(57)【要約】  【課題】脂肪細胞においてＧＩＰ受容体を効率よく発現できる系、及び当該発現系の利用法の提供。  【解決手段】脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
【請求項２】
脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
【請求項３】
脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＨＩＦαを活性化する工程が、低酸素環境下での培養である、請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＦαを活性化する工程が、ＨＩＦα活性化剤を培地に添加する培養である、請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項３記載の方法。
（ａ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｂ）被験物質を前記培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
【請求項８】
以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含む、請求項４記載の方法。
（ｄ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
【請求項９】
脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞及びＯｂ１７７１細胞から選ばれる前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、６〜１６日目の細胞を用いる請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＦα活性化剤が、２価のコバルトイオン、ニッケルイオン、マンガンイオン及びデフェロキサミンメシル酸塩、Ｏ−フェナントロリン、ヒドロキシピリジノンから選ばれる１種以上である、請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現制御及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管ホルモンの１つであるＧＩＰ（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、グルコース依存的に膵臓β細胞からインスリン分泌を促進し、血糖値の調節に寄与するインクレチンとして知られている。
【０００３】
一方で、ＧＩＰはインクレチン作用以外に、脂肪組織、骨、神経細胞において様々な膵外作用を有することが報告されている（非特許文献１）。中でも、ＧＩＰと肥満の関連性が示唆されており、脂肪組織に対するＧＩＰの作用は特に着目されている。すなわち、脂肪細胞にはＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）が発現し、ＧＩＰＲ欠損マウスにおいて高脂肪食負荷による肥満が認められないことが報告され（非特許文献２）、また、脂肪組織に対するＧＩＰの作用として、ＬＰＬ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ）活性化を介した脂肪酸取り込みの促進（非特許文献３）、Ａｋｔを介した糖取り込みの亢進（非特許文献４）、脂肪蓄積亢進（非特許文献５）、炎症性の亢進（非特許文献６）等が報告されている。
【０００４】
したがって、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現や機能の解析を進めることは、肥満や炎症のメカニズム解明や受容体分子を標的とした抗肥満物質や抗炎症物質の開発につながり、重要である。
上記非特許文献６では、アデノウィスルベクターを用い、ＧＩＰ受容体を強制高発現させた脂肪細胞において、インターロイキン６（ＩＬ６）の発現・産生が促進し、炎症反応が亢進することが開示されているが、アデノウィスルベクターを用いＧＩＰ受容体を強制高発現させる系は、操作が煩雑であり、また非生理的であることから、受容体機能の解明やスクリーニング系として使用することには適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Seino Y et al. GIP and GLP-1, the two incretin hormones: Similarities and differences. Journal of Diabetes Investigation (2010), 1, pp.8-23
【非特許文献２】Yip RG. et al. Functional GIP receptors are present on adipocytes. Endocrinology (1998), 139(9), pp.4004-4007
【非特許文献３】Miyawaki et al. Inhibition of gastric inhibitory polypeptide signaling prevents obesity. Nat Med. (2002), 8(7), pp.738-742
【非特許文献４】Song DH et al. Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide Enhances Adipocyte Development and Glucose Uptake in Part Through Akt Activation. Gastroenterology (2007), 133(6), pp.1796-1805
【非特許文献５】Kim SJ et al. Activation of Lipoprotein Lipase by Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide in Adipocytes. JBC (2007), 282(12), pp. 8557-8567
