(57)【要約】【課題】新規なスプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を提供する。【解決手段】ＳＳＯは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）またはＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）プレｍＲＮＡのエキソン７を標的とし、典型的には、それぞれエキソン７の部分的なまたは全体の欠失を含むＴＮＦＲ変異体の生成をもたらす。エキソン７を標的とするＳＳＯは、炎症性疾患の治療のために治療上の利益を有する、可溶性形態のＴＮＦＲを生じさせることが認められている。ＳＳＯは、ＲＮアーゼＨを動員できないまたは実質的に動員できないことを特徴とする。【選択図】図２０Ａ
2014050400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１６核酸塩基長のオリゴマーであって、ＣＡＡＴＣＡＧＴＣＣ（配列番号１４３）、ＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧ（配列番号１５９）、およびＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧ（配列番号１７５）からなる群より選択される核酸塩基配列を含むとともに、前記オリゴマーはその全体にわたり２’−デオキシ−およびロックト核酸（ＬＮＡ）のホスホロチオエート結合による交互ヌクレオシドからなり、かつ、５’末端のヌクレオシドがＬＮＡであるオリゴマー。
【請求項２】
ＬＮＡ単位は２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式リボヌクレオシド単位である請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
配列番号１３０，１３７，１３９，１４３，１４６，１５３，１５５，１５９，１６２，１６９，１７１、および１７５からなる群より選択される配列を有する請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマーおよび医薬的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項５】
ＴＮＦ−α受容体２（ＴＮＦＲ２）を発現する哺乳動物細胞において前記受容体のプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項４に記載の組成物を前記細胞に投与する工程からなる方法。
【請求項６】
ＴＮＦ−α受容体２（ＴＮＦＲ２）を発現する哺乳動物細胞において前記受容体の可溶性形態を調製する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項４に記載の組成物を前記細胞に投与する工程、および任意にＴＮＦ−α受容体２の可溶性形態を前記細胞から単離または精製する工程からなる方法。
【請求項７】
ＴＮＦ−α受容体２（ＴＮＦＲ２）を発現する哺乳動物細胞において前記受容体の可溶性形態の発現を高める方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項４に記載の組成物を前記細胞に投与する工程からなるとともに、インビトロまたはインビボで実施される方法。
【請求項８】
炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項４に記載の組成物の使用方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体２。
【請求項１０】
炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、請求項６に記載の方法に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体２の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボまたはインビトロでのＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦＲ）のスプライス変異体を作製するための組成物および方法、並びに結果として生じるＴＮＦＲタンパク質変異体に関する。このような変異体は、プレｍＲＮＡ分子のスプライシングを制御すること、およびスプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）でタンパク質発現を調節することによって作製され得る。本発明による好ましいＳＳＯは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）またはＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）プレｍＲＮＡのエキソン７または８を標的とし、典型的には、それぞれエキソン７または８の部分的なまたは全体の欠失を含むＴＮＦＲ変異体の生成をもたらす。エキソン７を標的とするＳＳＯは、炎症性疾患の治療のために治療上の利益を有する、可溶性形態のＴＮＦＲを生じさせることが認められている。ＳＳＯは、ＲＮアーゼＨを動員できないまたは実質的に動員できないことを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献１には、プレｍＲＮＡスプライシング、炎症および炎症性疾患におけるＴＮＦ−αの役割、並びにＴＮＦ１およびＴＮＦ２によるＴＮＦ−α活性の仲介に関する背景技術についての説明が提供されている。
【０００３】
ＴＮＦ−αは、膜結合ホモ三量体として存在し、プロテアーゼＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）によって循環中に放出される、プロ炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、損傷および感染に対する炎症性応答のメディエイタとして循環中に導入される。ＴＮＦ−α活性は、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬および乾癬性関節炎などの炎症性疾患の進行に関与する（非特許文献１）。大量感染の間に経験されるような、高レベルのＴＮＦ−αへの急性暴露は敗血症を生じさせる。その症状としては、ショック、低酸素症、多臓器不全および死亡が含まれる。ＴＮＦ−αの長期低用量は、体重減少、脱水および脂肪減少によって特徴づけられる疾患である悪液質を引き起こすことがあり、悪性疾患に結び付く。
【０００４】
ＴＮＦ−α活性は、主として２つの異なる遺伝子、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２によってコードされる２つの受容体を通して媒介される。ＴＮＦＲ１は約５５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する膜結合タンパク質であり、一方ＴＮＦＲ２は７５ｋＤａの分子量を有する膜結合タンパク質である。両受容体の可溶性細胞外ドメインは、メタロプロテアーゼの作用によって細胞膜からある程度切り離される。さらに、ＴＮＦＲ２のプレｍＲＮＡは、選択的スプライシングを受けて、完全長の活性膜結合型受容体（ｍＴＮＦＲ２）または膜貫通のためのコード配列を含むエキソン７および８を欠く分泌型おとり受容体（ｓＴＮＦＲ２）のいずれかを作り出す（非特許文献２）。ｓＴＮＦＲ２はＴＮＦ−αと結合するが、生理的応答を惹起せず、それ故ＴＮＦ−α活性を低下させる。ＴＮＦＲ１の内在性分泌型スプライス変異体はまだ同定されていないが、２つの受容体の類似の遺伝子構造は、このＴＮＦＲ１アイソフォームを生成する潜在的可能性を強く示唆する。
【０００５】
ＴＮＦスーパーファミリー成員による過度の活性が果たす役割の故に、分泌形態の量が増加し、内在性膜形態の量が減少するようにＴＮＦＲ受容体の選択的スプライシングを制御することは有用である。本発明は、この目標を達成するためのスプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を提供する。ＳＳＯはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）に類似する。しかし、ＡＳＯＮと異なり、ＳＳＯは、ＲＮアーゼＨによる標的の分解を生じさせることなく標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。
【０００６】
ＳＳＯは、一部のサラセミアにおいて認められるスプライシング異常を改善するために使用されてきた（Ｋｏｌｅの特許文献２、および非特許文献３）。ＩＬ−５受容体のα鎖（ＩＬ−５Ｒα）に関する試験は、膜にまたがるエキソンを対象とするＳＳＯが分泌形態の合成を上昇させ、内在性膜形態の合成を阻害することを明らかにした（Ｂｅｎｎｅｔｔの特許文献３、および非特許文献４）。特許文献４にも、ＩＬ−５Ｒのスプライシングを可溶性形態へと再指令する実施例が開示されている（実施例２５および３０）。ＳＳＯは、Ｔｏｎｅにおいて検出された主要なＣＤ４０スプライス変異体を生産するために使用され、前記変異体では、膜貫通領域の上流にあるエキソン６の欠失がタンパク質の読み枠の変化を生じさせた。ＳＳＯは予想されたｍＲＮＡスプライス変異体を生じさせたが、分泌された受容体が検出できなかったことから、変異体ｍＲＮＡの翻訳産物は不安定であると思われた（非特許文献５）。非特許文献６には、エキソン６を欠くマウススプライス変異体は安定な分泌形態のＣＤ４０ではない可能性が予測されている（１７５６ページ、右側の欄参照）。
【０００７】
特許文献５には、マウスＴＮＦＲ２を標的とする、２’ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するギャップマーオリゴマーが開示されており、これらのオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを動員してＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡを分解する（ｍＲＮＡの下方調節）ように設計されている。本発明のＳＳＯオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを動員しないが、ＴＮＦＲプレｍＲＮＡのプロセシングを妨げるように設計され、安定な、分泌型のリガンド結合ＴＮＦＲスプライス変異体を生じさせる。
【０００８】
特許文献６には、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＤ４０の選択的スプライスパターンを変化させるために使用し得ることが教示されているが、ＳＳＯによって標的とすべきスプライスエレメントまたはＣＤ４０の領域に関する指針、またはいずれの配列を使用すべきかについての指針は教示または提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５８８９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５９７６８７９号明細書
【特許文献３】米国特許第６２１０８９２号明細書
【特許文献４】国際公開第００／５８５１２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０８８３９３号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／２０２５３１号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：７３６−４６
【非特許文献２】Ｌａｉｎｅｚら、２００４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６：１６９
【非特許文献３】Ｌａｃｅｒｒａ，Ｇ．ら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：９５９１
【非特許文献４】Ｋａｒｒａｓ，Ｊ．Ｇ．ら、２０００，ＭｏＬ  Ｐｈａｒｍ，５８：３８０
【非特許文献５】Ｓｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｍ．ら、２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２；２６９５
【非特許文献６】Ｔｏｎｅら、ＰＮＡＳ，２００１，９８（４）：１７５１−１７５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、可溶性の、安定な、分泌型リガンド結合形態の量が増大し、内在性膜形態の量が減少するように、スプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を用いてＴＮＦＲスーパーファミリーからの受容体の選択的スプライシングを制御する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、８〜１６核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であるとともに、前記連続する核酸塩基配列が、５つ以上の連続するＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位を含まず、かつ、前記連続する核酸塩基配列が、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡおよびエナ−ＬＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、８〜１６核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００１３】
場合により、上記実施形態において連続する核酸塩基配列は、少なくとも１つのさらなるヌクレオチド類似体（Ｘ）を含むか、または少なくとも１つのさらなるヌクレオチド類似体（Ｘ）からなる。
【００１４】
一つの実施形態では、さらなるヌクレオチド類似体単位は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’ＭＯＥ  ＲＮＡ単位、およびＬＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
【００１５】
一つの実施形態では、オリゴマーまたは連続する核酸塩基配列は、８〜１５核酸塩基長、例えば９、１０、１１、１２、１３または１４核酸塩基からなる。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１３１〜配列番号１４５、配列番号１４７〜配列番号１６１、および配列番号１６３〜配列番号１７７からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基モチーフ配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基モチーフ配列内に存在する。
【００１６】
一つの実施形態では、オリゴマーは、配列番号２４５〜配列番号２４６、配列番号２５１〜配列番号２６３、配列番号２６４〜配列番号２７９、および配列番号２８０〜配列番号２９５からなる群より選択される。
【００１７】
一つの実施形態では、前記連続する核酸塩基配列は、配列番号１３０、配列番号１４６および配列番号１６２からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基モチーフ配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基モチーフ配列内に存在する。
【００１８】
一つの実施形態では、オリゴマーは、配列番号２４４、配列番号２６４および配列番号２８０からなる群より選択される。
本発明は、スプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）に関する。本発明による好ましいＳＳＯは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）またはＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）プレｍＲＮＡのエキソン７を標的とし、典型的には、それぞれエキソン７の部分的または全体の欠失を含むＴＮＦＲ変異体の生成をもたらす。エキソン７を標的とするＳＳＯは、炎症性疾患治療において治療上の利益を有する、可溶性形態のＴＮＦＲを生じさせることが認められている。ＳＳＯは、ＲＮアーゼＨを動員できないか、または実質的に動員できないことを特徴とする。
【００１９】
本発明は、８〜５０核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み（または前記配列からなり）、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であり、好ましくは完全に相補的であって、また前記連続する核酸塩基配列が、５つ以上の連続するＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位を含まない、８〜５０、例えば８〜１６核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００２０】
配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６５１号の配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４と同一である。
【００２１】
配列番号２４７は配列番号１の逆相補鎖である。配列番号２４８は配列番号２の逆相補鎖であり、配列番号２４９は配列番号３の逆相補鎖であり、配列番号２５０は配列番号４の逆相補鎖である。
【００２２】
それ故、本発明のオリゴマーは、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９または配列番号２５０の対応する領域（すなわち部分）に相同である（好ましくは１００％相同である）連続する核酸塩基配列を含むか、または前記連続する核酸塩基配列からなる。
【００２３】
本発明は、８〜５０核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み（または前記配列からなり）、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号２４７または配列番号２４８、配列番号２４９または配列番号２５０内に存在する連続するヌクレオチドの（対応する）領域に存在し、前記連続する核酸塩基配列が、５つ以上の連続するＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位を含まない、８〜５０核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００２４】
本発明は、８〜５０核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み（または前記配列からなり）、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であり、好ましくは完全に相補的であって、また前記オリゴマーが、相補的ｍＲＮＡ分子を有する複合体との二本鎖で形成されたとき、ＲＮアーゼＨを動員することができないか、または基本的にＲＮアーゼＨを動員することができない、８〜５０核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００２５】
本発明は、８〜５０核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み（または前記配列からなり）、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号２４７または配列番号２４８、配列番号２４９または配列番号２５０内に存在する連続するヌクレオチドの（対応する）領域に存在し、また前記オリゴマーが、相補的ｍＲＮＡ分子を有する複合体との二本鎖で形成されたとき、ＲＮアーゼＨを動員することができないか、または基本的にＲＮアーゼＨを動員することができない、８〜５０核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明によるオリゴマーおよび前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。
本発明はさらに、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートおよび医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体を発現する哺乳動物細胞において、ＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはＴＮＦＲＳＦ１Ａから選択されるＴＮＦ−α受容体プレｍＲＮＡ  ｍＲＮＡのスプライシングを変化させる方法を提供し、前記方法は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を細胞に投与することを含む。
【００２８】
本発明はまた、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体を発現する哺乳動物細胞において前記ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体の可溶性形態を作製する方法を対象とし、前記方法は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を細胞に投与することを含む。
【００２９】
上記方法は、可溶性形態のＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体を精製する工程をさらに含み得る。
本発明は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体を発現する哺乳動物細胞において前記ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＴＮＦ−α受容体の可溶性形態の発現を高める方法を提供し、前記方法は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を細胞に投与することを含む。
【００３０】
上記方法は、インビボまたはインビトロで実施され得る。
本発明は、炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、本発明によるオリゴマーの使用方法を提供する。
【００３１】
本発明は、炎症性疾患または状態の治療のための本発明によるコンジュゲートを提供する。
本発明は、炎症性疾患または状態に罹患している患者または罹患している可能性が高い患者に、本発明による医薬組成物を投与する工程を含む、炎症性疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。
【００３２】
本発明は、エキソン７によってコードされる膜貫通結合ドメイン内に欠失を含むＴＮＦ−α受容体の単離または精製された可溶性形態を提供し、前記ＴＮＦ−α受容体は、ＴＮＦ−α受容体ＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはＴＮＦＲＳＦ１Ｂから選択される。
【００３３】
本発明は、エキソン７によってコードされる膜貫通結合ドメインを欠くＴＮＦ−α受容体の単離または精製された可溶性形態を提供し、前記ＴＮＦ−α受容体は、ＴＮＦ−α受容体ＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはＴＮＦＲＳＦ１Ｂから選択される。
【００３４】
本発明はさらに、可溶性形態のＴＮＦ−α受容体をコードする核酸を提供する。
本発明はさらに、発現ベクターなどの、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
本発明はさらに、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、可溶性形態のＴＮＦ−α受容体を作製するための方法を提供し、前記方法は、本発明による核酸の発現を可能にする条件下で本発明による宿主細胞を培養し、その後前記宿主細胞から前記可溶性形態のＴＮＦ−α受容体を単離する工程を含む。
【００３６】
本発明はさらに、本発明による、または本発明の方法に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体、および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、本発明による、または本発明の方法に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体の使用を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、炎症性疾患または状態の治療のための、本発明による、または本発明の方法に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体を提供する。
【００３９】
関連事例、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６５１号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１０５５７号、米国特許出願第ＵＳ１１／５９５，４８５号および同第ＵＳ１１／７９９，１１７号は、すべてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
以下の図面は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１０５５７号に記載されているものと同じである。図２０は本出願に新規である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ヒトＴＮＦＲ２の構造を図式的に表示する。関連するエキソンおよびイントロンをそれぞれ四角および直線で示す。シグナル配列および膜貫通領域に陰影を付けている。シグナル配列、膜貫通領域、および最後の残基の境界を形成する残基を略図の下に示す。エキソン境界を略図の上に示す。エキソンの３’末端と次のエキソンの５’末端が同じ残基番号を有する場合、スプライスジャンクションはその残基をコードするコドン内に位置する。
【図２Ａ】ＳＳＯで処理した一次ヒト肝細胞からの可溶性ＴＮＦＲ２の量をグラフで表示する。指示されているＳＳＯを５０ｎＭで一次ヒト肝細胞にトランスフェクトした。最大４８時間後、細胞外培地を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）により可溶性ＴＮＦＲ２について分析した。誤差バーは、３回の独立した実験についての標準偏差を表す。
【図２Ｂ】ヒトＴＮＦＲ２に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲにより、全ＲＮＡをＴＮＦＲ２スプライススイッチに関して分析した。エキソン７を標的とするＳＳＯは、完全長ＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡ（ＦＬ）からＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡ（Δ７）へのシフトを導いた。ＳＳＯ  ３０８３は、ＴＮＦＲ２スプライススイッチ能力を持たない対照ＳＳＯである。
【図３】マウスＴＮＦＲ２  エキソン７を標的とするＳＳＯ  １０量体で処理したＬ９２９細胞のスプライシング産物を示す。Ｌ９２９細胞を指示されているＳＳＯ濃度（５０または１００ｎＭ）でトランスフェクトし、２４時間後にＲＴ−ＰＣＲによりＴＮＦＲ２のスプライススイッチに関して評価した。「完全長」（ＦＬ）ＴＮＦＲ２が４８６ｂｐのバンドによって示されるように、ＰＣＲプライマーを使用してエキソン５からエキソン９に増幅した。エキソン７を欠く転写産物（Δ７）は４０８ｂｐのバンドによって示される。
【図４Ａ】マウスＴＮＦＲ２  エキソン７を標的とするＳＳＯ  １０量体で処理したマウスのスプライシング産物を示す。指示されているＳＳＯを食塩水に再懸濁し、２５ｍｇ／ｋｇ／日で５日間、マウスに腹腔内注射した。ＳＳＯ注射の前にマウスから前採血し、最後のＳＳＯ注射の１０日後にも採血して、マウスを犠死させた。犠死の時点で、肝臓からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりＴＮＦＲ２のスプライススイッチに関して分析した。ＦＬ−完全長ＴＮＦＲ２、Δ７−ＴＮＦＲ２  Δ７。
【図４Ｂ】ＳＳＯ注射の前（前）および後（後）に採取した血清中のＴＮＦＲ２  Δ７の濃度を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用してＥＬＩＳＡによって定量した。誤差バーは、同じ試料の３回の独立した読取りからの標準誤差を表す。
【図５】異なる長さのＳＳＯのスプライススイッチ能力を表示する。一次ヒト肝細胞を指示されているＳＳＯでトランスフェクトし、ＴＮＦＲ２の発現を、図２におけるようにＲＴ−ＰＣＲ（上のパネル）およびＥＬＩＳＡ（下のパネル）によって分析した。誤差バーは、２回の独立した実験についての標準偏差を表す。
【図６Ａ】ＳＳＯで処理したマウスの肝臓におけるＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡの誘導を示す。ＳＳＯ  ３２７４処理マウスの肝臓からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供し、産物を１．５％アガロースゲル上で視覚化した。
【図６Ｂ】エキソン６−エキソン８ジャンクションの配列を示す。
【図７Ａ】ＳＳＯで処理した一次ヒト肝細胞におけるＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡの誘導を示す。ＳＳＯ  ３３７９処理細胞からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供し、産物を１．５％アガロースゲル上で視覚化した。
【図７Ｂ】エキソン６−エキソン８ジャンクションの配列を示す。
【図８Ａ】ＳＳＯ  ３３７８、３３７９および３３８４によるＴＮＦＲ２プレｍＲＮＡスプライシングの用量依存性を示す。一次ヒト肝細胞を指示されているＳＳＯの１〜１５０ｎＭでトランスフェクトした。最大４８時間後、全ＲＮＡのために細胞を採取し、細胞外培地を収集した。ヒトＴＮＦＲ２に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲにより、全ＲＮＡをＴＮＦＲ２スプライススイッチに関して分析した。各々のＳＳＯに関して、スプライススイッチの量をＳＳＯ濃度の関数として表示する。
【図８Ｂ】細胞外培地中の可溶性ＴＮＦＲ２の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、ＳＳＯの関数としてプロットした。誤差バーは、少なくとも２回の独立した実験についての標準偏差を表す。
【図９】Ｌ９２９細胞からの分泌されたＴＮＦＲ２スプライス変異体の検出をグラフで表示する。細胞を指示されているＳＳＯでトランスフェクトした。７２時間後、細胞外培地を取り出し、ＥＬＩＳＡによって分析した。データは、可溶性ＴＮＦＲ２のｐｇ／ｍＬで表されている。
【図１０】マウスにおけるＳＳＯ  ３２７４（上）および３３０５（下）の腹腔内注射に関するスプライシング産物を示す。ＳＳＯ  ３２７４を２５ｍｇ／ｋｇ／日で４日間（４／１および４／１０）または１０日間（１０／１）、腹腔内注射した。最初の注射後１日目（４／１および１０／１）または１０日目（４／１０）にマウスを犠死させ、肝臓からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによってＴＮＦＲ２スプライススイッチに関して分析した。ＳＳＯ  ３３０５を、１日につき指示されている用量で４日間注射した。その翌日にマウスを犠死させ、３２７４で処理したマウスと同様に肝臓を分析した。
【図１１Ａ】ＳＳＯ処理後１０日目のマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ２の量をグラフで示す。指示されているＳＳＯまたは食塩水（各群につきｎ＝５）を２５ｍｇ／ｋｇ／日でマウスに腹腔内注射した。血清は最初の注射の４日前および最後の注射後の指示されている日に採取した。血清を図２２で述べるようにＥＬＩＳＡによって分析した。
【図１１Ｂ】１０日後、マウスを犠死させ、肝臓を、図３０で述べるようにＲＴ−ＰＣＲによってＴＮＦＲ２スプライススイッチに関して分析した。
【図１２Ａ】ＳＳＯ処理後２７日目のマウス血清中の可溶性ＴＮＦＲ２の量をグラフで表示する。血清試料を最後の注射後２７日目まで採取したことを除き、図１１で述べたようにマウスを処理した。ＳＳＯ  ３０８３および３２７２は、ＴＮＦＲ２スプライススイッチ能力を持たない対照ＳＳＯである。
【図１２Ｂ】２７日目にマウスを犠死させ、肝臓を、図１１で述べたようにＲＴ−ＰＣＲによってＴＮＦＲ２スプライススイッチに関して分析した。
【図１３Ａ】ＳＳＯ処理マウスからの血清を用いた細胞ベースのアッセイにおける抗ＴＮＦ−α活性をグラフで表示しており、血清試料はＳＳＯ処理後５日目に採取した。Ｌ９２９細胞を、０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αに加えて指示されているＳＳＯで処理したマウスからの１０％血清のいずれかで処理した。細胞の生存能を２４時間後に測定し、未処理細胞に対して基準化した。
【図１３Ｂ】ＳＳＯ処理マウスからの血清を用いた細胞ベースのアッセイにおける抗ＴＮＦ−α活性をグラフで表示しており、血清試料はＳＳＯ処理後２７日目に採取した。Ｌ９２９細胞を、０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αに加えて指示されているＳＳＯで処理したマウスからの１０％血清のいずれかで処理した。細胞の生存能を２４時間後に測定し、未処理細胞に対して基準化した。
【図１４】図１３で述べた細胞生存率アッセイを用いて、指示されているＳＳＯオリゴヌクレオチドで処理したマウスからの血清の抗ＴＮＦ−α活性を、Ｓｉｇｍａ（登録商標）からの組換え可溶性ＴＮＦＲ２（ｒｓＴＮＦＲ２）細胞外ドメインおよびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）とグラフで比較する。
【図１５Ａ】ｍｕＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の安定性を比較する。マウスにＳＳＯ  ３２７２、ＳＳＯ  ３２７４またはＳＳＯ  ３３０５（ｎ＝５）のいずれかを２５ｍｇ／ｋｇ／日で毎日注射した。最後の注射後指示されている日にマウスから採血し、血清中のＴＮＦＲ２濃度を測定した。
【図１５Ｂ】ｍｕＴＮＦＲ２  Δ７ｍＲＮＡの安定性を比較する。マウスにＳＳＯ  ３２７２、ＳＳＯ  ３２７４またはＳＳＯ  ３３０５（ｎ＝５）のいずれかを２５ｍｇ／ｋｇ／日で毎日注射した。最後の注射後指示されている日に犠死させたマウスからの全ＲＮＡを、図１０で述べたようにＲＴ−ＰＣＲに供した。
【図１６】ＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質（点線）およびｍＲＮＡ（実線）レベルを、それぞれ最後の注射後１０日目のタンパク質またはｍＲＮＡの量のパーセンテージとして経時的に表示する。
【図１７】ＴＮＦＲ２  Δ７哺乳動物発現プラスミドによるトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞において発現されるＴＮＦＲ２  Δ７の用量依存的抗ＴＮＦ−α活性をグラフで表示する。ＨｅＬａ細胞を指示されているマウスまたはヒトＴＮＦＲ２  Δ７プラスミドでトランスフェクトし、４８時間後に細胞外培地を採集した。培地中のＴＮＦＲ２  Δ７濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、段階希釈液を調製した。これらの希釈液を、図１４におけるようにＬ９２９細胞傷害性アッセイにより抗ＴＮＦ−α活性に関して検定した。
【図１８】ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離した、発現されたマウス（Ａ）およびヒト（Ｂ）ＴＮＦＲ２  Ｄ７タンパク質を示す。ＨｅＬａ細胞を指示されているプラスミドでトランスフェクトした。最大４８時間後、細胞外培地を収集し、濃縮して、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液中に収集した。試料中のタンパク質をＰＡＧＥによって分離し、ヒトおよびマウスの両方のＴＮＦＲ２  Ｄ７タンパク質を認識するＣ末端ＴＮＦＲ２一次抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してウェスタンブロット法を実施した。培地、指示されているプラスミドでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞からの細胞外培地試料、溶解産物、指示されているプラスミドでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解産物。ＣＭ：トランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞からの対照培地、ＣＬ：トランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞からの対照細胞溶解産物。＋：分子量マーカー（ｋＤａｌ）。
【図１９】精製ＨｉｓタグヒトおよびマウスＴＮＦＲ２  Ｄ７を示す。指示されているＴＮＦＲ  Ｄ７タンパク質を含む非濃縮細胞外培地を図１８におけるように調製した。培地約３２ｍＬを１ｍＬ  ＨｉｓＰｕｒコバルト・スピン・カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に適用し、結合したタンパク質を、１５０ｍＭイミダゾールを含む１ｍＬ緩衝液中に溶出した。各々の試料をＰＡＧＥによって分析し、図１８におけるようにウェスタンブロット法を実施した。レーン１１４４−４および１３１９−１における複数のバンドは、可変的にグリコシル化された形態のＴＮＦＲ２  Ｄ７を表す。
【図２０Ａ】本発明によるオリゴマーモチーフをそれらの標的配列に対して比較したアラインメント−配列番号１。
【図２０Ｂ】本発明によるオリゴマーモチーフをそれらの標的配列に対して比較したアラインメント−配列番号２。
【図２０Ｃ】本発明によるオリゴマーモチーフをそれらの標的配列に対して比較したアラインメント−配列番号３。
