(57)【要約】【課題】薬物もしくは他の治療に耐性を示す変異型ＨＣＶまたは他のウイルスを同定し、そしてこれらの変異型ウイルスに対して有効である新規なウイルス治療を提供する。【解決手段】本発明は、ＨＣＶ改変体、および関連の方法および組成物を提供する。特に、ＶＸ−９５０のような１種以上のプロテアーゼインヒビターに対する感受性が低下している、ＨＣＶ改変体および改変体ＨＣＶプロテアーゼが、提供される。１つの局面において、本発明は、単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードするＨＣＶポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメントを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）改変体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中で１億７千万人を超える人々に感染し、慢性肝炎の主要な原因であり、この慢性肝炎は、最終的に、末期の肝硬変および肝細胞癌をもたらす。ＨＣＶ感染についての現在の標準的な処置は、ペグ化インターフェロンα（Ｐｅｇ−ＩＦＮ）とリバビリン（ＲＢＶ）との組み合わせである。ＨＣＶ治療の目標は、持続的ウイルス応答（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＳＶＲ）を得ることによってウイルス感染を消滅させることであり、抗ウイルス処置の６ヵ月後に血液中にＨＣＶ−ＲＮＡが検出されないことによって定義される。不運なことに、現在の処置は、遺伝子型１を有する被験体の約５０％において有効でなく、そして副作用が大きい。したがって、新しい抗ウイルス標的および改善された処置戦略が、必要とされている（非特許文献１、非特許文献２）。
非構造（ＮＳ）３−４Ａプロテアーゼは、ＨＣＶ複製のために必須であり、そして新規な抗ＨＣＶ治療についての有望な標的である。強力かつ特異的なＮＳ３−４ＡプロテアーゼインヒビターであるＶＸ−９５０は、ＨＣＶ遺伝子型１に感染した被験体の第１ｂ相臨床試験（Ｓｔｕｄｙ  ＶＸ０４−９５０−１０１）において実質的な抗ウイルス活性を示した。被験体が処置に応答する程度およびウイルスの跳ね返りが観察される割合は、プロテアーゼインヒビターに対する感受性における遺伝子型による相違に部分的に起因し得る。ＨＣＶの迅速な複製速度およびＨＣＶのポリメラーゼの忠実度の低さは、ＨＣＶのゲノム全体の変異の蓄積をもたらす（非特許文献３）。プロテアーゼ領域における配列の変化性が、酵素の触媒効率またはインヒビターの結合に影響する程度は、知られていない。さらに、顕著な配列変化を有する多くのウイルスゲノムの産生は、抗ウイルス治療によって処置される被験体における薬物耐性ウイルスの出現の問題の可能性を提示する。実際、抗ウイルス薬物（例えば、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター）に対する薬物耐性は、よく報告されている（非特許文献４）。薬物耐性変異は、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターの存在下でインビトロで発生することが、既に示されている（非特許文献５〜８）。プロテアーゼインヒビターＢＩＬＮ  ２０６１に対して耐性である変異が、ＮＳ３遺伝子におけるＲ１５５Ｑ、Ａ１５６Ｔ、およびＤ１６８Ｖ／Ａ／Ｙの位置において見出されているが、ＮＳ４領域またはＮＳ４プロテアーゼ切断部位においては変異は未だ観察されていない。ＶＸ−９５０耐性変異もまた、Ａ１５６Ｓの位置においてインビトロで見出されている。ＶＸ−９５０およびＢＩＬＮ  ２０６１の両方に対する交差耐性変異もまた、１５６位（Ａ１５６Ｖ／Ｔ）においてインビトロでの発生が示されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．，およびＪ．Ｇ．ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，２００４，「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ：ｐｒｏｍｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｉｔｆａｌｌｓ．Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ＡＡＳＬＤ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔｏｐｉｃ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７−Ｍａｒｃｈ  １，２００３」，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９：５５４−６７
【非特許文献２】Ｓｔｒａｄｅｒ，ら，２００４，「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．」，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９：１１４７−７１
【非特許文献３】Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．，２００４，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−１５  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３１７３−８８
【非特許文献４】Ｊｏｈｎｓｏｎ，ら，２００４，Ｔｏｐ．ＨＩＶ  Ｍｅｄ．１２：１１９−２４
【非特許文献５】Ｌｉｎら，２００５，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｗｏ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＶＸ−９５０  ａｎｄ  ＢＩＬＮ  ２０６１．」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３６７８４−３６７９１
【非特許文献６】Ｌｉｎ，ら，２００４，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＶＸ−９５０  ａｎｄ  ＢＩＬＮ  ２０６１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７５０８−１７５１４
【非特許文献７】Ｌｕ，ら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２２６０−６
【非特許文献８】Ｔｒｏｚｚｉ，ら，２００３，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３６６９−７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、薬物もしくは他の治療に耐性を示す変異型ＨＣＶまたは他のウイルスを同定する必要、およびこれらの変異型ウイルスに対して有効である新規なウイルス治療を開発する必要が、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
したがって、本発明は、ＨＣＶ改変体、および関連の方法および組成物を提供する。特に、ＶＸ−９５０のような１種以上のプロテアーゼインヒビターに対する感受性が低下している、ＨＣＶ改変体および改変体ＨＣＶプロテアーゼが、提供される。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードするＨＣＶポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメントを提供する。この単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６に対応する少なくとも１つのコドンを有し、この少なくとも１つのコドンは、対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている。該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその一部分（例えば、配列番号１の最初の５４３ヌクレオチド）を含んでもよい。あるいは、該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドは、配列番号１の配列に対して少なくとも６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一であるヌクレオチド配列、またはその一部分を含んでもよい。
【０００７】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６に対応するコドンを含み、このコドンは、Ｖをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｍ、Ｌ、Ａ、またはＧをコードする。
【０００８】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン４１に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ｑをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｈをコードする。
【０００９】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン４３に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ｆをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｓをコードする。
【００１０】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン５４に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ｔをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、ＳまたはＡをコードする。
【００１１】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン１４８に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ｇをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｅをコードする。
【００１２】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン１５５に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ｒをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｉ、またはＬをコードする。
【００１３】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン１５６に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、Ａをコードしない。特定の実施形態において、このコドンは、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＩをコードする。
【００１４】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択される任意の２つのコドンに対応する２つのコドンを含み、そしてこの２つのコドンは、どちらかが上記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドの対応するコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように、変異されている。例えば、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６に対応するコドンを含み、そしてこのコドンは、ＡまたはＭをコードする；上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドのコドン１５５に対応するコドンをさらに含み、そしてこのコドンは、ＫまたはＴをコードする；あるいは、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドのコドン１５６に対応するコドンをさらに含み、そしてこのコドンは、Ｔをコードする。
【００１５】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択される任意の３つのコドンに対応する３つのコドンを含み、そしてこの３つのコドンは、この３つのコドンの各々が、上記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドの対応するコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように、変異されている。
【００１６】
特定の実施形態において、上記単離されたＨＣＶポリヌクレオチドは、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６に対応する４つのコドンを含み、そしてこの４つのコドンは、この４つのコドンの各々が、上記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドの対応するコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように、変異されている。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のＨＣＶポリヌクレオチドを含む方法および組成物を提供する。例えば、上記ＨＣＶポリヌクレオチドを含む発現系が提供され、そしてこのような発現系は、プロモーターに作動可能に連結した上記ＨＣＶポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る；このベクターでトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入された宿主細胞もまた、提供される。あるいは、本発明の発現系は、ｍＲＮＡディスプレイ技術（例えば、米国特許第６，２５８，５５８号に記載されるＲＮＡ−タンパク質融合技術、または米国特許第６，３６１，９４３号に記載されるインビトロ「ウイルス」技術）に基づく。
【００１８】
別の局面において、本発明は、単離されたＨＣＶ改変体を提供する。単離されたＨＣＶ改変体は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み得、ここで、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択されるコドンに対応する該ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコドンは、該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドの対応するコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている。本発明のさらなる実施形態は、上記ＨＣＶ改変体を含む方法および組成物を提供する。例えば、本発明のＨＣＶ改変体の複製を阻害し得る化合物を同定するための方法が、提供される；本発明のＨＣＶ改変体によって感染した細胞が、提供される。
【００１９】
別の局面において、本発明は、単離されたＨＣＶプロテアーゼ、特にＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを提供する。単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含み得る。上記野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部分（例えば、配列番号２の最初の１８１アミノ酸）を含み得る。上記単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの生物学的に活性なアナログまたはフラグメントを含み得る（例えば、上記単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２のＮ末端の５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、または４８アミノ酸を有さない場合がある）。
【００２０】
単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼはまた、ＮＳ４Ａ補因子（例えば、配列番号２の最後の５４アミノ酸によって表されるようなＮＳ４Ａタンパク質）を含み得る。単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、ＮＳ４Ａ補因子をＮＳ３プロテアーゼドメインに繋留（ｔｅｔｈｅｒ）することによって形成されるタンパク質複合体であってもよい（例えば、米国特許第６，６５３，１２７号および同第６，２１１，３３８号に記載される）。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、本発明のＨＣＶプロテアーゼに特異的な抗体を提供する。この抗体は、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを認識し得る。本発明のさらなる実施形態は、本発明の抗ＨＣＶプロテアーゼ抗体を含む方法および組成物を提供する。例えば、本発明の抗体を含む診断キット、ならびに本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が、提供される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で本発明のＨＣＶポリヌクレオチドの核酸配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチドプローブまたはプライマーを提供する。本発明のさらなる実施形態は、上記プローブまたはプライマーを含む方法および組成物を提供する。例えば、本発明のプローブもしくはプライマーを含む診断キットまたは検出キットが提供され、そしてこのキットは、例えば、本発明のＨＣＶ改変体またはＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼがサンプル中に存在するか否かを決定するために有用である。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、患者におけるＨＣＶ感染のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価するための方法を提供する。このような方法は、ＨＣＶ感染患者から生物学的サンプルを収集する工程、ならびに該サンプルが該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードする核酸を含むか否かを評価するかまたは決定する工程を、包含する。上記プロテアーゼインヒビターは、ＶＸ−９５０であってもよく、または別のプロテアーゼインヒビターであってもよい。
【００２４】
患者におけるＨＣＶ感染のための処置を指示するか、または治療レジメンを設計するための方法もまた、提供される。この方法は、該患者のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価する工程、および該薬物耐性または感受性に基づいて該患者のためのレジメンを決定する工程を、包含し得る。例えば、薬物耐性が予測されるかまたは検出される（例えば、ＶＸ−９５０のようなプロテアーゼインヒビターに対する感受性の低下）場合、１種以上の他の化合物または薬剤が、該患者の処置計画もしくは治療レジメンに含められ得る。この方法は、該患者におけるＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの配列を決定する工程（例えば、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））、該患者におけるＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのプロテアーゼインヒビターに対する感受性を決定（例えば、表現型決定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））する工程、または患者のＨＣＶのウイルス適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）レベルを決定する工程の任意の組み合わせを含み得る。この表現型決定は、無細胞系（例えば、インビトロプロテアーゼアッセイ）および細胞ベースの系（例えば、レプリコンアッセイまたはウイルス感染もしくはウイルス複製アッセイ）において実施され得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、患者におけるＨＣＶ感染を処置するための候補化合物を同定するための方法を、提供する。このような方法は、本発明のＨＣＶ改変体によって感染したサンプルを提供する工程、および該サンプル中で該ＨＣＶ改変体の活性を阻害する候補化合物の能力をアッセイする工程を、包含し得る。ＨＣＶ改変体に感染したサンプルは、患者から得られ得る（例えば、細胞サンプルもしくは血漿サンプル）。ＨＣＶ改変体に感染したサンプルはまた、培養細胞であってもよい。ＨＣＶ改変体の活性は、感染するか、複製するか、そして／または放出されるその能力によって決定され得る。
【００２６】
あるいは、このような方法は、本発明のＨＣＶポリヌクレオチドを含むレプリコンＲＮＡを提供する工程、および候補化合物が該レプリコンＲＮＡの複製を阻害するか否かを適切なアッセイにおいて決定する工程を、包含し得る。
【００２７】
別の代替の方法は、本発明の単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよびプロテアーゼ基質を提供する工程、および該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ活性が、候補化合物の存在下で低下するか否かを決定する工程を包含し得る；該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよび／または該プロテアーゼ基質は、細胞ベースの系において存在してもよく（例えば、培養細胞中で発現される）、または該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよび／または該プロテアーゼ基質は、無細胞系（例えば、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよびペプチド基質を含む反応混合物）において存在してもよい。該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、米国特許第６，２５８，５５８号において記載されるようなＲＮＡ−タンパク質融合分子であってもよく、このような融合分子は、プロテアーゼ活性を評価する無細胞アッセイに含まれてもよい。
【００２８】
患者におけるＨＣＶ感染を処置するための候補化合物を評価するためのさらなる代替方法は、本発明のＨＣＶポリヌクレオチドおよびインジケーターをコードする指示遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に導入する工程、および該インジケーターを候補化合物の存在下および候補化合物の非存在下で測定する工程を、包含する。本発明の別の局面は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ（例えば、ＶＸ−９５０に対して耐性になっているＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ）に対するＶＸ−９５０の活性をレスキューし得る化合物を同定するための方法を提供する。そのような化合物はまた、「二次化合物」とも呼ばれる。この方法は、本発明のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを候補化合物と接触させる工程、および該ＨＣＶ
ＮＳ３プロテアーゼの活性を阻害するＶＸ−９５０の能力をアッセイする工程を、包含し得る。この方法はまた、ＶＸ−９５０に対する低下した感受性を有する改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）モデリングの工程（例えば、ＩＣ５０および／またはＫｉを測定することによって決定する工程）、ならびにＶＸ−９５０の活性をレスキューし得る化合物を設計するかそして／または選択する工程をも包含し得る。
【００２９】
また、患者におけるＨＣＶ感染を処置するための方法が提供され、該方法は、該患者に、ＶＸ−９５０の活性をレスキューし得る二次化合物の薬学的有効量を投与する工程を包含する。この二次化合物は、該患者に単独で投与されても、ＶＸ−９５０と組み合わせて投与されてもよい。この二次化合物は、該患者の治療レジメンにおけるＶＸ−９５０と、一時的にまたは永久に置き換わってもよい。例えば、一時的な置き換え治療レジメンにおいて、ＶＸ−９５０は、該化合物が該患者に投与され、そしてＶＸ−９５０の活性がレスキューされた後で、該患者に、再び投与される。
