(57)【要約】【課題】  ハイスループットシークエンサーを駆使し、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ；
を含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、及びＨＬＡ−ＤＰＢ１から選択される少なくとも２種の遺伝子であり、前記プライマーセットが、当該少なくとも２種の遺伝子に対応するプライマーセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが、配列番号１〜３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ａ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｂ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｃ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２（ＤＲ１５）型又はＤＲ２（ＤＲ１６）型を含み、前記プライマーセットが配列番号：９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型、ＤＲ５（ＤＲ１１）型、（ＤＲ１２）型、ＤＲ６（ＤＲ１３）型（ＤＲ１４）型又はＤＲ８を含み、前記プライマーセットが配列番号：１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４及び１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１６及び１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１８及び１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２０及び２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２２、２３、２４、２５及び２６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２７、２８及び２９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：３０及び３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲの温度条件が、９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６８度で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返し、その後、９８度で１０秒間、６５度で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返す条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号：１〜３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプライマーセット及び特定のＤＮＡポリメラーゼを含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイスループットＤＮＡシークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子の超高解像度マルチプレックスＤＮＡタイピング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱ，ＨＬＡ−ＤＰ）である。
【０００３】
ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ抗原のα鎖はＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ−ＤＲＢ１，ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ−ＤＲＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
【０００４】
ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ−ＤＲＡ，ＨＬＡ−ＤＲＢ１，ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１，ＨＬＡ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
【０００５】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一ハプロタイプ上にＨＬＡ−ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一ハプロタイプ上にＨＬＡ−ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ−ＤＲＢ１以外のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は位置しない（図１）。
【０００６】
各ＨＬＡ遺伝子のエクソンには複数の多型性に富む領域（多型領域）が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡアリル）に共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が複数のアリルに共通であることもある。
【０００７】
ＨＬＡには高度な多型が存在するためＨＬＡアリルの種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である（図２）。
【０００８】
骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡ型（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）が４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度の移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
【０００９】
ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各ＨＬＡ遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
【００１０】
例えば、特許文献１に記載された方法では、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ条件が同一でないことから、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲを独立的に実施しなければならず、操作の迅速化及び簡便化につながるものではなかった。
本発明者等は、ＨＬＡの各遺伝子座の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットを用いることにより、フェーズ・アンビギュイティのない高精度のタイピングが可能な方法を提案した（特許文献２及び非特許文献２）。しかしながら、当該方法においても各遺伝子に用いるＰＣＲ条件が完全には統一されておらず、全ての遺伝子座のＰＣＲを同時に実施するマルチプレックス法には至っていなかった。
さらに、ＰＣＲの迅速化が期待されるＰＣＲの際の温度の上昇や下降に必要な時間を大幅に短縮させた高速ＰＣＲ装置については検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１１−２１６０００号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／０１１７３４号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｉｎｄ  Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３−１０４２頁（２０１０年）
【非特許文献２】Ｓｈｉｉｎａ  Ｔ．等、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、第８０巻、３０５−３１６頁（２０１２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、新規に遺伝子特定的プライマーを設計したＨＬＡ−ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５を含む各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ条件（アニーリング温度）を同一にし、その条件に基づいて各ＨＬＡ遺伝子を同時に同一容器内でＰＣＲ増幅できるマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、さらには、当該方法を高速ＰＣＲ装置に適用した場合のマルチプレックスＰＣＲ法の条件（伸長反応に必要な時間）を設定することにより、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除し、かつ迅速化及び簡便化を達成できる超高解像度ＤＮＡタイピング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、各ＨＬＡ遺伝子に用いるプライマーを再設計し、使用するＤＮＡポリメラーゼを選択することにより、ＨＬＡ遺伝子の種類によらず同一の条件でＰＣＲすることが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、特にＨＬＡクラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡクラスＩＩ抗原であるＨＬＡ−ＤＲＢ１，ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に、かつ同一のアニーリング温度で増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計すること、本ＤＮＡタイピング方法に好適なＤＮＡポリメラーゼを選択すること、その酵素を使用した場合に１台のＰＣＲ装置で１度にすべてのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定すること、その条件に基づいたＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、さらには、高速ＰＣＲ装置を用いた場合のマルチプレックスＰＣＲ法の伸長反応に必要な時間を設定すること、ハイスループットシークエンシング技術を駆使することにより、上記従来技術の課題を解決した発明である。
