(57)【要約】      （修正有）【課題】特別な設備や栽培方法を必要とせず、常法による栽培方法によって、品質が高められた柑橘の生産方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列であるＲＮＡ又は前記塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列からなり、前記塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＵであるＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイド、前記ウイロイドを含有する、カンキツ果実の糖度、酸度又は果肉歩合の向上剤、前記ウイロイドを含有する柑橘、および前記ウイロイドを用いたカンキツ果実の糖度、酸度又は果肉歩合を向上させる方法ならびに柑橘果実を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイド：
配列番号１で示される塩基配列であるＲＮＡ、又は、
配列番号１で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であって、配列番号１で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＵであるＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイド、及び
以下のＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイド：
配列番号２で示される塩基配列であるＲＮＡ、又は、
配列番号２で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＡであるＲＮＡ、
を含有する、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含有する、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合の向上剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含有する、柑橘。
【請求項５】
配列番号１で示される塩基配列又は配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含有する、核酸（ただし、核酸がＤＮＡである場合には、塩基配列中のＵはＴである。）。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合を向上させる方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実を製造する方法。
【請求項８】
糖度、酸度、又は果肉歩合の向上した柑橘果実を製造する方法である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
総務省の家計調査年報によると、代表的な柑橘である温州みかんの日本の二人以上の世帯における消費量は、１９８８年は約３２ｋｇ／年であったが、２００８年には約１５ｋｇ／年と２０年間でほぼ半減している。その原因として、冬季に海外から色々な果物が輸入されること、また、イチゴの消費量が増えたことなどが挙げられている。
【０００３】
国内で生産される柑橘の消費量の低下と共に、柑橘生産農家の高齢化や後継者不足が進み、荒廃する柑橘園も増えている。このような状況の中で、消費者の購買意欲を促すため、柑橘生産農家にとって、高品質の柑橘を生産することは大きな課題であり、柑橘産地にとっての悲願ともなっている。
また、高品質の柑橘は、国内の消費を増進するだけでなく、国内で生産される柑橘の輸出競争力を増すことにもつながる。
特に、温州みかんは、カナダではクリスマスオレンジと称して、クリスマスシーズンに食べられている。さらに、温州みかんは、従来からの香港や台湾への輸出に加え、近年は、タイや中国富裕層に対しても輸出されている。
【０００４】
高品質の柑橘として求められることは、柑橘果実の糖と酸の含量や、それに加え果肉歩合が挙げられ、中でも、高い糖度を有する柑橘は、特に消費者に好まれている。
【０００５】
高い糖度の柑橘を生産するために、農家では柑橘園の土壌水分をコントロールして、柑橘樹への水分供給を少なくする栽培方法が一般的に行われている。具体的には、ハウス栽培による雨除け栽培、柑橘樹の周りにマルチを敷いて土壌水分を少なくするマルチ栽培、柑橘樹の周囲の根を切断し根からの水分吸収を少なくする根域制限栽培、ポットで栽培して根域を制限すると共に土壌水分の低下を図るポット栽培、さらに、傾斜地で栽培して水分吸収を少なくする斜面畑方式などが行われている。
しかし、これらの栽培方法は、いずれも多くの資材と労力を要するものである。特に、マルチ栽培は、広く行われているが、何年か継続すると細根が減少し、樹体が衰弱するばかりでなく、果実の酸度が高くなり過ぎる傾向があるなど、難点が指摘されている。さらに、柑橘園の大部分をマルチで覆うことにより、土壌侵食、土砂崩れ、洪水などが発生しやすくなり、防災面からも大きな問題となっている。
そこで、柑橘生産農家は、従来の柑橘栽培法に変わる、省力で高品質な柑橘生産ができる栽培法を期待している。
【０００６】
一方、塩基数が２４６〜４０２の１本鎖の環状ＲＮＡのみで構成され、宿主である植物に感染し、宿主の代謝系に完全に依存して増殖するウイロイドと呼ばれるものが知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。
宿主細胞中に侵入したウイロイドは、宿主の転写酵素によって相補的なＲＮＡに転写された後、再度宿主の酵素によって元の形に転写されて子孫ウイロイドを生じる。
ウイロイドは、タンパク質情報をコードしない「ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ」であり、ＲＮＡ分子中の特定の塩基配列あるいはそれによって規定される分子構造中に、特定の生物種で増殖するための要素、つまり、その生物種を宿主とするか否かの情報が存在しているものと考えられている。
すなわち、ウイルスゲノムの１０分の１にも満たない小さなＲＮＡに、宿主特異性、自立複製能、及び病原性という病原体の持つ全ての要素が備わっている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００７】
