(57)【要約】【課題】血小板凝集を決定する方法、ＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固に対する感受性を決定する方法、およびそれらに関するキットを提供すること。【解決手段】血小板の凝集をアッセイする方法であって、血小板と血小板活性化因子とを接触させる工程；活性化した該血小板と、ＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程；および該活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程、を包含し、該ＣＤ４０Ｌ結合部分と該架橋因子とは予め形成された免疫複合体ではなく、そして沈殿した血小板が、該血小板の凝集の指標となる、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、部分的に、血小板の凝集を測定する方法、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の投与の際の凝固に対する感受性を決定する方法、およびそれらに関連するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血栓塞栓合併症（ＴＥＣ）が、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌとは、ＣＤ４０リガンドの略語であり、ＣＤ１５４としても公知）抗体、特に抗ＣＤ４０Ｌに対するヒト化モノクローナル抗体のいくつかの臨床治験において観察されている。活性化Ｔ細胞によって発現されることが知られているが、ＣＤ４０Ｌはまた、活性化ヒト血小板の表面上に存在することもまた示されており、インビトロで内皮細胞における役割を果たし得る（非特許文献１）。しかしながら、血小板／内皮細胞相互作用のレベルにおけるインビトロでの凝固の制御における、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路の役割は、まだ明らかにされていない。
【０００３】
ＣＤ４０Ｌは、活性化Ｔ細胞において発現されることが最初に記載された、ＩＩ型膜タンパク質である。ＣＤ４０Ｌと、そのレセプターであるＣＤ４０との相互作用は、Ｂ細胞分化、増殖、およびヘルパーＴ細胞によって誘導される免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチのために重要である（非特許文献２；および非特許文献３）。血小板と内皮細胞との相互作用におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路の関与が、最近報告された（非特許文献１）。正常の状態下では、ＣＤ４０Ｌは血小板に保管される。活性化の際に、ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ６３、Ｐ−セレクチン、およびいくつかの他のタンパク質の表面出現、および血小板内顆粒からの可溶性メディエーターの放出を伴って、血小板の表面に移行する（非特許文献４）。そのようにして、ＣＤ４０Ｌは凝固前の活性における役割を果たし得る。
【０００４】
可溶性ＤＣ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）のレベルの上昇は、狼瘡患者の血液において見出されている（非特許文献５；および非特許文献６）。ＩｇのＦｃ部分に対する自己抗体であるリウマチ因子（ＲＦ）は、しばしば、自己免疫疾患の患者の血清において検出される（非特許文献７）。したがって、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の投与は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体に対する抗体の産生をもたらし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，５９１−５９４
【非特許文献２】Ｆｏｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１４，５９１−６１７
【非特許文献３】ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，２０００，６７，２−１７
【非特許文献４】Ｍｕｒａｎｏ  Ｇ．，Ｂａｓｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，１９８０，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
【非特許文献５】Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９９，１０４，９４７−９５５
【非特許文献６】Ｖａｋｋａｌａｎｋａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，１９９９，４２，８７１−８８１
【非特許文献７】Ｍａｇｅｅｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７，８１５，２９６−３１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、血小板の凝集をアッセイする方法を提供し、この方法は、血小板と血小板活性化因子とを接触させる工程、活性化血小板とＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程、この活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程を包含し、凝集が、血小板の沈殿によって定量化される。このＣＤ４０Ｌ結合部分とこの架橋因子とは、予め形成された免疫複合体ではない。上記血小板活性化因子は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンバルキシン（ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ）から選択される。血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）から得ることができる。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ｈｕ５ｃ８）である。上記架橋因子は、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される。抗ＣＤ４０Ｌ抗体対ｓＣＤ４０Ｌの比は、１：１０００〜１０００：１、１：５００〜５００：１、または３：２であり得る。
