(57)【要約】【課題】虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる医薬組成物を提供する。【解決手段】虚血に起因する障害の治療、予防又は診断に使用するための医薬組成物は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤。ＰＰＡＲγ作動剤及び造影剤からなる群より選ばれる１種以上の物質と、前記物質を内部に封入する生体適合性粒子と、を含む。前記生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５〜１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含むものであってもよい。【選択図】図１
2014196281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤、ＰＰＡＲγ作動剤及び造影剤からなる群より選ばれる１種以上の物質と、
前記物質を内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む、虚血に起因する障害の治療、予防又は診断に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
前記虚血に起因する障害は、
虚血再灌流障害である、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤は、
シクロスポリンである、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＰＰＡＲγ作動剤及びアンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤は、
イルベサルタンである、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＰＡＲγ作動剤は、
ピオグリタゾンである、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記虚血に起因する障害は、
虚血状態になった臓器における障害である、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記臓器の梗塞の大きさを小さくする、
ことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記物質は、
シクロスポリンであって、
前記虚血に起因する障害は、
左室リモデリングである、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞症（ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、以下単に「ＡＭＩ」とする。）は、虚血性心疾患の中で最も重篤な病態である。ＡＭＩを含む冠動脈疾患によって、世界中で年間７００万人が死亡しており、冠動脈疾患は、死因の第一位となっている。ＡＭＩ発症急性期の血行再建術やβ遮断薬及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤等による標準的な薬物治療の普及によって、急性期の死亡率は減少し、重篤な梗塞後心不全の発症も抑制されている。しかし、梗塞後心不全による予後は悪く、心不全による死亡者数及び入院患者数は増加の一途をたどっている。
【０００３】
ＡＭＩの最も重要な予後規定因子は、梗塞の大きさである。このため、梗塞を縮小させる早期の再灌流療法がＡＭＩに対する唯一の最適治療である（非特許文献１参照）。これによって、心原性ショック、致死性不整脈及び心不全が減少する。
【０００４】
一方、再灌流療法による冠血流回復で不可逆的な心筋細胞の壊死が促進され、再灌流療法の効果が制限される再灌流障害が問題となっている。
【０００５】
再灌流障害の原因の１つとして、酸化ストレスによるミトコンドリア膜透過性遷移孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ‐ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ、以下単に「ｍＰＴＰ」とする。）の開口が考えられている（非特許文献２参照）。このため、再灌流障害を抑制する治療因子としてｍＰＴＰ開口抑制活性を有するシクロスポリンが有望視されている（非特許文献３乃至９参照）。この他、再灌流障害を抑制する治療因子としては、その心保護効果により、例えば、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  II  ｔｙｐｅ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋｅｒ：以下、単に「ＡＲＢ」とする。非特許文献１０乃至１２参照）及びＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ作動剤（非特許文献１３乃至１７参照）が考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｉｍｅｌｉｎｅｓｓ  ｏｆ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｓｔ‐ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＪＡＭＡ，２０１０，３０３，２１４８‐２１５５
【非特許文献２】Ｓｈａｎｍｕｇａｎａｔｈａｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，２８９，Ｈ２３４‐Ｈ２４２
【非特許文献３】Ｇｏｍｅｚ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＫ３ｂｅｔａ  ｂｙ  ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００８，１１７，２７６１‐２７６８
【非特許文献４】Ｂｏｅｎｇｌｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｂｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｙｏｃｈａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｉｏｌ，２０１０，１０５，７７１‐７８５
【非特許文献５】Ｌｉｍ  ＳＹ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，２００７，７５，５３０‐５３５
【非特許文献６】Ｈｕｈｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉａ  ｂｌｏｃｋｓ  ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ；  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｓｅｓｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ，Ｂｒ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ，２００８，１００，４６５‐４７１