【図２０Ｄ】本発明によるオリゴマーモチーフをそれらの標的配列に対して比較したアラインメント−配列番号４。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２）およびＴＮＦＲスーパーファミリー由来の他のサイトカイン受容体をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを制御することにより、前記受容体の発現を制御するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、分泌形態の発現上昇および内在性膜形態の発現低下を生じさせる。さらに、本発明は、過度のサイトカイン活性に関連する疾患の治療において使用することができる。
【００４３】
内在性膜形態のｍＲＮＡ内に存在するが、一次転写産物（「プレｍＲＮＡ」）から除去されて分泌形態のｍＲＮＡを生成する１または複数のエキソンは、「膜貫通エキソン」と称される。本発明は、受容体プレｍＲＮＡの膜貫通エキソンおよび／または連続するイントロンのいずれかに相補的な核酸および核酸類似体を含む。相補性は、スプライス部位にまたがるプレｍＲＮＡの配列内の配列に基づくことができ、これはエキソン−イントロンジャンクションにまたがる配列に基づく相補性を含むがこれに限定されず、または相補性はイントロン配列にだけ基づくこともでき、または相補性はエキソンの配列だけに基づいていてもよい。
【００４４】
当業者に使用可能かつ公知のいくつかの選択的化学物質が存在する。一つの重要な特徴は、２’−デオキシオリゴヌクレオチド（「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、以下「ＡＳＯＮ」）のように、ＲＮアーゼＨによる標的の分解を生じさせることなく標的ＲＮＡにハイブリダイズする能力である。明確にするため、このような化合物はスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）と称される。当業者は、ＳＳＯが、２’Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドおよびリボヌクレオシドホスホロチオエート並びにペプチド核酸およびリボフラノシルに基づく結合を持たない他のポリマーを含むが、これらに限定されないことを理解する。
【００４５】
本発明の一つの実施形態は、患者または生存被験者にＳＳＯを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。投与されたＳＳＯは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態をコードするスプライス変異体を生産するようにプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させ、それによってその受容体に対するリガンドの活性を低下させる。もう一つの実施形態では、本発明は、ＳＳＯを細胞に投与することによってＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態を生産する方法である。
【００４６】
本発明の一つの実施形態は、ＴＮＦと結合することができ、哺乳動物ＴＮＦＲ遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされ、ｃＤＮＡ内でエキソン６の後に直接エキソン８が続き、その結果としてエキソン７を欠く（「ＴＮＦＲ  δ７」）、完全長または成熟タンパク質である。もう一つの実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７を含有する医薬組成物である。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７を含有する医薬組成物を投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。
【００４７】
さらにもう一つの実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸である。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含有する医薬組成物である。
【００４８】
もう一つの実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含む発現ベクターである。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含む発現ベクターで哺乳動物の細胞を形質転換することにより、哺乳動物の血清中の可溶性ＴＮＦＲのレベルを上昇させる方法である。
【００４９】
もう一つの実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞である。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞を、ＴＮＦＲ  δ７を発現するのに適した条件下で培養することによってＴＮＦＲ  δ７を生産する方法である。さらにもう一つの実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ  δ７をコードする核酸を含む発現ベクターを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。
【００５０】
さらにもう一つの実施形態では、ＴＮＦに結合することができ、エキソン６の後に直接エキソン８が続き、その結果としてエキソン７を欠く、哺乳動物ＴＮＦＲ２タンパク質（「ＴＮＦＲ２  δ７」）を生産するように哺乳動物ＴＮＦＲ２プレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる、スプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）が開示される。本発明の一つの実施形態は、患者または生存被験者にＳＳＯを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。投与されたＳＳＯは、ＴＮＦＲ２  δ７を生産するように哺乳動物ＴＮＦＲ２プレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる。もう一つの実施形態では、本発明は、ＳＳＯを細胞に投与することにより、細胞においてＴＮＦＲ２  δ７を生産する方法である。
【００５１】
本発明の前記および他の目的および態様を、本明細書の図面および以下に提供する明細書において詳細に論じる。
オリゴマー
一つの実施形態では、オリゴマーは連続する核酸塩基配列からなる。
【００５２】
しかしまた、オリゴマーは、典型的には５’または３’末端のいずれかにおいて、連続する核酸塩基配列に隣接する他の核酸塩基配列、または５’および３’末端の両方におけるさらなる核酸塩基配列を含み得ることも考慮される。適切には、これらの５’または３’「フランキング」領域は、１、２、３、４、５または６核酸塩基長であり得る。本発明のオリゴマーの末端にあるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸塩基は、内在性エキソヌクレアーゼによってインビボで使用されるときにオリゴマーから切断されると予想され、フランキングＤＮＡまたはＲＮＡ単位を含むことは、オリゴマーのインビボでの機能に影響を及ぼさないと考えられる。
【００５３】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の３’末端は、１、２または３個のＤＮＡまたはＲＮＡ単位に隣接する。３’側のＤＮＡ単位がオリゴマーの固相合成においてしばしば使用される。
【００５４】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の５’末端は、１、２または３個のＤＮＡまたはＲＮＡ単位に隣接する。
一つの実施形態では、本発明は、８〜５０核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号４内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であり（すなわち前記連続する核酸塩基配列が、配列番号２４７または配列番号２４８、配列番号２４９または配列番号２５０内に存在する連続するヌクレオチド（に「対応する」またはその一部）の領域に存在し）、前記連続する核酸塩基配列が、５つ以上の連続するＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位を含まない、８〜５０核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
【００５５】
一つの実施形態では、オリゴマーは、相補的ｍＲＮＡ分子を有する複合体との二本鎖で形成されたとき、基本的にＲＮアーゼＨを動員することができない。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド類似体（Ｘ）を含むか、またはヌクレオチド類似体（Ｘ）からなる。
【００５６】
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体（Ｘ）は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
【００５７】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド類似体（Ｘ）とヌクレオチド（ｘ）の両方を含む。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、７個以上の連続するヌクレオチド類似体単位（Ｘ）の領域を含まず、例えば６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の連続ヌクレオチド類似体単位（Ｘ）を含む。
【００５８】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も５’側の核酸塩基は、ヌクレオチド類似体（Ｘ）である。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も５’側の核酸塩基は、ＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位などのヌクレオチド単位（ｘ）である。
【００５９】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も３’側の核酸塩基は、ヌクレオチド類似体（Ｘ）である。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も３’側の核酸塩基は、ＤＮＡ（２’−デオキシリボヌクレオシド）モノマー単位などのヌクレオチド単位（ｘ）である。
【００６０】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチドと核酸塩基との交互配列を含むか、またはヌクレオチドと核酸塩基の交互配列からなる。
一つの実施形態では、ヌクレオチドと核酸塩基の交互配列は、Ｘｘ、ｘＸ、Ｘｘｘ、ｘＸｘ、ｘｘＸ、ＸＸｘ、ＸｘＸ、ｘＸＸ、ＸＸＸｘ、ＸＸｘＸ、ＸｘＸＸ、ｘＸＸＸ、ｘｘｘＸ、ｘｘＸｘ、ｘＸｘｘ、Ｘｘｘｘ、ＸＸＸＸｘ、ＸＸＸｘＸ、ＸＸｘＸＸ、ＸｘＸＸＸ、ｘＸＸＸＸ、ｘｘｘｘＸ、ｘｘｘＸｘ、ｘｘＸｘｘ、ｘＸｘｘｘ、Ｘｘｘｘｘからなる群より選択される配列であり、前記交互配列は場合により反復される。
【００６１】
一つの実施形態では、反復配列は、連続する核酸塩基配列の長さ全体にわたって反復され、場合により５’および／または３’反復配列が切断されてもよい。
一つの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記の少なくとも１つのＬＮＡ類似体単位およびＬＮＡ以外の少なくとも１つのさらなるヌクレオチド類似体単位を含む。
【００６２】
一つの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの配列Ｘ１Ｘ２Ｘ１またはＸ２Ｘ１Ｘ２［式中、Ｘ１はＬＮＡであり、およびＸ２は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位などの、ＬＮＡ以外のヌクレオチド類似体である］からなる。
【００６３】
一つの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列は、選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）Ｘ１およびＸ２単位からなる。
一つの実施形態では、Ｘなどのヌクレオチド類似体単位は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、およびＬＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
【００６４】
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体単位（Ｘ）はＬＮＡ単位である。
一つの実施形態では、ＬＮＡ単位は、オキシ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡおよびエナ−ＬＮＡからなる群より選択される。
【００６５】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ＤＮＡおよびＬＮＡ単位から独立して選択される５つ以上の連続する核酸塩基からなる連続するサブ配列を含まず、連続するサブ配列内に存在するＬＮＡ単位はα−Ｌ−立体配置である。
【００６６】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ＤＮＡおよびＬＮＡ単位から独立して選択される５つ以上の連続する核酸塩基からなる連続するサブ配列を含まず、連続するサブ配列内に存在するＬＮＡ単位はα−Ｌ−オキシＬＮＡである。
【００６７】
一つの実施形態では、すべてのＬＮＡ単位はβ−Ｄ立体配置である。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列はＬＮＡおよびＤＮＡ単位のみからなる。β−Ｄ−オキシまたはβ−Ｄ−チオまたはβ−Ｄ−アミノなどの、β−Ｄ立体配置のＬＮＡ単位が好ましい。
【００６８】
一つの実施形態では、ＬＮＡは、β−Ｄ−オキシＬＮＡまたはβ−Ｄ−チオＬＮＡまたはβ−Ｄ−アミノＬＮＡ、エナ−ＬＮＡからなる群であって、場合によりα−Ｌ−オキシＬＮＡまたはα−Ｌ−チオＬＮＡまたはα−Ｌ−アミノＬＮＡからなる群を含む群より選択され得る。
【００６９】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の長さは、８〜１６、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６核酸塩基の長さであるか、または１０〜１４または１１〜１４または１２〜１４核酸塩基の長さである。
【００７０】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の長さは、８〜１５、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５核酸塩基の長さである。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１または配列番号３の対応する領域に相補的である、すなわち配列番号２４７または配列番号２４９内に存在する連続するヌクレオチドの（対応する）領域に存在する、核酸塩基配列を含む。
【００７１】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１の５１〜１６４、配列番号２の５１〜７９、配列番号３の５１〜１２７、および配列番号４の５１〜８５からなる群より選択される配列内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的である。
【００７２】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１の１〜５０、配列番号１の１６５〜２１５、配列番号２の１〜５０、配列番号２の８０〜１３０、配列番号３の１〜５０、配列番号３の１２８〜１７８、配列番号４の１〜５０、および配列番号４の８６〜１３６からなる群より選択される配列内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的である。
【００７３】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、５’エキソン／イントロン３’または３’イントロン／エキソン５’境界に相補的な核酸塩基配列を含む。
一つの実施形態では、５’エキソン／イントロン３’または３’イントロン／エキソン５’境界は、配列番号１の５０−５１、配列番号１の１６４−１６５、配列番号２の５０−５１、配列番号２の７９−８０、配列番号３の５１−５２、配列番号３の１２９−１３９、配列番号４の５０−５１、配列番号４の８１−８２の核酸塩基からなる群より選択される。
【００７４】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号７４〜配列番号１０５からなる群より選択される配列内に存在する核酸塩基配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列内に存在する。
【００７５】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２および配列番号８４からなる群より選択される核酸塩基配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列内に存在する。
【００７６】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８および配列番号８９からなる群より選択される核酸塩基配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列内に存在する。
【００７７】
一つの実施形態では、オリゴマーは、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２および配列番号８４からなる群より選択される。
【００７８】
一つの実施形態では、オリゴマーは、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８および配列番号８９からなる群より選択される。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド４７〜４９、５４〜５６および１２２〜１２４から選択される配列番号３の領域に相補的な核酸塩基配列を含む。
【００７９】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１３０〜配列番号１４５、配列番号１４６〜配列番号１６１、および配列番号１６２〜配列番号１７７からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基配列モチーフと同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基配列モチーフ内に存在する。
【００８０】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号１３１〜配列番号１４５、配列番号１４７〜配列番号１６１、および配列番号１６３〜配列番号１７７からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基配列モチーフと同一であるかまたは前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基配列モチーフ内に存在する。
【００８１】
一つの実施形態では、オリゴマーは、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５および配列番号２４６からなる群より選択される。
一つの実施形態では、オリゴマーは、前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含む。
【００８２】
スプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）：
もう一つの態様では、本発明は、エキソン７を欠く可溶性のリガンド結合形態の量が増加し、内在性膜形態の量が減少するように、スプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を用いてＴＮＦＲ２の選択的スプライシングを制御する。本発明の方法および組成物は、過度のｔｎｆ活性に関連する疾患の治療において使用することができる。
【００８３】
従って、本発明の一つの実施形態は、患者にＳＳＯを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。投与されたＳＳＯは、エキソン７を欠く哺乳動物ＴＮＦＲ２タンパク質を生産するようにプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる。
【００８４】
もう一つの実施形態では、本発明は、細胞にＳＳＯを投与することにより、細胞においてエキソン７を欠く哺乳動物ＴＮＦＲ２タンパク質を生産する方法である。
ＳＳＯの長さ（すなわちオリゴマー内のモノマーの数）は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）と同様であり、典型的には約８〜３０ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ＳＳＯは約１０〜１６ヌクレオチドである。本発明は、ＲＮＡにハイブリダイズするが、従来のアンチセンス２’−デオキシオリゴヌクレオチドのようにＲＮアーゼＨによるＲＮＡの分解を活性化させない、いくつかの化学的性質のＳＳＯで実施することができる。本発明は、２’Ｏ修飾核酸オリゴマー、例えば２’Ｏが−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨまたは−Ｆで置換されているものを用いて実施でき、２’Ｏ−メチルまたは２’Ｏ−メチルオキシエチルが好ましい。核酸塩基は糖に結合している必要はない、すなわちいわゆるペプチド核酸オリゴマーまたはモルホリンベースのオリゴマーが使用できる。これらの種々の連結化学物質の比較は、Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３６９５に見られる。スプライススイッチオリゴヌクレオチドという用語は、上記形態を包含することが意図されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーとＳＳＯの関係を理解する。ギャップマーは、非活性化ヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーに隣接するＲＮアーゼＨ活性化領域（典型的には２’−デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート）を含むＡＳＯＮである。一般に、ギャップマーＡＳＯＮ内のフランキング配列のために適切な任意の化学物質をＳＳＯにおいて使用できる。
【００８５】
本発明のＳＳＯは、固相合成の周知の手法を通して作製され得る。当技術分野で公知のこのような合成に関する他の任意の手段を付加的または選択的に使用し得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを作製するために類似の手法を使用することは周知である。
【００８６】
ＳＳＯの塩基は、従来のシトシン、グアニン、アデニンおよびウラシルまたはチミジンであり得る。あるいは、修飾塩基が使用できる。特に興味深いのは、結合親和性を高める修飾である。好ましい修飾塩基の１つの非限定的な例は、グアノシンとの４つの水素結合を形成するシトシン類似体、いわゆるｇ−クランプまたは９−（アミノエトキシ）フェノキサジンヌクレオチドである（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９９，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３５１３、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｓ．Ｃ，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７５９）。他の塩基の具体例は、５−メチルシトシン（ｍｅＣ）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６，５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、２，６−ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニンおよび２−クロロ−６−アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
ＬＮＡヌクレオチドをＳＳＯにおいて使用するときは、非ＬＮＡヌクレオチドも同時に存在することが好ましい。ＬＮＡヌクレオチドは、有意の非特異的結合が存在し得るようなハイブリダイゼーションの高い親和性を有し、これは遊離ＳＳＯの有効濃度を低下させ得る。ＬＮＡヌクレオチドを使用するとき、それらを２’−デオキシヌクレオチドで好都合に変化させ得る。交互ヌクレオチド、交互ジヌクレオチドまたは混合パターン、例えばＬＤＬＤＬＤまたはＬＬＤＬＬＤまたはＬＤＤＬＤＤが使用できる。例えば一つの実施形態は、ＬＤＬＤＤＬＬＤＤＬＤＬＤＬＬ、ＬＤＬＤＬＬＬＤＤＬＬＬＤＬＬ、ＬＭＬＭＭＬＬＭＭＬＭＬＭＬＬ、ＬＭＬＭＬＬＬＭＭＬＬＬＭＬＬ、ＬＦＬＦＦＬＬＦＦＬＦＬＦＬＬ、ＬＦＬＦＬＬＬＦＦＬＬＬＦＬＬ、ＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬ、ＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤ、ＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤ、ＬＭＭＬＭＭＬＭＭＬ、ＭＬＭＭＬＭＭＬＭＭ、ＭＭＬＭＭＬＭＭＬＭ、ＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬ、ＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦ、ＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦ、ＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬ、ＬＤＬＤＬＤＬＤＬ、ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ、ＬＭＬＭＬＭＬＭＬ、ＦＬＦＬＦＬＦＬＦＬ、ＬＦＬＦＬＦＬＦＬ［式中、ＬはＬＮＡ単位であり、ＤはＤＮＡ単位であり、Ｍは２’Ｍｏｅであり、Ｆは２’フルオロである］からなる群より選択されるヌクレオチドの配列を含む。
【００８８】
２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオシドホスホロチオエートをＬＮＡヌクレオチドと混合するときは、ＲＮアーゼＨの活性化を回避することが重要である。ＳＳＯの約３分の１から３分の２のＬＮＡヌクレオチドが適切であると予想される。ＬＮＡまたはｇ−クランプヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、親和性増強修飾を使用するとき、当業者は、このような親和性増強修飾の割合を高める必要があり得ることを認識する。
【００８９】
ＲＮアーゼＨを活性化しない数多くの選択的化学物質が使用可能である。例えば適切なＳＳＯは、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つが、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートなどの修飾リン酸塩であるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、記述されているように、ヌクレオチド間の架橋リン酸残基を１つおきに修飾し得る。もう一つの非限定的な例では、このようなＳＳＯは、ヌクレオチドの少なくとも１つが２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４、直鎖または分枝、飽和または不飽和アルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−ブロペニルおよびイソプロピル）を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、記述されているようにヌクレオチドを１つおきに修飾し得る。（米国特許第５，９７６，８７９号明細書第４欄の中の参考文献参照）。インビボでの使用のためには、ホスホロチオエート結合が好ましい。
【００９０】
ＳＳＯの長さは約８〜約３０塩基長である。当業者は、親和性を高める化学修飾を使用するとき、ＳＳＯはより短くてよいが、まだ特異性を保持し得ることを理解する。当業者はさらに、ＳＳＯの大きさの上限が、標的配列の特異的認識を維持し、ＳＳＯの二次構造を形成する自己ハイブリダイゼーションを回避する必要性によって、および細胞に入り込むことの制限によって課せられることを理解する。これらの制限は、より長い（ＳＳＯの親和性に依存する一定の長さ以上の）ＳＳＯは、より特異性が低い、不活性であるまたは活性が低いことがより頻繁に認められることを示唆する。
【００９１】
本発明のＳＳＯは、ＳＳＯの活性、細胞分布または細胞取込みを高める１つ以上の部分またはコンジュゲートのＳＳＯへの化学結合を含むＳＳＯの修飾型を含むが、これらに限定されない。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
所与のＳＳＯ内のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に上記修飾の２つ以上が単一化合物内またはＳＳＯ内の単一ヌクレオシドにおいて組み込まれ得る。
ＳＳＯは、取込み、分布および／または吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、および経口製剤、直腸用製剤、局所製剤またはその他の製剤のような他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、複合または結合され得る。
【００９３】
当業者は、細胞分化がスプライソソームの分化を含むが、これに限定されないことを理解する。従って、特定のＳＳＯの活性は、それらが導入される細胞型に依存し得る。例えば、ある細胞型において有効なＳＳＯが、もう１つ別の細胞型では無効であり得る。
【００９４】
本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび製剤はまた、ヒトまたは動物遺伝子におけるスプライシングを検討するためのインビトロまたはインビボツールとしても有用である。このような方法は、本明細書で述べる手順によって、または当業者に明白であるそれらの修正法によって実施できる。
【００９５】
本明細書に開示するＳＳＯは、医師がｔｎｆの作用またはｔｎｆによって活性化されるシグナル伝達経路を制限しようとする何らかの状態を治療するために使用できる。特に、本発明は炎症性疾患を治療するために使用できる。一つの実施形態では、状態は、炎症性全身性疾患、例えば関節リウマチまたは乾癬性関節炎である。もう一つの実施形態では、疾患は炎症性肝疾患である。炎症性肝疾患の例は、ａ型、ｂ型またはｃ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪症を含むが、これらに限定されない。さらにもう一つの実施形態では、炎症性疾患は、乾癬などの皮膚状態である。
【００９６】
ＲＮアーゼＨの動員
本発明によるオリゴマーは、相補的一本鎖ＲＮＡ分子のＲＮアーゼＨに基づく切断を仲介しない。オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの動員において有効であるためには一続きの少なくとも５つの連続するＤＮＡ核酸塩基が必要である。
【００９７】
欧州特許第１２２２３０９号明細書には、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのインビトロ方法が提供されており、これはＲＮアーゼＨを動員する能力を決定するために使用され得る。化合物は、相補的ＲＮＡ標的が与えられたとき、欧州特許第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜実施例９５によって提供される方法を用いてｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度が、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基が存在する同等のＤＮＡだけのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％未満である場合、ＲＮアーゼＨを動員することができると見なされる。
【００９８】
化合物は、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮアーゼＨが与えられたとき、欧州特許第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜実施例９５によって提供される方法を用いてｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されたＲＮアーゼＨ初期速度が、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基が存在する同等のＤＮＡだけのオリゴヌクレオチドを用いて測定された初期速度の２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満、または好ましくは１％未満（またはさらに０．１％未満）の初期速度を有する場合、基本的にＲＮアーゼＨを動員することができないと見なされる。
【００９９】
ヌクレオチド類似体
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及するとき、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、前記配列内に存在するヌクレオチドの１つ以上の代わりに、ＬＮＡ単位または、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを上昇させるヌクレオチド類似体（すなわち親和性増強ヌクレオチド類似体）などの対応するヌクレオチド類似体を含み得る。
【０１００】
さらに、ヌクレオチド類似体はインビボでのオリゴマーの安定性を高め得る。
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体（Ｘ）は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’ＭＯＥ  ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
【０１０１】
一つの実施形態では、連続する核酸塩基は、２’ＯＭｅリボヌクレオチド類似体または２’−ＭＯＥリボヌクレオチド類似体を含まない。
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、２’ＭＯＥ、すなわち２’Ｏ−２メトキシエチルＲＮＡである。それ故一つの実施形態では、本明細書の核酸塩基モチーフにおいて言及されるＸ２またはＭは、２’−ＭＯＥであり得る。
【０１０２】
ＬＮＡまたは２’置換糖類などの、親和性増強ヌクレオチド類似体のオリゴマーへの組込みは、特異的に結合するオリゴマーの大きさを縮小させることができ、また上限を非特異的なまたは異常な結合が起こる前のオリゴマーの大きさに縮小し得る。
【０１０３】
適切には、オリゴマーの核酸塩基または連続する核酸塩基がＴＮＦＲ標的配列の対応する領域に対して完全に相補的でないとき、オリゴマーが親和性増強ヌクレオチド類似体を含む一つの実施形態では、このようなヌクレオチド類似体は、ＴＮＦＲ標的内のそれらの対応するヌクレオチドと相補鎖を形成する。
【０１０４】
従って、オリゴマーは天然ヌクレオチドの簡単な配列（好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（本明細書では一般に「ＤＮＡ」と称する）であるが、リボヌクレオチド（本明細書では一般に「ＲＮＡ」と称する）であってもよい）を含み、またはそれからなり得、若しくは１つ以上のヌクレオチド「類似体」を含み得る（場合により完全にそれからなり得る）。
【０１０５】
ヌクレオチド「類似体」は、糖および／または塩基および／またはリン酸部分の修飾に基づく天然ＤＮＡまたはＲＮＡの変異体である。「核酸塩基」という用語は、天然（ＤＮＡ型またはＲＮＡ型）ヌクレオチド並びにそれらのこのような「類似体」を包含するために使用される。類似体は、原則としてオリゴヌクレオチドとの関連において単に天然ヌクレオチドと「サイレント」または「同等」であり得る、すなわちオリゴヌクレオチドがβ−カテニンの発現を阻害するように働く様式に機能的影響を及ぼさない。このような「同等」の類似体は、それにもかかわらず、例えばそれらがより容易に若しくはより安価に製造されるか、または保存若しくは製造条件に対してより安定であるか、またはタグ若しくは標識である場合に有用であり得る。しかし、好ましくは、類似体は、例えば標的に対する結合親和性の上昇および／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性の上昇および／または細胞内への輸送の容易さの上昇を生じさせることにより、オリゴマーが発現を阻害するように働く様式に機能的影響を及ぼす。
【０１０６】
このようなヌクレオチドの修飾の例は、結合親和性を高め、おそらくある程度のヌクレアーゼ抵抗性上昇も提供する、２’−置換基を与えるまたは架橋（ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸）構造を生じさせるように糖部分を修飾すること、およびヌクレオチド間結合を、その通常のホスホジエステルから、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートなどの、ヌクレオチド攻撃に対してより抵抗性であるものに改変することを含む。
【０１０７】
好ましいヌクレオチド類似体は、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡなどのＬＮＡであり、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが最も好ましい。
