(57)【要約】【課題】胚性幹細胞培養のための自動化された方法および装置の提供。【解決手段】ヒトＥＳ細胞の増殖は極めて非効率的であって、変動的なプロセスである。なぜなら培養技術は、高程度の人的な熟練および時間を要するからである。さらに、ＥＳＣ培養の時間、労力および複雑性によって、このような培養に極めて高いコストがもたらされている。従って、幹細胞培養のための現行の方法では、研究団体の要求を満たすのに十分な数のＥＳＣの産生についてさえ不十分である。本発明は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、例えば、ヒトＥＳＣの自動化培養のための方法に関する。いくつかの局面では、本発明の方法は、細胞の最適化培養培地および限定的タンパク質分解処理を使用して、増殖のために細胞集合を分ける。ＥＳＣの継代および増殖のための自動化システムも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９４７，０１３号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／９４７，０１３号の全ての開示は、その全体がことわりなく参考として本明細書中に特に援用される。
【０００２】
本発明は、米国科学財団によって授与された補助金番号ＳＢＩＲ０７１２１８１のもと、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明における特定の権利を保有する。
【０００３】
本発明は、哺乳動物組織細胞培養システムに関する。さらに詳細には、本発明は自動化された幹細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）によるヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）の安定な培養の開始以来、ますます多くの研究者らがＥＳＣの潜在的な治療用途および診断用途を探索し始めている。しかし、ＥＳＣの研究使用でさえ、ＥＳＣ培養の限られた供給には負担となっている。ヒトＥＳ細胞の増殖は極めて非効率的であって、変動的なプロセスである。なぜなら培養技術は、高程度の人的な熟練および時間を要するからである。さらに、ＥＳＣ培養の時間、労力および複雑性によって、このような培養に極めて高いコストがもたらされている。従って、幹細胞培養のための現行の方法では、研究団体の要求を満たすのに十分な数のＥＳＣの産生についてさえ不十分である。ＥＳＣ細胞の商業上実現可能な治療用途および診断用途を実現するためにはさらに多数のＥＳＣが必要であろう。従って、ＥＳＣの培養のためには改良された費用効果的方法が必要である。
【０００５】
以前に、ＥＳ細胞培養の自動化維持のための方法が記載されている（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅら、２００７）；しかし、このような方法では、ＥＳ細胞培養物を増殖させることができず、従って大規模のＥＳ細胞産生に関連する問題に取り組むことはできない。手技的な手順での極めて大きい変動および細胞の経済的な大規模化産生への限界のせいで、自動化によって大量の細胞系列を経済的に大量に産生する能力は、この極めて若くかつ有望な分野では成功を定義し得る重要な基準であるようである。明らかに、ＥＳ細胞の培養および産生のための改良された方法およびシステムの必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、胚性幹細胞の効率的な継代および増殖のための方法および組成物を提供することによって先行技術の限界を克服する。特定の実施形態では、本発明は、胚性幹細胞の効率的な培養および増殖のための最適化された自動化システムを提供する。例えば、第一の実施形態では、胚性幹（ＥＳ）細胞の自動化された増殖または継代のための方法が提供され、この方法は、（ａ）増殖培地においてＥＳ細胞の第一の集団を得る工程と、（ｂ）自動化分離システムによってこのＥＳ細胞を分離する工程と、（ｃ）新鮮な増殖培地中にこの分離された細胞を懸濁してＥＳ細胞の増殖した集団を得る工程とを包含する。好ましい局面では、このような方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の継代または増殖のために用いられ得る。本明細書において用いる場合、細胞の「継代」という用語は、細胞の培養であって、この細胞が生存したままであるが、活発に分裂してもしなくてもよい細胞の培養をいう。さらに「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」という用語は、細胞の数が培養時間とともに増大する分裂している細胞の増殖をいう。ヒトＥＳＣなどの胚性幹細胞を得るための方法は、以前に記載されており、参照によって各々が本明細書に援用される、例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号、および同第７，０２９，９１３号を参照のこと。
【０００７】
特定の局面では、本発明は、細胞増殖培地に関する。例えば、ある局面では、増殖培地は、血清、例えば、ヒトまたはウシの血清を含んでもよい。他の局面では、増殖培地は、血清なしの培地、血清タンパク質なしの培地、またはタンパク質なしの培地として規定されてもよい。種々の実施形態では、培養された増殖されたＥＳ細胞では分化は全く生じないかまたは本質的に生じない；例えば、下の実施例では、Ｏｃｔ４発現に基づいて、培養された増殖されたＥＳ細胞のうち少なくとも９７％が未分化の状態で残っていた。当業者は、本発明による培地が、限定はしないがビタミン、緩衝液、グルタミン、糖（例えば、ピルビン酸塩）、還元剤（例えば、βメルカプトエタノール）、抗生物質、抗真菌剤、サイトカインまたは増殖因子を含む多数の成分を含んでもよいことを理解する。さらに、好ましい局面では、本発明による使用のための培地は解離されたＥＳ細胞中でアポトーシスを減じる成分を含んでもよい。例えば、培地は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、例えば、Ｙ−２７６３２，ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２またはその誘導体を含んでもよい（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７）。さらに、特定の局面では、本発明による増殖培地は、有効量のＲＯＣＫインヒビターを含んでもよく、この量は、細胞分離の間、細胞の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれ以上でアポトーシスを妨げるのに有効である量である。本発明の特定のさらなる局面では、培地は「規定の培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）」であってもよく、ここではこの培地処方物の正確な成分は既知である；例えば、規定培地は、バッチ間の状況で変化する、血清などの「規定されていない」動物産物を含まない。いくつかの極めて特異的な局面では、本発明における使用のための培地は、ＴｅＳＲ培地、例えば、規定のＴｅＳＲ培地であってもよい（表１：Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００７；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６）。
【０００８】
幹細胞、例えば、ヒトＥＳＣを培養するための種々の方法が本発明で用いられ得る。代表的には、ＥＳＣは、組織培養プレート上などで接着培養系で増殖される。特定の局面では、本発明における使用のための培養プレートは、コラーゲンまたはヒドロゲル・マトリックスなどのゲル・マトリックスを含んでもよい（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））。種々の実施形態では、培養プレートは、例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンでコーティングされてもよく、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）に記載されるように、胚性細胞の培養および維持のための固体支持体を提供するために組み合わせて用いられてもよい。組織培養プレートをコーティングするために本発明で用いられ得るマトリックス成分としては、コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ、ラミニン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ−１、−２、−３、−４および/または−５）、および/またはＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆ（商標）が挙げられる。組織培養中での使用のための三次元支持マトリックスは例えば、参照によって本明細書に各々援用される、米国特許出願公開第２００６０１９８８２７号および同第２００６０２１０５９６号に以前に記載されている。特定の局面では、接着性組織培養細胞は、細胞密度またはコンフルエンシーによって規定され得るということが当業者には理解されるであろう。従って、ある場合には、本発明の方法は、さらなる細胞増殖を促進するために高密度から低密度へ細胞を増殖するという増殖を包含する。例えば、本発明による細胞を増殖するための方法は、約５０％〜約９９％コンフルエントであるＥＳ細胞の第一の集団を包含し得る。例えば、特定の局面では、ＥＳ細胞の第一の集団は、約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％であるかまたはそれ以下コンフルエントであってもよい。さらに、特定の局面では、接着性ＥＳ細胞の増殖または継代は、新鮮な増殖培地中に分離された細胞を播種する工程を包含し得る。本明細書において用いる場合、細胞を「播種する」という用語は、得られる細胞培養物（単数または複数）がほぼ均一な密度であるように増殖培地中で細胞を分散させる工程を意味する。従って、細胞の播種とは、分離した細胞を新鮮な増殖培地と混合する工程、および／または組織培養プレートの表面を覆って分離した細胞を空間的に分散させる工程を包含し得る。
【０００９】
さらに、特定の局面では、本発明の方法は、新鮮な培地中で細胞を特定の密度に播種する工程を包含し得る。例えば、ある場合には、新鮮な培地中に分離した細胞の播種のために用いられる相対的な密度によって方法が規定され得る。例えば、分離された細胞は、ＥＳ細胞の第一の集団を含む表面積よりも大きいプレート表面積にわたって播種され得る。好ましい局面では、新規な細胞培養プレート（単数または複数）の表面積は、ＥＳ細胞の第一の集団を含むプレートの表面積よりも約、または約５倍〜約３５倍、約１０〜約３５倍、約１５〜約３０倍、または約２８〜約３４倍、または約３０倍、３１倍もしくは３２倍大きい。特定の局面では、本発明による細胞の増殖はより大きい培養プレート上に細胞を播種する工程を包含するが、ある場合には細胞は、複数のプレートに播種されてもよく、ここで新規なプレート表面積とはこの分離された細胞が播種されるプレートの表面積の合計として規定されることが当業者には理解されるであろう。従って、ある局面では、本発明の方法は、出発する細胞培養集団から複数の細胞培養集団を産生するために用いられ得る。
【００１０】
ある局面では、本発明は、自動化分離システムなどの細胞の分離のためのシステムに関する。特定の局面では、ＥＳ細胞は、機械的にまたは化学的に分離され得る。化学的分離は、キレート分子（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩、またはカルシウムおよび／もしくはマグネシウムイオンを効率的にキレートもしくは複合体化し得る類似の分子）を用いることによって達成され得る。他の実施形態では、尿素が細胞培養プレートから細胞を分離または取り出すために用いられ得る。これらのイオンの除去によって、お互いに対する、および血管表面に対する細胞の結合に必要なタンパク質がゆがめられる。ＥＤＴＡは細胞を剥離、および個別化するという目的のために販売されるほとんどのトリプシン試薬に存在する。化学物質は、細胞を十分バラバラにするおよび個別化するために、培地中の約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの最終濃度で用いられ得る。しかし、特定の場合には、細胞分離は、この細胞とタンパク質分解酵素などの酵素とを接触させることによって容易になる場合がある。例えば、タンパク質分解酵素は、トリプシンまたはトリプシン様プロテイナーゼ、例えば、精製もしくは組み換えのプロテイナーゼであってもよい。従って特定の局面では本発明による使用のための酵素は、他のヒトまたは動物のタンパク質または核酸を本質的に含まない組み換え酵素であってもよい。いくつかの特定の局面では、本発明での使用のためのプロテイナーゼは、ＴＲＹＰＬＥ（商標）であってもよい。さらに、特定の局面では、細胞は、１×濃度のＴＲＹＰＬＥ（商標）酵素溶液と接触されてもよい。当業者は、本発明の方法で使用される酵素の濃度は、細胞が酵素に曝される時間（すなわち、細胞が活性な酵素に曝される時間）の長さおよび曝露／インキュベーションの間の温度に依存するということを理解する。さらに、培養培地中のタンパク質は、細胞集合の分離において有効なタンパク質分解酵素を減少し得、従って、特定の局面では、細胞増殖培地は、細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる前に除去され得る。従って、特定の局面では、本発明の方法は、細胞分離のためのシステムを含み得、このシステムは、（ｉ）上記第一のＥＳ細胞集団から上記培地を除去する工程と；（ｉｉ）ＥＳ細胞集団とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と；（ｉｉｉ）この細胞集団とタンパク質分解酵素とをインキュベートして細胞集合を分離する工程とを包含する。例えば、ある場合には、ＥＳ細胞を約２〜約１０分の間、例えば、ほぼ、または多くとも約３、４、５、６、７、８または９分の間、上記タンパク質分解酵素または化学物質とともにインキュベートする。酵素的活性が代表的には温度依存性であり、従って活性はインキュベーション温度を変化させることによって調節され得ることを当業者はまた認識する。従って、特定の局面では、ＥＳ細胞は、約２５℃〜約４０℃、例えば、約２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、または３９℃でトリプシンなどの酵素とインキュベートされてもよい。