【００３０】
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ活性を低下させるために有効な化合物を同定するための方法が、さらに提供される。この方法は、本発明のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの三次元モデルを得る工程、および化合物を設計するかまたは選択する工程を包含し得る。この方法は、インシリコ、インビトロ、および／またはインビボで、該プロテアーゼに結合するかまたは該プロテアーゼと相互作用する化合物の能力を評価する工程を、さらに包含し得る。この方法はまた、設計されたかまたは選択された該化合物が、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ、特に、ＶＸ−９５０のようなプロテアーゼインヒビターに対して低下した感受性を有する改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの活性を阻害し得るか否かを、無細胞アッセイあるいは細胞ベースのアッセイで決定する工程を包含し得る。この方法はさらに、あるいは代替的に、細胞またはサンプル中でＨＣＶ複製を阻害する設計されたかまたは選択された化合物の能力をアッセイする工程を包含し得る。このＨＣＶ複製は、本発明のＨＣＶ改変体または本発明のＨＣＶレプリコンの複製を測定することによって、決定され得る。
【００３１】
本発明の別の局面は、生物学的サンプルまたは医療用装置もしくは研究室装置のＨＣＶ汚染を除去するかまたは減少させるための方法を提供する。この方法は、該生物学的サンプルまたは医療用装置もしくは研究室装置を、本発明の化合物（例えば、本明細書中で記載の方法によって同定された化合物）と接触させる工程を包含し得る。
【００３２】
本発明のさらなる局面は、患者におけるＨＣＶ感染を処置するための方法を提供する。この方法は、本発明の方法によって同定された化合物の薬学的に有効な量または治療的に有効な量を、単独でまたは別の抗ウイルス剤と組み合わせて該患者に投与する工程を包含し得る。
【００３３】
本発明の別の局面は、コンピューターツールに関し、このツールは、機械読み取り可能データでコードされたデータ記憶マテリアルを含む機械読み取り可能データ記憶媒体を提供し、該機械読み取り可能データは、ＨＣＶ改変体または生物学的サンプルに関連する少なくとも２つの特徴についての指標値を含む。該特徴は、以下：ａ）プロテアーゼインヒビターに対する感受性の低下について耐性を示す能力；ｂ）野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む、ＨＣＶプロテアーゼ；ｃ）患者の病的状態または回復可能性；ならびにｄ）該ＨＣＶ改変体の改変された（増大したかまたは減少した）複製能力、からなる群より選択される。
【００３４】
本発明のさらなる局面は、ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶ改変体のプロフィールを得る方法を提供する。この方法は、患者からサンプル（例えば、血漿サンプル）を得る工程、および該サンプルから少なくとも２種、２０種、５０種、１００種、２００種、５００種またはそれより多くのＨＣＶビリオン由来のＨＣＶプロテアーゼを遺伝子型決定するか、そして／または表現型決定する工程を包含し得る。例えば、このような遺伝子決定は、該血漿サンプル由来の少なくとも２種、２０種、５０種、１００種、２００種、５００種またはそれより多くのＨＣＶビリオンのヌクレオチドを配列決定する工程を包含し得る。
【００３５】
特定の実施形態において、このようなプロファイリングに供される患者は、ＶＸ−９５０のようなプロテアーゼインヒビターで処置されていてもよく、または処置されるように選択されてもよい。特定の実施形態において、血漿サンプルは、２回以上の異なる時点でこのようなプロファイリングに供される患者から得られる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードする単離されたＨＣＶポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメントであって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群から選択されるコドンに対応する少なくとも１つのコドンは、対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメント。
（項目２）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、前記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列またはその一部分を含む、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、前記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６に対応するコドンは、Ｖをコードしない、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目４）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン５４に対応するコドンは、Ｔをコードしない、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目５）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、前記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン１５５に対応するコドンは、Ｒをコードしない、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目６）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、前記野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン１５６に対応するコドンは、Ａをコードしない、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目７）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択される任意の２つのコドンに対応する２つのコドンが、いずれかのコドンが対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目８）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択される任意の３つのコドンに対応する３つのコドンが、該３つのコドンの各々が対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目９）
項目１に記載の単離されたＨＣＶポリヌクレオチドであって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６に対応するコドンが、４つのコドンの各々が、対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ＨＣＶポリヌクレオチド。
（項目１０）
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたＨＣＶ改変体であって、野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドン３６、コドン４１、コドン４３、コドン５４、コドン１４８、コドン１５５、およびコドン１５６からなる群より選択されるコドンに対応する該ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコドンが、対応する該野生型ＨＣＶポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ＨＣＶ改変体。
（項目１１）
単離されたＨＣＶプロテアーゼであって、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が、該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む、ＨＣＶプロテアーゼ。
（項目１２）
項目１１に記載のＨＣＶプロテアーゼであって、前記野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部分を含む、ＨＣＶプロテアーゼ。
（項目１３）
項目１１に記載のＨＣＶプロテアーゼであって、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの生物学的に活性なアナログを含む、ＨＣＶプロテアーゼ。
（項目１４）
項目１１に記載のＨＣＶプロテアーゼであって、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの生物学的に活性なフラグメントを含む、ＨＣＶプロテアーゼ。
（項目１５）
項目１１に記載のＨＣＶプロテアーゼであって、ＮＳ４Ａ補因子を含む、ＨＣＶプロテアーゼ。
（項目１６）
抗ＨＣＶプロテアーゼ抗体であって、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が、該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを認識する、抗ＨＣＶプロテアーゼ抗体。
（項目１７）
ストリンジェントな条件下で、項目１に記載のＨＣＶポリヌクレオチドの核酸配列にハイブリダイズ可能である、ヌクレオチドプローブまたはヌクレオチドプライマー。
（項目１８）
項目１に記載のＨＣＶポリヌクレオチドを含む発現系。
（項目１９）
項目１８に記載の発現系であって、ベクターを含み、該ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した項目１に記載のＨＣＶポリヌクレオチドを含む、発現系。
（項目２０）
項目１９に記載のベクターでトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入された宿主細胞。
（項目２１）
ｍＲＮＡディスプレイ系である、項目１８に記載の発現系。
（項目２２）
患者においてＨＣＶ感染のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）ＨＣＶ感染患者からの生物学的サンプルを収集する工程；および
ｂ）該サンプルが、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が、該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードする核酸を含むか否かを評価する工程
を包含する方法。
（項目２３）
患者におけるＨＣＶ感染のための処置を指示するための方法であって、該方法は、以下：ａ）項目２２に記載の方法にしたがって、該患者のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価する工程；
ｂ）ａ）において評価した該薬物耐性または感受性に基づいて、該患者のための処置レジメンを最適化する工程
を包含する方法。
（項目２４）
患者におけるＨＣＶ感染を処置するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１０に記載のＨＣＶ改変体に感染したサンプルを提供する工程；
ｂ）該サンプルにおける該ＨＣＶ改変体の活性を阻害する該候補化合物の能力をアッセイする工程
を包含する方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、前記ＨＣＶ改変体の前記活性は、複製である、方法。
（項目２６）
患者におけるＨＣＶ感染を処置または予防するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１に記載のポリヌクレオチドを含むレプリコンＲＮＡを提供する工程；
ｂ）該候補化合物が、ａ）の該レプリコンＲＮＡの複製を阻害するか否かを決定する工程を包含する方法。
（項目２７）
患者におけるＨＣＶ感染を処置するための候補化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１１に記載の単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼおよびプロテアーゼ基質を提供する工程であって、該プロテアーゼおよび該基質は、細胞ベースの系または無細胞系の中に存在する、工程；
ｂ）該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを該候補化合物と、該基質の存在下で接触させる工程；および
ｃ）該ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの活性が低下するか否かを決定する工程
を包含する方法。
（項目２８）
患者におけるＨＣＶ感染を処置するための候補化合物を評価するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１に記載のポリヌクレオチドおよびインジケーターをコードする指示遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に導入する工程；
ｂ）該宿主細胞を培養する工程；および
ｃ）該インジケーターを、該候補化合物の存在下および該候補化合物の非存在下で測定する工程
を包含する方法。
（項目２９）
生物学的サンプルまたは医療用装置もしくは研究室装置のＨＣＶ汚染を除去するかまたは減少させる方法であって、該生物学的サンプルまたは該医療用装置もしくは該研究室装置を、項目２４〜２８のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程を包含する方法。
（項目３０）
患者におけるＨＣＶ感染を処置する方法であって、該患者に、項目２４〜２８のいずれか１項に記載の化合物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
（項目３１）
ＶＸ−９５０に対し耐性であるＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼに対するＶＸ−９５０の活性をレスキューし得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１に記載のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを候補化合物と接触させる工程；
ｂ）ａ）の該プロテアーゼの該活性を阻害するＶＸ−９５０の能力をアッセイする工程
を包含する方法。
（項目３２）
患者におけるＨＣＶ感染を処置する方法であって、該方法は、該患者に、薬学的有効量の項目３１に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、前記化合物は、前記患者に、ＶＸ−９５０と組み合わせて投与される、方法。
（項目３４）
項目３２に記載の方法であって、前記化合物は、前記患者の処置においてＶＸ−９５０と置き換わる、方法。
（項目３５）
項目３４に記載の方法であって、ＶＸ−９５０は、前記化合物が前記患者に投与された後に該患者に投与され、そしてＶＸ−９５０の該活性がレスキューされている、方法。
（項目３６）
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ活性を低減するために有効な化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１に記載のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの三次元モデルを得る工程；
ｂ）化合物を設計もしくは選択する工程；
ｃ）ａ）の該プロテアーゼに結合するか、または該プロテアーゼと相互作用する該化合物の能力を評価する工程を包含する、方法。
（項目３７）
項目３６に記載の方法であって、前記設計されたかもしくは選択された化合物のＨＣＶ
ＮＳ３プロテアーゼ活性を阻害する能力を、無細胞アッセイもしくは細胞ベースのアッセイで評価する工程をさらに包含する、方法。
（項目３８）
項目３６に記載の方法であって、前記設計されたかもしくは選択された化合物のＨＣＶ複製を阻害する能力を、感染細胞もしくは感染サンプル中でアッセイする工程をさらに包含する、方法。
（項目３９）
機械読み取り可能データでコードされたデータ記憶マテリアルを含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該機械読み取り可能データは、ＨＣＶ改変体または生物学的サンプルに関連する少なくとも２つの特徴についての指標値を含み、ここで、該特徴は、以下：
ａ）プロテアーゼインヒビターに対する感受性の低下について耐性を示す能力；
ｂ）野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、および１５６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸が、該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む、ＨＣＶプロテアーゼ；
ｃ）患者の病的状態または回復可能性；ならびに
ｄ）該ＨＣＶ改変体の改変された（増大したかまたは減少した）複製能力
からなる群より選択される、機械読み取り可能データ記憶媒体。
（項目４０）
ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶ改変体のプロフィールを得る方法であって、該方法は、以下：
ａ）該患者から血漿サンプルを得る工程；
ｂ）該血漿サンプルからの少なくとも２種のＨＣＶビリオン由来のＨＣＶプロテアーゼのヌクレオチド配列を決定する工程
を包含する方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法であって、少なくとも２０種のＨＣＶビリオンが同定される、方法。
（項目４２）
項目４０に記載の方法であって、少なくとも５０種のＨＣＶビリオンが同定される、方法。
（項目４３）
項目４０に記載の方法であって、少なくとも１００種のＨＣＶビリオンが同定される、方法。
（項目４４）
項目４０に記載の方法であって、少なくとも２００種のＨＣＶビリオンが同定される、方法。
（項目４５）
項目４０に記載の方法であって、なくとも５００種のＨＣＶビリオンが同定される、方法。
（項目４６）
項目４０に記載の方法であって、前記ＨＣＶプロテアーゼのヌクレオチド配列が、項目１に記載のポリヌクレオチドの配列を含む、方法。
（項目４７）
項目４０に記載の方法であって、前記患者が、プロテアーゼインヒビターで処置されている、方法。
（項目４８）
項目４０に記載の方法であって、少なくとも２つの血漿サンプルが、前記患者から少なくとも２回の異なる時点で得られる、方法。
（項目４９）
生物学的サンプル中のＨＣＶ改変体の存在を検出するための方法であって、該生物学的サンプル中の項目１に記載のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を包含する、方法。
（項目５０）
項目１６に記載の抗体を含む、診断キット。
（項目５１）
項目１７に記載のヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む、診断キット。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、未処置遺伝子型１  ＨＣＶ感染被験体由来のＮＳ３タンパク質のＮ末端５４３ヌクレオチドの基線配列の系統発生分析を図示する。
【図２】図２は、遺伝子型１ａおよび１ｂのプロテアーゼ改変体についてのＴｅｌａｐｒｅｖｉｒ（ＶＸ−９５０）の基線ＩＣ５０を示す。
【図３】図３は、ＶＸ−９５０に対するウイルス応答に基づく被験体のグループ分けを図示する。
【図４】図４（カラー図）は、変異パターンに対応するウイルス応答をまとめる。
【図５】図５は、ＶＸ−９５０に対するプロテアーゼ一重耐性変異体の、酵素ＩＣ５０および参照ＨＣＶ−Ｈの遺伝子型１ａ株からの変化倍数を示す。
【図６】図６は、ＶＸ−９５０に対するプロテアーゼ二重耐性変異体の、酵素ＩＣ５０および参照ＨＣＶ−Ｈの遺伝子型１ａ株からの変化倍数を示す。
【図７】図７は、ＶＸ−９５０に対する耐性と適応度との間の逆相関を示す。
【図８】図８は、２種のＨＣＶプロテアーゼインヒビター：ＶＸ−９５０およびＢＩＬＮ  ２０６１の構造を図示する。
【図９】図９は、構造研究にしたがって、ＨＣＶプロテアーゼにおけるＶＸ−９５０変化の位置を図示する。
【図１０】図１０は、ＨＣＶウイルス改変体の表現型分析についての方法を概説する。
【図１１】図１１は、ＶＸ−９５０に対する低レベルの耐性を付与するＶ３６置換を示す。
【図１２】図１２は、Ｖ３６Ｍ改変体プロテアーゼのＸ線構造を示す。
【図１３】図１３は、ＶＸ−９５０と直接接触しないＶ３６を示す。
【図１４】図１４は、低レベルの耐性およびよりよい適応度を有する、Ｇ１ａにおけるＶ３６Ｍ改変体を示す。
【図１５】図１５は、低レベルの耐性およびより悪い適応度を有する、Ｇ１ａ／ｂにおけるＶ３６Ａ改変体を示す。
【図１６】図１６は、低レベルの耐性およびより悪い適応度を有する、Ｇ１ｂにおけるＶ３６Ｇ改変体を示す。
【図１７】図１７は、耐性を有さず、Ｇ１において希少であるＶ３６Ｌ改変体を示す。
【図１８】図１８もまた、ＨＣＶウイルス改変体の表現型分析のための方法を概説する。
【図１９】図１９は、ＶＸ−９５０に対する低レベル耐性を付与するＲ１５５置換を示す。
【図２０】図２０は、Ｒ１５５Ｋ改変体プロテアーゼのＸ線構造を示す。
【図２１】図２１は、Ｒ１５５Ｋ改変体プロテアーゼに対するＶＸ−９５０結合のコンピューターモデルを示す。
【図２２】図２２は、ＶＸ−９５０に対する低レベルの耐性を付与するＶ３６またはＴ５４の置換を示す。
【図２３】図２３は、Ｖ３６Ｍ改変体プロテアーゼに対するＶＸ−９５０結合のコンピューターモデルを示す。
【図２４】図２４は、ＶＸ−９５０に対する耐性の付与において、Ｖ３６ＭおよびＲ１５５Ｋが相加的であることを示す。
【図２５】図２５は、構造研究の結果を示す：（Ａ）ＮＳ４Ａ補因子との複合体におけるＬｙｓ１５５改変体ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびＡｒｇ１５５野生型ＮＳ３プロテアーゼドメインのＸ線構造の重ね合わせ。野生型プロテアーゼ（青）およびＲ１５５Ｋ改変体プロテアーゼ（赤）の両方のＣα原子追跡を、線で示す。残基１５５は、球と棒モデル（ｂａｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）（Ａｒｇ１５５）またはリコリスモデル（Ｌｉｑｕｏｒｉｃｅ  ｍｏｄｅｌ）（Ｌｙｓ１５５）のどちらかにより、窒素を青で、酸素を赤で強調されている。（Ｂ）野生型ＮＳ３−４ＡにおけるＡｒｇ１５５、Ａｓｐ１６８およびＡｒｇ１２３の側鎖と、Ｒ１５５Ｋ改変体における対応するＬｙｓ１５５、Ａｓｐ１６８およびＡｒｇ１２３の側鎖の重ね合わせ。Ｒ１５５Ｋ改変体プロテアーゼの３つの領域（Ａｒｇ１２３、Ａｓｐ１６８、およびＬｙｓ１５５）は、リコリスモデルで示され、野生型プロテアーゼのＡｒｇ１５５もまたリコリスモデルで示される。野生型プロテアーゼのＡｒｇ１２３およびＡｓｐ１６８残基は、細い線で示される。全ての窒素は、青で示され、酸素は赤で示される。
【図２６】図２６は、ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒとＮＳ４Ａ補因子との複合体におけるＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼドメインとの共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）のコンピューターモデルを示す。全ての３種のモデル（野生型プロテアーゼ（Ａ）、Ｒ１５５Ｋ改変体プロテアーゼ（Ｂ）またはＲ１５５Ｔ改変体プロテアーゼ（Ｃ）を含む）において、ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒは、水色の棒で示され、窒素は青、酸素は赤で示される。活性部位残基（Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ８１、およびＳｅｒ１３９）は、灰色の棒で示される。Ａｒｇ１２３残基およびＡｓｐ１６８残基は、紫色で示され、一方、残基１５５側鎖は、黄色で示される。Ｌｙｓ１５５またはＴｈｒ１５５側鎖は、伸びたコンホメーションのままであり、ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒのＰ２基と最小限の接触を行う。
【図２７】図２７は、ＶＸ−９５０耐性レプリコン改変体が、ＩＦＮ−αに対する完全な感受性を留めることを示す。
【図２８】図２８は、ＶＸ−９５０耐性レプリコン改変体が、リバビリンに対する完全な耐性を留めることを示す。
【図２９】図２９は、ＶＸ−９５０組み合わせ治療が、投薬の間、ウイルスの耐性の出現を抑制し、そしてウイルス突破を防いだことを示す。
【図３０】図３０は、ＨＣＶ配列のダイバーシティおよび耐性変異に関する要点を提供する。
【図３１】図３１は、先行研究を含むＨＣＶプロテアーゼインヒビターに対して耐性であるウイルス改変体のメカニズムをまとめる。
【図３２】図３２は、先行研究および本研究を含むＨＣＶプロテアーゼインヒビターに対して耐性であるウイルス改変体のメカニズムに関する結論を概説する。
