(57)【要約】      （修正有）【課題】第VII因子ポリペプチドの薬剤物質における産業規模の生成物関連の不純物除去による精製方法の提供。【解決手段】組み換えて作製した第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製方法であって、(a)疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含むものであり；(b)場合によって洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄し；そして、(c)溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質を溶出物として回収する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えて作製した第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製方法であって、 
(a) 疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含むものであり；
(b) 場合によって洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄し；そして、
(c) 溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質を溶出物として回収する；
という工程を含んでなり、それによって、本明細書中に定められる方法によって決定される生成物関連の不純物の含有量が、工程(a)に用いられる薬剤物質に含有される含有量と比較して、少なくとも５０％(w/w)に減少している方法。
【請求項２】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィ物質が、ブチル配位子及び／又はフェニル配位子にて置換された樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(a)の薬剤物質の負荷が樹脂ｌ当たり少なくとも２５０ｍｇの第VII因子ポリペプチドの範囲である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程(a)の薬剤物質が液体の形態であり、５０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
工程(b)の洗浄バッファが０．７〜２．２Ｍの範囲の濃度の塩を含む、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
工程(c)の溶出バッファが０．７〜２．２Ｍの範囲の開始濃度の塩を含む、請求項１から５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
工程(c)の溶出バッファが塩に関する勾配バッファである、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
勾配バッファの塩の開始濃度が１．７〜２．２Ｍの範囲であり、勾配バッファの塩の終濃度が０．０〜１．６Ｍの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
塩が酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一に記載の方法。
【請求項１０】
生成物関連の不純物が本明細書中に記載の方法によって測定するところの遅発型溶出ピークである、請求項１から９のいずれか一に記載の方法。 
【請求項１１】
生成物関連の不純物が一又は複数のＮ結合グリカンを欠く対象とする第VII因子タンパク質の形態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生成物関連の不純物が対象とする第VII因子ポリペプチドの酸化型である、請求項１から１１のいずれか一に記載の方法。  
【請求項１３】
生成物関連の不純物が対象とする第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解型である、請求項１から１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１４】
生成物関連の不純物が対象とする第VII因子ポリペプチドの二量体、オリゴマー及び／又は凝集塊である、請求項１から１３のいずれか一に記載の方法。
【請求項１５】
工程(c)において回収される第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質が工程(a)の薬剤物質と比較しておよそ５０％未満の遅発型溶出ピークを有する、請求項１から１４のいずれか一に記載の方法。
【請求項１６】
第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製方法であって、該薬剤物質が少なくとも３％の遅発型溶出ピークを有するものであり、 
(a) 疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が１．５〜２．５Ｍの範囲の濃度のアンモニウム塩を含むものであり；
(b) １．５〜２．５Ｍの範囲の濃度のアンモニウム塩を含む洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄しそして、
(c) アンモニウム塩を含む溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、このときの溶出バッファがアンモニウム塩に関する勾配バッファであるものであり、第VII因子ポリペプチドの精製した薬剤物質を溶出物として回収する
という工程を含んでなり、このときの工程(b)と(c)は組み合わせてもよい方法。
【請求項１７】
工程(c)の溶出バッファがアンモニウム塩に関する勾配バッファであり、このときの勾配バッファのアンモニウム塩の開始濃度が１．８〜２．２Ｍの範囲であり、勾配バッファのアンモニウム塩の終濃度が１．２〜１．６の範囲である、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
工程(a)〜(c)の温度が０〜２５℃の範囲であり、工程(a)〜(c)のｐＨが６〜９の範囲である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は第VII因子ポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィ(ＨＩＣ)精製のための方法に関する。本方法は、特定の濃度の疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と塩ないしは双性イオン、又はその両方の組み合わせを利用するものである。
【０００２】
（発明の背景）
例えば、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子及びプロテインＣを含む凝固カスケードに関与するタンパク質は、様々な病理学的状態を治療するために有用な治療的薬剤であることが判明している。したがって、薬学的に受容可能であって、均一かつ所定の臨床有効性を表すこれらのタンパク質を含有してなる製剤の必要性が増している。第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製のための全般的な産業的規模の方法は、かなりの量の生成物関連の(第VII因子関連の)不純物(例えば遅発型溶出ピークに包含される不純物(異なるレベルのＮ結合グリコシル化を有するグリコ-変異体(「デス-Ｎ-グリカン型」)を含む)、酸化型、タンパク質分解型(重鎖切断型)、又は対象とする第VII因子ポリペプチドよりも大きな分子量を有する凝集塊)を含むという欠点に悩まされうることがある。もちろん、これは望ましいことでなく、場合によって容認できないものである。
【０００３】
文献「Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells」, Biochemistry, 1988 Oct 4; 27(20): 7785-93は、いくつかの重鎖分解性生成物がインタクトな活性型第VII因子により共精製することを報告する。
文献「FVIIa derivatives obtained by autolytic and controlled cathepsin G mediated cleavage」 FEBS Lett. 1993 Feb 15; 317(3): 245-9は、第VII因子の重鎖切断型が非変性条件下で第VII因子から単離することができないことを述べている。
米国特許第６７７７３９０号(Baxter)は、ＡＩＥＸとその後のフェニル-セファロース上の疎水性クロマトグラフィによるクリオ上清からの第VII因子の精製に関する。
本発明の発明者の知識の限りでは、産業規模の方法でのＦVIIポリペプチドの薬剤物質における生成物関連の不純物の除去の課題は従来技術で解決されなかった。
【０００４】
（発明の簡単な説明）
本発明は、組み換えて作製した第VII因子ポリペプチドの薬剤物質中の生成物関連の不純物の含有量を低減するための方法、特に、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製方法であって、
(a) 疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含むものであり；
(b) 場合によって洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄し；そして、
(c) 溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質を溶出物として回収する；
という工程を含んでなり、それによって、本明細書中に定められる方法によって決定される生成物関連の不純物の含有量が、工程(a)に用いられる薬剤物質に含有される含有量と比較して、少なくとも５０％(w/w)に減少している方法に関する。
【０００５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷによるｒｈＦVII分離のクロマトグラムである(実施例１参照)。
図２は、ＴＳＫフェニル５ＰＷによるＦVIIa類似体分離のクロマトグラムである(実施例３参照)。
図３は、生成物ピークの全体にわたる不純物の溶出を例示する(実施例３参照)。
