(57)【要約】      （修正有）【課題】実用上十分な水へ分散性、及び可溶性を有するシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法を提供する。【解決手段】シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含むシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法であり、またシコニン系化合物（ａ）と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを、塩基性化合物（ｂ）を用いてアルカリ性に調整した溶液中で混合し、中和剤（ｄ）を用いて中和する工程とを含むシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法である。塩基性化合物（ｂ）はアミン類が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含む、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
【請求項２】
塩基性化合物（ｂ）が、アルキルアミン類、アルカノールアミン類、及びアルキレンアミン類からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
【請求項３】
塩基性化合物（ｂ）が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、モノプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジプロパノールアミン、及びトリプロパノールアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
【請求項４】
シコニン系化合物（ａ）と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを塩基性化合物（ｂ）を用いてアルカリ性に調整した溶液中で混合する工程と、混合した溶液に中和剤（ｄ）を添加して中和する工程とを含む、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含む、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムラサキ科ムラサキの根から抽出されるシコニンおよびその誘導体は、抗炎症作用、抗菌作用、傷の治癒促進作用があることが知られており、実際、医薬品有効成分として配合されるクリームとして市販されている。しかし、水に溶解しないためその使用方法は限定される。
【０００３】
具体的には、シコニンおよびその誘導体はたとえばエチルアルコール等のアルコール類や芳香族系の有機溶媒を用いて、ムラサキの根から抽出される。（特許文献１）
抽出されたシコニンおよびその誘導体は医薬品として使用される際には、ワセリンに混合する方法（特許文献２）や、Ｏ／ＷあるいはＷ／Ｏタイプに代表されるエマルジョンを形成する方法（特許文献３）を用いて製品化されるなど、製品及び製造工程が限定されている。
そこで、シコニンおよびその誘導体に水への分散性、及び可溶性を付与することにより、医薬品、化粧品等の用途に用いる新しい技術が期待されている。
【０００４】
一方、β-グルカンは、β-１,３-グルカン、β-１,６グルカン、β-１,３-１,６グルカンなどが自然界に生息するキノコ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分（数％から５０％程度）であり、それらの子実体だけでなく培養菌糸体にも含まれていることが知られている。また、それらのβ-グルカンには抗腫瘍活性があることが知られている（非特許文献１）。例えば、スエヒロタケ、カワラタケ、シイタケから抽出されたそれぞれのβ-グルカンは、既に抗がん剤などの医薬品として製造販売されている。一方、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium）に属する微生物もβ-１,３-１,６グルカンを生産することが知られている。
【０００５】
また、β-１,３-１,６グルカンは、一本鎖構造のものが絡みあい３重螺旋構造を形成していることが知られており、ジメチルスルホキシドなどの極性溶媒やアルカリ溶液で処理することにより、３重螺旋構造が解離し、一本鎖構造となることが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４０２８６０４号公報
【特許文献２】特開２０１０−１４３８８７号公報
【特許文献３】特公昭６１−２１５２３号公報
【０００７】
【非特許文献１】Immunity,19(3),311-315
【非特許文献２】J.Med.Mycol.Vol.33,267-277,（1992）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、実用上十分な水への分散性、及び可溶性を有するシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、シコニン系化合物（ａ）と、塩基性化合物（ｂ）と、β-１,３-１,６グルカンの中でも、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）を添加することで、実用上十分な水への分散性、及び可溶性を有するシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体が得られることを見出した。