【図３３】図３３は、本研究に基づく一定の結論をまとめる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＣＶ改変体に関する。詳細には、プロテアーゼインヒビターに対する耐性を示すＨＣＶ改変体が、提供される。また、このＨＣＶ改変体に関する方法および組成物も、提供される。この方法および組成物は、ウイルス改変体（ＨＣＶおよび他のウイルスの改変体を含む）を同定し、そして抗ウイルス化合物を評価しそして同定し、そしてウイルス感染に対する治療を開発しそして最適化するために有用である。
本発明は、臨床試験（Ｓｔｕｄｙ  ＶＸ０４−９５０−１０１）に含められた３４人の被験体から、ＶＸ−９５０を投薬する前に単離されたＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインにおける配列ダイバーシティの程度を最初に特徴付けた研究に基づく。次いで、インビボでのＶＸ−９５０に対する耐性の出現は、Ｘ−９５０を投薬する１４日間の後の被験体におけるプロテアーゼＮＳ３−４Ａの配列分析によってモニタリングされた。フォローアップサンプルを、投薬の終了後さらに７〜１０日間収集し、投薬の間に発生した何らかの薬物耐性変異が、ＶＸ−９５０の除去後も血漿中に維持されたか否かを見た。集団において基線より高く増大したことが見出された任意の変異を、潜在的薬物耐性変異とみなした。薬物耐性変異は、測定可能レベルまで蓄積するのに時間を要し得るので、この研究は、（野生型ウイルスおよびウイルス改変体の集団における優勢種ではなく）改変体の少数集団を検出するための新しい方法を含んだ。この方法は、１回の時点あたり、１人の被験体あたり多くの（例えば、８０〜８５個の）個々のウイルスクローンから配列を得、それによって、ＶＸ−９５０を投薬した１４日間に出現し得たウイルス改変体を、集団の約５％の感度で検出し得そして同定し得た。このような８０／８５の個々のウイルスクローンは、８０／８５の異なるビリオンを表し得る。
【００３８】
（ＨＣＶ改変体ならびに関連のポリヌクレオチドおよびプロテアーゼ）
本発明は、ＨＣＶ改変体を提供する。詳細な実施形態において、ＨＣＶ改変体は、プロテアーゼインヒビター（「改変体ＨＣＶプロテアーゼ」とも呼ばれる）、例えばＶＸ−９５０に対する低下した感受性を有するＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書中で使用される場合、野生型ＨＣＶとは、プロテアーゼインヒビター（詳細な実施形態において、このプロテアーゼインヒビターは、ＶＸ−９５０である）に対する通常のまたは望ましい感受性を有するＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド（「野生型ポリヌクレオチド」とも呼ばれる）を含むＨＣＶをいう。同様に、野生型ＨＣＶプロテアーゼとは、プロテアーゼインヒビター（詳細な実施形態において、このプロテアーゼインヒビターは、ＶＸ−９５０である）に対する通常のまたは望ましい感受性を有するＨＣＶプロテアーゼをいう。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、ＨＣＶは、任意の遺伝子型またはサブタイプ（例えば、遺伝子型１〜６）のＨＣＶであってもよい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「ＮＳ３プロテアーゼ」または「ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ」とは、ＨＣＶ  ＮＳタンパク質３またはセリンプロテアーゼ活性を有するＨＣＶ
ＮＳタンパク質３の部分をいう。例えば、ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２（６８５アミノ酸）の最初の６３１アミノ酸配列によって表されるＮＳ３タンパク質であってもよい；あるいは、ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２の最初の１８１アミノ酸によって表されるタンパク質であってもよい；この１８１アミノ酸のフラグメントはまた、当該分野で、ＮＳ３プロテアーゼドメインとも呼ばれる。ＮＳ３プロテアーゼはまた、米国特許第６，６５３，１２７号；同第６，２１１，３３８号において記載される複合体のような、ＮＳ３−ＮＳ４Ａタンパク質複合体であってもよい。「ＮＳ３プロテアーゼ活性」は、ＨＣＶ  ＮＳタンパク質３またはその部分の、ＮＳ４Ａタンパク質またはその生物学的に活性な部分の存在下もしくは非存在下におけるプロテアーゼ活性を意味する。ＮＳ４Ａタンパク質（例えば、配列番号２の最後の５４アミノ酸配列で表される）は、通常、ＮＳ３プロテアーゼについての補因子として機能し、そしてＮＳ３−ＮＳ４Ａセリンプロテアーゼ複合体を形成し得る；ＮＳ４Ａタンパク質の生物学的に活性な部分とは、ＮＳ３プロテアーゼに対する補因子としてのＮＳ４Ａタンパク質の機能を維持する、ＮＳ４Ａタンパク質のフラグメントを意味する。
【００４１】
本発明はまた、単離されたＨＣＶ改変体、単離された改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ、および改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドも、提供する。用語「単離された」は、一般に、そのウイルス、プロテアーゼ、またはポリヌクレオチドの天然の環境の構成要素から分離されたか、そして／または回収されたことを意味する。
【００４２】
特定の実施形態において、改変体ＨＣＶプロテアーゼは、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位、または１５６位の位置からの１つ以上の位置におけるアミノ酸が、該野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼであってもよい。上記野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列またはその部分（例えば、配列番号２の最初の１８１アミノ酸）を含み得る。単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの生物学的に活性なアナログまたはフラグメントを含み得、例えば、この単離されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、配列番号２のＮ末端の５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、または４８アミノ酸を有さなくてもよい。
【００４３】
改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの種々の位置におけるアミノ酸置換または変異の例は、表１〜４に示される。本明細書中の表、図面、および実施例はまた、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼまたは野生型ＨＣＶと比較した、改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼまたはＨＣＶウイルス改変体によって得られる種々のデータを提供する。
【００４４】
本発明の改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの生物学的に活性なフラグメントまたはアナログもまた、提供される。Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８：５０４５−５５）は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の種々のフラグメント（例えば、Ｎ末端の７残基または２３残基の欠失）は、ＮＳ４Ｂ／５Ａ部位における切断を廃止するが、ＮＳ３プロテアーゼ活性に供される他の切断部位に影響を及ぼさないこと；そしてＮ末端の３９残基の欠失は、ＮＳ４Ｂ／５Ａ部位およびＮＳ５Ａ／５Ｂ部位における切断を廃止し、そしてＮＳ４Ａ／４Ｂ部位におけるＮＳ３プロテアーゼ活性を低下させることを記載した。Ｆａｉｌｌａら（１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６９：１７６９−７７）は、野生型ＮＳ３タンパク質のＮ末端の１０残基の欠失は、ＮＳ３プロテアーゼ活性に影響を有さず、Ｎ末端の１５残基または２８残基は、部分的プロテアーゼ活性（ＮＳ５Ａ／５Ｂにおける通常の切断、しかしＮＳ４Ａ／４Ｂ部位およびＮＳ４Ｂ／５Ａ部位において低下）を有するＮＳ３タンパク質を生じ、Ｎ末端の４９残基の欠失は、完全に不活性なＮＳ３プロテアーゼを生じ、そしてＮＳ３タンパク質におけるＮＳ３プロテアーゼドメインのＣ末端の１０残基の欠失もまた、完全に不活性なＮＳ３プロテアーゼを生じることを記載した。
【００４５】
例えば、本発明の改変体ＨＣＶプロテアーゼを作製するための発現系が、提供される。発現系は、本発明のＨＣＶポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み得る。本発明のＨＣＶポリヌクレオチド（または「核酸」、本明細書中で相互交換可能に使用される）を含む適切な原核生物ベクターまたは真核生物ベクター（例えば、発現ベクター）は、適切な方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって適切な宿主細胞に導入され得、それにより、このポリヌクレオチドは、１つ以上の発現コントロールエレメントに作動可能に連結される（例えば、ベクター内で、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれる）。産生のために、宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導因子、適切な塩を有する適切な培地補充物質、成長因子、抗生物質、栄養補助物質、などの存在下で）維持され得、それにより、コードされるポリペプチドが、産生される。所望される場合、コードされるタンパク質は、（例えば、宿主細胞または培地から）回収され得、そして／または単離され得る。トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含する産生方法は、明らかである（例えば、ＷＯ  ９２／０３９１８参照）。発現系は、米国特許第６，２５８，５５８号に記載のＲＮＡ−タンパク質融合技術または米国特許第６，３６１，９４３号に記載のインビトロ「ウイルス」のような無細胞系に基づき得る。リボソームディスプレイ方法もまた、例えば、米国特許第５，８４３，７０１号において記載されるような方法が、使用され得る。
【００４６】
種々のアッセイ（例えば、ＨＣＶの表現型決定に適したアッセイ）が、提供される。このアッセイは、ウイルス活性（例えば、感染、複製、および／またはウイルス粒子の放出）、あるいは酵素活性（例えばプロテアーゼ活性）を測定することを指向し得る。ウイルス活性アッセイは、活性が測定されるウイルスまたはウイルス改変体に感染した細胞あるいはサンプルを使用し得る。細胞またはサンプルは、患者（例えばヒト患者）から得られ得る。あるいは、細胞またはサンプルは、インビトロで培養されそしてウイルスまたはウイルス改変体に感染され得る。ウイルス活性アッセイは、レプリコンベースの系、例えば、Ｔｒｏｚｚｉら（１３）および米国特許出願第２００５０１３６４００号に記載されるレプリコンベースのアッセイを使用してもよい。
【００４７】
酵素活性は、一般に目的の酵素またはその生物学的に活性なフラグメントもしくアナログおよび目的の酵素の基質を含む、無細胞系または細胞ベースの系において決定され得る。例えば、米国特許出願第２００３０１６２１６９号は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの活性をアッセイするための代替的な細胞ベースの系および方法を記載する。Ｔｒｏｚｚｉら（１３）は、ペプチド基質およびＨＰＬＣ系を使用する、インビトロ無細胞プロテアーゼアッセイを記載する。
【００４８】
本発明は、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの三次元構造が明らかにした事実を利用する（例えば、ＷＯ９８／１１１３４参照）。本発明の改変体プロテアーゼの三次元モデルが、得られ得る；化合物は、例えば、改変体プロテアーゼの三次元構造と相互作用するその能力に基づいて設計されるかまたは選択され、そして、このプロテアーゼに結合するかまたはこのプロテアーゼと相互作用する能力は、インシリコのモデリングによって評価され、そしてさらに、インビトロアッセイもしくはインビボアッセイによってさらに評価され得る。
【００４９】
上記化合物は、コンビナトリアルケミカルライブラリーから同定されたものであっても、合理的な薬物設計を通して調製されたものでもよい。例示的な実施形態において、この化合物は、合理的な薬物設計を通して調製され、ＶＸ−９５０のような公知のプロテアーゼインヒビターの構造から誘導された化合物である。合理的な薬物設計はまた、潜在的なプロテアーゼインヒビター薬物標的が、コンビナトリアルライブラリー由来の化合物によって試験される、ラージスケールスクリーニング実験の体系的方法と組み合わされてもよい。合理的な薬物設計は、候補薬物を同定するかまたは作製するための薬物レセプターまたはその天然のリガンドのひとつの構造に関する情報を使用する、注目されているアプローチである。タンパク質の三次元構造は、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴分光学のような方法を使用して決定され得る。本発明において、残基３６、４１、４３、５４、１４８、１５５、または１５６の１つ以上の変異を含むＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの改変体の三次元構造は、ここで、慣用的なＸ線結晶学および／またはＮＭＲ分光学の技術を使用して容易に決定され得る。合理的な薬物設計はまた、潜在的なプロテアーゼインヒビター薬物標的が、コンビナトリアルライブラリー由来の化合物によって試験される、ラージスケールスクリーニング実験の体系的方法と組み合わされてもよい。多くの異なる化合物の構造を含むデータベースを検索するために、コンピュータープログラムが、開発され得る。このコンピューターは、改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼと相互作用する可能性が最も高い化合物を選択し得、そしてこのような同定された化合物は、プロテアーゼインヒビターを評価するために適したアッセイ（例えば、ウイルスアッセイまたは酵素アッセイ）において、試験され得る。
【００５０】
特定の実施形態において、同定された化合物は、この化合物および薬学的に受容可能なキャリア、佐剤またはビヒクルを含む組成物に処方される。好ましくは、この組成物は、上記化合物を、ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性を低下するために有効な量で含有する。なおより好ましくは、この組成物は、患者への投与のために処方される。この組成物はまた、以下から選択される追加の薬剤を含み得る：免役調節剤；抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼの第二のインヒビター；ＨＣＶ生活環における別の標的のインヒビター；シトクロムＰ−４５０インヒビター；またはこれらの組み合わせ。種々の組成物が、以下により詳細に記載される。
【００５１】
別の局面において、本発明は、ＨＣＶプロテアーゼ、特に、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼと比較して１つ以上のアミノ酸が変化しているＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼに特異的な抗体を提供する。用語「抗体」は、広範な意味において使用され、そして、限定することなく、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）を、具体的に網羅する。用語「免疫グロブリン」は、種々の構造的に関連するタンパク質を含み、これらは必ずしも抗体ではない。
【００５２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域すなわち可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。
【００５３】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、１つのポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望される構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００５４】
用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖における２つのドメインの間を対形成するためには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、そして２つの抗原結合部位を形成する。ディアボディは、より完全に、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される。
【００５５】
改変体ＨＣＶプロテアーゼに対する抗体は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質に対する公知の抗体から、例えば分子進化を介して開発され得る。米国特許出願第２００４０２１４９９４号は、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質に対するヒト組換え抗体を記載する。アミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を公知の抗体のＤＮＡに導入することにより、またはペプチド合成により、調製される。このような改変体は、例えば、公知の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または該残基への挿入、および／または該残基の置換を含む。最終構築物が所望の特定を有する限り、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築物に到達する。アミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを改変し得る（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）。
【００５６】
本発明の抗体は、診断用途および治療用途を有し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、標識される。本開示の種々の抗体が、改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの発現を検出するかまたは測定するために使用され得、したがって、これらはまた、診断目的または研究目的のための、細胞選別および画像化のような用途（例えば、フローサイトメトリ、および蛍光活性化細胞選別）において有用である。本明細書中で使用される場合、用語「標識」または「標識された」は、抗体における別の分子の組み込みをいう。１つの実施形態において、この標識は、検出可能マーカーであり、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、あるいはマーカーをつけたアビジン（例えば、光学的方法または比色方法によって検出可能である蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン化部分のポリペプチドへの結合である。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療薬であり得、例えば、薬物結合体または毒素であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が、当該分野で公知であり、そして使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチン化基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ、磁気薬剤（例えば、ガドリニウムキレート）、毒素（例えば、百日咳毒素）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンならびにこれらのアナログもしくはホモログ。いくつかの実施形態において、標識は、立体障害の可能性を低下させるために、種々の長さのスペーサー腕によって結合される。
【００５７】
特定の局面において、生物学的サンプル中のＨＣＶウイルス、改変体ＨＣＶ  ＮＳ３ポリヌクレオチドまたは改変体ＨＣＶプロテアーゼの存在の検出において使用するためのキットもまた、提供され得る。このようなキットは、本発明の改変体ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを認識する抗体、ならびに、上記抗体と上記改変体プロテアーゼまたはその一部分との間の複合体の存在の検出に適した１種以上の補助試薬を含み得る。あるいは、このようなキットは、本発明のプローブまたはプライマーを含み得、このようなプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下で、本発明の改変体ＨＣＶ  ＮＳ３ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得る。本発明のプローブまたはプライマーは、目的の被験体を検出するために使用され得るＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに適し得る。あるいは、このようなキットは、市販のＰＣＲベースのＨＣＶ診断キットまたは非ＰＣＲベースのＨＣＶ診断キット（例えば、ＲＮＡ３．０アッセイ（ｂＤＮＡ）およびＲＮＡ定性的アッセイ（ＴＭＡ）を含む、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｓｙｓｔｅｍおよびＢａｙｅｒ  Ｖｅｒｓａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づき得る。ＡＭＰＬＩＣＯＲ  ＨＣＶ  ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ、ｖ２．０は、ヒト血清または血漿中のＨＣＶ  ＲＮＡの定量のためのインビトロ核酸増幅試験である。ＶＥＲＳＡＮＴ（登録商標）ＨＣＶ  ＲＮＡ  ３．０アッセイ（ｂＤＮＡ）は、２ｌｏｇ１０の微量を検出する信頼性が証明されているウイルス負荷アッセイである。ＶＥＲＳＡＮＴ（登録商標）ＨＣＶ  ＲＮＡ定性的アッセイは、従来技術の転写媒介型増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＭＡ）技術に基づく。
【００５８】
（薬学的組成物および処方物）
本発明の別の局面は、本発明の化合物（例えば、ＶＸ−９５０の活性をレスキューし得ると同定された二次化合物、もしくはＨＣＶ改変体に対して有効であると同定された化合物（例えば、ウイルス改変体の複製を減少させ得る化合物）および／または改変体ＨＣＶ
ＮＳ３プロテアーゼに対して有効であると同定された化合物（例えば、改変体プロテアーゼの酵素活性を低下させ得る化合物））を含有する薬学的組成物または処方物を提供する。。
【００５９】
本発明の別の局面は、医薬（例えば、患者におけるＨＣＶ感染を処置するための医薬）の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【００６０】
本発明の別の局面は、患者におけるＨＣＶ感染を処置するための方法を提供する。このような方法は、一般に、患者に薬学的にもしくは治療的に有効な量の本発明の化合物を、単独でまたは別の抗ウイルス剤と組み合わせて（順次もしくは同時に）投与する工程を包含する。化合物または薬剤の「有効量」は、一般に、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの発現もしくは活性、ＨＣＶ産生、複製、またはビルレンス、ＨＣＶ感染を、複製的に減少させるため、あるいは、ＨＣＶ感染の１つ以上の症状の緩和または軽減を生じるために、このような化合物または薬剤の非存在下における上記パラメータのレベルと比較して、有効な量をいう。
【００６１】
別の局面において、本発明の方法および組成物は、プロテアーゼインヒビター（例えば、ＶＸ−９５０）および別の抗ウイルス剤（好ましくは抗ＨＣＶ剤）を含む。ＨＣＶを標的化する組み合わせ治療もまた、米国特許第６，９２４，２７０号；同第６，８４９，２５４号において記載される。
【００６２】
