(57)【要約】【課題】ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤を提供する。【解決手段】(a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、(b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、30％〜70％エタノール水溶液又は1：1の比率で水とアセトンとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程とを含む、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤の製造方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、
(b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、30％〜70％エタノール水溶液又は1：1の比率で水とアセトンとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
を含む、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤の製造方法。
【請求項２】
30％〜70％エタノール水溶液が30％、50％又は70％エタノール水溶液である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
(a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、
(b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、50％〜70％エタノール水溶液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
(c) 工程(b)の分画物をカラムクロマトグラフィーに供し、80％：20％、70％：30％又は50％：50％の割合で水とメタノールとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
を含む、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤の製造方法。
【請求項４】
50％〜70％エタノール水溶液が50％又は70％エタノール水溶液である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られた分画物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤。
【請求項６】
プロスタグランジンE2生合成阻害剤である、請求項５記載の抗炎症剤。
【請求項７】
シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤である、請求項５記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用及び/又は抗炎症作用を有する飲食品又は医薬品及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願出願人は、特許文献１において、ビワ葉が高血糖値の降下作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、抗高脂血症作用等の効果を有することを明らかにし、ビワ葉を糖尿病、高脂血症、高血圧症、癌等の疾患の予防又は治療に使用できるものとして、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品及びその製造方法を提供した。
【０００３】
また、本願出願人は、特許文献２において、ビワ葉を利用して風味のあるビワ茶を多量に製造する方法及び製造設備を開示する。製造したねじめびわ茶については、「糖尿の血糖値が下がった」、「高血圧の血圧が正常になった」等の声が消費者より寄せられている(非特許文献１)。
【０００４】
従来において、ビワには以下のような活性又は利用方法があることが開示されている。
【０００５】
特許文献３には、ビワ又はその抽出物がマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP-1)阻害活性を有することが開示されている。
【０００６】
特許文献４には、ビワの木の葉を焼いて炭にして粉末状食品素材とすることが開示されている。
【０００７】
特許文献５には、ビワの生葉を切断し、蒸気で蒸し、熱風を送りつつ揉み、乾燥させ、整形した後、再度乾燥させることにより香気と旨味とを増すように仕上げることを特徴とした漢方茶の製造方法が開示されている。
【０００８】
特許文献６には、イネ科植物の葉緑健康茶とビワの茶葉を混合し、より多くのγ-アミノ酪酸を含有する健康茶の製造方法が開示されている。
【０００９】
特許文献７には、果実部を除くビワの抽出物がα-グルコシダーゼ阻害活性を有することが開示されている。
【００１０】
特許文献８には、シャキョクとビワ葉を混合した滋養強壮健康増進用組成物が開示されている。
【００１１】
特許文献９には、黄杞の葉を焙煎処理したものをビワ茶と混合してなる健康茶が開示されている。
【００１２】
特許文献１０には、甘茶とビワの混合物で構成する健康茶が開示されている。
【００１３】
特許文献１１には、バラ科ビワ属の有機抽出物を含む組成物が生物におけるシクロオキシゲナーゼ-2(cyclooxygenase-2：COX-2)活性を阻害することが開示されている。
【００１４】
また、本願出願人は、特許文献１２において、茶化合物を用いた、COX-2阻害及び/又はプロスタグランジンE2(PGE2又はPGE2)生合成阻害の作用を有する飲食品又は医薬品を開示する。本願出願人は、特許文献１２において「緑茶、烏龍茶、紅茶から分離された40種類の茶化合物を供試し、慢性炎症を引き起こす酵素COX-2及びその産物であるPGE2を標的として鋭意研究を行った結果、18種類の茶化合物がCOX-2の発現及び/又はPGE2の産生を抑制することを見出した。」として茶化合物を用いた、COX-2阻害及び/又はPGE2生合成阻害の作用を有する飲食品又は医薬品を提供した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第4974116号公報
【特許文献２】特許第3452351号公報
【特許文献３】特開2005-008539号公報
【特許文献４】特開2004-154108号公報
【特許文献５】特開2004-105036号公報
【特許文献６】特開2002-065227号公報
【特許文献７】特開2001-163795号公報
【特許文献８】特開2001-163792号公報
【特許文献９】特開平7-274832号公報
【特許文献１０】特開平5-056772号公報
【特許文献１１】特表2004-529079号公報
【特許文献１２】特開2012-56952号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】農業生産法人有限会社十津川農場, 「ねじめびわ茶パンフレット」, 2004年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述したように、ねじめびわ茶に含まれる種々の生物学的活性や活性化合物の存在が明らかにされたものの、ねじめびわ茶がリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)等の効果を有することは知られていなかった。これらの効果が確認できれば、ねじめびわ茶を糖尿病等のメタボリックシンドロームの予防又は治療に、あるいはCOX-2阻害剤及び/又はPGE2生合成阻害剤として、種々の癌疾患の予防又は治療に使用できるものと考えられる。
【００１８】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ねじめびわ茶を用いた、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)を有する飲食品又は医薬品及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、得られた抽出物が、リパーゼ阻害作用及びα-グルコシダーゼ阻害作用を有すること、また、リポポリサッカライド(LPS)を用いて炎症を誘発させたRAW264細胞(マウス由来マクロファージ)において、その細胞内の一酸化窒素産生を低下させ、COX-2及びiNOSの発現を抑制し、PGE2の産生を抑制することを見出した。さらに、ねじめびわ茶由来の当該抽出物が炎症のマーカーともいうべきサイトカイン類(IL-5、IL-6、IL-12、GM-CSF、MCP-1、TNF-α)の産生を抑制することを見出した。また、ねじめびわ茶由来の当該抽出物が上記のような炎症因子の産生に関わる炎症シグナル伝達系の内、MAPK細胞信号伝達系におけるp38、ERK、JNKのリン酸化を抑制し、NF-κB細胞信号伝達系におけるNF-κB(p65)、IKK、TAK1のリン酸化を抑制することを見出した。さらに、ねじめびわ茶の抽出物から得られた粗製分画物は強い抗酸化作用を有することを追認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
本発明は以下を包含する。
【００２１】
（１）ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、且つリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用及び抗炎症作用から成る群から選択される1以上の作用を有する飲食品又は医薬品。
【００２２】
（２）上記ビワ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする、（１）記載の飲食品又は医薬品。
【００２３】
（３）上記飲食品がリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用及び抗炎症作用から成る群から選択される1以上の作用を有する旨の表示を有するものであることを特徴とする、（１）記載の飲食品又は医薬品。
【００２４】
（４）抗炎症作用がプロスタグランジンE2(PGE2)生合成阻害作用又はシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害作用である、（１）記載の飲食品又は医薬品。
【００２５】
（５）ビワ葉又はビワ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供し、抽出物を得る工程を含むことを特徴とする、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用及び抗炎症作用から成る群から選択される1以上の作用を有する飲食品又は医薬品の製造方法。