【０１０８】
一部の実施形態では、オリゴマーは、３〜８個のヌクレオチド類似体、例えば６個または７個のヌクレオチド類似体を含む。最も好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つがロックト核酸（ＬＮＡ）であり、例えばヌクレオチド類似体の少なくとも３または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７または８がＬＮＡであり得る。一部の実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体がＬＮＡであり得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオチド類似体は、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位（インターカレート核酸）単位および２’ＭＯＥ単位から独立して選択される。
【０１１０】
２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーおよびＬＮＡは好ましいヌクレオチド類似体であり、従って本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含み得るか、または３つのタイプから選択される類似体の１つのタイプだけを含み得る。
【０１１１】
好ましくは、本発明によるオリゴマーは、少なくとも１つのロックト核酸（ＬＮＡ）単位、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のＬＮＡ単位、好ましくは４〜８個のＬＮＡ単位、最も好ましくは４、５または６個のＬＮＡ単位を含む。適切には、オリゴマーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、および以下のＬＮＡ単位：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、エナ−ＬＮＡおよび／またはＤ−βまたはＬ−αのいずれかの立体配座またはそれらの組合せのα−ＬＮＡの１つ以上の両方を含み得る。
【０１１２】
本発明の一つの実施形態では、オリゴマーはＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方を含み得る。好ましくは、ＬＮＡとＤＮＡ単位を合わせた合計は、８〜２４個、例えば８〜１５個または１０〜２５個、または１０〜２０個または１２〜１６個である。
【０１１３】
本発明の一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列などのオリゴマーの核酸塩基配列は、少なくとも１つのＬＮＡからなり、残りの核酸塩基単位はＤＮＡ単位である。
ＬＮＡを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明によるオリゴマーの一部の実施形態では、すべてのＬＮＡ  Ｃ単位は５’メチル−シトシンである。一部の実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体はＬＮＡである。
【０１１４】
最も好ましい実施形態では、オリゴマーは、ＬＮＡヌクレオチド類似体とヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくは、場合によりホスホロチオエートなどの修飾された核酸塩基間結合を有する、ＤＮＡヌクレオチド）だけを含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは２’−ＭＯＥ−ＲＮＡであり、例えば２、３、４、５、６、７または８個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ核酸塩基単位である。
【０１１６】
一部の実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは２’−フルオロ−ＤＮＡであり、例えば２、３、４、５、６、７または８個の２’−フルオロ−ＤＮＡ核酸塩基単位である。
【０１１７】
ヌクレオシド類似体の具体例は、例えばＦｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３によって述べられており、またスキーム１に示されている。
【０１１８】
【化１】
2014050400.tif 000003
「ＬＮＡ」という用語は、「ロックト核酸」として知られる二環式ヌクレオチド類似体である。この語は、ＬＮＡモノマーを表し得るか、または「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」に関連して使用されるときは、１つ以上のこのような二環式ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【０１１９】
特に好ましい化学的性質はロックト核酸（ＬＮＡ）によって提供される（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４：３６０７、Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５４０１）。本明細書において使用される、「ＬＮＡ単位」、「ＬＮＡモノマー」、「ＬＮＡ残基」、「ロックト核酸単位」、「ロックト核酸モノマー」または「ロックト核酸残基」という用語は、二環式ヌクレオシド類似体を指す。ＬＮＡ単位およびそれらの合成の方法は、中でも特に、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット、同第００／５６７４６号パンフレット、同第００／５６７４８号パンフレット、同第０１／２５２４８号パンフレット、同第０２／２８８７５号パンフレット、同第０３／００６４７５号パンフレットおよび同第０３／０９５４６７号パンフレットに述べられている。ＬＮＡ単位はまた、その化学式に関して定義され得る。それ故、本明細書において使用される「ＬＮＡ単位」は、以下の式１：
【０１２０】
【化２】
2014050400.tif 000004
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲＨ［式中、ＲはＨまたはＣ１−Ｃ４−アルキルである］からなる群より選択され、
Ｙは（−ＣＨ２）ｒ［式中、ｒは１〜４の整数である］であり、かつ、
Ｂは、上述したような天然または非天然起源の塩基である］
に示される化学構造を有する。
【０１２１】
好ましい実施形態では、ｒは１または２であり、より好ましい実施形態では、ｒは１である。
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるＬＮＡは、好ましくは一般式：
【０１２２】
【化３】
2014050400.tif 000005
［式中、ＸおよびＹは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−または−ＣＨ−（二重結合の部分である場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の部分である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−［式中、Ｒは水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］の群の中から独立して選択され、
ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され、
Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、かつ、
不斉基はいずれかの配向で存在し得る］
の構造を有する。
【０１２３】
好ましくは、本発明のオリゴマーにおいて使用されるＬＮＡは、式：
【０１２４】
【化４】
2014050400.tif 000006
［式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ（ＲＨ）であり、
ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され、
Ｂは、天然または非天然核酸塩基を構成し、かつ、
ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］
のいずれかに従った少なくとも１つのＬＮＡを含む。
【０１２５】
好ましくは、本発明のオリゴマーにおいて使用されるＬＮＡは、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−［式中、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］
から選択されるヌクレオシド間結合を含む。
【０１２６】
特に好ましいＬＮＡ単位をスキーム２に示す：
【０１２７】
【化５】
2014050400.tif 000007
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式内のＸまたはＹの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【０１２８】
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式内のＸまたはＹの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−［式中、Ｒは水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］から選択されるロックトヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【０１２９】
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式内のＸまたはＹの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表すロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【０１３０】
「エナ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式内のＹが−ＣＨ２−Ｏ−である（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は塩基Ｂに対して２’位に結合している）ロックトヌクレオチドを含む。
【０１３１】
好ましい実施形態では、ＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。
【０１３２】
好ましくは、本発明によるオリゴマーは、少なくとも１つのロックト核酸（ＬＮＡ）単位などのヌクレオチド類似体、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のロックト核酸（ＬＮＡ）単位などのヌクレオチド類似体、好ましくは３〜９個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、例えば４〜８個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、例えば６〜９個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、好ましくは６、７または８個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体を含む。
【０１３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明によるオリゴマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、特に３、４、５、６、７、８、９または１０個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、例えば１〜１０個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体、例えば２〜８個のＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体を含み得る。
【０１３４】
好ましくは、ＬＮＡ単位は、少なくとも１つのβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明のオリゴマーは、２以上のタイプのＬＮＡ単位を含み得る。適切には、化合物は、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、および以下のＬＮＡ単位：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、エナ−ＬＮＡおよび／またはＤ−βまたはＬ−αのいずれかの立体配座またはそれらの組合せのα−ＬＮＡの１つ以上の両方を含み得る。
【０１３５】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体とＤＮＡ単位の両方を含み得るか、またはそれらからなり得る。
ＬＮＡおよびＤＮＡが好ましいが、ＭＯＥ、２’−Ｏ−Ｍｅ、および他の２’−置換類似体およびＲＮＡも使用できる。
【０１３６】
好ましいＤＮＡ類似体は、２’−Ｈ基が、−ＯＨ（ＲＮＡ）以外の置換基で置換されている、例えば−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨまたは−Ｆで置換されているＤＮＡ類似体を含む。
【０１３７】
好ましいＲＮＡ類似体は、その２’−ＯＨ基において、例えば−Ｈ（ＤＮＡ）以外の基、例えば−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨまたは−Ｆによる置換によって修飾されているＲＮＡ類似体を含む。
【０１３８】
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体は「ＥＮＡ」である。
一つの実施形態では、本発明のオリゴマーはいかなるＲＮＡ単位も含まない。
高親和性ヌクレオチド類似体は、同等のＤＮＡヌクレオチドの結合親和性よりも高い、相補的ＲＮＡヌクレオチドとの二本鎖熱安定性を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるヌクレオチド類似体である。これは、典型的にはＴｍを測定することによって決定される。
【０１３９】
同等のヌクレオチドと比較して、オリゴマー／標的核酸のＴｍを上昇させるヌクレオチド類似体（親和性増強ヌクレオチド類似体）が好ましい。オリゴマーは、適切には、ＴＮＦＲ  ｍＲＮＡなどの標的核酸にハイブリダイズして、少なくとも３０℃、例えば３７℃、例えば少なくとも４０℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃または少なくとも６０℃のＴｍをを有する二本鎖を形成することができる。一つの態様では、例えば、Ｔｍは３０℃〜８０℃、例えば４０℃〜７０℃である。
【０１４０】
一つの実施形態では、本発明のオリゴマーの核酸塩基の少なくとも３０％、例えば少なくとも３３％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％は、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体核酸塩基である。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーの核酸塩基のすべてが、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体核酸塩基である。
【０１４１】
より短いオリゴヌクレオチドに関しては、ＬＮＡなどの（高親和性）ヌクレオチド類似体の割合を高める必要があり得ることは認識されるであろう。
「オリゴマー」という用語と交換可能に使用される「オリゴヌクレオチド」（または単に「オリゴ」）という用語は、本発明に関連して、２つ以上の核酸塩基の共有結合によって形成される分子を指す。本発明のオリゴヌクレオチド（一本鎖オリゴヌクレオチドとも称される）に関連して使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一つの実施形態では、例えば８〜２６個の核酸塩基、例えば１２〜２６個の核酸塩基を有し得る。本明細書において詳述される好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜１６核酸塩基または８〜１５核酸塩基の長さを有する。
【０１４２】
オリゴマーの長さの変化
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは変化し得る。実際に、１０〜１７または１０〜１５核酸塩基などの短いオリゴヌクレオチドを有することは有利であると考えられる。
【０１４３】
このような実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６核酸塩基の長さを有し得る。
一つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、８〜２４ヌクレオチド、例えば１０〜２４ヌクレオチドの長さ、１２〜２４ヌクレオチド、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長、好ましくは１０〜２２、例えば１２〜２２ヌクレオチド、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長、より好ましくは１０〜２０、例えば１２〜２０ヌクレオチド長、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長、さらに一層好ましくは１０〜１９、例えば１２〜１９ヌクレオチド長、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチド長、例えば１０〜１８、例えば１２〜１８ヌクレオチド長、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチド長、より好ましくは１０〜１７、例えば１２〜１７ヌクレオチド長、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチド長、最も好ましくは１０〜１６、例えば１２〜１６ヌクレオチド、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチド長を有する。
【０１４４】
ヌクレオシド間連結基
「ヌクレオシド間連結基」という用語は、ＤＮＡ単位間、ＤＮＡ単位とヌクレオチド類似体の間、２つの非ＬＮＡ単位の間、非ＬＮＡ単位とＬＮＡ単位の間、および２つのＬＮＡ単位の間等のような、２つの核酸塩基を共有結合することができる基を意味するように意図されている。好ましい例は、リン酸、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基を含む。
【０１４５】
ヌクレオシド間連結基は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−からなる群より選択され得、かつ／またはヌクレオシド間連結基は、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−からなる群より選択され得る［式中、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］。適切には、一部の実施形態では、上記で提供される硫黄（Ｓ）含有ヌクレオシド間連結基が好ましいと考えられる。
【０１４６】
ヌクレオシド間連結基の修飾
オリゴヌクレオチド内の典型的なヌクレオシド間連結基はリン酸基であるが、これらは、リン酸とは異なるヌクレオシド間連結基によって置換され得る。本発明のさらなる興味深い実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはそのヌクレオシド間連結基構造において修飾される、すなわち修飾オリゴヌクレオチドはリン酸とは異なるヌクレオシド間連結基を含む。従って、好ましい実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、リン酸とは異なる少なくとも１つのヌクレオシド間連結基を含む。
【０１４７】
リン酸（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−）とは異なる少なくとも１つのヌクレオシド間連結基の具体例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−［式中、ＲＨは水素またはＣ１−４−アルキルである］を含む。
【０１４８】
ヌクレオシド間連結基が修飾されるとき、ヌクレオシド間連結基は、好ましくはホスホロチオエート基（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）である。好ましい実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間連結基はホスホロチオエートである。
【０１４９】
大部分の治療用途に関して、オリゴヌクレオチドが完全にホスホロチオエート化されていることが望ましい−例外は、脳または脊柱などのＣＮＳにおける使用のための治療的オリゴヌクレオチドであり、ＣＮＳでは、ヌクレアーゼが存在しないため、ホスホロチオエート化は毒性であることができ、連続ＤＮＡ単位間であってもホスホジエステル結合を使用し得る。
【０１５０】
一つの実施形態では、オリゴマーは交互ＬＮＡおよびＤＮＡ単位（Ｘｘ）または（ｘＸ）を含む。
一つの実施形態では、オリゴマーは、交互ＬＮＡおよびそれに続く２つのＤＮＡ単位（Ｘｘｘ）、ｘＸｘまたはｘｘＸのモチーフを含む。
【０１５１】
一つの実施形態では、ＤＮＡまたは非ＬＮＡヌクレオチド類似体単位の少なくとも１つは、上記で述べた実施形態のいずれか１つにおいてＬＮＡ核酸塩基単位として同定された位置から選択される位置でＬＮＡ核酸塩基によって置換されている。
【０１５２】
一つの実施形態では、「Ｘ」はＬＮＡ単位を表す。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも３つのヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも４つのヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも５個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも６個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも７個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも８個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも９個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１１個、例えば少なくとも１２個のヌクレオチド類似体単位を含む。
【０１５３】
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも３個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも４個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも５個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも６個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも７個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも８個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも９個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも１０個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも１１個のＬＮＡ単位、例えば少なくとも１２個のＬＮＡ単位を含む。
【０１５４】
ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも１つがシトシンまたはグアニンのいずれかである一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の１〜１０個がシトシンまたはグアニンのいずれかであり、例えばＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の２、３、４、５、６、７、８または９個がシトシンまたはグアニンのいずれかである。
【０１５５】
一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも２つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも３つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも４つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも５つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも６つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも７つがシトシンまたはグアニンのいずれかである。一つの実施形態では、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の少なくとも８個がシトシンまたはグアニンのいずれかである。
【０１５６】
好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体は、相補的ＲＮＡヌクレオチドに対する同等のＤＮＡヌクレオチドの結合親和性よりも高い、前記相補的ＲＮＡヌクレオチドとの二本鎖熱安定性を有する。
【０１５７】
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、一本鎖オリゴヌクレオチドに高い血清安定性を付与する。
本発明のオリゴマーのさらなる設計
一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーの、３’末端から数えて最初の核酸塩基は、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体である。
【０１５８】
一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーの、３’末端から数えて２番目の核酸塩基は、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体である。
一つの実施形態では、ｘ’’はＤＮＡ単位を表す。
【０１５９】
一つの実施形態では、オリゴマーは、５’末端にＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体単位を含む。
一つの実施形態では、Ｘなどのヌクレオチド類似体単位は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
【０１６０】
一つの実施形態では、本発明のオリゴマーのすべての核酸塩基はヌクレオチド類似体単位である。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１つのＬＮＡ類似体単位およびＬＮＡ以外の少なくとも１つのさらなるヌクレオチド類似体を含む。
【０１６１】
一つの実施形態では、Ｘなどのヌクレオチド類似体単位は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、およびＬＮＡ単位からなる群より独立して選択される。
一つの実施形態では、１または複数の非ＬＮＡヌクレオチド類似体単位は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位から独立して選択される。
【０１６２】
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１つの配列Ｘ１Ｘ２Ｘ１またはＸ２Ｘ１Ｘ２［式中、Ｘ１はＬＮＡであり、およびＸ２は、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位のいずれかである］からなる。
【０１６３】
一つの実施形態では、オリゴマーの核酸塩基の配列は、選択的Ｘ１およびＸ２単位からなる。
一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、５個以上の連続するＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、６個以上の連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、７個以上の連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、８個以上の連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、３個以上の連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、２個以上の連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。
【０１６４】
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも２個の連続するＬＮＡ単位などの、少なくとも２個の連続するヌクレオチド類似体単位からなる少なくとも１つの領域を含む。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも３個の連続するＬＮＡ単位などの、少なくとも３個の連続するヌクレオチド類似体単位からなる少なくとも１つの領域を含む。
【０１６５】
一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、７個以上の連続するヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、６個以上の連続ヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、５個以上の連続ヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、４個以上の連続ヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、３個以上の連続ヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明のオリゴマーは、ＬＮＡ単位などの、２個以上の連続ヌクレオチド類似体単位の領域を含まない。
【０１６６】
一つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ロックト核酸（ＬＮＡ）核酸塩基単位などの、（好ましくは高親和性の）ヌクレオチド類似体であるオリゴマーの核酸塩基単位を少なくとも５０％、例えば５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または例えば１００％含む。
【０１６７】
以下の表３および表４は、本発明のオリゴヌクレオチドによって好都合に標的とされ得る短いマイクロＲＮＡ配列の非限定的な例を示す。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、一つの実施形態では、以下のモチーフからなる群より選択される核酸塩基の配列５’−３’を有し得る：
ＬｘＬｘｘＬＬｘｘＬＬ
ＬｘＬｘＬＬＬｘｘＬＬ
ＬｘｘＬｘｘＬｘｘＬ
ｘＬｘｘＬｘｘＬｘｘ  「２つおき」
ｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘ  「２つおき」
ｘＬｘＬｘＬｘＬｘＬ  「１つおき」
ＬｘＬｘＬｘＬｘＬ  「１つおき」
ＬｄＬｄｄＬＬｄｄＬＬ
ＬｄＬｄＬＬＬｄｄＬＬＬ
ＬＭＬＭＭＬＬＭＭＬＬ
ＬＭＬＭＬＬＬＭＭＬＬ
ＬＦＬＦＦＬＬＦＦＬＬ
ＬＦＬＦＬＬＬＦＦＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ
ＬＭＭＬＭＭＬＭＭＬ
ＭＬＭＭＬＭＭＬＭＭ  「２つおき」
ＭＭＬＭＭＬＭＭＬＭ  「２つおき」
ＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬ  「２つおき」
ＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦ  「２つおき」
ＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦ  「２つおき」
ｄＬｄＬｄＬｄＬｄＬ  「１つおき」
ＬｄＬｄＬｄＬｄＬ  「１つおき」
ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ  「１つおき」
ＬＭＬＭＬＭＬＭＬ  「１つおき」
ＦＬＦＬＦＬＦＬＦＬ  「１つおき」
ＬＦＬＦＬＦＬＦＬ  「１つおき」
ＬｄＬｄｄＬＬｄｄＬｄＬｄＬＬ
ＬｄＬｄＬＬＬｄｄＬＬＬｄＬＬ
ＬＭＬＭＭＬＬＭＭＬＭＬＭＬＬ
ＬＭＬＭＬＬＬＭＭＬＬＬＭＬＬ
ＬＦＬＦＦＬＬＦＦＬＦＬＦＬＬ
ＬＦＬＦＬＬＬＦＦＬＬＬＦＬＬ
ＬｄｄＬｄｄＬｄｄＬ（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）
ｄＬｄｄＬｄｄＬｄｄ（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）
ｄｄＬｄｄＬｄｄＬｄ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）
ＬＭＭＬＭＭＬＭＭＬ（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）
ＭＬＭＭＬＭＭＬＭＭ（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）
ＭＭＬＭＭＬＭＭＬＭ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）
ＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬ（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）
ＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦ（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）
ＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）
ｄＬｄＬｄＬｄＬｄＬ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）
ＬｄＬｄＬｄＬｄＬ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）
ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）
ＬＭＬＭＬＭＬＭＬ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）
ＦＬＦＬＦＬＦＬＦＬ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）
ＬＦＬＦＬＦＬＦＬ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）
式中、Ｌ＝ＬＮＡ単位、ｄ＝ＤＮＡ単位、Ｍ＝２’ＭＯＥ  ＲＮＡ、Ｆ＝２’フルオロおよび「ｘ」＝本明細書において定義される通り。より長いオリゴマーに関しては上記パターンが反復され得ること、およびより短いオリゴマーに関しては、５’末端からまたは３’末端から始まる、上記モチーフの対応する一部分を使用し得ること、およびカッコ内の残基は選択的であることが認識される。
【０１６８】
一つの実施形態では、本発明はさらに、オリゴマー（又な連続する核酸塩基配列）が少なくとも１つのホスホロチオエート結合および／または少なくとも１つの３’末端ＬＮＡ単位および／または少なくとも１つの５’末端ＬＮＡ単位を含むオリゴマーを提供する。
【０１６９】
タンパク質
本発明は、エキソン７によってコードされる膜貫通結合ドメイン内に欠失を含む、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体を提供し、前記ＴＮＦ−α受容体は、ＴＮＦ−α受容体ＴＮＦＲ１Ａ若しくはＴＮＦＲ１Ｂ、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログから選択される。
【０１７０】
一つの実施形態では、本発明による単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、エキソン７によってコードされる膜貫通結合ドメインを欠く。
一つの実施形態では、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、ヒトＴＮＦＲ１  ＴＮＦ−α受容体（配列番号１２３の残基１〜４５５または残基３０〜４５５、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログ）であり、前記欠失は、残基２０９から２４６の間（または配列番号１２３の残基２０９〜２４６に対応する領域）に存在する。
【０１７１】
一つの実施形態では、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、配列番号１１９の残基１〜２０８または残基３０〜２０８、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログからなる配列を有する。
【０１７２】
一つの実施形態では、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、ヒトＴＮＦＲ２  ＴＮＦ−α受容体（配列番号１２７の残基１〜４３５または残基２３〜４３５、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログ）であり、前記欠失は、残基２６３から２８９の間（または配列番号１２３の残基２０９〜２４６に対応する領域）に存在する。
