(57)【要約】【課題】セルロース分解活性の高い菌株を利用してセルロース分解酵素を含む培養上清を提供する。【解決手段】Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株、Trichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、もしくはFusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、またはそれらのセルロース分解活性を保持した変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。【選択図】図１
2014131501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株またはそのセルロース分解活性を保持し
た変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
【請求項２】
Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株またはそのセルロース分解活性を保持した変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
【請求項３】
Trichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株またはそのセルロース分解活性を保持し
た変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
【請求項４】
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、または該株を培養して得られた培養上清を用いてセルロースを分解することを特徴とする、セルロースの分解方法。
【請求項５】
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、または該株を培養して得られた培養上清を用いてセルロースを分解して糖類を得ることを特徴とする、糖類の製造方法。
【請求項６】
糖類が、セロオリゴ糖、セロビオース、及びグルコースからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の糖類の製造方法。
【請求項７】
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株を培養して培養上清中にセルラーゼを蓄積させ、セルラーゼを回収することを特徴とする、セルラーゼの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養上清に保存剤および／または安定剤を添加してなる酵素製剤。
【請求項９】
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株に由来し、還元型SDS-PAGEで分子量約80kDaを示す、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１〜５０７のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース分解活性を示す微生物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生資源可能資源、特にリグノセルロースバイオマスを分解して有用な化成品や燃料エタノールへ微生物変換する技術が開発されている。リグノセルロースからのバイオリファイナリーは一般に前処理・酵素加水分解・発酵の三つの工程からなる。セルロースから得られたエタノールが市場に流通するには、前処理やリグノセルロースを加水分解するための酵素であるセルラーゼのコスト高がボトルネックとなっている。従って、複数の多糖分解酵素系を同時に分泌する微生物を新たに見出すことが、リグノセルロースからのバイオエタノール生産技術を商業的に成立させるために重要である。
【０００３】
セルロースは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により高度に重合した高分子から構
成される物質である。セルロースは、天然では植物細胞壁の主たる構成成分として存在する。セルロース分子の隣接するグルコース残基間においては分子内水素結合が形成されるが、さらに、隣接するセルロース分子鎖同士も分子間水素結合を形成し、強固なセルロース繊維を形成する。セルロース繊維は強固な結晶構造をとる領域を高割合で含むため、セルロースをグルコースなどの単糖又は少糖まで加水分解（糖化）するのは容易ではない。自然界ではセルロースは主として微生物によって分解されており、細菌や糸状菌などの様々な微生物がセルロース分解酵素を生産することが知られている。
【０００４】
例えば、特許文献１には酸性条件下でセルロース分解活性を示すトリコデルマ（Trichoderma）属の微生物が開示されている。また、セルロースの分解にはTrichoderma reesei株
