(57)【要約】【課題】本発明は、添加濃度を増加させても細胞が死滅させることがなく、接着強度が高く、短時間で接着可能で、凝集能の高い細胞接着剤、及び、細胞が固く連結・凝集され、凝集性が高く、細胞生存期間が長く、細胞移植に応用可能な細胞凝集塊を提供することを課題とする。【解決手段】細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる細胞接着剤２２を用いることによって前記課題を解決できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなることを特徴とする細胞接着剤。
【請求項２】
前記細胞接着ペプチド配列が、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ又はＲＥＤＶのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の細胞接着剤。
【請求項３】
前記細胞接着ペプチド配列を有する高分子が生体高分子であることを特徴とする請求項２に記載の細胞接着剤。
【請求項４】
前記生体高分子がゼラチン、コラーゲン、ラミニン又はフィブロインの群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項３に記載の細胞接着剤。
【請求項５】
前記ゼラチンが、ウシ由来ゼラチン、ブタ由来ゼラチン、ティラピア由来ゼラチン、サケ由来ゼラチン、タラ由来ゼラチン、ヒト由来ゼラチン若しくはウシ、ブタ、ティラピア、サケ、タラ若しくはヒトのアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項４に記載の細胞接着剤。
【請求項６】
前記疎水基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基、オレオイル基の群から選択される１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞接着剤。
【請求項７】
細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなる細胞接着剤によって、２以上の細胞が連結・凝集されて、塊状とされたことを特徴とする細胞凝集塊。
【請求項８】
前記細胞が、ｉＰＳ細胞、幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞の群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項７に記載の細胞凝集塊。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着剤及び細胞凝集塊に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞凝集塊（スフェロイド）は、同一又は相異する複数の細胞を凝集させて塊状としたものである。細胞凝集塊中の細胞は、細胞−細胞間が接着タンパク質を介して接合することにより、細胞間コミュニケーションが行われ、細胞分化等の生理的機能が向上することが知られている。そのため、近年、細胞凝集塊の再生医療への応用が期待され、細胞凝集塊を形成するための技術や材料が盛んに研究されている（特許文献１〜４）。
【０００３】
現在検討されている細胞凝集塊の形成技術には、疑似微小重力環境での培養法や、細胞の接着・非接着を制御した表面加工材料上での培養法などが知られている。しかし、細胞移植をターゲットとした材料についてはほとんど研究されていない。
【０００４】
本発明者は、これまで、細胞移植へ応用可能な細胞凝集塊の調製の研究開発を行ってきた。例えば、親水性ユニット（ポリエチレングリコール）の両末端に疎水性ユニット（コレステリル基、オレオイル基）を導入した組織接着剤を合成した。この組織接着剤を細胞に添加することにより、細胞凝集塊が形成できた（非特許文献１〜３）。
【０００５】
しかし、この組織接着剤の添加濃度を増加させて、細胞凝集塊を形成した場合には、細胞凝集塊中の細胞の多くが早期に死滅した。これにより、この方法で調製した細胞凝集塊を細胞移植へ応用できないという課題を生じた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１８７０９７号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３１７４３号公報
【特許文献３】特開平９−２６６７８９号公報
【特許文献４】特開２００８−２２０２０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｃｈｉｋｏ  Ｉｔｏ、Ｔｅｔｓｕｓｈｉ  Ｔａｇｕｃｈｉ、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ５（２００９）２９４５−２９５２
【非特許文献２】Ｔｅｔｓｕｓｈｉ  Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｚｈｉ  Ｒａｏ、Ｍｉｃｈｉｋｏ  Ｉｔｏ、Ｍｉｙｕｋｉ  Ｍａｔｓｕｄａ、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．（２０１１）２２：２３５７−２３６３