これまでに約３０種類のウイロイドが知られている。全てのウイロイドは、同一起源で（例えば、非特許文献４参照）、組換えや変異によって多様化してきたものと考えられている。実際に自然界に存在するウイロイドには、異種ウイロイド間のキメラ構造を示すものが多数観察されている（例えば、非特許文献５参照）。
【０００８】
柑橘に感染するウイロイドには、Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ科の４属に属する６種のウイロイドが知られ、日本でもこれらすべてのウイロイドが生息していることが知られている。これらのウイロイドは、単独又は複合感染することによって、柑橘樹の矮化や台木の樹皮の亀裂などを誘発する場合があることが知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００９】
一方、ウイロイドによっては、柑橘に感染しても影響の少ないウイロイドが知られており、これらを選抜し柑橘に接種することにより、柑橘樹を矮化させ栽培管理を容易にする、密植栽培を可能にする、果実の初期収穫期を早めるなど、その園芸的利用も試みられている（例えば、非特許文献７、８参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｉｅｎｅｒ, Ｔ. Ｏ.， １９７７， Ｖｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献２】Ｄｉｅｎｅｒ, Ｔ. Ｏ.， １９８８， Ｔｈｅ ｖｉｒｏｉｄｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献３】佐野輝男， ２００４， ウイロイドの病原性と宿主適応， 植物ウイルス病研究会レポート， ７：１−１１
【非特許文献４】Ｅｌｅｎａ, Ｓ. Ｆ. ｅｔ ａｌ.， １９９１， Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｖｉｒｏｉｄｓ, ｖｉｒｏｉｄｌｉｋｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＲＮＡｓ, ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｏｉｄｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ δｖｉｒｕｓ ＲＮＡ， Pｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ， ８８:５６３１-５６３４
【非特許文献５】Ｓｐｉｋｅｒ, Ｒ. Ｌ.， １９９６， Ｉｎ-ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ‘ｉｎｖｅｒｓｅ’ ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｃｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉ ｖｉｒｏｉｄｓ ｅｖｏｌｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ， Ｊ. Ｇｅｎ. Ｖｉｒｏｌ.， ７７:２８３９-２８４６
【非特許文献６】伊藤隆男， ２００４， 国内のカンキツが保毒するウイロイドの発生生態と診断に関する研究，果樹研報， ３：９３−９５
【非特許文献７】Ｓｅｍａｎｃｉｋ, Ｊ. Ｓ. ｅｔ ａｌ.， １９９７， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｖｉｒｏｉｄｓ ｆｏｒ ｄｗａｒｆｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ‘Ｖａｌｅｎｃｉａ’ ｏｒａｎｇｅ， Ｊ. Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７２(４)：５６３−５７０.
【非特許文献８】Ｈａｔｔｏｎ, Ｒ. Ｊ. ｅｔ ａｌ.， ２０００， Ｖｉｒｏｉｄ ｄｗａｒｆｉｎｇ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｉｔｒｕｓ ｐｌａｎｔｉｎｇｓ， ｐ．２７７-３１７ ｉｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｖｏｌ. ２４ (ｅｄ. Ｊａｎｉｃｋ, Ｊ.)， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記従来の問題点を解消し、特別な設備や栽培方法を必要とせず、常法による栽培方法によって、品質が高められた柑橘の生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを接種した柑橘において、無接種の柑橘と比較して、果実の品質を高めることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、以下のとおりである。
［１］
以下のＲＮＡの含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイド：
配列番号１で示される塩基配列であるＲＮＡ、又は、
配列番号１で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であって、配列番号１で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＵであるＲＮＡ。
［２］
［１］に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイド、及び
以下のＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイド：
配列番号２で示される塩基配列であるＲＮＡ、又は、
配列番号２で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＡであるＲＮＡ、
を含有する、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド。
［３］
［１］又は［２］に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含有する、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合の向上剤。
