(57)【要約】      （修正有）【課題】各種の生体物質の検出、測定に適用される新規な発蛍光性化合物を提供する。【解決手段】下式（Ｉ）で表される発蛍光性化合物。2014012654.tif 000011［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、グアニジノ基、２，２’−ジピリジル−５−カルボニルアミノ基、ビス（２−ピリジルメチル）アミノ基、１−（ｏ−ホウ素化ベンジル）ピリジニウム−３−カルボニルアミノ基から選ばれる原子団を表し、ｎおよびｍは１から６の整数を表す。］【選択図】図６
2014012654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする発蛍光性化合物。
【化１】
2014012654.tif 000007
〔式（Ｉ）中、ＸおよびＹは、同一または異なっており、それぞれ独立して、下記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）で示される原子団を表し、ｎおよびｍは１から６の整数を表し、(−ＣＨ２−)ｎおよび(−ＣＨ２−)ｍ中の１つまたは２つの−ＣＨ２−は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−または−ＣＨ＝ＣＨ−で置き換えられてもよい。〕
【化２】
2014012654.tif 000008
【請求項２】
下記の式（II）で表され、式中、Ｘが前記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）で示される原子団の１つを表すことを特徴とする請求項１に記載の発蛍光性化合物。
【化３】
2014012654.tif 000009
【請求項３】
下記の式（III）で表され、式中、Ｘが前記の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）で示される原子団の１つを表し、Ｙが前記の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）で示される原子団の１つであって、Ｘで表される原子団とは異なる原子団を表すことを特徴とする請求項１に記載の発蛍光性化合物。
【化４】
2014012654.tif 000010
【請求項４】
ＸまたはＹが、前記の式（Ｃ）で示される原子団を表し、該原子団を介してＣｕまたはＺｎと錯体を形成していることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の発蛍光性化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な発蛍光性化合物に関し、特に、各種の生体物質または生体関連物質の存在下に蛍光を発し、それらの物質の検出や測定に用いることのできる発蛍光性化合物（蛍光プローブ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査や新薬の開発には各種の生体物質（生体関連物質）の分析が必須であり、高感度に微量分析が可能な手段として蛍光分析が用いられており、また、そのための発蛍光性化合物も案出されている。
【０００３】
例えば、シグナル伝達系における情報伝達の制御など生体内で重要な役割を果たすリン酸イオン（リン酸基）を分析するための発蛍光性化合物としては、ルテニウム−ビピリジルポリアザ化合物（P.D. Beer他、Angew. Chem.
Int. Ed., 40, 486 (2001)：非特許文献１）、亜鉛−ジピコリルアミン二核錯体（特許第４１３８３３１号公報：特許文献１）などが提案されている。しかし、リン酸（リン酸イオン）を選択的に認識する発蛍光性化合物は少なく、特に、特定のリン酸構造、例えば、重要な生体物質でＡＴＰに見られる三リン酸構造を認識して蛍光を発し得るような発蛍光性化合物の例は見られない。
【０００４】
また、糖尿病の診断マーカーとして知られているグルコースをはじめとする糖を検出・測定するための発蛍光性化合物としては、フェニルボロン酸構造を含有する各種の化合物が本発明者らによって案出されている（例えば、特許第２７９９８３７号公報：特許文献２、特許第２８８３８２４号公報：特許文献３、特許第２８８９４７６号公報：特許文献４など）。
【０００５】
その他の重要な生体物質の例として、生体内の多くの酸化還元反応において補酵素として機能するＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨがある。これらの補酵素系は、酸化還元反応の生成物や酵素活性を調べるなどの目的に利用され、例えば、ＮＡＤＨの蛍光が測定されることがある（例えば、特開平２−２６５５００号公報：特許文献５）が、それらの補酵素のうちの特定のものを認識して発光する発蛍光性化合物は知られていない。
【０００６】
上に例示したような生体物質を検出、測定する従来の発蛍光性化合物の多くは、溶液中の被検出物質の濃度に応じて、その蛍光強度が漸次変化することに基くものであり、低濃度域では蛍光が無く、一方、高濃度になると凝集体を形成して発光しなくなる（消光する）ことがあることが知られている。
【０００７】
これに対して、最近、凝集にともなって蛍光が増大する凝集誘起発光（Aggregation-induced emission：AIE）という現象が見出されている（Y.