【０１７３】
一つの実施形態では、単離または精製された可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、配列番号１２７の残基１〜２６２または残基２３〜２６２、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログからなる配列を有する。
【０１７４】
一つの実施形態では、可溶性形態のＴＮＦ−α受容体は、単離され且つ精製されている。
本発明の一つの実施形態は、哺乳動物ＴＮＦＲ遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされ、ｃＤＮＡ内でエキソン６の後に直接エキソン８が続き、その結果としてエキソン７を欠く、完全長または成熟タンパク質である。さらに前記タンパク質は、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦ−αに結合することができ、ＴＮＦアンタゴニストとして、好ましくはＴＮＦ−αアンタゴニストとして作用することができる。好ましくは、本発明のＴＮＦＲは、可溶性細胞外ドメイン単独よりも大きな度合で、より好ましくはＴＮＦＲ：Ｆｃと同等かまたはそれより大きな度合で、ＴＮＦ媒介性細胞傷害を阻害することができる。本開示における哺乳動物ＴＮＦＲは、ヒト、霊長動物、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびブタＴＮＦＲを含むが、これらに限定されない。さらに、本開示における哺乳動物ＴＮＦＲは、タンパク質が、それが比較される参照配列と同等の生物活性を保持する限り、例えば欧州特許出願第１１７２４４４号明細書に開示されるもののような、１つ以上の一塩基多型から生じるタンパク質配列を含むが、これに限定されない。
【０１７５】
一つの実施形態では、哺乳動物ＴＮＦＲは、哺乳動物ＴＮＦＲ１、好ましくはヒトＴＮＦＲ１である。ヒトＴＮＦＲ１に関して、この実施形態の２つの非限定的な例は、配列番号１２２に示されるシグナル配列を含むｈｕＴＮＦＲ１  Δ７およびシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ１  Δ７（配列番号１２２のアミノ酸３０〜４１７）によって与えられる。これらのｈｕＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の配列は、シグナル配列を含む野生型ヒトＴＮＦＲ１（配列番号１１８）のアミノ酸１〜２０８またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ１  Δ７についての野生型ヒトＴＮＦＲ１の３０〜２０８のいずれかであり、いずれの場合もそのすぐ後に野生型ヒトＴＮＦＲ１のアミノ酸２４７〜４５５が続く。
【０１７６】
もう一つの好ましい実施形態では、哺乳動物ＴＮＦＲは、哺乳動物ＴＮＦＲ２、最も好ましくはヒトＴＮＦＲ２である。ヒトＴＮＦＲ２に関して、この実施形態の２つの非限定的な例は、配列番号１２６に示されるシグナル配列を含むｈｕＴＮＦＲ２  Δ７またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７（配列番号１２６のアミノ酸２３〜４３５）によって与えられる。これらのｈｕＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の配列は、シグナル配列を含む野生型ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１２０）のアミノ酸１〜２６２またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７についての野生型ヒトＴＮＦＲ２の２３〜２６２のいずれかであり、いずれの場合も、エキソン６〜８ジャンクションにユニークコドンが創出されるためその後にグルタミン酸アミノ酸が続き、その後に野生型ヒトＴＮＦＲ２のアミノ酸２９０〜４６１が続く。
【０１７７】
本発明のタンパク質はまた、化学修飾されたタンパク質を包含する。タンパク質の化学修飾とは、そのアミノ酸残基の少なくとも１つが、プロセシングまたは他の翻訳後修飾などの自然過程によって、または当技術分野で公知の化学修飾手法によって修飾されているタンパク質を指す。このような修飾は、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰリボシル化、グリコシル化、メチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、またはコレステロール複合を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明のタンパク質はまた、一つの実施形態では、本発明のタンパク質の変異体、フラグメントおよびホモログを包含し得る。しかし、このようなタンパク質は、本明細書において説明するように、エキソン７またはエキソン８によってコードされるアミノ酸配列内に欠失を含む。
【０１７９】
核酸
本発明はさらに、本発明による可溶性形態のＴＮＦ−α受容体をコードする核酸を提供する。
【０１８０】
一つの実施形態では、核酸は、配列番号１２１のヌクレオチド１〜１２５１、配列番号１２１の８８〜１２５１、配列番号１２５の１〜１３０５および配列番号１２５の６７〜１３０５、またはその変異体、ホモログ若しくはフラグメントからなる群より選択され、遺伝暗号の縮重により、前記核酸と同じ一次アミノ酸配列をコードする核酸を包含する。
【０１８１】
本発明の一つの実施形態は、哺乳動物ＴＮＦＲ遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされ、ｃＤＮＡ内でエキソン６の後に直接エキソン８が続き、その結果としてエキソン７を欠く、完全長または成熟タンパク質をコードする核酸である。
【０１８２】
このような配列は、好ましくは、真核生物遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープン・リーディング・フレームの形態で提供される。関連配列を含むゲノムＤＮＡも使用できる。一つの実施形態では、核酸はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかである。もう一つの実施形態では、核酸はゲノムＤＮＡである。
【０１８３】
一つの実施形態では、哺乳動物ＴＮＦＲは、哺乳動物ＴＮＦＲ１である。この実施形態に関して、哺乳動物ＴＮＦＲ１は、好ましくはヒトＴＮＦＲ１である。ヒトＴＮＦＲ１に関して、この実施形態の２つの非限定的な例は、配列番号１２２に示されるシグナル配列を含むｈｕＴＮＦＲ１  Δ７をコードする核酸およびシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ１  Δ７（配列番号１２２のアミノ酸３０〜４１７）をコードする核酸である。好ましくは、これらのｈｕＴＮＦＲ１  Δ７核酸の配列は、シグナル配列を含む配列番号１２１のヌクレオチド１〜１２５１およびシグナル配列を欠く配列番号１２１のヌクレオチド８８〜１２５１である。これらのｈｕＴＮＦＲ１  Δ７核酸の配列は、シグナル配列を含む野生型ヒトＴＮＦＲ１（配列番号１１７）のヌクレオチド１〜６２５またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７についての野生型ヒトＴＮＦＲ１の８８〜６２５のいずれかであり、いずれの場合もそのすぐ後に野生型ヒトＴＮＦＲ１のアミノ酸７４０〜１３６８が続く。
【０１８４】
もう一つの好ましい実施形態では、哺乳動物ＴＮＦＲは、哺乳動物ＴＮＦＲ２、最も好ましくはヒトＴＮＦＲ２である。ヒトＴＮＦＲ２に関して、この実施形態の２つの非限定的な例は、配列番号１２６に示されるシグナル配列を含むｈｕＴＮＦＲ２  Δ７をコードする核酸またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７（配列番号１２６のアミノ酸２３〜４３５）をコードする核酸である。好ましくは、これらのｈｕＴＮＦＲ２  Δ７核酸の配列は、シグナル配列を含む配列番号１１５のヌクレオチド１〜１３０５およびシグナル配列を欠く配列番号１１５のヌクレオチド６７〜１３０５である。これらのｈｕＴＮＦＲ２  Δ７核酸の配列は、シグナル配列を含む野生型ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１１９）のヌクレオチド１〜７８７またはシグナル配列を欠く成熟ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７についての野生型ヒトＴＮＦＲ２の６７〜７８７のいずれかであり、いずれの場合もそのすぐ後に野生型ヒトＴＮＦＲ２のアミノ酸８６６〜１３８６が続く。
【０１８５】
本発明の核酸の塩基は、従来の塩基、シトシン、グアニン、アデニンおよびウラシルまたはチミジンであり得る。あるいは、修飾塩基が使用できる。他の適切な塩基は、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６，５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、２，６−ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニン、２−クロロ−６−アミノプリンおよび９−（アミノエトキシ）フェノキサジンを含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明の適切な核酸は、数多くの代替的な化学的性質を含む。例えば、本発明の適切な核酸は、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートなどの修飾リン酸塩であるものを含むが、これらに限定されない。もう一つの非限定的な例では、本発明の適切な核酸は、ヌクレオチドの少なくとも１つが２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４、直鎖または分枝、飽和または不飽和アルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−ブロペニルおよびイソプロピル）を含むものである。
【０１８７】
本発明の核酸はまた、ヌクレオチドの少なくとも１つが核酸類似体であるものを含むが、これらに限定されない。このような類似体の例は、ヘキシトール（ＨＮＡ）ヌクレオチド、２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート類似体、ホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチド類似体、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【０１８８】
本発明の核酸は、１つ以上の部分またはコンジュゲートの核酸への化学結合を伴う核酸の修飾型を含むが、これらに限定されない。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
【０１８９】
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一つの実施形態では、ベクターは、宿主細胞における前記核酸の発現を駆動することができる発現カセットを含む。
【０１９０】
本発明はまた、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、可溶性形態のＴＮＦ−α受容体の作製のための方法を提供し、前記方法は、前記核酸の発現を可能にする条件下で本発明による宿主細胞を培養し、その後前記宿主細胞から前記可溶性形態のＴＮＦ−α受容体を単離する工程を含む。
【０１９１】
本発明は、本発明の哺乳動物ＴＮＦＲをコードするＤＮＡを増幅するまたは発現するための発現ベクターを提供する。本発明はまた、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウィルスまたは昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結された哺乳動物ＴＮＦＲまたは生物学的に同等な類似体をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントを有する複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は一般に、（ａ）転写プロモーターまたはエンハンサーなどの、遺伝子発現において調節的役割を有する１つまたは複数の遺伝子因子、（ｂ）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、および（ｃ）適切な転写および翻訳開始配列および終結配列の集合体を含む。このような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列と、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列とを含み得る。通常は複製起点によって与えられる、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子が付加的に組み込まれ得る。
【０１９２】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連しているとき、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）についてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたとは、連続していること、および分泌リーダーの場合は、連続し、かつ読み枠内にあることを意味する。酵母発現系における使用を意図された構造エレメントは、好ましくは宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、前記タンパク質はＮ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、場合により、最終産物を提供するためにその後発現されたタンパク質から切断され得る。
【０１９３】
哺乳動物ＴＮＦＲ  ＤＮＡは、適切な宿主微生物、例えば大腸菌などの細菌またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母の実質的に均質な単一培養物を含む組換え発現系において発現または増幅され、前記宿主微生物は、（形質転換またはトランスフェクションによって）染色体ＤＮＡ中に組換え転写単位が組み込まれているか、または常在プラスミドの成分として組換え転写単位を担持する。本明細書で定義される組換え発現系は、構成的にまたはＤＮＡ配列若しくは合成遺伝子に連結された調節エレメントの誘導時に異種タンパク質を発現する。
【０１９４】
形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ手法を用いて構築された哺乳動物ＴＮＦＲベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。形質転換宿主細胞は通常ＴＮＦＲを発現するが、ＴＮＦＲ  ＤＮＡをクローニングまたは増幅するために形質転換された宿主細胞は、ＴＮＦＲを発現する必要はない。哺乳動物ＴＮＦＲの発現のための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、真菌または高等真核細胞を含む。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属細菌を含む。高等真核細胞は、樹立された昆虫および哺乳動物細胞系を含むが、これらに限定されない。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して哺乳動物ＴＮＦＲを生産するために使用できる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは当技術分野において周知である。
【０１９５】
原核生物発現宿主は、広汎なタンパク質分解およびジスルフィドプロセシングを必要としないＴＮＦＲの発現のために使用し得る。原核生物発現ベクターは一般に、１つ以上の表現型選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与するまたは独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確実にするために宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換のための適切な原核生物宿主は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕｓ）の中の様々な種を含むが、他も選択肢として使用できる。
【０１９６】
細菌での使用のための有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する細菌複製起点を含み得る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適切なプロモーターおよび発現しようとする構造配列と組み合わせる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含み、それ故形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。このような市販ベクターは、例えばＮｏｖａｇｅｎ（登録商標）ｐＥＴベクターのシリーズ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を含む。
【０１９７】
組換え微生物発現ベクターにおいて一般的に使用されるプロモーターは、ラクトースプロモーター系、およびλＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７  ｌａｃプロモーターを含む。特に有用な細菌発現系、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）ｐＥＴ系（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）は、Ｔ７またはＴ７  ｌａｃプロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含むＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌株を用いる。
【０１９８】
ＴＮＦＲタンパク質はまた、好ましくはＳ．セレビシエなどのサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からの、酵母および真菌宿主において発現され得る。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの他の属の酵母も使用できる。酵母ベクターは一般に、２μ酵母プラスミドからの複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ＴＮＦＲをコードするＤＮＡ、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択遺伝子を含有する。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点、および酵母と大腸菌の両方の形質転換を許容する選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および、それぞれトリプトファンまたはウラシル中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株についての選択マーカー、Ｓ．セレビシエＴＲＰ１またはＵＲＡ３遺伝子、および下流の構造配列の転写を誘導する、高発現酵母遺伝子に由来するプロモーターを含有する。酵母宿主細胞ゲノム内にＴＲＰ１またはＵＲＡ３損傷が存在することは、その後、それぞれトリプトファンまたはウラシルの不在下での増殖によって形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
【０１９９】
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖系酵素についてのプロモーターを含む。酵母発現における使用のための適切なベクターおよびプロモーターは当技術分野において周知である。
【０２００】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択と複製のためのｐＵＣ１８からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）並びにグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を用いて構築することができる。異種タンパク質の分泌を指令する、酵母α因子分泌リーダーは、プロモーターと発現する構造遺伝子の間に挿入できる。リーダー配列は、その３’末端付近に、外来遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にする１つ以上の有用な制限部位を含むように修飾することができる。適切な酵母形質転換プロトコールは当業者に公知である。
【０２０１】
ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、８０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを添加した、１％酵母抽出物、２％ペプトン、および１％または４％グルコースからなるリッチ培地において発現のために増殖させ得る。培地のグルコースが枯渇したとき、ＡＤＨ２プロモーターによる抑制の解除が起こる。粗酵母上清をろ過によって採集し、さらなる精製まで４℃に保持する。
【０２０２】
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系も、ＴＮＦＲタンパク質を発現するために好都合に利用できる。哺乳動物における組換えタンパク質は一般に正しく折りたたまれ、適切に修飾され、完全に機能性であるので、そのようなタンパク質の発現が特に好ましい。適切な哺乳動物宿主細胞系の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７系、および例えばＬ９２９などのＬ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を含む、適切なベクターを発現することができる他の細胞系を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、例えばＣＭＶｉｅプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーターまたは複合ｈＥＦｌ−ＨＴＬＶプロモーター、および発現する遺伝子に連結されたエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配列、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供給部位および受容部位、並びに転写終結配列などの５’または３’非翻訳配列のような、非転写エレメントを含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウィルス系は当業者に公知である。
【０２０３】
脊椎動物細胞を形質転換するときに使用される発現ベクター内の転写および翻訳制御配列は、ウィルス源によって提供され得る。例えば、一般的に使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウィルス２型、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、ＣＭＶｉｅプロモーターなどのヒトサイトメガロウィルス、複合ｈＥＦｌ−ＨＴＬＶプロモーターなどのＨＴＬＶに由来する。ＳＶ４０ウィルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされるその他の遺伝因子を提供するために使用できる。
【０２０４】
さらに、制御および／またはシグナル配列などの、哺乳動物ゲノムＴＮＦＲプロモーターは、このような制御配列が選択される宿主細胞と適合すれば、利用することができる。
本発明の好ましい態様では、ＴＮＦＲ  ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターは、宿主細胞のＤＮＡに安定に組み込まれる。
【０２０５】
タンパク質の発現および精製：
哺乳動物または昆虫細胞を使用するとき、適切に発現したＴＮＦＲタンパク質は細胞外培地に分泌される。標準的な生化学手法を用いてタンパク質を培地から回収し、濃縮して、精製する。レンチウィルスまたはＡＡＶ形質導入、プラスミドトランスフェクションまたは何らかの同様の手順による哺乳動物細胞での発現後、またはバキュロウィルス形質導入後の昆虫細胞における発現後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ろ過ユニットなどの適切な分子量カットオフ値を有する濃縮フィルタを用いてこれらの細胞の細胞外培地を濃縮する。ＴＮＦＲタンパク質の損失を回避するため、フィルタは５０ｋＤａｌまたはそれ以下のタンパク質の通過を許容すべきである。
【０２０６】
ＴＮＦＲタンパク質が細菌培養物中で発現されるときは、標準的な生化学手法によって精製することができる。細菌を溶解し、ＴＮＦＲを含む細胞抽出物を脱塩して、濃縮する。
【０２０７】
いずれの場合も、ＴＮＦＲタンパク質は、好ましくはアフィニティクロマトグラフィによって精製される。ＴＮＦ−αを含むアフィニティマトリックスとカラムクロマトグラフィの使用が好ましい。あるいは、アフィニティ精製タグをＴＮＦＲタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加することができる。例えば、少なくとも６個のヒスチジンを有するアミノ酸モチーフであるポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）がこの目的に使用できる（Ｈｅｎｇｅｎ，Ｐ．，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：２８５−８６）。Ｈｉｓタグの付加は、発現ベクター内のＴＮＦＲオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に、Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を直接インフレームで付加することによって達成できる。Ｃ末端Ｈｉｓタグの付加のための１つのこのようなヌクレオチド配列は、配列番号１２６において与えられる。Ｈｉｓタグがタンパク質に組み込まれるときは、ニッケルまたはコバルトアフィニティカラムが標識ＴＮＦＲを精製するために使用され、場合によりその後Ｈｉｓタグを切断することができる。他の適切なアフィニティ精製タグおよびそれらのタグを有するタンパク質の精製の方法は、当技術分野において周知である。
【０２０８】
あるいは、大きさ（サイズ排除クロマトグラフィ）、電荷（陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィ）および疎水性（逆相クロマトグラフィ）に基づいてタンパク質を分離する一連のカラム上でのＴＮＦＲ抽出物の分画を伴う、非アフィニティベースの精製スキームが使用できる。これらの工程を促進するために高性能液体クロマトグラフィが使用できる。
【０２０９】
ＴＮＦＲタンパク質の発現および精製のための他の方法は周知である（例えばＪａｃｏｂｓの米国特許第５６０５６９０号明細書参照）。
定義
「ヌクレオシド間連結基」という用語は、ＤＮＡ単位間、ＤＮＡ単位とヌクレオチド類似体との間、２つの非ＬＮＡ単位の間、非ＬＮＡ単位とＬＮＡ単位との間、および２つのＬＮＡ単位の間等のような、２つの核酸塩基を共有結合することができる基を意味するように意図されている。好ましい例は、リン酸、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基を含む。
【０２１０】
本明細書において、「窒素塩基」という用語は、ＤＮＡ核酸塩基Ａ、Ｃ、ＴおよびＧ、ＲＮＡ核酸塩基Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、並びに非ＤＮＡ／ＲＮＡ核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（ＭｅＣ）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６−フルオロウラシル、５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、２，６−ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニンおよび２−クロロ−６−アミノプリン、特にＭｅＣなどの、プリン類およびピリミジン類を包含するように意図されている。非ＤＮＡ／ＲＮＡ核酸塩基の実際の選択は、オリゴヌクレオチドの標的となるマイクロＲＮＡ鎖内に存在する、対応する（または一致する）ヌクレオチドに依存することが理解される。例えば、対応するヌクレオチドがＧである場合、通常は、Ｇに対して水素結合を形成することができる非ＤＮＡ／ＲＮＡ核酸塩基を選択する必要がある。この対応するヌクレオチドがＧである特定の例において、好ましい非ＤＮＡ／ＲＮＡ核酸塩基の典型的な例はＭｅＣである。
【０２１１】
本明細書において使用されるとき、「腫瘍壊死因子受容体」、「ＴＮＦ受容体」、および「ＴＮＦＲ」という用語は、天然哺乳動物ＴＮＦ受容体配列のアミノ酸配列または天然哺乳動物ＴＮＦ受容体配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ分子に結合することができるタンパク質を指す。これに関連して、「天然」受容体またはこのような受容体についての遺伝子は、天然に生じる受容体または遺伝子、並びにこのような受容体および遺伝子の天然に生じる対立遺伝子変異体を意味する。
【０２１２】
ＴＮＦＲに関連して使用される「成熟」という用語は、天然遺伝子の完全長転写産物において存在し得るような、リーダーまたはシグナル配列を欠く形態で発現されるタンパク質を意味する。
【０２１３】
本明細書で使用されるＴＮＦＲタンパク質についての命名法は、種の指定、例えばｈｕ（ヒトの場合）またはｍｕ（マウスの場合）の後にタンパク質の名称（例えばＴＮＦＲ２）を指定し、その後にΔ（欠失を表す）および欠失しているエキソンの番号を記述する慣例に従う。例えばｈｕＴＮＦＲ２  Δ７は、エキソン７を欠くヒトＴＮＦＲを指す。種の指定が存在しない場合、ＴＮＦＲは一般的に哺乳動物ＴＮＦＲを指す。
【０２１４】
「分泌型」という用語は、タンパク質が可溶性であること、すなわちそれが細胞膜に結合していないことを意味する。これに関連して、当業者に公知の従来のアッセイを使用して、膜に関係していない画分、例えば細胞上清中または血清中において、ある形態の大部分が検出できる場合、その形態は可溶性である。
【０２１５】
「安定な」という用語は、分泌型ＴＮＦＲ形態が、採集された細胞、細胞上清または血清においてウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイなどの当業者による従来のアッセイを用いて検出可能であることを意味する。
【０２１６】
本明細書において使用される、「腫瘍壊死因子」および「ＴＮＦ」という用語は、ＴＮＦ受容体に結合する、天然に生じるタンパク質リガンドを指す。ＴＮＦは、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
本明細書において使用される、「炎症性疾患または状態」という用語は、少なくともある程度、ＴＮＦのその受容体への結合から生じるまたは前記結合によって悪化する疾患、障害または他の医学的状態を指す。このような疾患または状態は、ＴＮＦのレベル上昇、ＴＮＦ受容体のレベル上昇、または対応するシグナル伝達経路の感受性上昇若しくは前記経路の調節解除を含むが、これらに限定されない。この用語はまた、公知のＴＮＦアンタゴニストが有用であることが示されている疾患および状態を包含する。炎症性疾患または状態の例は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
本明細書において使用される、「肝炎」という用語は、肝臓の炎症によって少なくとも部分的に特徴づけられる消化器疾患、状態または障害を指す。肝炎の例は、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、または虚血／再灌流に関連する肝炎症を含むが、これらに限定されない。
【０２１９】
本明細書において使用される、「ＴＮＦアンタゴニスト」という用語は、タンパク質が、当技術分野において周知の標準アッセイを用いてＴＮＦ媒介性細胞傷害を測定可能に阻害できることを意味する。（例えば以下の実施例で述べるＬ９２９細胞傷害アッセイ参照）。
【０２２０】
「ＴＮＦに結合する」という用語は、タンパク質が、当技術分野において周知の標準結合アッセイ（例えばＳｍｉｔｈの米国特許第５９４５３９７号明細書、ｃｏｌｓ．１６〜１７参照）によって測定される、検出可能なレベルのＴＮＦ、好ましくはＴＮＦ−αに結合できることを意味する。好ましくは、本発明の受容体は、標準結合アッセイを使用して、受容体１ｎｍｏｌ当たり０．１ｎｍｏｌを超えるＴＮＦ−α、より好ましくは受容体１ｎｍｏｌ当たり０．５ｎｍｏｌを超えるＴＮＦ−αを結合することができる。
【０２２１】
本明細書において使用される、「調節エレメント」という用語は、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシング、翻訳または分解を含むがこれらに限定されない、核酸の機能的調節に寄与する分子の相互作用に関わるヌクレオチド配列を指す。調節は、増強性または阻害性であり得る。当技術分野において公知の調節エレメントは、例えばプロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列を含む。プロモーターは、一定の条件下で、通常はプロモーターから下流（３’方向）に位置するコード領域の転写の開始を助けることができるＤＮＡ領域である。発現ベクターは、典型的には本発明の核酸に作動可能に連結されたこのような調節エレメントを含む。
【０２２２】
「オリゴマー」および「スプライススイッチオリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
本明細書において使用される、「作動可能に連結された」という用語は、遺伝因子が、それらが期待されたように作動することを可能にする関係で並べられることを指す。例えば、プロモーターがコード配列（例えば発現ベクター内の）の転写を開始するのを助ける場合、そのプロモーターはコード領域に作動可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域の間に介在残基が存在してもよい。
【０２２３】
本明細書において使用される、「形質転換」または「トランスフェクション」という用語は、挿入のために使用される方法、例えばリポフェクション、形質導入、感染または電気穿孔のいずれが使用されるかにかかわらず、外因性核酸の細胞への挿入を指す。外因性核酸は、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持され得るか、あるいは細胞のゲノム内に組み込まれ得る。
【０２２４】
本明細書において使用される、「ベクター」という用語は、それが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう一つのタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウィルスゲノム内に連結することができるウィルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクター、すなわち発現ベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドまたはウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス）の形態である。
【０２２５】
本明細書において使用される、「単離されたタンパク質」という用語は、天然には生じないおよび／または天然に結合している１若しくはそれ以上の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドを指す。
【０２２６】
本明細書において使用される、「単離された核酸」という用語は、実質的に純粋な、すなわち内在性夾雑物質を含まず、かつクローニングベクターを使用する方法等の標準的な生化学的方法による同定および操作を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離された核酸から誘導された、天然には生じない、かつ／または別個のフラグメントの形態、あるいはより大きな構築物の成分としての核酸を指す。
【０２２７】
本明細書において使用される、「精製されたタンパク質」という用語は、他のタンパク質が実質的に存在しない状態にあるタンパク質を指す。しかし、このような精製されたタンパク質は、安定剤、担体、賦形剤または併用治療薬として添加される他のタンパク質を含み得る。本明細書において使用される「精製された」という用語は、安定剤、担体、賦形剤または併用治療薬として添加されるタンパク質を除き、タンパク質が、乾燥重量比で少なくとも５０％、例えば少なくとも８０％、より好ましくは９５〜９９重量％の範囲、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％存在することを意味する。
【０２２８】
本明細書において使用される、「プレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる」という用語は、細胞プレｍＲＮＡ標的のスプライシングを変化させ、スプライシング産物の割合の変化を生じさせることを指す。このようなスプライシングの変化は、当業者に周知の様々な手法によって検出することができる。例えば、全細胞ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲは、ＳＳＯの存在下および不在下でスプライシング産物の割合を検出するために使用できる。
【０２２９】
