(57)【要約】【課題】ウイルス血症サンプルにおいてパルボウイルスＢ１９を検出するための信頼できる診断試験を開発すること【解決手段】本願において、ヒトパルボウイルスＢ１９プライマーと、パルボウイルスＢ１９ゲノムの保存領域に由来するプローブとが、開示される。このプライマーを使用する核酸ベースのアッセイ、ならびにこのプローブを使用する核酸ベースのアッセイもまた、本願において開示される。本願において、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出する方法もまた、開示される。本願において、標的ヒトパルボウイルスＢ１９ヌクレオチド配列を増幅するための方法もまた、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ウイルス診断剤に関する。特に、本発明は、パルボウイルスＢ１９感染を正確に診断するための核酸ベースのアッセイ、ならびにこれらのアッセイにおける使用のためのプライマーおよびプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトパルボウイルスＢ１９は、パルボウイルス科、エリスロウイルス属のメンバーであり、約５，６００ヌクレオチドの線状一本鎖ＤＮＡ分子を備える小さな２２ｎｍ正二十面体非エンベロープウイルスである。そのウイルスゲノムは、３つの主要タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＮＳ１をコードする。非特許文献１（Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６）および本明細書中の図１を参照のこと。ＶＰ１（８３ｋＤａ）およびＶＰ２（５８ｋＤａ）は、キャプシドの構造タンパク質である。この２つのタンパク質は、それぞれ、およそヌクレオチド２４４４〜４７８９およびおよそ３１２５〜４７８９の重複するリーディングフレームにおいてコードされている。ＶＰ２は、キャプシドの９５％を構成し、大きい方のＶＰ１タンパク質は、キャプシドのたった５％しか構成しない。ＶＰ１は、このウイルスの成熟したコンフォメーションに必要とされる。ＮＳ１（７７ｋＤａ）は、非構造タンパク質であり、感染した細胞の核画分中にのみ存在し、そして細胞質および血清中のインタクトなビリオンには存在しない。
【０００３】
パルボウイルスＢ１９は、正常な血液ドナーの血清中に最初発見された。パルボウイルスＢ１９は、ヒトにおいて病原性であることが公知であるパルボウイルス科の唯一のメンバーである。このウイルスは、広範な疾患発現と関連がある。ヒトパルボウイルスＢ１９は、通常、子供における無症候性感染または軽度の自己制限感染を引き起こす。成人において、パルボウイルスＢ１９は、発疹、一過性対称性多発性関節炎、および関節炎を引き起こし得る。パルボウイルスＢ１９は、溶血性障害に罹患した患者における内在する一過性無形成発症（ＴＡＣ）と関係付けられている。慢性Ｂ１９感染および持続性貧血が、急性白血病に罹患している免疫無防備状態の患者、先天性免疫不全に罹患している免疫無防備状態の患者、ＡＩＤＳに罹患している免疫無防備状態の患者、骨髄移植後の免疫無防備状態の患者において報告されている。パルボウイルスＢ１９はまた、妊娠している女性における胎児の死亡に関係付けられている。
【０００４】
ほとんどの国において、Ｂ１９ウイルス感染は、一般的には小児期に生じ、約５０％の子供が、１５歳までに抗Ｂ１９抗体を有する。Ｂ１９抗体の普及率は、寿命の間にさらに増加し得、老人において９０％を超える値に達する。
【０００５】
ヒトパルボウイルスＢ１９感染において、最初のウイルス複製は、気道において生じると考えられる。その後、このウイルスは、骨髄中の細胞を標的とする。これは、１０２粒子／ｍｌ〜１０１４粒子／ｍｌの間の報告されたウイルス血症を伴う大規模ウイルス複製をもたらし、これは、感染の７〜１０日後であるが症状の発症の前に生じる。ウイルス血症の停止は、２〜３カ月間上昇したままである特異的ＩｇＭ抗体の検出と同時に生じる。抗Ｂ１９  ＩｇＧ抗体は、ＩｇＭ抗体が出現する２〜３日後に検出され、一生持続する。
【０００６】
脂質エンベロープの非存在および限定されたＤＮＡ含量は、パルボウイルスＢ１９を、物理化学的不活化に対して非常に耐性にする。パルボウイルスＢ１９は、特に高濃度では、血液産物の従来の熱処理に耐え得、そして溶媒界面活性剤処理した第ＶＩＩＩ因子調製物ならびに蒸気加熱または乾燥加熱した第ＶＩＩＩ因子調製物および第ＩＸ調製物の投与を介するＢ１９の伝達が、記載されている。
【０００７】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、従来の細胞培養物中で増殖され得ず、このことは、実験室での検出およびこのウイルスの単離を非常に困難にする。従って、多年にわたり、抗原の唯一の供給源は、ウイルス血症の患者由来の血清からなった。組換え抗原が、これらの問題を克服するための試みにおいて、血清学的アッセイにおける使用のために生成された。例えば、非特許文献２（ＳｉｓｋおよびＢｅｒｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５：１０７７〜１０８０）；特許文献１（米国特許第６，２０４，０４４号）を参照のこと。免疫酵素的ＩｇＭ捕捉アッセイが、抗Ｂ１９ＩｇＭを検出するため、ならびに最近のＢ１９感染を診断するために、使用されている。しかし、多数の市販の試験の診断性能は、同質ではない。さらに、ＩｇＭベースの診断試験は、感染のウイルス血症段階の間にこのウイルスを検出し得ず、一旦ＩｇＭ抗体が合成されると、そのＩｇＭ抗体は、ウイルス血症の終了後数ヶ月間、循環中に残り得る。
【０００８】
正常な集団におけるＢ１９抗体の高普及率は、高ウイルス血症は、通常は、たった一週間の間しか持続しないという事実とともに、血清学ベースの試験の使用を非実用的にする。さらに、免疫無防備状態の患者において、血清化学的診断は、信頼できないかもしれない。
【０００９】
核酸ベースのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ドットブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション）が、Ｂ１９検出のために使用されている。これらのアッセイは、一般的には、１ｐｇ〜０．１ｐｇウイルスＤＮＡ（約１０４〜１０５ウイルス粒子）の検出限界を有する。ＰＣＲは、より高い感度（約１００ゲノムコピー）を有する。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術は、時間がかかり、そして使用が限定されており、ＰＣＲは、多数のサンプルをスクリーニングするために非実用的である。
【００１０】
従って、血液誘導体および血漿誘導体を介するかまたは密接な人的接触によるこのウイルスの伝達を妨害するため、ウイルス血症サンプルにおいてパルボウイルスＢ１９を検出するための信頼できる診断試験の開発の必要性が存在したままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，２０４，０４４号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６
【非特許文献２】ＳｉｓｋおよびＢｅｒｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５：１０７７〜１０８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、核酸ベースのアッセイにおける使用のための独特のプライマーおよびプローブの開発と、感染した可能性がある個体由来の生物学的サンプルにおけるパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡの検出のための高感度で信頼できる核酸ベースの診断試験の開発とに、基づく。本明細書中に記載される技術は、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）を使用するＢ１９配列のゲノム保存領域の増幅のためのテンプレートとして、ならびに５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において、抽出したサンプルＤＮＡを利用する。これらの方法は、１０３ウイルス粒子／ｍｌ程度の低いウイルス力価を有するウイルス血症サンプルにおけるＢ１９  ＤＮＡの検出を可能にする。従って、感染したサンプルが同定され得、輸血から排除され得、血液誘導体の調製から排除され得る。本明細書中に記載されるプローブおよびプライマーはまた、例えば、標準的ハイブリダイゼーション法、ならびにＰＣＲベースの技術、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ならびに分枝型ＤＮＡ分子を利用するアッセイにおいて、有用である。
【００１４】
従って、１つの実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出する方法に関する。この方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、上記核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）上記単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、第１オリゴヌクレオチドと反応させる工程であって、上記第１オリゴヌクレオチドは、上記ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と複合体を形成するに十分に、上記ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第１プライマーを含み、上記第１のプライマーは、上記複合体形成配列の５’側に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含み、上記反応は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下で実施される、工程；
（ｃ）上記ＲＮＡ標的配列をテンプレートとして使用して、上記ＲＮＡ標的配列と相補的な第１ＤＮＡプライマー伸長産物を生じるように、伸長反応において上記第１プライマーを伸長させる工程；
（ｄ）上記ＲＮＡ標的配列を選択的に分解する酵素を使用して、上記ＲＮＡ標的配列から上記第１ＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程；
（ｅ）上記ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下にて、第２オリゴヌクレオチドで処理する工程であって、上記第２オリゴヌクレオチドは、上記ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と複合体形成するに十分に、上記ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第２プライマーを含む、工程；
（ｆ）上記第２プライマーの３’末端を、第２ＤＮＡプライマー伸長産物を生じ、それにより上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートを生成するように、ＤＮＡ伸長反応において伸長させる工程；
（ｇ）上記プロモーター配列を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、上記標的配列の複数のＲＮＡコピーを生成するように上記テンプレートを使用する工程；ならびに
（ｈ）工程（ｇ）のＲＮＡコピーを使用し、上記標的配列を増幅するように工程（ｂ）〜（ｇ）を自己触媒的に反復する工程；
を包含する。
【００１５】
特定の実施形態において、この方法は、
（ｉ）工程（ｈ）の産物に、プローブ：標的複合体を形成する上記プローブと上記標的配列とのハイブリダイゼーションを提供する条件下で、標識オリゴヌクレオチドプローブを付加する工程であって、上記オリゴヌクレオチドプローブは、上記標的配列の一部と相補的である、工程；ならびに
（ｊ）上記標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
をさらに包含する。
【００１６】
さらなる実施形態において、上記標識はアクリジニウムエステルである。
【００１７】
なおさらなる実施形態において、上記方法において使用される第１プライマーおよび第２プライマーならびにプローブは、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域（例えば、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列）に由来する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出する方法に関する。この方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、上記核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）上記単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、第１オリゴヌクレオチドと反応させる工程であって、上記第１オリゴヌクレオチドは、上記ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と複合体を形成するに十分に、上記ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第１プライマーを含み、上記第１のプライマーは、上記複合体形成配列の５’側に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含み、上記第１プライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する配列を含み、上記反応は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下で実施される、工程；
（ｃ）上記ＲＮＡ標的配列をテンプレートとして使用して、上記ＲＮＡ標的配列と相補的な第１ＤＮＡプライマー伸長産物を生じるように、伸長反応において上記第１プライマーを伸長させる工程；
（ｄ）上記ＲＮＡ標的配列を選択的に分解する酵素を使用して、上記ＲＮＡ標的配列から上記第１ＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程；
（ｅ）上記ＤＮＡプライマー伸長産物を、第２オリゴヌクレオチドで処理する工程であって、上記第２オリゴヌクレオチドは、上記ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と複合体形成するに十分に、上記ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第２プライマーを含み、上記第２プライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、上記処理は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下にて実施される、工程；
（ｆ）上記第２プライマーの３’末端を、第２ＤＮＡプライマー伸長産物を生じ、それにより上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートを生成するように、ＤＮＡ伸長反応において伸長させる工程；
（ｇ）上記プロモーター配列を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、上記標的配列の複数のＲＮＡコピーを生成するように上記テンプレートを使用する工程；ならびに
（ｈ）工程（ｇ）のＲＮＡコピーを使用し、上記標的配列を増幅させるように工程（ｂ）〜（ｇ）を自己触媒的に反復する工程；
（ｉ）工程（ｈ）の産物に、アクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを付加する工程であって、上記オリゴヌクレオチドプローブは、上記標的配列の一部と相補的であり、上記プローブは、図２Ａ〜図２Ｕのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、上記プローブは、プローブ：標的複合体を形成する上記プローブと上記標的配列とのハイブリダイゼーションを提供する条件下で付加される、工程；ならびに
（ｊ）上記標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
を包含する。
【００１９】
なお別の実施形態において、本発明は、標的パルボウイルスＢ１９ヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。この方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、上記核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）上記ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズし得る１つ以上のプライマーを添加する工程であって、上記１つ以上のプライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、工程；
（ｃ）上記１つ以上のプライマーに対して３’側に、上記ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを付加する工程；
（ｄ）ポリメラーゼを使用して、上記１つ以上のプライマーを伸長させる工程；
を包含する。
【００２０】
特定の実施形態において、工程（ａ）のＲＮＡ標的配列は、ｃＤＮＡを提供するように逆転写される。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を使用して、上記ｃＤＮＡを増幅させる工程をさらに包含し得る。他の実施形態において、上記ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼであるが、これらに限定されない）である。さらなる実施形態において、上記ポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２１】
上記の種々の方法の特定の実施形態において、内部コントロールが、提供される。上記内部コントロールは、図１２の配列（配列番号９２）に由来し得る。さらなる実施形態において、上記内部コントロールは、配列番号９０を含む。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出するための方法に関する。この方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、上記核酸は、標的配列を含む、工程；
（ｂ）上記単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、上記標的配列と十分に相補的でありかつ上記標的配列とハイブリダイズし得る、検出可能に標識されたプローブと反応させる工程であって、上記プローブは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、さらに上記反応は、プローブ／標的配列複合体の形成を提供する条件下で実施される、工程；ならびに
（ｃ）上記標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
を包含する。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドに関し、このポリヌクレオチドは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、上記のようなポリヌクレオチドに関し、上記ヌクレオチド配列は、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ、図２Ｊ、図２Ｋ、図２Ｌ、図２Ｍ、図２Ｎ、図２Ｏ、図２Ｐ、図２Ｑ、図２Ｒ、図２Ｓ、図２Ｔ、図２Ｕ、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ、図１１Ｊ、図１１Ｋ、図１１Ｌ、図１１Ｍ、図１１Ｎ、図１１Ｏ、図１１Ｐ、図１１Ｑ、図１１Ｒ、図１１Ｓ、図１１Ｔ、図１１Ｕ、図１１Ｖ、図１１Ｗ、図１１Ｘ、図１１Ｙまたは図１１Ｚに示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、図３Ａ〜図３Ｃまたは４Ａ〜図４Ｃに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、上記のようなポリヌクレオチドに関し、上記ヌクレオチド配列は、図３Ａ〜図３Ｃまたは図４Ａ〜図４Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドのヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列と作動可能に連結した、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター領域からなる、オリゴヌクレオチドプライマーに関する。特定の実施形態において、上記プロモーター領域はＴ７プロモーターであり、上記ポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。さらに、上記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的配列は、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域（例えば、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列）に由来し得る。
【００２８】
なおさらなる実施形態において、本発明は、約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドのヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列と作動可能に連結した、Ｔ７プロモーターからなる、オリゴヌクレオチドプライマーに関し、上記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列は、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、アクリジニウムエステル標識に連結した、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブに関する。特定の実施形態において、上記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列は、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域（例えば、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列）に由来する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、診断試験キットに関し、このキットは、本明細書中に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと、該診断試験を実施するための指示書とを備える。特定の実施形態において、上記試験キットは、アクリジニウムエステル標識に連結した、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００３１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって、明らかになる。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出する方法であって、
