(57)【要約】      （修正有）【課題】配合飼料のような環境因子に頼らず、従来の遺伝的手法にように環境因子に影響することなく、長鎖高度不飽和脂肪酸の調節された鶏肉や鶏卵を提供する鶏を選抜及び生産する技術を提供する。【解決手段】下記の工程を含む、鶏の鑑定方法。（１）鶏に由来する試料からＤＮＡを取得する工程、（２）取得したＤＮＡの塩基配列について、ＥＬ５遺伝子の塩基配列の２１４９０番目の塩基におけるＡ／Ｔの多型、Ｄ５Ｄ遺伝子の塩基配列の５８６番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、及び、Ｄ６Ｄ遺伝子の塩基配列の第２５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、からなる群から選ばれる少なくとも一種のＳＮＰ情報を取得する工程、（３）上記ＳＮＰ情報に基づいて鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定する工程。【選択図】図３
2014050329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）鶏に由来する試料からＤＮＡを取得する工程、
（２）取得したＤＮＡの塩基配列について、
配列番号１に示すＥＬ５遺伝子の塩基配列の２１４９０番目の塩基におけるＡ／Ｔの多型、
配列番号３に示すＤ５Ｄ遺伝子の塩基配列の５８６番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
及び、
配列番号５に示すＤ６Ｄ遺伝子の塩基配列の２５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
からなる群から選ばれる少なくとも一種のＳＮＰ情報を取得する工程、
（３）上記ＳＮＰ情報に基づいて鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定する工程
を含む、鶏の鑑定方法。
【請求項２】
前記工程（３）において、配列番号１の前記多型がＴである、配列番号３の前記多型がＧである、又は配列番号５の前記多型がＧである場合に、長鎖高度不飽和脂肪酸含量がより高くなると推定する、請求項１に記載の鶏の鑑定方法。
【請求項３】
前記工程（３）において、前記ＳＮＰの組み合わせからなるハプロタイプを、ＥＬ５-Ｄ５Ｄ−Ｄ６Ｄの順に、Ｔ−Ａ−ＡをＨ１、Ｔ−Ｇ−ＡをＨ２、Ｔ−Ｇ−ＧをＨ３、そしてＡ−Ａ−ＡをＨ４と定義したときに、これらのハプロタイプから形成される最大１０種類のジェノタイプと、鶏肉又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量との相関関係に基づいて、鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定することを特徴とする、請求項１に記載の鶏の鑑定方法。
【請求項４】
前記長鎖高度不飽和脂肪酸がアラキドン酸である、請求項１に記載の鶏の鑑定方法。
【請求項５】
長鎖高度不飽和脂肪酸含量の調節された実用鶏の生産方法であって、
（Ａ）請求項１の鶏の鑑定方法の結果に基づいて特定のジェノタイプを有する実用鶏を選抜する工程、
（Ｂ）選抜された実用鶏の種鶏を育種する工程、
及び、
（Ｃ）育種された種鶏に前記実用鶏を産ませる工程
を含む、前記実用鶏の生産方法。
【請求項６】
前記実用鶏が、一代交雑種である、請求項5に記載の鶏の生産方法。
【請求項７】
前記工程（Ｂ）が戻し交配を用いる、請求項6に記載の鶏の生産方法。
【請求項８】
請求項5に記載の実用鶏の生産方法により生産される実用鶏を飼養して卵を産ませることからなる、長鎖高度不飽和脂肪酸の含量の調節された鶏卵の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鶏の鑑定方法に関し、より詳細には、鶏肉又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の合成に関与する酵素のジェノタイプの情報に基づいて、鶏肉又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸を鑑定する方法に関する。本発明は、さらに、上記鑑定結果に基づいて、長鎖高度不飽和脂肪酸の調節された鶏を育種する方法、さらに、長鎖高度不飽和脂肪酸の調節された鶏肉又は鶏卵を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
消費者の食や健康に対する関心は、ますます高くなっている。日本の消費者のグルメ志向は引き続き高いが、最近は、経済発展の著しいＡＳＥＡＮ地域でも、高嗜好性食品の需要が高まっている。そこで、日本の地鶏をはじめとする産品をＡＳＥＡＮ地域へ輸出する動きが、九州地方を中心に加速している。
【０００３】
食材の栄養価や食味を改善する物質として、長鎖高度不飽和脂肪酸が注目されている。長鎖高度不飽和脂肪酸は、ω−６脂肪酸とω−３脂肪酸とに大別される。ω−６脂肪酸は、２個以上の不飽和結合を有し、かつメチル末端から６番目の炭素原子に第１の二重結合を有する長鎖の高度不飽和脂肪酸である。ω−６脂肪酸の一種であるアラキドン酸は、細胞を構成する生体膜の構成材料となる、血中コレステロール量を正常化させる等の働きを有する。アラキドン酸は、また、食味の呈味を改善する効果を有する。例えば、特許文献１には、長鎖高度不飽和脂肪酸及び／又はそのエステル体並びにステロール及び／又はステロールエステルから成る飲食品の呈味向上剤が開示されている。アラキドン酸（ＡＡ）は、図１の生合成回路に示される一連の酵素反応によりリノール酸（ＬＡ）から変換される。
【０００４】
ω−３脂肪酸は、２個以上の不飽和結合を有し、かつメチル末端から３番目の炭素原子に第１の二重結合を有する長鎖の高度不飽和脂肪酸である。ω−３脂肪酸のうち生理学的に重要な脂肪酸として、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がよく知られている。ＤＨＡには、脳の発達、記憶力向上、老化防止、抗ガン、抗アレルギー等の作用があるといわれている。ＥＰＡには、血中のコレステロールを低下させ、動脈硬化、脳血栓等の成人病を予防する作用を有するといわれている。これらの脂肪酸は、図１の生合成回路に示す一連の酵素反応を介してα‐リノレン酸（ＡＬＡ）から変換される。
【０００５】
長鎖高度不飽和脂肪酸は、人間の体内では合成されない。したがって、日々、長鎖高度不飽和脂肪酸を含む食物から摂取しなければならない。食物摂取源の候補の一つとして、鶏肉や鶏卵が有望である。このような目的でＤＨＡを強化したＤＨＡ卵がすでに上市されている。
【０００６】