【０００７】
本発明はまた、血小板の凝集をアッセイする方法を提供し、この方法は、ＡＤＰによって血小板を活性化する工程、活性化血小板と、抗ＣＤ４０Ｌ抗体とを接触させる工程、およびこの活性化血小板とｓＣＤ４０Ｌまたは抗ｈＦｃ抗体とを接触させる工程を包含し、沈殿した血小板が、この血小板の凝集の指標となる。上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体とｓＣＤ４０Ｌとは、予め形成された免疫複合体ではない。
【０００８】
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固に対して個体が感受性であるか否かを決定する方法を提供し、この方法は、ヒトから血小板を採取する工程、この血小板と血小板活性化因子とを接触させる工程、活性化血小板とＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程、この活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程、および血小板凝集の存在または非存在を決定する工程を包含し、ここで、７０％またはそれより多い血小板の凝集が、凝固に対する感受性の指標となる。上記ＣＤ４０Ｌ結合部分と架橋因子とは、予め形成された免疫複合体ではない。上記血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンボルキシンから選択される。血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）から得ることができる。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ｈｕ５ｃ８）である。上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される。抗ＣＤ４０Ｌ抗体対ｓＣＤ４０Ｌの比は、１：１０００〜１０００：１、１：５００〜５００：１、または３：２であり得る。
【０００９】
本発明はまた、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の投与の際の凝固に対してヒトが感受性であるか否かを決定する方法を提供し、この方法は、そのヒトから血小板を採取する工程、その血小板をＡＤＰで活性化する工程、活性化血小板と抗ＣＤ４０Ｌ抗体とを接触させる工程、活性化血小板とｓＣＤ４０Ｌまたは抗ｈＦｃ抗体とを接触させる工程、および血小板凝集の存在または非存在を決定する工程を包含し、７０％またはそれより多い血小板凝集が、凝固に対する感受性の指標となる。上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体と上記架橋因子とは、予め形成された免疫複合体ではない。
【００１０】
本発明はまた、血小板活性化因子、架橋因子、および必要に応じてＣＤ４０Ｌ結合部分を含むキットを提供する。この血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、
トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンボルキシンから選択される。上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ｈｕ５ｃ８）であり得る。上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される。上記キットはさらに、少なくとも１本の針、血液を受容するための容器、アッセイ構成要素を受容するための容器、および指示書を含み得る。いくつかの実施形態において、アッセイ構成要素を受容するための容器は、キュベットである。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
血小板の凝集をアッセイする方法であって、
血小板と血小板活性化因子とを接触させる工程；
活性化した該血小板と、ＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程；および
該活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程、
を包含し、該ＣＤ４０Ｌ結合部分と該架橋因子とは予め形成された免疫複合体ではなく、そして沈殿した血小板が、該血小板の凝集の指標となる、方法。
（項目２）
上記血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンバルキシンから選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記血小板活性化因子はＡＤＰである、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記血小板は、多血小板血漿から得られたものである、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体はｈｕ５ｃ８である、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、および抗ｈＦｃ抗体から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、１：１０００〜１０００：１である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、１：５００〜５００：１である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、３：２である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