該方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）該単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、第１オリゴヌクレオチドと反応させる工程であって、該第１オリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と複合体を形成するに十分に、該ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第１プライマーを含み、該第１のプライマーは、該複合体形成配列の５’側に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含み、該反応は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下で実施される、工程；
（ｃ）該ＲＮＡ標的配列をテンプレートとして使用して、該ＲＮＡ標的配列と相補的な第１ＤＮＡプライマー伸長産物を生じるように、伸長反応において該第１プライマーを伸長させる工程；
（ｄ）該ＲＮＡ標的配列を選択的に分解する酵素を使用して、該ＲＮＡ標的配列から該第１ＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程；
（ｅ）該ＤＮＡプライマー伸長産物を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下にて、第２オリゴヌクレオチドで処理する工程であって、該第２オリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と複合体形成するに十分に、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第２プライマーを含む、工程；
（ｆ）該第２プライマーの３’末端を、第２ＤＮＡプライマー伸長産物を生じ、それにより該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートを生成するように、ＤＮＡ伸長反応において伸長させる工程；
（ｇ）該プロモーター配列を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、該標的配列の複数のＲＮＡコピーを生成するように該テンプレートを使用する工程；ならびに
（ｈ）工程（ｇ）のＲＮＡコピーを使用し、該標的配列を増幅させるように工程（ｂ）〜（ｇ）を自己触媒的に反復する工程；
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ）工程（ｈ）の産物に、プローブ：標的複合体を形成する前記プローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーションを提供する条件下で、標識オリゴヌクレオチドプローブを付加する工程であって、該オリゴヌクレオチドプローブは、該標的配列の一部と相補的である、工程；ならびに
（ｊ）該標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
をさらに包含する、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法であって、前記標識がアクリジニウムエステルである、方法。
（項目４）
項目２に記載の方法であって、前記第１プライマーおよび第２プライマーならびにプローブが、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域に由来する、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記第１プライマーおよび第２プライマーならびにプローブが、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、工程（ｂ）において内部コントロールを提供する工程をさらに包含する、方法。
（項目７）
項目６に記載の方法であって、前記内部コントロールが、図１２の配列（配列番号９２）に由来する、方法。
（項目８）
項目６に記載の方法であって、前記内部コントロールが、配列番号９０を含む、方法。
（項目９）
生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出する方法であって、
該方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）該単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、第１オリゴヌクレオチドと反応させる工程であって、該第１オリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と複合体を形成するに十分に、該ＲＮＡ標的配列の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第１プライマーを含み、該第１のプライマーは、該複合体形成配列の５’側に作動可能に連結したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含み、該第１プライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する配列を含み、該反応は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下で実施される、工程；
（ｃ）該ＲＮＡ標的配列をテンプレートとして使用して、該ＲＮＡ標的配列と相補的な第１ＤＮＡプライマー伸長産物を生じるように、伸長反応において該第１プライマーを伸長させる工程；
（ｄ）該ＲＮＡ標的配列を選択的に分解する酵素を使用して、該ＲＮＡ標的配列から該第１ＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程；
（ｅ）該ＤＮＡプライマー伸長産物を、第２オリゴヌクレオチドで処理する工程であって、該第２オリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と複合体形成するに十分に、該ＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端部分と相補的な複合体形成配列を含む第２プライマーを含み、該第２プライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、該処理は、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体の形成およびＤＮＡ合成の開始を提供する条件下にて実施される、工程；
（ｆ）該第２プライマーの３’末端を、第２ＤＮＡプライマー伸長産物を生じ、それにより該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートを生成するように、ＤＮＡ伸長反応において伸長させる工程；
（ｇ）該プロモーター配列を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、該標的配列の複数のＲＮＡコピーを生成するように該テンプレートを使用する工程；ならびに
（ｈ）工程（ｇ）のＲＮＡコピーを使用し、該標的配列を増幅させるように工程（ｂ）〜（ｇ）を自己触媒的に反復する工程；
（ｉ）工程（ｈ）の産物に、アクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを付加する工程であって、該オリゴヌクレオチドプローブは、該標的配列の一部と相補的であり、該プローブは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、該プローブは、プローブ：標的複合体を形成する該プローブと該標的配列とのハイブリダイゼーションを提供する条件下で付加される、工程；ならびに
（ｊ）該標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、工程（ｂ）において内部コントロールを提供する工程をさらに包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、前記内部コントロールが、図１２の配列（配列番号９２）に由来する、方法。
（項目１２）
項目１０に記載の方法であって、前記内部コントロールが、配列番号９０を含む、方法。
（項目１３）
標的パルボウイルスＢ１９ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、
該方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該核酸は、ＲＮＡ標的配列を含む、工程；
（ｂ）該ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズし得る１つ以上のプライマーを添加する工程であって、該１つ以上のプライマーは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、工程；
（ｃ）該１つ以上のプライマーに対して３’側に、該ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを付加する工程；
（ｄ）ポリメラーゼを使用して、該１つ以上のプライマーを伸長させる工程；
を包含する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、工程（ａ）のＲＮＡ標的配列が、ｃＤＮＡを提供するように逆転写される、方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を使用して、前記ｃＤＮＡを増幅させる工程をさらに包含する、方法。
（項目１６）
項目１３に記載の方法であって、前記ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼである、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記熱安定性ポリメラーゼが、ＴａｑポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼである、方法。
（項目１８）
項目１３に記載の方法であって、前記ポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、方法。
（項目１９）
項目１３に記載の方法であって、工程（ｂ）において内部コントロールを提供する工程をさらに包含する、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記内部コントロールが、図１２の配列（配列番号９２）に由来する、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、前記内部コントロールが、配列番号９０を含む、方法。
（項目２２）
ポリヌクレオチドであって、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。（項目２３）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ａに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｂに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２５）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｄに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２７）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｅに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２８）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｆに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｇに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３０）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｈに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３１）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｉに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３２）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｊに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３３）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｋに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３４）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｌに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３５）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｍに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｎに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３７）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｏに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３８）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｐに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目３９）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｑに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４０）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｒに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４１）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｓに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４２）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｔに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４３）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図２Ｕに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４４）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ａに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４５）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｂに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４６）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４７）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｄに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４８）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｅに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目４９）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｆに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５０）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｇに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５１）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｈに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５２）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｉに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５３）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｊに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５４）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｋに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５５）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｌに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５６）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｍに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５７）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｎに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５８）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｏに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目５９）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｐに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６０）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｑに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６１）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｒに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６２）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｓに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６３）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｔに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６４）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｕに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６５）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｖに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６６）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｗに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６７）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｘに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６８）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｙに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目６９）
項目２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図１１Ｚに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目７０）
ポリヌクレオチドであって、図３Ａ〜図３Ｃまたは４Ａ〜図４Ｃに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目７１）
項目７０に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図３Ａ〜図３Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目７２）
項目７０に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、図４Ａ〜図４Ｃに示されるヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（項目７３）
オリゴヌクレオチドプライマーであって、約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドのヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列と作動可能に連結した、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター領域からなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
（項目７４）
項目７３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記プロモーター領域がＴ７プロモーターであり、前記ポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、オリゴヌクレオチドプライマー。
