(57)【要約】【課題】化粧品業界は、直接的捕捉以外の機構を介して作用する抗酸化剤及びそれらを含む化粧品製剤を必要としており、提案された作用物質の抗酸化効果及び美容治療計画を評価するための改善された客観的方法を更に必要としている。【解決手段】皮膚への加齢に関連した酸化損傷に関連した遺伝子及び遺伝子産物に関する遺伝子パネル、マイクロアレイ、及びバイオマーカーパネル、並びに皮膚への酸化損傷の予防、逆転、又は減少のための化粧品剤の同定及び評価のための転写プロファイリングに基づく方法。第２相酵素の発現を増加させるために、抗酸化応答要素のｎｒｆ２媒介性活性化を誘発することができる化粧品剤及びその化粧品剤を含む組成物、その化粧品剤を採用して、皮膚の最適な酸化還元状態を回復させるための方法、並びにｎｒｆ２媒介性機構を介して作用する化粧品剤を同定及び評価するための方法。【選択図】図２
2014217388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化的ストレス下の皮膚の所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効な作用物質を同定又は評価するためのスクリーニング方法であり、
酸化的ストレス下の皮膚についての参照転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを提供する工程であって、前記参照転写プロファイルが、ＭＴＦ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＣＰ、ＴＬＲ４、ＣＬＵ、ＡＯＸ１、ＳＯＤ３、ＳＯＤ２、ＧＰＸ２、ＰＲＤＸ２、ＣＡＴ、ＣＬＮ８、ＨＭＯＸ１、ＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ３、ＤＨＣＲ２４、ＳＬＣ２３Ａ２、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＮＱＯ１、ＮＤＵＦＳ１、ＣＹＣＳ及びＨＳＰＤ１である遺伝子よりなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子を含み、前記バイオマーカープロファイルが、ＭＴＦ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＣＰ、ＴＬＲ４、ＣＬＵ、ＡＯＸ１、ＳＯＤ３、ＳＯＤ２、ＧＰＸ２、ＰＲＤＸ２、ＣＡＴ、ＣＬＮ８、ＨＭＯＸ１、ＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ３、ＤＨＣＲ２４、ＳＬＣ２３Ａ２、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＮＱＯ１、ＮＤＵＦＳ１、ＣＹＣＳ及びＨＳＰＤ１である遺伝子よりなる群から選択される２以上の遺伝子の各々のからの遺伝子産物を含む工程と、
試験皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物を、提案された作用物質とある期間接触させる工程と、
前記試験皮膚についての試験転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを生成する工程と、
前記試験プロファイルを前記参照プロファイルと比較する工程と、
前記試験プロファイルが実質的に前記参照プロファイルを模倣する場合、提案された作用物質が、所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効であると決定する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
皮膚への局所適用のために製剤化される化粧品組成物であって、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）のＮｒｆ２媒介性転写を調節することによって、酸化防止の利点を前記皮膚に提供する少なくとも１つの作用物質を含む、化粧品組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの作用物質が、Ｂａｒ−Ｔｉｍｐ、アージュン、キシメニン酸、アルファリポ酸、ローズマリー抽出物ＣＧ、ウンベリフェリン、グッグル、パドマベーッシク、ローズマリー酸、ブドウ種、Ｂｉｋ桑の木の葉、ムラサキツメクサ抽出物、マチュリン、フィトビチルＰＢＰＣ、オリーブ油ＤＦＦＡＰ又はオリーブ油ＢＪＯである化合物から選択される、請求項２に記載の化粧品組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの作用物質が、Ｂａｒ−Ｔｉｍｐ、アージュン、アルファリポ酸、及びローズマリー抽出物ＣＧからなる群から選択される、請求項３に記載の化粧品組成物。
【請求項５】
フリーラジカルの直接的捕捉によって、直接に酸化防止の利点を前記皮膚に提供する少なくとも１つの更なる作用物質を更に含む、請求項２に記載の化粧品組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの更なる作用物質が、ビタミン又はその機能的誘導体である、請求項５に記載の化粧品組成物。
【請求項７】
前記ビタミンが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、及びビタミンＥからなる群から選択される、請求項６に記載の化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の内的及び外的老化に基づく酸化的ストレスに関する遺伝子パネル、バイオマーカー、ＤＮＡマイクロアレイ、及び転写プロファイリング技術に関する。より具体的には、本発明は、皮膚への適用のために製剤化された安全かつ有効な量の特定作用物質を含む、皮膚細胞及び化粧品組成物における抗酸化効果のための作用物質を同定及び評価するための方法を提供する。
本出願は、特願２０１２−５５２１３６号に基づく分割出願である。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、哺乳類生物の最も大きく、かつ最も可視的な器官である。したがって、老化の兆候は、皮膚において最も容易に明らかであり、種々の遺伝子機構、環境機構、及びホルモン機構を伴う複合過程に起因する。人々は、概して、内的かつ経時的な老化と外的「環境」老化とを区別することができ、両方の過程は、相互に重なる作用とともに発生する。フリーラジカルは、一連の内的老化及び外的老化の両方において中心的役割を果たす。経時的な老化において、フリーラジカルが健常なヒトの代謝に由来する一方で、外的老化において、フリーラジカルは、紫外線放射曝露、喫煙、アルコール消費、及び空気汚染等の環境障害／ストレスによって産生される。実際、皮膚への紫外線放射誘発性損傷の半分以上がフリーラジカルの紫外線誘発性形成に起因すると推定される。活性酸素種（ＲＯＳ）として既知のフリーラジカルは、紫外線による皮膚老化及びメラニン形成に著しい影響を及ぼす。「老化のフリーラジカル説」は、１９５６年にＨａｒｍａｎらによって最初に提案され、フリーラジカルの形成と中和との間の不均衡は、依然として、皮膚老化の作用を説明するのに最も広く受け入れられている説である。
【０００３】
酸化的ストレスは、解毒、修復、及び防御する細胞応答の能力と比較して、活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生によって引き起こされる。細胞は、代謝エネルギーの一定入力を介して所望の還元状態を維持する酵素によって保たれる還元環境の維持を求める。この正常な酸化還元状態における妨害は、過酸化物及び超酸化物等のＲＯＳを含むフリーラジカルの産生を介して毒性作用を引き起こす。フリーラジカルは、種々の細胞組織膜、脂質、タンパク質、及び核酸を損傷し得る不対電子を有する高度の反応分子である。フリーラジカルは、皮膚老化に更なる影響を及ぼすと考えられる炎症にもつながる。フリーラジカルの産生が加齢に伴って増加する一方で、それらに対抗する内的防御機構の完全性及び能力は減少する。不均衡は、細胞組織への進行性かつ累積損傷につながり、環境老化が自然な老化過程に重なる老化及び促進老化をもたらす。
【０００４】
