(57)【要約】【課題】生体内物質の優れた物質識別能力を保持しつつ、長期間安定維持できる化学物質を探求し、それを利用した測定システムを構築し市場に供給することを目的とする。【解決手段】表面プラズモン共鳴又は磁気センシング測定用のペプチドプローブであって、被検物質に対して特異的結合能を示す被検物質結合部位を少なくとも１つ含むペプチド領域と、表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体表面に、ペプチド領域を固定化するためのリンカー領域とを含み、ここで、リンカー領域は分子長４〜２１の分子鎖から構成されているペプチドプローブ、及びペプチドプローブを利用した被検物質の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴又は磁気センシング測定用のペプチドプローブであって、
被検物質に対して特異的結合能を示す被検物質結合部位を少なくとも１つ含むペプチド領域と、
前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体表面に、前記ペプチド領域を固定化するためのリンカー領域とを含み、ここで、前記リンカー領域は分子長４〜２１の分子鎖で構成されているペプチドプローブ。
【請求項２】
前記リンカー領域が、分子長８〜２１の分子鎖で構成されている請求項１に記載のペプチドプローブ。
【請求項３】
前記固相担体表面が正又は負に荷電された状態であるとき、前記リンカー領域が非荷電性の分子鎖で構成されている請求項１又は２に記載のペプチドプローブ。
【請求項４】
前記リンカー領域が、アルキル鎖、又はペプチド核酸鎖である請求項３に記載のペプチドプローブ。
【請求項５】
前記固相担体表面が非荷電状態であるとき、前記リンカー領域が両親媒性の分子鎖で構成されている請求項１又は２に記載のペプチドプローブ。
【請求項６】
前記リンカー領域が、ポリエチレングリコール鎖、又は核酸鎖である請求項５に記載のペプチドプローブ。
【請求項７】
前記ペプチド領域が、４〜１１アミノ酸で構成されている請求項１〜６の何れか一項に記載のペプチドプローブ。
【請求項８】
前記ペプチド領域が、８アミノ酸で構成されている請求項７に記載のペプチドプローブ。
【請求項９】
前記ペプチド領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド鎖である請求項１〜８の何れか一項に記載のペプチドプローブ。
【請求項１０】
表面プラズモン共鳴又は磁気センシングによる被検物質の測定方法であって、
前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体表面に、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドプローブを前記リンカー領域を介して固定化する工程、
前記固相担体表面に固定化された前記ペプチドプローブに前記被検物質を接触させる工程、及び
前記ペプチドプローブの前記ペプチド領域に結合した前記被検物質を、前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングにより検出する工程、を含む被検物質の測定方法。
【請求項１１】
前記ペプチドプローブの前記ペプチド領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド鎖である請求項１０に記載の被検物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ペプチドプローブ及び当該ペプチドプローブを利用した被検物質の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
妊娠検査薬等の臨床診断で多用されているイムノクロマト式アッセイ法等では、抗体等の天然の生理活性物質を濾紙やメンブランフィルター等に塗布して、前記生理活性物質ともう1つ別の生理活性物質で被検物質をサンドイッチ式に挟んで、後者の生理活性物質を検出することにより測定するのが一般的である。また、遺伝子を用いた臨床診断においても、被検物質であるDNA等の核酸を濾紙やメンブランフィルター等に固定して測定するという概念は同様である。上述の生理活性物質や核酸等は、生体内物質であることから、気温や湿度等の外的環境の変化により、その活性は変化する。通常は、活性が減衰する方向に働くので、臨床診断の場合には、本来のシグナルよりも低い数値となる。その結果、実際には陽性の反応を示しているにもかかわらず陰性と判断される偽陰性となり、疾病の存在を見逃すという問題を引き起こしていた。
【０００３】
これらの問題を防ぐため、プローブとなる生理活性物質や核酸等の生体内物質を濾紙等に固定した後、一旦、乾燥させることによって活性を一定レベルまで下げ、長期的には活性の変動幅を抑えるという保存方法が一般的に行われている。通常、生理活性物質は乾燥により、活性は50％程度に減衰するが、その後1年の活性変動幅は10〜20％程度で安定する。しかしながら、１年後からも活性が徐々に低下することは避けられない。昨今、疾病の症状や治癒の進行具合を判定する等の臨床診断分野等で定量的な解析の必要性が増大しており、当該生体内物質の活性を安定化させることは急務であった。
【０００４】
近年、生理活性物質や核酸等の生体内物質を長期に亘って安定化させる方法が研究開発されている。例えば、抗体、抗原、酵素等のタンパク質が溶液中で不活性化することを抑制するタンパク質の安定化方法が報告されている（例えば、特許文献１、２等を参照）。特許文献１は、タンパク質を含有する溶液にペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを添加することにより、この物質のもつペプチジルプロリルシス−トランス異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作用等によりタンパク質の活性の低下を防御するものである。特許文献２は、溶液状態で存在する抗原又は抗体の特異性及び親和力、結合力を維持したまま長期間安定的に保存するために、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチン等のペプチド性プロテアーゼインヒビターを添加するものである。また、複数のバイオマーカーにより癌を診断することにより、生理活性物質の活性の変動及び各個体毎に生じる誤差を吸収して診断の正確度を向上させる方法も報告されている（例えば、特許文献３を参照）。
【０００５】
しかしながら、上述の技術は何れも生理活性物質や核酸等の生体内物質の活性の変動は、必然的に生じる事象であるとし、その活性変動幅を可能な限り低減することを目的とするものあった。したがって、生体内物質の活性の変動という問題を根本的に解決するものではなく、対処療法的な性格を持つに過ぎなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２９５９６号公報
【特許文献２】特開平６−２７３４１８号公報
【特許文献３】特表２０１２−５０２２８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明の目的は、抗体等の生体内物質を利用する測定システムにおける、当該生体内物質の長期的安定性の問題点を根本的に解決することにある。従来においては、生体内物質、特に抗体は、高い結合活性と特異性を有し、かつ抗体産生技術は確立された技術であるため、根本的な問題解決を先延ばししてきたといえる。そこで、生体内物質の優れた物質識別能力を保持しつつ、長期間安定維持できる化学物質を探求し、それを利用した測定システムを構築し市場に供給することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、被検物質を検出するプローブとしてペプチドを利用することにより、生体内物質の優れた物質識別能力を保持しつつ、長期間安定維持できることを見出し、そして、当該ペプチドを表面プラズモン共鳴や磁気センシング等の反応場となる固相担体に固定化する際のリンカーの分子長を好適化することにより高感度かつ高精度な測定システムを構築できることを見出した。さらに、固相担体表面とリンカーの荷電特性を好適化することにより、更なる感度及び精度の向上を実現できることを見出し、これらの知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、以下の〔１〕〜〔１１〕に示す発明を提供する。