（項目７５）
項目７３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的配列が、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域に由来する、オリゴヌクレオチドプライマー。
（項目７６）
項目７５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的配列が、図２Ａ〜２Ｕのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、オリゴヌクレオチドプライマー。
（項目７７）
オリゴヌクレオチドプライマーであって、約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチドのヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列と作動可能に連結した、Ｔ７プロモーターからなり、該ヒトパルボウイルスＢ１９特異的複合体形成配列は、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、オリゴヌクレオチドプライマー。
（項目７８）
アクリジニウムエステル標識に連結した、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
（項目７９）
項目７８に記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列が、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムのＶＰ１領域に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ。
（項目８０）
項目７９に記載のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記ヒトパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列が、図２Ａ〜２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ。
（項目８１）
診断試験キットであって、項目７３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーと、該診断試験を実施するための指示書とを備える、キット。
（項目８２）
項目８１に記載の診断試験キットであって、アクリジニウムエステル標識に連結した、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのパルボウイルスＢ１９特異的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、キット。
（項目８３）
生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染を検出するための方法であって、
該方法は、
（ａ）ヒトパルボウイルスＢ１９  ＤＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該核酸は、標的配列を含む、工程；
（ｂ）該単離されたパルボウイルスＢ１９核酸を、該標的配列と十分に相補的でありかつ該標的配列とハイブリダイズし得る、検出可能に標識されたプローブと反応させる工程であって、該プローブは、図２Ａ〜図２Ｕまたは図１１Ａ〜図１１Ｚのうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に由来し、さらに該反応は、プローブ／標的配列複合体の形成を提供する条件下で実施される、工程；ならびに
（ｃ）該標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程；
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムの図示であり、このウイルスの種々のコード領域を示す。３つのＰＣＲフラグメントが示される。１つは約７００ｂｐを有し、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する；１つは、この７００ｂｐフラグメント内の約３７０ｂｐを有し、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置３０７３〜３４４２に対応する；そして１つは、約２１４ｂｐを有し、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置４７２８〜４９４１に対応する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ａ（配列番号１）は、単離株ＣＨ４７−２６由来の対応する配列である；
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｂ（配列番号２）は、単離株ＣＨ４８−２９由来の対応する配列である；
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｃ（配列番号３）は、単離株ＣＨ３３−２由来の対応する配列である；
【図２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｄ（配列番号４）は、単離株ＣＨ３３−３由来の対応する配列である；
【図２Ｅ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｅ（配列番号５）は、単離株ＣＨ３３−４由来の対応する配列である；
【図２Ｆ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｆ（配列番号６）は、単離株ＣＨ４２−７由来の対応する配列である；
【図２Ｇ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｇ（配列番号７）は、単離株ＣＨ４２−１８由来の対応する配列である；
【図２Ｈ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｈ（配列番号８）は、単離株ＣＨ４２−１９由来の対応する配列である；
【図２Ｉ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｉ（配列番号９）は、単離株ＣＨ４６−２３由来の対応する配列である；
【図２Ｊ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｊ（配列番号１０）は、単離株ＣＨ１−１由来の対応する配列である；
【図２Ｋ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｋ（配列番号１１）は、単離株ＣＨ１−６由来の対応する配列である；
【図２Ｌ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｌ（配列番号１２）は、単離株ＣＨ２−８由来の対応する配列である；
【図２Ｍ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｍ（配列番号１３）は、単離株ＣＨ２−１０由来の対応する配列である；
【図２Ｎ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｎ（配列番号１４）は、単離株ＣＨ２−１１Ｃ由来の対応する配列である；
【図２Ｏ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｏ（配列番号１５）は、単離株ＣＨ５−１３由来の対応する配列である；
【図２Ｐ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｐ（配列番号１６）は、単離株ＣＨ７−２２由来の対応する配列である；
【図２Ｑ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｑ（配列番号１７）は、単離株ＣＨ１３−２７由来の対応する配列である；
【図２Ｒ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｒ（配列番号１８）は、単離株ＣＨ１４−３３由来の対応する配列である；
【図２Ｓ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｓ（配列番号１９）は、単離株ＣＨ６２−２由来の対応する配列である；
【図２Ｔ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｔ（配列番号２０）は、単離株ＣＨ６４−２由来の対応する配列である；
【図２Ｕ】図２Ａ〜図２Ｕ（配列番号１〜２１）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐ）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図２Ｕ（配列番号２１）は、単離株ＣＨ６７−２由来の対応する配列である。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃ（配列番号２２）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃ（配列番号２２）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃ（配列番号２２）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃ（配列番号２３）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃ（配列番号２３）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃ（配列番号２３）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の図１に示される約４．７ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレーム＋さらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。
【図５】図５Ａ（配列番号２４）および図５Ｂ（配列番号２５）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の、それぞれ、ＮＳ１ヌクレオチド配列およびＮＳ１タンパク質配列を示す。
【図６】図６Ａ（配列番号２６）および図６Ｂ（配列番号２７）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の、それぞれ、ＶＰ１ヌクレオチド配列およびＶＰ１タンパク質配列を示す。
【図７】図７Ａ（配列番号２８）および図７Ｂ（配列番号２９）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１由来の、それぞれ、ＶＰ２ヌクレオチド配列およびＶＰ２タンパク質配列を示す。
【図８】図８Ａ（配列番号３０）および図８Ｂ（配列番号３１）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の、それぞれ、ＮＳ１ヌクレオチド配列およびＮＳ１タンパク質配列を示す。
【図９】図９Ａ（配列番号３２）および図９Ｂ（配列番号３３）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の、それぞれ、ＶＰ１ヌクレオチド配列およびＶＰ１タンパク質配列を示す。
【図１０】図１０Ａ（配列番号３４）および図１０Ｂ（配列番号３５）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６由来の、それぞれ、ＶＰ２ヌクレオチド配列およびＶＰ２タンパク質配列を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ａ（配列番号６２）は、単離株ＣＨ８０−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｂ（配列番号６３）は、単離株ＣＨ８１−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｃ（配列番号６４）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１−４由来の対応する配列である；
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｄ（配列番号６５）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ２−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｅ（配列番号６６）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ３−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｆ（配列番号６７）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ４−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｇ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｇ（配列番号６８）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ５−２由来の対応する配列である；
【図１１Ｈ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｈ（配列番号６９）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ６−２由来の対応する配列である；
【図１１Ｉ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｉ（配列番号７０）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ７−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｊ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｊ（配列番号７１）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ８−２由来の対応する配列である；
【図１１Ｋ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｋ（配列番号７２）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ９−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｌ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｌ（配列番号７３）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ９−９由来の対応する配列である；
【図１１Ｍ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｍ（配列番号７４）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１０−２由来の対応する配列である；
【図１１Ｎ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｎ（配列番号７５）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１１−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｏ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｏ（配列番号７６）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１２−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｐ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｐ（配列番号７７）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１３−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｑ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｑ（配列番号７８）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１４−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｒ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｒ（配列番号７９）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１５−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｓ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｓ（配列番号８０）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１６−２由来の対応する配列である；
【図１１Ｔ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｔ（配列番号８１）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１７−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｕ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｕ（配列番号８２）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１８−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｖ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｖ（配列番号８３）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ１９−１由来の対応する配列である；
【図１１Ｗ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｗ（配列番号８４）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ２０−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｘ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｘ（配列番号８５）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ２１−３由来の対応する配列である；
【図１１Ｙ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｙ（配列番号８６）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ２２−１１由来の対応する配列である；
【図１１Ｚ】図１１Ａ〜図１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する配列（図１からの７００ｂｐフラグメント）を含む種々のパルボウイルスＢ１９単離株由来のＤＮＡ配列を示す。図１１Ｚ（配列番号８７）は、単離株Ｂ１９ＳＣＬ２−１４由来の対応する配列である。
【図１２】図１２（配列番号９２）は、標的の捕捉および増幅のために内部コントロール（ＩＣ）が誘導され得る、例示的配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内の従来の化学的方法、生化学的方法、組換えＤＮＡ技術およびウイルス学を使用する。このような技術は、文献において完全に例示される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（編））；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ（編），１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他のように明らかに示さない限り複数の言及を含むことに注意すべきである。従って、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」の言及は、２つ以上の抗原の混合物などを含む。
【００３５】
以下のアミノ酸略語は、全文を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）        アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）    アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）      グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）    グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）      イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）        リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）      フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）        セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）      トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）        バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３６】
（Ｉ．定義）
本発明の説明において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように規定されることが意図される。
【００３７】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして生成物の最小の長さに制限されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義の範囲に含まれる。全長タンパク質とそのフラグメントの両方が、定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的について、「ペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、改変（例えば、ネイティブな配列に対する欠質、添加および置換（一般に、天然で保存される））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように熟慮され得るか、またはＰＣＲ増幅に起因してタンパク質またはエラーを生成する宿主の変異を介するように偶発的であり得る。
