(57)【要約】【課題】  簡単な操作で、色素産生性に拘らずB群連鎖球菌を検出し得る培地を提供すること。【解決手段】  培地に、検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質を含有させる。この培地に検体スワブを穿刺してB群連鎖球菌を培養し、蛍光の発生の有無で検出する。さらに、培地にβ-グルクロニダーゼ基質を誘導するグルクロン酸塩を含有させると、感度が大幅に向上する。本発明の培地を用いることにより、Granada mediumで検出不可能な赤色色素非産生B群連鎖球菌を検出可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質を含有するB群連鎖球菌検出用培地。
【請求項２】
β-グルクロニダーゼ基質を誘導するグルクロン酸塩を含有する請求項１記載の培地。
【請求項３】
色素産生性B群連鎖球菌のカロテノイド色素産生能を増強させるためにキサンタンガムを含有するものである請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載の培地に検体を接種して培養し、当該培地中の赤色色素の有無を観察することを特徴とするB群連鎖球菌の検出法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項記載の培地に検体を接種して培養し、蛍光励起手段で励起させた当該培地中の蛍光の発生を観察することを特徴とするB群連鎖球菌の検出法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B群連鎖球菌の検出に用いる培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
B群連鎖球菌(Group B Streptococcus)はグラム陽性の桿菌であり、膣内および腸管内の常在菌である。妊婦が膣内に本菌を保有した場合、新生児に対して死亡あるいは髄膜炎等を引き起こすことがあり、本菌の管理は新生児の感染対策の点で重要である。（非特許文献１）。米国ではCDC(米国疾病予防管理センター)において、周産期の感染対策として、本菌のスクリーニング検査のガイドラインが作成されている。周産期に本菌の存在が認められた場合には、母子感染を防ぐための措置が取られる。
【０００３】
CDCのガイドラインにて推奨されるB群連鎖球菌のスクリーニング法は、膣または直腸スワブ検体をGranada  mediumと呼ばれる培地（非特許文献２）にて35℃、24時間、選択増菌培養を行う。ここで多くのB群連鎖球菌は本培地中に赤色のカロテノイド色素を出す。培地中に色素の産生を認めた検体は本菌陽性と判定される。一方、培地中に菌の増殖を認めているにもかかわらず、色素の産生を認めない場合には、培地中の増殖した菌から抗原を抽出し、ラテックス凝集反応などの免疫学的手法による確認を行うこととされている。(非特許文献３)
【０００４】
スワブ検体中のB群連鎖球菌を選択的に増殖させる培地が種々考案されている（特許文献１）が、いずれもGranada  mediumにおけるデンプン存在下での赤色色素産生性をB群連鎖球菌の指標として検出しているが、約10％程度のB群連鎖球菌は色素非産生株と報告されている（非特許文献４）。そのためCDCガイドラインに従って試験を行った場合には、多くのGranada mediumを応用した培地では、その選択性が完全ではないため、多くの場合で菌の発育が認められるが、色素産生が認められない試験結果が多発する。
このことは、Granada mediumを使用したスクリーニング検査では、多くの検体で、免疫学的手法を用いた確定試験を行う必要があり、検査費用と手間がかかる方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許公開  平９−３１３１７１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】産婦人科診療ガイドライン−産科編2011  社団法人日本産婦人科学会、社団法人日本産婦人科医会 pp239-241
【非特許文献２】Manuel de la Rosa, Ricardo Villareal, Dolores Vega, Consuelo Miranda, andAntonio Martinezbrocal：Granada medium for detection and identificationof group BStreptococci. Journal ofClinical Microbiology, vol.18 (1983) pp779-785.
