(57)【要約】【課題】ＲＧＤ１ペプチドの内部移行に関係する方法および組成物の提供。【解決手段】血管形成を受けている標的組織に対して、またはαｖインテグリンを発現する細胞もしくは組織に対して有用な組成物および方法が開示される。この組成物および方法は、動物において、血管形成を受けている組織に対して、またはαｖインテグリンを発現している細胞もしくは組織に対して選択的に結合し、かつホーミングするペプチド配列に基づく。この開示された標的化は、血管形成を経験している組織に対して、またはαｖインテグリンを発現する細胞もしくは組織に対して治療剤および検出可能剤を送達するために有用である。【選択図】図２４
2014028862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／０２２，１３１号の利益を主張する。２００８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／０２２，１３１号は、その全体が参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
（連邦により後援された研究に関する申告）
本発明は、ＮＩＨの国立癌研究所からの補助金第ＣＡ１０４８９８号、同第ＣＡ１１９４１４号、同第ＣＡ１１９３３５号、同第ＣＡ１２４４２７号、同第ＣＡ１１５４１０号、および同第３０１９９号ならびに国防総省からの補助金第ＢＣ０７６０５０号のもと連邦政府の後援でなされた。連邦政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は概して、分子医学、腫瘍学および血管生物学の分野に、さらに詳細には、腫瘍および血管形成部位に選択的にホーミングするＲＧＤ配列を含んでいるインテグリン−結合ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、いくつかのコラーゲンなどを含めて多くの細胞接着促進性細胞外マトリックスタンパク質における細胞表面レセプターの重要な認識配列である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００３）。インテグリンは細胞表面レセプターの大きいファミリーであって、ＲＧＤ配列で細胞外マトリックスに結合する。おおよそ３分の１のインテグリンがＲＧＤ配列をそれらの認識部位として用い；それ以外は他の配列を認識する。ＲＧＤ配列はまた、血液凝固においてフィブロネクチンに対する血小板の結合を媒介する。ＲＧＤペプチドおよびペプチド模倣物を用いて、インテグリン活性を調節することができる。これらの化合物はまた、治療および診断用の化合物をインテグリンが活性である部位に送達するのに有用である。膨大な薬物発見の努力がＲＧＤおよび関連のペプチドに対して集中しており、既に多数のＲＧＤベースの薬物が市場にあるか、または臨床試験中である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００３；２００４）。
【０００５】
腫瘍、組織再生、および炎症は、既存の血管から新規な血管の成長を誘導する。このプロセスである血管形成は、創傷治癒のためのバイタル要件である。なぜなら、新規な血管の形成によって種々の媒介因子栄養物および酸素が治癒組織に達することが可能になるからである（Ｍａｒｉｎ  １９９７，Ｓｉｎｇｅｒ＆Ｃｌａｒｋ  １９９９，Ｆａｌａｎｇａ  ２００６，Ｆｏｌｋｍａｎ  ２００６）。新しく形成された血管は、既存の脈管構造とは構造が異なる。このような相違は正常な血管に対して腫瘍脈管構造を比較することによって広く特徴付けられている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００２）。非悪性組織および前癌状態の病変における血管形成の血管は、腫瘍血管とマーカーを共有するが、別個のマーカーも存在する（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３；Ｊｏｙｃｅら、２００３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌処置の前進に対する主要なハードルは、正常な組織を残置しながら癌を選択的に標的化し得る因子が比較的欠如しているということである。例えば、一般的には局所的な処置である、放射線療法および手術は、処置領域における正常な組織に対する実質的な損傷を生じ得、これによって正常な組織の瘢痕化および喪失が生じる。化学療法は、これに対して、一般には全身に投与され、迅速な細胞の代謝回転および連続的な細胞分裂を受ける骨髄、粘膜、皮膚および小腸などの器官に実質的な損傷を生じ得る。結果として、望ましくない副作用、例えば、悪心、脱毛および血球数減少がしばしば、癌患者が化学療法薬で静脈内処置される場合に生じる。このような望ましくない副作用は、安全に投与可能な薬物の量を制限し得、それによって生存率を妨げて、患者の生活の質に影響する。従って、診断および処置の有効性を増大し、かつ全身の治療に関連する副作用を軽減する、腫瘍を選択的に標的化するための新規な治療ストラテジーが必要である。本発明は、腫瘍に選択的にホーミングし、薬物、遺伝子治療ベクターまたは他の作用物質を適切な組織に対して選択的に標的化するために適切である分子を提供することによってこの要件を満たす。関連する利点も提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本明細書に開示されるのは、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドである。このペプチドは、１００、５０または２０残基未満の長さを有し得る。このアミノ酸セグメントは、ジスルフィド結合を介するなどの環状であってもよい。このペプチドは、血管形成の部位、損傷の部位、外科的部位、腫瘍、関節炎の部位、または１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１もしくはその両方を発現する細胞もしくは組織に対して選択的にホーミングし得る。例えば、この細胞もしくは組織は、１つ以上のαｖインテグリンを発現し得、またはこの細胞もしくは組織は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現し得る。このインテグリンは、例えば、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリン、またはその組み合わせであってもよい。ある形態では、アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＲＧＤＲ／Ｋ／Ｈ（配列番号３２５）を含んでもよい。例えば、アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰＤ／ＨＣ（配列番号３２６）を含んでもよい。別の例としては、このアミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２７）を含んでもよい。別の例では、このアミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰ／ＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２８）を含んでもよい。従って、例えば、このアミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤＣ（配列番号３１３）、ＣＲＧＤＨＧＰＥＣ（配列番号３１４）、ＣＲＧＤＨＧＰＨＣ（配列番号３１５）、ＣＲＧＤＨＧＶＤＣ（配列番号３１６）、ＣＲＧＤＨＧＶＥＣ（配列番号３１７）、ＣＲＧＤＨＧＶＨＣ（配列番号３１８）、ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（配列番号１）、ＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（配列番号３）、ＣＲＧＤＫＧＰＨＣ（配列番号３０２）、ＣＲＧＤＫＧＶＤＣ（配列番号３１９）、ＣＲＧＤＫＧＶＥＣ（配列番号３２０）、ＣＲＧＤＫＧＶＨＣ（配列番号３２１）、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ（配列番号２）、ＣＲＧＤＲＧＰＥＣ（配列番号２９０）、ＣＲＧＤＲＧＰＨＣ（配列番号３０３）、ＣＲＧＤＲＧＶＤＣ（配列番号３２２）、ＣＲＧＤＲＧＶＥＣ（配列番号３２３）、またはＣＲＧＤＲＧＶＨＣ（配列番号３２４）を含んでもよい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチド。
（項目２）
前記アミノ酸セグメントが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含む、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目３）
１００残基未満の長さを有する、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目４）
５０残基未満の長さを有する、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目５）
２０残基未満の長さを有する、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目６）
アミノ酸セグメントが環状である、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目７）
アミノ酸セグメントがジスルフィド結合を介して環化される、項目６に記載の単離されたペプチド。
（項目８）
血管形成の部位に選択的にホーミングする、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目９）
前記血管形成が損傷の部位においてである、項目８に記載の単離されたペプチド。
（項目１０）
前記血管形成が外科的部位においてである、項目８に記載の単離されたペプチド。
（項目１１）
腫瘍に選択的にホーミングする、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目１２）
関節炎の部位に選択的にホーミングする、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目１３）
１つ以上のαｖインテグリンを発現する細胞または組織に対して選択的にホーミングする、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目１４）
１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現する細胞または組織に対して選択的にホーミングする、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目１５）
アミノ酸セグメントからなる、項目１に記載の単離されたペプチド。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか１項に記載のペプチドに連結された部分を含む、コンジュゲート。
（項目１７）
前記部分が抗血管形成剤、血管形成促進剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ナノ粒子、ポリペプチド、核酸分子、低分子、発蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３、または組み合わせである、項目１６に記載のコンジュゲート。
（項目１８）
前記部分が治療剤である、項目１７に記載のコンジュゲート。
（項目１９）
前記治療剤がデコリンである、項目１８に記載のコンジュゲート。
（項目２０）
前記部分が検出可能な薬剤である、項目１７に記載のコンジュゲート。
（項目２１）
ウイルスを含む、項目１７に記載のコンジュゲート。
（項目２２）
ファージを含む、項目２１に記載のコンジュゲート。
（項目２３）
ある部分が血管形成に対して指向される方法であって、被験体に対して項目１７〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
前記部分を用いて、癌、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性症、関節リウマチもしくは乾癬を処置するか、または創傷治癒を促進する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記コンジュゲートが治療効果を有する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
治療効果が炎症の減少、創傷治癒の速度の上昇、瘢痕組織の量の減少、疼痛の減少、腫脹の減少、または壊死の減少を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
被験体が標的されるべき部位を１つ以上有し、前記部分が該標的されるべき部位の１つ以上に対して指向される、項目２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
被験体が癌を有し、前記部分が該被験体において腫瘍血管形成に対して指向される、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
コンジュゲートが癌に対して治療効果を有する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
腫瘍のサイズが減少される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
腫瘍の増殖が減少されるか、停止されるか、または逆転される、項目２８に記載の方法。（項目３２）
前記部分を用いて癌を検出するか、１つ以上の腫瘍を可視化するか、またはその両方である、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
ある部分が腫瘍に対して指向される方法であって、被験体に対して項目１７〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
腫瘍中の細胞がαｖインテグリンを発現する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
腫瘍中の細胞がニューロピリン−１を発現する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
腫瘍中の細胞がニューロピリン−２を発現する、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
腫瘍中の細胞がニューロピリン−１、ニューロピリン−２、またはその両方を発現する、
項目３４に記載の方法。
（項目３８）
腫瘍中の細胞がαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現する、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
腫瘍中の細胞がニューロピリン−１を正常よりも高いレベルで発現する、項目３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
被験体中の腫瘍が１つ以上のαｖインテグリンを発現するか否かを決定する工程、および該腫瘍が１つ以上のαｖインテグリンを発現する場合、前記コンジュゲートを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
被験体における腫瘍がニューロピリン−１を正常よりも高いレベルで発現するか否かを決定する工程、および該腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現する場合、前記コンジュゲートを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
【０００８】
また、本明細書において開示されるのはコンジュゲートであって、ここでは、このコンジュゲートは、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいる、アミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドに連結された部分を含む。この部分は、血管新生阻害剤、血管形成促進剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ナノ粒子、ポリペプチド、核酸分子、低分子、発蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３、または組み合わせであってもよい。この部分は、治療剤、例えば、デコリンであってもよい。この部分は検出可能な薬剤であってもよい。このコンジュゲートは、ウイルス、例えば、ファージを含んでもよい。
【０００９】
さらに開示されるのは、ある部分が血管形成に対して指向される方法であって、この方法は被験体に対して、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドに連結された部分を含むコンジュゲートを投与する工程を包含する。この部分を用いて、癌、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性症、関節リウマチもしくは乾癬を処置するか、または創傷治癒を促進する。このコンジュゲートは、治療効果を有してもよく、この効果としては、例えば、炎症の減少、創傷治癒の速度の上昇、瘢痕組織の量の減少、疼痛の減少、腫脹の減少、または壊死の減少を含む。この被験体は、標的化されるべき１つ以上の部位を有し得、ここでこの部分は、標的化されるべき部位の１つ以上に対して指向される。この被験体は癌を有してもよく、この部分はこの被験体において腫瘍血管形成に対して指向される。例えば、このコンジュゲートは癌に対して治療効果を有し得る。例えば、腫瘍のサイズが減少されてもよいし、または腫瘍の増殖が減少されるか、停止されるか、もしくは逆転されてもよい。この部分はまた、癌を検出するか、１つ以上の腫瘍を可視化するか、またはその両方に用いることができる。
【００１０】
また開示されるのは、ある部分が腫瘍に対して指向される方法であって、この方法は被験体に対して、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドに連結された部分を含むコンジュゲートを投与する工程を包含する。この方法はさらに、被験体中の腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１またはその両方を発現するか否かを決定する工程、およびこの腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１またはその両方を発現する場合、コンジュゲートをこの被験体に投与する工程をさらに包含し得る。例えば、腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンを発現してもよいし、または腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現してもよい。この方法はさらに、被験体中の腫瘍がニューロピリン−１を正常よりも高いレベルで発現するか否かを決定する工程、および該腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現する場合、コンジュゲートを被験体に投与する工程をさらに包含してもよい。腫瘍中の細胞はαｖインテグリンを発現してもよい。腫瘍中の細胞は、ニューロピリン−１を発現してもよい。腫瘍中の細胞は、ニューロピリン−２を発現してもよい。腫瘍中の細胞は、ニューロピリン−１、ニューロピリン−２またはその両方を発現してもよい。腫瘍中の細胞は、αｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現してもよい。腫瘍中の細胞は、ニューロピリン−１を正常よりも高いレベルで発現してもよい。このインテグリンは、例えば、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１１】
開示される方法および組成物のさらなる利点は、以下の説明に部分的に示されており、その説明から部分的に理解されるか、または開示される方法および組成物の実行によって学習され得る。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される要素および組み合わせの手段によって実現および獲得されるであろう。前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示的かつ説明的でしかなく、特許請求される本発明の限定ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
