(57)【要約】【課題】開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法を提供する。【解決手段】開始メチオニン残基が除去された単量体または二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法は、ペプチド結合を介して免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結された免疫グロブリンヒンジＦｃ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターを用いて、開始メチオニン残基が除去された単量体または二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する。【選択図】図１
2014110816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド結合を介して免疫グロブリンヒンジ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結された組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターを製造する段階と、
前記組み換え発現ベクターで原核細胞を形質転換して形質転換体を製造する段階と、
前記形質転換体を培養し、前記免疫グロブリンＦｃ領域を凝集体形態で発現させる段階と、
前記免疫グロブリンＦｃ領域を分離精製する段階とを含み、
前記免疫グロブリンヒンジ領域が、Ｎ末端の開始アミノ酸としてシステイン、セリン又はプロリンを有し、かつ、その配列中に少なくとも１つのシステインを含み、
前記組み替え発現ベクターがシグナル配列を含まない、
開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法。
【請求項２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が単量体または二量体形態で分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤのヒンジ領域に由来した２つ以上の連続アミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４よりなる群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒンジ領域が、配列番号１８、１９、２０、２１、４９、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、並びにこれらの組み合わせおよびハイブリッドであるＦｃ領域よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびこれらの組み合わせおよびハイブリッドよりなる群から選ばれるＩｇＧのＦｃ領域である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＬドメインよりなる群から選ばれる１〜４個のドメインからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号７、９、１１、１３、２５、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み換え発現ベクターが、配列番号７、９、１１、１３、２５、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５及び４７からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記原核細胞が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換体が、大腸菌ＢＬ２１／ｐｍＳＣＰＦｃ（ＨＭ１１２００）、ＢＬ２１／ｐｍＰＳＣＦｃ（ＨＭ１１２０１）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＳＦｃ（ＨＭ１１２０４）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＡＦｃ（ＨＭ１１２０５）、ＢＬ２１／ｐＭＳＣＤＦｃ１（ＨＭ１１２０７）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＡＦｃ１（ＨＭ１１２０９）、ＢＬ２１／ｐＭＰＫＳＦｃ１（ＨＭ１１２１０）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＰＦｃ１（ＨＭ１１２１１）、ＢＬ２１／ｐＭＰＰＣＦｃ１（ＨＭ１１２１２）、ＢＬ２１／ｐＭＰＣＰＦｃ１（ＨＭ１１２１３）、ＢＬ２１／ｐｍＰＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１４）、ＢＬ２１／ｐｍＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１５）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１６）、ＢＬ２１／ｐｍＣＣＶＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１７）又はＢＬ２１／ｐｍＣＶＥＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１８）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換体が、寄託番号ＫＣＣＭ−１０６５９Ｐ、ＫＣＣＭ１０６６０Ｐ、ＫＣＣＭ−１０６６５Ｐ及びＫＣＣＭ−１０６６６Ｐで寄託された形質転換体からなる群より選ばれた形質転換体である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターを用いて、開始メチオニン残基が除去された単量体または二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝工学技術の発展に伴い、多種のタンパク質医薬品が製造されて用いられている。ところが、タンパク質医薬品の場合、容易に変性し或いは生体内プロテアーゼなどによって容易に分解して生体内濃度および力価を長らく持続させることができないという致命的な欠点を持っている。したがって、タンパク質の安定性を増加させてタンパク質医薬品の血中、生体内濃度を適正の水準に維持させることは、効果的な治療だけでなく、頻繁に注射などによりタンパク質の供給を受けるべき患者の不便軽減および経済的な側面でも非常に重要な問題である。
したがって、タンパク質医薬品の生体内安定性を増加させるために、タンパク質の剤形を変化させるか、他のタンパク質を融合させるか、或いはタンパク質の表面に適当な高分子を化学的または生物学的方法で付着させるなどの多様な方法が長い前から試みられてきた。
他のタンパク質との融合によってタンパク質の安定性を増加させるための試みの一つが、免疫グロブリンＦｃとタンパク質との融合である。
Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの固有機能である抗原結合能だけでなく、補体依存的毒性（ＣＤＣ、complement-dependent cytotoxicity）、抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ、antibody-dependent cell cytotoxicity）などのエフェクター機能(effector function)を担当する。また、Ｆｃ領域に存在するＦｃＲｎ配列は、新生児へのＩｇＧ輸送および半減期を増加させて血清内ＩｇＧの水準を調節する役割を果たし(Ghetie and Ward, Immunology Today 18: 592-598, 1997)、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇとの相互作用を調節する。このようなＦｃ領域と治療用タンパク質との融合によって治療用タンパク質の安定性を増加させようとする研究が盛んに行われた。
韓国特許第２４９５７２号は、ＩｇＧ１重鎖不変領域（Ｆｃ）のアミノ末端にＩＬ４受容体、ＩＬ７受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体などの様々なタンパク質のカルボキシル末端を連結させた後、これを哺乳動物細胞から製造した融合タンパク質を開示している。米国特許第５，６０５，６９０号は、腫瘍怪死因子受容体のカルボキシル末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ誘導体を融合して動物細胞から製造した融合タンパク質を報告している。また、Ｔａｎｏｘ社は、米国特許第５，７２３，１２５号および同第５，９０８，６２６号で、ヒトインターフェロンαおよびβ遺伝子のカルボキシル末端と天然型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ遺伝子をペプチドリンカーを用いて動物細胞から製造することを報告している。Ｌｅｘｉｇｅｎ社は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／６９９１３号で、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃカルボキシル末端とヒトインターフェロンのアミノ末端をリンカーなしで遺伝子組み換え方式で連結して動物細胞から生産した。米国特許公開第２００３００８２６７９号では、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子のカルボキシル末端とＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ末端をペプチドリンカーを用いて連結した後、動物細胞から生産した融合タンパク質が、増加した血中半減期を示すことを報告している。米国特許公開第２００１００５３５３９号、同第６，０３０，６１３号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／０２７０９号、同ＷＯ０１／０３７３７号、ヨーロッパ特許ＥＰ０４６４５３３Ｂ１号などは、ＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子或いはＦｃ遺伝子の誘導体をそのアミノ末端にペプチドリンカーを挿入し、或いはペプチドリンカーなしでヒトＥＰＯ遺伝子、ＴＰＯ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子、ヒトインターフェロンβ遺伝子のカルボキシル末端に連結させた後、それぞれの融合体を動物細胞を用いて生産し、このようなＦｃ融合タンパク質の血中半減期が全て天然型タンパク質より上昇したことを報告した。
ところが、前記Ｆｃとの融合タンパク質は、目的タンパク質の血中半減期が増加するが、これと同時に、Ｆｃ領域の持っているエフェクター機能が発揮されるという問題点がある（米国特許第５，３４９，０５３号）。Ｆｃ領域のエフェクター機能によって補体を固定させ、或いはＦｃγＲｓを発現する細胞に結合して特定の細胞を破壊させ、炎症を誘発する様々なサイトカインの生成および分泌を誘導することにより、所望しない炎症を誘発させる。また、融合部位のタンパク質配列は、人体に存在しない新規のタンパク質配列なので、長期投与の際に免疫反応誘発可能性もあるなどいろいろの欠点を持っている。
そこで、長い血中半減期を維持するがエフェクター機能の欠失された免疫グロブリン、或いは免疫グロブリン断片を利用しようとする研究が行われてきた。Ｃｏｌｅなどは、Ｆｃ受容体に対する親和力の減少したＦｃ誘導体を生産するためにＣＨ２領域のＦｃ受容体との結合に重要な役割を果たすものと知られている２３４、２３５および２３７番目の残基をアラニンで置換してＡＤＣＣの活性が抑制されることを報告した(Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997)。ところが、これらはいずれも、天然型ヒトＦｃ領域と他の不適切なアミノ酸の存在により、Ｆｃはさらに大きい免疫性または抗原性を持つことができ、好適なＦｃ機能を失うおそれもある。
免疫グロブリンの高い血中濃度を維持しながら所望しないエフェクター機能を除去或いは減少させるための方法の一つとして、免疫グロブリンの糖を除去する方法が研究された。米国特許第５，５８５，０９７号は、ＣＤ３抗体の製造の際に、抗体の糖化残基であるＣＨ２ドメインの２９７番目のアスパラギン残基を他のアミノ酸で置換することにより、非糖化された抗体誘導体を製造し、この場合、誘導体はＦｃＲｎ受容体との結合力を血中半減期の変化なしで維持しながら減少したエフェクター機能を示した。ところが、この方法も非正常的な配列を持つ新しい組み換え構造物の生成により免疫系において外部物質として認識され、拒否されるおそれがあるという問題点がある。米国特許公開第２００３００７３１６４号では、エフェクター機能の欠失された治療用抗体を製造するために、糖化機能のない大腸菌細胞を用いて分泌配列に重鎖と軽鎖を融合させて抗体を生産する方法を開示している。
米国のＡｍｇｅｎ社は、米国特許第６，６６０，８４３号、米国特許公開第２００４００４４１８８号および同第２００４００５３８４５号で、治療用タンパク質或いは治療用タンパク質ペプチドミミックを製造し、そのアミノ末端或いはカルボキシル末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃヒンジの最初５つのアミノ酸が欠失された誘導体を融合させた後、大腸菌宿主を用いて生産する方法を開示している。ところが、シグンル配列なしで発現される誘導タンパク質は、発現されて細胞質内に凝集体(inclusion body)形態で存在するため、分離後に別途のリフォールディング過程を経なければならないという欠点を持つ。リフォールディング過程を経ると、タンパク質の生産収率は低下し、ホモ二量体またはヘテロ二量体形態で存在するタンパク質の場合には、二量体として生成される収率が著しく減少するという問題点がある。また、シグナル配列なしで大腸菌で発現されるタンパク質は、大腸菌のタンパク質発現体系の特性上、アミノ末端にメチオニン残基が付加される。言及したＡｍｇｅｎ社の発現産物はアミノ末端にメチオニン残基が付加されており、このようなメチオニン残基は人体への反復投与或いは過量投与の際に免疫反応を誘発するおそれがある。また、これらは、治療用タンパク質をコードする遺伝子と、Ｆｃをコードする遺伝子とを連結させて大腸菌で融合タンパク質形態で発現させるため、大腸菌で発現することが難しいという欠点、或いは大腸菌での発現の際に活性に問題のある治療用タンパク質の融合体は生産することが難しいという欠点がある。また、２つのタンパク質の融合部位は生体内には存在しない非正常的な配列なので、免疫系において外部物質として認識されて免疫反応を引き起こすおそれもある。