【００１１】
当業者は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素に対する細胞の過剰な曝露が細胞生存に対して有害であり得ることを認識するであろう。従って、特定の局面では、プロテイナーゼのインキュベーションをモニターして組織培養プレートから細胞を分離するか、または細胞集合を分離するのに必要なインキュベーションの長さを決定してもよい。例えば、インキュベーションを、顕微鏡を介してまたはフローサイトメトリーによってモニターしてもよい（例えば、細胞集合の大きさを評価するために）。フローサイトメトリーを行うための方法は、当該分野で周知であって、例えば、米国特許第４，２８４，４１２号、同第４，９８９，９７７号、同第４，４９８，７６６号、同第５，４７８，７２２号、同第４，８５７，４５１号、同第４，７７４，１８９号、同第４，７６７，２０６号、同第４，７１４，６８２号、同第５，１６０，９７４号および同第４，６６１，９１３号を参照のこと。ある好ましい局面では、プロテイナーゼインキュベーションは、コンピューターによってモニターされてもよく、そのインキュベーションは、最適の細胞分離が達成されるとき（例えば、プロテイナーゼインヒビターの添加によって）中断されてもよい。従って、ある場合には、細胞の希釈または播種のための新鮮な培地は、酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒビターを含んでもよい。特定の局面では、本発明による使用のための新鮮培地は、細胞分離のために用いられるタンパク質分解酵素のインヒビターを含んでもよい。例えば、好ましい局面では、新鮮培地は、酵素活性のうちおよそ、または少なくともおよそ７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または実質的に全てを阻害するのに十分な酵素インヒビターの量を含んでもよい。例えば、本発明による細胞分離システムにトリプシンを用いる場合には、新鮮培地は、ダイズトリプシンインヒビターなどのトリプシンインヒビターを含んでもよい。例えば、いくつかの極めて特異的な局面では、新鮮増殖培地は、約０．５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含んでもよい。他の実施形態では、天然のトリプシンインヒビター、例えば、血清に存在するものを、例えば、細胞の分割の間、培地中に含まれるように、本発明で用いてもよい。なおさらなる局面では、細胞増殖培地はさらに、酵素が本質的に不活性化された後に、酵素インヒビターを含まない培地で置き換えられてもよい。
【００１２】
種々の他のプロテアーゼインヒビターを本発明で用いてもよい。ほとんどの場合、タンパク質分解酵素の希釈は、細胞に対する損傷を妨げるために十分である。本発明で用いられ得るプロテアーゼインヒビターの非限定的な例は以下から得ることができる：血清（例えば、α１−アンチトリプシン、約５２ｋＤａの血清トリプシンインヒビター）、ライマメ（例えば、約８〜１０ｋＤａという６つのライマメインヒビターが公知である）、ウシ膵臓（例えば、約６．５ｋＤａのアプロチニンとしても公知のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）インヒビター）、鳥類の卵白（例えば、オボムコイドは、約８〜１０ｋＤａの鳥類の卵白で見出される糖タンパク質プロテアーゼインヒビターである）および／またはダイズ（代表的には約２０．７〜２２．３ｋＤａであるいくつかのインヒビターが公知である）。
【００１３】
特定の好ましい局面では、本発明による方法は、自動化され得る。例えば、リキッド・ハンドラー・ロボットを用いて、本明細書に記載の方法を自動化してもよい。多彩なリキッド・ハンドラー・ロボットが当該分野で公知であって、本発明に従って用いられてもよく、例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，３２５，１１４号を参照のこと。ある局面では、本発明による使用のためのロボットは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）２０００リキッド・ハンドラー（Ｂ２Ｋ）であってもよい。さらに、本発明による使用のための自動化システムまたは装置は、バイオリアクターを備えてもよいと考えられ、ここでは流体の移動および／または細胞の播種は、ポンプまたは圧力勾配によって媒介される。下の実施例に示されるとおり、自動化装置およびシステムは、ヒトＥＳＣをフィードすることおよび再生可能な方法で分割することのために作り出される；この装置およびシステムを用いて培養されるヒトＥＳＣは、高品質であって、有意な分化を示さなかった（Ｏｃｔ４  ＦＡＣＳ分析によって測定される場合、９７％より多くが未分化）。下の実施例で用いられる特定の細胞はヒトＥＳＣであるが、本発明者らは、他のヒトもしくは哺乳動物の幹細胞もしくはｉＰＳ細胞が本発明によって未分化状態で培養、増殖および維持され得ると予想する。
【００１４】
種々の実施形態では、本発明の方法は、細胞の種々の状態を調節し得る化合物をスクリーニングするために用いられ得る。下の実施例に示されるとおり、この技術が規定の培養条件を用いてヒトＥＳＣ細胞培養ベースの低分子スクリーニングに用いられ得るということを、本発明者らは首尾よく示した。特定の実施形態では、本発明の方法、装置およびシステムは、細胞の種々の状態に影響し得る１つ以上の候補化合物（単数または複数）をスクリーニングするために用いられ得る。例えば、候補化合物は、特定の系列（例えば、造血系など）へ向かう幹細胞の分化を促進し得る。他の実施形態では、候補化合物は、細胞中の脱分化を促進するかまたは脱分化状態を維持し得る（例えば、線維芽細胞または他の細胞からのｉＰＳ細胞の生成を促進する）。
【００１５】
なおさらなる局面では、本発明の方法は、細胞を分離するための装置またはシステムを包含し得、このシステムは、組み合わせまたは機械的分離および酵素分離を包含する。例えば、ある場合には、細胞をトリプシンなどの酵素とともにインキュベートして、続いて機械的攪拌によって細胞集合をさらに分離してもよい。例えば、機械的攪拌は、細胞を開口部を通して繰り返しピペッティングすることなどによって細胞を剪断力に供する工程を包含し得る。
【００１６】
当業者は、多数のＥＳ細胞培養システムが、ＥＳ細胞増殖および／または分化を媒介する因子をトランスで供給する「フィーダー細胞」を含むことを理解するであろう。しかし、特定の局面では、本発明の方法は、非ＥＳ細胞を本質的に含まず、非ヒト細胞も本質的に含まないＥＳ細胞の集団に関する。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、本発明の方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞の連続的増殖のための自動化方法として規定され得、この方法は（ａ）増殖培地中でＥＳ細胞の第一の集団を得る工程と、（ｂ）自動化分離システムでこのＥＳ細胞を分離する工程と、（ｃ）新鮮な増殖培地中にこの分離された細胞を懸濁してＥＳ細胞の増殖した集団を得る工程と、（ｄ）細胞増殖を支持する条件下でこの増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程と、（ｅ）工程ｂ〜ｄを１回以上反復してＥＳ細胞の連続増殖した集団を得る工程とを包含する。従って、本発明の方法は、最初のＥＳ培養から細胞の老化までの多数の継代のための幹細胞の集団の継代または増殖のために用いられ得る。
【００１８】
本発明のなおさらなる実施形態では、ＥＳ細胞の自動化した増殖のためのシステムが提供され、このシステムは、インキュベーターと、リキッド・ハンドラー・ユニットと、細胞分離のための操作プログラムとを備える。例えば、操作プログラムは、（ｉ）第一のＥＳ細胞集団から培地を除去する工程、（ｉｉ）ＥＳ細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程、（ｉｉｉ）この細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートさせて、細胞集合を分離する工程、および／または（ｉｖ）このインキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程のための工程を包含し得る。従って、いくつかの局面では、操作プログラムを用いて、このシステム中の種々のチャンバの間で細胞および／または流体を動かしてもよい。ある局面では、細胞培養プレートは、１つのチャンバから別のチャンバに動かされてもよい（例えば、インキュベーターの中へまたはその外へ）。従って、特定の局面では、リキッド・ハンドラーは、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備えてもよい。なおさらなる局面では、リキッド・ハンドリング・ツールは、本質的に閉じたシステムまたは装置であってもよく、ここで細胞および／または流体は圧力勾配によってチャンバ間で移動される。
【００１９】
実質的に任意の多能性幹細胞または細胞株、例えば、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が本発明を介して培養され得るということが予測される。例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂおよび／またはＨ１４などを本発明で用いてもよい。その後に利用可能になる幹細胞株がまた本発明で用いられ得ることもさらに予想される。ヒト胚性幹細胞が好ましくは、本発明で用いられ、ある場合には、本発明では哺乳動物、マウス、霊長類など他の胚性幹細胞を用いることも可能である。
【００２０】
当業者によって理解されるとおり、通常はｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に誘導されたある種の多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、天然の多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞と多くの点で、例えば、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生きたキメラ形成、ならびに力価および分化能力に関して同一であると考えられるが、天然の多能性幹細胞に対するそれらの関連の完全な程度は依然として評価中である。ＩＰＳ細胞は以前に記載されている（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｙｕら２００７を参照のこと）。
【００２１】
本発明の方法および／または組成物の状況で考察される実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して使用されてもよい。従って、１つの方法または組成物に関する実施形態が、同様に本発明の他の方法および組成物に適用されてもよい。
【００２２】
本明細書において用いる場合、「１つの、ある（“ａ”または“ａｎ”）」という仕様は１つ以上を意味する場合がある。本明細書において特許請求の範囲（単数または複数）で用いる場合、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉と組み合わせて用いる場合、「１つの、ある（“ａ”または“ａｎ”）」という言葉は、１つまたは２つ以上を意味する場合がある。
【００２３】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを示すことを明確に示すか、または代替物がお互いに排他的であるのでない限り「および／または」を意味して用いられるが、この開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において用いる場合、「別の」とは、少なくとも２番目以降を意味し得る。
【００２４】
本出願全体にわたって、「約」という用語は、ある値がそのデバイスについて誤差の固有の変動を包含することを示すために用いられ、この方法は、その値またはその研究の被験体の間に存在する変動を決定するために使用される。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のために示されているに過ぎないことが理解されるべきである。なぜならこの詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変が明らかになるからである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
規定の培地条件下における多能性幹細胞の自動化増殖のための方法であって：
（ａ）規定の増殖培地において多能性細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該多能性細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁して多能性細胞の増殖した集団を得る工程と、
を包含する、方法。
（項目２）