【００１７】
本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係不明なフェーズ・アンビギュイティの認められない究極のＤＮＡタイピング法であり、例えば、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、発現が抑制されるｎｕｌｌアリルや新規アリルの検出が可能となる。
本発明では、１台のＰＣＲ装置で１度に複数から全てのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定したことから、操作上の迅速化及び簡便化が実現される。
本発明では、複数のＨＬＡ遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ法を提供することから、移植希望者とドナー候補との間のＨＬＡ型の更に高精度かつ迅速なＨＬＡタイピングが実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。
【図２】ＨＬＡアリルの分類法を示す図である。ＩＭＧＴ−ＨＬＡデータベース（www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から引用した。
【図３】（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。
【図４】各ＨＬＡ遺伝子の構造を示す模式図である。
【図５】（ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁〜第４７頁から引用した。
【図６】試験例１で増幅したＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図７】実施例１で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図８】実施例２で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図９】実施例３で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図１０】実施例４で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図１１】実施例５で増幅したＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，  ＨＬＡ−Ｃ，  ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図１２】実施例５で増幅したＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，  ＨＬＡ−Ｃ，  ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ産物をバイオアナライザーによりＰＣＲ産物の長さを測定した結果を示す図である。
【図１３】比較例１で増幅したＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，  ＨＬＡ−Ｃ，  ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図１４】比較例１で増幅したＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，  ＨＬＡ−Ｃ，  ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ産物をバイオアナライザーによりＰＣＲ産物の長さを測定した結果を示す図（上図）及びその電気泳動像を示す図（下図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１及びＨＬＡ−ＤＰＡ１の各遺伝子の上流領域から下流領域、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２及びエクソン２から３’側の非翻訳領域ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５のエクソン２から３’側の非翻訳領域を網羅的にＰＣＲさせるためのプライマーセットであって、同一条件でのアニーリングが可能なプライマーセットを準備する。
ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ抗原）の構造との関連も知られている（図３と図５参照）。
【００２０】
即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ抗原を規定するＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃの遺伝子は８個のエクソンを含んでおり（図３（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があり発現が調節されている（図３（ｂ））。
さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したような問題が生じていた（図４）。
また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ抗原を規定するＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図５（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図５（ｂ））。
さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したような問題が生じていた（図４）。
【００２１】
本発明では、古典的クラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲＢ１，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１，ＨＬＡ-ＤＰＢ１）の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）及びＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５のエクソン２から３’側の非翻訳領域をＰＣＲできるプライマーセットを調製し、それを用いて増幅したＰＣＲ産物を後述するハイスループットシークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ｎｕｌｌアリルの有無も正確に検知することができる。
【００２２】
具体的には、下記表１〜表３に掲げるＰＣＲプライマーセットのうち、少なくとも２種の遺伝子に対応するプライマーセットを調製する。
少なくとも２種の遺伝子とは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、及びＨＬＡ−ＤＰＢ１から選択される少なくとも２種の遺伝子を意味し、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、及びＨＬＡ−ＤＰＢ１から選択される２種、３種、４種、５種、６種及び７種の全ての組み合わせ、並びに８種全ての遺伝子の組み合わせを包む。
各遺伝子に対応するプライマーセットについては以下に述べる。
【００２３】
表１における配列番号１〜３は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２４】
配列番号１と２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８３番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９１４，９２５番目から第２９，９１４，９５４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
【００２５】
表１における配列番号４と５は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２６】
配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２５，７９６番目から第３１，３２５，８２４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２１，２１０番目から第３１，３２１，２３５番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，６００塩基（ｂｐ）である。
【００２７】
表１における配列番号６〜８は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２８】
