(57)【要約】【課題】細胞凝集塊形成方法を提供すること、特に、細胞に対するダメージがより小さく、より簡便且つ効率的な細胞凝集塊形成方法を提供すること。【解決手段】一般式（１）：【化１】2014218474.tif 000007［式中、ｊ及びｋは異なって１又は２を示し、ｎは６〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１を示し、ＸはPro、Lys−Pro、又はPro−Proを示し、ＹはLys、Lys−Lys、又はLys−Proを示す］で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2014218474.tif 000006
［式中、ｊ及びｋは異なって１又は２を示し、ｎは６〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１を示し、ＸはPro、Lys−Pro、又はPro−Proを示し、ＹはLys、Lys−Lys、又はLys−Proを示す］
で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ｊが２であり且つｋが１である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ｊが１であり且つｋが２である請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ｐ及びｑが０である請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを含有する細胞凝集塊形成剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドと細胞とを接触させることを含む細胞凝集塊の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集塊形成能を有するペプチド、細胞凝集塊形成剤、及び細胞凝集塊の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品等の研究開発においては、培養細胞に対して被検物質を作用させて応答を評価することや、培養細胞に生理活性物質を産生させること等が行われている。この際、多くの場合において、培養細胞として基材上で単層（二次元）培養されている細胞が用いられる。
【０００３】
一方、生体は三次元に配置された細胞群から構成されるところ、三次元培養されている細胞の方が、本来の生体の機能をより反映することが知られている。例えば、二次元培養されているES細胞やiPS細胞を分化させることは容易ではないが、凝集塊（三次元）の状態で培養されているES細胞やiPS細胞は、容易に分化させることができる。また、凝集塊（三次元）の状態で培養されている肝細胞の方が、肝細胞の機能であるアルブミン産生能がより高いことが知られている。このため、医薬品等の研究開発においては、三次元培養された細胞を用いる方が望ましい場合がある。
【０００４】
細胞を三次元培養する方法としては、ハンギングドロップ法、特定の表面処理が施された基材上で培養する方法、旋回培養法、三次元スキャフォールド法、遠心法等によって細胞凝集塊を形成する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法はいずれも煩雑な作業や特殊な装置（器具）を要するし、場合によっては細胞に対してダメージを与えることもある。したがって、細胞に対するダメージがより小さい方法や、より簡便且つ効率的な方法の開発が求められている。
【０００５】
その他の方法としては、特定のアミノ酸配列からなるペプチドによって細胞凝集塊を形成させる方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-20961号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞凝集塊形成方法を提供することを課題とする。特に、細胞に対するダメージがより小さく、より簡便且つ効率的な細胞凝集塊形成方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、（Lys−Lys−Pro）又は（Lys−Pro−Pro）を繰り返したアミノ酸配列からなるペプチドを細胞に接触させると、簡便且つ効率的に細胞凝集塊を形成できることを見出した。また、これらのペプチドを用いることにより、細胞に対するダメージを低く抑えつつ、細胞凝集塊を形成できることも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発明が完成した。
【０００９】
即ち、代表的な本発明は以下を包含する。
【００１０】
項１．
一般式（１）：
【００１１】
【化１】
2014218474.tif 000002
【００１２】
［式中、ｊ及びｋは異なって１又は２を示し、ｎは６〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１を示し、ＸはPro、Lys−Pro、又はPro−Proを示し、ＹはLys、Lys−Lys、又はLys−Proを示す］
で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１３】
