(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内でヒアルロン酸の生成を刺激するための方法、及び組成物の提供。【解決手段】繊維芽細胞とアスコルビン酸誘導体、好ましくは、３−Ｏ−アルキル−アスコルビン酸、特に、３−Ｏ−エチル−アスコルビン酸とを反応させ、生体内でヒアルロン酸の生成を刺激するための方法、及び組成物。アスコルビン酸誘導体の濃度は７５００ｐｐｍ〜１．２５ｐｐｍ、特に、２５００ｐｐｍ〜１．２５ｐｐｍの範囲であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞とアスコルビン酸誘導体を反応させる工程を含み、該アスコルビン酸誘導体は以下の一般式
2014094940.tif 000013
（式中、Ｒ１とＲ２は独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数１〜２０のヘテロシクロアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアシル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数１〜２０の複素環式芳香族基、及び炭素数３〜２０のシクロアルケニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、Ｒ１とＲ２は同時に水素原子である場合はない）で表される構造を有することを特徴とする、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項２】
前記アスコルビン酸誘導体の濃度は7500ppm〜1.25ppmの範囲にあることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項３】
前記アスコルビン酸誘導体の濃度は2500ppm〜1.25ppmの範囲にあることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸であることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項５】
前記3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸のアルキル基は炭素数２〜２０のアルキル基であることを特徴とする請求項４記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項６】
前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸であることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法。
【請求項７】
繊維芽細胞と反応することによりヒアルロン酸の生成を刺激するアスコルビン酸誘導体を含み、前記アスコルビン酸誘導体は以下の一般式
2014094940.tif 000014
（式中、Ｒ１とＲ２は独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数１〜２０のヘテロシクロアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアシル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数１〜２０の複素環式芳香族基、及び炭素数３〜２０のシクロアルケニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、Ｒ１とＲ２は同時に水素原子である場合はない）で表される構造を有することを特徴とする、ヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【請求項８】
前記アスコルビン酸誘導体の濃度は7500ppm〜1.25ppmの範囲にあることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【請求項９】
前記アスコルビン酸誘導体の濃度は2500ppm〜1.25ppmの範囲にあることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【請求項１０】
前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸であることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【請求項１１】
前記3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸のアルキル基は炭素数２〜２０のアルキル基であることを特徴とする請求項１０記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【請求項１２】
前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸であることを特徴とする請求項７記載のヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物に係り、特にアスコルビン酸誘導体によるヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（Hyaluronic Acid; HA、又は"ヒアルロナン（Hyaluronan）"という）又はヒアルロン酸ナトリウムは天然に存在して高度に水和する線状重合体であり、二糖（D-glucuronic acid-beta-1, 3-N-acetylglucosamine-beta-1,4）繰り返し単位を含有している。ヒアルロン酸の分子量は1000kDa〜10000 kDaの範囲である。通常ECMと略される細胞外マトリックスの流体が充填される空間には高濃度のヒアルロン酸が発見させられている。ヒアルロン酸の機能は主に水分をECMにロックし、コラーゲンとエラスチンとを濡れ、肌の若々しい外観を表現させることである。
【０００３】
ヒアルロン酸（HA）は、広く治療や美容に使用されている。一般にヒアルロン酸を得るためのソースは、動物の臓器の抽出や、微生物発酵や、化学合成などが挙げられる。上述の方法から得るヒアルロン酸は人にとってインビトロの物質であり、身体に危害する可能性があり、長期に身体内に存在することができない。
【０００４】