【非特許文献３】U.S. Center for Disease Control and Prevention, Prevention ofPerinatal Group B Streptococcal Disease, Revised Guidelines from CDC, 2010,Morbidity and Mortality Weekly Report, vol.59 (2010)
【非特許文献４】SilvieNickmans, ElineVerhoye, An Boel, Kristien Van Vaerenbergh, Hans De Beenhouwer： Possiblesolution to the problem of nonhemolytic group B Streptococcus on granada medium.Journal of Clinical Microbiology, vol.50 (2012) pp1132-1133.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡単な操作で、色素非産生性のB群連鎖球菌を含めた全てのB群連鎖球菌を検出し得る培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
斯かる実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った。まず、多くのB群連鎖球菌は、赤色のカロテノイド色素を産生するが、通常培地に用いられている発色性の遊離基を有する発色酵素基質、例えば、B群連鎖球菌が保有するβ‐グルクロニダーゼの基質となりうる、発色性のβ‐グルクロニダーゼ基質である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-グルクロニド、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-β-グルクロニドなどによる発色では、Granada Mediumによるカロテノイド色素との干渉により、明瞭な色原体の形成を目視にて確認することが困難である。そこで、B群連鎖球菌が保有するβ‐グルクロニダーゼにより蛍光検出可能な遊離性基を有する基質を単独で加えると、蛍光励起手段で励起させた蛍光が認められた。しかし、その形成は弱いので、同様に目視では判定しにくかった。そこで、さらに種々検討したところ、全く意外にも、検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質とグルクロン酸塩とを併用することにより、赤色のカロテノイド色素の産生能にかかわらず、B群連鎖球菌の存在を培地の蛍光により検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
１．検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質を含有するB群連鎖球菌検出用培地。
２．β-グルクロニダーゼ基質を誘導するグルクロン酸塩を含有する前記１記載の培地。
３．色素産生性B群連鎖球菌のカロテノイド色素産生能を増強させるためにキサンタンガムを含有するものである前記１又は２記載の培地。
４．前記１〜３の何れか１項記載の培地に検体を接種して培養し、当該培地中の赤色色素の有無を観察することを特徴とするB群連鎖球菌の検出法。
５．前記１〜４の何れか１項記載の培地に検体を接種して培養し、蛍光励起手段で励起させた当該培地中の蛍光の発生を観察することを特徴とするB群連鎖球菌の検出法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地を用いることにより、Granada mediumで検出不可能な赤色色素非産生B群連鎖球菌を、検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質による蛍光で検出でき、さらにグルクロン酸塩を併用することにより、より確実にかつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の培地は、基本培地に、以下に説明する蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質およびその他の成分を添加してなる。基礎となる培地はGranada mediumが好ましい。
【００１２】
本発明に用いる、検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質としては、蛍光性の色原体化合物を遊離し得るβ-グルクロニド又はその塩が挙げられ、具体的には、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−トリフルオロ−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、6−ブロモ−2−ナフチル−β−D−グルクロニド等が挙げられる。
このうち汎用性の点から、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドが好ましい。
検出可能な蛍光性の遊離性基を有するβ-グルクロニダーゼ基質の濃度は、0.001g/L〜2g/Lが好ましく、0.01g/L〜0.25g/Lがより好ましく、0.05g/L〜0.15g/Lが特に好ましい。
【００１３】
蛍光性のβ−グルクロニダーゼ基質と併用するβ-グルクロニダーゼ誘導基質としては、グルクロン酸ナトリウムが好ましく、0.001g/L〜2g/Lが好ましく、0.01g/L〜0.25g/Lがより好ましく、0.05g/L〜0.15g/Lが特に好ましい。
【００１４】
本発明の培地には、B群連鎖球菌の赤色のカロテノイド色素産生の点から、さらに、デンプンを含有せしめることが好ましい。デンプンの濃度は、1g/L〜50g/Lが好ましく、5g/L〜50g/Lがより好ましく、10g/L〜30g/Lが特に好ましい。
【００１５】
本発明の培地には、B群連鎖球菌の赤色カロテノイド色素産生の発色増強の点から、さらに、キサンタンガムを含有せしめることが好ましい。キサンタンガムの濃度は、0.01g/L〜10g/Lが好ましく、0.05g/L〜5g/Lがより好ましく、0.5g/L〜2g/Lが特に好ましい。
【００１６】
本発明の培地には、B群連鎖球菌の蛍光強度の安定化の点から、さらに、Tricineを含有せしめ、ｐHを7.8±0.1に調整することが好ましい。Tricineの濃度は、5g/L〜50g/Lが好ましく、10g/L〜50g/Lがより好ましく、15g/L〜20g/Lが特に好ましい。
