(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニック植物のゲノム中における目的外の他のＤＮＡフラグメントを含むベクターＤＮＡの出現を減少させ及び／又は低コピー形質転換事象の頻度を増加させる方法及び組成物の提供。【解決手段】アグロバクテリウム等の細菌中において１〜３コピーを維持する、アグロバクテリウム・リゾゲネスｐＲｉ（「ｏｒｉＲｉ」又は「ｏｒｉＰＲｉ」）由来のもの等の、ｒｅｐＡＢＣ複製起点を、植物形質転換ベクター中に使用したベクターは、非Ｔ−ＤＮＡ領域（すなわち、ベクター骨格ＤＮＡ）を導入する形質転換事象の頻度を顕著に減少させ、１又は２コピーＴ−ＤＮＡ（即ち、目的の遺伝子）形質転換事象の数を顕著に増加した。【選択図】図４
2014193173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞を形質転換するための方法であって、
複数の植物細胞を該植物細胞の形質転換にコンピーテントな細菌細胞と接触させ、ここに該細菌細胞は：
ｉ）少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー領域；
ｉｉ）該ボーダー領域に隣接する少なくとも１つの異種トランスジーン；
ｉｉｉ）細菌選択マーカーに対するコード領域；および
ｉｖ）ｒｅｐＡＢＣ複製起点のシスおよび／またはトランスエレメントを含む、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメント
を含むＤＮＡ構築物を含み；ついで
該ＤＮＡ構築物からの少なくとも１つの異種トランスジーンの単一コピーの存在および該ＤＮＡ構築物からのベクター骨格ＤＮＡの不存在に基づいて形質転換植物細胞を選択する
ことを含み、ここに該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が配列番号：４に少なくとも９５％同一である該方法。
【請求項２】
該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が配列番号：４である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物であって、
ｉ）少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー領域；
ｉｉ）該ボーダー領域に隣接する少なくとも１つの異種トランスジーン；
ｉｉｉ）細菌選択マーカーに対するコード領域；および
ｉｖ）植物細胞の形質転換にコンピ−テントな細菌中で低コピー数のＤＮＡ構築物を維持するためのｒｅｐＡＢＣ複製起点のシスおよび／またはトランスエレメントを含む、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントを含み、ここに該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が配列番号：４に少なくとも９５％同一である、該ＤＮＡ構築物。
【請求項４】
該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が配列番号：４を含む、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
該少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー領域が右側ボーダー領域または左側ボーダー領域のいずれかである、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
異種トランスジーンが、形質転換植物細胞中で発現した場合に、細胞または細胞に由来する形質転換植物に農学的特定を提供する、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
細菌選択マーカーに対するコード領域が抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
複数の形質転換植物細胞であって、
複数の植物細胞を該植物細胞の形質転換にコンピーテントな細菌細胞と接触させ、
ここに該細菌細胞が：
ｉ）少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー領域；
ｉｉ）該ボーダー領域に隣接する少なくとも１つの異種トランスジーン；
ｉｉｉ）細菌選択マーカーに対するコード領域；および
ｉｖ）ｒｅｐＡＢＣ複製起点のシスおよび／またはトランスエレメントを含む、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメント
を含むＤＮＡ構築物を含み、ここに該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択され；ついで
該細菌細胞と複数の植物細胞とを同時培養して複数の形質転換植物細胞を形成することによって作製され、
ここに形質転換植物細胞の１５％以下が該ＤＮＡ構築物からのベクター骨格ＤＮＡを有する、該複数の形質転換植物細胞。
【請求項９】
該形質転換植物細胞の少なくとも４０％が、１コピーまたは２コピーの異種トランスジーンのみを有する、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【請求項１０】
該形質転換植物細胞の少なくとも７０％が、１コピーまたは２コピーの異種トランスジーンのみを有する、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【請求項１１】
該形質転換植物細胞の少なくとも４０％が、単一コピーの異種トランスジーンのみを有する、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【請求項１２】
該ｒｅｐＡＢＣ複製起点が、配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３よりなる群から選択される、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【請求項１３】
該植物細胞がダイズ植物細胞である、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【請求項１４】
該植物細胞がトウモロコシ植物細胞である、請求項８記載の形質転換植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２００５年９月６日に出願された米国仮出願第６０／７１４，５０１号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物遺伝子形質転換についての改善された方法およびそれを達成するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
アグロバクテリウム媒介性方法による植物細胞の形質転換は、特定のＤＮＡプラスミドを含有するアグロバクテリウム細胞の懸濁液へ植物細胞および組織を暴露することを含む。これらのプラスミドは、植物細胞中において発現するトランスジーンを含有するように特異的に構築された（例えば、米国特許第５，０３４，３２２号を参照のこと）。大抵の場合、トランスジーンの１以上は、ポジティブ選択化合物（例えば、抗生物質または除草剤）の存在下で植物細胞が成長することを可能にする、ポジティブ選択マーカートランスジーンである。これらの細胞は、完全な稔性植物へ再生するようにさらに操作され得る。
【０００４】
アグロバクテリウム媒介性形質転換方法によってトランスジーンを植物中へ導入するための方法は、少なくとも１つのトランスジーンの遺伝子要素を含みかつそれらの遺伝子要素を植物のゲノム中へ導入するＴ−ＤＮＡ（トランスファーＤＮＡ）を一般的に関与させる。トランスジーンは、典型的に、ＤＮＡプラスミドベクター中において構築され、そして通常、アグロバクテリウムＴｉプラスミド右側ボーダーＤＮＡ領域（ＲＢ）および左側ボーダーＤＮＡ領域（ＬＢ）に隣接される。アグロバクテリウム媒介性形質転換のプロセスの間、ＤＮＡプラスミドは、右および左側ボーダー領域で、エンドヌクレアーゼ、ＶｉｒＤ２によって切り目を入れられる。Ｔ鎖と呼ばれる、切り目の間からの一本鎖のＤＮＡが、アグロバクテリウム細胞から植物細胞中へ導入される。Ｔ−ＤＮＡ領域に対応する配列が、植物ゲノム中へ挿入される。
【０００５】
植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの一体化は、一般的に、ＲＢで開始し、そしてＬＢで、Ｔ−ＤＮＡの末端へ連続する。しかし、エンドヌクレアーゼは、時には、両方の境界で等しく切り目を入れない。これが起こる場合、植物ゲノム中へ挿入されるＴ−ＤＮＡは、しばしば、プラスミドベクターＤＮＡの一部または全てを含有する。この現象は、「ボーダーリードスルー（ｂｏｒｄｅｒ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」と呼ばれる。隣接するプラスミドベクターＤＮＡ（ベクター骨格）無しに、右側ボーダー領域と左側ボーダー領域との間に配置されたトランスジーン（Ｔ−ＤＮＡ）のみが植物ゲノム中へ導入されることが通常好ましい。ベクター骨格ＤＮＡは、例えば、複製起点、細菌選択マーカー遺伝子、および作物商品において所望の形質を発現するようには要求されていない他のＤＮＡフラグメントを含む、種々のプラスミド維持要素を含有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
相当なリソースが、ベクター骨格ＤＮＡの存在について、トランスジェニック作物のゲノムをスクリーニングすることに向けられている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびサザンブロット分析等の方法が、外来ベクター骨格ＤＮＡを同定するためにもっともしばしば使用されている。これらの方法は、大規模なスクリーニング作業のために、多大な時間を必要としそして高価である。ベクター骨格ＤＮＡを含有すると分かったトランスジェニック植物は、一般的に、商業化について好ましくない。さらに、２を超えるトランスジーンを含有するトランスジェニック植物は、通常、商業的開発についてほとんど価値がない。商業的可能性を有さない植物細胞培養物から植物を再生することに、かなりの努力が費やされている。
【０００７】
したがって、トランスジェニック植物のゲノム中におけるベクター骨格ＤＮＡの出現を大いに減少させおよび／または低コピー形質転換事象の頻度を増加させる方法および組成物を開発することが出来れば、非常に有益である。より多数がベクター骨格ＤＮＡを含有せず、かつ、ほとんどの植物が１または２コピーのトランスジーンを有する場合、より少数のトランスジェニック植物が作製されなければならず、トランスジェニック植物作製の効率が非常に増加される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明の１態様によれば、細菌媒介性植物細胞形質転換、例えばアグロバクテリウム媒介性植物形質転換における事象の品質を改善するための構築物および方法が提供される。本発明は、減少された頻度のベクター骨格ＤＮＡ（すなわち、非−Ｔ−ＤＮＡ領域）形質転換事象を提供することにおいて、および該Ｔ−ＤＮＡの１または２のコピーを伴うＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度を増加させることにおいて、有利である。
【０００９】
本発明はまた、以下を含む植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物を提供する：ｉ）少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー領域；ｉｉ）該ボーダー領域に隣接する少なくとも１つの異種トランスジーン；ｉｉｉ）細菌選択マーカーに対するコード領域；ならびにｉｖ）植物細胞形質転換細菌中において低コピー数の該ＤＮＡ構築物を維持するための複製起点のシスおよび／またはトランスエレメントを含む、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメント。
【００１０】
