(57)【要約】      （修正有）【課題】熱安定性が向上したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む、熱安定性が向上した変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ；上記変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応を利用して、ケト酸からケト酸の脱炭酸生成物を生成することを含む、ケト酸の脱炭酸生成物の製造方法；ならびにアミノ基転移反応を上記脱炭酸反応と共役させることによりケト酸からアミノ酸を生成することを含む、アミノ酸の製造方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む、熱安定性が向上した変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列が、シュードモナス属またはマリノモナス属に属する微生物に由来する野生型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である、請求項１記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
【請求項３】
１以上のアミノ酸残基の変異が、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である、請求項１または２記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ：
（ｉ）３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；
（ｖ）２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列において、３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む、請求項１記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
【請求項５】
１以上のアミノ酸残基の変異が、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である、請求項４記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ：
（ｉ）３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；
（ｖ）２４３位のアラニン残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
【請求項６】
さらにｐＨ安定性および／または比活性が向上している、請求項１〜５のいずれか一項記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を用いて変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを生成することを含む、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応を利用して、ケト酸からケト酸の脱炭酸生成物を生成することを含む、ケト酸の脱炭酸生成物の製造方法。
【請求項１２】
ケト酸がオキサロ酢酸であり、ケト酸の脱炭酸生成物がピルビン酸である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アミノ基供与体の存在下でケト酸からアミノ酸を生成する能力を有するアミノ基転移酵素により触媒されるアミノ基転移反応を、請求項１〜６のいずれか一項記載の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応と共役させることにより、ケト酸からアミノ酸を生成することを含む、アミノ酸の製造方法。
【請求項１４】
アミノ基転移反応が下記１）の反応であり、脱炭酸反応が下記２）の反応である、請求項１３記載のアミノ酸の製造方法。
１）ケト酸＋アスパラギン酸→アミノ酸＋オキサロ酢酸
２）オキサロ酢酸→ピルビン酸＋ＣＯ２
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３）は、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）を脱炭酸してピルビン酸（ＰＡ）を生成する下記反応を触媒する酵素である。
【０００３】
【化１】
2014180224.tif 000002
【０００４】
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは細胞内酵素であるため、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを産生する菌体の培養ブロスを用いて酵素反応を行う際、基質の菌体細胞膜透過性を向上させるような処理が必要になる。このような処理としては、例えば、熱処理、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤処理（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）が挙げられる。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの熱安定性を向上させることができれば、培養ブロスの熱処理が容易になるため、溶剤、界面活性剤および溶菌酵素で処理することなく、基質の菌体細胞膜透過性を向上させることができると考えられる。
【０００５】
ところで、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来するものなどが知られている（例、非特許文献１〜３）。また、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する安定なポリペプチドについても報告がある（例、非特許文献４、５）。しかしながら、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの熱安定性を向上させるという思想、および熱安定性が実際に向上したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼのいずれについても報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｂｒｏｕ，Ｎ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３６５，１７−２４
【非特許文献２】Ｈｏｒｔｏｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９６４）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ８９，３８１−３８３
【非特許文献３】Ｎａｒａｙａｎａｎ，  Ｂ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１６７−１８２
【非特許文献４】Ｗｅｓｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ５，１０７５−１０８０．
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  ２，７５１−７５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、熱安定性が向上したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに特定の変異を導入することにより、高い熱安定性を有する変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを提供することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む、熱安定性が向上した変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
〔２〕配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列が、シュードモナス属またはマリノモナス属に属する微生物に由来する野生型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である、〔１〕の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
