(57)【要約】【課題】  アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞を用いて、アルカリホスファターゼを効率的に分泌生産させるためのシグナル配列（シグナルペプチド）を提供すること。【解決手段】  マウスまたはチャイニーズハムスター由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチドを、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナル配列として利用することで前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなる、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナルペプチド。
【請求項２】
アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドと、
当該ポリヌクレオチドの５’末端側にインフレームに連結された、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、
を含む、哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるための発現ベクター。
【請求項３】
アルカリホスファターゼが配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
配列番号４から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
配列番号８から１３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項２から５のいずれかに記載の発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションして得られる、アルカリホスファターゼを分泌生産可能な細胞。
【請求項７】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項６または７に記載の細胞を培養し、得られた培養液からアルカリホスファターゼを回収する、アルカリホスファターゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞を用いて、アルカリホスファターゼを効率的に分泌生産させるためのシグナル配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）は、アルカリ性に至適ｐＨを有する、基質選択性の低いホスホモノエステラーゼである。アルカリホスファターゼの多くは活性中心に亜鉛を有しており、大腸菌等の原核生物から哺乳動物等の真核高等生物にいたるまで、自然界に広く存在することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
アルカリホスファターゼは分子生物学分野や免疫診断分野において汎用されている有用性の高い酵素である。例えば分子生物学分野では、仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下ＣＩＰと表記）や北極小エビ由来のアルカリホスファターゼや大腸菌由来のアルカリホスファターゼ等が、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端の脱リン酸化に利用されている。またヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼ（特に分泌型に改変したもの）は、宿主細胞への外来遺伝子導入の効率を判定するためのレポーターとして利用されている。一方免疫診断分野では、比活性の高いＣＩＰが、抗体の標識酵素として利用されている。
【０００４】
またアルカリホスファターゼは、高等動物の腸管において栄養の吸収に関わっているほか、グラム陰性菌由来の毒素を脱リン酸化して解毒する働きもあり（例えば、非特許文献２および非特許文献３）、細菌感染症または敗血症等の治療や診断への応用展開も期待されている（例えば、特許文献１および特許文献２）。
【０００５】
アルカリホスファターゼの中でもＣＩＰは比活性が高いため免疫診断分野用途での有用性が高く、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞と表記）（非特許文献４）やメタノール資化性酵母（特許文献３）を宿主細胞とした、組換えＣＩＰの生産が開示されている。
【０００６】
ＣＨＯ細胞は異種タンパク質を生産させる目的で最も汎用されている宿主細胞であり、生産性を向上させるための技術開発が盛んになされている。ＣＨＯ細胞を用いて分泌タンパク質を生産させようとした場合、メッセンジャーＲＮＡから翻訳されたばかりの新生ポリペプチドが小胞体に分泌される過程が生産性に係るボトルネックの一つと考えられている。そこで、この問題を解消するために、これまでに様々なシグナル配列が報告されている（例えば、特許文献４および特許文献５）。しかしながら、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を利用した、アルカリホスファターゼの効率的な分泌生産に適した、シグナル配列については、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平９−５０２３４２号公報
【特許文献２】特表２００２−５３３６７９号公報
【特許文献３】特許第３６５７８９５号公報
【特許文献４】特表２０１０−５２８６３４公報
【特許文献５】国際公開２００８／０００４４５号
【特許文献６】特開平６−２８４８８５号公報
【特許文献７】特開２００４−１８７６５２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＭｃＣｏｍｂら、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ、  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）
【非特許文献２】Ｐｏｅｌｓｔｒａら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５１（４）、１１６３−１１６９（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｅｕｍｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、３０７（２）、７３７−７４４（２００３）
【非特許文献４】Ｍａｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（３６）、２３３５３−２３３６０（１９９８）
【非特許文献５】Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９０（３）、７３２−７４０（１９９３）
【非特許文献６】Ｍａｓｈｕｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８（１）、１２９−１４１（１９９３）
【非特許文献７】Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８，６７３−６７６（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞を用いて、アルカリホスファターゼを効率的に分泌生産させるためのシグナル配列（シグナルペプチド）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、マウスまたはチャイニーズハムスター由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチドを用いることで、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを効率的に分泌生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の態様を包含する。
【００１２】
（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなる、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナルペプチド。
【００１３】
（２）アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドの５’末端側にインフレームに連結された配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとを含む、哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるための発現ベクター。
【００１４】
（３）アルカリホスファターゼが配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２）に記載の発現ベクター。
【００１５】
（４）配列番号４から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、（３）に記載の発現ベクター。
【００１６】
（５）配列番号８から１３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、（４）に記載の発現ベクター。
【００１７】
（６）（２）から（５）のいずれかに記載の発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションして得られる、アルカリホスファターゼを分泌生産可能な細胞。
【００１８】
（７）哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、（６）に記載の細胞。
【００１９】
（８）（６）または（７）に記載の細胞を培養し、得られた培養液からアルカリホスファターゼを回収する、アルカリホスファターゼの生産方法。
