(57)【要約】【課題】効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造する水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法、水酸化グリチルレチン酸の製造方法、並びに水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる美白剤、抗老化剤、育毛剤、頭髪化粧料及び皮膚化粧料の提供。【解決手段】本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によりグリチルリチンを発酵させて水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によりグリチルリチンを発酵させて水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造することを特徴とする水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物を精製することを特徴とする水酸化グリチルレチン酸の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られたことを特徴とする水酸化グリチルレチン酸含有発酵物。
【請求項４】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び請求項２に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする美白剤。
【請求項５】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び請求項２に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする抗老化剤。
【請求項６】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び請求項２に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする育毛剤。
【請求項７】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び請求項２に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする頭髪化粧料。
【請求項８】
請求項１に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び請求項２に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法で製造した水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする皮膚化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及びその製造方法、水酸化グリチルレチン酸の製造方法、並びに美白剤、抗老化剤、育毛剤、頭髪化粧料及び皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物による物質変換（発酵）により、合成することの難しい成分の生産を効率的かつ容易に行う技術が知られており、甘草等から抽出されるグリチルリチンを用いてグリチルレチン酸に変換し、前記グリチルレチン酸から水酸化グリチルレチン酸に効率的に変換する技術が求められている。
【０００３】
ここで、前記グリチルレチン酸（中間体）から前記水酸化グリチルレチン酸（最終生成物）に変換する技術は知られているが（例えば、非特許文献１及び２参照）、微生物を用いて、前記グリチルリチン（出発物質）から水酸化グリチルレチン酸（最終生成物）を一段反応で変換できる技術は未だ知られていない。
【０００４】
一方、前記出発物質であるグリチルリチンは、優れた薬理活性を有する有用成分として知られているが、前記グリチルリチンは、酸性側ではゲル化し、アルカリ側では泡立ち（界面活性作用）が発生するため、物質の安定性を確保するには、限られた条件でしか使用することができないという問題がある。また、前記中間体であるグリチルレチン酸についても、優れた薬理活性を有する有用成分として知られているが、油溶性のため、水溶性の皮膚化粧料等に使用しても溶解性が低く、限られた条件でしか使用することができないという問題がある。
【０００５】
そこで、ｐＨ変動により安定性が低下することなく、油溶性及び水溶性の皮膚化粧料にも使用することができ、薬理活性が低下することのない代替物質として、水酸化グリチルレチン酸が検討されており、前記水酸化グリチルレチン酸を効率的に製造できる技術が強く望まれている。また、前記水酸化グリチルレチン酸が美白作用、抗老化作用、育毛作用等を有することについては、これまで知られていないが、前記水酸化グリチルレチン酸がこのような作用を有すれば、皮膚化粧料に用いる物質として、更に望ましい。
【０００６】
したがって、効率的かつ容易に前記グリチルリチンから前記水酸化グリチルレチン酸を製造する水酸化グリチルレチン酸の製造方法、該製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸を含有する有用薬剤の開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌ．ＣＡＮＯＮＩＣＡ，Ｇ．ＪＯＭＭＩ，Ｕ．Ｍ．ＰＡＧＮＯＮＩ,Ｆ．ＰＥＬＩＺＺＯＮＩ，Ｂ．Ｍ．ＲＡＮＺＩ  ｅ  Ｃ．ＳＣＯＬＡＳＴＩＣＯ，ｑｕｅｓｔａ  Ｇａｚｚｅｔｌａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｉｔａｌｉａｎａ  １９６６，９６（６），ｐｐ８２０−８３１
【非特許文献２】Ｘｉｎ  ｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｍｕｃｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ  ２００６；７２：１５６−１６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造する水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造する水酸化グリチルレチン酸の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた美白作用を有する美白剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた抗老化作用を有する抗老化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた育毛作用を有する育毛剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた育毛作用を有する頭髪化粧料を提供することを目的とする。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた美白作用及び抗老化作用を有する皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。
即ち、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によりグリチルリチンを発酵させると、前記グリチルリチンが水酸化グリチルレチン酸に変換されることがわかった。また、前記変換された前記水酸化グリチルレチン酸が、優れた美白作用、抗老化作用、及び育毛作用を有することを見出した。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によりグリチルリチンを発酵させて水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造することを特徴とする水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法である。
＜２＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物を精製することを特徴とする水酸化グリチルレチン酸の製造方法である。
＜３＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られたことを特徴とする水酸化グリチルレチン酸含有発酵物である。
＜４＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び前記＜２＞に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする美白剤である。