上記の問題を考慮すれば、ヒアルロン酸の生成率が高く且つ人の身体へ安全性高いヒアルロン酸の生成を刺激するための新規な方法及び組成物は工業上重要な課題になっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の問題に対して、本発明は、産業の需要を満たすために、刺激されるヒアルロン酸の生成率が高く且つ人の身体へ安全性が高くで、ヒアルロン酸の生成を刺激するための新規な方法及び組成物を提供することを目的としている。したっがて、ヒアルロン酸の製造することはできる。
【０００６】
本発明の一つの目的は、安全性が高くで、人の身体内にヒアルロン酸を生成するために、ヒアルロン酸の生成を刺激するための新規な方法及び組成物を提供する。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、標的領域における繊維芽細胞はヒアルロン酸を作り出すことを刺激させることにより、美容と治療結果を改善するために、ヒアルロン酸の生成を刺激するための新規な方法及び組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法を開示する。本発明のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法は繊維芽細胞とアスコルビン酸誘導体を反応させる工程を含む。本発明によるアスコルビン酸誘導体の刺激により、ヒアルロン酸の生成はより高い効率で、より高い安全性がある。本発明によって、好ましいのは少量のアスコルビン酸誘導体によるヒアルロン酸の生成を効率的に刺激することができる。
【０００９】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法は以下の一般式で表される構造を有するアスコルビン酸誘導体を利用することにより、繊維芽細胞を刺激し、そして、ヒアルロン酸を作り出す。
2014094940.tif 000002
【００１０】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法は、濃度が7500ppm〜1.25ppmであるアスコルビン酸誘導体を利用することにより、繊維芽細胞を刺激し、ヒアルロン酸を作り出す。
【００１１】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法は、3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸を利用することにより、繊維芽細胞を刺激し、ヒアルロン酸を作り出す。
【００１２】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法は、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸を利用することにより、繊維芽細胞を刺激し、ヒアルロン酸を作り出す。
【００１３】
本発明も、ヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物を開示する。上述の組成物はアスコルビン酸誘導体を含む。該アスコルビン酸誘導体はヒアルロン酸を作り出すために繊維芽細胞を刺激する。アスコルビン酸誘導体は以下の一般式で表される構造を持っている。
2014094940.tif 000003
【００１４】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物には、アスコルビン酸誘導体の濃度が7500ppm〜1.25ppmの範囲にある。
【００１５】
本発明の一つ好ましい実施形態において、ヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物には、前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸である。
本発明の特徴、実施と効果について、図面と共に好ましい実施例により、更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明によるマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激するヒアルロン酸の生成濃度をEchelon HA-ELISAで測定して分析する図である。
【図２】本発明による人類の繊維芽細胞（HS68）がアスコルビン酸誘導体により刺激するヒアルロン酸の生成濃度をEchelon HA-ELISAで測定して分析する図である。
【図３】本発明によるマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激するヒアルロン酸の生成濃度をR&D HA-ELISAで測定して分析する図である。
【図４】本発明による人類の繊維芽細胞（HS68）がアスコルビン酸誘導体により刺激するヒアルロン酸の生成濃度をR&D HA-ELISAで測定して分析する図である。
【図５】本発明によるマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸（AA）により刺激するヒアルロン酸の生成濃度をR&D HA-ELISAで測定して分析する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の開示は以下の実施形態及び実施例により説明される。しかし、以下の実施形態又は実施例は本発明の開示の限りではない、ただ、本発明の典型的な例である。
本発明はアスコルビン酸誘導体によるヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物を開示する。本発明を徹底的にご理解いただくために、下記の説明においてステップの詳細及びその構成を提供する。本発明の実施においては当該領域の技術者の熟知する特殊内容に制限されないことは顕著である。また、本発明が不必要に制限されるのを防ぐ為に、周知の組成もしくはステップを詳細内容中に説明しないこととする。本発明の実施例の詳細は次の通りであり、これらの詳細説明の他、本発明はその他実施例に広く応用することが可能であり、しかも本願の発明範囲は制限を受けることはなく、その範囲は下記の特許登録申請の範囲を基準とする。
【００１８】
本発明の一つ好ましい実施形態は、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法を開示している。本実施形態による方法は繊維芽細胞とアスコルビン酸誘導体を反応させる工程を備える。前記アスコルビン酸誘導体は以下の一般式で表される構造を有する。
2014094940.tif 000004
【００１９】
