(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＢＳ分子署名遺伝子に関連する核酸分子およびタンパク質、ならびにＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置に使用され得る化合物を同定するための方法におけるその使用、または被験体においてＩＢＳを確認およびモニタリングするための診断方法におけるその使用の提供。【解決手段】一般的に、慢性内臓過敏（ＣＶＨ）、特に過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と関連する障害の治療及び診断する。特に、ＣＶＨと関連することが示されているポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＣＶＨと関連する障害の診断、処置および／または予防、特にＩＢＳと関連する障害の診断、処置および／または予防に使用する。【選択図】図１−１
2014144003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）前記被験体の結腸粘膜生検または糞便細胞において、一方が過敏性腸症候群１（ＩＢＳ１）遺伝子であり、他の遺伝子が以下の群から選ばれる、少なくとも２つの遺伝子の遺伝子転写のレベルを測定するステップと、
−カスパーゼ−１ドミナントネガティブ阻害薬偽ＩＣＥ（ＣＯＰ１）、
−プロテアソームアクチベータサブユニット２（ＰＡ２８β）（ＰＳＭＥ２）、
−第ＸＩＩＩ凝固因子  Ａ１ポリペプチド（Ｆ１３Ａ１）、
−好中球細胞質ゾル因子４  ４０ｋＤａ（ＮＣＦ４）、
−コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦＲ１）、
−スカベンジャー受容体システイン高含有１型タンパク質（Ｍ１６０）、
−カリウム電位型チャネル  遅延整流  サブファミリＳ  メンバ３（ＫＣＮＳ３）、
−リゾチーム（ＬＹＺ）、
−膜貫通４−ドメイン  サブファミリーＡ  メンバー４（ＭＳ４Ａ４Ａ）、
−リンパ特異的ヘリカーゼ（ＨＥＬＬＳ）、
−ＦＲＣ４、
−ミニクロモソームメンテナンスディシエント５（ＭＣＭ５）、
−ＴＡＰ２、
−ＬＲＡＰ、
−ＤＴＬ、
−Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有４（ＶＳＩＧ４）、
−ＭＵＣ２０（ムチン２０）、
−ＣＫＢ、
−Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有２（ＶＳＩＧ２）、
−ＩｇＧのＦＣ断片  低親和性  ＩＩａ  受容体（ＦＣＧＲ２Ａ）、および、
−カスパーゼ  １  アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ１）、
（ｂ）該遺伝子転写のレベルを正常対照試料における遺伝子転写のレベルと比較するステップと、
（ｃ）前記少なくとも２つの遺伝子の転写のレベルが、対照試料に対し少なくとも１．１５倍変化に相当する増大、または少なくとも０．８５倍変化に相当する減少があるか否かを判定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの結果に基づきＩＢＳの存在を判定するステップであって、ここにおいて、前記少なくとも２つの遺伝子についての少なくとも１．１５倍変化に相当する増大、または少なくとも０．８５倍変化に相当する減少は、前記被験体におけるＩＢＳについての陽性指標として考えられる、ステップとを含む、インビトロ方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）において、
−ブチロフィリン様８（ＢＴＮＬ８）、
−ヒートショック９０ｋＤａプロテインＡＴＰａｓｅホモログ２のアクチベーター（ＡＨＳＡ２）、
−Ｃ６ｏｒｆ１１１、
−インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、
−ＣＤ７４抗原、
−ＨＲＡＳ様サプレッサー２（ＨＲＡＳＬＳ２）、および
−ＵＤＰ−グルクロノシル  トランスフェラーゼ  ２Ｂ１５（ＵＧＴ２Ｂ１５）
の遺伝子転写のレベルを測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、少なくとも３つの遺伝子、または、少なくとも４つの遺伝子、または、少なくとも５つの遺伝子、または、少なくとも６つの遺伝子の遺伝子転写のレベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）は、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＡＳＰ１からなる１１の遺伝子からなる群の少なくともいずれかの遺伝子転写のレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、慢性内臓過敏（ＣＶＨ）、特に過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と関連する障害の治療および診断に関する。特に、本発明は、ＣＶＨと関連することが示されているポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＣＶＨと関連する障害の診断、処置および／または予防、特に、ＩＢＳと関連する障害の診断、処置および／または予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腹痛、不快感（切迫と鼓脹）および排便習慣の変化が慢性的に繰返される症状を特徴とする状態の代表的な２つである。しかしながら、これらの腸疾患は病態と生理病理学が有意に異なり、したがって、異なる診断方法および処置方法が関与する。ＩＢＤが小腸および／または大腸における炎症または潰瘍化を特徴とする場合、かかる明白な構造上の変化はＩＢＳと関連していない。ＩＢＳは、病態が未知の機能性（器質性と反対）の腸障害に分類される。機能性障害は、主な異常が、特定可能な構造的または生化学的原因ではなく、生理学的機能の変化である障害または疾患をいう。現在、ＩＢＳの診断は、検出可能な構造的異常の非存在下での特徴的な症状群に基づくもの（Ｄｒｏｓｓｍａｎ  ＤＡ，Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ  Ｍ，Ｍａｙｅｒ  ＥＡ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＷＥ．ＡＧＡ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００２；１２３：２１０８−３１）、例えば、検出可能な進行中の器質性疾患の非存在下で起こる断続的な腹痛および不快感ならびに排便習慣の変化、例えば、弛緩性または高頻度の排便、下痢および／または便秘に基づくものである。腹痛または腹部の不快感の主症状の特異性が欠如しているため、ＩＢＳの現行の診断は、不均一な患者群にあてはまり、主な排便習慣（下痢が主、便秘が主、交代性の下痢と便秘、正常）に基づいて亜群を規定する試みの後になってあてはまる。
【０００３】
ＩＢＳは、一般人口のほぼ１０〜２０％が罹患している。これは、胃腸科専門医によって診断される最も一般的な疾患であり、プライマリ・ケアの医師によって確認される最も一般的な障害の１つである。
【０００４】
ＩＢＳの病態生理学が説明される現行の理論としては、内臓知覚、胃腸管の運動性または腸上皮の機能および免疫機能の変化が挙げられる。公表された証拠により、ＩＢＳが慢性内臓過敏（ＣＶＨ）状態と関連していることが示されており、内臓の知覚情報処理が変化しているが、ＩＢＳにおけるＣＶＨの発生と維持の原因となる分子上の変化は不明であることが示されている。公表された証拠により、ＩＢＳ症状の提示または悪化が誘発され得るそれぞれ中枢的および末梢的誘因としての、心理社会的および身体的（例えば、腸管感染症）ストレス要因の役割が裏づけられている。例えば、ＩＢＳの病因における低度の慢性炎症の推測的役割の証拠は増加している。そのため、ＩＢＳのための現行の医療処置は、潜在する原因ではなく、主に周辺症状を対象とするものであり、薬物処置による治療利得は、通常、適度であり、プラセボ応答は高い（Ｍｅｒｔｚ  Ｈ，Ｎａｌｉｂｏｆｆ  Ｂ，Ｍｕｎａｋａｔａ  Ｊ，Ｎｉａｚｉ  Ｎ，Ｍａｙｅｒ  ＥＡ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｒｅｃｔａｌ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９５；１０９：４０−５２）。したがって、原因となる神経学的欠陥および分子上の欠陥を明らかにすることは、より好成績の治療戦略の設計に重要である。さらに、当該技術分野において、ＩＢＳおよび他のＣＶＨ関連障害をスクリーニング、診断および処置するための改善された方法の必要性が存在する。
【０００５】
原因となる分子上の欠陥を特定しようとする（ｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ）ための第１の取り組みにおいて、Ｐａｓｒｉｃｈａ  Ｐら（ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／０２０９０２）は、ＣＮＩ−１４９３で処置したときの、慢性内臓過敏のラットモデル由来の結腸組織ＲＮＡおよびＳ１脊髄神経節ＲＮＡのマイクロアレイ発現プロフィールの解析を報告している。
【０００６】
本明細書では、ＩＢＳ患者と健常被験体対照被験体由来のＳ状結腸粘膜生検材料のマイクロアレイ発現プロフィールの解析を報告する。この解析では、ＩＢＳ患者において、宿主の防御システムと免疫応答の特定の成分の機能の変化を示すいくつかの差次的に発現される遺伝子が明らかになった。これは、ＩＢＳの病態の原因となる胃腸管の周辺変化に対する重要な役割を裏付ける。ＩＢＳ患者の結腸粘膜生検材料において最も著しく増大した発現を伴う２つの遺伝子プローブセットは、未同定の遺伝子（ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３）を表す。この遺伝子をＩＢＳ１に名称変更することを提案する。ＩＢＳ患者と健常対照被験体との識別を可能にするマイクロアレイ上での特定の遺伝子プローブセットの同定、いわゆる分子署名を記載する。ＩＢＳにおける発現プロフィールは、結腸内の種々の位置において一貫しており、経時的に安定である。したがって、同定された分子署名は、ＩＢＳ患者の（サブセットの）治療に対する応答の診断および評価に有用なバイオマーカを開発するための機会を提供する。これは、もっぱら臨床症状の変化のみに依存する現行の標準ではなく、生物学的活性の特定の変化に基づく有意な前進である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＩＢＳ患者の結腸に構造的異常がないにもかかわらず、正常組織と比べて差次的に発現される遺伝子だけでなく、その差次的発現が、ＩＢＳと関連し、診断上、予測上のおよび／または治療上の価値を有する遺伝子を同定することも可能であるという驚くべき所見に基づく。
【０００８】
したがって、本発明は、これまでＩＢＳと関連しておらず、本明細書において以下ＩＢＳ分子署名遺伝子（ＩＢＳ−ＭＳＧ）といういくつかの遺伝子（表１）の同定に関し、したがって、前記遺伝子に関連する核酸分子およびタンパク質、ならびにＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置に使用され得る化合物を同定するための方法におけるその使用、または被験体においてＩＢＳを確認およびモニタリングするための診断方法におけるその使用を提供する。
【０００９】
該核酸分子は、例えば、個々の遺伝子の発現レベルをモニタリングするために個々に使用され得るか、あるいはマイクロアレイ形式で、被験体においてＩＢＳを確認および／またはモニタリングするために提供され得る。該核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、および遺伝子発現の変更、診断、スクリーニングおよび治療の目的に有用な他の分子を設計するために使用され得る。さらに、該核酸分子は、コードされたタンパク質を発現させるために使用され得る。また、当業者は、該核酸配列に基づいてペプチド抗原を設計することができよう。
【００１０】
該タンパク質は、創薬のための標的として、例えば、その活性を作動または拮抗するリード化合物を化合物を同定するのに有用である（後述）。また、該タンパク質は、抗体または他の特異的結合剤を作製するために使用され得る。このような特異的結合剤は、被験体においてＩＢＳを処置、診断またはモニタリングするための方法、またはＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置に使用され得る化合物をスクリーニング、すなわち同定するための方法に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本発明は、対照試料に対して被験体由来の生物学的試料におけるＩＢＳ−ＭＳＧの１つ以上の発現レベルをヌクレオチドまたはタンパク質レベルで比較することにより、ＣＶＨ、特にＩＢＳを診断およびモニタリングするための方法、より詳細にはインビトロ方法を提供する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、（ａ）被験体の生物学的試料において、ＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルを測定する工程；（ｂ）該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較する工程；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて診断を得る工程を含む、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法を提供する。該ＩＢＳ−ＭＳＧは、典型的には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される（ｉｓ  ｉｓ）。より詳しくは、該方法は、対照試料におけるこれらの遺伝子の発現と比べて、これらの遺伝子の発現に差があることを調べることを伴い、それにより、これらの遺伝子の１つ以上における発現の差は、ＩＢＳ、ＩＢＳの状態および／または具体的な処置の型に対する感受性を示す。
【００１３】
本発明の方法の特別な実施形態において、工程ａ）は、上記のＩＢＳ−ＭＳＧの２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上を調べることを含む。特に、工程（ａ）は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０の発現レベルを測定することからなる。より詳細には、工程（ａ）は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２の発現レベルを測定することからなる。あるいはまた、該工程は、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２の発現レベルを測定することからなる。あるいはまた、該工程は、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４の発現レベルを測定することからなる。
【００１４】
本発明の方法の特別な実施形態において、工程ａ）は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧの２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上、あるいはまた、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群からの２、３、４、５、６種、あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択される２種または３種を調べることを含む。
【００１５】
本発明の方法の特別な実施形態において、工程ａ）は、さらに、少なくとも１、２、３種またはそれ以上の他の遺伝子、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの測定を含む。
【００１６】
本発明は、さらに、（ａ）被験体の生物学的試料において、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルを測定する工程；ならびに（ｂ）該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較し、該試料が、ＩＢＳを示すか、ＩＢＳの状態を示すか、および／または具体的な処置の型に対する感受性を示すか否かの判定を含み、ここで、ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２およびＭＵＣ２０からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬおよびＶＳＩＧ４からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるＩＢＳの存在の表示である、被験体においてＩＢＳを確認または判定するための方法を提供する。したがって、遺伝子転写レベルの差、より詳細には、ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２およびＭＵＣ２０からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬおよびＶＳＩＧ４からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるＩＢＳの存在の表示である。
【００１７】
本発明の方法は、特定の遺伝子の発現の増大および／または減少を調べることを伴う。特別な実施形態において、該方法は、対照と比べた該遺伝子の発現において、少なくとも１．１５倍、より詳細には少なくとも１．２倍変化に相当する増大があるか否か、または少なくとも０．８５倍変化、より詳細には少なくとも０．８倍変化に相当する減少があるか否かの判定を伴う。
【００１８】
本発明の方法の工程（ａ）では、遺伝子転写レベルは、好ましくは、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに結合する抗体を用いてタンパク質レベルで、または好ましくは、前記ＩＢＳ−ＭＳＧから転写されたオリゴヌクレオチドに特異的に結合するプローブを用いて遺伝子転写レベルで、好ましくは、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡレベルでのいずれかで測定される。遺伝子転写レベルは、任意選択で、アレイ手法を用い、本明細書に記載の特異的プローブを用いてオリゴヌクレオチドレベルで、または特異的結合剤、好ましくは本明細書に記載の抗体を用いてタンパク質レベルでのいずれかで測定される。
【００１９】
本発明の方法の具体的なある実施形態において、遺伝子転写レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて評価される。任意選択で、ＩＢＳ−ＭＳＧに対するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、他の遺伝子、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される遺伝子に特異的に結合するプローブと組み合わせる。
【００２０】
さらなる具体的なある実施形態は、ＩＢＳ遺伝子の発現レベルが、表１に示したプローブのアレイを用いて、より詳細には表２に示したプローブのアレイを用いて測定される方法に関する。
【００２１】
別の具体的なある実施形態によれば、遺伝子転写レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＱ−ＰＣＲ）を用いて評価される。
【００２２】
ＩＢＳ遺伝子の発現レベルの検出を伴う方法の具体的なある実施形態において、本発明の方法に使用される生物学的試料は、血液（例えば、全血、血清、血漿、特に、白血球）、尿、唾液、糞便試料、糞便細胞、組織生検材料（特に、結腸生検材料）または剖検材料からなる群より選択される。
【００２３】
本発明の方法のさらなる実施形態は、（ａ）被験体の生物学的試料において、少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質のタンパク質レベルを測定する工程；（ｂ）該タンパク質レベルを正常対照試料におけるタンパク質レベルと比較する工程；および（ｃ）試料がＩＢＳを示すか否かを判定する、および／または工程（ｂ）の結果に基づいて診断を得る工程を含む、被験体においてＩＢＳを確認および／またはモニタリングするための方法を提供する。したがって、このような実施形態によれば、ＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルは、タンパク質レベルで測定される。典型的には、このような方法では、タンパク質レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質に結合する抗体を用いて測定される。具体的なある実施形態において、該抗体は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０から選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドまたはタンパク質に対する抗体である。最も特別な実施形態において、ＩＢＳ１タンパク質のタンパク質レベルは、ＩＢＳ１の遺伝子産物に特異的な抗体を用いて測定される。
【００２４】
具体的なある実施形態では、該方法には、上記のタンパク質からのＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質の少なくとも２種、任意選択で３、４、５、６種またはそれ以上のタンパク質レベルの測定が包含される。特に、該方法には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧ、あるいはまた、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧ；あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたペプチドまたはタンパク質のタンパク質レベルの測定が包含される。
【００２５】
特別な実施形態において、本発明は、（ａ）被験体の生物学的試料を、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドと特異的に結合する薬剤と接触させること；（ｂ）該ポリペプチドに対する該薬剤の結合レベルを測定すること；および（ｃ）前記生物学的試料中の該薬剤の結合レベルを、正常対照試料中の該薬剤の結合レベルと比較すること；および（ｄ）工程（ｃ）の結果に基づいて診断を得る（または試料がＩＢＳを示すか否かを判定する）ことを含む、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法を提供する。工程（ｄ）は、典型的には、工程（ｃ）の結果に基づいて、試料がＩＢＳまたはＩＢＳの特定の状態を示すか否かの判定を含む。任意選択で、かかる方法では、結合レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧ特異的抗体のタンパク質アレイを用いて測定される。この場合も、具体的なある実施形態は、ＩＢＳ−ＭＳＧ特異的抗体が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧと反応性である方法に関する。特別な実施形態では、該方法には、各々が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される異なるＩＢＳ−ＭＳＧと反応性である少なくとも２種類の結合剤の使用が包含される。より詳細には、該方法には、この群から選択される２、３、４、５、６種またはそれ以上の結合剤の検出が包含される。このような方法の特別な実施形態において、検出されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる。より詳細には、検出されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる。さらにより詳細には、検出されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる。代替的な特別な実施形態によれば、ＩＢＳ−ＭＳＧの検出は、ＩＢＳ１ポリペプチドと反応性である特異的抗体を用いた、ＩＢＳ１にコードされたポリペプチドのタンパク質レベルの測定を含む。またさらなる特別な実施形態によれば、ＩＢＳ−ＭＳＧの検出は、ＩＢＳ１ポリペプチドと反応性である特異的抗体を用いた、ＩＢＳ１にコードされたポリペプチドのタンパク質レベルの測定からなる。
【００２６】
本発明の方法の具体的なある実施形態では、タンパク質アレイが利用され、任意選択で、ＩＢＳ−ＭＳＧに対するタンパク質アレイを、他の既知のＩＢＳマーカ、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択されるマーカと組み合わせる。
【００２７】