〔１〕表面プラズモン共鳴又は磁気センシング測定用のペプチドプローブであって、
被検物質に対して特異的結合能を示す被検物質結合部位を少なくとも１つ含むペプチド領域と、
前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体表面に、前記ペプチド領域を固定化するためのリンカー領域とを含み、ここで、前記リンカー領域は分子長４〜２１の分子鎖から構成されているペプチドプローブ。
〔２〕前記リンカー領域が、分子長８〜２１の分子鎖から構成されている。
〔３〕前記固相担体表面が正又は負に荷電された状態であるとき、前記リンカー領域が非荷電性の分子鎖で構成されている。
〔４〕前記リンカー領域が、アルキル鎖、又はペプチド核酸鎖である。
〔５〕前記固相担体表面が非荷電状態であるとき、前記リンカー領域が両親媒性の分子鎖で構成されている。
〔６〕前記リンカー領域が、ポリエチレングリコール鎖、又は核酸鎖である。
〔７〕前記ペプチド領域が、４〜１１アミノ酸で構成されている。
〔８〕前記ペプチド領域が、８アミノ酸で構成されている。
〔９〕前記ペプチド領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
〔１０〕表面プラズモン共鳴又は磁気センシングによる被検物質の測定方法であって、
前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体表面に、上記ペプチドプローブを前記リンカー領域を介して固定化する工程、
前記固相担体表面に固定化された前記ペプチドプローブに前記被検物質を接触させる工程、及び
前記ペプチドプローブの前記ペプチド領域に結合した前記被検物質を、前記表面プラズモン共鳴又は磁気センシングにより検出する工程、を含む。
〔１１〕前記ペプチドプローブの前記ペプチド領域が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【発明の効果】
【００１０】
上記〔１〕〜〔９〕の構成によれば、表面プラズモン共鳴又は磁気センシング測定用のペプチドプローブを提供できる。かかるペプチドプローブは合成ペプチドを被検物質の検出部位とする。したがって、外的環境の変化及び経時的な活性変動及び低下等の、従来のタンパク質等の生理活性物質や核酸等の生体内物質プローブが抱えていた問題を解消することができる。即ち、外的環境変化に測定結果が影響されることなく、また長期間の保存安定性を維持することができる。これにより、臨床診断分野における疾病の症状や治癒の進行具合を判定する等の定量的な解析等、臨床現場の要求に応えた測定システムの構築に貢献することができる。そして、ペプチドプローブは、固相担体表面にリンカー領域を介して固定化されるが、かかるリンカー領域の分子長を好適化して構成されている。被検物質を認識する部位であるペプチド領域と固相担体表面の距離が測定感度に大きな影響を与えるため、リンカー領域の長さの好適化が重要である。つまり、固相反応系の場合、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離が測定されるシグナル強度に影響し、その距離を最適化することにより感度を向上させることができ、高感度、かつ高精度な測定システムの構築を実現することができる。また、本願発明のペプチドプローブは化学的に合成することができることから、抗体のように生産者間及びロット間での活性誤差が生じることがなく、また、生産時に副産物として不純物が混入することないため、被検物質の測定の妨げとなるバックグラウンドノイズを低減でき、高感度、高精度かつ安定性の高い測定システムを構築するために利用することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、通常のペプチド合成機等を利用して安価に生産でき、上述の通り長期保存安定性を有することから大量調製も可能となり、測定システムのコスト削減にも寄与することができる。
【００１１】
特に、上記〔３〕〜〔６〕の構成によれば、本願発明のペプチドプローブのリンカー領域は、固相担体表面の荷電特性に対応してその荷電特性を好適化することができる。これにより、更なる測定感度が向上し、高精度の測定システムの実現に貢献することができる。
【００１２】
さらに、上記〔７〕〜〔８〕の構成によれば、本願発明のペプチドプローブのペプチド領域のアミノ酸長を特定することにより、被検物質を認識する部位であるペプチド領域と固相担体表面の距離が更なる好適化を図れる。このように好適化することにより、測定感度をより向上させることができ、高感度かつ高精度な測定システムの構築を実現することができる。
【００１３】
また、上記〔９〕の構成によれば、癌転移マーカーnm23の高感度かつ高精度な測定を可能とするペプチドプローブを提供することができる。これにより、癌転移に関する知見を得るための高感度かつ高精度な測定システムの構築を実現することができる。
【００１４】
上記〔１０〕〜〔１１〕の構成によれば、被検物質の測定方法を提供することができる。かかる測定方法は、合成ペプチドを被検物質の検出部位とする本願発明のペプチドプローブを使用することにより、外的環境の変化や経時的な活性変動や活性低下等の影響を受けることなく被検物質を測定することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、長期間の保存安定性を維持することができることから、臨床診断分野において疾病の症状や治癒の進行具合を判定する等の定量的な解析等、臨床現場の要求に応えることができる。そして、本願発明のペプチドプローブは、リンカー領域の分子長を好適化していることから、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離等が最適化され、高感度かつ高精度に被検物質を測定することができる。更に、本願発明のペプチドプローブのリンカー領域は、固相担体表面の荷電特性に対応してその荷電特性を好適化されたものであることからも、測定感度の向上が期待でき、高感度かつ高精度に被検物質を測定することができる。そして、本願発明のペプチドプローブは化学的に合成することができることから、抗体のように生産者間及びロット間での活性誤差が生じることがなく、生産時に副産物として不純物が混入することないため、被検物質の測定の妨げとなるバックグラウンドノイズを低減でき、高感度、高精度、かつ安定性をもって被検物質を測定することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、通常のペプチド合成機等を利用して安価に生産でき、かつ長期保存安定性を有することからコスト的にも有利である。
【００１５】
また、上記〔１１〕の構成によれば、癌転移マーカーnm23の高感度かつ高精度な測定を可能となる本願発明のペプチドプローブを利用することから、癌転移に関する知見を得るための測定方法を確立することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願発明のペプチドプローブは、ペプチド領域とリンカー領域を含んで構成される。ペプチド領域は、被検物質を特異的に認識し結合できる領域である。そして、リンカー領域は、ペプチド領域と表面プラズモン共鳴や磁気センシング等の分析反応を実施する固相担体との間に介在して、ペプチド領域を固相担体上に固定化するための領域である。
