(57)【要約】【課題】  最適材料を使用し、バブルの密度を最適な状態にすることによってバブルの直径の大きさが制御された、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法に関する。【解決手段】  （ａ）偏移温度が異なる１つ以上の第１脂質と、脂質膜を通過する親水性部分または分子と結合し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を減少する第２脂質と、を含む脂質混合物を準備する工程と、（ｂ）脂質混合物を溶剤によって乳化し、透明な脂質担体の溶液を形成する工程と、（ｃ）透明な脂質担体の溶液をハロ置換された炭化水素を含む密閉容器に配置する工程と、（ｄ）透明な脂質担体の溶液の温度を透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度に近くなるように調節する工程と、（ｅ）透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器を機械的に撹拌し、密閉容器内にマイクロバブル／ナノバブルを形成する工程と、を含む。【選択図】図１
2014218498.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法であって、前記方法は、
異なる主位相の偏移温度を有する１つまたはそれ以上の第１脂質であり、それぞれ親水性のＣ８〜Ｃ３０の末端を有する第１脂質と、親水性ポリマー部分または脂質膜を通過する分子と結合し、脂質二重層との間のファンデルワールス力を減少させるとともに、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される第２脂質と、を準備する工程と、
前記脂質混合物を溶剤によって機械的に乳化し、透明な脂質担体の溶液を準備する工程と、
前記透明な脂質担体の溶液を密閉容器に配置し、所定の気体または疎水性分子を与える工程と、
透明な脂質担体の溶液の温度を前記透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度に近づけるように調節する工程と、
前記透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器を撹拌し、前記密閉容器の内部でマイクロバブル／ナノバブルを形成する工程と；を含む、脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項２】
前記親水性のＣ８〜Ｃ３０の末端は、直鎖状のアルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖、フルオロアルキル基、分枝アルキル基、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項３】
前記第１脂質は、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3- ホスホエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2- ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミペンタアセテート酸、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、トコフェロール、トコトリエノール、パルミチン酸アスコルビル、SPAN（登録商標）、ロキシオール（登録商標）、アトラス（商標）、アラセル（商標）、エムコール（登録商標）及びこれらの混合物または誘導されるポリマーのグループから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項４】
前記第２脂質の親水性の長鎖ポリマーは、
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及び関連するコポリマー、ペプチド、DNA、RNA及びこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項５】
前記第２脂質は、
1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリエチレングリコール、TWEEN（登録商標）、Myrj（商標）、アトラス（商標）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート、抗体とペグが結合された脂質、ペプチドとペグが結合された脂質、DNAとペグが結合された脂質、RNAとペグが結合された脂質、ビオチンを修飾したペグ化脂質、マレイミドを修飾したペグ化脂質、アミンを修飾したペグ化脂質、及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせのグループから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項６】
脂質膜を通過し、かつ脂質のファンデルワールス力を低下する分子は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン-1,3-ジオール、プロパン-1,2,3-トリオール、プロパン-1,2-ジオール、プロパン-1,3-ジオール、プロパン-1-オール、エタン-1,2-ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド及びこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項７】
前記溶剤は、水、通常生理食塩溶液または緩衝食塩水などの溶剤と混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記溶剤に含まれる前記脂質混合物を機械的に乳化する方法として、音波処理、高速撹拌、高圧均質化処理、または膜のフィルタリングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の気体は、ハロ置換された炭化水素（パーフルオロカーボン）、不活性ガス、６フッ化硫黄、窒素、酸素、空気、及びこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１に記載の脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法。
【請求項１０】
前記機械的に撹拌する手段は、音波振動、手振り、高速機械撹拌、マイクロ装置／流動性装置のＴ−フォーカス、または同軸電気流体力学的微粒化（ＣＥＨＤＡ）によるマイクロ／バブル形成方法によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異なる主位相の偏移温度を有する１つまたはそれ以上の第１脂質であり、前記第１脂質はＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖を含み、前記Ｃ８〜Ｃ３０アルキル鎖は、直鎖状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、フルオロアルキル鎖、分枝アルキル鎖、またはこれらの組み合わせ若しくはこれらの誘導ポリマーから選択される第１脂質と、