Hong. J. W. Y. Lam およびB.Z. Tang,
Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5361-5388：非特許文献２）（J. Wu, W. Liu, J. Ge, H. ZhangおよびP. Wang,
Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 3483-3495：非特許文献３）。このＡＩＥ利用すれば、これまでにない新しい方式の蛍光分析ができるものと期待されているが、ＡＩＥを示す発蛍光性化合物の例はきわめて少ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４１３８３３１号公報
【特許文献２】特許第２７９９８３７号公報
【特許文献３】特許第２８８３８２４号公報
【特許文献４】特許第２８８９４７６号公報
【特許文献５】特開平２−２６５５００号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P.D. Beer他、Angew. Chem. Int. Ed., 40, 486 (2001)
【非特許文献２】Y. Hong. J. W. Y. Lam and B.Z.Tang, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5361-5388
【非特許文献３】J. Wu, W. Liu, J. Ge, H. Zhangand P. Wang, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 3483-3495
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、各種の生体物質の検出、測定に適用されるように設計することができる基本構造を有しＡＩＥを発現する新規な発蛍光性化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、アリールエテン誘導体のうち上記目的を達成し得るものがあることを見出し本発明を導き出した。
かくして、本発明は、下記の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする発蛍光性化合物を提供するものである。
【００１２】
【化１】
2014012654.tif 000003
【００１３】
式（Ｉ）中、ＸおよびＹは、同一または異なっており、それぞれ独立して、下記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）で示される原子団を表す。ｎおよびｍは１から６の整数を表し、(−ＣＨ２−)ｎおよび(−ＣＨ２−)ｍ中の１つまたは２つの−ＣＨ２−は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−または−ＣＨ＝ＣＨ−で置き換えられてもよい。
【００１４】
【化２】
2014012654.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）の合成スキームを示す。
【図２】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−bipy）の合成スキームを示す。
【図３】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｚｎ）の合成スキームを示す。
【図４】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｂ）の合成スキームを示す。
【図５】本発明の発蛍光性化合物の１例（hetero−ＴＰＥ）の合成スキームを示す。
【図６】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰE−Ｇ）のヌクレオチド（ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＡＴＰ）に対する蛍光特性を示す蛍光スペクトル（ａ）および写真（ｂ）を示す。
【図７】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）とＡＴＰとの混合によって得られる凝集体のＤＬＳ測定結果（ａ）およびＳＥＭ写真（ｂ）を示す。
【図８】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）にヌクレオチド（ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＡＴＰ）を添加した蛍光滴定試験の結果を示す。
【図９】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）の補酵素に対する蛍光特性を示す蛍光スペクトル（ａ）および写真（ｂ）を示す。
【図１０】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）を用いた補酵素に対する蛍光滴定試験の結果を示す。
【図１１】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）に補酵素を添加した場合のＤＬＳ測定の結果を示す。
【図１２】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｇ）に亜硫酸ナトリウムを添加して補酵素の蛍光測定を行った場合の補酵素と亜硫酸ナトリウムの付加化合物の化学構造式（ａ）、蛍光強度を示すグラフ（ｂ）、および蛍光の様子を示す写真（ｃ）である。
【図１３】本発明の発蛍光性化合物の１例（ＴＰＥ−Ｚｎ）のヌクレオチドに対する蛍光強度を示すグラフ（ａ）および蛍光の様子を示す写真（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上記の式（Ｉ）で表されるように、本発明の発蛍光性化合物は、アリールエテン（テトラフェニルエテン）構造から成る発光部位、ＸおよびＹで表される認識部位（目的の生体物質を認識しそれらと結合し得る部位）、および発光部位と認識部位との間のスペーサー部位から構成されている。
【００１７】
