(57)【要約】      （修正有）【課題】レチノイン酸受容体を活性化し、皮脂腺からの皮脂分泌を抑制する作用を有する効果等を発揮し得る医薬品、医薬部外品又は化粧料として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である、新規なレチノイン酸様剤の提供。【解決手段】ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を有効成分とするレチノイン酸様剤。さらに、ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤、ニキビ改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とするレチノイン酸様剤。
【請求項２】
ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
【請求項３】
ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とするニキビ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸様剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸（retinoic acid）及びその類縁化合物であるレチノイド（retinoid）は、生体内で形態形成制御作用、細胞の分化増殖制御作用等を発揮することが知られている。レチノイン酸には、オールトランスレチノイン酸（トレチノイン）、９シスレチノイン酸（アリトレチノイン）、１３シスレチノイン酸（イソトレチノイン）等の立体異性体が存在する。
【０００３】
レチノイン酸は、核内受容体であるレチノイン酸受容体（retinoic acid receptor;RAR）及びレチノイドＸ受容体（retinoid X receptor;RXR）の天然リガンドである。レチノイン酸が生体内でＲＡＲ及びＲＸＲに結合すると、ＲＡＲとＲＸＲはヘテロ二量体を形成する。これがリガンド誘導性転写因子として、標的遺伝子群のプロモーターに結合することにより、標的遺伝子群の発現を転写レベルで制御する。
【０００４】
ＲＡＲ及びＲＸＲには３つのサブタイプ（α、β、γ）が存在し、皮膚では主としてＲＡＲγとＲＸＲαが発現していることが知られている（非特許文献１、２）。ＲＡＲγは角化細胞の分化抑制に関わっており、ＲＡＲγ選択的アゴニストの一つであるアダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）は、ＲＡＲγに特異的に結合し、表皮角化細胞の分化を抑制することで、尋常性ざ瘡（ニキビ）の初発疹である面ぽうを治療できると云われている。
また、レチノイン酸及びレチノイドを外用すると、脂腺細胞の増殖・分化、ＩＬ−１やＴＮＦ−αの産生に関与するＰＰＡＲを制御することで、脂腺からの皮脂分泌を抑制できると云われている。
【０００５】
更に、レチノイン酸を多量に外用すると、表皮のターンオーバー（角化）が速まり、激しい落屑が見られ、同時に表皮基底層周辺のメラニンの排出が促され、２週間程度の短期間で劇的な表皮メラニンの減少が認められること（非特許文献３、４）、レチノイン酸は、真皮線維芽細胞のコラーゲン産生促進、ＭＭＰ抑制等の作用により光老化による真皮菲薄化（肌老化）を抑制することが報告されている（非特許文献５〜７）。
このようなことから、特に皮膚においてＲＡＲγを活性化し、レチノイン酸様作用を発揮できれば、皮脂分泌の抑制、ニキビ、皮膚の老化症状、表皮内色素沈着の予防・改善等に有用であると考えられる。
【０００６】
一方、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）は、マメ科（Fabaceae）に属する植物で便秘、咳や痰、強壮、抗マラリア、百日咳の治療に、有用なことが知られている。
しかしながら、ムラサキツメクサとレチノイン酸様活性との関係については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Elder et al.,J Invest Dermatol.1992;98(6 Suppl):36S-41S
【非特許文献２】Mangelsdorf et al.,Genes Dev.1992;6(3):329-44
【非特許文献３】Xiao,J.H et al., EMBO J 18 1999:1539-1548
【非特許文献４】Yoshimura,K.et al.,Plast Reconstr Surg 2000;105:1097-1108
【非特許文献５】Griffiths CE et al.,Skin Pharmacol.1993;6(suppl 1):70-77
【非特許文献６】Kligman AM et al.,Skin Pharmacol.1993;6(Suppl 1):78-82
【非特許文献７】Kligman,A et al.,J.Am.Acad.Dermatol.1986;15:836-859
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、レチノイン酸様剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＲＡＲγの分子構造内にあるligand binding domain（ＬＢＤ）を利用し、ＲＡＲγのＬＢＤへ物質（リガンド）が結合した時にのみ、細胞からルシフェラーゼが発せられるような系を構築し、ＲＡＲγに結合することでその活性を高める、すなわちレチノイン酸様作用を発揮する物質について鋭意研究したところ、ムラサキツメクサに優れたレチノイン酸様活性があることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（３）に係るものである。
（１）ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とするレチノイン酸様剤。
（２）ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
（３）ムラサキツメクサ、又はその抽出物を有効成分とするニキビ改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のレチノイン酸様剤等は、ＲＡＲγを活性化し、皮脂腺からの皮脂分泌を抑制する作用を有する効果等を発揮し得る医薬品、医薬部外品又は化粧料として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レチノイン酸又はＲＡＲγ選択的アゴニストを添加したハムスター初代培養皮脂腺細胞によるＮｉｌｅ  Ｒｅｄ蛍光強度を示す図である。
【図２】植物抽出物を添加したハムスター皮脂腺細胞によるＮｉｌｅ  Ｒｅｄ蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「レチノイン酸様」或いは「レチノイン酸様活性」とは、ＲＡＲ及びＲＸＲ、特にＲＡＲγへの結合、これの活性化等、レチノイン酸と同様の生理活性を意味する。
【００１４】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００１５】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１６】
本明細書において、ムラサキツメクサは、マメ科（Fabaceae）シャジクソウ属（Trifolium）に属するTrifolium pratenseを指す。