図４は、ＴＳＫフェニル５ＰＷによるＦVIIa類似体分離のクロマトグラムである(実施例４参照)。
図５は、１８５、１４０及び９０ｋＤａの高分子化合物を示すＨＩＣ負荷のＳＤＳ-ＰＡＧＥを例示する。
図６は、１８５、１４０及び９０ｋＤａの高分子化合物がほとんど取り除かれたことを示すＨＩＣプールのＳＤＳ-ＰＡＧＥを例示する。
図７は、ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷによるｒｈＦVII分離のクロマトグラムである(実施例６参照)。
図８は、ＧＤ-ＦVIIの部分的な除去を例示するＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルである。レーン１：ｍｗ標準物質、レーン２：負荷試料、レーン３：リーディングエッジ、レーン４：メインピーク、レーン５：テーリングエッジ、実施例６参照。 
図９は、ＦVII及びその生成物関連の不純物のＨＰＬＣクロマトグラムを例示する。 
図１０は、２０℃のＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたＦVIIaのＨＩＣ精製による他の生成物関連の不純物と遅発型溶出ピークの低減を例示する。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
現在、本発明の発明者等は、塩及び／又は双性イオンが用いられる特定の疎水性相互作用クロマトグラフィ手順に従うことによって、薬剤物質中の特定の生成物関連の不純物の存在を低減、又は実質的に取り除くことができることを明らかにした。特に、(ヒトＦVIIの)位置Ａｓｎ１４５及び／又はＡｓｎ３２２にＮ-グリカンを持たないＮ-グリコ変異体を含む「遅発型溶出ピーク」といった不純物の存在は低減されうる。
【０００７】
本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィを用いた、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製のための方法を提供する(請求項１を参照)。
したがって、本発明による方法は、特に、初めにかなりの量の遅発型溶出ピーク、すなわち、第VII因子ポリペプチドの総量の少なくとも２％(w/w)の遅発型溶出ピークのプールを有する第VII因子ポリペプチドの薬剤物質に関連する。場合によって、第VII因子ポリペプチドの産業規模の薬剤物質は、さらに多くの量の遅発型溶出ピーク、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、又は少なくとも５％、ときにはおよそ最大１０〜１２％にも達する遅発型溶出ピークを含み得、本発明の方法はそのような薬剤物質にさらに関連することが理解されるであろう。このような薬剤物質は発酵プロセスから直接選られうるが、より一般的には初めの粗生成物の精製の結果として得られうる。
さらに、本発明は、初めにかなりの量の酸化型、タンパク質分解型、及び／又は対象とする第VII因子ポリペプチドの薬剤物質よりも大きな分子量を有する凝集塊、すなわち、第VII因子ポリペプチドの総量の少なくとも２％(w/w)のタンパク質分解型及び／又は第VII因子ポリペプチドの総量の少なくとも１％(w/w)の酸化型のプールを有する第VII因子ポリペプチドの薬剤物質に関連する。
【０００８】
第VII因子ポリペプチドと組み合わせて用いる場合、生成物関連の不純物(例えば遅発型溶出ピーク)の割合(％)はタンパク質(生成物＋生成物関連の不純物)の総含有量の重量百分率として表される。 
したがって、生成物関連の不純物(例えば遅発型溶出ピーク)の２分の１の低減、例えば２％から１％への低減は、５０％の相対的な減少である；したがって、例えば８％から２％への低減は、４分の１の低減、すなわち７５％の相対的な減少を示す；そして、１２％から６％への低減は、生成物関連の不純物の含有量の２分の１の低減であり(すなわち５０％の減少)、６％-程度の減少ではない。
【０００９】
「生成物関連の不純物」なる用語には、異なるレベルのＮ結合グリコシル化を有するグリコ-変異体(ヒトＦVIIの例えば位置Ａｓｎ１４５及び／又はＡｓｎ３２２に一又は複数のＮ-結合グリカンを持たない第VII因子ポリペプチドを含む)、酸化型、タンパク質分解型(分子の重鎖の自己触媒分解)及び対象とする第VII因子ポリペプチドよりも大きな分子量を有する凝集塊(ダイマー、オリゴマー、ポリマーを含む)が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００１０】
遅発型溶出ピーク-不純物の正確な化学的構成は部分的に未知であるままであるが、「遅発型溶出ピーク」なる表現は、対象とする第VII因子ポリペプチドよりも相対的に滞留時間が長い第VII因子ポリペプチド関連の構造、おそらく第VII因子ポリペプチドが一又は複数の(例えば一方又は両方の)Ｎ-結合グリカンを欠いている形態などの望ましくないグリコフォームを意味することを意図する。
「遅発型溶出ピーク」の「相対的な滞留」(対象とするＦVIIポリペプチド、例えばｒＦVIIaとの相対)は、後述の一般法にて説明するような、ＲＰ-ＨＰＬＣアッセイを用いて決定される。
定量化のために、このような「遅発型溶出ピーク」の相対的な滞留時間(ＲＲ)は、一般的にＲＰ-ＲＰＬＣ分析法によって決定されるところの１．０４０から１．３００である(１．０００でのｒＦVIIaメインピーク)。
後述の一般法にて説明するように、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の遅発型溶出ピークの含有量を決定することができる。
【００１１】
第VII因子ポリペプチドの薬剤物質中の、第VII因子ポリペプチドの酸化型、タンパク分解型、及び高分子量型(ダイマー、オリゴマー、凝集塊)は、後述の一般法にて説明するように決定することができる。
限定するものではないが、本発明の方法は、第VII因子ポリペプチドの「産業的規模の」(又は「大規模な」)薬剤物質に特に適する。「産業的規模」なる用語は、一般的に、液体の第VII因子ポリペプチド組成物の容量が少なくとも１０Ｌ、例えば少なくとも５０Ｌ、例えば少なくとも５００Ｌ又は少なくとも５０００Ｌであるか又は、生成物の重量が少なくとも１ｇ(乾燥物)、例えば少なくとも１０ｇ、例えば少なくとも５０ｇ、例えば１〜１０００ｇである方法を意味する。
【００１２】
本明細書中の「薬剤物質」なる表現は、固形質量並びに液体質量、例えば第VII因子ポリペプチドを含む溶液又は懸濁液を意味することを意図する。「薬剤物質」なる表現は、特に「大きな」容量又は質量を指す、すなわち、大規模な方法及び産業的規模の方法から既知の容量及び質量を指すことを意味する。
「第VII因子ポリペプチド」なる用語はさらに後述で定義される。
【００１３】
本明細書中で用いられる「塩」なる表現は、第VII因子ポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質に結合するくらいに相対的に疎水性にしうる一又は複数の塩類を指すことを意図する。塩類の好適な例は、特定の陽イオン及び特定の陰イオンの組合せから選択されるものである。陽イオンのグループにはアンモニウム、ナトリウム及びカリウムが含まれ、陰イオンのグループには硫酸塩、酢酸塩及び塩化物が含まれる。塩類の例は、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カリウム及び硫酸カリウムである。好適な塩類は、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムである。好適な塩類の他のグループには、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び酢酸ナトリウムが含まれる。
【００１４】
以下の表では、２０℃での溶解性(飽和)及び一連の有用な塩類の８５％の飽和に相当するモル濃度を示す。
表
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【００１５】
「双性イオン」なる表現は、陰極及び陽極の電荷を伝えるが、中性分子を形成するイオンを意味することを意図する。有用な双性イオンの例は、中性アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、β-アラニン、ロイシン、イソロイシンなど、特にグリシン及びβ-アラニンである。
【００１６】
工程(a)−疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質との接触
方法の第一工程では、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質は、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させる。薬剤物質は(負荷溶液の温度で)０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含む。この目的は、前記疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への第VII因子ポリペプチドの一部の前記薬剤物質の結合を容易にすることである。特に好適な実施態様では、薬剤物質は０．５Ｍから飽和濃度の８５％の範囲の濃度、例えば０．７〜２．２Ｍの塩を含む。
【００１７】
特定の塩の飽和濃度(及びそれによる飽和濃度の８５％を成す濃度)は用いる実際の温度によって異なるであろう。例えば飽和濃度は通常２０℃の場合より５℃の場合の法が低いであろう。特に有用な塩類の２０℃の溶解性(飽和)を上記する。他の塩類の２０℃の溶解性並びに他の温度(例えば５℃)の溶解性は、一般的な化学の便覧、例えばThe CRC Handbook of Chemistry and Physics (CRC Press)などでわかるであろう。あるいは、水中での特定の固形物(塩)の溶解のための溶解曲線は、変化する既知の容量の水に既知の重量の塩を溶解し、それぞれの濃度で溶液を冷まし、塩が溶液から結晶化し始める温度を測定することによって容易に得られる。つまり、特定の重量の塩に対して、水の量を次第に増加し、各々の増加に対して、飽和点に達するために必要な温度を測定する。各々の飽和温度に対する水の重量及び塩の重量は、その温度に対する飽和溶液の濃度を表し、１００ｇ水当たりのｇ塩で表される。次いで、溶解曲線は、ｘ軸上の飽和温度に対するｙ軸上に１００ｇ水当たりのｇ塩をプロットすることによって描かれる。したがって、固形物の溶解性は、１リットルの液体に溶解する塩のモル数として、又は固形物のモル分率として、又は、本実施例では１００ｍｌの液体に溶解する固形物のグラム数として表されうる。
