(57)【要約】      （修正有）【課題】ポインセチア等のユーフォルビア属種間雑種植物体と、これを作製するための方法の提供。【解決手段】二倍体、三倍体及び四倍体の種間雑種植物体であって、雄性親としてのユーフォルビア・プルケリマと、雌性親としてのユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラのＦ１の雑種とのコルヒチン処理等による四倍体の作製及び交雑に由来する種間雑種植物体。二倍体、三倍体及び四倍体の種間雑種植物体及び植物部位を提供することに加えて、非機能性の小型杯状花序を伴う三倍体の種間雑種植物体を作製する方法、並びに非機能性の小型杯状花序及び赤色の苞葉を伴う四倍体の種間雑種植物体を作製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌性親としてのユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）の植物体と、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｃｏｒｎａｓｔｒａ）の種間雑種である雄性親植物体との交雑から作製される、ユーフォルビア属の種間雑種植物体又はその植物部位。
【請求項２】
前記植物部位が、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、杯状花序、苞葉、シュート、組織、葉柄、細胞、及び分裂組織細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の植物部位。
【請求項３】
請求項１に記載の植物体からクローン増殖させた、種間雑種植物体又はその植物部位。
【請求項４】
染色体数が２ｎ＝２８又は２ｎ＝５６である、請求項１に記載のユーフォルビア・プルケリマの植物体。
【請求項５】
染色体数が２ｎ＝２８又は２ｎ＝５６である、請求項１に記載のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体。
【請求項６】
染色体数が２ｎ＝２８、２ｎ＝４２、又は２ｎ＝５６である、請求項１に記載の種間雑種植物体。
【請求項７】
非機能性の小型杯状花序を有する、請求項６に記載の種間雑種植物体。
【請求項８】
苞葉が赤色である、請求項６に記載の種間雑種植物体。
【請求項９】
（ａ）雌性親としてのユーフォルビア・プルケリマの植物体を、雄性親としてのユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体と交雑させるステップと、
（ｂ）前記交雑から胚を生成させるステップと、
（ｃ）前記胚を生育させて、種間戻し交雑による雑種植物体を得るステップと
を含む、種間雑種植物体を作製する方法。
【請求項１０】
（ａ）第１の植物体及び第２の植物体を作製するステップであり、第１の植物体が、二倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体であり、第２の植物体が、二倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体であるステップと、
（ｂ）前記第１の植物体から花粉を採取するステップと、
（ｃ）前記第２の植物体の花に前記花粉を受粉するステップと、
（ｄ）前記受粉から結果として生じる胚を、組織培養における胚救出により分離するステップと、
（ｅ）前記胚を生育させて、戻し交雑による種間雑種植物体を得るステップと
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法により作製される、種間戻し交雑による雑種植物体又はその部位。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法により作製される、種間戻し交雑による雑種植物体又はその部位。
【請求項１３】
（ａ）雌性親としてのユーフォルビア・プルケリマの植物体と、雄性親としてのユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体との交雑から作製される、種間戻し交雑による雑種植物体の挿し木を得るステップと、
（ｂ）前記挿し木を生育させて、属間雑種植物体を得るステップと
を含む、種間戻し交雑による雑種植物体を作製する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により作製される、種間戻し交雑による雑種植物体。
【請求項１５】
ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数を改変して、四倍体の植物体を作製する方法であって、
（ａ）ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体を生育させるステップと、
（ｂ）抗有糸分裂剤を、前記植物体へと適用するステップと、
（ｃ）前記植物体からシュートを出芽させるステップと、
（ｄ）四倍体のシュートを選択するステップと、
（ｅ）前記シュートの染色体の相補体を評価するステップと、
（ｆ）前記シュートを、植物体へと生育させるステップと、
（ｇ）前記植物体の染色体の安定性を点検するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記改変された染色体数が、四倍体の２ｎ＝５６である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法により作製される、四倍体の植物体。
【請求項１８】
プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、杯状花序、苞葉、シュート、組織、葉柄、細胞、及び分裂組織細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の植物部位。
【請求項１９】
請求項１８に記載の植物部位からクローン増殖させた、四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体又はその部位。
【請求項２０】
三倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマとユーフォルビア・コルナストラとの種間雑種植物体を作製する方法であって、交雑の組合せが、雌性親としての二倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマと、雄性親としての二倍体又は四倍体のＥ．プルケリマ（Ｅ．ｐｕｌｃｈｒｒｉｍａ）×Ｅ．コルナストラ（Ｅ．ｃｏｒｎａｓｔｒａ）の雑種植物体とを用いるステップを伴う方法。
【請求項２１】
非機能性の小型杯状花序を有する、ユーフォルビア・プルケリマとユーフォルビア・コルナストラとの種間雑種植物体。
【請求項２２】
杯状花序の直径が約３ｍｍ以下である、請求項２１に記載の植物体。
【請求項２３】
非機能性で小型の杯状花序及び赤色の苞葉を有する、ユーフォルビア・プルケリマとユーフォルビア・コルナストラとの種間雑種植物体。
【請求項２４】
ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を保有する、三倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマとユーフォルビア・コルナストラとの種間雑種植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002]本発明は、赤色の苞葉及び非機能性の小型杯状花序を有する、ユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）×ユーフォルビア・コルナストラ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｃｏｒｎａｓｔｒａ）の種間雑種植物体を作製するための方法、及びこの方法により作製される植物体に関する。本出願で引用される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0003]本発明の分野は、園芸、植物育種、及び植物遺伝学に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0004]鑑賞植物の市場は大きく、多様であり、この市場においては、鑑賞者の充足及び関心を増大させるための新たな革新的生産物及び改善が常に要求されている。この市場で販売される人気のある１つの植物が、ポインセチア（ユーフォルビア・プルケリマ）である。ポインセチアは、その色彩豊かな苞葉（花を葉腋に抱く）でよく知られており、赤色、白色、ピンク色、紫色及び橙色などの色の範囲で生産されている。赤色が、最も人気の高い色であり、世界中の売上高の大半を占めている。
【０００４】
[0005]種間雑種は、２０００年１０月１６日に出願された、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｒ．、「Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｌａｎｔ」、米国特許第６，５１５，２０号；及び２００６年９月２８日に出願された、Ｂｅｒｎｕｅｔｚ、Ａ．、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ」、米国特許出願公開第２００６０２１８６７９号において記載されている通り、ユーフォルビア・プルケリマ（２ｎ＝２８）とユーフォルビア・コルナストラ（２ｎ＝２８）との間で作製されている。それらの全体が本明細書に組み込まれる、前述された２つの参考文献で概括された方法から作製される植物体は、ユーフォルビア・プルケリマと比較すると、異なる外見及び一部の改善された特徴を有する。例えば、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの雑種植物体は、市販されるポインセチアと比較して、分枝能が高く、苞葉のサイズを小さくする傾向がある。ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの雑種植物体は常に、ピンク色の苞葉を有し、通例、ポインセチアの最も人気の高い栽培品種と比較して、栽培後性状が劣る。ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの市販されている栽培品種には、プリンセチア（ＰＲＩＮＣＥＴＴＩＡ）シリーズ（Ｂｏｎｚａ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ，Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、米国植物特許第ＰＰ２３，２９６号；同第ＰＰ２１，３２７号；同第ＰＰ２１，３２６号；同第ＰＰ２１，３２５号；同第ＰＰ２１３２４号）及びドゥルセローザ（Ｄｕｌｃｅ  Ｒｏｓａ）（米国植物特許第ＰＰ１５，８４９号）が含まれる。突然変異育種は、様々な色調のピンク色をもたらすことができ、栽培品種であるプリンセチアマックスホワイト（ＰＲＩＮＣＥＴＴＩＡ  ＭａｘＷｈｉｔｅ）（米国植物特許第ＰＰ２３，２９６号）は、ピンク色の葉脈を伴う、白色〜極めて薄いピンク色の苞葉を有する。
【０００５】
[0006]市販されているユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ雑種は、ほとんど完全に雄性不稔性（一部の栽培品種では、時折、稔性葯を発生させることがある）であり、全てが雌性不稔性である。このようにこれらの植物体は繁殖できないという事実により、さらなる育種研究及び改善を行い得る範囲は限定されてしまう。
【０００６】
[0007]既に言及した文献において概括された方法は、市販可能な鑑賞用種間雑種であるＥ．プルケリマ（Ｅ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）×Ｅ．コルナストラ（Ｅ．ｃｏｒｎａｓｔｒａ）の植物体を開発するのには有用であったが、これらの方法により、（ａ）非機能性の小型杯状花序及び（ｂ）赤色の花の苞葉を伴う種間雑種であるＥ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの植物体を開発することは不可能であった。
【発明の概要】
【０００７】
[0008]以下の実施形態及びそれらの態様は、例示的であることを意図するものであり、範囲を限定することを意図するものではない、システム、ツール及び方法と共に記載される。様々な実施形態において、上記の問題のうちの１又は複数が軽減又は解消され、一方で他の実施形態は、他の改善へ向けたものである。
【０００８】
[0009]第１の態様では、本発明は、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を作製するための方法であって、（ａ）二倍体の（２ｎ＝２８）ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体であり、暗いピンク色の苞葉、ある量の稔性花粉を含有する偶発的な葯の生成、妥当な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性などの属性を好ましくは保有し得る、適切な雄性親の植物体を用意するステップと、（ｂ）上記の（ａ）において記載した植物体の、栄養枝の先端部による挿し木を用意するステップと、（ｃ）根の成長促進ホルモンを、栄養枝の先端部による挿し木の基部へと適用するステップと、（ｄ）栄養枝の先端部による挿し木を繁殖させて、根を伴う挿し木を作製するステップと、（ｅ）植物体の染色体数の四倍体（２ｎ＝５６）への倍加を結果としてもたらす、コルヒチンなどの化学組成物で、根を伴う挿し木を処置するステップと、（ｆ）選択された、染色体を倍加させたシュートを、顕花植物へと生育させるステップと、（ｇ）結果として得られる、四倍体と推定されるＦ１の雑種植物体の花粉の産生及び花粉の生存度を評価するステップと、（ｈ）植物体の染色体数を、細胞学的解析を介して確認するステップと、（ｉ）植物体を、継代の栄養繁殖を介して安定化させるステップとを含む方法を提供する。
