(57)【要約】【課題】炎症性疾患の新規予防・治療薬、並びにその探索方法の提供。【解決手段】ロイシンリッチα２グリコプロテイン（LRG）の発現又は機能阻害物質を含有する、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤。LRGもしくはその産生細胞を用い、LRGの発現又は機能阻害を指標として、抗炎症性物質をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチα２グリコプロテイン（LRG）の発現又は機能阻害物質を含有する、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
LRGの発現阻害物質が、
（ａ）LRG遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）LRG遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、又は
（ｃ）LRG遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
LRGの機能阻害物質がLRGに対する抗体である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
炎症性疾患が炎症性腸疾患又は炎症性自己免疫疾患である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
（１）LRG遺伝子もしくは該遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程
（２）前記細胞におけるLRG遺伝子もしくはLRGタンパク質又はレポータータンパク質の発現量を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、LRG遺伝子もしくはLRGタンパク質又はレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
【請求項６】
LRGと被検物質とを接触させ、LRGと結合能を有する被検物質を抗炎症性物質の候補として選択することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、請求項６記載のスクリーニング方法。
（１）被検物質の存在下でLRGを炎症性疾患の標的細胞の細胞膜画分と接触させる工程
（２）細胞膜画分に結合したLRG量を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、細胞膜画分に結合するLRG量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
【請求項８】
抗炎症性物質の候補として選択された被検物質を炎症モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することをさらに含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
（１）炎症性疾患の標的細胞を、LRGの存在下及び非存在下で被検物質に接触させる工程
（２）各条件下での前記細胞における炎症反応の程度を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、LRGの存在下で炎症反応を抑制し、LRGの非存在下で炎症反応を抑制しなかった被検物質を、LRGの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質の候補として選択する工程
【請求項１０】
標的細胞における炎症反応を惹起する工程をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
TNFαまたはH2O2刺激により炎症反応を惹起することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞が腸管上皮細胞又は滑膜細胞である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ等の炎症性疾患の予防・治療剤、並びに炎症性疾患予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、ロイシンリッチα２グリコプロテインの機能を阻害する物質を含有する、炎症性疾患の予防剤及び／又は治療剤、並びにロイシンリッチα２グリコプロテインの機能阻害を指標とする、炎症性疾患予防・治療薬の候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは以前、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、ベーチェット病、キャッスルマン病等の炎症性疾患において、血中のロイシンリッチα２グリコプロテイン（leucine rich alpha 2 glycoprotein: LRG）（以下、LRGともいう）濃度が疾患マーカーとなること、そして、従来炎症マーカーとして使用されてきたC-reactive protein（以下、CRPともいう)よりもLRGの方がこれらの疾患活動性に対して強く相関するため、優れた疾患活動性マーカーとなり得ることを報告した(特許文献１、非特許文献１、２)。
【０００３】
しかしながら、上記の疾患におけるLRGの機能に関しては未だ明らかにされておらず、LRGが潰瘍性大腸炎、関節リウマチ等の炎症性疾患の治療標的となり得るか否かは全く不明のままであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2010-286279号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Serada S et al., Ann Rheum Dis, Vol. 69, pages 770-774, 2010
【非特許文献２】Serada S et al., Inflamm Bowel Dis, Vol.18, pages 2169-2179, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、潰瘍性大腸炎、関節リウマチをはじめとする炎症性疾患におけるLRGの機能を明らかにすることであり、当該機能に基づいてLRGを標的とするこれら炎症性疾患の予防・治療剤を提供すること、並びにLRGの機能調節を指標として、新規な炎症性疾患の予防及び／又は治療活性を有する物質を探索する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、LRG欠損マウスにデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いて大腸炎を誘発し、野生型マウスのDSS大腸炎モデルと病態を比較した。その結果、LRG欠損マウスでは、野生型マウスに比べて、DSS投与による体重減少からの回復が早く、また、大腸の短縮も認められなかった。さらに、LRG欠損マウスに抗II型コラーゲン抗体カクテル投与により関節炎（CAIA）を誘起した。その結果、野生型マウス群と比較し、LRG欠損マウス群では関節炎スコアが低値であった。これらの結果は、炎症性腸疾患や関節炎をはじめとする炎症性疾患の病態悪化にLRGが関与していることを示すものである。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］ロイシンリッチα２グリコプロテイン（LRG）の発現又は機能阻害物質を含有する、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤。
［２］LRGの発現阻害物質が、
（ａ）LRG遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）LRG遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、又は
（ｃ）LRG遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
である、上記［１］記載の剤。
［３］LRGの機能阻害物質がLRGに対する抗体である、上記［１］記載の剤。
［４］炎症性疾患が炎症性腸疾患又は炎症性自己免疫疾患である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［５］以下の（１）〜（３）の工程を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
（１）LRG遺伝子もしくは該遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程
（２）前記細胞におけるLRG遺伝子もしくはLRGタンパク質又はレポータータンパク質の発現量を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、LRG遺伝子もしくはLRGタンパク質又はレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
［６］LRGと被検物質とを接触させ、LRGと結合能を有する被検物質を抗炎症性物質の候補として選択することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
［７］以下の（１）〜（３）の工程を含む、上記［６］記載のスクリーニング方法。
（１）被検物質の存在下でLRGを炎症性疾患の標的細胞の細胞膜画分と接触させる工程
（２）細胞膜画分に結合したLRG量を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、細胞膜画分に結合するLRG量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
［８］抗炎症性物質の候補として選択された被検物質を炎症モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することをさらに含む、上記［６］又は［７］記載の方法。
［９］以下の（１）〜（３）の工程を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
（１）炎症性疾患の標的細胞を、LRGの存在下及び非存在下で被検物質に接触させる工程
