(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪細胞においてＧＩＰ受容体を効率よく発現できる系、及び当該発現系の利用法の提供。【解決手段】（ａ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程、（ｂ）被験物質を前記共培養系に接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程を含む、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法、ＧＩＰ受容体の機能解析方法、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
【請求項２】
脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
【請求項３】
脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項３記載の方法。
（ａ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｂ）被験物質を前記共培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
【請求項６】
以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含む、請求項４記載の方法。
（ｄ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記共培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
【請求項７】
脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞及びＯｂ１７７１細胞から選ばれる前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、６〜１６日目の細胞を用いる請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
マクロファージが、ＲＡＷ２６４細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞又は腹腔マクロファージである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現制御及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管ホルモンの１つであるＧＩＰ（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、グルコース依存的に膵臓β細胞からインスリン分泌を促進し、血糖値の調節に寄与するインクレチンとして知られている。
【０００３】
一方で、ＧＩＰはインクレチン作用以外に、脂肪組織、骨、神経細胞において様々な膵外作用を有することが報告されている（非特許文献１）。中でも、ＧＩＰと肥満の関連性が示唆されており、脂肪組織に対するＧＩＰの作用は特に着目されている。すなわち、脂肪細胞にはＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）が発現し、ＧＩＰＲ欠損マウスにおいて高脂肪食負荷による肥満が認められないことが報告され（非特許文献２）、また、脂肪組織に対するＧＩＰの作用として、ＬＰＬ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ）活性化を介した脂肪酸取り込みの促進（非特許文献３）、Ａｋｔを介した糖取り込みの亢進（非特許文献４）、脂肪蓄積亢進（非特許文献５）、炎症性の亢進（非特許文献６）等が報告されている。
【０００４】
したがって、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現や機能の解析を進めることは、肥満や炎症のメカニズム解明や受容体分子を標的とした抗肥満物質や抗炎症物質の開発につながり、重要である。
上記非特許文献６では、アデノウィスルベクターを用い、ＧＩＰ受容体を強制高発現させた脂肪細胞において、インターロイキン６（ＩＬ６）の発現・産生が促進し、炎症反応が亢進することが開示されているが、アデノウィスルベクターを用いＧＩＰ受容体を強制高発現させる系は、操作が煩雑であり、また非生理的であることから、受容体機能の解明やスクリーニング系として使用することには適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Seino Y et al. GIP and GLP-1, the two incretin hormones: Similarities and differences. Journal of Diabetes Investigation (2010), 1, pp.8-23
【非特許文献２】Yip RG. et al. Functional GIP receptors are present on adipocytes. Endocrinology (1998), 139(9), pp.4004-4007
【非特許文献３】Miyawaki et al. Inhibition of gastric inhibitory polypeptide signaling prevents obesity. Nat Med. (2002), 8(7), pp.738-742
【非特許文献４】Song DH et al. Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide Enhances Adipocyte Development and Glucose Uptake in Part Through Akt Activation. Gastroenterology (2007), 133(6), pp.1796-1805
【非特許文献５】Kim SJ et al. Activation of Lipoprotein Lipase by Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide in Adipocytes. JBC (2007), 282(12), pp.8557-8567
