(57)【要約】      （修正有）【課題】磁力により容易に分離・回収可能で、生体分子を固定化することができ、かつ非特異的な吸着が抑制された、特に、粒径が小さいリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子の製造方法を提供する。【解決手段】超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、少なくとも１の下記式（１）：2014222152.tif 000020で表されるグラフト鎖とからなり、かつ粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、少なくとも１の下記式（１）：
【化１６】
2014222152.tif 000018
（式中、
ｍは２〜６であり、
ｎは２〜５００であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｓ１は単結合又は２価の有機基であり、
Ｔは生体分子固定可能な官能基である）
で表されるグラフト鎖とからなり、
かつ粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項２】
超常磁性ナノ粒子が、粒径２０nm以下の酸化鉄系の微粒子である、請求項１に記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項３】
超常磁性ナノ粒子が、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含む、請求項１又は２に記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項４】
疎水性ポリマーを構成するモノマーが、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項５】
生体分子固定可能な末端官能基が、カルボキシル基若しくはその活性エステル、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基、又はブロモアセトアミド基である、請求項１〜４のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項６】
式（１）で表されるグラフト鎖が、下記式（１′）：
【化１７】
2014222152.tif 000019
（式中、ｎは２〜５００であり、ｏは１〜１０である）
で表されるものであるか、又はその末端カルボン酸の活性エステル誘導体である、請求項１〜５のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【請求項７】
ｎが、３〜３０である、請求項１〜６のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁力により容易に分離し回収することができ、生体分子の非特異的な吸着が抑制された、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を特定の粒子に捕捉させることは、生体分子の分離、精製、測定、検出等を行う手段として非常に有用である。
【０００３】
生体分子を特定の粒子に捕捉させることによって、例えば、感染症や癌のバイオマーカーやホルモン等の検査対象物質を患者から検出して診断すること、核酸やタンパク質等の特定の生体分子を分離・定量すること、特定の細菌や細胞を分離することができる。
【０００４】
そのため、生体分子を捕捉することができる粒子（生体分子捕捉粒子）について広く検討が行われている。例えば特許文献１には、磁性粒子表面に重合開始基を導入し、当該重合開始基を重合開始源としてリビング重合反応を行い、磁性粒子表面にポリマーをグラフト化して得られた磁性ポリマー粒子が開示されている。磁性粒子をポリマーで被覆することによって、ポリマーの有する各種機能を磁性粒子に付与することができる。
【０００５】
ところで、このような生体分子捕捉粒子について問題となるのが、生体分子補足粒子が捕捉することを目的としていない非対象物を捕捉してしまう、非特異的吸着である。非特異的吸着は、非対象物と生体分子補足粒子との物理的・化学的な相互作用によっておこる現象である。
【０００６】
このような非特異的吸着により、精製や分離が不十分となったり、測定結果が不正確となる可能性がある。そこで非特異的吸着を低減するために従来行われているのが、ブロッキングと言われる方法である。ブロッキングは、生体分子捕捉物質を粒子上に固定化した後に、夾雑物の吸着量が少ないアルブミンやカゼイン等のバイオ分子系ブロッキング剤で粒子表面を被覆する方法である。しかし、ブロッキング剤の被覆効果が十分得られない場合や、ブロッキング剤の変質等によってその作用が経時的に変化し非特異的吸着が発生する場合がある。このため、ブロッキング剤による非特異的吸着の低減は不十分なものであった。
【０００７】
このような背景のもと、非特異的吸着をさらに低減させるため、粒子を各種機能性ポリマーで処理する技術が開発された。
【０００８】
例えば特許文献２には、非磁性体核粒子を磁性体層で被覆し、さらにその磁性体層を、２，３−ジヒドロキシプロピル基を含むポリマー（その水酸基の一部が、トシルオキシ基又はカルボキシアルキルカルボニルオキシ基に変換されている）層で被覆された磁性粒子が開示されている。２，３-ジヒドロキシプロピル基の存在により非特異的吸着が抑制される。さらに前記ポリマー層における各種官能基を、生体分子捕捉物質と結合させることによって、前記磁性粒子に生体分子捕捉機能を導入することができる。なお、磁性粒子は磁力により容易に分離・回収することができることから、この分野において広く利用されている。
【０００９】
また、ホスホリルコリン基を有するポリマーに非特異的吸着を抑制する作用があることが知られている。例えば特許文献３には、生体分子捕捉物質が固定化されたマイクロ粒子であって、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合されてなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子が、表面に被覆されていることを特徴とするマイクロ粒子が開示されている。
【００１０】
また、例えば非特許文献１には、磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆するポリスチレンからなるコア粒子が、ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリル酸エステル由来の繰り返し単位を含むポリマーで被覆された磁気粒子について開示されている。非特許文献１には、磁気粒子の粒径が約１μmであったこと、ポリマーの末端にカルボキシル基を導入し、カルボキシル基を介してストレプトアビジンの固定化と、ストレプトアビジン−ビオチン結合を用いることで、粒子上にＤＮＡを固定化することができたこと、そして非特異的な吸着がほとんど見られなかったことも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−３２８３０９号公報
【特許文献２】特許第４７１６０３４号公報
