(57)【要約】【課題】本発明は、新規の抗体改変体、特に重鎖および軽鎖の可変ドメイン内の位置に置換を有する抗ＨＥＲ２抗体改変体に関する。【解決手段】本発明は、アラニンスキャニングによって抗原結合に必須であることが決定された特定のヒト化抗ＨＥＲ２抗体ｈｕ４Ｄ５−８のアミノ酸、およびアラニンスキャニングによって抗原結合に比較的重要でないことが見出された他のアミノ酸（置換されて、ＨＥＲ２に対する高い親和性を有する改変体を作製し得る）の発見に基づく。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、新規の抗体改変体、特に抗ＨＥＲ２抗体改変体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
レセプターチロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーは、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存の重要なメディエータである。レセプターファミリーとしては、４つの異なったメンバー（上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む）が挙げられる。
【０００３】
ｐ１８５ｎｅｕは最初に、化学的に処置されたラットの神経膠細胞腫からのトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。活性化形態のｎｅｕプロトオンコジーンは、コードされるタンパク質の膜貫通領域における点変異（バリンからグルタミン酸へ）から生じる。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳癌および卵巣癌において観察され、そして質の低い予後に関連する（Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７−１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９０５）：７０７−７１２（１９８９）；および米国特許第４，９６８，６０３号）。今日までに、ｎｅｕプロトオンコジーンにおける点変異と類似した点変異はヒト腫瘍について報告されていない。  ＥｒｂＢ２の過剰発現（頻繁であるが均質ではない。遺伝子増幅に起因）もまた、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌を含めて、他の癌において観察されている。とりわけ、Ｋｉｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａら，  Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５−７６７（１９８６）；Ｆｕｋｕｓｈｉｇｉら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：９５５−９５８（１９８６）；  Ｇｅｕｒｉｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１−３１（１９８８）；Ｃｏｈｅｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１−８８（１９８９）；Ｙｏｎｅｍｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）；Ｂｏｒｓｔら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，３８：３６４（１９９０）；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１−４２５（１９９０）；Ｋｅｒｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）；Ｐａｒｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：  ６６０５（１９８９）；Ｚｈａｕら，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：３５４−３５７（１９９０）；Ａａｓｌａｎｄら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８−３６３（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６−５２（１９９１）；および  ＭｃＣａｎｎら，Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８−９２（１９９０）を参照のこと。ＥｒｂＢ２は、前立腺癌において過剰発現され得る（Ｇｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５−１８９（１９９６）；Ｒｏｓｓら，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７−８３３（１９９７）；  Ｒｏｓｓら，Ｃａｎｃｅｒ，７９：２１６２−２１７０（１９９７）；およびＳａｄａｓｉｖａｎら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６−１３１（１９９３））。
【０００４】
ラットｐ１８５ｎｅｕタンパク質産物およびヒトＥｒｂＢ２タンパク質産物に対して指向される抗体は、記載されている。Ｄｒｅｂｉｎおよび共同実験者は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに  対して抗体を惹起させた。例えば、Ｄｒｅｂｉｎら，Ｃｅｌｌ  ４１：６９５−７０６（１９８５）；Ｍｙｅｒｓら，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．１９８：２７７−２９０（１９９１）；およびＷＯ９４／２２４７８を参照のこと。Ｄｒｅｂｉｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２７３−  ２７７（１９８８）は、ｐ１８５ｎｅｕの２つの異なる領域と反応性の抗体の混合物が、ヌードマウス中に移植した、ｎｅｕで形質転換したＮＩＨ−３Ｔ３細胞に対して相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことを報告する。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号もまた参照のこと。  
【０００５】
種々の特性を有する他の抗ＥｒｂＢ２抗体は、以下において記載されている：Ｔａｇｌｉａｂｕｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７（１９９１）；ＭｃＫｅｎｚｉｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−５４８（１９８９）；Ｍａｒｉｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１−５３６９（１９９１）；Ｂａｃｕｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０−３６２（１９９０）；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１−８６９５（１９９１）；Ｂａｃｕｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０−２５８９（１９９２）；Ｘｕら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８（１９９３）；ＷＯ９４／００１３６；Ｋａｓｐｒｚｙｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１−２７７６（１９９２）；Ｈａｎｃｏｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０（１９９１）；Ｓｈａｗｖｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７−１３７３（１９９４）；Ａｒｔｅａｇａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）；Ｈａｒｗｅｒｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）；米国特許第５，７８３，１８６号；およびＫｌａｐｐｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）。
【０００６】
Ｈｕｄｚｉａｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−７２（１９８９）は、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けされた抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルの作製を記載する。抗体に対する曝露後のＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的細胞増殖は、７２時間後に、単層のクリスタルバイオレット染色によって決定された。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した、４Ｄ５と呼ばれる抗体を用いて最大阻害が得られた。このパネルにおける他の抗体は、このアッセイにおいてより低い程度まで細胞増殖を減少させた。抗体４Ｄ５はさらに、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳房腫瘍細胞株を、ＴＮＦ−αの細胞傷害性効果に対して感作することが見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号もまた参照のこと。Ｈｕｄｚｉａｋら（Ａ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（３）：１１６５−７２（１９８９））に考察される抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｆｅｎｄｌｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０（５）：１５５０−１５５８（１９９０）；  Ｋｏｔｔｓら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）；Ｓａｒｕｐら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２−８２（１９９１）；Ｓｈｅｐａｒｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１１７−１２７（１９９１）；Ｋｕｍａｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２）：９７９−９８６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９−１８３８（１９９４）；Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１−５３０９（１９９４）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）；Ｓｃｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００−５（１９９１）；Ｄ’ｓｏｕｚａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２−７２０６（１９９４）；Ｌｅｗｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６）；およびＳｃｈａｅｆｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）においてさらに特徴付けられる。
【０００７】
マウスモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２を２＋レベルおよび３＋レベルで過剰発現する乳癌細胞株の増殖を阻害するが、低レベルのＨＥＲ２を発現する細胞に対して活性を有さない（Ｌｅｗｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．［１９９３］）。この観察に基づき、抗体４Ｄ５が、ヒト化された（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９［１９９２］）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）と名付けられたヒト化バージョン（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に従来の化学療法を受けた、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍を有する乳癌患者において試験された（Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２６３９−２６４８［１９９９］）。この治験における患者のほとんどは、ＨＥＲ２を３＋レベルで発現したが、画分は２＋腫瘍であった。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、１５％の患者において著しく臨床応答を誘導し（患者の４％において完全応答、そして１１％において部分応答）、そしてこれらの応答の持続期間の中央値は９．１ヶ月だった。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ    Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎから１９９８年９月２５日に、腫瘍がＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の処置についての販売認可を受けた。  
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、アラニンスキャニングによって抗原結合に必須であることが決定された特定のヒト化抗ＨＥＲ２抗体ｈｕ４Ｄ５−８のアミノ酸、およびアラニンスキャニングによって抗原結合に比較的重要でないことが見出された他のアミノ酸（置換されて、ＨＥＲ２に対する高い親和性を有する改変体を作製し得る）の発見に基づく。潜在的な変異の好ましい位置は、図２において示される。従って、特定の改変体が本明細書中で詳細に考察されるが、図２中で示される１つ以上の位置で置換を有する他の改変体もまた、本発明によって企図され、そして包含される。したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１）抗体軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、該可変ドメインは、配列番号１の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）；Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、ポリペプチド。
（２）配列番号１の前記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（３）配列番号１の前記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（４）配列番号１の前記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、およびＹ９２（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目３に記載のポリペプチド。
（５）配列番号１の前記超可変領域が、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、およびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目４に記載のポリペプチド。
（６）２つまたは３つの前記アミノ酸置換を含む、項目５に記載のポリペプチド。
（７）前記アミノ酸置換の３つ全てを含む、項目６に記載のポリペプチド。
（８）配列番号１の前記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）ＷおよびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目３に記載のポリペプチド。
（９）Ｎ３０（ＶＬ）はＳと置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦと置換され、そしてＹ９２（ＶＬ）はＷと置換される、項目８に記載のポリペプチド。
（１０）抗体である、項目１、項目４および項目５のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
（１１）ヒト化抗体である、項目１０に記載のポリペプチド。
（１２）ヒト抗体である、項目１０に記載のポリペプチド。
（１３）Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目１０に記載のポリペプチド。
（１４）抗体重鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、該可変ドメインは、配列番号２の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、ポリペプチド。
（１５）配列番号２の前記超可変領域が、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆｌ００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（１６）配列番号２の前記超可変領域が、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目１５に記載のポリペプチド。
（１７）配列番号２の前記超可変領域が、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目１５に記載のポリペプチド。
（１８）アミノ酸置換Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを含む、項目１７に記載のポリペプチド。
（１９）配列番号２の前記超可変領域が、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目１５に記載のポリペプチド。
（２０）Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌのアミノ酸置換を含む、項目１９に記載のポリペプチド。
（２１）抗体である、項目１４および項目１７〜２０のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２２）ヒト化抗体である、項目２１に記載のポリペプチド。
（２３）ヒト抗体である、項目２１に記載のポリペプチド。
（２４）Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目２１に記載のポリペプチド。
（２５）ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号１の前記超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
（２６）Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、項目２５に記載の抗体。
（２７）配列番号１の前記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目２５に記載の抗体。
（２８）配列番号１の前記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、およびＹ９２（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目２７に記載の抗体。
（２９）配列番号１の前記超可変領域が、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、およびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目２８に記載の抗体。
（３０）２つまたは３つの前記アミノ酸置換を含む、項目２９に記載の抗体。
（３１）前記アミノ酸置換の３つ全てを含む、項目３０に記載の抗体。
（３２）配列番号１の前記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目２６に記載の抗体。
（３３）Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換され、そしてＹ９２（ＶＬ）はＷで置換される、項目３２に記載の抗体。
（３４）ヒト化抗体である、項目２５または項目２９に記載の抗体。
（３５）ヒト抗体である、項目２５または項目２９に記載の抗体。
（３６）Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目２５または項目２９に記載の抗体。
（３７）ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号２の超可変領域を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙｌ００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
（３８）配列番号２の前記超可変領域が、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ，Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目３７に記載の抗体。
（３９）配列番号２の前記超可変領域が、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目３８に記載の抗体。
（４０）配列番号２の前記超可変領域が、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目３８に記載の抗体。
（４１）アミノ酸置換Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを含む、項目４０に記載のポリペプチド。
（４２）ヒト化抗体である、項目２０に記載の抗体。
（４３）ヒト抗体である、項目３７または項目４０に記載の抗体。
（４４）Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目３７または項目４０に記載の抗体。
（４５）ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号１および配列番号２の前記超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）；Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
（４６）配列番号１および配列番号２の前記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目４５に記載の抗体。
（４７）Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換され、Ｙ９２（ＶＬ）はＷで置換され、Ｔ９４（ＶＬ）はＳで置換され、Ｄ９８（ＶＨ）はＷで置換され、Ｙ１００ａ（ＶＨ）はＦで置換され、そしてＹ１０２（ＶＨ）はＶで置換される、項目４６に記載の抗体。
（４８）Ｄ９８（ＶＨ）はＷで置換される、項目４６に記載の抗体。
（４９）配列番号１および配列番号２の前記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目４５に記載の抗体。
（５０）配列番号１および配列番号２の前記超可変領域が、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目４５に記載の抗体。
（５１）配列番号１および配列番号２の前記超可変領域が、以下の置換：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌを含む、項目５０に記載の抗体。
（５２）配列番号２の前記超可変領域が、置換Ｄ９８（ＶＨ）Ｗをさらに含む、項目５１に記載の抗体。
（５３）配列番号１および配列番号２の前記超可変領域が、以下の置換：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを含む、項目５０に記載の抗体。
（５４）配列番号２の前記超可変領域が、置換Ｄ９８（ＶＨ）Ｗをさらに含む、項目５３に記載の抗体。
（５５）項目４５に記載の抗体であって、ここで、ＨＥＲ２細胞外ドメインに対する前記抗体の結合親和性は、該ＨＥＲ２細胞外ドメインに対するヒト化モノクロ−ナル抗体４Ｄ５−８の結合親和性より少なくとも約３倍高い、抗体。
（５６）ヒト化抗体である、項目４５、項目５１または項目５３に記載の抗体。
（５７）ヒト抗体である、項目４５、項目５１または項目５３に記載の抗体。
（５８）Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’  フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目４５、項目５１または項目５３に記載の抗体。
（５９）ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号１の軽鎖可変ドメインを含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
（６０）配列番号１の前記軽鎖可変ドメインが、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｆ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目５９に記載の抗体。
（６１）Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換され、そしてＹ９２（ＶＬ）はＷで置換される、項目６０に記載の抗体。
（６２）Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｆ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｆ１００（ＶＬ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８。
（６３）Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８。
（６４）アミノ酸置換Ｄ９８（ＶＨ）Ｗをさらに含む、項目６３に記載の抗体。
（６５）Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）ＷおよびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目６２に記載の抗体。
（６６）Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目６２に記載の抗体。
（６７）以下のアミノ酸置換：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを含む、項目６４に記載の抗体。
（６８）以下のアミノ酸置換：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌを含む、項目６４に記載の抗体。
（６９）容器、そこに含まれる組成物、および該組成物がＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられる癌を処置するために使用され得ることを示すパッケ−ジ挿入物またはラベルを含む製品であって、該組成物は、項目６０または項目６１に記載の抗体を含有する、製品。
（７０）前記癌が乳癌である、項目６９に記載の製品。
（７１）ＨＥＲ２に結合する親抗体の抗体改変体であって、その重鎖可変ドメインの９８位にアミノ酸置換を含み、そしてここで、該抗体改変体のＨＥＲ２に対する結合親和性は、該親抗体のＨＥＲ２に対する結合親和性より高い、抗体改変体。
（７２）前記９８位のアミノ酸がＷと置換される、項目７１に記載の抗体改変体。
（７３）前記親抗体がヒト化抗体である、項目７０に記載の抗体改変体。
（７４）ヒト化抗ＨＥＲ２抗体の高親和性改変体を単離する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号２の超可変領域内において、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ），Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸における置換により抗ＨＥＲ２改変体を産生する工程であって、ここで、番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムに従う、工程；
（ｂ）（ａ）において産生された該改変体のＨＥＲ２細胞外ドメインに対する結合親和性を測定する工程；ならびに
（ｃ）高親和性改変体を選択する工程
を包含する、方法。
【０００９】