【００１８】
「０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲」なる用語は、０．５Ｍから一又は複数の工程(負荷(a)、洗浄(b)、溶出(c))が実施される実際の温度での特定の塩の飽和濃度の８５％までの範囲を意味することを意図すると理解されるであろう。
工程(a)と関連する「一部」なる用語は、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質に存在する第VII因子ポリペプチドの質量の少なくとも３０％(すなわち３０〜１００％)を意味する。ほとんどの場合、第VII因子ポリペプチドの質量のはるかに３０％より多く、例えば少なくとも５０％又は少なくとも７０％又は主な部分を結合することが望ましいと理解されるであろう。「主な部分」なる用語は、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質に存在する第VII因子ポリペプチドの質量の少なくとも９０％を意味する。好ましくは、さらに多い部分、例えば第VII因子ポリペプチドの薬剤物質に存在する第VII因子ポリペプチドの質量の少なくとも９５％、又は質量の少なくとも９８％、又は質量の少なくとも９９％、又は質量の実質的にすべてを疎水性相互作用クロマトグラフィ物質に結合するようになる。
【００１９】
一般的に、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質は、産業的規模の生産プロセス、例えば細胞培養、微生物プロセス、クローン動物(例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及び魚)又は昆虫等、特に細胞培養から生じる。 
疎水性相互作用クロマトグラフィ物質は、疎水性配位子、例えばエチル、ブチル、フェニル又はヘキシル(タンパク質結合を担うと思われる)と置換される基質である。好適な物質は、ブチル配位子及び／又はフェニル配位子に置換されるものである。物質は、多くの場合ビーズの形態、例えば０．１〜１０００μｍの範囲の平均直径を有する粒子状物質、又は棒状、膜状、ペレット状、モノリス状などの形態で存在することが多い。
疎水性相互作用クロマトグラフィ物質で最も一般的な配列はカラム形式である。バッチ容器の配列もまた可能である。
【００２０】
一般的に、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質は、先行する精製工程、又は必要ないしは有用である場合には後にｐＨ、イオン強度、二価金属イオンのキレート化などを有する先行する精製工程から直接得られる。 
一般的に、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の接触は、従来のプロトコールに従って実施される。すなわち薬剤物質の濃度、温度、イオン強度などは通常通りでよく、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質は洗浄して平衡化してから、通常通り用いてもよい。 
第VII因子ポリペプチドの負荷は、一般的に１リットルの基質(ＨＩＣ物質)当たり少なくとも２５０ｍｇ、例えば１リットルの基質(湿性の疎水性相互作用クロマトグラフィ物質)当たり０．５〜１０．０ｇ、例えば２．０〜５．０ｇの第VII因子ポリペプチドの範囲であり、一般的には薬剤物質は１時間当たり１〜５０カラム容量の流量で負荷される。
【００２１】
疎水性相互作用クロマトグラフィ物質に用いる前及び用いる際の薬剤物質のｐＨは、遅発型溶出ピークの形成に関連する役割を果たすようである。したがって、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質に用いる際には、薬剤物質が液体状態であり、３．０〜１０．０の範囲、例えば３．０〜７．０又は６．５〜１０．０の範囲のｐＨを有することが好ましい。いくつかの興味深い実施態様では、薬剤物質は４．０〜７．０の範囲、又は７．０〜９．０の範囲、又は４．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。好適なｐＨ範囲は５．０〜６．５である。
カルシウムイオンの含有量は、第VII因子ポリペプチドの安定性と関連して役割を果たしうる。いくつかの好適な実施態様では、工程(a)の薬剤物質は、少なくとも５ｍＭ、例えば５〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンの濃度を有する。このような場合には、好適なｐＨ範囲は５．０〜９．５である。
【００２２】
一般的に、伝導率は少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、例として少なくとも５０ｍＳ／ｃｍ、例として少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、例として少なくとも２００ｍＳ／ｃｍである。 
一般的に、薬剤物質の温度は、０〜２５℃、例としておよそ２〜１０℃又は２〜８℃である。一般的に、結合した第VII因子ポリペプチドを有する疎水性相互作用クロマトグラフィ物質の温度は、０〜２５℃、例としておよそ２〜１０℃又は２〜８℃であり、例えば冷却カバー及び温度を調節した溶液を用いることによって特定の範囲内に保たれる。
【００２３】
工程(b)−洗浄工程(任意)
一般的に、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の結合の後、洗浄工程(b)は、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質から遅発型溶出ピークの実質的分画を取り除くために実施される。この工程によって、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質上に残っている(結合した)第VII因子ポリペプチドの分画は、非常に少ない量の遅発型溶出ピークを有するであろう。
また、洗浄バッファ中の塩及び／又は双性イオンの含有は特定の利点を提供することがわかった。ゆえに、好ましくは、工程(b)の洗浄バッファは０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含む。最も好ましくは、洗浄バッファの塩及び／又は双性イオンの濃度は、工程(a)の薬剤物質中の塩の濃度の±０．１Ｍの範囲内である。特に好適な実施態様では、洗浄バッファは０．５Ｍから飽和濃度の８５％の範囲の濃度、例えば０．７〜２．２Ｍの塩を含む。
【００２４】
この洗浄工程(b)は２．０〜６．９の範囲のｐＨを有する洗浄バッファにて行うことが好ましい。いくつかの興味深い実施態様では、洗浄バッファは、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質に用いる際に、３．０〜１０．０の範囲、例えば３．０〜７．０又は６．５〜１０．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの興味深い実施態様では、洗浄バッファは４．０〜７．０の範囲、又は７．０〜９．０の範囲、又は４．５〜８．５の範囲のｐＨを有する。
上記の工程(a)のように、カルシウムイオンの存在は特定の役割を果たすようである。ゆえに、一般的に、工程(b)の洗浄バッファは、少なくとも５ｍＭ、例えば５〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンの濃度を有する。
【００２５】
一般的に、洗浄工程(b)は１時間当たり１〜５０のカラム容量の流速で実施される。
一般的に、洗浄バッファは、緩衝剤を含む水溶液であり、一般的に、緩衝剤は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸(例えば酢酸ナトリウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸及びコハク酸からなる群から選択される少なくとも一の成分を含む。緩衝剤が２以上の成分の混合物を含み、この混合物が特定の範囲のｐＨ値を提供しうることが理解されるであろう。実施例では酢酸及び酢酸ナトリウムなどを言及する。
洗浄工程(b)は１、２又はいくつかの異なる洗浄バッファを用いて、又は勾配洗浄バッファを用いて行ってもよい。
また、洗浄工程と溶出工程は別々の工程である必要はないが、特に溶出工程で勾配溶出バッファが用いられる場合には組み合わされうることを注記する。
【００２６】
工程(c)-溶出工程
一又は複数の洗浄工程(c)の後、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質は溶出バッファにて溶出され、第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質は溶出液として回収される。
溶出工程(c)には多くの変更が考えられうる。
前述の工程のように、溶出バッファもまた塩及び／又は双性イオンを含むことが好ましい。
【００２７】
したがって、溶出の種類は特に重要でなく、例えば、段階的に減少する勾配の塩及び／又は双性イオンを含む溶出バッファにて溶出する、線形的に減少する勾配の塩(段階的線形勾配(gradient-hold-gradient)ないしはその他の勾配)にて溶出する、又はｐＨ勾配を用いる、又は温度勾配を用いる、又は上記の組み合わせを用いてもよい。あるいは、カルシウムキレート化合物(例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩、マロン酸塩など)又は水より極性の低い溶媒(例えばエタノール、ＰＥＧ、２-プロパノールなどを含む水溶性の溶液)の勾配を溶出バッファとして用いてもよい。
【００２８】
一実施態様では、溶出バッファは０．７〜２．２Ｍの範囲の開始濃度の塩を含む。
一実施態様では、溶出バッファはカルシウムキレート化合物を含まない。他の実施態様では、溶出バッファはＥＤＴＡ及び／又はクエン酸塩を含まない。一実施態様では、溶出バッファはカルシウム塩を含む；他の実施態様では、カルシウム塩を含まない。一実施態様では、本発明に係る方法はカルシウム塩の存在下にて実施される；他の実施態様では、本発明に係る方法はカルシウム塩の非存在下にて実施される。
【００２９】