式中、Ｒ１とＲ２は独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数１〜２０のヘテロシクロアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアシル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数１〜２０の複素環式芳香族基、及び炭素数３〜２０のシクロアルケニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。また、Ｒ１とＲ２は同時に水素原子である場合はない。好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸である。この例には、前記3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸のアルキルは炭素数２〜２０のアルキルである。また、好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体の濃度が7500ppm〜1.25ppmの範囲にある。更に、より好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体の濃度が2500ppm〜1.25ppmの範囲にある。
【００２０】
本発明の他の一つ好ましい実施形態は、ヒアルロン酸の生成を刺激するための組成物を開示している。本実施形態による組成物はアスコルビン酸誘導体を含む。前記アスコルビン酸誘導体は以下の一般式で表される構造を有する。
2014094940.tif 000005
【００２１】
式中、Ｒ１とＲ２は独立に水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数１〜２０のヘテロシクロアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアシル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数１〜２０の複素環式芳香族基、及び炭素数３〜２０のシクロアルケニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種である。また、Ｒ１とＲ２は同時に水素原子である場合はない。好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体は3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸である。この例には、前記3-Ｏ-アルキル-アスコルビン酸のアルキルは炭素数２〜２０のアルキルである。
【００２２】
本実施形態によると、アスコルビン酸誘導体は繊維芽細胞と反応するために利用され、繊維芽細胞がヒアルロン酸を作り出すことを刺激する。また、好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体の濃度が7500ppm〜1.25ppmの範囲にある。更に、より好ましいのは前記アスコルビン酸誘導体の濃度が2500ppm〜1.25ppmの範囲にある。
【００２３】
本明細書を説明するために、本発明による好ましいヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物は、以下の記載である。以下の実施例には、ヒアルロン酸の生成を刺激するための方法がマウスの細胞及び人類の細胞それぞれに使用される。しかし、本発明の範囲は以下の説明により制限されず、請求項の記載に準じるものとする。
【００２４】
実施例１．マウスの繊維芽細胞に対するヒアルロン酸の生成を刺激するための方法の通常手順：
以下は3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸をアスコルビン酸誘導体とし、一つの例とし、しかし、本発明の範囲はこれにより制限されない。
材料：
細胞株：3T3（BCRC 60071、Bioresource Collection and Research Centerから購入した。）
洗浄緩衝液：無菌のD-PBS（Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水、Corning Incorporated and Caisson Labsから購入した。）
完全培地（陽性対照組）：10％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum; FBS）を含有するDMEM媒体（DMEMはCorning Incorporated and Caisson Labsから購入した。FBSはCaisson Labsから購入した。）
飢餓培地（陰性対照組）：0.1％ウシ血清を含有するDMEM媒体（DMEMはCorning Incorporated and Caisson Labsから購入した。FBSはCaisson Labsから購入した。）
試験材料：3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸
ヒアルロナン酵素免疫測定（HA-ELISA）キット（ブラッド：Echelon /Cat No：K-1200）
【００２５】
細胞播種：
完全培地は細胞播種段階に使用された。3T3細胞はコンフルエントになった後、無菌のD-PBSで洗浄され、トリプシン処理された、最後に、細胞の数を計数した。その後、細胞密度を4E+04/ｍLに希釈し、0.5ｍL細胞液（約2E+04個の細胞）を24ウェルの各ウェルに播種した。37℃、5％CO2、24時間の条件で、3T3細胞をインキュベートした。
【００２６】
対照組/試験材料の処理：
飢餓培地はこの段階に使用された。24時間で培養した3T3細胞は無菌のD-PBSで洗浄された後、洗浄緩衝液を廃棄した。異なる濃度の対照組/試験材料を24ウェルの3T3細胞に添加した。その後、37℃、5％CO2、72時間の条件で、3T3細胞をインキュベートした。
【００２７】
ヒアルロン酸の定量：
72時間のインキュベート後、対照組/試験材料で処理した細胞の上澄みの一部を新た容器に移送した。上澄みを2000ppmで5〜10分間遠心分離した。遠心分離した上澄みのヒアルロン酸の含有量はHA-ELISAキットによる決定され、以下の式１を利用することにより計算された。
2014094940.tif 000006
【００２８】
上述試験を繰り返してからの結果は以下の表１に示された。表１を参照し、陰性対照組と比較すると、2500ppmの3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸が刺激したヒアルロン酸の生成量は230.6％である。表１に示すように、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は10〜5000ppmであると、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体によって効率的に増加されることができる。つまり、この明細書によると、ヒアルロン酸の生成を刺激することは少量のアスコルビン酸誘導体による効率的に増加されることができる。
