(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、幹細胞を担体から剥離させずに大量培養しうる培養装置および培養方法を提供することである。【解決手段】  本発明は、少なくとも、培養漕と、該培養漕内を満たす培養液と、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質をコートさせた担体とを備え、担体表面に高低を形成させる低部が複数存在する幹細胞培養装置である。該担体は、幹細胞非剥離性を有し、幹細胞は担体表面上で培養される。担体表面には低部が担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存在することが好ましい。幹細胞付着性物質は、少なくともＥ−カドヘリン、マトリゲル、ラミニンのいずれか一つ以上である。本発明は、該担体を培養液中に浮遊させ、担体表面に幹細胞付着性物質を介して分散状態で付着させた幹細胞を、担体表面から剥離させず、増殖させる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、培養層と、該培養層内を満たす培養液と、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質をコートさせた担体とを備え、担体表面に高低を形成させる低部が複数存在する幹細胞培養装置。
【請求項２】
前記担体が幹細胞非剥離性を有し、該担体表面上で幹細胞を増殖させる請求項１に記載の幹細胞培養装置。
【請求項３】
前記低部が、担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存在する、請求項１または請求項２に記載の幹細胞培養装置。
【請求項４】
前記低部が、担体表面積1000000μｍ２あたり1000000〜3000000個存在する、請求項１または請求項２に記載の幹細胞培養装置。
【請求項５】
前記低部が、担体表面積1000000μｍ２あたり400〜14000個存在する、請求項１または請求項２に記載の幹細胞培養装置。
【請求項６】
前記低部が、担体表面積1000000μｍ２あたり1300000〜1700000個存在する、請求項１又は請求項２に記載の幹細胞培養装置。
【請求項７】
前記低部が、担体表面積1000000μｍ２あたり4000〜10000個存在する、請求項１または請求項２に記載の幹細胞培養装置。
【請求項８】
前記幹細胞付着性物質が、少なくともＥ−カドヘリン、マトリゲル、ラミニンのいずれか一つ以上である請求項１ないし請求項７に記載の幹細胞培養装置。
【請求項９】
幹細胞を播種させた培養液中に、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質をコートさせた担体を浮遊させる工程と、
前記担体表面に幹細胞付着性物質を介して分散状態で付着させた幹細胞を、該担体表面から剥離させず、かつ未分化状態を維持させて増殖させる工程とを含む幹細胞培養方法。
【請求項１０】
担体表面に高低を形成させる低部が担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存在する担体を用いる、請求項９に記載の幹細胞培養方法。
【請求項１１】
前記低部が担体表面積1000000μｍ２あたり1000000〜3000000個存在する担体を用いる、請求項９に記載の幹細胞培養方法。
【請求項１２】
前記低部が担体表面積1000000μｍ２あたり400〜14000個存在する担体を用いる、請求項９に記載の幹細胞培養方法。
【請求項１３】
前記低部が担体表面積1000000μｍ２あたり1300000〜1700000個存在する担体を用いる、請求項９に記載の幹細胞培養方法。
【請求項１４】
前記低部が担体表面積1000000μｍ２あたり400〜10000個存在する担体を用いる、請求項９に記載の幹細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を未分化状態で増殖させる培養装置および培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、血球、粘膜上皮、表皮等特定の機能を有する細胞に分化する能力を、細胞分裂後も保持し続ける細胞である。幹細胞は、個体組織の発生メカニズムの研究に重用される。また医療分野では、治療対象の組織や器官の幹細胞を培養して患者に移植することが期待される。
【０００３】
受精卵から発生する胚性幹細胞（Emblyonic Stem cell, ＥＳ細胞）は、あらゆる細胞に分化しうる多能性を有する。従って、ＥＳ細胞から分化させた任意の細胞を利用することにより、難病の原因解明や薬物の安全確認を分子レベルで行える可能性が高まっている。
【０００４】
上記の基礎研究、臨床研究の進展や実用化には、所望の細胞に分化誘導させ得る未分化の幹細胞の量産が前提となる。かかる背景により、幹細胞の量産可能な培養方法の確立が、一層望まれる。
【０００５】
従来、幹細胞の培養方法の例として、静置培養法がある。静置培養法は、シャーレ、6〜24穴のプレート、或いはＴ−フラスコ等の底面に細胞を付着させて行われる。しかし、この方法では、シャーレ上で得られる幹細胞の細胞密度が小さいため、大量培養が難しい。
【０００６】
例えば、直径20μｍのマウス幹細胞を培養する場合、シャーレ上で静置培養される細胞の密度は、6×10４Cells/ｃｍ２である。上記の方法によると、10８Cells培養するために、約2000ｃｍ２の平面が必要になる。
【０００７】