【特許文献３】特開２００６−２０１０９１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】福田義人、金野智浩、石原一彦、“単一細胞遺伝子発現解析での使用を目指したリン脂質ポリマー被覆磁気ビーズの創製”、第２０回日本ＭＲＳ学術シンポジウム予稿集、２０１０年１２月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献３や非特許文献１に開示されたリン脂質ポリマー被覆粒子は、粒径がマイクロメートルオーダーと大きく、その特異的吸着量も十分とは言い難いものであった（下記の比較例１参照）。したがって本発明は、磁力により容易に分離・回収可能で、生体分子を固定化することができ、かつ生体分子の非特異的な吸着が抑制された、リン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子であって、特に、粒径が小さく、特異的吸着量が改善されたリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子、並びにそのようなリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリル酸エステル由来の繰り返し単位及び生体分子固定可能な末端官能基を含むグラフト鎖とからなり、粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子、並びにそのようなリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子の製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．  超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、少なくとも１の下記式（１）：
【化１】
2014222152.tif 000002
（式中、
ｍは２〜６であり、
ｎは２〜５００であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｓ１は単結合又は２価の有機基であり、そして
Ｔは生体分子固定可能な官能基である）
で表されるグラフト鎖とからなり、かつ粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００１６】
２．  超常磁性ナノ粒子が、粒径２０nm以下の酸化鉄系の微粒子である、上記１に記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００１７】
３．  超常磁性ナノ粒子が、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含む、上記１又は２に記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００１８】
４．  疎水性ポリマーを構成するモノマーが、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である、上記１〜３のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００１９】
５．  生体分子固定可能な末端官能基が、カルボキシル基若しくはその活性エステル、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基、又はブロモアセトアミド基である、上記１〜４のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００２０】
６．  式（１）で表されるグラフト鎖が、下記式（１′）：
【化２】
2014222152.tif 000003
（式中、ｎは２〜５００であり、ｏは１〜１０である）
で表されるものであるか、又はその末端カルボン酸の活性エステル誘導体である、上記１〜５のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【００２１】
７．  ｎが３〜３０である、上記１〜６のいずれかに記載のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、磁力により容易に分離・回収可能で、生体分子を固定化することができ、かつ生体分子の非特異的な吸着が抑制されたものであると同時に、粒径が小さく、特異的吸着量が改善されたポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子、並びにそのようなリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の、動的光散乱（ＤＳＬ）を用いて測定された粒径分布図である。
【図２】実施例２で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の、動的光散乱（ＤＳＬ）を用いて測定された粒径分布図である。
【図３】比較例１で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の、動的光散乱（ＤＳＬ）を用いて測定された粒径分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
≪ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子≫
本発明は、超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、少なくとも１の下記式（１）：
【化３】
2014222152.tif 000004
（式中、
ｍは２〜６であり、
ｎは２〜５００であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｓ１は単結合又は２価の有機基であり、そして
Ｔは生体分子固定可能な官能基である）
で表されるグラフト鎖とからなり、かつ粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子に関する。
【００２６】
＜疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子＞
【００２７】
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子と該超常磁性ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子をコアとするものである。ここで、超常磁性ナノ粒子としては、粒径２０nm以下、好ましくは粒径５〜２０nmの酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含むことが好ましい。さらにこのような磁性体は、チタンカップリング剤、シランカップリング剤若しくは高級脂肪酸等の公知の疎水化処理剤により処理されたものであってもよい。
【００２８】
疎水性ポリマーは、水性溶媒との親和性に乏しいポリマーであり、疎水性ポリマーをコアに用いることにより、本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子に機械的強度や耐熱性を付与することができる。疎水性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、スチレン、α―メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー、（メタ）アクリロニトリル等のニトリル基含有モノマー、炭素数４以上のアルキル基を有するメタクリル酸エステル、ブタジエン等のジエン類等が挙げられる。好ましくは、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である。疎水性ポリマーは、一種のモノマーからなるホモポリマーであっても、二種以上のモノマーからなるコポリマーであってもよい。