認識部位のうち、上記（Ａ）で表される原子団は、グアニジウム基であり、この原子団を含む本発明の発蛍光性化合物は、生体液または生理的塩類中でリン酸イオンまたはリン酸基を有する生体物質を認識して蛍光を発する。ＸまたはＹとして、この（Ａ）で表される原子団を有する発蛍光性化合物は、特に、三リン酸（トリフォスフェート）構造を認識してＡＴＰを高感度に検出、測定することができるという特性を有する。さらに、（Ａ）で表されるグアニジウム基を有する本発明の発蛍光性化合物は、補酵素系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨのうち、特にＮＡＤＰＨに対して特異的にＡＩＥを示す特性を有し、その検出、測定に用いることができる。そして、本発明の発蛍光性化合物を用いれば、測定系に適当な付加化合物（adduct）を発生させることにより、その特異的反応性を変化させ、その付加化合物の存在しない場合に検出できないような物質の検出も可能にする。
【００１８】
また、認識部位として上記（Ｂ）で表される原子団は、ビピリジン類縁基であり、この原子団を含む本発明の発蛍光性化合物も、リン酸イオンまたはリン酸基を有する生体物質を認識して蛍光を発することができる。
【００１９】
認識部位として上記（Ｃ）で表される原子団は、ジピコリルアミン基である。この原子団を含む本発明の原子団は、その原子団を介して、適当な金属、特に亜鉛または銅との錯体の形態で用いられることにより、リン酸イオンまたはリン酸基を有する生体物質を認識して蛍光を発することができる。
【００２０】
認識部位として、上記（Ｄ）で表される原子団は、フェニルボロン酸含有原子団であり、生体液または生理的塩類中で、グルコースに代表される糖類を認識し糖類と結合するので、この原子団を有する本発明の発蛍光性化合物は生体液または生理的塩類中の糖類の検出、測定に用いることができる。
【００２１】
上記の式（Ｉ）で表される本発明の発蛍光性化合物のうち、合成の容易さなどから、好ましいものとして下記の式（II）で表される化合物を挙げることができる。式（II）中、Ｘは、前記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）で示される原子団の一つを表す。
【００２２】
【化３】
2014012654.tif 000005
【００２３】
上記の式（Ｉ）で表される本発明の発蛍光性化合物の別の好ましい例として、下記の式（III）で表される化合物を挙げることができる。式（III）中、Ｘは前記の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）で示される原子団の１つを表し、Ｙは前記の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）で示される原子団の１つであって、Ｘで表される原子団とは異なる原子団を表す。
【００２４】
【化４】
2014012654.tif 000006
【００２５】
上述した本発明の発蛍光性化合物を用いる生体物質の検出、測定においては、被検物質が一定以上の濃度になると凝集（Aggregation）に伴う急激な蛍光の発生が認められる。すなわち、蛍光発生に閾値が存在して、被検物質のOn／Off検出が可能となる。
【００２６】
本発明の発蛍光性化合物は、既知の反応を工夫することにより合成することができる。
例えば、図１には、上記の式（II）に属する本発明の化合物の例として、テトラフェニルエテン構造の末端（Ｘ）にスペーサー部位を介して、前記（Ａ）で表されるグアニジウム基が結合した発蛍光性化合物（ＴＰＥ−Ｇ）の合成スキームが示されている。
【００２７】
図２には、式（II）に属する本発明の化合物の別の例として、テトラフェニル構造の末端（Ｘ）にスペーサー部位を介して、前記（Ｂ）で表されるビピリジン類縁基が結合した発蛍光性化合物（ＴＰＥ−bipy）の合成スキームが示されている。
【００２８】
図３には、式（II）に属する本発明の化合物の別の例として、テトラフェニル構造の末端（Ｘ）にスペーサー部位を介して、前記（Ｃ）で表されるジピコリルアミン基が結合し、この基を介してＺｎ錯体を形成している発蛍光性化合物（ＴＰＥ−Ｚｎ）の合成スキームが示されている。
【００２９】
図４には、式（II）に属する本発明の化合物の更に別の例として、テトラフェニルエテン構造の末端（Ｘ）にスペーサー部位を介して、前記（Ｄ）で表されるフェニルボロン酸含有原子団が結合した発蛍光性化合物（ＴＰＥ−Ｂ）の合成スキームが示されている。
【００３０】
さらに、図５には、上記の式（III）に属する本発明の化合物の例として、テトラフェニルエテン構造の末端（Ｘ）および（Ｙ）に、スペーサー部位を介して、それぞれ、前記（Ａ）で表されるグアニジウム基および（Ｃ）で表されるジピコリルアミン基が結合した発蛍光性化合物（hetero−ＴＰＥ）の合成スキームが示されている。
以下、本発明をさらに具体的に説明するために実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＴＰＥ−Ｇの合成
図１に示す合成スキームに従って、本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−Ｇを合成した。
＜化合物２）の合成＞
４，４’−dimethoxybenzophenone１（５．００ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）とそれに亜鉛粉末（６．６６ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのＴＨＦに加え、ＴｉＣｌ４（７．５０ｍＬ，６８．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。その後、１５時間加熱還流した。反応溶液が室温まで冷却した後、１００ｍｌの水を加えた。溶液をクロロホルム１００ｍｌで三回抽出し、それぞれの抽出液を纏めて無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ液を減圧濃縮した。粗製物はシリカゲルカラムクロマトグラフで分離精製し、分離物をクロロホルム：ヘキサン＝２：１の溶媒から再結晶した。白色結晶として化合物２を３．４３グラム得た。収率７４％。
1H NMR（300MHz, DMSO-d6）δ6.85（d, J=8.7Hz, 8H）,6.69（d, J=8.7Hz, 8H）,3.68（s, 12H）
MS（ESI）m/z 452.2(M+).
