(57)【要約】      （修正有）【課題】形質転換によって低温での増殖性の改善された乳酸菌を提供する。【解決手段】１０℃以下の低温培養条件でペルオキシレドキシンの生産性を有すると共に増殖可能になるように、乳酸菌に対して特定の塩基配列を有するペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を組み込んで構築されたペルオキシレドキシン高発現性のプラスミドを導入して形質転換した乳酸菌の低温増殖性改善方法。ならびに、前記、形質転換によってペルオキシレドキシン高発現性となった、低温増殖性乳酸菌。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌がペルオキシレドキシン生産性を有すると共に低温で増殖可能であるように、前記乳酸菌にペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を導入して形質転換することからなる乳酸菌の低温増殖性改善方法。
【請求項２】
上記低温が、１０℃以下の低温である請求項１に記載の乳酸菌の低温増殖性改善方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の乳酸菌の低温増殖性改善方法に用いられ、配列番号１に記載の塩基配列を有する乳酸菌のペルオキシレドキシン高発現性遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を組み込んで構築されたペルオキシレドキシン高発現性のプラスミド。
【請求項５】
請求項４に記載のペルオキシレドキシン高発現性のプラスミドを導入して形質転換された低温増殖性乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乳酸菌の低温増殖性改善方法およびそれに用いるペルオキシレドキシン高発現性遺伝子、ペルオキシレドキシン高発現性のプラスミド並びに、このプラスミドを導入した低温増殖性乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、食品に有効活用される乳酸菌のうち、いくつかの乳酸菌種については食肉加工品に付着した場合に、適正な低温管理状況下においても急速に増殖し、製品の品質を劣化させることが以前から知られている。
【０００３】
そのため、食肉加工品メーカーにおいて、健康危害はないものの品質を著しく劣化させるこの乳酸菌種の性状を知ることは、品質管理の観点から非常に重要である。
【０００４】
また、海洋に生息する低温細菌の低温増殖機能や低温性酵素などの生産物の利用を目的とし、組換えプラスミドが構築されている（特許文献１）。
【０００５】
また、乳酸菌の一種であるラクトバチルス属のLactobacillus debrueckiiに、薬剤耐性遺伝子などの結合した組換えプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーション法などによって導入し、形質転換体を得る方法が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２３８６７５号公報
【特許文献２】特開平５−１７６７７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記した従来の技術のうち、特許文献１に記載された発明では、低温細菌の遺伝子組換え技術によって、熱に対して不安定な蛋白質や低温条件下で活性を示す酵素などを効率よく生産することを目的としており、宿主である細菌自体の耐寒性を向上させる技術を示すものではない。
【０００８】
また、特許文献２に記載された発明は、ラクトバチルス属の乳酸菌に対し、薬剤耐性に関わる遺伝子（同文献の段落００１１参照）を導入して形質転換する技術が開示されているが、乳酸菌の耐寒性を向上させる技術ではなかった。
【０００９】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、乳酸菌の低温増殖性に関わる生体内機構の作用を高めるため、乳酸菌が低温で高い増殖性を示す性質に関わる耐冷性に関与する所定の遺伝子を見出し、この遺伝子を用いて形質転換することによって、低温での増殖性の改善された乳酸菌を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、この発明は、乳酸菌の低温増殖性に関わる生体内機構として、細胞内抗酸化機構に関与するタンパク質（ペルオキシレドキシン）の産生能を高めることにより、乳酸菌が低温で高い増殖性を示すことを発見したことに基づいている。