血小板凝集をアッセイする方法であって、
ＡＤＰで血小板を活性化する工程；
活性化した該血小板と、抗ＣＤ４０Ｌ抗体とを接触させる工程；および
該活性化血小板と、ｓＣＤ４０Ｌまたは抗ｈＦｃ抗体とを接触させる工程
を包含し、該抗ＣＤ４０Ｌ抗体とｓＣＤ４０Ｌとは、予め形成された免疫複合体ではなく、そして沈殿した血小板は、該血小板の凝集の指標となる、方法。
（項目１３）
ヒトがＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固に感受性であるか否かを決定する方法であって、
該ヒトから血小板を採取する工程；
該血小板と、血小板活性化因子とを接触させる工程；
活性化血小板と、該ＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程；
該活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程であって、該ＣＤ４０Ｌ結合部分と該架橋因子とは予め形成された免疫複合体ではない、工程；および
血小板凝集の存在または非存在を決定する工程
を包含し、７０％またはそれより多くの血小板の凝集が、凝固に対する感受性の指標となる、方法。
（項目１４）
上記血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンバルキシンから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記血小板活性化因子はＡＤＰである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記血小板は、多血小板血漿から得られる、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体はｈｕ５ｃ８である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、および抗ｈＦｃ抗体から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、１：１０００〜１０００：１である、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、１：５００〜５００：１である、項目１３に記載の方法。
（項目２３）
ＣＤ４０Ｌ結合部分対架橋因子の比は、３：２である、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
ヒトが抗ＣＤ４０Ｌ抗体の投与の際の凝固に感受性であるか否かを決定する方法であって、
該ヒトから血小板を採取する工程；
該血小板をＡＤＰで活性化する工程；
活性化した該血小板と、該抗ＣＤ４０Ｌ抗体とを接触させる工程；
該活性化血小板と、ｓＣＤ４０Ｌまたは抗ｈＦｃ抗体とを接触させる工程であって、該抗ＣＤ４０Ｌ抗体とｓＣＤ４０Ｌとは予め形成された免疫複合体ではない、工程；および
血小板凝集の存在または非存在を決定する工程
を包含し、７０％またはそれより多くの血小板の凝集が、凝固に対する感受性の指標となる、方法。
（項目２５）
血小板活性化因子および架橋因子を含む、キット。
（項目２６）
上記血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチン、およびコンバルキシンから選択される、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
上記血小板活性化因子はＡＤＰである、項目２５に記載のキット。
（項目２８）
ＣＤ４０Ｌ結合部分をさらに含む、項目２５に記載のキット。
（項目２９）
上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体はｈｕ５ｃ８である、項目２９に記載のキット。
（項目３１）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される、項目２５に記載のキット。
（項目３２）
上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、および抗ｈＦｃ抗体から選択される、項目２５に記載のキット。
（項目３３）
少なくとも１本の針、血液を受容するための容器、アッセイ構成要素を受容するための容器、および指示書をさらに含む、項目２５に記載のキット。
（項目３４）
アッセイ構成要素を受容するための上記容器がキュベットである、項目３３に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＲＰコントロールと比較した、サンプルを透過する光のパーセントを示す、Ｂｉｏｄａｔａ  ４−チャネル血小板凝集プロファイラーによって作成したトレースを示す。このトレースは、最適以下のＡＤＰ添加の４分後に終了し、そして最終値は、凝集した血小板のパーセントであるとみなされる。ＡＤＰ滴定を実施し、各ＰＲＰサンプルについてのＡＤＰの最適以下の濃度を決定する。
【図２】図２は、活性化血小板が表面ＣＤ４０Ｌを発現していることを示す。ヒト血小板を、１分間、１０分間、２０分間、４０分間、または６０分間、１０μＭのＡＤＰと一緒に、またはＡＤＰなしで、インキュベートした。血小板表面上のＣＤ４０Ｌはビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体と相互作用することができるので、血小板表面上のＣＤ４０Ｌの活性化により誘導される増加が、活性化血小板に結合したビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体に対するウェスタンブロッティングによって定量化される。
