(57)【要約】【課題】  スポンジ様の空洞構造を有する架橋ゼラチンゲルでありながら、適度な形状保持性や強度と、高い透明性を有する細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを提供する。特に、細胞塊（スフェロイド）の培養に適した細胞培養培地を提供することを目的とする。【解決手段】  細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルであって、前記架橋ゼラチンゲルがゼラチンをエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体により架橋してなる細胞培養培地用の架橋ゼラチンゲル。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルであって、前記架橋ゼラチンゲルがゼラチンをエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体により架橋してなることを特徴とする細胞培養培地用の架橋ゼラチンゲル。
【請求項２】
前記架橋ゼラチンゲルが、スポンジ様の構造を有する請求項１記載の架橋ゼラチンゲル。
【請求項３】
前記架橋ゼラチンゲルの厚みが、１００μｍ以上１００ｍｍ以下である請求項１または２に記載の架橋ゼラチンゲル。
【請求項４】
前記架橋ゼラチンゲルが、波長４００ｎｍ〜８００ｎｍにおける光線透過率が７０％以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載の架橋ゼラチンゲル。
【請求項５】
前記架橋ゼラチンゲルの耐熱性が、４０℃以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の架橋ゼラチンゲル。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の架橋ゼラチンゲルを用いてなる細胞培養培地。
【請求項７】
前記細胞培養培地が、スフェロイドを培養するための培地である請求項７に記載の細胞培養培地。
【請求項８】
ゼラチン、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体および溶媒を含む混合溶液中で前記ゼラチンと前記エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体とを架橋させる、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを製造する方法であって、
前記混合溶液中のゼラチン濃度が０．５〜１０重量％、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体濃度が０．５〜１０重量％であり、かつ混合溶液中のゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との重量比が５：１〜１：５であることを特徴とする細胞培養培地用の架橋ゼラチンゲルの製造方法。
【請求項９】
前記混合溶液中でゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との架橋を、３０℃以上７０℃以下の温度で行う請求項８記載の架橋ゼラチンゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルおよびその製造方法に関する。詳しくは、ゼラチンをエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体により架橋することで、特に細胞塊（スフェロイド）の培養に好適な、透明性が高く、かつ優れた形状保持性を有する細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養には、液体培地や、寒天や架橋ゼラチンを用いた固体培地が広く使用されている。かかる培地には、さらに、培養しようとする細胞に合わせて、様々な成分の添加やｐＨの調整等を行い、目的とする細胞を培養する。液体培地は、容器であるプラスチックなどを足場として生育できる細胞しか培養できないこと、またコンタミネーションに弱いことが知られている。一方、寒天培地は、足場となる場があることや成分添加の自由度の高さから、広く細胞培養に用いられている。しかし、培地内の構造が密なため空洞（スペース）を必要とする細胞塊の培養が難しかったり、不透明な培地となるため観察に適さなかったり、寒天を主たる成分としているため増殖しにくい細胞があったりすることが知られている。
【０００３】
一方、ゼラチンやコラーゲンといった、動物性蛋白質に近い成分を原料とする架橋ゼラチンを用いた細胞培養培地が知られており、例えば、特許文献１には、架橋された酸処理ゼラチンを含む層を少なくとも有する細胞培養担体が記載されている。
この特許文献は、透明性が高く、細胞観察が行いやすい培地を提供することを目的とするものであり、具体的には、熱架橋や電子線架橋、化学架橋によって架橋されたゼラチンを細胞培養担体として用いるものである。しかし、当該引用文献１に例示されているような架橋方法による、架橋ゼラチンは一般的に強度が低く、それのみでは培地として用いることが難しいことが多い。そのため、当該引用文献の技術は、０．０１〜５０μｍ程度の薄膜として使用することや、合成高分子等の支持体上に架橋ゼラチン層を設けることを前提としているものである。また、未架橋のゼラチンの場合は、これらの架橋ゼラチンよりも、さらに耐熱性が低く、人体の細胞を培養するときに一般的な３５℃〜４０℃程度の温度でも流動性が高く、形状を維持しにくかったり、場合によっては溶けたりすることがある。
