(57)【要約】      （修正有）【課題】アミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための薬剤学的造成物及び予防又は治療するための方法の提供。【解決手段】Ｎｌａ（核含有物ａ）プロテアーゼ又は前記Ｎｌａプロテアーゼを符号化するニュクレチド序列を含む遺伝子運搬体を活性成分として含むアミロイドβがもたらす疾患の予防又は治療のための薬剤学的造成物。前記Ｎｌａプロテアーゼは、細胞内又は細胞外のアミロイドβ、或いは、チトゾールに存在するアミロイドβ、を切断する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｌａ（核含有物ａ）プロテアーゼ又は前記Ｎｌａプロテアーゼを符号化するニュクレチド序列を含む遺伝子運搬体を活性成分として含むアミロイドβがもたらす疾患の予防又は治療のための薬剤学的造成物。
【請求項２】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、細胞内又は細胞外のアミロイドβを切断する請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項３】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、チトゾールに存在するアミロイドβを切断する請求項２に記載の薬剤学的造成物。
【請求項４】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、前記アミロイドβが誘導した細胞死滅を抑制する請求項２に記載の薬剤学的造成物。
【請求項５】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、オリゴマーアミロイドβを切断する活性を有する請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項６】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、アミロイドβ１−４０及びアミロイドβ１−４２を切断する活性を有する請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項７】
前記Ｎｌａプロテアーゼは、序列番号３のアミノ酸１５及び１６の間のペプチード結合を切断する活性を有する請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項８】
前記遺伝子運搬体は、ウィルスベクトルである請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項９】
前記遺伝子運搬体は、レンチウィルスベクトルである請求項８に記載の薬剤学的造成物。
【請求項１０】
前記アミロイドβがもたらす疾患は、アルツハイマー症、軽度認知機能障害（ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｎｐａｉｒｍｅｎｔ（ＭＣＩ））、軽度から中等度までの認知機能障害、血管性認知症、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血、老人性認知症、ダウン症候群、封入体筋炎、加齢黄斑変性症及びアルツハイマー症に関する病で構成される郡から選択された疾患である請求項１に記載の薬剤学的造成物。
【請求項１１】
前記アミロイドβがもたらす疾患はアルツハイマー症である請求項１０に記載の薬剤学的造成物。
【請求項１２】
哺乳動物である対象に請求項１乃至請求項１１のうちいずれか一項に記載の薬剤学的造成物を投与することを含むアミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多様なアミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための薬剤学的造成物及びその方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー症（ＡＤ）は世界的に約２４，０００，０００人の人々に影響を及ぼす進行性神経退行性障害であり、老人性認知症の最も一般的な形である。ＡＤは進行性記憶欠陥及び認知機能障害を特徴とする。ＡＤの目立つ特徴は、長さが４０，４２及び４３個のアミノ酸であるアミロイドβ（Ａβ）を主成分とするアミロイド斑点の蓄積である。Ａβはアミロイドβ前駆代謝タンパク質（ＡＰＰ）がβ−及びγ−セクレターゼによって次第に切断されることで生成される１，２。Ａβはモノマー、オリゴマー（ダイマー、トリマー及びテトラマー）、プロト・フィブリル及びフィブリルのような他の形で存在してもよく、それらの他の形の状態はそれらの毒性と関連がある。オリゴマーＡβはフィブリルＡβ及びモノマーＡβよりそれぞれ約１０倍及び４０倍も細胞毒性が多いことが分かった３。また、最近の報告ではダイマーＡβはモノマーＡβより３倍も毒性が多く、トリマーＡβよ及びテトラマーＡβは１３倍も毒性が多いことが分かった４。
【０００３】
たとえＡβが明らかにＡＤの原因となる役割をしているが、この疾患の発病に寄与する基底メカニズムは依然として論難になっている。Ａβが細胞外的に病理学的活性を発揮すると広く容認されている。病理学的ＡＤ患者の脳から、Ａβはアミロイド斑点を形成する細胞の空間に分泌される５。培養培地に添加する際、Ａβは多様な細胞類型で試験管内細胞死滅を誘導することができる３，４，６。
【０００４】
しかし、蓄積証拠は細胞内Ａβの活性がＡＤの発病に重要であるということを提示する。幾人かの著者は、検死（ｐｏｓｔ−ｍｏｒｔｅｍ）ＡＤ患者の脳組織及び移植遺伝子ＡＤマウスからＡβの細胞内局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を報告している１，７，８。電子顕微鏡及び免疫細胞化学を利用した更に近接した調査は、Ａβが初期エンドソーム、トランス・ゴルジ網（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ）、粗い小胞体、外部ミトコンドリア膜及び核外膜を含む神経分化されたＰ１９細胞から多様な亜細胞の細胞機関に存在すると報告している９。トリプル移植遺伝子ＡＤマウスモデルにおいて、初期の認知障害は、アミロイド斑点の明白な蓄積又は神経原繊維がもつれることなく、海馬及び扁桃腺での細胞内Ａβの蓄積と関連があった１０。
【０００５】
細胞内Ａβはまた、ミトコンドリア機能を介してｐ５３−依存神経細胞の死滅１１，１２を誘導することが分かった１３。Ａβに向かう抗体の海馬内への注入は、細胞のＡβ沈殿物を減少させるだけでなく、細胞内Ａβの蓄積を減少させる。この抗体が消滅する際、細胞の沈殿物が再登場する前に細胞内Ａβの蓄積が起こっていた。このような観察は、細胞内Ａβ及び細胞外Ａβ間の動的交換が存在し、細胞内Ａβが細胞外アミロイド沈殿物のソースとして作用してＡＤの発病における細胞内Ａβに対する役割を示唆するということを提示する１４，１５。
【０００６】
Ａβの蓄積は、ＡＤの発病に最も重要な一つの要因とされるため、脳からのＡβの分解除去は価値のある治療戦略になるはずである。ネプリライシン（ＮＥＰ）、インシュリン分解酵素、エンドセリン変換酵素及びｕＰＡ／ｔＰＡ−プラスミンを含むいくつかのプロテアーゼはＡβを分解する能力を有しており、その中でもＮＥＰが最高の分解能を有することが分かった１６。マウスからのＮＥＰの薬物学的に抑制又は遺伝的に除去するとＡβの蓄積を増加させ、シナプス可塑性の欠乏及び海馬依存記憶障害を伴うことが分かったが１７，１８、一方、ＮＥＰのウィルス又は移植遺伝子−仲裁と過剰発現はＡβの蓄積及びそれに関する細胞病理学を減少させた１９，２０。しかし、最近ＮＥＰの過剰発現はオリゴマーＡβレベルを減少させないか、学習及び記憶障害を改善しないことが分かった。これらの結果は、ＡβのＮＥＰ依存性分解がオリゴマーＡβより更に効率的に斑点に影響を及ぼすということを提示することで現れた２１。このような適用に際して多様な特許及び公報を参照しており、引用文は参照として提示する。本発明及び本発明に関する技術の状態をより十分に説明するために、これらの特許及び公報の開示は本願に参考として含まれる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、アミロイドβガもたらす疾患、その中でもアルツハイマー症に対するタンパク質加水分解治療剤を開発するために集中的に努力した。その結果、発明者らは、カブ黄色モザイクウィルス（ＴｕＭＶ）の核含有物ａ（Ｎｌａ）プロテアーゼが効果的で特定な方式でモノマー及びオリゴマーアミロイドβ（Ａβ）を切断し、ニューロン培養細胞でＡβが誘導した細胞死滅、及び遺伝子移植ＡＤ（アルツハイマー症）マウスでＡβ関連病変を相当部分予防するということを発見した。よって、ＮｌａはＡＤ患者の脳から毒性オリゴマーＡβを除去するための新たな戦略を提供することができる。
【０００８】
従って、本発明の目的は、アミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための薬剤学的造成物を提供することにある。本発明の他の目的は、アミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、添付し特許請求の範囲及び図面と共に提供される詳細な説明によって明白になるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＮｌａによるＡβの切断を示す図である。
【図１Ｂ】ＮｌａによるＡβの切断を示す図である。
【図１Ｃ】ＮｌａによるＡβの切断を示す図である。
【図１Ｄ】ＮｌａによるＡβの切断を示す図である。（Ａ）Ａβのアミノ酸序列はＮｌａ，Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎの共通切断部位と整列される。（Ｂ）Ｎｌａは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から製剤され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。レイン１、分子サイズマーカー；レイン２、Ｎｌａ（１０ｐｇ）。（１Ｃ）ＮＥＭの存在下又は不在下でモノマーＡβ（２．５μm）をＮｌａ（１．５μm）に２５℃で３時間インキュベーションした。反応混合物はトリス−トリシンゲル上に分離、ブロットされ、抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０で検査された。各Ａβバンドの密度は密度計によって定量化された。３時間インキュベーションした後、バンド強度（レイン２，４及び６）を０時間で各サンプルのバンド強度（レイン１，３及び５）に対してフローティングした。ｎ＝４（Ｄ）オリゴマーＡβ（２．５μm）をＮＥＭの存在下又は不在下でＮｌａ（１．５μm）に２５℃で３時間インキュベーションした。反応混合物は分離され、抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０で免疫ブロットされた。オリゴマーＡβバンドの密度は密度計によって定量化された。３時間インキュベーションした後、オリゴマーＡβバンド強度（レイン２，４及び６）を３時間インキュベーションした時点で、前記Ａβサンプルのバンド強度（レイン２）に対してフローティングした。ｎ＝４  エラーバーはＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５そして＊＊Ｐ＜０．０１
