(57)【要約】【課題】トリボネクチンおよびトリボネクチンを直接損傷した関節または関節炎の関節に投与することにより行われる摩擦補強の方法を提供すること。【解決手段】本発明のトリボネクチンは、少なくとも１つのＯ結合型潤滑部分を含み、上記部分としては、β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分が挙げられる。また、上記摩擦補強の方法とは、哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、この方法は、関節を、単離された巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子産物と接触させる工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載のトリボネクチンまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願番号第０９／２９８，９７０号（１９９９年４月２３日出願）の一部継続であり、この出願の内容全体は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、哺乳動物関節の潤滑に関する。
【背景技術】
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は、関節疾患の最も一般的な形態の１つである。ＯＡの発症に寄与する因子としては、ＯＡの家族歴、外傷または手術による関節に対する以前の損傷、および関節の年齢（すなわち、関節のアーティキュレイティング（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ）表面の「摩耗および裂傷」）が挙げられる。ＯＡは、老人群において非常に一般的であるが、子供にも同様に発症し得る。
【０００４】
現在の処置は、ＯＡの痛みおよび他の症状を、例えば、鎮痛薬および抗炎症薬物を投与することによって軽減することに指向される。他の治療アプローチは、滑液の粘度を増加させるために、ヒアルロン酸およびその誘導体を投与することによる粘度補充（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、摩擦補充（ｔｒｉｂｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）による変形性関節症および他の変性関節疾患に対する新規な処置を特徴とする。摩擦補充は、損傷した関節または関節炎の関節に潤滑ポリペプチドを直接投与することによって実行される。粘度補充とは異なり、摩擦補充は、それが添加される溶液（例えば、滑液）の粘度を実質的に増加させない。トリボネクチン（ｔｒｉｂｏｎｅｃｔｉｎ）が添加される溶液の粘度は、わずか１０％、好ましくはわずか５％、より好ましくは、わずか２％、より好ましくは、わずか１％しか増加しない。最も好ましくは、トリボネクチンが添加される溶液の粘度は、不変であるか、または減少する。
【０００６】
従って、本発明は、トリボネクチンを提供する。トリボネクチンは、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列の少なくとも１つの反復を含む人工の境界潤滑剤である。トリボネクチンは、少なくとも１つのＯ結合型潤滑部分を含む。好ましくは、その潤滑部分は、β（１−３）Ｇａｌ−Ｇａｌ  ＮＡｃ部分である。天然に存在するトリボネクチンのタンパク質骨格のアミノ酸配列は、ヒト巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子のエキソンの選択的スプライシングに依存して、異なり得る。例えば、トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜２４および２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸２５〜１９９を欠損する。トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１５６および２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸１５７〜１９９を欠損する。トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１０６および２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸１０７〜１９９を欠損する。トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜２５、配列番号１の６７〜１０６および配列番号１の２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸２６〜６６を欠損する。トリボネクチンは、精製された天然に存在するポリペプチドもしくは合成的に作製されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドである。合成もしくは組換えトリボネクチンの骨格のアミノ酸配列は、天然に存在するトリボネクチンのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であり、そして、天然に存在するトリボネクチンの潤滑活性の少なくとも５０％を所有する。
【０００７】
トリボネクチンは、潤滑が所望される、哺乳動物関節または他の組織（例えば、心臓組織）への投与のために処方される。好ましくは、トリボネクチンは、組換えまたは化学的に合成された潤滑ポリペプチドである。例えば、トリボネクチンは、実質的に純粋なポリペプチドを含み、そのアミノ酸配列は、少なくとも１つの反復を含むが、７６未満の反復を含む。各サブユニットは、少なくとも７個のアミノ酸（そして代表的には、１０個以下のアミノ酸）を含む。各サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも５０％同一であり、そして参照配列における非同一アミノ酸は、保存的アミノ酸置換である。例えば、１つもしくは両方のスレオニン残基は、セリン残基に置換される。好ましくは、そのサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号３と同一である。トリボネクチンまた、アミノ酸配列ＸＸＴＴＴＸ（配列番号４）の１つ以上の反復を含む。本明細書中に記載されるポリペプチドまたは他の化合物が、それらが目的の化合物が少なくとも重量で６０％（乾燥重量）である調製物内にある場合、「実質的に純粋」であるといわれる。好ましくは、その調製物は、目的の化合物重量で、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも９０％、および最も好ましくは、少なくとも９９％である。純度は、任意の適切な標準的方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析）によって測定され得る。
【０００８】
特定のポリペプチドまたは核酸分子が、限定された長さの参照ポリペプチドまたは核酸分子と特定の同一性パーセントを有することが言われている場合、その同一性パーセントは、参照ポリペプチドまたは核酸分子に関連している。従って、１００アミノ酸長である参照ポリペプチドと５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸長部分と完全に同一である５０アミノ酸ポリペプチドであり得る。それはまた、その全長にわたって参照ポリペプチドと５０％同一である１００アミノ酸長ポリペプチドであり得る。
【０００９】
所定の参照ポリペプチドまたは核酸分子と「実質的に同一」であるポリペプチドまたは核酸分子は、所定の参照ポリペプチド配列または核酸分子の配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％およびより好ましくは９５％、９８％、９９％以上の同一性を有する配列を有するポリペプチドまたは核酸分子である。「同一性」は、当該分野で認められた意味を有し、そして公開された周知技術（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．，編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，１９９３，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ａｎａｙｌｕｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，１９９４，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｉｎ，Ｅ．Ｇ．，編、Ｅｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  ２０  Ｙｏｒｋ；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，１９９１，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｒｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して算出される。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するための方法は、多数存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知であり、そして所定の特定の方法に関する限定された意味を有する。本明細書中に記載される配列同一性は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ
ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定される。使用されるＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５（２）：１５１−３）である。使用されるパラメータは、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０である。
【００１０】
あるいは、所定の参照配列と異なる核酸は、参照配列を有するＤＮＡ鎖またはその相補鎖と、高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする。高いストリンジェンシー条件は、４２℃において５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーションさせ、６５℃にて２×ＳＳＣで第１の洗浄を行い、そして６５℃にて０．２×ＳＳＣで第２の洗浄を行うことである。
【００１１】
トリボネクチンは、支持表面間の摩擦計数（μ）を減少させるものとして特徴付けられる。例えば、摩擦の減少は、インビトロでラテックス：ガラスベアリングを使用して、摩擦装置における摩擦の減少を検出ことによって測定される。摩擦の減少はまた、インビボで、例えば患者の痛みの減少を測定することによって、測定される。本発明のトリボネクチンは、潤滑組成物である。参照配列と少なくとも５０％（しかし、１００％未満）のアミノ酸配列同一を有するポリペプチドが、支持表面間のμの減少を測定することによって潤滑摩擦について試験される。
【００１２】
トリボネクチンは、Ｏ結合型オリゴサッカリド（例えば、β型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣにおけるＮ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトース）を含む。例えば、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）およびＸＸＴＴＴＸ（配列番号４）反復ドメインは、β型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣ（これは、時折、（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣ−ＮｅｕＡｃの形態においてＮｅｕＡｃでキャップされ得る）によってグリコシル化される。ポリペプチドに関する用語「グリコシル化」は、炭水化物部分がポリペプチド分子の１つ以上の部位に存在することを意味する。例えば、トリボネクチンの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４０％がグリコシル化される。５０％以上までのトリボネクチンが、グリコシル化され得る。グリコシル化パーセントは、重量によって決定される。
【００１３】
トリボネクチンポリペプチドは、ＭＳＦの実質に純粋なフラグメントを含む。例えば、天然に存在するトリボネクチンのアミノ酸配列を有する実質的に純粋なトリボネクチンの分子量は、２２０〜２８０ｋＤａの範囲内にである。好ましくは、トリボネクチンの見かけの分子量は、２３０ｋＤａ未満、より好ましくは２５０ｋＤａ未満、そして最も好ましくは２８０ｋＤａ未満である。タンパク質またはポリペプチドフラグメントは、天然に存在するタンパク質またはそれから誘導されるポリペプチド（例えば、ＭＳＦ）のアミノ酸配列の一部（全てではない）と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして定義される。トリボネクチンは、ポリペプチドを含み得、そのアミノ酸配列は、配列番号１の残基２００〜１１４０（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であり、例えば、それは配列番号１の残基２００〜１１４０（包括的）のアミノ酸配列を含む。別の例において、このポリペプチドは、配列番号１の残基２００〜１１６７（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号１の残基２００〜１１６７（包括的）と同一であるアミノ酸配列を有する。このポリペプチドは、配列番号１の残基２００〜１２１２（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１の残基２００〜１２１２（包括的）と同一であるアミノ酸配列）を含むか、またはこのポリペプチドは、配列番号１の残基２００〜１２６３（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１の残基２００〜１２６３（包括的）と同一であるアミノ酸配列）を含む。好ましくは、ポリペプチドの配列は、配列番号１の残基１〜２４（包括的）のアミノ酸配列および／または配列番号１の残基６７〜１０４（包括的）のアミノ酸配列を欠損する。
【００１４】
本発明はまた、トリボネクチンをコードする単離された核酸分子を特徴とする。例えば、その核酸は、配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）と少なくとも５０％同一である配列を含む。好ましくは、その核酸は、配列番号１の残基２００〜１１４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。例えば、その核酸は、配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）の配列と同一であるヌクレオチド配列またはその縮重改変体を有する。単離された核酸分子は、５’および３’コード配列または生物体の天然に存在するゲノムにおいてすぐ隣に隣接するコード配列を伴う非コード配列から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に存在しない核酸分子（例えば、組換えＤＮＡ技術によって作製された核酸分子）を含む。例えば、本発明の核酸は、配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）を含むが、天然に存在するゲノム配列において、それらの配列のすぐ隣に隣接するヌクレオチドまたは天然に存在するｃＤＮＡを含まない。
【００１５】
