(57)【要約】【課題】良好な三量体化特性および改良された薬学的特性を兼ね備える組換え体の効率的な製造を可能とする、三量体を形成する融合タンパク質を提供する。【解決手段】本発明は、（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および、ｂ．コレクチンファミリーネック領域、を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン；（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに、（ｉｉｉ）エフェクターポリペプチド（ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される）を含む融合タンパク質を提供する。本明細書に記載されるように、この融合タンパク質、これをコードする核酸は、薬学的組成物として、または治療、診断および／もしくは研究に応用するために、好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および
ｂ．コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン；
（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに
（ｉｉｉ）該コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される、エフェクターポリペプチドであって、該エフェクターポリペプチドは、抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントである、エフェクターポリペプチド
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質−Ｄ、サーファクタントタンパク質−Ａ１、サーファクタントタンパク質−Ａ２、マンナン結合タンパク質−Ｃ、肝臓コレクチン１、胎盤コレクチン１またはコレクチン−１１の糖質認識ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記糖質認識ドメインが、１つのアミノ酸の変異または置換を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質Ｄの糖質認識ドメインであり、前記置換が、配列番号２１のフェニルアラニン３５５の置換であり、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンから選択される極性アミノ酸に変異される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記コレクチンファミリーネック領域が、サーファクタントタンパク質−Ｄ、サーファクタントタンパク質−Ａ１、サーファクタントタンパク質−Ａ２、マンナン結合タンパク質−Ｃ、肝臓コレクチン１、胎盤コレクチン１またはコレクチン−１１のネック領域である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーエレメントが、２５以下のアミノ酸長を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーエレメントが、アラニン、トレオニン、グリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸で構築される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントが、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体に対して作製されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
サイトカインに対する前記受容体が、ＩＬ４Ｒ−アルファである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記コレクチンファミリー糖質認識ドメインのＣ末端に、抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬品。
【請求項１２】
腫瘍、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患および移植拒絶を含む、ＴＮＦサイトカインの機能障害に関連する増殖性障害の処置のための、請求項１または９に記載の融合タンパク質を含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（説明）
（発明の分野）
本発明は、コレクチン三量体化ドメインのネック領域および糖質認識ドメイン、リンカーエレメント、ならびにエフェクターポリペプチドを含む融合タンパク質に言及する。さらに、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸に言及する。本明細書に記載されるように、この融合タンパク質、核酸および細胞は、薬学的組成物として、または治療、診断および／もしくは研究に応用するために、好適である。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
コレクチンタンパク質は、安定なオリゴマーを形成することが知られている。コレクチンは、Ｃ型レクチンドメインと呼ばれる構造タンパク質の折りたたみを含むタンパク質レクチンスーパーファミリーを構築する１８個の群メンバーのうちの１つである（Ｚｅｌｅｎｓｋｙら，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５，Ｖｏｌ  ２７２，ｐ  ６１７９−６２１７）。レクチンは、糖質に結合するタンパク質であり、Ｃ型レクチンは、結合にカルシウムを必要とする。Ｃ型レクチンドメインは、糖質結合に関与することから、このドメインは、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）とも呼ばれる。コレクチンは、生得免疫に関係し、数ある機能の中で、（例えば、ウイルスおよび細菌上に存在する）糖質に結合することによって、病原体を中和する。加えて、コレクチンは、補体の活性化および炎症への影響等の免疫機能を調節する。コレクチンの基本的な構造的特徴は、コラーゲン様ドメインおよびレクチンドメインであり、これらは、コレクチンの名称を示す構成要素である。いくつかのメンバーは、追加の構造的特徴を含むことが示されており、従って、それらは以下の構成要素を含む：ｉ）Ｎ末端コラーゲンドメイン、ｉｉ）このＮ末端コラーゲンドメインに接続された、ネック領域とも呼ばれるアルファへリックスセグメント、およびｉｉｉ）Ｃ末端のＣＲＤ（図３５）。コレクチンは、「三重らせんコラーゲン」領域、「コイルドコイルネック」領域およびＣＲＤ領域を介して非共有結合的に三量体化する。ヒトにおいて、コレクチン群は、血清マンノース結合タンパク質、肝臓、腎臓、胎盤および肺のコレクチンを含む。予め形成された三量体のジスルフィド媒介（ｍｅｄｉａｔｅｔ）オリゴマー化に関与するＮ末端システインを含む、肺サーファクタントタンパク質−Ａおよび−Ｄ（ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ）を包含する４種の肺コレクチンが公知である。例えば、ＳＰ−Ｄは、三量体の四量体を形成し、ＳＰ−Ａは、三量体の六量体を形成する（Ｋｉｓｈｏｒｅら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，Ｖｏｌ．４３，１２９３−１３１５）。
【０００３】
ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの三量体複合体を提供する試みにおいて、ＴＮＦサイトカインおよび多量体化構成要素を含む組換え融合タンパク質が、１つの可能なアプローチとして提案されてきた（例えば、特許文献１）。しかしながら、開示されたコンストラクトは、高分子量であり、かつ、非効率的な三量体化特性を有する、三量体化ドメインを呈した。
【０００４】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７（１９８９），１２０５−１２１３）は、ＴＮＦサイトカインの三量体は、Ｎ末端に位置する安定化モチーフによって安定化されると記載している。ＣＤ９５Ｌにおいて、ＣＤ９５Ｌ受容体結合ドメイン三量体の安定化は、おそらく、細胞膜の近辺に配置されるＮ末端アミノ酸ドメインによって生じる。
【０００５】
Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２２（２００４），１９７−２０２）は、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインは、Ｎ末端に位置する人工的なα−へリックスコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフによって安定化される可能性があると記載している。しかしながら、互いに対するポリペプチド鎖の方向（例えば、平行または逆平行方向）は、予測することがほとんど不可能であることが見出された。さらに、コイルドコイルジッパーモチーフにおけるヘプタッド（ｈｅｐｔａ−ｄ−）反復の最適な回数を決定することは困難である。加えて、コイルドコイル構造は、ｐＨおよび／またはイオン強度が変化した後、高分子凝集物を形成する傾向がある。
【０００６】
ＭｃＡｌｉｎｄｅｎら（Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２，２７７（４３）：４１２７４−４１２８１）は、ヒトＩＩＡ型プロコラーゲンアミノ酸配列と、ラットサーファクタントタンパク質（ＳＰ−Ｄ）のネックドメインの最初の２ヘプタッド反復に対応する１４アミノ酸配列との間の融合タンパク質の調製を開示している。
【０００７】
特許文献２は、シグナル配列、コラーゲンドメインおよびネックドメインを含むサーファクタントタンパク質−ＤとＣＤ４０Ｌとの間の融合タンパク質の調製を開示している。それらの融合タンパク質の不利な点は、それらが免疫原性の高い多量体凝集物を導き、それらが生化学的に規定される三量体リガンドを生成しないことである。
【０００８】
制御された三量体を形成するための手段としてコレクチン三量体化ドメインを使用することによって、当該分野に存在する明示された問題の回避が達成され得る。これに対する試みが、当該分野において行われてきた。しかしながら、コレクチン三量体化ドメイン（ＣＲＤ）のコイルドコイルネック領域のみが、そのような試みにおいて用いられてきた。特許文献３に記載されるように、ＮまたはＣ末端のいずれかでタンパク質ドメインに融合される三量体化ドメインとして、ＳＰ−Ｄ自体のコイルドコイル様ネック領域を使用することが可能である。
【０００９】
しかしながら、コイルドコイルネック領域単独を使用する場合、安定な三量体を得るためのヘプタッド反復の最適な回数（全長）を決定することは困難である。ＳＰ−Ｄネック領域の提示される部分は、それ自体は十分に安定な三量体を形成することはなく、安定化された三量体融合タンパク質を生じるためにその長さまたは反復の程度について最適化される必要がある。加えて、コイルドコイル構造は、ｐＨおよび／またはイオン強度が変化した後、高分子凝集物を形成する傾向がある。従って、コレクチンネック領域αへリックスバンドルは、生理学的条件を模倣した条件または生理学的条件に近似した条件においてのみ、三量体分子として存在する。これは、ｐＨの変動および／またはイオン強度の変更を使用する精製ストラテジーが、ネックのみに基づく融合タンパク質の三量体状態に対して悪影響を有するかもしれないことを暗示している。
【００１０】
また、コレクチン三量体化ドメインを使用することによって、抗体フラグメントのオリゴマー化が試みられてきた。例えば、組換えヒトフラグメントＳＰ−Ｄに融合された抗ＣＤ８９−Ｆａｂまたは抗ＣＤ６４−Ｆａｂを含む融合タンパク質（ネック＋ＣＲＤドメイン）が研究されており、それは、好中球に対して、病原体を標的にすることにおいて有効であると見出された。その提示される融合タンパク質は、化学的架橋によって作製されてきたが、その化学的架橋は、タンパク質産物の混合物を作り出すものであり、望まれるタンパク質種を得るためには、複雑な精製体制が必要である。
【００１１】
ヒトＳＰ−Ｄについて、アミノ酸フェニルアラニン３３５（配列番号２１のアミノ酸３５５に対応する）がアラニンに変異された変異体（ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ，Ｃｒｏｕｃｈら，ＪＢＣ  ２８１：１８００８−１８０１４）が記載されている。この変異体は、非常に弱い糖質結合を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開０１／４９８６６号
【特許文献２】国際公開０１／４２２９８号
【特許文献３】国際公開９５／３１５４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
Ｆａｂ−ＳＰ−Ｄに基づく融合タンパク質に対する効率的な製造プロセスを可能とするためには、面倒な精製手法を必要とするのではなく、粗混合物の代わりに規定された産物の制御された生成を可能とするプロセスが望ましい。
【００１４】
本発明者らは、本明細書に開示される融合タンパク質が、当該分野に存在する問題を克服し、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン等の様々なエフェクターポリペプチド、または抗体フラグメントもしくは１本鎖抗体の三量体の制御された作製を可能とすることを見出した。
【００１５】
本発明の目的は、良好な三量体化特性および改良された薬学的特性を兼ね備える組換え体の効率的な製造を可能とする、三量体を形成する融合タンパク質を提供することだった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、
（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および
ｂ．コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン；
（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに
（ｉｉｉ）エフェクターポリペプチド（ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される）
を含む融合タンパク質に関する。
【００１７】
本発明は、さらに、本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸分子、本明細書に記載されるような核酸分子によって形質転換またはトランスフェクトされた細胞または非ヒト生物に関する。
【００１８】
また、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞に関する。
【００１９】
本発明は、さらに、新生物、炎症性、感染性、変性、遺伝性、増殖性および血管性の疾患、ならびに前悪性がん状態および悪性がん性状態、がんおよび先天異常の治療および／または予防において使用するための（ｆｏｒ  ｕｓ）、本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子、または細胞に関した。
【００２０】
また、本発明は、本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞を活性な薬剤として含む、薬学的組成物または診断用組成物に関する。本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞は、新生物、炎症性、感染性、変性、遺伝性、増殖性および血管性の疾患、ならびに前悪性がん状態および悪性がん性状態、がんおよび先天異常の予防および／または処置における薬学的組成物の調製のために使用され得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および
ｂ．コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン；
（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに
（ｉｉｉ）該コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される、エフェクターポリペプチド
を含む、融合タンパク質。
（項目２）
上記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質−Ｄ、サーファクタントタンパク質−Ａ１、サーファクタントタンパク質−Ａ２、マンナン結合タンパク質−Ｃ、肝臓コレクチン１、胎盤コレクチン１またはコレクチン−１１の糖質認識ドメインである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
上記糖質認識ドメインが、１つ以上のアミノ酸の変異または置換を含む、項目１または２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目４）
上記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質Ｄの糖質認識ドメインであり、上記置換が、配列番号２１のフェニルアラニン３５５の置換であり、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンから選択される極性アミノ酸に変異される、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目５）
上記コレクチンファミリーネック領域が、サーファクタントタンパク質−Ｄ、サーファクタントタンパク質−Ａ１、サーファクタントタンパク質−Ａ２、マンナン結合タンパク質−Ｃ、肝臓コレクチン１、胎盤コレクチン１またはコレクチン−１１のネック領域である、項目１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
上記リンカーエレメントが、２５以下のアミノ酸長を有する、項目１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
上記リンカーエレメントが、アラニン、トレオニン、グリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸で構築される、項目１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目８）
上記エフェクターポリペプチドが、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体である、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目９）
上記エフェクターポリペプチドが、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体の変異体である、項目１〜７のうちの１項に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
上記エフェクタータンパク質が、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたは変異体であり、そのようなサイトカインのＮ末端ストーク領域が、上記融合タンパク質中に包含されない、項目８または９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
上記ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインが、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴおよびＲＡＮＫ−Ｌまたはそれらのそれぞれの受容体結合ドメインから選択される、項目１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
サイトカインに対する上記受容体が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＬＴベータＲ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１７およびＩＬ−４Ｒ−アルファから選択される、項目１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
上記エフェクターポリペプチドが、抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントである、項目１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
上記抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントが、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体に対して作製されている、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
サイトカインに対する上記受容体が、ＩＬ４Ｒ−アルファである、項目１４に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