したがって、現在最も好適な実施態様では、工程(c)の溶出バッファはアンモニウム塩に関する勾配バッファであり、勾配バッファのアンモニウム塩の開始濃度は１．７〜２．２Ｍの範囲であり、勾配バッファのアンモニウム塩の終濃度は０．０〜１．６Ｍの範囲である。
最終的な溶出バッファの伝導率は工程(a)の薬剤物質を含有する組成物の伝導率より低いことが好ましい。
多くの場合、一般的に、工程(c)の溶出バッファは工程(a)及び(b)のようなｐＨを有する。
また、工程(c)の溶出バッファは、少なくとも５ｍＭ、例えば５〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンの濃度を有する実施態様が好ましい。
一般的に、溶出工程(c)は１時間当たり１〜５０のカラム容量の流速で実施される。
【００３０】
「精製された薬剤物質」なる用語は、結果として生じる薬剤物質、すなわち工程(c)で回収された薬剤物質は、工程(a)に用いた薬剤物質よりも遅発型溶出ピークといった生成物関連の不純物の含有量が低い。「精製」なる用語は、精製された薬剤物質が得られる方法、すなわち本発明の方法を指す。
一般的に、本発明の方法は、薬剤物質中の生成物関連の不純物の初めの含有量の少なくとも５０％、又は該含有量に対して少なくとも５０％の相対量の生成物関連の不純物(遅発型溶出ピークを含む)の含有量を減らすことができるが、より好ましくかつ現実的には、相対的な減少量は少なくとも６０％、例として少なくとも７０％、又はさらに少なくとも８０％又は少なくとも８５％である。
【００３１】
一実施態様では、生成物関連の不純物は遅発型溶出ピークである。他の実施態様では、生成物関連の不純物は一又は複数のＮ-結合グリカンを持たない第VII因子ポリペプチドである。他の実施態様では、生成物関連の不純物は、酸化型、タンパク質分解型(分子の重鎖の自己触媒分解)又は対象とする第VII因子ポリペプチドよりも大きな分子量を有する凝集塊(ダイマー、オリゴマー、ポリマーを含む)である。他の実施態様では、生成物関連の不純物は上述の形状、ピーク及びグリカン欠失形状の一又は複数の混合物を含む。
さらに、非常に効率的な本発明の方法は、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質からの遅発型溶出ピークなどの生成物関連の不純物の除去を可能にし、更にこのような遅発型溶出ピークの形成の抑制を可能にする。
【００３２】
したがって、好適な実施態様では、工程(c)で回収された第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質は、工程(a)の薬剤物質と比較して５０％未満、例えば４０％未満又は３０％未満の遅発型溶出ピークを含む。
一実施態様では、工程(c)で回収された第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質の酸化型の含有量は、工程(a)の薬剤物質の含有量と比較して、少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％又は４５％減少する。他の実施態様では、工程(c)で回収された第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質のタンパク質分解型の含有量は、工程(a)の薬剤物質の含有量と比較して、少なくとも３０％、例えば少なくとも３２％又は３８％減少する。他の実施態様では、工程(c)で回収された第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質中の一又は複数のＮ-結合グリカンを持たない第VII因子ポリペプチド(デス-Ｎ-グリカン型)の含有量は、工程(a)の薬剤物質の含有量と比較して、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％又は７５％減少する。
より具体的には、第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質は、遅発型溶出ピークの多くとも５％、例として多くとも２．０％、又は多くとも１．５％、好ましくは多くとも１．０％又は多くとも５％を含む。
【００３３】
通常、疎水性相互作用クロマトグラフィ物質は一連の工程によってその後の使用の目的のために再生する。
洗浄工程と溶出工程は別々の工程である必要はないが、特に溶出工程で勾配溶出バッファが用いられる場合には組み合わされうることを注記する。
【００３４】
好適な実施態様
本発明は、第VII因子ポリペプチドの精製した薬剤物質を得るために特に有用であり、さらに、ｐＨに関して工程(a)−(c)の条件が適切に選択される場合、遅発型溶出ピークの形成を低減し、それにより方法全体の収率を増加することができる。
したがって、本発明の好適な実施態様は、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製のための方法であって、該薬剤物質が少なくとも３％の遅発型溶出ピークを含むものであり、
(a) 疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が１．５〜２．５Ｍの範囲の濃度のアンモニウム塩を含むものであり；
(b) １．５〜２．５Ｍの範囲の濃度、典型的には工程(a)と実質的に同じ濃度のアンモニウム塩を含む洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄し；そして、
(c) アンモニウム塩を含む溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、この溶出バッファがアンモニウム塩に関する勾配バッファであり、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質を溶出物として回収する
という工程を含んでなり、この工程(b)と(c)が組み合わされうる方法を提供する。
【００３５】
好ましくは、工程(c)の溶出バッファはアンモニウム塩に関する勾配バッファであり、勾配バッファのアンモニウム塩の開始濃度は１．８〜２．２Ｍの範囲であり、勾配バッファのアンモニウム塩の終濃度は０．０〜０．２Ｍの範囲である。アンモニウム塩は(カルシウムがないとき)酢酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムであることが好ましい。
【００３６】
第VII因子ポリペプチド
本明細書中で用いられる「第VII因子ポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)、その変異体、並びに第VII因子関連ポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを包含する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すＦVII変異体、第VII因子関連ポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
【００３７】
「第VII因子」なる用語は、それらの非切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチド、並びにそれぞれの生理活性型を得るためにタンパク質分解されてプロセシングされているもの(第VIIa因子とも称されうる)を包含することを意味する。一般的に、第VII因子は残基１５２と１５３の間で切断されて第VIIa因子を生じる。第VII因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合、変更された特定の活性などを含め、ヒトの第VII因子と比べて異なる性質を表してもよい。また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」は各個体に存在し、各個体で生じる天然の対立遺伝子変異体を含む。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞及び宿主細胞の環境の性質に応じて異なりうる。
また、「第VII因子ポリペプチド」なる用語は、第VIIa因子の生物学的活性が野生型第VIIa因子の活性と比較して実質的に修飾されている、ないしはいくらか減少している変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、ポリペプチドの生理活性を修飾するか又は破壊する特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第VII因子又は第VIIa因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
血液凝固の際の第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 組織因子(ＴＦ)に結合する、及び(ii) 第IX因子又は第X因子のタンパク質分解性の切断を媒介して活性化した第IX因子又は第X因子(それぞれ第IXa因子又は第Xa因子)を生成するという能力に由来する。
本発明のために、第VII因子ポリペプチドの生物学的活性(「第VII因子生物学的活性」)は、調製物の血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化されうる(本明細書中のアッセイ４を参照)。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第VII因子活性を含むプールしたヒト血清標準物質との比較により、「第VII因子単位」に変換される。あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 脂質膜に包埋されたＴＦ及び第X因子を含む系における第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドの活性化第X因子(第Xa因子)生産能の測定(Persson等, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii) 水性の系における第X因子の加水分解の測定(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、下記のアッセイ２を参照)；(iii) 表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)を基礎とする装置を用いた、第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的な結合の測定(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(iv) 第VIIa因子及び／又は第VII因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解の測定(「インビトロ加水分解アッセイ」、下記のアッセイ１を参照)；及び(v) ＴＦ-非依存性インビトロ系におけるトロンビンの生成の測定(下記のアッセイ３を参照)によって、定量化されうる。
