(57)【要約】【課題】微生物のコロニー形成数を短時間で見積もり可能な微生物検出システムを提供する。【解決手段】溶液に光を照射して、溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、溶液に含まれる微生物の数を検出する微生物検出装置２０と、溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を保存する関係記憶装置３５１と、相関関係を用いて、微生物検出装置２０が検出した微生物の数を、コロニー形成数に換算する換算部３０１と、を備える、微生物検出システム。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液に光を照射して、前記溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、前記溶液に含まれる前記微生物の数を検出する微生物検出装置と、
溶液中の微生物の数と、培地上で前記微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を保存する関係記憶装置と、
前記相関関係を用いて、前記微生物検出装置が検出した前記微生物の数を、コロニー形成数に換算する換算部と、
を備える、微生物検出システム。
【請求項２】
前記相関関係が、溶液中の微生物の数と、培地上で前記微生物が形成するコロニーの数と、の比である、請求項１に記載の微生物検出システム。
【請求項３】
前記微生物検出装置が、前記微生物が発する蛍光の蛍光強度に基づき、前記微生物の種類を特定し、
前記関係記憶装置が、前記相関関係を、前記微生物の種類毎に保存し、
前記換算部が、前記微生物検出装置が特定した前記微生物の種類に対応する前記相関関係を用いて、前記微生物検出装置が検出した前記微生物の数を、前記コロニー形成数に換算する、
請求項１又は２に記載の微生物検出システム。
【請求項４】
前記微生物検出装置が、前記微生物で生じる散乱光に基づき、前記微生物の種類を特定し、
前記関係記憶装置が、前記相関関係を、前記微生物の種類毎に保存し、
前記換算部が、前記微生物検出装置が特定した前記微生物の種類に対応する前記相関関係を用いて、前記微生物検出装置が検出した前記微生物の数を、前記コロニー形成数に換算する、
請求項１又は２に記載の微生物検出システム。
【請求項５】
前記微生物検出装置が、前記微生物が発する蛍光の蛍光強度、及び前記微生物で生じる散乱光に基づき、前記微生物の種類を特定し、
前記関係記憶装置が、前記相関関係を、前記微生物の種類毎に保存し、
前記換算部が、前記微生物検出装置が特定した前記微生物の種類に対応する前記相関関係を用いて、前記微生物検出装置が検出した前記微生物の数を、前記コロニー形成数に換算する、
請求項１又は２に記載の微生物検出システム。
【請求項６】
前記微生物検出装置が検出した前記微生物を培養する培養器を更に備える、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項７】
前記微生物検出装置が検出した前記微生物を捕集するメンブレンフィルターを更に備える、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項８】
前記溶液が製薬用水である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項９】
前記溶液が注射用水である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項１０】
前記溶液が精製水である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項１１】
前記溶液が流れるメインパイプから前記微生物検出装置に前記溶液の一部を導く支流パイプを更に備える、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
【請求項１２】
溶液に光を照射して、前記溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、前記溶液に含まれる前記微生物の数を検出することと、
溶液中の微生物の数と、培地上で前記微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を用意することと、
前記相関関係を用いて、前記光学的に検出した前記微生物の数を、コロニー形成数に換算することと、
を含む、微生物検出方法。
【請求項１３】
前記相関関係が、溶液中の微生物の数と、培地上で前記微生物が形成するコロニーの数と、の比である、請求項１２に記載の微生物検出方法。
【請求項１４】
前記微生物が発する蛍光の蛍光強度に基づき、前記微生物の種類を特定することを更に含み、
前記相関関係を用意することにおいて、前記相関関係が前記種類が特定された微生物に対応している、
請求項１２又は１３に記載の微生物検出方法。
【請求項１５】
前記微生物で生じる散乱光に基づき、前記微生物の種類を特定することを更に含み、
前記相関関係を用意することにおいて、前記相関関係が前記種類が特定された微生物に対応している、
請求項１２又は１３に記載の微生物検出方法。
【請求項１６】
