(57)【要約】      （修正有）【課題】レビー小体病のようなシヌクレイノパチーを予防及び/又は治療するための薬剤の提供。【解決手段】アミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体への結合能を有し、α-シヌクレインと結合する抗体のin vivo形成を誘導することができる、下記式１の構造を有する化合物の使用。(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m(式1)、(ここで、X1、X3、X4、及びX7は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、X2及びX6は、アミノ酸残基がアスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択され、、X5は、プロリン(P)及びアラニン(A)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、n及びmは、独立して、0又は0より大きい整数であり、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8量体ポリペプチドと同一のポリペプチド又はその断片を含まない。)【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体への結合能を有する、以下の構造を有する化合物であって、シヌクレイノパチーを予防及び/又は治療するための医薬を製造するための少なくとも1つの該化合物の使用：
(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m          (式1)
［ここで、
X1は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X2は、アミノ酸残基がアスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択され、
X3は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X4は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X5は、プロリン(P)及びアラニン(A)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X6は、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸残基  であり、
X7は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
n及びmは、独立して、0又は0より大きい整数であり、
及び
式Iのアミノ酸配列は、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8量体ポリペプチドと同一のポリペプチド又はその断片を含まない］。
【請求項２】
X1及び/又はX7が、アセチルアミノ酸残基又はシステイン(C)であることにより特徴づけられる請求項1に記載の使用。
【請求項３】
X3が、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、アラニン(A)、及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基であることにより特徴づけられる、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
X4が、グルタミン(Q)、トリプトファン(W)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、チロシン(Y)、アラニン(A)、セリン(S)、及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基であることにより特徴づけられる請求項1ないし3のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
化合物が、7ないし16アミノ酸残基を含むポリペプチドであることにより特徴づけられる請求項1ないし4のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
化合物が、(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、及び(C)DNPVHPEからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド含むことにより特徴づけられる請求項1ないし5のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
シヌクレイノパチーが、レビー小体病(LBDs)、好ましくは、パーキンソン病(PD)、痴呆を伴うパーキンソン病(PDD)、及びレビー小体型認知症(DLB)、並びに多系統萎縮症(MSA)又は脳内の鉄蓄積を伴うI型神経変性(I型NBIA)からなる群から選択されることにより特徴づけられる請求項1ないし6のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
化合物が、医薬的に許容される担体、好ましくは、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合していることにより特徴づけられる請求項1ないし7のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
化合物が静脈内、皮下、皮内又は筋肉内投与のために製剤されることにより特徴づけられる請求項1ないし8のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
化合物が、アジュバント、好ましくは、水酸化アルミニウムとともに製剤されることにより特徴づけられる請求項1ないし9のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
化合物が薬剤中、0.1ngないし10mg、好ましくは10ngないし1mg、特に100ngないし100μg含まれることにより特徴づけられる請求項1ないし10のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
CDQPVLPD、CDMPVLPD、CDSPVLPD、CDSPVWAE、CDTPVLAE、CDQPVLPDN、CDMPVLPDN、CDSPVLPDN、CDQPVTAEN、CDSPVWAEN、CDTPVLAEN、CHDRPVTPD、CDRPVTPD、CDVPVLPD、CDTPVYPD、CDTPVIPD、CHDRPVTPDN、CDRPVTPDN、CDNPVHPEN、CDVPVLPDN、CDTPVYPDN、CDTPVIPDN、CDQPVLPDG、CDMPVLPDG、CDSPVLPDG、CDSPVWAEG、CDRPVAPEG、CDHPVHPDS、CDMPVSPDR、CDSPVPPDD、CDQPVYPDI、CDRPVYPDI、CDHPVTPDR、CEYPVYPES、CDTPVLPDS、CDMPVTPDT、CDAPVTPDT、CDSPVVPDN、CDLPVTPDR、CDSPVHPDT、CDAPVRPDS、CDMPVWPDG、CDAPVYPDG、CDRPVQPDR、CYDRPVQPDR、CDMPVDPEN、CDMPVDADN、DQPVLPDC、DMPVLPDC、及びCEMPVDPDN、及びCDNPVHPEからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
ペプチドが医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合していることにより特徴づけられる請求項12に記載のペプチド。
【請求項１４】
好ましくはワクチンである、少なくとも1つのペプチドを含む請求項12又は13に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シヌクレイノパチーの予防及び/又は治療のために用いる治療剤に関連する。
【背景技術】
【０００２】