別の抗ウイルス剤はまた、プロテアーゼインヒビター、特にＨＣＶプロテアーゼインヒビターであり得る。当該分野で公知のＨＣＶプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：ＶＸ−９５０（図８）、ＢＩＬＮ  ２０６１（図８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／５９９２９；米国特許第６，６０８，０２７号もまた参照されたい）、化合物１（１３）、インヒビターＡ、Ｂ、およびＣ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０４／０３９９７０）。潜在的なＨＣＶプロテアーゼインヒビターはまた、以下の番号のＰＣＴ公開および米国特許出願公開に記載されている：ＷＯ  ９７／４３３１０、ＵＳ２００２００１６２９４、ＷＯ  ０１／８１３２５、ＷＯ  ０２／０８１９８、ＷＯ  ０１／７７１１３、ＷＯ  ０２／０８１８７、ＷＯ  ０２／０８２５６、ＷＯ  ０２／０８２４４、ＷＯ  ０３／００６４９０、ＷＯ  ０１／７４７６８、ＷＯ  ９９／５０２３０、ＷＯ  ９８／１７６７９、ＷＯ  ０２／４８１５７、ＵＳ２００２０１７７７２５、ＷＯ  ０２／０６０９２６、ＵＳ２００３０００８８２８、ＷＯ  ０２／４８１１６、ＷＯ  ０１／６４６７８、ＷＯ  ０１／０７４０７、ＷＯ  ９８／４６６３０、ＷＯ  ００／５９９２９、ＷＯ  ９９／０７７３３、ＷＯ  ００／０９５８８、ＵＳ２００２００１６４４２、ＷＯ  ００／０９５４３、ＷＯ  ９９／０７７３４、ＵＳ２００２００３２１７５、ＵＳ２００５００８００１７、ＷＯ  ９８／２２４９６、ＷＯ  ０２／０７９２３４、ＷＯ  ００／３１１２９、ＷＯ  ９９／３８８８８、ＷＯ  ９９／６４４４２、ＷＯ  ２００４０７２２４３、およびＷＯ  ０２／１８３６９、ならびに米国特許第６，０１８，０２０号；同第６，２６５，３８０号；同第６，６０８，０２７号；同第５，８６６，６８４号；Ｍ．Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８、ｐｐ．１７１３−１８（１９９８）；Ｗ．Ｈａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，１０，７１１−１３（２０００）；Ｒ．Ｄｕｎｓｄｏｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０，ｐｐ．１５７１−７９（２０００）；Ｍ．Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０、ｐｐ．２２６７−７０（２０００）；およびＳ．ＬａＰｌａｎｔｅら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０，ｐｐ．２２７１−７４（２０００）。多くのＮＳ３プロテアーゼインヒビターはまた、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ａ．Ｇ．、および他の会社によって開発されており、これらは、以下の番号の米国特許出願公開で記載されている：２００５０２４９７０２；２００５０１５３９００；２００５０２４５４５８；２００５０２２２０４７；２００５０２０９１６４；２００５０１９７３０１；２００５０１７６６４８；２００５０１６４９２１；２００５０１１９１６８；２００５００８５４２５；２００５００５９６０６；２００３０２０７８６１；２００２０１４７１３９；２００５０１４３４３９；２００５００５９６０６；２００５０１０７３０４；２００５００９０４５０；２００４０１４７４８３；２００４０１４２８７６；２００４００７７６００；２００４００１８９８６；２００���０２３６２４２；２００３０２１６３２５；２００３０２０７８６１；米国特許第６，９６２，９３２号；同第６，９１４，１２２号；同第６，９１１，４２８号；同第６，８４６，８０２号；同第６，８３８，４７５号。
【００６３】
抗ウイルス剤としてはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない：免役調節剤（例えば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、およびサイモシン；他の抗ウイルス剤、例えばリバビリン、アマンタジンおよびテルビブジン（ｔｅｌｂｉｖｕｄｉｎｅ）；他のＣ型肝炎プロテアーゼのインヒビター（ＮＳ２−ＮＳ３インヒビターおよびＮＳ３−ＮＳ４Ａインヒビター）；ＨＣＶ生活環の他の標的のインヒビター（ヘリカーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビターが挙げられる）；内部リボソーム侵入のインヒビター；広範なウイルスインヒビター（例えば、ＩＭＰＤＨインヒビター（例えば、米国特許第５，８０７，８７６号、同第６，４９８，１７８号、同第６，３４４，４６５号、同第６，０５４，４７２号、ＷＯ９７／４００２８、ＷＯ９８／４０３８１、ＷＯ００／５６３３１の化合物、およびミコフェノール酸およびその誘導体、ならびに、以下を含むが、これらに限定されない：ＶＸ−４９７、ＶＸ−１４８、および／またはＶＸ−９４４）；あるいは、上記の任意の抗ウイルス剤の組み合わせ。Ｗ．Ｍａｒｋｌａｎｄら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ＆  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４４、ｐ．８５９（２０００）および米国特許第６，５４１，４９６号もまた、参照されたい。
【００６４】
以下の定義が、本明細書中で使用される：
「Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ」は、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）（ｐｅｇインターフェロンα−２ｂ）を意味し、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ．から入手可能である；「Ｉｎｔｒｏｎ」は、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂ）を意味し、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ．から入手可能である；「リバビリン」は、リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−ｌＨ−ｌ，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）を意味し、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能である；Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、記載番号８３６５、第１２版に記載される；また、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ．からのＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標）、またはＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ．からのＣｏｐｅｇｕｓ（登録商標）としても入手可能である；「Ｐａｇａｓｙｓ」は、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）（ｐｅｇ−インターフェロンα−２ａ）を意味し、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ．ぁら入手可能である；「Ｒｏｆｅｒｏｎ」は、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）（組換えインターフェロンα−２ａ）を意味し、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ．から入手可能である；「Ｂｅｒｏｆｏｒ」は、Ｂｅｒｏｆｏｒ（登録商標）（インターフェロンα−２）を意味し、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ、Ｃｏｎｎ．から入手可能である；Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ（登録商標）（天然のαインターフェロン（例えばＳｕｍｉｆｅｒｏｎ）の精製混合物）は、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ、Ｊａｐａｎから入手可能である；Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロンα  ｎ１）は、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｌｔｄ．、ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎから入手可能である；Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）（天然αインターフェロンの混合物）は、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造され、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃｏ．、ＣＴ．から入手可能である。
【００６５】
用語「インターフェロン」は、本明細書中で使用される場合、ウイルス複製および細胞増殖を阻害し、そして免役応答を調節する、高度に相同な種特異的タンパク質のファミリーのメンバーを意味し、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγである。Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、記載番号５０１５、第１２版。本発明の１つの実施形態にしたがい、インターフェロンは、α−インターフェロンである。別の実施形態にしたがい、本発明の治療組み合わせは、天然のαインターフェロン２ａを利用する。あるいは、本発明の治療組み合わせは、天然のαインターフェロン２ｂを利用する。別の実施形態において、本発明の治療組み合わせは、組換えαインターフェロン２ａまたは２ｂを利用する。なお別の実施形態において、上記インターフェロンは、ペグ化αインターフェロン２ａまたは２ｂである。本発明に適したインターフェロンとしては、以下が挙げられる：（ａ）Ｉｎｔｒｏｎ（インターフェロン−α２Ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、（ｂ）Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ、（ｃ）Ｐｅｇａｓｙｓ、（ｄ）Ｒｏｆｅｒｏｎ、（ｅ）Ｂｅｒｏｆｏｒ、（ｆ）Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ、（ｇ）Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ、（ｈ）Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｂｕｒｙ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆから入手可能であるコンセンサスαインターフェロン、（ｉ）Ａｌｆｅｒｏｎ；（ｊ）Ｖｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）；（ｋ）Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）。
【００６６】
プロテアーゼインヒビターは、経口投与されてもよく、一方、インターフェロンは、代表的には、経口投与されない。しかし、本発明の方法または組み合わせを、いかなる特定の投薬形態またはレジメンにも、本明細書中で限定しない。したがって、本発明にしたがう組み合わせの各構成要素が、別個に、一緒に、順次または同時に、あるいはその任意の組み合わせで、投与され得る。
【００６７】
１つの実施形態において、上記プロテアーゼインヒビターおよびインターフェロンは、別個の投薬形態で投与される。１つの実施形態において、任意のさらなる薬剤が、プロテアーゼインヒビターを有する単一の投薬形態の一部として投与されるか、または別個の投薬形態として投与される。本発明は、化合物および／または薬剤の組み合わせを包含するが、各化合物または薬剤の特定の量は、組み合わせ中の化合物のお互いの特定の量に依存し得る。インターフェロンの投薬量は、代表的に、ＩＵで測定される（例えば、約４，０００，０００ＩＵ〜約１２，０００，０００ＩＵ）。
【００６８】
したがって、本発明の化合物との組み合わせにおいて試用され得る薬剤（免役調節剤として作用するかまたはそれ以外として作用するかにかかわらない）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インターフェロン−α２Ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）；レバトロン（Ｒｅｂａｔｒｏｎ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ、インターフェロンα２Ｂ＋リバビリン）；ペグ化インターフェロンα（Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｒ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ（４０−ｋｄ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ａ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ａ  ｉｎ  ｎｏｎｃｉｒｒｈｏｔｉｃ
ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３３、ｐｐ．４３３−４３８（２００１）；コンセンサスインターフェロン（Ｋａｏ，Ｊ．Ｈ．ら、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ」、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５、ｐｐ．１４１８−１４２３（２０００）、インターフェロン−α２Ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ａ；Ｒｏｃｈｅ）、リンホブラストイド（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）または「天然の」インターフェロン；インターフェロンτ（Ｃｌａｙｅｔｔｅ，Ｐ．ら、「ＩＦＮ−ｔａｕ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）４７、ｐｐ．５５３−５５９（１９９９）；インターロイキン２（Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｌ．ら、「Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ」、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１９、ｐｐ．１０３−１１２（１９９９）；インターロイキン６（Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｌ．ら、前出；インターロイキン１２（Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｌ．ら、前出；リバビリン；および１型ヘルパーＴ細胞応答の発生を増強する化合物（Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｌ．ら、前出）。インターフェロンは、直接的抗ウイルス作用を発揮することによって、そして／または感染に対する免役応答を改変することによって、ウイルス感染を緩和し得る。インターフェロンの抗ウイルス作用は、多くの場合、ウイルスの透過もしくは脱外皮（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）、ウイルスＲＮＡの合成、ウイルスタンパク質の転写、ならびに／またはウイルスアセンブリおよび放出の阻害を介して媒介される。
【００６９】
細胞におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Ｔａｚｕｌａｋｈｏｖａ，Ｅ．Ｂ．ら、「Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｒｓ」、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、２１ｐｐ．６５−７３）としては、単独で、またはトブラマイシンおよびイミキモッド（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｓａｕｄｅｒ，Ｄ．Ｎ．、「Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ」、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ、４３ｐｐ．Ｓ６−１１（２０００））と組み合わせた二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の化合物と組み合わせて使用され得る他の非免役調節化合物および免役調節化合物としては、本明細書中に参考として援用されるＷＯ  ０２／１８３６９（例えば、２７３頁、９〜２２行および２７４頁、４行〜２７６頁、１１行を参照、これらは本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
細胞におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Ｔａｚｕｌａｋｈｏｖａら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２１、６５−７３））としては、単独で、またはトブラマイシンおよびイミキモッド（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ｓａｕｄｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ａｒａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４３、Ｓ６−１１（２０００））と組み合わせた二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
ＨＣＶ抗ウイルス活性を有することが公知であるか、または有し得る他の化合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リバビリン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼインヒビター（ＶＸ−４９７、本明細書中で式が提供される）；アマンタジンおよびリマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）（Ｙｏｕｎｏｓｓｉら、Ｉｎ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １９、９５−１０２（１９９９））；ＬＹ２１７８９６（米国特許第４，８３５，１６８号）（Ｃｏｌａｃｉｎｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３４、２１５６−２１６３（１９９０））；および９−ヒドロキシイミノ−６−メトキシ−１，４ａ−ジメチル１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１−カルボン酸メチルエステル；６−メトキシ−１，４ａジメチル−９−（４−メチル−ピペラジン−１−イルイミノ）−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１カルボン酸メチルエステル−塩酸塩；１−（２−クロロ−フェニル）−３−（２，２−ビフェニル−エチル）−尿素（米国特許第６，１２７，４２２号）。
【００７３】
上記の分子についての処方、用量および投与の経路は、以下に引用される参考文献に教示されるか、または当該分野で周知であり、例えば、Ｆ．Ｇ．Ｈａｙｄｅｎ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９６）、第５０章、ｐｐ．１１９１−１２２３、およびその中に引用される参考文献において開示されている。あるいは、ＨＣＶ抗ウイルス活性（特に、ＨＣＶの薬物耐性株に対する抗ウイルス活性）を示す化合物が一旦同定されると、該化合物の薬学的有効量は、当業者に周知の技術を用いて決定され得る。例えば、Ｂｅｎｅｔら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９６）、第１章、ｐｐ．３−２７、およびその中に引用される参考文献に留意されたい。したがって、このような化合物の適切な処方、用量範囲および投薬レジメンは、慣用的方法によって容易に決定され得る。
【００７４】
本発明の組み合わせ治療に関連する組成物は、細胞（単数または複数）に対して、またはヒト患者に対して、同時にもしくは順次投与される別個の薬学的に受容可能な処方物、１種より多くの治療剤を含む処方物、または単剤処方物および多剤処方物の取り合わせのいずれかにおいて、提供され得る。投与の経路にかかわらず、これらの薬物組み合わせは、薬学的に受容可能な処方物の構成要素の抗ＨＣＶ有効量を形成する。
【００７５】
本発明の方法において使用され得る多数の他の免役調節因子および免役刺激因子が、現在利用可能であり、以下が挙げられる：ＡＡ−２Ｇ；アダマンチルアミドジペプチド；アデノシンデアミナーゼ、Ｅｎｚｏｎアジュバント、Ａｌｌｉａｎｃｅ；アジュバント、Ｒｉｂｉ；アジュバント、Ｖａｘｃｅｌ；Ａｄｊｕｖａｘ；アゲラスフィン（ａｇｅｌａｓｐｈｉｎ）−１１；ＡＩＤＳ治療、Ｃｈｉｒｏｎ；藻類グルカン、ＳＲＩ；アルガヌヌリン（ａｌｇａｎｕｎｕｌｉｎ）、Ａｎｕｔｅｃｈ；Ａｎｇｉｎｌｙｃ；抗細胞因子、Ｙｅｄａ；アンチコート（Ａｎｔｉｃｏｒｔ）；抗ガストリン−１７免役原、Ａｐ；抗原送達系、Ｖａｃ；抗原処方物、ＩＤＢＣ；抗ＧｎＲＨ免役原、Ａｐｈｔｏｎ；抗ヘパリン（Ａｎｔｉｈｅｒｐｉｎ）；アルビドール（Ａｒｂｉｄｏｌ）；アザロール（ａｚａｒｏｌｅ）；Ｂａｙ−ｑ−８９３９；Ｂａｙ−ｒ−１００５；ＢＣＨ−１３９３；ベタフェクチン（Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ）；ビオスチン（Ｂｉｏｓｔｉｍ）；ＢＬ−００１；ＢＬ−００９；ブロンコスタット（Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ）；カンタスチン（Ｃａｎｔａｓｔｉｍ）；ＣＤＲＩ−８４−２４６；セフォジザイム（ｃｅｆｏｄｉｚｉｍｅ）；ケモカインインヒビター、ＩＣＯＳ；ＣＭＶペプチド、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ；ＣＮ−５８８８；サイトカイン放出因子、Ｓｔ；ＤＨＥＡＳ、Ｐａｒａｄｉｇｍ；ＤＩＳＣ  ＴＡ−ＨＳＶ；Ｊ０７Ｂ；Ｉ０１Ａ；Ｉ０１Ｚ；ジチオカルブナトリウム；ＥＣＡ−１０−１４２；ＥＬＳ−１；内毒素、Ｎｏｖａｒｔｉｓ；ＦＣＥ−２０６９６；ＦＣＥ−２４０８９；ＦＣＥ−２４５７８；ＦＬＴ−３リガンド、Ｉｍｍｕｎｅｘ；ＦＲ−９００４８３；ＦＲ−９００４９４；ＦＲ−９０１２３５；ＦＴＳ−Ｚｎ；Ｇ−タンパク質、Ｃａｄｕｓ；グルダプシン（ｇｌｕｄａｐｃｉｎ）；グルタウリン；グリコホスホペプチカル（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｃａｌ）；ＧＭ−２；ＧＭ−５３；ＧＭＤＰ；成長因子ワクチン、ＥｎｔｒｅＭ；Ｈ−ＢＩＧ、ＮＡＢＩ；Ｈ−ＣＩＧ、ＮＡＢＩ；ＨＡＢ−４３９；ヘリコバクターピロリワクチン；ヘルペス特異的免役因子；ＨＩＶ治療、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄ；ＨｙｐｅｒＧＡＭ＋ＣＦ；ＩｍｍｕＭａｘ；Ｉｍｍｕｎ  ＢＣＧ；免役治療、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ；免役調節因子、Ｅｖａｎｓ；免役調節因子、Ｎｏｖａｃｅｌｌ；ｉｍｒｅｇ−１；ｉｍｒｅｇ−２；インドミューン（Ｉｎｄｏｍｕｎｅ）；イノシンプラノベックス（ｉｎｏｓｉｎｅ  ｐｒａｎｏｂｅｘ）；インターフェロン、Ｄｏｎｇ−Ａ（α２）；インターフェロン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（γ）；インターフェロン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（α）；インターロイキン−１２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓ；インターロイキン−１５、Ｉｍｍｕｎｅｘ；インターロイキン−１６、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒ；ＩＳＣＡＲ−１；Ｊ００５Ｘ；Ｌ−６４４２５７；リコマラスミン酸（ｌｉｃｏｍａｒａｓｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；ＬｉｐｏＴｈｅｒ；ＬＫ−４０９、ＬＫ−４１０；ＬＰ−２３０７；ＬＴ（Ｒｌ９２６）；ＬＷ−５００２０；ＭＡＦ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ；ＭＤＰ誘導体、Ｍｅｒｃｋ；ｍｅｔ−エンケファリン、ＴＮＩ；メチルフリルブチロラクトン；ＭＩＭＰ；ミリモスチン（ｍｉｒｉｍｏｓｔｉｍ）；混合細菌ワクチン、Ｔｅｍ、ＭＭ−１；モニリアスタット（ｍｏｎｉｌｉａｓｔａｔ）；ＭＰＬＡ、Ｒｉｂｉ；ＭＳ−７０５；ムラブチド；マラブチド（ｍａｒａｂｕｔｉｄｅ）、Ｖａｃｓｙｎ；ムラミルジペプチド誘導体；ムラミルペプチド誘導体ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）；−５６３；ＮＡＣＯＳ−６；ＮＨ−７６５；ＮＩＳＶ、Ｐｒｏｔｅｕｓ；ＮＰＴ−１６４１６；ＮＴ−００２；ＰＡ−４８５；ＰＥＦＡ−８１４；ペプチド、Ｓｃｉｏｓ；ペプチドグリカン、Ｐｌｉｖａ；ペルトン（Ｐｅｒｔｈｏｎ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｌａｎｔ；ＰＧＭ誘導体、Ｐｌｉｖａ；Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ  Ｎｏ．