抗酸化物質は、内的及び外的酸化的ストレスの両方からの保護を提供する物質である。皮膚への抗酸化物質の局所適用が、フリーラジカルを中和又は解毒し、かつそれらの老化作用のうちのいくつかを改善又は予防し得ると直観的に理解されるようである。抗酸化物質を含み、かつ皮膚への局所投与を目的とした化粧品組成物は、何世紀にもわたって使用されており、製剤は、古代文化の遺物の中に保存された状態で見つけられている。しかしながら、伝統的には、化粧品業界は、ビタミンＣ及びＥ等のフリーラジカルの捕捉及び中和によって作用する抗酸化物質の提供に焦点を当てている。直接作用する抗酸化物質を含む化粧品製剤は、そのような作用物質が生来不安定であり、酸化環境において容易に酸化されるため、それらが同一の環境障害によって不活性の状態にされ、処理しようとするフリーラジカルの不均衡を引き起こし得るという事実に悩まされている。更に、皮膚への吸収を評価するのは困難であり、有効性を評価する総合的な能力は、概して、皮膚における捕捉を達成させるインビトロ捕捉可能性の測定値の間の結び付きの推定、並びに治療計画にわたる皮膚の外観検査及び消費者の自己報告に基づく主観性及び依存性を伴っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、化粧品業界は、直接的捕捉以外の機構を介して作用する抗酸化剤及びそれらを含む化粧品製剤を必要としており、提案された作用物質の抗酸化効果及び美容治療計画を評価するための改善された客観的方法を更に必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、皮膚細胞若しくは組織における酸化的ストレスを逆転させるか、あるいは予防するのに有効であるか、あるいは望ましい酸化還元状態まで皮膚を回復させるのに有効である化粧品剤を同定し、かつ客観的に評価するための方法を提供することによって、当該技術分野における欠陥に取り組む。複数の内的及び外的抗酸化機構を介して皮膚に対する酸化均衡を維持するか、又は回復させるために作用する作用物質の同定及び評価を可能にする方法が提供される。より頑強な抗酸化作用を達成するために、内的抗酸化応答若しくは防御の誘発、内的抗酸化応答若しくは防御の増加、及び／又はフリーラジカルの直接的捕捉によって、酸化防止の利点を提供することが確認されている化粧品剤及び組成物が提供される。
【０００７】
独自の２２個一組の遺伝子を発見するために、ＤＮＡマイクロアレイ転写分析及び特定の生物情報処理及び統計的処理に関する技術が採用され、これらの遺伝子の転写プロファイル及びこれらの遺伝子の発現産物の発現プロファイルの検査は、皮膚の酸化還元状態及び提案された抗酸化剤への皮膚細胞の応答についての情報を提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態は、酸化的ストレスの機能としてヒト皮膚において転写的に調節される遺伝子を含む遺伝子パネルを対象とし、２つ以上の遺伝子を含むパネルは、図１の表１に示される遺伝子からなる群から選択される。一態様では、独創的な遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現産物を含むバイオマーカーパネルが提供される。別の態様では、本発明は、遺伝子パネルを構成する遺伝子に対応する核酸に特異的にハイブリダイズする固定化オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。マイクロアレイは、スクリーニング方法及び本発明による遺伝子パネルを組み込む方法を達成するのに特に有用である。
【０００９】
有効な化粧品剤を同定するためのいくつかのスクリーニング方法が提供される。一実施形態は、皮膚への加齢に関連した酸化損傷を予防するか、あるいは逆転させるのに有効な作用物質を同定するための独創的なスクリーニング方法を対象とする。方法は、（ａ）若い皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物についての参照転写プロファイルを提供する工程と、（ｂ）老化皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物についての参照転写プロファイルを提供する工程と、（ｃ）老化皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物を、提案された作用物質と接触させて、試験転写プロファイルを生成する工程と、（ｄ）試験転写プロファイルを、参照プロファイルと比較して、試験転写プロファイルが、若い参照プロファイルに向かって、かつ／又は老化参照プロファイルから離れて一方向に移動する場合、提案された作用物質を、皮膚への加齢に関連した酸化損傷を予防するか、あるいは逆転させるのに有効であると同定する工程とを含み、転写プロファイルは、本発明によるマイクロアレイで生成される。特定の態様では、有効であると同定される作用物質を含む組成物及び皮膚を組成物で処理する方法も提供される。更なる実施形態は、酸化的ストレス下の皮膚の所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効な作用物質を同定又は評価するためのスクリーニング方法を対象とする。方法は、酸化的ストレス下の皮膚についての参照転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを提供する工程と、試験皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物を、提案された作用物質とある期間接触させる工程と、試験皮膚についての試験転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを生成する工程と、試験プロファイルを参照プロファイルと比較する工程と、試験プロファイルが実質的に参照プロファイルを模倣する場合、提案された作用物質が、所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効であると決定する工程とを含み、転写プロファイルは、本発明によるマイクロアレイに由来する。
【００１０】
更なる実施形態によると、化粧品剤を、皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物における酸化的ストレスへの細胞内応答を誘発するか、あるいは増加させることができるＮｒｆ２活性化因子として同定するためのスクリーニングアッセイが提供され、細胞内応答は、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）からの転写における上方調節である。アッセイは、シグナル伝達遺伝子に結合されるＡＲＥを有するＡＲＥレポーター細胞株を提供する工程であって、シグナル伝達遺伝子が第２相（Phase 2）酵素をコードする、工程と、ＡＲＥレポーター細胞を、Ｎｒｆ２活性化因子として提案される化粧品剤に接触させる工程と、シグナルを測定することによって、シグナル伝達遺伝子のＡＲＥからの転写を測定する工程と、シグナルが検出される場合、化粧品剤が細胞内応答を誘発するか、あるいは増加させることができるＮｒｆ２活性化因子であると決定する工程とを含む。態様は、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）のＮｆｒ２媒介性転写を調節することによって、酸化防止の利点を皮膚に提供する少なくとも１つの作用物質を含む、皮膚への局所適用のために製剤化される組成物を含む。
【００１１】
本発明の種々の実施形態の特性及び利点は、本発明の幅広い表現を与えるよう意図される特定の実施形態の図及び実施例を含む以下の記述から明らかになる。種々の修正は、本発明の本記述及び実践から当業者には明らかである。範囲が開示の特定の形態に制限されるよう意図されず、本発明は、「特許請求の範囲」によって定義される本発明の趣旨及び範囲に収まるすべての修正、等価物、及び代替物を網羅する。
【００１２】
本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付の図は、本発明の特定の実施形態を示し、概要及び詳述を伴って、本発明の態様の原理を説明する役割を果たし、「特許請求の範囲」によって定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】酸化的ストレスの機能として老化皮膚において転写的に調節された際の、特定の生物情報及び統計的手法の適用と併用されるＤＮＡマイクロアレイ転写分析によって同定された２２個の遺伝子の表。表は、遺伝子発現産物、遺伝子記号、それが酸化的ストレスに関するとして既知の機能、及びそれぞれの同定された遺伝子に関するアレイに基づく折り畳み変化データを含む。