【非特許文献６】Nie Y et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide impairs insulin signaling via inducing adipocyte inflammation in glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor-overexpressing adipocytes. FASEB Journal (2012), 26(6), pp. 2383-2393
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体を効率よく発現できる系、及び当該発現系の利用法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明らは、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現について検討したところ、低酸素応答因子として知られているＨＩＦα（Hypoxia-inducible factor 1α）を活性化することにより、ＧＩＰ受容体の発現が高まり且つ維持されることを見出した。
【０００８】
すなわち、以下の１）−４）に係るものである。
１）脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
２）脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
３）脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
４）脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現を、アデノウィスルベクター等を用い、強発現させるような面倒な手間を掛けずに効率よく行うことができる。したがって、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現解析や機能解析を容易に行うことができ、これにより肥満や炎症のメカニズム解明や受容体分子を標的とした抗肥満物質や抗炎症物質等の探索が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】低酸素環境下（擬似低酸素環境）でのＧＩＰ受容体の発現変化を示すグラフ。
【図２】低酸素環境下（低酸素培養）でのＧＩＰ受容体の発現変化を示すグラフ。
【図３】低酸素環境下（低酸素培養）でのＧＩＰ受容体の発現に及ぼすＨＩＦα発現抑制の影響を示すグラフ。左：ＧＩＰ受容体の発現、右：ＨＩＦαの発現
【図４】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に伴うＧＩＰ受容体の遺伝子発現を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）の発現は、脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含むことによって行われる。
ここで、「脂肪細胞」は、脂肪細胞の性質（例えば、脂肪細胞特有の細胞内代謝を行い、脂肪滴を多量に蓄積する）をもち、ＧＩＰ受容体を発現し得る細胞であればよく、ヒトやラットの初代培養細胞等の培養脂肪細胞の他、前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞でもよい。前駆脂肪細胞としては、脂肪細胞に分化する能力を有する線維芽細胞として広く当該研究領域で使用されている３Ｔ３−Ｌ１細胞（Journal of Biological Chemistry (1996), 271(5), pp.2365-2368）、Ｏｂ１７７１（Biochemical and Biophysical Research Communications (1997), 238(2), pp.606-611）等が挙げられる。各種の動物に由来する脂肪前駆細胞は市販されており、適当な販社から購入することができる。例えばマウス由来の３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社等から購入することができる。
前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導は、公知の方法により前駆脂肪細胞に分化誘導刺激を加えることで行うことができる。例えば、３Ｔ３−Ｌ１細胞を脂肪細胞に誘導する場合、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＩＢＭＸ(３-Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ)、Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を含む脂肪細胞分化誘導カクテル等により当該前駆脂肪細胞の分化誘導を行うことができる（Wu Z. et
al., Genes & Dev. (1992), 9, pp.2350-2363等）。
【００１２】
前駆脂肪細胞から脂肪細胞へ分化誘導する場合、参考例１に示すように、３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、ＧＩＰ受容体は分化初期及び成熟期において２相性の発現を示し、その発現量は成熟期（分化誘導後６日目頃）において顕著に増加する。したがって、前駆脂肪細胞を分化誘導して用いる場合は、成熟期以降の細胞を用いるのが好ましく、例えば３Ｔ３−Ｌ１細胞であれば分化誘導後６日目以降、例えば６〜１６日目の細胞を用いるのが好ましい。
【００１３】
「ＨＩＦα」とは、細胞に対する酸素供給が不足状態に陥った際に誘導されるタンパク質であり、転写因子として機能する低酸素応答因子（Hypoxia Inducible Factor、HIF）のαサブユニットである。本発明は、脂肪細胞において、当該ＨＩＦαを活性化する工程を含むものである。
【００１４】
ここで、ＨＩＦαの活性化とは、ＨＩＦαの分解を抑制し安定化すること、転写機能を活性化すること、ＨＩＦαの発現を亢進させること等が含まれる。
通常酸素環境下では、ＨＩＦαはプロリン水酸化酵素（ＰＨＤ）によって水酸化修飾を受け、水酸化修飾されたＨＩＦαはユビキチン化され、プロテアソームで恒常的に分解されている。一方、低酸素条件下では、ＰＨＤは不活性化されていることから、ＨＩＦαの水酸化は抑制され、ＨＩＦαは安定化する（実験医学  2012 Vol.30 No.8, (5), 代謝、発生、免疫で動き出す低酸素応答システム）。したがって、本発明のＨＩＦαを活性化する手段（工程）としては、細胞を低酸素状態に置くことがその一態様として挙げられる。また別の態様として、ＨＩＦα活性化剤を培地に添加すること（Yun.Z et al., Developmental Cell, (2002), Vol.2, 331-341、Hanson. ES et al., JBC (2003), Vol. 278, 40337-40342他）が挙げられる。