鶏肉中のアラキドン酸をはじめとする長鎖高度不飽和脂肪酸含量は、環境因子と遺伝因子とが総合して得られる表現型質である。発明者らは、非特許文献１において、環境因子の影響として、アラキドン酸高含有油脂を添加した飼料を鶏に与えることによって、以下のように鶏肉のアラキドン酸を高めることができることを報告した。アラキドン酸含有油を０．６２５〜２．５％添加した飼料をブロイラーや比内地鶏へ与えたところ、アラキドン酸含有量の添加率の上昇とともに、もも肉中のアラキドン酸含量が有意に増加した。このとき、その他の呈味成分であるグルタミン酸含量やイノシン酸含量は有意に増加していなかった。官能評価では、２．５％及び１．２５％添加区は対照のコーン区よりも有意に香り、味も強かった。
【０００７】
このように環境因子によって、鶏の長鎖高度不飽和脂肪酸含量を改善することは可能である。しかし、アラキドン酸をはじめとする長鎖高度不飽和脂肪酸を高含有する油脂は、非常に高価である。
【０００８】
遺伝因子を利用した鶏の品種改良は、従来、主に統計遺伝学的手法が用いられてきた。すなわち、鶏から目的とする量的形質データ（表現型）を測定した後、優秀な成績の個体同士を交配して、優良個体を選抜することが行われてきた。
【０００９】
しかし、肉質の改良のための世代間選抜には多大な時間と労力が必要である。また、世代間選抜は、環境因子の影響を受けやすい。従来の選抜育種は、必ずしも能率的でなく、肉質の優れた個体を正確かつ容易に選抜できる技術と、選抜された優良な個体を安定的に生産する技術の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】再表２０１０／００４７８４
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９０，１８１７−１８２２，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、配合飼料のような環境因子に頼らず、また、従来の遺伝的手法のように環境因子に影響することなく、長鎖高度不飽和脂肪酸の調節された鶏肉や鶏卵を提供する鶏を選抜及び生産する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らの一部による研究（非特許文献１）において、ブロイラーと比内地鶏肉との間で見られるアラキドン酸含量の違いは、遺伝的なものであり、また、比内地鶏の鶏肉においてもアラキドン酸含量にばらつきがあることから、体内でのアラキドン酸をはじめとする長鎖高度不飽和脂肪酸の生合成に関わる遺伝子の存在が示唆された。
【００１４】
遺伝子が支配している形質には、質的形質と量的形質があるが、鶏の筋肉脂肪内の長鎖高度不飽和脂肪酸量が個体によって連続的に変化するという形質は、量的形質に属する。本発明者らは、鶏肉の長鎖高度不飽和脂肪酸生合成に関与する遺伝子を解明するため、比内地鶏のＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ、量的形質遺伝子座）解析を実施した。ＱＴＬ解析とは、量的形質を支配する１個以上の遺伝子座の染色体上の位置を知ることを目的とする解析法である。一つの量的形質は、複数の遺伝子座によって支配されることが多い。
【００１５】
図１に示す長鎖高度不飽和脂肪酸の生合成に関わる３つの遺伝子、エロンガーゼ５（ＥＬ５）、デルタ５デサチュラーゼ（Ｄ５Ｄ）及びデルタ６デサチュラーゼ（Ｄ６Ｄ）の一塩基多型（ＳＮＰ）を発見するため、比内地鶏の、該遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、後述の実施例に示すとおり、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子の発現調節領域に、それぞれ、１個の一塩基多型（ＳＮＰ）と４種類のハプロタイプ（ＳＮＰの組み合わせ）が存在することを発見した。図１の生合成回路で、エロンガーゼは、炭素原子を取り込むことによって分子を長くする「伸長」に関与する酵素として、そして、デサチュラーゼは、新たな二重結合が生成する「脱飽和」に関与する酵素として機能する。そして、上記ハプロタイプ間で、鶏肉及び鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸量が有意に異なることも発見した。これら発見に基づいて、以下の発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、
（１）鶏に由来する試料からＤＮＡを取得する工程、
（２）取得したＤＮＡの塩基配列について、
配列番号１に示すＥＬ５遺伝子の塩基配列の２１４９０番目の塩基におけるＡ／Ｔの多型、
配列番号３に示すＤ５Ｄ遺伝子の塩基配列の５８６番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
及び、
配列番号５に示すＤ６Ｄ遺伝子の塩基配列の２５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
からなる群から選ばれる少なくとも一種のＳＮＰ情報を取得する工程、
（３）上記ＳＮＰ情報に基づいて鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定する工程
を含む、鶏の鑑定方法。
【００１７】
前記工程（３）において、特に、配列番号１の前記多型がＴである、配列番号３の前記多型がＧである、又は配列番号５の前記多型がＧである場合に、長鎖高度不飽和脂肪酸含量がより高くなると推定する。
【００１８】
前記工程（３）において、特に、前記ＳＮＰの組み合わせからなるハプロタイプを、ＥＬ５-Ｄ５Ｄ−Ｄ６Ｄの順に、Ｔ−Ａ−ＡをＨ１、Ｔ−Ｇ−ＡをＨ２、Ｔ−Ｇ−ＧをＨ３、そしてＡ−Ａ−ＡをＨ４と定義したときに、これらのハプロタイプから形成される最大１０種類のジェノタイプと、鶏肉又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量との相関関係に基づいて、鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定する。
【００１９】
前記長鎖高度不飽和脂肪酸がアラキドン酸であることが好ましい。
【００２０】
本発明は、また、長鎖高度不飽和脂肪酸含量の調節された実用鶏の生産方法であって、
（Ａ）上記鶏の鑑定方法の結果に基づいて特定のジェノタイプを有する実用鶏を選抜する工程、
（Ｂ）選抜された実用鶏の種鶏を育種する工程、
及び、
（Ｃ）育種された種鶏に前記実用鶏を産ませる工程
を含む、前記実用鶏の生産方法を提供する。
【００２１】
本発明において、実用鶏は、鶏肉及び／又は鶏卵を提供する鶏を意味し、種鶏は、食用卵を産ませ、食肉用の実用鶏になる卵を産ませる目的の鶏を意味する。本明細書において、「種鶏」という用語は、その親である原種鶏、さらにその親の原々種鶏をも含む意味で使用される。
【００２２】
