(57)【要約】【課題】治療効果の拡大が期待され、副作用が少なくウイルス除去率の高いＣ型肝炎の予防・治療薬の提供。【解決手段】（Ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであるアクチノヒビン、（Ｂ）アクチノヒビンのアミノ酸配列の１又は１０％以内のアミノ酸配列が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチド、ならびに（Ｃ）上記（Ａ）及び／又は（Ｂ）が、好適には５０個以下のアミノ酸又はポリエチレングリコール残基からなるリンカーで連結されてなる多量体、からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する抗ＨＣＶ薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであるアクチノヒビン、
（Ｂ）アクチノヒビンのアミノ酸配列の１又は１０％以内のアミノ酸配列が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチド、ならびに
（Ｃ）上記（Ａ）及び／又は（Ｂ）がリンカーで連結されてなる多量体、
からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する抗ＨＣＶ薬。
【請求項２】
上記（Ｃ）の多量体を含有し、かつ、リンカーが５０個以下のアミノ酸からなる、請求項１記載の抗ＨＣＶ薬。
【請求項３】
上記（Ｃ）の多量体を含有し、かつ、リンカーがポリエチレングリコール残基からなる、請求項１記載の抗ＨＣＶ薬。
【請求項４】
上記多量体が２量体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＨＣＶ薬。
【請求項５】
上記多量体には上記（Ａ）とも（Ｂ）とも異なるポリペプチド又はタンパク質がさらに結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＣＶ薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus, HCV）の感染によって引き起こされるＣ型肝炎の予防・治療に有効な抗ウイルス薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスとしてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が発見されたことにより（Choo, Q. L. et al., Science, 244, 359-362, 1989）、当時非Ａ非Ｂ型とされていた肝炎のほとんどがＨＣＶ感染によるものであることが明らかとなり、さらに自己免疫性肝炎やアルコール性肝障害とされていた患者の中にも多くのＨＣＶ感染者がいることが明らかとなった。また、ＨＣＶ感染の２０−３０年後には、肝硬変そして肝がんに進行することが明らかとなっている。現在、世界には約１億７千万人、日本には約２００万人のＨＣＶ感染者がいると推定されている。
【０００３】
１９９０年代初頭に、Ｃ型肝炎に対するインターフェロン（ＩＦＮ）による治療が承認され、さらにリバビリン（ＲＢＶ）との併用による治療効果の向上とペグ−インターフェロン（Ｐｅｇ−ＩＦＮ）の導入により治療に対するコンプライアンスが改善された。現在、Ｐｅｇ−ＩＦＮ／ＲＢＶ併用により治療効果の増大が計られている。しかし、Ｐｅｇ−ＩＦＮ／ＲＢＶ併用治療はＣ型肝炎に対する治療効果を格段に向上させたが、ウイルス排除率は遺伝子１型高ウイルス症例で４０−５０％、その他の症例で８０％に留まっていて、本治療法に反応しなかった患者が年々増大しているのが現状である。さらに、高い確率で起こる発熱、頭痛、筋肉痛などのインフルエンザ様症状を始めとする多彩な副作用が大きな問題として残されている。従って、副作用が少なくウイルス除去率の高いＣ型肝炎の予防・治療薬の開発が望まれている（竹原徹郎、YAKUGAKU ZASSHI, 130, 143-156, 2010）。
【０００４】
その後、２０１１年にプロテアーゼ阻害薬であるテラプレビルが認可され、テラプレビルの使用によって遺伝子１型高ウイルス症例のウイルス除去率はさらに高まると言われているが、皮膚疾患等の副作用が難点であると言われている。
【０００５】
ＨＣＶの感染は、ウイルス標的細胞との選択的な結合によって始まるが、この細胞への選択的結合はウイルスの糖タンパク質（Ｅ１，Ｅ２）と細胞表面の特異的受容体との相互作用により決定される。ウイルスが細胞内へ侵入するには多段階の過程が想定されていて、最初にウイルスが細胞に非特異的に吸着すると考えられる。ウイルス侵入の次の段階はまだ解明されていないが、複数の受容体タンパク質が関係している（Ploss, A., et al., EMBO Rep. 10, 1220-1227, 2009）。ＨＣＶの糖タンパク質（Ｅ１，Ｅ２）の糖鎖などの詳細な解析は、大量のウイルス粒子の精製が困難なために、その構造と機能は不明のままである。
【０００６】
本発明者の一人である田中らは、ＨＩＶの構造やライフサイクルに関する知見をもとに、これまでの抗ＨＩＶ薬とは異なる作用メカニズムを有する抗ＨＩＶ薬の作用標的として、薬剤が細胞に入る必要のない接着・侵入の部位を選び、自ら開発したＴ−ｔｒｏｐｉｃまたはＭ−ｔｒｏｐｉｃ  ＨＩＶエンベロープ発現細胞と受容体発現細胞による合胞体形成系（Chiba, H. et al., J. Antibiot., 54, 818-826, 2001）を用いて、新属新種の放線菌Ｌｏｎｇｉｓｐｏｒａ  ａｌｂｉｄａ（Matsumoto, A. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 53, 1553-1559, 2003）が生産するアクチノヒビン（ＡＨ、図１、配列番号１）を発見した（Chiba, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 282, 595-601, 2001）。ＡＨは、強い合胞体形成阻害活性を示すと共に強い抗ＨＩＶ活性を有することが見出された。ＡＨは、１１４アミノ酸を含み、３８アミノ酸からなる３つのセグメントを有し、各セグメントの中央にＬＤモチーフと、Ｃ末側にＱＸＷモチーフを持つことからcarbohydrate binding module family 13 （ＣＢＭ１３）に属するレクチンと考えられている。
