(57)【要約】【課題】炎症性腸疾患（ＩＢＤ）抑制効果に優れ、安全で副作用の心配がなく、しかも大量に調製することのできる天然由来物質の探索および開発を行う。【解決手段】セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患を処置するための医薬組成物、セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患の抑制効果を有する飲食物、ならびにセルロースナノファイバーを摂取させることを特徴とする、炎症性腸疾患の抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患の抑制効果を有する飲食物。
【請求項５】
セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、請求項４記載の飲食物。
【請求項６】
セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、請求項５記載の飲食物。
【請求項７】
炎症性腸疾患を抑制することを必要とする対象にセルロースナノファイバーを摂取させることを特徴とする、該対象における炎症性腸疾患の抑制方法（医療行為を除く）。
【請求項８】
セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための医薬組成物、セルロースナノファイバーを含有するＩＢＤの抑制効果を有する飲食物、ならびにセルロースナノファイバーを摂取させることを特徴とする、ＩＢＤの抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＢＤは、小腸または大腸の粘膜固有層における炎症細胞浸潤を特徴とする慢性腸障害であり、潰瘍性大腸炎およびクローン病を包含する。これらの疾患は、原因不明の慢性的な下痢や腸の痛みを伴い、寛解と再発を繰り返す。近年のＩＢＤ患者数は日本国内で年間約１４万人とされ、増加傾向にある。
【０００３】
ＩＢＤの治療としては、サラゾピリン、プレドニゾロン、免疫抑制剤、インフリキシマブの投薬、血球成分除去療法などが行われている。しかし、これらの薬剤を生涯かけて服用するケースも多い。そのうえ、これらの薬剤や療法は重大な副作用を有すること、高価であること、あるいは手軽に実施することができないことが問題となっている。また、重症例では大腸全摘出が行われることもある。これらの状況は患者のＱＯＬの面からも好ましくない。
【０００４】
最近になって、安全性が高く副作用が小さいものとして、天然由来の素材を疾病の抑制や治療に応用する試みが盛んに行われている。食物線維の整腸作用はよく知られているが（非特許文献１）、既知の食物線維よりもＩＢＤ抑制効果が大きく、安全で副作用の心配がなく、しかも大量に調製することのできる天然由来物質の探索および開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Rose, D.J., DeMeo, M.T., Keshavarzian, A., & Hamaker, B.R. (2007) Influence of dietary fiber on inflammatory bowel disease and colon cancer: importance of fermentation pattern. Nutrition Reviews 65(2), 51-62
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＢＤ抑制効果に優れ、安全で副作用の心配がなく、しかも大量に調製することのできる天然由来物質の探索および開発を行う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を行った結果、ナノファイバー化したセルロース（セルロースナノファイバー）がＩＢＤ抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。従来、食物線維の整腸作用はよく知られていたが、セルロースナノファイバーがＩＢＤを効果的に抑制することは知られていなかった。
【０００８】
したがって本発明は以下のものを提供する。
（１）セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患を処置するための医薬組成物。
（２）セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、（１）記載の医薬組成物。
（３）セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、（２）記載の医薬組成物。
（４）セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患の抑制効果を有する飲食物。
（５）セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、（４）記載の飲食物。
（６）セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、（５）記載の飲食物。
（７）炎症性腸疾患を抑制することを必要とする対象にセルロースナノファイバーを摂取させることを特徴とする、該対象における炎症性腸疾患の抑制方法（医療行為を除く）。
（８）セルロースナノファイバーが、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法により得られるものである、（７）記載の方法。