本明細書において使用される、「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドと標的配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡとの間で安定且つ特異的な結合が起こるように十分な程度の相補性または正確な対合を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドの配列がその標的の配列に１００％相補的である必要がないことは当技術分野において理解される。例えばＳＳＯに関しては、スプライシングを許容する条件下で、標的への結合が起こり、非特異的結合が回避されるとき、十分な程度の相補性が存在する。しかし、オリゴヌクレオチドまたは連続する核酸塩基配列は標的配列（例えば本明細書において言及される、配列番号１〜４の領域）に十分に（すなわち完全に）相補的であることが好ましい。
【０２３０】
オリゴヌクレオチドに関連して使用される「に対応している」および「に対応する」という用語は、本発明の化合物の核酸塩基配列とその逆相補鎖との間、または一つの実施形態では核酸塩基配列と、例えば他の核酸塩基を含み得るが、同じ塩基配列を保持する同等の（同一の）核酸塩基配列またはその相補鎖との間の比較を指す。ヌクレオチド類似体は、それらの同等のまたは対応する天然ヌクレオチドと直接比較される。配列の逆相補鎖を形成する配列は、前記配列の相補配列と称される。
【０２３１】
本明細書において言及されるヌクレオチド分子の長さを表すとき、長さはモノマー単位、すなわち核酸塩基の数に対応し、それらのモノマー単位がヌクレオチドであるかまたはヌクレオチド類似体であるかにかかわらない。核酸塩基に関して、モノマーという用語と単位という用語は、本明細書においては交換可能に使用される。
【０２３２】
「約」という用語が特定の値または値の範囲に関連して使用されるとき、その開示は、言及される特定の値または範囲を包含すると解釈されるべきである。
タンパク質またはポリペプチド（配列）に関連して本明細書において使用される「変異体」という用語は、前記配列内の１つ以上のアミノ酸、すなわち少なくとも１つのアミノ酸、しかし好ましくは５０未満のアミノ酸、例えば４０未満、３０未満、２０未満または１０未満のアミノ酸、例えば１アミノ酸、１〜２アミノ酸、１〜３アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜５アミノ酸の挿入、欠失または置換によって、もとの（親）ポリペプチドから作製される、またはポリペプチドからの配列情報を使用して作製されるポリペプチドを指す。
【０２３３】
タンパク質またはポリペプチド（配列）に関連して本明細書において使用される「ホモログ」という用語は、前記ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％相同、例えば少なくとも８０％相同、例えば少なくとも８５％相同、または少なくとも９０％相同、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であるポリペプチドを指す。２つのポリペプチド配列の間の相同性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２アルゴリズムを併用するＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントアルゴリズムを使用して、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ギャップ・オープン・ペナルティ＝１０を用いて決定し得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）。アラインメントは、一つの実施形態ではローカルアラインメント（ｗａｔｅｒ）であり、または別の実施形態ではグローバルアラインメント（ｎｅｅｄｌｅ）である。本明細書で言及されるエキソン欠失ＴＮＦＲタンパク質のホモログはそれぞれのエキソン内の欠失も含むので、グローバルアラインメントが好ましいと考えられる。
【０２３４】
タンパク質またはポリペプチド（配列）に関連して本明細書において使用される「フラグメント」という用語は、ポリペプチド配列の部分のみからなるポリペプチドを指す。フラグメントは、それ故、前記ポリペプチド配列の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含む、前記ポリペプチド配列の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％を含有し得る。
【０２３５】
変異体、フラグメントおよびホモログの上記定義はまた核酸配列にも適用されるが、使用される相同性アルゴリズムはＤＮＡｆｕｌｌである。明らかに、核酸変異体、フラグメントまたはホモログに言及するとき、タンパク質、ポリペプチドおよびアミノ酸という用語はそれに応じて核酸、ポリヌクレオチドまたは核酸塩基／ヌクレオチドと置き換えられるべきである。
【０２３６】
本明細書において使用される、「膜結合形態」または「内在性膜形態」という用語は、細胞膜にまたがるアミノ酸配列を有し、膜の各々の側にアミノ酸配列が存在するタンパク質を指す。
【０２３７】
本明細書において使用される、「安定な、分泌型リガンド結合形態」または時として「安定な可溶性リガンド結合形態」としても知られる（「分泌型」と「可溶性」という用語は同義語であり、本明細書では交換可能である）用語は、タンパク質が分泌され、安定であり、且つまだ対応するリガンドに結合できるような方法で、天然膜結合形態の受容体に関連するタンパク質を指す。これらの形態はこのような分泌形態が生理的であるか否かによって定義される訳ではなく、単にこのようなスプライス変異体の産物が、生産されたとき、分泌され、安定であり、且つまだ対応するリガンドに結合できることにのみ留意すべきである。
【０２３８】
「分泌型」という用語は、その形態が可溶性であること、すなわちもはや細胞膜に結合していないことを意味する。これに関して、当業者に公知の従来のアッセイを使用して、この形態の大部分が膜に結合していない画分、例えば細胞上清中または血清中で検出できる場合、可溶性である。
【０２３９】
「安定な」という用語は、分泌型形態が当業者により従来のアッセイを用いて検出可能であることを意味する。例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイは、患者から採集された細胞、細胞上清または血清からこの形態を検出するために使用できる。
【０２４０】
「リガンド結合」という用語は、その形態が、対応する内在性膜形態の特異的リガンド結合活性の、必ずしもすべてではないが、少なくともある程度の有意のレベルを保持することを意味する。
【０２４１】
本明細書において使用される、「リガンドの活性を低下させる」という用語は、リガンドの受容体への結合または受容体との相互作用から生じる細胞内シグナル伝達の低下を導く何らかの作用を指す。例えば、活性は、リガンドの、その受容体の可溶性形態への結合によってまたはリガンドに結合するために使用可能なその受容体の膜形態の量を減少させることによって低下させ得る。
【０２４２】
医薬組成物および製剤
本発明の他の実施形態は、本発明によるオリゴマー、タンパク質および核酸を含有する医薬組成物である。
【０２４３】
本発明のオリゴマー、核酸およびタンパク質は、取込み、分布および/または吸収を助
けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤のような、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、複合または結合され得る。
【０２４４】
本発明の製剤は、水性担体などの生理的または医薬的に許容される担体中に本発明によるオリゴマー、核酸またはタンパク質を含有する。それ故本発明における使用のための製剤は、関節内、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射若しくは注入を含む非経口投与に適するもの、並びに局所、眼、膣、経口、直腸または肺投与（ネブライザ、気管内および鼻内送達によるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または送気（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）を含む）に適するものを含むが、これらに限定されない。製剤は、好都合には単位投与形態で提供されることができ、当技術分野で周知の方法のいずれかによって製造され得る。所与の場合に最も適切な投与経路は、被験者、治療される状態の性質と重症度、および使用される特定の活性化合物に依存し得る。
【０２４５】
本発明の医薬組成物は、生理的および医薬的に許容される塩、すなわち親化合物の所望生物活性を保持し、望ましくない毒性を与えない塩を含むが、これらに限定されない。このような塩の例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、ＮＨ４＋、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等と形成される塩と、（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と形成される酸付加塩と、（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸とで形成される塩である。
【０２４６】
本発明は、以下で論じるように、ＴＮＦの過度の活性を含む炎症性疾患に罹患している患者を治療するための薬剤を製造するための、上記で述べたオリゴマー、タンパク質および核酸の使用を提供する。本発明による薬剤の製造において、本発明のオリゴマー、核酸およびタンパク質は、典型的には、中でも特に、許容される担体と混合される。担体は、言うまでもなく、製剤中の他のいかなる成分とも適合性であるという意味で許容されねばならず、患者に対して有害であってはならない。担体は固体または液体であり得る。本発明のオリゴマー、核酸およびタンパク質は製剤中に組み込まれ、前記製剤は、場合により１つ以上の補助治療成分を含む、成分を混合することから基本的に成る製薬学の周知の手法のいずれかによって製造され得る。
【０２４７】
本発明の製剤は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含み得るが、前記製剤は、好ましくは意図される受容者の血液と等張であり、基本的に発熱物質不含である。これらの製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得るが、これらに限定されない。製剤は、単回用量または多回用量容器中で、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば食塩水または注射用蒸留水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。
【０２４８】
製剤において本発明のオリゴマー、核酸およびタンパク質は、非経口投与に適すると考えられる、リポソームまたは微結晶などの粒子または小胞内に封入され得る。粒子は、本発明のオリゴマー、核酸およびタンパク質がその中に含有される限り、単層または多重層などのいかなる適切な構造であってもよい。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質は、このような粒子および小胞のために特に好ましい。このような脂質粒子の製造は周知である（米国特許第５，９７６，８７９号ｃｏｌ．６の中の参考文献参照）。
【０２４９】
従って本発明の一つの実施形態は、安定な、分泌型リガンド結合形態のＴＮＦ受容体を投与し、それによって受容体に対するＴＮＦの活性を低下させることにより、炎症性疾患または状態を治療する方法である。もう一つの実施形態では、本発明は、安定な、分泌型リガンド結合形態のＴＮＦ受容体をコードするオリゴヌクレオチドを投与し、それによって受容体に対するＴＮＦの活性を低下させることにより、炎症性疾患または状態を治療する方法である。もう一つの実施形態では、本発明は、安定な、分泌型リガンド結合形態のＴＮＦ受容体を生産する方法である。
【０２５０】
以下で論じる本発明の以下の態様は、前記実施形態に適用される。
本発明の方法、核酸、タンパク質および製剤はまた、インビトロまたはインビボツールとしても有用である。
【０２５１】
本発明の実施形態は、医師が、ＴＮＦの作用またはＴＮＦによって活性化されるシグナル伝達経路を制限しようとする何らかの状態を治療するために使用できる。特に、本発明は炎症性疾患を治療するために使用できる。一つの実施形態では、前記状態は、炎症性全身性疾患、例えば関節リウマチまたは乾癬性関節炎である。もう一つの実施形態では、疾患は炎症性肝疾患である。炎症性肝疾患の例は、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症を含むが、これらに限定されない。さらにもう一つの実施形態では、炎症性疾患は、乾癬などの皮膚状態である。
【０２５２】
本発明の用途は、公知のＴＮＦアンタゴニストが有用であることが示されている疾患の治療を含むが、これに限定されない。３つの特異的ＴＮＦアンタゴニストが現在ＦＤＡによって承認されている。それらの薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である。これらの薬剤の１つ以上は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）の治療に関して承認されている。
【０２５３】
炎症性疾患の治療のためのタンパク質の使用
従って本発明の一つの実施形態は、患者にＳＳＯを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。投与されたＳＳＯは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態をコードするスプライス変異体を生産するようにプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させ、それによってその受容体に対するリガンドの活性を低下させる。もう一つの実施形態では、本発明は、ＳＳＯを細胞に投与することによってＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態を生産する方法である。
【０２５４】
治療用途のために、本発明の精製されたＴＮＦＲタンパク質は、関節炎などのＴＮＦ依存性炎症性疾患を治療するために患者、好ましくはヒトに投与される。ヒトの治療においては、ｈｕＴＮＦＲの使用が好ましい。本発明のＴＮＦＲタンパク質は、ボーラス注射、持続注入、インプラントからの持続放出、または他の適切な手法によって投与することができる。典型的には、ＴＮＦＲ治療用タンパク質は、精製タンパク質を生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と共に含有する組成物の形態で投与される。このような担体は、使用される用量および濃度で受容者に対して非毒性である。通常、このような組成物の製剤は、緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、グルタチオン並びに他の安定剤および賦形剤とＴＮＦＲを組み合わせることを必要とする。中性緩衝食塩水または同種血清アルブミンと混合された食塩水は適切な希釈剤の例である。好ましくは、生成物は、適切な賦形剤溶液、例えばスクロースを希釈剤として使用して、凍結乾燥物として製剤される。ベンジルアルコールなどの防腐剤も添加され得る。投与の量および頻度は、言うまでもなく、治療される適応症の性質と重症度、所望応答、患者の状態等のような因子に依存する。
【０２５５】
本発明のＴＮＦＲタンパク質は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／週から約１００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の治療有効量で全身的に投与される。好ましい実施形態では、ＴＮＦＲは、約０．５ｍｇ／ｋｇ／週から約５０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の量で投与される。局所投与に関しては、用量は、好ましくは注射当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２５６】
哺乳動物においてＴＮＦアンタゴニストのレベルを上昇させるための発現ベクターの使用
本発明は、哺乳動物においてＴＮＦアンタゴニストのレベルを上昇させる方法を提供する。この方法は、本明細書で述べるようにＴＮＦＲの発現を駆動する、本明細書で述べる発現ベクターで哺乳動物の細胞を形質転換する工程を含む。
【０２５７】
この方法は、家庭内ペット、食物生産のために使用されるものおよび霊長動物などの大型哺乳動物において特に有用である。例示的な大型哺乳動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカおよびブタである。例示的な霊長動物は、サル、類人猿およびヒトである。
【０２５８】
哺乳動物細胞は、インビボまたはエクスビボのいずれかで形質転換することができる。インビボで形質転換するときは、発現ベクターを注射などによって哺乳動物に直接投与する。インビボで細胞を形質転換する方法は、当技術分野で公知である。エクスビボで形質転換するときは、細胞を哺乳動物から取り出し、エクスビボで形質転換して、形質転換した細胞を哺乳動物に再移植する。
【０２５９】
本発明の用途は、既知のＴＮＦアンタゴニストが有用であることが示されている疾患の治療を含むが、これに限定されない。３つの特異的ＴＮＦアンタゴニストが現在ＦＤＡによって承認されている。それらの薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である。これらの薬剤の１つ以上は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）の治療に関して承認されている。
【０２６０】
被験者へのＳＳＯの投与は、ＡＳＯＮのために開発された手順を用いて実施できる。ＡＳＯＮは、６ｍｇ／ｋｇを週に３回という高用量で食塩水中での静脈内投与により実験動物およびヒト被験者に投与され、成功を収めた（Ｙａｃｙｓｙｈｎ，Ｂ．Ｒ．ら、２００２，Ｇｕｔ  ５１：３０（クローン病の治療のための抗ＩＣＡＭ−１  ＡＳＯＮ）、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｊ．ら、１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７：２２２７（ＰＢＭＣに標的とされる抗ＲＡＦ−１  ＡＳＯＮ）。ＴＮＦ−αを対象とする、２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートＡＳＯＮの薬物動態が報告されている（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．ら、２００３，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３１：１４１９）。混合ＬＮＡ／ＤＮＡ分子の全身的効果も報告された（Ｆｌｕｉｔｅｒ，Ｋ．ら、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：９５３）。
【０２６１】
マウスモデル系におけるＳＳＯの全身的活性が、２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートおよびＰＮＡ化学物質を用いて検討された。脳、胃および真皮を除き、検討されたすべての組織において有意の活性が認められた（Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，１２２８）。
【０２６２】
一般に、従来のアンチセンス治療において有用ないかなる投与方法も本発明のＳＳＯを投与するために使用できる。培養細胞におけるＳＳＯの試験のために、ＡＳＯＮまたはＳＳＯを試験するために開発された手法のいずれかを使用し得る。
【０２６３】
本発明の製剤は、水性担体などの、生理的または医薬的に許容される担体中にＳＳＯを含有する。それ故本発明における使用のための製剤は、腹腔内、関節内、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射若しくは注入を含む非経口投与に適するもの、並びに局所、眼、膣、経口、直腸または肺（ネブライザ、気管内および鼻内送達によるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または送気を含む）投与に適するものを含むが、これらに限定されない。製剤は、好都合には単位投与形態で提供することができ、当技術分野で周知の方法のいずれかによって製造され得る。所与の場合に最も適切な投与経路は、被験者、治療される状態の性質と重症度、および使用される特定の活性化合物に依存し得る。
【０２６４】
本発明の医薬組成物は、生理的および医薬的に許容される塩、すなわち親化合物の所望生物活性を保持し、望ましくない毒性を与えない塩を含むが、これらに限定されない。このような塩の例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、ＮＨ４＋、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等と形成される塩と、（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と形成される酸付加塩と、（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸とで形成される塩である。
【０２６５】
本発明は、上記で論じたように、ＴＮＦ−αを含む炎症性疾患に罹患している患者において、エキソン７を欠く哺乳動物ＴＮＦＲ２タンパク質の、その対応する膜結合形態に対する比率を高めるための薬剤を製造するための、上記で述べた特徴を有するＳＳＯの使用を提供する。本発明による薬剤の製造において、ＳＳＯは、典型的には、中でも特に、許容される担体と混合される。担体は、言うまでもなく、製剤中の他のいかなる成分とも適合性であるという意味で許容されねばならず、また患者に対して有害であってはならない。担体は固体または液体であり得る。ＳＳＯは本発明の製剤中に組み込まれ、前記製剤は、場合により１つ以上の補助治療成分を含む、成分を混合することから基本的に成る製薬学の周知の手法のいずれかによって製造され得る。
【０２６６】
本発明の製剤は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含み得るが、前記製剤は、好ましくは意図される受容者の血液と等張であり、基本的に発熱物質不含である。これらの製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得るが、これらに限定されない。製剤は、単回用量または多回用量容器中で、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供されることができ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば食塩水または注射用蒸留水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。
【０２６７】
製剤においてＳＳＯは、非経口投与に適すると考えられる、リポソームまたは微結晶などの粒子または小胞内に封入され得る。粒子は、ＳＳＯがその中に含有される限り、単層または多重層などのいかなる適切な構造であってもよい。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質は、このような粒子および小胞のために特に好ましい。このような脂質粒子の製造は周知である（米国特許第５，９７６，８７９号ｃｏｌ．６の中の参考文献参照）。
【０２６８】
ＳＳＯは、３’スプライス部位、５’スプライス部位、分岐点、ポリピリミジントラクト、エキソンスプライシングエンハンサー、エキソンスプライシングサイレンサー、イントロンスプライシングエンハンサー、イントロンスプライシングサイレンサーを含む、スプライシングを調節する何らかのエレメントまたはエレメントの組合せの標的とされ得る。
【０２６９】
当業者は、ヒトＴＮＦＲ２を対象とする本発明が、エキソン７およびその連続するイントロンを含むＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２遺伝子の部分の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、好ましくは１０〜１６ヌクレオチドに対して相補的である配列を有するＳＳＯを用いて実施できることを理解し得る。
【０２７０】
配列番号３は、ＴＮＦＲ２のエキソン７の配列とフランキングイントロンの５０連続するヌクレオチドを含む。例えば、ヒトＴＮＦＲ２の標的とするＳＳＯは、表４に列挙される配列から選択される核酸塩基配列を有し得る。ＬＮＡまたはＧクランプヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、親和性増強修飾を使用するとき、当業者は、ＳＳＯの長さをそれに応じて縮小できることを認識する。
【０２７１】
当業者はまた、ＳＳＯ配列の選択が、部分的「ヘアピン」二本鎖構造の形成を導き得る、自己相補的ＳＳＯを回避するように注意して行われねばならないことを認識するであろう。加えて、高いＧＣ含量は、非特異的塩基対合の可能性を最小限に抑えるために回避すべきである。さらに、例えばＢＬＡＳＴによって明らかにされるように、非標的遺伝子に一致するＳＳＯも回避すべきである。
【０２７２】
一部の状況では、ヒトおよび少なくとも１つの他の種を標的とすることができるＳＳＯ配列を選択することが好ましいと考えられる。これらのＳＳＯは、ヒトに使用する前に前記の他の種において本発明を試験し、最適化するために使用でき、それにより、規制当局の認可および薬剤開発目的のために有用である。例えば、ヒトＴＮＦＲ２を標的とする配列番号１４、３０、４６、７０および７１から選択される配列を有するＳＳＯは、対応するアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌｌａｔａ）配列にも１００％相補的である。結果としてこれらの配列は、ヒトに使用する前に、サルにおいて治療を試験するために使用できる。
【０２７３】
以下で論じる本発明の以下の態様は、前記実施形態に適用される。
ＳＳＯの長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）と同様であり、典型的には約１０〜２４ヌクレオチドである。本発明は、ＲＮＡにハイブリダイズするが、従来のアンチセンス２’−デオキシオリゴヌクレオチドのようにＲＮアーゼＨによるＲＮＡの分解を活性化させない、いくつかの化学的性質のＳＳＯで実施することができる。本発明は、２’Ｏ−メチルまたは２’Ｏ−メチルオキシエチルホスホロチオエートなどの、２’Ｏ修飾核酸オリゴマーを用いて実施できる。核酸塩基は糖に結合している必要はない。いわゆるペプチド核酸オリゴマーまたはモルホリンベースのオリゴマーが使用できる。これらの異なる結合化学の比較は、Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ら、２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３６９５に見られる。スプライススイッチオリゴヌクレオチドという用語は、上記形態を包含することが意図されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーとＳＳＯの関係を理解するであろう。ギャップマーは、非活性化ヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーに隣接するＲＮアーゼＨ活性化領域（典型的には２’−デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート）を含むＡＳＯＮである。一般に、ギャップマーＡＳＯＮ内のフランキング配列のために適切ないかなる化学物質もＳＳＯにおいて使用できる。
【０２７４】
本発明のＳＳＯは、固相合成の周知の手法を通して作製し得る。当技術分野で既知のこのような合成の他のいかなる手段も付加的または選択的に使用し得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを作製するために類似の手法を使用することは周知である。
【０２７５】
特に好ましい化学物質は、ロックト核酸（ＬＮＡ）によって提供される（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４：３６０７、Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら、１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５４０１）。ＬＮＡは、リボフラノシル部分が２’Ｏと４１Ｃの間の架橋によって二環状になっていることを除き、従来のホスホジエステル結合のリボヌクレオチドである。この架橋はリボフラノシル環の立体配座を、オリゴヌクレオチドが相補的ＲＮＡにハイブリダイズするときにとる、Ｖ−エンド（Ｖ−ｅｎｄｏ）立体配座に拘束する。ＬＮＡの合成における最近の進歩は、国際公開第０３／０９５４６７号パンフレットに記述されている。２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）並びに他のＬＮＡの合成は、Ｍｏｒｉｔａら、２００３，Ｂｉｏｏｒｇ．およびＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：２２１１に述べられている。しかし、選択的化学物質も使用でき、２’Ｏは２’Ｎで置換され得る。ＬＮＡと従来のヌクレオチドを混合してキメラＳＳＯを形成することができる。例えば、交互ＬＮＡと２’デオキシヌクレオチドのキメラＳＳＯまたは交互ＬＮＡと２’Ｏ−Ｍｅ若しくは２’Ｏ−ＭＯＥのキメラＳＳＯが使用できる。これらの化学物質のいずれかに代わるものとして、２’−デオキシヌクレオチドだけでなく、ホスホジエステルを置換するホスホロチオエートジエステル結合がある。インビボでの使用のためには、ホスホロチオエート結合が好ましい。
【０２７６】
ＬＮＡヌクレオチドをＳＳＯにおいて使用するときは、非ＬＮＡヌクレオチドも同時に存在することが好ましい。ＬＮＡヌクレオチドは、遊離ＳＳＯの有効濃度を低下させ得る、有意の非特異的結合が起こり得るほどの高いハイブリダイゼーション親和性を有する。ＬＮＡヌクレオチドを使用するとき、それらは好都合には２’−デオキシヌクレオチドと交互に存在し得る。交互ヌクレオチド、交互ジヌクレオチドまたは混合パターン、例えばＬＤＬＤＬＤまたはＬＬＤＬＬＤまたはＬＤＤＬＤＤが使用できる。２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオシドホスホロチオエートをＬＮＡヌクレオチドと混合するときは、ＲＮアーゼＨの活性化を回避することが重要である。ＳＳＯの約３分の１から３分の２のＬＮＡヌクレオチドが適切であると予想される。例えばＳＳＯが１２量体である場合、少なくとも４つのＬＮＡヌクレオチドと４つの従来のヌクレオチドが存在する。
【０２７７】
ＳＳＯの塩基は、通常のシトシン、グアニン、アデニンおよびウラシルまたはチミジンであり得る。あるいは修飾塩基も使用できる。特に興味深いのは、結合親和性を高める修飾である。好ましい修飾塩基の１つの非限定的な例は、グアノシンと４つの水素結合を形成するシトシン類似体、いわゆるＧ−クランプまたは９−（アミノエトキシ）フェノキサジンヌクレオチドである。（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３５１３、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｓ．Ｃ，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７５９）。
【０２７８】
ＲＮアーゼＨを活性化しない数多くの選択的化学物質が使用可能である。例えば適切なＳＳＯは、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つまたは全部が、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートなどの修飾リン酸塩であるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、記述されているように、ヌクレオチド間の架橋リン酸残基を１つおきに修飾し得る。もう一つの非限定的な例では、このようなＳＳＯは、ヌクレオチドの少なくとも１つまたは全部が２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４、直鎖または分枝、飽和または不飽和アルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−ブロペニルおよびイソプロピル）を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、記述されているようにヌクレオチドを１つおきに修飾し得る。［米国特許第５，９７６，８７９号ｃｏｌ．４の中の参考文献参照］。
【０２７９】
ＳＳＯの長さ（すなわちオリゴマー内のモノマーの数）は約８〜約３０塩基長である。一つの実施形態では、２’Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオシドホスホロチオエートの２０塩基が有効である。当業者は、親和性を高める化学修飾を使用するとき、ＳＳＯはより短くてよいが、まだ特異性を保持し得ることを理解する。当業者はさらに、ＳＳＯの大きさの上限が、標的配列の特異的認識を維持し、ＳＳＯの二次構造を形成する自己ハイブリダイゼーションを回避する必要性によって、および細胞に入り込むことの制限によって課せられることを理解する。これらの制限は、より長い（ＳＳＯの親和性に依存する一定の長さ以上の）ＳＳＯは、より特異的でない、不活性であるまたは活性が低いことがより頻繁に認められることを示唆する。
【０２８０】
本発明のＳＳＯは、ＳＳＯの活性、細胞分布または細胞取込みを高める１つ以上の部分またはコンジュゲートのＳＳＯへの化学結合を含むＳＳＯの修飾型を含むが、これらに限定されない。このような部分は、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分を含むが、これらに限定されない。
【０２８１】
所与のＳＳＯ内のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に上記修飾の２以上が単一化合物内またはさらにＳＳＯ内の単一ヌクレオシドにおいて組み込まれ得る。
ＳＳＯは、取込み、分布および／または吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤のような、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、複合または結合され得る。
【０２８２】
当業者は、細胞分化が、スプライソソームの分化を含むが、これに限定されないことを理解する。従って、本発明の特定のＳＳＯの活性は、それらが導入される細胞型に依存し得る。例えば、ある細胞型において有効なＳＳＯが、もう１つ別の細胞型では無効であり得る。
【０２８３】
本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび製剤はまた、ヒトおよび動物遺伝子におけるスプライシングを検討するためのインビトロまたはインビボツールとしても有用である。このような方法は、本明細書で述べる手順によって、または当業者に明白であるそれらの修正法によって実施できる。
【０２８４】
本発明は、医師が、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドの作用またはこのようなリガンドによって活性化されるシグナル伝達経路を制限しようとする何らかの状態を治療するために使用できる。特に、本発明は炎症性疾患を治療するために使用できる。一つの実施形態では、前記状態は、炎症性全身性疾患、例えば関節リウマチまたは乾癬性関節炎である。もう一つの実施形態では、疾患は炎症性肝疾患である。炎症性肝疾患の例は、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症を含むが、これらに限定されない。さらにもう一つの実施形態では、炎症性疾患は、乾癬などの皮膚状態である。
【０２８５】
本発明の用途は、既知のＴＮＦアンタゴニストが有用であることが示されている疾患の治療を含むが、これに限定されない。３つの特異的ＴＮＦアンタゴニストが現在ＦＤＡによって承認されている。それらの薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である。これらの薬剤の１つ以上は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）の治療に関して承認されている。
【０２８６】
好ましい実施形態では、受容体は、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２受容体のいずれかである。他の実施形態では、受容体は、エキソン７および８に相同なエキソンのいずれかまたは両方の欠失が分泌形態を生じさせるように、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に十分に相同であるＴＮＦＲスーパーファミリーの成員、例えばＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５またはＴＮＦＲＳＦ１１ＡまたはＴＮＦＲ２である。当業者は、本発明の実施可能性が、このような分泌形態が生理的であるか否かによっては左右されず、このようなスプライス変異体が分泌され、安定で、リガンド結合できるということによってのみ決定されることを理解する。
【０２８７】
被験者へのＳＳＯの投与は、ＡＳＯＮのために開発された手順を用いて実施できる。ＡＳＯＮは、６ｍｇ／ｋｇを週に３回という高用量で食塩水中での静脈内投与により実験動物およびヒト被験者に投与され、成功を収めた（Ｙａｃｙｓｙｈｎ，Ｂ．Ｒ．ら、２００２，Ｇｕｔ  ５１：３０（クローン病の治療のための抗ＩＣＡＭ−１  ＡＳＯＮ）、  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｊ．ら、１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７：２２２７（ＰＢＭＣに標的とされる抗ＲＡＦ−１  ＡＳＯＮ）。ＴＮＦ−αを対象とする、２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートＡＳＯＮの薬物動態が報告されている（Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．ら、２００３，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３１：１４１９）。混合ＬＮＡ／ＤＮＡ分子の全身的効果も報告されている（Ｆｌｕｉｔｅｒ，Ｋ．ら、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：９５３）。
