(57)【要約】      （修正有）【課題】吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することにより高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供する。【解決手段】基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、（１）親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、（２）基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程、を含む製造方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体表面に蛋白質を固定化するバイオチップの製造方法であって、
（１）親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、
（２）基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項２】
前記（１）工程の親水性高分子物質が、アルブミン、スキムミルク、カゼインおよび免疫グロブリンを含む群より選択される１種以上の親水性高分子物質である請求項１記載のバイオチップの製造方法。
【請求項３】
蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている請求項１または２記載のバイオチップの製造方法。
【請求項４】
複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項３記載のバイオチップの製造方法。
【請求項５】
前記（２）工程の固定化が共有結合または物理化学吸着である請求項１乃至４いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項６】
前記基体にポリマーを塗布した請求項１乃至５いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項７】
前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である請求項１乃至６いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項８】
前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１乃至７いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項９】
前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である請求項８記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１０】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項９記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１１】
基体の形状がスライドガラス状である請求項１乃至１０いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１２】
基体の材質がプラスチックである請求項１乃至１１いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１３】
前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項１２記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１４】
前記蛋白質が、抗体である請求項１乃至１３いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法
【請求項１５】
請求項１乃至１４いずれか１項に記載の製造方法で作製したバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の多数の蛋白質の検出および分析に用いられるバイオチップの製造方法に関する技術であり、さらに詳しくは、抗原抗体反応を用いた免疫分析、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現状のバイオチップの一つである蛋白質チップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
蛋白質、またはそれを捕捉する分子を基板上に固定化した後、該表面上で他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）と反応させて検出機等で検出する場合、蛋白質、またはそれを捕捉する
【０００４】
分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ 比） を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例え
ば非特許文献１参照） 。
このため通常は、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に、これらの分子が固定されていない部分で他の蛋白質が非特異的に吸着するのを防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。また、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質、またはそれを捕捉する分子の上に吸着防止剤がコーティングされてしまう場合があり、続く反応、即ち他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはそ
の抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）との反応において、反応性が低下するという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分での非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００５】
また、すべての蛋白質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
例えば、特許文献２や３の発明においては、生理活性物質固定のためのアミノ基含有ポリマーと親水性ポリマーを組み合わせることで、この目的を達成しようとした。基体の親水性を高めることで非特異吸着を抑制することが可能になった。
しかしながら、親水性を高めることは、基体表面に水を落とした時の前進接触角を低くすることでもあり、その結果、生理活性物質を含む水溶液を基体表面にスポットした場合に、スポット面積が広がり、さらにスポット外周部がにじんで真円のスポットにならないなどの問題が生じた。このようにスポットの形状が安定しないと、定量測定は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特開２００５−０９１２４５号公報
【特許文献３】特表２０１０−００８３７８号広報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ．５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することで高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）基体表面に蛋白質を固定化するバイオチップの製造方法であって、（１）親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、（２）基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