項２．
ｊが２であり且つｋが１である項１に記載のペプチド。
【００１４】
項３．
ｊが１であり且つｋが２である項１に記載のペプチド。
【００１５】
項４．
ｐ及びｑが０である項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【００１６】
項５．
項１〜４のいずれかに記載のペプチドを含有する細胞凝集塊形成剤。
【００１７】
項６．
項１〜４のいずれかに記載のペプチドと細胞とを接触させることを含む細胞凝集塊の形成方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞凝集塊形成能を有するペプチド、細胞凝集塊形成剤、及び細胞凝集塊形成方法を提供することができる。本発明のペプチドは、細胞に対して与えるダメージが少ない。したがって、本発明のペプチドを用いることにより、細胞に対するダメージをより低く抑えつつも、より簡便且つ効率的に細胞凝集塊を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（KPP）8ペプチド（実施例１）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図２】（KKP）8ペプチド（実施例２）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図３】（KP）10ペプチド（比較例１）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図４】（KP）12ペプチド（比較例２）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図５】（KP）14ペプチド（比較例３）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図６】（KA）12ペプチド（比較例４）のHPLC及びMALD-TOF-MSによる解析結果を示す。
【図７】比較試験例１の細胞観察像を示す。
【図８】比較試験例２の細胞観察像を示す。
【図９】比較試験例３の細胞観察像を示す。
【図１０】比較試験例４の細胞生存率を示すグラフを示す。
【図１１】試験例１の細胞観察像を示す。
【図１２】試験例２において（KPP）8ペプチドを用いた場合の細胞観察像を示す。
【図１３】試験例２において（KKP）8ペプチドを用いた場合の細胞観察像を示す。
【図１４】試験例３において（KPP）8ペプチドを用いた場合の細胞生存率を示すグラフを示す。
【図１５】試験例３において（KKP）8ペプチドを用いた場合の細胞生存率を示すグラフを示す。
【図１６】試験例４の細胞観察像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．ペプチド
一般式（１）：
【００２１】
【化２】
2014218474.tif 000003
【００２２】
で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、単に「本発明のペプチド」と表記することもある）について説明する。
【００２３】
ｊ及びｋは異なって１又は２を示す。すなわち、本発明のペプチドは、［Lys−Lys−Pro（ｊが２であり且つｋが１である場合）］が繰り返したアミノ酸配列、又は［Lys−Pro−Pro（ｊが１であり且つｋが２である場合）］が繰り返したアミノ酸配列を有する。より高い細胞凝集塊形成能を発揮するという観点（例えば、より低い濃度でも細胞凝集塊を形成できるという観点や、より効率的に多くの細胞凝集塊を形成できるという観点等）から、好ましくはｊが２であり且つｋが１であることができる。
【００２４】
ｎは６〜１０の整数を示す。ｎは、より高い細胞凝集塊形成能を発揮するという観点から、好ましくは７〜９であることができ、より好ましくは７〜８であることができる。
【００２５】
ＸはPro、Lys−Pro、又はPro−Proを示す。ｊが２であり且つｋが１である場合、Ｘは、好ましくはPro、又はLys−Proであることができる。ｊが１であり且つｋが２である場合、Ｘは、好ましくはPro、又はPro−Proであることができる。
【００２６】
ＹはLys、Lys−Lys、又はLys−Proを示す。ｊが２であり且つｋが１である場合、Ｙは、好ましくはLys、又はLys−Lysであることができる。ｊが１であり且つｋが２である場合、Ｙは、好ましくはLys、又はLys−Proであることができる。
【００２７】
ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１を示す。ｐ及びｑは、好ましくは０であることができる。ｐ及びｑが０の場合、本発明のペプチドは、下記一般式（１’）：
【００２８】
【化３】
2014218474.tif 000004
【００２９】
［式中、ｊ、ｋ、及びｎは前記に同じ］
で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００３０】
本発明のペプチドとして、具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド１）、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド２）が挙げられ、好ましくはペプチド２が挙げられる。