１つの局面において、本発明は、抗体軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドに関する。この可変ドメインは、配列番号１の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の上記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）ならびにＦ１００（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチドに関する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１の上記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチドに関する。
【００１２】
なお別の実施形態において、本発明は、配列番号１の上記超可変領域が、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチドに関する。
【００１３】
さらなる実施形態において、配列番号１の上記超可変領域は、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）ＹおよびＹ９２（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、配列番号１の上記超可変領域が、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、およびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、このポリペプチドは、上記アミノ酸置換を２つまたは３つ含み得る。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１の上記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）ＷおよびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドに関する。特定の実施形態において、Ｎ３０（ＶＬ）はＳと置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦと置換され、そしてＹ９２（ＶＬ）はＷと置換される。
【００１６】
全ての実施形態において、上記ポリペプチドは、例えば、ヒト化抗体（キメラ抗体を含む）またはヒト抗体のような抗体であり得、この抗体は、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、抗体重鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、この可変ドメインは、配列番号２の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換されるポリペプチドに関する。
【００１８】
１つの実施形態において、上記のポリペプチドにおける配列番号２の上記超可変領域は、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１９】
別の実施形態において、配列番号２の上記超可変領域は、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２０】
別の実施形態において、配列番号２の上記超可変領域は、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋのアミノ酸置換を含む。
【００２２】
上述のように、上記ポリペプチドは、例えば、ヒト化抗体（キメラ抗体を含む）またはヒト抗体のような抗体であり得、この抗体は、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、この抗体は、配列番号１の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される抗体に関する。
【００２４】
１つの実施形態において、この抗体において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される。
【００２５】
別の実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される。
【００２６】
なお別の実施形態において、配列番号１の上記超可変領域は、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、配列番号１の上記超可変領域は、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、およびＹ９２（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２８】
なおさらなる実施形態において、配列番号１の上記超可変領域は、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、およびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、抗体は、２つまたは３つの、例えば３つ全ての、上記置換を含み得る。
【００２９】
本発明は、配列番号１の上記超可変領域が、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体を、特に含む。従って、特定の実施形態において、本発明は、Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換されそしてＹ９２（ＶＬ）はＷで置換される抗体に関する。
【００３０】
上記抗体は、例えば、ヒト化抗体（キメラ抗体を含む）またはヒト抗体であり得、この抗体は、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、配列番号２の超可変領域を含む抗体重鎖可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙｌ００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体に関する。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明は、超可変領域が、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｙｌ００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体に関する。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の抗体において、配列番号２の上記超可変領域は、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００３４】
なお別の実施形態において、配列番号２の上記超可変領域は、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）ＫまたはＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。この抗体は、例えば、アミノ酸置換Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋ、またはＦ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌを含み得る。
【００３５】
本発明の別の局面と同じく、上記抗体は、ヒト化抗体（キメラ抗体を含む）またはヒト抗体であり得、この抗体は、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、この抗体は、配列番号１および配列番号２の超可変領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）；Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体に関する。
【００３７】
１つの実施形態において、この抗体において、配列番号１および配列番号２の上記超可変領域は、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００３８】
別の実施形態において、Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換され、Ｙ９２（ＶＬ）はＷで置換され、Ｔ９４（ＶＬ）はＳで置換され、Ｄ９８（ＶＨ）はＷで置換され、Ｙ１００ａ（ＶＨ）はＦで置換され、そしてＹ１０２（ＶＨ）はＶで置換される。
【００３９】
特定の実施形態において、Ｄ９８（ＶＨ）はＷで置換される。
【００４０】
なお別の実施形態において、配列番号１および配列番号２の上記超可変領域は、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｆ１００（ＶＬ）Ｗ；Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む。
【００４１】
さらなる実施形態において、配列番号１および配列番号２の上記超可変領域は、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００４２】
なおさらなる実施形態において、配列番号１および配列番号２の上記超可変領域は、以下の置換を含む：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌ。特定の実施形態において、配列番号２の上記超可変領域は、さらに置換Ｄ９８（ＶＨ）Ｗを含む。
【００４３】
さらなる実施形態において、ＨＥＲ２細胞外ドメインに対する上記抗体の結合親和性は、ＨＥＲ２細胞外ドメインに対するヒト化モノクロ−ナル抗体４Ｄ５−８の結合親和性より少なくとも約３倍高い。
【００４４】
さらに、この抗体は、例えば、ヒト化抗体（キメラ抗体を含む）またはヒト抗体であり得、この抗体は、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００４５】
異なった局面において、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、この抗体は、配列番号１の軽鎖可変ドメインを含み、ここで、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、およびＴ９４（ＶＬ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体に関する。
【００４６】
特定の実施形態において、配列番号１の上記軽鎖可変ドメインは、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｆ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、およびＴ９４（ＶＬ）Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００４７】
別の実施形態において、Ｎ３０（ＶＬ）はＳで置換され、Ｈ９１（ＶＬ）はＦで置換され、そしてＹ９２（ＶＬ）はＷで置換される。
【００４８】
なおさらなる局面において、本発明は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｆ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８に関する。
【００４９】
１つの実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００５０】
別の実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、アミノ酸置換Ｄ９８（ＶＨ）Ｗをさらに含む。
【００５１】
なお別の実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）ＷおよびＹ５５（ＶＬ）Ｗからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｋ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００５３】
なおさらなる実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、以下の置換を含む：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｋ。
【００５４】
異なった実施形態において、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、以下の置換を含む：Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、およびＹ１０２（ＶＨ）Ｌ。
【００５５】
別の局面において、本発明は、容器、そこに含まれる組成物、およびこの組成物がＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられる癌を治療するために使用され得ることを示すパッケ−ジ挿入物またはラベルを含む製品であって、この組成物は、請求項６０または請求項６１に記載の抗体を含有する、製品に関する。この癌は、例えば、乳癌であり得る。なお別の実施形態において、本発明は、ＨＥＲ２に結合する親抗体の抗体改変体であって、重鎖可変ドメインの９８位にアミノ酸置換を含み、そしてここで、この抗体改変体のＨＥＲ２に対する結合親和性は、この親抗体のＨＥＲ２に対する結合親和性より高い、抗体改変体に関する。特定の実施形態において、上記９８位のアミノ酸は、Ｗと置換される。親抗体は、ヒト化抗体であり得るが、これに限定されない。
【００５６】
異なった局面において、本発明は、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体の高親和性変異体を単離する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号２の超可変領域内において、Ｑ２７（ＶＬ）、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ），Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）、Ｙ１００ａ（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸における置換により抗ＨＥＲ２改変体を産生する工程であって、ここで、番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムに従う、工程；
（ｂ）（ａ）において産生されたこの改変体のＨＥＲ２細胞外ドメインに対する結合親和性を測定する工程；ならびに
（ｃ）高親和性改変体を選択する工程
を、包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−Ａ】図１Ａは、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸残基（配列番号１）を示す。図１Ａは、一般に、認められているＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））の番号付けスキームを使用する。図１Ａにおいて、超可変領域残基は、下線で示される。より以下で詳細に考察するように、超可変領域は、標準的配列定義（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））および構造的定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６（４）：９０１−１７（１９８７））の両方に従って決定した。図１Ａにおいて、これらの領域は、ＶＬ−超可変領域１（アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号１９）を含む）、ＶＬ−超可変領域２（アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２０）を含む）、およびＶＬ−超可変領域３（アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号２１）を含む）と名付けられる。
【図１−Ｂ】図１Ｂは、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の重鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸残基（配列番号２）を示す。図１Ｂは、一般に、認められているＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））の番号付けスキームを使用する。図１Ｂにおいて、超可変領域残基は、下線で示される。より以下で詳細に考察するように、超可変領域は、標準的配列定義（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））および構造的定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６  （４）：９０１−１７（１９８７））の両方に従って決定した。図１Ｂにおいて、超可変領域は、ＶＨ−超可変領域１（アミノ酸配列ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号２２）を含む）、ＶＨ−超可変領域２（アミノ酸配列ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）を含む）、およびＶＨ−超可変領域３（アミノ酸配列ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号２４）を含む）と名付けられる。
【図２】図２Ａは、ファージディスプレイライブラリーにおける変異した残基位置を示す。ｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂの表面上の１９残基を、ＮＮＳコドン縮重を使用して完全にランダム化した。ランダム化した残基（Ｋａｂａｔ番号付け；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．およびＷｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１）：２０５−６（２００１））を、抗体構造の表面上のその位置によって、図２Ｂに示す５つのライブラリーにグループ化した。幾つかの残基は、コンテクスト依存効果（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ）について試験するために、１つ以上のライブラリーに含めた。
【図３】図３は、Ｆａｂ−ファージクローンにおけるアミノ酸置換を示す。各位置について、供給源ライブラリー、野生型残基、および４ラウンドの選択の後で最も一般に観察される残基（φ）を示す。各アミノ酸の観察頻度（Ｋａｂａｔ番号付け；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．およびＷｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１）：２０５−６（２００１））を、独特の配列のクローンの数（ＮＵ；すなわち、同種クローンを除く）に基づいて計算し、縮重コドン、コドン傾向、および独特配列の総数（同種を除く）について基準化した。野生型および最も頻度の高い残基を、太字および下線でそれぞれ示す。ＮＴは、その位置において配列決定したクローンの総数（同種を含む）である。
【図４】図４は、３７℃におけるＦａｂ変異体の抗原結合動態学を示す。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。これらは、４図の回の異なったＨＥＲ２−ＥＣＤ密度（８６〜３８０ＲＵの範囲に及ぶ）における４測定の平均を表す。§は、１つの変異体Ｙ９２（ＶＬ）Ｗについてのデータを示す。これは、ＨＥＲ２結合の低い発現を示し、この変異体が誤って折り畳まれた（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）ことを示唆する。多くの変異体は、Ｍ．３（Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ）およびＭ．７（Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ＋Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ＋Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ＋Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ＋Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ）である。
【図５】図５は、ｈｕ４Ｄ５−８における選択した残基の可変性を示す。ファージ選択結果についてのＷｕ−Ｋａｂａｔ可変性パラメーター（Ｖｓ）（黒）  対  ヒトκ軽鎖およびヒト重鎖の天然可変性（灰色）。可変性は、以下のように計算される：Ｖｓ＝ｎａａ／（Ｎ最大値／Ｎ総数）、ここでｎａａ＝所定の位置における異なったアミノ酸の数（すなわち、２０の可能性がある）、Ｎ最大値＝その位置における最も一般的なアミノ酸の出現率、そしてＮ総数＝その位置におけるアミノ酸の総数（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２（２），２１１−５０  （１９７０））。
【図６】図６は、Ｆａｂ改変体のＨＥＲ２−ＥＣＤに対する結合親和性を示す。変異体を、示した各温度において野生型と比較した。この温度の範囲に渡って、ＷＴは、高温でやや弱くなる（ΔΔＧ＝０．２０）。ｈｕ４Ｄ５−８と比較した結合エネルギー（ΔΔＧ）の相違を、図４において示されるＫＤ値を使用して各変異体について計算した：（ΔΔＧ＝ΔＧ（ＷＴ）−ΔＧ（変異体）＝−ＲＴ  ｌｎ（ＫＤ（変異体）／ＫＤ（野生型））。表される変異体の順番は、各温度パネルについて、同じである：（１）Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ；（２）Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ；（３）Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ；（４）Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；（５）Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ；（６）Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ；（７）多変異Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ＋Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ＋Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ＋Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ＋Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ；および（８）Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ。
【図７】図７は、ｈｕ４Ｄ５−８構造における、配列多様性の比較（Ａ）およびＡｌａ−スキャン結果（Ｂ）を示す。ファージライブラリーから選択される残基（Ａ）は、３つの範疇に分類される：低い可変性のクラス１（残基Ｎ３０’、Ｇ９９’、Ｙ１００ａ、Ｗ９５、Ｒ５０’、Ｙ３３、Ｒ５８’、およびＹ５６）、中程度の可変性のクラス２（残基Ｙ９２、Ｈ９１’、Ｔ９４’、Ｆ５３’、Ｙ４９、Ｙ５５、およびＦ１００’）、ならびに高度の可変性のクラス３（残基Ｙ１０２およびＤ９８’）。（Ｂ）ＫＤに対する効果を有する残基を示すアラニンスキャン結果（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））；５０倍〜５０００倍のＫＤ（残基Ｈ９１’、Ｙ１００ａ、Ｗ９５、およびＲ５０’）、１．５〜２倍のＫＤ（残基Ｙ９２、Ｎ３０’、Ｆ５３’、Ｙ４９、Ｆ１００’、およびＤ９８’）、ならびに＜１．  ５倍のＫＤ（ＫＤの少ない改善を含む）（残基Ｄ２８’、Ｒ６６’、Ｔ３１’、Ｓ５０’、Ｓ５２’、Ｙ５５、Ｔ９３’、Ｔ９４’、Ｙ３３、Ｔ３２’、Ｙ５６、Ｙ５２、Ｄ３１’、Ｎ５４’、Ｔ５３’、およびＫ３０’）。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、親抗体と等しいか親抗体より高いＨＥＲ２結合親和性を有するヒト化抗ＨＥＲ２抗体、ｈｕ４Ｄ５−８の改変体の同定に基づく。これらの改変体は、一組のＦａｂライブラリーから同定された。このＦａｂライブラリーにおいて、軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインの中に１９の位置が２０個全てのアミノ酸で置換された。これらの位置は、ｈｕ４Ｄ５−８可変領域のアラニンスキャニング変異に一部基づく置換について選択された。ｈｕ４Ｄ５−８抗体の高親和性ＨＥＲ２結合部位の範囲内の配列可変性を、一価のディスプレイＦａｂ−ファージライブラリーの構築、ＨＥＲ２結合クローンの選択、および、高レベルの全体の可変性（最小の同種で、すなわち、同一クローンの出現）が観察される選択過程における一点における、各ライブラリープールからの大量サンプル（５０〜７０クローン）の配列決定によって試験した。可溶性Ｆａｂフラグメントの結合親和性もまた、試験した。１つの変異体、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗが、野生型ｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂに対し３倍の改善された結合親和性を有することが見出された。
【００５９】
従って、本発明は、抗体改変体、特に抗ＨＥＲ２抗体改変体に関する。
【００６０】
（１．定義）
他に規定されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）。当業者は、本明細書中で記載されるものと類似するかまたは等価の多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得ることを理解する。実際、本発明は、記載される方法および材料には決して限定されない。本発明の目的について、以下の用語を以下に定義する。
【００６１】
本開示を通じて、用語「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２レセプター」、「ｃ−ＥｒｂＢ２」、および「ＨＥＲ２」は、相互交換可能に使用され、そして、示されない限り、ＥｒｂＢ２ヒトポリペプチドのネイティブの配列、またはその機能的誘導体をいう。「ｈｅｒ２」、「ｅｒｂＢ２」、「ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２」は、対応するヒト遺伝子をいう。この文脈において、用語「ネイティブの配列」または「ネイティブ」は、その調製様式に関わらず、天然に存在するポリペプチドの配列を有するポリペプチドを、いう。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、天然から単離され得るか、あるいは組換え手段もしくは合成手段によって、またはこれらの方法もしくは類似の方法の任意の組み合わせによって、産生され得る。
【００６２】
従って、「ネイティブ」または「ネイティブ配列」ＨＥＲポリペプチドは、天然から単離され得るか、組換えＤＮＡ技術により産生され得るか、化学的に合成され得るか、またはこれらの方法もしくは類似の方法の任意の組み合わせによって産生され得る。ネイティブヒトＨＥＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列およびコードヌクレオチド配列は、例えば、Ｓｅｍｂａら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５）２（１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４（１９８６）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘｏ３３６３）において、開示される。ＥｒｂＢ２は、４つのドメイン（ドメイン１〜４）を含む。他の非ヒト動物（例えば、哺乳動物の種）由来のＨＥＲ２ポリペプチドもまた、当該分野で周知である。「機能的誘導体」としては、対応するネイティブペプチドの定性的生物学的活性を保有する限り、ネイティブポリペプチドのアミノ酸改変体、および共有結合誘導体が挙げられる。アミノ酸配列「改変体」は、一般に、ネイティブアミノ酸配列内のどこかでの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によってネイティブ配列と異なっている。欠失改変体としては、ネイティブポリペプチドのフラグメント、ならびにＮ末端切断および／またはＣ末端切断を有する改変体が、挙げられる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）」（ＨＲＧ）は、タンパク質複合体ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４を活性化する（すなわち、複合体におけるチロシン残基への結合に際して、チロシン残基のリン酸化を誘導する）ポリペプチドをいう。この用語によって包含される種々のヘレグリンポリペプチドは、例えば、Ｈｏｌｍｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；ＷＯ９２／２０７９８；Ｗｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（３）：１９０９−１９１９（１９９４）およびＭａｒｃｈｉｏｎｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３１２−３１８（１９９３）において開示される。この用語は、天然に存在するＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよび／または改変体（例えば、そのＥＧＦ様ドメインフラグメント（例えば、ＨＲＧβ１７７−２４４））を含む。
