(57)【要約】      （修正有）【課題】アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することができる抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及びその製造方法、並びに前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含有する抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物の提供。【解決手段】免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを動物に投与する工程と、前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、ハイブリドーマを調製する工程と、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られ、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られ、
アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体。
【請求項２】
アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３】
免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含み、
前記回収された抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４】
免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含み、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とするハイブリドーマの製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、ハイブリドーマ及びその製造方法、並びに抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＬＳ（Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ＬｉｐｏＳａｒｃｏｍａ）は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｓａｒｃｏｍａ）とも称される。前記ＴＬＳは、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の原因遺伝子として同定されたものである。しかしながら、前記ＡＬＳの発症機構は未だ明確とはなっていない。
【０００３】
これまでに、前記ＴＬＳは、タンパク質アルギニンメチル化酵素と結合し、前記タンパク質アルギニンメチル化酵素により、２１６番目、２１８番目、２４２番目、及び３９４番目のアルギニン残基がジメチル化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、前記ＡＬＳの患者の中には、前記ＴＬＳの２１６番目のアルギニン残基がシステイン残基に置換された変異を有する患者が見つかっている。
そのため、前記ＡＬＳにおいて、前記ＴＬＳのアルギニン残基のメチル化修飾が重要な役割を果たすことが示唆されている。
【０００４】
しかしながら、アルギニン残基がメチル化修飾されたＴＬＳを特異的に認識する手段が無く、前記アルギニン残基のメチル化修飾の役割を解明することができていないのが現状である。
したがって、アルギニン残基がメチル化修飾されたＴＬＳを特異的に認識する手段の速やかな開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．、  ＴＬＳ  ａｎｄ  ＰＲＭＴ１  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＬＳ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．、  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、  ２０１１年、  ４０４（４）、  ９９１−９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することができる抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及びその製造方法、並びに前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含有する抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られ、
アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体である。
＜２＞  アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１であることを特徴とするハイブリドーマである。
＜３＞  免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含み、
前記回収された抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法である。
＜４＞  免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含み、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
＜５＞  前記＜１＞に記載の抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することができる抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及びその製造方法、並びに前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含有する抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、アルギニン残基のジメチル化の流れを示した概要説明図である。
【図２】図２は、試験例１における一次抗体としてモノクローナル抗体１を用いた結果を示す図である。
【図３】図３は、試験例１における一次抗体としてモノクローナル抗体２を用いた結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例１における一次抗体としてモノクローナル抗体３を用いた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、並びにハイブリドーマ及びその製造方法）
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗体であり、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法により、好適に製造することができる。
本発明のハイブリドーマは、前記アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、本発明のハイブリドーマの製造方法により、好適に製造することができる。
以下、抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法、及びハイブリドーマの製造方法の説明と併せて、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体、及びハイブリドーマを説明する。
【００１１】
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程と、抗体を回収する抗体回収工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１２】
前記ハイブリドーマの製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記ハイブリドーマの製造方法における、前記免疫原投与工程、前記抗体産生細胞回収工程、前記ハイブリドーマ調製工程、及び前記ハイブリドーマ選択工程は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法と同様に行うことができる。
【００１３】
＜免疫原投与工程＞
前記免疫原投与工程は、免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程である。
【００１４】
＜＜免疫原＞＞
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）は、ＴＬＳの２１３番目から２２２番目のアミノ酸に相当する。前記配列番号１中、下線部で示されたアルギニン残基は、内在的にジメチル化されることが報告されている。なお、前記ＴＬＳのアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＰ＿００４９５１で入手することができる。