【００２９】
3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は7500ppm以上であると、細胞の生存能力は阻害されるから、その試験組（高い濃度）には刺激されたヒアルロン酸の生成量及びアスコルビン酸誘導体の使用量の関係を顕著に現れることではない。また、高濃度のアスコルビン酸誘導体は細胞に毒性を有する可能性があり、ヒアルロン酸の分泌量は減少される。
【００３０】
【表１】
2014094940.tif 000007
＊ ：この試料の濃度は標準曲線以外にある。
表１はマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の生成量を測定するデータ分析を示す。
【００３１】
図1は表１に示されたマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の分泌量を表す。図１に示すように、アスコルビン酸誘導体はヒアルロン酸の生成を刺激することを改善できる。
【００３２】
実施例２．人類の繊維芽細胞に対するヒアルロン酸の生成を刺激するための方法の通常手順：
以下は3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸をアスコルビン酸誘導体とし、一つの例とし、しかし、本発明の範囲はこれにより制限されない。
材料：
細胞株：Hs68（BCRC 60038、Bioresource Collection and Research Centerから購入した。）
洗浄緩衝液：無菌のD-PBS（Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水、Corning Incorporated and Caisson Labsから購入した。）
完全培地（陽性対照組）：10％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum; FBS）を含有するDMEM媒体（DMEMはCorning Incorporated and Caisson Labsから購入した。FBSはCaisson Labsから購入した。）
飢餓培地（陰性対照組）：0.1％ウシ血清を含有するDMEM媒体（DMEMはCorning Incorporated and Caisson Labsから購入した。FBSはCaisson Labsから購入した。）
試験材料：3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸
ヒアルロナン酵素免疫測定（HA-ELISA）キット（ブラッド：Echelon /Cat No：K-1200）
【００３３】
細胞播種：
完全培地は細胞播種段階に使用された。Hs68細胞はコンフルエントになった後、無菌のD-PBSで洗浄され、トリプシン処理された、最後に、細胞の数を計数した。その後、細胞密度を4E+04/ｍLに希釈し、0.5ｍL細胞液（約2E+04個の細胞）を24ウェルの各ウェルに播種した。37℃、5％CO2、24時間の条件で、Hs68細胞をインキュベートした。
【００３４】
対照組/試験材料の処理：
飢餓培地はこの段階に使用された。24時間で培養したHs68細胞は無菌のD-PBSで洗浄された後、洗浄緩衝液を廃棄した。違い濃度の対照組/試験材料を24ウェルのHs68細胞に添加した。その後、37℃、5％CO2、72時間の条件で、Hs68細胞をインキュベートした。
【００３５】
ヒアルロン酸の定量：
72時間のインキュベート後、対照組/試験材料で処理した細胞の上澄みの一部を新た容器に移送した。上澄みを2000ppmで5〜10分間遠心分離した。遠心分離した上澄みのヒアルロン酸の含有量はHA-ELISAキットによる決定され、以下の式２を利用することにより計算された。
2014094940.tif 000008
【００３６】
上述試験を繰り返してからの結果は以下の表２に示された。表２を参照し、陰性対照組と比較すると、1000ppmの3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸が刺激したヒアルロン酸の生成量は最大に205.4％である。表２に示すように、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は1000〜10ppmであると、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体の使用量に依存性がある。また、表２に示すように、この明細書によると、ヒアルロン酸の生成を刺激することは少量のアスコルビン酸誘導体による効率的に増加されることができる。
【００３７】
3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は10000ppmであると、細胞の生存能力は阻害されるから、その試験組（10000ppm）には刺激されたヒアルロン酸の生成量及びアスコルビン酸誘導体の使用量の関係を顕著に現れることではない。また、高濃度のアスコルビン酸誘導体は細胞に毒性を有する可能性がある。
【００３８】
【表２】
2014094940.tif 000009
表２は人類の繊維芽細胞（Hs68）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の生成量を測定するデータ分析を示す。
【００３９】
図２は表２に示された人類の繊維芽細胞（Hs68）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の分泌量を表す。図２に示すように、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体の使用量に依存性がある。
【００４０】
実施例３．マウスの繊維芽細胞に対するヒアルロン酸の生成を刺激するための試験：
この例に、別のブランドのHA-ELISAキット（R&D HA-ELISA、Cat No. DHYAL0）を使用し、刺激効果の再現性を考え出しだ。Echelon HA-ELISAの代わりにR&D HA-ELISAを利用する以外は他の材料と工程が実施例１と同様にして、試験を行った。
【００４１】