詳しくは、シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含むシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法であり、またシコニン系化合物（ａ）と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを、塩基性化合物（ｂ）を用いてアルカリ性に調整した溶液中で混合し、中和剤（ｄ）を用いて中和する工程とを含むシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法である。これらの製造方法によって、製造されるシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体は水へ分散性、及び可溶性を有することを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造方法を提供する。
【００１０】
項１  シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含む、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
項２  塩基性化合物（ｂ）が、アルキルアミン類、アルカノールアミン類、及びアルキレンアミン類からなる群より選ばれる少なくとも１種である項１に記載のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
項３  塩基性化合物（ｂ）が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、モノプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジプロパノールアミン、及びトリプロパノールアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である項１又は２に記載のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
項４    シコニン系化合物（ａ）と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とをアルカリとして塩基性化合物（ｂ）を用いてアルカリ性に調整した溶液中で混合する工程と、混合した溶液に中和剤（ｄ）を添加して中和する工程とを含む、シコニン系化合物のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体することにより、水への分散性、及び可溶性を付与することができる。発明は、食品成分としても利用されるβ-１,３-１,６グルカンを用いてシコニン系化合物を、水への分散性、及び可溶性を付与させているため、本発明の複合体を分散させた水分散液、本発明の複合体の溶液は安全性が高く、医薬・化粧品として利用可能なものである。また、本発明のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体は、複合体を分散させた水分散液、溶液として、石鹸、シャンプー、染料などの各種用途に使用できる。
また、本発明のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法を用いることで、効率よく安定性に優れた水への分散性、及び可溶性を有する複合体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの超音波照射したときの培養液の粒度分布を示す図である。
【図３】βグルカン−シコニン複合体の濃度４０ppm水分散液の紫外−可視吸収曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
（１）シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法
シコニン系化合物（ａ）、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合する工程を含む、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法である。
【００１５】
（１−１）シコニン系化合物（ａ）
本発明において、シコニン系化合物（ａ）とはシコニン、デオキシシコニン、アセチルシコニン、イソブチルシコニン、β,β-ジメチルアクリルシコニン、イソバシコニン、α−メチル−ｎ−ブチルシコニン、β−ヒドロキシイソバレリルシコニン等を例示することができ、分子が凝集して形成された集団又は微粒子の状態であってよい。これらのシコニンおよびその誘導体は、ムラサキ科ムラサキの根から水（５０℃以上の熱湯が好ましい）、又はクロロホルム、エチルアルコール等の有機溶媒を用いて抽出されるが、抽出条件は特に限定されない。
【００１６】
ムラサキ科ムラサキの根より水、又はクロロホルム、エチルアルコール等の有機溶媒を用いて抽出されるシコニン系化合物（ａ）はシコニン及びその誘導体（デオキシシコニン、アセチルシコニン、イソブチルシコニン、β,β-ジメチルアクリルシコニン、イソバシコニン、α−メチル−ｎ−ブチルシコニン、β−ヒドロキシイソバレリルシコニン等）の混合物であるが、目的や用途により、抽出物を乾固して粉末状にしても用いてもよく、抽出物を加水分解する、又はＨＰＬＣにより精製することにより得られる、高純度のシコニンを用いてもよい。
【００１７】
（１−２）塩基性化合物（ｂ）