【００６４】
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、核酸アナログから作製されたＤＮＡまたはＲＮＡどちらかの等価物、アナログを含み、一本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドに適用可能である。「単離された」核酸分子は、同定され、少なくとも１つの夾雑核酸分子（この核酸の天然の供給源において元来共存している）から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態または配列以外である。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞において存在する核酸分子から見分けられる。しかし、単離された核酸分子は、通常抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子（例えば、天然の細胞と異なる染色体位置における核酸分子）を含む。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子をいう。用語「発現ベクター」は、ベクターによって運ばれるそれぞれの組換え遺伝子にコードされる、目的のＨＥＲ２タンパク質を合成可能なプラスミド、コスミドまたはファージを含む。好ましいベクターは、自己複製および／または連結される核酸の発現が可能なベクターである。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般に使用されるベクターの形態であるため、相互交換可能に使用される。
【００６６】
用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、発現ベクター）の、核酸媒介性遺伝子転移による、レシピエント細胞への導入をいう。「形質転換」は、本明細書中で使用される場合、細胞の遺伝子型が、細胞の外因性ＤＮＡまたは外因性ＲＮＡの取り込みの結果として変化する（例えば、形質転換細胞が、ＨＥＲ２の組換え型を発現する）過程をいう。
【００６７】
用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳動物網の全てのメンバーをいう。「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物（ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、動物園の動物、運動用動物、または愛玩動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび高等霊長類）を含む）をいう。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、発現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、そしてこのような命名は全て、子孫を含む。従って、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、転移の回数を考慮せず、初代目的細胞およびそれに由来する培養物を含む。全ての子孫は、故意または故意でない変異に起因して、ＤＮＡ内容物において正確に同一でない場合があることがまた理解される。用語「子孫」は、最初に形質転換された細胞または細胞株の後の、全ての世代の任意のおよび全ての子孫をいう。子孫は、その最初に形質転換された細胞についてスクリーニングした同一の機能また同一の生物学的活性を有する変異体の子孫が、含まれる。ここで、明らかな命名が意図される場合、この名は、文脈から明らかとなる。
【００６９】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして特に、インタクトな抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成  される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメント（これらのフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り）を包含する。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に存在する可能性のある変異体を除いて同一である）から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体により混入されずに合成され得る点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法にこの抗体の産生を必要とするとはみなされない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）により作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば  Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００７１】
抗体は、特に「キメラ」抗体およびそのような抗体のフラグメント（これらが、所望の生物学的活性を示す限り）を含み、ここで  は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、その鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに由来する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００７２】
「抗体フラグメント」は、好ましくは抗原結合領域またはその可変領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００７３】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列改変体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。  
【００７４】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分については、ヒト化抗体  は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）の実質的に全てを含み、ここで全てまたは実質的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００７５】
ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体としては、米国特許第５，８２１，３３７号（本明細書中に参考として明確に援用される）の表３に記載されるような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ７）；同時係属出願番号０９／８１１１１５（本明細書中で参考として援用される）で記載されるような、ヒト化５２０Ｃ９抗体（ＷＯ９３／２１３１９）およびヒト化２Ｃ４抗体が挙げられる。本開示を通して、用語「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」および「ｈｕ４Ｄ５−８」は、相互交換可能に使用される。
【００７６】
用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、配列においておよび／または形態構造的に規定されるループの超可変な抗体可変ドメインの領域をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２、５０〜５２および９１〜９６ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２、５３〜５５、および９６〜１０１；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。両方の場合において、可変ドメイン残基は、以下でさらに詳しく考察されるように、Ｋａｂａｔら（前出）に従って番号付けられる。「フレームワーク」残基すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるこれらの超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７７】
「親抗体」または「野生型」抗体は、本明細書中に開示される抗体改変体と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変化を欠いたアミノ酸配列を含む抗体である。従って、親抗体は、一般に、アミノ酸配列において、本明細書中で開示される抗体改変体の対応する超可変領域のアミノ酸配列と異なる、少なくとも１つの超可変領域を有する。親ポリペプチドは、ネイティブな配列の（すなわち、天然に存在する）抗体（天然に存在する遺伝子座改変体を含む）、または天然に存在する配列の、前もって存在するアミノ酸配列改変（例えば、挿入、欠失、および／または他の変化）が存在する抗体を含み得る。好ましくは、親抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。例えば、以下に例示の目的で開示される、野生型抗体ｈｕ４Ｄ５−８（米国特許第５，８２１，３３７号に記載される）は、いかなるアミノ酸置換または他の改変を有さないｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８である。本開示を通じて、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」および「親（ｐａｒｅｎｔ）」または「親（ｐａｒｅｎｔａｌ）」抗体は、相互交換可能に使用される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「抗体改変体」または「改変抗体」は、親抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体をいう。好ましくは、抗体改変体は、天然に見出されないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。このような改変体は、親抗体に対し、１００％未満の配列同一性または配列類似性を有する。好ましい実施形態において、抗体改変体は、親抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対し、約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満、そして最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書中で、候補配列中の親抗体と同一なアミノ酸残基（すなわち、同じ残基）のパーセンテージとして、配列を並べ、そして配列同一性の最大パーセントを達成するために、必要な場合ギャップを導入した後で、定義される。Ｎ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失、または可変ドメインの外側の抗体配列への挿入のいずれも、配列同一性または類似性に影響するとは考えられない。抗体改変体は、一般に、その１つ以上の超可変領域の中に、またはこれに隣接して、１つ以上のアミノ酸改変を含む改変体である。
【００７９】
「アミノ酸改変」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列中の変化をいう。例示的な改変としては、挿入、置換、および欠失が挙げられる。「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基の、別のアミノ酸残基との置き換えをいう。
【００８０】
アミノ酸残基の「置き換え」は、アミノ酸配列中で別のアミノ酸残基と置き換えられるすなわち置換されるアミノ酸残基をいう。置き換え残基は、天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。
【００８１】
「アミノ酸挿入」は、１つ以上のアミノ酸残基の、所定のアミノ酸配列への導入をいう。アミノ酸挿入は、「ペプチド挿入」を含み得、ここでは、ペプチド結合によって結合された２つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドが、所定のアミノ酸配列内に導入される。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を含む場合、挿入されたペプチドは、ランダム突然変異誘発によって産生され得、これにより、このペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。「超可変領域に隣接する」アミノ酸改変は、超可変領域のＮ末端および／またはＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の導入または置換をいい、これにより、少なくとも１つの挿入されたアミノ酸残基または置換されたアミノ酸残基は、問題の超可変領域のＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基とペプチド結合を形成する。
【００８２】
「天然に存在するアミノ酸残基」は、遺伝子コードによってコードされる残基であり、一般に、以下からなる群から選択される：アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）。
【００８３】
本明細書中の「天然に存在しないアミノ酸残基」は、上で列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であり、ポリペプチド鎖内でアミノ酸残基に隣接して共有結合し得る残基である。天然に存在しないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよびＥｌｌｍａｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）において記載されるような他のアミノ酸残基アナログが挙げられる。このような天然に存在しないアミノ酸残基を産生するため、Ｎｏｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（前出）の手順が使用され得る。簡潔には、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基によるサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化、それに続くＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を含む。
【００８４】
本開示を通じて、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１）からの番号付けシステムが、参照される。これらの大要において、Ｋａｂａｔは、各サブクラスの抗体についての多くのアミノ酸配列を列挙し、そしてそのサブクラスにおいて各残基位置における最も一般に存在するアミノ酸を列挙する。Ｋａｂａｔは、列挙された配列の各アミノ酸に対する残基数を評価する方法を使用し、この残基数を評価する方法は、この分野で標準となっている。本明細書において、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、使用される。本発明の目的のために、候補抗体アミノ酸配列の候補の残基数（Ｋａｂａｔ大要に含まれない）を評価するため、以下の工程に従う。一般に、候補配列は、Ｋａｂａｔにおける任意の免疫グロブリン配列または任意の定常配列と並べられる。整列は手によってなされても一般に認められたコンピュータープログラム（例えば、Ａｌｉｇｎ  ２プログラム）を使用して、コンピューターによってなされてもよい。整列は、多くのＦａｂ配列に共通する幾つかのアミノ酸残基の使用によって、容易にされ得る。例えば、軽鎖および重鎖は、代表的に２つのシステイン（同じ残基番号を有する）を有する；ＶＬドメインにおける２つのシステインは、代表的に、残基番号２３および２８であり、ＶＨドメインにおける２つのシステイン残基は、代表的に、残基番号２２および９２である。フレームワーク残基は、一般に（常にではないが）およそ同じ数の残基を有するが、ＣＤＲは大きさが変化する。例えば、並べられたＫａｂａｔにおける配列中のＣＤＲより長い候補配列由来のＣＤＲの場合、代表的には、さらなる残基の挿入を示す接尾辞が、残基数に加えられる（例えば、図１Ｂにおける残基１００ａｂｃ）。例えば、残基３４および３６のＫａｂａｔ配列と並べたが、これらの間に残基３５を有さない候補配列については、番号３５は、単純に残基として評価されない。
【００８５】
本明細書中で記載されるように、特定のアミノ酸残基が、他の残基と置換され得る。本明細書中の置換改変体の命名は、文字に続く数字に続く文字からなる。最初（最も左）の文字は、野生型抗体におけるアミノ酸を表す。数は、アミノ酸置換が行われたアミノ酸位置をいい、そして第２の（右側の）文字は、その位置で野生型アミノ酸と置換されるために使用されたアミノ酸を表す。さらに、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、残基および／または置換の特定の位置を示す数に従って挿入され得る。例えば、図４に列挙されたｈｕ４Ｄ５−８改変体は、野生型ｈｕ４Ｄ５−８抗体軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１および配列番号２）を参照して表される。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「高い親和性」を有する抗体は、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲またはそれ以上のＫＤすなわち解離定数を有する抗体である。「ナノモル濃度範囲以上の」ＫＤは、ＸｎＭによって表され得、ここでＸは、約１０未満の数である。
【００８７】
「細胞死を誘導する」分子は、生存細胞を生育不能にさせる分子である。この細胞は、一般に、ＥｒｂＢ２レセプターを発現する細胞であり、特に、この細胞は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する。好ましくは、細胞は、癌細胞（例えば、乳房癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、子宮内膜癌細胞、唾液腺癌細胞、肺癌細胞、腎臓細胞、結腸癌細胞、甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞または膀胱癌細胞）である。インビトロでは、細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。インビトロでの細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を区別するために、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され得る。従って、細胞死についてのアッセイは、熱不活化血清を使用して（すなわち、補体の非存在下で）かつ免疫エフェクター細胞の非存在下で行われ得る。分子が細胞死を誘導し得るか否かを決定するために、膜の完全性の損失（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１（１９９５）を参照のこと）または７ＡＡＤの取り込みによって評価されるような）が、非処理細胞と比較して評価され得る。好ましい細胞死誘導抗体は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取り込みアッセイにおいて、ＰＩ取り込みを誘導する抗体である（以下を参照のこと）。
【００８８】
「アポトーシスを誘導する」分子は、以下によって決定されるような、プログラムされた細胞死を誘導する抗体である：アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成。この細胞は、通常、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞（例えば、乳房腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、子宮内膜腫瘍細胞、唾液腺腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、腎臓細胞、結腸腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞または膀胱腫瘍細胞）である。インビトロでは、細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−  ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。種々の方法が、アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）トランスロケーションが、アネキシン結合によって測定され得；ＤＮＡのフラグメント化が、ＤＮＡのラダー形成によって評価され得；そしてＤＮＡのフラグメント化に伴う核／クロマチンの圧縮が、低二倍体細胞の任意の増加によって評価され得る。好ましくは、アポトーシスを誘導する分子は、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、非処理細胞と比較して、約２〜５０倍、好ましくは、約５〜５０倍、そして最も好ましくは、約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導を生じる抗体である。時には、このプロアポトーシス分子は、ＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンド活性化をさらにブロックする抗体である。他の状況において、この分子は、ＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンド活性化を有意にブロックしない抗体である。さらに、この分子は、Ｓ期にある細胞の割合の大きな減少を誘導せずに、アポトーシスを誘導し得る（例えば、コントロールと比較して、これらの細胞の割合は、約０〜１０％の現象を誘導するのみの分子）。  
【００８９】
用語「処置する」または「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいい、ここで目的は、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、癌の発達または核酸）を予防または減速（減少）させることである。本発明の目的のためは、有益または所望の臨床結果としては、検出し得るかまたは検出し得ない、症状の軽減、疾患の程度の軽減、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の緩和または寛解、および寛解（部分的または全体のどちらか）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測された生存と比較して生存を引き伸ばすことも意味する。処置が必要なものとは、既に状態または障害を有するもの、ならびに状態または障害を有する傾向があるものあるいは状態または障害が予防されるべきものを含む。
【００９０】
用語「治療的有効量」とは、哺乳動物における疾患または障害を処置するために有効な分子の量をいう。癌の場合において、薬物の治療的有効量は、癌細胞の数を減少し得るか；腫瘍サイズを減少し得るか；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度減速させ得、そして好ましくは、停止させ得る）か；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度減速させ得、そして好ましくは、停止させ得る）か；腫瘍増殖をある程度阻害し得るか；そして／または癌に関連する１つ以上の症状をある程度軽減し得る。分子が増殖を妨げ得るか  そして／または既存の癌細胞殺傷し得る程度まで、分子は、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療のために、効力は、例えば、疾患進行に対する時間（ＴＴＰ）の評価および／または応答速度（ＲＲ）の決定によって測定され得る。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、全ての新生物細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）ならびに細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および全ての前癌性または癌性の細胞または組織をいう。
【００９２】
用語「癌」および「癌性」とは、調節されない細胞増殖によって代表的に特徴付けられる、哺乳動物の生理学的状態を言及または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。  
【００９３】
「ＥｒｂＢを発現する」癌または「ＥｒｂＢを発現する細胞」を含む癌は、その細胞表面に存在するＥｒｂＢタンパク質を有する細胞を含む癌である。「ＥｒｂＢを発現する」癌または「ＥｒｂＢを発現する細胞」を含む癌は、その細胞表面に十分なレベルのＥｒｂＢ２を産生する癌であり、その結果、抗ＥｒｂＢ２抗体が、それに結合し得、そしてこの癌に対する治療効果を有する。
【００９４】
ＥｒｂＢレセプターの「過剰な活性化によって特徴付けられる」癌は、癌細胞におけるＥｒｂＢレセプター活性化の程度が、同じ組織型の非癌性細胞におけるレセプターの活性化のレベルを有意に超える癌である。このような過剰な活性化は、ＥｒｂＢレセプターの過剰発現および／または癌細胞中のＥｒｂＢレセプターの活性化に利用可能な正常レベルを超えるＥｒｂＢリガンドから生じ得る。このような過剰な活性化は、癌細胞の悪性疾患状態を引き起こし得るか、そして／またはこのような状態から引き起こされ得る。
【００９５】
ＥｒｂＢレセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に有意により高いレベルのＥｒｂＢレセプター（例えば、  ＨＥＲ２）を有する癌である。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、あるいは転写または翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＥｒｂＢレセプターの過剰発現は、細胞の表面上に存在するＥｒｂＢタンパク質のレベルの増加を評価することによる（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる）、診断アッセイまたは予後アッセイにおいて決定され得る。あるいは、またはさらに、例えば、以下によって、細胞中のＥｒｂＢコード核酸のレベルを測定し得る：蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））。また、生物学的流体（例えば、血清）中の流出（ｓｈｅｄ）抗原（例えば、ＥｒｂＢ細胞外ドメイン）を測定することによって、ＥｒｂＢレセプター過剰発現を研究し得る（例えば、米国特許第４，９３３，２９４号（１９９０年６月１２日発行）；ＷＯ９１／０５２６４（１９９１年４月１８日公開）；米国特許第５，４０１，６３８号（１９９５年３月２８日発行）；およびＳｉａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０（１９９０）を参照のこと）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイが、当業者に利用可能である。例えば、患者の体内の細胞に抗体（必要に応じて、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識する）を曝露させ得、そしてこの抗体の患者の細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することによって、評価し得る。  
【００９６】
ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は、１細胞につき発現するＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学的値によって評価され得、そして生化学的に決定され得る：０＝０〜１０，０００コピー／細胞、１＋＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞、２＋＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞、３＋＝少なくとも約２，０００，０００コピー／細胞。チロシンキナーゼのリガンド非依存性活性化をもたらす３＋レベルのＨＥＲ２の過剰発現（Ｈｕｄｚｉａｋら，Ａ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（３）：１１６５〜７２（１９８９））は、約３０％の乳癌を引き起こし、そしてこれらの患者において、再発のない生存および全体の生存は、減少した（Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９０５）：７０７−１２（１９８９）；Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７−１８２（１９８７））。
【００９７】
逆に、「ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴付けられない」癌は、診断アッセイにおいて、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、正常レベルよりも高いレベルのＥｒｂＢ２レセプターを発現しない癌である。  
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害するかまたは妨げ、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、以下を含むことが意図される：放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素（そのフラグメントおよび／または改変体を含む）。
【００９９】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾデパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチェアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カラミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補助剤（例えば、フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベスト���ムブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’＝トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ７、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドクセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ７、Ｒｈｏｅｎｅ−  Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびにそれらのいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。この定義にはまた、以下のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン剤が含まれる：抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ））；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリドおよびゴセレリン）；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な  塩、酸または誘導体。  
【０１００】
「リポソーム」は、薬物（例えば、本明細書中で開示される抗ＥｒｂＢ２抗体および、必要に応じて、化学療法剤）の、哺乳動物への送達に有用な、種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配列に類似する二重層形成に配列される。
【０１０１】
本明細書中で、「低分子」は、約５００ダルトン以下の分子量を有するように定義される。
【０１０２】
（２．詳細な説明）
本発明は、抗体改変体に関し、好ましくは抗ＨＥＲ２抗体改変体に関する。本発明の抗体は、多くの異なった形態をとり得る。例えば、抗体は、インタクトな抗体（例えば、ＩｇＧ１抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ）、二種特異性抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。
【０１０３】
抗体改変体は、好ましくは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインに１つ以上のアミノ酸置換を含む。より好ましくは、抗体改変体は、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの超可変領域において、１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０１０４】
本発明は、本明細書中の基準に従い、１つのアミノ酸置換を企図するが、２つ以上の置換（例えば、１つの可変ドメインにつき、約２〜約１０または約２０の置換）（すなわち、両可変ドメインについて、それぞれ約２０または約４０までのアミノ酸置換）もまた、組み合わされ得る。本明細書中で記載される改変は、超過変領域において他のアミノ酸配列改変、または抗体の他の領域におけるアミノ酸改変と組み合わされ得る。
【０１０５】
改変重鎖ドメインおよび／または改変軽鎖ドメインを含むインタクトな抗体は、本明細書中に記載される、当該分野で周知の方法によって作製され得る。例えば、組換え改変体抗体は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）において産生され得る（これらの細胞は、他の抗体タンパク質を産生しない）。
【０１０６】
あるいは、インタクトな抗体または抗体フラグメントは、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）において記載される技術を使用して産生された抗体ファージライブラリーから単離され得る。
【０１０７】
（ヒト化抗体）
ヒト化抗体（特にヒト化抗ＨＥＲ２抗体）を産生するための方法が、公知である。例えば、ｈｕ４Ｄ５−８として知られるヒト化抗ＨＥＲ２抗体の産生は、以下の実施例および米国特許第５，８２１，３３７号（本明細書中で特に参考として援用される）において記載される。
【０１０８】
この抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５（Ｆｅｎｄｌｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０（５）：１５５０−８（１９９０））に由来し、ｐｌ８５ＨＥＲ２またはＨＥＲ２として知られるｅｒｂＢ２の遺伝子産物に対して惹起される（Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９０５）：７０７−１２（１９８９））。マウスモノクローナル抗体４Ｄ５およびその使用は、ＰＣＴ出願ＷＯ８９１０６６９２（１９８９年７月２７日公開）において記載される。マウス抗体４Ｄ５は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３の受託番号を与えられた。
【０１０９】
ｈｕ４Ｄ５および４Ｄ５の両方は、ｐｌ８５ＨＥＲ２過剰発現癌腫細胞に対し、抗増殖活性を示す（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（１０）：４２８５−９（１９９２ｂ）；Ｈｕｄｚｉａｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（３）：１１６５−７２（１９８９））。ＩｇＧ形態のｈｕ４Ｄ５−８（ハーセプチンＲ；トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））は、乳癌の処置において、治療として使用される（ＭｃＫｅａｇｅ，Ｋ．およびＰｅｒｒｙ，Ｃ．Ｍ．（Ｄｒｕｇｓ  ６２（１）：２０９−４３  （２００２））によって総説される）。
【０１１０】
一般に、ヒト化抗体は、好ましくは非ヒトである供給源からその抗体に導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基として言及される。この残基は、代表的に「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、超可変領域配列をヒト抗体のその対応配列に置換することによって、本質的にはＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２１−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って実施され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここでインタクトなヒト可変ドメインより、非ヒト種由来の対応配列によって、実質的にあまり置換されていない。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基によって置換されている、ヒト抗体である。
【０１１１】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、  げっ歯動物の配列の最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のためにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖および重鎖の特定小群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために  使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１１２】
抗体が、抗原に対する高い親和性の保持および他の有利な生物学的特性を有するようにヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーション構造を例示し、そして表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の綿密な調査は、候補免疫グロブリン配列の機能決定（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）する際に、残基の適切な役割を分析すること（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能にする。この方法において、ＦＲ残基は、レシピエントおよび輸入の配列から選択されて、そして組み合わせられ得、その結果、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原に対する増大した親和性）が達成される。一般的に、超可変領域残基  は、抗原結合に影響を及ぼす際に、直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１１３】
以下の実施例１は、例示的なヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体の作製を記載している。本明細書中のヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメイン内に組み込まれた非ヒト超可変領域残基を含み、そしてＲ６６（ＶＬ）位、Ａ７１（ＶＨ）位、Ｔ７３（ＶＨ）位、Ａ７８（ＶＨ）位およびＳ９３（ＶＨ）位（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される可変ドメイン番号付けシステムを利用する）からなる群から選択される位置におけるフレームワーク領域（ＦＲ）置換をさらに含み得る。一つの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｒ６６（ＶＬ）位、Ａ７１（ＶＨ）位、Ｔ７３（ＶＨ）位、Ａ７８（ＶＨ）位およびＳ９３（ＶＨ）位のうちの２箇所または全ての箇所におけるＦＲ置換を含む。  
【０１１４】
（ヒト抗体）
ヒト化の代替として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、トランスジェニック動物（例えば、マウス）であって、免疫の際に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の充分なレパートリーを生成し得るものを作製することが今や可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合部（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子のアレイの移入は、抗原攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に際しヒト抗体の産生を生じる。例えば、以下を参照のこと：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号。
【０１１５】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、免疫していないドナーから免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリー由来のヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生成し得る。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主被膜タンパク質遺伝子または副被膜タンパク質遺伝子のいずれか中にインフレームでクローニングされ、そしてファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、その抗体の機能的特性に基づく選択もまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。従って、そのファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われ得る；それらの概説については以下を参照のこと：Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ    Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために使用し得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の多岐のアレイを単離した。免疫していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして多岐のアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、以下に記載される技術に本質的に従って単離され得る：Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）。また、以下を参照のこと：米国特  許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号。
【０１１６】
上記のように、ヒト抗体はまた、インビトロで活性化したＢ細胞から生成され得る（以下を参照のこと：米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号）。
【０１１７】
ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体は、以下に記載される：米国特許第５，７７２，９９７号（１９９８年６月３０日発行）およびＷＯ  ９７／００２７１（１９９７年１月３日公開）。
【０１１８】
（抗体フラグメント）
種々の軽鎖および／または重鎖可変ドメインを含む抗体フラグメントが、本明細書中で記載される。種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化を介して誘導された（例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。
【０１１９】
しかし、抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明白である。例えば、抗体フラグメントは、組換え宿主細胞によって、いまや直接生成され得る。１つの実施形態において、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を用いて生成され得る。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。
【０１２０】
他の実施形態において、えり抜きの抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。例えば、以下を参照のこと：ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号。この抗体フラグメントはまた、「直鎖抗体」（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり得る（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるとおり）。そのような直鎖抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１２１】
（二重特異性抗体）
二重特異性抗体は、本明細書中で記載される抗ＨＥＲ２抗体改変体の結合部位を含むことが、企図される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、ＥｒｂＢ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４についての結合部位とを組合せ得る。あるいは、抗ＥｒｂＢ２アームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）またはＩｇＧについてのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ  （ＣＤ１６）））のような白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わされて、細胞防御機構をＥｒｂＢ２発現細胞へと集中させ得る。二重特異性抗体はまた、ＥｒｂＢ２を発現する細胞に対して細胞傷害性因子を局在化させるために使用され得る。ＷＯ  ９６／１６６７３は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、そして米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ  ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
【０１２２】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここでは、その２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな配列のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。このうち、たった１つが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製（これは、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる）は、かなり煩雑であり、そしてその産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１２３】
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原組合せ部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴い、少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３の領域の部分を含む。これらの融合物の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。これは、その構築において使用される不等の比率の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供するときの実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相対比率を調整するにおいてかなりの柔軟性を提供する。しかし、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することは、等価な比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率を生じるときまたはその比率が特に重要ではない場合に可能である。
【０１２４】
このアプローチの好ましい実施形態において、その二重特異性抗体は、一方のアームにおいて第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称性の構造は、所望ではない免疫グロブリン鎖組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。なぜなら、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１２５】
米国特許第５，７３１，１６８号において記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大化するように操作され得る。この好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの１つ以上の低アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えられる。その大きな側鎖と同一または類似のサイズの補償性の「溝」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって第二の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモダイマーのような他の所望されない最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増加するための機構を提供する。  
【０１２６】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技術もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクト抗体がタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤砒素ナトリウムの存在下で還元されて、ビジナルなジチオールが安定化され、そして分子間のジスルフィド形成が妨害される。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体へと変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つは、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールへと再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１２７】
最近の進歩により、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接の回収を容易にした。これは、化学的に結合されて、二重特異性抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各々のＦａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、そしてインビトロでの指向された化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の分解性活性をトリガーし得る。
【０１２８】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製および単離するための種々の技術もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎのタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。その抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成させ、次いで再度酸化されて抗体へテロダイマーを形成させた。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載された「ジアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供した。このフラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。このリンカーは、同じ鎖の上の２つのドメインの間を対合させるには短すぎる。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬのドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨのドメインと対合を強いられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって作製するための別の戦略もまた、報告されている。以下を参照のこと：Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）。
【０１２９】
２つを超える価数を伴う抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。ＴｕｔｔらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１３０】
（アミノ酸配列改変）
抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが好ましくあり得る。アミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗体改変体をコードする核酸に導入することによるか、またはペプチド合成により調製される。そのような改変としては、例えば、抗体改変体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入ならびに／あるいは置換を包含する。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、その最終構築物が所望の特性を有する場合に、最終構築物に達するように作製される。そのアミノ酸変化はまた、抗体改変体の翻訳後プロセシングを変更し得る（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）。
【０１３１】
変異誘発についての好ましい位置である、抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載される。本明細書において、標的残基の残基または基（例えば、荷電された残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）が同定され、そして中性または陰性に荷電したアミノ酸（最  も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換され、特定の抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示  すアミノ酸位置は、さらにまたは他の改変体を置換の部位またはそれにわたって導入することによって再度調整される。従って、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位が予め決定されるものの、その変異自体の性質は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が、標的コドンまたは標的領域に施され、そして発現された抗体改変体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１３２】
アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端の挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体改変体、または細胞傷害性ポリペプチドに対して融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体としては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）に対して抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合物または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドが挙げられる。