【００３９】
野生型第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は改善された生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された第VIIa因子の特定の活性の少なくともおよそ２５％、好ましくは少なくともおよそ５０％、より好ましくは少なくともおよそ７５％及び最も好ましくは少なくともおよそ９０％を表すものを包含する。野生型第VIIa因子と比較して実質的に低減した生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された第VIIa因子の特定の活性のおよそ２５％未満、好ましくはおよそ１０％未満、より好ましくはおよそ５％未満及び最も好ましくはおよそ１％未満を表すものを包含する。野生型第VII因子と比較して実質的に修飾された生物学的活性を有する第VII因子変異体には、ＴＦ-非依存性第X因子タンパク質分解活性を示す第VII因子変異体及びＴＦを結合するが第X因子を切断しない変異体が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００４０】
野生型第VII因子と実質的に同じかより良好な生理活性を示すか、ないしは野生型第VII因子と比較して実質的に修飾されたか低減した生理活性を示す第VII因子の変異体には、一又は複数のアミノ酸を挿入、欠失又は置換することによって野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これに限定するものではない。
【００４１】
野生型第VII因子と実質的に同じ生物学的活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦVIIa、Ｓ６０Ａ-ＦVIIa(Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示されるタンパク質分解安定性が増加しているＦVIIa変異体；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解されて切断されている第VIIa因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第VIIa因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されるＦVII変異体；及び、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示される、タンパク質分解安定性が増加しているＦVII変異体；国際公開第９９／２０７６７号(University of Minnesota)に開示される、修飾したＧｌａ-ドメインを有し、膜結合性の亢進を示すＦVII変異体；及び、国際公開第０１／５８９３５号(Maxygen ApS)に開示されるＦVII変異体が含まれる。
【００４２】
野生型ＦVIIaと比較して増加した生物学的活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、国際公開第０３／２７１４７号、国際公開第０３／３７９３２号に開示されるＦVII変異体；国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)；及び、特願２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示される、亢進した活性を有するＦVIIa変異体が含まれる。
【００４３】
また、「第VII因子ポリペプチド」なる用語は、第VIIa因子の生物学的活性が野生型第VIIa因子の活性と比較して実質的に修飾されている、ないしはいくらか減少しているが、典型的には第VII因子に有意なレベル、例として、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９３％、少なくともおよそ９５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性(例えばおよそ９７、９８又は９９％の同一性)を保持している変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、ポリペプチドの生理活性を修飾するか又は破壊する特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第VII因子又は第VIIa因子が含まれるが、これらに限定されるものではない(本明細書中でさらに例証される)。
【００４４】
本明細書中で用いられる「第VII因子誘導体」なる用語は、野生型第VII因子と比較して実質的に同じか又は改善された生物学的活性を示すＦVIIポリペプチドを表すことを意図し、このＦVIIポリペプチドにおいて、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に修飾されている。これには、ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。第VII因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国公開特許第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されるグリコＰＥＧ化ＦVII誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国公開特許第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国公開特許第２００３０２１１０９４号(University of Minnesota)に開示されるＦVIIコンジュゲート；及び、国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国公開特許第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)、及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示されるＦVII変異体が含まれる。
【００４５】
「増加した−」又は「改善された生物学的活性」なる用語は、i) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有するＦVIIポリペプチド、又はii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したＴＦ結合活性を有するＦVIIポリペプチド、又はiii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有するＦVIIポリペプチドを指す。「ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。ＰＥＧ分子が第VIIa因子ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基又は糖鎖を含む第VIIa因子ポリペプチドのいずれかの部分に付着しうることは理解されるであろう。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されるシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされるＰＥＧ分子を有する第VIIa因子を意味する。
【００４６】
野生型第VII因子と比較して実質的に低減した又は修飾した生物学的活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、R152E-FVIIa (Wildgoose等, Biochem 29:3413-3420, 1990)、S344A-FVIIa (Kazama等, J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995)、FFR-FVIIa (Holst等, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998)、及びＧｌａドメインを持たない第VIIa因子(Nicolaisen等, FEBS Letts. 317:245-249, 1993)が含まれる。
第VII因子ポリペプチドの例には、野生型第VII因子、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、and S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A -FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、Ｓ５２Ａ-第VII因子、Ｓ６０Ａ-第VII因子； Ｒ１５２Ｅ-第VII因子、Ｓ３４４Ａ-第VII因子、Ｇｌａドメインを欠いている第VIIa因子；及び、P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVI；及び、２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII、及びアミノ酸配列Ｉｌｅ１５３−Ａｒｇ２２３に置換、付加又は欠失を有するＦVIIが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００４７】
したがって、第VII因子ポリペプチドの置換変異体には、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｌ３０５、Ｌ３０５、Ｆ３７４、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７の置換、及びＴ２３３からＮ２４０又はＲ３０４からＣ３２９；又はＩ１５３からＲ２２３のアミノ酸配列の置換、付加又は欠失、又はそれらの組合せ、特にＰ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔといった変異体、及び、Ｔ２３３からＮ２４０、又はＲ３０４からＣ３２９、又はＩ１５３からＲ２２３のアミノ酸配列の置換、付加又は欠失、又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは組み換えて作製したヒト第VIIa因子(ｒｈVIIa)である。
