(57)【要約】      （修正有）【課題】肺炎連鎖球菌の予防に有効な、１５種類の相違する多糖−タンパク質コンジュゲートを有する多価の免疫原性組成物の提供。【解決手段】各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の異なる血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆ）から調製された莢膜多糖からなる。該免疫原性組成物は、好ましくはアルミニウム系アジュバントにてワクチンとして製剤され、特に乳児および幼児において、肺炎球菌性疾患に対して高い接種率をもたらす。前記アジュバントが燐酸アルミニウムである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ由来の莢膜多糖からなる多価の多糖−タンパク質コンジュゲート混合物；ならびに
（２）薬学的に許容され得る担体、
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ヒトに免疫学的有効量の請求項１に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に対する免疫応答の誘発方法。
【請求項８】
投与される免疫原性組成物が、６Ｂが４μｇである以外は２μｇの各糖質；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質；０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのＬ−ヒスチジンバッファーを含むように製剤化された０．５ｍＬ単回用量である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
なし
【技術分野】
【０００２】
本発明は、１５種類の相違する多糖−タンパク質コンジュゲートを有する多価の免疫原性組成物を提供する。各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の異なる血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆ）から調製された莢膜多糖からなる。該免疫原性組成物は、好ましくはアルミニウム系アジュバント上のワクチンとして製剤され、特に乳児および幼児において、肺炎球菌性疾患に対する広範な接種率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供する。
【背景技術】
【０００３】
肺炎連鎖球菌は、世界的に重篤な疾患の深刻な原因である。１９９７年、疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ＣＤＣ）により、米国では、年間肺炎球菌性髄膜炎は３，０００例、肺炎球菌性菌血症は５０，０００例、肺炎球菌性中耳炎は７，０００，０００例、そして肺炎球菌性肺炎は５００，０００例であると推定された。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３参照。さらに、これらの疾患の合併症は深刻な場合があり得、一部の試験により、肺炎球菌性髄膜炎では８％までの死亡率および２５％の神経系の続発症が報告されている。Ａｒｄｉｔｉら，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：１０８７−９７参照。
【０００４】
長年にわたって認可されている多価の肺炎球菌多糖ワクチンは、成人、特に、高齢者および高リスクの人における肺炎球菌性疾患の予防に有益であることが証明されている。しかしながら、乳児および幼児では、非コンジュゲート肺炎球菌多糖に対する応答は不充分である。肺炎球菌コンジュゲートワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、最も高頻度に単離された７種類の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有しており、米国で２０００年２月に最初に認可されたが、当時、幼児および乳児において侵襲性の肺炎球菌性疾患が引き起こされた。米国でＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が広く使用されるようになった後、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に存在する血清型により、小児では侵襲性肺炎球菌性疾患の有意な減少が見られている。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ２００５，５４（３６）：８９３−７参照。しかしながら、世界の特定の地域ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型接種率に制限があり、米国では、特定の新生血清型（例えば、１９Ａなど）の証拠がいくつかある。Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  １５９：６３４−４４；Ｗｈｉｔｎｅｙら，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：１７３７−４６；Ｋｙａｗら，２００６，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：１４５５−６３；Ｈｉｃｋｓら，２００７，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６：１３４６−５４；Ｔｒａｏｒｅら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９参照。
【０００５】
米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号には、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１３価の肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンが記載されている。中国特許出願公開第１０１５９０２２４号には、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１４価の肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンが記載されている。
【０００６】
他のＰＣＶにも、ＰＣＶ−１５に含めた血清型のうちの７、１０、１１または１３が含まれているが、一部の血清型で免疫干渉が観察されており（例えば、ＧＳＫのＰＣＶ−１１中の血清型３に対する防御は低い）、ＰｆｉｚｅｒのＰＣＶ−１３中の血清型６Ｂに対する応答率は低い。Ｐｒｙｍｕｌａら，２００６，Ｌａｎｃｅｔ  ３６７：７４０−４８およびＫｉｅｎｉｎｇｅｒら，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  １３−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｃｏｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ７−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｃｏｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｉｖｅｎ  ａｓ  ａ  ４−Ｄｏｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，（４８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ  ４６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２５−２８，２００８に提示）参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１５９０２２４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３
【非特許文献２】Ａｒｄｉｔｉら，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：１０８７−９７
【非特許文献３】Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ２００５，５４（３６）：８９３−７
【非特許文献４】Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  １５９：６３４−４４
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｎｅｙら，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：１７３７−４６
【非特許文献６】Ｋｙａｗら，２００６，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：１４５５−６３
【非特許文献７】Ｈｉｃｋｓら，２００７，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６：１３４６−５４
【非特許文献８】Ｔｒａｏｒｅら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９
【非特許文献９】Ｐｒｙｍｕｌａら，２００６，Ｌａｎｃｅｔ  ３６７：７４０−４８
