(57)【要約】【課題】機能性食品素材、抗酸化剤等として有用なアスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを植物等から効率よく抽出することができる方法、アスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを産生できる色素体ゲノム改変植物等を提供する。【解決手段】（I）カロテノイドを産生する植物又はその組織を、脱水用溶媒に接触させて脱水する工程、（II）脱水した植物又はその組織を、抽出溶媒で抽出し、カロテノイド含有抽出液を得る工程、及び（III）工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行い、カロテノイドを含有する有機溶媒層を回収する工程を含む植物又はその組織からカロテノイドを抽出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（I）カロテノイドを産生する植物又はその組織を、脱水用溶媒に接触させて脱水する工程、（II）脱水した植物又はその組織を、抽出溶媒で抽出し、カロテノイド含有抽出液を得る工程、及び（III）工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行い、カロテノイドを含有する有機溶媒層を回収する工程を含むことを特徴とする植物又はその組織からカロテノイドを抽出する方法。
【請求項２】
カロテノイドが、ケトカロテノイドを含むものであることを特徴とする請求項１に記載の抽出方法。
【請求項３】
カロテノイドが、アスタキサンチン脂肪酸エステルを含むものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の抽出方法。
【請求項４】
アスタキサンチン脂肪酸エステルが、ジエステル体とモノエステル体との混合物であることを特徴とする請求項３に記載の抽出方法。
【請求項５】
脱水用溶媒が、アセトン、エタノール、メタノール、及び2-プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項６】
抽出溶媒が、極性有機溶媒である請求項１〜５のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項７】
工程（III）で用いられる有機溶媒が、ヘキサン、ジエチルエーテル、石油エーテル、エチルメチルエーテル、及びジメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒である請求項１〜６のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項８】
工程（I）において、細切りした植物又はその組織を脱水用溶媒に接触させることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項９】
カロテノイドを産生する植物又はその組織が、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項１０】
カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号１の塩基配列を含むDNA、又は、(ii)配列番号１の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドのβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項９に記載の抽出方法。
【請求項１１】
カロテノイドを産生する植物又はその組織が、さらに、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の抽出方法。
【請求項１２】
カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号３の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号３の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドの3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項１１に記載の抽出方法。
【請求項１３】
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が、(i)配列番号５の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号５の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の抽出方法。
【請求項１４】
色素体ゲノム改変植物が、配列番号１の塩基配列を含むDNA、配列番号３の塩基配列を含むDNA、及び配列番号５の塩基配列を含むDNAを植物の色素体ゲノムに導入することにより得られるものであることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項１５】
植物が、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、又はタバコであることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の抽出方法。
【請求項１６】
カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物の、アスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するための使用。
【請求項１７】
カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号１の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号１の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドのβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
色素体ゲノム改変植物が、さらに、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項１９】
カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号３の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号３の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドの3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が、(i)配列番号５の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号５の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２１】
色素体ゲノム改変植物が、配列番号１の塩基配列を含むDNA、配列番号３の塩基配列を含むDNA、及び配列番号５の塩基配列を含むDNAを植物の色素体ゲノムに導入して得られるものであることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
アスタキサンチン脂肪酸エステルが、ジエステル体とモノエステル体との混合物であることを特徴とする請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
アスタキサンチン脂肪酸エステルが、アスタキサンチンのミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルであることを特徴とする請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
植物が、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、コメ、ダイズ、又はタバコであることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
色素体ゲノム改変植物が、前記遺伝子を葉緑体ゲノムに導入して得られる葉緑体ゲノム改変レタスであることを特徴とする請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性食品素材、抗酸化剤等として有用なカロテノイド、例えばアスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを植物から効率的に抽出する方法、色素体ゲノム改変植物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド（テルペノイドとも呼ばれる）は23,000種を超える、自然界で最も多様な化合物の集団である。カロテノイド（テトラテルペン）は炭素数40の基本骨格からなるイソプレノイドの１グループで750種以上の色素からなる。アスタキサンチン（Astaxanthin；構造は図１；以後、Astaとも記載する）はエビ、カニ等の甲殻類、サケ、マス、タイ等の赤色魚等に含まれるカロテノイドの１つである。これらの水産動物に含まれるAstaは脂肪酸エステル体になっている場合が多い。ただし、サケ、マスの筋肉や卵のAstaは遊離体である。ベニザケの筋肉や卵（イクラ）でのAsta含量は20〜38 μg/g湿重量である。甲殻類アメリカザリガニ及びナンキョクオキアミのAsta含量は1 g（湿重量）当たりそれぞれ、1〜3 μg及び20〜40 μgである（重量はAsta遊離体換算）。また、ハナサキガニはさらに、植物や藻類が一般的に有するカロテノイドであるルテイン（lutein；構造は図１）をケトカロノイド（4又は/及び4’位にケト基を持つカロテノイド）のフリチエラキサンチン（fritschiellaxanthin；構造は図１）に変換して蓄積するが、Astaの蓄積量と比較すると微量である（非特許文献１）。
【０００３】
α-プロテオバクテリア（α-Proteobacteria）綱（class）に属する（真正）細菌（(eu)bacteria）の一部や淡水性の緑藻ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialisは、摂取した栄養成分の分解産物を用いてAstaを始めから生合成（de novo合成）できる。なお、細菌が作るAstaのほとんどは遊離体（フリー体）であるのに対して、H. pluvialisが作るAstaは脂肪酸エステル体である。Asta脂肪酸エステル体は、遊離体に比べて、経口投与時の腸管吸収性が高く、機能性食品素材等として有用なものである（非特許文献２）。H. pluvialisにより産生されたAstaの脂肪酸エステルは、健康食品用素材として富士化学工業（株）等から販売されており、市場規模は原体レベルで20億円/年程度である。
【０００４】
β-カロテン（β-carotene；構造は図１）をAstaに変換する酵素遺伝子は1995年に初めて明らかにされた（特許文献１、及び非特許文献３）。それはα-プロテオバクテリア綱の海洋細菌パラコッカス属（Paracoccus sp.）N81106株（当初はアグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）と呼ばれていた）から単離された2つの酵素遺伝子であり、それぞれcrtWとcrtZと名付けられた。crtW及びcrtZ遺伝子はそれぞれ、carotenoid 4,4’-ketolase（ケト基導入酵素；carotenoid 4,4’-oxygenaseとも呼ばれる）及びcarotenoid 3,3’-hydroxylase（水酸基導入酵素）をコードしていた（特許文献１及び非特許文献３）。これらの酵素すなわちCrtWとCrtZは共に非ヘム鉄タンパク質であり、これらの触媒機能は図１に示されている。その後、crtW及びcrtZ遺伝子はAstaを合成するα-プロテオバクテリアに共通に存在することがわかった（非特許文献４）。特に、海洋細菌ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD212株由来のCrtWとCrtZはβ-カロテンを効率的にAstaに変換することが示された（特許文献２）。H. pluvialisはCrtWと相同性のあるcarotenoid 4,4’-ketolase遺伝子を3つ有しており、これらの遺伝子はそれぞれBkt1、Bkt2、Bkt3と呼ばれている（非特許文献５）。このBKT（CrtW）型酵素はケトカロテノイドを合成できる緑藻に広く存在しているようだ（非特許文献６）。また、H. pluvialisは、CrtZと相同性のあるcarotenoid 3,3’-hydroxylase遺伝子も有している（非特許文献７）。なお、高等植物もCrtZと相同性のある同遺伝子を有しておりBhyと呼ばれている（非特許文献５）。BHYは植物の葉においてβ-カロテンをゼアキサンチン（zeaxanthin）に変換する働きをしている（非特許文献５）（図１）。
【０００５】
