(57)【要約】【課題】光学的な方法により、非侵襲的にマウス、ラットなどの小動物の脳深部の活動を解析することのできる、脳活動の光学的画像解析法を提供する。【解決手段】近赤外蛍光色素で標識された被検動物の赤血球を被検動物に経静脈的に投与する投与ステップと、この投与ステップの後に近赤外レーザを励起光源とする共焦点光学系を用いて被検動物の脳における近赤外蛍光強度の空間分布を検出する検出ステップと、この検出ステップで検出された近赤外蛍光強度の空間分布に基づき被検動物の脳活動の空間分布を表示する表示ステップとを備えた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外蛍光色素で標識された被検動物の赤血球を被検動物に経静脈的に投与する投与ステップと、この投与ステップの後に近赤外レーザを励起光源とする共焦点光学系を用いて被検動物の脳における近赤外蛍光強度の空間分布を検出する検出ステップと、この検出ステップで検出された近赤外蛍光強度の空間分布に基づき被検動物の脳活動の空間分布を表示する表示ステップとを備えたことを特徴とする脳活動の光学的画像解析法。
【請求項２】
前記被検動物は、マウス又はラットであることを特徴とする請求項１記載の脳活動の光学的画像解析法。
【請求項３】
前記共焦点光学系は、近赤外光を出力するレーザ光源と、このレーザ光源から出力された近赤外光の焦点を被解析対象物に結ぶとともに被解析対象物で発生した近赤外蛍光を集光するレンズと、前記焦点と光学的に共役の位置に配置されたピンホールと、このピンホールを通過した近赤外蛍光を検出する検出器とを備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の脳活動の光学的画像解析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳活動の光学的画像解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳・精神疾患の治療法・治療薬の開発において、マウスやラットなどの小動物を用いた動物実験は必要不可欠であり、小動物の脳活動を画像化する技術が求められている。
【０００３】
しかし、従来の光学的な方法（例えば、特許文献１を参照）では、脳表面の活動を解析することは可能であるものの、脳深部の解析は不可能であった。したがって、脳深部の活動を解析するためには、脳の一部を取り除いて露出するか、細く加工したレンズを刺入するなど、脳に侵襲を加える操作を行わなければならなかった。
【０００４】
また、光学的な方法以外では、核磁気共鳴画像法やポジトロン断層法が知られているが、いずれも装置が高額であり、時間・空間分解能において光学的な方法よりも劣り、さらに、高磁場や放射線を用いるため実験上の制約を受けるという問題があった。
【０００５】
一方、近赤外線は、組織透過性に優れ、厚さ１センチメートル程度のヒトの頭皮や頭蓋骨を通過する。また、赤血球に含まれるヘモグロビンは、近赤外線を吸収する性質を持つ。さらに、脳活動は、局所脳血流量の増加を引き起こす。従って、ヒトの頭皮越しに、近赤外線を局所的に照射し、脳組織で散乱された光を計測すれば、照射部位近傍の局所脳血流量を知ることができる。この方法によって、ヒトの脳活動を可視化する方法が既に実用化されている（例えば、特許文献２を参照）。
【０００６】
しかし既に実用化されている方法は、数センチメートル程度の空間分解能しかなく、全体の大きさが数センチメートル以下の小動物の脳を解析には不十分である。また、仮に装置を小型化することによって空間分解能を上げたとしても、脳表面の活動を解析することはできるが、脳深部の活動は知ることができない。
【０００７】
脳深部の光学的信号を選択的に記録するには、低倍率のマクロレンズを装着したマクロ共焦点顕微鏡（例えばニコンインステック社製ＡＺ−Ｃ１）を用いることができる。しかし、この方法を用いて小動物の脳深部からの微弱な散乱光を記録しようとすると、レンズなどの光学的表面における反射光に埋もれ、うまく記録することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２９９７６０号公報
【特許文献２】特開平２１−１４２４９１号公報
【特許文献３】特開平９−３０９８４５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Frostig RD, Lieke EE, Ts'o DY, Grinvald A (1990) Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proc Natl Acad Sci USA 87:6082-6086.
