(57)【要約】【課題】炎症性腸疾患に対する医薬品や、炎症性腸疾患の病態解析に有用なツールを提供すること。【解決手段】ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有する医薬品は、炎症性腸疾患を治療または予防するために使用することができる。また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性腸疾患を誘発しにくいモデルマウスとして、炎症性腸疾患の病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、炎症性腸疾患を治療または予防するための医薬品。
【請求項２】
前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
前記ホスファチジルセリン結合性物質が、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＦＧ−Ｅ８変異体、Ｔ細胞免疫グロブリン、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項２に記載の医薬品。
【請求項４】
前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がＣＤ３００ａ結合性物質である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項５】
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１９で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項７】
前記ミエロイド系細胞が大腸粘膜固有層中のＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬品。
【請求項８】
炎症性腸疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性腸疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【請求項９】
炎症性腸疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患に関連する、ＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤を含有する医薬品、ならびにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスおよびＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主（人体または動物体内）に病原体（細菌、ウイルス、寄生虫等）が侵入したり、内因性の起炎物質が発生したりすると、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位にて細動脈が一時的に収縮した後、拡張・充血に至って、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位の血流が局所的に緩慢になるといった炎症反応が発生する。
【０００３】
すると、白血球が血管壁に膠着し、さらに各種免疫系細胞から放出されるケミカルメディエーターの作用により、アメーバ様運動により血管壁を通過して遊走する。ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、リンホカイン等が知られている。ヒスタミンやセロトニンを産生・放出するマスト細胞は、炎症反応において中心的な役割を果たしているリンパ球の一つである。また、マクロファージもマスト細胞と同様にＴＮＦ等のケミカルメディエーターを産生・放出する。
【０００４】
炎症反応によって、遊走させられた白血球が病原体等に誘引されると、病原体に抗原抗体反応を伴う体液性免疫や細胞障害性Ｔ細胞等が関与する細胞性免疫によって、病原体が体内から除去され（クリアランス）、感染拡大が防止される。このように、炎症反応およびそれに基づく免疫反応は、生体の恒常性を維持するためには極めて重要である。
【０００５】
一方で、炎症反応は、上述のような生体防御とともに、発赤、発熱、腫張、疼痛、機能障害といった不具合な徴候・症状を示してしまう。このような症状として、具体的には、アレルギー疾患、各種急性または慢性炎症が挙げられる。また、免疫学的寛容が適用されず、自己に対して免疫応等が生じてしまう自己免疫疾患が発生した場合も、炎症反応によって組織傷害が発生してしまう。
【０００６】
すなわち、炎症反応を伴う疾患を予防するには、炎症反応を惹起させる病原体を各種抗生物質（抗菌剤）によって死滅させることや、生体内の免疫機能を向上させる薬剤（免疫賦活剤）を投与して、炎症反応が過剰に亢進する前に、病原体を除去することが重要である。
【０００７】
一方、炎症反応を伴う疾患を改善・治療するには、たとえば、ケミカルメディエーターの放出を抑制するような、過剰に活性化した免疫機能を低下させる薬剤（抗炎症剤（免疫抑制剤））を投与して、炎症の鎮静化を図ることが知られている。
【０００８】
たとえば、特許文献１には、免疫活性剤として、抗原提示細胞として各種免疫系細胞の活性化を担う樹状細胞の機能賦活化剤が開示され、具体的には、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とすることを特徴とするものである。
【０００９】
特許文献２には、抗炎症剤（免疫抑制剤）として、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒоｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎ）ペプチドおよび薬理学的担体を含む薬剤が開示されている。
【００１０】
ところで、自然免疫系を担当するミエロイド系（骨髄系）細胞の細胞膜上には、ＭＡＩＲ（Myeloid Associated Ig like Receptors）と称されるレセプター分子群が発現していることが知られている（非特許文献１）。このうち、ＣＤ３００ａとしても知られている（その他「ＬＭＩＲ１」、「ＣＬＭ−８」と称されることもある）ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、肥満細胞、顆粒球（好中球）、樹状細胞に発現しており、細胞内領域のＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）配列を介して脱リン酸化酵素と会合し、抑制性シグナルを伝達する抑制性レセプターであることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、当該受容体のリガンドは不明であり、いわゆるオーファンレセプターとなっていた。
【００１１】
炎症性腸疾患の代表的な疾患である潰瘍性大腸炎（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、主として消化管に原因不明の炎症をおこす慢性疾患の総称であり、大腸に炎症が起こり潰瘍を形成する慢性疾患である。
【００１２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、病因が未知である２つの胃腸障害（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ））を記載するために使用される、集合的な用語である。
クローン病は、潰瘍性大腸炎に比べて病変部が広く、消化管のほぼ全域に炎症や潰瘍を生じる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、世界的に発生し、そして２００万人もの多くの人々に罹患したことが報告されており、ＩＢＤの経過および予後は、広範に変動する。
【００１３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、症状の良し悪しが変化しながら長期に渡って下痢、血便が続く。原因はまだ解明されておらず、有力な説としては、腸管免疫寛容の障害のために、食物や腸内細菌に対して免疫反応が起き、持続的な腸炎が起きると考えられている。
【００１４】
現在、根本的な治療法はなく、食事療法、下痢止め薬（抗コリン作用薬、ロペラミド又はジフェノキシレート等）又は抗炎症薬（アミノサルチル酸、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、プレドニゾロンなどのステロイド薬又はアミノサルチル酸等）、免疫抑制薬（アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン等）の使用などが行われている。
【００１５】
ＩＢＤ罹病者全体の１０％〜１５％が１０年間にわたり外科手術を必要とし、腸癌の発症の危険性も高い。
クローン病では、細菌が、疾患の開始および進行に関与しており、クローン病における腸炎症は、その頻繁な抗生物質に対する応答性および細菌糞便流に対する感受性で有名である。一般的な腸内微生物および新規の病原体が、直接的な検出によってか、または疾患に関連した抗微生物免疫応答によって、クローン病に関連付けられている。
【００１６】
さらに、慢性結腸炎の遺伝学的に感受性の多くのモデルにおいて、管腔微生物は、疾患に必須の補助因子であり、微生物のいない環境に閉じ込められた動物は、結腸炎を発症しない。
【００１７】
遺伝的因子、外因性の誘因、および内因性の微生物叢の組合せが、炎症性腸疾患において見られる腸粘膜への免疫媒介性損傷に寄与し得る。
免疫細胞の表面に存在する受容体タンパク質をコードするＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、塩素イオンおよび炭酸水素イオンのトランスポーターをコードするｓ８ＬＣ２６Ａ３、機能が未知の１３ｑ１２領域の遺伝子の３つの遺伝子領域で多型を持つ人が、潰瘍性大腸炎の発症と関連することも知られている（非特許文献３）。
【００１８】
しかし、クローン病における腸内微生物の役割についての多くの直接的証拠および間接的証拠にも関わらず、この疾患において見られる免疫調節不全に寄与する病原性生物および抗原は、同定されておらず、炎症性腸疾患（クローン病や炎症性腸炎）の病態解析に有用なツールや、治療等するための医薬品が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００７−２９７３７９号公報
【特許文献２】特開２０１１−５１６６０９号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Yotsumoto et al.. J Exp Med 198 (2), 223-233, 2003
【非特許文献２】Okoshi Y et al, Int Immunol., 17, 65-72, 2005.