シヌクレイノパチーは、共通の病理学的特徴を有する多様な神経変性疾患の群である:神経病理学的検査において、神経及びグリア細胞の選択的な群において異常なα-シヌクレイン(α-syn)タンパク質の凝集体を含む特徴的な病変が検知される。α-syn(当初、PARK1及びPARK4として同定されていた)は、大脳皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床及び小脳に広く発現される140アミノ酸のタンパク質である。α-synは、B-、T-、及びNK細胞並びに単球及び血小板を含む造血性細胞に広く発現される。これらの細胞における正確な役割は知られていないが、巨核球(血小板前駆細胞)の分化に関わってきている。
【０００３】
最もよく見られるシヌクレイノパチーは、パーキンソン病(PD)、痴呆を伴うパーキンソン病及びレビー小体型認知症(DLB)のようなレビー小体病(LBDs)、並びに、多系統萎縮症(MSA)又は脳内の鉄蓄積を伴うI型神経変性(I型NBIA)がある。これらの疾患の現在の治療オプションは、L-dopa、抗コリン薬、並びにモノアミンオキシダーゼ阻害剤のような対症療法を含む。しかし、現在ある全ての治療条件は、対症療法的な緩和しか導かず、患者において長期間の作用、疾患の改善効果は導かない。
【０００４】
レビー小体病(LBD)は、震え、硬直、動作緩慢及び、脳内のドパミン作動性ニューロンの喪失により特徴づけられる進行性神経変性疾患である。また、DLB及びPDDの場合には、認知疾患を含む。西欧諸国の60歳より年上の人口の2%がPD/LBDの典型的な兆候を示す。現在は、対症療法しか行えない。不幸なことに、これらの治療法は、初期症状の一時的な軽減しかもたらさず、疾患の進行を止めることはできない。
【０００５】
PD/LBDの発症機序は、まだ不完全にしかわかっていないが、遺伝的感受性及び環境因子がこの疾患の進展に関係しているようである。あらゆる遺伝学的進歩にもかかわらず、PD/LBDは、主に発症原因のわからない散発性疾患である(また、突発性PD/LBDとも呼ばれる)。この疾患の患者は、脳内の皮質及び皮質下の領域においては、レビー小体(LBs)と呼ばれる細胞内封入体においてユビキチン化される特徴を示す。特に、高濃度のドパミン作動性ニューロン、又はニューロン投射の領域ではこの典型的な病理的特徴を示す。
【０００６】
近年、いくつかの研究から、シナプスタンパク質であるα-synがLBDの発症機序において中心的な役割を果たすであろうことが示された。LBDおいて、α-synは影響される脳の全領域のLBに蓄積する。加えて、家族性パーキンソン病のまれな場合においては、α-syn遺伝子の単一の点突然変異並びに重複突然変異又は多重突然変異が関わっているであろうことが示されている。重要なことは、遺伝子組み換え(tg)マウス並びにキイロショウジョウバエにおける過剰発現研究の結果、これらの動物モデルはPDのいくつかの特徴と似た症状を呈するため、PD/LBDの発症機序において鍵となる役割が強調される。
【０００７】
もう一つ非常に重要なシヌクレイノパチーは多系統萎縮症(MSA)である。MSAは、L-DOPA抵抗性パーキンソン病の症状、小脳性運動失調及び自律神経疾患により特徴づけられる、散発的神経変性疾患である。患者は、線条体、中脳の黒質、小脳、橋、並びに下オリーブ及び脊髄を含む、様々な脳の領域に影響する多系統ニューロンの欠損に苦しむ。MSAは、中枢神経系全体にわたる、α-syn-陽性のグリア細胞質内封入体(GCI)及び微量の神経内封入体によって特徴づけられる。これらの封入体は、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症と関連し、髄質及び脊髄における自律神経核が関与している。MSAの発症機序におけるGCIの重要性は、最近の乏突起膠細胞におけるα-syn過剰発現の効果の、遺伝子組み換えマウスモデルによる分析により一般に受け入れられており、強調されている。ヒトα-syn過剰発現tgマウスは、GCI-様凝集体及びMSAの生化学的マーカーの両方を観察した。
【０００８】
α-synの蓄積により、シヌクレイノパチーにおいて神経変性及びシヌクレイノパチーの特徴的な症状のような典型的な特徴に至る正確な機序は完全には理解されていないが、最近の研究から、α-synの異常形成及びオリゴマーの蓄積がシヌクレイノパチーの病変過程に潜在していると示唆される。現在、例えばシナプス末端及び軸索における、そのようなオリゴマー形成はPD/LBDの進展に重要な役割を果たすと信じられている。それゆえ、α-syn堆積及びオリゴマー化の減少は、シヌクレイノパチー、特に突発性LBD/PD及びMSAの治療において有利であるはずであり、現在のL-DOPA適用戦略による症状の単なる緩和に加えこれらの神経変性疾患における第1戦略となりうる。
【０００９】
Iwatsubo T.は、α-シヌクレイノパチーの発症機序におけるα-シヌクレインの堆積だけでなく、そのリン酸化との関係についても試験した(Neuropathology 27 (5)(2007): 474-478)。この刊行物の著者は、シヌクレイノパチー疾患においてα-synのセリン129が広くリン酸化されていることを発見した。
【００１０】
米国特許出願2007/213253号公報は、野生型ヒトα-シヌクレインの凝集阻害に用いられ得る変異型ヒトα-シヌクレインだけでなく、それらのペプチド誘導体を開示する。
国際公開第2004/041067号パンフレットは、α-シヌクレイン断片の使用を含む、α-シヌクレインの凝集に関連する疾患の予防又は治療の手段及び方法を開示する。
米国特許出願2003/166558号公報は、タンパク質堆積物に対する免疫反応の誘導に用いられ得るペプチドが開示されている。
米国特許出願2005/198694号公報は、少なくとも100アミノ酸を含み、1から23アミノ酸のC末端が欠失しているα-シヌクレイン断片に関する。
【００１１】
神経栄養因子を使用した試験的治療及びドパミン作動性細胞の移植は期待できる結果であったが、α-synの神経蓄積を減少させるための代わりのアプローチをデザインする必要がある。
【００１２】
最近、能動及び受動免疫療法が、アルツハイマー病(AD)、プリオン病、並びにハンチントン舞踏病及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)のような神経変性疾患の治療の可能性のある新しい治療戦略として、より興味深くなってきている。例えば、近年の研究では、ADのtgマウスモデルにおける研究により、抗β-アミロイド1-42(Aβ)抗体が、脳からのアミロイドの除去を促進し、認知能力の改善につながることを示した。重要なことは、Aβ分子は、主として細胞外に局在し、それゆえ免疫系に利用し得るエピトープを構成する。免疫療法におけるそのような「古典的な」標的と対照的に、細胞内病原性分子の蓄積を減少させる免疫療法の可能性を評価するための試験を行った。プリオンタンパク質及びハンチントン病を標的とするワクチン接種アプローチは、α-synのような細胞内に蓄積する両分子の蓄積を、tgマウスの神経において減少させるのに有効であることが示された。加えて、最近の試験は、AD及びALSそれぞれについて、細胞内病原性タンパク質の凝集に対し、抗Tau及び抗SOD1治療が新しい治療戦略であることを示す。それゆえ、脳細胞における細胞内凝集体は、免疫療法により標的になりうる有力な証拠が蓄積している。事実、最近、シヌクレイノパチー治療において同様の可能性が示された。ヒトα-synタンパク質を過剰発現するtgマウスにワクチン接種をした。ワクチン化において高い相対的親和性のある抗体を生産するマウスにおいて、神経変性の減少に関連する神経細胞体及びシナプスにおいて、α-syn蓄積の凝集の減少が見られた。さらに、免疫化された動物によって産生された抗体は、おそらくリソソーム経路を介してであるが、異常なα-syn凝集体も検出した。α-syn特異的抗体を体外的に投与した受動免疫療法を用いても、同様の効果が観察された。これらの結果は、ワクチン接種が、α-syn凝集体の神経への蓄積を減少させに効果があること、及びこのアプローチのさらなる進展が、LBD及びシヌクレイノパチーの治療において有利な効果を示すであろうことを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ワクチンに基づくシヌクレイノパチーの予防及び治療のための薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