【０００４】
このように、細胞培養のために架橋ゼラチン等を用いるときに不足する強度を補強するために、特許文献２には、コラーゲンからなるスポンジ中に非生体分解性合成高分子が繊維状の形態で存在してなる足場材料が記載されている。これは、繊維状の形態で存在する非生体分解吸収性高分子が強度を補強することによって、コラーゲンからなるスポンジ中においても各種細胞を培養することができるようにするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２６９７７６号公報
【特許文献２】特許第４３９３８８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の細胞培養担体は、前述のように一般的な熱架橋や電子線架橋、化学架橋方法により作成される架橋ゼラチンゲルに関するものである。そのため、一般的な架橋ゼラチンゲルがそうであるように、空洞ができなかったり、形状保持性が不足したりするため、各種細胞、特に細胞塊を培養することが難しかった。一方、この架橋ゼラチンゲルに不足する形状保持性等の強度を補うために非生体分解性合成高分子を添加する、特許文献２に記載の足場材料は、細胞塊の培養をできることがあるが、コラーゲンやゼラチンと異なる繊維状の高分子を添加することで、透明性が低下し細胞を観察しにくいものとなったり、合成高分子の繊維が強固な構造を作ってしまい細胞が入り込めるスペースに制限が生じてしまい細胞増殖性が低下したりすることがあった。
【０００７】
本発明は、これら従来技術の課題を解決するものであり、スポンジ様の空洞構造を有する架橋ゼラチンゲルでありながら、適度な形状保持性や強度と、高い透明性を有する細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルであって、前記架橋ゼラチンゲルがゼラチンをエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体により架橋してなる細胞培養培地用の架橋ゼラチンゲル。
＜２＞  前記架橋ゼラチンゲルが、スポンジ様の構造を有する前記＜１＞記載の架橋ゼラチンゲル。
＜３＞  前記架橋ゼラチンゲルの厚みが、１００μｍ以上１００ｍｍ以下である前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の架橋ゼラチンゲル。
＜４＞  前記架橋ゼラチンゲルが、波長４００〜８００ｎｍにおける光線透過率が７０％以上である前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の架橋ゼラチンゲル。
＜５＞  前記架橋ゼラチンゲルの耐熱性が、４０℃以上である前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の架橋ゼラチンゲル。
＜６＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の架橋ゼラチンゲルを用いてなる細胞培養培地。
＜７＞  前記細胞培養培地が、スフェロイドを培養するための培地である前記＜６＞に記載の細胞培養培地。
＜８＞  ゼラチン、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体および溶媒を含む混合溶液中で前記ゼラチンと前記エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体とを架橋させる、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを製造する方法であって、
前記混合溶液中のゼラチン濃度が０．５〜１０重量％、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体濃度が０．５〜１０重量％であり、かつ混合溶液中のゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との重量比が５：１〜１：５であることを特徴とする細胞培養培地用の架橋ゼラチンゲルの製造方法。
＜９＞  前記混合溶液中でゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との架橋を、３０℃以上７０℃以下の温度で行う前記＜８＞に記載の架橋ゼラチンゲル。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、スポンジ様の構造を有する架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地でありながら、適度な強度を有し、かつ高い透明性を有する細胞培養培地が提供される。この培地は、特に、細胞塊として培養するための適度な空洞を必要とする細胞を培養するときに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）、（ｂ）いずれも、実施例の架橋ゼラチンゲル（１）の培地の断面写真である。