【非特許文献１０】Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒら，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  １３−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｃｏｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ７−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｃｏｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｉｖｅｎ  ａｓ  ａ  ４−Ｄｏｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，（４８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ  ４６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２５−２８，２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（１）担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の１５種類の異なる血清型由来の莢膜多糖からなる多価の多糖−タンパク質コンジュゲート混合物、および（２）薬学的に許容され得る担体、を含む免疫原性組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ由来の莢膜多糖からなる多価の多糖−タンパク質コンジュゲート混合物；ならびに薬学的に許容され得る担体、を含む１５価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ−１５）組成物を提供する。具体的な一実施形態において、該免疫原性組成物は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ由来の莢膜多糖を含み、そして担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００１０】
一部の特定の実施形態では、該組成物は、さらにアジュバントを含む。一部の特定の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどのアルミニウム系アジュバントである。本発明の特定の一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。
【００１１】
また、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の上記の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に対する免疫応答の誘発方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、６Ｂが４μｇである以外は２μｇの各多糖；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質；０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのＬ−ヒスチジンバッファーを含むように製剤化された０．５ｍＬ単回用量として投与される免疫原性組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】乳児アカゲザルでのＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）とＰＣＶ−１５とのＧＭＣの比較である（Ｐｒｅｖｎａｒ血清型，ＰＤ−２およびＰＤ−３）。エラーバーは２標準誤差を表す。
【図２】ＰＣＶ−１５で免疫処置した乳児アカゲザルでの非Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）血清型に対する血清型特異的ＧＭＣである。エラーバーは２標準誤差を表す。
【図３】ＮＺＷＲ−１：ＡＰＡなし（０ｘＡ）またはＡＰＡあり（Ｂ１）で、ＰＣＶ−１５で免疫処置したウサギでの力価の幾何平均の比較である（２回目の投与後）。エラーバーは、差の倍数の幾何平均に対する９５％ＣＩを表す（ＡＰＡなしのＰＣＶ−１５／ＡＰＡありのＰＣＶ−１５）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、１５種類の相違する多糖−タンパク質コンジュゲートを含む、本質的に該コンジュゲートからなる、あるいはまた該コンジュゲートからなる多価の免疫原性組成物を提供し、該コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた異なる莢膜多糖を含み、該莢膜多糖は、薬学的に許容され得る担体とともに肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから調製される。一部の特定の実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。該免疫原性組成物は、さらに、アジュバント、例えば、アルミニウム系アジュバント（リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなど）を含むものであってもよい。また、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の上記の多価の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘発方法を提供する。
【００１５】
本実施例（後述）において実例を示すように、乳児アカゲザルでの前臨床試験により、ＰＣＶ−１５の全１５種類の血清型に対して、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）の７種類の共通する血清型に対する応答と同等の強固な抗体応答が示された。血清型２２Ｆおよび３３Ｆを含む新たな多糖−タンパク質コンジュゲートの追加を含めた１５価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンにより強固な抗体応答が提供されるという本出願人らの所見は、既存の肺炎球菌ワクチンではカバーされない肺炎球菌の血清型の接種率の拡張の実現可能性を示す。
【００１６】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、本発明の免疫原性組成物について用いる場合、任意の他の成分（該抗原混合物に対する「〜からなる」という文言の制限を受ける）、例えばアジュバントおよび賦形剤などの包含をいう。用語「〜からなる」は、多価の多糖−タンパク質コンジュゲート混合物について用いる場合、混合物が該１５種類の特定の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有するが、異なる血清型由来の他の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートは有さないことをいう。
【００１７】
肺炎連鎖球菌莢膜多糖−タンパク質コンジュゲート
肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な手法によって調製され得る。例えば、多糖は、細菌から単離され得、既知の方法によって、好ましくはマイクロフルイダイゼーションによってある程度までサイジングしてもよい（例えば、欧州特許第４９７５２４号および同第４９７５２５号参照）。多糖は、多糖試料の粘度を低下させるため、および／またはコンジュゲート生成物の濾過性を改善するためにサイジングされ得る。本発明では、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから調製する。
【００１８】
一実施形態において、各肺炎球菌多糖の血清型はダイズベースの培地中で培養する。次いで、個々の多糖を、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準工程によって精製する。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。
【００１９】
担体タンパク質は、好ましくは、無毒性かつ非反応原性であり、そして、充分な量および純度で入手可能なタンパク質である。担体タンパク質は、該多糖の免疫原性を増強するために肺炎連鎖球菌多糖とコンジュゲートまたは連接され得る。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適したものであるのがよい。本発明の特定の一実施形態では、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。一実施形態では、各莢膜多糖を同じ担体タンパク質にコンジュゲートさせる（各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている）。別の実施形態では、莢膜多糖を２種類以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせる（各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている）。かかる実施形態において、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には同じ担体タンパク質にコンジュゲートさせる。
【００２０】
ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の無毒性バリアント（すなわちトキソイド）である。一実施形態において、これは、カザミノ酸と酵母抽出物ベースの培地中で培養したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載の方法に従って組換えにより調製される。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せによって精製される。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（TM）（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおいて調製される。
【００２１】