それゆえ、本発明は、該化合物が、α-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体への結合能を有するアミノ酸配列DMPVDPDNを含む、シヌクレイノパチーを予防及び/又は治療するための薬剤を生産するための
(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m          (式1)
(ここで、
X1は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X2は、アミノ酸残基がアスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択され、
X3は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X4は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X5は、プロリン(P)及びアラニン(A)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X6は、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸残基  であり、
X7は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
n及びmは、独立して、0又は0より大きい整数であり、
及び
式Iのアミノ酸配列が、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8量体ポリペプチドと同一又はその断片を含まない)
の少なくとも1つの化合物の使用に関連する。
【００１５】
本発明の化合物は、インビボでの、特にアミノ酸配列DMPVDPDN(該アミノ酸配列のα-シヌクレイン断片も含む)を含むα-シヌクレインのエピトープとなる、α-シヌクレインの抗体産生の誘導に向けられている（結合する）。抗体産生は該エピトープに向けられている(結合する)が、β-シヌクレインに対してはα-シヌクレインと比べ、全く又は有意に低い免疫反応しか示さない。対照的に、原DMPVDPDNを含むα-シヌクレインエピトープによるワクチン接種により誘導した抗体は、驚くべきことにα-シヌクレイン及びβ-シヌクレインの両方に結合する。それゆえ、原α-シヌクレイン又はその断片と異なり、本発明の化合物は、疾患関連の薬剤に特異性を示し、β-シヌクレインに関連しない疾患との交差反応性を避けられる。これは有効性及び安全性の点で、顕著な優位性を示すことが強く示唆されるが、後者は、特にβ-シヌクレインの神経保護特性のためである(Hashimoto M. et al., J Biol Chem. 2004 May 28;279(22):23622-9. Hashimoto M, Neuron. 2001 Oct 25;32(2):213-23)。
【００１６】
α-シヌクレイン特異的抗体は、本発明の化合物を投与することにより誘導され、α-シヌクレインのモノマー形態だけでなく、多重形態にも結合する。これにより個体の体内のα-シヌクレインオリゴマーの量が減少し、治療される。α-シヌクレインの減少は、特にシヌクレイノパチーの治療に有利である。
【００１７】
本発明は以下の図及び実施例においてさらに説明されるが、それらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、ヒトα-シヌクレイン115-122位特異的モノクローナル抗体を用いたELISAによるα-シヌクレイン特異的エピトープの検出を示す。  ペプチドp4446(α-シヌクレイン)、p4449及びp4448(ヒトエピトープ)は、抗体によって検出された。ネガティブコントロールペプチドp4447(β-シヌクレイン)及びp4450、p4451(マウスエピトープ)は検出されなかった。無関係なp1252は、ELISAアッセイにおいて結合しなかった。データは、直線的目盛りで表されている。
【００１９】
【図２】図2は、ヒトα-シヌクレイン115-122位特異的モノクローナル抗体を用いたELISAによるミモトープの検出を示す。2つのミモトープ(p4553、p4557)のデータを示す。ペプチドp4557は、原ペプチドp4448よりも弱い結合性を示した。ペプチドp4553は、抗体検出において強い結合を示した。無関係なペプチドp1253は、ELISAアッセイにおいて想定されるような結合を一切示さなかった。いずれのミモトープも、マウスに対するワクチン接種に対し、抗体価＞1/20000を示し、強い結合剤であると考えられる。
【００２０】
【図３】図3は、ヒトα-シヌクレイン115-122位特異的モノクローナル抗体を用いたELISAによるミモトープの競合阻害性を検出する。  記載された値は、ELISAによる結合阻害アッセイにおいて、40μgペプチドを用いた測定による。無関係なペプチドp1253及びミモトープp4492は、原ペプチドp4448に比べて、競合性を示さなかった。ミモトープp4490及びp4491は、原ペプチドp4448と同様の競合性を示した。競合性は、ELISAにおける40μgのペプチド濃度でのODを、原エピトープと比較することにより計算される。1付近の値は、強い阻害能を有することを示す。競合指数が5より大きいペプチドは、非競合的であるとされる。
【００２１】
【図４】図4は、注入したペプチド及び無関係なペプチドに対する免疫反応を示す。A)  4回のワクチン接種により免疫化されたマウスの上清は、注入されたペプチド(原エピトープ(p4448)及びミモトープ(それぞれp4456、p4466及びp4467)に対し、高い抗体価を示す。ELISAにより測定された抗体価は、約1:10.000(OD最大半量)であり、データは対数目盛りで表されている。ポジティブコントロールはα-シヌクレイン特異的モノクローナル抗体を用いた(CTRL pos(ポジティブコントロール))。B)  免疫化されたマウスの同じ上清は、無関係なペプチドを検出しなかった(p1253)。抗体価はELISAにおいて、1:100(OD最大半量)より低く、無関係なペプチドに特異的なモノクローナル抗体(CTRL pos)によるシグナルよりも100倍以上低かった。ネガティブコントロールとしては、一次抗体は用いなかった。データは、直線的目盛りで表される。
【００２２】
【図５】図5は、連続したミモトープによる免疫化に続くシヌクレインに対する免疫反応を表す。A)  全動物の集めた上清は、α-シヌクレインのC末端部分に局在するペプチドであるp4448に対し、それぞれ抗体価を示した。データは、対数目盛りで表されている。B)  4回のワクチン接種により、免疫化されたマウスの上清(p4448、p4457及びp4463)は、α-シヌクレインに対し抗体価を示した。免疫化されたマウス(p4466及びp4467)から集めた上清は、α又はβ-シヌクレインを検出しなかった(ELISAにより測定した抗体価は、最大半量1:100よりもずっと小さい)。原エピトープ(p4448)で免疫化されたマウスから集めた上清は、α及びβ-シヌクレインを検出した。ELISAによる抗体価で、最大半量1:100よりも小さいものが、アスタリスクによって示されており、これはバックグラウンド値に対応する値に近い値である。試したほとんどのミモトープは、β-シヌクレインとの交差反応をすることのない抗体を誘導した。データは対数目盛りで表されている。
【００２３】
【図６】図6Aは、ヒトα-synを特異的に検出する市販の抗体を用いたポジティブコントロールの染色を示す。図6Bは、非遺伝子組み換えマウスの脳の同一領域について同一抗体を用いて試験したものであり、この動物はヒトα-synを発現しないので、一切のα-syn陽性組織が検出されなかった。図6Cは、図6Aにおいて存在したのと同様の、ミモトープ誘導性上清(p4498誘導性上清)によるα-syn特異的染色を示す。マウス海馬におけるα-syn陽性の染色は、6A及び6Cに示される斑のパターンにより特徴づけられる。矢印は、それぞれ6A及び6Cにおけるα-syn陽性封入体の3つの実施例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