＜５＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び前記＜２＞に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする抗老化剤である。
＜６＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び前記＜２＞に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする育毛剤である。
＜７＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び前記＜２＞に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする頭髪化粧料である。
＜８＞  前記＜１＞に記載の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び前記＜２＞に記載の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでいることを特徴とする皮膚化粧料である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造する水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法を提供することができる。
また、本発明は、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造する水酸化グリチルレチン酸の製造方法を提供することができる。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた美白作用を有する美白剤を提供することができる。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた抗老化作用を有する抗老化剤を提供することができる。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた育毛作用を有する育毛剤を提供することができる。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた育毛作用を有する頭髪化粧料を提供することができる。
また、本発明は、水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含んでなる優れた美白作用及び抗老化作用を有する皮膚化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法）
本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によりグリチルリチンを発酵させて水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造する方法である。
【００１３】
＜グラフィウム  ｓｐ．＞
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）は、落ち葉が堆積し、腐葉土化した土壌などから分離される腐朽菌の一種であり、腐朽菌とは木材を腐朽（腐食による劣化）させる腐生菌のうち、特に木材に含まれる難分解性のリグニン、セルロース、ヘミセルロース等に対して分解能を有する真菌である。
【００１４】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）は、本発明者らが以前に分離した真菌であり、産業技術総合研究所、特許生物寄託センターにＧｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.ＭＺ０８１２１として寄託されている。その受託番号は、「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０６２」である。
【００１５】
＜グリチルリチン＞
前記グリチルリチン（グリチルリチン酸ともいう）は、下記構造式（１）で表され、マメ科の多年性植物である甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ  Ｌｉｎｎ．、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ  Ｂａｔａｌ等のＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属植物）の根及び根茎の有効成分として含まれている。
【００１６】
【化１】
2014050357.tif 000002
【００１７】
前記グリチルリチンを製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、甘草の根を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料である甘草の根を投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら、可溶性成分を溶出した後、濾過して抽出残渣を除くことによって甘草抽出物とした後、吸着樹脂を用いて精製する方法などが挙げられる。
【００１８】
前記甘草の抽出に用いる抽出溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水（水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等）、親水性溶媒（エタノール、メタノール、１，３−ブチレングリコール等）、又はこれらの混合溶媒（含水エタノール、含水メタノール、含水１，３−ブチレングリコール等）などが挙げられ、抽出溶媒量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましい。
【００１９】
前記甘草の抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出溶媒として水を用いた場合、常温〜９５℃にて１時間〜３時間で抽出することが好ましく、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒（含水エタノール）を用いた場合、常温〜８０℃にて３０分間〜３時間で抽出することが好ましい。
【００２０】
前記グリチルリチンは、前記甘草抽出物とした状態で使用することができるが、前記甘草抽出物の濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。前記甘草抽出物の乾燥物を得るにあたって、吸湿性を改善するために、デキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記甘草抽出物は、特有の味及び匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２１】
＜グリチルリチンを発酵させる方法＞
前記グリチルリチンを発酵させる方法としては、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）により前記グリチルリチンを発酵させる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）を前培養した後、前記グリチルリチン（例えば、甘草抽出物等）に供した前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）を本培養することにより、前記グリチルリチンを発酵させる方法などが挙げられる。
【００２２】
−前培養−
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）の前培養において使用する培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、無機塩類（０．３質量％ＮａＮＯ３；０．１質量％Ｋ２ＨＰＯ４；０．０５質量％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ等）及び炭素源（０．５質量％酵母抽出液；１質量％グルコース；０．５質量％ポリペプトン等）などを含む液体培地が好ましい。これらのうち、グルコース、ポリペプトン等の炭素源は含まなくてもよいし、グルコース、ポリペプトン等の炭素源を他の窒素源に変換してもよい。