【００１１】
そして、本願の発明者らは実際に変敗した食肉加工品から分離したLeuconostoc mesenteroides 野生株(ＮＨ０４株)の性状を調べ、低温環境では細胞膜の脂肪酸組成は分岐脂肪酸や飽和脂肪酸が多く存在し、また細胞内には抗酸化に働くタンパク質(ペルオキシレドキシン)が、他の株に比べて高発現し、また低温増殖性の高いＮＨ０４株は酸化ストレス耐性機構を発達させている可能性があることから、食肉製品を変敗させる乳酸菌の低温増殖能力は、所定の抗酸化機構の改善に相関するものと考え、この発明を完成させたのである。
【００１２】
すなわち、上記した課題を解決するために採用する手段は、乳酸菌が好ましくは１０℃以下の低温培養条件でペルオキシレドキシンの生産性を有すると共に増殖可能になるように、前記乳酸菌にペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を導入して形質転換することからなる乳酸菌の低温増殖性改善方法とすることである。
【００１３】
上記した低温増殖性改善方法であれば、乳酸菌には、所定のペルオキシレドキシン高発現性遺伝子が導入されているので、乳酸菌は、好ましくは１０℃以下の低温培養条件でもペルオキシレドキシンを多く生産する。
このとき、生産されたペルオキシレドキシンは、グルタチオン代謝酵素として細胞内の抗酸化機構に働くので、これによって多くの活性酸素種に対する抗酸化性が高められる。
【００１４】
ここで、低温環境での乳酸菌は、代謝によって酸化ストレスが生じ、それによって細胞毒性のある活性酸素種が多く生じ、そのために低温での増殖能力が阻害されていると推定され、その場合、ペルオキシレドキシンの多量の供給は低温での増殖能力を高めることになる。後述する実験結果からも、形質転換された乳酸菌には１０℃以下の低温培養条件において、予想されたとおりの優れた低温増殖性が得られている。
【００１５】
このように優れた乳酸菌の低温増殖性改善方法には、配列番号１に記載の塩基配列を有する乳酸菌のペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を採用することができる。
具体的には、上記の乳酸菌のペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を組み込んで構築されたペルオキシレドキシン高発現性のプラスミドを用いて乳酸菌を形質転換することが好ましく、またこのようにして得られたペルオキシレドキシン高発現性のプラスミドを導入して形質転換された低温増殖性の乳酸菌を利用し、低温増殖性の高い乳酸菌を得ることができる。
【発明の効果】
【００１６】
この発明は、乳酸菌が低温培養条件でペルオキシレドキシンの生産性を有すると共に増殖可能になるように、前記乳酸菌にペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を導入して形質転換したので、乳酸菌の低温増殖性に関わる生体内機構を改善できる利点がある。
また、この発明は、低温増殖性に関わる所定の遺伝子を組み込んだプラスミドを利用した乳酸菌の形質転換によって、低温で効率よく増殖させることができる低温増殖性の改善された乳酸菌になるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】耐冷性株（NH04）と標準株（NBRC3832）の低温培養による可溶性タンパク質の発現パターンを示す二次元電気泳動図
【図２】ベクターに使用したプラスミドと制限酵素の作用域を示す説明図
【図３】実施例１（形質転換体：NBRC3832pGKahpC）と比較例１（標準株：NBRC3832pGK）の増殖量と培養時間の関係を示す図表
【図４】実施例１のＡｈｐＣの発現を示すSDS-PAGE電気泳動図
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この発明の実施形態の乳酸菌の低温増殖性の改善方法は、乳酸菌が低温培養条件でペルオキシレドキシンの生産性を有すると共に増殖可能となるように、前記乳酸菌に対して配列番号１に示されるペルオキシレドキシン高発現性遺伝子を導入して形質転換する。
【００１９】
この発明によって低温増殖性を改善できる宿主細胞である乳酸菌は、特定の種に限定されるものではなく、適宜に一種以上を採用でき、例えばラクトバチルス属(Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)に属する産業上利用価値のある各種の乳酸菌が挙げられる。
