(57)【要約】【課題】優れた作用を有し、かつ安全性の高い、コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用の提供。【解決手段】パイナップル抽出物を含有するコラーゲン産生促進剤、パイナップル抽出物を含有する線維芽細胞増殖促進剤、パイナップル抽出物を含有するフィラグリン産生促進剤、パイナップル抽出物を含有するトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、パイナップル抽出物を含有するオクルディン産生促進剤、パイナップル抽出物を含有する最終糖化産物形成抑制剤、パイナップル抽出物を含有するＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項３】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤。
【請求項５】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするオクルディン産生促進剤。
【請求項６】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とする最終糖化産物形成抑制剤。
【請求項７】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生促進剤。
【請求項８】
パイナップル抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パイナップル抽出物を含有する、コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、皮膚線維芽細胞、及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、これら皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより、水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
ところが、紫外線（ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ）の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄、過酸化水素との接触等の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生量が減少すると共に、架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、きめの消失、弾力性の低下等には、様々な要因が挙げられているが、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分の減少及び変性、並びに線維芽細胞の増殖能の低下も関与している。したがって、コラーゲンの産生を促進することにより、また、線維芽細胞の増殖を促進することにより、皮膚の老化を防止及び改善することができると考えられる。
【０００３】
そこで、コラーゲン産生促進作用、皮膚線維芽細胞増殖作用を有する物質を安全性の点で有利な天然物から取得しようという試みがなされている。コラーゲン産生促進作用を有するものとして、例えば、スターフルーツ葉抽出物（特許文献１参照）、クスノハガシワ抽出物（特許文献２参照）などが確認されている。また、線維芽細胞増殖作用を有するものとして、例えば、月桃葉抽出物（特許文献３参照）、オニイチゴ抽出物（特許文献４参照）などが確認されている。
【０００４】
天然保湿因子（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが報告されている（非特許文献１参照）。
近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが報告されている（非特許文献２参照）。
したがって、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進を通じて、フィラグリンの合成を促進することによって角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
【０００５】
天然物由来のフィラグリン合成促進剤として、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）、又、天然物由来のプロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進剤の少なくともいずれかとして、Ｃｉｔｒｕｓ属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）などが提案されている。
【０００６】
表皮は、角化細胞の分裂とその後の分化により、常に新しい角質細胞を作り出すことで、外界からの種々の刺激から皮膚を守る防御機能を有する。特に、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン等のタンパク質が発現し、酵素トランスグルタミナーゼ−１の作用によって架橋され、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（以下「ＣＥ」と略記する）を形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生量が減少すると、ＣＥ形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生を高め、ＣＥの形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。
【０００７】
天然物由来のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤として、ノニ抽出物（特許文献８参照）、ローヤルゼリー抽出物（特許文献９参照）などが提案されている。
【０００８】
以前は、皮膚のバリア機能は角層のみが担っていると考えられていたが、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション（以下「ＴＪ」と略記する。）の構成タンパク質を遺伝子レベルで欠損させると皮膚のバリア機能が崩壊することから、近年、ＴＪも皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられている（非特許文献４参照）。ＴＪは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞の隙間をシールすることで物質の透過を制御する結合装置である。ＴＪを構成しているのは、細胞膜タンパク質のクローディンやオクルディンであり、これらのタンパク質はＴＪストランドの骨格を構成し、ＴＪのバリア機能を制御すると考えられている（非特許文献５参照）。以上のことから、クローディンやオクルディンの発現が何らかの原因で減少した場合、ＴＪの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状の原因となると予想される。
【０００９】
したがって、表皮においてクローディンやオクルディンの産生を促進することにより表皮角化細胞のＴＪ形成を促すことで、皮膚のバリア機能及び水分保持機能を高め、前記皮膚症状を予防又は改善することができると考えられる。このような考えに基づき、ＴＪ形成促進作用を介して皮膚バリア機能を向上させるものとして、天然物由来のオウレン抽出物（特許文献１０参照）、トウヒ抽出物（特許文献１１参照）などが提案されている。
【００１０】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特にグルコースなどの還元糖が反応して褐色色素を生成する反応をメイラード反応という。メイラード反応の最終産物として生成する物質を最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＧＥｓ」ともいう）という。メイラード反応は、アミノ基とグルコースが非酵素的に反応しシッフ塩基を形成し、ついでアマドリ転位を起こす早期反応、更に３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのジカルボニル基を有する活性中間体を生成する中期反応、活性中間体が更にアミノ基と非酵素的に反応し、脱水、縮合反応を繰り返してＡＧＥｓ形成する後期反応からなる。
ＡＧＥｓとしてはイミダゾロン（非特許文献６参照）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）（非特許文献７参照）、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、メチルグリオキサールリシンダイマー、グリオキサールリシンダイマーなどが同定されている。イミダゾロンは３−ＤＧがアルギニンと反応して生成する（非特許文献６参照）。
【００１１】
ＡＧＥｓが発症、進展に関与している病態の一つして、老化症状がある（非特許文献６、７参照）。生体組織におけるメイラード反応の進行により、皮膚組織においては皮膚弾性繊維の架橋などによる老化(弾性低下)を招き、又、血管壁組織や神経原線維へのＡＧＥｓの沈着により動脈硬化やアルツハイマー病を招くともいわれている（特許文献１２参照）。