（９）セルロース含有材料が、穀物、果実または海藻に由来するものである、（８）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、天然由来物質であるセルロースナノファイバーをＩＢＤの処置や抑制に用いることができ、その効果も大きい。セルロースナノファイバーは植物に豊富に含まれるため大量生産することができる。しかも、セルロースナノファイバーは天然由来の成分なので、安全性が高く、副作用の心配もない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーが大腸長さ（図１Ａ）および大腸肥厚（図１Ｂ）に与える影響を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２】図２は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーが大腸長さ（図２Ａ）および大腸肥厚（図２Ｂ）に与える影響を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】図３は、海藻由来のセルロースナノファイバーが大腸長さ（図３Ａ）および大腸肥厚（図３Ｂ）に与える影響を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】図４は、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色像（図４Ａ）および組織学的評点を示すグラフ（図４Ｂ）である。図４Ａ中、（ａ）はコントロール（−）群、（ｂ）はコントロール（＋）群、（ｃ）はナシＮＦ（＋）群である。スケールバーは２００μｍである。図４Ｂ  ＊＊ｐ＜０．０１。＊ｐ＜０．０５
【図５】図５は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーおよび海藻由来セルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色像である。図５中、ａ）はコントロール（−）群、ｂ）はコントロール（＋）群、ｃ）はハトムギＮＦ（＋）群、ｄ）はヒジキＮＦ（＋）群、ｅ）はコンブＮＦ（＋）群、ｆ）はモズクＮＦ（＋）群である。スケールバーは２００μｍである。
【図６】図６は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織の組織学的評点を示すグラフ（図６Ａ）、および海藻由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織の組織学的評点を示すグラフ（図６Ｂ）である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図７】図７は、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織の核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）染色像（図７Ａ）およびＮＦ−κＢ陽性エリア率を示すグラフ（図７Ｂ）である。図７Ａ中、（ａ）はコントロール（−）群、（ｂ）はコントロール（＋）群、（ｃ）はナシＮＦ（＋）群である。スケールバーは１００μｍである。＊＊ｐ＜０．０１。
【図８】図８は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーおよび海藻由来セルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織の核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）染色像である。図８中、ａ）はコントロール（−）群、ｂ）はコントロール（＋）群、ｃ）はハトムギＮＦ（＋）群、ｄ）はヒジキＮＦ（＋）群である。スケールバーは１００μｍである。
【図９】図９は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバー（図９Ａ）および海藻由来セルロースナノファイバー（図９Ｂ）を投与した動物の大腸組織の核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）陽性率を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０】図１０は、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織のマッソントリクローム（ＭＴ）染色像（図１０Ａ）および細胞外マトリクス中の陽性エリア率を示すグラフ（図１０Ｂ）である。図１０Ａ中、（ａ）はコントロール（−）群、（ｂ）はコントロール（＋）群、（ｃ）はナシＮＦ（＋）群である。スケールバーは２００μｍである。
【図１１】図１１は、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色像（図１１Ａ）およびＭＰＯ陽性細胞数を示すグラフ（図１１Ｂ）である。図１１Ａ中、（ａ）はコントロール（−）群、（ｂ）はコントロール（＋）群、（ｃ）はナシＮＦ（＋）群である。スケールバーは１００μｍである。＊＊ｐ＜０．０１。＊ｐ＜０．０５
【図１２】図１２は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーおよび海藻由来セルロースナノファイバーを投与した動物の大腸組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色像である。図１２中、ａ）はコントロール（−）群、ｂ）はコントロール（＋）群、ｃ）はハトムギＮＦ（＋）群、ｄ）はヒジキＮＦ（＋）群である。スケールバーは１００μｍである。
【図１３】図１３は、ハトムギ由来のセルロースナノファイバー（図１３Ａ）およびヒジキ由来セルロースナノファイバー（図１３Ｂ）を投与した動物の大腸組織のＭＰＯ陽性細胞数を示すグラフである。＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための医薬組成物を提供する。セルロースはβ−グルコースがグリコシド結合により多数結合した多糖類であり、植物界に極めて豊富に存在する。なお、本明細書において、ＩＢＤとは、小腸または大腸の粘膜固有層における炎症細胞浸潤を特徴とする慢性腸障害をいい、潰瘍性大腸炎およびクローン病を包含する。
