(57)【要約】【課題】  新規な抗糖化剤を提供する。【解決手段】  ベニバナの抽出液から糖類ないし配糖体を分離・除去してなる抽出物であって、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤。ベニバナの花弁の抽出液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記吸着剤Ｂに抗糖化剤を吸着させ、糖類ないし配糖体を含有する通過液と抗糖化剤とを分離し、前記吸着剤Ｂに吸着させた抗糖化剤を溶離することを特徴とする、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベニバナの花弁の抽出液から糖類ないし配糖体を分離・除去してなる抽出物であって、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤。
【請求項２】
ベニバナの花弁の抽出液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記ベニバナの花弁の抽出液に含まれる糖類ないし配糖体を分離・除去してなる、請求項１記載の抗糖化剤。
【請求項３】
ベニバナの花弁の抽出液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記吸着剤Ｂに抗糖化剤を吸着させ、糖類ないし配糖体を含有する通過液と抗糖化剤とを分離し、
前記吸着剤Ｂに吸着させた抗糖化剤を溶離することを特徴とする、
３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤の製造方法。
【請求項４】
ベニバナの花弁の抽出液をマクロポーラスな芳香族系非修飾型吸着剤Ａに接触させて、前記吸着剤Ａに色素Ａを吸着させ、抗糖化剤および糖類ないし配糖体を含有する通過液と色素Ａとを分離し、
前記通過液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記吸着剤Ｂに抗糖化剤Ｂを吸着させ、糖類ないし配糖体を含有する通過液と抗糖化剤とを分離し、
前記吸着剤Ｂに吸着させた抗糖化剤を溶離することを特徴とする、
請求項３記載の抗糖化剤の製造方法。
【請求項５】
ベニバナの花弁の抽出液から糖類ないし配糖体を分離・除去してなる抽出物であって、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上の抽出物を用いる抗糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品用添加剤や化粧料用添加剤として使用される抗糖化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
清涼飲料水、白米、砂糖、デザートなど、過剰に摂取した糖分とたんぱく質との結合「糖化反応（メイラード反応）」は現代人の健康維持にとって重要な問題となっている。また、糖尿病などで高血糖状態が続いたり、加齢により分解反応が進行し難くなると、糖化産物の生成に傾き、たんぱく質の機能が損なわれたり、糖化産物が蓄積したりする。
たんぱく質とグルコースが共存した際、非酵素的な反応、不可逆な変性を起こし、アマドリ化合物を経て最終的に終末糖化産物（アドバンスド・グリケーション・エンド・プロダクツ；以下、「ＡＧＥｓ」と略称する）となる。生成したＡＧＥｓは代謝によって体外へ排出されるが、加齢に伴い、代謝速度は遅くなりAGEsが生体内の各組織に蓄積する。AGEsは、生体内の各組織に蓄積したり、ＡＧＥｓの受容体と結合したりすることにより、種々の症状を引き起こすことが知られている。
例えば、皮膚（表皮、真皮）においてＡＧＥｓが生成し蓄積すると、肌全体の衰え（例えば、肌の張りや弾力の低下、シワ、タルミ、黄ぐすみのような皮膚の色味の変化、透明感の低下、シミ等）の一因になる。
また、糖尿病患者では、高血糖により生じたＡＧＥｓが白内障、動脈硬化、腎機能障害などの合併症を引き起こす。従って、生成したＡＧＥｓを体外へ排出するために、AGEsを体外へ排出し易い形に分解することが重要である。
【０００３】
従来、食品用や化粧料用の添加剤として、ＡＧＥｓの生成阻害成分や、ＡＧＥｓの分解成分の検討が行われている。
例えば、特許文献１にはブドレジャアキシラリス葉抽出物の、ＵＶＡ照射下でのＡＧＥｓ構造体生成抑制、ＣＭＡ生成抑制、ペントシジン生成抑制作用について記載されている。また、特許文献２には、柑橘類の揮発性油状物がＡＧＥｓ構造体の一部であるペントシジンの生成を阻害したことが記載されている。また、特許文献３には、オリーブのエタノール水溶液による抽出物がＡＧＥｓ分解作用を有し、肌のくすみを抑制したことが記載されている。