【００３２】
＜化合物３）の合成＞
化合物２（６．０１ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解し、寒剤を入れた氷浴で冷却しながら、２ＭＢＢｒ３の塩化メチレン溶液（３７．２ｍＬ，７４．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。氷浴を外し、室温で１２時間撹拌した後、水５０ｍｌを加えた。生じた沈殿物をろ取し、アセトン：水＝１：１で再結晶した。白色結晶として化合物３を５．２６グラム得た。収率９２％。
1H NMR（300MHz, DMSO-d6）δ9.24（s, 4H）,6.70（d, J=8.6Hz, 8H）,6.48（d, J=8.6Hz, 8H）
【００３３】
＜化合物５）の合成＞
３−bromopropylamine hydrobromide４（５．００ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）を乾燥した１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、それにＢｏｃ２Ｏ（５．４８ｇ，２５．１ｍｍｏｌ）とtriethylamine（３．５ｍＬ，２５．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で１４時間撹拌した。その後、１００ｍｌのジクロロメタンを加え、１Ｍ塩酸水溶液、水、食塩水の順に洗浄した。有機相は無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ液を減圧濃縮した。粗製物はシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、無色オイル状物として化合物５を５．１７グラム得た。収率９５％。
1H NMR（CDCl3, 300MHz）δ4.65（br s, 1H）,3.45（t, J=6.5Hz, 2H）,3.28（q, J=6.5Hz, 2H）,2.05（quint, J=6.5Hz, 2H）,1.45（s, 9H）.
【００３４】
＜化合物６）の合成＞
化合物３（１．００ｇ，２．３３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．６０ｇ，１８．８ｍｍｏｌ）および化合物５（２．５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ＤＭＦに加え、７０℃で１０時間加熱した。室温まで反応液の温度を戻した後、水５０ｍｌを加えた。生じた沈殿物をろ取し水で洗浄した。得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ液を減圧濃縮した。粗製物はシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物６を１．３４グラム得た。収率５６％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ6.91（d, J=8.8Hz, 8H）,6.62（d, J=8.8Hz, 8H）,4.78（br s, 4H）,3.95（t, J=6.1Hz, 8H）,3.30（q, J=6.1Hz, 8H）,1.94（quint, J=6.1Hz,
8H）,1.44（s, 36H）;
【００３５】
＜化合物７）の合成＞
化合物６（８２５ｍｇ，０．８０５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、ＴＦＡ（５ｍＬ，６５．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。その後、反応液をエーテルに空け、生じた白色沈殿をろ取し、エーテルで洗浄後乾燥した。白色固体として化合物７を６６０ｍｇ得た。収率７９％。
1H NMR（300MHz, DMSO-d6）δ7.98（s, 12H）,6.85（d, J=8.8 Hz, 8H）,6.70（d, J=8.8Hz, 8H）,3.97（t, J=5.8Hz, 8H）,2.95（t, J=7.4Hz, 8H）,1.97（quint, J=6.6Hz,
8H）
【００３６】
＜化合物８）の合成＞
化合物７（６００ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのジクロロメタンに懸濁し、Ｅｔ３Ｎ（０．６ｍＬ，４．３３ｍｍｏｌ）と１−Ｈ−pyrazole−１−（Ｎ，Ｎ’−bis（tert−butyloxycarbonyl））carboxamidine（１．２１ｇ，３．８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合溶液を室温で７２時間撹拌し、溶媒を減圧溜去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物８を５２３ｍｇ得た。収率５９％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ11.5（s, 4H）,8.66（t, J=4.7Hz, 4H）,6.91（d, J=8.6Hz, 8H）,6.69（d, J=8.6Hz, 8H）,3.98（t, J=5.3Hz, 8H）,3.62（q, J=5.8Hz, 8H）,2.03（quint, J=5.8Hz, 8H）,1.50（s, 36H）,1.49（s, 36H）;
【００３７】
＜ＴＰＥ−Ｇの合成＞
化合物８（４９２ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、ＴＦＡ（５ｍＬ，６５．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１３時間撹拌した。反応混合溶液をエーテルに空け、生じた沈殿物をろ取し、エーテル洗浄した後、乾燥した。粗製物はＴＦＡのジクロロメタン溶液に溶解し、エーテルに空け、生じた沈殿物をろ取し乾燥した。白色固体としてＴＰＥを１５３ｍｇ得た。収率４０％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ7.87（t, J=5.4 Hz, 4H）,7.29（br-s, 16H）,6.85（d, J=8.7Hz, 8H）,6.69（d, J=8.7Hz, 8H）,3.93（t, J=5.9Hz, 8H）,3.24（q, J=6.4Hz, 8H）,1.89（quint, J=6.4Hz, 8H）;
MS（ESI）m/z 1135.2（[M-CF3COO-]+）
Calc. for C50H60F12N12O12（TPE）:C, 48.08; H, 4.84; N, 13.46. Found: C, 47.78; H, 4.86; N, 13.22.