（２）各条件下での前記細胞における炎症反応の程度を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、LRGの存在下で炎症反応を抑制し、LRGの非存在下で炎症反応を抑制しなかった被検物質を、LRGの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質の候補として選択する工程
［１０］標的細胞における炎症反応を惹起する工程をさらに含む、上記［９］記載の方法。
［１１］TNFαまたはH2O2刺激により炎症反応を惹起することを特徴とする、上記［１０］記載の方法。
［１２］標的細胞が腸管上皮細胞又は滑膜細胞である、上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、LRGは炎症性腸疾患や関節炎をはじめとする炎症性疾患の病態悪化に関与することが明らかとなったので、LRGの発現もしくは機能を阻害することにより、炎症性疾患を治療又は予防することができる。また、LRGの発現もしくは機能阻害を指標として、抗炎症性物質、ひいては炎症性疾患の治療又は予防薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）で大腸炎を誘起した野生型マウスにおいて、DSS非処理群と比較して血清中のLRG（mLRG）濃度が上昇する事を示す図である。
【図２】DSSで大腸炎を誘起した野生型マウス（WT）及びLRG欠損マウス（LRG KO）における体重の変動を示す図である。3% DSSを5日間飲水させて大腸炎を誘起した（N=5）。9日目にWT2匹、KO1匹を他の実験に供した（以後、WT: N=3、KO: N=4）。
【図３】DSSで大腸炎を誘起した野生型マウス（WT）及びLRG欠損マウス（LRG KO）における大腸の長さ（A）、並びに大腸の重量/長さの比率（B）を示す図である。大腸炎の進行により大腸の短縮が生じ、また炎症に伴う浮腫や細胞浸潤により大腸の長さあたりの重量（重量/長さの比率）が増加する。図３A中、「*」はWTに対するP値が0.005未満であることを示す（ｔ検定による。）。
【図４】抗II型コラーゲン抗体カクテル（Chondrex社）投与により関節炎（CAIA）を誘起した野生型マウス（WT）及びLRG欠損マウス（KO）における関節炎スコアを示す図である。抗体カクテル5mg/匹を腹腔内投与し、３日と１３日後にLPS 50μg/匹を腹腔内投与して、関節炎症状（関節炎スコア 0-16）を観察した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、少なくとも部分的には、LRGが炎症性腸疾患をはじめとする炎症性疾患の増悪に寄与していることの発見に基づく。当該知見は、LRGが炎症マーカーとして利用できるだけでなく、炎症性疾患の創薬標的ともなり得ることを示すものである。即ち、LRGの既知の阻害薬は炎症性疾患の予防及び／又は治療に有用であるとともに、LRGタンパク質やそれを発現する細胞・動物を用いて、新規なLRG阻害薬、ひいては炎症性疾患の予防・治療薬となる物質を探索することもできる。
【００１２】
I. LRG又はこれをコードする核酸
本明細書において、LRGは公知のタンパク質であり、Genbank Accession No.: NP_443204、又はGenbank Accession No.: NP_084072として知られている、配列番号：２又は４で表されるヒト又はマウスLRGのアミノ酸配列、あるいはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。
本明細書において、LRGはヒトや他の温血動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞［例えば、好中球など］又は組織［例えば、血液など］等から、公知のタンパク質分離精製技術により単離・精製されるものであってよい。
【００１３】
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）が挙げられる：
（ａ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ) 配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列の相補鎖配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列。
具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトLRGタンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列、または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトLRGタンパク質もしくはそのオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体もしくは多型バリアントにおけるアミノ酸配列が挙げられる。
【００１４】
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００１５】
上記（ｅ）におけるストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００１６】
より好ましくは、「配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」として、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と、約90%以上、好ましくは約95%以上、より好ましくは約96%以上、いっそう好ましくは約97%以上、特に好ましくは約98%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００１７】
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質である。
ここで「実質的に同質の機能」とは、例えば生理学的に、あるいは薬理学的にみて、その性質が定性的に同じであることを意味し、機能の程度（例、約0.1〜約10倍、好ましくは0.5〜2倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、現時点でLRGの生体内での詳細な役割は未知であるが、炎症反応を促進する活性を有するタンパク質を、「実質的に同質の機能を有するタンパク質」とみなすことができる。
ここで、炎症反応の促進活性は、例えば、後述するin vitroもしくはin vivoの炎症（性疾患）モデルを用いて測定することができる。
【００１８】
本発明におけるLRGタンパク質として、例えば、（i）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の1〜30個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1〜30個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1〜30個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の1〜30個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失、付加または置換されている場合、その挿入、欠失、付加または置換の位置は、タンパク質が炎症反応を促進し得る限り、特に限定されない。
ここでアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
【００１９】
LRGの好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質（Genbank Accession No. NP_443204）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ（例えば、マウスLRGタンパク質（配列番号：４、Genbank Accession No. NP_084072）等）、アレル変異体、多型バリアント〔例えば一塩基多型（SNPs）〕などがあげられる。
【００２０】
「LRGをコードする核酸」は、上記（ａ）〜（ｅ）で示される、配列番号：２で表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を表す。具体的には、以下の（ｆ）〜（ｊ）：
（ｆ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号１で示される塩基配列、
（ｊ）配列番号１で示される塩基配列の相補鎖配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
を有する核酸が挙げられる。
尚、ここで遺伝子とは、cDNAもしくはゲノムDNA等のDNA、またはmRNA等のRNAのいずれでもよく、また一本鎖の核酸配列および二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。また、本明細書において、配列番号：１及び配列番号：３等に示される核酸配列は、便宜的にDNA配列であるが、mRNAなどRNA配列を示す場合には、チミン（T）をウラシル（U）として解する。
【００２１】
LRGをコードする核酸の好ましい例としては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列からなるヒトLRG cDNA（Genbank Accession No. NM_052972）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ（例えば、マウスLRG cDNA（配列番号：３、Genbank Accession No. NM_029796）等）、アレル変異体、多型バリアント〔例えば一塩基多型（SNPs）〕などがあげられる。
【００２２】
本発明は、LRGの発現を阻害する物質又は機能を阻害する物質を含有してなる、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤を提供する。
【００２３】
II．LRGの発現を阻害する物質