かかる点を改善するために、本発明者らは、従来の組み換え方法による融合ではなく、Ｆｃ領域およびタンパク質医薬品を各最上の発現システムで個別のポリペプチドに製造した後、共有結合させてＦｃを薬物のキャリアとして使用したことがある。この場合、糖化されたポリペプチド薬物と非糖化されたＦｃの結合体を製造することができるので、不適切な免疫反応は除去され、これと同時に生理学的薬物活性、生体的持続性および安定性は全て充足させる。
前記の場合、Ｆｃは非糖化された形態が好ましいので、大腸菌などの原核細胞発現システムを利用するようにする。大腸菌の発現体系を利用する生産方法は、既存の動物細胞を用いた方法に比べて様々な利点があるが、大腸菌は発現ベクターの製作が容易であって発現有無を速く検証することができ、成長速度が非常に速いため低いコストで大量生産することができ、比較的単純な発現方法を適用することができるから、商業的利用の側面でも他の宿主細胞を用いることより有用である。
大腸菌においてＦｃ領域を過発現させる場合、Ｆｃ領域は大部分、凝集体形態で発現される。Ｆｃ領域を産業的に利用するために、水溶性状態で発現されるＦｃ領域を利用しようとする試みがあった。ヨーロッパ特許ＥＰ０２２７１１０では、免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域を過発現させた後、水溶性状態で発現される産物(cell lysate)のみを取って免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域を生産する工程について開示している。ところが、水溶性状態で発現された免疫グロブリンのみを分離する場合、収率が１５ｍｇ／Ｌと非常に低いため、産業的利用価値が低いという欠点がある。かかる点を改善し、韓国特許出願第００９２７８３号では免疫グロブリンＦｃ領域を大腸菌シグナル配列と融合させた形態で発現させ、凝集体ではなく水溶性形態で発現させようとした。この場合、細胞内でシグナルペプチドが除去された可溶性形態で発現され、タンパク質は生産収率が５０〜６００ｍｇ／Ｌと大きく改善されたことを確認することができた。
このような背景の下に、本発明者らは、糖鎖が除去されて免疫反応誘発のおそれがない活性型の免疫グロブリンＦｃ領域を産業化可能な、より改善された収率で大量に生産する方法を探そうと努力したところ、特定のヒンジ領域を免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結させて発現させると、凝集体形態で発現された免疫グロブリンＦｃ領域が、水溶化およびリフォールディング過程によって開始メチオニン残基の除去された二量体または単量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域として生産されることを確認し、メチオニン開始コドンが除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量に生産する本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的は、免疫グロブリンヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含むベクターを製造する段階と、前記ベクターで原核細胞を形質転換する段階と、前記形質転換体を培養する段階と、形質転換体から凝集体形態で発現された免疫グロブリンＦｃ領域を分離精製する段階とを含む、開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記の方法で製造された、開始メチオニン残基の除去された二量体または単量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を提供することにある。  
【図面の簡単な説明】
【０００４】
この発明の前記および他の目的、特徴およびその他の利点は、添付図面を参照する次の説明によって明確に理解されるであろう。
【図１】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域の発現ベクターによるＦｃ領域の単量体および二量体の形成を考察した電気泳動結果である。
【図２】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＣ１ｑとの結合能を確認した結果である。
【図３】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃγＲIとの結合能を確認した結果である。
【図４】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃγＲIIIとの結合能を確認した結果である。
【図５】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃＲｎαβ２との結合能を確認した結果である。
【図６】ヒト免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域をキャリアとして用いて製造された結合タンパク質ＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の血中半減期を考察した結果である。
【図７】実施例２で収得した微生物形質転換体を発酵器に接種して発現させ、発酵液の一部を２×タンパク質サンプルバッファーと同量で混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した結果である。
【図８】実施例２でそれぞれの形質転換体から凝集体形態で発現された産物をリフォールドして前記条件で電気泳動してタンパク質バンドを確認したものである。
【図９】実施例３で収得した微生物形質転換体を発酵器に接種して発現させ、発酵液の一部を２×タンパク質サンプルバッファーと同量で混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した結果である。
【図１０】実施例３で精製されたそれぞれの発現産物を、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を除去したタンパク質サンプルバッファーと混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
一つの様態として、本発明は、免疫グロブリンヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を含むベクターを製造する段階と、前記ベクターで原核細胞を形質転換する段階と、前記形質転換体を培養する段階と、前記形質転換体から凝集体形態で発現された免疫グロブリンＦｃ領域を分離精製する段階とを含む、開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産する方法に関する。
本発明は、薬品のキャリアなどに有用に使用できる免疫グロブリンのＦｃ領域を大量に生産することが可能な方法に関するもので、ヒンジ領域を免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結させて発現させる場合、凝集体形態で発現された免疫グロブリンＦｃ領域が、開始コドンによってコードされる開始メチオニン残基の除去された活性型の二量体または単量体に水溶化およびリフォールドされることを確認した。ヒンジ領域が免疫グロブリンのＦｃ領域と結合することにより、活性に損失を与えず、開始コドンによってコードされる開始メチオニン残基の除去された天然型配列形態にプロセスおよびリフォールドされるように影響する決定的調節要素として作用するということを解明したという点で、本発明は意義が深い。
免疫グロブリンＦｃ領域と組み換え形態で結合してＦｃ領域の大量生産に使用できるヒンジ領域は、ヒト、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物から起源したＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ由来のヒンジ領域であり、より好ましくはＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のヒンジ領域（配列番号１４〜１７）である。ヒンジ領域は、全長のヒンジ領域またはその断片であり得る。好ましくは、ヒンジ領域断片は２つ以上の連続アミノ酸配列を有する断片であって、より好ましくは一つ以上のシステイン残基を含む２つ以上の連続アミノ酸配列を有する断片である。本発明の具体的な実施例では、配列番号１７に示されるＩｇＧ４由来のヒンジ領域に由来した断片を使用し、配列番号１８、１９、２０または２１に示される。配列番号１８、１９、２０のヒンジ領域を用いる場合には二量体および単量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を製造することができ、配列番号２１のヒンジ領域を用いる場合には単量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を効果的に製造することができる。また、本発明の具体的な実施例では、配列番号１４に示されるＩｇＧ１由来のヒンジ領域に由来した断片を使用した。これは、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５に示され、配列番号１５に示されるＩｇＧ２由来のヒンジ領域に由来した断片を使用した。これは、配列番号５６、５７、５８、５９または６０に示され、これらを用いる場合、二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域を製造することができる。
本発明によって生産できる免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト、山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物から分離した天然型、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であり得る。好ましくは、ヒト由来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのＦｃ領域、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドである。「組み換え」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが相異なる起源の単鎖ポリペプチドとの結合を形成することを意味し、「ハイブリッド」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、２つ以上の相異なる起源の免疫グロブリンＦｃ領域に該当する配列が存在することを意味する用語である。免疫グロブリンは、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４由来のＦｃ領域、またはこれらの組み合わせである。本発明で有用なヒト免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化する核酸配列およびこれを限定するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよび／またはＥＭＢＬデータベースに開示されたヌクレオチド配列によって暗号化されるものであり得る。
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域はアミノ酸配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然のアミノ酸配列とは一つ以上のアミノ酸残基が相異なる配列を有するものを意味し、自然的に発生し或いは人為的に発生させることができる。免疫グロブリンのＦｃ領域は、欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによる誘導体を含む。挿入は通常約１〜２０個のアミノ酸の連続配列からなるが、より大きい挿入も可能である。欠失は、通常、約１〜３０個の残基からなる。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。このような誘導体は、当該分野に公知になっている化学的ペプチド合成方法、またはＤＮＡ配列を基本とする組み換え方法によって製造できる(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., 1989)。
場合によっては、リン酸化(phosphrylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、またはファネシル化(farnesylation)などで修飾できる。