（２）前記（１）工程の親水性高分子物質が、アルブミン、スキムミルク、カゼインおよび免疫グロブリンを含む群より選択される１種以上の親水性高分子物質である（１）記載のバイオチップの製造方法。
（３）蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている（１）または（２）記載のバイオチップの製造方法。
（４）複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している（３）記載のバイオチップの製造方法。
（５）前記（２）工程の固定化が共有結合または物理化学吸着である（１）乃至（４）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（６）前記基体にポリマーを塗布した（１）乃至（５）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（７）前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である（１）乃至（６）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（８）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）乃至（７）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（９）前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である（８）記載のバイオチップの製造方法。
（１０）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（（９）記載のバイオチップの製造方法。
（１１）基体の形状がスライドガラス状である（１）乃至（１０）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（１２）基体の材質がプラスチックである（１）乃至（１１）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（１３）前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種である（１２）記載のバイオチップの製造方法。
（１４）前記蛋白質が、抗体である（１）乃至（１３）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法
（１５）（１）乃至（１４）いずれか１項に記載の製造方法で作製したバイオチップ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することで高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップを作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】1次抗体のスポット濃度１０ (ug/mL)の実施例１の蛍光スポット像
【図２】1次抗体のスポット濃度２０ (ug/mL)の実施例１の蛍光スポット像
【図３】1次抗体のスポット濃度１８０(ug/mL)の実施例１の蛍光スポット像
【図４】1次抗体のスポット濃度１０ (ug/mL)の実施例２の蛍光スポット像
【図５】1次抗体のスポット濃度２０ (ug/mL)の実施例２の蛍光スポット像
【図６】1次抗体のスポット濃度１８０(ug/mL)の実施例２の蛍光スポット像
【図７】1次抗体のスポット濃度１０ (ug/mL)の実施例３の蛍光スポット像
【図８】1次抗体のスポット濃度２０ (ug/mL)の実施例３の蛍光スポット像
【図９】1次抗体のスポット濃度１８０(ug/mL)の実施例３の蛍光スポット像
【図１０】1次抗体のスポット濃度１０ (ug/mL)の比較例の蛍光スポット像
【図１１】1次抗体のスポット濃度２０ (ug/mL)の比較例の蛍光スポット像
【図１２】1次抗体のスポット濃度１８０(ug/mL)の比較例の蛍光スポット像
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す工程によりバイオチップを製造することにより、上記課題を解決できることを見出した。
（１）親水性高分子物質を含有する水溶液に該蛋白質を溶解し、蛋白質固定用水溶液を作製する工程、
（２）基体表面に蛋白質固定用水溶液を点着または塗布し蛋白質を固定化する工程、
【００１３】
まず工程（１）について詳細に説明する。
工程（１）は、基体表面に固定化するための蛋白質を含む溶液の調製に関する工程である。
（溶液の組成）
溶媒としては、特に限定するものではないが、蛋白質溶液であるので、蛋白質の変性を防ぐ意味から水溶性の溶液であることが好ましい。水溶性溶液の溶媒としては、一般的な緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水等が挙げられ、特に限定するものではないが、免疫分析の分野で良く使用される、リン酸緩衝液を好適に使用することができる。
【００１４】
本発明の特徴としては、前記蛋白質溶液に親水性高分子物質を含有させることにある。
親水性高分子物質としては、合成高分子材料や生体由来高分子材料を用いることができる。特に生体高分子材料を用いることが好ましい。生体高分子であれば、溶液中での全体的な蛋白質濃度を増やし、固定化対象である蛋白質の安定化に寄与すると考えられる。
前記生体高分子は、他の生体高分子物質に不活性なアルブミン、スキムミルク、またはカゼインを含む群より選択される１種以上を用いることが好ましい。また、免疫グロブリンを用いても良いが、この場合、チップを免疫分析に用いる場合には、交差反応を惹起しない免疫グロブリンを選択することが重要であるである。
【００１５】
次に工程（２）について説明する。
工程（２）は、工程（１）において作製した蛋白質固定化用水溶液を、基体表面に固定化する工程になる。基体表面への固定化は、化学結合でも、物理化学的結合でもよい。
蛋白質は基体表面にスポット状に固定化されていることが好ましい。スポット状に点着させる方法としては、市販のスポッター（例えばAmersham Pharmacia Biotech社製  Microrraysystem Generation III spotter）を使用することができるが、特にこれにこだわる
ものではない。市販のスポッターを用いた場合のスポットのサイズは、直径０．２〜０．５ｍｍである。
用いる蛋白質の種類は１種類以上であればよく、マイクロチップの特性状、複数種の蛋白質のスポットを有する方が、一度に複数の検出が可能であるので効果的である。複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在していても良い。
【００１６】
蛋白質の固定化に関しては、表面に固定化され分析の際の洗浄工程によって蛋白質が表面から脱離しなければ特に限定しない。具体的な固定化の方法としては、共有結合または物理吸着であることが好ましい。
タンパク質を共有結合によって固定化する方法としては、チップ表面に官能基を導入し当該官能基と蛋白質中に存在する官能基とを反応させて結合させることで達成される。
また、基体表面に固定化のための官能基を有する親水性を持つポリマーを塗布することにより官能基を導入する方法がある。以下の具体的なポリマーについて述べる。
【００１７】
（ポリマーの構成）
ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばI s h i
h a r a K , T s u j i T , K u r o s a k i T , N a k a b a y a s h i N ,J o u rn a l o f B i o m e d i c a l M a t e r i a l s R e s e a r c h , 2 8 ( 2 ) , pp .