１０９９；Ｎｏ．１４２６；Ｎｏ．１５４９；Ｎｏ．１５８５；Ｎｏ．１６０７；Ｎｏ．１７１０；Ｎｏ．１７７９；Ｎｏ．２００２；Ｎｏ．２０６０；Ｎｏ．２７９５；Ｎｏ．３０８８；Ｎｏ．３１１１；Ｎｏ．３３４５；Ｎｏ．３４６７；Ｎｏ．３６６８；Ｎｏ．３９９８；Ｎｏ．３９９９；Ｎｏ．４０８９；Ｎｏ．４１８８；Ｎｏ．４４５１；Ｎｏ．４５００；Ｎｏ．４６８９；Ｎｏ．４８３３；Ｎｏ．４９４；Ｎｏ．５２１７；Ｎｏ．５３０；ピドチモド；ピメラウチド；ピナフィド；ＰＭＤ−５８９；ポドフィロトキシン、Ｃｏｎｐｈａｒｍ；ＰＯＬ−５０９；ポリ−ＩＣＬＣ；ポリ−ＩＣＬＣ、Ｙａｍａｓａ  Ｓｈｏｙｕ；ポリＡ−ポリＵ；多糖類Ａ；プロテイン  Ａ、Ｂｅｒｌｕｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＰＳ３４Ｗ０；シュードモナスＭＡｂ、Ｔｅｉｊｉｎ；プソマグロビン（Ｐｓｏｍａｇｌｏｂｉｎ）；ＰＴＬ−７８４１９；ピレキソール（Ｐｙｒｅｘｏｌ）；ピリフェロン（ｐｙｒｉｆｅｒｏｎｅ）；レトロゲン（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ）；レトロペプ（Ｒｅｔｒｏｐｅｐ）；ＲＧ−００３；ライノスタット（Ｒｈｉｎｏｓｔａｔ）；リファマキシル（ｒｉｆａｍａｘｉｌ）；ＲＭ−０６；ローリン（Ｒｏｌｌｉｎ）；ロムルチド；ＲＵ−４０５５５；ＲＵ−４１８２１；風疹抗体、ＲｅｓＣｏ；Ｓ−２７６４９；ＳＢ−７３；ＳＤＺ−２８０−６３６；ＳＤＺ−ＭＲＬ９５３；ＳＫ＆Ｆ−１０７６４７；ＳＬ０４；ＳＬ０５；ＳＭ−４３３３；ソルテイン（Ｓｏｌｕｔｅｉｎ）；ＳＲＩ−６２−８３４；ＳＲＬ−１７２；ＳＴ−５７０；ＳＴ−７８９；ｓｔａｐｈａｇｅ溶解物；スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）；サプレッシン（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎ）；Ｔ−１５０Ｒ１；Ｔ−ＬＣＥＦ；タビラウチド；テムルチド；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＳＶ；ＴＨＦ、Ｐｈａｒｍ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ；ＴＨＦ、Ｙｅｄａ；チマルファシン；胸腺ホルモン画分；サイモカルチン（ｔｈｙｍｏｃａｒｔｉｎ）；サイモリンホトロピン（ｔｈｙｍｏｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｎ）；サイモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）；サイモペンチンアナログ；サイモペンチン、Ｐｅｐｔｅｃｈ；サイモシン画分５、α；サイモスティミュリン（ｔｈｙｍｏｓｔｉｍｕｌｉｎ）；チモトリナン；ＴＭＤ−２３２；ＴＯ−１１５；転移因子、Ｖｉｒａｇｅｎ；タフシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）、Ｓｅｌａｖｏ；ウベニメクス；ウルサスタット（Ｕｌｓａｓｔａｔ）；ＡＮＧＧ−；ＣＤ−４＋；Ｃｏｌｌａｇ＋；ＣＯＬＳＦ＋；ＣＯＭ＋；Ｄ��−Ａ＋；ＧＡＳＴ−；ＧＦ−ＴＨ＋；ＧＰ−１２０−；ＩＦ＋；ＩＦ−Ａ＋；ＩＦ−Ａ−２＋；ＩＦ−Ｂ＋；ＩＦ−Ｇ＋；ＩＦ−Ｇ−１Ｂ＋；ＩＬ−２＋；ＩＬ−１２＋；ＩＬ−１５＋；ＩＭ＋；ＬＨＲＨ−；ＬＩＰＣＯＲ＋ＬＬＹＭ−Ｂ＋；ＬＹＭ−ＮＫ＋；ＬＹＭ−Ｔ＋；ＯＰＩ＋；ＰＥＰ＋；ＰＨＧ−ＭＡ＋；ＲＮＡ−ＳＹＮ−；ＳＹ−ＣＷ−；ＴＨ−Ａ−Ｉ＋；ＴＨ−５＋；ＴＮＦ＋；ＵＮ。
【００７６】
本発明において有用な代表的なヌクレオシド化合物およびヌクレオチド化合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（＋）−シス−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシメチル）−［１，３−オキサチオラン−５イル］シトシン；（−）−２’−デオキシ−３’−チオシチジン−５’−トリホスフェート（３ＴＣ）；（−）−シス−５−フルオロ−１−［２（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）；（−）２’，３’，ジデオキシ−３’−チアシチジン［（−）−ＳｄｄＣ］；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン（ＦＩＡＣ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシントリホスフェート（ＦＩＡＣＴＰ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）；１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチル−デキソシチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−デキソシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチル−デキソシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチル−シチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−シチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチル−シチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロチミジン（ＦｄｄＴｈｄ）；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−ＦｄｄＣ）２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−チアシチジン；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−シチジン（β−Ｌ−ｄｄＣ）；９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニン；２’−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシトシン；３’−アミノ−５−メチル−デキソシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２−アミノ−１，９−［（２−ヒドロキシメチル−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル］−６Ｈ−プリン−６−オン（ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ））；２−［２−（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９イルエチル）−１，３−プロパンジルジアセテート（ファムシクロビル）；２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−［（２−ヒドロキシ−エトキシ）メチル］６Ｈ−プリン−６−オン（アシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル−ブタ−１−イル）グアニン（ペンシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル−ブタ−１−イル）−６−デオキシ−グアニンジアセテート（ファムシクロビル）；３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）；３’−クロロ−５−メチル−デキソシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；９−（２−ホスホニル−メトキシエチル−）−２’，６’−ジアミノプリン−２’、３’−ジデオキシリボシド；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）−アデニン（ＰＭＥＡ）；アシクロビルトリホスフェート（ＡＣＶＴＰ）；Ｄ−炭素環−２’−デオキシグアノシン（ＣｄＧ）；ジデオキシ−シチジン；ジデオキシ−シトシン（ｄｄＣ）；ジデオキシ−グアニン（ｄｄＧ）；ジデオキシ−イノシン（ｄｄｌ）；Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジントリホスフェート；フルオロ−アラビノフラノシル−ヨードウラシル；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨード−ウラシル（ＦＩＡＵ）；スタブジン；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミンモノヒドレート（Ａｒａ−Ａ）；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミン−５’−モノホスフェートモノヒドレート（Ａｒａ−ＡＭＰ）；２−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシチジン；２’，３’−ジデオキシ−グアニン；および２’，３’−ジデオキシ−グアノシン。
【００７７】
本発明において有用であるヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製のための合成方法は、当該分野で周知であり、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ、４３、２５−３６（１９９６）；Ｓｗｅｄ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １５、３６１−３７８（１９９６）；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １２、１４６５−１４７９（１９９５）；Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．２７、２４２−２７６（１９９５）；Ｃｈｅｎａ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３、４２１−５３５（１９９４）；Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＥｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ４、９５−１１５（１９９５）において開示される。
【００７８】
先に引用される参考文献に記載される化学反応は、一般に、本発明の化合物の調製に対するその最も広い適用の観点から開示されている。時折、これらの反応は、本明細書において開示される化合物の範囲内に含まれる化合物の各々に対して、記載されるようには適用可能でない場合がある。この状態が生じる化合物は、当業者により容易に認識される。全てのこのような場合において、これらの反応は、当業者に公知の従来の修正によって（例えば、干渉基の適切な保護によって、代替的な従来の試薬に変更することによって、反応条件の慣用的な修正によって、など）首尾よく実施され得るか、または、本明細書において開示されるか、もしくは、他の従来の反応が、本発明の対応する化合物の調製に対して適用可能であるかのいずれかである。あらゆる調製法において、あらゆる出発物質が公知であるか、または、公知の出発物質から容易に調製可能である。
【００７９】
ヌクレオシドアナログは一般に、そのままで抗ウイルス因子として用いられるが、ヌクレオチド（リン酸ヌクレオシド）は時々、その細胞膜を横切る輸送を促進するために、ヌクレオシドへと変換されなければならない。細胞に進入し得る化学修飾されたヌクレオチドの一例は、Ｓ−１−３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピルシトシン（ＨＰＭＰＣ，Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。本発明において使用されるヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物（酸である）は、塩を形成し得る。例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム）との塩、または、有機塩基もしくは塩基性四級アンモニウム塩との塩が挙げられる。
【００８０】
当業者はまた、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼインヒビターを投与することを選択し得る。このようなインヒビターは、シトクロムＰ４５０により阻害される化合物の肝臓濃度を増加させ、そして／またはこのような化合物の血中レベルを増加させるのに有用であり得る。ＣＹＰインヒビターを必要とする本発明の一実施形態について、関連するＮＳ３／４Ａプロテアーゼの薬物動態を向上するあらゆるＣＹＰインヒビターが、本発明の組成物中に含まれ得、そして／または、本発明の方法において使用され得る。これらのＣＹＰインヒビターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：リトナビル（ＷＯ  ９４／１４４３６）、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、クロメチアゾール、シメチジン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、ネファゾドン、セルトラリン、インジナビル、ネルフィナビル、アムプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、ホスアムプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、サキナビル、ロピナビル、デラビルジン、エリスロマイシン、ＶＸ−９４４およびＶＸ−４９７。好ましいＣＹＰインヒビターとしては、リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリンおよびクロメチアゾールが挙げられる。リトナビルの好ましい投薬形態については、米国特許第６，０３７，１５７号およびこの米国特許において引用される文献（米国特許第５，４８４，８０１号、米国特許出願第０８／４０２，６９０号、ならびに国際出願ＷＯ  ９５／０７６９６およびＷＯ  ９５／０９６１４）を参照のこと。
【００８１】
シトクロムＰ  ５０モノオキシゲナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定するための方法は公知である（米国特許第６，０３７，１５７号およびＹｕｎら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．４０３−４０７（１９９３）を参照のこと）。
【００８２】
免疫調節因子、免疫刺激因子および本発明の併用療法の方法において有用な他の因子は、当該分野で従来どおりの量よりも少ない量で投与され得る。例えば、インターフェロンαは、ＨＣＶ感染の処置のために、代表的には、１人あたり約１×１０６単位で１週間に３回〜１人あたり約１０×１０６単位で１週間に３回の量で、ヒトに投与される（Ｓｉｍｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５：４４５−４４８（１９９７））。本発明の方法および組成物において、この用量は、１人あたり約０．１×１０６単位で１週間に３回〜１人あたり約７．５×１０６単位で１週間に３回の範囲；より好ましくは、１人あたり約０．５×１０６単位で１週間に３回〜１人あたり約５×１０６単位で１週間に３回の範囲；最も好ましくは、１人あたり約１×１０６単位で１週間に３回〜１人あたり約３×１０６単位で１週間に３回の範囲であり得る。本発明のＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターの存在下でのＣ型肝炎ウイルスに対する免疫調節因子、免疫刺激因子または他の抗ＨＣＶ因子の増強された抗ウイルス効果に起因して、これらの免疫調節因子／免疫刺激因子の減らした量が、本明細書において企図される処置方法および組成物において用いられ得る。同様に、免疫調節因子および免疫刺激因子の存在下でのＣ型肝炎ウイルスに対する本発明のＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターの増強された抗ウイルス効果に起因して、これらのＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターの減らした量が、本明細書において企図される方法および組成物において用いられ得る。このような減らした量は、治療を受けている感染患者におけるＣ型肝炎ウイルスの力価を慣用的にモニタリングすることによって決定され得る。これは、例えば、スロットブロット、ドットブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲ技術により患者の血清中のＨＣＶ  ＲＮＡをモニタリングすることによって、または、ＨＣＶの表面抗原もしくは他の抗原を測定することによって行われ得る。患者は、本明細書において開示されるＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターと抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物（例えば、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの抗ウイルス因子）とを用いる併用療法の間に同様にモニターされて、併用される場合の各々の最低有効用量を決定し得る。
【００８３】
本明細書において開示される併用療法の方法において、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの抗ウイルス化合物またはこれらの混合物は、１日１人あたり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の量；好ましくは、１日１人あたり約１０ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲の量；より好ましくは、１日１人あたり約２５ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲の量；なおより好ましくは、１日１人あたり約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇの範囲の量；そして、最も好ましくは、１日１人あたり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲の量で、ヒトに投与され得る。
【００８４】
化合物の用量は、単一の用量または見合った用量で投与され得る。後者の場合、投薬単位の組成物は、その分量（ｓｕｂｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）のこのような量を含んで１日の用量を構成し得る。１日あたりに複数の用量を用いることもまた、１日の総用量を増加させ得、これは、薬物を処方する人によって望まれるはずである。
【００８５】
ＨＣＶ感染に苦しむ患者を、本発明の化合物および／または組成物を用いて処置するためのレジメンは、種々の要因（患者の年齢、体重、性別、食事および医学的状態、感染の重篤度、投与経路、用いられる特定の化合物の効能、薬物動態および毒物学プロフィール、ならびに、薬物送達システムが利用されるかどうか、を含む）に従って選択される。本明細書において開示される薬物の組み合わせの投与は、一般に、ウイルスの力価が容認可能なレベルに到達し、感染が制御または根絶されたことを示すまで、数週間〜数ヶ月または数年の期間にわたり継続されるべきである。本明細書において開示される薬物の組み合わせを用いた処置を受けている患者は、治療の有効性を決定するために、スロットブロット、ドットブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲ技術により患者の血清中の肝炎ウイルスＲＮＡを測定することにより、または、血清中のＣ型肝炎ウイルス抗原（例えば、表面抗原）を測定することによって慣用的にモニターされ得る。これらの方法により得られるデータの継続的な解析は、組み合わせ中の各成分の最適な量が投与され、そして、処置の期間もまた決定され得るように、治療の間に処置レジメンを修正することを可能にする。従って、処置レジメン／投薬計画は、組み合わせて使用される抗ウイルス化合物（これらは、合わせて、満足のいく抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を示す）の最小量が投与され、そして、感染の首尾よい処置が必要である限り長きに渡ってこのような抗ウイルス化合物の併用での投与が継続されるように、治療の経過にわたり、合理的に修正され得る。
【００８６】
本発明は、患者（特に、ＶＸ−９５０および他の標準的なプロテアーゼインヒビターによる処置に対する耐性を生じた、ＨＣＶ感染を有する患者）においてＨＣＶ感染を処置または防止する抗ＨＣＶ活性を有する上記および類似の型の化合物との種々の組み合わせでの、本明細書において開示されるＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターの使用を包含する。例えば、１種以上のＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターが、以下との組み合わせで使用され得る：１種以上のインターフェロンもしくは抗ＨＣＶ活性を有するインターフェロン誘導体；１種以上の抗ＨＣＶ活性を有する非インターフェロン化合物；または１種以上のインターフェロンもしくは抗ＨＣＶ活性を有するインターフェロン誘導体と１種以上の抗ＨＣＶ活性を有する非インターフェロン化合物。ヒト患者においてＨＣＶ感染を処置または予防するために組み合わせで使用される場合、本明細書において開示されるＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターのいずれかと、抗ＨＣＶ活性を有する上記化合物とは、薬学的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在し得る。その相加的または相乗的な効果の観点から、上記の組み合わせで使用される場合、各々はまた、不顕性の（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）薬学的有効量または抗ＨＣＶ有効量（すなわち、単独で使用される場合には、ＨＣＶビリオンの蓄積を完全に阻害もしくは減少させるか、そして／または、患者におけるＨＣＶ感染もしくは病理に関連する状態もしくは症状を低減もしくは改善することにおいて、このようなＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターと抗ＨＣＶ活性を有する化合物とが薬学的有効量で使用される場合と比較して、減少した薬学的有効性を提供する量）で存在し得る。さらに、本発明は、ＨＣＶ感染を処置または防止するための、ＨＣＶセリンプロテアーゼインヒビターと上記のような抗ＨＣＶ活性を有する化合物との組み合わせの使用を包含し、ここで、１種以上のこれらのインヒビターまたは化合物は、薬学的有効量で存在し、そして、その他は、その相加的または相乗的な効果のために、不顕性の薬学的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在する。本明細書において使用される場合、用語「相加的効果」は、単独で投与した各因子の効果の合計と等しい、２（またはそれ以上）の薬学的に活性な因子の組み合わせた効果を記載する。「相乗的効果」は、２（またはそれ以上）の薬学的に活性な因子の組み合わせた効果が、単独で投与した各因子を効果の合計よりも大きい場合の効果である。
【００８７】
患者の状態が改善すると、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持用量が、必要に応じて投与され得る。その後、投薬量もしくは投与頻度、またはその両方が、症状の関数として、症状が所望のレベルまで改善したときに、その改善された状態が維持されるレベルまで減少され得る。しかし患者は、何らかの疾患の症状が再発したときに、長期を基礎とした間欠性の処置を必要とし得る。
【００８８】
任意の特定の患者についての特異的な投薬量および処置レジメンは、種々の要因（用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、および処置する医師の判断、ならびに、処置される特定の疾患の重篤度を含む）に依存する。活性成分の量はまた、特定の記載される化合物、および、組成物中のさらなる抗ウイルス因子の存在または非存在、およびその性質に依存する。
【００８９】