［４］
［１］又は［２］に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含有する、柑橘。
［５］
配列番号１で示される塩基配列又は配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含有する、核酸（ただし、核酸がＤＮＡである場合には、塩基配列中のＵはＴである。）。
［６］
［１］又は［２］に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合を向上させる方法。
［７］
［１］又は［２］に記載の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実を製造する方法。
［８］
糖度、酸度、又は果肉歩合の向上した柑橘果実を製造する方法である、［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特別な設備や栽培方法を必要とせず、常法による栽培方法によって、品質が高められた柑橘を生産することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ノーザン・ハイブリダイゼーションによる弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの感染試験の結果を示す。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによる弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの感染試験の結果を示す。
【図３】弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの接種区及び無接種区から収穫された果実の糖度の結果を示す。具体的には、感染樹がランダムに植えられた接種区の７樹から果実５６個を、同じく無接種樹がランダムに植えられた無接種区の１５樹から果実１１１個を、それぞれサンプリングして、果実ごとに糖度（Ｂｒｉｘ）を分析し、両処理区の糖度に統計的に差があるか、ｔ−検定で調査した。その結果、１％レベルで接種区の糖度が無接種区に比べ、高いことが判明した。
【図４】弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの接種区及び無接種区から収穫された果実の酸度の結果を示す。具体的には、感染樹がランダムに植えられた接種区の７樹から果実５６個を、同じくランダムに植えられた無接種区の１５樹から果実１１１個を、それぞれサンプリングして、果実ごとに酸度を分析し、両処理区の酸度に統計的に差があるか、ｔ−検定で調査した。その結果、１％レベルで接種区の酸度が無接種区に比べ、高いことが判明した。
【図５】弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの接種区及び無接種区から収穫された果実の果肉歩合の結果を示す。具体的には、感染樹がランダムに植えられた接種区の７樹から果実５６個を、同じく無接種樹がランダムに植えられた無接種区の１５樹から果実１１１個を、それぞれサンプリングして、果実ごとに果肉歩合を分析し、両処理区の果肉歩合に統計的に差があるか、ｔ−検定で調査した。その結果、１％レベルで接種区の果肉歩合が無接種区に比べ、高いことが判明した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１７】
「ウイロイド」には、Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ科に属し、柑橘に感染するウイロイドである、Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄ属のカンキツエクソコーティスウイロイド（「Ｃｉｔｒｕｓ  ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ  ｖｉｒｏｉｄ」、「ＣＥＶｄ」）、Ａｐｓｃａｖｉｒｏｉｄ属のカンキツベントリーフウイロイド（「Ｃｉｔｒｕｓ  ｂｅｎｔ  ｌｅａｆ  ｖｉｒｏｉｄ」、「ＣＢＬＶｄ」）、カンキツ矮化ウイロイド（「Ｃｉｔｒｕｓ  ｖｉｒｏｉｄ  ＩＩＩ」、「ＣＶｄ−ＩＩＩ」または「ＣＤＶｄ」）、カンキツウイロイドＯＳ（「Ｃｉｔｒｕｓ  ｖｉｒｏｉｄ  ＯＳ」、「ＣＶｄ−ＯＳ」）、Ｈｏｓｔｕｖｉｒｏｉｄ属のホップ矮化ウイロイド（「Ｈｏｐ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｏｉｄ」、「ＨＳＶｄ」）、及びＣｏｃａｄｖｉｒｏｉｄ属のカンキツウイロイドＩＶ（「Ｃｉｔｒｕｓ  ｖｉｒｏｉｄ  ＩＶ」、「ＣＶｄ−ＩＶ」）が知られている。
これらすべてのウイロイドが、日本で生息していることが知られている。
本発明における「弱毒性カンキツ矮化ウイロイド」は、Ｃｉｔｒｕｓ  ｖｉｒｏｉｄ  ＩＩＩ（ＣＶｄ−ＩＩＩまたはＣＤＶｄ）に属するウイロイドである。
【００１８】
「弱毒性」とは、当業界において汎用される用語であるが、本発明においては、ウイロイドを柑橘に感染させても、台木に剥皮症状、あるいは穂木の生育が著しく悪化し衰弱死するなどの重篤な症状にならなく、その影響が軽微なことを指す。
【００１９】
本発明において、弱毒性ウイロイドは、ウイロイドを柑橘に感染させて、感染植物体個体への生育形態への影響の軽微なものを選択し、樹勢の強いものはある程度矮化させて栽培させるなどの栽培特性に合わせて選抜することにより得ることができる。
【００２０】
具体的には、自然界からウイロイドを分離し、柑橘植物に接種し、栽培、選抜を行うことで、生育形態への影響の皆無のものや、軽微なものを選択し、栽培特性に合う弱毒性ウイロイドを選抜することができる。
「生育形態への影響が皆無または軽微」とは、柑橘樹が著しく悪くなるようなものではないことを指し、通常の栽培条件下で外観上の違いが認められない程度で、数年で矮化栽培に適した程度の矮化（栽培上好ましい性質）が生じることを指す。
なお、弱毒性ウイロイドは、特定の植物種にのみ感染し、ヒト、家畜、野生動物に対して全く無害なウイロイドである。
【００２１】
弱毒性ウイロイドを得るために、次いで、分離したウイロイドを、柑橘に接種して感染させる。
