍＭの抗体を含む、０．０２ｍｌのＮａＰＢに対し、１０ｍＭのその他の表５に示すビオチン−ＮＨＳ試薬のＤＭＳＯ溶液を０．０００５ｍｌ添加し、２５℃で１時間反応させた後、透析あるいはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したゲルろ過カラムを用いて、余剰のビオチンを除去し、ビオチン化抗体を取得した。
【０４１１】
得られた２９５ｎＭのビオチン化抗体及び１００ｎｍのＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように、２５℃、１時間で、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗体修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１２】
３−２：抗原（ペプチド、タンパク質、抗体等）の化学修飾
イムノチャンバーに抗原（タンパク質、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、ビタミン、低分子化合物等のペプチド、タンパク質等、さらに上述のように抗体を含む場合もある）を共有結合させることにより、例えば、以下に列記したスクリーニングが可能となる。
【０４１３】
１）抗原特異的な抗体を著量分泌するハイブリドーマの再セレクション。
２）抗原特異的な抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング。
３）抗原特異的な抗体を分泌するＢ細胞のスクリーニング。
４）抗原特異的な抗体を分泌するＣＨＯ細胞のスクリーニング。
５）抗原に対して親和性を有する分子（タンパク質、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、ビタミン、低分子化合物、抗体等）を分泌する、１）から４）に挙げた以外の細胞群のスクリーニング。
【０４１４】
このようなスクリーニングを達成するにあたり、イムノチャンバーに対する抗原修飾のための架橋剤の検討を行った。
【０４１５】
３−２−１：Ｂｉｓ−ＮＨＳ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、Ｂｉｓ−ＮＨＳ試薬を用い、ナノチャンバーと抗原それぞれのアミノ基どうしを架橋した。抗原にはタンパク質（ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）等）を用い、架橋剤は表３に示すものを利用した。各種Ｂｉｓ−ＮＨＳを０．００１２ｍＭ及びタンパク質を２９５ｎＭ含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように、２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１６】
３−２−２：ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を用い、イムノチャンバーのアミノ基と抗原のチオール基を架橋した。抗原にはＬＤＨ等を用い、架橋剤は表４に示す物を利用した。０．４ｍＭの各種ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４１７】
また、２９５ｎＭの抗体（ここでは、抗原として用いている）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、０．０５ｍＭのシステインを含む３ｍｌのＮａＰＢで洗浄し、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１８】
３−２−３：ビオチン―ＮＨＳ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、イムノチャンバーと抗体それぞれに対してビオチン−ＮＨＳ試薬を用いてビオチン標識し、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅを用いて抗体修飾イムノチャンバーを作製した。抗原にはＬＤＨ等を用い、架橋剤として用いたビオチン―ＮＨＳ試薬は、表５に示す製品である。
【０４１９】
まず、上記各種ビオチン−ＮＨＳ試薬（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図４のように２５℃、１時間で上述のアミノ基処理剤濃度を、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水１００にて流水洗浄した。
【０４２０】
一方、０．０１３３ｍＭの抗原を含む０．０２ｍｌのＮａＰＢに対し、１０ｍＭのその他の表５に示すビオチン−ＮＨＳ試薬のＤＭＳＯ溶液を０．０００５ｍｌ添加し、２５℃で１時間反応させた後、透析あるいはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したゲルろ過カラムを用いてフリーのビオチンを除去し、ビオチン化抗原を取得した。
【０４２１】
得られたビオチン化抗原２９５  ｎＭ及びＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ  １００  ｎＭを含むＮａＰＢの０．５ｍｌを図４のように、２５℃、１時間で、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４２２】
＜実験例＞
以下に、上述の各種の化学修飾を施したイムノチャンバーを用いた標的細胞の回収等の実験を行った。
【０４２３】
４−１：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーの細胞導入検討
上述の方法で作製した各種抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに、生細胞染色試薬であるＣｙｔｏＲｅｄを用いて染色したＨｙｂｒｉｄｏｍａ細胞、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した固定化済の肺腺上皮癌由来Ａ５４９細胞、ＥＧＦＰを産生するマウスＥＳ細胞、ＣｙｔｏＲｅｄ染色したＣＨＯ細胞等を播種し、これらの細胞の導入効率を評価した。結果を図８に示す。
【０４２４】
図８に示したとおり、最密充填（２７３，３７５ウェル）イムノチャンバーにおいては、８５％〜９０％の導入効率を示し、高集積（７１，４１５ウェル）イムノチャンバーにおいては７５％〜８５％の導入効率を示した。なお、高集積イムノチャンバー及び最密充填イムノチャンバー共に、架橋剤としてＰＥＧを含むものとを用い、そのエチレンオキシドの繰り返し単位数が大きいほうが細胞の導入効率が高い傾向となり、例えば高集積については、このような繰り返し単位数が短いと、ウェル間のピッチに多数の細胞が吸着する傾向となった。
【０４２５】
一方、細胞側をｐｌｕｒｏｎｉｃ等の共重合型界面活性剤や任意の分子量のＰＥＧで前処理すると、上述のＰＥＧにおけるエチレンオキシドの繰り返し単位数に関わらず、細胞の導入効率が高くなる傾向であった。
【０４２６】
４−２：抗体及び抗原修飾を施したナノチャンバー（イムノチャンバー）の細胞導入後の毒性の検討
上述の方法で作製した各種抗体修飾ナノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに、ＣｙｔｏＲｅｄ染色したＨｙｂｒｉｄｏｍａ細胞，マウスＥＳ細胞、ＣＨＯ細胞等を播種し、その直後（時間０）及び播種後４時間経過した時の蛍光像を観察した。結果を図９に示す。
【０４２７】
図９に示したとおり、時間０と４時間後の蛍光像に変化が無い事から、毒性は無いと示唆された。
【０４２８】
４−３：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーを用いる抗体分泌細胞の回収
上述の方法で作製した各種抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに対して、抗体分泌細胞を播種し、全自動１細胞単離解析装置（ＡＳ  Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｃｋｉｎｇ  システム；アズワン社）を用いて回収実験を行った。
【０４２９】
抗マウスＩｇＧ抗体又はＬＤＨで修飾したイムノチャンバーを所定のブラックフレームにセットし、２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１．２ｍｌのＰＢＳでブロッキング（室温、６０分）工程に供した。
【０４３０】
次いで、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ細胞の３，０００細胞とＣＨＯ細胞の３００，０００細胞ずつを１．２ｍｌの血清不含培地に懸濁し、高集積（７１，４１５ウェル）イムノチャンバー上には１０万細胞を、最密充填（２７３，３７５ウェル）イムノチャンバー上には３０万細胞を播種した。
【０４３１】
その後、血清を含む培地に置換して抗体分泌細胞に由来する抗体分泌を促し、３７℃、で５％のＣＯ２の存在下で３０分間静置後、５ｍｌの血清不含培地で洗浄した。
【０４３２】
０．００５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体及び０．００２ｍＭのＣｙｔｏＲｅｄを含む０．５ｍｌの血清不含培地を洗浄後のイムノチャンバーに添加し、室温で２０分静置した。その後、１０ｍｌの血清不含培地で洗浄し、１．２ｍｌの血清不含培地を添加して、上述の全自動１細胞単離解析装置にて観察及び回収した。具体的な観察及び回収方法は、装置のマニュアル通りに、ＦＩＴＣの輝度値の高いウェルに含まれる抗体分泌細胞を回収するプログラムにて行った。具体的には、輝度値の高い１３個のウェルに含まれる抗体産生細胞を回収した。観察結果を図１０に示し、回収の様子を図１１に示した。
【０４３３】
高集積イムノチャンバー及び最密充填イムノチャンバー共に、架橋剤としてＰＥＧを含むものとを用い、そのエチレンオキシドの繰り返し単位数が大きいほうが細胞の回収効率が高い傾向となった。
【０４３４】
一方、細胞側をｐｌｕｒｏｎｉｃ等の共重合型界面活性剤や任意の分子量のＰＥＧで前処理すると、上述のＰＥＧにおけるエチレンオキシドの繰り返し単位数に関わらず、細胞の回収効率が高くなる傾向であった。
【０４３５】
４−４：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーを用いた抗体を高分泌する抗体分泌細胞の回収
上述の方法で回収した抗体分泌細胞をそのまま育種工程に供し、観察した。約１週間の培養で全て浮遊形態を示す細胞コロニーが観察され、仮足を有する細胞コロニーは観察されなかった。細胞コロニーの様子を図１２に示す。
【０４３６】
このことから回収した細胞が抗体分泌細胞、すなわちハイブリドーマ細胞であることを示された。さらに約２０日の培養後、回収した抗体分泌細胞の培地上清をＥＬＩＳＡに供した。
【０４３７】
まず、ＥＬＩＳＡプレートを作製した。１ｍｌのＰＢＳ中に抗マウスＩｇＧ抗体を０．０１２ｍｇ添加し、これを９６ウェルプレートの１ウェルにつき０．０３ｍｌずつ添加し、４℃で１晩静置した。洗浄緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ；ＰＢＳＴ）で５回洗浄し，０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを１ｗｅｌｌにつき０．２ｍｌずつ添加し、２５℃で１時間静置して抗体固相化プレートを作製した。作製した抗体固相化プレートは密閉して４℃で保存した。
【０４３８】
次に、抗体固相化プレートの１ウェルに上述の輝度値の高い１０個のハイブリドーマを培養して得られた培養液の各検体の０．１ｍｌを添加し、室温で１時間静置して反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄し、蛍光標識抗体あるいはＨＲＰ標識抗体を０．２ｍｌ添加し、遮光状態で４℃で１時間静置した。ＰＢＳＴで５回洗浄し、蛍光標識抗体を用いたサンドイッチＦＩＡについては、そのまま蛍光／吸光プレートリーダーＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）により４８８ｎｍの蛍光を測定し、ＨＲＰ標識抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡについては、ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を０．１ｍｌ添加して３０分間反応させ、２Ｍの硫酸を０．１ｍｌ添加して反応を停止後、同様にＶａｒｉｏｓｋａｎにより４５０ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図１３に示した。
【０４３９】
図１３に示したとおり、輝度値の高いハイブリドーマの大半が抗体を著量分泌すると判明した。このことから本スクリーニング系において、蛍光輝度の高いイムノチャンバーから回収された抗体分泌細胞は、高い抗体分泌能を有することが明らかとなった。
【０４４０】
４−５：マニュアル操作による標的細胞取得
上記４−３に示す方法では、公知の全自動１細胞単離解析装置を用いた方法ではあるが、それ以外にナリシゲのマイクロマニピュレータを用い、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ）観察下で、手動（マニュアル）でも行うことが出来た。
【０４４１】
具体的には，上述の方法で作製した抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに抗体分泌細胞を播種し、共焦点レーザー顕微鏡観察下で、市販のマイクロマニピュレータ（ナリシゲ社）を用いて回収実験を行った。
【０４４２】
方法を次に示す。抗マウスＩｇＧ抗体又はＬＤＨ修飾イムノチャンバースライドをブラックフレームにセットし、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１．２ｍｌのＰＢＳでブロッキング（室温、６０分）に供した。抗体分泌細胞の１５０，０００細胞とＣＨＯ細胞の１５０，０００細胞ずつを１．２ｍｌの血清不含培地に懸濁し、高集積イムノチャンバー上には１０万細胞を、最密充填イムノチャンバー上には３０万細胞を播種した。
【０４４３】
これらの細胞を播種した後、血清を含む培地に置換して抗体分泌細胞に由来する抗体分泌を促し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で３０分間静置後、５ｍｌの血清不含培地で洗浄した。
【０４４４】
次いで、０．００５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体及び０．００２ｍＭのＣｙｔｏＲｅｄを含む５００ｍｌの血清不含培地を添加し、室温で２０分静置した。血清不含培地１０ｍｌで洗浄し、血清不含培地１．２ｍｌを添加してＬＳＭにて観察し、高い蛍光値を示すウェルに含まれる抗体分泌細胞をナリシゲのマイクロマニピュレータを用いて回収した。ＬＳＭによる観察結果は図１４に示した。
【０４４５】
４−６：フローサイトメトリー法との比較
本発明のイムノチャンバーを用いたスクリーニング方法と従来のフローサイトメトリー法とを比較する実験を行った。
【０４４６】
検出対象として、約１０７個のＣＤ４５陽性であるＪｕｒｋａｔ細胞と、約１０２個のＣＫ（サイトケラチン）１１、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの何れかを１種以上を発現するＡ５４９細胞を混合した（本明細書において、Ｊｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞又は単に混合細胞と呼ぶことがある。）
【０４４７】
ここで、Ａ５４９細胞を検出対象とし、０．００１％の検出精度が達成されるかどうかの実験を、本発明のイムノチャンバーを用いたスクリーニング法と、従来のフローサイトメトリー法とを比較して検討した。
【０４４８】
上述のＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞を４％のＰＦＡを用いて、室温条件下で２０分間の固定化処理に供した後に、最終濃度が０．０３％となるようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０μｌのＣｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ抗体カクテル（抗ＣＫ１１−ＰＥ標識抗体、抗ＣＫ１９−ＰＥ標識抗体、及び抗ＣＤ４５−ＡＰＣ標識抗体；Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を含む１００μｌのＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）に懸濁して、４℃で１時間静置し、上記界面活性剤及び抗体カクテルを含まないＭＡＣＳバッファーにて２回洗浄した。
【０４４９】
ついで、洗浄後の混合細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  ライフサイエンス社）を用いて、約１００万個の混合細胞の解析を行った。結果を図１５に示す。
【０４５０】
混合細胞中の検出対象となるＡ５４９細胞は、ＣＫ１１及びＣＫ１９には陽性で、且つＣＤ４５には陰性であるために、図１５中の４におけるＱ３画分（ＰＥ−Ａ＋，ＣＤ４５−）に、理論的には１０個の細胞が含まれるはずであるが、細胞の姿は見えなかった。図１５の５に、解析結果を統計的にまとめた表を示すが、Ｑ３にはすべての混合細胞に対して検出された細胞はわずか０％であった。
【０４５１】
即ち、従来のＦＡＣＳを用いた方法では、０．００１％程度の検出感度が達成できないことが明らかとなった。検出すらできないことから、所望の対象細胞を、公知のセルソーター機能に供して分別し、これをそのまま育種に供することもできない。
【０４５２】
一方で、本発明に係るスクリーニング方法として、先ず、適当な培地に上記混合細胞を懸濁し、これをイムノチャンバーに播種した。用いたイムノチャンバーは、上述の方法に沿って作製したものであり、具体的にはチャンバーのウェル内表面が、アミノ基処理剤で処理され、当該表面にアミノ基が付与されたウェルを有するチャンバー（おおよそ２７万ウェル）に対し、両端にＮＨＳ基を有するＰＥＧ９リンカー（ＢＳ（ＰＥＧ）９；Ｔｈｅｒｍｏ社）を介して、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＣＳＴ：ウサギモノクローナル抗体）が結合したイムノチャンバーである。
【０４５３】
上記混合細胞を上記イムノチャンバーに播種してから２０分静置し、１ｍｌのＭＡＣＳバッファーで１０回洗浄後、イムノチャンバーの各ウェルに細胞が１つ載置されていることを確認した。
【０４５４】
ついで、Ｃｙ３標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ標識抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）をそれぞれ１０μｌずつ含む１ｍＬのＭＡＣＳバッファーをイムノチャンバー内の各ウェルに添加し、４℃で１時間静置した。
【０４５５】
そして、上記イムノチャンバーのウェル内に載置された細胞を、界面活性剤を含まないＭＡＣＳバッファーで３回洗浄し、上述の全自動１細胞単離解析装置にて解析し（図１６）、Ｃｙ３の蛍光を発するウェルからＥｐＣＡＭ陽性細胞、即ちＡ５４９細胞が８２個程度存在していることを確認した。なお、図１６に示す写真像は、イムノチャンバーの一部の領域のみを示すものである。そして、確認したＡ５４９細胞のうち、高いＣｙ３蛍光値を示す１２個を回収した（図１７）。