添付の図面は、本明細書に組み込まれかつその一部を構成しており、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を説明とともに図示しており、開示される方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、ヒト前立腺癌の骨（脛骨）異種移植片における脈管構造に選択的にホーミングするペプチドについてのスクリーニングの間のＴ７ファージライブラリーの富化パターンの例を示す。３回のエキソビボ・ファージ・ディスプレイを行い、続いて、インビボのファージディスプレイを１回行った。次いで、この選択されたファージプールを追加回のエキソビボ・ファージ・ディスプレイに供して、標的腫瘍に対するその結合を正常な骨に対する結合と比較した。ランダムな個々のファージクローンをインビボの選択回およびエキソビボの最終回から配列決定した。その結果を表１に示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、種々のヒト異種移植片腫瘍に対するｉＲＧＤ１ペプチドのホーミングを示す。フルオレサミン標識したｉＲＧＤ１ペプチド（２００μｇ）を尾静脈から、頸骨および脳中に（Ａ）ＰＰＣ１ヒト前立腺癌異種移植片、（Ｂ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓同所異種移植片腫瘍、または（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌同所異種移植片腫瘍、を保有している免疫欠損マウスに注射する。４．５時間の循環後、マウスを灌流して、未結合のペプチドを除去して、器官を回収し、ＵＶ光（左パネル）および白色光（右パネル）のもとで観察した。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、マウス膵臓癌腫へのｉＲＧＤ１ペプチドの腫瘍ホーミングを示す。Ａ）フルオレサミン標識した２００μｇのｉＲＧＤ１ペプチドを尾静脈から、膵臓導管腺癌（ＰＤＡＣ）を有するトランスジェニックマウスに注射して、そのペプチドを４．５時間循環させた。Ｂ）過剰の非標識ｉＲＧＤ１（２ｍｇ／マウス）を、ＰＤＡＣマウスに注射して、３０分後にＡに記載されるようなフルオレサミン標識したｉＲＧＤ１ペプチドを注射した。ＵＶ光（左パネル）および白色光（右パネル）のもとで観察した、回収された器官を示す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、ＰＤＡＣ病変におけるＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドの時間依存性のインビボのホーミングパターンを示す。約２００μｇのＦＡＭ−ｉＲＧＤ１を、ＰＤＡＣを保有しているマウスに注射して、１５分（Ａ）、３０分（Ｂ）、２時間（Ｃ）および４．５時間（Ｄ）循環させた。それぞれ、ＤＡＰＩで染色している核、および抗ＣＤ３１抗体で染色している血管内皮細胞を示す。ＦＡＭ−ｉＲＧＤ１の注射の後、１５分（Ａ）〜３０分（Ｂ）では、血管中に（矢印）または血管の周囲の細胞中に色素が残留する（Ａ、右の上の角で窓の中の矢じり形）が、２時間後（Ｃ、矢印）または４．５時間後（Ｄ，矢印）、このペプチドでは血管染色は観察されない。ペプチド注射の３０分後、このペプチドの蛍光は腫瘍腺中に出現する（Ｂ，主要パネルおよび上部の右角の挿入）；腫瘍内のいくつかの個々の細胞は２時間後（Ｃ、星印）および４．５時間（Ｄ、星印）強力に陽性である。
【図５】図５は、ｉＲＧＤ１ペプチドのインビトロでの腫瘍細胞への内部移行を示す。Ｉ型コラーゲンでコーティングしたカバースリップ上で培養したＰＰＣ１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を１０μＭのフルオレサミン−ｉＲＧＤ１とともに３７℃で２時間インキュベートし、原形質膜マーカーおよび核染色ＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡下で画像化した。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ｉＲＧＤファージの腫瘍細胞への内部移行を示す。Ａ）Ｔ７ファージであって、ｉＲＧＤペプチド、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、配列番号４）を提示しているＴ７ファージ、またはＣＧ７Ｃ（コントロールのファージ）を、種々の腫瘍細胞株とともに３７℃で３０分間インキュベートした。細胞表面に結合したファージを、酸性緩衝液を用いて細胞を洗浄することによって取り除いて、内部移行したファージをレスキューして、滴定した。ｉＲＧＤファージの内部移行はＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ，配列番号４）のものよりも顕著に効率的である。Ｂ）Ｔ７ファージであって、ｉＲＧＤペプチド（主要パネル）を提示しているＴ７ファージまたはＣＧ７Ｃのコントロールのペプチド（右の上部パネル）を、Ｉ型コラーゲンでコーティングしたカバースリップ上で培養したＰＰＣ１細胞とともに３７℃で２時間インキュベートして、抗Ｔ７抗体、原形質膜マーカーおよびＤＡＰＩで染色して、核を可視化して、共焦点顕微鏡によって画像化した。ｉＲＧＤファージは腫瘍細胞中に過度に内部移行するが、コントロールのファージ（挿入物）は内部移行しないことに注意のこと。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＧ７Ｃを提示しているファージ（コントロールのファージ）の結合（Ａ）および内部移行（Ｂ）、またはスクリーニングで示されたｉＲＧＤ改変体の例を示す（配列番号１、１０６、３０２、２、２６２、および３０３）。ＰＰＣ１細胞を、このファージとともに１時間、４℃（Ａ）または３７℃（Ｂ）でインキュベートした。細胞表面に結合したファージ（Ａ）または細胞に内部移行したファージ（Ｂ）を滴定のためにレスキューした。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＣＧ７Ｃ（コントロールのファージ）、ｉＲＧＤ１、およびｉＲＧＤ１変異体（各々のアミノ酸（下線を付した）（配列番号１および３０４〜３１０）のアラニン置換を担持する）を提示するファージの結合（Ａ）および内部移行（Ｂ）を示す。ＰＰＣ１細胞を、このファージとともに１時間４℃（Ａ）または３７℃（Ｂ）でインキュベートした。細胞表面に結合したファージ（Ａ）または細胞に内部移行したファージを滴定のためにレスキューした。Ｒ、Ｇ、Ｄ、ＫおよびＧの中の５つの残基のうちのいずれか１つのアラニン変異は、腫瘍細胞へのｉＲＧＤファージの結合および内部移行を排除または大きく減少することに注意のこと。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＧ７Ｃ（コントロールのファージ）、ＣＲＧＤＫＧ、ＣＲＧＤＫ、ＣＲＧＤまたはＣＲＧ（それぞれ、配列番号５〜８）を提示しているファージの結合（Ａ）および内部移行（Ｂ）を示す。ＰＰＣ１細胞をこのファージとともに１時間４℃（Ａ）または３７℃（Ｂ）でインキュベートした。細胞表面に結合したファージ（Ａ）または細胞に内部移行したファージを滴定のためにレスキューした。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、腫瘍細胞に結合するｉＲＧＤ１ファージの阻害（Ａ）、およびそれらへの内部移行（Ｂ）を一連のペプチドを提示するＵＶ不活性化ファージによって示す。Ａ）ＰＰＣ１細胞は、ｉＲＧＤ１、ＫＧＤ（ＣＫＧＤＫＧＰＤＣ，配列番号９）を提示している１００〜１０００倍過剰のＵＶ不活性化ファージ、またはＣＧ７Ｃ（コントロールのファージ）を用いて前処理し、続いて活性なｉＲＧＤファージまたはＣＧ７Ｃファージとともに４℃で１時間同時インキュベートした。細胞表面に結合したファージを滴定した。Ｂ）ＰＰＣ１細胞を、それらをｉＲＧＤ１またはＣＧ７Ｃファージとともに３７℃で同時インキュベートした以外は、Ａ）に記載のとおり処理した。内部移行したファージを図５Ａについての凡例で記載されるとおり滴定のためにレスキューした。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ｉＲＧＤ１ファージ結合（Ａ）および内部移行（Ｂ）の阻害を一連の抗インテグリン抗体によって示す。Ａ）ＰＰＣ１細胞を一連の抗インテグリン抗体の有無によって、またはコントロールとして正常なマウスＩｇＧによって、４℃で３０分間、前処理し、続いて、ｉＲＧＤ１ファージまたはＣＧ７Ｃコントロールのファージとともに４℃（Ａ）または３７℃（Ｂ）で１時間のインキュベーションをした。細胞表面に結合したファージ（Ａ）または細胞に内部移行したファージ（Ｂ）をレスキューして滴定した。αＶインテグリンサブユニットに対する機能ブロッキング抗体は、ｉＲＧＤ１ファージの結合および内部移行の両方を効率的に阻害する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｅは、ｉＲＧＤペプチドのインビボ腫瘍ホーミングを示す。ａ）約２００μｇのＦＡＭ−ｉＲＧＤまたはコントロールのペプチドが含有されるＰＢＳを、新規な膵臓導管腺癌（ＰＤＡＣ）を保有しているＬＳＬ−Ｋｒａｓ，ｐ５３−ｆｌ／＋，ｐ４８−Ｃｒｅマウスに静脈内注射した（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２，８９７−９０９（２００２））。そのペプチドを２時間循環させて、器官を収集し、ＵＶ光（左側のパネル）または白色光（右側のパネル）のもとで可視化した。矢じり形は腫瘍を指している。ｂ、ｃ）ｉＲＧＤおよびコントロールのペプチドのインビボ分布の定量。ＦＡＭ−ｉＲＧＤ；非−インテグリン−結合ｉＲＧＤ変異体，ＦＡＭ−ＣＲＧＥＫＧＰＤＣ（配列番号２９１）（ＦＡＭ−ｉＲＧＥ）；およびＦＡＭ−標識された環状ポリグリシンペプチド（ＦＡＭ−ＣＧ７Ｃ）を、本明細書においていずれかに記載されているようにＰＤＡＣマウスに注射した（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２，８９７〜９０９（２００２））（ｂ）。ある場合には、１０倍過剰の未標識のｉＲＧＤペプチドまたはｉＲＧＥペプチドをＦＡＭ−ｉＲＧＤの３０分前に注射した（ｃ）。各々の組織における蛍光を、イメージＪソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて定量した。統計学的分析をスチューデントのｔ検定を用いて行った。未標識のペプチドの注射なしのＦＡＭ−ｉＲＧＤホーミングをｃにおいて１００％とみなした。ｎ＝３；エラーバー、標準偏差（ｓ．ｄ．）；二重星印、ｐ＜０．０１。ｄ）示したペプチド、ファージおよびミセルを注射したマウス由来の同所性２２Ｒｖ−１ヒト前立腺癌異種移植片の共焦点画像。ｉＲＧＤは同様のインテグリン結合と比較したが、内部移行しないペプチド、ＣＲＤＧＣ（配列番号３０１）とは比較しなかった。遊離のペプチドについての循環時間はペプチド提示ファージについては、２時間、１５分であって、ペプチドカップリングミセルについては３時間であった。矢印は、血管壁の内側またはすぐ外側のＦＡＭ−ＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）ペプチドまたはＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）ファージを指しており、腫瘍血管に対するそのホーミングを示しているが、ただし分散および内部移行はない。各々の３つの腫瘍の複数のセクション由来の代表的な視野を示す。縮尺バー＝５０μｍ。ｅ）ＦＡＭ−ｉＲＧＤミセルまたはＣｙ７で標識したＦＡＭコントロールミセルを注射したＰＤＡＣマウス（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ（２００２））の全身の画像化。画像はミセルの注射３時間後にとった。皮膚の剃毛した領域のみを破線によって描写して示す。明るい染色，８００ｎｍ（Ｃｙ７）；暗い方の染色，７００ｎｍ（バックグラウンドの蛍光）。蛍光性器官の、のこ歯の外観は、マウスの呼吸によって生じる。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ｉＲＧＤがαｖインテグリンに結合することを示す。ａ）合成のｉＲＧＤペプチドおよびその改変体、ならびに対応する非感染性ファージによる、ｉＲＧＤファージがＰＰＣ１前立腺癌に対して結合することの阻害。ｂ、ｃ）インテグリンまたはコントロールのマウスＩｇＧに対する抗体による、ＰＰＣ１細胞（ｂ）およびＭ２１細胞（ｃ）に対するｉＲＧＤファージ結合の阻害。統計学的分析をＡＮＯＶＡ（ａ，ｃ）およびスチューデントのｔ検定（ｂ）で行った。インヒビターなしのｉＲＧＤファージ結合をａにおいて１００％とみなした。ｎ＝３；エラーバー，標準偏差（ｓ．ｄ．）；一重星印，ｐ＜０．０５；二重の星印，ｐ＜０．０１；三重の星印，ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｅは、腫瘍細胞内のｉＲＧＤ内部移行におけるＣｅｎｄＲモチーフを示す。ａ）非感染性のＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）またはＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２９７）ファージで前処理したかまたはしていないＰＰＣ１細胞内のトリプシン処理したｉＲＧＤファージの内部移行。ｂ）合成のＣＲＧＤＫ（配列番号６）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）、およびＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２９７）のペプチド、および対応する非感染性のファージによる、ＰＰＣ１に対するＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージ結合の阻害。ｃ）抗ニューロピリン−１ブロッキング抗体（抗ＮＲＰ−１）またはコントロールのヤギＩｇＧ（左側のパネル）で処理したＰＰＣ１細胞、ならびにニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）の強制された発現を誘導するためにニューロピリン−１ｃＤＮＡでトランスフェクトされるか、ベクター単独でトランスフェクトされるかまたはトランスフェクションなしのＭ２１細胞に対する、ＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージの結合（右側のパネル）。ｄ）ＣｅｎｄＲ−内部移行ペプチドＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）およびＣＲＧＤＫ（配列番号６）を提示する非感染性ファージによるＰＰＣ１内のｉＲＧＤおよびｉＲＧＥファージ内部移行の阻害。ｅ）ニューロピリン−１機能をブロックする抗ニューロピリン−１抗体（抗ＮＲＰ−１）による、ＰＰＣ１細胞内のｉＲＧＤファージの用量依存性の阻害。統計的な分析をＡＮＯＶＡ（ａ，ｂ，ｄ）またはスチューデントのｔ検定（ｃ，ｅ）で行った。インヒビターなしのＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージ結合をｂにおいて１００％とみなした。ｎ＝３；エラーバー，標準偏差；一重の星印，ｐ＜０．０５；二重の星印，ｐ＜０．０１；三重の星印，ｐ＜０．００１。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは腫瘍細胞内のｉＲＧＤの内部移行がニューロピリン−１を包含することを示す。ａ）ｉＲＧＤファージでインキュベートしたＰＰＣ１細胞の共焦点顕微鏡画像。細胞をファージ、ニューロピリン−１、および核について染色した。右パネルは左パネルにおける破線の領域の高倍率視野である。ｉＲＧＤファージはＰＰＣ１細胞内に内部移行して、核周辺部で（矢じり形）および核で（矢印）ニューロピリン−１とともに同時局在化することに注意のこと。縮尺バー＝２０μｍ。ｂ）ＰＤＡＣにおけるαｖインテグリン（右側のパネル）およびニューロピリン−１（左側のパネル）の発現に関する、ＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチド（グリーン）の時間依存性のホーミング（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ（２００２））。ＦＡＭ−ｉＲＧＤによって標的化される血管は、αｖインテグリンおよびニューロピリン−１（矢印）の両方について陽性であった。挿入物は、ＦＡＭ−ｉＲＧＤによって標的化された脈管構造のＣＤ３１染色を示す。試験したほとんど全ての腫瘍導管において、αｖインテグリンは陽性であった。腫瘍細胞（矢じり形）および腫瘍導管（星印）もニューロピリン−１について強力に陽性であって、内部移行してＦＡＭ−ｉＲＧＤを残すのに極めて強力であった。縮尺バー＝５０μｍ。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、同所性異種移植片および自然発生のマウス腫瘍に対する合成のｉＲＧＤペプチドのホーミングを示す。ＰＢＳ中の約２００μｇのＦＡＭ−ｉＲＧＤを、腫瘍を保有しているマウスに対して静脈内投与した。そのペプチドを２時間循環させて、器官を収集してＵＶ光または白色光のもとで見た。矢じり形は、腫瘍を指している。ａ）この腫瘍はヒト前立腺癌ＰＰＣ１の脳および脛骨移植片（Ｚｈａｎｇら、Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｚｉｐ  ｃｏｄｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，５６９６−５７０６（２００６））、ならびに２２ｒｖ−１の同所性異種移植片（Ｄｒａｋｅら、Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２２，６７４−６８４（２００５））、ヒトすい臓癌ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＣＤ４４  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ＣＤ４４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，７１９１−７１９９（２００８））、およびヒト乳癌ＢＴ４７４（Ｒｕｓｎａｋら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＥｒｂＢ−２  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＧＷ２０１６，ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１，８５〜９４（２００１））であった。ｂ）自然発生のマウス腫瘍はＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの膵臓島腫瘍（Ｈａｎａｈａｎ，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  １−ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ／ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，１１５−１２２（１９８５））およびＫ１４−ＨＰＶ１６マウスの頸部腫瘍（Ａｒｂｅｉｔら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｋ１４−ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４３５８−４３６８（１９９４））であった。
【図１７】図１７は、ｉＲＧＤファージが腫瘍組織へ浸透し、腫瘍細胞へ内部移行することを示す。ｉＲＧＤ、ＲＧＤ−４Ｃ、またはＣＧ７Ｃファージを注射したトランスジェニックマウス由来のＰＤＡＣ腫瘍の共焦点画像。矢印はファージについて陽性である血管を指しており、星印は腫瘍導管を示す。上部の右パネルは上の左のパネルにおける破線の領域の拡大視野を示す。挿入物はＲＧＤ−４Ｃファージによって標的化された血管を示す。ｉＲＧＤファージは、腫瘍の実質内に広範に広がり、腫瘍細胞内に内部移行するが、一方ＲＧＤ−４Ｃファージは、血管を標的化するが、脈管構造内の近接会合にとどまる。ＣＧ７Ｃファージは、腫瘍ホーミングを示さなかった。縮尺バー＝５０μｍ。
【図１８】図１８は、ＣＧ７Ｃファージに比較したｉＲＧＤファージのＰＰＣ１細胞への結合および内部移行を示す。ＰＰＣ１細胞をｉＲＧＤまたはＣＧ７Ｃファージを用いて１時間４℃でまたは３７℃で処理した。内部移行を評価するために、細胞表面に結合したファージを、ファージ滴定の前に酸緩衝液を用いて細胞を洗浄することによって除去した。ｉＲＧＤファージの内部移行は、４℃では生じないことに注意のこと。統計学的分析をスチューデントのｔ検定で行った。ｎ＝３，エラーバーはｓ．ｄ．に相当する。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、腫瘍細胞におけるインテグリン発現を示す。ａ，ｂ）ＰＰＣ１（ａ）およびＭ２１細胞（ｂ）におけるインテグリン発現は、フローサイトメトリーによって分析した。このプロフィールは、未染色の細胞の値（薄い灰色）に相当し、細胞をマウスＩｇＧ（濃い灰色）または適切なインテグリン抗体（影なし、矢印つき）を一次抗体として用いてインキュベートした。
【図２０】図２０は、ＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドで処理したＰＰＣ１細胞から回収したペプチドフラグメントを示す。ＰＰＣ１細胞を、プロテアソームインヒビターＭＧ１３２の存在下でＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチド（Ｎ末端でＦＡＭ）とともに３７℃で９０分間インキュベートした。ペプチドフラグメントを抗ＦＩＴＣアフィニティーカラムで回収して、質量分析計によって分析した。ＦＡＭ−ＣＲＧＤＫ［Ｍ＋Ｈ］（ｍ／ｚ：１，０４９）（配列番号６）およびＦＡＭ−ＣＲＧＤＫ［Ｍ＋Ｎａ］（ｍ／ｚ：１，０７２）（配列番号６）の存在、ならびに全長のＦＡＭ−ｉＲＧＤ（ｍ／ｚ：１，４１９）の非存在に注意のこと。メジャーなペプチドフラグメントは、抗ＦＩＴＣアフィニティーカラムについてのアイソタイプコントロールとして用いたマウスＩｇＧカラムからも、またはＦＡＭ−ｉＲＧＤに曝されなかったＰＰＣ１細胞の溶解液を抗ＦＩＴＣに分画したときも、回収されなかった（示さず）。Ｃ末端においてＦＡＭで標識したｉＲＧＤペプチドによって、細胞からＧＰＤＣ−ＦＡＭ（（ＣＲＧＤＫ（配列番号６）を生じるｉＲＧＤ切断から期待される９８８質量単位のフラグメント）は生じなかった（示さず）。これによって、ｉＲＧＤペプチドがＫ−Ｇ結合でタンパク質分解性に切断される場合に生じるであろうニューロピリン−１−結合Ｎ末端フラグメント（ＣＲＧＤＫ；配列番号６））のみが内部移行することが示され、そしてジスルフィド結合は内部移行の前に減少されることが示される。ＭＧ１３２を略することによって、ＦＡＭ−ＣＲＧＤＫ（配列番号６）（示さず）より少ないペプチドのみが生じ（示さず）、これによって、細胞内ＦＡＭ−ＣＲＧＤＫ（配列番号６）はプロテアソームで分解されることが示される。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、インテグリン発現に関連する腫瘍細胞に対するＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージの結合を示す。ａ）インテグリン抗体は、ＰＰＣ１細胞に対するＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージの結合を阻害しない。ｂ）ＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージは、種々のαｖインテグリン発現レベルでＭ２１細胞に対して同様に結合する（αｖインテグリン発現パターンについては図１９Ｂを参照のこと）。
