(57)【要約】【課題】製造効率に優れ、短期間で製造することができ、品質面にも優れた人工多能性幹細胞の製造方法、及び人工多能性幹細胞製造用組成物の提供。【解決手段】Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含む人工多能性幹細胞の製造方法、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を含む人工多能性幹細胞製造用組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とする人工多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
人工多能性幹細胞が、ナイーブ型である請求項１に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である請求項１から２のいずれかに記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことを特徴とする人工多能性幹細胞製造用組成物。
【請求項５】
更に、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物を含む請求項４に記載の人工多能性幹細胞製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞製造用組成物、及び人工多能性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ）細胞」、又は「誘導多能性幹細胞」と称することがある）は、多能性、自己複製、及び高い増殖能といった性質を有しており、分化を誘導することにより、心筋細胞、血液細胞、網膜色素上皮細胞、神経細胞などに分化できることが知られている。そのため、例えば、細胞移植治療などの再生医療、薬剤スクリーニング、疾患の原因解明のためのツールなどとして用いることが期待されている。
【０００３】
前記人工多能性幹細胞の製造方法としては、例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を体細胞に導入することにより製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。前記提案の方法によれば、人工多能性幹細胞を製造することができるものの、（１）製造効率が低い、（２）製造期間が長い、（３）ヒト人工多能性幹細胞では、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）依存性を有するナイーブ型の人工多能性幹細胞が得られず、品質面で不十分である、という大きな問題がある。
【０００４】
したがって、製造効率に優れ、短期間で製造することができ、品質面にも優れた人工多能性幹細胞の製造方法の速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、製造効率に優れ、短期間で製造することができ、品質面にも優れた人工多能性幹細胞の製造方法、及び人工多能性幹細胞製造用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４（ＰＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １４）遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ）遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ（Ｓａｌ−ｌｉｋｅ  ４、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ａ）遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とする人工多能性幹細胞の製造方法である。
＜２＞  人工多能性幹細胞が、ナイーブ型である前記＜１＞に記載の人工多能性幹細胞の製造方法である。
＜３＞  人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の人工多能性幹細胞の製造方法である。
＜４＞  Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことを特徴とする人工多能性幹細胞製造用組成物である。
＜５＞  更に、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物を含む前記＜４＞に記載の人工多能性幹細胞製造用組成物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、製造効率に優れ、短期間で製造することができ、品質面にも優れた人工多能性幹細胞の製造方法、及び人工多能性幹細胞製造用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１−１は、試験例１−１の結果を示すグラフである。
【図１−２】図１−２は、試験例１−２の結果を示すグラフである。
【図１−３】図１−３は、試験例１−３の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、試験例２の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３における（１）のウイルス液を用いた場合の結果の一例を示す写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３における（１）のウイルス液を用いた場合の結果の他の一例を示す写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試験例３における（２）のウイルス液を用いた場合の結果の一例を示す写真である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、試験例３における（２）のウイルス液を用いた場合の結果の他の一例を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（人工多能性幹細胞の製造方法）
本発明の人工多能性幹細胞の製造方法は、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程（以下、「遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１１】
＜遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程＞
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程は、少なくともＯｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入する工程である。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入することにより、体細胞から人工多能性幹細胞を製造することができる。
前記遺伝子産物とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質をいう。
【００１２】
−Ｏｃｔ３／４遺伝子−
前記Ｏｃｔ３／４遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｏｃｔ３／４遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００２７０１（ヒト）、ＮＭ＿０１３６３３（マウス）で入手することができる。
【００１３】
−Ｓｏｘ２遺伝子−
前記Ｓｏｘ２遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｓｏｘ２遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００３１０６（ヒト）、ＮＭ＿０１１４４３（マウス）で入手することができる。
【００１４】
−Ｋｌｆ４遺伝子−