【図２】実施例の架橋ゼラチンゲル（２）の培地の断面写真である。
【図３】実施例の架橋ゼラチンゲル（３）の培地の断面写真である。
【図４】実施例の架橋ゼラチンゲル（４）の培地の断面写真である。
【図５】実施例１の細胞培養結果を示す顕微鏡観察写真である。
【図６】実施例２の細胞培養結果を示す顕微鏡観察写真である。
【図７】比較例１の細胞培養結果を示す顕微鏡観察写真である。
【図８】実施例の培地に培養された細胞数をＷＳＴ−８法により評価した結果である。
【図９】本発明の架橋ゼラチンゲルの光線透過率の波長依存性を測定した結果の１例である。
【図１０】本発明の架橋ゼラチンゲルの光線透過率の波長依存性を測定した結果の１例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を超えない限り、以下の内容に限定されない。
【００１３】
本発明は、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルであって、前記架橋ゼラチンゲルがゼラチンをエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体により架橋してなることを特徴とする架橋ゼラチンゲルである。このような構成とすることで、スポンジ様の空洞を有する培地でありながら、適度な形状保持性や強度を有し、かつ、透明性が高い細胞培養に適した培地して用いられる架橋ゼラチンゲルとすることができる。
【００１４】
本発明の架橋ゼラチンゲルは、溶媒中でゲル化した架橋ゼラチンのゲルを用いたものであり、これに培養しようとする細胞に合わせた成分を含有する溶液や粉末等の固体等を、適宜、添加して細胞培養培地として用いられるものである。本発明の細胞培養培地に用いられる架橋ゼラチンゲルは、ゼラチンをエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体により架橋することに特徴があり、原料となるゼラチンの溶液と、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体の溶液とを、混合し、所定の条件で架橋反応させることにより得られる。
【００１５】
「ゼラチン」
本発明は、ゼラチンを特定の架橋剤で架橋した架橋ゼラチンゲルを用いた培地である。
一般的に、ゼラチンは、いわゆる動物性タンパク質であるコラーゲンを熱、酸、アルカリ、酵素等により変性した水溶性の蛋白であるが、本発明においては、このような一般的なゼラチンはもちろん、本発明の架橋剤によって架橋することでゲル化し、培地として使用できるコラーゲンも、ゼラチンとして使用することができる。本発明に用いることができるゼラチンの平均分子量を例示すると、低分子量である３，０００以上１０，０００未満程度のものや、中分子量である１０，０００以上１００，０００未満のもの、高分子量である１００，０００以上５００，０００未満程度のものの、いずれも使用することができる。なお、ゼラチンの平均分子量はパギイ法第９版（２００２）により得られる分子量分布から求めることができる。
【００１６】
前記コラーゲンとしては、骨や皮や腱等の動物組織を原料として得られる従来公知のあらゆるコラーゲン、例えば、酸不溶化コラーゲン、中性塩不溶化コラーゲンのような不溶化コラーゲン；酸可溶化コラーゲン、中性塩可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンのような可溶化コラーゲン；これら不溶化もしくは可溶化コラーゲンを化学修飾（例えば、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等）したコラーゲン；可溶化コラーゲンからコラーゲン繊維を再生させた再生コラーゲン等が挙げられる。前記コラーゲンの分子種は、特に制限されないが、具体的には、例えば、豚皮由来Ｉ型コラーゲン、豚腱由来Ｉ型コラーゲン、牛鼻軟骨由来ＩＩ型コラーゲン、魚から抽出したＩ型コラーゲン等が好ましく挙げられる。
【００１７】
「エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体」
本発明の架橋ゼラチンゲルは、架橋剤として、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体を用いて架橋してなることを特徴とする。ここで、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体には、その開環重合体またはその塩も含む。エチレン性不飽和化合物としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、２−ブテン、イソブチレン等のオレフィン類、その他のエチレン性不飽和基を有する化合物が挙げられる。その開環重合体とは、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体に加水して開環した重合体、その塩とは開環重合体のアンモニウム塩、ナトリウム塩等の塩である。塩は上記酸共重合体または開環重合体と水酸化アンモニウム、または水酸化ナトリウム塩等を反応させて形成することができる。また、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体の構造の一部を極性の高い基に置換したり、さらに他のモノマー単位を加えたりすることで得られる共重合体を用いることもできる。このような、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン鎖共重合体を一部変性させたものとして、例えば、無水マレイン酸基を一部アンモニア変性させ、開環させたマレイミド単位とした構造を有する、共重合体等があげられる。