また、関節を、精製されたＭＳＦまたはトリボネクチンと接触させることによって、哺乳動物関節を潤滑させる（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）方法は、本発明の範囲内である。その哺乳動物は、好ましくは、ヒト、ウマ、イヌ、ウシ、ロバ、マウス、ラット、モルモット、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、サル、またはネコであり、そして関節は、アーティキュレイティング（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ）関節（例えば、膝、肘、肩関節、股関節部または任意の他の体重負荷関節）である。トリボネクチンは、関節内に投与される。治療的関節潤滑はまた、遺伝子治療（例えば、関節または滑液をトリボネクチンをコードする核酸と接触させること）によって実施され得る。例えば、核酸は、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）注射によって滑液腔に投与される。
【００１６】
哺乳動物関節における境界潤滑剤として機能することに加えて、トリボネクチンは、哺乳動物軟部組織間（例えば、皮膚もしくは内臓）または哺乳動物組織と医療デバイス（例えば、人工器官移植片）との間に、境界潤滑剤として使用される。従って、本発明は、組織癒着形成を阻害するために適切な形態で、トリボネクチンを含む生物学的適合性組成物を包含する。例えば、トリボネクチンは、フィルム、膜、泡沫、ゲルまたは繊維の形態である。本明細書中で使用される場合、用語「フィルム」は、薄い膜に泡沫またはゲルを押しつけることによって、例えば、鋳型に注ぎ込み、そして薄い膜に風乾することによってか、またはゲルもしくは繊維を押しつけることによってか、あるいはゲルまたは繊維を脱水させるか、もしくは脱水を引き起こすことによって形成される物質を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「泡沫」は、例えば、トリボネクチン溶液、懸濁物、ゲルまたは繊維内に空気のように導入することによって形成される多孔性構造を有する物質を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的適合性」とは、移植後の身体において、身体から除去されるか、または代謝される非毒性産物に分解する組織適合性材料の能力をいう。本明細書中で用語として使用される場合、「生物学的適合性」物質は、生物学的機能に対して医学的に受容不可能である毒性か、または傷害性の効果をもたない物質である。癒着を予防するためのトリボネクチン組成物がまた、例えば、組織が癒着を伴わずに増殖し得る型わくを形成するように、押出し（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）のために適切な組成物として処方される。
【００１７】
哺乳動物における第一表面と第二表面との間の接着形成を阻害する方法は、哺乳動物における表面の接着を防ぐのに十分な量で第一表面と第二表面との間にトリボネクチンを配置することによって実行される。例えば、表面の一方または両方が哺乳動物組織であり、そしてそれらの間に配置されたトリボネクチンが、治癒プロセスの間の接着の形成を妨げる。あるいは、第一表面または第二表面（あるは、その両方）は、整形外科移植物のような人工的なデバイスである。処置されるべき組織は、外科手術切開または外傷により損傷された組織を含む。
【００１８】
生物学的サンプルを哺乳動物から得て、生物学的サンプル中のＭＳＦフラグメントの量を測定することによって、変形性関節症またはそれに対する素因を診断するための方法もまた本発明の範囲内である。コントロール（例えば、変形性関節症を有しないことが既知の哺乳動物由来の生物学的サンプルまたはネイティブの診断に関連する所定の値）と比較した量の増加は、哺乳動物が変形性関節症を罹患するかまたは変形性関節症の発症にかかりやすくあることを示す。任意の生物学的サンプルが、この診断方法で試験するのに適する；典型的には、生物学的サンプルは、滑液、血液、血清または尿である。好ましくは、ＭＳＦフラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。あるいは、ＭＳＦフラグメントは、ＥＰＡＰＴＴのアミノ酸配列（配列番号５；トリボネクチンのトリプシン切断の産物）またはＰＴＴＫＥＰのアミノ酸配列（配列番号６；トリボネクチンのエラスターゼ切断の産物）を含む。
【００１９】
本発明の特徴および利点は、本発明の好ましい実施形態の以下の記載および特許請求の範囲から明らかである。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）  少なくとも１つのＯ結合型潤滑部分を含むトリボネクチン。
（項目２）  前記部分がβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分である、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目３）  項目１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜２４および２００〜１４０４を含み、配列番号１のアミノ酸２５〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
（項目４）  項目１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１５６および２００〜１４０４を含み、配列番号１のアミノ酸１５７〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
（項目５）  項目１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１０６および２００〜１４０４を含み、配列番号１のアミノ酸１０７〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
（項目６）  項目１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンが、配列番号１のアミノ酸１〜２５、６７〜１０６および２００〜１４０４を含み、配列番号１のアミノ酸２６〜６６を欠失する、トリボネクチン。
（項目７）  ポリペプチドを含むトリボネクチンであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのサブユニットを含むが７６個より少なく、ここで、
（ａ）各サブユニットが少なくとも７個のアミノ酸を含み；そして
（ｂ）該サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３に対して少なくとも５０％同一であり、ここで非同一アミノ酸が保存的アミノ酸置換である、
トリボネクチン。
（項目８）  前記サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３である、項目７に記載のトリボネクチン。
（項目９）  配列番号４のアミノ酸配列の１つ以上の繰り返しをさらに含む、項目７に記載のトリボネクチン。
（項目１０）  支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１１）  インビトロで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１２）  インビボで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１３）  前記トリボネクチンが添加される溶液の粘度を実質的に増大しない、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１４）  Ｏ結合型オリゴ糖を含む、項目７に記載のトリボネクチン。
（項目１５）  前記オリゴ糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミン−ガラクトースである、項目１４に記載のトリボネクチン。
（項目１６）  前記トリボネクチンの少なくとも１０％がグリコシル化される、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１７）  前記トリボネクチンの少なくとも４０％がグリコシル化される、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１８）  前記トリボネクチンの分子量が、２００〜２８０ｋＤａの範囲である、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目１９）  前記ポリペプチドが、巨核球刺激因子のフラグメントを含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２０）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１１４０の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２１）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１１４０のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２２）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１１６７の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２３）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１１６７のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２４）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１２１２の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２５）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１２１２のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２６）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１２６３の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２７）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜１２６３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２８）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基１〜２４のアミノ酸配列を欠失する、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目２９）  前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基６７〜１０４のアミノ酸配列を欠失する、項目１に記載のトリボネクチン。
（項目３０）  トリボネクチンをコードする、単離された核酸分子。
（項目３１）  前記核酸が、配列番号２に含まれるヌクレオチド６３１〜３４５３の配列を含む、項目３０に記載の核酸。
（項目３２）  哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を、単離されたＭＳＦ遺伝子産物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３３）  哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を、項目１に記載のトリボネクチンと接触させる工程を包含する、方法。
（項目３４）  ヒトのアーティキュレイティング関節である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  イヌのアーティキュレイティング関節である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）  ウマのアーティキュレイティング関節である、項目３３に記載の方法。
（項目３７）  前記トリボネクチンが、関節内に投与される、項目３３に記載の方法。
（項目３８）  哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を項目３０に記載の核酸と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３９）  哺乳動物における、屈指−関節症−心膜炎症候群を予防するかまたは処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物にトリボネクチンを投与する工程を包含する、方法。
（項目４０）  トリボネクチンを含む生物学的適合性組成物であって、該組成物は、組織接着形成の阻害に適切な形態である、組成物。
（項目４１）  前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維である、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）  哺乳動物において第１表面と第２表面との間の接着形成を阻害する方法であって、該方法は、該哺乳動物における該表面の接着を阻害するのに十分な量で該第１表面および該第２表面との間にトリボネクチンを配置する工程を包含する、方法。
（項目４３）  前記第１表面および前記第２表面が、共に前記哺乳動物の損傷した組織である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）  前記第１表面または前記第２表面が、人工デバイスである、項目４２に記載の方法。
（項目４５）  前記人工デバイスが整形外科用移植片である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維の形態である、項目４２に記載の方法。
（項目４７）  前記損傷が外科的切開に起因する、項目４２に記載の方法。
（項目４８）  前記損傷が外傷に起因する、項目４２に記載の方法。
（項目４９）  前記第１表面または前記第２表面が心膜組織である、項目４２に記載の方法。
（項目５０）  哺乳動物において、変形性関節症またはそれに対する素因を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物に由来する生物学的サンプルにおいて、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）またはそのフラグメント量を測定する工程を包含し、ここでコントロールと比較された該量における増大は、該哺乳動物が変形性関節症を罹患するか、または変形性関節症を発症しやすいかを示す、方法。
（項目５１）  前記生物学的サンプルが滑液、血液、血清、尿である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）  前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５３）  前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５４）  前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目５０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＭＳＦおよびヒトトリボネクチンのアミノ酸配列の配列の整列の図である。ＭＳＦエキソン７、８、および９を、それらの全体で示す；エキソン６は、その長さ（９４０アミノ酸）のため省略する。エキソン６は、Ｏ−グリコシル化の部位として機能する縮重配列ＫＥＰＡＰＰＴ（配列番号３）の合計７６反復を含む。配列決定されたトリプシンフラグメントのＣ末端リジン／アルギニン残基に影をつけている。エキソン６−特異的フォワードプライマーおよびエキソン６−特異的リバースプライマーに対応するアミノ酸２１４〜２２２および３００〜３０９に影がつけられ、そして下線が引かれる。アミノ酸配列座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）は、配列番号１のアミノ酸を示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂは、それぞれヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によるトリボネクチン発現の表現型アイソフォームの図である。図２Ａは、ＭＳＦエキソンがトリボネクチンアイソフォームで発現されたことを図で示す。図２Ｂは、滑膜線維芽細胞エキソン２、４、および５と比較した関節軟骨細胞におけるエキソン発現が、オルタナティブスプライシングされ、アイソフォーム発現を生じることを図で示す。