【実施例２】
【００３８】
ＴＰＥ−bipyの合成
図２に示す合成スキームに従って、本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−bipyを合成した。
＜化合物１１）の合成＞
２−クロロ−５−メトキシカルボニルピリジン（１．３ｇ、７．６ｍｍｏｌ）をｍ−キシレン２０ｍｌに溶解し、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．２７ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）と２−トリメチルスズピリジン（２．１ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を加え、２０時間加熱還流した。放冷後エーテルで希釈し、中性アルミナを通してろ過した。ろ液を数回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去後シリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として１．１３ｇの化合物１０を得た。収率７０％。
次いで、得られた化合物１０（１．１３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）をエタノール／水１：１  ２０ｍｌに懸濁し、ＫＯＨ（０．３５ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を水２ｍｌに溶解したものを添加し、室温で３時間撹拌した。その後、濃縮してエタノールを留去し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を中性になるまで添加した。得られた懸濁液をクロロホルムで三回抽出し、抽出液を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、淡黄色固体として化合物１１を０．８ｇ得た。収率７５％。
【００３９】
＜ＴＰＥ−Bipyの合成＞
化合物７（６００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５ｍｌ）に懸濁し、化合物１１（０．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．６ｍｌ、４．３３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１ｍｌ）を加えた。溶液を氷冷下、ＷＳＣ（１．７ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を加え２４時間撹拌した。溶媒を濃縮乾固し、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、ＴＰＥ−Bipy０．５ｇ（収率３６％）を得た。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ9.22（s, 4H）,8.54-8.88（m, 8H）,8.15-8.40（m, 8H）,7.67-7.84（m, 4H）,7.15-7.33（m, 4H）,6.90（d, J=8.7Hz, 8H）,6.72（d, J=8.7Hz, 8H）,3.65（t, J=6.4Hz, 8H）,3.06（q, J=6.4Hz, 8H）,1.77（quint, J=6.4Hz, 8H）;
MS（ESI）m/z 1353.4.(M+1)
Calc. for C82H72N12O4（TPE-bipy）:C, 72.76; H, 5.36; N, 12.41. Found: C, 72.55; H, 5.48; N, 12.20.
【実施例３】
【００４０】
ＴＰＥ−Ｚｎの合成
図３に示す合成スキームに従って、本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−Ｚｎを合成した。
＜化合物１２）の合成＞
化合物７（１．０５ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１００ｍｌ）に懸濁し、２−クロロメチルピリジン塩酸塩（２．２１ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えた。炭酸カリウム（４．６５ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム（２．２３ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）を加え、２２時間加熱還流した。放冷し沈殿物をろ別後、溶液を濃縮乾固し、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、淡黄色固体として化合物１２を１．３３ｇを得た。収率５８％。
1H NMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ8.43(m, 8H), 7.59(m, 8H), 7.43(m, 8H), 7.16(m, 8H), 6.86(d, J=8.8
Hz, 8H), 6.59(d, J=8.8 Hz, 8H), 3.87(t, J=6.2 Hz, 8H), 3.72(s, 16H), 2.55(t,
J=6.2 Hz, 8H), 1.85(quint, J=6.2 Hz, 8H);
13C
NMR(75 MHz, DMSO-d6) δ159.5, 156.9, 148.9, 138.3, 136.6, 136.4, 132.1, 122.7, 122.2,
113.8, 65.1, 59.9, 50.0, 26.7.
【００４１】
＜ＴＰＥ−Ｚｎの合成＞
化合物１２（５０ｍｇ、０．０３７０ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに溶解し、硝酸亜鉛Ｚｎ(ＮＯ３)２−６Ｈ２Ｏ（４４ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）に溶解した溶液を添加した。得られた溶液を室温で３０分撹拌後、溶媒を蒸発させて乾燥し、次いで水（３ｍｌ）を添加した。得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥して、淡黄色固体としてＴＰＥ−Ｚｎを得た（収率：定量）。
元素分析C86H88N20O28Zn4（TPE-Zn）：計算値：C, 48.92; H, 4.20; N, 13.27。実測値：C, 49.03; H, 4.11; N, 13.00。
【実施例４】
【００４２】
ＴＰＥ−Ｂの合成
図４に示す合成スキームに従って、本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−Ｂを合成した。
＜化合物１３）の合成＞
化合物７（６００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５ｍｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（０．６ｍｌ、４．３３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１ｍｌ）を加えた。塩化メチレン（３ｍｌ）に溶解した３−クロロカルボニルピリジン塩酸塩（０．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を５℃以下で滴下した。その後室温で３時間撹拌した。溶媒を濃縮乾固し、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色の化合物１３を０．３７ｇ得た。収率６３％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ9.05（s, 4H）,8.10-8.85（m, 12H）,6.86（d, J=8.7Hz, 8H）,6.73（d, J=8.7Hz, 8H）,3.70（t, J=5.9Hz, 8H）,3.11（q, J=6.4Hz, 8H）,1.82（quint, J=6.4Hz, 8H）;
MS (ESI) m/z 1045.2(M+1)
Calc. for C82H72N12O4
(13): C, 71.25; H, 5.79; N, 10.72. Found: C, 71.04; H, 5.99; N, 10.54.