配列番号６と７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２３６，０７５番目から第３１，２３６，１１４番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，８００塩基（ｂｐ）である。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表２における配列番号９と１０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲ１５）、ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲ１６）サブタイプを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３１】
配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３０番目から第３２，５５２，１５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，６００塩基（ｂｐ）である。
【００３２】
表２における配列番号１１と１２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ５（ＤＲ１１）、ＨＬＡ−ＤＲ５（ＤＲ１２）、ＨＬＡ−ＤＲ６（ＤＲ１３）、ＨＬＡ−ＤＲ６（ＤＲ１４）、ＨＬＡ−ＤＲ８サブタイプを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３３】
配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０８番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，６００塩基（ｂｐ）である。
【００３４】
表２における配列番号１３〜１５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３５】
配列番号１３と１４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第３，９３９，３５６番目から第３，９３９，３７９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第３，９３４，１８７番目から第３，９３４，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
【００３６】
表２における配列番号１６と１７は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｍｎ＿ｈａｐ４）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３７】
配列番号１６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第３，８５１，２７０番目から第３，８５１，２９３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第３，８４６，１０８番目から第３，８４６，１２８番目の塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
【００３８】
表２における配列番号１８と１９は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３９】
配列番号１８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，４８９，９３３番目から第３２，４８９，９５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，４８５，２５６番目から第３２，４８５，２７６番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，７００塩基（ｂｐ）である。
【００４０】
【表２】
2014217332.tif 000004
【００４１】
表３における配列番号２０と２１は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４２】
配列番号２０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，４６５番目から第３２，６０４，４８８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，９３６番目から第３２，６１１，９６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，５００塩基（ｂｐ）である。
【００４３】
表３における配列番号２２〜２６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４４】
配列番号２２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２７，４０６番目から第３２，６２７，４３３番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２３と２５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６４３番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２４と２６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６４０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，２００塩基（ｂｐ）である。
【００４５】
表３における配列番号２７〜２９は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４６】
配列番号２７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，６００番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号２８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，５９８番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号２９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８５番目から第３３，０３１，９１２番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，７００塩基（ｂｐ）である。
【００４７】
表３における配列番号３０と３１は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００４８】
配列番号３０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４８，１８２番目から第３３，０４８，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４２８番目から第３３，０５５，４５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，３００塩基（ｂｐ）である。
【００４９】
【表３】
2014217332.tif 000005
【００５０】
これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１〜表３に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニーリング可能なセンス（Ｓｅｎｓｅ）側プライマーとアンチセンス（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）側プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
なお、この明細書においては、リファレンス配列の同一の位置に相当する塩基配列（又はそれに相補的な塩基配列）であっても、１〜数塩基が相違しているプライマーについては各々別個の配列番号を付与した。これらの１〜数塩基の相違は多型によるものである。
【００５１】
（２）ＰＣＲステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲする。
ＰＣＲは、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
３．反応条件を設定してＰＣＲを実施する。
例：熱変性ステップ（通常は９２〜９８℃）
アニーリングステップ（通常は５５〜７２℃）
伸長ステップ（通常は６５〜８０℃）
本発明の方法では、前記アニーリング及び伸長ステップの温度を約６５〜７０℃とするのが好ましい。より好ましくは６５℃〜６８℃とする。約６５〜７０℃でアニーリング及び伸長させることにより、ＨＬＡアリルを等比率で（均一に）生成させることができる。
４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
【００５２】
本発明において新たに設定されたプライマーセットを用いることにより、１チューブ内での反応で複数の異なる遺伝子を同一条件かつ同時に増幅できることが可能となった。
なお、本発明で用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は特に限定されるものではないが、例えば、市販品を使用することもできる。例えば、ＴａＫａＲＡ社製のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｕｍｅｒａｓｅ、Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製のＬｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ等を挙げることができる。
【００５３】