他の実施態様では、第VII因子ポリペプチドは第VII因子配列変異体である。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒト第VII因子と異なるグリコシル化を有する。 
様々な実施態様では、例えば第VII因子ポリペプチドが第VII因子関連のポリペプチド又は第VII因子配列変異体である場合、第VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第VIIa因子(野生型ＦVIIa)の活性との間の比率は、本明細書中に記載の「インビトロタンパク質分解アッセイ」(アッセイ２)にて試験されると、少なくともおよそ１．２５、好ましくは少なくともおよそ２．０、又は４．０、最も好ましくは少なくともおよそ８．０である。
【００４９】
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは第VII因子関連のポリペプチド、特に、該第VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第VIIa因子(野生型ＦVIIa)の活性との間の比率が、「インビトロ加水分解アッセイ」(下記のアッセイ１を参照)にて試験される場合に少なくともおよそ１．２５である変異体である。他の実施態様では、その比率が少なくともおよそ２．０である。更なる実施態様では、その比率が少なくともおよそ４．０である。
【００５０】
第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質の使用
第VII因子ポリペプチドの精製された薬剤物質に相当する分画の収集の後、溶液に調製し、バイアルに分注して、凍結乾燥してもよいし又はそのまま保存してもよい。市販の、組み換えて作製されたＦVIIポリペプチド組成物に相当する最終生成物の例として、１．２ｍｇ 組み換えヒト第VIIa因子、５．８４ｍｇ ＮａＣｌ、２．９４ｍｇ ＣａＣｌ２、２ Ｈ２Ｏ、２．６４ｍｇ ＧｌｙＧｌｙ、０．１４ｍｇ ポリソルベート８０及び６０．０ｍｇ マンニトールを含有するバイアル(１．２ｍｇ)であるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ(登録商標)(Novo Nordisk A/S, Denmark)が述べられる。この生成物は、使用の前に２．０ｍｌの注射用蒸留水(ＷＦＩ)によってｐＨ５．５に再構成される。再構成の場合、タンパク質溶液は２４時間の使用に安定である。
組み換え活性化第VII因子(ｒＦVIIa)の全体的な製造は、Thrombosis and Hemostasis, Vol. 27, No. 4, 2001のセミナーにおいてJurlander等によって示される。
【実施例】
【００５１】
一般法
第VII因子ポリペプチドの生物学的活性を決定するために適するアッセイ
本発明に有用な第VII因子ポリペプチドは、簡単な事前のインビトロ試験として実施されうる適切なアッセイによって選択されうる。したがって、本明細書は、第VII因子ポリペプチドの活性のための簡易試験(「インビトロ加水分解アッセイ」と称する)を開示する。
【００５２】
第一の生成凝固アッセイ
基本的には国際公開第９２／１５６８６号又は米国特許第５９９７８６４号に記述されるように、第VII因子ポリペプチドの活性を１-段階(one-stage)凝固アッセイを用いて測定してもよい。簡単に言うと、試験する試料を、５０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．１％ＢＳＡにて希釈して、１００μlを、１００μｌの第VII因子欠損血漿及び２００μｌの１０ｍＭ Ｃａ２＋を含むトロンボプラスチンＣとともにインキュベートする。凝固時間を測定し、参照標準物質又は階段希釈のクエン酸塩加の正常ヒト血漿の貯留(プール)を用いた標準曲線と比較する。
【００５３】
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)
天然の(野生型)第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降ともに「第VIIa因子」と称する)を特定の活性についてアッセイしてもよい。また、これらはアッセイすると同時に、特定の活性を直接比較してもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)にて行う。発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(S-2288、Chromogenix, Sweden)を終濃度１ｍＭで、第VIIa因子(終濃度１００ｎＭ)を含む０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に加える。SpectraMaxTM 340プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続的に測定する。酵素を含まない空のウェルの吸光度を減算した後、２０分間のインキュベートの間に反応する吸光度を用いて、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子との活性の比率を算出する：
比率＝(Ａ４０５ｎｍの第VII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍの第VIIa因子野生型)
これを元に、天然の第VIIa因子よりも活性が低い、同等又は高い第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超えるものである第VII因子ポリペプチドが同定されうる。
また、第VII因子ポリペプチドの活性は、１００〜１０００ｎＭの濃度に適する、第X因子などの生理学的基質を用いて測定されうる(「インビトロタンパク質分解アッセイ」)。このアッセイでは生成された第Xa因子が適切な発色基質(例えばＳ-２７６５)を加えた後に測定される。さらに、活性アッセイは生理学的温度で行ってもよい。
【００５４】
インビトロタンパク質分解アッセイ(アッセイ２)
天然の(野生型)第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降ともに「第VIIa因子」と称する)はアッセイすると同時に、特定の活性を直接比較してもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)にて行う。第VIIa因子(１０ｎＭ)及び第X因子(０．８μＭ)を含む、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４ １００μｌを１５分間インキュベートする。次いで、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４ ５０μｌを加えて第X因子切断を止める。生成された第Xa因子の量は、発色基質Ｚ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(S-2765、Chromogenix, Sweden)を終濃度０．５ｍＭで加えて測定する。SpectraMaxTM 340プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続的に測定する。ＦVIIaを含まない空のウェルの吸光度を減算した後、１０分間反応する吸光度を用いて、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子のタンパク質分解活性の比率を算出する：
比率＝(Ａ４０５ｎｍの第VII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍの第VIIa因子野生型)
これを元に、天然の第VIIa因子よりも活性が低い、同等又は高い第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超えるものである第VII因子ポリペプチドが同定されうる。
【００５５】
トロンビン生成アッセイ(アッセイ３)
第VII因子ポリペプチドのトロンビン生成能は、生理的濃度のすべての関連する凝固因子及びインヒビター(血友病Ａ症状を模倣する場合の第VIII因子を含まない)、及び活性化血小板(参照により本明細書中に組み込まれるMonroe等 (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547の５４３ページに記述される)を含むアッセイ(アッセイ３)にて測定することができる。
【００５６】
１-段階(One-stage)凝固アッセイ(凝固アッセイ)(アッセイ４) 
また、第VII因子ポリペプチドは、１-段階(one-stage)凝固アッセイ(アッセイ４)を用いて、特定の活性(「凝固活性」)について試験してもよい。この目的のために、試験する試料を５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ-バッファ(ｐＨ７．２)、１％ＢＳＡにて希釈し、４０μｌを４０μｌの第VII因子欠損血漿及び８０μｌの１０ｍＭ Ｃａ２＋及び合成リン脂質を含むヒトの組み換え組織因子とともにインキュベートする。凝固時間(凝血時間)を測定して、類似のアッセイにて参照標準物質を用いた標準曲線と比較する。
【００５７】
「相対的な滞留時間」、及び酸化型ＦVII、重鎖分解ＦVII及び「遅発型溶出ピーク」の含有量の測定に適するＲＰ-ＨＰＬＣアッセイ
「遅発型溶出ピーク」は、例えば以下に記載するようなＲＰ-ＨＰＬＣアッセイにおける対象の第VII因子ポリペプチドと比較したときに長い滞留時間で溶出するものである： 
逆相ＨＰＬＣは、５μｍの粒子サイズと孔径３００Åの社内生産されたブチル結合シリカカラム(４．５×２５０ｍｍ)にて行った；(類似の結果は、ＡＣＥ Ｃ４、５μｍ、３００Å、４．６×２５０ｍｍカラムにて得られうる)。 
カラム温度：７０℃。Ａ-バッファ：０．１％v/v トリフルオロ酢酸。Ｂ-バッファ：０．０９％v/v トリフルオロ酢酸、８０％v/v アセトニトリル。 