【図２２】図２２は、ｉＲＧＤおよびＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージのＰＰＣ１およびＭ２１細胞への内部移行を示す。細胞をｉＲＧＤまたはＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージを用いて１時間３７℃で、続いて酸性の緩衝液洗浄によって処理して、細胞表面に結合するファージを除去した。ＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージは、ニューロピリン−１の高い発現を有するＰＰＣ１細胞におけるｉＲＧＤファージよりも効率的に内部移行するが、Ｍ２１細胞では逆転されないことに注意のこと。
【図２３】図２３は、ＣｅｎｄＲエレメントを欠くＲＧＤファージが腫瘍細胞に効率的に内部移行しないことを示す。ｉＲＧＤファージ改変体ＣＲＧＤＧＧＰＤＣ（配列番号２９８）、ＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）、またはＲＧＤ−４Ｃを発現するＴ７ファージとともにインキュベートされたＰＰＣ１細胞の共焦点顕微鏡画像。この細胞をファージ（矢印を付した）、ニューロピリン−１（遠位および隣接）、および核（中央塊）について染色した。ＣＲＧＤＧＧＰＤＣ（配列番号２９８）ファージの右パネルは、左パネルにおける破線の領域の高倍率の視野である。ＲＧＤファージは細胞の表面に結合する（矢じり形）が、細胞中には効率的に内部移行しないことに注意のこと。縮尺バー＝１０μｍ。
【図２４】ｉＲＧＤの２工程の内部移行機構を示す。ｉＲＧＤペプチド（配列番号１）は、αｖインテグリン−発現内皮および腫瘍内の他の細胞の表面に蓄積する。ＲＧＤモチーフは、インテグリン結合を媒介する。このペプチドを細胞表面会合したプロテアーゼ（単数または複数）によって切断して、潜在性のＣｅｎｄＲエレメントであるＲＸＸＫ／Ｒ（配列番号１３および１４）をＣ末端で露出する（ハサミをともなう破線）（配列番号６および３１１）。次いで、ＣｅｎｄＲエレメントはニューロピリン−１に対する結合を媒介し、細胞への内部移行を生じる。このペプチドは、細胞中にカーゴ、例えば、簡易な化合物またはナノ粒子を運び、ただしこのカーゴは、ｉＲＧＤペプチドのＮ末端に結合される。なぜなら、ジスルフィド結合はペプチドが内部移行される前に適切に壊れるからである（破線矢印）。廃棄されたペプチドは配列番号３１２である。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｃは、腫瘍およびファージ・ディスプレイ・スクリーニングからの富化データを示す。ａ）ＰＰＣ１脛骨異種移植片：下部パネルに示される領域のＩｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＦＸでとった上部パネル、Ｘ線写真。矢印は、脛骨における腫瘍を指す。ｂ）心臓の左心室への百万個の腫瘍細胞の注入からひろがったＧＦＰ−ＰＣ−３腫瘍。マウスは、Ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＴ−９９００を用いてＵＶ光のもとで画像化した。骨（例えば、顎、撓骨、大腿骨）で増殖する腫瘍をスクリーニングに用いた。ｃ）ファージ・ディスプレイ・スクリーニングの連続回で得た富化の例。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
開示される方法および組成物は、本明細書に含まれる特定の実施形態および実施例の以下の詳細な説明、ならびに図面およびそれらの以前のおよび以下の説明を参照することによってさらに容易に理解できる。
【００１４】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が開示および記載される前に、それらは別段特定しない限り、特定の合成方法または特定の組み換えバイオテクノロジー方法に限定されるものではなく、あるいは、別段特定しない限り、特定の試薬にも限定されず、従って当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書に用いられる用語法は、特定の実施形態を記載する目的でしかなく、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１５】
（Ａ．全般）
ファージディスプレイのペプチドライブラリーのインビボスクリーニングを用いて、腫瘍における血管の特殊化をプローブした。この方法によって、脈管構造における異質性の大きい程度が明らかになった；組織特異的ホーミングペプチドは、多数の正常な器官および組織、腫瘍およびアテローム性動脈硬化症で特定されている（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００２；Ｌｉｕら、２００３；Ｚｈａｎｇら、２００５；Ｋｏｌｏｎｉｎら、２００６）。腫瘍は、血管およびリンパ管の両方で特定の血管マーカーを担持することが示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００２；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２；２００４；Ｚｈａｎｇら、２００６）。ファージ・ディスプレイ・スクリーニングにおける標的として用いられなかった腫瘍タイプを概観することによって、腫瘍について選択的な追加のホーミングペプチド配列が明らかになる場合があることが推論された。前立腺癌および前立腺癌転移を、標的腫瘍として選択した。
【００１６】
αｖインテグリンを発現する新規な脈管構造または細胞および組織を選択的に標的化するあるクラスのペプチドが発見されている。ある形態では、このペプチドは、配列ＣＲＧＤＲ／ＫＧＰＤ／ＥＣ（配列番号３００）を有する。詳細には、新規な脈管構造を選択的に標的化する３つのペプチドが特定されている：ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（ｉＲＧＤ１，配列番号１と呼ばれる）、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ（ｉＲＧＤ２、配列番号２と呼ばれる）、およびＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（ｉＲＧＤ３、配列番号３と呼ばれる）。このクラスのペプチドの他の例としては、ＣＲＧＤＲＧＰＥＣ（配列番号２９０）が挙げられる。ある形態では、このペプチドは、配列ＲＧＤＲ／Ｋ／Ｈ（配列番号３２５）を有し得る。例えば、このペプチドは、配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰＤ／ＨＣ（配列番号３２６）を有してもよい。別の例としては、このペプチドは、配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２７）を有してもよい。別の例としては、このペプチドは、配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＰ／ＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２８）を有してもよい。従って、例えば、このペプチドは、配列ＣＲＧＤＨＧＰＤＣ（配列番号３１３）、ＣＲＧＤＨＧＰＥＣ（配列番号３１４）、ＣＲＧＤＨＧＰＨＣ（配列番号３１５）、ＣＲＧＤＨＧＶＤＣ（配列番号３１６）、ＣＲＧＤＨＧＶＥＣ（配列番号３１７）、ＣＲＧＤＨＧＶＨＣ（配列番号３１８）、ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（配列番号１）、ＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（配列番号３）、ＣＲＧＤＫＧＰＨＣ（配列番号３０２）、ＣＲＧＤＫＧＶＤＣ（配列番号３１９）、ＣＲＧＤＫＧＶＥＣ（配列番号３２０）、ＣＲＧＤＫＧＶＨＣ（配列番号３２１）、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ（配列番号２）、ＣＲＧＤＲＧＰＥＣ（配列番号２９０）、ＣＲＧＤＲＧＰＨＣ（配列番号３０３）、ＣＲＧＤＲＧＶＤＣ（配列番号３２２）、ＣＲＧＤＲＧＶＥＣ（配列番号３２３）、またはＣＲＧＤＲＧＶＨＣ（配列番号３２４）を有し得る。
【００１７】
これらのホーミングペプチドは、抗癌剤を送達するための腫瘍の全身的な標的化の容易さを示す。
【００１８】
Ｂ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの、ある（不定冠詞：ａ、ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」とは、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。従って、例えば、「薬学的なキャリア」についての言及には、このようなキャリアの２つ以上の混合物などを包含する。
【００１９】
範囲は、「約、ほぼ、およそ」ある特定の値から、および／または「約、ほぼ、およそ」別の特定の値までとして本明細書では表現され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が近似で表される場合、先行詞「約、ほぼ、およそ」の使用によって、この特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。各々の範囲のエンドポイントは、他のエンドポイントに関して、および独立して他のエンドポイントで、両方とも有意であることがさらに理解される。本明細書において開示される多数の値が存在すること、かつ各々の値は、その値自体に加えて「約、ほぼ、およそ」その特定の値として本明細書で開示されることも理解される。例えば、「１０」という値が開示されるならば、「約１０」も開示される。ある値がその値「以下」で開示される場合、当業者によって適切に理解されるとおり、「その値以上」および値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。本出願全体において、データは多数の異なる形式で提供されること、ならびにこのデータは、エンドポイントおよび出発ポイントに相当し、そしてデータポイントの任意の組み合わせにおよぶことも理解される。例えば、ある特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５より大きい、それ以上、それ未満、それ以下およびそれに等しい値が開示されるとみなされ、１０と１５との間も同様であることが理解される。２つの特定の単位の間の各々の単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３および１４も開示される。
【００２０】
本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると規定されるであろう多数の用語に対して言及がなされるであろう：
「任意の」または「必要に応じて」とは、実質的に記載される事象または環境が存在してもしなくてもよいこと、そしてこの説明はこの事象または環境が生じる場合、およびそれが生じない場合を包含することを意味する。
【００２１】
本出願全体にわたって、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示はその全体が本出願への参照によって援用されており、これが関与する当該分野の言及をさらに詳細に記載する。開示される引用文献はまた、その引用文献が依拠するセンテンスで考察される物質に含まれる物質について本明細書の引用文献によって個々にかつ詳細に援用される。
【００２２】
開示される方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術に、または別段特定しない限り特定の試薬に限定されず、従って変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書において用いられる用語法は、特定の実施形態を記載する目的でしかなく、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００２３】
材料
開示されるのは、開示される組成物を調製するために用いられるべき成分、および本明細書において開示される方法内で用いるべき成分自体である。これらおよび他の物質は、本明細書に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されているが、これらの化合物の各々の種々の個々のおよび総合的な組み合わせおよび順列の特定の言及が明確に開示され得ない場合、各々は詳細に考慮されかつ本明細書に記載される。例えば、特定のペプチドが開示されかつ考察され、ペプチドを含んでいる多数の分子に対してなすことができる多数の修飾が考察され、特に考慮されるのは、ペプチドおよび修飾の各々のかつあらゆる組み合わせおよび順列であって、それは特に反対が示されない限り可能である。従って、あるクラスの分子Ａ、ＢおよびＣが開示され、同様に、あるクラスの分子Ｄ、ＥおよびＦ、および組み合わせ分子Ａ−Ｄの例が開示されるならば、各々が個々に言及されない場合でさえ、各々が個々にかつ総合的に考慮され、これは組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ-Ｆが考慮され開示されることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは
組み合わせも開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが、開示されると考えられるであろう。この概念は、本出願の全ての局面にあてはまり、これには、限定するものではないが、開示される組成物を作製および用いる方法における工程を包含する。従って、実現可能な種々の追加の工程がある場合、これらの追加工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで行われてもよいことが理解される。
【００２４】
開示されるのは、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または関連のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる単離されたペプチドに関連する方法および組成物である。
【００２５】
また開示されるのは、単離されたペプチドであって、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドである。当業者は、どのアミノ酸が置換され得るか、かつ、ペプチドの機能を保持し得るかを容易に評価できる。
【００２６】
このペプチドは、例えば、１００残基未満の長さを有してもよい。このペプチドは例えば、５０残基未満の長さを有してもよい。このペプチドは、例えば、２０残基未満の長さを有してもよい。この開示されたアミノ酸セグメントは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでもよい。この開示されたアミノ酸セグメントは例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つであって、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有しているアミノ酸配列を含んでもよい。この開示されたペプチドは、例えば、円形または環状であってもよい。この開示されたペプチドは例えば、ジスルフィド結合を介して、円形または環状であってもよい。この開示されたペプチドは例えば、非円形または直線であってもよい。この開示されたアミノ酸セグメントは、例えば、円形または環状であってもよい。この開示されたアミノ酸セグメントは、例えば、ジスルフィド結合を介して、円形または環状であってもよい。この開示されたアミノ酸セグメントは例えば、非円形または直線であってもよい。この開示されたペプチドは、例えば、アミノ酸セグメントから構成されてもよい。この開示されたペプチドは選択的に、例えば、血管形成の部位、例えば、創傷部位または組織にホーミングしてもよい。
【００２７】
また開示されるのは、コンジュゲートであって、ここではこのコンジュゲートは開示されたペプチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいるペプチドなどに連結された部分を含む。
【００２８】
この部分は、例えば、抗血管形成剤、血管形成促進剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、低分子、発蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３、または組み合わせであってもよい。この部分は、例えば、治療剤であってもよい。この部分は例えば、検出可能な薬剤であってもよい。このコンジュゲートは、例えば、ウイルスであってもよい。このコンジュゲートは例えば、ファージを含んでもよい。このコンジュゲートはさらに、例えば、第二のペプチドを含んでもよく、ここでこの第二のペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでもよい。
【００２９】
このコンジュゲートは被験体中の血管形成組織に対して向けられるか、またはそれに標的化されるか、またはそれにホーミングし、従ってこのコンジュゲートはこの部分が血管形成組織に対して指向される。腫瘍が処置されている場合、従って、その部分は腫瘍に関連する血管形成組織に指向され得る。このコンジュゲートは、例えば、癌を処置するために用いられ得る。このコンジュゲートは、癌に対する治療的な効果を有し得る。例えば、腫瘍のサイズが減ってもよいし、および／または腫瘍の増殖が軽減されても、停止されても、もしくは逆転されてもよい。この部分を用いて癌を検出しても、１つ以上の腫瘍を可視化しても、またはその両方でもよい。
【００３０】
被験体は血管形成が生じている創傷を有してもよい。創傷は例えば、慢性であっても、または急性であってもよい。この創傷は、任意の段階の治癒において、炎症段階から、顆粒化へ、収縮へ、上皮形成へ、再構築期へであってもよく、これはコラーゲン形成および瘢痕組織の形成を包含する。創傷は、例えば、自動車、ボートまたは飛行機の事故、発砲、突刺またはナイフの事故、落下、産業事故または串刺し由来であってもよい。創傷はまた、例えば、手術の間に形成され得る。創傷は例えば、ポートの移植などの処置の結果でもあり得る。
【００３１】
コンジュゲートを用いて、例えば、創傷の部位の少なくとも１つを処置してもよい。コンジュゲートは、創傷の少なくとも１つの部位に対する治療効果を有してもよい。この部分を用いて、例えば、創傷の部位の少なくとも１つを検出、可視化または画像化、またはその組み合わせを行ってもよい。
【００３２】
このコンジュゲートはまた、例えば、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性症、関節リウマチまたは乾癬を、例えば、処置するためにも用いられ得る。
【００３３】
このコンジュゲートは、例えば、１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１、またはその両方を発現する細胞または組織に対して部分を向けるために用いられ得る。例えば、細胞または組織は、１つ以上のαｖインテグリンを発現してもよく、または細胞または組織は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロフィリン−１を発現してもよい。インテグリンは、例えば、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリン、またはその組み合わせであってもよい。
【００３４】
Ａ．ホーミング分子
開示されるのは、血管形成の部位に選択的にホーミングするホーミング分子である。種々のホーミング分子を開示された組成物、コンジュゲートおよび方法で用いてもよい。このようなホーミング分子としては限定するものではないが、本明細書に開示されるようなペプチドが挙げられる。詳細には、ホーミング分子およびその使用に対する本明細書での言及およびその説明はまた詳細には、開示されるペプチドに言及し、それに適用することを意図する。開示される化合物、組成物、コンジュゲートおよび方法は、種々の形態の開示されるホーミング分子を包含または使用し得る。発現の都合のために、本明細書の多くの場所でペプチドの用途または包含が言及される。このような場合、種々の形態でのホーミング分子がまた、ペプチドに関して記載されるのと同じまたは同様の方式で用いられるかまたは包含され得ると考えられ、そしてこのような用途および包含は詳細には、本明細書で意図されかつ開示されることが理解される。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「分子」という用語を広義に用いて、ポリマーまたは非ポリマー有機化合物、例えば、低分子薬物；核酸分子、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド；ペプチド；またはタンパク質、例えば、増殖因子レセプターまたはその抗体もしくはフラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦｄもしくはＦａｂフラグメントまたは抗原結合ドメインを含む別の抗体フラグメントを意味する。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「ホーミング分子」という用語は、正常な組織に優先して血管形成の部位、または腫瘍（詳細には、腫瘍の脈管構造）に対してインビボで選択的にホーミングする任意の分子を意味する。同様に、「ホーミングペプチド」という用語は、血管形成の部位に対してインビボで選択的にホーミングするペプチドを意味する。血管形成の部位に対してインビボで選択的にホーミングするホーミング分子は、このような部位に対する優先的なホーミングを示し得ることが理解される。