〔３〕１以上のアミノ酸残基の変異が、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である、〔１〕または〔２〕の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ：
（ｉ）３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；（ｖ）２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
〔４〕配列番号２のアミノ酸配列において、３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む、〔１〕の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
〔５〕１以上のアミノ酸残基の変異が、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である、〔４〕の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ：
（ｉ）３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；
（ｖ）２４３位のアラニン残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
〔６〕さらにｐＨ安定性および／または比活性が向上している、〔１〕〜〔５〕のいずれかの変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかの変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔８〕〔７〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔９〕〔８〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１０〕〔９〕の形質転換体を用いて変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを生成することを含む、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの製造方法。
〔１１〕〔１〕〜〔６〕のいずれかの変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応を利用して、ケト酸からケト酸の脱炭酸生成物を生成することを含む、ケト酸の脱炭酸生成物の製造方法。
〔１２〕ケト酸がオキサロ酢酸であり、ケト酸の脱炭酸生成物がピルビン酸である、〔１１〕の方法。
〔１３〕アミノ基供与体の存在下でケト酸からアミノ酸を生成する能力を有するアミノ基転移酵素により触媒されるアミノ基転移反応を、〔１〕〜〔６〕のいずれかの変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応と共役させることにより、ケト酸からアミノ酸を生成することを含む、アミノ酸の製造方法。
〔１４〕アミノ基転移反応が下記１）の反応であり、脱炭酸反応が下記２）の反応である、〔１３〕のアミノ酸の製造方法。
１）ケト酸＋アスパラギン酸→アミノ酸＋オキサロ酢酸
２）オキサロ酢酸→ピルビン酸＋ＣＯ２
【発明の効果】
【００１０】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、熱安定性に優れる。したがって、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを産生する菌体の培養ブロスの熱処理が容易になり、基質の菌体細胞膜透過性を向上させることができる。また、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの使用により、脱炭酸反応を、従来よりも高温条件下で長時間にわたり行うことができる。
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼはまた、熱安定性に加えて、ｐＨ安定性および／または比活性に優れる。したがって、ｐＨ安定性に優れる本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの使用により、脱炭酸反応を、従来よりも低いまたは高いｐＨ条件下で長時間にわたり行うことができる。また、比活性に優れる本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの使用により、脱炭酸反応を、高効率で行うことができる。
さらに、上述した特性を有する本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応を、既知のアミノ基転移反応と共役させることにより、上記のような条件下でアミノ基転移反応を促進することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、熱安定性が向上した変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを提供する。本発明では、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼとは、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）を脱炭酸してピルビン酸（ＰＡ）を生成する能力を有する酵素をいい、このような能力を有する限り別称の酵素も含まれる。本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基（以下、必要に応じて「相当アミノ酸残基」または「Ｘ位の相当アミノ酸残基」と省略する）からなる群より選ばれる１以上（例えば１〜５、好ましくは１〜３）のアミノ酸残基の変異を含む。アミノ酸残基の変異としては、例えば、置換、欠失、付加および挿入が挙げられるが、置換が好ましい。
【００１２】
変異されるアミノ酸残基は、天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上記アミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
【００１３】
変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼについて熱安定性の向上とは、緩衝液等の水溶液中において所定の時間（例、１時間）インキュベートされた後に測定された酵素活性がインキュベート前の酵素活性に対して半減する温度（Ｔｍ値）について、変異型酵素のＴｍ値が野生型酵素のＴｍ値よりも高いことをいう。変異型酵素のＴｍ値が野生型酵素のＴｍ値よりも５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１２℃または１５℃以上高いことが好ましい。
【００１４】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼが由来するオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとしては、例えば、任意の生物に由来する酵素を用いることができ、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはマリノモナス（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物に由来する酵素が挙げられる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）、およびシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が挙げられる。マリノモナス（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、例えば、マリノモナス・メヂテラネア（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、マリノモナス・ポシドニカ（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐｏｓｉｄｏｎｉｃａ）が挙げられる。
【００１５】
