(57)【要約】【課題】リンゴやナシ等のバラ科果樹の１世代の期間を短縮するための新しい手段を提供する。【解決手段】シロイヌナズナFT遺伝子を発現するポリヌクレオチドとバラ科果樹TFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドの両方を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルスRNAを発根直後のバラ科果樹実生の子葉に接種し、この感染種子を播種して育成し、開花した花に受粉する工程を含み、播種から12カ月以内に次世代種子を含む果実を結実させる。【選択図】図６
2014183754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナFT遺伝子を発現するポリヌクレオチドとバラ科果樹TFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドの両方を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルスRNAを発根直後のバラ科果樹実生の子葉に接種し、この感染種子を播種して育成し、開花した花に受粉する工程を含み、播種から12カ月以内に次世代種子を含む果実を結実させることを特徴とするバラ科果樹の１世代短縮方法。
【請求項２】
シロイヌナズナFT遺伝子を発現するポリヌクレオチドがシロイヌナズナFT遺伝子cDNAのタンパク質コード領域を構成するポリヌクレオチドであり、バラ科果樹TFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドがバラTFL1-1遺伝子cDNAの少なくとも一部を構成するポリヌクレオチドである請求項１の1世代短縮方法。
【請求項３】
前記の受粉工程において、別品種のバラ科果樹から採取した花粉を受粉させる請求項１または２の１世代短縮方法。
【請求項４】
前記の果実から採取した種子を発根させ、その直後の子葉に前記と同様の方法によりウイルスRNAを接種し、この感染種子を播種、育成し、開花した花に受粉して、播種から12カ月以内にさらに次世代の種子を採取することを１回以上繰り返す請求項１から３のいずれかの１世代短縮方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、バラ科果樹の１世代の期間（播種から次世代種子の取得までの期間）を1年以内に短縮させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
木本植物であるバラ科果樹は非常に長い幼若期間（juvenile phase）があり、播種から開花・結実するまで通常は6〜12年を要する。この幼若期間の長さがバラ科果樹の育種（品種改良）などにとっては大きな障害となっている。すなわち、バラ科果樹の通常の品種改良は、他品種の花粉を受粉させることにより行われるが、受粉を行うための開花やその結果を確認するための果実形成までに長い年数を待たねばならない。そのため、バラ科果樹の開花を促進させるための技術として、例えば以下が知られている。
遺伝子導入によるバラ科果樹の開花促進
本願発明者らは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana：At）の開花促進遺伝子FLOWERING LOCUS T(AtFT)を発現する組換えリンゴ小球形潜在ウイルス（Apple latent spherical virus：ALSV）に感染した増殖宿主（キノア）から濃縮したウイルスRNA（AtFT-ALSV）を、発根直後のバラ科果樹実生の子葉にパーティクルガン法を用いて接種することによって、例えばリンゴの場合は発芽後6〜12年を要する開花までの期間を1.5〜3ヶ月へと大幅に短縮することに成功した（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
ALSVはリンゴに病気を引き起こすことなく無病徴感染し、安定して全身感染を維持するが、その種子伝染率は低率であることから、AtFT遺伝子を発現する組換えALSVの濃縮RNA（AtFT-ALSV）の感染によって開花促進がなされたバラ科果樹の次世代からはウイルスフリーの個体を選抜することが可能であり、その選抜したウイルスフリー個体は、遺伝子導入がなされていない果樹個体となんら変わることがなく、そのまま育種素材として使用することできる（特許文献１）。
ジーンサイレンシングによるバラ科果樹の開花促進
植物の内在性遺伝子を組み込んだウイルスを植物に感染させ、RNAサイレンシングを誘導することによってその遺伝子発現を抑制する方法（ウイルス誘導ジーンサイレンシング：Virus-induced gene silencing: VIGS）が知られている。
【０００４】
本願発明者らは、VIGSのウイルスとしてALSVを用い、バラ科果樹の内在性遺伝子の発現を効率よく抑制する技術を開発している（特許文献２）。さらに発明者らは、リンゴ（Malus pumila var. domestica：Md）の開花抑制遺伝子TERMINAL FLOWER 1 (MdTFL1) cDNAの一部領域を含む組換えALSVの濃縮RNA（MdTFL-ALSV）を発根直後のバラ科果樹実生の子葉にパーティクルガン法を用いて接種することにより、MdTFL1遺伝子のジーンサイレンシングを誘導し、結果としてリンゴの発芽から開花までの期間を1.5〜3ヵ月にまで短縮させることに成功している（非特許文献２）。
【特許文献１】特開2010-183891号公報
【特許文献２】特開2010-183892号公報
【非特許文献１】Yamagishi N. et al. 2011. Promotion of flowering and reduction of a generation time in apple seedlings by ectopical expression of the Arabidopsis thaliana FT gene using the Apple latent spherical virus vector.  Plant Mol. Biol. 75(1-2): 193-204.