アミノ酸配列(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)mは、アミノ酸配列DMPVDPDNを含む、α-シヌクレインのエピトープのミモトープであると考えられている。本発明において、用語「ミモトープ」は、エピトープの形態学上の等価性を有するコンホメーションを持つ分子である模倣体を言う。ミモトープは、抗体において抗原結合領域と同一の部位に結合し、それは望ましい抗原への免疫特異的結合である。ミモトープは、宿主において、抗原の模倣体として反応し免疫反応を示す。またミモトープは、エピトープ及び該エピトープに結合する抗体の関与するインビトロ阻害アッセイ(例えば、ELISAによる阻害アッセイ)においてエピトープの模倣体として競合基質として作用する。しかし、本発明のミモトープは、インビトロ阻害アッセイにおいて、エピトープの模倣体であるので、必ずしも阻害又は競合しなくてもよいが、ホ乳類に投与した場合、特異的免疫反応を誘導できるものである。
【００２５】
本明細書中、用語「エピトープ」は、特定の抗体分子によって認識される抗原の免疫原性領域を言う。一般に、抗原は1つ以上のエピトープを有し、それぞれが、特定のエピトープを認識する抗体を結合することができる。
【００２６】
本発明のミモトープは、単離されたペプチド又は他のペプチド又はポリペプチドの一部としてのいずれかとして、当該分野においてよく知られた化学合成法により合成して生産しうる。あるいは、ペプチドミモトープは、ペプチドミモトープを産生する微生物中でも生産され得、必要であればその後単離され、さらに精製される。ペプチドミモトープは、例えばバクテリア、酵母又は菌類、例えば哺乳類又は昆虫細胞の真核細胞、又は遺伝子組換えウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス又はセンダイウイルスにおいても生産しうる。ペプチドミモトープを生産するのに適切なバクテリアには、大腸菌、枯草菌又は、例えばペプチドミモトープを発現するペプチドなど、他のあらゆるバクテリアが含まれる。適切な酵母の型には、サッカロマイセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、カンジダ、メタノール資化酵母又はペプチドを発現できる他のあらゆる酵母が含まれる。対応する方法は当業者に知られている。また遺伝子組換えにより生産されたペプチドを単離及び精製する方法も当該分野においてよく知られており、それには例えば、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等が含まれる。
【００２７】
ペプチドミモトープの単離を促進するため、アフィニティクロマトグラフィーによる単離が可能な異種のポリペプチドペプチドに、ペプチドミモトープが翻訳により融合できるような融合ポリペプチドが作製される。典型的な異種のポリペプチドは、His-Tag(例えば、His6; 6つのヒスチジン残基)、GST-Tag(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)等がある。融合ポリペプチドは、ミモトープの精製を促進するだけでなく、精製の間、ミモトープポリペプチドを分解から保護する。精製後、異種のポリペプチドを除去したい場合、融合ポリペプチドは、ペプチドミモトープと異種のポリペプチドの接合は開裂部位を含んでいてもよい。開裂部位は、当該部位のアミノ酸配列(例えば、プロテアーゼ)に、酵素特異的に開裂されるアミノ酸配列からなる。
【００２８】
また、本発明のミモトープは、それにより該部位にシステイン残基が結合できるように、N及び/又はC末端又はその付近で修飾されていてもよい。好ましい態様としては、末端部位に位置する(ペプチドのN及びC末端に位置する)システイン残基が、ジスルフィド結合によりペプチドを環化するために用いられることである。
また、本発明のミモトープは、特に免疫アッセイ及びキットといった様々なアッセイ及びキットに用いられ得る。それゆえ、ミモトープは他のペプチド又はポリペプチドの一部であることが特に好ましく、特に免疫アッセイにおいてレポーターとして用いられる酵素であることである。そのようなレポーター酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。
【００２９】
本発明のα-シヌクレインミモトープは、好ましくはアミノ酸配列がα-シヌクレイン又はα-シヌクレイン断片のアミノ酸配列が変化している抗原性ポリペプチドである。この観点から、1つ以上の天然由来のアミノ酸残基のアミノ酸置換体だけでなく、1つ以上の非天然のアミノ酸(すなわち、20の「典型的な」アミノ酸でない)、又はそのような完全に非天然のアミノ酸から集められたものであるものを含みうる。さらに、抗α-シヌクレイン抗体を誘導する独創的な抗原は、D-又はL-アミノ酸又はDL-アミノ酸の組み合わせを集めたものであり及び、任意に、さらに修飾、閉環反応又は誘導体化により変更されていてもよい。適切な抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原は、市販のペプチドライブラリーから入手可能である。好ましくは、これらのペプチドは少なくとも7アミノ酸であり、好ましい長さは16までであり、好ましくは、14又は20アミノ酸残基である(例えば、7又は8ないし20、7又は8ないし16等)。しかし本発明によると、長いペプチドも、よく抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原として用いられる。さらに本発明のミモトープも、また本発明のミモトープもポリペプチドの一部をなし得、従ってN-及び/又はC末端に少なくとも1つのさらなるアミノ酸残基を含み得る。
【００３０】
α-シヌクレインミモトープ(すなわち、抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原)の生産には、もちろんファージライブラリー、ペプチドライブラリーも適切であり、例えば、最も種々の構造をとる部分にはコンビナトリアルケミストリーの手法によって生産され、又はハイスループットスクリーニング技術により得られる(Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50(6):837-54)。
【００３１】
さらに本発明には、核酸(「アプタマー」)に基づく抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原が用いられ得、これらも種々の(オリゴヌクレオチド)ライブラリー(例えば、2-180核酸部分)により得られる(例えば、Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965、等がある)。核酸に基づく抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原においては、核酸骨格は、例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエート化合物により、又は本発明においては主として塩基としては、U、T、A、C、G、H及びmCが用いられうるが、その組み合わせ又は化学種(例えば、PNA)によって提供される。本発明において好ましいヌクレオチドの2’-残基は、H、OH、F、Cl、NH2、O-メチル、O-エチル、O-プロピル又はO-ブチルが用いられ得、ここで核酸は、また異なって修飾されていてもよく、すなわち、オリゴヌクレオチド合成には通常用いられるように、例えば保護基によって修飾されていてもよい。それゆえ、アプタマーベースの抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原は、また本発明の範囲に含まれる好ましい抗α-シヌクレイン-抗体-誘導抗原である。
【００３２】
本発明において用語「シヌクレイノパチー」とは、病的なシヌクレイン凝集体によって特徴づけられる全ての神経変性疾患を含む。いくつかの神経変性疾患には、パーキンソン病(PD)、レビー小体病(LBD)、広範性レビー小体病(DLBD)、レビー小体型認知症(DLB)、痴呆を伴うパーキンソン病(PDD)、多系統萎縮症(MSA)、及び脳内の鉄蓄積を伴うI型神経変性(I型NBIA)からなる群から選択される、まとめてシヌクレイノパチーとしてグループ化される。