高等植物を始めとして陸上植物（land plant）は通常、β環の4,4’位にケト基を導入する酵素遺伝子を有さないので、Astaやフリチエラキサンチン等のケトカロテノイドを合成できない。ただし、フクジュソウ（福寿草）の仲間アドニス（Adonis）属植物（例えばアドニス・エスティバリス（Adonis aestivalis））は例外で、その赤い花弁にAsta脂肪酸エステルを蓄積する（非特許文献８）。アドニス属植物におけるAsta合成に関る鍵遺伝子はcarotenoid β-ring 4-dehydrogenase遺伝子（カロテノイドβ環4-脱水素酵素遺伝子）（CBFD）である（非特許文献９）。CBFDはCrtW型酵素とは全く異なった構造と機能を有しており、構造的には高等植物のBHY（β-carotene 3,3’-hydroxylase）に近いので、CBFD遺伝子はBhy遺伝子から進化したと考えることができる。今日では、ケト基導入酵素（carotenoid 4,4’-ketolase）を利用した代謝工学（pathway engineering；先端（モダン）バイオテクノロジーの一技術分野）により、種々の高等植物にAsta産生能を与えることができる。よく使われるケト基導入酵素遺伝子としては、Paracoccus sp. N81106株又はBrevundimonas sp. SD212株由来のcrtWや、H. pluvialis由来のBkt1又はBkt2が挙げられる（非特許文献５）。ケト基導入酵素遺伝子は適当なプロモータとターミネータの制御下で、種々の高等植物の染色体DNA内に導入された。食用農作物では、ジャガイモ（Solanum phureja）の塊茎（非特許文献５）、ニンジン（Daucus carota）の主根（非特許文献５及び１０）、トウモロコシ（Zea mays）の胚乳（非特許文献１１）、ナタネ（キャノーラ；Brassica napus）の種（非特許文献１２）でAstaが産生された。特に、二重のCaMV 35Sプロモータの制御下でBkt1遺伝子を発現したニンジンでのAsta産生量は高く、主根1 g（湿重量）当り、91.6 μg（全カロテノイドの27％）のAstaが産生され、ケトカロテノイド全体としては236 μg（全カロテノイドの68％）であった（非特許文献１０）。一方、蓮沼らは、Brevundimonas sp. SD212株のcrtZとcrtW遺伝子（コドン使用は植物型に変えられている）をrrnプロモータの制御下で直接、非食用農作物のタバコ（Nicotiana tabacum）葉緑体のゲノムに導入し、葉緑体ゲノム改変（Chloroplast-Genome Modified；以後、CGMと記載）タバコを得た（非特許文献１３）。CGMタバコ葉では99％のカロテノイドが、Asta（全カロテノイドの74％）等のケトカロテノイドに変換されていたにもかかわらず、光合成を行い、正常に生育することができた。最近、同じcrtZとcrtW遺伝子を使用した類似のプラスミド（さらに、海洋細菌Paracoccus sp. N81106株由来のIPP isomerase (idi) 遺伝子を使っている）により、レタス（Lactuca sativa L. var. Berkeley）の葉緑体を形質転換することにより、赤色がかった葉をもつCGMレタスを作出し、T1種子を取得できたことが報告された（非特許文献１４及び１５）。CGMレタスの種子は99％の発芽率を示し、非形質転換体の発芽率（93％）よりむしろ高かった（非特許文献１５）。
【０００６】
最近、同じcrtZとcrtW遺伝子を使用した類似のプラスミド（さらに、海洋細菌Paracoccus sp. N81106株由来のIPP isomerase (idi) 遺伝子を使っている）により、レタス（Lactuca sativa L. var. Berkeley）の葉緑体を形質転換することにより、赤色がかった葉をもつCGMレタスを作出し、T1種子を取得できたことが報告された（非特許文献１４及び１５）。CGMレタスの種子は99％の発芽率を示し、非形質転換体の発芽率（93％）よりむしろ高かった（非特許文献１５）。
【０００７】
以上述べてきたように、今日では、先端バイオテクノロジーにより種々の農作物にAstaを合成させることが可能になったが、いずれの場合もAstaの遊離体の生産例であり、実際に健康食品用素材として販売されているH. pluvialisにより産生されたAsta脂肪酸エステルとは異なったものであった。このため、機能性食品素材等として有用なAsta脂肪酸エステル等を植物原料等から効率よく得ることができる技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開WO95/18220号パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2005/118812号パンフレット（US特許番号 7,999,151）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】津島己幸, FFIジャーナル, 212: 539-549, 2007
【非特許文献２】山下栄次, 食品と開発, 27(3): 38-40, 1992
【非特許文献３】N. Misawa, Y. Satomi, K. Kondo, A. Yokoyama, S. Kajiwara, T. Saito, T. Ohtani, and W. Miki, J. Bacteriol., 177 (22): 6575-6584, 1995
【非特許文献４】N. Misawa, Marine Drugs, 9 (5): 757-771, 2011
【非特許文献５】N. Misawa, Plant Biotechnol., 26: 93-99, 2009
【非特許文献６】Y. J. Zhong, J. C. Huang, J. Liu, Y. Li, Y. Jiang, Z. F. Xu, G. Sandmann, and F. Chen, J. Exp. Botany, 62 (10): 3659-3669, 2011
【非特許文献７】H. Linden, Biochim. Biophys. Acta., 1446 (3): 203-212, 1999
【非特許文献８】T. Maoka, T. Etoh, S. Kishimoto, S. Sakata, J. Oleo Sci., 60, 47-52, 2011
【非特許文献９】F. X. Cunningham, Jr., E. Gantt, Plant Cell, 23, 3055-3069, 2011
【非特許文献１０】J. Jayaraj, R. Devlin, Z. Punja ., Transgenic Res., 17: 489-501, 2008
【非特許文献１１】C. Zhu, S. Naqvi, J. Breienbach, G. Sandmann, P. Christou, and T. Capell, PNAS, 105 (47): 18232-18237, 2008
【非特許文献１２】M. Fujisawa, E. Takita, H. Harada, N. Sakurai, H. Suzuki, K. Ohyama, D. Shibata, and N. Misawa, J. Exp. Botany, 60 (4): 1319-1332, 2009
【非特許文献１３】T. Hasunuma, S. Miyazawa, S. Yoshimura, Y. Shinzaki, K. Tomizawa, K. Shindo, S. K. Choi, N. Misawa, and C. Miyake, Plant J., 55: 857-88, 2008
【非特許文献１４】N. Misawa, The 16th International Symposium on Carotenoids, Krakow, Poland, July 17-22, 2011（Acta Biologica Cracoviensia, 53 (suppl. 1): 83-84, 2011）
【非特許文献１５】原田尚志, 村上美由紀, 新井和子, 新藤一敏, 音松俊彦, 三沢典彦, 日本農芸化学会2012年度大会要旨集, 2A31p19, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、機能性食品素材、抗酸化剤等として有用なアスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを植物等から効率よく抽出することができる方法、アスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを産生できる色素体ゲノム改変植物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され発現した葉緑体ゲノム改変レタス（CGMレタス）の葉からカロテノイドを抽出する際に、（I）CGMレタスを、脱水用溶媒に接触させて脱水し、（II）脱水したCGMレタスを、抽出溶媒で抽出し、（III）前記（I）でCGMレタスに接触させた脱水用溶媒及び前記（II）で得られる抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行うと、有機溶媒層にアスタキサンチン脂肪酸エステルを主成分とする多量のカロテノイドが含まれることを見出し、前記（I）〜（III）の操作を行うことにより、植物からケトカロテノイド脂肪酸エステル等のカロテノイドを効率よく抽出することができることを見出した。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、従来の抽出方法ではCGMレタスから抽出できず、前記（I）〜（III）の操作を行うことによりCGMレタスから初めて抽出されたカロテノイド脂肪酸エステルである。
【００１２】
本発明者らはまた、前記CGMレタスから前記抽出方法により抽出したカロテノイドを分析することにより、CGMレタスにおいて通常レタスの約2.67倍量の総カロテノイドが産生されており、その67.4％がAsta脂肪酸エステル（49.2%：ジエステル体（diester）、18.2%：モノエステル体（monoester））であること、Asta脂肪酸エステルにおける脂肪酸部分はミリスミン酸（myristate）又はパルミチン酸（palmitate）であること、Asta脂肪酸エステル以外のケトカロテノイドとしてAsta遊離体（10%）、フリチエラキサンチン（6%）、カンタキサンチン（5.3%）、4-ケトアンテラキサンチン（4.3%）等が含まれ、さらにレタス固有のカロテノイドであるラクチュカキサンチン（3.8%）が含まれることを見出した（表１）。
【００１３】
上述したように、先端バイオテクノロジーにより種々の農作物にAstaを合成させることが報告されているが、いずれの場合もAsta遊離体の生産例である（前記非特許文献５及び１０〜１５）。今回のCGMレタスの場合のように、Astaの脂肪酸エステルが多量合成されており、しかもそれが総カロテノイドの半分以上含まれていたことは全く予想外の知見であり、今回、CGMレタスからカロテノイドの効率的な抽出法と精製法を検討したことにより初めて明らかとなった知見である。現在、Astaの脂肪酸エステル体としてH. pluvialisにより産生されたものが実際に健康食品用素材として販売されているが、前記CGMレタス等の植物は組換え植物用植物工場で容易に増殖できるので、Astaの脂肪酸エステルを工業的規模で効率よく製造するために好適に用いられる。また、本発明の抽出方法により、該CGMレタス等から、Asta脂肪酸エステル等の機能性食品素材、抗酸化剤等として有用なカロテノイドを効率よく抽出できるため、カロテノイドを安定的に供給することができることになる。
【００１４】
さらに、例えば前記CGMレタスは、Astaの脂肪酸エステルと共に、フリチエラキサンチン、4-ケトアンテラキサンチン、ラクチュカキサンチン等の希少カロテノイドも産生するが、これらの組合せのカロテノイド混合物を産生する生物は他に存在しないので、これらの希少カロテノイドを含むCGMレタスの総カロテノイド（マルチカロテノイドともいう）は、他の製造方法又は抽出方法では実現できないものである。また、前記CGMレタスにおけるAstaの総産生量は遊離体換算で180 μg/g湿重量となり、これまでに作出された組換え食用農作物の中だけでなく、サケやイクラ等のAsta含有食品（たとえば、サケやイクラのAstaの含有量は遊離体換算で20〜38 μg/g湿重量）と比較しても最高レベルであった。前記CGMレタス等の色素体ゲノム改変植物は、組換え植物用植物工場で容易に増殖できるので、Asta脂肪酸エステルに加えて他の希少ケトカロテノイドの安定的供給源として有用である。
【００１５】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のカロテノイドの抽出方法、及びアスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するための色素体ゲノム改変植物の使用に関する。
【００１６】
（１）（I）カロテノイドを産生する植物又はその組織を、脱水用溶媒に接触させて脱水する工程、（II）脱水した植物又はその組織を、抽出溶媒で抽出し、カロテノイド含有抽出液を得る工程、及び（III）工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行い、カロテノイドを含有する有機溶媒層を回収する工程を含むことを特徴とする植物又はその組織からカロテノイドを抽出する方法。
（２）カロテノイドが、ケトカロテノイドを含むものであることを特徴とする前記（１）に記載の抽出方法。
（３）カロテノイドが、アスタキサンチン脂肪酸エステルを含むものであることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の抽出方法。
（４）アスタキサンチン脂肪酸エステルが、ジエステル体とモノエステル体との混合物であることを特徴とする前記（３）に記載の抽出方法。
（５）脱水用溶媒が、アセトン、エタノール、メタノール、及び2-プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（６）抽出溶媒が、極性有機溶媒である前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（７）工程（III）で用いられる有機溶媒が、ヘキサン、ジエチルエーテル、石油エーテル、エチルメチルエーテル、及びジメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒である前記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（８）工程（I）において、細切りした植物又はその組織を脱水用溶媒に接触させることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（９）カロテノイドを産生する植物又はその組織が、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（１０）カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号１の塩基配列を含むDNA、又は、(ii)配列番号１の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドのβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（９）に記載の抽出方法。
（１１）カロテノイドを産生する植物又はその組織が、さらに、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織であることを特徴とする前記（９）又は（１０）に記載の抽出方法。
（１２）カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号３の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号３の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドの3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（１１）に記載の抽出方法。