【００１２】
ＡＧＥｓ生成抑制作用を有する天然物由来のものとしては、マメ科ディアリウムインダムの果皮抽出物が提案されている（特許文献１２参照）。
また、ＡＧＥｓ生成抑制作用を有する化合物として、例えばアミノグアニジン、ＯＰＢ−９１９５、ピリドキサミンなどの化合物が知られているが、これら化合物は副作用等の問題を有している（非特許文献６〜８参照）。
【００１３】
このように、コラーゲン産生、線維芽細胞増殖、フィラグリン産生、トランスグルタミナーゼ産生、オクルディン産生、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）を促進することのできる物質や、ＡＧＥｓ形成を抑制することのできる物質は、皮膚の老化に伴う、シワ、きめの消失、弾力性の低下、水分保持能の低下、バリア機能の低下等の予防及び治療において非常に有用であると考えられる。しかしながら、現在までのところ、コラーゲン産生、線維芽細胞増殖、フィラグリン産生、トランスグルタミナーゼ産生、オクルディン産生、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の少なくともいずれかの促進作用又はＡＧＥｓ形成抑制作用を有し、かつ安全性が高く、そのため、皮膚外用剤、美容用飲食品、研究用試薬などの成分として広く利用が可能な優れた物質は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【００１４】
また、近年、消費者の健康に対する意識はますます高まりを見せている。一方で、現代社会には、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレス等、免疫機構にダメージを与える要因が氾濫している。このようにして免疫力が低下することにより、癌、感染症、アレルギー症状等の各種疾患が誘発されることが知られており、逆に免疫力を賦活することによれば、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、更には体調リズムの回復・恒常性維持など、様々な効果が期待できる。
【００１５】
免疫機構には多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きく、中でもマクロファージは免疫応答の初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。例えば、マクロファージは、生体内に侵入した細菌やウイルス等の異物を摂取し（貪食能）、また、摂取した抗原を細胞表面に表出させる働き（抗原提示能）を有する。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相互作用は、白血球が分泌する微量タンパク質であるサイトカインによって担われることが分かってきている。
【００１６】
サイトカインには多くの種類があり、中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）に代表される炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出される。
ＴＮＦ−αの産生促進は、免疫賦活の指標の一つとされており、腫瘍に対する免疫作用の強化や、直接的な抗腫瘍効果、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランス改善によるとされるアレルギー性疾患の改善効果や免疫賦活作用などが知られている（特許文献１３参照）。  
【００１７】
従来、天然物由来のＴＮＦ−α産生促進剤として、例えば、ユキノシタ科スグリ属に属する植物からの抽出物（特許文献１４参照）等が提案されている。また、前記した以外にも、多くの天然物について免疫賦活作用が研究され、効果が認められたいくつかの素材や抽出物が、健康食品等の原料として既に実用化されている。しかしながら、これらの中には免疫賦活活性が不十分であったり、安全性が十分に確認されていないものなども存在し、したがって、優れた免疫賦活作用を有し、かつ、安全性が高く、飲食品等に広く利用可能な免疫賦活剤の提供は、未だ求められているのが現状である。
【００１８】
一方、パイナップル抽出物は、ヒドロキシ脂肪酸誘導体を含むことが知られており（特許文献１５参照）、更に、前記パイナップル抽出物はＥＧＦ産生促進作用（特許文献１５参照）、ＦＧＦ−２産生促進作用（特許文献１５参照）、フィブロネクチン産生促進作用（特許文献１５参照）、ラミニン−５産生促進作用（特許文献１６参照）、表皮ヒアルロン酸産生促進（特許文献１６参照）、及びヒアルロニダーゼ活性阻害作用（特許文献１６参照）を有することが知られているが、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用、フィラグリン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ産生促進作用、オクルディン産生促進作用、最終糖化産物形成抑制作用、ＴＮＦ−α産生促進作用、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８３７号公報
【特許文献３】特開２００２−００３３９０号公報
【特許文献４】特開２００３−１３７８０１号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献８】特開２０１０−０９００９３号公報
【特許文献９】特開２００９−１８４９５５号公報
【特許文献１０】特開２００７−１７６８３０号公報
【特許文献１１】特開２００７−１７６８３５号公報
【特許文献１２】特開２０１０−１１１６１５号公報
【特許文献１３】特開２００７−１３１５６８号公報
【特許文献１４】特開２００４−１０７６６０号公報
【特許文献１５】特開２０１２−１５８５７３号公報
【特許文献１６】特開２０１２−０９７００８号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】フレグランスジャーナル臨時増刊，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１４−１９（２０００）
【非特許文献２】Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２８８，ｐｐ．４４２−４４６（１９９６）
【非特許文献３】Ｈａｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７７，ｐｐ．４６６１６−４６６２１（２００２）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５６，ｐｐ．１０９９−１１１１（２００２）
【非特許文献５】日本香粧品科学会誌，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．２９６−３０１（２００７）
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１２７２−１２８０（１９９７）
【非特許文献７】Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．１３０３−１３０９（１９９６）
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．２１１７７−２１１８４（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたコラーゲン産生促進作用を有し、安全性の高いコラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。本発明は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有し、安全性の高い線維芽細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。本発明は、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することを目的とする。本発明は、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、安全性の高いトランスグルタミナーゼ産生促進剤を提供することを目的とする。本発明は、優れたオクルディン産生促進作用を有し、安全性の高いオクルディン産生促進剤を提供することを目的とする。本発明は、優れた最終糖化産物形成抑制作用を有し、安全性の高い最終糖化産物形成抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れたＴＮＦ−α産生促進作用を有し、安全性の高いＴＮＦ−α産生促進剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れたヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有し、安全性の高いヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、パイナップル抽出物が、優れたコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用、フィラグリン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、オクルディン産生促進作用、最終糖化産物形成抑制作用、ＴＮＦ−α産生促進作用、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有し、コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤としての用途に適することを知見した。
