(57)【要約】【課題】ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療及び／又は予防のために、ＴＤＰ−４３の凝集体の異常蓄積を抑制する医薬組成物を開発すること。【解決手段】  本発明は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を有効成分として含む、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む不溶性凝集体を形成する神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、前記不溶性凝集体の形成抑制剤の場合がある。前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ハンチントン病、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、及び、家族性英国型認知症からなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする、神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記神経変性疾患は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む不溶性凝集体を形成する疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物は、前記不溶性凝集体の形成抑制剤であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）のリン酸化抑制剤であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、嗜銀顆粒性認知症、ハンチントン病、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、及び、家族性英国型認知症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物と、他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項７】
前記他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬が、ドネペジル、メマンチン、ガランタミン、リバスチグミン、アポモルヒネ塩酸塩水和物、アマンタジン塩酸塩、エンタカポン、カベルゴリン、セレギリン塩酸塩、ゾニサミド、タリペキソール塩酸塩、チアプリド塩酸塩、トリヘキシフェニジル塩酸塩、ドロキシドパ、ビペリデン塩酸塩、ピロヘプチン塩酸塩、プラミペキソール塩酸塩水和物、レボドパ、レボドパ・カルビドパ水和物、ブロモクリプチンメシル酸塩、ペルゴリドメシル酸塩、ロピニロール塩酸塩、リルゾール、メチルコバラミン、及び、エダラボンからなる群から１種類以上選択されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
生体内でフルベストラントに代謝されるフルベストラント誘導体及び／又はその塩がプロドラッグとして含まれることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物と、ＴＤＰ−４３を含む不溶性凝集体を形成する生物学的試料とを含むことを特徴とする、神経変性疾患の研究のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を有効成分として含む神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。具体的には、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む不溶性凝集体の形成を抑制し、神経変性疾患（例えば、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合など）の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＤＰ−４３は、ＦＴＬＤ、及び、ＡＬＳの患者の脳にみられるタウ陰性ユビキチン陽性封入体の主要構成成分として同定された（非特許文献１）。また、ＴＤＰ−４３遺伝子の変異が、家族性及び弧発性ＡＬＳにおいて多数発見されたため、ＡＬＳにおける神経変性の原因がＴＤＰ−４３であることがほぼ確実となった。つまり、このことはＴＤＰ−４３がＡＬＳ治療の標的となりうることを意味する。さらに、ＴＤＰ−４３の凝集体の蓄積を伴う病変の拡大と臨床症状の進行とは非常によく一致するため、凝集体の形成が病気の発症や進行を促進すると考えられる。
【０００３】
ＴＤＰ−４３の異常は、上記疾患以外に、アルツハイマー病やレビー小体型認知症の３０〜５０％程度の患者に認められことが報告されている。また、ＴＤＰ−４３の凝集体の蓄積が、さまざまな神経変性疾患（例えば、嗜銀顆粒性認知症、ハンチントン病、ペリー症候群、家族性英国型認知症、及び、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合など）において報告されている（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒａｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２２；３５１（３）：６０２−１１  （２００６）
【非特許文献２】Ａｒａｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ３０（２）：１７０−８１  （２０１０）
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ−Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏ．  ６（４）：２１１−２０  （２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＴＤＰ−４３の凝集体の異常蓄積を伴うさまざまな神経変性疾患（いわゆるＴＤＰ−４３プロテイノパチー）の治療及び／又は予防のために、ＴＤＰ−４３の凝集体の異常蓄積を抑制する医薬組成物を開発する必要がある。
