(57)【要約】【課題】本発明は生物個体中で利用できる特定の標的細胞種選択的に光活性化可能なケージド化合物の提供を課題とする。【解決手段】一般式Ｋ−Ｑ−Ｘで表される、生理活性物質Ｘ、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合した化合物であって、ＱはＫが結合していないときに特定の波長の光で光分解を起こしＸから脱離する保護基であり、ＸはＱが結合しているときに生理活性を発現せずＱが脱離したときに生理活性を発現する物質であり、前記酵素によりＫがＱから脱離しＱ−Ｘで表される化合物を生成し、該Ｑ−Ｘで表される化合物に光照射し、ＱをＸから脱離させることにより、Ｋが生理活性を発現する化合物により上記課題を解決できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I)で表される、生理活性物質Ｘ、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合した化合物。
【化１】
2014193848.tif 000029
【請求項２】
下記一般式（I)で表される、生理活性物質Ｘ、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合した化合物であって、ＱはＫが結合していないときに特定の波長の光で光分解を起こしＸから脱離する保護基であり、ＸはＱが結合しているときに生理活性を発現せずＱが脱離したときに生理活性を発現する物質であり、前記酵素によりＫがＱから脱離しＱ−Ｘで表される化合物を生成し、該Ｑ−Ｘで表される化合物に光照射し、ＱをＸから脱離させることにより、Ｋが生理活性を発現する、請求項１記載の化合物。
【化２】
2014193848.tif 000030
【請求項３】
酵素の基質となり得る化合物ＫをＱ−Ｘから脱離させる酵素が細胞に内在する酵素又は細胞に導入した外来性の酵素であり、細胞内でＸが生理活性を発現する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
光分解性保護基ＱがBhc基、Bhcmoc基、キサンテン（Xanthene）型の光分解性保護基及びレゾルフィン（Resorufin）型の光分解性保護基からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
酵素の基質となり得る化合物と該酵素の組み合わせが、ガラクトースとβ-ガラクトシダーゼ、グルコースとグルコシダーゼ、グルクロン酸とグルクロニダーゼ及びリン酸とアルカリフォスファターゼからなる群の組み合わせから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
生理活性物質Ｘが、タンパク質、核酸、脂肪酸、アミノ酸からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
生理活性物質Ｘが、酵素阻害剤、ホルモン、脂質性シグナル分子、神経伝達物質、微小管脱重合阻害薬、微小管重合阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、プリン代謝阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、ピリミジン代謝阻害薬、葉酸代謝拮抗剤及びアルキル化薬なる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
光分解性保護基ＱがBhc基であり、酵素の基質となり酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋがガラクトースであり、β-ガラクトシダーゼにより、ガラクトースがＱ−Ｘから脱離する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物Ｋ−Ｑ−Ｘを細胞に導入する工程、細胞内の酵素の反応により、酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物ＫをＱ−Ｘから脱離させる工程、光を照射しＱ−ＸからＱを脱離する工程、とを含む、細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
【請求項１０】
酵素が細胞の内在性酵素である、請求項９記載の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
【請求項１１】
酵素が外来性の酵素である、請求項９記載の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
【請求項１２】
光分解性保護基ＱがBhc基又はBhcmoc基であり、照射する光の波長が400〜450nmである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
【請求項１３】
酵素の基質となり酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋがガラクトースであり、β-ガラクトシダーゼにより、ガラクトースがＱ−Ｘから脱離する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか1項に記載のＫ−Ｑ−Ｘで表される化合物の前駆体化合物であって、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合したＫ−Ｑで表される、生理活性物質Ｘを結合させることによりＫ−Ｑ−Ｘに変換される、請求項１〜８のいずれか1項に記載の化合物の前駆体化合物。
【請求項１５】
生理活性物質であるＸとしてDNA、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスRNA、ATP、ADP、cAMP、GTP、GDP、GTP-γ-A、GDP-β-S、cGMP、8-ブロモcAMP、8-クロロcAMP、8-ブロモcGMP、8-クロロcGMP、8-パラ-クロロフェニルチオcAMP及び8-パラ-クロロフェニルチオcGMPからなる群から選択される化合物を結合させ得る、光分解性保護基Ｑがジアゾ基を結合させたBhc基又はBhcmoc基であり、酵素の基質となり得る化合物Ｋがガラクトースである、請求項１４記載の前駆体化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の標的細胞内で光活性化により生理活性作用を発揮するケージド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生理機能を、できるだけ生理的な条件を再現したやり方、すなわち高い時空間分解能で制御するには、高分解能の顕微鏡を利用して光制御するしか方法が無いと考えられる。また、そのためには、適切に設計されたケージド化合物を利用することが必須であった。ケージド化合物とは、光分解性保護基を導入した生理活性分子のことであり、光照射によってその活性をオン（またはオフ）にできる。これまでに優れた性質を持つケージド化合物が開発されてきた（非特許文献１等）。その結果、培養細胞や脳スライス、あるいは固定して動かない状態にした個体では、神経伝達物質や細胞内セカンドメッセンジャー等のケージド化合物を導入後、顕微鏡のレンズで励起光を絞ることで非常に高い空間分解能で光刺激が達成できるようになった。
【０００３】
例えば、細胞内のごく一部を刺激する局所刺激を効果的に活用して、T細胞が抗原提示細胞を認識する際の、細胞内シグナル伝達の詳細な機構を解明する研究に応用できることが示されている（非特許文献２）。また、精子細胞の運動性には全く摂動を与えることなく、光照射によって、瞬時に特定の細胞内シグナル伝達経路を活性化できること、さらに、蛍光センサーを併用してカルシウムイオンの時空間動態をリアルタイムでモニターできることも示されている（非特許文献３及び４等）。しかし、既存のケージド化合物を生物個体に利用した例は限られている（非特許文献５〜７等）。
【０００４】
その主な理由として、動く個体の特定の細胞に狙いをつけて光照射できないこと、光刺激に用いる最適な波長が紫外部にあるため体表面から深部まで光が届きにくいことが挙げられる。
【０００５】
一方、脳・神経科学分野では、チャネルロドプシンの利用が、個体行動の光制御に関して、大きなブレークスルーをもたらした（非特許文献８等）。遺伝子でコードされた利点を活かし、チャネルロドプシンを特定の神経細胞に発現するトランスジェニック個体を作成することが可能である。これを実験に用いると、光照射そのもので狙いを付ける必要が無くなる。光はある程度広範囲に当たっていても、任意の神経細胞を刺激できるので、個々の神経細胞の活動と個体の行動を結びつけて解析することが可能になりつつある。ただし、現状では光制御できる生理機能は神経細胞の興奮と抑制にほぼ限られている。また、生まれ付きすべての神経細胞が光感受性に改変されることによる人工性と異常性も問題になりうる。よって、多様な生理機能の光制御を実現するには、タンパク質であるチャネルロドプシンの利点（狙った細胞にターゲッティングできること）と小分子有機化合物であるケージド化合物の利点（正常な個体に後から加えられること）を併せ持ち、個体の狙った細胞内だけで働くように設計したケージド化合物の開発が強く望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ACS Chem Biol. 2009, 4, 409
【非特許文献２】Nature Immun. 2009, 10, 627.