【００２３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤である。
＜２＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤である。
＜３＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤である。
＜４＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤である。
＜５＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするオクルディン産生促進剤である。
＜６＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とする最終糖化産物形成抑制剤である。
＜７＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生促進剤である。
＜８＞  パイナップル抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のコラーゲン産生促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたコラーゲン産生促進作用を有し、安全性の高いコラーゲン産生促進剤を提供することができる。
本発明の線維芽細胞増殖促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有し、安全性の高い線維芽細胞増殖促進剤を提供することができる。
本発明のフィラグリン産生促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することができる。
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、安全性の高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することができる。
本発明のオクルディン産生促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたオクルディン産生促進作用を有し、安全性の高いオクルディン産生促進剤を提供することができる。
本発明の最終糖化産物形成抑制剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れた最終糖化産物形成抑制作用を有し、安全性の高い最終糖化産物形成抑制剤を提供することができる。
本発明のＴＮＦ−α産生促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたＴＮＦ−α産生促進作用を有し、安全性の高いＴＮＦ−α産生促進剤を提供することができる。
本発明のヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤によると、前記従来における諸問題を解決することができ、優れたヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有し、安全性の高いヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤）
本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、パイナップル抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００２６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記コラーゲン産生促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記線維芽細胞増殖促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記フィラグリン産生促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
本発明のオクルディン産生促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記オクルディン産生促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
本発明の最終糖化産物形成抑制剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記最終糖化産物形成抑制剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記ＴＮＦ−α産生促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
本発明のヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、前記パイナップル抽出物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含むものであってもよい。前記ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤中の前記パイナップル抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
＜パイナップル抽出物＞
前記パイナップル抽出物は、ヒドロキシ脂肪酸誘導体として、下記構造式（１）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体を主成分として含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有する。前記パイナップル抽出物は、下記構造式（２）〜（５）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体の少なくともいずれかを更に含有することが好ましい。
【００３５】
【化１】
2014218481.tif 000002
【００３６】
【化２】
2014218481.tif 000003
【００３７】
【化３】
2014218481.tif 000004
【００３８】
【化４】
2014218481.tif 000005
【００３９】
【化５】
2014218481.tif 000006
【００４０】
前記パイナップル抽出物は、パイナップル可食部を溶媒により抽出することにより得られることが好ましく、パイナップル可食部の圧搾後の残渣を溶媒により抽出することにより得られることがより好ましい。
【００４１】
＜＜ヒドロキシ脂肪酸誘導体＞＞
前記構造式（１）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数２０の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基としてスフィンゴシン（２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール）の８位が２重結合となった２−アミノ−４，８−オクタデシジエン−１，３−ジオールからなる、化学式：Ｃ４４Ｈ８３ＮＯ９のヒドロキシ脂肪酸誘導体である。
前記構造式（２）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数１８の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基として２−アミノ−８−オクタデシジエン−１，３−ジオールからなる、化学式：Ｃ４４Ｈ７９ＮＯ９のヒドロキシ脂肪酸誘導体である。
前記構造式（３）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数２４の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基として２−アミノ−４−オクタデセン−１，３，４−トリオールからなる、化学式：Ｃ４９Ｈ９５ＮＯ１０のヒドロキシ脂肪酸誘導体である。
前記構造式（４）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数２５の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基として２−アミノ−４−オクタデセン−１，３，４−トリオールからなる、化学式：Ｃ５０Ｈ９７ＮＯ１０のヒドロキシ脂肪酸誘導体である。