【非特許文献６】Nie Y et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide impairs insulin signaling via inducing adipocyte inflammation in glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor-overexpressing adipocytes. FASEB Journal (2012), 26(6), pp.2383-2393
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体を効率よく発現できる系、及び当該発現系の利用法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明らは、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現について検討したところ、脂肪細胞をマクロファージと共培養することにより、ＧＩＰ受容体の発現が高まり且つ維持されることを見出した。
【０００８】
すなわち、以下の１）−４）に係るものである。
１）脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
２）脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
３）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
４）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現を、アデノウィスルベクター等を用い、強発現させるような面倒な手間を掛けず、また、より生理的条件に近い系で効率よく行うことができる。したがって、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現解析や機能解析を容易に行うことができ、これにより肥満や炎症のメカニズム解明や受容体分子を標的とした抗肥満物質や抗炎症物質等の探索が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】接触法による、脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）とマクロファージ（Ｒａｗ２６４）の共培養法（Ａ）、及び対照培養法（Ｂ）を示す模式図。
【図２】マクロファージ共培養による脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現変化を示すグラフ。
【図３】マクロファージ共培養条件下における、ＧＩＰによるＩＬ６遺伝子発現促進を示すグラフ。
【図４】マクロファージ共培養条件下における、ＧＩＰによるＩＬ６分泌促進を示すグラフ。
【図５】マクロファージ共培養系を用いた、ＧＩＰ受容体阻害剤によるＩＬ６分泌抑制を示すグラフ。
【図６】マクロファージ共培養系を用いた、ＧＩＰ受容体阻害剤によるＩＬ６分泌抑制を示すグラフ。
【図７】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に伴うＧＩＰ受容体の遺伝子発現を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）の発現は、脂肪細胞とマクロファージを共培養することによって行われる。
ここで、「脂肪細胞」は、脂肪細胞の性質（例えば、脂肪細胞特有の細胞内代謝を行い、脂肪滴を多量に蓄積する）をもち、ＧＩＰ受容体を発現し得る細胞であればよく、ヒトやラットの初代培養細胞等の培養脂肪細胞の他、前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞でもよい。前駆脂肪細胞としては、脂肪細胞に分化する能力を有する線維芽細胞として広く当該研究領域で使用されている３Ｔ３−Ｌ１細胞（Journal of Biological Chemistry (1996), 271(5), pp.2365-2368）、Ｏｂ１７７１（Biochemical and Biophysical Research Communications (1997), 238(2), pp.606-611）等が挙げられる。各種の動物に由来する脂肪前駆細胞は市販されており、適当な販社から購入することができる。例えばマウス由来の３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社等から購入することができる。
前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導は、公知の方法により前駆脂肪細胞に分化誘導刺激を加えることで行うことができる。例えば、３Ｔ３−Ｌ１細胞を脂肪細胞に誘導する場合、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＩＢＭＸ(３-Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ)、Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を含む脂肪細胞分化誘導カクテル等により当該前駆脂肪細胞の分化誘導を行うことができる（Wu Z. et
al., Genes & Dev. (1992), 9, pp.2350-2363.等）。
【００１２】
前駆脂肪細胞から脂肪細胞へ分化誘導する場合、参考例１に示すように、３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、ＧＩＰ受容体は分化初期及び成熟期において２相性の発現を示し、その発現量は成熟期（分化誘導後６日目頃）において顕著に増加する。したがって、前駆脂肪細胞を分化誘導して用いる場合は、成熟期以降の細胞を用いるのが好ましく、例えば３Ｔ３−Ｌ１細胞であれば分化誘導後６日目以降、例えば６〜１６日目の細胞を用いるのが好ましい。
【００１３】
本発明において用いられるマクロファージとしては、単球に由来するものであればよく、生物種は特に限定されず、例えばマウス、ラット、ヒト等の何れでもよい。好適には、例えば、マクロファージ様細胞として公知のＲＡＷ２６４細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、腹腔マクロファージ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）等が挙げられる。