前記実用鶏は、一代交雑種であることが好ましい。
【００２３】
前記工程（Ｂ）が戻し交配を用いることが好ましい。
【００２４】
本発明は、また、上記実用鶏の生産方法により生産される鶏を飼養して卵を産ませることからなる、長鎖高度不飽和脂肪酸の含量の調節された鶏卵の生産方法を提供する。
【００２５】
鶏肉や鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸を遺伝的に制御することや、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ、及びＤ６Ｄ遺伝子におけるＳＮＰ情報と鶏肉中の長鎖高度不飽和脂肪酸含量とが関連することについての報告はない。
【発明の効果】
【００２６】
従来の選抜育種は、鶏から目的とする量的形質データを採り、優秀な成績の個体同士を交配して優秀な子孫を得るものであった。量的形質は、環境因子の影響を受けやすいため、従来の選抜育種は、必ずしも能率的でなかった。一方、本発明は、鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸含量に影響する遺伝子の変異に基づいて、長鎖高度不飽和脂肪酸の調節された鶏を選抜及び育種することができる。本発明は、量的形質を支配している遺伝子を把握しているため、環境の影響を受けることなく、正確かつ能率的に鑑定や選抜を行うことができる。
【００２７】
本発明の鑑定方法は、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及び／又はＤ６ＤのＳＮＰ情報によって決定されるジェノタイプの相違に基づいて、鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の量や多寡を推定することが可能である。この鑑定方法によって、鶏肉又は鶏卵の栄養価や食味を推定することができる。
【００２８】
本発明は、鑑定方法の結果に基づき、優れた栄養価や食味を備えた鶏肉や鶏卵の得られる鶏を選抜、育種する方法を提供できる。ブロイラーといわれる外国品種は、日本人が好む優れた食味を備える地鶏（地域特産鶏）の肉と比べて食味が劣る。その要因として、ブロイラー鶏肉のアラキドン酸含量が地鶏と比べて有意に低いことが一因である。本発明の育種方法によれば、従来のブロイラーの食味の改善が可能である。
【００２９】
全国各地で地域特産の地鶏が生産されているが、その生産コストはブロイラーよりも格段に高い。生産者からは、おいしさの観点からのブロイラー鶏肉とのさらなる差別化が強く求められている。また、おいしい地鶏であっても、個体間でばらつくことがある。本発明によれば、各地域特産の地鶏の食味のさらなる向上を可能とする。また、同じ品種であっても、常に一定の品質を提供可能となる。本発明は、養鶏（鶏の飼育、繁殖、育種、改良等）、鶏肉や鶏卵の生産、加工分野において有効な技術を提供することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】長鎖高度不飽和脂肪酸の生合成回路と合成に関わる遺伝子を示す図である。
【図２】Ｄ６Ｄ遺伝子とＥＬ５遺伝子の遺伝子型分布を示す図である。鶏の品種の違いによってＤ６Ｄ遺伝子とＥＬ５遺伝子の遺伝子型分布が異なる。
【図３】ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子のＳＮＰ情報を判別する電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の鶏の鑑定方法は、
（１）鶏肉又は鶏卵からＤＮＡを取得する工程、
（２）取得したＤＮＡの塩基配列を調べ、
配列番号１に示すＥＬ５遺伝子の塩基配列の２１４９０番目の塩基におけるＡ／Ｔの多型、
配列番号３に示すＤ５Ｄ遺伝子の塩基配列の５８６番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
及び、
配列番号５に示すＤ６Ｄ遺伝子の塩基配列の２５番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、
からなる群から選ばれる少なくとも一種のＳＮＰ情報を取得する工程、
（３）上記ＳＮＰ情報に基づいて鶏肉及び／又は鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定する工程
を含む。上記工程を、以下に順に説明する。
【００３２】
（１）ＤＮＡを取得する工程
工程（１）では、鶏からＤＮＡを取得する。鶏は、いくつかの観点から分類することができる。本発明の方法に使用する鶏は、いずれの分類に属するものでもよい。
【００３３】
鶏の用途は、肉用種、卵用種又は卵肉兼用種に分かれる。肉用種の例には、軍鶏、ブラマ及びコーチンがある。卵用種の例には、白色レグホーン、黒色ミノルカ、アンダルシアン、オーストラロープ、イサブラウン、デカルプワーレンセクサルリンク、ハーバードコメット、ハイセックスブラウン、ハイラインブラウン等がある。卵肉兼用種の例には、横斑プリマロック、白色プリマスロック、ロードアイランド、ニューハンプシャー、名古屋コーチン、白色コーニッシュ、ロックホーン、ワイアンレッド、オーピントン等がある。
【００３４】
鶏は、また、産生国によって、国産鶏及び外国鶏に分けられる。外国鶏とは、海外の育種会社等によって育種改良され、国内に持ち込み生産された実用鶏をいう。外国鶏の例として、肉用種のブロイラーが有名である。ブロイラーは、生後３ヶ月未満の若鶏の状態で出荷するために、成長を促進させて肉質を高める方向へ改良された肉用若鶏の総称である。
【００３５】
国産鶏は、銘柄鶏や地鶏とも呼ばれ、日本国内の都道府県等により育種改良された鶏である。嗜好の多様化がすすむ中で、地方の在来種と肉味に定評のある軍鶏を掛け合わせる等した地域特産の地鶏が全国各地で作出されている。鶏を「地鶏」と銘打って市場に供給するためには、地鶏肉の特定ＪＡＳ規格（作り方ＪＡＳ）認定条件（血統、平飼い、飼育密度等）を満足する必要がある。地鶏の例として、比内地鶏、会津地鶏、奧美濃古地鶏、おおいた冠地どり、天草大王、みやざき地頭鶏、薩摩地鶏、名古屋コーチン等がある。
【００３６】
鶏は、自殖を進めて育成した固定種でも、雑種強勢を利用した一代交雑種（以下、Ｆ１やハイブリッドともいう）のいずれでもよい。ブロイラー及び地鶏のほとんどが一代交雑種である。ブロイラーは、白色コーニッシュ種のオスに白色プリマスロック種のメスを交配したものが大半を占める。比内地鶏は、比内鶏の特長を引き継ぎながら生産性を向上させるために、雄の比内鶏と雌のロードアイランドレッドを掛け合わせた一代交雑種である。一代雑種が市場を占有する理由は、収量性、耐病性等の表現形質が両親よりも優れる雑種強勢の発現、生産される鶏の表現形質が均一であること、Ｆ１を交配して得たＦ２はＦ１の性質を受け継がないので種鶏提供者の利益が確保される等が挙げられる。また、実用鶏の作出のもととなる種鶏が片性（雄又は雌の一方）でしか販売されていないこともある。したがって、Ｆ１鶏を導入して養鶏を行う生産者は、国内外の孵卵場や孵化場から雛又は雛を孵す卵を毎回購入する必要がある。地鶏は、一代交雑種に限定することなく、３品種、４品種の交雑によって生産されている場合もあるが、いずれにせよ、生産者は、特定の孵卵場や孵化場から雛又は雛を孵す卵を毎回購入する必要がある。