【００２９】
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子におけるコアである、超常磁性ナノ粒子と該超常磁性ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子は、粒径を小さくするため、疎水性モノマーを、超常磁性ナノ粒子、アニオン性界面活性剤及び重合開始剤の存在下で乳化重合させて得られたものであることが好ましい。非特許文献１記載の方法とは異なり、アニオン性界面活性剤の存在下で乳化重合することにより、粒径をナノオーダーに制御することできる。
【００３０】
＜グラフト鎖＞
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、コアである前記疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に、少なくとも１の下記式（１）：
【化４】
2014222152.tif 000005
（式中、
ｍは２〜６であり、
ｎは２〜５００であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｓ１は単結合又は２価の有機基であり、そして
Ｔは生体分子固定可能な官能基である）
で表されるグラフト鎖を有する。
【００３１】
ｎは、ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリル酸エステル由来の繰り返し単位の数を意味し、代表的には、２〜５００であり、特異的吸着量の改善の観点から、より好ましくは１０〜１００である。
【００３２】
Ｒは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を意味する。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、iso−イソプロピル基、ｎ−ブチル基、iso−ブチル基、sec−ブチル基又はtert−ブチル基が挙げられる。Ｒは、好ましくは水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは水素原子又はメチル基である。
【００３３】
Ｓ１は、ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリル酸エステル由来の繰り返し単位と、後述する生体分子固定可能な官能基Ｔとを結ぶ架橋基を意味し、単結合又は２価の有機基を意味する。そのような２価の有機基は、生体分子固定可能な官能基Ｔを導入するために使用される化合物から誘導される。代表的には、Ｓ１は、下記式（ａ）又は（ｂ）：
【化５】
2014222152.tif 000006
（式中、Ｓ２は炭素数１〜１０のアルキレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−及びそれらの２以上の組み合わせから選択される２価基である）
で表される２価の有機基である。このような２価の有機基を誘導しうる化合物は、クリックケミストリー試薬として、フナコシ（株）、Sigma-Aldrich等の試薬供給業者より入手することができる。
【００３４】
Ｔは、生体分子固定可能な官能基であり、例えば、カルボキシル基若しくはその活性エステル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基、又はブロモアセトアミド基等が挙げられる。
【００３５】
前記活性エステル基とは、カルボニルオキシ基に電子吸引性の基や嵩高い基が結合してなるエステル基である。このようなエステル結合はアミノ基、チオール基及び水酸基などによって容易に求核置換反応等の反応を受けるので、この活性エステルの部分に生体分子を反応させることにより、本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子に生体分子を固定することができる。カルボキシル基及びエポキシ基も同様に反応性の高い基で、この部分に生体分子を反応させることができる。なお、生体分子に活性エステル基、カルボキシル基又はエポキシ基と反応し得る部位が無い場合には、公知の方法で、例えばアミノ基のようなこれらの基と反応し得る基を生体分子に導入すればよい。
【００３６】
前記活性エステル基は、例えば下記式（ｃ）又は（ｄ）の構造で示される基である。
【００３７】
【化６】
2014222152.tif 000007
【００３８】
式（ｃ）及び式（ｄ）において、Ｒ′およびＲ″は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状又は環状のいずれであってもよい。また、式（ｄ）において、二つのＲ″はそれらが結合するＮとともに環を形成してもよい。
【００３９】
このような活性エステル基の具体例として、下記構造の基が挙げられる。
【化７】
2014222152.tif 000008
【００４０】
これらの他に、活性エステル基として、ペンタフルオロフェノールのエステル基、チオフェノールのエステル基；５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基及びＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等の複素環ヒドロキシ化合物のエステル基；並びにシアノメチルエステル基が挙げられる。
【００４１】
式（１）で表されるグラフト鎖の好ましい具体的な態様は、下記式（１′）：
【化８】
2014222152.tif 000009
（式中、ｎは２〜５００であり、ｏは１〜１０の整数を表す）
で示されるもの、又はその末端カルボン酸の活性エステル誘導体である。
【００４２】
＜粒径＞
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、粒径が５００nm以下である。ここで粒径は、動的光散乱を用いて測定された粒度分布図（頻度分布）から読み取れるモード径を意味する。したがって、本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、モード径が５００nm以下であり、好ましくは４００nm以下、より好ましくは３５０nm以下、特に好ましくは３００nm以下である。
【００４３】
≪ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の製造方法≫
本発明はまた、超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、少なくとも１の下記式（１）：
【化９】
2014222152.tif 000010
（式中、
ｍは２〜６であり、
ｎは２〜５００であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｓ１は単結合又は２価の有機基であり、そして
Ｔは生体分子固定可能な官能基である）
で表されるグラフト鎖とからなり、かつ粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００４４】
本発明の製造方法は、具体的には、