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるマウス由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチド、または配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるチャイニーズハムスター由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチドを、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナルペプチドとして利用することを特徴としている。
【００２２】
ＭＭＰ−９とはマトリックスメタロプロテアーゼファミリーに属するタンパク質分解酵素のひとつであり、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２１、ＭＭＰ−２８とともに分泌型マトリックスメタロプロテアーゼに分類される。マウス由来のＭＭＰ−９は、転移性腫瘍のセルラインから得られた１０５ｋＤａゼラチナーゼ（非特許文献５）やマクロファージのセルラインから得られたゼラチナーゼＢ（非特許文献６）と同じものであり、そのアミノ酸配列は公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＨ４６９９１）。ＭＭＰ−９は、ヒト、サル、ラット、チャイニーズハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシのようなマウス以外の哺乳動物にも存在し、さらに鳥類、両性類、魚類に由来するものも知られている。このうちチャイニーズハムスターのＭＭＰ−９のアミノ酸配列は、ＣＨＯ細胞のゲノム解析により明らかにされている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＸＭ＿００３５００５７５）。
【００２３】
本発明においてシグナルペプチドとは、メッセンジャーＲＮＡから翻訳されたばかりの新生ポリペプチドを小胞体にターゲットする役目を持つ２０前後のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドのことを指し、多くの場合前記ポリペプチドのＮ末端側に存在する。小胞体に分泌される過程においてシグナルペプチダーゼによる切断を受けるため、成熟したポリペプチドには存在しないことが多い。
【００２４】
本発明における、アルカリホスファターゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナルペプチドとして利用する、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドはＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＨ４６９９１中１番目から１９番目までのアミノ酸残基に相当するオリゴペプチドであり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドはＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＸＭ＿００３５００５７５中１番目から１９番目までのアミノ酸残基に相当するオリゴペプチドである。
【００２５】
本発明において発現ベクターとは、設計した遺伝子を機能発現させるための環状または直鎖状のポリヌクレオチドのことをいう。発現ベクターの構成要素としては、機能発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドの５’末端側にインフレームに連結したシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、転写活性化配列（プロモーター／エンハンサー）、転写終結配列、薬剤耐性や栄養要求性などのマーカー遺伝子、宿主細胞内でプラスミドとして増殖するために必要な複製開始点、などが含まれる。ここでインフレームに連結とは、（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド同士が同じ読み取り枠で翻訳されるように配置することを指す。マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン抵抗性遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシンＢ抵抗性遺伝子）、ブラスティサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティサイジン抵抗性遺伝子）といった薬剤耐性遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子といった栄養要求性に関わる遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子など光学的な識別を可能にする遺伝子等、トランスフェクションに用いる哺乳動物細胞において発現可能な選択マーカーをコードする遺伝子の中から適宜選択して使用すればよい。
【００２６】
なお本発明の発現ベクターに、大腸菌で働くｃｏｌＥ１複製開始点のような、動物細胞以外で働く複製開始点を含んでもよく、大腸菌で発現可能な選択マーカー（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン／カルベニシリン耐性遺伝子））を含んでもよい。前述したβ−ラクタマーゼ遺伝子とｃｏｌＥ１複製開始点とを含んだ、本発明の発現ベクターで大腸菌を形質転換し、当該組換え大腸菌をカルベニシリン入りの培地で培養することで、本発明の発現ベクターを大量に調製することができる。例えば、プラスミドｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ社製）やプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献７）などが、本発明の発現ベクターを作製するための材料として好適に用いることができる。
【００２７】
本発明におけるアルカリホスファターゼの由来に特に限定はないものの、比活性の高い仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）が好ましい。ＣＩＰの一例として、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＮ１９３９１）や、当該ポリペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側にオリゴペプチドの付加または欠失が生じた誘導体や、当該ポリペプチドのうち１から数アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された誘導体があげられる。なおＣＩＰを含め哺乳動物由来のアルカリホスファターゼの多くは膜結合性のため、細胞外に分泌させるためにはアルカリホスファターゼのＣ末端側２０から３０アミノ酸残基にあるＧＰＩアンカー領域を除去すると好ましい（例えば、特許文献３および特許文献６）なお、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるアルカリホスファターゼはＧＰＩアンカーが除去されたアルカリホスファターゼである。さらにＧＰＩアンカーの除去により細胞外に分泌されるようになったアルカリホスファターゼの精製や検出を容易にするため、Ｃ末端側にタグ配列を付加してもよい。タグ配列としては、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグが例示できる。
【００２８】
アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドの５’末端側にインフレームで連結されたシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学合成やｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素合成などを組み合わせることで合成できる。前記ポリヌクレオチドを用いて発現ベクターを作製する際は、その上流に転写活性化配列（プロモーター／エンハンサー）を配置すると好ましい。転写活性化配列はトランスフェクションに用いる哺乳動物細胞で機能するものであれば特に限定されるものではなく、恒常的に活性化されているものであっても、外部条件によって調節可能なものであってもよい。例えば、恒常的に活性化されているものとしては、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターが例示でき、調節可能なものとしては、例えばＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）が例示できる。
【００２９】
本発明のベクターに含まれる、アルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドの５'末端側にインフレームに連結された配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの一例として、
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにマウスＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）をＮ末端側に付加したポリペプチド（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号９および配列番号１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）、