細胞の培養方法の他の例として浮遊培養法がある。浮遊培養法は、培養容器内に満たした培地を撹拌、振とう等することにより細胞を浮遊させて培養する細胞培養方法である。浮遊培養法は、高い細胞密度で培養することができる。
【０００８】
上記の静置培養法の例で説明したものと同様のマウス幹細胞を浮遊培養する場合、培養される細胞の密度は１×10６ Cells/ｃｍ2である。この場合、100ｍLの培養漕で10８Cells培養することができる。すなわち、浮遊培養法は、比較的小さな装置で大量培養を行うことができる。
【０００９】
特許文献１は、浮遊培養による胚性幹細胞培養方法の例である。特許文献１では、目的の細胞以外の細胞が培養液中に実質的に存在しない条件下で、胚性幹細胞の球状の細胞塊を形成させ、該球状体で細胞を増殖させることが開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特願2007-228815号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし幹細胞の浮遊培養法では、幹細胞を担体に付着させても、培養液が撹拌等されることにより幹細胞に対しせん断力が働き、幹細胞が担体から剥離しやすい。したがって、幹細胞の大量培養においては、幹細胞の担体からの剥離を抑制することが求められる。
【００１２】
また、未分化状態を維持させて幹細胞を培養することが困難な場合がある。すなわち、幹細胞の培養では、未分化状態の幹細胞を得るために、培地に分化抑制剤を含有させることがある。幹細胞は付着性が高いため、浮遊させた幹細胞同士が付着し、大きな細胞塊が形成されやすい。大きな細胞塊の中心部には、分化抑制剤が侵入しにくい。その結果、細胞塊の中心部から分化が進行しやすくなる。
【００１３】
加えて、大きな細胞塊が形成されると、細胞回収時の遠心分離工程前に大きな細胞塊をほぐさなければならず、工程数が多くなる。
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、幹細胞を、未分化状態を維持しながら効率的に大量培養しうる培養装置および培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、その表面に所定の高低を有し、かつ幹細胞付着性物質をコートさせた担体を用い、幹細胞を未分化状態で維持して大量培養させうる培養装置および培養方法を発明するに至った。
【００１６】
本発明に用いられる担体は、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質がコートされる。該担体は幹細胞非剥離性を有し、その表面で幹細胞を増殖させる。担体表面に高低を形成させる低部は、担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存存在する。該低部は、1000000〜3000000個存在することが好ましく、400〜14000個存在することも好ましい。該担体表面にコートさせる幹細胞付着性物質としては、少なくともＥ−カドヘリン、マトリゲル、ラミニンのいずれか一つ以上が選択される。
【００１７】
本発明は、幹細胞を播種させた培養液中に、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質をコートさせた担体を浮遊させる工程と、前記担体表面に幹細胞付着性物質を介して分散状態で付着させた幹細胞を、該担体表面から剥離させず、かつ未分化状態を維持させて増殖させる工程とを含む幹細胞培養方法を包含する。
【００１８】
上記培養方法においては、担体表面に高低を形成させる低部が担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存在する担体が好ましく用いられる。担体表面に高低を形成させる低部が担体表面積1000000μｍ２あたり1000000〜3000000個存在する担体や、400〜14000個存在する担体を用いることも好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る幹細胞培養装置は、幹細胞の担体表面への付着性が良好である。本発明で発揮される担体の幹細胞非剥離性は、特に浮遊培養法に適用する場合に有用である。該装置は培養終了後の幹細胞の回収を簡便に行うことができる。従って、本発明に係る幹細胞培養方法は、未分化状態が維持された幹細胞を小さな装置で効率的に大量培養させることができる。
【００２０】
本発明は、特にＥＳ細胞の大量培養や、未分化状態で培養されたＥＳ幹細胞の効率的な回収に寄与する。マウス等の哺乳動物の幹細胞をはじめ、ヒトＥＳ細胞にも適用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る幹細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る幹細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【図３】本発明に係る幹細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【図４】本発明に用いる担体の一例の断面を示す模式図である。
【図５】本発明の実施例および比較例で得られる細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に係る幹細胞培養装置は、培養漕と、培養槽を満たす培養液と、幹細胞付着性物質をコートさせ、かつ所定の表面形状を形成させた担体とを備える。
【００２３】
本発明に用いられる担体は、その表面に高低を有し、かつ幹細胞付着性物質がコートされる。担体表面に高低を形成させる低部は、担体表面積1000000μｍ２あたり400〜3000000個存在する。本発明にかかる担体表面上の低部存在数は、培養対象となる幹細胞の種類により適宜決定される。
【００２４】
図１〜３は、本発明の幹細胞培養装置の例を示す模式図である。図１は培養液５を撹拌させて担体４を浮遊させる幹細胞培養装置１の例である。図２は、培養液５を振とうさせて担体４を浮遊させる幹細胞培養装置２である。図３は、培養液５を灌流させて担体４を浮遊させる幹細胞培養装置３の例である。図３に示される矢印は灌流方向を示す。図１〜３において４は担体、５は培養液、６は培養槽である。
【００２５】
図４は本発明に係る担体の一例の断面を示す模式図である。図４において、４は本発明に用いられる担体である。該担体の表面は後に説明する幹細胞付着性物質（不図示）でコートされる。担体表面は、複数の高部７と低部８とにより形成される高低を有する。Ｃは、高部７を足場にして担体４に付着した幹細胞である。
【００２６】
上記担体は、担体表面に高低を形成させる低部により担体表面と幹細胞との平坦な接着面積を確保することができる。該低部は、少なくとも従来公知の平坦な表面からなる担体と同様の幹細胞付着性を有する。
【００２７】
従来公知の平坦な表面からなる担体は、浮遊培養法に適用される場合、担体表面に付着させた幹細胞が、培養液中に生じるせん断力を直接受けるため、剥離しやすい。
【００２８】
これに対し本発明に用いられる担体は、低部が周囲を高部により囲まれている。そのため、培養液の撹拌等により生じるせん断力は該高部によって受け止められ、低部内では低減される。これにより本発明は、担体低部に付着する幹細胞がせん断力により担体表面から剥離することが抑制される。
【００２９】
すなわち本発明は、静置培養法に加え、浮遊培養法においても優れた幹細胞非剥離性を発揮する。本発明に用いられる担体において「非剥離性」とは幹細胞が全く剥離しない場合に加え、「担体から幹細胞が剥離しにくい」ことを包含する。
【００３０】
上記「担体から幹細胞が剥離しにくい」とは、担体に付着したと推測される細胞数に対し、担体に付着後剥離したと推測される細胞数が10％程度であることを意味する。上記細胞数の推測値は、担体の表面形状、培養対象となる細胞の種類、播種密度等を考慮し、培養を終了させ担体を培養層から取り出した直後の培養層内に残った細胞数等から導き出される。
【００３１】
低部と共に担体表面に高低を形成させる高部は、培地に播種された幹細胞を担体に付着させる足場として機能する。すなわち、培地に播種された幹細胞は、担体表面に付着すると、近傍にある高部をとらえて伸展する。
本発明は、担体表面に足場として機能する高部が形成されることにより、幹細胞が伸展しやすくなる。該幹細胞は、該高部にフィットして担体表面に良好に付着する。従って本発明に用いる担体に付着させた幹細胞は、せん断力が生じる培養液中においても剥離しにくい。
【００３２】
本発明で用いられる担体の表面には、幹細胞の表面に発現する所定の基底膜成分と親和性を有する幹細胞付着性物質をコートさせる。特に担体に形成される高部は、幹細胞付着性物質のコート量が比較的多量になる傾向がある。これにより本発明は、幹細胞の担体への付着性を向上させる。
【００３３】
上記の担体を培養液中にいれると、担体表面をコートする幹細胞付着性物質の親水性により、担体は培養槽底部へ沈降する。しかし培養液を撹拌等させることにより、沈降した担体を培養液内で浮遊させることができる。
【００３４】
浮遊させた該担体は、培養液中に播種された幹細胞と自然に接触する。担体表面の高部の頂点間の距離が幹細胞の直径より小さい領域では、幹細胞が低部に入り込まず、各頂点上に支持されるように接触させることができる。
担体表面の高部の頂点間の距離が幹細胞の直径より大きい領域では、幹細胞が低部に分散状態で付着する。低部では、幹細胞と担体表面との接着面積を広く確保できる。
【００３５】
本発明においては、担体表面に形成される高部と低部とのいずれにおいても幹細胞が付着しやすく、かつ剥離しにくい。
担体表面の高部においては該頂点が幹細胞付着の足場として機能することと比較的多量にコートされる幹細胞付着性物質とにより、良好な幹細胞付着性を発揮する。担体表面の低部においては、広い接着面積を確保することにより良好な幹細胞付着性を発揮する。
【００３６】
本発明において発揮される付着性は、少なくとも培養液の撹拌等により生じるせん断力に対抗しうる。すなわち本発明は、担体に付着する幹細胞が上記せん断力により担体から剥離することを抑制することができる。
【００３７】
本発明に用いられる担体は、その表面に幹細胞付着性物質がコートされているため、幹細胞が、該幹細胞付着性物質のコート領域に分散状態で生育させることができる。
【００３８】
本発明の培養装置を説明する。
［担体］
本発明に用いられる担体４は、その表面に複数の高部７と低部８とが存在する。該複数の高部と低部とは、本発明の担体表面に高低を形成させる。本発明において「高低を有する」とは、担体の表面が平坦でないことを意味する。
【００３９】
本発明に用いられる担体の高低を有する表面を、図４を用いて説明する。図４において、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、各高部の頂点である。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は各低部の最低点である。ｇ１、ｇ２、ｇ３は、高部と該高部と隣接する低部との高低差を表す。「高低を有する」とは、高部の頂点と該高部と隣接する低部の最低点との高低差の平均値が0.5μｍより大きいことを包含する。
【００４０】