本発明において「LRGの発現を阻害する物質」とは、LRGをコードする核酸（LRG遺伝子）の転写レベル、転写後調節のレベル、LRGタンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、LRGの発現を阻害する物質としては、例えば、LRG遺伝子の転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからLRGの翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する物質（例、siRNA、リボザイム）、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、
より好ましくは、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される物質が例示される。
（１）LRG遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（２）LRG遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、
（３）LRG遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。
ここで転写産物の好ましい例としては、mRNAが挙げられる。
【００２４】
LRG遺伝子のmRNAからLRGへの翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、好ましくは、これらのmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、投与対象となる哺乳動物におけるLRG産生細胞（例、好中球）の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約90％以上、好ましくは約95％以上、より好ましくは約97％以上の相同性を有する塩基配列である。
本発明における「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００２５】
より具体的には、LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、以下の（ｋ）または（ｌ）：
(ｋ)配列番号：１で表される塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列； 
(ｌ)配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ炎症反応を促進する活性を有するタンパク質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列；
が挙げられる。
ストリンジェントな条件は、前述のとおりである。
【００２６】
LRG遺伝子のmRNAの好ましい例としては、配列番号：１で表される塩基配列（Genbank Accession No. NM_052972）を含むヒトLRGのmRNA、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウスLRG（配列番号：３、Genbank Accession No. NM_029796）等）、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型バリアント等が挙げられる。
【００２７】
LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と「相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、LRG遺伝子のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上を含むものである。
【００２８】
具体的には、LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(１)〜(３）のいずれかのものが好ましく例示される：
(１) LRG遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸、
(２) LRG遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸、
(３) LRG遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。
【００２９】
(１) LRG遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「LRG遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていたりしてよい。
【００３０】
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、LRG遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、LRG遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【００３１】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質：LRGへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、LRGをコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、LRG遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端6-ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域または3’端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
【００３２】
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、LRG遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００３３】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
【００３４】
RNAの糖部のコンフォメーションはC2’-endo（S型）とC3’-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2’酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
【００３５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、LRG遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００３６】
(２) LRG遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸
LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。LRG遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００３７】
(３) LRG遺伝子のmRNAに対するsiRNA
本明細書においては、LRG遺伝子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、上記のアンチセンス核酸やリボザイムの代替技術として汎用されている。
【００３８】
siRNAは、標的遺伝子のcDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）、Teramotoら（FEBS Lett. 579(13):p2878-82(2005)）の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列は、原則的には15〜50塩基、好ましくは19〜49塩基、更に好ましくは19〜27塩基の長さを有しており、例えばAA+(N)19（AAに続く、19塩基の塩基配列）、AA+(N)21（AAに続く、21塩基の塩基配列）もしくはA+(N)21（Aに続く、21塩基の塩基配列）であってもよい。
本発明の核酸は、5’または3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2〜4塩基程度であり、siRNAの全長として19塩基以上である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシリボ核酸のデオキシチミジン残基を表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。
また、siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端および5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「aiRNA」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる（Sun, X.ら著、Nature Biotechnology Vol26 No.12 p1379、国際公開第WO2009/029688号パンフレット）。
標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTRおよび開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。上述の規則その他に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列およびTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００３９】
siRNAおよび／またはshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）およびpSilencer（登録商標） Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）があるがこれらに限定されない。
【００４０】
siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