【図３】図３は、トリボネクチンアイソフォームＶ１、Ｖ２、およびＶ３の境界のオルタナティブスプライシングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
多くの天然トリボネクチンアイソフォームが同定され、単離された。例えば、ヒト潤滑ポリペプチドは、滑液から精製され、ＭＳＦ遺伝子のエキソン２および４〜１２（エキソン１または３でない）によってコードされるアミノ酸を含むことが見出された。天然の全長ＭＳＦをコードする遺伝子は、１２エキソンを含み、そして天然のＭＳＦ遺伝子産物は、ヘモペキシン様領域およびソマトメジン様領域を含むビトロネクチンに対して複数のポリペプチド配列相同性を有する１４０４アミノ酸を含む。中心に位置するエキソン６は、９４０残基を含む。エキソン６は、Ｏ−グリコシル化ムチンドメインをコードする。配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３によってコードされるポリペプチドは、関節軟骨細胞の境界潤滑を提供する。
【００２２】
【表１−１】
2014144015.tif 000002
【表１−２】
2014144015.tif 000003
【表１−３】
2014144015.tif 000004
滑液から単離される境界潤滑物は、オルタナティブスプライシングされたＭＳＦの改変体である。このオルタナティブスプライシングされた改変体は、関節に潤滑能力を与える滑液に存在する組成物において見出された。ヒト滑液から単離される境界潤滑物は、ＭＳＦ遺伝子のエキソン２、および４〜１２によってコードされるアミノ酸を含む（すなわち、オルタナティブスプライシング改変体がＭＳＦ遺伝子のエキソン１および３によってコードされるアミノ酸を欠く）。ＭＳＦの少なくともエキソン６を含む組換え的にまたは化学的に産生されたポリペプチド（エキソン１も３もない）は、変形性関節症疾患を妨げる、そして／または処置するのに有用である。同一または保存的置換を有するのいずれかでアミノ酸配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の少なくとも１つの反復を含む組換え的または化学的に産生された潤滑ポリペプチドはまた、哺乳動物の関節を潤滑させるために投与される。
【００２３】
（組換え潤滑ポリペプチドの産生および精製）
組換えポリペプチドを産生するために、適切な発現ベクター中のＭＳＦのエキソン６（配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３）を含むＤＮＡが細胞にトランスフェクトされる。ＤＮＡはまた、ＭＳＦ遺伝子のエキソン７（配列番号２のヌクレオチド３５４〜３５３４）、エキソン８（配列番号２のヌクレオチド３５３５〜３６７０）、またはエキソン９（配列番号２のヌクレオチド３６７１〜３８２２）のいくつかまたはすべてを含み得る。ＭＳＦの種々のエキソンにわたるＤＮＡを生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法のためのプライマーが、以下に示される。他のアイソフォームは、発現されることが求められるアミノ酸配列をコードするＭＳＦのエキソンに対応する核酸をクローニングすることによって発現される。
【００２４】
【表２】
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種々の長さのトリボネクチンポリペプチドをコードし、そして例えば、エキソン２、４〜１２；エキソン６〜９；およびエキソン２、４〜９によってコードされるポリペプチドを作製するために、ＭＳＦ遺伝子の種々のエキソンを組み込むＤＮＡを作製するために使用されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計する方法は、分子生物学の分野で周知である。単離された核酸を用いて細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、分子生物学の当業者に周知である。例えば、培養物中の原核生物細胞または真核生物細胞は、細胞中で高レベル発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される本発明のＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。このような細胞は、多量の潤滑ポリペプチドを産生するのに有用であり、これは、標準的な方法を使用して精製される。潤滑ポリペプチドは、関節炎疾患の処置または予防のために治療的に使用される。ポリペプチドはまた、天然または組換え的に産生される潤滑糖タンパク質またはグリコペプチドに対する抗体を産生するために使用される。
【００２５】
例えば、組換え遺伝子産物は、融合タンパク質として発現され、市販の発現および精製システム（例えば、ｐＦＬＡＧ発現システム（ＩＢＩ））を使用して精製される。本発明の目的のために使用され得る発現システムには、本明細書中に記載される核酸分子を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターを用いて形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物が挙げられるが、これには限定されない。グリコシル化ポリペプチドの産生のために、真核生物発現系が使用さ得る。トリボネクチンポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換される酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａ）が使用される。トリボネクチンをコードする核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染される昆虫細胞系、および哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）からまたは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から誘導されるプロモーターを含む組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＥＯ、ＢＥＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞）もまた有用である。臨床的用途に加えて、組換えポリペプチドは、以下に記載されるような抗体を産生するためにウサギまたはゲッ歯動物に注射される。
【００２６】
炎症を起こしたまたは損傷した関節の滑液は、潤滑タンパク質またはポリペプチドを分解するタンパク質分解酵素を含む。例えば、好中球のような浸潤免疫細胞は、トリプシンおよび／またはエラスターゼを分泌する。関節に対する小さな損傷または炎症状態は、細胞性浸潤および外傷性滑膜炎を生じるタンパク質分解酵素分泌を生じ得る。数日または数週間の滑膜炎は、関節の細胞保護層の損失を生じ得、これは、次いで、軟骨の損失に導く。潤滑されていない軟骨の支持面（ｂｅａｒｉｎｇ）は、変形性関節症を開始し得る早発磨耗（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｗｅａｒ）を経験し得る。外傷性滲出（例えば、「膝関節水腫」）で臨床的に診察を受ける個人は、変形性関節症を発症しやすくあり；タンパク質分解酵素の生成が滑液中の天然に存在する潤滑組成物を分解し、消耗する。天然の潤滑組成物の消耗は、慢性関節リウマチのような他の炎症性関節疾患を生じる。本発明の潤滑組成物を用いたこのような損傷関節の滑液の置換または補充は、長期（例えば、数年、数十年後さえ）の変形性関節症の発症を防ぎ、すぐに関節を潤滑し、短期の損傷を最小化する。
インビボでの分解を受けにくい潤滑ペプチドのアナログ、ホモログまたは模倣物を使用して、哺乳動物の関節を潤滑させる。アナログは、アミノ酸配列、配列に影響を及ぼさない改変、またはその両方が、天然に存在するペプチドと異なり得る。改変（通常は主要配列を改変しない）としては、ポリペプチドのインビボもしくはインビトロの化学的誘導体化（例えば、アセチル化もしくはカルボキシル化）が挙げられる。グリコシル化の改変（例えば、その合成およびプロセシングの間に、またはさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変すること、例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことにより作製される改変）もまた、挙げられる。
【００２７】
被験体に注射した後のペプチドのタンパク質分解が問題である場合に、特に感受性のペプチド結合を非切断性のペプチド模倣結合と置換することは、得られるペプチドをより安定にし、従って治療剤としてより有用にする。治療ペプチドをペプチダーゼ（例えば、トリプシンまたはエラスターゼ（ｅｌａｓｔｉｓｅ））により分解されにくくするために、ペプチドのペプチド結合を、別の型の共有結合で置換し得る（「ペプチド模倣物」）。トリプシン、エラスターゼ、および他の酵素は、関節炎症の間に免疫細胞が浸潤することにより合成され得る。トリプシンは、リジンおよびアルギニンのカルボキシ末端側でポリペプチド結合を切断し；エラスターゼは、アラニン、グリシンのカルボキシ末端側で切断する。トロンビン（出血性関節において存在するセリンプロテアーゼである）は、アルギニンのカルボキシ末端側でペプチド結合を切断する。コラゲナーゼは、滑液代謝が変化した場合に（例えば、傷害の間に）線維芽細胞および軟骨細胞により生成される酵素のファミリーである。これらの酵素は、グリシンおよびプロリンのカルボキシ末端側で切断する。１つ以上のペプチダーゼ感受性ペプチド結合（例えば、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）反復配列に現れる結合）を改変して（例えば、非ペプチド結合と置換して）、部位を切断しにくくし、従って、治療処方物の臨床的半減期を増大させる。
【００２８】
このような模倣物およびポリペプチドにこれらの模倣物を組み込む方法は、当該分野で周知である。同様に、Ｌ−アミノ酸残基をＤ−アミノ酸で置換することは、ポリペプチドをタンパク質分解されにくくする標準的方法である。アミノ末端ブロック基もまた有用である。このブロック基としては、以下が挙げられる：ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テニル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）、アジピル（ａｄｉｐｙｌ）、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼレイル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４−ジニトロフェニル。
【００２９】
トリボネクチン（ｔｒｉｂｏｎｅｃｔｉｎ）の臨床的処方物はまた、ペプチダーゼインヒビターを含み得る。このペプチダーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌクロロメチルケトン（エラスターゼのインヒビター）。他の臨床的に受容可能なプロテアーゼインヒビター（例えば、Ｂｅｒｌｉｎｇら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ  ２４：９−１７）、例えば、ロイペプチン、アプロチニン、α１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、α１−プロテアーゼインヒビター、アンチキモトリプシン（ＡＣＨＹ）、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（ＰＳＴＩ）はまた、トリボネクチンとともに同時投与されて、プロテアーゼ分解切断を減少し、かつ臨床的半減期を増大させる。２つ以上のプロテアーゼインヒビターのカクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）もまた、同時投与され得る。
【００３０】
トリボネクチンポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸の組成物は、当該分野で公知の標準的な生理学的に適合性の賦形剤中に処方される（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））。他の処方物およびこのような処方物を作製するための方法は周知であり、かつ「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に見いだされ得る。トリボネクチンはまた、非架橋ヒアルロン酸調製物または粘性補充（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）組成物とともに処方される（例えば、架橋ヒアルロン酸調製物）。トリボネクチンを粘性補充処方物に添加する場合、トリボネクチンとヒアルロン酸との相互作用は、粘性補充物質の粘性を減少させる。
【００３１】
糖ペプチドを作製し、そしてグリコシル化％を決定する方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，７６７，２５４号に記載）。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は、Ｏ結合型オリゴサッカリド（すなわちＳｅｒ／Ｔｈｒ結合型オリゴサッカリド）の存在を示す。Ｏ結合型オリゴサッカリドにおいて、ＧａｌＮＡｃは、アミノ酸に対して直のＯ−グリコシドα結合において共通して見いだされる。Ｏ結合型オリゴサッカリドの存在はまた、Ｊａｃａｌｉｎ−セファロース（糖タンパク質におけるＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したコアのジサッカリド配列Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃに結合する固定化植物レクチン、すなわちβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃに結合するピーナッツ凝集素）に結合することにより検出される。Ｏ結合型オリゴサッカリドは、標準的な方法を用いて、Ｎ結合型オリゴサッカリドとは区別される。例えば、Ｏグリコシド結合であって、Ｎ結合型グリコシル結合でないオリゴサッカリドは、ホウ素化水素ナトリウムの存在下（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＢＨ4、４５℃で１６時間）で穏和な塩基を用いた処理によりペプチドから遊離しやく、β脱離反応を引き起こす。
【００３２】
（獣医学的適用）
イヌ変形性関節症は、本明細書中で記載される方法を使用して処置される有力な臨床的障害である。５匹の成体イヌに対して推定１匹が変形性関節症に罹っており；推定８００万匹のイヌがこの変性（潜在的に衰弱性疾患）に苦しんでいる。しかし、多くの飼い主は、慢性的なイヌの疼痛の兆候を認識していない。どのイヌも変形性関節症を発症し得るが、危険性が最も高いイヌは、多産（ｌａｒｇｅ  ｂｒｅｅｄ）の老齢化したイヌ、非常に活動的なイヌ（例えば、労働犬または競技用犬）、および臀部または肘形成異常のような遺伝した関節異常を有するイヌである。
【００３３】
ウマ変形性関節疾患（例えば、変形性関節症）は、ウマの不具および作業の減少の原因である。ヒトおよび他の動物でも同様に、ウマに罹る変性性関節疾患は、関節性軟骨変性および関節滲出により特徴づけられる滑膜性の連結の進行性障害である。急性または慢性の外傷、酷使、発達疾患、関節不安定性および老齢は滑膜炎、軟骨代謝の欠陥、および関節軟骨における亀裂の形成を導く。トリプシン、エラスターゼ、ストロメライシンおよびヒアルロニダーゼのような破壊酵素は、関節に放出され、関節では、それらは滑液および軟骨成分を分解し、結果として滑液粘性の減少、貧弱な潤滑性、軟骨代謝の衰え、ならびに疼痛および軟骨衰退を生じる摩擦の増大を生じる。現在の治療アプローチとしては、疼痛除去および抗炎症薬物のための医薬が挙げられる。本明細書中に記載される組成物および方法は、罹患した関節の潤滑能力を補充するために有用である。