ウイロイドを柑橘に接種するには、柑橘に切り込みを入れウイロイドを含む溶液を接種することによりウイロイドを柑橘に感染させることができる。例えば、柑橘の果実から採取した種子から育てたウイロイドフリーの実生に、カミソリで新梢に切り付け、ウイロイドを含有する溶液などを接種することにより行うことができる。
新梢へのウイロイド接種は、野外で行ってもよく温室内で行ってもよい。
【００２２】
ウイロイドを接種した実生は、その後、核酸を抽出し、ＣＤＶｄ−ＩＩＩのｃＲＮＡをプローブとしてノーザン・ハイブリダイゼーション法やＲＴ−ＰＣＲ法を行なって、感染の有無を確認する。
また、ウイロイドの接種後には、毎年、弱毒性ウイロイドの感染を確認することが好ましい。
【００２３】
弱毒性ウイロイドに感染していると判断した柑橘植物体から、再度、ウイロイドを分離することで、弱毒性ウイロイドを得ることができる。
【００２４】
弱毒性ウイロイドの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法により、弱毒性ウイロイドの配列に基づいて、核酸プライマーペアを設計して、検出することができる。
ＣＥＶｄ、並びにＣＶｄＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのゲノムの塩基配列としては、例えば、既に報告されているものを挙げることができ、それらの塩基配列は、下記表１に示すアクセス番号でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。複数の配列が登録されている場合には、それらの配列の間で変異の見られない領域に基づいて、核酸プライマーペアを設計することが好ましい。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
増幅処理によって得られる増幅産物は、電気泳動法などの公知の方法によって検出することができる。このような方法の実施に必要な条件等は、当業者であれば適切に選択することができる。電気泳動法によって検出を行う場合には、ウイロイドに特異的な断片は、それぞれ泳動度の異なる断片として確認することができ、それらの特異的断片の有無によりウイロイドを確認することができる。
また、ノーザン・ハイブリダイゼーション法によっても、弱毒性ウイロイドの検出を行うことができる。
【００２７】
核酸プライマーペアを用いてＰＣＲ法を行うことにより、ＣＥＶｄについては約３７０塩基、ＣＶｄＩについては約２３０塩基、ＣＶｄＩＩについては約３００塩基、ＣＶｄＩＩＩ（カンキツ矮化ウイロイド）については約２８５塩基、ＣＶｄＩＶについては約２１０塩基、ＣＶｄＶについては約１７０塩基、及びＣＶｄＶＩについては約２５０塩基の増幅断片が検出される。
また、増幅断片について、シークエンサーを用いて、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの塩基配列を決定することができる。
【００２８】
本発明における弱毒性カンキツ矮化ウイロイドは、配列番号１に示される塩基配列であるＲＮＡを含有するウイロイドを含んでいれば、２種以上のウイロイドを含んでいてもよく、かかる２種として、配列番号１に示される塩基配列であるＲＮＡを含有するウイロイドと、配列番号２に示される塩基配列であるＲＮＡを含有するウイロイドと、を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明における弱毒性カンキツ矮化ウイロイドが、２種以上のウイロイドを含む際、２種以上のウイロイドの複数クローンの塩基配列を読むことにより、２種以上のウイロイドの便宜上の存在比率を求めることができる。
かかる塩基配列を読んだことに基づく、２種以上の便宜上の存在比率としては、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合を向上させることができれば、特に限定されるものではないが、便宜上の存在比率として、例えば、配列番号１に示される塩基配列であるＲＮＡを含有するウイロイド：配列番号２に示される塩基配列であるＲＮＡを含有するウイロイドとして、１０：９０〜９０：１０の範囲であってもよく、２０：８０以上、３０：７０以上の範囲であってもよく、８０：２０以下、７０：３０以下、６０：４０以下、５０：５０以下、４０：６０以下の範囲内であってもよい。下記に示すとおり、本発明の実施例において得られたＤ４−１株においては、約３５：６５の存在比率を示した。
【００３０】
本発明においては、例えば、２種以上のウイロイドとして用いる場合、Ｄ４−１株のように、分離された弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いてもよく、また、２種のウイロイドを混合して用いることもでき、より具体的には、寄託されているＣＶｄ−３−２５０Ｕ及びＣＶｄ−３−２５０Ａを任意の範囲で混合して用いてもよい。
【００３１】
また、配列番号１に示される塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイドとしては、配列番号１で示される塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒カンキツ矮化ウイロイドのみならず、配列番号１で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイドであってもよい。
配列番号１で示される塩基配列が欠失、付加、および／または置換されていてもよい場合、本発明の所望の効果を示す範囲で欠失、付加、および／または置換されてもよいが、少なくとも配列番号１で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＵである必要がある。そして、かかる２５０番目の塩基がＵであるとは、かかる２５０番目の塩基に相当する塩基は、Ｕ以外に置換されていないことを意味する。
【００３２】
配列番号２に示される塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイドとしては、配列番号２で示される塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒カンキツ矮化ウイロイドのみならず、配列番号２で示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、付加、および／または置換された塩基配列であるＲＮＡを含有する弱毒性カンキツ矮化ウイロイドであってもよい。