前記微生物が発する蛍光の蛍光強度、及び前記微生物で生じる散乱光に基づき、前記微生物の種類を特定することを更に含み、
前記相関関係を用意することにおいて、前記相関関係が前記種類が特定された微生物に対応している、
請求項１２又は１３に記載の微生物検出方法。
【請求項１７】
前記検出した微生物を培養することを更に含む、請求項１２ないし１６のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項１８】
前記検出した微生物をメンブレンフィルターで捕集することを更に含む、請求項１２ないし１７のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項１９】
前記溶液が製薬用水である、請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項２０】
前記溶液が注射用水である、請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項２１】
前記溶液が精製水である、請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項２２】
前記微生物の数を検出することが、微生物検出装置によってなされ、前記溶液が流れるメインパイプから支流パイプを用いて、前記微生物検出装置に前記溶液の一部を導くことを更に含む、請求項１２ないし２１のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は品質評価技術に関し、特に微生物検出システム及び微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精製水、製薬用水、及び注射用水等は、微生物に対する処置基準値が薬局方で定められている。これらの溶液は、例えば、蒸留法、限外ろ過法、及び逆浸透膜法等を用いて製造される（例えば、特許文献１ないし３参照。）。製造中、これらの溶液は、導電率や全有機炭素（ＴＯＣ：  Ｔｏｔａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃａｒｂｏｎ）量が監視され、品質が管理される。例えば、注射用水を蒸留法により製造する際には、飛沫同伴による汚染が起こらないよう留意する。また、これらの溶液は、製造された後、溶液の一部が抽出されて培地に接種され、所定の条件下で培養された微生物のコロニー形成数が検査される。これにより、製造された溶液について、微生物に対する処置基準値を下回っているか否かが検査される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許２９９７０９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０３８５７５号
【特許文献３】特開２０１２−１９２３１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、溶液の導電率やＴＯＣは、溶液に含まれる微生物の数を、必ずしも、定量的に反映していない。また、溶液を製造後、微生物のコロニー形成数が多いことが発覚した場合、製造された溶液を処分しなければならず、製造コスト及び時間ともに、無駄が生じる。そこで、本発明は、溶液に含まれる微生物のコロニー形成数を短時間で見積もり可能な微生物検出システム及び微生物検出方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様によれば、（ａ）溶液に光を照射して、溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、溶液に含まれる微生物の数を検出する微生物検出装置と、（ｂ）溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を保存する関係記憶装置と、（ｃ）相関関係を用いて、微生物検出装置が検出した微生物の数を、コロニー形成数に換算する換算部と、を備える、微生物検出システムが提供される。
【０００６】
また、本発明の態様によれば、（ａ）溶液に光を照射して、溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、溶液に含まれる微生物の数を検出することと、（ｂ）溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を用意することと、（ｃ）相関関係を用いて、光学的に検出した微生物の数を、コロニー形成数に換算することと、を含む、微生物検出方法が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、微生物のコロニー形成数を短時間で見積もり可能な微生物検出システム及び微生物検出方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施の形態に係る微生物検出システムの模式図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る微生物の種類毎の蛍光強度を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態に係る溶液中の微生物の粒径と、蛍光強度と、の関係を模式的に示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態に係る溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係の一例を示す表である。