【非特許文献３】Asano. K et al. Nature Genetics 41. 1325-1329(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、炎症性腸疾患に対する医薬品や、炎症性腸疾患の病態解析に有用なツールなどを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、ＣＤ３００ａのリガンドおよびＣＤ３００ａの機能を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示されるような知見を得た。
（ｉ）ＣＤ３００ａのリガンドは、ホスファチジルセリン（フォスファチジルセリン、ホスホファチジルセリン）（ＰＳ）である。
（ｉｉ）ＰＳがマスト細胞等のＣＤ３００ａへ結合すると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が亢進し、マスト細胞等の活性化も抑制される。
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質が共存することにより、マスト細胞等のＣＤ３００ａとＰＳとの結合が阻害されると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が抑制され、マスト細胞等の活性化も維持される。
（ｉｖ）上記の活性化の抑制または維持を通じて、炎症性腸疾患を治療できる。
（ｖ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、炎症性腸疾患の病態解析などを行うためのツールとなり得る。
【００２３】
これらの知見に基づいてなされた本発明により、たとえば、下記［１］〜［９］に示される各発明が提供される。
［１］  ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、炎症性腸疾患を治療または予防するための医薬品。
【００２４】
［２］  前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、［１］に記載の医薬品。
［３］  前記ホスファチジルセリン結合性物質が、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＦＧ−Ｅ８変異体、Ｔ細胞免疫グロブリン、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３からなる群から選択される少なくとも１種類である、［２］に記載の医薬品。
【００２５】
［４］  前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がＣＤ３００ａ結合性物質である、［１］に記載の医薬品。
［５］  前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１９で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の医薬品。
【００２６】
［６］  前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の医薬品。
【００２７】
［７］  前記ミエロイド系細胞が大腸粘膜固有層中のＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞である、［４］または［５］に記載の医薬品。
［８］  炎症性腸疾患ついて、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性腸疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【００２８】
［９］  炎症性腸疾患ついて、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性腸疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【００２９】
また、上記発明の別の側面として、次の発明が提供される。
上記［１］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制することを特徴とする、炎症性腸疾患を治療または予防する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。
【００３０】
上記［１］に係る発明のさらなる側面として、炎症性腸疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制する活性調節剤の使用が提供される。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナル伝達を阻害する活性調節剤を有効成分として含有する、炎症性腸疾患を治療または予防するための医薬品の製造が可能となる。また、本発明により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス等を、炎症性腸疾患の病態解明や治療等に有用なモデルマウス等として使用することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、参考例１Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、参考例１Ｃで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、参考例１Ｅで得られたイムノブロット分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、野生型アレル中のＣＤ３００a遺伝子の構造、ＣＤ３００a欠損マウスを作成するために使用したターゲティングベクター、および標的化アレルを示すための模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、野生型アレルおよび変異型アレルのＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、野生型マウスおよびＣＤ３００a欠損マウスを用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのフローサイトメトリ−分析結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、参考例２Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、参考例２Ｃで得られた光学顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、参考例２Ｃで得られたレーザー走査型共焦点顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、参考例２Ｃで得られた、胸腺細胞を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体における細胞数の比率を示す結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、参考例２Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、参考例２Ｂで得られたＲＴ−ＰＣＲの分析の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、参考例３Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、参考例２Ａで得られたβ―ヘキサミニダーゼアッセイの分析結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、参考例３Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、参考例３Ｃで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、参考例３Ｅで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、参考例３Ｆで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、参考例３Ｇで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、参考例３Ｇで得られた、ＴＮＦ−αの増加率を示す図である。
【図８】図８は、参考例３Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、参考例４Ｃで得られた抗気性細菌のＣＦＵの算出結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＤ３００ａ好中球の誘導後、参考例４Ｃで得られた好中球およびマクロファージの細胞数を示す図である。
【図１１】図１１は、参考例４Ｃで得られた、大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数の比率を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、参考例４Ｄで得られたフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、参考例４Ｄで得られた各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、参考例４Ｄで各マウスの腸内の細菌クリアランスを細菌のＣＦＵで示した図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、参考例４Ｅで得られたフローサイトメトリー分析の結果等を示す図である。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、参考例４ＦでＴＸ４１を投与した後の各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の腸内のクリアランスを示す図である。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の好中球の細胞数の変化を分析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＤＳＳ誘導の腸炎による各マウスの体重の経時変化を示す図である（実施例１Ａ）。
【図１４】図１４は、ＤＳＳ投与開始後６日目の各マウスの大腸の長さを示すグラフである（実施例１Ｂ）。
【図１４Ａ】図１４Ａは、図１４のＷＴマウスとＣＤ３００ａ-/-の大腸の切片を示す図である（実施例１Ｃ）。
【図１５】図１５は、ＤＳＳ投与６日目の各マウスの細胞障害の度合を臨床スコアで比較した図である（実施例１Ｄ）。
【図１６】図１６は、ＤＳＳ投与９日目の各マウスの大腸における各サイトカインの量を示した図である（実施例１Ｅ）。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＤＳＳ投与開始後、０日、２日、４日および６日の各マウスの各免疫細胞数を示す図である（実施例１Ｆ）。
【図１７】図１７は、ＣＤ３００ａを発現している樹状細胞を特定するために行ったフローサイトメトリーの結果を示す図である（実施例１Ｇ）。
【図１８】図１８は、各マウスの大腸におけるサイトカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である（実施例１Ｈ）。
【図１９】図１９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における各サイトカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である（実施例１Ｉ）
【図２０】図２０は、ＴＸ４１とＴＸ４９のＨ鎖とＬ鎖とをそれぞれ相同性解析を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明に係る活性調節剤、これを含有する医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体について、以下詳細に説明する。免疫機構およびＣＤ３００ａ等に関する従来の知見や公知の試験方法に言及する際に用いる文献を、実施例の末尾に列挙した。
【００３４】
［活性調節剤］
本発明における活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を、抑制するためのものと、亢進するためのものを包含する。
【００３５】
ここで、「ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞」には、マスト細胞（肥満細胞）、マクロファージ、好中球、樹状細胞などが含まれる。ＣＤ３００ａは、ヒト、マウス、その他の哺乳類に発現しているものを総称しており、生物種は特に限定されるものではない。
【００３６】
また、「抑制性シグナル伝達」とは、抑制性レセプターであるＣＤ３００ａが、細胞内領域のＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）配列を介して脱リン酸化酵素と会合することにより生じるシグナル伝達である。
【００３７】
＜第１の活性調節剤＞
本発明における第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を抑制する作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を阻害する物質、すなわちホスファチジルセリン結合性物質およびＣＤ３００ａ結合性物質を用いることができる。第１の活性調節剤は、これらの何れか一方を含んでいてもよいし、これら両方を含んでいてもよい。
【００３８】
（ホスファチジルセリン結合性物質）
第１の第１の活性調節剤の一つであるホスファチジルセリン結合性物質は、ＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合して、ホスファチジルセリンとミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００３９】
ホスファチジルセリン結合性物質の具体例としては、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ  Ｆａｔ  Ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＧＦ−８）、Ｔ細胞免疫グロブリンや、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３などの可溶型蛋白質が挙げられ、中でもＭＦＧ−Ｅ８が好ましい。
【００４０】
また、ホスファチジルセリン結合性蛋白質としては、ＭＦＧ−Ｅ８などのようなネイティブの蛋白質に限定されず、ホスファチジルセリンへの結合性を喪失しない限り、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するもの（変異体）であってもよい（たとえば、実施例における「Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８」等）。
【００４１】
これらの変異体は、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）やランダム突然変異法などの公知の方法によって作製される。
また、上記「可溶型蛋白質」とは、膜蛋白質など、後述するような希釈剤や体液に対して不溶性である、ネイティブの蛋白質において、公知の遺伝子組み換えの技術によって、疎水性ドメインを削除したり、親水性のペプチドを付加したりして、希釈剤や体液に対して可溶性になるように改変した蛋白質を指す。
【００４２】
（ＣＤ３００ａ結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるＣＤ３００ａ結合性物質は、ＣＤ３００ａに結合して、ミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００４３】
ＣＤ３００ａ結合性物質の具体例としては、ＣＤ３００ａに対する中和抗体が挙げられる。中和抗体は、特定の一種類のモノクローナル抗体であってもよいし、二種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせ（ないしポリクローナル抗体）であってもよい。また、中和抗体は、完全長の抗体であってもよいし、断片化された抗体（Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）2等）であってもよい。
【００４４】
中和抗体は、公知の手法によって作製することができる。モノクローナル抗体であれば、一般的には、ＣＤ３００ａを用いた免疫、ハイブリドーマの作製、スクリーニング、培養、回収といった手順で、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体を作製することができる。それらの中から、好ましいＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合阻害能（中和作用）を有し、本発明の作用効果を奏する適切なモノクローナル抗体を選択すればよい。
【００４５】
（ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体）