【０００４】
一方、ベニバナは薬草としても古くから使用されてきており、漢方薬理作用として、月経不順、冷え性、更年期障害、血行障害などに対する効果が謳われている。
特許文献４には、ベニバナの花弁及び／又はその抽出物を有効成分として含有する抗糖尿病用組成物が開示される。
特許文献５には、ベニバナの子葉や茎の抽出エキスに活性酸素を効果的に減少させる効果が開示される。
特許文献６には、紅豆杉を主原料にベニバナ花弁乾燥粉末を加味した食品に産婦人科疾病の効果が開示される。
特許文献７には、冬虫夏草や紅花などの１７種の天然薬物を含有する混合組成物に糖尿病治療用効果が開示される。
特許文献８には、オタネニンジンエキスにベニバナもやしの緑化部分を使用したものを含む糖尿病などを防ぐ健康アイスクリームとしてが開示される。
特許文献９には、ベニバナの熱水抽出物にメントールを加えた湿布剤として報告されている。
特許文献１０には、ベニバナ花弁の紅色色素カルタミンに高コレステロール血症抑制の効果が開示されている。
【０００５】
また、特許文献１１には、ベニバナ色素を製造する際に吸着剤を用いる製造方法が開示される。特許文献１２には、酸処理後、分離膜処理による無臭若しくは微臭のベニバナ色素の製造方法が開示される。
【０００６】
さらに、グリケーション阻害剤に関する特許文献１３には多数列挙される植物の１つとしてベニバナが開示される（請求項１）。
特許文献１４には、メイラード阻害剤としてアケビやブクリョウ等の抽出物が開示されている（請求項１）。メイラード阻害剤を食品等に配合する際にはさらに植物由来の抽出物をその他の添加剤として添加し得る旨開示され、ベニバナ抽出物の利用が開示される（［００４２］〜［００４５］、［０１１５］）。
特許文献１５には、ベニバナを構成生薬とする冠元顆粒を有効成分とする最終糖化生産物生成抑制剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１０２２７０号公報
【特許文献２】特開２００４−３５４２４号公報
【特許文献３】特開２００１−１２２７５８号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０９４８５８のパンフレット
【特許文献５】特開２００１−３４６５５５号公報
【特許文献６】特開２０００−２３６８３８号公報
【特許文献７】特開２００１−５０６５８９号公報
【特許文献８】特開平７−３２２８２５号公報
【特許文献９】特開平２−２０７０２３号公報
【特許文献１０】特開２００３−４０７８０号公報
【特許文献１１】特開平０９−２９６１２４号公報
【特許文献１２】特開２００１−３３５７１６号公報
【特許文献１３】特開２００４−２５０４５５号公報
【特許文献１４】特開２００２−２４１２９３号公報
【特許文献１５】特開２０１０−１８０２５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献４〜１０、１４は、ベニバナ由来物質の種々の効果を開示するが、「抗糖化」作用について記載はない。
特許文献１３は、ベニバナ由来物質の抗糖化作用を開示するとはいうもの、その作用効果は低かった。
特許文献１５は、丹参、香附子、木香、紅花、芍薬、センキュウを構成生薬とする冠元顆粒にはＡＧＥｓ生成阻害活性があり、その活性は主として丹参と芍薬に依拠すること、香附子にも丹参と芍薬と比べると若干弱いがＡＧＥｓ生成阻害活性のあることが開示されている（［００５７］）。一方、センキュウ、木香、紅花には、ＡＧＥｓ生成阻害活性のないことが開示されている（図６（ｄ）〜（ｅ））。
【０００９】
本発明は、新規な抗糖化剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために、種々の植物由来抽出物について探索研究し、各種評価を行った結果、ベニバナ由来の抽出物のすべてにＡＧＥｓ生成阻害活性があるわけではなく、ベニバナの花弁を抽出の対象とし、抽出方法・精製方法を工夫することにより得られる、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上の抽出物が、たんぱく質と還元糖との間の糖化反応によるＡＧＥｓの生成を効果的に抑制することを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、ベニバナの花弁の抽出液から糖類ないし配糖体を分離・除去してなる抽出物であって、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、ベニバナの花弁の抽出液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記吸着剤Ｂに抗糖化剤Ｂを吸着させ、糖類ないし配糖体を含有する通過液と抗糖化剤Ｂとを分離し、