（１）疎水性モノマーを、超常磁性ナノ粒子、アニオン性界面活性剤及び重合開始剤の存在下で乳化重合させて疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子を得る工程；
（２）重合開始基を導入しうるモノマーを、工程（１）で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子、界面活性剤及び重合開始剤の存在下で乳化重合させて該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子に重合開始基を導入する工程；
（３）該重合開始基と式（２）：
【化１０】
2014222152.tif 000011
（式中、ｍは２〜６であり、Ｒは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基である）
で表されるモノマーを原子移動ラジカル重合させ、該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に、少なくとも１の、末端に重合開始基を有するグラフト鎖を形成する工程；
（４）グラフト鎖の末端に生体分子固定可能な官能基を導入する工程
を含む、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の製造方法に関する。
【００４５】
工程（１）では、疎水性モノマーを、超常磁性ナノ粒子、アニオン性界面活性剤及び重合開始剤の存在下で乳化重合させて疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子を得る。上述のとおり、アニオン性界面活性剤の存在下で乳化重合を実施することにより、粒径をナノオーダーに制御することできる。
【００４６】
工程（１）で使用できる疎水性モノマーとしては、例えば、スチレン、α―メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー、（メタ）アクリロニトリル等のニトリル基含有モノマー、エチレン、プロピレン等のα−オレフィン類、ブタジエン等のジエン類等が挙げられる。疎水性モノマーは、一種のモノマーを使用してもよいが、二種以上のモノマーを使用してもよい。
【００４７】
工程（１）で使用できる超常磁性ナノ粒子としては、上述のとおり、粒径２０nm以下、 好ましくは粒径５〜２０nmの酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含むことが好ましい。さらにこのような磁性体は、チタンカップリング剤、シランカップリング剤若しくは高級脂肪酸等の公知の疎水化処理剤により処理されたものであってもよい。
【００４８】
工程（１）における、超常磁性ナノ粒子とモノマーの使用量は、重量比で超常磁性ナノ粒子１に対してモノマーが２〜６が好ましい。
【００４９】
工程（１）で使用できるアニオン性界面活性剤としては、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ペルフルオロノナン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩等のカルボン酸型；１−ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロブタンスルホン酸、トルエンスルホン酸ナトリウム、クメンスルホン酸ナトリウム、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム、ナフタレントリスルホン酸三ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸型；ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム等の硫酸エステル型；ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸カリウム等のリン酸エステル型を挙げることができ、中でもドデシル硫酸ナトリウムのようなアルキル硫酸エステル塩類の存在下で乳化重合を実施するのが好ましい。
【００５０】
工程（１）で使用できる重合開始剤としては、ラジカル発生剤であれば、特に限定はないが、例えば、過酸化ラウロイル、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ開始剤が挙げられる。
【００５１】
工程（１）における、アニオン性界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度以上となるようにした。また、重合開始剤の使用量は、疎水性モノマー対して０．０１〜１０重量％が好ましい。
【００５２】
乳化重合は、疎水性モノマー、超常磁性ナノ粒子、アニオン性界面活性剤及び重合開始剤を水等の極性溶媒中に、必要であれば、助剤として疎水性有機溶媒（例えば、クロロホルム）を用いたり、超音波ホモジナイザー等を用いて、分散、乳化させたのち、例えば、０〜１００℃の温度で、０．５〜２４時間実施する。
【００５３】
工程（２）では、シード乳化重合により該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子に重合開始基を導入する。すなわち、工程（１）で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子をシードとし、重合開始基を導入しうるモノマーを、界面活性剤及び重合開始剤の存在下で乳化重合させ、該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子に重合開始基を導入する。
【００５４】
工程（２）で使用できる重合開始基を導入しうるモノマーとしては、続く工程（３）のグラフト鎖の形成に、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法を採用することから、重合開始基としてハロゲン原子、特に塩素（Ｃｌ）又は臭素（Ｂｒ）原子を導入することができるモノマーが挙げられる。そのようなモノマーとしては、エチレン性不飽和基と、臭素原子とを有するモノマーが挙げられ、例えば、２−（２-ブロモイソブチリルオキシ）エチルメタクリラート、１０−ウンデセニル ２−ブロモイソブチラート等を用いることが好ましい。
【００５５】
工程（２）では、重合開始基の導入量を調整する観点から、重合開始基を導入しうるモノマーに加えて、他のモノマーを使用してもよい。他のモノマーは、エチレン性不飽和基を有するモノマーであれば特に限定はないが、工程（１）で挙げた疎水性モノマーに加え、（メタ）アクリル酸若しくはその炭素数１〜１８のアルキルエステル等の（メタ）アクリラートモノマー；メタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミドモノマー；Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルアミド／ビニルエステルモノマー等が挙げられる。
【００５６】
工程（２）で使用できる界面活性剤としては、工程（１）で挙げたアニオン性界面活性剤に加え、モノ、ジ若しくはトリアルキルアミン塩酸塩等のアルキルアミン塩型、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩型、塩化ドデシルピリジニウム等のピリジニウム塩型のカチオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のエーテル型、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のエステルエーテル型のノニオン性界面活性剤が挙げられる。中でもドデシル硫酸ナトリウムのようなアルキル硫酸エステル塩類の存在下で乳化重合を実施するのが好ましい。