【００１２】
セルロースナノファイバーは、強度が高く、しかも軽量であるという性質を有することから、日用品から特殊用途品まで、例えば自動車ボディー、建築材料、コンテナや包装材料、家電品、スポーツ用品などへの用途が期待され、開発されている。しかしながら、セルロースナノファイバーをＩＢＤの処置や抑制に用いた例は存在しない。
【００１３】
本願明細書において、セルロース含有材料は、セルロースを含有するものであれば特に限定されず、いずれの材料であってもよいが、好ましくは植物由来の材料である。セルロース含有材料の非限定的な例としては、コメ、ムギ（例：オオムギ、コムギ、ハトムギ、エン麦など）、トウモロコシ、コウリャン、アワ、ヒエなどの穀物、サトウキビ、テンサイ、ダイズなどの植物の茎や籾殻、ナシ、リンゴ、バナナ、ブドウ、カキ、ミカン、イチゴ、ウリ、ブルーベリー、スイカなどの果実、キャベツ、白ねぎ、ブロッコリー、らっきょうなど野菜、長芋などのイモ類およびゴボウなどの地下茎などであってもよく、竹、ケナフ、綿などの植物体に由来するものであってもよい。また、セルロース含有材料はモズク、ヒジキ、ワカメ、コンブ、ケルプなどの海藻類由来であってもよい。
【００１４】
本発明で用いるセルロースナノファイバーの調製方法について説明する。一般的には、植物の線維質を解す（解繊）することによりセルロースナノファイバーを得ることができる。植物の線維質の取得方法は公知であり、特に限定されないが、例えば、植物体をすり潰して不溶性部分を集めることによって線維質を得ることができる。植物が木材の場合には、あらかじめ脱リグニン処理当の前処理が必要であり、これらの前処理は公知である。線維質の解繊方法も公知であり、特に限定されないが、グラインダーやミルなどの装置を用いて解繊することができる。代表的なセルロースナノファイバーの製造方法の例を以下に挙げる。
【００１５】
本発明で用いるセルロースナノファイバーの好ましい製造方法は、セルロース含有材料を水熱処理し、次いで、解繊処置する工程を含む方法である。この方法で得られたセルロースナノファイバーはＩＢＤの抑制効果が高い。この方法は、例えば下記工程を含むものであってもよい。
１）野菜や果実など任意のセルロース原料に水を添加し、ミキサーで荒破砕する
２）プレッシャークッカーに投入し１５０℃で２時間、水熱処理を行う
３）処理物を解繊装置（例えば湿式微粒化装置（スギノマシン製など）、石臼式摩砕機（増幸産業製など））を用いて解繊する。解繊処理はセルロース原料の種類に応じて繰り返し行う。
【００１６】
水熱処理は、亜臨界水（一般には、１００℃ないし３７４℃の温度で、１気圧ないし２２ＭＰａの圧力下）を用いて行われる、公知の処理方法である。水熱処理はオートクレーブ装置や高圧調理器などを用いて行うことができる。水熱処理によって植物細胞壁内の多糖類およびリグニンを分解し、植物組織を破壊し、線維を解しやすくすることができる。温度、ｐＨ、時間などの水熱処理の条件は、植物材料の種類や状態に応じて当業者が適宜定めうる。一般的には、約１２０〜約１８０℃で３０分〜１２０分の処理を行う。水熱処理はセルロースナノファイバーを結合する物質を選択的に破壊して効率的にナノファイバーに解繊できる。また、解繊を促すための化学薬品をいっさい使用しない点において有利である。
【００１７】
水熱処理後の材料を解繊処理に供する。解繊処理の前にカッターなどを用いて組織を細断しておいてもよい。解繊処理に用いる装置は特に限定されないが、石臼式摩砕器、高圧ホモジナイザー、凍結粉砕装置、超音波破砕機、高速回転ミキサーなどの装置を用いることができる。これらの装置は当業者によく知られており、材料やその他条件に応じて当業者が適宜選択して用いることができる。
【００１８】
本発明で用いるセルロースナノファイバーは、セルロース純品である必要はなく、セルロースを主成分としているものであればよい。本発明で用いるセルロースナノファイバーは、セルロース以外の糖類やペプチド類などの物質が混入あるいは結合していてもよい。
【００１９】
本発明で用いるセルロースナノファイバーは、好ましくは単離されたものである。セルロースナノファイバーが単離されているとは、セルロースナノファイバーが植物体から分離されていることをいう。
【００２０】
本発明で用いるセルロースナノファイバーのサイズは、典型的には、幅が５〜５０ｎｍ、長さが５００ｎｍ以上、好ましくは幅が１０〜３０ｎｍ、長さが１，０００ｎｍ以上である。なお、上述の水熱処理方法により製造したセルロースナノファイバーは多糖類等をその表面に残渣として含んでいる。
【００２１】
本明細書において、ＩＢＤを処置するとは、ＩＢＤを治療することおよび予防することを包含する。ＩＢＤを治療するとは、ＩＢＤの症状を緩和、軽減、抑制あるいは消失させることを包含する。ＩＢＤの予防とは、対象がＩＢＤに罹病しにくくすること、あるいは罹病しないようにすること、あるいは罹病しても症状を軽くすることを包含する。
【００２２】
セルロースナノファイバーを適当な担体や賦形剤と混合することにより、本発明のＩＢＤを処置するための医薬組成物を得ることができる。本発明のＩＢＤを処置するための医薬組成物の剤形は、経口剤形であればいずれの剤形であってもよく、シロップやドリンク剤のごとき液剤、カプセル、錠剤、顆粒、粉末、舌下錠などであってもよい。これらの剤形は公知の手段・方法により製造することができる。賦形剤や担体は常套的なものを用いることができ、混合、粉砕、打錠などの公知の手法を用いて様々な剤形を得ることができる。
【００２３】