配列番号２で示される塩基配列が欠失、付加、および／または置換されていてもよい場合、本発明の所望の効果を示す範囲で欠失、付加、および／または置換されてもよいが、少なくとも配列番号２で示される塩基配列の２５０番目に相当する塩基がＡである必要がある。そして、かかる２５０番目の塩基がＡであるとは、かかる２５０番目の塩基に相当する塩基は、Ａ以外に置換されていないことを意味する。
【００３３】
また、本発明においては、配列番号１で示される塩基配列又は配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸をも提供する。
【００３４】
かかる塩基配列は、本発明の目的に反しない範囲において、１又は数個（１０個以下であってもよく、５個以下であることが好ましく、３個以下であることがより好ましい。）の塩基が欠失、付加、及び／又は置換された塩基配列であってもよく（８５％以上が相同であればよく、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上が相同である。）、配列番号１で示されるＲＮＡであることが好ましい。ただし、該核酸がＤＮＡである場合には、配列番号１中のＵはＴである。また、配列番号１の塩基配列中には、ＡＴＧＣＵ以外にも、それぞれＡＴＧＣＵと等価な塩基を含んでいてもよく、等価な塩基として、ＡＴＧＣＵの塩基部分が置換又は修飾された塩基を含んでいてもよい。また、核酸中の糖部分が、リボース又はデオキシリボースと等価であれば、置換又は修飾されていてもよい。
【００３５】
本発明においては、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを柑橘に接種することによって、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合を高めることができる柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合の向上剤を提供する。弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実の糖度、酸度、又は果肉歩合を高めることができることにより、特別な設備や栽培方法を必要とせず、常法による栽培方法によって、すなわち、簡便に、高品質の柑橘を提供することができる。
【００３６】
本発明において「柑橘」とは、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）に属する植物を意味し、例えば、ミカン類、オレンジ類、グレープフルーツ類、香酸柑橘類、雑柑類、タンゴール類、ブンタン類、タンゼロ類、カラタチ類、キンカン類などが挙げられる。
中でも、柑橘としては、温州みかんが好適に用いられ、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドは、温州みかん果実の糖度、酸度、果肉歩合等の品質を高めるのに好適である。
【００３７】
本発明においては、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを感染させることで、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含む柑橘を提供することもできる。
弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを含む柑橘としては、柑橘の穂木、苗木、果実、実生、試験管内培養したものや、カラタチの台木に接種したもの、接種した接ぎ木苗などが挙げられる。
【００３８】
本発明においては、分離された弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを用いて、柑橘果実の糖度、酸度、及び／又は果肉歩合を向上させることができる。
具体的には、柑橘実生に対して弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの接種処理を行った後、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドに感染した苗木として圃場に定植することによって、柑橘樹を得ることにより、糖度、酸度、及び／又は果肉歩合が向上した柑橘果実を得ることができる。
また、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを接種した穂木又は台木を養成し、それらを接ぎ木した苗木を柑橘園に定植することによって、柑橘樹を得ることにより、糖度、酸度、及び／又は果肉歩合が向上した柑橘果実を得ることができる。
【００３９】
苗木からの栽培方法については、特に限定されず、一般的な栽培の方法に従って約５年栽培することにより柑橘樹を得ることができる。
収穫した柑橘果実の糖度は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド未接種のものに比べて、約１．０１〜１．４０倍に高めることができる。また、収穫した果実の酸度は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド未接種のものに比べて、約１．０１〜１．４０倍に高めることができる。収穫した果実の果肉歩合は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイド未接種のものに比べて、約１．０１〜１．４０倍に高めることができる。
本発明において、糖度や酸度については、ＨＰＬＣ分析など従来公知の方法により測定することができ、特に限定されるものではないが、実施例に記載する方法により測定することができる。
【００４０】
このようにして、本発明の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを接種した柑橘を栽培することにより、柑橘果皮の歩合が小さくなる、果肉歩合が大きくなる、果実の糖度と酸度が高まる、味が濃くなり美味しくなるなど、省力で高品質の柑橘を栽培することが可能になる。
なお、直花や有葉花の着生の仕方には、本発明における弱毒性カンキツ矮化ウイロイド接種の影響はみられない。
特に、本発明における弱毒性カンキツ矮化ウイロイドは、柑橘にしか感染しないウイロイドであり、普遍的に存在し、また、野外の植物や他の農作物への影響も心配されない。したがって、本発明の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの利用方法は、環境への影響や食品としての安全性にも優れた技術である。