【００３７】
上記鶏からＤＮＡを取得する部所は、特に限定されない。例えば、鶏から取得した臓器、組織、血液、細胞等の体液、羊水や漿尿液から採取した鶏胚由来細胞、採取した組織等を培養した細胞、鶏卵、鶏の卵殻等である。好ましくは、血液である。
【００３８】
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。ｃＤＮＡは、常法に従って、被検試料からｍＲＮＡを抽出、精製後、逆転写酵素によって合成する。ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出は、当業者に公知の方法、例えばフェノール・クロロホルム法、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット等を用いる。
【００３９】
（２）ＳＮＰ情報を調べる工程
本発明の鑑定方法が注目する遺伝子は、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄである。これらの酵素は、図１に示すように、長鎖高度不飽和脂肪酸の生合成に関与する。ＥＬ５は、飼料から摂取した必須脂肪酸を体内でより長くし、不飽和結合を増やす酵素である。ＥＬ５遺伝子の全ゲノムＤＮＡ配列を配列番号１に示す。この塩基配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｇａｌｌｕｓ＿ｇａｌｌｕｓ（鶏ドラフトシーケンス２０１１年１１月版））に、第３染色体８７，６５４，７９６−８７，６９２，５４２として登録されている。ＥＬ５のアミノ酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、国立バイオテクノロジー情報センターのタンパク質データベースＥｎｔｒｅｚ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）にアクセッション番号ＡＤＯ２１４９８に登録されている。いずれの配列も当業者であれば容易に取得することができる。
【００４０】
Ｄ５Ｄは、脂肪酸のカルボキシル基を１位として５番目の位置を不飽和化する酵素である。Ｄ５Ｄは、インスリンの作用で活性化されリノール酸をアラキドン酸に変換する。Ｄ５Ｄ遺伝子の全ゲノムＤＮＡ配列を配列番号３に示す。当該配列は、同Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（鶏ドラフトシーケンス２０１１年１１月版）の第５染色体１６，０７９，２５２−１６，０８８，５６３に示されている。また、Ｄ５Ｄのアミノ酸配列を配列番号４に示す。当該配列は、同Ｅｎｔｒｅｚのアクセッション番号ＡＤＵ０５４６７に示されている。
【００４１】
Ｄ６Ｄは、リノール酸をγ−リノレン酸に変換する等の機能を有する酵素である。Ｄ６Ｄ遺伝子の全ゲノムＤＮＡ配列を配列番号５に示す。当該配列は、同Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（鶏ドラフトシーケンス２０１１年１１月版）の第５染色体１６，０９４，５５４  −１６，１１１，７８４に示されている。また、Ｄ６Ｄのアミノ酸配列を配列番号６に示す。当該配列は、同Ｅｎｔｒｅｚのアクセッション番号ＡＢＲ２４８０６に示されている。
【００４２】
比内地鶏生産に関わる比内鶏とロードアイランドレッド種、及びブロイラーについて、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定し、比較したところ、各遺伝子の発現調節領域にＳＮＰを発見した。
【００４３】
ＥＬ５の配列番号１に示す塩基配列中、５’側から２１４９０番目の塩基（ｗ）はチミン（Ｔ）又はアデニン（Ａ）である。
【００４４】
Ｄ５Ｄの配列番号３に示す塩基配列中、５’側から５８６番目の塩基（ｒ）はアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）である。
【００４５】
Ｄ６Ｄの配列番号５に示す塩基配列中、５’側から２５番目の塩基（ｒ）はアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）である。
【００４６】
上記の塩基に付された番号は、配列番号１、３又は５に示される遺伝子のゲノムＤＮＡ配列の第１番目のヌクレオチドから数えて何番目に該当するかを示すものである。
【００４７】
被検査試料の上記３遺伝子の少なくとも一種のＳＮＰ情報を調べる。ＳＮＰを調べる方法は、特に限定されたものではなく、従来公知の方法を適用できる。その例には、ＭＡMＡ法（アレル特異的増幅法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型法）法、ＰＣＲ‐ＤＧＧＥ法、ＰＣＲ‐ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ‐ＳＳＯＰ法、ＣＲ‐ＲＤ法、ＰＣＲ‐ＭＰＨ法、シークエンス法、ミニシークエンシング法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、一塩基伸長法、ＳＮａＰ  ｓｈｏｔＴＭ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法等がある。
【００４８】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、検出したい変異部位を含む遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅し、変異部位を認識する制限酵素でそのＰＣＲ産物を消化し、電気泳動にかけ、制限酵素による切断の有無から変異の有無を検出する方法である。まず、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型にしてＳＮＰを含むＤＮＡ領域の増幅を行う。例えば、上記ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片にハイブリダイズするプライマーを用いて、ＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲを実施する。ＰＣＲ法は、鋳型となるＤＮＡとその両端において相補的であり優先的にハイブリダイズする２個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなるプライマー伸長合成を行うサイクルを１０〜８０回繰り返す工程を含む。これらの操作は、通常、反応液及び耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット、及び市販のＰＣＲ装置等を利用して簡便に実施できる。ＰＣＲ反応条件、試薬、プライマー、制限酵素等の条件についても、装置のマニュアル、実験又は経験によって、最適なものを容易に選定することができる。