【０４５６】
回収した細胞をそれぞれ独立に適当な培地及び培養条件にて２１日間培養に供し、６ｃｍディッシュにて６０％コンフルエントになるまで培養を続けた。その後、培養された細胞を３ｍｌのダルベッコＰＢＳにて２回洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコＰＢＳを用いて回収した。
【０４５７】
回収した細胞を、４％のＰＦＡを用いて、室温条件下で２０分間の固定化処理に供した後に、最終濃度が０．０３％となるようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０μｌのＣｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ抗体カクテル（抗ＣＫ１１−ＰＥ標識抗体、抗ＣＫ１９−ＰＥ標識抗体、及び抗ＣＤ４５−ＡＰＣ標識抗体；Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を含む１００μｌのＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）に懸濁して、４℃で１時間静置し、上記界面活性剤及び抗体カクテルを含まないＭＡＣＳバッファーにて２回洗浄した。
【０４５８】
次いで、洗浄後の混合細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  ライフサイエンス社）を用いて、約５万個の細胞の解析を行った。結果を図１８に示す。
図１８に示すように、回収した細胞はＣＫ１１＋又はＣＫ１９＋で、且つＣＤ４５−であるＡ５４９細胞であった。
【０４５９】
従って、本発明のイムノチャンバーを用いた方法によると、約０．００１％の精度で細胞を検出することが可能で、これを一細胞レベルで回収し、さらに育種に成功できたことを明らかに示している。
【図Ａ】
2014110785.tif 000058
【図Ｂ】
2014110785.tif 000059
【図Ｃ】
2014110785.tif 000060
【図Ｄ】
2014110785.tif 000061
【図Ｅ】
2014110785.tif 000062
【図Ｆ】
2014110785.tif 000063
【図Ｇ】
2014110785.tif 000064
【図１】
2014110785.tif 000065
【図２】
2014110785.tif 000066
【図３】
2014110785.tif 000067
【図４】
2014110785.tif 000068
【図５】
2014110785.tif 000069
【図６】
2014110785.tif 000070
【図７】
2014110785.tif 000071
【図８】
2014110785.tif 000072
【図９】
2014110785.tif 000073
【図１０】
2014110785.tif 000074
【図１１】
2014110785.tif 000075
【図１２】
2014110785.tif 000076
【図１３】
2014110785.tif 000077
【図１４】
2014110785.tif 000078
【図１５】
2014110785.tif 000079
【図１６】
2014110785.tif 000080
【図１７】
2014110785.tif 000081
【図１８】
2014110785.tif 000082
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月12日(2013.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の１細胞スクリーニング方法及びそれに用いられるイムノチャンバーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が有する機能を解析する為に、１細胞、すなわち単一細胞（Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ）レベルで機能を解析する技術が求められている。このような技術は、例えばハイブリドーマの選別のような細胞の交発現株のスクリーニング、疾患の有無を診断する為の基礎技術として研究が進められている。
【０００３】
この様な基礎技術として、例えば特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２に示すような、蛍光標識抗体を用いたスクリーニング方法、又はそれに用いられるデバイスが開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−０３４０４７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｔｏ  Ｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００４；２０（３）：８９７−９０４
【非特許文献２】Ｊｉｎ  Ａら，Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；１５（９）：１０８８−１０９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に示す１細胞スクリーニング方法は、細胞の脂質膜を介した修飾を行うことから、侵襲性を有しておりスクリーニング後の細胞の増殖等の育種の面で予期せぬ悪影響があるので好ましくない。
【０００７】
また、特許文献１及び非特許文献２に記載された、細胞侵襲性を示さない１細胞スクリーニング方法に関する記載は、ウェルの周囲を蛍光分子に基づいて光らせて、１細胞をスクリーニングする方法である。しかしながら、このような方法であれば、隣接する幾つかのウェルが光っていた場合、どのウェルに有用な生体分子を分泌産生する細胞が存在するかについて、機械的手法であっても、人為的手法であっても特定するのが困難であるという問題点がある。
【０００８】
そして、ウェルの周囲に蛍光分子に基づいて光らせるためにコーティングが必要となり、そのための部位を設ける必要があるため、１つのウェルに１個の細胞を格納させる効率が悪くなるという問題点も有している。
【０００９】
さらに、この様なコーティングについて、１細胞をスクリーニングした後に細胞の回収を目的とするのであれば、ウェル内壁の表面に親水性を付与しておかないと、細胞が吸着してしまう傾向となり、細胞回収時に細胞へ障害、ひいては破壊を引き起こしてしまう。
【００１０】
一方で、ウェル内壁の表面に疎水性を付与しておかないとウェル内での細胞の安定性を
欠いてしまう傾向となる。すなわち、コーティングについては、親水性の付与と組成性の付与という面から高度に制御する必要があるという問題点も存在している。
【００１１】
本発明は、１細胞単位で有用な生理活性物質を産生し、それを分泌又は表面提示する細胞をスクリーニングする為に、効率よく１つのウェル内に１個の細胞を載置し、且つスクリーニングの対象とする１つの細胞を簡便且つ確実に特定する為の方法を提供することを目的とする。さらに、スクリーニングした細胞を細胞に損傷を与えることなく回収することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、細胞に侵襲性を与えることのない手段で、且つ特定のイムノチャンバーを用いる、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を選択する方法を開発した。
【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様を広く包含するものである。
【００１４】
項１  以下の工程を含む、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示するタンパク質を産生する細胞のスクリーニング方法；
（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程１、
（２）工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程３。
【００１５】
項２  （４）前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項１に記載のスクリーニング方法。
【００１６】
項３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１又は項２に記載のスクリーニング方法。
【００１７】
項４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞
、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ・クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１〜項３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００１８】
項５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項１〜項４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００１９】
項６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２倍〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項１〜項５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２０】
項７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項１〜項６の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２１】
項８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の略一定の傾斜角を有する、上記項１〜項７の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２２】
項９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である前記項１〜項８の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２３】
項１０  前記チャンバーにおける任意の隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項１〜項９の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２４】
項１１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項１〜項１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２５】
項１２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項１１に記載のスクリーニング方法。
【００２６】
項１３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含む、ポリアルキレングリコールである上記項１２に記載のスクリーニング方法。
【００２７】
項１４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項１
３に記載のスクリーニング方法。
【００２８】
項１５  前記生理活性物質に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項１２〜項１４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００２９】
項１６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項１３〜項１５の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３０】
項１７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項１３〜項１６の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３１】
項１８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項１２〜項１７の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【００３２】
項１９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式１〜１０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項１２〜項１８の何れか１項に記載のスクリーニング方法；
【００３３】
【化１】
2014110785.tif 000083
【００３４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３５】
【化２】
2014110785.tif 000084
【００３６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３７】
【化３】
2014110785.tif 000085
【００３８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００３９】
【化４】
2014110785.tif 000086
【００４０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４１】
【化５】
2014110785.tif 000087
【００４２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４３】
【化６】
2014110785.tif 000088
【００４４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００４５】
【化７】
2014110785.tif 000089
【００４６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【００４７】
【化８】
2014110785.tif 000090
【００４８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【００４９】
【化９】
2014110785.tif 000091
【００５０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【００５１】
【化１０】
2014110785.tif 000092
【００５２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１００
０〜１００００である。）。
【００５３】
項２０  以下の工程を含む疾患の診断方法；
［１］複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
［２］工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程３。
【００５４】
項２１  ［４］前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項２０に記載の診断方法。
【００５５】
項２２  前記疾患が、癌、転移性癌、免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心筋梗塞心疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、骨疾患、内分泌系疾患、皮膚疾患、脳疾患、脳梗塞からなる群より選択される、少なくとも一種である上記項２０又は項２１に記載の診断方法。
【００５６】
項２３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項２０〜項２２の何れか１項に記載の診断方法。
【００５７】
項２４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ・クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項２０〜項２３の何れか１項
に記載の診断方法。
【００５８】
項２５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項２０〜項２４の何れか１項に記載の診断方法。
【００５９】
項２６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２倍〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項２０〜項２５の何れか１項に記載の診断方法。
【００６０】
項２７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項２０〜２６の何れか１項に記載の診断方法。
【００６１】
項２８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の傾斜角を有する、上記項２０〜項２７の何れか１項に記載の診断方法。
【００６２】
項２９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である上記項２０〜項２８の何れか１項に記載の診断方法。
【００６３】
項３０  隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項２０〜項２９の何れか１項に記載の診断方法。
【００６４】
項３１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項２０〜項３０の何れか１項に記載の診断方法。
【００６５】
項３２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項３１に記載の診断方法。
【００６６】
項３３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項３２に記載の診断方法。
【００６７】
項３４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項３３に記載の診断方法。
【００６８】
項３５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項３２〜項３４の何れか１項に記載の診断方法。
【００６９】
項３６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項３３〜項３５の何れか１項に記載の診断方法。
【００７０】
項３７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記
項３３〜項３６の何れか１項に記載の診断方法。
【００７１】
項３８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項３２〜項３７の何れか１項に記載の診断方法。
【００７２】