【図１Ｂ】酸化的ストレスの機能として老化皮膚において転写的に調節された際の、特定の生物情報及び統計的手法の適用と併用されるＤＮＡマイクロアレイ転写分析によって同定された２２個の遺伝子の表。表は、遺伝子発現産物、遺伝子記号、それが酸化的ストレスに関するとして既知の機能、及びそれぞれの同定された遺伝子に関するアレイに基づく折り畳み変化データを含む。
【図１Ｃ】酸化的ストレスの機能として老化皮膚において転写的に調節された際の、特定の生物情報及び統計的手法の適用と併用されるＤＮＡマイクロアレイ転写分析によって同定された２２個の遺伝子の表。表は、遺伝子発現産物、遺伝子記号、それが酸化的ストレスに関するとして既知の機能、及びそれぞれの同定された遺伝子に関するアレイに基づく折り畳み変化データを含む。
【図２】酸化ラジカルの存在によって誘発される細胞解毒系を示す。具体的には、反応性求電子種の存在に応答して上方調節される酵素の第２相ファミリーの発現が示される。
【図３】抗酸化応答要素（ＡＲＥ）のＮｆｒ２媒介性活性化の一般的機構を示す。
【図４Ａ】オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びＧＦＦ（酵母発酵濾液）によるＮｒｆ２媒介性転写のＡＲＥ活性化アッセイ及び用量依存的調節を示す。
【図４Ｂ】オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びＧＦＦ（酵母発酵濾液）によるＮｒｆ２媒介性転写のＡＲＥ活性化アッセイ及び用量依存的調節を示す。
【図４Ｃ】オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びＧＦＦ（酵母発酵濾液）によるＮｒｆ２媒介性転写のＡＲＥ活性化アッセイ及び用量依存的調節を示す。
【図５】抗酸化応答有効性の尺度として、ＨＯ−１の増加に対するＧＦＦとオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）との間の相乗効果を示す。
【図６】ヒト皮膚外植片におけるＨＯ−１バイオマーカーアッセイの正当性を示す。
【図７Ａ】ＨＯ−１バイオマーカーアッセイ：図４のそれぞれの作用物質についての第２相酵素であるＨＯ−１におけるＥＬＩＳＡでのＡＲＥ結果の確認を示す。
【図７Ｂ】ＨＯ−１バイオマーカーアッセイ：図４のそれぞれの作用物質についての第２相酵素であるＨＯ−１におけるＥＬＩＳＡでのＡＲＥ結果の確認を示す。
【図７Ｃ】ＨＯ−１バイオマーカーアッセイ：図４のそれぞれの作用物質についての第２相酵素であるＨＯ−１におけるＥＬＩＳＡでのＡＲＥ結果の確認を示す。
【図７Ｄ】ＨＯ−１バイオマーカーアッセイ：図４のそれぞれの作用物質についての第２相酵素であるＨＯ−１におけるＥＬＩＳＡでのＡＲＥ結果の確認を示す。
【図８】酸化的ストレスの機能として老化皮膚において調節されることを以前に予想又は決定されていない遺伝子の表。
【図９】化粧品剤オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）及びＧＦＦ（酵母発酵濾液）についての抗酸化プロファイルを評価するために独創的な方法の一実施形態を示す転写プロファイルデータ。
【図１０Ａ】提案された化粧品剤ＧＦＦ（酵母発酵濾液）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）についてのＡＲＥ活性化アッセイ結果の表。
【図１０Ｂ】提案された化粧品剤ＧＦＦ（酵母発酵濾液）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）についてのＡＲＥ活性化アッセイ結果の表。
【図１０Ｃ】提案された化粧品剤ＧＦＦ（酵母発酵濾液）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）についてのＡＲＥ活性化アッセイ結果の表。
【図１１Ａ】提案された化粧品剤ＧＦＦ（酵母発酵濾液）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）についてのＨＯ−１  ＥＬＩＳＡ結果の表。
【図１１Ｂ】提案された化粧品剤ＧＦＦ（酵母発酵濾液）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）についてのＨＯ−１  ＥＬＩＳＡ結果の表。
【図１２】独創的な方法に従って、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）のＮｒｆ２媒介性転写を調節することによって、酸化防止の利点を皮膚に提供する可能性において、「ヒット」として同定される化合物を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
皮膚細胞を含む細胞の最適な健康状態は、酸化剤及び抗酸化物質の微妙な均衡の維持を必要とする。この均衡が乱されるため、酸化剤が細胞の抗酸化能力を圧倒するとき、著しい損傷が発生し得る。この損傷は、細胞タンパク質、膜脂質、及びＤＮＡの機能に影響を及ぼし、検査を受けない場合、生物の低下した健康状態をもたらす。酸化的ストレスの損傷効果は、皮膚細胞、口腔細胞、及び呼吸細胞で最も容易に見られる。
【００１５】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、紫外線放射を受けた皮膚等の環境障害又は代謝及び炎症等の内的過程由来の皮膚細胞において生成される特に有害なフリーラジカルである。ＲＯＳは、高色素性しみ、しわ、及びＤＮＡ損傷をもたらす紫外線による老化の過程における主な要因であり、紫外線によって老化した皮膚に見られ、かつそれに関連する損傷の大部分を占める。老化のＲＯＳ理論は、１９５０年代後半に最初に提案され、現在でも依然として最も広く受け入れられている老化の理論である。ＲＯＳ理論によると、累積した環境及び代謝過程は、酸化的ストレスにつながる。酸化的ストレスは、ＭＭＰの上方調節及び皮膚マトリックスの分解を特徴とする炎症、低下した酵素機能及びタンパク質架橋を特徴とする修復機能性能力の減少を誘発する。これらは、皮膚の減少したコラーゲン含量、減少したＧＡＧ、及び増加した弾力線維症に現れる。ビタミンＡ、Ｃ、及びＥ等のビタミン並びに代謝産物を減少させることによって、酸化的ストレスへの最初の第１段階細胞応答が提供される。しかしながら、連続攻撃の際に、これらは枯渇させられ得、防御タンパク質、すなわち、第２相酵素の上方調節及び内因性系の発現及び分泌の増加を含む第２段階細胞応答が結果として起きる。最初の第１段階応答及び増大した第２段階応答を含む細胞解毒系の図式が図２に示され、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）からのＮｆｒ２媒介性転写、第２相酵素をコードする遺伝子に結合されるプロモータ領域に応答して、増加した発現を呈する第２相酵素の部分的なリストも含む。
【００１６】
化粧品業界は、可視的な老化の兆候を減少させるか、予防するか、あるいは逆転させることを目的とした多数のスキンケア製品を提供する。ゲノム科学及びプロテオーム科学の成長から得られた洞察によって、この業界の基礎となる、外観の改善への注目は、老化作用のうちの１つに対する取り組みから、それらの作用に反映される過程に対する取り組みに移行している。本発明者は、若い皮膚と、老化皮膚と、紫外線によって老化した皮膚との間に異なる形で現される酸化的ストレス及び抗酸化防御に関連した遺伝子の集中的なパネルを選別するために、ゲノム技術の適用に努めた。２２個の遺伝子の結果として生じるパネル（図１）は、外的及び内的老化皮膚における酸化的ストレスの証拠を提供し、皮膚における最適な酸化還元均衡の維持への特定の関連性を有する転写因子及び酵素をコードする相当数を含む。本分析の結果は、過酸化水素のレベルの増加を引き起こす老化皮膚における抗酸化防御の調節不全を実証し、かつ酸化的ストレスの証拠を提供する。
【００１７】