【図２Ａ】ＮｌａでインキュベーションされたモノマーＡβの質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｂ】ＮｌａでインキュベーションされたモノマーＡβの質量スペクトルを示す図である。（Ａ）予想された切断生成物の計算された分子質量を示した。（Ｂ）モノマーＡβ（２．５μm）をＮｌａ（１．５μm）で２５℃で３時間インキュベーションし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を利用して分析した。Ａβに対応するピークだけでなく、Ａβ切断生成物に対応する２つのピークが検出されたということに注目すべきである。対称として、Ｎｌａ及びＡβを別途に分析した。別途に表示された３つの小さいピークはＮｌａ製剤の汚染を示す。
【図３Ａ】Ｂ１０３神経亜細胞腫細胞からＮｌａ亜細胞を局在化する図である。
【図３Ｂ】Ｂ１０３神経亜細胞腫細胞からＮｌａ亜細胞を局在化する図である。（Ａ）ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａに形質転換されたＢ１０３神経亜細胞種細胞を抗−ＨＡ抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡で観察した。（Ｂ）ブランクプラスミド（Ｍｏｃｋ）又はｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａ（Ｎｌａ）に形質転換されたＢ１０３細胞を偏差遠心分離機によって微粒子（Ｐ）及び溶解性（Ｓ）断片に分類した。２つの断片はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ブロット及びＯｃｔｌ（ｎｕｃｌｅａｒ）、ＶＤＡＣ２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）、ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ）、ｏ−ｔｕｂｕｌｉｎ（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）及びＨＡ（Ｎｌａ）に対する抗体で検査された。
【図４Ａ】Ｎｌａによる細胞内Ａβの分解及び細胞内Ａβが誘導した細胞死滅の抑制を示す図である。
【図４Ｂ】Ｎｌａによる細胞内Ａβの分解及び細胞内Ａβが誘導した細胞死滅の抑制を示す図である。
【図４Ｃ】Ｎｌａによる細胞内Ａβの分解及び細胞内Ａβが誘導した細胞死滅の抑制を示す図である。
【図４Ｄ】Ｎｌａによる細胞内Ａβの分解及び細胞内Ａβが誘導した細胞死滅の抑制を示す図である。（Ａ）Ｂ１０３神経亜細胞腫の細胞をｐＧＦＰＵｂ−Ａβ及び空（ｅｍｐｔｙ）ベクトル（Ｍｏｃｋ）、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａ（Ｎｌａ）又はｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｍＮｌａ（ｍＮｌａ）で一緒に感染させた。４８時間インキュベーションした後、細胞を抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０で免疫染色した。（Ｂ）Ａβ−ポジティブ細胞（赤色）及びＧＦＰ−発現細胞（緑色）の数を顕微鏡下で数え、それらの割合を計算した。ｎ＝６（Ｃ）細胞内Ａβペプチードによって誘導された細胞死滅を形態及びＭＴＴ  ａｓｓａｙで測定した。ｎ＝６  エラーバーはＳＤを示す。＊＊Ｐ＜０．０１
【図５】Ｎｌａによる外因性的に添加されたＡβが誘導した細胞死滅の抑制を示す図である。空ベクトル（Ｍｏｃｋ）、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａ（Ｎｌａ）又はｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｍＮｌａ（ｍＮｌａ）で感染されたＢ１０３神経亜細胞腫の細胞を培養培地で４８時間Ａβ（５μm）で処理した。顕微鏡及びＭＴＴａｓｓａｙで細胞死滅を測定した。ｎ＝６  エラーバーはＳＤを示す。＊＊Ｐ＜０．０１
【図６Ａ】レンチウィルスが仲裁したＮｌａの発現を示す図である。
【図６Ｂ】レンチウィルスが仲裁したＮｌａの発現を示す図である。
【図６Ｃ】レンチウィルスが仲裁したＮｌａの発現を示す図である。
【図６Ｄ】レンチウィルスが仲裁したＮｌａの発現を示す図である。（Ａ）ＨＡ−Ｎｌａ及びＧＦＰの発現のためのレンチウィルス構造。（Ｂ）抗−ＨＡ抗体で行ったウェスタンブロッティングはレンチ−Ｎｌａで感染された２９３Ｔ細胞でＮｌａの発現レベルを示した。（Ｃ）マウスの脳からＮｌａの発現を抗−ＨＡ抗体及び抗−マウス−ＦＵＣ２次抗体で免疫組織化学によって検出した。レンチ−Ｎｌａが注入されたマウスの脳の前頭葉部分を非注入された対照群マウスの脳部分と比較した。（Ｄ）レンチ−ＧＦＰ及びレンチ−Ｎｌａが注入された脳はＰＴ−ＰＣＲ処理を受けた。Ｎｌａに対応するＰＣＲ生成物を検出した。ＧＡＰＤＨが対照群として使用された。ＣＭＶ、サイトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター；ＷＰＲＥ、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ肝炎転写後の調節要素；Ｕ５，ＨＩＶ５’−ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ；ΔＵ３，３’自己非活性Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ；ＰＳｌ、ディレクティングパッケージに責任があるウィルスＲＮＡの領域；ＰＲＥ、核から細胞質まで連結されていないＲＮＡの輸送を助けるＲｅｖタンパク質のための結合部位。
【図７Ａ】ＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９マウスの脳でＮｌａが仲裁したＡβのレベル及びＡβ斑点の減少を示す図である。
【図７Ｂ】ＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９マウスの脳でＮｌａが仲裁したＡβのレベル及びＡβ斑点の減少を示す図である。
【図７Ｃ】ＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９マウスの脳でＮｌａが仲裁したＡβのレベル及びＡβ斑点の減少を示す図である。（Ａ）ＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９の脳にＬｅｎｔｉ−ＧＦＰ及びＬｅｎｔｉ−Ｎｌａが両方向に注入され、ＥＬＩＳＡでＡβ１−４０及びＡβ１−４２の量を測定した。可溶性及び不溶性Ａβ１−４０の量を示した（上部レイン）。可溶性及び不溶性Ａβ１−４２の量を示した（下部レイン）。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ及びＬｅｎｔｉ−Ｎｌａが注入されたＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９オスマウスの前頭葉、頭頂葉、海馬、及び梨状皮質部分を抗−Ａβ抗体で染色した（Ｂａｍ−１０）。（ｃ）Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ及びＬｅｎｔｉ−Ｎｌａが注入されたＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９オスマウスの前頭葉、頭頂葉、海馬、及び梨状皮質から斑点の数を数えた。Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰが注入されたオスの場合ｎ＝５であり、メスの場合ｎ＝５であった。Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａが注入されたオスの場合ｎ＝６であり、メスの場合ｎ＝３であった。エラーバーはＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５そして＊＊Ｐ＜０．０１
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一様体において、Ｎｌａ（核含有物ａ）プロテアーゼ又は前記Ｎｌａプロテアーゼを符号化するニュクレチド序列を含む遺伝子運搬体を活性成分として含むアミロイドβがもたらす疾患の予防又は治療のための薬剤学的造成物が提供される。
【００１１】
本発明の他の様態において、哺乳動物の対象に上述した薬剤学的造成物を投与することを含むアミロイドβがもたらす疾患を予防又は治療するための方法が提供される。
【００１２】
本発明者たらは、アミロイドβガもたらした疾患、その中でもアルツハイマー症に対するタンパク質加水分解治療剤を開発するための集中的に努力した。その結果、発明者らは、カブ黄色モザイクウィルス（ＴｕＭＶ）の核含有物ａ（Ｎｌａ）プロテアーゼが効果的で特定な方式でモノマー及びオリゴマーアミロイドβ（Ａβ）を切断し、ニューロン培養細胞でＡβが誘導した細胞死滅、及び遺伝子移植ＡＤ（アルツハイマー症）マウスでＡβ関連病変を相当部分予防することを発見した。よって、ＮｌａはＡＤ患者の脳から毒性オリゴマーＡβを除去するための新たな戦略を提供することができた。
【００１３】
カブ黄色モザイクウィルス（ＴｕＭＶ）の核含有物ａ（Ｎｌａ）プロテアーゼは、ウィルス性多タンパク質を機能性タンパク質で処理することに責任がある。Ｎｌａは先にＶａｌ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎを好み、Ｇｌｎの後に位置された用意に切断され得る結合を有する比較的厳しい気質特異性を有することが分かった。アミロイド−β（Ａβ）の推定ａ−セクレターゼの切断部位の近くにおける同じ共通序列、Ｖａｌ１２−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ１５の存在は、発明者にとって「ＮｌａがＡβに対する活性を有しているだろう」という仮説を立てるようにした。好ましい実施例によると、ＮｌａプロテアーゼはモノマーＡβだけでなくオリゴマーＡβをも切断する活性を有する。この技術でよく知られているように、オリゴマーＡβはフィブリルＡβ及びモノマーＡβよりそれぞれ約１０倍及び４０倍も細胞毒性が多いことが分かった。ダイマーＡβはモノマーＡβより３倍も毒性が多く、トリマーＡβ及びテトラマーＡβは１３倍も毒性が多い。このような点から、本発明で使用されたＮｌａプロテアーゼは毒性がより多いＡβ分子を切断することでＡＤを治療するのに非常に有利である。