【非特許文献２】Sasaki S. et al. 2011. Efficient virus-induced gene silencing in apple, pear and Japanese pear using Apple latent spherical virus vectors. Plant Methods. 7:15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
AtFT-ALSVを用いた開花促進遺伝子AtFTの導入（特許文献１、非特許文献１）、またはMdTFL-ALSVを用いた開花抑制遺伝子MdTFL1のジーンサイレンシング（非特許文献２）によって、リンゴ等のバラ科果樹の開花を大幅に短縮すること（早期開花）が可能となっている。
【０００６】
しかしながら、これらの従来技術の場合には、早期開花が観察されたのはAtFT-ALSVを感染させた個体の40％程度（例えば、特許文献１ではAtFT-ALSV感染20個体中の8個体が早期開花）、およびMdTFL-ALSV感染個体の約10％である。また、AtFT-ALSV感染による早期開花は7〜8葉期のリンゴ実生で１回（１花）だけ生じる（図７参照）。従って、花粉の採取機会が制限されることから、早期開花にも関わらず次世代の種子を形成させるまでの期間（１世代）を、例えば1年生植物並みに短縮することは不可能であるという問題点を有していた。
【０００７】
本願発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、リンゴをはじめとするバラ科果樹の早期開花率（早期開花個体の割合および早期開花の発生回数）を向上させ、その結果として当代種子から次世代種子を得るまでの期間（バラ科果樹の１世代）を大幅に（具体的には1年以内に）短縮するための新しい手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願は、前記の課題を解決するための発明として、シロイヌナズナFT遺伝子を発現するポリヌクレオチドとバラ科果樹TFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドの両方を含む組換えリンゴ小球形潜在ウイルスRNAを発根直後のバラ科果樹実生の子葉に接種し、この感染種子を播種して育成し、開花した花に受粉する工程を含み、播種から12カ月以内に次世代種子を含む果実を結実させることを特徴とするバラ科果樹の１世代短縮方法を提供する。
【０００９】
また、前記の1世代短縮方法においては、シロイヌナズナFT遺伝子を発現するポリヌクレオチドがシロイヌナズナFT遺伝子cDNAのタンパク質コード領域を構成するポリヌクレオチドであり、バラ科果樹TFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドがバラTFL1-1遺伝子cDNAの少なくとも一部を構成するポリヌクレオチドであることを態様の一つとしている。
【００１０】
さらに、また前記の１世代短縮方法においては、前記の受粉工程において、別品種のバラ科果樹から採取した花粉を受粉させることも一つの態様としている。
【００１１】
またさらに、前記の１世代短縮方法においては、前記の果実から採取した種子を発根させ、その直後の子葉に前記と同様の方法によりウイルスRNAを接種し、この感染種子を播種、育成し、開花した花に受粉して、播種から12カ月以内にさらに次世代の種子を採取することを１回以上繰り返すことを別の態様としている。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明によれば、通常は6〜12年を要するバラ科果樹の1世代（播種から次世代種子の形成）を、12カ月以内へと大幅に短縮することが可能となる。これによって、バラ科果樹の品種改良等の育種を効率よく行うことが可能となる。
【００１３】
また、本願発明方法により１世代の期間を短縮されたバラ科果樹個体はほとんどがウイルスフリーであり、またウイルス保有個体は容易に識別排除することができるため、次世代の種子やその種子から発生した次世代個体はそのまま育種素材または改良品種として実用に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例で作成したMdTFL発現抑制cDNAクローン（pEALSR13’MCSMdTFL1-1）およびAtFT発現cDNAクローン（pEALSR2L5R5FT）の構成を示す。
【図２】MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約1.5カ月のリンゴ実生の写真像である。早期開花が観察された。
【図３】MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約2カ月のリンゴ実生の写真像である。花芽が連続して形成されている。
【図４】MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約3カ月のリンゴ実生の写真像である。栄養成長と開花が連続して継続している。
【図５】MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約8カ月（受粉後約4カ月）のリンゴ実生の写真像である。果実が結実している。
【図６】MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約10カ月（受粉後約5カ月）のリンゴ実生の写真像（上）、その切断面の写真像（中）、およびこのリンゴ実生から採取した種子（合計9粒、不稔種子なし）の写真像（下）である。
【図７】AtFT-ALSVおよびMdTFL-ALSVをそれぞれ単独で感染させてから約3カ月のリンゴ実生の写真像である。AtFT-ALSVは実施例で構築したAtFT発現cDNAクローン（pEALSR2L5R5FT）（図１下）と感染性cDNAクローンpEALSR1とをキノア葉においてウイルス化した組換えALSVの濃縮RNAである。またMdTFL-ALSVは、pEALSR2L5R5FT（図１下）のAtFTをMdTFL（実施例と同様に調製）に置換した組換えcDNAクローンとpEALSR1とをキノア葉においてウイルス化した組換えALSVの濃縮RNAである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願発明におけるバラ科果樹とは、特にバラ科ナシ亜科（Maloideae）に属する植物、特にリンゴ、ナシ等を言う。