【００４９】
ＭＡＭＡ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法では、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを、多型部位を含まない領域に対合できるように設計し、設計されたプライマーペアを用いてＤＮＡ増幅法を実施する。ＤＮＡ試料中に多型に該当するいずれかのアレルが存在すると増幅産物が得られ、これが存在しないと増幅産物が得られない。従って、増幅産物の有無を検出することによって、特定のアレルの有無を判定できる。
【００５０】
本発明において、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子において検出された３つのＳＮＰの組み合わせから構成されるハプロタイプは、理論上、表１に示す８種類である。
【００５１】
【表１】
2014050329.tif 000003
上記８種類のハプロタイプから、最大３６種類（＝８＋７＋６＋５＋４＋３＋２＋１）の遺伝子型（ジェノタイプ）が検出され得る。
【００５２】
鶏のジェノタイプの対立遺伝子（アレル）は、雄雌の親から受け継いだものである。品種によっては、特定のハプロタイプをもっていない場合がある。例えば、比内鶏は、図２に示すように、Ｄ６Ｄ遺伝子のＧの頻度が０であり、よって比内鶏はＨ３、Ｈ５、Ｈ６及びＨ８のハプロタイプを持っていない。また、地頭鶏、薩摩、土佐地鶏、岐阜地鶏は、ＥＬ５のＡの頻度は０があり、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ及びＨ８のハプロタイプを持っていない。したがって、特定の単一品種及びそれらを交雑した鶏の集団においては、８種類全てのハプロタイプや、３６種類全てのジェノタイプが出現しない場合もある。たとえば、後述する、９４羽の雌の比内地鶏を分析した結果では、表６に示す４つのハプロタイプ（Ｈ１〜Ｈ４）のみが検出され、表７に示す１０種類のジェノタイプが検出され、他のハプロタイプ及びジェノタイプは検出されていない。
【００５３】
（３）ＳＮＰ情報に基づく長鎖高度不飽和脂肪酸の含量を推定
本発明の鑑定方法で推定される長鎖高度不飽和脂肪酸には、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３、ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３、ＤＧＬＡ）及びアラキドン酸（Ｃ２０：４、ＡＡ）のω−６酸、並びにステアリドン酸（Ｃ１８：４、ＳＤＡ）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、テトラコサペンタエン酸（Ｃ２４：５）、テトラコサヘキサエン酸（Ｃ２４：６）、及びドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ＤＨＡ）のω−３酸を含む。
【００５４】
アラキドン酸は、鶏肉の食味を改善する。鶏卵の摂食によってコレステロールの過剰摂取が危惧されるが、ＥＰＡやＤＨＡには、コレステロールの低下作用がある。よって、前記長鎖高度不飽和脂肪酸は、好ましくは、アラキドン酸、ＥＰＡ及びＤＨＡである。
【００５５】
各遺伝子のアレルと鶏肉中のアラキドン酸含量との間には、以下の相関関係がある。
（Ｉ）ＥＬ５のアレルがチミン（Ｔ）である、
（ＩＩ）Ｄ５Ｄのアレルがグアニン（Ｇ）である、
又は、
（ＩＩＩ）Ｄ６Ｄのアレルがグアニン（Ｇ）である、
場合に、アラキドン酸含量がより高くなる。
【００５６】
ＥＬ５遺伝子におけるＴアレル、Ｄ５Ｄ遺伝子におけるＧアレル、そしてＤ６Ｄ遺伝子におけるＧアレルは、アラキドン酸含量の高いファクターとして使用できる。ＥＬ５遺伝子におけるＳＮＰがＴであるかＡであるか、Ｄ５Ｄ遺伝子におけるＳＮＰがＧであるかＡであるか、及び／又はＤ６Ｄ遺伝子のＳＮＰがＧであるかＡであるかを同定することにより、アラキドン酸含量の高低の鶏の予測が可能となる。
【００５７】
ＥＬ５遺伝子におけるＴ／Ｔ若しくはＴ／Ａ、Ｄ５Ｄ遺伝子におけるＧ／Ｇ若しくはＡ／Ｇ、並びにＤ６Ｄ遺伝子におけるＧ／Ｇ若しくはＡ／Ｇのジェノタイプは、アラキドン酸含量の高いファクターとして使用できる。
【００５８】
図２は、鶏の品種の違いによる、ＥＬ５遺伝子とＤ６Ｄ遺伝子のアレルの頻度の相関図を示す。図２を見ると、おいしいとの評価が定着している軍鶏は、Ｄ６Ｄ遺伝子でグアニンの頻度が比較的高く、ＥＬ５遺伝子でチミンの頻度も高い。一般に評価の芳しくない市販ブロイラーは、Ｄ６Ｄ遺伝子でグアニンの頻度、及びＥＬ５のチミンの頻度がともに低い。したがって、市販ブロイラーでも、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のＳＮＰ情報を変更することにより、よりおいしい肉質のブロイラーを作出することが期待できる。
【００５９】
多価不飽和脂肪酸含量という量的形質は、３種類の上記遺伝子のＳＮＰ情報が総合したものである。鶏肉や鶏卵の食味や栄養価という表現形質は、８種類のハプロタイプ及び最大３６種類のジェノタイプに依存する。したがって、長鎖高度不飽和脂肪酸量のより正確な予測のためには、評価したい品種において、ハプロタイプと長鎖高度不飽和脂肪酸との相関関係を求めることが好ましい。
【００６０】
９４羽の比内地鶏の場合、アラキドン酸に対する３遺伝子のハプロタイプの効果は、表２のように推定される。
【表２】
2014050329.tif 000004
表２では、Ｈ２＞Ｈ１＞Ｈ４、Ｈ３＞Ｈ１＞Ｈ４に、有意差が認められる。Ｈ２とＨ３との間には有意差は認められないが、Ｈ３が多い傾向にある。
【００６１】
３遺伝子のジェノタイプとアラキドン酸との間には、表３の相関関係が推定される。
【表３】
2014050329.tif 000005
【００６２】
上記したとおり、比内地鶏には、Ｈ３／Ｈ３やＨ４／Ｈ４のホモ接合個体は実在しない。しかし、後述の戻し交配により親の比内鶏のジェノタイプを変更すれば、上記ホモ接合体の創生も可能である。そのときのアラキドン酸含量は表３の値と推定される。
【００６３】
上記ＳＮＰ情報を遺伝子マーカーとして用いれば、望ましい表現型に基づいた育種用の鶏を、より効率的に確立することができる。本発明の長鎖高度不飽和脂肪酸含量の調節された鶏肉及び／又は鶏卵を提供する鶏の生産方法は、