本発明の医薬組成物の投与量は、通常、成人１人あたり１日に約５００ｍｇ〜約６００００ｍｇのセルロースナノファイバーが投与される量であってもよく、好ましくは５０００ｍｇ〜３００００ｍｇのセルロースナノファイバーが投与される量である。セルロースナノファイバーの投与量、投与間隔、投与期間は、患者のＩＢＤの重さ、患者が受けている他の治療法、患者の健康状態等により、医師が適宜定めうる。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、整腸作用を有することが知られている成分や消化剤、健胃成分、その他の成分を含んでいてもよい。例えば、従来の胃腸薬やＩＢＤ治療剤にセルロースナノファイバーを含ませてもよい。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、ＩＢＤの処置を必要とする対象にセルロースナノファイバーを投与することを特徴とする、ＩＢＤの処置方法を提供する。
【００２６】
本発明は、さらなる態様において、ＩＢＤを処置するための医薬を製造するためのセルロースナノファイバーの使用、ならびにＩＢＤを処置するためのセルロースナノファイバーの使用に関する。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、セルロースナノファイバーを含有する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の抑制効果を有する飲食物を提供する。ＩＢＤを抑制するとは、ＩＢＤの症状を緩和、軽減、抑制あるいは消失させることを包含する。さらにＩＢＤを抑制するとは、対象がＩＢＤに罹病しにくくすること、あるいは罹病しないようにすること、あるいは罹病しても症状を軽くすることを包含する。
【００２８】
本発明の飲食物はいかなる種類のものであってもよく、原材料、形状を問わない。本発明の飲食物は、製品である飲食物にセルロースナノファイバーを添加して得てもよい。また、本発明の飲食物は、原材料にセルロースナノファイバーを添加すること、あるいは製造工程においてセルロースナノファイバーを添加することによって得てもよい。セルロースナノファイバーの添加は公知の方法、例えば混合、混和、塗布または噴霧などの常套的な方法にて行われうる。本発明の飲食物に含まれるセルロースナノファイバーは、好ましくは単離されたものである。
【００２９】
本発明の飲食物中のセルロースナノファイバーの含有量は、通常、成人１人あたり１日に約５００ｍｇ〜約６００００ｍｇのセルロースナノファイバーが投与される量であってもよく、好ましくは５０００ｍｇ〜３００００ｍｇを経口摂取するように添加してもよい。本発明の飲食物へのセルロースナノファイバーの添加量は上記の量に限定されず、飲食物の種類、摂取量、風味などを考慮して適宜増減することができる。
【００３０】
本発明の飲食物の例としては、ジュースなどの飲料、ドレッシング、菓子類、パン、などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の飲食物は医薬組成物に準じた形状としてもよく、例えば錠剤、粉末、カプセル剤、ドリンク剤などの形態のサプリメントであってもよい。
【００３１】
本発明は、さらにもう１つの態様において、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を抑制することを必要とする対象にセルロースナノファイバーを摂取させることを特徴とする、該対象におけるＩＢＤの抑制方法を提供する。本発明のＩＢＤ抑制方法は、医療行為として行われてもよく、医療行為として行われなくてもよい。
【００３２】
本発明のＩＢＤ抑制方法におけるセルロースナノファイバーの摂取量は、通常、成人１人あたり１日に約５００ｍｇ〜約６００００ｍｇのセルロースナノファイバーが投与される量であってもよく、好ましくは５０００ｍｇ〜３００００ｍｇである。
【００３３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３４】
Ｉ．実験材料および方法
（１）実験動物および試薬
２０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（メス、５週齢）をＣＬＥＡジャパン（日本、大阪）から購入し、７日間馴化した後、実験に使用した。デキストラン硫酸ナトリウム（分子量３６〜５０ｋＤａ、試薬グレード）をMP Biomedicals LLC (Solon, OH, USA)から購入した。
【００３５】
ＩＢＤ惹起群のマウス（コントロール（＋）群）（control（＋）群とも表記）には実験開始日から５日間にわたり、３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を水道水に添加したものを飲料水として与え、自由に摂取させた。ＩＢＤ非惹起かつセルロースナノファイバー非投与であるコントロール（−）群（control（−）群とも表記）のマウスには水道水を飲料水として与え、自由に摂取させた。ＩＢＤ惹起かつナノファイバー処置群のマウス（ナシ果実（＋）群、ナシ果実水熱処理（＋）群、ナシＮＦ（＋）群、ハトムギＮＦ（＋）群、ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群、）には３％のＤＳＳおよび各材料由来のナノファイバーを水道水にて１０倍に希釈し飲料水としたものを自由に摂取させた。飲料水中のセルロースナノファイバー濃度は０．５７重量％であった。
【００３６】
（２）セルロースナノファイバーの調製方法
（２−１）以下にナシ果実からのセルロースナノファイバーの調製方法について説明する。成熟した２０世紀ナシの果肉を家庭用ブレンダーで粉砕した（ナシ果実（＋）群）、得られた試料（２１０ｇ）を水熱処理に供した。高圧調理器（VS-2416; Koy Engineering Corp. Saitama, Japan）を用いて水熱処理を１４０℃で６０分行った（ナシ果実水熱処理（＋）群）。水熱処理試料中に含まれているヘミセルロース、ペクチン、リグニン等を除去した。水熱処理前後の試料のｐＨは４．８であった。得られた試料を室温まで冷却し、濾過し、蒸留水にて充分に洗浄して水溶性成分を除去した。得られた試料を水に分散させ、グラインダー（１５００ｒｐｍ）で３回処理してナノファイバー試料（ナシＮＦ（＋）群）を得た。得られたナノファイバーの幅は約２０ｎｍであった。