【００１５】
細胞を低酸素状態に置く手段としては、例えば、細胞を低酸素環境下で培養することが挙げられる。
ここで、「低酸素環境下」とは、酸素が少ない環境下（「低酸素雰囲気下」）を意味し、「低酸素」とは、常酸素濃度（２１％）を下回る酸素濃度をいう。低酸素環境下における酸素の濃度は、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、更に好ましくは２％以下である。培養に供する細胞の生存を維持するため、最小限度の酸素濃度は必要である。斯かる観点から、酸素濃度は０．０１％以上、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上、更に好ましくは１％以上とするのがよい。また、好適な酸素濃度は、０．０１〜１０％、０．１〜１０％、０．５〜１０％、１〜１０％、０．０１〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、１〜５％、０．０１〜２％、０．１〜２％、０．５〜２％、１〜２％等である。
【００１６】
低酸素雰囲気は、例えば、低酸素培養キット（ＢＩＯＮＩＸ（スギヤマゲン））等を用いて、酸素濃度を上記の範囲に調節することにより実現できる。
【００１７】
ＨＩＦα活性化剤としては、ＨＩＦαの分解を抑制し安定化させる、ＨＩＦαの転写活性機能を亢進させる及びＨＩＦαの発現を誘導する、という機能を少なくとも一つ以上有する化合物又は因子が挙げられる。
斯かるＨＩＦα活性化剤は、夫々ＨＩＦαと相互作用する化合物、ＨＩＦαに結合する化合物、ＨＩＦαを修飾する化合物、或いはＨＩＦαと相互作用する因子（例えば、ＨＩＦαが基質となる酵素）の何れであっても良い。化合物としては、ポリヌクレオチドやポリペプチド、抗体、他のタンパク質、炭水化物、脂肪、脂質、有機及び無機物質（例えば、小分子等）の何れでもよいが、小分子化合物が好ましい。
【００１８】
ＨＩＦα活性化剤としては、例えば、２価のコバルトイオンやニッケルイオン、マンガンイオン、鉄のキレーターであるデフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯ）、Ｏ−フェナントロリン、ヒドロキシピリジノン等が挙げられる。
【００１９】
斯かるＨＩＦα活性化剤の添加量は、ＨＩＦαの安定化或いは転写活性能を亢進させる量であれば特に限定されない。
例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、マンガンイオンを用いる場合は、２５μＭ〜２００μＭ、ＤＦＯ、Ｏ−フェナントロリン、ヒドロキシピリジノンを用いる場合は、１０μＭ〜２００μＭが好ましい。
【００２０】
上記ＨＩＦαを活性化する工程において行われる脂肪細胞の培養は、培地として、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地を用いることができる。(H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. 11, 1552 (2004); Miki et al., Mol. Cell. Biol. (2001), 21, 2521; H. Sakaue et al., Genes & Dev. (2002), 16, 908を参照)
【００２１】
これらの培地には、ＧＩＰ受容体の発現に影響を与えない範囲で、適宜添加剤を添加することができる。
【００２２】
培養の温度は３０℃〜４０℃、好ましくは３５℃〜３７℃である。培地のｐＨ値は、一般に６〜８、好ましくはｐＨ７〜７．５である。
また、培養期間は、例えば１時間以上、４８時間以下であり、好ましくは、４時間以上、２４時間以下である。より好ましくは８時間以上、１６時間以下である。
【００２３】
培養後、培養物から脂肪細胞を回収する。回収方法は特に限定されないが、例えば、トリプシンを用いることが出来る。また、ＲＮＡを回収する際は、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ
５０（ＱＩＡＧＥＮ）付属のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを用いることが出来る。
【００２４】
後記実施例に示すように、ＨＩＦαの活性化剤を添加して脂肪細胞を培養すると、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現量が増加し、且つその発現は維持される（実施例1）。
また、脂肪細胞を低酸素環境下で培養すると、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現量が増加し、且つその発現は維持され（実施例２）、この場合において、ＨＩＦαの発現を抑制すると、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現量が抑制される（実施例３）。
したがって、脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化させる培養系は、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強のために使用できる。また、脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化させる培養系は、ＧＩＰ受容体の機能を解析するため、ＧＩＰ受容体発現制御物質又はＧＩＰ受容体親和性物質をスクリーニングするために使用できる。
【００２５】
ここで、ＧＩＰ受容体の発現増強とは、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体の存在量及び／又は産生量が増加することを意味する。当該ＧＩＰ受容体の存在量又は産生量は、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量として測定でき、遺伝子発現量の測定は、公知の方法によりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後、定量的リアルタイムＰＣＲ法等を用いることにより行うことができる。