【００３３】
本発明の化合物は、シヌクレイノパチーの治療に用いられうるだけでなく、シヌクレイノパチー(例えば、素因、例えばシヌクレイノパチーが発症する遺伝的な素因)が発症するリスクにある個体における該疾患の予防にも用いられる。
本発明におけるアミノ酸残基の略語はIUPAC推奨に従う：
2014177483.tif 000002
【００３４】
本発明の好ましい態様としては、X1及び/又はX7は、アセチル化アミノ酸残基又はシステイン(C)である。
本発明の他の好ましい態様としては、X2は、グルタミン酸であり、ここで該グルタミン酸はまたピログルタミン酸に誘導されうる。X2がピログルタミン酸を含む場合には、X1は0である。
本発明のさらなる好ましい態様としては、X3は、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、アラニン(A)及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００３５】
本発明の好ましい態様としては、X4は、グルタミン(Q)、トリプトファン(W)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、チロシン(Y)、アラニン(A)、セリン(S)、及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
また、本発明の化合物は、7ないし16アミノ酸残基を含むポリペプチドの一部であり得る。したがって、n及びmは、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、及び25からなるから群から選択される整数でありうる。
【００３６】
本発明の化合物は、アミノ酸配列(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)mからなり得、ここでn及びmは、独立して、0又は1、又は少なくとも7アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも10アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも15アミノ酸残基、及び/又は最大50アミノ酸残基、好ましくは、最大30アミノ酸残基、より好ましくは16アミノ酸残基を含む、ポリペプチドの一部である。
【００３７】
本発明の好ましい態様としては、(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、及び(C)DNPVHPEからなる群から選択される配列を有するペプチドを含む化合物である。
【００３８】
驚いたことに、上にリストしたアミノ酸配列を含む又はからなる本発明の化合物は、シヌクレイノパチーの予防又は治療のために用いられる薬剤の製造のために特に適切であることがわかった。これらのペプチド(ミモトープ)は、インビボで、アミノ酸配列DMPVDPDNを含むヒトα-シヌクレインの原エピトープ及びヒトα-シヌクレイン・タンパク質それ自体に対する抗体産生を誘導し得る。しかし、該ペプチド(ミモトープ)は、ヒトβ-シヌクレイン・タンパク質に対しては、免疫反応を誘導しない、又はごくわずかに誘導するのみであった。驚いたことに、原α-シヌクレイン(アミノ酸配列DMPVDPDNを含む)により誘導された抗体は、α-シヌクレインだけでなくβ-シヌクレインにも特異的に結合する。それゆえ、該ペプチド(ミモトープ)は、原ペプチドミモトープよりも、より精密な免疫反応(抗体)を誘導する。しかし、α-シヌクレイン及びβ-シヌクレインを必ずしも区別する必要はない。ペプチド誘導性抗体は、個体においてα-シヌクレイン(α-シヌクレイン凝集体、レビー小体の形成に関与する)の排除及び/又はα-シヌクレイン凝集体(レビー小体)の溶解を行う。
【００３９】
上にリストしたペプチドは、N末端システイン残基を含んでいてもいなくてもよく、もちろんC末端におけるC残基についても同様に付加されていてもよい。それゆえ、本発明は、N末端又はC末端におけるシステイン残基を含まない以下のペプチドを含む:DQPVLPD、DMPVLPD、DSPVLPD、DSPVWAE、DTPVLAE、DQPVLPDN、DMPVLPDN、DSPVLPDN、DQPVTAEN、DSPVWAEN、DTPVLAEN、HDRPVTPD、DRPVTPD、DVPVLPD、DTPVYPD、DTPVIPD、HDRPVTPDN、DRPVTPDN、DNPVHPEN、DVPVLPDN、DTPVYPDN、DTPVIPDN、DQPVLPDG、DMPVLPDG、DSPVLPDG、DSPVWAEG、DRPVAPEG、DHPVHPDS、DMPVSPDR、DSPVPPDD、DQPVYPDI、DRPVYPDI、DHPVTPDR、EYPVYPES、DTPVLPDS、DMPVTPDT、DAPVTPDT、DSPVVPDN、DLPVTPDR、DSPVHPDT、DAPVRPDS、DMPVWPDG、DAPVYPDG、DRPVQPDR、YDRPVQPDR、DMPVDPEN、DMPVDADN、EMPVDPDN、及びDNPVHPE。
【００４０】
本発明の化合物は薬剤、特にワクチンの調製のために用いられ得、ここで該薬剤はαシヌクレイノパチーの治療に用いられ得、該薬剤により特にパーキンソン病(PD)、レビー小体病(LBD)、広範性レビー小体病(DLBD)、レビー小体型認知症(DLB)、痴呆を伴うパーキンソン病(PDD)、多系統萎縮症(MSA)、及び脳内の鉄蓄積を伴うI型神経変性(I型NBIA)からなる群から選択される、シヌクレイノパチーの治療に適切である。
【００４１】
本発明の好ましい態様としては、化合物は医薬的に許容される担体と結合され、好ましくは、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン-結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP; Biol. Chem. 358: 581)、ペプチドリンカー(又は隣接領域)、並びに、Singh et al. Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (特にその文献の表1)、及びO'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735(特にその中に記載されている内因性免疫賦活物質及び送達システム)に記載されているアジュバント物質、及び他の物質又はそれらの混合物である。この文脈において結合化学(例えば、ヘテロ二官能性化合物、例えばGMBS、及び「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermansonに記載されているその他も当然に含み、それらを介して)は、当該分野における熟練者に知られている反応から選択され得る。さらに、ワクチン組成物はアジュバントとともに製剤化され得、好ましくは、低溶解性アルミニウム組成物、特に水酸化アルミニウムである。また、もちろん、MF59リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(例えば、QS21)、MDP誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、IC31、LPS、MPL、ポリホスファゼン、乳濁液(例えば、フロイント(Freund's)、SAF)、リポソーム、ビロソーム、免疫刺激複合体、コクリエート、PLG微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン(LT)、コレラ毒素(CT)、変異毒素(mutant toxins)(例えば、LTK63、及びLTR72)、微小粒子及び/又は重合リポソームのようなアジュバントも用いられ得る。
【００４２】
本発明の化合物は、好ましくは、NHS-ポリ(エチレンオキシド)(PEO)(例えばNHS-PEO4-マレイミド)からなる群から選択されるリンカーを介して担体又はアジュバントに結合する。