前記免疫グロブリン誘導体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるが、必要に応じてはそのタンパク質の特性を変形させた誘導体であってもよい。好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域誘導体は、生成される誘導体のタンパク質配列がヒトのものとはあまりにも相異しないため免疫反応を誘発しない範囲内において、アミノ酸配列上の誘導と修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性または可溶性が増加し、或いは硫化結合形成、発現宿主との親和性、補体との結合、Ｆｃ受容体との結合、抗体依存性細胞毒性などが改善された誘導体であり得る。この際、Ｆｃ領域誘導体において変化させた部位がヒトのものとは異なるため、ヒトへの投与の際に免疫反応を誘発してはならず、好ましい誘導体の例として、抗体依存性細胞毒性を誘発するＦｃ受容体に対して減少した結合力を示すようにＩｇＧ１ Ｆｃ領域の特定の残基を誘導させることができる。前記誘導体は、ＩｇＧ１ ＣＨ２配列に存在する２３４番のロイシン残基（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇはＫｏｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅの配列を参考）を欠失しまたは他の残基で置換することを含むことができるが、最も好ましい誘導は、ＩｇＧ４で同一の位置に該当するアミノ酸残基としてのフェニルアラニンで置換することである。
免疫グロブリンＦｃ領域を前記免疫グロブリンヒンジ領域と連結させ、組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を製造するようにする。本発明において、組み換え免疫グロブリンＦｃ領域とは、ヒンジ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端にペプチド結合で連結されたものを意味する。
免疫グロブリンＦｃ領域に応じて、結合するヒンジ領域は選択できる。好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域と同じ起源のヒンジ領域を使用するようにする。本発明の具体的な実施例では、ＩｇＧ４由来のＦｃ領域に配列番号１８、１９、２０または２１のアミノ酸配列を有するヒンジ領域が連結された、配列番号７、９、１１または１３のアミノ酸配列を有する組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を製造した。前記組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸は、好ましくはそれぞれ配列番号６、８、１０または１２に示される。
また、本発明の具体的な実施では、ＩｇＧ１由来のＦｃ領域に配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域が連結された、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５または３７のアミノ酸配列を有する組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を製造した。前記組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸は、好ましくはそれぞれ配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６に示される。
また、本発明の具体的な実施では、ＩｇＧ２由来のＦｃ領域に配列番号５６、５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列を有するヒンジ領域が連結された、配列番号３９、４１、４３、４５または４７のアミノ酸配列を有する組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列を製造した。前記組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸は、好ましくはそれぞれ配列番号３８、４０、４２、４４または４６に示される。
前記組み換え免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列は、これを発現することが可能なベクターに作動的に連結させて提供される。
本発明において、「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な組み換えベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
本発明において、「作動可能に連結された(operably linked)」とは、一般な機能を行うように核酸発現調節配列と目的タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。ベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に行うことができる。適合な発現ベクターは、プロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの発現調節エレメント配列を含むことができる。開始コドンおよび終結コドンは、遺伝子作製物が投与されたとき、個体において必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)になければならない。一般プロモータは構成的または誘導性である。発現ベクターは、ベクター含有宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含むことができる。本発明の具体的な実施では、ｐｍＳＣＰＦｃ、ｐｍＰＳＣＦｃ、ｐｍＣＰＳＦｃ、ｐｍＣＰＦｃ、ｐＭＥＰＫＦＣ１、ｐＭＳＣＫＦｃ１、ｐＭＤＫＴＦｃ１、ｐＭＣＰＡＦｃ１、ｐＭＰＫＳＦｃ１、ｐＭＣＰＰＦｃ１、ｐＭＰＰＣＦｃ、ｐＭＰＣＰＦｃ、ｐｍＰＰＣＧ２Ｆｃ、ｐｍＰＣＰＧ２Ｆｃ、ｐｍＣＰＧ２Ｆｃ、ｐｍＣＣＶＧ２ＦｃおよびｐｍＣＶＥ２Ｆｃを製造した。
前記タンパク質を発現する組み換え発現ベクターは、宿主細胞に形質転換される。
本発明の目的上、宿主細胞は、糖化がなされない原核細胞である。このような原核細胞には、大腸菌(Escherichia coli)、バチルスサブチルス(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)、またはスタヒロコッカス(Staphylococcus)などがあるが、好ましくは大腸菌である。大腸菌は、大腸菌ＸＬ−１ブルー、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＤＨシリーズ、大腸菌ＴＯＰ１０および大腸菌ＨＢ１０１であり、より好ましくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であるが、これに限定されるものではない。大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、大腸菌が糖鎖をタンパク質に連結する体系がないため、天然型免疫グロブリンのＣＨ２ドメインに存在する糖が源泉的に欠失された形態で免疫グロブリンのＦｃ領域を生産することができる。免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの糖は、免疫グロブリンの構造的安定性には影響しないが、免疫グロブリンがＦｃ受容体を発現する細胞と結合して抗体依存的細胞毒性を生じさせ、免疫細胞がサイトカインを分泌させて炎症反応を引き起こすようにし、補体のＣ１ｑ要素と結合して補体固定反応を誘発するものと知られている。したがって、非糖化された免疫グロブリンのＦｃ領域を生産して治療用タンパク質と結合させると、好ましくない免疫グロブリンのエフェクター機能は誘発しないながら治療用タンパク質の血中濃度を長らく維持させることができる。
前記ベクターの原核細胞への形質転換方法は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法も含み、当該分野で公知になっているように、宿主細胞に応じて適合な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション法(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンなどが含まれるが、これに限定されない。
本発明の具体的な実施様態では、ＢＬ２１／ｐｍＳＣＰＦｃ（ＨＭ１１２００）、ＢＬ２１／ｐｍＰＳＣＦｃ（ＨＭ１１２０１）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＳＦｃ（ＨＭ１１２０４）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＡＦｃ（ＨＭ１１２０５）、ＢＬ２１／ｐＭＥＰＫＦｃ１（ＨＭ１１２０６）、ＢＬ２１／ｐＭＳＣＤＦｃ１（ＨＭ１１２０７）、ＢＬ２１／ｐＭＤＫＴＦｃ１（ＨＭ１１１２０８）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＡＦｃ１（ＨＭ１１２０９）、ＢＬ２１／ｐＭＰＫＳＦｃ１（ＨＭ１１２１０）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＰＦｃ１（ＨＭ１１２１１）、ＢＬ２１／ｐＭＰＰＣＦｃ１（ＨＭ１１２１２）、ＢＬ２１／ｐＭＰＣＰＦｃ１（ＨＭ１１２１３）、ＢＬ２１／ｐｍＰＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１４）、ＢＬ２１／ｐｍＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１５）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１６）、およびＢＬ１／ｐｍＣＣＶＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１７）、ＢＬ２１／ｐｍＣＶＥＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１８）を製造した。
前記組み換え発現ベクターで形質転換された形質転換体は、通常の方法で培養される。
このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌主に応じて容易に調整して使用することができる。培養に使用される培地は、一般に細胞の成長および生存に必須的な全ての栄養素を含有しなければならない。前記培地は、多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例には、例えばブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、澱粉、セルロースなどの炭水化物、例えば大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの脂肪、例えばパルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、例えばグリセロールおよびエタノールなどのアルコール、例えば酢酸などの有機酸が含まれる。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。使用可能な窒素源の例には、例えばペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）、大豆ホエイなどの有機窒素源、および例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。前記培地にはリン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、および対応するナトリウム含有塩が含有できる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩が含有できる。その他に、アミノ酸、ビタミン、および適切な前駆体などが含有できる。培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。また、発酵器を用いることができる。発酵器を用いてタンパク質を生産する際には、宿主細胞の成長速度や発現産物の量などのいろいろの因子を考慮しなければならない。適切な培養条件でＩＰＴＧなどを投与してタンパク質の発現を誘導することもできる。
凝集体形態で過多発現される免疫グロブリンＦｃ領域は、通常の方式で精製できる。形質転換体から生産された免疫グロブリンＦｃ領域は、フレンチプレスや超音波粉砕機などの方法を用いて細胞を破砕した後、免疫グロブリンＦｃ領域を含む不溶性凝集体のみを遠心分離機を用いて分離した後、分画を溶解および変性させて尿素、グアニジン、アルギニンシステイン、β−メルカプトエタノールなどのリフォールディング剤でリフォールドさせた後、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、および限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせで適用させ、本発明の免疫グロブリン不変領域をコードするタンパク質を得ることができる。このようなリフォールディング過程は比較的複雑な工程であり、タンパク質のリフォールディング効率は非常に低く、リフォールディング後のタンパク質の活性も可溶性タンパク質に比べて低いものと知られている。
ところが、本発明の方法を用いる場合、上述したことを克服して凝集体から開始メチオニンが除去された活性型のＦｃ免疫グロブリンを大量に製造することができる。大腸菌で異種タンパク質を発現生産すると、開始コドンであるメチオニンが付加されており、メチオニンの付加されたタンパク質産物を治療目的で人体に反復投与或いは過量投与するときに免疫反応を誘発して効能を減少させ、毒性を生じさせるおそれがある。ところが、本発明の組み換え免疫グロブリンＦｃ領域を大腸菌で発現させると、開始コドンによって修飾されたメチオニン残基が大腸菌の細胞質内に元々存在する酵素の一つであるアミノペプチダーゼという酵素によって切断されることを、Ｎ末端配列分析によって分かることができた(Adams et al., J. Mol. Biol. 33:571-589, 1968, Takeda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1487-1494, 1968)。このようなアミノペプチダーゼの活性は、タンパク質のアミノ酸配列と構造に依存的なので(Moerschell et al., J. Biol. Chem. 265:19638-19643, 1990, James et al., Protein Expression and Purification 41:45-52, 2005)、ヒンジ領域が免疫グロブリンＦｃ領域に結合する場合、アミノペプチダーゼ活性に影響されて開始メチオニン残基がプロセスされることが分かり、プロセスされる程度は結合するヒンジ領域のアミノ酸配列によって異なる。