（１３）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が、(i)配列番号５の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号５の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（１１）又は（１２）に記載の抽出方法。
（１４）色素体ゲノム改変植物が、配列番号１の塩基配列を含むDNA、配列番号３の塩基配列を含むDNA、及び配列番号５の塩基配列を含むDNAを植物の色素体ゲノムに導入することにより得られるものであることを特徴とする前記（９）〜（１３）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（１５）植物が、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、又はタバコであることを特徴とする前記（９）〜（１４）のいずれか一項に記載の抽出方法。
（１６）カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物の、アスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するための使用。
（１７）カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号１の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号１の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドのβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（１６）に記載の使用。
（１８）色素体ゲノム改変植物が、さらに、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物であることを特徴とする前記（１６）又は（１７）に記載の使用。
（１９）カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子が、(i)配列番号３の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号３の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイドの3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（１８）に記載の使用。
（２０）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が、(i)配列番号５の塩基配列を含むDNA、又は(ii)配列番号５の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであることを特徴とする前記（１８）又は（１９）に記載の使用。
（２１）色素体ゲノム改変植物が、配列番号１の塩基配列を含むDNA、配列番号３の塩基配列を含むDNA、及び配列番号５の塩基配列を含むDNAを植物の色素体ゲノムに導入して得られるものであることを特徴とする前記（１６）〜（２０）のいずれか一項に記載の使用。
（２２）アスタキサンチン脂肪酸エステルが、ジエステル体とモノエステル体との混合物であることを特徴とする前記（１６）〜（２１）のいずれか一項に記載の使用。
（２３）アスタキサンチン脂肪酸エステルが、アスタキサンチンのミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルであることを特徴とする前記（１６）〜（２２）のいずれか一項に記載の使用。
（２４）植物が、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、コメ、ダイズ、又はタバコであることを特徴とする前記（１６）〜（２３）のいずれか一項に記載の使用。
（２５）色素体ゲノム改変植物が、前記遺伝子を葉緑体ゲノムに導入して得られる葉緑体ゲノム改変レタスであることを特徴とする前記（１６）〜（２４）のいずれか一項に記載の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、機能性食品素材、抗酸化剤等として有用であるアスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを植物から効率よく抽出することができる。これにより、例えば通常食用とされない植物からでも、アスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを効率よく供給することができることになる。
【００１８】
また、本発明によれば、例えばカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を葉緑体等の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物から、アスタキサンチン脂肪酸エステル含むカロテノイドを得ることができる。さらに、例えば色素体ゲノム改変植物が葉緑体ゲノム改変レタスであれば、アスタキサンチン脂肪酸エステルを主成分とし、他の希少なケトカロテノイドであるフリチエラキサンチン（fritschiellaxanthin）、及び4-ケトアンテラキサンチン（4-ketoantheraxanthin）、さらにレタス特有のカロテノイドであるラクチュカキサンチン（lactucaxanthin）を含むカロテノイド混合物を得ることができる。このように、本発明により、アスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドを、植物から安定的に供給することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、アスタキサンチン脂肪酸エステルを生合成する植物の一例として、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（CrtZ）、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（CrtW）及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Idi）の各酵素をコードする３種の遺伝子（それぞれcrtZ、crtW、及びidi）が葉緑体ゲノムに導入され発現した葉緑体ゲノム改変（CGM）レタスにおける各種カロテノイドの生合成経路及び各種カロテノイド合成酵素の機能を示す図である。図１中、実施例で抽出されたカロテノイド及びカロテノイド脂肪酸エステルは、下線で示している。なお、下線で示されたものの中で、ラクチュカキサンチンはβ環を持たないカロテノイドであり、これ以外はすべてβ環を持つカロテノイドである。
【図２】図２は、CGMレタス葉から抽出されたカロテノイドのHPLC分析結果を示す図である。
【図３】図３は、コントロールレタス葉から抽出されたカロテノイドのHPLC分析結果を示す図である。
【図４】図４は、レタス葉緑体形質転換用ベクターpRL200の構造を示す図である。
【図５】図５は、レタス葉緑体形質転換用プラスミドpRL-crtZWidiの構造、及びレタス葉緑体ゲノムへの遺伝子の挿入位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書中、カロテノイドには、β環を持つカロテノイドとβ環を持たないカロテノイドが含まれる。また、β環を持つカロテノイドには、遊離体のカロテノイド以外に、カロテノイドの脂肪酸エステルが含まれる。
【００２１】
１．抽出方法
本発明の抽出方法は、植物又はその組織からカロテノイドを抽出する方法であり、以下の（I）〜（III）の工程を、この順に含む。
（I）カロテノイドを産生する植物又はその組織を、脱水用溶媒に接触させて脱水する工程（脱水工程）
（II）脱水した植物又はその組織を、抽出溶媒で抽出し、カロテノイド含有抽出液を得る工程（抽出工程）
（III）工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行い、カロテノイドを含有する有機溶媒層を回収する工程（回収工程）
【００２２】
工程（I）において、材料として使用される植物又はその組織は、そのまま、又は適当な大きさに切断、破砕、細切り（細断）、若しくは粉末化して用いることができる。好ましくは、細切りした植物又はその組織を用いる。
【００２３】
工程（I）で使用される脱水用溶媒は、有機溶媒が好ましく、極性有機溶媒がより好ましく、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、メチルエチルケトン等の極性有機溶媒が好ましい。これらは１種のみ用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。中でも、好ましくは、アセトン、エタノール、メタノール、及び2-プロパノールからなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒であり、より好ましい脱水用溶媒は、アセトン、エタノール、又はこれらの混液等であり、さらに好ましくは、アセトンを含む極性有機溶媒等であり、特に好ましくはアセトン等である。
【００２４】
植物又はその組織を脱水用溶媒に接触させる方法は特に限定されず、例えば、植物又はその組織を脱水用溶媒中に浸漬する方法等が挙げられる。脱水用溶媒の量は、例えば、植物１ｇ（通常、湿重量）に対して、好ましくは脱水用溶媒を約１〜１００ｍＬ、より好ましくは約１〜３０ｍＬ、さらに好ましくは約２〜１０ｍＬ用いる。
【００２５】
脱水の条件は特に限定されず、例えば、植物を脱水用溶媒に接触させる時間は、通常約１０分〜２４時間であり、好ましくは約１〜１２時間、より好ましくは約３〜５時間である。脱水の際の温度は特に限定されず、通常約５〜３０℃、好ましくは約１８〜２４℃で行うことが好ましい。
【００２６】
前記脱水用溶媒と接触させ、脱水した植物又はその組織は、通常ろ過等により脱水用溶媒から分離し、次の抽出工程に用いる。植物又はその組織に接触させた（植物又はその組織の脱水に用いた）脱水用溶媒は、回収して後の回収工程（III）に用いる。
【００２７】
工程（II）（抽出工程）においては、脱水した植物又はその組織を、抽出溶媒で抽出し、カロテノイド含有抽出液を得る。
抽出溶媒は、特に限定されず、有機溶媒が好ましく、極性有機溶媒がより好ましく、例えば、含ハロゲン炭化水素、低級脂肪酸エステル、低級アルコール、ケトン等の極性有機溶媒等が挙げられる。含ハロゲン炭化水素として、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン等の炭素数１〜３の含ハロゲン炭化水素；低級脂肪酸エステルとして、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等の炭素数１〜６の脂肪酸のエステル；低級アルコールとして、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール等の炭素数１〜３のアルコール；ケトンとして、例えば、アセトン、メチルエチルケトン等の炭素数１〜４のケトン等が挙げられる。これら極性有機溶媒は１種のみ用いてもよく、２種以上を組み合わせた混合溶媒を用いることもできる。好ましくは、含ハロゲン炭化水素、低級アルコール、炭素数１〜４のケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）等の１種又はこれらの２種以上を組み合わせた抽出溶媒であり、より好ましくは、含ハロゲン炭化水素と低級アルコールとの混合溶媒等である。さらに好ましくは、含ハロゲン炭化水素はクロロホルム等であり、低級アルコールは、メタノール、エタノール等である。
【００２８】
２種以上の有機溶媒の混合溶媒を抽出溶媒として用いて抽出を行う場合、各有機溶媒の使用割合は、溶媒の種類に応じて適宜設定すればよく特に限定されない。例えば、抽出溶媒として含ハロゲン炭化水素と低級アルコールとの混合溶媒を用いる場合、含ハロゲン炭化水素と低級アルコールとの混合比率は、例えば、含ハロゲン炭化水素：低級アルコール（体積比）を１：１０〜５：１程度とすることが好ましく、１：２〜１：１程度とすることがより好ましい。
【００２９】
抽出方法としては、一般に用いられる方法で行えばよく、例えば抽出溶媒中に脱水した植物又はその組織を浸漬する方法、抽出溶媒の沸点以下の温度で加温、撹拌しながら抽出を行う方法等が挙げられる。また、抽出の効率を上げるために、抽出溶媒中で植物又はその組織を細切りする、すり潰す、磨砕する等の操作を行ってもよい。
【００３０】
抽出の条件は特に限定されず、例えば、抽出時間は、通常約１０分〜２４時間であり、好ましくは約１〜１２時間、より好ましくは約６〜８時間である。抽出の際の温度は特に限定されないが、通常約５〜３０℃であり、好ましくは約１８〜２４℃で行う。
【００３１】
抽出に用いる抽出溶媒の使用量は、例えば、脱水工程で使用した植物又はその組織１ｇ（通常、湿重量）に対して、通常約２〜５０ｍＬであり、好ましくは約５〜２５ｍＬである。
【００３２】
工程（II）（抽出工程）により、カロテノイド脂肪酸エステル等のカロテノイドが抽出溶媒中に抽出され、カロテノイド含有抽出液が得られる。抽出工程後、ろ過等により植物又はその組織を、カロテノイド含有抽出液から分離することが好ましい。
【００３３】
工程（III）（回収工程）においては、工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液に、水及び有機溶媒を添加して分液を行い、カロテノイドを含有する有機溶媒層を回収する。
【００３４】
工程（III）で用いられる有機溶媒は、炭化水素、直鎖又は分鎖炭化水素、エーテルなどの水と分離可能な有機溶媒であればよく、例えば、ヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジメチルエーテル、ノルマルペンタン、ノルマルヘプタン、ノルマルオクタン等が好ましい。有機溶媒は、１種のみ用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。中でも、有機溶媒は、ヘキサン、ジエチルエーテル、石油エーテル、エチルメチルエーテル、及びジメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種等がより好ましく、ヘキサン、ジエチルエーテル等がさらに好ましく、ヘキサンが特に好ましい。
【００３５】