前記多能性細胞がＥＳ細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）である項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞がヒトＥＳ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記培養された増殖した多能性ＥＳ細胞のうち少なくとも９７％で分化が全く生じないか、または本質的に生じない、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記増殖培地がＴｅＳＲ培地を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞培養プレート上に含まれる、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞培養プレートがゲル・マトリックスを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約５０％コンフルエントと約９９％コンフルエントとの間である、項目６に記載の方法。
（項目９）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約６０％、７０％、８０％または９０％コンフルエントである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
新鮮増殖培地中の前記分離された細胞を懸濁する工程が、１つ以上の新規な細胞培養プレート（単数または複数）中に該細胞を播種する工程を包含する、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記新規な細胞培養プレート（単数または複数）の表面積がＥＳ細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約５倍と約３５倍との間大きい、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記新規な細胞培養プレート（単数または複数）の前記表面積がＥＳ細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約１０と約３５倍との間大きい、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記自動化分離プロトコールが、多能性細胞の前記第一の集団とタンパク質分解酵素とを接触させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記タンパク質分解酵素がトリプシンである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質分解酵素が、組み換えトリプシン、トリプシン様プロテイナーゼ、またはＴＲＹＰＬＥである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記タンパク質分解酵素が、組み換え酵素である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記新鮮増殖培地がタンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記新鮮増殖培地が細胞分離のために用いられる前記タンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質分解酵素インヒビターがトリプシンインヒビターである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質分解酵素インヒビターがダイズトリプシンインヒビターである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記新鮮増殖培地が約０．５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記分離システムがリキッド・ハンドラー・ロボットによって自動化される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記自動化分離システムが：
（ｉ）前記第一の多能性細胞集団から前記培地を除去する工程と；
（ｉｉ）該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と；
（ｉｉｉ）該細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートして細胞集合を分離する工程と、
を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
タンパク質分解酵素インヒビターとＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターとを含む規定の培地が工程（ｉｉｉ）の後に溶液に添加される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＥＳ細胞が、約２〜約１０分の間前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ＥＳ細胞が、約２５℃と約４０℃との間で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記ＥＳ細胞が、約３７℃で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記自動化分離システムがさらに：
（ｉｖ）前記インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程、
を包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記機械的攪拌が、前記ＥＳ細胞を剪断力または吸引に供する工程を包含する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記タンパク質分解酵素インヒビターを含む前記増殖培地を、該インヒビターを実質的に含まない増殖培地で置き換える工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目３１）
多能性細胞の前記集団が非多能性細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目３２）
多能性細胞の前記集団がヒトＥＳ細胞であり、ヒトＥＳ細胞の集団が非ヒト細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
胚性幹（ＥＳ）細胞の自動化連続増殖のための方法としてさらに規定され：
（ａ）増殖培地においてＥＳ細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該ＥＳ細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な増殖培地中に該分離された細胞を懸濁してＥＳ細胞の増殖した集団を得る工程と、
（ｄ）細胞増殖を支持する条件下で該増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程と、
（ｅ）工程ｂ〜ｄを１回以上反復してＥＳ細胞の連続増殖した集団を得る工程と、
を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３４）
（ｄ）細胞増殖を支持する条件下で前記増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程が、培地灌流培養で該細胞をインキュベートする工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記増殖培地がＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターの有効量を含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨＡ−１００である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＨＡ−１００が約１０μＭの濃度で存在する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨ−１１３５である、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｈ−１１３５が約１〜３μＭの濃度で存在する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
多能性細胞の自動化した維持および増殖のための装置であって：
ａ）インキュベーター；
ｂ）リキッド・ハンドラー・ユニット；
ｃ）１つ以上のリザーバであって、ｉ）多能性細胞の生きている集団と、ｉｉ）規定の培地であって、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、規定の培地と、ｉｉｉ）プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビターおよびＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターのうちの１つ以上とを含むリザーバ；ならびに
ｄ）該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡したコントローラであって、該多能性細胞の自動化された増殖および維持を達成するように該リキッド・ハンドラー・ユニットに仕向けるように構成されている、コントローラ；
を備える、装置。
（項目４１）
前記コントローラが操作プログラムを含むコンピューター読み取り可能な媒体を備える、項目４０に記載の装置。
（項目４２）
前記コントローラが：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つをｉ）多能性細胞集団から培地を除去するように；ｉｉ）多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させるように；およびｉｉｉ）多能性細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートさせて細胞集合を分離するように仕向ける、項目４０に記載の装置。
（項目４３）
前記装置がさらに機械的攪拌装置および吸引装置を備え、かつ前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、該多能性細胞が機械的攪拌または吸引に供されるように仕向けて、細胞集合をさらに分離する、項目４０に記載の装置。
（項目４４）
前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、インキュベートされた多能性細胞がプロテアーゼインヒビターと接触するように仕向ける、項目４０に記載の装置。
（項目４５）
前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、インキュベートされた多能性細胞がＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターと接触するように仕向ける、項目４４に記載の装置。
（項目４６）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバを備え、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目４０に記載の装置。
（項目４７）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨ−１１５２またはＨ−１００である、項目４０に記載の装置。
（項目４８）
前記多能性細胞がＥＳ細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）である、項目４０に記載の装置。
（項目４９）
前記リキッド・ハンドラーが、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備える、項目４０に記載の装置。
（項目５０）
前記多能性細胞がヒトＥＳ細胞である、項目４０に記載の装置。
（項目５１）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと前記インキュベーターとの間の流体連絡を容易にするように構成されたロボット様デバイスをさらに備える、項目４０に記載の装置。
（項目５２）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のまたはそれ以上のリザーバをさらに備える、項目４０に記載の装置。
（項目５３）
前記第二のリザーバが細胞培養プレート、細胞増殖培地、またはタンパク質分解酵素溶液を備える、項目５２に記載の装置。
（項目５４）
前記リキッド・ハンドラーが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバと連絡しており、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、該培地がさらに、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目４０に記載の装置。
（項目５５）
前記コントローラがコンピューター中に含まれる、項目４０に記載の装置。
（項目５６）
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、前記装置が該増殖された多能性細胞のうち少なくとも９７％で該細胞のさらなる分化を伴わないかまたは本質的に伴わずに、前記多能性細胞の増殖をもたらすように構成されている、項目４０に記載の装置。
（項目５７）
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、かつ前記多能性細胞がヒトＥＳ細胞である、項目４０に記載の装置。
【００２６】
以下の図は、本明細書の一部であって、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこの図面を参照してさらによく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】胚性幹細胞増殖の例示的な自動化方法。描写される工程のうちの１つ以上が幹細胞増殖のためのシステムを制御するためにプログラム中に含まれてもよい。
【図２Ａ】ＥＳ細胞の自動化増殖のための例示的な装置およびシステムの略図。
