(57)【要約】【課題】ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤の提供。【解決手段】プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
【請求項２】
発酵茶抽出物中の高分子ポリフェノールとカフェインとの質量比率が１５：２以上である、請求項１記載のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
【請求項３】
発酵茶抽出物が、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることにより得られる請求項１記載のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
【請求項４】
水を含んでいてもよいエタノールがエタノール濃度４０％以上の含水エタノールである請求項３記載のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、交通手段の発達や情報・通信技術の発展に伴い、運動が不足している。運動不足による筋量・筋力の低下は、運動機能の低下の原因となり、特に高齢者にとっては、加齢による筋変化と相俟って、その後の生活の質（ＱＯＬ）に重大な悪影響をもたらすと考えられる。筋委縮、筋量・筋力の低下を起因とする日常動作中の転倒、及びそれに伴う骨折等は高齢者における主要な寝たきりの原因である。
一般的に、筋委縮、筋量・筋力の低下を防ぐ手段としては、適度な運動を実践する、或いはリハビリテーションを実践する等がある。しかし、時間的・物理的理由、モチベーションの維持の困難さ等から現実的には難しく、より効果的な方法が望まれている。
【０００３】
斯かる観点から、栄養学的アプローチにより運動機能を調節し得る成分の探索が行われ、例えば、プロアントシアニジンを有効成分とする筋萎縮抑制剤（特許文献１）、果実由来のポリフェノールを有効成分とする筋張力増強剤及び体脂肪調整剤（特許文献２）等が提案されている。
【０００４】
一方、ミオスタチンは、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、筋肉成長を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられている。ミオスタチンは、筋芽細胞の増殖及び分化を阻害すること（非特許文献１）、サテライト細胞の増殖を抑制し、サテライト細胞を休止状態としていること（非特許文献２）等が明らかにされている。また、ミオスタチン欠損マウスでは正常なマウスよりも筋線維の過形成及び肥大のために骨格筋量が約２倍に増大すること（非特許文献３）、さらに、ミオスタチンの内因性阻害剤であるフォリスタリンの過剰発現マウスで筋量増加が認められること（非特許文献４）が報告されている。
【０００５】
ミオスタチンの活性は、ミオスタチンが、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ）に結合し、さらにＩ型受容体（ＡＬＫ４又はＡＬＫ５）のリン酸化を引き起こすことで、細胞内シグナルカスケードが働き、リン酸化されたＩ型受容体は細胞内のＳｍａｄ２、３をリン酸化し、リン酸化されたＳｍａｄ２、３はヘテロダイマーを形成し、さらにＳｍａｄ４との複合体を形成することで核内へと移行可能となり、標的遺伝子上流のＳＢＥ（Ｓｍａｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合して、転写を開始することにより起こることが知られている（非特許文献５）。
したがって、当該ミオスタチンシグナル経路の何れかの段階を阻害すること、例えば、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩへの結合を阻害すること、Ｓｍａｄタンパク質を不活化すること等によってミオスタチンの活性を阻害することで、未分化の幹細胞であるサテライト細胞の活性を高めて筋肉の肥大・再生を促し、筋力の向上、筋量の調節・増加、筋萎縮の予防又は改善等が期待できると考えられている。
【０００６】
一方、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶には、その製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合して生成する高分子ポリフェノールが含まれることが報告され、このうち、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールには、脂肪肝の予防・治療（特許文献３）、異常型プリオンタンパク質の形成抑制（特許文献４）に有用であることが報告されている。また最近、当該高分子ポリフェノールに筋肉の遅筋化を促進する作用があり、持久力の増強や疲労回復に有用であることが報告されている（特許文献５）。さらに当該高分子ポリフェノールを簡便に調製する方法が報告されている（特許文献６）。
しかしながら、当該高分子ポリフェノールに、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用があることはこれまでに知られていない。
尚、特許文献５では、持久性運動と組み合わせたときの骨格筋の筋線維タイプの変化（ＩＩｂからＩＩａへの移行、遅筋化）促進が検討されているが、当該作用は、ＡＭＰキナーゼの活性化などに基づくＰＧＣ−１αの発現促進などにより、筋肉の遅筋化を促進する作用を有するものであり、これと加齢等に伴う速筋線維タイプの筋委縮や筋力の低下とは何ら関係するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−３３８４６４号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０７４９６２号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−３２０９５８号公報
【特許文献４】特開２００９−２９７５２号公報
【特許文献５】特開２０１０−３７３２３号公報
【特許文献６】特開２０１２−５４１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．， J  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  ２７５：４０２３５−４０２４３