【０２８８】
マウスモデル系におけるＳＳＯの全身的活性が、２’Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートおよびＰＮＡ化学物質を用いて検討された。脳、胃および真皮を除き、検討されたすべての組織において有意の活性が認められた（Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．ら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，１２２８）。
【０２８９】
一般に、従来のアンチセンス治療において有用ないかなる投与方法も本発明のＳＳＯを投与するために使用できる。培養細胞におけるＳＳＯの試験のために、ＡＳＯＮまたはＳＳＯを試験するために開発された手法のいずれかを使用し得る。
【０２９０】
本発明の製剤は、水性担体などの、生理的または医薬的に許容される担体中にＳＳＯを含有する。それ故本発明における使用のための製剤は、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射若しくは注入を含む非経口投与に適するもの、並びに局所（眼投与および膣送達を含む粘膜への投与を含む）、経口、直腸または肺（ネブライザ、気管内および鼻内送達によるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または送気を含む）投与に適するものを含むが、これらに限定されない。製剤は、好都合には単位投与形態で提供することができ、当技術分野で周知の方法のいずれかによって製造され得る。所与の場合に最も適切な投与経路は、被験者、治療される状態の性質と重症度、および使用される特定の活性化合物に依存し得る。
【０２９１】
本発明の医薬組成物は、生理的および医薬的に許容されるその塩、すなわち親化合物の所望生物活性を保持し、前記組成物に望ましくない毒性作用を与えない塩を含むが、これらに限定されない。このような塩の例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、ＮＨ４＋、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等と形成される塩と、（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と形成される酸付加塩と、（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸と形成される塩と、（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素陰イオンとから形成される塩である。
【０２９２】
本発明は、上記で論じたように、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの過度の活性を伴う炎症性疾患に罹患している患者において、ＴＮＦＲスーパーファミリー成員の可溶性形態の、その対応する膜結合形態に対する比率を高めるための薬剤を製造するための、上記で述べた特徴を有するＳＳＯの使用を提供する。本発明による薬剤の製造において、ＳＳＯは、典型的には、中でも特に、許容される担体と混合される。担体は、言うまでもなく、製剤中の他のいかなる成分とも適合性であるという意味で許容されねばならず、また患者に対して有害であってはならない。担体は固体または液体であり得る。ＳＳＯは本発明の製剤中に組み込まれ、前記製剤は、場合により１つ以上の補助治療成分を含む、成分を混合することから基本的に成る製薬学の周知の手法のいずれかによって製造され得る。
【０２９３】
本発明の製剤は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含み得るが、前記製剤は、好ましくは意図される受容者の血液と等張であり、基本的に発熱物質不含である。これらの製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得るが、これらに限定されない。製剤は、単回用量または多回用量容器中で、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば食塩水または注射用蒸留水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。
【０２９４】
製剤においてＳＳＯは、非経口投与に適すると考えられる、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内に封入され得る。粒子は、ＳＳＯがその中に含有される限り、単層または多重層などのいかなる適切な構造であってもよい。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質は、このような粒子および小胞のために特に好ましい。このような脂質粒子の製造は周知である。［米国特許第５９７６８７９号明細書第６欄の中の参考文献参照］。
【０２９５】
ＳＳＯは、３’スプライス部位、５’スプライス部位、分岐点、ポリピリミジントラクト、エキソンスプライシングエンハンサー、エキソンスプライシングサイレンサー、イントロンスプライシングエンハンサー、イントロンスプライシングサイレンサーを含む、スプライシングを調節する何らかのエレメントまたはエレメントの組合せに対する標的とされ得る。ＳＳＯの配列の決定は、それらの配列および位置が図２０に表示される通りであると認められるＳＳＯの活性を示す、以下の表によって導かれ得る。当業者は、１）エキソンに相補的なＳＳＯはスプライス受容部位またはスプライス供与部位のいずれにも相補的である必要がないことと、表１のＳＳＯ  Ａ７−１０、Ｂ７−７およびＢ７−９に留意）、２）イントロンの配列およびエキソンの１個のヌクレオチドだけに相補的なＳＳＯは作動性であり得ることと（表１のＡ８−５およびＢ７−６に留意）、３）エキソンに直接隣接するイントロンに相補的なＳＳＯも有効であり得ることと（表２の３３１２に留意）、４）オリゴヌクレオチド単独の効果は、通常、他のＳＳＯとの組合せでのＳＳＯの効果を予測することとに留意する。
【０２９６】
当業者は、ヒトＴＮＦ−α受容体を対象とする本発明が、エキソン７または８を含むＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２遺伝子の部分の少なくとも１０、好ましくは１５〜２０ヌクレオチドに相補的である配列を有するＳＳＯおよびそれらの隣接するイントロンを用いて実施できることを理解し得る。エキソン自体の少なくとも１つのヌクレオチドが相補的配列内に含まれることはさらに好ましい。配列番号１〜４は、ＴＮＦＲ１（配列番号１および２）およびＴＮＦＲ２（配列番号３および４）のエキソン７および８の配列およびフランキングイントロンの５０の隣接するヌクレオチドを含む。ＬＮＡまたはＧ−クランプヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、親和性増強修飾を使用するとき、当業者は、ＳＳＯの長さをそれに応じて低減できることを認識する。従来の交互ヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを使用するときは、１６の長さが有効である。
【０２９７】
当業者はまた、ＳＳＯ配列の選択が、部分的「ヘアピン」二本鎖構造の形成を導き得る、自己相補的ＳＳＯを回避するように注意して行われねばならないことを認識する。加えて、高いＧＣ含量は、非特異的塩基対合の可能性を最小限に抑えるために回避すべきである。さらに、例えばＢＬＡＳＴによって明らかにされるように、非標的遺伝子に一致するＳＳＯも回避すべきである。
【０２９８】
一部の状況では、ヒトおよび少なくとも１つの他の種を標的とすることができるＳＳＯ配列を選択することが好ましいと考えられる。これらのＳＳＯは、ヒトに使用する前に前記の他の種において本発明を試験し、最適化するために使用でき、それにより、規制当局の認可および薬剤開発目的のために有用である。例えば、ヒトＴＮＦＲ２を標的とする配列番号７４、７５、７７、７８、８０および８９は、対応するアカゲザル配列にも１００％相補的である。結果としてこれらの配列は、ヒトに使用する前に、サルにおいて治療を試験するために使用できる。
【０２９９】
本発明の範囲から逸脱することなく上述した本発明に対して様々な省略、追加および修正を行い得ること、およびこのような修正および変更はすべて、付属の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲内に含まれることが意図されていることは当業者に理解される。引用されるすべての参考文献、特許、特許出願または資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３００】
以下の列挙する配列の中で、配列番号１〜１１６は国際公開第２００７／０５８８９４号パンフレットに開示されている通りである。配列番号１１７〜２４２は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１０５５７号の配列番号１〜１２６として開示されている通りである。配列番号２４３〜２４６は本明細書出願に新規であり、本発明における好ましいオリゴマーである。
【０３０１】
【表４】
2014050400.tif 000008
2014050400.tif 000009
2014050400.tif 000010
2014050400.tif 000011
2014050400.tif 000012
2014050400.tif 000013
表１〜表３は、明確に本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０５８８９４号パンフレットの表１〜３に従う。
【０３０２】
本発明のさらなる実施形態
本発明は、１つ以上のスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの受容体に対するリガンドの活性を低下させる時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供し、前記１つ以上のＳＳＯは、前記受容体をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを、安定な、分泌型リガンド結合形態の前記受容体の生産を高めるように変化させることができる。
【０３０３】
一つの実施形態では、哺乳動物受容体は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ８およびＴＮＦＲＳＦ１１Ａからなる群より選択される。
【０３０４】
一つの実施形態では、受容体は、ヒトＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
一つの実施形態では、受容体はヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
【０３０５】
一つの実施形態では、リガンドは、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＴ−αまたはＬＴ−βである。
一つの実施形態では、疾患または状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症からなる群より選択される。
【０３０６】
炎症性疾患または状態を治療する方法の一つの実施形態では、２つ以上のＳＳＯが投与される。
一つの実施形態では、受容体は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５またはＴＮＦＲＳＦ１１Ａであり、前記プレｍＲＮＡのスプライシングの前記変化は、エキソン７、エキソン８またはその両方を前記プレｍＲＮＡから切り出すことを含む。
【０３０７】
一つの実施形態では、前記プレｍＲＮＡのスプライシングの前記変化は、エキソン７を切り出すことを含む。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂであり、および前記ＳＳＯは、配列番号１、２、３または４からの連続する配列に相補的である少なくとも１０から少なくとも２０ヌクレオチドを含む。
【０３０８】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯの配列は、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８２、８４および８６〜８９からなる群より選択される配列を含む。
一つの実施形態では、前記ＳＳＯは、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド、２’Ｏ−ＭＯＥリボヌクレオチド、ヘキシトール（ＨＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシド、２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシド、前記のいずれかのホスホロチオエート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体、前記のいずれかのメチルホスホネート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸類似体、前記のいずれかのＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート類似体、および前記のいずれかのホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチド類似体、およびそれらの組合せからなる群より独立して選択される１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【０３０９】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯは、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチドおよび２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【０３１０】
一つの実施形態では、前記投与は、非経口、局所、経口、直腸または肺投与である。
一つの実施形態では、本発明は、細胞においてＴＮＦＲスーパーファミリーからの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高める方法を提供し、前記方法は、前記細胞に１つ以上のスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を投与することを含み、前記１つ以上のＳＳＯは、前記受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高めるように、前記受容体をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。
【０３１１】
一つの実施形態では、前記方法はインビボで実施される。
一つの実施形態では、前記受容体は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ８およびＴＮＦＲＳＦ１Ａからなる群より選択される哺乳動物受容体である。
【０３１２】
一つの実施形態では、前記受容体は、ヒトＴＮＦＳＦ１ＡまたはヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
【０３１３】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯは、配列番号１、２、３または４からの連続する配列に相補的である少なくとも１０から少なくとも２０ヌクレオチドを含む。
一つの実施形態では、本発明は、少なくとも１０から少なくとも２０ヌクレオチドを含むスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を提供し、前記ＳＳＯは、ＴＮＦＲスーパーファミリーからの受容体をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを、前記受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高めるように変化させることができる。
【０３１４】
一つの実施形態では、前記受容体は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ８およびＴＮＦＲＳＦ１１Ａからなる群より選択される哺乳動物受容体である。
【０３１５】
一つの実施形態では、前記受容体は、ヒトＴＮＦＲＳＦ１ＡまたはヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂである。
【０３１６】
一つの実施形態では、ＳＳＯは、配列番号１、２、３または４からの連続する配列に相補的である少なくとも１０から少なくとも２０ヌクレオチドを含む。
一つの実施形態では、ＳＳＯは、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド、２’Ｏ−ＭＯＥリボヌクレオチド、ヘキシトール（ＨＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシド、２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシド、前記のいずれかのホスホロチオエート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体、前記のいずれかのメチルホスホネート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸類似体、前記のいずれかのＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート類似体、および前記のいずれかのホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチド類似体、およびそれらの組合せからなる群より独立して選択される１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【０３１７】
一つの実施形態では、２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、それぞれ２’Ｏ−４’Ｃ−（メチレン）−リボフラノシルヌクレオチド若しくはヌクレオシド、またはそれぞれ２’Ｏ−４’Ｃ−（エチレン）−リボフラノシルヌクレオチド若しくはヌクレオシドである。
【０３１８】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯは、２’Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチドおよび２’Ｏ−４’Ｃ結合二環式リボフラノシル（ＬＮＡ）ヌクレオチドまたはヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【０３１９】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯの配列は、配列番号８、９、１４、１７〜２１、２４〜２９、３２、３３、３８〜４２、４４〜４６、５０〜５２、５５〜５７、６０、６８〜７１、７４、７５、７７、７８、８０、８２、８４および８６〜８９からなる群より選択される配列を含む。
【０３２０】
一つの実施形態では、本発明は、ＳＳＯと医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
一つの実施形態では、前記ＳＳＯは、配列番号１、２、３または４からの連続する配列に相補的である少なくとも１０から少なくとも２０ヌクレオチドを含む。
【０３２１】
一つの実施形態では、本発明は、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸を含む配列を有する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合することができる単離されたタンパク質を提供し、ｃＤＮＡは、５’から３’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０までを含む。
【０３２２】
一つの実施形態では、前記ＴＮＦはＴＮＦ−αである。
一つの実施形態では、前記タンパク質は、少なくとも１つのプロセシング修飾、化学修飾または翻訳後修飾を含み、前記修飾は、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰリボシル化、グリコシル化、メチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、またはコレステロール複合からなる群より選択される。
【０３２３】
一つの実施形態では、前記受容体は、ヒトＴＮＦＲ１などのＴＮＦＲ１である。一つの実施形態では、前記受容体は、ヒトＴＮＦＲ２などのＴＮＦＲ２である。一つの実施形態では、前記タンパク質は、配列番号６、配列番号６のアミノ酸３０〜４１７、配列番号８、配列番号８のアミノ酸３０〜４１６、配列番号１０、配列番号１０のアミノ酸２３〜４３５、配列番号１２、および配列番号１２のアミノ酸２３〜４４８からなる群より選択される配列を含む。一つの実施形態では、本発明は、医薬的に許容される担体と混合された本発明によるタンパク質を含有する医薬組成物を提供する。一つの実施形態では、本発明は、本発明による精製されたタンパク質を含有する組成物を提供する。
【０３２４】
一つの実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物を、ＴＮＦの活性を低下させるために有効な時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供する。一つの実施形態では、前記疾患または状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）、Ａ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｂ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｃ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、虚血／再灌流に関連する肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症からなる群より選択される。一つの実施形態では、本発明は、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）遺伝子に由来する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合することができるタンパク質をコードする単離核酸を提供し、前記タンパク質のｃＤＮＡは、５’から３’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０までを含む。このような実施形態では、前記タンパク質の配列は、配列番号６、配列番号６のアミノ酸３０〜４１７、配列番号８、配列番号８のアミノ酸３０〜４１６、配列番号１０、配列番号１０のアミノ酸２３〜４３５、配列番号１２、および配列番号１２のアミノ酸２３〜４４８からなる群より選択される配列を含む。一つの実施形態では、前記核酸の配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜１２５１、配列番号５のヌクレオチド８８〜１２５１、配列番号７のヌクレオチド１〜１２４８、配列番号７のヌクレオチド８８〜１２４８、配列番号９のヌクレオチド１〜１３０５、配列番号９のヌクレオチド６７〜１３０５、配列番号１１のヌクレオチド１〜１３４４、および配列番号１１の６７〜１３４４からなる群より選択される配列を含む。一つの実施形態では、本発明は、調節配列に作動可能に連結された本発明の核酸を含む発現ベクターを提供する。
【０３２５】
一つの実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＴＮＦアンタゴニストのレベルを上昇させる方法を提供し、前記方法は、前記哺乳動物の細胞を本発明による発現ベクターで形質転換し、それによって前記ＴＮＦアンタゴニストを発現させることを含み、前記ベクターは前記ＴＮＦＲの発現を駆動する。
【０３２６】
一つの実施形態では、哺乳動物は、炎症性疾患または状態を有する個人であるヒトなどの、ヒトである。
一つの実施形態では、前記発現ベクターは、プラスミドまたはウィルスである。
【０３２７】
一つの実施形態では、細胞はインビボで形質転換される。
一つの実施形態では、細胞はエクスビボで形質転換される。
一つの実施形態では、前記発現ベクターは組織特異的プロモーターを含み、前記組織特異的プロモーターは、例えば肝細胞またはマクロファージに由来し得る。
【０３２８】
一つの実施形態では、細胞は、肝細胞、造血細胞、脾細胞および筋細胞からなる群より選択される。
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または微生物細胞などの、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【０３２９】
本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合することができるタンパク質を発現するのに適した条件下で本発明の細胞を培養し、前記細胞を回収することを含む、前記タンパク質を生産するための工程を提供する。
【０３３０】
本発明は、医薬的に許容される担体と混合された、本発明の核酸またはベクターを含有する医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明の発現ベクターを、ＴＮＦ−α活性などのＴＮＦ活性を低下させるために十分な時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供する。
【０３３１】
一つの実施形態では、疾患または状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）、Ａ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｂ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｃ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、虚血／再灌流に関連する肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症からなる群より選択される。
【０３３２】
一つの実施形態では、本発明は、１つ以上のスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を、ＴＮＦの活性を低下させるために十分な時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供し、前記１つ以上のＳＳＯは、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）（またはＴＮＦＲ１）をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合することができるタンパク質の生産を高めるように変化させることができ、前記タンパク質は、前記受容体についての遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸を含む配列を有し、ｃＤＮＡは、５’から３’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０までを含む。
【０３３３】
一つの実施形態では、前記疾患または状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）、Ａ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｂ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、Ｃ型肝炎ウィルスに関連する肝炎、虚血／再灌流に関連する肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症からなる群より選択される。一つの実施形態では、投与は、非経口、局所、経口、直腸または肺投与である。
【０３３４】
一つの実施形態では、本発明は、少なくとも８個のヌクレオチドを含むスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を提供し、前記ＳＳＯは、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）（またはＴＮＦＲ１）をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合することができるタンパク質を生産するように変化させることができ、前記タンパク質は、前記受容体についての遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸を含む配列を有し、ｃＤＮＡは、５’から３’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０までを含む。
【０３３５】
一つの実施形態では、本発明は、配列番号１３からの連続する配列に相補的である少なくとも８個のヌクレオチドを含むＳＳＯを提供する。
一つの実施形態では、前記ＳＳＯの配列は、配列番号１４、３０、４６、７０、７１、７２および７３、並びに少なくとも８ヌクレオチドのそれらのサブ配列からなる群より選択される配列を含む。
【０３３６】
一つの実施形態では、前記ＳＳＯの配列は、配列番号１４〜６１からなる群より選択される配列を含む。
本発明は、１つ以上のスプライススイッチオリゴマー（ＳＳＯ）を細胞に投与することを含む、前記細胞において、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合することができるタンパク質の生産を高める方法を提供し、前記タンパク質は、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）（またはＴＮＦＲ１）遺伝子に由来するｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸を含む配列を有し、ｃＤＮＡは、５’から３’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン６および前記遺伝子のエキソン８を経て前記遺伝子のエキソン１０までを含み、前記１つ以上のＳＳＯは、前記受容体をコードするプレｍＲＮＡのスプライシングを、前記タンパク質の生産を高めるように変化させることができる。一つの実施形態では、前記方法はインビボで実施される。
【０３３７】
本発明は、本発明のＳＳＯと医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【実施例】
【０３３８】
以下の実施例は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１０５５７号に述べられているものと同じである。
（実施例１）
オリゴヌクレオチド
表６は、交互の２’−デオキシ−および２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートとの、上述した配列を有するキメラロックト核酸（ＬＮＡ）ＳＳＯを列挙する。これらはＳａｎｔａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｄｅｎｍａｒｋによって合成された。各々のＳＳＯに関して、５’末端ヌクレオシドは２’Ｏ−４’−メチレン−リボヌクレオシドであり、３’末端ヌクレオシドは２’デオキシ−リボヌクレオシドであった。表７は、交互の２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド−ホスホロチオエート（２’−ＯＭｅ）および２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートとのキメラＬＮＡ  ＳＳＯの配列を示す。これらはＳａｎｔａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｄｅｎｍａｒｋによって合成された。ＬＮＡを大文字で示し、２’−ＯＭｅを小文字で示す。
【０３３９】
細胞培養およびトランスフェクション
Ｌ９２９細胞を、１０％胎仔ウシ血清および抗生物質を添加した最小必須培地に維持した（３７℃、５％ＣＯ２）。トランスフェクションのため、Ｌ９２９細胞を１０５細胞／ウェルで２４穴プレートで培養し、２４時間後にトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドを、指示されている濃度で、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬２μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合した。ヌクレオチド／脂質複合体を、次に、細胞に適用し、２４時間インキュベートした。その後培地を吸引し、細胞をＴＲＩ試薬（商標）（ＭＲＣ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で採集した。
【０３４０】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩ試薬（ＭＲＣ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で単離し、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡを、製造者の指示に従ってｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。反応当たり約２００ｎｇのＲＮＡを使用した。本明細書で述べる実施例において使用したプライマーは表２に含まれる。ＰＣＲのサイクルを実施した：９５℃、６０秒間、５６℃、３０秒間、７２℃、６０秒間を合計２２〜３０サイクル。
【０３４１】
一部の場合では、視覚化のためにＣｙ５標識ｄＣＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＣＲ工程に含めた（０．１μＬ／５０μＬ  ＰＣＲ反応）。ＰＣＲ産物を１０％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｃｙ５標識バンドをＴｙｐｈｏｏｎ（商標）９４００スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で視覚化した。スキャンをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアで数量化した。あるいは、Ｃｙ５標識ｄＣＴＰを含めない場合は、視覚化のために微量のエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分離した。
【０３４２】
ＰＣＲ
製造者の指示に従ってＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲを実施した。各反応物５０μＬについて、どちらも約３０ｐｍｏｌの正プライマーと逆プライマーを使用した。本明細書で述べる実施例において使用したプライマーは表５に含まれる。熱サイクル反応は、特に明記しない限り、以下のように実施した：９４℃、３分間、次に９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間および７２℃、１０５秒間を３０〜４０サイクル、次いで７２℃、３分間。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドで視覚化した。
【０３４３】
【表５】
2014050400.tif 000014
2014050400.tif 000015
ヒト肝細胞培養
ヒト肝細胞を、ＡＤＭＥＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからまたはＴｈｅ  ＵＮＣ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｃｏｒｅ  ａｔ  ＵＮＣ−Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌから懸濁液中で入手した。細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍＬヒトインスリンおよび１３ｎＭデキサメタゾンを添加したＲＰＭＩ  １６４０に懸濁した。培地３ｍＬ中０．５×１０６細胞／プレートで６穴プレートに肝細胞を塗布した。１〜１時間半後、非接着細胞を除去し、培地を、１ｍｇ／ｍＬヒトインスリンおよび１３ｎＭデキサメタゾンを添加した、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０と交換した。
【０３４４】
６穴プレート中の肝細胞にＳＳＯを送達するため、５ｍＭ  ＳＳＯ保存溶液１０ｍＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）１００ｍＬで希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ４ｍＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）１００ｍＬに希釈した。複合溶液２００ｍＬを、培地２８００ｍＬを含む６穴プレート中の細胞に適用し、合計３００ｍＬとした。最終ＳＳＯ濃度は１７ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＲＩ試薬（商標）中に採取した。全ＲＮＡを製造者の指示に従って単離した。全ＲＮＡの約２００ｎｇを逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に供した。
【０３４５】
ＥＬＩＳＡ
細胞培養培地または血清中の可溶性ＴＮＦＲ２のレベルを決定するため、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ｓＴＮＦ  ＲＩＩ  ＥＬＩＳＡキットを使用した。検出のために使用した抗体は、プロテアーゼ切断形態の受容体も検出する。ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍに設定したマクロプレートリーダを用いて読み取り、波長補正を５７０ｎｍに設定した。
【０３４６】