【非特許文献３】ChemBioChem, 2004, 5, 1119
【非特許文献４】J. Cell Biol. 2005, 169, 725
【非特許文献５】Nature Genet. 2001, 28, 317,
【非特許文献６】Cell 2005, 121, 141
【非特許文献７】Biotechniques, 2007, 43, 161
【非特許文献８】Annu. Rev. Neurosci. 2011, 34, 389
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既存のケージド化合物を生物個体中に利用するのは難しい。その主な理由として、動く個体の細胞に狙いをつけて光照射することが困難なため高い空間分解能を実現できないこと（問題点１）、光刺激に用いる最適な波長が紫外部にあるため体表面から深部まで光が届きにくいこと（問題点２）が挙げられる。
【０００８】
本発明はこのような問題点を解消し、生物個体中で利用できる特定の標的細胞種選択的に光活性化可能なケージド化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、現時点では最高の性能を持つと考えられるBhc-型の光分解性保護基（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 1193; Trends Anal. Chem. 2004, 23, 501.; J Synth. Org. Chem. Jpn., 2012, 69, 1164等）に新たな機能を加えて、細胞の種類を見分けて、その細胞内又はその周辺でのみ光活性化可能な新規ケージド化合物を開発して、問題点１の解決を図るべく検討を行った。さらに、問題点２を解決すべく、可視光で光脱保護可能な新規光分解性保護基の開発について検討を行った。
【００１０】
本発明者は、既存のケージド化合物の光分解性保護基を、特定の酵素の基質であり、該酵素で切断され得る物質でさらに保護し、基質が結合しているときには光分解性保護基が光活性化せず、基質が特定の酵素で切断され、光分解性保護基から脱離したときに光分解性保護基が光活性化し得る、新たなケージド化合物により問題点１が解決し、500nmより長波長の光で活性化し得る光分解性保護基により問題点２が解決することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  下記一般式（I)で表される、生理活性物質Ｘ、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合した化合物。
【化１】
2014193848.tif 000002
[２]  下記一般式（I)で表される、生理活性物質Ｘ、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合した化合物であって、ＱはＫが結合していないときに特定の波長の光で光分解を起こしＸから脱離する保護基であり、ＸはＱが結合しているときに生理活性を発現せずＱが脱離したときに生理活性を発現する物質であり、前記酵素によりＫがＱから脱離しＱ−Ｘで表される化合物を生成し、該Ｑ−Ｘで表される化合物に光照射し、ＱをＸから脱離させることにより、Ｋが生理活性を発現する、[１]の化合物。
【化２】
2014193848.tif 000003
[３]  酵素の基質となり得る化合物ＫをＱ−Ｘから脱離させる酵素が細胞に内在する酵素又は細胞に導入した外来性の酵素であり、細胞内でＸが生理活性を発現する、[１]又は[２]の化合物。
[４]  光分解性保護基ＱがBhc基、Bhcmoc基、キサンテン（Xanthene）型の光分解性保護基及びレゾルフィン（Resorufin）型の光分解性保護基からなる群から選択される[１]〜[３]のいずれかの化合物。
[５]  酵素の基質となり得る化合物と該酵素の組み合わせが、ガラクトースとβ-ガラクトシダーゼ、グルコースとグルコシダーゼ、グルクロン酸とグルクロニダーゼ及びリン酸とアルカリフォスファターゼからなる群の組み合わせから選択される、[１]〜[４]のいずれかの化合物。
[６]  生理活性物質Ｘが、タンパク質、核酸、脂肪酸、アミノ酸からなる群から選択される、[１]〜[５]のいずれかの化合物。
[７]  生理活性物質Ｘが、酵素阻害剤、ホルモン、脂質性シグナル分子、神経伝達物質、微小管脱重合阻害薬、微小管重合阻害薬、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、プリン代謝阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、ピリミジン代謝阻害薬、葉酸代謝拮抗剤及びアルキル化薬なる群から選択される、[１]〜[５]のいずれかの化合物。
[８]  光分解性保護基ＱがBhc基であり、酵素の基質となり酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋがガラクトースであり、β-ガラクトシダーゼにより、ガラクトースがＱ−Ｘから脱離する、[１]〜[７]のいずれかの化合物。
【００１２】
[９]  [１]〜[８]のいずれかの化合物Ｋ−Ｑ−Ｘを細胞に導入する工程、細胞内の酵素の反応により、酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物ＫをＱ−Ｘから脱離させる工程、光を照射しＱ−ＸからＱを脱離する工程、とを含む、細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
[１０]  酵素が細胞の内在性酵素である、[９]の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
[１１]  酵素が外来性の酵素である、[９]の細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
[１２]  光分解性保護基ＱがBhc基又はBhcmoc基であり、照射する光の波長が400〜450nmである、[９]〜[１１]のいずれかの細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
[１３]  酵素の基質となり酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋがガラクトースであり、β-ガラクトシダーゼにより、ガラクトースがＱ−Ｘから脱離する、[９]〜[１２]のいずれかの細胞内でＸの生理活性を発現させる方法。
[１４]  [１]〜[８]のいずれかのＫ−Ｑ−Ｘで表される化合物の前駆体化合物であって、光分解性保護基Ｑ及び酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物Ｋが結合したＫ−Ｑで表される、生理活性物質Ｘを結合させることによりＫ−Ｑ−Ｘに変換される、[１]〜[８]のいずれかの化合物の前駆体化合物。
[１５]  生理活性物質であるＸとしてDNA、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスRNA、ATP、ADP、cAMP、GTP、GDP、GTP-γ-A、GDP-β-S、cGMP、8-ブロモcAMP、8-クロロcAMP、8-ブロモcGMP、8-クロロcGMP、8-パラ-クロロフェニルチオcAMP及び8-パラ-クロロフェニルチオcGMPからなる群から選択される化合物を結合させ得る、光分解性保護基Ｑがジアゾ基を結合させたBhc基又はBhcmoc基であり、酵素の基質となり得る化合物Ｋがガラクトースである、[１４]の前駆体化合物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のケージド化合物は、従来の既存のケージド化合物が光分解性保護基という１つの鍵で生理活性物質の活性がマスクされていたのに対し、さらに酵素の基質というもう１つの鍵で光分解性保護基の光反応性をマスクする。本発明においては、酵素の基質を第１の鍵と呼び、光分解性保護基を第２の鍵と呼ぶ。この結果、本発明のケージド化合物は、ケージド化合物が含む基質を分解する酵素のある部位でのみ、酵素反応により基質が脱離し、第１の鍵が開かれる。第１の鍵が開かれることにより、第２の鍵である光分解性保護基の光反応性が復活し、光により光分解性保護基が脱離し、第２の鍵が開かれ、最終的に生理活性物質の活性が発現するようになる。第１の鍵として働く基質に対する、内在性又は外来性の特定の酵素を含む細胞を標的とすることにより、その標的細胞内又はその周辺のみで、第２の鍵が開き、さらに光を照射することにより第２の鍵が開かれ、結果的に特定の標的細胞内のみで生理活性物質の活性を発現させることができる。
【００１４】
本発明の細胞種選択的に光活性化可能なケージド化合物を利用することにより、特定の標的細胞内のみで生理活性物質の活性を発現させることができ、例えば、生理活性物質が抗癌剤等の治療薬の場合、癌細胞のみで開かれる第１の鍵を設定することにより、癌細胞でのみ抗癌剤を活性化することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Bhc基の構造を示す図である。
【図２】Bhcmoc基の構造を示す図である。
【図３】ガラクトースと結合させたキサンテン型の光分解性保護基及びガラクトースと結合させたレゾルフィン型の光分解性保護基の構造を示す図である。
【図４】酵素と酵素の基質となり得る化合物の組合せを示す図である。