【非特許文献７】Ａｒｇａｕｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００５，３８，３６７‐３７４
【非特許文献８】Ｋｒｏｌｉｋｏｗｓｋｉ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ，２００５，１０１，１５９０‐１５９６
【非特許文献９】Ｌｉｕ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｂｙ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ，  Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ，２０１１，５５，６２２‐６３０
【非特許文献１０】Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  II  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＴＣＶ‐１１６  ｏｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ‐ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，１９９４，１２８，１‐６
【非特許文献１１】Ｊａｌｏｗｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＡＴ１‐ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ＡＴ２‐ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，１９９８，３２，１７８７‐１７９６
【非特許文献１２】Ｊｕｇｄｕｔｔ  ＢＩ  ｅｔ  ａｌ．ＡＴ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＡＴ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，２６０，１１１‐１１８
【非特許文献１３】Ｍｅｒｓｍａｎｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｉｓ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉ／Ｒ，Ｓｈｏｃｋ，２００８，３０，６４‐６８
【非特許文献１４】Ｙｕｅ  Ｔｌ  ＴＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１，１０４，２５８８‐２５９４
【非特許文献１５】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｕｔｅ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｓ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ‐ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ＡＭＰＫ，  Ａｋｔ，  ａｎｄ  ＪＮＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１１，３０１，Ｈ８９５‐Ｈ９０２
【非特許文献１６】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＰＡＲ‐γ  ａｎｄ  ＡＭＰＫ‐ａｄｖａｎｔａｇｅｏｕｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１１，８２，１９５‐２００
【非特許文献１７】Ａｂｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｏｎ  ｒａｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５８９，２１５‐２１９
【非特許文献１８】Ｄｏｗ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７，１２９，１５３‐１６３
【非特許文献１９】Ｐａｇｅｌ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｌｋａｌｏｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｈｅｌｉｕｍ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ，２００９，１０８，１０７６‐１０８２
【非特許文献２０】Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ＬＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ，  ２．５  ｍｇ／ｋｇ，  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔ  Ｓｉｚｅ  ｉｎ  ａ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０１２，１７，１５９‐１６３
【非特許文献２１】Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ＬＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ａ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｓｃｈｅｍｉａ‐ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０１０，１５，１８２‐１８９
【非特許文献２２】Ｐｉｏｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｏｎ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００８，３５９，４７３‐４８１
【非特許文献２３】Ｍｅｗｔｏｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１０，５５，１２００‐１２０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、シクロスポリンには梗塞の大きさを縮小する効果がないという対極の結果も複数報告されている（非特許文献１８乃至２１参照）。また、ＡＭＩ患者を対象とした小規模臨床試験（対照群：３０人、シクロスポリン投与群：２８人）において、経皮的冠動脈インターベンションによる再灌流療法後の心臓壁運動異常の大きさ及び血中心筋逸脱酵素の増加を、シクロスポリンが抑制したものの、半年後の左室リモデリングの抑制には至っていない（非特許文献２２及び２３参照）。さらに、シクロスポリンは、臨床用量における副作用として、腎毒性、高血圧等が知られている。このため、再灌流障害抑制薬としてのシクロスポリンの用量を、十分な薬効が得られるまで増加させることは困難である。
【０００８】