上記コレクチンファミリー糖質認識ドメインのＣ末端に、抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントを含む、上記項目のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
医薬品として使用するための、項目１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
腫瘍、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患および移植拒絶を含む、ＴＮＦサイトカインの機能障害に関連する増殖性障害の処置のための、項目８〜１２または項目１４および１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのＳＥＣである。
【図２】図２は、親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１１の銀ゲルである。
【図３】図３は、親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１５によって誘導されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるカスパーゼ活性である。
【図４】図４は、ＷＭ３５、ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞に対するＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤの細胞毒性である。
【図５】図５は、親和性精製されたＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤのＳＥＣである。
【図６】図６は、固定化されたＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤへのＨＶＥＭ−Ｆｃの結合である。
【図７】図７は、ＴＲＡＩＬコンストラクトによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からのウェスタンブロットである。
【図８】図８は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるカスパーゼ活性である。
【図９】図９は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーである。
【図１０】図１０は、ヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤの細胞毒性活性である。
【図１１】図１１は、ＪｕｒｋａｔにおけるＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ誘導性カスパーゼ活性である。
【図１２】図１２は、ＨＴ１０８０細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤによる細胞毒性アッセイである。
【図１３】図１３は、ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤコンストラクトまたはＴＲＡＩＬ受容体選択的ＳＰＤコンストラクトによって一過性にトランスフェクトされた一過性トランスフェクトＨＥＫ細胞からのウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎプレート上に固定化されたＴＲＡＩＬ受容体選択的リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔおよびＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ）は、ＴＲＡＩＬ受容体１−ＦｃまたはＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃによって異なって検出される。
【図１５】図１５は、受容体選択的「ムテイン」リガンドへのＴＲＡＩＬ受容体の結合である。
【図１６】図１６は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーである。
【図１７】図１７は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１８】図１８は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４のＪｕｒｋａｔ細胞におけるカスパーゼ活性である。
【図１９】図１９は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーである。
【図２０】図２０は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２１】図２１は、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤ由来のＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１４のＪｕｒｋａｔ殺傷アッセイＪｕｒｋａｔである。
【図２２】図２２は、ヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤの細胞毒性活性である。
【図２３】受容体選択的ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤタンパク質は高度に可溶性である。
【図２４】図２４は、親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＡのＳＥＣである。
【図２５】図２５は、ＳＥＣ画分Ａ１〜Ａ１３の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２６】図２６は、ヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａの細胞毒性の効果である。
【図２７】図２７は、親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＤのＳＥＣである。
【図２８】図２８は、親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ由来のＳＥＣの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２９】図２９は、ヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの細胞毒性の効果である。
【図３０】図３０は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質の糖質への結合である。
【図３１】図３１は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）またはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）融合タンパク質の薬物動態である。
【図３２】図３２は、初代ヒト肝細胞におけるカスパーゼ活性である。
【図３３】図３３は、三量体ＡＰＲＩＬコンストラクトによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞由来の上清のウェスタンブロットである。
【図３４】ＴＡＣＩ−ＦｃはＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤに結合する。
【図３５】図３５は、コレクチンＳＰ−Ｄのドメイン構成の概略図である。コラーゲン領域およびネック領域はコレクチンを三量体化し、Ｎ末端はさらに三量体を、三量体の四量体または六量体へとオリゴマー化する。ＣＲＤは糖質への結合を媒介し、また、三量体形成に関与する。
【図３６】図３６は、ＴＮＦ−ＳＦタンパク質の一般的な構造を表わす概略図である。
【００２２】
【化１】
2014218510.tif 000002
は、細胞膜を表わし；Ｎ末端は細胞内に配置され、１．受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の逆平行βフォールド、２．ＲＢＤおよび細胞膜の境界面、３．プロテアーゼ切断部位である。
【図３７】図３７は、天然型ＴＮＦ−ＳＦ三量体の構造を表わす概略図である。シリンダー型構造（１）は、ＲＢＤを表わし、Ｎ末端（２）はストークを形成し、ＲＢＤを細胞膜と接続する。
【図３８】図３８は、ＴＮＦ−ＳＦ−ＲＢＤを最小化するために導入された改変を表わす概略図である。Ｎ末端ストークが削除されている。１．受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の逆平行βフォールド、２．ＲＢＤと細胞膜の境界面。
【図３９】図３９は、親和性精製されたＳｐ−ｓｃ００６−ＡＳＰＤ−Ｓｔの銀ゲルである。
【図４０】図４０は、親和性精製されたＳｐ−ｓｃ００６−ＡＳＰＤ−Ｓｔのサイズ排除クロマトグラフィーである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書において開示されるような融合タンパク質は、単量体タンパク質または多量体タンパク質であり得る。好ましくは、その融合タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい３つの単量体単位からなる三量体複合体として存在する。好ましくは、その三量体複合体は、３つの同一の融合タンパク質からなる。さらに好ましい実施態様において、その複合体は、本明細書に記載される３つの融合タンパク質間の共有結合（例えば、本明細書に記載されるような、コレクチン三量体化ドメインのシステイン間のジスルフィド架橋の共有結合）によって形成される。
【００２４】
そのような三量体複合体は、生物学的活性を示す。しかしながら、その三量体複合体のオリゴマー（例えば、基本的な三量体構造が２、３または４回存在する一定の複合体）もまた、生物学的活性を有することが見出された。従って、その三量体複合体のオリゴマーもまた好ましい。
【００２５】
上記融合タンパク質は、以下のエレメントを含む：
（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および
ｂ．コレクチンファミリーネック領域；］
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン
（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに
（ｉｉｉ）エフェクターポリペプチド（ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される）。
【００２６】
本明細書において使用されるようなコレクチン三量体化ドメインは、一般に、コレクチンポリペプチドのＣ末端部分に由来する。本明細書において使用されるような三量体化ドメインは、コイルドコイル領域（特定の実施態様においてネック領域と呼ばれる）および糖質認識ドメイン（本明細書においてＣＲＤとも呼ばれる）を含む。
【００２７】
コレクチン三量体化ドメインは、任意のコレクチンファミリーメンバーを含んでもよい。そのようなメンバーおよびそれらの構造は、例えば、Ｈａｋａｎｓｓｏｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，９：１６０７−１６１７）において要約されており、サーファクタントタンパク質−Ｄ（アクセッション番号：Ｐ３５２４７）、サーファクタントタンパク質−Ａ１（アクセッション番号：Ｑ８ＩＷＬ２）、サーファクタントタンパク質−Ａ２（アクセッション番号：Ｑ８ＩＷＬ１）、マンナン結合タンパク質−Ｃ（アクセッション番号：Ｐ１１２２６）、肝臓コレクチン１（アクセッション番号：Ｑ９Ｙ６Ｚ７）、胎盤コレクチン１（アクセッション番号：Ｑ５ＫＵ２６）、またはコレクチン１１（アクセッション番号：Ｑ９ＢＷＰ８）を含み得る。ＣＲＤと同様、コイルドコイル領域（ネック領域）は、上記コレクチンから選択されてもよい。しかし、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄ）（ネック領域）およびＣＲＤは、同一コレクチン由来である必要がないことが理解されなければならない。
【００２８】
本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインとは異なる種由来であってもよい。あるいは、本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインと同一の種由来であってもよい。好ましい実施態様において、本明細書に記載されるようなコレクチンドメインは、ヒト由来であり、本明細書に記載されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒト由来である。
【００２９】
ＣＲＤは、変異体、例えば、サーファクタントタンパク質−Ｄまたはコレクチン−１１の変異体（これは、マンノースに結合しない）を含み得る。そのような変異体は、当業者に公知の方法（例えば、Ｃｒｏｕｃｈら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００６，２８１（２６）：１８００８−１８０１４）に開示される方法）によって同定され得る。コレクチン三量体化ドメイン（ｉｉ）は、本明細書に記載されるような少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体をさらに含んでもよく、本明細書に記載されるように作製され得る。そのようなアミノ酸置換は、コレクチン三量体化ドメインがそのリガンドマンノースに結合することを改変する可能性があり、治療においておよび／または薬学的組成物として使用されるとき、本明細書に記載されるような融合タンパク質のクリアランス速度を変化させる可能性がある。その改変により、結果としてマンノースへの結合が低下するか、またはマンノースに結合しなくなり、低いクリアランス速度を生じる可能性がある。そのような改変は、例えば、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−ＤのＦ３５５位のアミノ酸に作用するアミノ酸置換によって、特に、アミノ酸置換Ｆ３５５Ａ、Ｆ３５５Ｓ、Ｆ３５５Ｔ、Ｆ３５５Ｅ、Ｆ３５５Ｄ、Ｆ３５５Ｋ、またはＦ３５５Ｒによって達成され得る。特に好ましくは、Ｆ３５５Ｄ置換である。あるいは、その改変は、マンノースへの結合の増強および高いクリアランス速度を生じる可能性がある。そのような改変は、例えば、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−ＤのＦ３５５位のアミノ酸に作用するアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換Ｆ３５５Ｌ、Ｆ３５５ＹまたはＦ３５５Ｗによって達成され得る。
【００３０】
本明細書において使用されるようなネック領域は、コイルドコイル構造を含み得る。このネックは、コレクチンのＣＲＤの近傍に配置されてもよいし、特定の場合は、ＣＲＤから離れて配置されてもよい。
【００３１】
好ましい実施態様において、コレクチン三量体化ドメインは、サーファクタントタンパク質−Ｄのネックドメインおよび糖質結合ドメイン（ＣＲＤ）ドメイン、特に、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−Ｄ由来のアミノ酸２１７〜３７５、２１８〜３７５、２１９〜３７５、２２０〜３７５、２２１〜３７５、２２２〜３７５、２２３〜３７５、２２４〜３７５、２２５〜３７５を含む。別の好ましい実施態様において、コレクチン三量体化ドメインは、サーファクタントタンパク質−Ｄのネックドメイン、特に、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−Ｄ由来のアミノ酸２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７または２２５〜２５７を含む。別の好ましい実施態様において、コレクチン三量体化ドメインは、コレクチン−１１のネックおよび糖質結合ドメイン（ＣＲＤ）ドメイン、特に、配列番号２２のヒトコレクチン−１１のアミノ酸１１０〜２７１、１１６〜２７１または１２１〜２７１を含む。別の好ましい実施態様において、コレクチン三量体化ドメインは、コレクチン−１１のネックドメイン、特に、配列番号２２のヒトコレクチン−１１のアミノ酸
【００３２】
【化２】
2014218510.tif 000003
を含む。
【００３３】
可撓性リンカーエレメントは、本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインとエフェクターポリペプチドポリペプチドの間に配置される。この可撓性リンカーエレメントは、好ましくは、２５アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。特定の実施態様において、そのリンカーエレメントは、３〜３０アミノ酸長、特に、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または３０アミノ酸長を有する。１つの実施態様において、リンカーエレメントの長さは、５〜２５アミノ酸、８〜２０アミノ酸または１０〜２０アミノ酸である。より好ましくは、リンカーの長さは、９〜１５アミノ酸である。一般に、本明細書において使用されるリンカーエレメントは、任意の公知のアミノ酸または人工アミノ酸誘導体で構成され得る。特定の実施態様において、リンカーエレメントは、低分子で疎水性の非荷電アミノ酸で構築される。一般に本発明に記載のリンカーエレメントは、Ｇ、Ｓ、ＡおよびＴから選択されるアミノ酸を含み得る。リンカーエレメントは、好ましくはグリシン／セリンリンカー、すなわち、実質的にアミノ酸グリシンおよびセリンからなるペプチドリンカーである。特に好ましい実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ０、１、２、３、４、５または６である）を有する。ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインがあらかじめＧにより終止される場合（例えば、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０））、そのようなＧは、リンカー配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃにおけるリンカーの最初のＧを形成し得ることが、当業者に明らかである。原則的には、リンカーエレメントの基本単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）は、１、２、３、４個またはそれより多い（ｏｒ  ｍｏｒ）アミノ酸で構成されてもよく、本明細書において有用なリンカーが、３エレメントの基本単位でできているリンカーに限定されないことが理解されなければならない。一般に、本明細書において使用されるようなリンカーエレメントは、基本単位で構成されてもよいし、ある一続きのアミノ酸から構成されてもよい。
【００３４】
本明細書において使用されるようなエフェクターポリペプチドは、細胞外ポリペプチドまたはそのようなタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質のフラグメントである。一般に、タンパク質またはそのフラグメントが、エフェクターポリペプチドとして使用され得る。エフェクターポリペプチドは、任意の起源のポリペプチドであってもよく、例えば、哺乳動物ポリペプチド、脊椎動物ポリペプチド、昆虫ポリペプチド、細菌ポリペプチド、植物ポリペプチド、酵母ポリペプチドから選択され得る。哺乳動物ポリペプチドは、マウス、ラット、ヒト、ウマ、ヤギ、イヌ、ウサギ、ネコ、ヒツジ、ハムスター、ロバ、サルおよびその他のポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはヒト化ポリペプチドである。そのような細胞外タンパク質またはタンパク質の細胞外部分は、例えば、細胞表面タンパク質、分泌型の細胞外タンパク質、膜貫通型タンパク質の細胞外領域等から選択され得る。本発明の特定の実施態様において、エフェクターポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメイン、サイトカインに対する受容体および／またはそれらの抗体またはフラグメントからなる群より選択される。
【００３５】
１つの実施態様において、エフェクターポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインである。好ましくは、サイトカインは、哺乳動物、特に、ヒトのサイトカインまたはその受容体結合ドメイン（その対立遺伝子改変体および／または誘導体を包含する）である。さらに、ＴＮＦサイトカインは、対応するサイトカイン受容体に結合することが可能でありかつ好ましくは受容体を活性化することが可能である（それによりアポトーシス活性または増殖活性が引き起こされ得る）、その受容体結合ドメインが好ましい。サイトカインは、例えば、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーから選択されてもよく、例えば、表１に示されるようなヒトＴＮＦＳＦ−１から−１８、好ましくは
【００３６】
【化３】
2014218510.tif 000004