マウスでのインビボ試験のために、動物からの血液を３７℃で１時間凝固させ、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｊｏｕａｎ  ＢＲＡ４ｉ遠心分離機）。血清を採取し、１：１０希釈したマウス血清５０ｍＬを使用して、製造者の指針に従って検定した。
【０３４７】
Ｌ９２９細胞傷害性アッセイ
１０４細胞／穴で９６穴プレートに接種したＬ９２９細胞を、合計１００ｍＬの完全ＭＥＭ培地（１０％標準ＦＢＳを含む）中の指示されたオリゴヌクレオチドで処理したマウスからの１０％血清の存在下に、０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αおよび１ｍｇ／ｍＬアクチノマイシンＤで処理し、３７℃で最大２４時間増殖させた。対照レーンは、未処理マウスからの１０％血清中で培養した。２４時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０ｍＬを添加し、マイクロプレートリーダで４９０ｎｍの吸光度を測定することによって細胞生存能を測定した。細胞生存能を未処理細胞に基準化した。
【０３４８】
ウェスタンブロット法
培地２０ｍＬまたは溶解産物２０ｍｇを４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各穴に負荷した。ゲルを２００Ｖで４０分間泳動させた。タンパク質を、３０Ｖで１時間、Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ（商標）ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写し、次にそれを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（登録商標）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）により、室温で１時間ブロックした。膜を、ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２のＣ末端を認識するウサギポリクローナル抗体（Ａｂｅａｍ）と共に室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で３回洗浄した後、膜を二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ａｂｅａｍ）と共に室温で１時間インキュベートし、再びＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した。次に、製造者の推奨に従ってＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でタンパク質を検出し、その後写真撮影した。
【０３４９】
（実施例２）
ＴＮＦＲ  ｍＲＮＡに関するＳＳＯスプライススイッチ活性
表６は、米国特許出願第１１／５９５，４８５号に述べられている配列を有し、マウスおよびヒトＴＮＦＲを標的とするＳＳＯのスプライススイッチ活性を示す。マウスＴＮＦＲ２  エキソン７を標的とするＳＳＯのうちで、少なくとも８つは多少のｍｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを生じた。特に、ＳＳＯ  ３３１２、３２７４および３３０５は、エキソン７の少なくとも５０％のスキッピングを誘導した。ＳＳＯ  ３３０５処理はほぼ完全なスキッピングを生じさせた。一次ヒト肝細胞にトランスフェクトした、ヒトＴＮＦＲ２  エキソン７を標的とするＳＳＯのうちで、少なくとも７つのＳＳＯは多少のｈｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを生じた。特に、ＳＳＯ  ３３７８、３３７９、３３８４および３４５９は、エキソン７の少なくとも７５％のスキッピングを誘導し（図２Ｂ）、ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７の細胞外培地への有意な誘導を生じさせた（図２Ａ）。
【０３５０】
【表６】
2014050400.tif 000016
表７は、交互の２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド−ホスホロチオエート（２’−ＯＭｅ）および２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートとの１０ヌクレオチドキメラＳＳＯの配列を含む。これらのＳＳＯは、マウスＴＮＦＲ２のエキソン７を標的とする。
【０３５１】
【表７】
2014050400.tif 000017
表７に列挙するＳＳＯのインビトロでのスプライススイッチ活性を分析するため、Ｌ９２９細胞を培養し、実施例１で述べたように播種した。表７の各々のＳＳＯをＬ９２９細胞に送達するため、ＳＳＯをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）５０ｍＬに希釈し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００混合物（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００対ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）の割合が１：２５）５０ｍＬを添加して、２０分間インキュベートした。その後無血清培地４００ｍＬをＳＳＯに添加し、２４穴プレート中の細胞に適用した。最終ＳＳＯ濃度は５０または１００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＲＩ試薬（商標）８００ｍＬ中に採取した。全ＲＮＡを製造者の指示に従って単離し、正プライマーＴＲ０４５（配列番号２２８）および逆プライマーＴＲ０４６（配列番号２２９）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図３）。
【０３５２】
表７に列挙するＳＳＯのインビボでのスプライススイッチ活性を分析するため、マウスに、表４に列挙するＳＳＯを２５ｍｇ／ｋｇ／日で５日間腹腔内注射した。注射前および最後の注射後１、５および１０日目にマウスから採血した。１回目の注射の前および最後の注射後１０日目に採取した血清中の可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（図４Ｂ）。１０日目にマウスを犠死させ、肝臓５〜１０ｍｇからの全ＲＮＡを、正プライマーＴＲ０４５（配列番号２２８）および逆プライマーＴＲ０４６（配列番号２２９）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図４Ａ）。
【０３５３】
インビトロで試験したＳＳＯ  ３２７４の１０ヌクレオチドＳＳＯサブ配列のうちで、それらのすべてが少なくとも多少のｍｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを生じた（図３）。特に、ＳＳＯ  ３８３９、３８４０および３８４１は、それらが由来するより長い１６ヌクレオチドＳＳＯ  ３２７４よりも大きなスプライススイッチ活性を示した。インビトロで最大の活性を示した３つの１０ヌクレオチドＳＳＯ、３８３９、３８４０、３８４１は、インビボでもマウスにおいて有意量のｍｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡ（図４Ａ）および可溶性ｍｕＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質（図４Ｂ）を生成することができた。
【０３５４】
ヒトＴＮＦＲ２におけるスプライススイッチ活性へのＳＳＯの長さの影響を評価するため、細胞を種々の長さのＳＳＯで処理した。一次ヒト肝細胞を、表４から選択した指示されているＳＳＯでトランスフェクトした。これらのＳＳＯは、交互の２’−デオキシ−および２’Ｏ−４’−（メチレン）−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートを用いてＳａｎｔａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｄｅｎｍａｒｋによって合成された。各々のＳＳＯに関して、５’末端ヌクレオシドは２’Ｏ−４’−メチレン−リボヌクレオシドであり、３’末端ヌクレオシドは２’デオキシ−リボヌクレオシドであった。これらのＳＳＯは１０、１２、１４または１６量体であった。可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（図５、上のパネル）。全ＲＮＡを、スプライススイッチ活性に関してＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図５、下のパネル）。
【０３５５】
（実施例３）
ＳＳＯが誘導するＴＮＦＲ２スプライス変異体のスプライスジャンクションの分析
マウスおよびヒトの両方の細胞におけるＳＳＯスプライススイッチが、予想されるＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを導くことを確認するため、ＳＳＯ誘導のＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって分析し、配列決定した。
【０３５６】
マウス
マウスにＳＳＯ  ３２７４を２５ｍｇ／ｋｇ／日で１０日間腹腔内注射した。その後マウスを犠死させ、肝臓からの全ＲＮＡを、正プライマーＴＲ０４５（配列番号２２８）および逆プライマーＴＲ０４６（配列番号２２９）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析した。産物を１．５％アガロースゲル上で分析し（図６Ａ）、ＴＮＦＲ２  Δ７についての産物を標準分子生物学手法を用いて単離した。単離したＴＮＦＲ２  Δ７産物を、同じプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、その後配列決定した（図６Ｂ）。配列データは、配列ＣＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号１２７のヌクレオチド７７７〜８０４）を含み、これは、ＳＳＯ誘導のＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡがエキソン７を欠くことおよびエキソン６がエキソン８に直接連結されていることを確認する。
【０３５７】
ヒト肝細胞
一次ヒト肝細胞を、実施例１で述べたようにＳＳＯ  ３３７９でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、製造者の指示に従ってランダム・ヘキサマ・プライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡに変換した。正プライマーＴＲ０４９（配列番号２０２）および逆プライマーＴＲ０５０（配列番号２０３）を使用して、ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。産物を１．５％アガロースゲル上で分析した（図７Ａ）。ＴＮＦＲ２  Δ７に対応するバンドを、標準分子生物学手法を用いて単離し、その後配列決定した（図７Ｂ）。配列データは、配列ＣＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＣ（配列番号１２５のヌクレオチド７７４〜８０１）を含み、これは、ＳＳＯ誘導のＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡがエキソン７を欠くことおよびエキソン６がエキソン８に直接連結されていることを確認する。
【０３５８】
（実施例４）
一次ヒト肝細胞におけるＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質のＳＳＯ用量依存的生産
一次ヒト肝細胞におけるＳＳＯのスプライススイッチ活性の用量反応を試験した。ヒト肝細胞をＡＤＭＥＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから懸濁液中で入手した。細胞を３回洗浄し、播種培地（Ｌ−グルタミン酸、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１２ｎＭデキサメタゾンを添加したＲＰＭＩ  １６４０）に懸濁した。肝細胞を生存能に関して評価し、コラーゲン被覆した２４穴プレートに１．０×１０５細胞／穴で播種した。典型的には、細胞生存率は８５〜９３％であった。約２４時間後、培地を維持培地（ＦＢＳを含まない播種培地）と交換した。
【０３５９】
各々のＳＳＯを肝細胞に送達するため、ＳＳＯをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）５０ｍＬに希釈し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００混合物（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００対ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）の割合が１：２５）５０ｍＬを添加して、２０分間インキュベートした。その後ＳＳＯを２４穴プレート中の細胞に適用した。最終ＳＳＯ濃度は１〜１５０ｎＭの範囲であった。４８時間後、細胞をＴＲＩ試薬（商標）８００ｍＬ中に採取した。
【０３６０】
細胞からの全ＲＮＡを、正プライマーＴＲ０４７（配列番号２００）および逆プライマーＴＲ０４８（配列番号２０１）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図８Ａ）。血清中の可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（図８Ｂ）。ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡ（図８Ａ）および分泌型ｈｕＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質（図８Ｂ）はいずれも、用量依存的上昇を示した。
【０３６１】
（実施例５）
マウス細胞からのＴＮＦＲ２スプライス変異体の分泌
可溶性ＴＮＦＲ２タンパク質の生産および細胞外培地中への分泌を誘導するＳＳＯの能力を試験した。Ｌ９２９細胞を実施例１で述べたようにＳＳＯで処理し、トランスフェクションの最大４８時間後に細胞外培地試料を収集した。試料中の可溶性ＴＮＦＲ２の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（図９）。ＲＮＡスプライシングのシフトを最もよく誘導したＳＳＯは、同時に大部分のタンパク質を細胞外培地に分泌した。特に、ＳＳＯ  ３３０５、３３１２および３２７４は、可溶性ＴＮＦＲ２をバックグラウンドに比べて少なくとも３．５倍に上昇させた。従って、スプライス変異体ｍＲＮＡの誘導は、可溶性ＴＮＦＲ２の生産および分泌と相関した。
【０３６２】
（実施例６）
ＳＳＯのインビボ注射はマウスにおいてｍｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを生成した。
食塩水中のＳＳＯ  ３３０５を、３ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量で４日間毎日マウスに腹腔内注射した。５日目にマウスを犠死させ、肝臓からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。データは、細胞培養において認められたのと同様のスプライススイッチ効果を示す。２５ｍｇ／ｋｇの最大用量で、ＳＳＯ  ３３０５処理はΔ７  ｍＲＮＡへのほとんど完全な変換を誘導した（図１０、下のパネル）。
【０３６３】
ＳＳＯ  ３２７４に関する同様の実験は、Δ７  ｍＲＮＡへの約２０％の変換を誘導した。ＳＳＯ  ３２７４のΔ７  ｍＲＮＡの誘導を最適化するため、用量レジメンおよび最後の注射から動物の犠死までの時間の両方を変化させた。ＳＳＯ  ３２７４を４日間毎日マウスに腹腔内注射した。ＳＳＯ処理は、１５日目に分析したマウスにおいてΔ７  ｍＲＮＡへの約３０％の変換を誘導し、一方５日目に分析したマウスでは２０％のシフトが認められた（図１０、上のパネル）。さらに、１０日間Δ７の注射を行い、１１日目に犠死させたマウスは、ｍＲＮＡの５０％の誘導を示した（図１０、上のパネル）。これらのインビボデータは、ＴＮＦＲ２  ＳＳＯが投与後少なくとも１０日間、ｍｕＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡを生産できることを示唆する。
【０３６４】
（実施例７）
循環ＴＮＦＲ２  Δ７
マウスに、ＳＳＯ  ３２７４、３３０５または対照３０８３を２５ｍｇ／ｋｇ／日で１０日間腹腔内注射した。注射前および最後の注射後１、５および１０日目にマウスから採血した。血清中の可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度を測定した。ＳＳＯ処理は、少なくとも１０日間、バックグラウンドを上回る可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質レベルを誘導した（図１１）。
【０３６５】
より長い時点での作用を試験するため、最後の注射後２７日目までに血清試料を収集したことを除いて、実験を反復した。結果は、最後のＳＳＯ注射後２７日目に可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７レベルのわずかな低下だけを示す（図１２）。
【０３６６】
（実施例８）
マウス血清における抗ＴＮＦ−α活性
ＳＳＯ  ３２７４処理マウスからの血清の抗ＴＮＦ−α活性をＬ９２９細胞傷害性アッセイにおいて試験した。このアッセイでは、血清を、実施例１で述べたように培養したＬ９２９細胞を固定濃度のＴＮＦ−αの細胞傷害作用から保護するその能力に関して評価する。ＳＳＯ  ３２７４で処理したマウスからの血清は、０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αに暴露したＬ９２９細胞の生存能を高めたが、対照ＳＳＯ（３０８３または３２７２）では生存能の上昇を認めなかった（図１３）。それ故、ＳＳＯ  ３２７４血清は、ＴＮＦ−αに結合して不活性化し、それによって細胞をＴＮＦ−αの細胞傷害作用から保護するのに十分なＴＮＦ−αアンタゴニストを含んでいた。この抗ＴＮＦ−α活性は、ＳＳＯ  ３２７４の最後の注射後５日目および２７日目の動物の血清中に存在した。
【０３６７】
（実施例９）
ＳＳＯが生成するＴＮＦＲ２  Δ７と他の抗ＴＮＦ−αアンタゴニストとの比較
Ｌ９２９細胞を上述したように播種した。（ｉ）マウスＴＮＦＲ２の２３６アミノ酸残基の細胞外ドメインを有する、Ｓｉｇｍａ（登録商標）からの組換え可溶性タンパク質（０．０１〜３ｍｇ／ｍＬ）、（ｉｉ）ＳＳＯ  ３２７４またはＳＳＯ  ３３０５処理マウスからの血清（１．２５〜１０％、未処理マウスからの血清中で希釈、ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した）、または（ｉｉｉ）最終容量１００μｌ、最終マウス血清濃度１０％のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（０．４５〜１５０ｐｇ／ｍｌ）のいずれかと共に、無血清ＭＥＭ  ９０μＬ、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む試料を調製した。試料を室温で３０分間インキュベートした。その後、培養した細胞に試料を適用し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で最大２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μＬを添加し、マイクロプレートリーダで４９０ｎｍの吸光度を測定することによって細胞生存能を測定した。細胞生存能を未処理細胞に基準化し、ＴＮＦアンタゴニスト濃度の関数として表示した（図１４）。
【０３６８】
（実施例１０）
ＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡおよびタンパク質の安定性
マウスを、２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量を腹腔内注射によって５日間毎日、ＳＳＯ  ３２７４または３２７２（対照）（ｎ＝５）で処理した。注射前および最後の注射後５、１５、２２、２７および３５日目に再びマウスから採血した。血清中の可溶性ＴＮＦＲ２  Δ７の濃度を測定した（図１５Ａ）。肝臓中のＴＮＦＲ２のスプライスシフトも、犠死の時点で肝からの全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって決定した（図１５Ｂ）。実施例７からのデータと合わせて、ＳＳＯ処理後のＴＮＦＲ２  ｍＲＮＡレベルの時間経過を構築し、血清中のＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の時間経過と比較した（図１６）。データは、インビボでのＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡが血清中のＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質よりも約４倍速い速度で崩壊することを示す。３５日目に、ＴＮＦＲ２  Δ７  ｍＲＮＡは微量しか検出できなかったが、ＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質はそのピーク濃度から２０％だけ低下していた。
【０３６９】
（実施例１１）
ヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡの作製
完全長ヒトＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡを含むプラスミドをＯｒｉＧｅｎｅ（カタログ番号：ＴＣ１１９４５９、ＮＭ＿００１０６６．２）から購入した。逆プライマーＴＲ００１（配列番号１１６）および正プライマーＴＲ００２（配列番号１１７）を用いてプラスミドに関するＰＣＲを実施することによりｃＤＮＡを得た。標準分子生物学手法を用いてＰＣＲ産物を単離し、精製した。ＰＣＲ産物は、終結コドンのない１３８３ｂｐのＴＮＦＲ２オープン・リーディング・フレームを含む。
【０３７０】
あるいは、完全長ヒトＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡは、ＴＲ００１逆プライマーおよびＴＲ００２正プライマーを用いてヒト単核細胞からの全ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲを実施することによって得られる。標準分子生物学手法を用いてＰＣＲ産物を単離し、精製する。
【０３７１】
ヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを作製するため、完全長ヒトＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関して２つの別々のＰＣＲ反応を実施し、それによってヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡの重複セグメントを作製した。一つの反応では、正プライマーＴＲ００３（配列番号１９０）および逆プライマーＴＲ００４（配列番号１９１）を用いて完全長ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。他方の反応では、逆プライマーＴＲ００５（配列番号１９２）およびＴＲ００２正プライマーを用いて完全長ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。最後に、２つの重複セグメントを組み合わせ、ＴＲ００２正プライマーとＴＲ００４逆プライマーを用いてＰＣＲを実施した。標準分子生物学手法を用いてＰＣＲ産物を単離し、精製した。ＰＣＲ産物は、終結コドンを有する１３０８ｂｐのＴＮＦＲ２
Δ７オープン・リーディング・フレーム（配列番号１２５）を含むと予想された。
【０３７２】
同様に、これらのＰＣＲ反応においてＴＲ００４逆プライマーの代わりにＴＲ００１逆プライマーを使用することにより、終結コドンを持たない１３０５ｂｐのヒトＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームを作製した。これは、最終ＰＣＲ産物を適切なベクターに挿入するとき、ＨｉｓタグなどのインフレームＣ末端アフィニティ精製タグの付加を可能にする。
【０３７３】
（実施例１２）
ヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡの作製
完全長ヒトＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡを含むプラスミドをＯｒｉＧｅｎｅ（カタログ番号：ＴＣ１２７９１３、ＮＭ＿００１０６５．２）から購入する。ＴＲ００６逆プライマー（配列番号２０４）およびＴＲ００７正プライマー（配列番号２０５）を用いてプラスミドに関するＰＣＲを実施することによりｃＤＮＡを得る。標準分子生物学手法を用いて完全長ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を単離し、精製する。
【０３７４】
あるいは、完全長ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡは、ＴＲ００６逆プライマーおよびＴＲ００７正プライマーを用いてヒト単核細胞からの全ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲを実施することによって得られる。標準分子生物学手法を用いて完全長ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を単離し、精製する。
【０３７５】
ヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡを作製するため、完全長ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関して２つの別々のＰＣＲ反応を実施し、それによってヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡの重複セグメントを作製する。一つの反応では、ＴＲ００８正プライマー（配列番号２０６）およびＴＲ００６逆プライマーを用いて完全長ＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。他方の反応では、ＴＲ００９逆プライマー（配列番号２０７）およびＴＲ０１０正プライマー（配列番号２０８）を用いて完全長ＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。最後に、２つの重複セグメントを組み合わせ、ＴＲ０１０正プライマーとＴＲ００６逆プライマーを用いてＰＣＲを実施する。標準分子生物学手法を用いてＰＣＲ産物を単離し、精製する。ＰＣＲ産物は、終結コドンを有する１２５４ｂｐのＴＮＦＲ１  Δ７オープン・リーディング・フレーム（配列番号１２１）を含む。
【０３７６】
あるいは、これらのＰＣＲ反応においてＴＲ００６逆プライマーの代わりにＴＲ０１１逆プライマー（配列番号２０９）を使用することにより、終結コドンを持たない１２５１ｂｐのヒトＴＮＦＲ１  Δ７オープン・リーディング・フレームが作製される。これは、最終ＰＣＲ産物を適切なベクターに挿入するとき、ＨｉｓタグなどのインフレームＣ末端アフィニティ精製タグの付加を可能にする。
【０３７７】
（実施例１３）
マウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡの作製
完全長マウスＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡを作製するため、ＴＲ０１２逆プライマー（配列番号２１４）およびＴＲ０１３正プライマー（配列番号２１５）を使用して、商業的に入手可能なＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（商標）  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号：ＡＭ３３００）に関するＰＣＲ反応を実施した。完全長マウスＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を、標準分子生物学手法を用いて単離し、精製する。次にＴＲ０１４正プライマー（配列番号２１６）とＴＲ０１２逆プライマーを用いて生じた産物に関するＰＣＲを実施することにより、適切なコザック配列を導入した。
【０３７８】
あるいは、完全長マウスＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡは、ＴＲ０１５逆プライマー（配列番号２１７）およびＴＲ０１６正プライマー（配列番号２１８）を用いてマウス単核細胞またはマウス肝細胞からの全ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲを実施することによって得られる。標準分子生物学手法を用いて完全長マウスＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を単離し、精製する。
【０３７９】
マウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを作製するため、完全長マウスＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関して２つの別々のＰＣＲ反応を実施し、それによってＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡの重複セグメントを作製した。一つの反応では、ＴＲ０１７正プライマー（配列番号２１９）およびＴＲ０１５逆プライマーを用いて完全長ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。他方の反応では、ＴＲ０１８逆プライマー（配列番号２２０）およびＴＲ０１６正プライマーを用いて完全長ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。最後に、２つの重複セグメントを組み合わせ、ＴＲ０１６正プライマーとＴＲ０１５逆プライマーを用いてＰＣＲを実施した。標準分子生物学手法を用いてＰＣＲ産物を単離し、精製した。ＰＣＲ産物は、終結コドンを有する１３４８ｂｐのマウスＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレーム（配列番号１２７）を含むと予想された。
【０３８０】
あるいは、これらのＰＣＲ反応においてＴＲ０１５逆プライマーの代わりにＴＲ０１９逆プライマー（配列番号２２１）を使用することにより、終結コドンを持たない１３４５ｂｐのマウスＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームを作製した。これは、最終ＰＣＲ産物を適切なベクターに挿入するとき、ＨｉｓタグなどのインフレームＣ末端アフィニティ精製タグの付加を可能にする。
【０３８１】
（実施例１４）
マウスＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡの作製
完全長マウスＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡを作製するため、ＴＲ０２０逆プライマー（配列番号２３０）およびＴＲ０２１正プライマー（配列番号２３１）を使用して、商業的に入手可能なＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（商標）  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号：ＡＭ３３００）に関するＰＣＲ反応を実施する。完全長マウスＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を、標準分子生物学手法を用いて単離し、精製する。
【０３８２】
あるいは、完全長マウスＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡは、ＴＲ０２０逆プライマーとＴＲ０２１正プライマーを用いてマウス単核細胞からの全ＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲを実施することによって得られる。標準分子生物学手法を用いて完全長マウスＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を単離し、精製する。
【０３８３】
マウスＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡを作製するため、完全長ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関して２つの別々のＰＣＲ反応を実施し、それによってＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡの重複セグメントを作製する。一つの反応では、ＴＲ０２２正プライマー（配列番号２３２）およびＴＲ０２０逆プライマーを用いて完全長ＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。他方の反応では、ＴＲ０２３逆プライマー（配列番号２３３）およびＴＲ０２４正プライマー（配列番号２３４）を用いて完全長ＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。最後に、２つの重複セグメントを組み合わせ、ＴＲ０２４正プライマーとＴＲ０２０逆プライマーを用いてＰＣＲを実施する。標準分子生物学手法を用いて１２５９ｂｐのＰＣＲ産物を単離し、精製する。ＰＣＲ産物は、終結コドンを有する１２５１ｂｐのマウスＴＮＦＲ１  Δ７オープン・リーディング・フレーム（配列番号１２３）を含む。
【０３８４】
あるいは、これらのＰＣＲ反応においてＴＲ０２０逆プライマーの代わりにＴＲ０２５逆プライマー（配列番号２３５）を使用することにより、終結コドンを持たない１２４８ｂｐのマウスＴＮＦＲ１  Δ７オープン・リーディング・フレームが作製される。これは、最終ＰＣＲ産物を適切なベクターに挿入するとき、ＨｉｓタグなどのインフレームＣ末端アフィニティ精製タグの付加を可能にする。
【０３８５】
（実施例１５）
哺乳動物細胞におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７の発現のためのベクターの構築
哺乳動物細胞におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１２からのヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込んだ。終結コドンを伴うものと終結コドンを伴わないものの両方の、実施例１２からのＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って平滑末端連結し、単離した。ヒトＴＮＦＲ２  Δ７をコードするインサートを含むプラスミドを、供給者の指示に従ってＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）  Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換混合物５０ｍＬを、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ培地で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地の培養物５ｍＬを接種し、３７℃で一晩インキュベートした。次に培養物を使用して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２００ｍＬに接種し、３７℃で一晩増殖させた。製造者の指示に従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してプラスミドを単離した。精製効率は、試料当たり０．５〜１．５ｍｇの範囲であった。
【０３８６】
３つのヒトＴＮＦＲ２  Δ７クローン（１３１９−１、１１３８−５および１２３０−１）を生成し、配列決定した。クローン１３１９−１は、終結コドンを持たないヒトＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームとそれに直接続くプラスミドからのインフレームＨｉｓタグを含む。一方クローン１１３８−５および１２３０−１は、ＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームとそのすぐ後に続く終結コドンを含む。プラスミドからのＨｉｓタグの配列を配列番号２４２に示す。クローン１２３０−１および１３１９−１のＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームの配列は、それぞれ終結コドンを伴う場合と伴わない場合の配列番号１２５と同一である。しかし配列番号１２５と比較して、クローン１１３８−５のＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームの配列（配列番号２３１）はエキソン１０内の１０５５位の１個のヌクレオチドが異なっており、前者ではＡ、後者ではＧであった。この１個のヌクレオチドの変化は、アミノ酸３５２をグルタミンからアルギニンへと変化させる。
【０３８７】
（実施例１６）
大腸菌におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７の発現
細菌におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１２からのヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー（ＴＲ００２）（配列番号１９１）および逆プライマー（ＴＲ０２６）（配列番号１９５）を使用して実施例１２からのＰＣＲフラグメントに関するＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲフラグメントを、製造者の指示に従ってｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、ヒトＴＮＦＲ２  Δ７細菌発現ベクターを作製する。生じたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換する。ヒトＴＮＦＲ２  Δ７を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