【００２３】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）の前培養における培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養温度としては、１５℃〜３５℃が好ましく、２５℃〜３２℃がより好ましく、培養する際のｐＨとしては、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５が好ましく、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．５がより好ましく、培養時間としては、２０時間〜４０時間が好ましく、培養方法としては、振とう培養（振とう条件：１２０ｒｐｍ〜１４０ｒｐｍ）、ジャーファーメンターを用いた培養（ジャーファーメンター回転条件：２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ）が好ましい。
【００２４】
−本培養−
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が前記グリチルリチンを発酵させる際に使用する培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、（１）前記前培養で用いた前記液体培地に甘草抽出物（含有量：１質量％〜５質量％）を含む液体培地、（２）基材に、１／２倍量〜４倍量の甘草抽出物（含有量：１０質量％〜４０質量％）の溶解液を含む固体培地を用いることが好ましい。なお、前記固体培地に使用する基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一般的な微生物の固体培養に使用する基材、穀物の皮、搾り粕、小麦ふすまや小豆、もちきび、おから、脱脂胡麻などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が前記グリチルリチンを発酵させる際の温度（培養温度）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、１５℃〜３５℃が好ましく、２５℃〜３２℃がより好ましい。
【００２６】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が前記グリチルリチンを発酵させる際に使用する培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５が好ましく、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．５がより好ましい。
【００２７】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が前記グリチルリチンを発酵させる際に、固体培地を用いる場合には静置培養を行うことが好ましく、液体培地を用いる場合には振とう培養又はジャーファーメンターを用いた培養が好ましい。
【００２８】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）の前記振とう培養における振とう条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、１２０ｒｐｍ〜１４０ｒｐｍが好ましい。
【００２９】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）の前記ジャーファーメンターを用いた培養におけるジャーファーメンター回転条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍが好ましい。
【００３０】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が前記グリチルリチンを発酵させて、前記水酸化グリチルレチン酸に変換するまでにかかる時間（培養時間）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を製造することができる点で、３日間〜１４日間が好ましい。
【００３１】
以上により、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）を、前記グリチルリチンに供して培養することにより、前記グリチルリチンが水酸化グリチルレチン酸に変換され、前記水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物が得られる。
【００３２】
＜グリチルリチンが水酸化グリチルレチン酸に変換されるメカニズム＞
前記グラフィウム  ｓｐ．（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ．）により、前記グリチルリチンが前記水酸化グリチルレチン酸に変換されるメカニズムについて記載する。
【００３３】
前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）は、前記グリチルリチンとともに培養すると、β−グルクロニダーゼを産生し、前記グリチルリチンからグリチルレチン酸モノグルクロナイドを経て、グリチルレチン酸（中間体）に変換する（下記式（１）参照）。そして、前記グリチルレチン酸（中間体）は、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）が産生する水酸化酵素により、３種類の水酸化グリチルレチン酸に変換される（下記式（２）参照）。このようなステップを経て、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）により、前記グリチルリチンが前記水酸化グリチルレチン酸に変換される。
【化２】
2014050357.tif 000003
【００３４】
なお、前記水酸化グリチルレチン酸としては、少なくとも７β−ヒドロキシグリチルレチン酸（下記構造式（３−１）で表される化合物）、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸（下記構造式（３−２）で表される化合物）、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸（水酸基下記構造式（３−３）で表される化合物）を含有する。
【化３】
2014050357.tif 000004
前記水酸化グリチルレチン酸（７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸）の構造は、核磁気共鳴装置（製品名「ＪＮＭ−ＡＬ４００」、ＪＥＯＬ製）により解析することができ、前記解析により得られる結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2014050357.tif 000005
【００３６】
上述したメカニズムにより、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）を前記グリチルリチンに供して培養することにより、グリチルリチンが水酸化グリチルレチンに変換され、水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物が得られる。
【００３７】
＜効果＞
本発明は、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）により前記グリチルリチンを発酵させるだけで、効率的かつ容易に前記グリチルリチンから前記水酸化グリチルレチン酸を含有する発酵物を製造することができる。
【００３８】
（水酸化グリチルレチン酸の製造方法）
本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法は、上述の方法により得られた水酸化グリチルレチン酸含有発酵物を精製することにより水酸化グリチルレチン酸を製造する方法である。
【００３９】
前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物から前記水酸化グリチルレチン酸を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、吸着カラムを用いて精製する方法などが挙げられる。
【００４０】
前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物中に前記水酸化グリチルレチン酸が含有されることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いて確認する方法などが挙げられる。
【００４１】