【０００７】
ＡＨは、ＨＩＶ−１の表面にあるｇｐ１２０の高マンノース型糖鎖（high-mannose type glycan 、ＨＭＴＧ）と結合することにより、ＨＩＶの細胞への接着・侵入を阻害し、逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤に対する耐性株を含む臨床分離ＨＩＶ−１株に対して、強い抗ウイルス活性を示すことが明らかになっている（Takahashi, A., et al., J. Antibiot., 64, 551-557, 2011）。これまでに実施された生化学的究及び既にＸ線結晶構造解析によって明らかにされたＡＨの立体構造から、ＡＨは１１４アミノ酸残基から構成されるタンパク質であり、α（１−２）ｍａｎｎｏｂｉｏｓｅに特異性を示すマンノース結合レクチンの一種で、分子内に３８アミノ酸残基で構成される３つのセグメント（糖鎖結合ポケット）を持つことが示されている（図２）。図２はＡＨのＸ線結晶構造を示すものであり、図２の左図は、互いに類似した３コのモジュール（糖結合ポケット）からなり、右図に示すｇｐ１２０の３本の高マンノース型糖鎖（ＨＭＴＧ）に結合することにより細胞への感染を阻止する。ＡＨは、ｇｐ１２０上のＨＭＴＧ３本を捕らえることで、いわゆる、レクチンのクラスター効果によりｇｐ１２０と強く結合し、強力な抗ＨＩＶ活性を示すと考えられている。ＡＨは、ｇｐ１２０のように多数のＨＭＴＧを持つ糖タンパク質のみに作用することから、ｇｐ１２０に対する選択性が非常に優れており、副作用の少ない薬剤として期待できる。また、ＨＩＶ感染予防薬として期待されているｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒが生産するシアノビリン−Ｎ（ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ−Ｎ，ＣＶ−Ｎ）はＨＭＴＧ１本のみでも強い親和性を示すため、ＣＶ−ＮよりＡＨの方が選択性において遥かに優れていると考えられている（Tanaka, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 106, 15633-15638, 2009）。ＣＶ−Ｎや植物由来の抗ＨＩＶ活性を有するレクチンは、発がんに結びつくマイトジェン活性を示す他、サイトカイン・ケモカイン誘導能、及び細胞毒性を示すが、ＡＨはこれらの副作用に結びつく活性を全く示さない（Hoorelbeke, H., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 54,3287-3301,2010）。ＡＨの以上の特異性から、ＡＨはＨＭＴＧのα（１−２）ｍａｎｎｏｂｉｏｓｅ及びα（１−２）ｍａｎｎｏｔｒｉｏｓｅのみを認識して３本のＨＭＴＧを持つ糖タンパク質のみに強い親和性を示すことから、抗体に匹敵するほどの特異的な親和性を示すと言える。また、ｇｐ１２０のように多くのＨＭＴＧを持つ糖タンパク質はヒトには知られていないことから、ＡＨは副作用の少ない抗ＨＩＶ薬となり得る。
【０００８】
さらに最近、ＡＨのポリエチレングリコール（Ｐｅｇ）化を検討し、例えば両端に官能基を持つＰｅｇにＡＨのＮ末端アミノ基を反応させて得られたＡＨ−Ｐｅｇ−ＡＨがＡＨの数倍強い合胞体形成阻害活性及び抗ＨＩＶ活性を示すことを見出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３９６２７７２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／０６９２９０Ａ１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００６／０５９６３８Ａ１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のとおり、Ｃ型肝炎治療薬としてはＰｅｇ−ＩＦＮ／ＲＢＶ併用療法が開発され、最近ではウイルス特異的なプロテアーゼを阻害するテラプレビルが導入されて治療効果の増大が計られているが、治療効果が認められない場合があり、これらの治療に反応しなかった患者が増え続けていることに加えて、高い確率で起こる発熱、頭痛、筋肉痛などのインフルエンザ様症状を始めとする多彩な副作用が大きな問題として残されているのが現状である。また、ＨＣＶの細胞への接着・侵入を阻害する薬剤は未開発であったが、近年、グリフィシン（griffithsin）がＨＣＶ細胞への接着・侵入を阻害することが発表された（Meuleman, P., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167, 2011）。しかし、細胞への感染を阻止するのに１０μg/ml（７６９ｎＭ）を必要として活性は低い。従って、本発明は、さらに強い治療効果の拡大が期待され、副作用が少なくウイルス除去率の高いＣ型肝炎の予防・治療薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような状況下で、アクチノヒビン（ＡＨ）の単量体・多量体が抗ＨＣＶ活性を有することを見出し、特に、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨが１．０ｎＭ以下の低濃度で肝細胞へのウイルスの接着・侵入を阻害することを発見し、本発明を完成するに至った。多くのＨＭＴＧを持つ糖タンパク質にのみ強い親和性を示すことを特徴とするＡＨ及びＡＨ誘導体が抗ＨＣＶ活性を示すという発見は、これまで構造と機能が不明であったＨＣＶの表面に存在する糖タンパク質が少なくとも３本以上のＨＭＴＧを持ち、その糖タンパク質上のＨＭＴＧが細胞への接着において重要な役割を果たしていることを示すものであり、これまで解明が進んでいなかったＨＣＶの糖タンパク質の構造と機能の解明に重要なヒントを与えるものである。また、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨの強い抗ウイルス活性もこれに由来すると考えられる。
【００１２】
本発明者らが鋭意検討した結果、以下の本発明を完成した。