【非特許文献２】Kitaura H, Uozumi N, Tohmi M, Yamazaki M, Sakimura K, Kudoh M, Shimizu T, Shibuki K (2007) Roles of nitric oxide as a vasodilator in neurovascular coupling of mouse somatosensory cortex. Neurosci Res 59:160-171.
【非特許文献３】Mchedlishvili G (1998) Disturbed blood flow structuring as critical factor of hemorheological disorders in microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc 19:315-325.
【非特許文献４】Ihler GM, Glew RH, Schnure FW (1973) Enzyme loading of erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA 70:2663-2666.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、非侵襲的にマウス、ラットなどの小動物の深部脳活動を可視化することのできる脳活動の光学的画像解析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、マウス、ラットなどの小動物の赤血球を近赤外蛍光色素で標識し、この標識赤血球をマウス、ラットなどの小動物に経静脈的に投与し、組織浸透性に優れた近赤外線レーザを励起光源とする空間分解能に優れた共焦点光学系により、非侵襲的に小動物の脳深部の局所赤血球密度を記録し、得られたデータに基づいて、深部脳活動を可視化することができることを見出し、本発明に想到した。
【００１２】
すなわち、本発明の請求項１記載の脳活動の光学的画像解析法は、近赤外蛍光色素で標識された被検動物の赤血球を被検動物に経静脈的に投与する投与ステップと、この投与ステップの後に近赤外レーザを励起光源とする共焦点光学系を用いて被検動物の脳における近赤外蛍光強度の空間分布を検出する検出ステップと、この検出ステップで検出された近赤外蛍光強度の空間分布に基づき被検動物の脳活動の空間分布を表示する表示ステップとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の請求項２記載の脳活動の光学的画像解析法は、前記被検動物は、マウス又はラットであることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の請求項３記載の脳活動の光学的画像解析法は、前記共焦点光学系は、近赤外光を出力するレーザ光源と、このレーザ光源から出力された近赤外光の焦点を被解析対象物に結ぶとともに被解析対象物で発生した近赤外蛍光を集光するレンズと、前記焦点と光学的に共役の位置に配置されたピンホールと、このピンホールを通過した近赤外蛍光を検出する検出器とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の脳活動の光学的画像解析法によれば、マウスやラットなどの被検動物の脳が活動すると、局所脳血流量が増加し、このとき予め投与された近赤外蛍光色素で標識された赤血球密度が局所的に増大し、この標識赤血球に由来する近赤外蛍光強度が増加する現象を利用して、深部脳活動の程度を容易に測定することができ、脳表面だけでなく深部脳組織も含めた脳活動の三次元的画像解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の近赤外蛍光色素で標識した蛍光赤血球を用いて、局所赤血球密度と局所脳血流量を計測する原理を示す模式図である。
【図２】実施例１の脳活動の光学的画像解析法に用いられる装置の全体構成を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の脳活動の光学的画像解析法は、脳活動により局所脳組織の赤血球密度が増加する現象を利用し、脳組織に対する透過性に優れた近赤外線レーザを用いた共焦点光学系で脳表及び脳深部の近赤外蛍光強度を走査し、予めマウス、ラットなどの被検動物に投与した近赤外蛍光色素で標識された赤血球に由来する近赤外蛍光信号を記録することによって、脳活動の三次元的画像解析を行うものである。