本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法は、前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物を精製することにより、容易に上述した３種類の水酸化グリチルレチン酸を得ることができる。前記水酸化グリチルレチン酸は、美白作用、抗老化作用、育毛作用等に優れる。
【００４２】
（水酸化グリチルレチン酸含有発酵物）
本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られ、美白剤、抗老化剤、育毛剤、頭髪化粧料、及び皮膚化粧料のいずれかとして利用することができる。
【００４３】
前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物を製造する際に、前記グリチルリチンとして、甘草抽出物を用いた場合には、前記グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）により前記甘草抽出物を発酵して得られた発酵甘草抽出物を、本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物として使用することができる。
【００４４】
前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物は、上述したように発酵甘草抽出物とした状態で使用することができるが、前記発酵甘草抽出物の濃縮液又は乾燥物としたものの方が利用しやすい。また、前記発酵甘草抽出物は、特有の色及び匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、未精製のままでも実用上支障はない。前記発酵甘草抽出物を精製する際に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、ブチレングリコール、メタノールなどが挙げられ、前記溶媒の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０質量％〜１００質量％が好ましい。
【００４５】
前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物における（Ａ）７β−ヒドロキシグリチルレチン酸及び１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸と、（Ｂ）７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸との含有質量比（Ａ：Ｂ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３：２〜３：１が好ましい。
【００４６】
（美白剤）
本発明の美白剤は、メラニン産生抑制作用を有する。
前記美白剤は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン含有発酵物及び上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記美白剤に使用する前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物は、上述した水酸化グリチルレチン酸を含有し、少なくとも前記構造式（３−１）で表される７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、前記構造式（３−２）で表される１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び前記構造式（３−３）で表される７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸の３種類の混合物を含有する。
前記美白剤に使用する前記その他の成分としては、美白作用を阻害しない成分であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料、香料、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、増粘剤、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤などが挙げられる。
【００４７】
前記美白剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パックなどが挙げられる。
前記美白剤における前記水酸化グリチルレチン酸の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、メラニン産生抑制作用に優れる点で、０．０５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬが好ましい。
【００４８】
前記美白剤は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によるグリチルリチンの発酵物由来のものを使用しており、該発酵物が３種類の水酸化グリチルレチン酸の混合物を含むため、各水酸化グリチルレチン酸を単独で使用したときよりも、メラニン産生抑制作用に優れ、優れた美白作用を有する。また、本発明の美白剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。
【００４９】
（抗老化剤）
本発明の抗老化剤は、表皮角化細胞増殖促進作用を有する。
前記抗老化剤は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン含有発酵物及び上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記抗老化剤に使用する前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物は、上述した水酸化グリチルレチン酸を含有し、少なくとも前記構造式（３−１）で表される７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、前記構造式（３−２）で表される１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び前記構造式（３−３）で表される７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸の３種類の混合物を含有する。
前記抗老化剤に使用する前記その他の成分としては、抗老化作用を阻害しない成分であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料、香料、油性成分、紫外線吸収剤、増粘剤、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤などが挙げられる。
【００５０】
前記抗老化剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ゼリー、リップクリームなどが挙げられる。
前記抗老化剤における前記水酸化グリチルレチン酸の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、表皮角化細胞増殖促進作用に優れる点で、３μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬが好ましい。
【００５１】
前記抗老化剤は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によるグリチルリチンの発酵物由来のものを使用しており、該発酵物が３種類の水酸化グリチルレチン酸の混合物を含むため、各水酸化グリチルレチン酸を単独で使用したときよりも、表皮角化細胞増殖促進作用に優れ、優れた抗老化作用を有する。また、本発明の抗老化剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。
【００５２】
（育毛剤）
本発明の育毛剤は、アンドロゲンレセプター拮抗作用を有する。
前記育毛剤は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン含有発酵物及び上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記育毛剤に使用する前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物は、上述した水酸化グリチルレチン酸を含有し、少なくとも前記構造式（３−１）で表される７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、前記構造式（３−２）で表される１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び前記構造式（３−３）で表される７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸の３種類の混合物を含有する。