本発明の方法の具体的なある実施形態には、ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ遺伝子に対する特異的結合剤の結合レベルの増大、またはＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬおよびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ遺伝子に対する特異的結合剤の結合レベルの減少が、前記被験体におけるＩＢＳの存在の表示である方法が包含される。
【００２８】
ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに対する薬剤の結合の検出を伴う方法の具体的なある実施形態において、生物学的試料は、血液（例えば、全血、血清、血漿、特に、白血球）、尿、唾液、糞便試料、糞便細胞、組織生検材料（特に、結腸生検材料）または剖検材料からなる群より選択される。
【００２９】
本発明の別の態様は、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物との薬剤の相互作用、または前記ＩＢＳ−ＭＳＧ／ＩＢＳ−ＭＳＧ産物の活性もしくは発現に対する薬剤の効果に基づいて、抗ＣＶＨ剤、特に、抗ＩＢＳ剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【００３０】
したがって、本発明は、（ａ）少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させる工程；（ｂ）前記ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルを測定する工程；および（ｃ）前記化合物の非存在下での前記ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルと比較する工程を含み、これにより、ＩＢＳにおいて観察されるＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルの変化を妨害することができる化合物が、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物として同定される、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定するための方法、特に、インビトロ方法を提供する。
【００３１】
このような方法の具体的なある実施形態は、ＩＢＳ−ＭＳＧが、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される方法を提供し、特に、本発明のスクリーニング方法において使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。
【００３２】
このような方法のさらなる具体的なある実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎ）には、少なくとも２種類のＩＢＳ−ＭＳＧを発現する細胞を接触させること、該少なくとも２種類のＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルを測定すること、および該化合物の非存在下での該少なくとも２種類のＭＳＧの発現レベルと比較することが包含される。より詳細には、（ａｔ）２、３、４、５、６種またはそれ以上の遺伝子が測定される。特別な実施形態には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧの発現、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧの発現、あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧの発現を調べることが包含される。
【００３３】
本発明のこのような方法の具体的なある実施形態において、発現レベルは、核酸レベルで、またはタンパク質レベルで検出される。さらに特別な実施形態では、発現レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧ、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧに結合するプローブを用いて測定され、最も詳細には、スクリーニング方法に使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。特別な実施形態では、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧ、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧ、あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧに対応するプローブが使用される。
【００３４】
本発明のこのような方法の特別な実施形態において、遺伝子の発現レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて、より詳細には、表１に示したプローブを用いて、または表２に示したプローブセットを用いて測定される。
【００３５】
本発明は、さらに、（ａ）少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させる工程；（ｂ）前記ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルを測定する工程；および（ｃ）前記化合物の非存在下での前記ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルと比較する工程を含み、これにより、ＩＢＳにおいて観察される前記ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルの変化を妨害することができる化合物が、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物として同定される、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供する。したがって、この実施形態によれば、ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドのタンパク質レベルを測定することにより測定される。
【００３６】
本発明の方法の具体的なある実施形態において、タンパク質レベルは、抗体を用いて測定される。さらなる具体的なある実施形態において、該抗体は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する。最も詳細には、本発明のスクリーニング方法において使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。
【００３７】
特に、該方法は、該抗体の少なくとも２種類の使用を含む。より詳細には、該方法は、２、３、４、５、６種またはそれ以上（ｏｆ  ｍｏｒｅ）の抗体であって、各々が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する抗体の使用を含む。最も詳細には、該方法は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子産物、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子産物、あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子産物のタンパク質レベルの検出を伴う。
【００３８】
本発明は、さらに、（ａ）ＩＢＳ−ＭＳＧ産物を試験対象の化合物とともにインキュベートする工程；および（ｂ）前記化合物がＩＢＳ−ＭＳＧ産物と結合できる能力を測定する工程を含み、ここで、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物に結合できる化合物は、ＩＢＳの処置のための候補化合物である、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定および取得するためのスクリーニング方法を提供する。このような方法では、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物は、前記遺伝子またはその断片にコードされたポリペプチドからなる。別の特別な実施形態によれば、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物は、前記遺伝子またはその断片から転写されたポリヌクレオチドである。
【００３９】
本発明のまた別の態様は、ＣＶＨ、特にＩＢＳを診断するためのキットを提供し、該キットは、以下：（１）ＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合するポリヌクレオチドプローブ、および（２）ＩＢＳ−ＭＳＧ産物に特異的に結合できる薬剤の少なくとも１つを備える。
【００４０】
したがって、本発明は、（ａ）ＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合する、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合する少なくとも１種類のプローブ；または（ｂ）ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤、より詳細には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤、さらにより詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤、最も詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤を備える診断用キットを提供する。
【００４１】
具体的なある実施形態において、本発明のキットは、各々がそれぞれ異なるＩＢＳ−ＭＳＧもしくはＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも２種類のプローブまたは薬剤を備え、該ＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される。より特別な実施形態は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧに対応する、さらにより詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧ、あるいはまた、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群に対応するＩＢＳ−ＭＳＧの異なるＩＢＳ−ＭＳＧまたはＩＢＳ−ＭＳＧ産物に特異的に結合するプローブまたは薬剤からなるキットに関する。少なくとも２種類のプローブまたは薬剤を備えたキットとは、典型的には、各々が、それぞれＩＢＳ−ＭＳＧまたはＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに特異的に結合する少なくとも２種類のプローブまたは少なくとも２種類の薬剤を含むことを意味するが、ＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合する少なくとも１種類のプローブおよびＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤を備えたキットもまたこの用語の範囲内に想定される。
【００４２】
また別の態様において、本発明は、ＣＶＨ、特にＩＢＳの処置のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体と、以下：（１）ＩＢＳ−ＭＳＧ産物；（２）ＩＢＳ−ＭＳＧ産物と結合する薬剤および／またはその活性をモジュレートする薬剤；ならびに（３）ＩＢＳ−ＭＳＧの発現をモジュレートする薬剤の少なくとも１種とを含む。したがって、本発明の目的は、患者（ｐａｔｅｎｔ）に、上記の医薬組成物を投与する工程を含む、患者のＣＶＨ、特にＩＢＳを処置するための方法を提供することである。特別な実施形態では、ＩＢＳ−ＭＳＧがＩＢＳ１である。
【００４３】
本発明の上記ならびに他の特性、特徴および利点は、以下の詳細説明を、本発明の原理を一例として図示した添付の図面と併せて考慮すると自明となろう。この説明は、本発明の範囲を限定することなく、単なる例示の目的で示す。以下に示す図面の記載事項は、添付の図面をさす。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１−１】図１は、１０例の個体から採取されたＳ状結腸試料の発現プロフィールの一致相関解析の図である。    試料の類似性の低度（一致相関係数、ＣＣＣ）をカラーコードで示す。解析には、各被験体について３つの試料を含めた。試料ＡとＢは、結腸内で互いにほぼ１０ｃｍ離れた位置で同時に採取、試料Ｃは８５日後に採取。青四角は、１例の個体由来の試料の一致相関解析を示す。濃い黒線は、ＩＢＳ被験体と健常被験体の試料を区別している。解析は、（Ａ）フルデータセットにおいて発現の最大変動を示した１，０００遺伝子プローブの組、および（Ｂ）マイクロアレイの予測解析で同定された３２遺伝子プローブの組において行なった。
【図１−２】図１は、１０例の個体から採取されたＳ状結腸試料の発現プロフィールの一致相関解析の図である。  試料の類似性の低度（一致相関係数、ＣＣＣ）をカラーコードで示す。解析には、各被験体について３つの試料を含めた。試料ＡとＢは、結腸内で互いにほぼ１０ｃｍ離れた位置で同時に採取、試料Ｃは８５日後に採取。青四角は、１例の個体由来の試料の一致相関解析を示す。濃い黒線は、ＩＢＳ被験体と健常被験体の試料を区別している。解析は、（Ａ）フルデータセットにおいて発現の最大変動を示した１，０００遺伝子プローブの組、および（Ｂ）マイクロアレイの予測解析で同定された３２遺伝子プローブの組において行なった。
【図２】図２は、ＩＢＳ患者と健常被験体のＳ状結腸試料のマイクロアレイデータに関するスペクトルマップ解析の結果を示すプロットの図である。  異なるグラフは、解析の６つの第１主成分（ＰＣ）の異なる組合せを示す。赤丸は、粘膜反復試料に対して志願した被験体由来の試料を示し、青丸は、他のすべての被験体（反復試料なし）を示す。反復試料を提供した被験体は、これらのグラフのいずれにおいてもクラスタリングしておらず、これらが、確かにコホート全体の代表であることを示す。
【図３】図３は、ＩＢＳ患者の結腸粘膜において差次的に発現された遺伝子の概略全体像の図である。ＩＢＳ患者対健常対照での結腸粘膜試料における発現が増大（下線）または減少した遺伝子。酸化的バースト（２Ｏ２→２０−）の原因であるタンパク質複合体を、五角形形状として示す。「ＲＯＳ」は、反応性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）を表す。
【図４】図４は、ＩＢＳ患者（緑色点）由来の結腸粘膜試料においてマイクロアレイ有意性解析（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＡＭ）によって同定された有意な遺伝子の相対発現レベルを健常対照（赤点）と比べた図である。発現レベル（ｙ軸）は、未処理データの処理後のアレイにおいて測定された蛍光シグナル強度として示す（方法の項目を参照）。個々の各点は、被験体１人あたりの２つの試料の発現の平均値を表す。
【図５−１】図５は、ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３（ＩＢＳ１）の遺伝子発現プロフィールと比較配列解析の図である。  （Ａ）ＩＢＳ患者（緑色、図の右側）および健常被験体（赤、図の左側）由来の結腸粘膜生検材料における、ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３（ＩＢＳ１）を表すＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ上の２つの異なるプローブセット（２０４６７８＿ａｔおよび２２５８０９＿ａｔ）の遺伝子発現プロフィール。各丸は、一例の個体由来の２つの試料の平均を示す。発現レベルは、未処理データの処理後のアレイにおいて測定されたシグナル強度として示す（方法の項目を参照）。緑と赤の水平線は、それぞれ、健常被験体とＩＢＳ被験体における平均発現レベルを表す。  （Ｂ）この図は、ＩＢＳ１遺伝子を示す２つのプローブセット間の優れた相関を示す。健常対照とＩＢＳ患者を、それぞれ、白四角と黒丸で表示する（図７もまた参照のこと）。
【図５−２】図５は、ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３（ＩＢＳ１）の遺伝子発現プロフィールと比較配列解析の図である。  （Ｃ）ヒト（Ｈｓ）ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３（ＩＢＳ１）（Ｈｓ＿ＮＰ＿０５６２０８）とそのマウス（Ｍｍ＿ＮＰ＿６６３５３７）およびラット（Ｒｎ＿ＮＰ＿７７５１３７）ホモログの比較タンパク質配列解析。黒または灰色背景で、異なる種間で同一のアミノ酸にハイライトする。タンパク質の種々のドメインを、そのアミノ酸配列の下部に表示する。
【図６】図６（Ａ）は、結腸内皮一次細胞における、炎症サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターロイキン４（ＩＬ４）によって誘導されたＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子発現の試験の図である。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ，受託番号ＧＤＳ５０２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｏ／ｇｄｓ／ｐｒｏｆｉｌｅＧｒａｐｈ．ｃｇｉ？＆ｄａｔａｓｅｔ＝ＭｚＡ＆ｄａｔａｓｅｔ＝Ｓ４Ｏ＄＆ｇｍｉｎ＝−０．０９０３０９＆ｇｍａｘ＝−０．０３２６２４＆ｇｄｓ＝５０２＆ｉｄｒｅｆ＝５５４３＆ａｎｎｏｔ＝ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３）より。  図６（Ｂ）は、誘導プロモーターからのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）Ｎｅｆの誘導後のジャーカットＣＤ４＋Ｔ細胞の解析の図である。Ｎｅｆタンパク質は、ＨＩＶおよびＳＩＶ感染症の初期において発現され、疾患進行に重要な役割を果たす。その結果、Ｔ細胞遺伝子発現においてＮｅｆ媒介性変化が確認されている。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ，受託番号ＧＤＳ２１６４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｏ／ｇｄｓ／ｐｒｏｆｉｌｅＧｒａｐｈ．ｃｇｉ？＆ｄａｔａｓｅｔ＝ＡＢＰｙｑｚ＆ｄａｔａｓｅｔ＝ＬＬ６ｇｅｅ＄＆ｇｍｉｎ＝２．６０００００＆ｇｍａｘ＝５６．９０００００＆ｇｄｓ＝２１６４＆ｉｄｒｅｆ＝２２５８０９＿ａｔ＆ａｎｎｏｔ＝ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３）より。
【図７】図７は、ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子を表す２つのプローブセット２０４６８７＿ａｔおよび２２５８０９＿ａｔの発現レベルの相関の図である。健常対照とＩＢＳ患者を、それぞれ、白四角（点線の集団）と黒丸（破線）で表示する。
【図８】図８は、ＩＢＳ疾患状態における最短収縮重心分類装置（ｎｅａｒｅｓｔ  ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）から出力されたマイクロアレイ予測解析（ＰＡＭ）のまとめの図である。  （Ａ）３２個の遺伝子を使用した場合に最も少ない誤分類エラーが得られることを示す、クロスバリデーション誤分類エラー曲線。対応するデルタ（２．０）を、さらなる解析のための閾値として選択した。  （Ｂ）閾値（デルタ＝２．０）で残存したこの３２個の遺伝子の各クラスの収縮重心分類。さらなる詳細については、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら（２００２）を参照のこと。
【図９−１】図９は、階層的クラスタリング解析のまとめの図である。  （Ａ）類似性の尺度として平均連鎖と相関を用いた、１６種のプローブセットと試料の階層的クラスタリングによるヒートマップのクラスタリング表示。ヒートマップの色は、青（高発現）から黒（中発現）に黄色（低発現）までの範囲で、色の度合の勾配で相対発現レベルを示す。この色の度合は、全試料において個々の各プローブセットに対して最大化される（すなわち、最高発現レベルの試料は青であり、最低発現の試料は黄色である）。ヒートマップ上の白色水平線は、得られたＩＢＳの分子署名によって予測される疾患状態を識別する。図の右パネルは、訓練組または試験組に割り当てられた被験体において臨床診断された疾患状態を示す。
【図９−２】図９は、階層的クラスタリング解析のまとめの図である。  （Ｂ）ここでも図９Ａの右パネルを示すが、この場合では、被験体の性別と併用薬物処置と関連させている（Ｍ：男性；Ｆ：女性；ＳＳＲＩ：選択的セロトニン再取り込み阻害薬；ＳＮＲＩ：セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害薬；ＳＮＤＲＩ：セロトニン−ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害薬；ＴＣＡ：三環系抗鬱薬）。
【図１０】図１０は、マイクロアレイおよびＲＴＱ−ＰＣＲで測定したときの、ＩＢＳ患者と健常被験体間でのｍＲＮＡ発現レベルの変化倍数の比較の図である。ＲＴＱ−ＰＣＲ解析で統計学的に有意（ｐ＜０．０５）と確認されたマイクロアレイ研究での有意な遺伝子に下線を付す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細説明
本発明の好ましい実施形態を以下に記載する。特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲における単語および語句は、これが適用される技術分野の当業者にとって、通常の慣用的な意味で示されているものとする。なんらかの他の意味が意図される場合、本明細書において、単語および語句に特別な意味が適用される旨を具体的に記載する。
【００４６】
さらに、本発明は、好ましい実施形態に記載する具体的な構造、材料または作用のみに限定されず、さらに、特許請求の範囲に記載の発明の機能が発揮される任意のあらゆる構造、材料または作用、ならびに特許請求の範囲に記載の発明を実施するための任意のあらゆる後発同等構造体、材料または作用を包含するものとする。
【００４７】
本開示全体において、さらなる実施例が存在し、本出願人は、本明細書には明白に特定していないが特許請求の範囲に記載の発明の機能が発揮され得る構造、材料、方法または作用の使用を本発明の範囲から排除することを意図しない。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「化合物」または「薬剤」は、生物学的化合物または化学化合物、例えば、単純または複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドなどを意味する。「試験化合物」は、本明細書で用いる場合、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物に結合するか否か、および／またはその活性をモジュレートするか否かを評価するために本発明による方法で使用する「化合物」または「薬剤」をいう。
【００４９】
用語「慢性内臓過敏−分子シグナル遺伝子」または「ＣＶＨ−ＭＳＧ」は、本明細書で用いる場合、その発現が慢性内臓過敏（ＣＶＨ）の臨床診断と関連している遺伝子をいう。このようなものとしては、健常対照患者と比べ、ＣＶＨと診断された患者において特異的に上方調節または下方調節される遺伝子が挙げられる。
【００５０】
用語「炎症性腸症候群分子署名遺伝子」または「ＩＢＳ−ＭＳＧ」は、本明細書で用いる場合、その発現が炎症性腸症候群（ＩＢＳ）の臨床診断と関連している遺伝子をいう。このようなものとしては、健常対照患者と比べ、ＩＢＳと診断された患者において特異的に上方調節または下方調節される遺伝子が挙げられる。
【００５１】
用語「ＩＢＳ−ＭＳＧ産物」または「遺伝子産物」は、本明細書で用いる場合、ＩＢＳ−ＭＳＧが転写および／または翻訳されたときに生成されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびそのバリアントが包含される。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチドのバリアント」には、元のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドと比べ、コードされたポリペプチドの活性が実質的に変化しない（例えば、該活性は、５０％未満、好ましくは２０％未満低減または増強されていてもよい）ような１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入により、元のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドが包含される。