以上のように、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドは、これまでにはないものであり、上記の方法で生産された柑橘の果実は、特に糖度、酸度、果肉歩合等の果実品質が高く極めて有用である。また、本発明の弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを従来の糖度向上法と組合わせて用いることも可能で、柑橘果実のさらに高い糖度の向上を図ることが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００４２】
＜弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの分離＞
弱毒性カンキツ矮化ウイロイドは、以下のような分離方法により、愛媛県で栽培されていた柑橘（品種：日向夏）から分離した。
日向夏の樹皮を乳鉢で形がなくなるまで磨砕した後、抽出バッファ液を２０ｍＬ、２−メルカプトエタノールを０．１ｍＬ、２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を０．１ｍＬ添加し、粘りが出てくるまでさらに磨砕した。抽出バッファ液は、ｐＨ８．９のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（０．１３Ｍ）、ｐＨ７．０のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．１７Ｍ）、ＳＤＳ（０．８３％）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、５％）、ＬｉＣｌ（１Ｍ）を用いて、括弧内に記載の濃度となるように調整した。
得られた磨砕液をサンプルチューブ（５０ｍＬ）に移し、フェノール：クロロホルム（１：１）の混合液１５ｍＬを加え、強く撹拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行った。
遠心分離により得られた上層（水層）液を、新しいチューブに移し、９９．５％エタノールを上層液の２．５倍量を加え、軽く撹拌後、−３０℃で１時間保管した。
再び遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行った後、上清を捨て、沈殿物をアスピレーターで５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に滅菌蒸留水を１ｍＬ添加し、完全に溶解した。なお、沈殿物が溶けない場合は、滅菌蒸留水を適宜増やした。
加えた滅菌蒸留水と等量の２．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．３）溶液と２−メトキシエタノールを加え、１分間強く撹拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分、１５℃）を行った。
遠心分離により得られた上層（水層）液を、新しいチューブに移し、全体で１２．５ｍＬになるように滅菌蒸留水を加えた。さらに２％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を０．５ｍＬ加え、軽く撹拌後、氷上で１晩静置した。
再び遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３０分、４℃）を行った後、上清を捨て、沈殿物に１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を０．４ｍＬ添加し、溶解した。なお、沈殿物が溶けない場合は、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を適宜増やした。
得られた溶液を１．５ｍＬの新しいチューブに移し、９９．５％エタノールを１Ｍ  ＮａＣｌ溶液の量の２．５倍量を加え、軽く撹拌後、−３０℃で１時間保管した。
遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、室温）を行った後、上清を捨て、沈殿物をアスピレーターで５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に、滅菌蒸留水を０．２ｍＬ添加し、完全に溶解した。さらに、４Ｍ  ＬｉＣｌ溶液を０．２ｍＬ加え、軽く撹拌後、氷上で４時間以上静置した。
再び遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、室温）を行った後、上清を１．５ｍＬチューブに移し、９９．５％エタノールを１ｍＬ（上清の２．５倍量）加え、軽く撹拌後、−３０℃で１晩保管した。
さらに遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、室温）を行った後、上清を捨て、沈殿物をアスピレーターで５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に、滅菌蒸留水を０．４ｍＬ添加し、完全に溶解した。
ＤＮａｓｅＩ（ＤＮＡ分解酵素、５ユニット／μＬ）を１．０μＬ、５倍濃度ＤＮａｓｅＩ用緩衝液を０．１ｍＬ添加し、３７℃で６０分、インキュベートした。等量（０．５ｍＬ）のフェノール：クロロホルム（１：１）混合液を添加し、激しく１分間攪拌後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５分、室温）した。上清（水層）０．５ｍＬを回収して新しいチューブに移し、２．５倍容量（１．２５ｍＬ）の９９．５％エタノールを添加し、軽く攪拌して、冷凍庫に一晩静置した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、室温）後、上清を捨て、沈殿物をアスピレーターで５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に、滅菌蒸留水を０．４ｍＬ添加し、完全に溶解した。
得られた溶液のＡ２６０の吸光値を分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製ナノドロップ）を用いて測定し、核酸濃度を１００ｎｇ／μＬに調整した。