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列について、当業者は適宜決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１６】
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、シュードモナス属またはマリノモナス属に属する微生物に由来する野生型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＮ６７０１２．１のアミノ酸配列（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来の野生型アミノ酸配列）である。配列番号１のヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子発現効率が最適化されたものである。配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとしては、例えば、以下の表１に挙げられる微生物由来のものが挙げられる。
【００１７】
【表１】
2014180224.tif 000003
【００１８】
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列の相当アミノ酸残基について、当業者は整列（ａｌｉｇｎ）したアミノ酸配列を比較することにより適宜決定することができる。例えば、表１に示される微生物由来のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼにおいて、相当アミノ酸残基は、以下の表２に示すとおりである。相当アミノ酸残基のうち、３位、３４位、６４位、および２４３位の相当アミノ酸残基の変異が好ましい。なお、表２において相当アミノ酸残基の位置が１位である変異タンパク質を調製する場合、１または数個のアミノ酸残基をＮ末端に付加したアミノ酸配列からなる変異タンパク質として使用することが好ましい。この場合、１または数個は後述するとおりであるが、発現効率の観点から変異タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基はメチオニンが好ましく、Ｎ末端に付加される１または数個のアミノ酸残基は、例えば、配列番号２のＮ末端に見出されるメチオニンおよびイソロイシンからなるジペプチド単位であってもよい。また、３４位、６４位、および２４３位の相当アミノ酸残基を含む近傍領域の保存性が非常に高いこと、およびこのような保存性が高い領域における変異により同様の性質を獲得し得る蓋然性が極めて高いことから、３４位、６４位、および２４３位の相当アミノ酸残基の変異がより好ましい。
【００１９】
【表２】
2014180224.tif 000004
【００２０】
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、熱安定性を向上させる変異は、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である：
（ｉ）３位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位の相当アミノ酸残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位の相当アミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；  
（ｖ）２４３位の相当アミノ酸残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
【００２１】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、さらにｐＨ安定性および／または比活性が向上していてもよい。
【００２２】
単独の変異または他の変異との組合せにおいてｐＨ安定性を向上させる変異としては、例えば、以下が挙げられる。
１）酸性条件下での安定性の向上に好適である置換の例：
・３４位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；および
・２４３位の相当アミノ酸残基のスレオニンまたはセリン残基への置換。
酸性条件は、ｐＨ約６．０以下の条件である。酸性条件のｐＨは、好ましくは約４．０〜約６．０、より好ましくは約４．５〜約５．５、最も好ましくは約５．０である。
【００２３】
２）中性条件下での安定性の改善に好適である置換の例：
・３位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・６４位の相当アミノ酸残基のバリン残基への置換；
・１５４位の相当アミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位の相当アミノ酸残基のスレオニン残基への置換。
中性条件は、ｐＨが約６．０よりも大きく約８．０未満の条件である。中性条件のｐＨは、好ましくは約６．５〜約７．５、より好ましくは約７．０〜約７．５、最も好ましくは約７．５である。
【００２４】
３）アルカリ性条件（例、ｐＨ９．５）下での活性の改善に好適である置換の例：
・３位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・１５４位の相当アミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位の相当アミノ酸残基のスレオニン残基への置換。
アルカリ性条件は、ｐＨ約８．０以上の条件である。アルカリ性条件のｐＨは、好ましくは約８．０〜約１０．０、より好ましくは約９．０〜約９．５、最も好ましくは約９．５である。
【００２５】
単独の変異または他の変異との組合せにおいて比活性を向上させる変異としては、例えば、以下が挙げられる：
・３位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位の相当アミノ酸残基のイソロイシン残基への置換；
・６４位の相当アミノ酸残基のバリン残基への置換；
・１５４位の相当アミノ酸残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位の相当アミノ酸残基のスレオニンまたはセリン残基への置換。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列において、３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含んでいてもよい。
【００２７】
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列における変異は、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選ばれる置換である：
（ｉ）３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉ）３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
（ｉｉｉ）６４位のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換；
（ｉｖ）１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；
（ｖ）２４３位のアラニン残基のスレオニンまたはセリン残基への置換；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）の組み合わせ。
【００２８】
配列番号２のアミノ酸配列において、３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の変異を含む本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、さらにｐＨ安定性および／または比活性が向上していてもよい。
【００２９】
配列番号２のアミノ酸配列に関して、単独の変異または他の変異との組合せにおいてｐＨ安定性を向上させる変異としては、例えば、以下が挙げられる。
１）酸性条件（上記と同様）下での安定性の向上に好適である置換の例：
・３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；および
・２４３位のアラニン残基のスレオニンまたはセリン残基への置換。
【００３０】
２）中性条件（上記と同様）下での安定性の改善に好適である置換の例：