2 2 5 - 2 3 2 , ( 1 9 9 4 )４ など） 。
ホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明に使用するポリマーは生理活性物質を固定化するための官能基を有することが好ましい。本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基をとしては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基などがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましい。特に、活性エステル基が生理活性物質との結合において良く用いられ、実績もあることから最も好ましい。
基体表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基体表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。
また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体、活性エステル基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体との三元共重合体が好ましい。
【００１９】
（ポリマーのコーティング）
本発明のバイオチップは、基体表面を該ポリマーでコーティングすることにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
基体へのポリマーのコーティングは、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけなどの公知の方法で
基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００２０】
有機溶剤としては、２−ブタノン、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトンなどの単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。
【００２１】
本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基材表面に塗布した後、溶液を除去し、有機溶媒で洗浄したのち、遠心乾燥するのが好ましい。遠心乾燥は、高速回転による遠心力と熱風で部品などを乾燥させるもので、様々な専用機が市販されており、メーカーによって「遠心分離乾燥機」「脱水乾燥機」「スピンドライヤー」と呼ばれている。
または、単純にチップ表面に存在する溶液を遠心操作で除去した後、乾燥させることで遠心乾燥と同じ効果を得ることができる。具体的には、1時間４０℃で処理し、チップ表面
に存在する溶液を除去、その後乾燥させる。
【００２２】
（基体の形状）
本発明に使用する基体の形状は、特に限定しないが、スライドガラス状の基板、マルチウェルプレート、ビーズ状の球体等が挙げられる。これらの基体表面に微細な流路を有していてもよく、流路内に抗体を固定化させることも可能である。
特に一般的なスライドガラス状での場合、市販の測定装置（例えばFigen社製GenePix4000B）で測定できるメリットがあり好適である。
【００２３】
（基体の材質）
前記基体の材質は、例えばガラス、プラスチック、金属を用いることが可能である。これらの中で、プラスチック製の基体は、加工性、使用後の焼却処理等の点で最も好適である。
基体に用いるプラスチックの素材は特に限定するものではないが、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選ばれる少なくとも1種であることが
好ましい。特に、透明性に優れたポリカーボネート、ポリスチレン、環状ポリオレフィンや、自家蛍光発色の少ない環状ポリオレフィンが好適に用いることができる。
【００２４】
バイオチップに固定化する蛋白質は、特に限定するものではないが、生体由来分子を用いることが多く、特に抗体を用いることが多い。抗体を固定化したバイオチップは、ＥＬＩＳＡ分析に用いることができる。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．ポリマーの調製
（１）ポリマーの合成
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、n−
ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を脱水エタノールに溶解させた。
そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。
なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮ
Ｐの順に７０：２７：３である。
その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することにより第１のポリマーを得た。
なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（２）に示すようにして合成した。
（２）ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。
−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。
−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。
【００２６】
２．抗原の検出
［実施例１］（BSAを含むスポット液でＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮ抗体を固定化）
まず、ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
基材：穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
特異抗体（一次抗体）：RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Cappel社製）を用意した。
標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識 SHEEP IGG FRACTION TO RATALBUMIN（Cappel社製）を用意した。
抗原：Albumin ,Rat (-)（Cappel社製）を用意した。
洗浄液：0.05% triton X100 /PBS  を用意した。
【００２７】
次に、ポリマーの０．５ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを成型品の穴部に点着したのち乾燥させ、エタノールを用いて洗浄し、底面にポリマーを導入した。
次に、BSAを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体溶液を
穴部に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置。次に、洗浄液を用いて３回洗浄した。
【００２８】
次に、抗原の70μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施、余剰の検体を洗浄液を用いて３回洗浄した。
【００２９】
次に、標識化特異抗体の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、こ
れを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（0.05%triton X100）を調製し、
これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
洗浄液を用いて３回洗浄を行った後、穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【００３０】
その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図１、
図２、図３にしめすように形状のよい円を提示した。  
【００３１】
［実施例２］（スキムミルクを含むスポット液でＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮ抗体を固定化）
実施例１と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。
【００３２】
次に、スキムミルクを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３３】
次に、抗原の70μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３４】
次に、標識化特異抗体の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、こ
れを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３５】
次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（0.05%triton X100）を調製し、
これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置し、３回洗浄を行った。
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【００３６】
その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図４、
図５、図６に示すように形状のよい円を提示した。
【００３７】
［実施例３］（ＩｇＧを含むスポット液でＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮ抗体を固定化）
実施例１と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。
【００３８】
次に、BSAを含むリン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部
に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３９】
次に、抗原の70μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００４０】
次に、標識化特異抗体の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、こ
れを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００４１】
次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（0.05%triton X100）を調製し、
これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【００４２】
その結果、1次抗体濃度が低い場合でもシグナルが検出され、各スポットの形も図７、図
８、図９に示すように形状のよい円を提示した。
【００４３】
比較例１
実施例１と同様にしてポリエチレン樹脂基板にポリマーを導入した。
【００４４】
次に、リン酸バッファー溶液で各々10,20,180ug/mLに調整した特異抗体を穴部に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００４５】
次に、抗原の70μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００４６】
次に、標識化特異抗体の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、こ
れを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００４７】
次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（0.05%triton X100）を調製し、
これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置し、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
その後、穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【００４８】
その結果、1次抗体濃度が高い場合はシグナルが検出されたが、濃度が低い場合はシグナ
ルが低くスポットの形状も図１０、図１１、図１２に示すように真円ではなく、スポット形も小さくなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本特許のバイオチップの製造方法を用いることにより、不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を有するバイオチップを作製でき、免疫分析反応に良好なバイオチップを得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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