【００２０】
配列番号１の塩基配列を有する乳酸菌のペルオキシレドキシン（ＡｈｐＣ）高発現性遺伝子は、例えば、以下のような手法により入手することができ、ＡｈｐＣの過剰発現用プラスミドを構築して、それを乳酸菌の市販の標準株などに導入し、低温での増殖速度を確認することができる。
【００２１】
例えば、低温環境での増殖速度が異なる２種類の乳酸菌として、L.mesenteroides（増殖性が優れているＮＨ０４株）と標準株（増殖性が標準的であるＮＨ０１株)を１０℃で培養し、ジヒドロエチジウム(ＤＨＥ)を用いて、菌体内のスーパーオキシドアニオンの蓄積量を解析する。
その結果からみて、低温増殖性の高いＮＨ０４株には、ＮＨ０１株に比べて、例えば１．７倍の多量のスーパーオキシドアニオンが蓄積していることが判明した。
【００２２】
因みにスーパーオキシドアニオンは、呼吸代謝の副生成物として生じ、より反応性の高いヒドロキシラジカルへと変換される可能性があるフリーラジカルである。
ＮＨ０４株の細胞内には、細胞毒性を示す活性酸素種が多く存在するにもかかわらず、他の株に比べて高い増殖性を示すことから、本株には活性酸素種による細胞毒性に対する防御機構が存在していると考えられる。
【００２３】
なお、本株を１０℃で培養した時に、グルタチオン代謝酵素の1つとして知られるペルオキシレドキシン(ＡｈｐＣ)が高生産され、ＮＨ０４ＡｈｐＣ高発現株は、野生型ＮＨ０１株に比べて低温での増殖速度が大きかった。
【００２４】
したがって、ＮＨ０４株由来のＡｈｐＣによる細胞内抗酸化機構が、食品変敗性乳酸菌の低温での増殖性に関与する可能性が高いと考えられ、ＮＨ０４株のＡｈｐＣが乳酸菌の低温増殖性におよぼす影響を解析するために、ＮＨ０４ＡｈｐＣの過剰発現用プラスミドを構築し、ＮＨ０１にエレクトロポレーションによって細胞内に導入する。
この発明の実施形態の乳酸菌の低温増殖性の改善方法について、さらに具体的に説明する。
【００２５】
［ＡｈｐＣ遺伝子］
この発明に用いるＡｈｐＣ遺伝子は、例えば、乳酸菌が使用される食品製造環境から採取された耐冷性の高い乳酸菌であるLeuconostoc mesenteroides（ＮＨ０４株）に由来する。このような環境内で採取したＮＨ０４株は、標準株として市販のLeuconostoc mesenteroides ＮＢＲＣ３８３２に比べて低温での増殖性が高いものであり、その理由を調べるために１０℃における両菌株のタンパク質発現パターンを調べたところ、ＡｈｐＣタンパク質が顕著に多く発現されていた（図１参照）。
【００２６】
このタンパク質の発現に関与する遺伝子領域を特定する方法は、以下の通りである。
既に遺伝子配列が解読され既知のものとなっているLeuconostoc mesenteroides（ＡＴＣＣ８２９３株）を含め、数種類の乳酸菌株のＡｈｐＣ遺伝子の配列を比較検討して、共通性の高い配列部分を用いて、ＮＨ０４株のＡｈｐＣ配列においても増幅すると想定されるプライマーを作成し、ＮＨ０４株のゲノムを鋳型としてＡｈｐＣ遺伝子と想定される配列を増幅し、その増幅産物の配列をシークエンサーにて解析する。ＡｈｐＣ配列の５’及び３’末端部分の配列を正確に決定付けるため、先に解析した配列を元にインバースＰＣＲ法を行い、最終的にＮＨ０４株のＡｈｐＣ配列全長を決定する。
【００２７】
［組換えプラスミドの構築］
図２に示すように、上記のＡｈｐＣ遺伝子の能力判定のために、この遺伝子配列をプラスミドに挿入し、菌体内に導入してＡｈｐＣタンパク質を合成させる。そのためのプラスミドには、市販のｐＧＫ：：nｕｃＭＣＳ（ＡＴＣＣ）などを用いることができる。
【００２８】
このようなＡｈｐＣ遺伝子をベクター（ｐＧＫ::ｎｕｃＭＣＳ）に組み込んで、その遺伝子を発現させるには、定法に従ってプロモーターと共に組み入れる。
すなわち、ｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳベクターにＡｈｐＣ遺伝子とプロモーター配列を導入する。作製手順は、まずＮＨ０４株のＡｈｐＣ遺伝子配列とプロモーター配列をそれぞれ別々に増幅するためのプライマーセットを一組ずつ用意する。
【００２９】
因みに、プロモーター配列とＡｈｐＣ遺伝子が直接連結(プロモーター配列はＡｈｐＣ遺伝子の５’上流に連結)できるように、プロモーター配列増幅用リバースプライマーの末端に１０塩基程度、ＡｈｐＣ遺伝子と同じ配列を付加させる。また、プロモーター配列とＡｈｐＣ遺伝子を連結した後に、それらはｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳの例えばＸｈｏＩ、ＳａｌＩ部位間に挿入する場合は、プロモーター配列増幅用フォワードプライマーの末端及びリポーター配列増幅用リバースプライマーの末端にはそれぞれＸｈｏＩ、ＳａｌＩ制限酵素認識部位配列を付加させる。
