(57)【要約】【課題】本発明の目的は、改善された特性を持つ新規なＴＮＦレセプターループペプチド（ＷＰ９ＱＹペプチド）の模倣ペプチドを提供することである。より具体的には、より望ましい特性を有するＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む骨粗鬆治療薬を提供することである。【解決手段】破骨細胞の分化阻害活性をもつ、架橋構造中に−ＮＲ−を有する新規な架橋構造をもつＴＮＦレセプターループペプチドの模倣ペプチドが提供された。また、該ペプチドを用いた破骨細胞の増殖阻害剤および該ペプチドを含む医薬組成物が提供された。【選択図】図６
2014101274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式で表されるペプチドからなる破骨細胞破骨細胞の増殖阻害剤、
【化１】
2014101274.tif 000077
（ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基および−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎOＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（ｎは整数である）で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜８のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる）
【請求項２】
下記の化学式で表されるペプチドからなる群より選ばれる請求項１に記載の阻害剤、
【化２】
2014101274.tif 000078
【化３】
2014101274.tif 000079
【化４】
2014101274.tif 000080
【化５】
2014101274.tif 000081
【化６】
2014101274.tif 000082
【化７】
2014101274.tif 000083
、および
【化８】
2014101274.tif 000084
（ここで、Ａｃはアセチル基を表し、ポリエチレングリコールは、５００〜２０００Ｄａの数平均分子量をもつポリエチレングリコールを表す）。
【請求項３】
請求項１または２記載の阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項４】
骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチ及び他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療剤である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチ及び他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療方法であって、このような治療が必要である哺乳類に、請求項１または２記載のペプチドの少なくとも一種を治療上の有効量で投与することを含む、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な架橋構造を含む、ＴＮＦレセプターのループペプチドの模倣ペプチドを用いた破骨細胞の増殖阻害剤に関する。本発明はまた、該ペプチドを用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどすべての生理学的プロセスは、ペプチドまたはタンパク質および他の生物学的活性成分などの分子的認識に基づいている。今までに、ホルモン、酵素、インヒビター、酵素基質、神経伝達物質、免疫調節物質などの重要な生物学的機能を有する多くのタンパク質が発見されてきた。しかし、タンパク質は分子量が大きいがゆえに、それを合成することが困難であるばかりでなく、医薬品としての利用が困難であった。そのため、分子レベルでのその機能を解明することがなされてきている。
生体内でのタンパク質の作用は、一般にはレセプターを介して作動される。レセプターもまたタンパク質であり、両者（リガンドおよびレセプター）の結合または接触が、生理作用に重要であると認識されている。そのため、リガンドとリセプターの結合にかかわる部位を特定し、その部分を模倣したペプチドを合成し、タンパク質の機能を分析するとともに、タンパク質に代わる作動物質あるいはタンパク質の作用を阻害する遮断物質としてのペプチドが注目されてきた。
【０００３】
しかしながら、リガント／レセプター間の結合または接触に関与する部分は、生体内では立体配置をとり、結合または接触部分のコンホメーションが重要であることが知られている。そのため、結合または接触に関与する部分のペプチドを、コンホメーションをもった状態で作成することが試みられてきた。
ペプチドのコンホメーションにおける全体的な制御は、環化によりペプチド鎖の柔軟性を制限することにより可能である。生物活性ペプチドの環化は、その代謝安定性およびレセプターに対する選択性を改善するだけでなく、均質なコンホメーションとすることにより、ペプチドのコンホメーション分析を可能とする。環化の形態は、天然の環状ペプチドに見られるものと同じである。例えば、側鎖−側鎖の環化、または側鎖−末端基の環化をあげることができる。環化のために、リガンド／レセプター間の認識に関与しないアミノ酸の側鎖を、互いに結合させたり、またはペプチド主鎖に結合させたりできる。また別の態様としては、末端−末端の環化をあげることができ、かかる場合は、完全に環状のペプチドとなる。
【０００４】
これらの環化のためには、架橋技術が欠かせないものとなっている。代表的な環化の例としては、ジスルフィド結合（ＳＳ結合）、アミド結合、チオエーテル結合、およびオレフィン結合を介した架橋をあげることができる。より具体的な例としては、二つのペニシラミン残基をジスルフィド架橋で連結することにより環化するもの（Mosberg ら、P.N.A.S. US, 80:5871, 1983)、リジンとアスパラギン酸との間にアミド結合を形成することにより環化するもの（Flora ら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005) 1065-1068）、または予めチオエーテル結合を導入した架橋部位を含むアミノ酸誘導体をペプチド結合に導入し、最後の縮合反応で環化するもの（Melinら US6,143,722）、およびオレフィンメタセシス反応を用いて主鎖に導入した（Ｓ）−α−２'−ペンテニル）アラニン同士を架橋させて環化するもの（Schafmeisterら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5891-5892, 2000）をあげることができる。また、コンホメーションを制御する為にペプチドの側鎖の修飾を必要としない方法としてペプチド主鎖骨格のアミドを構成する窒素を起点とした架橋構造も知られている。（GilonらBioplymers 31:745, 1991）。
【０００５】
コンホメーションが制御されたペプチドは、多くの薬理用途が期待できる。しかし、医薬品としてのペプチドの開発においては、以下のような問題がある。すなわち、ａ）生理学的条件下では、ペプチドの多くは、特異的および非特異的なペプチダーゼにより分解されるため、代謝安定性が低いこと、ｂ）その分子量が比較的高いため、経口摂取後の吸収が悪いこと、ｃ）肝臓および腎臓を通過する排出が速いこと、および、ｄ）ペプチドは構造的に柔軟であり、またペプチドに対する受容体は生物体に広く分布しえるので、標的としない組織・器官において所望しない副作用が起こること、である。
【０００６】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーに属する受容体Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ（ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥＲあるいはＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a）としても知られている）は、破骨細胞、樹状細胞、乳腺上皮細胞などで発現されている。ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ、またはＯＰＧＬ、ＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＮＦＳＦ１１（TNF ligand superfamily member 11）としても知られている）は、ＴＮＦ様タンパク質であり、骨芽細胞、骨随間質細胞およびＴ細胞などで発現されている。ＲＮＡＫおよびＲＡＮＫＬは、インビボおよびインビトロにおいて、破骨細胞の分化や樹状細胞の分化さらには乳腺の発達に必要であることも報告されている。ＴＮＦファミリーに属するＴＮＦαは、直接骨髄細胞に働いて破骨細胞形成を促進させるだけでなく、骨芽細胞にも働きＲＡＮＫＬのレベルを亢進させて間接的に骨髄細胞の破骨細胞形成応答を増幅させ、卵巣切除や炎症によって誘導される骨損失に大きく寄与している。ＲＡＮＫＬはまた、破骨細胞による骨吸収を増加させる。
ＷＰ９ＱＹペプチドは、ＴＮＦレセプターおよびＲＡＮＫの機能的部位の配列構造に似せた、５アミノ酸からなるペプチド配列をその環状内に有する架橋ペプチドであり、以下の構造を有する（特表２００３−５０５５０３号公報、および特表２００３−５０５５１４号公報）。
【０００７】
【化１】
2014101274.tif 000003
ＷＰ９ＱＹペプチドは、ＴＮＦαにより誘導される細胞毒性を阻害することが報告されている（高橋ら、Nat. Biotechnol. 1997, 15: 1266-1270）。ＷＰ９ＱＹペプチドはまた、ＲＡＮＫＬによって誘導されるシグナルをブロックし、骨吸収および骨損失を阻害することが報告されている（青木ら、J. Clin Invest. 2006; 116(6):1525-1534）。また、炎症性骨吸収を引き起こすリウマチ間接モデルにおいてＷＰ９ＱＹペプチドが同用量の抗ＴＮＦ抗体投与と比べて骨吸収抑制効果が優れていることが報告されている（斉藤ら、Rheumatoid Arthritis, Vol.56, No.4, 1164-1174）。さらに、歯周病原因細菌による炎症性骨破壊をＷＰ９ＱＹペプチド投与により抑制することも報告されている（鈴木ら、J. Periodontal Res., 2006 Apr. 41(2):81-91）。
【０００８】