【図３】図３は、血小板凝集が抗ＣＤ４０Ｌ抗体とｓＣＤ４０Ｌとの複合体によって影響されることを示す。ＰＲＰは、１０人の健常なドナーから入手した。抗ＣＤ４０Ｌ抗体およびｓＣＤ４０Ｌを、ＰＲＰ添加の少なくとも２０分前に混合した。滴定を各ドナーについて実施し、最適以下の凝集を生じるＡＤＰ濃度を決定した。凝集を、最適以下濃度のＡＤＰを使用して誘導した。各ドットは、１人の個人に由来する結果を示す。
【図４】図４は、血小板の凝集が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体と組換えｓＣＤ４０Ｌとの複合体によって特異的に増強されることを示す。ＰＲＰは、１人の健常な個体から入手した。凝集は０．７５μＭのＡＤＰで誘導し、これをこのドナーについての最適以下であると決定した。抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ｈＩｇＧおよびアグリコシル抗ＣＤ４０Ｌ抗体を、２００μｇ／ｍＬで、ｓＣＤ４０Ｌを３０μｇ／ｍＬで評価した。抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはｈＩｇＧは、ＰＲＰ含有キュベットへの添加の２０分以上前に、組換えｓＣＤ４０Ｌと混合した。バーは、２つのデータ点の平均および標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実施形態の説明）
本発明は、血小板凝集をアッセイする方法、ヒトがＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固に対して感受性であるか否かを決定する方法、およびこれらの方法において使用され得るキットを提供する。
【００１３】
一局面において、本発明は、血小板凝集をアッセイする方法を提供し、この方法は、血小板と血小板活性化因子とを接触させる工程、活性化血小板とＣＤ４０Ｌ結合部分とを接触させる工程、およびその活性化血小板と架橋因子とを接触させる工程を包含する。沈殿した血小板が、血小板凝集の指標となる。上記ＣＤ４０Ｌ結合部分と上記架橋因子とは、血小板に加えられるときに、予め形成された免疫複合体ではない。沈殿した血小板は、血小板凝集の指標となる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記血小板は、ヒトのような哺乳動物から得られる。血小板は、ヒトから得られたＰＲＰに存在し得る。さらに、血小板は、所望される場合にはＰＲＰから単離され得る。いくつかの実施形態において、血小板またはＰＲＰは、例えばヒトがＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固または血小板凝集の危険があるか否かを決定するためのＣＤ４０Ｌ結合部分（例えば、抗ＣＤ４０Ｌ抗体）の投与の前に、ヒトから得られる。血液は、広範に公知の技術によってヒトから入手され得る。ＰＲＰは、一般的に使用される分離技術によって細胞成分から分離され得る。この分離技術としては、例えば、遠心分離などが挙げられる。代表的な血小板調製は、以下の実施例２に記載されている。セファロースゲル濾過カラムによる精製は、Ｆｉｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９７６，８４，１１−２４および以下の実施例３に記載されている。
【００１５】
上記血小板またはＰＲＰは、血小板活性化因子と接触させられる。本明細書中で使用される場合、句「血小板活性化因子」とは、最適以下に血小板を活性化するために使用され得る任意の化合物をいう。ＣＤ４０Ｌ結合部分によって引き起こされる凝集を区別することができるように、血小板の最適以下の活性化が所望される。例えば、血小板は、ある量の血小板活性化因子と接触され、閾値量または最適以下量の血小板凝集を誘導する。血小板凝集のこの量は、ＣＤ４０Ｌ結合部分によって誘導される凝集の量よりも少ないものでなければならず、０％の凝集〜７０％の凝集、またはその中の任意の部分範囲の範囲であり得る。血小板活性化因子は、当業者に周知であり、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン（例えば、ＴｘＡ２）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ｐ−セレクチン、コンバルキシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
上記血小板はまた、ＣＤ４０Ｌ結合部分と接触される。本明細書中で使用される場合、句「ＣＤ４０Ｌ結合部分」とは、機能的Ｆｃ抗体ドメインを含み、かつＣＤ４０Ｌに結合することもできる任意の物質である。いくつかの実施形態において、このＣＤ４０Ｌ結合部分は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体である。本明細書中で使用される場合、句「抗ＣＤ４０Ｌ抗体」は、ＣＤ４０Ｌおよび／またはｓＣＤ４０Ｌに結合することができ、かつＦｃレセプターと機能的に相互作用することもできる任意の抗体、そのフラグメントまたは変異体を意味する。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤ４０Ｌ抗体は、完全にインタクトなＦｃ領域を含む。他の実施形態において、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、完全にインタクトであるが改変されたＦｃ領域を含み、ここでこの改変は、Ｆｃレセプターの結合および／またはシグナル伝達を妨害しない。他の実施形態において、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、変異型および／または短縮型Ｆｃ領域を含み、この変異および／または短縮は、Ｆｃレセプターの結合および／またはシグナル伝達を妨害しない。抗ＣＤ４０Ｌ抗体は当業者に周知であり、例えばｈｕ５ｃ８が挙げられる。さらなる抗ＣＤ４０Ｌ抗体としては、Ｍ９０、Ｍ９１、Ｍ９２、ＩＤＥＣ１３１、およびＡｎＣｅｌｌ抗ＣＤ１５４Ｌ（２４−３１としても公