【００５３】
また、ポリヌクレオチドのバリアントには、低ストリンジェンシー条件、より好ましくはストリンジェント条件、最も好ましくは高ストリンジェント条件下で、元のポリヌクレオチド（相補配列）にハイブリダイズさせることができるポリヌクレオチドが包含される。
【００５４】
当業者には、遺伝コードの縮重の結果、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多く存在することが認識されよう。これらのポリヌクレオチドの一部のものは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して有する相同性が最小限である。それでもなお、改変がサイレントな変化、すなわち、該ポリヌクレオチドにコードされたアミノ酸が改変されない変化に限定されたポリヌクレオチドが、特に本発明で想定される。
【００５５】
ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、天然ポリヌクレオチドと、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｔ）９５％、特に少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を示すものである。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、天然ポリヌクレオチドと、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すものである。
【００５６】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いる場合、単鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対合を介して相補鎖と接合されるプロセスをいう。
【００５７】
用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、非相同的な塩基対合に不都合である。低ストリンジェンシー条件は反対の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば、温度と塩濃度によって変更され得る。「ストリンジェント条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃での一夜インキュベーション後、０．１×ＳＳＣ中約６５℃でのフィルターの洗浄いう。さらなる適当なハイブリダイゼーション条件は、実施例に記載している。
【００５８】
「低ストリンジェンシー条件」としては、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロックＤＮＡを含む溶液中３７℃での一夜インキュベーション後、５０℃での１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳによる洗浄が挙げられる。また、さらに低ストリンジェンシーを達成するためには、ストリンジェントハイブリダイゼーション後に行なう洗浄を、さらに高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行なうとよい。上記の条件のバリエーションは、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を含めること、および／または置換することによって達成され得ることに注意されたい。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の専売製剤が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含めるには、適合性に関する問題のため、上記のハイブリダイゼーション条件の修正が必要な場合がある。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチドのバリアント」は、天然ポリペプチドの生体活性または免疫原性が実質的に減衰されないような１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入により、天然ポリペプチドと異なるポリペプチドである。換言すると、バリアントポリペプチドの生体活性、またはバリアントポリペプチドが抗原特異的抗血清と反応する能力は、天然ポリペプチドと比べて、５０％未満、好ましくは２０％未満増強または減衰されていてもよい。バリアントポリペプチドとしては、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメインなどの１つ以上の部分が除去されたものが挙げられる。他の好ましいバリアントとしては、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から小さい部分（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜１５個のアミノ酸）が除去されたバリアントが挙げられる。
【００６０】
さらなるバリアントポリペプチドは、天然ポリペプチドとアミノ酸配列が１つ以上の同類置換により異なるものである。「同類置換」は、ある特定のアミノ酸の当該技術分野で認識された置換可能性に基づいて、親分子の生物学的活性に影響のない親タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の置換をいう（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ３，ｐｇｓ３４５−３５２，１９７８を参照）。
【００６１】
バリアントはまた、あるいは代替的に、非同類変化を含むものであってもよい。好ましい実施形態において、バリアントポリペプチドは天然配列と、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加により異なる。バリアントはまた（あるいは代替的に）、例えば、該ポリペプチドの免疫原性、二次構造、三次構造およびハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質に対する影響が最小限であるアミノ酸の欠失または付加によって修飾されたものであり得る。
【００６２】
ポリペプチドバリアントは、好ましくは、元のポリペプチドと、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも約９７％の配列相同性を示すものである。さらなる実施形態において、該ポリペプチドバリアントは、元のポリペプチドと、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性を示すものである。
【００６３】
用語「相補的な」または「相補性」は、本明細書で用いる場合、プリンヌクレオチドおよびピリミジンヌクレオチドが水素結合によって会合し、二本鎖核酸分子を形成する能力をいう。以下の塩基対：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシルは、相補性と関連する。本明細書で用いる場合、「相補的」は、前述の関係が、前記両分子の全長にわたって２つの単鎖核酸分子を含む実質的にすべての塩基対にあてはまることを意味する。「一部相補的」は、前述の関係において、２つの単鎖核酸分子の一方が他方よりも長さが短いため、両分子の一方の一部が単鎖のままであるものをいう。
【００６４】
用語「被験体」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物（例えば、齧歯類（マウスもしくはラットなど）、ブタ、霊長類、または愛玩動物（例えば、イヌもしくはネコ））をいう。特に、該用語は、ヒトをいう。
【００６５】
用語「アレイ」および「マイクロアレイ」は、互換的に使用し、一般的に、種々の分子（本明細書では「プローブ」という）が、任意の順序で配列された（例えば、表面または基材上に）ものをいう。アレイの種々の各プローブは、アレイの状況の特定の分子（本明細書では、「標的」という）に対する特異的認識および／または結合能を有する。マイクロアレイを用いて検出され得る典型的な標的分子の例としては、ｍＲＮＡ転写物、ｃＤＮＡ分子、ｃＲＮＡ分子、およびタンパク質が挙げられる。
【００６６】
マイクロアレイは、試料中（関連細胞、組織もしくは生物体から単離されたｍＲＮＡ調製物、または対応するｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡ調製物など）の複数の異なる標的分子の存在、非存在および量を同時に検出するのに有用である。試料中のプローブの標的分子の存在および量または非存在は、表面または基材上の特定の位置において標的がプローブに結合したかどうか、（およびどれだけ多く結合したか）を解析することにより容易に測定され得る。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるアレイは、種々の各プローブが特定の「アドレス」と関連している「アドレス可能なアレイ」である。例えば、プローブが表面または基材上に固定化された好ましい実施形態では、アドレス可能なアレイの種々の各プローブは、該表面または基材上の特定の既知の位置に固定化される。したがって、試料中の該プローブの標的分子の存在または非存在は、標的が表面または基材上の該特定の位置に結合したかどうかを単純に検出することにより容易に測定され得る。
【００６８】
本発明によるアレイは、好ましくは、表面または基材上に固定化された複数の核酸プローブを含む核酸アレイ（本明細書では、「転写物アレイ」または「ハイブリダイゼーションアレイ」ともいう）である。種々の核酸プローブが試料中の種々の標的核酸分子に相補的であり、したがって、これらにハイブリダイズし得る。したがって、かかるプローブは、試料中の複数の異なる核酸分子の存在および量を同時に検出するため、複数の異なる遺伝子の発現レベル、例えば、異なるｍＲＮＡ分子または該分子に由来する核酸分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡ）の存在および存在量を測定するために使用され得る。
【００６９】
マイクロアレイ手法には、主に２つの型；スポット型ｃＤＮＡアレイおよび製造型オリゴヌクレオチドアレイがある。以下の実施例のセクションでは、高密度オリゴヌクレオチドＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイの使用を説明する。
【００７０】
アレイは、好ましくは再生可能であり、多コピーの所与のアレイを作製し、各々の結果を互いに容易に比較することが可能である。好ましくは、マイクロアレイは小型であり、通常、５ｃｍより小さく、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定な材料で作製されたものである。マイクロアレイ内の所与の結合部位または特殊な組の結合部位に標的（例えば、細胞内の単一の遺伝子のｍＲＮＡ）が特異的に結合する。特定の１つの標的に対して１つより多くの物理的結合部位（本明細書において以下「部位」）が存在し得るが、明確にする目的で、以下の論考では、存在する部位は１つであると仮定している。細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作製し、適当なハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイにハイブリダイズさせた場合、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ内の部位へのハイブリダイゼーションのレベルまたは程度は、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡの該細胞内における存在割合（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を反映することは認識されよう。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能に標識された（例えば、フルオロフォアにより）ｃＤＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせる場合、その細胞内で転写されない遺伝子（すなわち、該遺伝子の核酸産物に特異的に結合することができる）に対応するアレイ上の任意の部位は、シグナルをほとんどまたは全く有さないが、そのコードｍＲＮＡが高度の割合で存在する遺伝子は、比較的強力なシグナルを有する。一例として、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）では、遺伝子発現プロフィールの評価および他の生物学的アッセイのためのデータが得られる。
【００７１】
オリゴヌクレオチド発現アレイでは、数千個のｍＲＮＡ転写物（遺伝子またはＥＳＴ）が同時かつ定量的に「インテロゲート（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）」され、大きなゲノムの研究が簡単になる。各転写物は、多数のプローブ対によってプローブアレイ上に提示され、密接に関連する遺伝子ファミリの構成員が識別され得る。各プローブセットは、数百万コピーの特異的オリゴヌクレオチドプローブを含み、低強度のｍＲＮＡハイブリダイゼーションパターンであっても、正確で感度のよい検出を可能にする。ハイブリダイゼーション後、強度データを、例えば光学検出システム（例えば、スキャナー）を用いて捕捉し、ソフトウェアを使用すると、各プローブセルの強度値が自動的に算出され得る。プローブセル強度は、ｍＲＮＡの存在量と相関する各遺伝子の平均強度を算出するために使用され得る。発現データは、任意の解析パラメータに基づいて速やかに分類され、任意の選択した遺伝子サブセットについて、さまざまなグラフ形式で表示され得る。遺伝子発現検出手法としては、とりわけ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒおよびＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃによって製造販売されている研究用製品が挙げられる。
【００７２】
用語「同類置換」または「同類アミノ酸置換」は、ある特定のアミノ酸の当該技術分野で認識された置換可能性に基づいて、親分子の生物学的活性に影響のない親タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の置換をいう（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ３，ｐｇｓ３４５−３５２，１９７８を参照）。
【００７３】
「その断片」は、配列が本明細書に開示された核酸またはタンパク質分子の断片、小片または部分領域であって、親タンパク質または核酸分子内の連続する５個以上のアミノ酸、または１０個以上のヌクレオチドを含むようなものをいう。
【００７４】
「機能性断片」は、本明細書で用いる場合、本明細書に開示されたタンパク質またはアミノ酸配列の、例えば、機能的に明確な領域（受容体に対する活性部位など）を含む単離された部分領域または断片をいう。機能性断片は、クローニング手法によって、または選択的スプライシング機構の天然産物として得られ得る。
【００７５】
用語「ホモログ」または「相同的」は、異なる核酸分子またはアミノ酸配列が、前記分子または配列内の１つ以上のブロックまたは領域において一部同一または類似していることによって関連している、前記配列間または分子間の関係を示す。「単離された核酸化合物」は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡ配列をいうが、その天然の位置とは位置が異なるものも想定または合成される。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「同一性または類似性」は、当該技術分野において知られているように、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、これは、配列を比較することにより測定される。当該技術分野では、同一性はまた、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド配列間で配列が関連している程度を意味し、場合によっては、これは、かかる配列の全長（ｓｔｒｉｎｇ）間のマッチングによって測定される。同一性および類似性はともに、容易に算出され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定するための方法がいくつか存在するが、どちらの用語も当業者には周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３。配列間の同一性または類似性を測定するのに一般的に使用される方法としては、限定されないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３に記載されたものが挙げられる。
【００７７】
２つ以上の配列間の同一性および類似性を比較するために使用される方法は、当該技術分野でよく知られている。したがって、例えば、Ｗｉｎｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Ｄｅｖｒｅｕｘ  Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５，１９８４）において入手可能なプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性％、ならびに２つのペプチド間またはポリペプチド配列間の同一性％および類似性％が測定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴでは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所相同性」アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，１９５−１９７、１９８１）が使用され、２つの配列間に最良の単一の類似性領域が見出される。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２つのポリヌクレオチドまたは２つのペプチドもしくはポリペプチド配列を比較するのにより適しており、該プログラムでは、短い方の配列が長い方の一部であると仮定される。比較において、ＧＡＰでは、２つの配列をアラインメントし、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８，４４３−４５３，１９７０）に従って「最大類似性」が見い出される。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さの配列を比較するのにより適しており、アラインメントは全長にわたって予測される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメータ「ギャップウェイト」および「長さウェイト」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列で５０と３、およびポリペプチド配列では１２と４である。好ましくは、同一性および類似性の％は、比較される２つの配列を最適にアラインメントして測定する。また、配列間の同一性および／または類似性を測定するための他のプログラムも当該技術分野において知られている（例えば、ＢＬＡＳＴファミリのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７））。
【００７８】
「核酸プローブ」または「プローブ」は、本明細書で用いる場合、別の核酸化合物とハイブリダイズする核酸化合物、特に標識された核酸化合物である。「核酸プローブ」は、単鎖標的核酸配列とハイブリダイズする単鎖核酸配列を意味する。核酸プローブは、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーであり得る。「プローブ」には、通常、検出可能な部分が含まれ、これは、そのプローブの末端（一方または両方）に結合されていてもよく、そのプローブの配列内部に存在していてもよい。具体的なある実施形態では、「プローブ」はまた、本明細書において前述の「アレイ」および「マイクロアレイ」における使用のために固相支持体に結合させたオリゴヌクレオチド（例えば、約２５ヌクレオチド長）をいうために用いられる。
【００７９】
用語「プライマー」は、例えば核酸分子の酵素または合成による伸長のための開始基質としての機能を果たす核酸断片である。
【００８０】
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いる場合、単鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対合を介して相補鎖と接合されるプロセスをいう。
【００８１】
本明細書で用いる場合、用語「モジュレーション」には、その種々の文法形態（例えば、「モジュレートされる」、「モジュレーション」、「モジュレートすること」など）、上方調節、誘導、刺激、相乗的増強および／または阻害の緩和、ならびに阻害および／または下方調節もしくは抑制が包含される。
【００８２】
核酸配列は、該核酸配列が別の核酸配列と機能する関係で配置されている場合、前者は後者に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌性のリーダーペプチドのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、該ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響するならば、該配列に作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、翻訳を助長するような位置に存在するならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が隣接していること、および、分泌性リーダーの場合は、隣接し、かつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣用的実務に従って使用される。
【００８３】
本発明は、ＣＶＨの臨床症状、より詳細にはＩＢＳと関連するいくつかの遺伝子の同定に基づく。これらの遺伝子は、ＩＢＳと診断された患者と健常対照の差次的発現解析によって同定されている。より詳しくは、胃腸科専門医による患者のＩＢＳ診断を、腸疾患アンケート（Ｔａｌｌｅｙら、１９９０）（Ｒｏｍｅ  ＩＩ基準（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９９）に対応する質問を含む）によって確認した。また、腸疾患アンケートには、非潰瘍性消化不良の特徴である身体化障害および症状を確認することを意図した心身症状のチェックリストも含まれ、疫学的研究に拡張して使用されている。
【００８４】
本発明により、結腸粘膜におけるその発現が、健常対照と比べてＣＶＨ、より詳細にはＩＢＳの患者において減少しているか増大しているかのいずれかである遺伝子が同定されている。これらの発現マーカの特別な利点は、特定の遺伝子の発現とＩＢＳの発症との間に強力な相関があること、およびこれらの発現パターンが予測値を有することである。したがって、これらの発現マーカは、診断用ツールとして有用である。発現マーカは、必ずしも対応する遺伝子の多型の存在とは関連しておらず、さらに、たいていは関連しておらず、遺伝子マーカとは区別される。
【００８５】
スクリーニング方法
本発明は、ＣＶＨ、特にＩＢＳの処置用の治療剤としての使用のための化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに使用され得る核酸分子および遺伝子産物（タンパク質）を提供する。
【００８６】
本明細書に記載の核酸分子にコードされたタンパク質は、ＣＶＨ、特にＩＢＳを処置するためのリード化合物をスクリーニングするための結合アッセイおよび機能性アッセイに使用され得る。各遺伝子産物について記載のように、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかであることが確認できることにより、ＩＢＳのための新たな処置薬の開発が提供され得る。
【００８７】
したがって、核酸分子は、単離して直接結合アッセイに使用するタンパク質を発現させるのに有用である。タンパク質の発現は、任意の宿主細胞系、例えば、植物、原核生物（例えば、大腸菌）、酵母、昆虫の細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、バキュロウイルスベクターを使用）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳなど）において行われ得る。タンパク質産物の単離および精製のための手法は、当業者には周知である。
【００８８】
タンパク質産物またはその断片（例えば、タンパク質分解断片もしくは合成断片）を用いて、例えば、イムノアッセイによってタンパク質発現を直接検出するための特異的抗体が作製され得る。
【００８９】