【００３４】
（治療的ポリペプチドの適用）
ペプチドの送達について標準的な方法が使用される。このような方法は、当業者に周知である。関節内投与について、トリボネクチンは、１回の注射につき約０．１〜２ｍｌの容量で２０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で滑膜腔（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃａｖｉｔｙ）に送達される。例えば、２５０μｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌのトリボネクチンは、細い（例えば、１４〜２２ゲージ、好ましくは、１８〜２２ゲージ）針を用いて膝関節に注射される。本発明の組成物はまた、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、および腹膜内）のために有用である。
【００３５】
手術癒着を予防するために、本明細書中に記載のトリボネクチンを、ゲル、泡（ｆｏａｍ）、繊維、または織物（ｆａｂｒｉｃ）の形態で投与する。このように処方されたトリボネクチンは、並んでいる表面の間での癒着形成を予防するために、損傷したか、または曝された組織境界の上および組織境界の間に配置される。有効であるためには、ゲルまたはフィルムは、適所に留まっていなければならず、そしてゲルが最終的に分散し、そして組織が接触する場合に、もはや癒着の傾向がないように、十分長期間にわたり、組織接触を妨げなければならない。癒着形成を阻害または予防するために処方されたトリボネクチン（例えば、メンブレン、織物、泡沫、またはゲルの形態で）は、ラット盲腸接着モデル（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９１〜２０４頁、１９９３）において手術後癒着の予防について評価される。組成物を、外科的に磨り減らした（ａｂｒａｄｅｄ）ラット盲腸周辺に配置し、そして未処理コントロールと比較する（盲腸を磨り減らしたが、いずれの処置も受けなかった動物）。トリボネクチン処方物の存在下でのラットモデルにおける癒着形成の量の減少は、処方物非存在下での量と比較すると、この処方物が、組織癒着形成を減少するに臨床的に有効であることを示す。
【００３６】
トリボネクチンはまた、哺乳動物への移植の前に、人工四肢および関節をコーティングするために使用される。例えば、このようなデバイスは、トリボネクチンの溶液に浸漬、すなわち槽に入れられる（例えば、米国特許第５，７０９，０２０号および同第５，７０２，４５６号に記載）。
【００３７】
潤滑性ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸（少なくとも１つのＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）または少なくとも１つのＸＸＴＴＴＸ（配列番号４）反復を含む）であり、通常、長さが約２０の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも４０の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０の連続するアミノ酸、および最も好ましくは、少なくとも約６０〜８０の連続するアミノ酸である。例えば、このポリペプチドは、長さが約５００アミノ酸であり、そして７６反復のＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）を含む。このポリペプチドは、長さが１４０４残基未満であり、例えば、天然に存在するＭＳＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するが、少なくとも５、１０、１５、２０、または２４アミノ酸の天然に存在するＭＳＦを欠如する。このようなペプチドは当業者に公知の方法により作製され、このような方法としては、以下が挙げられる：組換えＭＳＦタンパク質のタンパク質分解、デノボ合成、または遺伝子操作（例えば、ＭＳＦ遺伝子のクローニングおよび少なくともエキソン６、７、８、および／または９の発現）。
【００３８】
トリボネクチンポリペプチドはまた、生化学的に精製される。酵素、キモトリプシンは、ＭＳＦ遺伝子のエキソン６によりコードされるアミノ酸をひとまとめにした部位で切断する。従って、ＭＳＦ遺伝子のエキソン（しかし、他のどのＭＳＦエキソンでもない）によりコードされるアミノ酸を含むポリペプチドは、キモトリプシンでの酵素消化により、天然に存在するか、または組換え生成されたＭＳＦ遺伝子産物から調製される。次いで、このポリペプチドを標準的な生化学的精製方法に供して、治療的投与、潤滑性活性の評価または抗体生成に適した実質的に純粋なポリペプチドを得る。
【００３９】
治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水）中で投与される。キャリアは、投与様式および経路ならびに標準的薬学的実施に基づいて選択される。治療組成物（例えば、潤滑性ポリペプチド）の治療的に有効な量は、処置した動物において医学的に所望される結果（例えば、哺乳動物関節の境界の潤滑）を生じ得る量である。医学的に所望される結果は、疼痛の減少（例えば、Ｐｅｙｒｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（補遺．３９）：１０−１５に記載の可視的類似疼痛スケール（ｖｉｓｕａｌ  ａｎａｌｏｇ  ｐａｉｎ  ｓｃａｌｅ）を用いて測定される）または関節を動かす能力の増大（例えば、Ｂｅｌｃｈｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ  １１：１０６−１０９に記載のようにペドメトリ（ｐｅｄｏｍｅｔｒｙ）を用いて測定される）である。処置後に滑液の潤滑性を測定する別の方法は、罹患した関節から少量の滑液を再吸引し、そして本明細書中に記載の摩擦装置を用いてインビトロで潤滑特性を試験することである。
【００４０】
医学分野で周知のように、任意の１匹の動物についての投薬量は、多くの因子に依存する。これらの因子としては、以下が挙げられる：動物のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物。一般に、損傷した関節または炎症を起こした関節に局所的に投与が行われる。あるいは、このポリペプチドは、損傷した関節または炎症を起こした関節の部位でゆっくりと放出させるために、関節のすぐ近くに配置された時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）インプラントを介して投与される。
【００４１】
（遺伝子治療）
遺伝子治療は、治療的潤滑性ペプチドをコードする哺乳動物核酸（例えば、アミノ酸配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の１回以上の反復をコードするＤＮＡまたはＭＳＦの潤滑性フラグメントをコードするＤＮＡ）を、標準的ベクターおよび／または遺伝子送達系により投与することで行われる。適切な遺伝子送達系としては、以下が挙げられる：リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）。
【００４２】
上記のように遺伝子送達系に加えて、治療組成物は、動物への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水のような生物学的に適合性のビヒクル）を含み得る。治療的に有効な量の核酸またはポリペプチド組成物は、処置される動物において医学的に所望される結果（例えば、関節の動きと関連した疼痛の減少、滑液の潤滑機能の増大）を生じ得る量である。
【００４３】
非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋内、および腹腔内送達経路）は、化合物を送達するために使用され得る。好ましくは、治療組成物（例えば、核酸またはポリペプチド）は、関節内に送達される。任意の１患者のための用量は、多くの因子（患者のサイズ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路に依存し、一般的な健康、および同時に投与される他の薬剤（例えば、抗炎症薬剤、粘性治療薬剤（ｖｉｓｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ））に依存する。核酸の投与の好ましい用量は、約１０６〜１０２２コピーの核酸分子である。
【００４４】
ＤＮＡは、標準ベクター（例えば、プロモーター配列に作動可能に連結されたトリボネクチンをコードするＤＮＡを含むベクター）によって患者の標的細胞に導入される。適切な遺伝子送達系としては、リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター（特にヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルス）が挙げられる。
【００４５】
ＤＮＡは、標準方法を使用するアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス送達系を使用して局所的に投与され得る。例えば、ＤＮＡを関節内の滑液に送達する方法およびＤＮＡを滑液由来の細胞（例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨細胞）に送達する方法は、米国特許第５，８５８，３５５号に記載される。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの複製およびパッケージングに必要とされるシス作用配列のみが、ＡＡＶ末端反復である。４ｋｂまでのＤＮＡが、ウイルス複製にもパッケージングにも影響しないで末端反復の間に挿入される。組換えＡＡＶベクターをパッケージングするために、末端反復を含むプラスミドおよび治療的ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびカプシドタンパク質を発現するプラスミドと共に、細胞に同時トランスフェクトされる。次いで、トランスフェクトされた細胞は、アデノ随伴ウイルスで感染され、そして所望の配列を含む組換えＡＡＶウイルスは、トランスフェクション後、約４８〜７２時間の細胞から単離される。次いで組換えウイルスは、公知の方法を使用して遺伝子治療適用のために投与される。
【００４６】
エレクトロポレーションは、標的細胞（例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨細胞）に、エキソビボでＤＮＡを導入する別の方法である。エレクトロポレーションされる細胞は、Ｈｅｐｅｓ緩衝液生理食塩水（ＥＢＳ）に、約１０7細胞／ｍｌの濃度で置かれる。エ
レクトロポレーションされるＤＮＡは、約５〜２０μｇ／ｍｌのＨＢＳの濃度で添加される。混合物はエレクトロポレーションデバイスに配置され、そして電場が標準プロトコール（例えば、約２５０と３００ボルトの間の範囲で）に従って適用される。エキソビボでの滑膜細胞へのＤＮＡの導入後、遺伝的に改変された自己滑膜細胞が、関節内注射によってドナーに移植される。約１０7細胞が、約１ｍｌの量で関節に関節内で注射される。
【００４７】
ＤＮＡが導入された滑膜細胞は、従来の方法（例えば、関節鏡を通じて）を使用して得ら得る。関節鏡は、滑膜細胞を関節鏡検査で回収するために外科的な機器への接近をアクセスを可能にする小さな刺創を介して膝に挿入された小さく、窪んだ杆体である。いくつかの場合において、関節鏡的に切除された組織における滑膜細胞は、結合組織マトリックスの酵素学的消化によって無菌的に回収される。例えば、滑膜は、約１ｍｍの直径の小片にカットされ、そして順次、トリプシン（Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中０．２％ｗ／ｖ）で、３７℃で３０分間、そしてコラゲナーゼ（Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中０．２％ｗ／ｖ）で、３７℃で２時間、消化される。遺伝的に改変された細胞の懸濁液は、レシピエント哺乳動物関節に注射される。この型の関節内注射は慣習的であり、かつ、さらなる外科的処置を用いないで医務室で行われる。必要な場合、繰り返しの注射が行われる。
【００４８】
あるいは、ＤＮＡ（裸またはウイルス内にパッケージングされた）は、適切な薬学的キャリア内に処方され、そして関節内に注射される。遺伝子治療はまた、変形性関節症を高度に発達させ易いと決定された個人（例えば、急性関節障害に罹患した個人）において変形性関節症の発達を防ぐために予防的な手段として投与され得る。治療的ポリペプチドをコードするＤＮＡの、関節への直接の関節内注射は、ＤＮＡの発現を可能にするためのレシピエントの滑膜細胞のトランスフェクションを生じる。
【００４９】
内因性トリボネクチンプロモーターを刺激する薬剤（例えば、ＴＧＦ−β）はまた、滑液の発現のレベルを増加するために上記のように投与され得る。
【００５０】
（滑液潤滑ポリペプチドに特異的な抗体の産生）
潤滑ポリペプチドに特異的な抗体は、当該分野で周知の技術によって得られる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。例えば、ポリクローナル抗体は、Ｇｈｏｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第９３巻，３２６−３２７，１９８３に記載される方法によって得られ得る。例えば、配列番号２のヌクレオチド６３２−３４５３によってコードされる潤滑ポリペプチドは、ウサギの抗血清においてポリクローナル抗体の産生を刺激するための免疫源として使用される。類似の方法が、動物（例えば、ヤギ、ヒツジおよびげっ歯類）において抗血清を惹起するために使用され得る。
【００５１】
モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７，１９７５に記載されるか、またはＧｅｒｈａｒｄ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０，第３７０−３７１頁によって変更された周知のプロセスによって得られる。ハイブリドーマは、抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。この抗体は、滑液潤滑ポリペプチドに高度に特異的である。好ましくは、抗体は、少なくとも約１０8リットル／モ
ルの親和性、そしてより好ましくは、少なくとも約１０9リットル／モルの親和性を有す
る。ポリクローナル抗体のモノクローナルは、大量の組換え潤滑ポリペプチドを急速に精製する手段を提供する。
【００５２】
トリボネクチンのペプチドコアを配向する抗体に加えて、トリボネクチンの糖部分または糖ペプチド複合体を配向する抗体が好ましい。ペプチドコアに対する抗体を産生するために、配列番号１のアミノ酸２００〜３５０に渡るペプチドが使用される。配列番号１のアミノ酸２００〜３５０の８〜１５アミノ酸部分に同一である、より短いペプチド（例えば、８〜１５アミノ酸長）はまた、このような抗体を産生するために使用され得る。トリボネクチンのペプチドコアに特異的な抗体についての免疫源として使用される他のペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸２４〜６６、配列番号１のアミノ酸１０５〜１５５、配列番号１のアミノ酸１５６〜１９９の領域におけるペプチドが挙げられる。グリコシル化されたトリボネクチンポリペプチドに結合する抗体を産生するために（しかしグリコシル化形態でも非グリコシル化形態でもない）、免疫源は好ましくは、糖ペプチド、トリボネクチンの高度にグリコシル化された部分に渡るアミノ酸配列（例えば、配列番号１の残基２００〜１１４０のアミノ酸配列を有するペプチド）である。その同じ高度にグリコシル化された領域内の、より短い糖ペプチド（例えば、８〜１５のアミノ酸長）はまた、免疫源として使用される。高度にグリコシル化された生体分子に対する抗体を産生する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９８０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１−３７６に記載される）。