他の好適な担体タンパク質としては、さらなる不活化細菌毒素、例えば、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド（ｔｏｘｉｄ））またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載のもの）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、および緑膿菌由来の外毒素Ａが挙げられる。細菌の外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌の表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ；国際公開第０２／０９１９９８号参照）、肺炎球菌の吸着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群の連鎖球菌由来Ｃ５ａペプチダーゼ、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ、肺炎球菌のニューモリシン（Ｋｕｏら，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３；２７０６−１３）、例えば、なんらかの様式で無毒化されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際公開第０４／０８１５１５号参照）またはｄＰＬＹ−ホルモール、ＰｈｔＸ、例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ  およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際公開第０１／９８３３４号および同第０３／５４００７号参照）もまた、使用され得る。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリン（ＰＰＤ）の精製タンパク質誘導体、ＰｏｒＢ（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来）、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ；例えば、欧州特許第０５９４６１０号参照）、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号および同第０４２７３４７号参照）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１７７１２および同第９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際公開第９８／５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号参照）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子もしくはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号参照）、種々の病原体由来抗原の多数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら，２００１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：３８１６−３８２４参照）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：４８８４−７参照）、鉄取込みタンパク質（国際公開第０１／７２３３７号参照）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡもしくはＢ（国際公開第００／６１７６１号参照）、ならびにフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａら，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６４：９参照）もまた、担体タンパク質として使用され得る。
【００２２】
他のＤＴ変異型、例えば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら，１９７３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ，編：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，１９９２に記載された他の変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒ、および／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの変異または欠失、ならびに米国特許第４，７０９，０１７号または同第４，９５０，７４０号に開示された他の変異；残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたはそれ以上の変異、ならびに米国特許第５，９１７，０１７号または同第６，４５５，６７３号に開示された他の変異；あるいは米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、を使用することもできる。
【００２３】
精製した多糖は、糖質が担体タンパク質と反応することができるようにするために化学的に活性化させる。活性化させたら、各莢膜多糖を別々に担体タンパク質にコンジュゲートさせ複合糖質を形成させる。この多糖コンジュゲートは、既知のカップリング手法によって調製され得る。
【００２４】
一実施形態において、多糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、同第４，６７３，５７４号および同第４，９０２，５０６号に記載の手段によって行われる。簡単には、この化学反応は、末端ヒドロキシル基をアルデヒドに酸化する任意の酸化剤、例えば過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸）との反応による肺炎球菌多糖の活性化を伴う。この反応により、糖質のビシナルヒドロキシル基のランダムな酸化的切断がもたらされ、反応性アルデヒド基の形成を伴う。
【００２５】
タンパク質担体（例えば、ＣＲＭ１９７）とのカップリングは、該タンパク質のリジル基の直接アミノ化を経る還元的アミノ化によるものであり得る。例えば、コンジュゲーションは、活性化させた多糖と担体タンパク質との混合物を還元剤（ナトリウムシアノボロヒドリドなど）と反応させることにより行われる。次いで、未反応アルデヒドを、強力な還元剤（水素化ホウ素ナトリウムなど）の添加によってキャッピングする。
【００２６】
別の実施形態において、コンジュゲーション方法は、糖質を１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化させ、シアン酸エステルを形成することに依存するものであり得る。活性化させた糖質は、かくして、直接、またはスペーサー（リンカー）基を介して担体タンパク質上のアミノ基にカップリングされ得る。例えば、スペーサーはシスタミンまたはシステアミンであり得、チオール化多糖が得られ、これは、マレイミド活性化型担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトアミド［例えば、エチルヨードアセトアミドＨＣｌ］もしくはブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジルもしくはＳＩＡＢ、もしくはＳＬＡ、もしくはＳＢＡＰを使用）との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングされ得る。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応によって作製したものであってもよい）をヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、アミノ誘導体化糖質を担体タンパク質に、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いてコンジュゲートさせる。かかるコンジュゲートは、国際公開第９３／１５７６０号、同第９５／０８３４８号および同第９６／２９０９４号；ならびにＣｈｕら，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０：２４５−２５６に記載されている。
【００２７】
他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用するものである。多くのものが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、カルボニルリンカーを伴うものであってもよく、これは、糖質の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎら，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８参照）、続いて、タンパク質との反応によるカルバメート結合の形成によって形成され得る。これは、アノマー末端の第１級ヒドロキシル基への還元（場合により第１級ヒドロキシル基の保護／脱保護を行う）、第１級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、および該ＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを伴うものであり得る。
【００２８】
一実施形態において、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜多糖抗原を個々に肺炎連鎖球菌から精製し、活性化させて反応性アルデヒドを形成し、次いで、還元的アミノ化を用いて担体タンパク質ＣＲＭ１９７に共有結合によりコンジュゲートさせる。
【００２９】
担体タンパク質への莢膜多糖のコンジュゲーション後、多糖−タンパク質コンジュゲートを、さまざまな手法のうちの１つ以上によって精製する（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）。このような手法の例は当業者に周知であり、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよびデプスフィルトレーションが挙げられる。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照のこと。
【００３０】
医薬組成物／ワクチン組成物
さらに、本発明は、１５種類の相違する多糖−タンパク質コンジュゲートを含む、本質的に該コンジュゲートからなる、あるいはまた該コンジュゲートからなる医薬組成物、免疫原性組成物およびワクチン組成物を含む組成物を提供し、ここで、該コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた異なる莢膜多糖を含み、そしてここで、該莢膜多糖は、薬学的に許容され得る担体およびアジュバントとともに肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから調製される。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々のプロセスで調製され、単回投与製剤にバルクで製剤化される。
【００３１】