項３９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式１１〜２０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項３２〜項３８の何れか１項に記載の診断方法。
【００７３】
【化１１】
2014110785.tif 000093
【００７４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７５】
【化１２】
2014110785.tif 000094
【００７６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７７】
【化１３】
2014110785.tif 000095
【００７８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００７９】
【化１４】
2014110785.tif 000096
【００８０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８１】
【化１５】
2014110785.tif 000097
【００８２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８３】
【化１６】
2014110785.tif 000098
【００８４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【００８５】
【化１７】
2014110785.tif 000099
【００８６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【００８７】
【化１８】
2014110785.tif 000100
【００８８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【００８９】
【化１９】
2014110785.tif 000101
【００９０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【００９１】
【化２０】
2014110785.tif 000102
【００９２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【００９３】
項４０  以下の工程を含む食品の安全性の検査方法；
〔１〕複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程１、
〔２〕工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程２、
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程３。
【００９４】
項４１  〔４〕前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程４を含む、上記項４０に記載の検査方法。
【００９５】
項４２  前記食品が、海産物及び／又は陸産物である上記項４０又は項４１に記載の検査方法。
【００９６】
項４３  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項４０〜項４２の何れか１項に記載の検査方法。
【００９７】
項４４  前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞が、ハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ、クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、及びＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項４０〜項４３の何れか１項に記載の検査方法。
【００９８】
項４５  前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項４０〜項４４の何れか１項に記載の検査方法。
【００９９】
項４６  前記ウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径の１．２〜２倍であり、且つ該開口部から該ウェルの底面までの距離が、該開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の０．６倍〜１．４倍である、上記項４０〜項４５の何れか１項に記載の検査方法。
【０１００】
項４７  前記開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径が２〜６０μｍである、上記項４０〜項４６の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０１】
項４８  前記ウェルの内壁側面が、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の傾斜角を有する、上記項４０〜項４７の何
れか１項に記載の検査方法。
【０１０２】
項４９  前記チャンバーにおける任意の隣接する４つのウェル間で形成される開口部以外の領域の面積が、該開口部の面積の２倍以下である上記項４０〜項４８の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０３】
項５０  隣接する２つのウェルにおける該ウェルのそれぞれ中心間の距離が、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の１倍〜２．５倍である、上記項４１〜項４９の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０４】
項５１  前記ウェルの内壁表面が、アミノ基を有する、上記項４１〜項５０の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０５】
項５２  前記アミノ基に、前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、リンカーを介して結合する、上記項５１に記載の検査方法。
【０１０６】
項５３  前記リンカーが、その一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項５２に記載の検査方法。
【０１０７】
項５４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項５３に記載の検査方法。
【０１０８】
項５５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項５２〜項５４の何れか１項に記載の検査方法。
【０１０９】
項５６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項５３〜項５５の何れか１項に記載の検査方法。
【０１１０】
項５７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項５３〜項５６の何れか１項に記載の検査方法。
【０１１１】
項５８  前記リンカーの分子長が、１０〜５０００Åである、上記項５２〜項５７の何れか１項に記載の診検査断方法。
【０１１２】
項５９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ
）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式２１〜３０記載にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項５２〜５８の何れか１項に記載の診断方法；
【０１１３】
【化２１】
2014110785.tif 000103
【０１１４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１５】
【化２２】
2014110785.tif 000104
【０１１６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１７】
【化２３】
2014110785.tif 000105
【０１１８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１１９】
【化２４】
2014110785.tif 000106
【０１２０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２１】
【化２５】
2014110785.tif 000107
【０１２２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２３】
【化２６】
2014110785.tif 000108
【０１２４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１２５】
【化２７】
2014110785.tif 000109
【０１２６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０１２７】
【化２８】
2014110785.tif 000110
【０１２８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０１２９】
【化２９】
2014110785.tif 000111
【０１３０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０１３１】
【化３０】
2014110785.tif 000112
【０１３２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０１３３】
項６０  上記項１〜１９の何れか１項に記載のスクリーニング方法における工程１、上記項２０〜３９の何れか１項に記載の診断方法における工程１、及び上記項４０〜５９の何れか１項に記載の検査方法における工程１からなる群より選択される少なくとも１つの工程にて用いられるイムノチャンバー。
【０１３４】
項６１  上記項６０に記載のイムノチャンバー並びにリンカー及び／又は生理活性物質に特異的に結合する分子を含む、キット。
【０１３５】
項６２  前記生理活性物質が、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、及びＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項６１に記載のキット。
【０１３６】
項６３  前記リンカーが、その一方の末端にアミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に前記生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールである上記項６１又は項６２に記載のキット。
【０１３７】
項６４  前記官能基が、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基からなる群より選択される上記項６１〜項６３の何れか１項に記載のキット。
【０１３８】
項６５  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する抗体である、上記項６１〜項６４の何れか１項に記載のキット。
【０１３９】
項６６  前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである、上記項６３〜項６５の何れか１項に記載のキット。
【０１４０】
項６７  前記ポリアルキレングリコールの分子量が、１３０〜５００００である、上記項６３〜項６６の何れか１項に記載の診断方法。
【０１４１】
項６８  前記リンカーの分子長が、１０Å〜５０００Åである、上記項６１〜項６７の何れか１項に記載のキット。
【０１４２】
項６９  前記リンカーが、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ及び、下記化学式３１〜４０にて示される化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、上記項６１〜項６８の何れか１項に記載のキット；
【０１４３】
【化３１】
2014110785.tif 000113
【０１４４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４５】
【化３２】
2014110785.tif 000114
【０１４６】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４７】
【化３３】
2014110785.tif 000115
【０１４８】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１４９】
【化３４】
2014110785.tif 000116
【０１５０】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５１】
【化３５】
2014110785.tif 000117
【０１５２】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５３】
【化３６】
2014110785.tif 000118
【０１５４】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０１５５】
【化３７】
2014110785.tif 000119
【０１５６】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０１５７】
【化３８】
2014110785.tif 000120
【０１５８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０１５９】
【化３９】
2014110785.tif 000121
【０１６０】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０１６１】
【化４０】
2014110785.tif 000122
【０１６２】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０１６３】
項７０  更に、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を含む上記項６１〜項６６の何れか１項に記載のキット。
【０１６４】
項７１  前記生理活性物質に特異的に結合する分子が、該生理活性物質に対する蛍光標識抗体である、上記項６１〜項７０に記載のキット。
【発明の効果】
【０１６５】
以下に、本発明の効果について記載する。ただし、本発明は、以下に示す効果の全てを発揮する発明に限定されず、少なくとも何れか１つの効果を発揮すればよい。
【０１６６】
本発明に係るスクリーニング方法は、例えば抗体や有用生体成分といった分泌タンパク質を高産生する細胞を非侵襲的に１細胞レベルでスクリーニングする方法として非常に有用である。
【０１６７】
本発明に係るスクリーニング方法は、例えば特定の抗原に対する抗体をスクリーニングするモノクローナル抗体の作製時におけるハイブリドーマの選別時に有用である。
【０１６８】
本発明に係る診断方法は、患者から得られる被検体に含まれる細胞数が少なくとも患者の疾患の有無の判定、又は疾患に罹患する可能性の有無、その大小を判定することができるので、被検体中の細胞濃度を高くする工程を必要としない診断方法として優れている。
【０１６９】
特に、細胞濃度を高くするための技術は、臨床現場では未だ容易には採用されることではなく更に、細胞の性質を変化させてしまう可能性もはらんでいる点からしても、本発明の診断方法は優れている。
【０１７０】
本発明に係る検査方法は、上述のような本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法に基づいた、１細胞レベルで検出する方法であるために、検体の量が少なくても、簡便に且つ確実に検査を行うことができるので優れている。
【０１７１】
本発明に係るイムノチャンバーは、上述のような優れたスクリーニング方法及び診断方法に好適に用いられ、優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】本発明に係るイムノチャンバー、スクリーニング方法、及び診断方法の１態様を説明する図。
【図２】本発明のイムノチャンバーを作製するＬＩＧＡプロセスを示す図。
【図３】本発明の高集積イムノチャンバーのレイアウト等を説明する図。ウェルの深さは２０μｍ、ウェル径はφ３０μｍでウェル側壁の傾斜角は２０度である。
【図４】本発明の最密充填イムノチャンバーのレイアウト等（１クラスターあたり）説明する図。ウェルの深さは２０μｍ、ウェルは３０μｍ□であり、ウェル側壁の傾斜角は２５度である。
【図５】本発明の最密充填イムノチャンバーの各クラスターのレイアウトを説明する図。
【図６】ＬＩＧＡプロセスにおける、Ｘ線照射されたＰＭＭＡ、Ｎｉ電析によって形成されたＮｉ電鋳入子、及びポリスチレン射出形成品のレーザー顕微鏡像。
【図７】アミノ基付与処理後のウェルに対して行った水滴接触角実験結果。
【図８】表面処理濃度の最適化の検討方法を示す図。
【図９】画像解析処理の自動化を説明する図。
【図１０】各ＮＨＳ濃度における蛍光輝度の結果を示すグラフ、横軸はＮＨＳ濃度を表し、縦軸は蛍光輝度値を表す。
【図１１】ブラックフレームにパッキングされた本発明のイムノチャンバーへの反応液滴下した様子を示す写真像。
【図１２】蛍光輝度解析した１５サブエリア（図中の四角で示す枠内）と１サブエリア内の８プロット（図中の丸で示す枠内）を示す。なお、プロットで示す位置については、図９で説明される自動解析を行った。
【図１３】各スライドにおける蛍光輝度のばらつきを示す図。なお、ばらつきとは、測定した数値等が、平均値や標準値の前後に不規則に分布することを意味する。図中のグラフにおけるｂｇはガラス基板の自家蛍光、励起にばらつきがないかどうか確認する為に測定を行った。Ｄはポリスチレンスライドで何ら表面処理しておらず、基板の自家蛍光を測定する為のコントロールである。Ｂ及びＡはＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳで処理したポリスチレンスライドである。
【図１４】イムノチャンバーにおけるアミノ基コートに依存的なビオチン化の蛍光可視化を示す図である。Ｓｌｉｄｅ  Ｄは、ポリスチレンスライドを示し、Ｓｌｉｄｅ  Ａは、ビオチン修飾したポリスチレンスライドを示す。
【図１５】抗体修飾イムノチャンバーへの細胞導入を示す写真像。透過像はイムノチャンバーの像を示したものである。蛍光像は各細胞種の導入の様子を示したものである。
【図１６】抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーの毒性評価を示す写真像。
【図１７】全自動１細胞単離解析装置を用いた抗体分泌細胞に由来するイムノチャンバーの蛍光観察像。ＨｙｂｒｉｄｏｍａとＣＨＯの個数をそれぞれ１：１００で混合したものである。
【図１８】全自動一細胞単離解析装置を用いる１細胞単離実験結果。Ａは細胞の回収前、Ｂは回収後を示す。丸で囲まれた部位は、装置によって細胞が認識された時に自動的に現れる。丸内部の細胞が回収されたことがわかる。
【図１９】回収した培養約１週間後の抗体分泌細胞のコロニーの写真像。