【００２６】
ＧＩＰ受容体の機能としては、ＧＩＰ受容体を介して引き起こされる各種細胞刺激活性や、糖取り込み促進作用、脂肪蓄積促進作用、脂肪分解抑制作用等が挙げられる。細胞刺激活性としては、例えば、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、細胞内タンパク質のリン酸化、炎症性サイトカイン（インターロイキン６（ＩＬ６）、ＴNＦα、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ１）の産生等が挙げられる。
【００２７】
また、ＧＩＰ受容体発現制御物質とは、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体の発現量を増加又は減少させる物質を意味する。ＧＩＰ受容体の発現量は、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量として測定できる。
【００２８】
また、ＧＩＰ受容体親和性物質としては、ＧＩＰ受容体に結合して受容体を活性化する物質、ＧＩＰ受容体に結合するが受容体を活性化しない物質等が挙げられる。受容体活性としては、ＧＩＰ受容体を介した細胞刺激活性、例えば、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、細胞内タンパク質のリン酸化、ＩＬ６、ＴＮＦαの産生等が挙げられる。
【００２９】
脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含むＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むものである。
（ａ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｂ）被験物質を前記培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
【００３０】
工程（ａ）の培養は、前記したとおりである。工程（ｂ）被験物質の接触は、被験物質を共培養系へ、１時間〜２４時間程度接触させることが好ましい。工程（ｃ）では、ＧＩＰ受容体の発現レベルが評価されるが、当該ＧＩＰ受容体発現レベルは、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。発現レベルの比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。比較の結果、被験物質の非存在下に対して被験物質の存在下で、ＧＩＰ受容体発現レベルの抑制が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体発現抑制物質となり得る。
【００３１】
また、脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含むＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法は、具体的には、例えば、以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含むものである。
（ｄ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
【００３２】
工程（ｄ）の培養は、前記したとおりである。工程（ｅ）被験物質及びＧＩＰの添加は、培養系へ、１時間〜２４時間分程度接触させることが好ましい。工程（ｆ）では、被験物質及びＧＩＰの存在下における受容体活性が測定される。同時に該受容体活性を、被験物質の非存在下の活性と比較する。受容体活性の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。比較の結果、被験物質の非存在下に対して被験物質の存在下で、活性の促進が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体作動物質、活性の抑制が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体阻害物質となり得る。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
＜２＞脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
＜３＞脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
＜４＞脂肪細胞においてＨＩＦαを活性化する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
＜５＞ＨＩＦαを活性化する工程が、低酸素環境下での培養である、＜１＞〜＜４＞の方法。
＜６＞ＨＩＦαを活性化する工程が、ＨＩＦα活性化剤を培地に添加する培養である、＜１＞〜＜４＞の方法。
＜７＞以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、＜３＞の方法。
（ａ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｂ）被験物質を前記培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
＜８＞以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含む、＜４＞の方法。
（ｄ）脂肪細胞を低酸素環境下で培養する工程、又は培地にＨＩＦα活性化剤を添加して脂肪細胞を培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
＜９＞脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞及びＯｂ１７７１細胞から選ばれる前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞である、＜１＞〜＜８＞の方法。
＜１０＞脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、６〜１６日目の細胞を用いる＜１＞〜＜９＞の方法。