・３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・６４位のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換；
・１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位のアラニン残基のスレオニン残基への置換。
【００３１】
３）アルカリ性条件（上記と同様）下での活性の改善に好適である置換の例：
・３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位のアラニン残基のスレオニン残基への置換。
【００３２】
配列番号２のアミノ酸配列に関して、単独の変異または他の変異との組合せにおいて比活性を向上させる変異としては、例えば、以下が挙げられる：
・３位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・３４位のメチオニン残基のイソロイシン残基への置換；
・６４位のフェニルアラニン残基のバリン残基への置換；
・１５４位のセリン残基のアスパラギン残基への置換；および
・２４３位のアラニン残基のスレオニンまたはセリン残基への置換。
【００３３】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼはまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００３４】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、上述した特性が保持される限り、上記変異を有するオキサロ酢酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列に対して、上記以外の位置に１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような変異型酵素を適宜作製することができる。追加変異を有する本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼのＴｍ値は、野生型酵素のＴｍ値よりも、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１２℃または１５℃以上高いことが好ましい。
【００３５】
アミノ酸配列において追加変異を導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして追加変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。
【００３６】
アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００３７】
したがって、上述した本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼはまた、以下（Ｉ）または（ＩＩ）のように特定することもできる：
（Ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列を含む、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ；または
（ＩＩ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列における配列番号２のアミノ酸配列における３位、３４位、６４位、１５４位および２４３位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、熱安定性が向上している、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列、および変異等の詳細は、上述したとおりである。また、ｐＨ安定性および／または比活性が向上していてもよい。
【００３８】
好ましい実施形態では、上記（Ｉ）および（ＩＩ）の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、下記（Ｉ’）および（ＩＩ’）の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼであってもよい：
（Ｉ’）配列番号２のアミノ酸配列において、３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列を含む、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ；または
（ＩＩ’）配列番号２のアミノ酸配列における３位のメチオニン残基、３４位のメチオニン残基、６４位のフェニルアラニン残基、１５４位のセリン残基および２４３位のアラニン残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、熱安定性が向上している、変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ。
変異等の詳細は、上述したとおりである。また、ｐＨ安定性および／または比活性が向上していてもよい。
【００３９】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、上述した変異および追加変異の双方を有することにより、変異前の野生型酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。同一性の決定方法は、上述したとおりである。
【００４０】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、例えば、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを発現する本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
【００４１】
本発明の発現ベクターは、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。本発明の発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。本発明の発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはまた、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、本発明の発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼとそれに付加された他のペプチド成分との切断をタンパク質発現後に可能にするため、本発明の発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを発現させるための宿主としては、任意の微生物を用いることができる。このような微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。形質転換体はまた、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼおよびアミノ基転移酵素の双方を産生する微生物であってもよい。このような形質転換体としては、例えば、ａ）本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびアミノ基転移酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された形質転換体、ｂ）本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子およびアミノ基転移酵素をコードする遺伝子の双方を含む発現ベクターが導入された形質転換体、ならびにｃ）本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターがアミノ基転移酵素を産生する微生物に導入された形質転換体が挙げられる。
【００４３】
本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
【００４４】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００４６】
また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
【００４８】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