（１）（Ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであるアクチノヒビン、（Ｂ）アクチノヒビンのアミノ酸配列の１又は１０％以内のアミノ酸配列が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチド、ならびに（Ｃ）上記（Ａ）及び／又は（Ｂ）がリンカーで連結されてなる多量体、からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する抗ＨＣＶ薬。
（２）上記（Ｃ）の多量体を含有し、かつ、リンカーが５０個以下のアミノ酸からなる、上記（１）の抗ＨＣＶ薬。
（３）上記（Ｃ）の多量体を含有し、かつ、リンカーがポリエチレングリコール残基からなる、上記（１）の抗ＨＣＶ薬。
（４）上記多量体が２量体である、上記（１）〜（３）のいずれかの抗ＨＣＶ薬。
（５）上記多量体には上記（Ａ）とも（Ｂ）とも異なるポリペプチド又はタンパク質がさらに結合している、上記（１）〜（４）のいずれかのＨＣＶ薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によりＡＨおよびＡＨ誘導体（多量体）は、後述の実施例に示す通り、細胞毒性を全く示さず、ウイルスに結合することにより、ウイルスの細胞への接着・侵入（感染）を阻止することが明らかとなった。また、これまでＨＣＶの接着・侵入に関する情報は少なく不明な点が多かったが、ＨＩＶに対するＡＨの研究で明らかになった、多くのＨＭＴＧを持つ糖タンパク質（ｇｐ１２０）上の３本のＨＭＴＧがＡＨの３つの糖鎖結合ポケットに結合した場合にのみ、いわゆるレクチンのクラスター効果によって強い親和性を示すというＡＨの特性を考えると、ＡＨが抗ＨＣＶ活性を示すという事実は、ＨＣＶの外套糖タンパク質には少なくとも３本以上のＨＭＴＧが存在することが推定される。さらに、ＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ/ＲＴＢ−Ｌ、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨなど）がＡＨより数倍強い抗ＨＣＶ活性を示すという事実は、ＨＣＶの外套糖タンパク質が３本よりさらに多くのＨＭＴＧを含むことを示すものである。従って、本発明は、新しいタイプの抗ＨＣＶ薬を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アクチノヒビンのアミノ酸配列を示す。
【図２】アクチノヒビンの結晶構造を示す。
【図３】ＡＨ−５ｋＰＥＧ−ＡＨ生成の反応模式図である。
【図４】ＯＤＳカラムクロマトグラフィーの溶出パターン（Ａ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）の結果を示す。
【図５】ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨの質量分析の結果を示す。
【図６】ＡＨ単量体およびＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）の抗ＨＣＶ活性を示す。
【図７】ＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）処理細胞へのＨＣＶ感染を示す。
【図８】ＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）の抗ＨＣＶ活性を示す。
【図９】ＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）の抗ＨＣＶ活性
【図１０】ＨＣＶへのアクチノヒビン関連物質の投与方法の模式図である。
【図１１】ＡＨ及びＡＨ２量体（ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨ，ＡＨｐＡＨ）の抗ＨＣＶ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳述する。
アクチノヒビン（ＡＨ）は配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。特許文献１に示した通り、ストレインＫ９７−０００３（ｓｔｒａｉｎＫ９７−０００３）として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ  Ｐ−６６７０）菌株を培地に培養することにより、培養物中にＡＨが蓄積し、当該培養物からＡＨを採取することができる。ＡＨについては、そのアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加されていてもよく、より具体的には、ＡＨの有する生物活性、特に、抗ＨＣＶ活性を有する限り、当該蛋白質に含まれるアミノ酸配列に１個又は２個以上の置換、付加、欠失、挿入等の変異が生じてもよい。
【００１６】
なお、菌の一般的性状として、ストレインＫ９７−０００３菌株の菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではない。自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射または変異誘導物質、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工変異手段により変異する。このような人工的変異株及び自然変異株を含めて、ＡＨを生産する能力を有し、放線菌に属する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの手法により細胞工学的に変異させた放線菌以外の菌株（例えば大腸菌など）も、本発明においてＡＨ生産菌として使用することができる。
【００１７】
ストレインＫ９７−０００３菌株の培養に際しては、放線菌の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。用いられる培地は微生物の資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地いずれも用いることができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、マルトース、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコール、メタン、エタン、プロパン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、グルタミン酸などのアミノ酸あるいはグリセロールなどが用いられる。