【００１７】
さらに、本発明の培地には、B群連鎖球菌以外の菌の抑制の点から、抗菌物質を含有せしめるのが好ましい。このような抗菌物質としては、Methotrexate hydrate、クリスタルバイオレット、コリスチン硫酸塩、ポリミキシンB、メトロニダゾール、アンホテリシンB等が挙げられる。これら抗菌物質の濃度は、0.01mg/L〜50mg/Lが好ましく、0.05mg/L〜15mg/Lがより好ましく、0.1mg/L〜10mg/Lが特に好ましい。
本発明の培地には、さらに培地に通常用いられる成分、例えば、リン酸水素二ナトリウム等の無機塩類、ピルビン酸ナトリウム等の有機酸塩、ペプトンや肉エキス等の栄養素、ビタミン類等を添加することが好ましい。  
【００１８】
本発明の培地の形態は、特に限定されず、高層半流動寒天培地、液体培地、寒天平板培地等を用いることができる。  
【００１９】
本発明方法によるＢ群連鎖球菌の検出法を具体的に例示すれば以下のとおりである。
β-グルクロニダーゼ基質を含有する本発明培地に検体スワブを穿刺して培養し、当該培地中の赤色の色素の産生の有無を観察しB群連鎖球菌を検出する。基本培地がGranada mediumであるので、大部分のＢ群連鎖球菌はこの段階で検出できるが、10%程度存在するといわれている色素非産生のB群連鎖球菌は検出できない。しかし、β-グルクロニダーゼ基質を含有している場合は、UVランプ等の蛍光励起手段で励起させた培地の蛍光により、色素非産生B群連鎖球菌を検出できる。ただし、その蛍光は極めて弱いので、検出が困難な場合も生じる。ところが、培地にβ-グルクロニダーゼ基質を誘導するグルクロン酸塩を併用した場合は、蛍光が強まるため、より明確かつ簡便に菌を検出することができる。
【００２０】
すなわち、本培地において赤色色素を確認できた場合には、B群連鎖球菌の存在が認められる。一方、発育を認めるが色素の産生を認めない場合、あるいは発色が弱くて判別困難な場合は、UVランプ等の蛍光を誘発する光を当てることにより、培地全体が蛍光を発するため、色素非産生のB群連鎖球菌が存在した場合においても高い蓋然性により容易に検出することが出来る。従って、色素非産生性のB群連鎖球菌を含めた全てのB群連鎖球菌を検出可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
培地の作製
表１に示す組成の各培地を次のように作製した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１の基礎培地成分に示すように、950ミリリットルの精製水に各成分を加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌し、約５０℃になるまで冷却後、予め溶解した過滅菌した表１の抗菌剤液を加え、良く混合し、ネジ口キャップ付き小試験官（φ10mm×100ｍｍ）に5mlずつ分注して培地が固まるまで静置し、本発明のB群連鎖球菌検出用培地Aを作製した。さらに、この培地から、蛍光性のβ−グルクロニダーゼ基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドまたはβ−グルクロニダーゼ誘導物質であるグルクロン酸ナトリウム、および両方を抜いたものをそれぞれ作製した。また対照品としてGranada mediumを基礎とする特許文献1記載の富士製薬（株）製GBS培地を用いた。
【００２４】
菌株の供試
供試菌株はヒツジ血液寒天培地で24時間前培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水中にマクファーランド#0.5になるように懸濁したものを供試菌原液とした。各供試菌原液は滅菌生理食塩水にて適宜10倍段階希釈し、10-2各希釈液の30μLを滅菌綿棒に全量染み込ませ、綿棒を培地に穿刺して本発明培地に接種した。
【００２５】
各菌株を供試し35℃、24時間培養し、目視による発育、赤色のカロテノイド色素の産生、ならびに365nmのUVランプを照射した際の蛍光の有無を確認した結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
本発明培地ではB群連鎖球菌である色素産生性のS. agalactiaeの良好な発育および赤色色素の産生ならびに蛍光の発生を認めた。また同時に色素非産生性のS. agalactiaeにおいては、本発明培地Aでは蛍光の発生を認めた。すなわち、赤色色素の産生と蛍光の発生を確認することにより赤色のカロテノイド色素の産生にかかわらずB群連鎖球菌を高い蓋然性をもって検出することが可能であることを認めた。さらに、誘導物質であるグルクロン酸ナトリウムを含まない培地A’でも、色素産生性のS. agalactiaeは蛍光の発生が認められたものが半数以上で、色素非産生性のS. agalactiaeにおいても蛍光の発生が認められた。
また、蛍光性のβ−グルクロニダーゼ基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含まない、培地Bおよび培地Cでは赤色色素の産生を認めたものの、蛍光の産生はいずれも認めなかった。
【００２８】
実施例2
培地の作製
実施例１と全く同様にして、本発明の培地を作成した。また同時にキサンタンガムを含まない本発明培地Dを作製した。また対照品としてGranada mediumを基礎とする特許文献1記載の富士製薬（株）製GBS培地を用いた。
菌株の供試は、実施例1と全く同様に行った。
各菌株を供試し35℃、24時間培養し、目視による発育、赤色のカロテノイド色素の強さを確認した結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
本発明培地Aではキサンタンガムが含まれており、キサンタンガムを添加することによりB群連鎖球菌の赤色のカロテノイド色素の産生が強まることを認めた。キサンタンガムを含まない培地Dおよび対照培地では、赤色色素の産生度合いは同等であったが、キサンタンガムを添加することにより、赤色のカロテノイド色素の産生が強くなることを認めた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の培地を用いることにより、Granada mediumで検出不可能な赤色色素非産生B群連鎖球菌を蛍光で確実にかつ簡便に検出することができる。