付加されるヒンジ領域の特徴によって、プロテアーゼによる翻訳後にプロセシング(post-translational modification)が異なるので、ヒンジ領域を適切に選択して使用することにより、二量体および単量体の生成比率を効果的に調節することができる。また、凝集体をリフォールドさせる場合、ジスルフィド結合形成の際にシステインのミスマッチなどによって正確な二量体の形成が障害を受けるが、本発明の方法を用いると、正確にジスルフィド結合を形成した活性型の二量体を生成することができるので、非常に好ましい。
また、免疫グロブリンＦｃ領域を大量生産するための既存の発明より大量に免疫グロブリンＦｃ領域を生産することができる。具体的に、ヨーロッパ特許ＥＰ０２２７１１０では、免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域を過発現させた後、水溶性状態で発現する産物(cell lyasate)のみを取って免疫グロブリンＧ１ Ｆｃ領域を１５ｍｇ／Ｌの収率で生産し、韓国特許出願第００９２７８３号では、免疫グロブリンＦｃ領域を大腸菌シグナル配列と融合させた形態で発現させ、凝集体ではなく、水溶性形態で発現させて５０〜６００ｍｇ／Ｌの収率で生産した。ところが、本発明のヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域を用いて凝集体から免疫グロブリンＦｃ領域を生産させる場合、３〜６ｇ／Ｌの収率で生産可能である。したがって、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域を生産する方法は、既存の方法に比べて著しく高い収率で産業用の免疫グロブリンＦｃ領域を生産するための非常に有用なシステムである。
別の様態として、本発明は前記方法によって製造された免疫グロブリンＦｃ領域に関する。
前記方法によって大腸菌などの原核細胞で生産された免疫グロブリンＦｃ領域の産業的適用は特に限定されない。一つの例示的適用は、任意の薬物との結合体形成のためのキャリアとして使用することである。免疫グロブリンＦｃ領域と薬物とが結合した結合体の形態は特に限定されない。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域と薬物とは多様な割合で結合可能であり、リンカーなどによって結合が媒介されることも可能である。
薬物はポリペプチド、化合物、抽出物、核酸などを含むが、好ましくはポリペプチド（タンパク質と同等な用語で使用）薬物である。リンカーは、ペプチド性リカーまたは非ペプチド性リンカーを全て含むが、好ましくは非ペプチド性リンカーであり、より好ましくは非ペプチド性重合体である。免疫グロブリン重鎖領域の好適な例はＦｃである。
本発明の方法で製造された免疫グロブリンＦｃ領域と結合して使用できる生理活性ポリペプチドとしては、血中半減期を増加させる必要があるものであればいずれも特別な制限なく使用することができる。例えば、ヒトの疾病を治療または予防する目的で使用されるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの多様な生理活性ポリペプチド、これらの誘導体または類似体を例示することができる。
具体的に、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば：インターフェロン−α、βおよびγ、水溶性タイプIインターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例えば：インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０等）とインターロイキン受容体類（例えば：ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば：グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロネート−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼ−Ａ、アガルシダーゼα、β、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク質類（例えば：ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合タンパク質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞怪死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍怪死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポイエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、血液因子VIIａ、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、プラズミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン(hirudin)、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤(tissue factor pathway inhibitor)、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)、アキソジェネシス因子−１(axogenesis factor-1)、脳ナトリウム利尿ペプチド(brain-natriuretic peptide)、神経膠由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、中性球抑制因子(neurophil inhibitor factor)、神経栄養因子、ニュートリン(neuturin)など）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、自己毒素(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体類（例えば：ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えばＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウィルス由来ワクチン抗原などを例示することができるが、これに限定されるものではない。本発明で適用可能な生理活性ポリペプチドは、天然型であるか、或いは大腸菌などの原核細胞、または酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞などの真核細胞から遺伝子組み換えによって生産されたものであるか、或いは天然型と同等な活性を持って一つ以上のアミノ酸位置で突然変異が起こった誘導体である。
本発明の具体的な実施では、形質転換体ＨＭ１１２０１から生産された免疫グロブリンＦｃ領域をポリエチレングリコールを用いてヒト赤血球生成促進因子（Erythropoietin；ＥＰＯ）に結合させてＥＰＯ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質結合体を製造し、前記タンパク質結合体が、天然型ＥＰＯ、および増加した血中半減期を示す２世代ＥＰＯとして知られているアラネスプ(Aranesp)（Ａｍｇｅｎ社）より優れた血中半減期を示すことを確認した。したがって、本発明によってヒンジ領域を用いて凝集体から生成された開始メチオニン残基の除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫反応を誘発する危険性なしで生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させ、生理活性を改善させるのに有用に使用できることが分かる。
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１＞ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現ベクターの製作、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域の発現および精製、並びにＮ末端配列の確認
＜１−１＞ＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現ベクターの製作
ＩｇＧ４のヒンジ領域を含む重鎖Ｆｃ領域をクローニングするために、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型として次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、Ｑｕｉａｍｐ ＲＮＡ血液キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約６ｍＬの血液から全体ＲＮＡを分離した後、このＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｕａｇｅｎ社）を用いて遺伝子を増幅した。この際、それぞれ異なるＮ末端配列の遺伝子を増幅するために、配列番号１と２、３と２、４と２、および５と２に示される始発体対を使用した。その後のクローニング過程を容易にするために、配列番号１、３、４および５の５’−始発体にはＮｄｅI制限酵素認識部位とタンパク質発現のために必要な開始コドンＡＴＧを挿入し、配列番号２の３’−始発体には終結コドンを含むＢａｍＨI制限酵素認識部位を挿入した。これから増幅されたＦｃ領域産物をそれぞれＮｄｅIとＢａｍＨIで切断した後、同一の制限酵素で処理されたプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入してそれぞれのプラスミドを製造した。それぞれのプラスミドは、ＩｇＧ４ヒンジの全体アミノ酸配列であるＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏのうち次のような配列を含むように考案された。
配列番号１と２で増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＳＣＰＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始するＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号６の塩基配列を有し、発現の際に配列番号７のアミノ酸配列を有する。配列番号３と２で増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＰＳＣＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始するＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号８の塩基配列を有し、発現の際に配列番号９のアミノ酸配列を有する。配列番号４と２で増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＣＰＳＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始するＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号１０の塩基配列を有し、発現の際に配列番号１１のアミノ酸配列を有する。配列番号５と２で増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＣＰＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始するＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号１２の塩基配列を有し、発現の際に配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｍＳＣＰＦｃ（ＨＭ１１２００）、ＢＬ２１／ｐｍＰＳＣＦｃ（ＨＭ１１２０１）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＳＦｃ（ＨＭ１１２０４）およびＢＬ２１／ｐｍＣＰＦｃ（ＨＭ１１２０５）を製造し、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にＢＬ２１／ｐｍＳＣＰＦｃ（ＨＭ１１２００）とＢＬ１／ｐｍＰＳＣＦｃ（ＨＭ１１２０１）は２００５年６月２０日付けでそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ−１０６５９ＰとＫＣＣＭ−１０６６０Ｐで寄託し、ＢＬ／ｐｍＣＰＳＦｃ（ＨＭ１１２０４）とＢＬ２１／ｐｍＣＰＦｃ（ＨＭ１１２０５）は２００５年７月２８日付けでそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ−１０６６５ＰとＫＣＣＭ−１０６６６Ｐで寄託した。
＜１−２＞ＩｇＧ４ Ｆｃ領域の発現および精製
前記実施例＜１−１＞で収得した微生物形質転換体を発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ社）に接種して発酵させた後、免疫グロブリンＦｃ領域断片の発現有無を確認した。