【図２０】回収した培養約４週間後の抗体分泌細胞の培地上清をＥＬＩＳＡ供した実験結果。用いた抗体分泌細胞はＩｇＧ１の抗体を分泌することから、精製ＩｇＧ１を用いてキャリブレーションをとり、単離した細胞の培地上清をＥＬＩＳＡ法に供し、絶対定量法により測定した。横軸番号は、輝度の順であり、縦軸は培地上清の抗体量から算出した１細胞あたりの１日あたりの抗体分泌量を示す。＊は、親株に対するｔ検定（ｐ＜０．０１）で有意なものを表す。ｎは測定回数を示す。
【図２１】共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ＬＳＭ）を用いる抗体分泌細胞に由来するイムノチャンバーの蛍光観察像を示す。ＨｙｂｒｉｄｏｍａとＣＨＯの個数をそれぞれ１：１で混合したものである。各パネルの右下枠は各パネル中央左枠の拡大像である。
【図２２】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いたＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞の分析結果を示す図。  １は混合細胞のドットプロット（Ｗｈｏｌｅ  ｇａｔｅ）であり、縦軸がＳＳＣ−Ａで横軸がＦＳＣ−Ａである。２及び３は、それぞれＦＡＣＳによるＣＫｓ（ＰＥ）及びＣＤ４５（ＡＰＣ）を検出した際の結果であり、縦軸は共にＳＳＣ−Ａで、横軸はそれぞれＰＥ−Ａ及びＡＰＣ−Ａを示す。４はＣＫ１１＋及びＣＫ１９＋で、且つＣＤ４５−細胞をクオドラントリージョンによってクローズアップしたものを示し、縦軸はＡＰＣ−Ａで、横軸はＰＥ−Ａを示す。５は４の各画分の統計を取った数値を示す。
【図２３】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いた、ＥｐＣＡＭ抗体処理イムノチャンバーへ播種したＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９細胞混合の観察例。写真像はイムノチャンバーの１つの区画を示している。
【図２４】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いた、抗体処理イムノチャンバーへ播種したＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９細胞混合からのＥｐＣＡＭ陽性細胞（Ａ５４９細胞）の単離例。
【図２５】実施例の「４−６：フローサイトメトリー法との比較」における、全自動１細胞解析単離装置を用いて単離したＥｐＣＡＭ陽性細胞（Ａ５４９細胞）の育種後のＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いた分析結果を示す図。１はドットプロット（Ｗｈｏｌｅ  ｇａｔｅ）を示す。２及び３はそれぞれＦＡＣＳによるＣＫ１１及びＣＫ１９（ＰＥ）、並びにＣＤ４５（ＡＰＣ）の検出結果を示す。１〜３の縦軸は全てＳＳＣ−Ａを示し、横軸は１〜３に対してそれぞれＦＳＣ−Ａ、ＰＥ−Ａ、及びＡＰＣ−Ａを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７３】
以下に本発明について詳細に説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
【０１７４】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ５Ｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊｕｌｉａｎ  Ｌｅｗｉｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒａｆｆ；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２／Ｅ（ＬＡＮＧＥ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ｂｙ  Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｓｕｓａｎ  Ｍａｓｔｅｒｓ
ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｔｒｅｖｏｒ（Ｄｅｃ  １３，２０１１）等の文献を参照すればよい。
【０１７５】
＜スクリーニング方法＞
本発明に係るスクリーニング方法は、下記の工程１〜工程３を含む、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞のスクリーニング方法である。
【０１７６】
工程１
（１）複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程。
【０１７７】
工程２
（２）上記工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０１７８】
工程３
（３）工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程。
【０１７９】
本発明のスクリーニング方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を包含していてもよい。
【０１８０】
工程４
（４）前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を
分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０１８１】
以下に、本発明に係るスクリーニング方法について詳述する。
【０１８２】
前記生理活性物質とは、細胞外に分泌されるものであっても、細胞表面に提示されるものであってもよく、これらのどちらであっても、他の細胞を標的として生理機能を誘起するものであれば特に限定はされない。このような生理活性物質としては例えば、タンパク質、ポリペプチド、糖鎖、脂質等が挙げられる。
【０１８３】
このようなタンパク質又はポリペプチドは、特に限定はされないが、アミノ酸のみからなるタンパク質又はポリペプチドであっても、それに糖鎖、脂質等といった生体に由来する成分が付加されていてもよく、翻訳後修飾が施されたものであってもよい。
【０１８４】
具体的な生理活性物質としては、例えば、サイトカイン、イムノグロブリン、リンフォカイン、ケモカイン、サイトケラチン、増殖因子、補体、アルブミン、オプソニン、パイロジェン、エンドトキシン、ホルモン、フェロモン、ウイルス性抗原、バクテリア毒素、プリオン、Ａβ、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、トキシン、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０等が挙げられる。
【０１８５】
なお、上述の生理活性物質において、細胞外に分泌されるものは、細胞表面に提示された後に、プロテアーゼ等といった他の生体分子によって切断されて分泌されるものも含まれる。
【０１８６】
上述した生理活性物質の中でも、サイトカイン、サイトケラチン、イムノグロブリン、エンドトキシン、ウイルス性抗原、ヒスタミン、ＤＯＰＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５４、ＣＤ６２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３３、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０等が、本発明のスクリーニング方法において好適である。
【０１８７】
前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞とは、特に限定はされないが、例えば、上述の分泌タンパク質を発現する細胞であればハイブリドーマ、ミエローマ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ細胞、ＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｌ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、酵母細胞、マクロファージ、クッパー細胞、貪食細胞群、単球、白血球、赤血球等の血球細胞群、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、脂肪幹細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、Ｃａｃｏ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＷｉＤｒ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞等が挙げられる
。
【０１８８】
この様な細胞の中でも、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、２９３Ｆ細胞胚性幹細胞、ＣＴＣ、初代培養細胞、ＨｕＨ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、Ｈ２２２８細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＮｕＥ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞等が好ましい。
【０１８９】
これらの細胞は、上述の生理活性物質がタンパク質又はポリペプチドである場合、これらを過剰産生すること等を目的に、当該タンパク質又はポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸、例えばプラスミド等で形質転換されていてもよい。このような細胞を作製する方法は、公知の技術を用いればよい。
【０１９０】
また、従来は、細胞からの分泌能を有さないタンパク質又はポリペプチドであっても、上述の核酸に細胞外分泌シグナルペプチド又は膜移行シグナルペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適用することによって、細胞外に分泌させるか、又は細胞表面に提示させることも可能である。このような方法についても、公知の技術を用いればよい。
【０１９１】
工程１について
本発明に係るスクリーニング方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を播種して、該細胞集団を構成する１個の細胞を載置する工程である。
【０１９２】
工程１におけるイムノチャンバーは、複数のウェルを有するものである。ウェルの個数は特に限定されず、通常は７００００個以上程度とすればよい。
【０１９３】
上記イムノチャンバーのウェルの形状は、例えば、錐台、逆錐台等の形状が挙げられ、特に限定はされないが、好ましくは錐台の形状である。本発明に係るスクリーニング方法におけるイムノチャンバーのウェルの形状が錐台とは、開口部の方が底面よりも大きいことを意味し、逆錐台とは底面の方が開口部よりも大きいことを意味する。
【０１９４】
このような錐台及び逆錐台等は、円錐台（略円錐台も含む。）、逆円錐台（略逆円錐台も含む。）であっても、角錐台（正角錐台、略正錐台等を含む。）、逆角錐台（正逆角錐台、略正逆錐台等を含む。）であってもよい。このような錐台及び逆角錐台は、１組の平行な平面を必ずしも有していなくてもよい。
【０１９５】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの開口部の大きさは、その直径又は開口部に最密する内接円の直径として、例えば、上述の前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の最大径に対して、通常は１〜２倍程度とすればよく、１．２〜１．５倍程度とすることが好ましい。
【０１９６】
具体的な、開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径は上述の範囲内であれば特に限定はされないが、通常は２〜６０μｍ程度とすればよい。このような範囲の中でも、好ましい下限値は６μｍ程度、より好ましくは７μｍ程度、さらに好ましくは８μｍ程度である。また、好ましい上限値は３４μｍ程度、より好ましくは３３μｍ程度、さらに好ましくは３２μｍ程度、さらに好ましくは３１μｍ程度、最も好ましくは３０μｍ程度である。
【０１９７】
開口部の直径は、開口部の形状には影響されず、略多角形の形状であっても、略円形の形状であっても、その中心を通る最も長い距離を直径と定義すればよい。また、開口部が
多角形の形状である場合には、当該多角形に最も接近する内接円の直径を上述の開口部の直径と同様に定義してもよい。なお、用語『内接円』とは、必ずしも多角形の全ての辺に接している必要はなく、少なくとも２つの辺に接していればよい。
【０１９８】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの開口部から該ウェルまでの距離、換言すると、該ウェルの深さは、上述のウェルの開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径に対して、通常は０．６倍〜１．４倍程度とすればよく、０．８倍〜１．２倍程度とすることが好ましい。
【０１９９】
上記イムノチャンバーにおけるウェルの内壁側面は、前記開口部が形成する面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して通常は１０度〜４５度程度とすればよく、１５度〜４０度程度の略一定の傾斜角を有することが好ましい。このような角度は上述した錐台又は逆錐台から復元される円錐の頂角の半分の角度でとほぼ同じである。
【０２００】
本発明のイムノチャンバーにおける任意の隣接するウェル間に形成される、ウェルの開口部以外の領域の面積は、該ウェルの一つの開口部に対して、２倍以下程度とすればよく、１倍以下程度とすることが好ましく、０．３倍以下とすることがさらに好ましい。。なお、この様な数値範囲の下限値は０が好ましいが、これは限りなく０であることを意味しており、実質的には０より大きい限りなく小さな数値である。
【０２０１】
本発明のイムノチャンバーにおける任意の隣接する２つウェルにおける該ウェル間のそれぞれの中心間の距離は、ウェル開口部の直径又は開口部に最密する内接円の直径の通常は１倍〜２．５倍とすればよい。
【０２０２】
このようなイムノチャンバーの材質は、特に限定はされないが、例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、環状オレフィンポリマー、ポリエーテルイミド等の透明性を有する熱可塑性ポリマーが挙げられる。
【０２０３】
一方、透明性を有さないポリマーであっても、ポリプロピレン、ポリアセタール、ポリフェニレンサルファイド、液晶ポリマー等といった射出成形可能なポリマーであれば、上述のイムノチャンバーの材質とすることができる。
【０２０４】
このような素材の中でも、各種培養液に対する耐薬品性；透明性；溶融温度、寸法精度等による易射成形性の観点から、ポリスチレンが好ましい。
【０２０５】
上述のイムノチャンバーの作製は、公知の方法を用いて作製することができる。例えば、図２に示すような、ＬＩＧＡ法を用いることによって、上述のような構造を有するイムノチャンバーを製造すればよい。より好ましくは、後述する製造例の記載に従い、適宜、設計変更することによって作製することができる。
【０２０６】
本発明のイムノチャンバーは、ウェルの少なくとも内壁表面がアミノ基を有していてもよく、当該チャンバーにおけるその他の部位についてはアミノ基を有さず、ウェルの内壁表面のみがアミノ基を有していることがより好ましい。
【０２０７】
用語『内壁表面がアミノ基を有する』とは、表面がアミノ化処理されたと同意である。
【０２０８】
具体的には、ウェル内壁に対して公知の親水化処理を行った後、シランカップリング剤等のコーティング剤を用いて処理することによってアミノ基による修飾が可能となる。なお、内壁とは、ウェル内の側面及び底面を含むものである。
【０２０９】
具体的な親水化処理としては、特に限定はされないが、例えば、酸素プラズマ処理、スパッタ処理、プラズマ放電処理、コロナ放電処理、遠紫外線、プラズマ紫外光エキシマレーザー等の乾式処理と硫酸浸漬による湿式処理等が挙げられる。
【０２１０】
具体的なコーティング剤としては、公知のものを適宜採用すればよいが、例えば、３−アミノプロピルエトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ―２―（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３―アミノプロピルトリメトキシシラン、３―アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３―ジメチルーブチリデン）プロピルアミン、Ｎーフェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ビニルベンジル）―２−アミノエチルー３−アミノプロピルトリメトキシシラン、又はこれらの塩酸塩等が挙げられる。
【０２１１】
本発明のイムノチャンバーは、上述のアミノ基に対し、リンカーを介して、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子が結合していてもよい。
【０２１２】
上述の生理活性物質に特異的に結合する分子とは、特に限定はされないが、例えば、生理活性物質に対する抗体が挙げられる。
【０２１３】
ここで、抗体とはイムノグロブリンに限定されず、そのＦａｂ化抗体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ等）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ等）等の抗体断片、斯かる断片を適宜組み合わせた多価化抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ等）等であってもよい。
【０２１４】
上記イムノグロブリンのサブタイプ、サブクラス等は、特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ等が挙げられる。
【０２１５】
上記抗体の由来は、特に限定はされず、例えばヒト、マウス、ラット、ラクダ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ダチョウ、ニワトリ、ラマ、アルパカ、ロバ等が挙げられ、適宜選択して用いればよい。
【０２１６】
上述の抗体以外に生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質が糖鎖そのものか、或いは糖鎖修飾されている場合、斯かる糖鎖に対して特異的に結合するレクチンを上記分子としてもよい。
【０２１７】
上述のリンカーは、特に限定はされないが、例えば、リンカーの一方の末端に前記アミノ基と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含み、且つもう一方の末端に上述の生理活性物質に特異的に結合する分子と反応性を示す、低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、及びカルボアミド基からなる群より選択される少なくとも一つを有していてもよい官能基を含むポリアルキレングリコールが挙げられる。
【０２１８】
低級アルキル基とは、特に限定はされないが、通常は炭素数が２個〜６個程度のアルキル基が挙げられる。
【０２１９】