知）、ならびにＧｒａｙら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４，６，３０３−３１０、およびＮｏｅｌｌｅ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９６，４，４１５−４１９に開示されるものが挙げられる。さらに、ＣＤ４０−Ｆｃは、ＣＤ４０Ｌを架橋することができる試薬である。
【００１７】
上記血小板はまた、架橋因子とも接触させられる。本明細書中で使用される場合、句「架橋因子」とは、ＣＤ４０Ｌ結合部分を架橋するために使用され得る任意の因子を意味する。適した架橋因子は当業者に周知であり、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４０Ｌ結合部分対ｓＣＤ４０Ｌの比率は、１：１０００〜１０００：１、１：５００〜５００：１、１：１００〜１００：１、１：１０〜１０：１、または３：２である。
【００１８】
血小板と、血小板活性化因子、ＣＤ４０Ｌ結合部分および架橋因子との接触の際に、血小板の沈殿が血小板凝集の指標となる。血小板沈殿の欠如は、血小板凝集の欠如の指標である。いくつかの実施形態において、ネガティブコントロールまたはブランクが、血小板凝集のベースラインまたは閾値量を確立するために使用され得る。血小板、血小板活性化因子、ＣＤ４０Ｌ結合部分、および架橋因子を含む試験サンプルは、血小板凝集を測定するためにアッセイされ得、そしてベースラインの血小板凝集と比較され得る。試験サンプルとネガティブコントロールとの間の血小板凝集における任意の差異が、その試験サンプルにおける血小板凝集の指標であり得る。このアッセイは、例えば試験チューブ、遠心チューブまたはキュベットのような、アッセイ成分を受容するための任意の適した容器において実施され得る。
【００１９】
別の局面において、本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ結合部分の投与の際の凝固に対してヒトが感受性であるか否かを決定する方法を提供する。上述のように、凝固を含む血栓塞栓合併症が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体のヒトへの投与の際に観察されている。従って、いくつかの例において、抗ＣＤ４０Ｌ抗体または他の任意のＣＤ４０Ｌ結合部分を受容することを企図しているヒトが、処置の際にそのような合併症を起こすことに対して感受性であるか否かを決定することが望ましい。代表的な方法は、ヒトから血小板を採取し、その血小板を上述のような血小板活性化因子で活性化させ、その活性化した血小板を上述のようなＣＤ４０Ｌ結合部分と接触させ、その活性化した血小板を上述のような架橋因子と接触させ、そして血小板凝集の存在または非存在を決定することを包含する。このＣＤ４０Ｌ結合部分と架橋因子とは、予め形成された免疫複合体ではない。
【００２０】
血小板凝集、およびその存在または非存在は、当業者に公知の多数の手段によって決定され得る。例えば、血小板沈殿の指標である血小板の凝集は、以下の実施例に記載されるようにモニタリングされ得る。血小板凝集の量は、例えばＣＤ４０Ｌ結合部分およびその血小板に依存して、サンプルごとに変動し得る。血小板凝集の量が７０％以上である場合、または７５％以上である場合、または８０％以上である場合、または８５％以上である場合、または９０％以上である場合、または９５％以上である場合、凝固および／または血栓塞栓合併症に対する感受性の指標である。例えば抗ＣＤ４０Ｌ抗体での処置を受けることを企図しており、かつ本明細書中に記載されるアッセイ方法において試験が陽性である（すなわち、７０％以上の血小板凝集を有する）ヒト（すなわち、そのヒトは凝固に対して感受性である）は、代替的な治療レジメンが企図され得る。実際に、ヘルスケアの専門家は、本明細書中に記載されるアッセイにおける特定の結果を受け取った際には、代替的な治療を申し出るだろう。
【００２１】
別の局面において、本発明は、血小板活性化因子、架橋因子、および必要に応じてＣＤ
４０Ｌ結合部分を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記血小板活性化因子は、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサン、好中球エラスターゼ、ｐ−セレクチンおよびコンバルキシンから選択される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ４０Ｌ結合部分は、例えばｈｕ５ｃ８のような抗ＣＤ４０Ｌ抗体である。いくつかの実施形態において、上記架橋因子は、ｓＣＤ４０Ｌ、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ｈＦｃ抗体、ＲＦ、Ｆｃレセプター陽性アクセサリー細胞、可溶性プロテインＡ、および可溶性ヒトＦｃレセプターから選択される。このキットはまた、例えば針、血液を受容するための容器、アッセイ成分を受容するための容器、および本明細書中に記載される方法を実施するための指示書のような、さらなる品目も含み得る。いくつかの実施形態において、アッセイ成分を受容するための容器はキュベットである。
【００２２】
本明細書中に開示される発明がより効率的に理解され得るために、実施例が以下に提供される。これらの実施例は単に例示目的のためのものであり、決して本発明を限定すると解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００２３】
（実施例１：試薬）