【００１４】
好ましい実施例によると、Ｎｌａプロテアーゼは細胞内または細胞外Ａβを切断する。更に好ましくは、本発明で使用されたＮｌａプロテアーゼはチトゾールに存在するＡβを切断する。実施例で示したように、神経細胞においてＮｌａの発現は細胞内に発現されたＡβ及び細胞外に添加されたＡβ両方によって誘導される細胞死滅を抑制する。及びに、ＡＤ遺伝子移植マウスの脳からレンチウィルスが仲裁したＮｌａの過剰発現は、Ａβ及び斑点形成のレベルを減少させる。これらのデータはＡＤの発病において細胞内Ａβに対する重要な役割を支援する追加的な証拠を提供する。この点から、Ｎｌａは細胞内Ａβによる細胞死滅の誘導を基底においている分子的事件を研究する新たな道具として使用されることができた。更に、本発明はチトゾールプロテアーゼによる細胞内Ａβの除去がＡＤの治療のための実行可能な戦略になり得るという概念の証明を提供する。
【００１５】
好ましい実施例によると、Ｎｌａプロテアーゼはアミロイドβが誘導する細胞死滅を抑制する。
【００１６】
好ましい実施例によると、Ｎｌａプロテアーゼはアミロイドβ１−４０及びアミロイドβ１−４２を切断する活性を有する。
【００１７】
好ましい実施例によると、Ｎｌａプロテアーゼは序列番号３のアミノ酸１５及び１６の間のペプチード結合を切断する活性を有する。
【００１８】
本発明で使用されたＮｌａプロテアーゼはＮｌａプロテアーゼを符号化するニュクレオチド序列を含むタンパク質又は遺伝子運搬体として提供されてもよい。Ｎｌａプロテアーゼがタンパク質の形で提供される場合、それは細胞内に効果的に浸透するようにタンパク質運搬ドメイン（ＰＴＤ）に代わりに融合され得る。Ｎｌａプロテアーゼの好ましいアミノ酸序列は、序列番号１で記載される。
【００１９】
本発明に有用なタンパク質運搬ドメインはＨＩＶ−ＴＡＴ，ＶＰ−２２，成長因子信号ぺプチード序列、Ｐｅｐ−１，Ｐｅｐ−７，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｐ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｎｉｅ，Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ，ＢｕｆｏｒｉｎII，ＭＡＰ（ｍｏｄｅｌ  ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ），ｋ−ＦＧＦ，ｋｕ７０，ｐＶＥＣ，ＳｙｎＢｌ及びＨＮ−１を含むが、それに限ることはない。
【００２０】
ＮｌａプロテアーゼがＡβを除去するための遺伝子運搬体として提供される場合、Ｎｌａプロテアーゼはこの技術分野における通常の知識を有するものに知られている従来の技術によって遺伝子運搬体として構成され得る。
本願で使用された「遺伝子運搬（ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ）という用語は遺伝子を細胞内に運搬することをいい、遺伝子伝達と同じ意味を有する。
【００２１】
本遺伝子運搬体を構成するために、ニュクレオチド序列を符号化するＮｌａプロテアーゼは適合した発現構造内に含まれることが好ましい。発現構造によると、ニュクレオチド序列を符号化するＮｌａプロテアーゼはプロモーターに作動的に連結される。「作動的に連結される（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌ  ｉｎｋｅｄ）」という用語は、（プロモーター、信号序列又は転写因子結合部位のアレイのような）核酸発現調節序列と第２核酸序列との間における機能的連結をいい、前記発現調整序列は前記第２序列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。本発明によると、Ｎｌａプロテアーゼ遺伝子に連結されたプロモーターは、好ましくは動物、更に好ましくは哺乳動物の細胞で作動可能であり、哺乳動物細胞のゲノム又は哺乳動物のウィルス、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅプロモーター、牛痘ウィルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーター及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターから由来したプロモーターを含むＮｌａプロテアーゼ遺伝子の転写を調節する。最も好ましくは、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００２２】
好ましくは、本発明で使用された発現構造はアデニル酸重合反応序列（例えば、牛の成長ホルモン終結者及びＳＶ４０由来のアデニル酸重合反応序列）を含む。
【００２３】
好ましい実施例によると、ニュクレオチド序列を符号化するＮｌａプロテアーゼのための発現構造は、「プロモーター−ニュクレオチド序列を符号化するＮｌａプロテアーゼ−アデニル酸重合反応序列」の構造を有する。
本発明の遺伝子運搬体は多様な形、好ましくは（i）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（II）プラスミド、（iii）ウィルスベクトル又は（iv）ネイキッド組換えＤＮＡ分子及びプラスミドを含むリポゾーム又はネオゾームで構成される。
【００２４】
Ｎｌａプロテアーゼ−符号化ニュクレオチド序列は、遺伝子治療に有用な多数の遺伝子運搬体、好ましくはプラスミド、アデノウィルス２２、アデノ関連ウィルス(ＡＡＶ，ＬａｓｈｆｏｒｄＬＳ．，など、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｈｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レトロウィルス２３、単純疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）ウィルス２４、牛痘ウィルス２５、リポゾーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２）又はネオゾームに適用され得る。最も好ましくは、本発明の遺伝子運搬体はＮｌａプロテアーゼ−符号化ニュクレオチド序列をレトロウィルス又はレンチウィルスに結合することで構成される。
【００２５】
（i）アデノウィルス
アデノウィルスは、中間サイズのゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的細胞範囲及び高い感染度のため、一般に遺伝子運搬体として採用されてきた。ウィルスゲノムの両端は、ウィルスＤＮＡ複製及びパッケージのために必要なｃｉｓ要素である１００〜２００ｂｐ  ＵＲ（ｉｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）を含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）はウィルスゲノム及び少数の細胞遺伝子の転写に責任があるタンパク質を符号化する。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウィルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成に帰結される。
【００２６】
これまで開発されたアデノウィルスベクトルのうち、削除されたＥ１領域を有する無能なアデノウィルスの複製が通常的に使用される。アデノウィルスベクトルから削除されたＥ３領域は、移植遺伝子のための挿入部位を提供し得る２５，２６。よって、Ｎｌａプロテアーゼ符号化ニュクレオチド序列は、削除されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）又は削除されたＥ３領域のうちいずれか一つに、更に好ましくは削除されたＥ３領域に挿入される。プロモーター−Ｎｌａプロテアーゼ遺伝子−ポリＡ序列は、好ましくは削除されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）又は削除されたＥ３領域、より好ましくは削除されたＥ３領域のうちいずれか一つ、更に好ましくは削除されたＥ３領域に存在する。
【００２７】
事実上、約２ｅｘｔｒａ  ｋｂのＤＮＡに対する容量であれば、アデノウィルスはワイルドタイプゲノムの約１０５％をパッケージし得る。この点から、上述したアデノウィルスに挿入された外部序列はアデノウィルスワイルドタイプゲノムに更に挿入され得る。
【００２８】
アデノウィルスは４２個の他の公知の血清型又は亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ）Ａ〜Ｆのうちいずれか一つで構成され得る。亜群Ｃのアデノウィルス５型は、本発明のアデノウィルス遺伝子運搬体を構成するための最も好ましい開始物質である。アデノウィルス５型に対する数多くの生化学的及び遺伝的情報が知られている。
【００２９】
本アデノウィルス遺伝子運搬体によって伝達された外部遺伝子はエピソームであるため、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。よって、本発明のアデノウィルス遺伝子運搬体を利用した遺伝子治療は相当安全であるといえる。
【００３０】
（ii）レトロウィルス又はレンチウィルス
比較的大きい外因性遺伝子を運搬し得るレトロウィルス又はレンチウィルス２３は、それらのゲノムを宿主ゲノムに統合し、広い宿主スペクトルを有するという点からウィルス遺伝子伝達ベクトルとして使用されてきた。
【００３１】
レトロウィルスベクトル又はレンチウィルスベクトルを構成するために、運搬されるＮｌａプロテアーゼ−符号化ニュクレオチド序列はあるウィルス序列の代わりにウィルスゲノムとして挿入され、複製欠陥ウィルスを生産する。ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）を生産するためにｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）及びΨ成分のないパッケージ細胞株が構成される２８。Ｎｌａプロテアーゼ−符号化序列、ＬＴＲ及びΨを含む組換えプラスミドがこの細胞柱に導入される際、前記Ψ序列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウィルス粒子でパッケージされるようにするが、それらの粒子はその後培養培地Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎに分泌される『Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ』Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ２９。組換えレトロウィルスを含む培地はその後集められ、選択的に濃縮されて遺伝子伝達のために使用される。