【０００９】
[0010]本発明のさらなる態様は、２ｎ＝５６の染色体を伴う四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体を提供することである。
【００１０】
[0011]本発明のさらなる態様は、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体の植物部位を提供することである。
【００１１】
[0012]本発明のさらなる態様は、染色体を倍加させる方法であって、コルヒチンを用いて、クローン増殖させた四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体又はその部位を作製する方法を提供することである。
【００１２】
[0013]第２の態様では、本発明は、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を作製する方法であって、（ａ）二倍体の（２ｎ＝２８）ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体であり、暗い赤色の苞葉、雄性稔性及び雌性稔性、良好な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性などの属性を好ましくは保有し得る、適切な雌性親の植物体を用意するステップと、（ｂ）上記の（ａ）において記載した植物体の、栄養枝の先端部による挿し木を用意するステップと、（ｃ）根の成長促進ホルモンを、栄養枝の先端部による挿し木の基部へと適用するステップと、（ｄ）栄養枝の先端部による挿し木を繁殖させて、根を伴う挿し木を作製するステップと、（ｅ）根を伴う挿し木を、植物体の染色体数の四倍体（２ｎ＝５６）への倍加を結果としてもたらす、コルヒチンなどの化学組成物で処置するステップと、（ｆ）選択された、染色体を倍加させたシュートを、顕花植物へと生育させるステップと、（ｇ）結果として得られる、四倍体と推定されるＦ１の雑種植物体の雌性稔性及び雄性稔性を評価するステップと、（ｈ）植物体の染色体数を、細胞学的解析を介して確認するステップと、（ｉ）植物体を、継代の栄養繁殖を介して安定化させるステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
[0014]本発明のさらなる態様は、２ｎ＝５６の染色体を伴う四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を提供することである。
【００１４】
[0015]本発明のさらなる態様は、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体の植物部位を提供することである。
【００１５】
[0016]本発明のさらなる態様は、染色体を倍加させる方法であって、コルヒチンを用いて、クローン増殖させた四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体又はその部位を作製する方法を提供することである。
【００１６】
[0017]第３の態様では、本発明は、雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を、雄性親としての四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体と交雑させることにより、戻し交雑による非機能性の小型杯状花序を伴う三倍体の種間雑種植物体を作製する方法であって、（ａ）第１の植物体及び第２の植物体を栽培するステップであり、第１の植物体が、二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体であり、第２の植物体が、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体であり、第１の植物体が、暗い赤色の苞葉、雄性稔性及び雌性稔性、良好な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性などの属性を好ましくは保有するステップと、（ｂ）生存可能な花粉を第２の植物体から採取して、第１の植物体の受容性の柱頭へと適用するステップと、（ｃ）結果として得られた胚を分離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適切な培地上で栽培するステップと、（ｄ）この胚の生育から結果として生じる三倍体の、染色体が２ｎ＝４２の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体を得るステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
[0018]本発明のさらなる態様は、最終的な植物体を、非機能性の小型杯状花序及び他の所望される商業属性に基づく商業的有用性について選択することである。
【００１８】
[0019]戻し交雑による三倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体の植物部位とは、花、挿し木、種子、花粉、胚珠又は細胞である。次いで、植物体を、植物部位からクローン増殖させる。
【００１９】
[0020]本発明のさらなる態様は、本発明の戻し交雑による三倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数が、２ｎ＝４２であることである。
【００２０】
[0021]本発明のさらなる態様は、本発明の戻し交雑による三倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体に、ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を感染させることである。
【００２１】
[0022]第４の態様では、本発明は、雌性親としての四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を、雄性親としての四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体と戻し交雑させることにより、非機能性の小型杯状花序及び赤色の苞葉を伴う、四倍体の種間雑種植物体を作製する方法であって、（ａ）第１の植物体及び第２の植物体を栽培するステップであり、第１の植物体が、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体であり、第２の植物体が、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体であり、（ｂ）第１の植物体が、暗い赤色の苞葉、雄性稔性及び雌性稔性、良好な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性などの属性を好ましくは保有するステップと、（ｃ）生存可能な花粉を第２の植物体から採取して、第１の植物体の受容性の柱頭へと適用するステップと、（ｄ）結果として得られた胚を分離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適切な培地上で栽培するステップと、（ｅ）この胚の生育から結果として生じる四倍体の、染色体が２ｎ＝５６の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの）戻し交雑による植物体を得るステップとを含む方法を提供する。
【００２２】
[0023]本発明のさらなる態様は、最終的な植物体を、非機能性の小型杯状花序、赤色の苞葉、及び他の所望される商業属性に基づく商業的有用性について選択することである。
【００２３】
[0024]戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の種間雑種植物体の植物部位とは、花、挿し木、種子、花粉、胚珠、又は細胞である。次いで、植物体を、植物部位からクローン増殖させる。
【００２４】
[0025]本発明のさらなる態様は、本発明の戻し交雑による四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数が、２ｎ＝５６であることである。
【００２５】
[0026]本発明のさらなる態様は、本発明の戻し交雑による四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体に、ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を感染させることである。
【００２６】
[0027]本発明のさらなる態様は、第３及び第４の態様から展開される、戻し交雑による三倍体及び戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を作製するための方法であって、（ａ）戻し交雑による三倍体又は戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体の挿し木を得るステップであり、前記植物体が、二倍体又は四倍体のユーフォルビア・プルケリマの雌性親と、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体との交雑から作製されるステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して、戻し交雑による三倍体又は戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を得るステップとを含む方法を提供することである。
【００２７】
[0028]本発明のさらなる態様は、戻し交雑による三倍体又は戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を作製するための方法であって、植物ホルモン組成物を挿し木の基部へと適用して、根の形成を誘導し、植物体を作製することでさらに定義される方法を提供することである。
【００２８】
[0029]本発明のさらなる態様は、ユーフォルビア・プルケリマ又はユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数を改変して、体細胞の染色体数を、二倍体の２ｎ＝２ｘ＝２８から、四倍体の２ｎ＝４ｘ＝５６へと増大させるための方法であって、（ａ）植物を栽培するステップと、（ｂ）抗有糸分裂剤を、前記植物体の成長点へと適用するステップと、（ｃ）処置された成長点からシュートを出芽させるステップと、（ｄ）このようにして発生させた、四倍体と推定されるシュートを選択するステップと、（ｅ）前記シュートの染色体の相補体を、細胞学的核型分析を介して評価するステップと、（ｆ）前記シュートを、植物体へと生育させるステップと、（ｇ）染色体の安定性を点検するステップとを含む方法を提供することである。
【００２９】
[0030]上記の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の説明を研究することにより、さらなる態様及び実施形態も明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
[0031]以下の説明及び表では、多数の用語が用いられる。本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、このような用語に与えられる範囲を含め、以下の定義が提示される。
【００３１】
[0032]脱落：杯状花序に関して、離層の形成後における、関連する付属器の脱離を包含する。
【００３２】
[0033]対立遺伝子：対立遺伝子とは、遺伝子の１又は複数の代替的形態のうちのいずれかであって、それらの全てが１つの形質又は特徴に関連する。二倍体の細胞又は生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子が、相同染色体の対において、対応する遺伝子座を占有する。
【００３３】
[0034]アミプロホスメチル（ＡＰＭ）：本明細書で用いられる、アミプロホスメチル（ＡＰＭ）とは、染色体の倍加を誘導するために、植物育種において用いられる化合物を指す。
【００３４】
[0035]雄蕊群：集合的に雄蕊と称する植物花の雄部位。
【００３５】
[0036]異質四倍体：本明細書で用いられる異質四倍体とは、各々が異なる種に由来する２つのゲノムについて二倍体である植物体を意味する。例えば、本発明の異質四倍体であるユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体は、２ｎ＝５６の染色体を有する。
【００３６】
[0037]異質三倍体：本明細書で用いられる異質三倍体とは、染色体数が一倍体の３倍である三倍体の植物体を意味する。例えば、本発明の異質三倍体の植物体は、２ｎ＝４２の染色体を有する。
【００３７】
[0038]異数性四倍体：本明細書で用いられる異数性四倍体とは、四倍体の植物体及び染色体数が一倍体の４倍を超えるか又は一倍体の４倍未満である任意の植物体を意味する。例えば、本発明の異数性四倍体のユーフォルビア属の植物体は、２ｎ＝５６±いくつかの染色体を有する。
【００３８】
[0039]異数性三倍体：本明細書で用いられる異数性三倍体とは、三倍体の植物体及び染色体数が一倍体の３倍を超えるか又は一倍体の３倍未満である任意の植物体を意味する。例えば、本発明の異数性三倍体の植物体は、２ｎ＝４２±いくつかの染色体を有する。
【００３９】
[0040]抗有糸分裂剤：本明細書で用いられる抗有糸分裂とは、有糸分裂（細胞分裂）を停止させることにより細胞の増殖を遮断するのに用いられる化合物又は化学物質であって、染色体の倍加を誘導するために、植物育種において用いられる化合物又は化学物質を指す。抗有糸分裂剤の例には、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン及びアミプロホスメチル（ＡＰＭ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