（Ａ）上記の鶏の鑑定方法の結果に基づいて特定のジェノタイプを有する実用鶏を選抜する工程、
（Ｂ）選抜された実用鶏の種鶏を育種する工程、
及び、
（Ｃ）育種された種鶏に前記実用鶏を産ませる工程
を含む。各工程を以下に詳述する。
【００６４】
（Ａ）特定のジェノタイプを有する実用鶏を選抜する工程
本発明の鑑定方法の結果に基づいて、所望のジェノタイプを有する実用鶏を選抜する。例えば、アラキドン酸含量に関して、１０種類のジェノタイプの格付けは、表３に示すとおりである。表３で、アラキドン酸含量の最も高い個体は、Ｈ３／Ｈ３ホモ型であり、最も低い個体はＨ４／Ｈ４ホモ型である。鶏肉の食味に関してアラキドン酸含量が高ければ高いほどよいというわけではない。鶏肉中のアラキドン酸含量は、通常、０．５〜５．０ｍｇ／ｇがよく、好ましくは０．８〜３．０ｍｇ／ｇである。この範囲は、アラキドン酸含量の高摂取と良好な食味を兼ね備える。したがって、適度のアラキドン酸含量を得るために、Ｈ１／Ｈ４ヘテロ型、Ｈ１／Ｈ１ホモ型、Ｈ２／Ｈ４ヘテロ型等の個体を選抜することもあり得る。
【００６５】
実用鶏は、固定種でも交雑種のいずれでもよい。アラキドン酸含量が一定の範囲に調節された地鶏やブロイラーの産業上の利用性は非常に高いので、好ましくは、交雑種である。
【００６６】
（Ｂ）選抜された実用鶏の種鶏を育種する工程
選抜された実用鶏のジェノタイプに基づいて、種鶏のジェノタイプを決定する。種鶏は、種鶏自体の他に、原々種鶏や原種鶏でもよい。例えば、鶏肉及び鶏卵用の一代雑種の実用鶏にジェノタイプＨ３／Ｈ３を選抜した場合、親となる種鶏のジェノタイプは、雄雌のジェノタイプともにＨ３／Ｈ３のホモ接合体となる。また、一代雑種の所望のジェノタイプがＨ２／Ｈ３ヘテロ型であった場合、親となる種鶏のジェノタイプは、片親をＨ２／Ｈ２ホモ接合体とし、もう片親をＨ３／Ｈ３のホモ接合体とする。
【００６７】
次いで、ジェノタイプが決定された種鶏を育種する。具体的には、戻し交配、系統内交雑、系統間交雑等により、選抜されたジェノタイプを鶏に導入する。
【００６８】
ジェノタイプがＨ３／Ｈ３である一代雑種の比内地鶏の種鶏として、雌の比内鶏の系統に、戻し交配でジェノタイプＨ３／Ｈ３を組み込む手順を以下に説明する。
【００６９】
ジェノタイプＨ３／Ｈ３を有する比内地鶏を戻し親である比内鶏（例えばＨ１／Ｈ１）と交配させ、Ｆ１世代を得る。Ｆ１世代の遺伝子座はＨ１／Ｈ３となる。Ｆ１世代における遺伝的背景の５０％は、比内鶏と同じである。このＦ１世代を比内鶏と戻し交配させ、Ｎ２世代を得る。Ｎ２世代における遺伝的背景の７５％は比内鶏と同じである。遺伝子座については、Ｈ１／Ｈ１の型をもった個体と、Ｈ１／Ｈ３のジェノタイプをもった個体が分離してくる。次に、Ｎ２世代を再び比内鶏へ戻し交配し、Ｎ３世代を得る。このとき、比内鶏への戻し交配に使用するＮ２個体とする、Ｈ３アリルをもった個体は、遺伝子マーカーによって容易に選抜することができる。このようにして選んだＮ２個体を比内鶏へ戻し交配しＮ３世代を得る。Ｎ３世代の個体の遺伝的背景は８７．５％が比内鶏と同じになっている。また、遺伝子座についてはＮ２世代同様、Ｈ１／Ｈ１の型をもつものと、Ｈ１／Ｈ３の型をもつものとが分離している。Ｎ２世代の場合と同様にして、Ｈ２アリルをもつＮ３個体を選び、比内鶏へ戻し交配を行う。得られたＮ４個体では、遺伝的背景の９３．７５％が比内鶏と同じになっている。遺伝子座についてはＮ２及びＮ３世代と同様であり、上記と同様の作業を行ってＮ５世代以降を得ていく。戻し交配の回数が増えるに従って、その世代の遺伝的背景は元の比内鶏の遺伝子構成に近づくが、遺伝子座については、元の比内鶏とは異なるＨ３アリルをもつ。
【００７０】
戻し交配を続ける限り、遺伝子座のジェノタイプは、Ｈ１／Ｈ３のヘテロ型のままである。遺伝的背景が比内鶏に十分近くなったと判断された時点で、ヘテロ型個体同士を交配させ、最終的にＨ３／Ｈ３ホモ型を持った比内鶏の系統が新たに確立される。
【００７１】
（Ｃ）育種した種鶏に実用鶏を産ませる工程
工程（Ｂ）で育種した雌雄の種鶏に実用鶏を産ませる。工程（Ｃ）は、工程（Ａ）及び（Ｂ）と同一又は異なる場所で行ってよい。通常、工程（Ａ）及び（Ｂ）は育種鶏を保有する公的機関や育種会社によって行われ、そして工程（Ｃ）は、種鶏場や原種鶏場にて実施される。
【００７２】
本発明の実用鶏の生産方法では、工程（Ａ）及び（Ｂ）で種鶏の系統を確立できれば、工程（Ｃ）の前に工程（Ａ）及び（Ｂ）を常に行う必要はない。したがって、工程（Ａ）及び（Ｂ）を用いて確立されている種鶏を工程（Ｃ）に適用することは、本発明の方法に含まれる。
【００７３】
本発明はまた、上記鶏の生産方法により生産される鶏を飼養して卵を産ませることからなる、長鎖高度不飽和脂肪酸の含量の調節された鶏卵の生産方法を提供する。この場合、雌親のジェノタイプが、そのまま鶏卵へ受け継がれる。
【００７４】
鶏卵中の含量が調節される長鎖高度不飽和脂肪酸は、好ましくはＥＰＡ及び／又はＤＨＡである。
【００７５】
本発明は、また、上記ＳＮＰ情報を含む遺伝子領域を、遺伝子増幅反応により特異的に増幅するためのプライマーを提供する。このプライマーは、鶏のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列上、上記ＳＮＰを挟み込むように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる。増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列は、ＳＮＰ情報の塩基配列を含むことになる。
【００７６】
プライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、さらに好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーによって増幅されるＤＮＡ断片の塩基長は、特に限定されないが、通常、１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。
【００７７】
ＳＮＰを検出するためのプライマーは、当業者であれば、配列番号１、３及び５の塩基配列に基づいて、容易に設計することができる。ＥＬ５遺伝子のＳＮＰを検出するためのプライマーとして、例えば配列番号７及び８で表される塩基配列を含むプライマー対が挙げられるが、これらに限定されない。同じく、Ｄ５Ｄ遺伝子のＳＮＰを検出するためのプライマーとして、例えば配列番号９及び１０、Ｄ６Ｄ遺伝子のＳＮＰを検出するためのプライマーとして、例えば配列番号１１及び１２を使用可能である。
【００７８】