【０１３３】
改変体の別の型は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、異なる残基によって置換された抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発のために最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変もまた企図される。保存置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示される。そのような置換が生物学的活性における変化を生じる場合、より実質的な変異（「置換の例」と表１において称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される）は、導入され得そしてその産物がスクリーニングされ得る。最も好ましいアミノ酸置換改変体は、以下の例において記載される。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはへリックスコンホメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性）、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持することに対するそれらの効果において有意に異なる特性を選択することによって達成され得る。
【０１３６】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて以下のような群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１３７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを他のクラスのものに交換することを包含する。
【０１３８】
抗体改変体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、一般にセリンに置換されて、その分子の酸化に対する安定性を  改善し得、そして異常な架橋を妨害し得る。逆に、システイン結合は、その抗体に付加されて、その安定性（特に、その抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）を改善し得る。
【０１３９】
特に好ましい型の置換改変体は、親の抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを包含する。一般に、生じた改変体は、その生物学的特性に基づいて選択され得る。このように、さらなる開発のために選択された改変体は、それらが生成される親抗体に比較して改善された生物学的特性（例えば、増強された結合活性）を有し得る。そのような置換改変体を生成するための簡便な方法は、以下に議論するファージディスプレイを使用した親和性成熟を包含する。  
【０１４０】
エフェクター機能（例えば、抗体の抗原依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を増強するために）に関して、本発明の抗体を改変することが所望され得る。このことは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいは、またはさらに、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これにより、この領域の鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする。従って、産生されたホモ二量体抗体は、内部移行能力を改善し得そして／または補体媒介細胞殺傷および抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を増加させ得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性の架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、そして、それによって、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１４１】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込み得る。本明細書に記載されているように、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。  
【０１４２】
（親和性成熟）
親和性成熟は、親抗体と比較して改善された親和性を有する抗体を生成し得る。天然に存在する抗体の配列多様性は、選択された多様な遺伝子セグメントの組換えを有するＢ細胞において生じ、この遺伝子セグメントは、不正確な切断事象、ヌクレオチド挿入、二次遺伝子再編成によって免疫グロブリン応答の成熟の間に続く二次遺伝子再編成、および点変異を有する。これらの変更は、親和性および特異性の高い抗体を産生するＢ細胞クローンの選択を介した免疫応答の特異性および有効性を増強するのに寄与する。
【０１４３】
親和性成熟過程は、ファージ、酵母、または他の宿主によって提示される抗体多様性ライブラリーを用いて、インビトロで効果的に模倣されている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）：３７１−８（２０００）；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｊ．およびＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２：３３９−７６（２０００）；Ｒａｄｅｒ，Ｃ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（４）：５０３−８（１９９７）によって総説される）。特に、ファージディスプレイは、種々の様式で行われ得る；これらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。
【０１４４】
１つのアプローチにおいて、目的の抗体超可変領域部位をコードするヌクレオチド配列は、変異され、各部位における全ての潜在的アミノ酸置換を生じる。変異配列は、インフレームで、ファージ粒子の表面上で、糸状バクテリオファージの主被膜タンパク質遺伝子または副被膜タンパク質遺伝子にクローン化され、機能的な抗体フラグメント賭して示される。
【０１４５】
１つのファージセルにつき１つの抗体フラグメントが呈示される場合、ディスプレイは、一価である。一価ディスプレイは、例えば、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７：２４９−６４（１９９８）によって記載されるように、ファージミドおよびヘルパーファージの使用によって達成され得る。好ましいファージは、Ｍ１３であり、そしてディスプレイは、好ましくは、被膜タンパク質３との融合タンパク質である（Ｌｏｗｍａｎら（前出）によって記載される）。
【０１４６】
他の適切なファージとしては、ｆｌ糸状ファージおよびｆｄ糸状ファージが挙げられる。他のウイルス被膜タンパク質を有する融合タンパク質ディスプレイもまた公知であり、本発明において使用され得る。米国特許第５，２２３，４０９号を参照のこと。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを有するため、抗体の機能特性に基づいた選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。特に、ファージディスプレイされた改変体は、本明細書中で開示されるように、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされ得る。特定の生物学的特性（例えば、高結合親和性）を有する改変体のその後の選択および続く選択された改変体の集団の再スクリーニングおよびこの集団からの再選択は、例えば、特定の抗原に対する高い親和性についてスクリーニングされる生物学的活性における改善を有する改変体の同定を可能にする。
【０１４７】
アラニンスキャニング変異誘発は、改変の超可変領域部位を同定するために実施され得る。抗原結合に大いに寄与するものとして同定されるこれらの超可変領域残基は、改変についての候補である。あるいは、またはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体と抗原との間の接点を同定するために有益であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書中で組み立てられた技術に従う置換の候補である。一旦、このような変異体が産生されると、一群の改変体が、本明細書中で記載されるように、スクリーニングに供され、そして１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、上で考察されたようなさらなる開発のために、選択され得る。
【０１４８】
親和性成熟の過程は、親抗体と比較して、親和性において著しい改善をもたらし得る。マウスにおける研究は、インビボ親和性変異の間のＫＤにおいて、１０〜１０３倍の改善を示した（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２（６３３５）：５３０−２（１９９１））。酵母提示ｓｃＦｖライブラリーを使用し、Ｗｉｔｔｒｕｐおよび共同研究者らは、抗体の結合親和性を、４８ｆＭ（ＫＤ＝４．８×１０−１４Ｍ；（Ｂｏｄｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（２０）：１０７０１−５（２０００））に対して、１０００倍より高く改善し得た。同程度に著しいのが、少数の変異が、時々、これらの変化をもたらし得るという事実である。例えば、抗原結合親和性は、別の抗ｅｒｂＢ２抗体のＣＤＲ−Ｌ３点変異体において１６倍改善され（Ｓｃｈｉｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３（４）：５５１−６７（１９９６））、抗ＶＥＧＦ抗体のＣＤＲ−Ｈ３点変異体において１４倍（Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ２９３（４）：８６５−８１（１９９９））、そして抗ｇｐｌ２０抗体のＣＤＲ−Ｈ３点変異体において、８倍（Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（９）：３８０９−１３（１９９４））改善された。
【０１４９】
（所望の特性を持った抗体のスクリーニング）
改変体抗体を生成した後に、所望する場合、特定の生物学的特徴を有する抗体をさらに選択し得る。
【０１５０】
例えば、所望の結合親和性を有する抗体をスクリーニングし得る。以下の実施例において議論されるように、ファージディスプレイしたＦａｂライブラリーは、結合親和性に基づいて分類され得る。手短に述べると、特定の抗体に由来する抗体フラグメントは、ファイージディスプレイ処理され、そして、ライブラリーへと組織化される。ついで、これらのライブラリーは、抗原の濃度を低下させることを利用して抗原結合選択性の増加するストリンジェントラウンドに供し得る。
【０１５１】
さらに、抗体集団の結合親和性および速度論を決定することよって、高い親和性の抗体を同定し得る。１つの実施形態において、以下の実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合親和性測定法が利用され得る。手短に述べると、抗体フラグメントは、目的の抗体から誘導される。次いで、ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００リアルタイム速度論的相互作用分析システムまたはＢＩＡｃｏｒｅ−３０００速度論的相互作用分析システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が、製造者の指示書に従って、固定された抗原フラグメントと結合相互作用する抗体フラグメントの結合定数（会合定数）（ｋｏｎ）および解離定数（ｋｏｆｆ）を決定するために使用され得る（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｍｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ，Ａ．＆  Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５（１−２）：２２９−４０（１９９１））。平衡定数ＫＤは、当該分野で公知のように、ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算される。野生型抗体と比較した場合の、自由エネルギーの差は、記載されるように（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（３７），８５０９−１７（１９９０））、計算され得る：ΔΔＧ＝−ＲＴｌｎ（ＫＤ（変異体）／ＫＤ（野生型））。
【０１５２】
さらに、１実施形態において、増殖阻害抗ＥｒｂＢ２抗体を同定するために、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体についてスクリーニングし得る。１つの実施形態では、増殖阻害抗体は、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、約２０〜１００％、そして好ましくは約５０〜１００％で、細胞培養中のＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を阻害し得る。そのような抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイが、行われ得る。このアッセイに従って、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよびペニシリンストレプトマイシンを補充した、Ｆ１２およびＤＭＥＭ培養液の１：１の混合物中で増殖される。このＳＫ−ＢＲ−３細胞は、３５ｍｍ細胞培養皿（２ｍｌ／３５ｍｍ皿）中に、２０，０００細胞がプレーティングされた。０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ２抗体が、１皿当りに加えられる。６日後、未処理の細胞に対して比較された細胞の数が、電動のＣＯＵＬＴＥＲＴＭ細胞カウンターを使用して、計算される。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を、約２０〜１００％または約５０〜１００％阻害するこれらの抗体は、増殖阻害抗体として選択され得る。
【０１５３】
細胞死を誘導する改変体抗体を選択するために、例えば、ＰＩ、トリパンブルーまたは７ＡＡＤの取り込みによって示される膜完全性の喪失が、コントロールに対して相対的に評価され得る。好ましいアッセイは、ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取り込みアッセイである。このアッセイに従って、ＢＴ４７４細胞（アメリカン  タイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から取得可能である）は、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（５０：５０）中で、培養された（従って、このアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で行なわれる）。ＢＴ４７４細胞は、１００×２０ｍｍ皿中で１皿当り３×１０６の密度で播種され、そして一晩付着させた。次いで、培地が、除去され、新鮮な培地単独または１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地で置換される。細胞は、３日の期間インキュベートされる。それぞれの処理の後に、単層が、ＰＢＳで洗浄され、そしてトリプシン処理によって剥離される。次いで、細胞は、４℃で５分間１２００ｒｐｍで遠心分離され、ペレットが、３ｍｌの氷冷したＣａ２＋結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中に再懸濁し、そして細胞凝集塊の除去のために、３５ｍｍストレーナーキャップの１２×７５チューブ（１チューブ当り１ｍｌ、１処理群当り３チューブ）にアリコートする。次いで、チューブは、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を受け入れた。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮＴＴＭフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＭＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析され得る。ＰＩの取り込みによって決定される統計的に有意なレベルの細胞死を誘導するこれらの抗体は、細胞死誘導抗体として選択され得る。
【０１５４】
アポトーシスを誘導する抗体もまた、選択され得る。アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイが利用可能である。ＢＴ４７４細胞は培養され、そして前の段落で議論されるように、シャーレに播種される。次いで、培地は、除去され、そして、新鮮な培地単独とか、または１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地で置換される。３日間のインキュベート期間の後、単層は、ＰＢＳで洗浄され、そしてトリプシン処理によって剥離される。次いで、細胞死アッセイのために上記議論されたように、細胞は、遠心分離され、Ｃａ２＋結合緩衝液中に再懸濁され、そしてチューブにアリコートする。次いで、チューブは、標識化アネキシン（例えば、アネキシンＶ−ＦＴＩＣ）（１μｇ／ｍｌ）を受け入れる。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析され得る。コントロールに対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する、これらの抗体は、アポトーシス誘導抗体として選択される。
【０１５５】
アネキシン結合アッセイに加えて、ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色アッセイがアポトーシスを誘導する抗体を同定するために利用され得る。このアッセイを行なうために、前の２つの段落に記載されるように、目的の抗体で処理したＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２ＴＭと共にインキュベートし、次いで、ＭＯＤＦＩＴＬＴＴＭソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を使用して、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥＴＭフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析された。未処理細胞（１００％未満のアポトーシス細胞）より２倍以上大きい（好ましくは３倍以上）アポトーシス細胞の割合の変化を誘導する抗体は、このアッセイを使用して、アポトーシス推進性の（Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）抗体として選択され得る。
【０１５６】
別の実施形態では、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、ＥｒｂＢリガンドがＥｒｂＢレセプターを発現する細胞に結合するのをブロックするその抗体の能力を決定することによって（例えば、目的のＥｒｂＢレセプターがＥｒｂＢヘテロオリゴマーを形成する別のＥｒｂＢレセプターと併用して）選択され得る。例えば、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーのＥｒｂＢレセプターを、天然で発現しているかまたはそれらを発現するようにトランスフェクトされた細胞が、その抗体とともにインキュベートされ、次いで、標識されたＥｒｂＢリガンドに対して曝露される。次いで、ＥｒｂＢへテロオリゴマー中のＥｒｂＢレセプターに結合する抗ＥｒｂＢ２抗体の能力が、評価される。
【０１５７】
例えば、ＭＣＦ７乳癌細胞株に対するＨＲＧ結合を、抗ＥｒｂＢ２抗体によって阻害することは、以下の実施例１において記載されるような、２４ウェルプレートフォーマットで氷上にて単層ＭＣＦ７培養物を使用して実施され得る。抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体は、ウェルの各々に対して添加され得、そして、３０分間インキュベートされ得る。次いで、１２５Ｉ標識ｒＨＲＧβ１１７７−２２４（２５ｐｍ）が添加され得、そしてこのインキュベーションは、４〜１６時間に亘って継続され得る。用量応答曲が準備され得、そして、ＩＣ５０値は、目的の抗体に対して計算され得る。１実施形態において、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、約５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下の、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合阻害についてのＩＣ５０値を有する。この抗体が、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合を阻害することに関するＩＣ５０値は、例えば、１００ｎＭ以下、より好ましくは、５０ｎＭ以下であり得る。
【０１５８】
あるいは、またはさらに、ＥｒｂＢへテロオリゴマーに存在するＥｒｂＢレセプターのＥｒｂＢリガンド刺激チロシンリン酸化をブロックする抗ＥｒｂＢ２抗体改変体の能力が、評価され得る。例えば、ＥｒｂＢレセプターを内因的に発現するかまたはそれらを発現するようにトランスフェクトされた細胞が、その抗体とともにインキュベートされ、次いで、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（これは、必要に応じて、検出可能な標識と結合体化され得る）を使用して、ＥｒｂＢリガンド依存性チロシンリン酸化活性についてアッセイされ得る。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されるキナーゼレセプター活性化アッセイは、ＥｒｂＢレセプター活性化および抗体によるその活性のブロックを決定するために利用可能である。
【０１５９】
１実施形態において、ＭＣＦ７細胞におけるｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激を阻害する抗体についてスクリーニングし得る。例えば、ＭＣＦ７細胞は、２４ウェルプレートにプレーティングされ得、そしてＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体が、それぞれのウェルに加えられ得、そして室温で３０分間インキュベートされ得る；次いで、ｒＨＲＧβ１１７７−２４４が、最終濃度の０．２ｎＭまでそれぞれのウェルに加えられ得、そしてそのインキュベーションは、８分間続けられ得る。培地が、ぞれぞれのウェルから吸引され、そして反応は、１００μｌのＳＤＳサンプル緩衝液（５％ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＤＴおよび２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）を加えることによって停止され得る。サンプルの各々（２５μｌ）は、４〜１２％の勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動され得、次いで、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに、電気泳動的に移され得る。抗ホスホチロシン（１μｇ／ｍｌ）免疫ブロットが現像され得、そして約１８０，０００のＭｒの優勢な反応性バンドの強度は、反射率デンシトメトリーによって定量され得る。選択された抗体は、このアッセイにおいて、好ましくは有意にｐ１８０チロシンリン酸化の刺激をコントロールの約０〜３５％に阻害し得る。反射率デンシトメトリーによって決定される場合のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激の阻害の用量応答曲線は、調製され得、そして目的の抗体についてのＩＣ５０が計算され得る。１つの実施形態では、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体は、このアッセイにおいて、約５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下のＨＲＧ刺激によるｐ１８０チロシンリン酸化を阻害するＩＣ５０を有し得る。抗体が、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＨＲＧ刺激によるｐ１８０チロシンリン酸化の阻害についてのＩＣ５０は、例えば、約１００ｎＭ以下、より好ましくは、５０ｎＭ以下であり得る。
【０１６０】
また、例えば、基本的にＳｃｈｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７）に記載されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞に対する抗体の増殖阻害的効果を評価し得る。このアッセイに従って、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞は、４日間、抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（１０μｌ／ｍＬ）で処理され得、そしてクリスタルバイオレットで染色され得る。抗ＥｒｂＢ２抗体とのインキュベーションは、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果と類似した、この細胞株に対する増殖阻害効果を示し得る。さらなる実施形態では、外因性ＨＲＧは、有意にこの阻害を覆さない。好ましくは、抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および非存在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５より大きい程度、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の細胞増殖を阻害し得る。
【０１６１】
１実施形態において、目的の抗ＥｒｂＢ２抗体改変体は、実質的にモノクローナル抗体４Ｄ５よりもより効果的な同時免疫沈降実験において決定されているように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞の両方においてＥｒｂＢ３とのＥｒｂＢ２のヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）依存性結合をブロックし得る。
【０１６２】
目的の抗体によって結合されるＥｒｂＢ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的クロスブロッキングアッセイ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるようなアッセイ）が実施され得る。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングが、当該分野で公知の方法によって実施され得る。
【０１６３】
次いで、上述のような細胞ベースアッセイにおいて取得される結果の後に、動物（例えば、げっ歯類）、モデル、およびヒト臨床実験が続く。特に、ＥｒｂＢ２過剰発現腫瘍を処置するための抗体改変体の能力が、同時係属出願第０９／８１１１１５号において開示されるトランスジェニックマウスモデルにおいて実証され得る。
【０１６４】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞障害性薬剤（例えば、化学治療剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物の起源由来の酵素学的に活性な毒素あるいはそのフラグメント、または放射活性同位体（すなわち、放射性結合体））と結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０１６５】
そのような免疫結合体の生成に有用な化学治療剤が、上に記載されている。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩ，およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｉｔａ）インヒビター、カーシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。種々の放射活性同位体は、放射性結合体化抗体の精製のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１６６】