が産生する酵素溶液が広く用いられているが、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性が弱いことが問題となっており、培養液に別に生産したＢＧＬを添加する等の処置がとられているがコスト高となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-319040号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＢＧＬ活性が強く、既存株に比しセルロース分解活性の高い新規微生物を利用してセルロース分解酵素を含む培養上清を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC107663）株、Trichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、およびFusarium proliferatum VN0096(NBRC109045)株の分離に成功し、これらはセルロース分解活性が極めて高いことを見出し、それに基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[１] Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株またはそのセルロース分解活性を保持した変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
[２] Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株またはそのセルロース分解
活性を保持した変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
[３] Trichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株またはそのセルロース分解活性を保持した変異株を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清。
[４] Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、または
該株を培養して得られた培養上清を用いてセルロースを分解することを特徴とする、セルロースの分解方法。
[５] Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株、または
該株を培養して得られた培養上清を用いてセルロースを分解して糖類を得ることを特徴とする、糖類の製造方法。
[６]糖類が、セロオリゴ糖、セロビオース、及びグルコースからなる群より選択される少なくとも１つである、[５]に記載の糖類の製造方法。
[７] Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株、Trichoderma brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株もしくはTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株を培養し
て培養上清中にセルラーゼを蓄積させ、セルラーゼを回収することを特徴とする、セルラーゼの製造方法。
[８] [１]〜[３]のいずれかに記載の培養上清に保存剤および／または安定剤を添加して
なる酵素製剤。
[９] Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株に由来し、還元型SDS-PAGEで分子量約80kDaを示す、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
[１０]  配列番号１〜５０７のアミノ酸配列を含む、[９]に記載のタンパク質。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物は、従来のTrichoderma reeseiに比し、セルロース分解活性および糖化活性が高い。培養上清の総セルロース分解活性（ＢＧＬ，エンドグルカナーゼ，セロビオハイドロラーゼ）はTrichoderma reesei に比しTrichodermna brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株およびTrichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株が高い。一方、培養
上清の蛋白質あたりのセルロース総分解活性はFusarium proliferatum VN0096(NBRC109045)株がTrichoderma reeseiに比し高い。ＢＧＬ活性もFusarium proliferatum VN0096(NBRC109045)株がTrichoderma reeseiに比し高い。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トウモロコシ茎葉の分解活性を示す図。
【図２】各精製段階でのタンパク質サンプルのSDS-PAGE（１０％ポリアクリルアミド）解析の結果を示す図（写真）。a-(1)  分子量マーカー、a-(2)  粗タンパク質抽出物、b-(1)  DEAE sepharose CL-6Bでの活性ピーク、b-(2)  分子量マーカー  c-1  改変ザイモグラムのCW2バンドのタンパク質、c-(2)  Superdex75  の活性ピーク、c-(3)  分子量マーカー、c-(4)  バッファーのみ。a,bはＣＢＢによる染色、cは銀染色である。
【図３】DEAEセファロースCL-6Bカラム（１５×１５０ｃｍ）を用いたβ−グルコシダーゼの精製。フラクション３ｍｌ／チューブ；溶出バッファー（0.1, 0.15, 0.2, 0.25, または0.3 MのNaClを含む20mM Tris-HCl (pH 8.5)）；β−グルコシダーゼ活性 (▲)、吸光度２８０ｎｍ (◆)。
【図４】Mono Q  5/ 50 GLカラムを用いたβ−グルコシダーゼの精製。フラクション２ｍｌ／チューブ；溶出には、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍのリニアなグラジエントを有する溶出バッファー（ 20 mM Tris-HCl  (pH 8.5)）を用いた。β−グルコシダーゼ活性 (■)、吸光度２８０ｎｍ (◆)。