【０００６】
本発明者らは、ＴＤＰ−４３凝集体蓄積細胞モデルを用いて、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに対する新規治療又は予防薬の開発を目的に、迅速かつ簡便なハイスループット・スクリーニング法を開発し、ＴＤＰ−４３の凝集体の形成を抑制する低分子化合物のスクリーニングを行った。その結果、本発明者らは、フルベストラントがＴＤＰ−４３の凝集及びリン酸化を抑制することを見出し、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療又は予防のための医薬組成物に関する本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を有効成分として含む、神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。
【０００８】
前記神経変性疾患は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む不溶性凝集体を形成する疾患の場合がある。
【０００９】
前記医薬組成物は、前記不溶性凝集体の形成抑制剤の場合がある。
【００１０】
前記医薬組成物は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）のリン酸化抑制剤の場合がある。
【００１１】
前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、嗜銀顆粒性認知症、ハンチントン病、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、及び、家族性英国型認知症からなる群から選択される場合がある。
【００１２】
本発明は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物と、他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬とを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
前記他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬は、ドネペジル、メマンチン、ガランタミン、リバスチグミン、アポモルヒネ塩酸塩水和物、アマンタジン塩酸塩、エンタカポン、カベルゴリン、セレギリン塩酸塩、ゾニサミド、タリペキソール塩酸塩、チアプリド塩酸塩、トリヘキシフェニジル塩酸塩、ドロキシドパ、ビペリデン塩酸塩、ピロヘプチン塩酸塩、プラミペキソール塩酸塩水和物、レボドパ、レボドパ・カルビドパ水和物、ブロモクリプチンメシル酸塩、ペルゴリドメシル酸塩、ロピニロール塩酸塩、リルゾール、メチルコバラミン、及び、エダラボンからなる群から１種類以上選択される場合がある。
【００１４】
前記医薬組成物には、生体内でフルベストラントに代謝されるフルベストラント誘導体及び／又はその塩がプロドラッグとして含まれる場合がある。
【００１５】
本発明は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物と、ＴＤＰ−４３を含む不溶性凝集体を形成する生物学的試料とを含む神経変性疾患の研究のためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の医薬組成物は、ＴＤＰ−４３の凝集及びリン酸化を顕著に抑制することができ、ＴＤＰ−４３の凝集体の異常蓄積を伴うさまざまな神経変性疾患（いわゆるＴＤＰ−４３プロテイノパチー）の治療及び／又は予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】陰性対照群（ＤＭＳＯのみ）、陽性対照群（ラトレピルジン（２０μＭ））、及び、実験群（フルベストラント（２０μＭ））における、ＧＦＰを強く発現する細胞の割合（％）を示すグラフ。
【図２−１】可溶性画分中のＴＤＰ−４３、及び、不溶性画分中のリン酸化ＴＤＰ−４３を示すウェスタンブロット図。
【図２−２】図２−１のウェスタンブロット図から算出したＴＤＰ−４３のリン酸化の割合を示すグラフ。
【図３】共焦点顕微鏡の画像データから算出した凝集体形成の割合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、「フルベストラント」とは、以下の化学式で示される化合物（７α−［９−（４，４，５，５，５−Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔｙｌｓｕｌｐｈｉｎｙｌ）ｎｏｎｙｌ］ｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎｅ−３，１７β−ｄｉｏｌ）（ＣＡＳ  １２９４５３−６１−８）（分子量：６０６．７７）をいい、乳がんを治療するための医薬品として使用されている。フルベストラントの半数致死量（ＬＤ50）は、マウスでは３００ｍｇ／ｋｇであり、ウサギでは３２００ｍｇ／ｋｇであり、ラットでは９８０ｍｇ／ｋｇであり、フルベストラントは安全性の高い化合物である。
（http://www.clearsynth.com/docs/MSD-CS-IS-23995.pdf）。
【化１】
2014196268.tif 000002
【００１９】
本発明の医薬組成物において、フルベストラント、その誘導体又は塩は、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又は、それらの混合物を含む場合がある。
【００２０】
前記神経変性疾患の治療又は予防のための化合物として前記フルベストラントを使用できる。
【００２１】