ＴＸ４１は抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）であり、ＴＸ４９は抗ヒトＣＤ３００ａモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１）である。どちらも後記実施例において作成、使用されたモノクローナル抗体であり、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を阻害してシグナル伝達を抑制する機能に優れているため、本発明におけるＣＤ３００ａ結合性物質として好ましい。ただし、本発明に用いることのできる抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する（同等のアミノ酸配列からなる可変領域を有する）抗体に限定されるものではない。
【００４６】
ＴＸ４１のＨ鎖の可変領域は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４１のＬ鎖の可変領域は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＨ鎖の可変領域は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＬ鎖の可変領域は配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する。なお、これらの可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域が含まれる。ＴＸ４１およびＴＸ４９の可変領域（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれ）のアミノ酸配列同士の相同性を解析した結果を図２０に示す。
【００４７】
マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４１に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域が配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００４８】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４９に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域として配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００４９】
また、マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１７で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号１８で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００５０】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１９で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号２０で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００５１】
このような変異を生じさせる部位は、可変領域のうちＣＤＲまたはその近傍の部位を避けることが好ましい。また、アミノ酸を置換する場合は、側鎖の構造および／または化学的な性質が類似するアミノ酸同士の間で行われる、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【００５２】
抗ＣＤ３００ａ抗体の定常領域、すなわちＦａｂ領域のうちの上記のような可変領域以外の領域およびＦｃ領域の形態（アミノ酸配列、アミノ酸長）は、ＣＤ３００ａへの結合性、すなわち中和作用にほとんど影響しないため、本発明の作用効果を阻害しない範囲で適宜設計することができる。
【００５３】
すなわち、上記所定の可変領域のアミノ酸配列と、公知の各種の定常領域のアミノ酸配列からなる融合タンパク質として抗ＣＤ３００ａ抗体を作製することができる。
たとえば、ヒトの定常領域を利用することにより、ヒトキメラ抗体として抗ヒトＣＤ３００ａ抗体を作製することは、好ましい実施形態の一つである。このような抗ＣＤ３００ａ抗体は、公知の手法により作製することが可能である。
【００５４】
たとえば、上記所定の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびその他の必要なＤＮＡ（転写因子等）と連結することにより、抗ＣＤ３００ａ抗体遺伝子の発現ベクターを構築することができる。このベクターを宿主細胞に導入して発現させるようにすれば、目的とする抗ＣＤ３００ａ抗体を産生することができる。
【００５５】
なお、上述したようなＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体は、本発明の作用効果に係る、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合により生じる抑制性シグナル伝達を阻害する目的以外にも使用できる可能性がある。
【００５６】
（ＣＤ３００ａ  ｓｉＲＮＡ）
また、ＣＤ３００ａの遺伝子配列（ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ/ＧｅｎＢａｎｋ＝ＩＮＳＤ等のＤＮＡデータベースから入手可能）を元に設計されたｓｉＲＮＡにより、罹患部位におけるミエロイド系細胞におけるＣＤ３００ａの発現を抑制することで、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させた状態またはＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害した状態と同様に、上記の各種疾患に対する治療効果を得ることができる。換言すれば、ＣＤ３００ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡも、本発明におけるＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の一種といえる。
【００５７】
（第１の活性調節剤の用途）
本発明における第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養されたものであってもよい。
【００５８】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを維持または向上させることで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も維持または向上され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第１の活性調節剤は、後述する所定の医薬品の有効成分として使用することができる。また、例えば、実験動物の炎症性腸疾患の病態を改善させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。
【００５９】
なお、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させる（すなわちＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を完全に生じさせない）ことで症状が緩和されることが確認される炎症性腸疾患に対しては、ＣＤ３００ａ結合性物質（ＴＸ４１、ＴＸ４９等の中和抗体）や、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）が治療薬となりうることは、当業者にとって十分に推認可能である。
【００６０】
＜第２の活性調節剤＞
第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を亢進する（つまり、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制する）作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質、特にＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリンを用いることができる。
【００６１】
また、本発明の別の側面により提供されるＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを用いたスクリーニングにより、ホスファチジルセリンと同様の作用を有する、ＣＤ３００ａに対するアゴニスト（低分子化合物、抗体等）を発見できる可能性があり、それらもホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質として用いることができる。
【００６２】
本発明では、第２の活性調節剤を、炎症性腸疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとして使用することができる。
【００６３】
（ホスファチジルセリン）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、ミエロイド系細胞に発現しているＣＤ３００ａのリガンドであり、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用（結合）によって、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナリングが亢進する。たとえば、マスト細胞においては、この抑制性シグナリングを介して、ヒスタミンや、サイトカイン、ケモカインなどのケミカルメディエーターを放出するという、炎症反応に関連するマスト細胞の活性が抑制される。ＰＳは工業的に生産されており、容易に入手することができる。
【００６４】
なお、生体外にある（試験的な環境における）ＣＤ３００ａ発現細胞に対しては、ＰＳを提示した状態にあるアポトーシス細胞（ＰＳは、通常の細胞においては細胞の内側（脂質二重層のうち細胞質側の層）に存在するが、アポトーシスが起こると細胞の外側に提示されることが知られている）も第２の活性調節剤となり得る。また、外側にＰＳを含む脂質膜が形成されているリポソーム等も、第２の活性調節剤として用いることができる可能性がある。
【００６５】
（カルシウム塩）
ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用は、カルシウムイオンを必要とすることから、第２の活性調節剤は、電離によってカルシウムイオンを発生するカルシウム塩（たとえば、塩化カルシウム等）を含有することが好ましい。
【００６６】
第２の活性調節剤中のカルシウム塩の含有量は、投与部位におけるカルシウムイオンの濃度や、第２の活性調節剤に含まれるＰＳの量等を考慮して、適宜決定することができる。
【００６７】
（第２の活性調節剤の用途）
本発明に係る第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養により生産したものであってもよい。
【００６８】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制することで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も抑制され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第２の活性調節剤は、例えば、実験動物の炎症性腸疾患を増悪させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分や、免疫抑制剤として使用することができる。
【００６９】
［医薬品］
本発明に係る医薬品（医薬組成物）は、上述したような活性調節剤を有効成分として含有し、必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤（たとえば担体）をさらに含有していてもよい。
【００７０】
このような医薬品は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または症状（特に炎症反応）を、治療または予防するためのものとして製剤することができる。
【００７１】
より具体的には、前記第１の活性調節剤を有効成分として配合することにより、炎症性腸疾患を治療または予防するための医薬品などを調製することができる。
医薬品の投与部位は、適用対象とする疾病または病状に応じて、過剰な免疫機能（炎症反応）が生じている部位とすることができ、特に限定されるものではない。たとえば、腹腔内、気管内、皮下、皮内、泌尿生殖器内などの部位が挙げられる。
【００７２】
ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞は、通常、哺乳類の粘膜下組織や結合組織に存在するため、医薬品は、上記の部位の粘膜下組織や結合組織またはその付近に直接的に投与されることが好ましい。そのような投与は、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射等の注射投与によって行うことができる。たとえば、炎症性感染症（細菌性腹膜炎など）を治療または予防する場合は、腹腔内注射が好ましい。
【００７３】
医薬品（ないしそこに含まれる有効成分）の１回あたりの投与量および投与回数は、患者の年齢、性別、体重及び症状、必要とされる治療効果の程度、投与方法、処理時間、有効成分の種類などにより異なり、適宜調整されてもよい。投与回数は、たとえば、１日あたり１回〜数回である。
【００７４】
医薬品が第１の活性調節剤のうちホスファチジルセリン結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ホスファチジルセリン結合性物質の１回あたりの投与量が通常３〜１５ｍｇ、好ましくは５〜１０ｍｇになるよう製剤化してもよい。
【００７５】
医薬品が第１の活性調節剤のうちＣＤ３００ａ結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ＣＤ３００ａ結合性物質の１回あたりの投与量が通常５０〜１５０ｍｇ、好ましくは５０〜１００ｍｇになるよう製剤化してもよい。
【００７６】
（薬学的に許容され得る担体）
本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
【００７７】
薬学的に許容され得る担体とは、医薬品の目的に反しないものである限り特に限定されず、たとえば、水性希釈剤や非水性希釈剤等の希釈剤、抗酸化剤（亜硫酸塩など）等の安定剤・保存剤、リン酸塩類等の緩衝剤、界面活性剤等の乳化剤、着色剤、粘稠剤、リドカインなどの局所麻酔剤、グリコール類などの溶解補助剤、塩化ナトリウムやグリセリン等の等張化剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
【００７８】
たとえば、本発明に係る医薬品の剤形が注射剤である場合、所望の粘度や含有成分の濃度になるように希釈剤を配合することにより、有効成分を希釈剤に溶解または分散させることが好ましい。
【００７９】
このような希釈剤としては、生理食塩水または市販の注射用蒸留水等の水性希釈剤、ポリエチレングリコール、エタノール等のアルコール類等の非水性希釈剤が挙げられる。
剤形が注射剤である医薬品は、常法に従って、フィルターによる濾過滅菌されてもよいし、殺菌剤の配合等により無菌化されてもよい。
【００８０】
また、本発明に係る医薬品を注射剤として投与する場合、用時調製の形態としてもよい。たとえば、凍結乾燥法などによって第１の活性調節剤を含む固体剤を調製し、使用前に希釈剤に溶解または分散させて注射剤を調製してから投与することができる。
【００８１】
＜炎症性感染症に関する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞（マスト細胞）に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、マスト細胞の活性を維持または向上させることができる。それにより、好中球の細胞数を増加させて、病原体（細菌、寄生虫など）への好中球による攻撃を活発化し、病原体の増殖抑制機能、病原体のクリアランス機能を向上させることができる。したがって、第１の活性調節剤（ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質）を有効成分として使用することにより、炎症性感染症に対する医薬品が得られる。
【００８２】
＜炎症性腸疾患に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞（大腸粘膜固有層中のＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞）に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、炎症性Ｔ細胞の増殖誘導を抑制することが知られている、ＣＤ４＋細胞等によるＩＬ−１０の産生量が増加し、炎症性Ｔ細胞の活性化を抑制して腸管免疫系の恒常性を維持することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、炎症性腸疾患に対する医薬品が得られる。
【００８３】
[ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用]
＜炎症性腸疾患に関する用途＞
本発明により得られた知見により、ＣＤ３００ａ欠損マウスに対して、炎症誘導物質（ＤＳＳ等）を投与する等して公知の方法により炎症性腸疾患を誘導させた場合、野生のマウスよりも炎症性腸疾患の症状が改善されている。
【００８４】