【００１８】
赤血球を標識する近赤外蛍光を発する蛍光色素としては、例えば、ＮＩＲ８１５、インドシアニングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ７９０などが挙げられ、標識された赤血球は、マウス、ラットなどの被検動物に経静脈的に投与される。そして、この被検動物の深部脳組織における近赤外蛍光信号の空間分布を、例えば、低倍率のマクロレンズを装着した、マクロ共焦点顕微鏡で可視化することによって、脳活動に伴う局所における赤血球の密度の変化を推定し、この赤血球の密度の変化に基づいて被検動物の深部脳活動を可視化する。
【００１９】
以下、本発明の脳活動の光学的画像解析法の実施例について、添付した図面を参照しながら説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、種々の変形実施が可能である。
【実施例１】
【００２０】
脳活動が起きると、局所脳血流量が増加する現象は公知である（例えば非特許文献１参照）。しかし、この局所血流量の増大を、効率よく光学的に捉えるためには、血漿成分ではなく赤血球成分に着目することが、重要である。
【００２１】
その原理に関して、図１に基づいて説明すると、脳血流量の増加は細動脈１などの拡張によって引き起こされる（例えば非特許文献２参照）。細動脈が拡張すると、それに続く毛細血管２や細静脈３の血流量が増加する。しかし、毛細血管２の直径は、あらかじめ投与しておいた近赤外蛍光色素で標識した赤血球４や、通常の赤血球５の直径と同程度であるため、近赤外蛍光色素で標識した赤血球４や通常の赤血球５が毛細血管２を流れるとき、毛細血管壁から摩擦抵抗を受け、血漿成分と比較して流速が遅くなる（例えば非特許文献３を参照）。しかし、血管断面積あたりの赤血球の流量と血漿成分の流量が、血管の太さにかかわらず、一定の比を保たねば、血管が赤血球で閉塞してしまう。従って、赤血球の流速の低下を補うため、細動脈１から毛細血管２において、赤血球の密度が上昇する（図１Ａ参照）。脳が活動して、局所脳血流速が上昇すると、赤血球が毛細血管壁から受ける摩擦抵抗はより大きくなり、赤血球の密度が高くなる現象はより著しくなる（図１Ｂ参照）。即ち脳活動が生じた部位を流れる細動脈１や毛細血管２では、近赤外蛍光色素で標識した赤血球４の密度が上昇するので、近赤外蛍光信号が増大する。従って近赤外蛍光強度の変化の空間分布を知れば、脳活動の空間分布を知ることができる。
【００２２】
つぎに、赤血球を近赤外蛍光色素で標識する方法について、説明する。まず、マウス、ラットなどの被検動物から採血し、血液を０．９％のＮａＣｌ水溶液や１０％ショ糖水溶液などの体液とほぼ等しい浸透圧を持つ等張液に懸濁し、赤血球を遠心分離機によって沈殿させ、上清を廃棄する操作を繰り返すことによって、赤血球を取り出す。
【００２３】
取り出した赤血球を近赤外蛍光を発する蛍光色素（例えば、ＮＩＲ８１５、インドシアニングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ７９０など）で標識するには、様々な方法を用いることができる。
【００２４】
例えば、赤血球を脂溶性色素のＮＩＲ８１５で標識する場合、赤血球を１０％ショ糖の等張溶液に懸濁させ、撹拌しながら、容量比０．１％程度のＮＩＲ８１５のエタノール溶液（濃度は１ｍＭ程度）を加え、素早く混入させる。ＮＩＲ８１５は脂質に溶け込む性質を有するため、赤血球の膜に素早く入り込んで、赤血球の膜を標識する。
【００２５】