前記吸着剤Ｂに吸着させた抗糖化剤Ｂを溶離することを特徴とする、
３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上である抗糖化剤の製造方法に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、ベニバナの花弁の抽出液から糖類ないし配糖体を分離・除去してなる抽出物であって、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上の抽出物を用いる抗糖化方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗糖化剤は、糖化反応を効果的に抑制し、この作用によりＡＧＥｓにより引き起こされる各種疾患、糖尿病合併症の白内障・網膜症・腎症・神経症など、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨祖鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、皮膚硬化、加齢黄班変性症、糖化ストレス、アンチエイジング等を予防または改善する事が期待できる。
本発明の抗糖化剤は、長い間の使用経験に基づく植物を起源とする天然物であることから副作用等の心配がない。食品または、食品添加物・紅花色素の範疇であり、菓子や飲料、健康食品等の形態に容易にすることが出来るため、服用しやすく、長期にわたって連続的に服用する事も可能である。また、化粧品原料としても、「ベニバナエキス（２）」、「ベニバナ黄」等の表示名称で登録されている安全な成分である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるベニバナは、キク科ベニバナ(Carthamus  tinctorius  LINNE.)であれば、生花でも乾燥花でもよく、さらに「最上紅花」「中国紅花」「岡山１号」「イスラエル」「カリフォルニア」などベニバナの種類に限定されることなく如何なる種類でもよい。
ベニバナの花弁には、口紅やほほ紅などの化粧品材料、チョコレート、打錠剤用着色料としてよく使用されている紅色色素カルタミンの他、食用色素として主に利用されている黄色のサフラワーイエロー類が含まれている。サフラワーイエロー類とはベニバナ黄色色素の総称で、サフラワーイエロー類には、サフロミンA、サフラワーイエローB、サフロミンC、プリカーサなどが含まれる。
ベニバナの花弁はそのまま抽出に供してもよいし、切断したり、粉砕したりしたものを抽出に供してもよい。
【００１５】
ベニバナ花弁を室温または加熱した中性ないし酸性の水に浸漬等することにより、花弁有効成分を水に抽出し、次いでデカンテーション、遠心分離法その他の方法により不溶物、夾雑物を除去し、抽出液を得ることができる。
必要に応じて水溶性有機溶剤を使用することもできる。水溶性有機溶剤としては、エタノール、メタノール、プロピルアルコール等のアルコールやアセトン等を挙げることができる。
【００１６】
抽出液を酸性とするために使用する酸性物質としては、塩酸、硫酸、リン酸などの鉱酸や酢酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸などの有機酸があり、その濃度は０．００１〜１モル濃度であればよい。又、抽出液を酸性とするために緩衝液を使用してもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、ピロリン酸ナトリウム緩衝液、グリシン−ナトリウム緩衝液、グッドバッファーなどがあるが、これらに限定されるものではない。抽出液のｐＨは２〜７、好ましくはｐＨ２〜４であれば良い。
【００１７】
３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上の抽出物を得ることができる方法であれば、本発明の抗糖化剤を得るための抽出、精製方法は特に制限されない。
例えば、ベニバナの花弁の抽出液には多くの場合、糖類ないし配糖体等の糖成分が含まれるが、これら糖成分はＡＧＥｓ生成阻害効果が期待できないので、抽出液から分離・除去することが好ましい。
【００１８】
ベニバナの花弁の抽出液から糖成分を分離・除去する方法の一例としては、マクロポーラスな吸着剤を利用する方法が挙げられる。
【００１９】
マクロポーラスな吸着剤を利用する方法について説明する。