【図５】本発明の実施例に係る光学式微生物検出装置の模式図である。
【図６】本発明の実施例に係る溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１０】
実施の形態に係る微生物検出システムは、図１に示すように、溶液に光を照射して、溶液に含まれる微生物が発する蛍光を検出して、溶液に含まれる微生物の数を検出する微生物検出装置２０と、溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を保存する関係記憶装置３５１と、相関関係を用いて、微生物検出装置２０が検出した微生物の数を、コロニー形成数に換算する換算部３０１と、を備える。換算部３０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００に含まれる。関係記憶装置３５１は、ＣＰＵ３００に接続されている。
【００１１】
溶液はメインパイプ１を流れている。メインパイプ１には、サンプリングポート３を介して支流パイプ２が接続されている。メインパイプ１を流れている溶液の一部は、支流パイプ２に流れ込む。溶液は、例えば、製造中又は製造された精製水、製薬用水、及び注射用水であるが、これらに限定されない。
【００１２】
微生物検出装置２０は、支流パイプ２に設けられている。これにより、溶液が流れるメインパイプ１から微生物検出装置２０に溶液の一部が導かれる。微生物検出装置２０としては、米国特許第７４３００４６号公報に開示された装置が使用可能であるが、これに限定されない。例えば、微生物検出装置２０は、レーザ等の光源を備える。光源は、溶液に向けてレーザ光等の光を照射する。光は、可視光であっても、紫外光であってもよい。光が可視光である場合、光の波長は、例えば４００乃至５５０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。光が紫外光である場合、光の波長は、例えば３１０乃至３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３４０ｎｍである。また、微生物検出装置２０は、照射光を焦点に結ぶ光学系、及び焦点に溶液を通過させる配管等を備える。
【００１３】
ここで、溶液に、細菌を含む微生物が含まれていると、光を照射された微生物に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びリボフラビン等が、蛍光を発する。また、溶液に、微生物及び非生物を含む粒子が含まれていると、粒子に当たった光がミー散乱により散乱し、散乱光が生じる。
【００１４】
細菌の例としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌、及びカビ胞子を含む真菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。カビ胞子を含む真菌の例としては、アスペルギルスが挙げられる。ただし、微生物検出装置２０が検出する微生物は、これらに限定されない。
【００１５】
微生物検出装置２０は、蛍光検出器及び散乱光検出器をさらに備える。蛍光検出器は、微生物が発した蛍光を検出し、蛍光強度を計測する。蛍光検出器が蛍光を検出した回数から、溶液に含まれる微生物の数を計測することが可能である。また、図２に示すように、微生物が発する蛍光の強度は、微生物の種類によって異なる。そのため、図１に示す微生物検出装置２０の蛍光検出器が検出した蛍光の強度から、溶液に含まれる微生物の種類を特定することが可能である。
【００１６】
散乱光検出器は、溶液に含まれる粒子によって散乱した光を検出する。散乱光検出器が散乱光を検出した回数から、粒子の数を計測することが可能である。また、粒子による散乱光の強度は、粒子の粒径と相関する。したがって、散乱光検出器で散乱光の強度を検出することにより、溶液に含まれる粒子の粒径を求めることが可能である。また、微生物の粒径は、微生物の種類によって異なる。そのため、散乱光検出器が検出した散乱光の強度から、溶液に含まれる微生物の種類を特定することが可能である。
【００１７】
散乱光検出器が散乱光を検出し、かつ蛍光検出器が蛍光を検出しなかった場合、溶液に含まれる粒子が非生物粒子であることが分かる。散乱光検出器が散乱光を検出し、かつ蛍光検出器が蛍光を検出した場合、溶液に微生物が含まれていることが分かる。ここで、非生物粒子とは、無害あるいは有害な化学物質、ごみ、ちり、及び埃等のダスト等を含む。
【００１８】
微生物検出装置２０は、検出した蛍光強度、及び散乱光強度に基づく粒径の少なくとも一方を用いて、溶液に含まれる微生物の種類を特定する。蛍光強度及び散乱光強度の両方に基づいて微生物の種類を特定する方法は、これらに限定されないが、米国特許６８８５４４０号公報及び米国特許７１０６４４２号公報に開示されている。例えば図３に示すように、微生物の種類によって、粒径と、蛍光強度と、は相関がみられる。したがって、図３に示すようなグラフを予め取得することによって、蛍光強度及び粒径から微生物の種類を特定することが可能である。