（ｂ）Ｎ末端側にマウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド（配列番号１）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにそれぞれ付加したポリペプチド（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８および配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにチャイニーズハムスターＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号２）をＮ末端側に付加したポリペプチド（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）、および
（ｄ）Ｎ末端側にチャイニーズハムスターＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号２）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）、
があげられる。
【００３０】
本発明の発現ベクターでトランスフェクションさせる宿主細胞は哺乳動物細胞であり、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）、マウスミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が例示できる。中でもＣＨＯ細胞が本発明の発現ベクターでトランスフェクションさせる宿主細胞として好ましい。ＣＨＯ細胞の株に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ｄｈｆｒ遺伝子欠損株であるＤＧ４４細胞やＤＸＢ１１細胞が例示できる。
【００３１】
本発明の発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションするには、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、といった当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して行なえばよい。トランスフェクションの際に用いる本発明の発現ベクターは環状のポリヌクレオチドであってもよく、適切な制限酵素で消化することで得られた直鎖状のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、プラスミドｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ中に１ヶ所存在する制限酵素ＰｖｕＩの認識部位はベクターを直鎖状にする目的で用いることができる。なお前記場合には、ｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯに挿入するポリヌクレオチド中に制限酵素ＰｖｕＩの認識部位を含まないよう設計するとよい。
【００３２】
本発明の発現ベクターでトランスフェクションして得られた組換え哺乳動物細胞は、当業者が通常用いる方法で単クローン化し、単クローン化した細胞を培養して得られた培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜することで、所望のアルカリホスファターゼ生産性を有した組換え細胞を選抜することができる。なお前記選抜した組換え細胞に対して、さらに本発明の発現ベクターを導入し、そこから単クローン化した組換え細胞を培養することで、アルカリホスファターゼ活性が更に上昇した組換え細胞を選抜してもよい。
【００３３】
また本発明の発現ベクターに共発現可能な選択マーカーを含んでいる場合、当該選択マーカーに対応した選択培地で培養することにより、当該選択マーカーが発現している組換え細胞群を選択し、当該選択した細胞群を単クローン化後、培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜してもよい。一例として、共発現可能なｄｈｆｒ遺伝子を含む本発明の発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に導入し、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まない選択培地でｄｈｆｒ遺伝子が発現している細胞群を増殖させ、当該細胞群から単クローン化した細胞を培養して培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜する方法があげられる。なお選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を用いた場合、組換え細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）を含んだ培地で培養し、導入した遺伝子の増幅を誘導することで、アルカリホスファターゼ活性が更に上昇した組換え細胞を選抜してもよい。
【００３４】
アルカリホスファターゼ活性は、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質に用いた加水分解反応により測定できる。一例として反応温度２５℃で、ｐＨ９からｐＨ１０の緩衝液（例えば、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６））中で、アルカリホスファターゼ活性による加水分解反応で生じるｐ−ニトロフェノールを波長４０５ｎｍにおける吸光度で定量することにより、酵素活性を算出することができる。なお前記緩衝液に、ウシ血清アルブミンのような酵素活性への影響が少ないタンパク質や、塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩や、塩化亜鉛のような亜鉛塩などを適量加えてもよい。アルカリホスファターゼ活性測定の具体的態様として、試料溶液５μＬを加えたマイクロウェルプレート（ＮＵＮＣ社製、カタログ番号２６９６２０）に、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（以下ｐＮＰＰと略記する）と、０．１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ａ７０３０）と、０．１ｍＭ塩化マグネシウムと、０．０１ｍＭ塩化亜鉛とを含んだ、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）（ｐＮＰＰ基質溶液）を１００μＬ添加し、２５℃で一定時間保温後、０．５Ｍの水酸化ナトリウム１００μＬ加えることで反応を停止し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した後、アルカリホスファターゼを含まない試料溶液を用いて同様に得た測定値の吸光度を差し引くことで測定する方法があげられる。試料溶液の濃度や反応の時間は実験的に定めればよく、吸光度の値が２以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下になるように条件を定めればよい。
【００３５】
またアルカリホスファターゼは抗体を利用して定量することができる。例えばアルカリホスファターゼがＣＩＰの場合、天然（仔牛小腸からの抽出精製品）のＣＩＰを抗原として作製した抗ＣＩＰ抗体を担体（例えば、マイクロウェルプレート）に固定化し、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキング後、適度に希釈したアルカリホスファターゼを含む試料溶液を添加し一定時間反応後、Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離を行ない、ｐＮＰＰ基質溶液と反応させ、固定化した抗ＣＩＰ抗体に結合したアルカリホスファターゼを既知の濃度の天然のＣＩＰを標準試料として測定し、比色定量すればよい。なお前記Ｂ／Ｆ分離後、固定化した抗ＣＩＰ抗体とは別の、アルカリホスファターゼ以外の酵素で標識した抗ＣＩＰ抗体と一定時間反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、前記標識した酵素の基質を作用させて標識酵素の活性測定を行ない、既知の濃度の天然のＣＩＰを標準試料として用いた比色定量（いわゆるエンザイムイムノアッセイ）を行なってもよい。
【００３６】
また適当なタグを付加したアルカリホスファターゼを定量する場合は、抗タグ抗体を利用した測定が可能である。例えば、Ｃ末端側にＨｉｓタグを付加したアルカリホスファターゼの場合、Ｃ末端側のＨｉｓタグを特異的に認識する市販の抗Ｈｉｓタグ抗体を利用すればよく、前記アルカリホスファターゼ以外の酵素で標識した酵素標識抗体の代わりに、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識した抗Ｈｉｓタグ抗体と一定時間反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、その後ペルオキシダーゼの基質を作用させてペルオキシダーゼ活性を測定することで定量することができる。
【００３７】