上述試験を繰り返してからの結果は以下の表３に示された。表３を参照し、陰性対照組と比較すると、5000ppmの3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸が刺激したヒアルロン酸の生成量は最大に240.5％である。表３に示すように、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は5000〜5ppmであると、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体の使用量に依存性がある。また、表３を参照し、この明細書によると、ヒアルロン酸の生成を刺激することは少量のアスコルビン酸誘導体による効率的に増加されることができる。
【００４２】
【表３】
2014094940.tif 000010
表３はマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の生成量を測定するデータ分析を示す。
【００４３】
図３は表３に示されたマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の分泌量を表す。図３に示すように、別のブランドのHA-ELISAキットを使用しても、アスコルビン酸誘導体はヒアルロン酸の生成を刺激し、また、ヒアルロン酸の生成を刺激する効果が顕著にある。
【００４４】
実施例４．人類の繊維芽細胞に対するヒアルロン酸の生成を刺激するための試験：
この例に、別のブランドのHA-ELISAキット（R&D HA-ELISA、Cat No. DHYAL0）を使用し、刺激効果の再現性を考え出しだ。Echelon HA-ELISAの代わりにR&D HA-ELISAを利用する以外は他の材料と工程が実施例２と同様にして、試験を行った。
【００４５】
上述試験を繰り返してからの結果は以下の表４に示された。表４に示すように、陰性対照組と比較すると、100ppmの3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸が刺激したヒアルロン酸の生成量は最大に174.9％である。表４によると、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は1000ppm、100ppm、7.5ppmでそれぞれ制御されると、刺激されたヒアルロン酸の生成量それぞれは133.9％、121.9％、134.0％である。好ましいのは3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は2.5ppmであると、刺激されたヒアルロン酸の生成量も136.7％である。つまり、表４を参照し、ヒアルロン酸の生成を刺激することは少量のアスコルビン酸誘導体による効率的に増加されることができる。表４に示すように、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の濃度は1000〜10ppmであれば、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体の使用量に依存性がある。
【００４６】
【表４】
2014094940.tif 000011
表４は人類の繊維芽細胞（Hs68）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の生成量を測定するデータ分析を示す。
【００４７】
図４は表４に示された人類の繊維芽細胞（Hs68）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の分泌量を表す。図４に示すように、別のブランドのHA-ELISAキットを使用しても、刺激されたヒアルロン酸の生成量はアスコルビン酸誘導体の使用量に依存性があり、また、ヒアルロン酸の生成を刺激する効果が顕著にある。
【００４８】
実施例５．アスコルビン酸によるマウスの繊維芽細胞に対するヒアルロン酸の生成を刺激するための試験：
この例に、アスコルビン酸による刺激効果を発見するかどうかを確認する。Echelon HA-ELISAの代わりに別のブランドのHA-ELISAキット（R&D HA-ELISA、Cat No. DHYAL0）を使用し、3-Ｏ-エチル-アスコルビン酸の代わりにアスコルビン酸を試験材料とする以外は他の材料と工程が実施例１と同様にして、試験を行った。
【００４９】
上述試験を繰り返してからの結果は以下の表５に示された。表５に示すように、陰性対照組と比較すると、2〜100ppmのアスコルビン酸はヒアルロン酸の生成を刺激することがない。また、あるケース（エントリー）にはヒアルロン酸の生成量を減少することもある。つまり、この明細書の開示と比較すると、アスコルビン酸はヒアルロン酸の生成を刺激する物質に利用されことはできない。
【００５０】
【表５】
2014094940.tif 000012
表５はマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の生成量を測定するデータ分析を示す。
【００５１】
図５は表５に示されたマウスの繊維芽細胞（3T3）がアスコルビン酸誘導体により刺激されるヒアルロン酸の分泌量を表す。図５に示すように、アスコルビン酸はヒアルロン酸の生成を刺激することができない。
【００５２】
結論として、本願はヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物を提案した。本願による方法は繊維芽細胞とアスコルビン酸誘導体を反応させる工程を含む。本願による組成物は繊維芽細胞と反応することによりヒアルロン酸の生成を刺激するアスコルビン酸誘導体を含む。アスコルビン酸誘導体によるマウス及び人類の繊維芽細胞に対する試験によって、ヒアルロン酸の生成量は効率的に増加されることができる。上述のヒアルロン酸の生成を刺激するための方法及び組成物はインビトロでマウス及び人類の細胞のヒアルロン酸を生成することを刺激できる。より好ましいのは、ヒアルロン酸の生成を刺激することは少量のアスコルビン酸誘導体を使用することにより達成できる。つまり、本願は治療と美容領域における細胞内のヒアルロン酸の生成を増加するために、より安全性がある効率な方法を提供する。
【００５３】
以上の実施例は本発明を説明するために提示されたものであり、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の要旨より離脱せずに当業者がなしうる各種の変更或いは修飾することは、本発明の請求範囲に属するものとする。特定の実施例は例として説明されるが、各種の変更或いは修飾することはでき、本発明の請求範囲は下記の特許登録申請の範囲を基準とする。
【図１】
2014094940.tif 000015
【図２】
2014094940.tif 000016
【図３】
2014094940.tif 000017
【図４】
2014094940.tif 000018
【図５】
2014094940.tif 000019
【外国語明細書】
2014094940000001.pdf