すなわち、前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性疾患を誘発しにくいモデルマウスとして利用でき、さらには上記病因遺伝子との関連等で、炎症性腸疾患の病態解析等に使用することができる。
【００８５】
（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの作製方法）
本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、染色体上のＣＤ３００ａ遺伝子が不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子に置換されたことにより、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損したマウスである。
【００８６】
「不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子」とは、ＣＤ３００ａ遺伝子の一部の欠損、ＣＤ３００ａ遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、ＣＤ３００ａ遺伝子内の点突然変異、ＣＤ３００ａ遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常なＣＤ３００ａタンパク質を発現できない遺伝子をいう。欠損型ＣＤ３００ａ遺伝子としては、たとえば、ＣＤ３００ａ遺伝子に含まれるエクソン1〜6の少なくとも一つが欠損した遺伝子などが挙げられるが、これには限定されない。
【００８７】
「ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損した」とは、本発明が関与する抑制性シグナル伝達に係るＣＤ３００ａタンパク質の機能の少なくとも一部が失われたことをいい（たとえば、ヘテロノックアウトマウスのように片方のアレルのみ不活性型に置換されて、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が一部失われたような場合が含まれる。）、好ましくは当該機能が完全に失われたことを意味する。
【００８８】
遺伝子カセットを用いてＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを得るための一般的な方法は次の通りである。ただし、本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはこの方法により得られるものに限定されない。
【００８９】
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソンを抗生物質耐性遺伝子（マーカー遺伝子）カセットで置き換えた標的化アレル（変異型アレル）を有するターゲティングベクターを調製する。常法に従い、当該ターゲティングベクターとＥＳ細胞を用いてキメラマウスを得る。当該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得る。
【００９０】
孫マウスからゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の野生型アレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認し、変異型アレルのみを有する孫マウス（ホモ接合体（−／−））を得る。さらにＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、当該マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析で確認し、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとする。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例に則して、本発明をより具体的に説明するが、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。
１．調製例
（１）ＣＤ３００ａ−Ｆｃ融合タンパク質、ＭＦＧ−Ｅ８およびＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の調製
（１−１）  ヒトＩｇＧのＦｃ部位を有するＣＤ３００ａの融合タンパク質（ＣＤ３００ａ−Ｆｃ）を、下記文献２５に記載されているように、マウスまたはヒトＣＤ３００ａの細胞外ドメイン全体をコードする遺伝子のｃＤＮＡとヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする遺伝子のｃＤＮＡとを含むキメラｃＤＮＡから調製した。なお、上記融合タンパク質において、ＣＤ３００ａの細胞外ドメインが、マウス由来のものおよびヒト由来のものを、それぞれ「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」および「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」と称する。
【００９２】
（１−２）  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ氏（ＲＣＡＩ、日本国横浜市）から提供されたものである。
（１−３）  Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、下記文献４に記載されているように、ＭＦＧ−Ｅ８のＲＧＤモチーフに部位特異的突然変異を導入して得られたＭＦＧ−Ｅ８の変異体である。
【００９３】
得られたＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ末端から８９番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグルタミン酸に置換されている。また、ＭＦＧ−Ｅ８（ネイティブ）は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合して、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞とを架橋する（下記文献４）のに対して、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するものの、αｖβ３インテグリンに結合しない。
【００９４】
（２）マウスおよび盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）
本実施例で使用されたノックアウトマウスは、以下のように作製あるいは提供されたものである。
【００９５】
（ｉ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウス
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソン１〜６を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＧＢ２−ｎｅｏ）で置き換え、標的化アレル（変異型アレル）を調製した（図３Ａ）。次いで、常法に従い、キメラマウスを得、さらに該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得た。
【００９６】
孫マウスの中から、ＣＤ３００ａ欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウスを選別するために、各孫マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の、ＷＴアレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認した。
【００９７】
なお、図３Ｂに示されるように、ＷＴアレルを示すＰＣＲ産物、変異型アレルを示すＰＣＲ産物は、それぞれ、約５４０ｂｐ、約７００ｂｐのバンドとして検出される。
さらにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、ＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。図３Ｃに示されるように、野生型マウスでは、約５０ｋＤａにＣＤ３００ａに由来するバンドが示される一方で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、このバンドは検出されなかった。
【００９８】
（ｉｉ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス（以下、「ｋｉｔW-sh/W-shマウス」または「マスト細胞欠損マウス」）は、理研バイオリソースセンター（日本国つくば市）から提供されたものである。なお、該マウスは、マスト細胞を欠損したマウスであること（下記文献２１）および、アポトーシス性のＤＮＡ断片化を経ずに、貪食細胞によってＤＮＡが取り込まれた後に、貪食細胞内でＤＮＡの分解が生じることが知られている（下記文献１２）。
【００９９】
（ｉｉｉ）ＣＡＤ欠損マウス
ＣＡＤ（カスパーゼ活性型ＤＮＡ分解酵素（Ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ））欠損マウスは、下記文献１２に記載されたものである。
【０１００】
（ｖ）マクロファージおよび好中球のｉｎ  ｖｉｖｏ除去
下記文献３０の記載に基づき、クロドン酸リポソームおよびコントロール用ＰＢＳリポソーム（Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を調製した。次いで、ＣＬＰ後２４時間目に、これらのリポソーム０．５ｍＬをマウス腹腔内に注入して、マクロファージを除去した。
【０１０１】
また、ＣＬＰ後２４時間目に、抗Ｇｒ−１抗体を、マウス腹腔内に注入して、好中球を除去した。
なお、本実施例におけるマウスを用いた調製および評価試験の実施は何れも、筑波大学生命科学動物資源センター動物倫理員会作製のガイドラインを遵守したものである。
【０１０２】
（３）各種抗体
各種抗体の購入先および調製方法を下記表１に示す。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
（４）各種細胞の調製
各種細胞は、以下のように調製されたものである。
（ｉ）骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）
マウス骨髄細胞２×１０8個を、１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で５週間以上培養して骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。調製されたＢＭＭＣのうち、９５％超は、フローサイトメトリー分析によって、ｃ−Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩ+細胞であることが示された。
【０１０５】
（ｉｉ）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）
マウス骨髄細胞２×１０6細胞を、１０ｃｍｍディッシュにて、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で１週間培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を調製した。
【０１０６】
（ｉｉｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体
常法に基づいて、Ｆｌａｇタグ付きＣＤ３００ａのｃＤＮＡまたはＦｌａｇタグ付きＣＤ３００ｄのｃＤＮＡを含むｐＭＸ−ｎｅｏレトロウイルスベクタープラスミドを調製した。
【０１０７】
調製されたプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入（トランスフェクト）して、ＣＤ３００ａまたはＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体を得た。得られた、ＣＤ３００ａを安定発現する形質転換体およびＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体をそれぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）」および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ｄ）」と称する。
【０１０８】
また、ＴＩＭ−４を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体は、Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ氏（東京大学）から提供されたものである。なお、この形質転換体を、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」と称する。
【０１０９】
［評価方法］
以下に、評価方法の条件を記載する。なお、生存試験においては、カプラン・マイヤーログランク検定（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を用い、その他の評価試験においては、アンペアード・スチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて統計学分析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的有意差とみなした。
【０１１０】
（５）結合アッセイ等
（ｉ）結合アッセイ
細胞を、２％ＦＢＳを含むリン酸緩衝液中、１ｍＭＣａＣｌ2の存在下または非存在下でＣＤ３００ａまたはコントロール用ヒトＩｇＧを用いて３０分間染色し、同一の緩衝液で２回洗浄して、ＦＩＴＣ結合型のヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ'）2フラグメントとともにインキュベートした。次いで、アネキシンＶで染色するために、細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．５ｍＭＣａＣｌ2を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中で、アネキシンＶとともに１５分室温でインキュベートした。
【０１１１】
（ｉｉ）結合阻止アッセイ
細胞を、マウスＣＤ３００ａに対するモノクローナル抗体（ＴＸ４１）、コントロール用アイソタイプの抗体またはＭＦＧ−Ｅ８とともに、３０分間プレインキュベートした後、上記結合アッセイのように、ＣＤ３００ａ−Ｆｃで染色した。また、ＣＤ３００ａ−Ｆｃがリン脂質へ結合したか否かを分析するために、ＰＩＰストリップアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を製造元の取扱説明書に準拠して実施した。
【０１１２】
（６）好気性細菌のＣＦＵ（コロニー形成単位）の測定
マウスの腹膜灌流液の段階希釈液をプレーティングして、該希釈液をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して算出した。
【０１１３】
［参考例１：ＣＤ３００ａのリガンドの同定］
［参考例１Ａ］
各種造血幹細胞系列細胞株または腫瘍細胞系列細胞株におけるマウスＣＤ３００ａリガンドの発現を確認するために、以下のような試験を行った。
【０１１４】
「１．調製例」において得られた、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）またはＩＬ−３依存性造血細胞株（ＢａＦ／３細胞）（各細胞数２Ｘ１０5個）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１１５】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した。
また、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃの代わりにコントロール用ヒトＩｇＧ（１μｇ）を用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、対照試験も実施した。
【０１１６】
ＢＭＭφ、ＢＭＤＣおよびＢａＦ／３細胞を用いた場合のフローサイトメトリーの分析結果を、それぞれ図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す（なお、対照試験は、「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」に示す。）。
【０１１７】
図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、塩化カルシウムを含む場合、ＰＩ-細胞（生細胞）に結合する一方、ＰＩ+細胞（死細胞）には結合しないことが分かった。つまり、マウスＣＤ３００ａリガンドは、死細胞において発現していることが示唆される。
【０１１８】
［参考例１Ｂ］
マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃが、死細胞の一種であるアポトーシス細胞に結合するか否かを検証するために、以下のような試験を行った。
【０１１９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型マウス）由来の胸腺細胞に、ＲＰＭＩメディウム中でデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）（１０μＭ）とともにインキュベートして、胸腺細胞のアポトーシス細胞を調製した。