本発明の発現ベクターでトランスフェクションして得られた、アルカリホスファターゼを分泌生産可能な組換え哺乳動物細胞を培養するための培地は、当業者が通常用いる培地中から適宜選択すればよく、一例として、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）  １６４０培地、Ｌ−１５培地、ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ；Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）、ハムのＦ１２培地、にそれぞれ５から１０％容量のウシ胎児血清を加えた培地があげられる。また分泌生産されたアルカリホスファターゼを効率よく精製するために、ウシ胎児血清を添加しない、いわゆる無血清培地を使用してもよい。なお無血清培地を使用する場合、多くの細胞の生育に必要とされるインシュリンやトランスフェリンを添加すると好ましい。さらに上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦＩおよびＩＧＦＩＩ）等の成長因子や、プロスタグランジンや、セルロプラスミンや、高密度リポタンパク質や、低密度リポタンパク質や、ウシ血清アルブミンや、脂肪酸等を、組換え哺乳動物細胞の生育や、アルカリホスファターゼの分泌生産や、アルカリホスファターゼの精製に好ましい範囲で培地に添加してもよい。具体例として組換え哺乳動物細胞がｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞であるＤＧ４４細胞の場合は、ヒポキサンチンとチミジンを含んでいる培地、例えばＣＤ  ＣＨＯ培地（商品名、ライフテクノロジーズ社製）にグルタミンを添加した培地を用いて培養するとよく、ｄｈｆｒ遺伝子を含む本発明のベクターでトランスフェクションして得られたＤＧ４４細胞の場合は、ヒポキサンチンとチミジンを含んでいない培地、例えば、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（商品名、ライフテクノロジーズ社製）にグルタミンを添加した培地を用いて培養するとよい。なおプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８（商品名、ライフテクノロジーズ社製）のような非イオン性界面活性剤や、市販のペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を適宜培地に加えてもよい。
【００３８】
本発明の発現ベクターでトランスフェクションして得られた、アルカリホスファターゼを分泌生産可能な組換え哺乳動物細胞を培養する際の、容器、温度、ＣＯ２濃度、振とう条件（エアレーション）などの外的な培養条件に特に制限はなく、例えば、組換え哺乳動物細胞がＤＧ４４細胞の場合、培養液３０ｍＬを入れた２００ｍＬ容のフラスコで、温度３７℃、ＣＯ２濃度８％、振とう速度１３５ｒｐｍで培養することで、効率よく組換え哺乳動物細胞を培養することができる。培養液中の細胞密度の測定は、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して測定すればよい。例えば、細胞が懸濁している培養液を採取し、採取した培養液と同容量の市販のトリパンブルー染色液（例えば、商品名０．４ｗ／ｖ％  Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬社製）と混合して、染色されない細胞（生細胞）の数を、顕微鏡下で溶液血球計算盤を用いて計測し算出すればよい。
【００３９】
本発明の発現ベクターでトランスフェクションして得られた、アルカリホスファターゼを分泌生産可能な組換え哺乳動物細胞の培養液から、アルカリホスファターゼを回収するには、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択／組み合わせて行なえばよい。回収方法の一例として、限外ろ過膜を用いた濃縮、硫安塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または前述した方法を組み合わせた方法があげられる。なおアルカリホスファターゼのＣ末端側にタグを付加している場合は、前記の方法に加え、タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせて精製してもよい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、マウスまたはチャイニーズハムスター由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチドを、アルカリホスファターゼを導入した哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを分泌生産させるためのシグナルペプチドとして用いることを特徴としており、前記シグナルペプチドにより前記哺乳動物細胞内でアルカリホスファターゼを効率的に生産することができる。当該効果は、ＣＨＯ細胞の分泌するＭＭＰ−９の量がごくわずかであることや、マウスＭＭＰ−９遺伝子を導入したＣＨＯ細胞が分泌したマウスＭＭＰ−９の量もまた同様にわずかであったという先行技術（非特許文献６）に照らし合わせても、全く予想されない効果である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】プラスミドｐＣＩＰ１００９Ｈの模式図。
【図２】プラスミドｐＣＩＰ６０００Ｈの模式図。
【図３】プラスミドｐＣＩＰ６０００の模式図。
【図４】プラスミドｐＣＩＰ６２００Ｈ２の模式図。
【図５】プラスミドｐＣＩＰ６２００−２の模式図。
【図６】プラスミドｐＣＩＰ９２００Ｈの模式図。
【図７】プラスミドｐＣＩＰ９２００の模式図。
【図８】アルカリホスファターゼ活性を有する各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果（実施例５）。
【図９】アルカリホスファターゼ活性を有する各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果（実施例７）。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  プラスミド（発現ベクター）の作製
本検討に用いたプラスミド（発現ベクター）を、それぞれ以下に示す方法で作製した。
【００４４】
（Ａ）プラスミドｐＣＩＰ１０００
（Ａ−１）Ｎ末端側に仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）のシグナルペプチドを、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を含むプラスミドである、ｐＣＩＰ−１（ＯＰＥＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社で合成）を鋳型とし、配列番号１８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１）および配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２）をプライマーセットとして、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
（Ａ−２）得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１）を、ＣＭＶプロモーターを用いた発現ベクターであるｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ社製）のクローニングサイトに挿入した。
（Ａ−３）（Ａ−２）でポリヌクレオチドを挿入したプラスミドの塩基配列を調べた。結果、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）が挿入されたプラスミド（５．９２４ｋｂｐ）であることを確認し、当該プラスミドをｐＣＩＰ１０００と名付けた。
【００４５】
（Ｂ）プラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈ
ｐＣＩＰ−１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得た１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２）と、（Ａ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得た４．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、プラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを作製した。
【００４６】
（Ｃ）プラスミドｐＣＩＰ１２００
（Ｃ−１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰのＮ末端側にＣＩＰのシグナルペプチドを付加したポリペプチド（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）を含むプラスミドである、ｐＣＩＰ−２（ＯＰＥＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社で合成）を鋳型とし、配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−３）および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−４）をプライマーセットとして、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製）を用いてＰＣＲを行なった。なおプラスミドｐＣＩＰ−２に挿入されている、配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列は、プラスミドｐＣＩＰ−１に挿入されている、配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列と同じ（配列番号２０）であるが、コドンが異なり、相互のポリヌクレオチド間の塩基配列の相同性は約８０％である。
（Ｃ−２）得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−４）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化したものと、（Ｂ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得た４．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−５）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、プラスミドｐＣＩＰ１２００を作製した。
【００４７】
（Ｄ）プラスミドｐＣＩＰ１００９Ｈ