【非特許文献２】ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  １６２：１１３５−１１４７
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．， ＮＡＴＵＲＥ  １９９７  ３８７：８３−９０
【非特許文献４】Ｇｉｏｓｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００９  ２９７：Ｅ１５７−Ｅ１６４
【非特許文献５】Ｊｏｕｌｉａ−Ｅｋａｚａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００７  ７：３１０−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ミオスタチンの細胞内シグナル伝達（ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル）を阻害する物質について鋭意研究を重ねた結果、特定の高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物に優れたミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用があることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等は、細胞におけるミオスタチンのシグナル伝達を阻害することから、筋力向上、筋萎縮の抑制等の効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品、食品等として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明発酵茶抽出物のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル」とは、ＡｃｔＲＩＩ、Ｓｍａｄタンパク質が関与するミオスタチンの細胞内シグナル伝達経路であり、「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害」とは、例えば、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩへの結合阻害、Ｓｍａｄタンパク質の不活性化等により当該シグナル伝達のいずれかを減少、調節或いは阻害することを意味する。これにより細胞におけるミオスタチンの活性を抑制することができる。「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用」は、後記実施例に示すように、Ｓｍａｄ複合体のＳＢＥへの結合、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を判別することにより評価することができる。
【００１５】
本明細書において、「筋力向上」とは、筋収縮力が増強することを意味する。
また、「筋萎縮」とは、筋蛋白の分解速度が合成速度を上回ることにより筋細胞が縮小し、筋量が低下することをいい、長期間の安静臥床や骨折等によるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）と筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）等の疾病による進行性筋萎縮に大別される。さらに、加齢に伴っても筋萎縮と同様の症状が起きることがあり、これは加齢性筋減弱症（サルコペニア）と呼ばれている。したがって「筋萎縮の抑制」とは、不活動や加齢、疾病等による筋量の低下を抑制することをいう。
【００１６】
本発明の発酵茶抽出物は、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有するものである。
斯かる高分子ポリフェノールは、発酵茶の製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合することで生成すると考えられる。
【００１７】
ここで、発酵茶とは、茶葉の発酵を進行させてなる茶を意味し、その具体例としては、半発酵茶であるウーロン茶や発酵茶である紅茶などが挙げられる。
【００１８】
プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
当該高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物は、（１）発酵茶葉の水溶出液と吸着剤を混合する工程と、（２）吸着剤の非吸着成分を除去する工程と、（３）水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させる工程により得ることができる。
上記工程（１）において、発酵茶葉の水溶出液は、例えば５０℃以上の温水ないし熱水、または沸騰水に発酵茶葉を投入することで得られる、発酵茶葉に含まれる高分子ポリフェノールをはじめとする水溶性成分を含む水溶液であることが望ましい。
また、吸着剤としては、高分子ポリフェノールを吸着するものであれば特に限定されないが、親水性ビニルポリマーが好ましく、メタクリレート共重合体がより好ましく、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートとの共重合体がさらに好ましい。具体的には、例えば親水性ビニルポリマー樹脂（東ソー社製「トヨパールＨＷ−４０」）を挙げることができる。
この工程は、例えば、発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様（攪拌時間は例えば５秒間〜１時間とすればよい）で行ってもよいし、吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行ってもよい。なお、発酵茶葉の水溶出液と吸着剤との混合割合は、例えば１：０．１〜１：５（容積比）とすればよい。
【００２１】
上記工程（２）は、（１）の工程を発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様で行った場合、例えば吸着剤を濾紙上に濾取した後、十分量の水を用いて吸着剤を洗浄することで行えばよい。また、（１）の工程を吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行った場合、十分量の水をカラムに流してカラム内の吸着剤を洗浄することで行えばよい。