【００５３】
（診断の方法）
変形性関節症は、ゆっくりと発達し、かつ関節痛がしばしば個人に医学処置を求めさせる、その後期段階まで診断が困難な疾患である。変形性関節症の初期診断、またはこの疾患を発達する素因の診断は、初期の介入が、進行した変形性関節症の発達を防ぐか、または減少すること可能にする。本発明は、この疾患またはそれを発達させる素因の初期の検出方法を提供する。この方法は、体液（例えば、血清または尿）を天然に生じるトリボネクチンのフラグメントの存在またはＭＳＦのフラグメントの存在について試験することによる。生物学的液体中のこのようなペプチドの検出および定量化は、当該分野で周知である。例えば、標準サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、天然に生じるトリボネクチンに対する２つの異なる抗体（例えば、糖ペプチドのオリゴサッカリド部分に結合する第１抗体および糖ペプチドのペプチドコアに結合する第２抗体）を使用して行われる。あるいは、以下に記載される液体クロマトグラフィーおよび質量分析による標準タンパク質配列決定は、生物学的サンプル内のＭＳＦフラグメントを検出するために使用される。コントロール値は、ネガティブな診断に関連して予め決定された値である；あるいは、コントロールサンプルは、変形性関節症がないことが既知の哺乳動物由来の生物学的サンプルである。３０のコントロール値またはサンプルに比較された量の増加は、その哺乳動物が変形性関節症に罹患することを示すか、または、進行中の変形性関節症の素因であることを示す。
【００５４】
（ヒト滑液由来のトリボネクチンの特徴付け）
診断的関節鏡検査および膝全体の交換を受けている患者由来の滑液のアリコートを収集し、そして摩擦装置でアッセイした。両方の場合において、滑液は、任意の外科的な手順の開始前に吸引され、そして直ぐに１０，０００×ｇで、４℃で２時間遠心分離し、細胞性細片は除去された。血液で汚染されたサンプルは廃棄した。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして−２０℃で保存した。
【００５５】
（トリボネクチンの精製および単離）
ヒト滑液（２００ｍｌ）を０．２２マイクロ滅菌フィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通じて、４℃で２日間フィルター濾過した。保持されたもの（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をフィルター膜から廃棄し、そして５０ｍＭ  ＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ５．５で、タンパク質分解インヒビター：１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  パラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）、および１０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含んで元々の滑液量まで再懸濁した。ヒアルロン酸の消化を、３７℃でストレプトミセスヒアルロニダーゼで、１Ｕ／ｍｌの再懸濁された滑液で行った。消化物を３００ｍｌの容量で設置かれたＤＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）にロードし、ＮａＡｃ緩衝液、５０ｍＭで平衡化し、そして１．５Ｌの同じ緩衝で洗浄した。潤滑作用を有する物質を１Ｍ  ＮａＣｌを用いてＤＥＡＥ膜から溶出した。１Ｌの洗浄液を収集し、そしてＸＭ−１００膜（分子量カットオフ  １００ｋＤａ）を備えた５００ｍｌのＡｍｉｃｏｎフローセルを介して濃縮した。濃縮されたサンプルを０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含
む２５ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．４に対して透析した。
【００５６】
ＤＥＡＥ結合濃縮物を、室温で２５ｍＭリン酸塩および０．１５  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化された、２５ｍｌの総容積で設置されたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）アガロース親和性カラムにロードした。２３０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸収がバックグラウンドまで減少するまで、非結合タンパク質を同じ緩衝液で溶出した。潤滑活性を有する物質を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の０．０７Ｍの濃度の段階的な（ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ）勾配で最大限に溶出した。この物質を、汚染物質としてフィブロネクチンを除去するためにアミン基を介して、ヒトフィブロネクチンに対する（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）マウスモノクローナル抗体に結合されたＡｃｔｉｇｅｌ  ＡＬＤアガロース（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｒｃａｄｉａ，ＣＡ）にロードした。溶出された物質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜１５％アクリルアミド）上で、およびＨＰＬＣによって純度についてアッセイした。
【００５７】
タンパク質電気泳動標準は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から、そしてＤＮＡラダー標準は、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）からである。
【００５８】
（高圧液体クロマトグラフィー）
Ｂｏｎｄｐａｋ  Ｃ１８  ３．９×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を、４５％（ｖ／ｖ）メタノール（Ｓｉｇｍａ）および５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｋ）ＨＰＬＣグレードを用いて、１ｍｌ／分で、３５℃で逆相で溶出した。溶出物を、フォトダイオードアレイ検出機ＰＤＡ  ９９６（Ｗａｔｅｒｓ）によってアッセイし、そしてピーク画分内の物質を、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して計算される純度プロットによって分析した。
【００５９】
（摩擦装置）
標準摩擦装置（例えば、Ｊａｙら、１９９２、Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．２８：７１−８８、またはＪａｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．４０：４１４−４１８に記載される装置）を使用して、潤滑活性を測定した。天然のラテックスを、１．５９ｃｍ2の定常接触面積を有する研磨されたガラスのリングに対して振動し
た。支持システムを、２つの垂直水平軸の周りを自由に回転するためにジンバルシステム内の軸の方向にロードした。支持物質としてのラテックスおよびガラスが選択された。なぜなら、それらは、０．０５ｍｍのオーダーの小さな隆起の高さを有する平らな表面を提供するからである。軟骨のようなラテックスが準拠している。ジンバルシステム内のこれらの表面は、ほとんど完全なｃｏ−ｐｌａｎａｒｉｔｙを有する。従って、液体ウェッジは、産生されず、そして境界液体の薄い層のみが存在した。同調する速度（すなわち、スライディングスピード）は、０．３５×１０6Ｎ／ｒｍ2の定常接触圧力で０．３７ｍｍ／ｓｅｃであった。
【００６０】
この摩擦装置は、直線変位電圧変換器を通じて垂直の負荷軸の周りのジンバルシステムの変位を記録した。この変換器の出力電圧は、その摩擦トルクの程度に正比例した。この信号のピークごとの増幅は、公知の摩擦トルクを有する以前の較正と関連した。
【００６１】
試験表面を、使用前に徹底的に洗浄した。ステンレス鋼スタッドに係合された３．８×３．８ｃｍのラテックス片を流れる蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）で２分間洗浄した。次いで、これを０．９％のＮａＣｌ生理食塩水（ＰＳ）の浅いバスに入れた。このガラススライドを、ＤＤＷ中１％（ｖ／ｖ）の７×界面活性剤（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）溶液で１０分間擦り、次いで、その同じ溶液中１００℃に浸させた。５分間の擦りもまた、熱い７×溶液で行い、続いて、２〜４分間流れるＤＤＷにもとで洗浄した。
【００６２】
μを３５℃で測定し、そしてＰＳを用いてそのμの基底腺測定をその前にした。潤滑を、ＰＳのμに対するμの減少によって示した。負のδ値は、潤滑を示し、他方で正の値は、摩擦を示す。２００μｌのＰＳおよび後の２００μｌの試験潤滑剤の添加に続き、ベアリング表面をその溶液が両方の面を湿潤させるに充分密接させる。５分間の平衡化の後、ラテックスコーティングしたベアリングをそれが振動するときにガラス上に静止させた。ピークごとの電圧を１、３および５分後に自動記録させた。この時点で、その表面を２分間分離し、次いでさらに５分間のセッションにわたって元に戻して一緒にした。最後の２回の５分間のセッションの３および５分のμ値は、代表的に安定しており、そしてこれを記録した。
【００６３】
ヒト血清フィブロネクチンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｆ０８９５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そして摩擦装置における使用前にＰＳに対して透析した。
【００６４】
境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってその効果を奏する。ベアリング表面は、境界モードにおいて潤滑となるように共同の反発力を生成しなければならない。境界潤滑剤の代表的な室温例は、グラファイト、テフロン（登録商標）、および亜硫酸モリブデンである。そのような組成物は、ベアリング表面の間の摩擦を減少させ、そして従ってトリボネクチンの潤滑特性を測定するためのアッセイにおいて正のコントロールとして使用される。トリボネクチンは、ラテックスのような日生物学的疎水性表面をコーティングすることによって両親媒性の特性を有し得る境界潤滑剤である。トリボネクチンのオリゴサッカリド成分は、周囲の水性環境とネットワーク形成する。最後および最後から二番目の糖は、滑液から精製された天然に存在するトリボネクチンから除去され、潤滑能力が除去される。
【００６５】
ラテックス：ガラスアースロトリプソメーター（ａｒｔｈｒｏｔｒｉｐｓｏｍｅｔｅｒ）は、再現性良く反復して、精製された生物学的潤滑因子を試験するための迅速な方法を提供する。天然ラテックスおよび研磨ガラスは、試験ごとの物理化学的特性の変化はないかまたはあっても殆どないベアリング表面を有する。対照的に、研磨ガラスまたは軟骨自身のいずれかに対して並置された切断された軟骨は、正確に制御され得ない変位を生じる。滑液によって潤滑される軟骨−軟骨ベアリングにおいて観察されるμは、０．００５と０．０２４との間であった。ラテックス：ガラス系におけるμの値は、認知可能により高く、そして代表的には０．０４以下であった。ベアリング材料間のμの変動は、軟骨の８０％（ｗ／ｗ）水含量に起因する。
【００６６】
（液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣＭＳ）によるタンパク質配列決定）
標準的なＬＣＭＳを、上記精製された潤滑材料のトリプシン消化で行った。潤滑材料を含む２ｍｍ厚の５〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から切り出されたバンドを分析した。この材料は、ＮａＮａｓｅＩＩＩおよびＯ−グリコシダーゼＤＳ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ；ＣＡ）によって脱グリコシル化した。脱グリコシル化は、それぞれ０．１８Ｕ／ｍｌおよび０．１０Ｕ／ｍｌの活性の上記酵素を用いて１８時間、０．５ｍｇ／ｍｌの滑液から精製されたトリボネクチンの存在下で行った。すべての場合において、ゲルスライスを、バンドの中央を通じて切断し、そして１６ｍｍ3のサイズであった。すべての接触表面は、慎重
に５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで洗浄した。配列データを、ＢＬＡＳＴ  ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）検索アルゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。
【００６７】
（ヒト滑膜線維芽細胞の単離および培養）
正常な外観を有するヒト滑膜を、関節鏡検査を受けた３０歳の白人男性から得た。術後１時間以内に、滑膜組織移植片を３回Ｄｕｌｂｅｃｃｏのカルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝化生理食塩水（ＧＩＢＣＯ）で洗浄した。２ｍｍ3のサイズの片を、１
ｍｌあたり１００Ｕのペニシリンおよび１００μｇのストレプトマイシンを補充し、４ｍｇ／ｍｌのＣｌｏｓｔｒｉｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＬＳ，１２５−２００  Ｕ／ｍｇ）を含み、０．２２ｍｍフィルター（Ｎａｌｇｅ）を通して滅菌されたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＧＩＢＣＯ）中に入れた、この組織断片を、さらに、１００ｍｍのプラスチックペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）で分割し、そして５％二酸化炭素および９５％空気の湿潤雰囲気下で３７℃で２０ｍｌの培地中で４時間インキュベートした。
【００６８】
消化物を、パスツールピペットへの吸引Ｓおよびそこからの排除によって多数回充分に混合した。改変されたＰｕｃｋ  Ｓａｌｉｎｅ  Ａ（ＧＩＢＣＯ）中の等容量の０．０５％トリプシンおよび０．０２％のＥＤＴＡを添加し、そしてインキュベーションを、さらに１時間、同じ条件下で続けた。懸濁物を、４００×ｇで２３℃で１０分間遠心分離し、そして３回４０ｍｌのカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水で各々洗浄した。このペレットを、１０％仔ウシ血清（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１００Ｕのペニシリンおよび１００ｍｇのストレプトマイシン（１ｍｌあたり）を補充した改変Ｅａｇｌｅ培地（２０ｍｌ）中に懸濁した。２ｍｌのこの最終混合物を、６０ｍｍプラスチックペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）１つあたりにプレートした。滑膜線維芽細胞を、コンフルエンスにまで増殖させ、そして細胞を採集した。ヒト皮膚線維芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＣＣＤ−１０９９５Ｋ；ＡＴＣＣ，Ｍａｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコントロールとして使用し、これもまた、上記手順を用いて増殖および採取した。
【００６９】
（ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析）
滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニカラムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって精製した。夾雑するゲノムＤＮＡを、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅなし）（Ｑｉａｇｅｎ）により除去した。第一の鎖のｃＤＮＡを、逆転写および以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により合成した。ＭＳＦ−エキソン６順向きプライマー５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１５）ａｎｄ  ＭＳＦ−エキソン  ６逆向きプライマー５’−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１６）。これらのプライマーは、ヒトＭＳＦ遺伝子（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０１３６）のヌクレオチド番号６７４−６９８および９５３−９２６にそれぞれ対応する。サーマルサイクル条件を、１２分間４２℃、９５℃で１０分、続いて４３サイクルの９４℃×２０秒および５５〜６５℃×３０〜９０秒であった。７分間の最終の伸長は７２℃であった（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００７０】
（トリボネクチンの代替のＭＳＦのスプライス改変体）
潤滑ポリペプチドをヒト滑液から標準的な生化学的方法に続いてピーナツ凝集素を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。最終の画分であって、唯一潤滑能を有したものは、見かけ上の分子量が２８０ｋＤａの産物を含んでいた。２８０ｋＤａを超える分子量の成分は、観察されなかった。２８０ｋＤａの切断バンドからのトリプシンフラグメントにおいて行われたＬＣＭＳは、２つの異なるタンパク質の存在を示した。このタンパク質は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムでフィブロネクチン前駆体およびＭＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ（ＴＭ）登録番号Ｕ７０１３６）と適合した。  ＭＳＦの配列は、ネイティブおよび脱グルコシル化の潤滑ポリペプチドの両方から同定された。従って、精製スキームを、抗フィブロネクチンカラムで終結させ、これは、不純物としてフィブロネクチンの除去を生じた（Ｃ１８分析ＨＰＬＣおよび純度プロット分析によってアッセイされるところ）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上７０ｋＤａおよび１６０ｋＤａにおけるより低分子量のバンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出する精製したトリボネクチン調製物からなくなっていた。摩擦装置においてアッセイされた精製したトリボネクチンは、全体の滑液のものに類似する境界潤滑活性をしめすことが分かった（表５）。対照的に、精製した血清フィブロネクチンは、摩擦を上昇させ、このことは、滑液潤滑能が精製されたトリボネクチンによって媒介されたことを示す。
【００７１】
【表３】
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*ＰＳに中２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。
**生理学的生理食塩水。
†死後のヒト滑液
さらに、トリプシン処理フラグメントのＬＣＭＳにより、エキソン６〜９（両端服務）の部分が同定された。精製されたトリボネクチンは、ピーナツ凝集素と反応した。このことは、その精製によるβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴサッカリドの存在を示す。電気泳動の移動度における増加が、ＮａＮａｓｅＩＩＩおよびＯ−グリコシダーゼＤＳでの消化後に観察された。このことは、この精製されたトリボネクチンが高度にＯ結合型オリゴサッカリドを介してグリコシル化されていることを示す。滑液から精製された脱グリコシル化したトリボネクチンの見かけ上の分子量は１２０ｋＤａであった。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＭＳＦのＮ末端およびエキソン６をコードするヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲは、２８０ｂｐ産物を生じ、これは設計されたプライマーの間の距離であった。逆転写酵素なしの類似の実験では、この産物は生じなかった。このことは、そのＲＮＡがゲノムＤＮＡを含まないことを示す。皮膚線維芽細胞からの精製されたＲＮＡは、この同じプライマーを用いても何ら産物を生じなかった。
【００７３】
ＭＳＦは、ヒト単球からまず単離された；ＭＳＦの２５ｋＤａフラグメントは、巨核球の発生を刺激することが見出された。ＭＳＦ前駆体タンパク質は、１４０４残基のサイズであり、そして１２のエキソンから構成される。エキソン６は、９４０残基の長さである中心に位置するムチンをコードするようである。エキソン６は、ビトロネクチンに対して相補性を有し、エキソン２および３は、ソマトスタチンＢ様領域に対して相補的であるようであり、そしてエキソン８、９は、ビトロネクチンにおけるヘモペキシン様領域に類似する。ヘモペキシンは、ヒアルロネートと相互作用する血清ヘムスカベンジタンパク質である。
【００７４】
滑液から精製されたトリボネクチンおよび関節軟骨から精製された関節軟骨の表面帯タンパク質（ＳＺＰ）は、ＭＳＦとの配列同一性を共有するが、それらの見かけ上の分子量およびアミノ酸配列において異なる。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：ヒト滑膜線維芽細胞によるＭＳＦ遺伝子発現）
天然に存在するトリボネクチンは、ＭＳＦをコードする遺伝子からのヒト滑膜線維芽細胞によって発現されることを見出した。すべてではないがいくつかのＭＳＦ遺伝子のエキソンは、トリボネクチン遺伝子産物において表現される。例えば、トリボネクチンは、ＭＳＦ遺伝子のエキソン６−９によってコードされる配列を含むが、天然に存在するＭＳＦ遺伝子の少なくとも１つのエキソンによってコードされる配列を欠如する。
【００７６】
ＭＳＦ遺伝子発現を以下のように評価した。正常の潤滑能力を有する、プールされたヒト滑液精製されたトリボネクチンの２４０ｋＤａの見かけ上の分子量バンドからのゲルスライスをトリプシンで消化した。トリプシン処理したフラグメントのＮ末端配列決定を、液体クロマトグラフィー質量分析によって行い、そして結果を、ＧｅｎＢａｎｋTMにおける公知配列と比較した。Ｏ−グリコシダーゼＤＳおよびＮａＮａｓｅＩＩＩを有する精製されたトリボネクチンの消化を用いて、コアタンパク質の分子量を示した。潤滑能力を、研磨ガラスのリングに対して、天然のラテックスを振動させる標準的な摩擦装置を用いてアッセイした。
【００７７】
２つの以前に同定されたタンパク質種は、ヒト滑液の最後の潤滑画分に存在した。フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）および巨核球刺激因子（ＭＳＦ）のトリプシン処理フラグメントを、両方とも同定した。１００％マッチ（Ｅ値は０．３１〜０．０４７の範囲である）が、エキソン６〜９について特異的なＭＳＦ配列を用いて観察された。ＭＳＦは、ビトロネクチンに類似する多重機能ドメインを有するサイズが１１０４アミノ酸である。このトリボネクチンは、摩擦係数（ｎ）を、０．１４２から０．０３６へと減少させたが、他方、精製された血清フィブロネクチンは、ｎを０．１３６から０．１８１へと上昇させた。配列番号１のアミノ酸位２１４−２２２および３００−３０９に対応する順向きおよび逆向きのＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いて、インビトロで増殖させたヒトの滑膜線維芽細胞から精製されたｍＲＮＡを検査した。２８０ｂｐ遺伝子産物が予測されたアミノ酸配列と一致していることが観察された。本明細書において記載されるデータは、天然に存在するトリボネクチンが、ＭＳＦ遺伝子の発現を介して、滑膜繊維が細胞から分泌されることを示す。
【００７８】
以下に記載される方法を使用して、滑液における潤滑成分を特徴付けた。
【００７９】
（ヒト滑液収集物）
診断関節鏡検査を受ける患者からの滑液および綜合膝置換物のアリコートを集め、そしてその摩擦装置においてアッセイした。両方の場合において、滑液を、任意の手術手順の開始の前に吸引し、そして直ぐに２時間４℃で１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞砕片を除去した。血液を肉眼で見て夾雑するサンプルを捨てた。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして−２０℃で格納した。
【００８０】
（ヒトトリボネクチンの精製および単離）
ヒト滑液２００ｍｌを、０．２２ｎｍの滅菌フィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して４℃で２日にわたって濾過した。保持物をフィルターメンブレンから掻き取り、そして５０ｍＭ  ＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ５．５を用いて再懸濁してもとの滑液容量とした。その再懸濁緩衝液は、タンパク質加水分解インヒビター：１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＰＣＭＢおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。ヒアルロン酸の消化を、１Ｕ／ｍｌの再懸濁した滑液のストレプトマイセスヒアルロニダーゼによって３７℃で行った。消化物を、３００ｍｌの設置した容量のＤＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ）上にのせ、ＮａＡｃ緩衝液、５０ｍＭに平衡化し、そして１．５Ｌの同じ緩衝液で洗浄した。所望の材料をＤＥＡＥマトリクスから、１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。１Ｌの洗浄物を収集し、そしてＸＭ−１００メンブレン（ｍｗカットオフ＝１００ｋＤａ）を有する５００ｍｌのＡｍｉｃｏｎフローセルを介して濃縮した。濃縮したサンプルを２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む）に対して透析した。
【００８１】
このＤＥＡＥ結合濃縮物を、２５ｍｌの設置ベッド容量を有するピーナツ凝集素（ＰＮＡ）アガロースアフィニティーカラムにのせ、室温で２５ｍＭホスフェートおよび０．１５ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４と平衡化した。結合していないタンパク質を、同じ緩衝液で、２３０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度がバックグラウンドにまで下がるまで溶出した。所望の材料をａ−ラクトースの段階勾配の存在下で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌ濃度でｐＨ７．４にて最大に溶出された。予備精製されたトリボネクチンを、アミン結合を介してヒトフィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）．）に結合されたＡｃｔｉｇｅｌ  ＡＬＤ  アガロース（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｒｃａｄｉａ，ＣＡ）にのせた。溶出された材料をクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ５−１５％およびＨＰＬＣによってアッセイした。
【００８２】
（高圧液体クロマトグラフィー）
μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ  １８  ３．９×１５０  ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｏｒｄ，ＭＡ）を、４５％（ｖ／ｖ）メタノール（Ｓｉｇｍａ）および５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）ＨＰＬＣ等級を用いた逆相中で１分間／分で３５℃で溶出した。溶離物を、光ダイオードアレイ検出器ＰＤＡ９９６（Ｗａｔｅｒｓ）によりアッセイし、そしてＭｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて算出した精製プロットによってピークを分析した。
【００８３】
（摩擦装置）
標準的な摩擦装置を用いて、上記のように潤滑活性を測定した。
【００８４】
μを、３５℃で測定した。その前に、μの基底線測定をＰＳを用いて行った。潤滑を、ＰＳのμに対する減少によって表した。負のΔμの値は、潤滑を示すが、他方、正の値は摩擦を表す。２００μｌのＰＳの添加および後の２００μｌの試験潤滑剤の添加に続いて、その溶液が両方の表面を湿らせるように十分ベアリング表面を近接させた。平衡化のための５分の後、ラテックスコーティングされたベアリングを、それが振動しているときにガラス上にとどまらせた。ピークごとの電圧を、１、３および５分後に自動的に記録させた。この時点で、その表面を２分間分離し、次いで別の５分間のセッションのために戻して一緒にした。最後の５分間のセッションの３分および５分のμ値は代表的に安定化し、そしてこれを記録した。
【００８５】
（ＬＣＭＳ）
トリプシン処理消化物のＬＣＭＳを、上記のように行った。バンドを、２ｍｍ厚の５−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からさらなる分析のために切り出した。脱グルコシル化をＮａＮａｓｅ  ＩＩＩおよびＯ−グルコシダーゼＤＳ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（それぞれ０．１７  Ｕ／ｍｌおよび０．１０  Ｕ／ｍｌの濃度で、０．５ｍｇ／ｍｌタンパク質の存在下で６時間）を用いて行った。全ての場合において、ゲルスライスを、バンドの中心を通り、１６ｍｍ3のサイズとなるように切り出した。すべての接触表面を、注意深く
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで洗った。配列データをＢＬＡＳＴ  ＧｅｎＢａｎｋTM検索アルゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。
【００８６】
（ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析）
滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニカラムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって精製した。夾雑するゲノムＤＮＡは、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅなし）（Ｑｉａｇｅｎ）．によって除去される。第一の鎖ｃＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー（ＭＳＦ特異的プライマーの相対位置は図１に示される）を用いて逆転写およびＰＣＲ増幅によって合成した：ＭＳＦ−エキソン  ６順向きプライマー５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１５）およびＭＳＦ−エキソン６逆向きプライマー５’−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１６）。これらのプライマーは、ＧＥＮＢＡＮＫTM登録番号Ｕ７０１３６（ヒトＭＳＦ）においてそれぞれ塩基対番号位置６７４−６９８および９５３−９２６に対応する。サーマルサイクリング条件は、１２分で４２℃、９５℃で１０分に続いて４３サイクルの９４℃×２０秒および５５〜６５℃×３０〜９０秒であった。７分間の最終の伸長を、７２℃であった（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００８７】
（種々の試薬）