親水性ポリマー部分または脂質膜を通過する分子と結合し、脂質二重層との間のファンデルワールス力を減少させるとともに、前記第１脂質のアルキル鎖を有し、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される第２脂質と、を有し；
前記脂質混合物は、前記主位相の偏移温度または前記脂質混合物を含む透明な脂質担体の溶液の脂質膜の流動性は、前記脂質混合物の配合を変更することによって調節可能であり、前記透明な脂質担体の溶液を主位相の偏移温度に近い温度で機械的に撹拌することによって、材料の効率が最適な所望の直径を有するマイクロバブル／ナノバブルが形成される、脂質混合物。
【請求項１２】
前記第１脂質は、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3- ホスホエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミペンタアセテート酸、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、トコフェロール、トコトリエノール、パルミチン酸アスコルビル、SPAN（登録商標）、ロキシオール（登録商標）、アトラス（商標）、アラセル（商標）、エムコール（登録商標）及びこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１１に記載の脂質混合物。
【請求項１３】
前記第２脂質の親水性の長鎖ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及び関連するコポリマー、ペプチド、DNA、RNA及びこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１１に記載の脂質混合物。
【請求項１４】
前記第２脂質は、
1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリエチレングリコール、TWEEN（登録商標）、Myrj（商標）、アトラス（商標）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート、抗体とペグが結合された脂質、ペプチドとペグが結合された脂質、DNAとペグが結合された脂質、RNAとペグが結合された脂質、ビオチンを修飾したペグ化脂質、マレイミドを修飾したペグ化脂質、アミンを修飾したペグ化脂質、及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせのグループから選択される、請求項１１に記載の脂質混合物。
【請求項１５】
脂質膜を通過し、かつ脂質のファンデルワールス力を低下する分子は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン-1,3-ジオール、プロパン-1,2,3-トリオール、プロパン-1,2-ジオール、プロパン-1,3-ジオール、プロパン-1-オール、エタン-1,2-ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド、またはこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１１に記載の脂質混合物。
【請求項１６】
異なる主位相の偏移温度を有する１つまたはそれ以上の第１脂質であり、前記第１脂質はＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖を含み、
前記Ｃ８〜Ｃ３０アルキル鎖は、直鎖状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、フルオロアルキル鎖、分枝アルキル鎖、またはこれらの組み合わせから選択される第１脂質と、親水性ポリマー部分と結合し、前記第１脂質のアルキル鎖を有し、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される第２脂質と、脂質膜を通過して脂質二重層との間のファンデルワールス力を減少する分子と；を有し、
前記脂質混合物は、前記脂質混合物を含む透明な脂質担体の溶液の脂質膜の流動性は、前記脂質混合物を通過する分子の配合を変更することによって調整可能であり、前記透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度に近い状態で機械的に撹拌することによって、材料の効率が最適な所望の直径を有するマイクロバブル／ナノバブルが形成される、脂質混合物。
【請求項１７】
前記第１脂質は、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミペンタアセテート酸、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、トコフェロール、トコトリエノール、パルミチン酸アスコルビル、SPAN（登録商標）、ロキシオール（登録商標）、アトラス（商標）、アラセル（商標）及びエムコール（登録商標）及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせのグループから選択される、請求項１６に記載の脂質混合物。
【請求項１８】
前記第２脂質は、
1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリエチレングリコール、TWEEN（登録商標）、Myrj（商標）、アトラス（商標）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート、抗体とペグが結合された脂質、ペプチドとペグが結合された脂質、DNAとペグが結合された脂質、RNAとペグが結合された脂質、ビオチンを修飾したペグ化脂質、マレイミドを修飾したペグ化脂質、アミンを修飾したペグ化脂質、及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせのグループから選択される、請求項１６に記載の脂質混合物。
【請求項１９】
脂質膜を通過し、かつ脂質のファンデルワールス力を低下する分子は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン-1,3-ジオール、プロパン-1,2,3-トリオール、プロパン-1,2-ジオール、プロパン-1,3-ジオール、プロパン-1-オール、エタン-1,2-ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド、またはこれらの組み合わせのグループから選択される、請求項１６に記載の脂質混合物。
【請求項２０】
前記機械的に撹拌する手段は、音波振動、手振り、高速機械撹拌、マイクロ装置／流動性装置のＴ−フォーカス、または同軸電気流体力学的微粒化（ＣＥＨＤＡ）によるマイクロ／バブル形成方法によって達成される、請求項１６に記載の脂質混合物。
【請求項２１】
前記脂質担体の前記主位相の偏移温度よりも低い温度は、摂氏１０℃から６０℃の範囲である、請求項１６に記載の脂質混合物。
【請求項２２】
脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを形成する装置であって、前記脂質混合物は蒸留水に溶解する初期材料であり、前記脂質混合物は、異なる主位相の偏移温度を有する１つまたはそれ以上の第１脂質と、親水性ポリマー部分または脂質膜を通過する分子と結合し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を減少させる第２脂質と、を有し、