【００４９】
得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを得ることができる。
【００５０】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
【００５１】
本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを回収するには、以下の方法などがある。本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを得ることができる。回収において、熱処理することを含んでいてもよい。また、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤処理（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）等によりさらに処理することを含んでいてもよい。
【００５２】
本発明はまた、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応を利用して、ケト酸からケト酸の脱炭酸生成物を生成することを含む、ケト酸の脱炭酸生成物の製造方法を提供する。
【００５３】
上記脱炭酸反応において材料として用いられるケト酸は、一般式：Ｒ−ＣＯＣＯＯＨにより表される。式中、Ｒは、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、１〜６の整数、好ましくは１、２、３または４である）を表す。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応により、Ｒ中のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がケト酸から脱離して炭酸分子に変換される。Ｒ中の「−（ＣＨ２）ｎ−」部分を構成する炭素原子に結合している１〜３個（好ましくは１または２個）の水素原子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されていてもよい（ＣＸ〜ＣＹは、基を構成する炭素原子数が１〜６であることを示す。以下同様。）。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応の基質（ケト酸）および生成物（ケト酸の脱炭酸生成物）の組合せとしては、例えば、オキサロ酢酸およびピルビン酸の組合せ、３−メチルオキサロ酢酸および３−メチルピルビン酸の組合せ（例、Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｂ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１６７−１８２を参照）が報告されている。
【００５４】
上記脱炭酸反応は、本発明の形質転換体から抽出された本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（抽出酵素）、または本発明の形質転換体を含む反応液（例、培養液）を用いることにより達成できる。抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記形質転換体から調製されたデカルボキシラーゼ含有画分、上記本発明の形質転換体の破砕物および溶解物）が挙げられる。本発明の形質転換体が用いられる場合、培養ブロスは、熱処理（例、４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）されてもよい。培養ブロスはまた、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）等により処理されてもよい。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合の温度は４℃〜６０℃で、好ましくは２０℃から３７℃に設定され得る。また、ｐＨは３〜１２に、好ましくはｐＨ７〜９に設定され得る。時間は５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度に設定され得る。ブロス保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくとも良い。
【００５５】
本発明の方法により得られた脱炭酸生成物含有反応液を、カラム処理、晶析処理、抽出処理等の既知の精製方法を駆使することによって、脱炭酸生成物を精製することができる。脱炭酸生成物は、塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩）の形態であってもなくてもよい。脱炭酸生成物はまた、水和物であってもよい。
【００５６】
本発明はまた、アミノ基供与体の存在下でケト酸からアミノ酸を生成する能力を有するアミノ基転移酵素により触媒されるアミノ基転移反応を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応と共役させることにより、ケト酸からアミノ酸を生成することを含む、アミノ酸の製造方法を提供する。
【００５７】
具体的には、上記アミノ基転移反応、および脱炭酸反応は、それぞれ、以下のとおりである。
アミノ基転移反応）ケト酸＋アミノ基供与体（アミノ基供与用カルボン酸化合物）→アミノ酸＋カルボン酸化合物
脱炭酸反応）カルボン酸化合物→脱炭酸生成物＋ＣＯ２
【００５８】
上記アミノ基転移反応において、アミノ基転移酵素は、アミノ基供与体（アミノ基供与用カルボン酸化合物）のアミノ基をケト酸に転移することにより、ケト酸からアミノ酸を生成する。アミノ基供与体（アミノ基供与用カルボン酸化合物）とは、アミノ基転移反応において、転移されるアミノ基、および残存するカルボキシル基の双方を有する化合物をいう。上記アミノ基転移反応により、アミノ基供与体のアミノ基がカルボニル基に変換され、ケト酸からアミノ酸の生成における副産物としてカルボン酸化合物（一般式：Ｒ−ＣＯＣＯＯＨにより表される上述したケト酸を意味する）が生成する。アミノ基転移酵素としては、例えば、アミノトランスフェラーゼ（例、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、システインアミノトランスフェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、ロイシンアミノトランスフェラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、ヒスチジンアミノトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、メチオニンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、およびトランスアミナーゼが挙げられる。上記アミノ基転移反応では、ケト酸としてはα−ケト酸が好ましい。したがって、アミノ酸としては、アミノ基供与体のアミノ基をα−ケト酸に転移することにより生成されるα−アミノ酸が好ましい。アミノ基供与体としては、α−アミノ酸（例、ＬまたはＤ−アスパラギン酸、３−メチルアスパラギン酸）が挙げられる。カルボン酸化合物は、アミノ基供与体の脱アミノ化により生成するケト酸であり、α−アミノ酸（例、ＬまたはＤ−アスパラギン酸）の脱アミノ化により生成するα−ケト酸（例、オキサロ酢酸）が好ましい。
【００５９】