（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンス（あるいは超高速シークエンス、大量並列シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
【００５４】
本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）の４５４  ＧＳシステムに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。なお、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムシークエンサーＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭシステム及びイルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＭｉＳｅｑシステムも同様に塩基配列決定が可能である。
１．前記ステップ（２）で得られたＰＣＲ産物をネブライザーにより約５００塩基ほどに断片化する。
２．その断片化されたＤＮＡ断片の末端にＤＮＡアダプターを付加する。
３．ＤＮＡアダプターを付加したＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
【００５５】
４．エマルジョンＰＣＲを実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
５．ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
６．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
【００５６】
（４）ＤＮＡタイピングステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られるｓｆｆ  ｆｉｌｅをＭＩＤタグ毎に分類した後、既知のＨＬＡアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡの第４区域レベルのＨＬＡアリル（８桁レベル）が決定される。
【００５７】
本発明の方法は、前記表１〜表３に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってアンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ｎｕｌｌアリルに関する情報を得ることもできる。
【００５８】
本発明では、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲの際のアニーリング温度が同一となるようなプライマーセットを新たに設定したことにより、１台のＰＣＲ装置で複数の遺伝子のＰＣＲを同時に行うことができる。
また本発明では、上記の新たなプライマーセットを設定したことにより、複数のＨＬＡ遺伝子を１チューブ内で同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ法を行うことが可能になった。
さらに、本発明で使用するプライマーセット及び酵素の組み合わせは、高速ＰＣＲ装置にも適用可能であることを確認した。したがって、従来より迅速かつ高精度にＰＣＲを行うことができる。
【実施例】
【００５９】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
（試験例１）
［目的］
本発明の方法に適したＰＣＲ酵素を特定すること。
［方法］
ＤＲ９とＤＲ１５をヘテロ接合体として有する既に抽出されているゲノムＤＮＡ、２サンプルを鋳型として、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のプロモーター領域からエクソン２を特異的に増幅させるプライマーセット（非特許文献２参照）を用いてＰＣＲを行った。
なお、このゲノムＤＮＡの選択は、ＤＲ９のＰＣＲ産物の長さが１１．２ｋｂであり、ＤＲ１５のＰＣＲ産物の長さが６．１ｋｂであることから、両ＨＬＡアリルが同量で増幅していることを確認しやすいこと、ＤＲ９のＰＣＲ産物は本発明の中で最も長いものであり、ＤＲ９のＰＣＲ産物が得られれば、その他のＨＬＡ遺伝子についても同様に増幅できると考えたことによる。
（１）ＰＣＲには表４に示した２３種類の市販されているＬｏｎｇ  ｒａｎｇｅ  ＰＣＲ酵素を用いた。すなわち、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１．５〜３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＬｏｎｇ  ｒａｎｇｅ  ＰＣＲ酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図６に示した。
【００６１】
［結果及び考察］
標準プロトコールに従ったＰＣＲならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、４種類の酵素、すなわちＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）及びＬｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にて、２サンプルともに目的の分子量の位置にかつ両ＨＬＡアリル由来のＰＣＲ産物が得られた（図６）。
しかしながら、以下に示す試験例１の結果から、上記４種類のうち、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）及びＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）及びＬｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）の３種類の酵素が、各ＨＬＡ遺伝子のアリル由来のＰＣＲ産物をほぼ均等に増幅できることが判明し、これら３種類の酵素が本発明の方法に特に好適であることを確認した。
【００６２】
【表４】
2014217332.tif 000006
【００６３】
（実施例１）
［目的］
酵素として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、各ＨＬＡ遺伝子における増幅状況を確認する。
［方法］
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１〜表３参照：配列番号１〜３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ緩衝液、１．６μＬのｄＮＴＰ溶液、１〜３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．４μＬのＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、７０℃で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図７に示した。
【００６４】
［結果及び考察］
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）におけるＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図７）。
【００６５】
（実施例２）
［目的］
酵素として、Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、各ＨＬＡ遺伝子における増幅状況を確認することを目的にした。
［方法］
Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１〜表３参照：配列番号１〜３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘ Ｇｆｌｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１〜３μＬ（４  ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図８に示した。
【００６６】
［結果及び考察］
Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）におけるＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて、目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図８）。
比較例１の結果と比較しても、Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いた場合は、各ＨＬＡ遺伝子とも満遍なく均一に増幅できた。
【００６７】
（実施例３）
［目的］
汎用されているＰＣＲ装置、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）とＰＣＲの高速化に特化した増幅装置、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）との間におけるＰＣＲ状況の相違を確認し、ＰＣＲに必要な時間を検討する。
［方法］
Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１〜表３参照：配列番号１〜３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘ Ｇｆｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１〜３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ  Ｇｆｌｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）とＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図９に示した。