本発明に用いる塩基性化合物（ｂ）としてはアミン類が好ましく、例えば、アルキルアミン類、アルカノールアミン類、アルキレンアミン類などを例示することができ、具体的には、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、オクチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、ジヘプチルアミン、ジオクチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、トリペンチルアミン、トリヘキシルアミン、トリヘプチルアミン、トリオクチルアミンなどのアルキルアミン類；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、アミノエチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルエタノールアミン、アミノエトキシエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシエタノール、プロパノールアミン、イソプロパノールアミン、ジプロパノールアミン、ジ−ｉｓｏ−プロパノールアミン、ジ−n−プロパノールアミン、ジ−n− ブタノールアミン、ジイソブタノールアミン、ジ−n−ペンタノールアミン、ジ−n−ヘキサノールアミン、トリプロパノールアミン、テトラエタノールエチレンジアミン、テトラ−ｉｓｏ−プロパノールエチレンジアミンシクロヘキシルアミン、ジブチルエタノールアミン、ジブチル−ｉｓｏ−プロパノールアミンなどのアルカノールアミン類；エチレンジアミン，トリメチレンジアミン，ジエチレントリアミン，トリエチレンテトラミン，テトラエチレンペンタミン，ペンタエチレンヘキサミンなどのアルキレンアミン類を例示することができる。中でも作業環境の点で、アルカノールアミン類が好ましく、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、モノプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミンがより好ましい。
【００１８】
本発明の複合体の製造法におけるシコニン系化合物（ａ）と、塩基性化合物（ｂ）の比率は、（塩基性化合物：シコニン系化合物）は重量比で、１：０.００１〜１００程度の範囲が好ましく、１：０.０１〜５０程度の範囲がより好ましく、１：０.１〜２０程度の範囲がさらに好ましい。
【００１９】
（１−３）β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）
本発明におけるβ-１,３-１,６グルカンはβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であれば特に限定することなく使用することができる。β-１,６結合の分岐度は６０〜１００％であることが好ましく、７０〜１００％であることがより好ましい。
【００２０】
本発明の複合体の製造法におけるシコニン系化合物（ａ）と、β-１,３-１,６グルカンの比率（β-１,３-１,６グルカン：シコニン系化合物）は重量比で、１：０.００１〜１００程度の範囲が好ましく、１：０.０１〜５０程度の範囲がより好ましく、１：０.１〜２０程度の範囲がさらに好ましい。上記範囲であれば、水中で十分な分散性を有する分散液が得られる。
【００２１】
(ｉ)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６グルカン
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium  sp.)に属する微生物から得ることができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium  sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
【００２２】
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium  pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ  Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ  Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium  sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
【００２３】
β-１,３-１,６グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
β-１,３-１,６グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。
【００２４】
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
β-１,３-１,６グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００２５】
(ｉｉ)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源などを挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源などを挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類などを添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
【００２６】
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件などが挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６グルカンを主成分とするβ-グルカン多糖が０．１％（ｗ/ｖ）〜数％（ｗ/ｖ）含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ(ｍＰａ・s)から数千ｃＰ（ｍＰａ・s）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００２７】
＜低粘度β-１,３-１,６グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ-グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β-グルカン濃度は、０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。
【００２８】
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