【００１５】
アルギニン残基のジメチル化の流れを図１に示す。
タンパク質中のアルギニン残基のメチル化は、タンパク質アルギニンメチル化酵素（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、「タンパク質アルギニンメチル基転移酵素」、「ＰＲＭＴ」と称することがある）が、Ｓ−アデノシルメチオニン（以下、「ＳＡＭ」、「ＡｄｏＭｅｔ」と称することがある）をメチル基供与体として、前記アルギニン残基へのメチル基の導入を触媒することにより行われる。
ここで、前記タンパク質アルギニンメチル化酵素には、タイプＩと、タイプＩＩとが存在する。前記タイプＩとしては、ＰＲＭＴ１が挙げられ、前記タイプＩＩとしては、ＰＲＭＴ５が挙げられる。
前記タイプＩのタンパク質アルギニンメチル化酵素によると、前記アルギニン残基は、非対称ジメチル化され、非対称性ジメチル化アルギニンとなる。一方、前記タイプＩＩのタンパク質アルギニンメチル化酵素によると、前記アルギニン残基は、対称ジメチル化され、対称性ジメチル化アルギニンとなる。
【００１６】
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により調製することができる。
【００１７】
＜＜動物＞＞
前記動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウスが好ましい。
前記マウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどが挙げられる。
【００１８】
＜＜投与＞＞
前記免疫原を投与する方法（動物を免疫する方法）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アジュバントとともに投与することが、前記マウスの免疫原への免疫応答性を高めることができる点で、好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、公知のアジュバントを適宜選択することができ、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記免疫原の投与は、原則１回であるが、複数回であってもよい。前記免疫原の投与を複数回行う場合に使用するアジュバントは、各回同一であってもよいし、異なっていてもよい。
前記免疫原の投与を複数回行う場合の投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記アジュバントの投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原及びアジュバントの投与部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、尾根部に投与することが好ましい。
【００１９】
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記抗体産生細胞回収工程は、前記動物から抗体産生細胞を回収する工程である。
【００２０】
＜＜抗体産生細胞回収＞＞
前記抗体産生細胞を回収する時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、最後の免疫原の投与から１７日間後などが挙げられる。
前記抗体産生細胞の回収方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの腸骨リンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、ステンレスのワイヤーメッシュを通して、回収する方法などが挙げられる。
【００２１】
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記ハイブリドーマ調製工程は、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程である。
【００２２】
＜＜ミエローマ＞＞
前記ミエローマの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス由来のものが好ましい。
前記マウス由来のミエローマとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４などが挙げられる。
【００２３】
＜＜細胞融合＞＞
前記細胞融合の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。
前記細胞融合された細胞の選択方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、選択培地として、ヒポキサン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）を用いて細胞を培養する方法などが挙げられる。前記ＨＡＴ培地を用いることにより、親細胞株が死滅し、細胞融合された細胞のみが増殖する。
【００２４】
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記ハイブリドーマ選択工程は、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程である。
【００２５】
＜＜選択＞＞
前記ハイブリドーマ選択工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法により選択する方法、ウエスタンブロット法により選択する方法などが挙げられる。これらは、単独で行なってもよいし、併用してもよい。
前記選択の回数としては、特に制限はなく、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
【００２６】
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含む組成物（以下、「ペプチド組成物」と称することがある）は、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含み、必要に応じてその他の構成を含む。
前記ペプチド組成物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとＧＳＴタンパク質とを融合させたペプチドなどが挙げられる。
【００２７】
前記ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、前記ペプチド組成物として、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いた場合には、例えば、前記ペプチドを感作用プレートに固相化し、次いで、前記ハイブリドーマが産生する抗体が含まれる培養上清を加え反応させた後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加えて反応させ、次いで、酵素基質（発色剤）を加え、発色させた後、波長４９２ｎｍの吸光度を測定する方法が挙げられる。
ここで、前記吸光度が高いものを選択することで、よりアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳに特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
【００２８】
前記ウエスタンブロット法としては、例えば、前記ＴＬＳを発現する細胞の溶解液を調製し、該溶解液をＳ−アデノシルメチオニンの存在下でＰＲＭＴ１にて処理し、前記処理液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、一次抗体として、前記ハイブリドーマが産生する抗体を用い、二次抗体として、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識された抗体を用い、発光シグナルを検出することにより行う方法が挙げられる。
前記ＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより、よりアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳに特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
【００２９】
前記選択したハイブリドーマを分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などが挙げられる。
【００３０】
−ハイブリドーマ−
本発明のハイブリドーマは、上述した工程により得ることができる。
前記本発明のハイブリドーマであるハイブリドーマ２Ｂ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１として、２０１３年４月１０日に寄託申請した（受領日は２０１３年４月１１日である）。