【００３７】
「選択的にホーミングする」とは、インビボで、このホーミング分子が非標的に比べた場合、標的に対して優先的に結合することを意味する。このようなホーミング分子は、例えば、血管形成の部位に対して選択的にホーミングし得る。例えば、血管形成部位に対して選択的にホーミングすることは、一般には血管形成を受けていない組織のいくつかの組織型に比較して、血管形成内の少なくとも２倍大きい局在化によって特徴付けられる。ホーミング分子は、いくつかのもしくは多くの非再生組織の組織型に比較した場合、またはほとんどもしくは全ての非再生組織に比較した場合、再生性の組織に対する、５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上の優先的な局在化によって特徴付けられ得る。従って、いくつかの場合には、ホーミング分子は、一部は、再生性の組織、創傷組織または腫瘍にホーミングすることに加えて、１つ以上の正常な器官にホーミングすることが理解される。選択的なホーミングはまた、標的化とも呼ばれ得る。
【００３８】
「血管形成」という用語は、既存の血管からの新規な血管の増殖に関与する生理学的なプロセスとして規定される。血管形成は、自然な血管形成に用いられる用語であり、腸重責症とは、既存のものを分裂することによる新規な血管形成についての用語である。血管形成は成長および発達における、そして創傷治癒における正常なプロセスである。腫瘍の移行においては、休止状態から悪性の状態へと基礎的な段階がある。血管形成とは、血管形成の前の同じ組織に、または標準的もしくはコントロールに比べた場合、所定の領域で新規な血管の増殖に１０％以上の増大があるとき、生じているといわれる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ホーミング分子とは、創傷組織または腫瘍などの血管形成を受けている組織に選択的にホーミングし、かつ抗体でもその抗原結合フラグメントでもない分子であり得る。「抗体」という用語は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいるペプチドまたはポリペプチドを指す、当該分野で認識される用語である。例えば、Ｂｏｒｒａｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと。
【００４０】
ホーミングには、優先的なホーミングおよび／または選択的なホーミングを含むが、これは、ホーミング分子がいかなる正常なおよび／または非標的領域にも結合しないことを意味しない（例えば、非腫瘍、非凝固および／または非創傷）。いくつかの実施形態では、ホーミング選択性は、他の非標的成分よりも相対的なＫｉに関して、対応する標的について例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍選択性であり得る。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は対応する標的に対して、少なくとも約５０倍選択性、少なくとも約１００倍選択性、少なくとも約２００倍選択性、少なくとも約３００倍選択性、少なくとも約４００倍選択性、少なくとも約５００倍選択性、少なくとも約６００倍選択性、少なくとも約７００倍選択性、少なくとも約８００倍選択性、少なくとも約１０００倍選択性、または少なくとも約１５００倍の選択性を有し得る。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、このホーミング分子は、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約７５ｎＭ未満という標的に対するＫｉ値を有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、このホーミング分子は、約５０ｎＭを超える、約２５ｎＭを超える、約２０ｎＭを超える、約１５ｎＭを超える、約１０ｎＭを超える、約５ｎＭを超える、約３ｎＭを超える、または約１ｎＭを超えるという標的に対するＫｉ値を有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、この標的部分は、その標的に約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、約１０−１２Ｍ未満、約１０−１３Ｍ、または約１０−１４Ｍ未満というＫＤで結合する。
【００４１】
結合とは、ホーミング分子のその標的に対する認識および／または結合の状況において、例えば、ホーミング分子がその標的に対して、共有結合および／または非共有結合によって、結合、付着そうでなければカップリングし得る場合、共有結合および非共有結合の両方を指してもよい。結合は、高い親和性または低い親和性のいずれであってもよく、好ましくは高い親和性であり得る。有用であり得る結合力の例としては限定するものではないが、共有結合、双極子相互作用、静電気力、水素結合、疎水性相互作用、イオン結合および／またはファンデルワールス力が挙げられる。
【００４２】
１．ペプチドおよびペプチド模倣物
開示されるのは、単離されたペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または関連のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる単離されたペプチドに関連する方法および組成物である。この単離されたペプチドは例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを例えば含んでいるアミノ酸セグメントを含んでもよい。
【００４３】
アミノ酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つに対して少なくとも約９０％、８０％、７０％または６０％同一性のアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸の付加または欠失を含む変化に相当するその間の任意の割合を含んでもよい。このアミノ酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでもよい。このアミノ酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つであって、１、２、３、４、５、６、７、８または９つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このアミノ酸セグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つのキメラを含んでもよい。このようなキメラは、付加物であってもよく、１つの配列の配列が別の実質的な配列に追加されているか、１つの配列の配列が別の配列の配列で置換されているか、またはその組み合わせである場合、追加的であり得る。開示されるペプチドは、このアミノ酸セグメントから構成され得る。
【００４４】
このアミノ酸セグメントは、例えば、非円形、直線、円形または環状であってもよい。アミノ酸セグメントは、任意の適切な結合、例えば、ジスルフィド結合を介して円形または環状にされてもよい。このペプチドは、任意の適切な長さ、例えば、１００残基未満の長さを有してもよい。このペプチドは、例えば、５０残基未満の長さを有してもよい。このペプチドは、例えば、２０残基未満の長さを有してもよい。
【００４５】
開示されるペプチドは、創傷組織、または腫瘍などの血管形成を受けている組織に対して選択的にホーミングし得る。この開示されたペプチドはこのような組織または腫瘍と選択的に相互作用し得る。
【００４６】
また開示されるのは、単離されたペプチドであって、１００残基未満の長さを有しており、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、またはそれらのペプチド模倣物を含む単離されたペプチドである。このような単離されたペプチドは、例えば、５０残基未満の長さまたは２０残基未満の長さを有してもよい。特定の実施形態では、開示されるのは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含み、かつ２０、５０または１００残基未満の長さを有する、ペプチドであり得る。
【００４７】
開示されるペプチドは、単離形態であってもよい。開示されるペプチドに関して本明細書において用いる場合、「単離された」という用語は、細胞中のペプチドと正常には会合されるか、またはライブラリー中もしくは粗調製物中でペプチドと会合している、混入しているポリペプチド、脂質、核酸および他の細胞物質などの物質を比較的含まない形態であるペプチドを意味する。
【００４８】
開示されるペプチドは、任意の適切な長さを有してもよい。開示されるペプチドは、例えば、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５または４０残基という比較的短い長さを有してもよい。開示されるペプチドはまた、有意に長い配列の状況で有用であり得る。従って、ペプチドは、例えば、最大、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００または２０００残基という長さを有し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基という長さを有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、５〜２００残基、５〜１００残基、５〜９０残基、５〜８０残基、５〜７０残基、５〜６０残基、５〜５０残基、５〜４０残基、５〜３０残基、５〜２０残基、５〜１５残基、５〜１０残基、１０〜２００残基、１０〜１００残基、１０〜９０残基、１０〜８０残基、１０〜７０残基、１０〜６０残基、１０〜５０残基、１０〜４０残基、１０〜３０残基、１０〜２０残基、２０〜２００残基、２０〜１００残基、２０〜９０残基、２０〜８０残基、２０〜７０残基、２０〜６０残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基または２０〜３０残基という長さを有し得る。本明細書において用いる場合、「残基」という用語は、アミノ酸またはアミノ酸アナログを指す。
【００４９】
ｉ．ペプチド改変体
特定のアミノ酸配列を参照して本明細書において用いる場合、「保存的改変体」とは、第一のアミノ酸が、その第一のアミノ酸の生化学的特性と類似の少なくとも１つの生化学的特性を有している別のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置き換えられている配列である；同様の特性としては、例えば、類似のサイズ、荷電、疎水性または水素結合能力が挙げられる。
【００５０】
例として、保存的改変体は、第一の非荷電の極性のアミノ酸が第二の（非同一）非荷電の極性のアミノ酸、例えば、システイン、セリン、トレオニン、チロシン、グリシン、グルタミンまたはアスパラギンまたはそれらのアナログで保存的に置換されている配列であり得る。保存的な改変体とはまた、第一の塩基性のアミノ酸が第二の塩基性のアミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルリジンまたはそれらのアナログで保存的に置換されている配列であってもよい。同様に、保存的な改変体とは、第一の疎水性アミノ酸が、第二の疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンまたはそれらのアナログで保存的に置換されている、配列であってもよい。同じ方法で、保存的改変体は、第一の酸性アミノ酸が第二の酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸またはそれらのアナログで保存的に置換されている配列；芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニンが第二の芳香族アミノ酸またはアミノ酸アナログ、たとえば、チロシンで保存的に置換されている配列；または第一の比較的小さいアミノ酸、例えば、アラニンが第二の比較的小さいアミノ酸またはアミノ酸アナログ、たとえば、グリシンもしくはバリン、またはそれらのアナログで置換されている配列であってもよい。例えば、１つのアミノ酸残基を生物学的および／または化学的に類似の別のアミノ酸残基で置換することは、当業者には保存的置換として公知である。例えば、保存的置換とは、１つの疎水性残基を別の残基、または１つの極性残基を別の残基で置き換えることである。この置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。各々の明確に開示された配列のこのような保存的に置換された改変体は、本明細書に提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【００５１】
本明細書は種々のタンパク質およびタンパク質配列を考察しているので、それらのタンパク質配列をコードし得る核酸も開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての変性配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有している全ての核酸、ならびにタンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする変性核酸を含んでいる全ての核酸を包含する。従って、各々の特定の核酸配列は本明細書で記載されていないかもしれないが、各々のかつあらゆる配列が現実には開示され、開示されるタンパク質配列を通じて本明細書で記載されていることが理解される。
【００５２】
開示される組成物に組み込まれ得る多くのアミノ酸およびペプチドアナログがあることが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸または上記で考察されるアミノ酸とは異なる機能的な置換を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体が開示され、同様にペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、部位特異的な方式でペプチド鎖中にアナログアミノ酸を挿入するために、選択したアミノ酸をともなうｔＲＮＡ分子を充填することによって、および例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を作成することによって、ポリペプチド鎖中に容易に組み込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８〜３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７〜２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００〜４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８〜１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８〜６８２（１９９４）これら全てがアミノ酸アナログに関連する物質について少なくとも参照によって本明細書に援用される）。
【００５３】
また開示されるのは、異種タンパク質に融合された開示されたペプチドを含んでいるキメラタンパク質である。一実施形態では、異種タンパク質は、サイトカイン活性、細胞傷害性活性、またはアポトーシス促進活性などの治療活性を有し得る。さらなる実施形態では、この異種タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。他の実施形態では、このキメラタンパク質は、異種タンパク質に融合された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、またはそれらの保存的改変体またはペプチド模倣物を含んでいるペプチドを包含する。「異種」という用語は本明細書において用いる場合、開示されるペプチドに融合されたタンパク質に対する言及では、このペプチドをコードする遺伝子以外の供給源由来のタンパク質、またはペプチド模倣物が由来するタンパク質を意味する。開示されるキメラタンパク質は、種々の長さを有してもよく、この長さとしては限定するものではないが、１００残基未満、２００残基未満、３００残基未満、４００残基未満、５００残基未満、８００残基未満、または１０００残基未満の長さを含む種々の長さを有し得る。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「キメラ」および「キメラの」とは、２つ以上の供給源由来の配列の任意の組み合わせをいう。これには、例えば、サブユニットの単一の部分（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸）から最大では他の配列に追加、挿入および／または置換される全体のソース配列（ｓｏｕｒｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）までが挙げられる。キメラは例えば、追加的であってもよく、ここではある配列の１つ以上の部分が１つ以上の他の配列の１つ以上の部分に追加され；置換であってもよく、ここではある配列の１つ以上の部分が１つ以上の他の配列の１つ以上の部分で置換されるか；またはそれらの組み合わせである。「保存的置換のキメラ」を用いて、置換キメラを指してもよく、ここではキメラのソース配列は、いくつかの構造的および／または機能的な関係を有し、同様のまたは類似の構造および／または機能を有している配列の一部がお互いに置換されている。代表的なキメラ抗体およびヒト化抗体は保存的な置換キメラの例である。
【００５５】
また開示されるのは、二機能性のペプチドであって、別の機能を有している第二のペプチドに融合されたホーミングペプチドを含むペプチドである。このような二機能性のペプチドは、全長分子の異なる部分によって付与される少なくとも２つの機能を有し、かつ例えば、選択性のホーミング活性に加えて、抗血管形成活性またはアポトーシス促進活性を呈し得る。
【００５６】
また開示されるのは、ホーミング分子を各々が独立して含んでいる少なくとも２つのサブ配列を含む単離された多価ペプチドである（例えば、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、またはそれらの保存的改変体またはペプチド模倣物）。この多価ペプチドは、例えば、ホーミング分子を各々が独立して含んでいるこのようなサブ配列のうち、少なくとも３つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０個を有し得る（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、またはそれらの保存的改変体またはペプチド模倣物）。特定の実施形態では、この多価ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個の同一または同一でないサブ配列を有してもよい。さらなる実施形態では、この多価のペプチドは、ホーミング分子からなる同一のサブ配列を含んでもよい（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、またはそれらの保存的改変体またはペプチド模倣物）。さらなる実施形態では、この多価ペプチドは、連続的な同一のまたは同一でないサブ配列を含み、これはいかなる介在するアミノ酸によっても隔てられていない。さらなる実施形態では、この多価ペプチドは、環状であっても、そうでなければ立体配置的に強制されてもよい。一例では、このペプチドは、ジスルフィド結合を介して円形にされても、環状にされてもよい。
【００５７】
必要に応じて、単離されたペプチド、またはホーミング分子は、本明細書においていずれかにさらに考察されるとおり、環状であっても、そうでなければ立体配置的に強制されてもよい。本明細書において用いる場合、「立体配置的に強制された」分子、例えば、ペプチドとは、三次元構造が経時的にある空間配置で実質的に維持されている分子である。立体配置的に強制された分子は、改善された特性、例えば、親和性の増大、代謝安定性、膜透過性または溶解度を有し得る。立体配置的な強制の方法は、当該分野で周知であり、本明細書においていずれかにさらに考察されるような環化を包含する。
【００５８】
ペプチドに対して本明細書において用いる場合、「環状の」という用語は、２つの隣接しないアミノ酸またはアミノ酸アナログの間の分子内結合を含んでいる構造を意味する。この環化は、共有結合または非共有結合を通じて達成され得る。分子内結合としては限定するものではないが、骨格対骨格、側鎖対骨格および側鎖対側鎖の結合が挙げられる。環化の好ましい方法は、非隣接アミノ酸またはアミノ酸アナログの側鎖の間のジスルフィド結合の形成を通じる。ジスルフィド結合を形成できる残基としては、例えば、システイン（Ｃｙｓ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、β，β−ペンタメチレンシステイン（Ｐｍｃ）、β，β−ペンタメチレン−β−メルカプトプロピオン酸（Ｐｍｐ）およびそれらの機能的な均等物が挙げられる。
【００５９】