【０３８８】
（実施例１７）
昆虫細胞におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７の発現
昆虫細胞におけるヒトＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１２からのヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー（ＴＲ０２７）（配列番号１９６）および逆プライマー（ＴＲ０２８）（配列番号１９７）を使用して実施例１２からのヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡに関するＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化する。消化したＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ、ｐＥＮＴＲ（商標）２Ｂ、ｐＥＮＴＲ（商標）３Ｃ、ｐＥＮＴＲ（商標）４、またはｐＥＮＴＲ（商標）１１ベクターのいずれか１つなどの、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＮＴＲ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と連結してエントリベクターを作製する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
【０３８９】
ヒトＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを含むバキュロウィルスベクターを、製造者の指示に従ってＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）直鎖ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とエントリベクターの相同的組換えによって生成する。次に反応混合物を使用してＳｆ９細胞に感染させ、組換えバキュロウィルスを生成する。組換えバキュロウィルスの採取後、ヒトＴＮＦＲ２  Δ７の発現を確認する。組換えバキュロウィルスの増幅は高力価のウィルスストックを産出する。高力価ウィルスストックを使用してＳｆ９細胞に感染させ、それによってヒトＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質を発現させる。
【０３９０】
（実施例１８）
ヒトＴＮＦＲ２  Δ７の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
ヒトＴＮＦＲ２  Δ７遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、ヒトＴＮＦＲ２  Δ７をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．ら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１４１２に述べられている３プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する。ユニークなフランキングＮｏｔＩ制限部位を導入するため、正プライマー（ＴＲ０２９）（配列番号１９８）および逆プライマー（ＴＲ０３０）（配列番号１９９）を使用して実施例１２の精製ヒトＴＮＦＲ２  Ｄ７  ＰＣＲ産物に関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、ＮｏｔＩ消化したフラグメントをＮｏｔＩ消化したｐＴＲ−ＵＦ２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、ＣＭＶｉｅプロモーターに作動可能に連結されたヒトＴＮＦＲ２  Ｄ７オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。生じたプラスミドを、次に、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているように、プラスミドｐＸＸ６８０およびｐＨｅｌｐｅｒ（ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターにより発現が駆動される、ヒトＴＮＦＲ２  Δ７遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生産する。Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているようにウィルス粒子を採取し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したｒＡＡＶストックを提供する。
【０３９１】
（実施例１９）
大腸菌におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７の発現
細菌におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、ｃＤＮＡをｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー（ＴＲ０１０）（配列番号２０８）および逆プライマー（ＴＲ００６）（配列番号２０４）を使用してｃＤＮＡに関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲフラグメントを、製造者の指示に従ってｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、ヒトＴＮＦＲ１  Δ７細菌発現ベクターを作製する。得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換する。ヒトＴＮＦＲ１  Δ７を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
【０３９２】
（実施例２０）
哺乳動物細胞におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７の発現
哺乳動物細胞におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、ヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込む。ヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物とｐｃＤＮＡ（商標）３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って平滑末端連結する。次に、標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製し、哺乳動物発現ベクターを産出する。その後、ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、そこで、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターによりヒトＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現が駆動される。
【０３９３】
（実施例２１）
昆虫細胞におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７の発現
昆虫細胞におけるヒトＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１２からのｃＤＮＡをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー（ＴＲ０３１）（配列番号２１０）および逆プライマー（ＴＲ０３２）（配列番号２１１）を使用して実施例１２からのｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化する。消化したＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ、ｐＥＮＴＲ（商標）２Ｂ、ｐＥＮＴＲ（商標）３Ｃ、ｐＥＮＴＲ（商標）４、またはｐＥＮＴＲ（商標）１１ベクターのいずれか１つなどの、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＮＴＲ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と連結してエントリベクターを産出する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
【０３９４】
ヒトＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡを含むバキュロウィルスベクターを、製造者の指示に従ってＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）直鎖ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とエントリベクターの相同的組換えによって生成する。次に反応混合物を使用してＳｆ９細胞に感染させ、組換えバキュロウィルスを生成する。組換えバキュロウィルスの採取後、ヒトＴＮＦＲ１  Δ７の発現を確認する。組換えバキュロウィルスの増幅は高力価のウィルスストックを産出する。高力価ウィルスストックを使用してＳｆ９細胞に感染させ、それによってヒトＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質を発現させる。
【０３９５】
（実施例２２）
ヒトＴＮＦＲ１  Δ７の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの生成
ヒトＴＮＦＲ１  Δ７遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、ヒトＴＮＦＲ１  Δ７をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．ら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１４１２に述べられている３プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する。ユニークなフランキングＮｏｔＩ制限部位を導入するため、正プライマー（ＴＲ０３３）（配列番号２１２）および逆プライマー（ＴＲ０３４）（配列番号２１３）を使用して精製ヒトＴＮＦＲ１  Ｄ７  ＰＣＲ産物に関するＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、ＮｏｔＩ消化したフラグメントをＮｏｔＩ消化したｐＴＲ−ＵＦ２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、ＣＭＶｉｅプロモーターに作動可能に連結されたヒトＴＮＦＲ１  Ｄ７オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。生じたプラスミドを、次に、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているように、プラスミドｐＸＸ６８０およびｐＨｅｌｐｅｒ（ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターにより発現が駆動される、ヒトＴＮＦＲ１  Δ７遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生成する。Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているようにウィルス粒子を採取し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したｒＡＡＶストックを提供する。
【０３９６】
（実施例２３）
哺乳動物細胞におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７の発現のためのベクターの構築
哺乳動物細胞におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１４からのマウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込んだ。終結コドンを伴うものと終結コドンを伴わないものの両方の、実施例１４からのＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物とｐｃＤＮＡ（商標）３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って平滑末端連結し、単離した。マウスＴＮＦＲ２  Δ７をコードするインサートを含むプラスミドを、供給者の指示に従ってＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）  Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換混合物５０ｍＬを、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ培地で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地の培養物５ｍＬを播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次に培養物を使用して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２００ｍＬに播種し、３７℃で一晩増殖させた。製造者の指示に従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してプラスミドを単離した。精製効率は、試料当たり０．５〜１．５ｍｇの範囲であった。
【０３９７】
２つのマウスＴＮＦＲ２  Δ７クローン（１１４４−４および１１４５−３）を作製し、配列決定した。クローン１１４４−４は、終結コドンを持たないマウスＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームとそれに直接続くプラスミドからのインフレームＨｉｓタグを含む。一方クローン１１４５−３は、ＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームとそのすぐ後に続く終結コドンを含む。プラスミドからのＨｉｓタグの配列を配列番号２４２に示す。配列番号１２７と比較して、２つのクローン、１１４４−４および１１４５−３のＴＮＦＲ２  Δ７オープン・リーディング・フレームの配列（配列番号２４０）は１１の位置で１個のヌクレオチドが異なった。これらの１個のヌクレオチドの変化の結果として、配列番号１２８と比較して４つのアミノ酸の相違が存在する。
【０３９８】
（実施例２４）
大腸菌におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７の発現
細菌におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１４からのマウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー（ＴＲ０３５）（配列番号２２２）および逆プライマー（ＴＲ０３６）（配列番号２２３）を使用して実施例１４からのＰＣＲフラグメントに関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲフラグメントを、製造者の指示に従ってｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、マウスＴＮＦＲ２  Δ７細菌発現ベクターを作製する。得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換する。マウスＴＮＦＲ２  Δ７を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
【０３９９】
（実施例２５）
昆虫細胞におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７の発現
昆虫細胞におけるマウスＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１４からのｃＤＮＡをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー（ＴＲ０３７）（配列番号２２４）および逆プライマー（ＴＲ０３８）（配列番号２２５）を使用して実施例１４からのｃＤＮＡに関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化する。消化したＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ、ｐＥＮＴＲ（商標）２Ｂ、ｐＥＮＴＲ（商標）３Ｃ、ｐＥＮＴＲ（商標）４またはｐＥＮＴＲ（商標）１１ベクターのいずれか１つなどの、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＮＴＲ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と連結してエントリベクターを産出する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
【０４００】
マウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡを含むバキュロウィルスベクターを、製造者の指示に従ってＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）直鎖ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とエントリベクターの相同的組換えによって作製する。次に反応混合物を使用してＳｆ９細胞に感染させ、組換えバキュロウィルスを作製する。組換えバキュロウィルスの収集後、マウスＴＮＦＲ２  Δ７の発現を確認する。組換えバキュロウィルスの増幅は高力価のウィルスストックを産出する。高力価ウィルスストックを使用してＳｆ９細胞に感染させ、それによってマウスＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質を発現させる。
【０４０１】
（実施例２６）
マウスＴＮＦＲ２  Δ７の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
マウスＴＮＦＲ２  Δ７遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、マウスＴＮＦＲ２  Δ７をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．ら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１４１２に述べられている３プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する。ユニークなフランキングＮｏｔＩ制限部位を導入するため、正プライマー（ＴＲ０３９）（配列番号２２６）および逆プライマー（ＴＲ０４０）（配列番号２２７）を使用して実施例１４の精製マウスＴＮＦＲ２  Ｄ７  ＰＣＲ産物に関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、ＮｏｔＩ消化したフラグメントをＮｏｔＩ消化したｐＴＲ−ＵＦ２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、ＣＭＶｉｅプロモーターに作動可能に連結されたマウスＴＮＦＲ２  Ｄ７オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。得られたプラスミドを、次に、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているように、プラスミドｐＸＸ６８０およびｐＨｅｌｐｅｒ（ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターにより発現が駆動される、マウスＴＮＦＲ２  Δ７遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生成する。Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているようにウィルス粒子を採集し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したｒＡＡＶストックを提供する。
【０４０２】
（実施例２７）
大腸菌におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７の発現
細菌におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１５からのｃＤＮＡをｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー（ＴＲ０２４）（配列番号２３４）および逆プライマー（ＴＲ０２０）（配列番号２３５）を使用して実施例１５からのｃＤＮＡに関するＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲフラグメントを、製造者の指示に従ってｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、マウスＴＮＦＲ１  Δ７細菌発現ベクターを作製する。生じたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換する。マウスＴＮＦＲ１  Δ７を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
【０４０３】
（実施例２８）
哺乳動物細胞におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７の発現
哺乳動物細胞におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１５からのマウスＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込む。実施例１５からのマウスＴＮＦＲ２  Δ７  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物とｐｃＤＮＡ（商標）３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って平滑末端連結する。次に、標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製し、哺乳動物発現ベクターを作製する。その後、ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、そこで、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターによりマウスＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現が駆動される。
【０４０４】
（実施例２９）
昆虫細胞におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７の発現
昆虫細胞におけるマウスＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質の発現のため、実施例１５からのｃＤＮＡをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー（ＴＲ０４１）（配列番号２３６）および逆プライマー（ＴＲ０４２）（配列番号２３７）を使用して実施例１５からのｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化する。消化したＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ、ｐＥＮＴＲ（商標）２Ｂ、ｐＥＮＴＲ（商標）３Ｃ、ｐＥＮＴＲ（商標）４、またはｐＥＮＴＲ（商標）１１ベクターのいずれか１つなどの、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＮＴＲ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と連結してエントリベクターを作製する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
【０４０５】
マウスＴＮＦＲ１  Δ７  ｃＤＮＡを含むバキュロウィルスベクターを、製造者の指示に従ってＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）直鎖ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とエントリベクターの相同的組換えによって作製する。次に反応混合物を使用してＳｆ９細胞に感染させ、組換えバキュロウィルスを作製する。組換えバキュロウィルスの収集後、マウスＴＮＦＲ１  Δ７の発現を確認する。組換えバキュロウィルスの増幅は高力価のウィルスストックを生じる。高力価ウィルスストックを使用してＳｆ９細胞に感染させ、それによってマウスＴＮＦＲ１  Δ７タンパク質を発現させる。
【０４０６】
（実施例３０）
マウスＴＮＦＲ１  Δ７の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
マウスＴＮＦＲ１  Δ７遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、マウスＴＮＦＲ１  Δ７をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．ら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１４１２に述べられている３プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する。ユニークなフランキングＮｏｔＩ制限部位を導入するため、正プライマー（ＴＲ０４３）（配列番号２３８）および逆プライマー（ＴＲ０４４）（配列番号２３９）を使用して実施例１４の精製マウスＴＮＦＲ１  Ｄ７  ＰＣＲ産物に関するＰＣＲを実施する。生じたＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、ＮｏｔＩ消化したフラグメントをＮｏｔＩ消化したｐＴＲ−ＵＦ２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、ＣＭＶｉｅプロモーターに作動可能に連結されたマウスＴＮＦＲ１  Ｄ７オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。得られたプラスミドを、次に、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているように、プラスミドｐＸＸ６８０およびｐＨｅｌｐｅｒ（ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターにより発現が駆動される、マウスＴＮＦＲ１  Δ７遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生産する。Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．らに述べられているようにウィルス粒子を採集し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したｒＡＡＶストックを提供する。
【０４０７】
（実施例３１）
ＴＮＦＲ  Δ７の発現のためのレンチウィルスベクターの生成
ＴＮＦＲ  Δ７遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、ＴＮＦＲ  Δ７をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、複製能を欠くレンチウィルスベクターを作製する。実施例２７、３０、３５および３８からのＰＣＲ産物とｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って平滑末端連結する。得られたプラスミドを、標準分子生物学手法を用いて大腸菌に形質転換し、増幅して、精製する。このプラスミドを製造者の指示に従って２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、強力な構成的ＣＭＶｉｅプロモーターにより発現が駆動されるＴＮＦＲ  Δ７遺伝子を含むレンチウィルス粒子を生産する。このウィルス粒子を採集し、Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ，Ｇ．ら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：２４１に述べられているように精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したレンチウィルスストックを提供する。
【０４０８】
（実施例３２）
哺乳動物細胞におけるＴＮＦＲ２  Δ７の発現
実施例２６および実施例３４で作製されたプラスミドを使用して、哺乳動物ＨｅＬａ細胞において活性タンパク質を発現し、生じたタンパク質を抗ＴＮＦ−α活性に関して試験した。ＨｅＬａ細胞を、２４穴プレートにおいてＬ−グルタミン、ゲンタマイシン、カナマイシン、５％ＦＢＳおよび５％ＨＳを含むＳＭＥＭ培地中に１．０×１０５細胞／穴で播種した。細胞を５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡ約２５０ｎｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）５０ｍＬに添加し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００混合物（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００対ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）の割合が１：２５）５０ｍＬを添加して、２０分間インキュベートした。その後無血清培地４００ｍＬを添加し、２４穴プレート中の細胞に適用した。５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で〜４８時間のインキュベーション後、培地を収集し、細胞をＴＲＩ試薬（商標）８００ｍＬ中に採取した。全ＲＮＡを製造者の指示に従って細胞から単離し、正プライマーＴＲ０４７（配列番号２００）および逆プライマーＴＲ０４８（配列番号２０１）を使用したＲＴ−ＰＣＲによりヒトＴＮＦＲ２  Δ７に関して分析するか、または正プライマーＴＲ０４５（配列番号２２８）および逆プライマーＴＲ０４６（配列番号２２９）を使用したＲＴ−ＰＣＲによりマウスＴＮＦＲ２  Δ７に関して分析した。培地中の可溶性ＴＮＦＲ２の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０４０９】
上記培地の抗ＴＮＦ−α活性をＬ９２９細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｌ９２９細胞を、１０％標準ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地中、２×１０４細胞／穴で９６穴プレートで培養し、５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で一晩増殖させた。培地試料を、トランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞からの培地で１、２、４、８および１６倍希釈した。これらの試料の各々９０μＬを、１．０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む無血清培地１０μＬに添加した。細胞からの培地を除去し、これらの１００μＬ試料と交換した。その後細胞を５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で一晩増殖させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０ｍＬを各々の穴に添加した。４時間後、マイクロプレートリーダで４９０ｎｍの吸光度を測定することによって細胞生存能を測定した。細胞生存能を未処理細胞に正規化し、ＴＮＦアンタゴニスト濃度の関数として表示した（図１７）。
【０４１０】
各々のアンタゴニストについてのＥＣ５０値を決定するため、本実施例および実施例９からのデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。これらの実施例からの各アンタゴニストに関して、Ｓ字形用量反応曲線を、最大反応と最小反応をそれぞれ１００％と０％に固定して、非線形回帰法によって当てはめた。表８に示すＥＣ５０値は９５％信頼レベルに相当し、各々の曲線は０．７〜０．９の範囲のｒ２値を有していた。
【０４１１】
【表８】
2014050400.tif 000018
（実施例３３）
哺乳動物細胞におけるＴＮＦＲ２  Δ７の発現および精製
実施例１５および実施例で生成したプラスミドを、哺乳動物ＨｅＬａ細胞からＴＮＦＲ２  Δ７を発現させ、精製するために使用した。ＨｅＬａ細胞を５×１０５細胞／穴で６穴プレートで培養し、加湿雰囲気中３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。次に各々のウェルを、１１４４−４（Ｈｉｓタグを有するマウスＴＮＦＲ２  Δ７）、１１４５−１（マウスＴＮＦＲ２  Δ７、Ｈｉｓタグなし）、１２３０−１（ヒトＴＮＦＲ２  Δ７、Ｈｉｓタグなし）または１３１９−１（Ｈｉｓタグを有するヒトＴＮＦＲ２  Δ７）プラスミドのいずれかを使用してプラスミドＤＮＡ  １．５ｍｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの最大４８時間後に培地を収集し、Ａｍｉｃｏｎ  ＭＷＣＯ  ３０，０００フィルタを用いて約４０倍に濃縮した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１２０ｍＬに氷上で５分間溶解した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。タンパク質溶解産物のアリコートおよび細胞外培地からタンパク質を単離し、実施例１で述べたようにウェスタンブロット法によってＴＮＦＲ２に関して分析した（図１８）。
【０４１２】
Ｈｉｓタグを有するヒトおよびマウスＴＮＦＲ２  Δ７（それぞれ１３１９−１および１１４４−４）を上記培地からアフィニティクロマトグラフィによって精製した。Ｈｉｓタグを含むマウスおよびヒトＴＮＦＲ２  Δ７を上記培地から精製するためにＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト・スピン・カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。培地約３２ｍＬを、製造者によって推奨されるように５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡させた１ｍＬ  ＨｉｓＰｕｒ（商標）カラムに適用した。次にカラムを２カラム容量の同じ緩衝液で洗浄し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１５０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬでタンパク質を溶出した。各々の溶出液５ｍＬを上述したようにウェスタンブロット法によって分析した（図１９）。ＴＮＦＲ２  Δ７は溶出液中に出現し、多数のバンドは可変的にグリコシル化された形態のＴＮＦＲ２  Δ７を示す。陰性対照として、Ｈｉｓタグを含まないプラスミド１２３０−１または１１４５−１から発現されたＴＮＦＲ２  Δ７タンパク質を上記精製手順に供した。これらのタンパク質はアフィニティカラムを結合せず、溶出液中に現れない（図１９）。
【図１】
2014050400.tif 000019
【図２Ａ】
2014050400.tif 000020
【図２Ｂ】
2014050400.tif 000021
【図３】
2014050400.tif 000022
【図４Ａ】
2014050400.tif 000023
【図４Ｂ】
2014050400.tif 000024
【図５】
2014050400.tif 000025
【図６Ａ】
2014050400.tif 000026
【図６Ｂ】
2014050400.tif 000027
【図７Ａ】
2014050400.tif 000028
【図７Ｂ】
2014050400.tif 000029
【図８Ａ】
2014050400.tif 000030
【図８Ｂ】
2014050400.tif 000031
【図９】
2014050400.tif 000032
【図１０】
2014050400.tif 000033
【図１１Ａ】
2014050400.tif 000034
【図１１Ｂ】
2014050400.tif 000035
【図１２Ａ】
2014050400.tif 000036
【図１２Ｂ】
2014050400.tif 000037
【図１３Ａ】
2014050400.tif 000038
【図１３Ｂ】
2014050400.tif 000039
【図１４】
2014050400.tif 000040
【図１５Ａ】
2014050400.tif 000041
【図１５Ｂ】
2014050400.tif 000042
【図１６】
2014050400.tif 000043
【図１７】
2014050400.tif 000044
【図１８】
2014050400.tif 000045
【図１９】
2014050400.tif 000046
【図２０Ａ】
2014050400.tif 000047
【図２０Ｂ】
2014050400.tif 000048
【図２０Ｃ】
2014050400.tif 000049
【図２０Ｄ】
2014050400.tif 000050
【配列表】
2014050400000001.app