【００１８】
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、綿実油、大豆カゼイン、カザミノ酸、ファーマメディアなどが用いられる。無機物としてはリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩化コバルト、食塩などが用いられる。その他必要に応じて培地に微量の金属塩、ビタミン、サイアミンなど菌体の増殖あるいはＡＨの生産を促進する物質を加えることができる。また微生物が特定の物質を要求する場合は、生育に必要なものを加えることが必要である。これらのものはＡＨの生産に役立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
【００１９】
ストレインＫ９７−０００３菌株の大量培養には液体培地を用いた振盪培養法、通気撹拌培養法などが好ましい。培養温度は生産菌が発育し、ＡＨを生産できる範囲で適用できる。培養はストレインＫ９７−０００３菌株の性質に応じて、適宣選択して行なうことができる。培養物中のＡＨが培養液中に存在する場合には、菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法にしたがって、濾過、遠心分離などにより培養液中のＡＨと微生物菌体とを分離した後のＡＨ溶液が使用される。ＡＨが菌体内に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加してＡＨを可溶化して、水溶液として分離採取する。
【００２０】
このようにして得られたＡＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。ついでこの沈殿物を水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製しこれらの手段を用いて得られるＡＨ含有溶液は、減圧濃縮、凍結乾燥等の処理にてより精製されたＡＨを得ることができる。ＡＨは、合成ペプチドであってもよい。
【００２１】
本発明の抗ＨＣＶ薬は：
（Ａ）ＡＨの単量体、
（Ｂ）ＡＨのアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドの単量体、
（Ｃ１）ＡＨの多量体、
（Ｃ２）ＡＨのアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドの多量体、
（Ｃ３）ＡＨと、ＡＨのアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドとの多量体、
のいずれかを含有する。抗ＨＣＶ薬は、Ｃ型肝炎の予防又は治療の少なくとも一方の効能を有する薬剤である。上記（Ｂ）及び（Ｃ２）はアクチノヒビンのアミノ酸配列の１又は１０％以内のアミノ酸配列が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドであってもよい。本発明の抗ＨＣＶ薬は、上記（Ａ）〜（Ｃ３）のいずれかと、既存の他のＣ型肝炎治療薬、例えば、Ｐｅｇ−ＩＦＮやＲＢＶなどとの併用薬であってもよく、従来のＣ型肝炎治療薬よりも治療効果のさらなる増大が見込まれる。
【００２２】
ＡＨは３つの相同ドメイン（配列番号１中、１〜３８、３９〜７６及び７７〜１１４）から構成されており、ＡＨ多量体（ｎ量体）に１または２個の相同ドメインが付加されたものも含まれる。ＡＨ多量体（ｎ量体）に含まれるＡＨ単位の数（ｎ）は、抗ＨＣＶ活性を示す限りにおいて特に限定されないが、精製時の取扱性等を考慮して通常は６量体以下、好ましくは３量体以下、例えば、２量体である。
【００２３】
本発明において多量体とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列が任意のリンカーを介して連結したものを意味し、さらに、ポリペプチドの精製や取扱に有用な配列を含んでもよい。
【００２４】
リンカーは、多量体の抗ＨＣＶ作用を害さないものであれば特に限定されないが、通常、５０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下のアミノ酸残基からなる配列が挙げられる。例えば、配列番号２によって示されるポリペプチドが含まれる。従って、本発明における多量体には、配列番号１のポリペプチド−配列番号２のリンカー配列−配列番号１のポリペプチドからなるポリペプチド（配列番号３として示す）が含まれる。このポリペプチドは２量体であるが、３量体以上の構造も同様である。
【００２５】
リンカーとして、ポリエチレングリコール残基を用いることができる。具体的には上記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の単量体どうしを（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎの繰り返し単位で連結することで多量体を得ることができる（pegylation）。リンカーとして用いる（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎの繰り返し単位の分子量は好ましくは１０００〜３００００である。Pegylationの具体的な方法は従来公知の方法を参照してもよいし、後述の実施例を参照することもできる。
【００２６】
本発明では、多量体に（Ａ）とも（Ｂ）とも異なるポリペプチド又はタンパク質がさらに結合していてもよい。そのようなポリペプチドの精製や取扱に有用な付加配列の例としては、プロテアーゼ認識配列を含むものが挙げられ、就中Ｈｉｓタグ又はTobacco Etch Virus由来プロテアーゼ認識配列を含むものが挙げられる。その他、ＧＳＴタグも使用できる。Ｈｉｓタグは例えば、Ｈｉｓ６タグである。
【００２７】
ＡＨ多量体が優れた抗ＨＣＶ活性を示す理由は明らかではないが、抗ＨＩＶ活性においては、約１０本のＨＭＴＧを持つｇｐ１２０がＨＩＶの表面で３量体を形成していて、ＡＨ多量体が隣のｇｐ１２０のＨＭＴＧに跨って結合することにより、いわゆるレクチンのクラスター効果により強い抗ＨＩＶ活性を示すと推定されている。ＨＣＶの外套糖タンパク質については、不明な点が多いが、ＨＩＶｇｐ１２０と同様にＨＭＴＧを持つ糖タンパク質が複合体を形成していると考えると良く理解できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００２９】