前記構造式（５）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数２６の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基として２−アミノ−４−オクタデセン−１，３，４−トリオールからなる、化学式：Ｃ５１Ｈ９９ＮＯ１０のヒドロキシ脂肪酸誘導体である。
【００４２】
−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の同定方法−
前記ヒドロキシ脂肪酸誘導体の同定方法としては、特に制限はなく、常法により行うことができる。例えば、ＴＣＬ分析により、単糖をもった糖脂質であるモノヘキソシルセラミド（ＣＭＨ）の分子骨格を有することを確認し、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析などの質量分析によって測定した分子量と、先の分子骨格情報から、分子構造を推定する。続いて、前記ヒドロキシ脂肪酸誘導体を加水分解することにより、構成単位であるグルコシル基と、脂肪酸と、スフィンゴイド塩基とに分解し、脂肪酸部分及びスフィンゴイド塩基部分についてそれぞれ構造解析を行い、推定した分子構造情報と併せて、ヒドロキシ脂肪酸誘導体の分子構造を決定することができる。
前記脂肪酸部分及びスフィンゴイド塩基部分の同定方法としては、ＧＣ−ＭＳ分析などの質量分析により行うことができる。
【００４３】
前記パイナップル抽出物中のヒドロキシ脂肪酸誘導体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、少なくとも１０質量％であることが好ましく、少なくとも２０質量％であることがより好ましい。
【００４４】
＜＜パイナップル＞＞
パイナップル（Ｐｉｎａｐｐｌｅ）は、パイナップル科アナナス属に属する多年生の植物で、学名：Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．乃至Ａｎａｎａｓ ｓａｔｉｖｕｓ  Ｓｃｈｕｌｔであり、中国では鳳梨とも呼ばれている。果実は大角形で多肉、黄色く熟し芳香を放ち、食用として用いられる。パイナップルの産地は、米国、フィリピン、マレーシア、ブラジル、オースラリアなどを主としているが、本発明に用いられる抽出物を得るにあたっては、その種類や産地は特に限定されない。
【００４５】
前記パイナップル抽出物の抽出原料としては、果肉、果芯部（芯）などのパイナップル可食部であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、パイナップル可食部の圧搾後の残渣、即ち、パイナップル果汁を採取した後に残留した繊維質（パイナップルパルプ）が特に好ましい。
前記抽出原料は、採取後、洗浄して乾燥し、粉砕したものを用いることが好ましい。ここで、乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を使用して行ってもよい。
【００４６】
前記パイナップル抽出物は、前記パイナップル可食部を、前記溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより容易に得ることができる。
【００４７】
＜＜溶媒＞＞
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール；ヘキサン；低級脂肪族アルコール、低級脂肪族ケトン、多価アルコールなどの親水性有機溶媒と水との混合溶媒などが挙げられる。これらの中でも、親水性有機溶媒と水との混合溶媒が好ましい。前記親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、メタノール、エタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールなどが好ましく、エタノールがより好ましい。
水と親水性有機溶媒との混合溶媒において、前記親水性有機溶媒として低級脂肪族アルコールを用いる場合、前記低級脂肪族アルコールの前記混合溶媒における含有量としては、１０体積％〜１００体積％が好ましく、７０体積％〜１００体積％がより好ましく、９０体積％が特に好ましい。前記親水性有機溶媒として低級脂肪族ケトンを用いる場合、前記低級脂肪族ケトンの前記混合溶媒における含有量としては、１０体積％〜８０体積％が好ましい。前記親水性有機溶媒として多価アルコールを用いる場合、前記多価アルコールの前記混合溶媒における含有量としては、１０体積％〜９０体積％が好ましい。
【００４８】
前記パイナップル抽出物の抽出方法としては、前記パイナップル可食部に含まれる脂溶性成分を前記溶媒に溶出させることが可能であれば、特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。また、抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温乃至還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
具体的には、前記パイナップル抽出物の抽出方法としては、例えば、エタノール水溶液などの前記溶媒を満たした処理槽に、パイナップル可食部を圧搾した後の残渣（パイナップルパルプ）などの前記抽出原料を投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過して脂溶性成分を溶出した後、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、更に同様の濾過処理を行い、目的とするヒドロキシ脂肪酸誘導体含有物を得る方法が挙げられる。
この際、抽出条件は、前記抽出原料などに応じて適宜調整し得るが、前記抽出溶媒量は、前記抽出原料としてのパイナップル可食部に対して５倍量〜２０倍量（質量比）が好ましく、抽出時間は１時間〜３時間が好ましく、抽出温度は２０℃〜９５℃が好ましい。
【００４９】
なお、得られた前記パイナップル抽出物は、前記パイナップル抽出物の希釈物、濃縮物、乾燥物、粗精製物、精製物などを得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製などの処理を施してもよい。
また、得られた前記パイナップル抽出物は、そのままでも前記コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤のいずれかとして使用することができるが、利用しやすい点で、前記濃縮液、前記乾燥物が好ましい。前記乾燥物を得るに当たって、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリンなどのキャリアーを加えてもよい。
【００５０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、などが挙げられる。
【００５１】
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸、などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、などが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール、などが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸、などが挙げられる。また、前記矯味剤乃至矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸、などが挙げられる。
【００５２】
なお、本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じてコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用、フィラグリン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、オクルディン産生促進作用、最終糖化産物形成抑制作用、ＴＮＦ−α産生促進作用、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれかを有する他の天然抽出物などを共に配合して用いることができる。
【００５３】
前記コラーゲン産生促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、コラーゲン産生促進作用を発揮する。
前記線維芽細胞増殖促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、線維芽細胞増殖促進作用を発揮する。
前記フィラグリン産生促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、フィラグリン産生促進作用を発揮する。
前記トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮する。
前記オクルディン産生促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、オクルディン産生促進作用を発揮する。