抗体および細胞障害性薬剤の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピネート（ＳＰＤＰ））、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピン酸ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して行なわれ得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように、調製され得る。炭素１４標識した１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合体化についての例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１６７】
別の実施形態では、抗体は、標的化される前の腫瘍の利用のための「レセプター」（ストレプトアビジンなど）に結合体化され得（ここで、抗体−レセプター結合体が患者に投与される）、引き続き除去剤を使用して、未結合の結合体を循環より除去し、次いで、細胞障害性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化される「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。好ましい実施形態では、抗体は、同時係属出願０９／８１１１２３において記載されるようなメイタンシノイドに結合される。
【０１６８】
（薬学的処方物）
本発明に従って使用される抗体改変体の治療的処方物は、凍結乾燥形態または水溶液として、所望の程度の純度を有すると抗体と必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤とともに混合されることによって、調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して毒性はなく、そして例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；例えば、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、または  デキストリンを含む）；例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤；例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；例えば、ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。好ましい凍結乾燥された抗ＥｒｂＢ２抗体処方物は、ＷＯ９７／０４８０１に記載され、本明細書中に参考として明確に援用される。
【０１６９】
本明細書中の処方物はまた、特定の兆候が処置されるために必要な１つを超える活性化合物を含み得、好ましくは、お互いに悪影響を与えない補完的な活性を有する化合物である。例えば、１つの処方物において、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（例えば、ＥｒｂＢ２上の異なったエピトープ）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体をさらに提供することが、所望であり得る。あるいは、またはさらに、組成物は、化学療法剤、細胞障害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害薬剤、抗ホルモン剤、および／または心保護剤をさらに含み得る。そのような分子は、意図される目的のために効果的な量で、組み合わせて、適切に提供される。
【０１７０】
活性成分はまた、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面のポリマー化（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））ミクロカプセル）によって調製されたミクロカプセルに  捕捉され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）において開示される。
【０１７１】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、例えば、フィルム、またはミクロカプセルなどの成形品の形態で存在する。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシメチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７３３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注入可能な微粒子）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、そしてポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシル酪酸が挙げられる。
【０１７２】
インビボ投与で使用される処方物は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を介するかにより容易に達成される。
【０１７３】
１実施形態において、この処方物は、５ｍｇ／ｍｌの改変体ｈｕ４Ｄ５−８、１００ｍｇ／ｍｌスクロール、０．１％ポリソルベート２０ならびに１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む。
【０１７４】
本発明に従って、抗ＥｒｂＢ２抗体改変体は、種々の疾患または障害を処置するために使用されることが企図される。例示的な状態または障害としては、良性または悪性の腫瘍；白血病およびリンパ系の悪性疾患；ニューロン、グリア細胞、星状細胞、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、支質、分割腔、炎症性、新脈管形成性および免疫系の障害のようなその他の障害が挙げられる。
【０１７５】
一般的に、処置される疾患または障害は、癌である。本明細書中において、処置される癌の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌を含む）、非小細胞癌、肺の腺癌、肺の扁平細胞癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃部の癌または胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、（神経）膠芽（細胞）腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直結腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、癌唾液腺腫、腎臓癌または腎性癌、前立腺癌、弁姓の癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【０１７６】
好ましくは、抗体改変体は、乳癌を処置するために使用される。この癌は、ＥｒｂＢ発現細胞を含み、その結果、ここで、抗ＥｒｂＢ抗体が癌に結合し得、そして、代表的には、ＥｒｂＢレセプターの過剰発現によって、特徴付けられる。好ましい実施形態において、癌は、ＥｒｂＢ２発現細胞を含み、より好ましくは、ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴付けられる細胞を含む。癌におけるＥｒｂＢ（例えば、ＥｒｂＢ２）発現を決定するために、種々の診断的／予防的アッセイが利用できる。１つの実施形態では、ＥｒｂＢ２の過剰発現は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を使用して）、分析され得る。腫瘍生検に由来するパラフィン埋包した組織切片は、ＩＨＣアッセイに供され得、そして以下のようなＥｒｂＢ２タンパク質染色強度基準に従い得る：
スコア０  染色は全く見られないかまたは膜染色が、１０％未満の腫瘍細胞で見出される。
スコア１＋  かすかな／かろうじて認知できる膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で検出される。その細胞は、それらの膜の一部のみが染色されている。
スコア２＋  弱から中程度の完全な膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で検出される。
スコア３＋  中程度から強い完全な膜染色が、１０％を越える腫瘍細胞で見出される。
【０１７７】
ＥｒｂＢ２過剰発現の評価のための、スコア０または１＋を有するこれらの腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現しないとして特徴付けられ得、これに対して、スコア２＋または３＋を有する腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現するとして特徴付けられ得る。
【０１７８】
あるいは、またはさらに、ＩＮＦＯＲＭＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａによって販売される）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮＴＭ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のような蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイは、腫瘍におけるＥｒｂＢ２過剰発現の程度（もしあれば）を決定するために、ホルマリン固定された、パラフィン埋包の腫瘍組織で実行され得る。ＩＨＣアッセイと比較して、このＦＩＳＨアッセイは（これは、ｈｅｒ２遺伝子増幅を測定する）が、抗ＨＥＲ２抗体を用いた処置に対する患者の応答とより良好に相関するようであり、抗ＨＥＲ２抗体処置（例えば、市販のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を用いた処置）または本発明の改変体を用いた処置から利益を得やすい患者を同定する好ましいアッセイであると現在考えられている。
【０１７９】
好ましくは、本発明の改変体および／またはＥｒｂＢ（例えば、ＥｒｂＢ２）、それらが結合するタンパク質は、細胞によって内在化され、それらの改変体が結合する癌細胞を殺傷することにおける改変体の治療的な効力を増大する結果となる。好ましい実施形態において、細胞障害因子（例えば、メイタンシノイド）は、癌細胞中の核酸を標的とするかまたはそれらを妨げる。
【０１８０】
抗ＥｒｂＢ抗体改変体は、静脈投与（例えば、ボーラスまたは連続注入）のような周知の方法に従って、または一定の期間にわたる継続的な注入（筋内経路、腹腔内経路、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）経路、皮下経路、関節内経路、滑液包内経路、髄腔内経路、経口経路、局所経路、または吸入経路などによる）に従って、哺乳動物に、好ましくは、ヒト患者に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好まれる。
【０１８１】
他の治療レジメンは、抗ＥｒｂＢ抗体改変体の投与と組み合わせられ得る。その組み合わせられた投与は、別々の処方物または単一の薬学的処方物を使用した同時投与およびどちらかの順序での連続投与を含み、ここで、好ましくは、両方（または全て）の活性薬剤が、それらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。
【０１８２】
１つの好ましい実施形態では、患者は、２つ以上の異なった抗ＥｒｂＢ抗体で処置され、この抗体のうちすくなくとも１つは、改変体の形態にある。例えば、患者は、その抗体が増殖阻害性である第１の抗ＥｒｂＢ２抗体改変体、ならびに第２の抗ＥｒｂＢ２抗体改変体もしくは抗体結合体（例えば、抗体−メイタンシノイド結合体）を用いて処置さ得る。この第２の抗ＥｒｂＢ２抗体改変体もしくは抗体結合体は、ＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする抗体または抗体結合体（例えば２Ｃ４、あるいはヒト化したかそして／または親和性を成熟させた２Ｃ４の改変体）、あるいは、ＥｒｂＢ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する抗体または抗体結合体（例えば、７Ｃ２、７Ｆ３、あるいはヒト化したかそして／または親和性を成熟させた７Ｃ２または７Ｆ３の改変体）である。別の実施形態において、その処置は、２つ以上の異なるＥｒｂＢレセプター（例えば、ＥｒｂＢ２レセプターおよびＥＧＦＲレセプター）に特異的に結合する抗体を投与することを包含する。ここで、これらの抗ＥｒｂＢ抗体のうちの少なくとも１つは、ｈｕ４Ｄ５−８改変体である。好ましくは、このような併用療法は、相乗的な治療効果を生じる。
【０１８３】
抗ＥｒｂＢ抗体改変体の投与と、レセプターのＥｒｂＢファミリーのメンバーでない別の腫瘍特異的抗原に対して指向される抗体の投与とを併用することもまた、所望され得る。この場合の他の抗体は、例えば、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得、そして、メイタンシノイド結合体の形態または別の免疫結合体の形態である。
【０１８４】
１つの実施形態では、本発明の処置は、抗ＥｒｂＢ２抗体改変体および１つ以上の化学療法剤または増殖阻害剤の組み合わせ投与を含み、異なった化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。好ましい化学療法剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。そのような化学療法剤のための調製および投薬計画は、製造業者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように、使用され得る。そのような化学療法のための調製物および投薬計画はまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）に記載される。
【０１８５】
好ましい実施形態において、この処置は、抗ＥｒｂＢ抗体改変体を用いて開始され、その後、親抗ＥｒｂＢ抗体を用いた維持的な処置が続く。
【０１８６】
その抗体改変体は、そのような分子に既知の用量で、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン（例えば、ＥＰ  ６１６  ８１２を参照のこと）などの抗プロゲステロン；またはフルタミドのような抗アンドロゲンと組み合わせられ得る。処置される癌が、ホルモン非依存性の癌である場合、患者は、以前に抗ホルモン治療に供された可能性があり、そして癌が、ホルモン非依存性になった後、抗ＥｒｂＢ２抗体（および必要に応じて本明細書中に記載されるような他の薬剤）が患者に投与され得る。
【０１８７】
時々、心保護剤（その治療に関連した心筋機能障害を予防するまたは減少させるために）または１つ以上のサイトカインを患者に同時投与することはまた、有益であり得る。上記の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および／または照射治療に供され得る。
【０１８８】
上記で同時投与される任意の薬剤の適切な投薬量は、現在使用される投薬量であり、そして薬剤および抗ＥｒｂＢ抗体の組み合わせ作用（相乗作用）に起因して、低減され得る。
【０１８９】
疾患の予防または処置のために、抗体改変体の適切な用量は、上記に定義されるように、処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的または治療目的のために投与されるのかどうか、以前の治療、患者の臨床履歴および抗体に対する応答、および担当医の自由裁量に依存する。この抗体改変体は、１回以上の一連の処置において患者に適切に投与される。その状況に依存した、数日間以上に亘る反復投与のために、その処置は、疾患症状の所望する抑制が生じるまで維持される。この治療法の進行は、従来型の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１９０】
（製造品）
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置に有用な物質を含む製造品が、提供される。この製造品は、容器上にあるかまたはその容器に付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の物質から形成され得る。その容器は、状態の処置に効果的な組成物を保持し、そして滅菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下組織注射針によって貫通し得るストッパーを有するバイアルであり得る）を有し得る。その組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明に教示従った、抗体改変体である。１つの実施形態において、その容器は、本明細書において記載の抗体改変体を含有する１０ｍＬの溶液を含む１０ｃｃバイアルである。
【０１９１】
このラベルまたはパッケージ挿入物は、その組成物が、選択された状態（例えば、癌ＥｒｂＢ）を処置するための使用されることを示す。好ましい実施形態において、このラベルまたはパッケージ挿入物は、この組成物が乳癌を処置するために使用されることを示す。別の実施形態において、このラベルまたはパッケージ挿入物は、ＥｒｂＢ２に結合する改変体抗体を含むその組成物が、以下からなる群より選択されるＥｒｂＢレセプター（好ましくは、ＥＧＦＲ）を発現する癌を処置するのに使用されることを示す：上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４。さらに、そのラベルまたはパッケージ挿入物は、処置を受ける患者が、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４から選択されるＥｒｂＢレセプターの過剰な活性化によって特徴付けられる癌を有する患者であることを示す。例えば、その癌は、これらのレセプターのうちの１つを過剰発現する癌および／またはＥｒｂＢリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）を過剰発現する癌であり得る。このラベルまたはパッケージ挿入物はまた、その組成物が、ＥｒｂＢ２レセプターの過剰発現によって特徴づけられない癌を処置するために使用され得ることも示す。他の実施形態において、このパッケージ挿入物は、その組成物がまた、ホルモン非依存性癌、前立腺癌、結腸癌または結腸直腸癌を処置するために使用され得ることを示す。
【０１９２】
さらに、製造品は、（ａ）製造品に含まれる組成物を有する第一の容器（ここで、その組成物は、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体改変体を含む）；および（ｂ）製造品に含まれる組成物を有する第二の容器（ここで、その組成物は、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢレセプターのリガンド活性化をブロックする第二の抗体、あるいは、この第二の抗体とメイタンシノイドとの結合体を含む）を含み得る。本発明の実施形態における製造品は、第一組成物および第二の抗体組成物が、癌を処置するために使用され得ることを示すパッケージ挿入物をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製造品は、薬学的に受容可能な緩衝液（注入のための静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液など）を含む第二（または第三）の容器をさらに含み得る。それは、商業的および利用者の観点から所望の他の物質をさらに含み得、これらの物質としては、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、およびシリンジが挙げられる。
【０１９３】
本発明のさらに詳細なものは、以下の非限定的な実施例において例示される。
【実施例】
【０１９４】
（実施例１）
（抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体４Ｄ５の生成、特徴付けおよびヒト化）
ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体４Ｄ５を、Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０）に記載されるように、生成した。手短には、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（３）：１１６５〜７２（１９８９）に記載されるように生成したＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３４００細胞（約１×１０５ＥｒｂＢ２分子／細胞を発現する）は、２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を用いて収集し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスに、０、２、５および７週間で、０．５ｍｌ  ＰＢＳ中の１０７細胞の腹腔内注入を付与した。３２Ｐ  標識したＥｒｂＢ２で免疫沈降する抗血清を有するマウスは、９および１３週で、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）セファロースで精製したＥｒｂＢ２膜抽出物の腹腔  内注入を付与した。続いて、０．１ｍｌのＥｒｂＢ２調製物の静脈内注入を行い、脾細胞を、マウス骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。ハイブリドー  マ上清を、ＥＬＩＳＡおよび放射性免疫沈降によるＥｒｂＢ２結合についてスクリーニングした。
【０１９５】
（エピトープマッピングおよび特徴づけ）
モノクローナル抗体４Ｄ５によって結合されるＥｒｂＢ２エピトープを、競合的結合分析（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０））によって決定した。交差ブロック研究を、蛍光を定量するためにＰＡＮＤＥＸＴＭスクリーンマシンを使用して、インタクトな細胞の直接の蛍光によって、行なった。これらのモノクローナル抗体を、確立された手順（Ｗｏｆｓｙ  ら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｍｏｌｏｇｙ，ｐ．２８７，ＭｉｓｈｅｌおよびＳｃｈｉｉｇｉ（編）ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｗ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（１９８０））を使用して、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合された。ＮＩＨ  ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３４００細胞のコンフルエントな単層をトリプシン処理し、１回洗浄し、そして０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％ＮａＮ３を含むコールドなＰＢＳ中で、１．７５×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。最終濃度１％のラテックス粒子（ＩＤＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を、ＰＡＮＤＥＸＴＭプレート膜の塊状化を減少させるために加えた。細胞懸濁液２０μｌ、および精製されたモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌ）２０μｌを、ＰＡＮＤＥＸＴＭプレートウェルに加え、そして氷上３０分間インキュベートした。２０μｌ中の所定のＦＩＴＣ標識のモノクローナル抗体の希釈液を、それぞれのウェルに加え、３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてその蛍光を、ＰＡＮＤＥＸＴＭに  よって定量した。モノクローナル抗体を、無関係のモノクローナル抗体のコントロールと比較して、それぞれの抗体が５０％以上他の抗体の結合をブロックすれば、エピトープを共有すると見なした。この実施例では、モノクローナル抗体４Ｄ５に、それぞれエピトープＩ（ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（残基約２２〜約６４５（端の残基を含む））中の、アミノ酸残基約５９０〜約６２５に由来する）を割り当てた。
【０１９６】
マウスモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５は、癌細胞株の増殖を阻害する。
モノクローナル抗体４Ｄ５の増殖阻害特徴を、乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９）を参照のこと）を使用して評価した。手短には、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリプシンを使用して剥離し、そして１ｍｌ当り４×１０５細胞の密度で、完全培地に懸濁した。１００μｌ（４×１０４細胞）のアリコートを、９６ウェル微量希釈溶液プレートにプレートし、それらの細胞を接着させ、そして培地のみ１００μｌまたはモノクローナル抗体（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を含む培地１００μｌを、次いで、加えた。Ｓｕｇａｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９４３−９４５（１９８５）に記載されるように、７２時間後、プレートを、２回ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄し、クリスタルバイオレット（メタノール中０．５％）で染色し、相対的な細胞増殖を分析した。モノクローナル抗体４Ｄ５は、ＳＫ−ＢＲ−３相対的細胞増殖を約５６％阻害した。
【０１９７】
モノクローナル抗体４Ｄ５を、ＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物由来の、分子量（Ｍｒ）が１８０，０００程度のタンパク質の、ＨＲＧにより刺激されるチロシンリン酸化をこれらが阻害する能力について、評価した（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７−１４６５（１９９６））。ＭＣＦ７細胞は、公知の全てのＥｒｂＢレセプターを発現することが報告されているが、比較的低いレベルにおいてである。ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４は、ほぼ同じ分子サイズを有するので、全細胞溶解物がウェスタンブロット分析により評価される場合に、どのタンパク質がチロシンリン酸化されるかを区別することは、可能ではない。しかし、これらの細胞は、ＨＲＧチロシンリン酸化アッセイに関しては、理想的である。なぜなら、使用されるアッセイ条件下で、外因的に添加されるＨＲＧの非存在下では、これらは低レベルから検出不可能なレベルまでの、分子量（Ｍｒ）が１８０，０００程度のチロシンリン酸化タンパク質を示すからである。
【０１９８】
ＭＣＦ７細胞を、２４ウェルプレートにプレートし、そしてＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした；次いで、ｒＨＲＧβ１１７７−２４４を、０．２ｎＭの最終濃度まで各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを８分間続けた。培地を注意深く各ウェルから吸引し、そして１００μｌのＳＤＳサンプル緩衝液（５％  ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ  ６．８））の添加によって、反応を停止させた。各サンプル（２５μｌ）を、４〜１２％の勾配のゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動し、次いでポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移した。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、ＵＢＩ由来、１μｇ／ｍｌで使用）免疫ブロットを現像し、そして分子量（Ｍｒ）約１８０，０００の優先的な反応性バンドの強度を、以前に記載されたように（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４６６１  −１４６６５（１９９４））反射デンシトメトリー（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって定量した。
【０１９９】
モノクローナル抗体４Ｄ５は、分子量１８０，０００におけるＨＲＧ誘導チロシンリン酸化シグナルの発生を、有意に阻害した。ＨＲＧの非存在下では、分子量が１８０，０００程度のタンパク質のチロシンリン酸化を刺激し得なかった。また、この抗体は、ＥＧＦＲ（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８（１９９０））とも、ＥｒｂＢ３とも、ＥｒｂＢ４とも交差反応しない。モノクローナル抗体４Ｄ５は、約５０％までチロシンリン酸化のＨＲＧ刺激をブロックし得た。
【０２００】