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒されるケト酸の脱炭酸反応は、アミノトランスフェラーゼにより触媒されるアミノ基転移反応（換言すれば、アミノ酸生成反応）と共役させることで、より多量のアミノ酸を得ることができるため、アミノ酸合成に有用である。アミノ基転移酵素により触媒されるアミノ基転移反応を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼにより触媒される脱炭酸反応と共役させることで、反応の平衡を目的物の方へシフトさせ、アミノ酸やアミンを高収率で合成した例が報告されている。例えば、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼにより触媒される反応を共役させることによるＤ−Ｐｈｅの合成、ならびにω−トランスアミナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼにより触媒される反応を共役させることによるキラルアミンの合成を、高い変換率で達成できることが報告されている（Ｈoｈｎｅ，Ｍ．，Ｋuｈｌ，Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．（２００８）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｒａｌ  Ａｍｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．９，３６３−３６５）。また、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびピルビン酸デカルボキシラーゼにより触媒される反応を共役させることで、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンやＬ−６−ヒドロキシノルロイシンを合成する方法が報告されている（Ｓｅｏ，Ｙ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１０４９−１０５２、およびＳｅｏ，Ｙ−Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）  Ｂｉｏｃａｔ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｎｓ．３０，１７１−１７６）。
【００６０】
好ましい実施形態では、アミノ基転移酵素の作用によりアミノ酸（例、アスパラギン酸）から生成したケト酸（例、オキサロ酢酸）を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに接触させて、生成したケト酸の分解を促進することにより、目的のアミノ酸を生成する反応の平衡を、より多量のアミノ酸を生成するようにシフトさせることができる。したがって、共役されるべきアミノ基転移反応および脱炭酸反応は、それぞれ、下記のとおりであってもよい。
アミノ基転移反応）ケト酸（例、α−ケト酸）＋アスパラギン酸（例、Ｌ体またはＤ体）→アミノ酸（α−アミノ酸）＋オキサロ酢酸
脱炭酸反応）オキサロ酢酸→ピルビン酸＋ＣＯ２
【００６１】
【化２】
2014180224.tif 000005
【００６２】
製造されるアミノ酸としては、例えば、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、およびグリシンからなる群より選ばれる、タンパク質の天然構成成分であるα−アミノ酸（これらのアミノ酸は、グリシンを除き、Ｌ体またはＤ体である）、ならびにその誘導体が挙げられる。α−アミノ酸の誘導体としては、例えば、上記α−アミノ酸の異性体アミノ酸、ならびにハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（上述したものと同様）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル）、アリール基（例、フェニル、ナフチル）、およびヒドロキシル基で置換されていてもよいアダマンチル基からなる群より選ばれる置換基で置換されたα−アミノ酸またはその異性体アミノ酸が挙げられる。より具体的には、α−アミノ酸の誘導体としては、例えば、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン、４−ヒドロキシイソロイシン、3-ヒドロキシアダマンチルグリシン、２−ナフチルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、およびフェニルグリシンが挙げられる。したがって、アミノ基転移反応において材料として用いられるケト酸は、製造されるべき上記アミノ酸のアミノ基（−ＮＨ２）がオキソ基（＝Ｏ）で置き換えられている化合物である。
【００６３】
また、上記１）および２）の共役反応としては、例えば、以下を挙げることもできる。
【００６４】
【化３】
2014180224.tif 000006
【００６５】
共役反応におけるアミノ基転移反応は、本発明の形質転換体から抽出されたアミノ基転移酵素（抽出酵素）、またはアミノ基転移酵素を産生する微生物を含む反応液（例、培養液）を用いることにより達成できる。アミノ基転移酵素を産生する微生物としては、例えば、アミノ基転移酵素を天然に産生する微生物、アミノ基転移酵素の発現ベクターが導入された形質転換体が挙げられる。抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記微生物から調製されたアミノ基転移酵素含有画分、上記微生物の破砕物および溶解物）が挙げられる。共役反応における脱炭酸反応は、本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを用いる上述した方法により達成できる。共役反応の様式としては、例えば、ａ）アミノ基転移酵素（抽出酵素）およびデカルボキシラーゼ（抽出酵素）を用いる方法、ｂ）アミノ基転移酵素を産生する微生物および本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（抽出酵素）を用いる方法、ｃ）アミノ基転移酵素（抽出酵素）および本発明の形質転換体を用いる方法、ｄ）アミノ基転移酵素を産生する微生物および本発明の形質転換体を用いる方法、ｅ）アミノ基転移酵素および本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼを産生する微生物（例、両酵素をコードする遺伝子を含む１または２の発現ベクターが導入された形質転換体、および本発明の変異型オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターがアミノ基転移酵素を産生する微生物に導入された形質転換体）を用いる方法が挙げられる。微生物を用いる場合、培養ブロスは、熱処理（例、４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）されてもよい。培養ブロスはまた、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）等により処理されてもよい。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合の温度は４℃〜６０℃で、好ましくは２０℃から３７℃に設定され得る。また、ｐＨは３〜１２に、好ましくはｐＨ７〜９に設定され得る。時間は５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度に設定され得る。ブロス保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくとも良い。反応液は、適切な条件（例、温度、ｐＨ、時間）下で殺菌されてもよい。
【００６６】
アミノ基転移反応および脱炭酸反応の共役反応は、１つの反応槽中で実施でき、共役反応の間に基質が補充されてもよい。例えば、基質は、バッチ法またはフィード法により反応系に添加されてもよい。酵素、酵素発現菌体、酵素発現菌体処理物、培養ブロス、または培養ブロス処理物もまた、バッチ法またはフィード法により反応系に添加されてもよい。
【００６７】
本発明の方法により得られたアミノ酸含有反応液を、カラム処理、晶析処理、抽出処理等の既知の精製方法を駆使することによって、アミノ酸を単離および／または精製することができる。アミノ酸は、塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩）の形態であってもなくてもよい。アミノ酸はまた、水和物であってもなくてもよい。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
実施例１：ＰｐＯＤＣ発現プラスミドの作製
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来ｃａｒｂｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｕｔａｓｅ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ  （ＰｐＯＤＣ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＮ６７０１２．１，配列番号２）の遺伝子配列の開始コドンをatgに変更し、５’末端にＮｄｅＩ認識配列を、３’末端の終止コドンの直前にＸｈｏＩ認識配列を付与したＤＮＡ配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓに供し、Ｅ．  ｃｏｌｉでの遺伝子発現効率が最適化された合成ＤＮＡを得た。配列番号１のヌクレオチド配列は、この合成ＤＮＡのヌクレオチド配列のうち、配列番号２のアミノ酸配列をコードする部分のヌクレオチド配列である。