得られた核酸溶液（２０〜５０μＬ）を１５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１、ゲルサイズ２０ｃｍ×２０ｃｍ×１ｍｍ、１倍ＴＡＥ緩衝液、垂直スラブ型電気泳動装置（アトー社製））のサンプルウェルに入れ、２５ｍＡ（２５０Ｖ）定電流で約１５０分間電気泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色して、トランスイルミネーター（アトー社製）上で核酸のバンドを確認し、ゲルの上端から５．８ＳリボソームＲＮＡの間を５等分（上から分画１〜５）してゲル片を剃刀で切り出した。ゲル片を剃刀でさらに約１ｍｍ角に刻み、１．５ｍＬサンプリングチューブに入れ、５００μＬの核酸溶出用緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＡ）を加えて３７℃で一晩振とう溶出した。溶液を新しい１．５ｍＬサンプリングチューブに移して、２．５倍量（Ｖ／Ｖ）の９９．５％エタノールを加えて攪拌し、−３０℃に１時間以上静置して、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、エタノールを完全に捨て、沈殿物を５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に、滅菌蒸留水を０．０１ｍＬ添加し、完全に溶解した。
得られた各ゲル溶出核酸溶液（１０μＬ）に２μＬのマーカー色素液（０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノールＦＦ、５０％グリセロール）と１０μＬの５０％尿素液を加えて、６８℃で１５分間加熱変性処理を行った。変性後、試料は氷水中で急冷し、８Ｍ尿素を含む７．５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１、ゲルサイズ２０ｃｍ×２０ｃｍ×１ｍｍ、１倍ＴＢＥ緩衝液、垂直スラブ型電気泳動装置（アトー社製））のサンプルウェルに入れ、４５ｍＡ（４５０Ｖ）定電流で約９０分間電気泳動した。泳動後、ゲルは臭化エチジウムで染色して、トランスイルミネーター（アトー社製）上で核酸のバンドを確認し、分画２−３のゲル上部に出現するカンキツ矮化ウイロイドの環状ＲＮＡのバンドを含むゲル片を剃刀で切り出した。ゲル片を剃刀でさらに約１ｍｍ角に刻み、１．５ｍＬサンプリングチューブに入れ、５００μＬの核酸溶出用緩衝液（前出）を加えて３７℃で一晩振とう溶出した。溶液を新しい１．５ｍＬサンプリングチューブに移して、２．５倍量（Ｖ／Ｖ）の９９．５％エタノールを加えて攪拌し、−３０℃に１時間以上静置して、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）してウイロイドを沈殿させ、５分間乾した後、滅菌蒸留水（０．０１ｍＬ）に完全に溶解した。
【００４３】
上記の方法で分離したウイロイドを、日向夏の果実から採取した種子から育てたウイロイドフリーの実生に、カミソリで新梢に切り付けて接種した。温室で約１年間栽培した後、病原性を示していない苗木において、ウイロイドの感染が確認ができたものを選抜した。ウイロイドの感染の確認は、ノーザン・ハイブリダイゼーション（ＲＮＡゲルブロット）により行った。
数年間に渡りウイロイドの感染を確認しつつ、温室で栽培後、上記のウイロイドの分離方法と同じ方法で弱毒性ウイロイドを分離した。得られた弱毒性ウイロイドを、以下、Ｄ４−１株と称する。
【００４４】
＜弱毒性ウイロイドの塩基配列の決定＞
Ｄ４−１株の塩基配列の決定は、ＲＴ−ＰＣＲで全長のｃＤＮＡを増幅後、ＴＡクローニングでプラスミドベクター（プロメガ社製ｐＧＥＭ−Ｔベクター）に挿入後、大腸菌を形質転換してクローン化した。塩基配列の決定は、ＡＢＩ社製のシークエンサーを使用し、同社のプロトコールに従い行った。
Ｄ４−１株には、２種類のウイロイドが存在していることが分かり、それぞれ配列番号１及び２に示す塩基配列を有するウイロイドであった。
【００４５】
Ｄ４−１株は、塩基配列の結果から、カンキツ矮化ウイロイドに属する弱毒性ウイロイドであることが分った。Ｄ４−１株については、日本国特許庁長官の指定する寄託機関である、独立法人産業総合研究所の特許生物寄託センターと、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターのいずれにも寄託の受け入れが認められないものである。このため、本出願人は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドＤ４−１株の分譲申請がある場合には、自家寄託として、その分譲申請に応ずる用意がある。
【００４６】
Ｄ４−１株について、６４個のクローンから塩基配列を読み、配列番号１で示される塩基配列を有するものが２２個、配列番号２で示される塩基配列を有するものが４２個であることが分った。
【００４７】
「弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの分離」の項目に示した方法に準じて、Ｄ４−１株感染カンキツ樹から抽出した低分子量ＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ）２μＬをＭＭｕＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社）２００Ｕと共に推奨のプロトコールに準じて２５μＬの反応系で３７℃、６０分間インキュベートした。反応液２μＬを分取し、ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）１．２５Ｕと共に推奨のプロトコールに準じて２５μＬの反応系で、カンキツ矮化ウイロイド特異的プライマーセット（CVd-3H: CAGAAGTCGACGAAGGCAGCTAAGTTGGTG及びCVd-3C: CACAAGTCGACGACGACAGGTAAGTTTCCC）を用いて、３５サイクルのＰＣＲを行い、全長ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応液（５〜１０μＬ）を７．５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１、ゲルサイズ２０ｃｍ×２０ｃｍ×１ｍｍ、１倍ＴＡＥ緩衝液、垂直スラブ型電気泳動装置（アトー社製））のサンプルウェルに入れ、２５ｍＡ（２５０Ｖ）定電流で約９０分間電気泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色して、トランスイルミネーター（アトー社製）上でカンキツ矮化ウイロイドの全長約３００ｂｐに相当するバンドを確認し、ゲル片を剃刀で切り出した。ゲル片を剃刀でさらに約１ｍｍ角に刻み、１．５ｍＬサンプリングチューブに入れ、５００μＬの核酸溶出用緩衝液（前出）を加えて３７℃で一晩振とう溶出した。溶液を新しい１．５ｍＬサンプリングチューブに移して、２．５倍量（Ｖ／Ｖ）の９９．５％エタノールを加えて攪拌し、−３０℃に１時間以上静置して、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、エタノールを完全に捨て、沈殿物を５分間乾燥した。乾燥させた沈殿物に、滅菌蒸留水を２０μＬ添加し、完全に溶解した。