本明細書において、「フルベストラント誘導体」とは、フルベストラントの官能基及び／又は側鎖が修飾された化合物をいう。前記誘導体は、具体的には、酵素、胃酸などによる酸化、還元及び加水分解されることを含む生体内での化学的反応及び／又は生物学的反応によってフルベストラントを遊離できる化合物を含むプロドラッグをいう。前記誘導体は、エステル誘導体を含むが、これらに限定されない。前記エステル誘導体は、メチルエステル、エチルエステルその他のプロドラッグとして慣用されるエステル化合物を含む。また、前記誘導体は、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸などのような生体高分子との結合誘導体と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルなどのような合成高分子との結合誘導体とを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において、フルベストラント誘導体の「塩」とは、金属塩、アミン塩、酸塩、酢酸塩、酸付加塩、塩基付加塩などを含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などの場合がある。前記塩は、水和物及び無水和物を含む。
【００２３】
本明細書において、「ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）」とは、不均一核内リボ核酸タンパク質（ｈｎＲＮＰ）の一種であり、核に局在し、ＲＮＡの安定化や選択的スプライシング、転写調節などに関与するタンパク質をいい、野生型、多型（一塩基多型（ＳＮＰ）など）、変異型（欠失、挿入、スプライシング・バリアントなど）、修飾型（リン酸化、ユビキチン化など）、ホモログ、パラログ、オルソログ、断片（ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、融合タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰなどの他のタンパク質、又は、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ＧＳＴなどの他のペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端での融合産物）などを含む。
【００２４】
本発明において、神経変性疾患とは、中枢神経系の神経細胞が異常タンパク質の凝集体の蓄積により、徐々に変性し、機能不全や細胞死に陥る進行性疾患をいう。典型的には、前記神経変性疾患はＴＤＰ−４３の不溶性凝集体の異常蓄積を伴う、いわゆるＴＤＰ−４３プロテイノパチーである。前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ハンチントン病、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、家族性英国型認知症を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、フルベストラントが、ＴＤＰ−４３のリン酸化、及び／又は、凝集体の形成を抑制する効果を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、結合剤、滑剤、崩壊剤、溶解剤、緩衝剤、着色剤、香料、甘味料、防腐剤、安定化剤、及び、当業者に知られたその他の医薬品添加剤を含むが、これらに限られない。
【００２６】
本発明の医薬組成物の剤型は、フルベストラントが、ＴＤＰ−４３のリン酸化、及び／又は、凝集体の形成を抑制する効果を損なわないことを条件として、特に限定されない。本発明の組成物の剤型は、経口剤、注射剤、塗布剤、経鼻剤を含み、従来の医薬組成物に用いるものであればいかなるものでもかまわない。
【００２７】
フルベストラントの処方例は、下記の処方例を含むが、これに限定されない。
【００２８】
フルベストラントの筋注剤の処方例
成分                  含量（１ｍＬ中）
フルベストラント          ５０ｍｇ
エタノール              １００ｍｇ
ベンジルアルコール      １００ｍｇ
安息香酸ベンジル        １５０ｍｇ
ヒマシ油                      適量
【００２９】
本発明の医薬組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規範に適合した条件（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ基準）で実施されることが好ましい。
【００３０】
本発明は、本発明の医薬組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、神経変性疾患を治療又は予防する方法を提供する。前記医薬組成物は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を有効成分として含む場合がある。また、前記医薬組成物は、フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物と、他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬とを含む場合がある。フルベストラント、その誘導体及びその塩からなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物は、他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬と同時又は別々に投与される場合がある。前記神経変性疾患は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）を含む不溶性凝集体を形成する疾患の場合がある。前記医薬組成物は、前記不溶性凝集体の形成抑制剤の場合がある。前記医薬組成物は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）のリン酸化抑制剤の場合がある。前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ハンチントン病、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、及び、家族性英国型認知症からなる群から選択される場合がある。典型的には、前記被験体はヒトである。