【００１６】
シロイズナズナFT遺伝子（AtFT）を発現するポリヌクレオチドとしては、シロイズナズナのゲノムDNAに存在するFT遺伝子それ自体を使用することもできるが、特許文献１および非特許文献１に記載されているようなシロイズナズナFT遺伝子cDNAのコード領域を構成するポリヌクレオチドを使用することが好ましい。AtFT遺伝子cDNAはその配列情報（GenBank/AB027504）に基づいて、シロイヌナズナのトータルRNAを鋳型とするRT-PCRや、シロイヌナズナcDNAライブラリーのプラークハイブリダイゼーション法等の公知の方法により取得することができる。具体的には、後記の実施例に記載の手順で容易に取得することができる。
【００１７】
バラ科果樹TFL1遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドとしては、ジーンサイレンシングによってTFL1遺伝子の発現抑制を行うことのできるポリヌクレオチドを採用する。例えば、リンゴTFL1遺伝子（MdTFL1） cDNA（GenBank/AB052994）の一部やナシTFL1遺伝子cDNA（GenBank/AB601157）の一部である。後記の実施例には、リンゴMdTFL1遺伝子（MdTFL）cDNAの一部領域からなるポリヌクレオチドの調製方法が詳細に記載されている。なお、リンゴTFL1遺伝子cDNAとナシTFL1遺伝子cDNAは相同性が極めて高いため、リンゴTFL1遺伝子を発現抑制するポリヌクレオチドの使用によってナシのTFL1遺伝子を発現抑制することができ、またその逆も可能である。
【００１８】
例えばリンゴTFL1遺伝子を発現抑制し、シロイズナズナFT遺伝子を発現する組換えALSVのRNA（MdTFL-AtFT-ALSV）は、例えば以下のように得ることができる。
【００１９】
先ず、ALSV感染性cDNAクローンにAtFTポリヌクレオチドをクローニングしてAtFT発現cDNAクローンを構築し、別のALSV感染性cDNAクローンにMdTFLポリヌクレオチドをクローニングしてMdTFL発現抑制cDNAクローンを構築する。２つのcDNAクローンは、ALSV増殖宿主（例えば、キノア）における両者の融合によってウイルス化が可能なもの、例えばALSV-RNA2に由来するcDNAクローンpEALSR2L5R5とALSV-RNA1に由来するcDNAクローンpEALSR1（例えば、Li, C. et al. 2004, Arch Viol. 149:1541-1558）を使用することができる。ALSV-RNA2に由来するcDNAクローンpEALSR2L5R5は外来遺伝子導入部位を備えているため、この部位に上記いずれかのポリヌクレオチドをクローニングすることができる（例えば図１下）。またALSV-RNA1に由来するcDNAクローンpEALSR1には、例えば後記実施例に示したようにORF直後（終止コドンの後ろ側）に外来遺伝子導入部位を付加し、この部位に他方のポリヌクレオチドをクローニングすることができる。
【００２０】
次に、AtFT発現cDNAクローンとMdTFL発現抑制cDNAクローンを増殖宿主に接種し、ウイルス化を行うことで組換えALSVを得る。
【００２１】
そして、増殖宿主の感染葉から組換えALSVを抽出し、遠心分離等の処理により濃縮し、この濃縮した組換えALSVからRNA（MdTFL-AtFT-ALSV）を単離する。
【００２２】
このようにして得たRNA（MdTFL-AtFT-ALSV）をバラ科果樹実生の子葉に接種することで、ほぼ100%の効率でMdTFL-AtFT-ALSV感染実生苗を作出することができる。子葉へのMdTFL-AtFT-ALSV接種は公知の方法に従って行うことができるが、特にパーティクルガン接種（例えば、特許文献１、非特許文献１、２）が適している。
【００２３】
以上の具体的操作は、後記実施例に詳細に記載されており、実施例の記載に従って実施することができる。
【００２４】
RNAを接種した種子は、遮光して湿度を保った状態で2〜3日静置したのち、徐々に外気に馴化させ、その後培養土に移植して、通常の生育温度（約25℃）で育成する。
【００２５】
このようにして育成したバラ科果樹は、後記の実施例に示したリンゴの場合は90％以上の個体が3ヶ月以内に早期開花し、早期開花した個体は少なくとも6カ月間は開花と栄養成長を繰り返して多数の花芽を形成する。そして、花に受粉をすることで、播種から12カ月以内に果実を結実させ、次世代種子を取得することが可能となる。
【００２６】
受粉は、通常のリンゴ栽培と同様に行うことができる。例えば、完全に開花する前の風船状の花から葯の部分を取り出し、この葯から採取した花粉を、早期開花した花の雌しべに塗布する。バラ科果樹のうちリンゴやナシは他家受精植物であるため、早期開花した個体とは別個体の花粉を用いて受粉を行う。例えば、下記の実施例に示したように早期開花した複数の個体相互で受粉を行うこともできるが、通常の方法で育成されたリンゴやナシの花から採取した花粉を早期開花した花に受粉することもできる。また、花粉は同品種の個体からものであってもよく、早期開花した個体とは別品種からの花粉であってもよい。別品種の花粉を受粉することで、品種改良を行うこともできる。
【００２７】
さらにまた、早期開花した花への受粉によって得られた次世代種子に対して上記の工程を行い、早期開花した花に受粉（例えば別品種の花粉による受粉）を行うことを繰り返すことによって、１年ごとに品種を改良し続けることもできる。
【００２８】
以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
1．材料および方法
（1）AtFTを発現する感染性cDNAクローンの構築