前記育毛剤に使用する前記その他の成分としては、育毛作用を阻害しない成分であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料、香料、油性成分、紫外線吸収剤、増粘剤、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤などが挙げられる。
【００５３】
前記育毛剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アストリンゼント、ヘアトニック、シャンプー、リンスなどが挙げられる。
前記育毛剤中の前記水酸化グリチルレチン酸の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、アンドロゲンレセプター拮抗作用に優れる点で、１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬが好ましい。
【００５４】
前記育毛剤は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によるグリチルリチンの発酵物由来のものを使用しており、該発酵物が３種類の水酸化グリチルレチン酸の混合物を含むため、各水酸化グリチルレチン酸を単独で使用したときよりも、アンドロゲンレセプター拮抗作用に優れ、優れた育毛作用を有する。また、本発明の育毛剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。
【００５５】
（頭髪化粧料）
本発明の頭髪化粧料は、育毛作用（アンドロゲンレセプター拮抗作用）を有する。
前記頭髪化粧料は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン含有発酵物及び上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記頭髪化粧料に使用する前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物としては、上述した水酸化グリチルレチン酸を含有し、少なくとも前記構造式（３−１）で表される７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、前記構造式（３−２）で表される１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び前記構造式（３−３）で表される７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸の３種類の混合物を含有する。
前記頭髪化粧料に使用する前記その他の成分としては、頭髪化粧料として使用できる成分であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料、香料、油性成分、紫外線吸収剤、増粘剤、粉末成分、色剤、水性成分、水、頭髪栄養剤、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤などが挙げられる。
【００５６】
前記頭髪化粧料の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘアトニック、ヘアローション、ヘアリキッド、ヘアクリーム、整髪剤、シャンプー、リンス、トリートメント、ポマードなどが挙げられる。
前記頭髪化粧料における前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物、前記水酸化グリチルレチン酸の含有量としては、特に制限はなく、化粧料の種類や前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物、前記水酸化グリチルレチン酸の生理活性等によって適宜調整することができるが、０．０００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．００１質量％〜５質量％がより好ましい。
【００５７】
前記頭髪化粧料は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によるグリチルリチンの発酵物由来のものを使用しており、３種類の水酸化グリチルレチン酸の混合物を含むため、各水酸化グリチルレチン酸を単独で使用したときよりも、育毛作用に優れる。また、本発明の頭髪化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。
【００５８】
（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、美白作用（メラニン産生抑制作用）及び抗老化作用（表皮角化細胞増殖促進作用）を有する。
前記皮膚化粧料は、上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン含有発酵物及び上述した本発明の水酸化グリチルレチン酸の製造方法により得られた水酸化グリチルレチン酸の少なくともいずれかを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記皮膚化粧料に使用する前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物としては、上述した水酸化グリチルレチン酸を含有し、少なくとも前記構造式（３−１）で表される７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、前記構造式（３−２）で表される１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び前記構造式（３−３）で表される７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸の３種類の混合物を含有する。
前記皮膚化粧料に使用する前記その他の成分としては、皮膚化粧料として使用できる成分であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料、香料、油性成分、紫外線吸収剤、増粘剤、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤などが挙げられる。
【００５９】
前記皮膚化粧料の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤などが挙げられる。
前記皮膚化粧料における前記水酸化グリチルレチン酸含有発酵物、前記水酸化グリチルレチン酸の含有量としては、特に制限はなく、化粧料の種類や前記発酵物の生理活性等によって適宜調整することができるが、０．０００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．００１質量％〜５質量％がより好ましい。
【００６０】
前記皮膚化粧料は、グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）によるグリチルリチンの発酵物由来のものを使用しており、該発酵物が３種類の水酸化グリチルレチン酸の混合物を含むため、各水酸化グリチルレチン酸を単独で使用したときよりも、美白作用及び抗老化作用に優れる。また、本発明の皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。
【実施例】
【００６１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６２】
（試験例１：水酸化グリチルレチン酸の製造方法）
グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０６２）によりグリチルリチンを発酵させることにより、水酸化グリチルレチン酸を製造した。該製造方法を下記に示す。
【００６３】
−製造例１（液体培養）−
グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）、（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０６２）を、表２−１に記載の前培養の条件にて前培養を行った。次に、前培養により得られた培養液（ＯＤ６５０値：１０倍希釈液で１．１）を用い、表２−１に記載の本培養（液体培養）の条件にて本培養を行い、液体培地中に含まれている甘草抽出物を発酵させて、発酵甘草抽出物１（発酵物１）を製造した。得られた発酵甘草抽出物１（発酵物１）を滅菌した後、抽出溶媒として１００質量％エタノールを添加して、３０質量％エタノール溶液に調製した。この３０質量％エタノール溶液を、ダイヤイオンＨＰ２０を用いて樹脂処理し、得られた７０質量％エタノール溶出部を発酵甘草抽出物粗精製物１とした。そして、高速液体クロマトグラフィーを用いて、発酵甘草抽出物粗精製物１から３種類の化合物を単離した。