したがって、本発明の一実施形態は、加齢に関連した酸化的ストレスの機能としてヒト皮膚において調節される遺伝子を含む遺伝子パネルを提供する。パネルは、表１、図１に示される遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む。転写分析は、Ｎｒｆ２をコードするＮＲＦＴ、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）を活性化するＤＮＡ結合タンパク質、及びＭｔｆ１をコードするＭＴＦ１、すなわち、金属毒性に対する重要な防衛要素であるメタロチオネインの調節因子を含む、抗酸化防御機構を調節する２２個の表中の遺伝子及び遺伝子産物の間の加齢に関連した主要な転写因子の下方調節を明らかにした。結果的に、特定の実施形態において、調節は、転写調節を含み、選択された遺伝子は、（ａ）転写調節が下方調節を含む、１つ以上のＮＲＦ２、ＭＴＦ１、及びＧＰＸ２、並びに（ｂ）転写調節が上方調節を含む、ＣＰ、ＣＬＵ、ＴＬＲ４、ＳＯＤ３、及びＡＯＸ１のうちの１つ以上を含む。酸化的ストレスは、皮膚の暦年齢及び／又は皮膚に影響を与える環境要因のいずれか又は両方の結果として経験され得る。皮膚に酸化的ストレスを引き起こす周知の環境要因には、紫外線Ａ及び紫外線Ｂの両方の紫外線放射への皮膚の曝露、直接及び間接喫煙、アルコールの消費、及び空気汚染が含まれる。別の特定の実施形態では、酸化的ストレスは、Ｈ2Ｏ2産生に由来し、選択された遺伝子は、（ａ）調節が転写下方調節を含む、ＧＰＸ２、ＰＲＤＸ２、及びＣＡＴ、並びに（ｂ）調節が転写上方調節を含む、ＳＯＤ３及びＡＯＸ１を含む。
【００１８】
表１に示される遺伝子はそれぞれ、加齢に関連した酸化的ストレスに関与する特定のタンパク質をコードする。皮膚細胞又は皮膚組織における遺伝子産物の発現の測定値は、皮膚の酸化還元状態についての情報も提供する。遺伝子産物は、臨床的に関連するバイオマーカーパネルを形成する。本発明者は、ＣＰ（セルロプラスミン）及びＣＬＵ（クラスタリン）等の酸化的ストレスのある特定のマーカーをコードする遺伝子が、老化皮膚において実質的に上方調節されることを見出した。
【００１９】
遺伝子パネルの臨床的有用性には、ＲＴ−ＰＣＲ等の標準の分子生物学的手法の使用、及び全２２個の遺伝子パネル又はある関連するその小集団のハイスループット転写プロファイリングのために設計される低密度のＤＮＡチップの提供が含まれる。したがって、本発明は、遺伝子パネル、及び本発明による遺伝子パネルうちのいずれかを構成する遺伝子に対応する核酸に特異的にハイブリダイズする固定化オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイの、ＲＴ−ＰＣＲ分析のための一組の特定のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。所与の一組の遺伝子をプロファイルすることができる低密度のＤＮＡマイクロアレイ／チップの産生は、当該技術分野において既知の方法を用いて、十分に当業者の能力の範囲内である。このパネルはまた、ＥＬＩＳＡ、固定化抗体を伴うビーズに基づくアッセイ、及びウエスタンブロット法、並びに質量分光検出を伴うプロテオーム分析等の標準の免疫化学的方法を用いて、タンパク質発現レベルでスクリーニングすることによって利用され得る。
【００２０】
本発明は、皮膚への加齢に関連した酸化損傷を予防するか、あるいは逆転させるのに有効な作用物質を同定するためのスクリーニング方法を更に提供する。方法は、（ａ）若い皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物についての参照転写プロファイルを提供する工程と、（ｂ）老化皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物についての参照転写プロファイルを提供する工程と、（ｃ）老化皮膚、皮膚細胞、若しくは皮膚等価物を、提案された作用物質と接触させて、試験転写プロファイルを生成する工程と、（ｄ）試験転写プロファイルを、参照プロファイルと比較して、試験転写プロファイルが、若い参照プロファイルに向かって、かつ／又は老化参照プロファイルから離れて一方向に移動する場合、提案された作用物質を、皮膚への加齢に関連した酸化的損傷を予防するか、あるいは逆転させるのに有効であると同定する工程とを含む。本方法を達成するのに必要な転写プロファイリングは、本発明によるマイクロアレイを含むＤＮＡチップ、ＲＴ−ＰＣＲ、又は転写分析ための他の標準方法によって着手され得る。遺伝子産物の発現プロファイリング及びタンパク質発現の測定は、ＥＬＩＳＡ及び他の免疫アッセイ、ウエスタンブロット法、並びに質量分光を含むが、それらに限定されない当該技術分野において周知の多くのプロテオーム法によって着手され得る。
【００２１】
加齢に関連した酸化損傷を減少させるのに有効であると同定される作用物質は、皮膚への局所適用のために化粧品組成物に製剤化され得る。そのような組成物は、酸化的ストレスによる可視的な老化の兆候を予防するか、あるいは減少させるために、消費者によって皮膚の処理に利用され得る。
【００２２】
本発明は、酸化的ストレス下の皮膚の所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効な作用物質を同定又は評価するためのスクリーニング方法を更に提供し、本方法は、酸化的ストレス下の皮膚についての参照転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを提供する工程と、試験皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物を、提案された作用物質とある期間接触させる工程と、試験皮膚についての試験転写プロファイル又はバイオマーカープロファイルを生成する工程と、試験プロファイルを参照プロファイルと比較する工程と、試験プロファイルが実質的に参照プロファイルに重なり合う場合、提案された作用物質が、所望の酸化還元均衡を回復させるのに有効であると決定する工程とを含む。この場合、細胞解毒及び防御／修復応答を模倣する作用物質が求められ、かつ同定される。同定された作用物質又は有効であると評価された作用物質を含む化粧品組成物は、皮膚への局所適用のために製剤化される。
【００２３】
求電子試薬及び活性酸素種の継続的な存在に応答して増加した第２相酵素の発現は、このタンパク質ファミリーに共通した抗酸化応答要素（ＡＲＥ）からの転写によって駆動される。転写上方調節は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、及びヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）等の抗酸化関連タンパク質の増加をもたらす。これらの酵素は、Ｏ2−及びＨ2Ｏ2等の酸化中間体の還元を触媒して、Ｈ2Ｏ等のより有害性の低い最終産物にする。有害な毒素の代謝に関与するタンパク質に加えて、ＲＯＳによって引き起こされる損傷を実際に同定及び修復する他のタンパク質が上方調節される。
【００２４】
ＡＲＥは、酸化還元サイクリングフェノール及び求電子試薬によって活性化される独自のシス作用調節要素である。近年の研究は、多くの他の転写因子がＡＲＥ配列に結合するにもかかわらず、ＤＮＡ結合タンパク質Ｎｒｆ２がＡＲＥ活性化に必要とされる主な転写因子であることを示唆する。ＮＦＥ２Ｌ２又はＮｒｆ２としても既知の核因子（赤血球由来２）様２は、ヒト中でＮＦＲ２遺伝子によってコードされる転写因子である。したがって、Ｎｒｆ２は、抗酸化応答の主要な調節因子であり、酸化的ストレスは、ＡＲＥ活性化の主な原動力である。図３は、Ｎｒｆ２媒介性ＡＲＥ活性化の図式を説明する。酸化的ストレス又は求電子試薬は、Ｋｅａｐ１の酸化を誘発し、立体配座変化は、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１複合体からのＮｒｆ２の放出をもたらし、複数のＡＲＥのその後の活性化を伴うインポーチン媒介性輸送を介するＮｒｆ２の核転座及びＡＲＥに結合された遺伝子の転写の増加をもたらす。
【００２５】
ＡＲＥからの転写の上方調節は、求電子試薬及び酸化剤を解毒して無害な代謝産物にし、細胞中の主な抗酸化物質である大量のグルタチオンを増加させ、かつ有害なタンパク質の分解を増加させ、ＤＮＡ損傷を同定及び処理することによって損傷を修復する、３０個を超えるタンパク質の生成を触媒する第２相酵素の発現をもたらす。結果的に、Ｎｒｆ２活性化因子として同定される活性物質は、増加した内因性抗酸化能力を有する組織を提供するために、細胞自身の防御機構を高めることができると考えられ得る。他方では、ＲＯＳ捕捉を介して働く直接的な抗酸化剤は、細胞及び細胞環境中の酸化剤を直接減少させることにより、直接的ではあるが、より一時的な利点を提供する。