【００４３】
化合物１３（０．３７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に懸濁し、２−ブロモメチルフェニルボロン酸プロピレンエステル（０．４５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を加え、５時間加熱還流する。その後溶媒を濃縮乾固し、得られた粗製物シリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、ＴＰＥ−Ｂ０．３２ｇ（収率４４％）を得た。
1H NMR（300MHz, CD3OD）δ9.44（s, 4H）,9.05-9.22（m, 4H）,8.35-8.90（m, 8H）,7.37-7.86（m, 20H）,6.80（d, J=8.7Hz, 8H）,6.65（d, J=8.7Hz, 8H）,4.65（d, J=6.8Hz, 16H）,3.66（t, J=5.9Hz, 8H）,3.04（q, J=6.4Hz, 8H）,2.35（d, J=6.8Hz, 8H）,1.80（quint, J=6.4Hz, 8H）;
Calc. for C82H72N12O4
(TPE-B): C, 59.33; H, 10.42; N, 10.72. Found: C, 59.08; H, 10.66; N, 10.36.
【実施例５】
【００４４】
hetero−ＴＰＥの合成
図５に示す合成スキームに従って、本発明の発蛍光性化合物hetero−ＴＰＥを合成した。
＜化合物１５）の合成＞
ビス（４−ヒドロキシフェニル）ケトン（５ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１０ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ−ブトキシカルボニルアミド（７．８ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間撹拌した。沈殿物をろ別し、濾液を濃縮乾固したのち、粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製した。白色固体として化合物１５を８．９ｇ得た。収率７２％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ8.20（s, 2H）,7.13（d, J=8.6Hz, 4H）,6.92（d, J=8.6Hz, 4H）,4.08（t, J=6.2Hz, 4H）,3.44（q, J=6.2Hz, 4H）,2.04（quint, J=6.2Hz,
4H）,1.42（s, 18H）
【００４５】
＜化合物１６）の合成＞
化合物１５（８．９ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、氷冷下トリフルオロ酢酸（７．７ｇ、６７．５ｍｍｏｌ）を滴下した。その後室温で３時間撹拌したのち、溶媒を濃縮乾固した。得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物１６を７．０ｇ得た。収率７４％。
【００４６】
＜化合物１７）の合成＞
化合物１６（７ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（４．９ｇ、４９ｍｍｏｌ）と１−Ｈ−ピラゾール−１−（Ｎ，Ｎ’−ビス（tert−ブトキシカルボニル））カルボキサミジン（１１．６ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で７２時間撹拌したのち、溶媒を濃縮乾固した。得られた粗製をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物１７を５．３ｇ得た。収率５２％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ10.2（s, 2H）,9.04（t, J=4.7Hz, 2H）,7.22（d, J=8.6Hz, 4H）,7.05（d, J=8.6Hz, 4H）,4.03（t, J=5.3Hz, 4H）,3.89（q, J=5.8Hz, 4H）,2.03（quint, J=5.8Hz, 4H）,1.49（s, 36H）
【００４７】
＜化合物１８）の合成＞
ビス（４−ヒドロキシフェニル）ケトン（５ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１０ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１５．０ｇ、５６．２ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃で２４時間撹拌した。沈殿物をろ別後、ろ液を濃縮乾固した。得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、淡黄色固体として化合物１８を７．３ｇ得た。収率５３％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ8.13（d, J=7.8, 4H）,7.71(d, J=7.7,
4H),7.27（d, J=8.6Hz, 4H）,7.06（d, J=8.6Hz, 4H）,4.11（t, J=6.2Hz, 4H）,3.85（q, J=6.2Hz, 4H）,2.13（quint, J=6.2Hz, 4H）
【００４８】
＜化合物１９）の合成＞