またはそれらの受容体結合ドメインから選択され得る。各タンパク質の好ましい受容体結合ドメインは、表１において示され（ＮＨ２−ａａからＣＯＯＨ−ａａ）、例えば、ＬＴＡ（配列番号１）のアミノ酸５９〜２０５または６０〜２０５、ＴＮＦα（配列番号２）のアミノ酸８６〜２３３、ＬＴＢ（配列番号３）のアミノ酸８２〜２４４または８６〜２４４、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）のアミノ酸５２〜１８３または５５〜１８３、ＣＤ４０Ｌ（配列番号５）のアミノ酸１１２〜２６１または１１７〜２６１、ＣＤ２７Ｌ（配列番号７）のアミノ酸５１〜１９３または５６〜１９３、ＣＤ３０Ｌ（配列番号８）のアミノ酸９７〜２３４、９８〜２３４または１０２〜２３４、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号９）のアミノ酸８６〜２５４、ＲＡＮＫＬ（配列番号１１）のアミノ酸１６１〜３１７、ＴＷＥＡＫ（配列番号１２）のアミノ酸１０３〜２４９、１０４〜２４９または１０５〜２４９、ＡＰＲＩＬ１（配列番号１３）のアミノ酸１１２〜２４７または１１３〜２４７、ＡＰＲＩＬ２（配列番号１４）のアミノ酸１１２〜２５０または１１３〜２５０、ＢＡＦＦ（配列番号１５）のアミノ酸１４０〜２８５、ＬＩＧＨＴ（配列番号１６）のアミノ酸９１〜２４０、ＴＬ１Ａ（配列番号１７）のアミノ酸９１〜２５１または９３〜２５１、ＧＩＴＲＬ（配列番号１８）のアミノ酸５２〜１７７、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号１９）のアミノ酸２４５〜３９１、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号２０）のアミノ酸２４５〜３８９を含む。
【００３７】
１つの実施態様において、エフェクターポリペプチドは、ＩＬ４Ｒ−アルファ（アクセッション番号Ｐ２４３９４）であってもよい。
【００３８】
より好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ＣＤ９５ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはそれらの受容体結合ドメインから選択される。特に好ましい実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、膜配置ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）を伴わない受容体結合ドメインを含むＴＮＦサイトカインの細胞外部分を含む。
【００３９】
好ましい実施態様において、融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒトＣＤ９５Ｌ（配列番号６）、特に、ヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸１４２〜２８１または１４４〜２８１から選択される。
【００４０】
さらに好ましい実施態様において、融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）、特に、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１または１２０〜２８１である。別の好ましい実施態様において、ヒトＴＲＡＩＬは、開始アミノ酸として配列番号１０の９５〜１２０の任意のアミノ酸〜アミノ酸２８１を含む。
【００４１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、本明細書に記載されるような融合タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインは、ＴＲＡＩＬ−受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）および／またはＴＲＡＩＬ−受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）に結合し、そして／またはそれらを活性化する、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインの変異体を含む。この変異体の結合および／または活性は、例えば、本明細書に開示されるようなアッセイによって（例えば、実施例において、またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ，２００６，１０３：８６３４−８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：２２０５−２２１５）もしくはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５，６５：１１２６５−１１２７０）に開示されるアッセイによって）測定され得る。
【００４２】
上記変異体は、任意の技術によって作製されてもよく、それは当業者に公知であり（例えば、ａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ，２００６，１０３：８６３４−８６３９）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：２２０５−２２１５）またはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５，６５：１１２６５−１１２７０）に開示される技術）、任意のタイプの構造的変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失、重複および／または挿入）を含んでもよい。好ましい実施態様は、置換の生成である。置換は、本明細書に記載されるようなＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸に影響する可能性がある。好ましい実施態様において、置換は、ＴＲＡＩＬ（例えば、ヒトＴＲＡＩＬ（例えば、配列番号１０））のアミノ酸の少なくとも１つに影響し得る。この点に関して好ましい置換は、配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの以下：
【００４３】
【化４】
2014218510.tif 000005
のアミノ酸のうちの少なくとも１つに影響する。配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ酸置換は、以下：
【００４４】
【化５】
2014218510.tif 000006
の置換のうちの少なくとも１つである。
【００４５】
アミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬ（例えば、ヒトＴＲＡＩＬ）の、ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２のいずれかへの結合および／またはいずれかに対する活性に影響し得る。あるいは、アミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬ（例えば、ヒトＴＲＡＩＬ）の、ＴＲＡＩＬＲ１とＴＲＡＩＬＲ２の両方への結合および／または両方に対する活性に影響し得る。ＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、正に影響され得る（すなわち、より強く、より選択的な結合もしくはより特異的な結合および／または受容体のより大きな活性化）。あるいは、ＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、負に影響され得る（すなわち、より弱く、より選択的でない結合もしくはより特異的でない結合および／または受容体のより低い活性化もしくは受容体の活性化がない）。
【００４６】
ＴＲＡＩＬＲ１とＴＲＡＩＬＲ２の両方の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記を参照）の表１に見られ、配列番号１０の以下の２アミノ酸置換、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄ、または以下の単一アミノ酸置換Ｙ１８９Ａを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含み得る。
【００４７】
ＴＲＡＩＬＲ１の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記を参照）の表１に見られ、配列番号１０の以下の４アミノ酸置換、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄ、または以下の５アミノ酸置換、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含み得るか、またはＫｅｌｌｅｙら（上記を参照）の表２に見られ、以下の６アミノ酸置換、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９ＶおよびＫ２０１ＲまたはＹ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９ＲおよびＫ２０１Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含み得る。
【００４８】
ＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性に影響するアミノ酸置換を有するＴＲＡＩＬの変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記を参照）の表１またはＫｅｌｌｅｙら（上記を参照）の表２に見られ、配列番号１４の以下の６アミノ酸置換、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６ＬおよびＤ２６７Ｑを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含み得るか、またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｏｏｔら（上記を参照）の表２に見られ、以下の単一アミノ酸置換Ｄ２６９Ｈ、以下の２アミノ酸置換、Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５ＲまたはＤ２６９ＨおよびＴ２１４Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ変異体を含み得る。
【００４９】
さらに好ましい実施態様において、融合タンパク質のサイトカイン部分は、ヒトＬＩＧＨＴ（配列番号１６）、特に、配列番号１６のアミノ酸９１〜２４０に由来する。ＬＩＧＨＴは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、その受容体は、リンフォトキシン−ベータ受容体（ＬＴベータＲ）およびヘルペスウイルス侵入メディエーター（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）／ＡＴＡＲ／ＴＲ２として同定されており、これらの両方は、「デスドメイン」と命名される細胞質配列を欠く。ＬＩＧＨＴは、細胞受容体としてのＬＴベータＲおよびＨＶＥＭと会合するので、ＬＴアルファおよびＬＴベータの生物学的機能に類似する生物学的機能を有すると予想される。以前の研究が示すように、ＬＩＧＨＴは、ＬＴアルファが行うように、ＨＴ−２９細胞の細胞死を誘導し（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａetal.ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２７５４８−２７５５６；Ｚｈａｉ，Ｙ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，１１４２−１１５１およびＲｏｏｎｅｙ，Ｉ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１４３０７−１４３１５）、平滑筋細胞への発生的変化の後にＲＤ細胞において成長停止を引き起こし、その細胞からのＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳの分泌を刺激する（Ｈｉｋｉｃｈｉ，Ｙ．ら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９，６７０−６７７）。また、ＬＩＧＨＴが、Ｔ細胞におけるＣＤ２８非依存性共刺激分子のうちの１つであることも報告されている（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４１０５−４１１０）。
【００５０】
１つの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインは、ＲＡＮＫ−Ｌである。ヒトＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）は、免疫系、骨発生およびホメオスタシスの重要な制御因子であると知られるタンパク質の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３９０：１７５−１７９，１９９７）。また、このリガンドは、腫瘍壊死因子関連活性化誘導性サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）（Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：２０７５，１９９７）、破骨細胞分化抑制因子リガンド（ＯＰＧＬ）（Ｌａｃｅｙら，Ｃｅｌｌ  ９３：１６５，１９９８）、および破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）（Ｙａｓｕｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３５９７，１９９８）とも命名されている。腫瘍壊死ファミリーのメンバーは、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化等の種々の、時に反対の生物学的反応を媒介する。
【００５１】
さらなる実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインは、ＴＷＥＡＫである。最近、ピコモル濃度のＴＷＥＡＫが正常内皮細胞の増殖を促進すること、およびＴＷＥＡＫがｉｎ  ｖｉｖｏのラット角膜モデルにおいて血管新生を誘導することが観察されたことから（Ｌｙｎｃｈら，１９９９，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１３）ｐｐ．８４５５−８４５９）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳＦメンバー１２）は、血管新生（血管の形成および成長）の直接的かつ強力な誘導因子であることが見出された。
【００５２】
より一層の好ましい実施態様において、融合タンパク質のサイトカイン部分は、ヒトＡＰＲＩＬ（配列番号１３または１４）、特に、配列番号１３のアミノ酸１１２〜２４７もしくは１１３〜２４７、または配列番号１４の１１２〜２５０もしくは１１３〜２５０に由来する。ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬＳメンバー１３）は、受容体ＴＮＦＲＳＦ１３ＢおよびＴＮＦＲＳＦ１７に結合する三量体サイトカインである。最近、様々な腫瘍細胞に組換えＡＰＲＩＬを添加することにより、それらの増殖が刺激されることが示され、それゆえにＡＰＲＩＬは、腫瘍細胞の成長の調節に関係がある可能性がある（Ｈａｈｎｅ  Ｍ．ら，１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−１１９０）。また、ＡＰＲＩＬが単球／マクロファージ媒介免疫プロセスに関与し得ることも示唆されている。
【００５３】
エフェクターポリペプチドとして本明細書において使用されるＴＮＦスーパーファミリーサイトカインは、特定の実施態様においてＮ末端側で切断されてもよい。この点で使用されるような切断は、ストーク領域のすべてのアミノ酸の削除、またはストーク領域の一部のアミノ酸の削除を指すものとする。
【００５４】
ＴＮＦスーパーファミリーのタンパク質は、１５〜３０アミノ酸のＮ末端部分（いわゆるストーク領域）を介して膜につなぎ留められる。ストーク領域は、三量体化に寄与し、細胞膜に対して一定距離を提供する。しかしながら、ストーク領域は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部を形成しない。
【００５５】
重要なことには、ＲＢＤは、そのＮおよびＣ末端のアミノ酸の特有の局在性によって特徴づけられる。前記アミノ酸は、三量体の軸のすぐ近くに隣接し、三量体の軸の中心となるよう配置される。ＲＢＤの最初のＮ末端アミノ酸は、ＲＢＤのＣ末端のアミノ酸と逆平行β鎖を形成する（図３６および３８）。
【００５６】
従って、ＲＢＤの逆平行ベータ鎖は、細胞膜との境界面を形成し、それはストーク領域のアミノ酸を介して細胞膜に接続され、細胞膜内につなぎ留められる。本発明の特定の実施態様において、エフェクターポリペプチドとして使用されるＴＮＦスーパーファミリーサイトカインのストーク領域が削除される。これは、ストーク領域とリンカーコレクチンとの間の立体障害を回避することができるという特有の長所を有する。そうでなければ、ＴＮＦ−ＳＦ−ＲＢＤドメインのうちの１つのＣ末端をコレクチンドメインのＮ末端と接続するリンカーは、ストークによって立体的障害を受け、それにより、不安定性および／または凝集物形成が生じる可能性がある。
【００５７】
特定の実施態様において、Ｎ末端のストーク領域の削除によってＴＮＦスーパーファミリーサイトカインを切断することは、コレクチン三量体化ドメインのＣ末端のポジショニングにとって必要条件である。特定の実施態様において、コレクチンに基づく三量体融合タンパク質は、ストーク領域由来の任意のアミノ酸を欠くＴＮＦ−ＳＦサイトカインの受容体結合ドメインを含むことが特に好ましい。
【００５８】
コレクチンに基づく三量体ＴＮＦ−ＳＦ融合ポリペプチド（ここで、エフェクターＴＮＦスーパーファミリーサイトカインは、コレクチン三量体化ドメインのＮ末端に位置される）がそれぞれのサイトカイン受容体に対する少なくとも１つの機能的結合部位を含む規則正しい三量体構造を形成する能力は、本発明の特定の実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインのストーク領域の全部または一部の削除に決定的に関連する。
【００５９】
本明細書に記載されるような本発明の融合タンパク質において、コレクチン三量体化ドメインは、エフェクターポリペプチドのＣ末端に配置される。従って、その融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなエフェクターポリペプチド、ならびにコレクチンファミリーネックドメインおよびコレクチンファミリーＣＲＤドメイン（例えば、サーファクタントタンパク質ＤのネックドメインならびにＣＲＤおよび／もしくはネックドメイン、またはコレクチン−１１のネックドメインならびにＣＲＤおよび／もしくはネックドメイン（両方とも本明細書に記載されるとおりのもの））を含むコレクチン三量体化ドメインを含み得、ここで、それらのドメインは、エフェクターポリペプチドのＣ末端に配置される。この実施態様において、コレクチン三量体化ドメインがネックドメインおよびＣＲＤを含むことが好ましい。
【００６０】
本明細書に開示される融合タンパク質は、コレクチン三量体化ドメインのＮ末端にエフェクターポリペプチドを含む。本発明者らは、この方向付けが満たされた場合にのみ、三量体の制御された形成がもたらされ得ることを見出した。コレクチン三量体化ドメインのＮ末端にエフェクターポリペプチドを有するコンストラクトのみが、制御された安定な三量体を導き、取り扱い中および精製中により大きな凝集物を形成する傾向が最小限である。組換えヒトＳＰ−Ｄのネック−ＣＲＤ部分の公開された結晶構造（Ｓｈｒｉｖｅ，Ａ．Ｋ．ら、２００３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３１：５０９−５２３）から、各単量体（ｍｏｎｏｍｅｒａ）のＮおよびＣ末端のアミノ酸の相対的位置を得ることができる。三量体（ｔｒｉｍｅｒｅ）のアミノ末端のアミノ酸（Ａ２０５［Ａ２２５］＊）は、溶媒曝露され、平行なコイルドコイル構造の先頭に直接的に近接して配置されるが、一方で、三量体（ｔｒｉｍｅｒｅ）のＣ末端（Ｆ３５５［Ｆ３７５］＊）アミノ酸の側鎖は、ＣＲＤドメイン内に埋もれており、互いに対称的に離れた三角形の位置に置かれる。Ｆ３５５［Ｆ３７５］＊のＣＯＯＨ基は、およそ２３オングストロームの辺長の二等辺三角形を形成している。重要なことには、ネック−ＣＲＤ三量体（ｔｒｉｍｅｒｅ）のタンパク質コアはこの三角形内にあり、従って、そのネック−ＣＲＤコアに対して放射状の空間のみが融合パートナーに接近可能である。
【００６１】
ＳＰ−Ｄ三量体（ｔｒｉｍｅｒｅ）のネック−ＣＲＤ部分におけるＮおよびＣ末端アミノ酸は、互いに対する相対的位置から、融合タンパク質の構築のための継目としての用途に関して等価ではないと結論付けられ得る。
【００６２】
ＴＮＦ−ＳＦタンパク質の場合における不利な点として、ストーク領域を有する細胞外領域を含むＣ末端融合（これは、ネック−ＣＲＤのＣ末端のアミノ酸へＴＮＦ−ＳＦフラグメントを融合することを意味する；Ｆ３５５［Ｆ３７５］＊）は、ＴＮＦ−ＳＦフラグメント自体の三量体化する力により高分子の凝集物を生じ得る。