前記Ｋｌｆ４遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｋｌｆ４遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００４２３５（ヒト）、ＮＭ＿０１０６３７（マウス）で入手することができる。
【００１５】
−ｃ−Ｍｙｃ遺伝子−
前記ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００２４６７（ヒト）、ＮＭ＿０１０８４９（マウス）で入手することができる。
【００１６】
−Ｐｒｄｍ１４遺伝子−
前記Ｐｒｄｍ１４遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｐｒｄｍ１４遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０２４５０４（ヒト）、ＮＭ＿００１０８１２０９（マウス、配列番号７参照）で入手することができる。
【００１７】
−Ｅｓｒｒｂ遺伝子−
前記Ｅｓｒｒｂ遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｅｓｒｒｂ遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿００４４５２（ヒト）、ＮＭ＿０１１９３４（マウス、配列番号８参照）で入手することができる。
【００１８】
−Ｓａｌｌ４ａ遺伝子−
前記Ｓａｌｌ４ａ遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、などが挙げられる。
前記Ｓａｌｌ４ａ遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号ＮＭ＿０２０４３６（ヒト）、ＮＭ＿１７５３０３（マウス、配列番号９参照）で入手することができる。
【００１９】
前記Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物の配列は、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、前記各遺伝子の配列のうち、タンパク質に翻訳される部分のみであってもよいし、それ以外の部分を含んでもよい。また、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の配列は、変異が含まれていてもよい。
前記変異としては、例えば、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない変異、前記各遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列において、１個又は数個（２個〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加される変異、などが挙げられる。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が変異を有する場合の野生型との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、タンパク質に翻訳される部分の塩基配列において、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
【００２０】
−体細胞−
前記体細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胎児期の体細胞、成熟した体細胞、などが挙げられる。
前記成熟した体細胞の具体例としては、脂肪組織由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の既に分化した細胞、などが挙げられる。
【００２１】
前記体細胞は、人工多能性幹細胞の選択を容易にするために、組み換えたものであってもよい。
前記組換え体細胞の具体例としては、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子の遺伝子座に、レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子の少なくともいずれかを組み込んだ組換え体細胞が挙げられる。
前記分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子としては、例えば、Ｆｂｘ１５遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、などが挙げられる。
前記レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、などが挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子としては、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、などが挙げられる。
【００２２】
前記体細胞を採取する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、得られる人工多能性幹細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、個体自身、又はＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他個体が好ましい。
ここで、前記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、免疫抑制剤などの使用により、前記体細胞由来の人工多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞を個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
【００２３】
前記体細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％、などが挙げられる。
前記体細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％〜２０質量％の血清を含む、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地、などが挙げられる。
【００２４】
−導入方法−
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターを用いる方法、合成したｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を用いる方法、組換えタンパク質を用いる方法、などが挙げられる。
【００２５】
−−ベクター−−
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、などが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター、などが挙げられる。
前記人工染色体ベクターの具体例としては、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、などが挙げられる。
前記ベクターを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、などが挙げられる。
【００２６】
前記ウイルスベクターを用いる場合には、パッケージング細胞を用いて得られたウイルス粒子を用いてもよい。
前記パッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であり、該細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターを導入すると、該目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルス粒子を産生する。