【００３７】
（２−２）以下にハトムギの外皮および薄皮より成る籾殻からのセルロースナノファイバーの調製方法について説明する。ハトムギの籾殻に水を添加し１％の濃度とし、家庭用ミキサーで荒く破砕した。これをプレッシャークッカー（京真エンジニアリング製）に投入し１５０℃で２時間、１３８ＭＰａで水熱処理を行った。水熱処理物を湿式微粒化装置（スターバーストミニ、スギノマシンを用いて解繊した。解繊処理は５回繰り返し行った。これによりハトムギ由来セルロースナノファイバーを得た（ハトムギＮＦ（＋）群）。
海藻（ヒジキ、モズク、コンブ）由来のセルロースナノファイバーについても、上記と同様に水熱処理を行うことにより得た（ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群）。
【００３８】
（３）動物実験
コントロール（＋）群、コントロール（−）群、ナシ果実（＋）群、ナシ果実水熱処理（＋）群、ナシＮＦ（＋）群、ハトムギＮＦ（＋）群、ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群のそれぞれに５匹のマウスを用いた。実験を５日間行い、５日目に全群のマウスの大腸をサンプリングした。
【００３９】
（４）ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色および組織学的評点
大腸組織を１０％緩衝化ホルマリン中に固定した。各試料から切片（厚さ３ミクロン）を作成して、ＨＥ染色後に組織学的観察を行った。各切片を顕微鏡観察し、組織学的評点を行った。組織学的評点は、Ohkawara et al. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 40(9), 1049-1057 (2005)に記載されたようにして行った。
評点０：正常粘膜；評点１：炎症細胞の浸潤；評点２：腸絨毛の長さが正常の半分までは短縮していない（shortening of the crypt by less than half of the height）；評点３：腸絨毛の長さが正常の半分以上短縮している（shortening of the crypt by more than half of the height）；評点４：腸絨毛は消失している（crypt loss）；評点５：上皮細胞の破壊。組織学的評点は、各群３匹のマウスを用いて倍率１００倍にて１０個の視野において行った。合計３０個の視野の平均を各群の評点とした。
【００４０】
（５）核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の組織学的検出
ＮＦ−κＢはＩＢＤの大腸粘膜において活性化されることが知られている（Reed, K.L. et al. Digestive Disease and Science 50(12), 2366-2378 (2005); Visekruna, A. et al. Journal of Clinical Investigation 116(12), 3195-3203）。スライドグラス上に作製された大腸組織切片（厚さ３ミクロン）を脱パラファイン処理し、エタノールおよび水で洗浄し、ＰＢＳに浸漬した。切片を０．０１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理（５分間）した後、ＰＢＳで洗浄し、１％過酸化水素メタノール中室温で３０分インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をウサギポリクローナル抗−ＮＦ−κＢ  ｐ６５  抗体（1:500, sc-372; Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA）とともに室温で６０分間インキュベーションした。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Dako社（Glostrup, Denmark）のキット（コード番号Ｋ３４６６）を用いて室温で３０分間可視化させた。対比染色として、ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドとともにインキュベーションした組織切片を用いた。
【００４１】
上記のごとくして得られた大腸上皮中のＮＦ−κＢ陽性エリアの拡張を調べた。各縦断面（cross section）用にランダムに選択された高倍率（high-power fields）（倍率２００倍）を、顕微鏡に装備されたデジタルカメラで撮影した。Lumina Visionソフトウェア（Mitani Corporation, Tokyo, Japan）を用いてイメージをデジタル化し、カラースペクトルを分析した。ＮＦ−κＢ陽性エリアの全ピクセルエリアを視野中の全大腸組織に対応する全ピクセルエリアで割ることにより、大腸上皮中のＮＦ−κＢ陽性エリアのパーセンテージを計算した。この実験では各群３匹のマウスの大腸を使用した。３０視野から得た平均スコアを各群の線維形成の程度を示すものと見なした。
【００４２】
（６）マッソントリクローム（ＭＴ）染色
ＤＳＳにより惹起されたＩＢＤにおいて、急性フェーズおよび慢性フェーズの両方において大腸の粘膜および粘膜下層の線維形成が観察された（Suzuki, K. et al. Pathology International. 61(4):228-238 (2011)）。本実験では、デジタル技術による形態学的分析を用いて、大腸の粘膜および粘膜下層の線維形成エリアを定量した。具体的には、ＭＴ染色した大腸切片の細胞外マトリクスを、ＮＦ−κＢの組織学的検出のところで説明した手順に従ってデジタル的にイメージング分析した。３０視野から得た平均スコアを各群の線維形成の程度を示すものと見なした。