AtFT遺伝子cDNA(864bp,GenBank/AB027504)のFTタンパク質発現領域である525bp(塩基番号70〜594番)を次のように増幅した。DNA増幅の際、鋳型にはpBlue script II SK(+)のXbaI/SacIサイトにFT mRNAの塩基番号29〜709番までの配列を組み込んだプラスミド(pBSAtFT-19)を用い、またプラス鎖プライマーには10μM FT-Xho(+)[5’- CCGCTCGAGATGTCTATAAATATAAGAGA-3’]（配列番号１）を、マイナス鎖プライマーには10μM FT-Sma(-)[5’-TCCCCCGGGAAGTCTTCTTCCTCCGCAGC-3’]（配列番号２）を用いた。鋳型DNA溶液(10ng/μl)を1μl、プラス鎖プライマーとマイナス鎖プライマーをそれぞれ2μl、2.5mM dNTP mixture(TaKaRa)を1.6μl、10×Ex Taq Buffer(TaKaRa)を2μl、滅菌水を11.2μl、TaKaRa Ex Taqを0.2μl混合し、GeneAmp PCR System2400(Perkin Elmer)を使用して94℃で5分間処理した後、[94℃、30秒→55℃、30秒→72℃、60秒]の反応を35サイクル行い、続いて72℃で7分間処理した後、最後に4℃で5分間処理してPCRを終了した。得られたPCR産物1μlにLoading Buffer[0.25％ブロモフェノールブルー、1mM EDTA(pH8.0)、40％スクロース]1μlを加え、Agarose S(ニッポンジーン)0.15g、TAE[40mM Tris、20mM 酢酸、1mM EDTA(pH8.0)]15ml、エチジウムブロマイド0.6μlで調製した1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動し、増幅したDNAが期待されたAtFTポリヌクレオチドのサイズであることを確認した。
【００３０】
次に、増幅したAtFTポリヌクレオチドをXhoIおよびSmaIで以下のように切断した。まず、PCRで増幅したAtFTポリヌクレオチドの溶液を10μl、10×K Buffer(TaKaRa)を10μl、滅菌水を78μl、XhoI(TaKaRa)を2μl混合し、37℃で2時間静置した。この反応液に100μlの滅菌水、100μlのTE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)]飽和フェノール、100μlのクロロホルムを順に加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌し、14,000rpm(日立RPR16ローター、以下同様。)で5分間(4℃)遠心分離した。上清200μlに等量のクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌した後、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離し、この上清200μlを別の1.5ml容チューブに移した。その上清に20μlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)、600μlの99％エタノールを加え、十分に撹拌した後、-80℃で30分間静置した。14,000rpmで10分間(4℃)遠心分離して得られた沈殿に70％エタノール1mlを加えて14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、沈殿を減圧乾燥し、50μlの滅菌水に懸濁した。引き続きこの溶液に10×T Buffer(TaKaRa)を10μl、0.1％BSA(TaKaRa)を10μl、滅菌水を28μl、SmaI(TaKaRa)を2μl混合し、25℃で2時間静置した。制限酵素処理を施した反応液に100μlの滅菌水、100μlのTE飽和フェノール、100μlのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌し、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清200μlに等量のクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌した後、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。遠心分離後、この上清200μlに20μlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)と600μlの99％エタノールを加え、十分に撹拌した後、-80℃で30分間静置した。14,000rpmで10分間(4℃)遠心分離して得られた沈殿に70％エタノール1mlを加えて14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、沈殿を減圧乾燥し、20μlの滅菌水に懸濁した。XhoIおよびSmaIによる酵素処理は、ALSV-RNA2に外来遺伝子導入サイトを付加した感染性cDNAクローンのpEALSR2L5R5(100ng/μl)10μlに対しても上と同様に行った。
【００３１】
続いて、制限酵素処理したAtFTポリヌクレオチドおよびpEALSR2L5R5の回収をQIA quick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて行った。AtFTポリヌクレオチドの溶液18μlに10×Loading Buffer 2μlを加え、1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動した後、メスを用いて目的のDNA断片をアガロースゲルから切り出し、1.5ml容チューブに入れゲルの重量を測った。ゲルの3倍容のBuffer QGを1.5ml容チューブに加え50℃に加温してゲルを完全に溶解し、溶液の色が黄色であることを確認した。ゲルと等量のイソプロパノールを加え、2ml容のチューブにカラムをセットし、これにゲルが溶解した溶液を入れ、10,000rpmで1分間(室温)遠心分離した。2ml容チューブに落ちた溶液を捨て、カラムに750μlのBuffer PEを加えて洗浄し、10,000rpmで1分間(室温)遠心分離した後、再度2ml容チューブに落ちた溶液を捨てた。10,000rpmで1分間(室温)遠心分離し、カラムを新たな1.5ml容チューブにセットし、DNA溶出のため30μlのBuffer EB[10mＭ Tris-HCl(pH8.5)]をカラムの中央に加え、1分間静置後、13,000rpmで1分間(室温)遠心分離した。