【００２２】
上記工程（３）において、水を含んでいてもよいエタノールとして、含水エタノールを用いる場合、そのエタノール濃度は、高分子ポリフェノールの溶出効率の点から、４０容量％以上、６０容量％以上が好ましく、９０以下、８０以下が好ましい。また、６０〜８０容量％がより好ましく、８０容量％がより好ましい。
なお、この工程は、（１）の工程を発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様で行った場合、（２）の工程で洗浄した吸着剤に対して溶出溶媒を添加することで行えばよい。また、（１）の工程を吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行った場合、（２）の工程で洗浄したカラムに溶出溶媒を流すことで行えばよい。
【００２３】
以上の工程により得られた発酵茶抽出物ついて、エタノールを例えば減圧濃縮を行って除去した後、凍結乾燥や噴霧乾燥を行えば、発酵茶抽出物を粉末状物として得ることができる（粉砕操作は要しない）。また、凍結乾燥や噴霧乾燥のかわりに減圧濃縮を行えば、発酵茶抽出物を液状濃縮物として得ることができる。その高分子ポリフェノールの含量は概ね７．５重量％以上であり（上限は概ね３０重量％）、それ以外の成分としてはフラボノイド系化合物が主体を占め（５０重量％以上）、その他にカテキン類やテアフラビン類が含まれる。尚、この発酵茶抽出物にはカフェインがほとんど含まれていないので（１重量％以下）、カフェインの副作用が殆ど無いという特徴が挙げられる。
斯かる観点から、本発明の発酵茶抽出物においては、高分子ポリフェノールとカフェインとの質量比が１５：２以上であることが好ましい。
【００２４】
後記実施例で示すとおり、本発明の発酵茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルに着目した、ＳＢＥを利用したレポータージーンアッセイ系において優れたミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用を示した（実施例１）。すなわち、本発明の発酵茶抽出物は、ミオスタチンシグナル経路の何れかの段階を抑制することによりミオスタチンの活性を阻害する。これにより、サテライト細胞の活性が高められ、筋肉の肥大・再生を促し、筋力の向上、筋量の調節・増加、筋萎縮の予防又は改善等が期待できると考えられる。
したがって、本発明の発酵茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００２５】
また、本発明の発酵茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等には、本発明の発酵茶抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２６】
当該ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤は、それ自体、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品又は飼料であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。食品としては、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害、筋力の向上、筋萎縮の抑制等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２７】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、例えば注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、各種外用剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明の発酵茶抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２８】
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、製剤中の本発明の発酵茶抽出物の含有量は、一般的に０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。
【００２９】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の発酵茶抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の発酵茶抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１〜１００質量％とするのが好ましく、０．１〜１００質量％とするのがより好ましく、更に好ましくは１〜１００質量％とするのが好ましい。
【００３０】
また、上記飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、本発明の発酵茶抽出物の他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を組み合わせて用いることができる。
また、飼料中の、本発明の発酵茶抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
【００３１】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、本発明の発酵茶抽出物として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、更に０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与又は摂取され得るが、１日１回〜数回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
【００３２】