【００３８】
パルボウイルスＢ１９ポリペプチドは、上記のようなＢ１９ゲノムによってコードされるタンパク質（例えば、非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）、およびウイルスのカプシドを形成するタンパク質（ＶＰ１（約７８１アミノ酸長）またはＶＰ２（約５５４アミノ酸長））由来のポリペプチドである。代表的なＮＳ１、ＶＰ１およびＶＰ２配列は、本明細書中の図５〜１０に記載される。ポリペプチドは、物理学的にパルボウイルスＢ１９に誘導される必要はないが、合成的にか、または組み換え的に生成されうる。さらに、ポリペプチドは、任意の種々のパルボウイルスＢ１９株および単離体に由来し得る。多数の保存領域および可変領域は、これらの株と単離体との間で公知であり、そして一般に、例えば、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列がアライメントされる場合に、高い程度の配列相同性（例えば、約３０％よりも高く、好ましくは４０％よりも高いアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＶＰ１」ポリペプチドは、任意の種々のパルボウイルスＢ１９株および単離体由来のネイティブＶＰ１をいう。多くのパルボウイルスＢ１９株および単離体の上記タンパク質についての完全遺伝型および配列が既知である。例えば、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６；Ｇａｌｌｉｎｅｌｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９３）４１：２０３〜２１１を参照のこと。さらに、これらの領域由来のパルボウイルスＢ１９由来のエピトープもまた、既知である。例えば、米国特許第５，４３６，１２７号；および国際公開番号ＷＯ９１／１２２６９を参照のこと。
【００３９】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照の分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいい、これらは所望の活性（例えば、診断アッセイにおける免疫反応性）を保持する。一般に、用語［アナログ」は、改変が免疫原性の活性を破壊しない限り、ネイティブな分子に関する１つ以上のアミノ酸添加、置換（一般に天然に保存される）および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチド（例えば、国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２に記載されるペプチド）をいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、ネイティブ分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製する方法は、当該分野において公知であり、以下にさらに記載される。
【００４０】
特に好ましいアナログとしては、天然で保存する置換（すなわち、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリーで起こる置換）が挙げられる。詳細には、アミノ酸は、一般に以下の４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの単離された置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の単離された置換、セリンでのスレオニンの単離された置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の保存的置換が、生物学的活性に主な効果を有さないことが当然予測される。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは約１５〜２５までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数を含みうる。当業者は、目的の分子の領域を用意に決定し得、これらは、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって変化に耐え得る。
【００４１】
「単離された」によって、ポリペプチドを言及する際、示される分子が生物全体から分離および別にされることが意味され、ここでこの分子は、天然でか、または同じ型の他の生物学的高分子の実質的に非存在下で見出される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」は、天然で普通に関連する配列；または天然に存在するがそれに関する異種配列を有する配列；または染色体と関係ない分子の全体または一部を欠く核酸分子である。
【００４２】
示された配列に「由来する」ポリヌクレオチドまたは示された配列に「特異的な」ポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、同一または相補的である）少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。誘導されたポリヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列に物理学的に由来する必要はないが、任意の様式で生成され得、これらとしては、化学合成、複製、逆転写または転写が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、そのポリヌクレオチドが由来する領域に基づく配列によって提供される情報に基づく。このように、これらは、元のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを示し得る。
【００４３】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の％類似性をいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、配列が、規定された長さの配列にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％、配列類似性を示す際に、互いに「実質的に相同性」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００４４】
一般に、「同一性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の対応する正確なヌクレオチド  対  ヌクレオチドまたはアミノ酸  対アミノ酸をいう。％同一性は、配列を整列することにより２つの分子間の配列情報を直接比較し、２つの整列された配列間の正確な一致数を計数し、より短い配列の長さに分け、そして結果に１００を乗算することによって決定され得ること。
【００４５】
容易に利用可能なコンピュータプログラムは、相同性および同一性の分析における補助のために使用され得る（例えば、ペプチド分析についてのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９、１９８１の局所相同性アルゴリズムに適用する、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．Ａｔｌａｓ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），５補遺３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，第８バージョン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉから入手可能）（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに基づく））にて利用可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨される初期パラメーターで容易に利用され、そして上記で参照したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の％相同性は、６つのヌクレオチド位の初期スコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００４６】
本発明の文脈において％相同性を確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって寄与されたＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージの適用から、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、初期パラメーターがスコアリングテーブルについて使用される際（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）に、用いられ得る。このデータから、「配列相同性」を反映する「一致（ｍａｔｃｈ）」値を得た。配列間の％同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当該分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムとしてはＢＬＡＳＴがあり、初期パラメータと共に使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期パラメーターを用いて使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；除外＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４７】
あるいは、相同性は、相同性領域の間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化したフラグメントのサイズを決定することにより決定され得る。実質的に相同性であるＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定されたようなストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験にて同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業者の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（前出）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。
【００４８】
「作動可能に連結した」は、記載された化合物は、その所望の機能を実行するように構成されるエレメントのアライメントをいう。従って、核酸配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、転写に影響し得、そしてコード配列の場合において、適切な転写因子などが存在する際にコード配列の発現に影響し得る。プロモーターは、その転写および／または発現に直接作用する限り、核酸配列と連続である必要はない。従って、例えば、翻訳されていないが転写された配列の介在は、転写されたイントロンがあり得るように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結した」とみなされ得る。
【００４９】
核酸分子を説明するために本明細書中で使用される場合、「組換え」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成または合成起源のポリヌクレオチドをいい、その起源または操作の点は、天然で関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、クローン化され、次いで以下にさらに記載されるように形質転換された生物にて発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を生成する外来遺伝子を発現する。
【００５０】
「制御エレメント」は、それが連結するヌクレオチド配列の転写および／または翻訳におけいて補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）を含み、そして適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが挙げられ、これらは宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳のために集団で提供される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合「プロモーター」は、ポリメラーゼに結合し得、そしてそれに作動可能に連結した下流（３’方向）ヌクレオチド配列の転写を開始し得る調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、上記のバックグラウンドを検出可能なレベルで目的の配列の転写を開始するのに必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。ここで、プロモーター配列は、転写開始部位であり、そしてタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）は、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの結合を担う。例えば、核酸に結合するシグナルとしてのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識され、そして特定の部位でＲＮＡの転写を開始する核酸配列であり得る。結合について、このようなトランスクリプターゼは、プロモーター配列およびその相補体を含む部分で二本鎖であるＤＮＡを一般に必要とし；鋳型部分（転写される配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写の促進におけるそれらの効率を著しく改変し得る種々の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーター配列に結合して転写を開始する場合、プロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。従って、これにより生成されたＲＮＡ転写産物は含まれない。
【００５２】
ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そして隣接配列を転写する場合、制御配列は、ヌクレオチド配列の「転写を指向する」。
【００５３】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼがある。全ての既知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するための相補的プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、相補的ＤＮＡを合成し得る。
【００５４】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子または部分的二本鎖ＤＮＡ（通常二本鎖）から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写産物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置で開始して５’から３’方向に合成される。トランスクリプターゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００５５】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。全ての既知の逆転写酵素はまた、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを作製する能力を有し；従って、これらはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方である。プライマーは、ＲＮＡテンプレートとＤＮＡテンプレートの両方で合成を開始する必要がある。
【００５６】
「ＲＮＡｓｅ  Ｈ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。これらの酵素は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。大半の逆転写酵素は、そのポリメラーゼ活性に加えてＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を通常含む。しかし、ＲＮＡｓｅ  Ｈの他の供給源は、ポリメラーゼ活性と関連せずには利用不可能である。この分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じ得る。あるいは、ＲＮＡｓｅ  Ｈは、種々の位置でＲＮＡを単純に切断し得、その結果ＲＮＡの一部は融解するか、または酵素にＲＮＡの一部をほどかせる。
【００５７】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書中で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含むように使用される。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、三重鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに三重鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを含む。これはまた、改変（例えば、メチル化および／またはキャッピングによる）、および非改変形態のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、任意の他の型のポリヌクレオチド（プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである）、および非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミン（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、および他の合成配列特異的核酸ポリマーが挙げられるが、ただしこのポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡにて見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構造で核塩基を含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」の間に意図された方向の長さは存在せず、そしてこれらの用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語としては、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ，オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホルアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドが挙げられ、そして既知の型の改変（例えば、当該分野において公知の標識、メチル化、「キャップ」、アナログでの天然に存在するヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電の連結での改変（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、陰性に荷電した連結（例えば、ホルホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および陽性に荷電した連結（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル））、ペンダント部分を含む改変（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）、インターカレーターを用いた改変（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーターを含む改変（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキレーターを含む改変、改変された連結を用いた改変（例えば、αアノマー性核酸など）、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。特に、ＤＮＡは、デオキシリボ核酸である。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸領域」または「標的核酸」は、増幅されるべき「標的配列」を伴なう核酸を示す。この標的核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、そして標的配列の一方で他の配列を含み得、これは増幅され得ない。用語「標的配列」は、増幅される標的核酸の特定のヌクレオチド配列をいう。標的配列は、標的分子内に含まれるプローブ−ハイブリダイゼーション領域を含み得、ここでプローブは、所望の条件下で安定なハイブリッドを形成する。「標的核酸」はまた、オリゴヌクレオチドプライマーが複合体化する、複合体配列を含み得、標的配列をテンプレートとして使用して伸長され得る。標的核酸が、初め一本鎖である場合、用語「標的配列」はまた、標的核酸中に存在する場合、「標的配列」に対して配列相補的であるという。「標的核酸」が元々二本鎖である場合、用語「標的配列」は、プラス（＋）鎖とマイナス（−）鎖の両方をいう。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」は、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびポリマー化誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）の存在下、および適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度）に置かれる場合に、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始するように作用するオリゴヌクレオチドをいう。このプライマーは、増幅の最大効率のために好ましくは一本鎖であるが、あるいは二本鎖でもあり得る。二本鎖である場合、このプライマーは伸長生成物を調製するために使用される前にその鎖を分離するようまず処置される。この変性工程は、代表的に熱によって影響されるが、あるいはアルカリ、続いて中和によって実施され得る。従って、「プライマー」は、テンプレートに相補的であり、水素結合またはテンプレートを用いたハイブリダイゼーションにより複合体化して、ポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／テンプレート複合体を与え、これはＤＮＡ合成のプロセスにてテンプレートにその３’末端で連結した共有結合した塩基の添加によって伸長される。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、上記のようにポリヌクレオチドから構成される構造をいい、これらは、標的核酸分析物に存在する核酸配列に相補的である核酸配列を含む。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「オリゴヌクレオチドプローブ」が、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において使用される場合、このプローブは、少なくとも１つの蛍光および少なくとも１つのクエンチャーを含み、これは、任意の増幅された標的オリゴヌクレオチド配列を検出するために反応にて使用されるポリメラーゼの５’エンドヌクレアーゼ活性によって消化される。この文脈において、オリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に隣接した十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、使用される５’から３’へのヌクレアーゼ活性は、結合したプローブを効果的に分解して蛍光およびクエンチャーを分離し得る。オリゴヌクレオチドプローブが、ＴＭＡ技術にて使用される場合、これは以下に記載されるように適切に標識される。