前記他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬は、ドネペジル、メマンチン、ガランタミン、リバスチグミン、アポモルヒネ塩酸塩水和物、アマンタジン塩酸塩、エンタカポン、カベルゴリン、セレギリン塩酸塩、ゾニサミド、タリペキソール塩酸塩、チアプリド塩酸塩、トリヘキシフェニジル塩酸塩、ドロキシドパ、ビペリデン塩酸塩、ピロヘプチン塩酸塩、プラミペキソール塩酸塩水和物、レボドパ、レボドパ・カルビドパ水和物、ブロモクリプチンメシル酸塩、ペルゴリドメシル酸塩、ロピニロール塩酸塩、リルゾール、メチルコバラミン、及び、エダラボンからなる群から１種類以上選択される場合がある。前記医薬組成物には、生体内でフルベストラントに代謝されるフルベストラント誘導体及びその塩がプロドラッグとして含まれる場合がある。本発明の医薬組成物の有効量を被験体に投与するステップにおいて、本発明の医薬組成物の投与経路は、経口、静脈内、経皮、経鼻を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物の調製及び送達には、フルベストラント、その誘導体及びその塩の体内分布を、量的、空間的及び時間的に制御できる当業者に周知の送達システムを用いることができる。
【００３１】
本明細書において、有効量とは、本発明の医薬組成物を投与された被験体が健康を害さず、かつ、該被験体で本発明の効果を発揮する投与量をいう。前記有効量は、被験体の体重、年齢、性別、遺伝子型、病状などを考慮して設定される場合がある。典型的には、前記被験体はヒトであり、男性及び女性の未成年者、成人及び高齢者を含む。
【００３２】
本発明の医薬組成物に含まれるフルベストラント、その誘導体及び／又は塩の１日摂取量の下限は、ＴＤＰ−４３のリン酸化、及び／又は、凝集体の形成を抑制する効果が損なわれないことを条件として特に限定されないが、例えば、体重１ｋｇあたり２０ｍｇであればよく、好ましくは１０ｍｇである。１回あたりの投与量５ｍｇが、１日あたり３回投与される場合がある。また、本発明の医薬組成物に含まれるフルベストラント、その誘導体及び／又は塩の１日摂取量の上限は、ＴＤＰ−４３のリン酸化、及び／又は、凝集体の形成を抑制する効果が損なわれないことを条件として特に限定されないが、例えば、体重１ｋｇあたり１００ｍｇが好ましく、７５ｍｇがより好ましく、５０ｍｇが最も好ましい。
【００３３】
本発明のキットは、他の神経変性疾患の治療薬又は予防薬をさらに含む場合がある。本発明のキットにおける化合物は、生物学的試料内でフルベストラントに代謝されるフルベストラント誘導体及び／又はその塩のプロドラッグを含む。本発明は、本発明の神経変性疾患の研究のためのキットを使用するステップを含む神経変性疾患を解析する方法を提供する。前記神経変性疾患の研究では、リン酸化酵素の活性、プロテアソームの活性などが測定できる。
【００３４】
本明細書において、「生物学的試料」とは、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を形成する可能性がある全ての生物学的試料をいい、ヒト、実験動物の生体内から採取された細胞、組織及び器官と、培養細胞とを含むが、これらに限定されない。前記神経変性疾患関連タンパク質は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、α−シヌクレイン、タウ、β−アミロイド、ポリグルタミン、ＳＯＤ１及び／又はプリオンを含むが、これらに限定されない。前記培養細胞は、生体内から採取した細胞の初代培養と、継代培養された細胞と、ｉＰＳ細胞、外胚葉系幹細胞その他の多分化能を有する幹細胞から分化された細胞と、細胞株とを含むが、これらに限定されない。前記実験動物は、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物を含む。前記生物学的試料は、当業者に標準的な方法で調製することができる。前記生物学的試料の生物種は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ及びメダカを含むが、これらに限定されない。前記ヒトは、健常者と、神経変性疾患患者（例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病などの患者）とを含むが、これらに限定されない。本発明において、前記生物学的試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及び／又は、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる。
【００３５】
本明細書において、「ＴＤＰ−４３を含む不溶性凝集体を形成する生物学的試料」とは、典型的には、ＴＤＰ−４３を含む不溶性凝集体を形成することができる細胞である。前記細胞は、神経細胞に類似した性質を有する細胞が好ましいが、その由来は、神経変性疾患に由来する細胞であってもかまわないし、該疾患と無関係に得られた細胞であってもかまわない。また、前記細胞は、神経細胞の細胞系譜に属する細胞や、神経細胞の細胞系譜由来の腫瘍細胞であってもかまわない。前記細胞として、Ｂ１０３、ＫＥＬＬＹ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＢＥ（２）−Ｃ、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、及び、ＳＫ−Ｎ−ＳＨを含むが、これらに限定されない、神経芽種細胞株が用いられる場合がある。前記細胞は、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞その他の多分化能を有する幹細胞から神経細胞に分化させられた細胞であってもかまわない。前記細胞は、所望の機能を有するタンパク質を構成的に発現するための発現ベクターが組み込まれたトランスフェクタントを含む。
【００３６】