【００３１】
＜抗体回収工程＞
前記抗体回収工程は、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程である。
【００３２】
＜＜抗体回収＞＞
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリドーマの培養上清から回収する方法、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法などが挙げられる。
【００３３】
前記ハイブリドーマの培養上清から回収する方法における前記ハイブリドーマの培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、高密度培養、スピナーフラスコによる培養などが挙げられる。前記各培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、プリスタンなどの免疫抑制作用を有する物質を投与したマウスの腹腔内へ前記ハイブリドーマを移植し、約１週間後から３週間後に腹水を採取する方法などが挙げられる。
【００３４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程などが挙げられる。
【００３５】
＜＜精製工程＞＞
前記精製工程は、前記回収工程により回収された抗体を精製する工程である。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに培養上清をアプライし、精製する方法などが挙げられる。
【００３６】
−抗ＴＬＳモノクローナル抗体−
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、上述のように、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１のハイブリドーマが産生し、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗体である。
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、前記免疫原を用いているため、前記ＴＬＳの２１６番目及び２１８番目のアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識すると考えられる。
【００３７】
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを行い、ウエスタンブロット法により確認する方法などが挙げられる。
【００３８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイは、例えば、以下のようにして行うことができる。
前記ＴＬＳと、前記アルギニンメチル化酵素（ＰＲＭＴ１又はＰＲＭＴ５）とをＳ−アデノシルメチオニンの存在下、メチレーションバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で反応させる。前記反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、一次抗体として、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを行う。
前記ウエスタンブロットの結果、前記アルギニンメチル化酵素として、ＰＲＭＴ１を用いた場合にのみ、前記ＴＬＳが検出された場合には、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、前記アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識していると判断することができる。
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイにおけるＴＬＳの態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＳＴタンパク質と融合させた融合タンパク質の態様などが挙げられる。
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３０℃で６０分間とするなどが挙げられる。
【００３９】
（抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物）
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識できるので、前記ＴＬＳのメチル化状態を調べるための試薬として好適に用いることができる。また、前記ＴＬＳは、前記ＡＬＳの原因遺伝子の１つであるので、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記ＡＬＳのバイオマーカーとしても好適に用いることができる。
【００４０】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の試薬又は試薬キットに用いられている構成を目的に応じて適宜選択することができる。前記公知の試薬又は試薬キットに用いられている構成としては、例えば、標識、緩衝液、プレート、反応停止液などが挙げられる。前記標識の具体例としては、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質などが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下、製造例、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例に何ら限定されるものではない。
【００４２】
（製造例１：免疫原の調製）
免疫原として、以下の３種類のペプチドを化学合成により製造した（ＡｎｙＧｅｎ社製）。
免疫原１：ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）
ただし、前記配列番号１中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、左から順に、ＴＬＳにおける２１６番目、２１８番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号１で表されるペプチドは、ＴＬＳの２１３番目から２２２番目の部分に相当する。
免疫原２：ＣＧＹＥＰＲＧＲＧＧ（配列番号２）
ただし、前記配列番号２中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、ＴＬＳにおける２４２番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号２で表されるペプチドは、ＴＬＳの２３７番目から２４６番目の部分に相当する。
免疫原３：ＣＰＭＧＲＧＧＹＧＧ（配列番号３）
ただし、前記配列番号３中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、ＴＬＳにおける３９４番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号３で表されるペプチドは、ＴＬＳの３９０番目から３９９番目の部分に相当する。
【００４３】
（製造例２：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
免疫原として、前記免疫原１を用い、以下のようにしてマウスに免疫原を投与した。
前記免疫原１と、オボアルブミンとをガラスニードル中で混合して抗原エマルジョンを作製し、該抗原エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウスの尾根部に注射した。
【００４４】
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記免疫原投与工程免疫原の投与から１７日間後に、免疫したマウスの腸骨リンパ節を取り出し、以下のようにして細胞を回収した。
前記取り出したマウスの腸骨リンパ節を破砕し、ステンレスのワイヤーメッシュを通して、リンパ球細胞を回収した。
【００４５】
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記抗体産生細胞回収工程で回収したリンパ球細胞と、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを用い、以下のようにして細胞融合を行った。
前記リンパ球細胞と、前記ミエローマ細胞とを遠心管に入れ、混ぜ合わせた。前記混ぜ合わせた細胞を遠心して回収し、培地を除去した。そこに、予め温めておいたＰＥＧを添加し、緩やかに震盪した。次いで、ＲＰＭＩ培地を加え、ＰＥＧを希釈した。その後、遠心して細胞を回収し、該細胞をＨＡＴ培地で９６穴プレートにまいて培養した。
【００４６】
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記細胞融合を行った細胞について、以下のようにして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマ２Ｂ１２株を得た。