【００６１】
ハイブリッド形成配列が、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有さないことが理解される。多くの状況において、安定なハイブリッドは、約１０％よりも少ない塩基がミスマッチする場合に、４つ以上のヌクレオチドのイグノアリングループ（ｉｇｎｏｒｉｎｇ  ｌｏｏｐ）を形成する。従って、本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいい、一般に約９０％よりも高い相同性がある。
【００６２】
用語「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分相補的であるヌクレオチド配列間の複合体の形成をいう。プライマーが標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、このような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡポリメラーゼによって要求されるプライミング機能を与えるのに十分安定である。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「結合対」は、互いに特異的に結合する第１および第２の分子（例えば、核酸二重鎖を形成し得る相補的ポリヌクレオチド対）をいう。サンプル中の結合対の第２のメンバーに対する結合対の第１のメンバーは、サンプル中の他の成分に対するよりも優れた親和性および特異性で、第２のメンバーに対する第１のメンバーの結合、またはその逆によって確認される。結合対のメンバー間の結合は、代表的に非共有結合である。文脈が明らかに他を示さない限り、用語「親和性分子」および「標的分析物」は、本明細書中でそれぞれ結合対の第１のメンバーおよび第２のメンバーをいうために使用される。
【００６４】
用語「特異的結合分子」および「親和性分子」は、本明細書中で交換可能に使用され、そしてサンプル中に存在する検出可能な基質に化学的手段または物理学的手段を介して選択的に結合される分子をいう。「選択的結合」によって、目的の標的に優先的に結合するか、または他の分子よりも高い親和性で結合する分子が意味される。例えば、ＤＮＡ分子は、実質的に相補的な配列に結合し、そして関連しない配列には結合しない。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡの「融解温度」または「Ｔｍ」は、ＤＮＡのヘリックス構造の半分が、熱または塩基対間の水素結合の他の解離（例えば、酸処理もしくはアルカリ処理など）に起因して喪失する温度として規定される。ＤＮＡ分子のＴｍは、その長さおよびその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対がリッチなＤＮＡ分子は、大量のＡＴ塩基対を有する分子よりも高いＴｍを有する。ＤＮＡの分離された相補鎖は、温度がＴｍよりも低い場合に、解離するかまたはアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する。核酸ハイブリダイゼーションの最も速い速度は、Ｔｍの約２５℃より下で生じる。Ｔｍは、以下の関係式を用いて見積もられ得る：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒら（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９〜１１８）。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織または流体のサンプルをいい、これらは共通して、被験体によって生成される抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、これらとしては、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆液、髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚の分泌物、気道、腸管、および尿生殖器の道、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検が挙げられるがこれらに限定されず、そしてまたインビトロの細胞培養物構築物のサンプルとしては、培養培地中のおよび組織細胞（例えば、組換え細胞、および細胞成分）の増殖から得た馴化培地が挙げられるがそれに限定されない。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」は、検出可能な分子をいい、これらとしては、放射性同位体、蛍光、化学蛍光、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアミジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）またはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光」は、基質またはその一部をいい、これらは、検出可能な範囲で蛍光を示し得る。
【００６８】
（ＩＩ．発明を実行する様式）
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の処方物または当然変化し得るプロセスパラメーターに限定されないことが理解される。本明細書中で使用される専門用語が、本発明の特定の実施形態を説明する目的のみであり、限定を意図しないことが理解される。
【００６９】
本明細書中に記載される組成物および方法に類似または等しい多数の組成物および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００７０】
上記のように、本発明は、生物学的サンプルにおけるパルボウイルスＢ１９感染を正確に検出するための新規プライマーおよびプローブおよび診断方法の発見に基づく。これらの方法は、感受性の核酸ベースの検出技術に依存し、これらは、少量のウイルスを含むサンプル中のパルボウイルスＢ１９標的核酸配列の同定を可能にする。
【００７１】
特に、本明細書中の発明者らは、診断試験についての所望の標的であるパルボウイルスＢ１９ゲノム内の特徴づけられた領域を有する。これらの領域に由来するプライマーおよびプローブは、生物学的サンプルにおけるパルボウイルスＢ１９感染の検出のために特に有用である。
【００７２】
上記のパルボウイルスＢ１９プライマーおよびプローブは、生物学的サンプルにおけるヒトパルボウイルスＢ１９感染の検出のための核酸ベースのアッセイにて使用される。
【００７３】
特に、これらのアッセイにおける使用のためのプライマーおよびプローブは、好ましくはＳｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６のヌクレオチド２１７〜４６７８位に対応するパルボウイルスＢ１９ゲノムの約４．７ｋｂフラグメントに由来する。２つの異なるパルボウイルスＢ１９単離体からのこの領域のヌクレオチド配列は、本明細書中の図３Ａ〜３Ｃおよび４Ａ〜４Ｃに記載される。上記で説明されるように、このフラグメントは、ＮＳ１、ＶＰ１およびＶＰ２コード領域を含む。
【００７４】
本アッセイでの使用のために特に好ましいプライマーおよびプローブは、パルボウイルスＢ１９ゲノムの高度に保存された領域から設計されて種々の単離体によって生じるパルボウイルスＢ１９感染の検出を可能にする。本明細書中に記載されるように、パルボウイルスＢ１９ゲノムの高度に保存された領域は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムについて番号づけられたヌクレオチド２９３６〜３６３５位の間隔の７００ｂｐ内に見出される。この領域は、ゲノムのＶＰ１領域内に見出される。２１個の異なるパルボウイルスＢ１９単離体由来のこの領域の配列は、本明細書中の図２Ａ〜２Ｕに示される。さらなる２６個の単離体由来の配列は、本明細書中の図１１Ａ〜１１Ｚに示される。これらの配列の比較は、この領域が単離体から単離体に約９８％〜９９．５％の配列相同性を示し、非常の所望される標的配列を作製することを示す。プライマーおよびプローブの設計のために、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に関して番号つけられた約ヌクレオチド３０７３〜３４４２位の間隔であるＶＰ１内に見出される３７０ｂｐ領域、ならびに４．７ｋｂの３’位およびＳｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に関して番号つけられたヌクレオチド４７２８〜４９４１の間隔内で生じる図１に記載の２１４ｂｐのフラグメントもまた所望される。
【００７５】
４．７ｋｂｐ、７００ｂｐおよび３７０ｂｐ領域は、これらの特定の領域内に見られるパルボウイルスＢ１９配列の部分を、本明細書中ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同４，８８９，８１８号に記載され、そして本明細書中に提供される配列に基づく反応のようなＰＣＲ反応のプライマーとして使用して、さらなる単離物から容易に得られる。所望の配列を有するヌクレオチド配列を得る別の方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機で生成された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的な対をアニールすることに続いて適切なＤＮＡリガーゼでライゲーションすることおよびライゲーションされたヌクレオチド配列をＰＣＲを介して増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４〜４０８８を参照のこと。一旦、この配列が調製または単離されると、これらは、任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングされ得る。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、設計事項である。適切なベクターとしては、適切な制御エレメントと結合した場合に複製し得るプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。組換えクローンは、当該分野で周知であり、そして以下の実施例に記載される技術を使用する、制限酵素分析およびポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により、容易に同定される。
【００７６】
本明細書中に記載のアッセイにおける使用のためのプライマーおよびプローブは、これらの配列に由来し、そして米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号；Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３〜２３１１；およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １３号（１９８７年４月１日）に開示されるような、標準的な技術（例えば、ホスホルアミダイト化学を介した固相合成）によって容易に合成される。他の化学的合成方法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０に記載されたホスホトリエステル方法およびＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９により開示されたホスホジエステル方法が挙げられる。ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ）、あるいは他の非相補的なヌクレオチド伸長は、これらの同じ方法を使用してプローブに取り込まれ得る。ヘキサエチレン酸化物伸長は、当該分野で公知の方法によってプローブに結合され得る。Ｃｌｏａｄら、（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４〜６３２６；Ｌｅｖｅｎｓｏｎらに対する米国特許第４，９１４，２１０号；Ｄｕｒａｎｄら、（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３〜６３５９；およびＨｏｒｎら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５−４７０８。代表的には、プライマー配列は、１０〜７５ヌクレオチド長の間の範囲内（例えば、１５〜６０、２０〜４０など）であり、より代表的には１８〜４０ヌクレオチド長の間の範囲内および述べられた範囲内の任意の長さである。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の間の範囲内（例えば、１５〜４０、１８〜３０など）および述べられた範囲内の任意の長さである。
【００７７】
さらに、このプローブは、検出のために標識に結合され得る。標識の付加を可能にする反応官能基でオリゴヌクレオチドを誘導体化することについて公知のいくつかの方法が存在する。例えば、プローブをビオチン化するために、いくつかのアプローチが利用可能であり、その結果アビジンを介して、放射活性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素的標識、または電子密度標識が、結合され得る。例えば、Ｂｒｏｋｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９７８）５：３６３−３８４（これは、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用を開示する）；およびＣｈｏｌｌｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）１３：１５２９−１５４１（これは、アミノアルキルホスホルアミドリンカーアームを介したオリゴヌクレオチドの５’末端のビオチン化を開示する）を参照のこと。イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのような、アミノ反応基によって誘導体化された蛍光化合物または他の型の化合物により容易に標識されるアミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するために、いくつかの方法がまた利用可能である（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１３１−３１３９，Ｇｉｂｓｏｎら、（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６４５５〜６４６７およびＭｉｙｏｓｈｉらに対する米国特許第４，６０５，７３５号を参照のこと）。チオール特異的標識に反応し得るスルフヒドリル誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するための方法がまた、利用可能である（例えば、Ｆｕｎｇらに対する米国特許第４，７５７，１４１号、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４８５〜４５０２およびＳｐｏａｔら、（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４８３７〜４８４８を参照のこと）。ＤＮＡフラグメントを標識するための方法論の総合的な総説は、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１〜２５に提供される。
【００７８】
例えば、プローブは、蛍光分子をプローブの未連結末端に連結することによって蛍光標識され得る。適切な蛍光標識を選択するための手引きは、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０〜３０１；Ｋａｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５〜４９６２；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に見出され得る。好ましい蛍光標識としては、米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：１５１〜１６４に開示されるような、フルオレセインおよびその誘導体ならびに６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１またはＮＡＮ−２などが挙げられる。
【００７９】
さらに、プローブは、下記の技術を使用して、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識され得る。現在の技術は、ＡＥ標識が、プローブ内の任意の部位に位置付けられることを可能にする。例えば、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．Ｊ．（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＮｅｌｓｏｎら、（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」；Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら（編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＮｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）  ｔｏ  ＰＣＲ」；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。ＡＥ分子は、プローブ内の任意の位置における標識の配置を可能にする、非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を使用してプローブに直接結合され得る。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。
【００８０】
特定の実施形態において、内部コントロール（ＩＣ）または内部標準物質が、標的の捕捉および増幅についてのコントロールとして供するために添加される。好ましくは、標的配列と異なる配列を含むＩＣは、サンプル由来の生物について特異的なオリゴヌクレオチドを分離するために使用されるプローブ配列とハイブリダイズされ得、そして増幅され得る。ＩＣの使用は、分離プロセス、増幅プロセス、および検出系の制御を可能にし、そしてサンプルについてのアッセイ性能および定量化のモニタリングを可能にする。ＩＣが得られ得る代表的な配列は、図１２で示される。このＩＣは、任意の適切なポイント（例えば、溶解緩衝液中）において含まれ得る。一つの実施形態において、ＩＣは、パルボウイルスＢ１９由来のヌクレオチド配列を含むＭ１３  ｓｓＤＮＡおよびプローブとハイブリダイズする特有の配列（例えば、標的配列が、５〜２０塩基もしくはそれ以上、好ましくは５〜１５塩基（例えば、５、１０または１５塩基）、またはこの範囲内の任意の数だけ置換するかまたは欠失させることによって改変された、ＶＰ１領域由来の配列を含む）を含む。置換された塩基または欠失された塩基は、好ましくは２個または３個の連続した配列のみが置換されるように標的配列の全長にわたって存在する。従って、例えば、標的配列がＣＴＡＣＴＴＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴ（配列番号９１）である場合、この配列は、ＩＣにおいて例えば、ＡＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧ（配列番号９０）で置換され得る。
【００８１】
固体支持体は、さらに内部標準に特異的なプローブ（ＩＣプローブ）を含み得、それによって、このＩＣプローブが使用された場合、捕捉が容易となる。このＩＣプローブは、必要に応じて、標的配列に対する検出可能な標識とは異なる検出可能な標識と結合され得る。検出可能な標識が発蛍光団である実施形態において、このＩＣは、分光光度法で検出研究の限界まで定量され得る。代表的には、標的検出に干渉しないＩＣのコピー数は、標的の固定されたＩＵ（好ましくは、下限において）でＩＣを滴定することによって決定され、検量線が国際的に受容されるＩＵのサンプルを希釈することにより作成される。パルボウイルスＢ１９の定量について、８０００ＩＵ〜１２５ＩＵの８メンバーのパネルが、使用され得る。
【００８２】
別の実施形態において、本明細書中に記載されるようなＩＣは、当業者に公知である標準的な技術、および本明細書中に記載される標準的な技術に従って、サンプルから単離されたＲＮＡと組み合わされる。次いで、ＲＮＡは、コピーＤＮＡを提供するために逆転写酵素を使用して逆転写される。必要に応じて、標識化プライマーを使用してｃＤＮＡ配列が（例えば、ＰＣＲによって）増幅され得る。増幅産物は、代表的に電気泳動によって分離され、そして放射活性の量（増幅産物の量に比例する）が決定される。次いで、既知の標準物質により産生されたシグナルとの比較によって、サンプル中のｍＲＮＡの量が算出される。
【００８３】
上に記載のプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中のパルボウイルスＢ１９感染を検出するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術において使用され得る。ＰＣＲは、核酸分子または分子の混合物中に含まれる所望の標的核酸配列を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズするために、プライマーの対が、過剰量で使用される。このプライマーは、標的核酸を鋳型として使用して、ポリメラーゼによりそれぞれ伸長される。伸長産物は、元の標的鎖から解離後、それ自体が標的配列になる。次いで、新たなプライマーがハイブリダイズされ、ポリメラーゼにより伸長され、そして標的配列分子の数を幾何級数的に増加させるために、このサイクルを繰り返す。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのＰＣＲ方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｉｎｎｉｓら（編）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  １９９０）；Ｔａｙｌｏｒ（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，ｉｎ  ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８８９，８１８号に記載されている。