本明細書において、「神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される」とは、いずれかの神経変性疾患関連タンパク質を一過的又は恒久的に発現することをいい、前記神経変性疾患関連タンパク質が多くの細胞で発現されていることを条件として、いかなる手法で前記神経変性疾患関連タンパク質が発現されてもかまわない。好ましくは、所望の機能を有するタンパク質を発現するために、前記神経変性疾患関連タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターがリポフェクション法で細胞に導入される。この手法に用いる試薬は当業者に知られたいかなる試薬を用いてもかまわない。例えば、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９、ＦｕＧＥＮＥ６、リポフェクチン、リポフェクタミン、マルチフェクタムなどの市販の試薬が利用できる。
【００３７】
本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用されるベクターであって、前記所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。前記タンパク質は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）、α−シヌクレイン、タウ、β−アミロイド、ポリグルタミン、ＳＯＤ１及び／又はプリオンの場合がある。前記ベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミドを含むが、これらに限定されない。前記ベクターは、市販の発現ベクター（例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など）を利用できる。一般的に、前記所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製され、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素などを利用する当業者に周知の遺伝子工学の手法を用いて前記発現ベクターに組み込まれる。前記ＰＣＲで用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを増幅できることを条件として、いかなる配列であってもかまわない。前記プライマーは、前記発現ベクターに組み込むための制限酵素認識配列を有する場合がある。
【００３８】
神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される細胞は、該タンパク質を含む不溶性凝集体を形成でき、該不溶性凝集体の形成を抑制する薬物のスクリーニングで用いられる場合がある。前記タンパク質は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ化した融合タンパク質（ＧＦＰ−ＴＤＰ４３）の場合がある。
【００３９】
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」は、有機化合物、無機化合物、金属イオン（カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、生体高分子（例えば、糖、脂質、核酸、タンパク質、ペプチドなど）、合成高分子（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルなど）と共有結合又は非共有結合によって結合又は会合している場合がある。
【００４０】
本明細書において、タンパク質の量は、細胞により産生されたタンパク質の量の他、採取された生物学的試料中に存在するタンパク質の量を含む。所望のタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学染色、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望のタンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で作製された抗体であってかまわないし、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００４１】
本明細書において、タンパク質の量は、測定するときの細胞の数又は全タンパク質の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコなどに播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のタンパク質の量は、候補薬物を添加する前の前記細胞の所望のタンパク質の量を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において、所望のタンパク質の量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコなどに播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照タンパク質の量で標準化される場合がある。前記対照タンパク質は、いわゆるハウスキーピング遺伝子のタンパク質、例えば、β−アクチン、γ−チューブリンを含むが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子のタンパク質の量をＥＬＩＳＡなどによって測定するためには、前記タンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。不溶性凝集体の形成を抑制する薬物のスクリーニングにおいて、候補薬物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００４２】
本明細書において、リン酸化タンパク質の量は、細胞により産生されたリン酸化タンパク質の量の他、採取された生物学的試料中に存在するリン酸化タンパク質の量を含む。所望のリン酸化タンパク質の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学染色、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望のリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で作製された抗体であってかまわないし、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００４３】