（Ｄ−１）（Ｃ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１２００を鋳型とし、配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−５）および５’末端側をリン酸化した配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−６）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．７５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−６）を得た。
（Ｄ−２）（Ｂ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを鋳型とし、配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−７）および配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−８）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．４９ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−７）を得た。
（Ｄ−３）（Ｄ−１）で得たＤＮＡ−６と、（Ｄ−２）で得たＤＮＡ−７とを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーション後、Ｐｒｉｍｅｒ−５（配列番号２７）およびＰｒｉｍｅｒ−８（配列番号３０）をプライマーセットにしたＰＣＲを行ない、１．２ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−８）を得た。
（Ｄ−４）（Ｄ−３）で得たＤＮＡ−８を制限酵素ＸｂａＩとＳｐｈＩで二重消化して得られた０．５５  ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−９）と、プラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを制限酵素ＸｂａＩとＳｐｈＩで二重消化して得られた５．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１０）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰのうち１番目のロイシンをアスパラギン酸に置換し、かつ当該ＣＩＰのＮ末端側にＣＩＰのシグナルペプチドを、Ｃ末端にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ付加したポリペプチド（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）を含むプラスミドｐＣＩＰ１０００ＨｓｓＤ２を作製した。
（Ｄ−５）（Ｂ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを鋳型とし、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−９）および配列番号３２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１０）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
（Ｄ−６）（Ｄ−５）で得られたポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１１）を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−９（配列番号３１）および配列番号３３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
（Ｄ−７）（Ｄ−６）で得られたポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１２）を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−９（配列番号３１）および５’末端側をリン酸化した配列番号３４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、最終的に０．５５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１３）を得た。
（Ｄ−８）（Ｄ−７）で得られたＤＮＡ−１３を制限酵素ＮｄｅＩで消化して得られたポリヌクレオチドと、（Ｄ−４）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００ＨｓｓＤ２を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＶで二重消化して得られた５．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１４）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にマウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド（配列番号１）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにそれぞれ付加したポリペプチド（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を含む本発明の発現ベクターｐＣＩＰ１００９Ｈを作製した。ｐＣＩＰ１００９Ｈの模式図を図１に示す。
【００４８】
（Ｅ）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２
（Ｅ−１）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献７）を鋳型とし、配列番号３５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１３）および配列番号３６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１４）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３７ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１５）を得た。
（Ｅ−２）（Ｅ−１）で得られたＤＮＡ−１５を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−１３（配列番号３５）および配列番号３７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１５）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３９ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１６）を得た。
（Ｅ−３）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献７）を鋳型とし、配列番号３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１６）および配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１７）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．６９ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１７）を得た。
（Ｅ−４）（Ｅ−３）で得られたＤＮＡ−１７を鋳型とし、配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１８）およびＰｒｉｍｅｒ−１７（配列番号３９）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．７１ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１８）を得た。
（Ｅ−５）（Ｅ−２）で得られたＤＮＡ−１６を制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化し得られたポリヌクレオチドと、（Ｅ−４）で得られたＤＮＡ−１８を制限酵素ＸｂａＩとＰｃｉＩで二重消化して得られたポリヌクレオチドと、プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献７）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｃｉＩで二重消化し得られた２．８ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１９）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号４１に記載の塩基配列を含んだプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２を作製した。なおプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２は、プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献７）のＳＶ４０後期（ｌａｔｅ）プロモーターとｄｈｆｒ遺伝子の間にある制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位をなくし、かつ、ＳＶ４０初期（ｅａｒｌｙ）プロモーターからＳＶ４０ポリＡまでの領域を置換したプラスミドである。
【００４９】
（Ｆ）プラスミドｐＣＩＰ４０００Ｈ