【００２６】
ＡＲＥレポーター細胞株は、酸化的ストレスに応答して、ＡＲＥからの転写を増加させる化合物をスクリーニングするために開発及び使用され得、細胞抗酸化防御タンパク質の増加をもたらす。ＡＲＥ３２レポーター細胞株は、アッセイを、ＡＲＥからの転写を増加させ、かつ第２相酵素の発現を増加させ得る化粧品剤に提供するよう適合され、したがって、身体自身の抗酸化応答を増加させる。ＡＲＥ３２は、ＣＸＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって、ＭＣＦ７細胞を、ｐＧＬ８ｘ−ＡＲＥ（ルシフェラーゼ遺伝子に結合される８個のラットＧＳＴ  ＡＲＥ複写物）及びネオマイシン選択性マーカーを含有するｐＣＤＮＡ３．１でトランスフェクトすることにより産生される安定したレポーター細胞株である。選択はＧ４１８の存在下で行われ、耐性クローンは単離され、ルシフェラーゼの誘導においてスクリーニングされる。例示の標準物質は、ｔｅｒｔ−ブチルハイドロキノン（ｔＢＨＱ）、既知のＮｒｆ２の活性化因子である。
【００２７】
化粧品組成物は、皮膚への局所適用のために製剤化され得、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）からのＮｒｆ２媒介性転写を調節することによって、酸化防止の利点を皮膚に提供する少なくとも１つの作用物質を送達する。組成物は、ＡＲＥ調節から独立した細胞内抗酸化応答機構を誘発することによって酸化防止の利点を皮膚に少なくとも部分的に提供する、少なくとも１つの更なる作用物質を更に含み得、合わせられた抗酸化作用の有効性は相乗的であり、かつ／あるいはフリーラジカルの直接的捕捉によって直接に酸化防止の利点を皮膚に提供する、少なくとも１つの更なる作用物質を含み得る。フリーラジカル捕捉剤である作用物質の非限定的な例には、ビタミンＡ、Ｅ、及びＣが挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物中に包含され得る他のスキンケア活性物質の非限定的な例は、アミノ糖、ビタミンＢ３、レチノイド、ペプチド、植物ステロール、ヘキサミジン、ジアルカノイルヒドロキシプロリン化合物、サリチル酸化合物、Ｎ−アシルアミノ酸化合物、日焼け止め活性物質、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、及び皮膚科学的に許容される担体である。
【００２９】
本発明によるヘキサミジンは、異性体、互変異性体、塩、並びにカルボン酸等の有機酸及びスルホン酸等の鉱酸を含むが、それらに限定されない誘導体を含むと理解される。ヘキサミジンの専門的な名称は、４，４’−（ヘキサメチレンジオキシ）ジベンゼンカルボキシイミダミドである。皮膚科学的に許容される塩には、カリウム及びナトリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属塩、非毒性重金属塩、並びにアンモニウム及びトリアルキルアンモニウム塩が含まれる。あるいは、ヘキサミジンは、ＥＬＡＳＴＡＢ  ＨＰ１００の商標名でフランスのＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｕｌｎｏｙから市販されているイセチオン酸ヘキサミジンである。
【００３０】
本発明による組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約２５重量％、あるいは約０．００１重量％〜約１０重量％、あるいは約０．０１重量％〜約５重量％、及びあるいは約０．０２重量％〜約２．５重量％のヘキサミジンを含み得る。
【００３１】
ＩＳＰ−Ｖｉｎｃｉｅｎｃｅのシグナリン（商標）は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ種（ホホバ（jojoba））ワックスから抽出される約１０％の脂肪アルコールでの酵素加水分解によってＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ（オリーブ（olive））油から得られる１，２−ジアシルグリセロール（１，２−ＤＡＧ）から主に構成される特許成分である。本発明による組成物が製剤化され得る。
【００３２】
オリベム（登録商標）は、Ｂ＆Ｔ  Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標である。市販のオリベム４００シリーズには、本出願の出願日現在、オリベム４００、４５０、及び４６０が含まれており、すべて、オリーブ油脂肪酸に由来する極めて低刺激性のアニオン性界面活性剤として同定されており、かつ概して、所有者によってＰＥＧ−７オリーブ油カルボン酸ナトリウムとして特徴付けられている。オリベムシリーズは、約８１％のオレイン酸、８％のパルミチン酸、７％のリノール酸、及び２％のステアリン酸を含む。オリベム４００、４５０、及び４６０は、それぞれ、３６％、５０％、及び６０％の活性濃度を有する。化粧品製剤における使用は、概して、３〜１０重量％の濃度である。「オリベム」が登場する本出願にわたって、別途示されない限り、オリベム４６０のことであると理解される。頭字語ＤＦＦＡＰは、「脂肪酸由来、ペグ化」を意味するよう意図されている。本明細書で使用されるＧＦＦは、「ガラクトマイセス発酵濾液」、すなわち、酵母様の真菌属であるガラクトマイセスの発酵濾液を指すと理解される。
【００３３】
本発明は、化粧品剤を、皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物における酸化的ストレスへの細胞内応答を誘発するか、あるいは増加させることができるＮｒｆ２活性化因子として同定又は評価するためのスクリーニングアッセイも提供し、細胞内応答は、抗酸化応答要素（ＡＲＥ）からの転写における上方調節である。アッセイは、ＡＲＥレポーター細胞株を提供する工程であって、ＡＲＥがレポーター遺伝子に結合され、ＡＲＥからの転写が、Ｎｒｆ２活性化因子に応答するＮｒｆ２によって媒介される、工程と、ＡＲＥレポーター細胞を、Ｎｒｆ２活性化因子として提案される化粧品剤に接触させる工程と、ＡＲＥからのレポーター遺伝子の転写によって生成されるシグナルを検出する工程と、シグナルが検出される場合、化粧品剤が、細胞内応答を誘発するか、あるいは増加させることができるＮｒｆ２活性化因子であると決定する工程とを含む。特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼである。シグナルは、任意の既知のレポーター系に従って検出され得る。特定の実施形態では、シグナルは、発光である。
【００３４】
スクリーニングは、皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物を、提案されたＮｒｆ２活性化因子と接触させる工程と、皮膚、皮膚細胞、又は皮膚等価物上の第２相酵素活性について、バイオマーカーを測定する工程とを含む、確認工程も含み、バイオマーカーは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ヘムオキシゲナーゼ、及びその触媒産物からなる群から選択される。
【００３５】
本発明による組成物を製造する方法も提供される。具体的には、酸化防止利点を皮膚に提供するのに有効な化粧品組成物を製造する方法の一実施形態は、独創的なスクリーニングアッセイのうちの１つ以上に従って同定される１つ以上の作用物質を用いて組成物を製剤化する工程を含む。例えば、製造方法は、化粧品剤を、皮膚における酸化的ストレスへの細胞内応答、皮膚細胞、又は皮膚等価物を誘発するか、あるいは増加させることができるＮｒｆ２活性化因子として同定するためのスクリーニングアッセイに従って同定される１つ以上の作用物質での製剤化を含み得るか、あるいは本発明による遺伝子パネルを構成する遺伝子の転写調節を介して、酸化防止利点を皮膚に提供すると同定される１つ以上の作用物質での製剤化を含み得る。遺伝子パネルに対して相補的なマイクロアレイの使用は、ある特定の実施形態にも包含される。他の方法において、製造方法は、新規のスクリーニングアッセイのある組み合わせから同定される１つ以上の作用物質での製剤化を含み得る。