本明細書で使用する「ペプチド模倣体」とは、レセプターのリガンドとして、ペプチドの生物学的効果をレセプターレベルで模倣（作動物質）または遮蔽（拮抗物質）することができる化合物である。最も可能性のある作動物質としてのペプチド模倣体を得るためには、ａ）代謝安定性、ｂ）良好な生物学的利用能、ｃ）高い受容体親和性および受容体選択性、ならびにｄ）最少の副作用、等の要因を考慮する必要がある。また、薬理および医学的観点から、しばしば、レセプターレベルでのペプチドの効果を模倣する（作動作用）だけでなく、必要であればレセプターを遮蔽する（拮抗作用）ことが望ましい。上記の作動物質としてのペプチド模倣体を設計するために考慮すべき薬理事項と同じことが、ペプチド拮抗物質の設計に対しても適用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００３−５０５５０３号公報
【特許文献２】特表２００３−５０５５１４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Mosberg ら、P.N.A.S. US, 80:5871, 1983
【非特許文献２】Charpentier ら、J. Med. Chem. 32:1184, 1989
【非特許文献３】Rodriguez ら、Int. J. Pept. Protein Res. 35:441, 1990
【非特許文献４】Schafmeisterら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5891-5892, 2000
【非特許文献５】Goodmanら、J. Org. Chem. 2002, 67, 8820-8826
【非特許文献６】高橋ら、 Nat. Biotechnol. 1997, 15: 1266-1270
【非特許文献７】青木ら、J. Clin Invest. 2006; 116(6):1525-1534
【非特許文献８】斉藤ら、Rheumatoid Arthritis, Vol.56, No.4, 1164-1174
【非特許文献９】鈴木ら、J. Periodontal Res., 2006 Apr. 41(2):81-91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
。
ＴＮＦαにより誘導される細胞毒性を阻害するとともに骨吸収を阻害するペプチド模倣体として、ＷＰ９ＱＹペプチドが知られているが、ジスルフィド結合は一般に生体内に存在する還元酵素で切断されてしまうという問題があり、さらに改善された模倣ペプチドが望まれていた。また、他の環化形式も存在するが、架橋中にアミドが存在するものは、生体内に存在するアミド構造を切断する酵素によって切断されてしまうという問題がある。さらには、架橋の自由な設計や架橋への自由な変更が、ペプチドの生理活性を改善するためには望まれているが、従来の環化形式では難しいという問題があった。
本発明の目的は、より望ましい特性を有するＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む骨粗鬆治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規な架橋構造をその内部にもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を合成し、それが破骨細胞の分化阻害活性を持つことを確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下に記載する新規なＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を用いた破骨細胞の増殖阻害剤および該ペプチドを含む医薬組成物を提供するものである。
１．下記の化学式で表されるペプチドからなる破骨細胞の増殖阻害剤
【００１３】
【化２】
2014101274.tif 000004
（ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基および−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜８のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる）
２．下記の化学式で表されるペプチドからなる群より選ばれる上記１に記載の破骨細胞の分化または増殖阻害剤、
【００１４】
【化３】
2014101274.tif 000005
【００１５】
【化４】
2014101274.tif 000006
【００１６】
【化５】
2014101274.tif 000007
【００１７】
【化６】
2014101274.tif 000008
【００１８】
【化７】
2014101274.tif 000009
【００１９】
【化８】
2014101274.tif 000010
および
【００２０】
【化９】
2014101274.tif 000011
（ここで、Ａｃはアセチル基を表し、ポリエチレングリコールは、５００〜２０００Ｄａの数平均分子量をもつポリエチレングリコールを表す）。
【００２１】
３．上記１または２に記載の化学式で表されるペプチドの少なくとも一つを有効成分として含有する医薬組成物。
４．骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療剤である、上記３に記載の医薬組成物。
５．骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移からなる群から選択される疾病の治療方法であって、このような治療が必要である哺乳類に、上記１または２に記載の化学式で表される少なくとも一種を治療上の有効量で投与することを含む、治療方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、特性がより改善された、例えば、ペプチダーゼに対する耐性が向上した、または破骨細胞に対する阻害活性が向上したＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を含む医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している。
【図２】図２は、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を概略図で示している。
【図３】図３は、参考例としての、チオエーテル架橋をもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を示している。
【図４】図４は、参考例としての、オレフィン架橋をもつＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成例を示している。
【図５】図５は、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-5、Bdev-6、Bdev-8）の破骨細胞分化抑制活性を示している。
【図６】図６は、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-2、Bdev-3）の、破骨細胞分化抑制活性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、環状ペプチドであり、その環状内にＷＰ９ＱＹペプチドと同様のアミノ酸配列をもち、かつ架橋構造中に−ＮＲ−結合を有することを特徴とする。具体的には、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、以下の構造を有するペプチドである。
【００２５】
【化１０】
2014101274.tif 000012
（ここで、Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基、および−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、Ｚ2はヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜８のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれる）
【００２６】
Ｚ1およびＺ3は、それぞれ独立に、水素原子、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基および−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれるが、好ましくは、水素原子、置換または置換された炭素数１〜６のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜６のアルキル基、または、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量３００〜５，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは水素原子、置換または置換された炭素数１〜４のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜４のアルキル基、または、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量５００〜２，０００Ｄａのポリエチレングリコールである。
Ｚ2は、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜８のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群より選ばれるが、好ましくは、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜６のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量３００〜５，０００Ｄａのポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは、ヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜４のモノアルキルアミノ基、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量５００〜２，０００Ｄａのポリエチレングリコールである。
また、Ｚ1とＺ3は、一方が、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基および−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールからなる群から選ばれ、他方が、水素原子またはアセチル基から選ばれることが好ましい。