【００１７】
ここで、被検物質は、ペプチドプローブのペプチド領域と特異的に結合する能力がある物質であれば、特に制限はない。例えば、各種タンパク質、ペプチド、糖、脂質、糖タンパク質、核酸、有機物、無機物等が挙げられる。生体内の癌マーカー、ホルモン、神経伝達物質、成長因子等が例示できる。そして、ペプチド領域と特異的に結合する特定の細胞、生体組織、器官、細菌、ウイルス、真菌等も被検物質となり得る。生体内物質の他、薬剤、農薬、食品添加物や環境ホルモン等の化学物質をも被検物質とすることができる。具体的には、被検物質として、nm23等の癌転移マーカー、PTH（副甲状腺ホルモン）等のホルモンマーカー等が挙げられる。
【００１８】
ペプチド領域は、ペプチド分子鎖から構成され、被検物質に対する特異的結合性、つまり物質識別能を利用して被検物質を特異的に認識し結合できる結合部位を含んで構成される。ペプチド領域に存在する被検物質に対する結合部位は単数であっても複数であってもよく、好ましくは1〜3個の結合部位を有する。したがって、ペプチド領域の全てが被検物質に対する特異的結合性を有するアミノ酸で構成されている必要はなく、ペプチド領域全体で被検物質に対する特異的結合性を示すものでよい。
【００１９】
ペプチド領域としては、特異的結合性の観点から8アミノ酸程度の長さを有するものである。ペプチド領域が短すぎると被検物質への特異的結合能を維持することができず、長すぎると非特異的な結合を誘発する。例えば、好ましくは0〜21アミノ酸長であり、より好ましくは4〜11アミノ酸長又は4〜16アミノ酸長であり、特に好ましくは8アミノ酸長である。このように、ペプチド領域のアミノ酸長を特定することにより、被検物質への特異的結合能を十分に発揮できると共に、当該被検物質を認識する部位であるペプチド領域と固相担体表面の距離の最適化を図ることができる。
【００２０】
ペプチド領域の配列は、被検物質を特異的に認識し、好ましくは特異的結合性を有する限り特に制限はない。そして、ペプチド領域と被検物質との結合性は、抗原と抗体との結合、酵素基質と酵素との結合、DNAとDNA 結合タンパク質との結合等に類似した結合性の他、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合等、ペプチド領域が被検物質を認識できる限り特に制限はない。例えば、被検物質が抗原性物質である場合には、抗原上のエピトープを認識し結合できる配列を利用することができる。また、それとは逆に、被検物質が抗体である場合には、当該エピトープをぺプチド領域に利用することができる。また、被検物質が酵素である場合には、酵素は標的となる基質タンパク質の特定領域の配列を特異的に認識して反応するため、その特定領域のペプチド配列を利用することもできる。また、レセプター−リガンド反応の認識部位の配列等を利用してもよい。具体的には、癌転移マーカーであるnm23結合ペプチド（Arg-Arg-Leu-Thr-Ile-Arg-Asn-Gly：配列番号１）が例示されるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
ここで、ペプチドは、コンビナトリアルケミストリーのアプローチに適した物質である。したがって、被検物質と特異的結合性を有するペプチド鎖の探索や配列最適化等に利用するようにペプチド領域を設計してよい。また、コンビナトリアルケミストリーにより同定されたペプチド鎖をペプチド領域として、本願発明のペプチドプローブを構築してもよい。
【００２２】
ここで、ペプチド鎖とは、2分子以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。ペプチド鎖を構成するアミノ酸としては、天然アミノ酸の他、化学修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。アミノ酸の化学修飾は、例えばリジンのＮ末端アミノ酸であるアミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、トリプトファンのインドール核、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基、セリン、スレオニンの水酸基等の官能基を対象として行うことができる。例えば、アミノ基のアセチル化、スクシニル化、グアニジル化、イミダゾール基のエトキシホルミル化、カルボキシル基のアミド化、エチルエステル化等の化学修飾を行うことができるが、アミノ酸の化学修飾技術については多種多様な技術が報告されており、何れを用いることができる。
【００２３】
また、本願発明で用いられるペプチド鎖は非アミノ酸を含んで構成されていてもよい。そして、当該非アミノ酸と隣接する結合がペプチド結合でない場合があるが、この場合も、本明細書においてはペプチドと称するものとする。例えば、本願発明で用いられるペプチド鎖としては、ペプチド骨格に核酸塩基をもつペプチド核酸鎖であってもよい。当該ペプチド核酸鎖を利用することにより、本願発明のペプチドプローブを核酸の検出に用いることができる。
【００２４】
本願発明のペプチド領域を構成するペプチド鎖は、公知のペプチド合成技術を利用して合成することができる。例えば、液相合成法や固相合成法等の化学合成技術を利用することができる。特に、フルオレニルメトキシカルボニル（以下、「Fmoc」と称する）基やtert-ブトキシカルボニル（以下、「tBoc」と称する）基を利用した固相合成技術を利用する方法が汎用されている。具体的な手法としては、例えば、適当に保護したアミノ酸を、各種縮合方法等により所望のアミノ酸配列を順次担体上で結合させていくことにより行うことができる。一般には、Ｃ末端からＮ末端に向かって合成され、Ｃ末端になるアミノ酸のα-アミノ基以外のすべての官能基を保護したアミノ酸に、カルボキシ基以外のすべての官能基を保護したアミノ酸を縮合させペプチド結合を形成させる。次に、アミノ基を脱保護し、カルボキシル基以外のすべての官能基を保護したアミノ酸を縮合させ、Ｎ末端のアミノ酸に達するまで縮合反応を繰り返すことにより行うことができる。アミノ酸の保護は公知の技術により行うことができ、例えば、アミノ基の保護にはtBoc基、Fmoc基を、カルボキシル基の保護にはメチルやエチル等の短鎖アルキル鎖、4-ニトロベンジル基を利用することができ、市販の各種保護アミノ酸を利用することもできる。縮合反応は、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、ジイソププロピルカルボジイミド等のカルボジイミド類を好ましく使用できる。また、市販のペプチド自動合成装置等を利用することができる。
【００２５】
リンカー領域とは、上述のペプチド領域と、表面プラズモン共鳴や磁気センシング等の分析反応を実施する固相担体との間に介在して、ペプチド領域を固相担体表面上に固定化するための領域である。そのため、リンカー領域は、固相担体表面に固定化可能な部位とペプチド領域を導入できる部位を分子内に含んでいることが好ましい。そして、本願発明のペプチドプローブは、ペプチド領域が有する生体関連物質の特異的結合性を利用して被検物質を検出及び測定等するものである。そのため、リンカー領域は、被検物質以外の被検試料中含まれる夾雑物質等と非特異的な相互作用を示さないものでなければならない。
【００２６】
また、リンカー領域の構造は、直鎖状、分枝状、環状等を問わないが、好ましくは直鎖状である。分枝状及び環状とする場合には、分枝や環の位置や形状等はペプチド領域と被検物質との反応において立体障害等とならないように構成する。
【００２７】