研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体、組換えｓＣＤ４０Ｌ、および組換え可溶性ＣＤ４０−ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質（ＣＤ４０−Ｆｃ）を、Ｂｉｏｇｅｎにて調製した（Ｆｅｒｒａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，３９，７７−８４）。コントロールのヒトＩｇＧは、Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から購入したヒトＩｇＧ１κであった。ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体（抗ｈＦｃ）は、親和性精製されたマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）であった。Ｒｂ７７９は、ＣＤ４０ＬのＣ末端に由来するペプチドに対して惹起されたウサギ抗血清である（Ｇａｒｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，３３５４５−３３５５０）。
【００２４】
（実施例２：多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製および血小板の回収）
インビトロ血小板凝集実験において使用した全ての血小板は、１０日以内にアスピリンまたはアスピリン含有化合物を摂取していないと言った健常なヒトボランティアから単離した。凝集アッセイは、ＰＲＰに対して実施した。約５０ｍＬの全血を、０．５ｍＬの３．８％クエン酸ナトリウムを含む４．５ｍＬのＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブにアリコートで収集した。ＰＲＰは、抗凝固性の血液を２００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集することによって調製した。
【００２５】
（実施例３：ウェスタンブロッティング）
ＣＤ４０Ｌに対するウェスタンブロッティングを、以下のように調製した精製血小板において実施した。総量５０ｍＬの全血を０．５ｍＬの３．８％クエン酸ナトリウムを含む４．５ｍＬのＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブにアリコートで収集した。ＰＲＰを、その血液を２０分間１８０ｇで遠心分離することによって調製した。収集されたＰＲＰ上清を、カラム用量の２倍のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で事前に平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ２Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）ゲル濾過カラムに流した。血小板を溶出させ、ＰＢＳで洗浄した。ウェスタンブロッティングを、血小板中に存在するＣＤ４０Ｌの量を定量するために実施した。簡潔に述べると、血小板をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で処理し、タンパク質を、勾配ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，６８０−６８５）で電気泳動することによって解離させた。そのタンパク質をニトロセルロース（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７９，７６，４３５０−４３５４）に移し、その膜を、ヒトＣＤ４０Ｌタンパク質のＣ末端に
由来するペプチドに対して惹起させたウサギ抗血清であるＲｂ７７９でブロッティングした（Ｇａｒｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，３３５４５−３３５５０）。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化させたヤギ抗ウサギ抗血清によって検出した。組換えｓＣＤ４０Ｌの段階希釈を、血小板由来タンパク質サンプルとパラレルで評価した。その血小板サンプル中のＣＤ４０Ｌの量は、組換えｓＣＤ４０Ｌ標準との比較によって見積もった。
【００２６】
血小板を、ビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体とインキュベートし、ＣＤ４０Ｌが血小板の表面上に存在するか否かを決定した。ＰＲＰを、１０μＭのＡＤＰと一緒に、またはＡＤＰなしで、１分間、１０分間、２０分間、４０分間、または６０分間インキュベートし、次いで、ビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体とインキュベートした。結合していない抗体を、ＰＢＳで洗浄することによって血小板から除去した。血小板に結合した抗ＣＤ４０Ｌ抗体の量を、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジンを使用するウェスタンブロッティングによって決定した。ビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体の血小板への特異的結合を、その抗体を組換えｓＣＤ４０Ｌとプレインキュベートすることによって評価した。
【００２７】
（実施例４：血小板凝集アッセイ）
Ｂｉｏｄａｔａ  ４チャネル血小板凝集プロファイラー（ＰＡＰ−４；Ｂｉｏｄａｔａ
Ｃｏｒｐ．，Ｈａｔｂｏｒｏ，ＰＡ）を、乏血小板血漿（ＰＰＰ）のみを含むキュベットを使用してブランクとした。約２〜５×１０８／ｍＬの血小板を含むＰＲＰの３５０μＬアリコートを、攪拌棒を備えるキュベットに加えた。抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ヒトＩｇＧ、正常ヒト血清、ＣＤ４０−Ｆｃ、または抗ｈＦｃを、総容量１００μＬで加えた。充填されたキュベットを機械上に配置し、ＡＤＰの添加前に反応成分を混合した。
【００２８】
凝集を、最適以下濃度（最終濃度は各個体サンプルに応じて変動する）のＡＤＰの５０μＬの添加によって開始した。上記凝集プロファイラーは、同時に稼動し得る４つのポートを有する。凝集のトレースを、ＡＤＰの添加後４分間、各サンプルについて作成した。トレースの最後に、機器が、サンプルを通る光の透過とＰＰＰブランクを通る光の透過とを比較することによって、凝集のパーセンテージを算出する。代表的なＡＤＰ滴定を示すトレースを、図１に示す。各実験の開始時に滴定を実施し、その後の試行を最適以下のＡＤＰ濃度で実施した。