投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤はミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害及び筋力の向上を図ることができることから、特に、運動愛好者やアスリート、ロコモティブシンドローム発症者、加齢性筋減弱症（サルコペニア）者、神経・筋疾患（炎症性筋疾患、内科的疾患に伴うミオパチー、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、ミトコンドリア脳筋症、糖原病等）者、運動不足者、ベッドレスト者、外科的/内科的疾患後のリハビリトレーニング者における投与又は摂取が有効である。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞  プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
＜２＞  プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とする筋力向上剤。
＜３＞ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤を製造するための、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の使用。
＜４＞筋力向上剤を製造するための、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の使用。
＜５＞ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害に使用するための、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物。
＜６＞筋力向上に使用するための、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物。
＜７＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を投与又は摂取するミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害方法。
＜８＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を投与又は摂取する筋力向上方法。
＜９＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を投与又は摂取するミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの非治療的阻害方法。
＜１０＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を投与又は摂取する非治療的筋力向上方法。
＜１１＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とする食品を用いたミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの非治療的阻害方法。
＜１２＞プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含み、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物を有効成分とする食品を用いた非治療的筋力向上方法。
＜１３＞前記＜１＞〜＜１２＞において、発酵茶抽出物中の高分子ポリフェノールとカフェインとの質量比率は、好ましくは１５：２以上である。
＜１４＞前記＜１＞〜＜１２＞において、発酵茶抽出物は、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることにより得られるものである。
＜１５＞前記＜１４＞において、水を含んでいてもよいエタノールは、好適にはエタノール濃度４０％以上の含水エタノールである。
＜１６＞前記＜１４＞において、親水性ビニルポリマーは、好適にはメタクリレート共重合体、より好適にはグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートとの共重合体である。
【実施例】
【００３４】
製造例１［発酵茶抽出物の調製と高分子ポリフェノールの分析］
（Ａ）発酵茶抽出物の調製
特開２０１２-５４１３号公報記載の調製方法及び分析を行った。
市販の紅茶（デイリークラブ：三井農林の商品名）３０ｇを弱く沸騰させた水１Ｌに投入し、約１分間そのままの状態を保ち、さらに時々攪拌しながら１０分間保つことで、紅茶に含まれる水溶性成分の抽出を行った。その後、ブフナーロートにＮｏ．２濾紙（アドバンテック）２枚を敷いて吸引濾過を行って濾液（紅茶の水溶出液）を得た。この濾液に、親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤として水で予め洗浄した東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆ（製品名、粒子径：３０μｍ〜６０μｍ）２５０ｍＬを加えて１分間攪拌した後、ブフナーロートにＮｏ．２濾紙（アドバンテック）１枚を敷いて吸引濾過を行い、濾紙上に吸着剤を濾取し、濾紙上の吸着剤を１回につき水１５０ｍＬを用いて１０回洗浄した。次に、濾紙上の吸着剤に対して１５０ｍＬのエタノール濃度が８０％の含水エタノールを添加して吸着剤の吸着成分を溶出させる操作を１２回行った。１２回分の吸着剤の吸着成分の溶出液を５０℃で減圧濃縮を行ってエタノールを除去した後、凍結乾燥を行うことで、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物２．９６ｇを茶褐色粉末として得た。この紅茶由来の抽出物に含まれる成分の含量を以下の方法によって定量した。
【００３５】
（Ｂ）高分子ポリフェノールの分析
（ア）分析装置：中圧ポンプ（ＳＰ１１、東京理化器械）２台、トヨパールＨＷ−４０Ｆを充てんした中圧液体クロマト用カラム（φ１×３０ｃｍ）、試料注入器（Ｉｎｊｅｃｔｏｒ  ＶＩ、東京理化器械）、フラクションコレクター（ＣＨＦ１６１ＲＡ、アドバンテック）を用い、溶媒の直線的濃度勾配が可能な装置を組み立てた。
（イ）展開溶媒：Ａ溶媒としてアセトン濃度が２０％の含水アセトン９０ｍＬ、Ｂ溶媒としてアセトン濃度が５０％の含水アセトン９０ｍＬを用い、流速を１．５ｇ／４分とし、Ａ溶媒とＢ溶媒の割合を１００：０から０：１００に直線的に変化させた。
（ウ）試料注入：サンプル４０ｍｇをアセトン濃度が２０％の含水アセトン２ｍＬに溶解して行った。