外因性ｒＨＲＧβ１の存在下または非存在下での、モノクローナル抗体４Ｄ５の、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する  増殖阻害の効果を評価した（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５−１３９４（１９９７））。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞におけるＥｒｂＢ２レベルは、正常な胸部上皮細胞において見出されるレベルより４〜６倍高く、そしてＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４レセプターは、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞において、構成的にチロシンリン酸化される。モノクローナル抗体４Ｄ５は、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の細胞増殖を、外因性ＨＲＧの存在下と非存在下との両方において、阻害し得た。４Ｄ５による細胞増殖の阻害は、ＥｒｂＢ２発現レベルに依存する（Ｌｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５−２６３（１９９３））。６６％の最大阻害が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞において検出され得た。しかし、この効果は、外因性ＨＲＧによって克服され得た。
【０２０１】
（ヒト化）
マウスモノクローナル抗体４Ｄ５を、米国特許第５，８２１，３３７号（これは、その全体が参考として本明細書中で明示的に援用される）に記載の、新規の「遺伝子変換変異」ストラテジーを利用してヒト化した。以下の実験で使用されるヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５は、その特許の中でｈｕ４Ｄ５−８として示される抗体改変体である。Ｈｕ４Ｄ５−８は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（配列番号１）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号２）を含む。この配列番号１の軽鎖可変ドメインは、以下の３つの超可変領域である：ＶＬ−超可変領域１（アミノ酸ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号１９）を含む）；ＶＬ−超可変領域２（アミノ酸ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２０）を含む）；ＶＬ−超可変領域３（アミノ酸ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号２１）を含む）。同様に、配列番号２の重鎖可変ドメインも、以下の３つの超可変領域である：ＶＨ−超可変領域１（アミノ酸ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨ（配列番号２２）を含む）；ＶＨ−超可変領域２（アミノ酸ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）を含む）；ＶＨ−超可変領域３（アミノ酸ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号２４）を含む）。
【０２０２】
（実施例２）
（ＨＵ４Ｄ５−８改変体）
多くの場合、抗体の認識は、抗原結合部位の中央に接触する超可変領域の残基の一部に関与する（Ｓｃｈｉｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３（４）：５５１−６７（１９９６）を参照のこと）。これは、ｈｕ４Ｄ５として公知のヒト化抗体による腫瘍抗原ＨＥＲ２の認識における場合である。ファージディスプレイは、結合部位の全体的な改変体の調査を可能にし、親和性を改善するためにさらなる置換がなされ得る位置を明らかにした。ｈｕ４Ｄ５−８の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、ＣＤＲ残基と共に図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示した。
【０２０３】
ｈｕ４Ｄ５−８抗体の高親和性ＨＥＲ２結合部位中の配列変異性を、１価的に表現されたＦａｂ−ファージライブラリーを構築すること、ＨＥＲ２結合クローンを選択すること、および高レベルの全体的な多様性（最小限の同種、これは同一のクローンの発生である）が観察される選択工程の時点において、各々のライブラリープール由来の多くの試料（５０〜７０クローン）を配列決定すること、により試験した。
【０２０４】
（置換のためのＣＤＲ残基の選択）
ファージライブラリーの設計は、アラニンスキャニング研究に由来する４個の重要な残基に集中した（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））。これらは、軽鎖（ＶＬ）の可変的ドメインと重鎖（ＶＨ）の可変的ドメインの両方（Ｈ９１（ＶＬ）、Ｒ５０（ＶＨ）、Ｗ９５（ＶＨ）、およびＹ１００ａ（ＶＨ））（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））において、ＣＤＲ残基を含む。ＶＬ：ＶＨ界面に対して近接した、抗原結合部位の中央に近く、ｈｕ４Ｄ５−８の結晶構造の検査に基づいて（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２９（４）９６９−９５（１９９３））、付加的に表面露出した残基もまた、置換のために選択される。主鎖構造または標準的な構造に対する重要性が公知の残基（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９））は、ライブラリーから除外した。すべての改変体の十分な表現を達成するために、標的位置を、５つのライブラリーに分割し、その各々が表面位置の小さいクラスタからなり、各々に標的とした残基がわずか７個であるように分割した。各ライブラリー（ＣＤＲ−Ｈ３中の５個の残基を標的とするライブラリーを除く）は、ＶＬとＶＨの両方に由来する残基の変異を可能とした（図２）。いくつかの残基は、状況の影響を試験し、他の近位位置での共変動を可能にするために、１つより多くのライブラリーにおいて発現させた。
【０２０５】
（部位特異的変異誘発における使用のためのオリゴヌクレオチド）
ｈｕ４Ｄ５−８の合計１９残基を、２０のすべてのアミノ酸をコードする変性ＮＮＳコドン（Ｎ＝Ａ，Ｇ，ＴまたはＣ；Ｓ＝ＧまたはＣ）での部位特異的変異誘発を使用して、無作為化した。部位特異的変異誘発を、以下のデオキシオリゴヌクレオチドを使用して実施した：
【０２０６】
【化１】
2014218505.tif 000003
【０２０７】
選択されたファージを配列決定するために使用したオリゴヌクレオチドは、
【０２０８】
【化２】
2014218505.tif 000004
【０２０９】
である。
【０２１０】
（ｈｕ４Ｄ５−８ファージライブラリーの構築）
ｈｕ４Ｄ５−８ファージミド（５６４／１１）は、Ｆａｂ（Ｋｅｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（２４）：５４３４−４１（１９９２））の軽鎖および重鎖を融合することにより、Ｍ１３ファージ被膜タンパク質の１つをコードするｇ３の短縮形態になるように作製した。
【０２１１】
ｈｕ４Ｄ５ライブラリーを、以前の方法（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２８：３３３−６３（２０００ａ）；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７：２４９−６４（１９９８））に記載されるように構築した。各々のライブラリーに関して、鋳型は、アミノ酸が突然変異されるべき位置に導入された終止コドン（ＴＡＡ）を含む、ファージミド５６４／１１の改変版であった。各々のライブラリーに対して、異なる終止用テンプレートを作製した。終止用テンプレートおよび前の節に記載した変異原性オリゴを、標準的Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０４：１２５−３９（１９９１））において使用した。終止用テンプレートに対する変異原性オリゴのアニーリングは、終止コドンを修復し、そして所望の突然変異を誘導した。すべてのライブラリーが１０１０の次数にあり、理論的な多様性の１０倍〜１０００倍以上で良好であった。このことは、各々のライブラリーにおいて、すべての改変体の複製物が少なくとも１つ存在することを保証した。
【０２１２】
（ｈｕ４Ｄ５−８ファージライブラリーの選別）
ファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増幅し、そしてＨＥＲ２−ＥＣＤの濃度減少を利用して、１０ｎＭで開始し、各ラウンドで１０倍減少する徐々にストリンジェントなラウンドの抗原結合選択に供した。
【０２１３】
ファージライブラリーを、以前に記載されたストラテジー（Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６（３）：８８９−９６（１９９２））と類似のストラテジーを使用して、ＨＥＲ２レセプターに対する結合能により選択した。ビオチン化ＨＥＲ２−ＥＣＤ抗原に結合したライブラリーファージを、３７℃にて１時間乳タンパク質でブロックしていた磁気ビーズで捕捉した。ビーズに付着したファージを３７℃にて１時間プレインキュベーションすることで、各々のラウンドにおいて選択されたファージの非特異的結合を最小限にした。ＨＥＲ２−ファージ複合体と結合したビーズを分離し、ラウンド１では５回、そしてその後のすべての選別のラウンドでは１０回洗浄した。ファージをビーズから溶出させ、ＨＣｌで中和した。溶出させたファージの一部を、Ｍ１３−ＶＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下、迅速に分離するＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはＳＳ３２０（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２８：３３３−６３（２０００ｂ））細胞中で増殖させた。ライブラリーの大きさは、細胞の連続希釈液を寒天にプレーティングすることにより決定した。ライブラリーの富化度は、抗原の存在下および非存在下で単離されたファージの数を比較することにより決定した。その他の点では、ファージは、プレインキュベーション工程、磁気ビーズによる分離工程、および洗浄工程に関して、同様に処理した。
【０２１４】
選択の最初のラウンドにおいて、１×１０１３個のライブラリーファージを、１０ｎＭの抗原と共にインキュベートした。次いで、その後の各々の選別のラウンドでは、抗原の濃度を１０分の１に減少させた。個々のクローンのファージの上澄み液を、ファージＥＬＩＳＡ（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８７：２４９−６４（１９９８））において、活性に関してアッセイし、そして５０％より多くが、選択の第２ラウンド後に陽性であったことを示した。すべてのライブラリーは、ラウンド４（０．０１ｎＭの抗原を使用する選択）までに富化を示した。
【０２１５】
（ファージＤＮＡの配列決定および分析）
ファージを、細胞培養上澄み液から直接に、配列決定した。ファージについての標準的なＰＣＲ反応で、Ｆａｂの軽鎖および重鎖を増幅した。Ｍ１３の一般的な順方向および逆方向のプライマー配列は、ＰＣＲプライマーに含まれるため、生成物は標準的なプライマーで容易に配列決定し得た。得られた配列を、最初に、以前に記載されたようにＳＧｃｏｕｎｔ（Ｗｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７（１６）、８９５０−４（２０００））で分析した。配列が不確定なクローンは、分析から除外した。次いで、残った配列を、（１）同種の除去、（２）ＮＮＳコドンの使用の結果である任意のコドンの偏りに対する標準化、および（３）異なるライブラリー由来の結果を直接に比較し得るための、配列総数に対する標準化、によりフィルターをかけた。各々のライブラリーに関して分析したクローン数は、以下の通りであった：ライブラリー１から７１個、ライブラリー２から８２個、ライブラリー３から７１個、ライブラリー４から７４個、およびライブラリー５から５７個。
【０２１６】
（ｈｕ４Ｄ５−８結合部位中の可変性の分析）
ｈｕ４Ｄ５−８結合部位中の配列の可変性を系統的にマッピングするために、配列データからＷｕ−Ｋａｂａｔ可変性係数を計算した。可変性（Ｖｓ）は、所定の位置での種々のアミノ酸の数を、所定の位置での最も一般的なアミノ酸の頻度で除算した数である（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２（２）、２１１−５０（１９７０））。
【０２１７】
各々のライブラリー由来のクローンを、ＨＥＲ２−ＥＣＤ選択の４ラウンド後に配列決定した。配列データを、一度より多く示されたコドンに対して調節するために標準化した。ほとんどのライブラリーにおいて、同種（ＤＮＡ配列と同一のクローン）はほとんどなかった。しかし、ライブラリー４は、全体でわずか７個の固有の配列を有する単一の配列により支配されており、そしてライブラリー４において２個の残基以外すべてが、他の場所で変異したため、ライブラリー４はさらなる分析から除外した。残りのライブラリーにおける任意の同種もまた、アミノ酸の可変性分析において除外した。
【０２１８】
この測定を使用すると、アミノ酸を選択したファージの可変性を、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．およびＷｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１）：２０５−６（２００１））中に見出される天然の可変性（およそ２０００のヒトＩｇκ軽鎖および４５００のヒトＩｇ重鎖）と、比較し得た。結果（図５）は、Ｋａｂａｔデータベース中の広範な抗体の可変性と比較した場合の、ｈｕ４Ｄ５−８残基における極端に減少した可変性を示した。しかし、ｈｕ４Ｄ５−８結合部位中では、本実施例で試験した残基の可変性において、明らかな相違がある。これらの位置を、その可変性点に従ってランク付けした：クラス１、相対的に不変な残基（Ｖｓ＜１０）；クラス２、中程度に可変的な残基（Ｖｓ＝１０〜４０）；そしてクラス３、高度に可変的な残基（Ｖｓ＞４０）。４つのライブラリーから選択されたクローンに対する配列情報を、図３に示した。この配列情報は、この分類系に従って示した。すべてのアミノ酸が、いくつかの頻度および位置で観察されたが、ＣｙｓおよびＧｌｎは単に例外的に観察された（２つの位置それぞれで２〜３％）。可変性の様式と結合親和性におけるその置換効果との間の関係もまた、研究した。
【０２１９】
全体的に、野生型の残基は、多くの位置で強力に保存された。軽鎖の残基であるＦ５３およびＴ９４と共に、重鎖の残基であるＹ３３、Ｒ５０、Ｙ５６、Ｒ５８、Ｗ９５、Ｇ９９、Ｆ１００およびＹ１００ａは、標準化頻度が４５％以上ですべて保存された（図３）。Ａｌａに変異した場合に１２，０００倍を超える効果であるＹ１００ａ（ＶＨ）（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））、Ａｌａに変異した場合に２０００倍を超える効果であるＲ５０（ＶＨ）、および以前に突然変異されていないＧ９９（ＶＨ）は、約９０％〜１００％保存された（後の２つは２つの独立したライブラリーにおいて）。一方で、多数のライブラリーで現れるいくつかの残基は、アミノ酸発生において、状況依存的な相違を示した。１８，０００倍より大きいＡｌａヒットであるＷ９５（ＶＨ）は、１つのライブラリー（ライブラリー２）において、８２％の頻度で優先的な残基として野生型を示したが、別のライブラリー（ライブラリー１）では、わずか５９％であった。適度な７倍のＡｌａヒットであるＦ１００（ＶＨ）は、１つのライブラリー（ライブラリー３）において、かなり強力に保存されたが、別のライブラリー（ライブラリー５）では、ＴｒｐまたはＭｅｔにより置換された場合とほぼ等しい頻度であった。Ｆ５３（ＶＬ）は、いくつかの選択された残基が状況に応じてどのように変化するかについての別の実施例である。ライブラリー３において、野生型Ｐｈｅは、Ｔｒｐに対して６７％〜１６％で優先的であったが、ライブラリー５では、その優先度はＴｒｐがＰｈｅに対して５５％〜１６％と逆転した（図３）。
【０２２０】
野生型の残基は、他の位置でそれほど支配的ではない。興味深いことに、Ａｌａ置換がほとんど効果を有さないＴ９４（ＶＬ）では、Ｔｈｒについて４５％の保存が存在しただけでなく、化学的に明確な置換であるＴｒｐがかなり高度に（２７％）発生した。Ａｌａスキャニング効果が６倍〜２００倍の範囲を示したいくつかの軽鎖の残基もまた、非野生型残基の強力な選択（４５％以上の頻度）を示したが、野生型の化学的特徴（２つのライブラリーにおけるＮ３０（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、ならびにＹ９２（ＶＬ））は保存された。ＶＬ３０では、野生型のＡｓｎは、選択されたクローンのわずか３４％でしか発生せず、そして選択されたクローンの５３％でＳｅｒに置換された。興味深いことに、ＶＬ９２の近隣で、Ｔｒｐは選択されたクローンの４１％で発生したが、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒ（野生型）は各々、そのクローンの１６％〜１９％で発生した。ＶＬ５５でのＴｙｒは、Ｔｒｐにより優先的に置換され（５８％）、そしてＰｈｅまたはＴｙｒよりも低い頻度（各々１２％）であった。これらの置換型は一般的に結合親和性において予測不可能な効果を有するため、これらの型を、可溶性ｈｕ４Ｄ５−８Ｆａｂ調製物の状況下での点突然変異について、さらに試験した（以下を参照のこと）。
【０２２１】
残りの３つの位置（Ｙ４９（ＶＬ）、Ｄ９８（ＶＨ）、およびＹ１０２（ＶＨ））では、置換の様式は、約３０％より多くの頻度で発生した単一のアミノ酸が全くなく、より複雑であった。これらの残基は、頻度が１０％未満でＷＴ同一性を維持し、そして最も多様なアミノ酸を有した。Ｙ４９（ＶＬ）は、軽鎖：重鎖の界面で、Ｙ５５（ＶＬ）と共にＶＨ１００およびＶＨ１０２に面した。ＶＨ４９は、２つのライブラリーにおいて不完全に保存され（わずか９％ＷＴ）、そして状況に依存して、ＴｒｐまたはＰｈｅに対する優先性を示した。ＶＨ１０２でのＴｙｒは、結合親和性を改善するためのヒト化（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９（１０）：４２８５−９（１９９２ｂ））の間に添加されたマウスＣＤＲ由来の側鎖であった；しかし、単離における点変異は、親和性に影響しなかった（Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））。ファージライブラリーデータから、ヒトの枠組み残基であるＶａｌは、実際にこの位置で優先的であった。ＶａｌおよびＴｙｒは両方とも、この位置のヒトＩｇ重鎖において、頻繁に発生する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．およびＷｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１）：２０５−６（２００１））。近隣の残基であるＶＬ５５は、不完全に保存された（上記で述べた）。最も不完全に保存された残基は、ＶＨ９８であった。Ｄ９８（ＶＨ）は、重鎖の可変的なループ３の先端に位置する。それは、選択されたすべてのクローンの９８％で変異され、そしてＣｙｓを除くすべてのアミノ酸の置換がそこで観察された。この位置で最も頻度が高いアミノ酸は、Ｔｒｐであり、２３％の頻度で発生した。これらの置換もまた特定の目的のものであり、そしてそれらを、可溶性ｈｕ４Ｄ５−８Ｆａｂ調製の状況下での点突然変異について、さらに試験した（以下を参照のこと）。
【０２２２】
（配列の可変性およびＡｌａスキャニングデータの比較）
アラニンスキャニングは、ＷＴ残基をアラニンで置換し、そして一般的に機能の損失を測定する。これらの実験で使用されたファージライブラリーに関する目標は、無作為な置換および抗原結合性選択を通じて機能を維持することであった。抗体の結晶構造（図７）の状況下における、ｈｕ４Ｄ５−８のＡｌａスキャニング性マップ（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））でのＶＳパラメーター（図５）を使用して、配列の変異度を比較した。２つのマップは、いくつかの共通の特徴および異なる特徴を示した。
【０２２３】
ｈｕ４Ｄ５−８の４個の残基が、アラニン突然変異に基づくＨＥＲ２−ＥＣＤの結合部位における抗原結合性に対して、最も重大であることが見出されてきた（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））。これら、Ｒ５０（ＶＨ）、Ｗ９５（ＶＨ）、およびＹ１００ａ（ＶＨ）の３つの残基（図７を参照のこと）の重要性は、これらが無作為化された状況にもかかわらず、ＷＴ同一性としてこれらが一貫して選択されたことにおいて、確認された。しかし、ファージディスプレイもまた、アラニンスキャニング法（図７）により検出されないＷＴとして、高度に保存された４個のさらなる残基（Ｎ３０（ＶＬ）、Ｒ５６（ＶＨ）、Ｒ５８（ＶＨ）、およびＧ９９（ＶＨ））を選択した。これらのうちの２個であるＮ３０（ＶＬ）およびＲ５６（ＶＨ）は、アラニンに変異した場合、４分の１倍〜６分の１倍のＫＤの減少が見出された。アラニンスキャニングの結果とファージディスプレイの結果との間の１つの矛盾が、ＶＬ９１であった。ＶＬ９１がアラニンに変異された場合、結合性は２００分の１倍の減少であった。ＶＬ９１は、２つの異なるライブラリーにおいて、選択されたすべてのクローンのうち４４％〜４５％で、Ｐｈｅに変異した。ＷＴ  ｈｕ４Ｄ５−８は、この位置にＨｉｓを有している。このＨｉｓは結晶構造において、わずか２２％しか露出した表面領域を有さないため、なおＰｈｅに適合する余地があった（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２９（４）：９６９−９５（１９９３））。余分な芳香族環は、近隣の残基に対して密集し得、疎水性の中核へと拡大し得る。
【０２２４】
アラニンは、無作為化された１９個の残基のうちわずか６個（ＶＬ４９、ＶＬ５３、ＶＬ５５、ＶＨ９８、ＶＨ９９、ＶＨ１０２）において発生し、そしてこれらの残基の５個に対しては６％未満の頻度であり、他の残基（ＶＨ９９）に対しては１４％であった。これら６個の残基のうち４個は、アラニンスキャニングに含まれ、そしてこれら４個すべてが、２分の１倍のＫＤの減少を示した（Ｋｅｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（２４）：５４３４−４１（１９９２））。これらの位置でのアラニン選択の欠如は、これらの結果に一致し、本実施例で使用した条件下でのＨＥＲ２結合選択が、結合親和性における２分の１未満の減少で改変体を除去することにおいて、一般に効果的であることを提供した。優勢な置換についてのＦａｂ結合親和性の分析は、このことを支持した（図２および図３）。なぜなら、高い頻度（５０％を超える）のすべての改変体が、野生型の２倍以内の結合親和性を示したからである。対照的に、低い頻度（１０％）の置換であるＹ１００ａＦ（ＶＨ）は、ｈｕ４Ｄ５−８の結合親和性よりも、約５分の１倍弱い結合親和性を示した（図４）。
【０２２５】
ファージライブラリー選択は、抗原に対して高い親和性で変異体を選択することを目的とした。特定の側鎖の保存は、直接的な抗原の接触、抗体の構造安定性もしくは発現に対する必要条件、またはこれらの効果の組み合わせの結果となり得た。適当な構造安定性保存の実施例は、Ｇ９９（ＶＨ）での実施例であった。ＶＨ９９は、重鎖の可変的なループ３において、高度に保存された残基であった。この残基は、最も一般的にはＧｌｙであるＩＩ型βターンである位置ｉ＋２ループである（Ｗｉｌｍｏｔ，Ｃ．Ｍ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０３（１）、２２１−３２（１９８８））。そのため、それは恐らく構造安定性残基であるように思われた。
【０２２６】
（観察された置換の化学的特性）
脂肪族側鎖は、本明細書で試験されたライブラリーでは特異的に標的化されなかった。おそらく驚くことではないが、疎水的置換は、任意の所定の部位で支配し得なかった。しかし、この変異されたクローンの中に、低レベルを示す大多数の疎水的残基が存在した。もちろん、最も高い発生率は、Ｒ５８（ＶＨ）で置換されたＬｅｕについてたったの２３％しかなかった。
【０２２７】
２つの極性側鎖は、よく保存されていた：Ｒ５０（ＶＨ）およびＲ５９（ＶＨ）。しかし、Ｈ９１（ＶＬ）およびＤ９８（ＶＨ）は、より高頻度で非極性芳香族残基に置換され、そしてＴ９４（ＶＬ）は、時々Ｔｒｐに置換される。Ｄ９８Ｗ（ＶＨ）は、以下に考察されるように抗体結合を改善するので、特に興味深くあった。
【０２２８】
化学的特徴の保存は、ｈｕ４Ｄ５−８ライブラリーにおいて芳香族残基および疎水的残基の中で特に生じた。選択されたクローンの８０％以上において、芳香族を好む６残基（ＶＨ１００ａ、ＶＨ５６、ＶＬ５３、ＶＨ３３、ＶＨ９５、およびＶＬ５５）が存在した。５つの部位（ＶＬ４９、ＶＬ５３、ＶＬ９１、ＶＬ９２、ＶＨ１００）は、選択された時点の５０％以上で芳香族を選択した。残基に対してしばしばある偏りが生じたが、一つの場合（ＶＨ１００）においては、ＰｈｅおよびＴｒｐが、等しい頻度で生じた（３０％または３４％）。
【０２２９】
３つの高度保存残基は、カチオン−π相互作用に関係しやすい。この相互作用は、Ａｒｇ（ＶＨ５０）と、Ｔｙｒ（ＶＨ３３）と、Ｔｒｐ（ＶＨ９５）との間であった（Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｐ．およびＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ａ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６（１７）：９４５９−６４（１９９９））。一つのライブラリーにおいて変異された場合、これらのクローンの９３％において、ＶＨ５０でＡｒｇが生じた。Ｔｒｐ  ＶＨ９５は、これらのクローンの５９％において選択され、そして、選択されたクローンの６１％においてＴｙｒ  ＶＨ３３であった。ＶＨ９５およびＶＨ３３での他のアミノ酸置換は、ＰｈｅまたはＴｙｒ（ＶＨ９５）ならびにＴｒｐ（ＶＨ３３）のような他の疎水的残基によるものであった。これらの変異は、おそらく、すべてＡｒｇ  ＶＨ５０により化学安定性を保存した。この結果は、アラニンへ変異された場合これらの残基の２つ（ＶＨ５０およびＶＨ９５）が、ΔΔＧを劇的に増加させる事実により支持された（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））。
【０２３０】
他の芳香族もまた、保存された。ｈｕ４Ｄ５−８結合部位の表面上で、これらは高度保存残基の領域を取り囲んだ（図７）。これらの変異のいくつかは、一セットの予想されるπ−π相互作用を含んだ。一つの実施例は、ＶＬ５３位、ＶＬ４９位およびＶＨ１００位であった。ｈｕ４Ｄ５−８においては、これらは、それぞれフェニルアラニン、チロシン、およびフェニルアラニンであった。ｈｕ４Ｄ５−８の構造は、これらの残基が互いに５Å以内であり、そしてこの芳香族環が向き合うか、またはπ−π相互作用に特有の好ましいＴ型立体配置にあることを示した（Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．およびＰｅｔｓｋｏ，Ｇ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７０８）：２３−８（１９８５））。ライブラリー３に関して、外部のフェニルアラニンは保存され、一方で中央部のＴｙｒは、選択されたクローンの２８％においてＰｈｅを選択した。異なるライブラリー（すなわちライブラリー５）において、すべての３つの残基が改変された。ＶＬ４９において、これらのクローンの３１％がＴｒｐを有したが、５５％は、ＶＬ５３でＴｒｐを有し、そして６４％はＶＬ１００でＴｒｐまたはＰｈｅのどちらかを有した。これらのライブラリーの両方（この中でこれらは変異誘発されていた）においてこれらの位置が芳香族アミノ酸を選ぶという事実は、ｈｕ４Ｄ５−８の表面上で安定化されたπ−π相互作用の保存は、抗体構造に対して重要であることを示唆した。これらは、抗体結合接触にもまた寄与していてもよい。
【０２３１】
別のπ−π相互作用は、軽鎖および重鎖の表面に位置する２つのチロシン（ＶＬ５５およびＶＨ１０２）間で生じた。これらのチロシンは、Ｔ型ジオメトリーにあり、そして安定化の供給源であり得た。驚くべきことに、この相互作用は、選択されたクローンにおいては消失した。これらのクローンの３５％が、ＶＬ５５をＴｒｐで置換し、一方ＶＨ１０２は１９％のバリンの出現頻度を有した。大部分の任意の他のアミノ酸が、ＶＨ１０２で生じ得たが、バリンがわずかに好まれた。
【０２３２】
（結合自由エネルギーに際しての非付加的な効果）
ｈｕ４Ｄ５−８ファージライブラリーは、５つのライブラリーの中に１９個の表面残基を分配した。いくつかの残基は、一つ以上のライブラリーに存在し、これらが近接して共変異（ｃｏｖａｒｙ）することをが可能にした。複写ライブラリーに表された残基の中で、いくつかの違いが、上述のような文脈に基づいて観察された。しかし、共変異（ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ）の統計学的分析に基づいて、有意な任意のこれらの位置における置換の二つ一組の相関関係はなかったが、より多数の配列が、これらの相互作用をより明らかにし得た。