【００２９】
（実施例５：活性化血小板の表面上でのＣＤ４０Ｌの発現）
ＣＤ４０Ｌの発現は、ヒト血小板から調製した溶解物において容易に検出した（データは示さず）。ＣＤ４０Ｌが静止型血小板および／または活性化血小板で発現されるか否かを決定するために、血小板をビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体と一緒にインキュベートし、表面ＣＤ４０Ｌの存在を、結合したビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体を定量することによって決定した。ＣＤ４０Ｌの表面発現を、１０μＭのＡＤＰと一緒に、またはＡＤＰなしでのインキュベートの１分後、１０分後、２０分後、４０分後、および６０分後に評価した。ＣＤ４０Ｌの表面発現は、活性化のわずか１分後にＡＤＰ活性化血小板上で検出可能であり、経時的に増加した（図２）。ｓＣＤ４０Ｌとのビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体のプレインキュベートは活性化血小板への結合を阻害する（データは示さず）ので、ビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体の結合はＣＤ４０Ｌに特異的である。不活性化（「静止型」）血小板上で検出された表面ＣＤ４０Ｌの量もまた、経時的に増加した。この現象は、本発明者らの実験条件下での血小板活性化の基本レベルに起因するようである。
【００３０】
それにもかかわらず、ＡＤＰ処理された血小板上で発現する表面ＣＤ４０Ｌの量は、一致する未処理コントロールよりも一貫して高かった。これらの結果は、ＣＤ４０Ｌが通常は血小板の内部に隠れており、活性化の際に表面に転位するという概念と一致する。さらに、ビオチン結合体化抗ＣＤ４０Ｌ抗体の結合により、抗ＣＤ４０Ｌが血小板表面上に存
在するＣＤ４０Ｌ分子を認識することが確認される。
【００３１】
（実施例６：血小板部分におけるＣＤ４０Ｌの量の評価）
活性化血小板の表面上に発現されるＣＤ４０ＬはＣＤ４０Ｌ抗体によって認識され得るので、抗ＣＤ４０Ｌ抗体に対するこの潜在的な「くぼみ（ｓｉｎｋ）」のサイズを評価することが重要である。ウェスタンブロッティング法を使用して、血小板中のＣＤ４０Ｌの量を、組換えｓＣＤ４０Ｌ標準の既知の量と比較した。１００万個の血小板におけるＣＤ４０Ｌの量は、約８０ｐｇであると見積もられる。新たに採血した血液の各１ｍＬは約３００万個の血小板を含み、平均的な人は約５Ｌの総容量を有する。計算上は、約１２０μｇのＣＤ４０Ｌが、平均的な個体の血小板部分に存在する。
【００３２】
（実施例７：血小板凝集における研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体の効果）
抗ＣＤ４０Ｌ抗体と、活性化血小板上で発現されたＣＤ４０Ｌとの相互作用が止血カスケードに影響するか否かを決定するために、研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下での健常なヒトの血小板の凝集を試験した。研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、広範なＡＤＰ濃度にわたって、ＡＤＰ活性化血小板の凝集に影響しなかった（表１〜３）。静止型血小板もまた、抗ＣＤ４０Ｌ抗体によって影響されなかった（表１および表３〜５）。予想されたように、コントロールのヒトＩｇＧ抗体（表２および表３）は、血小板凝集に影響しなかった。ＣＤ４０−Ｆｃを評価し、血小板の表面上に発現されるＣＤ４０Ｌに対する二量体レセプタータンパク質の結合が凝集に影響するか否かを決定した。ＣＤ４０−Ｆｃは、血小板凝集に影響しなかった（表４）。
【００３３】
（実施例８：血小板凝集における架橋抗ＣＤ４０Ｌ抗体の効果）
（抗体によって架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体）
抗ＣＤ４０Ｌ抗体がＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体によって架橋されるときに凝集における影響があるか否かを決定するために、活性化血小板および静止型血小板を、架橋因子としての抗ｈＦｃと一緒に、または抗ｈＦｃなしで、抗ＣＤ４０Ｌ抗体で処理した。一方の実験では、架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体の効果を、種々の量のＡＤＰおよび抗ｈＦｃで交差滴定した（表５）。抗ＣＤ４０Ｌ抗体の、２０μｇ／ｍＬまたは６．６６μｇ／ｍＬの抗ｈＦｃとの架橋は、血小板凝集に影響しなかった（表５）。しかしながら、抗ＣＤ４０Ｌ抗体が２．２２μｇ／ｍＬの抗ｈＦｃと架橋されたときに、凝集の増加が観察された（表５、１０９の行と１１０の行との比較）。そのような増強効果は、低濃度のＡＤＰが活性化に使用されたときには観察されなかった（表５）。血小板は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を架橋するとは考えられない通常のヒト血清の存在下では、抗ＣＤ４０Ｌ抗体によって影響されなかった（表６）。これらの結果は、抗体によって架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体による血小板凝集の増強が、可能性があることを示唆している。
【００３４】
（可溶性ＣＤ４０Ｌリガンドによって架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体）