【非特許文献３】Ｚｈｉ  Ｒａｏ、Ｍａｋｏｔｏ  Ｓａｓａｋｉ、Ｔｅｔｓｕｓｈｉ  Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｃｏｌｌｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  １０１（２０１３）２２３−２２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがなく、接着強度が高く、短時間で接着可能で、凝集能の高い細胞接着剤、及び、細胞が固く連結・凝集され、凝集性が高く、細胞生存期間が長く、細胞移植に応用可能な細胞凝集塊を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記事情を鑑み、実験を繰り返すことにより、本発明者は、細胞接着剤を構成する高分子材料が有する界面活性効果により、細胞が死滅するのではないか、そのため、用いる高分子材料を、所定の細胞接着ペプチド配列を有する高分子材料とすることにより、細胞の死滅を低減できるのではないかと考えた。その推測を元に、細胞接着ペプチド配列を有する高分子に疎水基を導入して、新たな細胞間架橋用高分子、すなわち、細胞接着剤を合成した。更に、得られた細胞接着剤を用いて細胞凝集塊を形成した。この細胞凝集塊を培養して、細胞数を調べた。その結果、培養１日後（Ｄａｙ  １）には、細胞接着剤の添加濃度を１０％として形成した細胞凝集塊の細胞数に比較して、細胞接着剤の添加濃度を１０％として形成した細胞凝集塊の細胞数が４倍以上となることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。
【００１０】
（１）細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなることを特徴とする細胞接着剤。
（２）前記細胞接着ペプチド配列が、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ又はＲＥＤＶのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする（１）に記載の細胞接着剤。
（３）前記細胞接着ペプチド配列を有する高分子が生体高分子であることを特徴とする（２）に記載の細胞接着剤。
【００１１】
（４）前記生体高分子がゼラチン、コラーゲン、ラミニン又はフィブロインの群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする（３）に記載の細胞接着剤。
（５）前記ゼラチンが、ウシ由来ゼラチン、ブタ由来ゼラチン、ティラピア由来ゼラチン、サケ由来ゼラチン、タラ由来ゼラチン、ヒト由来ゼラチン若しくはウシ、ブタ、ティラピア、サケ、タラ若しくはヒトのアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする（４）に記載の細胞接着剤。
（６）前記疎水基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基、オレオイル基の群から選択される１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞接着剤。
【００１２】
（７）細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなる細胞接着剤によって、２以上の細胞が連結・凝集されて、塊状とされたことを特徴とする細胞凝集塊。
（８）前記細胞が、ｉＰＳ細胞、幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞の群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする（７）に記載の細胞凝集塊。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の細胞接着剤は、細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなるので、細胞接着剤の一の疎水基を細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定するとともに、別の疎水基を別の細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定することができる。また、細胞接着剤の主鎖が有する細胞接着ペプチド配列も、細胞の表面に接着することができる。これらにより、２以上の細胞を容易に、かつ、短時間に連結・凝集できる。また、凝集形態を塊状とすることにより、細胞凝集塊を形成することができる。これらの凝集体は、細胞接着剤の主鎖が有する細胞接着ペプチド配列が細胞間を接着する構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００１４】