また、ＡＲＢ及びＰＰＡＲγ作動剤による心保護効果は、虚血前に投与されることを前提とする。このため、臨床の現場において投与のタイミングの見極めが難しく、再灌流障害抑制薬としての薬効が確実に得られるとは言い難い。このように、シクロスポリン等の治療因子の虚血に起因する障害における治療薬としての役割は確立されていないのが現状である。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の観点に係る虚血に起因する障害の治療、予防又は診断に使用するための医薬組成物は、
ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤、ＰＰＡＲγ作動剤、及び造影剤からなる群より選ばれる１種以上の物質と、
前記物質を内部に封入する生体適合性粒子と、
を含む。
【００１１】
この場合、前記虚血に起因する障害は、
虚血再灌流障害である、
こととしてもよい。
【００１２】
また、前記生体適合性粒子は、
個数平均粒子径が２．５〜１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体又はそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤は、
シクロスポリンである、
こととしてもよい。
【００１４】
また、前記ＰＰＡＲγ作動剤及びアンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤は、
イルベサルタンである、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記ＰＰＡＲγ作動剤は、
ピオグリタゾンである、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記虚血に起因する障害は、
臓器における障害である、
こととしてもよい。
【００１７】
また、前記医薬組成物は、
前記臓器の梗塞の大きさを小さくする、
こととしてもよい。
【００１８】
また、前記物質は、
シクロスポリンであって、
前記虚血に起因する障害は、
左室リモデリングである、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体適合性粒子に封入されたミトコンドリア膜透過性遷移孔開口抑制剤、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤、ＰＰＡＲγ作動剤及び造影剤からなる群より選ばれる１種以上の物質が虚血部位に選択的に輸送されるため、虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるシクロスポリン（Ｃｓ）封入粒子による梗塞面積の縮小作用を示す図である。
【図２】心筋虚血再灌流モデルマウスから得られた心臓の画像を示す。Ａは、冠動脈閉塞部及び冠動脈閉塞部領域の光学画像と蛍光画像とを示す。Ｂは、心臓の短軸断面の、エバンスブルー/ＴＴＣ染色画像及び蛍光画像を示す。Ｃは、拡大したＦＩＴＣ蛍光画像、ＦＩＴＣ免疫染色画像及びヘマトキシリン‐エオシン（ＨＥ）染色画像を示す。
【図３】心筋虚血再灌流モデルマウスから抽出したミトコンドリア画分及び細胞画分の光学画像、蛍光画像及びＦＩＴＣを定量したデータを示す図である。Ａは、ミトコンドリア画分に関する図である。Ｂは、細胞画分に関する図である。
【図４】生理食塩水又は過酸化水素に暴露し、ＦＩＴＣ封入粒子を作用させた培養心筋細胞の画像及び過酸化水素に暴露した培養心筋細胞のＦＩＴＣ陽性細胞の割合を示す図である。
【図５】心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるシクロスポリン及びシクロスポリン封入粒子の濃度を示す図である。Ａは、虚血心筋におけるシクロスポリン及びシクロスポリン封入粒子の濃度の経時変化を示す図である。Ｂは、非虚血心筋におけるシクロスポリン及びシクロスポリン封入粒子の濃度の経時変化を示す図である。Ｃは、再灌流から５分後及び３０分後の虚血心筋及び非虚血心筋から抽出したミトコンドリア画分におけるシクロスポリンの濃度を示す図である。
【図６】心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、再灌流３０分後の時点で得られた虚血心筋の心臓サンプル由来の細胞内ミトコンドリア画分及び細胞画分各々から抽出したタンパク質を検出したデータを示す図である。Ａは、ウェスタンブロッティングの結果を示す図である。Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれｓｈａｍを基準としたシトクロムＣ／ＧＡＰＤＨ、シトクロムＣ／ＶＤＡＣ、Ｂａｘ／ＧＡＰＤＨ及びＢａｘ／ＶＤＡＣを示す図である。
【図７】シクロフィリンＤノックアウトマウスにおけるシクロスポリン封入粒子の治療効果を示す図である。Ａは、虚血領域の面積に対する梗塞面積を示す図である。Ｂは、左室心筋全体の面積に対する虚血領域の面積の割合を示す図である。
【図８】Ａは、生理食塩水、シクロスポリン及びシクロスポリン封入粒子を投与した心筋虚血再灌流モデルマウスに対する虚血前及び再灌流から１、２、４週間後の２次元心エコー検査の結果を示す図である。Ｂは、再灌流４週後の左室拡張末期径を示す図である。Ｃは、再灌流４週後の左室収縮末期径を示す図である。Ｄは、再灌流４週後の短縮率を示す図である。Ｅは、再灌流４週後の駆出率を示す図である。
【図９】心筋虚血再灌流モデルマウスの再灌流６時間後の心臓、血液及び脾臓における白血球のフローサイトメトリー解析でのＦＩＴＣシグナルの結果を示す図である。
【図１０】イルベサルタン（Ｉｒｂ）封入粒子を投与した心筋虚血再灌流モデルマウスの再灌流１２時間後の心臓における単球/マクロファージ及び炎症マーカーに関するフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。
【図１１】Ａは、心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるイルベサルタン（Ｉｒｂ）封入粒子及びピオグリタゾン（Ｐｉｏ）封入粒子の梗塞面積の縮小作用を示す図である。Ｂは、心筋虚血再灌流モデルマウスにおける左室心筋全体の面積に対する虚血領域の面積の割合を示す図である。
【図１２】イルベサルタン（Ｉｒｂ）封入粒子投与時の心筋虚血再灌流モデルマウスの虚血心筋におけるＰＰＡＲγ活性を示す図である。
【図１３】心筋虚血障害モデルマウス（上段）及びｓｈａｍ（下段）から得られた心臓の短軸断面の光学画像及び蛍光画像を示す。
【図１４】心筋虚血障害モデルマウスから得られた心臓の短軸断面の画像を示す。上段は、ＦＩＴＣ封入粒子を投与した虚血部位の光学画像と蛍光画像とを示す。下段は、ＦＩＴＣを投与した虚血部位の光学画像と蛍光画像とを示す。
【図１５】図１４のＦＩＴＣ封入粒子を投与した虚血部位の蛍光画像を拡大した画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１について説明する。本実施の形態に係る医薬組成物は、ｍＰＴＰ開口抑制剤、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗剤及びＰＰＡＲγ作動剤からなる群より選ばれる１種以上の物質と、当該物質を内部に封入する生体適合性粒子とを含む。以下では、生体適合性粒子に封入する物質としてｍＰＴＰ開口抑制剤を用いる場合を説明する。