なお、特に制限酵素切断部位、ＸｈｏＩ, ＳａｌＩに限ることなく、このプラスミドに含まれている制限酵素認識部位であればどれでも使用可能である。
【００３０】
以上のことに留意して、プロモーター配列とリポーター配列をそれぞれ別々にＰＣＲ増幅し、その後、それぞれのＰＣＲ増幅断片を混合し、プロモーター配列増幅用フォワードプライマーとリポーター配列増幅用リバースプライマーを用いて再度ＰＣＲを行ない、プロモーターとリポーター配列が連結した断片を得ることができる。
【００３１】
この断片は１％アガロースゲルにて電気泳動して規定のサイズのバンドを切り出し、抽出・精製すればよい。
そして、得られた精製断片及びｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳはそれぞれ制限酵素にて切断処理を行ない、精製する。
【００３２】
処理して得た組換えプラスミドは、大腸菌に導入し、培養し、増幅させた大腸菌からプラスミドの抽出により、大量の組換えプラスミドを得ることができる。
【００３３】
組換えプラスミドを乳酸菌に導入するには、定法に従って適切に行なえばよく、例えば公知文献のJ Dairy Sci. 74: 1454-1460, 1991に記載の周知技術に従って行なうことができる。
【実施例】
【００３４】
［過剰発現用プラスミドの構築］
配列番号１のＡｈｐＣ遺伝子を市販のベクター（ｐＧＫ::ｎｕｃＭＣＳ）にプロモーター配列とともに導入した。
先ず、ＮＨ０４株のＡｈｐＣ遺伝子配列とプロモーター配列をそれぞれ別々に増幅するためのプライマーセットを一組ずつ用意し、プロモーター配列増幅用フォワードプライマーの末端及びリポーター配列増幅用リバースプライマーの末端にはそれぞれＸｈｏＩ、ＳａｌＩ制限酵素認識部位配列を付加させた。
【００３５】
プロモーター配列とリポーター配列をそれぞれ別々にＰＣＲ増幅し、その後、それぞれのＰＣＲ増幅断片を混合し、プロモーター配列増幅用フォワードプライマーとリポーター配列増幅用リバースプライマーを用いて再度ＰＣＲを行ない、プロモーターとリポーター配列が連結した断片を得た。
【００３６】
この断片は１％アガロースゲルにて電気泳動して規定のサイズのバンドを切り出し、抽出・精製した。得られた精製断片及びｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳはそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩ、ＳａｌＩにて３７℃で切断処理を行なった。
【００３７】
ｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳにおいては、引き続きアルカリフォスファターゼ処理を行ない、処理した断片及びｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳはタンパク質を除去するためにフェノール・クロロホルム処理を行なった。その後、エタノール沈殿を行ない、精製した。
精製した断片及びｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳの規定の量を混合し、タカラ社製の「ＤＮＡ Ligation Kit  Ver. 2.1」にてライゲーション処理を行なった。
【００３８】
処理して得た組換えプラスミドは引き続き、ＴａＫａＲａ社製の「E.coli DH5α Competent Cells」を用いて、大腸菌に導入し、５００μｇ／ｍｌエリスロマイシン添加ＬＢプレートにて３７℃で培養し、組換えプラスミドが正しく導入された大腸菌を得た。
この大腸菌を釣菌し、５００μｇ／ｍｌエリスロマイシン添加ＬＢブロスにて３７℃にて振とう培養し、増幅させた大腸菌からプラスミドを抽出して、大量の組換えプラスミドを得た。
【００３９】
［組換えプラスミドのLeuconostoc属、Lactobacillus属乳酸菌への導入］
組換えプラスミドを導入するための乳酸菌は、文献J Dairy Sci. 74: 1454-1460, 1991に従って、５０ｍｌの１％グルコース添加ＧＡＭブイヨン(ニッスイ)に対象菌を接種し、ＯＤ６００＝０．６になるまで25℃にて振とう培養した。遠心集菌後、７５ｍｌの氷冷した滅菌水にて２回洗浄遠心し、５ｍｌの氷冷したＥＰＢ（１ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５Ｍスクロース)液にて懸濁し、使用時まで氷冷した。これを導入用菌体とした。