（実施例１）
＜ＡＨ−５ｋＰＥＧ−ＡＨの調製＞
両端に官能基としてアルデヒド基を有する平均分子量５０００のＣＨＯ−５ｋＰｅｇ−ＣＨＯを用いて、ＡＨを２量体化したＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨを調製した。図３に、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨ生成の反応模式図を示す。
【００３０】
１６ｍｇのＡＨを用いて、１．５ｍＭＡＨ、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）／３０％  ＣＨ３ＣＮ、０．５ｍＭ  ＣＨＯ−５ｋＰｅｇ−ＣＨＯ（Ｇｒｅａｔｉｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社、米国）（ＡＨ：５ｋＰｅｇ＝３：１、モル比）、２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように調製し、３７℃で１時間反応した。その後、反応液をＯＤＳカラムにアプライし、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨの溶出画分を回収した。ＯＤＳカラムは、ＰＥＧＡＳＩＬ−３００  Ｃ４Ｐ（４．６φ×２５０ｍｍ、センシュー科学（株）、東京）を用い、移動相は５％−５０％  ＣＨ３ＣＮ／０．０１％  ＴＦＡ（２０分の直線濃度勾配）、流速１ｍｌ／ｍｉｎで行った。得られたＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨを含む溶出画分を凍結乾燥し、白色粉末２．８ｍｇ（回収率１３．４％）を得た。ＯＤＳカラムからの溶出パターンを図４（Ａ）に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを図４（Ｂ）に、質量分析の結果を図５に示す。
【００３１】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って行った（Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-685, 1970）。使用したゲルは、１５−２０％グラジエントゲル（バイオクラフト、東京）を用いた。試料は、１０％になるように２−メルカプトエタノールを添加したTris-Glycine SDS Sample buffer（×２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、東京）と等量で混合し、１００℃で５分間加熱してからアプライした。泳動には、泳動用緩衝液［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％ＳＤＳ］を用いた。タンパク質の可視化は、ゲルをImperial protein（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、横浜市）で染色後、水で脱色して行った。分子量マーカーには、タンパク質分子量マーカーＩＩ（ＴＥＦＣＯ、東京）を用いた。
【００３２】
＜ヨウ素による染色＞
Ｐｅｇの染色は、Ｋｕｒｆｕｅｒｓｔらの染色方法に従って行った（Kurfuerst, M. M., Anal. Biochem., 200, 244-248, 1992）。ＳＤＳ−ＡＰＧＥ後のゲルを０．１Ｍ  ＨＣｌＯ４に浸して１０分間振騰後、５％ＢａＣｌ２を含む０．１Ｎヨウ素溶液でバンドが染色されるまで振騰した。その後、バンドがはっきり見えるまで水で脱色し、ゲル中のＰｅｇ化タンパク質を可視化した。
【００３３】
＜質量分析＞
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型のＡＸＩＭＡ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所、京都）を用いて質量分析を行った。ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨにアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含む）１０μｌを直接加えて溶解し、１マイクロｌを測定プレートにのせ、マトリックスとして１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸溶液（Ｓｉｇｍａ）１μｌをプレート上で混合し、乾燥後に分析した。標準タンパク質として、１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン（Ｓｉｇｍａ）１μｌを同様にプレート上にスポットし、マトリックスと混合、乾燥後測定を行った。質量値の計算にはウマミオグロビン１価イオンおよび２価イオンの理論値１６９５２．２７と８４７６．１３５を用いた。
【００３４】
（実施例２）
＜ＡＨおよびＡＨ２量体の抗ＨＣＶ効果＞
＜細胞とウイルス＞
細胞：ＨｕＨ７．５
ウイルス：ＪＦＨ１（ＨＣＶ−２ａ型に由来する感染性ＨＣＶ粒子を産生する。
培養液：（DMEM-10% FCS-5 ml of non essential amino acid mix (Gibco)-5 ml of Penicillin-Streptomycin（Ｇｉｂｃｏ））（以下ＤＭＥＭと称する）
薬剤：ＡＨ（特許文献１、配列番号１、図１）及びＡＨ２量体（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ/ＲＴＢ−Ｌ、特許文献３、配列番号３）。１ｍＭ  ＨＣｌで希釈して濃度を調整した。
【００３５】
＜ＡＨ２量体をコードする遺伝子の構築＞
以下の手順に従って、配列番号３で表されるＡＨ２量体をコードする遺伝子（配列番号４）を構築した。
はじめに、２個のアクチノヒビン遺伝子（以下、ＡＨ遺伝子）を連結するための１２アミノ酸残基（配列番号２）をコードするリンカ一遺伝子（以下、ＲＴＢ−Ｌ遺伝子）を次のようにして作成した。
【００３６】