まず、ＬＢ培地１００ｍＬに前記形質転換体をそれぞれ一晩振とう培養した後、発酵器に接種して本培養を行った。発酵器の温度は３５℃或いは２８℃を維持し、嫌気性状態に進むことを防止するために、空気を２０ｖｖｍで投入しながら５００ｒｐｍで攪拌した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源は、ブドウ糖と酵母抽出液を微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００ｎｍでＯＤ値が８０となる時期に誘導物質のＩＰＴＧを投与して発現を誘導した。これを４０〜４５時間培養して吸光度６００ｎｍでＯＤ値が１００〜１２０となるように高濃度で培養した。
前記大腸菌形質転換体から免疫グロブリンＦｃの発現有無、凝集体形成有無および二量体形成有無を確認するために、下記のような試験を行った。細胞質内における全体発現有無を確認するために、前記発酵液の一部を２ｘタンパク質サンプルバッファーと同量で混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気泳動した結果、製造した形質転換体全てで免疫グロブリンＦｃが過発現されることを確認した。その後、前記発酵液をウルトラ−ソニケーション（Ｍｉｓｏｎｉｘ社）を用いて破砕して細胞溶解液を得、その細胞溶解液を遠心分離して水溶性物質と不溶性物質を分離した後、水溶性分画と不溶性分画をそれぞれ１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した結果、発現された産物の大部分は不溶性凝集体として存在することを確認した。凝集体からＦｃのリフォールディング程度、二量体形成有無および二量体形成程度を確認するために、凝集体を次のような方法でリフォールドした。まず、細胞１０ｇをｌｙｓｉｓバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２Ｍ ＮａＣｌ）１００ｍＬに溶かしてウルトラソニケーションを行った後、１０，０００ｒｍｐで２０分間遠心分離して水溶性分画と不溶性分画を分離した後、不溶性凝集体２ｇを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）２０ｍＬと水溶化バッファー（６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ）２０ｍＬに溶かした後、４℃で３０分間軽く振とうしながら反応させる。反応が完了すると、４℃でリフォールディングバッファー（２Ｍウレア、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍアルギニン、３ｍＭシステイン、ｐＨ９．０）を１０倍添加して希釈させた後、一晩軽く振とうしながら反応させる。反応が完了すると、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を除去したタンパク質サンプルバッファーと混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気泳動した。電気泳動済みのゲルはｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色薬で染色してタンパク質バンドを確認した。図１はそれぞれの形質転換体から凝集体形態で発現された産物をリフォールドして前記条件で電気泳動してタンパク質バンドを確認したものである。図１のレーン１、２は形質転換体ＨＭ１１２０１によってそれぞれ３２℃と２８℃で生成された凝集体をリフォールドしたものであり、レーン３、４はＨＭ１１２００によってそれぞれ２８℃と３２℃で生成された凝集体をリフォールドしたものであり、レーン５、６はＨＭ１１２０４によってそれぞれ２８℃と３２℃で生成された凝集体をリフォールドしたものであり、レーン７、８はＨＭ１１２０５によって３２℃と２８℃で生成された凝集体をリフォールドしたものである。対照群としてのレーンＣは、以前研究者らが大腸菌で精製したＦｃを使用した。全体タンパク質中のＦｃタンパク質が多くの比率を示すことが分かる。また、リフォールディング後にも二量体を形成することが分かる。ところが、形質転換体の種類、すなわち形質転換体にコードされたＦｃタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の差異によって二量体と単量体の比率が異なることが分かる。すなわち、ＨＭ１１２０１の産物であるＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−ＣＨ３で開始するＦｃタンパク質は相当数が二量体として存在し、ＨＭ１１０２５の発現産物であるＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−ＣＨ３で開始するＦｃタンパク質は二量体はほぼ存在せず、全て単量体として存在することが分かる。これは、Ｆｃ Ｎ末端配列の差異による大腸菌宿主細胞における宿主細胞のアミノペプチダーゼタンパク質のプロセシングの差異と思われる。
＜１−３＞Ｎ末端配列の確認
前記実施例で凝集体をリフォールドして二量体形態で発現されるＦｃは、開始コドンであるメチオニンが付加されているため、天然型とは異なる配列を持つ。このようなメチオニン残基が大腸菌プロテアーゼによってプロセスされるかを確認するために、基礎科学支援研究所のソウル分所に前記タンパク質のＮ末端配列分析を依頼した。分析すべき試料は下記のように準備した。
まず、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）をメタノールに約２〜３秒間浸漬して活性化させた後、遮断緩衝溶液（１７０ｍＭグリシン、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０％メタノール）に十分濡らした。実施例＜１−２＞で展開された非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、前記のように準備されたＰＶＤＦ膜にブロットキット（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて約１時間ブロットした。ＰＶＤＦ膜に移動したタンパク質を、タンパク質染色薬であるクマシブルーＲ−２５０（Ａｍｎｅｓｃｏ社）で瞬時（３〜４秒間）染色した後、脱色溶液（水：酢酸：メタノール＝５：１：４）で洗浄した。洗浄済みの膜からタンパク質の含まれている部位（二量体と単量体それぞれ）をハサミで切断してＮ末端配列分析を依頼した。
ヒンジ領域を含むＩｇＧ４ Ｆｃタンパク質配列はＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−ＣＨ３であり、それぞれ形質転換体にコードしたアミノ酸配列とＮ末端配列分析結果は下記表１の通りである。
【表１】
2014110816.tif 000003
以上のようなアミノ酸配列分析結果、本発明の大腸菌形質転換体から凝集体形態で発現されてリフォールドされたＦｃ断片のうち二量体を形成する産物は、メチオニンがプロセスされて正確なＮ末端配列を有するものと確認された。また、リフォールドしても単量体として残っているタンパク質産物は、二量体の形成に必要なシステイン残基が除去されて二量体を形成することができないものと思われる。また、図１から分かるように、それぞれ形質転換体毎に単量体の比率が異なり、ＨＭ１１２０５の場合、二量体は存在しないことからみて、Ｎ末端配列のアミノ酸配列がＮ末端のプロセシングに影響を及ぼし、これを調節することにより、凝集体からタンパク質の生産の際に所望のＮ末端配列を得ることができることが分かる。また、同一の配列を持っているタンパク質であっても、タンパク質を生産する大腸菌宿主の培養条件、特に温度によってそのプロセスされることが異なることを下記のような試験によって分かることができる。ＨＭ１１２００の場合、低温（２８℃〜３２℃）で培養する場合、凝集体として存在するだけ水溶化形態で存在することが分かる。このような水溶化形態は、Ｎ末端のアミノ酸であるＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓが切断されて単量体として存在することが分かる。したがって、本発明者らは、Ｎ末端のアミノ酸配列と宿主細胞の培養条件によって単量体の免疫グロブリンＦｃ或いは二量体の免疫グロブリンＦｃを調節して収得することができることを確認した。
前記大腸菌形質転換体から発現された免疫グロブリンＦｃ領域の発現量を定量的に確認するために、リフォールディング溶液で免疫グロブリンＦｃ領域に強い親和性があると知られているタンパク質−Ａカラムを用いて下記のような方法で精製した。
前記の方法で遠心分離によって回収された凝集体をリフォールドした後、カラムクロマトグラフィーを行って精製した。タンパク質Ａ親和カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５ｍＬをＰＢＳで平衡化させた後、細胞溶解液を５ｍＬ／分の流速で負荷した。結合していない分画はＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された分画を脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した。Ｑ ＨＰ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬを用いて２次陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行ったが、１次精製された組み換え免疫グロブリンＦｃ領域分画を結合させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）条件で直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．２Ｍ）方法で流して高純度の分画を得ることができた。各産物をタンパク質Ａカラムによって部分精製した後の発現量を下記表２に示した。
【表２】
2014110816.tif 000004
＜実施例２＞ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃ領域発現ベクターの製作、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の発現および精製、並びにＮ末端配列の確認
＜２−１＞ＩｇＧ１ Ｆｃ領域発現ベクターの製作
ＩｇＧ１のヒンジ領域を含む重鎖Ｆｃ領域をクローニングするために、前記実施例＜１−１＞でＩｇＧ４ Ｆｃ領域をクローニングするために実施した方法と同一のＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、相異なるＮ末端配列を有する遺伝子を増幅するために、下記のような配列のプライマーを使用した。
【表３】
2014110816.tif 000005
３’プライマーは、５’ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｃ３’を使用し、それぞれ異なるＮ末端を有する遺伝子を増幅するときに同一に使用した。以後のベクターへのクローニングを容易にするために、５’プライマーにはＮｄｅI認識部位を挿入し、３’プライマーにはＢａｍＨI認識部位を挿入した。前記プライマー対で増幅してＩｇＧ４ Ｆｃ領域をクローニングするときに使用したベクターに挿入して発現させると、ＩｇＧ１ Ｆｃの全体ヒンジアミノ酸配列であるＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏのうち次のような配列を含む。ＭＥＰＫプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＥＰＫＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号２２の塩基配列を有し、発現の際に発現番号２３のアミノ酸配列を有する。ＭＳＣＤプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＳＣＫＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号２４の塩基配列を有し、発現の際に配列番号２５のアミノ酸配列を有する。ＭＤＫＴプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＤＫＴＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号２６の塩基配列を有し、発現の際に配列番号２７のアミノ酸配列を有する。ＭＣＰＡプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＣＰＡＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号２８の塩基配列を有し、発現の際に配列番号２９のアミノ酸配列を有する。ＭＰＫＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＰＫＳＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号３０の塩基配列を有し、発現の際に配列番号３１のアミノ酸配列を有する。ＭＣＰＰプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＣＰＰＦｃ１であり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号３２の塩基配列を有し、発現の際に配列番号３３のアミノ酸配列を有する。ＭＰＰＣプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＰＰＣＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号３４の塩基配列を有し、発現の際に配列番号３５のアミノ酸配列を有する。ＭＰＣＰプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐＭＰＣＰＦｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列が���ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号３６の塩基配列を有し、発現の際に配列番号３７のアミノ酸配列を有する。それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＭＥＰＫＦｃ１（ＨＭ１１２０６）、ＢＬ２１／ｐＭＳＣＤＦｃ１（ＨＭ１１２０７）、ＢＬ２１／ｐＭＤＫＴＦｃ１（ＨＭ１１２０８）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＡＦｃ１（ＨＭ１１２０９）、ＢＬ２１／ｐＭＰＫＳＦｃ１（ＨＭ１１２１０）、ＢＬ２１／ｐＭＣＰＰＦｃ１（ＨＭ１１２１１）、ＢＬ２１／ｐＭＰＰＣＦｃ１（ＨＭ１１２１２）およびＢＬ２１／ｐＭＰＣＰＦｃ１（ＨＭ１１２１３）を製造した。