【０１２０】
得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１２１】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いて分析した（結果：図２Ａ）。
また、塩化カルシウムを含むメディウムの代わりに塩化カルシウムを含まないメディウムを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いた分析に供した（結果：図２Ｂ）。
【０１２２】
図２Ａによると、塩化カルシウムの存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アネキシンＶで染色されない（アネキシンＶ-）胸腺細胞に結合しないのに対して、アネキシンＶで染色される胸腺細胞に結合することが分かる。すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞に結合することが示される。
【０１２３】
一方で、図２Ｂに示されるように、塩化カルシウムの非存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞へ結合しないことが分かる。
本試験結果から、マウスＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的に、アポトーシス細胞に結合することが理解できる。
【０１２４】
［参考例１Ｃ］
参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）、コントロール用ヒトＩｇＧ１（１μｇ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１２５】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図２Ｃ「ＨｕＩｇＧ１」）。
【０１２６】
また、コントロール用ヒトＩｇＧ１の代わりに、モノクローナル抗体である「ＴＸ４１」またはマクロファージに発現する蛋白質「ＭＦＧ−Ｅ８」を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｃ「ＴＸ４１」および「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
【０１２７】
ここで使用された「ＴＸ４１」は、上述したように、抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体であり、マウスＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
また、「ＭＦＧ−Ｅ８」は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合し、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）とを架橋することが知られている（下記文献４）。
【０１２８】
図２Ｃの各フローサイトメトリーの結果を対比すると分かるように、ＴＸ４１またはＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、マウスＣＤ３００ａは、アポトーシス細胞へ結合しないことが理解できる。
この点を鑑みると、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、ＰＳに対する結合性を有すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が示唆される。
【０１２９】
［参考例１Ｄ］
ヒトＣＤ３００ａも、マウスＣＤ３００ａと同様に、アポトーシス細胞に結合するのか否かを検証すべく、以下の試験を行った。
【０１３０】
まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞系列）を、ＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁させ、該メディウムに紫外線を６０分間照射して、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス細胞を調製した。
【０１３１】
アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用いたこと以外は、参考例１Ａの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｄ）。
【０１３２】
また、アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用い、さらに、「ＴＸ４１」の代わりに「ＴＸ４９」または「コントロール用ヒトＩｇＧ１」を用いたこと以外は、参考例１Ｂの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｅ「ＴＸ４９」または「ＨｕＩｇＧ１」）。なお、「ＴＸ４９」とは、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体（モノクローナル抗体）であり、ＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
【０１３３】
図２Ｄ〜図２Ｅに示されるように、ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃも、アネキシンＶ+細胞に結合する一方で、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体の存在下では結合しないことが分かる。
すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃと同様に、ヒトＣＤ３００ａもアポトーシス細胞に結合することが示唆される。
【０１３４】
［参考例１Ｅ］
メンブレン（ＰＩＰ−ｓｔｒｉｐ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に、各種リン脂質（ＰＳ、ＰＣ、ＰＥ）（１００  ｐｍｏｌ）を含む液（試料液）をスポットして、該メンブレン上に各種リン脂質を吸着させた。
【０１３５】
次いで、該メンブレンを、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍＬ）を含む塩化カルシウム（１ｍＭ）及びＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ  ８．０）中に２０℃で２時間浸漬した。
【０１３６】
浸漬後、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃを含まないＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）で、３回洗浄して、メンブレン上の各リン脂質に未結合のＣＤ３００ａ−Ｆｃを除去した後、ＨＲＰ結合型抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎ社製）を含むＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて検出した（結果：図２Ｆ）
【０１３７】
図２Ｆ中、「ＰＥ」、「ＰＣ」および「ＰＳ」は、それぞれホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルセリンがメンブレン上にスポットされた部分を指し、「Ｂｌａｎｋ」は、何れのリン脂質もメンブレン上にスポットされていない部分を指す。
【０１３８】
図２Ｆによれば、ＣＤ３００ａは、ＰＥおよびＰＣの何れにも結合しない一方、ＰＳに特異的に結合したことを示している。
参考例１Ａ〜１Ｅの結果から、ＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が理解できる。
【０１３９】
［参考例２：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
一部のＰＳ結合性受容体は、貪食細胞において発現し、生理学的および病理的状況下で、アポトーシス細胞の除去に関与することが知られている（下記文献４〜９）。
【０１４０】
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａを発現する細胞である貪食細胞（マクロファージ等）において、いわゆる「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを介在することが知られている（下記文献１０〜１１）。この点を鑑みて、下記参考例２Ａ〜Ｃに記載の試験を行って、ＣＤ３００ａが、アポトーシス細胞の貪食作用に関与するか否かを検証した。
【０１４１】
［参考例２Ａ］
ＣＡＤ欠損マウスに由来する胸腺細胞を、参考例１Ｂと同様にして、アポトーシス胸腺細胞を調製した。
【０１４２】
次いで、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ（チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）（２×１０5細胞）を、８穴Ｌａｂ−ＴｅＫＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）内で、ＣＡＤ欠損マウスに由来するアポトーシス胸腺細胞とともに、１：５（マクロファージ：アポトーシス胸腺細胞（細胞数））の比率で、３７℃、１時間共培養した。
【０１４３】
次いで、下記文献５または２６に記載されているように、共培養したマクロファージを冷ＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒド（１％）を含む固定液で固定した後、ＦＩＴＣ標識化ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む緩衝液を用いたＴＵＮＥＬ染色に供した。
【０１４４】
染色された５０細胞数以上のマクロファージをランダムにレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社製、「ＦＶ１０ｉ」、型番：１Ｂ２２３５８）で分析し、マクロファージ１細胞に含まれるＴＵＮＥＬポジティブ細胞（アポトーシス細胞）の数を計測した。全マクロファージの個数を１００％として、０〜８個の各アポトーシス細胞を含むマクロファージの比率（貪食率）を算出した（結果：図４Ａ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
【０１４５】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージの代わりに、野生型マウス由来のマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食率を計測した（結果：図４Ａ「ＷＴ」）。
【０１４６】
図４Ａに示されるように、マクロファージがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに由来する場合であっても、野生型マウスに由来する場合であっても、貪食率には明確な差異は見られなかった。
【０１４７】
［参考例２Ｂ］
マスト細胞は、公知のＰＳ受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリン２、インテグリンαｖβ３）を発現するか否かを検証するために、以下の試験を行った。
【０１４８】
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）（細胞数２Ｘ１０5個）と、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合型抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＡＰＣ結合型抗ＴＩＭ−４モノクローナル抗体（０．１μｇ）およびＡｌｅｘａ結合型抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（０．５μｇ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートした。
【０１４９】
次いで、ＰＢＳを用いて、２回洗浄した後、染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図５Ａ「ＢＭＭＣｓ」）。
【０１５０】
また、ＢＭＭＣのかわりに、腹腔マクロファージおよびＢＭ由来マクロファージを用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、フローサイトメトリー分析も実施した（結果：図５Ａ「Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」および「ＢＭ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」）。
【０１５１】
さらに、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、腹腔マクロファージおよびＢＭＭＣからｃＤＮＡを調製し、調製された各ｃＤＮＡを用いて、スタビリン２、ＢＡｌ−１、αｖインテグリン、Ｃｄ３００ａおよびβアクチン（ローディングコントロール））の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（結果：図５Ｂ）。
図５Ａおよび図５Ｂを参照すると、マクロファージの場合とは異なって、マスト細胞は、ＣＤ３００ａおよびαｖβ３インテグリンを発現するものの、貪食作用に関与するＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４およびスタビリン２を低いレベルでしか発現していないことが分かる。
【０１５２】
［参考例２Ｃ］
ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）（細胞数６Ｘ１０4）を、ＦＩＴＣで標識化した細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））とともに、２時間共培養し、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製、ＢＺ−９０００）で分析した（結果：図４Ｂ）。
【０１５３】
また、共培養および洗浄後の細胞を、パラフォルムアルデヒドを含む固定液Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で固定して、レーザー走査型共焦点顕微鏡によって分析した（結果：図４Ｃ）。なお、図４Ｃにおいて、緑色部分（矢印で示す。）は、包摂された細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））を示す。
【０１５４】
また、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）の代わりに、ＮＩＨ３Ｔ３未形質転換細胞（ネガティブコントロール）または「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」（ポジティブコントロール）を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて分析した。
【０１５５】
図４Ｂおよび図４Ｃにおける「ＮＩＨ−３Ｔ３」および「ＮＩＨ−３Ｔ３／Ｔｉｍ４」は、それぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３」（未形質転換細胞）および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」を用いた光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージを示す。
【０１５６】
また、レーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージから、アポトーシス胸腺細胞を細胞質内に取り込んだ、未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」）。
【０１５７】
また、同様にして、胸腺細胞（生細胞）を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「Ｌｉｖｅ」）。
【０１５８】
図４Ｂに示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３とは異なって、上記の形質変換体は、両方ともアポトーシス胸腺細胞に付着した。しかしながら、図４Ｃおよび図４Ｄから判断すると、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）のみがアポトーシス胸腺細胞を取り込み、貪食作用を発揮したことがわかる。
【０１５９】
また、データを示さないが、ＮＩＨ３Ｔ３と同様に、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）は、生細胞（胸腺細胞）を貪食しないことが観察された。
参考例２Ａ〜Ｃの結果から、ＣＤ３００ａは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用に関与しないことが理解できる。
【０１６０】
［参考例３：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