【図５】Gal-Bhc-Xの構造、酵素反応及び光反応を示す図である。
【図６】本発明のケージド化合物の例を示す図である。
【図７】Bhcmoc-propargylとGal-Bhcmoc-propargylのUVスペクトルを示す図である。
【図８】光分解によるBhcmoc-propargylとGal-Bhcmoc-propargylの減少を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定の標的細胞内でのみ光活性化能を獲得し、細胞種選択的に光活性化可能なケージド化合物である。
【００１７】
１．本発明のケージド化合物の構造
本発明の化合物は、下記一般式（I)
【化３】
2014193848.tif 000004
で表される。
【００１８】
Ｘは、生理活性物質であり、Ｑは光分解性保護基であり、Ｋは酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物である。ここで、酵素の基質となり得る化合物であって酵素反応によりＱ−Ｘから脱離する化合物とは、化合物Ｋ−Ｑ−Ｘにおいて、酵素反応により、Ｋ−Ｑの結合が加水分解等により分解され、ＫとＱ−Ｘが脱離し得る化合物をいう。例えば、Ｋがガラクトースである場合、ガラクトースと光分解性保護基はガラクトースのヒドロキシ基と光分解性保護基がエーテル結合により結合し、β-ガラクトシドを形成する。β-ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシドを基質とし、加水分解によりガラクトースを生成するが、本発明においては、ガラクトースをβ-ガラクトシダーゼの基質となり得る化合物と呼ぶ。
【００１９】
Ｘは単独では、細胞内で生理活性作用を有している生理活性物質であるが、Ｑと結合し、Ｘの官能基が光分解性保護基で保護されているときは、活性がマスクされており、生理活性を発現しない。
【００２０】
ケージド化合物の光分解性保護基は特定の波長を照射することにより、光活性化し、光分解反応を起こし、その結果脱保護によりＫから脱離し、その結果Ｋは生理活性作用を発現するようになる。
【００２１】
しかしながら、Ｑ−ＸにＫが結合しているとき、Ｑは400 nmより長波長の光照射を受けても光活性化されず、Ｋから脱離しないので、Ｘが生理活性作用を発現することはない。
【００２２】
化合物Ｋ−Ｑ−Ｘから、酵素反応により最初にＫを脱離させると、生理活性物質Ｘが光分解性保護基と結合したＱ−Ｘで表されるケージド化合物が生成し、該ケージド化合物に光照射を行うと、Ｑ−Ｘから光分解性保護基のＱが脱離し、Ｋが生理活性を発現するようになる。
【００２３】
すなわち、特定の細胞内にＫ−Ｑ−Ｘを導入し、細胞内で酵素反応を起こさせ、Ｋ−Ｑ−ＸからＫを脱離させる。次いで、細胞内に残存するＱ−Ｘに光照射することにより、光分解性保護基Ｑが脱離し、Ｘが生理活性を発現するようになる。すなわち、生理活性物質が光分解性保護基により保護されたケージド化合物において、光分解性保護基の光感受性が酵素の基質となり得る化合物であるＫによりマスクされている。本発明において、酵素の基質になり得る化合物による光分解性保護基の光感受性のマスクを第１の鍵と呼び、光分解性保護基により生理活性物質の生理活性作用の発現を阻害することを第２の鍵と呼ぶ。
【００２４】
Ｘで表される生理活性物質は、限定されず、光分解性保護基で保護可能な官能基を有し、なおかつ該官能基を介して光分解性保護基で保護された場合に、生理活性を失うか、少なくとも部分的に抑制される物質である限りいかなる生理活性物質も用いることができる。ここで、生理活性物質とは生物に対して生理作用や薬理作用を発揮する物質や化合物をいい、生体物質も合成化合物も含む。また、本発明においては、蛍光色素等と生体の細胞内の物質と結合し得る化合物との複合体であって、生体内でシグナルを発生し、生体内の物質等の検出に用い得る化合物も生体内の物質と反応する観点から生理活性物質と呼ぶ。
【００２５】
光分解性保護基で保護可能な官能基としては、カルボン酸、リン酸、スルホン酸、アミド、第一級若しくは第二級アミン、アルコール、フェノール、チオール、ケトン並びにアルデヒドが挙げられ、これらの官能基を有している生理活性物質を本発明のケージド化合物の生理活性物質として利用することができる。
【００２６】
例えば、生理活性物質として、サイトカイン（各種インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、成長因子など）、抗体等のタンパク質やペプチド；グルタミン酸、システイン等のアミノ酸；DNA、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスRNA等の核酸；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ラクトースなどの糖、オリゴ糖、多糖；アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の脂肪酸；脂質；ATP、ADP、cAMP、GTP、GDP、GTP-γ-A、GDP-β-S、cGMP、8-ブロモcAMP、8-クロロcAMP、8-ブロモcGMP、8-クロロcGMP、8-パラ-クロロフェニルチオcAMP、8-パラ-クロロフェニルチオcGMPなどのヌクレオチド；リン酸、リン酸エステルなどのリン酸；EDTA、EGTAなどのキレート剤；ニグリシンなどのイオノフォア；cADPリボース、8-アミノ-cADP-リボース、8-ブロモ-cADP-リボースなどのヌクレオシド；イノシトール等のシクリトールやミオイノシトールリン酸、ミオイノシトール-1,4,5-三リン酸、ミオイノシトール-1,3,4,5-テトラキスリン酸、ミオイノシトール-3,4,5,6-テトラキスリン酸などのイノシトールリン酸；フルオレセインなどの蛍光色素、ローダミン、蛍光タンパク質等の蛍光物質若しくはそれと細胞内に存在する物質と結合する化合物との複合体；低分子化合物等が挙げられる。また、生理活性物質をその機能で分類した場合、インスリン、グルカゴン、甲状腺刺激ホルモン、エピネフリン、エストロゲン、プロゲステロン等の各種ホルモン；各種酵素阻害剤；ジアシルグリセロールなどの脂質性シグナル分子；ペニシリン等の抗生物質；グルタミン酸、アスパラギン酸、カルバミルコリン、ドーパミン、エピネフリン、GABA、グリシン、ハロペリドール、イソプロテレノール、カイニン酸、MMDA、NMDA受容アンタゴニストMK-801、ノルエピネフリン、フェニレフリン、プロプラノロール、セロトニンなどの神経伝達物質等が挙げられる。また、高分子化合物又は低分子化合物からなる各種医薬も生理活性物質として用いることができる。例えば、各種抗癌剤等が挙げられ、抗癌剤としてパクリタキセル（タキソール）、ドセキテキセル（タキソテール）などの微小管脱重合阻害薬；ドキソルビシン、マイトマイシンC、プレオマイシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなどの微小管重合阻害薬；イリノテカン、ノギテカンなどのトポイソメラーゼ阻害薬；アザチオプリン、ペントスタチン等のプリン代謝阻害薬；ヒドロキシウレア等のリボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；フルシトシン等のピリミジン代謝阻害薬；スルファジアジン、スルファメトキサゾール、メソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン等の葉酸代謝拮抗剤；シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、デモゾロマイド、ベンダムスチン等のアルキル化薬等が挙げられる。
【００２７】
これらの生理活性物質は、カルボン酸、リン酸、スルホン酸、アミド、第一級若しくは第二級アミン、アルコール、フェノール、チオール、ケトン並びにアルデヒド等の官能基を利用して光分解性保護基と結合させることができる。例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等は、カルボン酸、アミド、アミン、アルコール、チオール等の官能基を有しており、DNAやRNA等の核酸はアミド、アミン、リン酸等の官能基を有しており、これらの官能基を利用して光分解性保護基と結合させ、光分解性保護基により保護すればよい。
【００２８】
Ｑで表される光分解性保護基としては、特定の波長の光を照射することにより分解され、ケージド化合物Ｑ−Ｘから脱離し、かつ酵素の基質となり得る化合物Ｋと結合し、光感受性がロックされる光分解性保護基が挙げられる。このような基として、（6-ブロモ-7-ヒドロキシクマリン-4-イル）メチル基（Bhc基）が挙げられる。Bhc基は図１に示す構造を有し、Ｘで表される基の部分に生理活性物質Ｘを結合させればよい。また、図２に示す構造を有する（6-ブロモ-7-ヒドロキシクマリン-4-イル）メトキシカルボニル基（Bhcmoc基）を用いてもよい。さらに、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド等の核酸関連物質は、Bhcのジアゾメタン誘導体である6-ブロモ-4-ジアゾメチル-7-ヒドロキシクマリン（Bhc-diazo）を用いればよい。
【００２９】