前記最終糖化産物形成抑制剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、最終糖化産物形成抑制作用を発揮する。
前記ＴＮＦ−α産生促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮する。
前記ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、有効成分として含有される前記パイナップル抽出物の作用により、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮する。
【００５４】
本発明のコラーゲン産生促進剤によると、優れたコラーゲン産生促進作用を通じて、例えば、シワの形成及び皮膚バリア機能の低下を予防及び改善することが可能となる。ただし、本発明のコラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にもコラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００５５】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤によると、優れた線維芽細胞増殖促進作用を通じて、例えば、皮膚線維芽細胞の細胞分裂乃至成長を促進し、シワの形成及び皮膚バリア機能の低下を予防及び改善することが可能となる。ただし、本発明の線維芽細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００５６】
本発明のフィラグリン産生促進剤によると、優れたフィラグリン産生促進作用を通じて、例えば、角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を維持することで、肌機能の低下を予防及び改善することが可能となる。ただし、本発明のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００５７】
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤によると、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、コーニファイドエンベロープの形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れを予防及び改善することが可能となる。ただし、本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、これらの用途以外にもトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００５８】
本発明のオクルディン産生促進剤によると、優れたオクルディン産生促進作用を通じて、表皮角化細胞のＴＪ形成を促すことで、皮膚のバリア機能及び水分保持機能を高め、肌の乾燥や肌荒れを予防及び改善することが可能となる。ただし、本発明のオクルディン産生促進剤は、これらの用途以外にもオクルディン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００５９】
本発明の最終糖化産物形成抑制剤によると、優れた最終糖化産物形成抑制作用を通じて、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）の沈着による皮膚弾性繊維の架橋などによる老化(弾性低下)を防ぐことが可能となる。ただし、本発明の最終糖化産物形成抑制剤は、これらの用途以外にも最終糖化産物形成抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００６０】
本発明のＴＮＦ−α産生促進剤によると、優れたＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、腫瘍に対する免疫作用の強化や、抗腫瘍効果、アレルギー性疾患の改善や免疫系を賦活化することが可能となる。ただし、本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、これらの用途以外にもＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００６１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤によると、優れたヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進進作用を通じて、美白作用、及び抗老化作用の強化することが可能となる。ただし、本発明のヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００６２】
本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、優れた作用を有するとともに、その含有成分は食用とされるパイナップルから得られたパイナップル抽出物であり、安全性に優れているため、化粧料や飲食品に配合するのに好適である。
【００６３】
また、本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、優れた作用を有するので、コラーゲン、線維芽細胞増殖、フィラグリン、トランスグルタミナーゼ−１、オクルディン、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）及びＴＮＦ−αの研究や、コラーゲン、線維芽細胞増殖、フィラグリン、トランスグルタミナーゼ−１、オクルディン、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）、ＴＮＦ−α、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）に関連する機能乃至疾患の研究のための試薬として好適に利用できる。
【００６４】
なお、本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００６５】
本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤を飲食品に添加する場合の添加量としては、添加する飲食品に応じて異なり一概には規定できないが、錠剤、カプセル剤などの場合は、１質量％〜９０質量％が好ましく、その他の飲食品では、０．００１質量％〜５０質量％が好ましい。また、添加対象飲食品の一般的摂取量を考慮して、成人一日当たりの前記コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤のいずれかの摂取量が約１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度になるように調製することが好ましい。
【実施例】
【００６６】
以下、製造例及び実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００６７】
（製造例１）
＜パイナップル抽出物の製造＞
パイナップル可食部の圧搾後の残渣（パイナップルパルプ）１００ｇを９０体積％エタノール１，０００ｍＬに加え、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。その後、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、更に同様の濾過処理を行った。得られた残渣について５００ｍＬの水で洗浄し、ペースト状のパイナップル抽出物１．５ｇを得た。抽出物の収率は、１．５（質量％）であった。
【００６８】
得られたパイナップル抽出物について、以下の通り成分分析を行った。
−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の測定−
前記パイナップル抽出物を乾燥させた乾燥物１００ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解したものを被験試料として用い、市販のスフィンゴ糖脂質標準品エタノール溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）とともにシリカゲル薄層クロマトグラフィープレートにアプライし、クロロホルム：メタノール混合溶液（９：１、体積比）で展開した。展開後、硫酸を噴霧し、加熱を行い、スフィンゴ糖脂質標準品と同じＲｆ値となるスポットをスフィンゴ糖脂質のスポットとした。薄層クロマトグラフィーの発色強度を、デンシトメーター（株式会社島津製作所製、ＣＳ−９３００ＰＣ）により測定し、得られた標準品の発色強度に基づいて検量線を作成し、試料の発色強度よりスフィンゴ糖脂質量を求めた。測定の結果、前記パイナップル抽出物は、２０質量％のヒドロキシ脂肪酸誘導体を含有することがわかった。
【００６９】
−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の同定−
下記の手順により、得られたヒドロキシ脂肪酸誘導体含有物に含まれるヒドロキシ脂肪酸誘導体を同定した。
【００７０】
＜１．ＴＬＣ分析による分子骨格の推定＞