本発明の化合物(ミモトープ)及び医薬的に許容される担体を含むワクチンは、例えば、皮内、静注、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下等のあらゆる適切な投与様式、及びあらゆる適切な送達装置(O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735)により投与されうる。本発明の化合物は、好ましくは、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内投与(例えば「Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations」, Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004参照)のために製剤化される。
【００４３】
典型的には、ワクチンは、0.1ngないし10mg、好ましくは、10ngないし1mg、特に100ngないし100μg、又はあるいは、例えば100fmolないし10μmol、好ましくは、10pmolないし1μmol、特に100pmolないし100nmolで本発明の化合物を含んでいてもよい。また、典型的には、ワクチンは、例えば緩衝剤、安定剤等の補助物質を含んでいてもよい。
本発明の他の側面としては、本発明は、(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、及び(C)DNPVHPEからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００４４】
本発明の好ましい態様としては、ペプチドは医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合している。
本発明の他の側面は、本発明の少なくとも1つのペプチドを含む医薬組成物、好ましくはワクチンに関してであり、それは(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、(C)DSPVWAE、(C)DTPVLAE、(C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、(C)DQPVTAEN、(C)DSPVWAEN、(C)DTPVLAEN、(C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、(C)DNPVHPEN、(C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、(C)DTPVIPDN、(C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、(C)DSPVWAEG、(C)DRPVAPEG、(C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、(C)DSPVPPDD、(C)DQPVYPDI、(C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、(C)EYPVYPES、(C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、(C)DAPVYPDG、(C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、(C)DMPVDPEN、(C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、DMPVLPD(C)、(C)EMPVDPDN、及び(C)DNPVHPEからなる群から選択される。
本発明の医薬組成物は、あらゆるシヌクレイノパチーの治療において用いられ得、ここでそれは、例えば皮下、静脈内及び/又は筋肉内投与のためのワクチンに製剤されうる。
【実施例１】
【００４５】
本発明のミモトープの同定に用いられ得る抗体は、ヒトα-シヌクレイン誘導性アミノ酸配列DMPVDPDN(＝原エピトープ、配列番号 1)、及び全長ヒトα-シヌクレインである。それはヒトβ-シヌクレインを認識しない。抗体は、モノクローナル抗体製剤又はポリクローナル抗体製剤又はいかなる抗体部分又はその誘導体であってもよく、特異的にヒトα-シヌクレインのDMPVDPDNエピトープに結合し、すなわち、それはペプチド及び全長タンパク質には結合するが、ヒトβ-シヌクレインには結合しない。
ミモトープは、同定され、及びさらに、モノクローナル抗体(ヒトα-シヌクレイン・タンパク質のアミノ酸115-122位)及びペプチドライブラリーによって特徴づけられる。
【００４６】
実施例1:  ヒトβ-シヌクレインではなく、原ヒトα-シヌクレインエピトープC-DMPVDPDN及びヒトα-シヌクレインを特異的に検出するモノクローナル抗体の産生。
融合「AFFiRiS 3」から誘導されたモノクローナル抗体：Balb/cマウスを、BTG(ウシチログロブリン)及びCFA(完全フロイントアジュバント;最初の注入)並びにIFA(不完全フロイントアジュバント;3回の追加免疫の注射)をアジュバントとして結合した原α-シヌクレインエピトープC-DMPVDPDNにより免疫化した。DMPVDPDN-ペプチド特異的抗体産生ハイブリドーマがELISA(DMPVDPDN-ペプチド-コーティングELISAプレート)により検出された。ヒトα-シヌクレイン(遺伝子組換えタンパク質)をポジティブコントロールペプチドとして用いた:ペプチド及び全長α-シヌクレインの両方に特異的に結合するため、ELISAプレートに固定された遺伝子組換えタンパク質を認識するハイブリドーマが含まれる。ヒトβ-シヌクレイン(遺伝子組換えタンパク質)は、ネガティブコントロールペプチドとして用いた:2つの異なるシヌクレイン・タンパク質を区別しないため、ELISAプレートに固定された遺伝子組換えタンパク質を認識するハイブリドーマは含まれない。
【００４７】
ハイブリドーマクローン(AFFiRiS3/9(内部名「A509」;IgG1)を、天然ヒトα-シヌクレインエピトープDMPVDPDNの特異的検出のために分析した。A509は、ELISAにおいて、注入したエピトープだけでなく、全長α-シヌクレイン・タンパク質(遺伝子組換えタンパク質;遺伝子組換えペプチドより得られたもの、Bogart社, GA, USA)も認識する。しかし、ELISAにおいて、β-シヌクレイン・タンパク質(遺伝子組換えタンパク質;遺伝子組換えペプチドより得られたもの、Bogart社, GA, USA)は、検出しなかった。さらに、A509抗体はα-シヌクレインのマウス変異株をコードするペプチドは検出しない。同様の結果が市販のmABクローン(すなわち、α-シヌクレイン(LB509)モノクローナル抗体カタログ番号SIG-39725; Covance社(Princton, NJ, USA))からも得られた。
【実施例２】
【００４８】
実施例2:  ファージ提示法、インビトロでの結合性及び阻害性(ELISA)
この実施例において用いたファージディスプレーライブラリーは、Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L(直線7量体ライブラリー)、及びPh.D. 12: New England BioLabs E8111L(直線12量体ライブラリー)である。ファージ提示法は、製造者のプロトコール(www.neb.com)に従い行った。
2又は3の連続のピックアップにより、1つのファージクローンを選択し、及びファージ上清を、ピックアップ過程において用いた抗体でコーティングしたプレートで、ELISAにかけた。このELISAにおいて陽性(標的は強いシグナルを示したが、非特異的コントロールはシグナルを示さなかった)であったファージクローンの配列を決定した。DNA配列から、ペプチド配列を推定した。ペプチドを合成し、及びELISAにより結合性及び阻害性により特徴づけた。いくつかのペプチドには追加のアミノ酸がC末端に結合している。加えて、スクリーニングにおいて同定したミモトープの結合配列情報から、いくつかの新規なミモトープを作製した。新規にデザインされたミモトープを含むいずれの群も、ミモトープのワクチン化のためのコンセンサス配列の同定のサポートとして用いた。
【００４９】
1.  インビトロにおける結合アッセイ(ELISA)