なお、図４において、ｄ１はＰ１とＰ２との間の隣り合う頂点間の距離であり、ｄ２はＰ２とＰ３との間の頂点間距離である。
【００４１】
上記担体は、目的となる幹細胞の直径や柔軟性に対応させた所定の高低からなる表面粗さを有するため、培養液中に懸濁される幹細胞を担体表面にフィットさせやすい。担体表面に形成される高部は、幹細胞を支持する足場として機能する。また幹細胞剥離抑制作用を奏する。これにより、本発明は、良好な幹細胞付着性を有する。
【００４２】
培養終了後は、該担体を培地から取り出して、常法に従い幹細胞を回収できる。本発明は、幹細胞を担体上に分散状態で付着させて培養するため、大きな細胞塊は形成されない。したがって、回収工程を簡便に行うことができる。
【００４３】
本発明に用いられる担体表面の高低は、担体表面積1000000μｍ２あたりの低部の存在数で表現されうる。本発明において該低部の存在数は、担体表面積1000000μｍ２あたりおよそ400〜3000000個である。
好ましくは、担体表面積1000000μｍ２あたり1000000〜3000000個であり、より好ましくは1300000〜1700000個であり、さらに好ましくは1500000個である。他の好ましい低部存在数は、担体表面積1000000μｍ２あたり400〜14000個であり、より好ましくは4000〜10000個である。
該低部の存在数を上記の好ましい範囲内で形成させる方法は特に限定されない。該担体の製造方法は、後にその例を挙げて説明する。
【００４４】
該担体の表面粗さは、図４においてｄ１又はｄ２で例示される高部の頂点間距離によっても表現されうる。上記隣り合う高部の頂点間の好ましい距離は、培養される幹細胞の直径や柔軟性等により適宜決定される。頂点間の距離は、幹細胞の直径より1〜5％、或いは50〜200％程度の大きさであることが好ましい。
【００４５】
図４においてｄ１、ｄ２により例示される頂点間距離が小さすぎる担体や、ｇ１、ｇ２およびｇ３により例示される表面高低差の平均値が、0.5μｍより小さな担体は、各高部の頂点と幹細胞とのそれぞれの接触面積が小さくなりやすい。そのため、担体表面の高部の足場として機能が低くなり、幹細胞が担体表面から剥離しやすくなる。上記のような滑らかな担体表面を有する担体の多くは、低部の存在数が3000000個より多い場合に認められる。
【００４６】
マウス多能性幹細胞の培養に用いられる担体の場合、好ましい頂点間距離は、0.1〜2.7μｍであり、より好ましくは、0.5〜2.0μｍである。他の好ましい頂点間距離は、5μm〜40μmである。担体表面の平均高低差は、0.5〜2.7μｍが好ましく、0.5〜2.0μｍが好ましい。
【００４７】
担体表面の低部の存在数すなわち表面粗さの程度は、培養対象となる幹細胞の種類に対応して適宜決定される。具体的な考慮すべき要素としては、幹細胞のサイズや、幹細胞の移動速度等が挙げられる。
【００４８】
低部の存在数と高部の存在数は比例する。すなわち低部の存在数が少ない場合、高部の存在数も少なくなる。高部の頂点間距離と幹細胞直径との差がほとんどない担体は、幹細胞の足場が少ない。そのため、幹細胞を複数の高部で支持しがたくなる。その場合、浮遊培養法による所望の幹細胞培養が困難になる。
【００４９】
幹細胞は培養基材表面上を移動して増殖するが、その速度はその培養基材表面性状により異なる。細胞の移動速度が速い場合、細胞は急速に伸張、収縮する。急速に収縮して球形に近い形状になった細胞は、培養基材との接触面積が減少する。したがって好ましい付着性を得難くなる。
【００５０】
移動速度が速い細胞を培養する場合は、上記に推察される低付着性を補完する観点から、幹細胞の伸張時に足場となる高部を提供しうる担体を用いることが好ましいと考えられる。すなわち移動速度が速い細胞を培養する場合、本発明所定の範囲内で比較的担体表面の低部の存在数が多い担体を用いることは、好ましい選択である。
【００５１】
コロニー形成を防止するためには、培養対象となる幹細胞のサイズに対し適切な表面粗さを備える担体を用いるが好ましい。播種密度が過度に高い培養液で頂点間距離が大きな担体を用いると、低部に多数の幹細胞が入り込みコロニーを形成する可能性が高まる。コロニーになった幹細胞は、コロニー中心部から分化が進む傾向がある。したがって幹細胞のサイズを考慮して担体の表面粗さを選択することが、未分化細胞培養の観点から好ましい。
【００５２】
担体基材としては、幹細胞、特にマウスＥＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用する公知の材料を用いることができる。本発明の担体はその表面に起伏を形成させるため、基材には成型加工が容易な材料を用いることが好ましい。好ましくはポリスチレン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリウレタン等を用いることができる。
【００５３】
担体の形状は、培養液中に浮遊させた担体同士が接触しにくい形状が選択される。担体同士の接触を抑制することにより、担体に付着させた幹細胞の剥落を抑制できる。
【００５４】
好ましい担体の形状としては、球状、ディスク型、リング型、ファイバー型等が例示される。特にディスク型担体は、担体同士が接触しにくく、接触した場合も接触面積が少ないため、幹細胞の剥離を抑制することができる。ディスク型担体は、製造コスト面からも好ましい形状の担体である。
【００５５】
担体のサイズは、培地中で接触しにくいサイズが適宜選択される。3〜20ｍｌ／ｗｅｌｌの培養漕内で用いられる担体のサイズとしては、ディスク型担体の場合、外径1〜6ｍｍが好ましく、4〜6ｍｍがより好ましい。また厚さは0.01〜0.03ｍｍが好ましい。ファイバー型担体の場合、断面直径0.5〜1ｍｍ、長さ1〜6ｍｍ程度が好ましい。