マクロポーラスな吸着剤としては、芳香族系非修飾型吸着剤（以下、芳香族系非修飾型吸着剤Ａもしくは吸着剤Ａという）や芳香族系修飾吸着剤（以下、芳香族系修飾吸着剤Ｂもしくは吸着剤Ｂという）が挙げられる。本発明の抗糖化剤は吸着剤Ｂに吸着し易いので、吸着剤Ｂを用いて抽出液から抗糖化剤を分離し、吸着剤Ｂから抗糖化剤を溶離することが好ましい。
【００２０】
さらに、吸着剤Ｂの使用に先立ち、抗糖化機能の弱い成分（以下、色素Ａという）を予め吸着させるために吸着剤Ａを用いることによって、抗糖化機能の高い抗糖化剤を得ることができる。
あるいは、吸着剤Ｂを使用し、抗糖化剤および色素Ａを吸着させた後、吸着剤Ｂから両成分を溶離し、溶離液を吸着剤Ａに接触させ、吸着剤Ａに色素Ａを吸着させ、通過液として抗糖化剤を得ることもできる。
作業効率、生産性等の点から、吸着剤Ａを使用し、次いで吸着剤Ｂを使用することが好ましい。
【００２１】
即ち、ベニバナの花弁の抽出液を、マクロポーラスな芳香族系非修飾型吸着剤Ａに接触させて、吸着剤Ａに色素Ａを吸着させ、抗糖化剤および糖類ないし配糖体を含有する通過液と色素Ａとを分離し、次いで、前記通過液をマクロポーラスな芳香族系修飾型吸着剤Ｂに接触させて、前記吸着剤Ｂに抗糖化剤を吸着させ、糖類ないし配糖体を含有する通過液と抗糖化剤とを分離し、前記吸着剤Ｂに吸着させた抗糖化剤を溶離することにより、本発明の抗糖化剤を得ることが好ましい。
【００２２】
本発明に用いられる吸着剤Ｂとしては、スチレンとジビニルベンゼンから得られる架橋構造を有する樹脂に塩素原子、臭素原子等の電子吸引性基を含有させたものを粒子状にしたものが挙げられる。例えば、三菱化成工業株式会社のセパビーズＳＰ−２０６，ＳＰ−２０７などが挙げられる。
具体的にはこれら吸着剤Ｂを詰めたカラムに、抽出液を通過させ、抗糖化剤を吸着剤Ｂに吸着させる。
【００２３】
本発明において用いられる吸着剤Ａとしては、スチレン、ビニルピロリドン等のビニルモノマーにジビニルベンゼンのような架橋性のモノマーを配合して得られる網状構造を有する樹脂を粒子状にしたものであって、塩素原子、臭素原子等の電子吸引性基を含有しないものが挙げられる。例えば、ダイヤモンドシャムロックケミカル社のデュオライトＳ−３０，ＥＳ−３３、Ｓ−３７，Ｓ−８６２，Ｓ−８６１，Ｓ−５８７，Ｓ−７６１等、ロームアンドハース社のアンバーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−７，ＸＡＤ−８，ＸＡＤ−１６，ＸＡＤ−１１８０，ＸＡＤ−２０００，ＸＡＤ−２０１０等、三菱化成工業株式会社のダイヤイオンＨＰ−１０，ＨＰ−２０，ＨＰ−２１，ＨＰ−４０等、セパビーズＳＰ−８５０等、ダウケミカル社のダウエックスＸＵＳ−４０３２３，ＸＵＳ−４０２８５等、北越炭素工業株式会社のＫＳ，ＨＳ，ＡＦ，Ｌ−１、ＩＳＰ社のポリクラール  ＳＢ−１００、ポリクラール・スーパーＲ、ポリクラール  １０（ＰＶＰＰ  不溶性ポリビニルポリピロリドン）、東洋曹達工業株式会社のトヨパールＨＷ−４０など等が挙げられる。
【００２４】
吸着剤Ｂに抗糖化剤を吸着させた後、吸着剤Ｂを洗浄した後、抗糖化剤を溶離することが好ましい。具体的には、吸着剤Ｂを詰めたカラムに洗浄液を通過させた後、カラムに溶離用液を通過させればよい。
吸着剤Ｂは、中性の水、微酸性の水溶液などで洗浄した後、さらに有機溶剤と水との混合溶剤にて洗浄しても良い。混合溶剤中には酸性物質を存在させても良い。有機溶剤としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。食品製造用途に使用可能という観点からエタノール溶剤が好適である。これら有機溶剤と水との容量比、有機溶剤：水＝１〜２０：９９〜８０であることが好ましい。
溶離用液は、有機溶剤と水との容量比、有機溶剤：水＝１００〜２１：０〜７９の混合溶剤であることが好ましい。用いられる有機溶剤としては上記と同様のものを挙げることができる。例えば、エタノール：水＝５０：５０の溶離液を用いることができる。カラムに溶離用液を通過させることによって、吸着剤Ｂに吸着していた抗糖化剤を離脱させた脱離液（溶離液ともいう）を得ることができる。
【００２５】
このようにして得られた脱離液をそのまま抗糖化剤とすることもできるし、適宜濃縮し抗糖化剤とすることもできるし、乾燥させたものを抗糖化剤とすることもできる。本発明の抗糖化剤は、３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における固形分１００％換算色価が７００以上であれば、優れた抗糖化機能が期待できる。抗糖化機能の点から色価は大きければ大きいほど好ましく、具体的には色価が１０００以上であることが好ましく、１３００以上であることがより好ましく、コストを考慮すると現実的には２０００以下が好ましい。