工程（III）において、水及び有機溶媒の使用量は、脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液の合計に対して、体積比で水及び有機溶媒の合計を２〜１０倍程度使用することが好ましく、２〜４倍程度使用することがより好ましい。
【００３６】
水及び有機溶媒の使用比率は、有機溶媒の種類等により適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば、水：有機溶媒（体積比）を３：１〜１：１０程度とすることが好ましく２：１〜１：５程度とすることが好ましく、１：０．８〜０．８：１．２程度とすることがより好ましい。
【００３７】
分液の際は、(i)工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液を合わせて、この混合液に水及び有機溶媒を添加して分液を行ってもよく、(ii)工程（I）で植物又はその組織に接触させた脱水用溶媒及び工程（II）で得られるカロテノイド含有抽出液それぞれに、水及び有機溶媒を添加して分液を行ってもよい。好ましくは、(i)の方法により分液を行う。分液の方法は、通常の方法で行うことができる。前記(i)及び(ii)のいずれの方法においても、カロテノイドは有機溶媒層に移行する。通常、有機溶媒層は、カロテノイドにより橙又は赤色に着色している。
【００３８】
有機溶媒層には、原料である植物に含まれるカロテノイドが抽出されている。カロテノイドの種類は、原料である植物により異なるが、通常２種類以上の遊離のカロテノイド、及び／又はカロテノイド脂肪酸エステルが含まれるカロテノイド混合物が得られる。
【００３９】
本発明の方法によれば、植物又はその組織に含まれるカロテノイド、例えば、ケトカロテノイドの遊離体、ケトカロテノイドの脂肪酸エステル等を植物又はその組織から効率よく抽出することができる。中でも、本発明の方法は、アスタキサンチン脂肪酸エステルの抽出に特に好適である。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、ジエステル体であってもよく、モノエステル体であってもよく、ジエステル体とモノエステル体との混合物であってもよい。ジエステル体とモノエステル体との混合物が得られる場合、さらに精製等を行うことにより、ジエステル体とモノエステル体とを分離することができる。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、好ましくは、アスタキサンチンのミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルである。
【００４０】
例えば、後述するカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子等が植物の色素体ゲノムに導入され発現した色素体ゲノム改変植物又はその組織を本発明の抽出方法により抽出すると、通常、アスタキサンチン脂肪酸エステルを含むカロテノイド混合物を得ることができる。また、例えばカロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され発現した色素体ゲノム改変植物又はその組織を原料として用いると、通常、アスタキサンチン脂肪酸エステルを主成分とし、さらに、例えばアスタキサンチン、フリチエラキサンチン、4-ケトアンテラキサンチン等の遊離体のカロテノイドを含むカロテノイド混合物を得ることができる。本発明は、このようなカロテノイド脂肪酸エステルを含むカロテノイド混合物の抽出方法として好適なものである。
【００４１】
特に、色素体ゲノム改変植物が、葉緑体ゲノム改変レタスであれば、有機溶媒層には、通常、アスタキサンチン脂肪酸エステルと共に、アスタキサンチン遊離体、フリチエラキサンチン、4-ケトアンテラキサンチン、ラクチュカキサンチン等が含まれる。また、葉緑体ゲノム改変レタスの場合、前記抽出方法により抽出される全カロテノイド中、アスタキサンチン脂肪酸エステルが通常約５０〜９０重量％、好ましくは約５０〜８０重量％含まれる。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、通常モノエステル体とジエステル体の混合物である。また、エステルは、通常アスタキサンチンのミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルである。
【００４２】
本発明の方法は、本発明の効果を奏することになる限り、前記（I）〜（III）以外の工程を含んでもよい。例えば、工程（I）で使用する植物又はその組織を適当な大きさに切断、破砕、細切り、粉末化等する工程を行ってもよい。また、工程（I）の前に、原料である植物又はその処理物を乾燥させてもよい。また、回収したカロテノイドを含有する有機溶媒層をさらに濃縮、精製等する工程を行ってもよい。カロテノイドを含有する有機溶媒層をさらに精製等することにより、各カロテノイドを単離することができる。濃縮、精製等は、公知の方法により行うことができる。
【００４３】
２．カロテノイドを産生する植物又はその組織
本発明において原料として用いられるカロテノイドを産生する植物又はその組織は、葉緑体、アミロプラスト、エライオプラスト、有色体等の色素体（プラスチド）を有する植物又はその組織であればよい。中でも、葉緑体、有色体等の色素体を有する植物又はその組織が好ましい。本発明において、植物には、植物の細胞、組織、器官のみならず、植物個体（植物体）も含まれる。色素体（プラスチド）を有する植物の組織は、例えば、葉、茎、塊茎、根、根茎、花、花蕾、種子、果実等である。また、プロトプラスト、カルス等の植物細胞も、本発明における植物に含まれる。植物は、天然の植物であってもよく、外来性遺伝子が導入されたゲノム改変植物（遺伝子組換え植物）であってもよい。
【００４４】
植物としては特に限定されず、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類のいずれであってもよい。種子植物は、裸子植物であってもよく、被子植物であってもよい。被子植物の場合、単子葉植物、双子葉植物のいずれでもよく、特に限定されない。種子植物として、例えば、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ等の穀類；レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、バジル、ダイコン、小松菜、ホウレンソウ、カブ、カボチャ、ピーマン等の野菜類；アルファルファ、クローバー、レンゲ等の緑肥植物；コスモス、トレニア、キク、ガーベラ、パンジー、ラン、シャクヤク、チューリップ等の花卉類；ダイズ、アズキ、インゲン、落花生、ソラマメ、エンドウ等の豆類；コウライシバ、ベントグラス、ノシバ等の芝類；他にもシロイヌナズナ、ニチニチソウ、タバコ等が挙げられる。中でも、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、タバコ、アドニス（Adonis）属植物等が好ましい。シダ植物として、例えば、ゼンマイ、ワラビ、スギナ等が、コケ植物として、例えば、ゼニゴケ、ツノゴケ、スギゴケ、ミズゴケ等が、藻類として、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クラミドモナス（Chlamydomonas属）、ミドリムシ（ユーグレナ藻；Euglena属）等が挙げられる。本発明における原料として、このような植物の色素体を有する組織等を用いることが好ましい。
【００４５】
本発明における植物又はその組織は、好ましくは、ケトカロテノイドを産生する植物であり、より好ましくはケトカロテノイド脂肪酸エステルを産生する植物であり、さらに好ましくは、アスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する植物である。アスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する植物として、例えば、フクジュソウ（福寿草）の仲間アドニス（Adonis）属植物（例えばアドニス・エスティバリス（Adonis aestivalis））、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）等の緑藻が挙げられる。また、例えばケトカロテノイド脂肪酸エステルの産生が確認されていない植物又はその組織であっても、実際にはケトカロテノイド脂肪酸エステルを産生していれば、本発明の方法に供することによって、ケトカロテノイド脂肪酸エステルが抽出される。
【００４６】
３．色素体ゲノム改変植物
本発明においては、カロテノイドを産生する植物又はその組織として、カロテノイド生合成に関与する酵素の遺伝子をゲノムに導入して得られるゲノム改変植物（遺伝子組換え植物）又はその組織を好適に用いることができる。ゲノム改変植物は、好ましくは色素体ゲノム改変植物である。カロテノイドは、通常葉緑体、有色体等の色素体で生合成されるため、色素体に直接カロテノイド生合成に関与する酵素の遺伝子を導入することにより、効率よくカロテノイドを産生する植物又はその組織を得ることができる。色素体ゲノム改変植物は、好ましくは、アスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する植物又はその組織である。
【００４７】
アスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する植物又はその組織は、例えば、カロテノイド生合成に関与する酵素の遺伝子として、β-カロテンからアスタキサンチンを合成する（β-カロテンをアスタキサンチンに変換する）酵素をコードする遺伝子を植物又はその組織に導入することにより得ることができる。このようなβ-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織は、本発明における原料として好適に用いることができる。
【００４８】
β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物について、以下に説明する。
３．１  β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子
β-カロテンからAstaを合成するのに必要な酵素遺伝子については、上述したように、典型的には2つの酵素遺伝子、すなわち、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（ケト基導入酵素）及びカロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（水酸基導入酵素）をコードする遺伝子が好適である。ケト基導入酵素遺伝子として、α-プロテオバクテリア綱に属する細菌から単離されたcrtW遺伝子や、H. pluvialisから単離されたBkt遺伝子（Bkt1、Bkt2、Bkt3）等が知られている（前記非特許文献４及び５）。なお、CrtW（crtW遺伝子がコードするタンパク質の意味）とBKT（Bkt遺伝子がコードするタンパク質の意味）は互いに相同性を有している。水酸基導入酵素遺伝子として、α-プロテオバクテリア綱又はγ-プロテオバクテリア綱に属する細菌から単離されたcrtZ遺伝子や、高等植物から単離されたBhy遺伝子等が知られている（前記非特許文献４）。なお、CrtZとBHYは互いに相同性を有している。例えば、アスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する色素体ゲノム改変植物の作製には、これらの公知の遺伝子のいずれを用いてもよい。好ましくは、少なくともカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（ケト基導入酵素）を用いる。より好ましくは、β-カロテンから最も効率よくAstaを合成する遺伝子の組み合わせであるブレバンディモナス属細菌SD212株（Brevundimonas sp. SD212株）由来のカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（CrtW）とカロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（CrtZ）をそれぞれコードする遺伝子配列（前記特許文献３；配列情報はそれぞれDDBJ アクセッション番号 AB377271及びアクセッション番号 AB377272に記載）を用いる。前記ブレバンディモナス属細菌SD212株（Brevundimonas sp. SD212株）由来のカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（CrtW）をコードする遺伝子配列（DDBJ アクセッション番号 AB377271）を、配列番号１に、ブレバンディモナス属細菌SD212株由来のカロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（CrtZ）をコードする遺伝子配列（DDBJ アクセッション番号 AB377272）を配列番号３に、それぞれ示す。また、ブレバンディモナス属細菌SD212株由来のカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（ケト基導入酵素）（CrtW）のアミノ酸配列を配列番号２に、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（CrtZ）のアミノ酸配列を配列番号４に、それぞれ示す。例えば、この2遺伝子をレタス葉緑体ゲノムに導入することにより、Astaエステルを主成分として産生する葉緑体ゲノム改変（CGM）レタス等の葉緑体ゲノム改変植物を得ることができる。しかし必ずしも、これと同じcrtWとcrtZ遺伝子配列を用いる必要は無く、他の生物由来のケト基導入酵素と水酸基導入酵素遺伝子を用いてもよいし、後者の相当遺伝子（Bhy）は植物にあることを考えると、前者のケト基導入酵素遺伝子のみを用いてもよい。また、アドニス植物由来のβ-カロテンからAstaへの変換酵素遺伝子（CBFDとHBFD；前記非特許文献９）を用いることも可能である。なお、Asta（遊離体）からAsta脂肪酸モノエステルを経てAsta脂肪酸ジエステルを作る酵素遺伝子については単離されていない。例えばβ-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子を導入して得られるCGMレタスの場合、レタス葉緑体内で生成したAsta（遊離体）は葉緑体の内在性酵素によって、エステル化したと考えられる。
【００４９】
３．２  高等植物におけるカロテノイド生合成経路