本発明の細胞凝集塊は、細胞接着ペプチド配列を有する高分子からなる主鎖と、疎水基を有する側鎖とからなる細胞接着剤によって、２以上の細胞が連結・凝集されて、塊状とされた構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させて、固く連結・凝集された塊としても、細胞を死滅させることがない。これにより、細胞凝集塊の調製を容易にすることができるとともに、様々な実験に用いることができ、汎用性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態である細胞凝集塊の一例を示す概略図である。
【図２】細胞の一例を示す図であって、平面図（ａ）、（ａ）におけるＡ−Ａ’線における断面図（ｂ）、（ｂ）のＢ部の拡大模式図（ｃ）である。
【図３】細胞接着剤の一例を示す模式図である。
【図４】細胞の脂質２分子膜に、細胞接着剤の疎水基が突き刺さった様子と、細胞接着剤の細胞接着ペプチド配列が、細胞の脂質２分子膜と接着した様子の一例を示す概念図である。
【図５】細胞凝集能評価の工程図である。
【図６】実施例１−１〜実施例２−３、比較例１−１〜比較例２の細胞接着剤溶液を用いた各培養環境における細胞数（Ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ）を示すグラフである。
【図７】実施例１−１〜実施例１−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ）を用いた接着剤を用いたものである。
【図８】実施例２−１〜実施例２−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。疎水化ゼラチン（６９Ｃｈｏｌ）を用いた接着剤を用いたものである。
【図９】比較例１−１〜比較例１−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。ゼラチン（０Ｃｈｏｌ）を用いた接着剤を用いたものである。
【図１０】比較例２の培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。細胞接着剤を用いない培養環境である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（本発明の実施形態）
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である細胞接着剤及び細胞凝集塊について説明する。
【００１７】
＜細胞凝集塊＞
まず、本発明の実施形態である細胞凝集塊について説明する。
図１は、本発明の実施形態である細胞凝集塊の一例を示す概略図である。
図１に示すように、本発明の実施形態である細胞凝集塊１１は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる細胞接着剤２２によって、２以上の細胞（Ｃｅｌｌ）２１が連結・凝集されて、塊状とされて、概略構成されている。
図１では、９つの細胞２１が連結・凝集されているが、細胞２１の数はこれに限られるものではない。
細胞接着剤２２の数も特に限られるものではなく、１本で２以上の細胞を連結・凝集させてもよく、２本以上で２以上の細胞を連結・凝集させてもよい。
【００１８】
図２は、細胞の一例を示す図であって、平面図（ａ）、（ａ）におけるＡ−Ａ’線における断面図（ｂ）、（ｂ）のＢ部の拡大模式図（ｃ）である。
図２（ａ）に示すように、細胞２１の表面は、リン脂質の親水性部３１ａで覆われている。
また、図２（ｂ）に示すように、細胞２１の表面は、脂質２分子膜３３で形成されており、内部に核３４を有している。
また、図２（ｃ）に示すように、脂質２分子膜３３は、表面側からリン脂質の親水性部３１ａ、リン脂質の疎水性部３２ａ、リン脂質の疎水性部３２ｂ、リン脂質の親水性部３１ｂと配置されて構成されている。
【００１９】
細胞２１が、ｉＰＳ細胞、幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞の群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。
ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、体細胞へ数種類の遺伝子を導入し、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、分裂増殖を経ても自己複製能を持たせた細胞である。幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、分裂して様々な細胞に分化できる細胞である。肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）は、肝臓の７０−８０％を構成する約２０μｍの細胞である。膵臓β細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ）は、膵臓のランゲルハンス島に存在し、インスリンを血中に分泌する細胞である。線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）は、コラーゲン蛋白を合成、分泌する結合組織細胞である。血管内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）は、血管の内表面を構成する扁平で薄い細胞である。