【００５７】
工程（２）で使用できる重合開始剤としては、工程（１）で挙げた重合開始剤と同様に、ラジカル発生剤であれば特に限定はないが、例えば、過酸化ラウロイル、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ開始剤が挙げられる。
【００５８】
工程（２）における、界面活性剤の濃度は臨界ミセル濃度以上となるようにした。また、重合開始剤の使用量は、モノマーに対して０．０１〜１０重量％が好ましい。
【００５９】
シード乳化重合は、工程（１）で得られた疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子、重合開始基を導入しうるモノマー、界面活性剤及び重合開始剤を水等の極性溶媒中に、必要であれば、超音波ホモジナイザー等を用いて分散、乳化させたのち、例えば、０〜１００℃の温度で、０．５〜２４時間実施する。
【００６０】
工程（３）では、該重合開始基と式（２）：
【化１１】
2014222152.tif 000012
（式中、ｍ及びＲは上記と同義である）
で表されるモノマーを原子移動ラジカル重合させ、該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に少なくとも１のグラフト鎖を形成する。
【００６１】
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）は、分子量や分子量分布、官能性や組成などのポリマー構造の制御に優れた技術として知られている。工程（３）は、代表的には、溶媒中で、工程（２）で得られた重合開始基を導入した磁性ナノ粒子と、式（２）で表されるモノマーを、触媒の存在下で反応させることにより実施される。
【００６２】
工程（３）で使用できる式（２）で表されるモノマーとしては、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（２−エチルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、２−（２−プロピルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、２−（２−ブチルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン等が挙げられる。好ましくは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が用いられる。例えばＭＰＣは、公知の方法（例えば、Polymer Journal, Vol. 22, No. 5,(May 1990), pp. 355-360参照）により調製することにより、あるいは東京化成工業（株）等の試薬供給業者より入手することができる。
【００６３】
工程（３）で使用できる触媒としては、原子移動ラジカル重合に使用できる触媒として公知のものであれば特に限定はないが、例えば、遷移金属錯体、具体的には、銅、チタン、鉄、コバルト、ニッケル、モリブデン又はルテニウム等の遷移金属化合物と窒素含有配位子とをベースとする触媒が挙げられる。ここで遷移金属化合物としては、塩化銅（Ｉ）若しくは塩化銅（II）、臭化銅（Ｉ）若しくは臭化銅（II）、塩化チタン（II）、塩化チタン（III）若しくは塩化チタン（IV）、臭化チタン（IV）、塩化鉄（II）若しくは塩化鉄（III）、臭化鉄（II）若しくは臭化鉄（III）、塩化コバルト（II）、臭化コバルト（II）、塩化ニッケル（II）、臭化ニッケル（II）、塩化モリブデン（III）、塩化モリブデン（V）又は塩化ルテニウム（III）等を用いることができる。窒素含有配位子としては、２，２′−ビピリジル、４，４′−ジメチル−２，２′−ジピリジル、４，４′−ジ−tert−ブチル−２，２′−ジピリジル、４，４′−ジノニル−２，２′−ジピリジル等のビピリジル配位子；Ｎ−ブチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−オクチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−ドデシル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−オクタデシル−２−ピリジルメタンイミン等のアルキルピリジルメタンイミン配位子；Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−ペンタメチルジエチレントリアミン、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン等のアルキルアミン配位子；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン等の環状アミン配位子；トリス（２−ピリジルメチル）アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン等のピリジルメチルアミン配位子等を用いることができる。好ましくは、銅と窒素含有配位子とをベースとする触媒、特に、銅（Ｉ）化合物とビピリジル配位子とをベースとする触媒が挙げられる。
【００６４】
工程（３）で使用できる溶媒としては、原子移動ラジカル重合に使用できる溶媒として公知のものであれば特に限定はないが、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；メタノール、エタノール等の炭素数１〜４のアルコール類；ジメチルスルホキシド、水等が挙げられる。
【００６５】
工程（３）は、さらに必要であれば、還元剤の存在下で実施してもよい。還元剤により、酸素による金属錯体の失活を低減することができ、ひいては金属錯体の使用量を減らすこともできる。そのような還元剤としては、原子移動ラジカル重合法に使用できる還元剤として公知のものであれば特に限定はないが、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ開始剤、アスコルビン酸若しくはその塩、グルコース、ヒドラジン、銅（０）等が挙げられる。
【００６６】
工程（３）により、本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子のコアである、疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に、少なくとも１の下記式（２′）： 
【化１２】
2014222152.tif 000013
（式中、ｍ、ｎ及びＲは上記と同義であり、Ｘはハロゲン原子、特に塩素又は臭素原子である）
で表される、末端に重合開始基を有するグラフト鎖を形成することができる。
【００６７】
工程（４）では、グラフト鎖の末端に生体分子固定可能な官能基を導入する。工程（３）で形成されたグラフト鎖の末端の重合開始基（ハロゲン原子）と、生体分子固定可能な官能基を有する化合物を、公知の方法により反応させることにより、特に、該末端重合開始基（ハロゲン原子）をアジド源と反応させてアジド化し、次いで生体分子固定可能な官能基を有するアルキン化合物と反応させることにより（いわゆる、クリック反応により）、グラフト鎖の末端に生体分子固定可能な官能基を導入することができる。