前記第１脂質はそれぞれＣ８〜Ｃ３０アルキル鎖を含み、前記Ｃ８〜Ｃ３０アルキル鎖は、直鎖状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、フルオロアルキル鎖、分枝アルキル鎖、またはこれらの組み合わせから選択され、前記第２脂質は前記第１脂質のアルキル鎖を有し、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合され、前記装置はさらに、
前記透明な脂質担体の溶液の温度を主位相の偏移温度に近づけるように調節する温度制御ユニットと、
前記透明な脂質担体の溶液を機械的に撹拌する機械撹拌機と、を有し、
前記装置は、前記主位相の偏移温度に近い温度を有する前記透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器を撹拌するために前記機械撹拌機を使用し、前記密閉容器の内部に、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを形成する、装置。
【請求項２３】
前記機械撹拌機は、
蒸留水で溶解された前記脂質混合物を含む密閉容器を保持するクランプと、
撹拌を達成するために前記クランプと接続されたレバーと、
前記レバーの端部に接続され、前記レバーの動きの制限するファスナーと、
前記レバーと接続され、反復運動を引き起こすモーターと、を有する、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
さらに、温度制御ユニットと、機械撹拌機と、前記脂質混合物を配置する密閉容器とを収容するケースを有する装置であり、前記温度制御ユニットはさらに：
ケースの内部に向けた空気の流れを作るインレット気体を生成する第１ファンセットと、
ケースの外部に向けた空気の流れを作るアウトレット気体を生成する第２ファンセットと、
前記インレット気体を加熱する熱コイルと、
前記ケースの内部の温度を検知し、前記第１ファンセット及び前記第２ファンセットを制御するセンサーと、を有し、
前記ケース内の温度を第１目標温度に達成させる際に前記第１ファンセット及び前記熱コイルが作動し、前記ケース内の温度を第２目標温度に達成させるために第２ファンセットが作動する、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記センサーは前記クランプまたはレバーに統合されており、前記ケース内の温度を検知する、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記温度制御ユニットは前記クランプ、前記レバー、または前記ケースのいずれかに統合された熱乾燥部を有し、前記ケース内の温度を上昇させる、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月３日に、台湾特許庁に対して出願された台湾特許出願第１０２１１５９６７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルに関し、特に、最適材料を使用し、バブルの密度を最適な状態にすることによってバブルの直径の大きさが制御された、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロバブルは一般的に超音波造影剤として使用される直径１〜５μｍの微細気泡であり、生分解性材料によって被包されている。このようなマイクロバブルを用いた超音波造影剤は血液中でよく循環し、超音波診断において、灌流に対して良好に反応する。マイクロバブルは、（人体の組織と比較した場合）その小さい密度及び内部の圧縮可能性によって、エコー輝度が高い。これらの特徴によって、バブルは超音波を反映し、さらに超音波を振動させる。マイクロバブルに含有されたガスと人体の軟組織とのエコー輝度の差異は著しく異なるため、超音波シグナルの強度は２０〜４０ｄＢ程度増強する。従って、マイクロバブルを用いた超音波造影剤は、臓器の血液灌流の画像化、及び心臓や他の臓器の血流を測定するために使用される。研究の結果、マイクロバブルは、腫瘍を診断する医療用イメージングシステムの造影剤と類似する特徴があることが分かった。マイクロバブルをベースとした超音波造影剤の別の医療面における用途としては、超音波分子イメージングが挙げられる。リガンド結合されたマイクロバブルを目標組織の特定の生物マーカーに絞ることにより、超音波イメージングは、腫瘍、血流不全及び炎症が起こっている組織を強調するようになっている。これにより、医者が様々な病気を早期に発見する助けになる。超音波分子イメージングの類似する適用方法は、標的治療である。血管に注入されるマイクロバブルには、薬剤がカプセル化されている。標的組織において著しい量のマイクロバブルが蓄積されると、焦点が向けられた超音波によって薬剤が活発にトリガーされる。超音波はバブルを破壊し、キャビテーションの閾値を低下させることにより、マイクロバブルの流れが生じ、細胞膜の透過性が上昇する。換言すると、マイクロバブルは抗腫瘍剤を移動させ、超音波に露出されることによって抗腫瘍剤を放出するため、超音波によってトリガーされた薬剤の放出とされる。幾つかの調査において、マイクロバブル／ナノバブルを使用して遺伝子を生細胞に運ぶ方法が発見された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−５１６６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、現在使用されているマイクロバブルの直径は比較的に大きいため、血液の循環において不安定である。これらのマイクロバブルが、限られた時間内に標的組織に十分に蓄積されるのはとても難しい。材料の利用効率を最適にしたマイクロバブルを準備する方法（脂質からバブルへの変換比率）が無いことによって、リガンド結合されたマイクロバブル、カプセル化されたマイクロバブル、ナノ粒子を含有するマイクロバブルなどの機能性マイクロバブルの開発に遅れが生じている。材料の利用効率が低いことによって、コストがかかる機能性合成物が失われ、結果として機能性マイクロバブルの商業化が難しくなる。従って、直径、安定性、材料の利用効率（材料の最適な利用効率）を制御できるマイクロバブルの開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述の問題を解決するにあたり、本開示は、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブル（超音波造影剤のマイクロバブルを含む）を製造する方法を開示し、脂質膜の流動性及び透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度は、脂質混合物の構成要素によって特定される。そして、脂質担体を含む密閉容器が脂質担体の主位相の偏移温度辺りで機械的に撹拌されることによって、使用時において最適なマイクロバブルが形成される。マイクロバブル／ナノバブルの粒度分布及び循環安定性は、流動性を制御することによって向上する。
【０００７】