本明細書において、リン酸化タンパク質の量は、測定するときの細胞の数又は全タンパク質の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコなどに播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のリン酸化タンパク質の量は、候補薬物を添加する前の前記細胞の所望のリン酸化タンパク質の量を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において所望のリン酸化タンパク質の量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコなどに播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照のリン酸化タンパク質の量で標準化される場合がある。前記対照タンパク質は、いわゆるハウスキーピング遺伝子のタンパク質、例えば、β−アクチン、γ−チューブリンを含むが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子のタンパク質の量をＥＬＩＳＡなどによって測定するためには、前記タンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。不溶性凝集体の形成を抑制する薬物のスクリーニングにおいて、候補薬物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００４４】
本明細書において、凝集体の量は、細胞により産生された凝集体の量の他、採取された生物学的試料中に存在する凝集体の量を含む。所望の凝集体の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学染色、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望の凝集体を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で作製された抗体であってかまわないし、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００４５】
本明細書において、凝集体の量は、測定するときの細胞の数又は全凝集体の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコなどに播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望の凝集体の量は、候補薬物を添加する前の前記細胞の所望の凝集体の量を基準とする測定値で表される場合がある。前記不溶性凝集体は、ＴＤＰ−４３を含む不溶性凝集体を含むが、これらに限定されない。前記不溶性凝集体の形成を抑制する薬物のスクリーニングにおいて、候補薬物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００４６】
前記候補薬物は、微生物、菌類、植物及び動物から調製される化合物と、化学的に合成される化合物とを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記候補薬物は医薬品である。前記候補薬物として、市販の低分子化合物ライブラリー（例えば、プレストウィック・ザ・ケミカルライブラリーなど）が利用できる。
【００４７】
前記ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学染色、免疫沈降法及び免疫比濁法は、市販の試薬、キット、及び／又は、装置を用いて、当業者に周知な標準的な手順で実施できる。
【００４８】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００４９】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００５０】
以下の実施例の実験は公益財団法人東京都医学総合研究所の研究倫理委員会の承認（承認番号：１２−３、承認日：２００４年３月３０日）を得て実施された。
【実施例１】
【００５１】
フローサイトメトリーによる候補薬物の凝集体形成抑制能の評価
材料及び方法
細胞培養
候補薬物の凝集体形成抑制能を評価するために、神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現されるトランスフェクタントが用いられた。このトランスフェクタントの作製及び培養は、原則として、Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ６４（１）：６０−７０（２００８）、Ｎｏｎａｋａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １５；１８（１８）：３３５３−６４（２００９）、及び、国際公開番号  ＷＯ／２００９／１２５６４６に従って行われた。簡潔には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びそのトランスフェクタントは１０％ウシ胎仔血清を含む細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて培養された。以下、特記されない場合には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びそのトランスフェクタントは、３７°Ｃ、５％ＣＯ2及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、播種翌日にウェル中で５０％コンフルエントになるように市販の６ウェルプレートに播種された。
【００５２】
コンストラクション
ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ化した２種類の融合タンパク質（ＧＦＰ−ＴＤＰ４３）それぞれを前記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で発現させるため、前記融合タンパク質をエンコードする２種類の発現ベクターが調製された。１つの発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸の第１６２番目から第４１４番目までとをエンコードするポリヌクレオチド（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）を有する発現ベクターである。もう１つの発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、アミノ酸の第７８番目から第８４番目までの核局在シグナル（ＮＬＳ）及びアミノ酸の第１８７番目から第１９２番目までの領域を欠損したＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質とをエンコードするポリヌクレオチド（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）を有する発現ベクターである。
【００５３】
トランスフェクション
前記発現ベクター１μｇと、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）３μＬと、前記ＯｐｔｉＭＥＭ  １００μＬとの混合液が、５０％コンフルエントの前記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加され、６時間培養された。その後、２種類のトランスフェクタントは、以下の薬物処理に供された。
【００５４】
薬物処理
薬物処理は、原則として、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２１；５８３（１４）：２４１９−２４（２００９）、及び、国際公開番号  ＷＯ／２００９／１２５６４６に従って行われ、ＴＤＰ−４３凝集体形成を抑制するための薬物がハイスループット・スクリーニングされた。簡潔には、前記トランスフェクタントは、候補薬物で４日間処理された。前記候補薬物として、市販の化合物ライブラリー（プレストウィック・ザ・ケミカルライブラリーＶｅｒ．１３、株式会社パーキンエルマージャパン）が用いられた。陰性対照として、溶媒であるＤＭＳＯのみが添加された。陽性対照として、２０μＭのラトレピルジン（ディメボン（商標）、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が添加された。処理後、トランスフェクタントは以下のフローサイトメトリーに供された。
【００５５】
フローサイトメトリー
候補薬物で処理したトランスフェクタントは回収され、１ｍＬのＰＢＳに懸濁された。その後、前記トランスフェクタントのＧＦＰの蛍光強度が、製造者の指示に従ってフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ／ＸＬ−ＭＣＬ：ベックマン・コールター株式会社）で測定された。この評価システムでは、凝集体が形成されると、ＧＦＰも同時に凝集され、その結果として、ＧＦＰの蛍光強度が増加し、凝集体を形成する細胞はＧＦＰの蛍光強度が高い細胞として検出される。したがって、候補薬物の凝集体形成抑制能はＧＦＰの蛍光強度を指標に評価できる。また、この評価システムでは、得られたヒストグラムからＧＦＰを強く発現する細胞の割合（％）が、解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ：トミーデジタルバイオロジー株式会社）を用いて算出され、各候補薬物の凝集体形成抑制能が、陰性対照及び陽性対照と比較された。
【００５６】
結果
図１は、陰性対照群（ＤＭＳＯのみ）、陽性対照群（ラトレピルジン（２０μＭ））、及び、実験群（フルベストラント（２０μＭ））における、ＧＦＰを強く発現する細胞の割合（％）を示すグラフである。各実験条件の標準偏差は、同一条件で３回繰り返した実験結果の測定値から算出された。スチューデントｔ検定において、アスタリスク（＊＊）はｐ値が１％未満であることを示す。ＧＦＰを強く発現する細胞の割合（％）は、陰性対照では約２６％であり、陽性対照では約１９％であり、実験群では約１８％であった。図１に示されるとおり、フルベストラントは、陰性対照と比較して、統計学的に有意に凝集体形成を抑制した。また、フルベストラントの凝集体形成抑制能は、陽性対照と比較して高かった。なお、フルベストラントの細胞毒性は認められなかった（データは示されない。）。
【００５７】
フルベストラントの半数致死量（ＬＤ50）は、上述のとおり、マウスでは３００ｍｇ／ｋｇである。本実施例で用いたフルベストラントの濃度は２０μＭ（０．０１２２ｍｇ／ｍＬ）である。したがって、フルベストラントは、凝集体の形成を抑制する有効性発現濃度は安全域の範囲内であることが示された。
【実施例２】
【００５８】
ウェスタンブロットによる候補薬物の凝集体形成抑制能の評価
材料及び方法
細胞培養、コンストラクション、トランスフェクション及び薬物処理は、原則として、実施例１と同様に行われた。薬物処理３日後に、ＴＤＰ−４３及びリン酸化ＴＤＰ−４３の量がウェスタンブロットによって測定された。
【００５９】
可溶性画分及び不溶性画分の調製
候補薬物で処理したトランスフェクタントは回収され、１ｍＬのＰＢＳに懸濁された。前記トランスフェクタントは、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む細胞破砕溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社））中で超音波破砕され、トランスフェクタントの細胞溶解液が調製された。上清と沈殿とが遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）によって分離され、前記上清が可溶性画分として、前記沈殿が不溶性画分として分画された。これらの画分は、以下のウェスタンブロットによる解析に供された。
【００６０】