【００３２】
２世代レトロウィルスベクトルを利用した成功的な遺伝子伝達は、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）序列が外皮領域の代わりに挿入され、結果的に新たな結合性質を有するキメラタンパク質を生産するモロニネズミ科動物の白血病ウィルスの異型を製造したＫａｓａｈａｒａなど３０によって報告されている。おそらく、本遺伝子運搬体は２世代レトロウィルスベクトルのための構成戦略によって攻勢され得る。
【００３３】
（iii）ＡＡＶベクトル
アデノ関連ウィルスは未分割細胞及び多様な類型の細胞を感染させることができ、本発明の遺伝子運搬体を構成するにおいてそれらを有用に使用することができる。ＡＡＶベクトルの用途及び製造に対する詳細な記載は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に説明されている。
【００３４】
遺伝子運搬体としてのＡＡＶに対する研究結果は、ＬａＦａｃｅなど３１、Ｚｈｏｕなど３２、Ｗａｌｓｈなど３３及びＦｌｏｔｔｅなど３４に開示されている。最近、ＡＡＶベクトルは、嚢胞性線維症を治療するための第１相ヒト臨床試験のために承認された。
【００３５】
典型的に、組換えＡＡＶウィルスは２つのＡＡＶ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔなどが付いているＮｌａプロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド３５，３６及びｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのないワイルドタイプのＡＡＶ符号序列を含む発現プラスミド３７によって製造される。
【００３６】
（iv）その他のウィルスベクトル
その他のウィルスベクトルは、本発明で遺伝子運搬体として採用され得る。牛痘ウィルス２５（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，『Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．』、Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ２９；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，『Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ．』Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ３８（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８（１９８６））及び単純疱疹ウィルス２４のようなウィルスから由来したベクトルが、Ｎｌａプロテアーゼ遺伝子を細胞内に伝達するための本伝達システムで使用され得る。
【００３７】
（v）リポゾーム
リポゾームは、燐脂質が多量の水溶性培地に懸濁されるとき自発的に形成される。リポゾームが仲裁した核酸の伝達は、Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ３９、そしてＮｉｃｏｌａｕなど４０に記載されているように非常に成功的であった。リポゾームを利用した動物細胞を感染させるための商業的に入手可能な試薬の例は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む。Ｎｌａプロテアーゼ遺伝子を捕獲するリポゾームは、細胞異物の吸収（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、吸着及び融合、そして、その後細胞内への序列伝達のような器具によって細胞と相互作用を行う。
【００３８】
本発明の更に他の様態において、上述したような本発明の遺伝子運搬体を細胞を含むバイオサンプルと接触させることを含む遺伝子伝達方法が提供される。
【００３９】
本遺伝子運搬体がウィルスベクトル構造に基づいて構成される場合、前記接触はこの技術分野で知られている従来の感染方法として行われる。ウィルスベクトルを利用した宿主の感染は、上記で引用した公報に詳細に記載されている。
【００４０】
本遺伝子運搬体がネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子又はプラスミドである場合、伝達されるＮｌａプロテアーゼ−符号化序列及びニュクレオチド序列は顕微注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）４１，４２、カルシウム・リン酸塩共同沈殿（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）４３，４４、電気穿孔方（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）４５，４６、リポゾーム仲裁形質注入（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）４７，３９，４０、ＤＥＡＥ−デキストラン処理４８及び粒子衝突４９によって細胞内に導入される。
【００４１】
好ましい実施例によると、Ｎｌａプロテアーゼ遺伝子（例えば、序列番号２）はウィルスベクトルであり、更に好ましくは、レトロウィルスベクトル又はレンチウィルスベクトルで運搬される。
【００４２】
本発明の薬剤学的造成物において、薬剤学的に妥当な運搬体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ラバーアラブル（ｒｕｂｂｅｒ  ａｒａｂｌｅ）、カリウム、リン酸塩、アルギネート（ａｒｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン、珪酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）、マイクロクリスタルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｅｎｚｏａｔｅ）、プロピルヒドロキシベンゾエート（ｐｒｏｐｙｌｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｅｎｚｏａｔｅ）、滑石（ｔａｌｃ）、マグネシウムステアレート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）及び鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌｓ）を含む剤形用の従来成分であってもよいが、それに限ることはない。本発明による薬剤学的造成物は潤滑剤、保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、甘味料、芳香剤、乳化剤、懸濁剤及び保存剤を更に含んでもよい。適合かつ薬剤学的に妥当な運搬体及び剤形の詳細な内容は、本願に参照として含まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）を参照するとよい。
【００４３】
本発明の薬剤学的造成物は、好ましくは非経口的に投与されてもよい。非口腔投与のために極小注射、脊髄注射、静脈注射又は腹腔内注射が採用されてもよい。
【００４４】
本発明の薬剤学的造成物の適合的な投与量は、薬剤学的剤形方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、疾患の重症度、食習慣、投与時間、投与経路、排泄分率及び使用された薬剤学的造成物に対する敏感性に応じて変化され得る。この技術分野における通常の知識を有する医者は、望みの治療のために本薬剤学的造成物の効果的な量を決定してもよい。好ましくは、本発明の薬剤学的造成物は毎日０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の量が投与される。
【００４５】
この技術分野で通常の知識を有する者に知られている従来技術によると、本薬剤学的造成物は、上述したように薬剤学的に妥当な運搬体及び／又は伝達体とともに剤形化され、最終的に１回服用量の形及び多数回服用量の形を含む様々な形を提供し得る。剤形の非制限的な例がそれに限ることはないが、溶液、オイル又は水溶性培地内の懸濁液又乳液、抽出物、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、粉末、顆粒、製剤及びカプセルを含み、分散剤又は安定化剤を更に含んでもよい。
【００４６】
本発明の薬剤学的造成物は、アルツハイマー症、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、軽度から中等度までの認知機能障害、血管性認知症、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血、老人性認知症、ダウン症候群、封入体筋炎、加齢黄斑変性症及びアルツハイマー症に関する病を含む多様な疾患又は障害を予防又は治療するために採用され得る。特に、本発明の薬剤学的造成物は、アルツハイマー症のための前途有望な治療剤である。
【００４７】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。それらの実施例は本発明を更に具体的に例示するためのものであり、添付した特許請求の範囲に記載された本発明の範囲がそれらの実施例によって制限されないということは本技術分野における通常の知識を有する者にとっては自明である。
【実施例】
【００４８】
材料及び方法
抗体及び試薬