９６穴プレートの各穴に抗原（前記免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド））を加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた。その後、各穴に前記細胞融合で得られたハイブリドーマの培養上清を加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた後、ＰＢＳで４回洗浄した。
次いで、西洋ワサビパーオキシターゼ標識された抗体（Ｐ０１６１、ＤＡＫＯ社製）を各穴に加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた後、西洋ワサビパーオキシターゼの基質Ｏ−フェニレンジアミン（１６１−１１８５１、Ｗａｋｏ社製）を各穴に加え、発色させた。前記発色は、波長４９２ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。前記発色が強かったハイブリドーマを選択し、以下のようにして単クローン化した。
前記ハイブリドーマの単クローン化は、限界希釈法により、以下のようにして行った。
前記選択されたハイブリドーマを９６穴プレートの穴からはがして回収し、段階希釈した。次いで、１穴に１細胞だけ撒けた穴を記録し、数日後に抗体産生の有無を確認した。
【００４７】
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１として、２０１３年４月１０日に寄託申請した（受領日は２０１３年４月１１日である）。
【００４８】
＜抗体回収工程＞
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を以下のようにして培養した後、培養上清を回収し、抗体を回収した。
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株は、１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％二酸化炭素、３７℃で、１×１０７細胞／ｍＬ程度になるまで培養し、３日ごとに継代培養した。なお、前記ハイブリドーマは、無血清培地での培養する馴化を行なうことも可能である。
【００４９】
＜精製工程＞
前記培養上清に含まれる抗体を以下のようにして精製し、モノクローナル抗体１を得た。
回収した培養上清を遠心した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを充填したカラムに前記培養上清をアプライした。その後、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で洗浄し、次いで、溶出バッファー（０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム）で溶出した。
【００５０】
（比較製造例１：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
前記製造例２において、前記免疫原１を用いた代わりに前記免疫原２を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、マウスに免疫原を投与した。
【００５１】
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞を回収した。
【００５２】
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞融合を行った。
【００５３】
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記製造例２において、抗原として免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた代わりに、免疫原２（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマ４Ｅ５株を得た。
【００５４】
＜抗体回収工程＞
前記製造例２において、前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を用いた代わりに前記ハイブリドーマ４Ｅ５株を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、抗体を回収した。
【００５５】
＜精製工程＞
前記製造例２において、ハイブリドーマ２Ｂ１２株の培養上清を用いた代わりにハイブリドーマ４Ｅ５株の培養上清を用いた以外は、前記製造例２と同様にして精製し、モノクローナル抗体２を得た。
【００５６】
（比較製造例２：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
前記製造例２において、前記免疫原１を用いた代わりに前記免疫原３を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、マウスに免疫原を投与した。
【００５７】
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞を回収した。
【００５８】
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞融合を行った。
【００５９】
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記製造例２において、抗原として免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた代わりに、免疫原３（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマＢ５株を得た。
【００６０】
＜抗体回収工程＞
前記製造例２において、前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を用いた代わりに前記ハイブリドーマＢ５株を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、抗体を回収した。
【００６１】
＜精製工程＞
前記製造例２において、ハイブリドーマ２Ｂ１２株の培養上清を用いた代わりにハイブリドーマＢ５株の培養上清を用いた以外は、前記製造例２と同様にして精製し、モノクローナル抗体３を得た。
【００６２】
（試験例１：アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳの認識）
前記モノクローナル抗体１〜３の特異性をｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを行い、ウエスタンブロット法により確認した。
【００６３】
＜ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製＞
−プラスミドの調製−
大腸菌ＤＨ５α株にトランスフォーメーションした以下のプラスミドＤＮＡをもつシングルコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ培地で、３７℃で一晩震盪培養した。培養後、遠心により大腸菌を回収し、アルカリＳＤＳ法で大腸菌から前記プラスミドＤＮＡを抽出した。
前記プラスミドＤＮＡは、配列番号４で表されるＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｃＲＮＡｓ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｙ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｉｓ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．、  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８年、４５４（７２００）、１２６−１３０の記載を参考にして作製した。
−大腸菌による融合タンパク質の発現−
大腸菌Ｙ１０  ９０株にトランスフォーメーションした前記プラスミドＤＮＡをもつシングルコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ培地で、３７℃で一晩震盪培養した。一晩培養した大腸菌５ｍＬをアンピシリン含有ＬＢ培地２００ｍＬに移し替え、３７℃で３時間震盪培養した後、ＩＰＴＧ（最終濃度２．５ｍＭ）を加え、２０℃で３時間震盪培養した。その後、遠心により大腸菌を回収し、ＷＣＥバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、超音波破砕を行った。次いで、遠心により、融合タンパク質を含む細胞抽出液を回収した。
−融合タンパク質の精製−
前記大腸菌で発現させた融合タンパク質は、ＧＳＴアガロースビーズ（シグマアルドリッチ社製）を用い、以下のようにして精製した。