本発明のある実施形態において、植物細胞形質転換（植物細胞形質転換コンピテントな）細菌細胞中において低コピー数のＤＮＡ構築物を維持するための複製起点のエレメントは、ｒｅｐＡ（例えば、配列番号３２または配列番号３８）；ｒｅｐＢ（例えば、配列番号３３または配列番号３９）；ｒｅｐＣ（例えば、配列番号３４または配列番号４０）；ｉｇｓ１（例えば、配列番号３５または配列番号４１）；ｉｇｓ２（例えば、配列番号３６または配列番号４２）の１以上を含む。構築物はまた、必要に応じて、パリンドロミック配列、例えば、配列番号３７の１６ｂｐパリンドロミック配列を含み得る。これらのエレメントは、互いにシスまたはトランスに配置され得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、Ｔ−ＤＮＡボーダー領域は、右側ボーダー領域（ＲＢ）または左側ボーダー（ＬＢ）領域として規定される。さらに、ある実施形態において、ＲＢおよび／またはＬＢ配列は、配列番号４３または配列番号４４を含む。特定の実施形態において、異種トランスジーンは、形質転換植物細胞中において発現されると、該細胞または該細胞由来の形質転換植物対して農学的表現型（ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を提供する。さらなる実施形態において、細菌選択マーカーについてのコード領域は、カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびゼオシン耐性遺伝子から選択される抗生物質耐性遺伝子である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、複製起点は、配列番号１、２、３、または４より選択されるｒｅｐＡＢＣ配列を含む。１実施形態において、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、複製遺伝子ｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ、およびｒｅｐＣを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、遺伝子間配列１（ｉｇｓ１）および遺伝子間配列２（ｉｇｓ２）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、１６塩基対パリンドロミック配列を含む。他の実施形態において、ＤＮＡのセグメントは、アグロバクテリウムまたは他の植物細胞形質転換コンピテント細菌中において低コピー数（１細胞当たり１〜３コピー）を維持するために必要なｒｅｐＡＢＣの全ての配列を含む。ｒｅｐＡＢＣを含有する構築物およびそれらの使用方法は、下記においてより詳細に説明される。
【００１３】
本発明のＤＮＡ構築物は、任意の細胞、例えば、植物細胞形質転換コンピテント細菌等へ導入され得る。このような細菌は当該分野において公知であり、そして例えば、以下の種に属し得る：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種およびブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種。好ましくは、このような細菌は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に属し得る。本発明のＤＮＡ構築物は、大腸菌中において構築物のコピーを維持するための１以上の複製起点をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、大腸菌中において構築物のコピーを維持するための複製起点は、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣの少なくとも１つから由来する。
【００１４】
本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物細胞形質転換細菌に関し、そしてこれは、植物細胞を形質転換するために使用され得る。いくつかの実施形態において、植物形質転換細菌は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種  Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ種、またはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種より選択される。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも第１植物（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ）細胞と本発明の植物細胞形質転換細菌とを接触させること；ならびに少なくとも１つの異種トランスジーンで形質転換された少なくとも１つの植物細胞を選択することを含む、植物細胞を形質転換するための方法に関する。いくつかの実施形態において、植物細胞は、ダイズ、キャノーラ、トウモロコシ、または綿植物細胞である。１実施形態において、本発明の方法は、植物細胞から植物を再生することをさらに含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明の植物またはその部分を得ること；および該植物またはその部分から食品、飼料または産業製品を製造することを含む、食品、飼料または産業製品の製造方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物で植物を遺伝的に形質転換し、そして非Ｔ−ＤＮＡベクター領域で形質転換される植物の頻度を減少させる方法を含む。いくつかの実施形態において、非Ｔ−ＤＮＡ領域で形質転換される植物の頻度は、約２０％以下と規定され得る。いくつかの実施形態において、頻度は約１５％以下であり、いくつかの実施形態において、約１０％未満であり、そしていくつかの実施形態において、約８％または５％以下である。本発明の方法のいくつかの実施形態において、得られる１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度は、約７０％または７５％以上である。場合によっては、その頻度は、約８０％または８５％以上へ上昇され得、そしていくつかの実施形態においては、約９０％または９５％超へ上昇され得る。
【００１８】
全長ｏｒｉＲｉに加えて、本発明は、本発明において使用される場合に全長配列と実質的に類似する機能を保持するｏｒｉＲｉの変異体およびバリアントを含有する植物形質転換ベクターを包含する。例えば、出願人は、本発明における使用に好適である配列番号３に開示される切断配列を同定した。当業者は、ｏｒｉＲｉ配列においてさらなる変化、欠失、置換等を容易に行い得、そして本発明の方法を使用して機能的活性についてスクリーニングし得る。したがって、本発明は、このようなバリアントおよび変異体を包含する。
【００１９】
本発明のさらなる特徴および利点は、一部分において続いての説明中に記載され、そして一部分において該説明から明らかとなり、あるいは、本発明の実施によって確認され得る。本発明の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘されるエレメントおよび組み合わせによって実現化および達成される。
【００２０】
前述の一般的な説明および下記の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であるだけであり、特許請求の範囲のように本発明を限定するものではないことが理解される。
【００２１】
本明細書の一部に組み込まれかつこれを構成する添付の図面は、本発明の種々の実施形態を例証し、そして該説明と一緒に、本発明の原理を説明するに役立つ。
【００２２】
特に規定されない限り、本明細書中において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中の本発明の説明中に使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみであり、そして本発明の限定であるように意図されない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ア（ａ）」、「アン（ａｎ）」、および「ザ（ｔｈｅ）」は、文脈が特に明確に記載しない限り、複数形も同様に含むように意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ダイズ形質転換についてのｐＭＯＮ８３８８２およびトウモロコシ形質転換についてのｐＭＯＮ９７３５２の構築のために使用された５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントを有するベースベクターである、ｐＭＯＮ８３８５６のプラスミドマップを示す。
【図２】図２は、例として、ダイズ形質転換のための、５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントおよび５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ）選択マーカー遺伝子および目的のｕｉｄＡ（ｇｕｓ）遺伝子を有するテストベクターである、ｐＭＯＮ８３８８２のプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、ｐＭＯＮ８３９３７の構築のために使用された４．２ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントを有するベースベクターである、ｐＭＯＮ８３９３４のプラスミドマップを示す。
【図４】図４は、例として、ダイズ形質転換のための、４．２ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントおよびＣＰ４選択マーカー遺伝子およびＧＯＩ（ｇｕｓ）を有するテストベクターである、ｐＭＯＮ８３９３７のプラスミドマップを示す。
【図５】図５は、例として、トウモロコシ形質転換のための、５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントおよびＣＰ４選択マーカー遺伝子およびＧＯＩ（ｇｕｓ）を有するテストベクターである、ｐＭＯＮ９７３５２のプラスミドマップを示す。
【図６】図６は、トウモロコシ形質転換についてのコントロールとして使用されたｐＭＯＮ９２７２６のプラスミドマップを示す。それは、複製起点以外はｐＭＯＮ９７３５２と同一の遺伝子構造を含有する。それは、ｏｒｉＲｉの代わりにｏｒｉＶを含有する。
【図７】図７は、ダイズ形質転換についてのコントロールとして使用された、２Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターである、ｐＭＯＮ８７４８８のプラスミドマップを示す。それは、ｏｒｉＲｉの代わりにｏｒｉＶを含有する。
【図８】図８は、例として、ダイズ形質転換のための、４．３ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントおよびＣＰ４選択マーカー遺伝子およびＧＯＩ（ｇｕｓ）を有する２Ｔ−ＤＮＡ形質転換テストベクターである、ｐＭＯＮ９６００１のプラスミドマップを示す。
【図９】図９は、例として、ダイズ形質転換のための、５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントおよびＣＰ４選択マーカー遺伝子およびＧＯＩ（ｇｕｓ）を有する２Ｔ−ＤＮＡ形質転換テストベクターである、ｐＭＯＮ９６０１０のプラスミドマップを示す。
【図１０】図１０は、トウモロコシにおける形質転換頻度に対する複製起点のタイプの効果を示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示し；＊は、ｏｒｉＲｉ（ｐＭＯＮ９７３５２）とｏｒｉＶ（ｐＭＯＮ９２７２６）との有意差を示す。
【図１１】図１１は、トウモロコシ形質転換における骨格配列導入に対する複製起点のタイプの効果を示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示し；＊は、ｏｒｉＲｉ（ｐＭＯＮ９７３５２）とｏｒｉＶ（ｐＭＯＮ９２７２６）との有意差を示す。ｏｒｉＲｉ／ｏｒｉＶ、ＲＢ、およびＬＢは、使用された骨格プローブのタイプを示す。
【図１２】図１２は、トウモロコシ形質転換におけるトランスジーン品質に対する複製起点のタイプの効果を示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。０、１、２、３＋は、コピー数を示す。
【図１３】図１３は、ダイズについての、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＦＮ４２  ｐ４２ｂ  プラスミド由来のｒｅｐＡＢＣ複製起点およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳ選択マーカー遺伝子を含有する、ｐＭＯＮ９６９５１のプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、ここで、添付の図面を時々参照しつつ、より詳細な実施形態を参照することによって説明される。しかし、本発明は、種々の形態で具現化され得、そして本明細書中に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、例示的であり、そしてこの開示が徹底的かつ完全となるように提供され、そして当業者に対して本発明の範囲を完全に伝える。