【００６８】
末端重合開始基（ハロゲン原子）とアジド源との反応は、溶媒中、工程（３）で得られたＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子とアジド源とを反応させることにより実施される。この反応により、ＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子の末端重合開始基（ハロゲン原子）が、アジド基に変換される。
【００６９】
アジド化で使用できるアジド源としては、例えば、アジ化リチウム（水溶液）、アジ化ナトリウム、アジ化セシウム、アジドトリメチルシラン、アジ化テトラブチルアンモニウム、４−カルボキシベンゼンスルホニルアジド、４−アセトアミドベンゼンスルホニルアジド等が挙げられる。
【００７０】
アジド化で使用できる溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；メタノール、エタノール等の炭素数１〜４のアルコール類；ジメチルスルホキシド、水等が挙げられる。
【００７１】
続く、ＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子の末端アジド基と生体分子固定可能な官能基を有するアルキン化合物との反応（いわゆる、クリック反応）は、溶媒中、銅触媒及び還元剤の存在下又は非存在下に実施される。
【００７２】
クリック反応で使用できる生体分子固定可能な官能基を有するアルキン化合物は、クリックケミストリー試薬として、フナコシ（株）、Sigma-Aldrich等の試薬供給業者より入手することができる。例えば、末端アジド基との反応により、生体分子固定可能な官能基Ｔと共に、架橋基Ｓ１として、下記式（ａ）： 
【化１３】
2014222152.tif 000014
（式中、Ｓ２は炭素数１〜１０のアルキレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−及びそれらの２以上の組み合わせから選択される２価基である）
で表される２価の有機基を形成するアルキン化合物としては、２−プロピン酸、３−ブチン酸、４−ペンチン酸、５−ヘキシン酸、６−ヘプチン酸、１０−ウンデシン酸等のカルボキシル基を有するアルキン化合物及びその活性エステル誘導体；プロパルギルアルコール、３−ブチン−１−オール、５−ヘキシン−１−オール等の水酸基を有するアルキン化合物のｐ−トルエンスルホナート誘導体及びグリシジルエーテル誘導体；プロパルギルアミン、３−ブチニルアミン、４−ペンチニルアミン、２−メチル−３−ブチン−２−アミン、４−エチニルアニリン等のアミノ基を有するアルキン化合物及びそのブロモアセトアミド誘導体等が挙げられる。
【００７３】
さらに、末端アジド基との反応により、生体分子固定可能な官能基Ｔと共に、架橋基Ｓ１として、下記式（ｂ）：
【化１４】
2014222152.tif 000015
（式中、Ｓ２は炭素数１〜１０のアルキレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−及びそれらの２以上の組み合わせから選択される２価基である）
で表される２価の有機基を形成するアルキン化合物としては、種々のシクロオクチン誘導体化合物が知られているが、代表的には、DBCO-Acid、DBCO-NHS ester、DBCO-sulfo-NHS ester、DBCO-S-S-NHS ester、DBCO-PEG4-Acid、DBCO-Amine等が挙げられる。その具体的な構造は、以下のとおりである。
【００７４】
【化１５】
2014222152.tif 000016
【００７５】
クリック反応で使用できる溶媒としては、特に限定はないが、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；メタノール、エタノール等の炭素数１〜４のアルコール類；ジメチルスルホキシド、水等が挙げられる。
【００７６】
クリック反応で使用できる銅触媒としては、臭化銅（Ｉ）、ヨウ化銅（Ｉ）、酢酸銅（II）、硫酸銅（II）又はその水和物等を挙げることができる。還元剤としては、代表的には、アスコルビン酸若しくはその塩等が挙げられる。
【００７７】
さらに必要であれば、クリック反応は、窒素含有配位子の存在下で実施してもよい。窒素含有配位子により、銅触媒による付加環化の効率を高めることができる。そのような窒素含有配位子としては、トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン、トリス（２−ベンゾイミダゾリルメチル）アミン等を挙げることができる。
【００７８】
なお、クリックケミストリー試薬の種類によっては、銅触媒及び還元剤を添加しなくともよい。例えば、式（ｂ）で表される２価の有機基を形成するアルキン化合物であるシクロクチン誘導体は、環の歪みから活性化エネルギーが低く、触媒なしでも容易にアジドと反応することができる。
【００７９】
このような製造方法により、本発明の超常磁性ナノ粒子と該ナノ粒子の周囲を被覆する疎水性ポリマーとからなる疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子と；該疎水性ポリマー被覆磁性ナノ粒子の表面に存在する、リン脂質由来の繰り返し単位及び生体分子固定可能な末端官能基を含むグラフト鎖とからなり、粒径が５００nm以下である、ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子を得ることができる。なお、生体分子固定可能な末端官能基は、目的とする官能基を有するクリックケミストリー試薬を使用することによって導入してもよいが、クリックケミストリー試薬との反応後、該試薬の有する官能基を、適宜、目的とする官能基に変換してもよい。例えば、クリックケミストリー試薬として水酸基を有するアルキン化合物を末端アジド基と反応させ、次いで水酸基をｐ−トルエンスルホナート化又はグリシジルエーテル化し、生体分子固定可能な官能基がトシル基又はエポキシ基であるポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子を調製してもよい。
【００８０】
≪ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の用途≫
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、グラフト鎖の末端に生体分子固定可能な官能基を有することから、生体分子を固定化することができる。この生体分子は、標的となる生体分子に特異的に相互作用する物質であれば特に制限されない。前記特異的な相互作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。
【００８１】
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、ホスホリルコリン構造を有する繰り返し単位及び生体分子固定可能な末端官能基を含むグラフト鎖を有することから、非特異的吸着が抑制されると考えられる。
【００８２】