Bhc基は、pH７で７位のフェノール性ヒドロキシ基がイオン化されるので、中性付近の細胞内等の生理的な環境下では、370nmに吸収極大を有する（J Synth. Org. Chem. Jpn., 2012, 69, 1164など）。一方、この位置をアルキル化したBhc基誘導体は、水溶液のpHに関わらず、330 nm近辺に吸収極大がシフトする（Org. Lett. 2007, 9, 4717）。よって、７位に酵素の基質となり得る化合物Ｋを結合させたケージド化合物の吸収極大は370nmよりも短波長側にシフトし、たとえば405nmのような可視光では光活性化できないのに対して、酵素を発現する細胞内で基質となり得る化合物Ｋが脱離され、Bhc基に変換されると、405nmの光で光分解性保護基を光活性化し、光分解性保護基を生理活性物質から脱離させることができる(図７）。
【００３０】
また、キサンテン（Xanthene）型の光分解性保護基又はレゾルフィン（Resorufin）型の光分解性保護基を用いることもできる。図３にガラクトースと結合させたキサンテン型の光分解性保護基及びガラクトースと結合させたレゾルフィン型の光分解性保護基を示す。図３には光分解性保護基と対応するケージド化合物の構造を示す。例えば、キサンテン型の光分解性保護基とＸのケージド化合物として、キサンテニル-CH2-Ｘが挙げられる。キサンテン型の光分解性保護基又はレゾルフィン型の光分解性保護基は、Bhc基よりも長波長の光で光活性化され、光分解される。例えば、キサンテン型の光分解性保護基の吸収極大は、516nmにある。
【００３１】
Ｋで表される酵素の基質となり得る化合物は、細胞内の内在性の酵素又は外来的に導入した酵素の基質となり得る化合物である。酵素の基質となり得る化合物Ｋと酵素の組合せとして、例えば、ガラクトースとβ-ガラクトシダーゼ、グルコースとグルコシダーゼ、グルクロン酸とグルクロニダーゼ、リン酸とアルカリフォスファターゼ等の組合せが挙げられる。
【００３２】
ガラクトースは光分解性保護基Ｑと結合し、β-ガラクトシドを形成し、β-ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシドを加水分解し、ガラクトースがＱ−Ｘから脱離する。グルコースは光分解性保護基Ｑとグリコシド結合により結合し、グルコシダーセはグリコシド結合を加水分解し、グルコースがＱ−Ｘから脱離する。グルクロン酸は光分解性保護基Ｑとグルクロニド結合により結合し、グルクロニダーゼはグルクロニド結合を加水分解し、グルクロン酸がＱ−Ｘから脱離する。リン酸は光分解性保護基Ｑとリン酸エステル結合により結合し、アルカリフォスファターゼはリン酸エステル結合を加水分解し、リン酸がＱ−Ｘから脱離する。図４に光分解性保護基と生理活性物質の結合体Ｑ−Ｘにガラクトース、グルコース、グルクロン酸又はリン酸が結合した本発明のケージド化合物の構造、及び該ケージド化合物から酵素による酵素の基質となり得る化合物ＫのＱ−Ｘからの脱離反応を示す。
【００３３】
また、酵素の基質となり得る化合物として、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと該特定のアミノ酸配列を認識してその部分でタンパク質又はペプチドを切断する基質特異性の高いプロテアーゼを組合せて用いることもできる。例えば、トリプシンは塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する。光分解性保護基にタンパク質又はペプチドを結合させ、その際に光分解性保護基との結合部分にプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列が存在するようにすればよい。プロテアーゼにより光分解性保護基に結合したタンパク質又はペプチドを脱離させればよい。
【００３４】
以上の組合せの中から、例えば、酵素の基質となり得る化合物Ｋがガラクトース(Gal)であり、光分解性保護基ＱがBhc基であるGal-Bhc-Xで表される化合物を本発明のケージド化合物として利用することができる。図５にGal-Bhc-Xの構造、酵素反応及び光反応を示す。図５に示すように、Gal-Bhc-Ｘ、即ち第１の鍵であるGalが結合した状態では、405nmの光を照射しても光分解性保護基は光反応しない。しかし、β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）を作用させると酵素反応により、Gal-Bhc-ＸからGalが脱離し、Bhc-Ｘで表される化合物が生成する。この化合物に405nmの光を照射すると光分解性保護基が光反応によりＸからはずれ、生理活性物質Ｘが活性を発現する。
【００３５】
また、図６にＫ−Ｑ−Ｘで表される本発明のケージド化合物の例を示す。図６Aは、生理活性物質としてfluoresceinを用いたGal-Bhcmoc-fluoresceinの構造を示す。図６Bは生理活性物質としてジアシルグリセロール（DiC8）を用いたGal-Bhcmoc-DiC8の構造を示す。また、図６Cは生理活性物質として抗癌剤であるパクリタキセル（PTX)を用いたGal-Bhcmoc-PTXの構造を示す。図６Dは生理活性物質としてcAMPを用いたAcGal-Bhc-cAMPの構造を示す。
【００３６】
酵素の基質となり得る化合物は、光分解性保護基であるBhc基、キサンテン型の光分解性保護基又はレゾルフィン型の光分解性保護基のフェノール性のOH基に結合させればよい。
【００３７】
本発明の化合物Ｋ−Ｑ−Ｘから、細胞内でＫを脱離させるには、細胞内でＫを基質として切断し得る酵素を作用させればよい。酵素は細胞が本来有している内在性の酵素を用いてもよいし、細胞が本来有していない外来性の酵素を用いてもよい。
【００３８】
本発明において、細胞は培養細胞も生体内の細胞も含む。培養細胞や単離した生体内の細胞にin vitroで本発明のケージド化合物を適用することもできるし、生体個体内の細胞にin vivoで本発明のケージド化合物を適用することもできる。細胞は、細菌、酵母等の微生物、植物、昆虫、鳥、非ヒト動物、ヒトのあらゆる組織、器官の細胞を含む。
【００３９】
外来性の酵素の細胞内への導入は、例えば、その酵素タンパク質をコードするDNAを細胞に導入して、細胞内で発現させることにより行うことができる。細胞内への遺伝子の導入は公知の方法で行うことができるが、例えば、ベクターやプラスミドに酵素タンパク質をコードするDNAを挿入し、該ベクターやプラスミドを用いて細胞を形質転換させればよい。ベクターとしては、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用い、DNAを挿入したウイルスを標的細胞に感染させればよい。また、ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム(internal liposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム(electrostatic type liposome)による遺伝子導入法、HVJ-リポソーム法、改良型HVJ-リポソーム法(HVJ-AVEリポソーム法)、HVJ-E(エンベロープ)ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体(金属粒子)とともにDNA分子を細胞に移入する方法、naked-DNAの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、DNAを挿入したベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
【００４０】
この際、本発明のケージド化合物を導入し、生理活性物質Ｘを作用させようとする細胞が特定の細胞である場合、酵素を該特定の細胞にのみ導入する。このためには、公知の化合物デリバリーシステムを用いることができる。例えば、酵素をコードするDNAを導入したベクターの表面に特定の細胞の表面に発現しているタンパク質や糖に特異的に結合する化合物を結合させればよい。例えば、細胞表面に発現しているタンパク質や糖に対する抗体が用いることができ、標的細胞が癌細胞の場合は、癌特異的抗原に対する抗体等を用いることができる。このようにして作製したベクターは、特定の細胞を標的として、集積し結合し、細胞に取り込まれ、細胞内で酵素が発現する。また、細胞に結合して細胞の周囲で酵素を発現させることもできる。例えば、癌細胞はインテグリンを高発現しており、ベクターの表面にRGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）ペプチドを結合させることにより癌細胞を標的とすることが可能である。このように、本願のケージド化合物を標的としてＫを切断する酵素を細胞種特異的に導入することにより、標的細胞中のみにおいて、光活性化することが可能であり、特定の標的細胞内でのみ、生理活性作用物質の生理活性を発現させることができる。
【００４１】
２．本発明のケージド化合物の作製
本発明のケージド化合物Ｋ−Ｑ−Ｘは、光分解性保護基と生理活性物質を結合させ、化合物Ｑ−Ｘを作製し、該化合物に酵素の基質となり得る化合物を結合させて作製することができる。また、光分解性保護基に酵素の基質となり得る化合物を結合させて、化合物Ｋ−Ｑを作製し、該化合物に生理活性物質を結合させてもよい。
【００４２】
生理活性物質と光分解性保護基の結合、すなわち生理活性物質の光分解性保護基による保護は、公知の文献に記載の方法により行うことができる。なお、生理活性物質の光分解性保護基による保護は、保護することにより生理活性物質の生理活性が失われるか、抑制される官能基に対して行えばよい。