本明細書において定義する場合、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強する機能を果たす物質である。免疫アジュバントは、単独で投与した場合は免疫原性が弱い（例えば、誘発される抗体力価もしくは細胞媒介性免疫応答がない、もしくは弱い）抗原に対する免疫応答を増強するもの、抗原に対する抗体力価を増大させるもの、および／または個体において免疫応答を得るのに有効な抗原の用量を低減させるものであり得る。したがって、アジュバントは、多くの場合、免疫応答を押し上げるために与えられ、当業者に周知である。該組成物の有効性を増強するための好適なアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００３２】
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど。
【００３３】
（２）水中油型乳剤配合物（ムラミルペプチド（下記に定義）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤あり、またはなし）、例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５を含み（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含んでいてもよい）、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に配合されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズされているか、またはボルテックスして大粒径の乳剤が生成されているかのいずれかであるＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびに３−Ｏ−脱アセチル化モノホスホリルリピド（ｄｅａｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ（TM））（米国特許第４，９１２，０９４号に記載）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（TM））からなる群の１種類以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（TM）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；ならびに（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡなど。
【００３４】
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ  ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（TM）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号参照）が使用され得るか、または該アジュバントから生成させた粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組合せによって形成された免疫賦活性複合体）ならびにＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが該タンパク質を含まない）。
【００３５】
（４）細菌リポ多糖、合成リピドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体、これらは、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；かかるＡＧＰの一例は、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ｝−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として公知であった）、水性形態または安定な乳剤として配合されたものである。
【００３６】
（５）合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフ（１つまたは複数）を含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）。
【００３７】
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共起刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２など。
【００３８】
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体
別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの２種類、３種類またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アセチル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１も含有している水中油型乳剤）である。
【００３９】
ムラミルペプチドとしては、限定されないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【００４０】
一部の特定の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ならびにＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩としては、限定されないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、アルハイドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムが挙げられる。
【００４１】
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造されたものである。ブレンドプロセス後、その物質をハイシェアミキサーを用いてサイズリダクションし、２〜８μｍの範囲の目的の凝集体粒径を得る。次いで、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。
【００４２】
一部の特定の実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）３（例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用し、タンパク質を、５０〜２００ｇのタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比率で吸着させる。タンパク質の吸着は、別の実施形態において、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および媒体のｐＨに依存性である。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強力に正荷電アルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、２〜３週間の期間にわたってゆっくり放出されるＡｇの貯蔵部を構築し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、および／または先天性免疫機構を刺激する（おそらく、尿酸の刺激によって）ことがあり得る。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔら，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２３を参照のこと。
【００４３】
一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドし、６Ｂでは目標の１６μｇ／ｍＬまで希釈した以外は、すべての血清型を目標の８μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等容量のリン酸アルミニウムアジュバントを目標最終アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬまで無菌的に添加する。アジュバントを加えた製剤バッチを、単回使用の０．５ｍＬ／用量バイアル内に充填する。
【００４４】
一部の特定の実施形態では、アジュバントはＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントはＯＤＮ  １８２６であり、これは、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐから取得され得る。
【００４５】
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」および類似した用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含む６〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド分子をいう。例えば、Ｗａｎｇら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４２９７を参照のこと。別の実施形態では、該用語の任意の他の当該技術分野で認知された定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレオシド間結合を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基および／または修飾糖鎖を含むものである。
【００４６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒら，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８；およびＹａｓｕｄａら，２００６，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０に記載されている。
【００４７】
投与／投薬量
本発明の組成物および製剤は、ワクチンを全身経路または粘膜経路によって投与するという手段によって肺炎球菌感染に易感染性のヒトを保護または処置するために使用され得る。一実施形態において、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘発方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒトに免疫学的（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌｌｙ）有効量の本発明の免疫原性組成物を投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチンを接種する方法を提供する。