【００５６】
本発明に用いられる担体の製造方法は、本発明の作用効果を阻害しない限り特に限定されない。通常は所定の高低を有する担体基材を製造し、得られた担体基材に幹細胞付着性物質をコートさせることにより製造することができる。
【００５７】
表面に本発明所定の高低を有する担体基材の成型方法としては、担体基材にガラス板を圧接させる方法や、射出成型法が挙げられる。上記の圧接による製造方法を行う場合、圧接材は、選択される担体基材の硬度に対応して適宜選択される。好ましい圧接材としては、ガラス、ステンレス、鉄等の金属、セラミックを挙げることができる。
【００５８】
圧接材には、平均粒子径0.1〜2μｍの粒子が含有される。該粒子は、圧接材の担体基材との接触面に適宜露出する。該粒子の露出部分が担体基材に圧接されることにより、担体基材表面に高低が形成される。
【００５９】
担体基材にポリスチレンを選択する場合、圧接材にはガラスが好ましく用いられる。以下にポリスチレンからなる担体基材の製造方法の一例を説明する。まず、一組のガラス板の間にポリスチレンペレットを挟み、各ガラス板の一面をポリスチレンペレットに圧接させる。
【００６０】
ガラス板は、上記の所定の平均粒子径の範囲内で所望の表面粗さを形成させるのに適した粒子径を含有させたものが選択される。したがって、ガラス板の粒子露出面をポリスチレンペレットに加熱下で圧接させることにより、ポリスチレンペレットはフィルム状に変形され、該ポリスチレンフィルムに所望の高低を有する表面を形成させることができる。
【００６１】
ポリスチレンフィルム表面において、ガラス板の粒子露出部を圧接させた部分が低部となり、他の部分が高部となる。したがって、担体表面積あたりの低部の存在数は、圧接材に含有させる粒子数により調節することができる。
【００６２】
粒子露出面を有するガラス板は、一組のガラス板のうち一方でもよく双方でもよい。双方に粒子露出面を有するガラス板を用いれば、担体基材の両面に表面粗さを形成することができる。
【００６３】
本発明に用いられる担体は、本発明の作用効果を十分に引き出すため、基材の全表面に均質に上記所定の表面粗さを備えることが好ましい。かかる観点から、本発明にかかる担体の成型に用いられるガラス板は、含有される粒子のガラス板表面への露出部分が均等に分散していることが好ましい。しかし本発明は、その作用効果を阻害しない限り、担体の表面粗さが不均質に形成されるものも包含する。従って、上記ガラス板は、該粒子の露出部分が不均等に分散されるものを用い得る。
【００６４】
圧接材に含有させる上記粒子は、加熱圧接時にその硬度が担体基材表面の硬度より硬い材料であって、担体表面に高部と低部とを形成させることができるものであれば、公知の有機フィラーや無機フィラー等を限定することなく用いることができる。例としては、ダイヤモンド、アルミナを挙げられる。
【００６５】
圧接時の処理温度は、選択される担体基材と圧接材とにより適宜調整される。ガラス板によりポリスチレンからなる担体基材を成型する場合の処理温度は、130〜170℃が好ましく、150〜170℃がより好ましい。
【００６６】
所望の高部と低部とを表面に形成させたポリスチレンフィルムは、室温で5〜10分間静置する。その後、得られたポリスチレンフィルムをパンチしてディスク状にする等、上記に説明した好ましい形状に適宜成型する。成型された所定の高低を有する基材担体に、以下に説明する幹細胞付着性物質をコートさせることにより、本発明に用いる担体を得ることができる。
【００６７】
本発明に用いられる担体の表面にコートさせる当該幹細胞付着性物質の例としては、フィブロネクチン、コラーゲン等の細胞結合物質が好ましく、特にＥ−カドヘリン、マトリゲル、ラミニン等がより好ましく用いられる。本発明において、上記の幹細胞付着性物質は一種を用いてもよく、二種以上を混合させて用いてもよい。該幹細胞付着性物質は、常法にしたがって製造してもよく、市販品を用いてもよい。
【００６８】
担体表面に接触した幹細胞は、幹細胞表面に発現する所定の基底膜成分と、担体表面にコートさせた幹細胞付着性物質とが互いの親和性により強固に結合するため、担体表面に十分に接着させることができる。幹細胞付着性物質として例示したＥ−カドヘリン、マトリゲル、ラミニンについて説明する。
【００６９】
Ｅ−カドヘリンは、未分化のマウスＥＳ細胞で発現するタンパク質の一種で、多能性幹細胞の付着性にかかわる物質として知られている。
【００７０】
マトリゲルは、マウスＥＨＳ肉腫から抽出、生成される基底膜成分である。マトリゲルにはＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクテン等が含有される。
【００７１】
ラミニンは、基底膜を構成する主要タンパク質の一つであり、細胞の接着、遊走、増殖に関与すると考えられている。ラミニンは、α、β、γ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ三量体である。ヒトラミニンの数種は、その組み換えタンパク質が、ヒトＥＳ細胞が発現する接着受容体と高い親和性を有することが解明されている。そのようなラミニンとして、本発明においては、ラミニン、ヒトラミニン、ヒトラミニンα５β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２が、好ましく用いられる。
【００７２】