【００４３】
例えば、以下の示す文献の記載に基づいて、光分解性保護基と各種生理活性物質の複合体を合成することができる。
1. T. Furuta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1193-1200 (1999)
2. H. Ando et al., Nature Genetics, 28, 317-325 (2001).
3. A. Z. Suzuki et al., Org. Lett., 5, 4867-4870 (2003).
4. T. Nishigaki et al., Dev. Biol. 272, 376-388 (2004).
5. T. Furuta et al., ChemBioChem, 5, 1119-1128 (2004).
6. H. Ando et al., Methods in Cell Biology, 77, 159-171 (2004).
7. C. D. Wood et al., J Cell Biol. 169, 725-731 (2005)
8. H. Ando et al., Dev Biol; 287, 456-468 (2005)
9. T. Furuta et al., Org. Lett. 9, 4717-4720 (2007)
10. T. Kawakami et al., ChemBioChem, 9, 1583-1586 (2008)
11. K. Katayama et al., Chem Commun, 5399-5401 (2008).
12. E. J. Quann et al., Nature Immun. 10, 627-635 (2009).
13. S. Yamaguchi et al., Chem. Commun. 46, 2244-2246, (2010)
14. S. Mizukami et al., J. Am. Chem. Soc. 132, 9524-9525 (2010)
15. W. Nomura et al., ChemBioChem, 12, 535-539 (2011)
16. T. Furuta, Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan, 69, 1164-1169 (2012)
17. T. Furuta et al., Org. Lett. 14, 6182-6185 (2012).
18. T. Furuta et al., Trends Anal. Chem. 23, 501-509 (2004).
19. T. Furuta et al., Chapter 1.2: Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers, in “Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules,” M. Goeldner and R. S. Givens Eds, WILEY-VCH, pp 29-55 (2005)
20. WO00/31588号公報
21. WO2006/093083号公報
22. US2002/0155606号公報
23. 特開2002-315576号公報
【００４４】
この中で、15には、Bhc-各種生理活性物質の合成方法が記載され、10には、Bhc-ペプチドの合成方法が記載され、2、9、17、18及び21にはBhc-核酸の合成方法が記載され、5には、Bhc-ヌクレオシドの合成方法が記載され、1にはBhc-グルタミン酸の合成方法が記載され、3にはBhc-OH基を有する化合物の合成方法が記載されている。
【００４５】
これらの記載に基づいて、各種生理活性物質をBhc基、Bhcmoc基と生理活性物質を結合させ、Ｑ−Ｘで表されるケージド化合物を合成することができる。また、同様にキサンテン型の光分解性保護基又はレゾルフィン型の光分解性保護基と生理活性物質を結合させ、Ｑ−Ｘで表されるケージド化合物を合成することができる。
【００４６】
キサンテン型の光分解性保護基の合成
【化４】
2014193848.tif 000005
10 mLナスフラスコにクロロ酢酸を1.9095 g (20.2 mmol)、塩化チオニルを1.5 mL (21.21 mmol)入れ、DMFを一滴加えた。コンデンサーと塩化カルシウム管を取り付け、90℃で加熱しながら3時間撹拌した。反応溶液を室温に戻し、溶媒を減圧除去した。
【００４７】
1H NMR (DMSO-d6) δ 4.27 (s, 2H)
【化５】
2014193848.tif 000006
20 mLナスフラスコに塩化アルミニウムを2.0039 g (1.4 mmol)入れ、ニトロベンゼンを2.5 mL, chloroacetyl chlorideを0.08 mL (2 mmol)加えた。0℃で撹拌しながら、レゾルシノールを0.055 g (0.5 mmol)加えた。反応溶液を室温に戻し、18時間撹拌した。クロロホルムで分液し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、溶媒を減圧除去した。得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン / 酢酸エチル= 4/1）で精製して、目的物である2-chloro-1-(2,4-dihydroxyphenyl)ethanoneを0.51 g (2.73 mmol, 52％ yield) 得た。
【００４８】
1H NMR (DMSO-d6) δ 5.01 (s, 2H), 6.33 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.39 (dd, 1H, J = 2.4＆ 8.7 Hz), 7.73 (d, 1H, J = 8.7 Hz)
【化６】
2014193848.tif 000007
30 mLナスフラスコにコンデンサーと塩化カルシウム管を取り付け、2-chloro-1- (2,4-dihydroxyphenyl)ethanoneを0.119 g (0.64 mmol)入れ、レゾルシノールを0.07 g (0.67 mmol)、メタンスルホン酸を0.5 mL加えた。90℃で1時間撹拌した後、反応溶液を室温に戻し、水を加えて生成した沈殿を吸引濾過で回収した。沈殿物を真空下で乾燥させ、目的物9-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)chloromethylを0.11 g (0.41 mmol, 64％ yield)
得た。
【００４９】
1H NMR (DMSO-d6) δ 6.53 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.58 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.61 (s, 2H), 6.65 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.68(d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.51(d, 1H, J = 9 Hz), 8.23 (d, 1H, J = 9 Hz)13C NMR (DMSO-d6) δ 102.47, 102.70, 105.73, 110.62, 111.13, 112.42, 112.74, 124.96, 125.82, 128.68, 150.81, 152.65, 158.82, 159.05
【００５０】
酵素の基質となり得る化合物であるＫは、光分解性保護基であるBhc基、キサンテン型の光分解性保護基又はレゾルフィン型の光分解性保護基のフェノール性のOH基に、Ｋの官能基を解して結合させればよい。Ｋの光分解性保護基への結合は公知の方法で行うことができる。
【００５１】
本発明は、Ｋ−Ｑ−Ｘで表されるケージド化合物を合成するための前駆体化合物であるＫ−Ｑ又はＱ−Ｘで表される化合物も包含する。例えば、光分解性保護基であるＱと酵素の基質となり得る化合物であるＫを結合させたＫ−Ｑで表される化合物であって、ＱにＸと結合させるための基を付けた、ケージド化合物を合成するための前駆体化合物がある。該前駆体化合物として、DNA、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、アンチセンスRNA等の核酸やATP、ADP、cAMP、GTP、GDP、GTP-γ-A、GDP-β-S、cGMP、8-ブロモcAMP、8-クロロcAMP、8-ブロモcGMP、8-クロロcGMP、8-パラ-クロロフェニルチオcAMP、8-パラ-クロロフェニルチオcGMPなどのヌクレオチドを結合させるためにＱにジアゾ基（-N=N+-)を結合させた前駆体化合物が挙げられる。具体的には、6-ブロモ-4-ジアゾメチル-7-ヒドロキシクマリンにＫを結合させた前駆体化合物、Gal-Bhc-diazo、AcGal-Bhc-diazo等が挙げられる。該前駆体化合物には、核酸等のリン酸基とジアゾ基の反応により核酸等であるＸを結合させることによりＫ−Ｑ−Ｘで表されるケージド化合物に変換させることができる。
【００５２】
３．本発明のケージド化合物の利用
本発明のＫ−Ｑ−Ｘで表されるケージド化合物は、以下のようにして用いる。
【００５３】
（１）本発明のケージド化合物を導入してケージド化合物が含む生理活性物質を作用させようとする標的細胞において発現している酵素を決定する。この際、標的細胞に特異的に発現している酵素を選択するのが好ましい。
この際外来性の酵素を用いる場合。標的細胞に上記の方法で酵素を導入する。
【００５４】
（２）本発明のケージド化合物Ｋ−Ｑ−Ｘの基質Ｋとして、選択した酵素の基質を選択する。また、標的細胞で生理活性を発現させようとする生理活性物質を選択する。光分解性保護基としては、上記のものを用いればよい。
【００５５】
（３）Ｋ−Ｑ−Ｘを合成する。
【００５６】
（４）Ｋ−Ｑ−Ｘを標的細胞に導入する。Ｋ−Ｑ−Ｘの標的細胞への導入には、例えば、公知の薬剤デリバリーシステムを用いて標的細胞に導入することができる。例えば、リポソーム等の微小カプセルにＫ−Ｑ−Ｘを内包し、微小カプセルに標的細胞表面に結合する物質を結合させることによりＫ−Ｑ−Ｘを標的細胞に導入することができる。
【００５７】
（５）Ｋ−Ｑ−Ｘが標的細胞に導入されると、標的細胞内の内在性の酵素又は形質転換により導入し細胞内で発現した酵素により酵素基質となり得る化合物Ｋが切断され、光分解性保護基で保護された生理活性物質Ｑ−Ｘとなる。次いで、細胞に特定波長の光を照射することにより光分解性保護基が光活性化され、ＫからＱが脱離する。
【００５８】
光分解性保護基の光活性化にはＱ−Ｘで表される化合物に特定の波長の励起光を照射すればよい。励起光の波長は細胞の内在性の分子に吸収されない波長とすることが必要であり、300nm以上の波長（λmax）とすることが望ましい。光分解性保護基がBhc基、Bhcmoc基の場合は、400〜450nmの範囲の波長の光、好ましくは405±10nm程度の波長の光を照射すればよい。また、光分解性保護基がキサンテン（Xanthene）型の光分解性保護基又はレゾルフィン（Resorufin）型の光分解性保護基の場合は、450〜600nmの範囲の波長の光を照射すればよい。照射時間は、0.1〜5.0秒間、好ましくは0.5〜2.0秒間、さらに好ましくは0.5〜1.0秒間程度がよい。光照射は本発明のケージド化合物を導入した細胞に対して行えばよく、生体内の細胞に対しては、生体外から光を照射させることができる。また、カテーテルの先端に光照射手段を設置し、生体内の標的細胞が存在する箇所に光照射手段を血管等を経由し到達させ、光を照射してもよい。