第１の観点は、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法である。本方法は、（ａ）偏移温度が異なる１つ以上の第１脂質と、親水性部分と結合し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を減少する第２脂質と、を含み、第１脂質は、それぞれ親水性のＣ８〜Ｃ３０末端基を有し、第２脂質は、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される脂質混合物を準備する工程と、（ｂ）脂質混合物及び溶剤を機械的に混合して乳化し、透明な脂質担体の溶液を形成する工程と、（ｃ）透明な脂質担体の溶液を密閉容器に配置し、特定の気体または疎水性分子と混合する工程と、（ｄ）透明な脂質担体の溶液の温度を透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度に近くなるように調節する工程と、（ｅ）透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器を機械的に撹拌し、密閉容器内にマイクロバブル／ナノバブルを形成する工程と、を含む。
【０００８】
第２の観点は、（ａ）それぞれＣ８〜３０のアルキル鎖を有しており、Ｃ８〜３０のアルキル鎖は、直鎖状のアルキル基、分枝アルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖またはフルオロアルキル基、またはこれらの組み合わせから選択される、主位相の遷移温度が異なる１つ以上の第１脂質と、（ｂ）親水性部分と結合し、またはかつ脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下し、第１脂質のアルキル鎖を有し、かつ分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される第２脂質と、を有し、脂質混合物は、主位相の偏移温度または脂質混合物を含む透明な脂質担体の溶液の脂質膜の流動性は、脂質混合物の混合比を調節することによって調節可能であるようにされており、これによって、脂質担体の主位相の偏移温度に近い温度において透明な脂質担体の溶液を撹拌することにより、所望の直径を有するマイクロバブル／ナノバブルを機械的に形成することが可能となる。
【０００９】
第３の観点は、脂質混合物に関し、脂質混合物は、（ａ）Ｃ８〜Ｃ３０のアルキル鎖をそれぞれ有し、Ｃ８〜Ｃ３０のアルキル鎖は、直鎖状のアルキル基、分枝アルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖またはフルオロアルキル基、またはこれらの組み合わせを含む、偏移温度が異なる１つ以上の第１脂質と、（ｂ）親水性部分と結合し、第１脂質のアルキル鎖を有し、かつ分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される第２脂質と、（ｃ）脂質膜を通過し、かつ脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する分子と、を有し、脂質混合物は、脂質混合物を含む透明な脂質担体の溶液の脂質膜の流動性は、脂質混合物に含まれる脂質膜を通過する機能を有する分子の配合を調節することによって調節可能であり、脂質担体の主位相の偏移温度よりも低い温度において透明な脂質担体の溶液を撹拌することにより、所望の直径を有するマイクロバブル／ナノバブルを機械的に形成することが可能となる。
【００１０】
さらに、第４の観点は、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを形成する装置に関し、脂質混合物が通常生理食塩溶液または緩衝食塩水などの溶剤と混合される初期材料として使用され、脂質混合物は主位相の偏移温度が異なる１つまたはそれ以上の第１脂質と、親水性ポリマー部分と結合し、または脂質膜を通過する分子と結合し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する第２脂質と、を有し、第１脂質はそれぞれＣ８〜３０アルキル鎖を含み、Ｃ８〜３０アルキル鎖は、直鎖状のアルキル基、分枝アルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖またはフルオロアルキル基、またはこれらの組み合わせであり、第２脂質は第１脂質のアルキル鎖を有し、かつ分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される。
【００１１】
上述の装置は、（ａ）透明な脂質担体の溶液の温度を主位相の偏移温度に調節する温度制御部と、（ｂ）透明な脂質担体の溶液を機械的に撹拌する機械撹拌機と、を有し、装置に配置される機械撹拌機によって透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器を撹拌することにより、密閉容器の内部に、主位相の偏移温度に近い透明な脂質担体の溶液が形成され、密閉容器の内部で脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルが形成される。
【００１２】
本開示の方法では、脂質混合物の成分を調節し、脂質担体を含む容器を脂質担体の主位相の偏移温度に近い温度で機械的に撹拌することによって、マイクロバブル／ナノバブルの製造コストを著しく減少することが可能となる。さらに、マイクロバブル／ナノバブルのサイズ及び直径は、脂質混合物の成分及び脂質担体が機械的に撹拌される温度を修正することによって特定される。組成物に偏移温度が高い材料が混合されることにより、循環の安定性またはカプセル化された薬剤の保持時間が改善される。従って、本開示内容は、超音波造影剤による非線形の画像、超音波分子イメージング、及びマイクロバブル／ナノバブルを使用する標的治療に貢献する。さらに、密度が最適化されたマイクロバブル／ナノバブル造影剤は、皮膚への染み渡り及び超音波振動による角質への浸透性の向上などから、経皮送達における有用性が認められる。製造された脂質の界面活性剤により形成された最適化されたバブルは、洋服の洗浄、歯磨き、または半導体の洗浄工程など、クリーニングの用途においても幅広く適用される。
【００１３】
本開示の特徴、具体化、機能の実施例は、以下の説明において図を用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本開示は詳細な説明によって明らかになるが、下記説明は図示を目的としており、本開示の内容を制限するものではない。
【図１】アメリカ薬局方の規格に準拠した、コールターカウンター（Coulter counter）粒子分析器によって開示された、ＤＳＰＣを含有するマイクロバブル／ナノバブルの粒度分布である。
【図２】本開示の第１実施例による、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置の斜視図である。
【図３】図２の断面図である。
【図４】本開示による機械撹拌機の斜視図である。
【図５】脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する機械に、機械撹拌機を組み入れた状態の斜視図である。
【図６】本開示による温度制御ユニットの正面図である。