【００８４】
詳細には、ＰＣＲは、比較的短いオリゴヌクレオチドプライマー（増幅される標的ヌクレオチド配列に隣接し、それらの３’末端が互いの方を向くように置かれ、各プライマーは他方に向かって伸長する）を使用する。ポリヌクレオチドサンプルは抽出され、そして（好ましくは、熱によって）変性され、そしてモル過剰で存在する第一プライマーおよび第二プライマーでハイブリダイズされる。重合は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ−−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマー伸長産物を産生し得る任意の酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、以下から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）（種々の供給源（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から入手可能）、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））のようなプライマー依存性および鋳型依存性のポリヌクレオチド重合化剤を使用して触媒される。これは、その５’末端（新たに合成された元の鎖の相補体に共有結合されている）にそれぞれのプライマーを含む２つの「長い産物」を生じる。次いで、反応混合物は、例えば、温度を下げる工程、変性剤を不活化する工程、またはさらなるポリメラーゼを加える工程によって、重合化条件に戻され、そして第二サイクルが開始される。第二サイクルは、２個の元の鎖、第一サイクル由来の２個の長い産物、元の鎖から複製された２個の新たな長い産物、および長い産物から複製された２個の「短い産物」を提供する。この短い産物は、各末端にプライマーを有する標的配列の配列を有する。各追加のサイクルにおいて、さらなる２個の長い産物、ならびに（前サイクルの最後において残っている長い産物および短い産物の数と等しい）多数の短い産物が産生される。従って、標的配列を含む短い産物の数は、各サイクルで指数関数的に増大する。好ましくは、ＰＣＲは、市販の熱サイクル機（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成される。
【００８５】
ＲＮＡは、上に記載されるように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、増幅され得る。あるいは、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、一つの酵素が両方の工程に使用され得る。ｍＲＮＡはまた、Ｍａｒｓｈａｌｌら、（１９９４）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：８０〜８４に記載されるように、ｃＤＮＡに逆転写され、次いで、非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）が行われる。
【００８６】
蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）として知られる）は、核酸標的に対する強力かつ多用途のＰＣＲベース検出システムである。故に、本明細書中に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムの領域由来のプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中の感染の存在を検出するために、ＴａｑＭａｎＴＭ分析において使用され得る。分析は、蛍光シグナルの産生をモニターすることによって、熱サイクル法と連動して実施される。このアッセイ系は、ゲル電気泳動分析の必要性をなくし、標的コピー数の決定を可能にする定量的データを作成する能力を有する。
【００８７】
蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイは、例えばＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼ（これは、内在性の５’ヌクレアーゼ活性を有し、蛍光レポーター色素およびクエンチャーの両方で標識された内部オリゴヌクレオチドプローブを消化する）を使用して、都合よく実施される（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９３）２１：３７６１〜３７６６を参照のこと）。アッセイの結果は、増幅サイクルの間に起こる蛍光の変化を測定することによって検出される。なぜなら、蛍光プローブが消化されることにより、色素標識とクエンチャー標識が分離し、そして標的ＤＮＡの増幅に比例する蛍光シグナルにおける増強を生じるからである。
【００８８】
増幅産物は、溶液中または固体支持体を使用して検出され得る。この方法において、ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、所望のＰＣＲ産物中の標的配列にハイブリダイズするように設計される。ＴａｑＭａｎＴＭプローブの５’末端は、蛍光レポーター色素を含む。このプローブの３’末端は、プローブの伸長を防ぐためにブロックされ、５’発蛍光団の蛍光をクエンチする色素を含む。その後の増幅の間に、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが反応液中に存在する場合、５’蛍光標識は、切り離される。５’発蛍光団の切除は、検出され得る蛍光の増加を生じる。
【００８９】
詳細には、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズされない場合に、このプローブが少なくとも１つの一本鎖構造（ここでクエンチャー分子は、レポーター分子の蛍光をクエンチするために十分なほどリポーター分子の近くにある）で存在するように構築される。オリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合に、クエンチャー分子がレポーター分子の蛍光をクエンチするために十分なほどレポーター分子の近くには位置されないような少なくとも一つの構造で存在する。これらのハイブリダイズされた構造およびハイブリダイズされていない構造を取り入れることによって、プローブがハイブリダイズされた場合およびハイブリダイズされていない場合で、プローブ上のレポーター分子およびクエンチャー分子は、異なる蛍光シグナル強度を示す。結果として、レポーター分子、クエンチャー分子またはその組合せの蛍光強度の変化に基づいて、プローブがハイブリダイズされているか、あるいはハイブリダイズされていないかを決定し得る。さらに、このプローブは、ハイブリダイズされていない場合、クエンチャー分子がレポーター分子をクエンチするように設計され得るので、このプローブは、ハイブリダイズされるかまたは消化されない限り、レポーター分子が限定的な蛍光を示すように設計され得る。
【００９０】
従って、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、標的Ｂ１９配列にハイブリダイズし得る１つ以上のプライマー、ならびにプライマーに対して３’側の標的Ｂ１９配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して標的パルボウイルスＢ１９ヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。増幅の間に、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプローブが標的配列にハイブリダイズされた場合にそのオリゴヌクレオチドプローブを消化し、それによりレポーター分子をクエンチャー分子から分離する。増幅が実施されながら、核酸増幅の発生に対応するレポーター分子の蛍光がモニターされる。レポーター分子は、好ましくはフルオレセイン色素であり、そしてクエンチャー分子は、好ましくはローダミン色素である。
【００９１】
プライマーおよびプローブの長さは、変わり得るが、プローブの配列は、プライマー配列より低い融解温度を有するように選択される。故に、プライマー配列は、一般にプローブ配列よりも長い。代表的には、プライマー配列は、１０〜７５ヌクレオチド長の範囲内であり、より代表的には２０〜４５ヌクレオチド長の範囲内である。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲内であり、より代表的には１５〜４０ヌクレオチド長の範囲内である。
【００９２】
固体支持体が使用される場合、オリゴヌクレオチドプローブは、種々の様式において、固体支持体に結合され得る。例えば、このプローブは、固体支持体に、そのプローブの３’または５’末端ヌクレオチドを結合させることによって、固体支持体に結合され得る。より好ましくは、このプローブは、固体支持体からプローブを遠ざけるために役立つリンカーによって固体支持体に結合される。このリンカーは通常、少なくとも１５〜３０原子の長さであり、より好ましくは１５〜５０原子の長さである。。このリンカーに必要とされる長さは、使用される特定の固体支持体に依存する。例えば、固体支持体として高架橋化ポリスチレンが使用される場合、一般に、６原子のリンカーで十分である。
【００９３】
広範な種々のリンカーが当該分野で公知であり、オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に結合させるために使用され得る。このリンカーは、固体支持体に結合されたプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションに有意に干渉しない任意の化合物で形成され得る。このリンカーは、自動化合成によって容易にリンカーに付け足され得るホモポリマーのオリゴヌクレオチドで形成され得る。あるいは、官能性ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカーとして使用され得る。このようなポリマーは、ホモポリマーのオリゴヌクレオチドよりも好ましい。なぜなら、標的オリゴヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを有意に干渉しないからである。ポリエチレングリコールが、特に好ましい。
【００９４】
固体支持体、リンカーおよびプローブの間の連結は、好ましくは高温における塩基性条件下での塩基保護基の除去の間に切断されない。好ましい連結の例としては、カルバメート連結およびアミド連結が挙げられる。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化のための固体支持体の好ましい型の例としては、制御された多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンコートされたポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストランが挙げられる。
【００９６】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ、その使用に関する試薬および条件の詳細な説明については、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９１）８８：７２７６〜７２８０；米国特許第５，５３８，８４８号、同第５，７２３，５９１号および同第５，８７６，９３０号を参照のこと。
【００９７】
本明細書中に記載されるパルボウイルスＢ１９配列はまた、転写介在増幅（ＴＭＡ）アッセイの基材として使用され得る。ＴＭＡは、生物学的サンプル中に非常に少量で存在する標的核酸配列を同定する方法を提供する。このような配列は、直接的なアッセイ方法では検出することが難しいかまたは不可能であり得る。特に、ＴＭＡは、標的配列の１０億を超えるＲＮＡコピーを提供し得る等温の自己触媒性核酸標的増幅系である。このアッセイは、生物学的サンプル中の標的配列の存在または非存在を正確に検出するために定性的に実施され得る。このアッセイはまた、標的配列の量の数桁規模の濃度範囲にわたる定量的測定を提供し得る。ＴＭＡは、温度、イオン強度およびｐＨのような反応条件の反復操作なしで標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成するための方法を提供する。
【００９８】
一般的に、ＴＭＡは、以下の工程を包含する：（ａ）パルボウイルスＢ１９に感染されていると推測される目的の生物学的サンプルから核酸（ＲＮＡを含む）を単離する工程、および（ｂ）反応混合物に以下を組み合わせる工程：（ｉ）単離された核酸、（ｉｉ）第一オリゴヌクレオチドプライマーおよび第二オリゴヌクレオチドプライマーであって、第一プライマーは、ＲＮＡ標的配列（例えば、（＋）鎖）が存在する場合には、ともに複合体化するＲＮＡ標的配列の３’末端部分に十分に相補的な複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）配列を有し、そして第二プライマーはともに複合体化するその相補物（例えば、（−）鎖）の標的配列の３’末端部分に十分に相補的な複合体化配列を有し、ここで第一オリゴヌクレオチドは、複合体化配列の５’側の配列（プロモーターを含む）をさらに含む、第一オリゴヌクレオチドプライマーおよび第二オリゴヌクレオチドプライマー（ｉｉｉ）逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）ならびに（ｖ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ。
【００９９】
反応混合物の成分は、段階的に混合されても、一度に混合されてもよい。反応混合物は、オリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件下（ＤＮＡプライミング条件および核酸合成条件（リボヌクレオチド三リン酸およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む）を含む）で、標的配列の複数コピーを提供するために十分な期間インキュベートされる。この反応は、酵素成分のような反応成分の安定性を維持するために適切な条件下で、増幅反応の過程中における反応条件を改変も操作もする必要なく有利に起こる。従って、この反応は、実質的に等温であり、そして実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む条件下で起こり得る。この反応は、便利なことに、第１のＤＮＡ伸長反応により産生されるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離するための変性工程を必要としない。
【０１００】
適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（例えば、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）のような逆転写酵素が挙げられる。
【０１０１】
プライマーへの組み込みに適切なプロモーターまたはプロモーター配列は、その配列を認識および結合し、そしてＲＮＡ転写物が産生される転写プロセスを開始するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列（天然に存在する核酸配列、合成により生成された核酸配列または制限消化の産物のいずれか）である。この配列は、必要に応じて、さらなる安定性または分解プロセスに対する感受性あるいは増強された転写効率を与え得る、ＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて広がるヌクレオチド塩基を含み得る。有用なプロモーターの例としては、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のポリメラーゼのような特定のバクテリオファージのポリメラーゼによって認識されるプロモーター、あるいはＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターが挙げられる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＥｐｉｃｅｎｔｒｅのような商業的供給源から容易に入手可能である。
【０１０２】
本明細書中の方法における使用に適切ないくつかの逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素のようにＲＮＡｓｅＨ活性を有する。しかし、ＡＭＶ逆転写酵素が使用される場合でさえ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅＨのような外来のＲＮＡｓｅＨを添加することが好適であり得る。ＲＮＡｓｅＨは、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから容易に入手可能である。
【０１０３】
これらの方法によって産生されたＲＮＡ転写物は、上記の機序を介して標的配列のさらなるコピーを産生するための鋳型として役立ち得る。この系は、自己触媒的であり、そして増幅は、温度、ｐＨ、イオン強度などのような反応条件を繰り返し改変（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）も変更（ｃｈａｎｇｉｎｇ）もする必要なく、自己触媒的に起こる。
【０１０４】
検出は、直接の配列決定、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼージョン、ゲル電気泳動および質量分析を含む、広範な種々の方法を使用して実施され得る。これらの方法は、異種の形態または同種の形態の同位体標識または非同位体標識、ならびに全くの無標識を使用し得る。
【０１０５】
一つの好ましい検出の方法は、上記の４．７ｋｂｐフラグメント、７００ｂｐフラグメント、３７０ｂｐフラグメント、および２１４ｂｐフラグメント由来の標的配列特異的オリゴヌクレオチドプローブの使用である。このプローブは、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（ＨＰＡ）において使用され得る。この実施形態において、このプローブは、高度に化学発光性の分子である、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で都合よく標識される。例えば、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．Ｊ．（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＮｅｌｓｏｎら、（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」；Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら（編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＮｅｌｓｏｎら、（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （ＨＰＡ）  ｔｏ  ＰＣＲ」；Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９；Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照のこと。１つのＡＥ分子は、プローブ内の任意の位置における標識の配置を可能にする、非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を使用してプローブに直接結合される。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。化学発光は、励起されたＮ−メチルアクリドン（これは続いて、光子の放出で基底状態に落ちる）を生じるアルカリ性の過酸化水素との反応により引き起こされる。さらに、ＡＥは、非化学発光性メチルアクリジニウムカルボン酸を生じるエステル加水分解を起こす。
【０１０６】
ＡＥ分子が、核酸プローブに共有結合される場合、加水分解は、弱アルカリ性条件下で迅速である。ＡＥ標識化プローブが標的核酸に正確に相補的である場合、ＡＥ加水分解の速度は、かなり低減される。故に、ハイブリダイズしたＡＥ標識化プローブおよびハイブリダイズしていないＡＥ標識化プローブは、物理的な分離の必要性なしに、溶液中で直接検出され得る。
【０１０７】
ＨＰＡは、一般的に以下の工程からなる：（ａ）ＡＥ標識化プローブを、溶液中で約１５〜約３０分間、標的核酸分子とハイブリダイズする。次いで、弱アルカリ性溶液が添加され、そしてハイブリダイズしていないプローブと結合したＡＥは、加水分解される。この反応は、おおよそ５〜１０分かかる。残りのハイブリッド関連ＡＥは、存在する標的の量の尺度として検出される。この工程は、おおよそ２〜５秒間かかる。好ましくは、差示的加水分解の工程は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度（代表的には５０〜７０℃）で実施される。あるいは、第二の差示的加水分解工程が、室温で実施され得る。これは、上昇されたｐＨ（例えば、１０〜１１の範囲内）が使用されることを可能にする。上昇されたｐＨは、ハイブリダイズしたＡＥ標識化プローブとハイブリダイズしていないＡＥ標識化プローブとの間の加水分解の速度に大きな差を生じさせる。ＨＰＡは、例えば、米国特許第６，００４，７４５号；同第５，９４８，８９９号；および同第５，２８３，１７４号において詳細に記載される。
【０１０８】
ＴＭＡは、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号において詳細に記載される。代表的なアッセイの一つの例において、単離された核酸サンプル（パルボウイルスＢ１９標的配列を含むことが予測される）は、緩衝剤、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、ジチオトレイトール、およびスペルミジンを含む緩衝剤濃縮物と混合される。この反応は、必要に応じて、いかなる二次構造をも変性させるために約１００℃でおおよそ２分間インキュベートされる。室温まで冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅＨが添加され、そしてこの混合物は、３７℃で２〜４時間インキュベートされる。次いで、この反応は、産物を変性し、プローブ溶液を添加し、６０℃で２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を添加し、６０℃で６分間、この反応をインキュベートし、そして照度計で残存する化学発光を測定することによりアッセイされ得る。
【０１０９】
本発明のオリゴヌクレオチド分子はまた、核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）において使用され得る。この方法は、特定の核酸の連続的、均一的かつ等温性のインビトロ増幅を誘導し、その核酸のＲＮＡコピーを提供する、プロモーター指向性の酵素的プロセスである。ＮＡＳＢＡを実施するための試薬としては、プロモーターを含む５’テールを有する第一ＤＮＡプライマー、第二ＤＮＡプライマー、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ−Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰおよびｄＮＴＰが挙げられる。ＮＡＳＢＡを使用して、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ、あるいは二本鎖ＤＮＡのいずれかから、大量の一本鎖ＲＮＡが産生される。ＲＮＡが増幅される場合、ｓｓＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を含む第一プライマーの伸長による、第一ＤＮＡ鎖の合成のための鋳型として働く。このＤＮＡ鎖は、次いで第二プライマーの伸長によって、相補的な第二のＤＮＡ鎖の合成のための鋳型として働き、活性な二本鎖のＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を生じ、そしてこの第二のＤＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと協力して大量の第一鋳型（ｓｓＲＮＡ）の合成するための鋳型として働く。ＮＡＳＢＡ技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、欧州特許第３２９，８２２号、国際特許出願ＷＯ  ９１／０２８１４、ならびに米国特許第６，０６３，６０３号、同第５，５５４，５１７号、および同第５，４０９，８１８号に記載される。