上記に例示したラミニンを組み換えタンパク質として製造する場合、まず、目的ラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡを取得し、それぞれ発現ベクターに挿入する。得られた各発現ベクターを宿主細胞に共導入して発現させ、三量体を形成しているタンパク質を精製する。これにより目的のラミニンを得ることができる。本発明に用いられるラミニンについて、上記の製造方法は一つの例である。したがって、目的のラミニンを得られる方法であれば、製造方法は上記に限定されない。
【００７３】
幹細胞付着性物質のコート量は、付着性向上の観点から、担体に対しコートさせ得る最
大量とすることが好ましい。本発明に用いる担体は表面に所定の高低を有するため、表面積が大きい。したがって幹細胞付着性物質を多量にコートさせることができる。担体基材表面に対する幹細胞付着性物質のコート量は、0.6〜1.1μｇ/ｃｍ２が好ましく、0.8〜1.1μｇ／ｃｍ２がより好ましい。
【００７４】
幹細胞付着性物質を担体表面にコートさせる方法は特に限定されない。一例としては、幹細胞付着性物質を蒸留水またはＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎ（ＰＢＳ）で10μｇ／ｍＬに調製後、ろ過、滅菌した溶液に担体基材を接触させ、室温35℃〜37℃で30〜60分間静置させる方法を挙げることができる。
【００７５】
担体基材と所定の幹細胞付着性物質とを接触させることにより、担体基材に対し、幹細胞付着性物質を吸着させたり、共有結合させたりすることにより、幹細胞付着性物質が担体基材に定着し、本発明に用いられる担体を得ることができる。
【００７６】
幹細胞付着性物質を担体基材に接触させる前に、幹細胞付着性物質に予め抗原性分子を結合させておくと共に、担体基材表面に該抗原性分子と特異的に結合する抗体分子を付加させておくことも好ましい。これにより幹細胞付着性物質中の抗原と担体基材表面の抗体とが特異的に結合し、担体表面に幹細胞付着物質を良好に定着させることができる。
【００７７】
［培養液］
本発明の培養漕を満たす培養液は、従来公知の幹細胞培養液を用いることができる。従来公知の培養液の例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｒａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ６４０等を挙げることができる。
【００７８】
上記に例示した培地にＬ−グルタミン、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、２−メルカプトエタノール、Ｌ―アラニル−Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラチン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン等公知の成分を添加することができる。培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等添加できるが、無血清培養してもよい。
【００７９】
上記の培地に、分化抑制剤として白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加してもよい。
ヒト多能性幹細胞にはＬＩＦ反応性がない。従ってヒト多能性幹細胞を培養する場合、未分化状態を維持する目的で、マウスやヒト由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いる共培養法を適用しうる。
【００８０】
しかしヒト多能性幹細胞を再生医療に応用する観点からは、共培養法は、目的となる多能性幹細胞に対する影響が懸念される。そのため、近年、フィーダー細胞を用いないヒト多能性幹細胞の培養方法に関する知見が得られている。従って、上記の知見に基づく手法を適用することにより、本発明においても培養液に分化抑制剤を添加することなく未分化状態を維持してヒト多能性幹細胞を培養しうる。
【００８１】
[培養漕]
本発明の培養装置に用いる培養漕は、撹拌培養、灌流培養、振とう・ゆらし培養等に適した公知の培養漕を用いることができる。浮遊培養法に用いる培養漕の内壁には、幹細胞の付着を抑制する成分が塗布されうる。
【００８２】
［培養方法］
続いて、本発明に係る幹細胞培養方法について説明する。
上記に説明した幹細胞培養に適する培養液を培養漕に満たし、本発明所定の担体を培養液中に入れる。該担体は、親水性の幹細胞付着性物質でコートされているため、培養槽の底部に沈降しやすい。培養液量3〜20ｍｌに対する担体の個数は、3〜100個が好ましく、6〜50個がより好ましい。
【００８３】
該培養液に、単一細胞に分散させた幹細胞を播種する。播種される幹細胞は特に限定されないが、本発明は、特にヒト、マウス、ウシ等種々の哺乳動物由来のＥＳ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）等に好適である。
上記の幹細胞の本発明の担体に対する播種密度は、5〜100ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、20〜50ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましい。
【００８４】
培養漕内の培養液を、撹拌、振とう、或いは灌流させることにより、幹細胞を培養液に懸濁させ、かつ培養漕の底部に沈降した担体を浮遊させる。
【００８５】
本発明に用いられる担体の表面には、播種される幹細胞のサイズに対応して適切な接触面積を提供する高部と低部とが形成される。また、該担体表面には、播種される幹細胞の表面に発現する基底膜成分と親和性を有する幹細胞付着性物質がコートされる。