ペプチドはまた、アミノ酸またはそのアナログの側鎖基を利用して、アミノ末端残基のＮ末端アミンに対して共有結合を形成し得る、例えば、ラクタム結合を介して環化し得る。ラクタム結合を形成できる残基としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、オルニチン（ｏｒｎ）、α，β−ジアミノ−プロピオン酸、γ−アミノ−アジピン酸（Ａｄｐ）およびＭ−（アミノメチル）安息香酸（Ｍａｍｂ）が挙げられる。環化はさらに、例えば、リジン（Ｌｙｓ）残基とロイシン（Ｌｅｕ）残基との間のリシノノルロイシン結合、または２つのチロシン（Ｔｙｒ）残基の間のジチロシン結合の形成を通じて達成され得る。当業者は、これらおよび他の結合が環状ペプチドに含まれ得ることを理解する。
【００６０】
Ｂ．コンジュゲート
開示されるのは、本明細書において開示されるようなペプチドなどの部分およびホーミング分子を含んでいるコンジュゲートである。例えば、開示されるのは、血管形成を受けている組織に対して選択的にホーミングするホーミング分子に連結された治療剤を含んでいるコンジュゲートである。開示されるコンジュゲートは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいるペプチドに連結された部分を含んでもよい。
【００６１】
本明細書に開示されるホーミング分子の任意の形態または型を、開示されるコンジュゲートにおいて用いてもよい。この部分は任意の分子であってもよい。好ましくは、この部分は、ホーミング分子の標的に有用に標的化される分子である。例えば、治療効果を有する部分などの標的に影響するか、または蛍光分子もしくは放射性核種などの、標的の検出、可視化または画像化を促進する部分。血管形成を受けている組織にホーミングする開示されたペプチドは、例えば、創傷治癒を促進、炎症もしくは疼痛を処置、または癌を処置し得る部分と例えば、有用に組み合され得る。種々の治療剤が、コンジュゲート中で有用であり、これには限定するものではないが、抗血管形成剤、血管形成促進剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、低分子、発蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３である部分、または組み合わせが挙げられる。
【００６２】
多重ホーミング分子を含んでいるコンジュゲートは、例えば、２つ以上、３つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、または１０００個以上のホーミング分子を含んでもよい。一実施形態では、このコンジュゲートは、全てが同一のアミノ酸配列を有するホーミング分子を含む。別の実施形態では、このコンジュゲートは、２つ以上の非同一のアミノ酸配列を有しているホーミング分子を含む。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを別々に用いてもまたは一緒に用いてもよい。多重ホーミング分子を組み込んでいるコンジュゲート中で有用な部分としては、限定するものではないが、ファージ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、粒子、例えば、金粒子、マイクロデバイス、ナノデバイス、およびナノスケールの半導体物質が挙げられる。
【００６３】
コンジュゲートは、例えば、少なくとも２つのホーミング分子に連結されたリポソームまたは他のポリマー性マトリックスを含んでもよい。必要に応じて、このリポソームまたは他のポリマーマトリックスは、少なくとも１０個、少なくとも１００個、または少なくとも１０００個のホーミング分子に連結され得る。リポソームはこのようなコンジュゲートで有用であり得；リン脂質または他の脂質からなるリポソームは非毒性であり、作製および投与が比較的簡単である生理学的に受容可能であり、かつ代謝可能なキャリアである（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８４））。このリポソームまたは他のポリマーマトリックスは必要に応じて、別の成分、例えば、限定するものではないが、治療剤、癌化学療法剤、細胞傷害性剤、抗血管形成剤、ポリペプチドまたは核酸分子を含んでもよい。
【００６４】
開示されるコンジュゲートの成分は、任意の適切な方式で組み合されても、結合されても、および／またはカップリングされてもよい。例えば、部分およびホーミング分子は、共有結合的にまたは非共有結合的に、直接または間接的に、リンカー部分と会合されてもされなくてもよい。
【００６５】
Ｃ．部分
開示されるのは、標的に対して部分を向ける組成物および方法である。本明細書において用いる場合、「部分」という用語は広義に用いて、結合する分子に対して生物学的に有用な機能を一般的に付与する物理的、化学的または生物学的な物質を意味する。ある部分は限定するものではないが、生物学的物質、例えば、細胞、ファージまたは他のウイルス；有機化合物、例えば、低分子；放射性核種；核酸分子またはオリゴヌクレオチド；ポリペプチドまたはペプチドを含めて任意の天然または非天然の物質であってもよい。有用な部分としては、限定するものではないが、抗血管形成剤、血管形成促進剤、癌化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、低分子、発蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３、または組み合わせが挙げられる。有用な部分としてはさらに、限定するものではないが、ファージおよび他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックスまたは粒子、例えば、金粒子、マイクロデバイスおよびナノ粒子、ならびにナノスケールの半導体物質が挙げられる。当該分野で公知のこれらおよび他の部分は、コンジュゲートの成分であり得る。
【００６６】
１．治療剤
コンジュゲート中に組み込まれた部分は、治療剤であってもよい。本明細書において用いる場合、「治療剤」という用語は、正常または生理学的な組織において１つ以上の生物学的な活性を有する分子を意味する。種々の治療剤がコンジュゲートに含まれてもよい。
【００６７】
本明細書に開示されるコンジュゲートを用いて、創傷または組織損傷をホーミングしてもよい。この目的のために有用な部分は、いくつかの基本的なグループに属する分子を含んでもよく、これには、炎症を予防する抗炎症剤、組織増殖を妨げる再狭窄予防薬物、血栓の形成または血栓溶解を阻害または制御する抗血栓形成薬物、および組織増殖を調節し、組織の治癒を増強する生物活性剤が挙げられる。
【００６８】
このコンジュゲートはまた、癌化学療法剤を含んでもよい。本明細書において用いる場合、「癌化学療法剤」は癌細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学剤である。このような癌化学療法剤は、限定するものではないが、タキサン、例えば、ドセタキセル；アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；代謝拮抗剤；白金剤、例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン；ステロイド、例えば、メトトレキセート；抗生物質、例えば、アドリアマイシン；イソファミド；または選択的なエストロゲンレセプターモジュレーター；抗体、例えば、トラスツズマブであってもよい。
【００６９】
コンジュゲートで有用な治療剤は、ヒト化モノクローナル抗体などの抗体であってもよい。例えば、抗上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌を処置するためにコンジュゲート中で有用な治療剤である（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５２：１２５−１４１（２００１））。
【００７０】
有用な治療剤はまた、細胞毒性剤であってもよく、これは本明細書において用いる場合、細胞死を直接または間接的に促進する任意の分子であってもよい。有用な細胞毒性剤としては、限定するものではないが、低分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸−分子、細胞およびウイルスが挙げられる。非限定的な例として、有用な細胞毒性剤としては、細胞傷害性低分子、例えば、ドキソルビシン、ドセタキセルまたはトラスツズマブ；抗菌ペプチド、例えば、以下にさらに記載されるペプチド；アポトーシス促進性ポリペプチド、例えば、カスパーゼおよびトキシン、例えば、カスパーゼ−８；ジフテリア毒素Ａ鎖、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素、例えば、ＤＡＢ３８９ＥＧＦ、トウゴマ（ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）毒素（リシン）；および細胞傷害性細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞が挙げられる。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２１８〜３２２４（２０００）；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９０：２５２〜２５９（１９９７）；Ａｌｌａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２６１５〜２６１８（１９９７）；ならびにＯｓｂｏｒｎｅおよびＣｏｒｏｎａｄｏ−Ｈｅｉｎｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．２：１７５（１９９６）を参照のこと。当業者は、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知であるこれらおよび追加の細胞毒性剤が、開示されるコンジュゲートおよび方法で有用であり得ることを理解する。
【００７１】
一実施形態では、治療剤は、治療用ポリペプチドであってもよい。本明細書において用いる場合、治療用ポリペプチドは、生物学的に有用な機能を有する任意のポリペプチドであってもよい。有用な治療ポリペプチドとしては、限定するものではないが、サイトカイン、抗体、細胞毒性ポリペプチド；アポトーシス促進性ポリペプチド；および抗血管形成ポリペプチドを包含する。コンジュゲートのなかで有用な治療剤はまた、抗血管形成剤であってもよい。本明細書において用いる場合、「抗血管形成剤」という用語は、血管の成長および発達である、血管形成を軽減または予防する分子を意味する。このコンジュゲートを血管形成に関連する任意の疾患、状態または障害を処置または診断するために用いてもよい。例えば、黄斑変性症および糖尿病性血管合併症が診断および／または処置され得る。種々の抗血管形成剤が、ごく普通の方法によって調製できる。このような抗血管形成剤としては、限定するものではないが、低分子；タンパク質、例えば、血管新生因子、転写因子および抗体のドミナントナガティブ型；ペプチド；ならびに核酸分子、例としては、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および核酸分子であって、例えば、血管新生因子およびレセプター、転写因子のドミナントネガティブ型をコードする核酸分子、ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、ＨａｇｅｄｏｒｎおよびＢｉｋｆａｌｖｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８９〜１１０（２０００）、ならびにＫｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０：１４９〜１６３（２０００）を参照のこと。
【００７２】
２．検出可能因子
開示されるコンジュゲート中の部分はまた検出可能因子であってもよい。種々の検出可能因子が開示される方法で有用である。本明細書において用いる場合、「検出可能剤」という用語は、検出できる任意の分子をいう。有用な検出可能因子としては、インビボで投与可能で、かつ引き続き検出可能な部分が挙げられる。開示されるコンジュゲートおよび画像化方法で有用な検出可能因子としては、限定するものではないが、放射性標識および蛍光分子が挙げられる。検出可能因子は例えば、好ましくは、非侵襲性および／またはインビボの可視化技術によって、直接または間接的に検出を容易にする任意の部分であってもよい。
【００７３】
好ましい実施形態では、検出可能因子は、標的に対してホーミング分子がホーミングする能力を妨げないような方法でホーミング分子にカップリングされ得る。いくつかの実施形態では、検出可能因子は、ホーミング分子に対して化学的に結合され得る。いくつかの実施形態では、この検出可能因子は、ホーミング分子に対してそれ自体化学的に結合される部分に対して化学的に結合されてもよく、このホーミング分子が画像化部分および標的化部分を間接的に連結する。
【００７４】
Ｄ．薬学的組成物およびキャリア
開示されるコンジュゲートは、薬学的に受容可能なキャリア中で、インビボで投与されてもよい。「薬学的に受容可能な」とは、生物学的にもそれ以外でも望ましい物質を意味し、すなわち、この物質は、なんら望ましくない生物学的効果を生じることなく、その物質が含まれている薬学的組成物の他のなんらかの成分と有害な方式で相互作用することもなく、核酸またはベクターと一緒に被験体に投与され得る。このキャリアは当然のこととして、当業者に周知であるとおり、活性成分の任意の分解を最小化するように、および被験体における任意の有害な副作用を最小化するように選択される。この物質は、溶液、懸濁液中であってもよい（例えば、マイクロ粒子、リポソーム、または細胞中に組み込まれる）。
【００７５】
方法
本明細書に開示されるのは、開示されるペプチドなどの、開示されるホーミング分子を用いる方法である。例えば、開示されるのは、血管形成を受けている組織に対してある部分を差し向ける方法であって、この方法は、本明細書に開示されるコンジュゲートを被験体に投与する工程を包含する。上記で考察されるとおり、この組織は、腫瘍の部位であっても、創傷、例えば、損傷もしくは外科手術によって生じる創傷であってもよい。
【００７６】
本明細書に開示されるコンジュゲートは、腫瘍が血管形成に関連しているので腫瘍を有する被験体で有用であり得る。開示されるのはある部分を腫瘍に仕向ける方法であって、この方法は、本明細書に開示される任意のコンジュゲートを被験体に投与する工程を包含する。例えば、コンジュゲートは治療効果を有してもよい。この被験体は、標的化されるべき１つ以上の部位を有してもよく、ここでこの部分は、標的化されるべき１つ以上の部位に向けられる。例えば、被験体は、本明細書に開示される部分で処置され得る複数の創傷または病変を有し得る。この被験体はまた癌を有してもよく、この部分は、被験体における腫瘍血管形成に向けられてもよい。この場合、このコンジュゲートは、癌に対する治療効果を有し得る。例えば、腫瘍のサイズが低減されてもよいし、または腫瘍の増殖が低減、停止または逆転されてもよい。この部分はまた、癌を検出するか、１つ以上の腫瘍を可視化するか、またはその両方に用いられ得る。
【００７７】
開示される組成物は、癌などの未制御の細胞増殖が生じる任意の疾患を処置するために用いられ得る。種々のタイプの癌の非限定的なリストは以下のとおりであり得る：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高度神経膠腫、芽細胞腫、芽腫、神経芽細胞腫、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫または肉腫、転移性癌または一般的な癌。
【００７８】
処置に対して開示された組成物を用いることができる癌の代表的だが非限定的な列挙は以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系の癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽腫／膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、のど、喉頭および肺の扁平上皮癌、直腸癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、および上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血系の癌；精巣癌；結腸および直腸の癌、前立腺癌、または膵臓癌。
【００７９】
開示される組成物および方法についての標的として特に有用である癌および腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１またはその両方を発現する癌および腫瘍である。例えば、この癌および腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンを発現し得るか、またはこの癌および腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現し得る。ニューロピリン−１を正常より高度に発現する癌および腫瘍は、特に有用な標的である。これらの目的のためには、腫瘍におけるまたは腫瘍に近いある程度の細胞が１つ以上のαｖインテグリンを発現し、腫瘍におけるある程度の細胞がニューロピリン−１を発現することも十分である。本明細書において用いる場合、遺伝子またはタンパク質の正常な発現レベルは、正常な組織または細胞における発現のレベルである。任意の適切な比較組織または細胞を用いてもよい。例えば、癌細胞および腫瘍の場合、非癌組織または非腫瘍性組織のレベルを用いて、発現の正常なレベルを達成してもよい。同じタイプの正常な細胞または組織を癌または腫瘍の供給源として用いることが有用な場合がある。
【００８０】
開示されるのは、ある部分を腫瘍に向ける方法であって、この方法は、被験体中の腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１、またはその両方を発現するか否かを決定する工程と、およびこの腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１、またはその両方を発現する場合、この被験体に対して本明細書に開示される任意のコンジュゲートを投与する工程を包含する。例えば、この腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンを発現してもよいし、またはこの腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現してもよい。また開示されるのは、ある部分を腫瘍に向ける方法であって、この方法は、被験体中の腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現するか否かを決定する工程と、およびこの腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現する場合、この被験体に対して本明細書に開示される任意のコンジュゲートを投与する工程を包含する。
【００８１】
また開示されるのは、ある部分を腫瘍に向ける方法であって、この方法は、この被験体に対してコンジュゲートを投与する工程を包含し、ここでこのコンジュゲートは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つ、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０のアミノ酸配列、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、もしくはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを含んでいるアミノ酸セグメントを含んでいる、単離されたペプチドに連結された部分を含む。この方法はさらに、被験体中の腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１、またはその両方を発現するか否か、およびこの腫瘍が１つ以上のαｖインテグリン、ニューロピリン−１、またはその両方を発現するか否かを決定する工程と、この被験体に対してコンジュゲートを投与する工程を包含し得る。例えば、この腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンを発現してもよいし、またはこの腫瘍は、１つ以上のαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現してもよい。この方法はさらに、被験体中の腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現するか否かを決定する工程と、およびこの腫瘍がニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現する場合、この被験体に対してこのコンジュゲートを投与する工程を包含する。腫瘍における細胞は、ニューロピリン−１を発現してもよい。腫瘍における細胞はαｖインテグリンおよびニューロピリン−１を発現してもよい。腫瘍における細胞は、ニューロピリン−１を正常より高いレベルで発現してもよい。このインテグリンは、例えば、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリンまたは組み合わせであってもよい。
【００８２】