【００４０】
この調整した菌液40μlに対して、組換えプラスミド1μg/1〜4μlを混合して０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベットに入れ、５分氷冷した。その後、ジーンパルサー Ｘｃｅｌｌ ＰＣ システムを用いて４００Ω、２５μＦ、８ｋＶ／ｃｍにてエレクトロポレーションを行なった。その後すぐに全量が１ｍｌとなるように氷冷した１％グルコース添加ＧＡＭブイヨンを添加し、２５℃にて２時間、静置培養した。培養後、５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを加えた１％グルコース添加ＧＡＭプレートに塗抹し２５℃７２時間培養後、得られたコロニーを組換えプラスミドが導入された乳酸菌株とし、以下の低温増殖試験に供した。
【００４１】
［形質転換された乳酸菌の低温増殖試験］
Leuconostoc mesenteroides ＮＨ０４株、ＮＢＲＣ３８３２株、その他形質転換株を低温で培養する際の試験方法は、フリーズストック及びプレートに形成されたコロニーを１％グルコース添加ＧＡＭブイヨン(形質転換株の場合は５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを添加する)５ｍｌに５０μｌもしくは１コロニー接種し、２５℃にて２代継代培養後、バイオフォトレコーダー(バイオラッド社製)専用Ｌ字型試験管(培地は同じ)に菌体濃度がＯＤ６００＝０．０１となるように希釈接種し、１０℃、７０ｒｐｍにて培養し、菌体増加による濁度の上昇をモニタリングすることで計測し、その結果を図３に示した。
【００４２】
上記評価試験の結果、１０℃という低温条件で培養した際に、一定濃度まで増殖するのに要する時間が、ＮＢＲＣ３８３２株について短くなることが確認された。
【００４３】
［ＡｈｐＣ発現量の解析試験］
組換えプラスミドを導入したＮＢＲＣ３８３２株、及びコントロールとしてｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳを導入したＮＢＲＣ３８３２株について、上記と同様にバイオフォトレコーダーにて増菌し、集菌、洗浄、超音波破砕、可溶性タンパク質の回収、濃度測定を行い、１０μｇのタンパク質をＡｈｐＣ発現量の違いを確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＡＴＴＯ社製のｅＰＡＧＥＬ(１２．５％アクリルアミド濃度)を用いて１５ｍＡ、９０分実施した。染色及び検出は二次元電気泳動と同様に行ない、タンパク質の発現パターンを示す電気泳動図を図４に示した。
【００４４】
上記の方法で１０℃にて静止期まで増殖させた菌体を５ｍｌ遠心集菌し、１００ｍＭTris-HCl Buffer (ｐＨ  ７．０)にて２回洗浄後、再度このバッファーに懸濁して、菌体を超音波破砕した。
【００４５】
破砕後、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清の可溶性タンパク質画分を得た。このタンパク質溶液をブラッドフォード法にて濃度を測定し、１５０μｇのタンパク質を二次元電気泳動, Ready Strip IPG strips 17cm pH4-7 (BioRad)に用いた。一次元目の泳動はPROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)にて行い、２次元目はストリップサイズに見合うSDS-PAGEを行なった。泳動終了後、SYPRO Ruby (Invitrogen) にて染色し、Typhoon 9400 (GE Healthcare) にて検出した。
【００４６】
図３、４の結果からも明らかなように、形質転されたＮＢＲＣ３８３２株（図中には、ＮＢＲＣ３８３２＿ｐＧＫａｈｐＣと記す。）、及びコントロールとしてｐＧＫ：：ｎｕｃＭＣＳを導入したＮＢＲＣ３８３２株（図中には、ＮＢＲＣ３８３２＿ｐＧＫと記す。）のうち、形質転されたＮＢＲＣ３８３２株は、１０℃という低温条件で培養した際に、ＡｈｐＣタンパク質を発現させて増殖能力が向上した。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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