＊［］内に提示される数字は、配列番号２１を参照する。
【００６３】
従って、その内因性ストークＣ末端を有するＴＮＦ−ＳＦ−ＲＢＤドメインをネック−ＣＲＤコンストラクトに融合しても、規定される三量体の集合体を生じないであろう。従って、本発明の特定の実施態様において、ストーク領域を欠くＴＮＦ−ＳＦ−ＲＢＤ（ＴＮＦスーパーファミリー受容体結合ドメイン）の切断されたポリペプチドが、エフェクターポリペプチドとして使用される。
【００６４】
好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１もしくは１２０〜２８１、および本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインまたはその変異体、特に、サーファクタントタンパク質−ＤのＣＲＤおよびネックドメイン、好ましくは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−Ｄのアミノ酸２１７〜３７５、２１８〜３７５、２１９〜３７５、２２０〜３７５、２２１〜３７５、２２２〜３７５、２２３〜３７５、２２４〜３７５、２２５〜３７５（ここで、そのコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に配置される）を含む。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２６または２７である。あるいは、上記融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ０、１、２、３、４、５または６である）を有するリンカーを追加的に含んでもよい。好ましくは、リンカーは、９〜１５アミノ酸長を有する。
【００６５】
好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１または１２０〜２８１、および本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインまたはその変異体、特に、サーファクタントタンパク質−Ｄのネックドメイン、好ましくは、配列番号２１のヒトサーファクタントタンパク質−Ｄのアミノ酸２１７〜２５７、２１８〜２５７、２１９〜２５７、２２０〜２５７、２２１〜２５７、２２２〜２５７、２２３〜２５７、２２４〜２５７または２２５〜２５７（ここで、そのコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に配置される）を含む。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２８である。あるいは、上記融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ０、１、２、３、４、５または６である）を有するリンカーを追加的に含んでもよい。
【００６６】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１または１２０〜２８１、および本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインまたはその変異体、特に、コレクチン−１１のＣＲＤおよびネックドメイン、好ましくは、配列番号２２のヒトコレクチン−１１のアミノ酸１１０〜２７１、１１６〜２７１または１２１〜２７１（ここで、そのコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に配置される）を含む。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号２９および３０である。あるいは、上記融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ０、１、２、３、４、５または６である）を有するリンカーを追加的に含んでもよい。好ましくは、リンカーは、９〜１５アミノ酸長を有する。
【００６７】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメイン、または本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬの変異体、好ましくは、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の９５〜２８１、１１６〜２８１、１１７〜２８１、１１８〜２８１、１１９〜２８１または１２０〜２８１、および本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインまたはその変異体、特に、コレクチン−１１のネックドメイン、好ましくは、配列番号２２のヒトコレクチン−１１のアミノ酸
【００６８】
【化６】
2014218510.tif 000007
（ここで、そのコレクチン三量体化ドメインは、本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬまたは変異体ＴＲＡＩＬのＣ末端に配置される）を含む。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号３１である。あるいは、上記融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなリンカー、例えば、アミノ酸配列（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ０、１、２、３、４、５または６である）を有するリンカーを追加的に含んでもよい。
【００６９】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＣＤ９５Ｌ、特に、ヒトＣＤ９５Ｌまたは本明細書に記載されるようなその受容体結合ドメイン、例えば、配列番号４０のアミノ酸２１〜１６０、ならびにヒトＳＰ−ＤのネックドメインおよびＣＲＤ（例えば、それぞれ、配列番号４０のアミノ酸１７２〜２０９および２１０〜３２７）を含むコレクチン三量体化ドメインまたは本明細書に記載されるようなその変異体を含む。上記融合タンパク質は、リンカー（例えば、可撓性リンカー）、より好ましくは、好ましくは９〜１５のアミノ酸長を有する本明細書に記載されるようなグリシン／セリンリンカーを含んでもよい。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４０、特に、配列番号４０のアミノ酸２１〜３２７を含む。
【００７０】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＬＩＧＨＴ、特に、ヒトＬＩＧＨＴまたは本明細書に記載されるようなその受容体結合ドメイン、好ましくは、配列番号４１のアミノ酸２１〜１７０、ならびにヒトＳＰ−ＤのネックドメインおよびＣＲＤ（例えば、それぞれ、配列番号４１のアミノ酸１８２〜２１９および２２０〜３３７）を含むコレクチン三量体化ドメインまたは本明細書に記載されるようなその変異体を含む。そのサイトカインおよびコレクチンドメインは、リンカー（例えば、好ましくは９〜１５アミノ酸長を有する、本明細書に記載されるようなグリシン／セリンリンカー）によって接続される。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４１、特に、配列番号４１のアミノ酸２１〜３２７を含む。
【００７１】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは本明細書に記載されるようなＴＲＡＩＬの変異体（例えば、配列番号４３（野生型ＴＲＡＩＬ）のアミノ酸２１〜１８１、配列番号４７（ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ）のアミノ酸２１〜１８１または配列番号４８（ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ）のアミノ酸２１〜１８１）を含む。さらに、上記融合タンパク質は、ヒトＳＰ−Ｄのネックドメインおよび任意にＣＲＤ（例えば、それぞれ配列番号４３のアミノ酸１９３〜２３０および２３１〜３８４）から選択されるコレクチン三量体化ドメイン、または本明細書に記載されるようなその変異体（例えば、配列番号４９または５０に示されるような変異体）を含む。上記融合ポリペプチドは、ヒトＳＰ−Ｄのネック領域およびＣＲＤの両方を含む。上記サイトカインおよびコレクチンドメインは、リンカー（例えば、本明細書に記載されるようなグリシン／セリンリンカー）によって接続される。好ましくは、リンカーは、９〜１５のアミノ酸長を有する。
【００７２】
この点に関して好ましい融合タンパク質は、（ｉ）配列番号４３、特に、配列番号４３のアミノ酸２１〜３４８、（ｉｉ）配列番号４４、特に、配列番号４４のアミノ酸２１〜２３０、（ｉｉｉ）配列番号４７、特に、配列番号４７のアミノ酸２１〜３４８、（ｉｖ）配列番号４８、特に、配列番号４８のアミノ酸２１〜３４８、（ｖ）配列番号４９、特に、配列番号４９のアミノ酸２１〜３４８、または（ｖｉ）配列番号５０、特に、配列番号５０のアミノ酸２１〜３４８を含む。
【００７３】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、特に、ヒトＴＲＡＩＬもしくはその受容体結合ドメインまたは上記の本明細書に記載されたようなＴＲＡＩＬの変異体、ならびにヒトコレクチン１１のネックドメインおよびヒトコレクチン１１のＣＲＤ（例えば、それぞれ、配列番号４５のアミノ酸１９３〜２２４および２２５〜３４７）であるコレクチン三量体化ドメインを含む。そのサイトカインおよびコレクチンドメインは、リンカー（例えば、好ましくは、９〜１５アミノ酸長を有する、上記の本明細書に記載されたようなグリシン／セリンリンカー）によって接続される。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号４５および配列番号４６、特に、配列番号４５のアミノ酸２１〜３４７または配列番号４６のアミノ酸２１〜２２９を含む。
【００７４】
別の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、ＡＰＲＩＬ、特に、ヒトＡＰＲＩＬまたは本明細書に記載されるようなその受容体結合ドメイン（例えば、配列番号５１のアミノ酸２１〜１５８）および本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメイン、特に、本明細書に記載されるようなヒトＳＰ−Ｄまたはその変異体のネックドメインおよびＣＲＤ（例えば、それぞれ、配列番号５１のアミノ酸１７０〜２０７および２０８〜３２５）を含む。そのサイトカインおよびコレクチンドメインは、リンカー（例えば、好ましくは、９〜１５アミノ酸長を有する、本明細書に記載されるようなグリシン／セリンリンカー）によって接続される。この点に関して好ましい融合タンパク質は、配列番号５１、特に、配列番号５１のアミノ酸２１〜３２５を含む。
【００７５】
特定の実施態様において、エフェクターポリペプチドは、抗体である。本明細書において使用されるような抗体は、従来の野生型抗体ならびに改変および変更された抗体を含み得る。そのような改変は、１本鎖抗体、抗体フラグメント、ヒト化抗体等の作製を含み得る。一般に、抗体または抗原結合アミノ酸配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）は、任意の種由来の抗体またはＣＤＲ、ならびに組換え的に生成された抗体またはＣＤＲであり得る。
【００７６】
抗体は、ヒトクラスＡ、Ｅ、Ｄ、ＭもしくはＧ、好ましくは、ＩｇＧからの完全抗体、またはその抗原結合フラグメントであり得る。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト定常領域を有するキメラ抗体またはヒト化抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブクラスまたはそれらの組み合わせ、あるいは変更されたエフェクター機能を有する遺伝子操作された改変体である。エフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり得る（ｍａｙ  ｂｙ）。遺伝子操作されたＦｃ部分は、変更された薬物動態学的特性も有し得る。さらに、完全なヒト抗体またはその抗原結合フラグメントが好ましい。より好ましくは、抗体は、ヒトまたは実質的にヒトのフレームワーク領域を追加的に含むヒト化抗体もしくはヒト抗体またはそれらのフラグメントである。また、抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂフラグメント等の二価または一価の抗体フラグメント）が好ましい。他方、抗体は、組換え抗体（例えば、１本鎖抗体またはそのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント（Ｆｖフラグメントは、任意のアミノ酸配列、好ましくは、低分子極性アミノ酸によって接続され、より好ましくは、グリシンおよび／またはセリンおよび／またはトレオニンで構成される）））であり得る。さらに、組換えの抗体は、多量体ｓｃＦｖ集合体（例えば、単一ポリペプチド上で共に連結された２以上のｓｃＦｖ−フラグメント）であり得る。
【００７７】
特定の実施態様において、抗体、１本鎖抗体、または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントは、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体に対して作製される。特別の実施態様において、抗体は、ＩＬ４Ｒ−アルファに対して作製される。
【００７８】
特定の実施態様において、上記抗体は、抗体または抗体フラグメント、例えば、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８８２によって産生されるマウス抗体Ｘ２／４５（Ｔｏｎｙら，１９９４）に由来するキメラ抗体またはヒト化抗体である。ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８８２は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＺＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにおいて２００８年１月２９日付で微生物の寄託に関するブダペスト条約のもと寄託された。特定の特別な実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ヒトＩＬ４Ｒａ受容体細胞外ドメインを認識する。さらなる実施態様において、マウスＸ２／４５の重鎖および軽鎖の相補性決定領域は、ヒトＩＬ４Ｒａを認識するヒト抗体もしくはヒト化抗体または組換えヒト化抗体フラグメントを作製するために使用されている。好ましい実施態様において、配列番号５２の２１〜２６４位に示されるようなヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントが、エフェクターポリペプチドとして使用される。
【００７９】
本明細書に記載されるような融合タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチドドメインを追加的に含んでもよく、それによって、好適な宿主細胞中でのプロセッシング（例えば、細胞外分泌）が可能になる。好ましくは、Ｎ末端のシグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ、例えば、シグナルペプチダーゼの切断部位を含み、従って、発現の後または発現の間に除去されることにより、成熟タンパク質が得られ得る。好ましい実施態様において、Ｎ末端のシグナルペプチドドメインは、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５の配列を含む。
【００８０】
さらに、融合タンパク質は、認識／精製ドメイン、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇドメインおよび／またはポリＨｉｓドメイン（これらはＮ末端またはＣ末端に配置され得る）を含んでもよい（ｍａｙ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）。
【００８１】
融合タンパク質は、例えば、１〜５０、好ましくは、１０〜３０アミノ酸長を有し、本明細書において記載されるような認識／精製ドメインを含み得、および／またはそのドメインに接続され得る、Ｃ末端可撓性エレメントを追加的に含んでもよい。
【００８２】
特定の実施態様において、融合タンパク質は、ＣＲＤのＣ末端に融合された、抗体、１本鎖抗体、または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントを追加的に含んでもよい。そのような抗体は、特定の実施態様において、例えば、融合タンパク質が特定の分子または部位を標的にするのに役立ち得る。また、そのようなコンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原特異性を有する融合ポリペプチドを作製する機会を提供し得る。
【００８３】
本発明のさらなる側面は、本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。その核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、２本鎖または１本鎖のＤＮＡ分子）またはＲＮＡ分子であり得る。この核酸分子は、本明細書に記載されるようなシグナル配列、または分泌もしくは精製のための他の異種アミノ酸部分（好ましくは、本明細書に記載されるような融合タンパク質のＮおよび／またはＣ末端に配置される）を含み得る融合タンパク質あるいはその前駆体（例えば、その融合タンパク質のプロフォームまたはプレプロフォーム）をコードし得る。その核酸分子は、異種アミノ酸部分が、プロテアーゼ切断部位（例えば、第Ｘａ因子、トロンビンまたはＩｇＡのプロテアーゼ切断部位）を介して第１および／または第２ドメインに連結され得る、融合タンパク質をコードしてもよい。
【００８４】
上記核酸分子は、発現制御配列（例えば、所望の宿主細胞において核酸分子を発現することを可能にする発現制御配列）に作動可能に連結されてもよい。その核酸分子は、ベクター（例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、染色体組込みベクター等）に配置されてもよい。好適な発現制御配列およびベクターの例は、例えば、
【００８５】
【化７】
2014218510.tif 000008
またはさらにそれらの最新版に記載されている。
【００８６】
様々な発現ベクター／宿主細胞系を、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を発現するために使用してもよい。好適な宿主細胞としては、細菌（例えば大腸菌）等の原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞等の真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸（ｎｕｃｌｉｅｃ  ａｃｉｄ）分子は、好適な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞またはヒト細胞））における発現についてそのコドン使用頻度を考慮して最適化されてもよい。
【００８７】
さらに、本発明は、本明細書に記載されるような核酸分子により形質転換またはトランスフェクトされた、非ヒト生物（例えば、マウスまたはラット）に関する。そのような生物は、相同組換えを含む公知の遺伝学的移動方法によって作製されるノックアウト生物を含み得る。あるいは、そのような生物は、本明細書に記載されるような核酸分子の数コピーを含むトランスジェニック生物を含み得る。トランスジェニック生物の作製は、当該技術分野において公知である。
【００８８】
融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換またはトランスフェクトされた細胞ならびに三量体複合体または三量体複合体のオリゴマー（すべて本明細書に記載されたとおりのもの）を、医薬、診断および／または研究に応用するために使用してもよい。これらの応用については、本明細書に記載されるようなエフェクターポリペプチドと本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインの両方が、免疫学的作用を最小化するために同一種由来であること、例えば、ヒトにそのようなタンパク質を適用するときはヒト由来である融合タンパク質を使用することが好ましい。加えて、本明細書に記載されるようなネック−コレクチン三量体化ドメイン（例えば、サーファクタントタンパク質−Ｄまたはコレクチン−１１由来のネックドメイン）への本明細書に記載されるようなエフェクターポリペプチドの融合は、迅速なクリアランスを導く可能性がある。あるいは、本明細書に記載されるようなＴＮＦスーパーファミリーサイトカインまたはその受容体結合ドメインの、本明細書に記載されるようなネックドメインおよびＣＲＤ−コレクチン三量体化ドメイン（例えば、サーファクタントタンパク質−Ｄまたはコレクチン−１１由来のネックドメインおよびＣＲＤドメイン）への融合は、低いクリアランスを導く可能性がある。本明細書に記載されるようなコレクチン三量体化ドメインの変異体の使用は、本明細書に記載されるような方法で融合タンパク質のクリアランス速度を改変する可能性がある。