【００１８】
エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体はこれらのエチレン性不飽和化合物と無水マレイン酸との共重合体であり、エチレン性不飽和化合物と無水マレイン酸とのモル比は１０：１〜１：１０、好ましくは５：１〜１：５、平均分子量は、通常２，０００〜５，０００，０００であり、好ましくは３，０００〜３，０００，０００である。このようなエチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体としては市販品が用いられる。または、その開環重合体をモノマー単位とする場合、アンモニウム塩、ナトリウム塩等の塩における開環または塩に変換する割合は任意であるが、無水環の一部または全部を変換することができる。
【００１９】
本発明の架橋ゼラチンゲルには、ゲル化の程度や細胞培養培地としての適性を阻害しない範囲において、後述するような細胞培養培地に含まれる基本的な栄養成分等の他の添加物を含んでいてもよい。
【００２０】
［製造方法］
本発明の他の態様は、ゼラチン、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体および溶媒を含む混合溶液中で前記ゼラチンと前記エチレン性不飽和化合物とを架橋させる、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを製造する方法であって、
前記混合溶液中のゼラチン濃度が０．５〜１０重量％、エチレン性不飽和化合物濃度が０．５〜１０重量％であり、かつ混合溶液中のゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との重量比が５：１〜１：５であることを特徴とする架橋ゼラチンゲルの製造方法である。
【００２１】
架橋ゼラチンゲルを作成するにあたって、ゼラチン、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体および溶媒を含む混合溶液中のゼラチン濃度が０．５〜１０重量％、エチレン性不飽和化合物濃度が０．５〜１０重量％であり、かつ混合溶液中のゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との重量比が５：１〜１：５となるように混合し混合溶液を作成する。ここで、混合溶液中のゼラチン濃度と、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体濃度とは、それぞれ好ましくは、１〜１０重量％、より好ましくは３〜８重量％である。また、混合溶液中のゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との重量比は、５：１〜１：５であり、好ましくは、３：１〜１：３であり、より好ましくは１．５：１〜１：１．５である。この混合溶液の調整は、ゼラチン溶液と、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体溶液とをそれぞれ別々に調整して、これらの溶液を混合することで調整してもよいし、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物とを粉末等の固体の状態で秤量し、これを同じ溶液中に溶解させることで混合溶液を調整しても良い。
【００２２】
混合溶液の状態で、架橋反応をさせるため、ゼラチンおよびエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体の濃度が低い場合、架橋後の架橋ゼラチンゲルは空洞が多くなりすぎ、十分な形状保持性や強度を有する架橋ゼラチンゲルを得ることができないことがある。一方、混合溶液中のこれらの濃度が高い場合、架橋後の架橋ゼラチンゲルは密な構造となりすぎるため、細胞培養に適さないことがある。混合溶液中のこれらの濃度が、上記範囲のとき、得られる架橋ゼラチンゲルは、適度な空洞を有しつつ、かつ、形状保持性や強度を有し、細胞培養、特に、スフェロイドの培養に適した培地となる。
また、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物の重量比が、上記範囲内のとき、架橋が十分に行われやすい。この範囲から外れる場合、一方の成分が多くなりすぎる為、好ましい架橋ゼラチンゲルを得ることができなくなることがある。
【００２３】
混合溶液の溶媒としては、水性溶媒を用いる。ここで、水性溶媒とは、水を含む溶媒であり、水または、水と水溶性溶媒の混合物などが使用できる。このような水性溶媒としては、水、水とアルコールその他の水溶性成分等との混合物などが挙げられる。
【００２４】