【００３２】
ゲル回収後のAtFTポリヌクレオチドをインサートDNA、pEALSR2L5R5をプラスミドベクターとしてライゲーションを行った。インサートDNA溶液4μlとプラスミドベクター溶液1μlを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)のI液を5μl加えて16℃で2時間静置した後、1.1μlのIII液を加えてライゲーション溶液とした。
【００３３】
形質転換はHeat Shock法で行った。-80℃で保存していた100μlのコンピテントセルを氷中でゆっくりと解凍し、そこへライゲーション溶液を5μl加え5秒間ゆっくりと混合し、氷中で30分間静置した。続いてウォーターバスを用いて42℃で45秒間加温し、終了後2分間氷中で冷却した。予め温めておいたSOC[2％tryptone、0.5％yeast extract、0.058％NaCl、0.019％KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM グルコース] 900μlをクリーンベンチ内で加え蓋をしてパラフィルムを巻き、振とう培養器を用いて37℃で1時間振とうした。この培養液200μlをLMAプレート[1％tryptone、0.5％yeast extract、0.058％NaCl、10mM MgSO4、1.5％agar、40mg/mlアンピシリン]に滴下し、スプレッダーで培地の表面に塗布し、シャーレの蓋を開けた状態で10分間乾かした。残った培養液800μlは14,000rpmで30秒間遠心分離し、上清600μlを捨て残った200μlの溶液で沈殿を懸濁した。この溶液のうち100μlを同様にLMAプレートに滴下してスプレッダーで培地の表面に塗布、さらに蓋を開けた状態で10分間乾かした。培地が乾燥したら各プレートはインキュベーターに入れ、37℃で12〜16時間培養した。
【００３４】
形質転換したコロニーをスモールスケール培養するため2mlのLB培養液[1％tryptone、0.5％yeast extract、1％NaCl]を入れた試験管を16本用意し、オートクレーブ後これに10倍希釈したアンピシリン[25mg/ml]を各試験管に40μl添加した。コロニーを滅菌した爪楊枝の先端でかきとりLMAプレートに接触させることで大腸菌の一部を植菌してマスタープレートを作成し、爪楊枝はそのままLB培養液の入った試験管に入れた。マスタープレートはコロニーごとに番号をふって区別し、37℃で一晩静置培養した後、ビニールテープで密閉し、4℃で保存した。LB培養液の入った試験管にもマスタープレートと対応する番号をふり、傾けて37℃で一晩振とう培養した後、各試験管の全量を同じ番号を記した16本の1.5ml容チューブに移して14,000rpmで1分間(室温)遠心分離した。以下、16本の各1.5ml容チューブについて行った操作を示す。上清をアスピレーターで除去し、STET[0.1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、5% TritonX-100]350μlを加えて混和し、沈殿を懸濁した。10mM Tris-HCl(pH8.0)に10mg/mlになるよう調製したリゾチーム溶液を25μl加えて3秒間撹拌し、40秒間煮沸した後氷中で5分間冷却した。14,000rpmで10分間(室温)遠心分離し、沈殿を滅菌した爪楊枝を用いて除去し、残った上清に3M酢酸ナトリウム(pH5.2)40μlとイソプロパノール420μlを加えて撹拌した後、室温で5分間静置した。これを14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離し、上清を丁寧に取り除いた。得られた沈殿に500μlの70％エタノールを加え、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離後、上清を除去し、沈殿を減圧乾燥した。これにRNaseが20μg/mlとなるよう調整したTEを50μl添加して懸濁し、37℃で30分間静置してプラスミド溶液とした。
【００３５】
スモールスケール培養により得たプラスミドにAtFTポリヌクレオチドが導入されているかどうかを制限酵素で処理して確認した。プラスミド溶液2μl、10×K Buffer(TaKaRa) 1μl、滅菌水6.8μl、XhoI(TaKaRa)0.2μlを新たな1.5ml容チューブに移して混合し、37℃で2時間静置した。その後、90μlの滅菌水、50μlのTE飽和フェノール、50μlのクロロホルムを順に加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌し、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清100μlに等量のクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌した後、14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離し、この上清100μlを別の1.5ml容チューブに移した。その上清に10μlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの99％エタノールを加え、十分に撹拌した後、-80℃で30分間静置した。静置後、14,000rpmで10分間(4℃)遠心分離し、得られた沈殿に70％エタノール500μlを加えて14,000rpmで5分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、沈殿を減圧乾燥し、10μlの滅菌水に懸濁した。引き続きこの溶液に10×T Buffer(TaKaRa)を2μl、0.1％BSA(TaKaRa)を2μl、滅菌水を5.6μl、SmaI(TaKaRa)を0.4μl混合し、25℃で2時間静置した。静置後、XhoIとSmaIで処理したプラスミド溶液のうち9μlに10×Loading buffer 1μlを加え1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動した。泳動の結果、PCRにより得られたAtFTポリヌクレオチドと同じサイズの断片がプラスミドから切り出されているサンプルの番号を控え、次のラージスケール培養にその番号の記されたコロニーを用いた。