【００８９】
本発明のさらなる側面は、少なくとも１つの融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換またはトランスフェクトされた細胞ならびに三量体複合体または三量体複合体のオリゴマー（すべて本明細書に記載されるとおりのもの）を活性な薬剤として含む薬学的組成物または診断用組成物に関する。
【００９０】
少なくとも１つの融合タンパク質、それをコードする核酸、形質転換またはトランスフェクトされた細胞ならびに三量体複合体または三量体複合体のオリゴマー（すべて本明細書中に記載されるとおりもの）は、増殖性障害、特に、ＴＮＦサイトカインの機能不全によって引き起こされる、それらと関連するおよび／またはそれらを伴う障害、例えば、腫瘍（例えば、固形腫瘍またはリンパ腫）、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害（例えば、リウマチおよび／または関節炎疾患）、変性疾患（例えば、多発性硬化症等の神経変性疾患）、アポトーシス関連疾患および移植拒絶から選択される障害の治療（例えば、予防および／または処置）において使用され得る。
【００９１】
本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞は、疾患の治療において、例えば、新生物、炎症性、感染性、変性性、遺伝性、増殖性および血管性の疾患、ならびに前悪性がん状態および悪性のがん性状態、がんおよび先天異常の予防および／または処置における医薬品として、または薬学的組成物の調製のために、使用され得る。
【００９２】
本発明の特定の実施態様において、変性疾患は、神経変性疾患、骨および骨格の変性疾患、皮膚、粘膜上皮の変性疾患等の種々の組織または器官の変性疾患を含み得、例えば、骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｅｓｉｓ）、骨減少症、アルツハイマー病等を含み得る。
【００９３】
１つの実施態様において、増殖性疾患は、腫瘍である。腫瘍は、頭部および頚部の腫瘍、気管の腫瘍、肛門性器管（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ）の腫瘍、消化管の腫瘍、泌尿器系の腫瘍、生殖器系の腫瘍、内分泌系の腫瘍、中枢および末梢神経系の腫瘍、皮膚およびその付属器官の腫瘍、軟組織および骨の腫瘍、リンパ系および造血系の腫瘍等を含み得る。腫瘍は、例えば、新生物、例えば良性および悪性の腫瘍、カルシノーマ、肉腫、白血病、リンパ腫または形成不全を含み得る。特有の実施態様において、腫瘍は、例えば、頭部および頚部のがん、気管のがん、肛門性器管のがん、消化管のがん、皮膚およびその付属器官のがん、中枢および末梢神経系のがん、泌尿器系のがん、生殖器系のがん、内分泌系のがん、軟組織および骨のがん、造血系およびリンパ系のがんである。
【００９４】
エフェクターポリペプチドがＴＮＳＦポリペプチドまたはサイトカイン受容体ポリペプチドからなる群より選択される特定の実施態様において、本発明は、治療において使用するため、例えば、増殖性障害、特に、ＴＮＦサイトカインの機能不全によって引き起こされる、それらと関連する、および／またはそれらを伴う障害、例えば、腫瘍（例えば、固形腫瘍またはリンパ腫）、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害（例えば、リウマチおよび／または関節炎疾患）、変性疾患（例えば、多発性硬化症等の神経変性疾患）、アポトーシス関連疾患および移植拒絶の予防および／または処置における薬学的組成物を調製するために本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞を使用するための、本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞にも関する。
【００９５】
エフェクターポリペプチドが抗体、１本鎖抗体または抗体もしくは１本鎖抗体のフラグメントである特定の実施態様において、本発明は、さらに、治療において使用するため（例えば、増殖性障害、免疫学的障害、自己免疫障害、炎症性疾患、リンパ腫、感染症、代謝性疾患、自己免疫障害（例えば、リウマチおよび／または関節炎疾患）、変性疾患（例えば、多発性硬化症等の神経変性疾患）、アポトーシス関連疾患および移植拒絶の予防および／または処置における薬学的組成物を調製するために本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞を使用するため）の本明細書に記載されるような融合タンパク質、核酸分子または細胞に関する。
【００９６】
上記組成物は、単独療法として投与されてもよいし、さらなる医薬品（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは化学療法剤、副腎皮質ステロイドおよび／または抗生物質）との組み合わせ療法として投与されてもよい。好ましくは、その組成物は、例えば、実施例２．８に記載されるような腫瘍選択的アポトーシス感作剤および／または腫瘍選択的アポトーシス誘発剤と共に投与される。
【００９７】
上記融合タンパク質は、好適な手段によって具体的症状を処置するための十分な用量において、その必要のある被験体（特にヒト患者）に投与される。例えば、その融合タンパク質は、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤および／またはアジュバントと共に薬学的組成物として処方されてもよい。治療の効果および毒性は、標準的プロトコルに従って測定され得る。薬学的組成物は、全身的（例えば、腹腔内、筋肉内または静脈内）に投与されてもよいし、局所的（例えば、鼻腔内、皮下または髄腔内）に投与されてもよい。静脈内投与が好ましい。
【００９８】
投与される融合タンパク質の用量は、処置される被験体、被験体の体重、疾患のタイプおよび重症度、投与方法ならびに処方医の判断に当然依存する。融合タンパク質の投与については、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの１日量が好適である。
【００９９】
（参考文献）
【０１００】
【数１】
2014218510.tif 000009
（融合タンパク質の基本構造）
以下において、本発明の組換えタンパク質の基本構造を、本明細書に記載されるようなＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカインに関して例証して示す。この例証は、本発明の一般的な範囲を限定することを意図するのではなく、融合タンパク質に存在する構成要素の全体的な印象を与えるものである。
【０１０１】
基本構造として、融合タンパク質は、以下のエレメントを含む：
（ｉ）ａ．コレクチンファミリー糖質認識ドメイン；および
ｂ．コレクチンファミリーネック領域；］
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン
（ｉｉ）リンカーエレメント；ならびに
（ｉｉｉ）エフェクターポリペプチド（ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のＮ末端に配置される）。
【０１０２】
【化８】
2014218510.tif 000010
【０１０３】
【化９】
2014218510.tif 000011
ヒトコレクチンサーファクタントタンパク質−Ｄおよびコレクチン−１１の様々なフラグメントが、本明細書に記載されるような三量体化ドメインとして考えられる。
【０１０４】
１．４  可撓性リンカーエレメント
（ＧＳＳ）ａ（ＳＳＧ）ｂ（ＧＳＧ）ｃ（式中、ａ、ｂ、ｃはそれぞれ、０、１、２、３、４、５または６である。）
【０１０５】
【化１０】
2014218510.tif 000012
【０１０６】
【化１１】
2014218510.tif 000013
【０１０７】
【化１２】
2014218510.tif 000014
【０１０８】
【化１３】
2014218510.tif 000015
【０１０９】
【化１４】
2014218510.tif 000016
【０１１０】
【化１５】
2014218510.tif 000017
本明細書に記載されるように、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの様々なフラグメント（例えば、受容体結合ドメイン）が考えられる。
【０１１１】
【化１６】
2014218510.tif 000018
【０１１２】
【化１７】
2014218510.tif 000019
【実施例】
【０１１３】
（実施例）
（１．１  Ｃ末端に位置するコレクチン由来三量体化ドメインによって安定化されるＴＮＦ−ＳＦタンパク質の構築）
ヒトコレクチン−１１（Ｃｏｌ１１）、コレクチン−１１の「コイルドコイル」（ＣＣ１１）、ヒト肺サーファクタントタンパク質−Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、ＳＰ−Ｄの「コイルドコイル」（ＣＣＳＰＤ）から得られた三量体化モチーフ（表２および３）を、ＣＤ９５Ｌのヒト受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（「ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ」；Ｇｌｕ１４２〜Ｌｅｕ２８１）、ヒトＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ（Ｇｌｎ１２０〜Ｇｌｙ２８１）、ヒトＬＩＧＨＴ−ＲＢＤ（Ｇｌｕ９１〜Ｖａｌ２４０）およびヒトＡＰＲＩＬ−ＲＢＤ（Ｌｙｓ１１３〜Ｌｅｕ２５０）のＣ末端にそれぞれ融合した。
【０１１４】
【表２】
2014218510.tif 000020
【０１１５】
【表３】
2014218510.tif 000021
可撓性リンカー要素リンカーエレメントは、ＴＮＳＦ−ＲＢＤと三量体化ドメインとの間に様々な長さで配置された（表４）。
【０１１６】
【表４】
2014218510.tif 000022
（１．２  発現コンストラクトの作製）
本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸分子は、融合タンパク質を発現するための好適なベクター中にクローニングされ得る。そのようなベクターを作製するために必要な分子ツールは、当業者に公知であり、そのツールには、制限酵素、ベクターおよびベクターを増やすための好適な宿主が含まれる。
【０１１７】
精製および分析ストラテジーのために、Ｓｔｅｐ−ｔａｇＩＩ（アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ）をＣ末端に付加した。この親和性タグは、可撓性リンカーエレメント（アミノ酸配列ＰＳＳＳＳＳＳＡ）によって三量体化ドメインに連結された。分泌に基づく発現を可能とするため、ヒトＩｇκ由来のシグナルペプチドを前記タンパク質のＮ末端に融合した。この融合タンパク質のアミノ酸配列を逆翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）し、それらのコドン使用頻度を哺乳動物細胞に基づく発現のために最適化した。遺伝子合成は、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ  ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行われた。最終的な発現カセットを、プラスミドの唯一のＨｉｎｄ−ＩＩＩ部位およびＮｏｔ−Ｉ部位を使用してｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−骨格にサブクローニングした。すべての発現カセットを、ＤＮＡ配列決定によって通常どおり確かめた。
【０１１８】
以下のコンストラクトについてのデータが本明細書中に提示される（表５ａおよび５ｂ）。
【０１１９】
【表５ａ】
2014218510.tif 000023
【０１２０】
【表５ｂ】
2014218510.tif 000024
（１．３  ＴＮＦスーパーファミリーの遺伝子操作されたリガンドの発現および精製）
１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧｉｂＣｏ）中で育成されたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした。組換えタンパク質を含有する細胞培養上清をトランスフェクトの３日後に収集し、３００×ｇでの遠心分離により不純物を除去した後、０．２２μｍの滅菌フィルターに通して濾過した。親和性精製のために、４ｍｌの５０％Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２ｍｌカラムに詰め、３０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水，ｐＨ７．４（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．１００１０）または緩衝液Ｗ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）で平衡化した。上記細胞培養上清を４℃において２ｍｌ／分の流速でカラムに注いだ。その後、カラムをＰＢＳまたは緩衝液Ｗで洗浄し、特異的に結合したタンパク質を５×２ｍｌ緩衝液Ｅ（２．５ｍＭのデスチオビオチン，ｐＨ７．４を含むＰＢＳまたは緩衝液Ｗ）の添加によって段階的に溶出した。溶出画分のタンパク質内容物を吸光分光法および銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。陽性画分をその後、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｖｉｖａｓｐｉｎ，１０，０００Ｄａカットオフ）によって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに分析した。
【０１２１】
Ａｅｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにおいてＳＥＣを行った。カラムをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．１００１０）で平衡化し、濃縮されたｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ精製タンパク質を０．５ｍｌ／分の流速でＳＥＣカラムに充填した。溶出物を（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｓ）２８０ｎｍの吸光度によりモニターした。ゲル濾過標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの較正に基づいて、精製タンパク質の見かけの分子量を測定した。
【０１２２】
（１．４  細胞死アッセイ）
カスパーゼ活性化を分析するために、ＪｕｒｋａｔＡ３永久ヒトＴ細胞株（ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ２５７０，ＡＴＣＣ）による細胞アッセイを使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂＣｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を用いてフラスコ中で育成した。アッセイ前に、各ウェルについて１００，０００個の細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種した。架橋抗体ありまたはなしで上記タンパク質を含有する種々の溶液をウェルに添加した（最終容量：２００μｌ）後、３７℃で３時間のインキュベーションを行った。２０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＥＢＳＦ，ｐＨ７．５）を添加することによって細胞を溶解し、プレートを氷上で３０分〜２時間インキュベートした。アポトーシスは、カスパーゼ活性の増加と並行して起こる。それゆえに、特異的なカスパーゼ基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ）の切断を用いることにより、アポトーシスの程度を測定した。カスパーゼ活性アッセイのために、２０μｌの細胞溶解物を黒色の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ショ糖、０．１％ＣＨＡＰＳ、５０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよび２５ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．５を含有する８０μｌの緩衝液の添加の後、プレートをＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度の増加をモニターした（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）。
【０１２３】
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞、ＨｅＬａ子宮頚がん細胞およびＷＭ３５メラノーマ細胞における細胞死を測定するため、１５，０００個の細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中で一晩、９６ウェルプレートに置いておいた。Ｃｏｌｏ２０５細胞については、５０，０００個の細胞を一晩置いておいた。次の日に、示されるリガンドで細胞を刺激し、さらに１８時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞については、シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）を、リガンドによる刺激の間、最終濃度２．５μｇ／ｍｌで使用した。ＨＴ１０８０、ＨｅＬａおよびＷＭ３５の細胞死を、緩衝液ＫＶ（０．５％クリスタルバイオレット、２０％メタノール）で染色することによって定量した。染色後、ウェルを水で洗浄し風乾した。染料をメタノールで溶出し、５９５ｎｍにおける光学濃度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して計測した。Ｃｏｌｏ２０５細胞の生存率を、ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量した。
【０１２４】
（１．５  肝細胞細胞毒性アッセイ）
ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の影響を測定するため、初代ヒト肝細胞を健常ドナーから調製し、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２５，０００個の細胞を使用してＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地中で培養した。２日目に、培地を１０％ＦＣＳ、ヒトインスリン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、最小必須培地（ＭＥＭ）、ピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓが補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２に変更し、もう１日培養した。３日目に、架橋抗体（ＳｔｒｅｐＭａｂＩｍｍｏ、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）の存在下または非存在下で、様々な濃度の示されるタンパク質によって細胞を刺激した。リガンドと化学療法剤との共処置（ｃｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の潜在的な肝毒性の影響を評価するために、様々な濃度のＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄを、５ｍＭのドキソルビシンまたは５ｍＭのゲムシタビンと共に共インキュベートした。細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で５または２４時間インキュベートし、その後、「細胞死アッセイ」欄に記載されるようにカスパーゼ活性の測定のために溶解した。
【０１２５】
（１．６  Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ−ＥＬＩＳＡ）