当該修飾として具体的には、siRNAを構成するヌクレオチド分子の一部を、天然型のDNAや、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を施したRNAに置換することができる（Usman and Cedergren,1992,TIBS 17,34;Usman et al.,1994,Nucleic Acids Symp.Ser.31,163を参照）。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、siRNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等）、フッ素原子（-F）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。その他上記（１）に記載されたアンチセンス核酸における修飾方法を用いることができる。あるいは、siRNAにおけるRNAの一部をDNAに置換する化学修飾（2'-デオキシ化、2'-H）を施してもよい。また、糖（リボース）の2'位と4'位を-O-CH2-で架橋しコンフォメーションを N 型に固定した人工核酸（LNA：Locked Nucleic Acid）を用いてもよい。
また、siRNAを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、リンカーを介し、細胞表層に存在する受容体を特異的に認識するリガンド、ペプチド、糖鎖、抗体、脂質や正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通するオリゴアルギニン、Tatペプチド、RevペプチドまたはAntペプチドなどと化学結合していてもよい。
【００４１】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これを、ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００４２】
本明細書においては、生体内でLRG遺伝子のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやsiRNAを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば5〜25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
このようにして構築したsiRNAもしくはshRNA発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなどが用いられる。
【００４３】
上記siRNAは、ヌクレオチド配列の情報に基づいて、例えば394 Applied Biosystems,Inc.合成機等のDNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って化学的に合成することができる。例えば、Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology 211,3-19、Thompson et al.,国際公開99/54459、Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684、Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59、Brennan et al.,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33-45、Usman et al.,1987 J.Am.Chem.Soc.,109,7845、Scaringe et al.,1990 Nucleic Acids Res.,18,5433、および米国特許第6001311号に記載される方法等が挙げられる。具体的には、当業者に公知の核酸保護基（例えば5’末端にジメトキシトリチル基）およびカップリング基（例えば3’末端にホスホルアミダイト）を用いて合成できる。すなわち、5'末端の保護基を、TCA（トリクロロ酢酸）等の酸で脱保護し、カップリング反応を行う。ついでアセチル基でキャッピングを行った後、次の核酸の縮合反応を行う。修飾されたRNAやDNAを含むsiRNAの場合には、原料として修飾されたRNA（例えば、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-デオキシ−2'-フルオロヌクレオチド）を用いればよく、カップリング反応の条件は適宜調整できる。また、リン酸結合部分が修飾されたホスホロチオエート結合を導入する場合には、ボーケージ試薬（3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド）を用いることができる。
【００４４】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、別々に合成し、合成後に例えばライゲーションにより一緒につなげてもよいし（Moore et al.,1992,Science 256,9923;Draper et al.国際公開WO93/23569;Shabarova et al.,1991,Nucleic Acids Research 19,4247;Bellon et al.,1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951;Bellon et al.,1997,Nucleosides&Nucleotides,Bellon et al.,1997,Bioconjugate Chem.8,204）、または合成および／または脱保護の後にハイブリダイゼーションにより、一緒につなげてもよい。siRNA分子はまたタンデム合成法により合成することができる。すなわち、両方のsiRNA鎖を、切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドとして合成し、次にこれを切断して別々のsiRNAフラグメントを生成し、これをハイブリダイズさせて精製する。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００４５】
合成したsiRNA分子は、当業者に公知の方法を用いて精製できる。例えばゲル電気泳動により精製する方法、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製する方法が挙げられる。
【００４６】
LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の別の好ましい例として、該mRNAを標的とするmicro RNA（miRNA）が挙げられる。ヒトLRG mRNAを標的とするヒトmiRNAとしては、例えば、has-miR-220b、has-miR-93、has-miR-95等が挙げられる。miRNAも、上述のsiRNAについて記載した方法に準じて調製することができる。
【００４７】
LRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で提供されたり、他の分子が付加された形態で提供されうる。付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大させたりするような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００４８】
これらの核酸のLRG発現阻害活性は、LRGをコードする核酸を導入した形質転換体、生体内や生体外のLRG遺伝子発現系、または生体内や生体外のLRGタンパク質の翻訳系を用いて調べることができる。
【００４９】
本発明におけるLRGの発現を阻害する物質は、上記のようなLRG遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、LRGの産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
【００５０】
III.  LRGの機能を阻害する物質
本発明において「LRGの機能を阻害する物質」とは、いったん機能的に産生されたLRGがその機能を発揮するのを阻害する限りいかなるものでもよい。
【００５１】
具体的には、LRGの機能を抑制する物質として、例えば、LRGに対する抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
好ましい一実施態様において、LRGに対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
LRGの機能を抑制する別の好ましい物質は、Lipinski's Ruleに見合った低分子化合物である。そのような化合物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
【００５２】
LRGの発現もしくは機能を阻害する物質は、LRGにより促進される炎症反応を抑制する活性を示すことから、抗炎症剤として、炎症性腸疾患などの炎症性疾患の予防及び／又は治療に有用である。
従って、LRGの発現もしくは機能を阻害する物質を含有する医薬は、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤（抗炎症剤）として使用することができる。
【００５３】
IV．アンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬
LRG遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができる本発明のアンチセンス核酸や、LRG遺伝子の転写産物(mRNA）と相同な（もしくは相補的な）塩基配列を有し、当該転写産物を標的として該転写産物を切断し得るsiRNA（もしくはリボザイム）、さらに該siRNAの前駆体であるshRNAなど（以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある）は、生体内におけるLRGの発現を抑制し、炎症反応を抑制するので、抗炎症剤として使用することができる。
本発明の核酸を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００５４】
本発明の核酸を上記の抗炎症剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【００５５】
本発明の核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００５６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００５７】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００５８】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