（エ）分画：溶出液をフラクションコレクターで１．５ｇずつ分取した（フラクション総数：１１５）。溶出液の３５０ｎｍの吸光度の測定結果をもとに溶出曲線を描き、これに従って分画した。各画分を５０℃で減圧濃縮してアセトンを除去した後、凍結乾燥を行ってから秤量し、その重さから画分を構成する成分のサンプル中の割合を求めた。
【００３６】
（Ｃ）分析結果
目的とする高分子ポリフェノールは、フラクションＮｏ．７５〜１１０の画分として得られ、サンプルに含まれるその含量は２５．６重量％であった。なお、この画分が目的とする高分子ポリフェノールであることは、特開２００７−３２０９５８号公報に記載の方法による平均分子量の測定結果（数平均分子量：１．３６×１０4、重量平均分子量：１．５８×１０4）と構造解析の結果に基づいて確認した（以下に示す部分構造を有する）。フラボノイド系化合物は、フラクションＮｏ．２０〜７４の画分として得られ、サンプルに含まれるその含量は６０．６重量％であった。
【００３７】
【化２】
2014012659.tif 000003
【００３８】
（Ｄ）その他成分の分析
サンプルを精密に秤量し、アセトニトリル濃度が１０％の含水アセトニトリルの一定量に溶解して調製した分析試料を用いて分析を行った。
（ア）分析装置：島津製作所のＬＣ−１０Ａシステム（ポンプＬＣ−１０ＡＤ、カラムオープンＣＴＯ−１０Ａ、検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ）を用いた。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、φ４．６×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ（ジーエルサイエンス）を用いた。
（イ）分析条件：分析試料の注入量は４．０μＬとし、流速は０．７ｍＬ／分とした。カラム温度は４０℃とした。
（ウ）展開溶媒：Ａ溶媒としてアセトニトリル濃度が５％の含水アセトニトリル（０．０２％ＴＦＡ含有）、Ｂ溶媒としてアセトニトリル濃度が４０％の含水アセトニトリル（０．０２％ＴＦＡ含有）を用い、Ａ溶媒とＢ溶媒の割合を７０分間で１００：０から０：１００に直線的に変化させた。
（エ）検出：２８０ｎｍと３７５ｎｍを検出波長とし、標準物質のエリア数と分析試料のエリア数から、サンプルに含まれる成分のサンプル中の割合を求めた。
（オ）結果：サンプルには、カテキン類（エピガロカテキン：３．５重量％、エピガロカテキンガレート：３．８重量％）やテアフラビン類（テアフラビン１：１．１重量％、テアフラビン２ａｂ：１．２重量％、テアフラビン３：３．８重量％）が含まれていることがわかった。サンプルに含まれるカフェインの含量は０．３８重量％であった。
【００３９】
（Ｅ）その他成分の分析結果
以上の結果から、上述の調製方法で得られた紅茶由来の抽出物は、その約１／４が高分子ポリフェノールから構成されていることがわかった。また、この抽出物のカフェインの含量は１重量％以下であったことから、上述の調製方法にて、紅茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含み、しかも脱カフェイン化された抽出物を、水とエタノールだけを用いて簡易に調製することができる方法であることがわかった。
【００４０】
また紅茶のかわりにウーロン茶を用いる方法、またはエタノール濃度が８０％の含水エタノールのかわりにエタノール濃度が４０％の含水エタノールを用いる方法においても同様の高分子ポリフェノールが得られることを確認した。
【００４１】
実施例１［ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害活性試験］
ＨＥＫ２９３細胞を９６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ （１０％  ＦＢＳ）中で一晩培養した。ＣｉｇｎａｌTM  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に含まれるＣｉｇｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ(ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＳｍａｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔをつないだレポータープラスミドと内部標準用ウミシイタケルシフェラーゼが４０：１の比率で混合されたもの)を、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞に導入した。
その６時間後に被験物質として、製造例１で調製された発酵茶抽出物を終濃度０．００１（ｗ／ｖ）％、０．００２（ｗ／ｖ）％でそれぞれ含むＤＭＥＭ（０．２％ ＦＢＳ）へと培地交換を行い、さらに２時間後にＭｙｏｓｔａｔｉｎ（０．０５  μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（０．２％  ＦＢＳ）を加え、一晩培養した。 翌日、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。コントロール（ＣＮＴ）として高分子ポリフェノールの代わりに２０（ｖ／ｖ）％エタノールを用いた。結果を図１に示す。
【００４２】
Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ホタルルシフェラーゼ活性）/ (ウミシイタケルシフェラーゼ活性)
ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害活性試験の結果は、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ非刺激のルシフェラーゼ活性を０％、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ刺激によるルシフェラーゼ活性を１００％とした際の転写活性化率を、％表示した。
【００４３】
図１に示すように、発酵茶抽出物によりミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）が濃度依存的に抑制され、当該発酵茶抽出物は、有意なミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用を有していることが確認された。
【図１】
2014012659.tif 000004