カラムは、Ｘから(Ｘ＋１３)％Ｂまでの直線的濃度勾配にて３０分間溶出した。Ｘは、ＦVIIaがおよそ２６分の滞留時間で溶出するように調整した。 
流速：１．０ｍｌ／分。検出：２１４ｎｍ。負荷：２５μｇのＦVIIa。
図９は、ＦVIIのＨＰＬＣクロマトグラム及びその生成物関連の不純物を示す。
【００５８】
凝集塊の含有量
凝集塊の含有量は非変性サイズ排除ＨＰＬＣ(ＳＥＨＰＬＣ)によって測定する。非変性サイズ排除クロマトグラフィは、移動相として０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、５％ ２-プロパノール ｐＨ７．０を用いたWaters Protein Pak 300 SWカラム、７．５×３００ｍｍにて行った。流速：０．５ｍｌ／分。検出：２１５ｎｍ。負荷：２５μｇのＦVIIa。
【００５９】
デスＧｌａ-第VII因子ポリペプチド構造の含有量の測定
完全長第VII因子ポリペプチド構造に対するデスＧｌａ-第VII因子ポリペプチド構造の含有量はＳＤＳ-ＰＡＧＥによって測定される。１５０μｌの試料に５０μｌの試料バッファ(非還元、NuPAGE)を加え、５分間煮沸する。１０μｌの試料を１２％のBisTris NuPAGEゲル(Invitrogen)に流す。ゲルを２００ボルト、１２０ｍＡで５５分間動作する。クーマシーブリリアントブルー溶液を用いてゲルを染色し、脱色して、乾燥する。相対的なデスＧｌａ-第VII因子ポリペプチド含有量を、およそ５０ｋＤａの第VII因子ポリペプチドバンド領域と４５ｋＤａのデスＧｌａ-第VII因子ポリペプチドバンドの領域で除したデスＧｌａ-第VII因子ポリペプチドバンドの領域として算出する。
あるいは、デスＧｌａ-第VII因子ポリペプチド構造の含有量を陰イオン交換ＨＰＬＣで測定してもよい。この方法は、Ｇｌａ-ドメインのない第VII因子ポリペプチドをインタクトな第VII因子ポリペプチドから切り離す。Ｇｌａ-ドメインのない第VII因子ポリペプチドの含有量は、第VII因子ポリペプチド関連のピーク領域の％で表される。分析カラムには、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ-１００、２５０×４ｍｍ (Dionex Corp.)を用いる。カラムは、１．０ｍｌ／分の流速で、３０分にわたって、ｐＨ９．０の０〜０．５Ｍの酢酸アンモニウムの直線的濃度勾配にて溶出する。溶出物の２８０ｎｍの吸光度をモニタリングする。
【００６０】
一又は複数のＮ-結合グリカンを持たない第VII因子ポリペプチド構造の含有量の測定
一方又は両方のＮ-結合グリカンを持たない第VII因子ポリペプチド構造の含有量は、例えば高性能液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)；キャピラリー電気泳動法(ＣＥ)；又は質量分析(ＭＡＬＤＩ-ＭＳ及びＬＣ-ＭＳ)を用いて測定されうる。
例えば、ＭＡＬＤＩ-ＭＳを用いる場合、およそ５０ｋＤａ、４７．５ｋＤａ及び４５ｋＤａの質量を表すピークは、両方のＮ-結合グリカンを有する第VII因子ポリペプチド及び一又は両方のグリカンを持たないそれぞれの第VII因子ポリペプチドを示す。
Ｎ-結合オリゴ糖のパターンは、高性能液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)；キャピラリー電気泳動法(ＣＥ)；核磁気共鳴法(ＮＭＲ)；イオン化技術を用いた質量分析(ＭＳ)、例えば高速原子衝撃、エレクトロスプレー、又はマトリックス支援レーザー脱離(ＭＡＬＤＩ)；ガスクロマトグラフィ(ＧＣ)；及び、陰イオン交換(ＡＩＥ)-ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ(ＳＥＣ)又はＭＳと組み合わせたエキソグリコシダーゼによる治療法を含むがこれらに限定されるものではない、当分野で公知の任意の方法を用いて測定されうる。例として、Weber等, Anal. Biochem. 225:135 (1995)；Klausen等, J. Chromatog. 718:195 (1995)；Morris等, in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen等, eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167；Conboy等, Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992；Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990)；Sutton等, Anal. Biohcem. 318:34 (1994)；Harvey等, Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994)を参照。
上記の方法のいずれかを用いた第VII因子グリコフォームの分解の後、分解された種は、異なるグループ(i) 〜 (iii)に分類される。(i) 〜 (iii)のそれぞれの相対的な含有量は、試料中のグリコフォームの総含有量に対するあるグループに分類されたグリコフォームの合計として算出される。
【００６１】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するものである。これらの実施例は、例示の目的にのみ記載するもので、いかなる場合においても請求される本発明の範囲を制限することを目的としない。
【００６２】
実施例１−ＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたｐＨ６でのｒｈＦVIIaのＨＩＣ精製による重鎖が分解された酸化型ｒｈＦVIIの減少
５ｍｇの純度の高いｒｈＦVIIaに、終濃度１．８ＭのＮＨ４-アセテートと終濃度１０ｍＭのＣａＣｌ２と終濃度１０ｍＭのメチオニンを加えた。ｐＨはｐＨ６．０に調整した。試料を、５ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ メチオニン、ｐＨ６．０(負荷１．６ｇ／ｌ)にて平衡化したToso Haas ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷを充填したカラム(０．５ｃｍ内径×１０．０ｃｍの長さ＝２ｍｌのカラム容量(ＣＶ))に流し込んだ。カラムを、３ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ メチオニン、ｐＨ６．０にて洗浄した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ メチオニン、ｐＨ６．０を含むバッファ中で１．８ＭのＮＨ４-アセテートから５０ｍＭのＮＨ４-アセテートの直線的な勾配溶液 １８ＣＶを用いて溶出を行った。リーディングエッジで最大吸光度(２８０ｎｍ)のおよそ６５％及びテーリングエッジで最大吸光度のおよそ２０％のピーク集積であるが、貯留を回収した。図１にクロマトグラムを示す。
６〜１２ＣＶ／ｈの流速及び５℃の温度で精製を行った。５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ７．０及び０．５Ｍ ＮａＯＨにてカラムを再生した。
【００６３】
貯留の分析及び分析的ＲＰ-ＨＰＬＣに供した試料は、表１に示すように、重鎖が分解した酸化型のｒｈＦVIIの減少を示した。
表１
2014193883.tif 000003
重鎖が分解した酸化型のｒｈＦVIIは、修飾されていないｒｈＦVIIよりも相対的に滞留時間が短いために主に減少し、それによってリーディングエッジの切断によって減少した。
【００６４】
実施例２−疎水性相互作用クロマトグラフィの実施
ｒｈＦVIIの試料に終濃度１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４を加える。ｐＨは２０ｍＭのトリスにて緩衝してｐＨ８．６に調整する。この試料を５ＣＶの１Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４、２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．６にて平衡化したToyopearl butyl 650Sを充填したカラムに加える。カラムを５ＣＶの１Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４、２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．６にて洗浄する。２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．６を含むバッファ中で１．０Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４から０Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４の直線的な勾配溶液 ２０ＣＶを用いて溶出を行う。ＦVII含有貯留(プール)はピークの集積によって選択する。重鎖が分解された酸化型のｒｈＦVIIは天然のｒｈＦVIIと比較して滞留時間が短いために減少する。遅発型溶出ピーク１、２及び３は、天然のｒｈＦVIIと比較して滞留時間が相対的に長いために減少する。
【００６５】
実施例３−ＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたｐＨ６でのＦVIIaのＨＩＣ精製による遅発型溶出ピークの減少
４．７ｍｌのカラムにＴＳＫフェニル５ＰＷ(２０μｍ)樹脂を充填して、２．０Ｍ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０を含有するバッファ ２０ＣＶにて平衡化した。
１５ｍｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ ＦVIIa類似体を含む２．０Ｍ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０からなる負荷物質をカラムに流した(０．８ｍｇ／ｍｌ樹脂の特定の負荷に相当)。５ＣＶの平衡化バッファを用いてカラムを洗浄した。１０ＣＶにわたって洗浄バッファ及び平衡化バッファから１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０への直線的な勾配溶液を用いた後に５ＣＶの勾配の付いていない溶液を用いて溶出を行った。５ｍｌの分画を溶出ピーク全体にわたって回収した。クロマトグラムを図３に示す。