プライマーをゲノムＤＮＡにハイブリダイゼズさせる条件は、当業者であれば適宜選択できる。例えば、２５％ホルムアミド（より厳しい条件では５０％ホルムアミド）、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液及び温度条件は、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃、より厳しい条件としては０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃で、さらに厳しい条件では０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃で実施する。プライマーは、蛍光物質；ビオチンやジゴキシゲニンのような結合親和性物質等で標識可能である。
【００７９】
本発明は、また、上記遺伝子の遺伝子多型の検出方法に用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子のＳＮＰ部位を含む領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで、「特異的」とは、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな条件で、上記遺伝子の多型部位を含む領域にハイブリダイズし、他の領域にハイブリダイズしないことを意味する。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜、選択することができる。
【００８０】
ストリンジェントな条件は、オリゴヌクレオチドとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）及びハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等を参照することができる。
【００８１】
ハイブリダイゼーション条件は、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８２】
オリゴヌクレオチドは、上記ＳＮＰを含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、ＤＮＡ領域に完全に相補的である必要はない。例えば５’末端側に数ｂｐ程度の他の塩基への置換があってもよく、また、５’末端側に任意の塩基が付加されてもよい。
【００８３】
オリゴヌクレオチドの鎖長は、上記ＳＮＰを含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、特に制限はない。好ましくは、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、より好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであり、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。
【００８４】
オリゴヌクレオチドは、固相に固定されていてもよい。固相の例には、セルロース、ニトロセルロース等のセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミックス、樹脂等が挙げられる。固相の形状及び材質は、特に限定されない。オリゴヌクレオチドは、市販のオリゴヌクレオチド合成機、合成オリゴヌクレオチド受託サービスを利用して容易に取得可能である。
【００８５】
前記オリゴヌクレオチドは、前記ＳＮＰを検出するためのプローブ、及び前記ＳＮＰを含むＤＮＡを精製するための吸着リガンドとして利用できる。プローブは、容易な検出のために、標識されてもよい。標識手段の例には、分光学的、光学的、生化学的、免疫学的、酵素化学的、及び放射化学的な手段がある。標識手段の具体例として、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素、３２Ｐ等のアイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質及び発色物質が挙げられる。
【００８６】
上記プライマー及び／又はオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ検出、さらには鶏肉又は鶏卵の長鎖高度不飽和脂肪酸含量を評価するための検査試薬として使用できる。したがって、本発明は、上記プライマー及び／又はオリゴヌクレオチドを含む遺伝子多型検出用キットを提供する。上記キットは、適宜、その他の試薬や器具、例えば、本発明の方法に用いるための各種試薬、制限酵素、反応液、対照標品、反応容器、操作器具等を含む。
【００８７】
本発明は、特に、上記オリゴヌクレオチドを複数用いたＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを提供する。ＤＮＡチップは、被検試料のＤＮＡをハイブリダイゼーションさせ、基板をスキャンしてハイブリダイゼーションシグナルの有無を検出することにより、ＳＮＰタイピングを行う。多数のプローブに対する反応を同時に観察できる。ＤＮＡチップに貼り付けるプローブは、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡのいずれでもよい。塩基配列の相補配列でもよい。ヌクレオチドの長さは、好ましくは２０〜３０ｍｅｒである。
【実施例】
【００８８】
以下に本発明の実施例を示すことにより、本発明を詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
比内地鶏から調製したゲノムＤＮＡの３種の遺伝子に関するＳＮＰ情報を以下の手順で調べた。
【００８９】
１．ＤＮＡの取得
比内地鶏（比内鶏とロードアイランドレッド種の一代交雑種）の雌９４羽を入手し、同一の飼料を２２週間与えて、環境に順化させた。この比内地鶏から採血し、以下の方法により、ＤＮＡを抽出、精製した。ＦＴＡカードに鶏の血液を垂らし、風乾する。パンチ（１．２ｍｍ径）で打ち抜き、９６ウェルＰＣＲプレートの１ウェルあたり、１個のディスクを置く。ＦＴＡ精製試薬（８０６８０６０１９，Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＮＡｚｏｌＢＤ試薬（ＤＮ１２９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）に続いて、滅菌蒸留水で２回洗浄後、１００μｌの滅菌蒸留水を加え、９０℃、１０分間加熱することによって、ディスクから、ＤＮＡを回収した。
【００９０】
２．ＳＮＰの決定
上記ＤＮＡを用いて、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子のＳＮＰ情報を、MAMA法で決定した。ＰＣＲ反応液の組成は、以下のとおりであった。