【図５】superdex 75カラム（１．５×６０ｃｍ）を用いたβ−グルコシダーゼの精製。フラクション３ｍｌ／チューブ；溶出バッファー（ 20 mM Tris-HCl  (pH 8.5)）；β−グルコシダーゼ活性 (■)、吸光度２８０ｎｍ (◆)。
【図６】SDS-PAGE 分析 (10 %ポリアクリルアミドゲル)（写真）。レーン１：マーカー、レーン２：Superdex 75カラムの第１７フラクション、レーン３：Superdex 75カラムの第１８フラクション、レーン４：MonoQカラムからの活性ピーク、レーン５：DEAEカラムからの活性ピーク、レーン６：沈殿及び透析後のサンプル。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
VN0090株は、ＥＦ−１α遺伝子の配列解析に基づき、Trichodermna brevicompactumとし
て同定された。この株は、２０１０年９月２日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物資源センターNBRC (Biological Resource Center, NITE)（日本国千葉県木更津市かず
さ鎌足2-5-8）に、受託番号NBRC107663で寄託された。
【００１３】
VN0092株は、ＥＦ−１α遺伝子の配列解析（配列番号５０９）に基づき、Trichodermna harzianumとして同定された。この株は、２０１０年７月２７日に独立行政法人 製品評価
技術基盤機構 生物資源センターNBRC (Biological Resource Center, NITE)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号NBRC107620で寄託された。
【００１４】
VN0096株は、ＥＦ−１α遺伝子の配列解析（配列番号５０８）に基づき、Fusarium proliferatumとして同定された。この株は、２０１２年６月２８日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物資源センターNBRC (Biological Resource Center, NITE)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号NBRC109045で寄託された。
【００１５】
Trichodermna brevicompactum VN0090（NBRC 107663）株、Trichoderma harzianum VN0092(NBRC 107620)株およびFusarium proliferatum VN0096(NBRC109045)株より誘導される株、例えば、これらの自然突然変異体、遺伝子組換え体、突然変異誘発処理体、プラスミド導入等による形質転換体、倍数化体などはセルロース分解活性を保持する限りにおいて、本発明の微生物に含まれる。ここで、セルロース分解活性を保持するとは、下記で述べるセルロース分解試験において、親株であるそれぞれの株と比較して８０％以上のセルロース分解能を示すことを意味する。
【００１６】
これらの微生物は菌体外に複数のセルラーゼを分泌し、セルロースはセルラーゼによって、主に、セロオリゴ糖、セロビオースを経てグルコースへと分解される。
【００１７】
本明細書において、セルラーゼとはセルロースを加水分解する酵素群のことを意味するが、具体的には、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）、セロビオハイドロラーゼ（EC 3.2.1.91）およびβ-グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）を意味する。
【００１８】
エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）は、エンド型の作用様式でセルロースを加水分解し、セロオリゴ糖、セロビオース、及びグルコースを生産する酵素であり、カルボキシメチルセルロース（CMC）などの非結晶性セルロースをよく加水分解することが知られている。
【００１９】
セロビオハイドロラーゼ（EC 3.2.1.91）は、セルロース鎖をエキソ型の作用様式で加水
分解し、末端からグルコース又はセロビオースを遊離する酵素である。これらの酵素は綿繊維やアビセルなどの結晶性セルロースをよく加水分解し、エキソセルラーゼとも呼ばれている。
【００２０】
β-グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）は、グルカン1,4-βグルコシダーゼ及びセルロース1,4-βセロビオシダーゼの作用によってセルロースから生成されるような、セロオリゴ糖、セロビオース、及びβグルコシド（グルコースの配糖体）に作用し、非還元末端からグルコースを遊離する酵素である。
【００２１】
本発明の微生物を培養することによりセルロース分解酵素を含む培養物または培養上清を得ることができる。ここで、培養物とは、培養後に得られる菌体と培養後に菌体外へ分泌された複数のセルラーゼ等と培地を含む組成物を意味し、培養上清とは、遠心分離、濾過、又はその他の方法により培養物から菌体を除き、培養後に菌体外へ分泌された複数のセルラーゼ等を含む液体を意味する。微生物を固体培地で培養した後、培養物を液体に懸濁し、そこから菌体を除いたものも培養上清に含まれる。
本発明の微生物を培養するための培地としては、特に限定されないが、一般的に糸状菌の培養に用いられる培地が使用でき、例えば、ポテトデキストロース培地（PDB）、ふすま