（Ｂ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２と同じ）と、（Ｅ）で作製したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた３．９ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２０）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にＣＩＰのシグナルペプチドを、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を含んだプラスミドｐＣＩＰ４０００Ｈ（５．４１５ｋｂｐ）を得た。
【００５０】
（Ｇ）プラスミドｐＣＩＰ５０００Ｈ
（Ｇ−１）（Ｂ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈを鋳型とし、配列番号４４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１９）および配列番号４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２０）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．８ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２１）を得た。
（Ｇ−２）（Ｇ−１）で得られたＤＮＡ−２１を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−１９（配列番号４４）および配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．８ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２２）を得た。
（Ｇ−３）（Ｇ−２）で得られたＤＮＡ−２２を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−１９（配列番号４４）および５’末端側をリン酸化した配列番号４７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．８ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２３）を得た。
（Ｇ−４）（Ｇ−３）で得られたＤＮＡ−２３を制限酵素ＳｐｅＩで消化後、（Ｄ−４）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００ＨｓｓＤ２を制限酵素ＳｐｅＩとＥｃｏＲＶで二重消化して得られたポリヌクレオチドと、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、プラスミドｐＣＩＰ１０１４Ｈを作製した。
（Ｇ−５）（Ｇ−４）で作製したｐＣＩＰ１０１４Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチドと、（Ｅ）で作製したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得られたポリヌクレオチドとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にＣｙｐｒｉｄｉｎａ由来ルシフェラーゼ（ＣＹＰＬＦ）のシグナルペプチドを、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号４２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４３）を含んだプラスミドｐＣＩＰ５０００Ｈを作製した。
【００５１】
（Ｈ）プラスミドｐＣＩＰ６０００Ｈ
（Ｄ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１００９Ｈを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２４）と、（Ｆ）で作製したＤＮＡ−２０とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にマウスＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ６０００Ｈを作製した。ｐＣＩＰ６０００Ｈの模式図を図２に示す。
【００５２】
（Ｉ）プラスミドｐＣＩＰ６０００
（Ａ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１０００を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた０．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２５）と、（Ｈ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ６０００Ｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた４．９ｋｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２６）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにマウスＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）をＮ末端側に付加したポリペプチド（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ６０００（５４０２ｂｐ）を作製した。ｐＣＩＰ６０００の模式図を図３に示す。
【００５３】
（Ｊ）プラスミドｐＣＩＰ６２００Ｈ２
（Ｊ−１）配列番号４８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２３）を鋳型とし、配列番号４９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２４）および配列番号５０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２５）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、増幅産物をアガロースゲル電気泳動を用いて精製することで０．０７ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−２７）を得た。
（Ｊ−２）プラスミドｐＣＩＰ−２（ＯＰＥＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社で合成）を鋳型とし、配列番号５１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２６）および配列番号５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２７）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、増幅産物をアガロースゲル電気泳動を用いて精製することで０．５８ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２８）を得た。
（Ｊ−３）（Ｊ−１）で得られたＤＮＡ−２７および（Ｊ−２）で得られたＤＮＡ−２８を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−２４（配列番号４９）およびＰｒｉｍｅｒ−２７（配列番号５２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．６ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２９）を得た。
（Ｊ−４）（Ｊ−３）で得られたＤＮＡ−２９を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで二重消化して得られたポリヌクレオチドと、ｐＣＩＰ−２を制限酵素ＥｃｏＲＶとＭｌｕＩで二重消化して得られた０．９ｋｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３０）と、（Ｆ）で調製したＤＮＡ−２０とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にマウスＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ６２００Ｈ２を作製した。ｐＣＩＰ６２００Ｈ２の模式図を図４に示す。
【００５４】
（Ｋ）プラスミドｐＣＩＰ６２００−２
（Ｃ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１２００を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた０．５ｋｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３１）と、（Ｊ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ６２００Ｈ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた４．９ｋｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３２）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにマウスＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）をＮ末端側に付加したポリペプチド（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ６２００−２を作製した。ｐＣＩＰ６２００−２の模式図を図５に示す。