ファージ提示法並びにそれらのC末端延長変異体から誘導されたペプチドをBSAに結合し、ELISAプレート(それぞれの図に示す通り1μM)に結合させ、続いて、同定されたペプチドの結合能の分析のためのスクリーニングプロセスに用いたモノクローナル抗体中で培養した。
2.  インビトロにおける結合阻害アッセイ(ELISA)
スクリーニングプロセスにおいて用いたモノクローナル抗体とともに、ファージディスプレーから得られた量の異なるペプチド(それぞれ図に示す通り、濃度範囲40μgないし0.3μg(段階希釈))を培養した。ELISAプレートにコーティングした原ヒトα-シヌクレインエピトープ(アミノ酸：ヒトα-シヌクレイン・タンパク質におけるタンパク質)に結合する抗体の量を減少させるペプチドを、このアッセイにおいて阻害することであるとする。
【実施例３】
【００５０】
実施例3:  インビボにおけるミモトープの試験：免疫原性及び交差反応性の分析
1.  インビボにおけるミモトープの試験
阻害並びに非阻害性ペプチドをKLHに結合させ、適切なアジュバント(水酸化アルミニウム)とともにマウス(野生型C57/Bl6マウス；脇腹への皮下注射)に注入した。動物は、隔週の間隔で4-6回ワクチン化し、血清も隔週で採取した。各血清について、注入ペプチド並びに無関係なペプチドの抗体価を決定した。それぞれ血清3から始め、遺伝子組換えヒトα-シヌクレイン・タンパク質、及び遺伝子組換えヒトβ-シヌクレインの抗体価を決定した。原ヒトα-シヌクレインエピトープ(アミノ酸115-122位)に対して、集めた血清を試験した。一般に、血清の分析は、ペプチドをウシ血清アルブミン(BSA)に結合し、ELISAプレートに固定した遺伝子組換え全長タンパク質と反応させることにより行われる。抗体価は、抗マウスIgG特異的抗体を用いて決定した。結果の詳細は図4、及び図5に示す。
【００５１】
2.  インサイチュにおけるミモトープの試験
α-syn交差反応性を示す選択された血清もマウス脳断片のインサイチュにおけるヒトα-synの検出能の試験を行った。詳細な結果は図6参照。
3.  結果
3.1.  α-シヌクレイン特異的mABの同定:
図1は、融合AFFiRiS 3に由来するα-シヌクレイン特異的モノクローナル抗体AFFiRiS3/9(内部名「A509」;IgG1)の特徴を示す。
3.2.  α-シヌクレイン特異的mABによるスクリーニング:
3.2.1.  ファージディスプレーライブラリーPh.D. 7、及び12
3.2.1.1.  DMPVDPDNに対するモノクローナル抗体のスクリーニング
PhD7及びPhD12ファージディスプレーライブラリーをスクリーニングし、このスクリーニングにより、51配列が同定された：表1は、ペプチドの同定及び原エピトープと比較したそれらの結合能の概略を示す。
【００５２】
【表１−１】
2014177483.tif 000003
【表１−２】
2014177483.tif 000004
【００５３】
表1の説明:結合能は、以下の結合コードにより示される:  1:Xは、親抗体の希釈係数を示す。
2014177483.tif 000005
3.3.  インビトロにおける、α-シヌクレインに対するモノクローナル抗体のファージディスプレーライブラリーによるスクリーニングによって同定されたミモトープの特徴：
図2及び3は、インビトロにおける結合及び阻害アッセイの代表例を示す。得られたデータは、それぞれ表1及び2に概説する。
インビトロにおける競合阻害試験において、51配列のうち29配列がα-シヌクレイン特異的モノクローナル抗体の結合を阻害した。残りの22配列はインビトロにおける競合阻害試験において、α-シヌクレイン特異的モノクローナル抗体の結合を阻害しなかったが、なお、親抗体に対する結合能は保っていた。
【００５４】
【表２】
2014177483.tif 000006
【００５５】
表2の説明：阻害能は以下の配列によってコードされている：
弱い阻害は、AB結合を低下させるのに、原エピトープよりも多くのペプチドが必要であることを意味する；強い阻害は、AB結合を低下させるのに、原エピトープと近い量のペプチドが必要であることを意味する。原ペプチドを標準としてミモトープと比較した。アッセイにおいて用いた40μgのペプチドによるODを、原ペプチドと比較して競合阻害能を計算するのに用いた。
2014177483.tif 000007
【表３】
2014177483.tif 000008
【００５６】
3.4.  インビボにおける、α-シヌクレインに対するモノクローナル抗体のファージディスプレーライブラリーにおけるスクリーニングによって同定されたミモトープの特徴付け：
雌C57/Bl6マウス各群5-6匹を、KLHに結合させたペプチド30μgで皮下注射により免疫化した。コントロール群はp4448-KLH結合体を投与した。アジュバントとしてはアラムを用いた(全て1mg/マウス)。投与したペプチドは、全て、モノクローナル抗体のヒトα-シヌクレイン特異的結合部位であるアミノ酸配列115-122位に結合することができたが、いくつかのペプチドは、その親抗体の原エピトープへの結合をインビトロで阻害しなかった(インビトロ結合阻害アッセイ)。インビトロのELISAアッセイによる抗体価の決定は、単独のマウスの血清又は集めた血清(図5参照)により、それぞれのワクチン接種2週間経過後に行った(図4及び5をそれぞれ参照)。ELISAプレートのウェルは、ミモトープ-BSA結合体及び無関係なペプチド-BSA結合体(ネガティブコントロール)によりコーティングした。ポジティブコントロールは、親抗体をミモトープ-BSA結合体と反応させて行った。検出は、抗マウスIgGで行った。さらに、遺伝子組換えタンパク質をELISAプレートに固定し、血清を反応させた。
繰り返しのワクチン接種後、C57/Bl6マウスにおいて試験した全てのミモトープについて、個々の注入したペプチドに反応する抗体が検出された。加えて、示した4つのうち2つのミモトープ(それぞれ図5及び表1参照)は、ヒトα-シヌクレインと反応し抗体を形成したが、ヒトβ-シヌクレインには反応しなかった。4つのうち2つは遺伝子組換えタンパク質は交差反応性を示さなかった。重要なことは、原エピトープDMPVDPDNは、2つの遺伝子組換えシヌクレイン・タンパク質を区別することなく免疫反応を誘導したことである。
【００５７】
図4及び5は、インビボにおけるミモトープの特徴付けに用いられたアッセイの代表例を示す。図4は、インビボにおけるミモトープのワクチン接種により誘導された免疫反応を、注入ペプチド及び関係のない配列を含む無関係なペプチドに対する免疫反応を分析することによって特徴付けた例である。原エピトープp4448、ポジティブコントロールペプチド、及びミモトープp4456、p4466、及びp4467は注入ペプチドに対して免疫反応を誘導したが、無関係な配列(p1253)に対する非特異的免疫反応は誘導しなかった。
【００５８】
図5は、インビボにおける、ミモトープのワクチン接種による全長α-シヌクレイン及びβ-シヌクレインに対する免疫反応による特徴付けの例を示す。試験した全てのワクチンは、原α-シヌクレインエピトープの115-122位に対して検出可能な免疫反応を誘導した。この実施例において試験したほとんど全てのミモトープ及び原エピトープはさらに全長α-シヌクレインに対する反応性を有した。しかし、原エピトープ誘導性免疫反応は、また全長β-シヌクレイン・タンパク質も検出し、それゆえ特異性をα-シヌクレイン特異性をなくし、2つのタンパク質を区別する能力を失っている。この発見と対照的に、(すべてではないが)ほとんどのミモトープ誘導性血清は、β-シヌクレインを検出せず、それゆえ2つのタンパク質を区別することができず、有効で安全なプロフィールを得るための活性免疫化プログラムにおける高い抗α-シヌクレイン特異性を保証することができない。
【００５９】
3.5.インサイチュにおけるミモトープの試験