【００５９】
（６）この結果、Ｋが細胞内で生理活性を発現する。
【実施例】
【００６０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
実施例１  Bhcmoc-propargylとGal-Bhcmoc-propargylの光反応性の検討
１．Gal-Bhcmoc-propargylの合成
6-ブロモ-7-ヒドロキシ-4-ヒドロキシメチルクマリン-（BhcCH2-OH)より、Bhcmoc-propargyl(下記化学式の一番右の式で表される化合物）を合成した。光照射後に生成するプロパルギルアミンは、アミノ基を持つ生理活性分子のモデル化合物である。
【化７】
2014193848.tif 000008
【００６２】
合成方法は以下のとおりであった。
【化８】
2014193848.tif 000009
50 mLナスフラスコにBhc-CH2OHを1.3546 g (5.00 mmol)、脱水ジクロロメタンを15 mL、iPr2NEtを1.2 mL (6.9 mmol)、MOM-Clを494 mL (6.05 mmol)加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。0.5 Mクエン酸水溶液とクロロホルムで分液し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去した後、ヘキサン/クロロホルム = 1/1の溶液を加えて懸濁し、沈殿を吸引濾過で回収した。沈殿物を真空下で乾燥し、目的物6-bromo-7-methoxymethoxy-4-hydroxymethylcoumarinを1.2433 g (3.95 mmol, 79％ yield) 得た。
【００６３】
1H NMR (CDCl3) δ・3.52 (3H, s), 4.86 (2H, dd, J = 6 & 1.5 Hz), 5.31 (2H, s), 6.52 (1H, t, J = 1.5 Hz), 7.16 (1H, s), 7.70 (1H, s)
【化９】
2014193848.tif 000010
10 mLナスフラスコに6-bromo-7-methoxymethoxy-4-hydroxymethylcoumarinを315.4 mg (1.00 mmol)、脱水ジクロロメタンを2 mL加えて、塩化カルシウム管を取り付け、0℃で撹拌した。そこにCDIを196.2 mg (1.21 mmol)加えたところ、溶液が濁っていてスピナーが回転していなかったので、脱水ジクロロメタンを更に2 mL加えて、室温で1.5時間撹拌した。TLC (展開溶媒: ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)で反応の進行を確認したところ、原料が残っているようだったのでCDIを24.7 mg (0.152 mmol)加え、更に1時間反応させた。DMAPを160.5 mg (1.31 mmol)、プロパルギルアミンを85.6μL (1.35 mmol)加え、1.5時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、ジクロロメタンを加えて懸濁し、沈殿を吸引濾取した。沈殿物を真空下で乾燥し、目的物(6-bromo-7-methoxymethoxycoumarin-4-yl)methoxycarbonyl propargylamideを218.9 mg (0.552 mmol, 55％ yield)得た。
【００６４】
1H NMR (DMSO-d6) δ・3.15 (1H, t, J = 2.1 Hz), 3.42 (3H, s), 3.84 (2H, dd, J = 2.1 & 5.4 Hz), 5.32 (2H, s), 5.43 (2H, s), 6.28 (1H, s), 7.28 (1H, s), 7.98 (1H, s), 8.03 (1H, t, J = 5.4 Hz)
【化１０】
2014193848.tif 000011
10 mLナスフラスコに(6-bromo-7-methoxymethoxycoumarin-4-yl)methoxycarbonyl propargylamideを99.9 mg (0.252 mmol)、HCl/メタノールを2 mL (HCl：2.5 mmol)加え、室温で24時間撹拌した。TLC (展開溶媒: ジクロロメタン/メタノール = 20/1)で反応の進行を確認したところ、原料が残っているようだったので、HCl/メタノールを0.5 mL (HCl：0.6 mmol)加え、更に3時間反応させた。溶媒を減圧除去して、真空下で乾燥し、目的物(6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methoxycarbonylpropargylamide (Bhcmoc- propargyl)を88.5 mg (0.251 mmol, 100％ yield)得た。
【００６５】
1H NMR (DMSO-d6) δ・3.15 (1H, t, J = 2.1 Hz), 3.84 (2H, dd, J = 5.7 & 2.1 Hz), 5.30 (2H, s), 6.18 (1H, s), 6.92 (1H, s), 7.88 (1H, s), 8.02 (1H, t, J = 5.7 Hz)
【００６６】
さらに、Bhcmoc-propargylより以下の反応式によりガラクトシル基を結合させ、Gal-Bhcmoc-propargylを合成した。
【化１１】
2014193848.tif 000012
20 mLナスフラスコにBhcmoc- propargylを69.9 mg (0.199 mmol)、2,3,4,6-tetra-O- acetyl-α-D-galactopyranosyl bromideを92.0 mg (0.224 mmol)、Bu4NHSO4を81.8 mg (0.241 mmol)、ジクロロメタンを4 mL、1 M NaOHを600μL (0.600 mmol)加え、室温で4時間撹拌した。分液して有機層を別のフラスコに回収してから、溶媒を減圧除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒: ジクロロメタン/メタノール = 100/1)で精製し、目的物AcGal-Bhcmoc-propargylを64.0 mg (93.7μmol, 47％ yield)得た。
【００６７】
1H NMR (CDCl3) δ・2.03 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.21 (3H, s), 2.31 (1H, t, J = 2.1 Hz), 4.04 (2H, dd, J = 2.1 & 5.4 Hz), 4.19-4.25 (3H, m), 5.13-5.19 (2H, m), 5.26 (1H, d, J = 4.5 Hz), 5.50 (2H, d, J = 3.3 Hz), 5.60-5.66 (1H, m), 6.41 (1H, s), 7.19 (1H, s), 7.70 (1H, s)
【化１２】
2014193848.tif 000013
20 mLナスフラスコにAc-GalBhcmoc-propargylを50.0 mg (73.3μmol)、TEAを14.6μL (0.105 mmol)、メタノールを5 mL加え、65℃で14時間撹拌した。TLC (ジクロロメタン/メタノール = 10/1)で反応の進行を確認したところ、原料は消失していたが、Ac基が全て外れていないものが残っているようだったので、TEAを4.86μL (34.9 μmol)加え、更に65℃で1時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、クロロホルムで洗浄後、生成物を吸引濾取した。真空下で乾燥し、目的物Gal-Bhcmoc-propargylを14.7 mg (28.6μmol, 39％ yield)得た。
【００６８】
1H NMR (DMSO-d6) δ・3.16 (1H, s), 3.41-3.56 (3H, m), 3.63-3.72 (3H, m), 3.84 (2H, d, J = 3.0 Hz), 5.15 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.34 (2H, s), 6.63 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.97 (1H, s), 8.05 (1H, t, J = 6.0 Hz)
13C NMR (DMSO-d6) δ 29.84, 48.48, 60.19, 61.08, 67.93, 69.84, 73.26, 75.71, 80.94, 100.48, 103.57, 107.14, 109.60, 112.01, 128.23, 150.69, 153.56, 155.03, 155.98, 159.48
【００６９】
２．Bhcmoc-propargylとGal-Bhcmoc-propargylの光反応性の検討
Gal-Bhcmoc-propargylの10-5 M KMOPS溶液 (0.1% DMSO, pH 7.3)を作成し、HPLCで分析した。その結果、325 nm又は350 nmで検出されるピークが一つだったので、光分解実験に使用しても問題ないと判断した。
【００７０】
（１）UVスペクトル
Gal-Bhcmoc-propargylの10-5 M KMOPS溶液(0.1％ DMSO, pH 7.3)と、Bhcmoc-propargylの10-5 M KMOPS溶液(0.1％ DMSO, pH 7.3)を用いて、UVスペクトルを測定した。
UVスペクトルを図７に示し、表１に吸収波長を示す。
【表１】
2014193848.tif 000014
【００７１】
（２）光分解
Gal-Bhcmoc-propargyl又はBhcmoc-propargylの10-5 M KMOPS溶液(0.1％ DMSO, pH 7.3)に、405 nmの光を照射し、光照射時間の増加に伴う反応の進行をC18逆相HPLCでモニターした。HPLCの条件は表２に示した。
【表２】
2014193848.tif 000015
【００７２】
保持時間(RT) 9.5 min付近にGal-Bhcmoc-propargylのピークが見られた。光照射時間を0秒、5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、60秒、及び300秒と増加させても、Gal-Bhcmoc-propargylは減少しなかった。
【００７３】
保持時間(RT) 6.0 min付近にBhcmoc-propargylのピーク、4.4 min付近に光分解産物(Bhc-OHと思われる)のピークが見られた。光照射時間を0秒、5秒、10秒、15秒、20秒、30秒と増加させると、Bhcmoc-propargylが減少し、光分解産物が増加していることが確認できた。
【００７４】
光分解によるBhcmoc-propargylとGal-Bhcmoc-propargylの減少をグラフに示した(図８）。405 nm光照射でGal-Bhcmoc-propargylは光分解せず、Bhcmoc-propargylは光分解することが分かった。
【００７５】
３．β-Gal存在下でGal-Bhcmoc-propargylがBhcmoc-propargylに変換されることの確認