[0041]無性繁殖／無性生殖：無性繁殖又は無性生殖とは、有性生殖された種子を除くあらゆる種類の植物体の繁殖を意味する。無性繁殖の例には、挿し木、接ぎ木、株分け、無配偶生殖、又は組織培養における再生が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
[0042]戻し交雑：戻し交雑とは、育種家が、雑種の後代を、親植物のうちの１つへと繰り返し差し戻して交雑させる過程であって、例えば、第１世代の雑種Ｆ１を、Ｆ１雑種の親遺伝子型のうちの１つと交雑させる過程である。
【００４２】
[0043]苞葉：有色であることが多い変形した葉構造であって、ユーフォルビア属の一部の種において杯状花序を葉腋に抱く葉構造。
【００４３】
[0044]細胞：本明細書で用いられる細胞には、分離されている場合であれ、組織培養物中の場合であれ、植物体内又は植物部位内に組み込まれている場合であれ、植物細胞が含まれる。
【００４４】
[0045]キメラ：キメラ又はキメラ植物体とは、２つ以上の遺伝子的に異なる細胞群からなる植物体である。遺伝子的な異質性は通例、突然変異に由来する。
【００４５】
[0046]染色体数：植物細胞により保有される染色体数。
【００４６】
[0047]染色体の安定性：本明細書で用いられる染色体の安定性とは、突然の変化若しくは変動又は極端な変化若しくは変動の下に置かれることのない染色体を指す。
【００４７】
[0048]コルヒチン：コルヒチンとは、イヌサフランから得られる淡黄色のアルカロイドＣ２２Ｈ２５ＮＯ６であって、染色体の倍加を誘導するために、植物育種において用いられるアルカロイドである。
【００４８】
[0049]交雑：植物体の雌花による受粉であって、これにより、花からの種子の生成を結果としてもたらす可能性がある受粉。
【００４９】
[0050]他家受粉：異なる植物体に由来する２つの配偶子の合一による受精。
【００５０】
[0051]挿し木：植物体から採取された茎、葉又は根など、植物体に由来する部位であって、移植又は接ぎ木などを介して、新たな植物体を繁殖させる部位。
【００５１】
[0052]杯状花序の直径：ミリメートル単位の直径であって、杯状花序のうちの最も幅の広い部位において横方向に測定される一次杯状花序又は二次杯状花序の直径。
【００５２】
[0053]杯状花序（ｃｙａｔｈｉｕｍ）（複数形：ｃｙａｔｈｉａ）とは、ユーフォルビア属（ユーフォルビア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）科）の植物体の花序を形成する、特殊な偽花（「疑似花」）の１種である。杯状花序は、植物体において生成する際、一次（第１の）、二次（第２の）、三次（第３の）などと記載される。
【００５３】
[0054]二倍体：二倍体（体細胞の染色体数である２ｎ＝２ｘにより表示される）とは、基本（一倍体の）染色体数（記号ｘにより表示される）が倍加されるように、各種類の染色体の１つの対（相同対）を有する体細胞又は植物体である。本文書の文脈において、二倍体とは、２ｎ＝２８を意味する。
【００５４】
[0055]優性遺伝：特定の特徴又は形質の表現型が優性対立遺伝子により決定される遺伝方式を指す。
【００５５】
[0056]優性突然変異：優性突然変異の表現型は、ヘテロ接合の遺伝子型において目視可能である。
【００５６】
[0057]除雄する：植物体の雄性生殖器官の除去、或いは化学薬剤又は雄性不稔性を付与する細胞質若しくは核の遺伝因子による雄性生殖器官の不活化。
【００５７】
[0058]胚：前胚が胚及び胚柄へと分化した場合の受精又は単為生殖の後における幼齢の植物個体。
【００５８】
[0059]胚培養：ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適切な培地上における、分離された植物胚の育成。
【００５９】
[0060]胚救出：本明細書で用いられる胚救出とは、植物育種家が、親植物では脆弱な場合もあり、未成熟した場合もあり、他の形で成熟した生存可能な種子へと発育しない場合もある胚を成長させようと試みるために用いる過程である。例えば、胚救出の１つの形態は、種子から胚珠を無菌的に取り出して、胚珠を人工的な培地に入れ、胚の成長及び植物体への生育を可能とすることを伴う胚珠培養である。
【００６０】
[0061]ユーフォルビア・コルナストラ：ユーフォルビア科に由来する植物種であって、部分的に栽培化されているが市販はされていない植物種。本文書の文脈では、別段に言明されない限り、ユーフォルビア・コルナストラの染色体数が、二倍体の２ｎ＝２８である。
【００６１】
[0062]ユーフォルビア・プルケリマ：ユーフォルビア科に由来する植物種であって、栽培化されており、商業園芸において鑑賞植物として用いられている植物種である。本文書の文脈では、別段に言明されない限り、ユーフォルビア・プルケリマの染色体数は、二倍体の２ｎ＝２８である。
【００６２】
[0063]ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ：雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマと、雄性親としての二倍体のユーフォルビア・コルナストラとの種間雑種。結果として得られるＦ１の種間雑種の染色体数は、二倍体の２ｎ＝２８である。
【００６３】
[0064]Ｆ２：「Ｆ２」という記号は、第１世代であるＦ１世代のメンバーの自殖又は自己交配から結果として生じる子孫を表示する。
【００６４】
[0065]微毛を伴う杯状花序：内部形質の肥大という特徴を保有する杯状花序であって、外側へ拡張し、杯状花序を開かせ、これに柔微毛を伴う外見をもたらす杯状花序。微毛を伴う杯状花序は通例、通常の杯状花序と比較して大幅に肥大しており、商業的に望ましい植物体の形質であるとは考えられない。
【００６５】
[0066]配偶子：接合子を形成する有性融合に関与し得る細胞又は核。
【００６６】
[0067]遺伝子：本明細書で用いられる遺伝子とは、核酸のセグメントを指す。遺伝子は、異なる種に由来する場合であれ、同じ種に由来する場合であれ、形質転換又は多様な育種法を用いて種のゲノムへと導入することができる。
【００６７】
[0068]遺伝子型：細胞又は生物の遺伝子構成を指す。
【００６８】
[0069]雌蕊群：植物体の花部位を生成させる胚珠。
【００６９】
[0070]半数体：半数体とは、染色体の相補体の各染色体の一方の代表だけを含有する細胞核であり、記号ｎにより表示される。半数体数（ｎ）とは、半数体の細胞核内の染色体数である。配偶子とは、半数体の細胞である。
【００７０】
[0071]ヘテロ接合性：特定の遺伝子の遺伝子座の対応する対立遺伝子が異なる遺伝子構成を指す。
【００７１】
[0072]ホモ接合性：特定の遺伝子の遺伝子座の対応する対立遺伝子が同一である遺伝子構成を指す。
【００７２】
[0073]同系交配：遺伝子的に近縁の配偶子の融合による子孫の生成と定義される。
【００７３】
[0074]花序：主枝からなる茎に配置される花の群若しくはクラスター又は枝の配置。
【００７４】
[0075]種間交雑：種間交雑とは、各々が同じ属の異なる種に由来する２つの個体の有性の雑種形成を意味する。例えば、ユーフォルビア・プルケリマの植物体を、ユーフォルビア・コルナストラの植物体と交雑させることを意味する。
【００７５】
[0076]種間雑種：種間雑種とは、種間交雑又は２つの異なる種の間の交雑から結果として生じるＦ１世代の植物体を意味する。
【００７６】
[0077]核型分析：本明細書で用いられる核型分析とは、染色された中期染色体を光学顕微鏡解析することによる染色体数及び構成の確認を意味する。細胞を採取し、分裂するように誘導し、次いで、中期（染色体が凝縮されており、したがって、目視可能な細胞分裂の相）で停止させる。染色体を、明色バンド及び暗色バンドのパターンを示す特定の色素で染色する。染色体の大きな変化は、核型分析を用いて検出することができる。
【００７７】
[0078]遺伝子座：遺伝子座は、例えば、除草剤忍容性、虫害抵抗性、病害抵抗性、花の呈色、花の形、植物体の丈高など、１又は複数の形質を付与する。形質は、例えば、品種のゲノムへと導入される自然発生の遺伝子により付与される場合もあり、戻し交雑、天然若しくは誘導性の突然変異、又は遺伝子形質転換法を介して導入されるトランス遺伝子により付与される場合もある。遺伝子座は、単一の染色体位置に組み込まれた１又は複数の対立遺伝子を含み得る。
【００７８】
[0079]Ｍ０：Ｍ０世代とは、突然変異原で処理された世代である。後続の世代を、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３などと称する。
【００７９】
[0080]一倍体：一倍体の染色体数とは、単一の（非相同）セット内の染色体数（ｘ）であり、半数体数（ｎ）とは異なり得る。
【００８０】
[0081]突然変異：突然変異とは、細胞のゲノムのＤＮＡ配列内の変化であり、放射線又は化学物質などの突然変異原により引き起こされるほか、ＤＮＡの複製時に自発的に生じるエラーによっても引き起こされる。
【００８１】
[0082]非機能性の小型杯状花序：「非機能性の小型杯状花序」という語句は、横方向に測定される平均直径が３ｍｍ以下である杯状花序であって、機能的な雄蕊群及び雌蕊群を欠いているために性的能力を有さない杯状花序について記載する。
【００８２】
[0083]オリザリン：本明細書で用いられる、オリザリンとは、染色体の倍加を誘導するために、植物育種において用いられる化合物を指す。
【００８３】
[0084]異系交配（ｏｕｔｂｒｅｅｄｉｎｇ）：他殖配（ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ）としても知られており、遠縁の配偶子の融合による子孫の生成として説明される。異系交配とは、同系交配の反意語である。
【００８４】
[0085]胚珠培養：切り出された胚珠の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適切な培地上における培養。
【００８５】
[0086]表現型：花の呈色、植物体のサイズなど、植物体の任意の観察可能な特徴又は形質を指す。
【００８６】
[0087]植物体：本明細書で用いられる植物体という用語は、そこから種子又は葯が採取される植物体を含め、未成熟又は成熟した全植物体に対する言及を包含する。また、植物体を生成させる種子又は胚も、植物体であると考えられる。
【００８７】
[0088]植物細胞：本明細書で用いられる植物細胞は、分離されている場合であれ、組織培養物中の場合であれ、植物体内又は植物部位内に組み込まれている場合であれ、植物細胞が含まれる。
【００８８】
[0089]草性：草性とは、植物体の全体的な生育表現型の目視による評価である。
【００８９】
[0090]植物ホルモン組成物：本明細書で用いられる植物ホルモン組成物とは、植物の生育を調節する化学物質を指す。例えば、インドール−３−酪酸、Ｎ６−ベンジルアデニン、及びジベレリン酸を指す。
【００９０】
[0091]植物部位：本明細書で用いられる「植物部位」という用語は、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、杯状花序、苞葉、シュート、組織、葉柄、細胞、及び分裂組織細胞などを包含する。
【００９１】
[0092]ＰｏｉＢＩ：特定のユーフォルビア属の種に感染し、感染した植物体の分枝を増大させる影響を及ぼすファイトプラズマである、ポインセチア分枝誘導ファイトプラズマの略記。
【００９２】
[0093]受粉：受粉とは、花粉を植物体内に移送し、これにより、受精及び有性生殖を可能とする過程である。
【００９３】
[0094]倍数体：２つを超える相同染色体の完全なセットを保有する植物個体。
【００９４】
[0095]栽培後：栽培後とは、温室栽培施設を離れた後の時間を意味する。
【００９５】
[0096]栽培後性状：栽培後性状とは、温室栽培施設を離れる時点からの植物の品質及びその後の品質の低下に関する。
【００９６】
[0097]後代：本明細書で用いられる後代には、ユーフォルビア・プルケリマの植物体の、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ系統に由来する植物体との交雑から作製されるＦ１の植物体が含まれる。後代には、後続のＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１０世代の、親植物体と後代植物体との交雑腫がさらに含まれるがこれらに限定されない。
【００９７】
[0098]劣性遺伝：特定の特徴又は形質の表現型が劣性対立遺伝子により決定される遺伝方式を指す。
【００９８】
[0099]劣性突然変異：劣性突然変異の表現型は、ホモ接合性の遺伝子型だけにおいて目視可能である。
【００９９】
[0100]再生：植物体の、組織培養物からの発生を指す。
【０１００】
[0101]有性繁殖／有性生殖：植物体の、種子からの繁殖を指す。
【０１０１】
[0102]体細胞：植物の胞子、配偶子、又はそれらの前駆体以外の任意の細胞。
【０１０２】
[0103]四倍体：本明細書で用いられる四倍体とは、染色体数が一倍体の染色体数の４倍である細胞又は植物体を指し、体細胞では２ｎ＝４ｘで表される。本文書の文脈では、四倍体は２ｎ＝５６を意味する。
【０１０３】
[0104]トリフルラリン：本明細書で用いられるトリフルラリンとは、染色体の倍加を誘導するために、植物育種において用いられる化合物を指す。
【０１０４】
[0105]三倍体：本明細書で用いられる三倍体とは、染色体数が一倍体の染色体数の３倍である細胞又は植物体を指し、体細胞では２ｎ＝３ｘで表される。本文書の文脈では、三倍体は２ｎ＝４２を意味する。
【０１０５】
[0106]品種：植物育種の当業者により用いられる植物品種とは、既知の最も階層の低い単一の植物学的分類群内の植物の群分けであって、所与の遺伝子型又は表現型の組合せから結果として生じる特徴の発現により定義することができ、前記特徴のうちの少なくとも１つの発現により他の任意の植物の群分けから識別することができ、変化させずに繁殖させるためのその適性に関する単位として考えられ得る、既知の最も階層の低い分類群内の植物の群分けを意味する（植物の新品種の保護に関する国際条約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ））。