遺伝子発現プロフィールは、差次的に発現される表１の遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質発現をモジュレートする化合物のスクリーニングに使用され得る。かかる差次的に発現される遺伝子を「目的遺伝子」と称し、かかるモジュレート化合物をモジュレーターと称し、これは、ｍＲＮＡの転写を上方調節もしくは下方調節するもの、またはタンパク質の活性を作動もしくは拮抗するものであり得る。かかる化合物は、例えば、ＩＢＳにおいて調節されることがわかっている遺伝子の発現を阻害または刺激するのに有用である。該遺伝子の１つ以上の発現プロフィールをモジュレートする化合物は、当該技術分野において知られた数多くのスクリーニング方法を用いて容易に同定され得る。本明細書で用いる場合、遺伝子の発現は、標準的な手法を用いてｍＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質の活性を測定することにより測定され得る。
【００９０】
したがって、本発明の目的は、
ａ）少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させること；
ｂ）前記ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルを測定すること；ならびに
ｃ）前記化合物の非存在下での前記ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルと比較すること
を含み、
これにより、ＩＢＳにおいて観察されるＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルの変化を妨害することができる化合物が、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物として同定される、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供することである。
【００９１】
本発明のスクリーニング方法に使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、典型的には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択され、最も詳細には、本発明のスクリーニング方法において使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。
【００９２】
特定の一実施形態によれば、細胞は、結腸細胞、より詳細には結腸粘膜細胞である。
特定の一実施形態によれば、本発明の方法は、工程（ｂ）において、少なくとも２つの異なる遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の１つが、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０からなる群より選択され、１つ以上の他の遺伝子が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される測定を含み、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群の少なくとも２つの遺伝子、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群の少なくとも２つの遺伝子の発現の測定を含む。本発明のさらなる実施形態は、工程（ｂ）において、少なくとも２つの遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の１つがＩＢＳ１であり、その他が、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される測定を含む。
【００９３】
上記の各実施形態では、工程（ｃ）は、前記化合物と接触させた後の前記細胞による前記少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを、前記化合物の非存在下での前記細胞による前記遺伝子の発現と比較することからなる。
【００９４】
本明細書で用いる場合、ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルは、核酸レベルまたはタンパク質レベルで検出され得る。核酸レベルでの発現レベルの測定は、遺伝子転写レベルが測定される任意の利用可能な手法を用いて達成され得る。例えば、該方法は、インサイチュハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーションまたは核酸マイクロアレイ（オリゴヌクレオチドマイクロアレイもしくはｃＤＮＡマイクロアレイなど）に対するハイブリダイゼーションを使用するものであり得る。あるいはまた、該方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えば、蛍光色素系定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ）などを使用するものであり得る。以下に示す実施例のセクションでは、核酸発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイに対する全細胞ｍＲＮＡ由来の標識ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびＲＴＱ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ）の使用によって得た。タンパク質レベルでの発現レベルは、タンパク質レベルが測定される任意の利用可能な手法を用いて評価され得る。例えば、該方法は、タンパク質マイクロアレイ手法、ウエスタンブロッティング、免疫細胞学的検査、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析を使用する相対的定量および必須アミノ酸の同位体異性形態での細胞の予備標識（Ｕｎｗｉｎ  Ｒ．Ｄ．，Ｅｖａｎｓ，ＣＡ．およびＷｈｅｔｔｏｎ  Ａ．Ｄ．２００６  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｖｏｌ．３１（８）；４７３−４８４）を使用するものであり得る。
【００９５】
好ましくは、発現レベルは核酸レベルで測定される。この場合、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、検出に直接使用され得るか、または解析前にＰＣＲもしくは他の増幅手法を用いて酵素的に増幅され得る。好ましくは、前記解析方法は、そのポリヌクレオチドの適当な領域に標的化される標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。したがって、特別な実施形態では、発現レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧに結合するプローブを用いて、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧに結合するプローブを用いて測定され、最も詳細には、該スクリーニング方法に使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。なおさらなる実施形態では、該遺伝子の発現レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて、より詳細には、表１に示したプローブを用いて、最も詳細には、以下の表２に示したプローブセットを用いて測定される。
【００９６】
【表１】
2014144003.tif 000003
【００９７】
【表２】
2014144003.tif 000004
【００９８】
【表３】
2014144003.tif 000005
【００９９】
【表４】
2014144003.tif 000006
【０１００】
【表５】
2014144003.tif 000007
【０１０１】
あるいはまた、遺伝子転写レベルは、タンパク質レベルで測定され、本発明は、
ａ）少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させること；
ｂ）前記ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルを測定すること；ならびに
ｃ）前記化合物の非存在下での前記ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルと比較することを含み、
これにより、ＩＢＳにおいて観察されるＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質レベルの変化を妨害することができる化合物が、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物として同定される、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供する。
【０１０２】
好ましくは、タンパク質レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物に結合する抗体を用いて測定される。特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する抗体が使用され、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する抗体が使用され、最も詳細には、本発明のスクリーニング方法において使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、ＩＢＳ１からなる。
【０１０３】
特定の一実施形態によれば、本発明の方法は、工程（ｂ）において、少なくとも２つの異なる遺伝子の遺伝子産物のタンパク質レベルの測定（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）であって、該遺伝子の１つが、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０からなる群より選択され、１つ以上の他の遺伝子が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される測定を含み、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の遺伝子産物のタンパク質レベルの測定、特にＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群の少なくとも２つの遺伝子、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群の少なくとも２つの遺伝子の遺伝子産物のタンパク質レベルの測定を含む。本発明のさらなる実施形態は、工程（ｂ）において、少なくとも２種類の遺伝子産物の（ｏｆ  ｏｆ）タンパク質レベルの測定であって、該遺伝子の１つがＩＢＳ１遺伝子産物であり、その他が、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢの遺伝子産物からなる群より選択される測定を含む。
【０１０４】
本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、該ポリペプチドもしくはエピトープ含有断片、類縁体またはこれらを発現する細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物に、常套的なプロトコルを用いて投与することにより得られ得る。モノクローナル抗体の調製には、細胞株の連続培養によって産生される抗体が得られる任意の手法が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ手法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられる。
【０１０５】
単鎖抗体の作製のための手法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号に記載のものなど）もまた、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体の作製に適合させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物体（例えば、他の哺乳動物）を用いて、ヒト化抗体を発現させ得る。
【０１０６】
上記の抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離および同定するため、または親和性クロマトグラフィによって該ポリペプチドを精製するために使用され得る。
【０１０７】
本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、ＣＶＨを処置するため、特にＩＢＳの処置のために使用され得る。
【０１０８】
タンパク質量を測定するため、本発明による抗体は、慣用的な免疫学的手法で使用される。好適な免疫学的手法は当業者には周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット解析、競合的またはサンドイッチイムノアッセイなどが挙げられる。他の点も周知であるように、これらはすべて、抗原−抗体免疫複合体の形成に依存しており、アッセイの目的のため、抗体は、例えば、放射能、酵素もしくは蛍光標識で検出可能に標識され得るか、または不溶性担体上に固定化され得る。
【０１０９】
例えば、ＥＬＩＳＡスクリーニング形式では、抗体は、担体（ＢＳＡなど）にカップリングされたタンパク質またはそのペプチド断片のいずれかでコーティングされた固相（例えば、マイクロプレートの底面）に添加され、次いで、検出可能な標識（酵素、好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼ、または１２５Ｉなどの放射性同位体など）にコンジュゲートされた抗免疫グロブリン抗体が添加される（例えば、免疫処置がマウスで行なわれる場合は、抗マウス免疫グロブリン抗体、例えばヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）が使用される）。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態では、個々の核酸および／または遺伝子産物は、最初に、特定の遺伝子または遺伝子産物に特異的に結合する「候補化合物」を同定するためのスクリーニング方法において使用される。同定されたら、候補化合物は、さらに、細胞系または完全体の動物系アッセイで、特定の核酸の発現またはその遺伝子産物の発現もしくは活性（すなわち、機能）に対するその効果を、同じ核酸および／または遺伝子産物を発現する未処置対照の細胞または動物と比較して調べるために使用され得る。本発明では、発現はまた、ＩＢＳを処置するために一般に使用される薬物、例えば、プロビオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）、例えば、ラクトバチルスおよびビフィドバクテリウム；抗炎症剤、例えば、局所活性５−ＡＳＡ化合物またはコルチコステロイド類など（例えば、ブデノシドなど）；肥満細胞安定剤、ＰＡＲ−２アンタゴニスト、およびカスパーゼ活性を阻害するアプローチ、例えば、Ｎ１−３−メチルブチリル−Ｎ４−６−アミノヘキサノイル−ピペラジン；ＣＮＩ−１４９３またはプラルナカサンでさらに処理した細胞または未処理細胞においても検出され得る。結腸細胞（例えば、Ｃａｃｏ−２またはＨＴ−２９細胞）を用いた細胞培養アッセイを用いて、試験化合物が発現のモジュレーターとしての機能を果たすか否かが測定され得る。具体的なある実施形態では、細胞を試験化合物と接触させ、発現に対する該化合物の効果を、試験化合物と接触させていない対応する細胞と比較して評価する。本明細書で用いる場合、用語「対応する細胞」は、試験試料のものとは別の試料中の細胞であって、好ましくは、試験対象の細胞と同じ組織型由来の同じ細胞型をいう。
【０１１１】
したがって、本発明の目的は、
ａ）ＩＢＳ−ＭＳＧ産物を試験対象の化合物とともにインキュベートすること；および
ｂ）前記化合物がＩＢＳ−ＭＳＧ産物と結合できる能力を測定すること、ここで、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物に対して結合できる化合物は、ＩＢＳの処置のための候補化合物である、を含む、ＣＶＨの処置、特にＩＢＳの処置のための候補化合物を同定および取得するためのスクリーニング方法を提供することである。
【０１１２】
このような結合アッセイでは、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物は、典型的には、前記遺伝子またはその断片にコードされたポリペプチドからなり、試験化合物が前記ポリペプチドに結合できる能力は、当該技術分野で知られた手順、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）に記載のものなどを用いて測定される。代替的な実施形態において、ＩＢＳ−ＭＳＧ産物は、ＩＢＳ−ＭＳＧ遺伝子またはその断片から転写されたポリヌクレオチドである。
【０１１３】
特定の一実施例において、本発明のポリペプチドに結合する候補化合物は、クロマトグラフィ系の手法を用いて同定され得る。例えば、本発明の組換えポリペプチドは、該ポリペプチド（例えば、上記のもの）を発現するように操作された細胞から、標準的な手法によって精製され得、カラム上に固定化され得る。次いで、候補化合物の溶液をカラムに通し、固定化された本発明のポリペプチドに特異的な化合物が、該ポリペプチドに結合する能力に基づいて同定され、カラム上に固定化される。該化合物を単離するため、カラムを洗浄して非特異的結合分子を除去し、次いで、目的の化合物をカラムから放出させ、収集する。同様の方法が、ポリペプチドマイクロアレイに結合した化合物の単離に使用され得る。この方法（または任意の他の適切な方法）によって単離された化合物は、所望によりさらに精製され得る（例えば、高速液体クロマトグラフィによって）。また、このような候補化合物は、本発明のポリペプチドの活性を改変する（例えば、増大または低下させる）能力について試験され得る。このアプローチによって単離された化合物はまた、例えば、ヒト被験体においてＩＢＳを処置するための治療剤として使用され得る。本発明のポリペプチドに１０μＭ以下の親和性定数で結合すると確認された化合物は、本発明に特に有用であるとみなし、本明細書において以下、特異的結合剤とも称する。
【０１１４】
あるいはまた、該結合アッセイは、さらに、目的のＩＢＳ−ＭＳＧに対する特異的結合剤、すなわち、目的遺伝子と結合することがわかっている抗体または別の薬剤のいずれかの存在を含む。本発明のＩＢＳ−ＭＳＧについて、既知の市販の抗体および既知のアゴニストのリストを、以下にリストアップする。結合アッセイでは、試験化合物のＩＢＳ−ＭＳＧと結合できる能力を、ＩＢＳ−ＭＳＧと前記特異的結合剤との相互作用に対する試験化合物の効果を測定することにより評価する。
【０１１５】
表１に示した遺伝子に対する市販の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の例：
抗ヒトＣＡＳＰ１抗体
（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
抗ヒトＮＣＦ４抗体
（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｂｅａｍ，ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
抗ヒトリゾチーム抗体
（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
抗ヒトＰＳＭＥ２抗体
（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
抗ヒトＨＥＬＬＳ抗体
（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
抗ヒトＣＯＰ１抗体
（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＭＧＥＮＥＸ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）
抗ヒトＭＣＭ５抗体
（Ａｂｅａｍ，ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
抗ヒトＴＡＰ２抗体
（Ａｂｇｅｎｔ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
抗ＶＳＩＧ２抗体
（Ａｂｅａｍ：マウスモノクローナル皮質胸腺細胞抗体，ａｂ２４２３５−ヒト系と反応）
表１に示した遺伝子にコードされたタンパク質に対するアゴニストの例：
リゾチーム活性化（アゴニスト）：
−シクロスポリンＡ（リゾチーム放出の誘導）
−１−エチル−ベンズイミダゾリノン（１−ＥＢＩＯ）
−カルバコール
−タプシガルジン
−フェニレフリン
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化：
−アンギオテンシンＩＩ［Ａｎｇ  ＩＩ］
−ＰＭＡ
−ＴＮＦ−α
−増殖因子
−トロンビン
−酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）
ＰＳＭＥ２およびＴＡＰ２活性化：
−インターフェロン−γ
前述のスクリーニングアッセイを用いた目的遺伝子への結合能を有する分子の検出では、目的遺伝子に特異的に結合する分子（例えば、抗体、アゴニストまたはポリヌクレオチドプローブ）は、原子（例えば、放射性核種）、分子（例えば、フルオレセイン）、または物理的もしくは化学的特性により該分子の存在を示す複合体を含有しているので、検出可能に標識され得る。また、分子は、検出可能な原子、分子または他の複合体をもたらす基体に対して作用する「レポーター」分子（例えば、酵素などの生体分子）に共有結合されている場合、あるいはこれと会合している場合、検出可能に標識され得る。本発明における使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明に有用な標識としては、標識アビジンまたはストレプトアビジンコンジュゲートでの染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、リサミン、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ［Ａｍｅｒｓｈａｍ］、ＳｙＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩおよびＩＩ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ］など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３２Ｐ）、酵素（例えば、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、など）、基質、補因子、インヒビター、化学発光基、色素形成剤、ならびに比色的標識、例えば、金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０１１６】
かかる標識を検出するための手段は当業者に周知である。したがって、例えば、化学発光標識および放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンタを用いて検出され得、蛍光マーカは、放射光を検出するための光検出器を用いて検出され得る（例えば、蛍光標示式細胞分取の場合と同様に）。酵素標識は、典型的には、該酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生成される着色反応生成物を検出することにより検出される。比色的標識は、着色された標識を単に可視化することにより検出される。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段としては、シンチレーションカウンタ、オートラジオグラフィの場合のような写真フィルム、または記憶蛍光体画像形成が挙げられる。標識が蛍光標識である場合、これは、蛍光色素を適切な波長の光で励起し、生じた蛍光を検出することにより検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）もしくは光電子増倍管などの電子検知器などの使用によって、可視的に検出され得る。同様に、酵素標識は、適切な基質を該酵素に提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出され得る。また、単純な比色的標識は、該標識に伴う発色を観察することにより検出され得る。蛍光共鳴エネルギー転移は、非標識リガンドの結合に適合されており、アレイにおいて有用であり得る。
【０１１７】