上述の官能基としては、特に限定はされないが、例えばマレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基、アリルアジド基、カルボジイミド基、ジアジリン基、ヒドラジド基、ヒドロキシメチルホスフィン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基等が挙げられる。中でも、マレイミジル基、スクシンイミジル基、ビオチニル基等が好ましい。
【０２２０】
上述の官能基が、上述の低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、又はカルボアミド基を有している場合、これらの化学結合の様式は特に限定されない。
【０２２１】
また、官能基に対する上述の低級アルキル基、カルボニルオキシ基、アミド基、又はカルボアミド基の結合位置も特に限定はされないが、例えば、上記官能基がマレイミジル基又はスクシンイミジル基である場合、該基に含まれる窒素原子と結合していることが好ましい。また、ビオチニル基である場合には該基に含まれるカルボニルオキシ基に結合していることが好ましい。
【０２２２】
また、スクシンイミジル基、マレイミジル基はその２位がスルホ基又はその塩で置換されていてもよい。
【０２２３】
ポリアルキレングリコールとは、特に限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０２２４】
上記リンカーの分子量は、特に限定はされないが、必要に応じて重量平均分子量として通常は１３０〜５００００程度とすればよく、４００〜３００００程度とすることが好ましい。
【０２２５】
また、このようなリンカーの分子長は、特に限定はされないが、通常は通常は１０Å〜５０００Å程度とすればよく、３０Å〜３０００Å程度とすることが好ましい。
【０２２６】
上述の具体的なリンカーとして、例えば、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、Ｂｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ［ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｔｅｔｒａｃｏｓａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ等が挙げられる。
【０２２７】
また、具体的なリンカーとして、下記の化学式４１〜５０にて表わされるものも挙げられる。
【０２２８】
【化４１】
2014110785.tif 000123
【０２２９】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３０】
【化４２】
2014110785.tif 000124
【０２３１】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３２】
【化４３】
2014110785.tif 000125
【０２３３】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３４】
【化４４】
2014110785.tif 000126
【０２３５】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３６】
【化４５】
2014110785.tif 000127
【０２３７】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２３８】
【化４６】
2014110785.tif 000128
【０２３９】
（式中、ｎは２〜１０００の整数である。）
【０２４０】
【化４７】
2014110785.tif 000129
【０２４１】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で８００〜１００００である。）
【０２４２】
【化４８】
2014110785.tif 000130
【０２４３】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）
【０２４４】
【化４９】
2014110785.tif 000131
【０２４５】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜２００００である。）
【０２４６】
【化５０】
2014110785.tif 000132
【０２４７】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示し、その分子量は重量平均分子量で１０００〜１００００である。）。
【０２４８】
また、上述の生理活性物質が上述のようなイムノグロブリンに代表される抗体である場合、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子は、斯かる抗体に対する抗原であってもよい。このような抗原は、例えばアビジン化合物及びビオチンの複合体等をさらに介して上述のリンカーに結合していてもよい。
【０２４９】
なお、上述のイムノチャンバーは、イムノデバイス、イムノプレート、イムノウェル、イムノスライド、イムノチップ、イムノセンサーチップ、イムノセンサースライド、イムノセンサーウェル、イムノセンサーチャンバー等とも称される。
【０２５０】
生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団は公知の方法で入手することができる。例えば、例えば生理活性物質が抗体である場合、斯かる抗体を産生するハイブリドーマ（例えばＢ細胞及びミエローマ細胞を融合したハイブリドーマ等が挙げられる。）を上記細胞集団とすればよい。
【０２５１】
その他にも、例えば、任意の分泌タンパク質が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列によって形質転換された細胞も、上記細胞集団とすることができる。
【０２５２】
また、本発明の細胞集団は、生体から定義採取したものであってもよい。例えば、個体の任意の組織から細胞集団を、公知の方法で採取したもの、個体の血液、組織、リンパ液等から公知の方法で細胞集団を採取したもの等が挙げられる。
【０２５３】
更に、食品材料から得られた抽出物と、任意の細胞を接触させたものであってもよい。
【０２５４】
このようにして得られた細胞集団は、本発明の工程１に供する前に、適宜洗浄工程に供してもよい。具体的な洗浄方法は、特に限定はされないが、例えば、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いて洗浄すればよい。
【０２５５】
このような洗浄工程に関して、細胞に不必要な障害を与える危険性や、余分な工程が必要となる点から、このような工程を含まないものが好ましいことは明らかである。
【０２５６】
用語『播種』とは、シード（Ｓｅｅｄ）と同意であり、細胞を播くという行為を表す。すなわち、免疫分野にて用いられる「Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ」の意味とも、ガンの分野で用いられる「Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａｔｉｏｎ」の意味とも異なるものである。ここで、播種された細胞は、必ずしも増殖する必要はなく、死滅さえしなければよい。
【０２５７】
用語『細胞集団』とは、同種の細胞の集団であっても、異種の細胞の集団であってもよい。同種の細胞の集団とは、必ずしも同一の遺伝学的性質を有する細胞の種類には限定されず、同一の遺伝学的性質を有していたとしても、細胞内の成分が異なる細胞の集団を含んでいたとしても、同種の細胞集団とみなしてもよい。
【０２５８】
上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を、上述のイムノチャンバーに播種することによって、該イムノチャンバーの少なくとも１つに、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を構成する１個の細胞が載置される。状況に応じて、播種の後のイムノチャンバーを遠心工程に供してもよい。
【０２５９】
用語『載置』とは、単に存在することを意味し、格納されて保持されることとも換言される。用語『保持』とは、必ずしも不可逆的にウェル内に保持されている必要はなく、積極的に除去する行為によって保持されない状態とならない限り特に限定されない。用語『積極的な除去』とは、例えば、マニュピュレーター等で細胞が除去されることが挙げられる。
【０２６０】
用語『１個の細胞』とは、単一の細胞であることも意味する。
【０２６１】
工程１において、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団のうち、上述のウェルに載置されない細胞の割合の上限値は、細胞集団全体の５０％程度であり、より好ましくは２０％程度、更に好ましくは５％程度である。また、下限値は、０％であることが好ましい。
【０２６２】
工程１の後、上述のような前記ウェルに載置されない細胞を除去する工程に供してもよい。具体的には、イムノチャンバーを洗浄工程に供すればよく、浸漬法、流水法等によって洗浄すればよい。洗浄する際には、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いればよい。なお、上述のイムノチャンバーに細胞集団を播種した後、洗浄工程に供するまでの時間は、特に限定はされないが、通常は１分〜４８時間程度とすればよい。
【０２６３】
工程２について
本発明に係るスクリーニング方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０２６４】
生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子とは、生理活性物質に特異的に結合する分子に、公知の蛍光分子が結合していれば良く、特に限定はされない。
【０２６５】
生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質に対する抗体に蛍光分子が結合した蛍光標識抗体が挙げられる。
【０２６６】
ここで、抗体とはイムノグロブリンに限定されず、そのＦａｂ化抗体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ等）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ等）等の抗体断片、斯かる断片を適宜組み合わせた多価化抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ等）等であってもよい。
【０２６７】
上記イムノグロブリンのサブタイプ、サブクラス等は、特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を包含する）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＥ等が挙げられる。
【０２６８】
上記抗体の由来は、特に限定はされず、例えばヒト、マウス、ラット、ラクダ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ダチョウ、ニワトリ、ラマ、アルパカ、ロバ等が挙げられ、適宜選択して用いればよい。
【０２６９】
上述の抗体以外に生理活性物質に特異的に結合する分子として、例えば、生理活性物質が糖鎖そのもの又は糖鎖修飾されている場合、斯かる糖鎖に対して特異的なレクチンを上記分子とすることができる。
【０２７０】
上記蛍光分子は、特に限定されることはなく、公知のものを適宜採用すればよいが、例えば、ローダミン、フルオロセイン、ＦＩＴＣ、各種Ｃｙ色素、量子ドット（Ｑドット〔登録商標〕）、ＡＭＣＡ、ＡＰＣ、Ａｌｅｘａ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＰＥ、ＴＲＩＴＣ等
が挙げられる。
【０２７１】
これらの蛍光分子と、上述の生理活性物質に特異的に結合する分子を結合させる方法は、公知の方法を適宜組み合わせて採用すればよい。
【０２７２】
工程２において上記ウェルに蛍光分子を添加する前に、ウェルに対してブロッキング剤を添加していてもよい。ブロッキング剤とは、特に限定はされないが、例えばアルブミン、スキムミルク等が挙げられる。
【０２７３】
工程２の後、イムノチャンバーを洗浄工程に供してもよい。具体的な洗浄方法としては、浸漬法、流水法等によって洗浄が挙げられ、蒸留水、滅菌水、緩衝液（界面活性剤の含有の有無は問わない。）、培地等を、必要に応じて適宜組み合わせて用いればよい。
【０２７４】
工程３について
本発明に係るスクリーニング方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程である。
【０２７５】
工程３では上述の工程２にて用いた蛍光分子に基づく蛍光を発するウェルを特定し、斯かるウェルに載置された細胞を、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定すればよい。ウェルを特定する方法として、例えば蛍光顕微鏡を用いて、イムノチャンバー全体を観察し、必要に応じてその写真像を入手した後に、決定することができる。また、公知の全自動１細胞単離解析装置を用いて、斯かる装置のマニュアルに沿った自動的な解析に基づいて決定してもよい。このような装置として、例えばアズワン社より販売される、ＡＳ  Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｃｋｉｎｇ  システム等が挙げられる。
【０２７６】
また工程３によって決定されるウェルにおいて、高い強度の蛍光を発するウェルに含まれる細胞が、上述の生理活性物質を著量分泌する又は著量表面に提示するといった傾向を示すと決定することもできる。このような決定に基づいて、上述の生理活性物質の高産生細胞と決定してもよい。
【０２７７】
工程４について
本発明に係るスクリーニング方法において、工程３の後に含まれていてもよい工程４は、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程である。
【０２７８】
具体的に細胞を回収する方法は、公知のマニュピュレーターを採用すればよく特に限定はされない。また、上述の公知の全自動１細胞単離解析装置を用いてもよい。
【０２７９】
このようにして回収された細胞は、適宜公知の培養方法に供して更に育種することができる。このようにして培養した細胞は、そのまま生理活性物質の分泌生産に使用することが可能である。
【０２８０】
また、斯かる細胞を更に種々の実験、疾患の診断、又は食品の安全性の検査用途に供することも可能である。
【０２８１】
以上に詳述した本発明に係るスクリーニング方法は、疾患の診断方法及び食品の安全性の検査方法に好適に用いることができる。
【０２８２】
＜診断方法＞
本発明に係る診断方法は、以下の工程１〜３を含む疾患の診断方法である。
【０２８３】
工程１
［１］複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程。
【０２８４】
工程２
［２］工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０２８５】
工程３
［３］工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程。
【０２８６】
本発明の診断方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を含んでいてもよい。
【０２８７】
工程４
［４］前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０２８８】
以下に、本発明に係る診断方法について詳述する。
【０２８９】
本発明に係る診断方法における疾患とは、特に限定はされないが、例えば、癌、転移性癌、免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心筋梗塞、脳梗塞、脳疾患、心疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、骨疾患、内分泌系疾患、皮膚疾患等が挙げられる。これらの中でも、転移性癌、免疫疾患等が、本発明の診断方法において好適である。
【０２９０】
用語『診断』とは、上述の疾患に罹患しているかどうかを判定する為の指標を与えるものであり、上述の疾患に罹患する可能性が高いかどうかを決定する為の指標を与えることも、本発明における『診断』に含まれる。
【０２９１】
工程１について
本発明に係る診断方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、ヒト患者から採取された生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程である。
【０２９２】
用語『ヒト患者』とは、上述の疾患に罹患している患者であり、疾患に罹患しているかどうか判断できないが、疾患に罹患する可能性が高いヒトも『ヒト患者』に含まれる。
【０２９３】
用語『被検体を接触させ』とは、例えば、イムノチャンバーに被検体を添加することによって実施できる。
【０２９４】
工程１におけるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９５】
用語『生理活性物質』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法に詳述したとおり
とすることができる。
【０２９６】
用語『細胞集団』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述した生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を含む集団であり、その余についても、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９７】
ヒト患者からの生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体の採取方法は、特に限定はされず、例えば、ヒト患者の血液、リンパ液、所望の組織から、外科的手段、注射器を用いた手段、内視鏡を用いた手段等の公知の方法を用い採取すればよい。
【０２９８】
用語『１個の細胞を載置する』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１にて詳述したものと同様とすることができる。
【０２９９】
工程２について
本発明に係る診断方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０３００】
工程２は、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程２にて詳述した工程と同様にすることができる。
【０３０１】
工程３について
本発明に係る診断方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記ヒト患者を前記疾患に罹患すると決定する工程である。
【０３０２】
前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程は、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程３にて詳述した工程と同様にすることができる。
【０３０３】
疾患の判定は、被検体に含まれる総細胞に対する、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の割合を基に決定すればよい。所定の割合よりも高い数値であれば、上述の疾患に罹患していると決定すればよい。