【０１１０】
本明細書中に記載されるパルボウイルスＢ１９配列はまた、分枝ＤＮＡ分子を利用する核酸ハイブリダイゼーションおよび増幅技術において有用である。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖の分析物核酸は、標識化一本鎖核酸プローブにハイブリダイズされ、そして生じた標識化二本鎖が検出される。この基本スキームのバリエーションが、外来の物質に由来する検出されるべき二本鎖の分離を容易にするためおよび／または検出されるシグナルを増幅するために開発されている。シグナルを増幅するための一つの方法は、分析物核酸または分析物に結合される核酸の鎖に特異的にハイブリダイズする第一セグメントを有するポリヌクレオチドである増幅マルチマーおよび標識化プローブに特異的にハイブリダイズする第二セグメントの反復物を使用する。この増幅は、第二セグメントの反復物に理論上比例する。このマルチマーは、直線であっても分枝であってもよい。分枝マルチマーの２つの一般的な型（フォークおよびコーム）は、これらの技術において有用である。分枝核酸分子を作製および使用するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第５，８４９，４８１号において記載される。
【０１１１】
本発明の別の局面において、上記の２以上の試験が、生物の存在を確認するために実施される。例えば、第一テストが、検出のために核酸を増幅するために転写介在増幅（ＴＭＡ）を使用した場合、別の（例えば、本明細書中に記載されるようにＰＣＲ増幅、ＲＴ  ＰＣＲなどを使用することによる）核酸試験（ＮＡＴ）が実施される。従って、サンプルが、例えばＨＩＶおよびＢ型肝炎ウイルスのような他の生物を含む場合でさえ、パルボウイルスＢ１９は、特異的かつ選択的に検出され得る。
【０１１２】
容易に明白であるように、本明細書に記載されるアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象となり、多くの様式が当該分野で公知である。上の記載は、ただ手引きとして提供されるにすぎず、当業者は、当該分野で周知の技術を使用して容易に記載のプロトコールを改変し得る。
【０１１３】
上記のアッセイ試薬（プライマー、プローブ、結合されたプローブを有する固体支持体、および他の検出試薬を含む）は、上記のようなアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキットで提供され得る。このキットは、通常、別個の容器内に、プライマーとプローブとの組合せ（固体マトリクスに既に結合されているか、またはそれらをマトリックスに結合させる試薬とともに別個であるかのいずれか）、コントロール処方物（陽性および／または陰性）、標識化試薬（アッセイ様式が同じことを必要とする場合）およびシグナル産生試薬（例えば、酵素基質）（標識が直接にはシグナルを産生しない場合）を備える。アッセイを実施するための指示書（例えば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）は、通常キット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のアッセイに依存して、他の包装された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝剤など）を含み得る。上に記載されるアッセイのような標準的なアッセイは、これらのキットを使用して実施され得る。
【０１１４】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、そして決して本発明の範囲を制限するようには意図されていない。
【０１１５】
使用される数（例えば、量、温度など）に関して、正確さを確かにするように努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１１６】
下記の実施例において、酵素は、商業的供給源から購入し、製造者の指示に従って使用した。ニトロセルロースフィルターなどもまた、商業的供給源から購入した。
【０１１７】
ＤＮＡフラグメントの単離において、全てのＤＮＡ操作を標準的な手順に従って実施した（記載する場合を除く）。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．Ｃｏｌｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、および他の生物学的試薬を商業的供給業者から購入し、そして製造者の指示に従って使用し得る。二本鎖ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲルで分離した。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
（ＰＣＲのためのパルボウイルスＢ１９核酸抽出）
ＩｇＭ試験またはＰＣＲ試験のいずれかにより、ヒトパルボウイルスＢ１９について陽性であることが前もって試験されたヒト血清サンプルを、商業的供給源から得た。そして次のＰＣＲ実験のために、その血清サンプルを使用してＤＮＡを単離した。サンプルを、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１９】
製造者の仕様書に従って、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、以下を考慮して使用して、０．２ｍＬの血清からＤＮＡを抽出した。キャリアＤＮＡを溶解緩衝液に添加して、核酸の結合と収量を増強した。具体的には、１サンプルあたり５．６μｇの量のポリアデニル酸５’（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはポリｄＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加した。さらに、パルボウイルスＢ１９ＤＮＡを、水の代りに２００μＬの緩衝液ＡＥ（Ｑｉａｇｅｎ）で溶出した。
【０１２０】
（実施例２）
（ＰＣＲによるパルボウイルスＢ１９核酸陽性サンプルの検出）
２つの異なるＰＣＲ手順を使用して、パルボウイルスＢ１９フラグメントを増幅した。以下に詳細に記載される１方法を使用して、約７００ｂｐ、３７０ｂｐおよび２１４ｂｐのフラグメントを増幅した（図１を参照のこと）。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、約４．７ｋｂのフラグメントを増幅した。約７００ｂｐのフラグメントは、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する。約３７０ｂｐは、この７００ｂｐフラグメント内のヌクレオチド位置３０７３〜３４４２に存在する。約４．７ｋｂフラグメントは、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６のヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。
【０１２１】
約７００ｂｐ、３７０ｂｐおよび２１４ｂｐのＢ１９フラグメントを増幅するために、表１に示すプライマーを使用した。
【０１２２】
【表１】
2014061007.tif 000002
この実験について、２μｌの精製したパルボウイルスＢ１９ＤＮＡ（上に記載するように精製した）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸および１．２５単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１００μＬの最終容量でＰＣＲを実施した。増幅プロフィールは、９４℃２分間の変性、３７℃３分間のプライマーアニ−リングおよび７２℃３分間の伸長を３５サイクル含む。９４℃３分間のプレインキュベーションは、最初の変性を確実にし、そして最後の７２℃７分間のインキュベーションは、３５ＰＣＲサイクル以前のフラグメントおよび３５ＰＣＲサイクル後のフラグメントそれぞれの完全な伸長を確実にする。ＰＣＲ産物を７％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてＵＶ源下で可視化した。ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、増幅したフラグメントの精製を実施した。７００ｂｐのバンドがポリアクリルアミドゲル上で可視化されなかった場合、３７０ｂｐのＢ１９フラグメントを増幅するためにネスティッドＰＣＲを実施した。表１に示すプライマーを使用するネスティッドＰＣＲに、この７００ｂｐのＤＮＡ材料を使用した。
【０１２３】
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、以下のように４．７ｋｂのパルボウイルスＢ１９フラグメントを増幅した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）ならびにプライマー、Ｈｉｃｋｓ−５（５’ＣＣＣＧＣＣＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＡＧ３’）（配列番号４２）およびＨｉｃｋｓ−３（５’ＴＴＧＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧ３’）（配列番号４３）を製造元の推奨に従って使用した。増幅条件は、９４℃１分間、５０℃２分間、６８℃４分間を３５サイクルまたは４５サイクルであった。９４℃２分間のプレインキュベーションおよび７５℃７分間のポストインキュベーションもまた、含んだ。このＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して精製した。
【０１２４】
（実施例３）
（パルボウイルスＢ１９ＤＮＡフラグメントのクローニング）
ＰＣＲフラグメントを、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。増幅したＤＮＡが１個のデオキシアデノシン（Ａ）をその３’末端に含む場合、これらのベクターへのクローニングが高度に促進される。従って、３’（Ａ）オーバーヘッドを付加する触媒反応を使用した。この反応ミックスは、１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含有し、そして７２℃１５分間進行した。
【０１２５】
ＰＣＲフラグメントを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡクローニングキット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓを備えるＴＯＰＯＴＭＴＡ  ＣｌｏｎｉｎｇＲ  Ｋｉｔ）を製造業者の仕様書に従って使用して、ｐＣＲ−２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローニングした。細菌細胞を、３７℃で、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．６６ｍＭのＩＰＴＧおよび０．０３３％のＸ−Ｇａｌを含むルリアブロスプレート上で３７℃でインキュベートした。４ｍＬのルリアブロスアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に多くの白色コロニーを植菌し、そして振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。３ｍＬの一晩培養物を使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。組換えクローンを、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および上に記載するような７％ポリアクリルアミドゲルまたは１％アガロースゲルでの制限酵素分析により同定した。
【０１２６】
これらのクローンのＤＮＡ配列を決定するために、組換えクローン由来の大量のプラスミドを上記のように調製し、このＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に０．２ｍｇ／ｍｌになるように懸濁した。Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３（またはＭｏｄｅｌ  ３７７）ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、パルボウイルスＢ１９フラグメントのヌクレオチド配列決定を実施した。
【０１２７】
図２Ａ〜２Ｕ（配列番号１〜２１）は、上記のように精製し、増幅し、そして配列決定した２１個のパルボウイルスＢ１９単離体からのＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する（図１からの７００ｂｐフラグメントおよび上に記載のフラグメント）。図２Ａ（配列番号１）は、単離体ＣＨ４７−２６由来の配列である；図２Ｂ（配列番号２）は、単離体ＣＨ４８−２９由来の配列である；図２Ｃ（配列番号３）は、単離体ＣＨ３３−２由来の配列である；図２Ｄ（配列番号４）は、単離体ＣＨ３３−３由来の配列である；図２Ｅ（配列番号５）は、単離体ＣＨ３３−４由来の配列である；図２Ｆ（配列番号６）は、単離体ＣＨ４２−７由来の配列である；図２Ｇ（配列番号７）は、単離体ＣＨ４２−１８由来の配列である；図２Ｈ（配列番号８）は、単離体ＣＨ４２−１９由来の配列である；図２Ｉ（配列番号９）は、単離体ＣＨ４６−２３由来の配列である；図２Ｊ（配列番号１０）は、単離体ＣＨ１−１由来の配列である；図２Ｋ（配列番号１１）は、単離体ＣＨ１−６由来の配列である；図２Ｌ（配列番号１２）は、単離体ＣＨ２−８由来の配列である；図２Ｍ（配列番号１３）は、単離体ＣＨ２−１０由来の配列である；図２Ｎ（配列番号１４）は、単離体ＣＨ２−１１Ｃ由来の配列である；図２Ｏ（配列番号１５）は、単離体ＣＨ５−１３由来の配列である；図２Ｐ（配列番号１６）は、単離体ＣＨ７−２２由来の配列である；図２Ｑ（配列番号１７）は、単離体ＣＨ１３−２７由来の配列である；図２Ｒ（配列番号１８）は、単離体ＣＨ１４−３３由来の配列である；図２Ｓ（配列番号１９）は、単離体ＣＨ６２−２由来の配列である；図２Ｔ（配列番号２０）は、単離体ＣＨ６４−２由来の配列である；そして図２Ｕ（配列番号２１）は、単離体ＣＨ６７−２由来の配列である。
【０１２８】
図１１Ａ〜１１Ｚ（配列番号６２〜８７）は、上記のように精製し、増幅し、そして配列決定した、さらなる２６個のパルボウイルスＢ１９単離体からのＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド位置２９３６〜３６３５に対応する（図１からの７００ｂｐフラグメントおよび上に記載のフラグメント）。図１１Ａ（配列番号６２）は、単離体ＣＨ８０−１由来の配列である；図１１Ｂ（配列番号６３）は、単離体ＣＨ８１−３由来の配列である；図１１Ｃ（配列番号６４）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１−４由来の配列である；図１１Ｄ（配列番号６５）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ２−１由来の配列である；図１１Ｅ（配列番号６６）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ３−１由来の配列である；図１１Ｆ（配列番号６７）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ４−３由来の配列である；図１１Ｇ（配列番号６８）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ５−２由来の配列である；図１１Ｈ（配列番号６９）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ６−２由来の配列である；図１１Ｉ（配列番号７０）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ７−３由来の配列である；図１１Ｊ（配列番号７１）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ８−２由来の配列である；図１１Ｋ（配列番号７２）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ９−１由来の配列である；図１１Ｌ（配列番号７３）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ９−９由来の配列である；図１１Ｍ（配列番号７４）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１０−２由来の配列である；図１１Ｎ（配列番号７５）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬＩ１−１由来の配列である；図１１Ｏ（配列番号７６）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１２−１由来の配列である；図１１Ｐ（配列番号７７）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１３−３由来の配列である；図１１Ｑ（配列番号７８）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１４−１由来の配列である；図１１Ｒ（配列番号７９）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１５−３由来の配列である；図１１Ｓ（配列番号８０）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１６−２由来の配列である；図１１Ｔ（配列番号８１）は、単離体ＢＩ９ＳＣＬ１７−１由来の配列である；図１１Ｕ（配列番号８２）は、単離体ＢＩ９ＳＣＬ１８−１由来の配列である；図１１Ｖ（配列番号８３）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ１９−１由来の配列である；図１１Ｗ（配列番号８４）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ２０−３由来の配列である；図１１Ｘ（配列番号８５）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ２１−３由来の配列である；図１１Ｙ（配列番号８６）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ２２−１１由来の配列である；図１１Ｚ（配列番号８７）は、単離体Ｂ１９ＳＣＬ２−１４由来の配列である。
【０１２９】
配列比較は、種々の単離体の間で、この７００ｂｐの配列の約９８％〜９９．５％の配列相同性を明らかにした。
【０１３０】
図３Ａ〜３Ｃ（配列番号２２）は、図１に示され、そして上に記載される、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１からの約４．７ｋｂｐのＰＣＲフラグメントの配列を示す。図において示される配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６のヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレームならびにさらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。配列決定したフラグメントは、５’非コード領域において、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６により報告されたＢ１９配列のヌクレオチド位置３６７とヌクレオチド位置３６８との間にさらなるヌクレオチドを含有した。
【０１３１】
図４Ａ〜４Ｃ（配列番号２３）は、図１に示され、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６からの約４．７ｋｂｐＰＣＲフラグメントの配列を示す。この配列は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６のヌクレオチド位置２１７〜４８９３に対応する４６７７ヌクレオチドフラグメントである。示される配列は、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするパルボウイルスＢ１９全長オープンリーディングフレームならびにさらなる５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。配列決定したフラグメントは、５’非コード領域において、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６により報告されたＢ１９配列のヌクレオチド位置３６７とヌクレオチド位置３６８との間にさらなるヌクレオチドを含有した。
【０１３２】
（実施例４）
（パルボウイルスＢ１９のＮＳ１組換えタンパク質、ＶＰ１組換えタンパク質、およびＶＰ２組換えタンパク質のクローニングならびに発現）
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（上に記載）中にクローニングしたパルボウイルスＢ１９の４．７ｋｂフラグメントを使用して、ＮＳ１、ＶＰ１、およびＶＰ２をコードするフラグメント（図１を参照のこと）を増幅した。具体的には、ＰＣＲプライマー（下記を参照のこと）を、パルボウイルスＢ１９のＮＳ１領域、ＶＰ１領域、およびＶＰ２領域をＰＣＲする（ＰＣＲ  ｏｕｔ）ように設計した。酵母発現ベクターへのこれらの領域のクローニングを容易にするために、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を、必要な場合、プライマー中に導入した。
【０１３３】
ＮＳ１組換えタンパク質、ＶＰ１組換えタンパク質、およびＶＰ２組換えタンパク質の酵母発現のためのパルボウイルスＢ１９フラグメントをクローニングおよび増幅するために使用したプライマーは、上で得た配列に基づく。これらのプライマーは、以下のとおりである：
ＮＳ１−５（センスプライマー）
５’ＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＡＴＴＴＡＧＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴ３’（配列番号４４）
ＮＳ１−３（アンチセンスプライマー）
５’ＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号４５）
ＶＰ１−５ＳＮ（センスプライマー）
５’ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＴ３’（配列番号４６）