【００５９】
本発明の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、潰瘍性大腸炎（UC）やクローン病（CD）等の炎症性腸疾患（IBD）の治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００６０】
なお前記した各組成物は、本発明の核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り適宜他の活性成分を含有してもよい。
【００６１】
V．LRGに対する抗体、LRGの発現もしくは機能を阻害する低分子化合物等を含有する医薬
LRGに対する抗体や、LRGの発現もしくは機能を阻害する低分子化合物は、LRGの産生または機能を阻害することができる。したがって、これらの物質は、生体内におけるLRGの発現もしくは機能を阻害するので、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤として使用することができる。
上記の抗体や低分子化合物を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００６２】
上記の抗体や低分子化合物は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００６３】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体または低分子化合物もしくはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【００６４】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００６５】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
【００６６】
上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、IBDの治療・予防のために使用する場合には、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
なお前記した各組成物は、上記抗体や低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００６７】
上述のLRGに対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬や、LRGに対する抗体、LRGの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物は、抗炎症剤として、炎症性疾患の治療、予防、または進行防止に用いることができる。炎症性疾患として、具体的には、潰瘍性大腸炎（UC）やクローン病（CD）等の炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ（RA）、ベーチェット病、キャッスルマン病等の炎症性の自己免疫疾患などが挙げられるが、これらに限定されず、LRGがその病態の増悪に関与しているいかなる炎症も、本発明の対象である炎症性疾患に包含される。
【００６８】
上述のLRGに対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬や、LRGに対する抗体、LRGの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物を炎症性疾患の治療または予防に使用する場合には、単独で使用してもよいが、１種または２種以上の抗炎症作用を有する薬剤と併用してもよい。
併用する薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、メサラジン、副腎皮質ステロイド（例、ベタメタゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン等）、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDs; 例、サリチル酸系、アントラニル酸系、アリール酸系、プロピオン酸系、オキシカム系、ピリン系）、抗TNFα抗体（インフルキシマブ、アダリムマブ）、抗リウマチ薬（例、アクタリット等の免疫調節薬、メトトレキサート等の免疫抑制薬、抗TNFα抗体やエタネルセプト等の生物学的製剤）などが挙げられる。
【００６９】
VI. 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
上述の通り、LRGの発現及び／又は機能を阻害すると、炎症反応が抑制される。従って、LRGの発現及び／又は機能を阻害する化合物は、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤（抗炎症剤）として使用することができる。
したがって、LRGを産生する細胞は、LRG（又はLRG遺伝子）の発現量及び／又は機能を指標とすることにより、抗炎症性物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。
【００７０】
LRGの発現又は機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、LRGを産生する能力を有する細胞を、被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるLRGの発現量又は機能の程度を比較することを含む。また、LRGの機能を阻害する化合物は、精製したLRGタンパク質への結合能、LRGタンパク質とその結合タンパク質（例えば、LRG受容体）との結合阻害活性を試験することによっても、スクリーニングすることができる。
【００７１】
上記のスクリーニング方法において用いられるLRGを産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒトもしくは他の哺乳動物細胞またはそれを含む生体試料（例：血液、組織、臓器等）であれば特に制限はない。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に被検物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、LRGを産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、H4IIE-C3細胞、HepG2細胞、HEK293細胞、COS7細胞、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
具体的には、LRGをコードするDNA（即ち、配列番号：１で表される塩基配列または該塩基配列に対し相補性を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むDNA）を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。
【００７２】
LRGをコードする遺伝子の調製方法について、以下に説明する。
LRGをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得することができる。すなわち、LRGをコードするDNAは、例えば、配列番号：１で表される塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、前記したLRGを産生する細胞・組織由来のcDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やPCR法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（上記）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７３】
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
【００７４】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
次いで、得られたLRG遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じてLRGタンパク質を製造・取得することができる。
例えば、LRG遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物からLRGを取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自律的に複製できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、LRGをコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、lac、trp、tacなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、タカラバイオ等から市販されている。当該発現ベクターにLRGをコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素もタカラバイオ等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、LRGをコードするDNAの上流にリボソーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボソーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００７５】
また、動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどを用いることもできる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、aP2遺伝子プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。
【００７６】
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
【００７７】
上記したLRGをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより、LRG発現細胞を製造することができる。