【０３０４】
所定の割合とは、健常者から得られる被検体における割合を基に決定すればよい。
【０３０５】
以下に、本発明に係る診断方法の一例を示す。
【０３０６】
被検体として、乳がんの患者からインフォームドコンセントのもと採取した７．５ｃｃの末梢血を用いる。或いはヒトでは末梢血７．５ｃｃ中に赤血球を除く細胞数として約５ｘ１０７個程度であることから、マウス末梢血７．５ｃｃを採取し、そこにＡ５４９細胞の生細胞を５細胞スパイクしたものを被検体としてもよい。
【０３０７】
次いで、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び／又は抗ＨＥＲ２抗体の一方で、少なくともウェル内壁を、適宜リンカーを介して修飾した最密充填イムノチャンバーに、前記細胞を含む血しょうを１．２ｃｃ滴下し、５０ｘｇで１分間遠心し、その上清を取り除いて、すぐに被検体を再度１．２ｃｃマイクロチャンバーに滴下する。そして、再度先の条件で遠心を行い、該操作を被検体がなくなるまで繰り返す。
【０３０８】
更に、血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換し、４℃で１５分静置して、イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換する。これによって、本発明に係る診断方法の工程１を実施することができる。
【０３０９】
そして、例えば、ＰＥ標識抗サイトケラチン８、ＰＥ標識抗サイトケラチン１８抗体、ＰＥ標識抗サイトケラチン１９抗体、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＰＥ標識抗ＨＥＲ２抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体を上述のイムノチャンバーに添加し、４℃で１５分静置する。イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に同ＰＢＳの１．２ｍｌ又は血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換する。これによって、本発明の診断方法における工程２が実施できる。
【０３１０】
そして、蛍光イメージアナライザー又は蛍光顕微鏡等で上述の工程２を施したイムノチャンバーを観察し、ＰＥに基づく蛍光シグナルを検出する。
【０３１１】
このような工程を１２回程度行うと、バックグラウンドに比べて有意に蛍光シグナルを発するウェルが、それぞれ２、５、５、６、５、４、５、４、３、４、３、及び５細胞程度となる。
【０３１２】
この様なウェル数を健常者から得られたものと比較して、多ければ多いほど乳ガンに罹患している可能性、罹患する可能性又は乳がん患者がガンの転移を引き起こす可能性が高い傾向になっていると判断することができる。これによって、本発明に係る診断方法における工程３が実施できる。
【０３１３】
また、本発明に係る診断方法における工程３の一つの実施態様として、以下に説明する方法も採用できる。
【０３１４】
ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体及び／又はＰＥ標識抗ＨＥＲ２抗体を工程２によって得られるイムノチャンバーに添加し、４℃で１５分静置する。次いで、イムノチャンバー上の培地を２０ｍｌのＤーＰＢＳで還流洗浄し、最後に血清不含のＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ；０８４５８−４５）の１．２ｍｌに置換し、蛍光イメージアナライザー又は蛍光顕微鏡等で観察し、ＰＥに基づく蛍光シグナルを検出する。この様な工程を１２回程度行うとバックグラウンドに比べて有意に蛍光シグナルを発するウェルが、それぞれ２、４、０、３、４、５、５、３、４、３、４、４細胞程度となる。
【０３１５】
また、蛍光顕微鏡観察下、蛍光シグナルを発するウェルに含まれる細胞を手動で回収することができ、７日間培養したところ、回収細胞の９０％（４１細胞中３７細胞）程度となる。このような上述の本発明に係る診断方法における工程４も実施可能である。
【０３１６】
以上より、本発明に係る診断方法は、被検体に含まれる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞数が希少である被検体を用いても、疾患の審査断が可能であり、しかも検出する細胞が生細胞としての回収ができることから極めて優位な診断方法である。
【０３１７】
＜検査方法＞
本発明に係る検査方法は、以下の工程１〜３を含む食品の安全性の検査方法である。
【０３１８】
工程１
〔１〕複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽
出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させて、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程。
【０３１９】
工程２
〔２〕工程１の後、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程。
【０３２０】
工程３
〔３〕工程２の後、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程。
【０３２１】
本発明の検査方法には、工程３の後に必要に応じて下記の工程４を含んでいてもよい。
【０３２２】
工程４
〔４〕前記工程３の後に、前記蛍光分子に基づく蛍光シグナルを発するウェルに載置される、生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を回収する工程。
【０３２３】
以下に、本発明に係る検査方法について詳述する。
【０３２４】
本発明に係る診断方法における食品とは、特に限定はされないが、例えば、魚類、貝類、海藻類等の海産物；肉類、山菜類、キノコ類等の陸産物等が挙げられる。
【０３２５】
用語『安全性』とは、上述の食品の摂取に基づいて摂取者が健康被害を生じる可能性を示すものである。例えば、安全性が低いとは、上記健康被害を生じる可能性が高いことを意味する。
【０３２６】
工程１について
本発明に係る検査方法における工程１は、複数のウェルを有するイムノチャンバーの該ウェルの少なくとも１つに、食品の抽出物を接触させて得られる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団を含む被検体を接触させ、該被検体に含まれる１個の細胞を載置する工程である。
【０３２７】
用語『被検体を接触させ』とは、例えば、イムノチャンバーに被検体を添加することによって実施できる。
【０３２８】
食品の抽出物とは、上述の食品を公知の方法によって抽出したものである。必要に応じて固液分離工程に供し、それによって得られる液体画分を更にフィルタリング工程に供したものを抽出物としてもよい。
【０３２９】
この様な抽出物を、上述の本発明に係るスクリーニング方法にて詳述した生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞に接触させたものを含む集団を、本発明の検査方法における工程１の細胞集団とすればよい。ここでの用語『接触させ』とは、単に上述の抽出物と生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞を、公知の条件下に混合することによって実施できる。
【０３３０】
なお、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞集団は、前記チャンバーに被検体を接触させる前に、食品の抽出物と接触させていても、細胞集団を前記チャンバーに接触させた後に、食品の抽出物と接触させてもよい。
【０３３１】
用語『生理活性物質』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３２】
工程１におけるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は上述の本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３３】
用語『１個の細胞を載置する』とは、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程１にて詳述したものと同様である。
【０３３４】
工程２について
本発明に係る診断方法における工程２は、前記生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を前記ウェルに添加する工程である。
【０３３５】
工程２は、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は本発明に係る診断方法における工程２に詳述したようにすればよい。
【０３３６】
工程３について
本発明に係る診断方法における工程３は、前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定し、該細胞の個数の前記被検体に含まれる総細胞数に対する割合に基づいて、前記食品の安全性を決定する工程である。
【０３３７】
前記蛍光分子に由来する蛍光シグナルを発するウェルに載置された細胞を、前記生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞と決定する工程は、上述の本発明に係るスクリーニング方法及び／又は診断方法における工程３で詳述したものと同様にすればよい。
【０３３８】
安全性の決定は、被検体に含まれる総細胞に対する、上述の生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞の割合を基に決定すればよい。所定の割合よりも高い数値であれば、上述の安全性が低いと決定すればよい。
【０３３９】
所定の割合とは、例えば、工程１にて用いる生理活性物質を分泌及び／又は表面提示する細胞において、食品の抽出物を接触させない細胞を含む被検体における割合を基に決定すればよい。
【０３４０】
以下に、本発明に係る検査方法の一例を示す。
【０３４１】
バキュロウイルス発現系を用いてＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞に発現させた、例えばヒトノロウイルスキャプシド（ウイルス様粒子）精製物（Ａ）を得て、これを本発明に係る検査方法におけるキャリブレーションとして用いることができる。
【０３４２】
例えば、市販の生ガキを５６ロット程度入手し、これらの各ロットの０．１ｇを、１ｍｌのＰＢＳ中で公知の方法にてすりつぶして遠心し、その上清を回収してカキ検体とする。また、これらの検体を一つにまとめたものをバックグラウンド（Ｂ）と準備すればよい。
【０３４３】
また、（Ａ）／（Ｂ）タンパク量比が０／１、１／２，１／１０，１／１００，１／１０００，１／１万，１／１０万、１／１００万、１／１０００万、１／１億の割合となるように混合したサンプル液１００μｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃ）を調製した。これらの（Ａ）〜（Ｃ）の何れかを、適宜、本発明に係る検査方法の工程１における食品の抽出物
とすればよい。
【０３４４】
また、抗ＩＬ−１２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＩＮＦ−γ抗体（１３０−０９５−７２９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−２抗体（１３０−０９５−７３６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＴＮＦα抗体（１３０−０９５−７２５；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−４抗体（１３０−０９５−７１５；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−５抗体（１３０−０９５−７１２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＩＬ−６抗体（１３０−０９６−１３０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、又は抗ＩＬ−１２抗体（５０５３０４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の何れかで、少なくともウェル内壁を修飾した最密充填イムノチャンバーをそれぞれ作製すればよい。これを本発明に係る工程１にて用いるイムノチャンバーとすることができる  Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌：６〜８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）の脾臓より、公知の方法に基づいて、ＭＡＣＳ（登録商標）テクノロジー（ミルテニーバイオテク株式会社）に用いて脾臓細胞群（Ｄ）を得て、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｎａｃａｌａｉ、３０２６４−１４）に例えば２５万細胞／１．２ｍｌとなるよう懸濁したものを準備すればよい。
【０３４５】
本発明の検査方法に係る工程１では、上述のイムノチャンバーに、上述の（Ｄ）に示す細胞群をそのまま接触させて、イムノチャンバー内のウェルに細胞を載置した後に上述の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかを、適宜接触させてもよく（態様Ｉ）、上述のイムノチャンバーに上述の（Ｄ）に示す細胞群を接触させる前に、予め上述の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかと接触させた後に、上述のイムノチャンバーに接触させて、細胞を載置してもよい（態様ＩＩ）。
【０３４６】
上記Ｉ又はＩＩの何れの態様であっても、イムノチャンバーには（Ｄ）に示す懸濁された細胞を１．２ｍＬ程度イムノチャンバーに接触させればよく、上記（Ｄ）と、（Ａ）〜（Ｃ）の何れかとを接触させた後は、５％程度のＣＯ２環境下で、４時間〜４０時間程度インキュベートすればよい。このようにして、本発明に係る検査方法の工程１を実施することができる。
【０３４７】
この様にして得られたイムノチャンバーに対して、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌを用いた洗浄工程に供し、次いで血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地１．２ｍｌにて置換し、各抗体に対応する蛍光標識抗体として、ＰＥ標識抗ＩＮＦ−γ抗体（１３０−０９２−３４６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−２抗体（１３０−０９２−３０２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＦＩＴＣ標識抗ＴＮＦα抗体（１３０−０９２−２４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−４抗体（１３０−０９５−７０９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−５抗体（１３０−０９５−７１０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体（１３０−０９６−１３９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥ標識抗ＩＬ−１２抗体（５０５２０４：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を作用させた。これによって、本発明に係る検査方法における工程２が実施できる。
【０３４８】
その後、所定の時間チャンバーをインキュベーションした後に、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、ＰＥに基づく蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等の装置を用いた公知の手段でイメージングすれば、（Ａ）／（Ｂ）タンパク量比減少に伴い、例えばサイトカイン群の分泌（特に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等）に由来するＰＥの蛍光シグナルを発するチャンバー中のウェル数の減少が観察される。これは、例えば、上記食品の抽出物に含まれるノロウイルスの量について、依存的なデジタル検出系の構築が可能となる。
【０３４９】
次に、上述のカキ検体の５６ロットのそれぞれ１０μｌを、新たに上記（Ｂ）と同様に作製したものの１ｍｌを用いて、全てのカキ検体ロットを希釈したカキ検体群（Ｆ）を作製して、そのそれぞれ１０μｌを上記態様Ｉと同様に、予め細胞を載置したイムノチャン
バーに滴下し、ＣＯ２インキュベータ内で４時間〜４０時間培養する。
【０３５０】
そして、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地１．２ｍｌに置換し、上述の通り作製した、各イムノチャンバーを修飾した抗体に対応する、ＰＥ標識抗体を各イムノチャンバーに作用する。これを、Ｄ−ＰＢＳの２０ｍｌで洗浄後、ＰＥに基づく蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等の公知の中断によってイメージングすれば、カキの数ロットについては、新たに上記（Ｂ）と同様に作製した被検体と比べてよりＰＥに基づく蛍光シグナルを発するウェルが多く観察でき、かつ定量化できる。この様な数ロットについては、更に他のロット観察結果に基づいて比較検定することにより、再度陽性と判定することもできノロウイルス等がカキ中に存在していた可能性が強いと判断できる。当然、この様な可能性が大きいほど、食品の安全性は低く見積もられる。
【０３５１】
＜イムノチャンバー＞
本発明に係るイムノチャンバーは、上述の本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法における工程１、及び本発明に係る検査方法の工程１からなる群より選択される少なくとも１つの工程にて用いられるイムノチャンバーである。
【０３５２】
具体的なイムノチャンバーについては、上述の本発明に係るスクリーニング方法における工程１、本発明に係る診断方法における工程１、又は本発明に係る検査方法における工程１にて詳述したとおりとすることができる。
【０３５３】
このような本発明に係るイムノチャンバーは、後述する本発明に係るキットの構成要素の１つとして有用である。
【０３５４】
＜具体例＞
以下に、本発明のイムノチャンバー及び、本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法の１つの態様について、図１に示す概略図を基に説明する。
【０３５５】
本発明に係るイムノチャンバーは、上述のように、ウェルの内壁側面は、前記開口部面及び前記底面に対して鉛直方向に形成される面に対して１０度〜４５度の略一定の傾斜角を有していてもよく、図１のａ又はｂに示すウェルの縦断面図におけるΘの角度を意味する。また、略一定の角度とは、開口部から底面にかけて略一定の角度の斜面を有しているとも説明できる。
【０３５６】