下記のＴＬＣ分析条件において、下記標準試料と共に被験試料を展開した結果、被験試料が単糖をもった糖脂質であるモノヘキソシルセラミド（ＣＭＨ）を含むと推定された。
［ＴＬＣ分析条件］
プレート：ＨＰＴＬＣ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（Ｍｅｒｃｋ社製）
使用直前に１２０℃、３０分間の活性化を行う
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４（体積比）
発色：    オルシノール硫酸試薬
標準試料：モノヘキソシルセラミド（ＣＭＨ）及びステリルグリコシド
【００７１】
＜２．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析による分子構造の推定＞
マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により、以下の手順で、得られたヒドロキシ脂肪酸誘導体含有物に含まれるヒドロキシ脂肪酸誘導体の分子構造を推定した。
マトリックス（試料分子イオン化補助剤）としての２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を、１０体積％エタノール水溶液で１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した溶液をマトリックス溶液として用いた。次いで、被験試料を１ｍｇ／ｍＬ濃度となるようにクロロホルム：メタノール＝１：１（体積比）溶液に溶解して糖脂質溶液を調製し、該糖脂質溶液０．２μＬとマトリックス溶液１．０μＬとをサンプルプレート上で混合した後、風乾して結晶化させた。このサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析装置であるＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットし、質量分析を行った。
【００７２】
その結果、Ｃ４４Ｈ８３ＮＯ９の分子式を持つ下記構造式（１）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体を主成分とし、該ヒドロキシ脂肪酸誘導体とは脂肪酸部分及びスフィンゴイド塩基部分が異なる下記構造式（２）〜（５）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体を含む混合物であると推定された。
【００７３】
【化６】
2014218481.tif 000007
【００７４】
【化７】
2014218481.tif 000008
【００７５】
【化８】
2014218481.tif 000009
【００７６】
【化９】
2014218481.tif 000010
【００７７】
【化１０】
2014218481.tif 000011
【００７８】
＜３．ＧＣ−ＭＳ分析による脂肪酸部分の構造同定＞
ガス・クロマトグラフを直結した質量分析計（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＧＣ−ＭＳ）により、以下の手順で、脂肪酸部分の構造同定を行った。
被験試料中の糖脂質１００μｇ〜２００μｇ当たり２．５体積％無水塩酸メタノール０．３ｍＬを加えて８０℃で１２時間加水分解した（メタノリシス）。反応液に等量のヘキサンを加え、生成した脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出した。ヘキサン抽出を３回繰り返し、得られたヘキサン層を一度窒素気流下で乾固した後、残渣にトリメチルシリル（ＴＭＳ）化試薬（ピリジン：１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）：トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）＝１：１．３：０．８、体積比）２００μＬを加え、６０℃で１０分間加熱した。反応液を遠心分離し、得られた上清０．２μＬをＧＣ−ＭＳにて分析した。ＧＣ−ＭＳ分析のカラムには、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＤＢ−５Ｍ（０．２５ｍｍ×３０ｍ）を用い、カラム温度は試料注入後、最初の１分間は６０℃に保ち、その後、毎分８℃で３００℃まで昇温させ、３００℃で９分間保つ条件で行った。
【００７９】
ＧＣ−ＭＳによる脂肪酸部分解析の結果、主成分のヒドロキシ脂肪酸誘導体を構成する脂肪酸部分が、炭素数２０の直鎖α−ヒドロキシ酸であることが同定できた。また、被験試料に由来する脂肪酸部分としては、炭素数がそれぞれ１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６の直鎖α−ヒドロキシ酸が同定できた。
【００８０】
＜４．ＧＣ−ＭＳ分析によるスフィンゴイド塩基部分の構造同定＞
被験試料中の糖脂質２００μｇ当たり水性塩酸メタノール（濃塩酸８．６ｍＬ、水０．４ｍＬ、メタノール４１．０ｍＬを混合して調製）０．３ｍＬを加えて７５℃で１６時間加水分解した。反応液に等量のヘキサンを加え、脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出除去した。酸性メタノール層を窒素気流下で乾固した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．６ｍＬとメタノール１．０ｍＬを加え、次いでクロロホルム２．０ｍＬを加えて混合し、遠心分離して上層を除去した。下層のクロロホルム層をＦｏｌｃｈの上層（クロロホルム：メタノール：水＝１：５０：４９、体積比）で２回洗浄した。得られたクロロホルム層を窒素気流下で乾固した後、残渣にＴＭＳ化試薬（ピリジン：ＨＭＤＳ：ＴＭＣＳ＝１：１．３：０．８、体積比）１００μＬを加え、６０℃で１０分間加熱した。反応液を遠心分離し、得られた上清０．２μＬをＧＣ−ＭＳにて分析した。ＧＣ−ＭＳの分析は、脂肪酸分析と同じ条件で行った。
【００８１】
ＧＣ−ＭＳによるスフィンゴイド塩基部分解析の結果、主成分のヒドロキシ脂肪酸誘導体を構成するスフィンゴイド塩基部分が、２−アミノ−４，８−オクタデシジエン−１，３−ジオールであることが同定できた。また、被験試料に由来するスフィンゴイド塩基部分としては、２−アミノ−４，８−オクタデシジエン−１，３−ジオール及び２−アミノ−４−オクタデセン−１，３，４−トリオールが同定できた。
【００８２】
＜５．ヒドロキシ脂肪酸誘導体の同定＞
以上の分析結果から、上記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析で推定した通り、前記ヒドロキシ脂肪酸誘導体含有物に含まれるヒドロキシ脂肪酸誘導体の主成分は、グルコシル基と、脂肪酸として炭素数２０の直鎖α−ヒドロキシ酸と、スフィンゴイド塩基として２−アミノ−４，８−オクタデシジエン−１，３−ジオールからなる、化学式：Ｃ４４Ｈ８３ＮＯ９の前記構造式（１）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体であることが確認できた。また、前記ヒドロキシ脂肪酸誘導体含有物は、前記構造式（１）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体を主成分として、更にその脂肪酸部分の炭素数及びスフィンゴイド塩基が異なる前記構造式（２）〜（５）で表されるヒドロキシ脂肪酸誘導体を含む混合物であることが確認できた。
【００８３】
（実施例１）
＜Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、Ｉ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
【００８４】
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各穴に１５０μＬ添加し（試料濃度：０．７８μｇ／ｍＬ、３．１３μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した後、上清９０μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し換え、４℃、一晩でプレートに吸着させた後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行った。その後、１質量％ＦＢＳを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、抗ヒトコラーゲンタイプＩ抗体（ウサギＩｇＧ、ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた後、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。
Ｉ型コラーゲン産生促進率は、標準品を用いて上記ＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成し、試料無添加時のＩ型コラーゲン産生量を１００％として算出した。各試料のＩ型コラーゲン産生促進率（％）を表１に示す。