【００６４】
なお、製造例１の発酵甘草抽出物粗精製物１を得るにあたり、抽出溶媒として、１００質量％エタノールを用いていたが、１０質量％以上の含水エタノール、ブチレングリコール、メタノール等の抽出溶媒を用いても、発酵物１から３種類の化合物が単離できたことが本発明者らにより確認されている。同様に、製造例１では、樹脂処理する溶液として、３０質量％エタノール溶液を使用していたが、抽出溶媒の種類や濃度に応じて適宜変更されていても、問題なく発酵物１から３種類の化合物が単離できたことが本発明者らにより確認されている。
【００６５】
−製造例２（固体培養）−
グラフィウム  ｓｐ.（Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ.）、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０６２）を、表２−１に記載の前培養の条件にて前培養を行った。次に、前培養により得られた培養液（ＯＤ６５０値：１０倍希釈液で１．１）を用い、表２−１に記載の本培養（固体培養）の条件にて本培養を行い、固体培地中に含まれている甘草抽出物を発酵させて、発酵甘草抽出物２（発酵物２）を製造した。得られた発酵甘草抽出物２（発酵物２）を滅菌した後、抽出溶媒として７０質量％エタノールを添加した後、更に水を添加して３０質量％エタノール溶液に調製した。この後、３０質量％エタノール溶液を、ダイヤイオンＨＰ２０を用いて樹脂処理し、得られた７０質量％エタノール溶出部を発酵甘草抽出物粗精製物２とした。そして、高速液体クロマトグラフィーを用いて、発酵甘草抽出物粗精製物２から３種類の化合物を単離した。
【００６６】
なお、製造例２の発酵甘草抽出物粗精製物２を得るにあたり、抽出溶媒として、７０質量％エタノールを用いていたが、１０質量％以上の含水エタノール、ブチレングリコール、メタノール等の抽出溶媒を用いても、発酵物２から３種類の化合物が単離できたことが本発明者らにより確認されている。同様に、製造例２では、樹脂処理する溶液として、３０質量％エタノール溶液を使用していたが、抽出溶媒の種類や濃度に応じて適宜変更されていても、問題なく発酵物２から３種類の化合物が単離できたことが本発明者らにより確認されている。
【００６７】
【表２−１】
2014050357.tif 000006
【００６８】
−結果（化合物の構造決定）−
製造例１及び２により得られた発酵甘草抽出物中に含まれる３種類の化合物の構造を、核磁気共鳴装置（製品名「ＪＮＭ−ＡＬ４００」、ＪＥＯＬ製）により解析した。その結果、前記発酵甘草抽出物中には、３種類の水酸化グリチルレチン酸（７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸）の混合物が含まれていることがわかった。結果を表２−２に示す。
また、製造例２の発酵甘草抽出物２（発酵物２）には、（Ａ）７β−ヒドロキシグリチルレチン酸及び１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸と（Ｂ）７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸」との含有比（Ａ：Ｂ）が４：１であることがわかった。なお、発酵物１についても同程度の含有比となることが本発明者らにより確認されている。結果を表１−３に示す。
【００６９】
【表２−２】
2014050357.tif 000007
【００７０】
【表２−３】
2014050357.tif 000008
【００７１】
（試験例２：水酸化グリチルレチン酸の溶解性試験）
試験例２では、試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸の溶解性について、各種溶媒に溶解するか否かをもとに試験した。その結果、得られた水酸化グリチルレチン酸は、グリチルレチン酸と比較して、溶解性が高いことがわかった。特に、７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸は、７β−ヒドロキシグリチルレチン酸及び１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸よりも溶解性が高いことがわかった。結果を表２に示す。
【００７２】
【表３】
2014050357.tif 000009
【００７３】
（試験例３：美白作用試験）
試験例３では、試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸を、吸着カラム及び分取ＨＰＬＣを用いて単離し、各成分に対するＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制を試験することにより、美白作用を評価した。
【００７４】
−試験方法（美白作用）−
まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭを２ｍＬ加えた直径６０ｍｍシャーレに０．５ｍＬずつ播種し、８時間培養した。培養後、１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで終濃度の２倍に調製した被験試料を２．５ｍＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を回収し細胞数を数えた。その後、遠心（２，５００×ｇ、６分間、室温）して培地を取り除き、１０体積％ＤＭＳＯ含有１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２ｍＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊した。これをろ過し、得られたろ液の波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、空試験として、１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭのみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
メラニン産生抑制作用の計算方法は、以下のとおりである。
メラニン産生抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×（Ｃ／Ｄ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは、被験試料無添加での４７５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｂは、被験試料添加での４７５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃは、被験試料添加での細胞数を表す。Ｄは、被験試料無添加での細胞数を表す。
【００７５】
−結果（美白作用）−
試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸（７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸）が、優れたメラニン産生抑制作用を有することがわかった。結果を表３に示す。
【００７６】
【表４】
2014050357.tif 000010
【００７７】
（試験例４：抗老化作用試験）
試験例４では、試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸を、吸着カラム及び分取ＨＰＬＣを用いて単離し、各成分に対する表皮角化細胞増殖促進作用を試験することにより、抗老化作用を評価した。
【００７８】
−試験方法（抗老化作用）−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４細胞／ｍＬの濃度に正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地で希釈した後、コラーゲンコートした９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地で溶解した被験試料を各穴に１００μＬ添加し、３日間培養した。次に、表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各穴に１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。