ヒト血清フィブロネクチンを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｆ０８９５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そしてＰＳに対して透析し、その後、摩擦装置において使用した。タンパク質電気泳動の標準物を、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入し、そしてＤＮＡラダー標準物を、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）から購入した。
【００８８】
ヒト滑液からのトリボネクチンを精製した。唯一潤滑能力を有した最終画分は、主に、２８０ｋＤａの見かけ上の分子量を有する産物を含んだ。この画分はまた、マイナーな分子量成分を含んでおり、これは、最終の抗体ベースの精製工程で除去された。２８０ｋＤａを超える分子量を有する成分は、観察されなかった。２８０ｋＤａから切り出されたバンドからのトリプシン処理フラグメントにおいて実施されたＬＣＭＳは、２つの異なるタンパク質の存在を示し、これは、フィブロネクチン前駆体およびＭＳＦに対するＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムに適合した（ＧＥＮＢＡＮＫTM登録番号Ｕ７０１３６）。ＭＳＦの配列は、ネイティブおよび脱グルコシル化トリボネクチンの両方から同定された。従って、精製スキームを、抗フィブロネクチンカラムによって終結させ、そしてＣ１８分析ＨＰＬＣおよび精製プロット分析において不純物としてフィブロネクチンのおおよその除去を達成した。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける７０ｋＤａおよび１６０ｋＤａにおけるマイナーな低分子量バンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出された精製調製物から除かれていた。摩擦装置においてアッセイされた精製されたトリボネクチンは、滑液の全体のものに類似する境界潤滑活性を示すことが見出された（表６）。
【００８９】
【表４】
2014144015.tif 000007
*生理食塩水
†ＰＳにおいて２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。
【００９０】
対照的に、精製された血清フィブロネクチンは、摩擦を上昇させた。このこことは、滑液潤滑能力がトリボネクチンによって媒介されることを示した。
【００９１】
トリプシン処理フラグメントのＬＣＭＳは、ＭＳＦのエキソン６〜９（両端含む）の部分を正確に同定した。エキソン６の初めおよび終わりで核酸配列によってコードされたフラグメントが見出された。トリボネクチンは、ＰＮＡと反応した。このことは、その精製による、（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴサッカリドの存在を示すさらに、ＮａＮａｓｅ  ＩＩＩおよびＯ−グルコシダーゼＤＳでの消化後に電気泳動移動度における非常に有意な増加が存在した。このことは、トリボネクチンがＯ結合型オリゴサッカリドを介してグリコシル化されることを示す。脱グルコシル化トリボネクチンの見かけ上の分子量は１２０ｋＤａであった。
【００９２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＭＳＦのエキソン６のＮ末端をコードするヌクレオチド配列について特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲは、２８０ｂｐの産物を生成した。これは、設計されたプライマーの間の推定距離である。逆転写酵素のない類似の実験は、この産物を生成しなかった。このことは、このＲＮＡは、ゲノムＤＮＡを含まないことを示した。皮膚線維芽細胞から精製されたＲＮＡは、同じプライマーを用いて何も産物を生成しなかった。
【００９３】
本明細書において記載されたデータは、ＭＳＦ遺伝子のエキソンが選択スプライシングされて、滑膜関節において潤滑ポリペプチドを発現することを示す。滑膜線維芽細胞は、関節におけるそのようなトリボネクチンの供給源のひとつである。本明細書においてきさいされた単離された天然に存在するトリボネクチン（Ｍｒ−２８０ｋＤａ）およびＳＺＰ（Ｍｒ−３４５ｋＤａ）は異なる分子である。なぜなら、６５ｋＤａだけ見かけ上の分子量が異なるからである。ＭＳＦは、滑膜腔に集中する２つの独立した細胞株によってＭＳＦエキソンの異なる発現によって両方の分子についての前駆体であることが可能である。トリプシン処理された消化物の反復ＬＣＭＳ配列決定は、ＭＳＦにおけるエキソン６から９に囲まれたエキソンのいずれも同定しなかった。仔ウシから精製された天然に存在するトリボネクチンは、ヒト供給源から精製されたトリボネクチンと同じ分子量を有することが見出された。
【００９４】
境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってこれらの効果を奏する。ベアリング表面は、境界モードで潤滑されるために、相互反発を生成しなければならない。通常の室温（環境）の例は、グラファイト、テフロン（登録商標）および硫化モリブデンである。トリボネクチンは、ラテックスのような非生物学的疎水性表面をコーティングすることによって両親媒性特性を有するようである。広汎なグリコシル化は、周囲の水性環境でネットワークにとって重要である。最後および最後から二番目の糖が除去されるとき、潤滑能力が消失した。エキソン９によって発現されるタンパク質を介すＳＺＰまたはトリボネクチンに対するヒアルロネートの結合は、滑液における役割をヒアルロネートが果たす機構を支持する。ヒアルロネートポリマーは、多くのＳＺＰまたはトリボネクチンの分子を、タンデムで側方に結合するように機能し得る。従って、せん断ストレスを分配し、そして潤滑分子を安定化させる。
【００９５】
ＭＳＦ前駆体（トリボネクチンのような選択スプライシング遺伝子産物）の主な構造は、ＭＧ２、スタテリン（ｓｔａｔｈｅｒｉｎｅ）およびプロリンリッチ糖タンパク質のもの（これは、唾液および潤滑歯科ベアリングにおいて見出される）とは異なる。ＭＧ２のみがこのラテックス：ガラスベアリングにおいて試験され、そしてトリボネクチンと同程度に有効に潤滑させることが見出された。糖タンパク質の両方は、同じＯ結合型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｚ部分を共有する。これらのデータは、Ｏ結合型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分は境界潤滑活性にとって重要であることを示す。
【００９６】
酵素消化実験は、滑液によって提供される境界潤滑は、トリプシンにとって非常に感受性であることを示す。これらの実験は、ホスホリパーゼによる潤滑能力の除去（極少量のトリプシン様プロテアーゼが夾雑する）がプロテアーゼインヒビターのロイペプチンおよびアプロチニンとともに同時インキュベーションすることによって除去され得る。リジンおよびアルギニンは、徹底的にグリコシル化され、そして従ってタンパク質分解を妨害し得るトリボネクチンの同じ領域であるとはいえトリプシン感受性の観察を支持するエキソン６産物のそれぞれ１３．５％および１．３％を含む。トリプシンまたはエラスターゼを詳述するさらにマイナーな炎症状態は、天然に存在するトリボネクチンの潤滑能力に対して有害効果を有するようである。非潤滑性軟骨ベアリングは、変形性関節症を開始し得る未熟な摩損量を経験し得る。そのような条件は、本明細書に記載される潤滑ポリペプチド、すなわちトリボネクチンを用いて処理される。
【００９７】
（実施例２：染色体１ｑ２５に局在されるヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によるトリボネクチンおよびＳＺＰ：ＭＳＦ産物の遺伝子発現の相同性）
トリボネクチンの発現を初代ヒト滑膜線維芽細胞および初代関節軟骨において評価した。ＲＮＡを、変性関節疾患のない被検体から得られた組織移植片からインビトロで増殖したヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞から精製した。ＲＴ−ＰＣＲをＭＳＦ遺伝子のエキソン６ならびにエキソン６のＮ末端およびＣ末端の両方における個々のエキソンを発現する中心のムチンにわたる多重相補的プライマー対とともに用いた。エキソン２、４および５は、滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によって変動して発現されるようである。ＭＳＦ遺伝子の種々のエキソンから発現される、潤滑ポリペプチドであるトリボネクチンは、軟骨細胞および滑膜線維芽細胞の両方をインビトロで発現する。トリボネクチンおよび関連プロテオグリカンである表面帯タンパク質（ＳＺＰ）の両方は、類似の（ではあるが同一ではない）一時構造を共有する。トリボネクチンおよびＳＺＰはまた、Ｏ結合型オリゴサッカリドと翻訳後改変において異なり：トリボネクチンは、Ｏ結合型オリゴサッカリドを含むが、他方、そのような翻訳後改変は、ＳＺＰには検出されなかった。オリゴサッカリドは、トリボネクチンにおいて優勢である；制限された量のコンドロイチンおよびケラチン硫酸がＳＺＰにおいて見出された。ほとんどのＭＳＦエキソンがトリボネクチンの発現に関与していることから、ビトロネクチンに対する強力な相同性が持続する。ヒトゲノムＢＡＣライブラリーのエキソン６について相補的なｃＤＮＡプライマー対を使用したスクリーニングは、２つのクローンを同定した。両方のクローンは、染色体１ｑ２５について、インサイチュハイブリダイゼーションによって相補的であった。この位置は、屈指（ｃａｍｐｔｏｄａｃｔｙｌ）−関節症−心膜炎症候群（ＣＡＰ）に、遺伝子マッピングによって相関付けられた。大きな関節の関節症であるＣＡＰは、滑膜によって提供される無効な境界潤滑と関連している。従って、本明細書において記載されるトリボネクチンは、ＣＡＰを予防および／または処置するに有用である。
【００９８】
以下に記載されるデータは、以下の課題を検討する：１）１２のＭＳＦのエキソンのうちどれが、滑膜線維芽細胞によって発現され、そしておそらく、滑膜の腔へのトリボネクチン分泌を生じるか。２）どのようにこれが、軟骨の表面にＳＺＰ分泌を生じる関節軟骨細胞によるＭＳＦの発現とは異なるか、３）トリボネクチンおよびＳＺＰが同じ一次構造を共有するかどうか、４）トリボネクチンは、ＳＺＰの特徴であるコンドロイチン硫酸で翻訳後かいへんされるかどうか、ならびに５）単離されたエキソン６産物が境界潤滑能力をゆうするかどうか。
【００９９】
ヒト滑液を上記のように処理した。収集し、そしてトリボネクチンを上記の方法を用いてヒト組織から精製および単離した。潤滑活性を標準的な摩擦装置を用いて測定した。
【０１００】
（コンドロイチン−６−硫酸の免疫検出）
モノクローナル抗体Ｍ６２１Ｃ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を用いてコンドロイチン−６−硫酸の存在を検出した。標準的なドットブロット技術およびウェスタンブロット技術を用いた。
【０１０１】
（キモトリプシンでのトリボネクチンの消化）
ヒト滑液のＴＬＣＫ処理したキモトリプシン０．１ＢＴＥＥ  Ｕ／ｍｌを、３７℃で１時間インキュエートした。消化後すぐに潤滑活性を、摩擦装置においてアッセイした。さらなる消化を、市販のＴＬＣＫ処置がトリプシンを夾雑して不完全に不活化した場合において、同じ方法で、ただし１０μｇのロイペプチンおよび５μｇ／ｍｌのアプロチニンの存在下で行なった。
【０１０２】
（ヒト関節軟骨細胞の単離および培養）
ヒト滑膜線維芽細胞を上記のように単離することに加えて、ヒト軟骨細胞を単離した。ヒトの膝関節の大腿部の関節丘および頚骨平坦部（ｐｌａｔｅａｕ）から軟骨を解剖によりドナー（関節疾患の既知の履歴のない）または組織銀行からの健常器官ドナーから入手した。軟骨スライスを、２−３ｍｍ3の片に切断し、ＤＭＥＭ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ
ＡＢ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で洗浄し、そしてトリプシン１０％（ｖ／ｖ）で３７℃で水浴中で１５分間処理した。この組織をＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ，ペニシリン−ストレプトマイシン−フンジゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）および２ｍｇ／ｍｌＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓコラゲナーゼＩＶ型（Ｓｉｇｍａ）へと移し、そしてこれを旋回シェーカー上で一晩消化した。この細胞を３回ＤＭＥＭで洗浄し、そして５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１０３】
（ヒト単球の培養）
懸濁物中のヒト単球ＣＲＬ−９８５５をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞を、遠心分離により濃縮し、そして次いでＴ７５フラスコに再懸濁して、熱非働化していない１０％仔ウシ血清（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．０３ｍＭチミジン、０．１ｍＭヒポキサンチンおよび０．０５ｍＭ２−メルイカプトエタノールを補充したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地を用いて０．２×１０6／ｍｌと１．０×１０6／ｍｌとの間に濃縮した。単球が増幅するにつれ、その培養物は、上記の濃度範囲を維持するように拡張した。
【０１０４】
（ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析）
ヒト滑膜および関節の軟骨細胞および単球からのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニカラムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。夾雑するゲノムＤＮＡを、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅなし）（Ｑｉａｇｅｎ）により除去した。相補的なＤＮＡ合成を、逆転写酵素によるヘキサマープライマーの伸長のために２５℃で１０分間、および４２℃で１２分間のｃＤＮＡの合成および９５℃で１０分間のＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体のＡｍｐｌｉＴａｑ／変性の活性化のためインキュベートすることによって行なった。サーマルサイクリング条件は、４３サイクルの９４℃、２０秒（変性のため）および６２℃、６０秒および７２℃で７分間の最終の伸長であった（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムにより染色した、３％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ  アガロース（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）ゲル電気泳動により分析した。推定されるＲＴ−ＰＣＲ産物サイズに対応しないバンドを、切り出し、そしてアガロースから抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。
【０１０５】
（ＢＡＣクローンライブラリースクリーニング）
ヒトゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＣライブラリーを、ＭＳＦエキソン６に対して相補的なｃＤＮＡプライマー対を用いてＰＣＲによりスクリーニングしたＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）：配列番号２の６７４−６９８および９５３−９２６の塩基対位置番号に対して相補的な順向き５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１５）および逆向きプライマー５’−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１６）。候補となるＥ．ｃｏｌｉクローンを、１２．５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天中で３７℃で１６時間増殖した。ゲノムＤＮＡのない大きな構築物ＤＮＡを、アニオン交換およびエキソヌクレアーゼ消化によって精製した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｒｇｅ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｋｉｔ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。