【００３６】
ラージスケール培養には200μlのアンピシリンを加えた100mlのLB培養液とQIAGEN Plasmid Midi Kit(100)(QIAGEN)を用いて行った。マスタープレートから単一コロニーを爪楊枝で採取し、これをLB培養液の入った坂口フラスコに入れ37℃で12〜16時間振とう培養し、培養後ファルコンチューブに培養液50mlを移して7,500rpmで15分間(4℃)遠心分離した。上清を捨て、残りの50mlも同じように遠心分離し、その後ペレットをRNaseの入った4mlのBuffer P1に懸濁して4mlのBuffer P2を添加後、4〜6回転倒させ十分に混和し５分間室温で静置した。冷却したBuffer P3を4ml添加して4〜6回転倒させ混和した後、15分間氷上でインキュベーションした。続いて50ml容の遠心管に溶液を移し、13,000rpmで30分間(4℃)遠心分離し、プラスミドDNAを含む上清を回収した。この上清を再度13,000rpmで15分間(4℃)遠心分離した。カラムに4mlのBuffer QBTを加えカラムが空になるまで自然落下させ平衡化し、遠心分離で得られた上清をこのカラムに添加して樹脂に浸透させた。カラムを10mlのBuffer QCで2回洗浄し、5mlのBuffer QFでDNAを新たなファルコンチューブに溶出した。溶出したDNA溶液にイソプロパノール3.5mlを添加し混和した後、COREXチューブへ入れ直ちに11,000rpmで30分間(4℃)遠心分離し、上清を素早くデカンテーションで除去した。沈殿したDNAを70％エタノール2mlで洗浄し、11,000rpmで10分間(4℃)遠心分離し、上清を取り除いて沈殿したDNAを減圧乾燥した後、TE100μlに溶解した。分光光度計（ＮanoDrop Technologies, ND-1000 v3.1.2）を用いてDNAの濃度を1μg/μlに調製し、pEALSR2L5R5にFTポリヌクレオチドを導入した感染性cDNAクローンpEALSR2L5R5FTを得た。
（2）MdTFL1を発現抑制する感染性cDNAクローンの構築
リンゴTFL1-1遺伝子(MdTFL1-1) cDNA（GenBank/AB052994）の201bp(塩基番号40-239番)を次のように増幅した。MdTFL1-1 cDNA全長が挿入されたプラスミド（pBSMdTFLfull♯12）を鋳型として用い、プラス鎖プライマーには4μM MdTFLSal(+)[5’-TACATGTCGACATGAAAAGAGCCTCGGAG-3’]（配列番号３）を、マイナス鎖プライマーには4μM MdTFLMlu(-)[5’-TACATACGCGTCACCAAAGTAAAGAAAGA-3’]（配列番号４）を用いた。鋳型DNA溶液（10ng/μl）を1μl、プラス鎖プライマーとマイナス鎖プライマーをそれぞれ5.0μl、2mM dNTPs(TOYOBO)を5.0μl、25 mM MgSO4を3.0μl、10xBuffer for KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO)を5.0μl、KOD-Plus-(TOYOBO)を1.0μl、滅菌蒸留水を30.0μl混合し、TaKaRa Thermal Cycler Dice mini(TaKaRa)を使用して94℃で2分間処理した後、[98℃、10秒→55℃、30秒→68℃、15秒]の反応を35サイクル行った。得られたPCR産物2μlにLoading Buffer[0.25%ブロモフェノールブルー、1mM EDTA(pH8.0)、40％スクロース]2μlを加え、Agarose S(ニッポンジーン)0.15g、TAE[40mM Tris、20mM酢酸、1Mm EDTA(pH8.0)]15mlで調製した1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動したあとエチジウムブロマイド溶液で染色し、増幅したDNAが期待されたサイズであることを確認した。
【００３７】
ALSVRNA-1のORFのストップコドンの直後に新たな制限酵素サイトを導入するために以下の処理を行った。まず、ALSVRNA-1の感染性クローンであるpEALSR1を鋳型として用い、プラス鎖プライマーには4μM ALSR 3668(+)[5’-CCTGGATTCGAAAACGCTAGG-3’]（配列番号５）を、マイナス鎖プライマーには4μM ALSR1MCS6625(-)[5’-TACATACGCGTCACCAAAGTAAAGAAAGA-3’]（配列番号４）を用いた。鋳型DNA溶液（10ng/μl）を1μl、プラス鎖プライマーとマイナス鎖プライマーをそれぞれ5.0μl、2mM dNTPs(TOYOBO)を5.0μl、25 mM MgSO4を3.0μl、10xBuffer for KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO)を5.0μl、KOD-Plus-(TOYOBO)を1.0μl、滅菌蒸留水を30.0μl混合し、TaKaRa Thermal Cycler Dice mini(TaKaRa)を使用して94℃で2分間処理した後、[98℃、10秒→55℃、30秒→68℃、3分15秒]の反応を25サイクル行った。得られたPCR産物を鋳型として用い、鋳型DNA溶液を1μl、プラス鎖プライマー4μM ALSR 3668(+)[5’-CCTGGATTCGAAAACGCTAGG-3’]（配列番号５）とマイナス鎖プライマーALSR1MCS6705(-)[5’-AAAGAAAGAAAGAAAAGAAGGAAGAAAGACCAAACACCACGCGTGTCGAC-3’]（配列番号６）をそれぞれ5.0μl、2mM dNTPs(TOYOBO)を5.0μl、25 mM MgSO4を3.0μl、10xBuffer for KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO)を5.0μl、KOD-Plus-(TOYOBO)を1.0μl、滅菌蒸留水を30.0μl混合し、TaKaRa Thermal Cycler Dice mini(TaKaRa)を使用して94℃で2分間処理した後、[98℃、10秒→55℃、30秒→68℃、3分15秒]の反応を25サイクル行った。