【００２９】
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３-３．７に調整して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法など公知の方法で行うことができる。
【００３０】
（２）シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法
本発明のシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体は、以下の態様によって製造することができる。
【００３１】
シコニン系化合物（ａ）と、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合すること（混合工程）によって、シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体が得られる。
【００３２】
（２−１）混合工程
本発明の混合工程は、シコニン系化合物（ａ）と、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）とを混合することができれば、添加の順序、方法等については特に限定されることはない。
即ち、シコニン系化合物（ａ）と、塩基性化合物（ｂ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）それぞれ添加した後に攪拌混合する方法、シコニン系化合物（ａ）とβ-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）を塩基性化合物（ｂ）、具体的にはアミン類のみ、又はアミン類と他の塩基性化合物を用いてｐＨを調整したアルカリ性（好ましくはｐＨ１１以上、さらに好ましくはｐＨ１２以上）の溶液中で攪拌混合する方法、塩基性化合物（ｂ）、具体的にはアミン類のみ、又はアミン類と他の塩基性化合物を用いてｐＨを調整したアルカリ性の後述のβ-１,３-１,６グルカン溶液を調製し、そのアルカリ溶液中にシコニン系化合物を直接添加した後に攪拌混合する方法、後述するシコニン系化合物（ａ）の懸濁液を調製し、β-１,３-１,６グルカンの粉体及び塩基性化合物（ｂ）を添加、又は塩基性化合物（ｂ）等を用いてｐＨを調整したアルカリ性のβ-１,３-１,６グルカン溶液を添加して攪拌混合する方法が挙げられる。
【００３３】
（２−２）β-１,３-１,６グルカンの溶液の調製方法
本発明の混合工程において、β-１,３-１,６グルカンの溶液は混合する際の溶液のｐＨ調整のし易さの点で、溶液のｐＨを、塩基性化合物（ｂ）等を用いてアルカリ性（好ましくはｐＨ１１以上、さらに好ましくはｐＨ１２以上）に調整したものであることが好ましい。
【００３４】
β-１,３-１,６グルカンの溶液の調製方法としては、溶液に粉体、又は水溶液のβ-１,３-１,６グルカンを添加し、攪拌することによって調製することができる。なお、溶液のｐＨ調整は、β-１,３-１,６グルカンを添加する前の水に塩基性化合物（ｂ）を添加して調節してもよく、β-１,３-１,６グルカンを添加しながら、同時に塩基性化合物（ｂ）を添加して調節してもよく、β-１,３-１,６グルカンを添加した後に、塩基性化合物（ｂ）を添加して調整してもよい。
【００３５】
（２−３）シコニン系化合物の懸濁液の調製方法
シコニン系化合物の「懸濁液」とは、シコニン系化合物を（水）溶液に添加し、攪拌することで一時的に（水）溶液中に分散状態となっているものを意味し、一定時間が経過するとシコニン系化合物が凝集あるいは沈降し、分散状態を保持することができないものをいう。
シコニン系化合物の懸濁液は、シコニン系化合物と（水）溶液とを攪拌混合して得られる。混合した後に、必要に応じて適宜、溶液のｐＨを調整してもよい。
【００３６】
本発明の混合工程における攪拌方法は、シコニン系化合物と塩基性化合物とβ-１,３-１,６グルカンを溶液中で均一に分散できる方法であれば、特に限定されない。具体的には、メカニカルスターラー、ディスパー、マグネティックスターラー、超音波分散機、遊星ミル、ビーズミル、三本ロールなどを例示することができる。なかでも、分散性の点で、ディスパー、ビーズミル、超音波分散機が好ましい。
混合工程における温度は１０〜４０℃であればよく、攪拌時間は０．１〜２時間であればよい。上記範囲であれば、溶液中で各成分を均一に混合することができる。
【００３７】
（２−４）中和工程
上記方法にて製造した水分散液はそのまま使用することができるが、医薬品・化粧品向けの用途に用いるものは、ｐＨ４〜９の範囲であることが好ましく、ｐＨ５〜７．５の範囲であることがより好ましいため、シコニン系化合物の水分散液の製造法として、更に中和工程を含めることができる。
【００３８】
本発明における中和工程は、上述した混合工程で得られるアルカリ性の溶液に中和剤（ｄ）を添加して中和する工程である。なお、中和の際の攪拌は、上述した攪拌方法によって行うことができる。
【００３９】
中和工程に用いる中和剤（ｄ）としては、一般に市販されているものを用いることができ、例えば、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸、不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、ウロン酸などの有機酸を例示することができる。
【００４０】
飽和脂肪族カルボン酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などのモノカルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸などのジカルボン酸、クエン酸、イソクエン酸などのトリカルボン酸を例示することができる。
【００４１】
不飽和脂肪族カルボン酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸など例示することができる。