【００４３】
（７）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色
ＭＰＯ染色は組織中への白血球侵入のマーカーである（Schneidhelm et al. Clinical Chemistry, 55(8), 1462-1470 (2009)）。常法（Ohtsuka, Y. et al. Gut, 49(4), 526-533 (2001)）に記載された方法に従ってＭＰＯ染色を行った。Azuma, K. et al. Carbohydrate Polymers 87(2), 1399-1403 (2012)に記載された方法に従って、粘膜下層のＭＰＯ陽性細胞の計数を行った。各群３匹のマウスを用いて、倍率４００倍の１０視野中でＭＰＯ陽性細胞を計数した。３０視野から得た平均スコアをＭＰＯ陽性細胞数を示すものと見なした。
【００４４】
（８）統計学的分析
データを平均値±標準偏差として表した。大腸長さ、大腸肥厚は1-way ANOVAおよびTukey-Kramer's testを用いて統計学分析を行った。組織学的スコア、ＭＰＯ陽性細胞数、ＮＦ−κＢ陽性面積率、線維化面積率はSteel-Dwass testを用いて統計学的分析を行った。０．０５よりも小さいｐ値の場合に統計学的に有意であると見なした。
【００４５】
ＩＩ．実験結果
（１）セルロースナノファイバーがＩＢＤモデルマウスの大腸長さおよび大腸肥厚さに及ぼす影響
（１−１）ナシ果実由来のセルロースナノファイバー
大腸長さについては、コントロール（＋）群では５．０±０．１ｃｍであり、コントロール（−）群（７．３±０．１ｃｍ）よりも有意に短かった。ＩＢＤ惹起かつナシ果実由来のセルロースナノファイバー投与群（ナシＮＦ（＋）群）の大腸長さは５．６±０．１ｃｍであり、大腸の長さが有意に増加し、ＩＢＤの抑制が認められた（図１Ａ）。ナシ果実（＋）群およびナシ果実水熱処理（＋）群においても同様に大腸の長さが増加した（図１Ａ）。
【００４６】
大腸肥厚については、コントロール（＋）群では４１．０±０．７ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（−）群（２５．０±０．５ｍｇ／ｃｍ）よりも有意に大きな値であった。ナシＮＦ（＋）群の大腸肥厚は３６．９±０．６ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（＋）群と比較して有意に値が小さく、ＩＢＤの抑制が認められた（図１Ｂ）。ナシ果実（＋）群においても同様にＩＢＤの抑制が認められた（図１Ｂ）。
【００４７】
（１−２）ハトムギ由来のセルロースナノファイバー
大腸長さについては、コントロール（＋）群では５．０±０．１ｃｍであり、コントロール（−）群（７．３±０．１ｃｍ）よりも有意に短かった。ＩＢＤ惹起かつハトムギ由来のセルロースナノファイバー投与群（ハトムギＮＦ（＋）群）の大腸長さは５．７±０．１ｃｍであり、大腸の長さが増加し、ＩＢＤの抑制が認められた（図２Ａ）。
【００４８】
大腸肥厚については、コントロール（＋）群では４２．９±１．６ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（−）群（２５．０±０．５ｍｇ／ｃｍ）よりも有意に大きな値であった。ハトムギＮＦ（＋）群の大腸肥厚は３７．３±１．３ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（＋）群と比較して有意に値が小さく、ＩＢＤの抑制が認められた（図２Ｂ）。
【００４９】
（１−３）海藻由来のセルロースナノファイバー
大腸長さについては、コントロール（＋）群では５．０±０．１ｃｍであり、コントロール（−）群（７．３±０．１ｃｍ）よりも有意に短かった。ＩＢＤ惹起かつ海藻由来のセルロースナノファイバー投与群（ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群）の大腸長さはそれぞれ６．１±０．５ｃｍ、５．８±０．４ｍｇ／ｃｍ、５．９±０．２ｍｇ／ｃｍであり、大腸の長さが増加し、ＩＢＤの抑制が認められた（図３Ａ）。
【００５０】
大腸肥厚については、コントロール（＋）群では４２．８±１．６ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（−）群（２５．０±０．５ｍｇ／ｃｍ）よりも有意に大きな値であった。ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群の大腸肥厚はそれぞれ３４．４±０．８ｍｇ／ｃｍ、３７．４±１．３ｍｇ／ｃｍ、３９．４±０．４ｍｇ／ｃｍであり、コントロール（＋）群と比較して有意に値が小さく、ＩＢＤの抑制が認められた（図３Ｂ）。
【００５１】
（２）セルロースナノファイバーがＩＢＤモデルマウスの組織学的変化に及ぼす影響
ＨＥ染色を用いて大腸組織を調べ、組織学的評点をつけた。
（２−１）ナシ果実由来のセルロースナノファイバー
コントロール（＋）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および大腸の浮腫が観察された（図４Ａ（ｂ））。コントロール（−）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および浮腫は観察されなかった（図４Ａ（ａ））。ナシＮＦ（＋）群では腸絨毛の浸食が幾分観察されたが、腸絨毛の短縮または破壊は顕著に抑制されていた。大腸の浮腫もある程度抑制されていた（図４Ａ（ｃ））。これらの結果から、ナシ果実由来セルロースナノファイバーによるＩＢＤの抑制が明らかとなった。