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞等を挙げることができる。哺乳動物細胞としては、例えば、HepG2細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、ヒトFL細胞、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットH4IIE-C3細胞、ラットGH3細胞などが用いられ得る。例えば、LRGの大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００７８】
形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法を用いることができる。
【００７９】
上記のようにして得られる形質転換細胞や生来LRGを産生する能力を有する哺乳動物細胞または該細胞を含む組織・臓器は、例えば、約5〜20%の胎仔牛血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122巻,501(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology,8巻,396(1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などの培地中で培養することができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８０】
LRGタンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清からLRGを前記と同様にして精製してもよい。また、LRGタンパク質が前記の培養により得られた形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、例えば、該形質転換体を遠心分離等で集めた後、細胞を破砕または溶解せしめ、必要であればタンパク質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製されたタンパク質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
【００８１】
本発明のスクリーニングを実施するに当たり、被検物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
また、LRGもしくはLRG遺伝子の発現量を低下させる物質、またはLRGの機能を低下させる物質を選択する際に、被検物質を接触させない対照細胞を比較対照として用いることもできる。ここで「被検物質を接触させない」とは、被検物質の代わりに被検物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、LRGもしくはLRG遺伝子の発現量またはLRGの機能に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００８２】
被検物質の上記細胞との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100μMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
【００８３】
LRGを産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、該動物個体の状態は特に制限されないが、例えば、薬剤もしくは遺伝子改変により炎症を誘起した炎症性疾患モデル動物（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）や2.4.6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）等の薬剤により大腸炎を誘起したマウス、IL-10ノックアウトマウスやIL-2ノックアウトマウス等の遺伝子改変マウス等のIBDモデル動物、コラーゲン誘導関節炎（CIA）マウス、SKGマウス、PD-1ノックアウトマウス、K/BxNマウス、シノビオリンTgマウス等のRAモデル動物など）であってもよい。使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、SPFグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。被検物質の該細胞との接触は、該動物個体への被検物質の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約0.5〜20 mg／kgを、1日1〜5回、好ましくは1日1〜3回、1〜14日間投与することができる。
あるいは、上記のスクリーニング方法は、LRGを産生する能力を有する細胞に代えて、該細胞の抽出液、あるいは該細胞から単離精製したLRGに、被検物質を接触させることにより行うこともできる。
【００８４】
（LRG遺伝子またはLRGの発現量の測定）
本発明は、LRGを産生する能力を有する細胞における該タンパク質（遺伝子）の発現を、被検物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被検物質の種類、被検物質と細胞との接触の態様などは、上記と同様である。
【００８５】
LRGの発現量は、前記したLRGをコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号：１で表される塩基配列もしくはそれと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（DNA)（以下、「本発明の検出用核酸」という場合がある）を用いて、LRG遺伝子のmRNAを検出することにより、RNAレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記したLRGに対する抗体（以下、「本発明の検出用抗体」という場合がある）を用いて、これらのタンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（a）LRGを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするmRNAの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法、および
（b）LRGを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、本発明の検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法を提供する。
【００８６】
すなわち、LRGの発現量を変化させる物質のスクリーニングは、以下のようにして行うことができる。
（i）正常あるいは疾患モデル（例えば、DSSもしくはTNBS誘起大腸炎モデルなど）非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して被検物質を投与し、一定時間経過した後（30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後）に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳等）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
LRGのmRNAは、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出して定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、LRGのタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ii）LRG遺伝子を発現する細胞（例えば、LRGを導入した形質転換体）を上記の方法に従って作製し、常法に従って培養する際に被検物質を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後（1日後〜7日後、好ましくは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後）、該細胞培養物中に含まれるLRGあるいはそれをコードするmRNAを、上記（i）と同様にして定量、解析することができる。
【００８７】
LRG遺伝子（mRNA)の発現レベルの検出および定量は、前記細胞から調製したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。具体的には、LRG遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、RNA中のLRG遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプローブもしくはプライマーは、LRG遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（http://primer3.sourceforge.net/）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００８８】
ノーザンブロット法を利用する場合、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
RT-PCR法を利用する場合は、細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のLRG遺伝子の領域が増幅できるように、LRG遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
被検物質を添加した細胞におけるLRG遺伝子の発現が被検物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被検物質はLRG遺伝子の発現抑制物質として選択することができる。