さらに、Ｚ1が水素、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、または無置換または置換された炭素数１〜８のアルキル基であり、かつＺ2がヒドロキシル基、アミノ基、無置換または置換された炭素数１〜８のアシル基、無置換または置換された炭素数１〜８のモノアルキルアミノ基である場合、Ｚ3は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3で表される分子量１００〜１０，０００Ｄａのポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００２７】
本明細書において、本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の作用を表す際に用いる「破骨細胞の増殖阻害」とは、破骨細胞の生育または増殖を阻害する場合、未熟な破骨細胞が成熟細胞へと分化するのを阻害する場合のいずれも含む意味で用いる。
本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体は、ＴＮＦα／ＴＮＦレセプターが関与する疾患に有効であるとともに、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬが関与する疾患にも有用である。疾患としては、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチおよび他の形態の炎症性関節炎、変形性関節症、プロテーゼ破損、溶骨型腫瘍、骨髄腫並びに骨への腫瘍転移をあげることができるが、これらに限定されず、ＴＮＦα／ＴＮＦレセプターおよび／またはＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬが関与する疾患も含まれる。
【００２８】
本発明のペプチドは、任意の既知の製薬上許容できるキャリアを含む医薬組成物としてもよい。
本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩の形態にすることもできる。
本発明のペプチドは、経口的または非経口的に投与されうる。経口投与の場合、カプセル、錠剤、顆粒剤、液剤などの形態で投与されうる。非経口投与の場合、注射液、点滴製剤などの形態で投与される。
本発明のペプチドは、単独で用いる他、他の骨粗鬆治療・予防薬、例えば、有機ビスホスホネートと組み合わせてもちいることもできる。
【００２９】
本発明のペプチドは、例えば、ヒトまたはその他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。本発明のペプチドの適切な投与量は、治療する疾患や障害、投与経路、治療をうける患者の年齢や体重などの要素によってさまざまである。経口投与の場合、一般的に通常ヒト成人においては、一日につき有効成分を約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜２００ｍｇであり、非経口的に投与する場合は、一日につき有効成分を約０．０１〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。
本発明の製剤は、好ましくは、非経口的に、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、等により投与する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例においては、下記の略号を用いた。
【００３１】
【表１】
2014101274.tif 000013
【００３２】
ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体の合成
図１および図２の合成スキームに従って、架橋構造としてジスルフィド結合の代わりに、−（ＣＨ2）4−ＮＨ−（ＣＨ2）4−を持つ、ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体である架橋ペプチド（Bdev７）を合成した。
以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
（実施例１）合成中間体（化合物１４）の合成
１−１．原料である化合物１３の合成
化合物１の合成
【００３３】
【化１１】
2014101274.tif 000014
2,4-ジドコシロキシベンジルアルコール（「ＫｂＯＨ」と表記する） (7.69 g, 10.1 mmol) をCH2Cl2 (200 mL) に溶解し、Fmoc-Gly-OH (4.52 g, 15.2 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (3147 μＬ, 20.2 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (12.3 mg, 0.101 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で30分間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にMeOHを加えて析出した沈殿物をろ過し、MeOH懸洗を2回 、CH3CN懸洗を行い化合物1 (10.1 g, 96.7%) を得た。
化合物2の合成
【００３４】
【化１２】
2014101274.tif 000015
化合物1 (10.1 g, 9.74 mmol) をTHF (200 mL) に溶解し、piperidne (1863 μＬ, 17.5 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (1863 μＬ, 17.5 mmol, 1.8 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。反応液のpHが6前後になるまで濃塩酸を加えて減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物2 (8.21 g, 98.7%) を得た。
化合物3の合成
【００３５】
【化１３】
2014101274.tif 000016
化合物2 (7.60 g, 8.96 mmol) をCH2Cl2 (180 mL) に溶解し、DIPEA (3589 μＬ, 20.6 mmol, 2.3 equiv) およびNsCl (2.59 g, 11.7 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で攪拌した。1時間後DIPEA (359 μＬ, 2.06 mmol, 0.2 equiv) を追加し室温で19分間攪拌した。反応液にＭｅＯＨ (30 mL) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物3 (8.95 g, 99.9%) を得た。
化合物4の合成
【００３６】
【化１４】
2014101274.tif 000017
化合物3 (4.70 g, 4.71 mmol) および化合物A (3.11 g, 9.46 mmol, 2.0 equiv) をTHF (94 mL) に溶解し、PPh3 (2.49 g, 9.50 mmol, 2.0 equiv) およびDEAD (4272 μＬ, 9.42 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。PPh3 (248 mg, 0.946 mmol, 0.2 equiv) およびDEAD (427 μＬ, 0.942 mmol, 0.2 equiv) を加えて1時間攪拌した。PPh3 (245 mg, 0.934 mmol, 0.2 equiv) およびDEAD (427 μＬ, 0.942 mmol, 0.2 equiv) を加えて1時間15分攪拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣にCH3CNを加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物4 (6.12 g,  99.2%) を得た。
化合物5の合成
【００３７】
【化１５】
2014101274.tif 000018
化合物4 (5.65 g, 4.31 mmol) をTHF (40 mL) に溶解し、PhSH (1328 μＬ, 12.9 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (1934 μＬ, 12.9 mmol, 3.0 equiv) を加え室温で1時間30分攪拌した。反応液にCH3CN (200 mL) を加えて析出した沈殿物をろ過し、CH3CN懸洗を2回行い化合物5 (4.77 g, 98.4%) を得た。
化合物6の合成
【００３８】
【化１６】
2014101274.tif 000019
化合物5 (7.49 g, 6.65 mmol) をTHF (70 mL) に溶解し、Fmoc-Leu-OH (3.53 g, 9.98 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (2.27 g, 16.7 mmol, 2.5 equiv)、HATU (6.32 g, 16.6 mmol, 2.5 equiv) およびDIPEA (5800 μＬ, 33.3 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で6分間攪拌した。DIPEA (580 μＬ, 3.33 mmol, 0.5 equiv) を加えて8分間攪拌した。さらに、DIPEA (580 μＬ, 3.33 mmol, 0.5 equiv) を加えて1時間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexane/EtOAc = 100 : 0 - 85 : 15) に付し、化合物6 (9.10 g, 93.7%) を得た。
化合物7の合成
【００３９】
【化１７】
2014101274.tif 000020
化合物6 (1.05g,  0.721 mmol) をCH2Cl2 (36 mL) に溶解し、TFE (3.6 mL) およびTFA (360 μＬ) を加えて室温で40分間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にCH2Cl2を加えて水で3回洗浄し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水MgSO4で乾燥、ろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 90 :10) に付し、化合物7 (478 mg, 92.2%) を得た。