【００３６】
以下の実施例は、本発明のある特定の態様を説明するために提供されており、「特許請求の範囲」によって定義されるその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：内因的かつ紫外線によって老化した皮膚における酸化的ストレスに関連する２２個の遺伝子の独自のパネルの生成。
日光から保護された若い皮膚、日光から保護された老化した皮膚、日光によって損傷した若い皮膚、及び日光によって損傷した老化した皮膚における転写発現の比較。対象には、１０名の若年（１８〜２０歳）及び１０名の高齢（６０〜６７歳）の女性が含まれた。３個の４ｍｍのパンチ生検を、それぞれの対象の２つの皮膚部位：日光から保護された皮膚（臀部「ＹＢ」及び「ＯＢ」）及び日光に曝露された皮膚（外側前腕、「ＹＡ」及び「ＯＡ」）のうちのそれぞれから得た。高齢の対象を、ある程度、前腕に可視的な中程度から重度の紫外線による損傷を有することに基づいて選択した。ＲＮＡを生検から抽出し、精製した。標識化標的ｃＲＮＡを合成し、全ヒトゲノムを包含する５４６１３個のプローブセットを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイを用いて分析した。
【００３８】
抗酸化防御又は酸化的ストレスに関連した遺伝子の同定は、以下のプロトコルに従った：（１）Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ、及びＳｗｉｓｓ  ＰｒｏｔデータベースからのＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０遺伝子チップ（商標）上の遺伝子への機能注釈を、キーワードプロトコルを用いて検索した［酸化的ストレス又は抗酸化物質又はフリーラジカル又は過酸化水素又は有機過酸化物又は超酸化物又は活性酸素種］。これから、合計２４５個の独自の注釈付き遺伝子を同定した。（２）２４５個の酸化的ストレス関連遺伝子のリストの配列データを、内因的老化又は紫外線による老化のうちのいずれかにおいて調節される遺伝子を同定するために、以下のフィルタリングプロトコルに供した。
・すべての試料にわたって少なくとも１０パーセントの要求（４パーセント以上の要求）
・腕又は臀部の高齢対若年比較において、ｔ−試験ｐ値０．０５未満
・腕又は臀部の高齢対若年比較において、折り畳み変化−１．５未満又は１．５超
【００３９】
この段階に至るまで、合計２７個の遺伝子がフィルタリング評価基準を満たした。老化及び抗酸化活性の両方との関連の強さに基づく更なる生物情報工程を行い、相関性不十分であるという理由からのこれらの遺伝子のうちの１１個の排除、及び６個の更なる遺伝子（ＣＡＴ、ＨＭＯＸ１、ＭＧＳＴ３、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ２、及びＳＯＤ２）の包含をもたらし、それらが上述の折り畳み変化評価基準を満たし損なったにもかかわらず、老化及び酸化的ストレスの両方への統計的に有意な相関を呈した。
【００４０】
これらの遺伝子の全フィルタリングプロトコル及び転写発現データの最終産物として出現した２２個の遺伝子のパネルが、表１に示され、図１に示される。図１に示される表中のデータの検査によって示されるように、老化皮膚における酸化的ストレス関連遺伝子の発現のパターンは、方向性に関して、紫外線から保護された部位と紫外線によって損傷した部位との間のパターンと実質的に類似している。保護機構を調節する主要な転写因子は、加齢に伴って下方調節され、加齢に伴う細胞質保護応答の損失を示す。Ｈ2Ｏ2（例えば、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ）を解毒するのに必要とされる酵素をコードする遺伝子の同時増加を伴うことなく、Ｈ2Ｏ2産生（スーパーオキシドジスムターゼ３「ＳＯＤ３」及びアルデヒドオキシダーゼ１「ＡＯＸ１」）に関連した遺伝子の実質的な上方調節が存在する。遷移金属の存在下のＨ2Ｏ2は、極度に有害なヒドロキシラジカルを形成し得る。Ｈ2Ｏ2は、本研究において著しく上方調節されたマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）も誘発し得る。増加したＭＭＰ活性は、老化と関連した皮膚マトリックスの損失に寄与し得る。この遺伝子発現パターンは、老化皮膚における酸化的ストレスに寄与し得る。グルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）が内因的に老化した皮膚において著しく下方調節されたことにも注目すべきである。図８は、本方法に従って転写的に調節されることが見出されたが、皮膚における加齢に関連した変化に関与するとして以前に同定又は示唆されていないタンパク質をコードする、表１に示される遺伝子の小集団（subset）を説明する。特定の実施形態では、本発明による遺伝子パネルは、加齢に関連した酸化的ストレスの機能としてヒト皮膚において調節される遺伝子の選択的小集団を含み、パネルは、表１に示される遺伝子からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子を含み、選択された遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＳＯＤ２、ＣＡＴ、ＨＭＯＸ１、ＭＧＳＴ３、又はＮＱＯ１である。
【００４１】
減少したグルタチオンペルオキシダーゼに照らして、増加したセルロプラスミン及びＳＯＤは、自己免疫疾患リウマチ性関節炎におけるこれらのタンパク質について以前に報告された遺伝子発現のパターンに類似している。ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の上方調節は、恐らく酸化的ストレスと関連した老化皮膚における先天性免疫応答の活性化を示唆する。老化皮膚における発現減少を示す他のＲＯＳ保護遺伝子には、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＤＨＣＲ２４、ＭＧＳＴ１、及びＳＬＣ２３Ａ２が含まれる。
【００４２】
実施例２：転写プロファイリング方法の適用、オリベム（商標）４６０及びＧＦＦで処理された皮膚外植片の転写プロファイルの生成
皮膚外植片を、外科廃棄物（腹壁形成、４６歳女性）から収集し、同日に処理した。皮膚試料を冷たいＰＢＳ中ですすぐことによって処理し、皮下脂肪を、外科用メスを用いて除去し、端部を再切断し、その後、１．３ｃｍの正方形を収集した。それぞれの正方形を６ウェルプレート中のトランスウェルフィルタ上に設置し、８０μＬの処理物を局所的に適用した。外植片を、水中のオリベム４６０（０．１％）及びＧＦＦ（２０％）で処理し、３３℃、９５％の湿度で３日間インキュベートし、その後、処理物を除去した。組織を更に３日間インキュベートし、４ｍｍのパンチを採取し、後の遺伝子特異的プライマーでのＲＮＡ単離及びＰＣＲ分析のために、液体Ｎ2中で急速凍結させた。対照皮膚は処理しなかった。
【００４３】
オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）及びＧＦＦを含む化粧品組成物での処理によって転写的に調節された遺伝子の表は、図９に示され、本発明による遺伝子パネルを構成する。とりわけ、過酸化水素を解毒するＣＡＴ及びＰＲＤＸ２に加えて、過酸化水素を産生する酵素を解毒するＡＯＸ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤ３の発現の上方調節、すなわち、均衡のとれたかつ有益な抗酸化応答が観察される。これは、ＡＯＸ１、ＳＯＤ２、及びＳＯＤ３が上方調節されるが、ＧＰＸ２に加えて、ＣＡＴ及びＰＲＤＸ２が下方調節される、老化皮膚におけるパターンと対照する。
【００４４】
実施例３：提案された作用物質の抗酸化活性を評価するための、ＡＲＥ活性化アッセイ及びヘムオキシゲナーゼ１ＥＬＩＳＡの適用。
オリーブ油ＤＦＡＰ、シグナリン、及びＧＦＦの抗酸化特性は、ＡＲＥ転写アッセイ及びＥＬＩＳＡバイオマーカーアッセイから得られた結果によって実証され、バイオマーカーは、第２相酵素ＨＯ−１である。ヒト皮膚外植片培養物を用いた、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）バイオマーカー試験の結果も示される。