Gal-Bhcmoc-propargyl（終濃度15 μM）、メルカプトエタノール（0.11 M）、及び塩化マグネシウム（1 mM）を含む0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.3）に、終濃度0.25 ng/μLになるようにβ-Galを加えた。反応溶液を37℃に保ちながら、反応の進行をHPLCで追跡すると（分析条件は表２参照）、1時間後にはすべてのGal-Bhcmoc-propargylがBhcmoc-propargylに変換されることを確認した。
【００７６】
本実施例の結果より、405 nm光を照射すると、β-Gal非存在下では光分解せず、β-Gal存在下では光分解することがわかった。
【００７７】
本実施例は、（1）Gal-Bhc基を合成できること、（2）その吸収極大は330 nm近辺にあること（図７参照）、（3）合成したGal-Bhc基は、pH 7の水溶液中でβ-Galの基質になり、定量的にBhc基に変換されること、（4）Gal-Bhcケージド化合物に405 nm光を照射しても全く反応しないこと、及び、（5）β-Galと反応後のBhcケージド化合物は，405 nm光照射により高効率でケージ解除できることを示す。
【００７８】
実施例２  AcGalを導入したケージドフルオレセインの合成
（１）dipropargyl fluoresceinの合成
下記反応式で合成した。
【化１３】
2014193848.tif 000016
100 mLナスフラスコにfluoresceinを3.32 g (9.99 mmol)、K2CO3を3.87 g (27.6 mmol)、propargyl bromideを3.5 mL (39.3 mmol)、脱水DMFを20 mL加え、アルゴン雰囲気下、65℃で4時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、H2Oで懸濁し、沈殿を吸引濾取した。NMRで確認したところ、目的物以外のピークが少し見られたので、次の反応で精製を試みることとした。得られたサンプルは4.12 g(10.1 mmol, quant)であった。
【００７９】
1H NMR (CDCl3) δ 2.33 (1H, t, J = 2.4 Hz), 2.61 (1H, t, J = 2.4 Hz), 4.60 (2H, dd, J = 4.2 & 2.7 Hz), 4.80 (2H, d, J = 2.4 Hz), 6.46 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.55 (1H, dd, J = 10.2 & 2.0 Hz), 6.78-6.92 (3H, m), 7.06 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.33 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.66-7.99 (2H, m), 8.28 (1H, d, J = 7.5 Hz)
【００８０】
（２）propargyl fluoresceinの合成
下記反応式で合成した。
【化１４】
2014193848.tif 000017
50 mLナスフラスコにdipropargyl fluoresceinを0.818 g (2.00 mmol)、LiOH・H2Oを0.545 g (13.0 mmol)、H2Oを6.7 mL、THFを6.8 mL加え、室温で6時間撹拌した。原料が消失していなかったので、LiOH・H2Oを41.4 mg (0.987 mmol)加え、更に17時間撹拌した。THFのみを減圧除去した後、HClを加えて反応をクエンチし、クロロホルムを加えて分液した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：CH2Cl2/MeOH=40/1)で精製し、目的物を155.9 mg (0.421 mmol, 21.0％ yield) 得た。
【００８１】
1H NMR (CDCl3) δ 2.56 (1H, t, J = 2.3 Hz), 4.72 (2H, d, J = 2.4 Hz), 5.30 (1H, s), 6.53 (1H, dd, J = 8.7 and 2.3 Hz), 6.64-6.75 (3H, m), 6.87 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.16 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.59-7.70 (2H, m), 8.02 (1H, d, J = 7.2 Hz)
【００８２】
（３）MOMBhcmoc-propargyl fluoresceinの合成
下記反応式で合成した。
【化１５】
2014193848.tif 000018
50 mLナスフラスコにpropargyl fluoresceinを106.1 mg (0.287 mmol)、MOMBhcmoc-Clを203.6 mg (0.539 mmol)、DMAPを78.1 mg (0.639 mmol)、脱水CH2Cl2を10 mL加え、アルゴン雰囲気下、室温で22.5時間撹拌した。HClを加えて反応をクエンチし、クロロホルムを加えて分液した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：CH2Cl2/MeOH=150/1)で精製を試みた。得られたサンプルは185.9 mg(0.261 mmol, 90.9％ yield)であった。得られたサンプルについてMOMの脱保護を行った。
【００８３】
1H NMR (CDCl3) δ 2.60 (1H, t, J = 1.8 Hz), 3.52 (3H, s), 4.73 (2H, d, J = 1.8 Hz), 5.32 (2H, s), 6.45 (2H, d, J=15.9 Hz), 6.70-6.75 (2H, m), 6.83-6.95 (3H, m), 7.14-7.21 (3H, m), 7.62-7.72 (4H, m), 8.03 (1H, d, J = 7.2 Hz)
【００８４】
（４）Bhcmoc-propargyl fluoresceinの合成
下記反応式で合成した。
【化１６】
2014193848.tif 000019
脱保護の条件を検討するため、まずは少量で行なうことにした。
10 mLナスフラスコにMOMBhcmoc-propargyl fluoresceinを53.8 mg (0.0756 mmol)、脱水CH2Cl2を3 mL、TFAを1 mL加え、室温で2.5時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、NMRで確認した（※）。脱保護を確認し、残りのMOMBhcmoc-propargyl fluoresceinも同様に脱保護反応を行った。
【００８５】
30 mLナスフラスコにMOMBhcmoc-propargyl fluoresceinを132.1 mg (0.186 mmol)、脱水CH2Cl2を3 mL、TFAを1 mL加え、室温で2時間撹拌した。NMRで確認したところ、上記の※のものとほぼ同じだったので、一緒に精製することにした。得られた生成物をCH2Cl2で濾過し、濾液をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：CH2Cl2/MeOH=80/1)で精製して、目的物を89.8 mg (0.135 mmol, 51.6% yield)得た。
【００８６】
1H NMR (CDCl3) δ 2.57 (1H, t, J = 2.1 Hz), 4.72 (2H, d, J = 2.1 Hz), 5.38 (2H, s), 6.44 (1H, s), 6.71 (2H, s), 6.82-6.94 (5H, m), 7.02 (1H, s), 7.14-7.20 (2H, m), 7.62-7.72 (3H, m), 8.04 (1H, d, J = 7.5 Hz)
【００８７】
（５）AcGal-Bhcmoc-propargyl fluoresceinの合成
下記反応式で合成した。
【化１７】
2014193848.tif 000020
10 mLナスフラスコにBhcmoc-propargyl fluoresceinを49.8 mg (0.0746 mmol)、Acetobromo-α-D-galactoseを33.6 mg (0.0817 mmol)、Bu4NHSO4を30.9 mg (0.0910 mmol)、CH2Cl2を1.5 mL、1N NaOHを225μL (0.225 mmol)加え、室温で5.5時間撹拌した。有機層を回収して、溶媒を減圧除去し、得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：CH2Cl2/MeOH=50/1)で精製して、目的物を19.1 mg (0.0191 mmol, 25.6％ yield)得た。
【００８８】
1H NMR (CDCl3) δ 2.02 (3H, s), 2.06 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.58 (1H, t, J = 2.1 Hz), 4.04-4.24 (5H, m), 4.73 (1H, d, J = 2.1 Hz), 5.03-5.11 (2H, m), 5.50-5.53 (2H, m), 6.54 (1H, s), 6.70-6.76 (3H, m), 6.82-6.94 (3H, m), 7.17-7.22 (3H, m), 7.62-7.74 (3H, m), 8.04 (1H, d, J = 7.2 Hz)
【００８９】
（６）15-chloro-3,6,9-trioxapentadecyl azideの合成
下記反応式で合成した。
【化１８】
2014193848.tif 000021
30 mLナスフラスコにNaHを54.7 mg (2.28 mmol)、2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethanolを160.3 mg (0.915 mmol)、THFを3 mL加え、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。そこに1-chloro-6-iodohexaneを152μL (1.01 mmol)加え、3.5時間撹拌した。TLC上で原料がまだ残っていたので、1-chloro-6-iodohexaneを28μL (0.183 mmol)加え、更に16時間撹拌した。それでもまだ原料が残っていたので、NaHを11.2 mg (0.467 mmol)加え、5.5時間撹拌したが、TLCは変わらなかった。H2Oを加えて反応をクエンチし、溶媒を減圧除去した。フラスコにCHCl3と1M HClを加えて撹拌し、有機層を回収して、MgSO4で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒：hexane/EtOAc=6/1)で精製し、目的物を42.6 mg (0.145 mmol, 15.8％ yield)得た。
【００９０】
（７）AcGal-Bhcmoc-propargyl fluoresceinと15-chloro-3,6,9-trioxapentadecyl azide
のクリック反応
【化１９】
2014193848.tif 000022
10 mLナスフラスコにAcGal-Bhcmoc-propargyl fluoresceinを9.5 mg (0.0095 mmol)、15-chloro-3,6,9-trioxapentadecyl azideを4.9 mg (0.017 mmol)、(BimH)3を4.2 mg (0.010 mmol)、CuBrを7.3 mg (0.051 mmol)加え、アルゴン雰囲気下、室温で2.5時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、NMRを確認したところ、目的物を含んでいた。