固相担体上を反応場とする表面プラズモン共鳴や磁気センシング等においては、被検物質を認識する部位であるペプチド領域と固相担体表面の距離が測定感度に大きな影響を与えるため、リンカー領域の長さの好適化が重要である。つまり、固相反応系の場合、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離が測定されるシグナル強度に影響し、その距離を最適化することにより感度を向上させることができる。測定感度は、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離が長くなると測定感度が下がり、逆に、短すぎるとペプチド領域による被検物質の認識が立体障害等の要因になり測定感度が低下してしまう。したがって、リンカー領域の長さは、直鎖状リンカーの場合には、分子長を4〜21とすることが好ましく、7〜21、又は8〜21とすることがより好ましく、16とすることが特に好ましい。
【００２８】
また、リンカー領域を分枝状及び環状として構成する場合には、固相担体表面からペプチド領域までの距離が上述した直鎖状リンカーと同程度の長さになるように構成する。例えば、分枝状の場合には、側鎖を含めず主鎖の分子長がリンカー領域の分子長として設計される。
【００２９】
リンカー領域の構成は、固相担体表面の荷電特性に従って選択される。固相担体表面が正又は負に荷電している場合には、リンカー領域は非荷電性の分子鎖により構成される。一方、固相担体表面が非荷電性である場合には、リンカー領域は両親媒性の分子鎖により構成される。このように、荷電特性を好適化することにより、被検物質とペプチド領域の反応性、及び表面プラズモン共鳴や磁気センシング等におけるシグナルの検出強度を高めることができる。
【００３０】
また、リンカー領域の調製は、上記ペプチド領域の調製に続けて行うことができるし、リンカー領域の調製の後にペプチド領域の調製を続けて行ってもよい。例えば、ペプチド合成機等の自動合成装置を用いて順次合成していくように構成することができる。一方、別々に調製したリンカー領域とペプチド領域を連結させてもよい。その場合には、共有結合、物理的吸着、イオン結合等を介して連結することができ、例えば、リンカー領域の反応性官能基とペプチド領域の反応性官能基とを連結させればよい。連結に際して、適当なスペーサーを介在させてもよい。例えば、アミノ基やカルボニル基を反応性官能基として利用するため被検物質との結合には関与しないアミノ酸を付加して、これを連結のために利用してもよい。また、2価以上の官能基を有する多官能性の架橋試薬で架橋固定する架橋法をも利用できる。架橋試薬としては、例えばグルタルアルデヒド、ジイソシアナート化合物、ビスジアゾベンジジン等が利用できる。そして、ビオチン−アビジン結合等の生体内物質の相互作用を利用することができる。スペーサーは、リンカー領域及び固相担体表面の荷電特性に変化を与えないように選択することが好ましい。
【００３１】
リンカー領域が非荷電性の分子鎖として構成される場合、リンカー領域が固相担体表面に固定化される際に荷電を有しないものであれば、リンカー領域として特に制限なく利用することができる。ここで、非荷電性とは、電気を帯びていないことを意味する。つまり、電気的に中性になっている状態であり、イオン化、つまり、電子の授受が行われない状態を指す。例えば、鎖状炭化水素鎖、脂環式炭化水素鎖、芳香族炭化水素鎖等の炭化水素鎖として構成することができる。具体的には、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキルジエニル鎖、ポリエニル鎖等のエチレン系炭化水素鎖、アルキニル鎖等のアセチレン系炭化水素鎖、シクロアルキル鎖、フェニール鎖、ナフチル鎖等のアリール鎖、アリールアルキル鎖等を挙げることできる。また、ペプチド核酸（以下、「PNA」と称する）鎖として構成することもできるが、これらに限定するものではない。特には、アルキル鎖、PNA鎖として構成することが好ましい。
【００３２】
リンカー領域を、アルキル鎖等の炭化水素鎖として構成する場合に、分子長を炭素数として、好ましくは4〜21とし、より好ましくは7〜21、又は8〜21、特に好ましくは16とする。そして、アルキル鎖は当該技術分野で公知の方法により製造でき、例えば、アルケンの水素化やグリニャール試薬の加水分解等を利用して合成することができる。
【００３３】
PNA鎖は、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子鎖であり、具体的には、ペプチド結合で繋がれたN-（2-アミノエチル）グリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもつ分子鎖の総称である。そして、PNA鎖にはDNAやRNAに見られるリン酸基による電荷が存在しない。分子長は、N-（2-アミノエチル）グリシン数であり、好ましくは4〜21とし、より好ましくは7〜21、又は8〜21、特に好ましくは16とする。そして、PNA鎖は当該技術分野で公知の方法により製造でき、例えば、ペプチド合成と同様にFmoc法やtBoc法を利用して合成することができる。
【００３４】
リンカー領域が両親媒性の分子鎖として構成される場合、両親媒性を有するものである限り当該リンカー領域として特に制限なく利用することができる。ここで、両親媒性の分子鎖とは、その内部に親水基と疎水基を有するものを意味する。親水基とは分子の中にある原子団のうち水分子との間に水素結合を形成しやすいものを意味し、一般に、酸素、窒素、硫黄等の原子を含む基、具体的には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基等が例示される。疎水基とは、水に対する親和性が低い原子団を意味し、例えば、上述の炭化水素基等が例示できる。両親媒性分子としては、例えば、上述の炭化水素の１又は数個の水素原子をヒドロキシ基に置換したアルコール、上述の炭化水素の１又は数個の水素原子がカルボニル基に置換した脂肪酸、アンモニアの１又は数個の水素原子が上述の炭化水素に置換したアミン等が挙げられ、また複数個を重合させたものであってもよい。特には、二価のアルコールであるエチレングリコールを複数重合させたポリエチレングリコール（以下、「PEG」と称する）が好ましい。また、塩基と糖、リン酸からなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である核酸鎖であってもよい。核酸鎖は、糖の種類によりDNA鎖とRNA鎖に大別され、リンカー領域として何れをも利用できるが、DNA鎖が好ましい。
【００３５】
PEG鎖は、エチレングリコールが重合した構造をもつ高分子化合物である。ここで、PEG鎖の分子長は、PEG鎖を構成する重合したエチレングリコールの数を意味する。つまり、ポリエチレングリコールの構造式（-CH2-CH2-O-）nにおけるnの数が分子長となり、分子長を4〜21とすることが好ましく、7〜21、又は8〜21とすることがより好ましく、16とすることが特に好ましい。そして、PFG鎖は、当該技術分野で公知の方法により製造でき、例えば、エチレンオキシドをイオン触媒の存在下で重合させること等によって合成することができる。
【００３６】
DNA鎖は、2-デオキシリボースと、プリン若しくはピリミジン塩基及びエステル結合リン酸基によって構成されるヌクレオチド残基が、3´、5´-ホスホジエステル結合し、糖とリン酸基が交互に連なったポリデオキシリボヌクレオチドである。そして、DNA鎖に含まれる塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンであるが、塩基についての制限はない。また、メチル化等の修飾を受けた修飾塩基を含んでいてもよい。そして、DNA鎖の数についても特に制限はなく、一本鎖の他、二本鎖及び三本鎖等の多重鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。DNA鎖の分子長は、塩基数を分子長として、好ましくは4〜21とし、より好ましくは7〜21、又は8〜21、特に好ましくは16とする。そして、DNAは当該技術分野で公知の方法により製造でき、例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等を利用して合成することができる。