特に、血管内皮細胞を上記他の細胞と組み合わせて細胞凝集塊を形成することにより、塊の内部に配置された上記他の細胞にも酸素や栄養分を十分供給することができ、細胞の死滅を回避することができる。これにより、様々な実験における細胞凝集塊の取り扱い性能を向上させることができる。
【００２０】
図３は、細胞接着剤の一例を示す模式図である。
図３に示すように、細胞接着剤２２は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる。図３では、疎水基４２の数は５つとされているが、これに限られるものではない。
【００２１】
細胞接着ペプチド配列４３が、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ又はＲＥＤＶのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。細胞接着剤２２は、この細胞接着ペプチド配列で隣接する細胞と効率よく接着できる。図３では、細胞接着ペプチド配列４３の数は３つとされているが、これに限られるものではない。
【００２２】
細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１として、生体高分子を挙げることができる。
前記生体高分子がゼラチン、コラーゲン、ラミニン又はフィブロネクチンの群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。これにより、細胞を効率よく接着できる。また、細胞接着剤２２の濃度を高めて、細胞凝集塊を形成しても、細胞を死滅させることがない。
【００２３】
また、前記ゼラチンが、ウシ由来ゼラチン、ブタ由来ゼラチン、ティラピア由来ゼラチン、サケ由来ゼラチン、タラ由来ゼラチン、ヒト由来ゼラチン若しくはウシ、ブタ、ティラピア、サケ、タラ若しくはヒトのアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンのいずれか１種又は２種以上の組み合わせであることが好ましい。これらのゼラチンを用いることにより、細胞を効率よく接着できる。
【００２４】
前記ゼラチンの分子量は、５００００以上１０００００未満であることが好ましい。分子量を５００００以上とすることにより、接着強度を向上させることができる。
また、前記ゼラチンは、アルカリ処理して用いることが好ましい。これにより、ウイルス等が死滅するため生体に対する安全性が向上する。
【００２５】
前記ティラピア、サケ、タラゼラチンは、常温で水への溶解性が高く、分子量を５００００以上としても、ゲル化せず、水溶液中に均一に溶解させることができ、液体状の細胞接着剤を形成することができる。
【００２６】
前記疎水基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基、オレオイル基の群から選択される１種または２種以上の組み合わせであることが好ましい。これにより、疎水基からなる先端を脂質２分子膜に効率よく突き刺すことができ、細胞接着剤２２を細胞２１に強固に固定することができる。
【００２７】
細胞接着剤２２の具体的態様としては、アミノ基の一部をコレステリル基で置換したゼラチンを挙げることができる。
また、アミノ基の置換の割合がｘ％の場合、ゼラチンｘＣｈｏｌと呼称する場合がある。
【００２８】
ゼラチン中に含まれるアミノ基の疎水基への置換割合ｘ％は、１％以上９０％以下とすることが好ましく、０％以上７０％以下とすることがより好ましい。疎水基への置換割合ｘ％は、例えば、ゼラチンのアミノ基のコレステリル基への置換割合である。これにより、接着力を高めた細胞接着剤とすることができ、凝集性の高い細胞凝集塊を形成できる。
【００２９】
図４は、細胞の脂質２分子膜３３Ａに、細胞接着剤２２の疎水基４２が突き刺さった様子と、細胞接着剤２２の細胞接着ペプチド配列４３が、細胞の脂質２分子膜３３Ｂと接着した様子の一例を示す概念図である。
細胞接着剤２２の疎水基４２は、脂質２分子膜３３Ａを貫いて、突き刺さっている。これにより、脂質２分子膜３３Ａから疎水基４２は容易に抜けることはない。
また、細胞接着剤２２の細胞接着ペプチド配列４３は、細胞の脂質２分子膜３３Ｂ上に含有されている膜タンパク質であるインテグリンとの相互作用により強固に接着する。また、この細胞接着ペプチド配列４３は、生体由来のものであるため、接する細胞が増殖するための足場として作用する。
【００３０】
＜細胞接着剤＞
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる。
細胞接着剤２２を緩衝液に溶解させてなる構成としてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いることができる。
【００３１】