【００７０】
合成ＤＮＡをＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）を抽出した。このプラスミドを用いて、ｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）を作製した。以下のような方法で作製することができる。
【００７１】
ｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）を鋳型として、ＰｐＯＤＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する。プライマーは、プライマーＴ７ｐｒｏ（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’：配列番号３）およびプライマーＸｈｏＨｉｓＰｓｔ＿ＲＶ（５’−ａａａａｃｔｇｃａｇｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇ−３’：配列番号４）を用いる。ＰＣＲはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行う。
【００７２】
１  ｃｙｃｌｅ        ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ      ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、１ｍｉｎ
１  ｃｙｃｌｅ        ６８℃、１ｍｉｎ
４℃
【００７３】
増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＰｓｔＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＰｓｔＩで制限酵素処理したｐＳＦＮ（国際公開第２００６／０７５４８６号に記載のベクター）のベクター側断片とライゲーションする。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）を抽出する。
【００７４】
実施例２：ＰｐＯＤＣ変異ライブラリーの構築
Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによるランダム変異導入は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔのプロトコルに準拠して行った。実施例１で作製したｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）を鋳型として、ＰｐＯＤＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマーｐＳＦＮ＿ＰｐＯＤＣ＿ＦＷ（５’−ｃａｃｃｇｔａａｇｇａｇｇａａｔｇｃａｔａｔｇ−３’：配列番号５）およびプライマーｐＳＦＮ＿ＰｐＯＤＣ＿ＲＶ（５’−ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇ−３’：配列番号６）を用いた。ＰＣＲはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
【００７５】
１  ｃｙｃｌｅ        ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ      ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、１ｍｉｎ
１  ｃｙｃｌｅ        ６８℃、１ｍｉｎ
４℃
【００７６】
得られたＤＮＡ断片を鋳型として、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。
【００７７】
１  ｃｙｃｌｅ        ９５℃、２ｍｉｎ
３０  ｃｙｃｌｅｓ      ９５℃、１ｍｉｎ
５５℃、１ｍｉｎ
７２℃、１ｍｉｎ
１  ｃｙｃｌｅ        ７２℃、１０ｍｉｎ
４℃
【００７８】
増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理したｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）のベクター側断片とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体を角形大プレートに入ったＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）寒天培地に塗布し、コロニーを形成させてＰｐＯＤＣ変異ライブラリーとした。
【００７９】
実施例３：熱安定性が向上した変異型ＰｐＯＤＣの選抜（１ｓｔラウンド）
ＰｐＯＤＣ変異ライブラリーより変異体をコロニーピッカーにて採取し、９６  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに入ったアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＴＢ培地１ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間、１０００ｒｐｍにて振とう培養を行った。得られた培養液を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μｌずつ分注し、６５℃の湯浴で１時間インキュベートした。その後、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｅｔｅｒ  Ｍｉｘ（メルク）１５０μｌを添加して室温で１０分間静置し、得られた菌体破砕液４０μｌに反応液１６０μｌを添加してＯＤＣ活性（脱炭酸反応によりオキサロ酢酸からピルビン酸を生成する活性。以下同様）を測定した。
【００８０】
ＯＤＣ活性測定条件：ＯＡＡ  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの吸光度の減少から活性を算出。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。
【００８１】
高い活性を示した上位１００株の培養液５０μｌを９６  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに入ったアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＴＢ培地１ｍｌに植菌し、３７℃で２０時間、１０００ｒｐｍにて振とう培養を行った。得られた培養液を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μｌずつ分注し、７０℃の湯浴で１時間インキュベートした後、上記と同様の方法で菌体を破砕、ＯＤＣ活性を測定した。７０℃の処理後に活性を示した１５株の培養液１５０μｌをアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＴＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１５時間、１２０ｒｐｍにて振とう培養を行った。得られた培養液を６０℃または７０℃の湯浴で１時間インキュベートした後、培養液１００μｌにＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｅｔｅｒ  Ｍｉｘ（メルク）４００μｌを添加して室温で１０分間静置し、上記の条件でＯＤＣ活性を測定した。熱処理なしの培養液の菌体も同様に破砕、ＯＤＣ活性を測定した。６０℃の処理後に高い残存活性を示したＩＤ１、４のプラスミドを回収してヌクレオチド配列を決定し、ＩＤ１にはＭ３４Ｉ、ＩＤ４にはＭ３Ｉ／Ｓ１５４Ｎ（ＩＤ４−１）、またはＳ１５４Ｎ（ＩＤ４−３）の変異が導入されていることを確認した。
【００８２】
【表３】
2014180224.tif 000007
【００８３】
実施例４：熱安定性が向上した変異型ＰｐＯＤＣの選抜（２ｎｄラウンド）