【００２６】
色価とは、一般に「試料」の単位質量当たりの吸光極大（λmax）における１０（ｗ／ｖ％）に換算した吸光度を意味する。
例えば、任意の「試料」：１ｇを溶媒に溶かし１０ｍｌにした溶液の吸光度が１であれば、前記「試料」の色価は１となる。ところで、「試料」が乾燥物の場合と、「試料」が既に何らかの溶媒に溶解され、固形分が５０％の場合と、固形分が１０％の場合とでは、色価の意味は異なる。
また、色価は「試料」を溶解する溶媒の種類やｐＨによっても影響を受ける。
そこで、本発明では、固形分、溶媒、ｐＨ等の影響を排除し、固形分１００％換算色価により抗糖化剤を特定する。
即ち、脱離液をそのまま抗糖化剤とする場合であっても、脱離液を濃縮し、例えば固形分５０質量％とする場合であっても、固形分１００％に換算すれば同じ色価を呈することとなる。
【００２７】
本発明の抗糖化剤は、食品用添加剤として食料品に添加したり、化粧料用添加剤として化粧料に添加したりして、経口吸収ないし経皮吸収することにより、抗老化剤、皮膚コラーゲンの損傷抑制剤、及び肌の張り若しくは弾力の低下、又は皮膚のしわの抑制、予防、又は改善剤などが期待できる。
【００２８】
あるいは本発明の抗糖化剤をそのまま摂取したり、又はこれに食品に通常用いられている賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に、公知の手法にて製剤化したものを摂取することによっても同様の効果を期待できる。中でも、服用および携帯が容易である点で、液状飲料、粉末飲料、ゼリー剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、ドロップ剤のような形態が好適である。必要に応じて、油脂、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、香料、増粘剤、甘味料、着色剤、香料、保存料、酸化防止剤、有機酸などの食品添加剤と共に混合して、製剤化すればよい。
【００２９】
また、本発明の抗糖化剤は、医薬分野において常用される既知の他の化合物、および経口投与に適した形態に成型するのに必要な化合物、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどを配合して、経口投与に適した形状、例えば、粉末、液剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の種々の形態で使用することができる。液剤は溶液、懸濁剤のいずれでもよく、担体として水、硬化ヒマシ油、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、脂肪油、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトールなどが挙げられる。
【００３０】
食料品としては、一般的な食料品や飲料の他、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品を含む）が挙げられる。
【００３１】
化粧品等の外用剤の場合、剤形及び用途は特に限定されず、例えば、剤形は、溶液状、乳液状、クリーム状、水性ゲル状等のいずれでもよく、又、用途としては基礎化粧料を始め、下地料の他、ファンデーション、コントロールカラー等の仕上げ料を挙げることができる。これらの化粧料は、上記抗糖化剤を配合する以外は、通常の化粧料と同様の方法で製造することができる。
【００３２】
本発明の抗糖化剤を使用・摂取する際には、その他の活性成分として、本発明の効果をさらに増強する目的で、公知の抗糖化成分を配合することができる。公知の抗糖化成分は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【実施例】
【００３３】
以下に、本発明の構成ならびに効果をより明確にするために、実施例および比較例を記載する。但し本発明は、これらの実施例等に何ら影響されるものではない。
【００３４】
［製造例１］
乾燥ベニバナ花弁１０Ｋｇを５％酢酸水２００リットルに２０時間、浸漬抽出した。
前記抽出液を、多孔質芳香族系合成吸着剤Ａ：「ダイヤイオンＨＰ−２０；三菱化学社製」１０リットルを詰めたカラム、続いて芳香族修飾型合成吸着剤Ｂ：「セパビーズＳＰ−２０７；三菱化学社製」１０リットルを詰めたカラムに流した。
前記吸着剤Ａ、Ｂを詰めたカラムをそれぞれ２０リットルの１％酢酸水で別個に洗浄した後、各吸着剤に吸着していた成分をそれぞれ５０％エタノール（１％酢酸含有）３０リットルに溶離した。エバポレータを用いて、前記溶離液をそれぞれ濃縮し、固形分約６０％の溶離液Ａ（ベニバナ抽出液Ａともいう）：約３０ｇ、固形分約６０％の溶離液Ｂ（ベニバナ抽出液Ｂともいう）：約５０ｇを得た。