前記濃度は０．０１％以上５０％以下とすることが好ましく、０．０５％以上３０％以下とすることがより好ましい。これにより、細胞と細胞接着剤の割合が適当な細胞凝集塊を形成できる。前記濃度が０．０１％未満の場合には、接合が弱く、取り扱い途中で、崩壊するおそれが発生する。逆に、５０％超の場合には、細胞量の少ない細胞凝集塊となり、評価に用いることができない場合が発生する。
【００３２】
＜細胞凝集塊の作成方法＞
次に、細胞凝集塊の作成方法の一例について説明する。細胞凝集塊の作成方法は、細胞接着剤の合成工程Ｓ１と、細胞接着剤溶液の調製工程Ｓ２と、細胞凝集塊の作成工程Ｓ３と、を有する。
（細胞接着剤の合成工程Ｓ１）
まず、細胞接着ペプチド配列を有する高分子を用意する。
次に、この高分子の側鎖に疎水基を導入して、細胞接着剤を合成する。
例えば、細胞接着ペプチド配列を有する高分子として、アルカリ処理したテラピアゼラチン（分子量７万）からなるゼラチンを用意してから、この高分子の側鎖のアミノ酸のｘ％となるようにコレステリル基で置換して、細胞接着剤（ゼラチンｘＣｈｏｌ）を合成する。
【００３３】
（細胞接着剤溶液の調製工程Ｓ２）
次に、細胞接着剤を所定の濃度でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させて、細胞接着剤を調製する。
例えば、細胞接着剤（ゼラチンｘＣｈｏｌ）を濃度ｙ％でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させて、細胞接着剤溶液（ｘＣｈｏｌ―ｙ％）を調製する。
【００３４】
（細胞凝集塊の作成工程Ｓ３）
次に、細胞を、血清を含有していない培養液に溶解させて、所定の濃度の細胞懸濁液を調製する。前記濃度は、例えば、培養容器の構成に合わせて、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとする。
次に、細胞接着剤溶液と細胞懸濁液を所定の比で混合して、混合溶液を調製する。
次に、前記混合溶液を攪拌する。例えば、ボルテックッスで２分間攪拌する。
以上の工程により、２以上の細胞が連結・凝集されて、塊状とされてなる細胞凝集塊を作成することができる。
【００３５】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる構成なので、細胞接着剤の一の疎水基を細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定するとともに、別の疎水基を別の細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定することができる。また、細胞接着剤の主鎖が有する細胞接着ペプチド配列も、細胞の表面に接着することができる。これらにより、２以上の細胞を容易に、かつ、短時間に連結・凝集できる。また、凝集形態を塊状とすることにより、細胞凝集塊を形成することができる。これらの凝集体は、細胞接着剤の主鎖が有する細胞接着ペプチド配列が細胞間を接着する構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００３６】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、細胞接着ペプチド配列４３が、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ又はＲＥＤＶのいずれか１種又は２種以上の組み合わせである構成なので、２以上の細胞を容易に、かつ、短時間に連結・凝集できる。また、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００３７】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１が生体高分子である構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００３８】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、前記生体高分子がゼラチン、コラーゲン、ラミニン又はフィブロインの群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせである構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００３９】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、前記ゼラチンが、ウシ由来ゼラチン、ブタ由来ゼラチン、ティラピア由来ゼラチン、サケ由来ゼラチン、タラ由来ゼラチン、ヒト由来ゼラチン若しくはウシ、ブタ、ティラピア、サケ、タラ若しくはヒトのアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンのいずれか１種又は２種以上の組み合わせである構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させても細胞を死滅させることがない。