【００１９】
また、図１に示す微生物検出装置２０は、蛍光の検出回数及び散乱光の検出回数の少なくとも一方を用いて、所定の体積の溶液に含まれる微生物の数を特定する。例えば、メインパイプ１を流れる溶液の流量と、支流パイプ２を流れる溶液の流量と、の流量比から、メインパイプ１を流れる溶液の所定の体積の溶液に含まれる微生物の数を特定することが可能である。メインパイプ１及び支流パイプ２のそれぞれを流れる溶液の流量は、流量計によって計測可能である。なお、微生物検出装置２０は、所定の体積の溶液に含まれる微生物の数として、溶液中の微生物の濃度を特定してもよい。
【００２０】
微生物検出装置２０は、特定した微生物の種類、及び所定の体積の溶液に含まれる微生物の数を、ＣＰＵ３００に送信する。なお、微生物の数を特定できたが、微生物の種類を特定できなかった場合、微生物検出装置２０は、微生物の種類を特定できなかったことを示す信号、及び所定の体積の溶液に含まれる微生物の数を、ＣＰＵ３００に送信する。
【００２１】
関係記憶装置３５１は、溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係として、例えば図４に示すように、培地上で微生物が形成するコロニーの数に対する、溶液中の微生物の数の比を、微生物の種類毎に保存する。なお、相関関係は、高次関数で表現されていてもよい。培地上で微生物が形成するコロニーの数の単位は、例えばＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）である。溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係は、例えば、以下の手順によって、予め取得される。まず、微生物の含有数が異なる溶液を複数用意する。次に、用意した複数の溶液のそれぞれに含まれる微生物の数を、微生物検出装置で検出する。さらに、用意した複数の溶液のそれぞれを培地上に接種し、所定の培養条件の下、微生物を培養して、コロニー形成数を測定する。その後、微生物検出装置で検出された微生物の数と、培地上で微生物が形成したコロニーの数との相関関係がとられる。ここで、相関関係を取得する際の微生物検出装置、サンプリングポート、支流パイプの体積、及びメインパイプの洗浄条件などは、図１に示す微生物検出装置２０で微生物を検出する際と同じであることが好ましい。
【００２２】
なお、微生物が形成するコロニーの数は、培養条件によって異なりうる。そのため、例えば、コロニー形成数の基準値が法律や規則等で定められている場合、相関関係を取得する際の培養条件は、コロニー形成数の基準値を定めている法律や規則等で指定された培養条件に従う。培養条件には、培地に接種される溶液の希釈又は濃縮の有無、メンブレンフィルターによる微生物捕集の有無、培地に接種されるまでの溶液の保存方法、培地の種類、培養時間、及び培養温度等が含まれる。
【００２３】
図１に示すＣＰＵ３００に含まれる換算部３０１は、微生物検出装置２０が特定した微生物の種類に対応する、溶液中の微生物の数と、培地上で微生物が形成するコロニーの数と、の相関関係を、関係記憶装置３５１から読み出す。例えば、微生物検出装置２０が特定した微生物の種類が図４に示す「微生物種Ａ」であり、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ａ」の数が３４である場合、換算部３０１は、培地上で「微生物種Ａ」が形成するコロニーの数に対する、溶液中の「微生物種Ａ」の数の比１．４８を読み出す。さらに、換算部３０１は、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ａ」の数３４を、１．４８で割り、培地上で「微生物種Ａ」が形成するコロニーの数２３を算出する。
【００２４】
また、微生物検出装置２０が特定した微生物の種類が図４に示す「微生物種Ｂ」であり、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ｂ」の数が５４である場合、換算部３０１は、培地上で「微生物種Ｂ」が形成するコロニーの数に対する、溶液中の「微生物種Ｂ」の数の比１．９３を読み出す。さらに、換算部３０１は、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ｂ」の数５４を、１．９３で割り、培地上で「微生物種Ｂ」が形成するコロニーの数２８を算出する。
【００２５】
あるいは、微生物検出装置２０が特定した微生物の種類が図４に示す「微生物種Ｃ」であり、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ｃ」の数が３３である場合、換算部３０１は、培地上で「微生物種Ｃ」が形成するコロニーの数に対する、溶液中の「微生物種Ｃ」の数の比１．２７を読み出す。さらに、換算部３０１は、所定の体積の溶液に含まれる「微生物種Ｃ」の数３３を、１．２７で割り、培地上で「微生物種Ｃ」が形成するコロニーの数２６を算出する。
【００２６】