細胞培養試薬をＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。合成Ａβ１−４２ぺプチードをＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びＡｎｙｇｅｎ（Ｇｗａｎｇｊｕ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。Ａβぺプチードの６Ｅ１０抗体認識残基をＳｉｇｎｅｔＴＭ（Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＨＡ，ａ−ｔｕｂｕｌｉｎ，ＶＤＡＣ２，Ｏｃｔｌ及びＣａｔｈｅｐｓｉｎＤに対する抗体をＡｂｅａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＫ）から購入した。キチンビード（ｃｈｉｔｉｎ  ｂｅａｄ）をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。その他の全ての試薬をＳｉｇｍａから購入した。
【００４９】
Ｎｌａプロテアーゼの精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から組換えＮｌａタンパク質を生産するために、Ｎｌａ遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌ部位を介してｐＴＹＢ１２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で複製した。ｐＴＹＢ１２ベクトルはＮ−末端インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）タグを含む。ｐＴＹＢ１２−ＮｌａベクトルをＥ．ｃｏｌｉ変種ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換し、ＬＢ培地で３７℃で成長させた。４００μmのＩＰＴＧを２０℃で一晩中添加し、Ｎｌａタンパク質を誘導した。細胞を採取し、カラム緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ＩｍＭ  ＥＤＴＡ）で再懸濁し、超音波処理で分解した。分解物を遠心分離し、得られた上清液をカラム緩衝液で平行が維持されたキチンカラムにロードした。長時間洗浄した後、Ｎｌａタンパク質を５０ｍＭ  ＤＴＴ含有するカラム緩衝液を利用してカラムから溶かして分離し、貯蔵緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で透析（ｄｉａｌｙｚｅ）し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濃縮した。ＢＣＡ法でタンパク質の濃度を判断し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で分析した。
【００５０】
Ａβの製造
Ａβ溶液を製造するために、発明者らはＹａｎなど５０、Ｄａｈｌｇｒｅｎなど３が記述した方法に従った。合成ヒトＡβ１−４２ぺプチード（＞９５％純度（高性能クロマトグラフィ及び質量分析検査））を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に５ｍＭの濃度で溶解させた。モノマーＡβの場合、使用直前にＤＭＳＯ内のＡβ溶液をＰＢＳに希釈し、２５μmの最終濃度にした。オリゴマーＡβの場合、ＤＭＳＯ内のＡβ溶液をＰＢＳに希釈して１００μmの最終濃度にし、４℃で３６時間インキュベーションした。Ａβの物理的状態を１０〜２０％トリス−トリシンゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＰＡＧＥによって確認した。
【００５１】
切断分析及び質量分析
１．５μmの組換えＮｌａプロテアーゼを、分析緩衝液（ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］，２０ｍＭ  ＫＣＬ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２．５μm  Ａβ製剤で２５℃で３時間インキュベーションした。対照として、Ｎｌａプロテアーゼをシステインプロテアーゼ抑制剤、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で４℃で１０分間予めインキュベーションした。インキュベーションした後、混合物は１０〜２０％トリス−トリシンゲルを利用したＰＡＧＥ及び抗−Ａβ抗体６Ｅ１０を使用したウェスタンブロッティングを受けた。切断生成物を更に分析するために、反応混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析器（４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で分析した。対称として、Ｎｌａ及びＡβを別途に分析した。
【００５２】
細胞培養、形質注入及びＡβ処理
Ｂ１０３ネズミ神経亜細胞腫細胞を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭで培養した５１。触媒３価元素（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）内のＡｓｐ８１がＡｌａに変化された変種Ｎｌａ遺伝子をＰＣＲ突然変異精製によって精製した。Ｂ１０３細胞からワイルドタイプ及び変種Ｎｌａを発現するために、該当遺伝子をＮ−末端ＨＡタグを含むｐｃＤＮＡ３（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブ複製（ｓｕｂｃｌｏｎ）した。製造者のプロトコールに応じて、細胞はリポフェクタミン試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）利用して形質注入された。チトゾール（ｃｙｔｏｓｏｌ）Ａβ１−４２発現ベクトルは既に上述されている５２。Ａβを処理するために、５μmの最終濃度までＡβ溶液（１００μm）を添加した。
【００５３】
細胞死滅の評価
細胞の生存能力をＭＴＴ分析及び細胞形態的方法で評価した。３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｚａｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌまで可溶化した。１０％の培養培地の容積と同じ容積のＭＴＴ溶液を３７℃で３時間添加した。培養培地の容積と同じ容積の可溶化溶液（無水イソプロパノール内１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．１  ＮＨＣＬ）を添加し、得られたフォーマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）結晶が完全に溶解されるまで３７℃でインキュベーションした。資料の吸光度を５７０ｎｍで測定し、核ウェル（ｗｅｌｌ）の背景（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の吸光度を６９０ｎｍで測定した。細胞形態を評価するために、培養された細胞を実験プラスミド及びＧＦＰプラスミドとともに形質転換し、ＧＦＰ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞の形を蛍光顕微鏡４２（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｈｉｎｊｕｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で検査した。
【００５４】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡
Ｂ１０３ネズミ神経亜細胞腫細胞を１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで洗浄し、３．５％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１０分間固定した。ＰＢＳで０．２％トリトンＸ−１００で１０分間インキュベーションすることで細胞を透過性にし、ＰＢＳで５％ＢＳＡで１時間遮断し、抗−６Ｅ１０モノクローン抗体又はＨＡモノクローン抗体で1時間インキュベーションした。
【００５５】
その後、固定された細胞をＰＢＳで洗浄（ｒｉｎｓｅ）し、Ａｌｅｘａ  ４８８  ｆｌｕｏｒ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ２次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＴＲＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）で１時間インキュベーションした。免疫蛍光顕微鏡法のために、ＰｒｏｇＲｅｓ  Ｃ１０ｐｌｕｓカメラ（ＪＥＮＯＰＴ１Ｋ、Ｇｏｅｓｃｈｗｉｔｚｅｒ  Ｓｔｒａｓｓｅ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を搭載した蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で免疫反応性を捕捉した。ＩＭＴ−ｉソリューションソフトウェア（ＩＭＴｉ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を利用し、カラーコーディングを行った。ＧＦＰポジティブ細胞の中からＡβ集合のレベルを判断するために、Ａβポジティブ細胞対ＧＦＰポジティブ細胞の数を、培養物当たり２０個の任意のフィールドでカウントした。共焦点顕微鏡分析のために、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２，ＬＥＩＣＡ，Ｅｒｎｓｔ−Ｌｅｉｔｚ−Ｓｔｒａｓｓｅ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して蛍光信号を可視化した。
【００５６】
亜細胞の分類法
Ｎｌａタンパク質の細胞内局在化を判断するために、上述したプロトコールを使用してＮｌａ−発現細胞を分類した５３。簡単には、細胞を均質緩衝液（２００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｘ完全なプロテアーゼ抑制剤カクテル）に掻き入れて採集し、２６ゲージの針を有する注射器で何回か移して分離し、７０，０００Ｘｇの速度で４℃で３０分間超遠心分離した。ペレット（クルード（ｃｒｕｄｅ）膜の断片）を０．５％トリトンＸ−１００を含む均質緩衝液で再懸濁し、１分間超音波処理を行った。各断片から部分標本（５０ｐｇ）をウェスタンブロッティングで分析した。
【００５７】
電気泳動及びウェスタンブロッティング