構築されたリガンドへの受容体の結合を測定するために、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされた９６ウェルマイクロプレートを使用した。従って、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清、マウス血清または精製タンパク質を、ＰＢＳ中で１〜３時間、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎプレート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）上に固定化した。試料を、ＥＬＩＳＡ結合／ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０−ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ））中に希釈した。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、マウス抗ＴＲＡＩＬ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＲＩＫ−２）、ＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＡＣＩ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨＶＥＭ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、Ｆｃタンパク質を抗ヒト−または抗マウス−Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ結合体化抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出した。呈色反応は１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の添加により行われ、停止溶液として２５μｌの２５％Ｈ２ＳＯ４を添加した後、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いて４５０ｎｍ−６３０ｎｍとして値を計算した。
【０１２６】
（１．７  マンナン結合アッセイ）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、滅菌コーティング緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．０２５％ＮａＮ３，ｐＨ９．６）中で、１０μｇ／ウェルの酵母マンナン（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートした。プレートを、最初に緩衝液ＢＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡおよび２０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０−ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ））と共に室温で１時間インキュベートし、次に様々な濃度の示されるリガンドと共に緩衝液ＢＢ中でさらに９０分間インキュベートした。プレートを緩衝液ＷＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、緩衝液ＢＢ中においてｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を使用して検出を行った。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて発色させた。停止溶液として２５μｌの２５％Ｈ２ＳＯ４を添加した後、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いて４５０ｎｍ−６３０ｎｍとして値を計算した。
【０１２７】
（１．８  ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の薬物動態）
雄性ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、３００μｌのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解された１０μｇのタンパク質を静脈注射した。０分後（投与前）、５分後、３０分後、２時間後、６時間後および２４時間後に血液を採取した。各時点について２試料を採取した。血液試料を処理して血清を得、−１５℃で保存した。ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の濃度を、以下（１．９章）に記載されるようにＥＬＩＳＡを用いて測定し、半減期を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．０）。
【０１２８】
（１．９  マウス血清中のＴＲＡＩＬコンストラクトを定量化するためのＥＬＩＳＡ）
マウス血清中のＴＲＡＩＬタンパク質（薬物動態研究起源）の濃度を定量するため、９６ウェルマイクロプレートを使用するＥＬＩＳＡ法を使用した。
【０１２９】
ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのマウス抗ＴＲＡＩＬ（クローンＲＩＫ−２；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３７℃において１時間コーティングした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて３７℃で３０分間プレートをブロッキングした後、０．２％および５％の濃度の血清試料、較正試料およびコントロール試料を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。較正試料およびコントロール試料を、各ＴＲＡＩＬバッチ（ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ−Ｆ３３５ＡまたはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ−Ｆ３３５Ｄ）から調製し、潜在的なマトリクス効果を説明するために、それらに０．２％または５％のプールされた無処理ＣＤ１マウス血清を補充した。コントロール試料（高、中および低濃度のＴＲＡＩＬコンストラクト）を、ＴＲＡＩＬ定量の精度および正確性を保証するための品質コントロール（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、定められたアッセイウィンドウ（ａｓｓａｙ  ｗｉｎｄｏｗ）において添加した。プレートを再度洗浄し、ＳｔｒｅｐＴａｇを含むＴＲＡＩＬコンストラクトを、１：１０００希釈されたＳｔｒｅｐ  Ｔａｃｔｉｎ−ＰＯＤ（ＩＢＡ）により検出した。すべての試料およびタンパク質をＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ））により希釈した。呈色反応は、１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した後、開始された。停止溶液として２５μｌの２５％Ｈ２ＳＯ４を添加した後、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定した。ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いて４５０ｎｍ−６３０ｎｍとして値を計算した。
【０１３０】
（２．結果）
（２．１  ＣＤ９５Ｌ融合タンパク質（ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤ）の特徴づけ）
Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎで親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤから、０．５ｍｌ（０．８６ｍｇのタンパク質）を、ランニング緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）としてＰＢＳを用いて流速０．５ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに充填した。０．５ｍｌの画分を採取した（Ａ１〜Ａ１１が示される）。１１．９２ｍｌにおける主要なピークの保持容量は、サイズ排除標準（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）から決定された１７０ｋＤａに対応した。これは、そのタンパク質がグリコシル化された単量体で構成される三量体であることを示した。単量体ポリペプチドの計算された分子量は、３８ｋＤａである。画分Ａ１〜Ａ１１のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびカスパーセ活性のために使用した。一定の三量体のピーク（画分Ａ７〜Ａ１０）のみを最終分析に使用した。結果を図１に示す。
【０１３１】
親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色に使用した。およそ４０〜４５ｋＤａに検出されたバンド（矢印によって示される）は、ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤに対応した。三量体種は、画分Ａ７〜Ａ１０中に存在した。結果を図２に示す。
【０１３２】
親和性精製されたＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤを用いたＳＥＣ由来の画分Ａ１〜Ａ１５からの最終８倍希釈におけるアリコートと共に、Ｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。３時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、カスパーゼ活性を蛍光発生アッセイにより測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は高度に架橋されたリガンドを必要とすると知られているので、三量体ピーク（画分Ａ７〜Ａ１０）に対応する画分は、Ｊｕｒｋａｔにおいて明確であるが弱いカスパーゼ活性を誘導した。ゆえに、画分Ａ１〜Ａ６中の凝集した未確定の種は、カスパーゼ活性化の強力な誘導物質である（さらに使用せず）。重要なことに、一定の三量体種（Ａ７〜Ａ１０）のみが採取され、最終分析に使用された。結果を図３に示す。
【０１３３】
ヒトがん細胞株ＨＴ１０８０（Ａ）、ＨｅＬａ（Ｂ）またはＷＭ３５（Ｃ）を、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で、示された濃度の精製された三量体ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤと共にインキュベートした。細胞を１８時間インキュベートし、そして細胞毒性をクリスタルバイオレット染色によって分析した。その結果、ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤは、ＨｅＬａ子宮頚がんおよびＨＴ１０８０線維肉腫において細胞死を誘導したが、ＷＭ３５メラノーマ細胞においては誘導しなかった。結果を図４に示す。
【０１３４】
ＣＤ９５Ｌ−ＡＳＰＤのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１３５】
【化１８】
2014218510.tif 000025
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１６０：ＣＤ９５Ｌ受容体結合ドメイン
１６１〜１７１：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１７２〜２０９：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２１０〜３２７：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３２８〜３３８：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３３９〜３４６：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１３６】
（２．２  ＬＩＧＨＴ融合タンパク質（ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤ）の特徴づけ）
親和性精製されたＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤから、０．５ｍｌ（１．５６ｍｇ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに充填し、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、０．５ｍｌ／分で分離した。１１．９６ｍｌで検出される主要なピークは、１７０〜１８０ｋＤａのサイズに対応したことから、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤが３つのグリコシル化された単量体で構成される三量体であることが示された。三量体のピーク（画分Ａ７〜Ａ１０）を採取し、最終的な分析に使用した。挿入図は、２つの独立する精製された三量体ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤバッチ（０９１７および０９１８と命名される）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。結果を図５に示す。
【０１３７】
様々な濃度（０〜１０マイクログラム）の親和性精製およびＳＥＣ精製された三量体ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤを、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされたマイクロプレート上へのＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを介する固定化に使用した。その後、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤを、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの受容体ＨＶＥＭおよびＴＲＡＩＬ受容体１のＦｃ融合タンパク質を用いるＥＬＩＳＡ設定において検出した。固定化されたリガンドの量の増加に伴ってＨＶＥＭ−Ｆｃに対するＥＬＩＳＡシグナルが増加したが、一方で、分析された全範囲に亘ってＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃに対してはなんらのシグナルも検出されなかった。これは、ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤがその受容体ＨＶＥＭに結合することが可能な機能的分子であることを示した。結果を図６に示す。
【０１３８】
ＬＩＧＨＴ−ＡＳＰＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１３９】
【化１９】
2014218510.tif 000026
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１７０：ＬＩＧＨＴ受容体結合ドメイン
１７１〜１８１：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１８２〜２１９：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２２０〜３３７：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３３８〜３４８：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３４９〜３５６：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１４０】
（２．３  ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の特徴づけ）
ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質をコードする２４個の異なる発現ベクターで一過性にトランスフェクトした（表６）。
【０１４１】
【表６】
2014218510.tif 000027
上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用し、ＴＲＡＩＬコンストラクトをＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって検出した。
【０１４２】
検出された特異的なバンドは、矢印によって示される。発現強度は、構築に使用された三量体化モチーフのタイプ（ＳＰＤ＞６９／Ｔ４／コレクチン１１／ＣＣＳＰＤ／ＣＣ１１）、ならびにリンカーエレメントの長さ（Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ）に依存した。結果を図７に示す。
【０１４３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの上清と共に、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下（黒色バー、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）または非存在下（白色バー）で３時間インキュベートした。上清は、様々なリンカーエレメント（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤリンカー）を介して融合された様々な三量体化モチーフ（Ｔ４、６９、ＳＰＤ、ＣＣＳＰＤ、Ｃｏｌ１１、ＣＣ１１）を有するＴＲＡＩＬ融合タンパク質を含有した。ネガティブコントロールとして、トランスフェクトされていない細胞からの細胞上清を使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解し、蛍光発生アッセイによりカスパーゼ活性について分析した。
【０１４４】
その結果、カスパーゼ活性は使用されたリンカーエレメントのタイプ（Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ）、および使用されたＦｏｌｄ−Ｏｎによって減少した。コレクチン−１１またはコレクチン−１１のコイルドコイル（ＣＣＣｏｌ１１）を含むＴＲＡＩＬコンストラクトは、発現される（ウェスタンブロット分析により示される）が機能的ではなかった一方で、ＳＰＤ由来フォールドオン（ｆｏｌｄ−ｏｎ）モチーフは、機能的ＴＲＡＩＬリガンドを生じた。結果を図８に示す。
【０１４５】
親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤを、０．５ｍｌ（０．４ｍｇのタンパク質）を、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、０．５ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに充填することによりＳＥＣに供した。タンパク質溶出を２８０ｎｍにおける吸光度によってモニターし、０．５ｍｌの画分を採取した。１２．２８ｍｌの保持容量は、サイズ排除標準から決定された１３５〜１４０ｋＤａに対応する。これは、単量体ポリペプチドの計算された分子量が４０ｋＤａであるので、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤがホモ三量体であることを示した。重要なことに、野生型ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ配列からなるＳＥＣにより分析されたすべての融合タンパク質について、非活性かつ凝集したＴＲＡＩＬ融合タンパク質に対応するおよそ８ｍｌにおける追加のピークが観察された。採取された画分Ａ１〜Ａ１４から、三量体のピーク（Ａ８〜Ａ１０）のみをさらなる分析に使用した。結果を図９に示す。
【０１４６】
ヒトがん細胞株ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、Ｃｏｌｏ２０５またはＷＭ３５を、示される濃度の精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤと共に、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下で１８時間インキュベートした。細胞死をクリスタルバイオレット染色（ＨｅＬａ、ＷＭ３５およびＨＴ１０８０）またはＭＴＳアッセイ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量した。高いリガンド濃度におけるＣｏｌｏ２０５細胞の生存率の上昇は、架橋抗体の限界に起因するとみられる。結果を図１０に示す。
【０１４７】
様々な濃度（Ａ）または一定濃度（Ｂ）の親和性精製およびＳＥＣ精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤを、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされた９６ウェルプレート上への固定化のために使用した。プレートを、その後、１ウェル当たり１００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞と共に、３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートし、蛍光発生アッセイによりカスパーゼ活性を測定した。特異性を分析するために、示される様々な濃度のアンタゴニスト抗ＴＲＡＩＬ抗体（クローンＲＩＫ−２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にプレート（Ｂ）を３０分間インキュベートした後、細胞を添加した。結果を図１１に示す。