前記混合溶液中でゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体とを架橋させることで、細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルを製造する。架橋は、前記ゼラチンと前記エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体との混合溶液とすることで、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体が架橋剤として機能し、時間経過に伴い、徐々に反応が進行することで架橋ゼラチンとなる。ここで、架橋するための好ましい条件として、混合溶液の温度が、２０〜７０℃、好ましくは３０℃〜６０℃の状態で架橋させることが好ましい。架橋には、このような温度条件で、５〜２４時間程度を要し、その間、温度が急激に上昇したり、低下したりしないことが好ましいため、一般的には、恒温槽内にて静置する。
【００２５】
このように、所定の濃度の混合溶液を作成し、架橋反応させることで、架橋ゼラチンゲルを得ることができる。架橋ゼラチンゲルを得るにあたっては、混合溶液を、目的に応じた容器（例えば、シャーレ等）内に分注する等して、当該容器内で架橋反応させることで、目的とする形状に合わせた培地用の架橋ゼラチンゲルとすることができる。
【００２６】
本発明の架橋ゼラチンゲルは、その厚みが、１００μｍ以上１００ｍｍ以下であることが好ましい。好ましくは５００μｍ以上１００ｍｍ以下、さらに好ましくは１ｍｍ以上１００ｍｍ以下である。従来の手法による架橋ゼラチンは強度が不足するため、例えば５０μｍ程度の薄膜として用いるか、補強剤等を添加する必要があった。しかし、本発明の架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地は、架橋剤として、エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体を用いて、所定の濃度の混合溶液を架橋させることで得られるもののため、十分な形状保持性や強度を有しているため、１００μｍ以上、特に好ましくは１ｍｍ以上とすることができる。このような厚みを有し、かつ、適度な空洞を有するスポンジ様の構造を有するため、本発明の細胞培養培地は、細胞塊の培養等に非常に適している。厚みは、一般的に、培養用のシャーレやフラスコ、プレート、チューブ等に合わせて適宜調整されるが、厚くしすぎると実験系を多くする際に手間がかかることがあるため、効率的ではない場合がある。
【００２７】
本発明の架橋ゼラチンゲルは、その厚みが１ｃｍのとき、波長４００〜８００ｎｍにおける光線透過率が７０％以上であることが好ましい。本発明の細胞培養培地は、前述した架橋ゼラチンゲルを用いたものである。この架橋ゼラチンゲルを構成する架橋ゼラチンは、十分な強度を有するため、白濁の原因となる繊維等の補強材を必要としないため、非常に透明性が高いものである。このため、波長４００〜８００ｎｍにおける光線透過率が７０％以上といった透明性を確保することができ、これによって、光学的な手法等によって、細胞培養している培地をそのまま観察しても、細胞の状態を観察しやすいものとすることができる。光線透過率は、８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上であることが好ましい。光線透過率が８０％以上の場合、吸光度として換算したときに０．１程度のため、後述する比色定量法等を行う際も、安定した定量値を得ることができる。なお、一般的に光線透過率は１００％以下であり、実際の測定値は通常９５％以下である。
【００２８】
本発明の架橋ゼラチンゲルのゼリー強度は５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。ゼリー強度は、培地の形状保持性の指標となるもので、ＪＩＳ  Ｋ６５０３のゼリー強度として測定することができる。本発明の架橋ゼラチンゲルは、細胞培養培地に用いられるものであり、特に細胞塊等の培養に適した適度な空洞を有するものである。このとき、細胞が培養される程度の強度があれば十分であるが、低すぎる場合、細胞培養の足場として不十分な場合があるため、一定の強度を有することが好ましい。
【００２９】
本発明の架橋ゼラチンゲルの耐熱性が４０℃以上であり、５０℃以上であることが好ましく、６０℃以上であることがより好ましい。このような耐熱性を有するため、本発明の架橋ゼラチンゲルを用いた培地は、細胞培養に適した温度である３０〜４０℃付近に、適当な形状安定性を有している。また、細胞培養培地は、滅菌処理することが多いが、本発明の架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地は、耐熱性に優れたものであるため、例えば５０〜８０℃の温度での殺菌処理を行うことができる。また、架橋ゼラチンゲルとして、架橋後の状態でなく、混合溶液を調整する過程で作成することがある、ゼラチン溶液やエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体溶液のそれぞれの溶液の状態で、加熱殺菌することもできる。ここで、本発明の架橋ゼラチンゲルの耐熱性とは、その温度に静置した時に、架橋ゼラチンゲルが液化するかで判断する。培地が液化しない温度の上限値を、耐熱性を有する温度とする。溶解性を確認するために必要な静置時間は、３０分以上であれば十分である。なお、本発明の細胞培養培地の滅菌は、紫外線処理や濾過処理等の他の手法によることもできる。
【００３０】