【０１０６】
四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の雑種植物体の発生
[0107]本発明は、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体であって、本明細書では、染色体数が２ｎ＝５６であると定義される植物体を発生させるための方法を提供する。利用可能な先行技術では、Ｂｅｒｎｕｅｔｚ，Ａ．、「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｄｗａｒｆ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｓ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ  Ｗｉｌｌｄ．）ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ」、シドニー大学への博士論文（２００１）の著者がそれらの潜在的な発生及び使用について示唆している（２４３〜２４４ページ、２７１ページ）が、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体については報告されていない。
【０１０７】
[0108]ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の四倍体は、好ましくは、抗有糸分裂剤を用いることにより発生させる。抗有糸分裂剤の例には、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン、アミプロホスメチル、及び（１又は複数の）他の倍数性誘導剤が含まれるがこれらに限定されない。四倍体は、天然で自発的に生じる場合もあり、コルヒチンなどの紡錘糸阻害剤を用いて誘導することもできる。コルヒチン誘導性の倍数体形成法は、１９３０年代から用いられている。コルヒチンは、チューブリンサブユニットの紡錘糸へのアセンブリーを阻害するため、染色体の移動が生じず、よって、有糸分裂の中期にある細胞が蓄積される。染色分体が分離されても紡錘体により分離された細胞へと分裂しないと、染色体数が倍加され、同質倍数体が創出される。育種を目的として倍数体を創出する場合は、配偶体の組織を発生させる頂端分裂組織層を倍加させる必要がある。倍加が成功する確率を最適化するように、多数の小型で活発に生育する分裂組織を処置する。通例では、コルヒチンを、組織及び種に応じて、０．１％〜２．０％の濃度で用いる。Ｐｏｅｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｍ．、「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ」、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｉｎｃ．（１９６６）；Ｗａｔｔｓ，Ｌ．、「Ｆｌｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」、Ｇｒｏｗｅｒ  Ｂｏｏｋｓ（１９８０）；Ｃａｌｌａｗａｙ  Ｄ．Ｊ．及びＣａｌｌａｗａｙ  Ｍ．Ｂ．、「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ  Ｐｌａｎｔｓ」、Ｔｉｍｂｅｒ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（２０００）において論じられている通り、当技術分野では、種子をコルヒチン又は他の紡錘糸阻害剤で処置するための方法がよく知られている。
【０１０８】
[0109]倍数性の変化は、交雑能力、生殖性、細胞サイズ、及びヘテロ接合性に影響を及ぼす。これらの因子は、潜在的な利益のほか、植物育種における限界ももたらす。倍数性の操作は、複数の異なる倍数性の間における生殖細胞質の遺伝子移入のために用いられた。例えば、リリウム属（Ｌｉｌｉｕｍ）の種間雑種のＦ１における不稔性を克服するための四倍体の誘導に、コルヒチンが用いられた。４つのリリウム属種の近縁種群による雑種間の四倍体のレベルでの種間交雑が行われた。Ｖａｎ  Ｔｕｙｌ，Ｊ．及びｖａｎ  Ｈｏｌｓｔｅｉｊｎ，Ｈ．、「Ｌｉｌｙ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ」、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、４１４：３５〜４５（１９９６）を参照されたい。天然では二倍体であるブドレジャ・グロボーサ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ  ｇｌｏｂｏｓａ）の四倍体の植物体が、コルヒチンによる処置を用いて作製され、天然の四倍体のブドレジャ・ダビディイー（Ｂｕｄｄｌｅｊａ  ｄａｖｉｄｉｉ）との交雑が施されて、花の黄色の呈色がブドレジャ・ダビディイーへと導入されている。Ｒｏｓｅ，Ｊ．、Ｋｕｂｂａ，Ｊ．、及びＴｏｂｕｔｔ，Ｋ．、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｈａｒｄｙ  ｏｒｎａｍｅｎｔａｌｓ」、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、５６０：１０９〜１１２（２００１）を参照されたい。花を全て黄色に呈色させたシクラメン・ペルシクム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｅｒｓｉｃｕｍ）の栽培品種は二倍体であり、花弁に「色斑」を有さない。コルヒチンによる処置を用いて、花を黄色に呈色させた四倍体のシクラメンを誘導した。四倍体の「色斑を伴う」栽培品種と交雑させた後も、分離のために、花を黄色に呈色させた「色斑を伴う」選択を種子により維持することはできなかった。Ｔａｋａｍｕｒａ，Ｔ．、Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．、Ｔａｎａｋａ，Ｍ．、及びＫａｇｅ，Ｔ．「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅｌｌｏｗ−ｆｌｏｗｅｒｅｄ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｗｉｔｈ  “ｅｙｅ”」、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、４５４：１１９〜１２６（１９９８）を参照されたい。
【０１０９】
[0110]本発明は、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数を改変して、染色体数が２ｎ＝５６である四倍体の植物体を発生させる方法であって、（ａ）ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体を栽培するステップと、（ｂ）抗有糸分裂剤を植物体の成長点へと適用するステップと、（ｃ）シュートを処置された植物体の成長点から出芽させるステップと、（ｄ）植物体からこのようにして発生した、四倍体と推定されるシュートを選択するステップと、（ｅ）細胞学的核型分析を介して四倍体のシュートの染色体の相補体を評価するステップと、（ｆ）四倍体のシュートを植物体へと生育させるステップと、（ｇ）染色体の安定性を点検するステップとを含む方法を提供する。当業者は、四倍体性への誘導の結果、染色体数が予想される四倍体数より多いか又は少ない植物体がもたらされる可能性があることを認識し得、本明細書では、このような異数体の植物体は、異数性四倍体と定義される。
【０１１０】
四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体の発生
[0111]本発明は、本明細書では染色体数が２ｎ＝５６であると定義される、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を発生させるための方法を提供する。
【０１１１】
[0112]ポインセチアでは、四倍体の植物体が、ある植物体については自然発生の突然変異によるものとして報告され、他の植物体についてはコルヒチンの使用を介する誘導性のものとして報告されている。（Ｂｅｒｎｕｅｔｚ，Ａ．、２４７〜２５６ページ（２００１）；Ｅｗａｒｔ，Ｌ．Ｃ．及びＷａｌｋｅｒ，Ｄ．Ｅ．、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、５１：２０３〜２０７（１９６０）；Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｐ．、「Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  Ｐｌａｎｔ  “Ｐｅａｒｌ”」、米国植物特許第１０，１６０号（１９９７）；並びにＳｔｅｗａｒｔ，Ｒ．、「Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ｉｎ  ｃａｒｎａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、５７：４０８〜４１０（１９５１））。
【０１１２】
[0113]しかし、四倍体の植物体の発生に成功することの困難性及び四倍体の植物体の発生に成功する可能性の程度は、適用される遺伝子型及び方法と共に変化する。例えば、Ｐｉｃｋｅｎｓ，Ｋ．Ａ．及びＣｈｅｎｇ，Ｍ．、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｏｒｙｚａｌｉｎ  ｏｎ  Ｃａｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  Ｓｈｏｏｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ，‘Ｗｉｎｔｅｒ  Ｒｏｓｅ’」、ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ、４１（７）：１６５１〜１６５５（２００６）の著者は、彼らの実験では四倍体の植物体が発生しなかったという事実について論じている。Ｂｅｒｎｕｅｔｚ（２００１）は、根を伴うポインセチアの挿し木を、０．１％〜０．３％の範囲のコルヒチン水溶液中で処置することにより、少数の四倍体のポインセチア植物体を発生させた。
【０１１３】
[0114]当業者は、倍数体化剤が適用される方法の詳細及び処置される個別の遺伝子型により、予想外の帰結が結果としてもたらされることを認識し得る。驚くべきことに、本発明者は、ある範囲の遺伝子型の間で倍数体のポインセチアを作製する、簡単であるが高度に効率的な方法を発見した。
【０１１４】
[0115]本発明は、ユーフォルビア・プルケリマの植物体の染色体数を改変して、染色体数が２ｎ＝５６である四倍体の植物体を発生させる方法であって、（ａ）ユーフォルビア・プルケリマの植物体を栽培するステップと、（ｂ）抗有糸分裂剤を植物体の成長点へと適用するステップと、（ｃ）シュートを処置された植物体の成長点から出芽させるステップと、（ｄ）植物体からこのようにして発生した、四倍体と推定されるシュートを選択するステップと、（ｅ）細胞学的核型分析を介して四倍体のシュートの染色体の相補体を評価するステップと、（ｆ）四倍体のシュートを植物体へと生育させるステップと、（ｇ）染色体の安定性を点検するステップとを含む方法を提供する。当業者は、四倍体性の誘導の結果、染色体数が予想される四倍体数より多いか又は少ない植物体がもたらされる可能性がありを認識し得、本明細書では、このような異数体の植物体は異数性四倍体と定義される。
【０１１５】
非機能性の小型杯状花序を伴う植物体（戻し交雑による三倍体の雑種）の発生
[0116]栽培後寿命は、鑑賞植物体において所望される鍵となる属性である。Ｅ．プルケリマ及びＥ．コルナストラによる雑種は、おそらくはそれらの杯状花序がかなり早く脱落するために、従来の最良のポインセチアの栽培品種と比較して栽培後寿命が短い後代を生成させ、鑑賞者の充足期間は短い（Ｂｅｒｎｕｅｔｚ、２４３ページ、（２００１））。ドゥルセローザは、その杯状花序サイズの大きさ及び比較的短い栽培後寿命で知られている（Ｄｏｌｅ，Ｊ．、Ｈａｍｍｅｒ，Ａ．、及びＢａｒｒｅｔｔ，Ｊ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｔｒｉａｌｓ−Ｎｅｗ  ｒｅｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ２００６、Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｅｗｓ、２月号、２２〜２６ページ（２００６））。したがって、杯状花序の保持の改善が、一部の公表された研究の焦点となっている。Ｂｅｒｎｕｅｔｚ（２００１）は、予備研究（データは示されていない）において、ＰｏｉＢＩに感染していない雑種植物体は収穫後期間が短く、この属性を改善すべきことについて言及した。植物体をＰｏｉＢＩに感染させたところ、栽培後性状がわずかに改善された。Ｂｅｒｎｕｅｔｚは、Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラのＦ１（二倍体）雑種を、栽培後性状が優れたＥ．プルケリマ（二倍体）の植物体へと戻し交雑すれば、後代における栽培後性状が改善され得ることについて示唆したが、これをどのように実施し得るのかについては詳述せず、杯状花序の保持が改善され得ることを暗示した。利用可能な文献では、二倍体の戻し交雑が成功した証拠を見出すことができず、このような植物体が見られないことは、この種の交雑の成功率が低いか、雄性稔性のＦ１（Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラ）の後代が発生して用いられることがまれであるか、又はおそらく発生した後代が市販可能でなかったこと起因した可能性がある。
【０１１６】