【００４２】
芳香族カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、サリチル酸などを例示することができる。アルドン酸としては、グルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、リボン酸、キシロン酸、マルトビオン酸、マルトトリオン酸、マルトテトラオン酸、マルトペンタオン酸、ラクトビオン酸などを例示することができる。ウロン酸としては、グルクチュロン酸、ガラクチュロン酸、マンヌロン酸などを例示することができる。
【００４３】
中和に使用する中和剤（ｄ）の添加量は、目的とするｐＨに応じて適宜選択すればよい。また、中和の際に発熱するため、必要に応じて冷却しながら中和をおこなってもよい。また、中和に用いる中和剤の添加方法としては、必要量を一括で添加してもよく、少量ずつ分けて添加して行うことができる。また、上述した中和剤を２種以上組合せて用いることもできる。
【００４４】
（３）その他
上記説明した本発明の複合体の製造法は、シコニン系化合物の水分散化又は水溶化方法、又はシコニン系化合物への水への可溶性又は水分散性の付与方法と捉えることもできる。尚、本発明において、分散（状態）とは、一定時間が経過しても溶液中にシコニン系化合物が均一に分散した状態で保たれたものを意味する。
【００４５】
水分散液として用いる場合のシコニン系化合物（ａ）の添加量は、水分散液中での最終濃度として、０．０００００１〜５重量％であればよく、０．００２〜２重量％が好ましく、０．０１〜０．５重量％がより好ましい。上記範囲であれば、安定した水分散液が得られる。
【００４６】
水分散液として用いる場合の塩基性化合物（ｂ）の添加量は、使用するシコニン系化合物（ａ）の使用量にもよるが、水分散液とした際の最終濃度として０．０００００１〜５重量％であればよく、０.００２〜２重量％が好ましく、０.０１〜０．５重量％がより好ましい。上記範囲であれば、安定した水分散液が得られる。
【００４７】
水分散液として用いる場合のβ-１,３-１,６グルカン（ｃ）の添加量は、使用するシコニン系化合物（ａ）の使用量にもよるが、水分散液とした際の最終濃度として０．０００００１〜５重量％であればよく、０.００２〜２重量％が好ましく、０.０１〜０．５重量％がより好ましい。上記範囲であれば、安定した水分散液が得られる。
【００４８】
本発明の製造法により得られたシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体、特に複合体の水分散液、溶液は、安全性が高く、医薬品原料、医薬部外品、化粧品原料、染料、着色料などの各種用途に応用可能なものである。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例（精製β-１,３-１,６グルカンの製造）
（１）低粘度β-１,３-１,６グルカンの調製
（１-１）β−グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム  プルランス（Aureobasidium  pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００５０】
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
【００５１】
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００５２】
【表１】
2014193967.tif 000002
【００５３】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（ｍＰａ・ｓ）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ(ｍＰａ・s)であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
【００５４】
（１−３）β-グルカン水溶液の脱塩
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
【００５５】
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
【００５６】
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行  監修,  微生物利用の大展開,  1012-1015,  エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ  ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β−グルカンがβ-１,３-１,６グルカンであることが証明された（今中忠行  監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。
【００５７】
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
【００５８】
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６グルカンとβ-１,３-１,６グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
【００５９】
（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理及び菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６グルカンを含むβ-１,３-１,６グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ  ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【００６０】