前記パッケージング細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス繊維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースとしたパッケージング細胞、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−Ｅ細胞、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−Ａ細胞、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ−ＧＰ細胞、などが挙げられる。これらの中でも、ヒト体細胞に対して組換えウイルスベクターを導入する場合にはＰＬＡＴ−Ａ細胞、ＰＬＡＴ−ＧＰ細胞が、宿主指向性の点で、好ましい。
前記パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、などが挙げられる。
前記得られたウイルス粒子を前記体細胞へ感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【００２７】
前記ベクターは、前記各遺伝子の導入を確認するためのマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
前記マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。前記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、などが挙げられる。
前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子、などが挙げられる。
前記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子、などが挙げられる。
前記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、などが挙げられる。
【００２８】
前記ベクターを用いて前記各遺伝子を体細胞に導入する方法では、１つのベクターに１つの遺伝子を組み込んでもよいし、２つ以上の遺伝子を組み込んでもよい。前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込むことにより、該２つ以上の遺伝子を同時に発現（以下、「共発現」と称することがある）させることができる。
【００２９】
前記１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記２つ以上の遺伝子を、連結配列を通じて組み込むことが好ましい。
前記連結配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、口蹄疫ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ  Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）由来２Ａペプチドをコードする遺伝子配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ）、などが挙げられる。
【００３０】
前記ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記組換えタンパク質を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
【００３１】
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入回数は、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の全てを同時期に導入してもよいし、異なる時期に導入してもよい。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、前記各遺伝子のうち、ある遺伝子は遺伝子産物を用い、他の遺伝子は遺伝子を用いる態様であってもよい。
【００３２】
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の体細胞への導入量としては、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物を等量ずつ導入してもよいし、異なる量で導入してもよい。前記各遺伝子乃至その遺伝子産物として、遺伝子を用いる場合の例としては、Ｏｃｔ３／４遺伝子がＳｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、又はｃ−Ｍｙｃ遺伝子に対して多量、例えば約３倍量、導入するのが（ＰＮＡＳ  １０６（３１）：１２７５９−１２７６４．２００９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（４３）：３６２７３−３６２８２．２０１２）好ましい。
【００３３】
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程では、本発明の効果を損なわない限り、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物以外の遺伝子乃至その遺伝子産物を導入してもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物以外の遺伝子乃至その遺伝子産物としては、例えば、Ｏｃｔファミリー（Ｏｃｔ１Ａ、及びＯｃｔ６）遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｍｙｃファミリー（Ｎ−Ｍｙｃ、及びＬ−Ｍｙｃ）遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、及びＳｏｘ１８）遺伝子乃至その遺伝子産物、ＴＥＲＴ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＨＰＶ１６  Ｅ６遺伝子乃至その遺伝子産物、ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｂｍｉｌ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｆｂｘ１５遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｎａｎｏｇ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＥＲａｓ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｔｃｌ１遺伝子乃至その遺伝子産物、β−ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＥＣＡＴ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｇ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子乃至その遺伝子産物、ＥＣＡＴ８遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｇｄｆ３遺伝子乃至その遺伝子産物、ＥＣＡＴ１５−１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｆｔｈｌ１７遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｒｅｘ１遺伝子乃至その遺伝子産物、ＵＴＦ１遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｔｅｌｌａ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｔａｔ３遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｇｒｂ２遺伝子乃至その遺伝子産物（特開２０１１−１８８８６０号公報参照）；ＧＬＩＳ１遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｎａｔｕｒｅ  ４７４（７３５０）：２２５−２２９．２０１１）；