、が挙げられる。ポテトデキストロース培地は、ポテト抽出物200g、デキストロース20g
を水1Lに溶解し（滅菌前のpH値：5.6）、それを121℃で15分オートクレーブ滅菌することにより、調製することができる。本発明の微生物は、このような培地において１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で好気的に培養することができる。培養容器は、例えば、試験管、フラスコ、バッフルつきフラスコ、坂口フラスコ等を用いることができる。回転は往復でも回転型でも可能であり、回転型であれば100rpm前後の回転速度が好ましい。
【００２２】
セルロース分解試験は、例えば、Mandels らの方法（Mandels,M.,et.al (1976) Biotech.Bioengsymp No.6.21）に従って、ろ紙分解活性を調べることによって行うことができる。
【００２３】
また、セルラーゼ活性は、培養上清について各種セルラーゼの活性を検出することによって判定することもできる。
例えば、本発明の微生物由来の培養上清をエンドグルカナーゼの基質となるカルボキシメチルセルロースと反応させ、カルボシキメチルセルロースの分解によって生じる還元糖の量を測定することにより、本発明の菌株がエンドセルラーゼ活性を示すか否かを判定することができる。還元糖の濃度は、ジニトロサリチル酸による比色定量法（Miller,G L.(1959) Anal.Chem.31,426）で測定することができる。
【００２４】
本発明の微生物がβ-グルコシダーゼ活性を有することは、例えば、培養上清をβ-グルコシダーゼの基質となるp-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシドと反応させ、その分解
によって生じるp-ニトロフェノールを、410nmでの吸光度測定により定量することにより
、確認することができる。
【００２５】
本発明微生物の菌株またはその培養上清を用いれば、セルロースを効率よく分解することができる。
【００２６】
分解するために使用するセルロースは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合
した分子鎖若しくはその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースなどの、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体化が為されたもの）、又はそれらが複数結合したもの（セルロース繊維など）が挙げられる。なお、セルロースには、セロオリゴ糖、セロビオース、βグルコシドなども含まれる。
また、セルロースは、アビセルや綿繊維などの結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。セルロースはまた、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。さらにセルロースは、植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものでもよい。ヘミセルロース、ペクチン質、リグニンなどに結合したセルロースによって構成される植物細胞壁に由来するセルロースを用いることも好ましい。
【００２７】
本発明の微生物菌株をセルロースを含む培地で培養するか、本発明の微生物菌株を培養して得られる培養上清をセルロースを含む溶液中で反応させて、セルロースを加水分解することにより、セロオリゴ糖、セロビオース又はグルコースなどの糖類をセルロースから遊離させることができる。
セルロースとしては、上記のようなものが挙げられるが、工業的プロセスにおいては、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲わら、コーンストーバー、籾殻、木材チップなどの農産廃棄物などが挙げられる。これらは適宜、酸やアルカリ等の前処理を行ったものであることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る微生物菌株をセルロースを含む培地で培養することによってセルロースを分解させる場合に用いる培養培地としては、セルロースを含有するものである以外は、通常、糸状菌などの培養に使用可能な任意の培地を用いることができる。培地の組成は、例えば、「微生物の分離法」（山里一英ら編、株式会社R&Dプランニング発行、2001年7月6日
（1986年初版発行））の記載を参考として決定することができる。培地に含める炭素源としては、上記のセルロースに加えて、スクロース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノール、澱粉、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、ビートモラセス等の炭素源を用いてもよい。培地に含める窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸カルシウムなどの硝酸塩、又はその他の有機若しくは無機窒素源を用いることができる。さらに培地には、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物などの天然栄養源を含めることも好ましい。培地には、抗生物質、pH緩衝剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸アンモニウム、水酸化ナトリウムなど）、マーカー物質などを含めてもよい。培地は液体培地であってもよいし、固体培地であってもよい。培地に加えるセルロースの量は、特に限定されないが、液体培地で培養する場合には通常1L当たり1g〜100g程度用いればよい。セルロースは、培養中、適宜補充してもよい。
【００２９】
用いる培地のpH値は、培養開始前に、本発明に係る微生物の生育可能範囲内にあればよい。本発明の方法では、好ましくはpH1.0〜pH7.0、より好ましくはpH2.0〜6.4の酸性pH値を示す培地を用いることが望ましい。
【００３０】
培養温度は、本発明に係る微生物の生育可能範囲内の温度であればよいが、10℃〜40℃が好ましく、より好ましくは25℃〜35℃である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましい。
【００３１】
培養時間は、当業者であれば任意に設定することができるが、少なくとも24時間培養を継続することが好ましい。
【００３２】
以上のようにして本発明に係る微生物の菌株をセルロースの存在下で培養すると、セルロースが加水分解されて生じたセロオリゴ糖、セロビオース又はグルコースなどの糖類が培養物中に生産される。そのようにして生産された糖類は、培養液から、HPLC法、アルコール沈殿法、結晶化法などの当業者に公知の方法により精製してもよい。あるいは、その培養液から菌体を除去して培養上清を調製し、それを糖類等を豊富に含む溶液として利用することもできる。得られた糖類は、エタノールなどの有用物質の発酵生産に利用できる。
【００３３】
また、本発明に係る微生物を培養することによって得られたセルラーゼを含む培養上清をセルロースの分解に使用することができ、それによって糖類を製造することもできる。培養上清はそのまま使用しても構わないし、ろ過した粗精製物を用いてもよいし、さらには分画やカラム等でセルラーゼを精製したものを用いても構わないが、３種のセルラーゼ（ＢＧＬ，ＥＧ，ＣＢＨ）が存在することが望ましい。分画には、硫安分画（タンパク質溶液に硫酸アンモニウムを添加することで、タンパク質を沈殿させる手法）を用いることができる。カラムには、イオン交換樹脂カラム、ないしフェニルセファロース樹脂カラムを用いて、ゲル濾過することができる。
酵素反応は、上述の微生物を培養しながらセルロースを分解する場合と同様の条件（ｐＨ、温度、セルロース濃度）で行うことができるし、セルロースは適宜追加してよい。反応
時間は当業者であれば任意に設定することができるが、少なくとも10分間、好ましくは1
時間以上にわたり反応させることが好ましい。
【００３４】
また、本発明は、本発明の微生物を培養して得られる、セルロース分解酵素を含む培養上清に保存剤および／または安定剤を添加してなる酵素製剤を提供する。培養上清を適当な濃度に濃縮した後に保存剤および／または安定剤を加えてもよいし、培養上清から不純物を除去した後に保存剤および／または安定剤を加えてもよい。
ここで、保存剤としてはアジ化物や、ポリＬ−リジン、安息香酸ナトリウムが例示される。安定化剤としては、牛血清アルブミンやフルクタン、メチルイソチアゾロン、ブロモニトロジオキサンが例示される。なお、保存剤および安定剤以外の成分も含まれてよい。
【００３５】
本発明はまた、Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株に由来し、β−グルコシ
ダーゼ活性を有するタンパク質を提供する。このタンパク質は還元型SDS-PAGEで分子量約80kDaを示し、好ましくは配列番号１〜５０７のアミノ酸配列を含む。このタンパク質は
、Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株からβ−グルコシダーゼ活性を指標に
実施例に記載したような方法で精製することができる。また、多くの部分配列が明らかにされたので、これらの配列をもとにプライマーを作成し、このタンパク質をコードするDNAを単離することもできる。そして、得られたDNAを適当な宿主で発現させることによって組み換え微生物や組み換えタンパク質を得ることもできる。また、配列のホモロジーに基づいてFusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株以外の微生物からホモログを得る
こともできる。ホモログとしては、配列番号１〜５０７のアミノ酸配列を含むFusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株のβ−グルコシダーゼに対して配列同一性が９０％
以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
ベトナム山林より採取された土壌からセルロース分解微生物を単離した。具体的には、該土壌の希釈液をセルロース含有寒天培地に播き、セルロース含有寒天培地上で生育できる微生物をスクリーニングした。その結果、三種類のセルロース分解微生物が得られ、それぞれ、VN0090, VN0092, VN0096と名付けた。これらの微生物についてEF-1α遺伝子の配列を解析し、系統分析を行ったところ、それぞれ、Trichoderma brevicompactum、Trichoderma harzianum、Fusarium proliferatum に同定された。
これらの微生物について、以下の手順にて、セルロース分解活性等を確認した。
【００３８】
実験方法
培養条件
VN0090, VN0092, VN0096および T. reesei QM9414 はPDA培地（ポテトデキストロース寒