【００８６】
本発明においては担体表面に形成される高部を足場にできるため、担体に幹細胞を付着させやすい。撹拌等させた培養液中で該担体表面に接触した幹細胞は、担体の高部を足場として担体表面に付着する。さらに幹細胞付着性物質と幹細胞の基底膜成分とが結合する。
【００８７】
その結果、本発明は幹細胞が担体表面に良好に付着させることができ、撹拌等により生じるせん断力によって担体からの幹細胞の剥離を抑制することができる。すなわち本発明は幹細胞のロスを低減し、効率的に幹細胞培養を行うことができる。本発明の培養方法における幹細胞の上記担体に対する接着効率は、50〜100％である。
【００８８】
本発明においては、幹細胞を担体表面の幹細胞付着性物質の存在領域に分散状態で付着させる。本発明において分散状態とは、担体表面の幹細胞付着性物質コート領域に、幹細胞を単一細胞として個々に付着させた状態を意味し、さらに各幹細胞が明確なコロニーを形成しない程度に互いの接触領域が少ない状態で付着させることを包含する。したがって本発明により培養される幹細胞は細胞塊になりにくく未分化状態を維持しやすい。
【００８９】
上記の方法により、コンフルエントになるまで担体上で幹細胞の培養を続ける。培養条件は、従来公知の浮遊培養条件を適用することができる。例えば、本発明の撹拌培養装置でマウスＥＳ細胞を培養する場合、温度条件35〜37℃、2〜5％ＣＯ２の環境下で行うことができる。
【００９０】
培養液の撹拌条件は、培養液中に本発明所定の担体を浮遊させ得ることが求められる。撹拌が弱すぎると担体を浮遊させることが困難になる他、培養液への酸素導入が不十分になる問題がある。しかし撹拌が強すぎると、培養液のせん断力が大きくなるため、幹細胞が担体から剥離しやすくなる。
【００９１】
従って本発明においては、担体を浮遊させ得る撹拌条件であって、かつ酸素導入およびせん断力抑制の観点から好ましい撹拌条件が選択される。撹拌培養や振とう培養を行う場合、好ましい振とう数は60〜80ｒｐｍであり、65〜75ｒｐｍがより好ましい。
【００９２】
本発明を用いて培養された幹細胞の未分化率は、85〜90％程度であると推察される。かかる未分化率は、カドヘリンをコートさせた担体を用いて分散状態で幹細胞を培養させた場合の、公知の未分化率である。幹細胞を分散状態で培養させる場合、幹細胞同士の接触領域が少ない。そのため幹細胞がコロニーを形成しにくい。従って、担体に付着させた全ての幹細胞に十分に分化抑制剤を作用させることができる。その結果、幹細胞の未分化状態を維持させることができる。
【００９３】
例えば特許第4688793号には、幹細胞の未分化状態が維持される例として、分化抑制剤（LIF）の濃度が100Ｕ/ｍＬの場合に、細胞未分化率約90％で培養しうることが開示されている。ただし、特許第4688793号で用いる担体は、表面に所定の高低が形成されていない点で本発明と異なる。
【００９４】
本発明は、その表面に所定の高低を有する担体を用いることにより、幹細胞を良好に付着させることができる。従って、静置培養法だけでなく、浮遊培養法でせん断力により幹細胞が担体から剥離しやすい条件下においても、未分化状態を維持した幹細胞を培養することができる。
【００９５】
培養細胞の未分化状態の確認は、後に詳説するＥＳ細胞の種類に対応するＡＬＰ活性や特異的マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。上記特異的マーカーとしては、Ｏｃｔ−３／４やＲｅｘ１／Ｚｆｐ４２等の遺伝子産物の発現を利用することができる。
【００９６】
ＡＬＰ活性の検出の一例は、培養したＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄後、66％アセトン／3％ホルマリンを含むクエン酸溶液で固定し、ＰＢＳで洗浄後、ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ染色液で15分間処理し、発色反応させることにより行われる。
【００９７】
また、抗原分子を未分化マーカーとして利用してもよい。各種抗原分子の低減、消失によってもＥＳ細胞の分化を確認することができるからである。そのような抗原分子の例として、マウスＥＳ細胞の場合は、ＳＳＥＡ−１、ヒトＥＳ細胞の場合は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＧＣＴＭ−２等がある。
【００９８】
未分化マーカーの利用例として以下の方法がある。まず、培養されたＥＳ細胞からＲＮＡを調整し、常法に従ってｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより、所定の未分化マーカーの遺伝子の断片を増幅させる。得られたＰＣＲ産物を染色し検出する。未分化マーカーが有意に検出されることにより、培養されたＥＳ細胞が未分化であることを確認できる。
【００９９】
培養液がコンフルエントになった場合、本発明は常法により幹細胞を継代させることができる。継代は少なくとも3〜10継代まで行い得る。
【０１００】
培養した幹細胞を回収する場合、培養液中から幹細胞を分散状態で付着させた担体を回収し、常法により担体から単一細胞を得る。培養液の撹拌等を停止させると担体は３〜４時間で自然に培養槽の底部に沈降する。したがって、本発明において担体の回収は、該沈降した担体を培養液から取り出すことにより、極めて簡単に行うことができる。
【０１０１】