すなわち、ＲＴＢ−Ｌ遺伝子は、ｐｒｉｍｅｒ−１（ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＴＴＣ）（配列番号５）およびｐｒｉｍｅｒ−２（ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＧ）（配列番号６）の２種のプライマーを用い、それぞれの３’末端側９塩基分でオーバーラップさせ、プライマーダイマ一を形成させた後、ＰＣＲ（反応条件：９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとし、３０サイクル反応）により作成した。
【００３７】
次に、ＡＨ生産菌からクローニングされたＡＨ遺伝子を保持するブラスミドｐＢＳＫ＋：２Ａ３Ｋを鋳型として、ＡＡ−１Ｂａｍ（ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣＣ）（配列番号７）およびｐｒｉｍｅｒ−３（ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴＴ）（配列番号８）の２種のプライマーを用いてＰＣＲによりＡＨ遺伝子を増幅した。これにより、ＡＨ遺伝子の３’末端にＲＴＢ−Ｌ遺伝子の５’末端側１２塩基対分を付加させたＮ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を作成した。
【００３８】
３番目に、ＲＴＢ−Ｌ遺伝子とＮ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を鋳型とし、ＡＡ−１Ｂａｍおよびｐｒｉｍｅｒ−２を用いてＳＯＥ法（Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., and Pease, L. R., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes ：gene splicing by overlap extension, Gene 77, 61〜68(1989)）によるＰＣＲで、ＡＨ遺伝子の３’末端にＲＴＢ−Ｌの全長遺伝子を付加させたＬ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を作成した。一方、ＡＨ遺伝子をＡｃｃｓｅｎ（ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＡＧ）  （配列番号９）および  ＴＧＡＨｉｎｄ（ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  Ｃ）  （配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅し、Ｃ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を作成した。
【００３９】
このようにして得られたＬ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子とＣ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を、それぞれ制限酵素、ＢａｍＨＩとＡｃｃＩＩＩおよびＡｃｃ  ＩＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた２つのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した大腸菌クローニングベクターＰＵＣ１９と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この溶液で大腸菌ＪＭｌ０９を形質転換し、ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９：ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを作成した。
【００４０】
＜Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ発現プラスミドの構築＞
以下の手順に従って、融合タンパク質結合アクチノヒビン２量体（以下、Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）発現プラスミドを構築した。
ｐＵＣ１９：ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを鋳型として、１５１ｓｅｎ（Ｃ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ）  （配列番号１１）および１５１ａｓｎ（ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  Ｃ）  （配列番号１２）を用いてＰＣＲによりＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子を増幅した。
【００４１】
このＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ遺伝子溶液と大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５１／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯ溶液とを等量混合し、室温で３０分間インキュベートした後、その混合液全量を使って大腸菌ＪＭｌ０９を形質転換して、Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ発現プラスミド、ｐＥＴ１５１：ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを構築した。
【００４２】
＜Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌの大腸菌での発現＞
Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ発現プラスミドｐＥＴ１５１：ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌで形質転換された大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳを、アンピシリン（ＡＰ）１００μｇ／ｍｌ、クロラムフエニコール（ＣＭ）３４μｇ／ｍ１および２％グルコースを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養した。この菌液を接種菌濃度１％でＡＰ  １００μｇ／ｍ１およびＣＭ３４μｇ／ｍ１を含むＬＢ培地に接種し、３７℃で振とう培養した。Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値（当該大腸菌の生育度）が０．２５〜０．３０に達したところでイソプ口ピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度ＩｍＭになるように添加し、さらに２時間振とう培養した。培地を氷水で急冷して大腸菌の増殖を停止させた後、培養液を８０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを菌体内に発現させた大腸菌を、結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））に懸濁した。
【００４３】
＜ＡＨ２量体の調製・精製＞
上記に準じてＨｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを菌体内に発現させた大腸菌を結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣ１（ｐＨ７．９））１０ｍｌに懸濁した。大腸菌の懸濁液を１０秒毎に１０秒間のインターバルをとり、計３分間超音波処理で菌体を破壊し、菌抽出液を得た。抽出液を８０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分に分けた。不溶性画分は、６Ｍグアニジン塩酸を含む結合緩衝液（以下、結合緩衝液ＤＮ）に溶解させ、ニッケルキレートカラムクロマトグラフィーによる精製用の試料とした。
【００４４】
＜ニッケルキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅを用いたアフィニティークロマトグラフィ一＞
５ｍｌのＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）オープンカフムに充填し、２５ｍＩの結合緩衝液ＤＮで樹脂を平衡化して、結合緩衝液ＤＮで溶解したＨｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ溶液を通した。２５ｍｌの結合緩衝液ＤＮで樹脂を洗浄後、イミダゾールの濃度を１００ｍＭとした結合緩衝液ＤＮ２５ｍ１でＨｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを溶出させた。
【００４５】
＜ＯＤＳカラムクロマトグラフィー＞
アセトニトリルに懸濁したＯＤＳ樹脂（ＳＳＣセンシユー科学株式会社）１０ｍ１をオープンカラムに充填し、５Ｏｍ１の５０％アセトニトリル−０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で樹脂を洗浄した後、５０ｍ１の５％アセトニトリル−０．０１％ＴＦＡで樹脂を平衡化した。ニッケルキレートカラムで精製したＨｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ溶液を流し込み、５０ｍ１の５％アセトニトリル一０．０１％ＴＦＡで樹脂を洗浄した後、５０ｍ１の５０％アセトニトリル−０．０１％ＴＦＡでＨｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌを溶出した。得られた溶出液は、遠心エバポレーターを用いて濃縮乾固した後ｍｉ１１ｉＱ水に溶解した。
【００４６】
＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
ＯＤＳカラムで脱塩した試料を少量のｍｉ１１ｉＱ水に溶解し、ＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ  ０ＤＳ  ２０Φ×２５０ｍｍ（ＳＳＣセンシュー科学株式会社））にかけた。移動相は５％アセトニトリル−０．０１％ＴＦＡを５分間流し、ここから２５分後に７０％アセトニトリル−０．０１％ＴＦＡに到達するようにグラジエンドをかけた。流速は７ｍ１Ｚｍｉｎとし、カラム温度は４０℃に設定した。溶出液を波長２１０ｎｍのＵＶでモニターし、約１８分に溶出されるピークを分画した後、溶液のｐＨが中性付近に到達するまで遠心エバポレーターで凍結乾燥を繰り返した。
【００４７】
＜アッセイの基本手順＞
１）ＨｕＨ７．５細胞へのＨＣＶＪＦＨ１株の感染：ＪＦＨ１をｍｏｉ約１００で感染。
２）細胞：２４穴プレートを用いて３００ｍｌのＤＭＥＭ中で３７℃で培養。
３）感染実験：薬剤処理の前後でウイルスを感染させ、通常はその２日後に培養上清のウイルス量を測定。
４）薬剤の添加：薬剤を含む３００ｍｌのＤＭＥＭを加えて２日間培養。
５）ウイルスの定量：培養上清のウイルス量をＨＣＶ  Ｃｏｒｅ蛋白質のＥＬＩＳＡで測定。富士レビオのＥＬＩＳＡ測定キットを用いｍａｎｕａｌに従った。実験は３回行い、値を平平均化した。図６〜９には薬剤を添加しない細胞上清の値を１００として感染性を％で示した。
６）ＨｕＨ７．５．１細胞へのＨＣＶＪＦＨ１株の感染阻害実験：
感染性ＨＣＶＪＦＨ１H株をヒト肝がん細胞由来のＨｕＨ７．５．１細胞に感染させる際に異なる濃度のレクチンで1時間前処理し、ＪＦＨ１をｍｏｉ約０．３で感染させ、72時間後に定量的PCR法によりウイルス遺伝子量の変化を調べた(図１０)。ここでは、感染阻止試験に用いるウイルス量を、抗ＨＣＶ活性測定に用いられているｍｏｉ約０．３として測定した。
【００４８】
＜結果＞
（１）薬剤のＨｕＨ７．５細胞への毒性チェック
５×１０５個の細胞をプレートに撒き、翌日培地を各濃度のＡＨまたはＡＨ２量体を含むＤＭＥＭ３００ｍｌで置換。４日間培養して細胞増殖をＰＯＭＥＧＡのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTMで測定（ＡＴＰ量をルシフェラーゼ活性で測定する）。
その結果、ＡＨ，ＡＨ２量体ともに３０００ｎＭまでルシフェラーゼ活性の低下は見られなかった（細胞毒性は観察できなかった）。