本発明のポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子は、標的ではない生体分子の非特異的吸着が生じ難い、優れた生体分子捕捉粒子として利用することができる。より具体的には、感染症や癌のバイオマーカーやホルモン等の検査対象物質を患者から検出して診断を行ったり、核酸やタンパク質等の特定の生体分子を分離・定量したり、特定の細菌や細胞を分離することができる。
【００８３】
そのような生体分子の具体例としては、核酸、アプタマー、タンパク質、ペプチド、糖鎖および糖タンパク質が挙げられる。例えば、前記タンパク質としては、酵素、抗体、抗原等が挙げられる。
【実施例】
【００８４】
以下に、本発明を具体的な実施例により示すが、本発明は実施例の内容のみに制限されるものではない。
【００８５】
実施例中で用いた略号は、以下の意味を有する：
ＤＶＢ-＝ジビニルベンゼン、
ＬＰＯ＝過酸化ラウロイル、
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム、
ＢＩＥＭ＝２−（２-ブロモイソブチリルオキシ）エチルメタクリラート、
ＳＤＢＳ＝ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、
ＫＰＳ＝過硫酸カリウム、
ＭＰＣ＝２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、
ｂｐｙ＝２，２’−ビピリジン、
ＥＢＩＢ＝α−ブロモイソ酪酸エチル、
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド、
ＰＶＰ＝ポリビニルピロリドン。
【００８６】
［実施例１］ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の調製
（１）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子の合成
疎水性コート酸化鉄（粒径約１０ｎｍ）１．０ｇとクロロホルム１．５ｇとを混合して超音波ホモジナイザーにて分散させた分散液に、スチレンモノマー３．０ｇを加えた後、減圧によりクロロホルムを除去し、酸化鉄のスチレンモノマー分散液を得た。
次いで、上記分散液にＤＶＢ ０．１６ｇとＬＰＯ ６０．９ｍｇを加え、次いで水５０ｍＬに溶かしたＳＤＳ ０．１４ｇを混合して超音波ホモジナイザーにて乳化させた。
得られた乳化液を２００ｍＬフラスコに投入し、アルゴン置換を行った後、６０℃で２０時間、乳化重合を行うことによりポリスチレン被覆磁性ナノ粒子を得た。
【００８７】
（２）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子へ重合開始基の導入
工程（１）で得たポリスチレン被覆磁性ナノ粒子０．６０ｇを１ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＢＳ水溶液１００ｍＬに分散させた分散液に、ＢＩＥＭ ０．３０ｇを加え、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した後、水１ｍＬに溶かした開始剤ＫＰＳ １８．３ｍｇを添加して、６０℃で１６時間、乳化重合を行うことにより重合開始基（Ｂｒ）を導入した磁性ナノ粒子を得た。
【００８８】
（３）重合開始基を導入した磁性ナノ粒子へのＭＰＣポリマーブラシの導入
ＭＰＣ ３．０ｇ、ＣｕＢｒ ０．０１７ｇ、ｂｐｙ ０．０３５ｇをメタノールに溶かして、ＭＰＣモノマー濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ溶液とした。溶液をアルゴン置換した後、工程（２）で得た重合開始基を導入した磁性ナノ粒子０．２ｇと開始剤ＥＢＩＢ １４．９μＬを添加して、濃度が、ＭＰＣモノマー：ＣｕＢｒ：ｂｐｙ：ＥＢＩＢ＝１００：１：２：１（モル比）となるようにした。２０℃で２４時間、原子移動ラジカル重合を行い、ＭＰＣポリマーブラシ（ｎ＝１００）を有する磁性ナノ粒子を得た。
【００８９】
（４）末端Ｂｒ基の末端アジド基への変換
工程（３）で得たＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子０．２ｇとメタノール：アセトニトリル＝７：３溶媒２０ｍＬに溶かしたアジ化ナトリウム７１．６ｍｇを５０℃、８時間反応させることにより末端官能基をアジド基に変換した磁性ナノ粒子を得た。
【００９０】
（５）末端アジド基の末端カルボキシル基への変換
硫酸銅５水和物３．２ｍｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム２５．０ｍｇ、４−ペンチン酸１１．８ｍｇをＤＭＳＯ：水=１：１溶媒１２ｍＬに溶かし、工程（４）で得たＭＰＣポリマーブラシ末端にアジド基を有する磁性ナノ粒子０．２ｇと混合して室温、１４時間反応させることにより末端官能基をカルボキシル基に変換したポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子を得た。
【００９１】
［比較例１］ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の調製
（１）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子の合成
疎水性コート酸化鉄（粒径約１０ｎｍ）０．５０ｇ、スチレンモノマー３．０ｇ、ＤＶＢ ０．１６ｇ、ＬＰＯ ６２．２ｍｇを混合した分散液と、ＰＶＰ １．２ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、亜硝酸ナトリウム５．４ｍｇを水５０ｍＬに溶かした溶液を混合して超音波ホモジナイザーにて乳化させた。
得られた乳化液を２００ｍＬフラスコに投入し、アルゴン置換を行った後、７０℃で２４時間、乳化重合を行うことによりポリスチレン被覆磁性ナノ粒子を得た。
【００９２】
（２）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子へ重合開始基の導入
工程（１）で得たポリスチレン被覆磁性ナノ粒子０．６７ｇを１ｍｇ／ｍＬ ＳＤＢＳ水溶液１００ｍＬに分散させた分散液に、ＢＩＥＭ ０．３４ｇとＤＶＢ ６８．１ｍｇを加え、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した後、水１ｍＬに溶かした開始剤ＫＰＳ ２０．３ｍｇを添加して、７０℃で１４時間、乳化重合を行うことにより重合開始基（Ｂｒ）を導入した磁性ナノ粒子を得た。
【００９３】
（３）重合開始基を導入した磁性ナノ粒子へのＭＰＣポリマーブラシの導入
ＭＰＣ２．３ｇ、ＣｕＢｒ０．０１３ｇ、ｂｐｙ０．０２４ｇをメタノールに溶かして、ＭＰＣモノマー濃度０．７ｍｏｌ／Ｌ溶液とした。溶液をアルゴン置換した後、工程（２）で得た重合開始基を導入した磁性ナノ粒子０．５ｇと開始剤ＥＢＩＢ １０．５μＬを添加して、濃度が、ＭＰＣモノマー：ＣｕＢｒ：ｂｐｙ：ＥＢＩＢ＝１００：１：２：１（モル比）となるようにした。２０℃で２４時間、原子移動ラジカル重合を行い、ＭＰＣポリマーブラシ（ｎ＝１００）を有する磁性ナノ粒子を得た。
【００９４】
（４）末端Ｂｒ基の末端アジド基への変換
工程（３）で得たＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子０．２ｇとメタノール：アセトニトリル＝１：１溶媒２０ｍＬに溶かしたアジ化ナトリウム０．１３ｇを室温、２４時間反応させることにより末端官能基をアジド基に変換した磁性ナノ粒子を得た。
【００９５】
（５）末端アジド基の末端カルボキシル基への変換