化合物8の合成
【００４０】
【化１８】
2014101274.tif 000021
化合物7 (4.08 g, 5.66 mmol, 1.2 equiv) をTHF (70 mL) に溶解し、化合物29（合成方法は後で記載する） (5.52 g, 4.72 mmol)、DIPCI (1104 μＬ, 7.09 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (963 mg, 7.08 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (4940 μＬ, 28.4 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。HOAt (325 mg, 2.39 mmol, 0.5 equiv) およびDIPCI (368 μＬ, 2.36 mmol, 0.5 equiv) を加えて2時間攪拌した。溶媒を減圧下留去した後、化合物２の合成と同等の後処理を行い化合物8 (8.54 g, 98.5%) を得た。
化合物9の合成
【００４１】
【化１９】
2014101274.tif 000022
化合物8 (8.54 g, 4.65 mmol) をTHF (93 mL) に溶解し、piperdine (891 μＬ, 8.37 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (904 μＬ, 6.04 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (8.31 g) を得た。
【００４２】
【化２０】
2014101274.tif 000023
脱Fmoc体 (8.31 g) をTHF (93 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (3.21 g, 6.99 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (1.59 g, 11.7 mmol, 2.5 equiv)、HATU (4.42 g, 11.6 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (4860 μＬ, 27.9 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で40分間攪拌した。化合物４の合成と同等の後処理を行い化合物9 (9.05 g, 94.7%) を得た。
化合物10の合成
【００４３】
【化２１】
2014101274.tif 000024
化合物9 (4.17 g, 2.03 mmol) をTHF (41 mL) に溶解し、piperidine (389 μＬ, 3.65 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (395 μＬ, 2.63 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (3.92 g) を得た。
【００４４】
【化２２】
2014101274.tif 000025
脱Fmoc体 (3.92 g) をTHF (41 mL) に溶解し、Fmoc-Gln(Trt)-OH (1.86 g, 3.04 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.93 g, 5.07 mmol, 2.5 equiv)、HOAt (691 mg, 5.07 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (2120 μＬ, 12.2 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で30分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物10 (4.83 g, 98.0%) を得た。
化合物11の合成
【００４５】
【化２３】
2014101274.tif 000026
化合物10 (4.83 g, 1.99 mmol) をTHF (40 mL) に溶解し、piperidine (382 μＬ, 3.59 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (388 μＬ, 2.59 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.63 g) を得た。
【００４６】
【化２４】
2014101274.tif 000027
脱Fmoc体 (4.63 g) をTHF (40 mL) に溶解し、Fmoc-Ser(tBu)-OH (1.15 g, 2.99 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.89 g, 4.98 mmol, 2.5 equiv)、HOAt (676 mg, 4.98 mmol, 2.5 equiv)、およびDIPEA (2082 μＬ, 11.9 mmol, 6.0 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物11 (5.49 g) を得た。
化合物12の合成
【００４７】
【化２５】
2014101274.tif 000028
化合物11 (5.49 g) をTHF (40 mL) に溶解し、piperidine (382 μＬ, 3.59 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (388 μＬ, 2.59 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.65 g, 98.0% from  10) を得た。
【００４８】
【化２６】
2014101274.tif 000029
脱Fmoc体 (4.65 g, 1.95 mmol) をTHF (39 mL) に溶解し、Fmoc-Trp(Boc)-OH (1.54 g, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (398 mg, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、HATU (1.11 g, 2.92 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (1698 μＬ, 9.75 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で70分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物12 (5.32 g, 95.4%) を得た。
化合物13の合成
【００４９】
【化２７】
2014101274.tif 000030
化合物12 (5.32 g, 1.86 mmol) をTHF (37.2 mL) に溶解し、piperidine (372 μＬ, 3.50 mmol, 1.9 equiv) およびDBU (372 μＬ, 2.49 mmol, 1.3 equiv) 加えて室温で5分間攪拌した。化合物2の合成と同等の後処理を行い脱Fmoc体 (4.96 g) を得た。
【００５０】
【化２８】
2014101274.tif 000031
脱Fmoc体 (4.96 g) をTHF (12.6 mL) に溶解し、TBAF (1.0 M solution in THF, 6.0 mL, 6.00 mmol, 3.2 equiv) を加えて室温で19時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣にCH2Cl2を加えて1 N HCl、水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥しろ過後、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/THF, 100 : 0 - 75 : 25) に付し、化合物13 (2.02 g, 45.3%) を得た。
化合物29の合成
【００５１】
【化２９】
2014101274.tif 000032
3,4,5-トリオクタデシルオキシベンジルアルコール （「ＫａＯＨ」と表記する）(20.1 g, 22.0 mmol) をCH2Cl2 (220 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (15.2 g, 33.0 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (6856 μＬ, 44.0 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (26.9 mg, 0.220 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で35分間攪拌した。化合物1の合成と同等の後処理を行い化合物28 (29.9 g, quant. y.) を得た。
【００５２】
【化３０】
2014101274.tif 000033
化合物28 (9.58 g, 7.07 mmol) をTHF (141 mL) に溶解し、piperidine (1260 μＬ, 12.7 mmol, 1.8 equiv) およびDBU (1374 μＬ, 9.19 mmol, 1.3 equiv) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物29 (8.28 g,  quant. y.) を得た。
１−２．原料である化合物３８の合成
化合物30の合成
【００５３】
【化３１】
2014101274.tif 000034
3,4,5-トリオクタデシルオキシベンジルアルコール (3.00 g, 3.28 mmol) をCH2Cl2 (32.8 mL) に溶解し、Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3.08 g, 4.93 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (1023 μＬ, 6.57 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (4.0 mg, 0.0328 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で42分間攪拌した。化合物1の合成と同等の後処理を行い化合物30 (5.32 g) を得た。
化合物31の合成