植物の色素体では、メバロン酸経路ではなく、非メバロン酸経路（2-C-メチル-D-エリストール4-リン酸（以後、MEPと記載する場合がある）を経由するのでMEP経路とも呼ばれる）により最初のイソプレノイド基質であるイソペンテニル二リン酸（イソペンテニルピロリン酸とも呼ばれる；以後IPPと記載する場合がある）が作られる。IPPは、IPPイソメラーゼ（IPP isomerase；以後IDI又はIdiと記載する場合がある）によりジメチルアリル二リン酸（以後、DMAPPと記載する場合がある）に変換される。DMAPPはゲラニルゲラニル二リン酸（以後、GGPPと記載する場合がある）合成酵素（シンターゼ；synthase）（GGPS）によりIPPと順次縮合することにより、炭素数10のゲラニル二リン酸（以後、GPPと記載する場合がある）、炭素数15のファルネシル二リン酸（以後、FPPと記載する場合がある）、炭素数20のGGPPが合成される。このGGPPから分岐して、カロテノイド（テトラテルペン）が合成される（図１）。
【００５０】
2分子のGGPPがフィトエン合成酵素（phytoene synthase; PSY）により縮合することにより、最初のカロテノイドである無色のフィトエン（Phytoene）が合成される（図１）。植物の色素体では、フィトエンは脱水素反応（不飽和化反応）と異性化反応を経てリコペン（Lycopene）に変換される。この反応の詳細を述べると、まず、フィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase; PDS）によりフィトエンから9,15,9'-tri-cis-ζ-Caroteneが合成され、次に、ζ-カロテン不飽和化酵素（ζ-carotene desaturase; ZDS）と2種類のカロテンイソメラーゼ（carotene isomerase; Z-ISOとCRTISO）によりリコペンが合成される（図１）（Q. Yu, S. Ghisla, J. Hirschberg, V. Mann, P. Beyer, J. Biol. Chem. 286: 8666-8676, 2011）。このステップは未だに十分には解明されていない。
【００５１】
例えば、一般の高等植物の葉緑体の場合、リコペンから２種類の環化カロテンが合成される。リコペンに、リコペンβ環化酵素（lycopene β-cyclase; LCYb）のみが作用した場合は、2つのβ環を持つβ-カロテンに変換される（図１）。β-カロテンはBHYにより3,3’位の水酸化反応を受け、β-クリプトキサンチン（β-Cryptoxanthin）を経てゼアキサンチン（Zeaxanthin）に変換される。ゼアキサンチンは、ゼアキサンチンエポキシ化酵素（zeaxanthin epoxidase; ZEP）によりアンテラキサンチン（Antheraxanthin）を経てビオラキサンチン（Violaxanthin）に変換される。ビオラキサンチンは、ネオキサンチン（Neoxanthin）合成酵素（synthase; NSY）により、高等植物の葉におけるカロテノイド最終形の１つであるネオキサンチンに変換されると考えられる。リコペンに、リコペンε環化酵素（lycopene ε-cyclase; LCYe）とLCYbが作用した場合は、ε環とβ環を持つα-カロテン（α-Carotene）に変換される（図１）。α-カロテンはCYP97CサブファミリーのシトクロムP450であるε-カロテン水酸化酵素（ε-carotene hydroxylase; EHY）により3’位の水酸化反応を受けα-クリプトキサンチン（α-Cryptoxanthin；β,ε-Caroten-3’-ol）に変換され、さらにBHY又はCYP97AサブファミリーのP450により3位の水酸化反応を受けルテインに変換されると考えられる（図１）（R.F. Quinlan, T.T. Jaradat, E.T. Wurtzel, Arch. Biochem. Biophys. 458: 146-157, 2007）。
【００５２】
通常の高等植物の葉緑体でのカロテノイド生合成は、通常ここまでであるが、例えばレタスの場合、もう１種類の環化カロテンができる。すなわち、リコペンにLCYeのみが作用し、２つのε環を持つε-カロテン（ε-Carotene）に変換される（図１）（F.X. Jr. Cunningham, E. Gantt, PNAS 98: 2905-2910, 2001）。ε-カロテンはEHYにより、ラクチュカキサンチン（Lactucaxanthin）に変換されると考えられている（図１）。
【００５３】
３．３  IPPイソメラーゼ遺伝子
IDI（Idi；IPP isomerase）によりIPPとDMAPPの量比が調整される。IDI（Idi）には互いに構造が異なる、1型（type 1）と2型（type 2）のものが存在している。2型のidi遺伝子は、α-プロテオバクテリア綱又はγ-プロテオバクテリア綱に属するカロテノイド産生細菌が有するカロテノイド生合成遺伝子群（carotenoid biosynthesis gene cluster）の中に時々一緒に存在している（三沢典彦, オレオサイエンス 9 (9): 385-391, 2009）。1型、2型にかかわらず、idi遺伝子をカロテノイド生合成遺伝子と共に大腸菌に導入して発現させると、idi遺伝子を導入しない場合と比べて、カロテノイドの生産量が上昇することがわかっている（H. Harada, N. Misawa, Appl. Microbiol. Biotechonol. 84: 1021-1031, 2009）。本発明で用いられる色素体ゲノム改変植物は、前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子に加えて、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入することにより得られる色素体ゲノム改変植物であることが好ましい。
【００５４】
本発明者らは、下記実施例では一例として2型のidi遺伝子を用いた。具体的には、パラコッカス属細菌N81106株（Paracoccus sp. N81106株）由来のIdiをコードする遺伝子配列（前記非特許文献１２；配列情報はDDBJ アクセッション番号 AB453829に記載）を用いた。すなわち、実施例では、このidi遺伝子配列を、前述したBrevundimonas sp. SD212由来のCrtWとCrtZをコードする遺伝子配列とともにレタス葉緑体ゲノムに導入し、Astaエステルを主成分として産生する葉緑体ゲノム改変（CGM）レタスを得た。前記パラコッカス属細菌N81106株（Paracoccus sp. N81106株）由来のIPPイソメラーゼ（Idi）をコードする遺伝子配列（DDBJ アクセッション番号 AB453829）を配列番号５に、また、パラコッカス属細菌N81106株由来のIPPイソメラーゼ（Idi）のアミノ酸配列を配列番号６に、それぞれ示す。
【００５５】
本発明におけるカロテノイドを産生する植物又はその組織として、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織が好ましい。このような色素体ゲノム改変植物は、例えばアスタキサンチン脂肪酸エステル等を産生することができるものであるため好ましい。
【００５６】
前記カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子としては、ブレバンディモナス属細菌SD212株由来のカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素（CrtW）（配列番号２）をコードする遺伝子が好ましく、このような遺伝子として、例えば、配列番号１の塩基配列を含むDNA等が好ましく、配列番号１の塩基配列からなるDNAがより好ましい。
【００５７】
また、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子として、配列番号１の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイド（β-カロテンやゼアキサンチン等）のβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAも、好適に用いられる。また、このようなDNA配列として、配列番号１の塩基配列からなるDNAと通常約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつβ環を持つカロテノイドのβ環の4位及び／又は4’位にケト基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAが好適に用いられる。
【００５８】
本明細書中において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Tm)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
【００５９】
色素体ゲノム改変植物又はその組織は、より好ましくは、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子に加えて、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物又はその組織である。カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を導入することにより、アスタキサンチン脂肪酸エステルがより多く産生されるため好ましい。
【００６０】
前記カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子として、ブレバンディモナス属細菌SD212株由来のカロテノイド3,3’-水酸基導入酵素（CrtZ）（配列番号４）をコードする遺伝子が好ましく、このような遺伝子として、例えば、配列番号３の塩基配列を含むDNA等が好ましく、配列番号３の塩基配列からなるDNAがより好ましい。
【００６１】
また、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素をコードする遺伝子として、配列番号３の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ環を持つカロテノイド（β-カロテンやカンタキサンチン等）の3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNA等も好適に用いられる。また、このようなDNAとして、例えば、配列番号３の塩基配列からなるDNAと通常約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつβ環を持つカロテノイドの3位及び／又は3'位の炭素に水酸基を導入する活性を有するポリペプチドをコードするDNAが好適に用いられる。
【００６２】
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子として、パラコッカス属細菌N81106株由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Idi）（配列番号６）をコードする遺伝子が好ましく、このような遺伝子として、例えば、配列番号５の塩基配列を含むDNA等が好ましく、配列番号５の塩基配列からなるDNAがより好ましい。
【００６３】
また、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子として、配列番号５の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA等も好適に用いられる。また、このようなDNAとして、例えば、配列番号５の塩基配列からなるDNAと通常約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつイソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが好適に用いられる。
【００６４】
本発明においては、カロテノイドを産生する植物又はその組織として、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子が色素体ゲノムに導入され発現した色素体ゲノム改変植物又はその組織が好適に用いられる。
【００６５】
前記色素体ゲノム改変植物として、配列番号１の塩基配列を含むDNA、配列番号３の塩基配列を含むDNA、及び配列番号５の塩基配列を含むDNAが植物の色素体ゲノムに導入され発現した色素体ゲノム改変植物が特に好ましい。これらの３種の遺伝子を導入することにより、より多くのアスタキサンチン脂肪酸エステルが産生されるため好ましい。
【００６６】
３．４  色素体形質転換ベクター
前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子等は、公知の方法により植物の色素体に導入される。葉緑体への外来性遺伝子の導入方法は特に限定されず、例えば、導入したい外来性遺伝子を、公知の方法により適当なプロモータとターミネータの利用により発現する形にして色素体の形質転換用ベクターに挿入してプラスミドを作製し、該プラスミドを植物の細胞に導入すればよい。複数の遺伝子を導入する場合、それらの遺伝子は、１つの形質変換用ベクターにより導入されてもよく、それぞれ異なる形質変換用ベクターにより導入されてもよい。
【００６７】
色素体の形質転換用ベクターは、植物の種類等により適宜選択すればよいが、葉緑体の形質転換用ベクター等が好ましく、例えば、レタス葉緑体の形質転換用ベクターpRL200（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）、タバコ葉緑体形質転換用ベクターpLD200（前記非特許文献１３）、キャベツ葉緑体形質転換用ベクターpASCC201 (C.-W. Liu, C.-C. Lin, J.J.W. Chen, M.-J. Tseng, Plant Cell Reports 26(10): 1733-1744, 2007)、ニンジン葉緑体形質転換用ベクターpDD-Dc-aadA/badh (S. Kumar, A.Dhingra, and H. Daniell, Plant Physiology 136: 2843-2854, 2004)、セイヨウナタネ葉緑体形質転換用ベクターpNRAB（B.-K. Hou, Y.-H. Zhou, L.-H. Wan, Z.-L. Zhang, G.-F. Shen, Z.M. Hu Transgenic research 12(1): 111-114, 2003）等が挙げられる。また、プロモータは、植物の色素体中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、rrnプロモータ、psbAプロモータ、clpPプロモータ、psbDプロモータ、rbcLプロモータ、rpoC1プロモータ、atpIプロモータ、rpl23プロモータ、pabDプロモータ等が挙げられる。中でも、導入した遺伝子が葉緑体等の色素体において恒常的に発現することが好ましいことから、構成的プロモータを用いることが好ましく、rrnプロモータ等がより好ましい。