【００４９】
（２）感染阻害実験
１）ＡＨとＡＨ２量体の抗ＨＣＶ阻害効果
ＡＨおよびＡＨ２量体を２０−１２００ｎＭの濃度でウイルス粒子産生を測定した（図６、上側：ＡＨ，下側：ＡＨ２量体）。その結果、ＡＨ２量体はＡＨの４〜５倍の阻害活性を示した。
【００５０】
２）薬剤により細胞が感染に抵抗を示すようになった可能性の否定実験
ウイルスを細胞に感染させる前に、ウイルスをＡＨ２量体で１２時間処理し、ＡＨ２量体を除いてからウイルスを細胞に感染させ、２日間３７℃で培養した後に培養液上清のウイルス量を測定した。その結果、薬剤濃度を１２００ｎＭまで上げても、感染性の変化は見られなかった（図７）。つまり、図６に示したＡＨ２量体による阻害は、細胞に由来するものではなく、ＡＨ２量体がウイルスに作用した結果であることが明らかとなった。
【００５１】
３）感染阻害はウイルス粒子の細胞への吸着の段階で起こることを示す実験
感染阻害の起こる時期を調べるために下記の実験を行った。細胞にウイルスを混ぜてすぐに４℃に冷却した後、ＡＨ２量体を加えて１時間処理した（この段階ではウイルス粒子は細胞に吸着するが侵入はしないと考えられている）。その後、薬剤の入っていないＤＭＥＭに置き換えてから３７℃に戻して、２日間培養を続け、培養上清のウイルス量を測定した（図８）。
【００５２】
４℃で処理している過程でＡＨ２量体が存在していても、その後薬剤を除いて３７℃に戻すと阻害は図６と同じように観察された。従って、ＡＨ２量体は、ウイルス粒子が細胞に吸着する段階で阻害効果を示すものと考えられる。
【００５３】
４）ＡＨ２量体による阻害は感染の早い時期に起こることを示す実験
細胞にウイルスを感染させると同時にＡＨ２量体を添加して１時間保温した。その後薬剤の入っていない培地に置き換えて培養を続け、２日後に上清のウイルス量を測定した（図９）。阻害効果は図６に示したのと同様であった。
５）ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨによるＨＣＶの肝細胞への感染阻害実験
ＡＨ前処理により、感染して７２時間後の細胞中ＨＣＶ遺伝子ＲＮＡの顕著な減少が認められた。特にＡＨ２量体（ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨ，ＡＨｐＡＨ）が単量体に比較して約１０倍強い抗ＨＣＶ活性を示すことを見いだした（図１１）。
【００５４】
＜結果のまとめ＞
（１）ＡＨおよびＡＨ２量体はＨＣＶに対して阻害効果を示した。ＡＨ２量体がＡＨに比べ高い阻害活性を示した（図６）。
（２）感染阻害は薬剤の細胞への効果ではなく、ウイルス粒子に働いて引き起こす（図７）。
（３）抗ＨＣＶ効果は感染の初期に働いて抗ウイルス作用を示す。特にウイルス粒子が細胞に接触する過程を阻害すると考えられる（図８、図９）。
（４）本薬剤が抗ＨＣＶ効果を示す最大容量（ＡＨ：１０ｍＭ、ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨ：１．０ｍＭ）での細胞毒性は認められなかった。
（５）ＡＨおよびＡＨ２量体（ＡＨ−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨ  ｄｉｍｅｒ／ＲＴＢ−Ｌ）
のＩＣ５０は、ウイルス量をｍｏｉ約１００として測定した場合、それぞれ３００ｎＭ、６０−７０ｎＭであった。
（６）ウイルス量を実際のウイルス測定試験に用いられる約０．３として測定したＡＨ及びＡＨ２量体（ＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨ）のＩＣ５０は、それぞれ３ｎＭ、０．３−０．５ｎＭであった。（図１１）
【００５５】
＜考察＞
これまでのＡＨ、ＡＨ２量体の生化学的研究並びにＸ線結晶構造解析の結果から、ＡＨは多くのＨＭＴＧを持つ糖タンパク質に対してのみ強い特異的な親和性を示すことが分かっている。従って、上記の結果は、ＨＣＶがその表面に多くのＨＭＴＧを持つことを示すものであり、ＡＨ及びＡＨ２量体は、ＨＣＶ粒子表面に存在するＨＭＴＧに結合することにより抗ＨＣＶ活性を示したものと考えられる。また、上記の結果は、ＨＣＶの表面に存在するＨＭＴＧがＨＣＶの細胞への感染に必須でることを示すものである。そして、上述の作用機序を考慮すれば、当該活性は、ＡＨ及びＡＨ２量体に限らず、２量体以外の多量体や、ＡＨのアミノ酸配列の１又は数個が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドにおいても発現するものと考えられる。また、上述のＨＴＭＧに結合することにより肝細胞への接着・侵入を阻害すると考えられているグリフィシンによる肝細胞への阻害には１０μｇ/ｍｌ（７６９ｎＭ）を必要とするのに対し、ＡＨ２量体のＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨを用いた場合にはそのＩＣ５０値は０．３−０．５ｎＭとなり、グリフィシンと比べてかなり低い値となる。これも上述の作用メカニズムの違いによるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、ＡＨ又はその誘導体を有効成分とするＣ型肝炎の予防・治療薬が提供される。ＡＨ又はその誘導体は、ＨＣＶの細胞への接着を阻止することにより抗ＨＣＶ活性を示すので、新しいタイプのＣ型肝炎予防・治療薬を提供することになる。特に、ＡＨ２量体であるＡＨ−５ｋＰｅｇ−ＡＨは、ＩＣ５０：０．３−０．５ｎＭという強い抗ＨＣＶ活性を有するので、単独での使用による慢性肝炎患者に対する肝臓移植時の使用はもとより、既存の他のＣ型肝炎治療薬、例えば、Ｐｅｇ−ＩＦＮやＲＢＶなどとの併用により治療効果のさらなる増大が見込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号１：アクチノヒビン
配列番号２：リンカー
配列番号３：Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＡＨダイマー／ＲＴＢ−Ｌ
配列番号４〜１２：ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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