【図７】本開示による脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置の底面図である。
【図８】空気の流入及び流出を図示した、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置の正面図である。
【図９】クランプの反復運動を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次の実施形態の説明においては、本開示の特定の実施例を図示するための図面を参考に説明する。尚、本開示の実施例の範囲内において、他の実施形態を用いてもよく、または構造の変化を加えてもよい。
【００１６】
本開示による、脂質を有するマイクロバブル／ナノバブルを製造する方法では、機械による撹拌が行われる。脂質膜を有する脂質混合物は撹拌されることによって元の膜構造を破壊した後、最内層に注入された気体をカプセル化するために膜を再構成することによって、マイクロバブル／ナノバブルを形成する。脂質膜の流動性は、膜上で脂質が移動する機能を指し（膜の破壊／再生の容易性をいう）、これは、スループット、サイズ、粒度分布によって形成されたマイクロバブル／ナノバブルに大きく影響する。実務上、造影剤に含まれるマイクロバブルの大きさが８μmになると、肺毛細管を詰まらせる。従って、マイクロバブルのサイズを適切に制御することが重要である。しかし、造影剤のマイクロバブルの大きさと粒度分布とを同時に調整することは難しいため、従来の技術では、所定の直径よりも大きいバブルは最終的に除去されていた。大きさが１０μm以上のマイクロバブルの含有割合が２〜５％となる製品は、臨床での使用における安全面が心配されていた。
【００１７】
超音波用マイクロバブル／ナノバブル造影剤を製造する方法の実施例の１つは、次の工程を含む。
【００１８】
第一の工程として、脂質混合物を用意する。脂質混合物はグリーン状態で用意することが可能であり、この場合、最初の段階で混合する溶剤であるグリセロール（プロパン-1,2,3-トリオール）またはプロピレングリコール（プロパン-1,2-ジオール）によって全ての脂質（溶剤の温度は、脂質混合物の主位相の遷移温度に近い範囲で調整される）が分散される。公知技術と比較すると、このクリーンな製造方法によって、メタノール、トルエン、クロロホルムなどの有毒性がある有機溶剤の使用を避けることができる。
【００１９】
脂質混合物は、（ａ）主位相の遷移温度が異なる１つ以上の第１脂質と（ｂ）親水性部分と結合する第２脂質とを含む。第１脂質は、それぞれ親水性のＣ８〜Ｃ３０末端基を有する。代替案として、脂質膜を通過し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する機能を有する、１つ以上の種類の分子を追加することにより、脂質混合物の主位相の遷移温度の制御または第２脂質の変更をすることが可能となる。さらに、脂質混合物の主位相の遷移温度を制御する目的と同様に、例えば非水溶剤などの、水を含有しない溶剤を追加し、脂質間の相互の影響を低下することができる。親水性のＣ８〜Ｃ３０末端基は、直鎖状のアルキル基、分枝アルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖またはフルオロアルキル基、またはこれらの組み合わせであってよい。複数の親水性のＣ８〜Ｃ３０末端基を有するポリマーを第１脂質として使用してもよい。
【００２０】
さらに、第一脂質を例示する。
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DMPG）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DMPS）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DMPA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DPPA）、2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DPPS）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DPPG）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン （DPPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DSPG）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DSPA）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DSPS）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DOPA）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DOPG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DOPS）、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DPTAP）、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DSTAP）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（DMDDA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミペンタアセテート酸（DPPE-DTPA）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸（DSPE-DTPA）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、トコフェロール、トコトリエノール、パルミチン酸アスコルビル、SPAN（登録商標）、ロキシオール（登録商標）、アトラス（商標）、アラセル（商標）、エムコール（登録商標）またはこれらの組み合わせ、または誘導されるポリマーとの組み合わせ。その他、本実施例の第１脂質として、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DSPG）の組み合わせが使用される。
【００２１】
尚、主位相の遷移（固体から液体）温度は、ＤＰＰＣの場合は摂氏４１℃であり、ＤＳＰＧの場合は摂氏５５℃であると理解される。遷移温度が高い脂質は、サイズ（直径）の縮小及びマイクロバブル／ナノバブルの安定性の向上において有利である。第２脂質は、上記の第１脂質に類似する炭素鎖構造（Ｃ８〜Ｃ３０，主鎖）を有するが、さらに、第２脂質は分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される。親水性の長鎖ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及び関連するコポリマー、ペプチド、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、またはこれらの組み合わせである。
【００２２】
第２脂質は以下に列挙されるが、これに限定されない。