＜２−２＞ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の発現および精製
ＩｇＧ４ Ｆｃのように前記実施例＜２−１＞で収得した微生物形質転換体を発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ社）に接種して発酵させた後、免疫グロブリンＦｃ領域断片の発現有無を確認した。
まず、ＬＢ培地１００ｍＬに前記形質転換体をそれぞれ一晩振とう培養した後、発酵器に接種して本培養を行った。発酵器の温度は３５℃或いは２８℃を維持し、嫌気性状態に進むことを防止するために、空気を２０ｖｖｍで投入しながら５００ｒｐｍで攪拌した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源は、ブドウ糖と酵母抽出液を微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００ｎｍでＯＤ値が８０となる時期に誘導物質のＩＰＴＧを投与して発現を誘導した。これを４０〜４５時間培養して吸光度６００ｎｍでＯＤ値が１００〜１２０となるように高濃度で培養した。
前記大腸菌形質転換体から免疫グロブリンＦｃの発現有無、凝集体形成有無および二量体形成有無を確認するために、下記のような試験を行った。細胞質内における全体発現有無を確認するために、導入(induction)前後の発酵液を等分して下記のような還元(reducing)条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
前記発酵液の一部を２ｘタンパク質サンプルバッファーと同量で混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気泳動した結果、図７に示した。レーン１は対照群として使用したＩｇＧ４ Ｆｃであり、レーン２における４はＨＭ１１２０８形質転換体の時間別発現量であり、レーン５における７はＨＭ１１２０６形質転換体の時間別発現量であり、レーン８における１３はそれぞれＨＭ１１２０７、ＨＭ１１２１２、ＨＭ１１２０９、ＨＭ１１２１０、ＨＭ１１２１３、およびＨＭ１１２１１形質転換体の発現を示すものである。図７から分かるように、発現試験に使用した全試料において、導入の前には見られなかった約３０ＫＤａに該当するバンド（Ｆｃ領域）が、導入後に非常に鮮明に見えて組み換えＩｇＧ１ Ｆｃが発現されたことをＧ４Ｆｃ対照群と対比して確認した。発現されたＦｃ領域の量は全体タンパク質量の約３０％以上と過発現されることを確認した。
前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の発現量を定量的に確認するために、リフォールドした溶液で免疫グロブリンＦｃ領域に強い親和性があると知られているタンパク質Ａカラムを用いてＩｇＧ４ Ｆｃを精製した方法と同一の方法で精製した。
発現が確認されたｐＭＤＫＴＦｃ、ｐＭＥＰＫＦｃ、ｐＭＳＣＤＦｃ、ｐＭＰＰＣＦｃおよびｐＭＰＣＰＦｃ形質転換体の発現率は、凝集体１０ｇ当り１３３．３ｍｇ、１５９ｍｇ、３４０ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇと測定された。また、ｐＭＳＣＤＦｃプラスミド形質転換体が最も多い発現率を示している。
前記実施例のＩｇＧ４ Ｆｃにおいて二量体の含量を測定したものと同一の方法で前記ＩｇＧ１ Ｆｃの発現産物の二量体の含量を調査した。前記発酵液をウルトラ−ソニケーション（Ｍｉｓｏｎｉｘ社）を用いて破砕して細胞溶解液を得、その細胞溶解液を遠心分離して水溶性物質と不溶性物質を分離した後、水溶性分画と不溶性分画をそれぞれ１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した結果、発現された産物の大部分は不溶性凝集体として存在することを確認した。凝集体からＦｃのリフォールディング程度、二量体形成有無および二量体形成程度を確認するために、凝集体をリフォールドした。リフォールディング反応が完了すると、タンパク質Ａカラムによって精製した後、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を除去したタンパク質サンプルバッファーと混ぜた後、１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気泳動した。電気泳動済みのゲルはｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色薬で染色してタンパク質バンドを確認した。図８はそれぞれの形質転換体から凝集体として発現された産物をリフォールドして前記条件で電気泳動してタンパク質バンドを確認したものである。
図８のレーン３、６および８は対照群として使用したＩｇＧ４ Ｆｃを非還元条件で電気泳動したものであり、レーン１、２、４、５および７はそれぞれＨＭ１１２０８、ＨＭ１１２０６、ＨＭ１１２０７、ＨＭ１１２１２およびＨＭ１１２１３形質転換体の発酵産物をタンパク質Ａカラムによって精製した産物を非還元条件で電気泳動したものである。図８から分かるように、実験に使用したＩｇＧ１ Ｆｃ断片はその量において多少の差異はあるが、いずれも二量体を形成することが分かる。
＜２−３＞Ｎ末端配列の確認
また、ＩｇＧ４ Ｆｃの場合から分かるように、Ｎ末端配列の差異によって開始コドンとしてのメチオニンが付加されるか、或いは正確にプロセス或いは付加されたメチオニン以外の他の残基まで切断され、所望のタンパク質配列とは異なる配列を持つことが分かる。ＩｇＧ１ Ｆｃの場合、前記実施例で製造した相異なるＮ末端を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、このようなメチオニン残基が大腸菌プロテアーゼによってプロセスされて天然型配列を維持するかを確認するために、ＩｇＧ４ ＦｃのＮ末端配列を確認したことと同一の方法で基礎科学支援研究所のソウル分所に前記タンパク質のＮ末端配列分析を依頼した。各Ｎ末端配列分析結果は下記表４の通りである
【表４】
2014110816.tif 000006
過発現されて正常的な二量体として存在するＨＭ１１２０８とＨＭ１１２０６の形質転換体は、Ｎ末端のメチオニン残基がプロセスされていないままで存在するが、ＨＭ１１２０７、ＨＭ１１２１２およびＨＭ１１２１３の形質転換体発酵産物は開始コドンとしてのメチオニンが正確にプロセスされてＮ末端メチオニン残基がないものと確認された。
以上のような実験によってＩｇＧ１ Ｆｃ領域を大腸菌で発現させるときにＮ末端配列の差異によって発現有無、発現量、二量体の形成比率、Ｎ末端プロセシングなどが異なり、また、これを利用することにより、開始メチオニン残基の除去されたＦｃ領域を大量に収得することができることが分かる。このように収得されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、生理活性ペプチドに結合して外来アミノ酸の付加による免疫反応なしで生理活性ペプチドの血中半減期を増加させ、生理活性を改善させるのに有用に使用できる。
＜実施例３＞ヒト免疫グロブリンＩｇＧ２ Ｆｃ領域の発現ベクターの製作
＜３−１＞ＩｇＧ２ Ｆｃ領域の発現ベクターの製作
ＩｇＧ２のヒンジ領域を含む重鎖Ｆｃ領域をクローニングするために、前記実施例でＩｇＧ４ Ｆｃ領域をクローニングするために実施した方法と同一のＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、相異なる配列を有する遺伝子を増幅するために、下記のような配列のプライマーを使用した。
【表５】
2014110816.tif 000007
３’プライマーは、５’ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｃ３’を使用し、それぞれ異なるＮ末端を有する遺伝子を増幅するときに同一に使用した。以後のベクターへのクローニングを容易にするために、５’プライマーにはＮｄｅI認識部位を挿入し、３’プライマーにはＢａｍＨI認識部位を挿入した。前記プライマー対で増幅してＩｇＧ４ Ｆｃ領域をクローニングするときに使用したベクターに挿入して発現させると、ＩｇＧ２ Ｆｃの全体ヒンジアミノ酸配列であるＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏのうち次の配列を含む。Ｇ２ＭＰＰＣＳＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＰＰＣＧ２Ｆｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓで開始してＩｇＧ２のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号３８の塩基配列を有し、発現の際に配列番号３９のアミノ酸配列を有する。Ｇ２ＭＰＣＰＳＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＰＣＰＧ２Ｆｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ２のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号４０の塩基配列を有し、発現の際に配列番号４１のアミノ酸配列を有する。Ｇ２ＭＣＰＳＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＣＰＧ２Ｆｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ２のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号４２の塩基配列を有し、発現の際に配列番号４３のアミノ酸配列を有する。Ｇ２ＭＣＣＶＳＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＣＣＶＧ２Ｆｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ２のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号４４の塩基配列を有し、発現の際に配列番号４５のアミノ酸配列を有する。Ｇ２ＭＣＶＥＳＳプライマーで増幅された遺伝子を含むプラスミドは、ｐｍＣＶＥＧ２Ｆｃであり、Ｎ末端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏで開始してＩｇＧ２のＣＨ２とＣＨ３のＤＮＡ配列をコードしており、塩基配列分析結果、配列番号４６の塩基配列を有し、発現の際に配列番号４７のアミノ酸配列を有する。それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｍＰＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１４）、ＢＬ２１／ｐｍＰＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１５）、ＢＬ２１／ｐｍＣＰＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１６）、ＢＬ２１／ｐｍＣＣＶＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１７）およびＢＬ２１／ｐｍＣＶＥＧ２Ｆｃ（ＨＭ１１２１８）を製造した。
＜３−２＞発現および精製、Ｎ末端配列の確認
ＩｇＧ４ Ｆｃのように前記実施例で収得した微生物形質転換体を発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ）社に接種して発酵させた後、免疫グロブリンＦｃ領域断片の発現有無を確認した。発現条件は、前記実施例で実施した方法とは大きく異ならず、発現の際に温度、発現培地組成、発現誘導物質の濃度などの多様な条件で発現を誘導して過発現されることを還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって確認した。図９は発酵液の一部を２×タンパク質サンプルバッファーと同量で混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動したもので、レーン１は対照群として使用したＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、レーン２〜６はＨＭ１１２１４、ＨＭ１１２１５、ＨＭ１１２１６、ＨＭ１１２１７およびＨＭ１１２１８形質転換体の発現を示すものである。図９から分かるように、実験に使用した５種の形質転換体はいずれも過発現されることが分かる。各発現産物の二量体の含量を調査するために、前記実施例と同一の方法で細胞を破砕した後、不溶性分画をリフォールドした後、タンパク質Ａカラムを介してＦｃ断片領域のみを精製した。精製されたそれぞれの発現産物は、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を除去したタンパク質サンプルバッファーと混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に電気泳動した。電気泳動済みのゲルはｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色薬で染色してタンパク質バンドを確認した。図１０は電気泳動した結果を示すもので、レーン１と７は対照群として使用したＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、レーン２〜６はそれぞれＨＭ１１２１４、ＨＭ１１２１５、ＨＭ１１２１６、ＨＭ１１２１７およびＨＭ１１２１８形質転換体の二量体を示している。図１０から分かるように、各形質転換体から発現される産物はＮ末端配列の差異或いは発現条件の差異などによってやや異なるが、二量体を形成することが分かる。このように形成される二量体のＮ末端配列で開始メチオニン残基がプロセスされるかを確認するために、前述と同一の方法で基礎科学支援研究所のソウル分所に二量体のＮ末端配列を依頼した結果、２番目のアミノ酸残基がＰｒｏで開始する配列を有するＨＭ１１２１４、ＨＭ１１２１５形質転換体の産物は開始メチオニン残基が除去されることを確認した。以上のような実験によってＩｇＧ２ Ｆｃ領域も大腸菌で大量に発現させることができ、Ｎ末端配列の差異によって発現有無、発現量、二量体の形成比率、Ｎ末端プロセシングなどが異なり、また、これを利用することにより、開始メチオニン残基の除去されたＦｃ領域を大量に収得することができることが分かる。このように収得されたＩｇＧ２ Ｆｃ領域は生理活性ペプチドに結合して外来アミノ酸の付加による免疫反応なしで生理活性ペプチドの血中半減期を増加させ、生理活性を改善させるのに有用に使用できる。