【００１７】
斯かるムラサキツメクサは、いずれの任意の部位、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子等、又はそれらの組み合わせを使用することができるが、好ましくは地上部、より好ましくは葉または花を使用する。
斯かるムラサキツメクサは、そのまま又は乾燥・粉砕等して用いることができる。また、上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。該抽出物は天然成分由来であり安全性も高い。
【００１８】
抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１００〜４００ｒｐｍ／ｍｉｎで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
【００１９】
抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。
【００２０】
抽出のための溶剤としてアルコール−水混合液を使用する場合には、アルコール類と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０が更に好ましく、３０〜７０：７０〜３０が更により好ましく、４０〜６０：６０〜４０がなお好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が、好ましくは４０容量％以上、より好ましくは４５容量％以上である。そして、好ましくは６０容量％以下、より好ましくは５５容量％である。また好ましくは４０〜６０容量％、より好ましくは４５〜５５容量％である。
【００２１】
溶剤の使用量としては、ムラサキツメクサ（乾燥質量換算）１ｇに対して好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは８ｍＬ以上である。そして好ましくは１００ｍＬ以下、より好ましくは５０ｍＬ以下である。また、好ましくは１〜１００ｍＬ、より好ましくは８〜５０ｍＬである。抽出時間としては、好ましくは１分間以上、より好ましくは１０分間以上である。そして好ましくは１００日間以下、より好ましく３日間以下である。また好ましくは１分間〜１００日間、より好ましくは１０分間〜３日間である。このときの抽出温度は、好ましくは０℃以上、より好ましくは２０℃以上、更に好ましくは４０℃以上である。そして好ましくは溶媒沸点以下、より好ましくは１００℃以下、更に好ましくは９０℃以下である。また、好ましくは０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃、更に好ましくは４０〜９０℃である。
【００２２】
斯くして得られるムラサキツメクサの抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２３】
上記ムラサキツメクサの抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、更に得られた粗精製物を既知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２４】
後記実施例で示すとおり、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、ＲＡＲγの分子構造内にあるligand binding domain(LBD)を利用したin vitro評価系において優れたレチノイン酸様活性を示した。
当該評価系は、リガンドのＬＢＤへの結合、すなわちＲＡＲγの活性化を、リガンドがＬＢＤに結合する際に発生するルシフェラーゼ活性を指標として判別することにより、レチノイン酸様活性の評価を可能にしたものである。
【００２５】
また、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、皮脂腺細胞において皮脂の分泌を抑制する作用を示した。
そして、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、ＲＡＲγに結合し、これを活性化することが有用と考えられる各種症状の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。例えば、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、ニキビ等の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。
【００２６】
従って、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、レチノイン酸様活性のために、皮脂の分泌抑制のために、或いはニキビの予防、改善又は治療のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２７】
すなわち、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、レチノイン酸様剤、皮膚外用剤（以下、レチノイン酸様剤等）として使用することができ、更にこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該レチノイン酸様剤等には、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２８】
当該レチノイン酸様剤等は、それ自体、レチノイン酸様活性、皮脂の分泌抑制、ニキビ、皮膚の老化症状、シミの予防、改善又は治療効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料又は食品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
食品としては、レチノイン酸様活性、皮脂の分泌抑制、ニキビ、シワやハリの低下等の皮膚の老化症状、くすみ、シミ等のメラニン色素性疾患の予防、改善又は治療等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
【００２９】
ここで、上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、バップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤（歯磨剤、液状歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム、口腔用軟膏、うがい用錠剤、トローチ、のど飴等）等のいずれかでもよい。投与形態も経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）のいずれであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、当該レチノイン酸様剤等を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３０】
これらの投与形態のうち、好ましい形態は非経口投与であり、上記製剤中の上記ムラサキツメクサ又はその抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上である。そして、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。また、好ましくは０．００００１〜１０質量％、より好ましくは０．０００１〜１質量％である。
【００３１】