【図２Ｂ】ＥＳ細胞の自動化増殖のための例示的な装置およびシステムの略図。
【図３Ａ】クリーンルーム中の自動化ヒトＥＳ（ＨＥＳ）培養装置およびシステムの例を示す。図３Ａは、リキッド・ハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ２０００）を接続しているＰｌａｔｅｃｒａｎｅＸＴ（Ｈｕｄｓｏｎ）に隣り合う開口の自動化インキュベーター（Ｃｙｔｏｍａｔ６０００）の例を示す。
【図３Ｂ】クリーンルーム中の自動化ヒトＥＳ（ＨＥＳ）培養装置およびシステムの例を示す。図３Ｂは、そのシステムの左側の閉じられたＣｙｔｏｍａｔ６０００、真ん中後ろのＢｉｏｍｅｋ２０００、および下の温度制御ユニットの例を示す。Ｂｉｏｍｅｋ２０００システムのスタッカーはそのシステムの右側に置かれている。
【図３Ｃ】クリーンルーム中の自動化ヒトＥＳ（ＨＥＳ）培養装置およびシステムの例を示す。図３ＣはＨＥＳ細胞を分割してフィードするためのロボット様の構成要素を示す。図３Ｃは最初に使った培地を吸引し、４ウェルまたは８ウェルのプレートをフィードするために用いられる単一のチャネル洗浄ツールを示す。後ろの裏側は４ウェルのプレート、６ウェルのプレートを用いて、トリプシンのリザーバとして機能する。
【図３Ｄ】クリーンルーム中の自動化ヒトＥＳ（ＨＥＳ）培養装置およびシステムの例を示す。図３ＤはＨＥＳ細胞を分割してフィードするためのロボット様の構成要素を示す。図３Ｄは、４ウェルの母プレートから８ウェルの娘プレートへ最終分割において、トリプシン処理および個別化されたＨＥＳ細胞を混合しかつ分散させるための特定の実施例で用いられる８チャネルのツール（Ｐ２００）を示す。
【図４Ａ】フィーディング後のヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。図４Ａ、単一の２日齢のヒトＥＳ細胞コロニーの２０×倍率。
【図４Ｂ】フィーディング後のヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。図４Ｂ、培養された細胞の分布および密度を示すための２日齢の培養物の４×倍率。
【図４Ｃ】フィーディング後のヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。図４Ｃ、フィーディングの５日後のＨ１培養物の４×倍率。
【図５Ａ】１０００倍増殖の後のヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。図５Ａは大規模の２回目の継代の６日後のヒトＥＳ細胞コロニーの４×倍率。
【図５Ｂ】１０００倍増殖の後のヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真。図５Ｂ、ＦＡＣＳによるＯｃｔ４分析。左側のバンドは、バックグラウンドを示すための標識されたＩｇＧコントロールで処理した細胞を示しており、中実なバンドはプールされて染色されたプレート２からのＯｃｔ４陽性集団を示す。両方の分析によって、９７％を超えるＯｃｔ４陽性集団が示され、このことは自動化手順が未分化状態で多能性細胞を効率的に維持することを示唆している。
【図６】自動化細胞培養システムを用いる１０００×の増殖後の無作為にピックアップされたプレートからの細胞カウント。プレートをトリプシン処理してトリパン・ブルーで染色し、血球計でカウントした。総細胞は代表的なサンプルから計算した。平均値からの推定によって、約１６０×１６００万＝２５億６千万個のヒトＥＳ細胞が生成されることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ヒト幹細胞は現在、種々の治療適用および診断適用における使用について開発中である。詳細には、ＥＳＣは種々の細胞タイプに分化し得、従って、種々のヒト組織の疾患を処置または研究するために用いられ得る。しかし、多数の培養されたヒト幹細胞の利用性はこの分野では大きな限界があることが証明されている。形質転換細胞株の従来の組織培養とは異なり、ＥＳＣは増殖条件に極めて感受性であって、その周囲の微小環境が細胞生存度およびＥＳＣが増殖する速度を調節し得る。さらに、ＥＳＣ培養は、極めてヒトの労働集約的であって、それによって、細胞集団を増殖させる費用が増大し、かつ細胞培養物の汚染の可能性が増大する。細胞培養のこれらの面倒な方法でさえ代表的には、約１：１２の増殖比しか可能にせず、そのせいで特定の期間にわたって増殖され得る細胞の数が制限され、かつ最大細胞増殖速度を維持するのに必要な細胞分割の頻度が増える。
【００２９】
本発明はＥＳＣ細胞培養を継代および増殖するための自動化方法を提供するのにおけるＥＳＣ培養のための以前の方法の多くの欠陥に取り組む。下の実施例に示されるとおり、ＨＥＳ細胞の６ウェルのプレートのうちの１つのウェル（約２５０万個の細胞）を１６０個のプレートという最終数まで（約２０〜３０億個の細胞）増殖することを可能にするＥＳ細胞の自動化フィーディングおよび分割を可能にする装置およびシステムを作製した。これは、そうでなければ一人ではほぼ不可能な技術である３週間にわたる１０００倍増殖と等価である。Ｏｃｔ４染色によって示されるとおり、これらの幹細胞の大部分、すなわち９７％より多くが、未分化状態で維持された。
【００３０】
本発明は、新しいプレートに播種するために細胞を分けるための細胞集合の限られた酵素的処置を使用する自動化ＥＳＣ培養システムを提供した。したがって、ある局面では細胞培養の機械的攪拌は限られており、かつ生存しているＥＳＣのより多くの割合が継代の間に担持される。詳細には、本明細書において提供される方法および組成物によって、細胞は１回の分割で１つのプレートから３０のプレートに（すなわち、３０倍大きい表面積まで）増殖することが可能になり、これは代表的には任意の所定の時間で１２倍以下の増殖を可能にする、手技による分割方法を上回る改善である。さらに、本明細書に記載される自動化システムはヒトの労力の必要性を、従って細胞培養の費用を大きく減じる。このような自動化装置およびシステムは、汚染する傾向が低く、かつ治療剤として最終的に用いられ得る幹細胞産物に好ましい。従って、本発明は、ＥＳＣ治療剤、例えば、輸血における使用のためのＥＳＣ由来の血液の急速な商業的開発を可能にし得る。
【００３１】
Ｉ．細胞増殖培地
ＥＳ細胞培養物のための種々の培地および培養条件が当該分野で公知である。特定の局面では、細胞は、線維芽細胞などのフィーダー細胞とともにまたは線維芽細胞馴化培地中で増殖され得る。しかし、ある場合には、ＥＳ細胞がフィーダー細胞の非存在下で増殖されることが好ましい場合がある。さらにより好ましい局面では、細胞はＴｅＳＲ（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＭＴＥＳＲ（商標）１）などの規定の培地中で増殖され得る（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ、米国特許出願公開第２００６／００８４１６８号）。このような培地は、ＥＳ細胞の無血清培地について用いられ得る。例えば、ある場合には増殖培地は、表１に規定される培地であってもよい。しかし、特定の場合には無血清システムの高いコストのせいで、無血清培養物に用いられる増殖因子は、コストを減じるために、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６ｂ）に記載されるようにゼブラフィッシュからクローニングされたＦＧＦなど別の供給源から得る場合がある。さらに、特定の局面では、培地には必須の増殖因子を供給するためにウシまたはヒトの血清を補充する（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）。従って、特定の場合には、ＥＳ増殖培地は、表１に示される成分を含んでもよく、この培地は本明細書に例示されるように、示された「増殖因子およびタンパク質」の代わりにウシ血清を補充される。
【００３２】
【表１−１】
2014110817.tif 000002
【００３３】
【表１−２】
2014110817.tif 000003
【００３４】
【表１−３】
2014110817.tif 000004
【００３５】
【表１−４】
2014110817.tif 000005
【００３６】
【表１−５】
2014110817.tif 000006
Ａ．ＲＯＣＫインヒビター
本発明のなおさらなる局面では、細胞が解離されるとき（例えば、細胞集団の分割の間）ＥＳ細胞のアポトーシスを軽減する分子など、追加の培地成分がＥＳ細胞増殖培地に含まれてもよい。例えば、本発明での使用のための培地は、１つ以上のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、例えばＹ−２７６３２またはその誘導体を含んでもよい。さらに、ある局面では、本発明の培地はＨＡ−１００；またはその誘導体を含んでもよい。
【００３７】
【化１】
2014110817.tif 000007
ＨＡ−１００は、ＥＳ細胞増殖培地中に、例えば、約１〜１５μＭ、５〜１５μＭ、１〜３０μＭ、５〜３０μＭの濃度で、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０μＭ、またはそのなかで導出可能な任意の範囲で存在してもよい。特定の実施形態では、ＨＡ−１００は約１０〜２０μＭでＥＳ細胞増殖培地中に存在する。
【００３８】
本発明に従うＥＳ細胞増殖培地に含まれてもよい他のＲＯＣＫインヒビターとしてはＨ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン）が挙げられる。Ｈ−１１５２はＨＡ−１００よりも約１０倍大きい力価を示す。従って、Ｈ−１１５２はＥＳ細胞増殖培地中に、例えば、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜５μＭ、約１〜３μＭ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４もしくは５μＭの濃度で、またはそれから導出可能な任意の範囲で存在してもよい。特定の実施形態では、ＨＡ−１００は約１μＭでＥＳ細胞増殖培地中に存在する。Ｈ−１１５２は、９６ウェルプレート中で個別化されたヒトＥＳ細胞の極めて効率的な播種を可能にする（ＨＡ−１００と同様だが、１０倍低い濃度である）。細胞集塊中でそうでなければ継代される個別化されたＨＥＳ細胞によって、細胞ベースの低分子スクリーニングのストリンジェントな前提条件である１ウェルについてさらに均一な細胞密度が可能になる。従って、Ｈ−１１５２は、本発明による自動化細胞培養を包含するＥＳ細胞ベースの低分子スクリーニングのプロトコールで用いられ得る。Ｈ−１１５２は、参照によって本明細書に援用される、例えば、Ｉｋｅｎｏｙａら（２００２）およびＳａｓａｋｉら（２００２）に以前に記載されている。
【００３９】
【化２】
2014110817.tif 000008
ＥＳ細胞増殖培地中に含まれてもよい他のＲＯＣＫインヒビターとしては、Ｙ−２７６３２、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）ウレア、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、グリシル−Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン）および／またはＨＡ１１００（ヒドロキシファスジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｕｓｄｉｌ））が挙げられる。Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されており、以前に記載されている（例えば、Ｍａｅｋａｗａら、１９９９；Ｄａｖｉｅｓら、２０００を参照のこと）。
【００４０】
【化３】
2014110817.tif 000009
ＩＩ．細胞培養の装置、システムおよび方法
ある局面では、本発明は、バイオリアクター技術を利用し得る。バイオリアクター中の本発明による細胞増殖によって、最終用途のためのさらなる分化が可能な完全に生物学的に活性な細胞の大規模産生が可能になる。バイオリアクターは、懸濁および固着の両方に依存した動物細胞培養からの生物学的産物の産生のために広範に用いられている。攪拌されたタンクバイオリアクターにおけるマイクロキャリア細胞培養によって、極めて高い容積に対する培養表面積比が得られ、かつウイルスワクチンの産生のために用いられている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，１９８６）。さらに、攪拌されたタンクバイオリアクターは産業的に拡大可能であることが証明されているが、このような技術は、固着とは独立した培養で細胞が増殖され得るときにのみ使用され得る。Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒｎによって増殖されるマルチプレートＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）細胞培養システムはまた、極めて高い、容積に対する培養面積比をもたらす。培養プレートの両側で増殖する細胞は緻密な立方の形状で一緒に密閉された。攪拌タンクバイオリアクターと異なり、ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）培養ユニットは使い捨て可能である。これは臨床産物の初期の産生では、使い捨て可能なシステムに関連する設備投資、品質管理および品質保証コストの軽減の理由で極めて望ましい。
【００４１】
Ａ．非灌流固着システム