【００５４】
【化３２】
2014101274.tif 000035
化合物30 (5.32 g) をCH2Cl2 (32.8 mL) に溶解し、TIS (3284 μＬ) およびTFA (985.2 μＬ) を加えて室温で12分間攪拌した。TIS (3284 μＬ) を追加し更に53分間攪拌した。TFA (985.2 μＬ) を追加して更に16分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物31 (4.48 g) を得た。
化合物32の合成
【００５５】
【化３３】
2014101274.tif 000036
化合物31 (4.48 g) をCH2Cl2 (65.7 mL) に溶解し、DIPEA (1258 μＬ, 7.22 mmol, 2.2 equiv) およびNsCl (873 mg, 3.94 mmol, 1.2 equiv) を加えて室温で37分間攪拌した。化合物3の合成と同等の後処理を行い化合物32 (4.75 g, quant. y.) を得た。
化合物33の合成
【００５６】
【化３４】
2014101274.tif 000037
化合物32 (4.38 g, 3.02 mmol) をCH2Cl2 (27 mL) に溶解し、TIS (6.0 mL) およびTFA (27 mL) を加えて室温で 2時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣にCH2Cl2加えて希釈し水で3回、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥、ろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 85 : 15) に付し、化合物33 (1.42 g, 84.8%) を得た。
化合物34の合成
【００５７】
【化３５】
2014101274.tif 000038
2,4-ジドコソキシベンジルアルコール (2.09 g, 2.76 mmol) をCH2Cl2 (27.6 mL) に溶解し、化合物33 (2.29 g, 4.14 mmol, 1.5 equiv)、DIPCI (859 μＬ, 5.51 mmol, 2.0 equiv)、およびDMAP (3.4 mg, 0.0278 mmol, 0.01 equiv) を加えて室温で45分間攪拌した。化合物1と同等の後処理を行い化合物34 (4.13 g, quant. y.) を得た。
化合物35の合成
【００５８】
【化３６】
2014101274.tif 000039
化合物34 (4.13) をTHF (55.1 mL) に溶解し、piperidine (491 μＬ) およびDBU (536 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物35 (3.00 g, 98.2%) を得た。
化合物36の合成
【００５９】
【化３７】
2014101274.tif 000040
化合物35 (332 mg, 0.300 mmol) をTHF (6 mL) に溶解し、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (207 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (61.3 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv)、HATU (171 mg, 0.450 mmol, 1.5 equiv) およびDIPEA (261 μＬ, 1.50 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で53分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物36 (441 mg, 97.3%) を得た。化合物37の合成
【００６０】
【化３８】
2014101274.tif 000041
化合物36 (2.73 g, 1.81 mmol) をTHF (36.1 mL) に溶解し、piperidine (322 μＬ) およびDBU (351 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TLCにて原料消失を確認後、化合物2の合成と同等の後処理を行い化合物37 (2.25 g, 94.1%) を得た。
化合物38の合成
【００６１】
【化３９】
2014101274.tif 000042
化合物37 (266 mg, 0.201 mmol) をTHF (4 mL) に溶解し、ミリスチン酸 (68.9 mg, 0.302 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (41.4 mg, 0.304 mmol, 1.5 equiv)、HATU (114 mg, 0.301 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (174 μＬ, 0.999 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で1時間50分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物38 (289 mg, 95.5%) を得た。
１−３．中間体である化合物１４の合成
【００６２】
【化４０】
2014101274.tif 000043
化合物13 (265 mg, 0.111 mmol)、化合物38 (289 mg, 0.192 mmol, 1.7 equiv)、およびPPh3 (118 mg, 0.450 mmol, 4.1 equiv) をTHF (11 mL) に溶解し、DEAD (201 μＬ, 0.443 mmol, 4.0 equiv) を加えて室温で61分間攪拌した。PPh3 (121 mg, 0.461 mmol, 4.2 equiv) およびDEAD (201 μＬ, 0.0.443 mmol, 4.0 equiv) を加えて59分間攪拌した。化合物３の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2CH2/THF, 100 : 0 - 88 : 12) に付し、光延反応物 (132 mg, 30.6%) を得た。
【００６３】
【化４１】
2014101274.tif 000044
光延反応物 (132 mg, 0.0340 mmol) をCH2Cl2 (3.4 mL) に溶解し、TFE (340 μＬ) およびTFA (34.0 μＬ) を加えて室温で70分間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH, 100 : 0 - 95 : 5) に付し、本発明の中間体である化合物14 (75.1 mg, 70.3%) を得た
（実施例２）ＷＰ９ＱＹペプチド模倣体（Bdev-7）の合成
化合物15の合成
【００６４】
【化４２】
2014101274.tif 000045
化合物14 (75.1 mg, 0.0239 mmol)、HOAt (4.2 mg, 0.0309 mmol, 1.3 equiv)、およびHATU (11.2 mg, 0.0295 mmol, 1.2 equiv) をTHF (4780 μＬ) に溶解し、DIPEA (20.8 μＬ, 0.119 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で17時間40分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物15 (64.5 mg, 86.6%) を得た。
化合物16の合成
【００６５】
【化４３】
2014101274.tif 000046
化合物15 (64.5 mg, 0.0207 mmol) をTHF (414 μＬ) に溶解し、PhSH (6.38 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (9.29 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で1時間38分間攪拌した。PhSH (6.38 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (9.29 μＬ, 0.0621 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で3時間29分間攪拌した。反応液に濃塩酸 (10 μＬ) を加えて減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物16 (55.6 mg, 91.3%) を得た。
Bdev-7の合成
【００６６】
【化４４】
2014101274.tif 000047
化合物16 (21.8 mg, 0.0743 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (743 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。沈殿物をろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣にIPEを加え沈殿物を析出させ、遠心分離後の残渣をHPLC精製し本発明の架橋ペプチドBdev-7 (2.8 mg, 2.6%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C78H111N12O16: 1471.8241, found 1472.1734。
下記のペプチド配列構造を有する他のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体を合成した。
【００６７】
【化４５】
2014101274.tif 000048
合成したそれぞれの化合物のＺ1〜Ｚ3は、以下の表２に記載の通りである。
【００６８】
【表２】
2014101274.tif 000049
【００６９】
（実施例３）Bdev-3，-5，-6，-12および-13合成のための中間体（化合物１９）の合成
Bdev-3，-5，-6，-12および-13合成のための中間体の合成の概略図を以下に示す。
【００７０】
【化４６】
2014101274.tif 000050
それぞれの合成は、以下のようにして行った。
化合物39の合成
【００７１】
【化４７】
2014101274.tif 000051