【００５２】
組織学的スコアについては、コントロール（＋）群では３．７±０．２であり、コントロール（−）群（０．０±０．０）よりも有意に大きな値であった。ナシＮＦ（＋）群の組織学的スコアは２．１±０．２であり、コントロール（＋）群よりも有意に低い値であり、ＩＢＤの抑制が認められた（図４Ｂ）。ナシ果実（＋）群およびナシ果実水熱処理（＋）群においても組織学的スコアの改善が認められた（図４Ｂ）。
【００５３】
（２−２）ハトムギ由来のセルロースナノファイバー
コントロール（＋）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および大腸の浮腫が観察された（図５Ａ（ｂ））。コントロール（−）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および浮腫は観察されなかった（図５（ａ））。ハトムギＮＦ（＋）（図５（ｃ））群では正常な腸粘膜構造が保たれており、浮腫や炎症性細胞浸潤などの炎症所見はほとんど認められなかった。これらの結果から、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤ抑制効果を有することが明らかとなった。
【００５４】
組織学的スコアについては、コントロール（＋）群では３．７±０．２であり、コントロール（−）群（０．０±０．０）よりも有意に大きな値であった。ハトムギＮＦ（＋）群の組織学的スコアは２．１±０．２であり、コントロール（＋）群よりも有意に低い値であり、ＩＢＤの改善が認められた（図６Ａ）。
【００５５】
（２−３）海藻由来のセルロースナノファイバー
コントロール（＋）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および大腸の浮腫が観察された（図５Ａ（ｂ））。コントロール（−）群では腸絨毛の浸食、短縮または破壊、および浮腫は観察されなかった（図５（ａ））。ヒジキＮＦ（＋）群（図５（ｄ））、コンブＮＦ（＋）群（図５（ｅ））、モズクＮＦ（＋）群（図５（ｆ））ではコントロール（＋）群と比較して炎症所見は乏しかった。これらの結果から、海藻由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤ抑制効果を有することが明らかとなった。
【００５６】
組織学的スコアについては、コントロール（＋）群では３．７±０．２であり、コントロール（−）群（０．０±０．０）よりも有意に大きな値であった。ヒジキＮＦ（＋）群、モズクＮＦ（＋）群、コンブＮＦ（＋）群の組織学的スコアはそれぞれ１．８±０．２、２．３±０．２、２．３±０．２であり、コントロール（＋）群よりも有意に低い値であり、ＩＢＤの抑制が認められた（図６Ｂ）。
【００５７】
（３）セルロースナノファイバーがＩＢＤモデルマウスの大腸上皮のＮＦ−κＢに及ぼす影響
（３−１）ナシ果実由来のセルロースナノファイバー
ＮＦ−κＢ染色結果を図７Ａに示す。コントロール（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが大きかった（図７Ａ（ｂ））。ナシＮＦ（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが著しく減少した（図７Ａ（ｃ））。コントロール（−）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアはわずかであった（図７Ａ（ａ））。
【００５８】
図７Ａの結果を数値化（ＮＦ−κＢ陽性エリア％／視野、陽性面積率という）したものを図７Ｂに示す。コントロール（＋）群は１０．７±０．９％／視野であるのに対し、ナシＮＦ（＋）群は４．１±０．４％／視野であり、著しい減少が見られた。コントロール（−）群は１．８±０．３％／視野であった。これらの結果から、ナシ果実由来のセルロースナノファイバー、特に水熱処理および解繊により得られたセルロースナノファイバーがＩＢＤを効果的に抑制することが示された。
【００５９】
（３−２）ハトムギ由来のセルロースナノファイバー
ＮＦ−κＢ染色結果を図８に示す。コントロール（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが大きかった（図８（ｂ））。ハトムギＮＦ（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが著しく減少した（図８（ｃ））。コントロール（−）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアはわずかであった（図８（ａ））。
【００６０】
図８の結果を数値化（ＮＦ−κＢ陽性エリア％／視野、陽性面積率という）したものを図９Ａに示す。コントロール（＋）群は１０．７±０．９％／視野であるのに対し、ハトムギＮＦ（＋）群は５．３±０．６％／視野であり、著しい減少が見られた。コントロール（−）群は１．８±０．３％／視野であった。これらの結果から、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤを抑制することが示された。
【００６１】
（３−３）海藻由来のセルロースナノファイバー
ＮＦ−κＢ染色結果を図８に示す。コントロール（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが大きかった（図８（ｂ））。ヒジキＮＦ（＋）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアが著しく減少した（図８（ｄ））。コントロール（−）群では大腸上皮細胞中のＮＦ−κＢ陽性エリアはわずかであった（図８（ａ））。
【００６２】