また、LRGの発現量を変化させる物質のスクリーニングは、LRG遺伝子の転写調節領域を用いたレポーター遺伝子アッセイで行うことも可能である。ここで、「転写調節領域」とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数kbから数十kbの範囲を指し、例えば、（i）5'-レース法（5'-RACE法）(例えば、5'-full Race Core Kit（タカラバイオ社製）等を用いて実施されうる)、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により、5'末端を決定するステップ；（ii）Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて5'-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することが出来る。
【００８９】
LRG遺伝子の転写調節領域の下流に機能可能な形でレポータータンパク質をコードする核酸（以下、「レポーター遺伝子」という）を連結して、レポータータンパク質発現ベクターを構築する。該ベクターは当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出されたLRG遺伝子の転写調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
レポータータンパク質としては、β-グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（GAS）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、青色蛍光タンパク質（CFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）等が挙げられる。
調製したLRG遺伝子の転写調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することができる。ベクターに搭載される選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、安定な形質転換細胞を得ることができる。あるいは、LRG遺伝子の転写調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子は、宿主細胞内に一過的に発現させてもよい。
また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよびATPと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピッカジーンデュアルキット（登録商標；東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
【００９０】
LRGのタンパク質量の測定方法としては、具体的には、例えば、
（i）本発明の検出用抗体と、試料液および標識化されたLRGとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより試料液中のLRGを定量する方法や、
（ii）試料液と、担体上に不溶化した本発明の検出用抗体および標識化された別の本発明の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のLRGを定量する方法等が挙げられる。
【００９１】
LRGのタンパク質発現レベルの検出および定量は、LRGを認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体としてLRGを認識する抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体としてLRGを認識する抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００９２】
上記の抗体は、その形態に特に制限はなく、LRGを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であってもよく、さらにはLRGを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体を用いることもできる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。
【００９３】
上記（ii）の定量法においては、2種の抗体はLRGの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がLRGのN端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として該タンパク質のC端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【００９４】
本発明の検出用抗体を用いるLRGの定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
【００９５】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
【００９６】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の検出用抗体に試料液を反応させ（1次反応）、さらに標識化した別の本発明の検出用抗体を反応させた（2次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のLRGを定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００９７】
本発明の検出用抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のLRGと標識したLRGとを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B，Fいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のLRGを定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（1次抗体）に対する2次抗体などを用いてB/F分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは1次抗体は可溶性のものを用い、2次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のLRGと固相化したLRGとを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のLRGと過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したLRGを加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のLRGの量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００９８】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてLRGの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の検出用抗体を用いることによって、細胞におけるLRGの量を感度よく定量することができる。
【００９９】
例えば、上記スクリーニング法において、被検物質の存在下におけるLRGの発現量（mRNA量またはタンパク質量）が、被検物質の非存在下における場合に比べて、約20%以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合、該被検物質を、LRGの発現阻害物質、従って、抗炎症性物質の候補として選択することができる。
【０１００】
あるいは、上記スクリーニング法において、LRG遺伝子を発現する細胞に代えて、LRG遺伝子の内在の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を用いることができる。このような細胞は、LRG遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子（例、ルシフェラーゼ、GFPなど）を導入したトランスジェニック動物の細胞、組織、臓器もしくは個体であってもよい。かかる細胞を用いる場合には、LRGの発現量は、レポーター遺伝子の発現レベルを、常法を用いて測定することにより評価することができる。
【０１０１】
（LRGの機能の測定）
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がLRGの機能を阻害するか否かを指標として行うこともできる。
LRGは主に好中球から血中に分泌されるタンパク質であるので、LRGタンパク質に結合能を有する物質は、LRGタンパク質とその結合パートナーであるタンパク質（例えば、標的細胞表面上のLRG受容体）との相互作用を遮断することにより、LRGの機能を阻害し得ると考えられる。従って、LRGへの結合能を指標として、LRGの機能阻害物質の候補をスクリーニングすることができる。
例えば、被検物質をウェルプレートの各ウェルに吸着させ、適当な標識剤で標識したLRG溶液を各ウェルに添加してインキュベートした後液相を除き、洗浄後に固相に結合した標識量を測定することにより、LRGとの結合能を有する被検物質を検出することができる。LRGを直接標識する代わりに、標識した抗LRG抗体を用いて固相に結合したLRGを検出することもできる。あるいは、LRGを固定化した担体（例、アフィニティーカラム）に被検物質の溶液を通し、該担体に保持された被検物質を、LRGとの結合能を有する物質、即ち抗炎症性物質の候補として選択することもできる。