さらに、結合相互作用の評価がＢｉａｃｏｒｅ手法を用いて行われ得、この場合、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドまたはその結合パートナーをマイクロチップに、化学修飾によって直接、または抗体−エピトープ会合（例えば、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに対する抗体）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓタグ）に指向される抗体もしくは融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ）による結合（ｔｅｔｈｅｒ）のいずれかで結合させる。次いで、第２のタンパク質（１つまたは複数）を、該「チップ」に流すことによって適用し、シグナルの変化を検出する。最後に、試験化合物を該「チップ」に流すことによって適用し、シグナルの変化を検出する。
【０１１８】
かかるスクリーニングアッセイによって同定され得る化合物の種類としては、限定されないが、小分子（例えば、分子量が約２ｋｄ未満、より好ましくは分子量が約１ｋｄ未満の、および／または血液脳関門を通過することができるか、もしくは適切な細胞内に進入し、関連遺伝子の発現あるいは関連遺伝子産物の活性に影響する有機または無機分子）が挙げられる。また、このようなスクリーニングアッセイによって同定される化合物としては、ポリペプチド（可溶性ペプチド、融合ペプチドなど）、コンビナトリアルライブラリ（Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４：８２−８４；およびＨｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４：８４−８６に記載のものなど）の構成員；コンビナトリアル化学によって誘導されたライブラリ（Ｄ−および／またはＬ−配置アミノ酸の分子ライブラリ）の構成員；ホスホペプチド、例えば、ランダムまたは部分縮重指向型ホスホペプチドライブラリ（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ  １９９３，７２：７６７−７７８を参照）の構成員など；「ファージ方法」（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，２４９：３８６−３９０；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７：６３７８−６３８２；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，４９：４０４−４０６）によるペプチドライブラリ；他の化学物質ライブラリ（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９８６，２３：７０９−７１５；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７，１０２：２５９−２７４；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５１：７６７−７７３；Ｆｕｒｋａら、１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，Ｖｏｌｕｍｅ  ＆  ｎｕｍ；５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＦＲ：０１３；Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１，３７：４８７−４９３；米国特許第４，６３１，２１１号；米国特許第５，０１０，１７５号；Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３，９０：１０７００−４；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３，９０：１０９２２−１０９２６；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ９２／００２５２；およびＰＣＴ公開公報番号ＷＯ  ９４／２８０２８）由来の化学物質；ならびにさまざまな供給元、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、およびＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能な合成または天然化合物の大型ライブラリ（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、ＴＩＢＴｅｃｈ  １９９６，１４：６０参照）が挙げられ得る。
【０１１９】
診断アッセイ
本発明は、さらに、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧの変異型形態の検出、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群、最も詳細には、ＩＢＳ１からなる本発明の診断方法に使用されるＩＢＳ−ＭＳＧの変異型形態の検出により、該遺伝子の不充分な発現、過剰発現または空間的改変または一時的発現に起因する疾患の診断もしくは疾患に対する感受性に付加されるか、またはこれらが明示され得る診断用ツールが提供される。該遺伝子に変異を有する個体は、さまざまな手法によってＤＮＡレベルで検出され得る。
【０１２０】
したがって、本発明により、
（ａ）本発明によるポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を測定すること；および
（ｂ）前記変異の存在または非存在に基づいて、病的状態または病的状態に対する感受性診断すること
を含む、被験体におけるＣＶＨ、特にＩＢＳと関連する病的状態または病的状態に対する感受性の診断方法が提供されることが認識されよう。
【０１２１】
該方法は、さらに、上記工程（ａ）に基づいて、試料が、ＩＢＳおよび／またはＩＢＳの特定の段階を示すか否か、および／またはＩＢＳの感受性を示すか否かを判定する方法を含む。
【０１２２】
診断用の核酸は、被験体の細胞、例えば、血液（例えば、全血、血清、血漿、特に、白血球）、尿、唾液、糞便試料、糞便細胞、組織生検材料（特に、結腸生検材料）または剖検材料などから採取されたものであり得る。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、これを、解析前に、ＰＣＲまたは他の増幅手法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様にして使用され得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅産物の大きさの変化によって検出され得る。点変異は、増幅ＤＮＡを、標識哺乳動物プリンパーミアーゼヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより確認され得る。完全にマッチした配列はミスマッチ二本鎖と、ＲＮアーゼ消化または融解温度の差によって識別され得る。また、ＤＮＡ配列の差は、キャピラリ電気泳動カラムもしくはゲル内のＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化によって（変性剤の有無）、または直接ＤＮＡ配列決定（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）によっても検出され得る。また、特定の位置における配列の変化は、特異的制限エンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮアーゼおよびＳ１保護など）または化学的切断方法（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照）によっても示され得る。別の実施形態では、ＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニングが行なわれ得る。アレイ手法・方法は周知であり、一般適用性を有し、分子遺伝学、例えば、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性におけるさまざまな問題に取り組むために使用され得る（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ２７４，ｐｐ６１０〜６１３（１９９６）を参照）。
【０１２３】
該診断アッセイは、記載の方法によってＩＢＳ−ＭＳＧにおける変異を検出することによるＩＢＳに対する感受性の診断または判定プロセスを提供する。また、かかる疾患は、正常な構造と比較して被験体由来の試料からポリペプチドまたはｍＲＮＡの異常に減少または増大したレベルを測定すること、ならびに前記試料からタンパク質誘導体の存在を調べることを含む方法によって診断され得る。発現の減少または増大は、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野で周知である任意の方法を用いて、例えば、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲによる）；ＲＮアーゼ保護；ノザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法などによって、ＲＮＡレベルで測定され得る。宿主由来の試料中の本発明のポリペプチドなどのタンパク質のレベルを測定するために使用され得るアッセイ手法は、当業者には周知である。かかるアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。タンパク質誘導体またはバリアントの存在を調べるために使用され得るアッセイ手法には、とりわけ、質量分析が含まれる。
【０１２４】
したがって、別の態様において、本発明は、
（ａ）被験体の生物学的試料において、ＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルを測定すること；
（ｂ）該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること；ならびに
（ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて診断を得ること
を含む、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法を提供する。
【０１２５】
該方法は、さらに、試料がＩＢＳおよび／またはＩＢＳの特定の段階を示すか否か、および／または上記の工程（ａ）および（ｂ）に基づいてＩＢＳの感受性を示すか否かを判定する方法を含む。
【０１２６】
本発明の診断方法に使用されるＩＢＳ−ＭＳＧは、典型的には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択され、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択される。
【０１２７】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）被験体の生物学的試料において、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルを測定すること、
（ｂ）該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること；ならびに
（ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、診断を得ることおよび／または試料が（特定の型の）ＩＢＳを示すか否かを判定すること
を含む、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法を提供することである。
【０１２８】
被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法のさらなる実施形態において、工程ａ）は、上記のＩＢＳ−ＭＳＧの２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上を調べることを含む。
【０１２９】
特別な実施形態では、前記患者の生物学的試料は、結腸組織の試料、より詳細には結腸粘膜組織の試料である。
【０１３０】
特定の一実施形態によれば、本発明による被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法は、工程（ａ）において、少なくとも２つの異なる遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の１つが、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０からなる群より選択され、１つ以上の他の遺伝子が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される測定、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の発現の測定、特にＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子；より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群の少なくとも２つの遺伝子；さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群の少なくとも２つの遺伝子の発現の測定を含み、本発明のさらなる実施形態は、工程（ａ）において、少なくとも２つの遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の１つがＩＢＳ１であり、その他が、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される測定を含む。
【０１３１】
記載の各実施形態では、工程（ｂ）は、前記少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを、健常対照試料における前記遺伝子の転写レベルと比較することからなる。
【０１３２】
特に、これは、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０の発現レベル；より詳細には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２の発現レベル；さらにより詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２の発現レベル；最も詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４の発現レベルを測定することからなる。
【０１３３】
被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための前述の任意の方法において、本出願書類に特定されたＩＢＳ−ＭＳＧの使用は、他の遺伝子、例えば、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２Ａ、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＬＣｌ２Ａ２、ＳＣＮＮｌＡ、ＯＰＲＩＭ、ＡＱＰ３、ＮＫＣＣｌ、ＴＨＰｌ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−Ｉ０、ＧＮＢ３、ＡＤＲＡ２Ａ、ＴＮＦＡ、ＣＣＫｌ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１βおよびＣＫＢなどと組み合わせてもよい。
【０１３４】
したがって、本発明の目的は、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法であって、前述の任意の実施形態による工程ａ）が、さらに、ＩＢＳマーカとして知られる遺伝子の少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれ以上、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルを測定することを含む方法を提供することである。
【０１３５】
被験体においてＩＢＳを検出するためには、前記被験体の試料におけるＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルを、正常対照試料と比較する必要があり得る。対照試料における前記遺伝子の発現レベルと比較したときの、前記被験体の試料におけるＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルの変化は、前記被験体におけるＩＢＳの診断またはＩＢＳに対する感受性を示す。例えば、以下：ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２またはＭＵＣ２０のＩＢＳ−ＭＳＧのいずれかのレベルが対照試料と比べて増大している場合（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％またはそれ以上）、これを前記被験体におけるＩＢＳに対する陽性指標とみなす。別の例では、以下：ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬまたはＶＳＩＧ４のＩＢＳ−ＭＳＧのいずれかのレベルが対照試料と比べて減少している場合（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）、これを前記被験体におけるＩＢＳに対する陽性指標とみなす。さらにあるいはまた、発現における差は、対照試料で観察される発現レベルと比べた「変化倍数」で示され得る。かかる実施形態では、１．４倍変化は４０％の増大に相当するなどである。一般に、発現の減少は、４０％の減少に対して０．６倍変化と称する。＊＊＊「確認されたい」＊＊＊
したがって、本発明の目的は、
（ａ）被験体の生物学的試料において、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧの遺伝子転写レベルを測定すること、ならびに
（ｂ）該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること
を含み、
ここで、ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２およびＭＵＣ２０からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬおよびＶＳＩＧ４からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるＩＢＳの存在の表示である、被験体においてＩＢＳを確認するための方法を提供することである。
【０１３６】
本明細書において上記のように、遺伝子転写レベルは、好ましくは、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに結合する抗体を用いてタンパク質レベルで、または好ましくは、前記ＩＢＳ−ＭＳＧから転写されたオリゴヌクレオチドに特異的に結合するプローブを用いて遺伝子転写レベルで、好ましくは、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡのレベルでのいずれかで測定される。特別な実施形態において、遺伝子転写レベルは、アレイ手法を用い、本明細書で前述の特異的プローブを用いてオリゴヌクレオチドレベルで、または特異的結合剤、好ましくは、本明細書で後述する抗体を用いてタンパク質レベルでのいずれかで測定される。
【０１３７】
したがって、本発明のさらなる実施形態では、前述の方法における遺伝子の発現レベルは、目的遺伝子のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに特異的に結合するプローブを用いて、特に、マイクロアレイ手法を用いて評価される。
【０１３８】
したがって、本発明の目的は、被験体においてＩＢＳを測定およびモニタリングするための方法であって、遺伝子転写レベルが、ＩＢＳ−ＭＳＧに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて評価される方法を提供することである。一実施形態において、前記遺伝子は、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択され、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択される。既に本明細書において前述のように、ＩＢＳ−ＭＳＧに対するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、任意選択で、他の遺伝子、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される遺伝子に特異的に結合するプローブと組み合わせる。したがって、本発明のさらなる目的において、遺伝子の発現レベルは、表１に示したプローブのアレイを用いて、より詳細には、表２に示したプローブのアレイを用いて測定される。
【０１３９】
タンパク質アレイは、典型的には、表面（例えば、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量分析計のプレートおよびビーズまたは他の粒子）上に固定化されたタンパク質を使用した固相リガンド結合アッセイシステムである。自動マルチウェル形式は、最良に開発されたものであり、自動９６ウェルプレート系スクリーニングシステムは、最も広く使用されている。本発明の方法に使用され得るタンパク質アレイの説明については、米国特許第６，４７５，８０９号；同第６，４０６，９２１号および同第６，１９７，５９９号；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ００／０４３８９およびＷＯ００／０７０２４を参照のこと。
【０１４０】
アレイの構築では、タンパク質の供給源として、組換えタンパク質のための細胞系の発現系、天然供給源からの精製、無細胞翻訳系によるインビトロ作製、およびペプチドの合成方法が挙げられる。捕捉アレイおよびタンパク質の機能解析では、タンパク質が正しくフォールディングされており、機能性であることが重要である。これは、例えば、組換えタンパク質が細菌から変性条件下で抽出される場合は必ずしもそうではないが、他の方法（天然タンパク質の単離、無細胞合成）では、一般的に、機能性が保持される。しかしながら、変性タンパク質のアレイは、交差反応性に関する抗体のスクリーニング、自己抗体の特定およびリガンド結合タンパク質の選択に有用である。
【０１４１】
使用される固定化方法は、再生可能であり、種々の性質（大きさ、親水性、疎水性）のタンパク質に適用可能であり、ハイスループットおよび自動化し易く、および充分に機能性のタンパク質活性の保持と適合性であるのがよい。共有結合性と非共有結合性の両方のタンパク質固定化方法が使用される。共有結合のための基材としては、アミノ−またはアルデヒド含有シラン試薬（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）でコーティングされたガラススライドが挙げられる。Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ系（Ｐｒｏｌｉｎｘ）では、フェニル二ボロン酸で誘導体化されたタンパク質と、支持体表面上に固定化されたサリチルヒドロキサム酸との相互作用によって、可逆的共有結合が得られる。安定な結合をもたらす共有結合方法は、ある範囲のタンパク質に適用され得る。非修飾タンパク質の非共有結合は、３次元ポリアクリルアミドゲル系のＨｙｄｒｏＧｅｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などの多孔質構造において生じる。
【０１４２】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、
（ａ）被験体の生物学的試料において、少なくとも１種類のＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質のタンパク質レベルを測定すること；
（ｂ）該タンパク質レベルを正常対照試料におけるタンパク質レベルと比較すること；および
（ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて診断を得ること
を含む、被験体においてＩＢＳを確認および／またはモニタリングするための方法を提供する。
【０１４３】
好ましくは、タンパク質レベルは、ＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質に結合する少なくとも１種類の抗体を用いて測定される。特に、１種類以上の抗体であって、各々が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０から選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する抗体が使用され、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたポリペプチドに結合する抗体が使用され、最も特別な実施形態では、タンパク質レベルは、ＩＢＳ１に特異的な抗体を用いて測定される。
【０１４４】