【００４５】
ヒト皮膚角化細胞及び線維芽細胞の初代培養物、並びにエクスビボヒト皮膚培養物（外植片）を、特定のオリーブ油誘導体（ＰＥＧ−７「オリーブ油ＤＦＡＰ」で変性されたオリーブ油由来脂肪酸）、ホホバ油（シグナリン（商標））とブレンドしたオリーブ油、及びガラクトマイセス発酵濾液（ＧＦＦ）で２４時間処理した。ＡＲＥをＣＸＲ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＡＲＥ−３２レポーター細胞株を用いてアッセイし、以下に詳細が示される。
【００４６】
ＡＲＥアッセイ
ＡＲＥ３２は、ｐＧＬ８ｘ−ＡＲＥ（ルシフェラーゼ遺伝子に結合される８個のラットＧＳＴ  ＡＲＥ複写物）及びネオマイシン選択性マーカーを含有するｐＣＤＮＡ３．１を含有する安定したＭＣＦ７細胞株であり、ＣＸＲｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから許可された。選択はＧ４１８の存在下で行われ、耐性クローンを単離した。クローンを、ｔＢＨＱに応答したルシフェラーゼの誘発についてスクリーニングした。
【００４７】
試薬及び器具
・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０５４−０２０、ロット番号１３６１２４２）
・加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０６３、ロット番号１３４５７６４）
・ゲネチシンＧ４１８硫酸塩（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８１１−０３１）
・定常Ｇｌｏ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２５１０）
・９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）
・ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３、ロット番号１０９７３３）
・Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１，２９４−１）
・パーキンエルマーエンビジョンリーダー
【００４８】
ＡＲＥＣ３２細胞の維持
ＡＲＥ３２細胞を、以下を含有するＤＭＥＭ（フェノールレッドフリー）中で定期的に維持する：
１０％のＦＢＳ
５０単位／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン
０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８
細胞を３〜４日毎に二次培養する。細胞を、９０％のＦＢＳ及び１０％のＤＭＳＯを含有する培地中で凍結させた。
【００４９】
ｔＢＨＱでのルシフェラーゼの誘発
１．９６ウェルプレート中で、１×１０４細胞／ウェルを、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、及び１０％のＦＢＳを含有する１００μＬのＤＭＥＭ中に播種する。
２．細胞を、５％のＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で２４時間インキュベートする。
３．培地を１００μＬの新鮮な培地に置き換え、１ウェルにつき２μＬの試験化合物で処理し、陽性対照は、２５μＭのＴＢＨＱであった。（原液の１０ｍＭのｔＢＨＱを、ＤＭＳＯ中で新たに調製した。）
４．処理後、１００μＬの培地を添加し、最終のアッセイ容積を２００μＬにする。
５．細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で更に２４時間インキュベートする。
６．製造業者の指示に従って、定常ｇｌｏアッセイシステムを用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイする：
ａ．１００μＬの培地を除去する
ｂ．１００μＬの再構成基質をウェルに直接添加する
ｃ．５〜１０分間振盪インキュベートする
ｄ．Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイプロトコルを用いて、エンビジョン上で読み取る。（定常ｇｌｏの半減期は５時間）
ｅ．プレートを１ウェル当たり５秒間読み取る。
【００５０】
ＡＲＥの細胞型及び組織確認を、１試料当たりの総タンパク質に基準化されたＨＯ−１  ＥＬＩＳＡを介して確認した。スチューデントのｔ−試験を用いて統計分析を行い、処理した試料と対照試料を比較した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【００５１】
ＡＲＥからの転写を促進する作用物質を同定するために、ＡＲＥレポーターアッセイがどのように作動するかの一般的図式が、図３に示される。オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）、シグナリン、及びＧＦＦのＡＲＥアッセイ結果が、図４に示される。３つすべての作用物質は、ＡＲＥからの転写の著しい用量依存的上方調節を引き起こした。角化細胞におけるＨＯ−１のオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）誘発性発現の結果が図７Ａに示され、線維芽細胞におけるオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）の結果が図７Ｂに示され、更にシグナリン及びＧＦＦの結果が図７Ｃ及び７Ｄに示される。３つすべての作用物質は、ヒト皮膚角化細胞及び線維芽細胞においてＨＯ−１（細胞抗酸化能力のバイオマーカー）の著しい用量依存的増加を引き起こした。図９は、ヒト皮膚外植片についてのＨＯ−１データを説明する。ヒト皮膚エクスビボに局所的に適用されたシグナリン、ＧＦＦ、及びＧＦＦ／オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）の組み合わせは、ＨＯ−１の著しい発現増加を引き起こした。ヒト皮膚角化細胞におけるＧＦＦ及びシグナリンの組み合わせは、図６に示されるように、ＨＯ−１発現の相乗的増加をもたらした。結果の厳重な検査は、ＡＲＥからの転写が、ＨＯ−１バイオマーカー結果による予測よりもＧＦＦによって少ない影響を受けたことを示す。これは、ＨＩＦ−１（低酸素症誘発因子１、低酸素状態に応答する転写因子）等の代わりの経路が関与し得ることを示唆する。更に、ＡＲＥからの転写に影響を及ぼさない程度に低いレベルのオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）で処理されたヒト皮膚角化細胞は、それにもかかわらず、ＧＦＦと相乗的に振舞って、ＧＦＦ単独での予測した程度を超えてＨＯ−１を増加させ、相乗的な抗酸化作用、並びに独立した経路のへの支援を示した。
【００５２】
実施例４：更なる提案された作用物質：オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）、シグナリン（商標）（オリーブ油ＢＪＯ）、及びＧＦＦ（酵母発酵濾液）の抗酸化活性を評価するためのＡＲＥ活性化アッセイ及びヘムオキシゲナーゼ１ＥＬＩＳＡの適用。
実施例３に記載のＡＲＥ活性化アッセイを採用した。抗酸化応答要素からの転写を試験するために、レポーター株を成長させ、それぞれ異なる用量の化合物を添加し、２４時間インキュベートする。次に、細胞を溶解し、発光出力を検出及び定量化する。シグナリンの用量応答結果が、図１０Ａに示される。検査は、上方調節が用量依存的であることを示す。オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）の用量応答結果が、図１０Ｂに示される。検査は、上方調節が用量依存的であることを示す。ＧＦＦの用量応答結果が、図１０Ｃに示される。検査は、ＧＦＦによる上方調節がどの用量においても著しくないことを示す。
【００５３】