【００３１】
本発明者等の検討によれば、本発明のペプチドは、ポリプロリンＩＩへリックス構造又はその類似構造をとると推測され、これにより細胞凝集塊形成能が発揮されると考えられるが、本発明のペプチドはこれに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、縮合法等の一般的な化学合成法により合成することができる。当該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００３３】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばＤＭＴ−ＭＭを用いる方法、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００３４】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００３５】
かくして得られる本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３６】
斯かる構成を有する本発明のペプチドは、細胞毒性が低く、且つ細胞凝集塊形成能を発揮することができる。そのため、本発明のペプチドは、細胞凝集塊形成剤の有効成分として有用である。また、本発明のペプチドによれば、細胞に対するダメージを低く抑えつつ、細胞凝集塊を簡便且つ効率的に形成することができる。
【００３７】
２．細胞凝集塊形成剤
本発明によれば、本発明のペプチドを含有する細胞凝集塊形成剤（以下、単に「本発明の細胞凝集塊形成剤」と表記することもある）が提供される。
【００３８】
本発明の細胞凝集塊形成剤は、本発明のペプチドのみを含むものであってもよいし、本発明のペプチドの細胞凝集塊形成能を損なわない限りにおいて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば研究用試薬用として通常使用される成分、具体的には水、緩衝剤、有機溶媒、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤、着色剤、細胞培養用培地等が挙げられる。
【００３９】
本発明の細胞凝集塊形成剤の剤形は、細胞に本発明のペプチドを接触させることができる限り特に限定されない。剤形としては、例えば固形剤又は液剤等が挙げられる。
【００４０】
本発明の細胞凝集塊形成剤中の本発明のペプチドの含有割合は、特に限定されないが、通常約０．０００００１〜１０重量％程度であることができる。
【００４１】
斯かる構成を有する本発明の細胞凝集塊形成剤によれば、細胞に対するダメージを低く抑えつつ、細胞凝集塊を簡便且つ効率的に形成することができる。
【００４２】
３．細胞凝集塊の形成方法
本発明によれば、本発明のペプチドと細胞とを接触させることを含む細胞凝集塊の形成方法（以下、単に「本発明の方法」と表記することもある）が提供される。なお、本発明の方法においては、本発明のペプチドの供給源として本発明の細胞凝集塊形成剤を用いてもよい。
【００４３】
本発明の方法において凝集塊を形成させる対象である細胞は、特に限定されない。例えば、接着性細胞又は非付着性細胞等が挙げられる。具体的には、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等を挙げることができる。
【００４４】
本発明のペプチドと細胞とを接触させる態様は、特に限定されない。例えば細胞を、本発明のペプチドを含有する培地中で培養する方法が挙げられる。
【００４５】
培地は、本発明のペプチドの細胞凝集塊形成能を損なわない限りにおいて特に限定されず、細胞の種類に応じて適宜選択される。具体的には、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩ等の公知の培地が挙げられる。また、これらの培地に、公知の添加成分を加えたものであってもよい。公知の添加成分としては、例えば抗生物質等が挙げられる。より効率的に細胞凝集塊を形成し得るという観点から、培地には血清が含まれないことが好ましい。
【００４６】
培地中の本発明のペプチド含有割合は、細胞凝集塊を形成させることができる限りにおいて特に限定されない。例えば、０．００００００１〜０．０１重量％、好ましくは０．０００００１〜０．００１重量％、より好ましくは０．００００１〜０．００１重量％であることができる。また、本発明のペプチドが、［Lys−Lys−Pro（ｊが２であり且つｋが１である場合）］が繰り返したアミノ酸配列を有する（又はからなる）ペプチドである場合、より低い濃度でも細胞凝集塊を形成できる。この場合、培地中の本発明のペプチドの含有割合は、好ましくは０．００００００１〜０．０００１重量％、より好ましくは０．０００００１〜０．００００１重量％であることができる。
【００４７】
培養条件は、細胞凝集塊を形成させることができる限りにおいて特に限定されず、細胞の種類に応じた条件が適宜選択される。例えば、「飽和水蒸気下、５％ＣＯ２濃度下、３７〜４０℃」という条件が挙げられる。
【００４８】
細胞として接着細胞を用いる場合、細胞に対するダメージをより低く抑えるという観点及びより効率的に細胞凝集塊を形成するという観点から、本発明のペプチドと接触させる前に、予め細胞を培養ディッシュ上に接着させておくことが望ましい。