1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DPPE-PEG2000）、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]（DPPE-PEG3000）、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]（DPPE-PEG5000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）-3000]（DSPE-PEG3000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）-5000]（DSPE-PEG5000）、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、Ｍｙｒｊ（商標）、アトラス（商標）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート（ビタミンＥ ＴＰＧＳ）、抗体とＰＥＧ（ペグ）が結合された脂質、ペプチドとペグが結合された脂質、DNAとペグが結合された脂質、RNAとペグが結合された脂質、ビオチンを修飾したペグ化脂質、マレイミドを修飾したペグ化脂質、アミンを修飾したペグ化脂質、及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせ。本実施例では、ステアリン酸ポリエチレングリコール４０（ＰＥＧ（ペグ）４０Ｓ）が使用される。
【００２３】
脂質膜を通過し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を低減する分子は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン-1,3-ジオール、プロパン-1,2,3-トリオール、プロパン-1,2-ジオール、プロパン-1,3-ジオール、プロパン-1-オール、エタン-1,2-ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限られない。本実施例では、膜の流動性及び脂質膜が自律的に再構成される機能を向上させるために、プロパン-1,2,3-トリオール（グリセロール）が使用される。特に、メタノールやエタノール等の化合物の濃度が０．１〜２重量％の範囲内で含まれる場合、脂質混合物の当初の主位相の偏移温度（水中によって測定される）よりも著しく低い場合であっても、マイクロバブルの最終的な発生量を著しく上昇させる事がある。
【００２４】
第２段階として、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＣ及びＰＥＧ４０Ｓを含む脂質混合物は、通常生理食塩溶液または緩衝食塩水などの溶剤と混合される。例えば、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＣ及びＰＥＧ４０Ｓの混合物は、１重量％のグリセロールを含むリン酸塩緩衝食塩水の溶剤と混合されることにより、二重層の脂質膜が形成される。特に、ＰＥＧ４０Ｓは脂質膜の流動性を高める機能があるため、その後の一層構造を形成する際の撹拌において、二重層の脂質膜が容易に破壊及び再構築され、注入された気体をカプセル化し、マイクロバブル／ナノバブルの最終的な量を増やす。例えば本開示によるグリセロールなど、脂質膜を通過し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する分子は、ＰＥＧ４０Ｓと同様の機能を果たす。また、第１脂質において、主位相の変遷温度が高いＤＳＰＧは、脂質膜の流動性を低下させ、最終的なマイクロバブルを安定させる。
【００２５】
第３段階として、これらの脂質と溶剤とを混合することによって発生した溶液は、透明な脂質担体の溶液が形成されるまで、機械的に乳化される。溶剤に含まれる脂質混合物を機械的に乳化する方法として、音波処理、高速撹拌、高圧均質化処理、または膜のフィルタリングが挙げられる。本実施例では、音波洗浄機を用いて音波処理が行われ、透明な脂質担体の溶液の濃度は、摂氏２０℃において脂質担体が３ｍｇ／ｍＬとなるように調節される。本工程は、透明な脂質担体の溶液に脂質を分散し、脂質担体の分子のサイズを縮小することにより、マイクロバブル／ナノバブルの準備を促進することを目的としている。尚、ナノバブル（大きさが１μm以下のバブル）を形成するための脂質の濃度は、一般的に０．５ｍｇ／ｍＬよりも高い。第４段階として、脂質担体として使用される透明な脂質担体の溶液が、適切な大きさの密閉容器に入れられる。本例においては、１．８ｍＬの密閉容器の中に、１ｍＬの透明な脂質担体の溶液が入れられる。好ましくは、０．５〜１．０ｍＬの透明な脂質担体の溶液が使用される。
【００２６】
第５段階として、密閉容器が真空状態となり、ハロ置換された炭化水素（パーフルオロカーボン）、不活性ガス、６フッ化硫黄、窒素、酸素、空気、またはこれらの組み合わせなど、所定のガスが充填される。所定のガスは、容器を所定のガスを含有している密閉されたシステムまたは環境に容器を密封する、または容器に所定のガスを流し込む／充填する方法で注入してもよい。本工程においては、所定のガスと一緒に、特定の機能を持つ疎水性分子を添加しても良い。疎水性分子は、超音波にトリガーされた薬剤放出、超音波が用いられる腫瘍の治療、及びマイクロ／バブルを元とした血液脳関門の崩壊など、医療用途のマイクロバブル／ナノバブルの脂質膜に適用される特定の薬剤であるが、これに限られない。尚、当業者は所定の気体を充填する方法を理解しているため、この方法に関する詳細な説明は行わない。
【００２７】
第６工程としては、例えばウォーターバスなどによって透明な脂質担体の溶液の温度が主位相の偏移温度にまで調節されることにより、膜の流動性、脂質膜が自主的に再構成する機能、及びマイクロバブルの量が向上する。例えば、主位相の偏移温度が摂氏４６℃である透明な脂質担体の溶液がＤＰＰＣ、ＤＳＰＧ及びＰＥＧ４０Ｓによって構成され、その割合が１：１：１である場合、反応温度が摂氏４３℃である次の段階においては、反応温度が摂氏２０℃である場合のマイクロバブル／ナノバブルの量と比較すると、約３倍となる。簡単に説明すると、マイクロバブル／ナノバブルが最適な効率を発揮する状態を準備するには、透明な脂質担体の溶液の温度を操作することが好ましい。しかし、機械での撹拌プロセス時に透明な脂質担体の溶液の温度が下がるケースを考慮し、透明な脂質担体の溶液の温度を主位相の偏移温度に近いかそれよりも高く調節してもよい。
【００２８】
例えば、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００との割合が１０：４（ｗ／ｗ）よりも低い透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度が摂氏５６℃である場合、撹拌プロセス時には温度を摂氏５０℃までにしか保てないため、透明な脂質担体の溶液の温度は好ましくは摂氏６０℃に熱しておくことにより、マイクロバブル／ナノバブルを最適な量に増やすことが可能となる（マイクロバブル／ナノバブルの量は最大４Ｅ＋１０バブル／ｍＬである）。ＤＳＰＣなどの偏移温度が高い材料を使用することにより、平均的なサイズを４００から７００ｎｍ（合成物による）の範囲にまで減らすことが可能となる。
【００２９】