また、例えば、臨床医学分野で血管造影剤として広く用いられている近赤外蛍光色素のインドシアニングリーンで赤血球を標識する場合、赤血球を低張液中で破裂させ、破れた膜の破たん部から蛍光物質を赤血球内部に取り込ませる方法（例えば非特許文献４参照）を用いる。インドシアニングリーンは、水溶液中に単独で存在する場合、弱い蛍光しか発しないが、高密度リポタンパク質と結合すると強い蛍光を発する性質を有する（例えば特許文献３を参照）。そこで高密度リポタンパク質を多量に含有する卵黄やその抽出物などに１ｍｇ／ｍｌ程度のインドシアニングリーンを加えて撹拌し、コロイド状の高密度リポタンパク質とインドシアニングリーンの結合物を含む溶液を作成する。さらに蒸留水で希釈することによって浸透圧を体液の４分の１程度に調整する。赤血球をこの低張コロイド溶液に加えると、浸透圧によって赤血球が膨化し、膜が破たんする。この膜の破たん部から、高密度リポタンパク質とインドシアニングリーンの結合物が、赤血球の内部に侵入する。さらに、５％程度のＮａＣｌ水溶液を適量加えることによって、赤血球溶液の浸透圧を体液と等しくなるように調整すると、膜の破たん部が自動的に修復され、赤血球内部にコロイド状の高密度リポタンパク質とインドシアニングリーンの結合物が入り込むことで、赤血球を標識することができる。こうして標識された赤血球は、遠心分離操作を繰り返すことによって、コロイド状の溶液から分離することができる。
【００２６】
また、例えば、赤血球をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ７９０などの近赤外蛍光色素で標識する場合、タンパク質など特異的に結合する蛍光色素の多種多様な誘導体がインビトロゲン社などから市販されているため、これらを用いて、赤血球の膜タンパクなどに蛍光色素を結合させ、赤血球を近赤外蛍光色素で標識することができる。
【００２７】
そして、はじめの投与ステップでは、近赤外蛍光色素で標識された被検動物の赤血球を被検動物に経静脈的に投与する。
【００２８】
好ましくは、近赤外蛍光色素で標識された赤血球は、赤血球密度が約５０％程度になるように、０．９％ＮａＣｌ溶液などに懸濁させ、被検動物としてマウスやラットなどの小動物の体重の１％程度の赤血球液を経静脈的に投与する。
【００２９】
この投与ステップの後に、検出ステップでは、近赤外レーザを励起光源とする共焦点光学系を用いて被検動物の脳における近赤外蛍光強度の空間分布を検出する。そして、表示ステップでは、この検出ステップで検出された近赤外蛍光強度の空間分布に基づき被検動物の脳活動の空間分布を表示する。
【００３０】
ここで、検出ステップ、表示ステップを実施するために用いられる共焦点光学系の一般的構成について、図２を用いて説明する。図２において、６は波長８００ナノメートル付近の近赤外励起光を発するレーザ光源であり、レーザ光源６から出力された励起光は、ピンホール７、励起光を透過させるダイクロイックミラー８、レンズ９を順に通過し、レンズ10によって、被解析対象物Ｏの観察点に焦点Ｐを結ぶようになっている。ここで、ピンホール７と焦点Ｐは光学的に共役の位置に配置されている。
【００３１】
そして、焦点Ｐに存在する、近赤外蛍光色素によって標識された赤血球において発生した近赤外蛍光は光路を逆向きにレンズ10，９を通過した後、励起波長より長い光のみ反射させるダイクロイックミラー８で反射され、ピンホール11と励起波長より長い光のみを透過させる光学フィルター12を順に通過し、検出器13で測定されるようになっている。そして、検出器13で測定された近赤外光の光量信号は電気信号に変換され、図示しない演算手段へ送信されるようになっている。ここで、焦点Ｐとピンホール11は光学的に共役の位置に配置されている。
【００３２】
また、図示しないが、レンズ10によって集点Ｐが結ばれる励起光を水平面上で走査させるための走査ミラーが光路に挿入されており、この走査ミラーはガルバノメータで回転可能に構成されている。さらに、被解析対象物Ｏが載置されるとともに上下方向に移動可能なステージが設けられている。そして、これらガルバノメータ、ステージの動作は、図示しない制御手段により制御され、走査ミラーの回転角度とステージの移動量の情報は、制御手段から演算手段へ送信されるようになっている。演算手段は、走査ミラーの回転角度とステージの移動量の情報から検出器13により光量信号が得られた被解析対象物Ｏ上の位置情報を算出し、光量信号とその位置情報に基づいて画像データを作成し、この画像データを図示しない表示手段に出力するように構成されている。
【００３３】
つぎに、上記の共焦点光学系の動作について、マウスの脳を解析する場合を例にとって説明する。レーザ光源６をオンにし、マウスの脳の観察点に焦点Ｐが位置するように、マウスの脳と装置の位置関係を調整する。レーザ光源６から出力された近赤外光は、ピンホール７、ダイクロイックミラー８、レンズ９，10を順に通過して、マウスの脳の観察点に焦点Ｐを結ぶ。ここで、マウスは全脳の厚みが５ｍｍ程度で頭蓋骨が近赤外線に対して透過性が高いため、近赤外線はマウス脳底まで到達可能である。したがって、本実施例の脳活動の光学的画像解析装置によれば、マウスの脳の任意の部位を解析可能である。