従って、治療的処置に有用な本願の因子は、単独で、適切な薬学的キャリアを含む組成物において、または、他の治療剤と組み合わせて投与され得る。投与される因子の有効量は、ケースバイケースを基礎として決定され得る。通常考慮されるべき要因としては、年齢、体重、状態の段階、他の疾患状態、処置期間、および最初の処置に対する応答性が挙げられる。代表的には、因子は、液性溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能であるように調製される。しかし、注射前の液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液のために適切な固体形態もまた調製され得る。因子はまた、当該分野で公知の方法に従って、腸溶性コーティングされた錠剤またはゲルカプセルへと処方され得る。本願の因子は、医学的に受容可能なあらゆる方法で投与され得、この投与方法は、因子の同一性および／または処置される疾患の状態もしくは処置される損傷に依存し得る。可能な投与経路としては、非経口経路（例えば、血管内、静脈内、硬膜内など）による注射、ならびに、例えば、吸入、エアロゾル化または噴霧化による、経口、経鼻腔、経眼、経直腸、局所、または経肺での投与が挙げられる。因子はまた、例えば外科手術の間に、組織表面に直接適用され得る。デポー注射、経皮パッチ、または腐食可能な移植物のような手段による持続放出投与もまた本願に具体的に含められる。
【００９０】
別の実施形態によれば、本発明は、ウイルスの生活環に必要なウイルスによりコードされるセリンプロテアーゼによって特徴付けられるウイルスに感染した患者を処置するか、または、このようなウイルスによる感染を防止するための方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的に受容可能な組成物を上記患者に投与することによるものである。好ましくは、本発明の方法は、ＨＣＶ感染に苦しむ患者を処置するために使用される。このような処置は、ウイルス感染を完全に根絶し得るか、または、その重篤度を低減し得る。より好ましくは、患者は人間である。
【００９１】
用語「処置する」は、予防的（例えば、防止する）および／または治療的な処置を包含する。用語「予防的または治療的な」処置は、当該分野において認識され、そして、１以上の本発明の組成物の宿主への投与を包含する。処置が望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）が臨床上発現する前に実施される場合、その処置は予防的なものであり（すなわち、その処置は、宿主が望ましくない状態を発症することに対して保護する）、一方で、処置が望ましくない状態が発現した後に実施される場合、その処置は治療的なものである（すなわち、その処置は、既存の望ましくない状態またはその副作用を減少、改善または安定化することが意図される）。
【００９２】
代替的な実施形態において、本発明の方法はさらに、抗ウイルス因子（好ましくは、抗ＨＣＶ因子）を上記患者に投与する工程を包含する。このような抗ウイルス因子としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：免疫調節因子（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロンおよびγ−インターフェロン、ペグ化され誘導体化されたインターフェロンα化合物ならびにサイモシン）；他の抗ウイルス因子（例えば、リバビリンおよびアマンタジン）；Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの他のインヒビター（ＮＳ２−ＮＳ３インヒビターおよびＮＳ３−ＮＳ４Ａインヒビター）；ＨＣＶの生活環における他の標的のインヒビター（ヘリカーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビターを含む）；内部リボソーム進入のインヒビター；ＩＭＰＤＨインヒビターのような広域スペクトルウイルスインヒビター（例えば、ＶＸ−４９７および米国特許第５，８０７，８７６号に開示される他のＩＭＰＤＨインヒビター、ミコフェノール酸およびその誘導体）；または、上記のいずれかの組み合わせ。
【００９３】
このようなさらなる因子は、本発明の化合物およびさらなる抗ウイルス因子の両方を含有する単一の投薬形態の一部として上記患者に投与され得る。あるいは、さらなる因子は、本発明の化合物とは別個に、複数の投薬形態の一部として投与され得、この場合、上記さらなる因子は、本発明の化合物を含有する組成物の前、本発明の化合物を含有する組成物と一緒に、または、本発明の化合物を含有する組成物の跡に投与される。
【００９４】
なお別の実施形態において、本発明は、患者への投与のために意図される生物学的な物質を前処理する方法を提供し、この方法は、上記の生物学的な物質を、本発明の化合物を含有する薬学的に受容可能な組成物と接触させる工程を包含する。このような生物学的な物質としては、血液およびその成分（例えば、血漿、血小板、血球の亜種）；腎臓、肝臓、心臓、肺などのような臓器；精子および卵子；骨髄およびその成分、ならびに、患者内に注入される予定の他の流体（例えば、生理食塩水、デキストロースなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９５】
別の実施形態によれば、本発明は、ウイルスの生活環に必要なウイルスによりコードされるセリンプロテアーゼによって特徴付けられるウイルスと潜在的に接触し得る物質を処理する方法を提供する。この方法は、上記物質を本発明に従う化合物に接触させる工程を包含する。このような物質としては、外科手術用の機器および衣服；研究所用の機器および衣服；血液回収の装置および物質；ならびに、シャント、ステントなどのような侵襲性デバイスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９６】
別の実施形態においては、本発明の化合物は、ウイルスによりコードされるセリンプロテアーゼの単離を補助するための研究所用のツールとして使用され得る。この方法は、固体支持体に結合された本発明の化合物を提供する工程；上記固体支持体をウイルスのセリンプロテアーゼに、上記プロテアーゼを上記固体支持体に結合させる条件下で接触させる工程；および、上記固体支持体から上記セリンプロテアーゼを溶出する工程を包含する。好ましくは、この方法により単離されたウイルスのセリンプロテアーゼは、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼである。より具体的には、本明細書に記載されるＶＸ−９０５および／またはＢＩＬＮ  ２０６１による処置に対して抵抗性であるのは、変異型ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼである。代表的なこのようなプロテアーゼとしては、配列番号２のタンパク質の３６位、４１位、４３位、５４位、１４８位、１５５位および／または１５６位に変異（すなわち非野生型）残基を有するような、本明細書において記載されるプロテアーゼが挙げられる。
【実施例】
【００９７】
本開示はここで一般的に記載されているが、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。以下の実施例は、単に本開示の特定の局面および実施形態を例示する目的のために含まれ、本開示を制限することは意図されない。
【００９８】
（実施例１  患者の集団と研究設計）
ＶＸ−９５０（研究ＶＸ０４−９５０−１０１）についての、第１ｂ相の無作為化盲検の用量増加臨床試験に参加した、遺伝子型１のＨＣＶに感染した３４人の患者が、この研究の被験体であった。全ての患者は、１８歳と６５歳との間の年齢であり、少なくとも１０５ＩＵ／ｍＬの基線ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを有し、そして、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＨＩＶに対してはネガティブであった。患者を３つの群に分け、連続した１４日間にわたり、４５０（ｑ８ｈ）ｍｇ、７５０（ｑ８ｈ）ｍｇ、または１２５０（ｑｌ２ｈ）ｍｇのＶＸ−９５０を与えた。各投薬群に、２人のプラシーボの患者を含んだ。研究の患者から、３つの時点において４ミリリットル（ｍＬ）の血液サンプルを採取した：投薬前日（基線サンプル）、投薬の１４日目すなわち処置の終了時（ＥＴＲサンプル）、および、研究薬物の最後の投薬から７〜１０日目（追跡サンプル）。血液を前腕の静脈の静脈穿刺によりＥＤＴＡ（Ｋ２）抗凝固薬を含むチューブに採取した。１０分間の遠心分離により血漿を分離し、凍結し、そして、−８０℃にて６ヶ月を下回る期間にわたり保存した。配列解析のために、この血漿からビリオンを単離した。
【００９９】
（実施例２  患者の血漿からのＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの増幅および配列決定）
ＨＣＶの配列解析を、血漿ウイルスからの５３４塩基対（ｂｐ）の全ＮＳ３セリンプロテアーゼ領域を含むＨＣＶ  ＲＮＡフラグメントの半ネスト化逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅によって行った。変性条件下でビリオンを溶解し、そして、標準的な市販のシリカゲル膜結合法（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ＨＣＶ  ＲＮＡを単離した。ウイルスＲＮＡからＮＳ３セリンプロテアーゼ領域を含む相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）フラグメントを合成し、そして、市販の１段階逆転写酵素ＰＣＲ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて増幅した。９１２ｂｐのＮＳ３のコード領域を、ＮＳ３領域に隣接するプライマー（ＮＳ３−１ｂ−１ｓ：ＧＧＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣ（配列番号３）；およびＮＳ３−１ｂ−３ａ：ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣ（配列番号４））を用いて増幅した。１×専売反応緩衝液中０．５μＭのプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４および３４．８単位のＲＮＡガード（ｇｕａｒｄ）（ブタＲＮａｓｅインヒビター，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の最終濃度において、各サンプルにつき２ラウンドのネストＰＣＲを行った。反応混合物を、まず、３０分間の逆転写反応のために４７℃でインキュベートし、その後、９４℃での変性段階を３分間、次いで、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間そして６８℃で４５秒間の３０サイクルを行った。最初のＰＣＲ産物を１：１０に希釈し、そして、１．２５単位のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ
Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μＭのプライマー（ＮＳ３−１ｂ−１ｓおよびＮＳ３−１ｂ−４ａ；ＣＡＴＡＴＡＣＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡ（配列番号５））、０．３ｍＭのｄＮＴＰｓ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、および１×反応緩衝液を用いた、別の半ネスト化反応において使用した。外側ＰＣＲからのＤＮＡ産物を、９４℃で３分間変性させ、そして、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間そして６８℃で３０秒間の３０サイクルで増幅した。次いで、このＰＣＲからのＤＮＡを、１％アガロースゲル上で分離し、そして、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、適切なサイズの生成物（８３０ｂｐ）を精製した。次いで、単離したＤＮＡを、Ｚｅｒｏ
Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてクローニングした。クローニングプレートを、ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に送り、ここで、９６個のクローンを増幅し、そして、患者ごと時点ごとに配列決定した。
【０１００】
（実施例３  配列アラインメントおよび系統発生解析）
配列を整列させ、そして、ソフトウェアＭｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用いて変異について解析した。ＮＳ３プロテアーゼのＮ末端の５４３個のヌクレオチド（１８１アミノ酸）を解析した。各患者についてのコンセンサス配列を、８４個の基線配列の平均から明らかにし、そして、１４日目と、追跡中（研究薬物の最終投薬から７〜１０日後）に各患者について８１個の配列の平均を得た。ＰＨＹＬＩＰ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．１９９３．ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン３．５ｃ．著者により配布。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）Ｄｎａｄｉｓｔ  ａｎｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｔｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｃｖ−ｄｂ，２００５年６月にアクセスした）を用いて、系統樹を作製した。
【０１０１】
（実施例４  組換えＮＳ３プロテアーゼタンパク質の発現および精製）
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのＭｅｔ１〜Ｓｅｒ１８１をコードするＤＮＡフラグメントを、各ＨＣＶ改変体に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、患者からの単離体の選択されたプラスミドクローンから増幅した。ＤＮＡフラグメントを、前にはＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの１８１残基が、そして、後ろにはＣ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号６）がある状態でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＢＥＶ１１へとクローニングした。次いで、組換え６×Ｈｉｓタグ（配列番号６）化ＮＳ３プロテアーゼを、以前に刊行された漏出発現法（４）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。ＮＳ３プロテアーゼ発現プラスミドを用いて新たに形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の５〜７個の単離したコロニーを用いて、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地を播種した。これらの接種培養物を、ＯＤ６２０が０．３と１との間に達するまで、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）、３７℃にてインキュベートし、次いで、これを用いて、２５０ｍＬのエルレンマイアーフラスコ中で、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する５０ｍＬの４×ＴＹ培地（３２ｇ／Ｌのトリプトン、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）を播種した（最初のＯＤ６２０は約０．０１０であった）。この発現培養物を、周囲温度（約２５℃）にて２５０ｒｐｍで振盪させながら２４時間インキュベートした。３０００×ｇで３０分間遠心分離させることにより細胞を回収し、このペレットを即座に−８０℃のエタノール浴内で凍結し、そして、プロテアーゼを精製するまで−８０℃にて保存した。
【０１０２】
組換えプロテアーゼを、刊行された方法（７）の修正法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。凍結した細胞ペレットを解凍し、そして、６．８ｍＬの冷緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０］；１Ｍ  ＮａＣｌ；１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール；５ｍＭ  イミダゾール；５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；０．１％  オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド［Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］；２μｇ／ｍＬ  ロイペプチン［Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］；１μｇ／ｍＬ  Ｅ−６４［Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］；２μｇ／ｍＬ  ペプスタインＡ［Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］）中に再懸濁した。０．８ｍＬの１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖｏｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および８μＬの１０００×Ｂｅｎｚｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖｏｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加え、その後、４℃にて３０分間やさしくロッキングすることによって、細胞を溶解した。細胞溶解物を、１６，０００×ｇで遠心分離して、不溶性の物質を除去した。各上清を、使い捨てのポリプロピレンカラム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）内の、緩衝液Ａで平衡化した０．２５ｍＬのベッドボリュームのＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にアプライした。溶解物／樹脂のスラリーを、４℃にて３０分間ロッキングした。溶解物をカラムから排出し、そして、樹脂を、３〜５ｍＬ容量の緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ８．０］；１Ｍ  ＮａＣｌ；２５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロール；３００ｍＭ  イミダゾール；５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；０．１％  オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド；２μｇ／ｍＬ  ロイペプチン；１μｇ／ｍＬ  Ｅ−６４；２μｇ／ｍＬ  ペプスタインＡ］）の２つのアリコート（各々０．２５ｍＬ）を用いて、カラムに結合したタンパク質を溶出し、２つの画分をプールし、小さなアリコートに分けて、そして、−８０℃に保存した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をウシ血清アルブミン標準物質と共に製造業者の説明書に従って用いて、この溶出したタンパク質の濃度を決定した。Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で染色した変性アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分解させたタンパク質サンプルから、プロテアーゼの純度を、１Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて見積もった。
【０１０３】
（実施例５  ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインについての酵素的アッセイ）
ＶＸ−９５０プロテアーゼインヒビターおよびＢＩＬＮ  ２０６１プロテアーゼインヒビターの両方を含む９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＢＳ  ３９９０）において、刊行されたように（７）して、インビトロプロテアーゼ活性をアッセイした。ＢＩＬＮ  ２０６１は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａにより発見されたＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼインヒビターである。簡単に述べると、プロテアーゼを５μＭの補因子ＫＫ４Ａと共に２５℃にて１０分間、そして、３０℃にて１０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ中で段階希釈したプロテアーゼインヒビター（ＶＸ−９５０またはＢＩＬＮ  ２０６１）を加え、そして、３０℃にてさらに１５分間インキュベートした。５μＭのＲＥＴ−Ｓ１（Ａｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および内部クエンチした蛍光デプシペプチド基質を加えることにより反応を開始し、３０℃にてインキュベートした。Ｔｅｃａｎ  ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＰｌｕｓプレートリーダーにおいて、生成物の放出を２０分間モニターした（３６０ｎｍにおいて励起、そして５００ｎｍにおいて放射）。データを、シンプルなＩＣ５０の式：Ｙ＝Ｖ０／（１＋（Ｘ／ＩＣ５０））にフィットさせた。
【０１０４】
（実施例６  ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインタンパク質のＫｍ決定）
内部でクエンチした蛍光デプシペプチド基質であるＲＥＴ−Ｓ１（Ａｃ−ＤＥＤ（ＥＤＡＮＳ）ＥＥαＡｂｕψ［ＣＯＯ］ＡＳＫ（ＤＡＢＣＹＬ）−ＮＨ２（配列番号７））（Ｔａｌｉａｎｉら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０（１），６０−６７）を用いて、基質の反応速度論パラメーターを決定した。プロテアーゼを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％  グリセロール、５ｍＭ  ジチオスレイトール中５μＭの補因子ペプチドＫＫ４Ａ（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫ（配列番号８））（Ｌａｎｄｒｏら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（３１），９３４０−９３４８）と共に、２５℃にて１０分間、そして、３０℃にて１０分間事前インキュベートした。ＲＥＴ−Ｓ１基質（Ａｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を加えることにより反応を開始し、３０℃にて１０分間インキュベートした。アッセイの総容量は１００μＬであった。この反応を、２５μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによりクエンチした。反応生成物を、４０℃に加熱した逆相マイクロボア高速液体クロマトグラフィーカラム（Ｐｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μ  Ｃ１８  ３００  Ａカラム，１５０×２．０ｍｍ）において分離した。Ｈ２Ｏ／０．１％  ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびアセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を用い、流速は０．２ｍｌ／分であった。以下のとおりに線形勾配を用いた：１分間にわたり５％〜３０％の溶媒Ｂ、１５分間にわたり３０％〜４０％の溶媒Ｂ、次いで、１分間にわたり、４０％〜１００％の溶媒Ｂ、３分間の定組成、その後、１分間で１００％〜５％のＢ、そして、１０分間５％のＢにおける平衡。ＤＡＢＣＹＬ−ペプチド生成物を５００ｎｍにおいて検出し、そして、代表的には、１７分付近で溶出した。ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータをミカエリス−メンテン式にフィットさせることにより、Ｋｍを決定した。
【０１０５】
（実施例７  ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼドメイン改変体のテラプレビル（Ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）（ＶＸ−９５０）のＫｉ（ａａｐ，１ｈ）の決定）