図１は、アメリカ薬局方の規格に準拠した、コールターカウンター（Coulter counter）粒子分析器によって開示された、ＤＳＰＣを含有するマイクロバブル／ナノバブルの粒度分布である。
【００３０】
第７段階として、透明な脂質担体の溶液を含む密閉容器が機械的に撹拌され、密閉容器の中でマイクロバブル／ナノバブルを含有する超音波造影剤を形成する。機械的な撹拌は、例えば音波振動、手振り、高速機械撹拌、マイクロ装置／流動性装置のＴ−フォーカス、または同軸電気流体力学的微粒化（ＣＥＨＤＡ）によるマイクロ／バブル形成方法によって達成される。本実施例では、機械撹拌機が４５秒間、４，５５０ｒｐｍで使用されることにより、製造物の９９．９％が直径８μm以下となるマイクロバブルが形成される。好ましくは、マイクロバブルの直径は０．２μmから８μmの間である。機械による高速撹拌は、マイクロバブルのサイズ及び粒度分布が効率的に制御される点において好ましい。表１は、透明な脂質担体の溶液の混合物の割合が異なる場合のマイクロバブルの平均的な直径（０．７μmから１８μm）である。下記の合成物の直径は、平均的な直径の測定範囲である０．７μmから１８μmよりも小さい。
【表１】
2014218498.tif 000003
【００３１】
代替として、脂質混合物は（ａ）それぞれＣ８〜Ｃ３０のアルキル鎖を含み、主位相の偏移温度が異なる１つ以上の第１脂質、（ｂ）親水性ポリマー部分と結合し、第１脂質と同じアルキル鎖を有する第２脂質、及び（ｃ）脂質膜を通過し、かつ脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する１種類以上の分子を含む。Ｃ８〜Ｃ３０のアルキル鎖は、直鎖状のアルキル基、分枝アルキル基、アルケニル鎖、アルキニル鎖またはフルオロアルキル基、またはこれらの組み合わせであってよいが、これらに限られない。第１脂質として、複数の親水性Ｃ８〜Ｃ３０末端基を有するポリマーを使用してもよい。
【００３２】
さらに、第１脂質は、例えばこれらのいずれかであってよい。
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DMPG）、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DMPS）、1,2- ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DMPA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DPPA）、2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DPPS）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DPPG）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1’-rac-グリセロール）（DSPG）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DSPA）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DSPS）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸塩（DOPA）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-（1'-rac-グリセロール）（DOPG）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン（DOPS）、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DPTAP）、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DSTAP）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（DMDDA）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミペンタアセテート酸（DPPE-DTPA）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-ジエチレントリアミン五酢酸（DSPE-DTPA）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、トコフェロール、トコトリエノール、パルミチン酸アスコルビル、SPAN（登録商標）、ロキシオール（登録商標）、アトラス（商標）、アラセル（商標）、エムコール（登録商標）及びこれらの組み合わせまたは誘導ポリマー。
【００３３】
第２脂質の炭素鎖構造は、第１脂質の炭素鎖構造（Ｃ８〜３０の骨格）と類似しており、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される。親水性の長鎖ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及び関連するコポリマー、ペプチド、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、またはこれらの組み合わせである。
【００３４】
第２脂質はこれらであってよいが、以下に限られない。
1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DPPE-PEG2000）、1，2−ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]（DPPE-PEG3000）、1，2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]（DPPE-PEG5000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-3000]（DSPE-PEG3000）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-5000]（DSPE-PEG5000）、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリエチレングリコール、TWEEN（登録商標）、Myrj（商標）、アトラス（商標）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート（ビタミンＥ TPGS）、d-アルファ-トコフェリル・ポリエチレングリコール・1000・スクシネート（ビタミンＥ TPGS）、抗体とペグが結合された脂質、ペプチドとペグが結合された脂質、DNAとペグが結合された脂質、RNAとペグが結合された脂質、ビオチンを修飾したペグ化脂質、マレイミドを修飾したペグ化脂質、アミンを修飾したペグ化脂質、及びこれらの組み合わせまたは誘導されるポリマーとの組み合わせ。
【００３５】