代替的な実施形態において、該方法は、本発明による少なくとも１種類のタンパク質に限定されないが、ＩＢＳに関与すると確認されたタンパク質群、すなわち、表１に示したＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたタンパク質群の発現レベルの同時評価が必要とされ、一実施形態において、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群；特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群のＩＢＳ−ＭＳＧにコードされたタンパク質群の発現レベルの同時評価が必要とされる。好ましい実施形態において、タンパク質群の発現レベルの同時評価は、アレイ手法を用いて、特に、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡなど）を用いて行われる。本明細書において前述のように、タンパク質アレイでは、一次薬剤、典型的には、ＩＢＳタンパク質を認識する抗体またはタンパク質を、固相支持体（例えば、膜またはマイクロタイタープレート）に結合させる。この固相支持体を使用し、ＩＢＳタンパク質が生物学的試料から抽出され得、検出可能な標識（酵素、好ましくは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、または１２５Ｉなどの反応性同位体など）とコンジュゲートさせた二次薬剤（例えば、ＩＢＳタンパク質の第２のエピトープを認識する二次抗体、または一次抗体を認識する抗体もしくはタンパク質）を用いて定量され得る。
【０１４５】
したがって、本発明の目的は、
ａ）被験体の生物学的試料を、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドと特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤と接触させること；
ｂ）該ポリペプチドに対する該薬剤の結合レベルを測定すること；
ｃ）前記生物学的試料中の該薬剤の結合レベルを、正常対照試料中の該薬剤の結合レベルと比較すること；ならびに
ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、診断を得ること、または試料がＩＢＳおよび／またはＩＢＳの特定の状態を示すか否かを判定すること
を含む、被験体においてＩＢＳを検出および／またはモニタリングするための方法を提供することである。
【０１４６】
既に本明細書において前述のように、好ましい実施形態では、該アッセイは、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチド特異的抗体のタンパク質アレイを用いて行なわれる。一実施形態において、２つ以上の特異的抗体は各々、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドと反応性であり、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドと反応性であり、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドと反応性であり、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧと反応性である。既に本明細書において前述のように、ＩＢＳ−ＭＳＧのタンパク質アレイを、任意選択で、他の遺伝子、特に、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される遺伝子に特異的に結合する薬剤と組み合わせる。
【０１４７】
被験体においてＩＢＳを検出するためには、前記被験体の試料におけるＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに対する薬剤の結合レベルを、正常対照試料における結合レベルと比較する必要があり得る。結合レベルの変化は、前記被験体におけるＩＢＳの診断またはＩＢＳに対する感受性を示す。例えば、以下：ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２またはＭＵＣ２０のＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドのいずれかの結合レベルが対照試料と比べて増大している場合（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％またはそれ以上）、これを前記被験体におけるＩＢＳに対する陽性指標とみなす。別の例では、以下：ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬまたはＶＳＩＧ４のＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドのいずれかの結合レベルが対照試料と比べて減少している場合（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）、これを前記被験体におけるＩＢＳに対する陽性指標とみなす。
【０１４８】
本明細書に記載の診断方法はまた、被験体においてＩＢＳをモニタリングするため、または治療用化合物の投薬量を決定するために使用され得る。一例において、治療用化合物が投与され、ＩＢＳ−ＭＳＧの発現レベルが、治療過程で測定される。
【０１４９】
本発明では、ＩＢＳ−ＭＳＧの任意の１つ以上の発現をモジュレートする治療剤を特に有用であるとみなす。一例では、治療過程で以下：ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２またはＭＵＣ２０のＩＢＳ−ＭＳＧのいずれかの発現レベルを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％またはそれ以上減少させる治療用薬剤を、有効な治療用薬剤または有効投薬量の治療用薬剤とみなす。別の例では、治療過程で、以下：ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬまたはＶＳＩＧ４のＩＢＳ−ＭＳＧのいずれかの発現レベルを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上増大させる治療用薬剤を、有効な治療用薬剤または有効投薬量の治療用薬剤とみなす。
【０１５０】
診断用キット
本発明はまた、生物学的試料中のＩＢＳ−ＭＳＧ産物の存在を検出するためのキットを包含し、該キットは、上記の任意の診断アッセイ行なうのに必要とされる成分と、生物学的試料におけるＩＢＳ−ＭＳＧの発現の評価および被験体におけるＩＢＳの診断に該成分を使用するための使用説明書とを備える。
【０１５１】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）ＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合する少なくとも１種類のプローブ、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ、より詳細には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ、さらにより詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧ、最も詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧに特異的に結合する少なくとも１種類のプローブ；または
（ｂ）ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤；特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチド、より詳細には、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチド、さらにより詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチド、最も詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群より選択されるＩＢＳ−ＭＳＧのポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも１種類の薬剤、
を備える診断用キットを提供することである。
【０１５２】
特定の一実施形態によれば、本発明のキットは、少なくとも２つの異なる遺伝子の発現を測定するための２種類以上のプローブおよび／または結合剤であって、該遺伝子の１つが、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０からなる群より選択され、１つ以上の他の遺伝子が、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される、少なくとも２つの異なる遺伝子の発現を測定するための２種類以上のプローブおよび／または結合剤を備え、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４およびＭＵＣ２０からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の発現を測定するための２種類以上のプローブまたは結合剤、特に、ＩＢＳ１、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＶＳＩＧ２からなる群より選択される少なくとも２つの遺伝子の発現を測定するための２（ｔｗｏｒ）種類以上のプローブ、より詳細には、ＩＢＳ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１およびＶＳＩＧ２からなる群由来の２つ以上の遺伝子の発現を測定するための少なくとも２種類のプローブおよび／または結合剤、さらにより詳細には、ＭＵＣ２０、ＶＳＩＧ２およびＶＳＩＧ４からなる群の少なくとも２つの遺伝子の発現を測定するための少なくとも２種類のプローブおよび／または結合剤を備える。本発明のキットのさらなる実施形態は、少なくとも２つの遺伝子の発現を測定するための２種類以上のプローブおよび／または結合剤を備え、該遺伝子の１つはＩＢＳ１であり、その他が、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦＲ１、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＦＲＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬ、ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＭＵＣ２０、ＣＡＳＰ１、ＦＣＧＲ２ＡおよびＣＫＢからなる群より選択される。
【０１５３】
任意のかかるキットにおいて、（ａ）または（ｂ）には、本明細書において前述の任意の診断アッセイを行なうのに必要とされるさらなる成分が含まれていてもよいことは認識されよう。例えば、好ましい実施形態では、ＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチドに特異的に結合する薬剤は抗体であり得、キットは、さらに、該抗体とＩＢＳ−ＭＳＧポリペプチド間の結合を定量するのに必要とされる成分を含むものであり得る。本発明の一実施形態において、かかる免疫学的キットは、一次薬剤（例えば、抗原を認識する抗体またはタンパク質）でコーティングされた固相支持体（例えば、膜またはマイクロタイタープレート）、標準曲線を作成するための精製タンパク質の標準溶液、体液（例えば、血清または尿）、分析実験の品質試験用の対照、標識もしくは酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）にコンジュゲートされた、または他の方法で標識された二次薬剤（例えば、検出対象の抗原の第２のエピトープと反応性である二次抗体、または一次抗体を認識する抗体もしくはタンパク質）、基質溶液、停止溶液、洗浄バッファーおよび取扱説明書を含むものである。膜は計深棒構造体上に支持され得る（この場合、試料は膜上に、計深棒構造体を試料内に配置することにより配置される）か、または膜は、側方流カセット内に支持され得る（この場合、試料は膜上に、カセット内の開口部を通して配置される）。キットはまた、アレイ形式であってもよく、バイオチップ上（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭなど）に配列された本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドに特異的に結合する結合分子のアレイを含むものであり得る。
【０１５４】
また、診断用キットには、一般的に、キット成分の意図される用途、および標準曲線を作成するために使用される参照試料または精製タンパク質に関するラベルまたは使用説明書が含まれる。一例において、キットは、該キットをＩＢＳの診断に使用するための使用説明書を含む。また別の例では、キットは、該キットをＩＢＳの処置のための治療処置または投薬レジメンのモニタリングに使用するための使用説明書を含む。参照試料値は、キットの意図される用途に依存することは理解されよう。例えば、試料は、正常参照値と比較され得、この場合、１種類以上の本発明のポリペプチドのレベルまたは１種類以上の本発明のポリペプチドの測定使用レベルの変化は、ＩＢＳまたはＩＢＳに対する素因を示す。別の例において、治療モニタリングに使用されるキットはＩＢＳを示す参照値を有し得、この場合、参照試料と比べた１種類以上の本発明のポリペプチドのレベルまたは１種類以上の本発明のポリペプチドの測定使用レベルの変化は、治療用化合物の治療有効性または有効投薬量を示すために使用され得る。
【０１５５】
治療有用性
本発明は、被験体においてＣＶＨを処置または予防するため、特にＩＢＳを処置または予防するための方法および組成物を特徴とする。ＩＢＳ１、ＶＳＩＧ２およびＭＵＣ２０のレベルは、ＩＢＳを有する被験体において増大していることが見出された。したがって、本発明は、これらのポリペプチドまたは核酸分子の任意の１種以上の発現レベルまたは生物学的活性を減少させる方法および薬剤を包含する。かかる薬剤（より詳細に後述）としては、上記のポリペプチドの任意の１種以上の生物学的活性を下方調節または阻害する化合物；免疫学的／ワクチン製剤；上記のポリペプチドの任意の１種類に特異的に結合する精製抗体または抗原結合断片；アンチセンス核酸塩基オリゴマー；および上記のポリペプチドのいずれかを標的化するｄｓＲＮＡが挙げられる。
【０１５６】
第１の態様において、ＩＢＳにおいて上方調節されるポリペプチドの生物学的活性の低下は、治療有効量のアンタゴニスト、例えばペプチドまたは小分子化合物を、薬学的に許容され得る担体または賦形剤との組合せで含む医薬組成物を用いて確立される。
【０１５７】
本発明のさらなる一態様は、免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、これは、哺乳動物宿主に導入されると、該哺乳動物において、本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を誘導し、該組成物は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むものである。該ワクチン製剤は、さらに、適当な担体を含んでいてもよい。ポリペプチドは胃で分解され得るため、好ましくは非経口投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）。非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の滅菌注射用液剤（これには、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および製剤をレシピエントの血液と等張性にするための溶質が含有され得る）；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁剤（これには、懸濁剤または増粘剤が含有され得る）が挙げられる。該製剤は、単位投与容器または反復投与容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）にて提示され得るか、使用直前に滅菌液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存され得る。また、ワクチン製剤には、製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系（水中油型系および当該技術分野において知られた他の系など）が含まれ得る。投薬量は、ワクチンの特異的な活性に依存し、常套的な実験手法によって容易に決定され得る。
【０１５８】
さらに別のアプローチでは、上方調節される遺伝子の発現は、発現ブロック手法を用いて阻害され得る。かかる既知の手法は、内部で生成させるか、外的に投与するかのいずれかで、アンチセンス配列の使用を伴う（例えば、Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  （１９９１）５６：５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照）。あるいはまた、該遺伝子と三重らせん（「三重鎖」）を形成するオリゴヌクレオチドが供給され得る（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照）。このようなオリゴマーは、それ自体を投与してもよく、関連オリゴマーをインビボで発現させてもよい。合成アンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチドは、修飾塩基または修飾主鎖を含むものであってもよい。後者の例としては、メチルホスホネート、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸主鎖が挙げられる。かかる主鎖は、ヌクレアーゼによる分解からの保護をもたらすため、アンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチド内に組み込まれ、当該技術分野で周知である。これらおよび／または他の修飾主鎖とともに合成されるアンチセンスおよび三重鎖分子もまた、本発明の一部を構成する。
【０１５９】
細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する別の方法では、一部または完全に二本鎖の性質を有するＲＮＡを細胞内または細胞外環境に導入する。阻害は、標的遺伝子の一部分に由来するヌクレオチド配列が阻害性ＲＮＡの作製に選択されているという点で、特異的である。該ＲＮＡは、１つ以上の重合リボヌクレオチド鎖を含むものであってもよく、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドのいずれかに対して修飾を含むものであってもよい。二本鎖構造は、１本の自己相補性ＲＮＡ鎖または２本の相補鎖によって形成され得る。阻害は、該ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子阻害の標的となる点で、配列特異的である。標的配列の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡが好ましい。ＲＮＡ阻害手法の例は、国際特許出願ＷＯ９９／３２６１９を見るとよい。
【０１６０】
また、上方調節されるＩＢＳ−ＭＳＧタンパク質の発現は、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを使用することにより抑制され得る。リボザイムは触媒的に活性なＲＮＡであり、天然または合成のものであり得る（例えば、Ｕｓｍａｎ，Ｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３を参照）。合成リボザイムは、前述のｍＲＮＡを選択した位置で特異的に切断し、それにより前記ｍＲＮＡの機能性ポリペプチドへの翻訳が抑制されるように設計され得る。リボザイムは、ＲＮＡ分子に通常見られるような天然リボースのリン酸主鎖と天然塩基を用いて合成され得る。あるいはまた、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護をもたらす非天然主鎖（例えば、２‘−Ｏ−メチルＲＮＡ）を用いて合成され得、修飾塩基を含んでいてもよい。
【０１６１】
別の代替例として、被験体においてＩＢＳを予防または処置するために、上記の上方調節されるＩＢＳ−ＭＳＧに結合し、その活性を中和する抗体が使用され得る。本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、該ポリペプチドまたはエピトープ含有断片、類縁体またはこれらを発現する細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物に、常套的なプロトコルを用いて投与することにより得られ得る。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の調製のため、細胞株の連続培養によって産生される抗体をもたらす任意の手法が用いられ得る。例としては、ハイブリドーマ手法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられる。モノクローナル抗体、特に、齧歯類（例えば、マウス）に由来するものが、種々の疾患の処置に使用されている。しかしながら、その使用（例えば、ヒト抗マウス免疫グロブリン応答の誘導）には制限があり、急速なクリアランスおよび処置の有効性の低下が引き起こされる。例えば、齧歯類のモノクローナル抗体の臨床使用における大きな制限は、治療中での抗グロブリン応答である（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，６２：９８８−９９５  １９８３；Ｓｃｈｒｏｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４５：８７９−８８５，１９８５）。
【０１６２】
当該技術分野では、動物の抗原結合可変ドメインがヒト定常ドメインに連結された「キメラ」抗体を構築することにより、この問題の解決が試みられている（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６４３−６４６，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２６８−２７０，１９８５）。キメラ抗体は、好ましくは、実質的または排他的にヒト抗体定常領域に由来する定常領域と、実質的または排他的にヒト以外の哺乳動物の可変領域の配列に由来する可変領域とを有するものである。かかるヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である。非ヒト抗体のヒト化方法は、当該技術分野で周知である（概説については、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１９，１９９８ならびにＣａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１：１１８−１２９，２００１を参照）。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。このような非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート（ｉｍｐｏｒｔ）残基と称され、典型的にはインポート可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的に当該技術分野において知られ方法に従って（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６  １９８８）、齧歯類のＣＤＲまたは他のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列で置き換えることにより行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体は、実質的にインタクトに満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基と場合によっては一部のＦＲ残基が、齧歯類の抗体内の類似部位に由来する残基で置換されたヒト抗体である（Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２）。
【０１６３】
本発明のモノクローナル抗体のカクテルは、妊娠関連高血圧性障害（子癇前症または子癇など）に対する有効な処置剤として使用され得る。該カクテルは、２、３もしくは４種程度の少数の異なる抗体を含むもの、または６、８または１０種もの多数の異なる抗体を含むものであり得る。また、本発明の抗体は、現在ＩＢＳの処置に使用されている薬物（例えば、ＣＮＩ−１４９３）またはＩＢＳもしくはＩＢＳと関連する症状の処置に使用される任意の他の投与薬物と併用してもよい。
【０１６４】
本発明の方法に有用な抗体の非限定的な例は、以下のとおり：抗ＩＢＳ１；抗ＶＳＩＧ２、例えば、市販の抗ＶＳＩＧ２抗体（Ａｂｃａｍ製）［ａｂ２４２３５、マウスモノクローナル皮質胸腺細胞抗体］および抗ＭＵＣ２０である。
【０１６５】