【００４８】
本発明の組成物の「有効量」は、後の抗原刺激の際に肺炎連鎖球菌の感染（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｉｙ）の尤度または重症度を有意に低減させる抗体を誘起するに必要とされる用量をいう。
【００４９】
本発明の方法は、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる主要な臨床症候群（侵襲性感染（髄膜炎、肺炎、および菌血症）と、非侵襲性感染（急性中耳炎、および副鼻腔炎）の両方を含む）の予防および／または低減のために使用され得る。
【００５０】
本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射；または口道／消化管、呼吸道もしくは尿生殖路への粘膜投与のうちの１つまたはそれ以上を含むものであり得る。一実施形態では、鼻腔内投与が肺炎または中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭通過がより有効に抑制され得、したがって、初期の段階で感染が減弱されるため）。
【００５１】
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、有意な有害効果なく免疫防御応答を誘発する量として選択される。かかる量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、各用量は、０．１〜１００μｇ、特に０．１〜１０μｇ、より特別には１〜５μｇの各多糖を含む。例えば、各用量は、１００、１５０，２００、２５０、３００、４００、５００、もしくは７５０ｎｇまたは１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００μｇを含み得る。
【００５２】
特定のワクチンのための諸成分の最適量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な試験によって確認され得る。例えば、別の実施形態では、ヒトへのワクチン接種のための投薬量は、動物試験をヒトデータに外挿することによって決定される。別の実施形態では、該投薬量は経験的に決定される。
【００５３】
一実施形態において、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇもしくはそれ以上である。また別の実施形態では、上記のミョウバン塩の用量は、組換えタンパク質１μｇあたりのものである。
【００５４】
本発明の特定の一実施形態では、ＰＣＶ−１５ワクチンは、ＣＲＭ１９７に個々にコンジュゲートさせた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖の滅菌された液状製剤である。各々０．５ｍＬ用量が、６Ｂが４μｇである以外は２μｇの各糖質；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇ、または±１μｇ）；０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジンバッファーを含むように製剤化される。塩化ナトリウム濃度は約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭ、または±５ｍＭ）であり、Ｌ−ヒスチジンバッファーは約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭ、または±０．５ｍＭ）である。
【００５５】
本発明のいずれかの方法によれば、一実施形態において、被検体はヒトである。一部の特定の実施形態では、ヒト患者は乳児（１歳未満）、よちよち歩きの子供（およそ１２〜２４ヶ月）、または幼児（およそ２〜５歳）である。他の実施形態では、ヒト患者は高齢患者（＞６５歳）である。また、本発明の組成物は、年長児、青年および成人（例えば、年齢１８〜４５歳または１８〜６５歳）での使用にも適している。
【００５６】
本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は単回接種物として投与される。別の実施形態では、ワクチンは、２回、３回または４回またはそれ以上、充分に間隔をあけて投与される。例えば、該組成物は、１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間隔で、またはその任意の組合せの間隔で投与され得る。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に設計されたものに従ったスケジュールであり得る。例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児およびよちよち歩きの子供での常套的なスケジュールは、年齢が２、４、６、および１２〜１５ヶ月のときである。したがって、好ましい実施形態では、該組成物は、年齢が２、４、６、および１２〜１５ヶ月のときに一連の４回の用量で投与される。
【００５７】
また、本発明の組成物は、肺炎連鎖球菌由来の１種類以上のタンパク質も含んでいてもよい。含めるのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８５５号および同第０２／０５３７６１号において特定されるものが挙げられる。
【００５８】
製剤
本発明の組成物は、被検体に当業者に公知の１種類以上の方法、例えば、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内にて投与され得、それに応じて製剤化され得る。
【００５９】
一実施形態において、本発明の組成物は、液状製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸粘膜内注射によって投与される。注射のための液状製剤としては液剤などが挙げられる。
【００６０】
本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数投与バイアルまたは充填済シリンジとして製剤化され得る。
【００６１】
別の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、したがって、経口投与に適した形態、すなわち、固形または液状の調製物として製剤化される。固形経口製剤としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液状経口製剤としては、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油性剤などが挙げられる。
【００６２】
液状製剤用の薬学的に許容され得る担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、乳液または油類である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、乳液または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。
【００６３】
医薬組成物は、等張性、低張性、または高張性であってよい。しかしながら、多くの場合、注入または注射用の医薬組成物は、投与されるとき本質的に等張性であることが好ましい。したがって、保存の際、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組成物が保存の際に高張性である場合、投与前に等張性溶液となるように希釈するのがよい。
【００６４】
等張性薬剤は、イオン性等張性薬剤（塩など）であっても非イオン性等張性薬剤（糖類など）であってもよい。イオン性等張性薬剤の例としては、限定されないが、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２が挙げられる。非イオン性等張性薬剤の例としては、限定されないが、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。
【００６５】
また、少なくとも１種類の薬学的に許容され得る添加剤はバッファーであることが好ましい。ある目的の場合では、例えば、医薬組成物が注入または注射を意図したものである場合、たいていは該組成物にバッファーを含めることが望ましく、バッファーは、溶液を４〜１０の範囲（５〜９など、例えば、６〜８）のｐＨに緩衝する能力を有するものである。
【００６６】
バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸バッファー、グルタミンバッファー、乳酸バッファー、マレイン酸バッファー、酒石酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、炭酸バッファー、グリシン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、グリシンバッファー、コハク酸バッファーおよびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択され得る。
【００６７】
さらに、バッファーは、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためＵＳＰ適合バッファーから選択されるものであり得る。例えば、バッファーは、一塩基酸（酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸など）；二塩基酸（アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ、コハク酸および酒石酸など）、多塩基酸（クエン酸およびリン酸など）；ならびに塩基（アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩＳなど）からなる群から選択されるものであり得る。
【００６８】
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液および揮発油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、体液補給液および栄養補給液、電解質補給液（例えば、リンゲルデキストロース主体のもの）などが挙げられる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容され得るアジュバントの添加を伴うまたは伴わない、滅菌液状物（水および油類など）である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、グリコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、ならびにポリソルベート−８０が好ましい液状担体である（特に、注射用液剤に）。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。