【００２６】
（６）上記抽出物を精製手段に供し、精製物を得る工程をさらに含むことを特徴とする、（５）記載の製造方法。
【００２７】
（７）上記精製手段がカラムクロマトグラフィーであることを特徴とする、（６）記載の製造方法。
【００２８】
（８）上記ビワ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする（５）記載の製造方法。
【００２９】
（９）抗炎症作用がPGE2生合成阻害作用又はCOX-2阻害作用である、（５）記載の製造方法。
【００３０】
また、本発明は以下を包含する。
【００３１】
（１'）(a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、(b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、30％〜70％エタノール水溶液又は1：1の比率で水とアセトンとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程とを含む、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤の製造方法。
【００３２】
（２'）30％〜70％エタノール水溶液が30％、50％又は70％エタノール水溶液である、（１'）記載の方法。
【００３３】
（３'）(a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、(b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、50％〜70％エタノール水溶液を用いた抽出により分画物を得る工程と、(c) 工程(b)の分画物をカラムクロマトグラフィーに供し、80％：20％、70％：30％又は50％：50％の割合で水とメタノールとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程とを含む、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤の製造方法。
【００３４】
（４'）50％〜70％エタノール水溶液が50％又は70％エタノール水溶液である、(３'）記載の方法。
【００３５】
（５'）（１')〜（４'）のいずれか１に記載の方法により得られた分画物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤又は抗炎症剤。
【００３６】
（６'）PGE2生合成阻害剤である、（５'）記載の抗炎症剤。
【００３７】
（７'）COX-2阻害剤である、（５'）記載の抗炎症剤。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)を有し、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を含有する飲食品又は医薬品が提供される。本発明に係る飲食品(特に、健康補助食品若しくは特定保健用食品)又は医薬品は、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)を有することから、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用を有する抗炎症剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、実施例１においてねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」の抗酸化作用を調べた結果を示す。縦軸は抗酸化能を百分率(％)で示した値で、横軸はねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」を示し、それぞれの粉末を50μg/mlの濃度で調整し試験した。
【図２】図２は、実施例２においてねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の薄層クロマトグラフ(TLC)を示す。TLCに直接、252nmの波長の紫外線(UV)を照射し、検出した。展開溶媒は、ベンゼン-ギ酸エチル-ギ酸-水の4種の溶媒を用い、その比率を4：31：5：1の溶液用量で混合したものを用いた。数字の1〜9は、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」に対応する。
【図３】図３は、実施例２においてねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」のTLCを示す。TLCに直接、10％硫酸水溶液を噴霧し、茶色から淡青色に発色する物質が検出される。展開溶媒は、ベンゼン-ギ酸エチル-ギ酸-水の4種の溶媒を用い、その比率を4：31：5：1の溶液用量で混合したものを用いた。数字の1〜9は、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」に対応する。
【図４】図４は、実施例２においてねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の抗酸化作用を調べた結果を示す。対照として、実施例１で使用したねじめびわ茶の分画「C」を用いた。縦軸は抗酸化能を百分率(％)で示した値で、横軸はねじめびわ茶の分画「C」、粗製分画物・分画「C1〜C9」を示し、それぞれの粉末を10μg/mlの濃度で調整し試験した。
【図５】図５は、実施例３においてねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」のリパーゼ阻害作用を調べた結果を示す。縦軸は50％の有効濃度を示し、横軸はねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」を示している。
【図６】図６は、実施例４においてねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」のリパーゼ阻害作用を調べた結果を示す。対照として、ねじめびわ茶の分画「C」を用いた。縦軸は50％の有効濃度を示し、横軸はねじめびわ茶の分画「C」、粗製分画物・分画「C1〜C9」を示している。
【図７】図７は、実施例５においてねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」のα-グルコシダーゼ阻害作用を調べた結果を示す。縦軸は50％の有効濃度を示し、横軸はねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」を示している。
【図８】図８は、実施例６においてねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C4」のα-グルコシダーゼ阻害作用を調べた結果を示す。対照として、ねじめびわ茶の分画「C」を用いた。縦軸は50％の有効濃度を示し、横軸はねじめびわ茶の分画「C」、粗製分画物・分画「C1〜C4」を示している。
【図９】図９は、実施例７においてねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」の一酸化窒素産生の抑制作用を調べた結果を示す。縦軸はLPSで誘導され生成した一酸化窒素の量を100％とし、これに対する百分率の値で示し、横軸はLPSで炎症を誘導した「LPS」、ねじめびわ茶の抽出物(M)及び分画「A〜D」(各50μg/mlの濃度)を示している。
【図１０】図１０は、実施例８においてねじめびわ茶の分画「C」及び粗製分画物・分画「C2」の一酸化窒素産生の抑制作用を調べた結果を示す。縦軸はLPSで誘導され生成した一酸化窒素の量を100％とし、これに対する百分率の値で示し、横軸はLPSで炎症を誘導した「LPS」、ねじめびわ茶の分画「C」及び粗製分画物・分画「C2」の濃度を12.5から100μg/ml以上で調査した結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例１０においてねじめびわ茶の抽出物(M)、分画「A〜D」のCOX-2及びiNOSの発現抑制作用を調べた電気泳動の図を示す。
【図１２】図１２は、実施例１０においてねじめびわ茶の分画「C」のCOX-2及びiNOSの発現抑制作用を調べた電気泳動の図を示す。
【図１３】図１３は、実施例１１においてねじめびわ茶の分画「C2」のCOX-2及びiNOSの発現抑制作用を調べた電気泳動の図を示す。
【図１４】図１４は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-5の産生が低下することを示す図である。
【図１５】図１５は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-6の産生が低下することを示す図である。
【図１６】図１６は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-12の産生が低下することを示す図である。
【図１７】図１７は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってGM-CSFの産生が低下することを示す図である。
【図１８】図１８は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってMCP-1の産生が低下することを示す図である。
【図１９】図１９は、実施例１２においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってTNF-αの産生が低下することを示す図である。
【図２０】図２０は、実施例１３においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」のMAPK細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものと比較した図である。具体的には、p38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の図を示す。
【図２１】図２１は、実施例１３においてねじめびわ茶の粗製分画「C」のMAPK細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものと比較した図である。具体的には、p38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の図を示す。
【図２２】図２２は、実施例１４においてねじめびわ茶の粗製分画「C2」のNF-κB細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものと比較した図である。具体的には、IκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の図を示す。