＜実施例４＞活性酵素免疫測定によるＣｌｑ結合能の確認
前記実施例＜１−２＞で大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質がヒトＣｌｑと結合するか否かを確認するために、下記のように活性酵素免疫測定分析法（ＥＬＩＳＡ）を行った。形質転換体ＨＭ１１２００、ＨＭ１１２０１から生産された免疫グロブリンＦｃ領域試料と、比較群として糖が結合している免疫グロブリン（ＩＶＩＧＧ−グロブリンＳ、緑十字ＰＢＭ）を１０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／μＬの濃度で準備した。準備された試料を９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にウェル当たり２００ｎｇの量で分注し、４℃で一晩コートした後、ウェルプレートをＰＢＳ−Ｔ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ツイン２０）で３回洗浄した。牛血清アルブミンを１％の濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液に溶解させて準備した遮断緩衝液２５０μＬを各ウェルに添加した後、常温で１時間放置し、同一のＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液と試料を適当な濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈した後、抗体のコートされたウェルに点滴して常温で１時間放置させて反応させた後、再びＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。遮断反応済みのプレートに２μｇ／ｍＬ Ｃｌｑ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した後、２時間常温で反応させ、反応済みのプレートを前記ＰＢＳ−Ｔ溶液で６回洗浄した。ヒトの抗ヒトＣｌｑ抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社、米国）を遮断緩衝溶液に１０００：１で希釈して各ウェルに２００μＬずつ点滴した後、１時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、発色溶液ＡとＢ（カラー−Ａ−安定化ペルオキシダーゼ溶液およびカラーＢ安定化クロモゲン溶液、ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を同量で混合して各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０分間放置した。その後、反応停止溶液である２Ｍ硫酸を５０μＬずつ添加して反応を停止させた。反応済みのウェルプレートは、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて４５０ｎｍ波長で標準液と検液の吸光度を測定し、その結果を図２に示した。
図２に示すように、本発明によって大腸菌で生産した免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質は、糖があるものに比べて著しく低下したＣｌｑに対する結合能を示すため、生理活性ポリペプチドとの結合タンパク質形成の際にキャリアとして使用されて人体に投与される場合にも、細胞毒性や炎症などの免疫反応を誘発する危険性が非常に低いことが分かる。
＜実施例５＞活性酵素免疫測定によるヒトＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２との結合能の確認
免疫グロブリンＦｃは、生体内血液細胞の受容体であるＦｃγＲI、ＦｃγＲIIIと結合して抗体依存的細胞毒性のようなエフェクター機能を行うものと知られている。大腸菌で生産した免疫グロブリンＦｃもこのようなエフェクター機能を引き起こすかを調べるために、各受容体を収得した後、活性酵素免疫測定法を行ってその結合能を確認した。また、免疫グロブリンの生体内代謝に影響を及ぼすものと知られているＦｃＲｎ受容体との結合能を確認するために、同一の方法で試験を行った。
＜５−１＞ヒトＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２発現細胞株の確立
ヒト抹消血液単核球から全体リボヌクレオチドをキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．ｎｏ．）を用いて分離した後、これを母体として逆転写重合反応と重合反応でヒトＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２の細胞外リガンド結合部分の遺伝子配列を得てＧＳＴ(glutathione S-transferase)遺伝子と連結してジヒドロ葉酸還元酵素発現遺伝子の入っている動物細胞発現用ベクターでクローニングした。前記製造されたｐＨＭ０００プラスミドでＣＨＯ細胞を形質転換するために、６ｃｍの培養皿に１×１０６細胞を接種して３７℃、５％ＣＯ２恒温器で２４時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ．，Ｃａｔ．ｎｏ．３１９８５−０７０）で２回洗浄した。１０μｇのｐＨＭ０００プラスミドが入っている１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにリポフェクタミンＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．ｎｏ．１８３２４−０２０）１ｍＬを混合して常温で２０分間反応させた後、準備されたＣＨＯ細胞に均一に入れ、１８時間３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養した後、さらに１０％牛胎児血清と１％フェニシリン−ストレプトマイシンが含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地で交換して４８時間培養した。形質転換された細胞株を選別するために、１０％透析牛胎児血清(dialyzed fetal bovine serum)と１％フェニシリン−ストレプトマイシン、および８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６１−２３４ＲＧ）が入っているα−ＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＬＭ００８−０２）選別培地に０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ．，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４００−０５４）処理と遠心分離によって得られた細胞株を全てＴ２５培養容器（Ｎｕｎｃ）に移して接種した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養し、形質転換されて選別された細胞株が培養容器で９０％以上となるように培養した。選別された細胞株のＦｃγＲI、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎαβ２の発現量を増加させるために、ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ−８４０７）を２０ｎＭから２０ｎＭ単位で２週毎に増加させ、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養した。
＜５−２＞ヒトＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２の生産および精製
ＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２を得るために、Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ，Ｃａｔ．ｎｏ．１７０００９）にｆａｃｔｏｒｙ当り３．５×１０８細胞を接種して３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４８時間培養し、ＰＢＳでＦａｃｔｏｒｙ当り１Ｌつ２回ずつ水洗した後、０．３ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ−５８８７）入り生産培地であるＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭを１Ｌずつ仕込み、３３℃、５％ＣＯ２恒温器で培養し、２日毎に７回発現上澄み液を回収した。回収した発現上澄み液は遠心分離して０．２２μｍの濾過装置（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で濾過し、濃縮装置（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＰＮ ０Ｓ０１０Ｃ７０）で濃縮した後、ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｒｅｓｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃａｔ．ｎｏ．１７−０５７５−０２）に０．１Ｍ硫化ニッケル（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｎ４８８７）を結合させたカラムに流してＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２のＧＳＴがニッケルに結合するようにした。結合したＦｃγＲI、ＦｃγＲIII、ＦｃＲｎαβ２は５０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから分離して精製した。
＜５−３＞ＦｃγＲIとの結合能の確認
実施例＜６−２＞で精製されたＦｃγＲIを０．７５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した後、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にウェル当り１００μＬずつ分注して４℃の冷蔵状態で１８時間反応させてウェルの底部に結合するようにした。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．０７７７）の添加された水洗用緩衝溶液をウェル当り３００μＬずつ分注して３回水洗した後、ウェルの底部に不要な物質の結合を防ぐために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０と３％ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．０３３２）が添加された分析用緩衝溶液をウェル当り３００μＬずつ分注して３７℃の恒温器で１時間反応させ、反応液をウェルから全て除去した。実施例２で精製されたＨＭ１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群として糖鎖が存在するヒト由来ｓｅｒｕｍ ＩｇＧとｓｅｒｕｍ ＩｇＧをパパイン処理して分離したＦｃを分析用緩衝溶液に９μｇ／ｍＬの濃度で希釈した後、さらに分析用緩衝溶液で１／３ずつ７段階まで希釈して９６ウェルプレートにウェル当り１００μＬずつ分注して２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させ、水洗用緩衝溶液で６回水洗した。ウェルの底部のＦｃγＲIに結合したＨｍ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群を確認するために、このような物質に結合することが可能なＨＲＰの付いている塩素由来のヒト抗体重鎖に対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＰ３０９Ｐ）を分析用緩衝溶液に１／１００００で希釈してウェル当り１００μＬずつ分注して２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させた後、水洗用緩衝溶液で６回水洗し、抗体に付いているＨＲＰと反応することが可能な基質（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．ｎｏ．５５５２１４）をウェル当り１００μＬずつ入れて２５℃で２０分間反応させた。反応が完了すると、それ以上反応が行われないように２Ｎ硫酸溶液としての反応停止溶液を入れ、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍの波長で発色程度を測定した。図３から分かるように、大腸菌で生産したＦｃはＦｃγＲIとほぼ結合せず、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧとＦｃの場合は強く結合することが分かる。