ターミネータとしては、導入する遺伝子等により適宜選択することができるが、例えば、psbAターミネータ、rps16ターミネータ、rbcLターミネータ、rps7ターミネータ、psbBターミネータ等が挙げられる。
【００６８】
また、色素体形質転換ベクターにより目的とする外来性遺伝子（例えば、CrtZをコードする遺伝子等）が導入された植物細胞を効率よく選抜するために、各種選抜マーカー遺伝子を用いてもよい。選抜マーカー遺伝子は、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、薬剤耐性を付与する遺伝子を選抜マーカーとして用い、この選抜マーカー遺伝子と前記カロテノイドの生合成に関わる遺伝子とを含むプラスミド等を色素体形質転換ベクターとして植物細胞に導入することが好ましい。これによって選抜マーカー遺伝子の発現から効率良く外来性遺伝子が色素体ゲノムに導入された植物細胞を選抜することができる。このような選抜マーカー遺伝子として、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、除草剤クロルスルフロン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、該選抜マーカー遺伝子の上流及び下流には、該遺伝子を発現するためのプロモータ及びターミネータを有することが好ましい。
【００６９】
一例として、前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子をレタスの葉緑体ゲノムに導入するための葉緑体形質転換ベクターについて説明するが、レタス以外の植物についても、公知の方法により色素体の形質転換用ベクターを作製し、該ベクターを細胞に導入することにより、色素体ゲノム改変植物を得ることができる。
【００７０】
レタス葉緑体の形質転換用ベクター、及びこれを用いたレタス葉緑体の形質転換法は、金本らによって報告された（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）。レタス葉緑体の形質転換用ベクターpRL200は、レタス葉緑体ゲノム由来のrbcLとaccD遺伝子の間に、NotI-NheI-SalIのクローニング部位が挿入されたベクターである（図４）。このクローニング部位に、レタス葉緑体で発現させたい外来遺伝子をプロモータとターミネータの間に挿入したものを導入すればよい。プロモータやターミネータはレタス葉緑体で機能するものを用いればよいが、例として、前者ではrrnやpsbAのプロモータ、後者ではpsbAやrps16のターミネータを挙げることができる。これらのプロモータやターミネータ配列はレタス葉緑体ゲノム由来のものが好ましいが、タバコ葉緑体由来のもの等他の植物由来のものを用いることもできる。例えば実施例では、タバコ葉緑体由来のrrnのプロモータとpsbAやrps16のターミネータを用いた。さらに、プロモータとターミネータに囲まれた薬剤耐性遺伝子を形質転換のマーカー遺伝子として一緒に用いることが好ましい。薬剤耐性遺伝子の例として、ストレプトマイシン/スペクチノマイシン アデニルトランスフェラーゼ（Streptomycin/Spectinomycin Adenyltransferase; aadA）遺伝子を挙げることができ、ストレプトマイシンやスペクチノマイシンの耐性能を宿主に付与する（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）。例えば、50 mg/Lのスペクチノマイシン二塩酸塩を培地に加えることにより、葉緑体形質転換体を選抜することができる。なお、aadA遺伝子は、大腸菌を始めとして種々の細菌の形質転換の選抜にも用いられている（N.C. Clark, O. Olsvik, J.M. Swenson, C.A. Spiegel, F.C. Tenover, Antimicrobial Agent and Chemotherapy 43: 157-160, 1999）。
【００７１】
３．５  植物の色素体の形質転換と色素体ゲノム改変植物の取得
植物の色素体の形質転換は、公知の方法により行うことができる。例えば、導入したい外来遺伝子（例えば、β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素遺伝子）や選抜マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子など）を適当なプロモータとターミネータの利用により発現する形にしたDNA断片を作製し、該DNA断片を、例えば隣り合った２つの色素体遺伝子の配列を持つベクターに挿入したプラスミドを作製し、それをパーティクル・ガン等により、好ましくは植物の葉、茎等の葉緑体を含む植物の組織の細胞に打ち込めばよい。「隣り合った２つの色素体遺伝子の配列を持つベクター」とは、天然の植物色素体ゲノムにおいて隣接している２つの遺伝子を含むベクターであり、該２つの遺伝子の間に導入する遺伝子を挿入することが好ましい。遺伝子が導入された植物又はその組織を、通常栽培又は培養して再分化させることにより、色素体ゲノム改変植物が得られる。色素体ゲノム改変植物又はその組織中の色素体において、カロテノイドが産生される。遺伝子が導入された植物又はその組織を栽培又は培養する方法、再分化させる方法等は特に限定されず、植物の種類等に応じて適宜設定すればよい。
【００７２】
例えば、食用農作物の色素体の形質転換は、レタス以外でも、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ（キャノーラ）、ジャガイモ（バレイショ）、トマト、ニンジン、コメ、ダイズで報告されている（D. Verma, H. Daniell, Plant Physiology 145: 1129-1143, 2007）。したがって、実施例ではレタスを用いて形質転換を行ったが、これらの農作物等を用いて同様のことを行うことが可能である。レタスの葉緑体の形質転換法は金本らにより報告されている（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）。この方法を用いればよいが、外来遺伝子の導入方法は、通常のパーティクル・ガン法と同じである。例えばレタスであれば、レタス葉緑体の形質転換用ベクター（例えば前述のpRL200）に、導入したい外来遺伝子（例えばcrtW、crtZ、idi、及びaadA）を前述のプロモータとターミネータの利用により発現する形にして挿入したプラスミドを作製し、それをパーティクル・ガンによりレタス葉に打ち込めばよい。例えばaadA遺伝子を用いた場合は、スペクチノマイシンを含むレタス再分化用培地（培地組成の一例は試験例２に示されている）に置床し、培養することにより、不定芽形成を経て、葉緑体形質転換レタスを選抜することができる。例えばベクターpRL200を用いた場合は、葉緑体ゲノム内で隣り合っているrbcLとaccD遺伝子の間に、外来遺伝子（例えばcrtW、crtZ、idi、aadA等）を導入することができる。aadA遺伝子を用いた場合は、スペクチノマイシンを含むレタス再分化用培地で、葉からの再分化を数回繰り返すことにより、葉緑体ゲノムの大部分が、外来遺伝子が導入された組換えゲノムになる。このようにして得られたレタスを、葉緑体ゲノム改変（Chloroplast-Genome Modified；CGM）レタスと呼ぶ。
【００７３】
前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードする遺伝子等がその色素体に導入される植物は特に限定されないが、例えば、上述した種子植物等が好ましい。中でも、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、タバコ等が好ましく、レタスがより好ましい。
【００７４】
前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素（前記カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素等）をコードする遺伝子を導入する色素体、すなわち形質転換される色素体は、植物の種類、組織等に応じて適宜選択すればよく、例えば、葉緑体、アミロプラスト、エライオプラスト、有色体等である。例えば、レタス、キャベツ、タバコ等の植物であれば、葉緑体に前記遺伝子を導入して葉緑体ゲノム改変植物とすることができる。例えば、カリフラワー、ジャガイモ（バレイショ）、コメ、ダイズ、セイヨウナタネ（キャノーラ）等のアミロプラストを有する植物であれば、アミロプラスト等に前記遺伝子を導入してアミロプラストゲノム改変植物とすることができる。例えばトマト、ニンジン等の有色体を有する植物であれば、有色体に前記遺伝子を導入して有色体ゲノム改変植物とすることができる。導入された遺伝子が色素体で発現することにより、該色素体においてアスタキサンチン、アスタキサンチン脂肪酸エステル等のカロテノイドが効率よく産生される。
【００７５】
例えば、その葉緑体に前記遺伝子が導入され、葉緑体ゲノムが改変されたレタス、キャベツ、タバコ等では、通常葉等でアスタキサンチン脂肪酸エステル等が産生される。アミロプラストに前記遺伝子が導入され、アミロプラストゲノムが改変されたカリフラワー、ジャガイモ（バレイショ）、コメ、ダイズ、セイヨウナタネ（キャノーラ）等の植物では、アミロプラストが存在する組織、例えばカリフラワーの花蕾；ジャガイモの塊茎；コメ、セイヨウナタネの種子；ダイズの子葉等でアスタキサンチン脂肪酸エステル等が産生される。有色体に前記遺伝子が導入され、有色体ゲノムが改変されたトマト、ニンジン等では、有色体が存在する組織、例えばトマトの果実；ニンジンの根等でアスタキサンチン脂肪酸エステル等が産生される。色素体で産生されたアスタキサンチン脂肪酸エステル等は、通常該色素体に蓄積する。
【００７６】
色素体に導入した外来性遺伝子が色素体ゲノム改変植物又はその組織において発現していることは、例えば、ノザンブロッティング、RT-PCR、ウェスタンブロッティング等の方法により確認することができる。また、該植物又はその組織においてカロテノイドが産生されていることは、例えば、HPLC分析、LC-MS分析等の方法により確認することができる。また、β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードする遺伝子が色素体に導入され、発現した色素体ゲノム改変植物又はその組織は、野生型の植物又はその組織と比較して、通常産生されたカロテノイドに由来する黄色〜赤色を呈するものとなる。例えば葉緑体ゲノム改変植物であれば、野生型の植物では緑色を呈する葉等が、黄色〜赤色がかったものとなる。このため、目視によってもカロテノイドの産生等を確認することができる。
【００７７】
例えば、前記β-カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードする遺伝子等が色素体ゲノムに導入され、発現した色素体ゲノム改変レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、タバコ等は、本発明における植物として好ましいものである。すなわち前記色素体ゲノム改変植物は、レタス、カリフラワー、キャベツ、セイヨウナタネ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、イネ、ダイズ、又はタバコで等が好ましい。中でも、本発明における色素体ゲノム改変植物は、特に好ましくは葉緑体ゲノム改変植物であり、最も好ましくは、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、発現したレタスである。レタスは、例えば、バークレー、シスコ、カイザー、レガシー等の結球レタス；グリーンリーフ、フリルレタス、グリーンウエーブ等のリーフレタスが挙げられ、結球レタスが好ましく、中でも、バークレー等がより好ましい。例えば、非特許文献１４又は１５に記載されている葉緑体ゲノム改変レタス等も、本発明における色素体ゲノム改変植物として好適に用いられる。
【００７８】
前記のカロテノイド4,4’-ケト基導入酵素等をコードする遺伝子が色素体ゲノムに導入され、発現した色素体ゲノム改変植物は、通常、形質転換された色素体においてアスタキサンチン脂肪酸エステルを産生する。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、抗酸化作用、抗老化（アンチエージング）作用（肌の光老化の抑制、黄斑変性症の予防など）、抗疲労作用（眼精疲労や筋肉疲労の軽減など）、抗生活習慣病作用（糖尿病性腎症予防、LDL（悪玉コレステロール）の酸化予防、血液の流動性改善、血圧上昇の抑制）、抗炎症作用、抗癌作用等の作用を有する（例えば、吉川敏一、内藤裕二監修、アスタキサンチンの機能と応用、シーエムシー出版、2012）。さらに、アスタキサンチン脂肪酸エステルは、遊離体（アスタキサンチン）に比べて、経口投与時の腸管吸収性が高く、機能性食品素材等として有用なものである。
【００７９】
本発明の抽出方法により、例えば前記カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素等をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入することにより得られる色素体ゲノム改変植物からアスタキサンチン脂肪酸エステルを含むカロテノイドを効率よく抽出することができる。このため、このような色素体ゲノム改変植物は、アスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するために好適に使用され得る。
【００８０】
４．色素体ゲノム改変植物のアスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するための使用
本発明は、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物の、アスタキサンチン脂肪酸エステルを製造するための使用も包含する。色素体ゲノム改変植物やその作製方法等の好ましい態様は、上述した通りであり、カロテノイド4,4’-ケト基導入酵素をコードする遺伝子と共に、カロテノイド3,3’-水酸基導入酵素、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの各酵素をコードする遺伝子を植物の色素体ゲノムに導入して得られる色素体ゲノム改変植物が好ましい。