【図２３】図２３は、実施例１４においてねじめびわ茶の粗製分画「C」のNF-κB細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものと比較した図である。具体的には、IκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の図を示す。
【図２４】図２４は、実施例１５においてねじめびわ茶の粗製分画「A」〜「D」のプロスタグランジンE2産生量を比較した図である。
【図２５】図２５は、実施例１６においてねじめびわ茶の粗製分画「C」及び「C2」のプロスタグランジンE2産生量を比較した図である。
【図２６】図２６は、実施例１７においてねじめびわ茶の抽出物がICRマウスの足浮腫を改善した写真を示す。Ctlはコントロール、LPSはねじめびわ茶を与えなかったグループ、Biwa+LPSはLPS処理をし、ねじめびわ茶を与えたICRマウスの足の写真を示す。
【図２７】図２７は、実施例１８におけるねじめびわ茶の抽出物「M」・粗製分画「A〜D」の粉末に含まれる相対的フェノール性成分の含量を示す。
【図２８】図２８は、実施例１８におけるねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の粉末に含まれる相対的フェノール性成分の含量を示す。
【図２９】図２９は、実施例１９におけるねじめびわ茶とビワ葉の抽出物の機能性成分を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４１】
本発明に係る飲食品又は医薬品は、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、且つリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)から成る群から選択される1以上の作用を有するものである。本発明に係る飲食品又は医薬品をヒト等の動物に摂取又は投与することにより、糖尿病等のメタボリックシンドロームを予防又は治療することができる。また、本発明に係る飲食品又は医薬品をヒト等の動物に摂取又は投与することにより、COX-2及びPGE2の産生を抑制せしめ、炎症を抑えることができる。
【００４２】
ここで、リパーゼ阻害作用とは、摂取した中性脂肪の分解・吸収を低下させることを意味する。また、α-グルコシダーゼ阻害作用とは、摂取した糖類の単糖までの分解・吸収を抑えることを意味する。
【００４３】
COX-2阻害作用とは、PGE2の合成を抑えることを意味する。また、iNOS抑制作用とは、一酸化窒素(NO)の合成を抑制させることを意味する。さらに、PGE2とNO産生の抑制作用とは、炎症を抑制させることを意味する。
【００４４】
サイトカイン類(IL-5、IL-6、IL-12、GM-CSF、MCP-1、TNF-α等)の産生抑制とは、炎症を抑えることを意味する。
【００４５】
LPSで炎症を誘発させることは、炎症を惹き起こすことを意味する。
【００４６】
本発明においては、ビワ葉又はビワ茶を用いる。ビワ葉としては、新鮮葉又は乾燥葉をそのまま使用することができる。ビワ茶としては、いずれのビワ茶であってもよいが、例えば、ねじめびわ茶(商品名)が挙げられる。ねじめびわ茶は、トルマリン石による高温加熱により焦がしたもので、上述した特許文献２に記載の方法によって調製することができる。なお、ねじめびわ茶(根占枇杷茶)は、鹿児島県農業生産法人有限会社十津川農場から市販されている。
【００４７】
本発明に係る飲食品又は医薬品に使用する抽出物は、ビワ葉又はビワ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供することで得ることができる。例えば、ビワ葉又はビワ茶を、熱湯を用いた抽出に供し、これを1回又は数回(例えば3回)繰り返すことでビワ葉又はビワ茶抽出物を得ることができる。あるいは、例えば、ビワ葉又はビワ茶を水、低級アルコールやアセトン等の有機溶媒を用いた抽出に供することで、ビワ葉又はビワ茶抽出物を得ることができる。なお、本発明においては、ビワ葉又はビワ茶抽出物とは、上記抽出方法で得られた抽出液若しくは各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥粉末を意味する。
【００４８】
また、本発明においては、上述したビワ葉又はビワ茶抽出物を濾過、遠心分離又は精製処理等の精製手段に供することで、当該抽出物から夾雑物を除去した精製物を用いることができる。精製手段としては、例えば、カラムクロマトグラフィー、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過が挙げられるが、カラムクロマトグラフィーが特に好ましい。
【００４９】
例えば、ビワ葉又はビワ茶の水抽出溶液又は熱水抽出物(濃縮物若しくは乾燥粉末)を直接、逆相用のゲル(例えば、MCI gel CHP-20P(三菱化学)等)のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にA液として水、B液としてエタノールを用い、A液とB液との比率を100：0、30：70(70％エタノール水溶液)、70：30(30％エタノール水溶液)と変えて、クロマトグラフィーを行う。あるいはC液としてアセトンを用い、A液とC液との比率を50：50にしてクロマトグラフィーを行う。A液とB液との比率が70：30(30％エタノール水溶液)で溶出する粗製分画物(例えば、下記の実施例における「分画B」)、A液とB液との比率が30：70(70％エタノール水溶液)で溶出する粗製分画物(例えば、下記の実施例における「分画C」)並びにA液とC液との比率が50：50で溶出する粗製分画物(例えば、下記の実施例における「分画D」)には、強いリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)が見られる。従って、これら粗製分画物は、ビワ葉又はビワ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することができる。このように、例えば30％〜70％エタノール水溶液(例えば30％、50％又は70％エタノール水溶液)、1：1の比率で水とアセトンとを含有する混合液等を使用し、溶出した分画物をビワ葉又はビワ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することができる。
【００５０】
あるいは、例えば上述のようにカラムクロマトグラフィーにおいて50〜70％エタノール水溶液(例えば50％又は70％エタノール水溶液)で溶出したビワ葉又はビワ茶精製物(分画物)を減圧エバポレータにて溶媒を留去した後、残渣を再度逆相用のゲル(例えば、ODSカラム)のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にA液として水、B液としてメタノールを用い、A液からB液へのリニアーグラジエントによってクロマトグラフィーを行う。この方法で溶出する粗製分画物には、強いリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)が見られる。このように、例えば80％：20％、70％：30％又は50％：50％の割合で水とメタノールとを含有する混合液を使用し、溶出した分画物(例えば、下記の実施例におけるそれぞれ「分画C1」、「分画C2」、「分画C4」)をビワ葉又はビワ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することができる。
【００５１】
以上のように説明したビワ葉又はビワ茶抽出物又は精製物を有効成分として用いることで、本発明に係る飲食品又は医薬品を製造することができる。本発明に係る飲食品又は医薬品には、含有するビワ葉又はビワ茶抽出物又は精製物の作用としてリパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用及び抗炎症作用から成る群から選択される1以上の作用を有する旨の表示を付すことができる。
【００５２】
本発明の抽出物又は精製物の有効量を、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトル等の任意の形態に添加又は封入するか、あるいは任意の食品に添加することで、本発明に係る飲食品を得ることができる。本発明に係る飲食品は、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)を有する飲食品、特に、健康補助食品又は特定保健用食品として使用することができる。好ましくは、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトル等の形態の健康補助食品又は特定保健用食品とするのがよい。
【００５３】
飲食品には、例えば、菓子類、レトルト食品、ジュース類、お茶類、乳製品等が含まれるが、これらに限定されない。また、飲食品には、必要に応じて甘味剤、調味料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤等を添加してもよいし、あるいはビタミン類、栄養剤、免疫増強剤(例えば、プロポリスやきのこ抽出物等)等を添加してもよい。
【００５４】
本発明に係る飲食品に対するビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の添加量は、摂取する成人体重1kg当たり0.1〜200mgに相当する範囲内の量又は1製品当たり例えば50mg〜1gであるが、この範囲に限定されない。
【００５５】
一方、本発明に係る医薬品は、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の有効量を含む。本発明に係る医薬品は、リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、COX-2阻害剤及び/又はPGE2生合成阻害剤(いわゆる抗炎症作用剤又は抗炎症剤)として使用することができる。
【００５６】
本発明に係る医薬品には、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物以外に、さらに製薬上許容可能な担体(賦形剤若しくは希釈剤）並びに結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁化剤、保存剤、着色剤、風味剤及び甘味剤等から適宜選択される添加剤を含有させることができる。担体及び添加剤は、製剤化のために一般的に使用されるものを、本発明に係る医薬品の製造に使用することができる。例えば、結合剤の例としては、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。増量剤の例としては、ラクトース、微結晶セルロース等が挙げられる。滑沢剤の例としては、タルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等が挙げられる。湿潤剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。乳化剤の例としては、セルロース誘導体、ソルビトール等が挙げられる。また、保存剤の例としては、メチル-p-ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸等が挙げられる。ただし、本発明に使用できる添加剤は、これら添加剤の例に限定されない。