ゲノムＤＮＡ  １〜１０ｎｇ、
ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ  ＰＣＲ  マスターミックス（ＲＰ３００Ａ、タカラバイオ）  ４μｌ、
フォワードプライマー（２００μＭ）  ０．０１２５μｌ、
及び、
リバースプライマー（２００μＭ）  ０．０１２５μｌ
を上記組成物に超純水を加えて８μｌにメスアップした。
【００９１】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの配列を表４に示す。
【表４】
2014050329.tif 000006
【００９２】
ＰＣＲの反応条件は、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（Ｘ℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）を３０サイクル行った。表５に示す配列の組み合わせとアニーリング温度でＰＣＲを行った時、想定されるサイズのＤＮＡバンドがアガロースゲル電気泳動で検出されるか否かで、遺伝子型判定を行った。
【００９３】
【表５】
2014050329.tif 000007
【００９４】
反応後の断片をゲル電気泳動にかけた。電気泳動の条件は、２．５％アガロースゲル、１００Ｖ、３０分間であった。
（１）ＥＬ５の場合、図３の電気泳動図で、Tプライマーの２４７ｂｐのバンドのみ検出された時をＴ／Ｔ、Aプライマーの２４８ｂｐのバンドのみを検出した時をＡ／Ａ、そしてバンドを検出した時をＴ／Ａと判定した。
（２）Ｄ５Ｄの場合、図３の電気泳動図で、Aプライマーの１９５ｂｐのバンドのみ検出された時をＡ／Ａ、Ｇプライマーの１９５ｂｐのバンドのみ検出された時をＧ／Ｇ、そして両方のバンドを検出した時をＧ／Ａと判定した。
（３）Ｄ６Ｄの場合、図３の電気泳動図で、Aプライマーの２７４ｂｐのバンドのみ検出された時をＡ／Ａ、Ｇプライマーの３９７ｂｐのバンドのみ検出された時をＧ／Ｇ、そして両方のバンドを検出した時をＧ／Ａと判定した。
【００９５】
３．ハプロタイプの決定
ハプロタイプの同定を行ったところ、４つのハプロタイプが見出された（表６）。
【表６】
2014050329.tif 000008
【００９６】
４．ジェノタイプ
９４羽について、各ジェノタイプの羽数と頻度を検出した（表７）。
【表７】
2014050329.tif 000009
【００９７】
５．脂肪酸組成
９４羽のうち３２羽を計画的にピックアップし、脂肪酸組成を調査した。試験方法は以下のとおりである。
【００９８】
（アラキドン酸含量の測定）
もも肉ミンチ０．５ｇにＰＢＳ（−）４．５ｍｌを加え、ウルトラタックスＴ−１０（ＩＫＡ社、Ｓ１０Ｄ−７Ｇ−ＫＳ−１１０  シャフトジェネレーター装着）で３００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズした。もも肉懸濁液１ｍｌに３ｍｌクロロホルム／メタノール（１：２  ｖ／ｖ）混合液、クロロホルム９００μｌ、内部標準溶液（Ｃ２３：０ｍｅｔｈｙｌをクロロホルムに溶解  約０．０１ｇ／ｍｌ）１００μｌ、ＰＢＳ（−）０．５ｍｌを加え再度ホモジナイズすることで脂質を抽出した。抽出液の溶媒を留去し脂質を得た後、基準油脂分析試験法（２．４．１．２−１９９６、参３．２．３−１９９６）に従って脂肪酸メチルエステルを調製し、ガスクロマトグラフ法によりアラキドン酸含量を分析した。
【００９９】
（分離条件）
カラム：キャピラリーカラムＤＢ−２３  内径０．２５ｍｍ×３０ｍ（アジレント・テクノロジー社製）
キャリアガス：ヘリウム
ヘッド圧：１２６ｋＰａ  （線速度３５．４ｃｍ／ｓｅｃ）
カラム温度：昇温モード  ８０〜２３０℃
検出器：ＦＩＤ
【０１００】
各遺伝子のジェノタイプとアラキドン酸と関係は、以下のとおりであった。
ＥＬ５  ：  Ｔ／Ｔ＞Ｔ／Ａ  （Ｐ＜０．０５）
ＥＬ５遺伝子の２つの対立遺伝子のうち、Ｔ／Ｔ型の鶏は、Ｔ／Ａ型の鶏よりもアラキドン酸含有量が高い。
【０１０１】
Ｄ５Ｄ  ：  Ｇ／Ｇ＞Ａ／Ａ，Ａ／Ｇ＞Ａ／Ａ  （Ｐ＜０．０５）
Ｄ５Ｄ遺伝子の２つの対立遺伝子のうち、Ｇ／Ｇ型及びＧ／Ａ型の鶏は、Ａ／Ａ型の鶏よりもアラキドン酸含有量が高い。Ｄ５ＤのＧ／ＧとＡ／Ｇ間に、有意差は認められなかった。
【０１０２】
Ｄ６Ｄ  ：  Ａ／Ｇ＞Ａ／Ａ  （Ｐ＜０．０５）
Ｄ６Ｄ遺伝子の２つの対立遺伝子のうち、Ａ／Ｇ型の鶏は、Ａ／Ａ型を保有する鶏よりもアラキドン酸含有量が高い。
【０１０３】
３遺伝子のＳＮＰとアラキドン酸の関係を調べた(表８)。
【表８】
2014050329.tif 000010
Ｄ５ＤとＤ６ＤのＳＮＰ間に有意差が認められた。ＥＬ５のＴとＡとの間に有意差は認められなかったが、Ｔが多い傾向にあった。３種の遺伝子のジェノタイプを調べることで、鶏のアラキドン酸含量とそれによる食味の良さをも判定することが可能であることが示された。
【０１０４】
アラキドン酸に対する３遣伝子の各ハプロタイプの効果を、Ｔｈｅｓｉａｓ（Ｔｒｅｇｏｕｅｔ  ＤＡ，  Ｇａｒｅｌｌｅ  Ｖ．  Ａ  ｎｅｗ  ＪＡＶＡ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＨＥＳＩＡＳ：  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ＥｆｆｅｃｔＳ  Ｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．  ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３  （８）：  １０３８−１０３９  （２００７））を用いて見積もった。結果を表９に示す。
【０１０５】
【表９】
2014050329.tif 000011
【０１０６】
Ｈ２＞Ｈｌ＞Ｈ４、及び、Ｈ３＞Ｈ１＞Ｈ４であり、各ハプロタイプ間に有意差が認められた。Ｈ２とＨ３間に有意差は認められなかったが、Ｈ３が多い傾向にあった（Ｐ＝０．０５３）。わかりやすく説明すると、Ｈ４／Ｈ４型個体のアラキドン酸は、表１０に示すように、０．７６×２＝１．５２％になると推定され、Ｈ３／Ｈ３型個体のアラキドン酸は、１．５５×２＝３．１０％になると推定される。
【０１０７】
【表１０】
2014050329.tif 000012
【０１０８】
以上の結果から、ＥＬ５、Ｄ５Ｄ及びＤ６Ｄ遺伝子のＳＮＰの組み合わせ（ハプロタイプ）情報を活用すれば、鶏肉のアラキドン酸を遺伝的に調節でき、市場の要求に合わせた実用鶏を生産することができる。
【図１】
2014050329.tif 000013
【図２】
2014050329.tif 000014
【図３】
2014050329.tif 000015
【配列表】
2014050329000001.app