化合物37 (746 mg, 0.562 mmol) をCH2Cl2 (11 mL) に溶解し、Et3N (160 μＬ, 1.14 mmol, 2.0 equiv) およびAc2O (100 μＬ, 1.06 mmol, 1.9 equiv) を加えて室温で52分間攪拌した。化合物3の合成と同等の後処理を行い化合物39 (698 mg, 0.524 mmol, 93.2%) を得た。
化合物40の合成
【００７２】
【化４８】
2014101274.tif 000052
化合物35 (775 mg, 0.700 mmol) をTHF (14 mL) に溶解し、Boc-Tyr(tBu)-OH (354 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (143 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv)、HATU (399 mg, 1.05 mmol, 1.5 equiv) およびDIPEA (610 μＬ, 3.50 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で42分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物40 (935 mg, 96.1%) を得た。
化合物17の合成
【００７３】
【化４９】
2014101274.tif 000053
化合物13 (944 mg, 0.394 mmol)、化合物39 (635 mg, 0.477 mmol, 1.2 equiv)、およびPPh3 (211 mg, 0.804 mmol, 2.0 equiv) をTHF (40 mL) に溶解し、DEAD (357 μＬ, 0.787 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で3時間7分攪拌した。次に、PPh3 (208 mg, 0.793 mmol, 2.0 equiv) を加えて33分間攪拌した。さらに、DEAD (357 μＬ, 0.787 mmol, 2.0 equiv) を加えて1時間50分攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣 (1.573 g) を次反応に用いた。
【００７４】
【化５０】
2014101274.tif 000054
残渣 (1.573 g) をCH2Cl2 (47.7 mL) に溶解し、TFE (4770 μＬ) およびTFA (477 μＬ) を加えて室温で1時間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、ろ液にDIPEA (1050 μＬ) を加えた後、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH, 100 : 0 - 90 : 10 およびCHCl3/EtOH, 100 : 0 - 93 : 7) に付し、本発明の中間体である化合物17 (651 mg, 55.7%) を得た。
化合物18の合成
【００７５】
【化５１】
2014101274.tif 000055
化合物17 (485 mg, 0.163 mmol)、HOAt (26.8 mg, 0.197 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (74.8 mg, 0.197 mmol, 1.2 equiv) をTHF (32.6 mL) に溶解し、DIPEA (142 μＬ, 0.815 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間30分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物18 (462 mg, 96.3%) を得た。
化合物19の合成
【００７６】
【化５２】
2014101274.tif 000056
化合物40 (462 mg, 0.157 mmol) をTHF (1560 μＬ) に溶解し、PhSH (16.0 μＬ, 0.156 mmol, 1.0 equiv) およびDBU (70.0 μＬ, 0.468 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。PhSH (32.0 μＬ, 0.312 mmol, 2.0 equiv) を加えて1時間11分攪拌した。PhSH (48.0 μＬ, 0.467 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (70.0 μＬ, 0.468 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。反応液に濃塩酸 (78.0 μＬ) を加えて減圧下溶媒を留去した。化合物４の合成と同等の後処理を行い化合物19 (416 mg, 96.2%) を得た。
【００７７】
（実施例４）Bdev-3，-5，-6，-12および-13の合成
（１）Bdev-6の合成
Bdev-6は、以下の通りにして合成した。
【００７８】
【化５３】
2014101274.tif 000057
化合物19 (48.2 mg, 0.0174 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1740 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev−７の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-6 (5.3 mg, 23.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C66H87N12O16: 1303.6363, found 1303.9331.
（２）Bdev-12の合成
Bdev-12は、以下の通りにして合成した。
化合物20の合成
【００７９】
【化５４】
2014101274.tif 000058
化合物19 (149 mg, 0.0540 mmol)、ミリスチン酸 (18.7 mg, 0.0819 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (11.1 mg, 0.0816 mmol, 1.5 equiv)、およびHATU (31.0 mg, 0.0815 mmol, 1.5 equiv) をTHF (1080 μＬ) に溶解し、DIPEA (47.0 μＬ, 0.270 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物20 (147 mg, 91.5%) を得た。
Bdev-12の合成
【００８０】
【化５５】
2014101274.tif 000059
化合物20 (147 mg, 0.0494 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-12 (28.0 mg,  37.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C80H113N12O17: 1513.8347, found 1514.2531.
（３）Bdev-3の合成
Bdev-3は、以下の通りにして合成した。
化合物21の合成
【００８１】
【化５６】
2014101274.tif 000060
化合物19 (111 mg, 0.0400 mmol)、MeO-PEG-CO2H（MW：２，０００Ｄａ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製） (121 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (6.5 mg, 0.0480 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (18.3 mg, 0.0480 mmol, 1.2 equiv) をTHF (2 mL) に溶解し、DIPEA (34.8 μＬ, 0.200 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で53分間攪拌した。DIPEA (34.8 μＬ, 0.200 mmol, 5.0 equiv) を加えて56分間攪拌した。MeO-PEG-CO2H (121 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、HATU (22.8 mg, 0.0600 mmol, 1.5 equiv)、およびDIPEA (17.4 mL, 0.0999 mmol, 2.5 equiv) を加えて2時間9分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/MeOH, 100 : 0 - 90 : 10) に付し、化合物21 (313 mg) を粗生成物として得た。
【００８２】
Bdev-3の合成
【００８３】
【化５７】
2014101274.tif 000061
化合物21 (147 mg, 0.0494 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-3 (28.0 mg,  37.4%) を得た。m/z 3140付近を中心に44マス間隔で1価イオン、1640付近を中心に22マス間隔で2価イオンを検出した。
（４）Bdev-5の合成
Bdev-5は、以下の通りにして合成した。
化合物22の合成
【００８４】
【化５８】
2014101274.tif 000062
化合物19 (161 mg, 0.0580 mmol) をCH2Cl2 (1160 μＬ) に溶解し、Et3N (15.8 μＬ, 0.112 mmol, 1.9 equiv) およびAc2O (11.0 μＬ, 0.116 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で40分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物22 (143 mg, 87.6%) を得た。
Bdev-5の合成
【００８５】
【化５９】
2014101274.tif 000063
化合物22 (143 mg, 0.0508 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (5 mL) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-5 (25.6 mg,  37.4%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C68H88N12O17: 1345.6499, found 1345.5516.