＜１１＞ＨＩＦα活性化剤が、好ましくは２価のコバルトイオン、ニッケルイオン、マンガンイオン及びデフェロキサミンメシル酸塩、Ｏ−フェナントロリン、ヒドロキシピリジノンから選ばれる一種以上である＜６＞〜＜１０＞の方法。
【実施例】
【００３４】
実施例１  低酸素環境下でのＧＩＰＲの発現（１）
（１）分化誘導
３Ｔ３−Ｌ１（ＤＳ  ファーマバイオメディカル株式会社）をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｓｉｇｍａ）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で継代培養した後、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、若しくは６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。２日後、Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）：１０μｇ／ｍｌ，ＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）：０．５ｍＭ，Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）：１μＭを含む上記ＤＭＥＭ培地に交換し、分化誘導を開始した。更に２日後Ｉｎｓｕｌｉｎ：５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ培地に交換し、２日間培養した。その後、ＤＭＥＭ培地にて２日毎に培地交換をし、分化誘導開始から合計６日間培養した。
（２）低酸素環境下での培養
分化誘導後６日目の３Ｔ３−Ｌ１に、ＨＩＦα活性化剤である塩化コバルトII（ＣｏＣｌ2，Ｗａｋｏ）、又はデフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯ，Ｓｉｇｍａ）（５０，１００，２００ｎＭ）を含む培地で培養した。２４時間後、以下の方法により、３Ｔ３−Ｌ１におけるＧＩＰＲの遺伝子発現レベルの測定を行った。
【００３５】
（３）遺伝子発現量の測定
培養後の３Ｔ３−Ｌ１より、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ５０（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成（Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）後、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）により遺伝子の発現定量を行い、内部標準として３６Ｂ４を用い、各遺伝子の発現量を補正した。なお、プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓのＧＩＰ受容体(Ｍｍ０１３１６３４４＿ｍ１)、３６Ｂ４(Ｍｍ００７２５４４８＿ｓ１)を用いた。
【００３６】
（４）結果
その結果、図１に示すように、ＣｏＣｌ2又はＤＦＯ（５０，１００，２００ｎＭ）濃度依存的にＧＩＰＲの発現が亢進した。
【００３７】
実施例２  低酸素培養によるＧＩＰＲ発現（２）
実施例１と同様の方法により３Ｔ３−Ｌ１を分化誘導し、分化誘導後６日目の３Ｔ３−Ｌ１をＢＩＯＮＩＸ（スギヤマゲン）低酸素培養キットを用いて、脱酸素剤により酸素濃度を２％以下に維持し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータにて培養した。また、対照培養としては、低酸素状態としない同実験系で行った。２４時間後、実施例１と同様に、３Ｔ３−Ｌ１におけるＧＩＰＲの遺伝子発現レベルの測定を行った。
その結果、図２に示すように、低酸素状態である２％Ｏ2により、ＧＩＰＲの発現が亢進した。
【００３８】
実施例３  ＨＩＦ１αｓｉＲＮＡがＧＩＰＲの発現に及ぼす影響
（１）ｓｉＲＮＡの導入
分化誘導後６日目の３Ｔ３−Ｌ１に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  （ＳｉｌｅｎｃｅｒR  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、あるいはＨＩＦ１αに対するｓｉＲＮＡ（ＦｌｅｘｉＴｕｂｅ  ＧｅｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＧＳ１５２５１  ｆｏｒ  ＨＩＦ１α；  Ｑｉａｇｅｎ）の導入を行った。これらの操作は添付のプロトコルに従い、Ｒｅｖｅｒｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法で行った。なお、各ウェルへの細胞播種数は５×１０４／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）とし、ｓｉＲＮＡ濃度は１０ｎＭとした。
【００３９】
（２）ＨＩＦ１αｓｉＲＮＡがＧＩＰＲの発現に及ぼす影響
ＨＩＦ１αに対するｓｉＲＮＡを用いて、ＧＩＰＲの発現に及ぼす影響を検討した。その結果、ＨＩＦ１αを７０％Ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ  （ＫＤ）した条件において、実施例２と同様の方法で低酸素培養した。その結果、低酸素培養（２％Ｏ2）によって増強されるＧＩＰＲの発現が著明に低下した（図３）。これらの結果から、低酸素によって誘導されるＧＩＰＲはＨＩＦ１αの制御下にあることが示唆された。
【００４０】
参考例１
３Ｔ３−Ｌ１を実施例１の方法に従い、分化誘導させ、分化誘導後０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、２ｄａｙ、３ｄａｙ、４ｄａｙ、６ｄａｙ、８ｄａｙ、１２ｄａｙ、１６ｄａｙにおいて上記方法によりＲＮＡ抽出、ＧＩＰ受容体の遺伝子発現解析を行った。
その結果、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に伴い、ＧＩＰ受容体は分化後２ｈ、６日目に２相性の発現を示すことが確認された（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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