図５に示すように、マスト細胞は、ＣＤ３００ａを発現するものの、マクロファージとは異なって、ＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリンを発現しない。
【０１６１】
これらのＰＳ受容体には、ＰＳが直接的にまたは間接的に結合することが知られており、アポトーシス細胞の取り込みに寄与することが知られている（下記文献１３）。そこで、ＣＤ３００ａもこのような機能を有しているのか否か（アポトーシス細胞を取り込む機能的重複があるのか否か）を検証すべく、下記参考例３Ａ〜Ｃに示す試験を行った。
【０１６２】
［参考例３Ａ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄細胞（ＢＭ細胞）２×１０8個を１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で４週間培養して、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄由来のマスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。なお、ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。
【０１６３】
次いで、得られたＢＭＭＣを、ＦＩＴＣ結合型抗ＦｃεＲＩα抗体（０．１μｇ）およびＰＥ結合型抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４９メディウム中で、４℃、３０分インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＣＤ３００-/-」）。
【０１６４】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の骨髄細胞の代わりに野生型マウス由来の骨髄細胞を用いて、ＢＭＭＣを調製したこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＷＴ」）なお、図６Ａの数字は、ボックス中の細胞の比率を指し、各試験は独立して３回行った。
【０１６５】
また、各ＢＭＭＣを用いてβ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ（脱顆粒アッセイ）を以下のように実施した（詳細な条件は下記文献２９に記載されている）。
まず、対数増殖期における各ＢＭＭＣ１×１０5細胞〜２×１０5細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートされた２４穴プレート中で３７℃、一昼夜培養し、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含み、サプリメントを含まないメディウム中において、３７℃、１時間インキュベートした。
【０１６６】
次いで、上記メディウム中にストレプトアビジンを添加して、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ同士をクロスリンクさせて、３７℃、４５分間培養した後、上清を採取した。
【０１６７】
採取された上清に、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミド（Ｓｉｇｍａ社製）およびクエン酸（０．４Ｍ）およびリン酸ナトリウム（０．２Ｍ）を含む緩衝液（ｐＨ４．５）を加え、３７℃、３時間インキュベートして、放出されたβ−ヘキソサミニダーゼによってｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドを加水分解反応させ、該反応を、０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．７）を添加して、停止した後、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドの加水分解によって生じる波長４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼの放出量を定量した。さらに、上記処理をしていない各ＢＭＭＣに対する、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率（％）を図６Ｂに示した。
【０１６８】
図６Ｂは、β−ヘキソサミニダーゼを放出したＢＭＭＣの比率を示す。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、ＦｃεＲＩαやｃ−Ｋｉｔの発現（マスト細胞のマーカー蛋白質）や、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率には、有意な差異は見られなかった。
すなわち、骨髄細胞からの分化やＦｃｅＲＩ介在性の脱顆粒化には、ＣＤ３００ａは影響を与えるものではないことが分かる。
【０１６９】
［参考例３Ｂ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｌ）、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）およびＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ）を含むＰＢＳ中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
【０１７０】
染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図７Ａ「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
【０１７１】
また、ＭＦＧ−Ｅ８の代わりにコントロール用ＩｇＧを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図７Ａ「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」）。
【０１７２】
図７Ａに示される結果から、コントロール用ＩｇＧの存在下では、ＣＤ３００ａ−Ｆｃはアポトーシス細胞（アネキシンＶ+）に結合するのに対して、ＭＦＧ−Ｅ８（ＰＳ結合性物質）の存在下では、この結合が特異的に阻害されていることが分かる。
【０１７３】
なお、この混合試料の上清において、サイトカインおよびケモカインの濃度は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインやケモカインの定量を試みたところ、サイトカインやケモカインは検出されなかった。
【０１７４】
［参考例３Ｃ］
ＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞が共存する場合、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）の刺激によって、各種サイトカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
【０１７５】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、メディウムの上清を採取した。
【０１７６】
次いで、サイトカインおよびケモカインの濃度を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いて３回測定し、上記のＬＰＳ処理が実施されていないＢＭＭＣの各サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率を算出した（結果：図７Ｂ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
【０１７７】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、サイトカインおよびケモカインの増加率を算出した（結果：図７Ｂ「ＷＴ」）。
【０１７８】
図７Ｂに示されるように、何れのＢＭＭＣにおいても、ＬＰＳによって、各種サイトカインの放出量が増加した。しかしながら、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣにおいては、野生型マウス由来のＢＭＭＣに比べてＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１が有意に増加した。
【０１７９】
［参考例３Ｄ］
さらに、各ＢＭＭＣの細胞内中の各種サイトカインおよびケモカインの増加率を検証すべく、以下の試験を行った。
【０１８０】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）を含むメディウム（ＲＰＭＩ）中で４時間インキュベートした後、上記インキュベート後のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体と、ホルムアルデヒドを含むメディウム（ＦＩＸ  ＆  ＰＥＲＭ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で４℃、２０分インキュベートし、染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図８矢印（１））。また、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（２）））。
【０１８１】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図８矢印（３））。さらに、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（４）））。
【０１８２】
また、図８のグラフは、各ＢＭＭＣにおける各サイトカイニンおよびケモカインに関するＭＦＩ値（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、ＬＰＳ未処理のＢＭＭＣに対するＭＦＩの増加量を示す。
【０１８３】
図８によれば、何れのＢＭＭＣの細胞質中においても、ＬＰＳ未処理の場合に比べてサイトカイニンおよびケモカインの量が増加したことを示しているが、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中では、野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中と比べても、ＴＮＦ−α等が有意に増加したことが分かる。
【０１８４】
［参考例３Ｅ］
Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、ＲＧＤモチーフにおいて点変異（Ｄ８９Ｅ）を含むＭＦＧ−Ｅ８のバリアント（変異体）であり、ＰＳに結合するが、αｖβ３インテグリンに結合しないという結合特性を有する。
【０１８５】
そこで、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下において、各ＢＭＭＣのサイトカインおよびケモカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を含むメディウム中に、ＬＰＳとともにＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ／ｍＬ）を添加したこと以外は、参考例３Ｃと同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＣＤ３００ａ-/-」）。
【０１８６】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＷＴ」）。
【０１８７】
図７Ｃに示されるように、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、各種サイトカインの濃度には、有意な差異が見られなかった。
【０１８８】
［参考例３Ｆ］
ＣＤ３００ａは、細胞内部位において免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、抗ＣＤ３００ａ抗体で架橋されると、ＳＨＰ−１が誘導されることが知られている（下記文献１４）。
【０１８９】
そこで、ＣＤ３００ａとＳＨＰ−１とが相互作用するのか否かを検証すべく、以下のような試験を実施した。試験例３Ｃのように、ＬＰＳの存在下でアポトーシス細胞と４時間共培養したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞破砕物を、抗ＣＤ３００ａ抗体（ＴＸ４１）で免疫沈降させた。
【０１９０】
得られた免疫沈降物を用いて、下記文献１４に記載されているように、抗ＳＨＰ−１抗体または抗ＣＤ３００ａ抗体によるイムノブロットを行った（結果：図７Ｄ）。
この結果からも分かるように、ＢＭＭＣがアポトーシス細胞と共培養された場合、ＬＰＳ刺激に応答して、ＳＨＰ−１を誘導（リクルート）することが分かる。しかしながら、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下においては、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１をリクルートしなかった。
すなわち、ＬＰＳ刺激の応答に対するＣＤ３００ａによるＳＨＰ−１の誘導（リクルート）には、ＰＳがＣＤ３００ａへ結合することが必要であると考えられる。
【０１９１】
［参考例３Ｇ］
ＳＨＰ−１が、ＣＤ３００ａ介在性のシグナリングに関与しているかどうかを調べるために、まず、野生型マウス由来のＢＭＭＣにおいて、ｓｉＲＮＡでＰｔｐｎ６（ＳＨＰ−１遺伝子）をノックアウトして、ＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）野生型マウス由来のＢＭＭＣを以下の条件で作製した。また、同様にして、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣからＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを作製した。
【０１９２】
ＢＭＭＣ中のＳＨＰ−１遺伝子（Ｐｔｐｎ６遺伝子）をターゲットとしたｓｉＲＮＡ（ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡ）（ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｍ）０．５ｍＭを、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）１ｍＬと混合し、下記文献２８に記載されているように、５×１０5細胞のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣに形質導入（トランスフェクト）して、ＳＨＰ−１がノックダウンされたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
【０１９３】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、ＳＨＰ−１がノックダウンされた野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
【０１９４】
ここで、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが各ＢＭＭＣに形質導入され、ＳＨＰ−１の発現量が低減していることを確認するために、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）のライセートを用いて、抗ＳＨＰ−１抗体、抗ＳＨＰ−２抗体および抗βアクチン抗体によるイムノブロッティング分析を行った（結果：図７Ｅ）。
【０１９５】
図７Ｅに示されるように、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣでは、ＳＨＰ−１の発現量が低減されていることが確認できる。なお、「Ｃｔｒｌ」は、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡの代わりに、コントロール用ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣを用いたイムノブロッティング分析の結果を示す。
【０１９６】
次に、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）および参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）およびＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、参考例３Ｂと同様にして、ＴＮＦ−αの放出量を測定した（結果：図７Ｆ）。
【０１９７】
図７Ｆ（左グラフ）に示されるように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは野生型マウス由来のＢＭＭＣよりも有意にＴＮＦ−αを産生した。一方で、図７Ｆ（右グラフ）に示されるように、野生マウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが形質導入された場合、野生由来ＢＭＭＣもＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣも、ＴＮＦ−αの放出量は同程度であり、両者に有意な差異は見られなかった。
【０１９８】