【００３７】
本願発明の方法で用いられるペプチドプローブは、表面プラズモン共鳴法（以下、「SPR」と省略する場合がある）や磁気センシング等の固相担体上を反応場とする分析系に好適に使用することができる。
【００３８】
ここで、SPRとは、表面プラズモンを利用して分子の相互作用を分析する手法であり、表面プラズモンとは、金属の表面に沿って伝搬する特殊な電磁波である。具体的には、透明基板上の片側に、金属の薄膜、必要に応じてペプチドプローブを固定化するための薄膜を順に積層して構成した固相担体上の金属の薄膜側にペプチドプローブを固定化する。そして、被検試料を接触させる。被検試料中に被検物質が含まれると、ペプチドプローブと被検物質が結合し、見かけ上の分子量が変化する。この分子量の変化が起因となり、表面プラズモン共鳴に変化が起きるため反射光の屈折率の変化という光学的な変化として検出される。この光学的変化に基づいて被検物質を分析するものである。ここで、被検試料と固相の接触は、連続的な送液方式により被検試料を連続的に供給することができる。
【００３９】
表面プラズモンの共鳴の原理を詳述すると、光源から全反射角以上で光を入射させると、光が反射するときエバネッセント波が透明基板と金属薄膜の界面にごく僅かに生じる。一方、金属薄膜にも表面プラズモンが発生し得る。そして、エバネッセント波が伝わる速度が、発生し得る表面プラズモンの波動の伝わる速度が一致する時に共鳴が起こり、表面プラズモンが誘発され、光エネルギーが表面プラズモンの波動のエネルギーに変化する。このように光エネルギーの一部が表面プラズモンの励起に利用されるため反射光として戻る光エネルギーに変化が起こることを利用した装置が利用される。つまり、透明基板表面上に金属を蒸着させ薄膜を作製し、本願発明のペプチドプローブを固定化する。そこへ、被検試料を流して被検物質とペプチドプローブを接触させる。接触の前後で一定波長の光を金属薄膜に照射し反射光の時間変化を観測する。反射光は表面プラズモン現象によって金属薄膜近傍の物質の密度の影響を受ける。したがって、被検物質が結合することよって表面の密度が高くなる。これを感知することによって被検物質を検出するものである。また、光化学的な変化を経時的に検出することができ、結合過程及び解離過程の解析から結合速度定数と解離速度定数を算出することができる。
【００４０】
固相担体は、透明基板上に、金属の薄膜、必要に応じてペプチドを固定化するための薄膜を順に積層して構成される。固相の形状は、SPRに適した形状であれば、特に制限はなく、平板形状、球体形状、立方体等の立体形状等であってもよい。あらゆる形状のものを利用することができる。好ましくは、シート状又は板状として形成される。また、各層の厚みも適宜、調整することができる。
【００４１】
透明基板としては、任意の透明の不溶性材料を利用でき、ガラス、シリコンであっても、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等の合成高分子ポリマーであってもよい。
【００４２】
金属の薄膜としては、金、銀、銅、白金、およびアルミニウム等を利用することができ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよい。酸化などの耐久性の観点からは金が好ましい。金属の薄膜の形成は、公知の方法の何れを使用しても行ってよく、例えば、スパッタリング法、蒸着法、電気めっき法、無電解めっき法等によって金属膜の薄膜を基板上に形成することができる。
【００４３】
そして、固相担体表面の荷電特性は、リンカー領域の構成に応じて適宜好適化することが好ましい。リンカー領域が非荷電性である場合には正又は負に荷電するように構成され、リンカー領域が両親媒性の場合には非荷電性となるように構成される。したがって、ペプチドプローブを固定化するための薄膜を積層する場合や表面処理を行う場合には、荷電特性を考慮する必要がある。
【００４４】
ここで、正又は負に荷電した固相担体表面とは、固相担体の表面が電気を帯びていることを意味する。正に荷電とはプラスの電荷を持っている状態を指し、負に荷電とはマイナスの電荷を持っている状態を指す。非荷電性とは、固相担体の表面が電気を帯びていないことを意味する。したがって、固相担体表面が電気的に中性になっている状態であり、イオン化、つまり、電子の授受が行われない状態を指す。
【００４５】
ペプチドプローブを固定化するための薄膜を積層する場合には、上述したとおり、薄膜は固相担体表面の荷電特性に影響を与えることから、所望の荷電特性を有する材料により構成する。薄膜を非荷電性とする場合には、非荷電特性を有する任意の不溶性材料により構成できる。例えば、デキストラン、セルロース等の中性糖類が多重重合した多糖類、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等の合成高分子ポリマー等、また、これらの組み合わせ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。薄膜を正又は負に荷電させる場合には、正又は負の荷電特性を有する任意の不溶性材料により構成できる。したがって、具体的には、その内部に、カルボキシル基、アミノ基、スルホン基、リン酸基等の官能基を包含するものが例示される。したがって、上述の非荷電材料の一部に、カルボキシル基、アミノ基、スルホン基、リン酸基等の官能基を導入したものを好適に利用することができる。例えば、カラギナン、デキストラン硫酸、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース等の多糖類や、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸、ポリアミド等の合成ポリマー等、また、これらの組み合わせ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
また、ペプチドプローブを固定化するための薄膜は、自己組織化単分子膜として構成してもよい。自己組織化単分子膜とは、金、白金、銀、銅等の金属面等の固相担体表面に有機分子自身が自発的に結合、集積、規則正しく組織化して形成される単分子膜である。このような自己組織化単分子膜を形成する有機分子としては、チオール基、ジスルフィド基、セレノール基、イソシアニド基等を含む有機分子が知られており、特にアルカンチオールが汎用されている。また、ペプチドプローブの固定化を容易にするべく、種々の官能基が導入した自己組織化単分子膜が知られており、それらを好適に利用することができる。
【００４７】
ペプチドプローブの固相担体表面への固定化は、リンカー領域の固相担体表面への固定化により行われ、当該ペプチドプローブが有する被検物質に対する特異的結合性及び荷電特性に影響を与えない限り、公知の何れの方法をも利用することができる。例えば、共有結合、物理的吸着、イオン結合を介して固定化する担体結合法を利用することができるが、共有結合法が好ましい。共有結合法としては、ジアゾ法、酸アジド法、イソシアナート法、ブロムシアン法、カルボニル基とアミノ基の直接縮合法、ジスルフィド結合法等が例示できるが、これに限定されるものではない。そして、リンカー領域及び固相担体表面のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホン基、リン酸基、チオール基、イミダゾール基等の反応性官能基を利用して固定化することが好ましい。また、固定化に際して、これらの官能基を活性化することができ、例えば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド (WSC)とN-ヒドロキシコハク酸イミド (NHS)等でカルボキシル基を活性化させてもよい。
【００４８】