ウェスタンブロットは、当業者に周知な標準的な方法で行われた。簡潔には、ＳＤＳサンプルバッファーが前記可溶性画分及び前記不溶性画分に添加された後に熱処理され、ウェスタンブロット用サンプルが調製された。前記サンプルは、１２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離された。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜に転写され、適切に希釈した１次抗体及び２次抗体と反応され、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）と、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ＬＡＳ  ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）とを用いて検出された。
【００６１】
可溶性画分のウェスタンブロットでは、１次抗体として抗ＴＤＰ−４３抗体（１０７８２−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）が、２次抗体としてＢｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が用いられた。不溶性画分のウェスタンブロットでは、１次抗体として自作の抗リン酸化ＴＤＰ−４３（ｐＳ４０９／４１０）抗体（Ａｒａｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２２；３５１（３）：６０２−１１（２００６））が、２次抗体としてＢｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が用いられた。
【００６２】
得られたブロットデータはＩｍａｇｅＪで解析され、ＴＤＰ−４３のリン酸化の割合が算出された。このＴＤＰ−４３のリン酸化の割合に基づいて、候補薬物の凝集体形成抑制能が評価された。サンプル１つあたり実験２回が行われた。
【００６３】
結果
図２−１は、可溶性画分中のＴＤＰ−４３、及び、不溶性画分中のリン酸化ＴＤＰ−４３を示すウェスタンブロット図である。図２−１に示されるとおり、陽性対照群（ラトレピルジン（２０μＭ））、及び、実験群（フルベストラント（２０μＭ））でのリン酸化ＴＤＰ−４３の量は、陰性対照群（ＤＭＳＯのみ）と比較して少なかった。図２−２は、図２−１のウェスタンブロット図から算出したＴＤＰ−４３のリン酸化の割合を示すグラフである。ＴＤＰ−４３のリン酸化の割合は、陰性対照群（ＤＭＳＯのみ）では約０．４１であり、陽性対照群（ラトレピルジン（２０μＭ））では約０．１４であり、実験群（フルベストラント（２０μＭ））では約０．１８であった。図２−２に示されるとおり、フルベストラントは、陰性対照と比較して、顕著にＴＤＰ−４３のリン酸化を抑制した。なお、フルベストラントの細胞毒性は認められなかった（データは示されない。）。
【実施例３】
【００６４】
免疫細胞化学染色による候補薬物の凝集体形成抑制能の評価
材料及び方法
細胞培養、コンストラクション、トランスフェクション及び薬物処理は、原則として、実施例１と同様に行われた。ヒト神経細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はカバーグラス上で培養され、各発現ベクターがトランスフェクションされた。６時間後、トランスフェクタントは候補薬物で処理された。
【００６５】
共焦点顕微鏡観察
トランスフェクション３日後に、トランスフェクタントは、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を用いてカバーグラス上に室温で３０分間固定された。また、膜透過処理が０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを用いて室温で１０分間行われた。さらに、ブロッキングが、５％  ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で３０分間行われた。その後、適切に希釈した１次抗体及び２次抗体それぞれを用いて、抗原抗体反応が３７°Ｃで１時間ずつ行われた。１次抗体として抗リン酸化ＴＤＰ−４３（ｐＳ４０９／４１０）抗体が、２次抗体としてＡｌｅｘａ−５６８標識抗ウサギ抗体が用いられた。細胞の核はＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で３７°Ｃで１時間染色された。前記トランスフェクタントはＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号Ｐ３６９３４、インビトロジェン株式会社）で封入され、共焦点顕微鏡（カールツァイスマイクロスコピー株式会社）で観察された。
【００６６】
この評価システムでは、凝集体が形成されると、ＧＦＰも同時に凝集され、その結果として、ＧＦＰの蛍光強度が増加し、凝集体を形成する細胞はＧＦＰの蛍光強度が高い細胞として検出される。したがって、候補薬物の凝集体形成抑制能はＧＦＰの蛍光強度を指標に評価できる。この評価システムでは、レーザーの波長（４８８ｎｍ）は、ＴＤＰ−４３凝集体のみを検出できるように調節された。またＴＯ−ＰＲＯ−３の染色シグナルを視野内の細胞数とみなすことによって、凝集体形成の割合が算出された。サンプル１つあたり視野８つ以上の画像データが取得され、数値化された。
【００６７】
結果
図３は、共焦点顕微鏡の画像データから算出した凝集体形成の割合を示すグラフである。凝集体形成の割合は、陰性対照群（ＤＭＳＯのみ）では約０．０４３であり、陽性対照群（ラトレピルジン（２０μＭ））では約０．０２１であり、実験群（フルベストラント（２０μＭ））では約０．０２４であった。図３に示されるとおり、フルベストラントは、陰性対照と比較して、統計学的に有意に凝集体形成を抑制した。なお、フルベストラントの細胞毒性は認められなかった（データは示されない。）。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
フルベストラントがＴＤＰ−４３の凝集及びリン酸化を顕著に抑制することができる。したがって、フルベストラントを有効成分として含む医薬組成物は、ＴＤＰ−４３の凝集体の異常蓄積を伴うさまざまな神経変性疾患（いわゆるＴＤＰ−４３プロテイノパチー）の治療又は予防に有用である。
【図１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図２−１】
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