なお、微生物検出装置２０が、所定の体積の溶液に含まれる微生物の数を検出したが、微生物の種類を特定できなかった場合、換算部３０１は、溶液中の微生物の数から換算される、培地上で微生物が形成するコロニーの数が最も大きくなる相関関係を、関係記憶装置３５１から読み出す。図４に示す例においては、溶液中の微生物の数から換算される、培地上で微生物が形成するコロニーの数が最も大きくなる相関関係として、培地上で微生物が形成するコロニーの数に対する、溶液中の微生物の数の比１．２７を読み出す。その後、比１．２７を用いて、種類を特定できなかった微生物が培地上で形成するコロニーの数を算出する。これにより、コロニー形成数を少なく見積もる危険が回避される。
【００２７】
ただし、目的に応じて、微生物検出装置２０が微生物の種類を特定できなかった場合、換算部３０１は、換算されるコロニーの数が最も小さくなる相関関係を用いてもよい。あるいは、換算部３０１は、全ての相関関係を用いて換算されるコロニーの数の平均値を算出してもよい。また、培地上で微生物が形成するコロニーの数に対する、溶液中の微生物の数の比も、目的に応じて適宜設定されればよい。また、微生物検出装置２０が複数の微生物の種類を特定した場合、換算部３０１は、それぞれの微生物の種類毎にコロニー形成数を算出し、それらを合算してもよい。
【００２８】
ＣＰＵ３００には入力装置３２１及び出力装置３２２が接続されている。入力装置３２１には、キーボード及びマウス等が使用可能である。入力装置３２１は、例えば関係記憶装置３５１に相関関係を保存する際に使用される。また、出力装置３２２には、ディスプレイ及びスピーカ等が使用可能である。出力装置３２２は、換算部３０１が算出した、培地上で微生物が形成しうるコロニーの数を出力する。
【００２９】
ＣＰＵ３００は、警報部３０２をさらに備える。警報部３０２は、微生物検出装置２０がエンドトキシンのような毒素を産生する微生物を検出した場合、あるいは換算部３０１が算出した算出コロニー数が基準値を超えた場合に、ＣＰＵ３００に接続される出力装置３２２等を介して、警報を発する。
【００３０】
以上説明した、実施の形態に係る微生物検出システムによれば、溶液に含まれる微生物を培養した場合のコロニー形成数を、瞬時に予測することが可能となる。そのため、例えば、製薬工場で製造中の精製水、製薬用水、及び注射用水等に含まれる微生物を培養した場合のコロニー形成数を、リアルタイムに予測することが可能となる。また、予測されたコロニー形成数が、法律や規則等で定められている基準を上回っている場合、溶液の製造装置を洗浄する等の、速やかな処置を施すことが可能となる。
【００３１】
また、微生物検出装置２０が検出した微生物を培養器で培養してもよい。例えば、微生物検出装置２０に供給された溶液の少なくとも一部を培地に接種、もしくはメンブレンフィルターを用いた菌捕集を実施し、微生物を培養することにより、微生物の種類及び実際のコロニー形成数を、目視もしくは光学顕微鏡により検証することが可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって実施の形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３３】
微生物として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、及び表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を用意した。次に、それぞれの菌を含む複数の溶液を用意した。複数の溶液のそれぞれの菌の濃度は異ならせた。なお、溶液の溶媒としては純水を用いた。次に、光学式微生物検出装置を用いて、複数の溶液のそれぞれの１ｍＬ当たりに含まれる菌の数を計測した。
【００３４】
なお、実施例に係る光学式微生物検出装置は、図５に示すように、光源１０１、光源から発せられた光で照射される配管１０２であって、微生物を含む溶液が流される配管１０２であり、ガラス等の透明材料からなるフローセル等の配管１０２、配管１０２中の微生物によって生じた散乱光を集光するレンズ１０３、レンズ１０３で集光された散乱光を検出する散乱光検出器１０３、散乱光以外の光から散乱光検出器１０３を遮蔽する遮蔽板１０５、及び配管１０２中の微生物によって生じた蛍光を検出する蛍光検出器１０６を備えていた。
【００３５】
次に、培地として栄研化学株式会社製のトリプトソイ寒天培地を用意し、複数の溶液のそれぞれ８０ｍＬを培地に接種した。その後、温度３２℃の条件の下、２４時間菌を培養し、目視にて菌のコロニー形成数を数えた。その後、菌種ごとに、溶液中の菌の数と、コロニー形成数と、をプロットし、最小自乗法により、その相関関係を１次関数に近似したところ、図６に示すように、溶液中の菌の数と、コロニー形成数と、は、比例関係にあった。
【符号の説明】
【００３６】
１      メインパイプ
２      支流パイプ
３      サンプリングポート
２０    微生物検出装置
１０１  光源
１０２  配管
１０３  レンズ
１０３  散乱光検出器
１０５  遮蔽板
１０６  蛍光検出器
３００  中央演算処理装置
３０１  換算部
３０２  警報部
３２１  入力装置
３２２  出力装置
３５１  関係記憶装置
【図１】
2014135935.tif 000003
【図２】
2014135935.tif 000004
【図３】
2014135935.tif 000005
【図４】
2014135935.tif 000006
【図５】
2014135935.tif 000007
【図６】
2014135935.tif 000008