固定化に際して、適当なスペーサーを介在させてもよい。例えば、アミノ基やカルボニル基等を反応性官能基として利用するため被検物質との結合には関与しないアミノ酸を付加してこれを連結のために利用してもよい。また、２価以上の官能基を有する多官能性の架橋試薬で架橋固定する架橋法をも利用できる。架橋試薬としては、例えばグルタルアルデヒド、ジイソシアナート化合物、ビスジアゾベンジジン等が利用できる。そして、ビオチン−アビジン結合等の生体内物質の相互作用を利用することができる。スペーサーは、リンカー領域及び固相担体の荷電特性に変化を与えないように選択される。さらに、多糖類、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、光架橋性ポリマー等の網目構造をもつポリマー、透析膜等の半透性膜内に封入して固定化する包括法等をも利用することができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
公知の種々のSPR装置を利用することができ、例えば、クレッチマン機構を利用した装置を利用することができる。SPR装置としては、市販品を利用することができ、例えば、Biacore 1000等を利用することができる。SPR装置の構造を、一例を挙げて説明すると、透明基板上に、金属薄膜、ペプチドを固定化できる薄膜が順に配置された固相担体と、前記透明基板の金属薄膜が形成されていない側に配置されたプリズムと、前記透明基板と前記金属薄膜との界面に対して種々の角度で光を入射させることができる光源と、前記透明基板と金属薄膜との界面で反射した光の強度を測定する光検出器とを備えて構成される。
【００５０】
また、磁気センシングとは、磁性物質や電流が発する磁気や地磁気等の大きさや向きを検知することにより、物質の相互作用を分析する手法である。例えば、磁性センサー等を利用することができる。具体的には、固相担体上にペプチドプローブを固定化する。そして、被検試料を接触させると、被検試料中に被検物質が含まれると、ペプチドプローブのペプチド領域と被検物質が結合する。そして、被検物質からの磁気信号強度を検出することにより被検物質を分析するものである。被検物質からの磁気信号強度の検出は、例えば、被検物質を磁性粒子で標識することにより行うことができ、被検物質に対して特異的結合性を有する物質、例えばペプチドや抗体等を、磁性粒子で標識することによって行うことができる。
【００５１】
ここで、磁性粒子とは、磁場内で磁化される磁性体物質を含むものであり、かつ粒子として形成されたものを意味する。磁性体物質は、強磁性体、反磁性体、常磁性体、超常磁性体、フェリ磁性体等に分類される。磁気信号を検出でき、ペプチドプローブと被検物質の特異的結合性、ペプチドプローブと固相担体の荷電特性及びその他の測定試薬類の機能を阻害しない何れをも利用することができる。例えば、鉄、コバルト、ニッケル、ガドリニウム等の強磁性金属、鉄−ニッケル、鉄−コバルト等の前記強磁性金属を同士の合金、強磁性金属を含む合金、マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γ-Fe2O3）及びその中間体等の各種フェライト類に代表される強磁性金属の酸化物等が挙げられる。特には化学的安定性及び磁場に対する反応性の観点からフェライト類の使用が好ましく、フェライト類にコバルト、マンガン、ニッケル、亜鉛等の金属を添加したものも好適に利用することができる。
【００５２】
磁性粒子の形状や大きさには特に制限はなく、ペプチドプローブと被検物質の特異的結合性、ペプチドプローブと固相担体の荷電特性及びその他の測定試薬類の機能を阻害しない限り、適宜、好適な形状及び大きさが選択される。形状としては、例えば、球状、楕円体状、粒状、立方体状、柱状、棒状、板状、針状、繊維状、塊状等が挙げられ、均一形状に成形することが好ましい。また、磁性粒子は、ナノ粒子又はマイクロ粒子として構成することが好ましく、特に好ましくは、磁性ナノ粒子である。具体的な平均コア粒径としては、例えば、1nm〜3μmが好ましく、10 nm〜150nmがより好ましく、15nm〜30nmが特に好ましい。
【００５３】
磁性粒子は、磁性体物質のみで構成してもよく、磁性体物質が粒子の全体又は表面に分布するように構成しても、粒子の内部に封入して構成してもよい。例えば、磁性体物質が一様に分布したポリマー等を粒子状に形成してもよく、ポリマー等に磁性体物質が一様に分布した核を、ポリマー等で被覆することによって調製することができる。ポリマーは、親水性ポリマー及び疎水性ポリマーの別は問わず、測定態様に応じて適宜選択することができる。具体的には、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の高分子ポリマーを好適に使用することができる。また、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基、トシル基、ヒドロキシル基等の官能基を導入して機能性を発現するように構成してもよい。なお、調製に際しては、一粒子当たりの磁化が均一になるように調製することが好ましい。
【００５４】
磁性粒子での標識は、磁性粒子や標識され得る被検物質に対する特異的結合性を有する物質の安定性と機能性を保持できる限りは、公知のいずれを標識技術をも使用できる。例えば、物理的吸着法及び化学的結合法が例示される。物理的吸着法は、磁性粒子と捕捉物質とを、水、生理食塩水、各種緩衝液等の水溶性溶媒中で接触させることにより行うことができる。化学的結合法としては、ジアゾ法、酸アジド法、イソシアナート法、ブロムシアン法等による共有結合の形成による標識化が例示される。また、グルタルアルデヒド等の官能基を2以上有する多官能性試薬等の架橋試薬を用いて固定化する方法も利用できる。そして、上述したように、磁性粒子の表面に機能性を発現するように導入されたアミノ基、カルボキシル基、トシル基、ヒドロキシル基等の官能基と、捕捉物質上の官能基を化学的に結合させることもできる。また、適当な鎖長の反応性側鎖（スペーサー）、アルブミンやプロテインA等のタンパク質を介して、磁性粒子と捕捉物質を化学的に結合させることができる。特に、強い親和性と特異性を有するビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）結合法等を利用することができる。
【００５５】
磁気粒子からの磁気信号は磁気センサー等の磁気検出手段によって検出される。磁気信号強度は被検物質の量に比例する。したがって、磁気検出手段は、磁性粒子からの磁気に応答して電気信号を発生するように構成され得ることが好ましい。
【００５６】
被検物質とペプチドプローブとの反応場となり、そして、磁気信号の検知面となる固相担体は、その形状は特に制限はなく、平板形状、球体形状、立方体等の立体形状等であってもよい。好ましくは、平面的に積層された平板形状として構成する。好ましくはアレイとして構成される。例えば、固相担体表面に、複数のウェル、コンパートメント、チャンバー、チャネル等を形成することが好ましい。
【００５７】
そして、固相担体を構成する材料は、シリコンやシリカ、酸化チタン等の無機化合物、アクリルアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート等の合成ポリマー等で製造することができる。そして、PtMn、NiMn、IrMn、PdMn、PdPtMn、RhMn等を主成分とする反強磁性層、Ta、Ru、Cr、Rh、Ir、Au、Ag、Cu、Zr、Pt、Mo、W等を主成分とする非磁性層、NiFe、Co、CoFe等を主成分とする強磁性層、シード層、絶縁体層等を積層してよく、磁気信号の検出方式に応じて適宜選択することができる。そして、固相担体表面の荷電特性は、リンカー領域の構成に応じて適宜好適化することが好ましい。リンカー領域が非荷電性である場合には正又は負に荷電するように構成され、リンカー領域が両親媒性の場合には非荷電性となるように構成される。特に、ペプチドを固定化するための薄膜を積層する場合や表面処理を行う場合には、荷電特性を考慮する必要がある。かかる構成については、SPRの場合と同様に行うことができる。