以前に刊行されたようにして（Ｌｉｎら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７），１７５０８−１７５１４）、ＮＳ３プロテアーゼドメイン改変体のテラプレビルに対する感受性を９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＢＳ  ３９９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において決定した。簡単に述べると、ＮＳ３プロテアーゼドメインを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％  グリセロール、５ｍＭ  ジチオスレイトール中５μＭのＫＫ４Ａと共に、２５℃にて１０分間、そして、３０℃にて１０分間事前インキュベートした。ＤＭＳＯ中で段階希釈したテラプレビルをこのプロテアーゼ混合物に加え、そして、３０℃にてさらに６０分間インキュベートした。５μＭのＲＥＴ−Ｓ１基質を加えることにより反応を開始し、３０℃にてインキュベートした。Ｔｅｃａｎ  ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＰｌｕｓプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）において、生成物の放出を２０分間モニターした（３６０ｎｍにおいて励起、そして５００ｎｍにおいて放射）。アッセイの総容量は１００μｌであった。アッセイの経過の間に、１０〜２０％の基質がターンオーバーするように、プロテアーゼの濃度を選択した。見かけの阻害定数（Ｋｉ（ａａｐ，１ｈ））の値を計算するために、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて、密な結合阻害についてのＭｏｒｒｉｓｏｎの式（３８）の積分形態にデータをフィットさせた。定常状態アッセイは、野生型の酵素と、全てのＲ１５５Ｋ／Ｔ／Ｉ／Ｓ改変体とが、検出限界（１００μＭ）よりも高いＲＥＴ−Ｓ１についてのＫｍを有したことを示した。従って、Ｋｉ（ａａｐ，１ｈ）値を計算するために、Ｋｍを１００μＭに設定した。Ｋｍを有意に下回る基質濃度（５μＭ）において、インヒビター研究を行った。それゆえ、真のＫｍと、計算に使用したＫｍとの間の偏差は、Ｋｉ（ａａｐ，１ｈ）の計算において無視できる作用を有するはずである。
【０１０６】
（実施例８  基線サンプルの配列解析）
各患者のＨＣＶ集団についてのコンセンサス配列を、ＨＣＶ  ｃＤＮＡを含む８４の独立したプラスミドクローンの平均から導いた。コンセンサス配列の系統解析は、配列が患者特異的であったことを示した（図１）。平均した患者間のアミノ酸準種の複雑性（ｉｎｔｒａ−ｐａｔｉｅｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）（Ｓｈａｎｎｏｎエントロピー）および多様性（Ｈａｍｍｉｎｇ距離）は低く（それぞれ、０．３３２±０．１０９および０．４２１±０．１９５）、準種の異質性と、基線におけるＨＣＶ  ＲＮＡ血漿濃度との相関性は観察されなかった。患者内のアミノ酸の多様性（この試行においては、個々のコンセンサスを、患者の遺伝子型１ａまたは１ｂのコンセンサス配列と比較した）は、遺伝子型１ａについて１．３％であり、そして、遺伝子型１ｂについて２％であった。構造モデリング解析は、全ての患者のコンセンサス配列間で観察されるサブタイプ内のアミノ酸の差は、ＶＸ−９５０の結合に対してほとんど影響を有さないか、または、影響がないものと予測した。
【０１０７】
次いで、患者特異的なプロテアーゼクローンを発現させ、そして、ＶＸ−９５０による阻害について試験した。モデリングでの観察と一致して、特定のサブタイプ内での異なる患者の単離体に由来するこれらのプロテアーゼの酵素的ＩＣ５０値には有意な差は存在しなかった。しかし、遺伝子型１ｂの患者についての平均ＩＣ５０は、遺伝子型１ａの患者についての平均ＩＣ５０よりもわずかに高かった（図２）。この知見は、ＨＣＶ−Ｈ（１ａ）およびＨＣＶ  Ｃｏｎ１（１ｂ）についてのＫｉ値を測定した以前のインビトロでの結果（７）と一致している。１ａ遺伝子型の１ｂ遺伝子型に対するモデリング解析は、インヒビター／基質の結合に影響し得る重要な差が、残基の１３２位にあり、一方で、他の差は、結合ポケットの外側に位置することを示唆した。遺伝子型１ｂのプロテアーゼのＶａｌ１３２側鎖は、ＶＸ−９５０のＰ３第三級ブチル−グリシン基と１つのファンデルワールス接触のみを形成し、一方で、遺伝子型１ａのプロテアーゼのＩｌｅ１３２側鎖は、２つの接触を形成する。この相互作用における構造的な差は、遺伝子型１ｂのプロテアーゼに比べて、より低い遺伝子型１ａのプロテアーゼとの酵素的ＩＣ５０を示す実験データと一致する。サブタイプ間にわずかな差が存在するが、両方のサブタイプが依然としてＶＸ−９５０に対してはっきりと感受性である。まとめると、ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼにおいて観察される配列の多様性にもかかわらず、遺伝子型１の患者は、プロテアーゼインヒビターＶＸ−９５０を用いた処置に対して応答性であることが期待される。ＶＸ−９５０に対するウイルスの応答において有意な差が観察されなかったという臨床データは、この知見を支持する。
【０１０８】
（実施例９  遺伝子型データ：ＥＴＲおよび追跡サンプルの配列分析
処理終了時（ＥＴＲ）のＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ配列を、各患者について基線でのコンセンサス配列と比較して、潜在的耐性変異を同定した。８０配列の平均を各ＥＴＲサンプルについて得て、そして１８１の位置の各々での改変体のパーセントを計算した。最初に、ＥＴＲサンプルの任意の１アミノ酸位置での、基線と比較して５％以上の頻度の増加を、潜在的耐性変異であると考えた。５％カットオフ値を用いた。なぜなら、これは、分析したクローン数およびＰＣＲの誤りの割合に基づく本発明者らの配列決定プロトコルのより低いレベルの感度であったからである。基線で多型である部位での変化は、耐性変異とは考えなかった。投薬の終了時のみに存在して複数の患者において観察された部位での変化を、潜在的耐性変異であると考え、次いでこれらを全ての患者において分析した。
【０１０９】
分析に関しては、患者を、ＶＸ−９５０に対するウイルス量（血漿ＨＣＶ  ＲＮＡレベル）応答に基づいてグループに分けた。患者を、ウイルス動的分析において「初期応答者」または「継続応答者」グループ分けした。ウイルス配列分析において、「初期応答者」群を、最初の減少後の血漿ＨＣＶ  ＲＮＡの増加に基づいてさらに２つの群に分けた。測定された最低ＨＣＶ  ＲＮＡレベルから投薬の最後までの０．７５のｌｏｇ１０未満の増加を有する患者を、ＨＣＶ  ＲＮＡの「プラトー」な患者と分類した。０．７５のｌｏｇ１０よりも大きな血漿ＨＣＶ  ＲＮＡ増加を有する患者を、ＨＣＶ  ＲＮＡの「跳ね返り」のある患者と分類した。未処置患者におけるＨＣＶ  ＲＮＡの正常の変動は、約０．５のｌｏｇ１０であり、これらのグループ分けは、抗ウイルス応答ならびにウイルス変異パターンに基づいた。２つのタイプの分析間でこれらのカテゴリーが不一致である２人の患者が存在した。患者１２３０８は、底から投薬終了（１４日目）までで０．０５のｌｏｇ１０の増加を有し、同じ配列分析について「プラトー」と分類されたが、ウイルスの動的分析については、１２３０８は、「継続応答者」群に入れられた。患者３１１２は、１１日目に検出不可能な血漿ＨＣＶ  ＲＮＡ（＜１０  ＩＵ／ｍｌ）を有したが、投薬終了時（１４日目）には３５ＩＵ／ｍｌの検出可能な血漿ＨＣＶ  ＲＮＡを有した。ＨＣＶ  ＲＮＡにおけるこの増加は、この患者がウイルス動的分析に関して「初期応答者」群に入れられることを引き起こした；しかし、配列分析においては、ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルは、配列決定アッセイによって検出不可能なままであり、それゆえこの患者は「継続応答者」群に入れられた。
【０１１０】
配列分析は、以下によって患者をグループ分けした：応答なし（プラシーボ）；投薬中の低下、続いて跳ね返り（跳ね返り）；投薬中の低下、続いてプラトー（プラトー）；および投薬全体を通しての継続低下（継続応答者）（図３）。さらに、これらの群内で、患者を、用量群および遺伝子型サブ群（１ａまたは１ｂ）によって分析した。最後に、変異を、ＶＸ−９５０の投薬中止後７〜１０日間収集した追跡サンプルにおいて分析して、何らかの変異の存続ならびに基線改変体からの何らかのシフトをモニタリングした。８１のクローンの平均を、各追跡サンプルに関して分析した。完全は配列分析は、患者のうちの２８人について利用可能であり、そして残りの６人の患者の分析は現在進行中である。分析は、跳ね返りを有する２人の患者、プラトーを有する３人の患者、および継続低下を有する１人の患者に関して進行中である。プラシーボ患者の最初の群（ｎ＝６）においては、どの患者のいずれの位置においても基線からの顕著な変化は存在しなかった。
【０１１１】
（実施例１０  投薬中のＨＣＶ  ＲＮＡの跳ね返りを有する患者）
ＨＣＶ  ＲＮＡにおいて２より大きなｌｏｇ１０低下でＶＸ−９５０に対して最初に応答したが、ＶＸ−９５０を投薬しながらも最終的に跳ね返りし始めた、１３人の患者が存在した。これらの１３人の患者のうち、６人は４５０ｍｇのｑ８ｈ用量群であり、１人は７５０ｍｇのｑ８ｈ用量群であり、そして６人は１２５０ｍｇのｑ１２ｈ用量群であった。完全な配列分析は、１４日目のこれらの患者のうち１１人について利用可能である（表１）。これらの患者の全てが、３６位の変異における顕著な増加を有した。３６位では、遺伝子型１ｂの患者では、野生型バリンがアラニン（Ｖ３６Ａ）に変異し（平均６０％、範囲３１％〜８６％）、そして遺伝子型１ａの患者では、アラニンまたはメチオニン（Ｖ３６Ｍ）のいずれかに変異した（平均６２％、範囲１８％〜９０％）。サブタイプ１ｂにおいてＶ３６Ｍが存在しないのは、サブタイプ１ａにおいてはほんの１つの変化であるのに対して、サブタイプ１ｂにおいては２つのヌクレオチド置換が必要であることによるようである。Ｖ３６Ａ変異は、サブタイプ１ａまたは１ｂのいずれにおいても１ヌクレオチド変化を必要とする。３６位でのグリシンへの変異（Ｖ３６Ｇ）もまた、遺伝子型１ｂの患者においてみられ、ロイシンへの変異（Ｖ３６Ｌ）は１ａ患者においてみられたが、その頻度はずっと低かった。３人の患者はまた、５４位において、トレオニンからアラニンへの変異（Ｔ５４Ａ）（平均３５％、範囲８％〜６７％）を有し、より低い頻度でセリンへの変異（Ｔ５４Ｓ）を有した。興味深いことに、３６位および５４位での変異は、相互に排他的であるようである。さらに、遺伝子型１ａである、この群における全ての患者は、１５５位においてアルギニンからリジン（Ｒ１５５Ｋ）またはトレオニン（Ｒ１５５Ｔ）のいずれかへの変異（平均６０％、範囲２２％〜９９％）を、そしてより低い頻度でイソロイシン（Ｒ１５５Ｉ）、セリン（Ｒ１５５Ｓ）、メチオニン（Ｒ１５５Ｍ）またはグリシン（Ｒ１５５Ｇ）への変異を含んだ。Ｒ１５５におけるこれらの変異がサブタイプ１ａ患者に制限されるという観察もまた、１ｂ患者においては基線からの２つのヌクレオチドの変化を必要とするのに対して、１ａ患者においては１ヌクレオチドの変化を必要とすることによるようである。この群からの追跡サンプルにおいては、野生型ウイルスは、再度出現し始めたが、ＥＴＲにおいて見られた全ての変異は、おそらくウイルスの適応度の相違に起因して頻度は異なるが、依然として存在した。配列決定サンプルは、各患者に関して跳ね返りが最初に観察された時点では利用可能ではなく、それゆえ、他の変異がそれよりも前に存在していたのかは明確ではない。
【０１１２】
（実施例１１  投薬中にプラトーなＨＣＶ  ＲＮＡ応答を有する患者）
次の群（ｎ＝８）において、患者は、ＶＸ−９５０に最初は応答したが、それらのＨＣＶ  ＲＮＡ応答は安定化され、低下し続けなかったが、ＨＣＶ  ＲＮＡの増加はみられなかった。これらの患者のうちの２人は４５０ｍｇ  ｑ８ｈ用量群であり、２人は７５０ｍｇ  ｑ８ｈ用量群であり、そして４人は１２５０ｍｇ  ｑ１２ｈ用量群であった。分析は、１４日目にこれらの患者のうちの５人について完了する（表１）。全ての患者は、１５６位においてアラニンからバリン（Ａ１５６Ｖ）またはトレオニン（Ａ１５６Ｔ）への変異を発達させ、そして非常に稀な頻度でセリン（Ａ１５６Ｓ）またはイソロイシン（Ａ１５６Ｉ）への変異を発達させた。このＡ１５６Ｖ／Ｔ変異は、この群における患者のうちの３人において非常に高い頻度（１００％）で見られ、そして他の変異はこれらの患者において見られなかった。他の２人の患者（０２１０４および１２３０８）は、それぞれ、８％のＡ１５６Ｔ変異ウイルスおよび３０％のＡ１５６Ｖ変異ウイルスを有するのみであったが、これらの患者はまた、他の位置において変異を有した（患者０２１０４に関しては４７％のＶ３６Ａ／Ｍおよび３６％のＲ１５５Ｋ／Ｔ；患者１２３０８に関しては６８％のＴ５４Ａ）。跳ね返り群からの１人の患者０２１０２はまた、類似の頻度（１１％）の変異を１５６位に有した。追跡時間点では、１５６位の変異は、野生型ウイルスまたは３６位、５４位および／もしくは１５５位の変異を有する変異のいずれかによってほぼ完全に置き換えられた。１５６位のセリンへの変化（Ａ１５６Ｓ）は、ＶＸ−９５０のインビトロ耐性研究（７）の間に見られた優勢な変異であった。Ａ１５６Ｖ／Ｔ変異もまた、インビトロ研究（７）においてＶＸ−９５０およびＢＩＬＮ  ２０６１の両方に対する交差耐性として同定された。
【０１１３】
（実施例１２  投薬中に継続応答を有する患者）
残りの７人の患者は、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルが１４日間の投薬期間全体を通して継続的に減少して、ＶＸ−９５０に応答した。これらの患者のうちの５人は、７５０ｍｇ  ｑ８ｈ用量群であり、そして２人は４５０ｍｇ  ｑ８ｈ用量群であった。これらの患者は、１４日目に非常に低いレベルのＨＣＶ  ＲＮＡ（６４ＩＬ／ｍＬから検出不可能（＜１０  ＩＬ／ｍＬ））を有し、そして配列決定データは、この時点では得られなかった。しかし、ＨＣＶ  ｃＤＮＡは、これらの患者に関して追跡サンプルから成功裏に増幅された。そして分析は、これらの７人の患者のうち６人について完了している（表１）。１４日目までに検出不可能なレベルに達した遺伝子型１ａの患者（０３２０５）は、追跡の時点で３つの変異（Ｖ３６Ａ／Ｍ（６７％）、Ｔ５４Ａ（１１％）、およびＲ１５５Ｋ／Ｔ（２６％））を有した。追跡において、２人の遺伝子型１ｂの患者は、Ｖ３６Ａ変異（２１％および２５％）およびＴ５４Ａ変異（５４％および２０％）を有し、そして別の２人の１ｂ患者は、ほんの低レベルのＶ３６Ａ変異（３％および９％）およびＴ５４Ａ変異（６％および１％）を有した。１４日目に検出不可能なＨＣＶ  ＲＮＡレベル（＜１０ＩＬ／ｍＬ）を有した最後の１ｂ患者においては、変異は、追跡において検出されなかった。
【０１１４】
（実施例１３  二重変異の頻度）
患者において見出された二重変異の頻度もまた分析した。３６位の変異が、１５５位（３６／１５５二重変異）および１５６位（３６／１５６二重変異）の両方での変異と組み合わせて見出された。遺伝子型１ａの患者のみが、３６／１５５二重変異を有した。これは、１４日目のＥＴＲにおいて、跳ね返り群において分析された８人全ての１ａ患者（平均２７．６％、範囲１０％〜７７％）およびプラトー群における２人の１ａ患者のうちの１人（９％）において見られた。３６／１５６二重変異は、ずっと頻度が低く、そして１４日目のＥＴＲにおいて、跳ね返り群において３人の患者（３％、範囲１％〜５％）およびプラトー群において２人の患者（１％および４％）において見出された。二重変異もまた、追跡サンプルにおいて、３６／１５５については類似の頻度で見出されたが、３６／１５６については、ＥＴＲサンプルと比較してより低い頻度で見出された。低下し続けた患者の群に関しては、ほんの１人の患者が３６／１５５二重変異を有したが、これは、５％で存在した。
【０１１５】
単独または組み合わせのいずれかで見出された変異の頻度を図４に示す。耐性パターンのまとめを図５に示す。図５は、各患者群に関する変異したアミノ酸の平均パーセントを示す。
【０１１６】
（実施例１４  表現型データ：耐性変異の酵素的ＩＣ５０分析）
８２個の独立した配列決定クローンの平均を遺伝子型分析に供したので、表１に示すように、各患者においてビリオンの混合物が存在した。上記配列分析において見られた全ての変異体（Ｖ３６Ａ／Ｍ／Ｇ、Ｔ５４Ａ／Ｓ、Ｒ１５５Ｋ／Ｔ／Ｍ／Ｇ／Ｓ、およびＡ１５６Ｔ／Ｖ／Ｓ）の酵素、ならびにインビボで見出されたこれらの変異の任意の観察された組み合わせのＩＣ５０を、少なくとも２つの異なる患者特異的な遺伝的背景において決定した。１つの遺伝子型内の全ての患者に関する基線ＩＣ５０は、実施例６において報告されたとおり類似していた。耐性プロテアーゼの酵素のＩＣ５０値は、遺伝子型１ａ  ＨＣＶ−Ｈ参照株と比較して倍数変化と報告されている。この参照株のＩＣ５０は、この酵素アッセイにおいて６４ｎＭであることが見出された。
【０１１７】
図５は、１変異体に関して、酵素のＩＣ５０値および参照株に対する倍数変化を示す。所定の位置での任意のアミノ酸変化が類似している値を、この図においてボックス内に一緒にグループ化する。３６位における１変異は、ＶＸ−９５０に対する低レベルの耐性を付与する。Ｖ３６Ａ／Ｍ／Ｌ変異は、特異的アミノ酸の変化にかかわらず、酵素ＩＣ５０における約１．５〜１０倍の増加を示す。トレオニンからセリンへの５４位の置換（Ｔ５４Ｓ）は、ＩＣ５０を重大には増加させなかった。しかし、Ｔ５４Ａ変異は、酵素のＩＣ５０を約１０倍増加させた。１５５位の置換はまた、アルギニンからトレオニンへの変化（Ｒ１５５Ｔ）、アルギニンからリジンへの変化（Ｒ１５５Ｋ）、アルギニンからメチオニンへの変化（Ｒ１５５Ｍ）またはアルギニンからセリンへの変化（Ｒ１５５Ｓ）のいずれについても、ごく低いレベルの耐性（ＩＣ５０における約５〜１５倍の増加）を与えた。アラニンからバリンへの１５６位の変異（Ａ１５６Ｖ）、アラニンからトレオニンへの１５６位の変異（Ａ１５６Ｔ）またはアラニンからイソロイシンへの１５６位の変異（Ａ１５６Ｉ）は、高レベルの耐性（酵素ＩＣ５０における約４００〜５００倍の増加）を与えた。興味深いことに、Ａ１５６Ｓ変異は、この位置における他のアミノ酸変化よりもＶＸ−９５０に対してずっと耐性が低く（ＩＣ５０におけるほんの２２倍の増加）、このことは、インビトロでの耐性研究（６、７）と一貫している。
【０１１８】
図６は、二重変異体について、実際の酵素ＩＣ５０値ならびに参照株に対する倍数変化を示す。これらの位置での二重変体は、いずれの単一変異よりも高いレベルの耐性を与える。１５５位または１５６位のいずれかの変異と組み合わせた３６位の変異は、それぞれの単一変異体のさらに約１０倍の耐性増加を与える。表２は、ＶＸ−９５０ならびに別のＨＣＶプロテアーゼインヒビターＢＩＬＮ２０６１に対して試験した全ての変異体に関する実際のＩＣ５０値を列挙する。３６位および５４位の変異は、ＢＩＬＮ２０６１に対してよりもずっと大きくＶＸ−９５０に対する感受性に影響を与えるが、一方、残基１５５での変異は、ＢＩＬＮ２０６１に対するずっと互いレベルの耐性を付与する。１５６位での変異ならびに二重変異は全て、両方のインヒビターに対する高レベルの耐性を付与する。しかし、Ａ１５６Ｓ変異体は、ＶＸ−９５０に対してより耐性であり、これは、以前にインビトロで示されている（７）。表３は、所定の位置での全ての変異の酵素のＩＣ５０および参照株に対する倍数変化の平均および標準偏差の値を示す。
【０１１９】
（実施例１５  各患者に関する平均表現型）
ここで行った遺伝子型分析は、各患者内での異なる耐性変異の相対比率の詳細な実験を可能にした。これらのウイルス混合物によって付与される表現型耐性のレベルをより良く理解するために、調査分析を行って、各患者に関する平均表現型を得た。所定の単一変異または二重変異内のビリオンのパーセントに、所定のその変異体に関する酵素ＩＣ５０内の平均倍率変化（表３）をかけ、次いで全ての値を各患者に加えた。相対数（１００によって割った値）を、表１の最後の欄に示す。跳ね返り群の患者に関する平均値は、１４日目に２７（範囲６〜７０）であり、そして追跡において１５（範囲３〜２９）であった。プラトー群の患者に関する平均値は、１４日目に２７２（範囲２６〜４６６）であり、そして追跡において３２（範囲１〜１２６）であった。低下し続けた最後の群の患者は、追跡において平均値４を有した（範囲０〜１０）。これらの非常に予備的な計算から、全ての患者群における耐性のレベルは、最後の用量の後に（１４日目から追跡まで）低下したようである。このことは、予想外ではない。なぜなら、薬物圧は、耐性ビリオンの選択に関してもはや存在しないからである。跳ね返り群の患者が、プラトーである患者よりも低いレベルの耐性を有するようでもある。薬物動態学的データと耐性パターンとを相関させる分析が現在行われている。
【０１２０】
（実施例１６  耐性変異の適応度分析）
これらのウイルス改変体の耐性プロファイルに加えて、これらのウイルス改変体の別の重要な局面は、適応度のレベルである。単一変異体および二重変異体のウイルス適応度を計算した（表４）。所定の時点での個々の患者における各ＨＣＶ改変体の感染単位の絶対数（ＩＵ／ｍＬ）を決定した。例えば、１４日目の患者０３２０１におけるＡ１５６Ｖ／Ｔ変異内の改変体の感染単位の絶対数を以下の通りに計算した：ＶＬｄ１４（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）＝ＶＬｄ１４（全体，３２０１）×％  Ａ１５６Ｖ／Ｔｄ１４（３２０１）。投薬終了時（１４日目，ＶＬｄ１４（全体，３２０１））または追跡（２１日目，ＶＬｄ２１（全体，３２０１））のいずれかでの総ＨＣＶ  ＲＮＡを、Ｒｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ  Ｔａｑｍａｎ  ＨＣＶアッセイによって決定したとおりの血漿ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの分析から得た。検出不可能なレベルのＨＣＶ  ＲＮＡは、５ＩＵ／ｍＬであると考えられた。投薬終了時（１４日目，％Ａ１５６Ｖ／Ｔｄ１４（３２０１））または追跡（２１日目，％Ａ１５６Ｖ／Ｔｄ２１（３２０１））のいずれかでの各個々の改変体群（例えば、Ａ１５６Ｖ／Ｔ）の百分率を、上記の配列分析から得た（表１）。次に、投薬後（１４日目〜２１日目）の個々の患者の血漿中の各ＨＣＶ改変体およびＨＣＶ集団全体に関する血漿ＨＣＶウイルス量の正味の増加倍率（ＮＶＬ）を決定した。例えば、
ＮＶＬ（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）＝ＶＬｄ２１（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）／ＶＬｄ１４（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）
ＮＶＬ（全体，３２０１）＝ＶＬｄ２１（全体，３２０１）／ＶＬｄ１４（全体，３２０１）
各ＨＣＶ改変体のＮＶＬを、各患者における血漿ＨＣＶ集団全体のＮＶＬに対して正規化した：％ＮＶＬ（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）＝ＮＶＬ（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）／ＮＶＬ（全体，３２０１）。
【０１２１】
次いで、個々の患者における各ＨＣＶ改変体の正規化したウイルス量の正味の増加倍率を、ｌｏｇ１０に変換した値（Ｌｏｇ１０［％ＮＶＬ（Ａ１５６Ｖ／Ｔ，３２０１）］）に変換し、そして１つの改変体に関する平均値を全ての患者から決定した。次いで、ＨＣＶ変異体の適応度を計算した：Ａ１５６Ｖ／Ｔ変異に関する適応度＝１０Ｌｏｇ（適応度，Ａ１５６Ｖ／Ｔ）。この相対適応度スコアを、各変異体の耐性レベルを用いて分析した。図７に示すとおり、全ての変異体は、野生型よりも適応度がより低かった。そして一般に、この分析を用いると、単一変異体の適応度と耐性との間に逆の相関が存在する。しかし、二重変異体３６／１５５は、適応度にそれほど影響を与えずに耐性における有意な増加を有する。これは、耐性を依然として付与しながらも適応度の喪失を代償する変異の相互作用に起因し得る。
【０１２２】
（実施例１７  Ｒ１５５Ｋ改変体プロテアーゼのＸ線構造）
ＮＳ４Ａペプチド補因子との複合体におけるＨＣＶ−Ｈ株プロテアーゼドメインの精製されたＲ１５５Ｋ改変体（Ｋｉｍら，（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７（２），３４３−３５５）（濃度８．０ｍｇ／ｍｌ）を、結晶化試験に用いた。このタンパク質の結晶を、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．２）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールのレザバ液体で成長させた。単結晶を、２日間にわたる平衡化後にぶら下げた液滴において得た。０．１５×０．１５×０．３５ｍｍの寸法の単結晶を、窒素ガス流中で１００Ｋまで瞬間冷却（ｆｌｕｓｈ−ｃｏｏｌ）される直前に２５％グリセロールが添加された母液の凍結防止剤溶液中に移した。回折像を、ＡＬＳビームライン５，０１に取り付けられたＣＣＤ４画像プレート機器を用いて収集した。２．５Åの解像度でのデータを指数化し、そしてＨＫＬ（２０００，ＨＫＬ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）およびＣＣＰ４ソフトウェアを用いて統合した。これらの結晶は、ａ＝２２５．３１Å、ｂ＝２２５．３１Å、ｃ＝７５．６６Å、α＝９０．００°，β＝９０．００°およびγ＝１２０．００°の単位格子寸法を有する空間群Ｒ３２に属する。後の精密化において試験自由Ｒ因子に割り当てられたデータの５％が存在する。ここで研究したＲ１５５Ｋ改変体の結晶は、以前に公開された野生型プロテアーゼＮＳ３−４Ａの結晶格子（Ｋｉｍら，前出）と同一の結晶格子を有する。公開されたＮＳ３−４Ａプロテアーゼドメイン（ＰＤＢコード：１Ａ１Ｒ）を用いて、このモデルの最初の剛体および位置精密化を行った。残基１５５の側鎖における相違がＡｒｇの代わりのＬｙｓであることを電子密度地図において確認した。このタンパク質分子を、ＱＵＡＮＴＡプログラムを用いて電子密度地図に対して視覚的に調べた。さらに、２０．０から２．５Åの解像度の範囲で精密化および個々のＢ因子精密化において溶媒分子を含ませることにより、Ｒ因子および自由Ｒ因子がそれぞれ２２．０％および２４．７％に減少した。精密化モデルに含まれた残基は、結晶非依存性分子および２つのＺｎ金属イオンに関して、ＮＳ３プロテアーゼドメインのアミノ酸１〜１８１およびＮＳ４Ａ補因子の残基２１〜３９の範囲に及ぶ。