ＰＢＳで３回洗浄した後細胞を採集し、IXプロテアーゼ抑制剤核的を含むＲＩＰＡ緩衝液で再懸濁し、簡単に超音波処理を行った。１０，０００Ｘｇで遠心分離した後、可溶性タンパク質の断片を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＢＣＡ法でタンパク質の濃度を判断した。Ａβぺプチードを分析するために、１０〜２０％トリス−トリシンゲルを利用した電気泳動で資料を分離した。その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ及び２０％メタノールで浸したＰＶＤＦ膜の上にタンパク質を移した。膜を５％非脂肪乳（ｎｏｎ−ｆａｔ  ｍｉｌｋ）で遮断し、６Ｅ１０，ＨＡ，ａ−ｔｕｂｕｌｉｎ，ＶＤＡＣ２，Ｏｃｔｌ及びＣａｔｈｅｐｓｉｎＤに対する抗体でインキュベーションした。ＥＣＬ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用してバンドを可視化し、各バンドの強度を濃度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で数量化した。
【００５８】
レンチウィルスの生産
Ｎｌａ及びＧＦＰを符号化するｃＤＮＡ断片をｐＬＥＸ−ＭＣＳレンチウィルスベクトル（Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）にサブ複製した。得られた組換えプラスミドをパッキングプラスミドとともに２９３Ｔに形質転換し、上清液を集めた。レンチウィルスを集め、上述した超遠心分離１９，５４で濃縮した。ＰＣＲを使用してＨＩＶ  ｐ２４抗原の量を測定することで、Ｎｌａ及びＧＦＰの力価を推定した。
【００５９】
ＡＤネズミ科動物モデル及び外科的（ｓｕｒｇｉｃａｌ）手続
上述したように、ヒト突然変異ＡＰＰ及びＰＳＩ（ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳｌｄＥ９）を過剰発現する遺伝子移植ＡＤモデルマウス、Ｔｇ−ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳｌｄＥ９をＣ５７ＢＬ６ｘＣ３Ｈ  Ｆ１ハイブリッドマウスに維持した。これらのマウスを１２時間明るい／暗い周期（午前７時に点灯）下の温度及び湿度が調節された環境で、飲食物と水に自由に接近し得る普通のプラスチックケージに内に放置した。生後６．５ヶ月のＴｇ−ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳｌｄＥ９マウスをＬｅｎｔｉ−Ｎｌａ（ｎ＝９）及びＬｅｎｔｉ−ＧＦＰ（ｎ＝１０）群から任意抽出した。これらのマウスの両側の脳室（ｉ．ｃ．ｖ）に３μmのＬｅｎｔｉ−Ｎｌａウィルス（１Ｘ１０８ＴＵ）又はＬｅｎｔｉ−ＧＦＰレンチウィルスを同じ力価で注入した。１ヶ月後、注入されたマウスを犠牲し、０．９％の食塩水で灌流させた。組織学及び生化学的分析のために、脳の左右側の半球体をそれぞれ使用した。全ての動物を梨花女子大学医科大学の動物管理指針に従って取り扱った。
【００６０】
ＲＰ−ＰＣＲ
前頭の大脳皮質組織から全体のＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）で分離した。オリゴ−ｄＴプライミングを有するＩｍＰｒｏｍIIリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を利用して逆転写を行った。Ｎｌａの発現を検出するために、Ｎｌａの特異的プライマーセット（５’−ＡＣＧ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＧＧＡ−３’と５’−ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＴＴ−３’）を使用してＰＣＲを行った。対照実験のために、ＧＡＰＤＨの特異的プライマーセット（５’−ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ−３‘と５’−ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＣＧＣ−３‘）を使用してＰＣＲを行った。
【００６１】
免疫組織化学
右側の半球体を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に４℃で一晩中４％パラホルムアルデヒドで後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）し、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ；Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して厚さ４０ｐｍのパートに管状に切断した。フリーフローティング（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ）部分を５％正常ヤギ血清、２％ＢＳＡ及び２％ＦＢＳで遮断した。発色のためにビオチン化されたＨＲＰシステムを使用した。Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）から抗−Ａβ抗体Ｂａｍ−１０（Ａ５２１３）を購入した。ＤＰ７１カメラ及びＤＰ−Ｂソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を装着したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡を使用し、顕微鏡検査を行った。斑点レベルを数量化するために、各領域で斑点の数をＴＯＭＯＲＯ  ＳｃｏｐｅＥｙｅ  ３．６プログラム（Ｔｅｃｈｓａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を使用して測定した。
【００６２】
Ａβレベルの評価
Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）レベルに対するＥＬＩＳＡ分析は以前の研究４６に記載されている。簡単には、前頭大脳皮質をプロテアーゼ抑制剤混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ；Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）の存在下でＴｒｉｓ−緩衝食塩水（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ａｎｄ  １３７ｍＭ  ＮａＣｌ，［ｐＨ７．６］）で均質化させた。均質液を１００，０００Ｘｇで４℃で１時間遠心分離し、ＡβのＴｒｉｓ緩衝液−可溶性形態のレベルを測定するために上清液を使用した。７０％ホルム酸でペレットを超音波処理し、上述したように遠心分離した。得られた上清液はホルム酸を抽出可能なＡβであると考えられ、追加的な分析のために集められた。供述したように、使用する前にホルム酸抽出物を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ１１）で１：２０の希釈割合で中和させた。製造者の指示に従って、ヒトＡβ（１−４０）又はＡβ（１−４２）ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｉｃ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、最終分析を行った。
【００６３】
統計的分析
非等変性（Ｕｎｅｑｕａｌ  ｖａｒｉａｃｅ）を有するｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓｔ−テストを使用して２つの資料を比較し、多重比較はＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重レインジテストをする前に一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）で行った。０．０５未満のｐ値は統計的に重要なものとして受け入れられた。データは平均±ＳＤで提供された。
【００６４】
結果
Ｎｌａによるモノマー及びオリゴマーＡβの切断
以前、発明者らはＮｌａが非常に厳しい気質特異性を有し、容易に切断され得る結合がＧｌｎの後ろに位置する保存序列要素Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎによって定義されるその切断部位を有すると報告した。面白くも、序列Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎは推定されたａ−セクレターゼの切断部位の近くでのＡβに存在する（図１Ａ）。このような発見に基づいて、発明者らはＮｌａがＡβを特異的に切断し得るか否かを判断することを目標とした。この目的のために、組換えＮｌａタンパク質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、キチンビードカラムの上に均質に精製した（図１Ｂ）。その後、Ｎｌａをシステインプロテアーゼ抑制剤であるＮＥＭの存在下又は不在下でモノマーＡβ製剤で３時間インキュベーションした。ウェスタンブロッティングによる分析は、モノマーＡβレベルがＮｌａによって大きく減少されたことを示したが（図１Ｃ、レイン２対４）、これはＮＥＭの存在下で部分的に逆になっていた（図１Ｃ、レイン６）濃度計分析の結果は、ＮｌａがＮＥＭの不在下で６４％程度Ａβレベルを減少させ、ＮＥＭ存在下で３３％程度Ａβレベルを減少されたことを示したが、これはＮｌａによるモノマーＡβの特異的切断を提示する。
【００６５】
発明者らの発見はＮＥＭがＮｌａ活性を完全に抑制し切れなかったことを示すが、これはＮｌａの触媒３価元素内のシステイン残基の突然変異がそのタンパク質加水分解活性を完全に除去し切れなかったことを示す以前の報告書と一致している。その後、発明者らはモノマーＡβより更に毒性が多いと知られているオリゴマーＡβをＮｌａが切断し得るのか否かを試験した。Ａβぺプチード溶液を４℃で３６時間インキュベーションし、オリゴマーＡβを製造した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価されたように、オリゴマーＡβ製剤はほぼ同じ量のモノマー及びオリゴマーＡβを含んでおり（図１Ｄ、レイン１，３及び５）、２５℃で３時間追加的にインキュベーションした後、モノマーＡβを犠牲してオリゴマーＡβの形成が増加する方に変わることで均衡を成した。発明者らの発見は、Ａβオリゴマーがインキュベーション時間及び温度の増加で加速されたということを示す以前の報告と一致している。同じ条件下で、オリゴマーＡβの１９％のみが残っているということを示す濃度計評価によって数量化されたように、オリゴマーＡβの残量はＮｌａ（レイン４）によって大きく減少された。Ｎｌａ仲裁によるオリゴマーＡβのこのような現象は、ＮｌａがＡβを特異的に切断するということを暗示するＮＥＭ（レイン６）によって著しく遮断された。
【００６６】