上記食品は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、当該レチノイン酸様剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の上記ムラサキツメクサ又はその抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％である。そして、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは８０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜８０質量％である。
【００３２】
上記医薬品等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、非経口投与の場合成人１人当たり、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上である。そして好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ以下、特に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下である。また好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００３３】
上記化粧料（医薬部外品も含む）は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物からなる群より選択される少なくとも１種と、皮膚化粧料に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００３４】
当該化粧料の全量中の、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物の含有量は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
当該化粧料の全量中の、上記ムラサキツメクサ又はその抽出物は、抽出物の乾燥物換算で、通常好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上である。そして好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、更に好ましくは５質量％以下である。また好ましくは０．０００１〜２０質量％、より好ましくは０．００１〜１０質量％、更に好ましくは０．０１〜５質量％である。
【００３５】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を有効成分とするレチノイン酸様剤。
＜２＞ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
＜３＞ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を有効成分とするニキビ改善剤。
＜４＞レチノイン酸様剤を製造するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物の使用。
＜５＞皮脂分泌抑制剤を製造するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物の使用。
＜６＞ニキビ改善剤を製造するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物の使用。
＜７＞レチノイン酸様物質として使用するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物。
＜８＞皮脂分泌抑制に使用するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物。
＜９＞ニキビ改善に使用するための、ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物。
＜１０＞非治療的使用である、＜７＞〜＜９＞のいずれかに記載の使用。
＜１１＞ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を、ヒト若しくは動物に投与又は摂取する皮脂分泌抑制方法。
＜１２＞ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）、又はその抽出物を、ヒト若しくは動物に投与又は摂取するニキビ改善方法。
＜１３＞非治療的方法である、＜１１＞又は＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞前記＜１＞〜＜１３＞において、上記ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）の使用部位は、好適には地上部、より好適には葉または花を用いる。
＜１５＞前記＜１＞〜＜１４＞において、上記ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）の抽出物を得るための抽出溶剤は、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が好ましく、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンがより好ましい。
＜１６＞前記＜１＞〜＜１５＞において、上記ムラサキツメクサ（Trifolium pratense）の抽出物を得るための抽出溶剤は、好適にはエタノール水溶液等のアルコール−水混合液であり、エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が、好ましくは４０容量％以上、より好ましくは４５容量％以上である。そして、好ましくは６０容量％以下、より好ましくは５５容量％である。また好ましくは４０容量％以上６０容量％以下、より好ましくは４５容量％以上５５容量％以下である。
【実施例】
【００３６】
実施例１  ＲＡＲγ結合活性作用
＜植物抽出物の調製＞
（製造例）ムラサキツメクサ抽出物の調製
ムラサキツメクサ（Red Clover Flowers/Leaves、新和物産製）５０ｇを細切し、５０（ｖ／ｖ）％エタノール５００ｍＬを加え、８５℃で２回抽出（１回目：２時間、２回目：１時間）した後に、濾過し、溶媒を除き、固形分６．７ｇを得た。この固形分を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるように希釈し、ムラサキツメクサ抽出物を調製した。
【００３７】
＜評価方法＞
１）ｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγの作成
先ず、ヒトの皮膚組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰｖｕＩとＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを含む、表１に示すプライマーを利用して、ＲＡＲγのＬＢＤを含む領域をＰＣＲにより増幅した。
【００３８】
【表１】
2014094911.tif 000002
【００３９】