【０１２３】
（実施例１８  コンピュータモデリング）
テラプレビルを、以前に記載された手順（Ｌｉｎら，前出）に従って、ＮＳ４Ａ補因子ペプチドとの複合体におけるＲ１５５Ｋ改変体アポ酵素のＸ線結晶構造を用いてＲ１５５Ｋ改変体ＮＳ３プロテアーゼドメインの活性部位にモデル化した。テラプレビルのケトアミド基をモデル化して、ｓｉ面付着のＳｅｒ１３９側鎖を有する共有結合付加物を形成した。この結合モードは、類似のケトアミドインヒビター（Ｐｅｒｎｉら，（２００４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４（６），１４４１−１４４６）およびケト酸インヒビター（Ｄｉ  Ｍａｒｃｏら，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１０），７１５２−７１５７）に関して観察された。このインヒビターの主鎖は、これらのケトアミドインヒビターおよびケト酸インヒビターの類似の主鎖上に重ねられた。その結果、テラプレビル主鎖は、以下の骨格水素結合の全てを作成する：Ｌｙｓ１５５カルボニルとのＰ１  ＮＨ、Ａｌａ１５７  ＮＨとのＰ３カルボニル、Ａｌａ１５７カルボニルとのＰ３  ＮＨ、およびＣｙｓ１５９のＮＨとのＰ４キャップカルボニル。この結合モードでは、Ｌｙｓ１５５側鎖を移動することを全く必要とせずに、テラプレビルのＰ２基をＳ２ポケットに配置した。テラプレビルのｔ−ブチル基およびシクロヘキシル基を、それぞれ、Ｓ３ポケットおよびＳ４ポケットに配置した。このインヒビターを、２段階でエネルギーを最小化した。第１段階では、このインヒビターおよびこのプロテアーゼのＡｒｇ１２３、Ｌｙｓ１５５、およびＡｓｐ１６８の側鎖原子のみを、１０００工程のエネルギー最小化中に移動させた。第２段階では、このプロテアーゼの全ての側鎖原子を、さらに１０００工程についてこのインヒビターとともに移動させた。このモデル化構造は、以前に記載された野生型ＮＳ３プロテアーゼの活性部位でのテラプレビルモデル（Ｌｉｎら，前出）を密接に模倣する。Ｌｙｓ１５５側鎖または他の活性な残基の側鎖の位置での有意なシフトは観察されなかった。同じ手順をテラプレビルを、ＮＳ３プロテーアゼドメインのＲ１５５Ｔ改変体の活性部位にドッキングさせるために繰り返した。しかし、この場合の酵素の構造は、Ｘ線結晶構造ではなく、Ｒ１５５Ｋ改変体結晶構造を用いて構築されたモデルである。Ｌｙｓ１５５残基をＴｈｒ側鎖で置換し、そしてＴｈｒ１５５側鎖以外の固定された酵素の全ての原子を保持することにより最小化した。このモデルでは、Ｔｈｒ１５５側鎖のヒドロキシル基は、Ａｓｐ８１の側鎖と水素結合を形成する。全てのモデリングおよび最小化の手順を、ＱＵＡＮＴＡ分子モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて実施した。
【０１２４】
（実施例１９  研究結果）
酵素アッセイおよび構造研究からの結果を、本発明の特定の改変体についての上記の考察に加えてここに提示する。
【０１２５】
１）ＮＳ３プロテアーゼのＡｒｇ１５５での置換は、ＨＣＶレプリコン細胞中でテラプレビルに対する低レベルの耐性を付与する。
【０１２６】
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼドメインのＡｒｇ１５５の観察された置換が、テラプレビル（ＶＸ−９５０）に対する耐性を付与するのに充分であるか否かを決定するために、ＮＳ３の残基１５５でのいくつかの置換（Ｒ１５５Ｋ、Ｒ１５５Ｔ、Ｒ１５５Ｓ、Ｒ１５５Ｉ、Ｒ１５５ＭまたはＲ１５５Ｇ）を高効率サブゲノムレプリコンプラスミド（Ｃｏｎ１−ｍＡＤＥ）に導入した。安定なＨＣＶレプリコン細胞をこれらの改変体の各々に関して作製し、ＮＳ３  Ａｒｇ１５５の異なる残基での置換が、細胞中でのＨＣＶ  ＲＮＡ複製がなくならなかったことを示した。野生型ＨＣＶレプリコンＣｏｎ１−ｍＡＤＥ細胞中のテラプレビルの平均４８時間ＩＣ５０値は、０．４８５±０．１０８μＭであった。これは、異なるセットの適応変異を有するＣｏｎ１ベースのＨＣＶレプリコン細胞中で以前に決定された値（０．３５４μＭ）（２４−２）（２５，４１）よりもわずかに高い。２つの主要Ａｒｇ１５５改変体（Ｒ１５５ＫおよびＲ１５５Ｔ）は、テラプレビル単独での第Ｉｂ相試験において観察され、Ｒ１５５Ｋに関して３．５９±０．２８μＭの、そしてＲ１５５Ｔに関して９．６０±０．８７μＭの、平均４８時間テラプレビルＩＣ５０値を有した。これはそれぞれ、野生型Ｃｏｎｌ−ｍＡＤＥレプリコンと比較して７．４倍の増加または２０倍の増加に対応する（表Ｉ）。テラプレビルに対する感受性の類似の減少は、Ａｒｇ１５５での他の４つのマイナーな改変体を含むＨＣＶレプリコン細胞において観察された：Ｒ１５５Ｓ、Ｒ１５５Ｉ、Ｒ１５５Ｍ、またはＲ１５５Ｇ；表Ｉ。これらの４つの改変体は、テラプレビルの第Ｉｂ相試験においてＲ１５５Ｋ／Ｔよりもずっと低い頻度で見出された。これらの４つの改変体に関するレプリコン４８時間ＩＣ５０値は、１．９７±０．２１μＭ（Ｒ１５５Ｓ）、１１．７±２．５μＭ（Ｒ１５５Ｉ）、２．６８±０．２１μＭ（Ｒ１５５Ｍ）、および３．５８±０．２４μＭ（Ｒ１５５Ｇ）であった。これは、テラプレビルに対する４．１倍、２４倍、５．５倍、および７．４倍の感受性喪失に対応する（表Ｉ）。これらの結果は、ＮＳ３  Ａｒｇ１５５の置換が、置換された残基（これは、正に荷電した残基（Ｌｙｓ）、親水性残基（ＴｈｒまたはＳｅｒ）、疎水性残基（ＩｌｅまたはＭｅｔ）、または側鎖を欠く残基（Ｇｌｙ）を含む）の物理的特性とは独立して、ＨＣＶレプリコン細胞におけるテラプレビルに対する低レベル（＜２５倍）の耐性をもたらしたことを示す。
【０１２７】
【表１】
2014217390.tif 000002
安定な野生型（ｍＡＤＥ）および改変体のＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞株を、対応する高効率Ｃｏｎ１レプリコンプラスミドからのＴ７  ＲＮＡランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）転写産物を用いて作製した。テラプレビルの平均ＩＣ５０値およびＳＤを、３つの独立した実験において、４８時間のアッセイにおいてＨＣＶレプリコン細胞株について決定した。倍数変化を、所定の改変体のＩＣ５０を、野生型ＨＣＶレプリコンのＩＣ５０によって割ることによって決定した。
【０１２８】
２）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのＡｒｇ１５５での置換は、酵素アッセイにおけるテラプレビル感受性の低下をもたらした。
【０１２９】
ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼドメイン中のＡｒｇ１５５での置換が、酵素レベルで、テラプレビルに対する感受性の欠如を引き起こすに充分であるか否かを確認するために、Ａｒｇ１５５を、ＮＳ３プロテアーゼドメイン（遺伝子型１ａ）（ここからテラプレビルを投薬する前に患者におけるＨＣＶサンプル由来の配列を誘導した）において、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＩｌｅで置換した。Ｒ１５５Ｋ変異、Ｒ１５５Ｔ変異、Ｒ１５５Ｓ変異、またはＲ１５５１変異を含むＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてテラプレビルに対する酵素感受性の決定前に精製した。テラプレビルに対する耐性を、Ｋｉ（ａｐｐ，１ｈ）における倍数変化によって規定した。Ｋｉ（ａｐｐ，１ｈ）は、テラプレビルとの１時間の事前インキュベーション後に測定した見かけのＫｉである。
【０１３０】
Ａｒｇ１５５での置換を有する改変体に対する、ＫＫ４Ａ補因子ペプチドと共複合体化（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）した野生型ＨＣＶプロテアーゼドメインについてのテラプレビルの感受性の比較を、表ＩＩに示す。ＫＫ４Ａペプチドと複合体化した、野生型遺伝子型１ａの患者のＮＳ３プロテアーゼドメインに対するテラプレビルの平均Ｋｉ（ａｐｐ，１ｈ）値は、０．０４４±０．０３３μＭであった（表ＩＩ）。対照的に、テラプレビルの平均Ｋｉ（ａｐｐ，１ｈ）値は、Ｒ１５５Ｋプロテアーゼに関して約１１倍高く、そしてＲ１５５Ｔプロテアーゼに関して９倍高かった（表ＩＩ）。この２つの主な改変体は、テラプレビル単独の第Ｉｂ相試験において観察された。テラプレビルの第Ｉｂ相試験において観察されたマイナーなＡｒｇ１５５改変体のうちの２つであるＲ１５５ＳおよびＲ１５５Ｉは、それぞれ、野生型プロテアーゼのＫｉ（ａｐｐ，１ｈ）値と比較して、２２倍および１６倍のＫｉ（ａｐｐ，１ｈ）値の増加を示した（表ＩＩ）。これらのデータは、別の正に荷電した残基（Ｌｙｓ）の保存的置換を含めた、異なるアミノ酸でのＡｒｇ１５５の置換が、テラプレビルに対する感受性の低下をもたらすことを示す。
【０１３１】
【表２】
2014217390.tif 000003
テラプレビルの平均Ｋｉ（ａｐｐ，１ｈ）値およびＳＤを、３〜５つの独立した実験においてＫＫ４Ａ補因子ペプチドおよびＦＲＥＴ基質を用いて、精製された野生型および４つの改変体ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインについて決定した。倍数変化を、野生型プロテアーゼのＫｉ（ａｐｐ，１ｈ）によって、所定の改変体のＫｉ（ａｐｐ，１ｈ）を割ることによって決定した。
【０１３２】
３）Ｒ１５５Ｋ  ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのＸ線構造
正に荷電したアミノ酸（Ｌｙｓ）を含めた別の残基によるＡｒｇ１５５の置換が、テラプレビルに対する感受性の欠如をなぜもたらすのかを理解するために、Ｒ１５５Ｋ  ＮＳ３プロテアーゼのＸ線結晶構造を決定した。Ｒ１５５Ｋ変異を操作して、ＮＳ４Ａ補因子ペプチドと共複合体化した野生型プロテアーゼの構造を決定するために以前に用いられたＴ７−タグ融合ＨＣＶ−Ｈプロテアーゼ構築物にした。２．５Åの解像度での、ＮＳ４Ａ補因子ペプチドと共複合体化したＲ１５５Ｋプロテアーゼドメインのアンサンブル構造は、以前に記載された野生型ＨＣＶ−Ｈ株プロテアーゼ複合体のアンサンブル構造（Ｋｉｍら，前出）と非常に類似する。手短に述べると、１分子のＮＳ３プロテアーゼドメイン（残基１〜１８１）および１分子の補因子ＮＳ４Ａ（残基２１〜３９）は、球状の実体を形成し、これは次いで、非対称単位において、別の球状実体とのホモダイマーを形成する。ＮＳ４Ａ補因子との複合体におけるＬｙｓ１５５改変体プロテアーゼの１つの球状単位は、野生型Ａｒｇ１５５共複合体と重なった。Ｃα原子のｒｍｓ偏差はほんの０．３１４Åであったので、これらの２つのプロテアーゼの構造にはほとんど相違が存在しない。
【０１３３】
Ｓ２ポケットおよびＳ４ポケットにおけるＮＳ３プロテアーゼの残基１２３、１６８および１５５の側鎖のクローズアップ図を図２５（Ｂ）に示す。残基１５５の側鎖（Ｌｙｓ１５５対Ａｒｇ１５５）の全体的なシフトは、残基１５５のＣδと、触媒三つ組み残基のうちの１つであるＡｓｐ８１のＣβとの間の距離によって実証されるように小さい：Ｌｙｓ１５５について４．２６Å、そしてＡｒｇ１５５について４．２４Å。Ｒ１５５Ｋプロテアーゼにおいて、Ｌｙｓ１５５の最後のアミン（Ｎｚ）とＡｓｐ８１のＣβとの間の距離は３．５Åであり、Ｌｙｓ１５５のＣδとＡｓｐ８１のＣβとの間の距離は３．６Åである。野生型プロテアーゼでは、Ａｒｇ１５５のＮＨ１およびＮｚはそれぞれ、そのＡｓｐ８１のＣβとは離れており、５．６Åおよび５．３Åである。従って、Ｒ１５５Ｋプロテアーゼ中のＬｙｓ１５５の末端アミン基は、Ａｒｇ１５５の匹敵する末端アジド基よりもＡｓｐ８１のカルボキシル基により近い。対照的に、野生型プロテアーゼにおけるＡｒｇ１５５の末端ＮＨ２およびＡｓｐ１６８のＯε２の対応する対が３．２Åであるのと比較して、Ｌｙｓ１５５のＮｚとＡｓｐ１６８のカルボキシル原子Ｏε２との間の距離はＲ１５５Ｋプロテアーゼにおいて５．８Åである。従って、Ｒ１５５ＫプロテアーゼにおけるＬｙｓ１５５の末端アミン基は、Ａｒｇ１５５の匹敵する末端アジド基よりもＡｓｐ１６８のカルボキシル基からさらに離れている。それゆえ、残基１５５でのＬｙｓによるＡｒｇの置換は、Ｓ２結合ポケットの形状を変化させ、その結果、Ｌｙｓ１５５のＮｚ原子における正の電荷は、野生型Ａｒｇ１５５とＡｓｐ１６８対の場合のようには、Ａｓｐ１６８の隣接する側鎖によって中和され得ない。
【０１３４】
４）Ｒ１５５Ｋ改変体またはＲ１５５Ｔ改変体のテラプレビルに対する耐性の機構
テラプレビルとＮＳ３プロテアーゼとの間の相互作用の構造モデルが以前に記載されている（例えば、Ｌｉｎら，前出）。Ｒ１５５Ｋ酵素とのテラプレビルの共複合体のモデルでは、残基１５５の側鎖での相違以外は、同じ相互作用が維持された。野生型プロテアーゼ構造では、Ａｒｇ１５５側鎖は、テラプレビルの二環式Ｐ２基上で曲がって、いくつかの直接的ファンデルワールス接触を行い、そしてテラプレビルのＰ２基に疎水性環境を提供する（図２６（Ａ））。しかし、Ｒ１５５Ｋ酵素のＬｙｓ１５５側鎖は、伸びたコンホメーションを有し、そしてＰ２基との１つまたは２つのみの直接接触を行い、従って、テラプレビルのＰ２基を、溶媒に対してより露出させたままにする（図２６（Ｂ））。この観察は、インビトロ酵素アッセイで示されたように、Ｒ１５５Ｋ酵素がテラプレビルに対して感受性がより低いことと一貫している。Ｒ１５５Ｍ改変体がＭｅｔ１５５側鎖の伸びたコンホメーションを有し、それゆえ、インヒビターの結合の観察された減少と一貫して、テラプレビルのＰ２基との同様により少ない相互作用を有すると仮定することは合理的である。
【０１３５】
１５５位により短い側鎖を有する残基を有する改変体に対するテラプレビルの結合の機構を理解するために、テラプレビルと複合体化したＲ１５５Ｔ改変体酵素のモデルを用いた。Ｔｈｒ１５５側鎖がインヒビターのＰ２基に疎水性カバーを提供するには短すぎることは、このモデルから明白である（図２６（Ｃ））。Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＧＩｙのような他の短い側鎖は、サイズが同様に短いかまたはさらに短く、そしてＰ２基との相互作用を失うと予想され、そしてテラプレビルに対する、より低下した結合親和性を有すると予想される。
【０１３６】
５）ＮＳ３プロテアーゼのＡｒｇ１５５に置換を有するＨＣＶ改変体レプリコンは、ＩＦＮ−αに対する感受性を完全に保持する。
【０１３７】
ＮＳ３残基１５５に置換を有するテラプレビル耐性改変体レプリコン細胞がＩＦＮ−αまたはリバビリンに対して感受性のままであるか否かをまた決定した。表ＩＩＩに示すように、ＩＦＮ−αまたはリバビリンのＩＣ５０は、Ｒ１５５Ｋ変異、Ｒ１５５Ｔ変異、またはＲ１５５Ｍ変異を含むＨＣＶレプリコン細胞について、野生型レプリコン細胞と比較して実質的に同じままであった。これらの結果は、ＩＦＮ−αとリバビリンありまたはリバビリンなしでの組み合わせが、ＮＳ３プロテアーゼ残基１５５での置換を有するＨＣＶ改変体の出現を抑制するための潜在的治療ストラテジーであり得ることを示唆する。
【０１３８】
【表３】
2014217390.tif 000004
安定な野生型ＨＣＶおよび改変体ＨＣＶのサブゲノムのレプリコン細胞株を、対応する高効率Ｃｏｎ１レプリコンプラスミド由来のＴ７  ＲＮＡランオフ転写産物を用いて作製した。ＩＦＮ−αおよびリバビリンの平均ＩＣ５０値およびＳＤを、３回の独立した実験において４８時間アッセイにて、ＨＣＶレプリコン細胞株について決定した。所定の改変体のＩＣ５０を野生型ＨＣＶレプリコンのＩＣ５０で割ることにより、倍数変化を決定した。
【０１３９】
（実施例２０  研究結果のまとめ）
１つの研究は、ＶＸ−９５０が１４日間投薬された遺伝子型１のＣ型肝炎を有する被験体におけるＨＣＶプロテアーゼＮＳ３−４Ａ領域の配列分析により、ＶＸ−９５０単独療法に対する薬物耐性変異の可能な出現をモニタリングすることであった。伝統的に、抵抗性遺伝子型決定は、集団ベースの配列決定によって行われている。これは、血漿ウイルスにおける優勢な配列を検出する。ウイルス集団のうちの２０％未満を構成するあらゆる配列は、この方法によっては検出されない。薬物耐性変異は、１４日間よりも長くかかって、この測定可能なレベルを蓄積し得るので、改変体のマイナーな集団を検出するための新たな方法が開発された。配列を、１つの時点で１人の被験体から約８０〜８５の個々のウイルスクローンから得て、その結果、集団のうちの約５％まで低下した感度で、ＶＸ−９５０の１４日間の投薬中に出現し得る耐性変異が同定され得る。
【０１４０】
ＶＸ−９５０に対するウイルス応答によってグループ分けされた被験体では、別個の変異パターンが観察された。ＨＣＶ  ＲＮＡが投薬期間中に跳ね返りをした第１群の被験体では、野生型ウイルスは、ＥＴＲおよび追跡において３６位、５４位または１５５位の変異を含む３つのウイルス改変体のうちの１つによってほぼ完全に置き換えられた。Ｖ３６Ａ変異は、遺伝子型１ｂ被験体において見出され、一方、Ｖ３６Ａ／ＭまたはＲ１５５Ｋ／Ｔは、遺伝子型１ａ被験体において見られた。いくつかの改変体はまた、１ａ被験体において３６位および１５５位の二重変異を含んだ。Ｔ５４Ａ変異は、１ａおよび１ｂの両方のサブタイプにおいて見られた。３６位および５４位の変異は、相互に排他的のようであった。なぜなら、これらは同じゲノムにおいて稀にしか一緒に見出されなかったからである。第２群の被験体は、１４日間の投薬期間の最後にレベルオフになった最初のＨＣＶ
ＲＮＡ低下を有した。これらの被験体は、１５６位にアラニンからバリン（Ａ１５６Ｖ）またはトレオニン（Ａ１５６Ｔ）のいずれかへの変異を含んだウイルスを保有した。１５６位でのこの変異は、ＶＸ−９５０の存在下でインビトロで発達することが以前に示された（６，７）。何人かの被験体は、３６位および１５６位において二重変異も含んだいくつかの改変体を保有した。
【０１４１】
被験体特異的プロテアーゼクローンを発現させ、そしてＶＸ−９５０による阻害について試験した。１つのサブタイプ内の異なる被験体単離体から誘導された基線のプロテアーゼの酵素のＩＣ５０値に有意な相違は存在しなかった。しかし、変異体プロテアーゼのＩＣ５０値は、ＶＸ−９５０に対する種々の程度の感受性減少を示す。最後の群の被験体におけるＨＣＶ  ＲＮＡは、投薬期間を通して低下し続け、そしていくつかは、現行のアッセイの検出限界（１０ＩＵ／ｍＬ）未満のレベルに到達した。本発明者らの配列決定アッセイの感度の限界（＞１００ＩＵ／ｍＬ）に起因して、ウイルス配列データは、投薬１４日目にこれらの被験体について入手可能ではない。しかし、ＶＸ−９５０の最後の用量の７〜１０日後に採取されたサンプルは、全ての被験体について成功裏に配列決定された。最初の２つの応答群からの追跡サンプルでは、耐性変異が、全ての被験体の血漿において持続することが見出された。しかし、多くの場合、１５６位での変異頻度は、野生型ならびに３６位または５４位の変異が比例して増加し始めたので、有意に減少した。１５５位の変異を有するビリオンの比率は、比較的一定のままであった。変異パターンにおけるこれらのシフトは、薬物選択圧の非存在下での改変体間の適応度の相違に起因するようである。３６位、５４位または１５５位に変異を有するウイルスは、野生型よりも適応度が低いにもかかわらず、依然として合理的に適合するが、一方、残基１５６の変異体は、薬物の非存在下では極めて適合しないようである。これらのデータから、種々の単一変異体に関して耐性レベルと適応度との間に逆の相関が存在するようである。血漿ＨＣＶ  ＲＮＡがプラトーの被験体群から得られたデータは、所定の臨床応答を生じることにおけるウイルス学的耐性および適応度の影響を示した。従って、臨床応答自体は、基礎となるウイルス学を示すことはできない。
【０１４２】
投薬中に連続したＨＣＶ  ＲＮＡ低下を有して低レベルのＨＣＶ  ＲＮＡに到達した最後の群の被験体の分析は、追跡時に存在するウイルスが、大部分が３６位および５４位での低レベルの耐性変異からなっていたこと、および被験体のうちの３人がほとんど変異を保有せず、大部分または完全に野生型であったことを明らかにする。あったにしろどのような改変体が１４日目に存在していたかは不明であるが、この結果は、ＶＸ−９５０に対する最適な応答を用いて、単独療法での、または他の抗ウイルス化合物（例えば、Ｐｅｇ−ＩＦＮ）の追加による、臨床耐性を回避することが可能であり得ることを示唆する。投薬レジメンを最適化することは、この応答をより多数の患者へと広げ得る。
【０１４３】
まとめると、これらの結果は、この研究におけるＶＸ−９５０の投薬レジメンが、種々のレベルの薬物耐性を有するＮＳ３プロテアーゼにおける異なる変異の選択をもたらし得ることを示す。増加した濃度のＶＸ−９５０は、（３６位、５４位および１５５位の）低レベルの耐性を有するウイルスの出現を予防すると予想される。（１５６位での）残りの高レベルの耐性ウイルスは、併用治療を含めた異なる処置選択肢を通して克服され得る。より高い薬物濃度は、ウイルス複製をより完全に阻害して、より急な勾配の最初の低下を引き起こし得る；従って、耐性変異が選択されて臨床耐性を引き起こす機会を減らす。ＶＸ−９５０処置に対するＰｅｇ−ＩＦＮの追加は、これらのウイルスの免疫媒介性クリアランスを増強し得、そして免疫媒介クリアランスの有効性は、耐性改変体の存在によって影響されないはずである。１５６位での変異は高レベルの耐性を付与するが、ＶＸ−９５０の非存在下でのその相対的な複製速度によって測定された場合、顕著な適応度コストを有するようになるようである。抗ウイルス薬物耐性が、損なわれたウイルス適応度と関連するというますます増加している証拠が存在する。これは、臨床利益へと翻訳され得る（１〜３，９）。このような低いレベルで複製する耐性ウイルスは、代償的適応度変異を直ちに蓄積せず、宿主免疫系または他の薬物（例えば、Ｐｅｇ−ＩＦＮ）が残りのウイルスをクリアランスするのを可能にし得る。
【０１４４】
（参考文献）
【０１４５】
【化１】
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【０１４６】
【化２】
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【０１４７】
【化３−１】
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【０１４８】
【化３−２】
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ａ底から１４日目（投薬の終了）までのＨＣＶ  ＲＮＡの対数変化。患者３１０８は、１４日目のＨＣＶ  ＲＮＡ値を有さなかったので、１１日目の値と１７日目の値とを使用して推測した。
ｂＶＸ−９５０の最初の投薬からの日数
ｃ８２クローンの平均に基づく割合
ｄ（アミノ酸位置の変異％）×（全ての単一および二重変異についてのアミノ酸についてのＩＣ５０の平均の倍数変化）／１００の合計
ｅＥＴＲ＝処置の終了（１４日目）
ｆＦＵ＝追跡（ＥＴＲ後、７〜１０日）
ｇｎ／ａ＝利用可能ではない（進行中）
ｈｎｄ＝検出不能。
【０１４９】
表２．ＶＸ−９５０およびＢＩＬＮ２０６１での単一変異および二重変異のＩＣ５０分析
【０１５０】
【化４】
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＊ｎｄ＝調べていない
【０１５１】
【化５】
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【０１５２】
【化６】
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（参考としての援用）
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、あたかも各々個々の刊行物または特許が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるように、それらの全体が参考として援用される。
【０１５３】
本開示の具体的な実施形態が議論されたが、上記の明細書は例示的であり、かつ限定的ではない。本開示の多くのバリエーションが、本明細書および上記の特許請求の範囲を鑑みることにより当業者に明らかになる。本開示の完全な範囲が、特許請求の範囲（その等価物の完全な範囲とともに）、本明細書（このようなバリエーションとともに）を参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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