【００５７】
本発明に係る医薬品は、例えば経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、腹腔内、経直腸内、皮下、筋肉内、舌下、経鼻腔内、経膣内等)用に製剤化され得る。製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば溶液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、座剤、噴霧剤、制御放出剤、懸濁剤及びドリンク剤等が挙げられる。
【００５８】
本発明に係る医薬品に含まれるビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の用量は、患者の年齢、体重、性別、状態、重篤度等の要因によって変化し得る。患者に投与されるビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の1日用量は、例えば患者の体重1kg当たり0.1〜200mg、好ましくは1〜100mgの範囲であるが、この範囲に限定されない。必要に応じて、用量を数回、例えば2〜3回に分けて分割投与してもよい。また、本発明に係る医薬品は治療用途の同じ又は異なる他のリパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、COX-2阻害剤及び/又はPGE2生合成阻害剤(いわゆる抗炎症作用剤)と併用して患者に投与することもできる。
【００５９】
本発明に係る飲食品又は医薬品は、例えば、以下のように薬理評価を行うことができる。
【００６０】
本発明に係る飲食品又は医薬品の抗炎症作用の薬理評価としては、例えばモデル動物に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、飼育中又は飼育後に、LPS誘発による足浮腫の発生の程度を足の周囲の長さの測定によって比較する方法が挙げられる。本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取していない動物と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、足に発生する浮腫が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に抗炎症作用を有すると判断することができる。また、本発明に係る飲食品又は医薬品の抗炎症作用の薬理評価としては、例えば、マウスのマクロファージ様細胞(RAW264)を用いる方法が挙げられる。すなわち、本発明に係る飲食品又は医薬品不在下でRAW264細胞を培養し、LPSにより炎症を誘発させた炎症発症群(対照群)と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品の存在下でRAW264細胞を培養し、LPSにより炎症を誘発させた炎症抑制群において、その炎症の発現が抑制された場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に抗炎症の作用を有すると判断できる。この場合の炎症抑制の程度を知るための評価方法として、RAW264細胞中のCOX-2及びiNOSのタンパク質の定量、PGE2の定量、サイトカイン類(IL-5、IL-6、IL-12、GM-CSF、MCP-1、TNF-α等)の定量によって、また、MAPK細胞信号伝達系及びNF-κB細胞信号伝達系の遺伝子の発現や、これらの遺伝子によって生ずるリン酸化タンパク質の量を測定することによって知ることができる。
【００６１】
本発明に係る飲食品又は医薬品のリパーゼ阻害作用の薬理評価としては、例えば高血脂の予防に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、一定期間(1〜2月)後に、血中の血糖値や中性脂肪を測定することによって比較する方法が挙げられる。本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取(投与)していない高脂肪餌の動物と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取(投与)した動物において、中性脂肪が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好にリパーゼ阻害作用を有すると判断することができる。あるいは、Nakai, M., et al., J. Agric. Food Chem., 53 (11), 4593-4598, 2005に記載の方法に準じて、すなわち、in vitroで本発明に係る飲食品又は医薬品存在下で基質4-methylumbelliferyl oleate(4-MUO)がリパーゼによって分解されて生じる4-methylumbelliferone(4-MU)の蛍光発光を測定し、その値からリパーゼ活性阻害率を算出する方法により本発明に係る飲食品又は医薬品のリパーゼ阻害作用を評価することができる。
【００６２】
本発明に係る飲食品又は医薬品のα-グルコシダーゼ阻害作用の薬理評価としては、例えば高血糖の予防に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、飼育後に、血糖の値を測定することによって比較する方法が挙げられる。本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取(投与)していない動物と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取(投与)した動物において、高血糖が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好にα-グルコシダーゼ阻害作用を有すると判断することができる。あるいは、Miwa I., et al., Clin. Chem. Acta, 37, 219-224,1972に記載の方法に準じて、すなわち、基質として麦芽糖(マルトース)又はサッカロースを使用し、in vitroで本発明に係る飲食品又は医薬品存在下におけるα-グルコシダーゼ阻害作用の程度を、生成するグルコース量を指標として算出し、本発明に係る飲食品又は医薬品のα-グルコシダーゼ阻害作用を評価することができる。
【００６３】
焙煎ビワ葉や非焙煎ビワ葉には、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び／又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)は全く認められない。一方、本発明においては、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を用いることで、リパーゼ阻害作用、α-グルコシダーゼ阻害作用、COX-2阻害作用及び/又はPGE2生合成阻害作用(いわゆる抗炎症作用)を有する飲食品又は医薬品を製造できる。これら飲食品又は医薬品は糖尿病、癌等の疾患の予防又は治療に有用である。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
なお、下記の実施例で使用するねじめびわ茶は、鹿児島県農業生産法人有限会社十津川農場から市販されているものである。
【００６６】
また、各実施例に伴う図中の結果は、各群の平均値又は平均値±標準偏差で示し、統計上5％以下で有意差のあるものにはアスタリスクマーク(*)を、1％以下で有意差のあるものにはダブルのアスタリスクマーク(**)を記した。
【００６７】
［実施例１］ねじめびわ茶の抽出物の抗酸化作用の効果
（１）ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」の調製
市販のねじめびわ茶から分画の抽出方法は、以下の特許文献に記載の方法を用いて行った(特許第4974116号公報)。
【００６８】
市販のねじめびわ茶(約1kg)を熱湯で繰り返し抽出した。具体的には、市販のねじめびわ茶葉を約100gごとに約400mlの熱湯で15分間煮沸し、10回に分けて抽出した。得られた熱湯抽出液を冷後、順次、MCI gel CHP-20Pのオープンカラムクロマトに付した。なお、ゲルの量は乾燥重量として、1kg前後量を使用することが好ましい。また、使用したガラスカラムのサイズは内径8cmであった。本実施例では、ガラスカラムを使用したが、カラムの材質はガラス、アクリル材質等に限定されなくても良い。溶媒を、水(2L)、30％エタノール水溶液(2L)、70％エタノール水溶液(2L)及び水-アセトン(1：1の比率)(2L)をそれぞれ用いて溶出させ、4つの分画を得た。水(2L)で溶出した乾燥粗製分画物を分画「A」という。30％エタノール水溶液(2L)で溶出した乾燥粗製分画物を分画「B」という。70％エタノール水溶液(2L)で溶出した乾燥粗製分画物（以下、分画「C」という）は13.18gであった。水-アセトン(1：1の比率)(2L)で溶出した乾燥粗製分画物を分画「D」という。
【００６９】
分画「C」を得る方法として、前記した熱湯で15分間煮沸し抽出した熱湯抽出液を冷やした後に、沈殿物が生じる場合は遠心分離機で処理することにより、その上澄み液をMCI gel CHP-20Pのオープンカラムクロマトに付して、得ることができた。また、MCI gel CHP-20Pのオープンカラムクロマトに付して分画Cを得るためには、70％エタノール水溶液(2L)で溶出させる代わりに50％エタノール水溶液(2L)で溶出させても、分画Cを得ることができた。
【００７０】
本「分画A、B、C、D」は、冷凍庫等で-20℃で保存することが可能である。
【００７１】
以降の実施例において、分画「A〜D」を用いて行った実験(すなわち、実施例２における分画「C1〜C9」の調製の出発物質である分画「C」以外)においては、50％エタノール溶出で得た分画「C」を用いた。
【００７２】
（２）ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」の抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Rabah, I.O., et al., J. Agric. Food Chem., 52, 7152-7157, 2004)。
【００７３】