【０２３３】
大部分のＦａｂ変異体がＫＤにおいてわずかに負の効果を有するが、多重変異体Ｍ．７におけるすべての試験された点変異の組み合わせは、改善された結合アフィニティーをさらに与えた。いくつかの単一点変異は、ｈｕ４Ｄ５−８において、変異として明らかに加算性でなく、逆に結合、および／または折りたたみ安定性に影響するＹ１００ａＦ（ＶＨ）およびＹ９２Ｗ（ＶＬ）が、他の変異との組み合わせにより、加算性原理により予想されたよりも大きい程度で、「レスキューされた」（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（３７），８５０９−１７（１９９０））。
【０２３４】
（実施例３）
（Ｈｕ４Ｄ５−８改変体Ｆａｂ構築物）
実施例２において考察されたアッセイは、すべての試験されたクローンが抗原に対する高親和性（ナノモル〜ナノモル以下）結合親和性を保持したことを、定性的に上で実証した。これらのアッセイに加えて、可溶性Ｆａｂフラグメントの結合親和性もまた、試験した。
【０２３５】
（Ｆａｂ結合試験のためのクローンの選択）
可溶性Ｆａｂフラグメントの文脈において点変異を使用する８個のクローン（非野生型残基の高頻度での発生および可変性供給源の範囲を表す）は、選択された置換がｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂと比較していかにＨＥＲ２結合に影響するかを決定するために選択されおよび試験される。
【０２３６】
同種（ｓｉｂｌｉｎｇ）のデータは、個々の部位での種々の変異を分析することに使用されないが、これらのデータは結合実験のための改変体の設計において考慮された。単一のクローンがいくつかの回数の選択の後に複数のコピーに存在した場合、これは潜在的に、結合、安定性または発現における改善によるものであり得たと、理由付けられた。最も豊富な同種（ｓｉｂｌｉｎｇ）の３つが、選択された：３重変異体（Ｍ．３（Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ）と呼ばれる）および単一変異体Ｔ９４（ＶＬ）ＳおよびＹ１００ａ（ＶＨ）Ｆ。これらのクローンは、配列決定されたクローンの全個数のざっと２０％を表した。すべての個々の変異はまた、１個の多重変異クローン、Ｍ．７、（Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ＋Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ＋Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ＋Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ＋Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ）の中に組み合わされた。
【０２３７】
（Ｆａｂ構築物および精製）
Ｆａｂ−発現プラスミドｐＡＫ１９に対する変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて以前に記載されたように導入した（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９（１０）：４２８５−９（１９９２ｂ））。Ｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂ変異体をＥ．ｃｏｌｉにおける分泌により過剰発現させ（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）１０（２）：１６３−７（１９９２ａ））、そしてタンパク質−Ｇアフィニティーカラムを使用して精製した（Ｋｅｌｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（２４）：５４３４−４１（１９９２））。各々の変異体の濃度を、分光光度的に決定し、そして定量的アミノ酸分析により決定した；これらの２つの方法は、５〜１２％以内で一致した。
【０２３８】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合親和性測定）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤレセプターへの過剰発現されたＦａｂの結合反応動態学を測定するために使用した。ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ−３０００実時間反応動態学相互作用分析システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、ｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂ変異体の会合定数（ｋｏｎ）および解離定数（ｋｏｆｆ）（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５（１−２）：２２９−４０（１９９１））を決定するために使用した。Ｂ１バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、製造者の指示に従って活性化させ、そして１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．８）中で８６〜５００ＲＵ（応答ユニット）のＨＥＲ２−ＥＣＤで固定化した。未反応の群を、１Ｍのエタノールアミンでブロックした。ｈｕ４Ｄ５−８  変異体の固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤへの結合の反応動態学は、泳動緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．０１％  アジ化ナトリウム）中の１００ｎＭ  Ｆａｂで始まる一連の２倍希釈により、２０μｌ／分の流速で測定した。結合測定を、１９℃、２５℃、３１℃および３７℃で、４つの異なる濃度の固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤで記録した。データは、会合定数（ｋｏｎ）と解離定数（ｋｏｆｆ）との比を計算するＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウエアバージョン３を使用して、１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。平衡定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算した。野生型ｈｕ４Ｄ５−８と比較した自由エネルギー差異を、記載されるように計算した（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（３７），８５０９−１７（１９９０））：ΔΔＧ＝−ＲＴ  ｌｎ（ＫＤ（変異体）／ＫＤ（野生型））。
【０２３９】
（Ｆａｂ改変体の抗体結合親和性）
変異型ＦａｂがＨＥＲ２−ＥＣＤに生理学的温度（３７℃）で結合するための反応動態学データが、図４に示される。このＦａｂ変異体は、一般に非常に近い会合比定数および解離比定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を有した。結果として、変異体の大部分はｈｕ４Ｄ５−８  Ｆａｂと類似のＫＤを有した。１つの変異体Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆは、ＫＤ上で４倍の負の効果を有した。二つの変異体は、改善されたＫＤを有し、３７℃で、多重変異体Ｍ．７、（Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ＋Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ＋Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ＋Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ＋Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ＋Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ＋Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ）は、１．５倍、そして単一変異体Ｄ９８（ＶＨ）Ｗは、約３倍であった（図４）。
【０２４０】
１９〜３７℃の範囲の温度では、試験された改変体のすべては、１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（野生型ｈｕ４Ｄ５−８のＨＥＲ２への結合についての結合エネルギー）以内に十分入る結合エネルギーを示した（図６）。同じ範囲で、ｈｕ４Ｄ５−８の親和性は、本質的に定常であり、ＫＤは０．１３〜０．３３ｎＭの範囲であった。
【０２４１】
変異体Ｙ９２（ＶＬ）Ｗについて結合構築物は、報告しなかった。なぜなら、これは任意の他のＦａｂの１／１０未満で発現し、そしてＨＥＲ２への乏しい結合を示したからである。これはファージにより選択されたが、この結果は、野生型ｈｕ４Ｄ５−８の背景において機能することが不可能であったことを示す。興味深いことに、この変異は、多重変異体、Ｍ．３またはＭ．７のいずれかの状況において「レスキューされた」。可溶性タンパク質としてほとんど挙動しないＩＧＦ−１の変異体を呈示された特定のファージについて観察されたように、ｇ３タンパク質への融合は、折りたたみにおいて支持し得る（Ｄｕｂａｑｕｉｅ，Ｙ．およびＬｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８（２０）：６３８６−９６（１９９９））。
【０２４２】
（親和性改善改変体の同定）
ｈｕ４Ｄ５−８Ｆａｂの結合アフィニティーは、ナノモル以下の範囲で報告されている（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．およびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２（２７）：６８２８−３５（１９９３））。単一変異体、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗを、野生型の３倍の改善を有するとして選択した。Ｄ９８（ＶＨ）は、重鎖の可変ループ３の先端に位置し、そして抗体の表面上で最も突出した残基である（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２９（４）：９６９−９５（１９９３））。さらに、これはＷ９５（ＶＨ）（アラニンスキャンにおける４つの強いヒットの中の１つである）に隣接する。Ｄ９８（ＶＨ）は、ランダム化した１９残基全ての中で最も変化する位置である。Ｔｒｐは選択されたプールを支配しないが、最も高頻度の置換が選択される。予想される結合部位の隣の表面上のＴｒｐ  ＶＨ９８の位置は、これが抗原に直接接触する配列の柔軟性の部位であり得たことを示唆する。
【０２４３】
（実施例４：４Ｄ５  Ｆａｂファージライブラリーを用いたストリンジェントなオフ速度（ＯＦＦ−ＲＡＴＥ）結合選択）
ヒト化４Ｄ５のさらなる高親和性改変体を検索するために、先の実施例において記載される４Ｄ５改変体の５つのライブラリー（Ｇｅｒｓｔｎｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１，８５１−８６２（２００２）もまた参照のこと）を、結合標的として、固定化ＨＥＲ２での結合選択のために使用した。
【０２４４】
さらなるライブラリーを最初のライブラリーを用いた選択の結果に基づいて設計し、構築した。特に、ライブラリー６および７を設計して、選択された縮重コドンを使用して制限された多様性により、最初のライブラリーにおいて同定された残基の組み合わせを標的化し、先に同定されたものに近い位置での多様性を含めた。表２は、これらのライブラリーに、操作された多様性をまとめる。
【０２４５】
【表２】
2014218505.tif 000005
【０２４６】
（表２：４Ｄ５ライブラリー５および６の設計）
前述の表２において、位置は、Ｋａｂａｔの番号付けの系（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））に従って示す。縮重コドンを、ＩＵＰＡＣコード（Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）を用いて示す。
【０２４７】
一連の結合選択実験において、４Ｄ５ファージライブラリーを増殖させて、本質的に以下に記載のソートに供した（Ｌｏｗｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８７，２４９−２６４（１９９８）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９））。簡潔には、イムノソルベントプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中、２μｇ／ｍｌのＨＥＲ２−ＥＣＤでコーティングし、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックした。その後、ファージを、ＢＳＡおよびＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中、約１０１１ファージ／ｍｌの濃度で添加した。
【０２４８】
ストリンジェントなオフ速度選択のために、ファージ結合を、１６時間以上の時間にわたって平衡に達するようにし、その後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、（ｒｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５抗体ありまたはなし）０．０１％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液中で連続的により長い時間、解離させた（表３）。ファージを、１００ｍＭ  ＨＣＩとの短時間（１０分間）のインキュベーションにより溶出し、中和し、記載のように（Ｌｏｗｍａｎ，１９９８，前出）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で一晩増殖させた。
【０２４９】
（表３：オフ速度結合選択の条件）
【０２５０】
【表３】
2014218505.tif 000006
【０２５１】
結合富化を、ＨＥＲ２  対  ＢＳＡウェルから回収したファージの力価を比較することにより測定した。結合選択の徐々に増加しているストリンジェントなラウンドに対する結果は、ライブラリー４を除く各ライブラリーについてのバックグラウンド結合に対するＨＥＲ２−ＥＣＤ結合ファージの富化を示す（データは示さず）。
【０２５２】
ファージクローンを、配列決定およびさらなる特徴付けのために、４ラウンドの結合選択後に単離した。これらのクローンの配列を、各位置での野生型（ｒｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５）の残基と比較して、表４に示す。有意性の統計学的検定（Ｌｏｗｍａｎ＆Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４，５６４−５７８（１９９３））を、非野生型残基が一般的に観察される各位置での都合の良い置換を規定するために適用した（表４）。簡潔には、各アミノ酸のその観察される頻度（Ｐｏｂｓ）を、特定のコドン縮重性を用いて、アミノ酸（Ｐｅｘｐ）をコードし得るコドンの数から決定される予測される（無作為）頻度と比較する。その有意性スコアＳは、Ｓ＝（Ｐｏｂｓ−Ｐｅｘｐ）／σとして計算され、ここでσは、理論的不規則分布の標準偏差である（Ｌｏｗｍａｎ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，１９９３，前出）。
【０２５３】
（表４：固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤを用いる４回のオフ速度結合選択後の４ｄ５ファージ単離物の配列））
【０２５４】
【表４−１】
2014218505.tif 000007
【０２５５】
【表４−２】
2014218505.tif 000008
【０２５６】
【表４−３】
2014218505.tif 000009
【０２５７】
ライブラリー４を用いた４回目の選択から、配列決定可能なクローンは、回収されなかった。前述の表において、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）の読みとりによってコードされるＧｌｎ残基は、Ｑ＊によって示される。自発的変異（ＶＨ  Ｙ１０２Ｍ）を、もともとのライブラリーにおける変異誘発のために標的化しなかった部位で同定した（＊＊）。コンセンサス残基を、非野生型残基が、有意な頻度で存在する位置について示す。ライブラリー６〜７において使用される制限されたコドン選択が、表２に記載される。ライブラリー３において、「塩基性」残基とは、Ｈ、Ｋ、およびＲの組み合わせをいう。ブランクは、対応する位置における不確定または決定されていない配列を示す。非野生型残基の存在は、それらの置換を含む改変体についての改善された結合親和性、安定性、および／または発現レベルを反映しうる。しかし、先の親和性変異研究において、有意性スコア＞２は、しばしば、結合親和性の改善と相関した（Ｌｏｗｍａｎ＆Ｗｅｌｌｓ，１９９３，前出）。従って、表４からの配列有意性スコアに基づいて、ＨＥＲ２に対する４ｄ５の結合親和性を改善しうる置換を、表５に列挙する。これらの置換は、Ｇｅｒｓｔｎｅｒら（２００２），前出の知見と比較されうる。例えば、その研究において、４Ｄ５−ファージの溶液相捕捉を用いると、ここで同定された置換のいくつかがまた、見出された。いくつかの位置は、類似の置換を示し、例えば、ＶＬ変異Ｆ５３Ｗ、Ｙ５５ＷおよびＹ９２Ｗは、先の実験において共通して見出された。しかし先の実験において共通して見出されなかった置換は、ＶＨの９８位で置換された塩基性残基（Ｒ、Ｋ、Ｈ）およびＶＨの１００位で置換されているＰを含む。これらの変異は、個々に、または他の変異と組み合わさって作用して、ＨＥＲ２に対する４Ｄ５の結合親和性を改善しうる。
【０２５８】
（表５：オフ速度選択からの位置によるコンセンサス残基のまとめ）
【０２５９】
【表５】
2014218505.tif 000010
【０２６０】
（実施例５：オフ速度選択から選択された４Ｄ５クローンのスクリーニング）
選択された代表的クローンを、競合的ファージ−ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｌｏｗｍａｎ，１９９８）においてさらに特徴付けするために選択した。いくつかの改変体は、野生型４Ｄ５  Ｆａｂと比較すると、ＨＥＲ２−ＥＣＤに対して改善された結合を有するように見えた（表６）。野生型４Ｄ５の比較的高い親和性に起因して、このアッセイは、４Ｄ５の親和性成熟バージョンの信頼できる尺度を提供しない（Ｇｅｒｓｔｎｅｒら，２００２）；しかし、本発明者らはこのアッセイを用いて、さらなる分析のためにクローンを順位付けした。
【０２６１】
（表６）選択された４Ｄ５−ファージの競合的ファージ−ＥＬＩＳＡの結果）
【０２６２】
【表６】
2014218505.tif 000011
【０２６３】
報告された相対的ＩＣ５０は、ＩＣ５０（野生型）／ＩＣ５０（改変体）として計算する；値＞１野生型より高い見かけの親和性を反映する。誤差を、標準偏差（ｓ．ｄ．）として報告する。比較のために、先に報告した改変体の２つの独立したクローンＤ９８Ｗ（ＶＨ）の値もまた、示す。
【０２６４】
ファージ−ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、いくつかの改変体は、ＨＥＲ２に対する改善された結合親和性を有すると推定した：４ｄ５．２１、４ｄ５．５０、４ｄ５．５１、４ｄ５．５５、４ｄ５．５７、４ｄ５．８０、４ｄ５．８１、および４ｄ５．９２。全てのこれらのクローンの中で同定される点変異を、表７にまとめる。従って、これらの変異は、ＨＥＲ２に対する４ｄ５の結合親和性を改善するように別個にまたは相乗作用的に作用すると示された。
【０２６５】
（表７：ファージ−ＥＬＩＳＡスクリーニングによって同定される最も高い親和性改変体の中で見出された位置による点変異のまとめ）
【０２６６】
【表７】
2014218505.tif 000012
【０２６７】
２つの最も高い見かけの親和性改変体（４ｄ５．２１および４ｄ５．９２）において存在する変異を、（＊）で示す。
【０２６８】
（実施例６：オフ速度選択から選択された４Ｄ５クローンの親和性測定）
Ｆａｂ改変体の平衡結合親和性（Ｋｄ）を決定するために、可溶性ＦａｂフラグメントをＥ．ｃｏｌｉにおいて生成し、固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤを３７℃で用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイ（Ｇｅｒｓｔｎｅｒら，２００２）において試験した。Ｆａｂ濃度を、定量的アミノ酸分析によって決定した。動力学的測定の結果を、表８にまとめる。
【０２６９】
（表８）
（表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用する、選択した４ｄ５  Ｆａｂ改変体の結合速度論および結合親和性）
【０２７０】
【表８】
2014218505.tif 000013
【０２７１】
上記の表８において、平衡解離親和性（Ｋｄ）を、ｎ個の測定についてｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。誤差は、標準偏差（ｓ．ｄ．）として示される。相対的親和性を、Ｋｄ（ＷＴ）／Ｋｄ（改変体）として計算する。１より大きな値は、ＨＥＲ２−ＥＣＤについてのより高い見掛けの親和性を示す。
【０２７２】
これらの実験の結果は、ファージクローン４ｄ５．５１、４ｄ５．８０および４ｄ５．５０に対応するＦａｂ、ならびに以前に記載された点変異体Ｄ９８Ｗ（ＶＨ）は、各々、ＷＴと比較して２倍を超えて改善した結合を有することを、示す。比較のために、これらの改変体の各々において見出される置換を、表９にまとめる。一方、４Ｄ５．２１および４Ｄ５．５５は、ほとんど改善を有さないか、またはわずかに結合が弱い。
【０２７３】
相対的なオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）およびオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の比較は、溶液相結合選択（Ｇｅｒｓｔｎｅｒら、２００２）によって同定されたＤ９８Ｗは、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの両方が改善し、一方、固定４ｄ５を使用する厳密なオフ速度選択によって同定された最良の改変体は、一貫して、より遅いｋｏｆｆを有し、ＷＴと比較してｋｏｎが遅かったことを示す。
【０２７４】
（表９）
（速度論分析によって同定された親和性が改善した４ｄ５改変体の点変異。ＷＴと異なる残基が、太字で示される。ＷＴと同一の残基が、（−）で示される）
【０２７５】
【表９】
2014218505.tif 000014
【０２７６】
（実施例７）
（選択された変異の組み合わせによって生成された４Ｄ５改変体）
変異は、個別に作用し得るか、または同じ４ｄ５ファージ選択体において見出される他の変異と組み合わせて作用し得るので、本発明者らは、最高の親和性改変体（以前に記載されたＤ９８Ｗ（ＶＨ）を含む）からの変異の組み合わせを試験することに興味を抱いた。一組の改変体を、「ＤＷＷ」（すなわち、ＶＬ変異Ｄ４９Ｄ／Ｆ５３Ｗ／Ｙ５５Ｗ）単独、ならびに「ＤＷＷ」および「ＰＬ」または「ＰＫ」（すなわち、ＶＨ変異Ｆ１００Ｐ／Ｙ１０２ＫまたはＦ１００Ｐ／Ｙ１０２Ｌ）とＶＨ変異Ｄ９８Ｗとの組み合わせの寄与を試験するために設計した（表１０）。
【０２７７】
（表１０）
（４ｄ５の組み合わせ改変体）
【０２７８】
【表１０】
2014218505.tif 000015
【０２７９】
改変体Ｆａｂを、部位特異的変異誘発によって生成し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして３７℃でＢＩＡｃｏｒｅ結合によってアッセイした。これらのアッセイにおいて、会合定数および解離定数を、以前に記載された（Ｇｅｒｓｔｎｅｒら、２００２）通りに測定したが、但し、各実験の解離相を３０分間まで延長させて、非常に遅いｋｏｆｆ速度のより正確な測定が観察されるのを可能にした。結果を表１１に示す。
【０２８０】
（表１１）
（選択された４ｄ５−ファージ改変体からの変異を組み合わせる４ｄ５改変体の速度論分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）からの結合親和性）
【０２８１】
【表１１】
2014218505.tif 000016
【０２８２】
上記の表において、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して別個に適合させた。平衡解離親和性（Ｋｄ）を、ｎ個の測定について、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。誤差は、標準偏差（ｓ．ｄ．）として示される。相対的親和性を、Ｋｄ（ＷＴ）／Ｋｄ（改変体）として計算する。１より大きな値は、ＨＥＲ２−ＥＣＤについてのより高い見かけの親和性を示す。Ｎ．Ｄ．＝決定せず。
【０２８３】
これらの長期解離アッセイの結果により、改変体Ｄ９８Ｗ、４ｄ５．５０および４ｄ５．５１が、野生型と比較して改善されたＨＥＲ２に対する結合親和性を有することが、確認された。しかし、Ｄ９８Ｗと１００Ｐ／Ｙ１０２ＫまたはＦ１００Ｐ／Ｙ１０２Ｌとの組み合わせは、これらの実験において付加的改善を生じなかった。
【０２８４】
本明細書中および本明細書全体を通して引用されるすべての参考文献は、本明細書中に参考として明示的に援用される。
【０２８５】
（生物学的材料の寄託）
以下のハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【０２８６】
抗体名        ＡＴＣＣ番号                    寄託日
４Ｄ５        ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３    １９９０年５月２４日。
【０２８７】
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定によってなされた。このことは、寄託日から３０年間の生存培養物の維持を保証する。この生物は、ブダペスト条約の条件下ではＡＴＣＣによって入手可能にされ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の同意の対象である。このことは、適切な米国特許の発行の際、または任意の米国特許出願もしくは外国特許出願の公共に対する公開の際（いずれか早い方）に、公共に対するその培養物の子孫の永続的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして米国特許商標庁長官によって、３５  ＵＳＣ  §１２２およびそれによる規則（３７  ＣＦＲ  §１．１２、８８６  ＯＧ  ５３８に対する特定の言及を含む）に従って権利を有することが決定された人物に対するその培養物子孫の利用可能性を保証する。
【０２８８】
欧州特許を求める指定に関して、寄託された微生物のサンプルは、その欧州特許査定の公開まで、またはその出願が拒絶もしくは取り下げられるかまたは取り下げたと見なされる日まで、そのサンプルを要求する人物によって任命された専門家に対するそのようなサンプルの供給によってのみ、入手可能になる（ＥＰＣ規則２８（４））。
【０２８９】
本出願の譲受人は、寄託中の培養物が、適切な条件下で培養された場合に死ぬか失われるかまたは破壊される場合に、通知された時に同じ培養物の生検体で迅速に置換することに同意している。寄託された株の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府当局の下で付与される権利に違反して本発明を実施するための認可として解釈されるべきではない。
【０２９０】
上記の明細書は、当業者が本発明を実施することが可能であるために十分であると考えられる。本発明は、寄託された構築物によって範囲を制限されるべきではない。なぜなら、寄託された実施形態は、本発明の特定の局面のみを例示することが意図され、機能的に等価な任意の構築物が、本発明の範囲内にあるからである。本明細書中の材料の寄託は、含まれる本明細書の記載が、本発明の任意の局面（その最良の形態を含む）の実施を可能にするために不十分であるという承認を構成するわけでもなければ、特許請求の範囲を特定の例示に限定するものとして解釈されるべきでもない。実際、本明細書中に示されそして記載される本発明の種々の改変に加えて、本発明の種々の改変が、上記の記載から当業者にとって明らかになり、そしてそれは、添付の特許請求の範囲内にある。
【０２９１】
本発明の教示を特定の課題または状況に適用することは、本明細書中に含まれる教示を考慮すれば、当業者に能力の範囲内にあることが、理解される。本発明の生成物およびその単離、使用、および製造のための代表的プロセスの例は、本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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