複数の濃度の抗ＣＤ４０Ｌ抗体とｓＣＤ４０Ｌとを、血小板凝集アッセイにおいて評価し、ｓＣＤ４０Ｌによって架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体が血小板凝集を増強するか否かを決定した。ｓＣＤ４０Ｌおよび抗ＣＤ４０Ｌ抗体において利用可能な結合部位の数に基づいて、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、２分子の三量体ｓＣＤ４０Ｌが３分子の二価抗ＣＤ４０Ｌ抗体に結合したときに、最大に架橋される。計算によると、最大の架橋のための重量／重量比は、理論上、抗ＣＤ４０Ｌ抗体  ３．７５対ｓＣＤ４０Ｌ  １である。この範囲におけるいくつかの比率を試験し、２３３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０Ｌ抗体と、３０μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌが、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の最大架橋のための条件であることが、実験的に見出された。１０倍低い濃度および１０倍高い濃度の抗ＣＤ４０Ｌ抗体もまた、３０μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌで評価した。この試験は、１０人の健常なドナーから調製されたＰＲＰを使用して実施された。興味深いことに、増強された凝集が、全てではないがいく人かの健常ドナーから単離された血小板で起こった。
【００３５】
血小板凝集は、ｓＣＤ４０Ｌによって最大に架橋された抗ＣＤ４０Ｌによって誘導された（図３）。アグリコシルバージョンのｓＣＤ４０Ｌによって架橋された抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、血小板凝集を増強しなかった。このことは、この効果がＦｃγＩＩａ依存性であることを示している（図４）。コントロールのヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）およびｓＣＤ４０Ｌはともに、血小板凝集に対して効果を有さなかった（図４）。
【００３６】
【表１】
2014112114.tif 000002
抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、静止型血小板の凝集を誘導もしないし、ＡＤＰ活性化血小板の凝集に影響もしない。ＰＲＰをキュベットに入れ、５μｇ／ｍＬの研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体と一緒に、またはそれなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００３７】
【表２】
2014112114.tif 000003
抗ＣＤ４０Ｌ抗体およびコントロールのヒトＩｇＧは、ＡＤＰ活性化血小板に影響しない。ＰＲＰをキュベットに入れ、５μｇ／ｍＬの研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体もしくはヒトＩｇＧと一緒に、またはそれらなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００３８】
【表３】
2014112114.tif 000004
抗ＣＤ４０Ｌ抗体および非特異的ヒトＩｇＧは、静止型血小板の凝集を誘導もしないし、ＡＤＰ活性化血小板の凝集に影響もしない。ＰＲＰをキュベットに入れ、５μｇ／ｍＬの研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体もしくはヒトＩｇＧと一緒に、またはそれらなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００３９】
【表４】
2014112114.tif 000005
活性化血小板の表面上のＣＤ４０Ｌに対する抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはＣＤ４０−Ｆｃの結合は、血小板凝集に影響しない。ＰＲＰをキュベットに入れ、列挙された濃度の研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体もしくはＣＤ４０−Ｆｃと一緒に、またはそれらなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００４０】
【表５】
2014112114.tif 000006
活性化血小板の表面上のＣＤ４０Ｌへの抗ＣＤ４０Ｌ抗体の架橋は、限定された条件下で、凝集を増強し得る。ＰＲＰをキュベットに入れ、２μｇ／ｍＬの研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体および／もしくは列挙された濃度の抗ｈＦｃと一緒に、またはそれらなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００４１】
【表６】
2014112114.tif 000007
正常ヒト血清は、静止型血小板の凝集に影響しなかった。ＰＲＰをキュベットに入れ、２μｇ／ｍＬの研究用グレードの抗ＣＤ４０Ｌ抗体および／もしくは列挙された濃度の正常ヒト血清と一緒に、またはそれらなしで、攪拌した。ＡＤＰを、列挙されている最終濃度まで添加した。４分間の凝集のトレースを各サンプルに対して作成し、凝集のパーセントを算出した。
【００４２】
当業者には、本明細書中に記載されているものに加えて種々の改変が上述の説明から明白である。そのような改変もまた、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。本願において参照された各参考文献（ジャーナルの記事、米国特許、米国以外の特許、特許出願公報、国際出願公報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などが挙げられるが、これらに限定されない）は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【図１】
2014112114.tif 000008
【図２】
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【図３】
2014112114.tif 000010
【図４】
2014112114.tif 000011
【外国語明細書】
2014112114000001.pdf