表１のプライマーで増幅したＰＣＲ産物とＰｖｕＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＩＮＤ−ＲＡＲγを、In Fusion Advantage PCR Cloning Kit（タカラバイオ社）を用いてライゲーションした。その後、Ｐｒｏｍｅｇａ社の示すプロトコールに従い、JM109 Competent Cells(Promega社)にトランスフォーメーションし、目的のプラスミドが導入された大腸菌から、EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN社)を用いてプラスミドを抽出した。
なお、pBIND-RARγ及びpGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro]はPromega社より購入した。
【００４０】
２）細胞培養
ヒト腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３は、10% Fetal Bovine Serum(FBS)を含むＤＭＥＭ中で培養を行った（３７℃、５％ＣＯ2）。
【００４１】
３）ＨＥＫ２９３へのプラスミドの導入とＲＡＲγアゴニストの添加
ＨＥＫ２９３を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度になるように播種した。その１２時間後に培養液（５％チャコール処理ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ）を交換し、pBIND-RARγとpGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro]を、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)を用いて、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入から２４時間後に、コントロール溶媒（0.1% Dimethyl sulfoxideを含む培養液）、陽性対照であるadapalene(Tocris Bioscience社)（終濃度１０ｎＭ）、上記製造例で調製した植物抽出物（終濃度０．１、０．５又は１（ｖ／ｖ）％）をそれぞれ含む培養液と置換し、更に２４時間培養を行った（ｎ＝６）。
【００４２】
４）ルシフェラーゼ活性測定
ホタルルシフェラーゼ（ＲＡＲγのＬＢＤ結合活性の指標）及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ導入効率の指標）の活性測定には、Dual GloTM Luciferase Assay System(Promega社)を用い、添付のプロトコールに従い行った。ホタルルシフェラーゼの活性を、ウミシイタケルシフェラーゼの活性で除し、補正した値を相対的発光強度(RLU:Relative Luminescence Unit)とした。
ｐＥＲＥ（ホタルルシフェラーゼ）はＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より購入した。ｐＲＬ−ＣＭＶ（ウミシイタケルシフェラーゼ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入した。
それぞれの活性値は、陽性対照におけるＲＬＵを１００とした場合の相対値として示した。結合活性作用の評価は陰性対照であるコントロール溶媒を添加した際の結合活性値と比較して行った。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2014094911.tif 000003
【００４４】
＜結果＞
ＨＥＫ２９３細胞からの蛍光強度を測定したところ、上記植物抽出物を培養液に添加した細胞群では、その蛍光強度がコントロール溶媒を添加した群に比べ増加していた。実施例にて測定した蛍光は、ＲＡＲγのＬＢＤへの結合能を反映していることから、上記抽出物にレチノイン酸様の活性があることが確認された。
【００４５】
参考例１  レチノイン酸及びＲＡＲγ選択的アゴニストの皮脂分泌抑制作用
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ、和光純薬工業社）、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、ＢＭＳ９６１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をそれぞれ、０．１％、１００μＭ、１０ｎＭ、１０ｎＭとなるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した（ｎ＝６）。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、５％ＣＯ2の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
【００４６】
＜結果＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞からの蛍光強度を測定したところ、コントロール群と比較して、ａｔＲＡ、ａｄａｐａｌｅｎｅ、又はＢＭＳ９６１を添加した群では、その蛍光強度は有意に減少していた。統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊＊＊：ｐ＜０．００１）。その結果を図１に示す。
【００４７】
図１から、レチノイン酸及びＲＡＲγ選択的アゴニストは皮脂の分泌抑制に有効であることが確認された。なお、これまでにアダパレンによる皮脂分泌抑制作用は明らかにされていないが、レチノイン酸及び他のＲＡＲγ選択的アゴニストと同様、有意に皮脂腺からの皮脂分泌を抑制することが確認された。
【００４８】
実施例２  植物抽出物の皮脂分泌抑制作用
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、陰性対照であるDimethyl sulfoxide（コントロール）、陽性対照であるアダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、又は上記製造例で調製した植物抽出物をそれぞれ１（ｖ／ｖ）％となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した（ｎ＝３）。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、５％ＣＯ2の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
【００４９】
＜結果＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞からの蛍光強度を測定したところ、コントロール群と比較して、製造例で調製した植物抽出物を添加した群では、その蛍光強度は統計的に有意に減少していた。統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。その結果を表３及び図２に示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
上記で測定した蛍光は、中性脂質に結合したＮｉｌｅ  Ｒｅｄから発せられるものであり、皮脂を構成する脂質の大半が中性脂質であることから、皮脂腺細胞中の皮脂量を反映していると考えられる。よって、上記植物抽出物は皮脂分泌抑制作用を有していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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