【００４０】
本発明の実施形態である細胞接着剤２２は、疎水基４２が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α−リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基、オレオイル基の群から選択される１種または２種以上の組み合わせである構成なので、細胞接着剤の一の疎水基を細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定するとともに、別の疎水基を別の細胞の脂質２分子膜に突き刺して固定することができ、２以上の細胞を容易に、かつ、短時間に連結・凝集できる。
【００４１】
本発明の実施形態である細胞凝集塊１１は、細胞接着ペプチド配列４３を有する高分子４１からなる主鎖と、疎水基４２を有する側鎖とからなる細胞接着剤２２によって、２以上の細胞２１が連結・凝集されて、塊状とされた構成なので、細胞接着剤の添加濃度を増加させて、固く連結・凝集された塊としても、細胞を死滅させることがない。これにより、細胞凝集塊の取り扱いを容易にすることができ、ハンドリング性能が高く、様々な実験に用いることができ、汎用性を高めることができる。
【００４２】
本発明の実施形態である細胞凝集塊１１は、細胞２１が、ｉＰＳ細胞、幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞の群から選択されるいずれか１種又は２種以上の組み合わせである構成なので、様々なタイプの細胞凝集塊を形成することができる。これにより、様々な実験に用いることができ、汎用性を高めることができる。
【００４３】
本発明の実施形態である細胞接着剤及び細胞凝集塊は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
（実施例１−１）
（細胞接着剤の合成）
まず、ゼラチン（テラピアゼラチン、分子量７万、アルカリ処理）を用意した。
次に、上記ゼラチンのアミノ基の４４％をコレステリル基で修飾して、細胞接着剤を合成した。
（細胞接着剤溶液の調製）
次に、細胞接着剤（アミノ基の４４％をコレステリル基で修飾したゼラチン）の濃度を０．１％として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させて、実施例１−１の細胞接着剤溶液（４４Ｃｈｏｌ―０．１％）を調製した。
【００４５】
（実施例１−２）
アミノ基の４４％をコレステリル基で修飾したゼラチンの濃度を１％とした他は実施例１−１と同様にして、実施例１−２の細胞接着剤溶液（４４Ｃｈｏｌ―１％）を調製した。
【００４６】
（実施例１−３）
アミノ基の４４％をコレステリル基で修飾したゼラチンの濃度を１０％とした他は実施例１−１と同様にして、実施例１−３の細胞接着剤溶液（４４Ｃｈｏｌ―１０％）を調製した。
【００４７】
（実施例２−１）
上記ゼラチンのアミノ基の６９％をコレステリル基で修飾した他は実施例１−１と同様にして、実施例２−１の細胞接着剤溶液（６９Ｃｈｏｌ―０．１％）を調製した。
【００４８】
（実施例２−２）
アミノ基の６９％をコレステリル基で修飾したゼラチンの濃度を１％とした他は実施例２−１と同様にして、実施例２−２の細胞接着剤溶液（６９Ｃｈｏｌ―１％）を調製した。
【００４９】
（実施例２−３）
アミノ基の６９％をコレステリル基で修飾したゼラチンの濃度を１０％とした他は実施例２−１と同様にして、実施例２−３の細胞接着剤溶液（６９Ｃｈｏｌ―１０％）を調製した。
【００５０】
（比較例１−１）
次のようにして、比較例１−１の細胞接着剤を準備した。
まず、ゼラチン（テラピアゼラチン、分子量７万、アルカリ処理）を用意した。
次に、ゼラチンの濃度を０．１％として、比較例１−１の細胞接着剤溶液（０Ｃｈｏｌ―０．１％）を調製した。
【００５１】
（比較例１−２）
ゼラチンの濃度を１％とした他は比較例１−１と同様にして、比較例１−２の細胞接着剤溶液（０Ｃｈｏｌ―１％）を調製した。
【００５２】
（比較例１−３）
ゼラチンの濃度を１％とした他は比較例１−１と同様にして、比較例１−２の細胞接着剤溶液（０Ｃｈｏｌ―１％）を調製した。
【００５３】
（比較例２）
リン酸緩衝液ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。
各実施例、比較例と、試料名、試料の構成、細胞接着剤濃度の関係を表１にまとめた。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
＜細胞凝集能評価＞
図５は、細胞凝集能評価の工程図である。細胞凝集能評価は、混合サンプル調製工程と、混合サンプル評価工程とからなる。この工程に従い、細胞凝集能評価を行った。
【００５６】
＜混合サンプル調製工程＞
まず、混合サンプル評価工程で用いる培養容器の構成に合わせて、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞懸濁液を１００μＬ調製した。ＨｅｐＧ２（ヒト肝ガン由来細胞）細胞を用いた。
次に、実施例１−１〜実施例２−３、比較例１−１〜比較例２の細胞接着剤溶液を１００μＬ量り取った。