Ｔｂｘ３遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｎａｔｕｒｅ  ４６３（７２８４）：１０９６−１００．２０１０）；ＴＥＴ（Ｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ファミリー（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、及びＴＥＴ３）遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｎａｔｕｒｅ  ４８８（７４１３）：６５２−６５５．２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  ４９５（７４４１）：３７０−３７４．２０１３）；Ｐａｒｐ１遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｎａｔｕｒｅ  ４８８（７４１３）：６５２−６５５．２０１２）；Ｋｄｍ２ａ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｄｍ２ｂ遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９（６）：５７５−５８７．２０１１、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４（５）：４５７−４６６．２０１２）；Ｎｒ５ａ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｒａｒファミリー遺伝子乃至その遺伝子産物（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０８（４５）：１８２８３−１８２８８．２０１１）；Ｕｔｘ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｍｄｍ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｒｉｎｇ１ｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｗｄｒ５遺伝子乃至その遺伝子産物、などが挙げられる。
【００３４】
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入工程では、本発明の効果を損なわない限り、低分子化合物を投与してもよい。
前記低分子化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＳＫ−３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、などが挙げられる。
前記ＧＳＫ−３阻害剤の具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１などが挙げられる。
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤の具体例としては、Ｆｏｌｓｋｏｌｉｎなどが挙げられる。
前記低分子化合物の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程、などが挙げられる。
【００３６】
−遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程−
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が導入された体細胞を培養する工程である。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％〜５％、などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＬＩＦ」と称することがある）、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（以下、「ＫＳＲ」と称することがある）、１×ＮＥＡＡ、２−メルカプトエタノール、ＧｌｕｔａＭａｘを含むＤＭＥＭ培地、などが挙げられる。
前記遺伝子乃至その遺伝子産物導入細胞培養工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
＜人工多能性幹細胞＞
前記人工多能性幹細胞の製造方法により製造される人工多能性幹細胞は、分化多能性、及び自己複製能を有する。前記分化多能性とは、三胚葉系列すべてに分化できることを意味する。また、前記自己複製能とは、未分化状態を保持したまま増殖できる能力を意味する。
【００３８】
前記人工多能性幹細胞の製造方法により製造された細胞が人工多能性幹細胞であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記体細胞として、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子の遺伝子座に、レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子の少なくともいずれかを組み込んだ組換え体細胞を用いた場合には、前記レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子を利用して確認することができる。具体的には、前記レポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いた場合には、例えば、フローサイトメーターによりＧＦＰ陽性の細胞を確認する方法が挙げられる、また、前記薬剤耐性遺伝子として、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、細胞にピューロマイシンを投与することにより確認することができる。
【００３９】
前記人工多能性幹細胞の型としては、プライム型であってもよいし、ナイーブ型であってもよいが、品質に優れる点で、ナイーブ型が好ましい。
前記人工多能性幹細胞がナイーブ型であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コロニーの形態、ｂＦＧＦを含まないＬＩＦ添加培地で増殖できるか否か、２ｉ添加培地（ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ阻害剤とを添加した培地）で増殖できるか否か、単一細胞に分散して継代することができるか否かを指標とすることにより確認することができる。具体的には、コロニーの形態がドーム状であり、ｂＦＧＦを含まないＬＩＦ添加培地で増殖することができ、２ｉ添加培地で増殖することができ、単一細胞に分散して継代することができる細胞である場合には、ナイーブ型であると判断することができる。
【００４０】
前記人工多能性幹細胞の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒトが好ましい。
【００４１】
（人工多能性幹細胞製造用組成物）
本発明の人工多能性幹細胞製造用組成物は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００４２】
＜Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物＞
前記Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様である。また、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記人工多能性幹細胞製造用組成物における前記Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、遺伝子がベクターに組み込まれている態様、合成ｍＲＮＡの態様、組換えタンパク質の態様、などが挙げられる。