ＲＡＷ２６４細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社等から購入可能である。また、腹腔マクロファージは、公知の調製方法、例えば、チオグリコネート含有液をマウスの腹腔内に投与し、２−４日後に腹腔内を洗浄し、その洗浄液からマクロファージを回収することにより得ることができる。
【００１４】
マクロファージと脂肪細胞の共培養は、脂肪細胞とマクロファージが相互に接触する方法（接触法）、或いは脂肪細胞とマクロファージが同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ、細胞自体を物理的に接触させない方法（非接触法）の何れでもよい。非接触法としては、例えば、通常の細胞培養に用いられるカルチャーインサート等のフィルターを用いて両細胞を隔てて培養するトランスウェル法が挙げられ、本発明においては、マクロファージと脂肪細胞を個々に回収し、それぞれの遺伝子発現の解析を行うこと、また、接触による両細胞間での相互作用を回避する点から当該非接触法を用いるのが好ましい。
トランスウェル法において、フィルターの孔径は、0.1μｍ以上、好ましくは0.4μｍ以上で、3μｍ以下、好ましくは1μｍ以下である。このようなフィルターとしては、BD Falcon セルカルチャーインサート等を挙げることができる。脂肪細胞とマクロファージのどちらをフィルター上に培養しても構わないが、マクロファージをフィルター上で培養するのが好ましい。
【００１５】
培養培地としては、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地を用いることができる。(H. Sakaue et al., Mol. Endocrinol. (2004), 11, 1552.; Miki et al., Mol. Cell. Biol. (2001), 21, 2521.; H. Sakaue et al., Genes & Dev. (2002), 16, 908.を参照)
【００１６】
これらの培地には、ＧＩＰ受容体の発現に影響を与えない範囲で、適宜添加剤を添加することができる。
【００１７】
共培養の温度は３０℃〜４０℃、好ましくは３５℃〜３７℃である。培地のｐＨ値は、一般に６〜８、好ましくはｐＨ７〜７．５である。
共培養は、通常、約５％のＣＯ2雰囲気下で行われ、共培養期間は、例えば１時間以上、４８時間以下であり、好ましくは、１６時間以上、２４時間以下である。
【００１８】
また、共培養開始時の脂肪細胞とマクロファージの細胞数の割合は、特に限定されないが、例えば、５０：１〜１：１であり、好ましくは２０：１〜１：１であり、より好ましくは５：１〜２：１である。
【００１９】
共培養後、共培養物から脂肪細胞を回収する。回収方法は特に限定されないが、例えば、トリプシンを用いることが出来る。また、ＲＮＡを回収する際は、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ５０（ＱＩＡＧＥＮ）付属のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを用いることが出来る。
【００２０】
後記実施例に示すように、脂肪細胞をマクロファージと共培養すると、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現量が増加し、且つその発現は維持される。
したがって、脂肪細胞とマクロファージの共培養系は、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強のために使用できる。また、脂肪細胞とマクロファージの共培養系は、ＧＩＰ受容体の機能を解析するため、ＧＩＰ受容体発現制御物質又はＧＩＰ受容体親和性物質をスクリーニングするために使用できる。
【００２１】
ここで、ＧＩＰ受容体の発現増強とは、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体の存在量及び／又は産生量が増加することを意味する。当該ＧＩＰ受容体の存在量又は産生量は、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量として測定でき、遺伝子発現量の測定は、公知の方法によりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成後、定量的リアルタイムＰＣＲ法等を用いることにより行うことができる。
【００２２】
ＧＩＰ受容体の機能としては、ＧＩＰ受容体を介して引き起こされる各種細胞刺激活性や、糖取り込み促進作用、脂肪蓄積促進作用、脂肪分解抑制作用等が挙げられる。細胞刺激活性としては、例えば、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、細胞内タンパク質のリン酸化、炎症性サイトカイン（インターロイキン６（ＩＬ６）、ＴNＦα、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ１）の産生等が挙げられる。
【００２３】
また、ＧＩＰ受容体発現制御物質とは、脂肪細胞においてＧＩＰ受容体の発現量を増加又は減少させる物質を意味する。ＧＩＰ受容体の発現量は、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量として測定できる。
【００２４】
また、ＧＩＰ受容体親和性物質としては、ＧＩＰ受容体に結合して受容体を活性化する物質、ＧＩＰ受容体に結合するが受容体を活性化しない物質等が挙げられる。受容体活性としては、ＧＩＰ受容体を介した細胞刺激活性、例えば、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、細胞内タンパク質のリン酸化、ＩＬ６、ＴＮＦαの産生等が挙げられる。
【００２５】
脂肪細胞とマクロファージの共培養を用いたＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むものである。
（ａ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｂ）被験物質を前記共培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
【００２６】