伝統的に、固着に依拠した細胞培養は、本明細書に記載の小型のガラスまたはプラスチックの容器の底で増殖される。実験室規模に適切である、古典的かつ伝統的な技術によって得られる限定された表面対容積比が、大規模での細胞の産生および細胞産物における障壁を生じている。小さい培養容積で増殖される細胞の大きいアクセス可能な表面をもたらすシステムを提供する試みでは、多数の技術が提唱されている：ローラー・ボトル・システム、スタック・プレート・プロパゲータ、スパイラル・フィルム・ボトル・システム、ホロー・ファイバー・システム、充填層、プレート交換システム（ｐｌａｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）、および膜チューブ・リール（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｕｂｉｎｇ  ｒｅｅｌ）。これらのシステムは自然には均一ではなく、時には複数のプロセスに基づくので、それらは以下の欠点を被る−−大規模化能力の制限、細胞サンプルを採取することが困難、重要なプロセスパラメーターを測定および制御する能力の限界、ならびに培養全体にわたって均一な環境条件を維持することの困難性。
【００４２】
これらの欠陥にかかわらず、大規模の固定依存性の細胞産生のための現在用いられるプロセスはローラー・ボトルである。もう少し大きい、示差的に形成されたＴフラスコでは、システムが簡易であることによって、極めて信頼可能になり、従って魅力的である。１日当たり数千個のローラー・ボトルを取り扱うことが可能で、これによって、それ以外なら必要とされる集中的なヒトの取扱に関連する汚染および不一致のリスクを排除する、完全に自動化されたロボットが利用可能である。
【００４３】
Ｂ．マイクロキャリアでの培養
伝統的な固着に依拠する培養プロセスの欠点を克服する試みでは、ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ（１９６７）はマイクロキャリア培養系の概念を発展させた。このシステムでは、細胞はゆっくりした攪拌によって増殖培地中で懸濁される小さい固体粒子の表面で増殖される。細胞はマイクロキャリアに結合して、そのマイクリキャリア表面上で徐々にコンフルエンシーまで増殖する。実際には、この大規模培養システムは、単一のディスクプロセスから単層および懸濁培養物の両方が一緒にされている単位プロセスまで固着依存性培養をアップグレードする。従って、細胞が増殖するために必須の表面を組み合わせて、均質な懸濁培養物の利点によって産生を増大する。
【００４４】
ほとんどの他の固着依存性の大規模培養方法を超えるマイクロキャリア培養の利点は数倍である。第一に、マイクロキャリア培養物によって、高い表面対容積の比（キャリア濃度を変化させることによって可変である）が得られ、これによって高い細胞密度収率および極めて濃縮された細胞産物を得るための能力がもたらされる。細胞収率は、培養物が灌流されたリアクターモードで増殖されるとき、最大１〜２×１０７個の細胞／ｍｌである。第二に、細胞は、多くの低産生性の容器（すなわち、フラスコまたはディッシュ）を用いる代わりに１つの単位プロセス容器で増殖され得る。これによって、かなり優れた栄養物利用および培養培地のかなりの節約が得られる。さらに、単一リアクターの増殖によって、施設の空間の必要性の減少および１細胞あたりに必要な取扱工程の回数の減少がもたらされ、これによって労働の費用および汚染のリスクが軽減される。第三に、十分混合されたおよび均質なマイクロキャリア懸濁培養物によって、環境条件（例えば、ｐＨ、ｐＯ２および培地成分の濃度）をモニターおよび制御することが可能になり、これによってさらに再生可能な細胞増殖および産生物の回収がもたらされる。第四に、顕微鏡観察、化学的試験または列挙のための代表的なサンプルを採取することが可能になる。第五に、マイクロキャリアは懸濁液から急速に沈殿するので、細胞のフィード・バッチプロセスの使用または収集が、比較的容易に行うことができる。第六に、マイクロキャリア上の固着依存性の培養増殖の方式によって、他の細胞操作、例えば、タンパク質分解酵素の使用なしの細胞移動、細胞の共培養、動物への移植、およびマイクロキャリア保持のためのデカンター、カラム、流動床またはホロー・ファイバーを用いる培養物の灌流のためにこのシステムを用いることが可能になる。第七に、マイクロキャリア培養はマイクロバイアルの培養および懸濁物中の動物細胞の培養のために用いられる従来の装備を用いて比較的容易に大規模化される。
【００４５】
Ｃ．哺乳動物細胞のマイクロカプセル化
哺乳動物細胞を培養するために特に有用であることが示されている１方法は、マイクロカプセル化である。哺乳動物細胞は、半透過性のヒドロゲル膜の内側に保持される。多孔性の膜は細胞の周囲に形成され、このカプセルを囲んでいるバルク培地との栄養物、ガスおよび代謝産物の交換を可能にする。穏やかで、急速でかつ非毒性であり、得られた膜が培養の期間全体にわたって増殖中の細胞塊を維持するために十分多孔性であってかつ強力であるいくつかの方法が開発されている。これらの方法は全て、カルシウム含有溶液と接触した液滴によってゲル化される可溶性のアルギン酸塩に基づく。Ｌｉｍ（参照によって本明細書に援用される、１９８２、米国特許第４，３５２，８８３号）は、液滴を形成し、かつ約１％の塩化カルシウム溶液中に自由にさせる、小さい開口部を通じて強制されるアルギン酸ナトリウムの約１％の溶液中で濃縮した細胞を記載している。次いで、この液滴は表面のアルギン酸塩に対してイオン的に結合するポリアミノ酸の層にキャスティングされる。結局、このアルギン酸塩はカルシウムイオンを除去するためにキレート剤で液滴を処理することによって再液化される。他の方法はカルシウム溶液中で細胞を用いてアルギン酸溶液中に滴下させ、これによって中空のアルギン酸塩の球を作製する。同様のアプローチは、アルギン酸塩中に滴下されたキトサン溶液中に細胞を含み、これによっても中空の球を作製する。
【００４６】
マイクロカプセル化された細胞は、攪拌されたタンクリアクター中で容易に増殖され、ここでは直径１５０〜１５００μｍという範囲のビーズの大きさであって、これが微細なメッシュのスクリーンを用いて、灌流されたリアクター中に容易に保持される。総培地容積に対するカプセル容積の比は１：２〜１：１０という密度で維持され得る。最大１０８個というカプセル内の細胞密度を考慮すれば、培養物中の有効な細胞密度は１〜５×１０７個である。
【００４７】
他のプロセスを超えるマイクロカプセル化の利点としては、散布および攪拌から生じる剪断ストレスの有害な効果からの保護、灌流システムを用いる目的のためにビーズを容易に保持する能力、大規模化が比較的直接的であること、および移植のためにビーズを用いる能力が挙げられる。
【００４８】
Ｄ．灌流される固着システム
灌流される固着システムは、本発明の好ましい形態である。灌流とは、（生理学的な栄養溶液の）細胞のある集団全体にわたるかまたはそれを覆う一定速度御での連続的な流れをいう。これは回収（ｗｉｔｈｄｒａｗｎ）培地（例えば、ケモスタット）で細胞を洗浄する連続流培養とは対照的に培養ユニット内の細胞の保持を意味する。灌流のアイデアは今世紀の初めから公知であって、拡大された顕微鏡観察のために生きている組織の小片を保持するために適用されている。この技術は、インビボで細胞環境を模倣するために始まり、ここでは細胞は血液、リンパ液または他の体液を連続的に供給される。灌流がなければ、培養中の細胞は、フィーディングおよび枯渇されているという交互の段階を経ることになり、これによってその増殖および代謝能力の完全な発現が制限される。
【００４９】
灌流された培養物の現在の使用は、高密度（すなわち、０．１〜５×１０８個の細胞／ｍｌ）で細胞を増殖させるという課題に答えている。２〜４×１０６個の細胞／ｍｌを超えて密度を増大するためには、培地は、栄養不足を埋め合わせるためにおよび毒性産物を除去するために新鮮供給物で一貫して置換されなければならない。灌流とは、培養環境（ｐＨ、ｐＯ２、栄養レベルなど）のかなり優れた制御を可能にし、細胞接着のための培養内の表面積の利用を有意に増大するという意味である。
【００５０】
不織布のベッド・マトリックスを用いる灌流された充填床リアクターの開発によって、床容積（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）のうち１０８細胞／ｍｌを超える密度で灌流培養を維持する手段が提供された（ＣＥＬＬＩＧＥＮ（商標），Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｗａｎｇら、１９９２；Ｗａｎｇら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９４）。簡単に述べれば、このリアクターは、固着依存性および非固着依存性の細胞の両方の培養のための改善されたリアクターを含む。このリアクターは、内部の再循環を提供する手段を有する充填床として設計される。好ましくは、ファイバーマトリックスキャリアは、リアクター容器内のバスケットに入れられる。このバスケットの上部および下部には、穴があり、これによって、バスケットを通じて培地が流れることが可能になる。特別に設計されたインペラによって、栄養物の均一な供給および廃棄物の除去を保証するためのファイバーマトリックスによって占有される空間を通じた培地の再循環が得られる。これによって、無視できる量の総細胞塊がその培地中に懸濁されることが同時に保証される。このバスケットおよび再循環の組み合わせによってまた、ファイバーマトリックスを通じた酸素化された培地の泡の無い流れが得られる。このファイバーマトリックスは、不織布であって、１０μｍ〜１００μｍという「細孔」直径を有し、これによって高い内部容積が得られ、ここで細孔容積は、個々の細胞の容積の１〜２０倍に相当する。
【００５１】
他の培養システムと比較して、このアプローチではいくつかの有意な利点が得られる。ファイバーマトリックスキャリアでは、細胞は攪拌および発泡からの機械的ストレスに対して保護される。このバスケットを通じた自由な培地流動によって、最適に調節されたレベルの酸素、ｐＨおよび栄養物が細胞に与えられる。産物は培養物から連続的に取り出され、そして収集された産物は、細胞を含まず、かつ引き続く精製工程を容易にする低タンパク質培地中で産生され得る。また、このリアクターシステムの固有の設計によって、このリアクターを大規模化するための容易な方法が得られる。現在、最大３０リットルの大きさが利用可能である。１００リットルおよび３００リットルのバージョンが開発中であり、理論的な計算では最大１０００リットルのリアクターが支持される。この技術はその全体が参照によって本明細書に援用される国際公開第９４／１７１７８号（１９９４年８月４日、Ｆｒｅｅｄｍａｎら）に詳細に説明されている。
【００５２】
ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）モジュールは、基質に結合した細胞の固定および増殖のための大きいスチレン表面積を提供する。これは、隣接するプレートの間に薄い密閉された層流スペースを作製するために結合された一連の平行な培養プレートを有する一体としてカプセル化された無菌の一回使用のデバイスである。
【００５３】
ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）モジュールは、お互いに対角線上に反対に向いており、培地の流れを調節する入口および出口を有する。増殖の最初の数日間、培養物は一般に最初の播種の後システム内に含まれる培地によって満たされる。最初の播種と培地灌流の開始との間の時間の長さは播種の接種での細胞の密度および細胞増殖の速度に依存する。循環培地における栄養濃度の測定は、培養の状況の良好な指標である。手順を確立する場合、最も経済的でかつ生産的な操作パラメーターを決定するために種々の異なる灌流速度で栄養組成物をモニターする必要がある場合がある。
【００５４】
システム内の細胞は、伝統的な培養システムにおいてよりも高い密度の溶液に達する（細胞／ｍｌ）。多くの代表的に用いられる基本培地は、１〜２×１０６細胞／ｍｌ／日を支持するように設計される。代表的なＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）は、８５，０００ｃｍ２の表面で行い、そのモジュール内に約６Ｌの培地を含む。この細胞密度はしばしば、培養容器内で１０７細胞／ｍＬを超える。コンフルエンスでは１日あたりリアクターの２〜４容積の培地が必要である。
【００５５】
ＩＩＩ．ＥＳ細胞の自動化増殖のための装置／システム
本発明の特定の局面は、図２Ａおよび図２Ｂに図形として示され、かつ図３Ａ〜図３Ｄに市販のハードウェア構成要素で図示される、ＥＳ細胞などの多能性細胞の自動化増殖のための装置またはシステムに関する。従って、理解できるとおり、例示的なデバイスは、生きているＥＳ細胞集団（１０２）、インキュベーター（１０４）と液体連絡しているリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）、および細胞分離のための操作プログラムを備えるコントローラ（１０６）を備え得る。
【００５６】
本発明の装置における使用のためのＥＳ細胞集団（１０２）は、当業者に公知の任意の供給源由来のＥＳ細胞集団を含んでもよい。例えば、ヒトＥＳＣなどの胚性幹細胞を得るための方法は米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号および同第７，０２９，９１３号に以前に記載されている。本明細書において用いる場合、装置という用語は、単一のハウジングのデバイスには限定されず、例えば、電気的、機械的または他の結合機構を介して、一緒に結合された複数のデバイスを含んでもよいことが理解される。
【００５７】
種々のタイプのリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）が市販されており、例えば、特定の局面では、リキッド・ハンドラーは、ロボット様のハンドラー、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＩＣＲＯＬＡＢ（登録商標）ＳＴＡＲワークステーション、またはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）２０００リキッド・ハンドラー（Ｂ２Ｋ）であってもよい。また、ロボット様リキッド・ハンドラーに関する米国特許第６，３２５，１１４号も参照のこと。さらに他の局面では、リキッド・ハンドラーはロボット様のアームを備えないが、バルブの作動および圧力勾配の適用によって液体を動かすデバイス、例えば、流体または微小流体リキッド・ハンドラーであってもよい。