前記ベクターとしては、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
【００４３】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物を含むことが好ましい。
【００４４】
前記Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様のものである。また、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物は、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
前記人工多能性幹細胞製造用組成物における前記Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子がベクターに組み込まれている態様、合成ｍＲＮＡの態様、組換えタンパク質の態様、などが挙げられる。
前記ベクターとしては、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様のものが挙げられる。
前記合成ｍＲＮＡ、前記組換えタンパク質は、公知の方法により製造することができる。
【００４５】
前記人工多能性幹細胞製造用組成物は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物が、個別の容器に分けられているものであってもよいし、１つの容器にまとめられているものであってもよいし、任意の数ごとに容器にまとめられているものであってもよい。
前記人工多能性幹細胞製造用組成物における前記各遺伝子乃至その遺伝子産物の量としては、特に制限はなく、全ての遺伝子乃至その遺伝子産物を等量としてもよいし、異なる量としてもよい。
【００４６】
前記人工多能性幹細胞製造用組成物は、前記各遺伝子乃至その遺伝子産物以外の遺伝子乃至その遺伝子産物を含んでいてもよく、また、前記ウイルスベクターを用いる場合には、例えば、パッケージング細胞を含んでいてもよい。
前記各遺伝子乃至その遺伝子産物以外の遺伝子乃至その遺伝子産物、前記パッケージング細胞としては、前記人工多能性幹細胞の製造方法で記載したものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００４７】
以下、製造例、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
（製造例１−１：Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクター）
マウス由来野生型Ｏｃｔ３／４タンパク質の全長をコードする遺伝子がｐＭＸｓ−ｇｗのマルチクローニングサイトに組み込まれている、Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを使用した（国立大学法人京都大学ｉＰＳ細胞研究所より入手、Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６．２００６）。
【００４９】
（製造例１−２：Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルスベクター）
マウス由来野生型Ｓｏｘ２タンパク質の全長をコードする遺伝子がｐＭＸｓ−ｇｗのマルチクローニングサイトに組み込まれている、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルスベクターを使用した（国立大学法人京都大学ｉＰＳ細胞研究所より入手、Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６．２００６）。
【００５０】
（製造例１−３：Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルスベクター）
マウス由来野生型Ｋｌｆ４タンパク質の全長をコードする遺伝子がｐＭＸｓ−ｇｗのマルチクローニングサイトに組み込まれている、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルスベクターを使用した（国立大学法人京都大学ｉＰＳ細胞研究所より入手、Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６．２００６）。
【００５１】
（製造例１−４：ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルスベクター）
マウス由来野生型ｃ−Ｍｙｃタンパク質の全長をコードする遺伝子がｐＭＸｓ−ｇｗのマルチクローニングサイトに組み込まれている、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルスベクターを使用した（国立大学法人京都大学ｉＰＳ細胞研究所より入手、Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６．２００６）。
【００５２】
（製造例１−５：Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルスベクター）
Ｂ６マウス由来胚性幹細胞（以下、「ＥＳＣ」と称することがある、国立大学法人筑波大学生命科学動物資源センターより入手）よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、下記配列番号１及び２で表されるプライマーを用い、ＰＣＲ法にてＰｒｄｍ１４遺伝子（Ｐｒｄｍ１４タンパク質の全長をコードする遺伝子（配列番号７参照）を増幅、回収し、ｐＭＸｓベクター（国立大学法人東京大学医科学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込み、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルスベクターを得た。
＜プライマー＞
（１）５’→３’：ＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＴＣＴＧ（配列番号１）
（２）５’→３’：ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣ（配列番号２）
【００５３】
（製造例１−６：Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルスベクター）
Ｂ６マウス由来胚性幹細胞（以下、「ＥＳＣ」と称することがある、国立大学法人筑波大学生命科学動物資源センターより入手）よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、下記配列番号３及び４で表されるプライマーを用い、ＰＣＲ法にてＥｓｒｒｂ遺伝子（Ｅｓｒｒｂタンパク質の全長をコードする遺伝子（配列番号８参照）を増幅、回収し、ｐＭＸｓベクター（国立大学法人東京大学医科学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込み、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルスベクターを得た。
＜プライマー＞
（１）５’→３’：ＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧ（配列番号３）
（２）５’→３’：ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡ（配列番号４）
【００５４】
（製造例１−７：Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルスベクター）
Ｂ６マウス由来胚性幹細胞（以下、「ＥＳＣ」と称することがある、国立大学法人筑波大学生命科学動物資源センターより入手）よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、下記配列番号５及び６で表されるプライマーを用い、ＰＣＲ法にてＳａｌｌ４ａ遺伝子（Ｓａｌｌ４ａタンパク質の全長をコードする遺伝子（配列番号９参照）を増幅、回収し、ｐＭＸｓベクター（国立大学法人東京大学医科学研究所より入手）のマルチクローニングサイトに組み込み、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルスベクターを得た。