各遺伝子及びその好ましい態様は、上述した通りである。色素体ゲノム改変植物は、好ましくは、葉緑体ゲノム改変レタスである。
【００８１】
作出した色素体ゲノム改変植物又はその組織を、通常、栽培又は培養することにより、該植物又はその組織内にアスタキサンチン脂肪酸エステルが産生される。色素体ゲノム改変植物又はその組織の栽培又は培養方法は、植物の種類等に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。
【００８２】
アスタキサンチン脂肪酸エステルは、ジエステル体であってもよく、モノエステル体であってもよく、ジエステル体とモノエステル体との混合物であってもよい。ジアスタキサンチン脂肪酸エステルは、好ましくは、アスタキサンチンのミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルである。
【００８３】
例えば、色素体ゲノム改変植物が、葉緑体ゲノム改変レタスであれば、その葉等には、カロテノイドとして、通常、アスタキサンチン脂肪酸エステルと共に、アスタキサンチン遊離体、フリチエラキサンチン、4-ケトアンテラキサンチン、ラクチュカキサンチン等が含まれる。このため前記抽出方法により、これらのカロテノイド混合物が得られる。また、葉緑体ゲノム改変レタスの場合、前記抽出方法により抽出される全カロテノイド中、アスタキサンチン脂肪酸エステルが通常約５０〜９０重量％、好ましくは約５０〜８０重量％含まれる。アスタキサンチン脂肪酸エステルは、通常モノエステル体とジエステル体の混合物であり、ミリスミン酸エステル又はパルミチン酸エステルである。色素体ゲノム改変植物により、このようなカロテノイド混合物を製造することができる。
【００８４】
色素体ゲノム改変植物により産生されるカロテノイドの混合物は、例えば、健康・機能性食品、養殖魚、養禽などの飼料等に好適に用いられる。また、カロテノイドの混合物から、HPLC等の公知の分離又は精製方法により、さらに各カロテノイドを単離することもできる。
【００８５】
前記色素体ゲノム改変植物又はその組織は、例えばアスタキサンチン脂肪酸エステル等を含有する素材として、そのまま、又は所望により加熱、乾燥、細断、粉末化等の処理を行って、機能性食品の材料、養殖魚、養禽などの飼料等としても好適に用いられる。
【実施例】
【００８６】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００８７】
＜試験例１＞
（アスタキサンチン産生用プラスミドの作製）
海洋細菌ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD212株由来のCrtWとCrtZはβ-カロテンを効率的にAstaに変換する酵素の組み合わせである（前記特許文献２）。
【００８８】
Brevundimonas sp. SD212株由来のオリジナルなcrtWとcrtZ遺伝子はGC含量が70％と高いので、植物型のコドン使用に変えたcrtWとcrtZを化学合成した（コードされるアミノ酸配列はオリジナルなものと同一）。合成したcrtWとcrtZの配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号３に示す。化学合成したcrtWとcrtZの塩基配列（配列番号１及び配列番号３）はそれぞれ、DDBJ アクセッション番号 AB377271及びアクセッション番号 AB377272から入手することができる。
【００８９】
アスタキサンチン産生用プラスミドプラスミドpRL-crtZWを作製するために使用したpLD200-ZWについて、説明する。
蓮沼らは、前記遺伝子crtWとcrtZ（それぞれ配列番号１及び配列番号３）をrrnプロモータの制御下で直接、非食用農作物のタバコ（Nicotiana tabacum）葉緑体のゲノムに導入し、葉緑体ゲノム改変（Chloroplast-Genome Modified；以後、CGMと記載）タバコを得た（前記非特許文献１３）。rrnプロモータの下流に、crtZとcrtWの順番で挿入し、下流にrps16のターミネータを付けたプラスミドpLD200-ZW（前記非特許文献１３）で形質転換されたCGMタバコが高いAsta生産性を示した。このCGMタバコにおけるAstaの産生量は最大で、葉1 g乾重量当たり5.44 mgに達したが、産生されたAstaはすべて遊離体であった（前記非特許文献１３）。本CGMタバコの葉では99％のカロテノイドが、Asta（全カロテノイドの74％）等のケトカロテノイドに変換されていたにもかかわらず、CGMタバコは光合成を行い、正常に生育することができた。なお、プラスミドpLD200-ZWは、NotI-Prrn-aadA-TpsbA-Prrn-crtZ-crtW-EcoRI-Trps16-SalI断片（前記非特許文献１３）を、タバコ葉緑体形質転換用ベクターであるpLD200におけるrbcLとaccD遺伝子（タバコ葉緑体ゲノム由来）間のNotI-SalI部位に挿入したプラスミドである。PとTはそれぞれ、プロモータとターミネータを示す。aadAはストレプトマイシン/スペクチノマイシン アデニルトランスフェラーゼ（Streptomycin/Spectinomycin Adenyltransferase）遺伝子のことであり、スペクチノマイシン（又はストレプトマイシン）の耐性能を宿主に付与する（マーカー遺伝子）。また、タバコ葉緑体形質転換用ベクターpLD200の塩基配列はDDBJ アクセッション番号 CS165378に開示されている。なお、前述のNotI-Prrn-aadA-TpsbA-Prrn-crtZ-crtW-EcoRI-Trps16-SalI断片は、前述の化学合成したcrtZとcrtWを鋳型としてPCR増殖したBamHI-crtZ-XbaI-crtW-EcoRI断片を、NotI-Prrn-aadA-TpsbA-Prrn-BglII-XbaI-EcoRI (MCS)-Trps16-SalI断片を持つプラスミドpLD7-rrnP-MCS（塩基配列はDDBJ アクセッション番号 AB375764に開示されている）のBglII- EcoRI部位に挿入することにより作製されたものである（作製されたプラスミド名はpLD7-rrnP-crtZ-crtW；前記非特許文献１３）。なお、PCR増殖したBamHI-crtZ-XbaI-crtW-EcoRI断片におけるcrtZとcrtW遺伝子の開始コドンATGの上流の配列は、各々の制限部位以降同じで、BamHI/XbaI部位-AAAGAGGAGAAATTACATATG（配列番号７）となっている。この配列は葉緑体で翻訳効率のよいリボソーム結合部位を含んでいる。
【００９０】
本発明者らはレタス葉緑体の形質転換用ベクターとして、金本らによって作製されたpRL200（図４）を用いた（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）。pRL200は、レタス葉緑体ゲノム由来のrbcLとaccD遺伝子の間に、NotI-NheI-SalIのクローニング部位を持つ（図４）。上記プラスミドpLD200-ZWにおけるNotI-Prrn-aadA-TpsbA-Prrn-crtZ-crtW-EcoRI-Trps16-SalI断片を切りだし、本ベクターpRL200のNotI-SalI部位に挿入し、プラスミドpRL-crtZWを作製した。
【００９１】
Paracoccus sp. N81106株由来のオリジナルなidi遺伝子はGC含量が70％と高いので、植物型のコドン使用に変えたidiを化学合成した（コードされるアミノ酸配列はオリジナルなものと同一）。化学合成したidiの配列を、配列番号５に示す。この化学合成したidiの塩基配列（配列番号５）は、DDBJ アクセッション番号 AB453829から入手することができる。次に、この化学合成遺伝子を鋳型としたPCRにより、MfeI-idi-EcoRI断片を合成した。本DNA断片におけるidi遺伝子の開始コドンATGの上流の配列は、MfeI部位-AAAGAGGAGAAATTACATATG（配列番号８）となっている。この配列は葉緑体で翻訳効率のよいリボソーム結合部位を含んでいる。このMfeI-idi-EcoRI断片を、プラスミドpLD7-rrnP-crtZ-crtW（前記非特許文献１３）のEcoRI部位に挿入することにより、プラスミドpLD7-rrnP-crtZ-crtW-idiを得た。次に、本プラスミドにおけるNotI-Prrn-aadA-TpsbA-Prrn-crtZ-crtW-idi-EcoRI-Trps16-SalI断片を切り出し、レタス用ベクターpRL200のNotI-SalI部位に挿入し、プラスミドpRL-crtZWidiを作製した（図５）。
【００９２】
＜試験例２＞
（レタス葉緑体の形質転換）
試験例１で作製したプラスミドpRL-crtZW及びpRL-crtZWidiを用いて、レタス（Lactuca sativa L. var. Berkeley）の葉（葉緑体）を形質転換した。具体的には次のように行った。
【００９３】
野生型のレタス・バークレー（Lactuca sativa L. var. Berkeley）の種子はタキイ種苗から購入した。このレタス種子を70%エタノールに2分間浸漬して滅菌し、滅菌水でよく洗った後、0.8%の植物培養用アガー（和光純薬工業製）、0.1%のMSビタミン溶液（シグマアルドリッチ製）、及び3%のショ糖（和光純薬工業製）を含み、pH 5.8に調製したMS培地（Murashige and Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497, 1962）（以下、レタス培地と記す）に置床し、人工気象室（Sanyo Growth Cabinet）内で20℃にて無菌培養した。3〜4週間培養後の葉組織を切り出し、0.5 mg/Lのベンジルアミノプリン（シグマアルドリッチ製）と0.1 mg/Lのナフタレン酢酸（シグマアルドリッチ製）を含むレタス培地（レタス再分化用培地）に並べ暗所で一晩静置した後、試験例１で作製したアスタキサンチン産生用プラスミド2種（pRL-crtZW及びpRL-crtZWidi）を用いて、パーティクル・ボンバードメント法（パーティクルガン法）により遺伝子導入を行った。導入は、金本らの方法（H. Kanamoto, A. Yamashita, H. Asao, S. Okumura, H. Takase, M. Hattori, A. Yokota, K. Tomizawa, Transgenic Research 15: 205-217, 2006）に従って行った。遺伝子導入後の葉組織を暗所で2日間静置後切片化し、0.5 mg/Lのベンジルアミノプリン、0.1 mg/Lのナフタレン酢酸、500 mg/Lのポリビニルピロリドン、及び50 mg/Lのスペクチノマイシン二塩酸塩（和光純薬工業製）を含むレタス培地に置床して3〜8週間選抜を行い、葉緑体形質転換レタスin vitro植物体を得た。
【００９４】
＜試験例３＞
（葉緑体ゲノム改変レタスT1の取得）
試験例２で得た葉緑体形質転換レタスin vitro植物の中で、赤色がかった葉を選抜して、0.5 mg/Lのベンジルアミノプリン、0.1 mg/Lのナフタレン酢酸、及び50 mg/Lのスペクチノマイシン二塩酸塩を含むレタス培地に置床し、不定芽経由でin vitro植物を再分化させ、レタス培地で生育させた。このin vitro植物の中で、より赤色がかった葉を選抜し、上記と同じ操作により、不定芽経由でin vitro植物を再分化させるという過程を2〜3回、繰り返した。このようにして得られた葉がより赤みがかった葉緑体形質転換レタスin vitro植物は、プラスミドpRL-crtZWidiによって形質転換された系統であった。このうちの１つのin vitro植物を土に移し替え、数週間、人工気象器内で順化した後、特定網室に移した。該レタス形質転換体、すなわち、葉緑体ゲノム改変（Chloroplast-Genome Modified）レタス（CGMレタス）は順調に生育し、ピンク色の花を咲かせ、多くの種子を付けた。これをT1種子と呼ぶ。このT1種子は99％の発芽率を示し、非形質転換体の発芽率（93％）よりむしろ高かった（前記非特許文献１５）。このT1種子から生育させたCGMレタスの葉を用いて以下の実験を行った。
【００９５】
＜比較例１＞
（葉緑体ゲノム改変レタスからカロテノイドの抽出と精製）
ポール・フレーザー（Paul D. Fraser）らの方法（P. D. Fraser, M. Elisabete, S. Pinto, D. E. Holloway, P. M. Bramley, Plant Journal, 24: 551-558, 2000）は、植物組織からカロテノイドを抽出する際によく用いられている方法である。例えば、前記非特許文献１２〜１５でも用いられた。この方法は、溶媒の種類などいくつかの抽出条件を検討し最適化されたものであり、植物組織を乳鉢ですり潰した後、メタノール、クロロホルムの順で加え、色素を抽出するものである。
【００９６】
本発明者らは、葉緑体ゲノム改変レタス（CGMレタス）T1植物の葉（0.2 g）を用いて、このポール・フレーザーらの方法により、カロテノイド全体を抽出することを試みた。しかしながら、この方法では、CGMレタスT1植物の葉から効率的に色素を抽出することはできず、抽出済みであるはずの葉の画分に褐色の色が残った。
【００９７】
＜実施例１＞
（葉緑体ゲノム改変レタスからカロテノイドの抽出と精製）
カロテノイドの抽出には、メタノール又はクロロホルム-メタノール、又はアセトンがよく用いられる。そこで、CGMレタスT1植物の葉（0.2 g）を乳鉢ですり潰した後、アセトンで抽出することを試みたが、アセトン抽出液は微かに褐色になる程度であった。そこで、発明者らは、細切りした葉をアセトンで通した後、クロロホルム-メタノールに漬け、そこで乳鉢ですり潰すという方法を採用した。この抽出液と、微かに色の付いたアセトン前処理液を合わせ、ヘキサンと水を加えて分液ロートで分液するという方法により、上層の有機溶媒層に完全にカロテノイド色素を集めることができた。具体的には、次のように行った。
【００９８】
CGMレタスT1植物の葉数枚（5.11 g）を切り出し、細切りした後、アセトン20 mLを加えて室温で５時間脱水した。アセトン溶液にわずかに色（褐色）が付いた。アセトンからレタス葉を取り出し乳鉢に移した後、クロロホルム-メタノール（１：１） 50 mLを段階的に加え良く磨り潰し、室温で６時間抽出を行った。上記アセトン液とクロロホルム-メタノール（１：１）液を合併した後、分液漏斗に移し、これにヘキサンと水（ヘキサン：水が１：１（体積比））200 mLを加え分液した後、着色した有機溶媒層（上層）を分離した。
【００９９】
コントロールとして、非形質転換レタスの葉（6.86 g）を切り出し、同様にカロテノイド色素を抽出し、着色した有機溶媒層（上層）を分離した。
【０１００】