【０１４８】
ＨＴ１０８０細胞を、示される濃度の精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤと共に、同じ９６ウェルプレート上でインキュベートした。次の日に、細胞死をクリスタルバイオレット染色によって定量した。ＴＲＡＩＬ−ＤＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに対するそれぞれ２７ｎｇ／ｍｌおよび６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値によって示されるように、Ｄリンカーの使用は、生物活性をおよそ４．５倍低下させた。結果を図１２に示す。
【０１４９】
ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を以下に示す。
【０１５０】
配列番号４２：Ｓｐ−ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤの発現カセット
エンドヌクレアーゼ制限部位に下線を付している（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡＡＧＣＴＴ；ＢａｍＨＩ，ＧＧＡＴＣＣ；ＮｏｔＩ，ＧＣＧＧＣＣＧＣ）。翻訳開始コドンは太字である。
【０１５１】
【化２０】
2014218510.tif 000028
【０１５２】
【化２１】
2014218510.tif 000029
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜３４８：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３４９〜３５９：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３６０〜３６７：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１５３】
【化２２】
2014218510.tif 000030
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜２３８：リンカーエレメント（ＰＳＳＳＳＳＳＡ）
２３９〜２４６：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１５４】
【化２３】
2014218510.tif 000031
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２２４：ヒトコレクチン−１１のコイルドコイル「ネック」領域
２２５〜３４７：ヒトコレクチン−１１のＣ型レクチンドメイン
３４８〜３５７：リンカーエレメント（ＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３５８〜３６５：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１５５】
【化２４】
2014218510.tif 000032
１〜２０：分泌シグナルペプチド（下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９３：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；ＧＳＳ  ＧＳＳ  ＧＳＳ  ＧＳＧイタリック）
１９４〜２２９：ヒトコレクチン１１のコイルドコイル「ネック」領域
２３０〜２３８：リンカーエレメント（ＧＰＳＳＳＳＳＳＡ）
２３９〜２４６：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１５６】
（２．４  受容体選択的ＴＲＡＩＬ（「ムテイン」）融合タンパク質の特徴づけ）
ＨＥＫ２９３細胞を、種々のＴＲＡＩＬ受容体選択的ＳＰＤコンストラクトをコードする発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。
【０１５７】
【化２５】
2014218510.tif 000033
トランスフェクトの３日後に上清を採取し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩに特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティングのために使用した。特異的なバンドは、およそ３８ｋＤａ（ＳＰＤ融合タンパク質）および２８ｋＤａ（コイルドコイルＳＰＤ融合タンパク質）に検出された。発現されるタンパク質の量は、リガンド自体に依存し（ＴＲＡＩＬＲ１ムテイン＞ＴＲＡＩＬＲ２ムテイン＞ＴＲＡＩＬ）、第２に、使用されたリガンド長に依存し（Ａ＞Ｄ）、そして第３に、使用された三量体化モチーフに依存した（ＳＰＤ＞ＣＣＳＰＤ）。見かけの分子量は、計算されたサイズから予測されたとおりだった（ＳＰＤおよびＣＣＳＰＤ融合タンパク質についてそれぞれ４０ｋＤａおよび２７ｋＤａ）。結果を図１３に示す。
【０１５８】
ＳＰＤ／ｃｃＳＰＤとＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔおよびＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔの融合タンパク質に対するＴＲＡＩＬ受容体１またはＴＲＡＩＬ受容体２の選択性は、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ−ＥＬＩＳＡによって示された。従って、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清中のＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質を、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされたマイクロプレート上に固定化した。トランスフェクトされていない細胞からの細胞上清は、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。結果を図１４に示す。特異的に結合したタンパク質は、一定濃度（Ａ、Ｂ）または様々な濃度（Ｃ、Ｄ）のＴＲＡＩＬ受容体１−ＦｃまたはＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃのいずれかによって検出された。（Ａ）に示されるように、ＳＰＤに融合されたリガンドＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ改変体は、ＴＲＡＩＬ受容体１によって検出される一方、リガンドＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔは、検出されない。（Ｂ）に示されるように、リガンドＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔは、ＴＲＡＩＬ受容体２によって優先的に検出される一方、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔコンストラクトおよびＴＲＡＩＬ野生型コンストラクトは同様に、良好に検出される。Ｃに示されるように、ＴＲＡＩＬ受容体１−Ｆｃは、受容体測定（titration）範囲全体にわたって同様に、良好にＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに結合した一方、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤは、検出されない。Ｄに示されるように、ＴＲＡＩＬ受容体２−Ｆｃは、分析された受容体測定範囲にわたって同様に、良好にＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤに結合した一方、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤに対するシグナルは、受容体濃度の減少に伴って迅速に減少した。
【０１５９】
１００マイクロリットルのＰＢＳ中の１マイクログラム／ｍｌの親和性精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤを、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされたマイクロプレート上へのＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを介した固定化のために使用した。結合したリガンドを、ＴＲＡＩＬ受容体１（Ａ）およびＴＲＡＩＬ受容体２（Ｂ）のＦｃ融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡ設定において検出した。（Ａ）に示されるように、ＴＲＡＩＬ受容体１は、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤに比べ、受容体選択的ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤに優先的に結合した。（Ｂ）に示されるように、ＴＲＡＩＬ受容体２は、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤに比べ、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤに優先的に結合した。結論として、ＳＰＤに融合された構築されたＴＲＡＩＬ改変体は、受容体選択的である。結果を図１５に示す。
【０１６０】
親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに０．５ｍｌ（０．９５ｍｇのタンパク質）を充填することによってＳＥＣに供した。結果を図１６に示す。タンパク質を、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用い、０．５ｍｌ／分で分離し、０．５ｍｌの画分を採取した（画分Ａ１〜Ａ１４が示される）。１２．４６ｍｌの保持容量は、サイズ排除標準によって決定された１４０〜１４５ｋＤａに対応した。１０．８３ｍｌにおける小さなピークは、いくつかの凝集種を示したが、重要なことに、実行し始め（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｆｒｏｎｔ）（８ｍｌ）ではピークが検出されなかったことから、野生型ＴＲＡＩＬアミノ酸配列の一部を含むタンパク質に比べて、この分子がより一層可溶性であることが示される。
【０１６１】
親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後の、図１７に示されるような銀染色に使用した。非還元条件下では、３５および７０ｋＤａにおいて２つのバンドが検出された一方で、還元条件下では４０ｋＤａの単一バンド（矢印で示される）が検出された。これは、ジスルフィド架橋された分子の形成を示した。三量体種は、画分Ａ８〜Ａ１１中に存在し、後の分析に使用された。
【０１６２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤのＳＥＣ由来の画分Ａ１〜Ａ１４からの最終８０倍希釈におけるアリコートと共に、２．５マイクログラム／ｍｌの架橋抗体の非存在下（白色バー）または存在下（黒色バー）においてインキュベートした。結果を図１８に示す。ネガティブコントロールとして、Ｊｕｒｋａｔ細胞を培地のみでインキュベートした。３時間のインキュベーションの後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解し、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、主にＴＲＡＩＬ受容体２を発現することが示されているので、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｉｔ−ＡＳＰＤがＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ特異的抗体によって架橋されたときでさえも、どの画分も顕著なカスパーゼ活性を誘導しなかった。これは、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤがＴＲＡＩＬ受容体２に結合しないことを示した。
【０１６３】
親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤを、図１９に示されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに０．５ｍｌ（０．５ｍｇのタンパク質）を充填することによって、サイズ排除クロマトグラフィーに供した。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分でタンパク質を分離し、０．５ｍｌの画分を採取した（画分Ａ１〜Ａ１４が示される）。１２．６０ｍｌの保持容量は、サイズ排除標準から決定された１３０〜１３５ｋＤａに対応する。これは、４０ｋＤａという予測される単量体重量から計算されるように、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤがホモ三量体であることを示した。重要なことに、９５％超が三量体ピーク画分中に存在し、凝集物は検出されなかった。三量体ピークを後の分析に使用した。
【０１６４】
親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤのサイズ排除クロマトグラフィーからのアリコートを、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く、図２０に示されるような銀染色に使用した。非還元条件下では、３５および７０ｋＤａにおいて２つのバンドが検出された一方で、還元条件下では、およそ４０ｋＤａの単一バンド（矢印で示される）が検出された。これは、ジスルフィド架橋された分子の形成を示した。三量体種は、画分Ａ９〜Ａ１１中に存在し、後の分析に使用された。
【０１６５】
ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤを用いたＪｕｒｋａｔ細胞殺傷アッセイの結果を図２１に示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤのＳＥＣ由来画分Ａ１〜Ａ１４からのアリコートと共に、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の非存在下（白色バー）または存在下（黒色バー）においてインキュベートした。試料を最終６４０倍希釈で使用した。３時間のインキュベーションの後に細胞を溶解し、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、効率的なシグナル伝達のために多量体化リガンド型を必要とするＴＲＡＩＬ受容体２を主に発現することが示されているので、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤは、架橋されるとき、カスパーゼ活性を誘導した。これは、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤが機能的分子であることを示した。
【０１６６】
種々のヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤおよびＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤの細胞毒性活性を図２２に示す。示される細胞株ＨＴ１０８０（ＡおよびＢ）、Ｈｅｌａ（ＣおよびＤ）またはＣｏｌｏ２０５（ＥおよびＦ）を、架橋抗体（抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の非存在下（Ａ、ＣおよびＥ）または存在下（Ｂ、ＤおよびＦ）で、様々な濃度の精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤまたはＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤで処理した。細胞を、示される濃度のリガンドと共に１８時間インキュベートし、クリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ）またはＭＴＳアッセイ（Ｃｏｌｏ２０５）によって細胞死を定量した。その結果、リガンドＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤは、試験された３種の細胞株に対して細胞死を誘導し、ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤは、優れた細胞殺傷活性を示した。対照的に、ＴＲＡＩＬ受容体１に選択的なＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤは、試験されたどの細胞株に対しても活性ではなかった。
【０１６７】
親和性精製されたＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ−ＡＳＰＤを、１０ｋＤａ膜に通す遠心分離によってＰＢＳ中に２０倍に濃縮することにより、２．５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。濃縮物から、０．１ｍｌをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。その結果、三量体ピークのみが検出され、凝集物は検出されなかったことから、この組成物が、改良された生成能力を有することが示される（図２３）。同様の結果が、ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ−ＡＳＰＤについて達成され、ここで、５．４ｍｇ／ｍｌの濃縮溶液でさえも凝集の徴候を示さなかった（示さず）。対照的に、野生型ＴＲＡＩＬ配列で構成される受容体結合ドメインを含む試験されたすべての融合タンパク質は、０．４ｍｇ／ｍｌもの低濃度で４０％の凝集物を伴う凝集を示した。
【０１６８】
受容体選択的なＴＲＡＩＬムテイン融合ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１６９】
【化２６】
2014218510.tif 000034
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬＲ１ｍｕｔ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜３４８：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３４９〜３５９：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３６０〜３６７：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１７０】
【化２７】
2014218510.tif 000035
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬＲ２ｍｕｔ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜３４８：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３４９〜３５９：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３６０〜３６７：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１７１】
（２．５  ＳＰＤ糖質−改変体の特徴づけ）
親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａを、図２４に示されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（０．４ｍｇのタンパク質）を充填することによってサイズ排除クロマトグラフィーに供した。タンパク質を、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分で分離し、０．５ｍｌの画分を採取した（Ａ１〜Ａ１３が示される）。１２．２７ｍｌの保持容量は、サイズ排除標準から決定された１３５〜１４５ｋＤａに対応する。これは、４０ｋＤａという予測される単量体重量から計算されるように、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａがホモ三量体であることを示した。８．３２および１０．６８ｍｌにおける２つの追加的ピークは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ凝集物の形成を示した。三量体ピークのみを後の分析に使用した。
【０１７２】