また、本発明に係る生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法における１態様について、ａにて説明する。本発明のイムノチャンバーの一つのウェルには、細胞が１個載置される。載置された細胞が分泌する生理活性物質は、ウェルのアミノ基でコーティングされた内壁表面にリンカーを介して結合する「生理活性物質に結合する分子」に結合し、斯かる生理活性物質は、後の工程にて「生理活性物質に結合する蛍光物質」と結合して複合体を形成する。
【０３５７】
このような複合体がウェル内で形成されることによって、生理活性物質を分泌する細胞が載置されるウェルを、前記蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出することによって決定できる。また、斯かる蛍光強度は、分泌したタンパク質の量に基づいて変化するという効果を発揮する。本発明に係るスクリーニング方法が、ウェル内部にて蛍光シグナルを検出できることから、隣接するウェルの強度の差を区別しやすくなる。
【０３５８】
さらに、ａに図示されるように、本発明に係る生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法では、斯かる細胞そのものに処理を与えることのない方法であるため、細胞へ
の悪影響を限りなく減少される。
【０３５９】
このように蛍光シグナルを発するウェルを決定した後、必要に応じて斯かるウェルに載置される細胞を、生理活性物質を分泌する細胞として回収することが可能となる。
【０３６０】
本発明に係る生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法における１態様について、図１のｂを用いて説明する。本発明のイムノチャンバーの１つのウェルには、細胞が１個載置される。載置された細胞が表面提示する生理活性物質は、ウェルのアミノ基でコーティングされた内壁表面にリンカーを介して結合する「生理活性物質に結合する分子」に結合し、斯かる生理活性物質は、後の工程にて「生理活性物質に結合する蛍光物質」と結合して複合体を形成する。
【０３６１】
このような複合体がウェル内で形成されることによって、生理活性物質を表面提示する細胞が載置されるウェルを、前記蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出することによって決定される。また、斯かる蛍光強度は、表面提示された生理活性物質の量に基づいて変化するという効果を発揮する。これは、本発明に係るスクリーニング方法が、ウェル内部にて蛍光シグナルを検出できることから、隣接するウェルの強度の差を区別しやすくなることに基づいている。
【０３６２】
さらに、図１のｂに図示されるように、本発明に係る生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法では、ウェルに細胞を安定に保持することも可能であるために、斯かる細胞がウェルから離脱する可能性が少ないという点で、特に上述の本発明の診断方法及び検査方法として用いる場合に優れている。
【０３６３】
このように蛍光シグナルを発するウェルを決定した後、上述のように必要に応じて斯かるウェルに載置される細胞を回収することが可能となる。
【０３６４】
なお、本発明に係る診断方法及び検査方法においても、これらの生理活性物質を分泌する細胞のスクリーニング方法又は生理活性物質を表面提示する細胞のスクリーニング方法と同様に説明される。
【０３６５】
＜キット＞
本発明に係るキットは、上述の本発明に係るイムノチャンバー並びにリンカー及び／又は生理活性物質に特異的に結合する分子を含む。
【０３６６】
本発明のキットに含まれるイムノチャンバーは、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１にて詳述したとおりとすることができる。
【０３６７】
本発明のキットに含まれるリンカーは、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述したとおりとすることができる。
【０３６８】
本発明のキットに含まれる生理活性物質に特異的に結合する分子は、上述の本発明に係るクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述したとおりとすることができる。
【０３６９】
本発明に係るキットを用いる事によって、上述した本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法において好適に用いられるイムノチャンバーを作製することができる。このようなイムノチャンバーの具体的な製造方法は、上
述の本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程１のイムノチャンバーにて詳述した通りとすることができる。
【０３７０】
本発明に係るキットには、さらに生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子を含んでいてもよい。ここで、生理活性物質とは、上述の本発明のキットに含まれる分子が特異的に結合する生理活性物質と同じものとすることができる。具体的な生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子は、上述の本発明のスクリーニング方法、本発明の診断方法、又は本発明に係る検査方法における工程２にて詳述したものと同様にすることができる。
【０３７１】
このような、生理活性物質に特異的に結合する蛍光分子も含む態様の本発明に係るキットは、上述した本発明に係るスクリーニング方法、本発明に係る診断方法、及び本発明に係る検査方法からなる群より選択される少なくとも１つの方法に有用に用いられる。
【実施例】
【０３７２】
以下に示す実験例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明が以下に示す実験例に限定されないのは言うまでもない。
【０３７３】
＜製造例＞
〔イムノチャンバーの作製〕
１．チャンバーの作製
チャンバーの製造は、ＬＩＧＡプロセスに基づいて実施した。具体的なＬＩＧＡプロセスを図２に示す。
【０３７４】
射出成型にはポリスチレンを採用した。ウェルのレイアウトは、高集積（７１，４１５ウェル）チャンバーと（図３）、最密充填（２７３，３７５ウェル）チャンバー（図４及び図５）の２種類を作製した。
【０３７５】
なお、ＬＩＧＡプロセスにおけるＸ線の照射時には、図２に示すＸ線照射マスクを移動させながらＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリル酸）に対するＸ線の照射量をコントロールして、ウェルに任意の傾斜角を設けることが可能である。このような方法は、具体的には特許３３８０８７８号に記載の方法を採用して行った。
【０３７６】
また、図４に示すレイアウトは、最密充填チャンバーの一つのクラスターにおけるレイアウトを示しており、このクラスターを図５に示すように載置したものを、本実施例における最密充填チャンバーとした。クラスター間には１７０μｍのギャップが設けられている。
【０３７７】
このようにして製造した最密充填チャンバーの図２にて示すＸ線照射後のＰＭＭＡ、Ｎｉによる電析を行った後のＮｉ電鋳入子、及びそれを用いたポリスチレン射出形成品のレーザー顕微鏡観察像を図６に示す。
【０３７８】
この結果から、ウェルの形状は、上述のパターン通りに形成されていることが明らかとなった。
【０３７９】
２．チャンバーへの化学修飾
次いで、上記方法にて得られたチャンバーへ、各種物質で化学修飾する為の表面処理剤の使用濃度の最適化を検討した。
【０３８０】
具体的には、上述の高集積チャンバー及び最密充填チャンバーへの化学修飾を行うにあたり、ウェル内壁に対してアミノ基付与処理を行う際に用いたシランカップリング剤の濃
度の最適化を行い、その処理の均一性を評価した。
【０３８１】
まず、ウェルに対し酸素プラズマを照射した。具体的には、ヤマトマテリアル(株)社製ＰＤＣ２１０のプラズマ装置を用いて、酸素ガス１００ｃｃ、ＲＦ出力３００Ｗで処理時間１０秒で行った。ついで、シランカップリング剤である、３−アミノプロピルエトキシシランを０．１重量％及び１．０重量％の濃度で酸素プラズマ処理後のチャンバーに添加し、アミノ化処理を行った。次いで、乾燥、冷却の工程に供し、蒸留水でディッピング洗浄の後、細胞培養時に物理吸着したシランカップリング剤が培養液中に溶出し細胞毒性を示さない程度に蒸留水による流水による水洗（例えば、各チャンバーあたり蒸留水５０ｍｌ使用）を行った。
【０３８２】
洗浄工程の後に、乾燥、冷却工程を行って、ウェル内壁をアミノ基付与処理したイムノチャンバーを作製した。得られたイムノチャンバー表面（０．１重量％で処理したもの）の親水性について、純水の水滴接触角試験を用いて検討した。その結果を、図７に示す。
【０３８３】
未処理のチャンバー表面と比較して、０．１重量％の３−アミノプロピルエトキシシランで処理したチャンバーは、アミノ基が付与され、十分に親水性を示すことが明らかとなった。
【０３８４】
２−１：表面処理濃度の最適化
ＣＦ４８８Ａ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ
（ＮＨＳ化合物）（Ｅｘ４８８／Ｅｍ５１５）蛍光物質（ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｃａｔ．＃  ９２１２０）を用い、上述のアミノ基処理剤の濃度を１．０％（ｗ／ｖ）として、アミノ基でウェル内がコートされたチャンバー（Ｓｌｉｄｅ  Ａ）及び０．１％（ｗ／ｖ）でウェル内がコートされたチャンバー（Ｓｌｉｄｅ  Ｂとする）に、どの程度の量のＮＨＳ化合物が結合するかを可視化した。
【０３８５】
濃度幅（１ｍｇ／ｍｌ（１．６７ｍＭ）を起点として４倍系列希釈）を設け、サブエリアを覆うように０．５μｌの上述の蛍光物質をスポットし、次いで、ＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳを含むＮａＰＢ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む〔ｐＨ８．０〕）を図８に示すように２５℃、１時間作用させ、反応させた。
【０３８６】
次いで１００ｍｌの滅菌水で流水洗浄を行い、１つのサブエリアについて、８カ所のプロット（図９の丸で囲んだ領域）を蛍光測定した。結果を図１０及び表１に示す。
【０３８７】
【表１】
2014110785.tif 000133
【０３８８】
図１０に示したように、Ｓｌｉｄｅ  Ａでは０．０６２５ｍｇ／ｍｌ（約０．１ｍＭ−ＮＨＳ）、Ｓｌｉｄｅ  Ｂでは０．２５ｍｇ／ｍｌ（約０．４ｍＭ−ＮＨＳ）の濃度で蛍光が飽和しており、この濃度でチャンバーのウェル内が好適に修飾されることが示唆された。
【０３８９】
２−２：表面処理濃度の均一性評価
高集積（７１，４１５ウェル）チャンバー及び最密充填（２７３，３７５ウェル）チャンバーの化学修飾を行うにあたり、上述のアミノ基でコートされたチャンバーに均一に処理できるかどうかを評価した。ＣＦ４８８Ａ−ＮＨＳを０．０７ｍｇ／ｍｌ（０．１ｍＭ）の濃度で含むＮａＰＢの０．８６ｍｌを図１１のように作用（２５  ℃，１時間）させた。その後、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄し、各チャンバーの図１２の四角枠に示す１５つのサブエリアにおける、８カ所のプロット（図１２の丸で囲んだ領域）を蛍光測定した。結果を図１３及び表２に示す。
【０３９０】
【表２】
2014110785.tif 000134
【０３９１】
図１３に示したように、標準偏差を見たところ，バラつきはおおよそ１０％以内であると判明し、上述のチャンバーのウェル内は、均一にアミノ基によってコートされていることが示唆された。
【０３９２】
３−１：抗体の化学修飾
上記チャンバーに抗体を共有結合させることにより、例えば、以下に列記したスクリーニング又は疾患の診断方法の提供が可能となる。
【０３９３】
１）抗体を著量分泌するハイブリドーマの再セレクション。
２）所望の抗体、サイトカイン、分泌タンパク質等を分泌する遺伝子組み換えＣＨＯ細胞等のスクリーニング。
３）所望の抗体、サイトカイン、及び分泌タンパク質等を分泌する１）と２）に挙げた以外の細胞群等のスクリーニング。
４）表面抗原タンパク質の発現量の有無又はその発現量を指標とした疾患の診断方法。
【０３９４】
このようなスクリーニングを達成するにあたり、イムノチャンバーに対する抗体修飾のための架橋剤の検討を行った。
【０３９５】
３−１−１：Ｂｉｓ−ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）試薬を介する抗体修飾
上述のチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、Ｂｉｓ−ＮＨＳ（ＮＨＳ―リンカー―ＮＨＳ）試薬を用い、上述のチャンバー内壁に修飾されたアミノ基を介して抗体を架橋した。
【０３９６】
抗体として抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ｐｉｅｒｃｅ（ｔａｋａｒａ）Ｃａｔ．＃  ３１１６８）又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いた。架橋剤として用いたＢｉｓ−ＮＨＳ試薬は表３に示す製品である。
【０３９７】
【表３】
2014110785.tif 000135
【０３９８】
０．００１２ｍＭの上記の各種Ｂｉｓ−ＮＨＳ及び２９５ｎＭの上記抗体を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを、図１１に示すように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させた。
【０３９９】
３−１−２：ＮＨＳ−ＭＡＬ（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）試薬を介する抗体修飾
ナノチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、ＮＨＳ−ＭＡＬ（ＮＨＳ―リンカー―ＭＡＬ）試薬を用い、イムノチャンバーのアミノ基と抗体のチオール基を架橋した。
【０４００】
抗体には上述の抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いた。架橋剤として用いたＮＨＳ−ＭＡＬ試薬は表４に示す製品である。
【０４０１】
【表４】
2014110785.tif 000136
【０４０２】
０．４ｍＭの上記各種各ＮＨＳーＭＡＬ試薬を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４０３】
ついで、イムノチャンバーに２９５ｎＭの上記抗体を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で作用させ、０．０５ｍＭのシステインを含む３ｍｌのＮａＰＢで洗浄し、抗体修飾イムノチャンバーを得た。
【０４０４】
３−１−３：ビオチン−ＮＨＳ試薬を介する抗体修飾
イムノチャンバーに対する抗体修飾をするにあたり、イムノチャンバーと抗体それぞれに対して、ビオチン−ＮＨＳ（ビオチン−リンカー−ＮＨＳ）試薬を用いてビオチン標識し、次いで、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅを用いて抗体修飾イムノチャンバーを作製した。比較実験として、アミノ基を有さない単なるチャンバーに対して同様の実験を行った。
【０４０５】
イムノチャンバーにビオチンが標識されているかどうかは、Ｃｙ３標識したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを用いて、蛍光による可視化で確かめた。０．４ｍＭの各ビオチン−ＮＨＳを含む、０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ１００ｍｌの滅菌水で流水洗浄後、０．００１ｍｇのＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎを含む、５ｍｌのＮａＰＢを該ビオチン標識チャンバーに２５℃、１時間作用させて蛍光を観察した。その結果を図１４に示す。
【０４０６】
図１４に示したとおり、アミノ基の無いポリスチレン基板をビオチン−ＮＨＳとＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎで処理した時に比べ、アミノ基のあるＳｌｉｄｅ  Ａをビオチン−ＮＨＳとＣｙ３標識Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎで処理した時では、強い蛍光が観察された。この結果から、アミノ基コート依存的にビオチンがコートされたことが示唆された。
【０４０７】
イムノチャンバーをビオチン化できることが示されたので、抗体として上述の抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用い、架橋剤として用いたビオチン−ＮＨＳ試薬は、表５に示す製品である。
【０４０８】
【表５】
2014110785.tif 000137
【０４０９】
先ず、０．４ｍＭの上記各種ビオチン−ＮＨＳ試薬（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉ
ｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４１０】
一方、０．０１３３ｍＭの抗体を含む、０．０２ｍｌのＮａＰＢに対し、１０ｍＭのその他の表５に示すビオチン−ＮＨＳ試薬のＤＭＳＯ溶液を０．０００５ｍｌ添加し、２５℃で１時間反応させた後、透析あるいはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したゲルろ過カラムを用いて、余剰のビオチンを除去し、ビオチン化抗体を取得した。
【０４１１】
得られた２９５ｎＭのビオチン化抗体及び１００ｎｍのＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように、２５℃、１時間で、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗体修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１２】
３−２：抗原（ペプチド、タンパク質、抗体等）の化学修飾
イムノチャンバーに抗原（タンパク質、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、ビタミン、低分子化合物等のペプチド、タンパク質等、さらに上述のように抗体を含む場合もある）を共有結合させることにより、例えば、以下に列記したスクリーニングが可能となる。
【０４１３】
１）抗原特異的な抗体を著量分泌するハイブリドーマの再セレクション。
２）抗原特異的な抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング。
３）抗原特異的な抗体を分泌するＢ細胞のスクリーニング。
４）抗原特異的な抗体を分泌するＣＨＯ細胞のスクリーニング。
５）抗原に対して親和性を有する分子（タンパク質、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、ビタミン、低分子化合物、抗体等）を分泌する、１）から４）に挙げた以外の細胞群のスクリーニング。
【０４１４】
このようなスクリーニングを達成するにあたり、イムノチャンバーに対する抗原修飾のための架橋剤の検討を行った。
【０４１５】