α-syn特異的免疫反応を示すミモトープは、遺伝子組み換えマウス脳組織においてα-syn免疫反応性封入体も認識しうる。図6に示すように、ミモトープによりワクチン接種した動物から得られた血清は、ヒトα-synを過剰発現しているマウスの脳切片に存在するα-syn陽性の構造体を染色しうる。簡単に言うと、ELISAにおいてヒトα-syn陽性反応を示す血清は、免疫組織化学(IHC)に用いられてきた。パラフィンを敷いたマウス脳7μM断片をSuperfrost Plusガラススライドにのせ、IHCにかけた。断片を培養し(PBS中、1:100、及び1:400希釈)、続いて免疫組織化学の標準的プロトコールに従い、VECTASTAIN ABCシステムにより、DAB、及びMOMブロッキング試薬を用いて染色した(すべての反応は、それぞれVector labより入手した市販された試薬を用いて行い、製造者のプロトコールに従って行った)。対比染色は、ヘマトキシリンを用いて行った。スライドをエンテランに載せ、続いて従来からの明視野照明顕微鏡を用いて記載した。シヌクレインの検出には、最終希釈度1/250のヒトα-syn(LB509、Covance)特異的モノクローナル抗体をポジティブコントロールとして用いた
【００６０】
図6Aは、ポジティブコントロールの斑が示されている。図6Bは、この動物においてはヒトα-synを発現しないため、非遺伝子組み換えマウスの脳の同一の分野において検出されなかった。図6Cは、ミモトープから誘導された血清(p4498から誘導された血清)により、図6Aに示したのと同様のα-synに特異的な斑が見られた。ネズミ海馬におけるα-syn陽性の斑は、図6A及び図6Cに示したのと同様のたくさんの斑により特徴づけられる。α-syn特異的抗体を誘導する可能性のある実施例はp4456、p4498、及びp4562に基づくワクチンに限られない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月23日(2014.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列DMPVDPDNを含むα-シヌクレインのエピトープに特異的な抗体への結合能を有し、α-シヌクレインと結合する抗体のin vivo形成を誘導することができる、以下の構造を有する化合物であって、シヌクレイノパチーを予防及び/又は治療するための医薬を製造するための少なくとも1つの該化合物の使用：
(X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)m          (式1)
［ここで、
X1は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
X2は、アミノ酸残基がアスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択され、
X3は、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)、チロシン(Y)、アラニン(A)、及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X4は、グルタミン(Q)、トリプトファン(W)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、チロシン(Y)、アラニン(A)、セリン(S)、及びロイシン(L)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X5は、プロリン(P)及びアラニン(A)からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
X6は、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸残基  であり、
X7は、いかなるアミノ酸残基であってもよく、
n及びmは、独立して、0又は0より大きい整数であり、
及び
式Iのアミノ酸配列は、アミノ酸配列DMPVDPDNを有するα-シヌクレインの8量体ポリペプチドと同一のポリペプチド又はその断片を含まない］。
【請求項２】
X1及び/又はX7が、アセチルアミノ酸残基又はシステイン(C)であることにより特徴づけられる請求項1に記載の使用。
【請求項３】
化合物が、7ないし16アミノ酸残基を含むポリペプチドであることにより特徴づけられる請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
化合物が、(C)DQPVLPD、(C)DMPVLPD、(C)DSPVLPD、 (C)DQPVLPDN、(C)DMPVLPDN、(C)DSPVLPDN、 (C)HDRPVTPD、(C)DRPVTPD、(C)DVPVLPD、(C)DTPVYPD、(C)DTPVIPD、(C)HDRPVTPDN、(C)DRPVTPDN、 (C)DVPVLPDN、(C)DTPVYPDN、 (C)DQPVLPDG、(C)DMPVLPDG、(C)DSPVLPDG、 (C)DHPVHPDS、(C)DMPVSPDR、 (C)DRPVYPDI、(C)DHPVTPDR、 (C)DTPVLPDS、(C)DMPVTPDT、(C)DAPVTPDT、(C)DSPVVPDN、(C)DLPVTPDR、(C)DSPVHPDT、(C)DAPVRPDS、(C)DMPVWPDG、 (C)DRPVQPDR、(C)YDRPVQPDR、 (C)DMPVDADN、DQPVLPD(C)、およびDMPVLPD(C)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド含むことにより特徴づけられる請求項1ないし3のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
シヌクレイノパチーが、レビー小体病(LBDs)、好ましくは、パーキンソン病(PD)、痴呆を伴うパーキンソン病(PDD)、及びレビー小体型認知症(DLB)、並びに多系統萎縮症(MSA)又は脳内の鉄蓄積を伴うI型神経変性(I型NBIA)からなる群から選択されることにより特徴づけられる請求項1ないし4のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
化合物が、医薬的に許容される担体、好ましくは、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合していることにより特徴づけられる請求項1ないし5のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
化合物が静脈内、皮下、皮内又は筋肉内投与のために製剤されることにより特徴づけられる請求項1ないし6のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
化合物が、アジュバント、好ましくは、水酸化アルミニウムとともに製剤されることにより特徴づけられる請求項1ないし7のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
化合物が薬剤中、0.1ngないし10mg、好ましくは10ngないし1mg、特に100ngないし100μg含まれることにより特徴づけられる請求項1ないし8のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
CDQPVLPD、CDMPVLPD、CDSPVLPD、CDQPVLPDN、CDMPVLPDN、CDSPVLPDN、CHDRPVTPD、CDRPVTPD、CDVPVLPD、CDTPVYPD、CDTPVIPD、CHDRPVTPDN、CDRPVTPDN、CDVPVLPDN、CDTPVYPDN、CDQPVLPDG、CDMPVLPDG、CDSPVLPDG、CDHPVHPDS、CDMPVSPDR、CDRPVYPDI、CDHPVTPDR、CDTPVLPDS、CDMPVTPDT、CDAPVTPDT、CDSPVVPDN、CDLPVTPDR、CDSPVHPDT、CDAPVRPDS、CDMPVWPDG、CDRPVQPDR、CYDRPVQPDR、CDMPVDADN、DQPVLPDC、およびDMPVLPDCからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１１】
ペプチドが医薬的に許容される担体、好ましくはKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合していることにより特徴づけられる請求項10に記載のペプチド。
【請求項１２】
好ましくはワクチンである、少なくとも1つのペプチドを含む請求項10又は11に記載の医薬製剤。
【外国語明細書】
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