【００３４】
マウスの脳の観察点Ｐにおいて発生した近赤外蛍光は、レンズ10，９、ダイクロイックミラー８、ピンホール11、光学フィルター12を順に通過して、検出器13で測定される。脳活動は局所脳血流量を増加させ、これに応じて近赤外蛍光色素で標識した赤血球の密度が上昇するので、発生した近赤外蛍光の強度を観測することにより、焦点Ｐに位置するマウスの脳の局所脳活動を解析することができる。また、焦点Ｐで発生した近赤外蛍光のみがピンホール11に遮られずに通過するため、焦点Ｐにおける蛍光強度のみを選択的に測定することができる。さらに、ダイクロイックミラー８，光学フィルター12の適合波長を選択することにより、レンズ９，10の表面や、頭蓋骨表面、脳組織などで反射された励起光の影響を受けずに蛍光のみを観察することができる。
【００３５】
検出器13で測定された近赤外蛍光の光量信号は電気信号に変換され、演算手段へ送信される。また、制御手段は、ガルバノメータ、ステージの動作を制御し、走査ミラーの回転角度とステージの移動量の情報は、演算手段へ送信される。演算手段は、走査ミラーの回転角度とステージの移動量の情報から検出器13により光量信号が得られた被解析対象物Ｏ上の位置情報を算出する。なお、これら光量信号とその位置情報は、近赤外蛍光強度の空間分布に関する情報となる。そして、演算手段は、光量信号とその位置情報に基づいて画像データを作成し、この画像データを表示手段に出力する。そして、表示手段は、被検動物の脳活動の空間分布として、測定画像を表示する。
【００３６】
以上のように、本実施例の脳活動の光学的画像解析法は、近赤外蛍光色素で標識された被検動物の赤血球を被検動物に経静脈的に投与する投与ステップと、この投与ステップの後に近赤外レーザを励起光源とする共焦点光学系を用いて被検動物の脳における近赤外蛍光強度の空間分布を検出する検出ステップと、この検出ステップで検出された近赤外蛍光強度の空間分布に基づき被検動物の脳活動の空間分布を表示する表示ステップとを備えたものである。
【００３７】
また、本実施例に用いられる共焦点光学系は、近赤外光を出力するレーザ光源６と、このレーザ光源６から出力された近赤外光の焦点Ｐを被解析対象物Ｏに結ぶとともに被解析対象物Ｏで発生した近赤外蛍光を集光するレンズ10と、前記焦点Ｐと光学的に共役の位置に配置されたピンホール11と、このピンホール11を通過した近赤外蛍光を検出する検出器13とを備えたものである。
【００３８】
脳活動によって局所脳血流量が増加する現象を用い、あらかじめ小動物に近赤外蛍光色素で標識した赤血球を投与しておけば、本実施例の共焦点光学系により脳組織の近赤外蛍光強度を測定することにより、脳血流量の変化を介して、脳活動の程度を容易に測定することができる。また、公知の手段を用いて三次元的に走査することにより、脳活動の三次元的画像解析が可能となる。
【００３９】
また、本実施例の共焦点光学系によれば、従来の光学的方法と比較して脳深部の活動が非侵襲的に解析でき、核磁気共鳴画像法やポジトロン断層法と比較して装置が安価であり、時間・空間分解能が優れ、高磁場や放射線を用いないため、実験上の制約が少ない。
【００４０】
また、マウスの頭蓋骨表面を透明な樹脂やガラス板等で保護すれば、本実施例の脳活動の光学的画像解析法は覚醒マウスに使用可能である。脳・精神疾患の治療法・治療薬の開発には覚醒マウスの深部脳活動の解析が重要であるので、本実施例の脳活動の光学的画像解析装置によって脳・精神疾患の治療法・治療薬の開発が促進されるものと期待される。
【符号の説明】
【００４１】
１  細動脈
２  毛細血管
３  細静脈
４  近赤外蛍光色素で標識した赤血球
５  赤血球
６  レーザ光源
７  ピンホール
８  ダイクロイックミラー
９  レンズ
10  レンズ
11  ピンホール
12  光学フィルター
13  検出器
Ａ  安静時の局所脳血流
Ｂ  脳活動時の局所脳血流
Ｏ  被解析対象物（マウスの脳）
Ｐ  焦点
【図１】
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【図２】
2014217588.tif 000004