ＮｌａによるＡβの特異的切断を更に分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析によって切断生成物を分析した（図２）。モノマーＡβ製剤は汚染されずに一つのピークを生成しており、一方、Ｎｌａは３つの汚染ピープを生成した。ＡβとＮｌａを含む反応混合物において、Ａβに対応するピークは大きく減少しており、Ａβのアミノ酸１−１５及び１６−４２に当たる１，８２６Ｄａ及び２，７０４Ｄａの分子量を有する２つの新たなピークが検出された（図２Ｂ）。この結果は、予想したとおり、ＮｌａはＧｌｎ１５の後ろに位置するぺプチード結合を切断するということを示している。
【００６７】
Ｎｌａ亜細胞の局在化
Ｂ１０３神経亜細胞腫細胞はＨＡ−タグが付いたＮｌａ発現ベクタによって形質転換され、抗−ＨＡ抗体で染色された。共焦点顕微鏡を利用した検査は、Ｎｌａが細胞質で支配的に発現されたことを示す（図３Ａ）。形質転換された細胞を微粒子（Ｐ）と可溶性（Ｓ）断片に分類し、ウェスタンブロッティングを受けた（図３Ｂ）。Ｏｃｔｌ（核マーカー）、ＶＤＡＣ２（ミトコンドリアマーカー）及びカテプシンＤ（リソソームマーカー）が微粒子断片から発見され、ＨＡは可溶性断片に排他的にａ−ｔｕｂｕｌｉｎ（チトゾールマーカー）とともに同じ細胞で存在していた。これらのデータは、Ｎｌａがチトゾールに支配的に存在するということを提示する。
【００６８】
ＮｌａはＡβが誘導した細胞死滅を防止する
Ｎｌａが細胞内でＡβに対する活性を有するか否かを試験するために、発明者らは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ユビキチン（Ｕｂ）及びＡβの三重融合タンパク質を符号化するプラスミドｐＧＦＰＵｂ−Ａを使用し、細胞内にＡβを精製した。ＵｂとＡβ間のぺプチード結合は、チトゾールにＧＦＰ−Ｕｂ及びＡβの等モル比（ｅｑｕｉｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）を生成する内生脱ユビキチン化（ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ）酵素によって素早く伝達される５２。Ｂ１０３細胞をｐＧＦＰＵｂ−Ａβ及び空プラスミド、Ｎｌａ−発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａ又はＮｌａ発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｍＮｌａと一緒に形質転換させた。Ｎｌａ突然変異は触媒３価元素内のＡｓｐ乃至Ａｌａ置換で構成される。その後、細胞を抗−Ａβ抗体、６Ｅ１０で免疫染色した（図４Ａ及びＢ）。その結果は、Ａβポジティブ細胞の割合がｐＧＦＰＵｂ−Ａβの空プラスミド（ＭｏｃＫ）に居所を提供するそのような細胞からＧＦＰ−ポジティブ細胞のうち５６％であり、一方、その割合はｐＧＦＰＵｂ−Ａβ及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａ（Ｎｌａ）に居所を提供する細胞で１４％まで急激に減少したということを示した。変種Ｎｌａプロテアーゼプラスミド（ｍＮｌａ）を発現する細胞から観察された割合は４２％であったが、これは空プラスミドで得られた割合と相当違っていた。これらのデータは、Ｎｌａが細胞内Ａβを特異的に分解し得るということを示す。
【００６９】
ＮｌａがＡβ−誘導細胞死滅を防止するのか否かを評価するために、発明者らは２つの異なる方法、即ち、形態学的接近法とＭＴＴ細胞生存率分析法を使用した（図４Ｂ及びＣ）。ｐＧＦＰＵｂ−Ａβを介したＡβの細胞内発現は細胞死滅の相当な増加に帰結された（形態学的分析で６２％、ＭＴＴ分析で５５％）。このような細胞内Ａβ−誘導細胞死滅はｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａとともに共同形質転換によってほぼ完全に遮断されたが、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｍＮｌａを共同発現する細胞からは影響を受けていない。外因性ＡβでＢ１０３細胞を治療した場合相当な割合の細胞死滅（形態学的分析で４０％、ＭＴＴ分析で３８％）があったが、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ｍＮｌａ共同発現によってではなく、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−Ｎｌａで共同形質転換によって抑制された。先に、細胞外Ａβは細胞表面収容体によって自らのものとして作られ、リソソーム、ミトコンドリア及びチトゾールのような亜細胞の細胞機関から検出され、それらの機関の機能障害を介して細胞死滅を起こすことが分かった。たとえＮｌａと内面化されたＡβが共同で局在化されても、チトゾールＮｌａは内面化されたＡβを切断し得ることが分かった。それにもかかわらず、発明者らのデータは、Ｎｌａが細胞内に発現されたＡβ及び外因性的に添加されたＡβ両方によって誘導される細胞死滅を防止することができるということを示している。
【００７０】
Ｎｌａのレンチウィルス仲裁の過剰発現
Ｎｌａ及びＧＦＰを発現するレンチウィルスベクトルが精製された（図６Ａ）。抗−ＨＡ抗体を利用したウェスタンブロッティングによって評価されたように、Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａで感染されたヒト２９３Ｔ細胞は強いＮｌａ発現を示した。定位方法で（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃａｌｌｙ）３μmのＬｅｎｔｉ−Ｎｌａ（１Ｘ１０８ＴＵ）を二重移植遺伝子マウス（ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳｌｄＥ９）の両側脳室に注入した。Ｎｌａの発現を評価するために、注入してから１ヶ月目に免疫組織化学を行った。注入されていない対照マウスの脳部分に比べ、Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａが注入されたマウスの脳部分からはＮｌａ発現が検出された。Ｎｌａ発現パターンは大脳皮質、海馬、扁桃及び視床にかけて広い分布を示した（データ図示せず）。
【００７１】
ＲＴ−ＰＣもまた、Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａ感染された脳からＮｌａ転写の存在を示した。対照として作用したＧＡＰＤＨ信号は、全ての試料から同じく発現された（図６Ｄ）。
Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａを注入されたＡＰＰｓｗ／ＰＳｌ移植遺伝子マウスの脳から減少されたＡβレベルＮｌａがマウスの脳からＡβの減少を起こすのか否かを評価するために、生後６，５ヶ月のＡＰＰｓｗ／ＰＳｌｄＥ９マウスの脳の両側の脳室にＬｅｎｔｉ−Ｎｌａを注入した。対照として、同量のＬｅｎｔｉ−ＧＦＰを同じ方式で注入した。注入後１ヶ月目に脳を除去し、可溶性（Ｔｒｉｓ−緩衝液で抽出可能な）及び不溶性（ＦＡ−緩衝液で抽出可能な）断片両方からＡβレベルをＥＬＩＳＡで測定した。発明者らは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２両方のレベルがＬｅｎｔｉ−ＧＦＰを注入した脳に比べ相当減少されたことを発見した（図７Ａ）。Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａの注入はオスでは可溶性Ａβ１−４０を３３％、メスでは３６％減少させ、オスでは不溶性Ａβ１−４０を２４％、メスでは２１％減少させた（図７Ａ、上側レイン）Ｎｌａはまた、オスでは可溶性Ａβ１−４２を３８％、メスでは２８％減少させ、オスでは不溶性Ａβ１−４２を３３％、メスでは３６％減少させた（図７Ａ、下側レイン）オスの脳でのＡβ１−４２レベルの減少は統計的な意味はなかった。
【００７２】
Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａを注入されたＡＰＰｓｗ／ＰＳｌ移植遺伝子マウスの脳から減少されたＡβの蓄積
免疫組織化学分析は、前頭葉、頭頂葉、海馬、及び梨状皮質からＡβ蓄積がＬｅｎｔｉ−ＧＦＰが注入された脳に比べＬｅｎｔｉ−Ｎｌａが注入された脳で著しく減少されたことが分かった（図７Ｂ）。Ａβレベルの両論的評価は、Ｌｅｎｔｉ−Ｎｌａの注入が前頭葉では斑点を５７％、頭頂葉では６２％、そして梨状皮質では５９％程度減少させたことが分かった（図７Ｃ）。
【００７３】
論議
Ａβの生成及び蓄積はＡＤの発病に最も重要な事件であり、Ａβの除去はＡＤの治療のための価値のある戦略を提供し得るということを提示する。Ａβはいくつかの組立形態及び集合形態で存在するが、オリゴマーＡβは最も毒性の多い形態であると知られている。Ａβは生成された後直ちに細胞内でオリゴマー化され、それらの分子はその後細胞から分泌される。分布されたＡβオリゴマーの一部は選択的吸収を介して細胞に入った後亜細胞の細胞機関の機能異常をもたらすが、これはＡＤ患者から典型的に観察される記憶及び認知能力低下と関連がある６０。ＡβはＡＤ脳の神経細胞内の細胞及び細胞外の空間両側で検出される。最近の研究は、ＡＤ患者及びＡＤ遺伝子移植マウスモデルで細胞外斑点が次第に多くなるにつれ、細胞内Ａβレベルが減少するということを示した１０，６１。それらの結果は、疾患の進行における細胞内Ａβの蓄積は細胞外Ａβ堆積物の形成に先立つということを提示する。面白くも、ＡＤ関連変種ＡＰＰを発現する細胞ではＡβは細胞内に維持されるが、一方、ワイルドタイプＡＰＰを発現する細胞ではＡβは大部分分泌されることが分かる３２。及びに、変種プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）１を運搬する老人性マウスにおいて、Ａβ集合体はニューロン内で検出されるが、細胞外液では検出されない６２。 プロテアゾーム活性の抑制は生体内及び試験管内の両方でＡβレベルが更に高くなるが、これはプロテアゾームがチトゾールでＡβ処理において責任がある個ということを提示する５２，６３，６４。Ａβの過剰な生産はプロテアゾームの過剰な増加をもたらし、究極的にＡＤの特徴であるプロテアゾーム活性異常に繋がる６５，６６。
【００７４】
これらの報告は、ＡＤの発病における細胞内Ａβに対する中心的役割を支持する。植物ポリフェノールレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｏｌ）によってもたらしたプロテオゾームの活性増加は、細胞外Ａβレベルだけでなく細胞内Ａβレベルを減少させ、神経退行性疾患を予防することが分かった６７。パーキン（ｐａｒｋｉｎ）は、細胞内に発現されたＡβのユビキチン化に参与するＥ３リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）である。 パーキンの過剰発現は、プロテアゾーム仲裁Ａβレベルの減少６８に帰結され、一方、パーキンのノックアウトはＡβ堆積物の蓄積６８，６９をもたらすことが分かった。よって、細胞内Ａβの除去率の増加は斑点形成、２次病的異常及び早期死亡を予防することができる。