【００５８】
ペプチドプローブの固相担体表面への固定化は、SPRにおける固定化手法に準じて行うことができるまた、固定化に際しては、非特異的結合の抑制のため、必要に応じて、固相担体表面にブロッキング等の処理を行うこともできる。
【００５９】
磁気の検出は、磁気センサーにより行うことが好ましく、磁気センサーとしては、センサー表面上の磁性粒子からの磁気信号を検出できるものであれば制限はなく、例えば、ホール素子、磁気インピーダンス（magneto-impedance ：MI）素子、磁気抵抗(Magneto Resistive：MR）素子や巨大磁気抵抗（Giant Magneto Resistive：GMR）素子等の磁気抵抗素子、トンネル磁気抵抗（Tunnel Magneto Resistive：TMR）素子、超伝導量子干渉素子（Superconductivity Quantum Interface Device ：SQUID）等を使用することができる。計測手法としては、磁化率測定や磁気緩和測定法等を公知の何れの技術を使用することができる。特には、磁気抵抗素子であるGMR素子であり、S.X  Wang他著、Biosensors and Bioelectronics、2010年、第25巻、第9号、第2051〜2057頁等に記載されるようなGMRセンサーを利用することが好ましい。例えば、磁場の変化により、磁気センサーの抵抗値が変化することを利用して磁気粒子の磁化を検出するように構成することができる。外部磁場の存在によりセンサー上の磁気粒子が磁化され、磁化された磁気粒子は磁気センサーの抵抗の変化を誘発する。そして、この磁気センサーの抵抗変化量を検出することにより、磁気粒子の存在を検出することができる。
【００６０】
以上説明したとおり、本願発明のペプチドプローブは合成ペプチドを被検物質の検出部位とする。したがって、外的環境の変化及び経時的な活性変動及び活性低下等の、従来のタンパク質等の生理活性物質や核酸等の生体内物質プローブが抱えていた問題を解消することができる。即ち、外的環境変化に測定結果が影響されることなく、また長期間の保存安定性を維持することができる。これにより、臨床診断分野における疾病の症状や治癒の進行具合を判定する等の定量的な解析等、臨床現場の要求に応えた測定システムの構築に貢献することができる。そして、ペプチドプローブは、固相担体表面にリンカー領域を介して固定化されるが、かかるリンカー領域の分子長を好適化して構成されている。被検物質を認識する部位であるペプチド領域と固相担体表面の距離が測定感度に大きな影響を与えるため、リンカー領域の長さの好適化が重要である。つまり、固相反応系の場合、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離が測定されるシグナル強度に影響し、その距離を最適化することにより感度を向上させることができ、高感度、かつ高精度な測定システムの構築を実現することができる。また、本願発明のペプチドプローブは化学的に合成することができることから、抗体のように生産者間及びロット間での活性誤差が生じることがなく、また、生産時に副産物として不純物が混入することないため、被検物質の測定の妨げとなるバックグラウンドノイズを低減でき、高感度、高精度かつ安定性の高い測定システムを構築するために利用することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、通常のペプチド合成機等を利用して安価に生産でき、上述の通り長期保存安定性を有することから大量調製が可能となり、測定システムのコスト削減にも寄与することができる。
【００６１】
本願発明のペプチドプローブを利用して、被検試料中に含まれる被検物質を検出する方法に利用することができ、かかる被検物質の測定方法も本願発明の一部を構成する。
【００６２】
具体的には、本願発明の被検物質の測定方法は、上述の表面プラズモン共鳴又は磁気センシングによって被検物質を検出する方法であって、（１）表面プラズモン共鳴又は磁気センシングの反応場となる固相担体に、本願発明のペプチドプローブを前記リンカー領域により固定化する工程、（２）前記固相担体に固定化された前記ペプチドプローブに前記被検物質を接触させる工程、及び（３）前記ペプチドプローブのペプチド領域に結合した被検物質を、表面プラズモン共鳴又は磁気センシングにより検出する工程を含んで構成される。各工程については上述の通りに行うことができる。
【００６３】
ここで、本願発明の方法に適用される被検物質を含む被検試料は、測定対象となる被検物質を含む可能性のある試料であれば特に制限はない。例えば、動物由来の血液、血漿、血清、脳脊髄液、羊水、乳、汗、尿、唾液、喀痰、糞便、組織、細胞培養物等の生体由来試料、植物の根、茎、葉、花、果実等の植物由来試料、土壌、地下水、河川水、湖沼水等の環境試料、野菜、肉、卵、加工食品等の食品等が例示される。また、これらの試料は、そのまま測定対象とすることができるが、被検物質の分離、抽出、精製等の前処理が施されていてもよい。したがって、本発明のペプチドプローブ、及び当該ペプチドプローブを用いた被検物質の測定方法は、様々な技術分野、特には臨床診断等の医療分野、食品分野、環境分野等で利用することができる。
【００６４】
以上説明したとおり、本願発明の被検物質の測定方法は、合成ペプチドを被検物質の検出部位とする本願発明のペプチドプローブを使用することにより、外的環境の変化や経時的な活性変動や活性低下等の影響を受けることなく被検物質を測定することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、長期間の保存安定性を維持することができることから、臨床診断分野における疾病の症状や治癒の進行具合を判定する等の定量的な解析等、臨床現場の要求に応えることができる。そして、本願発明のペプチドプローブは、リンカー領域の分子長を好適化していることから、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離等が最適化され、高感度かつ高精度に被検物質を測定することができる。更に、本願発明のペプチドプローブのリンカー領域は、固相担体表面の荷電特性に対応してその荷電特性を好適化されたものであることからも、測定感度の向上が期待でき、高感度かつ高精度に被検物質を測定することができる。そして、本願発明のペプチドプローブは化学的に合成することができることから、抗体のように生産者間及びロット間での活性誤差が生じることがなく、生産時に副産物として不純物が混入することないため、被検物質の測定の妨げとなるバックグラウンドノイズを低減でき、高感度、高精度、かつ安定性をもって被検物質を測定することができる。また、本願発明のペプチドプローブは、通常のペプチド合成機等を利用して安価に生産でき、かつ長期保存安定性を有することからコスト的にも有利である。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により、本願発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本願発明は以下の実施例に限定されるものではなく、様々な実施形態が可能であることは明確に理解されるべきである。
【００６６】
実施例１．リンカー領域の分子長が反応活性に与える影響（SPR）
本実施例においては、本願発明のペプチドプローブのリンカー領域の分子長が反応活性に与える影響をSPRの強度比較により検討した。
【００６７】
（試薬）
ペプチドプローブとしては、以下のペプチド領域及びリンカー領域を有するものをペプチド合成機で合成して使用した。
ペプチド領域は、癌転移マーカーであるnm23結合合成ペプチドを用いた。なお、nm23結合合成ペプチドの配列情報は以下の通りである。