【００５８】
多様なインキュベーター（１０４）が当該分野で公知であり、かつ本発明の実施形態に従って用いられ得る。例えば、特定の実施形態では、インキュベーターはＫｅｎｄｒｏ  ＣＹＴＯＭＡＴ（商標）インキュベーターであってもよい。
【００５９】
さらに、本発明の特定の実施形態における多能性細胞またはＥＳ細胞の増殖装置およびシステムは、ＥＳ細胞の増殖の制御のためのコントローラ（１０６）を備えてもよい。このようなプログラムは、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）、流体連絡デバイス（１０８）および／またはインキュベーター（１０４）と電気的に連絡されてもよい。当業者は、特定の局面では、作動装置またはシステムがコンピューターまたはコンピューター読み取り可能な媒体に備えられてもよいことを理解する。本発明の実施形態における使用のための例示的な操作プログラムは、図１に示される工程を含み得る。この例示的な実施形態では、作動性のコントローラは、以下によって達成されるＥＳ細胞分離を仕向ける：（ｉ）培地を除去する工程；（ｉｉ）ＥＳ細胞集団の細胞とタンパク質分解性の化学物質または酵素、例えばトリプシンとを接触させる工程；（ｉｉｉ）細胞をインキュベートおよび攪拌して細胞の解離を保証する工程；ならびに（ｉｖ）新鮮培地中で分離されたＥＳ細胞を播種する工程。特定の実施形態では、上記のプロセスを繰り返してさらにＥＳ細胞を産生してもよい。
【００６０】
理解されるとおり、作動する装置は、コンピューター自動化の方法によって効果を発揮し得、これによって作動する装置は、本発明の特定の実施形態を行う種々のハードウェアデバイスを仕向けかつ制御する。ハードウェア構成要素の組み込みを果たすために使用され得る例示的な作動プログラムは、ＯＶＥＲＬＯＲＤ（商標）組み込みソフトウェアプログラム（Ｂｉｏｓｅｒｏ，Ｉｎｃ．）であって、これは器械の間の連絡を設定するための簡易なドラッグ・アンド・ドロップシステムを使用する。このソフトウェアによってまた、数的な変数および文字的な変化などのある範囲のプログラミングエレメント、条件文（例えば、ＩＦ  ＴＨＥＮ，ＥＬＳＥ），および制御ループ（例えば、ＦＯＲＮＥＸＴ）が可能になる。
【００６１】
必要に応じて、本発明による装置は、インキュベーター（１０４）とリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）との間の流体連絡を容易にする流体連絡デバイス（１０８）を備えてもよい。例えば、リキッド・ハンドラーがロボット様ハンドラーである場合には、流体連絡デバイス（１０８）はロボット様デバイス、例えば、リキッド・ハンドラー・ユニットとインキュベーターとの間の細胞のプレートを動かすデバイスであってもよい。例えば、ロボット様デバイスはＨｕｄｓｏｎ  ＰｌａｔｅｃｒａｎｅＸＬであってもよい。
【００６２】
さらに、多能性細胞またはＥＳ細胞増殖システムは、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）の試薬を含む１つ以上のリザーバ（１１０、１１２、１１４）を備えてもよい。例えば、リザーバは以下を備えてもよい：プロテイナーゼインヒビターを含むかまたは含まない細胞増殖培地（例えば、ＲＯＣＫインヒビターを含んでいる培地）；細胞培養プレート；タンパク質分解酵素溶液；リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）；および／またはピペットチップ。特定の局面では、さらなるロボット様デバイスを用いてリキッド・ハンドラー・デバイスとリザーバとの間の連絡を容易にしてもよい。特定の実施形態では、リザーバは、ＴｅＳＲ培地を、必要に応じてＲＯＣＫインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター、例えばダイズトリプシンインヒビターとともに含んでもよい。他の実施形態では、このリザーバはタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、ＥＤＴＡなど）を含んでいる溶液を含んでもよい。例えば、ある局面では、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｔａｃｋｅｒ  Ｃａｒｏｕｓｅｌを用いてリザーバ（例えば、プレートまたはピペットリザーバ）とリキッド・ハンドラー・デバイスとの間の連絡を容易にしてもよい。このリザーバは温度制御ユニット、例えば、冷蔵庫に収容してもよい。この温度制御ユニットは必要に応じて、所望の温度（例えば、約３７℃）まで溶液を事前加熱する加熱ユニットを備えてもよい；しかし、本発明者らは、下の実施例では単なる冷蔵庫が首尾よく用いられているように、加熱ユニットが特定の実施形態では必要がないということを発見している。
【００６３】
ここで図２Ｂを参照すれば、自動化された細胞培養物を得るための装置５０の上面図は、スタッカー・カルーセル（１４１）と、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）と、インキュベーター（１０４）と、流体連絡デバイス（１０８）と、コントローラ（１０６）と、一連のリザーバ（１１０、１１２、１１４）とを備える。特定の実施形態では、このスタッカー・カルーセル（１４１）はリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）の一部に機械的に結合されるかまたはそれを備える。本明細書において用いる場合、「リザーバ」という用語は流体の容積を維持することができる任意のデバイスを包含する。図２Ｂに示される種々の成分が組み合されてもよいしまたは分けられてもよいということも理解される。例えば、リザーバ（１１０、１１２、１１４）は、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）と一体化されてもよいし、またはリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）から分けられてもよい。特定の実施形態では、流体連絡デバイス（１０８）はロボット様アーム、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅ  ＸＴである。特定の実施形態では、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）はＢｉｏｍｅｋ２０００であり、かつインキュベーター４００はＣｙｔｏｍａｔ６００モデルである。
【００６４】
この例示的な実施形態では、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）は種々の大きさのリキッド・ハンドリング・ツール、例えば、種々の容積の液体をピペッティングするために用いられ得るピペッティング・ツールを備えるツール・ステーション１２１をさらに備える。ツール・ステーション（１２１）はまた、細胞培養プロセスの種々の工程の間に細胞培養プレートからリッドを取り出すかおよび／または取り付けるために例えば、用いられ得るグリッパー・ツールを備えてもよい。示される特定の実施形態ではリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）は、ステーション（１２１）のＭＰ２００ピペット・ツールとともに用いられ得るＰ２５０バリアチップを備えるステーション（１２２）を備える。さらに、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）は、供給源プレートのためのステーション（１２３）と、娘プレートのリッドのためのステーション（１２４）と、娘プレートのためのステーション（１２５）とを備える。
【００６５】
図２Ｂに示される実施形態では、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）はまた、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン溶液）または化学的リザーバとして機能するステーション（１３２）と、供給源プレートにリッドを提供するステーション（１３３）と、娘プレートにリッドを提供するステーション（１３４）と、娘プレートを提供するステーション（１３５）とを備える。
【００６６】
特定の実施形態では、自動的な継代は、以下の例示的なプロトコールを用いて達成され得る。流体連絡デバイス（１０８）を介したインキュベーター（１０４）からの母プレートの除去後、ステーション（１２１）からの洗浄ツールは使った培地を除去する。次いで、ステーション（１２１）からのピペッティング・ツール（例えば、８−チャネルの２００μｌのピペッティング・ツールＭＰ２００）は、ステーション（１３２）から約３ｍｌのトリプシン（０．１％）を追加し得る。次いで、流体連絡デバイスはプレートをインキュベーター１０４に移してもよい。約７分のインキュベーション後、流体連絡デバイス（１０８）は、処理されたプレートをリキッド・ハンドラー・ユニット（１００）に戻す。次いで、２μＭのＨ−１１５２と１ｍｇ／ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ
Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのダイズトリプシンインヒビター）とを含む３ｍｌのＴｅＳＲ培地の混合物を、１つ以上のリザーバ（１１０、１１２、１１４）からの各々のウェルに添加する。次いで、この細胞をプレート表面から洗浄して、反復した分配および吸引によってステーション１２１からピペッティング・ツールを用いて混合してもよい。次いで、ステーション１２１からピペッティング・ツールを用いてステーション１２５または１３５から提供される娘プレートにこの細胞を分配してもよい。
【００６７】
次いで、細胞を、例えば、１：３２の比で、スタッカー・カルーセル（１３１）からリキッド・ハンドラー（１００）（例えば、Ｂｉｏｍｅｋ２０００）にロードされた、プレコーティングされたＭａｔｒｉｇｅｌプレート上に播種してもよい。播種はＭａｔｒｉｇｅｌコーティング培地を吸引して、それを、１つ以上のリザーバ（１１０、１１２、１１４）から提供されたＨ−１１５２およびダイズインヒビターを含有する改変ＴｅＳＲ培地（例えば、１μＭのＨＡ−１１５２および０．５ｍｇ／ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含有するＴｅＳＲ）で置換した後に行ってもよい。コントローラ（１０６）は、リキッド・ハンドラー・ユニット（１００）、流体連絡デバイス（１０８）および／またはインキュベーター（１０４）の動きを制御するために用いられ得る。ステーション１２１からのグリッパー・ツールはまた、自動化細胞培養方法における適切な工程の間にプレートからリッドを取り出して差し込むためにも用いられ得る。
【００６８】
上記のとおり、Ｈ−１１５２は、所望の場合Ｈ−１００などの別のＲＯＣＫインヒビターで置換されてもよい。この方法では、この細胞は増殖培地からタンパク質分解酵素を物理的に除去する必要なしに分離されて分割されてもよく；例えば、このアプローチを用いて、この不活性化されたトリプシンは、例えば、遠心分離を介して、培地から物理的に除去される必要はない。
【００６９】
種々の実施形態では、複数のロボット様構成要素が、培養プロトコールをさらに促進し、そのシステムの高処理能力を向上するために利用されてもよい。例えば、分離ツールを操作するために複数のロボット様アームを利用してもよく、他の結合した細胞株の維持のために首尾よく確立されているＴｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙシステムなどのリキッド・ハンドリング・システムも本発明で用いてもよい。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明の種々の局面をさらに例示するために含まれる。本発明者らによって開発された本発明の技術および／または組成物に従う本実施例に開示される技術は本発明の実施において十分機能するものであり、従ってその実施のための好ましい方式を構成するとみなされ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態で多くの変更がなされてもよく、かつやはり同様のまたは類似の結果が得られるということを本開示に照らして理解するべきである。
（実施例１）
幹細胞の自動化継代および増殖
Ｈ１細胞継代１８５および６２を、ＴｅＳＲ培地を用いて培養し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｂｉｏｍｅｋ２０００リキッド・ハンドラー（Ｂ２Ｋ），Ｇｉｂｃｏ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｔｒｙｐｓｉｎ，ＴｅＳＲ培地およびＴｅＳＲ  Ｐｌｕｓ（１０μＭのＨＡ−１００および０．５ｍｇ／ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含有）を用いて分割した。Ｈ１細胞（ほぼ７０％コンフルエント）を、８．６μｇ／ｃｍ２のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコーティングした６ウェルのプレートおよびＴＲＹＰＬＥ（商標）トリプシンを含有するリザーバとともにＢ２Ｋ作業表面に置いた。グリッパー・ツールを用いて、分割すべきプレートからのリッドを取り出した。このロボットはグリッパー・ツールを廃棄して、Ｗａｓｈ１ツールをロードして細胞を含むプレートから培地を吸引した。次に、Ｐ１０００ツールを用いてＴＲＹＰＬＥ（商標）酵素を分割すべきプレートに移した。このリッドをプレートにおいて、そのプレートを３７℃のＣＹＴＯＭＡＴ（商標）インキュベーターに移動し７分間細胞をプレートから解離させた。
【００７１】