各々の有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、吸光法（K. Schiedt, S. Liaaen-Jensen, Isolation and analysys, in Carotenoids (G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander (Eds.) Birkhauser, Basel; 1995; Vol. 1A, pp 81-108）により総カロテノイド含量を測定した。アスタキサンチン（脂肪酸エステルや遊離体）を始めとするケトカロテノイドの定量には、470 nmにおける分子吸光係数 (E（１ｃｍ、１％（ｗ／ｖ）のときの吸光度）)として2100を用いた。ケトカロテノイド以外のカロテノイドの定量には、447 nmにおける分子吸光係数 (E（１ｃｍ、１％（ｗ／ｖ）のときの吸光度）)として2400を用いた。
CGMレタス葉及びコントロールレタス葉の総カロテノイド含量はそれぞれ、1 g（湿重量）当たり、230 μg及び86 μgであった。CGMレタスの方がコントロールレタスより2.67倍多かった。
【０１０１】
上記の抽出溶液をエバポレーターで濃縮乾固した後、それぞれのカロテノイド成分をHPLCにより分離し、精製した。
HPLCの条件：
HPLCカラム  Cosmosil 5SL-II 4.6×250 ｍｍ
移動層0-20分  アセトン／ヘキサン（2：8）、20分以降アセトン/ヘキサン（4：6）、  流速  1.0 ml/min、検出450 nm
各カロテノイドの組成はHPLCのピーク面積より求めた。
【０１０２】
（葉緑体ゲノム改変レタスにより産生されたカロテノイドの同定と定量）
HPLC分析の結果を図２及び図３に示した。各カロテノイドはそれぞれ分取してUV-VIS、FAB MS、1H-NMR、及びCDにより同定した（図２及び図３；各スペクトルデータは後記）。
【０１０３】
図２における各ピークは、以下のように同定された。
1: (3S,3’S)-Astaxanthin diesters, 2: Canthaxanthin, 3: : (3S,3’S)-Astaxanthin monoesters, 4: (3S)-Adonirubin, 5: (3’S)-Asteroidenone, 6: (3S,3’S)-Astaxanthin, 7: Fritschiellaxanthin, 9: Lactucaxanthin, 10: 4-Ketoantheraxanthin, 11: cis-4-Ketoantheraxanthin. 12: クロロフィル分解物。
【０１０４】
図３における各ピークは以下のように同定された。
1 : β-Carotene, 2 : β-Cryptoxanthin, 3 : Lactucaxanthin, 4 : Lutein, 5 : Zeaxanthin, 6 : Lutein-5,6-epoxide, 7 : Antheraxanthin, 8: クロロフィル分解物, 9 : 9’-cis-Neoxanthin．
【０１０５】
その結果、明らかとなったCGMレタス葉及びコントロールレタス葉におけるカロテノイド組成を表１に示した。CGMレタスにおける各種カロテノイドの生合成経路と各種カロテノイド合成酵素の機能は、図１に示されている。
【０１０６】
【表１】
2014050374.tif 000002
* ミリスチン酸とのジエステル：パルミチン酸及びミリスチン酸とのジエステル：パルミチン酸とのジエステル (19:47:34)
** アスタキサンチンのミリスチン酸エステル：パルミチン酸エステル  (45:55)
【０１０７】
これらの研究を通して本発明者らは、CGMレタスにおいて通常レタスの2.67倍量の総カロテノイドが産生されており、その67.4％がAsta脂肪酸エステル（49.2%：ジエステル体（diester）、18.2%：モノエステル体（monoester））であること、Asta脂肪酸エステルにおける脂肪酸部分はミリスミン酸（myristate）又はパルミチン酸（palmitate）であること、Asta脂肪酸エステル以外のケトカロテノイドとしてAsta遊離体（10%）、フリチエラキサンチン（6%）、カンタキサンチン（5.3%）、4-ケトアンテラキサンチン（4.3%）等が含まれ、さらにレタス固有のカロテノイドであるラクチュカキサンチン（3.8%）が含まれることを発見した（表１）。今日では、先端バイオテクノロジーにより種々の農作物にAstaを合成させることが報告されているが、いずれの場合もAsta遊離体の生産例である（前記非特許文献５、及び１０〜１５）。今回のCGMレタスの場合のように、Astaの脂肪酸エステルが多量合成されており、しかもそれが総カロテノイドの半分以上含まれていたことは全く予想外の知見であった。今回、CGMレタスからカロテノイドの効率的な抽出法と精製法を検討したことにより初めて明らかとなった知見である。実際に健康食品用素材として販売されているH. pluvialisにより産生されたAstaも脂肪酸エステル体であるので、これはCGMレタスから抽出したカロテノイド（さらに将来的にはCGMレタスそのもの）の健康食品素材としての利用を考える上で好都合であった。さらに、CGMレタスは、フリチエラキサンチン、4-ケトアンテラキサンチン、ラクチュカキサンチンといった希少カロテノイドも産生するが、これらの組合せのカロテノイド混合物を産生する生物は他に存在しないので、これらの希少カロテノイドを含むCGMレタスの総カロテノイド（マルチカロテノイドと呼ぶ）は他の製造方法では実現できないものである。また、CGMレタスにおけるAstaの総産生量は遊離体換算で180 μg/g湿重量となり、これまでに作出された組換え食用農作物の中だけでなく、サケやイクラ等のAsta含有食品（たとえば、サケやイクラのAstaの含有量は遊離体換算で20〜38 μg/g湿重量）と比較しても最高レベルであった。なお、4-ケトアンテラキサンチンは、CGMタバコの葉において初めて同定された新規カロテノイドであり（前記非特許文献１３）、フリチエラキサンチンはハナサキガニやアカテガニに微量含まれる希少カロテノイドである（前記非特許文献１）。今回作出したCGMレタスは組換え植物用植物工場で容易に増殖できるので、Astaに加えて他の希少ケトカロテノイドの安定的供給源として期待されるだけでなく、高等植物におけるケトカロテノイドの生理的役割を探るためのモデル植物となることが期待される。
【０１０８】
（葉緑体ゲノム改変レタスにより産生されたカロテノイドのスペクトルデータ）
葉緑体ゲノム改変レタスから同定されたカロテノイドのスペクトルデータを示す。
(3S,3’S)-Astaxanthin diester: UV-VIS: 470 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 1072 (Astaxanthin dimyristate), m/z 1044 (Astaxanthin myristyl palmitate), m/z 1016 (Astaxanthin dipalmitate. MSのイオン強度によるAstaxanthin dimyristateとAstaxanthin myristyl palmitateとAstaxanthin dipalmitateの比率 (19:47:34). 1H NMR δ (CDCl3): 0.88 (t, J=7.5 Hz, CH3 in fatty acid moiety), 1.23 (6H, s, CH3-17, 17’), 1.26 (s, CH2 in fatty acid moiety), 1.34 (6H, s CH3-16, 16’), 1.70 (t, J=7.5 Hz, CH2 in fatty acid moiety), 1.91 (6H, s, CH3-18, 18’), 1.99 (6H, s, CH3-19, 19’), 2.00 (6H, s, CH3-20, 20’), 2.01 (2H, overlapped, H-2, 2’ eq), 2.07 (2H, dd J=12, 6 Hz, H-2, 2’ ax), 2.08 (t, J=7.5 Hz, CH2 in fatty acid moiety), 2.43 (m, CH2 in fatty acid moiety), 5.54 (2H, dd, J= 13.5, 5.5 Hz, H-3, 3’), 6.20 (2H, d, J=16 Hz, H-7, 7’), 6.30 (2H, d, J=11.5 Hz, H-10, 10’), 6.32 (2H, m, H-14, 14’), 6.40 (2H, d, J=16 Hz, H-8, 8’), 6.45 (2H, d, J=15.5 Hz, H-12, 12’), 6.65 (2H, dd, J=15.5, 11.5 Hz, H-11, 11’), 6.67 (2H, m, H-15, 15’). CD λ nm (Δε) : 240 (-20.0), 252 (0), 270 (+20.0), 284 (0), 314 (-34.0), 355 (0), 372 (+3.0).
【０１０９】
Canthaxanthin: UV-VIS: 470 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 564 [M]+.
(3S,3’S)-Astaxanthin monoester: UV-VIS: 470 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 834 (Astaxanthin myristate), m/z 806 (Astaxanthin palmitate. MSのイオン強度によるAstaxanthin myristate とAstaxanthin dipalmitateの比率 (45:55). 1H-NMR δ (CDCl3): 0.88 (t, J=7.5 Hz, CH3 in fatty acid moiety), 1.21 (3H, s, CH3-17’), 1.23 (3H, s, CH3-17), 1.26 (s, CH2 in fatty acid moiety), 1.32 (3H, s, CH3-16’), 1.34 (3H, s, CH3-16), 1.70 (t, J=7.5 Hz, CH2 in fatty acid moiety), 1.82 (1H, dd, J=13, 13 Hz, H-2’ax), 1.91 (3H, s, CH3-18), 1.95 (3H, s, CH3-18’), 1.99 (6H, s, CH3-19, 19’), 2.00 (6H, s, CH3-20, 20’), 2.01 (1H, overlapped, H-2 eq), 2.07 (1H, dd, J=12, 6 Hz, H-2 ax), 2.08 (t, J=7.5 Hz, CH2 in fatty acid moiety), 2.16 (1H, dd, J=12, 5.5 Hz, H-2’ eq), 2.43 (m, CH2 in fatty acid moiety), 3.69 (1H, d, J=1.5 Hz, OH-3’), 4.33 (1H, ddd, J=13.5, 5.5, 1.5 Hz, H-3’), 5.54 (1H, dd, J=13.5, 5.5 Hz, H-3), 6.20 (1H, d, J=16 Hz, H-7), 6.21 (2H, d, J= 16Hz, H-7’), 6.30 (2H, d, J=11.5 Hz, H-10, 10’), 6.31 (2H, m, H-14, 14’), 6.40 (2H, d, J=16 Hz, H-8), 6.43 (2H, d, J=16 Hz, H-8’), 6.45 (2H, d, J=15.5 Hz, H-12, 12’), 6.66 (2H, dd, J=15.5, 11.5 Hz, H-11, 11’), 6.67 (2H, m, H-15, 15’). CD λ nm (Δε) : 240 (-20.0), 252 (0), 270 (+20.0), 284 (0), 314 (-34.0), 355 (0), 372 (+3.0).
【０１１０】
(3S)-Adonirubin: UV-VIS: 470 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 580 [M]+. CD λ nm (Δε) : 220 (+12.0), 230 (0), 234 (-12.0), 252 (0), 275 (+10.0), 283 (0), 310 (-17.0), 340 (0), 370 (+4.4).
(3’S)-Asteroidenone：UV-VIS: 455 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 566 [M]+.
(3S,3’S)-Astaxanthin: UV-VIS: 470 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 596 [M]+. CD λ nm (Δε) : 240 (-20.0), 252 (0), 270 (+20.0), 284 (0), 314 (-34.0), 355 (0), 372 (+3.0).
【０１１１】
Fritschiellaxanthin：UV-VIS: 452 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 582 [M]+.
4-Ketoantheraxanthin : UV-VIS: 452 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 598 [M]+.
cis-4-Ketoantheraxanthin : UV-VIS: 448 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 598 [M]+.
Lactucaxanthin：UV-VIS: 416, 439, 468 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 568 [M]+.
Lutein：UV-VIS: 422, 445, 474 nm (Et2O). FAB-MS: m/z 568 [M]+.
【図２】
2014050374.tif 000003
【図３】
2014050374.tif 000004
【図４】
2014050374.tif 000005
【図１】
2014050374.tif 000006
【図５】
2014050374.tif 000007
【配列表】
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