【００９１】
実施例３  AcGal-Bhc- cAMPの合成法
（１）Bhc-CH2OTBDMSの合成
【化２０】
2014193848.tif 000023
Bhc-CH2OH (1361.7 mg, 5.0236 mmol)、tert-butyldimethylsilyl chloride (2237.0 mg, 14.842 mmol)、DMAP (2109.6 mg, 17.268 mmol)をジクロロメタン (30 mL)に溶解し、室温で30分撹拌した。0.5 Mクエン酸水溶液で反応を停止させ、有機層をジクロロメタンで2回抽出し、有機層を減圧下にて濃縮乾固させた。得られた粗精製物をDMF (14 mL)に溶解させ、水酸化リチウム一水和物 (627.3 mg, 14.950 mmol)を加え室温で30分撹拌した。0.5 Mクエン酸水溶液で反応を停止させた後、クロロホルムで3回抽出、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮乾固させた。粗生成物を、クロロホルム/ヘキサン=1/2の混合溶媒に懸濁させ、沈殿を集め真空下で乾燥させ、目的の化合物 Bhc-CH2OTBDMS ( 1612.3 mg, 4.1842 mmol, 83%)を得た。
【００９２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.60 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 0.96 (s, 6H), 0.16 (s, 9H)
【００９３】
（２）AcGal-Bhc-CH2OTBDMSの合成
【化２１】
2014193848.tif 000024
Acetobromo-α-D-galactose (1230.6 mg, 2.9927 mmol), tetrabutylammonium hydrogen sulfate (1083.9 mg, 3.1924 mmol), ジクロロメタン (30 mL)、1M水酸化ナトリウム水溶液 (8 mL)、Bhc-CH2OTBDMS (771.9 mg, 2.003 mmol)を混合し、室温で15時間激しく撹拌した。有機層をクロロホルムで抽出、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下にて濃縮させた。得られた粗精製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 溶出溶媒：ジクロロメタン/メタノール = 50/1)にて精製し、化合物4 (334.3 mg, 0.4671 mmol, 23%)及び、目的の化合物AcGal-Bhc-CH2OTBDMSとacetobromo-α-D-galactoseが混合した粗精製物 (639.4 mg)を得た。
【００９４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.63 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.63 (dd, 1H, J = 8.1 Hz, 11.0Hz), 5.49 (br, 1H), 5.14 (dd, 1H J = 3.3 Hz, 11.0Hz), 5.16 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.80 (s, 2H), 4.22 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 4.16-4.12 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.03 (s, 3H) 0.96 (s, 9H), 0.16 (s, 6H)
【００９５】
（３）AcGal-Bhc-CH2OHの合成
【化２２】
2014193848.tif 000025
THF (3.3 mL) に1M tetrabtylammonium fluoride THF溶液 (200 μL)と酢酸13.74 μLを溶解させ、よく混合させた溶液に、AcGal-Bhc-CH2OTBDMS (171.6 mg, 0.2854 mmol)を加え、室温で20分撹拌した。0.5 Mクエン酸水溶液で反応を停止させた後、減圧下でTHFのみ留去し、水層をクロロホルムで2回抽出し、減圧下で濃縮した。得られた粗精製物をクロロホルム/ヘキサン=1/2の混合溶媒に懸濁させ、沈殿を集め真空下で乾燥させ、白色粉状の目的化合物AcGal-Bhc-CH2OH (109.2 mg, 0.1816 mmol, 64%)を得た。
【００９６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.70 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.63 (dd, 1H, J = 8.1 Hz, 11.0Hz), 5.50 (br, 1H), 5.14 (dd, 1H J = 3.3 Hz, 11.0Hz), 5.15 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.86 (s, 2H), 4.23 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 4.16-4.12 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.03 (s, 3H)
【００９７】
（４）AcGal-Bhc-CHOの合成
【化２３】
2014193848.tif 000026
AcGal-Bhc-CH2OH (30.31 mg, 0.05040 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL) に溶解させ、Dess-Martin periodinane (23.37 mg, 0.05510 mmol)を加え、室温で2時間半撹拌した。Dess-Martin periodinane (4.81 mg, 0.01134 mmol)を追加し、さらに室温で1時間半撹拌した後、反応溶液をフラッシュカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 溶出溶媒：ジクロロメタン/メタノール = 60/1)で精製し、淡黄色固体の目的化合物 AcGal-Bhc-CHO (29.5 mg, 0.04922 mmol, 98%)を得た。
【００９８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.05 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.63 (dd, 1H, J = 8.1 Hz, 11.0Hz), 5.51 (br, 1H), 5.17-5.08 (m, 2H), 4.28-4.14 (m, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.03 (s, 3H)
【００９９】
（５）AcGal-Bhc-diazoの合成
【化２４】
2014193848.tif 000027
AcGal-Bhc-CHO (306.6 mg, 0.5116 mmol)とp-toluenesulfonyl hydrazide (106.61 mg, 0.5725 mmol)をアセトニトリル (9 mL)に溶解し、45℃で2時間15分撹拌した。溶媒を減圧留去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 溶出溶媒：ジクロロメタン/メタノール = 40/1~30/1)にて精製し、ジアゾ化合物1とヒドラゾンの混合物を得た。この混合物に、メタノール (10 mL)とトリエチルアミン (30.3 μL)を加え0℃で2時間撹拌した。析出した沈殿を集め、真空下で乾燥させ、淡黄色粉状の目的化合物 AcGal-Bhc-diazo (206.84 mg, 0.3128 mmol, 62%)を得た。
【０１００】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.49 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 5.80 (s, 1H), 5.64 (dd, 1H, J = 8.1 Hz, 11.0Hz), 5.50 (br, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.14 (dd, 1H J = 3.3 Hz, 11.0Hz), 5.07 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.22 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 4.16-4.12 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.03 (s, 3H)
【０１０１】
（６）AcGal-Bhc-cAMPの合成
【化２５】
2014193848.tif 000028
10 mLのナス型フラスコにAcGal-Bhc-diazo (28.4 mg, 0.0467 mmol)、cAMP (50.3 mg, 0.153 mmol)、および DMSO (1 mL) を入れてアルゴン雰囲気下、50℃で5時間撹拌した。室温まで放冷後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー (10 gのシリカゲル60, 溶出溶媒：ジクロロメタン/メタノール = 20/1) にて精製し、目的のAcGal-Bhc-cAMPを21.7 mg (0.0238 mmol, 51% yield) 得た。AcGal-Bhc-cAMPの構造式を図６Dに示す。
【０１０２】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) AcGal-Bhc基がaxial結合したものとequatorial 結合したものの異性体混合物。かっこ内はminor isomerの化学シフトを示す。 δ 8.39 (8.35) (s, 1H), 8.19 (8.13) (1H, s), 8.09 (8.04) (1H, s), 7.31 (7.33) (1H, s), 6.49 (6.60) (1H, s), 6.35 (6.41) (1H, d, J = 5 Hz), 6.09 (6.07) (1H, s), 5.64 (5.67) (1H, s), 5.51-5.25 (6H, m), 4.80-4.18 (8H, m), 2.17 (3H, s), 2.07 (2.08) (3H, s), 2.06 (2.05) (3H, s), 1.97 (3H, s).
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明のK-Q-Xで表されるケージド化合物は、２つの鍵を用いて、生理活性物質の活性をマスクしており、任意の時間に任意の標的細胞中で、２つの鍵を開くことにより、生理活性物質の活性を発現させることができ、診断、治療用途や研究用途に用いることができる。
【図１】
2014193848.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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