Ｉ型コラーゲン産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。
Ｉ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時のＩ型コラーゲン量、Ｂは被験試料無添加時のＩ型コラーゲン量を表す。
【００８５】
【表１】
2014218481.tif 000012
表１の結果から、パイナップル抽出物が、強いＩ型コラーゲン産生促進作用を有することが認められた。
【００８６】
（実施例２）
＜皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
【００８７】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に５質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養終了後、５質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した被験試料を各穴に１００μＬ添加し（試料濃度：６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。皮膚線維芽細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、各穴から培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各穴に１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。
皮膚線維芽細胞増殖促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表２に示す。
皮膚線維芽細胞増殖促進率（％）＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
ただし、前記式中、Ｓｔは被験試料を添加した細胞でのブルーホルマザン生成量を、Ｃｔは被験試料を添加しない細胞でのブルーホルマザン生成量を表す。
【００８８】
【表２】
2014218481.tif 000013
表２の結果から、パイナップル抽出物が、強い皮膚線維芽細胞増殖促進活性を有することが認められた。
【００８９】
（実施例３）
＜プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、フィラグリン産生促進作用を試験した。
【００９０】
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ３のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して５％ＣＯ２下、３７℃で３日間培養した。培養後、培地を０．２質量％ＤＭＳＯに溶解した被験試料（試料濃度：５μｇ／ｍＬ、又は２０μｇ／ｍＬ）を含む、又は含まない（コントロール）ＫＧＭ  ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
【００９１】
＜＜ウエスタンブロッティング＞＞
１０μｇ／列に調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）で５，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍に希釈して順次反応させ、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた発光により、プロフィラグリン及びフィラグリンを画像撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて検出した。検出したバンドをＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にて定量した。
結果は、被験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バンド強度）を用いて、被験試料のフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン・フィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。結果を表３及び４に示す。
プロフィラグリン・フィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは「被験試料添加時のＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を、Ｂは「被験試料無添加時（コントロール）のＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」を表す。
【００９２】
【表３】
2014218481.tif 000014
表３の結果から、パイナップル抽出物が、プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用を有することが認められた。
【００９３】
（実施例４）
＜トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を試験した。
【００９４】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料濃度：０．３９μｇ／ｍＬ、１．５６μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬ）を各穴に１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定し、細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ−１の量をモノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ−１抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製  プレートリーダー）した。結果を表４に示す。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度、Ｂは被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。
【００９５】
【表４】
2014218481.tif 000015
表４の結果から、パイナップル抽出物が、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することが認められた。
【００９６】
（実施例５）
＜オクルディン産生促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、オクルディン産生促進作用を試験した。
【００９７】
正常ヒト皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ３のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５個／ｍＬの細胞密度となるようにＫＧＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴あたり１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ2下、３７℃で一晩培養した。
培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料濃度：０．７８μｇ／ｍＬ、３．１３μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定し、細胞表面に発現したオクルディンの量をポリクローナル抗ヒトオクルディン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表５に示す。
オクルディン産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。
オクルディン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、式中、Ａは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表し、Ｂは被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。
【００９８】
【表５】
2014218481.tif 000016
表５の結果から、パイナップル抽出物が、オクルディン産生促進作用を有することが認められた。
【００９９】
（実施例６）
＜最終糖化産物形成抑制作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）形成抑制作用を試験した。
【０１００】
９６穴のＩ型コラーゲンプレートにＰＢＳ（−）で調製した０．２ＭのＤ（−）−リボース及び被験試料（試料濃度：６．２５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）の混合物を１００μＬ添加し、３７℃で約２週間静置し、ＡＧＥｓを形成させた。このとき、陰性対象としてＰＢＳ（−）のみを添加したもの、陽性対象としてＤ（−）−リボースのみを添加したものを同様に静置した。１７日後、抗ＡＧＥｓ抗体（トランスジェニック社製）を用いたＥＬＩＳＡ法によりＡＧＥｓ量を測定し、ＡＧＥｓ形成抑制作用を評価した。結果を表６に示す。