【００４９】
培養ディッシュは、細胞凝集塊を形成させることができる限りにおいて特に限定されない。具体的には、例えばポリスチレンディッシュが挙げられる。培養ディッシュには、細胞凝集塊を形成させることができる限りにおいて、細胞接着性の表面処理が施されていてもよい。
【００５０】
斯かる本発明の方法によれば、細胞と本発明のペプチドとを接触させた後、一定時間経過後（例えば２〜９日後）に細胞凝集塊が形成される。なお、細胞凝集塊の形成の有無は、公知の方法に従って、例えば光学顕微鏡で観察することにより評価することができる。この評価の際には、例えば直径２０μｍ以上の細胞集合体を「細胞凝集塊」と定義する等、具体的基準を採用してもよい。
【実施例】
【００５１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
実施例1〜2及び比較例1〜4：ペプチドの合成
下記表1に示すペプチド（実施例1〜2及び比較例1〜4）を定法の固相合成法によって合成した。なお、表1中、例えば（KPP）8は、N末端側からリシン（K）、プロリン（P）、プロリン（P）の順で並んだアミノ酸配列が、8回繰り返したアミノ酸配列を意味する。得られたペプチドをHPLC及びMALDI-TOF-MSで解析した。
【００５３】
【表１】
2014218474.tif 000005
【００５４】
HPLC及びMALDI-TOF-MSの解析結果を図1〜6に示す。各図中、上段左側に合成したペプチドの分子量及び化学式を示し、上段右側にHPLC解析結果を示し、下段にMALDI-TOF-MSで解析した結果を示す。図1〜6より、高純度で目的のペプチドが合成できたことが確認された。
【００５５】
比較試験例1:ペプチドによる細胞凝集塊形成試験（（KP）12ペプチド及び（KA）12ペプチド）
（KP）12ペプチド（比較例2）及び（KA）12ペプチド（比較例4））を用いて、細胞凝集塊形成試験を行った。具体的には次のように行った。
【００５６】
［ペプチド溶液の調製］
（KP）12ペプチド（比較例2）又は（KA）12ペプチド（比較例4））を、EMEM（日水製薬）（無血清）で、1.0 mg/mlになるように希釈した。この希釈液をペプチド溶液として用いた。
【００５７】
［細胞溶液の調製］
L929細胞（マウス結合組織由来繊維芽細胞）（理化学研究所  バイオリソースセンター）を、EMEM（＋10％FBS（Thermo Scientific））を培地として用いて、培養ディッシュ上で接着培養（37℃、5％CO2）した。ディッシュ上の細胞を、定法に従ったトリプシン処理により剥がし、コニカルチューブに回収した。該チューブを遠心（720 g、5分間）後、上清を除去した。該チューブ底部の細胞塊を、2.5×104〜5.0×104cells/200μlになるようにEMEM（無血清）で懸濁した。この懸濁液を細胞溶液として用いた。
【００５８】
［細胞凝集塊形成試験］
細胞溶液200μl（2.5×104〜5.0×104cells）を96ウェルプレート（コーニング、組織培養用プレート）の各ウェルに播種（2.5×104〜5.0×104cells/well）した。播種した細胞を、6時間培養（37℃、5％CO2）することにより、ウェルの底部に接着させた。培養後、ペプチド溶液50μl又はEMEM（無血清）50μlを各ウェルに添加した。添加後、光学顕微鏡（オリンパス TH-4-100）で各ウェルを観察した。
【００５９】
［結果］
播種した日を0日目とした場合の、1日目、3日目、及び5日目の観察像を図7に示す。図7中、controlはペプチド溶液に代えてEMEM（無血清）を添加した場合を示し、各観察像中のバーの長さは100μmを示す（後述の比較試験例及び試験例においても同様である）。図7より、（KP）12ペプチドを用いた場合のみ細胞凝集塊の形成が確認できた。
【００６０】
比較試験例2：各種アミノ酸残基数のペプチドによる細胞凝集塊形成試験（（KP）10ペプチド及び（KP）12ペプチド）
ペプチドとして、（KP）10ペプチド（比較例1）、及び（KP）12ペプチド（比較例2）を用いる以外は、比較試験例1と同様に行った。
【００６１】
［結果］
観察像を図8に示す。図8より、（KP）10ペプチド、及び（KP）12ペプチドを用いた場合共に、細胞凝集塊の形成が確認できた。ただ、よりアミノ酸残基数が多い（KP）12ペプチドを用いた場合の方が、形成された細胞凝集塊の数が若干多かった。
【００６２】
比較試験例3：各種ペプチド濃度における細胞凝集塊形成試験（（KP）12ペプチド）
ペプチドとして（KP）12ペプチドを用い、且つペプチド溶液として、1.0 mg/ml、0.50 mg/ml、及び0.25 mg/mlのペプチド濃度のペプチド溶液を用いる以外は、比較試験例1と同様に行った。
【００６３】
［結果］
観察像を図9に示す。図9中、左側の濃度は用いたペプチド溶液のペプチド濃度を示す。図9より、いずれの濃度のペプチド溶液を用いた場合でも細胞凝集塊の形成が確認できた。ただ、0.25 mg/mlのペプチド溶液を用いた場合は、他の濃度のペプチド溶液を用いた場合に比べて、細胞凝集塊の形成効率が悪かった。
【００６４】
比較試験例4：ペプチドの細胞毒性評価試験（（KP）14ペプチド）
（KP）の繰り返し配列からなるペプチドの細胞毒性を評価した。具体的には次のように行った。
【００６５】
［ペプチド溶液の調製］