表皮角化細胞増殖促進率の計算方法は、以下のとおりである。
表皮角化細胞増殖促進率（％）＝（Ｓｔ／Ｃｔ）×１００  ・・式（２）
前記式（２）中、Ｓｔ及びＣｔは下記で表される。
Ｓｔ：被験試料を添加した細胞での吸光度
Ｃｔ：被験試料を添加しない細胞での吸光度
【００７９】
−結果（抗老化作用）−
試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸（７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸）が、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することがわかった。結果を表４に示す。
【００８０】
【表５】
2014050357.tif 000011
【００８１】
（試験例５：育毛作用試験）
試験例５では、試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸を、吸着カラム及び分取ＨＰＬＣを用いて単離し、各成分に対するアンドロゲンレセプター拮抗作用を試験することにより、育毛作用を評価した。
【００８２】
−試験方法（育毛作用）−
マウス自然発生乳がん（シオノギ癌、ＳＣ１１５）よりクローニングされたＳＣ−３細胞を２％のＤＣＣ−牛胎児血清（ＦＢＳ）、及び１０−８ｍｏｌ／Ｌのテストステロン含有ＭＥＭ（ＭＥＭ／２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に活性炭処理ＦＢＳ含有ＭＥＭ（ＭＥＭ／２）で希釈し、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、１０−９ｍｏｌ／Ｌのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を含む０．５体積％のＢＳＡ含有Ｈａｍ  Ｆ１２＋ＭＥＭ（ＨＭＢ）に溶解した被験試料を１００μＬ添加し、４８時間培養した。その後、終濃度０．４ｇ／ｍＬで活性炭処理ＦＢＳ含有ＭＥＭ／２に溶解したＭＴＴを各穴に１００μＬ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。なお、空試験として、ＨＭＢのみで培養した細胞を、陽性対照として１０−９ｍｏｌ／ＬのＤＨＴのみを含有したＨＭＢで培養した細胞を用い、同様の方法で試験を行って補正した。次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記アンドロゲンレセプター拮抗率の測定を行い、各濃度におけるアンドロゲンの結合阻害率（％）を求め、その結果から内挿法により、アンドロゲンの結合を５０％拮抗する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を求めた。
アンドロゲンレセプター拮抗率の計算方法は、以下のとおりである。
アンドロゲンレセプター拮抗率（％）＝
［１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）］×１００  ・・式（３）
前記式（３）中、Ａ〜Ｄは下記で表される。
Ａ：ＤＨＴ添加、試料溶液無添加での５７０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける吸光度
Ｂ：ＤＨＴ無添加、試料溶液無添加での５７０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：ＤＨＴ添加、試料溶液添加での５７０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける吸光度
Ｄ：ＤＨＴ無添加、試料溶液添加での５７０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける吸光度
【００８３】
−結果（育毛作用）−
試験例１により得られた水酸化グリチルレチン酸（７β−ヒドロキシグリチルレチン酸、１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸、及び７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸）が、優れたアンドロゲンレセプター拮抗作用を有することがわかった。結果を表５に示す。
【００８４】
【表５】
2014050357.tif 000012
【００８５】
（配合例１：皮膚化粧料）
−乳液−
下記の組成の乳液を常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物１（発酵物１）                        １．００質量部
・ホホバオイル                                                  ４．００質量部
・オリーブオイル                                                ２．００質量部
・スクワラン                                                    ２．００質量部
・セタノール                                                    ２．００質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ２．００質量部
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０）                ２．５０質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ２．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００８６】
（配合例２：皮膚化粧料）
−乳液−
下記の組成の乳液を常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物２（発酵物２）                        １．００質量部
・ホホバオイル                                                  ４．００質量部
・オリーブオイル                                                ２．００質量部
・スクワラン                                                    ２．００質量部
・セタノール                                                    ２．００質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ２．００質量部
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０）                ２．５０質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ２．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００８７】
（配合例３：皮膚化粧料）
−乳液−
下記の組成の乳液を常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物粗精製物１                            １．００質量部
・ホホバオイル                                                  ４．００質量部
・オリーブオイル                                                ２．００質量部
・スクワラン                                                    ２．００質量部
・セタノール                                                    ２．００質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ２．００質量部
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０）                ２．５０質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ２．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００８８】