また、前記吸着剤ＡおよびＢに吸着せず、両カラムを通過した水溶液を同様にエバポレータで濃縮し、固形分約６０％の通過液Ｃ（ベニバナ抽出液Ｃともいう）：約２００ｇを得た。
なお、固形分は、溶離液もしくは通過液の一部を測定用試料として、当該試料の乾燥前後の質量から求めた値である。乾燥条件は、１０５℃で３０分間としたが、凍結乾燥によってもよい。
【００３５】
次いで、ベニバナ抽出液Ａ〜Ｃの吸光度を「食品添加物公定書第８版」記載の方法に準じて測定し、色価を以下の方法にて求めたところ、それぞれ４００、８００、１０であった。固形分はそれぞれ約６０％なので、ベニバナ抽出液Ａ〜Ｃの固形分１００％換算の色価は、それぞれ６６７、１３３３、１７となる。
【００３６】
＜ベニバナ抽出液Ａ＞の吸光度、および色価
ベニバナ抽出液Ａを０．３ｇ秤量し、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に１００ｍｌとした。この溶液を５ｍｌ測り取り、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に１００ｍｌとした（希釈倍率Ｆ＝１００／５＝２０）。この試料溶液を吸光度測定用の検液とした。
調整後の退色の影響を避けるため、検液の調整後３０分以内に、検液について３５０〜４５０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における吸光度Ａを測定したところ、０．６であった。測定装置は島津紫外可視分光光度計ＵＶ−１８００（株式会社島津製作）を用い、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を対照とし、液層の長さ１ｃｍにてスペクトラムモードで吸光度を測定した。
色価は次式により求めた。
色価＝{１０×Ａ（；吸光度）×Ｆ（；希釈倍率）}／試料の採取量（ｇ）
ベニバナ抽出液Ａの色価；４００＝１０×０．６×２０／０．３
【００３７】
＜ベニバナ抽出液Ｂ＞の吸光度、および色価
ベニバナ抽出液Ｂを０．２５ｇ秤量し、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に１００ｍｌとした。この溶液を５ｍｌ測り取り、２００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に２００ｍｌとする（希釈倍率Ｆ＝２００／５＝４０）。この試料溶液を吸光度測定用の検液とし、ベニバナ抽出液Ａと同様に吸光度を測定したところ０．５であった。
色価は下記式にて算出した。
ベニバナ抽出液Ｂの色価；８００＝１０×０．５×４０／０．２５
【００３８】
＜ベニバナ抽出液Ｃ＞の吸光度、および色価
ベニバナ抽出液Ｃを０．５ｇ秤量し、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に１００ｍｌとした（希釈倍率Ｆ＝１）。この試料溶液を吸光度測定用の検液とし、ベニバナ抽出液Ａと同様に吸光度を測定したところ０．５であった。
色価は下記式にて算出した。
ベニバナ抽出液Ｃの色価；１０＝１０×０．５×１／０．５
【００３９】
［製造例２］
乾燥ベニバナ花弁１ｋｇを黄色素が出なくなるまで良く水洗した後、炭酸カリウム１５０ｇ、精製水５Ｌを加え、赤色素を抽出した。得られた抽出液にセルロース粉末を２００ｇ加え、充分撹拌しながら分散させた後、クエン酸を１５０ｇ添加してｐＨを酸性にした。分散液を濾過し、赤色に着色したセルロース粉末を得、充分水洗した後、乾燥し、約１００ｇのベニバナ抽出乾燥物Ｄを得た。
次いで、ベニバナ抽出乾燥物Ｄの色価を測定した。ベニバナ抽出乾燥物Ｄ０．１６７ｇを秤量し、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、５ｍｌのイオン交換水で膨潤させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えて正確に１００ｍｌとした（希釈倍率Ｆ＝１）。この試料溶液をＮｏ．５Ｃ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）のろ紙を用いてろ過した。ろ液を吸光度測定用の検液とした。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを対照とし、液層の長さ１ｃｍにて検液の５２０〜５４０ｎｍ間の吸光極大（λmax）における吸光度を測定したところ０．５であった。