次に、２ｍＬチューブで、細胞懸濁液と細胞接着剤の混合液を調製した。
次に、この混合液を２ｍｉｎボルテックスにより撹拌した。
以上の工程により、細胞接着剤と細胞の混合サンプルを調製した。
【００５７】
＜混合サンプル評価工程＞
まず、混合サンプルを、播種細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように４８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ−１に移した。
培地として、ＤＭＥＭ（１回目  ウシ血清なし、２回目以降ウシ血清（＋））を用いた。また、培地交換は２日とした。
【００５８】
次に、細胞接着剤と細胞の混合サンプルを３７℃のインキュベーター内で培養した。
次に、培養開始から１日後（Ｄａｙ  １）、３日後（Ｄａｙ  ３）、７日後（Ｄａｙ  ７）、位相差顕微鏡により、細胞凝集能及び生存状況の観察を行った。また、ＷＳＴ−８（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）を用いて、細胞数（Ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ）のカウントを行った。
【００５９】
＜細胞凝集能評価結果＞
図６〜１０に示す細胞凝集能評価結果が得られた。
図６は、実施例１−１〜実施例２−３、比較例１−１〜比較例２の細胞接着剤溶液を用いた各培養環境における細胞数（Ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ）示すグラフである。
図６に示すように、疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ、６９Ｃｈｏｌ）では、添加濃度を増加させることにより、細胞の増殖が認められた（実施例１−２〜実施例２−３）。疎水化ゼラチン中に含まれる細胞接着ペプチド配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）により細胞増殖が促進したと思われる。
【００６０】
図７は、実施例１−１〜実施例１−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ）を細胞接着剤として用いたものである。
図７に示すように、疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ）の添加濃度を０．１％から１０％へと増加させることにより、大幅に細胞数が増加した。細胞の凝集（細胞間の接着）が認められた。ゼラチンに導入したコレステリル基が細胞膜にアンカリングすることにより、細胞間接合を促進した。
【００６１】
図８は、実施例２−１〜実施例２−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。疎水化ゼラチン（６９Ｃｈｏｌ）を細胞接着剤として用いたものである。
図８に示すように、疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ）と同様に、疎水化ゼラチン（６９Ｃｈｏｌ）の添加濃度を０．１％から１０％へと増加させることにより、大幅に細胞数が増加した。細胞の凝集（細胞間の接着）が認められた。ゼラチンに導入したコレステリル基が細胞膜にアンカリングすることにより、細胞間接合を促進した。
【００６２】
図９は、比較例１−１〜比較例１−３の細胞接着剤溶液を用いた培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。ゼラチン（０Ｃｈｏｌ）を細胞接着剤として用いたものである。
図９に示すように、疎水化ゼラチン（４４Ｃｈｏｌ）及び疎水化ゼラチン（６９Ｃｈｏｌ）の場合とは異なり、ゼラチン（０Ｃｈｏｌ）の添加濃度を０．１％から１０％へと増加させることにより、細胞数はあまり変わらなかった。
【００６３】
図１０は、比較例２の培養環境（Ｄａｙ  １）の位相差顕微鏡写真像である。細胞接着剤を用いない培養環境である。
図１０に示すように、細胞の凝集はほとんどなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の細胞接着剤は、添加濃度を増加させても細胞が死滅させることがなく、接着強度が高く、短時間で接着可能で、凝集能の高いものであり、本発明の細胞凝集塊は、細胞が固く連結・凝集され、凝集性が高く、細胞生存期間が長く、細胞移植に応用可能なものであり、医療用デバイス・医療用材料・医療用機器産業において利用可能性がある。
【符号の説明】
【００６５】
１１…細胞凝集塊、２１…細胞、２２…細胞接着剤、３１ａ、３１ｂ…リン脂質の親水性部、３２ａ、３２ｂ…リン脂質の疎水性部、３３、３３Ａ、３３Ｂ…脂質２分子膜、３４…核、４１…高分子、４２…疎水基、４３…細胞接着ペプチド配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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