脂質膜を通過し、脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する機能を持つ分子は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルブミン、アミノ酸、糖アルコール、ブタン-1,3-ジオール、プロパン-1,2,3-トリオール、プロパン-1,2-ジオール、プロパン-1,3-ジオール、プロパン-1-オール、エタン-1,2-ジオール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホオキシド、またはこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限られない。
【００３６】
透明な脂質担体の溶液の膜の流動性及び脂質膜が自主的に再形成する機能は、脂質混合物の組成を調整することにより、脂質混合物の脂質膜を通過する分子が混合される割合を調節することによって調節される。その後、脂質担体の溶液は、主位相の偏移温度よりも低い温度で乳化または機械的に撹拌されることにより、直径が好ましくは０．２μmから８μm（大きさは限定されない）となるマイクロバブル／ナノバブルを形成し、温度の範囲は摂氏１０℃から６０℃の範囲となる。
【００３７】
音波振動、手振り、高速機械撹拌、マイクロ装置／流動性装置のＴ−フォーカス、または同軸電気流体力学的微粒化（ＣＥＨＤＡ）によるマイクロ／バブル形成方法を用いて最適効率を有するマイクロバブル／ナノバブルを形成するには、例えばウォーターバス、熱乾燥、機械的な撹拌などによって、機械的な撹拌の前に透明な脂質担体の溶液の温度を上昇させた後、温度を脂質担体の主位相の偏移温度にまで低下させ、全体の透明な脂質担体の溶液を機械的に撹拌する方法が挙げられる。代替案として、例えば、機械撹拌機とヒーター／クーラーとを同時に使用し、脂質担体の温度の調節を促進させてもよい。
【００３８】
図２は、本開示の第１実施例による、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置の斜視図である。
【００３９】
装置１００に配置される脂質混合物の原材料は、（ａ）それぞれ１つまたは２つの鎖長８〜３０炭素原子（Ｃ８〜Ｃ３０のアルキル鎖）を有する、主位相の偏移温度が異なる１つ以上の第１脂質、及び（ｂ）親水性ポリマー部分と結合する第２脂質、または脂質膜を通過し、かつ脂質二重層の間のファンデルワールス力を低下する分子を含む。第２脂質の炭素鎖構造は、第１脂質の炭素鎖構造（Ｃ８〜３０の骨格）と類似しており、分子量が２００〜２００，０００の間である親水性の長鎖ポリマーと結合される。脂質混合物は蒸留水に溶解するための初期材料として使用される。
【００４０】
図３は、図２の装置１００の断面図である。装置１００は、機械的な撹拌を引き起こす機械撹拌機１１０と、透明な脂質担体の溶液の温度を主位相の偏移温度に調整する温度調整部１２０と、を有する。
【００４１】
クランプ（図示しない）によって保持される密閉容器２００に最初の撹拌が行われた後、機械撹拌機１１０からの撹拌が脂質担体に行われると、マイクロバブル／ナノバブルが容器の内部で形成される。
【００４２】
図４は、本開示による機械撹拌機１１０の斜視図である。機械撹拌機１１０は、密閉容器２００を保持するクランプ１１１と、クランプ１１１に接続されて振動されるレバー１１２と、レバー１１２と接続されてクランプ１１１及びレバー１１２と統合されて電気を出力するモーター１１３と、レバー１１２の端部に配置され、その動きを制御するファスナー（図示しない）と、を有する。クランプ１１１とレバー１１２との反復運動がスムーズに行われることによって、モーター１１３及びファスナーの抑制が機能することにより、前述の機会的撹拌または乳化が達成される。図５は、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する機械に、機械撹拌機を組み入れた状態の斜視図である。本例では、クランプ１１１が温度制御部１２０の上部に配置されることにより、脂質混合物を有する密閉容器２００の温度制御部１２０による調節及びクランプ１１１による固定が容易になる。言い換えると、クランプ１１１とレバー１１２とが、モーターによって水平に反復して撹拌（直線または図９に図示されるような８の字）を行なった場合であっても、クランプ１１１に固定された密閉容器２００の位置は、温度制御部１２０の上部から反復によって移動することがない。この方法であれば、温度を調節する性能が十分に機能する。
【００４３】
さらに、図２、３に図示される通り、装置１００は、全ての構成要素と脂質混合物とを囲うケース１３０を有してもよい。ケース１３０は、構成要素の取付、取り外し、置換を促進するためのリッドを有してもよい。図６は、本開示による温度制御部１２０の正面図である。ケース１３０の内部に配置される温度制御部１２０は、第１ファンセット１２１と、第２ファンセット１２２と、熱コイル１２３と、センサー（図示しない）と、を有する。代替として、温度制御部１２０は、クランプ１１１またはレバー１１２に含まれていてもよい。図７は、本開示による脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置１００の底面図である。図７では、温度制御部１２０はケース１３０の下部に配置されている。
【００４４】
第１ファンセット１２１は、ケース１３０の内部に向けた空気の流れを作るインレット気体３１０を生成し、第２ファンセット１２２は、ケース１３０の外部に向けた空気の流れを作るアウトレット気体３２０を生成する。熱コイル１２３はインレット気体３１０を加熱し、センサーはケース１３０の内部の温度を検知する。
【００４５】
ケース１３０の内部温度が目標温度に達すると、第１ファンセット１２１及び熱コイル１２３が作動する。しかし、第２ファンセット１２２は、熱対流を促進するために、任意で作動する。反して、ケース１３０の内部温度が異なる目標温度に低下すると、任意で第２ファンセット１２２と第１ファンセット１２１とが同時に作動開始する。図８は、空気の流入及び流出を図示した、脂質ベースのマイクロバブル／ナノバブルを製造する装置の正面図である。
【００４６】
別の実施例では、装置１００は、クランプ１１１またはレバー１１２に、熱乾燥部（図示しない）を有してもよい。熱乾燥部によって、密閉容器２００の温度の上昇が促進される。さらに、脂質担体として透明な脂質担体の溶液を含有する密閉容器２００は、機械撹拌機によって発生する激しい振動によって温度上昇が発生する可能性がある。従って、本例では、上昇している温度が目標温度よりも高い場合、機械による撹拌が一時的に停止する。
【００４７】
本開示において、脂質膜の流動性及び透明な脂質担体の溶液の主位相の偏移温度は、脂質混合物の成分によって決まる。脂質担体を含む密閉容器２００は、脂質担体の主位相の偏移温度の範囲で撹拌されることにより、最適なマイクロバブルが形成される。従って、本開示は、マイクロバブル／ナノバブルの製造コストを著しく減少出来る点において優位である。
【００４８】
加えて、マイクロバブル／ナノバブルのサイズ及び直径は、脂質混合物の成分及び脂質担体が機械的に振動される温度によって特定される。
【００４９】
本明細書には実施方法を例示しているが、これらの実施例にはさまざまな変形を加えてもよい。さらに、その技術的範囲は開示された特定の例に限定されず、全ての変形例、代替案なども本開示の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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