これらの結果は、ＰＳがＣＤ３００ａに結合すると、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１を誘導して、ＢＭＭＣの活性化抑制シグナルを介在し、結果として、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることを示唆している。
【０１９９】
参考例３の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用は、ＢＭＭＣから炎症誘発性の（ＬＰＳ誘導性の）サイトカインおよびケモカインの産生を阻害すること、およびこの相互作用はＳＨＰ−１をリクルートして、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることが理解される。
【０２００】
［参考例４：ＣＤ３００ａの機能解析（３）］
マスト細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−３およびＭＣＰ−１は、好中球の化学誘引物質であり、ＣＬＰ腹膜炎マウスにおいて、細菌クリアランスに重要な役割を果たすことが知られている（下記文献１５〜１９）。
そこで、ＣＤ３００ａが細菌クリアランス機能を有するか否かを検討するために、下記参考例４Ａ〜４Ｈを行った。
【０２０１】
［参考例４Ａ］
野生型マウスの盲腸（腹側域）上において、１〜２ｃｍの正中線切開を実施し、その末端部を結紮した。次いで、結紮部位において、２７ゲージ針を用いて２回穿刺した後、該盲腸を腹部に戻し、無菌食塩水１ｍＬを皮下注射して補水した後、切開部を縫合して切開部分を閉じた。なお、上記のＣＬＰの詳細内容・条件は、下記文献１６に記載されている。
【０２０２】
ＣＬＰの実施前またはＣＬＰの実施後４時間目において、腹膜灌流液を採取した。次いで、該腹膜灌流液にＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｇ）およびＣＤ３００−Ｆｃ（１μｇ）を添加した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧおよびＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色し、フローサイトメトリーで分析した（結果：図１２Ａ）。
【０２０３】
図１２Ａは、下記文献２０に記載されているように、腹膜炎部位は、多数の細胞がアポトーシスに至る部位であることを確認できる結果となっている。
すなわち、ＣＤ３００ａは、膜炎部位のマスト細胞の免疫制御に影響を与えることが示唆される。
【０２０４】
［参考例４Ｂ］
ＣＤ３００ａとマスト細胞の免疫制御との関係を検証すべく、以下のようにプロテオーム解析を行った。
【０２０５】
まず、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）に、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施した。
ＣＬＰ実施から４時間経過後、各マウスの腹膜灌流液を採取して、採取された腹膜灌流液を、製造元の説明書に準拠して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイトカインおよびケモカインのプロテオーム解析に供した。
【０２０６】
図９Ａは、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）の腹膜灌流液を用いたデンシトメトリー分析（プロテオーム分析）の結果を示す（図９Ａ中「ＰＣ」はポジティブコントロールを示す。）。
【０２０７】
また、図９Ｂは、図９Ａで示される各シグナルをデンシトメトリー像から得られた、各ケモカインやサイトカインのシグナルのピクセル密度を示す。
図９Ｂに示されるように、ＣＬＰ後４時間目において、腹腔内のケモカインの濃度は、野生型マウスよりもｋｉｔW-sh/W-shマウスにおいて高いことが分かる。なお、本試験は、２回実施しても同様の結果が得られた。
【０２０８】
［参考例４Ｃ］
参考例４Ｂと同様にして、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）から腹膜灌流液を採取した（各ｎ＝３）。
【０２０９】
次いで、各腹膜灌流液から段階希釈液系列を調製し、調製された腹膜灌流液の各段階希釈液をプレーティングし、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して好気性細菌のＣＦＵを算出した（結果：図１０Ａ）。
【０２１０】
また、各腹膜灌流液中の好中球およびマクロファージの細胞数も計測し、結果をそれぞれ図１０Ｂの「ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ」および「ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」に示す。
さらに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）からＢＭ由来マクロファージを調製した。これらのマクロファージ（細胞数：１Ｘ１０6）を、フルオレセイン標識化大腸菌を含むメディウム中で、２４穴プレートで１時間共培養し、フローサイトメトリーで大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数を測定し、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＢＭ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
【０２１１】
野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＢＭ由来マクロファージの代わりに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＰＥＣマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＰＥＣ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
【０２１２】
図１０Ａに示されるように、ＣＬＰ後４時間目のマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウスに比べて、腹腔内における細菌ＣＦＵが少なく、好中球の細胞数が多いことが分かる。対して、図１０Ｂおよび図１１に示されるように、マクロファージの細胞数および貪食作用は、両遺伝子型間で有意差が無いものであった。
【０２１３】
［参考例４Ｄ］
ＣＤ３００ａが好中球の誘導（リクルート）に関与するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
【０２１４】
マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）に、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（細胞数１Ｘ１０6）を含むＰＢＳ緩衝液を腹腔内注射で投与した（ｎ＝２０）。次いで、投与してから２８日間経過後、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＷＴ  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。
【０２１５】
また、野生型マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＣＤ３００ａ-/-  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。なお、図１２Ｂにおける「ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」は、ＢＭＭＣを投与しないで、ＣＬＰを実施したマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の生存率を示す。
【０２１６】
図１２Ｂによれば、ＣＬＰ後であっても、野生型マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、ＢＭＭＣを投与されなかった場合と比べて、高い生存率が示された。
【０２１７】
しかしながら、ＣＬＰの後において、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウス由来のＢＭＭＣやＢＭＭＣが投与されなかったマウスと比べて、ＣＬＰ後であっても生存率が有意に高かったことが分かる（図１２Ｂ）。
【０２１８】
さらに、ＣＬＰ後４時間目の上記各マウスの腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして細菌のＣＦＵを測定したところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、他のマウスに比べて、細菌クリアランスも大きいことが示された（結果：図１２Ｃ）。
【０２１９】
［参考例４Ｅ］
ＢＭＭＣをマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に投与することで、ＴＮＦ−αの放出量が増加するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
【０２２０】
ＣＬＰの２４時間前において、マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に、ＣＦＳＥ標識化した混合ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ：野生マウス由来のＢＭＭＣ＝１：１（細胞数比））を腹腔内注射で投与した。
【０２２１】
該混合ＢＭＭＣが注射されたマウスに参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、ＣＬＰ後４時間目に、腹膜灌流液を採取した。該腹膜灌流液中に含まれる各ＢＭＭＣをフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図１２Ｄ）。
【０２２２】
図１２Ｄに示されるように、ＣＬＰから４時間後において、ＣＤ３００Ｄ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-ＣＦＳＥ+細胞）は、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ+ＣＦＳＥ+細胞）よりも有意に大量のＴＮＦ−αを産生していることが分かる。
【０２２３】
［参考例４Ｆ］
抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）を投与した場合、ＣＤ３００ａにおいてどのような影響があるのかを検証するために、以下のような実施例を行った。
【０２２４】
まず、ＣＬＰの１時間前または１８時間前において、野生型マウスに、５００μｇの抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（ｎ＝１３）を腹腔内注射したこと以外は、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施して、参考例４Ｄと同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ３００ａ」）。
【０２２５】
また、コントロールとして、ＴＸ４１（ｎ＝１３）の代わりに、アイソタイプコントロール用抗体（ｎ＝１１）を用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」）。
【０２２６】
図１２Ｅに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した後にＣＬＰを実施した場合、コントロール用抗体を投与した場合と比べて、生存期間が長くなることが分かった。
【０２２７】
［参考例４Ｇ］
参考例４Ｆにおける、ＣＬＰ後４時間目の各マウスから腹膜灌流液を採取した。得られた腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして、細菌ＣＦＵおよび好中球の細胞数を測定した（コントロール用抗体：ｎ＝５および、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体：ｎ＝５）（それぞれ図１２Ｆおよび図１２Ｇ）。
【０２２８】
なお、ＴＸ４１が腹腔内注射で投与されても、各マウスのマスト細胞を含めたミエロイド系細胞が欠損することはなかった。
図１２Ｆおよび図１２Ｇに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した場合、腹腔内において、有意に好中球の細胞数は増加し、細菌クリアランスも向上した。
【０２２９】
参考例４の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用を、たとえばＴＸ４１などで阻止することで、腹膜炎誘発性の敗血症を予防できることが理解される。
なお、生理的状況下においては、多くの細胞がアポトーシスに至っている。ここで、アポトーシス細胞の取り込みには、ＰＳ受容体は中心的な役割を果たし、自己免疫疾患の進展を防ぐのに必須なものである（下記文献２２）。
【０２３０】
一方で、微生物感染のような病理的状況では、顕著にアポトーシスによる細胞死が増加し、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）に対する受容体（たとえばＴｏｌｌ様受容体）を介し、マスト細胞による炎症反応を引き起こすことが知られている（下記文献１５，２３および２４）。また、マスト細胞は、病原体に対する免疫反応において重要な役割を果たすことも知られている。
【０２３１】
以上から、上記実施例における結果は、ＰＳが、数種類のＰＳ受容体を介して貪食細胞へ取り込みシグナルを提供することのみならず、今回新たな知見として得られたように、ＣＤ３００ａを介したマスト細胞による炎症反応を有効に抑制する効果を有することが理解できる。
【０２３２】
したがって、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）やＣＤ３００ａ結合性物質（ＣＤ３００ａに対する中和抗体等）が、ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用を阻止して、マスト細胞を活性化させるまたは該活性を維持させることが理解される。
【０２３３】
すなわち、これらの物質は、たとえばＬＰＳ誘発性の各種炎症性感染症（さらにはそれによる敗血症）の予防に用いられる免疫賦活化剤の有効成分として有用であることが理解できる。
【０２３４】
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制させてマスト細胞の活性化を抑制することから、たとえば、アレルギー疾患や自己免疫疾患における炎症反応を抑制して（たとえば、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を抑制して）、アレルギー疾患や自己免疫疾患の症状を緩和または治療する（過剰な免疫機能を抑制する）ために用いられる免疫抑制剤の有効成分として有用であることが理解できる。
【０２３５】
＜腸炎＞
（材料および方法）
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴマウス）はＣｌｅａより購入した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、当研究室でＢａｌｂ／ｃＡ由来ＥＳ細胞より樹立したものをＣ５７ＢＬ／６に戻し交配し、１２世代以降のマウスを使用した。
実験に用いたマウスは筑波大学生命科学動物資源センター内にて特定病原体未感作（ＳｐｅｃｉｆｉｃＰａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）環境下で飼育した。
【０２３６】
（腸炎の誘導）
１０〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにＤｅｘｔｒａｎ  ＳｕｌｆａｔｅＳｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｇｒａｄｅ（ＤＳＳ，ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ（ＭＷ）= ３６０００〜５００００)を２．５％（ｗ／ｖ）８日間連続で飲水させ、腸炎を誘発した。
【０２３７】
（抗体）
ＢＤ  ビオチン抗ＣＤ３００ａ（ＴＸ４１）は当研究室で作製したものを使用した。
それ以外の下記抗体はＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。
・精製した抗マウスＴＮＦ−α、
・ビオチン標識化抗マウスTNF-α、
・精製したマウスＩＬ−６、
・ビオチン標識化抗マウスＩＬ−６、
・精製した抗マウスＩＬ−１０、
・ビオチン標識化抗マウスＩＬ−１０、
・アロフィコシアニン−Ｃｙ７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）標識化抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、
・フィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）標識化抗マウスＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、
・フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）
【０２３８】