硫酸銅５水和物５．２ｍｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム４０．２ｍｇ、４−ペンチン酸９８．１ｍｇをエタノール：水＝１：１溶媒２０ｍＬに溶かし、工程（４）で得たＭＰＣポリマーブラシ末端にアジド基を有する磁性ナノ粒子７５．０ｍｇと混合して室温、２４時間反応させることにより末端官能基をカルボキシル基に変換したポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子を得た。
【００９６】
［実施例２］ポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子の調製
（１）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子の合成
疎水性コート酸化鉄（粒径約１０ｎｍ）０．９９ｇとクロロホルム１．６ｇとを混合して超音波ホモジナイザーにて分散させた分散液に、スチレンモノマー３．１ｇを加えた後、減圧によりクロロホルムを除去し、酸化鉄のスチレンモノマー分散液を得た。
次いで、上記分散液にＤＶＢ ０．１５ｇとＬＰＯ ５９．７ｍｇを加えた溶液と、次いで水５０ｍＬに溶かしたＳＤＳ ０．１５ｇを混合して超音波ホモジナイザーにて乳化させた。
得られた乳化液を２００ｍＬフラスコに投入し、アルゴン置換を行った後、６０℃ で２１時間、乳化重合を行うことによりポリスチレン被覆磁性ナノ粒子を得た。
【００９７】
（２）ポリスチレン被覆磁性ナノ粒子へ重合開始基の導入
工程（１）で得たポリスチレン被覆磁性ナノ粒子０．２０ｇを１ｍｇ／ｍＬ ＳＤＢＳ水溶液５０ｍＬに分散させた分散液にＢＩＥＭ ０．１０ｇを加え、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した後、水１ｍＬに溶かした開始剤ＫＰＳ ７．１ｍｇを添加して、６０℃で１７時間、乳化重合を行うことにより重合開始基（Ｂｒ）を導入した磁性ナノ粒子を得た。
【００９８】
（３）重合開始基を導入した磁性ナノ粒子へのＭＰＣポリマーブラシの導入
ＭＰＣ３．０ｇ、ＣｕＢｒ０．１４ｇ、ｂｐｙ０．３１ｇをメタノールに溶かして、ＭＰＣモノマー濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ溶液とした。溶液をアルゴン置換した後、工程（２）で得た重合開始基を導入した磁性ナノ粒子０．０７ｇと開始剤ＥＢＩＢ  ０．１５ｍＬを添加して、濃度が、ＭＰＣモノマー：ＣｕＢｒ：ｂｐｙ：ＥＢＩＢ＝１０：１：２：１（モル比）となるようにした。２０℃で２４時間、原子移動ラジカル重合を行い、ＭＰＣポリマーブラシ（ｎ＝１０）を有する磁性ナノ粒子を得た。
【００９９】
（４）末端Ｂｒ基の末端アジド基への変換
工程（３）で得たＭＰＣポリマーブラシを有する磁性ナノ粒子０．０７ｇとメタノール：アセトニトリル＝７：３溶媒１０ｍＬに溶かしたアジ化ナトリウム３３．２ｍｇを室温、２６時間反応させることにより末端官能基をアジド基に変換した磁性ナノ粒子を得た。
【０１００】
（５）末端アジド基の末端カルボキシル基への変換
硫酸銅５水和物３．０ｍｇ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム２３．７ｍｇ、４−ペンチン酸１２．１ｍｇをＤＭＳＯ：水=１：１溶媒１２ｍＬに溶かし、工程（４）で得たＭＰＣポリマーブラシ末端にアジド基を有する磁性ナノ粒子０．０７ｇと混合して室温、１８時間反応させることにより末端官能基をカルボキシル基に変換したポリマーブラシ層被覆磁性ナノ粒子を得た。
【０１０１】
（粒径分布測定）
実施例１及び２、並びに比較例１の各工程（１）で得られたポリスチレン被覆磁性ナノ粒子を水に分散させ、動的光散乱（ＤＬＳ） を用いて粒径分布を測定した。結果を図１〜３に示す。
【０１０２】
（特異的吸着の程度）
実施例１〜２及び比較例１で得られた磁性粒子１０ｍｇを１５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させ、磁性粒子を磁気分離にて洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬの水溶性カルボジイミドを加え、室温で回転攪拌機にて２０分間攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて回収、上清を除去後、１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ溶液（Sigma Aldrich製、Protein A from Staphylococcus aureus Soluble, Cowan strain, recombinant, expressed in E. coli, aqueous solution, ≧９５％（ＨＰＬＣ）を１５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈）を加え、室温で回転攪拌機にて一晩攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて回収し、ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄後、更にＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄を行った。磁気分離にて上清を除去後、５倍希釈したウサギ血清（VECTOR LABORATRIES. INC. 製Serum, Rabbit, NormalをＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈）を加え、室温で回転攪拌機にて１時間攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて回収し、ＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄後、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．８）を加え、室温で回転攪拌機にて１５分攪拌した。その後磁性粒子と反応液を磁気にて分離し、反応液における２８０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の測定には株式会社日立ハイテクフィールディング製の分光光度計（Ｕ−３５００）を用いた。この吸光度には主として磁性粒子に特異的に捕捉されたウサギ抗体ＩｇＧの量が反映される。この吸光度とウサギ抗体ＩｇＧのモル吸光係数（A280（１ｍｇ／ｍＬ）≒１．４）から反応液中のウサギ抗体ＩｇＧ量が算出される。算出されたウサギ抗体ＩｇＧ量を表１に示す。実施例１〜２は比較例１の３倍以上の抗体捕捉量であった。また、実施例２は実施例１より抗体捕捉量が約２０％増加した。
【０１０３】
（磁気応答性）
実施例１〜２及び比較例１で得られた磁性粒子２ｍｇをＰＢＳ緩衝液に分散させ、磁石を近づけてから、液の色が透明になるまでの時間（磁性粒子を完全に回収するまでの時間）を測定した。結果を表１に示す。実施例１〜２は比較例１より磁気応答性が勝っていた。
【０１０４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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