[0117]驚くべきことに、本発明者は、雌性親としての二倍体のＥ．プルケリマ植物体を、四倍体のＥ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラのＦ１雑種植物体と交雑させたところ、後代の多くは、杯状花序サイズが大幅に低減され、杯状花序の保持も実際に改善されることもなかったことを見出した。これらの杯状花序は小型で非機能性であり、このために、それらの小型のサイズを介して、植物体の栽培後性状を予想外に改善した。これらの小型で非機能性の杯状花序が脱落しても、製品の販売可能な外見に著明な影響が及ぶことはなかった。
【０１１７】
[0118]ポインセチアでは、栽培後性状が、Ｎｅｌｌ，Ｔ．Ａ．、Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｒ．Ｔ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｅ．、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、４０５：１３２〜１３７（１９９５）；Ｎｅｌｌ，Ｔ．Ａ．及びＬｅｏｎａｒｄ，Ｒ．Ｔ．、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｌｏｓｓｅｓ」、ＧｒｏｗｅｒＴａｌｋｓ、７月号、９８〜１０４ページ（１９９６）；Ｅｍｂｒｙ，Ｊ．Ｌ．及びＮｏｔｈｎａｇｅｌ，Ｅ．Ａ．、「Ｌｅａｆ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｓ  ｉｎ  Ｌｏｗ−ｌｉｇｈｔ  Ｓｔｒｅｓｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１９（５）：１００６〜１０１３（１９９４）；並びにＬｅｅ，Ｙ、Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，Ｐ．Ｊ．、Ｋｎｏｘ，Ｐ、及びＡｎｎｅ  Ｋａｔｈｒｉｎｅ  Ｈｖｏｓｌｅｆ−Ｅｉｄｅ，Ａ．Ｋ．、「Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｄｉｃｅｌ  ａｂｓｃｉｓｓｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）」、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、５４、９９３〜１００３（２００８）を含め多数の著者により探索されている。
【０１１８】
[0119]ポインセチア又はユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ種間雑種についての植物体の栽培後劣化の徴候は通例、まず、杯状花序と、これらの杯状花序を葉腋に抱き、一次杯状花序が上方に付いた苞葉とが脱落し、これに続き、最も老化した下方の葉が一次杯状花序の下の苞葉にとどくまで上方へと順に脱落し、最後に、一次杯状花序の下の苞葉が脱落する。
【０１１９】
[0120]本発明者は、驚くべきことに、本明細書で記載される方法を用いて、戻し交雑による非機能性の小型杯状花序を伴う三倍体の種間雑種植物体を発生させ、これにより、栽培後低下の第１相を事実上消失させ得ることを見出した。
【０１２０】
[0121]小型の非機能性の杯状花序は、完全に成熟しても直径が約３ｍｍ未満であり、脱落すると乾燥し、鑑賞者には事実上感知できない極めて小さなサイズまでしぼむ。これらの杯状花序を葉腋に抱く苞葉は、驚くべきことに、脱落しない。
【０１２１】
[0122]非機能性の小型杯状花序の別の予想外の鍵となる利益は、真菌であるボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）による感染に対するそれらの感受性が極めて低いことである。この一般的な温室真菌は、ポインセチア及びユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ種間雑種の杯状花序の葯及び蜜腺において増殖し、感染は、杯状花序の未熟状態での離脱を引き起こすことが多い。植物体の真菌による感染は、しばしば苞葉の脱落及び上方の苞葉枝の腐朽をもたらすことから、作物損失をもたらし、植物体を販売不可能とすることが多い。本発明の対象である植物体の小型の非機能性の杯状花序は、葯を保有しない。小型の非機能性の杯状花序はまた、杯状花序腺を大幅に退縮させ、蜜を産生しないことがしばしばである。これらの特徴のいずれもが、これにより、ボトリティス・シネレア感染及び作物損失の可能性を低減している。
【０１２２】
[0123]本発明は、非機能性の小型杯状花序を伴う雑種である三倍体の植物体の生成を予想外に結果としてもたらした。本発明の方法では、種間交雑における雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を、「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の雄性親と共に用いたが、ここで、前記交雑は、以下のステップ：（ａ）花粉を第２の植物から採取するステップ、（ｂ）第１の植物の杯状花序にこの花粉を受粉するステップ、（ｃ）受粉から結果として生じる胚を胚救出により分離するステップ、（ｄ）胚をニュートリエント寒天培地上で培養するステップ、（ｅ）この胚の生育から結果として生じる雑種の小植物体を得るステップ；及び（ｆ）小植物体を温室の育成培地へと移植するステップを含み、小植物体は、成熟した三倍体の雑種植物体へと発育した。
【０１２３】
[0124]四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を雄性親として用いることにより、雑種である後代は、非機能性の小型杯状花序を伴う後代の発生をもたらさなかった、二倍体の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を雄性親として用いる場合と比較して、非機能性の小型杯状花序を予想外に保有した。
【０１２４】
[0125]本発明のさらなる態様は、本発明の雑種植物体が、本明細書で定義される三倍体であって、染色体数が２ｎ＝４２の三倍体であることである。
【０１２５】
[0126]本発明のさらなる態様は、三倍体の雑種植物体を繁殖させることであり、（ａ）雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体と、雄性親としての「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の植物体との交雑から作製される雑種植物体の挿し木を得るステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して、三倍体の雑種植物体を得るステップとを含む。
【０１２６】
[0127]本発明のさらなる態様は、三倍体の雑種植物体を作製するための方法であって、植物ホルモン組成物を挿し木の基部へと適用して、四倍体の雑種植物体を作製するための根の形成を誘導することでさらに定義される方法を提供することである。
【０１２７】
[0128]本発明のさらなる態様は、本発明の三倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ雑種植物体に、ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を感染させることである。
【０１２８】
[0129]上記の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の例を研究することにより、さらなる態様及び実施形態も明らかとなる。
【０１２９】
赤色の苞葉及び非機能性の小型杯状花序を伴う植物体（種間戻し交雑による四倍体の雑種）の発生
[0130]花き業界は、顕花植物の新たな異なる品種を開発しようと努力している。このような新規の品種を創出するための有効な方途は、花の呈色の操作を介する。花の呈色は、２種類の色素：フラボノイド及びカロテノイドに主に起因する。フラボノイドは、黄色〜赤色〜青色の範囲の色に寄与する。カロテノイドは、帯赤色〜橙色又は黄色の色合いを付与し、一般に黄色又は橙色の花における唯一の色素である。花の呈色に主要な寄与をなすフラボノイド分子はアントシアニンであり、アントシアニンは、シアニジン、デルフィニジン、ペツニジン、ペオニジン、マルビジン及びペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であり、液胞内に局在化している。異なるアントシアニンは、呈色の顕著な差違をもたらし得る。花の呈色また、無色のフラボノイドとの共色素沈着、金属錯体化、グリコシル化、アシル化、メチル化、及び液胞のｐＨによっても影響される。Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｇ．、「Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｓ  ｆｌｏｗｅｒ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ：ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、１０６：１〜２６（１９９１）を参照されたい。
【０１３０】
[0131]本発明は、苞葉の赤色及びさらなる属性である非機能性の小型杯状花序を伴う種間戻し交雑による四倍体の植物体の作製を予想外に結果としてもたらした。本発明により作製される種間戻し交雑による四倍体の植物体の苞葉の赤色は、これらに限定されるものではないが、「Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｃｈａｒｔ」、２００１に基づく色であるＲＨＳ  Ｎ３４Ａ、Ｎ３４Ｂ、４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４３Ａ、４３Ｂ、４３Ｃ、４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、４５Ａ、４５Ｂ、４５Ｃ、４５Ｄ、４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、４７Ａ、４７Ｂ、４７Ｃ、４７Ｄ、５０Ａ、５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、５３Ｄなどの色として定義される。当業者は、苞葉の呈色の解釈が、生育温度、光の強度、栄養物の適用、有害生物及び病害に対する化学的処置、土壌の水分含量などを含めた多数の因子に起因して変化し得ることを認識し得る。
【０１３１】
[0132]本発明の方法では、種間交雑における雌性親としての四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を、「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の雄性親と共に用いたが、ここで、前記交雑は、以下のステップ：（ａ）花粉を第２の植物から採取するステップ、（ｂ）第１の植物の杯状花序にこの花粉を受粉するステップ、（ｃ）受粉から結果として生じる胚を胚救出により分離するステップ、（ｄ）胚をニュートリエント寒天培地上で培養するステップ、（ｅ）この胚の生育から結果として生じる小植物体を得るステップ；及び（ｆ）小植物体を温室の育成培地へと移植するステップを含み、小植物体は、成熟した四倍体の植物体へと発育した。
【０１３２】
[0133]本発明のさらなる態様は、本発明の雑種植物体が、本明細書で定義される四倍体であって、染色体数が２ｎ＝５６の四倍体であることである。
【０１３３】
[0134]本発明のさらなる態様は、四倍体の雑種植物体を繁殖させることであり、（ａ）雌性親としての四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体と、雄性親としての「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の植物体との交雑から作製される植物体の挿し木を得るステップと、（ｂ）この挿し木を栽培して、四倍体の雑種植物体を得るステップとを含む。
【０１３４】
[0135]本発明のさらなる態様は、四倍体の雑種植物体を作製するための方法であって、植物ホルモン組成物を挿し木の基部へと適用して、四倍体の雑種植物体を作製するための根の形成を誘導することでさらに定義される方法を提供することである。
【０１３５】
[0136]本発明のさらなる態様は、本発明の四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体に、ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を感染させることである。
【０１３６】
[0137]上記の例示的な態様及び実施形態に加えて、以下の例を研究することにより、さらなる態様及び実施形態も明らかとなるであろう。
【０１３７】
[0138]Ｅ．プルケリマにおける苞葉呈色の遺伝についての遺伝学的特質はかなり単純であり、Ｓｔｅｗａｒｔ（１９６０）は、ＷＨと称する単一の完全な優性遺伝子が、苞葉の赤色の原因となることを説明した。ホモ接合性のｗｈｗｈは、苞葉の白色を付与した。ある範囲の赤色及び白色の苞葉を伴う植物体が作製されたので、変更因子が存在する。後に、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＡｒｉｓｕｍｉ（１９６６）は、ホモ接合性の劣性形態にあり、ＷＨ遺伝子座において遺伝子型ＷＨ−−を有する場合は、ｐｋと称する第２の独立の遺伝子座が、ポインセチアの苞葉の遺伝的なピンク色の原因となることを実証した。遺伝子型ｐｋｐｋは、ＷＨ／−−（赤色）が確立される場合に形成されるアントシアニン色素の量を低減した。現在のところ、ポインセチア市場では、ピンク色の栽培品種は、全てキメラであり、遺伝的にピンク色なのではないと考えられている。
【０１３８】
[0139]著者は、遺伝子構成がＷＨＷＨ、ＷＨｗｈ又はｗｈｗｈである雌性親としてのポインセチアを、雄性親としてのＥ．コルナストラと交雑させると、後代は常にピンク色の色調を帯びることを予想外に発見した。１０年間を超える期間にわたる育種における多数の交雑の組合せから発生した１，０００体を超える植物体からは、白色及び赤色の植物体が作製されなかった。