本発明の架橋ゼラチンゲルは、ゲル中の水分を維持する保湿性が高く、培地が乾燥しにくいため培地として用いやすい。また、形状保持性にも優れているため培地自体の形状維持性に優れている。また、乾燥しにくく、形状維持性がありながらも、適度な空洞を形成しているため、培地中の成分濃度が変化しにくいため、非常に取扱い性に優れている。
【００３１】
本発明は、前述した細胞培養培地として用いられる架橋ゼラチンゲルである。また、前記架橋ゼラチンゲルを用いてなる細胞培養培地である。前述した架橋ゼラチンゲルを、そのまま細胞培養培地として用いることもできるが、培養対象となる細胞に合わせて、架橋ゼラチンゲルを、さらに調整して使用することもできる。例えば、架橋ゼラチンゲルをそのまま培養液に浸して培地として使用したり、架橋ゼラチンゲルを減圧脱水あるいは凍結乾燥等させ、水分を除去させた乾燥状態としたところに、培養液を加えて架橋ゼラチンゲルを膨潤させたものを培地として使用したりすることができる。
【００３２】
培養液には、培養対象に応じて、様々な成分が含有、添加されるが、例えば、糖分、脂質、アミノ酸やミネラル、ビタミンといった細胞培養のための基本的な栄養成分や、細胞培養の増殖因子となる成分、細胞を遊走させる遊走因子、ｐＨ調整剤等が挙げられる。増殖因子としては、血清（特に、非働化処理を行った血清が好ましい）等を用いることができる。遊走因子としては、がん細胞や白血球を遊走させるケモカイン等を用いることができる。これらのペプチドやタンパク質性のものの他にも、薬剤等の低分子物質を添加することもできる。
【００３３】
本発明の細胞培養培地は、架橋ゼラチンゲルを用いた培地でありながら、適度な形状保持性や強度を有し、かつ高い透明性を有する優れたものであり、各種細菌や細胞の培養に適したものである。なかでも、適度な空洞を有するスポンジ様の構造をしているため、スフェロイドのような塊として培養することが求められる細胞の培養に非常に適したものである。
【００３４】
本発明の架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地により培養される細胞として、がん細胞が挙げられる。がん細胞は、液体培地では各細胞が独立した形状で培養されることが多い。しかし、人体内等ではがん細胞は、各細胞が独立した形状のままではなく、複数の細胞が凝集し、複数の階層を有し、全体として球状や、楕円形状等に似た形のいわゆるスフェロイド状となる。がん細胞の研究を、試験管やシャーレ内（いわゆる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の条件下で行うためには、このスフェロイド化する培地であることが望まれ、本発明の架橋ゼラチンゲルを用いて細胞培養培地を調製することで、スフェロイド化させて培養することができる。
【００３５】
本発明の架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地は、前述のように架橋ゼラチンゲル層が透明性に優れている。また、これに、適宜添加される培養液や、細胞を播種し培養したのちも一定の透明性を保持している。この透明性が優れていることから、本発明の細胞培養培地は、培養された細胞自身や酵素活性等の状態を調べるときに用いられる比色定量法や、顕微鏡観察に非常に適している。比色定量法を行うにあたっては、吸光度を測定する波長において培地に起因する吸光が低い（光線透過率が高い）ことが好ましく、本発明の培地はこれらの吸光が低いため、比色定量法の試験の作業が簡便となったり、測定結果が安定するといった優れた適性がある。このような試験として具体的には、ＭＴＴ試験や、ＭＴＳ試験、ＷＳＴ試験のような酵素活性の測定や、これらより求められる培養細胞の生存率、増殖率、細胞数の評価などが挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［架橋ゼラチンゲルの製造］
（原料）
・ゼラチン（ａ−１）：ニッピ社製“ＡＰ５０”
・ゼラチン（ａ−２）：ゼライス株式会社製“ＣＰＡＭ５”（本発明において、ゼラチンとして使用することができる加水分解コラーゲン）
・架橋剤（ｃ−１）：エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体である、クラレ社製“イソバン−１１０”（アンモニア変性イソブチレン―無水マレイン酸共重合体）
・水：ＲＯ水
【００３８】
「架橋ゼラチンゲル（１）の製造」
水にゼラチン（ａ−１）を溶解させ、ゼラチン５重量％溶液（Ａ−１）を調整した。一方、水に架橋剤（ｃ−１）を溶解させ、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）を調整した。前記、ゼラチン５重量％溶液（Ａ−１）５０ｍＬと、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）５０ｍＬとを、５０℃にて混合し、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸との混合溶液（１）を調整した。混合溶液（１）を、シャーレに分注し、５０℃雰囲気下にて２４時間静置して、架橋ゼラチンゲル（１）を得た。
【００３９】
「架橋ゼラチンゲル（２）の製造」