この時間の間、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングプレート（単数または複数）からのリッドを取り出して、Ｗａｓｈ１ツールを用いて過剰のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を取り出した。ＴｅＳＲ  Ｐｌｕｓ培地の適切な容積を、各々のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングプレートについて１ウェルあたりに分注した。次いでこのインキュベーターからのプレートを取り出してグリッパー・ツールを用いてふたをとった。Ｗａｓｈ１ツールを用いて、このプレートにＴｅＳＲ  Ｐｌｕｓ培地を加えて、トリプシン処理したウェル中でＴＲＹＰＬＥ（商標）を中和した。細胞の残りの集合塊をゆっくり混合し、Ｐ１０００ツールを用いてバラバラにした。この細胞懸濁液を、各々のプレートのウェルにまたがって細胞を間欠的に混合しかつゆっくり分配（播種）させながら、新しいＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングプレート（単数または複数）に移した。このプロセスは、全ての新規なプレートに細胞が播種されるまで続けた。次いで、グリッパー・ツールを用いて、そのリッドをプレート（単数または複数）に戻し、プレート（単数または複数）を３７℃に２４時間おいた。
【００７２】
２４時間後、播種したプレートをインキュベーターから取り出して、Ｗａｓｈ１ツールを用いて、ＴｅＳＲプラス培地を吸引し、新鮮な標準のＴｅＳＲ培地を細胞の各々のプレートに加えた。そのリッドを置換して、そのプレートを再度、インキュベーターに戻し、約４〜５日後それらを再度分割する必要があるまで標準のＴｅＳＲ培地（ＨＡ−１００およびダイズトリプシンインヒビターなしのＴｅＳＲ）を２４時間ごとに供給した。この方法によって、１回の分割で１つのプレートから３０のプレートに（すなわち、３０×より大きい表面積まで）細胞を増殖することが可能になった。
（実施例２）
自動化したＨＥＳ細胞培養および維持のシステム
ＨＥＳ細胞の労力および時間集約的な維持を改善するために、本発明者らは、ＨＥＳ細胞のフィーディングをまず自動化した。この提唱された実験は、滅菌および再生可能な条件を確立するために自動化培地交換による継代の間１０個の６ウェルプレートを維持することであった。本発明者らは、確立されたリキッド・ハンドリング・システムを用いる首尾よい自動的な培地交換によってその目標を達成した。これは、この実施形態でのＨＥＳ細胞培養の自動化に向かう重要な段階であった。
【００７３】
図３Ａ〜図３Ｂは例示的な実施形態の以下の実験で用いる自動化システムを示す。このシステムは、Ｂｉｏｍｅｋ２０００Ｓｙｓｔｅｍ（ピン・ツール、洗浄ツール、スタッカー、単一および８チャンネルの２０、２００および１０００マイクロリットルのピペッティング・ツール（Ｐ２０、Ｐ２００，Ｐ１０００，Ｂｅｃｋｍａｎ），Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅ  ＸＴ，およびＨｅｒａｅｕｓ  Ｃｙｔｏｍａｔ６０００を包含する。この実施形態では、簡易なソーダ冷蔵庫を培地の貯蔵に用いて、これから培地を培養ウェルに直接送達した。送達された培地のインラインの加熱は、実験に基づいて必須であるとは考えられなかった。この組み込みは、Ｏｖｅｒｌｏｒｄソフトウェアを用いてＢｉｏｓｅｒｏと協力して行った。この完全なシステムは、バイオセーフティー・レベル２（ＢＳＬ２、個人および環境に対する潜在的な危険が中程度であって因子の取扱を調節する）規定に適合したクラス１００のクリーンルーム（すなわち、１立方フィートあたり０．５ミクロンを超える粒子が１００個未満）に収容され、標準的なＢＳＬ２組織培養フードに対して適合する十分な無菌性が達成された。
【００７４】
Ｎｕｎｃから購入した長方形の４ウェルおよび８ウェルのＮｕｎｃｌｏｎΔプレートを手技的な手順で通常用いられる丸底の６ウェルプレートの代わりに用いた。この１つの理由は、全ての市販の６ウェルのプレートのプレート高が、スクリーニングおよび自動化リキッド・ハンドリングに用いられる標準のマイクロウェルプレートの高さを有意に超えるということであった。標準の丸底６ウェルプレートを用いることの不利益は、１００プレート未満までこの自動化インキュベーターの能力のほぼ半分が減少することであった。さらに、プレートの長方形の形状によって、８チャネルのリキッド・ハンドリング・ツールの使用が可能になった。なぜなら６ウェルのプレートはさらにアクセス出来ない領域を含むからである。後者の事実によってまた、不可能な培養表面積が１．４６倍に増大した（６ウェルのプレートについての５７．６ｃｍ２に比較して、４ウェルおよび８ウェルのプレートについては８４ｃｍ２）。このフィーディングおよび播種のシステムは、４ウェルおよび８ウェルのプレートを洗浄ツールおよび８チャネルのツールとともに用いた（図３Ｃ〜図３Ｄ）。
【００７５】
この実施形態では、ロボット様構成要素をＨＥＳ細胞の分割およびフィーディングに用いた。この単一のチャネル洗浄ツールを最初に用いて、使った培地を吸引して、４ウェルまたは８ウェルのプレートにフィードした。４ウェルのプレートの背の後ろ側で６ウェルのプレートを用いて、トリプシンのリザーバとして役立てる。８チャネルのツールＰ２００を用いて、最終分割で４ウェルの母プレートから８ウェルの娘プレートにトリプシン処理して個別化したＨＥＳ細胞を混合して分配させた。
【００７６】
例示的な実施形態では、表面は、Ｎｕｎｃが製造し、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたＮｕｎｃｌｏｎΔであった。以下のロボット様構成要素が、ＨＥＳ細胞を分割およびフィードするために用いられ得る：Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅは、リキッド・ハンドリング・ロボットＢｉｏｍｅｋ２０００とインキュベーターＣｙｔｏｍａｔ６０００とを接続する。Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅのグリッパーは、インキュベーターのターンテーブル上に置かれる。培地を収容している冷蔵庫は、洗浄ツール（テープのあるボックス）の蠕動ポンプを繋いでいる配管を有し、減圧によってもたらされる使用した培地の廃棄ボトルは、ハウジング減圧システムによって提供された洗浄ツールのバルブによって制御された。
【００７７】
最初に、Ｏｍｎｉｔｒａｙｓ、すなわち、全体のプレートに区画のないプレートを試験したが、ＰｌａｔｅｃｒａｎｅおよびＣｙｔｏｍａｔ６０００のターンテーブルによる移動の間に過剰にしぶきが跳ねるせいで断念された。最終のフィーディングプロトコールでは（最初に取り扱った６ウェルのプレート）２つの８ウェルプレートをある時点でＣｙｔｏｍａｔ６０００の１つから取り出して、Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅを用いてＢｉｏｍｅｋ２０００のデッキの２つの最も外側の右の位置に移した。Ｂｉｏｍｅｋ２０００のグリッパー・ツールは、プレートからリッドを取り出し、それらをデッキ上の隣接する左の位置に置いた。８チャネルの洗浄ツールに切り替えた後、その培地を４ウェルまたは８ウェルのプレートを横切る８位置で吸引して、使用した培地の十分な除去を確実にする。手技的なプロセスでは、そのプレートをある角度でひっくり返し、その底で使用した培地を十分に除去して収集する。このような角度は、これらのロボット工学では信頼性を保持して実現することはできなかった。この新規な培地（それぞれ１ウェルあたり６および３ｍｌ）を次のウェルまたはプレートに動かす直前に分注した。フタをとりおよび再度フタをするプロセス、ならびに洗浄ツールの高さの配置は一時的な介入を要した。これらはエラーの最も顕著な原因（１００の動きのうちの約１）であって、作業者の存在および介入を要した。洗浄ツールの流速は、培養の質に負の影響はないようであった。なぜなら、細胞は、洗浄ツールの蠕動ポンプによって生じる圧力によって表面を洗い去ることができないからである。培養の質は、培養プロセスの各日の後に培養の視覚的評価によって判定した（図４Ａ〜図４Ｃ）。
【００７８】
自動化手順は、５日の実験の間、分化の出現の増大を何ら示さず、その培養物は、標準のＭａｔｒｉｇｅｌプレートで首尾よく手技的に分割できた。冷却された培地を予備加熱するためのインラインの加熱カラムを有する最初の実験は、本発明者らが予備加熱カラムなしでなんら負の効果を観察しなかったので続けなかった。この目的における主なおよび時間消費的な作業は、フィーディングおよび分割の間同様である重要な動きおよび作業のための自動化システムをマスターすることであった。フィーディングの工程に関するこのシステムの処理能力は、以下に起因してある程度限定された：統合ソフトウェアによって可能な同時の動きの数にある限界、複数のツール（フィーディングの場合には：グリッパーおよび洗浄ツール）を作動するために用いられているＢｉｏｍｅｋ２０００、ならびにＰｌａｔｅｃｒａｎｅおよび２つのプレートを同時に処理することを可能にするＢｉｏｍｅｋ２０００の利用可能なデッキ・スペースとの配置。しかし、より進歩したリキッド・ハンドリング・システムおよびより洗練された統合プラットフォーム（マルチタスクを可能にする、複数のアーム、適合したソフトウェア、組み込み可能なロボット工学）によって得られるより大きいデッキで、処理における有意な改善ができるし、できなければならない。目的２を含めて本研究の終わりまでには、本発明者らは、本発明者らが、滅菌可能および再生可能な条件を確立するために自動化培地交換によって継代の間１６０個のＮｕｎｃｌｏｎΔ８ウェルプレートを維持できるということを首尾よく示すことができた。培養の質を損なうことなく、１人で１日あたり約２０個のＮｕｎｃｌｏｎΔ６ウェルプレートを慣用的に取り扱うことができる。上記のシステムによって明確に、手技的に維持された細胞培養技術と適合する、ＨＥＳ細胞培養の多能性（Ｏｃｔ４レベル）、速度、再現性、および経済的有効性の維持において測定可能な良好な培養の質が実証された。
（実施例３）
ｈＥＳ細胞の自動化された継代および増殖
ＨＥＳ細胞の継代はＨＥＳ細胞培養において最も労働集約的であってかつ変動する工程であるので、技術者の技術に極めて依存して実験の結果に膨大な変動がもたらされる。本発明者らは、継代の自動化がさらに堅調であってかつ再現可能なＨＥＳ細胞培養をもたらすということを仮定した。本発明者らは、現行のシステムでかつこのプロジェクトで利用可能な限られた時間に起因してこの理論が確認できないが、本発明者らは、そうでなければ一人ではほぼ不可能な作業である、３週にわたる１０００倍の増殖に等しい、ＨＥＳ細胞の６ウェルプレートのうちの１ウェル（約２５０万個の細胞）から１６０プレートという最終数（約２０〜３０億個の細胞）までの増殖によって原理の証明を示すことができた。
【００７９】
本発明者らは、実施例１に記載されるシステムを利用し、かつ簡易なリキッド・ハンドリング・プロトコールに基づいたＨＥＳ細胞の継代のための手順を開発した。分割技術における近年の革新によって、そうでなければ手技的手順が要求されるこの効率的な自動化が可能になった。ＨＥＳ細胞は、ＴｅＳＲ培地で生存のための細胞間接触を要するので、それらは、集合塊で播種する必要があり、これは結合した細胞の剥離を要し、自動化するには極めて困難な手順である。しかし、低分子のＨＡ−１００およびその１０倍を超えて特異的な誘導体Ｈ−１１５２は、トリプシン処理後にＨＥＳ細胞の生存を可能にすることが確認された。０．１％のトリプシンを用いてＨＥＳ細胞をはがして個別化する能力、ならびに１μＭのＨ−１１５２および０．５ｍｇ／ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含有しているわずかに改変された規定のＴｅＳＲ培地中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングしたＮｕｎｃｌｏｎΔプレート上への引き続く播種によって、本発明者らは、他者によって自動化されている技術を、接着した癌細胞株の必要性が少なく適合させることができた。
【００８０】
自動化された継代のために、以下の手順が開発された：インキュベーターからの母プレートの回収後、洗浄ツールは、目的１に記載されたとおり使った培地を除去する。８チャネルの２００μｌのピペッティング・ツールＭＰ２００を用いて、３ｍｌのトリプシン（０．１％）を添加する。Ｃｙｔｏｍａｔ６０００の内側の処置プレートの７分のインキュベーション後、２μＭのＨ−１１５２および１ｍｇ／ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含有する３ｍｌのＴｅＳＲ培地の混合物をこのウェルに添加する。その細胞をプレート表面から洗い、８チャネルのＭＰ２００ツールを用いて反復する分散および吸引によって混合する。次いで細胞を、ＭＰ２００ツールを用いて娘プレートに分注する。次いでその細胞を、スタッカーからＢｉｏｍｅｋ２０００に対してロードされた、事前コーティングされたＭａｔｒｉｇｅｌプレート上に１〜３２まで播種する。上記のフィーディングのプロトコールに記載されるとおり、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング培地を吸引し、それをＨ−１１５２およびダイズインヒビターを含有する改変ＴｅＳＲ培地で置き換えた後に播種を行う。最初に用いたＯｍｎｉｔｒａｙの総表面積は、本発明者らが目的２でＨＥＳ細胞を継代するために一旦、方法を試験したところ、次の分割の段階でこのシステムの処理能力には大きすぎるようになった。母プレートから平均２５個の娘プレートまで細胞を分配するのにかかる時間は、個別化された細胞が播種される前に懸濁物中で生存できる時間を超えた。
【００８１】
本発明者らは、これらの新規なプロトコールの実現可能性を確立するために極めて堅調な増殖細胞でロボット的プロトコールを確立するために最初には、核型の正常な極めて多い継代（＞ｐ２００）のＨ１  ＨＥＳ細胞培養を用いた。これらの細胞はさらに、造血前駆細胞および心筋細胞を産生して、それらの分化能力を実証した。しかし、継代が少ない細胞培養については堅調なプロトコールの要求が特に大きい。なぜなら、それらは、さらに高感度から最適でない条件まで反応し、それによって細胞培養に大きい変動がもたらされるからである。後の実験では、本発明者らは、３〜５継代を超える５プレートを用いたより小規模の実験で、継代の少ないＨ１細胞（＞ｐ６０）での誘導された手順の変動を確認することができた。この証拠によって、自動化システムを用いてこれらの継代の少ない細胞を培養する能力が支持される。