【００８６】
（５）Bdev-13の合成
Bdev-13は、以下の通りにして合成した。
【００８７】
【化６０】
2014101274.tif 000064
Bdev-５ (10.1 mg, 0.00750 mmol, 1.5 equiv)、ＯＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨ2 （MW：２，０００Ｄａ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）(10.4 mg, 0.00516 mmol)、およびDMT-MM (1.4 mg, 0.00506 mmol, 1.0 equiv) のTHF (1100 μＬ) およびMeOH (900 μＬ) 混合物を室温で7時間35分攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、残渣にPEG-NH2 (10.4 mg, 0.00516 mmol) およびDMT-MM (5.7 mg, 0.0206 mmol)、およびDMF (1 mL) を加えて室温で4時間38分攪拌した。DMT-MM (14.2 mg, 0.0513 mmol) を加えて1時間20分攪拌した。HPLCにて精製を行いBdev-13 (3.6 mg, 14.5%) を得た。m/z 1700付近を中心に22マス間隔で2価イオン群、m/z 1150付近を中心に15マス間隔で3価イオン群、m/z 900付近を中心に11マス間隔で4価イオン群が検出した。
（実施例５）Bdev-2, -4, -8,および-10合成のための中間体（化合物２５）の合成
Bdev-2,-4,-8,および-10合成の中間体の合成の概略図を以下に示す。
【００８８】
【化６１】
2014101274.tif 000065
それぞれの合成は、以下のようにして行った。
化合物23の合成
【００８９】
【化６２】
2014101274.tif 000066
化合物13 (890 mg, 0.372 mmol)、化合物40 (776 mg, 0.559 mmol, 1.5 equiv)、およびPPh3 (147 mg, 0.559 mmol, 1.5 equiv) をTHF (8 mL) に溶解し、DEAD (253 μＬ, 0.558 mmol, 1.5 equiv.) を加えて室温で54分間攪拌した。次に、PPh3 (148 mg, 0.564 mmol, 1.5 equiv.) を加えて20分間攪拌した。次に、DEAD (84.4 μＬ, 0.186 mmol, 0.5 equiv.) を加えて2時間20分攪拌した。次に、PPh3 (147 mg, 0.560 mmol, 1.5 equiv) を加えて14分間攪拌した。さらに、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて34分間攪拌した。次に、PPh3 (44.8 mg, 0.171 mmol, 0.5 equiv) を加えて2分間攪拌した。さらに、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて3時間15分攪拌した。最後に、DEAD (33.7 μＬ, 0.0743 mmol, 0.2 equiv) を加えて21分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2CH2/THF, 100 : 0 - 90 : 10) に付し、光延反応物 (1.05 g, 75.0%) を得た。
【００９０】
【化６３】
2014101274.tif 000067
光延反応物 (637 mg, 0.169 mmol) をCH2Cl2 (16.9 mL) に溶解し、TFE (1690 μＬ) およびTFA (169 μＬ) を加えて室温で40分間攪拌した。沈殿物をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。化合物4の合成と同等の後処理を行い得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3/EtOH, 100 : 0 - 95 : 5) に付し、化合物23 (294 mg, 58.1%) を得た。
化合物24の合成
【００９１】
【化６４】
2014101274.tif 000068
化合物23 (294 mg, 0.0970 mmol)、HOAt (15.8 mg, 0.116 mmol, 1.2 equiv)、およびHATU (44.7 mg, 0.118 mmol, 1.2 equiv) をTHF (19.4 mL) に溶解し、DIPEA (84.5 μＬ, 0.485 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間10分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物24 (284 mg, 97.2%) を得た。
【００９２】
化合物25の合成
【００９３】
【化６５】
2014101274.tif 000069
化合物24 (284 mg, 0.0943 mmol) をTHF (943 μＬ) に溶解し、PhSH (29.0 μＬ, 0.282 mmol, 3.0 equiv) およびDBU (42.3 μＬ, 0.283 mmol, 3.0 equiv) を加えて室温で2時間30分間攪拌した。化合物16の合成と同等の後処理を行い、Bdev-2,-4,-8,および-10合成の中間体である化合物25 (255 mg, 95.8%) を得た。
（実施例６）Bdev-2, -4, -8,および-10の合成
（１）Bdev-8の合成
Bdev-8の合成は、以下のようにして行った。
【００９４】
【化６６】
2014101274.tif 000070
化合物25 (55.1 mg, 0.0181 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1810 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理およびHPLC精製を行いBdev-8 (12.0 mg, 52.6%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C64H85N12O15: 1261.6257, found 1261.4668.
（２）Bdev-4の合成
化合物26の合成
【００９５】
【化６７】
2014101274.tif 000071
化合物25 (62.6 mg, 0.0222 mmol)、ミリスチン酸 (7.7 mg, 0.0337 mmol, 1.5 equiv)、HOAt (4.5 mg, 0.0331 mmol, 1.5 equiv)、およびHATU (12.8 mg, 0.0337 mmol, 1.5 equiv) をTHF (444 μＬ) に溶解し、DIPEA (19.3 μＬ, 0.111 mmol, 5.0 equiv) を加えて室温で3時間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物26 (56.9 mg, 84.7%) を得た。
Bdev-4の合成
【００９６】
【化６８】
2014101274.tif 000072
化合物26 (56.9 mg, 0.0188 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (1514 μＬ) を加えて室温で5分間攪拌した。TIS (46.9 mL) を加えて3時間55分攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-4 (4.0 mg, 14.5%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C78H111N12O16: 1471.8241, found 1471.8190.