化合物１７（５．３ｇ、６．５ｍｍｏｌ）と化合物１８（３．８３ｇ、６．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、亜鉛粉末（０．４２ｇ、６．５ｍｍｏｌ）を加え、４塩化チタン（４．７ｍｌ、４２．９ｍｍｏｌ）を滴下したのち２４時間加熱還流した。放冷後、１００ｍｌの水を徐々に加え過剰の４塩化チタンを加水分解し、水層をクロロホルムで３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶液を濃縮乾固した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物１９を１．１ｇ得た。収率１２．２％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ9.74（s, 2H）,9.09（t, J=4.7Hz, 2H）,8.08（d, J=7.8, 4H）,7.88（d, J=7.7, 4H）,7.28-7.35（m, 4H）,7.02-7.10（m, 4H）,4.02-4.10（m, 8H）,3.63-3.90（m, 8H）,2.00-2.13（m, 8H）,1.51（s, 36H）
【００４９】
＜化合物２０の合成＞
化合物１（２ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をエタノール（５０ｍｌ）に溶解し、ヒドラジン１水和物（０．３６ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を入れ、５時間加熱還流した。放冷後、析出したフタルヒドラジドをろ別し、ろ液を濃縮乾固した。得られた粗製をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、白色固体として化合物２０を１．０ｇ得た。収率６１．７％。
1H NMR（300MHz, CD3OD）δ8.43（s-br, 2H）,7.07（d, J=8.6Hz, 4H）,6.89（d, J=8.6Hz, 4H）,3.87-4.11（m, 8H）,3.63-3.90（m, 8H）,2.00-2.13（m, 8H）,1.49（s, 36H）
【００５０】
＜化合物２１の合成＞
化合物２０（１ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（３ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム（２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及び２−クロロメチルピリジン塩酸塩（０．７ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、２４時間加熱還流した。放冷後沈殿物をろ別し、ろ液を濃縮乾固した。得られた粗製をシリカゲルカラムクロマトグラフで精製し、淡黄色固体として化合物２１を０．８５ｇ得た。収率６４％。
1H NMR（300MHz, CDCl3）δ11.5（s, 4H）,8.50-8.70（m, 8H）,7.06-7.88（m, 8H）,6.75-6.93（m, 8H）,6.56-6.71（m, 8H）,3.70-3.99（m, 8H）,3.24-3.60（m, 8H）,1.88-2.06（m, 8H）,1.48（s, 36H）
【００５１】
＜hetero−ＴＰＥの合成＞
化合物２１（０．８５ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３０ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍｌ、６５．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応後、エーテルに溶液を添加し、生じた沈殿をろ別したのち少量のエーテルでろ洗後減圧乾燥した。粗製物を少量の塩化メチレンに溶解し、その溶液をエーテルに添加し再沈してろ取、エーテルで洗浄、乾燥し、白色固体として化合物２２を２４９ｍｇ得た。収率４０％。
1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ11.5（s, 4H）,8.50-8.70（m, 8H）,7.06-7.88（m, 12H）,6.75-6.93（m, 8H）,6.56-6.71（m, 8H）,3.70-3.99（m, 8H）,3.24-3.60（m, 8H）,1.88-2.06（m, 8H）,1.48（s, 36H）
MS (ESI) m/z 1077.8([M-CF3COO-]+)
Calc. for C64H76N12O4
(13): C, 51.32; H, 4.55; N, 10.25. Found: C, 51.15; H, 4.82; N, 10.03.
【実施例６】
【００５２】
ＴＰＥ−Ｇの特性試験（１）
実施例１で合成した本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−Ｇについて、その特性を調べた。
＜ヌクレオチドに対する蛍光特性＞
ＴＰＥ−Ｇに、ヌクレオチドとしてＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰを加えて蛍光を測定した。測定条件は以下のとおりである。
ＴＰＥ−Ｇの濃度：６μＭ、ＨＥＰＥＳバッファー（５ｍＭ、ｐＨ７．４）中。
ＡＴＰ，ＡＤＴおよびＡＴＰの濃度：それぞれ、２０μＭ、１２μＭおよび８μＭ。
励起波長λｅｘ：３３５ｎｍ
測定装置：Perkin−ElmerＬＳ５５
測定温度：２５℃
測定セル：１ｃｍ石英セル
測定結果を図６に示す。図６（ａ）に示されるように本発明の発蛍光性化合物ＴＰＥ−ＧはＡＴＰを選択的に認識して蛍光を発することが理解される。このことは、紫外線照射下（λｅｘ：３３５ｎｍ）で肉眼でも観察された（図６（ｂ）参照）
【００５３】
＜凝集体の確認＞
ＴＰＥ−ＧにＡＴＰを添加して紫外可視スペクトルを観察したところ、吸収最大ピークが拡がり且つ３１０ｎｍから３３５ｎｍにシフトした。このことは、凝集体（aggregates）が形成していることを示唆していると考えられたので、ＤＬＳ（dynamic light scattering：ダイナミック光散乱）測定を行ったところ（測定装置：Malvern Zeta sizer Nano-ZS）、水性分散液中に平均直径６７７±２５２ｎｍの凝集体の形成が認められた（図７（ａ）参照）。また、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡：HitachiＳ−５０００）観察によっても、〜１μｍ程度の凝集体の形成が認められた（図７（ｂ）参照）。