【０１３９】
[0140]著者はその後、苞葉が赤色の突然変異体を誘導することを目的として、選択されたいくつかのユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの栽培品種を、ガンマ放射線で処理して、突然変異を誘導することを試みた。驚くべきことに、数年間にわたり観察された数千個の突然変異体からは、苞葉が赤色の突然変異体が記録されなかった。
【０１４０】
[0141]戻し交雑は、Ｅ．プルケリマとＥ．コルナストラとの雑種を、元の雌性親（Ｅ．プルケリマ）との交雑における雄性親として用いる、別の育種法である。Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの交雑に由来する大半の後代が雄性不稔性であるために、この経路は困難である。著者は、この方法を、少数のまれな雄性稔性のＥ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの雑種である植物体について試みたが、後代のうちのいずれもが、赤色の苞葉を呈示しなかった。
【０１４１】
[0142]苞葉が赤色の種間雑種であるＥ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの植物体を発生させるための別の選択肢は、Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラ雑種を、さらなる交雑における雌性親として使用することである。しかし、１，０００体を超えて作製された実生に由来するいずれの植物体も、雌構造（花柱、柱頭、子房）を保有せず、完全な雌性不稔性であった。Ｅ．プルケリマとＥ．コルナストラとを交雑させることにより発生させたＦ１雑種は、文献では雌性稔性を伴うことが記載されていない。現在の世界市場では、Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの栽培品種のいずれも、機能的な雌付属器（柱頭、花柱、子房）を有さない。葯をある程度保有する雑種を発生させるまれな機会には、花粉の生存度が極めて低いことが通例である。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ（２００１）は、そのプログラムにおいて発生させたＦ１雑種において、花粉の生存度が３〜１８％であることについて報告した。これにより、それらの使用が雄性親だけに限界づけられる。
【０１４２】
[0143]このために、本発明以前は、苞葉が赤色のＥ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラの種間雑種の発生を、当業者に明白な方法により得ることは不可能であった。
【０１４３】
ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）による感染
[0144]一実施形態では、自由分枝形成病原体を有する植物体を本発明の植物体に接ぎ木することにより、自由分枝形成病原体を本発明の植物体へと伝染させることができる。用いられる接ぎ穂は、自由分枝形成植物から本発明の植物体への、自由分枝形成病原体の伝染を結果としてもたらす任意の接ぎ穂であり得る。病原体を伝染させるのに用いられる接ぎ木法は、寄せ接ぎ木法であることが好ましい。寄せ接ぎ木法は、本発明の植物体及び自由分枝形成植物の両方において、茎の断面へと、好ましくは約１０〜３０ｍｍの長さで、形成層に到達する程度に十分に深く切り込みを施すステップと、その後、自由分枝形成病原体の、自由分枝形成植物から本発明の植物体への移動が生じるまで、切込みを施された部位を互いと接触させるように維持するステップとを伴う。次いで、挿し木を栽植し、自由分枝形成特徴を有する植物体を、挿し木から生育させることができる。別の実施形態では、寄生性植物であるネナシカズラ（例えば、クスクタ（Ｃｕｓｃｕｔａ）属種）を用いて、自由分枝形成病原体を、本発明の植物体へと伝染させることができる。例えば、寄生性のネナシカズラを用いて、自由分枝形成病原体を、自由分枝形成植物から非自由分枝形成植物へと移動させることができる。寄生性のネナシカズラが、自由分枝形成病原体を有することが適切である。当技術分野では、病原体を伝染させるための寄生性のネナシカズラの使用が知られており、例えば、Ｌｅｅ，Ｉ−Ｍ．、Ｋｌｏｐｍｅｙｅｒ，Ｍ．、Ｂａｒｔｏｓｚｙｋ，Ｉ．、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ−Ｒｉｎｄａｌ，Ｄ．、Ｃｈｏｕ，Ｔ．、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｋ．、及びＥｉｓｅｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．、「Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｒｅｅ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：１７８〜１８２（１９９７）において記載されている。さらに別の実施形態では、自由分枝形成病原体を、バッタを介して伝染させることもできる。植物体の間で病原体を伝染させるためのバッタの使用が知られており、例えば、ＭｃＣｏｙ，Ｒ．、Ｃａｕｄｗｅｌｌ，Ａ．、Ｃｈａｎｇ，Ｃ．、Ｃｈｅｎ，Ｔ．、Ｃｈｉｙｋｏｗｓｋｉ，Ｌ、Ｃｏｕｓｉｎ，Ｍ．、Ｄａｌｅ，Ｊ．、ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ，Ｇ．、Ｇｏｌｉｎｏ，Ｄ．、Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｋ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，Ｂ．、Ｍａｒｗｉｔｚ，Ｒ．、Ｐｅｔｚｏｌｄ，Ｈ．、Ｓｉｎｈａ，Ｒ．、Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｍ．、Ｗｈｉｔｃｏｍｂ，Ｒ．、Ｙａｎｇ，Ｉ．、Ｚｈｕ，Ｂ．、Ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．、「Ｐｌａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、Ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ、５：５４５〜５６３（１９８９）において記載されている。
【０１４４】
[0145]ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）は、ポインセチアモザイクウイルス（ＰｎＭＶ）及び／又はポインセチア潜在ウイルス（ＰｎＣＶ）などのウイルスと混合されて見出されることが多い。これらの病原体のうちの１又は複数を保有するポインセチアの植物体には、例えば、ｃｖ．  Ｖ１０  Ａｍｙ  ｒｅｄが含まれる。しかし、当業者には、自由分枝形成病原体を、事実上任意のユーフォルビア・プルケリマ又は選り抜きのユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの雑種へと移送することができ、次いで、感染した選り抜きのユーフォルビア属を用いて、自由分枝形成病原体を本発明の植物体へと伝染させ得ることが認識される。自由分枝形成病原体が選り抜きのユーフォルビア属又は本発明の植物体へと伝染したことの確認は、例えば、植物体の自由分枝形成特徴に言及するための形態学的検証など、当技術分野で知られた技法により達成することができる。加えて、又は代替的に、実際の自由分枝形成病原体は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）又はＩＳＥＭ（免疫電子顕微鏡法）など、よく知られた技法を用いて検出することができる。
【０１４５】
[0146]本方法において用いるのに適する自由分枝形成ユーフォルビア属の植物体の例には、例えば、ユーフォルビア・プルケリマの品種であるフリーダム（Ｆｒｅｅｄｏｍ）（米国植物特許第ＰＰ７，８２５号）、サクセスレッド（Ｓｕｃｃｅｓｓ  Ｒｅｄ）（米国植物特許第ＰＰ８，７７３号）、レッドベルベット（Ｒｅｄ  Ｖｅｌｖｅｔ）（米国植物特許第ＰＰ１１，１２４号）、ピータースター（Ｐｅｔｅｒｓｔａｒ）（米国植物特許第ＰＰ８，２５９号）、アネットヘッグダークレッド（Ａｎｎｅｔｔｅ  Ｈｅｇｇ  Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ）（米国植物特許第ＰＰ３，１６０号）、及びＶ−１４グローリー（Ｖ−１４  Ｇｌｏｒｙ）（米国植物特許第ＰＰ４，３８４号）が含まれる。また、以下の植物特許（米国植物特許第ＰＰ２３，２９６号；同第ＰＰ２１，３２７号；同第ＰＰ２１，３２６号；同第ＰＰ２１，３２５号；同第ＰＰ２１３２４号）において記載されるプリンセチア品種も用いることができる。
【実施例１】
【０１４６】
[0147]以下の例は、本発明をさらに例示するために提供される。これらの例は、いかなる形であれ、添付の特許請求の範囲に示される限定を超えて本発明の範囲を限定するものとみなすべきものではない。本発明の精神及び範囲内にとどまりながら、多くの変化及び改変を施すことができる。
【０１４７】
実施例１：雄性親として用いられる四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）雑種植物体の発生
[0148]本発明は、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体数を改変して、体細胞の染色体数を二倍体から四倍体へと倍加させるための新たな方法を提供する。利用可能な先行技術では、四倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体がかつて報告されたことはない。本発明の染色体数を改変するための方法は、まず、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体を栽培することで始まり、次いで、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン、又はアミプロホスメチル（ＡＰＭ）などの抗有糸分裂剤が、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の成長点へと適用された。次いで、四倍体のシュートを、処置されたユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の成長点から出芽させ、四倍体と推定されるシュートであって、ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の成長点から発生したシュートを選択した。次いで、細胞学的核型分析を介して四倍体のシュートの染色体の相補体を評価し、次いで、解析された四倍体のシュートを植物体へと生育させた。新たなユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体の染色体の安定性を点検し、新たな四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を選択及び維持した。
【０１４８】
[0149]本発明の一態様は、これらに限定されるものではないが、暗いピンク色の苞葉、ある量の稔性花粉を含有する偶発的な葯の生成、妥当な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性を含めた、標的の形質を育種するのに有用な、適切な遺伝子的な特徴を伴うユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ系統の植物体を得るステップを伴った。ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体を得た後に、以下の方法を用いて、四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を発生させた。挿し木を栄養成長する母株から採取し、切断された基部を、２０００ｐｐｍのインドール酪酸粉末中に浸漬し、次いで、オアシス（ＯＡＳＩＳ）ブランドの楔形育苗用資材へと栽植した。次いで、挿し木を、約２０℃で維持される育苗ハウス内の間欠的な噴霧下に置いた。３週間後に、挿し木を温室条件へと馴致し、次いで、各植物体を、標準的な鉢植え用苗床ミックスで満たした直径１５ｃｍの植木鉢へと鉢植した。鉢植された植物体を、最低温度１８℃温室内の長日性の光周期下に置き、開花を防止した。約３週間後、植物体にするコルヒチンを適用する準備が整った。コルヒチンを適用する前日、各植物体から頂端分裂組織を採取した。コルヒチンは、水溶性のゲルと共に、重量／容量０．１％〜３．０％のペーストとして調製した。どの濃度が処置された各系統に最適の結果をもたらすのかを決定し得るように、植物体を処置するのにある範囲のコルヒチン濃度を用いた。ペーストは、小型のブラシで芽に潤沢に適用し、２４時間後に微粒子の水ミストを用いて洗い落とした。完了時に生成効率の測定を行い得るように、適用時に、塗布された植物体及び芽の数をカウントした。
【０１４９】
[0150]その後の数週間にわたり、最良の慣行及び生育手順（Ｅｃｋｅ，Ｐ．、Ｆａｕｓｔ，Ｊ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｃｋｅ  Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｂａｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）において記載される）に従い、植物体を観察及び維持した。新たなシュートを、四倍体性の徴候について評価した。これらの徴候には、シュートの茎葉が通常より大きく、葉柄の直径が大きいことが含まれた。栄養成長の後、植物体を１０時間の短日性光周期下で開花させた。約７〜９週間後、顕花植物が観察され、四倍体性を示す以下の特徴：杯状花序が大きく、杯状花序が稔性葯を伴い、苞葉及び葉が広く、長く、厚く、花粉の直径が大きいことについて、四倍体性の徴候が、対照と比較して認められた。開花するシュートであって、四倍体であると考えられたシュートを、栄養挿し木について既に記載されている通りに標識し、採取し、繁殖させた。