【００２５】
本発明は、一部において、アグロバクテリウム等の細菌中において１〜３コピーを維持する、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ｐＲｉ（「ｏｒｉＲｉ」または「ｏｒｉＰＲｉ」）由来のもの等の、ｒｅｐＡＢＣ複製起点が、植物形質転換ベクター中に使用され得、そして非常に望ましい形質転換事象を与え得るという発見に関する。本発明のベクターは、例えば、非Ｔ−ＤＮＡ領域（すなわち、ベクター骨格ＤＮＡ）を導入する形質転換事象の頻度を顕著に減少させ得、そして、例えば、１または２コピーＴ−ＤＮＡ（すなわち、目的の遺伝子）形質転換事象の数を顕著に増加させ得る。先行技術は、これらの予想外の形質転換結果を達成するためにｏｒｉＲｉを使用することを教示も示唆もしていない。本発明のベクターおよび方法は、トランスジェニック作物の作製における形質転換事象を改善する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、トランスジェニック作物は、作物細胞のゲノム中に挿入された外来ポリヌクレオチド分子または異種トランスジーンを含有する。作物細胞は、非限定的に、植物細胞を含み、そしてさらに懸濁培養物、胚、分裂領域（ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ）、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、胚珠、花粉および小胞子、および種子、および果実を含む。「外来の」または「異種の」によって、ポリヌクレオチド分子が導入される植物細胞の外部に由来するポリヌクレオチド分子が意味される。外来ポリヌクレオチド分子は、天然または非天然ヌクレオチド配列を有し得る。当業者は、外来ポリヌクレオチド分子が、該ポリヌクレオチド分子が導入される植物とは異なる種の任意の他の生物または植物種から誘導される異種分子であり得ること、あるいはそれが導入される植物と同一の植物種から誘導されるポリヌクレオチド分子であり得ることを理解する。
【００２７】
外来ポリヌクレオチド（異種トランスジーン）は、形質転換植物細胞中において発現されると、該細胞に対してまたは該細胞由来の形質転換植物に対して農業形質を提供する。目的のこれらの遺伝子（ＧＯＩ）は、例えば以下を含む遺伝子要素が挙げられるがこれらに限定されない、有利な農業形質を作物に対して提供する：除草剤耐性（米国特許第５，６３３，４３５号；米国特許第５，４６３，１７５号）、増加された収率（米国特許第５，７１６，８３７号）、昆虫制御（米国特許第６，０６３，５９７号；米国特許第６，０６３，７５６号；米国特許第６，０９３，６９５号；米国特許第５，９４２，６６４号；米国特許第６，１１０，４６４号）、真菌性疾患耐性（米国特許第５，５１６，６７１号；米国特許第５，７７３，６９６号；米国特許第６，１２１，４３６号；および米国特許第６，３１６，４０７号；および米国特許第６，５０６，９６２号）、ウイルス耐性（米国特許第５，３０４，７３０号および米国特許第６，０１３，８６４号）、線虫耐性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌性疾患耐性（米国特許第５，５１６，６７１号）、デンプン産生（米国特許第５，７５０，８７６号および米国特許第６，４７６，２９５号）、変性油産生（米国特許第６，４４４，８７６号）、高油産生（米国特許第５，６０８，１４９号および米国特許第６，４７６，２９５号）、変性脂肪酸含有量（米国特許第６，５３７，７５０号）、高タンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実熟成（米国特許第５，５１２，４６６号）、増強された動物およびヒト栄養分（米国特許第５，９８５，６０５号および米国特許第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第５，９５８，７４５号および米国特許公開公報２００３／００２８９１７）、環境ストレス耐性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチド（米国特許第６，０８０，５６０号）、改善されたプロセッシング形質（米国特許第６，４７６，２９５号）、改善された消化率（米国特許第６，５３１，６４８号）、低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、産業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、改善されたフレーバー（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、雑種種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、およびバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）；上記に列挙される特許中に記載される遺伝子要素およびトランスジーンは、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００２８】
本発明は、トランスジェニック作物を作製するための植物組換えＤＮＡ構築物を提供する。当業者に周知である方法が、本発明の作物組換えＤＮＡ構築物を作製するために使用され得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。該方法によって作製された外来ポリヌクレオチド分子は、アグロバクテリウム等の植物形質転換細菌によって、または植物形質転換の分野における当業者に公知の他の方法によって、作物細胞中へ導入され得る。植物への遺伝子導入は、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら（２００５）および米国仮出願６０８００８７２（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、様々な種類の細菌を使用して示されている。本発明の組換えＤＮＡ構築物は、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、または植物細胞を形質転換し得る任意の他の細菌を使用する形質転換によって、作物細胞中へ導入され得る。
【００２９】
本発明は、植物のアグロバクテリウム媒介性形質転換における使用のための植物形質転換ベクターを含む。本発明のベクターは、一般的にプラスミドであるが、ｏｒｉＲｉ複製起点は、アグロバクテリウム中において非常に低いコピー数（１細胞当たり１〜３コピー）を維持するために、ｒｅｐＡＢＣファミリー由来の他の複製起点によって置換され得る。また、アグロバクテリウム維持複製起点を有さないベクターは、相同的組換えによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中のＴｉプラスミド、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）中のＲｉプラスミド、またはアグロバクテリウム染色体のいずれかに一体化され得るＴ−ＤＮＡ中の配列でアグロバクテリウム中においてそれら自体を維持することが出来る。これは、非Ｔ−ＤＮＡ配列挿入の減少および低コピー数形質転換事象の増加という同一の効果を生じさせるが、これは染色体、ＴｉまたはＲｉプラスミドが単一コピー中に存在するためである。Ｒｈｉｚｏｂｉａ種または非アグロバクテリウム種が植物形質転換のために使用される場合、ＧＯＩを含有するＴ−ＤＮＡは、アグロバクテリウムが生じさせるのと同一の効果を生じさせ得る、宿主細菌中において染色体中またはｒｅｐＡＢＣプラスミド中へ一体化され得る。
【００３０】
本発明のベクターは、少なくとも１つのアグロバクテリウムＴｉプラスミド右側ボーダーまたは左側ボーダー領域を含み得る。該ベクターは、少なくとも１対の境界を含み得る。該ベクターは、４対の境界を含み得るが、該ベクターは、しばしば１または２対を含む。
【００３１】
本発明のベクターは、細菌宿主中における維持のための選択マーカーについてのコード領域をさらに含み得る。選択マーカーについてのコード領域としては、スペクチノマイシンもしくはストレプトマイシン、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子に対して耐性を与えるＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐが挙げられる。他の耐性遺伝子としては、カルベネシリン（ｃａｒｂｅｎｅｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン、およびカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。他のものは公知であり、そして当業者によって本発明において容易に使用され得る。
【００３２】
本発明のベクターはまた、形質転換された植物細胞を対応の試薬で選択するために、典型的にＴ−ＤＮＡ中に配置される、植物選択マーカー遺伝子についてのコード領域を含み得る。植物選択マーカーは、ポジティブ選択化合物に対する耐性、例えば、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等）、または除草剤耐性（例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グリホサート、ジカンバ、グルホシナート、スルホニル尿素、イミダゾリノン、ブロモキシニル、ダラポン、シクロヘキサンジオン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、およびイソキサフルトール除草剤）を提供し得る。除草剤耐性に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、当該分野において公知であり、そして以下をコードするポリヌクレオチド分子が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）グリホサートに対する耐性を与える５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼを含む（ＥＰＳＰＳ；米国特許第５，６２７，０６１号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第６，０４０，４９７号、米国特許第５，０９４，９４５号、ＷＯ０４０７４４４３、およびＷＯ０４００９７６１）、グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ；米国特許第５，４６３，１７５号）、グリホサートデカルボキシラーゼ（ＷＯ０５００３３６２および米国特許出願２００４０１７７３９９）、およびグリホサート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ；米国特許公開公報２００３００８３４８０）を含むグリホサートに対する耐性；ｂ）ジカンバ等のオーキシン様除草剤に対する耐性を与えるジカンバモノオキシゲナーゼ（ｄｄｍＣによってコードされる、ＤＭＯ）（米国特許出願２００３０１１５６２６、２００３０１３５８７９；Ｈｅｒｍａｎら，２００５）；ｃ）ホスフィノトリシンまたはグルホシナートに対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）（米国特許第５，６４６，０２４号、米国特許第５，５６１，２３６号、欧州特許２７５，９５７；米国特許第５，２７６，２６８号；米国特許第５，６３７，４８９号；米国特許第５，２７３，８９４号）；ｄ）２，２−ジクロロプロピオン酸に対する耐性を与える２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｄａｌａｐｏｎ）（ＷＯ９９２７１１６）；ｅ）スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジルオキシベンゾエートおよびフタリド等のアセト乳酸合成酵素阻害剤に対する耐性を与えるアセトヒドロキシ酸合成酵素またはアセト乳酸合成酵素（米国特許第６，２２５，１０５号；米国特許第５，７６７，３６６号、米国特許第４，７６１，３７３号；米国特許第５，６３３，４３７号；米国特許第６，６１３，９６３号；米国特許第５，０１３，６５９号；米国特許第５，１４１，８７０号；米国特許第５，３７８，８２４号；米国特許第５，６０５，０１１号）；ｆ）ブロモキシニルに対する耐性を与えるハロアリールニトリラーゼ（Ｂｘｎ）（ＷＯ８７０４１８１Ａ１；米国特許第４，８１０，６４８号；ＷＯ８９００１９３Ａ）；ｇ）シクロヘキサンジオン（セトキシジム）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（ハロキシホップ）に対する耐性を与えるための修飾化アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（米国特許第６，４１４，２２２号）；ｈ）スルホンアミド除草剤に対する耐性を与えるためのジヒドロプテロイン酸合成酵素（ｓｕｌＩ）（米国特許第５，５９７，７１７号；米国特許第５，６３３，４４４号；米国特許第５，７１９，０４６号）；ｉ）トリアジン除草剤に対する耐性を与えるための３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら，１９８３）；ｊ）５−メチルトリプトファンに対する耐性を与えるためのアントラニル酸合成酵素（米国特許第４，５８１，８４７号）；ｋ）アミノエチルシステインに対する耐性を与えるためのジヒドロジピコリン酸合成酵素（ｄａｐＡ）（ＷＯ８９１１７８９）；ｌ）ノルフルラゾン等のピリダジノン除草剤に対する耐性を与えるためのフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）（ＪＰ０６３４３４７３）；ｍ）イソキサフルトール等のシクロプロピルイソオキサゾール除草剤に対する耐性を与えるためのヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＷＯ９６３８５６７；米国特許第６，２６８，５４９号）；ｎ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤に対する耐性を与えるための修飾化プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩ（ｐｒｏｔｏｘ）（米国特許第５，９３９，６０２号）；ならびにｏ）アリールオキシアルカノエート部分を含有する除草剤に対する耐性を与えるためのアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）（ＷＯ０５１０７４３７）。このような除草剤の例としては、フェノキシオーキシン（例えば、２，４−Ｄおよびジクロルプロップ）、ピリジルオキシオーキシン（例えば、フルロキシピルおよびトリクロピル）、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（例えば、ハロキシホップ、キザロホップ、およびジクロホップ）、および５−置換フェノキシアセテートプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ阻害剤（例えば、ピラフルフェンおよびフルミクロラック）が挙げられる。
【００３３】
植物選択マーカーに加えて、いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子を使用することが望ましくあり得る。場合によっては、レポーター遺伝子は、選択マーカー存在または不存在下で使用され得る。レポーター遺伝子は、典型的にレシピエント生物または組織中に存在せず、かつ、典型的にいくつかの表現型変化または酵素特性を生じさせるタンパク質をコードする、遺伝子である。このような遺伝子の例は、Ｗｉｓｉｎｇら（１９８８）において提供され、これは参照により本明細書中に組み込まれる。好ましいレポーター遺伝子としては、大腸菌のｕｉｄＡ座のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、大腸菌のＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、生物発光クラゲアクオレラ・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質、およびホタル（フォティナス・ピラリス、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。次いで、レポーター遺伝子発現を検出するためのアッセイが、該遺伝子がレシピエント細胞中へ導入された後の好適な時に行われ得る。好ましいこのようなアッセイは、本明細書中においてＧＵＳと呼ばれる、形質転換された細胞を同定するためのＪｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）に記載されるような大腸菌のｕｉｄＡ座のベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子の使用を伴う。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、大腸菌中における維持のための１つの複製起点を含む。これらの複製起点は、例えば、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣから誘導され得る。このような複製起点の１つの例は、ＣｏｌＥ１である。本発明のベクターは、大腸菌中において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００あるいはそれ以上のプラスミドコピーを維持する任意の複製起点を含み得る。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、大腸菌中においてより高いコピー数を維持する（例えば、５、１０、１５、２０、２５、または３０を超え、そしていくつかのさらなる実施形態においては、１０、１５、２０、２５または３０を超える）。このような高コピー数ベクターは、形質転換のために利用可能なＤＮＡの量を増幅することをより容易にする。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、大腸菌細胞中において高いコピー数を提供するｏｒｉと、アグロバクテリウム中において非常に低いコピー数（例えば、１〜３）を維持する、第２のｏｒｉ、例えば、ｒｅｐＡＢＣファミリーに属するｏｒｉ、例えば、ｏｒｉＲｉとを含有するベクターを含む。
【００３５】
本発明のベクターはまた、アグロバクテリウム等の植物形質転換細菌中における低コピープラスミド維持（１〜３コピー）のために必要かつ十分である、シスおよび／またはトランスエレメントを含む、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントを含む。ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、好ましくは、ｒｅｐＡＢＣファミリー由来の複製起点を含む。さらに、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミド複製起点（ｏｒｉＲｉ）および／またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉのプラスミドｐ４２ｂ由来のｒｅｐＡＢＣ起点を含み得る。なおさらに、ｒｅｐＡＢＣファミリーは、好ましくは、複製遺伝子ｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ、およびｒｅｐＣを含む。少なくとも１つのセグメントはまた、遺伝子間領域配列、ｉｇｓ１およびｉｇｓ２を含み得る。なおさらに、ＤＮＡの少なくとも１つのセグメントは、ｒｅｐＣの後に１６−ｂｐパリンドロームを含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ｒｅｐＡＢＣ」プラスミド（すなわち、細胞における複製および分配のためにこのような配列を使用するプラスミド）の「複製起点」は、ｒｅｐＡ（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｐＲｉ由来の配列番号３２；Ｒ．ｅｔｌｉのｐ４２ｂ由来の配列番号３８）、ｒｅｐＢ（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来の配列番号  配列番号３３；Ｒ．ｅｔｌｉのｐ４２ｂ由来の配列番号３９）、ｒｅｐＣ（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来の配列番号  配列番号３４；Ｒ．ｅｔｌｉのｐ４２ｂ由来の配列番号４０）、ｉｇｓ１（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来の配列番号３５；Ｒ．ｅｔｌｉのｐ４２ｂ由来の配列番号４１））、ｉｇｓ２（例えば、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来の配列番号３６；Ｒ．ｅｔｌｉのｐ４２ｂ由来の配列番号４２）を含むとして規定され得、そして必要に応じてパリンドロミック配列（例えば、配列番号３７）を含み得る。他の実施形態において、複製起点は、植物細胞を形質転換する細菌細胞中において低コピー数（例えば、１〜約３コピー）を維持するために必要な配列を含み得る。このようなｒｅｐＡＢＣ複製起点の例は、特に、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドのｏｒｉＲｉ中、およびＲ．ｅｔｌｉのプラスミドｐ４２ｂ中、配列番号１〜４において見られる。
【００３７】
１実施形態において、少なくとも１つのセグメントは、配列番号１に同定される通りである。他の実施形態において、少なくとも１つのセグメントは、以下の配列から実質的になる：配列番号２として同定されるｐＭＯＮ８３８８２塩基（６３３−６２５０）の５６１８ｂｐ  ｏｒｉＲｉ。別の実施形態において、少なくとも１つのセグメントは、配列番号３に同定される配列を含むおよび／または配列番号３に同定される配列から実質的になる。なお別の実施形態において、少なくとも１つのセグメントは、配列番号４に同定されるＲ．ｅｔｌｉ由来のｐ４２ｂ由来のｒｅｐＡＢＣであり得る。
【００３８】
本明細書中で規定される核酸またはポリペプチド配列のいずれかの定義に含まれるのは、このような配列と特定の程度の同一性を示す配列である。例えば、特定の核酸配列が本明細書中に記載される一方、本発明の範囲から逸脱することなく、記載される配列に対して修飾が成され得ることが、理解されるべきである。特に、本明細書中に記載されるものと実質的に同一である核酸配列は、本発明で使用され得る。他の核酸（またはその相補鎖）と最適に配置されると（適切なヌクレオチド挿入または欠失が、比較のウィンドウにわたって合計で参照配列の２０パーセント未満となる）、少なくとも２００個のヌクレオチド位、好ましくは少なくとも３００個のヌクレオチド位、より好ましくは少なくとも４００個のヌクレオチド位の比較ウィンドウと比べて、そして最も好ましくは第１核酸の全長と比べて、少なくとも約７５％ヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、もしくは８９％同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一性が存在する場合、第１核酸配列は、参照核酸配列に対して「実質的な同一性」を示す。比較ウィンドウを配置するための配列の最適な配置は、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似法によって；好ましくはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ．中のこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって、行われ得る。参照核酸は、全長分子またはより長い分子の一部であり得る。
【００３９】
あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で一方が他方にハイブリダイズする場合、２つの核酸は実質的な同一性を有する。用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、実験的に測定され得るように、テスト配列が標的配列と特異的にハイブリダイズするが非標的配列とはハイブリダイズしない条件として規定される。用語「ストリンジェントな条件」は、特異的ハイブリダイゼーション手順によって標的核酸配列への（すなわち、目的の特定の核酸配列への）核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に規定される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，９．５２−９．５５、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，９．４７−９．５２，９．５６−９．５８；Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９８４；ならびにＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ，１９６８を参照のこと）。ＤＮＡハイブリダイゼーションについて適切なストリンジェントな条件は、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃で０．２×ＳＳＣの洗浄である。このような方法の詳細は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）が挙げられるがこれに限定されない実験マニュアルにおいて見られ得る。いくつかの実施形態において、より低いストリンジェンシー条件は、洗浄を５０℃で約２．０×ＳＳＣに変化させることによって使用され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃でのより高いストリンジェンシー条件へ増加され得る。温度および塩の両方が変化されてもよく、あるいは温度または塩濃度のいずれかが一定に保たれつつ他方の変数が変化されてもよい。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブまたはプライマーを使用するハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーについて、６５℃で６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１００μｇ／ｍＬ非特異的ＤＮＡ（例えば、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ）中において行われ、６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄され得る。
【００４０】
核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書中で使用される場合、分子は、該分子の一方の各ヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子は、少なくとも慣習的な「低ストリンジェンシー」条件下でそれらが互いにアニールされた状態のままでいること可能にするに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズし得る場合、「最小限に相補的」と言われる。同様に、分子は、慣習的な「高ストリンジェンシー」条件下でそれらが互いにアニールされた状態のままでいることを可能にするに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズし得る場合、「相補的」であると言われる。標的配列へのプローブまたはプライマーの結合の特異性が保存される場合、より低い程度の配列類似性を有する関連配列を同定するために、より低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、より低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄温度）が使用され得ることが考えられる。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的ストレッチと二本鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために使用され得る。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡセグメントの検出は、当業者に周知であり、そしてしたがって、想定される適用に依存して、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが望まれ、そして選択の方法は、所望の結果に依存する。慣習的なストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）においてそしてＨａｙｍｅｓら（１９８５）によって記載されている。
【００４１】
本発明のＤＮＡ構築物は、好適なアグロバクテリウム媒介性植物形質転換法によって、所望の植物宿主のゲノム中へ導入され得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換によって植物を形質転換するための方法としては、Ｆｒａｌｅｙら（１９８５）、およびＲｏｇｅｒｓら（１９８７）が挙げられる。アグロバクテリウム媒介性形質転換は、アグロバクテリウム属に属する遺伝子操作された土壌細菌の使用によって達成される。いくつかのアグロバクテリウム種は、「Ｔ−ＤＮＡ」として公知の特異的ＤＮＡの導入を媒介し、これは、任意の所望のＤＮＡ断片を多くの植物種中へ運搬するように遺伝子操作され得る。Ｔ−ＤＮＡ媒介性病因のプロセスの印となる主な事象は、毒性遺伝子の誘導、ならびにＴ鎖のプロセッシングおよび導入である。このプロセスは、多くの検討の主題である（Ｒｅａｍ，１９８９；ＨｏｗａｒｄおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ，１９９０；Ｋａｄｏ，１９９１；Ｗｉｎａｎｓ，１９９２；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，１９９２；Ｇｅｌｖｉｎ，１９９３；ＢｉｎｎｓおよびＨｏｗｉｔｚ，１９９４；ＨｏｏｙｋａａｓおよびＢｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ，１９９４；ＬｅｓｓｌおよびＬａｎｋａ，１９９４；ＺｕｐａｎおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ，１９９５）。非アグロバクテリウム種、例えば、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉもまた、本発明のＤＮＡ構築物を使用して遺伝子を導入するために使用され得る（参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら，２００５および米国仮出願６０／８００，８７２）。細胞中へＤＮＡを導入するための他の方法もまた使用され得る。これらの方法は、当業者に周知であり、そして化学的方法および物理的方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを含み得る。
【００４２】
植物細胞再生技術は、組織培養増殖培地中における特定の植物ホルモンの取り扱いに依存し、また典型的に所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存する。好適なプロトコルでの方法の選択は、以下由来の宿主について利用可能である：Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（ニンジン、セロリ、パースニップ）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ（キャベツ、ダイコン、キャノーラ／ナタネ等）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ（メロンおよびキュウリ）、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（コムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ等）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ（ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）、種々の花作物（ｆｌｏｒａｌ  ｃｒｏｐｓ）、例えば、ヒマワリ、および木の実を有する樹木、例えば、アーモンド、カシュー、クルミ、およびピーカン。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏら（１９８４）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）；Ｆｒｏｍｍ（１９９０）；Ｖａｓｉｌら（１９９０）；Ｖａｓｉｌら（１９９２）；Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏ（１９９０）；およびＤａｔｔａら（１９９０）を参照のこと。このような再生技術は、一般的に、Ｋｌｅｅら（１９８７）に記載されている。本発明の実施においてトランスジェニックＤＮＡ構築物を植物ゲノム中へ導入することによって植物を形質転換するための方法および組成物は、周知かつ実証された方法のいずれをも含み得る。例えば、米国特許第５，８２４，８７７号；第５，５９１，６１６号；および第６，３８４，３０１号（これらの全ては、参照により本明細書中に組み込まれる）に示されるようなアグロバクテリウム媒介性形質転換。
【００４３】
本発明の実施によって作製され得る植物は、形質転換および再生へ供される任意の植物を含み、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない：アカシア、アルファルファ、アネット、リンゴ、アンズ、アーティチョーク、キバナスズシロ、アスパラガス、アボガド、バナナ、ダイズ、豆、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、サクランボ、コリアンダー、柑橘類、クレメンタイン、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ダグラスファー、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、フェンネル、イチジク、森林樹、ウリ、ブドウ、グレープフルーツ、蜜（ｈｏｎｅｙ  ｄｅｗ）、クズイモ、キーウィフルーツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、木の実、オートムギ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、西洋ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジエータ松、赤チコリ、ダイコン、ラズベリー、米、ライムギ、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、チャ、タバコ、トマト、芝生、つる植物（ｖｉｎｅ）、スイカ、コムギ、ヤムイモ、およびズッキーニ。好ましい実施形態において、植物は、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、または綿植物である。特定の実施形態において、植物はトウモロコシ植物である。特定の実施形態において、植物はダイズ植物である。他の実施形態において、植物は綿植物である。そして、なおさらなる実施形態において、植物はキャノーラ植物である。
【００４４】
本発明は、改善された形質転換効率を生じさせ、ベクター骨格ＤＮＡ、または「非Ｔ−ＤＮＡ」で形質転換される植物の頻度を顕著に減少させる。いくつかの実施形態において、非Ｔ−ＤＮＡで形質転換される植物の頻度は、約２０％以下である。いくつかの実施形態において、非Ｔ−ＤＮＡで形質転換される植物の頻度は、約１５％以下、または約１０％以下、または約８％または５％以下である。さらに、本発明の方法は、非常に高い１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象を生じさせる。例えば、いくつかの実施形態において、１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度は、サザンブロット法を使用して測定した場合、約７０％または７５％以上である。いくつかの実施形態において、その頻度は、サザンブロット法を使用して測定した場合、約８０％または８５％以上、そして場合によっては、９０％または９５％である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、非Ｔ−ＤＮＡベクター領域で形質転換される植物の頻度は、本発明のｏｒｉＲｉエレメント等のｒｅｐＡＢＣエレメントを含有しない植物形質転換ベクターで形質転換された同一種類の植物中において見られるＴ−ＤＮＡの頻度よりも約５０％、４０％、２０％、１５％、または１０％低い。他の実施形態において、１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度は、本発明のｏｒｉＲｉエレメント等のｒｅｐＡＢＣエレメントを含有しない植物形質転換ベクターで形質転換された同一種類の植物に関する１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度よりも約５０％、４０％、２０％、１５％、または１０％高い。