＜プライマー＞
（１）５’→３’：ＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧ（配列番号５）
（２）５’→３’：ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣ（配列番号６）
【００５５】
（製造例２−１：Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス−１）
トランスフェクション前日にパッケージング細胞ＰＬＡＴ−Ｅ（国立大学法人東京大学医科学研究所より入手、以下、「ＰＬＡＴ−Ｅ細胞」と称することがある）を１０ｃｍのゼラチンコートディッシュ１枚あたり３．６×１０６個播種した。なお、培地としては、１０％血清を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）を用い、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。
前記ＰＬＡＴ−Ｅ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ  ６（プロメガ社製）を用いて前記製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターをトランスフェクションした。
前記トランスフェクション翌日に前記ＰＬＡＴ−Ｅ細胞の培地を交換し、前記培地を交換した翌日に、前記ＰＬＡＴ−Ｅ細胞の培養上清を回収し、次いで、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１とした。
【００５６】
（製造例２−２：Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−２で得られたＳｏｘ２遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００５７】
（製造例２−３：Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−３で得られたＫｌｆ４遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００５８】
（製造例２−４：ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−４で得られたｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００５９】
（製造例２−５：Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−５で得られたＰｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００６０】
（製造例２−６：Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−６で得られたＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００６１】
（製造例２−７：Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−７で得られたＳａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１を得た。
【００６２】
（比較製造例２−１：外来遺伝子不含有ウイルス−１）
前記製造例２−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記ｐＭＸｓベクターのみに代えた以外は、製造例２−１と同様にして、外来遺伝子不含有ウイルス液−１を得た。
【００６３】
（製造例３−１：Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス−２）
トランスフェクション前日にパッケージング細胞ＰＬＡＴ−ＧＰ（国立大学法人東京大学医科学研究所より入手、以下、「ＰＬＡＴ−ＧＰ細胞」と称することがある）を１０ｃｍのゼラチンコートディッシュ１枚あたり３．６×１０６個播種した。なお、培地としては、１０％血清を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）を用い、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。
前記ＰＬＡＴ−ＧＰ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ  ６（プロメガ社製）を用いて前記製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを、ＶＳＶ−Ｇ発現ベクター（ＧＩＢＣＯ社製）と共にトランスフェクションした。
前記トランスフェクション翌日に前記ＰＬＡＴ−ＧＰ細胞の培地を交換し、前記培地を交換した翌日に、前記ＰＬＡＴ−ＧＰ細胞の培養上清を回収し、次いで、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−２とした。
【００６４】
（製造例３−２：Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−２で得られたＳｏｘ２遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００６５】
（製造例３−３：Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−３で得られたＫｌｆ４遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００６６】
（製造例３−４：ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−４で得られたｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００６７】
（製造例３−５：Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−５で得られたＰｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００６８】
（製造例３−６：Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−６で得られたＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００６９】
（製造例３−７：Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記製造例１−７で得られたＳａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルスベクターに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−２を得た。
【００７０】
（比較製造例３−１：外来遺伝子不含有ウイルス−２）
前記製造例３−１において、製造例１−１で得られたＯｃｔ３／４遺伝子含有ウイルスベクターを用いていた点を、前記ｐＭＸｓベクターのみに代えた以外は、製造例３−１と同様にして、外来遺伝子不含有ウイルス液−２を得た。
【００７１】
（試験例１−１：製造効率試験−１）
−細胞−