【０１０６】
（ＢＡＣクローンＤＮＡおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション）
中期染色体を、樹立されたプロトコルに従って正常な個体からの短期リンパ球培養物から調製した。陽性のクローンからの２μｇのＢＡＣ  ＤＮＡを、製造者により供給されたプロトコルに従ってニック翻訳反応においてＢｉｏＮｉｃｋ標識キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ）を用い、ビオチン１４−ｄＡＴＰを用いて標識した。ニック翻訳後、反応産物を、Ｇ５０カラムにおいて精製した。１００ｎｇの標識されたＤＮＡおよび２０μｇのｃｏｔ１  ＤＮＡをエタノールを用いて共沈した。そのＤＮＡを遠心分離により回収し、そして２０μｌのハイブリダイゼーション溶液（Ｈｙｂｒｉｓｏｌ  ｖｉｉ，Ｏｎｃｏｒ）中に溶解した。プローブハイブリダイゼーション、洗浄、顕微鏡およびプローブのマッピングを標準的な手順に従って行なった。
【０１０７】
（キモトリプシンでのトリボネクチンの消化および潤滑活性についてのアッセイ）
トリボネクチンを、プールされたヒト滑液から、Δμ＜−０．０６であると規定される正常な潤滑活性を有する精製し、そして２８０ｋＤａの見かけ上の分子量を有した。抗フィブロネクチン工程を用いて精製を終結させることを行なって、夾雑バンドを除去した。この工程はまた、＜６°へと純度角度を減少させた。２５０μｇ／ｍｌの濃度でのトリボネクチンはラテックス：ガラスベアリングを変性関節疾患なしに被検体からの死後滑液と同様に有効に潤滑にさせた（表７）。
【０１０８】
【表５】
2014144015.tif 000008
平均±ＳＤ
†ＰＳ中で２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した
‡生理食塩水
*死後ヒト滑液
§ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下でＴＬＣＫ処置されたキモトリプシンで消化したＨＳＦ
ＴＬＣＫ処理されたキモトリプシンでの酵素消化を行なって、その単離されたエキソン５タンパク質産物が潤滑活性を有するかどうかを判定した。なぜなら、このドメインは、芳香族アミノ酸を有していないからである。得られた消化物は、μを、生理食塩水コントロールの値μ＝０．１０７から０．１３０へと上昇させた。ロイペプチン／アプロチニンの存在下での類似の消化は、潤滑活性を実証しないままであった（Δμ＝＋０．０２）。
【０１０９】
（コンドロイチン−６−硫酸の免疫検出）
モノクローナル抗体Ｍ６２１  Ｃ  を用いてニトロセルロースに移されたトリボネクチンを検査した。もとのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける２８０ｋＤａバンドに対応する反応は観察されなかった。これは、トリボネクチンがコンドロイチン−６−硫酸を含まないことを示す。
【０１１０】
（滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析）
軟骨細胞および滑膜線維芽細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを表８において例示されるプライマーを用いて行なった。推定されるよりも少ない他のものに加えて推定されるサイズのＲＴ−ＰＣＲ産物が、両方の細胞株について観察された。エキソン６のＣ末端からエキソン１２のＮ末端までにわたるプライマー対が７６９ｂｐであることが観察された。これは、両方の細胞株について推定される長さである。同様に、エキソン６からエキソン１１までの同じ位置にわたるプライマー対は、６５４ｂｐの推定されるＲＴ−ＰＣＲ産物を生産した。エキソン５および６のプライマー対は、両方の細胞株について２７８ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ推定産物を生成した。
【０１１１】
【表６】
2014144015.tif 000009
塩基対位置番号は、ＧＥＮＢＡＮＫTMにおいて登録番号Ｕ  ７０１３６に対応する
【０１１２】
【表７】
2014144015.tif 000010
塩基対位置番号は、ＧＥＮＢＡＮＫTMにおいて登録番号Ｕ  ７０１３６に対応する。
【０１１３】
エキソン１からエキソン６までにわたるプライマー対は、７５６ｂｐの推定産物サイズを単一に生成しなかった。３つのより小さなサイズの（３５０、４５０および４９０ｂｐ）のバンドの代わりに、両方の細胞株について観察された。エキソン２からエキソン６Ｎ末端にわたるプライマー対は、両方の細胞株についてほぼ４２０ｂｐのサイズの産物を生成し、そしてこれはその推定サイズより短い２７２ｂｐ（６９２ｂｐ−４２０ｂｐ）であった。推定されたＲＴ−ＰＣＲ  ６９２ｂｐ産物は、軟骨細胞についてわずかに観察され、滑膜線維芽細胞についてはそれほどではなかった。エキソン２から６のプライマー対４２０ｂｐ産物を切り出し、そして配列決定し、これは、エキソン５およびエキソン４のほとんど（最初の２つのＮ末端アミノ酸である配列番号１のＡｌａ105およびＬｅｕ106を除く）がないことを明らかにした。エキソン１〜６のプライマー対からの４９０および４５０のＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定によって、同じ欠失が同定された。エキソン１から６プライマー対からのより小さな３５０ｂｐの産物の配列決定によって、Ｎ末端Ｑ25をのぞいてエキソン２に加えてこれらと同じ欠失を明らかにした。エキソン４および６のプライマー対は、両方の細胞株について４４９ｂｐの推定されたＲＴ−ＰＣＲ産物およびより小さな３４０ｂｐの産物を生成した。この３４０ｂｐ産物の配列決定は、Ｎ末端のＥ156を除
きエキソン５の欠失が明らかにした。
【０１１４】
選択スプライシングは、滑膜線維芽細胞および軟骨細胞の両方からの４つの異なる表現型のＭＳＦアイソフォームを生成することを担うことが見出された（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１１５】
表現型Ｖ０はすべての１２のエキソンからなり、Ｖ１はエキソン５を欠失し、Ｖ２は、エキソン５およびエキソン４のほとんどを欠失し、そしてＶ３は、エキソン５およびエキソン４および２のほとんどを欠失する。さらに別のアイソフォームは、ＭＳＦエキソン１および６−１２（エキソン５を欠失する）によってコードされるアミノ酸からなるポリペプチドである。これは、おそらく、最も小さな天然に存在するトリボネクチンである。各アイソフォームは、潤滑性ドメインエキソン６を含む。エキソン１によってコードされるドメインは、トリボネクチンの疎水性表面様軟骨に結合することを媒介することにおいて役割を果たす。
【０１１６】
（単球ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析）
ＭＳＦエキソン６に相補的なプライマー対（表９）を使用して、生成された単球ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲは、任意の産物を生成しなかった、エキソン１〜３にわたるプリマー対が、２５０ｂｐ（その予測される大きさ）のＰＣＲ産物を産生した。エキソン１〜４にわたる別のプライマー対は、３１２ｂｐの予測された大きさより小さいおよそ１３０ｂｐであるＰＣＲ産物を産生した。エキソン２〜５にわたるさらに別のプライマー対は、任意のＰＣＲ産物を生成せず、エキソン５は発現されないことを示した。これらのデータは、単球がエキソン１〜３、１〜４を不定に発現し、そしてエキソン６を発現しないことを示したようである。エキソン１における正方向プライマー配列は、単球、滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ）線維芽細胞および軟骨細胞を含む上記のＲＴ−ＰＣＲ実験の全てに共通した。
【０１１７】
（ＢＡＣクローンＤＮＡおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション）
上記のＭＳＦエキソン６ｃＤＮＡプライマー対を用いたヒトゲノムＢＡＣクローンライブラリーのスクリーニングが、２つの候補クローンを生じた。ＢＡＣクローン３３０および２８５が、ｑ２５領域（ＤＡＰＩバンド）の染色体１にハイブリダイズした。染色体１に対する局在を確認するために、中期染色体を、染色体１特異的動原体プローブ（ＶＹＳＩＳ）と共に、ＢＡＣプローブにハイブリダイズした。動原体ならびにＢＡＣプローブの両方が、染色体１にハイブリダイズした。同じスライドの引き続くＧバンドが、ｑ２５の局在を確認した。
【０１１８】
インビトロで増殖した滑膜線維芽細胞は、ＭＳＦエキソン２，４または５、あるいはそれらの組み合わせのいずれかを代替でスプライスした（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｕｔ）。エキソン４の場合、発現は、そのエキソンの最初の２つのコドン（Ａｌａ105およびＬｅｕ106）後で停止した。残基Ｅ156を除く、エキソン５のない同位体およびＱ25を除くエキソン２
のない同位体もまた存在する。３つのＲＴ−ＰＣＲ産物が、表現型Ｖ１〜３に対応するようなエキソン１〜６プライマー対と共に存在した。しかし、エキソン２〜６プライマー対に対する期待されたＲＴ−ＰＣＲ６９２ｂｐ産物を観察し、これらのエキソンの各々を含む同位体Ｖ０もまた存在することを示した。トリボネクチンの４または５の異なる表現型同位体は、滑膜線維芽細胞により発現されるようである。軟骨細胞は、この表現型の発現を共有する。両方の細胞株に対する代替のスプライス部位の概要を、図３において例示する。軟骨細胞について、６９２ｂｐエキソン２〜６プライマー産物および４４９ｂｐエキソン４〜６プライマー産物の比較的大きい強度は、これらの細胞がより高い分子量同位体を潜在的に選択し得ることを示唆する。
【０１１９】
ＭＳＦにおけるエキソン６は、アナログヘパリン硫酸結合領域（ＭＳＦエキソン４）とヘモペキシン様リピート（ＭＳＦエキソン８、９）との間に位置する。これらのドメインの分離は、ドメインの近接に起因してこれらのドメインがグリコサミノグリカン結合と競合することが考えられるビトロネクチンとは異なるグリコサミノグリカンとのより大きい相互作用を与える。おそらく、潤滑ドメインのいずれかの末端または両方の末端におけるグリコサミノグリカンに結合する能力は薄層スプレンディン（ｌａｍｉｎａ  ｓｐｌｅｎｄｉｎ）に覆われた軟骨において潤滑活性を安定にするのに機能する。あるいは、相互作用は、トリボネクチンとコラーゲンＩＩ型との間に存在し、この相互作用は、軟骨に直接トリボネクチンを結合するのに機能する。
【０１２０】
トリボネクチンのような境界潤滑剤は、支持表面に結合し、そして境界モード（ｍｏｄｅ）で潤滑させるために、相互反発を生成する。この二機能性の寄与は、ラテックスのような非生物学的疎水性表面により、両親媒性の挙動により現れる。広範なグリコシル化は、周囲の水性環境とネットワークを作る。最後の（ｕｌｔｉｍａｔｅ）糖および最後から二番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）糖を除く場合、潤滑能力は、排除される。ＭＳＦエキソン６の発現を、潤滑活性のために必要とし；最適な潤滑活性は、少なくとも１つのさらなるＭＳＦエキソン（例えば、エキソン１）により発現されるドメインの発現をおそらく必要とする。行われたキモトリプシン消化実験は、エキソン６産物を削除し、そして他の放出されたエキソン産物が、潤滑能力を妨げないと仮定して、潤滑のためのこの消化（ｄｉｇｅｓｔａｔｅ）を試験するために意図された。この消化（ｄｉｇｅｓｔａｔｅ）は、ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下での複製にも関わらず、ｗｅ；；を潤滑にせず、他のエキソン産物が必要とされ得ることを示唆した。例えば、エキソン３が必要とされ得、エキソン３は、ムチンポリマーの凝集に重要である、多数のシステイン残基を有する。表面をコートするトリボネクチンの量は、凝集するのに、疎水性および個々のトリボネクチンポリマーの能力におそらく依存する。
【０１２１】
免疫組織化学的研究は、コンドロイチン−６−硫酸を検出できず、存在しないか、またはコンドロイチン硫酸を結合するＤ220ＥＡＳＧ224に隣接するＯ結合型グリコシル化により立体的に妨げられることを示唆した。ＳＺＰにおけるコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の存在を、35Ｓ標識ならびにケラタナーゼおよびコンドロイチンリアーゼＡＢＣを用いた消化後の放出により確認した。しかし、ＳＺＰ分子量における顕著な変化を、この消化後には観察せず、少量の置換のみをおそらく観察することを示唆した。グリコサミノグリカンのいずれかを、トリボネクチンに結合体化することが可能である。
【０１２２】
トリボネクチンおよびＳＺＰは、ＭＳＦエキソン１、３および６〜１２、ならびに代替のスプライスされたエキソン２〜５を共有する類似の分子である。類似の初期構造に関わらず、２つのタンパク質との間の翻訳後改変における相違を検出した。Ｏ結合型潤滑部分β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃの存在を、本明細書中で記載されるトリボネクチンについてと同様に、ＳＺＰに対して検出しなかった。トリボネクチンとＳＺＰとの間の分子量における相違を、ＳＺＰに対して開発された抗体（表在性帯域の（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｚｏｎｅ）軟骨細胞から生成した）を用いたウェスタンブロッティングにより支持した。
【０１２３】
（屈指−関節症−心膜炎症候群（ＣＡＰ））
インサイチュハイブリダイゼーション実験で、両方のＢＡＣクローンプローブが、同じ位置に独立して局在することから、トリボネクチンをコードするＤＮＡ配列が、染色体１ｑ２５に存在することを示した。Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のブールサーチで、同じ座に遺伝的にマップされた１つの関節炎疾患を明らかにした。屈指−関節症−心膜炎症候群（ＣＡＰ）は、一つ以上の指間関節（ｉｎｔｅｒ−ｐｈａｌａｎｇｅａｌ  ｊｏｉｎｔ）（屈指）の若年性発症大関節非炎症性関節症（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｏｎｓｅｔ  ｌａｒｇｅ  ｊｏｉｎｔ  ｎｏｎ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）および先天的非外傷性屈曲拘縮により特徴付けられる。この常染色体上に受け継がれた疾患を有する患者由来の滑膜および腱滑膜組織の組織病理学的様子は、Ｂ型滑膜細胞過形成（Ｂ−ｔｙｐｅ  ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）および終期（ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ）線維症の組織病理学的様子である。ＣＡＰ症候群は、早発性関節摩耗（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｊｏｉｎｔ
ｗｅａｒ）を生じる、効果のない潤滑の直接の結果である。ＣＡＰを患う数人の患者はまた、心膜炎を発症する。単離された天然に存在するまたは合成性トリボネクチンは、ＣＡＰを処置するため、および心膜組織を潤滑させるために有用である。ＣＡＰを、ＭＳＦ遺伝子における変異体を検出することにより診断する。
【０１２４】
他の実施形態は、上記の請求の範囲内にある。
【図２】
2014144015.tif 000011
【図３】
2014144015.tif 000012
【図１】
2014144015.tif 000013
【配列表】
2014144015000001.app
【外国語明細書】
2014144015000001.pdf