【００４６】
したがって、本発明のある実施形態は、非Ｔ−ＤＮＡベクター領域で形質転換される植物の頻度を減少させるための、本明細書中に記載される配列を含む、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉのプラスミドｐ４２ｂ由来のｒｅｐＡＢＣ起点およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のｏｒｉＲｉ等のｒｅｐＡＢＣエレメントの使用を含む方法を提供する。本発明はまた、１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象の頻度を増加させるための、本明細書中に記載される配列を含む、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉのプラスミドｐ４２ｂ由来のｒｅｐＡＢＣ起点およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のｏｒｉＲｉ等のｒｅｐＡＢＣエレメントの使用に関する。いくつかの実施形態において、両方の方法は、より低い頻度の骨格組み込みを有する形質転換事象およびより高い頻度の１または２コピーＴ−ＤＮＡ形質転換事象を達成するために、組み合わせて使用される。
【実施例】
【００４７】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施をより十分に明瞭にするために提供され、そして本発明の範囲を限定するようには決して解釈されるべきでない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の方法および遺伝子に対して種々の修飾、付加、置換、切断等がなされ得ることを理解する。
【００４８】
実施例１
ベクターの作製
クローニング工程は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載される標準プロトコルに従った。ＤｒａＩ消化によってｐＣＧＮ１５８９から切除した５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉフラグメントを使用して、ＰｓｈＡＩおよびＢｓｔＸＩで消化されそしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化された（ｂｌｕｎｔ）ｐＭＯＮ６７４３８のｏｒｉＶフラグメントを置換した。これによって、ｏｒｉＲｉベースベクターｐＭＯＮ８３８５６（図１）が作製された。連続的にＡｃｃＩ（平滑化）／ＢａｍＨＩで消化されたｏｒｉＶコントロールベクターｐＭＯＮ６７４３８由来のｇｕｓおよびＣＰ４フラグメントを、ＰｍｅＩ／ＢａｍＨＩで開裂されたｐＭＯＮ８３８５６中へ列挿入することによって、５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉテストベクターｐＭＯＮ８３８８２（図２）を作製した。ｏｒｉＲｉフラグメントを切断するために、２つのプライマー、５’ＣＡＣＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧ３’（ｏｒｉＲｉ  ５’プロモータ上流；配列番号５）および５’ＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＣＡＡＣ３’（ｒｅｐＣ後のｏｒｉＲｉ３’：配列番号６）を合成し、そして高忠実度ｐｆｕポリメラーゼおよびテンプレートとしてのｐＭＯＮ８３８５６を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を精製し、そしてｐＭＯＮ８３９３０（これは、ＡｆｅＩおよびＸｈｏＩで消化されそしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化された）中へ挿入し、ｏｒｉＶフラグメントを置換した。切断されたｏｒｉＲｉを有する、得られたベクターｐＭＯＮ８３９３４（図３）を、次いでＤＮＡ配列決定によって確認した。切断されたｏｒｉＲｉを有するテストベクターｐＭＯＮ８３９３７（図４）を作製するために、ｐＭＯＮ８３９３４をＫｐｎＩで開裂し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そして続いてＢａｍＨＩ消化を行い；ｏｒｉＶコントロールベクターｐＭＯＮ６７４３８由来のｇｕｓおよびＣｐ４フラグメントを連続的にＡｃｃｌで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋め（ｆｉｌｌｅｄ  ｉｎ）、そして次いでＢａｍＨＩでさらに消化した。２つのフラグメントをＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートし、そしてｐＭＯＮ８３９３７が得られた。
【００４９】
トウモロコシ形質転換ベクターｐＭＯＮ９７３５２（図５）を構築するために、ＳｐｅＩおよびＰｓｐＯＭＩ部位を含有するリンカー配列を、２つのオリゴ  ５’−ＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＡ−３’（配列番号８）をアニーリングすることによって合成し、そしてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化を伴ってｐＭＯＮ８３８５６中へ挿入した。得られた中間体ｏｒｉＲｉベクターをＳｐｅＩおよびＰｓｐＯＭＩで開裂し、そしてＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ消化を伴ってｐＭＯＮ９２７２６（図６）から切除したＣＰ４およびｇｕｓ発現カセットでライゲートした（図５、ｐＭＯＮ９７３５２を参照のこと）。ｏｒｉＶ親ベクターｐＭＯＮ９９２７２６をコントロールベクターとして使用し、トウモロコシｏｒｉＲｉテストベクターｐＭＯＮ９７３５２と比較した。
【００５０】
ｏｒｉＶ  ２ＴコントロールベクターｐＭＯＮ８７４８８（図７）を構築するために、オクトピン右側ボーダーをｐＭＯＮ５１６７６から切除し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてｐＭＯＮ８７４８５（これは、ＳａＩＩ／ＳｐｅＩで開裂され、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋められ、そしてＣＩＰ処理された）中に挿入した。ｏｒｉＲｉ  ２Ｔベクター、ｐＭＯＮ９６００１（図８）およびｐＭＯＮ９６０１０（図９）を作製するために、ｐＭＯＮ８７４８８中のｏｒｉＶをＡｆｅＩおよびＸｈｏＩで除去し、該ベクターをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋め、そしてＰｍｌＩおよびＢｓｔＺ１７ＩでｐＭＯＮ８３９３４を消化することによって得られたｐＭＯＮ８３９３４由来の４．２ｋｂ  ｏｒｉＲｉレプリコンで挿入し（ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｗｉｔｈ）、ｐＭＯＮ９６００１を得た。それをＤｒａＩ消化で消化することによって得られたｐＣＧＮ１５８９由来の５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉレプリコンを挿入し、ｐＭＯＮ９６０１０を得た。
【００５１】
実施例２
ダイズ作物形質転換
アグロバクテリウム媒介性形質転換によるダイズ細胞の形質転換および該細胞のインタクトな稔性植物への再生は、当該分野において公知の種々の方法を使用して行われ得る。ダイズ形質転換（例えば、米国特許第６，３８４，３０１号および第７，００２，０５８号）のための方法を、器官形成プロセスと共に使用した。
【００５２】
本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物（例えば、実質的に図２に示される、プラスミドｐＭＯＮ８３８８２、および実質的に図４に示される、プラスミドｐＭＯＮ８３９３７）を、安全化したアグロバクテリウム株ＡＢＩ中に形質転換する。２つのｏｒｉＶコントロールベクター、ｐＭＯＮ６７４３８およびｐＭＯＮ８３８９８（同一のＧＯＩ、しかし異なる方向で）もまた、アグロバクテリウム細胞中へ導入した。上述の２つのＴ  ＤＮＡ構築物およびそれぞれのコントロールもまた、ダイズを形質転換するために使用した。ＤＮＡ構築物をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム中へ導入した。単一のコロニーを、スペクチノマイシン５０ｍｇ／ｌ（ｏｒｉＲｉベクターについて）または７５ｍｇ／ｌ（ｏｒｉＶベクターについて）およびカナマイシン５０ｍｇ／１を含むＬＢ培地上において回収し、そして２００ｒｐｍで撹拌器中、同一選択を含む２０〜５０ｍｌ液体ＬＢ培地中に接種した。アグロバクテリウム中のプラスミドを、１０ｍｌ培養物からのミニ調製したプラスミドの制限酵素消化によって確認した。液体培養物の残りを２０％の最終濃度までグリセロールと混合し、等分し、そして種培養物として−８０Ｃで保存した。
【００５３】
形質転換のためのアグロバクテリウム接種材料を作製するために、０．２５〜１ｍｌ凍結種培養物を、上述したものと同一の抗生物質選択を含む２５０または５００ｍｌ  ＬＢ培地中に接種し、そしてミッド−ログ増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）まで２００ｒｐｍで撹拌しながら２６℃〜２８℃で一晩増殖させた。培養物を沈降させ、そして分光光度計で測定した場合ＯＤ６６０約０．３の濃度で接種培地（ＩＮＯ培地）中に直接懸濁化した。
【００５４】
ダイズ栽培品種Ａ３５２５を、記載されるような（例えば、米国特許７，００２，０５８号）アグロバクテリウム媒介性形質転換のために使用した。ダイズ種子を、ＢＧＭ培地中において室温で１４時間未満の間発芽させ、そしてダイズ成熟種子由来の分裂組織外植片（ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｅｘｐｌａｎｔｓ）を、米国特許出願２００５０００５３２１に記載される機械によって切除した。バッチ超音波処理のために、ＰＬＡＮＴＣＯＮ蓋中約１００個の外植片を、ＩＮＯ培地中において２０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液と混合し、そして２０秒間Ｗ−１１３Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ中において超音波処理した。バルク超音波処理のために、プラントコン蓋（ｐｌａｎｔｃｏｎ  ｌｉｄ）中約１０００個の外植片を、ＩＮＯ培地中において１００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液と混合し、そして２０秒間超音波処理した。超音波処理後、外植片を、１６／８時間の明／暗周期で２３℃において２〜４日間、同一ＰＬＡＮＴＣＯＮ中において共培養した。次いで、外植片を、７５μＭグリホサートを含むＷＰＭ選択培地の表面上に移した。各ＰＬＡＮＴＣＯＮは約５０個の外植片を含有した。２週間後、外植片を再び、培地中に挿入された初生主根（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｄｉｃｌｅ）を含む７５μＭグリホサート固体ＷＰＭ培地中へ移し、各ＰＬＡＮＴＣＯＮは約２５個の外植片を含有した。接種後６〜１０週に回収した完全に広がった三つ葉を有する芽を、ＩＡＡ０．１ｍｇ／ｌおよび２５μＭグリホサート選択を含むＢＲＭ倍地中に植え付けた。植え付けた植物体を成熟のために温室へ移した。ダイズ形質転換のために使用した種々の培地を、表１において下記に詳述する。
【００５５】
上記の形質転換および再生方法は、ベクター骨格ＤＮＡの出現が大幅に減少される植物を提供する。さらに、植物は、減少されたコピー数の挿入Ｔ−ＤＮＡを有するという付加利益を有する。本発明で作製された植物は、本発明の態様である。
【００５６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【００５７】
植物形質転換および組織培養の分野において公知の方法によって、他の双子葉植物細胞が形質転換されそしてインタクトな植物へ再生され得る。本発明のプラスミドのＴ−ＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウム媒介性方法の使用は、当該分野において周知である。例えば、綿（参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，００４，８６３号；第５，１５９，１３５号；第５，５１８，９０８号、第５，８４６，７９７号、および第６，６２４，３４４号）およびＢｒａｓｓｉｃａ（米国特許第５，７５０，８７１号）。