ゲル溶出核酸溶液４μＬをｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社）１μＬ（０．１μｇ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）５Ｕと共に推奨のプロトコールに準じて１０μＬの反応系で１５℃、約８時間インキュベートした。反応後、推奨のプロトコールに準じて、ライゲーション溶液にＪＥＴコンピテントセル（社）５０μＬ、リカバリーメジューム５００μＬを添加して大腸菌を形質転換して、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩インキュベートした。得られた形質転換体大腸菌コロニーを爪楊枝でピックアップして２ｍＬのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、アルカリ−ＳＤＳ法に準じてプラスミドＤＮＡを抽出し、カンキツ矮化ウイロイドの全長ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを調整した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を分析して、ＣＶｄ−３−２５０ＡとＣＶｄ−３−２５０Ｕを選抜した。
【００４８】
プラスミド「ＣＶｄ−３−２５０Ａ」及び「ＣＶｄ−３−２５０Ｕ」は、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）において、国内寄託により、２０１２年１１月２８日に受領番号「ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４７２」及び「ＮＩＴＥ  ＡＰ−１４７３」が付与された後、２０１２年１２月１４日に受託され、受託番号「ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７２」及び「ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７３」が付与されている。
【００４９】
＜弱毒性ウイロイドの感染試験＞
カラタチの台木に接いだ、ウイロイドフリーの温州みかん（品種：宮川早生）の苗木に、カミソリで新鞘に切り付けて、Ｄ４−１株を接種し、温室で３年間栽培した。なお、温室における施肥、薬剤散布などの栽培管理は、一般的な栽培管理方法に合わせて行った。
３年間温室で栽培した後、愛媛大学農学部付属農場に、Ｄ４−１株感染樹と無接種樹（対照）をランダムに定植した。３年後に果実を収穫し、果実の品質及び形状を調査した。なお、農場における施肥、薬剤散布などの栽培管理は、一般的な栽培管理方法に合わせて行った。
Ｄ４−１株接種区及び無接種区の比較の結果、Ｄ４−１株接種による温州みかんの生育形態、形状への影響は、観察されなかった。
【００５０】
ノーザン・ハイブリダイゼーション（ＲＮＡゲルブロット）では、３、４、７、８、９、１０及び１１の温州みかん樹がＤ４−１株に感染し、そのウイロイド濃度が高まっていることを示している（図１）。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、赤矢印にバンドのある３、４、５、７、８、９、１０及び１１の温州みかん樹が、Ｄ４−１株に感染したと判断された（図２）。
【００５１】
愛媛大学農学部付属農場で栽培したウイロイドの感染がないことが確認されている温州みかん１１樹と、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドＤ４−１株の感染が確認された温州みかん７樹から果実を収穫して分析を行った。
糖度は屈折糖度計（アタゴ社製デジタル糖度計PR-100α）で測定しＢｒｉｘで表した。平均値としての結果を図３に示す。
酸度は滴定法で測定し、果汁１００ｍＬ当たりのクエン酸当量（％）として表した。平均値としての結果を図４に示す。
果肉歩合の測定は、果皮を剥皮して果皮と果肉の重さを測定して比率を求めた。平均値としての結果を図５に示す。なお、果皮として、外果皮部分と中果皮部分の重さを測定し、内果皮部分は、果肉として重さを測定した。
【００５２】
図３に示すように、Ｄ４−１株感染樹から収穫された温州みかんは、無接種樹から収穫された温州みかん（対照区）を比べて、果実の糖度が１．０８倍に高められることが示された。
図４に示すように、Ｄ４−１株感染樹から収穫された温州みかんは、無接種樹から収穫された温州みかん（対照区）を比べて、果実の酸度が１．１２倍に高められることが示された。
図５に示すように、Ｄ４−１株感染樹から収穫された温州みかんは、無接種樹から収穫された温州みかん（対照区）を比べて、果実の果肉歩合が１．０３倍に高められることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、弱毒性カンキツ矮化ウイロイドを柑橘に接種し、栽培することで、糖度、酸度、果肉歩合等の品質が高められた柑橘果実を生産することができる方法を提供する点で、産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１は、分離されたＤ４−１株中の２５０Ｕである弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの全塩基配列を示す。
配列番号２は、分離されたＤ４−１株中の２５０Ａである弱毒性カンキツ矮化ウイロイドの全塩基配列を示す。
配列番号３は、カンキツ矮化ウイロイド特異的プライマーCVd-3Hの塩基配列を示す。
配列番号４は、カンキツ矮化ウイロイド特異的プライマーCVd-3Cの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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