（大腸組織培養液）
ＤＳＳ又は水の投与後の９日後のマウスより大腸を摘出後、リン酸緩衝液で洗浄し、糞便を除去した。大腸を長軸に切開した後、肛門より３ｍｍの部分から３ｍｍ ずつ５つの組織片を切り出し、１０%ＦＢＳＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製)で１２時間培養後、その上清を回収したものを大腸組織培養液とした。培養液中に含まれるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【０２３９】
（大腸粘膜固有層細胞の単離）
マウスを屠殺し、その大腸を採取した。まず、大腸をハサミで４ピースに切断し、リン酸緩衝液で洗浄し、糞便を取り除いた。残った組織を１ｍＭ  ＤＴＴ／５ｍＭ  ＭＥＤＴＡ／Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製)に入れ、３７℃恒温槽（シェイカー式）で３０分間インキュベートした。
【０２４０】
その後、組織を再びリン酸緩衝液で洗浄し、剥がれた上皮や夾雑物を取り除いた。残った組織をハサミで細切し、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ タイプ３（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製造）／０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）／５%Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ’ｓｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、３７℃恒温槽（シェイカー式）で２時間インキュベートし、完全に融解させた。
【０２４１】
細胞懸濁液を７０μｍのナイロンに通し、遠心した。得られた細胞を４０％Ｐｅｒｃｏｌｌに懸濁し、７０％Ｐｅｒｃｏｌｌの上に重層し、遠心後に得られる中間層の細胞を回収し、大腸粘膜固有層細胞としてフローサイトメトリー法に用いた。
【０２４２】
（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離）
単離した大腸粘膜固有層細胞をＡＰＣ−Ｃｙ７標識化抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＰＥ−Ｃｙ７標識化抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）およびＦＩＴＣ標識化抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）で標識した。標識された細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）にてソーティングし、それぞれＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞とした。
【０２４３】
（ｍＲＮＡ量の測定）
ＦＡＣＳＡｒｉａにてソーティングした細胞をＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン）で融解した。融解した細胞からｍＲＮＡ抽出キットを用いてｍＲＮＡを抽出し、逆転写キットを用いてｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡを各種プライマー（配列表の配列番号１〜１６参照）及びＰｏｗｅｒ  Ｃｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混和し、７５００ＦａｓｔＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を用いてｍＲＮＡ量を測定した。
【０２４４】
[実施例１Ａ] 体重変化率（図１３）
２．５％（ｗ／ｖ）Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＳＳ）をＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにそれぞれ８日間連続で飲水させ、腸炎を誘発し、体重を毎日測定した。
【０２４５】
マウスは１０〜１２週齢のメスを用い、ＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスそれぞれ１５匹の体重変化率を観察した。スチューデントｔ検定を用いて有意差を求めた（**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１）。
【０２４６】
図１３に示すように、２．５％ＤＳＳを飲水させて誘導した腸炎による体重減少は、ＭＡＩＲ−Ｉを有しないＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（□）の方がＷＴマウス（●）と比較して体重減少が有意に軽度であった。
【０２４７】
[実施例１Ｂ] 大腸の長さの測定（図１４）
ＤＳＳ投与６日目にＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスそれぞれ７匹ずつから大腸を採取し、肛門部より盲腸部までの長さを測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（**：ｐ＜０．０１）。
【０２４８】
図１４に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの大腸の方が長く、ＤＳＳで誘導した腸炎による大腸の萎縮は、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの方がＷＴマウスと比較して軽度であった。
【０２４９】
[実施例１Ｃ] 大腸の長さの測定（図１４Ａ）
同時に大腸の組織学的評価をおこなったところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＷＴマウスの大腸と比較して組織学的変化が軽度であることが観察された（図１４Ａ）。
【０２５０】
[実施例１Ｄ] 細胞障害活性測定（図１５）
ＤＳＳ投与６日目のＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの大腸組織をＨＥ (ヘマトキシリン・エオジン)染色にて染色後、スコア０〜５（０： 変化なし、１：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の肥大や構造変化、２：杯細胞の著しい減少、３：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）は認められるが、ほとんど構造を保っていない、４：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の消失が認められるが、上皮の剥離は認められない、５：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の消失、上皮の剥離、著しい細胞浸潤が認められる)でスコアリングした。
【０２５１】
ＷＴマウスおよびＣＤ３００a遺伝子欠損マウスの各７匹ずつの大腸について、それぞれを肛門側より強視野で１０区画撮影したものをスコア化し、スチューデントｔ検定を用いて有意差を求めた（***：ｐ＜０．００１）。その結果を図１５に示す。
図１５に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＤＳＳ腸炎による組織傷害が軽度であった。
【０２５２】
[実施例１Ｅ] ＩＬ−１０の計測（図１６）
ＤＳＳもしくは水(コントロール群)を投与し、ＤＳＳ投与から９日後の各マウスより大腸を取り出し、リン酸緩衝液で洗浄後、肛門側より３ｍｍ3ピースに細切した。
【０２５３】
細切した大腸の組織を１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で１２時間培養後、その上清を回収し、その培養上清中をサンドイッチＥＬＩＳＡ法に供して各サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の蛋白量を測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（*：ｐ＜０．０５）。
【０２５４】
図１６に示すように、ＤＳＳ誘導で腸炎を起こした大腸組織において、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αは、ＷＴマウス、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで差は見られなかったものの、ＩＬ−１０の産生がＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで高値であることが明らかとなった（図１６）。
【０２５５】
Ｍｒｅｇ細胞でＩＬ−１０が炎症性Ｔ細胞の活性化に必要な蛋白質のＣＤ８０やＣＤ８６の発現を抑制していることが知られている（下記文献３３）。
図１６に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおいて、５％の有意差で、ＩＬ−１０の産生量が増加していることから、炎症性Ｔ細胞の増殖誘導を抑制して、炎症性Ｔ細胞の活性化を抑制し、腸管免疫系の恒常性維持に寄与すると考えられる。
【０２５６】
[実施例１Ｆ] 各細胞数の計測（図１６Ａ）
ＤＳＳ投与、０日目、２日目、４日目および６日目の各マウスについて、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞について細胞集団の変化を調べた。
その結果、図１６Ａに示すように、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで大腸に集まってくる細胞集団の数に違いは認められなかった。
【０２５７】
[実施例１Ｇ] ＣＤ３００ａの発現解析（図１７）
大腸より単離した細胞をＡＰＣ-Ｃｙ７標識化ａｎｔｉＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＰＥ−Ｃｙ７標識化ａｎｔｉＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｎｔｉＣＤ３００ａ（ＴＸ４１）で染色した。ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ−分画、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−分画、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋分画、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋分画の細胞に関して、ＣＤ３００ａの発現をフローサイトメトリー法にて測定した。この結果を図１７に示す。
図１７に示すように、大腸粘膜固有層において、ＣＤ３００ａは特殊な細胞といえるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞に発現していた。
【０２５８】
[実施例１Ｈ] ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞における発現定量（図１８）
各マウスの大腸より単離したＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞をＦＡＣＳＡｒｉａにてソーティングした後、細胞よりｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、定量ＰＣＲ法にてＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量を測定した。
【０２５９】
その結果、図１８に示すように、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞では、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量は、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで差が認められなかった。
【０２６０】
[実施例１Ｉ]ＣＤ４＋Ｔ細胞における発現定量（図１９）
ＤＳＳ投与した各マウスの大腸より単離したＣＤ４＋細胞をＦＡＣＳＡｒＡｉａにてソーティングした後、細胞よりｍＲＮＡ抽出した。抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ７５００ｆａｓｔを用いて、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦ-β、Ｔ−ｂeｔ、ＧＡＴＡ−３、ＲОＲγｔのｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲ法にて測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１）。
図１９に示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴｇｆβのｍＲＮＡ量がＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおいて高かった。
【０２６１】
（考察）
実施例１Ａ〜６Ｉの結果から、ＤＳＳにより腸炎を誘導したマウスではＭＡＩＲ−Ｉが欠損すると、ＩＬ−１０等の抗炎症性の各種サイトカインが産生され（図１９）、腸炎の病態が改善される。
【０２６２】
このことは、何らかの細胞集団の増加ではなく（図１６Ａ）、ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞自身、もしくはこの樹状細胞がいずれかの細胞に働きかけてＩＬ―１０の産生を、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を介して制御していると考えられる。
【０２６３】
つまり、ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞を介したＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のシグナル伝達を抑制、もしくは阻害することにより腸炎の病態が改善することが予測される。
【０２６４】
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【図１】
2014094898.tif 000003
【図２Ａ】
2014094898.tif 000004
【図２Ｂ】
2014094898.tif 000005
【図２Ｃ】
2014094898.tif 000006
【図２Ｄ】
2014094898.tif 000007
【図２Ｅ】
2014094898.tif 000008
【図２Ｆ】
2014094898.tif 000009
【図３Ａ】
2014094898.tif 000010
【図３Ｂ】
2014094898.tif 000011
【図３Ｃ】
2014094898.tif 000012
【図３Ｄ】
2014094898.tif 000013
【図４Ａ】
2014094898.tif 000014
【図４Ｂ】
2014094898.tif 000015
【図４Ｃ】
2014094898.tif 000016
【図４Ｄ】
2014094898.tif 000017
【図５Ａ】
2014094898.tif 000018
【図５Ｂ】
2014094898.tif 000019
【図６Ａ】
2014094898.tif 000020
【図６Ｂ】
2014094898.tif 000021
【図７Ａ】
2014094898.tif 000022
【図７Ｂ】
2014094898.tif 000023
【図７Ｃ】
2014094898.tif 000024
【図７Ｄ】
2014094898.tif 000025
【図７Ｅ】
2014094898.tif 000026
【図７Ｆ】
2014094898.tif 000027
【図８】
2014094898.tif 000028
【図９Ａ】
2014094898.tif 000029
【図９Ｂ】
2014094898.tif 000030
【図１０Ａ】
2014094898.tif 000031
【図１０Ｂ】
2014094898.tif 000032
【図１１】
2014094898.tif 000033
【図１２Ａ】
2014094898.tif 000034
【図１２Ｂ】
2014094898.tif 000035
【図１２Ｃ】
2014094898.tif 000036
【図１２Ｄ】
2014094898.tif 000037
【図１２Ｅ】
2014094898.tif 000038
【図１２Ｆ】
2014094898.tif 000039
【図１２Ｇ】
2014094898.tif 000040
【図１３】
2014094898.tif 000041
【図１４】
2014094898.tif 000042
【図１４Ａ】
2014094898.tif 000043
【図１５】
2014094898.tif 000044
【図１６】
2014094898.tif 000045
【図１６Ａ】
2014094898.tif 000046
【図１７】
2014094898.tif 000047
【図１８】
2014094898.tif 000048
【図１９】
2014094898.tif 000049
【図２０】
2014094898.tif 000050
【配列表】
2014094898000001.app