サンプルは、前記（１）で得られた分画「A〜D」の4つの粗製分画物をそれぞれ50μg/mlの濃度で調整したもの、コントロールとしてねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を50μg/mlの濃度で調整したものを用いた。これらのサンプルを平底のプレート(96ウェル)に加え、さらにDPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl、マイクロモーラーの濃度で調整したもの)を190μL加え、10秒間混合した後、遮光して30分間放置した。この反応後、各ウェルの反応溶液を、490nmの波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、その吸光度の値からTroloxの吸光度標準曲線を用いてTrolox濃度を換算した。その換算値より、Troloxのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。
【００７４】
抗酸化作用の実験結果を図１に示す。図１中、A〜Dのサンプル記号は、それぞれの粗製分画「A〜D」に対応する。また、記号「M」はねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を示す。
【００７５】
図１に示すように、粗製分画「C」に強い抗酸化作用があることが分かる。また、粗製分画「C」の抗酸化作用は、ねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」に比べ1.5倍程度強くなることが分かる。
【００７６】
［実施例２］ねじめびわ茶の粗製分画物の抗酸化作用の効果
（１）ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の調製
市販のねじめびわ茶から粗製分画物の作出方法は、以下の特許文献に記載の方法を用いて行った(特許第4974116号公報)。
【００７７】
「実施例１」で得られた乾燥粗製分画物・分画「C」(13.18g)について、ODSのカラムクロマトに付した。当該分画「C」は、実施例１において70％エタノール水溶液で溶出した分画「C」である。なお、ゲルの量は乾燥重量として、1kg前後量を使用することが好ましい。また、使用したガラスカラムのサイズは内径8cmであった。本実施例では、ガラスカラムを使用したが、カラムの材質はガラス、アクリル材質等に限定されなくても良い。ODSのオープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にクロマトレックスODS(Chromatorex ODS、富士シリシア化学株式会社、Fuji Silysia Chemical LTD.)を用い、移動層にA液として蒸留水(H2O)、B液としてメタノール(MeOH)を用い、A液からB液の含量を増やすことによって各種クロマトグラフィーを行った。具体的には、溶媒として、80％H2O-20％MeOH(1L)、70％H2O-30％MeOH(1L)、60％H2O−40％MeOH(1L)、50％H2O−50％MeOH(1L)、40％H2O−60％MeOH(1L)、30％H2O-70％MeOH(1L)、20％H2O-80％MeOH(1L)、10％H2O-90％MeOH(1L)、100％MeOH(1L)を用いて溶出を行い、各1L溶出画分を分取し、それぞれ「C1」〜「C9」と称する計9個の分画を得た。この結果、粗製分画「C1〜C9」と称する9つの粗製分画物の収量は、粗製分画「C1」が540mg、粗製分画「C2」が570mg、粗製分画「C3」が720mg、粗製分画「C4」が630mg、粗製分画「C5」が420mg、粗製分画「C6」が490mg、粗製分画「C7」が1.71g、粗製分画「C8」が1.78g、粗製分画「C9」が3.33gであった。
【００７８】
本粗製分画「C1〜C9」は、冷凍庫等で-20℃で保存することが可能である。
【００７９】
これら9つの粗製分画物のうち粗製分画「C1〜C9」のTLC(thin layer chromatography、薄層クロマトグラフ)を図２及び図３に示す。図２及び図３中、1〜9の番号はそれぞれ粗製分画「C1〜C9」の結果を示す。なお、TLCに用いた展開溶媒は、ベンゼン-ギ酸エチル-ギ酸-水の4種の溶媒を用い、その比率を4：31：5：1の溶液用量で混合したものを用いた。発色試薬は、硫酸(H2SO4)を5〜10％程度の水に溶解したものを用い、TLCへ直接噴霧することにより、化合物を発色検出した。図２に示すように、252nmの紫外線照射によって影がみえるものはフェノール性の物質であることが分かる。また、図３に示すように、10％硫酸水溶液の噴霧後加熱によって茶色から淡青色に発色する物質が含まれていることが分かる。
【００８０】
（２）ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Rabah, I.O., et al., J. Agric. Food Chem., 52, 7152-7157, 2004)。
【００８１】
サンプルは、上記（１）で得られた分画「C1〜C9」の9つの粗製分画物をそれぞれ10μg/mlの濃度で調整したもの、コントロールとしてねじめびわ茶の抽出物「分画C」を10μg/mlの濃度で調整したものを用いた。
【００８２】
抗酸化作用の実験は実施例１と同様の方法で行った。
【００８３】
抗酸化作用の実験結果を図４に示す。図４中、1〜9のサンプルナンバーは、それぞれの粗製分画「C1〜C9」に対応する。また、「C」はねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を示す。
【００８４】
図４に示すように、粗製分画「C1」、「C2」及び「C4」に強い抗酸化作用があることが分かる。また、粗製分画「C1」、「C2」及び「C4」の抗酸化作用は、ねじめびわ茶の抽出物・分画「C」に比べ1.4倍程度強くなることが分かる。
【００８５】
［実施例３］ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」のリパーゼ阻害作用の効果
リパーゼ阻害作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Nakai, M., et al., J. Agric. Food Chem., 53 (11), 4593-4598, 2005)。
【００８６】
サンプルは、「実施例１」で得られたねじめびわ茶の分画「A〜D」の4つの粗製分画物を用いてリパーゼ阻害作用の程度をIC50の濃度(mg/ml)として算出した。コントロールとしてねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を用いた。
【００８７】
リパーゼ活性測定は、基質4-methylumbelliferyl oleate(4-MUO)がリパーゼによって分解されて生じる4-methylumbelliferone(4-MU)の蛍光発光を測定し、その値からリパーゼ活性阻害率を算出する。実験は以下の方法で行った。96ウェル(黒)にびわ茶サンプル50μlと4-MUO液20μlを添加し、1分間混合した後、リパーゼ液25μlを添加し30秒間混合した。37℃で30分インキュベートした後、0.1Mクエン酸ナトリウムを100μl添加し、反応を停止させ、蛍光マルチラベルカウンターの355nm(励起波長）、460nm(発光波長)で蛍光発光を測定した。その値からリパーゼ活性阻害率を算出する。
【００８８】
リパーゼ阻害作用の実験結果を図５に示す。図５中、A〜Dのサンプル記号は、それぞれの粗製分画「A〜D」に対応する。また、記号「M」はねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を示す。
【００８９】
図５に示すように、粗製分画「C」に強いリパーゼ阻害作用があることが分かる。また、粗製分画「C」のリパーゼ阻害作用は、ねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」に比べ2.5倍程度強くなることが分かる。
【００９０】
［実施例４］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」のリパーゼ阻害作用の効果
リパーゼ阻害作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Nakai, M., et al., J. Agric. Food Chem., 53 (11), 4593-4598, 2005)。
【００９１】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C9」の9つの粗製分画物を用いてリパーゼ阻害作用の程度をIC50の濃度(mg/ml)として算出した。コントロールとしてねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を用いた。
【００９２】
リパーゼ阻害作用の実験は実施例３と同様の方法で行った。
【００９３】
リパーゼ阻害作用の実験結果を図６に示す。図６中、1〜9のサンプルナンバーは、それぞれの粗製分画「C1〜C9」に対応する。また、「C」はねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を示す。
【００９４】
図６に示すように、粗製分画「C2」に強いリパーゼ阻害作用があることが分かる。また、粗製分画「C2」のリパーゼ阻害作用は、ねじめびわ茶の抽出物・分画「C」と同等であった。
【００９５】
［実施例５］ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」のα-グルコシダーゼ阻害作用の効果
α-グルコシダーゼ阻害作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Miwa I., et al., Clin. Chem. Acta, 37, 219-224,1972)。
【００９６】
サンプルは、「実施例１」で得られたねじめびわ茶の分画「A〜D」の4つの粗製分画物を用いてα-グルコシダーゼ阻害作用の程度をIC50の濃度(mg/ml)として算出した。コントロールとしてねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を用いた。基質として、麦芽糖(マルトース)とサッカロースを使用した。
【００９７】
実験は、グルコースCIIテストワコー(和光純薬)を用いてグルコース検量線及びびわ茶によるα-グルコシダーゼ阻害作用を測定した。マイクロチューブに基質、粗酵素液、びわ茶サンプルを10μlずつ添加し、37℃、60分で反応させた。その後、100℃で10分間加熱して反応を停止させ、マイクロチューブに発色試液1.1mlと試料7.33μlを添加し、よく混合後、37℃、5分間で反応させ、分光光度計の505nmで測定した。α-glucosidase活性阻害率は、びわ茶サンプルからブランクを引いて生成グルコース量の減量から算出した。
【００９８】
α-グルコシダーゼ阻害作用の実験結果を図７に示す。図７中、A〜Dのサンプル記号は、それぞれの粗製分画「A〜D」に対応する。また、記号「M」はねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を示す。