また、ＣＯＰ１、ＰＳＭＥ２、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、ＣＳＦ１Ｒ、Ｍ１６０、ＫＣＮＳ３、ＬＹＺ、ＭＳ４Ａ４Ａ、ＨＥＬＬＳ、ＲＦＣ４、ＭＣＭ５、ＴＡＰ２、ＬＲＡＰ、ＤＴＬおよびＶＳＩＧ４のレベルは、ＩＢＳを有する被験体において減少していることがわかった。したがって、本発明はまた、これらのポリペプチドまたは核酸分子の任意の１種以上の発現レベルまたは生物学的活性を増大させる任意の方法および薬剤を包含する。かかる薬剤（より詳細に後述）としては、該ポリペプチドの任意の１種以上の生物学的活性を上方調節または増大させる化合物、例えば、このようなポリペプチドまたは該ポリペプチド自体の精製形態をコードするオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１６６】
タンパク質の不充分な発現に関連する異常な状態を処置するため、いくつかのアプローチもまた利用可能である。アプローチの一例は、被験体に、本発明のポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、上記のアゴニスト）の治療有効量を、薬学的に許容され得る担体との組み合せで投与し、それにより異常な状態を緩和することを含むものである。本発明による方法に有用なＩＢＳ−ＭＳＧアゴニストの例は、リゾチーム（ＬＹＺ）アゴニスト、例えば、シクロスポリンＡ（リゾチーム放出の誘導）、１−エチル−ベンズイミダゾリノン（１−ＥＢＩＯ）、カルバコール、タプシガルジンおよびフェニレフリンなど；ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化因子、例えば、アンギオテンシンＩＩ［Ａｎｇ  ＩＩ］、ＰＭＡ、ＴＮＦ−、増殖因子、トロンビンおよび酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）など；ならびにインターフェロン−γによるＰＳＭＥ２およびＴＡＰ２の誘導である。
【０１６７】
あるいはまた、被験体において関連細胞による哺乳動物系プリンパーミアーゼの内因的産生をもたらすため、遺伝子治療が使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のように、複製欠陥レトロウイルスベクターでの発現のために操作され得る。次いで、レトロウイルス発現構築物は単離され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞内に、該パッケージング細胞が、目的遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するように導入され得る。このようなプロデューサー細胞は、被験体に、細胞のインビボ操作および該ポリペプチドのインビボ発現のために投与され得る。遺伝子治療の概要については、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）の第２０章、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびそこに挙げられた参考文献）を参照のこと。別のアプローチは、治療量の本発明のポリペプチドを、適当な医薬用担体との組み合わせで投与することである。
【０１６８】
上記に基づき、さらなる態様において、本発明は、治療有効量のポリペプチド、例えば、本発明のポリペプチドの可溶性形態、アゴニスト／アンタゴニストペプチドまたは小分子化合物を、薬学的に許容され得る担体または賦形剤との組み合わせで含む医薬組成物を提供する。かかる担体としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられる。本発明は、さらに、本発明の前述の組成物の成分の１種類以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独または他の化合物（治療用化合物など）と組み合わせて使用され得る。
【０１６９】
該組成物は、投与経路（例えば、全身性または経口経路）に適合される。全身性投与の好ましい形態としては、注射、典型的には静脈内注射が挙げられる。他の注射経路（皮下、筋肉内または腹腔内など）が使用され得る。全身性投与のための代替的手段としては、胆汁塩またはフシジン酸または他のデタージェントなどの浸透剤を用いる経粘膜および経皮投与が挙げられる。また、本発明のポリペプチドまたは他の化合物が、腸溶性製剤またはカプセル封入製剤に製剤化され得る場合、経口投与も可能であり得る。また、このような化合物の投与は、貼付剤、軟膏、ペースト剤、ゲル剤などの形態で局所的および／または局部的であり得る。
【０１７０】
必要とされる投薬量の範囲は、選択された本発明のペプチドまたは他の化合物、投与経路、製剤の性質、被験体状態の性質、および主治医の判断に依存する。しかしながら、好適な投薬量は、被験体の０．１〜１００μｇ／ｋｇの範囲である。しかしながら、利用可能な化合物の多様性および種々の投与経路の効率性の差異を鑑みると、必要な投薬量には広範な変動が予測される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投薬量が必要であることが予測され得る。このような投薬量レベルの変動は、最適化のための標準的な常套的実験を用いて調整され得、これは当該技術分野において充分理解されている。
【０１７１】
処置に使用されるポリペプチドはまた、被験体において内因的に生成されたものであってもよく、処置モダリティにおいて、上記のように、しばしば「遺伝子療法」と称される。したがって、例えば、被験体由来の細胞は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）によりポリペプチドをコードするように、例えば、レトロウイルスプラスミドベクターの使用によってエキソビボで操作され得る。次いで、該細胞を被験体に導入する。
【実施例】
【０１７２】
本発明は、以下の詳細な実施例を参照することによって、より良好に理解されよう。しかしながら、当業者には、これらが、添付の特許請求の範囲により充分に記載した本発明の例示にすぎないことは容易に認識されよう。
【０１７３】
さらに、本出願書類全体を通して、種々の刊行物を引用している。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の技術水準をより充分に示すために、引用により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
実験手順
本発明の目的は、ＩＢＳの病因の分子的機序をさらに理解することであり、常套的な臨床実務と同様にして採取した生検材料を使用し、Ｓ状結腸粘膜のマイクロアレイ発現プロファイリング研究を行なった。
【０１７５】
本明細書において以下により詳細に説明するように、本発明者らの研究には、３６例のＩＢＳ患者（２１例のＩＢＳ−Ｄおよび１５例のＩＢＳ−Ｃ）ならびに２５例の健常対照被験体を含めた。患者はすべて、ＩＢＳ診断（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９９）のＲｏｍｅ  ＩＩ基準を満たしており、臨床検査を受けており、他の胃腸管の障害は除外した。患者は、標準的なアンケートによって研究時に確認された主な腸機能障害に基づいて選択した。Ｓ状結腸鏡検査時、各参加者から２つのＳ状結腸生検材料を採取した。健常およびＩＢＳにおける分子署名の安定性を評価するため、１０例の被験体（５例のＩＢＳ患者および５例の健常対照）から、２〜３ヶ月後にさらなる第３の結腸生検材料を採取した。
【０１７６】
方法
被験体の募集および結腸生検試料の採取
ＩＢＳ参加者は、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）から半径１５０マイル以内に居住している７５２例のＩＢＳ患者の管理データベースから選択し、郵送で募集した。ＩＢＳ患者はすべて、胃腸科専門医スタッフにより、内視鏡検査、生検材料および直腸排出試験を含む臨床表示試験によって既に評価済みであった。患者は、標準的なアンケート（Ｔａｌｌｅｙら、１９９０）によって研究時に確認された主な腸機能障害に基づいて選択した。健常志願者は、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮで一般広告によって募集した。参加の案内状に応募した参加者はすべて、研究のインフォームドコンセント（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認済）に署名した。各参加者は、有効腸疾患アンケート（Ｔａｌｌｅｙら、１９９０）（Ｒｏｍｅ  ＩＩ基準（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９９）に対応する質問を含む）に記入した。また、腸疾患アンケートには、非潰瘍性消化不良の特徴である身体化障害および症状を確認することを意図した心身症状のチェックリストを含め、疫学的研究に拡張して使用した。
【０１７７】
参加者は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ７）に参加して、結腸生検材料採取のための軟性Ｓ状結腸鏡検査を受けた。生検手順による出血のリスクのため、アスピリンまたは抗凝血剤を服用している参加者は、この投薬が内視鏡検査の少なくとも１週間前までに中止不可能であった場合、除外した。２つのリン酸ナトリウム塩注腸剤（Ｆｌｅｅｔ（登録商標）注腸剤、Ｃ．Ｂ  Ｆｌｅｅｔ，Ｌｙｎｃｈｂｕｒｇ，ＶＡ）を、Ｓ状結腸鏡検査の１時間前に投与した。生検材料は、外観が正常粘膜からのみ採取した。すなわち、内視鏡圧による浮腫を伴う領域は回避した。Ｓ状結腸鏡検査は、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃにおける臨床基準の場合と同様、鎮静なしで行ない、被験体を、生検後６０分間モニタリングし、任意の出血または他の合併症の徴候がなく安定であることを保証した。標準的な大型の生検用鉗子を使用し、１５例のＩＢＳ−Ｃ、２１例のＩＢＳ−Ｄ患者および２５例の健常対照から、２つのＳ状結腸粘膜生検材料を採取した。これらの被験体のうち１０例（５例の対照および５例のＩＢＳ患者）を無作為に選択し、データ再現性を評価するために、最初の採取から２〜３ヶ月後に第２のＩＲＢ承認Ｓ状結腸鏡検査を受けさせた。
【０１７８】
アレイ処理およびデータ前処理
採取時、結腸生検試料は、直ちに５容量のＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中に浸漬させ、さらなる解析まで−２０℃で保存した。組織をミキサーミル５０１（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にて、ＲＬＴ細胞溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で均質化した後、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム上でのＤＮアーゼ処理により、破砕細胞からＲＮＡ抽出を行なった。１μｇの全ＲＮＡをビオチン標識し、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ上で、供給元（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の使用説明書に従ってハイブリダイズさせた。試料数が大きいため（ｎ＝１３２）、実験室でのこの処理は、４つの異なるバッチで行ない、各々には、ＩＢＳと健常被験体の両方の試料を含めた。未処理のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐデータの遺伝子発現サマリー値を、ｇｃＲＭＡアルゴリズム（Ｗｕら  ２００４）（これは、ＧＣ親和性を考慮して、バックグラウンド調整、分位標準化および要約を行なう）を用いてコンピュータ処理した。ＰＡＮＰ（Ｗａｒｒｅｎら、２００６）を、遺伝子の非存在または存在の呼び出し検出に使用し、１つの処置群の試料の少なくとも５０％において存在が呼び出された場合は、遺伝子をフィルター処理した（ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋおよびＥｄｅｎｂｅｒｇ，２００６）。種々の試料処理バッチの効果は、標準化後の明白なままであった。この技術的変動源を、元のバッチの関数として（ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ）一元配置ＡＮＯＶＡにおいて、発現レベルをモデル設計することにより補正し、このモデルの残差を、その後のすべての解析に使用した。最後に、擬似複製（Ｈｕｒｌｂｅｒｔ  １９８４）により誤った結果が得られるのを回避するため、ＳＡＭおよびＰＡＭ解析について、複製試料の発現値を患者ごとに平均した（下記参照）。
【０１７９】
反復測定の一致の評価
同じ患者での経時的および組織空間の試料の再現性を定量するため、１０００個の最も可変的な遺伝子プローブ、ならびにＰＡＭ解析においてＩＢＳ疾患状態を予測することがわかった３２遺伝子プローブの組について、一致係数（Ｌｉｎ  １９８９）を算出した。
【０１８０】
差次的に発現された遺伝子の試験
マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を、ＩＢＳ疾患者対健常者において差次的に発現される遺伝子の特定に適用した（０．０５のＤを使用）（Ｔｕｓｈｅｒら、２００１）。また、代替法として、混合型ＡＮＯＶＡの適用（バッチおよび疾患状態は固定、患者は変量効果、ＦＤＲ補正あり（Ｓｔｏｒｅｙら、２００３））によって、より厳密な統計学的モデルを、未処理データ（すなわち、バッチ補正前のすべての生検試料処理前データ）に適用した。
【０１８１】
分類
疾患状態の予測のため、マイクロアレイ予測解析（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）（ＰＡＭ）を適用した。これは、収縮重心法（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２）を用いた最短重心分類の向上型変法である。８例のＩＢＳ患者および８例の健常被験体由来の試料を、モデル構築工程とは独立して維持し、起こり得る過剰適合がチェックされるようにモデルの予測力を評価した。
【０１８２】
階層的クラスタリング
分子署名の基礎構造を特定するため、階層的クラスタリング（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ  ８．２  ソフトウェア）を、ＰＡＭおよびＳＡＭ解析の両方で選択された１６遺伝子プローブの組に適用した。
【０１８３】
ＵＲＬ
ＳＡＭソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／で入手可能である。
【０１８４】
ＰＡＮＰソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｂｒａｎｄｅｉｓ．ｅｄｕ／〜ｄｔａｙｌｏｒ／ＰＡＮＰ／で入手可能である。
【０１８５】
結果および考察
試料解析
各結腸生検試料から調製したビオチン標識全ＲＮＡを、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）においてハイブリダイズさせた。得られた未処理データファイル（バックグラウンド調整、データの標準化および変換、ならびに技術的バッチ変動に対する補正を含む）の前処理により、各試料の遺伝子発現サマリー値のプロフィールが示された。これを、すべてのさらなる解析に使用した。
【０１８６】
任意の有用なバイオマーカに対する必要条件は、個々の被験体における遺伝子発現プロフィールの再現性である。一致係数（これは、一組の点が、どれだけ良好に同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）直線と適合しているかの指標である（Ｌｉｎ  １９８９））を、マイクロアレイ上の１，０００の最も可変的な遺伝子プローブを用いて、同じ患者の反復試料間で測定した。２つの同時に採取された試料間の一致（０．７±０．０３）および３ヶ月の間隔をあけて同じ人から採取された２つの試料間の一致（０．４１±０．０３）はともに、全体一致（０．２５±０．１２；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定；それぞれ、Ｗ＝３５１０、ｐ＜０．０００１およびＷ＝６７４４、ｐ＜０．０００１）よりも有意に高かった。ＩＢＳ患者と健常対照との間に一致の値に有意差は観察されなかった（図１Ａ）。Ｓ状結腸生検材料の全体の発現プロフィールは、２つの部位および２つの採取時点の試料で比較的安定であったため、各患者の２つの採取結腸試料の遺伝子プローブ発現レベルを、その後の解析（マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）および分類など（下記参照））のために平均した。さらに、反復採取試料のサブグループに選択したものは、元の研究群の代表とした。これを、反復試料採取する１０例の個体（５例の健常対照および５例のＩＢＳ患者）を、なんら選択基準を考慮することなく無作為に選択することにより評価した。帰納的に、スペクトルマップ解析を用いて、このサブグループの被験体がコホート全体を代表するか否か確認した。この解析のグラフ出力（６つの第１主成分の複合効果をまとめたもの）は、確かに、反復試料採取のために選択された被験体が、コホート全体を代表することを示す（図２）。
【０１８７】
次に、ＳＡＭアルゴリズム（Ｔｕｓｈｅｒら、２００１）を用いて、ＩＢＳ患者と健常対照間で差次的に発現された遺伝子に関する調査を行なった。５％偽発見率で、２５の遺伝子プローブセットがＩＢＳと健常者間で、ｑ値０．１の有意性レベルで差次的に発現されることがわかった。これらの２５の有意な（ｑ＜０．１）遺伝子プローブセットは、２０個の異なる遺伝子を示し、健常対照と比べ、ＩＢＳ患者において４個は上方調節および１６個は下方調節されていた（表１）。また、代替的な統計学的アプローチも、標準化された未処理データに適用した。これは、混合型ＡＮＯＶＡモデルであり、バッチおよび疾患状態を固定し、患者は変量効果とし、偽発見率補正を有した（Ｓｔｏｒｅｙら、２００３）。この解析により、ＳＡＭ解析と同等のｑ値を有する非常に類似した遺伝子のリストが得られた（表１）。有意に差次的に発現された遺伝子は、発現レベルの微妙な変化を反映した。該有意な遺伝子のうち数個のみが、ＩＢＳ患者と健常対照間で＞１．５倍の発現レベルの変化を有した。
【０１８８】
【表６】
2014144003.tif 000008
【０１８９】
【表７】
2014144003.tif 000009
【０１９０】
同定された２０個の有意な遺伝子の大部分が、免疫応答または細菌侵入に対する宿主の防御システムにある役割を果たしていることは注目に値する。健常対照と比べたＩＢＳ患者の結腸粘膜において差次的に発現された遺伝子の概略全体像を図３に示す。ＩＢＳ疾患者と健常者間で差次的発現を有する一部の有意な遺伝子の発現レベルのプロットを図４に示す。
【０１９１】
抗原プロセシングに影響する遺伝子の改変
ＩＢＳ患者の結腸粘膜において有意に低い発現レベルを有する少なくとも３つの遺伝子は、主要組織適合性Ｉ複合体：ＰＳＭＥ２（プロテアソームアクチベータサブユニット２、ＰＡ２８β）、ＴＡＰ２（輸送体２、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリＢ）、およびＬＲＡＰ（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）による抗原のプロセッシングおよび提示の経路に不可欠な役割を果たしている。ＰＡ２８は、クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ペプチド（Ｐｒｅｃｋｅｌら、１９９９）の抗原プロセシングを担う細胞質ゾル免疫プロテアソーム複合体の合成に不可欠である。ＴＡＰ２は、ＴＡＰ１とともに、小胞体（ＥＲ）膜内でヘテロ二量体膜貫通ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体を形成しており、これは、細胞質ゾルからＥＲへの抗原性ペプチドの送達に不可欠であり、ＥＲでは、このペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に負荷される。ＴＡＰ２は、ＴＡＰ１とは異なり、単離において非常に不安定であり、機能性ＴＡＰの生合成は、新たに合成されたＴＡＰ２による既存のＴＡＰ１の合成に依存するが、逆はそうではなく、これは、主に、ＴＡＰ２発現によって活性輸送体分子の数が調節されることを示す（Ｋｅｕｓｅｋｏｔｔｅｎら、２００６）。ＥＲでは、ＭＨＣクラスＩ分子は、前駆体を抗原性ペプチドにトリミングするアミノペプチダーゼに依存している。ＬＲＡＰ（ＥＲアミノペプチダーゼ２（ＥＲＡＰ２）とも称される）は、タンパク質またはペプチド基質のＮ末端アミノ酸の加水分解を担う重要な酵素の１つである（Ｓａｖｅａｎｕら、２００５）。総合すると、ＩＢＳ患者の結腸粘膜におけるＰＳＭＥ２、ＴＡＰ２およびＬＲＡＰの有意に低い発現レベルは、ＭＨＣクラスＩ抗原提示における機能的活性が、これらの患者においてモジュレートされていることを強く示す。
【０１９２】
免疫応答を制御する遺伝子の改変
また、本発明者らの研究において、他の６個の有意に改変された遺伝子：ＶＳＩＧ２、ＶＳＩＧ４、ＦＣＧＲ２Ａ、ＭＳ４Ａ４Ａ、Ｍ１６０およびＭＵＣ２０が免疫応答に関与している（それぞれのｑ値については表１を参照）。Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有タンパク質ファミリ（ＶＳＩＧ）の構成員であるＶＳ１Ｇ４の発現は減少しているが、別の近縁ファミリ構成員であるＶＳＩＧ２の発現は、これらの被験体の結腸粘膜において高くなっている。ＩＢＳ患者におけるＶＳＩＧ４およびＶＳＩＧ２の遺伝子発現の同時に起こるが反対の改変の意義は、これらの遺伝子の機能に関する最近の知見を考慮すると非常に興味深い。ＶＳＩＧファミリの構成員すべての機能的役割は、まだ充分研究されていないが、ＶＳＩＧ４は、食作用および／または抗原提示によって媒介される免疫応答の調節に重要と思われる（Ｋｉｍら、２００５）。別の有意な遺伝子改変は、ＩＢＳ患者の結腸においてモジュレートされた免疫応答システムのさらなる証拠が、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２）であることを示し、これは、免疫グロブリンＦｃ受容体をコードしている。この受容体は、循環系から抗原抗体複合体を除去することによる外来抗原に対する生物体の防御に不可欠である。Ｆｃ受容体は、単球、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびにＴおよびＢリンパ球上に存在しており、免疫複合体の食作用およびＢ細胞による抗体産生のモジュレーションに関与している（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ  ＪＣ，１９８９）。また、ＭＳ４Ａ４ＡおよびＣＤ１６３分子様１（Ｍ１６０）の発現もＩＢＳ患者において低い。ＭＳ４Ａ４Ａは、別の免疫グロブリン受容体のβサブユニットホモログであり、ＣＤ１６３分子様１（Ｍ１６０）は、スカベンジャー受容体システイン高含有スーパーファミリの膜アンカー型構成員であり、主に、免疫系と関連する細胞において発現される。
【０１９３】
局部防御機構に関与している遺伝子の改変
他方において、細胞表面結合ムチン２０タンパク質（ＭＵＣ２０にコードされている）の発現は、ＩＢＳ患者において上昇している。この遺伝子は、主に腎臓で発現されることが知られており、発現の上昇は、ＩｇＡ腎症患者ならびに数例の腎臓障害モデルの近位尿細管由来の上皮細胞において報告されている（Ｈｉｇｕｃｈｉら、２００４）。さらに、炎症誘発性物質、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）または腫瘍壊死因子αなどで尿細管上皮細胞株を刺激すると、ＭＵＣ２０  ｍＲＮＡ発現が有意に増大する。ＩＢＳ患者の結腸粘膜に見られるＭＵＣ２０発現の上昇は、局部の損傷または炎症に対する応答を反映しているかもしれない。
【０１９４】
病原体に対する宿主の防御応答に関与している遺伝子の改変
少なくとも４個の差次的に発現された遺伝子（ＬＹＺ、ＣＡＳＰ１、ＣＯＰ１、ＮＣＦ４）（表１）は、結腸において病原体に対する宿主の防御応答に関与している。抗菌因子リゾチーム（ＬＹＺ）（その天然基質は、細菌細胞壁のペプチドグリカンである）の発現レベルはＩＢＳ患者において有意に低く、これは、ＩＢＳ患者の結腸における先天性免疫の障害の生物学的根拠が存在し得ることを示す。この機能は、さらなる研究を必要とする。パネート細胞は、小腸粘膜の分泌性上皮細胞であり、リゾチームを含む抗菌性のペプチドの主な供給源である。また、この抗菌性防御物質は、ほとんどの場合は粘膜の先天性免疫応答機構として、パネート細胞の化生によって結腸内の炎症部位に漸増され得る（Ｗｅｈｋａｍｐら、２００６）。結腸の粘膜の先天性免疫システムがＩＢＳ患者において冒されているか否かには、さらなる研究が必要とされる。炎症誘発性サイトカイン、例えば、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）などは、抗菌的防御システムの重要な成分である。ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γ刺激因子であり、さまざまなグラム陽性およびグラム陰性菌病原体に対する防御に重要な役割を果たしている。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の合成は、システインプロテアーゼカスパーゼ１（ＣＡＳＰ１）（インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）変換酵素としても知られる）によるその前駆体タンパク質（プロ−ＩＬ−１βおよびプロ−ＩＬ−１８）のタンパク質分解的切断に依存する。実際、カスパーゼ−１欠損マウスは、ＩＬ−１８およびＩＬ−１βのインビボ産生に大きな欠陥を有し、これは、致死用量の内毒素／ＬＰＳに対する抵抗性によって行なわれる（Ｌｉら、１９９５）。このマウスはまた、先天性の宿主防御機構の機能不全のため、野生型マウスよりも致死的大腸菌感染に対する感受性が２〜３倍高い（Ｊｏｓｈｉら、２００２）。カスパーゼ−１ドミナントネガティブ阻害薬（ＣＯＰ１）（偽ＩＣＥとしても知られる）は、カスパーゼ−１と物理的に相互作用してその活性化をブロックし、したがってＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の分泌をブロックする。