【００５５】
（Ｌ）プラスミドｐＣＩＰ９２００Ｈ
（Ｌ−１）配列番号５３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２８）を鋳型とし、配列番号５４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２９）および配列番号５５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−３０）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．０７ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−３３）を得た。
（Ｌ−２）（Ｃ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１２００を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−２６（配列番号５１）およびＰｒｉｍｅｒ−２７（配列番号５２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．５８ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−３４）を得た。
（Ｌ−３）（Ｌ−１）で得られたＤＮＡ−３３および（Ｌ−２）で得られたＤＮＡ−３４を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ−２９（配列番号５４）およびＰｒｉｍｅｒ−２７（配列番号５２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．６ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３５）を得た。
（Ｌ−４）（Ｌ−３）で得られたＤＮＡ−３５を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで二重消化した得られたポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３６）と、（Ｊ−４）で調製したＤＮＡ−３０と、（Ｆ）で調製したＤＮＡ−２０とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、Ｎ末端側にチャイニーズハムスターＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号２）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、それぞれ配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰに付加したポリペプチド（配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ９２００Ｈを作製した。ｐＣＩＰ９２００Ｈの模式図を図６に示す。
【００５６】
（Ｍ）プラスミドｐＣＩＰ９２００
（Ｃ）で作製したプラスミドｐＣＩＰ１２００を制限酵素ＥｃｏＲＶとＭｌｕＩで二重消化して得られた０．９ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３７）と、（Ｌ−４）で作製したＤＮＡ−３６と、（Ｆ）で調製したＤＮＡ−２０とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＩＰにチャイニーズハムスターＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号２）をＮ末端側に付加したポリペプチド（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）を含んだ本発明の発現ベクターｐＣＩＰ９２００を作製した。ｐＣＩＰ９２００の模式図を図７に示す。
【００５７】
実施例２  ＣＨＯ細胞への導入およびＣＩＰの分泌（その１）
（１）実施例１で作製したプラスミドのうち、（Ｆ）ｐＣＩＰ４０００Ｈ、（Ｇ）ｐＣＩＰ５０００Ｈ、（Ｈ）ｐＣＩＰ６０００Ｈを制限酵素ＰｖｕＩで消化することで直鎖化後、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ試薬（ライフテクノロジーズ社製）を使用したリポフェクション法によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であるＤＧ４４細胞に導入した。
（２）プラスミドを導入したＤＧ４４細胞を、８ｍＭのグルタミンおよび０．１８％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ライフテクノロジーズ社製）を含んだＣＤ  ＣＨＯ培地（培地１）で、温度３７℃、ＣＯ２濃度８％、回転振とう速度１３５ｒｐｍで２日間培養した。
（３）培養液を低速（９００ｒｐｍ）で遠心分離することで培養細胞を回収後、８ｍＭ  グルタミンおよび０．１８％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（培地２）に懸濁して（培地交換１回目）、３日間培養を継続した。
（４）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換２回目）、３日間培養を継続した。
（５）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換３回目）、４日間培養を継続した。
（６）（５）の４日目の培養液中の細胞群の細胞密度とアルカリホスファターゼ活性を測定した。なおアルカリホスファターゼ活性の測定は、仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した。結果を表１に示す。ＣＩＰ自身のシグナルペプチド（配列番号１４）やＣｙｐｒｉｄｉｎａ由来ルシフェラーゼ（以下、ＣＹＰＬＦと略記する）のシグナルペプチド（配列番号１５）（特許文献７）と比較してマウス由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）を使用した場合にＣＩＰの分泌生産量が向上していることがわかる。
【００５８】
【表１】
2014180222.tif 000002
実施例３  ＣＨＯ細胞への導入およびＣＩＰの分泌（その２）
（１）実施例１で作製したプラスミドのうち、（Ｊ）ｐＣＩＰ６２００Ｈ２、（Ｌ）ｐＣＩＰ９２００Ｈ、（Ｋ）ｐＣＩＰ６２００−２、（Ｍ）ｐＣＩＰ９２００を制限酵素ＰｖｕＩで消化することで直鎖化後、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ試薬（ライフテクノロジーズ社製）を使用したリポフェクション法によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であるＤＧ４４細胞に導入した。
（２）プラスミドを導入したＤＧ４４細胞を、８ｍＭのグルタミンおよび０．１８％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ライフテクノロジーズ社製）を含んだＣＤ  ＣＨＯ培地（培地１）で、温度３７℃、ＣＯ２濃度８％、回転振とう速度１３５ｒｐｍで２日間培養した。
（３）培養液を低速（９００ｒｐｍ）で遠心分離することで培養細胞を回収後、８ｍＭ  グルタミンおよび０．１８％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（培地２）に懸濁して（培地交換１回目）、３日間培養を継続した。
（４）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換２回目）、３日間培養を継続した。
（５）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換３回目）、４日間培養を継続した。
（６）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換４回目）、２日間培養を継続した。
（７）（６）の２日目の培養液中の細胞群の細胞密度とアルカリホスファターゼ活性を測定した。なおアルカリホスファターゼ活性の測定は、仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した。結果を表２に示す。マウス由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号１）の代わりにチャイニーズハムスター由来のＭＭＰ−９のシグナルペプチド（配列番号２）を使用しても、ＣＩＰを効率的に分泌生産できることがわかる。
【００５９】
【表２】
2014180222.tif 000003
実施例４  ＣＩＰの生産（その１）
実施例２で検討した細胞のうち、（Ｈ）ｐＣＩＰ６０００Ｈを導入したＣＨＯ細胞を用いてアルカリホスファターゼの生産を試みた。
（１）実施例２に記載の方法に基づき（Ｈ）ｐＣＩＰ６０００ＨをＤＧ４４細胞に導入し、培地２を用いて増殖させた細胞群を限界希釈することで単クローン化し、細胞株＃４を得た。
（２）（１）で得られた細胞株＃４を濃度２５ｎＭから５００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含んだ培地２で４日間培養後、培養液を低速（９００ｒｐｍ）で遠心分離することで細胞を回収し、各濃度のＭＴＸを含んだ培地２に懸濁して（培地交換１回目）、４日間培養を継続した。
（３）再度、各濃度のＭＴＸを含んだ培地２に交換（培地交換２回目）を行ない、さらに５日間培養した。
（４）ＭＴＸ濃度２５ｎＭで培養された細胞群から限界希釈による単クローン化を行ない、細胞株＃２５−２２を得た。
（５）（４）で得られた細胞株＃２５−２２を濃度７５ｎＭから５００ｎＭのＭＴＸを含んだ培地２で４日間培養後、培養液を低速（９００ｒｐｍ）で遠心分離して細胞を回収し、各濃度のＭＴＸを含んだ培地２に懸濁して（培地交換１回目）、６日間培養を継続した。