図８の結果を数値化（ＮＦ−κＢ陽性エリア％／視野、陽性面積率という）したものを図９Ｂに示す。コントロール（＋）群は１０．７±０．８％／視野であるのに対し、ヒジキＮＦ（＋）群は５．３±０．５％／視野であり、著しい減少が見られた。コントロール（−）群は１．８±０．２％／視野であった。これらの結果から、ヒジキ由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤを抑制することが示された。
【００６３】
（４）セルロースナノファイバーがＩＢＤモデルマウスの大腸線維化に及ぼす影響
（４−１）ナシ果実由来のセルロースナノファイバー
ＭＴ染色の結果を図１０Ａに示す。コントロール（＋）群ではコラーゲンの蓄積が多く見られたが（図１０Ａ（ｂ））、コントロール（−）群ではコラーゲンの蓄積が少なかった（図１０Ａ（ａ））。ナシＮＦ（＋）群ではコラーゲンの蓄積がコントロール（＋）群と比較して著しく少なかった（図１０Ａ（ｃ））。
【００６４】
図１０Ａの結果を数値化（細胞外マトリクス中の陽性エリア％／視野、陽性面積率という）したものを図１０Ｂに示す。コントロール（＋）群は７．５±０．８％／視野であるのに対し、ナシＮＦ（＋）群は３．５±０．４％／視野であり、著しい減少が見られた。コントロール（−）群は１．５±０．２％／視野であった。これらの結果から、ナシ果実由来のセルロースナノファイバー、特に水熱処理および解繊により得られたセルロースナノファイバーがＩＢＤを効果的に抑制することが示された。
【００６５】
（４−２）ハトムギ由来のセルロースナノファイバー
ＭＴ染色の結果を図１１に示す。コントロール（＋）群ではコラーゲンの蓄積が多く見られたが（図１１（ｂ））、コントロール（−）群ではコラーゲンの蓄積が少なかった（図１１（ａ））。ハトムギＮＦ（＋）群ではコラーゲンの蓄積がコントロール（＋）群と比較して若干少なかった（図１１（ｃ））。
【００６６】
図１１の結果を数値化（細胞外マトリクス中の陽性エリア％／視野、陽性面積率という）したものを図１２Ａに示す。コントロール（＋）群は７．５±０．８％／視野であるのに対し、ハトムギＮＦ（＋）群は６．９±１．２％／視野であり、若干減少が見られた。コントロール（−）群は１．５±０．２％／視野であった。これらの結果から、ハトムギ由来のセルロースナノファイバーが大腸の線維化を抑制し、ＩＢＤを抑制することが示された。
【００６７】
（５）セルロースナノファイバーがＩＢＤモデルマウスの大腸線維化に及ぼす影響
大腸組織中への白血球侵入をＭＰＯ染色を用いて調べた。
（５−１）ナシ果実由来のセルロースナノファイバー
ＭＰＯ染色の結果を図１１Ａに示す。コントロール（＋）群（図１１Ａ（ｂ））ではＭＰＯ陽性細胞数が、コントロール（−）群（図１１Ａ（ａ））と比べて有意に多かった。ナシＮＦ（＋）群（図１１Ａ（ｃ））ではＭＰＯ陽性細胞数はコントロール（＋）群と較べて有意に少なかった。
【００６８】
図１１Ａの結果を数値化（ＭＰＯ陽性細胞数（個／視野））したものを図１１Ｂに示す。コントロ−ル（＋）群では１５．２±０．８個／視野、コントロール（−）群では０．０±０．０個／視野であり、ナシＮＦ（＋）群では８．１±１．１個／視野であった。ナシ果実（＋）群およびナシ果実水熱処理（＋）群においてもＭＰＯ陽性細胞数がある程度減少した。これらの結果から、ナシ果実由来のセルロースナノファイバー、特に水熱処理および解繊により得られたセルロースナノファイバーがＩＢＤを効果的に抑制することが示された。
【００６９】
（５−２）ハトムギ由来のセルロースナノファイバー
ＭＰＯ染色の結果を図１２に示す。コントロール（＋）群（図１２（ｂ））ではＭＰＯ陽性細胞数が、コントロール（−）群（図１２（ａ））と比べて有意に多かった。ハトムギＮＦ（＋）群（図１２（ｃ））ではＭＰＯ陽性細胞数はコントロール（＋）群と較べて有意に少なかった。
【００７０】
図１２の結果を数値化（ＭＰＯ陽性細胞数（個／視野））したものを図１３Ａに示す。コントロ−ル（＋）群では１５．２±０．８個／視野、コントロール（−）群では０．０±０．０個／視野であり、ハトムギＮＦ（＋）群では８．６±０．８個／視野であった。これらの結果から、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤを抑制することがわかった。
【００７１】
（５−３）海藻由来のセルロースナノファイバー
ＭＰＯ染色の結果を図１２に示す。コントロール（＋）群（図１２（ｂ））ではＭＰＯ陽性細胞数が、コントロール（−）群（図１２（ａ））と比べて有意に多かった。ヒジキＮＦ（＋）群（図１２（ｄ））ではＭＰＯ陽性細胞数はコントロール（＋）群と較べて顕著に少なかった。
【００７２】
図１２の結果を数値化（ＭＰＯ陽性細胞数（個／視野））したものを図１３Ｂに示す。コントロ−ル（＋）群では１５．２±０．８個／視野、コントロール（−）群では０．０±０．０個／視野であり、ヒジキＮＦ（＋）群では４．６±０．５個／視野であった。これらの結果から、ナシ果実由来のセルロースナノファイバーがＩＢＤを抑制することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、天然由来でしかも効果的なＩＢＤ抑制剤を提供する。したがって、本発明は、医薬品の分野、食品の分野等において利用可能である。
【図１】
2014177437.tif 000002
【図２】
2014177437.tif 000003
【図３】
2014177437.tif 000004
【図６】
2014177437.tif 000005
【図９】
2014177437.tif 000006
【図１３】
2014177437.tif 000007
【図４】
2014177437.tif 000008
【図５】
2014177437.tif 000009
【図７】
2014177437.tif 000010
【図８】
2014177437.tif 000011
【図１０】
2014177437.tif 000012
【図１１】
2014177437.tif 000013
【図１２】
2014177437.tif 000014