細胞として、Ｎａｎｏｇ遺伝子プロモーター依存的にｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、「ＥＧＦＰ」と称することがある）及びピューロマイシン耐性遺伝子を発現するマウス胎仔線維芽細胞（以下、「ＮＧ−ＭＥＦ」と称することがある、理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されているトランスジェニックマウスＳＴＯＣＫ  Ｔｇ（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ，Ｐｕｒｏ）１Ｙａｍ（Ｎｏ．ＲＢＲＣ０２２９０）を入手、交配し、１３．５日胚からトリプシンを用いて単離、調製した）を用いた。前記ＮＧ−ＭＥＦの培養には、１０％血清を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）を用い、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。
【００７２】
−ウイルス感染−
下記（１）から（８）のそれぞれのウイルス液に、最終濃度４μｇ／ｍＬのポリブレンを加えて調製したウイルス液を、それぞれ前記ＮＧ−ＭＥＦに感染させた。
前記感染の翌日に、上清をＬｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＬＩＦ」と称することがある、ＬＩＦタンパク質を発現するベクターｐＣＡＧＧＳ−ＬＩＦ（理科学研究所  発生・再生科学より入手）をＣｏｓ−７細胞にリン酸カルシウム法により導入し、その培養上清を用いた）、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（以下、「ＫＳＲ」と称することがある、ＧＩＢＣＯ社製）、１×ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ社製）、２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ社製）、ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤＭＥＭ培地に置き換え、その後は、１日おきに培地交換を行った。
〔ウイルス液〕
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ６００μＬ
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ４００μＬ
（３）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ４００μＬ
（４）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ４００μＬ
（５）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ２００μＬ
（６）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ２００μＬ
（７）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ２００μＬ
（８）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及びＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ
【００７３】
−人工多能性幹細胞のコロニー数の計測−
前記ウイルス感染後８日目から１２日目までピューロマイシン（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）に曝露し、ウイルス感染後１２日目に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性コロニー数を計測した。結果を図１−１に示した。
図１−１中、（１）から（８）は、それぞれ前記（１）から（８）のウイルス液を用いた場合の結果を示す。
図１−１の結果から、前記（８）の場合には、人工多能性幹細胞のコロニー数（「ｉＰＳコロニー数」と称することもある）が、前記（１）から（７）の場合よりも高く、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＥｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物を用いることにより、人工多能性幹細胞の製造効率を高めることができることが示された。
【００７４】
（試験例１−２：製造効率試験−２）
−細胞−
細胞は、前記試験例１−１と同様に、ＮＧ−ＭＥＦを用いた。
【００７５】
−ウイルス感染−
前記試験例１−１において、ウイルス液を下記（１）及び（２）のいずれかのウイルス液に代えた以外は、前記試験例１−１と同様にして、前記ＮＧ−ＭＥＦにウイルスを感染させた。
〔ウイルス液〕
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ６００μＬ
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及びＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ
【００７６】
−人工多能性幹細胞の割合−
前記ウイルス感染後８日目に、前記ＮＧ−ＭＥＦをトリプシンで剥離し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）、日本ベクトン・ディッキンソン社製）で１０万個あたりのＧＦＰ陽性細胞数を計測した。結果を図１−２に示した。
図１−２中、（１）及び（２）は、それぞれ前記（１）及び（２）のウイルス液を用いた場合の結果を示す。
図１−２の結果から、前記（２）の場合には、全細胞に対する人工多能性幹細胞の割合が、前記（１）の場合よりも高く、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＥｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物を用いることにより、人工多能性幹細胞の製造効率を高めることができることが示された。
【００７７】
（試験例１−３：製造効率試験−３）
−細胞−
細胞として、ヒト皮膚線維芽細胞（以下、「ＨＤＦ」と称することがある、東洋紡株式会社製）を用いた。前記ＨＤＦの培養には、ヒト皮膚線維芽細胞基本培地（東洋紡株式会社製）を用い、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。
【００７８】
−ウイルス感染−
前記試験例１−１において、細胞をＮＧ−ＭＥＦから前記ＨＤＦに代え、ウイルス液を下記（１）及び（２）のいずれかのウイルス液に代えた以外は、前記試験例１−１と同様にして、前記ＨＤＦにウイルスを感染させた。
〔ウイルス液〕
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−２  ６００μＬ
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、及びＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ
【００７９】
−人工多能性幹細胞のコロニー数の計測−
前記ウイルス感染後１５日目にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識されたＴＲＡ−１−６０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて染色し、蛍光顕微鏡下で陽性コロニー数を計測した。結果を図１−３に示した。
図１−３中、（１）及び（２）は、それぞれ前記（１）及び（２）のウイルス液を用いた場合の結果を示す。
図１−３の結果から、前記（２）の場合には、ＴＲＡ−１−６０陽性コロニー数が、前記（１）の場合よりも多く、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＥｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物を用いることにより、人工多能性幹細胞の製造効率を高めることができることが示された。
【００８０】
（試験例２：製造期間試験）
−細胞−
細胞は、前記試験例１−１と同様に、ＮＧ−ＭＥＦを用いた。
【００８１】