【００５８】
実施例３
トウモロコシ作物形質転換
２つのベクター、両方ともイネ・アクチンプロモータによって駆動される、同一の植物選択マーカーＣＰ４およびｇｕｓ遺伝子カセットを含有するｐＭＯＮ９７３５２（ｏｒｉＲｉ、アグロバクテリウム中単一コピー）およびｐＭＯＮ９２７２６（ｏｒｉＶ、コントロールとしてアグロバクテリウム中複数コピー）を（図５）、トウモロコシ形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＢＩ中にエレクトロポレーションした。グリセロールストック中のベクターを含有するアグロバクテリウムを、抗生物質（有効成分中の全て）カナマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）、スペクチノマイシン（３１ｍｇ／Ｌ）、ストレプトマイシン（３８ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５ｍｇ／Ｌ）が補足された固体ＬＢ培地上に画線し、そして２日間２８℃でインキュベートした。トウモロコシ未熟胚のアグロバクテリウム接種の２日前に、アグロバクテリウムプレート由来の１コロニーまたは小型ループ（ｓｍａｌｌ  ｌｏｏｐ）のアグロバクテリウムを取り上げ、そして２５０ｍＬフラスコ中の６２ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンおよび４０ｍｇ／Ｌのカナマイシンが補われた２５ｍＬの液体ＬＢ培地中へ接種した。フラスコを、一晩、約１５０〜２００ｒｐｍおよび２７〜２８℃で、撹拌器上に置いた。次いで、アグロバクテリウム培養物を同一の液体培地中に希釈し（１対５）、そして再び撹拌器上に置いた。数時間後、接種の１日前に、アグロバクテリウム細胞を１５分間３５００ｒｐｍで沈降させた。細菌細胞ペレットを、２００μＭのアセトシリンゴンならびに５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む誘導ブロス中に再懸濁し、そして細胞密度をＯＤ６６０で０．２に調節した。次いで、細菌細胞培養物（各２５０ｍＬフラスコ中５０ｍＬ）を再び撹拌器上に置き、そして一晩増殖させた。接種日の朝、細菌細胞を沈降させ、そして２００μＭのアセトシリンゴンが補われた液体１／２  ＭＳ  ＶＩ培地（表２）で洗浄した。もう１回遠心分離した後、細菌細胞ペレットを、２００μＭのアセトシリンゴン（表２）を含む１／２  ＭＳ  ＰＬ培地（表２）中に再懸濁し、そして細胞密度を接種のためにＯＤ６６０で１．０に調節した。
【００５９】
試薬は市販されており、そして多数の供給業者から購入され得る（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏを参照のこと）。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
トウモロコシ株ＬＨ２４４（米国特許第６，２５２，１４８号）をこの研究において使用した。未熟胚を含有する穂を収穫し、そして使用まで４℃での冷凍状態に維持した。未熟胚を表面滅菌された穂から単離し、そしてマイクロ遠心分離チューブ中の調製したアグロバクテリウム細胞懸濁液中に直接滴下し、そして５〜２０分間接種した。微細な先端の滅菌トランスファーピペットを使用してアグロバクテリウム細胞懸濁液を除去した後、未熟胚を共培養培地（表２）上に移した。胚を約２４時間暗いインキュベータ（２３℃）中において培養した。
【００６２】
共培養後、胚を、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび０．１ｍＭグリホサートが補われた改変ＭＳ培地（誘導ＭＳ、表２）上に３０℃で２週間、続いて２７〜２８℃で暗い培養室中さらに１週間移した。次いで、全てのカルス断片を、第１再生培地（２，４−Ｄおよびピクロラムが３．５ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰによって置き換えられた以外は上述と同一の培地（ＭＳ／６ＢＡ、表２））上へ個々に移し、そしてカルベニシリンレベルを２５０ｍｇ／Ｌへ低下させた。培養物を、１６時間明／８時間暗光周期および２７℃で培養室中へ移した。５〜７日後、カルス断片を、第２再生培地（ＭＳＯＤ、表２）上へ移した。さらに２週間、再生された芽を有したカルス断片を、さらなる増殖のためにＰｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）中において同一のホルモンフリーの培地上へ移した。１以上の健康な根を有する再生された植物（Ｒ０）を、増殖チャンバ中のピートポット中の土壌へ移した。７〜１０日において、それらを１２インチポットへ移植し、そして通常のトウモロコシ植物成長についての条件を有する温室へ移動した。植物を、自家授粉するかまたは野生型植物と交配した。
【００６３】
実施例４
骨格ＤＮＡおよびコピー数についての分子分析
Ａ．１Ｔ−ＤＮＡ構築物で形質転換されたダイズ
本発明のＤＮＡプラスミドで形質転換された温室で成長した植物から回収された組織サンプルから、ＤＮＡを抽出した。ＰＣＲに基づく方法を使用し、ベクター骨格の指標としてｒｅｐＡフォワードプライマー５’−ＡＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧ−３’（Ｘｄ４８７ｂ；配列番号１１）およびｒｅｐＡリバースプライマー５’−ＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣ−３’（Ｘｄ４８８；配列番号１２）を使用してｏｒｉＲｉ配列の存在についてＤＮＡを評価した。このＤＮＡは、ＬＢに隣接し、そして再生された植物から抽出されたＤＮＡ中におけるその存在は、ＬＢを超えるベクター配列の導入が生じたことを示している。ＤＮＡは、任意の多数の方法、例えば、ＣＴＡＢ手順（Ｒｏｇｅｒｓら，１９８５）またはＤＮＡｅａｓｙ（商標）９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃６９１８１，Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）によって、製造業者の指示書に従って、植物組織から単離され得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法と記載されており、そして製造業者によって提供される指示書において完全に理解される。ＤＮＡプライマー分子（配列番号１１および１２）は、植物抽出物由来のｏｒｉＲｉ  ＤＮＡを同定するために記載される方法において使用した。使用した条件および装置は、同一の結果を提供するように、当業者によって改変され得る。
【００６４】
成熟種子から切除されたダイズ分裂組織軸（ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ａｘｉｓ）を、コントロールＤＮＡプラスミド（ｐＭＯＮ６７４３８またはｐＭＯＮ８３８９８）および本発明のプラスミド（ｐＭＯＮ８３８８２またはｐＭＯＮ８３９３７）で形質転換し、次いでインタクトな植物へ再生した。インタクトな植物を、目的の遺伝子（ＣＰ４）ならびに非Ｔ−ＤＮＡ  ｏｒｉＲｉおよびｏｒｉＶ配列の存在について分析した。表３は、この分析の結果を示す。
【００６５】
試験した３９個の植物のうち、たった３個がベータ骨格配列、７．７％の頻度を有した。比較において、コントロールプラスミド（ｏｒｉＶプラスミド）は、（どのサンプルが考慮されたかに依存して）２１％〜２５％のベクター骨格頻度を示した。この差異は、非常に劇的であり、そして完全に予想外であった。
【００６６】
商業的に実行可能なトランスジェニック植物の別の重要な成分は、低い挿入物複雑性の出現である。これは、しばしば、「低コピー数」とも呼ばれる。挿入物のコピー数が非常に高い場合、子孫を選択しそしてトランスジェニック形質を首尾良く繁殖させることは、困難である。理想的には、トランスジーンの単一コピーのみが、１トランスジェニック事象において存在する。
【００６７】
コピー数は、分子生物学の分野において公知のいくつかの方法によって測定され得る。サザンブロット分析は、最も一般的に使用される方法である。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）技術を使用する方法（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）もまた、トランスジェニック植物中におけるＴ−ＤＮＡ挿入物のコピー数を測定するために使用される。
【００６８】
ダイズ植物細胞を、上述のように、コントロールＤＮＡプラスミド（ｐＭＯＮ６７４３８）および本発明のプラスミド（ｐＭＯＮ８３８８２）で形質転換し、次いでインタクトな植物へ再生した。得られたトランスジェニック植物を、２つの異なる方法を使用してコピー数について分析した：１）「Ｉｎｖａｄｅｒ  ＣＰ４」法および２）サザンブロット法。結果を表３に示す。
【００６９】
表３．ダイズ形質転換における、形質転換頻度、コピー数および挿入物に対するｐＲｉ  ｏｒｉベクター骨格効果。ａ３つの並列実験からの統合データ。ｂ並列比較からの植物数。ｃ作製されたｐＭＯＮ６７４３８植物の統合植物数。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
「Ｉｎｖａｄｅｒ  ＣＰ４」法を使用して、他の実験の統合サンプルを使用して時間の（ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｍｅ）２５％だけあるいは並列実験を使用して時間の３７％だけ単一コピー形質転換事象を生じたコントロールプラスミドｐＭＯＮ６７４３８と比較した場合、本発明のプラスミド、ｐＭＯＮ８３８８２は、時間の４１％単一コピー形質転換事象を生じた。１および２コピー事象を一緒に考慮すると、コントロールプラスミドを使用しての統合サンプルからの６３％および並列実験からの６０％と比較して、ｐＭＯＮ８３８８２は、時間の７９．５％事象を生じた。サザンブロット法比較を使用すると、ｐＭＯＮ８３８８２は、時間の５６．４％１コピー事象を生じ、そして時間の３３．３％２コピー事象を生じ、合計で約９０％の組み合わせられた１および２コピー事象を生じた。また、これらの結果は、劇的でありかつ予想外であった。
【００７２】
Ｂ．ダイズ２Ｔ−ＤＮＡ形質転換体におけるトランスジーンコピー数の分子分析
２Ｔ−ＤＮＡ形質転換に対するｏｒｉＲｉ効果を分析するために、４．２ｋｂ  ｏｒｉＲｉ  ２ＴベクターｐＭＯＮ９６００１を、６回について、ｏｒｉＶ  ２ＴベクターｐＭＯＮ８７４８８と並列比較した。５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉ  ２ＴベクターｐＭＯＮ９６０１０もまた、これらの予備実験における最後２回の比較実験に含めた（表４、グループＡ）。トータルＤＮＡを、温室から収穫した成熟種子の種子セグメントから抽出し、そしてＣＰ４プローブおよびＮＯＳプローブを使用するＩｎｖａｄｅｒ技術によってトランスジーンコピー数を測定するために使用した。ＣＰ４  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）検出アッセイは、標的化部位として以下の配列を使用した：５’ＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＣＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧ３’（配列番号１３）およびＧＴＡＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＧ（配列番号１４）（プローブ配列として）。ＮＯＳ  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）検出アッセイは、標的化部位として以下のｎｏｓ  ３’配列を使用した：ＴＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＣＡＴＧＡＣＴ（配列番号１５）およびＧＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１６）（ＮＯＳ  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）プローブ配列として）。
【００７３】