このようにして得られた候補物質が実際に抗炎症作用を有するか否かは、該候補物質を炎症モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することにより確認することができる。そのような炎症モデルとしては、in vivo及びin vitroのモデルを用いることができる。in vivoモデルとしては、例えばDSS誘起大腸炎モデル（分子量5,000〜10,000のDSSを3〜5%(w/v)含有する水を、非ヒト動物に5〜10日間飲水させることにより調製することができる）、TNBS誘起大腸炎モデル（TNBSを50%エタノールに溶解し、例えば50μg/g体重の量で非ヒト動物に直腸内投与することにより調製することができる）等のIBDモデル、CIAモデル（完全フロイントアジュバントとエマルジョン化したII型コラーゲンで非ヒト動物を免疫することにより調製することができる）、CAIAモデル（II型コラーゲンのCB11内のエピトープを認識するモノクローナル抗体カクテルを非ヒト動物に注射することにより調製することができる）等のRAモデル等を用いることができるが、これらに限定されない。一方、in vitroモデルとしては、炎症性疾患における標的細胞（例えば、IBDにおける腸管上皮細胞、RAにおける滑膜細胞等）の培養系（例えば、Caco-2細胞培養系、RA患者の滑膜組織由来の滑膜線維芽細胞の培養系等）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのin vitroモデルは、必要に応じてTNFα等の炎症性サイトカインやH2O2等の活性酸素、LPS等による刺激、あるいは単球、マクロファージ、好中球等の炎症性サイトカイン産生細胞との複合培養（例えば、トランスウェルTM培養システム等を用い、上部コンパートメントに標的細胞（例、Caco-2細胞）、下部コンパートメントに炎症性サイトカイン産生細胞（マクロファージ様のTHP-1細胞、RAW264.7細胞）をそれぞれ単層培養する培養系）などにより、炎症反応を惹起することができる。
候補物質が抗炎症作用を有するか否かは、上記の炎症モデルにおける炎症反応が候補物質の添加により抑制されたか否かにより判定することができる。例えば、上記の薬剤誘起大腸炎モデル動物であれば、体重の変化（大腸炎発症による体重減少の抑制、あるいは体重減少からの回復の程度等）、大腸長の短縮、大腸炎症部位における上皮の損傷及び炎症細胞浸潤の程度などを指標にして、抗炎症効果の有無及び／又はその程度を判定することができる。一方、in vitro炎症性腸疾患モデルである腸管上皮細胞の単層培養系を用いた場合、経上皮電気抵抗（TER）値の低下、LDH産生、IL-8発現上昇を指標にして炎症反応の程度を評価することができる。
【０１０２】
本発明の別の好ましい態様においては、LRGタンパク質とその結合タンパク質（例えば、LRG受容体）との結合阻害活性を試験することによって、LRGの機能阻害物質をスクリーニングすることができる。LRGの受容体やLRGと結合する生体物質は未だ同定されていないが、LRGが主に好中球から血中に分泌されるタンパク質であることから、炎症性疾患における標的細胞の表面上に発現するタンパク質の中に、LRGの生理学的な結合パートナーが存在することが強く示唆される。従って、該標的細胞の膜画分（例えば、腸管上皮細胞の場合、粘膜固有層側の膜画分を常法に従って単離し、これを適当な担体上に固相化し、被検物質の存在下及び非存在下で、該固相に標識したLRGタンパク質を接触させ、被検物質の非存在下で細胞膜画分に結合したLRG量と比較して、被検物質の存在下で細胞膜画分に結合したLRG量が有意に低かった場合、該被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択することができる。こうして選択された候補物質が抗炎症作用を有するか否かは、上記と同様の方法で確認することができる。
【０１０３】
本発明のさらに別の実施態様においては、上記in vitro炎症モデルを用いて、LRGの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質を、ワンステップでスクリーニングすることもできる。当該方法は以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）炎症性疾患の標的細胞を、LRGの存在下及び非存在下で被検物質に接触させる工程
（２）各条件下での前記細胞における炎症反応の程度を測定する工程
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、LRGの存在下で炎症反応を抑制し、LRGの非存在下で炎症反応を抑制しなかった被検物質を、LRGの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質の候補として選択する工程
当該方法は、必要に応じて、上記工程（１）と同時もしくはその前後において、炎症を惹起する工程をさらに含み得る。炎症を惹起する方法としては、例えば、TNFα等の炎症性サイトカインやH2O2等の活性酸素、LPS等による刺激、あるいは単球、マクロファージ、好中球等の炎症性サイトカイン産生細胞との複合培養等が挙げられる。好ましい一実施態様においては、例えば、トランスウェルTM培養システム等を用い、上部コンパートメントに標的細胞（例、Caco-2細胞）、下部コンパートメントに炎症性サイトカイン産生細胞（マクロファージ様のTHP-1細胞、RAW264.7細胞）をそれぞれ単層培養する方法が挙げられる。この場合、下部コンパートメントの培地にLRGを添加する。当該培地に、さらにLPS等を添加して炎症を惹起してもよい。被検物質は通常、下部コンパートメントの培地に添加されるが、例えば、腸管吸収されてLRGの機能を阻害し得る食品中に含有される成分や、経口投与可能なLRG機能阻害薬をスクリーニングすることを目的とする場合等においては、上部コンパートメントの培地に被検物質が添加され得る。
【０１０４】
本発明の上記いずれかのスクリーニング方法を用いて得られる、LRGの発現または機能を阻害する物質は、炎症性疾患の予防及び／又は治療用の医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、上記LRGの発現または機能を阻害する低分子化合物と同様に製剤化することができ、同様の投与経路および投与量で、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して、経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【０１０５】
以下の実施例は、単に本発明をより具体的に例示するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１０６】
（参考例１）LRG欠損マウスの作製
以下の方法により、LRGホモ欠損マウスを作製した。
マウスLRG遺伝子（Lrg1）をPCR法にて取得し、ジフテリア毒素配列を有するベクターに挿入して次のような改変を加えてターゲティングベクターを作成した。Lrg1遺伝子のコード領域（エクソン２）の下流に、FRT配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子（Neo）を挿入し、さらにエクソン２上流とNeo下流にそれぞれLoxp配列を挿入した。本ターゲティングベクターをマウスES細胞にエレクトロポレーション法で導入し、ネオマイシン耐性ESクローンを選択した。相同組み換えクローンをPCR法にて同定し、キメラマウス作製に用いた。キメラマウスの産仔をPCR法でスクリーニングして目的のヘテロマウスを得たのち、FLP発現トランスジェニックマウスさらにCre発現トランスジェニックマウスとの交配により、NeoおよびLrgの各配列を順に欠損させた。得られたLrg1ヘテロ欠損マウス同士の交配によりLrgホモ欠損マウスを得た。
【０１０７】
（参考例２）DDS誘起大腸炎モデルにおける血中LRG濃度の上昇
野生型マウス（C57BL/6マウス）（性別：オス；週齢：8週齢；5匹）に、3%デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含有する水を5日間飲水させ、その後は通常水で飼育した。DSSの供与開始から7日後に野生型マウス2匹から採血し、血中LRG濃度をELISA法により測定したところ、コントロール（DSS非処理）群に比べてDSS処理群では血中LRG濃度の上昇が認められた（図１）。
【０１０８】
（実施例３）DSS誘起大腸炎に及ぼすLRG欠損の効果
参考例２と同様の方法で作製したDSS誘起大腸炎モデルマウス（LRG欠損マウス、野生型マウス各5匹使用）につき、DSSの供与開始から14日後まで（10日目以降はLRG欠損マウス4匹、野生型マウス3匹）、1日おきに体重を測定した。その結果、LRG欠損マウス群では野生型マウス群と同程度に体重の減少が見られたが、その後の体重の回復についてはLRG欠損マウス群の方が早く正常値に戻ることが明らかとなった（図２）。
次に、DSSの供与開始から14日後にマウスを屠殺し、体重と、大腸の長さ及び重量を測定した。その結果、DSS供与により、野生型マウスでは大腸が短くなっていたのに対し、LRG欠損マウスでは大腸長の短縮は認められなかった（p<0.005；図３A）。また、大腸の重量／長さ比は野生型マウスに比べて、LRG欠損マウスで低下傾向にあった（図３B）。尚、有意差の検定は、t検定により行った。
【０１０９】
（参考例４）リウマチ様関節炎モデルの作製
参考例１で作製したLRG欠損マウス及び対応する野生型マウス（C57BL/6マウス）（性別：メス；週齢：6週齢；各2匹）に、抗II型コラーゲン抗体カクテル5mg（Chondrex社 関節炎惹起用モノクロナール抗体カクテル(5クローン)）を腹腔内投与し、さらに３日後と１３日後にLPS 50μgを腹腔内投与した。
【０１１０】
（実施例５）リウマチ様関節炎に及ぼすLRG欠損の効果
LRG欠損マウス、野生型マウス各2匹につき、関節炎誘導開始から14日後まで関節炎スコアを測定した。その結果、LRG欠損マウス群では野生型マウス群よりも関節炎スコアが低値であった（図４）。関節炎スコアは標準的手法（J Immunol Methods. 2009 Mar 31;343(1):49-55.）により評価した。
以上の結果は、LRGが潰瘍性大腸炎、関節リウマチの病態悪化に寄与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、これまでの治療剤の標的とは異なる因子であるLRGを標的とした、炎症性疾患の予防及び／又は治療剤が提供される。新たな作用機序を有する治療薬が提供されることにより、既存の治療法では病状回復効果が認められない、又は病状回復効果が十分でない炎症性疾患患者、及び既存の治療薬を継続使用することで該治療薬について耐性を獲得した炎症性疾患患者に対してもより良い治療を提供し得る。さらに本発明は、炎症性疾患を未然に防ぐ予防目的、及び炎症性疾患が一時寛解した患者が病気の再発を予防する目的にも使用され得る。また、本発明によれば、LRGの発現又は機能を阻害することで抗炎症作用を発揮する、炎症性疾患の新規予防・治療薬の候補物質をスクリーニングすることが可能である。
【図１】
2014205630.tif 000002
【図２】
2014205630.tif 000003
【図３】
2014205630.tif 000004
【図４】
2014205630.tif 000005
【配列表】
2014205630000001.app