（６）再度、各濃度のＭＴＸを含んだ培地２に交換（培地交換２回目）を行ない、さらに６日間培養した。
（７）ＭＴＸ濃度７５ｎＭで培養された細胞群から限界希釈による単クローン化を行ない、細胞株＃７５−１３を得た。
（８）（７）で得られた細胞株＃７５−１３を培地２で培養し、３日から５日毎に培養液を採取し、採取した容量と同容量の培地２を加えて、培養を継続した。
（９）採取した培養液を１００００×ｇで２０分間遠心分離することで上清を回収した。
（１０）培養上清１．７Ｌに含まれるアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【００６０】
仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した結果、アルカリホスファターゼの生産量は２０ｍｇと算出された。
【００６１】
実施例５  ＣＩＰの精製（その１）
実施例４で生産したアルカリホスファターゼの精製を試みた。
（１）実施例４（９）で得られた培養上清１．３Ｌに、活性炭５．２ｇを加え４℃で一晩撹拌混合後、１００００×ｇで１０分間遠心分離することで上清を回収した。
（２）上清を０．２２μｍのニトロセルロースフィルターでろ過後（培養液上清画分）、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で透析した。
（３）透析液をＨｉＰｒｅｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライ後、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（４）アルカリホスファターゼ活性を有する画分に対して濃度が１．２Ｍとなるよう硫安を添加後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、硫安濃度１．２Ｍから０Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（５）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（Ｐｈｅｎｙｌ回収画分−１）をＴｒｉｓ緩衝液で透析後、透析液をＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（６）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（ＤＥＡＥ回収画分−１）をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）にアプライし、アルカリホスファターゼを溶出した。
（７）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（Ｇ３０００回収画分−１）をＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦにアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配で溶出し、アルカリホスファターゼ活性を有する画分を回収した（ＤＥＡＥ回収画分−２）。
【００６２】
アルカリホスファターゼ活性を有する各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図８に示す。なお図８中、レーンＭは蛋白質マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、カタログ番号Ｐ７７０８Ｓ）であり、レーン番号１は培養上清画分であり、レーン番号２はＰｈｅｎｙｌ回収画分−１であり、レーン番号３はＤＥＡＥ回収画分−１であり、レーン番号４はＧ３０００回収画分−１である。
【００６３】
またＤＥＡＥ回収画分−２に含まれるアルカリホスファターゼを、仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した結果、２．９ｍｇであった。
【００６４】
実施例６  ＣＩＰの生産（その２）
実施例３で検討した細胞のうち、（Ｋ）ｐＣＩＰ６２００−２を導入したＣＨＯ細胞を用いてアルカリホスファターゼの生産を試みた。
（１）実施例３に記載の方法に基づき（Ｋ）ｐＣＩＰ６２００−２をＤＧ４４細胞に導入し、培地２を用いて増殖させた細胞群を限界希釈することで単クローン化し、細胞株＃１１を得た。
（２）（１）で得られた細胞株＃１１を培地２で培養し、３日から５日毎に培養液を採取し、採取した容量と同容量の培地２を加えて、培養を継続した。
（３）採取した培養液を１００００×ｇで２０分間遠心分離することで上清を回収した。
（４）培養上清８Ｌに含まれるアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【００６５】
仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した結果、アルカリホスファターゼの生産量は８ｍｇと算出された。
【００６６】
実施例７  ＣＩＰの精製（その２）
実施例６で生産したアルカリホスファターゼの精製を試みた。
（１）実施例６（３）で得られた培養上清８Ｌに活性炭３２ｇを加え４℃で一晩撹拌混合後、１００００×ｇで１０分間遠心分離することで上清を回収した。
（２）上清を０．２２μｍのニトロセルロースフィルターでろ過後、限外ろ過膜ぺリコンＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ−５０（ミリポア社製）で濃縮した（培養上清濃縮画分）。
（３）濃縮液をＨｉＰｒｅｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（４）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（ＤＥＡＥ回収画分−３）に濃度１．２Ｍとなるよう硫安を添加後、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、硫安濃度１．２Ｍから０Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（５）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（Ｂｕｔｙｌ回収画分−１）をＴｒｉｓ緩衝液で透析し、透析液をＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（６）アルカリホスファターゼ活性を有する画分に濃度１．２Ｍとなるよう硫安を添加後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、硫安濃度１．２Ｍから０Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（７）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（Ｐｈｅｎｙｌ回収画分−２）をＴｒｉｓ緩衝液で透析し、透析液をＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配でアルカリホスファターゼを溶出した。
（８）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（ＤＥＡＥ回収画分−４）をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）にアプライし、アルカリホスファターゼを溶出した。
（９）アルカリホスファターゼ活性を有する画分（Ｇ３０００回収画分−２）をＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦにアプライし、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍまでの塩濃度勾配で溶出し、アルカリホスファターゼ活性を有する画分を回収した（ＤＥＡＥ回収画分ー５）。
【００６７】
アルカリホスファターゼ活性を有する各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図９に示す。なお図９中、レーンＭは蛋白質マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、カタログ番号Ｐ７７０８Ｓ）であり、レーン番号１は培養液上清濃縮画分であり、レーン番号２はＰｈｅｎｙｌ回収画分−２であり、レーン番号３はＤＥＡＥ回収画分−３であり、レーン番号４はＧ３０００回収画分−２である。
【００６８】
またＤＥＡＥ回収画分−５に含まれるアルカリホスファターゼを、仔牛小腸由来の高活性アルカリホスファターゼ１３Ｇ（バイオザイム社製）を標準にして定量した結果、２ｍｇであった。
【００６９】
実施例８
実施例５および７で得られたアルカリホスファターゼ各１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、常法に従ってアルカリホスファターゼに相当するバンドを切り出してＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）膜に転写後、Ｎ末端側から５残基のアミノ酸配列を分析した。
【００７０】
結果、ともにＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号５６）であり、配列番号３に記載のＮ末端配列と一致していた。
【図１】
2014180222.tif 000004
【図２】
2014180222.tif 000005
【図３】
2014180222.tif 000006
【図４】
2014180222.tif 000007
【図５】
2014180222.tif 000008
【図６】
2014180222.tif 000009
【図７】
2014180222.tif 000010
【図８】
2014180222.tif 000011
【図９】
2014180222.tif 000012
【配列表】
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