【００７５】
本研究において、発明者らは植物ウィルスプロテアーゼであるＮｌａが試験管で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）モノマーＡβだけでなくオリゴマーＡβを特異的に切断し、神経細胞がチトゾールに支配的に局在化されることを示す。
【００７６】
神経細胞においてＮｌａの発現は細胞内に発現されたＡβ及び細胞外に添加されたＡβ両方ともによって誘導される細胞死滅を抑制する。及びに、ＡＤ遺伝子移植マウスの脳からレンチウィルスが仲裁したＮｌａの過剰発現は、Ａβ及び斑点形成のレベルを減少させることが分かった。これらのデータはＡＤの発病において、細胞内Ａβに対する重要な役割を支援する追加的な証拠を提供する。この点において、Ｎｌａは細胞内Ａβによる細胞死滅の誘導を基底においている分子的事件を研究する新たな道具として使用されることができた。 最後に、本発明らの結果は、チトゾールプロテアーゼによる細胞内Ａβの除去がＡＤの治療のための実行可能な戦略になり得るという概念の証明を提供する。
【００７７】
謝辞
本研究は韓国政府（ＭＥＳＴ）（Ｎｏ．２００９−００８５７４７）の財源で韓国研究財団（ＮＲＦ）及び光州科学技術院によって提供されたシステム生物学基盤構造施設許可で支援された研究である。
【００７８】
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本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明の範囲を逸脱しない異形及び変形は本発明の技術分野における通常の知識を有する者にとって明白になるはずであり、本発明の範囲は添付した請求項及びそれらの等価物によって決定されると理解されるはずである。
【００７９】
Sequence Listing
<110>    Gwangju Institute of Science and Technology
<120>    AMYLOID-BETA CLEARANCE
<160>    3
<170>    KopatentIn 1.71
<210>    1
<211>    243
<212>    PRT
<213>    Turnip mosaic virus
<400>    1
Ser Asn Ser Met Phe Arg Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Asn
1               5                  10                  15 
Asn Ile Cys His Leu Thr Asn Val Ser Asp Gly Ala Ser Asn Ser Leu
20                  25                  30 
Tyr Gly Val Gly Phe Gly Pro Leu Ile Leu Thr Asn Arg His Leu Phe
35                  40                  45 
Glu Arg Asn Asn Gly Glu Leu Val Ile Lys Ser Arg His Gly Glu Phe
50                  55                  60 
Val Ile Lys Asn Thr Thr Gln Leu His Leu Leu Pro Ile Pro Asp Arg
65                  70                  75                  80 
Asp Leu Leu Leu Ile Arg Leu Pro Lys Asp Ile Pro Pro Phe Pro Gln
85                  90                  95 
Lys Leu Gly Phe Arg Gln Pro Glu Lys Gly Glu Arg Ile Cys Met Val
100                 105                 110 
Gly Ser Asn Phe Gln Thr Lys Ser Ile Thr Ser Val Val Ser Glu Thr
115                 120                 125 
Ser Thr Ile Met Pro Val Glu Asn Ser Gln Phe Trp Lys His Trp Ile
130                 135                 140 
Ser Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Met Val Ser Thr Lys Asp
145                 150                 155                 160 
Gly Lys Ile Leu Gly Leu His Ser Leu Ala Asn Phe Gln Asn Ser Ile
165                 170                 175 
Asn Tyr Phe Ala Ala Phe Pro Asp Asp Phe Ala Glu Lys Tyr Leu His
180                 185                 190 
Thr Ile Glu Ala His Glu Trp Val Lys His Trp Lys Tyr Asn Thr Ser
195                 200                 205 
Ala Ile Ser Trp Gly Ser Leu Asn Ile Gln Ala Ser Gln Pro Ser Gly
210                 215                 220 
Leu Phe Lys Val Ser Lys Leu Ile Ser Asp Leu Asp Ser Thr Ala Val
225                 230                 235                 240 
Tyr Ala Gln
<210>    2
<211>    732
<212>    DNA
<213>    Turnip mosaic virus
<400>    2
gagagtaact ccatgttcag agggttgcgt gattacaacc caatatcaaa caacatttgt         60
catctcacaa atgtttcaga tggagcatca aactcgttat atggagtcgg tttcggacca        120
ctcatattaa cgaaccgaca cctctttgag cggaataacg gtgaactcgt aataaaatca        180
cgacatggtg agttcgtgat taaaaacaca actcagctac atttgctacc gattccagac        240
agagatctcc tgctaatccg gttaccaaag gacatcccac cctttccaca gaaattgggt        300
ttcaggcaac ctgagaaggg tgagcgaatc tgcatggtgg ggtccaactt ccaaactaag        360
agcataacga gtgtagtctc tgagactagc acaataatgc cagtggaaaa cagtcagttt        420
tggaaacact ggattagcac gaaagacggc caatgcggaa gtccaatggt gagcacgaaa        480
gacgggaaaa tacttggact acacagccta gcaaacttcc agaattccat taattacttt        540
gctgctttcc cagatgattt tgccgagaag tatctccata ccattgaagc acacgagtgg        600
gtcaagcatt ggaaatataa tactagtgcc atcagctggg gctctttgaa tatacaagca        660
tcgcaaccgt caggtttgtt caaagtaagc aaactaatct cagacctcga cagcacggca        720
gtctacgcac aa                                                            732
<210>    3
<211>    42
<212>    PRT
<213>    Homo sapiens
<400>    3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                  10                  15 
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20                  25                  30 
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35                  40        
【図１Ａ】
2014144933.tif 000002
【図１Ｂ】
2014144933.tif 000003
【図１Ｃ】
2014144933.tif 000004
【図１Ｄ】
2014144933.tif 000005
【図２Ａ】
2014144933.tif 000006
【図２Ｂ】
2014144933.tif 000007
【図３Ａ】
2014144933.tif 000008
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2014144933.tif 000014
【図６Ｂ】
2014144933.tif 000015
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2014144933.tif 000018
【図７Ｂ】
2014144933.tif 000019
【図７Ｃ】
2014144933.tif 000020
【外国語明細書】
2014144933000001.pdf