【００６８】
［結果及び考察］
２機種のＰＣＲ装置を用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、両機種間でバンドの出現状況に大差はなく、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて、目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図９）。
ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）の場合、ＰＣＲに必要な時間は３時間１０分間であったのに対して、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）では、２時間４５分間であった。
したがって、本発明の方法は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）等の高速ＰＣＲ装置への適用が可能であり、ＰＣＲの高速化に寄与することが確認された。
【００６９】
（実施例４）
［目的］
Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）ならびにＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いたＰＣＲ産物の再現性を確認するとともに、本発明で設定したＰＣＲ条件がＨＬＡ遺伝子の超高解像度ＤＮＡタイピングに好適であることを裏付けるために、複数のＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行った。
［方法］
１．Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されており、ＨＬＡ型が既に明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体（Ｓａｍｐｌｅ１〜４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１〜表３参照：配列番号１〜３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘＧｆｌｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１〜３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ  ＧｆｌｅｘＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１０に示した。
【００７０】
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり２万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＩＭＧＴ  ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（５）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視でマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。
【００７１】
［結果及び考察］
１．ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図１０）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうるものと考えられた。
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体を用いてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ−ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域の各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＨＬＡタイピングをおこなった。その結果、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１については、遺伝子領域全体のタイピングが可能であった。ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１については、エクソン部分のみのタイピングが可能であった。さらに、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子では、新規アリルを検出した（表５）。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールであると考えられた。
【００７２】
【表５】
2014217332.tif 000007
【００７３】
（実施例５）
［目的］
Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ならびにＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法の可能性を検証する。
［方法］
１．Ｔｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されており、ＨＬＡ型が既に明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体（Ｓａｍｐｌｅ１〜４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の各遺伝子特異的プライマーセット（特許文献３、表１及び表２参照：配列番号１〜１２）を１本のチューブに混合したもの用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘＧｆｌｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１〜３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ  ＧｆｌｅｘＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１１に示した。また、バイオアナライザー（ＤＮＡ１２０００チップ）を用いて、ＰＣＲ産物の長さを正確に測定した。その泳動像を図１２に示した。
【００７４】
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり２万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＩＭＧＴ  ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（５）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。
【００７５】
［結果及び考察］
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の各遺伝子を独立的にＰＣＲさせた場合、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図１１のレーン１〜３）。その一方、それらプライマーをミックスしてＰＣＲさせた場合、各遺伝子におけるＰＣＲ産物を反映すると思われる複数のバンドが観察された（図１１のレーン４）。そこでバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１２０００キット）を用いて詳細にＰＣＲ産物の長さを測定した結果、各遺伝子由来のＰＣＲ産物が増幅していることを確認した（図１２）。さらに、各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＨＬＡタイピングをおこなった結果、いずれのサンプルとも、矛盾なく実施例４にて得られたＨＬＡアリルに判定された。よって高速ＰＣＲ装置を使用した本発明のマルチプレックス法は、臨床現場におけるＰＣＲの煩雑な操作の簡素化や迅速化に役立つ優れたツールであると考えられた。
【００７６】
（比較例１）
［目的］
本発明のプライマーセットがマルチプレックス増幅に適していることを確認する。
［方法］
実施例５と同様の条件で、特許文献２に開示されているＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の各遺伝子に対するプライマーセットを用いてＰＣＲさせる実験を行った。
［結果及び考察］
ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１３（左側）に示した。また、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１２０００キット）を用いて、ＰＣＲ産物の長さを正確に測定した。その泳動像を図１４（左側）に示した。
比較のため、本発明で新たに設定したプライマーセットを使用した場合の結果を同図の右側に示した。
図１４から明らかなように、従来（特許文献２）に記載されたプライマーセット（前開発プライマーセット）を用いた場合には、特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の各遺伝子を同時に同一容器内で増幅させた場合、特異ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃが十分に増幅されなかったのに対し、本発明の新規なプライマーセット（新規開発プライマーセット）を使用した場合は、いずれの遺伝子も均等に増幅された。
【図１】
2014217332.tif 000008
【図２】
2014217332.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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