カラムは、５ＣＶの５０ｍＭ 三クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５の後に５ＣＶの１．０Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて再生した。流速は精製の間６ＣＶ／ｈとし、５℃の一定温度を維持した。
図２に示すように、相対的な滞留時間(ＲＲ)が１０００より大きい遅発型溶出ピークを分離した。全体で、遅発型溶出ピーク(ＲＲ1045、ＲＲ1066、ＲＲ1119、ＲＲ1148、ＲＲ1192及びＲＲ1247)が因子２．５によって減少した。ピークの滞留時間は、分析的ＲＰ-ＨＰＬＣシステムの主要な生成物ピークと比較したときのそれぞれのピークの相対的な滞留時間を示す。分画１２〜１７を回収したところ６２％の収率であった。
【００６６】
実施例４−高分子化合物の減少
２．０ｌのカラムに、ＴＳＫフェニル５ＰＷ(２０μｍ)樹脂を充填し、２０ＣＶの２．０Ｍ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０にて平衡化した。０．７５１ｍｇ／ｍｌのＦVIIa類似体を含む２．０Ｍ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０を含有する５．３ｌの溶液を負荷した(２．０ｍｇ／ｍｌ樹脂の特定の負荷に相当)。１０ＣＶの平衡化バッファを用いてカラムを洗浄した。１０ＣＶにわたって洗浄バッファ及び平衡化バッファから１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６．０への直線的な勾配溶液を用いた後に６．５ＣＶの勾配の付いていない溶液を用いて溶出を行った。貯留分画は、リーディングエッジの１００ｍＡｕ(５ｍｍの光路)から、テーリングエッジの６５ｍＡｕ(５ｍｍの光路)まで回収した。図４にクロマトグラムを示す。貯留容量は９．０ｌであった。
カラムは、５ＣＶの５０ｍＭ 三クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５の後に５ＣＶの１．０Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて再生した。流速は精製の間６ＣＶ／ｈとし、５℃の一定温度を維持した。
【００６７】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによると、負荷は、生成物より大きい分子量を有するいくつかの成分を含有した。記述した精製工程は、これらのすべて〜濃度の半分より少ない程度までに減少した(表２及び図５及び６を参照)。
表２
2014193883.tif 000004
【００６８】
実施例５−遅発型溶出ピークの減少
負荷及び貯留の試料を上記の一般法で記載したＲＰ-ＨＰＬＣによって分析した。酸化型及び遅発型溶出ピーク(ＬＥピーク)の両方の減少が観察された(表３を参照)。
表３
2014193883.tif 000005
【００６９】
実施例６−ＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたｐＨ６でのＦVIIa類似体のＨＩＣ精製によるＧＤ-ＦVIIの減少
６ｍｇの組み換えｈＦVIIaに、終濃度１．８ＭのＮＨ４-アセテートと終濃度１０ｍＭのＣａＣｌ２を加えた。ｐＨはｐＨ６．０に調整した。試料を、５ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０(負荷１．６ｇ／ｌ)にて平衡化したToso Haas ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷを充填したカラム(０．５ｃｍ内径×１０．５ｃｍの長さ＝２ｍｌのカラム容量(ＣＶ))に流し込んだ。カラムを、３ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０にて洗浄した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０を含むバッファ中で１．８ＭのＮＨ４-アセテートから５０ｍＭのＮＨ４-アセテートの直線的な勾配溶液 １８ＣＶを用いて溶出を行った。３つの試料を回収した；リーディングエッジ、メインピーク及びテーリングエッジ。リーディングエッジで最大吸光度(２８０ｎｍ)のおよそ５０％及びテーリングエッジで最大吸光度のおよそ２０％のピーク集積であるが、メインピークを回収した。図７にクロマトグラムを示す。
６〜１２ＣＶ／ｈの流速及び５℃の温度で精製を行った。５ＣＶの５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ７．０及び５ＣＶの０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてカラムを再生した。
【００７０】
３つの回収した試料とアプリケーション試料中の、ＦVII、ｍｗおよそ４８ｋＤａと比較してＧＤ-ＦVII、ｍｗおよそ４３ｋＤａの相対的な含有量は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(図８)及びゲルのスキャニング(図)によって分析した。メインピークのＧＤ-ＦVIIの量の減少が観察された(表５)。
表５
2014193883.tif 000006
【００７１】
実施例７−２０℃のＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたＦVIIaのＨＩＣ精製による遅発型溶出ピークと他の生成物関連の不純物の減少
６ｍｇの組み換えｈＦVIIaに、終濃度１．８ＭのＮＨ４-アセテートと終濃度１０ｍＭのＣａＣｌ２を加えた。ｐＨはｐＨ６．０に調整した。試料を、５ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０にて平衡化したToso Haas ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷを充填したカラム(０．５ｃｍ内径×１０．０ｃｍの長さ＝２ｍｌのカラム容量(ＣＶ))に加えた。 
カラムを、３ＣＶの１．８Ｍ ＮＨ４-アセテート、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０にて洗浄した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０を含むバッファ中で１．８ＭのＮＨ４-アセテートから５０ｍＭのＮＨ４-アセテートの直線的な勾配溶液 １８ＣＶを用いて溶出を行った。
リーディングエッジで最大吸光度(２８０ｎｍ)のおよそ６５％及びテーリングエッジで最大吸光度のおよそ２０％のピーク集積である。貯留を回収した。図１０にクロマトグラムを示す。
６〜１２ＣＶ／ｈの流速及び２０℃の温度で精製を行った。５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ７．０及び０．５Ｍ ＮａＯＨにてカラムを再生した。
【００７２】
表６に示すように、酸化型及び重鎖が分解されたＦVII及び遅発型溶出ピークの含有量は減少した。
表６
2014193883.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷによるｒｈＦVII分離のクロマトグラムである(実施例１参照)。
【図２】ＴＳＫフェニル５ＰＷによるＦVIIa類似体分離のクロマトグラムである(実施例３参照)。
【図３】生成物ピークの全体にわたる不純物の溶出を例示する(実施例３参照)。
【図４】ＴＳＫフェニル５ＰＷによるＦVIIa類似体分離のクロマトグラムである(実施例４参照)。
【図５】１８５、１４０及び９０ｋＤａの高分子化合物を示すＨＩＣ負荷のＳＤＳ-ＰＡＧＥを例示する。
【図６】１８５、１４０及び９０ｋＤａの高分子化合物がほとんど取り除かれたことを示すＨＩＣプールのＳＤＳ-ＰＡＧＥを例示する。
【図７】ＴＳＫ-Ｇｅｌフェニル５ＰＷによるｒｈＦVII分離のクロマトグラムである(実施例６参照)。
【図８】ＧＤ-ＦVIIの部分的な除去を例示するＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルである。レーン１：ｍｗ標準物質、レーン２：負荷試料、レーン３：リーディングエッジ、レーン４：メインピーク、レーン５：テーリングエッジ、実施例６参照。
【図９】ＦVII及びその生成物関連の不純物のＨＰＬＣクロマトグラムを例示する。
【図１０】２０℃のＴＳＫフェニル５ＰＷを用いたＦVIIaのＨＩＣ精製による他の生成物関連の不純物と遅発型溶出ピークの低減を例示する。
【図１】
2014193883.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014193883.tif 000012
【図６】
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【図７】
2014193883.tif 000014
【図８】
2014193883.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月6日(2014.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えて作製した第VII因子ポリペプチドの薬剤物質の精製方法であって、 
(a) 疎水性相互作用クロマトグラフィ物質への薬剤物質の一部の結合を促す条件下にて疎水性相互作用クロマトグラフィ物質と薬剤物質を接触させ、このときの該薬剤物質が０．０〜０．１Ｍの範囲又は０．５Ｍからそれぞれの塩の飽和濃度の８５％の範囲の濃度の塩類及び／又は双性イオンを含むものであり；
(b) 場合によって洗浄バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を洗浄し；そして、
(c) 溶出バッファにて該疎水性相互作用クロマトグラフィ物質を溶出し、第VII因子ポリペプチドの薬剤物質を溶出物として回収する；
という工程を含んでなり、それによって、本明細書中に定められる方法によって決定される生成物関連の不純物の含有量が、工程(a)に用いられる薬剤物質に含有される含有量と比較して、少なくとも５０％(w/w)に減少している方法。
【外国語明細書】
2014193883000001.pdf