水にゼラチン（ａ−１）と加水分解コラーゲン（ａ−２）とを溶解させ、ゼラチン成分６重量％溶液（Ａ−２）を調整した（該溶液中の（ａ−１）：（ａ−２）との重量比は、１：５）。一方、水に架橋剤（ｃ−１）を溶解させ、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）を調整した。前記、ゼラチン６重量％溶液（Ａ−２）１００ｍＬと、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）２５ｍＬとを、５０℃にて混合し、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸との混合溶液（２）を調整した。混合溶液（２）をシャーレに分注し、５０℃雰囲気下にて２４時間静置して、架橋ゼラチンゲル（２）を得た。
【００４０】
「架橋ゼラチンゲル（３）の製造」
水にゼラチン（ａ−１）と加水分解コラーゲン（ａ−２）とを溶解させ、ゼラチン成分２８．５重量％溶液（Ａ−３）を調整した（該溶液中の（ａ−１）：（ａ−２）との重量比は、１：１）。一方、水に架橋剤（ｃ−１）を溶解させ、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）を調整した。前記、ゼラチン２８．５重量％溶液（Ａ−３）３５ｍＬと、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）２５ｍＬとを、５０℃にて混合し、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸との混合溶液（３）を調整した。混合溶液（３）をシャーレに分注し、５０℃雰囲気下にて２４時間静置して、架橋ゼラチンゲル（３）を得た。
【００４１】
「架橋ゼラチンゲル（４）の製造」
水にゼラチン（ａ−１）と加水分解コラーゲン（ａ−２）とを溶解させ、ゼラチン成分３７．５重量％溶液（Ａ−４）を調整した（該溶液中の（ａ−１）：（ａ−２）との重量比は、１：２）。一方、水に架橋剤（ｃ−１）を溶解させ、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）を調整した。前記、ゼラチン３７．５重量％溶液（Ａ−４）４０ｍＬと、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）２５ｍＬとを、５０℃にて混合し、ゼラチンとエチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸との混合溶液（４）を調整した。混合溶液（４）をシャーレに分注し、５０℃雰囲気下にて２４時間静置して、架橋ゼラチンゲル（４）を得た。
【００４２】
「架橋ゼラチンゲル（１）〜（４）の断面写真」
架橋ゼラチンゲル（１）〜（４）を凍結乾燥して、その断面を顕微鏡観察した。架橋ゼラチンゲル（１）の断面図を図１（ａ）、（ｂ）に、架橋ゼラチンゲル（２）の断面図を図２に、架橋ゼラチンゲル（３）の断面図を図３に、架橋ゼラチンゲル（４）の断面図を図４に示す。図に示すように、本発明の架橋ゼラチンゲルはスポンジ様の構造を有している。図１の（ａ）（左側）と（ｂ）（右側）は、倍率を変更したものである。
【００４３】
［細胞の培養］
前述の方法で製造した架橋ゼラチンゲルを用いて、ヒト膵臓がん細胞株ＫＬＭ−１（以下、「ＫＬＭ−１」）を培養した。
【００４４】
（原料）
・酸処理ゼラチン：ニッピ社製“ＡＰ５０”
・アルカリ処理ゼラチン：宏榮化成株式会社製“ＪＳ２００”
・架橋剤：エチレン性不飽和化合物―無水マレイン酸共重合体である、クラレ社製“イソバン−１１０”（アンモニア変性イソブチレン―無水マレイン酸共重合体）
・水：ＲＯ水
【００４５】
・プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製“９６ウェルマルチウェルプレート平底（型番：３５３０７２）”）
【００４６】
・架橋ゼラチンゲル培地用の混合溶液
「混合溶液（５）の作成」
（１）溶媒として水を用いた１％（ｗ（重量）／ｖ（容量））酸処理ゼラチン溶液と、５％（ｗ／ｖ）架橋剤溶液とを等量ずつ混合して架橋ゼラチンゲル培地用の混合溶液（５´）を調整した。（最終濃度は、酸ゼラチン０．５％（ｗ／ｖ）、架橋剤２．５％（ｗ／ｖ））
（２）前記混合溶液（５´）を０．２２μｍフィルタ（メーカー：ＡＤＶＡＮＴＥＣ  商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＡＳ  型番：２５ＡＳ０２０ＡＳ）を用いてろ過滅菌して、滅菌した架橋ゼラチンゲル培地用の混合溶液（５）を得た。
【００４７】
「混合溶液（６）の作成」
前記混合溶液（５）の作成工程において、酸処理ゼラチンに代えて、アルカリ処理ゼラチンを用いた以外は、同じ工程で混合溶液（６）を得た。
【００４８】
［がん細胞の培養］
・培地の容器：上記のプレートを用いた。
・培養液の調整：ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチ社製：“Ｒ８７５８”組成）に非働化ウシ胎児血清を最終濃度１０容量％となるように加えたものを、がん細胞培養用の培養液（１）として用いた。
・がん細胞培養液：前記培養液（１）に、ＫＬＭ−１を培養して、ＫＬＭ−１培養液を調整した。培地に播種した時のＫＬＭ−１培養液中の細胞濃度は５ｘ１０4ｃｅｌｌ／ｍＬであった。
【００４９】
「実施例１」