nm23結合合成ペプチド：Arg-Arg-Leu-Thr-Ile-Arg-Asn-Gly  （配列番号１）
リンカー領域としては、5、8、12、16、21、25分子長のPEG鎖を用いた。なお、PEG鎖の分子長は、PEG鎖の構造式（-CH2-CH2-O-）nにおけるnの数を分子長とした。
【００６８】
（方法）
前記nm23結合合成ペプチドと各分子長のPEGを連結したペプチドプローブをSPRの固相担体の金薄膜上に固定化した。固定化に際して、金薄膜を１−メルカプトウンデカン酸及び１−メルカプトドデカノール（1:10）で処理して金薄膜上に自己組織化膜を形成し、水溶性カルボジイミド／PEG付ペプチド（10：1）混合液を加えることで、固定化した。続いて、SPRにより各ペプチドプローブの結合速度定数を求めた。SPR装置としてはBiacore1000（Biacore 社製）を用い、展開溶液としてはPBSを用いた。被検試料としてnm23/PBSを流速200μg/mlで添加して25℃にて測定した。
【００６９】
（結果）
結果を表１に示す。表１は、リンカー領域の分子長が16のときの活性を100％とし、各分子長での相対活性値を示す。
【００７０】
【表１】
2014149199.tif 000002
【００７１】
表１の結果、本願発明のペプチドプローブは、リンカー領域の分子長を8〜21とした場合に、高い反応性を示すことが確認できた。固相反応系の場合、固相担体表面と被検物質を認識する部位との距離が測定されるシグナル強度に影響し、その距離を最適化することにより測定感度及び精度を向上させることができることが理解できる。
ただし、反応性は、測定システムの影響を受けることから、実際に使われる測定システムに応じてリンカー領域の分子長を最適化してもよい。
【００７２】
実施例２．ペプチドプローブの耐熱性及び保存安定性の評価
本実施例では、本願発明のペプチドプローブの耐熱性及び保存安定性を、一般的な抗体との比較により評価した。本実施例も、実施例１と同様にSPRにて評価を行った。
【００７３】
（試薬）
ペプチドプローブは、以下のペプチド領域及びリンカー領域を有するものを使用した。
ペプチド領域として、癌転移マーカーであるnm23結合合成ペプチド（配列番号１）を用い、リンカー領域として、6分子長のPEG鎖を用いた。
比較例として、nm23に対する一般的な抗体であるnm23-H1 Antibody（NM301）（品番sc-465、Santa Cruz社製）モノクローナル抗体を用いた。ここで、一般的な抗体とは、動物の免疫応答により産生されるタンパク質抗体のことである。
【００７４】
（方法）
上述のnm23結合合成ペプチドとPEG鎖を連結したペプチドプローブを、SPRの固相担体の金膜上に固定化した。連結および固定化条件等は、実施例１の手順に準じて行った。比較対照のモノクローナル抗体も同様に金薄膜上に固定化した（比較例）。そして、耐熱性及び保存安定性を評価すべく、25℃及び50℃にて、0時間、1日、1週間、2週間及び1ヶ月静置した後、SPRにより結合速度定数を求めた。SPR装置及び測定条件等は、実施例１の手順に準じて行った。
【００７５】
（結果）
結果を表２に示す。表２は、25℃、0時間での抗体の活性を100％とし、各条件での抗体及び本願発明のペプチドプローブの相対活性値を示す。
【００７６】
【表２】
2014149199.tif 000003
【００７７】
表２の結果より、本願発明のペプチドプローブは、25℃で0時間での初期ピーク時のみ抗体のシグナル強度に劣るものの、他の条件下では活性を維持して安定な測定システムを実現できていることが理解できる。特に、50℃では抗体活性は著しく低下しているが、ペプチドプローブでは活性変動は認められなかった。つまり、本願発明のペプチドプローブは、外的環境変化に測定結果が影響されることなく、また長期間の保存安定性を維持することができることが理解できる。
【００７８】
実施例３．リンカー領域の分子長が反応活性に与える影響（磁性センシング）
本実施例においては、本願発明のペプチドプローブのリンカー領域の分子長が反応活性に与える影響を磁気センシングによる磁気強度の比較により検討した。
【００７９】
（試薬）
ペプチドプローブとしては、以下のペプチド領域及びリンカー領域を有するものをペプチド合成機で合成して使用した。
ペプチド領域として、癌転移マーカーであるnm23結合合成ペプチド（配列番号１）を用いた。
リンカー領域としては、0、4、7、11、16、21、及び25分子長のPEG鎖、0、4、7、11、16、21、及び25分子長のアルキル鎖を夫々用いた。なお、PEG鎖は、PEG鎖の構造式（-CH2-CH2-O-）nにおけるnの数を分子長とし、アルキル鎖は、炭素数を分子長とした。
【００８０】
（方法）
磁性センサーとして、GMRセンサーを用いて磁気強度を測定した。ここで、GMRセンサーはS.X  Wang他著、Biosensors and Bioelectronics、2010年、第25巻、第9号、第2051〜2057頁の記載に基づいて構築したものを使用した。
【００８１】
まず、GMRセンサーの表面をアルコール洗浄した後、プラズマ照射（1000W、1分）により不純物を完全分解した。続いて、センサー表面を、68℃にて2% APTES/エタノールに浸すことで、センサー表面のSi基を化学的にアミノ基に修飾した。GMRセンサーを十分乾燥させた後、上述のnm23結合合成ペプチドとPEG鎖、又はアルキル鎖を連結したペプチドプローブをGMRセンサーに塗布して固定した。詳細には、１つのGMRセンサーの大きさは100μm×100μmであり、ここに1011〜12個のペプチドを固定した。そして、1チップに80個のセンサーが載っており、上述の異なるリンカータイプを4か所ずつ固定した。続いて、室温25℃にて、10ng/mlのnm23抗原／PBSを150μl添加して2時間反応させた後、洗浄（0.1％BSA、0.05%  Tween20／PBS）し、１μg/mlのビオチン標識抗nm23抗体／PBSを150μl加えて更に1時間反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン標識磁性ナノ粒子溶液100μLを加えて反応させ、反応15分後に磁気信号の強度を測定した。
【００８２】
（結果）
結果を表３に示す。表３は、各リンカー種及び各分子長のペプチドプローブの磁気信号強度を示し、4か所分の平均値である。なお、信号強度は下記式の通りに算出した。
【００８３】
〔数１〕
磁気信号の強度（ppm）≒△変化した磁性抵抗（Ω）／掛けている磁性抵抗（Ω）
注：変化する磁性抵抗は約μΩであり、センサーに掛けている磁性抵抗は約2kΩであるため、磁気信号の強度の単位は「ppm」となる。
【００８４】
【表３】
2014149199.tif 000004
【００８５】
表３の結果より、僅かながらアルキル鎖の方が、PEGよりも反応効率が良いことが理解できる。固相担体であるGMRセンサー表面はアミノ化されており、固相担体表面は正に荷電している状態にあることから、非荷電性のアルキル鎖をリンカー領域として選択することが適当であることが導かれる。また、本願発明のペプチドプローブは、リンカー領域の分子長を４〜２１とした場合に、高い反応性を示すことが確認できた。GMRセンサーによる磁気センシングの場合には、センサーの表面から磁性ナノ粒子までの距離が近い方が感度が上がることもあり、実施例１、２のSPRに比べてリンカー領域の分子長が短くても良いと思われ、本実施例の結果もそれに合致するものであった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本願発明のペプチドプローブ、及び当該ペプチドプローブを用いた被検物質の測定方法は、被検物質の測定が要求される様々の技術分野で利用することができ、特には臨床診断等の医療分野、食品分野、環境分野等で利用することができる。
【配列表】
2014149199000001.app