サイズ排除クロマトグラフィーから、画分Ａ１〜Ａ１３から採取されたアリコートを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを銀染色した（図２５）。およそ４０ｋＤａにおいて検出されたバンドは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａに関する４０ｋＤａという計算された分子量に対応した。ＳＥＣ実行（ｒｕｎ）の三量体分子に対応する陽性画分（Ａ８、Ａ９、Ａ１０）をプールし、さらなる分析に使用した。
【０１７３】
ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ糖質改変体融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１７４】
【化２８】
2014218510.tif 000036
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜３４８：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン（Ｐｈｅ変異（太字））
３４９〜３５９：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３６０〜３６７：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１７５】
【化２９】
2014218510.tif 000037
１〜２０：分泌シグナルペプチド（Ｓｐ；下線）
２１〜１８１：ＴＲＡＩＬ受容体結合ドメイン
１８２〜１９２：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；イタリック）
１９３〜２３０：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２３１〜３４８：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン（Ａｓｐ変異（太字））
３４９〜３５９：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３６０〜３６７：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１７６】
ヒトがん細胞に対するＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａの細胞毒性の効果を図２６に示す。示されるヒトがん細胞株を、様々な濃度の親和性精製およびＳＥＣ精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａと共に、架橋抗体（２．５マイクログラム／ｍｌの抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下において一晩インキュベートした。細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０、ＨｅＬａおよびＷＭ３５）またはＭＴＳ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量した。高濃度のリガンドにおけるＣｏｌｏ２０５細胞の生存率の上昇は、架橋抗体の限界に起因するとみられる。
【０１７７】
親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄを、図２７に示されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに０．５ｍｌ（０．２ｍｇのタンパク質）を充填することによってサイズ排除クロマトグラフィーに供した。ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分でタンパク質を分離し、０．５ｍｌの画分を採取した（画分Ａ１〜Ａ１３が示される）。１２．２９ｍｌの保持容量は、サイズ排除標準から決定された１３５〜１４５ｋＤａに対応する。これは、４０ｋＤａという予測される単量体重量から計算されるように、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄがホモ三量体であることを示した。８．３５におけるピークは、野生型ＴＲＡＩＬアミノ酸配列の一部を含むすべての融合タンパク質について典型的に見出される非活性のＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ凝集物に対応した。
【０１７８】
サイズ排除クロマトグラフィーから、採取された画分Ａ１〜Ａ１３からの親和性精製されたＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄのアリコートを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを銀染色した（図２８）。およそ４０ｋＤａにおいて検出されたバンド（矢印で示される）は、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄに関する４０ｋＤａという計算された分子量に対応した。三量体タンパク質を含有する画分（画分Ａ８〜Ａ１０）をプールし、さらなる分析に使用した。
【０１７９】
ヒトがん細胞株ＨＴ１０８０（Ａ）、ＨｅＬａ（Ｂ）、ＷＭ３５（Ｃ）またはＣｏｌｏ２０５（Ｄ）を、架橋抗体（抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）の存在下または非存在下において、様々な濃度の親和性精製された三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄと共に、一晩インキュベートした。細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色（ＨＴ１０８０、ＨｅＬａおよびＷＭ３５）またはＭＴＳ（Ｃｏｌｏ２０５）によって定量した。データは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄが、例示されたがん細胞株において細胞死を誘導することが可能であることを示している（図２９）。高濃度のリガンドにおけるＣｏｌｏ２０５細胞の生存率の上昇は、架橋抗体の限界に起因するとみられる。
【０１８０】
（２．６  ＳＰＤ三量体化モチーフ改変体の糖質結合特性の分析）
いくつかの種由来の野生型の完全長オリゴマーＳＰ−Ｄタンパク質ならびにヒトＳＰ−Ｄの三量体ネック＋ＣＲＤは、いくつかの異なる糖質に結合することが示されている。加えて、ヒトＳＰ−Ｄのネック＋ＣＲＤはまた、好中球等の免疫細胞に対する走化性因子として働くことによって、免疫調節効果を発揮することが示されている（Ｃａｉら，１９９９，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６：１３１−１３６）。他の細胞も、ＳＰ−Ｄによってリクルートされ得る。マルトースの添加が走化性機能を阻害したので、ヒトＳＰ−Ｄのネック＋ＣＲＤの走化性作用は、糖結合機能に依存することが示された。従って、ＳＰ−Ｄ媒介走化性機能を有するＴＮＦＳＦのリガンドは、天然アミノ酸配列を有するリガンドまたはそのコンストラクトに比べて、より優れた活性を有し得る。例えば、がんの処置等の細胞効果が望ましいシナリオでは、そのような記載されるリガンドが望ましいことがある。
【０１８１】
加えて、ＳＰ−Ｄが糖質機能を有しないリガンドが、他の設定では望ましいことがある。ヒトＳＰ−Ｄについて、アミノ酸フェニルアラニン３３５（配列番号２１のアミノ酸３５５に対応する）がアラニンに変異された変異体が記載されている（ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａ，Ｃｒｏｕｃｈら，ＪＢＣ  ２８１：１８００８−１８０１４）。この変異体は、非常に弱い糖質結合を示した。しかしながら、糖質結合が望まれない場合、荷電アミノ酸（例えば、酸性アミノ酸）の導入は、Ｆ３３５Ａに比べてさらに良い可能性がある。従って、変異体ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは、Ｆ３３５Ａ変異体よりも優れていることがある。
【０１８２】
ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の糖質への結合を分析するために、酵母由来のマンナンをマイクロプレート上に固定化し、ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ、ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５ＡまたはＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの結合をＥＬＩＳＡによって検出した。結果を図３０に示す。予測された通り、ＥＬＩＳＡシグナルは、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ濃度の増加に伴って増強した。対照的に、糖質変異体型のＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ａは、非常に低いＥＬＩＳＡシグナルを示した。加えて、新たに構築された改変体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは、最も低いＥＬＩＳＡシグナルを表わした（挿入図および矢印を参照のこと）。これは、変異体Ｆ３３５Ｄが、前述のＳＰ−Ｄ変異体型のＦ３３５Ａに比べて、より低いマンナン結合親和性を有することを示唆した。
【０１８３】
（２．７  ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の薬物動態）
ＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質の半減期を測定するために、１０マイクログラムのＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）またはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）を雄性ＣＤ１マウスに静脈注射し、いくつかの時点の後（投与前、５分後、３０分後、２時間後、６時間後および２４時間後）、血清試料を採取した。マウス血清中のＴＲＡＩＬタンパク質をＥＬＩＳＡによって定量し、そのデータを使用して半減期を計算した。結果を図３１に示す。分析された２種のタンパク質については、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ（Ａ）およびＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄ（Ｂ）に対して７〜１４時間という半減期が計算された。観察期間中、動物は死亡せず、不耐性の徴候も示さなかった。このデータは、げっ歯類において３〜５分の範囲の半減期を有すると報告されている野生型ＴＲＡＩＬ（Ｋｅｌｌｅｙら２００１）に比べ、少なくとも８０倍の血清半減期の改良を示す。
【０１８４】
（２．８  ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質の細胞毒性）
ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ、ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５ＡまたはＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄの潜在的な肝毒性の影響を分析するために、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、架橋抗体（抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）有りまたは無しで、様々な濃度の示されるＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質と共にインキュベートした。コントロールとして、ＣＤ９５Ｌの安定化された改変体であるＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（ＷＯ２００８／０２５５１６に記載される）を使用した。結果を図３２に示す。
【０１８５】
加えて、５ｍＭの化学療法薬物とのＰＨＨの同時インキュベーションの影響をＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄについて分析した。５時間（Ａ、ＢおよびＥ）または２４時間（Ｃ、ＤおよびＦ）のインキュベーションの後、細胞を溶解し、蛍光発生アッセイによってカスパーゼ活性を評価した。
【０１８６】
その結果、リガンドが抗体によって二次的に架橋された場合でさえも、分析されたすべてのＴＲＡＩＬ−ＳＰＤ融合タンパク質は、肝毒性の影響を誘導しなかった。対照的に、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、活性なカスパーゼの増加によって示されるように、肝毒性である（Ａ〜Ｄ）。化学療法薬物と共に、初代ヒト肝細胞と三量体ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄとを５時間共インキュベートすることによっては、カスパーゼ活性は誘導されなかった（Ｅ）。しかしながら、ドキソルビシンと共に２４時間インキュベートした後、可溶性ＴＲＡＩＬ−ＡＳＰＤ＿Ｆ３３５Ｄは、強いカスパーゼ活性シグナルを誘導した（Ｆ）。
【０１８７】
これは、本発明のＴＲＡＩＬ融合タンパク質が、医学的用途において望ましくない肝毒性を示さない可能性があることを示唆する。従って、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、好ましくは、アポトーシス感作剤および／またはアポトーシス誘発剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、エトポシド、ゲムシタビン、イリノテカン等の化学療法薬物）、またはＢｃｌ２ファミリー、特に、Ｂｃｌ２またはＢｃｌｘｌのポリペプチドに結合するＢｃｌ２結合分子（例えば、低分子またはペプチド化合物）である薬物と組み合わせて投与される。
【０１８８】
（２．９  ＡＰＲＩＬ融合タンパク質の特徴づけ）
ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＰＲＩＬ−Ａ６９（ＷＯ２００８０２５５１６）、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ、ＡＰＲＩＬ−ＡＣＣＳＰＤまたはＡＰＲＩＬ−ＡＣｏｌ１１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。３日後、上清をウェスタンブロッティングによって分泌タンパク質について分析した。結果を図３３に示す。ＡＰＲＩＬ融合タンパク質の検出のために、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩに特異的な抗体を使用した。矢印は、４０ｋＤａ付近で検出された特異的バンド（それぞれ、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤおよびＡＰＲＩＬ−ＡＣｏｌ１１を示す）ならびに２５ｋＤａ付近で検出された特異的バンド（それぞれ、ＡＰＲＩＬ−Ａ６９およびＡＰＲＩＬ−ＡＣＣＳＰＤ）を示している。従って、ＡＰＲＩＬ発現カセットは、機能的であり、タンパク質の分泌は、タンパク質が適切に折り畳まれていることを示した。分析された他のＴＮＦＳＦタンパク質については、最も高い分泌タンパク質のレベルが、ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」＋ＣＲＤで構成される三量体化モチーフに融合されたＡＰＲＩＬに対して見出された（ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ、レーン番号２）。ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤを、受容体ＴＡＣＩへの結合を分析するために使用した。
【０１８９】
構築されたＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤ融合タンパク質が機能的であることを示すために、ＡＰＲＩＬの公知の受容体、すなわちＴＡＣＩへの結合を評価した（図３４）。従って、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの上清中のＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤを、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎでコーティングされたマイクロプレート上に固定化した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞からの細胞上清は、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。特異的に結合したタンパク質を、様々な濃度のＴＡＣＩ−Ｆｃによって検出した後、ペルオキシダーゼに結合体化された抗ヒトＦｃ特異的抗体と共にインキュベートした。その結果、ＴＡＣＩ−Ｆｃの濃度が増加するにつれてＥＬＩＳＡシグナルが増強したことから、ＡＰＲＩＬ−ＡＳＰＤが機能的分子であることが示される。
【０１９０】
ＡＰＲＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１９１】
【化３０】
2014218510.tif 000038
１〜２０：シグナル分泌ペプチド（下線）
２１〜１５８：ＡＰＲＩＬ−ＲＢＤ
１５９〜１６９：可撓性リンカーエレメント（Ａ−リンカー；ＧＳＳ  ＧＳＳ  ＧＳＳ  ＧＳイタリック）
１７０〜２０７：ヒトＳＰ−Ｄのコイルドコイル「ネック」領域
２０８〜３２５：ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン
３２６〜３３６：リンカーエレメント（ＧＧＳＰＳＳＳＳＳＳＡ）
３３７〜３４４：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１９２】
（実施例３  エフェクターポリペプチドとしての１本鎖抗体との融合タンパク質の作製）
１本鎖（ｓｃ）Ｆｖ−ＳＰＤ融合タンパク質に関して例となるアミノ酸配列を以下に示す（配列番号５２、５３）。
【０１９３】
【化３１】
2014218510.tif 000039
１〜２０：シグナル分泌ペプチド（下線）
２１〜１４０：重鎖可変ドメイン
１４１〜１５５：リンカーエレメント
１５６〜２６４：軽鎖可変ドメイン
２６５〜２７６：Ａ−リンカー
２７７〜４３１：ＳＰＤ−モチーフ（ｍｏｔｉｖ）（ネック＋ＣＲＤ）
４３２〜４４１：リンカーエレメント
４４２〜４５０：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）
【０１９４】
【化３２】
2014218510.tif 000040
１〜２０：シグナル分泌ペプチド（下線）
２１〜１４０：重鎖可変ドメイン
１４１〜１５５：リンカーエレメント
１５６〜２６４：軽鎖可変ドメイン
２６５〜２７６：Ａ−リンカー
２７７〜４３１：ＳＰＤ−モチーフ（ｍｏｔｉｖ）（ネック＋ＣＲＤ）
４３２〜４４１：リンカーエレメント
４４２〜４５０：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）。
【０１９５】
上記タンパク質を発現させ、１．３欄に記載されたような親和性クロマトグラフィーに供した。溶出物のアリコートを、還元条件下または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。４５．８ｋＤａという予測される分子量を有するｓｃ００６−ＡＳＰＤ−Ｓｔに対応する、矢印によって示される（図３９を参照のこと）４０〜５０ｋＤａにおける単一バンドが、検出され得る。
【０１９６】
上記タンパク質を発現させ、親和性精製し、そして１．３欄に記載されたようなサイズ排除クロマトグラフィーに供した。５０マイクログラムの親和性精製されたタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに充填し、クロマトグラムが示される（図４０を参照のこと）。１２．６３ｍｌにおける主要なピークは、ＳＰＤを介して三量体に構築された３つのｓｃＦｖ分子の予測された種に類似する、１６０±１５ｋＤａの分子量に対応する。その分子は、抗原を固定化しｓｃ００６−ＳＰＤ−Ｓｔを検出することによってＥＬＩＳＡ設定において機能的に試験され得る。
【０１９７】
本実験において生成される融合タンパク質は、ＩＬ４Ｒ−アルファに対して作製された１本鎖抗体を含む。
【図１】
2014218510.tif 000041
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2014218510.tif 000070
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2014218510.tif 000080
【配列表】
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【外国語明細書】
2014218510000001.pdf