（配合例４：皮膚化粧料）
−乳液−
下記の組成の乳液を常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物粗精製物２                            １．００質量部
・ホホバオイル                                                  ４．００質量部
・オリーブオイル                                                ２．００質量部
・スクワラン                                                    ２．００質量部
・セタノール                                                    ２．００質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ２．００質量部
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０）                ２．５０質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ２．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００８９】
（配合例５：皮膚化粧料）
−乳液−
下記の組成の乳液を常法により製造した。
・７β−ヒドロキシグリチルレチン酸                              ０．３０質量部
・１５α−ヒドロキシグリチルレチン酸                            ０．３０質量部
・７β，１５α−ジヒドロキシグリチルレチン酸                    ０．４０質量部
・ホホバオイル                                                  ４．００質量部
・オリーブオイル                                                ２．００質量部
・スクワラン                                                    ２．００質量部
・セタノール                                                    ２．００質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ２．００質量部
・ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０）                ２．５０質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ２．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００９０】
（配合例６：皮膚化粧料）
−化粧水−
下記の組成の化粧水を常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物１（発酵物１）                        ２．２０質量部
・グリセリン                                                    ３．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ３．００質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          ０．５０質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１５質量部
・クエン酸                                                      ０．１０質量部
・クエン酸ソーダ                                                ０．１０質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【００９１】
（配合例７：皮膚化粧料）
−クリーム−
下記の組成のクリームを常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物１（発酵物１）                        １．１０質量部
・流動パラフィン                                                ５．００質量部
・サラシミツロウ                                                ４．００質量部
・セタノール                                                    ３．００質量部
・スクワラン                                                  １０．００質量部
・ラノリン                                                      ２．００質量部
・ステアリン酸                                                  １．００質量部
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０）          １．５０質量部
・モノステアリン酸グリセリル                                    ３．００質量部
・１，３−ブチレングリコール                                    ６．００質量部
・パラオキシ安息香酸メチル                                      １．５０質量部
・香料                                                          ０．１０質量部
・精製水                                                                  残部
【００９２】
（配合例８：皮膚化粧料）
−パック−
下記の組成のパックを常法により製造した。
・試験例１の発酵甘草抽出物１（発酵物１）                        ５．００質量部
・ポリビニルアルコール                                        １５．００質量部
・ポリエチレングリコール                                        ３．００質量部
・プロピレングリコール                                          ７．００質量部
・エタノール                                                  １０．００質量部
・パラオキシ安息香酸エチル                                      ０．０５質量部
・香料                                                          ０．０５質量部
・精製水                                                                  残部
【受託番号】
【００９３】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０６２
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の水酸化グリチルレチン酸含有発酵物の製造方法及び水酸化グリチルレチン酸の製造方法は、効率的かつ容易にグリチルリチンから水酸化グリチルレチン酸を含有する水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸を製造することができるため、水酸化グリチルレチン酸を含有する食品、医薬品、化粧品、更には研究用の試薬として好適に利用できる。また、該製造方法により得られる水酸化グリチルレチン酸含有発酵物及び水酸化グリチルレチン酸は、優れた美白作用、抗老化作用、育毛作用等を有するため、美白剤、抗老化剤、育毛剤、頭髪化粧料及び皮膚化粧料として好適に利用できる。