開示されるのは、治療効果が炎症の軽減を含んでいる方法である。「炎症における軽減」とは、炎症が処置されなかった場合に比較した炎症の軽減を意味する。炎症の軽減は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００％の増大、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００倍以上であってもよい。創傷治癒の速度において、未処置の創傷に比較した場合増大があり得る。創傷治癒の速度の増大は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００％の増大、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００倍以上であってもよい。損傷または創傷の未処置の部位に比較して、瘢痕組織の量の減少も存在してもよい。瘢痕組織の量の減少は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％であってもよい。疼痛の量の減少が必要な被験体が受ける疼痛の量の減少も、疼痛の処置を受けない場合の疼痛の量に比較して存在し得る。疼痛におけるこの軽減は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の減少であり得る。腫脹における減少も存在し得る。腫脹におけるこの減少は、未処置の膨張に比較され得、腫脹における約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の減少であり得る。未処置の組織に比較して、組織の壊死の軽減も存在してもよい。壊死の軽減は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％であってもよい。
【００８３】
本明細書において開示されるコンジュゲートはまた、関節炎および他の炎症性疾患を有する被験体で有用であり得る。なぜならこのような病変は血管形成に関連する場合が多いからである。このコンジュゲートは、血管形成に関連する任意の疾患、状態または障害を処置または診断するために用いられ得る。例えば、黄斑変性症および糖尿病性血管合併症が診断および／または処置され得る。
【００８４】
本明細書に開示される組成物および開示される方法を行うために必要な組成物は、他に特段の注記が無い限り、その特定の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を用いて作製することができる。
【００８５】
開示されたタンパク質、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９０、アミノ酸配列ＣＲＧＤＲ／Ｋ／ＨＧＶＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３２９）のうちの１つ、またはアミノ酸配列ＣＲＧＤＨＧＰＤ／Ｅ／ＨＣ（配列番号３３０）のうちの１つを作製する一方法は、タンパク質化学の技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば，ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを用いて市販の実験装置を用いて化学的に合成され得る。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、開示されるタンパク質に相当するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応によって合成され得ることを容易に理解できる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成されてもよいし、その合成樹脂から切断されなくてもよいが、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントが合成されて、樹脂から実質的に切断されてもよく、それによって他のフラグメント上で機能的にブロックされる末端基を露出する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントがそれぞれ、それらのカルボキシ末端およびアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合されて、抗体またはそれらのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ  Ｇ  Ａ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．，編集（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、ペプチド合成に関連する材料について少なくとも参照することによって本明細書に援用される）。あるいは、このペプチドまたはポリペプチドは本明細書に記載のようにインビボで独立して合成される。一旦単離されれば、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは連結されて、類似のペプチド縮合反応を介してペプチドまたはそのフラグメントを形成し得る。
【００８６】
例えば、クローニングされるかまたは合成のペプチドセグメントの酵素的連結によって、比較的短いペプチドフラグメントを、連結して、より大きいペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインを作製することが可能になる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然の化学的連結を利用して、短いペプチドフラグメントから大きいペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築してもよい。この方法は２工程の化学的反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６〜７７９（１９９４））。この第一の工程は、チオエステル−連結中間体を最初の共有結合産物として生じるための保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含んでいる別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択性反応である。反応条件における変化なしで、この中間体は、自然な、急速な分子内反応を受けて、連結部位での天然のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【００８７】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントが化学的に連結され、ここでは化学的連結の結果としてのペプチドセグメントの間で形成された結合は天然でない（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術を用いて、タンパク質ドメインのアナログおよび全生物学的活性を有する比較的純粋な大量のタンパク質を合成した（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒ  Ｃら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７〜２６７（１９９２））。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、当業者に対して、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのように行われ、評価されるかという詳細な開示および説明をもたらすために示しており、かつ純粋に例示を意図するものであって、この開示を限定するものではないものとする。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する労力を払っているが、ある程度の誤差および偏差（逸脱）が考慮されるべきである。他に示すことが無い限り、部分は重量部分であり、温度は℃であるか、または外界温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００８９】
（実施例１）
１．実施例１：損傷組織の脈管構造における分子変化
ｉ．ファージディスプレイによるホーミングペプチドの特定
腫瘍における脈管構造にホーミングする候補ペプチドを特定するために、Ｔ７ファージ中のペプチドライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングの間に観察されるライブラリーの富化の例を図１に示す。エキソビボスクリーニングは、Ｔ７ファージライブラリー（多様性約１０９）と、種々のヒト前立腺癌細胞の骨異種移植片から作製された細胞懸濁液とをインキュベートすることによって行い、細胞に結合されたファージを滴定のために回収してさらなる回について増幅した。エキソビボの回数を３回繰り返した後、インビボのファージディスプレイに移動した。エキソビボおよびインビボのファージ選択は、Ｈｏｆｆｍａｎら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ
ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，」ＣｌａｒｋｓｏｎおよびＬｏｗｍａｎ（編集）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００４））に記載されるように行った。
【００９０】
スクリーニングのインビボ段階では、エキソビボ選択したファージプールを、ヒト前立腺癌細胞の骨異種移植片を保有しているヌード（免疫欠損）マウスに静脈内注射した。そのマウスを、ＰＢＳを用いて心臓を通して灌流することによって１０分後に屠殺して、腫瘍および他の組織をファージ滴定および回収のために収集した。腫瘍組織からのファージを増幅して、これを用いて最終のエキソビボ・ファージ・ディスプレイを行った。ここで、標的腫瘍に対するファージプールの結合を、正常な骨に対する結合と比較した。限られた数の個々のファージクローンを標的腫瘍および正常な骨から無作為にピックアップして、配列決定に供した。
【００９１】
個々のファージクローンの配列決定によって、選択されたプールで複数回明らかになったペプチド配列が明らかになった（表１）。３つの配列であって、各々がＲＧＤモチーフを含んでいる配列をさらなる分析のために選択した。この選択されたペプチドは環状ペプチドＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（ｉＲＧＤ１、配列番号１と呼ばれる）、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ（ｉＲＧＤ２、配列番号２と呼ばれる）、およびＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（ｉＲＧＤ３、配列番号３と呼ばれる）である。
【００９２】
ｉｉ．ｉＲＧＤペプチドの腫瘍ホーミング
ファージディスプレイで特定されたｉＲＧＤ配列の腫瘍ホーミングをｉＲＧＤ１ペプチドが腫瘍にホーミングする能力を研究することによって確認した。約２００μｇのフルオレサミン（フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅ  ｓｃａｍｉｎｅ））−標識したｉＲＧＤ１ペプチド（ＦＡＭ−ｉＲＧＤ１）を、尾静脈を通じて、ＰＰＣ１ヒト前立腺癌、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌、またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌の異種移植片を保有している免疫欠損マウスに注射して、４．５時間循環させた（図２）。ＵＶ光のもとでの収集した器官の検査によって、ｉＲＧＤ−注射したマウスの腫瘍は強い蛍光性であったが、正常な組織は蛍光性でなかったことが示された。同様の結果が、自然発生の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）腫瘍を保有しているトランスジェニックマウスにＦＡＭ−ｉＲＧＤ１を注射した場合得られた（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，２００２）（図３Ａ）。過剰な未標識のｉＲＧＤ１ペプチドを同時注射することによって、ＰＤＡＣ腫瘍におけるＦＡＭ−ｉＲＧＤ１の蓄積が阻害され、このことは、ｉＲＧＤ１ホーミングの特異性を実証している（図３Ｂ）。ＦＡＭ−ｉＲＧＤ１を注射された動物からのＰＤＡＣ腫瘍切片の共焦点顕微鏡によって、このペプチドについての時間依存性のインビボのホーミング動態が示された。このペプチドは腫瘍血管で最初に蓄積し（図４Ａ、矢印）、次いで細胞周囲の脈管構造で蓄積し（図４Ａ、矢じり形）、そして３０分後に腫瘍腺中の腫瘍細胞にシフトした（図４Ｂ）。この時点までに、脈管構造では微量しかみられず（図４Ｂ、矢印）、調査した後の時点では血管の蛍光は見られなかった（図４ＣおよびＤ）。腫瘍細胞に関連するペプチド蛍光は腫瘍細胞の核周囲の領域に凝縮した（図４Ｃおよび４Ｄ、星印）。これらの観察によって、ｉＲＧＤは腫瘍血管および腫瘍細胞の両方を標的化すること、およびｉＲＧＤは腫瘍細胞内で蓄積することが示される。
【００９３】
ｉｉｉ．ｉＲＧＤの腫瘍細胞への内部移行
ｉＲＧＤペプチドが腫瘍細胞へ内部移行するという概念は、共焦点顕微鏡によって確認された。種々のタイプの腫瘍細胞をＦＡＭ−ｉＲＧＤ１とともに２時間３７℃でインキュベートしたとき、ペプチドの蛍光は細胞内に蓄積した（図５）。さらに、ｉＲＧＤファージはまた、腫瘍細胞に内部移行し、その内部移行は、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、配列番号１０）またはＣＧ７Ｃのコントロールのペプチド（図６）などの他のＲＧＤペプチドを提示するファージの内部移行よりもかなり広範であった。従って、ｉＲＧＤは、単純な化合物（フルオレセイン）の内部移行およびナノ粒子の内部移行を生じ得る（Ｔ７ファージは約５０ｎｍの直径を有するナノ粒子である）。ｉＲＧＤの特定の改変体、例えば、ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ、またはＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（それぞれ、配列番号１、２、および３）は、同様の腫瘍細胞結合および内部移行をＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（図７．配列番号１）として示し、このことはｉＲＧＤの重要なモチーフが５つのアミノ酸ＲＧＤＫ／ＲＧに存在することを示唆している。ｉＲＧＤ中のモチーフを特定するために、２つの実験を行った。第一に、ｉＲＧＤのアラニンスキャンを行った。Ｒ、Ｇ、Ｄ、Ｋ、またはＧの中の５つの残基のうちの任意の１つをアラニンへ変異させることによって、ｉＲＧＤファージの内部移行は排除または大きく減少された（図８）。第二に、ＣＲＧＤＫＧ、ＣＲＧＤＫ、ＣＲＧＤ、またはＣＲＧ（配列番号５〜８）を提示しているファージを構築して、腫瘍細胞へ結合および内部移行する能力を試験した（図９）。ＣＲＧＤＫＧおよびＣＲＧＤＫ（配列番号５および６）のファージは両方とも腫瘍細胞に結合して内部移行したが、ＣＲＧＤおよびＣＲＧはしなかった。まとめると、これらの結果から、ｉＲＧＤの重要なモチーフはＲＧＤＫ／Ｒ（配列番号１１および１２）からなることが示唆される。
【００９４】
ｉｖ．ｉＲＧＤのレセプター
ＰＰＣ１ヒト前立腺癌細胞へのｉＲＧＤファージの結合および内部移行はＵＶ不活性化ｉＲＧＤファージによって用量依存性の方式で劇的に阻害されたが、ＣＧ７ＣコントロールペプチドまたはＫＧＤ（ＣＫＧＤＫＧＰＤＣ、配列番号１）ペプチドを発現するＵＶ不活性化ファージでは阻害されず、このことは、レセプター媒介性の作用が、腫瘍細胞へのｉＲＧＤの結合および内部移行に関与したことを示唆している（図１０）。
【００９５】
ＲＧＤモチーフはインテグリン認識配列であって、ＲＧＤ−指向性インテグリン、例えば、αｖβ３、αＶβ５、およびα５β１は血管形成性の内皮細胞および特定の腫瘍細胞で上方制御されることが公知である（ＥｌｉｃｉｅｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ，２００１；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００２）。従って、ｉＲＧＤの腫瘍細胞結合および内部移行に対するＲＧＤ−指向性インテグリンに対する抗体の効果を試験した。
【００９６】
図１１に示されるとおり、αＶβ５インテグリンに対する抗体は、ＰＰＣ１前立腺癌細胞へのｉＲＧＤファージおよびペプチドの結合、ならびにこれらの細胞によるファージの引き続く内部移行を廃した。対照的に、抗α５β１は、ｉＲＧＤ内部移行に対してわずかな効果しか有さなかった。従って、１つ以上のαＶインテグリンは、ｉＲＧＤの１つのレセプターとして作用する。しかし、ｉＲＧＤの顕著な内部移行効率、および抗α２抗体および抗α５β１抗体などの他の抗インテグリン抗体がｉＲＧＤの内部移行に対してある程度の阻害性の効果を示すという事実を考慮すれば、αＶインテグリン結合が腫瘍ホーミングにおけるｉＲＧＤの固有の力価を完全に説明する可能性は低い。ｉＲＧＤ配列は、フリン型プロテアーゼのコンセンサス切断部位を含む（ＲＸＸＫ／Ｒ；配列番号１３および１４；Ｔｈｏｍａｓ，２００２）。フリンは、大型のタンパク質分解酵素ファミリーであって、そのメンバーは細胞型特異的な方式で発現される場合が多い。腫瘍におけるインテグリンに対するｉＲＧＤの結合に続いて、ＲＧＤＫ／Ｒ（配列番号１１および１２）配列に選択性のタンパク質分解性切断はどういうものかペプチドの内部移行およびそのペイロードを促進することが推測される。内部移行は次に、標的細胞におけるｉＲＧＤの蓄積を生じ、これによってｉＲＧＤはホーミングペプチドとして特に有効になる。
【００９７】
表１は、ヒト前立腺癌の骨異種移植片で行った、インビボのファージディスプレイ（図１で星印で示す）および４回のエキソビボ・ファージ・ディスプレイ（図１の二重の星印）からのその後の結果を示す。小文字でかつ下線を引いてない配列は、骨腫瘍および正常な骨に対して共通であって、排除された。大文字でかつ二重の下線の配列は、ｉＲＧＤおよびその改変体を示し、大文字でかつ下線なしの配列は、ｉＲＧＤに関連するモチーフを有した。ｉＲＧＤ保有ファージの数は独立したスクリーニングを表すことに注意のこと。４つのアミノ酸またはそれより長いアミノ酸のアミノ酸配列は配列番号１５〜２８９であって、左から右、次に上から下である。
【００９８】
【表１−１】
2014028862.tif 000003
【００９９】
【表１−２】
2014028862.tif 000004
【０１００】
【表１−３】
2014028862.tif 000005
【０１０１】
【表１−４】
2014028862.tif 000006
【０１０２】
【表１−５】
2014028862.tif 000007
【０１０３】
【表１−６】
2014028862.tif 000008
Ｂ．実施例２：ｉＲＧＤホーミングおよび内部移行の分析
ＲＧＤインテグリン認識モチーフを含有するペプチド（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．Ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ
ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９，３０〜３３（１９８４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｔｈｅ  ＲＧＤ  ｓｔｏｒｙ：  ａ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ａｃｃｏｕｎｔ．Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．２２，４５９−４６５（２００３））およびその模倣物を、腫瘍血管で発現されるαｖ−インテグリンに対して薬物、生物製剤、造影剤およびナノ粒子を送達するために用いた（ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ，Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３，５６３−５６８（２００１）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２，８３〜９０（２００２）；Ａｒａｐら、Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，３７７〜３８０（１９９８）；Ｃｕｒｎｉｓら、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α  ｗｉｔｈ
αｖｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５６５〜５７１（２００４）；Ｓｉｐｋｉｎｓら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  αｖβ３−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４，６２３〜６２６（１９９８）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ
ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５，９３４３−９３４８（２００８））。しかし、重大な障害はこのようなＲＧＤ標的剤が腫瘍実質に浸透してその中に蓄積する能力が、標的インテグリンの明らかな発現にかかわらず、限定されていることである（Ｊａｉｎ，Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．９，２５３〜２６６（１９９０））。開示されるのは、血管外遊走を組織化することおよび腫瘍組織内の連鎖したペイロードの広がりにおいて、例外的に有効であり、かつ腫瘍細胞内で引き続き内部移行する環状ＲＧＤペプチド、ｉＲＧＤ（配列：ＣＲＧＤＫ／ＲＧＰＤ／ＥＣ；配列番号１、２、３および２９０）である。このペプチドは２つの機能的なエレメントを組み込む：腫瘍特異性を与えるＲＧＤモチーフ（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．Ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９，３０−３３（１９８４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００３）；ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００１）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００２）；Ａｒａｐら、（１９９８）；Ｃｕｒｎｉｓら、（２００４）；Ｓｉｐｋｉｎｓら、（１９９８）；Ｍｕｒｐｈｙら、（２００８））、および浸透を媒介するＲＸＸＫ／Ｒモチーフ（ＣｅｎｄＲモチーフ、配列番号１３および１４）。ｉＲＧＤはαｖインテグリンを発現する培養細胞に容易に結合して、他のＲＧＤペプチドよりもかなり効率的に内部移行された。内部移行は、ＣｅｎｄＲモチーフについてのレセプターであるニューロピリン−１の発現に依存した。試験した７つ全ての腫瘍モデルでは、フルオレセイン、ファージまたは人工のナノ粒子のペイロードに結合されたｉＲＧＤは、インビボで腫瘍血管周囲に蓄積し、腫瘍間質に広がり、腫瘍細胞内に内部移行した。近赤外線色素で標識されたｉＲＧＤミセルの全身投与はマウスの全身画像化に強力かつ特異的な腫瘍シグナルを生じた。ｉＲＧＤの組織浸透特性は、診断画像化および治療のためのナノ規模のペイロードのシナフィック（ｓｙｎａｐｈｉｃ）（ドッキングベースの）腫瘍標的化のための新規なツールである。
【０１０４】
前立腺癌のマウスモデルを、ファージライブラリー選択において標的として用いて（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｓｗｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３８３〜３９１（２００３））、腫瘍血管に結合するペプチドを特定した。ＲＧＤモチーフを含んだファージ（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ（１９８４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００３））であって、３つの関連の配列ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（配列番号１）、ＣＲＧＤＲＧＰＤＣ（配列番号２）、およびＣＲＧＤＫＧＰＥＣ（配列番号３）内のファージは、選択されたプール中で優勢であった（表２）。ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（「ｉＲＧＤ」「内部移行する−ＲＧＤ」；配列番号１）が最も頻繁であって、さらなる分析のために選択した。
【０１０５】
【表２】
2014028862.tif 000009
４８例の固体クローンを最終回のエキソビボ・ファージ・ディスプレイで回収したファージプールから配列決定のために無作為にピックアップした。配列決定の結果が失敗であったクローン（５％未満）はこの分析の間除外した。各々のＲＧＤペプチドの割合を示す。
【０１０６】
ｉＲＧＤはフルオレセイン標識したペプチド（ＦＡＭ−ｉＲＧＤ）として合成して、このペプチドを腫瘍保有マウス中に静脈内注射した。ＦＡＭ−ｉＲＧＤは、試験した各々の腫瘍モデルで腫瘍組織に蓄積した。腫瘍はＵＶ光のもとで強力に蛍光を発したが正常な組織では蛍光性ではなかった（図１２Ａ、１２Ｂおよび１６）。コントロールのペプチドは、最低限の腫瘍蛍光しか生じなかった（図１２Ｂ）。過剰な未標識のｉＲＧＤペプチドを同時注射することによって、腫瘍におけるＦＡＭ−ｉＲＧＤの蓄積を大きく減じたが、非インテグリン結合（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ（１９８４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００３））改変体，ＣＲＧＥＫＧＰＤＣ（ｉＲＧＥ；配列番号２９１）は、同じ効果を有さなかった（図１２Ｃ）。これらの結果によって、ｉＲＧＤは腫瘍を特異的に標的化すること、およびそのＲＧＤモチーフは標的に重要であることが示される。
【０１０７】
共焦点顕微鏡によって、腫瘍血管の中および周囲、ならびに腫瘍実質内のＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドの蓄積が明らかになった（図１２Ｄ）が、正常な組織では見られなかった。著しいことに、ｉＲＧＤファージ（直径約５０ｎｍ）および別のｉＲＧＤ−コーティングナノ粒子、自己アセンブリングするミセル（直径１５〜２５ｎｍ）（Ｋａｒｍａｌｉら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ａｒｌｅｔｈら、Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈａｉｒｙ  ｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ａｎｄ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｄｉａ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１，３２７９〜３２９０（２００５））も血管外腫瘍実質に達した（図１２Ｄおよび図１７）。２つの他のＲＧＤペプチドおよび対応するファージ，ＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）およびＲＧＤ−４Ｃ（配列番号２９３）は、αｖインテグリンに対して強力な親和性を有し（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  α
５  β  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２０２０５−２０２１０（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｃｕｃｌｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｉｎｇ  ｓｉｚｅｓ：ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＧＤ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）１３，２６５〜２７０（１９９５））、やはり腫瘍にホーミングしたが、腫瘍血管におよびその周囲にのみ蓄積し、ｉＲＧＤのように間質全体には分散しなかった（図１２Ｄおよび１７）。
【０１０８】
近赤外線色素Ｃｙ７で標識したＦＡＭ−ｉＲＧＤミセルを注射したマウスの全身の画像化は、腫瘍からの強力かつ特異的なシグナルを生じ、腫瘍標的化についてのｉＲＧＤの能力を示している（図１２Ｅ）。ｉＲＧＤの内部移行特性および腫瘍組織へのそのみかけの広がりによって、ｉＲＧＤのこれらの固有の活性の背景にある機構の研究が促進された。
【０１０９】
培養された前立腺腫瘍細胞は４℃でｉＲＧＤファージに結合したが、有意に内部移行しなかった、一方３７℃では、結合および内部移行の両方が生じた（図１８）。４℃での結合は、用量依存性の方式で、遊離のｉＲＧＤペプチドによって、および非感染性（ＵＶ−不活性化）ｉＲＧＤファージによって阻害されたが、非−インテグリン−結合ｉＲＧＥペプチドまたはファージによっては阻害されなかった（図１３Ａ）。ＲＧＤ−指向性のインテグリンαｖβ３、αｖβ５、およびα５β１は、血管形成性の内皮細胞および特定の腫瘍細胞で上方制御される（ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００１）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００２））。ＰＰＣ１細胞は、αｖβ５およびα５β１を発現するが、αｖβ３は発現しない（図１９Ａ）。抗αｖβ５抗体はＰＰＣ１細胞に対するｉＲＧＤファージ結合をほぼ完全に阻害したが、αｖβ３、α５β１、およびいくつかの他のインテグリンに対する阻害性抗体は、効果を有さなかった（図１３Ｂ）。αｖβ３およびαｖβ５の両方を発現するＭ２１ヒト黒色腫細胞（ＣｈｅｒｅｓｈおよびＳｐｉｒｏ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ，ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１７７０３〜１７７１１（１９８７））（図１９Ｂ）は、ｉＲＧＤに結合したが、これらのインテグリンの発現を欠いている改変体は、結合せず、これによってｉＲＧＤ結合のαｖインテグリン依存性が確認された（図１３Ｃ）。Ｍ２１細胞結合は、抗αｖβ３または抗αｖβ５（図１３Ｃ）のいずれかによって軽減され、このことは、ｉＲＧＤがこれらのインテグリンの両方を認識することを示した。
【０１１０】
コンセンサスなＣｅｎｄＲモチーフであるＲ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号１３、１４、２９４、および２９５）は、細胞へのニューロピリン−１−依存性結合およびペプチドの内部移行を媒介することが示された。このモチーフは、ペプチド中のＣ末端位置を占める限り活性ではない。ｉＲＧＤは、ＣｅｎｄＲモチーフ、ＲＧＤＫ／Ｒを含むが、このモチーフはＣ−末端ではない。タンパク質分解性処理は、ＲＧＤ中でＣＲＧＤＫモチーフを活性化するために必要である場合があると理解された。実際図１４Ａに示されるとおり、アルギニンおよびリジン残基の後ろでタンパク質を切断するトリプシンを用いるｉＲＧＤファージの処理は、ＰＰＣ１細胞に対するｉＲＧＤファージの結合を増強した。トリプシンは、内部移行しないペプチドＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）またはＲＧＤ−４Ｃ（配列番号２９３）に効果を有さなかった（示さず）。インタクトなｉＲＧＤファージではないが、トリプシン処理したｉＲＧＤファージの４℃での結合は（示さず）、原型のＣｅｎｄＲペプチド、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）を発現する非感染性ファージによってブロックされたが、ＣｅｎｄＲモチーフがＣ末端に対するアラニン残基の付加によって破壊されたペプチド（ＲＰＡＲＰＡＲＡ；配列番号２９７）を提示するファージによってはブロックされなかった。
【０１１１】
ｉＲＧＤ中のＣｅｎｄＲモチーフが細胞性プロテアーゼによって実際に活性化されるか否かを決定するため、ＦＡＭ−ｉＲＧＤ（そのＮ末端にＦＡＭを担持する）を、ＰＰＣ１前立腺癌細胞とともにインキュベートして、細胞内産物を、抗ＦＩＴＣ抗体に対するアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。細胞表面でタンパク質分解を可能にしながら細胞質のタンパク質分解を妨げるために、インキュベーションはプロテアソームインヒビターの存在下で行った。細胞内の全長ＦＡＭ−ｉＲＧＤは検出されず、ＦＡＭ−ＣＲＧＤＫフラグメント（配列番号６）が回収された（図２０）。
【０１１２】
タンパク質分解性に放出されるＣＲＧＤＫ（配列番号６）はｉＲＧＤの活性な内部移行成分であるという意味に基づいて、ＣＲＧＤＫ（配列番号６）を発現するファージを操作して、これがＰＰＣ１細胞に結合およびその中に内部移行したことが見出された。結合プロセスはαｖインテグリン−依存性ではなかった（図２１Ａおよび図２１Ｂ）が、ＣｅｎｄＲシステムを要することが明らかになった。なぜなら、これはＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）ファージによって用量依存性に阻害されたからである（図１４Ｂ）。さらに、ＣｅｎｄＲペプチドについてのレセプターであるニューロピリン−１に対する抗体も結合を減らした（図１４Ｃ，左側のパネル）。ＣＲＧＤＫ（配列番号６）ファージは、ニューロピリン−１の発現が最小であるＭ２１細胞へ実質的に結合せず内部移行もしなかった（図２２）、しかし、これらの細胞においてニューロピリン−１の発現を強制し、結合（図１４Ｃ，右側のパネル）および内部移行（示さず）を３．５倍増大した。これらの結果によって、ＣＲＧＤＫ（配列番号６）（同様にＲＰＡＲＰＡＲ；配列番号２９６）が細胞に結合して、ＣｅｎｄＲ経路の後に内部移行することが示される。
【０１１３】
ｉＲＧＤで内部移行する配列であるＲＧＤＫ  ＣｅｎｄＲエレメント（配列番号１１）と一致して、ＣＲＧＤＫ（配列番号６）およびＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）ファージは、ＰＰＣ１細胞へのｉＲＧＤファージ内部移行をブロックした（図１４Ｄ）。抗−ニューロピリン−１はまた、内部移行を阻害したが（図１４Ｅ）、細胞に対するファージの結合の影響は小さかった（示さず）。ｉＲＧＤにおけるＲＧＤおよびＲＸＸＫモチーフの相対的な役割を、ｉＲＧＥファージを用いて試験したが、このｉＲＧＥファージは、破壊されたＲＧＤモチーフに起因してインテグリンに結合せず（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ（１９８４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００３））、ただし、ＣｅｎｄＲモチーフ，ＲＸＸＫを依然として含んでいる。ｉＲＧＥファージは、ＰＰＣ１細胞内に内部移行せず、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２９６）およびＣＲＧＤＫ（配列番号６）は両方とも内部移行を阻害し（図１４Ｄ）、このことによって、これはＣｅｎｄＲ内部移行経路に続くことが示された。内部移行はｉＲＧＤのものよりもかなり有効であったが、これはおそらくｉＲＧＥが細胞表面でファージを濃縮するであろうインテグリン結合を欠いているためであった。これらの結果によって、ｉＲＧＤはＲＸＸＫ配列を利用するＣｅｎｄＲ経路を通じて細胞内で内部移行すること、およびこの内部移行は、ＲＧＤを通じたインテグリンへの最初の結合によって容易にされることが示される。
【０１１４】
共焦点顕微鏡によって、ｉＲＧＤファージおよびニューロピリン−１が特定の領域に、および培養細胞の核に同時局在することが示され（図１５Ａ）、このことは腫瘍細胞へのｉＲＧＤの内部移行におけるＣｅｎｄＲ経路の関与を支持している。ＣｅｎｄＲモチーフ（ＣＲＧＤＧＧＰＤＣ；配列番号２９８）、ＣＲＧＤＣ（配列番号２９２）、またはＲＧＤ−４Ｃ（配列番号２９３）（図２３）を欠くｉＲＧＤ改変体を提示しているファージは、ニューロピリン−１で同時局在せず、それらは内部移行することもなかった。新規のＰＤＡＣを保有しているマウスへのＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドの静脈内注射（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，（２００２））の後、ペプチドは最初に、腫瘍血管で同時局在し、次いでαｖインテグリンに陽性である腫瘍細胞内で出現した（図１５Ｂ，左側のパネル）。重要なことに、ニューロピリン−１について強力に陽性の腫瘍細胞は、ＦＡＭ−ｉＲＧＤを蓄積および保持するのに特に有効であった（図１５Ｂ，右側のパネル）。
【０１１５】
これらの結果、ｉＲＧＤの新規な多段階標的機構が示され、インタクトなペプチドがαｖインテグリンを発現する細胞の表面で蓄積し、ここでこのペプチドはタンパク質分解的に切断して、ＣＲＧＤＫ（配列番号６）フラグメントを含んでいるＣｅｎｄＲモチーフを生成する。次いでこのフラグメントは、ニューロピリン−１に結合して、標的細胞内に内部移行する（図２４）。この機構はｉＲＧＤスペシャルを作製し：これは強力な腫瘍特異性を呈し、標的細胞内に効率的に内部移行され、腫瘍組織に浸透する。この多段階工程は、ｉＲＧＤの腫瘍特異性に各々が加わってもよい。なぜなら、αｖインテグリンおよびニューロピリン−１の発現は種々の腫瘍型で上昇するからである（ＥｌｉｃｅｉｒｉおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００１）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２００２）；Ｐｅｌｌｅｔ−Ｍａｎｙら、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４１１，２１１〜２２６（２００８））。同じことがプロテアーゼ（単数または複数）を処理することにも当てはまる場合がある。例えば、Ｒ／ＫＸＸＲ／Ｋ  ＣｅｎｄＲモチーフと類似の配列後でタンパク質を優先的に切断する、膜結合プロテアーゼであるマトリプターゼは腫瘍で過剰発現される（Ｕｈｌａｎｄ，Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．６３，２９６８〜２９７８（２００６））。
【０１１６】
インテグリンは細胞表面から細胞内区画へ往復し、かつ細胞表面に戻り、そして特定のウイルス病原体は細胞へ進入するのにこの機構を利用する（ＰｅｌｌｉｎｅｎおよびＩｖａｓｋａ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｔｒａｆｆｉｃ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１９，３７２３−３７３１（２００６））。しかし、ＣｅｎｄＲ経路を要する、ｉＲＧＤの内部移行能力は、従来のＲＧＤペプチドの能力よりもかなり効果的であり、その後にインテグリン輸送が続く。最も顕著な結果は、ｉＲＧＤの組織浸透活性であって、これは従来のＲＧＤペプチドおよびそれらの模倣物で達成され得る活性をかなり上回り、これは腫瘍血管に対するそれらのペイロードしかとらない（Ｍｕｒｐｈｙら、（２００８）；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、αｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，５４２〜５４６（１９９７））。このことによってＣｅｎｄＲモチーフは、依然として構想される機序を介して腫瘍間質への浸透のために重要であることが示される。
【０１１７】
いくつかの以前に記載された腫瘍特異的な細胞浸透ペプチドは潜在性のＣｅｎｄＲ配列を含む（Ｈｏｆｆｍａｎら、（２００３）；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、Ａ  ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８，７５１〜７５５（２００２）；Ｐｏｒｋｋａら、Ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ
ｔｈｅ  ＨＭＧＮ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，７４４４〜７４４９（２００２）；Ｊｏｙｃｅら、Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  ａ
ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３９３〜４０３（２００３））。ＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号２９９；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、（２００２））は９アミノ酸の環状ペプチドであって、特定のレセプターの結合部位（Ｆｏｇａｌら、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ／ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ３２／ｇＣ１ｑＲ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｒｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，７２１０〜７２１８（２００８））および潜在性のＣｅｎｄＲモチーフであるＫＲＴＲ（配列番号２９９のアミノ酸４〜７）を有する。ｉＲＧＤナノ粒子と同様、ＬｙＰ−１−コーティングされたナノ粒子は静脈内注射後数分内で腫瘍組織に滲出する（Ｋａｒｍａｌｉら、（２００８）；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、（２００２）；ｖｏｎ  Ｍａｌｔｚａｈｎら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  “ｃｌｉｃｋ”  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９，１５７０〜１５７８（２００８））。ＬｙＰ−１および他のホーミングペプチドの活性におけるＣｅｎｄＲの関与はまだ研究されなければならないが、同様に考えられる。ｉＲＧＤおよびＣｅｎｄＲシステムは、癌標的および処置を改善するために用いられ得る。
【０１１８】
１．方法
マウスを施設のガイドラインに従って維持し、動物実験はカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）の動物研究委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認された。本発明者らは、トランスジェニック腫瘍マウス（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，（２００２）；Ａｒｂｅｉｔら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ
Ｋ１４−ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４３５８〜４３６８（１９９４）；Ｈａｎａｈａｎ，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ／ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，１１５〜１２２（１９８５））およびＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに１０６個のヒト癌細胞を同所に、心臓内にまたは脳および脛骨内に注射することによって作製した異種移植片腫瘍（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いた。個々のペプチド（例えば、ｉＲＧＥ）を発現するＴ７ファージを、製造業者の指示に従って、Ｔ７−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎ．Ｊ．）で作製した。インビボでのファージホーミング研究およびインビトロでの細胞結合研究（Ｚｈａｎｇら、（２００６））、免疫蛍光（Ｋａｒｍａｌｉら、（２００８））およびフローサイトメトリー（Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＤ４４  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ４４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３２２５９〜３２２６５（２００３））を記載のとおり行った。全身画像化を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いてＣｙ７標識したミセルの注射３時間後に行った。ファージ内部移行アッセイでは、細胞を１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）のファージを用いて３７℃で１時間処理し、酸性緩衝液（グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）で洗浄して、細胞表面に対して結合されたファージを取り除きかつ不活性化し、ファージ滴定のために溶解した。ペプチドの内部移行は、２０μＭのＦＡＭ−標識したペプチドとともに９０分間３７℃でインキュベートすることによって研究した。ＰＰＣ１に内部移行したＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドは、抗ＦＩＴＣ親和性クロマトグラフィーによって酸洗浄した細胞から取り除き、質量分析計によって分析した。ファージの結合および／または内部移行を阻害するために、ＵＶ照射によって非感染性にされた合成ペプチドまたはファージを、試験ファージとのインキュベーションの２０分前に細胞に添加した。組織中のＦＡＭ−標識ペプチドを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて蛍光を測定することによって定量した。スチューデントのｔ検定および一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）続いて適切な事後のｔ検定を統計学的分析に用いた（表３）。
【０１１９】
【表３−１】
2014028862.tif 000010
【０１２０】
【表３−２】
2014028862.tif 000011
ｉ．腫瘍モデル
異種移植片は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに以下の１０６個のヒト癌細胞を同所性にまたは脛骨および脳に注射することによって作製した：前立腺癌ＰＣ−３（Ｙａｎｇら、Ａ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，７８１〜７８６（１９９９））、ＰＰＣ１（Ｚｈａｎｇら、（２００６））、および２２Ｒｖ−１（Ｄｒａｋｅら、Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２２，６７４〜６８４（２００５））、膵臓癌ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＣＤ４４  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ＣＤ４４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ
ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，７１９１〜７１９９（２００８））、および乳癌ＢＴ４７４（Ｒｕｓｎａｋら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＥｒｂＢ−２  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＧＷ２０１６，ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ
ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１，８５−９４（２００１））。播種性の前立腺腫瘍は、心臓の左心室に１０６個のＧＦＰ−ＰＣ−３細胞を注射することによって生成した（Ｙａｎｇら、（１９９９））。腫瘍は、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｉｎ
Ｖｉｖｏ  ＦＸのＸ線システム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ）またはＩｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＴ−９９００（Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いてモニターした。トランスジェニックマウスを記載のとおり維持した（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ（２００２）；Ａｒｂｅｉｔら、（１９９４）；Ｈａｎａｈａｎ（１９８５））。
【０１２１】
ｉｉ．ファージライブラリーのスクリーニング
本発明者らは、Ｔ７ファージ（多様性約１０９）で提示される環状のＣＸ７Ｃ（Ｃ＋システイン；Ｘ＝任意のアミノ酸）ペプチドライブラリー、ならびにエキソビボおよびインビボのスクリーニングの組み合わせを用いた（Ｈｏｆｆｍａｎら、（２００３））。ＰＰＣ１およびＰＣ−３（図２５Ａ）の異種移植片またはＧＦＰ−ＰＣ−３の播種性の骨腫瘍を用いた（図２５Ｂ）。腫瘍細胞懸濁物での３回のエキソビボ選択に続いて腫瘍ホーミングのための１回のインビボ選択を行った。最終のエキソビボ選択の後、得られたファージプールは、腫瘍細胞由来懸濁物に対してもとのライブラリーより２００〜４００倍多く、正常な骨髄由来細胞に対して５倍多く結合した（図２５Ｃ）。個々のファージクローンはファージプールから無作為にピックアップされて配列決定された。
【０１２２】
ｉｉｉ．インビボのペプチドおよびファージホーミング
フルオレセインで標識した合成ペプチド（Ｋａｒｍａｌｉら、（２００８））（約２００μｇ）を腫瘍保有マウスに静脈内注射して、１５分〜２時間循環させた。組織を収集して、ＵＶ光下で観察するか（Ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＴ−９９００）または免疫蛍光のために処理した（Ｋａｒｍａｌｉら、（２００８））。ファージホーミングを評価するために（Ｚｈａｎｇら、（２００６））、１０９ｐｆｕのＴ７ファージを、腫瘍保有マウスに静脈内注射して、１５分間循環させた。そのマウスを、１％ＢＳＡを含有しているＰＢＳを用いて心臓を通して灌流させ、その組織を免疫蛍光のために回収した。
【０１２３】
ｉｖ．ミセルの調製
脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−ｉＲＧＤ（ＦＡＭ）は、Ｎ末端上にシステインを保有しているＦＡＭ−ｉＲＧＤペプチドを、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−マレイミド（ポリエチレグリコール）２，０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−マレイミド）に対して室温で４時間１：１のモル比でカップリングすることによって調製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−ＦＡＭは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２，０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−アミン）とＮＨＳ−フルオレセイン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とを１：１のモル比で、室温で１時間カップリングすることによって調製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−Ｃｙ７は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−アミノ（ポリエチレングリコール）２，０００およびＣｙ７−ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いて同様に調製した。
【０１２４】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−ｉＲＧＤ（ＦＡＭ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−アミンおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−Ｃｙ７を３：６．７：０．３のモル比でクロロホルム／メタノール（３：１，ｖ／ｖ）中に溶解した。その溶媒をエバポレートして、乾燥された脂質フィルムを減圧下で８時間維持して、ＰＢＳ中で、６０℃で２時間膨張させた。そのバイアルをボルテックスして、超音波処理し、ミセルを生じた。そのミセルを０．２μｍおよび０．１μｍのフィルターを通じて連続的に濾過して、無菌のＰＢＳで洗浄して未反応のペプチドを除去した。コントロールのＣｙ７ミセルを、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−ＦＡＭをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２，０００−ｉＲＧＤ（ＦＡＭ）の代わりに用いて調製した。そのミセルは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）で、動的レーザー光散乱（屈折率、１．５９；粘性、０．８９）によって脱イオン水中で測定した場合、１５〜２５ｎｍの直径であった。
ミセルペプチドコンジュゲートのインビボ画像化。
【０１２５】
ＰＤＡＣマウス（ＢａｒｄｅｅｓｙおよびＤｅＰｉｎｈｏ，（２００２））に、ＰＢＳ中の１ｍＭミセルの１００μｌを注射した。３時間後そのマウスを麻酔して、剃毛し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いる全身画像化に供した。
【０１２６】
ｖ．免疫蛍光
組織切片は、記載どおりに処理した（Ｋａｒｍａｌｉら、（２００８））。細胞（２×１０５個の細胞）をコラーゲンＩ−コーティングカバースリップ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で一晩増殖し、１０８ｐｆｕ／ｍｌのＴ７ファージとともに３０分間インキュベートした。その細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定して、抗体およびＤＡＰＩで染色した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。一次抗体はラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびウサギ抗ヒトαｖインテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ウサギ抗ヒトニューロピリン−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウス抗ヒトニューロピリン−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）、およびウサギ抗Ｔ７ファージポリクローナル抗体であった。マウス、ラットおよびウサギＩｇＧに対する二次抗体，Ａｌｅｘａ５９４ヤギ抗体、およびＡｌｅｘａ４８８ロバ抗ウサギ抗体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからであった。細胞および組織切片は、共焦点顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ５００，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）によって検査した。
【０１２７】
ｖｉ．インビトロのファージ結合および内部移行アッセイ
懸濁された細胞（１％のＢＳＡを含有するＤＭＥＭ中の１０６個の細胞）を１０８ｐｆｕ／ｍｌのＴ７ファージとともに４℃で１時間インキュベートした。その細胞を結合緩衝液で４回洗浄し、１％のＮＰ−４０を含有する溶原性ブロスで溶解して、滴定した。ファージ内部移行アッセイは、細胞を３７℃でファージとともにインキュベートしたこと、および酸性緩衝液（５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグリシン、１％のＢＳＡ，ｐＨ２．５）を第二の洗浄で結合緩衝液と置き換えたこと以外は同じ手順を用いた。結合および内部移行のインヒビターをファージとのインキュベーションの２０分前に添加した。非感染性ファージを、１％ＢＳＡを含有しているＤＭＥＭ中で８分間ＵＶを用いてファージを処理することによって調製した。１粒子あたり約２００ペプチドを発現するＵＶ不活性化ファージ粒子が得られ、これを多価インヒビターとして用いた。遊離の合成ペプチド、ヒトα１、α２、αｖβ３、αｖβ５、α５β１、α４またはαｖインテグリンおよびインテグリンサブユニットに対するマウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ヤギ抗ウサギニューロピリン−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と、マウスおよびヤギのＩｇＧアイソタイプコントロール（Ａｂｃａｍ）も試験した。
【０１２８】
ｖｉｉ．フローサイトメトリー
１ｍＭのＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２を緩衝液に添加したこと以外は、実験は記載のとおり行った（Ｓｕｇａｈａｒａら、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＤ４４  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ４４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３２２５９〜３２２６５（２００３））。この抗体は、細胞結合アッセイと同じであって、Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で検出した。細胞はＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で分析した。
【０１２９】
ｖｉｉｉ．ＦＡＭ−ｉＲＧＤフラグメント単離
ＰＰＣ１細胞（ＤＭＥＭ中の１０７個の細胞）を１０μＭのカルボベンゾキシル−ロイシニル−ロイシニル−ロイシナル（ＭＧ１３２，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を用いて３０分間３７℃で処理してプロテアソームを阻害して、Ｎ−末端またはＣ−末端をＦＡＭで標識した２０μＭのｉＲＧＤペプチドとインキュベートした。この細胞を酸性緩衝液で１回洗浄し、氷上でプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有するＭＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で３０分間溶解した。そのサンプルを３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上清を抗ＦＩＴＣアフィニティーカラムに加え、洗浄後、結合したペプチドをグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８で溶出した。その溶出物を質量分析にかけた。
【０１３０】
本出願全体を通じて、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する当該分野の状況をさらに詳細に記載するためにその全体が出典明記によって本出願に援用される。
【０１３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの、ある（不定冠詞：ａ、ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。従って、例えば、「あるペプチド（ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という言及は、複数のこのようなペプチドを包含し、「このペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）という言及は、当業者に公知の１つ以上のペプチドおよびそれらの均等物などについての言及である。
【０１３２】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、その後に続いて記載される事象、環境または材料（物質）が生じても生じなくても存在しなくても存在してもよいことを意味し、そしてその説明はその事象、環境または材料（物質）が生じるかまたは存在する場合、および生じず、存在もしない場合を包含する。
【０１３３】
範囲は、本明細書においては、「約、およそ、ほぼ」ある特定の値から、および／または「約、およそ、ほぼ」別の特定の値までで表されてもよい。このような範囲が表される場合、また特に意図されて、開示されると考慮されるのは、その文脈が特に他を示すのでない限り、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までの範囲である。同様に、値が近似値で表される場合、先行詞「約」という使用によって、特定の値が、文脈上特に他を示すのでない限り、開示されるとみなされるべき別の特に意図される実施形態を形成することが理解されるであろう。この範囲の各々のエンドポイントは他のエンドポイントに関して、かつ文脈上特に他を示すのでない限り他のエンドポイントと独立して、その両方で重要であることがさらに理解されるであろう。結局、明確に開示される範囲内に含まれる個々の値および値の部分的範囲の全てがまた特に考慮され、かつ文脈上特に他が示されるのでない限り開示されるとみなされるべきであることが理解されるべきである。前述は、これらの実施形態の特定の場合いくつかまたは全てが明確に開示されるか否かにかかわらずあてはまる。
【０１３４】
他に規定しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、開示される方法および組成物が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様または均等な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実践または試験において用いることができるが、特に有用な方法、デバイスおよび材料は記載されるとおりである。本明細書に引用される刊行物およびそれらに挙げられる材料は、出典明記によって本明細書に詳細に援用される。本明細書は決して本発明が先行発明を理由としてこのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。いかなる引用文献も先行技術を構成するとは承認されない。引用文献の考察はそれらの著者が主張するものを言及しており、出願人らは引用される文献の正確性および適切性に意義を申し立てる権利を保留している。多数の刊行物が本明細書で言及されるが、このような引用文献はこれらの文書のいずれかが当該分野の共通の一般的な知識の一部を構成することを認めるものではないことが明らかに理解される。
【０１３５】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通じて「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびその用語の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「限定するものではないが〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味し、例えば、他の追加物、成分、整数または工程を排除する意図はない。
【０１３６】
開示される方法および組成物は、それらが変化し得るので、特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが理解される。本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であって、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【０１３７】
当業者は、慣用的な実験以下を用いて、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【０１３８】
【数１】
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【０１３９】
【数２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014028862000001.pdf