天培地）上30℃で前培養した。PDA培地上に菌糸が蔓延した後に、菌糸体を培地ごと25-mlの滅菌水と共に30秒間ホモジナイズした。ホモジネート10-mlをMandels inorganic nutrients培地150-mlに添加し、暗所、30℃、100 rpmで25日間培養を行った。なお、Mandels inorganic nutrients培地（KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、MgSO4・7H2O 0.3g/L、CaCl2・2H2O 0.3g/L、FeSO4・7H2O 5.0mg/L、MnSO4・H2O 1.6mg/L、ZnSO4・7H2O 1.4mg/L、CoCl2 2.0mg/L）には炭素源としてリグノセルロース材料（コーンストーバーまたはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））を加えた。培養後、遠心分離により培養上清を得、粗酵素液とした。
【００３９】
実施例１：セルロース分解活性の測定
１０ｇのＣＭＣを添加した上記Mandels inorganic nutrients培地（pH5.5）にて４日間、３０℃、100RPMにて振とう培養した。
ろ紙分解活性はMandels らの方法（Mandels,M.,et.al (1976) Biotech. Bioengsymp No.6.21）に従って測定した。0.5mlの培養上清を1.5mlの0.05M クエン酸緩衝液(pH.4.5)に加
え、1cm x 1.5cmのNo.1 filter paper(Whatman 社製)を添加した。45℃にて1時間培養し
たのち、3mlのジニトロサリチル酸試薬を加え反応を停止した。1PFUは一分間に放出され
るグルコース1μモルと等量である。還元糖の濃度は、ジニトロサリチル酸による比色定
量法（Miller,G L.(1959) Anal.Chem.31,426）で測定した。
【００４０】
蛋白質濃度の測定
可溶性蛋白質濃度はLowryらの方法（Lowry, O.H.,et al J.Biol.Chem.(1951) 193,265.）に従い、牛血清アルブミンを標準物質として測定した。
【００４１】
実施例２：トウモロコシ茎葉の分解活性
VN0090, VN0092および T. reesei QM9414はPDA培地上30℃で培養されたものをブレンダーで破砕し、1mlを10mlのPDB培地に移植した。カビが培地表面を覆った時点で、ヴォルテックスミキサーで撹拌し、1mlをトウモロコシ茎葉の粉末（5g 水分含量80%）に加え30℃で
４日間培養し、重量減を測定した。結果を図１に示す。
【００４２】
実施例３：β-グルコシダーゼ活性
β-グルコシダーゼ活性はp-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシド（pNPG）を基質として測定した。酵素反応系（1.25ml）は、50 mM 酢酸ナトリウム（pH 5.0）中に2mM pNPGと0.25 mlの培養上清を含み、45℃で10分間インキュベートすることで反応を行った。p-ニ
トロフェノールの定量は、2.5 mlの1M Na2CO3 を加えて反応を止めた後に、410 nmの吸光度を測定することで定量した。1 unitは、1.0μmol/minとした。
【００４３】
結果および考察
３株の培養液上清中のセルラーゼ活性（１ｍｌあたりの活性およびタンパク質１ｍｇ当たりの活性）を表１に示した。VN0090,VN0092の培養上清はT. reesei に比較し高い分解活
性を示した。一方蛋白質あたりの分解活性はVN0096が最も高い分解活性を示した。
【００４４】
また、図１より、VN0090およびVN0092は、T. reesei QM9414株に比べて高いトウモロコシ茎葉分解能を示した。
【００４５】
β-グルコシダーゼ活性については、Mandels inorganic nutrients培地にコーンストーバーを加えた培地で培養して5日目の培養上清を用いて比較した結果を表２にまとめた。VN0096は、これまでの報告で最も高いAspergillus nigerと比較しても3倍近く高い比活性を
有していることが分かった。β-グルコシダーゼは、セロビオースを分解する酵素であり
、この活性が低いとセルロース分解時にセロビオースが系内に蓄積することで、セルロース分解にフィードバック阻害がかかることが知られている。T. reeseiは、セルラーゼ活
性は高いもののβ-グルコシダーゼ活性が低いために最大糖化効率を得るためには外部か
らβ-グルコシダーゼの添加を必要としており、この点でVN0096はT. reeseiよりも優れていると考えられる。
【００４６】
【表１】
2014131501.tif 000003
【００４７】
【表２】
2014131501.tif 000004
【００４８】
Fusarium proliferatum産生ＢＧＬ（β−グルコシダーゼ）の精製及び活性測定
VN0096株の培養上清に、１％のコーンストーバー、１％のふすまを加えたMandels inorganic nutrients培地をｐＨ５に調整した。次に、硫酸アンモニウムを飽和度５０％で加え
、４℃にて３０分間スターラーにて混和した。４２５００ｇにて６０分間遠心分離し、上清を分離した。再び飽和度８０％となるよう、硫酸アンモニウムを加え、一昼夜４℃にてスターラーで混和した。再度同条件で遠心分離した。沈殿を回収し、緩衝液にて溶解し、２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）に透析した。透析した溶液をＤＥＡＥ  sepharose CL-6B(1.5cmφｘ２０ｃｍ)にアプライした。カラムは使用前に２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）にて平衡化した。未吸着のタンパク質は平衡化に使った緩衝液１００ｍｌで溶出した。酵素画分の溶出は塩化ナトリウムのグラジエント（０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５Ｍ，０．３Ｍの濃度で平衡化緩衝液に溶解）にて行った。各画分の酵素活性を測定した結果、０．１５Ｍの画分に活性が確認できたので、Amicon(Millipore Corporation Billerica,MA,USA)を用いて濃縮した。次にスーパーデックス  ７５カラム（１．５ｃｍφｘ６０ｃｍ、２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）にて平衡化）にてゲル濾過分画を行った。流速は1ml /分で実施した。精製の各ステップの酵素活性を表