１および／または２コピー形質転換体は、コントロールｏｒｉＶベクターにおける３５％から両方のｏｒｉＲｉベクターにおける４０％超へ増加された。Ｒ０植物中におけるマーカーフリー植物の頻度（マーカーフリー事象／総Ｒ０植物）は、ｏｒｉＶコントロールベクターにおける４．７６％から、２つのｏｒｉＲｉベクターにおける、それぞれ、１６．４％および１８．４％へ増加された。全体で、ｏｒｉＶ  ２Ｔベクターと比較して、２つのｏｒｉＲｉ  ２Ｔベクターベクターにおいて、２倍を超えるマーカーフリー形質転換頻度（マーカーフリー事象／初期外植片数）。
【００７４】
より多い初期外植片数での追加の並行実験をさらに使用し、ｏｒｉＶコントロール２Ｔベクターと４．２ｋｂ  ｏｒｉＲｉ  ２Ｔベクターとを比較した（表４、グループＢ）。ｏｒｉＲｉ  ２Ｔベクターは、結果を再現した：１＋２コピー事象頻度およびマーカーフリー頻度（ＭＦ％）は両方とも増加され、マーカーフリー形質転換頻度は、ｏｒｉＲｉベクターにおいて２倍を超える。結果は、ｏｒｉＲｉ  ２Ｔ  ベクターは、低コピー事象を増加させそしてマーカーフリー形質転換頻度を改善することによって、ｏｒｉＶ  ２Ｔベクターよりも、マーカーフリー植物を産生するに顕著に効率的であることを示した。
【００７５】
表４．ダイズの２Ｔ−ＤＮＡベクター形質転換に対する複製起点のタイプの効果。注：１）ＴＦ：形質転換頻度＝Ｒ０植物／総外植片；２）１＋２コピーＣｏ−Ｔ：１および／または２コピーｇｕｓならびにＣＰ４マーカー２Ｔ−ＤＮＡ共形質転換体。１〜２コピー事象のみを、種子中におけるマーカー分離を分析するためにさらに進めた；３）ＭＦ事象：種子分離によって分析された１＋２コピー共形質転換体からのｇｕｓ遺伝子陽性のマーカーフリー事象；４）ＭＦ％植物：ｇｕｓ陽性のマーカーフリー植物／Ｒ０植物数；５）マーカーフリー形質転換頻度（ＭＦ  ＴＦ）＝非連結事象数（ｕｎｌｉｎｋｅｄ  ｅｖｅｎｔ  ＃）／初期外植片数。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
Ｃ．１Ｔ−ＤＮＡ構築物で形質転換されたトウモロコシ中におけるベクター骨格ＤＮＡおよびトランスジーンコピー数の分子分析
トウモロコシ形質転換に対するｏｒｉＲｉ複製起点効果を調べるために、両方ともイネ・アクチンプロモータによって駆動される、ｇｕｓおよびＣＰ４遺伝子を含有する５．６ｋｂ  ｏｒｉＲｉベクターｐＭＯＮ９７３５２を、ｇｕｓおよびＣＰ４遺伝子を含有する同一Ｔ−ＤＮＡ構造を有するｏｒｉＶベクターｐＭＯＮ９２７２６と比較した。Ｃｕｌｔｉｖａｒ  ＬＨ２４４由来のトウモロコシ未熟胚に、並行して、ｏｒｉＲｉまたはｏｒｉＶベクターのいずれかを含有するアグロバクテリウムを接種した。各処理は、約１１０個の胚からなった。総計で１６個の並列比較実験を開始した。ｏｒｉＲｉベクターは、ｏｒｉＶコントロールベクターよりも顕著に低い形質転換頻度を示し（図１０）、ｏｒｉＲｉおよびｏｒｉＶベクターについてそれぞれ平均ＴＦ９．５％および１６．３％であった。しかし、ｏｒｉＲｉおよびｏｒｉＶベクターでの全体的な形質転換効率は、同一であった。
【００７８】
トランスジェニックトウモロコシ植物中における骨格配列の存在を、ｏｒｉＲｉまたはｏｒｉＶ配列、ＬＢ切れ目部位（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｓｉｔｅ）付近の短いリードスルー（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）について３’フランキングＬＢ配列、およびインタクトな骨格リードスルー（ｉｎｔａｃｔ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）についてのＲＢ切れ目部位の前に５’フランキングＲＢ配列について、Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）によって測定した。ｏｒｉＶプライマー５’ＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＴＴＴＡＣＧＣＧＡＧ３’（フォワード；配列番号１７）および５’ＣＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＣＴＴＡＴＣ３’（リバース；配列番号１８）；５’末端で蛍光色素６−ＦＡＭで標識されたプローブＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣ（配列番号１９）を有する。ｏｒｉＲｉプライマーは以下である：５’ＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧ３’（フォワード；配列番号２０）および５’ＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＴＴＴ３’（リバース；配列番号２１）；ＬＢ切れ目部位の６２１ｂｐ下流のｏｒｉＲｉ配列を検出するためのプローブ６−ＦＡＭ−ＴＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＧＴＣＣ（配列番号２２）を有する。ＲＢ５’フランキングプライマーは以下である：５’ＧＣＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴ３’（フォワード；配列番号２３）および５’ＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧＡＡＡ３’（リバース；配列番号２４）；ＲＢ切れ目部位の１８６ｂｐ前の５’ＲＢフランキングを検出するためのプローブ６ＦＡＭ−ＴＧＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号２５）を有する。ＬＢ切れ目部位の３５ｂｐ下流のＬＢを検出するためのプライマーは以下であった：５’ＧＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＴ３’（フォワード；配列番号２６）および５’ＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＡＧＴ３’（リバース；配列番号２７）；５’末端で蛍光色素６−ＦＡＭで標識されたプローブＣＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣＧＣＡＧ（配列番号２８）を有する。約１０ｎｇのＤＮＡを、製造業者の指示書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従ってＥｎｄｐｏｉｎｔ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応について使用した。
【００７９】
図１１に示されるように、ｏｒｉＲｉベクターから誘導されたトランスジェニック植物の約９５％が、骨格フリーであり、これは、約７８％骨格フリー頻度を示すｏｒｉＶベクターコントロールよりも顕著に良好である。ベクター骨格は、切れ目部位の後のＬＢで始まりそしてＲＢ切れ目部位の前で終わるので、ｏｒｉＲｉおよびｏｒｉＶベクター誘導植物の両方における３つの異なる骨格プローブ（ＬＢダウンストリーム、ｏｒｉＲｉ／ｏｒｉＶ、およびＲＢアップストリーム）の使用は、導入された大抵のベクター骨格が全ベクター骨格配列を含有したことを明らかにした。
【００８０】
ＣＰ４トランスジーンコピー数を、ＣＰ４配列を使用して、製造業者の指示書（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に従ってＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイによって測定した。ｇｕｓトランスジーンコピー数を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用してｇｕｓカセット転写ターミネータｐｉｎＩＩ（図５および６においてＰｉｓ４として示される）を測定することによって、測定した。ｐｉｎＩＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーは以下であった：５’ＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴ３’（フォワード；配列番号２９）および５’ＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＴＴ３’（リバース；配列番号３０）；５’末端に蛍光色素６−ＦＡＭおよび３’末端にＭＧＢＮＦＱで標識されたプローブＴＧＡＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣ−（配列番号３１）を有する。
【００８１】
図１２は、トランスジーンコピー数アッセイ結果を示す。ｏｒｉＲｉベクターは、コントロールｏｒｉＶベクターと比較して、単一コピー植物頻度を顕著に増加させ、一方、ｏｒｉＲｉベクターにおける２以上コピー事象の頻度は減少された。２つの異なるプローブを用いてのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよびＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは両方とも、同様の結果を示した。単一コピー骨格フリー植物は研究および開発の両方について最も価値があるので、トウモロコシにおいて単一コピー頻度を増加させかつバッキング（ｂａｃｋｉｎｇ）含有事象を減少させるｏｒｉＲｉベクターは、トランスジェニック事象作製における品質について顕著な改善を示す。
【００８２】
実施例５
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ由来のｒｅｐＡＢＣ複製起点を含有する植物形質転換ベクターの構築
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＦＮ４２株由来のｒｅｐＡＢＣ複製起点をクローン化するために、ＵＳＤＡ株をＵＳＤＡ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。４．３ｋｂ  ｒｅｐＡＢＣフラグメントを、プライマー５’ＣＣＡＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＡＧＡＣ３’（Ｘｄ７４５；配列番号９）および５’ＧＣＣＴＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＧＴ３’（Ｘｄ７４６；配列番号１０）を用いるＰＣＲによって、株ＣＦＮ４２において見られるＲ．ｅｔｌｉプラスミドｐ４２ｂから増幅し、そしてＴＯＰＯ平滑クローニング（ｂｌｕｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）へ結合し、これによってｐＭＯＮ９６９４１が得られ、そして配列決定によって確認した。ｒｅｐＡＢＣ  フラグメントをＰｍＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化し（プライマー中において下線が引かれた配列によって示される）、そしてＳｍａＩおよびＡｖｒＩＩで開裂したｐＭＯＮ９６９４８へライゲートした。結合物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＡＢ２（カナマイシン感受性株）コンピテント細胞へ直接導入し、そしてカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢプレート上に置いた。ｋａｎ耐性コロニーを、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む液体ＬＢ培地中へ接種し、そしてプラスミドＤＮＡをミニプレップによって調製した。構築物を制限消化によって確認した。ベクターｐＭＯＮ９６９５１は大腸菌複製起点を含有しないので、それは大腸菌中において維持され得ない。
【００８３】
ｐＭＯＮ９６９５１（図１３）を、上述のように、植物種を形質転換するために使用する。トランスジェニック事象を、実施例４に記載の方法によって、減少されたベクター骨格一体化および高頻度の低コピー形質転換事象について分析する。
【００８４】
本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書中に開示される本発明の実施を考慮することにより当業者に明らかである。本明細書および実施例は例示的のみと考えられることが意図され、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。
【００８５】
参考文献
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欧州特許出願番号２７５，９５７
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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