−ウイルス感染−
前記試験例１−１において、ウイルス液を下記（１）及び（２）のいずれかのウイルス液に代えた以外は、前記試験例１−１と同様にして、前記ＮＧ−ＭＥＦにウイルスを感染させた。
〔ウイルス液〕
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−１  ６００μＬ
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｓａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、及びＥｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ
【００８２】
−人工多能性幹細胞のコロニー数の計測−
前記ウイルス感染後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、又は６日目から１２日目までピューロマイシン（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）に曝露し、ウイルス感染後１２日目に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性コロニー数を計測した。結果を図２に示した。
図２中、Ｄ１からＤ６は、それぞれピューロマイシンの曝露開始日（ウイルス感染後１日目から６日目）を示し、「◆」は、前記（１）のウイルス液を用いた場合の結果を示し、「■」は、前記（２）のウイルス液を用いた場合の結果を示す。
図２に示すように、前記（２）の場合には、ウイルス感染後２日目にピューロマイシンを曝露した場合でも３回の実験で安定的に人工多能性幹細胞が確認された（人工多能性幹細胞のコロニー数：平均９個）のに対し、前記（１）の場合には、ウイルス感染後６日目にピューロマイシンを曝露した場合に初めて３回の実験で安定的に人工多能性幹細胞が確認された（人工多能性幹細胞のコロニー数：平均８個）。
したがって、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を用いることにより、人工多能性幹細胞を短期間で製造することができることが示された。
【００８３】
（試験例３：品質試験）
−細胞−
細胞として、ヒト皮膚線維芽細胞（以下、「ＨＤＦ」と称することがある、東洋紡株式会社製）を用いた。前記ＨＤＦの培養には、ヒト皮膚線維芽細胞基本培地（東洋紡株式会社製）を用い、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。
【００８４】
−ウイルス感染−
下記（１）及び（２）のそれぞれのウイルス液に、最終濃度４μｇ／ｍＬのポリブレンを加えて調製したウイルス液を、それぞれ前記ＨＤＦに感染させた。
前記感染の翌日に、上清をＬｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＬＩＦ」と称することがある、ＬＩＦタンパク質を発現するベクターｐＣＡＧＧＳ−ＬＩＦ（理科学研究所  発生・再生科学より入手）をＣｏｓ−７細胞にリン酸カルシウム法により導入し、その培養上清を用いた）、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（以下、「ＫＳＲ」と称することがある、ＧＩＢＣＯ社製）、１×ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ社製）、２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ社製）、ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤＭＥＭ培地に置き換え、その後は、１日おきに培地交換を行った。
〔ウイルス液〕
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、及び外来遺伝子不含有ウイルス液−２  ６００μＬ
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｓｏｘ２遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｋｌｆ４遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子含有ウイルス液−１  ２００μＬ、Ｅｓｒｒｂ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子含有ウイルス液−２  ２００μＬ
【００８５】
−人工多能性幹細胞−
前記ウイルス感染後１８日目の細胞、及びクローン化した細胞を倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）で撮影した結果を図３Ａから３Ｄに示した。
図３Ａ及び３Ｂは、前記（１）のウイルス液を用いた場合の写真の一例であり、図３Ｃ及び３Ｄは、前記（２）のウイルス液を用いた場合の写真の一例である。図３Ａから３Ｃ中、スケールバーは、２００μｍを表す。
前記（１）のウイルス液を用いて得られた人工多能性幹細胞は、コロニーの形態が扁平状であり、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）添加培地で増殖することができ、２ｉ添加培地（ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ阻害剤とを添加した培地）では増殖できず、単一細胞に分散すると死んでしまう細胞であり、プライム型人工多能性幹細胞であることがわかった。
一方、前記（２）のウイルス液を用いて得られた人工多能性幹細胞は、コロニーの形態がドーム状であり、ｂＦＧＦを含まないＬＩＦ添加培地で増殖することができ、２ｉ添加培地で増殖することができ、単一細胞に分散して継代することができる細胞であり、ナイーブ型人工多能性幹細胞であることがわかった。
したがって、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を用いることにより、高品質の人工多能性幹細胞を製造することができることが示された。
【００８６】
本発明の人工多能性幹細胞の製造方法によれば、人工多能性幹細胞を高効率で製造することができるので、少数の体細胞からの人工多能性幹細胞の樹立が可能となり、また、希少な細胞や組織の採取量を軽減することができると考えられる。更に、非人工多能性幹細胞の増殖を抑え、人工多能性幹細胞を選択的に増やすことが可能であるため、人工多能性幹細胞クローンの樹立が容易になると考えられる。
また、本発明の人工多能性幹細胞の製造方法によれば、人工多能性幹細胞を短期間で製造することができるので、早期に細胞移植が必要な脊髄損傷などの疾患への自己由来の人工多能性幹細胞の利用を可能とし、また、長期間の人工多能性幹細胞誘導過程によるゲノム損傷リスクを軽減したり、一過性の遺伝子導入による人工多能性幹細胞の作製方法を容易にしたりするなど、安全な人工多能性幹細胞の作製が可能となると考えられる。
更に、本発明の人工多能性幹細胞の製造方法によれば、人工多能性幹細胞を効率良く短期間で製造することができるので、従来の方法と比べてコストを軽減することができる。
また、本発明の人工多能性幹細胞の製造方法によれば、ヒト細胞の場合でもナイーブ型の人工多能性幹細胞を製造することができるので、人工多能性幹細胞の取扱いを簡便化することができ、分化誘導効率を向上させることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の人工多能性幹細胞の製造方法によれば、製造効率に優れ、短期間で製造することができ、品質面にも優れた人工多能性幹細胞を製造することができるので、細胞移植治療などの再生医療、薬剤スクリーニング、疾患の原因解明のためのツールなどとして用いる人工多能性幹細胞の製造方法に好適に利用可能である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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