【０１５０】
[0151]新鮮な四倍体と推定されるシュートが生成したら、挿し木を採取し、繁殖させた。これらの第２世代の植物体を、四倍体性の安定性及び均一性について、表現型に基づき持続的に評価した。次いで、核型分析を実施することにより、推定四倍体を確認又は廃棄した。確認の後、植物体を、さらに少なくとも２回にわたり繁殖させ、それらが安定的な四倍体であることを確保した。定期的に、植物体を、目視により、四倍体性の形態学的特徴について検証した。発生させたユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ系統の選択された四倍体に対して、染色体の計数を実施した。
【０１５１】
[0152]四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体は、保有されることがしばしばである雄性稔性を発生させたが、雌蕊群が存在しないか又は大幅に低減されて非機能性であるために、常に雌性稔性を欠いた。雄性稔性は改善されたが、雌性稔性は改善されなかったために、これは、驚くべき結果であった。
【０１５２】
[0153]表１は、第１欄にコルヒチンで処理されたユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体、第２欄に選択理由、第３欄に処置法、第４欄になされた選択の数を示し、第５欄に保持された植物体の数及びこれらの植物体の染色体数を示す。表１はまた、他の方法（自発的方法及びガンマ放射線処置を介する方法）により作製される２つの植物体も示す。
【表１】
2014180283.tif 000002
【０１５３】
実施例２：雌性親として用いられる四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体の発生
[0154]本発明は、ユーフォルビア・プルケリマの植物体の染色体数を改変して、体細胞の染色体数を二倍体から四倍体へと倍加させるための新たな方法を提供する。本発明の染色体数を改変するための方法は、まず、ユーフォルビア・プルケリマの植物体を栽培することで始まり、次いで、コルヒチン、トリフルラリン、オリザリン、又はアミプロホスメチル（ＡＰＭ）などの抗有糸分裂剤が、ユーフォルビア・プルケリマの植物体の成長点へと適用された。次いで、四倍体のシュートを、処置されたユーフォルビア・プルケリマの植物体の成長点から出芽させ、四倍体と推定されるシュートであって、ユーフォルビア・プルケリマの植物体の成長点から発生したシュートを選択した。次いで、細胞学的核型分析を介して四倍体のシュートの染色体の相補体を評価し、次いで、解析された四倍体のシュートを植物体へと生育させた。新たなユーフォルビア・プルケリマの植物体の染色体の安定性を点検し、新たな四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を選択及び維持した。
【０１５４】
[0155]本発明の一態様は、これらに限定されるものではないが、暗い赤色の苞葉、雄性稔性及び雌性稔性、良好な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性を含めた標的の形質を育種するのに有用な、適切な遺伝子的な特徴を伴うユーフォルビア・プルケリマの植物体を得るステップを伴った。ユーフォルビア・プルケリマの植物体を得た後に、以下の方法を用いて、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を発生させた。挿し木を栄養成長する母株から採取し、切断された基部を、２０００ｐｐｍのインドール酪酸粉末中に浸漬し、次いで、オアシスブランドの楔形育苗用資材へと栽植した。次いで、挿し木を、約２０℃で維持される育苗ハウス内の間欠的な噴霧下に置いた。３週間後に、挿し木を温室条件へと馴致し、次いで、各植物体を、標準的な鉢植え用苗床ミックスで満たした直径１５ｃｍの植木鉢へと鉢植した。鉢植された植物体を、最低温度１８℃温室内の長日性の光周期下に置き、開花を防止した。約３週間後、植物体にするコルヒチンを適用する準備が整った。コルヒチンを適用する前日、各植物体から頂端分裂組織を採取した。コルヒチンは、水溶性のゲルと共に、重量／容量０．１％〜３．０％のペーストとして調製した。どの濃度が処置された各系統に最適の結果をもたらすのかを決定し得るように、植物体を処置するのにある範囲のコルヒチン濃度を用いた。ペーストは、小型のブラシで芽に潤沢に適用し、２４時間後に微粒子の水ミストを用いて洗い落とした。完了時に生成効率の測定を行い得るように、適用時に、塗布された植物体及び芽の数をカウントした。
【０１５５】
[0156]その後の数週間にわたり、最良の慣行及び生育手順（例えば、Ｅｃｋｅら（２００４））に従い、植物体を観察及び維持した。新たなシュートを、四倍体性の徴候について評価した。これらの徴候には、シュートの茎葉が通常より大きく、葉柄の直径が大きいことが含まれた。栄養成長の後、植物体を１０時間の短日性光周期下で開花させた。約７〜９週間後、顕花植物が観察され、以下の特徴：杯状花序が大きく、杯状花序が稔性葯を伴い、苞葉及び葉が広く、長く、厚く、葯の花粉の直径が大きいことについて、四倍体性の徴候が、対照と比較して認められた。開花するシュートであって、四倍体であると考えられたシュートを、栄養挿し木について既に記載されている通りに標識し、採取し、繁殖させた。
【０１５６】
[0157]新鮮な四倍体と推定されるシュートが生成したら、挿し木を採取し、繁殖させた。これらの第２世代の植物体を、四倍体性の安定性及び均一性について、表現型に基づき持続的に評価した。次いで、核型分析を実施することにより、推定四倍体を確認又は廃棄した。確認の後、植物体を、さらに少なくとも２回にわたり繁殖させ、安定性を確保した。定期的に、植物体を、目視により、四倍体性の形態学的特徴について検証した。発生させたユーフォルビア・プルケリマ系統の選択された四倍体に対して、染色体の計数を実施した。表２は、第１欄にコルヒチンで処理された二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体、第２欄に選択理由、第３欄に処置法、第４欄になされた選択の数を示し、第５欄に保持された植物体の数及びこれらの植物体の染色体数を示す。
【表２】
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【０１５７】
実施例３：戻し交雑による三倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）雑種植物体であって、小型で非機能性の杯状花序を伴う雑種植物体を作製する雑種形成の方法
[0158]本発明の別の態様は、二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を、「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の植物体と交雑させるステップを伴った。二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体は、暗い赤色の苞葉、雄性稔性及び雌性稔性、良好な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性など、所望される標的の形質のための育種において用いられる適切な特徴について選択した。次いで、花粉を、選択された「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」の植物体であって、雄性親として用いられる植物体から採取した。花粉は、ユーフォルビア・プルケリマの柱頭が受容性である場合に、小型のブラシを用いて、二倍体のユーフォルビア・プルケリマの雌植物体の柱頭へと適用した。用いられる親植物は、異系交配させ、自家受粉させなかったので、ユーフォルビア・プルケリマの杯状花序の除雄は要請されなかった。数週間後に、受粉しなかった対照を超える子房の腫脹により交雑の成功が認められた。腫脹した子房は、受粉の４週間後又は脱落の直前に収穫した。この時点以降、Ｂｅｒｎｕｅｔｚ（２００６）の胚救出法を使用して、ＰｏｉＢＩに感染させた三倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の雑種植物体を作製した。
【０１５８】
[0159]明確性のために、この方法が本明細書に記載される。各子房には、無菌法を適用した。子房を、好ましくは無傷のまま、材料をカバリングするために添加される４％の次亜塩素酸ナトリウムと共に容器に入れた後で、１滴のＴｗｅｅｎ  ２０洗浄剤を滴下した。容器を蓋で密閉し、５分間にわたり、１分間当たり１回ずつ振とうした。次いで、容器を空け、子房をオートクレーブ処理された蒸留水中で３回にわたりすすいだ。次いで、子房を取り出し、個別に解剖した。滅菌メスを用いて３つの子房室の各々を開裂させ、発生しつつある胚珠があれば取り出した。次いで、胚を、長手方向に２つの部位へと両断し、５０ｍＬのプラスチック製ねじ口型試験管内の適切な胚救出培地上に置いた。培地は、好ましくは、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）による塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．及びＳｋｏｏｇ，Ｆ、「Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１５：４７３〜４９７（１９６２））、１ｇ／ｌの活性炭、１ｇ／ｌのカゼイン加水分解物、４％のスクロース、及び７ｇ／ｌの寒天を含有した。培地を、ｐＨ５．８へと調整してから、１ｋｇ／ｍ２、１２１℃で１７分間にわたるオートクレーブ処理を施した。解剖された胚を含有する試験管は、白色蛍光灯下、２５℃±２℃の育成チャンバーに入れ、培養容器蓋のレベルにおいて約６０〜７０マイクロモルｍ−２秒−１の光強度を、１６時間／日にわたり施した。発生しつつある胚を、上記で言及した再生培地又はＭＳ基礎塩、０．３ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン、１ｇ／ｌのカゼイン加水分解物、４０ｇ／ｌのスクロース、及び７ｇ／ｌの寒天を含有する増殖培地へと継代培養し、ｐＨを５．８へと調整してから、オートクレーブ処理を施した。後続の継代培養は、約３〜４週間おきに、生育に応じていずれかの組成を有する新鮮な培地上で実施した。
【０１５９】
[0160]ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した小植物体（一次植物）は、胚から直接出芽した再生小植物体を栽植することにより、又は発生したシュートを切断し、２０００ｍｇ／ｌのＩＢＡ粉末中に浸漬することにより、フラスコから出してから、拡張型のオアシスの楔形育苗用資材に入れた。まず、定常的な水の噴霧を適用し、その後、小植物体が根を発生させてからは、徐々に低減して、馴致を容易とした。植物体は、Ｅｃｋｅら（２００４）において記載される標準的な慣行下で生育させた。
【０１６０】
[0161]市販可能な植物体であって、分枝が高度な植物体を作製するため、ポインセチア分枝誘導性ファイトプラズマ（ＰｏｉＢＩ）を導入した。栄養挿し木を、新たな三倍体（Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラ）の植物体から採取し、ＰｏｉＢＩに感染させたポインセチアの栽培品種へと寄せ接ぎ木した。寄せ接ぎ木は、両方の植物体の茎に対する、約２０〜３０ｍｍの長さで、形成層へと切り込む程度に十分に深い垂直断面の切込みを伴い、次いで、切り込まれた２つの部位を互いに対面させ、接ぎ穂の結合体をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）Ｍラボラトリーフィルムで密封した。次いで、挿し木を、水ミスト下で繁殖させた後、硬化させ、ポインセチアのための標準的な生成慣行に従い、植木鉢内で生成させた。十分な生育（例えば、１０週間にわたる）が生じたら、ＰｏｉＢＩに感染した挿し木を、接ぎ木された三倍体（Ｅ．プルケリマ×Ｅ．コルナストラ）の植物体から採取し、次いで、これらの挿し木を用いて、栽培品種のＰｏｉＢＩ感染株を確立した。
【０１６１】
実施例４：小型で非機能性の杯状花序及び赤色の苞葉を伴う、戻し交雑による四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を作製する雑種形成の方法
[0162]本発明の別の態様は、ユーフォルビア・プルケリマの四倍体の植物体を、「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」系統の植物体と交雑させるステップを伴った。四倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体は、暗いピンク色の苞葉、ある量の稔性花粉を含有する偶発的な葯の生成、妥当な栽培後性状、枝折れに対する抵抗性、暗い緑色の茎葉、及びコンパクトな草性など、所望される標的の形質のための育種において用いられる適切な特徴について選択した。次いで、花粉を、選択された「四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）」の植物体であって、雄性親として用いられる植物体から採取した。花粉は、柱頭が受容性である場合に、小型のブラシを用いて、四倍体のユーフォルビア・プルケリマの雌植物体の柱頭へと適用した。用いられる親植物は、異系交配させ、自家受粉させなかったので、ユーフォルビア・プルケリマの杯状花序の除雄は要請されなかった。数週間後に、受粉しなかった対照を超える子房の腫脹により交雑の成功が認められた。腫脹した子房は、受粉の４週間後又は脱落の直前に収穫した。この時点以降、Ｂｅｒｎｕｅｔｚ（２００６）の胚救出法を使用して、ＰｏｉＢＩに感染させた新たな四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の雑種植物体を作製した（既に実施例３で概括した）。