【０１９５】
ＣＡＳＰ１およびＣＯＰ１の発現はともに、ＩＢＳ患者の結腸粘膜において減少している。ＣＡＳＰ１とＣＯＰ１の遺伝子は、染色体ＩＩｑ上で隣接しており、両遺伝子は、その同一の組織分布に基づき、類似した転写調節下にあることが示唆されている（Ｄｒｕｉｌｈｅら、２００１）。しかしながら、ＣＡＳＰ１およびＣＯＰ１のｍＲＮＡ発現の改変の、そのタンパク質の発現レベルならびにその後のＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生に対する効果は不明である。本発明者らの研究集団の試料では、ＩＬ−１βは差次的に発現されなかったが、直腸粘膜でのＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現の増大が、後天性感染後ＩＢＳ患者において、最近報告されている（Ｇｗｅｅら、２００３）。
【０１９６】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体は、最初に、食細胞において同定および特徴付けされ、該細胞で、酸素とＮＡＤＰＨからのスーパーオキシドの酸化的バーストの生成を触媒することにより、微生物生物体に対する非特異的宿主防御に不可欠な役割を果たしている。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの構造は、２つの膜結合要素（ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘ、それぞれ、ＣＹＢＢおよびＣＹＢＡにコードされている）、３つの細胞質ゾル成分（ｐ６７ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ４０ｐｈｏｘ、それぞれ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ１およびＮＣＦ４にコードされている）、ならびに低分子量Ｇタンパク質（ｒａｃ１またはｒａｃ２のいずれか、ＲＡＣ１およびＲＡＣ２にコードされている）からなる。該酵素複合体の活性化は、細胞膜への細胞質ゾル成分の移動と関連しており、そのため、完全なオキシダーゼが合成され得る（ＤｅＣｏｕｒｓｅｙおよびＬｉｇｅｔｉ，２００５）。したがって、ＩＢＳ患者の結腸粘膜におけるＮＣＦ１とＮＣＦ４の低発現により、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体の膜結合要素に輸送される細胞質ゾル成分の不足が引き起こされ得、食細胞発現型ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性の減衰がもたらされ得る。該オキシダーゼの不可欠な触媒性コアであるｇｐ９１ｐｈｏｘ（最近では、Ｎｏｘ２とも称される）は、いくつかの非常に類似したオキシダーゼからなるファミリに属する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体のホモログは、数多くの非食細胞の細胞型で同定されており、例えば、結腸の表面粘膜上皮細胞で主に発現されるＮｏｘ１酵素複合体が挙げられる（Ｋｉｋｕｃｈｉら、２０００）。種々の酵素複合体ホモログは、そのサブユニットの組成に基づいて、分子レベルで識別され得る。食細胞において発現されるＮｏｘ２複合体と比較すると、Ｎｏｘ１複合体はｐ２２ｐｈｏｘ（ＣＹＢＡ）サブユニットを共有しているが、ｇｐ９１ｐｈｏｘ（ＣＹＢＢ）、ｐ４７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ１）およびｐ４０ｐｈｏｘ（ＮＣＦ４）サブユニットは、それぞれ、ＮＯＸ１、ＮＯＸＯ１およびＮＯＸＡ１に置き換えられている。興味深いことに、ＩＢＳ患者の少なくともサブセットの結腸粘膜におけるＮＯＸ１発現の上昇のボーダーラインは、マイクロアレイ上のいくつかのＮＯＸ１プローブセットで見られた（２０６４１８＿ａｔ；２０７２１７＿ｓ＿ａｔ；２１０８０８＿ｓ＿ａｔ）。ヒト結腸上皮細胞は、ＩＦＮ−γ（Ｋｕｗａｎｏら、２００６）およびサルモネラ・エンテリティディス由来のフラゲリン（Ｋａｗａｈａｒａら、２００４）に応答してＮｏｘ１発現を誘導し、スーパーオキシド産生を上方調節することが示された。ヘリコバクターピロリのリポ多糖は、ヒトの胃粘膜において持続性の炎症およびＴｈ１免疫応答の増強を引き起こすことが知られており、これはまた、モルモットの胃粘膜細胞においてＮＯＸ１とＮＯＸＯ１のｍＲＮＡ発現を刺激した後、スーパーオキシドの生成を上方調節する（Ｋｕｓｕｍｏｔｏら、２００５）。ＮＯＸ／ＤＵＯＸオキシダーゼ遺伝子ファミリの別の構成員は、デュアルオキシダーゼ（ｄｕａｌｏｘｉｄａｓｅ）２（ＤＵＯＸ２）であり、これは、消化管全体において発現され、最大レベルは、盲腸とＳ状結腸の粘膜表面上皮細胞において見られる���Ｅｌ  Ｈａｓｓａｎｉら、２００５）。また、ＤＵＯＸ２のｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＢＳ患者のＳ状結腸粘膜生検材料において高度に増大していることがわかった  （ＤＵＯＸ１はそうではなかった）（２１９７２７＿ａｔ，ｑ＝０．１５，３．８倍増大、これは、すべての遺伝子で最も大きな変化倍数である）。ＤＵＯＸ２は（ＤＵＯＸ１とは対照的に）、構成的ではなく誘導的に発現されるデュアルオキシダーゼと考えられているため、およびＤＵＯＸ２は、感染または炎症時に、ロバストな自己限定的な応答をもたらすため（Ｈａｒｐｅｒら、２００５）、この所見は、いくぶん驚くべきことかもしれない。デュアルオキシダーゼは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼドメイン（Ｈ２Ｏ２生成を担う）とヘムペルオキシダーゼドメイン（これは、ミエロペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼなどのいくつかのペルオキシダーゼと近縁種である）の両方を含む。これらのオキシダーゼは、宿主の防御機構に不可欠な役割を有するスーパーオキシドおよびＨ２Ｏ２などの反応性酸素種（ＲＯＳ）の上皮での供給源を提供する（Ｇｅｉｓｚｔら、２００３；Ｅｌ  Ｈａｓｓａｎｉら、２００５）。ＩＦＮ−γなどの炎症誘発性刺激はＤＵＯＸ２の発現を誘導し、Ｈ２Ｏ２生成の上昇をもたらす（Ｈａｒｐｅｒら、２００５）。腸免疫性におけるデュアルオキシダーゼの直接的な役割は、ショウジョウバエにおいて示された。デュアルオキシダーゼ発現がサイレント化された成虫のハエは、微生物汚染食物の摂取による軽微な感染後であっても、死亡率の著しい増大を示した。この効果はデュアルオキシダーゼの再導入によって逆転され得、これは、該酵素によって、腸内での微生物の増殖を制限する上皮での特殊な酸化的バーストが生じることを示す（Ｈａら、２００５）。ＤＵＯＸ２発現の上昇は、ＩＢＳ患者の結腸における軽度だが慢性的な炎症状態の存在を示すと考えられる。総合すると、ＩＢＳ患者の結腸における多サブユニットＮＡＤＰＨオキシダーゼ／デュアルオキシダーゼ酵素複合体のいくつかの構成員の発現の改変は、結腸内への細菌および他の侵入物質に対する宿主の防御応答がＩＢＳ患者において撹乱されているという仮説のさらなる裏づけを示す。
【０１９７】
過敏性腸症候群における新規遺伝子の上方調節
最後に、ＩＢＳ患者の結腸粘膜生検材料において、最も有意に上方調節されたプローブセットの２つ（図５Ａ）は、公の配列データベースにＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３  （ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅｌＤ：２５８４９）とアノテーションされたものと同じ遺伝子を示す。この遺伝子は、本明細書ではＩＢＳ１（過敏性腸症候群１）と名称変更している。インシリコ解析では、ＩＢＳ１の５ｋｂのｃＤＮＡ配列が、９３０ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示されており、これは、シグナルペプチド（２０ＡＡ）、細胞外領域（２３８ＡＡ）、膜貫通領域（２１ＡＡ）、および細胞内領域（３１ＡＡ）を含む３１０アミノ酸（ＡＡ）の予測原形質膜タンパク質をコードしている。
【０１９８】
ＩＢＳ１遺伝子のマウスホモログは、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ９１３０２１３Ｂ０５として知られており、細胞表面の糖タンパク質前駆体としてさらにアノテーションされている。ラットでは、ＩＢＳ１ホモログは、去勢すると前立腺腹部で上方調節され、アポトーシスと関連する遺伝子と確認され、したがって、Ｃｉｐａｒ−１（去勢誘導型前立腺アポトーシス関連タンパク質１）またはＰＡＲＭ−１（前立腺アンドロゲン抑制メッセージ１）とアノテーションされた（Ｂｒｕｙｎｉｎｘら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１４０：４７８９−４７９９；Ｃｏｒｎｅｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２００３，５６：２２０−２３０）。
【０１９９】
ヒトＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子に関する文献は、ＰｕｂＭｅｄにおいてまだ入手可能ではないが、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）には、炎症および免疫応答における役割を指摘するヒトＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子の発現の有意な改変に関するマイクロアレイ実験データが含まれている。第１の研究では、種々の組織に由来する一次ヒト内皮細胞が、炎症性および免疫サイトカインでチャレンジされた。ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３の発現は、ＴＮＦαに曝露すると、ＩＦＮγまたはＩＬ−４への曝露と比べて一次結腸内皮細胞において増大した（図６Ａ）。後者の２つは、主にＴヘルパー細胞サブセットと関連しているが、ＴＮＦαは、炎症性応答と免疫学的応答の両方において重要な機能を有する多面発現性のサイトカインである。結腸内皮細胞に関するこれらのデータは、大規模な研究の一部を構成しているにすぎないため、このような実験に関する刊行物には、ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３に関する結果が含まれておらず、むしろ、周知の遺伝子に重点が置かれている（Ｓａｎａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００５；２９：２５６−２６９）。
【０２００】
第２の研究では、遺伝子発現が、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来のＮｅｆタンパク質の誘導後のジャーカットＣＤ４＋Ｔ細胞において評価された（Ｎｄｏｌｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６；３５３：３７４−３８７）。Ｎｅｆタンパク質は、ＳＩＶ（およびＨＩＶ）感染症の初期に発現され、細胞表面の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子を下方調節し、それにより、免疫回避（ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ）が助長される。マイクロアレイ実験は、充分特徴付けされた多くの遺伝子の中で、特にＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子の発現は、ＳＩＶ−Ｎｅｆによって上方調節されることを示す（図６Ｂ）。
【０２０１】
文献のこれらの２つの後者の研究は、対照と比べたＩＢＳ患者の結腸における免疫応答の改変を示す本発明者らの結果と、概念的には一致している。免疫応答に対する効果によるＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３遺伝子とＩＢＳとの生物学的関連の仮説には、さらなる機能的特性評価が必要とされる。
【０２０２】
該遺伝子は、主に結腸と胎盤で発現されるが、多くの他の組織でも見られる。ヒト、マウスおよびラットホモログのアミノ酸配列アラインメントにより、膜貫通領域と細胞内領域において、高度に保存された配列が示されている（これらの領域での３種間のアミノ酸配列同一性は、それぞれ９５％および９４％）が、細胞外領域における相同性は低い（５１％ＡＡ配列同一性）（図５Ｃ）。
【０２０３】
ＩＢＳ１の機能的役割に関して現在わかっている情報がないため、ＩＢＳ患者の結腸における発現レベルの増大の結果は不明である。しかしながら、マイクロアレイ上に２つの独立した遺伝子プローブセットにより、この遺伝子が、２つの独立した解析（ＳＡＭおよび混合型ＡＮＯＶＡ）の中で最も有意であると確認されたこと、およびこれらの２つのプローブセット単独に基づいて、ＩＢＳと健常の比較的良好な識別が可能であること（図７、図５Ｂ）は注目に値する。
【０２０４】
差次的に発現される遺伝子がＩＢＳの原因か否か、そうではなくＩＢＳの結果であるか否かは不明である。ＩＢＳは、おそらく複雑な多因子性障害であるため、多くの遺伝子が関与している可能性があるが、各々の表現型全体に対する寄与は比較的少ない。主に、ＩＢＳ患者の結腸粘膜における多くの遺伝子の発現の微妙な変化を示す本発明者らの結果は、この概念を裏付けている。特定の遺伝子の発現の改変は、場合によっては、ＩＢＳ患者のサブセットのみで観察される。これは、表現型は共通するが原因となる分子的機序が不均一であることを反映している可能性がある。発現に有意な変化を有する遺伝子のほとんどは、管腔内抗原もしくは細菌の侵入またはその炎症誘発性効果に対する宿主の応答に関与する類似した機能的細胞プロセスに関与している。同定された遺伝子におけるこの機構特異性の程度を考慮すると、この２つの適用した統計学的方法論を用いて偶然取り出したとき、これらが偽陽性関係を示すことは、起こりにくいと考えられる。
【０２０５】
粘膜遺伝子発現プロファイリングに基づいたＩＢＳの分子診断の可能性
その臨床的関連性のため、続いて、Ｓ状結腸発現プロフィールに基づいたＩＢＳの分子診断の予測力を評価した。したがって、６１例の被験体を訓練組と試験組に無作為に分けた。訓練組（ｎ＝４５）は、１７例の健常被験体と２８例のＩＢＳ患者（１６例のＩＢＳ−Ｄ、１２例のＩＢＳ−Ｃ）で構成し、試験組（ｎ＝１６）は、残りの８例の健常対照と８例のＩＢＳ患者（５例のＩＢＳ−Ｄ、３例のＩＢＳ−Ｃ）で構成した。続いて、過剰適合に対してかなりロバストであるため、多くの測定値および比較的少数の試料でのデータセットにおいて良好に実施されることが示された２つの異なる独立した分類解析方法を適用した。まず、有効組に対してマイクロアレイの予測解析（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）（ＰＡＭ）（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２）を使用し、３２遺伝子プローブセット署名を得（図８）、平均クロスバリテーション誤分類率は２２％であった（健常およびＩＢＳ被験体について、それぞれ、１３／１７例および２２／２８例が正しく分類された）。この分子署名を試験組の独立した試料に対して使用すると、ＰＡＭにより参加者の７５％の疾患状態が正しく予測され、疾患者と健常者で等しく正確に予測された。誤分類率が訓練組（２２％）と試験組（２５％）で同様であったため、過剰適合は問題ではないようであった。
【０２０６】
３２遺伝子プローブセットの分子署名をさらに有効にするため、再現性を測定した。すると、分子署名は、同じ患者の同時に採取された試料の反復試料間（一致０．７６±０．０５）、および２〜３ヶ月の間隔をあけて採取された２つの試料間（一致０．６７±０．０４）で、高度に再生可能であった。患者では、一致は、参加者間の全体の一致よりも有意に高かった（一致−０．０２±０．０２；不等分散でのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定；それぞれ、Ｗ＝３９３８、ｐ＜０．０００１およびＷ＝７６８３、ｐ＜０．０００１）（図１Ｂ）。
【０２０７】
最後に、ＰＡＭおよび訓練組のみの試料に対して行なったＳＡＭ解析で共通して同定された遺伝子プローブの選択により、分子署名のプローブ数をさらに少なくすることを試みた。得られた１６プローブの組は１１個の異なる遺伝子を表しており、次いで、これを、研究の６１例すべての被験体（すなわち、訓練組と試験組の両方）を含めた教師なし分類法、すなわち階層的クラスタリングに使用した。このクラスタリング方法により、一方では、一緒になった種々の被験体から類似した遺伝子発現プロフィールを有する遺伝子プローブが分類され、他方ではまた、類似性の尺度として平均連鎖と相関性を使用し、クラスタ階層に一緒になった１６遺伝子プローブから類似した発現プロフィールを有する結腸試料が分類される（図９Ａ）。遺伝子プローブ（Ｘ軸）の階層の第１レベルでは、ＩＢＳ患者と健常対照との比較において、上方調節または下方調節された遺伝子プローブセット間で明白な識別が行なわれた。被験体（Ｙ軸）の階層の第１レベルでは、ＩＢＳ患者のサブセットが、他のすべての被験体と分離され、これは、Ｆ１３Ａ１、ＮＣＦ４、Ｍ１６０、ＣＳＦ１Ｒおよび／またはＦＣＧＲ２Ａの低発現レベルによって強く決定されるようである。第２の階層的クラスタリングレベルでは、主に、ＩＢＳ患者群と健常個体群に対応するさらに２つの群が分離される。分類のための遺伝子プローブセットを選択するのに使用した訓練組の試料について予測され得るように、良好な分離が観察された（健常被験体およびＩＢＳ患者で、それぞれ、１４／１７例および２５／２８例が正しく分類された）。全体的に、試験組被験体では、１６例のうち１１例が正しく分類され（６９％）、上記のＰＡＭ解析の結果と一致する。陽性予測値（すなわち、分子署名を有する人が実際にＩＢＳ患者である確率：６／８）は７５％であり、一方、陰性予測値（すなわち、分子署名を持たない人がＩＢＳ患者でない確率：５／８）は６３％であった。さらなる研究により、予測値、感度および特異性をより正確に測定することが可能であるが、結腸粘膜におけるこれらの分子署名が、ＩＢＳ患者の大部分に対して特定力を有することは、既に明白である。この知見は、共通の分子署名に基づいてＩＢＳ患者の特定のサブグループが規定され、したがってより個別化された医療への道が開かれる可能性を示す。結腸粘膜生検材料における分子署名の評価により、医師が、ＩＢＳの診断、および個々の患者に対する最も有益な治療戦略を決定するのを補助するための新たな補足的ツールが提供される。
【０２０８】
結果に対する性別または薬物処置の影響の可能性は、考慮されるべきである。コホートにおける性別と薬物処置の分布のグラフ表示が図９Ｂに挙げられており、これは、このような潜在的交絡因子による分類解析に対する潜在的影響は、あったとしてもわずかであったであろうことを示す。これは、署名遺伝子の組を用いたさらなる混合型ＡＮＯＶＡ解析によって確認された。以下のことがわかった。
【０２０９】
ａ．投与薬物は、これらの遺伝子の発現レベルに影響しなかった（投与薬物の影響の試験では、すべてｑ＞０．７）
ｂ．投与薬物と疾患との間に相互作用はなく、これは、該遺伝子発現が疾患状態に応じた投与薬物（すなわち、健常とＩＢＳ）に影響されなかったことを示す（投与薬物と疾患状態との間の相互作用の試験では、すべてｑ＞０．１）
ｃ．性別は、これらの署名遺伝子の発現レベル（投与薬物の影響の試験では、すべてｑ＞０．９）または健常者とＩＢＳ患者間の差（性別と疾患状態との間の相互作用の試験では、すべてｑ＞０．９）に影響しなかった
独立した手法、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＱ−ＰＣＲ）によるマイクロアレイ解析で見られた遺伝子発現の変化の確認データ
マイクロアレイデータ解析で同定された１２個の遺伝子を、有効蛍光発生ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ−オン−デマンド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による確認解析のために選択した。ＴａｑＭａｎアッセイの結果の標準化を対照ＳＡＲＴ１遺伝子に対して行なった。それは、この遺伝子が、早くに安定であることがわかっていたため、また結腸試料において適度に発現される（Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ  Ｍら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７）ためである。全体的に、ＩＢＳ患者と健常被験体間で発現レベルの変化倍数を比較すると、データは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイとＴａｑＭａｎ間でデータの実質的な一致を示す（図１０）。ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子を除く、解析した１２個の遺伝子のうち１１個が、健常被験体と比べて、ＩＢＳにおいて発現の上方調節または下方調節という同じ傾向を示した。ＩＢＳと健常被験体間の有意差（ｐ＜０．０５）は、１２個の遺伝子のうち６個において確認され、これらは、変化倍数の値が最も大きい遺伝子であった。この有意性レベルは、変化倍数の差がより微妙な遺伝子では得られなかった。これは、ＴａｑＭａｎ法では、遺伝子発現データを単一の参照遺伝子（本発明者らのアッセイではＳＡＲＴ１）に対してのみ標準化しているが、マイクロアレイ法では、マイクロアレイ上の他のすべての遺伝子に対して個々の各遺伝子の発現レベルを標準化することが可能であることによって、一部説明され得る。これは、ＳＡＲＴ１遺伝子の遺伝子発現変動が比較的少ない場合であっても、ＲＴＱ−ＰＣＲ手法を使用すると、目的遺伝子の標準化された発現レベルにノイズ（および変動）が導入されることを意味する。したがって、ＴａｑＭａｎ手法は、マイクロアレイと比べて感度に関していくつかの利点を有する（すなわち、マイクロアレイ手法では解析が不可能であり得る低発現の遺伝子が、ＲＴＱ−ＰＣＲを用いて解析され得る）が、ＴａｑＭａｎアッセイではマイクロアレイ解析と比べて、比較的大きな群内変動がしばしば見られることは明白である。
【０２１０】
まとめると、ＴａｑＭａｎアッセイで得られたデータにより、個々の遺伝子の変化倍数レベルに関するマイクロアレイデータの大部分が確認される。
【０２１１】
結論として、いくつかの差次的に発現される遺伝子が、ＩＢＳ患者の結腸粘膜に見られる。これらの遺伝子の多くは、宿主の防御機構の変化に関する。宿主の防御機構に関与しているタンパク質、または差次的に発現される遺伝子にコードされたタンパク質は、ＩＢＳのための新規薬物の開発のための潜在標的となり得る。ＩＢＳ患者において発現が上昇している最も有意な遺伝子は、機能が不明である充分に特徴付けされていない膜タンパク質（ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０８２３）をコードするものであり、これに対して、名称ＩＢＳ１を提案する。限定的な遺伝子の組に基づいた結腸における遺伝子発現の分子署名により、ＩＢＳ疾患状態が予測され得る。このような遺伝子発現プロフィールは数ヶ月にわたって安定であり、これは、分子署名によってＩＢＳの診断が改善され、治療有効性がモニタリングされる可能性を示す。少なくとも、ＩＢＳ患者におけるこのような生物学的な差は、結腸に客観的な差があること、および該疾患が、中枢神経系の知覚の障害のみを示すのではないことを示す。
【図４】
2014144003.tif 000010
【図５−１】
2014144003.tif 000011
【図７】
2014144003.tif 000012
【図８】
2014144003.tif 000013
【図１０】
2014144003.tif 000014
【図１−１】
2014144003.tif 000015
【図１−２】
2014144003.tif 000016
【図２】
2014144003.tif 000017
【図３】
2014144003.tif 000018
【図５−２】
2014144003.tif 000019
【図６】
2014144003.tif 000020
【図９−１】
2014144003.tif 000021
【図９−２】
2014144003.tif 000022
【配列表】
2014144003000001.app