工程（ａ）の共培養は、前記したとおりである。工程（ｂ）被験物質の接触は、被験物質を共培養系へ、１時間〜２４時間程度接触させることが好ましい。工程（ｃ）では、ＧＩＰ受容体の発現レベルが評価されるが、当該ＧＩＰ受容体発現レベルは、例えばＧＩＰ受容体遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。発現レベルの比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。比較の結果、被験物質の非存在下に対して被験物質の存在下で、ＧＩＰ受容体発現レベルの抑制が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体発現抑制物質となり得る。
【００２７】
また脂肪細胞とマクロファージの共培養を用いたＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法は、具体的には、例えば、以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含むものである。
（ｄ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記共培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
【００２８】
工程（ｄ）の共培養は、前記したとおりである。工程（ｅ）被験物質及びＧＩＰの添加は、共培養系へ、１時間〜２４時間程度接触させることが好ましい。工程（ｆ）では、被験物質及びＧＩＰの存在下における受容体活性が測定される。同時に該受容体活性を、被験物質の非存在下の活性と比較する。受容体活性の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。比較の結果、被験物質の非存在下に対して被験物質の存在下で、活性の促進が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体作動物質、活性の抑制が確認できれば、その被験物質はＧＩＰ受容体阻害物質となり得る。
【００２９】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の発現増強方法。
＜２＞脂肪細胞をマクロファージと共培養する、脂肪細胞におけるＧＩＰ受容体の機能解析方法。
＜３＞脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体発現制御物質のスクリーニング方法。
＜４＞脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程を含む、ＧＩＰ受容体親和性物質のスクリーニング方法。
【００３０】
＜５＞以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、＜３＞の方法。
（ａ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｂ）被験物質を前記共培養系に接触させる工程
（ｃ）工程（ｂ）において被験物質を接触させた場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルと、被験物質を接触させない場合におけるＧＩＰ受容体の発現レベルとを比較する工程
＜６＞以下の工程（ｄ）〜（ｆ）を含む、＜４＞の方法。
（ｄ）脂肪細胞をマクロファージと共培養する工程
（ｅ）被験物質及びＧＩＰを前記共培養系に接触させる工程
（ｆ）工程（ｅ）において被験物質の存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性と、被験物質の非存在下でＧＩＰを共培養系へ接触させた場合における受容体活性とを比較する工程
＜７＞脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞及びＯｂ１７７１細胞から選ばれる前駆脂肪細胞から分化誘導された細胞である、＜１＞〜＜６＞の方法。
＜８＞脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、６〜１６日目の細胞を用いる＜１＞〜＜７＞の方法。
＜９＞マクロファージが、ＲＡＷ２６４細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞又は腹腔マクロファージである＜１＞〜＜８＞の方法。
【実施例】
【００３１】
実施例１
（１）脂肪細胞とマクロファージの共培養によるＧＩＰＲの発現
３Ｔ３−Ｌ１（ＤＳ  ファーマバイオメディカル株式会社）をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｓｉｇｍａ）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で継代培養した後、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、若しくは６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。２日後、Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）：１０μｇ／ｍｌ，ＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）：０．５ｍＭ，Ｄｅｘ（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）：１μＭを含む上記ＤＭＥＭ培地に交換し、分化誘導を開始した。更に２日後Ｉｎｓｕｌｉｎ：５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ培地に交換し、２日間培養した。その後、ＤＭＥＭ培地にて２日毎に培地交換をし、分化誘導開始から合計６日間培養した。
マクロファージ様細胞（Ｒａｗ２６４，ＤＳ  ファーマバイオメディカル株式会社）をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｓｉｇｍａ）にて３７℃、５％ＣＯ2存在下で継代培養した後、０．４μｍ孔を有する多孔質膜からなる２４ｗｅｌｌ
ｐｌａｔｅ、若しくは６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ用トランスウェルインサート（ＢＤファルコン）に１×１０4〜１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。