３に示す。
また精製した酵素活性の比較を表４に示す。表４の精製度は、粗抽出物の比活性を１としたときの硫酸アンモニウムを用いた分画後（(NH4)2SO4）、ＤＥＡＥ  sepharoseカラム処理後（DEAE Sepharose）、スーパーデックス  ７５カラムにてゲル濾過処理後（Superdex75）の比活性を示す。表４の回収率は、粗抽出物の総活性に対する各ステップ後の総活性割合（％）を示す。電気泳動による解析結果を図２に示す。
【００４９】
【表３】
2014131501.tif 000005
【００５０】
【表４】
2014131501.tif 000006
【００５１】
Fusarium proliferatum産生ＢＧＬ（β−グルコシダーゼ）の精製〜その２
Fusarium proliferatum VN0096(NBRC 109045)株の培養上清に硫安を飽和度５０％で加え
、氷上にて３０分間スターラーにて混和した。１２００ｒｐｍにて６０分間遠心分離し、上清を分離した。再び飽和度８０％となるよう、硫安を加え、一昼夜４℃にてスターラーで混和した。再度同条件で遠心分離した。沈殿を回収し、緩衝液にて溶解し、２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）に透析した。透析した溶液の不溶物を除いたのち、Amicon(Millipore Corporation Billerica,MA,USA)を用いて濃縮した。濃縮した酵素溶液をDEAE
Sepharose CL-6B(1.5cmφｘ２０ｃｍ)にアプライした。カラムは使用前に２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）にて平衡化した。未吸着のタンパク質は平衡化に使った緩衝液１００ｍｌで溶出した。酵素画分の溶出は塩化ナトリウムの段階的グラジエント（０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５Ｍ，０．３Ｍの濃度で平衡化緩衝液に溶解）にて行った。各画分の酵素活性を測定した結果、０．１５Ｍの画分に活性が確認できたので、Amicon(Millipore Corporation Billerica,MA,USA)を用いて濃縮した。次に高速液体クマトグラフィー（FPLC:Pharmacia Biotech, Uppsala Sweden）による分画を実施した。カラムはMonoQ  5/50 GL column（GE Healthcare）を用いた。濃縮した酵素溶液をカラムに添加したのち、２０ｍMのTris-HCl(pH 8.0)にて未吸着のタンパク質を洗浄したのち、０−
０．５Mの塩化ナトリウムを２０ｍMのTris-HCl(pH 8.0)に加えたリニアなグラジエントにより溶出した。（フローレート：１ｍｌ/分）２３番目と２４番目の画分を集め、上記Amiconにより濃縮したのち、Superdex  ７５カラム（GE Healthcare）（１．５ｃｍφｘ６０ｃｍ、２０ｍＭ  Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）にて平衡化）にてゲル濾過分画を行った。流速は1ml /分で実施した。精製の各ステップの酵素活性を表５に示す。また精製した
酵素活性の比較を表６に示す。DEAE  セファロースのカラムクロマトの溶出パターン（A280とBGL活性）を図３、MONOQカラムクロマト溶出パターンを図４、Superdex ７５カラム
クロマトの溶出パターンを図５に示す。１０％SDS-PAGE（電気泳動）による解析結果を図６に示す。（ＣＢＢによる染色、精製酵素（BGL）はレーン３）
【００５２】
【表５】
2014131501.tif 000007
【００５３】
【表６】
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【００５４】
Fusarium proliferatum産生β−グルコシダーゼのアミノ酸配列解析
上記表３で得られたFusarium proliferatum NBRC109045由来のβ−グルコシダーゼ粗精製物についてアミノ酸配列解析を行った。
まず、粗精製酵素溶液を、冷却遠心型濃縮機TAITEC (TITEC社製) を用いて10倍に濃縮
した後、SDS-PAGE（Mini-Protean TGX Gel：Bio-Rad社）による分離を行った。次に活性
を指標としてβ−グルコシダーゼを含むゲル断片を切出した。切出したゲル断片は、システイン残基の還元処理及びアルキル化を実施した後にトリプシン処理によりゲル内消化を行った。消化されたペプチド断片を抽出し、脱塩処理した後にnanoLC-MS/MS（QSTAR XL：Applied Biosystems、Bio NanoLC：KYA TECH）による解析を実施した。解析の結果得られたアミノ酸配列を配列番号１〜５０７に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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