【００９９】
図７に示すように、粗製分画「C」に非常に強いα-グルコシダーゼ阻害作用があることが分かる。
【０１００】
［実施例６］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C4」のα-グルコシダーゼ阻害作用の効果
α-グルコシダーゼ阻害作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Miwa I., et al., Clin. Chem. Acta, 37, 219-224,1972)。
【０１０１】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C1〜C4」の4つの粗製分画物を用いてα-グルコシダーゼ阻害作用の程度をIC50の濃度(mg/ml)として算出した。コントロールとしてねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を用いた。基質として、麦芽糖(マルトース)とサッカロースを使用した。
【０１０２】
α-グルコシダーゼ阻害作用の実験は実施例５と同様の方法で行った。
【０１０３】
α-グルコシダーゼ阻害作用の実験結果を図８に示す。図８中、1〜4のサンプルナンバーは、それぞれの粗製分画「C1〜C4」に対応する。また、「C」はねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を示す。
【０１０４】
図８に示すように、粗製分画「C2」に比較的強いα-グルコシダーゼ阻害作用があることが分かる。
【０１０５】
［実施例７］ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」の一酸化窒素産生の抑制作用の効果
一酸化窒素産生の抑制作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Archer, S. FASEB J., 7, 349-360,1993)。
【０１０６】
サンプルは、「実施例１」で得られたねじめびわ茶の分画「A〜D」の4つの粗製分画物を用いて一酸化窒素産生の抑制作用の程度をLPSで誘導したものを100％として、その程度を百分率で比較した。コントロールとしてねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を用いた。
【０１０７】
一酸化窒素の測定は、Griess法で行った。Griess法はNOが酸化されて生じるNO2によるジアゾニウム塩化化合物をナフチルエチレンジアミンのアゾカップリングを利用して検出する方法である。より詳しくは、ビワ茶と共培養したマクロファージ細胞(RAW264.7)の培地上清を96ウェルプレートに100μlずつ分注し、さらにGriess試薬を100μlずつ添加し、室温で10min反応をさせた。その後、マイロプレートリーダーで（550nm）で測定し、吸収度の強さによるNOの産生量を換算した。
【０１０８】
一酸化窒素産生の抑制作用の実験結果を図９に示す。図９中、A〜Dのサンプル記号は、それぞれの粗製分画「A〜D」に対応する。また、記号「M」はねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を示す。
【０１０９】
図９に示すように、粗製分画「C」はLPSで誘導される一酸化窒素産生を70％程度抑制する効果のあることが分かる。
【０１１０】
［実施例８］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の一酸化窒素産生の抑制作用の効果
一酸化窒素産生の抑制作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Archer, S. FASEB J., 7, 349-360,1993)。
【０１１１】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の粗製分画物を用いて一酸化窒素産生の抑制作用の程度をLPSで誘導したものを100％として、その程度を百分率で比較した。コントロールとしてねじめびわ茶の抽出物・分画「C」を用いた。
【０１１２】
一酸化窒素産生の抑制作用の実験は実施例７と同様の方法で行った。
【０１１３】
一酸化窒素産生の抑制作用の実験結果を図１０に示す。図１０中、びわ茶の粗製分画物・分画「C2」は白抜きのカラム、また、抽出物・分画「C」は黒地のカラムで示す。
【０１１４】
図１０に示すように、抽出物・分画「C」及び粗製分画「C2」は濃度依存的にLPSで誘導される一酸化窒素産生をコントロールと同程度まで抑制する効果のあることが分かる。
【０１１５】
［実施例９］抗炎症作用の調査方法
抗炎症作用を調査するための実験方法は、以下の特許文献に記載の方法を用いて行った(特開2012-56952号公報)。
【０１１６】
［実験１］細胞の培養法
（１）細胞の種類
RIKEN CELL BANKから入手したマウスのマクロファージ様細胞(Cell No.RCB0535、以下、「RAW264」と称す)を用いた。
【０１１７】
（２）培地の準備
D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium "Nissui")9.5gを水(H2O)1Lに溶解し、オートクレーブにて高温加圧滅菌した。冷却後、10％NaHCO3溶液を15ml加え、抗生物質混合試薬(PSG[penicillin、streptomycin、glutamin]：Gibco 100mL Lot No.1185891)を10mL加えた。FBS(Fetal Bovine Serum：Equitech-Bio 500mL Lot No.SFB30-1463)溶液を前記調整した溶液に10%の割合で添加し、培地を準備した。
【０１１８】
（３）細胞の継代
予め冷凍庫(-80℃)にて保管しておいたRAW264細胞を解凍し、前記調整した培地(以下、「培地」と称す)を10mL添加し、細胞と混合した。軽く混ぜ、遠心分離(1000rpm、5min)し、上澄みを捨て、この操作を2回繰り返した。上澄みを除去し、トリプシン(Trypsin-EDTA：Gibco 100mL)を1mL加え、培地9mLを加え攪拌した後、遠心分離(1000rpm、5min)し、上澄み培地を除去、培地10mLを加えた。細胞の入った培地を10cmのシャーレに置床した。各シャーレのRAW264細胞の濃度が1〜3x105セル数程度になるよう調整した。細胞は、37℃、5％の二酸化炭素(CO2)を気流に混入させたインキュベーター(以下、「CO2インキュベーター」と称す)中で培養した。
【０１１９】
［実験２］細胞中のCOX-2の誘導法
（１）コントロール細胞の培養
シャーレ(6mLサイズ)中、RAW264細胞の濃度が1x106セル数になるよう調整した。これを予め37℃、21時間、CO2インキュベーターで培養した。培養後、細胞をシャーレ(3mLサイズ)へ置床した。このときは、培地にFBS溶液を加えなかった。引き続き、37℃、3時間、CO2インキュベーターで培養した。培養後、リポ多糖を5ng/μLに調整したもの(以下、「LPS」と称す)を、24μL培地へ添加し、37℃、12時間、CO2インキュベーターで培養した。この方法により、COX-2に加えて、COX-1、iNOSの誘導も調査した。
【０１２０】
（２）試験化合物の調整
びわ茶の抽出物及び粗製分画物・分画を各12.5〜100μMの濃度で溶解した。溶媒に水(H2O)とジメチルスルフォキシド(以下、「DMSO」と称す)を用いた。以下、この濃度に調整したサンプルを「試験化合物」と称す。
【０１２１】
（３）試験細胞の培養
シャーレ(6mLサイズ)中、RAW264細胞の濃度が1x106セル数になるよう調整した。これを予め37℃、21時間、CO2インキュベーターで培養した。培養後、細胞をシャーレ(3mLサイズ）へ置床した。このときは、培地にFBS溶液を加えなかった。引き続き、37℃、2時間半、CO2インキュベーターで培養した。培養後、調整した試験化合物を添加し、37℃、30分間、CO2インキュベーターで培養した。これに、リポ多糖を5ng/μLに調整したもの(以下、「LPS」と称す)を、24μL培地へ添加し、37℃、12時間、CO2インキュベーターで培養した。この方法により、COX-2に加えて、COX-1、iNOSの誘導も調査した。
【０１２２】
［実験３］細胞中のCOX-2タンパク質の回収と検出法
（１）COX-2タンパク質の回収
前記実験２（１）及び（３）で培養した細胞を回収した。回収した細胞を37℃、PBS(KCl：0.02％、KH2PO4：0.02％、NaHPO4・12H2O：0.29％、NaCl：0.8％の水溶液)で洗浄後、SDS試薬(1M Tris-HCl、pH6.8を1.25mL；SDS(2％w/v）0.4g；Glycerol(10％)2mL；1M DTT(50mM)1mL；bromophenol blue(0.1％)0.02gを混合したもの)を20mL添加し、100℃、5分間煮沸加熱し、細胞中のタンパク質を回収した。
【０１２３】
（２）COX-2タンパク質の検出
前記（１）にて回収したタンパク質溶液を、発現したCOX-2タンパク質を調べるためには10μL、発現したCOX-1タンパク質を調べるためには30μL、発現したiNOSタンパク質を調べるためには37μLを電気泳動用ウェルにそれぞれ吸着させた。定電流で電気泳動を行った。メンブランを活性化し、よく洗浄した後、トランスファー緩衝液に浸積し、ゲル板と濾紙とを共に装着し、定電流でトランスファーした。回収したメンブランについてウェスタンブロットを行い、抗体反応を繰り返し行い、化学発光検出器によってタンパク質を検出した。検出されたタンパク質について、Lumi Vision Analyzer 140を用いて、泳動画像を保存した。
【０１２４】
［実施例１０］ねじめびわ茶の抽出物・分画「A〜D」のCOX-2及びiNOS発現抑制作用の効果
COX-2及びiNOSの発現抑制作用の実験は、以下の特許文献に記載の方法を用いて行った(特開2012-56952号公報)。
【０１２５】
サンプルは、「実施例１」で得られたねじめびわ茶の分画「A〜D」の4つの粗製分画物を用いてCOX-2及びiNOSの発現抑制作用の程度をLPSでCOX-2の発現とiNOSの発現を誘導した電気泳動の図と比較した。コントロールとしてねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を用いた。また、ねじめびわ茶の分画「C」について、濃度依存的なCOX-2及びiNOSの発現抑制を調査した。
【０１２６】
COX-2及びiNOSの発現抑制作用の実験結果を図１１に示す。図１１中、A〜Dのサンプル記号は、それぞれの粗製分画「A〜D」に対応する。また、記号「M」はねじめびわ茶の熱湯抽出物「M」を示す。それぞれ200μg/mlの濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１２７】