（３）高純度β-１,３-１,６グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、ろ過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機４０Ｄ-４を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外ろ過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
【００６１】
（４）シコニン系化合物（ａ）の抽出
１）シコニン系化合物（ａ１）
水洗し日陰干しした乾燥紫根を刻んだものを、クロロホルムに浸漬し、超音波処理により抽出する。抽出液をろ過後、エバポレーターで濃縮乾固することで、シコニン及びシコニン誘導体を含有する混合物（以下、シコニン系化合物（ａ１）とする。）を得た。
２）シコニン系化合物（ａ３）
水洗し日陰干しした乾燥紫根を刻んだものを、クロロホルムに浸漬し、超音波処理により抽出する。抽出液に１Ｍ水酸化ナトリウムを加え、１分間分配後、下層を廃棄し、上層に１Ｍ塩酸を加え、クロロホルムを加えて分配する。下層をエバポレーターで濃縮乾固することで、シコニン及びシコニン誘導体を含有する混合物（以下、シコニン系化合物（ａ２）とする。）を得た。
また、シコニン系化合物（ａ２）を７０％メタノールに溶解させたものをサンプルとし、ＨＰＬＣにより精製して、精製シコニン（純度９９％以上、以下、シコニン系化合物（ａ３）とする。）を得た。
ＨＰＬＣ条件（リサイクル分取ＨＰＬＣ、２回目で分取）
カラム  ＷａｔａｒｓＯＤＳ （Ｘ Ｂｒｉｇｅ Ｃ１８  １９Ｘ１５０ｍｍ、）
Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ１８（２０Ｘ２
５０ｍｍ）
溶離液  ７０％メタノール
流速    ５．５ｍｌ/ｍｉｎ
検出    ＵＶ ２１４ｎｍ
（５）シコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造法
【００６２】
（実施例１）
（β-グルカン溶液の調製）
以下の方法を用いてβグルカン溶液を調製した。
２２５ｍｌのガラス瓶に２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを３ｇ用いて、ｐＨ１１．０に調整したイオン交換水９７ｇに上述した方法によって得られたβ-１，３-１，６グルカン粉末３．０ｇを添加し、ホモディスパー（プライミクス社製）を用いて、回転数１０００rpmで３時間、温度８５℃で攪拌処理を行い、３％β-グルカン溶液１００ｇを得た。
【００６３】
（混合工程）
イオン交換水２９ｇに上記方法により調整した３％β-グルカン溶液  １ｇとシコニン系化合物（ａ１）０．０３ｇを添加し、ジルコニアビーズをメディアとしてペイントコンディショーナー（レッドデビル社）用いて２時間分散を行い、水分散液１  ３０ｇ（ｐＨ８．２）を得た。得られた分散液１（中和前）の分散性を測定した。結果を表２に示す。
【００６４】
中和工程
上記で得られた分散液１  ３０ｇをホモディスパー（プライミクス（株）製）を用いて、回転数８００ｒｐｍで撹拌しながら、中和剤として２５％クエン酸溶液を使用して、中和を実施し、シコニン系化合物とβ-グルカンとアミンを含む水分散液２  約３０ｇ（分散液中のシコニン系化合物濃度０．１％、グルカン濃度０．１％、塩基性化合物濃度０．１％、ｐＨ６．７）を得た。得られた分散液２（中和後）の分散性を測定した。結果を表２に示す。
【００６５】
（実施例２）
シコニン系化合物（ａ１）の代わりに、シコニン系化合物（ａ３）を使用した以外は、実施例１と同様に行い、分散液３（中和前）、分散液４（中和後）を得た。
【００６６】
（比較例１）
βグルカンを使用せず、シコニン系化合物（ａ１）を０．０３ｇとした以外は、実施例１に記載の方法により、シコニン系化合物の水分散液の作成を試みたが、凝集し塊状になり水分散液を得ることができなかった。そのため、中和は行わなかった。
（比較例２）
βグルカンを使用せず、シコニン系化合物（ａ１）０．３ｇからシコニン系化合物（ａ３）０．０３ｇとした以外は、実施例１に記載の方法によりシコニン系化合物の水分散液の作成を試みたが、凝集し塊状になり水分散液を得ることができなかった。そのため、中和は行わなかった。
【００６７】
評価方法
（分散性の評価）
分散性は、得られた水分散液を１２時間（室温）静置し、粒子の沈降状態を観察し、以下のように評価した。
○・・・沈降なし。
×・・・沈降が確認され、底部に粘土質の沈殿が発生する。
【００６８】
各実施例、及び比較例の評価結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
2014193967.tif 000003
【００７０】
表２に示すように、シコニン系化合物、塩基性化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体は、良好な分散性を保持していた。また、中和によって、分散性への影響は確認されなかった。従って、シコニン系化合物に水分散性が付与されたことが確認できた。
【００７１】
（実施例３）
水分散液３を蒸留水で２５倍希釈し、得られた溶液の紫外可視吸収スペクトル（日本分光(株)製  分光光度計  ＵＶ−５５０型、測定温度２５℃）を測定するとシコニンのピークが確認され、シコニン系化合物に水への可溶性が付与されたことが確認できた。紫外−可視光吸収強度曲線を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の製造法により得られるシコニン系化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体は、水への分散性、及び可溶性が付与されているため、医薬及び化粧品または染料として実用可能なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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