単一細胞は、常法に従って得ることができる。一例として、タンパク質分解酵素溶液を用いる方法がある。この方法においては、まず培養幹細胞が分散状態で付着する担体を洗浄し、洗浄後の担体に該トリプシン等のタンパク質分解酵素溶液を加え、35〜37℃の温度条件で3〜10分間培養する。続いて該幹細胞を本発明で用いる上記培養液に懸濁させて、単一細胞を得る。
【０１０２】
他の回収方法の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を用いる方法がある。この方法においては、上記方法と同様にして担体を洗浄後、ＥＤＴＡ溶液を濃度が0.01〜100ｍＭ程度になるように添加し、35〜37℃の温度条件で１〜60分間処理して担体から幹細胞を剥離させ、上記本発明で用いる培養液に懸濁させて単一細胞を得る。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明する。ただし本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
［実施例１］
平均粒子径0.5〜2μｍのガラス粒子を含有させたガラス製の圧接材（8ｃｍ２）２枚を150℃に加熱した。直径0.3ｃｍのポリスチレンペレットを、上記圧接材２枚の粒子露出面に接触するようにして挟み、最大375ｋＰａで徐々に加圧して薄く延ばした。直径2.5ｃｍの表面粗さ＃14000のポリスチレンフィルムを作製した。
得られた表面粗さ＃14000のポリスチレンフィルムをパンチングして、外径6ｍｍのディスク状担体を30個作製した。表面粗さ＃14000の担体表面１ｍｍ２に存在する低部数を目視で数え、該低部数を担体表面積1000000ｍ２あたりの低部数に換算したところ、該低部数は、2000000個であった。
【０１０５】
Ｅ−カドヘリンをＰＢＳで10μｇ／ｍＬに希釈し、ろ過、滅菌した溶液を調製した。該Ｅ−カドヘリン溶液に得られたディスク状担体を浸漬させ、室温35℃〜37℃で約30〜60分間静置させ、担体基材にＥ−カドヘリンをコートさせ、本発明の実施例１に用いる担体を得た。
【０１０６】
0.1％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）溶液に30分以上浸漬させて該ＢＳＡコート処理した24Ｗｅｌｌのプレートに、Ｌ−グルタミン、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、２−メルカプトエタノールからなる培地１ｍＬを添加し、上記担体を2個、該24Ｗｅｌｌプレートに入れた。さらに該プレートに、マウスＥＳ細胞を3000細胞播種した。
【０１０７】
上記プレートを振とう機（アズワン株式会社製  ミニウェーブＷＥＶ-03）のインキュベータ内に載置し、37℃、2％ＣＯ２条件下で振とう回転数70ｒｐｍで振とうさせ、幹細胞の培養を開始した。
【０１０８】
常法に従って継代操作を行いながら培養を続け、３日後、振とうを停止させて培養を終了した。振とうの終了により、プレート内の担体は自然に沈降した。該担体をプレート内から取り出して洗浄し、担体に付着する幹細胞を回収した。幹細胞の回収は、プレートから取り出した担体にＡｃｃｕｔａｓｅを添加し、37℃で10分間程度インキュベートした後、上記培養液に懸濁させて単一細胞とすることにより行った。
【０１０９】
［実施例２、３および比較例１〜５］
用いる担体を表１に示す表面粗さのものに変えた他は、上記実施例１と同条件にして幹細胞培養を行い、実施例２、３および比較例１〜４とした。比較例５は、Ｅ−カドヘリンをコートさせた平坦な付着面からなる培養漕を用いて静置培養した比較例である。下記に説明する方法により実施例１〜３および比較例１〜５により得られた幹細胞数を測定した。測定結果を表１および図５に示す。
【０１１０】
表１および図５によれば、実施例１は、静置培養法を行った比較例５より多くの細胞を培養することができた。比較例１〜４は、培養液の撹拌中に細胞が剥離し、培養細胞を効率的に回収することができなかった。
【０１１１】
すなわち、本発明は、所定の高低を有する担体を用いることにより、幹細胞と担体との付着性が良好で、浮遊培養法で培養液に生じるせん断力に対抗しうる非剥離性を発揮する。上記担体表面に形成される高部の頂点間の距離は幹細胞直径よりやや小さいため、低部で細胞塊が形成されることがない。また幹細胞を担体表面に分散状態で生育しやすい。
【０１１２】
［細胞数の測定方法］
細胞数の測定は、Ａｃｃｕｔａｓｅで分散した細胞を回収し、２４Ｗｅｌｌプレートにいれ、１５〜３０分静置し、細胞の沈降を待った。細胞が底部に沈降したら、顕微鏡で写真撮影を3枚異なる視野で行い、細胞数の平均値を計数した。総細胞数は
計数平均値×２４Ｗｅｌｌプレート１Ｗｅｌｌの面積／視野面積
で算出した。
【０１１３】
【表１】
2014183770.tif 000003
【符号の説明】
【０１１４】
１、２、３  幹細胞培養装置
４  担体
５  培養液
６  培養漕
７  高部
８  低部
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３  担体表面に形成される高部の頂点
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３  担体表面に形成される低部の最低点
ｄ１  Ｐ１とＰ２との頂点間距離
ｄ２  Ｐ２とＰ３との頂点間距離
ｇ１  Ｐ１とＢ１との高低差
ｇ２  Ｐ２とＢ２との高低差
ｇ３  Ｐ３とＢ３との高低差
Ｃ  幹細胞
【図１】
2014183770.tif 000004
【図２】
2014183770.tif 000005
【図３】
2014183770.tif 000006
【図４】
2014183770.tif 000007
【図５】
2014183770.tif 000008