ＡＲＥからの転写の活性化を確認し、かつ可能性のある抗酸化機構を更に調査するために、角化細胞及び線維芽細胞の両方において、それぞれの作用物質に対して実施例に記載のヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）ＥＬＩＳＡも採用する。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）は第２相酵素であり、細胞中のその産生を定量化するために、市販のＥＬＩＳＡを選択した。図１１Ａに示されるように、ＧＦＦ及びシグナリンの両方ともに、角化細胞において用量依存的応答を実証するが、線維芽細胞において用量依存的応答は実証しない。図１１Ｂは、オリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）が、角化細胞及び線維芽細胞の両方において用量依存的上方調節を呈することを示す。最も高い容量は有毒であると考えられており、角化細胞よりも線維芽細胞に当てはまり、最も高い濃度での明らかに不定の結果を説明する。図５に示されるように、ＨＯ−１の上方調節をもたらさなかった用量のオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）がＧＦＦと合わせられるとき、ＨＯ−１発現の予想されなかった相乗的増加が起こる。シグナリン及びＧＦＦは、単独又はオリベム（商標）４６０（オリーブ油ＤＦＦＡＰ）との組み合わせで、ヒト皮膚外植片におけるＨＯ−１発現を上方調節する。
【００５４】
実施例５：提案された化合物がＡＲＥのｎｒｆ２媒介性誘発を調節する際の潜在的有効性についてスクリーニングされる本発明の実施形態を示す。
提案された化合物を、上述の実施例３に示されるＡＲＥアッセイを用いてスクリーニングする。図１２は、それぞれの化合物において試験した濃度及び観察されたＡＲＥの増加率に加えて、「ＡＲＥスクリーニングヒット」の表を説明する。概して、ＡＲＥからの転写を上方調節する化合物は、増加した抗酸化能力を提供する細胞中の第２相保護酵素の量を増加させる。
【００５５】
本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、種々の修正、拡張、及び変更が本発明に加えられ得ることが当業者には明らかである。前述を考慮して、本発明の修正及び変更が以下の「特許請求の範囲」及びそれらの等価物の範囲内に収まるという条件で、本発明がそれらを網羅することが意図されている。
【００５６】
配列同定情報
配列番号：１ホモサピエンスアルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＡ２（ＡＬＤＨ３Ａ２）、転写変異体２
配列番号：２ホモサピエンスアルデヒド脱水素酵素３ファミリー、メンバーＡ２（ＡＬＤＨ３Ａ２）、転写変異体１
配列番号：３ホモサピエンスアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）
配列番号：４ホモサピエンスカタラーゼ（ＣＡＴ）
配列番号：５ホモサピエンスセロイドリポフスチン症、神経細胞８（てんかん、精神遅滞を伴って進行）（ＣＬＮ８）
配列番号：６ホモサピエンスクラスタリン（ＣＬＵ）、転写変異体１
配列番号：７ホモサピエンスクラスタリン（ＣＬＵ）、転写変異体２
配列番号：８ホモサピエンスセルロプラスミン（フェロオキシダーゼ）（ＣＰ）
配列番号：９ホモサピエンスシトクロムｃ、身体（ＣＹＣＳ）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子
配列番号：１０ホモサピエンス２４−デヒドロコレステロール還元酵素（ＤＨＣＲ２４）
配列番号：１１ホモサピエンスグルタチオンペルオキシダーゼ２（胃腸管系）（ＧＰＸ２）
配列番号：１２ホモサピエンスヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）１（ＨＭＯＸ１）
配列番号：１３ホモサピエンス熱ショック６０ｋＤａタンパク質１（シャペロニン）（ＨＳＰＤ１）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体１
配列番号：１４ホモサピエンス熱ショック６０ｋＤａタンパク質１（シャペロニン）（ＨＳＰＤ１）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体２
配列番号：１５ホモサピエンス熱ショック６０ｋＤａタンパク質１（シャペロニン）（ＨＳＰＤ１）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体２
配列番号：１６ホモサピエンスミクロソームグルタチオンＳ−転移酵素１（ＭＧＳＴ１）、転写変異体１ａ
配列番号：１７ホモサピエンスミクロソームグルタチオンＳ−転移酵素１（ＭＧＳＴ１）、転写変異体１ｂ
配列番号：１８ホモサピエンスミクロソームグルタチオンＳ−転移酵素１（ＭＧＳＴ１）、転写変異体１ｃ
配列番号：１９ホモサピエンスミクロソームグルタチオンＳ−転移酵素１（ＭＧＳＴ１）、転写変異体１ｄ
配列番号：２０ホモサピエンスミクロソームグルタチオンＳ−転移酵素３（ＭＧＳＴ３）
配列番号：２１ホモサピエンス金属調節転写因子１（ＭＴＦ１）
配列番号：２２ホモサピエンスＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１、７５ｋＤａ（ＮＡＤＨ−補酵素Ｑ還元酵素）（ＮＤＵＦＳ１）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子
配列番号：２３ホモサピエンス核因子（赤血球由来２）様２（ＮＦＥ２Ｌ２）、転写変異体１
配列番号：２４ホモサピエンス核因子（赤血球由来２）様２（ＮＦＥ２Ｌ２）、転写変異体２
配列番号：２５ホモサピエンス核因子（赤血球由来２）様２（ＮＦＥ２Ｌ２）、転写変異体３
配列番号：２６ホモサピエンスＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素、キノン１（ＮＱＯ１）、転写変異体１
配列番号：２７ホモサピエンスＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素、キノン１（ＮＱＯ１）、転写変異体２
配列番号：２８ホモサピエンスＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素、キノン１（ＮＱＯ１）、転写変異体３
配列番号：２９ホモサピエンスペルオキシレドキシン２（ＰＲＤＸ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体１
配列番号：３０ホモサピエンスペルオキシレドキシン２（ＰＲＤＸ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体３
配列番号：３１ホモサピエンス溶質担体ファミリー２３（核酸塩基輸送体）、メンバー２（ＳＬＣ２３Ａ２）、転写変異体１
配列番号：３２ホモサピエンス溶質担体ファミリー２３（核酸塩基輸送体）、メンバー２（ＳＬＣ２３Ａ２）、転写変異体２
配列番号：３３ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体１
配列番号：３４ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体２
配列番号：３５ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子、転写変異体３
配列番号：３６ホモサピエンススーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外（ＳＯＤ３）  配列番号：３７ホモサピエンスｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、転写変異体１
配列番号：３８ホモサピエンスｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、転写変異体３、コード化なし
配列番号：３９ホモサピエンスｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、転写変異体４
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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