得られたPCR産物を鋳型として用い、鋳型DNA溶液を1μl、プラス鎖プライマー4μM ALSR 3668(+)[5’-CCTGGATTCGAAAACGCTAGG-3’]（配列番号５）とマイナス鎖プライマーALSR1MCS6705(-)[5’-CTTAACGGATCCAAGGATCACAACAAACTAGTTCAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGA-3’]（配列番号７）をそれぞれ5.0μl、2mM dNTPs(TOYOBO)を5.0μl、25 mM MgSO4を3.0μl、10xBuffer for KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO)を5.0μl、KOD-Plus-(TOYOBO)を1.0μl、滅菌蒸留水を30.0μl混合し、TaKaRa Thermal Cycler Dice mini(TaKaRa)を使用して94℃で2分間処理した後、[98℃、10秒→55℃、30秒→68℃、3分15秒]の反応を30サイクル行った。得られたPCR産物をMonoFas DNA精製キットI（ジーエルサイエンス）を用いて以下のように精製した。PCR産物50μlにBuffer Aを500μl加えてよく攪拌した後、スピンカラムに移し、×9000gで30秒間遠心を行った。フロースルーを捨てた後、スピンカラムにBuffer Bを500μl加えて、×9000gで30秒間遠心を行い、続いてスピンカラムをマイクロ遠心チューブに付け替え、Buffer Cを20μl加えて、×9000gで30秒間遠心を行った。引き続き、得られた精製PCR産物17.5μlに10xHBuffer(TOYOBO) 5.5μl、BamHI(TaKaRa) 2.0μl、Csp45I (TOYOBO) 3.0μl、滅菌蒸留水27.0μlを加えて混合し、37℃で5時間静置した。BamHIおよびCsp45Iによる制限酵素処理はpEALSR1(100ng/μl)10μlに対しても上と同様に行った。
【００３８】
続いて、制限酵素処理した精製PCR産物およびpEALSR1の回収をMonoFas DNA精製キットIを用いて以下のように行った。DNA溶液の1/10量のLoading Bufferを加え、1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動した後、メスを用いて目的のDNA断片をアガロースゲルから切り出して刻み、1.5mlチューブに入れ、ゲルの重量を量った。ゲルと等量のBuffer Aを加えて60℃に加温してゲルを完全に溶解した。溶解したゲル溶液をスピンカラムに移し、×9000gで30秒間遠心を行った。フロースルーを捨てた後、スピンカラムに、Buffer Bを500μl加えて×9000gで30秒間遠心を行い、続いてスピンカラムをマイクロ遠心チューブに付け替え、Buffer Cを20μl加えて×9000gで30秒間遠心を行い、DNAの回収を行った。
【００３９】
ゲル回収後のPCR精製産物をインサートDNA、pEALSR1をプラスミドベクターとしてライゲーションを行った。インサートDNA溶液5μlとプラスミドベクター5μlを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)のI液を10μl加えて16度で一晩静置した。
【００４０】
形質転換と、形質転換したコロニーのスモールスケール培養は上記（1）と同様に行った。
【００４１】
スモールスケール培養により得られたプラスミドから目的である制限酵素サイトが新たに付加されたpEALSR1(pEALSR13’MCS)を選抜した。プラスミド溶液5μl、10xHBuffer(TOYOBO) 1.0μl、SalI(TaKaRa) 0.5μl、Csp45I (TOYOBO) 0.5μl、滅菌蒸留水3.0μlを加えて混合し、37℃で2時間静置した。DNA溶液の1/10量のLoading Bufferを加え、1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動した後、エチジウムブロマイド溶液で染色し、切り出されたバンドが期待されたサイズであることを確認した。
【００４２】
次に、上記の増幅したMdTFL1-1ポリヌクレオチドをSalIおよびMluIで以下のように切断した。まず、PCRで増幅したMdTFL1-1ポリヌクレオチド溶液を14μl、10XHbuffer(TaKaRa)5.0μl、SalI(TaKaRa)2.0μl、MluI(TaKaRa)2.0μl、滅菌蒸留水を27.5μlを混合し、37℃で2時間静置した。SalIとMluIによる制限酵素処理は、pEALSR13’MCSに対しても同様に行った。
【００４３】
続いて制限酵素処理したMdTFL1-1ポリヌクレオチドおよびpEALSR13’MCSの回収をMonoFas DNA精製キットIを用いたゲル回収により、上記（1）と同様に行った。
【００４４】
ゲル回収後のMdTFL1-1ポリヌクレオチドをインサートDNA、pEALSR13’MCSをプラスミドベクターとしてライゲーション、および形質転換、形質転換したコロニーのスモールスケール培養は上記（1）と同様に行った。
【００４５】
スモールスケール培養により得られたプラスミドにMdTFL1-1ポリヌクレオチドが導入されているかどうかを制限酵素で処理して確認した。プラスミド溶液5μl、10xHBuffer(TOYOBO) 1.0μl、SalI(TaKaRa) 0.5μl、MluI (TaKaRa) 0.5μl、滅菌蒸留水3.0μlを加えて混合し、37℃で2時間静置した。DNA溶液の1/10量のLoading Bufferを加え、1％アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動した後、エチジウムブロマイド溶液で染色し、切り出されたバンドが期待されたサイズであることを確認した。
【００４６】
ラージスケール培養は上記（1）のpEALSR2L5R5FTの場合と同様に行い、pEALSR13’MCSにMdTFL1-1ポリヌクレオチドを導入した感染性cDNAクローンpEALSR13’MCSMdTFL1-1を得た。