【００６９】
また、本発明の製剤に界面活性剤を含めてもよい。好ましい界面活性剤としては、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にはＴｗｅｅｎと称される）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（商標名ＤＯＷＦＡＸ（TM）で販売）、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−ｌ，２−エタンジイル）基の数が種々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（TM）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般的にはＳＰＡＮとして公知である）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートが挙げられる。本乳剤に含めるのに好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。
【００７０】
界面活性剤の混合物（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物）を使用することもできる。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）など）とオクトキシノール（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）など）の組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含むものである。
【００７１】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０など）が０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤）が０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【００７２】
別の実施形態では、医薬組成物は制御放出系にて送達される。例えば、該薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与され得る。別の実施形態では、ポリマー物質が、例えばマイクロスフィアまたはインプラントにおいて使用される。
【００７３】
また、本発明には、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結合によって修飾された化合物も包含される。かかる修飾は、水溶液中での化合物の溶解性を増大させるもの、凝集を解消するもの、化合物の物理的および化学的安定性を増強するもの、ならびに化合物の反応原性を大きく低減させるものであり得る。別の実施形態では、かかるポリマー−化合物付加体（ａｂｄｕｃｔ）の、非修飾化合物よりも少ない頻度または少ない用量での投与によって所望のインビボ生物学的活性が得られる。
【００７４】
好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジンバッファーを用いて製剤される。
【００７５】
添付の説明文および図面に関して本発明の種々の実施形態を記載したが、本発明は、詳述した該実施形態に限定されないこと、および当業者には、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修正が行われ得ることを理解されたい。
【００７６】
以下の実施例により本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。
【００７７】
実施例
実施例１：肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製
肺炎球菌の培養方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：５２を参照のこと。また、肺炎球菌莢膜多糖の調製方法も当該技術分野で周知である。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの分離菌はＡＴＣＣから入手可能である。
【００７８】
該細菌は、莢膜を有し、非運動性であり、グラム陽性であり、ランセット形状の双球菌（これは、血液寒天上でα−溶血性である）として特定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて識別される。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。
【００７９】
細胞バンク
ＰＣＶ−１５に存在させる各肺炎連鎖球菌血清型に相当する細胞バンクを、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）から凍結バイアルにて入手した。
【００８０】
接種
解凍した種培養物を、予備滅菌した適切な増殖培地を入れた種醗酵槽に移した。
【００８１】
種醗酵
培養物は、温度とｐＨを制御した種醗酵槽内で培養した。種醗酵槽内の全容量を、予備滅菌した増殖培地を入れた醗酵生産槽に移した。
【００８２】
醗酵生産
醗酵生産は、当該プロセスの最終細胞増殖段階とした。温度、ｐＨおよび撹拌速度を制御した。
【００８３】
不活化
醗酵プロセスは、不活化剤の添加によって終了させた。不活化後、バッチを不活化槽に移し、このとき、該槽は、制御された温度および撹拌下に保持した。
【００８４】
精製
遠心分離と濾過の組合せを用いて細胞残屑を除去した。バッチを限外濾過し、ダイアフィルトレーションした。次いで、バッチを溶媒での分別に供し、これによって不純物を除去し、多糖を回収した。
【００８５】
実施例２：肺炎球菌多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化プロセス
異なる血清型の糖質を、個々に精製ＣＲＭ１９７担体タンパク質に、一般的なプロセスフローを用いてコンジュゲートさせる。このプロセスでは、糖質を溶解させ、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。次いで、精製ＣＲＭ１９７に、この活性化糖質をコンジュゲートさせ、得られたコンジュゲートを限外濾過によって精製した後、膜濾過によって最終０．２μｍにする。各工程におけるいくつかのプロセスパラメータ（ｐＨ、温度、濃度、および時間など）は、この実施例に記載のように、血清型特異的である。
【００８６】
工程１：溶解
精製多糖を水に２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解させた。溶解多糖を、圧力を０〜１０００バールに予め設定した機械式ホモジナイザーに通した。サイズリダクション後、この糖質を濃縮し、滅菌水を用いて１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過器でダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を、酢酸ナトリウムバッファー（終濃度５０ｍＭ）でｐＨ４．１に調整した。血清型４および５では、ｐＨ５．０の１００ｍＭの酢酸ナトリウムを使用した。血清型４では、溶液を５０±２℃でインキュベートした。２０〜２４℃まで冷却することにより加水分解を停止させた。
【００８７】
工程２：過ヨウ素酸反応
肺炎球菌の糖質の活性化に必要とされる過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量を、総糖質含量を用いて決定した。充分な混合により、５、７Ｆおよび１９Ｆでは温度を２〜６℃とした以外はすべての血清型で２０〜２４℃にて、酸化を３〜２０時間進行させた。
【００８８】
工程３：限外濾過
酸化させた糖質を濃縮し、ｐＨ６．４の１０ｍＭのリン酸カリウム（血清型５ではｐＨ４．３の１０ｍＭの酢酸ナトリウム）を用いて１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過器でダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を３Ｍリン酸カリウムバッファーの添加によってｐＨ６．３〜８．４に調整した。
【００８９】
コンジュゲーションプロセス
工程１：コンジュゲーション反応
濃縮した糖質を、ＣＲＭ１９７担体タンパク質と０．２〜２対１の電荷比で混合した。ブレンドした糖質−ＣＲＭ１９７混合物を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【００９０】
コンジュゲーション反応は、糖質１モルあたりナトリウムシアノボロヒドリドが１．８〜２．０モルとなるようにナトリウムシアノボロヒドリド溶液を添加することにより開始させた。反応混合物を２０〜２４℃で４８〜１２０時間インキュベートした（血清型３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａおよびｌ９Ｆでは８〜１２℃）。
【００９１】
工程２：ボロヒドリド反応
コンジュゲーションインキュベーションの終了時、反応混合物を４〜８℃に、そして１．２Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーまたは３Ｍリン酸カリウムバッファー（血清型５以外）のいずれかでｐＨを８〜１０に調整した。糖質１モルあたり水素化ホウ素ナトリウム０．６〜１．０モル（血清型５では、０モルのボロヒドリドを添加）となるように水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加することにより、コンジュゲーション反応を停止させた。反応混合物を４５〜６０分間インキュベートした。
【００９２】
工程３：限外濾過工程
反応混合物を、最小限の２０容量の１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８．４バッファーを用いて、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過器でダイアフィルトレーションした。１００ｋＤａ限外濾過器での保持液を、最小限の２０ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の１５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いて３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過器で、２０〜２４℃にてダイアフィルトレーションした。透過液は廃棄した。