ＶＰＡＬＬ−３（アンチセンスプライマー）
５’ＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＡＴＴＣ３’（配列番号４７）
ＶＰ２−５ＳＮ（センスプライマー）
５’ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣＴ３’（配列番号４８）
ＰＣＲプライマーを合成し、精製し、そして３００μＬのｄＨ２Ｏに懸濁し、そしてそれらの２６０ｎｍでの光学的濃度を決定した。反応ミックスは、最終容量５０μＬ中に０．２５ｎｇの鋳型、１００ｐｍｏｌの各プライマー、１０μＬの１，２５ｍＭ各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含有した。増幅条件は、９４℃１分間、５０℃２分間、６８℃４分間を３５サイクルであった。７５℃７分間のポストインキュベーションを加えて、フラグメントの完全な伸長を確実にした。５μＬのアリコートを使用して、１％アガロースゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ合成をチェックした。次いで、ＰＣＲ産物全量を電気泳動し、そしてＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の推奨に従って使用して、予想したサイズを示すフラグメントをゲルから精製した。精製したＰＣＲ  ＤＮＡの約０．８μｇを適切な制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）で３７℃３時間消化し、そしてその産物をＰｒｏｍｅｇａのＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用してさらに精製した。
【０１３４】
プラスミドｐＢＳ２４．１を、パルボウイルスＢ１９組換えタンパク質の異種発現のために使用した。この酵母発現ベクターは、酵母における自律複製のための２μ配列および逆繰り返し配列（ＩＲ）、転写終結を確実にするためのαファクター終結因子、ならびに選択のための酵母ｌｅｕ−２ｄおよび酵母ＵＲＡ３を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉにおける増殖および選択のために、ＣｏｌＥ１複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子もまた存在する（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，第５章、Ｊ．Ｌ．ＣｌｅｌａｎｄおよびＣ．Ｃｒａｉｋ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．の１２９〜１６１頁、Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９９６）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」）。プラスミドｐＢＳ２４．１を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、１０単位のウシ腸アルカリフォスファターゼ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で、製造者によって推奨される条件下で脱リン酸化した。消化および精製したＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化したｐＢＳ２４．１および（クローニングするべきＰＣＲフラグメントに存在する制限酵素部位に依存して）ＢａｍＨＩ／ＳｆｕＩまたはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで消化した酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ（Ｃｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：２６５〜２７５）を含むＤＮＡフラグメントと混合した。ＲｏｃｈｅのＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔおよびプロトコールで、ライゲーションを実施した。次いで、ライゲーションミックスを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞を形質転換した。そして、形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリアブロスプレートにおいて、３７℃一晩のインキュベーション後に選択した。各形質転換のいくつかのコロニーを採取し、そしてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む３ｍＬのルリアブロスに植菌し、そして振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３５】
１．５ｍｌの培養物およびＱｌＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩでの分析的な制限酵素分析によって、組換えクローンを同定した。配列決定を実施して、クローニングしたパルボウイルスＢ１９フラグメントのヌクレオチド配列を確認するために、組換えプラスミドの大規模調製を実施した。
【０１３６】
ＮＳ１、ＶＰ１およびＶＰ２について予測された配列を示す酵母発現プラスミドを、以下のように、酵母の形質転換に使用した。コンピテントＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３細胞［Ｍａｔ  ａ，ｔｒｐ１＋，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂｌ−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃｌ−４０７，［ｃｉｒ０］，：：ｐＤＭ１５（ｐＧＡＰ／ＡＤＲＩ：：Ｇ４１８Ｒ）］，ｌｅｕ２（ΔＡＤ）］を、上に記載したようにクローニングしたＮＳ１、ＶＰ１またはＶＰ２をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換した。酵母組換え体の選択を、２回のウラシル欠乏プレート、続く３０℃４８〜７２時間インキュベーション後の１回のロイシン欠乏プレートによって達成した。次いで、組換えタンパク質の発現をチェックする前に、培養物を、ロイシン欠乏培地中で、次いで、２％グルコースを補充したＹＥＰ（Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）６：３２４〜３３７）中で４８時間増殖させた。
【０１３７】
二つの異なる単離体由来の種々のタンパク質についての配列を、図５〜１０に示す。特に、図５Ａ（配列番号２４）および５Ｂ（配列番号２５）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１に由来するＮＳ１ヌクレオチド配列およびＮＳ１タンパク質配列をそれぞれ示す。図６Ａ（配列番号２６）および６Ｂ（配列番号２７）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１に由来するＶＰ１ヌクレオチド配列およびＶＰ１タンパク質配列をそれぞれ示す。図７Ａ（配列番号２８）および７Ｂ（配列番号２９）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ１に由来するＶＰ２ヌクレオチド配列およびＶＰ２タンパク質配列をそれぞれ示す。図８Ａ（配列番号３０）および８Ｂ（配列番号３１）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６に由来するＮＳ１ヌクレオチド配列およびＮＳ１タンパク質配列をそれぞれ示す。図９Ａ（配列番号３２）および９Ｂ（配列番号３３）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６に由来するＶＰ１ヌクレオチド配列およびＶＰ１タンパク質配列をそれぞれ示す。図１０Ａ（配列番号３４）および１０Ｂ（配列番号３５）は、パルボウイルスＢ１９クローン２−Ｂ６に由来するＶＰ２ヌクレオチド配列およびＶＰ２タンパク質配列をそれぞれ示す。
【０１３８】
（実施例５）
（ＴａｑＭａｎＴＭによるパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの検出および定量）
パルボウイルスＢ１９感染の検出のための敏感な診断方法を、以下のように設計した。具体的には、ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ技術を使用して、パルボウイルスＢ１９ＤＮＡを検出および定量した。定量的ＰＣＲは、核酸の効果的な抽出を必要とする。ＤＮＡ抽出に使用する血漿／血清の容量もまた、検出の感度に影響する。２つのアプローチを使用して、０．５ｍｌの血漿／血清から核酸を単離した。具体的には、ＤＮＡを、（ａ）シリカへの結合および（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドへのアニ−リング、によって抽出した。
【０１３９】
（（ａ）シリカへの結合による核酸の単離）
高濃度のカオトロピック塩（例えば、グアニジンイソチオシアネート）の存在下で、核酸は、シリカに結合する。小さいサイズの核酸は、酸性ｐＨの条件下で、より効果的にシリカに結合する。結合された核酸は、高温において低塩のアルカリ性ｐＨ緩衝液で効果的に溶出される。通常のシリカを磁化シリカに変更することは、核酸単離の洗浄工程および溶出工程を大いに容易にする。磁性基材を使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕らえた（故に通常のシリカ粒子を沈降するために必要とされる遠心分離を排除した）。
【０１４０】
使用した溶解緩衝液は、Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）から入手した。この溶解緩衝液は、タンパク質を可溶化し、そしてＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを不活化するためにグアニジンイソチオシアネートを含む。界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、細胞構造および核タンパク質の可溶化および分解（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のプロセスをさらに促進し、故に、核酸を放出する。核酸結合を増強するために溶解試薬を酸性化し、そして５０μｌのアルカリ性溶出緩衝液を使用して、結合した核酸を溶出した。核酸の単離に次いで、以下に記載するように、ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲを実施することにより、パルボウイルスＤＮＡの存在を決定した。
【０１４１】
（（ｂ）標的特異的オリゴヌクレオチドへのアニーリングによる核酸の単離）
磁化シリカの使用は、洗浄工程および溶出工程の間の迅速かつ容易な操作を著しく容易にするが、核酸分子の単離は、なお面倒かつ時間を要する。従って、磁性ビーズを使用する、血漿または血清からの特定の核酸標的のワンステップ捕捉を使用した。これを広範な種々のウイルス核酸捕捉試験に適用可能にするために、一般的な、オリゴｄＴに結合した磁性ビーズを使用した。１４マーのオリゴｄＴ長を有するＳｅｒａ−Ｍａｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、３’末端で、使用したパルボウイルス特異的配列(下に明記する配列の最後におい
て示される)に隣接する２０ポリＡを含む捕捉オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用し
た。
【０１４２】
使用したアンチセンス捕捉オリゴヌクレオチドは、７００ｂｐフラグメントに由来し、そして以下のとおりであった：
ＶＳＰＣ１−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡ（ヌクレオチド３４９２〜３５１４）（＊）（配列番号４９）
ＶＳＰＣ２−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＧ（ヌクレオチド３５４９〜３５６８）（配列番号５０）
ＶＳＰＣ３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧ（ヌクレオチド３６３９〜３６６０）（配列番号５１）
ＶＳＰＣ４−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣ（ヌクレオチド３７３７〜３７５９）（配列番号５２）
ＶＳＰＣ５−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＡ（ヌクレオチド３７８９〜３８０８）（配列番号５３）
ＶＳＰＣ６−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧ（ヌクレオチド３８３８〜３８５７）（配列番号５４）
ＶＳＰＣ７−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣ（ヌクレオチド３９１０〜３９２９）（配列番号５５）
（＊）ヌクレオチド番号は、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に従う。
【０１４３】
磁性ビーズを、Ｎｏｖａｇｅｎ溶解緩衝液（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に懸濁し、そしてＦＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＦＤＡ−ＣＢＥＲ）から得たパネルからパルボウイルスＢ１９Ｂ１９ＤＮＡを捕捉するために、７つの捕捉オリゴヌクレオチドの系列（上記のＶＳＰＣ１〜ＶＳＣＰ７）を、個々にかまたは組み合わせて試験した。
【０１４４】
（（ｃ）洗浄緩衝液でのビーズの洗浄）
捕捉に次いで、このビーズを、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５％ＮＰ−４０中にｐＨ７．５に緩衝化された１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含む緩衝液で洗浄した。溶解緩衝液での血清の処理、ハイブリダイゼーション、ビーズの磁性吸着、および溶解緩衝液の除去の後、１．５ｍｌの洗浄緩衝液をビーズに添加した。通常のボルテックス、磁性吸着、および洗浄緩衝液の除去の後、ビーズを、０．５ｍｌの同じ緩衝液で２回目の洗浄を行った。その結果、Ｔａｑｍａｎアッセイのための全ての試薬を含有する１００ｍｌのユニバーサルＰＣＲ緩衝液中における容易な懸濁のために、この磁性ビーズは詰められ得る。捕捉したＤＮＡを有するビーズを、以下に記載するように、ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲによる検出のために、ＴａｑＭａｎＴＭプレートに移した。いくつかのオリゴヌクレオチドの組合せは、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイにより検出されるようにＢ１９を捕捉することにおいて効果的であった。
【０１４５】
詳細には、ＴａｑＭａｎＴＭ技術は、捕捉した標的核酸をＤＮＡアンプリコンとして増幅する。代替法では、捕捉した標的をＲＮＡとして増幅する。これについて、増幅オリゴヌクレオチドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡアンプリコンを産生するためにＴ７プロモーター配列を有するパルボウイルスＢ１９特異的プライマーからなった。３つの増幅プライマー（ＶＳＡ１−Ａ３、以下に記載する）（Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に記載されるパルボウイルスＢ１９ゲノムのヌクレオチド２９３６〜３６３５に対応する７００ｂｐ配列に由来する）を、それらの増幅する能力について試験した。これらのプライマーは、以下のとおりであった：
センス鎖増幅プライマー
ＶＳＡ１−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＡＣＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴＧＴ（ヌクレオチド２９４２〜２９６１）（配列番号５６）
ＶＳＡ２−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡ（ヌクレオチド３２７２〜３２８８）（配列番号５７）
ＶＳＡ３−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡ（ヌクレオチド３３１７〜３３３３）（配列番号５８）
ＶＳＰ２−ＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴ（アンチセンスプライマー−ヌクレオチド３４２４〜３４４２）（配列番号５９）
ＲＮａｍｐｌｉｆｉｒｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）試薬を使用して、２０ｍＬの最終容量中５０コピーのパルボウイルスＤＮＡを標的として使用して、増幅効率を試験した。ＶＳＰ２を第二プライマーとして使用して、増幅プライマーを、個々にかまたは組合せて試験した。製造業者に推奨されるように、４２℃で１時間インキュベートした後、増幅した材料のアリコートを、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイにより検出して増幅プライマーの効率を評価するために、１００倍に希釈した。２つの増幅プライマーの組合せ、ＶＳＡ２とＶＳＰ２およびＶＳＡ３とＶＳＰ２は、ＲＮＡアンプリコンの産生において非常に効果的であった。
【０１４６】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイの感度、ＰＣＲプライマーの適合性および至適反応条件を、上に記載した４．７ｋｂフラグメントを含むプラスミドＤＮＡを使用して確立した。このフラグメントは、ＶＰ１領域、ならびにＮＳ１領域およびＶＰ２領域を含む（図１を参照のこと）。ＶＰ１領域に由来するＰＣＲ増幅プライマー（下に詳述する）を使用した。番号付けは、Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５８：９２１〜９３６に対応する。Ｘは、５’−フルオレセインホスホルアミダイトを示し、Ｚは、ＤＡＢＣＹＬ−ｄＴを示す。両方を、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから得た。配列の右に示した数字は、パルボウイルスＢ１９配列からのプライマーのヌクレオチドをいう。
ＶＳＰ１−ＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＣＡ（センスプライマー−ヌクレオチド３３３４−３３５０）（配列番号６０）
ＶＳＰ２−ＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴ（アンチセンスプライマー−ヌクレオチド３４２４−３４４２）（配列番号５９）
ＶＳＰＰＲ１−ＸＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＧＡＴＴＺ（プローブ−ヌクレオチド３３７９−３３９８）（配列番号６１）
Ｖｐａｒａ８：ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡ（ヌクレオチド３２６２−３４６０）（配列番号８８）
Ｖｐａｒａ９：ＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＣ（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ−ヌクレオチド３３１３−３３３１）（配列番号８９）
Ｖｐａｒａ１０：ＸＡＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＺ、ここでＸは、Ｆａｍであり、そしてＺは、Ｔａｍｒａである。（ヌクレオチド３２８６−３３１０）  （配列番号９０）
プラスミドＤＮＡ濃度を、分光光度法で概算し、そして段階希釈を実施して５，０００〜１０コピー／２０μｌを得た。最終容量５０μｌ中の反応ミックスは、２０μｌのサンプル、３．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１ＸＧｏｌｄ  Ｔａｑ増幅緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、３００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｐｍｏｌの各増幅プライマー、０．４ｐｍｏｌのプローブ、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ酵素を含有した。反応条件は、以下を含んだ：ＡＢＩ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて、酵素を活性化するための９５℃１０分間、次いで４５サイクルの、６０℃と交互の９５℃３０秒間。
【０１４７】
わずかに１０コピー／アッセイが、１０９ｂｐＰＣＲ産物を産生するプライマー対、ＶＳＰ１およびＶＳＰ２、ならびにプローブＶＳＰＰＲ１を使用して検出可能であった。サンプル容量は、最終容量５０μＬのうち２０μＬであったので、このことは、わずかに５０コピー／ｍＬのパルボウイルスＢ１９ＤＮＡを含む血漿サンプルが抽出され得、そしてＴａｑＭａｎＴＭ技術によって検出され得たことを示唆している。パルボウイルスは、高力価ウイルスであるので、５０μＬの血漿／血清容量が、抽出され得、そして分析に使用され得る。
【０１４８】
ＦＤＡ−ＣＢＥＲパルボウイルスＢ１９ＤＮＡ陽性サンプル（１０６コピー／ｍｌ）を使用して、ＴａｑＭａｎＴＭ技術は、１アッセイあたりわずか５０コピーを検出した。核酸と免疫力価を関連させる試みにおいて、ウイルスＤＮＡ負荷を、いくつかの抗体−陽性サンプルにおいて定量した。
【０１４９】
従って、新規のヒトパルボウイルスＢ１９およびこれらの配列を使用する検出アッセイが、開示されている。前述の記載から、本発明の特定の実施形態が、例示を目的として本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図２Ｓ】
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【図２Ｔ】
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【図２Ｕ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１１Ｗ】
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【図１１Ｘ】
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【図１１Ｙ】
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【図１１Ｚ】
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【図１２】
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【配列表】
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