【０１６２】
実施例５：実施された交雑及び得られた結果についての説明
[0163]交雑は、実施例３及び４で記載した通りに実施した。交雑の結果を、以下の表３、４、及び５に表化する。表３は、小型の杯状花序（直径＜３ｍｍ）を伴う三倍体の後代を作製するために、雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマと、雄性親としての四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）とを用いて行われた他家受粉の結果を示す。表３の第１欄は、雌性親（二倍体のユーフォルビア・プルケリマ）を示し、第２欄は、雄性親の四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）を示し、第３欄は、直径が３ｍｍ未満の杯状花序を伴って作製された三倍体の植物体の数を示し、第４欄は、直径が３ｍｍを超える杯状花序を伴って作製された三倍体の植物体の数を示し、第５欄は、作製された三倍体の植物体の苞葉の呈色を示す。表３では、苞葉の呈色について、発生した全ての三倍体の植物体がピンク色であり、多様な色調が、分類はされていないが、観察された。
【表３】
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【０１６３】
[0164]表３に示す通り、５７例の異なる交雑の組合せを実施したところ、この交雑研究に由来する、直径が３ｍｍ未満の小型の杯状花序を伴う、三倍体の後代の百分率は、８５／１２６＝６７．５％であった。三倍体の後代の苞葉は、１００％がピンク色であった。また、一部の雄性稔性を保有する、まれな二倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの雄性親の植物体を用いる交雑も、雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマの植物体を用いて実施した。表４は、この交雑の結果を提示する。雄性稔性の二倍体の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）の植物体を得て交雑を実施することは、それらが、Ｂｅｒｎｕｅｔｚ（２００６）及びＫｏｂａｙａｓｈｉ（２０００）の方法を用いてまれに作製されるものであるために、極めて困難である。表４では、一部の雄性稔性を保有する、３つの二倍体のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの雄性親の植物体を、二倍体のユーフォルビア・プルケリマの雌性親との１５例の異なる組合せにおいて用いた。
【０１６４】
[0165]表４は、雌性親としての二倍体のユーフォルビア・プルケリマと、雄性親としての二倍体の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）とを用いて行われた他家受粉の結果を示す。表４の第１欄は、雌性親（二倍体のユーフォルビア・プルケリマ）を示し、第２欄は、雄性親二倍体の（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）を示し、第３欄は、直径が３ｍｍ未満の杯状花序を伴って作製された二倍体の植物体の数を示し、第４欄は、直径が３ｍｍを超える杯状花序を伴って作製された二倍体の植物体の数を示し、第５欄は、作製された二倍体の植物体の苞葉の呈色を示す。表４の注記される場合には、一部の二倍体の植物体が、直径が３ｍｍ未満の杯状花序をある比率で生成させたが、また、杯状花序の直径が３ｍｍを超える他の枝も生成させ、これらの植物体を不安定と注記した。
【表４】
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【０１６５】
[0166]表４に示す通り、二倍体の植物体のうちのいずれも、杯状花序の直径が３ｍｍ未満となることは一貫しておらず、ピンク色の苞葉が１００％であった。表３及び表４からの結果は、本発明の方法が、小型の杯状花序を伴うユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラの植物体を発生させるための効率において優れている（６７．５％対０％）ことを実証している。いずれの方法も、ピンク色の苞葉を伴う植物体を１００％で発生させた。なお、表４における、杯状花序の直径が３ｍｍを超える植物体は、杯状花序の直径が高度に多様なことが多く、杯状花序が同じ苞葉クラスター内で均一でないことが多いことが認められたが、これは、所望されない商業属性である。
【０１６６】
[0167]交雑を四倍体のレベルで、すなわち、雌性親としての四倍体のユーフォルビア・プルケリマ及び雄性親としての四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）のレベルで実施する場合、発生した四倍体の後代の全てにおいて、小型の杯状花序を伴う植物体の比率が増大するだけでなく、赤色の苞葉の利益の付加も観察される。表５は、小型で非機能性の杯状花序及び赤色の苞葉を伴う四倍体の後代を作製するための、雌性親としての四倍体のユーフォルビア・プルケリマと、雄性親としての四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）とを用いて行われた他家受粉の結果を示す。表５の第１欄は、雌性親（四倍体のユーフォルビア・プルケリマ）を示し、第２欄は、雄性親の四倍体（ユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ）を示し、第３欄は、直径が３ｍｍ未満の杯状花序を伴って作製された四倍体の植物体の数を示し、第４欄は、直径が３ｍｍを超える杯状花序を伴って作製された四倍体の植物体の数を示し、第５欄は、作製された四倍体の植物体の苞葉の呈色を示す。
【表５】
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【０１６７】
[0168]表５に示す通り、４６例の異なる交雑の組合せを実施したところ、この交雑研究に由来する、直径が３ｍｍ未満の小型の杯状花序を伴う、三倍体の後代の百分率は、９７．８％であった。四倍体の後代の苞葉は、１００％が赤色であった。杯状花序が中型又は大型である、低百分率（２．２％）の植物体は、まれな二倍体の花粉又は倍数体の種間雑種に固有の細胞学的環境が及ぼす通常と異なる他の影響であって、異数性四倍体の可能性が最も高い、おそらくは四倍体以外の植物体を発生させる影響に帰せられた。選択された植物体は、ＰｏｉＢＩに感染したユーフォルビア属へと接ぎ木して、ＰｏｉＢＩを導入した。数カ月間後に、ＰｏｉＢＩに感染した植物体を選択して、比較試験で生育させ、試験の終了時において測定を行い、杯状花序の直径、苞葉の呈色、及び染色体数を決定し、結果を表６に示す。同時に、温室内の天然の長日性の条件下で生育させた母株から採取された、７週齢の栄養枝からも植物体を繁殖させた。繁殖の後、植物体を、ポインセチアの育成に適する従来の鉢植え用ミックスで満たした１５ｃｍの植木鉢へと栽植した。植物体を３週間にわたり生育させ、次いで、頂端成長のうちの先端の１〜２ｃｍを除去することにより摘芽した。植物体には、ポインセチアを育成するための標準的な苗床慣行（Ｅｃｋｅら（２００４）を参照されたい）に従い細流灌漑及び施肥した。２週間後に、植物体を、開花及び発育を可能とする程度に十分に短日性である、天然の短日性の光周期下に置いた。短日性の光周期の開始から１０週間後に、全て植物体は、完全に発育し、測定を行った。各植物体の幼齢苞葉の呈色及び成熟苞葉の呈色を決定するために、ＲＨＳ（Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１）のカラーチャートを使用した。アクセッション番号１つ当たり３例ずつの植物体における３つの幼齢苞葉により測定を行った。測定はまた、アクセッション番号１つ当たり３例ずつの植物体における３つの成熟苞葉についても行った。杯状花序の直径は、ベニヤ製キャリパーで、各アクセッション番号に由来する３例ずつの植物体における３つの杯状花序（１次杯状花序又は２次杯状花序）の最も幅の広い断面を測定し、次いで、平均を導出することにより測定した。染色体数は、根端の細胞学的調製物により評価した。また、植物体の丈高、幅、及び枝数も記録したが、データは示さない。
【０１６８】
[0169]表６は、新たな本発明の結果として発生した、選択された植物体、それらの親植物、及び市販可能な栽培品種についての表現型及び染色体の特徴づけを示す。表６の第１欄は、アクセッション番号を示し、第２欄は、植物体の種類を示し、第３欄は、系統を示し、第４欄は、観察される染色体数を示し、第５欄は、３例の植物体の幼齢苞葉において測定される、ＲＨＳによる幼齢苞葉の呈色を示し、第６欄は、幼齢苞葉の呈色についての記載を示し、第７欄は、３例の植物体の成熟苞葉において測定される、ＲＨＳによる成熟苞葉の呈色を示し、第８欄は、成熟苞葉の呈色についての記載を示し、第９欄は、各アクセッション番号の３連の植物体において測定される最大の３つの杯状花序について、杯状花序の直径の平均（９つの測定値の平均）を示す。上付き文字の「１」で印づけられた染色体数は、細胞学的に検証され、撮影されている。
【表６】
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【０１６９】
[0170]種間雑種の戻し交雑による実生はＰｏｉＢＩを欠いているために、商業生産のためには、接ぎ木して、このファイトプラズマを導入することが必要である。ＰｏｉＢＩが、杯状花序の直径又は苞葉の呈色に著明な影響を及ぼしたかどうかを決定するために、３つのアクセッション番号を、既に言及された、ＰｏｉＢＩ感染を伴う場合とこれを伴わない場合による試験に組み入れた。結果を表７に示す。表７の第１欄は、アクセッション番号を示し、第２欄は、ＰｏｉＢＩの感染状態（＋＝感染、−＝非感染）を示し、第３欄は、植物体の種類を示し、第４欄は、系統を示し、第５欄は、染色体数を示し、第６欄は、３例の植物体の幼齢苞葉において測定される、ＲＨＳによる幼齢苞葉の呈色を示し、第７欄は、幼齢苞葉の呈色についての記載を示し、第８欄は、３例の植物体の成熟苞葉において測定される、ＲＨＳによる成熟苞葉の呈色を示し、第９欄は、成熟苞葉の呈色についての記載を示し、第１０欄は、各アクセッション番号の３連の植物体において測定される最大の３つの杯状花序について、成熟杯状花序の直径の平均（９つの測定値の平均）を示す。
【表７】
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【０１７０】
[0171]表７に示す通り、ＰｏｉＢＩ感染は、杯状花序の直径に著明には影響しなかった。
【０１７１】
[0172]雄性親及び雌性親の両方の多様な倍数性を含め、他の多数の育種用交雑の組合せを実施して、新規のユーフォルビア・プルケリマ×ユーフォルビア・コルナストラ雑種植物体を試みて発生させた。表８は、試みられた交雑の組合せの結果、及び子孫交雑の種類に従う、親遺伝子による理論的な寄与、及び発生した植物体の記載を示す。表８の第１欄は、雌性親を示し、第２欄は、配偶子の染色体への雌性親の寄与を示し、第３欄は、雄性親を示し、第４欄は、配偶子の染色体への雄性親の寄与を示し、第５欄は、体細胞の染色体数（２ｎ）を示し、第６欄は、ユーフォルビア・プルケリマの寄与パーセントを示し、第７欄は、ユーフォルビア・コルナストラの寄与パーセントを示し、第８欄は、後代についての記載を示し、第９欄は、注記を示す。
【表８】
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【０１７２】
[0173]本発明について記載する文脈における、“a”及び“an”及び“the”という用語並びに類似の指示詞の使用（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈における使用）は、本明細書で別段に示されるか、又は文脈により明確に否認されない限り、単数形及び複数形の両方を対象とするものと理解されたい。“comprising”、“having”、“including”、及び“containing”という用語は、別段に言及されない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「〜が含まれるがこれらに限定されない」を意味する）ものと理解されたい。本明細書で別段に示されない限り、本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に収まる各個別の値を個別に指す簡略法として用いられることだけを意図するものであり、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されたと仮定した場合と同様に本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示される場合はまた、１１、１２、１３、及び１４も開示される。本明細書で別段に示されるか、又は文脈により別段に明確に否認されない限り、本明細書で記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提示される任意の例及び全ての例又は例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく例示することだけを意図するものであり、別段に主張されない限り、本発明の範囲に限定を付与するものではない。本明細書におけるいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠なものとして主張されていない要素を示すものと理解されるべきではない。
【０１７３】
[0001]［関連出願の相互参照］本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／８０３，０１１号に基づく優先権の利益を主張する。
【外国語明細書】
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