【００９３】
工程４：滅菌濾過
３００ｋＤａ  ＭＷＣＯダイアフィルトレーションでの保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、放出試験、プロセス内対照、および製剤（血清型１９Ｆ以外）に適切な容量でホウケイ酸ガラス製容器内に充填した。血清型１９Ｆコンジュゲートは、０．２μｍフィルターに通して保持槽に入れ、２０〜２４℃でインキュベートした。インキュベーション後、コンジュゲートを最小限の２０ダイア容量の１５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いて３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ限外濾過器で、２０〜２４℃にてダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、放出試験、プロセス内対照、および製剤に適切な容量でホウケイ酸ガラス製容器内に充填した。最終バルク濃縮物を２〜８℃で保存した。
【００９４】
実施例３：１５価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
必要とされるバルク濃縮物の容量を、バッチ容量およびバルク糖質濃度に基づいて計算した。合わせた１５種類のコンジュゲートを、塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン（ｐＨ５．８）含有バッファーの添加によって、目標吸着濃度までさらに希釈した。充分に混合した後、このブレンド物を０．２μｍ膜に通して滅菌濾過した。この滅菌製剤バルクを、バルクのリン酸アルミニウムとのブレンド中およびブレンド後に、静かに混合した。この製剤化ワクチンを２〜８℃で保存した。
【００９５】
別のプロセスにおいて、合わせた１５種類のコンジュゲートを、塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン（ｐＨ５．８）含有バッファーの添加によって目標濃度までさらに希釈した。ポリソルベート８０を終濃度０．００５％まで添加し、希釈緩衝コンジュゲート混合物にした後、滅菌濾過した。滅菌濾過後、製剤化ワクチンを２〜８℃で保存した。
【００９６】
表１は、ＰＣＶ−１５のアジュバント添加形態およびアジュバント無添加形態の最終組成を示す。
【表１】
2014012720.tif 000002
【００９７】
実施例４：免疫原性試験
多種類の肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤の免疫原性を乳児アカゲザル（ＩＲＭ）およびニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ）動物モデルにおいて評価するための実験を設計した。乳児アカゲザルでの実験は、米国における肺炎球菌コンジュゲートワクチンに対する推奨スケジュールに充分適合するように設計し、年齢が取得時に２ヶ月、４ヶ月および６ヶ月の一連の乳児サルを使用した。したがって、乳児アカゲザルには、年齢が２〜３ヶ月のときに免疫処置を開始し、２ヶ月間隔でワクチンを投与した。４回目の投与（これも、米国の小児に対する推奨スケジュールの一部である）は行わなかった。成体ウサギ（ＮＺＷＲ）は、多種類のワクチン製剤を評価するために使用した。ＮＺＷＲ試験は、２つのワクチン用量を用いて行い、加速（２週間隔）免疫化レジメにて行われた。免疫応答の前臨床評価のため、ヒト用量の全量をウサギに送達し、一方、乳児サルにはヒト用量の半分を与えた。乳児サルに対してヒト用量の半分を選択した理論的根拠は、乳児アカゲザルの単一の筋肉内部位に投与してもよい容量の制限によるものであった。
【００９８】
血清型特異的ＩｇＧ応答の評価
電気化学的刺激を受けると発光するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（TM）標識を利用したメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）技術を用いるヒトアッセイに基づいた、ウサギおよびアカゲザル血清での使用のための多重電気化学的発光（ＥＣＬ）アッセイを開発した。Ｍａｒｃｈｅｓｅら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：３８７−９６参照。専用のＥＣＬプレートリーダーを使用し、プレート付属電極に電流を流して一連の電気誘導性反応をもたらし、発光シグナルを生じさせる。開発および確認に使用した多スポット構成は、９６ウェルプレート形式で１０スポット／ウェルのものとし、各ウェルに５ｎｇの肺炎球菌（Ｐｎ）多糖（Ｐｓ）／スポットをコートした。２プレート形式は、交差反応性の多糖（すなわち、６Ａと６Ｂ、および１９Ａと１９Ｆ）が別々のプレート内で試験されることを確実にするために使用した。プレートフォーマット１には、血清型３、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含め、一方、プレートフォーマット２には、血清型１、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆを含めた。また、各ウェルに、２つのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）スポットも含め、これは、アッセイのバックグラウンド反応性（すなわち、ＰｎＰｓの非存在下での血清および標識二次抗体に関連する応答）を評価するために使用した。アッセイ標準（８９ＳＦ−２）、対照、および試験血清を、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、１％のＢＳＡ、５μｇ／ｍｌのＣ−多糖（ＣＰｓ）、１０μｇ／ｍｌの血清型２５多糖（ＰｎＰｓ２５）および１０μｇ／ｍｌの血清型７２多糖（ＰｎＰｓ７２）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で適切なレベルに希釈し、４℃（２〜８℃）で一晩または周囲温度で４５分間インキュベートした。乳児サル試料を試験する場合はヒト抗体試薬および標準を使用し、一方、ウサギ血清試料を試験する場合では、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（TM）標識抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。各抗原コートプレートを、ブロック剤を伴って振盪機プラットフォームで周囲温度にて１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、予備吸着させて希釈した２５μＬ／ウェルの試験血清を添加し、振盪機プラットフォームで周囲温度にて４５分間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（TM）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（アカゲザル血清の場合）および標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ウサギ血清の場合）を各ウェルに添加し、振盪機プラットフォームで周囲温度にて１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、水で１：４に希釈した１５０μＬのＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ−Ｔ  ４×（界面活性剤を含む）を各ウェルに添加した。ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．２４００または６０００を用いてプレートの読み値を得た。ウサギ試験については、結果を力価の幾何平均（ＧＭＴ）またはＧＭＴの比で示す。乳児アカゲザル試験については、結果を、ヒト参照標準（８９  ＳＦ−２）に帰属させた血清型特異的ＩｇＧ濃度を用いた標準曲線からの濃度の読み値の幾何平均で表示した。
【００９９】
機能性（オプソニン作用性）応答の評価
乳児アカゲザル試験２の試料を４重ＭＯＰＡアッセイ（ＭＯＰＡ−４）において試験した。Ｂｕｒｔｏｎら，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：１００４−９参照。このアッセイでは、アッセイの第一部（分化ＨＬ−６０細胞内におけるオプソニン作用および取込み）が一度に４種類までの血清型を用いて行われ得るように、４種類の抗生物質のうち１種類に耐性であるように選択した細菌株を使用する。細菌死滅の読出しは、各特異的血清型の死滅力価を調べるため、対応する株が耐性である４種類の各抗生物質の存在下でパラレルで行う。結果を、５０％の死滅が観察された希釈度の逆数で表示する（内挿後）。
【０１００】
前臨床試験のための統計学的方法論
どちらの動物モデルも、標本サイズに関して制限を有する。一般に、試験群あたり８匹の乳児サルまたは８匹のウサギを使用した。８匹の動物／群では、処置群間の力価の幾何平均の臨界差の倍数が２．５倍を意義のある応答閾値とみなした。２．５倍の差は、各血清型について、処置群における自然対数変換力価の標準偏差はｌｎ（２）という仮定に基づいて決定した。
【数１】
2014012720.tif 000003
【０１０１】
はｉ番目の処置群におけるＩｎ変換力価の平均、ｎｉはｉ番目の処置群の動物の数、σｉ２はｉ番目の処置群の動物間のＩｎ変換力価の既知分散を表すとし、すべてのｉについて、ｎｉ＝８およびσｉ２＝（ｌｎ（２））２と設定すると、
【数２】
2014012720.tif 000004
【０１０２】
を解くことにより２．５の値が得られ、このとき、
【数３】
2014012720.tif 000005
【０１０３】
であり、Ｚ０．９９５は、標準的な累積正規分布の逆関数を表し、確率は０．９９５（すなわち、Ｚ０．９９５＝２．５７６）である。計算値２．４４は、丸めを行って２．５にしていることに注意のこと（２．５では、簡便な０．４という逆数が得られるためでもある）。
【０１０４】
ＰＣＶ−１５に対する乳児アカゲザル（ＩＲＭ）の血清型特異的ＩｇＧ応答