ＡＧＥｓ形成抑制率の計算方法は、以下のとおりである。
ＡＧＥｓ形成抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）｝×１００
ただし、Ａは陰性対象の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂは陽性対象の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｃは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。
【０１０１】
【表６】
2014218481.tif 000017
表６の結果から、パイナップル抽出物が、最終糖化産物形成抑制作用を有することが認められた。
【０１０２】
（実施例７）
＜ＴＮＦ−α産生促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、ＴＮＦ−α産生促進作用を試験した。
【０１０３】
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2下で４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度１％ＤＭＳＯを含む１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで溶解した各濃度の被験試料を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２４時間培養した。また、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、被験試料を添加せず、終濃度１％ＤＭＳＯを含む１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭのみを添加して、同様に実験を行った。
培養終了後、各ｗｅｌｌの培養上清中のＴＮＦ−α量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。結果を表７に示す。
ＴＮＦ−α産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。
ＴＮＦ−α産生促進率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時のＴＮＦ−α量を表し、Ｂは被験試料無添加時のＴＮＦ−α量を表す。
【０１０４】
【表７】
2014218481.tif 000018
表７の結果から、パイナップル抽出物が、ＴＮＦ−α産生促進作用を有することが認められた。
【０１０５】
（実施例８）
＜ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用試験＞
製造例１のパイナップル抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【０１０６】
（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍＤｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養終了後、被験試料添加培地に交換し、更に２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、被験試料を添加しない以外は上記と同様にして細胞を培養し、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法により行った。
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ＩＳＯＧＥＮ、ニッポンジーン社製）に溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加した後、遠心（１２，０００回転、４℃、１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、更にイソプロパノールで濃縮した。
濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ，タカラバイオ社製）、及びリアルタイムＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ  ＥｘＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎ  Ｋｉｔ，ＲＲ０３５Ａ，タカラバイオ社製）を用いてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。
【０１０７】
（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ３遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれも、タカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-TCGGCGATTCGGTGGACTA-3'
アンチセンスプライマー：5'-CCTCCAGGACTCGAAGCATCTC-3'
また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（いずれも、タカラバイオ社製）を用いた。
センスプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'
アンチセンスプライマー：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
試料添加及び試料無添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ、及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ，Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）、及びリアルタイムＰＣＲキット（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ，ＲＲ０４１Ａ，タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１００，０００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１００，０００」、「１０，０００」、「１，０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
【０１０８】
（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量から、ＨＡＳ３及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＨＡＳ３の発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、更に「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。この算出結果から、下記式に基づいてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。結果を表８に示す。
ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記式中、Ａは試料添加時の補正値を表し、Ｂは試料無添加時の補正値を表す。
【０１０９】
【表８】
2014218481.tif 000019
表８の結果から、パイナップル抽出物が、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明のコラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、フィラグリン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、最終糖化産物形成抑制剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進剤は、安全性に優れ日常的に摂取可能であり、かつ安価でありながら、優れたコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用、フィラグリン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、オクルディン産生促進作用、最終糖化産物形成抑制作用、ＴＮＦ−α産生促進作用、及びヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）ｍＲＮＡ発現促進作用を有するので、化粧料、飲食品の成分や、研究用の試薬として好適に利用可能である。