＜５−４＞ＦｃγＲIII結合能の確認
実施例＜１−２＞で精製されたＨＭ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群として糖鎖のあるヒト由来ｓｅｒｕｍ ＩｇＧとｓｅｒｕｍ ＩｇＧをパパイン処理して分離したＦｃをそれぞれ９μｇ／ｍＬの濃度で炭酸塩緩衝溶液（ｐＨ９．０）で希釈した後、さらに炭酸塩緩衝溶液で１／３ずつ７段階希釈して９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にウェル当り１００μＬずつ分注して４℃の冷蔵状態で１８時間反応させてウェルの底部に結合するようにした。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．０７７７）が添加された水洗用緩衝溶液を３００μＬつ分注して３回水洗した後、ウェルの底部に不要な物質の結合を防ぐために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と５％脱脂粉乳（Ｄｉｆｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．２３２１００）が添加された分析用緩衝溶液をウェル当り３００μＬずつ分注して３７℃の恒温器で１時間反応させ、反応液をウェルから全て除去した。実施例４−２で精製されたＦｃγＲIIIを分析溶液に１μｇ／ｍＬの濃度で希釈して９６ウェルプレートにウェル当り１００μＬずつ分注して２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させ、水洗用緩衝溶液で６回水洗した後、ＨＭ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群に結合したＦｃγＲIIIのＧＳＴ(glutathion s-transferase)と結合することが可能なウサギ由来の抗−ＧＳＴ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ３２８２）を分析用緩衝溶液に１／１００００で希釈してウェル当り１００μＬずつ分注し、２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させた。反応が完了した後、水洗用緩衝溶液で６回水洗し、抗体に結合可能なウサギ抗体に対する抗体を分析用緩衝溶液に１／７５００となるように希釈してウェル当り１００μＬずつ分注した。
２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させた後、水洗用緩衝溶液で６回水洗し、実施例＜６−４＞でのように基質を入れてＥＬＩＳＡリーダーで発色程度を測定した。図４から分かるように、大腸菌で生産したＦｃはＦｃγＲIIIとほぼ結合せず、糖鎖のあるヒト由来ＩｇＧとＦｃの場合は強く結合することが分かる。
＜５−５＞ＦｃＲｎαβ２の結合能の確認
実施例＜１−２＞で精製されたＨＭ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群として糖鎖のあるヒト由来ｓｅｒｕｍ ＩｇＧとｓｅｒｕｍ ＩｇＧをパパイン処理して分離したＦｃをそれぞれ２０μｇ／ｍＬの濃度で炭酸塩緩衝溶液（ｐＨ９．０）で希釈した後、さらに炭酸塩緩衝溶液で１／３ずつ７段階希釈して９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にウェル当り１００μＬつ分注して４℃の冷蔵状態で１８時間反応させてウェルの底部に結合するようにした。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．０７７７）が添加された水洗用緩衝溶液を３００μＬずつ分注して３回水洗した後、ウェルの底部に不要な物質の結合を防ぐために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と０．５％ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．ｎｏ．０３３２）が添加された分析用緩衝溶液をウェル当り３００μＬずつ分注して３７℃の恒温器で１時間反応させ、反応液をウェルから全て除去した。実施例６−２で精製されたＦｃＲｎαβ２を分析溶液に３μｇ／ｍＬの濃度で希釈して９６ウェルプレートにウェル当り１００μＬずつ分注して２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させ、水洗用緩衝溶液で６回水洗した後、ＨＭ１１２００とＨＭ１１２０１産物、そして対照群に結合したＦｃＲｎαβ２のＧＳＴと結合することが可能なウサギ由来の抗−ＧＳＴ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ３２８２）を分析用緩衝溶液に１／１００００で希釈してウェル当り１００μＬずつ分注し、２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させた。反応が完了した後、水洗用緩衝溶液で６回水洗し、抗体に結合可能なウサギ抗体に対する抗体を分析用緩衝溶液に１／７５００となるように希釈してウェル当り１００μＬずつ分注した。２５℃で一定に振とうしながら２時間反応させた後、水洗用緩衝溶液で６回水洗し、実施例２でのように基質を入れてＥＬＩＳＡリーダーで発色程度を測定した。図５から分かるように、大腸菌で生産したＦｃもヒト由来天然型ＩｇＧおよび糖鎖のあるＦｃの場合と同様に強く結合する。
＜実施例６＞ヒト赤血球生成促進因子結合体の製造および薬物動力学
＜６−１＞ヒト赤血球生成促進因子の製造
ヒト赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）の結合体を製造するために、まずＥＰＯ遺伝子を血液からＲＴ−ＰＣＲで得た後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）ベクターにクローニングしてｐＢｌｕｅＥＰベクターを製作した。ＥＰＯ遺伝子を動物細胞発現ベクターｐＣＭＶ／ｄｈｆｒ−（ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にｄｈｆｒ遺伝子を挿入したベクター）に移すために、前記ベクターｐＢｌｕｅＥＰをＨｉｎｄIIIとＢａｍＨI制限酵素で切断してＥＰＯ遺伝子含有切片を得た後、同一の制限酵素で処理された前記動物細胞発現ベクターに挿入してｐｃｍｖＥＰを製作した。ＥＰＯ遺伝子の挿入されたｐＣＭＶ／ｄｈｆｒ−発現ベクターをリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を用いてタンパク質発現細胞株としてのＣＨＯ細胞株に形質感染させ、発現量を増加させるために、ＭＴＸの濃度を１２０ｎＭまで段階的に高めて１Ｌ当り１００ｍｇ以上のＥＰＯ発現を確認した。
＜６−２＞ヒト赤血球生成因子−ＰＥＧ連結体の製造
両側末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、前記で生産されたＥＰＯが５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解している１００ｍＭリン酸塩緩衝液に、ＥＰＯ：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。ここに還元剤としてのナトリウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、４℃で徐々に攪拌しながら２時間反応させた。ＥＰＯのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとインターフェロンαが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をもってスーパーデキス（ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶出液として１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＥＰＯ−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧに結合していないＥＰＯ、未反応ＰＥＧ、および２つのＥＰＯがＰＥＧと連結された二量体副産物を除去した。精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した。これから反応性が最も良く、二量体などの副産物が少ないＥＰＯ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。
＜６−３＞ヒト赤血球生成因子−ＰＥＧ連結体と組み換え免疫グロブリンＦｃ領域の結合体の製造
前記実施例＜６−２＞で製造したＥＰＯ−ＰＥＧ連結体と、実施例＜１−３＞でＨＭ１１２０１形質転換体で生産した免疫グロブリンＦｃ領域とを結合させた。具体的に、実施例＜１−３＞で準備された免疫グロブリンＦｃ領域断片（約５３ｋＤａ）を１０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解させた後、ＥＰＯ−ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片のモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるようにＥＰＯ−ＰＥＧ連結体と混合して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液状態に作り、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これから反応性が最も良く、二量体などの副産物が少ないＥＰＯ−ＰＥＧ連結体：Ｆｃ領域断片の最適反応モル比は１：２であることを確認した。
結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＥＰＯ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ領域タンパク質結合体を精製するために、高圧液体クロマトグラフィーを行った。カップリング反応液を脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ２６／１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した後、Ｑ ＨＰ ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬに８ｍＬ／分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０Ｍ→０．２Ｍ）方法で所望の分画を得た。溶出された分画を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化されたｐｏｌｙＣＡＴ２１．５×２５０カラム（ｐｏｌｙＬＣ社）に１５ｍＬ／分の流速で再び結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ→０．３Ｍ）方法で溶出して高純度の分画を得ることができた。
＜６−４＞薬物動力学
各群当り３匹のＳＤラットに、前記実施例＜４−３＞で得た天然型ＥＰＯとシアル酸の量を増やして半減期を増加させたアラネスプ（Ａｍｇｅｎ社）、そして前記実施例＜５−３＞で製造したＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（試験群）を１００μｇ／ｋｇとなるように皮下注射した。対照群は注射０．５、１、２、４、６、１２、２４、および４８時間後に採血し、試験群は注射１、１２、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２４０、２８８、３３６および３８４時間後に採血した。血液試料は１．５ｍＬのチューブに集めて凝固させた後、エッペンドルフ高速マイクロ遠心分離器で１０分間遠心分離して血球細胞を除去した。血清内タンパク質の量はＥＰＯに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法によって測定した。
表６および図６は各天然型タンパク質と結合タンパク質の血中半減期を示すもので、本発明によって生産された免疫グロブリンＦｃ領域をキャリアとして用いて製造された結合タンパク質ＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体が天然型ＥＰＯに比べて著しく増加した血中半減期を示した。これは増加した血中半減期を示す２世代ＥＰＯとして知られているアラネスプより優れるものと確認された。
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０００６】
上述したように、本発明のヒンジ領域を含む組み換え免疫グロブリンＦｃ領域を用いて大腸菌において凝集体形態で免疫グロブリンＦｃ領域を大量に生産することができ、生産された免疫グロブリンＦｃ領域は、生理活性ペプチドに結合し、免疫反応を誘発する危険性なしで生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させ、生理活性を改善させるのに有用に使用できる。
【受託番号】
【０００７】
ＫＣＣＭ−１０６５９Ｐ
ＫＣＣＭ−１０６６０Ｐ
ＫＣＣＭ−１０６６５Ｐ
ＫＣＣＭ−１０６６６Ｐ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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