免疫原性のパイロット試験（ＩＲＭ−１）を行い、乳児アカゲザル（ＩＲＭ）が、Ｐｎ多糖ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンを評価するための良好なモデルとなり得るかどうかを調べた。実験の主な目的は、ＩＲＭ（ヒト乳児と類似）が、遊離Ｐｎ多糖には非応答性であるが、コンジュゲートワクチンには良好に応答し得るかどうかを調べることであった。５匹のＩＲＭの群に、Ｐｎ多糖であるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）またはＰＣＶ−１５のいずれかの注射を、年齢が２〜３ヶ月のときに開始した。３つの用量のワクチンを２ヶ月間隔で筋肉内（ＩＭ）投与し、血清型特異的ＩｇＧ応答を、初回投与前ならびに２回目の投与の１ヶ月後および３回目の投与の１ヶ月後にマルチアレイ電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを用いて測定した（データ表示せず）。
【０１０５】
その結果により、ＩＲＭは、遊離Ｐｎ多糖に対して応答するとしても不充分であるが、コンジュゲートワクチンには非常に良好に応答することが示された。結果は、乳児アカゲザルにおけるＰｎ多糖に対するＩｇＧ応答の誘発が担体タンパク質に対する多糖のコンジュゲーションに依存性であり、したがって、古典的Ｔ細胞依存性応答であることを示していた。したがって、ＩＲＭモデルは、ＰＣＶ−１５製剤の評価に適していると判定した。
【０１０６】
遊離（非コンジュゲート）多糖および非コンジュゲートＣＲＭ１９７を最小限にするバルクコンジュゲーションプロセスを使用したＰＣＶ−１５製剤を評価するため、第２の試験（ＩＲＭ−２）を行った。図１は、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ）に含まれた７種類の血清型についての、２回目の投与後（ＰＤ−２）および３回目の投与後（ＰＤ−３）のＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）（対比）に対するＰＣＶ−１５のＩｇＧ応答を示す。ＰＣＶ−１５に対するＰＤ−２応答は、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）の対応する応答と同等であるか、または若干低かったが、ＰＣＶ−１５に対するＰＤ−３応答は、ほぼすべての血清型で、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）によって誘起されるものよりもいくぶん高かった。
【０１０７】
ＰＣＶ−１５中の非Ｐｒｅｖｎａｒ血清型に対するＩＲＭ応答を図２に示す。ＰＣＶ−１５中の非Ｐｒｅｖｎａｒ血清型に対するＰＤ−２応答はすべて、ベースライン（ワクチン接種前）ＩｇＧ濃度よりも少なくとも１０倍高く、ＰＤ−３では力価が上昇し続けた。
【０１０８】
結果は、ＰＣＶ−１５およびＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）に対する抗体応答が、
７種類の共通の血清型では同等であったこと、ならびに追加した８種類の血清型では、ＰＣＶ−１５に対するワクチン接種後の応答がベースラインよりも＞１０倍高かったことを示す。
【０１０９】
ＰＣＶ−１５に対するＩＲＭの機能性（オプソニン作用性）免疫応答
乳児サルにおいてＰＣＶ−１５によって機能性抗体応答が誘発されるかどうかを調べるため、オプソニン作用性死滅（ＯＰＡ）アッセイを、ＩＲＭ−２での血清において行った。ワクチン接種前、ＰＤ−２、およびＰＤ−３でのＰＣＶ−１５およびＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）に対する応答を表２に示す。示した結果は、二連でアッセイした各時間点における７〜８匹のサル由来の血清試料でのＧＭＴである。また、ＰＤ−３の時間点での応答動物（すなわち、ＯＰＡ力価が≧８のもの）の割合も示す。ＰＣＶ−１５により、１型および３３Ｆ型以外のすべての血清型で高いＰＤ−２  ＧＭＴが誘発された。３回のワクチン投与後、ＰＣＶ−１５により、各血清型に対して高いＯＰＡ  ＧＭＴ、およびワクチンに含まれた全１５種類の血清型で１００％のＯＰＡ応答率が誘導された。また、注目すべきことに、ＰＣＶ−１５により、ワクチン中に入れていない血清型６Ｃに対して良好な交差反応性のＯＰＡ応答も誘発された。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）では、ワクチンに含まれたすべての血清型で高いＯＰＡ力価および１００％応答率が誘導されたが、サル画分中の血清型６Ａおよび６Ｃに対して誘発された交差反応性の応答は弱いものにすぎなかった。
【表２】
2014012720.tif 000006
【０１１０】
ニュージーランド白ウサギでのＰＣＶ−１５製剤の評価
ＰＣＶ−１５製剤を、成体ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ）での４つの試験において、圧縮免疫処置レジメを用いて評価し、ここで、このレジメでは、ウサギに、ヒト用量の全量のワクチンを０日目と１４日目に与え、解析のために血清を０、１４および２８日目に収集した。試験はすべて、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）を比較の基準とし、表３（ＮＺＷＲ実験１〜４）にまとめる。
【０１１１】
表３には、両ワクチンに共通する血清型について、Ｍｅｒｃｋ  ＰＣＶ−１５に対するＩｇＧ応答の幾何平均をＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）に対する比で示した、ニュージーランド白ウサギの２回目の投与後の応答の結果を示す。
【表３】
2014012720.tif 000007
【０１１２】
血清型特異的ＩｇＧ応答は、一般的に、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）の対応する応答の２．５倍以内であった。例外は血清型（２３Ｆ）であり、これは、４つの実験のうち２つで、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に対するものよりも＞２．５倍低かった。０日目から２８日目まで（２回目の投与後，ＰＤ−２）の非Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）血清型に対する抗体レベルの上昇倍数を表４にまとめる。
【表４】
2014012720.tif 000008
【０１１３】
ＮＺＷＲにおける免疫原性に対する多糖コンジュゲートワクチン用量の効果
また、増大用量（倍用量，２×）の多糖コンジュゲートの免疫原性も、ＰＣＶ−１５に含まれるすべての血清型について、計画したヒト用量（１×）のワクチンと比較して評価した。２×多糖コンジュゲート製剤では、ほとんどのコンジュゲートがアルミニウムアジュバントに結合され得ることを確実にするため、ＡＰＡ濃度を１．５×に増大した。表５に示されるように、ワクチン中の多糖−コンジュゲートの量の増加に有意な有益性はないようであった。すべての血清型間での差は２倍以内であり、比率の倍数（１×ＰＣＶ−１５／２×ＰＣＶ−１５＋１．５×ＡＰＡ）の幾何平均は１．１であった。
【表５】
2014012720.tif 000009
【０１１４】
ＮＺＷＲにおけるＰＣＶ−１５の免疫原性に対するアルミニウムアジュバントの効果
抗体応答に対するアルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）の影響を一例のウサギ試験において評価した。計画したヒト用量のＡＰＡ（ＰＣＶ−１５  １×ＡＰＡ）を配合した、２倍の計画したヒト用量のＡＰＡ（ＰＣＶ−１５  ２×ＡＰＡ）を配合し、そしてアルミニウムアジュバントは全くなしの（ＰＣＶ−１５  ０×ＡＰＡ）ＰＣＶ−１５を試験した。また、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）群も試験に含めた。
【０１１５】
ＰＤ−２の結果により、ＡＰＡの濃度の倍加は、ＰＣＶ−１５に対する血清型特異的ＩｇＧ応答に対してほとんど影響がないことが示された。力価の差の倍数（１×ＡＰＡ／２×ＡＰＡ）は０．６（血清型６Ｂ）〜２．３（血清型２２Ｆ）の範囲であり、１５種類の血清型間の比率の倍数の幾何平均は１．１であった。アルミニウムアジュバントがない場合では、抗体力価は、多くの血清型で、１×ＡＰＡを含むＰＣＶ−１５と比べて低いようであった。力価の差の倍数（１×／０×）は０．５（血清型５）〜２．９（血清型２３Ｆ）の範囲であり、１５種類の血清型間の比率の倍数の幾何平均は１．４であった。全体的に、アルミニウムアジュバントのレベルを倍加することは純然たる利点にはならないようであり、この動物モデルにおいてアジュバントを除外すること（表６）は不都合なようである。
【０１１６】
ＰＤ−２の結果により、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含まない群の多くの血清型で、ＡＰＡ含有ＰＣＶ−１５と比べて抗体力価の低減がみとめられ（図３）、これは、ウサギにおける最適なＰＣＶ−１５の免疫原性にはアルミニウムアジュバントを含めることが要件であることを示すことが示された。また、倍加量のＡＰＡをワクチンに含めた場合、有益性は見られなかった（データ表示せず）。
【表６】
2014012720.tif 000010
【０１１７】
2014012720.tif 000011
【０１１８】
考察および結論
前臨床データは、ＰＣＶ−１５製剤（ＡＰＡを配合）が２つの種（乳児アカゲザルおよびウサギ）において高度に免疫原性であることを示す。ＰＣＶ−１５に対する血清型特異的応答は、両ワクチンに共通する７種類の血清型で、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）によって誘起されるものと同等であった。ＰＣＶ−１５の新たな８種類の血清型では、乳児アカゲザルとウサギの両方において強固な応答が誘起され、両方の種において２回のワクチン投与後、すべての血清型でＩｇＧ応答≧１０倍上昇した。限界用量範囲での実験で、多糖コンジュゲートの量の２倍増により抗体応答の増大はもたらされないことが示された。同様に、アルミニウムアジュバント濃度の２倍増でも、ＰＣＶ−１５の免疫原性プロフィールは有意に改善されないようであった。しかしながら、アジュバントを除外すると一部の血清型に対して応答の低下がもたらされ、これは、ヒトにおいてアジュバントが必要である可能性を示唆する。ワクチン中の全１５種類の血清型ならびにＰＣＶ−１５の成分でない血清型６Ｃに対してＰＣＶ−１５による機能性（ＯＰＡ）抗体応答が誘起された。
【図１】
2014012720.tif 000012
【図２】
2014012720.tif 000013
【図３】
2014012720.tif 000014