カラムに、前記融合タンパク質の細胞抽出液と、前記ＧＳＴアガロースビーズとを加え、４℃で３０分間ローテーターによりカラムを旋回させた。その後、遠心により前記ＧＳＴアガロースビーズを回収し、ＷＣＥバッファーで洗った。この操作を２回繰り返した後、ＳＤＳサンプルバッファーを加え、前記融合タンパク質を溶出させた。
【００６４】
＜タンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ１の調製＞
−プラスミドの調製−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製におけるプラスミドの調製において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを用いた代わりに、以下のＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡを用いた以外は同様にして調製した。
前記ＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡは、配列番号５で表されるＰＲＭＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、前記非特許文献１の記載を参考にして作製した。なお、前記ＰＲＭＴ１の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＭ＿１９８３１８、ＮＰ＿９３８０７４で入手することができる。
−大腸菌によるＰＲＭＴ１の発現−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製における大腸菌による融合タンパク質の発現において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた代わりに、前記ＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた以外は同様にして行い、ＰＲＭＴ１を含む細胞抽出液を回収した。
【００６５】
＜タンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ５の調製＞
−プラスミドの調製−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製におけるプラスミドの調製において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを用いた代わりに、以下のＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡを用いた以外は同様にして調製した。
前記ＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡは、配列番号６で表されるＰＲＭＴ５タンパク質をコードするＤＮＡをｐＡＳＫ−ＩＢＡベクター（２−１４０４−０００、ＩＢＡ社製）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入したものである。前記ＤＮＡは、ＨｅＬａ細胞のＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により調製した。なお、前記ＰＲＭＴ５の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＭ＿００６１０９、ＮＰ＿００６１００で入手することができる。
−大腸菌によるＰＲＭＴ５の発現−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製における大腸菌による融合タンパク質の発現において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた代わりに、ＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた以外は同様にして行い、ＰＲＭＴ５を含む細胞抽出液を回収した。
【００６６】
＜ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイ＞
１μｇの前記融合タンパク質（ＧＳＴ−ＴＬＳ）と、２００ｎｇの前記ＰＲＭＴ１及び前記ＰＲＭＴ５のいずれかとを、２０μＭのＳ−（５’−Ａｄｅｎｏｓｙｌ）−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（以下、「ＳＡＭ」と称することがある）を含むメチレーションバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で、３０℃で６０分間反応させた。
前記反応液をＷＣＥバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーを８μＬ加え、その全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、以下のようにしてウエスタンブロット法にて解析した。
【００６７】
−ウエスタンブロット−
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）へブロッティングした。
前記ブロッティングされた膜を、前記モノクローナル抗体１〜３のいずれかと、１％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間、室温で反応させ、次いで、二次抗体であるＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と１％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間、室温で反応させた後、発光シグナルをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により検出した。結果を図２から図４に示した。
【００６８】
図２は、一次抗体として前記モノクローナル抗体１を用いた結果を示し、図３は、一次抗体として前記モノクローナル抗体２を用いた結果を示し、図４は、一次抗体として前記モノクローナル抗体３を用いた結果を示す。図２から図４中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「ｎｏ」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合の結果を示し、「Ｐ１」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ１を用いた場合の結果を示し、「Ｐ５」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合の結果を示す。
図２から図４の結果から、前記モノクローナル抗体１を用いた場合には、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ１を用いた場合にのみ前記融合タンパク質のシグナルが確認され、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合及びタンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合には、前記融合タンパク質のシグナルは、確認されなかった。前記ＰＲＭＴ１は、アルギニン残基の非対称ジメチル化を触媒し、前記ＰＲＭＴ５は、アルギニン残基の対称ジメチル化を触媒することから、前記モノクローナル抗体１は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することがわかった。
一方、前記モノクローナル抗体２及び３では、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合及びタンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合にも前記融合タンパク質のシグナルが確認された。そのため、前記モノクローナル抗体２及び３は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識するものではないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識できるので、アルギニン残基のメチル化状態を調べるための試薬、ＡＬＳのバイオマーカーなどとして好適に利用可能である。
本発明のハイブリドーマは、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造に好適に用いることができる。
【受託番号】
【００７０】
ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１５９１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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