【００８２】
最初に、本発明者らは、ウェルの複数の位置に細胞を添加することによる播種のための単一チャネルのツールを用いて、細胞の均一な分布を達成した。本発明者らは、高および低継代のＨＥＳ培養物で首尾よく達成し得るが、大規模実験の最終工程において１６０個の８ウェルのプレートへ本発明者らが細胞を増殖したとき、この手順の処理能力には８チャネルのＰ２００ツールの使用を必要とした。細胞の均一な分布の低下および細胞の細胞密度の減少が娘プレートで観察されたが、本発明者らは、この方法がこれらの特徴を改善するために最適であり得ることを理解する。この実験での増殖は、初回の継代において６ウェルプレートのうち単一のウェルから５つの必要な４ウェルプレートまで、次いで第二の継代で１６０の最終の８ウェルのプレートに行われた。本発明者らは、上記で確立されたプロトコールでの継代後２日次いで毎日フィードすることによって全ての１６０個のプレートを維持した。本発明者らは、分化および密度について全てプレートを視覚的に検査した。本発明者らは、３０個のプレートを無作為にピックアップし、それらを細胞分布のスキャンおよび評価のためにトリパン・ブルー染色で染色した。プレートの視覚的検査から、さらなる改善が可能であり、かつ高い再現性の目的の同質性が作製されるはずであることが理解される。また本発明者らは、プレート２および１０を無作為にピックアップして、２０日間にわたって２継代および１０００倍増殖後に細胞のＯｃｔ４含量について試験する。Ｏｃｔ４  ＦＡＣＳ分析によって、この最初の大規模化実験で未分化細胞の高い品質が明らかになった。
【００８３】
自動化されたＨＥＳ細胞培養の標準的な質を達成するいずれのプレートでも有意な量の分化は観察されなかった。これは、小規模の多くの他の実験で、およびより少ない継代の培養で、ならびにＦＡＣＳ分析中の極めて高い含量のＯｃｔ４陽性細胞によって支持された。現行の細胞培養に対するこの継代頻度および密度は、その歴史および主に年齢（すなわち継代数）に依存していた。手技的なＨＥＳ細胞培養での経験から、本発明者らは、より若い培養物では、最適に満たない条件および古い細胞よりも厳しい処置に対して、より鋭敏に反応する傾向を有するということを学習している。細胞株の挙動は最初の２〜３継代でそれが解凍され取り扱われる方法に依存して変化し得る。これらの要因の全てが、変動の程度の大きさに寄与し得、これは増殖および分化の程度をモニタリングすることによってのみ抑制され得る。このような測定は、本明細書に記載されるシステムの引き続く変動において自動化され得る。図６に示されるとおり、変動がプレートの間で観察された。改良された混合手順および組み込まれた細胞カウントは、将来のシステムでの良好な均一性に適応し得、これらの改変は比較的容易に実行されるはずである。なぜならそれらは以前に他の細胞培養で達成されているからである。
【００８４】
１０００倍増殖が試験された後、大規模化実験からプレートを無作為にピックアップした。培地を取り出して、プレートを乾燥させた後、トリパン・ブルーでプレートを染色した。この色素はＨＥＳ細胞コロニーをマークした。分割プロトコールを最適化する場合、細胞分布を改善する必要は残っているが、本発明者らは、プレートにまたがる分布における一貫性の改善がプロトコールの最適化で達成され得るということを理解する。
【００８５】
１０００倍増殖後の大規模化実験からの無作為にピックアップしたプレートを細胞カウントに供した。プレートをトリプシン処理して、トリパン・ブルーで染色し、血球計算器でカウントした。代表的なサンプルから総細胞を計算した。下のまとめの統計学に示される平均の結果から推定して、約１６０×１６００万個＝２５億６千万個の細胞が上記の実験から生成された。異なるプレートでの細胞増殖を図６に示しており、この実験についての細胞増殖のまとめの統計学を下の表２に示す。
【００８６】
【表２】
2014110817.tif 000010
（実施例４）
細胞ベースのスクリーニングのための９６ウェルの形式についてのＨＥＳ細胞培養の自動化播種
本発明者らは、個別化された細胞からＴｅＳＲ１培地中でＨＥＳ細胞のコロニー形成を活発に増大した、ＨＡ−１００由来の第二世代の低分子に相当する、新規な化合物Ｈ１１５２を用いた。ＨＡ−１００は、フォローアップ研究においてＨ１１５２のような関連の化合物の発見をもたらした、第一のＨＥＳ細胞ベースの低分子スクリーニングのうちの１つで発見された。Ｈ−１１５２は、９６ウェルのプレート中の個別化されたＨＥＳ細胞の極めて効率的な播種を可能にし（ＨＡ−１００と同様であるが、１０分の１の濃度である）、ＨＥＳ細胞ベースの低分子スクリーニングを可能にする。そうでなければ細胞集塊中で継代される個別化されたＨＥＳ細胞によって、細胞ベースの低分子スクリーニングのストリンジェントな必要条件である１ウェルあたりについてさらに均一な細胞密度が可能になる。本発明者らはまた、現在の低分子（ＨＡ−１００）および関連の化合物Ｈ１１５２がヒトＥＳ細胞を継代するために十分であると判断した。
【００８７】
本発明者らは、低分子ライブラリー（公知の生体活性を有する２０００個の化合物）を用いて造血を増大する能力を有し得る化合物についてスクリーニングした。本発明者らは、上記のシステムがＨＥＳ細胞を９６ウェル形式にプレートして、低分子スクリーニングのためのプラットフォーム、ならびに他の因子および条件のスクリーニングをもたらし得ることを実証した。本発明者らは、造血系前駆細胞をもたらす指向性分化方法を用いる自動化のために適切なスクリーニングアッセイおよびプロトコールを誘導した。本発明者らは、これらの条件下で首尾よくスクリーニングを行い、かつ現在確証されている２８個の最初の候補化合物を特定した。スクリーニングの能力によってさらにアッセイの発達はより徹底的に改善され得るが、自動化スクリーニングのためにＨＥＳ細胞をプレートするという重要な目標が達成されている。このプラットフォームによって、これらの細胞を大量に産生することが可能になるが、そうでなければスクリーニング、毒性学的試験および標的バリデーションに関与する研究に必要な量で得ることは困難である。別の供給源（血液および骨髄から単離した細胞）では限られた量しか得られず、プールされるべき異なるドナーから一回分にまとめるという事実に起因して、安定な遺伝的バックグラウンドを提供することができない。これらの方法を用いて、再生可能な質を有する細胞を、研究団体に提供することが可能になり得る。
【００８８】
このプロトコールで用いられるアッセイは、２つの特徴的な細胞表面マーカー（ＣＤ３４およびＣＤ４３）の存在を検出し得るＥＬＩＳＡプロトコールに基づいて開発された。これらのマーカーは強力な造血系前駆細胞を特定し、これを本発明者らは引き続いて単離して、所望の血液系列にこの細胞を分化させるか、または出発材料などとして提供することができる。本発明者らは、自動化されたプラットフォームを用いて、個別化されたヒトＥＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種して、それらを４日間増殖させた。次いで、その培地を規定の分化培地に切り替えて、スクリーニングされるべき化合物を、ロボットによって９６チャネルのピン・ツールを用いて２０マイクロモルという最終濃度まで添加した。２日後の培地の添加を含む化合物に対する４日の曝露後、培地を増殖因子の減少している分化培地に変更して、細胞を最終読み取りのためのＥＬＩＳＡプロトコールに供するまで、さらに６日間維持した（培地は１日おきに変える）。この実験の時系列は、分化培地のみについて伸展させた。本発明者らは、この方法によって１〜６％のＣＤ４３陽性細胞および２〜２５％のＣＤ３４陽性細胞を得た。このスクリーニングは強力な造血系前駆細胞の集団をさらに増大して産生を増大する化合物を検出するように設計した。ＣＤ３４抗体での問題に起因して、ＣＤ４３発現についてのデータしか得られなかった。それにもかかわらず、ＣＤ４３陽性細胞の集団は、血液系列への方向付けを特定するための最も重要なマーカーと考えられる。
【００８９】
本発明者らは、多重化ＥＬＩＳＡでＡｍｐｌｅｘＵｌｔｒａＲｅｄおよびＳｅｎｓｉＦｌｅｘアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることが可能であって、コントロールを用いて、これらのアッセイが適合しておりかつＳＣＰが２つの細胞マーカーについて（このプロトコールにおける別の洗浄工程の追加後、細胞の表面または内側で）同時にスクリーニングする可能性がえられることを示した。これは、十分な認識のために２つ以上のマーカーを要する細胞系列についてスクリーニングする場合に特に重要である。いくつかのプレートの端部でコントロールのＤＭＳＯウェルの間の高率の偽陽性、およびいくつかのプレートの上端の行と下端の行の間のヒットの蓄積。この最後の研究で予備データの収集を行ったが、本発明者らは、他のＥＬＩＳＡスクリーニングで実証されているとおり、このスクリーニングアッセイがＥＬＩＳＡの段階で、良好な洗浄手順を通じて、ならびに最適化された抗体および濃度で最適化され得る。それにもかかわらず、９６ウェルプレートでのスクリーニングのためにＨＥＳ細胞を首尾よく提供することは、重要な成果である。
【００９０】
本出願では、本発明者らは、上記で確立された改変された手順を用いて９６ウェルプレート中にプレートするのに極めて良好な均一性をえることができた。しかし、この目的については、本発明者らは、この１ウェルあたり１６，０００個の細胞をプレートし、これは自動化手順で未分化のＨＥＳ細胞の標準的な増殖および維持よりも５倍高い播種密度である。この特別な変更は、分化プロトコールにおける重大な工程であることが判明した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ以外の別の独自のマトリックスに対する結合を適合させるために用いた。堅調なスクリーニングを容易にするために９６ウェル形式で首尾よい播種が用いられる場合がある。
【００９１】
本発明者らは、近い将来自動化リキッド・ハンドリング・システムでのこのスクリーニングのための培地変更を行う能力を有するが、本発明者らは、バキューム１２チャネルワンドを手技的に用いて吸引することおよびスタッカーなしで自動化ディスペンサーを用いて分注することによって、時間および金銭的の利益のために培地を変更してＥＬＩＳＡアッセイを行うことを決めた。本発明者らは、完全自動化システムの再現性を利用しなかったが、本発明者らは、大きく時間および試薬を節約した。Ｍａｔｒｉｘ  Ｗｅｌｌｍａｔｅ自動化ディスペンサーを用いた。
【００９２】
上記の実施例は、首尾よい自動化ＨＥＳ細胞の培養および維持を示す。上記のデータは、本発明者らがＨＥＳ細胞培養のための自動化可能な手順を提供することに向かう主な課題を解決できたということを示す。本発明者らはさらに、追加の処理能力がこのシステムの最適化を介して達成され得るということを予測する。本発明者らは、上記のシステムを用いて改善された品質管理、細胞増殖のモニタリング、および改善された継代が達成され得るということを理解する。最適化手順では、当業者は手技的なプロトコールで必要である分化の不純物を特定および単離する必要がない場合があることが予測される。
【００９３】
上記のシステムは、他の結合した細胞株の維持のために首尾よく達成されているＴｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙシステムなどのリキッド・ハンドリング・システムを備えるように容易に改変されてもよい。このようなシステムの適用に向かう主な工程は、細胞を継代するためにトリプシンの使用であった。Ｗａｔａｎａｂｅらによる独立した刊行物、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００７）「Ａ  ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」は、ＨＡ−１００がＨＥＳ細胞増殖を維持する能力を支持する。
【００９４】
本明細書に開示され特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、この組成物および方法に対して、ならびにこの工程において、または本明細書に記載される方法の工程の順序において、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変更が適用され得ることが当業者には明らかであろう。さらに詳細には、同じまたは同様の結果を達成しながら、化学的にかつ生理学的に関連する特定の因子で本明細書に記載される因子を置換できる場合があることも明白である。全てのこのような類似の置換および改変は、当業者に明らかであり、かつ添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲および概念内であるとみなされる。
【００９５】
引用文献
以下の引用文献は、それらが例示的な手順上のまたは他の詳細な補遺をそこに示す引用文献に対して提供する程度まで、参照によって本明細書に詳細に援用される。
【００９６】
【化４】
2014110817.tif 000011
【００９７】
【化５】
2014110817.tif 000012
【図１】
2014110817.tif 000013
【図２Ａ】
2014110817.tif 000014
【図５Ｂ】
2014110817.tif 000015
【図６】
2014110817.tif 000016
【図２Ｂ】
2014110817.tif 000017
【図３Ａ】
2014110817.tif 000018
【図３Ｂ】
2014110817.tif 000019
【図３Ｃ】
2014110817.tif 000020
【図３Ｄ】
2014110817.tif 000021
【図４Ａ】
2014110817.tif 000022
【図４Ｂ】
2014110817.tif 000023
【図４Ｃ】
2014110817.tif 000024
【図５Ａ】
2014110817.tif 000025
【外国語明細書】
2014110817000001.pdf