９６ウェルマルチウェルプレートに、前記混合溶液（５）（酸処理ゼラチン培地）を１００μＬ添加し、温度５０℃にて一晩静置し、固化させることで架橋ゼラチンゲル培地（５）を得た。この架橋ゼラチンゲル培地（５）に、ＫＬＭ−１培養液を１００μＬ播種した。その後、温度３７℃、５％ＣＯ2および飽和水蒸気圧下で、培養した。
【００５０】
「実施例２」
９６ウェルマルチウェルプレートに、前記混合溶液（６）（アルカリ処理ゼラチン培地）を１００μＬに添加し、温度５０℃にて一晩静置し、固化させることで架橋ゼラチンゲル培地（６）を得た。この架橋ゼラチンゲル培地（６）に、ＫＬＭ−１培養液を１００μＬ播種した。その後、温度３７℃、５％ＣＯ2および飽和水蒸気圧下で、培養した。
【００５１】
「比較例１」
（コントロール培地）
９６ウェルマルチウェルプレートに、架橋ゼラチンゲル培地を設けることなく、ＫＬＭ−１培養液を１００μＬ播種した。その後、温度３７℃、５％ＣＯ2および飽和水蒸気圧下で、培養した。
【００５２】
［結果］
「顕微鏡による観察像」
実施例１、２および比較例１にて３日間培養したのちの各細胞を、位相差顕微鏡で観察した。図５に実施例１、図６に実施例２、図７に比較例１の観察像を示す。
図５や図６に示すように、実施例１、２には、細胞塊として培養されているがん細胞を確認することができた。一方、図７に示すように、比較例１では、がん細胞を培養することができたが、細胞塊としての成長はみられなかった。
【００５３】
「ＷＳＴ−８法による細胞数の評価」
実施例１、２および比較例１にて３日間培養したのちの各培地における細胞数を、ＷＳＴ−８法により評価した。実施例１、２および比較例１にて３日間培養したのちの各培地に、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（同仁化学研究所社製）を１０μＬずつ添加した。その後、温度３７℃、５％ＣＯ2および飽和水蒸気圧下で、２時間培養し呈色反応を進行させた。呈色反応を進行させた各培地の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定結果を図８に示す。なお、ＷＳＴ−８法は、本法に用いられる試薬が細胞のミトコンドリアによって還元され波長４５０ｎｍにおける吸光度が上昇することを利用して、細胞の相対的な数（ミトコンドリア数に依存するミトコンドリアの還元活性）を評価するものである。
【００５４】
比較例１の吸光度は、およそ２．２５であり、実施例１、２の吸光度はおよそ０．２５であった。本発明の細胞培養培地は、透明性に優れているため、このような呈色試験に適しており、吸光度の測定が容易であった。がん細胞培養において、細胞塊（スフェロイド）が形成されると、細胞数の増殖速度は低下することが知られている。本実施例の結果は、この知見と一致するものであり、呈色試験の結果からも実施例１、２の培地に培養されている細胞は、細胞塊を形成していることが確認された。
【００５５】
「架橋ゼラチンゲルの光線透過率」
前記混合溶液（１）を用いて得られる架橋ゼラチンゲル（１）を、厚み１ｃｍに調整し、分光光度計「Ｕ−１８００」（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、その光線透過率を測定した。測定結果を図９に示す。図９に示すように、架橋ゼラチンゲル（１）は、波長４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光線の範囲において、光線透過率が８０％以上の非常に高い透明性を有していることが確認された。
【００５６】
「架橋ゼラチンゲル（７）の製造およびその光線透過率」
水にアルカリ処理ゼラチン（宏榮化成株式会社製“ＪＳ２００”）を溶解させ、ゼラチン５重量％溶液（Ａ−５）を調整した。一方、水に架橋剤（前記クラレ社製“イソバン−１１０”）を溶解させ、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）を調整した。前記、ゼラチン５重量％溶液（Ａ−５）５０ｍＬと、架橋剤５重量％溶液（Ｃ−１）５０ｍＬとを、５０℃にて混合し、ゼラチンと架橋剤との混合溶液（７）を調整した。混合溶液（７）を、５０℃雰囲気下にて２４時間静置して、架橋ゼラチンゲル（７）を得た。この架橋ゼラチンゲル（７）を厚み１ｃｍに調整し、分光光度計「Ｕ−１８００」（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、その光線透過率を測定した。測定結果を図１０に示す。図１０に示すように、架橋ゼラチンゲル（１）は、波長４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光線の範囲において光線透過率が８０％以上の非常に高い透明性を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明に係る細胞培養培地は、架橋ゼラチンゲルを用いた細胞培養培地であって、その優れた透明性や、強度、溶液調整の自由度の高さから、各種細菌や細胞の培養に適している。特に、適度な空洞を有するスポンジ様の構造を有しているため、スフェロイドの培養に適しており、がん細胞のような細胞塊としての特性を評価、分析するために適したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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