従って、ベニバナ抽出乾燥物Ｄの色価；３０＝１０×０．５×１／０．１６７  となる。
なお、上記検液の場合、３５０〜４５０ｎｍ間には吸光極大（λmax）を有しなかった。
【００４０】
［製造例３］
乾燥ベニバナ紅花花弁を乳鉢で粉砕し、目開き１００μｍのメッシュを通過したものを「ベニバナ粉末Ｅ」とした。
次いで、ベニバナ粉末Ｅの色価を測定した。ベニバナ粉末Ｅ１ｇを秤量し、１００ｍｌのメスフラスコに入れ、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を加えて正確に１００ｍｌとした（希釈倍率Ｆ＝１）。この試料溶液をＮｏ．５Ｃ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）のろ紙を用いてろ過した。ろ液を吸光度測定用の検液とした。調整したｐＨ５．０のクエン酸緩衝液を対照とし、液層の長さ１ｃｍにて検液の３５０〜４５０ｎｍ間の吸光度を測定したところ、０．５であった。
従って、ベニバナ粉末Ｅの色価；５＝１０×０．５×１／１  となる。
【００４１】
［製造例４］
乾燥ベニバナ花弁１０Ｋｇを５％酢酸水２００リットルに２０時間、浸漬抽出した。固形物を濾別した後、濾過液はエバポレータを用いて濃縮し、固形分約６０％の「ベニバナ抽出液Ｆ約２００ｇを得た。
ベニバナ抽出液Ａ、Ｂ等と同様の方法にて色価を求めたところ、「ベニバナ抽出液Ｆ」の色価は２５０であり、固形分１００％の色価は約４１７であった。
【００４２】
［製造例５］
乾燥ベニバナ花弁１０Ｋｇを精製水１００リットルにて１時間１００℃で加熱抽出した。固形物を濾別した後、濾過液はエバポレータを用いて濃縮し、固形分約６０％の「ベニバナ抽出液Ｇ」約２００ｇを得た。
ベニバナ抽出液Ａ、Ｂ等と同様の方法にて色価を求めたところ、「ベニバナ抽出液Ｇ」の色価は２８０であり、固形分１００％の色価は約４６７あった。
【００４３】
［製造例６］
乾燥ベニバナ花弁１０Ｋｇを９９度醗酵エタノール１００リットルに浸漬し、２５℃で１時間加熱抽出した。抽出液から固形物を濾別した後、濾過液はエバポレータを用いて濃縮し、固形分約５０％の「ベニバナ抽出液Ｈ」約５０ｇを得た。
ベニバナ抽出液Ａ、Ｂ等と同様の方法にて色価を求めたところ、「ベニバナ抽出液Ｈ」の色価は１２０であり、固形分１００％の色価は約２４０あった。
【００４４】
［製造例７］
乾燥ベニバナ花弁１０kgを水２００リットルに浸漬し、室温下に一夜放置して、色素を抽出した。濾過助剤、珪藻土を使用して吸引濾過し、濾液として抽出液約２００リットルを得た。この抽出液を限外濾過膜（ＡＨＰ-２０１３膜：旭化成製、分画分子量５０，０００）を用いて処理した。次いで得られた処理液に硫酸を加え、ｐＨ２に調整し、これを４０〜８０℃で３０分間撹拌処理をした。つづいて、当該酸性溶液に、水１００リットルを加えて逆浸透膜処理（NTR-７２５０膜：日東電工製、分画分子量：約３０００程度）を行い、膜処理液１０リットルを得た。膜処理液１０リットルを減圧下で濃縮して、固形分約６０％の「ベニバナ抽出液Ｉ」約４．５ｋｇを得た。
ベニバナ抽出液Ａ、Ｂ等と同様の方法にて色価を求めたところ、「ベニバナ抽出液Ｉ」の色価は３２０であり、固形分１００％の色価は約５３３あった。
【００４５】
＜抗糖化  in vitro 糖化反応＞
製造例１、４〜６で得た固形分約６０％のベニバナ抽出液Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｇをそれぞれ蒸留水にて任意希釈した複数の濃度の希釈液を得た。
【００４６】
製造例２で得たベニバナ抽出乾燥物Ｄについては非水溶性の為、水溶成分の紅花赤色素を脱着する前処理を行った。ベニバナ抽出乾燥物Ｄ；５ｇに１％炭酸ナトリウム水溶液５０ｍＬを加え、氷上で５分間攪拌後、ろ過（Ｎｏ，５Ｃ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ）してろ液を回収した。前処理は糖化反応を開始する当日に行い、ろ液は使用するまで４℃にて保存した。得られたろ液を蒸留水にて任意希釈した複数の濃度の希釈液を得た。
なお、回収したろ液のうち５ｍＬは、アルミトレイに入れ１０５℃で３０分間乾燥させ、固形分重量を測定した。固形分は１３．７ｍｇ／ｍＬであった。１０ｍｇ／ｍＬは炭酸ナトリウム分である事から、ベニバナ抽出乾燥物Ｄの水溶性成分（紅花赤色素成分）は３．７ｍｇ／ｍＬとなる。
【００４７】
製造例３で得たベニバナ粉末Ｅについては、水溶成分の紅花色素を抽出する前処理を行った。ベニバナ粉末Ｅ；５ｇにイオン交換水５０ｍＬを加え、２５℃で５分間攪拌後、ろ過（Ｎｏ，５Ｃ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ）してろ液を回収した。前処理は糖化反応を開始する当日に行い、ろ液は使用するまで４℃にて保存した。得られたろ液を蒸留水にて任意希釈した複数の濃度の希釈液を得た。