ＰｐＯＤＣ変異ライブラリーより変異体をコロニーピッカーにて採取し、９６  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに入ったアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＴＢ培地１ｍｌに植菌し、３７℃で２４時間、１０００ｒｐｍにて振とう培養を行った。得られた培養液を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μｌずつ分注し、６５℃の湯浴で１時間インキュベートした。その後、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｅｔｅｒ  Ｍｉｘ（メルク）１５０μｌを添加して室温で１０分間静置し、得られた菌体破砕液４０μｌに反応液１６０μｌを添加してＯＤＣ活性を測定した。活性測定は実施例３に記載の条件で行った。
【００８４】
高い残存活性を示した上位８８株の培養液を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μｌずつ分注し、６５℃または７０℃の湯浴で1時間インキュベートした後、上記と同様の方法で菌体を破砕、ＯＤＣ活性を測定した。熱処理なしの培養液の菌体も同様に破砕し、ＯＤＣ活性を測定した。６５℃および７０℃の処理後に高い残存活性を示したＩＤ３７、４５、４７、５３、７９、８０のプラスミドを回収してヌクレオチド配列を決定し、ＩＤ３７、４５、４７にはＡ２４３Ｔ、ＩＤ５３にはＡ２４３Ｓ、ＩＤ７９にはＦ６４Ｖ、ＩＤ８０にはＭ３Ｉ／Ａ２４３Ｔの変異が導入されていることを確認した。
【００８５】
【表４】
2014180224.tif 000008
【００８６】
実施例５：部位特異的変異による変異型ＰｐＯＤＣ発現プラスミドの作製
部位特異的変異による変異型ＰｐＯＤＣ発現プラスミドの作製はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔのプロトコルに準拠して行った。目的とするヌクレオチド残基の変異（置換）を導入し、かつ２本鎖ＤＮＡの各々の鎖に相補的になるように設計した１セットのＤＮＡプライマーを合成した。作製した変異体と作製に用いたプライマーのヌクレオチド配列をそれぞれ表５、６に示す。ＩＤ８１、８２、８３の作製にはｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ８０−Ｈｉｓ（Ｃ）を、ＩＤ８４、８５の作製にはｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ３７−Ｈｉｓ（Ｃ）を、ＩＤ８６、８７の作製にはｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ５３−Ｈｉｓ（Ｃ）をそれぞれ鋳型とし、以下のＰＣＲ条件で変異型プラスミドを作製した。
【００８７】
１  ｃｙｃｌｅ        ９５℃  １  ｍｉｎ
１８  ｃｙｃｌｅｓ      ９５℃  ３０  ｓｅｃ
５５℃  １  ｍｉｎ
６８℃  ８  ｍｉｎ
ｃｙｃｌｅｓ終了後      ４℃
【００８８】
メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理（３７℃、１ｈｒ）によって鋳型ｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ８０−Ｈｉｓ（Ｃ）、ｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ３７−Ｈｉｓ（Ｃ）、またはｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣ５３−Ｈｉｓ（Ｃ）を切断した後に、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収してヌクレオチド配列を決定し、目的とするヌクレオチド残基の変異（置換）が導入されていることを確認した。
【００８９】
【表５】
2014180224.tif 000009
【００９０】
【表６】
2014180224.tif 000010
【００９１】
実施例６：変異型ＰｐＯＤＣの発現および精製
実施例３、４、５で得られたｐＳＦＮ−ＰｐＯＤＣｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）を抽出した。ｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、変異型ＰｐＯＤＣ発現株ｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を作製した。ＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で生育させた変異型ＰｐＯＤＣ発現株ｐＥＴ−２２−ＰｐＯＤＣｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の菌体を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（メルク）１００ｍｌに植菌し、３７℃で１６時間、坂口フラスコを用いて振とう培養を行った。培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭを用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋＤａ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、変異型ＰｐＯＤＣ溶液とした。必要に応じて、培養液量、Ｈｉｓ  ＴＡＬＯＮカラムの連結数を増やして精製を行った。
【００９２】
実施例７：比活性の測定
実施例６で調製した変異型ＰｐＯＤＣ溶液を酵素源として用いた。酵素の希釈にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＢＳＡ０．０１％を用いた。活性測定は以下の条件で行った。
【００９３】
ＯＤＣ活性測定条件：ＯＡＡ  １ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの吸光度の減少から活性を算出。
【００９４】
タンパク質の濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク）の５倍希釈液を用いて行った。
【００９５】
【表７】
2014180224.tif 000011
【００９６】
実施例８：変異型ＰｐＯＤＣの熱安定性解析
実施例６で調製した変異型ＰｐＯＤＣ溶液を酵素源として用いた。酵素濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、ＯＤＣ活性を測定した。本希釈液を２５、３０、３７、４０、４２、５０、５５、６０、７０℃の水浴で１時間インキュベートした後、ＯＤＣ活性を測定し、温度処理前の活性に対する処理後の活性の割合を算出し、活性の残存率（％）を調べた。活性測定は、実施例７に記載の条件で行った。酵素の熱安定性の指標として、酵素活性が半減する温度（Ｔｍ）について変異体と野生体で比較すると、いずれの変異体においても、Ｔｍ値の向上が認められた。ＩＤ８２ではＴｍ値が６２．８℃、ＩＤ８５では６２．４℃、ＩＤ８１では６２．０℃と、特に高い熱安定性を有していた。
【００９７】
【表８】
2014180224.tif 000012
【００９８】
実施例９：変異型ＰｐＯＤＣのｐＨ安定性解析
実施例６で調製した変異型ＰｐＯＤＣ溶液を酵素源として用いた。酵素濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように、Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ（ｐＨ５．０）１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ、またはＢｏｒａｔｅ−Ｎａ（ｐＨ９．５）１００ｍＭ溶液で希釈し、２５℃で１時間インキュベートした。ＯＤＣ活性を測定し、ｐＨ処理前の活性に対する処理後の活性の割合を算出し、活性の残存率（％）を調べた。活性測定は、実施例７に記載の条件で行った。ｐＨ５．０で処理した後の残存活性は、ＩＤ８５で７７％、ＩＤ８７で７５％と、野生体の４２％と比較して向上しており、酸性条件下での酵素の安定性が向上していた。ｐＨ９．５で処理した後の残存活性は、ＩＤ３７で６８％、ＩＤ８５で６６％と、野生体の５４％と比較して向上しており、塩基性条件下での酵素の安定性が向上していた。
【００９９】
【表９】
2014180224.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、ケト酸の脱炭酸生成物およびアミノ酸の製造などに有用である。
【配列表】
2014180224000001.app