３−２−１：Ｂｉｓ−ＮＨＳ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、Ｂｉｓ−ＮＨＳ試薬を用い、ナノチャンバーと抗原それぞれのアミノ基どうしを架橋した。抗原にはタンパク質（ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）等）を用い、架橋剤は表３に示すものを利用した。各種Ｂｉｓ−ＮＨＳを０．００１２ｍＭ及びタンパク質を２９５ｎＭ含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように、２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１６】
３−２−２：ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を用い、イムノチャンバーのアミノ基と抗原のチオール基を架橋した。抗原にはＬＤＨ等を用い、架橋剤は表４に示す物を利用した。０．４ｍＭの各種ＮＨＳ−ＭＡＬ試薬を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水にて流水洗浄した。
【０４１７】
また、２９５ｎＭの抗体（ここでは、抗原として用いている）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で、上述のアミノ基処理剤濃度を１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、０．０５ｍＭのシステインを含む３ｍｌのＮａＰＢで洗浄し、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４１８】
３−２−３：ビオチン―ＮＨＳ試薬を介する抗原修飾
イムノチャンバーに対する抗原修飾をするにあたり、イムノチャンバーと抗体それぞれに対してビオチン−ＮＨＳ試薬を用いてビオチン標識し、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅを用いて抗体修飾イムノチャンバーを作製した。抗原にはＬＤＨ等を用い、架橋剤として用いたビオチン―ＮＨＳ試薬は、表５に示す製品である。
【０４１９】
まず、上記各種ビオチン−ＮＨＳ試薬（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を含む０．５ｍｌのＮａＰＢを図１１のように２５℃、１時間で上述のアミノ基処理剤濃度を、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、１００ｍｌの滅菌水１００にて流水洗浄した。
【０４２０】
一方、０．０１３３ｍＭの抗原を含む０．０２ｍｌのＮａＰＢに対し、１０ｍＭのその他の表５に示すビオチン−ＮＨＳ試薬のＤＭＳＯ溶液を０．０００５ｍｌ添加し、２５℃で１時間反応させた後、透析あるいはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したゲルろ過カラムを用いてフリーのビオチンを除去し、ビオチン化抗原を取得した。
【０４２１】
得られたビオチン化抗原２９５  ｎＭ及びＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ  １００  ｎＭを含むＮａＰＢの０．５ｍｌを図１１のように、２５℃、１時間で、１．０重量％で用いて作製したイムノチャンバーに作用させ、抗原修飾イムノチャンバーを得た。
【０４２２】
＜実験例＞
以下に、上述の各種の化学修飾を施したイムノチャンバーを用いた標的細胞の回収等の実験を行った。
【０４２３】
４−１：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーの細胞導入検討
上述の方法で作製した各種抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに、生細胞染色試薬であるＣｙｔｏＲｅｄを用いて染色したＨｙｂｒｉｄｏｍａ細胞、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した固定化済の肺腺上皮癌由来Ａ５４９細胞、ＥＧＦＰを産生するマウスＥＳ細胞、ＣｙｔｏＲｅｄ染色したＣＨＯ細胞等を播種し、これらの細胞の導入効率を評価した。結果を図１５に示す。
【０４２４】
図１５に示したとおり、最密充填（２７３，３７５ウェル）イムノチャンバーにおいては、８５％〜９０％の導入効率を示し、高集積（７１，４１５ウェル）イムノチャンバーにおいては７５％〜８５％の導入効率を示した。なお、高集積イムノチャンバー及び最密充填イムノチャンバー共に、架橋剤としてＰＥＧを含むものとを用い、そのエチレンオキシドの繰り返し単位数が大きいほうが細胞の導入効率が高い傾向となり、例えば高集積については、このような繰り返し単位数が短いと、ウェル間のピッチに多数の細胞が吸着する傾向となった。
【０４２５】
一方、細胞側をｐｌｕｒｏｎｉｃ等の共重合型界面活性剤や任意の分子量のＰＥＧで前処理すると、上述のＰＥＧにおけるエチレンオキシドの繰り返し単位数に関わらず、細胞の導入効率が高くなる傾向であった。
【０４２６】
４−２：抗体及び抗原修飾を施したナノチャンバー（イムノチャンバー）の細胞導入後の毒性の検討
上述の方法で作製した各種抗体修飾ナノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに、ＣｙｔｏＲｅｄ染色したＨｙｂｒｉｄｏｍａ細胞，マウスＥＳ細胞、ＣＨＯ細胞等を播種し、その直後（時間０）及び播種後４時間経過した時の蛍光像を観察した。結果を図１６に示す。
【０４２７】
図９に示したとおり、時間０と４時間後の蛍光像に変化が無い事から、毒性は無いと示唆された。
【０４２８】
４−３：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーを用いる抗体分泌細胞の回収
上述の方法で作製した各種抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに対して、抗体分泌細胞を播種し、全自動１細胞単離解析装置（ＡＳ  Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｉｃｋｉｎｇ  システム；アズワン社）を用いて回収実験を行った。
【０４２９】
抗マウスＩｇＧ抗体又はＬＤＨで修飾したイムノチャンバーを所定のブラックフレームにセットし、２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１．２ｍｌのＰＢＳでブロッキング（室温、６０分）工程に供した。
【０４３０】
次いで、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ細胞の３，０００細胞とＣＨＯ細胞の３００，０００細胞ずつを１．２ｍｌの血清不含培地に懸濁し、高集積（７１，４１５ウェル）イムノチャンバー上には１０万細胞を、最密充填（２７３，３７５ウェル）イムノチャンバー上には３０万細胞を播種した。
【０４３１】
その後、血清を含む培地に置換して抗体分泌細胞に由来する抗体分泌を促し、３７℃、で５％のＣＯ２の存在下で３０分間静置後、５ｍｌの血清不含培地で洗浄した。
【０４３２】
０．００５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体及び０．００２ｍＭのＣｙｔｏＲｅｄを含む０．５ｍｌの血清不含培地を洗浄後のイムノチャンバーに添加し、室温で２０分静置した。その後、１０ｍｌの血清不含培地で洗浄し、１．２ｍｌの血清不含培地を添加して、上述の全自動１細胞単離解析装置にて観察及び回収した。具体的な観察及び回収方法は、装置のマニュアル通りに、ＦＩＴＣの輝度値の高いウェルに含まれる抗体分泌細胞を回収するプログラムにて行った。具体的には、輝度値の高い１３個のウェルに含まれる抗体産生細胞を回収した。観察結果を図１７に示し、回収の様子を図１８に示した。
【０４３３】
高集積イムノチャンバー及び最密充填イムノチャンバー共に、架橋剤としてＰＥＧを含むものとを用い、そのエチレンオキシドの繰り返し単位数が大きいほうが細胞の回収効率が高い傾向となった。
【０４３４】
一方、細胞側をｐｌｕｒｏｎｉｃ等の共重合型界面活性剤や任意の分子量のＰＥＧで前処理すると、上述のＰＥＧにおけるエチレンオキシドの繰り返し単位数に関わらず、細胞の回収効率が高くなる傾向であった。
【０４３５】
４−４：抗体及び抗原修飾を施したイムノチャンバーを用いた抗体を高分泌する抗体分泌細胞の回収
上述の方法で回収した抗体分泌細胞をそのまま育種工程に供し、観察した。約１週間の培養で全て浮遊形態を示す細胞コロニーが観察され、仮足を有する細胞コロニーは観察されなかった。細胞コロニーの様子を図１９に示す。
【０４３６】
このことから回収した細胞が抗体分泌細胞、すなわちハイブリドーマ細胞であることを示された。さらに約２０日の培養後、回収した抗体分泌細胞の培地上清をＥＬＩＳＡに供した。
【０４３７】
まず、ＥＬＩＳＡプレートを作製した。１ｍｌのＰＢＳ中に抗マウスＩｇＧ抗体を０．
０１２ｍｇ添加し、これを９６ウェルプレートの１ウェルにつき０．０３ｍｌずつ添加し、４℃で１晩静置した。洗浄緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ；ＰＢＳＴ）で５回洗浄し，０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを１ｗｅｌｌにつき０．２ｍｌずつ添加し、２５℃で１時間静置して抗体固相化プレートを作製した。作製した抗体固相化プレートは密閉して４℃で保存した。
【０４３８】
次に、抗体固相化プレートの１ウェルに上述の輝度値の高い１０個のハイブリドーマを培養して得られた培養液の各検体の０．１ｍｌを添加し、室温で１時間静置して反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄し、蛍光標識抗体あるいはＨＲＰ標識抗体を０．２ｍｌ添加し、遮光状態で４℃で１時間静置した。ＰＢＳＴで５回洗浄し、蛍光標識抗体を用いたサンドイッチＦＩＡについては、そのまま蛍光／吸光プレートリーダーＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）により４８８ｎｍの蛍光を測定し、ＨＲＰ標識抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡについては、ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を０．１ｍｌ添加して３０分間反応させ、２Ｍの硫酸を０．１ｍｌ添加して反応を停止後、同様にＶａｒｉｏｓｋａｎにより４５０ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図２０に示した。
【０４３９】
図２０に示したとおり、輝度値の高いハイブリドーマの大半が抗体を著量分泌すると判明した。このことから本スクリーニング系において、蛍光輝度の高いイムノチャンバーから回収された抗体分泌細胞は、高い抗体分泌能を有することが明らかとなった。
【０４４０】
４−５：マニュアル操作による標的細胞取得
上記４−３に示す方法では、公知の全自動１細胞単離解析装置を用いた方法ではあるが、それ以外にナリシゲのマイクロマニピュレータを用い、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ）観察下で、手動（マニュアル）でも行うことが出来た。
【０４４１】
具体的には，上述の方法で作製した抗体修飾イムノチャンバー及び抗原修飾イムノチャンバーに抗体分泌細胞を播種し、共焦点レーザー顕微鏡観察下で、市販のマイクロマニピュレータ（ナリシゲ社）を用いて回収実験を行った。
【０４４２】
方法を次に示す。抗マウスＩｇＧ抗体又はＬＤＨ修飾イムノチャンバースライドをブラックフレームにセットし、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１．２ｍｌのＰＢＳでブロッキング（室温、６０分）に供した。抗体分泌細胞の１５０，０００細胞とＣＨＯ細胞の１５０，０００細胞ずつを１．２ｍｌの血清不含培地に懸濁し、高集積イムノチャンバー上には１０万細胞を、最密充填イムノチャンバー上には３０万細胞を播種した。
【０４４３】
これらの細胞を播種した後、血清を含む培地に置換して抗体分泌細胞に由来する抗体分泌を促し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で３０分間静置後、５ｍｌの血清不含培地で洗浄した。
【０４４４】
次いで、０．００５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体及び０．００２ｍＭのＣｙｔｏＲｅｄを含む５００ｍｌの血清不含培地を添加し、室温で２０分静置した。血清不含培地１０ｍｌで洗浄し、血清不含培地１．２ｍｌを添加してＬＳＭにて観察し、高い蛍光値を示すウェルに含まれる抗体分泌細胞をナリシゲのマイクロマニピュレータを用いて回収した。ＬＳＭによる観察結果は図２１に示した。
【０４４５】
４−６：フローサイトメトリー法との比較
本発明のイムノチャンバーを用いたスクリーニング方法と従来のフローサイトメトリー法とを比較する実験を行った。
【０４４６】
検出対象として、約１０７個のＣＤ４５陽性であるＪｕｒｋａｔ細胞と、約１０２個の
ＣＫ（サイトケラチン）１１、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの何れかを１種以上を発現するＡ５４９細胞を混合した（本明細書において、Ｊｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞又は単に混合細胞と呼ぶことがある。）
【０４４７】
ここで、Ａ５４９細胞を検出対象とし、０．００１％の検出精度が達成されるかどうかの実験を、本発明のイムノチャンバーを用いたスクリーニング法と、従来のフローサイトメトリー法とを比較して検討した。
【０４４８】
上述のＪｕｒｋａｔ／Ａ５４９混合細胞を４％のＰＦＡを用いて、室温条件下で２０分間の固定化処理に供した後に、最終濃度が０．０３％となるようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０μｌのＣｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ抗体カクテル（抗ＣＫ１１−ＰＥ標識抗体、抗ＣＫ１９−ＰＥ標識抗体、及び抗ＣＤ４５−ＡＰＣ標識抗体；Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を含む１００μｌのＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）に懸濁して、４℃で１時間静置し、上記界面活性剤及び抗体カクテルを含まないＭＡＣＳバッファーにて２回洗浄した。
【０４４９】
ついで、洗浄後の混合細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  ライフサイエンス社）を用いて、約１００万個の混合細胞の解析を行った。結果を図２２に示す。
【０４５０】
混合細胞中の検出対象となるＡ５４９細胞は、ＣＫ１１及びＣＫ１９には陽性で、且つＣＤ４５には陰性であるために、図２２中の４におけるＱ３画分（ＰＥ−Ａ＋，ＣＤ４５−）に、理論的には１０個の細胞が含まれるはずであるが、細胞の姿は見えなかった。図２２の５に、解析結果を統計的にまとめた表を示すが、Ｑ３にはすべての混合細胞に対して検出された細胞はわずか０％であった。
【０４５１】
即ち、従来のＦＡＣＳを用いた方法では、０．００１％程度の検出感度が達成できないことが明らかとなった。検出すらできないことから、所望の対象細胞を、公知のセルソーター機能に供して分別し、これをそのまま育種に供することもできない。
【０４５２】
一方で、本発明に係るスクリーニング方法として、先ず、適当な培地に上記混合細胞を懸濁し、これをイムノチャンバーに播種した。用いたイムノチャンバーは、上述の方法に沿って作製したものであり、具体的にはチャンバーのウェル内表面が、アミノ基処理剤で処理され、当該表面にアミノ基が付与されたウェルを有するチャンバー（おおよそ２７万ウェル）に対し、両端にＮＨＳ基を有するＰＥＧ９リンカー（ＢＳ（ＰＥＧ）９；Ｔｈｅｒｍｏ社）を介して、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＣＳＴ：ウサギモノクローナル抗体）が結合したイムノチャンバーである。
【０４５３】
上記混合細胞を上記イムノチャンバーに播種してから２０分静置し、１ｍｌのＭＡＣＳバッファーで１０回洗浄後、イムノチャンバーの各ウェルに細胞が１つ載置されていることを確認した。
【０４５４】
ついで、Ｃｙ３標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ標識抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）をそれぞれ１０μｌずつ含む１ｍＬのＭＡＣＳバッファーをイムノチャンバー内の各ウェルに添加し、４℃で１時間静置した。
【０４５５】
そして、上記イムノチャンバーのウェル内に載置された細胞を、界面活性剤を含まないＭＡＣＳバッファーで３回洗浄し、上述の全自動１細胞単離解析装置にて解析し（図２３）、Ｃｙ３の蛍光を発するウェルからＥｐＣＡＭ陽性細胞、即ちＡ５４９細胞が８２個程度存在していることを確認した。なお、図２３に示す写真像は、イムノチャンバーの一部の領域のみを示すものである。そして、確認したＡ５４９細胞のうち、高いＣｙ３蛍光値を示す１２個を回収した（図２４）。
【０４５６】
回収した細胞をそれぞれ独立に適当な培地及び培養条件にて２１日間培養に供し、６ｃｍディッシュにて６０％コンフルエントになるまで培養を続けた。その後、培養された細胞を３ｍｌのダルベッコＰＢＳにて２回洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコＰＢＳを用いて回収した。
【０４５７】
回収した細胞を、４％のＰＦＡを用いて、室温条件下で２０分間の固定化処理に供した後に、最終濃度が０．０３％となるようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０μｌのＣｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ抗体カクテル（抗ＣＫ１１−ＰＥ標識抗体、抗ＣＫ１９−ＰＥ標識抗体、及び抗ＣＤ４５−ＡＰＣ標識抗体；Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を含む１００μｌのＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）に懸濁して、４℃で１時間静置し、上記界面活性剤及び抗体カクテルを含まないＭＡＣＳバッファーにて２回洗浄した。
【０４５８】
次いで、洗浄後の混合細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  ライフサイエンス社）を用いて、約５万個の細胞の解析を行った。結果を図２５に示す。
【０４５９】
図２５に示すように、回収した細胞はＣＫ１１＋又はＣＫ１９＋で、且つＣＤ４５−であるＡ５４９細胞であった。
【０４６０】
従って、本発明のイムノチャンバーを用いた方法によると、約０．００１％の精度で細胞を検出することが可能で、これを一細胞レベルで回収し、さらに育種に成功できたことを明らかに示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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