なお、回収したろ液のうち５ｍＬは、アルミトレイに入れ１０５℃で３０分間乾燥させ、固形分重量を測定した。固形分は１５ｍｇ／ｍＬであった。
【００４８】
０．０５ｍｏｌ／リットルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４)、８ｍｇ／ミリリットルのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)（Sigma- Aldrich Corporation）、０．２ｍｏｌ／リットルのグルコース反応液中に、調製した各濃度の上記希釈液を1／１０の濃度になるように添加し、６０℃で４０時間インキュベートした。
陰性対照としては、ベニバナ抽出液等の希釈液の代わりに蒸留水を添加し、同様の条件にてインキュベートしたものを用いた。
【００４９】
＜抗糖化活性（蛍光性ＡＧＥｓ（ＨＳＡ）生成抑制作用）の測定＞
蛍光性ＡＧＥｓは、サンプル反応液のＡＧＥｓ由来の蛍光（励起波長：３７０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍ）を測定した。蛍光値は５μg／ミリットルの硫酸キニーネ（０．１Ｎの硫酸水溶液）の蛍光値を１０００とした時の相対値として算出した。
蛍光性ＡＧＥｓ生成阻害率（％）は、in vitro 糖化反応において測定対象の希釈液を添加した反応液（Ａ）、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したもの（Ｂ）、測定対象の希釈液を添加しない溶液のみを添加してインキュベーションしたもの（Ｃ）、ブランクとしてグルコースの代わりに蒸留水を添加したもの（Ｄ）として下記の式に従って算出した。
蛍光性ＡＧＥ生成阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
抗糖化活性はＩＣ50（５０％生成阻害濃度：固形分濃度あたり）を算出した。
【００５０】
【表１】
2014234366.tif 000002
【００５１】
ＩＣ50の点から抗糖化活性が認められたベニバナ抽出液Ｂについて、３ＤＧ活性、抗ペントシジン活性、抗ＣＭＬ活性  を測定した。
サンプル調整は上記＜抗糖化  in vitro 糖化反応＞同様ベニバナ抽出液Ｂを任意の各濃度に希釈し、０．０５ｍｏｌ／リットルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４)、８ｍｇ／ミリリットルのヒト血清アルブミン(HSA)（Sigma- Aldrich Corporation）、０．２ｍｏｌ／リットルのグルコース反応液中に、調製した各濃度の上記希釈液を1／１０の濃度になるように添加し、６０℃で４０時間インキュベートした。
陰性対照としては、ベニバナ抽出液Ｂの希釈液の代わりに蒸留水を添加し、同様の条件にてインキュベートしたものを用いた。
【００５２】
＜３ＤＧ活性（ＨＳＡ)の測定＞
サンプル反応液中に生成した3DGは、2，3-pentanedioneを内部標準物質とした2，3-diaminonaphthalenプレラベル化HPLC法により定量した。
抗3DG活性は生成阻害率からIC50（50%生成阻害濃度：試験品バルクおよび固形分濃度あたり）を算出し、小数点以下3桁で表示した。アミノグアニジンは粉末であるため試験品バルクと固形分濃度を同じとした。
【００５３】
＜抗ペントシジン活性（ＨＳＡ)の測定＞
サンプル反応液中に生成したペントシジンは、FSKペントシジンキット（株式会社伏見製薬所）によるELISA法で定量した。
抗ペントシジン活性は生成阻害率からIC50（50%生成阻害濃度：試験品バルクおよび固形分濃度あたり）を算出し、小数点以下3桁で表示した。アミノグアニジンは粉末であるため試験品バルクと固形分濃度を同じとした。
【００５４】
＜抗ＣＭＬ活性（ＨＳＡ)の測定＞
サンプル反応液中に生成したCMLは、CircuLex  CML/Nε-（carboxymethyl）lysine ELISA KIT （株式会社サイクレックス）によるELISA法で定量した。
抗CML活性は生成阻害率からIC50（50%生成阻害濃度：試験品バルクおよび固形分濃度あたり）を算出し、小数点以下3桁で表示した。アミノグアニジンは粉末であるため試験品バルクと固形分濃度を同じとした。
【００５５】
【表２】
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