分化誘導後６日目の３Ｔ３−Ｌ１と上記２４時間培養したＲａｗ２６４を図１（Ａ）に示すようにトランスウェルを用いた非接触法により共培養を行った。２４時間共培養後、下層ウェルの３Ｔ３−Ｌ１を採取し、下記（２）の方法で、ＧＩＰＲの遺伝子発現レベルの測定を行った。なお、対照培養法として、図１（Ｂ）に示すように、３Ｔ３−Ｌ１とＲａｗ２６４をそれぞれ単独で培養し、同様に遺伝子発現レベルの測定を行った。
【００３２】
（２）遺伝子発現量の測定
共培養した３Ｔ３−Ｌ１より、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ５０（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成（Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）後、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）により遺伝子の発現定量を行い、内部標準として３６Ｂ４を用い、各遺伝子の発現量を補正した。なお、プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓのＧＩＰ受容体(Ｍｍ０１３１６３４４＿ｍ１)、３６Ｂ４(Ｍｍ００７２５４４８＿ｓ１)を用いた。
【００３３】
（３）結果
図２に示すように、共培養により３Ｔ３−Ｌ１におけるＧＩＰＲの発現が亢進した。また、遺伝子発現亢進の程度は、Ｒａｗ２６４の細胞数に依存した。
【００３４】
実施例２  ＧＩＰＲの機能解析
実施例１の方法により発現されたＧＩＰＲの機能をＩＬ６の発現を指標として確認した。
（１）ＩＬ６遺伝子発現量
実施例１と同様の方法により、３Ｔ３−Ｌ１とＲａｗ２６４を２４時間共培養した後、ＧＩＰ，ＧＩＰ＋ｉｎｓｕｌｉｎを含む培地で刺激し、１，３，６時間後に下層ウェルの３Ｔ３−Ｌ１を採取し、ｃＤＮＡ合成（Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）後、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）により遺伝子の発現定量を行い、３６Ｂ４による補正を行った。なお、プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓのＩＬ６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）を用いた。その結果、図３に示すようにＧＩＰはインスリン存在下、非存在下いずれにおいても刺激後１時間においてＩＬ６の遺伝子発現を亢進した。
【００３５】
（２）ＩＬ６産生量
実施例１と同様の方法により、３Ｔ３−Ｌ１とＲａｗ２６４を２４時間共培養した後、ＧＩＰ，ＧＩＰ＋ｉｎｓｕｌｉｎを含む培地で刺激し、３時間後に培養上清を回収し、市販の固相酵素免疫検定法（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ６  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ，  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、上清中ＩＬ６の定量を行った。
その結果、図４に示すようにＧＩＰによりＩＬ６の産生が亢進した。また、インスリン共存下においても、ＧＩＰ刺激によりＩＬ６の産生が亢進した。
【００３６】
実施例３  ＧＩＰ受容体阻害物質のＩＬ６産生阻害作用
実施例１と同様の方法により、３Ｔ３−Ｌ１とＲａｗ２６４を２４時間共培養した後、ＧＩＰにより誘導される炎症性サイトカイン（ＩＬ６）の産生を抑制する物質として公知（Timper, K et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide induces cytokine
expression, lipolysis, and insulin resistance in human adipocytes. Am J Physiol
Endocrinol Metab (2013), 304, E1-E13）のＨ−８９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｐａｎ）２０ｎＭを１時間前処理した後、ＧＩＰ  １００ｎＭを含む培地で刺激し、１時間後に下層ウェルの３Ｔ３−Ｌ１を採取し、ＩＬ６の遺伝子発現レベルの測定を行った。
その結果、図５に示すように、Ｈ−８９により、ＧＩＰによるＩＬ６の発現亢進が有意に阻害された。これより、本発明の共培養系は、Ｈ−８９のようなＧＩＰ受容体阻害物質をスクリーニングするための系として有用であることが確認された。
【００３７】
実施例  ４  ＧＩＰ受容体親和性物質の評価
実施例３と同様の方法により、分化誘導後６日目の３Ｔ３−Ｌ１とＲａｗ２６４を２４時間共培養した後、実施例３で用いたＨ−８９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｐａｎ）  ２０ｎＭ、オウゴンエキス０．００５％、ジンジャーエキス０．００５％を添加した培地にて１ｈ前処理した後、ＧＩＰ  １００ｎＭを含む培地で刺激し、１時間後に下層ウェルの３Ｔ３−Ｌ１を採取し、ＩＬ６の遺伝子発現レベルの測定を行った。
その結果、図１に示すように、オウゴンエキス及びジンジャーエキスは、Ｈ−８９と同様に、ＧＩＰによるＩＬ６の発現亢進を有意に阻害した。また、結果は各剤を添加した刺激培地に対する相対値で示している。
したがって、オウゴンエキス及びジンジャーエキスは、ＧＩＰ受容体阻害物質であると評価できる。
【００３８】
参考例１
３Ｔ３−Ｌ１を実施例１の方法に従い、分化誘導させ、分化誘導後０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、２ｄａｙ、３ｄａｙ、４ｄａｙ、６ｄａｙ、８ｄａｙ、１２ｄａｙ、１６ｄａｙにおいて上記方法によりＲＮＡ抽出、ＧＩＰ受容体の遺伝子発現解析を行った。
その結果、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に伴い、ＧＩＰ受容体は分化後２ｈ、６日目に２相性の発現を示すことが確認された（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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