（3）感染性cDNAクローンのウイルス化
増殖宿主のChenopodium quinoa（キノア）の葉にカーボランダムをふりかけ、pEALSR13’MCSMdTFL1-1（1μg/μl）(図１上)とpEALSR2L5R5FT（1μg/μl）（図１下）を等量ずつ混ぜ合わせたDNA溶液をこれら1葉当たり8μlずつ接種しウイルス化を行うことでAtFT遺伝子を発現しながらMdTFL1-1遺伝子の発現抑制を行うALSVベクター（MdTFL-AtFT-ALSV）を得た。MdTFL-AtFT-ALSV感染により退緑症状が現れたキノア葉をサンプリングし、以下の操作に用いた。
（4）RNAの抽出
MdTFL-AtFT-ALSV感染キノア葉からの全RNA抽出は以下の手順で行った。まず、MdTFL-AtFT-ALSVをキノアに接種後、7〜10日の接種葉と病徴の現れた上葉をサンプリングした。この感染葉2gを液体窒素と乳棒と乳鉢を用いて完全に破砕し、20mlのTripure RNA isolation reagentが入った50mlチューブに移した。10分間室温で攪拌した後、10分間室温で静置した。15分間の遠心により分離した水層を新しいチューブに移し、等量の2-プロパノールを加えて混合し、10分間遠心して沈殿を得た。70％エタノールを加えて沈殿を洗浄した後、5分間遠心して全RNAを沈殿させた。70％エタノールを取り除き、全RNAの沈殿を800μlの滅菌蒸留水に溶解し、400μlずつ新しい1.5mlチューブに分注した。それぞれのチューブに水飽和フェノールとクロロホルムを200μlずつ加えてボルテックスミキサーで十分に攪拌した後、14000rpmで10分間の遠心により分離した水層400μlを新しいチューブに移し、40μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）、1mlの99.5％エタノールを加え、十分に攪拌した。攪拌後14000rpmで10分間の遠心により得られた全RNAの沈殿に70％エタノール1.5mlを加えて洗浄した。70％エタノールを取り除いた後、全RNAを滅菌蒸留水に溶解し、分光光度計（ＮanoDrop Technologies, ND-1000 v3.1.2）で得られた溶液を4μg/μlに調整し、これをRNA溶液とした。
（5）パーティクルガン接種（Helios Gene Gun System (BIO-RAD)）
マイクロキャリア（RNA:5μg/金粒子：0.4mg/shot）の調製は以下の手順で行った。まず、1.5mlチューブに金粒子（0.6μm）を16mg量り取り、滅菌蒸留水50μlを加え、ボルテックスミキサーで十分に混和した。超音波洗浄機にチューブを入れ、5分間以上ソニケーションした。ボルテックスミキサーにチューブをセットし、攪拌しながら50μlのRNA溶液（4μg/μl）を静かに加えた。同様に、5M酢酸アンモニウムを10μl、続いて2-プロパノールを220μl静かに加えた。しばらく攪拌した後、-20℃で1時間以上静置した。上清を取り除き金粒子の沈殿をボルテックスミキサーで一瞬攪拌した。金粒子の沈殿に1mlの100％エタノールを加え、沈殿を崩さないように静かに浸透し、その後上清を取り除いた。この作業を4回繰り返した後に2.4 mlの100％エタノールに金粒子を懸濁し、ゴールドコートチューブの調製に使用した。チュービングプレップステーション（BIO-RAD）にゴールドコートチューブ（BIO-RAD）をセットし、純窒素ガスを20分間通してゴールドコートチューブの内部を完全に乾燥させた。続いて金粒子の懸濁液を、均一になるようゴールドコートチューブ内に充填し、5分間放置して金粒子をゴールドコートチューブ内に沈着させた後、上清の100％エタノールをゴールドコートチューブ内から取り除いた。続いてチュービングプレップステーションを回転させ、金粒子をゴールドコートチューブ内部に均一に拡散させながらゴールドコートチューブ内に純窒素ガスを通し、金粒子を完全に乾燥させた。続いてゴールドコートチューブをチューブカッター（BIO-RAD）を用いて40個に裁断し、パーティクルガンを用いて植物への接種を行った。4℃、遮光条件下で催芽した発根直後のリンゴ種子の種皮をメスで取り除き、その子葉に接種した。接種はヘリウム圧360psiのHelios Gene Gun System (BIO-RAD)を用いて1個体あたり4shot行った。
（6）接種個体の育成
接種個体は湿度を保ち、4℃、遮光条件下で1〜2日静置した後に長日条件下（25℃、明期16時間/暗期8時間）で2〜3日静置し、その後培養土に移植し、培養室（25℃、明期16時間/暗期8時間）で育成した。
（7）受粉
開花したから一般的な方法で花粉を採取し、開花個体同士で相互に受粉を行い、果実の形成を観察した。
2．結果
MdTFL-AtFT-ALSVを接種した20個体中18個体（90％）で接種後1.5〜3ヵ月に早期開花が認められた（図２）。この早期開花率は、AtFT-ALSVの接種（特許文献１、非特許文献１）の早期開花率約40％やMdTFL-ALSVの接種の早期開花率約10％（非特許文献２）に比べ大幅に向上した。さらに、花芽が連続して形成され（図３）、6カ月以上にわたって栄養成長と開花が連続して継続した（図４）。
【００４７】
また、図５はMdTFL-AtFT-ALSVの接種から8カ月後（受粉後4カ月）のリンゴ実生であり、種子を含む果実が結実した。さらに図６は、MdTFL-AtFT-ALSVを感染させてから約10カ月（受粉後約5カ月）のリンゴ実生の写真像（上）、その切断面の写真像（中）、およびこのリンゴ実生から採取した種子（合計9粒、不稔種子なし）の写真像（下）である。本願発明方法によって、MdTFL-AtFT-ALSVの接種から12カ月以内に次世代種子が取得可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上詳しく説明したように、本願発明はリンゴやナシ等のバラ科果樹の１世代の期間を１年生作物並みの12カ月以内に短縮することを可能とし、バラ科果樹の品種改良等の育種に大きく貢献する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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