【００５４】
＜蛍光滴定試験＞
ＴＰＥ−Ｇ（濃度：６μＭ）に、ＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰを逐次添加して蛍光滴定試験を行った。バッファー、励起波長、測定装置、測定温度、測定セルなどの測定条件は、前述の「ヌクレオチドに対する蛍光特性」の項で述べたのと同じである。
その結果を図８に示す。図中、Ｆ０はヌクレオチドが存在しない場合の蛍光強度を表し、Ｆはヌクレオチドが存在する場合の蛍光強度を表し、△Ｆ＝Ｆ−Ｆ０である。したがって、△Ｆ／Ｆ０は蛍光強度の変化の度合いを意味することになる。
【００５５】
図８（ｂ）に示されるように、ＡＭＰおよびＡＤＰを添加しても実質的な蛍光強度の変化は見られない。これに対して、ＡＴＰの添加に対しては、濃度の増加に対して急激に蛍光が発生し、その強度が大きくなり飽和している。図８の（ｂ）はＡＴＰの場合の低濃度域を拡大して示されているものであるが、この図から、ＴＰＥ−Ｇの蛍光強度はＡＴＰの濃度に対してシグモイド状に変化している。すなわち、従来の均一溶液系において蛍光が濃度に応じて漸増する場合に比べて、本発明の発蛍光性化合物を用いると、一定のＡＴＰ濃度においてターンオンまたはスイッチオン式にＡＴＰを検出し得ることが理解される。
【実施例７】
【００５６】
ＴＰＥ−Ｇの特性試験（２）
＜補酵素に対する蛍光特性＞
実施例１で合成したＴＰＥ−Ｇに補酵素として、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨを加えて蛍光を測定した。補酵素の濃度：１５μＭ、その他の測定条件は、実施例１の場合と同じである。
測定結果を図９に示す。図９（ａ）に示されるように本発明の発蛍光化合物ＴＰＥ−ＧはＮＡＤＰＨを選択的に認識して蛍光を発することが理解される。このことは、紫外線照射下（λｅｘ：３３５ｎｍ）で肉眼でも観察された（図９（ｂ）参照）。
【００５７】
＜蛍光滴定試験＞
ＴＰＥ−Ｇ（濃度：６μＭ）に、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨを逐次添加して蛍光滴定試験を行った。測定条件は、実施例１の場合と同じである。結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋を添加しても実質的な蛍光強度の変化は見られない。これに対して、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの添加に対しては、蛍光強度の増加が見られた。ＴＰＥ−Ｇの蛍光強度は、ＮＡＤＨに対しては漸増するのに対して、ＮＡＤＰＨに対しては濃度の増加に伴って急激に蛍光が発生し、シグモイド状の応答曲線を示している。
このように、補酵素に対して本発明の発蛍光性化合物を用いると、一定のＮＡＤＰＨ濃度においてターンオンまたはスイッチオン式にＮＡＤＰＨを検出し得ることが理解される。
【００５８】
＜凝集体形成挙動の追跡＞
ＴＰＥ−Ｇ（濃度：６μＭ）に、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨを逐次添加し、ＤＬＳ測定によって凝集体の形成挙動を追跡した。図１１に示されるように、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨを添加しても実質的な光散乱強度の変化は見られないことから、ＴＰＥ−Ｇと凝集体を形成しないことが分かる。これに対して、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨの添加に対しては、光散乱強度の増加が見られたことから、ＴＰＥ−Ｇとの凝集体形成が認められた。
光散乱強度は、ＮＡＤＰ＋に対しては４０μＭから漸増するのに対して、ＮＡＤＰＨに対しては発蛍光応答濃度と連動した急激な増加が認められた。このことは、ＮＡＤＰＨに対しては、蛍光応答閾値はＡＩＥ（凝集誘起発光）に因る臨界会合濃度を反映することを意味している。
【００５９】
＜ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋の蛍光検出＞
上記のように、ＴＰＥ−Ｇ（濃度：６μＭ）に、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋を添加しても実質的な蛍光強度の変化は見られない。しかし、亜硫酸ナトリウムを添加（最終濃度：５ｍＭ）することで、発蛍光強度の差異が認められた。これは、亜硫酸ナトリウムとの付加反応により得られる、ＮＡＤ−ＳＯ３、ＮＡＤＰ−ＳＯ３の負電荷数の差異を識別し、結果としてＮＡＤＰ＋を認識したものと理解される（図１２参照）。このように、本発明の発蛍光性化合物を用いれば、付加化合物（adduct）を発生させることにより、被測定物質に対する特異的反応性を変えることができる。
測定条件：ＴＰＥ−Ｇ濃度：６μＭ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋濃度：８０μＭ、亜硫酸ナトリウム濃度：５ｍＭ、ＨＥＰＥＳバッファー（５ｍＭ，ｐＨ７．４）中。
【実施例８】
【００６０】
ＴＰＥ−Ｚｎの特性試験
＜ヌクレオチドに対する蛍光特性＞
実施例３で合成したＴＰＥ−Ｚｎに、イオン強度１００ｍＭの条件下で、ヌクレオチドとして、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰを加えて蛍光を測定した。ヌクレオチドの濃度：１５μＭ、ＮａＣｌ濃度：１００ｍＭ、その他の測定条件は、実施例１の場合と同じである。
測定結果を図１３に示す。図１３（ａ）に示されるように本発明の発蛍光化合物ＴＰＥ−Ｚｎは、特に高塩濃度条件下で、ＡＤＰ、ＡＴＰを選択的に認識して蛍光を発することが理解される。このことは、紫外線照射下（λｅｘ：３３５ｎｍ）で肉眼でも観察された（図１３（ｂ）参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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