（３）Bdev-2の合成
化合物27の合成
【００９７】
【化６９】
2014101274.tif 000073
化合物24 (204 mg, 0.0724 mmol) をCH2Cl2 (1448 μＬ) に溶解し、Et3N (20.4 μＬ, 0.145 mmol, 2.0 equiv) およびAc2O (13.7 μＬ, 0.145 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で50分間攪拌した。化合物4の合成と同等の後処理を行い化合物27 (200 mg, 96.3%) を得た。
【００９８】
Bdev-2の合成
2014101274.tif 000074
化合物27 (200 mg, 0.0697 mmol) にTFA/TIS/H2O = 95 : 5 : 5 の溶液 (6970 μＬ) を加えて室温で3時間攪拌した。Bdev-7の合成と同等の後処理を行いBdev-2 (54.4 mg, 59.8%) を得た。HRMS m/z [M + H]+: calcd for C66H87N12O16: 1303.6363, found 1303.5524.であった。
（４）Bdev-10の合成
【００９９】
【化７０】
2014101274.tif 000075
Bdev-2 (13.1 mg, 0.0101 mmol) およびSUNBRIGHT  ME-020AS（日油株式会社製） (40.4 mg, 0.0202 mmol, 2.0 equiv) のDMF (404 μＬ) にEt3N (2.84 μＬ, 0.0202 mmol, 2.0 equiv) を加えて室温で22時間40分攪拌した。HPLC精製しBdev-10 (16.8 mg, 48.9%) を得た。
m/z 1700付近を中心に22マス間隔で2価イオンが検出された。
【０１００】
（比較例）比較例化合物の合成
比較例として、ＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド架橋：ジスルフィド架橋：化合物番号：STD）を用いた。ＷＰ９ＱＹペプチドは、２，４ドコシロキシベンジルアルコールにアミノ酸を逐次縮合し、直鎖配列を合成した後、ヨウ素酸化によってジスルフィド結合を形成しトリフルオロ酢酸により２，４ドコシロキシベンジルアルコールを切断する工程を経て調製した。
【０１０１】
（参考例）参考例の合成
参考例として架橋部分が、チオエーテル架橋（化合物番Comp.１）、またはオレフィン架橋（化合物番号Comp．３）に改変された改変体を用いた。チオエーテル架橋ＷＰ９ＱＹペプチドは、図３に記載の合成スキームに従って合成した。オレフィン架橋ＷＰ９ＱＹペプチドは、図４に記載の合成スキームに従って合成した。
【０１０２】
（実施例７）ペプチダーゼに対する抵抗性
カルボキシペプチダーゼおよびキモトリプシンを用いて、本発明のペプチドのペプチダーゼに対する抵抗性を検討した。ペプチダーゼに対する抵抗性は以下の通りにして測定した。
（カルボキシペプチダーゼによる分解）
SIGMA社より購入したカルボキシペプチダーゼを、PBSにて1U/mlになるように酵素液を調製し、ウォーターバスにて37℃で保温した。次いで、DMSO:純水＝１：１混合溶媒にて５mg/mlに調製したペプチド容積をPBS(-)にて１mg/mlに調製し、酵素液とペプチド溶液を４：１で混合し、ペプチドの終濃度が0.2mg/mlとなるようにした。その後速やかに37℃にして反応を行った。経時的に0.1mlずつサンプリングし、反応停止液（25%TFA in アセトニトリル 20μＬ）を加えて反応を停止した。各試料をHPLCにて測定し、ペプチダーゼによるペプチドの分解を測定した。サンプリングのタイミングは０分、０．５分、１分、２分にて行い、２分においても５０％以上の分解が得られない場合は、さらに０．５時間後、１時間後、３時間後、加えて場合により６時間後に行い、長時間安定なペプチドに関しては、さらに２４時間後から１６８時間後までの範囲で必要に応じてサンプリングを行った。添加したペプチドの半分が分解される時間を測定した。結果を表３に示す。
【０１０３】
（キモトリプシンによる分解）
SIGMA社より購入したキモトリプシンを、0.1M Tris-HCl(pH8.0)にて4U/mlになるように酵素液を調製し、ウォーターバスにて37℃で保温した。次いで、DMSO：純水=1：1にて5mg/mlに調製したペプチド溶液を0.1M Tris-HCl(pH8.0)にて1mg/mlに調製し、酵素液とペプチド溶液を４：１で混合しペプチド終濃度0.2mg/mlとなるようにした。その後、速やかに37℃にてして反応を行った。経時的に0.1mlずつサンプリングし、反応停止液（25%TFA in アセトニトリル 20μＬ）を加えて反応を停止した。各試料をHPLCにて測定し、キモトリプシンによるペプチドの分解を測定した。サンプリングのタイミングは０分、０．５分、１分、２分にて行い、２分において５０％以上の分解が得られない場合は、さらに０．５時間後、１時間後、３時間後に行い、添加したペプチドの半分が分解される時間を測定した。結果を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
2014101274.tif 000076
【０１０５】
上記の結果より、本発明の架橋化方法従って作成された本発明のＷＰ９ＱＹペプチド模倣体が、ジスルフィド架橋またはチオエーテル架橋のＷＰ９ＱＹペプチドペプチドに比べて、ペプチダーゼに対する分解耐性が改善していることが示された。
【０１０６】
（実施例８：破骨細胞分化抑制試験）
本発明のWＰ９ＱＹペプチド模倣体の破骨細胞分化抑制活性を、培養破骨細胞を用いて、以下のようにして検討した。
自家繁殖させたC57BL/６jjc1マウス（体重18-20g）から骨髄細胞を採取し、ＲＡＮＫＬ（５０ng/ml、組換えヒトＲＡＮＫＬを和光純薬工業から購入）およびＭ−ＣＳＦ（２５ng/ml、組換えヒトＭ−ＣＳＦを、R&D Systemから購入）を含有する培地（α−MEM、10％FBS（SIGMA）、penicillin 100U、streptomycin 100μg/ml、含有）にて、各ＷＰ９ＱＹ架橋ペプチド模倣体の存在下で、４日間培養した。
【０１０７】
各ペプチドは、DMSO：MQ=1:1にて5mg/ml に調製（下記図５に示す実験に使用）もしくはDMSO：MQ=1:9にて4mM に調製（下記図６に示す実験に使用）した溶液を培養培地にて希釈し、フィルター（0．22μm）にて濾過滅菌し、ペプチド調製液とした。各ペプチド調製液を、目的の終濃度となるようにして加え、骨随細胞を上記条件で培養した。
培養３日目に新しい培地に交換し、４日目に3．6％ホルマリン（36％ホルマリンをPBS(-)にて希釈）にて10分間固定した後、アセトン：エタノール＝１：１にて30秒間透過処理し20分間乾燥させてＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ポスファターゼ）染色を行い、成熟破骨細胞を確認した。ペプチド濃度は、培地中の最終濃度が、０．３、１、３、１０μＭになるようにして培養した。コントロールとして、ペプチド無添加およびＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド結合）添加を用いた。結果を、図５よび図６に示す。Bdev-2およびBdev-3が、低濃度において、ＷＰ９ＱＹペプチド（ジスルフィド結合）より強い破骨細胞分化抑制作用を持つことが示された。
【図１】
2014101274.tif 000085
【図２】
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【図３】
2014101274.tif 000087
【図４】
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【図５】
2014101274.tif 000089
【図６】
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