（KP）14ペプチドを、EMEM（日水製薬）（無血清）で、1.0、0.5、0.1、又は0.01 mg/mlになるように希釈した。この希釈液をペプチド溶液として用いた。
【００６６】
［細胞溶液の調製］
L929細胞（マウス結合組織由来繊維芽細胞）（理化学研究所  バイオリソースセンター）を、EMEM（日水製薬）（＋10％FBS（Thermo Scientific））を培地として用いて、培養ディッシュ上で接着培養（37℃、5％CO2）した。ディッシュ上の細胞を、定法に従ったトリプシン処理により剥がし、コニカルチューブに回収した。該チューブを遠心（720 g、5分間）後、上清を除去した。該チューブ底部の細胞塊を、5.0×104cells/200μlになるようにEMEM（無血清）で懸濁した。この懸濁液を細胞溶液として用いた。
【００６７】
［細胞毒性試験］
細胞溶液200μl（5.0×104cells）を96ウェルプレート（コーニング  組織培養用プレート）の各ウェルに播種（5.0×104cells/well）した。播種した細胞を、6時間培養（37℃、5％CO2）することにより、ウェルの底部に接着させた。培養後、ペプチド溶液50μl又はEMEM（無血清）50μlを各ウェルに添加した。添加24時間後、定法に従って細胞をエリスロシンで染色し、光学顕微鏡（オリンパスTH-4-100）で各ウェルの生存細胞（非染色細胞）数を測定した。
【００６８】
［結果］
細胞生存率を示すグラフを図10に示す。図10より、用いたペプチド溶液の濃度が1 mg/mlの場合は、細胞生存率が20％にも満たなかった。このことより、（KP）の繰り返し配列からなるペプチドは、高濃度で用いると強い細胞毒性を発揮することが示唆された。
【００６９】
試験例1：ペプチドによる細胞凝集塊形成試験（（KPP）8ペプチド、（KKP）8ペプチド、（KP）10ペプチド、及び（KP）12ペプチド）
ペプチドとして、（KPP）8ペプチド（実施例1）、（KKP）8ペプチド（実施例2）、（KP）10ペプチド（比較例1）、及び（KP）12ペプチド（比較例2）を用い、且つペプチド溶液として5.0 mg/mlのペプチド濃度のペプチド溶液を用いる以外は、比較試験例1と同様に行った。
【００７０】
［結果］
7日目の観察像を図11に示す。図11より、（KPP）8ペプチドを用いた場合、（KKP）8ペプチドを用いた場合共に、細胞凝集塊が形成された。
【００７１】
試験例2：各種ペプチド濃度における細胞凝集塊形成試験（（KPP）8ペプチド及び（KKP）8ペプチド）
ペプチドとして、（KPP）8ペプチド（実施例1）及び（KKP）8ペプチド（実施例2）を用い、且つペプチド溶液として1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml、及び0.01 mg/mlのペプチド濃度のペプチド溶液を用いる以外は、比較試験例1と同様に行った。
【００７２】
［結果］
（KPP）8ペプチドを用いた場合の7日目の観察像を図12に、（KKP）8ペプチドを用いた場合の7日目の観察像を図13に示す。図12及び13より、（KPP）8ペプチドを用いた場合、（KKP）8ペプチドを用いた場合共に、細胞凝集塊が形成された。また、（KKP）8ペプチドは、非常に低濃度のペプチド溶液（0.01 mg/ml）を用いた場合であっても、細胞凝集塊を形成した（図13）。
【００７３】
試験例3：ペプチドの細胞毒性評価試験（（KPP）8ペプチド及び（KKP）8ペプチド）
（KPP）又は（KKP）の繰り返し配列からなるペプチドの細胞毒性を評価した。具体的には、ペプチドとして、（KPP）8ペプチド（実施例1）及び（KKP）8ペプチド（実施例2）を用いる以外は、比較試験例4と同様に行った。
【００７４】
［結果］
（KPP）の繰り返し配列からなるペプチドを用いた場合の細胞生存率を示すグラフを図14に、（KKP）の繰り返し配列からなるペプチドを用いた場合の細胞生存率を示すグラフを図15に示す。図14及び15より、（KPP）又は（KKP）の繰り返し配列からなるペプチドについて、比較的高濃度のペプチド溶液（1 mg/ml）を用いた場合であっても、高い細胞生存率（60％以上）を示した。
【００７５】
試験例4：HepaRG細胞を用いた細胞凝集塊形成試験（（KPP）8ペプチド、（KKP）8ペプチド、（KP）10ペプチド、及び（KP）12ペプチド）
細胞としてHepaRG細胞（ヒト肝臓細胞）（日本チャールズ・リバー）を用い、ペプチドとして（KPP）8ペプチド（実施例1）、（KKP）8ペプチド（実施例2）、（KP）10ペプチド（比較例1）、及び（KP）12ペプチド（比較例2）を用い、ペプチド溶液として5.0mg/mlのペプチド濃度のペプチド溶液を用い、且つ培地としてBasal hepatic cell medium（BIOPREDIC INTERNATIONAL）を用いる以外は、比較試験例1と同様に行った。
【００７６】
［結果］
観察像を図16に示す。図16より、（KPP）又は（KKP）の繰り返し配列からなるペプチドは、細胞としてHepaRG細胞を用いた場合であっても、細胞凝集塊を形成できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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