図１１に示すように、粗製分画「C」及び「D」はLPSで誘導されるCOX-2及びiNOSの発現抑制効果のあることが分かる。
【０１２８】
また、びわ茶の粗製分画「C」について、濃度依存的なCOX-2及びiNOSの発現抑制作用の実験結果を図１２に示す。びわ茶の粗製分画「C」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってCOX-2及びiNOSの発現抑制が強くなることが分かる。
【０１２９】
［実施例１１］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」のCOX-2及びiNOS発現抑制作用の効果
COX-2及びiNOSの発現抑制作用の実験は、以下の特許文献に記載の方法を用いて行った(特開2012-56952号公報)。
【０１３０】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の粗製分画物を用いてCOX-2及びiNOSの発現抑制作用の程度をLPSで誘導したものを100％として、その程度を百分率で比較した。具体的には、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」について、濃度依存的なCOX-2及びiNOSの発現抑制を調査した。
【０１３１】
COX-2及びiNOSの発現抑制作用の濃度依存的実験結果を図１３に示す。図１３中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、50、100、200μg/mlの濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１３２】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってCOX-2及びiNOSの発現抑制が強くなることが分かる(図１３)。
【０１３３】
［実施例１２］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」のサイトカイン産生抑制作用の効果
サイトカイン産生抑制作用の実験は、Bio-Rad社のマウスサイトカインアッセイキットを用いてサスペンションアレイシステム器機で行った。
【０１３４】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の粗製分画物を用いてサイトカイン産生抑制作用の程度をLPSで誘導したものを各サイトカイン産生量の濃度として比較した。具体的には、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」について、濃度依存的なサイトカイン産生抑制の効果を調査した。
【０１３５】
サイトカイン産生抑制作用の実験は、Bio-Rad社のマウスサイトカインアッセイキットを用いてサスペンションアレイシステム器機で行った。具体的にマウスマクロファージ様細胞RAW264.7(ATCC, TIB-71，USA)を1.2×105個細胞/1ml/ウェルの濃度で12ウェルプレートに撒き、21.5時間前培養した。前培養後、FBS(牛胎児血清)未添加のDMEM培地に培地交換し2.5時間飢餓させた。その後にビワ茶画分液を加え、さらに0.5時間後LPS(終濃度が40ng/ml)を添加した。12時間培養後上清を1ml回収した。マウス23種類サイトカインの測定は、測定キット(Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex Panel, M60-009RDPD: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-17, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, KC, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES and TNFα)を用いた。サイトカインとそれぞれの抗体を結合させるため、一次抗体ビーズ溶液と各ビワ茶培養後上清(又はStandard液）をブラック96 Well Plateに50μlずつ分注し、アルミで遮光、60分間振動(1100rpm 1min, 300rpm 59min)で混合した。MAG×3液で洗浄した後、ビオチン化抗体を25μlずつ分注し、アルミで遮光、30分間振動(1100rpm 1min, 300rpm 29min)で混合した。MAG×3液で洗浄した後、ストレプトアビジン-フィコエリスリン(PE)液を25μlずつ分注し、アルミで遮光、10分間振動(1100rpm 1min, 300rpm 9min)で混合した。MAG×3液で洗浄した後、Assay Bufferを125μl加え、1分間振動(1100rpm 1min)で混合し、サスペンションアレイシステム器機で測定を行った。データから蛍光強さの絶対値及びStandardによる換算した濃度値(pm/ml)とも求めた。
【０１３６】
（１）IL-5について
IL-5の産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１４に示す。図１４中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１３７】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-5の産生が抑制されることが分かる(図１４)。
【０１３８】
（２）IL-6について
IL-6の産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１５に示す。図１５中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１３９】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-6の産生が抑制されることが分かる(図１５)。
【０１４０】
（３）IL-12について
IL-12の産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１６に示す。図１６中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１４１】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってIL-12の産生が抑制されることが分かる(図１６)。
【０１４２】
（４）GM-CSFについて
GM-CSFの産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１７に示す。図１７中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１４３】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってGM-CSFの産生が抑制されることが分かる(図１７)。
【０１４４】
（５）MCP-1について
MCP-1の産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１８に示す。図１８中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１４５】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってMCP-1の産生が抑制されることが分かる(図１８)。
【０１４６】
（６）TNF-αについて
TNF-αの産生抑制作用の濃度依存的実験結果を図１９に示す。図１９中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。
【０１４７】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を100、200、200μg/ml以上と増やすことによってTNF-αの産生が抑制されることが分かる(図１９)。
【０１４８】
［実施例１３］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」のMAPK細胞信号伝達系抑制作用の効果
MAPK細胞信号伝達系抑制作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Hou.D.X.et al., Carcinogenesis,25：29-36,2004年)。
【０１４９】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の粗製分画物を用いてMAPK細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものをp38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の濃度を比較した。具体的には、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」について、濃度依存的なMAPK細胞信号伝達系抑制の効果を調査した。
【０１５０】
MAPK細胞信号伝達系抑制作用の実験は実施例９の［実験１］、［実験２］及び［実験３］に準じた細胞培養、細胞タンパク質の回収と検出法を用いて行った。検出用の抗体はERK、JNK、p38及びそれぞれのリン酸化抗体を使った。
【０１５１】
p38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の濃度依存的変化の結果を図２０に示す。図２０中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、「C」のサンプル記号は、粗製分画「C」に対応し、それぞれ50、100、200μg/mlの濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。比較のために粗製分画「C」の実験も加えた。その結果を図２１に示した。
【０１５２】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってp38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量が抑制されることが分かる(図２０)。これに対してびわ茶の粗製分画「C」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってp38、ERK、JNKの発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量を調査したが、「C2」のそれに対して抑制の程度は低かった(図２１)。
【０１５３】
［実施例１４］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」のNF-κB細胞信号伝達系抑制作用の効果
NF-κB細胞信号伝達系抑制作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Hou.D.X. et al.，Biochemical Pharmacology 74 : 742-751, 2007年)。
【０１５４】
サンプルは、「実施例２」で得られたねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」の粗製分画物を用いてNF-κB細胞信号伝達系抑制作用の程度をLPSで誘導したものをIκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質発現量の電気泳動の濃度を比較した。具体的には、ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」について、濃度依存的なNF-κB細胞信号伝達系抑制の効果を調査した。
【０１５５】
NF-κB細胞信号伝達系抑制作用の実験は実施例９の［実験１］、［実験２］及び［実験３］に準じた細胞培養、細胞タンパク質の回収と検出法を用いて行った。検出用の抗体はp65、IKK、TAK1、IκB及びそれぞれのリン酸化抗体を使った。
【０１５６】
IκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量の電気泳動の濃度依存的変化の結果を図２２に示す。図２２中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、それぞれ50、100、200μg/mlの濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlで炎症を誘発させた。比較のために粗製分画「C」の実験も加えた。その結果を図２３に示した。
【０１５７】
びわ茶の粗製分画「C2」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってIκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量が抑制されることが分かる(図２２)。これに対してびわ茶の粗製分画「C」の濃度を50、100、200μg/mlと増やすことによってIκB、IKK、TAK1の発現遺伝子の濃度とそれらのリン酸化タンパク質の発現量を調査したが、「C2」のそれと同等の抑制を示した(図２３)。
【０１５８】
［実施例１５］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「A〜D」のLPS誘発によるPGE2産生抑制作用の効果について
LPS誘発によるPGE2産生抑制作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った(Uto, T.,et al., Biochemical Pharmacology 70,1772-1784, 2005）。RAW264.7細胞を1.2×105/ml/well(12 well plate)になるようにまき、21時間培養後、牛胎児血清が含まれていない培地(FBS-free DMEM)で交換し、さらに2.5時間培養した。ビワ茶サンプルを加え、30分培養後、LPSを40ng/mlになるように添加し、さらに12時間培養した。得られた細胞培養液を回収し、PGE2測定キットを用いて測定した。
【０１５９】
ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「A〜D」について、PGE2産生の抑制効果試験を行った。その結果を図２４に示す。図２４中、「A〜D」のサンプル記号は、粗製分画「A〜D」に対応し、それぞれ200μg/mlの濃度で実験した。また、LPSは40ng/mlの濃度で炎症を誘発させた。比較のために抽出物「M」も加えた。ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「A〜D」はLPSで誘導されたPGE2の産生を非常に強く抑制していることが分かる（図２４）。図中、折れ線は細胞の生存率を示す。図中、アスタリスクを付けたものは、LPS誘発によるPGE2の産生を統計上に有意に抑えた。
【０１６０】
［実施例１６］ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」のLPS誘発によるPGE2産生抑制作用の効果について
実験は実施例１５と同様の方法で行った。
【０１６１】
ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」について、PGE2産生の抑制効果試験を行った。その結果を図２５に示す。図２５中、「C2」のサンプル記号は、粗製分画「C2」に対応し、それぞれ100、200、200μg/ml以上の濃度で実験した。また、LPSは2％の濃度で炎症を誘発させた。比較のために粗製分画「C」も加えた。ねじめびわ茶の粗製分画物・分画「C2」及び「C」の両者はLPSで誘導されたPGE2の産生を抑制していることが分かる(図２５）。図中、折れ線は細胞の生存率を示す。
【０１６２】
［実施例１７］ねじめびわ茶の抽出物のICRマウスのLPS誘発による足浮腫の炎症抑制効果について
（１）ICRマウスのLPS誘発による足浮腫のモデル実験
ICRマウスの体重を25±2gに均等化し、日中と夜間をそれぞれ12時間のサイクルとして日中に照明を確保し、餌と水をランダムに与え飼育した。1グループを3匹としてびわ茶の抽出物を200mg/kgの容量で4日間毎日皮下注射した。コントロールとして0.9％の塩化ナトリウムを溶解した等張液を同様の容量で4日間毎日皮下注射した。コントロールのICRマウスはそのまま何もせず放置した(Ctlグループ）。0.9％の塩化ナトリウムを溶解した等張液を200mg/kgの容量で4日間毎日皮下注射した別のグループのICRマウス3匹に対して4日目に足の裏に0.1％LPS(重量/容量）25μLを皮下注射した(LPSグループ)。また、びわ茶の抽出物を200mg/kgの容量で4日間毎日皮下注射したICRマウス3匹に対しても同様に4日目に足の裏に0.1％LPS(重量/容量)25μLを皮下注射した(LPS+Biwaグループ)。3グループの足の厚さを0.1％LPS(重量/容量)25μLを皮下注射した後から1時間ごとにデジタルカリパスを用いて測定した。時間ごとに足の厚さを測定し、ビワ茶による足の浮腫抑制を比較した。
【０１６３】
（２）ICRマウスの足浮腫による足周囲の長さ(直径)の測定
表１に0.1％LPS（重量/容量）25μLを皮下注射した後に測定した3グループの足の周囲の長さ(直径)を示す。びわ茶の抽出物を投与したグループでは投与しなかったグループと比較して足の厚さが有意に減少し、LPS誘発による足浮腫を抑える効果のあることが分かる。
【０１６４】
【表１】
2014177454.tif 000003
【０１６５】
（３）ICRマウスの足浮腫の実態顕微鏡での障害の観察
LPSの皮下注射6時間後にICRマウスを解剖し、足浮腫を比較し、その障害の程度を観察した。その写真を図２６に示す。LPS+BiwaグループのICRマウスの足浮腫がLPSグループのICRマウスに比べて大きく改善されていることが分かる（図２６）。
【０１６６】
［実施例１８］ねじめびわ茶の抽出物「M」・粗製分画「A〜D」及び粗製分画物・分画「C1〜C9」に含まれるポリフェノール含量の測定について
ねじめびわ茶の抽出物「M」・粗製分画「A〜D」及び粗製分画物・分画「C1〜C9」の粉末に含まれているフェノール性成分量を測定した。具体的には、各分画粉末を炭酸ナトリウム溶液で3分間処理した後、50％Folin-Ciocalteau試薬を用いて室温で30分間処理し、595nmの波長を測定して没食子酸と比較して値を算出した。
【０１６７】
その結果を図２７及び図２８に示す。図２７中、粗製分画「C」は相対的にポリフェノール含量が高いことが分かる。また、図２８中、粗製分画物・分画「C2」は相対的にポリフェノール含量が高いことが分かる。
【０１６８】
[実施例１９]ねじめびわ茶抽出物の機能性成分の定量及び性質付け
ねじめびわ茶とビワ葉の抽出物の機能性成分を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて解析した。HPLC分離は、CresPak C18T-5カラム(4.6 mm i.d. × 250 mm)を用いて40℃で行った。
【０１６９】
結果を図２９及び表２に示す。
【０１７０】
図２９中の(A)のパネルにおいて、ねじめびわ茶とビワ葉の抽出物のHPLC分離の結果を示す((a)ビワ葉、(b)ねじめびわ茶の熱湯抽出物M、(c)分画C、及び(d)分画C2)。また、(B)のパネルには、実施例１８に記載の方法に準じて行ったフェノール性成分量を測定した結果を示す（「Fresh」：ビワ葉、「M」：ねじめびわ茶の熱湯抽出物M、「A」：分画A、「B」：分画B、「C」：分画C、「D」：分画D、「C2」：分画C2)。
【０１７１】
また、以下の表２において、「Leaves water extract(L)」はビワ葉の水抽出物を示し、「Tea water extract(T)」はねじめびわ茶の熱湯抽出物Mを示し、「Fraction C」は分画Cを示し、且つ「Fraction C2」は分画C2を示す。
【０１７２】
【表２】
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【０１７３】
図２９及び表２に示すように、ビワ葉に存在する既知の4つの主要活性分(3-カフェオイルキナ酸(3-caffeoylquinic acid：3-CQA)、5-カフェオイルキナ酸(5-caffeoylquinic acid：5-CQA)、(-)-エピカテキン((-)-epicatechin：EC)及びプロシアニジンB2(procyanidin B2：PCB2))を標品として解析した結果、3-CQA、5-CQA、EC及びPCB2は、ビワ葉の水抽出物(L)に多く、ねじめびわ茶の熱湯抽出物Mには少量しか存在しなかった。
【０１７４】
一方、精製分画した分画C及ぶ分画C2においては、3-CQA、5-CQA、EC及びPCB2が検出されなかった。その代わりに、ビワ葉の水抽出物には存在しなかった新しい成分が検出された（表２に示すCompound 1及びCompound 2）。当該新しい成分についてFT-IRで解析した結果、多くのO-H、また、複数のC-H、C=C、C-C環が見られ、単一置換したベンゼン環と推定された。さらに、1H-NMRで解析した結果、芳香族的、又はオレフィンのようなプロトン、メチレンや脂環式プロトンが認められた。これらの化合物の最終的な構造はまだ同定されていないが、ビワ葉をローストするビワ茶製造過程に産生された複数のフェノール性化合物であると考えられた。これらの化合物が抗酸化活性等を有し、ねじめびわ茶の機能性物質の一部であると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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