【００２２】
ｍＰＴＰ開口抑制剤は、ｍＰＴＰの開口を直接的、あるいは間接的に抑制するあらゆる物質、例えば、化合物、合成物、天然物、ペプチド、核酸等を含む。ｍＰＴＰは、シクロフィリンＤ、ＶＤＡＣ（ｖｏｌｔａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）等から構成され、ミトコンドリア内膜と外膜との接触部位にある孔構造である。ｍＰＴＰは、ｍＰＴＰ開口抑制剤は、例えば、シクロスポリンであることが好ましい。シクロスポリンは、環状ポリペプチドで、カルシニューリン阻害作用を有し、免疫抑制剤として用いられている。シクロスポリンは、シクロフィリンＤに結合し、シクロフィリンＤを内膜から除去することで、ｍＰＴＰの開口を抑制することが知られている。ｍＰＴＰ開口抑制剤として、シクロスポリンの中で天然に最も多いシクロスポリンＡを用いてもよい。また、ｍＰＴＰ開口抑制剤として、Ｎ‐メチル‐バリン‐シクロスポリン、Ｎ‐メチル‐４‐イソロイシン-シクロスポリン(ＮＩＭ８１１)等のシクロスポリンの誘導体を用いてもよい。
【００２３】
また、ｍＰＴＰ開口抑制剤として、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼを介してｍＰＴＰの開口を抑制するｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼ阻害剤、ｃＧＭＰアナログ及び一酸化窒素産生剤の他、２‐アミノエトキシジフェニルホウ酸塩（２‐ＡＰＢ）、ボングクレキン酸、サングフェリンＡ及び吸入麻酔薬、例えばイソフルラン等を挙げることができる。
【００２４】
ｍＰＴＰ開口抑制剤は、市販のものを用いることができる。また、ｍＰＴＰ開口抑制剤は、既知の合成法、例えば化学反応又は酵素反応を利用した合成法で製造することができる（例えば、シクロスポリンであれば特開２００５‐３２５０６１号公報参照）。この他、ｍＰＴＰ開口抑制剤は、化合物ライブラリに含まれる化合物の中から、ｍＰＴＰ開口抑制作用を有する化合物として選択した化合物であってもよい。
【００２５】
ｍＰＴＰ開口抑制作用を有する化合物の選択には、既知の方法、例えば、蛍光色素カルセインを用いた画像解析あるいはフローサイトメトリーで評価する方法等を利用してもよい。また、ｍＰＴＰ開口抑制作用は、市販の測定キットを用いて定量してもよい。より具体的には、該測定キットは、例えば、ＭｉｔｏＰｒｏｂｅ（商標）  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｐｏｒｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（モレキュラープローブス社製）等である。
【００２６】
ｍＰＴＰ開口抑制剤を内部に封入する生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーから製造することができる。生体適合性ポリマーは、その様々な平均鎖長によって、内部粘性及びポリマー特性の差異をもたらす。本実施の形態で用いられるポリマーは、生体への刺激や毒性が低い生体適合性を備え、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが好ましい。生体内分解性のポリマーとしては、例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート等の部生物で産生される高分子及びコラーゲン、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、ハイアミロースコーンスターチ、澱粉、キトサン等の天然高分子等が挙げられる。
【００２７】
生体適合性ポリマーから得られた生体適合性粒子は、封入するｍＰＴＰ開口抑制剤を持続して放出、すなわち徐放することが好ましい。このため、生体適合性ポリマーとしては、例えば分子量５，０００〜２００，０００のもの、分子量１５，０００〜２５，０００のものが好ましい。
【００２８】
生体適合性粒子は、生体適合性ポリマー、例えば生体適合性ポリエステルから製造することができる。生体適合性ポリエステルは、例えばＤ，Ｌ‐ラクチド、Ｄ‐ラクチド、Ｌ‐ラクチド、Ｄ，Ｌ‐乳酸、Ｄ‐乳酸、Ｌ‐乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε‐カプロラクトン、ε‐ヒドロキシヘキサン酸、γ‐ブチロラクトン、γ‐ヒドロキシ酪酸、δ‐バレロラクトン、δ‐ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸等から選択される１種又はそれ以上のモノマーを重合することにより合成されるポリエステルである。好ましくは、生体適合性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又は乳酸・アスパラギン酸共重合体、とりわけポリラクチドグリコライド共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリエチレングリコール／キトサン修飾‐ＰＬＧＡ（ＰＥＧ／ＣＳ‐ＰＬＧＡ）である。
【００２９】
生体適合性ポリマーとしてのＰＬＧＡは、例えば１：９９〜９９：１、好ましくは３：１の割合で、乳酸又はラクチドとグリコール酸又はグリコライドとからなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから一般的な方法で合成してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）が挙げられる。乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトン等の有機溶媒に可溶である点で好ましい。
【００３０】
上記生体適合性粒子をＰＬＧＡから製造する場合、生体適合性粒子は、その粒子径が１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜６００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜５００ｎｍ、最も好ましくは２００〜４００ｎｍのＰＬＧＡを含むようにしてもよい。粒子径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験等で測定できる。粒子径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、粒子径は、複数の粒子を測定対象として、その平均で表した個数平均粒子径、体積平均粒子径、面積平均粒子径等であってもよい。例えば、個数平均粒子径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒子径である。具体的には、粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を平均粒子径としてもよい。
【００３１】
ＰＬＧＡで製造された生体適合性粒子は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位等に移行しやすいため、封入するｍＰＴＰ開口抑制剤を内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位等で持続して放出する点で好ましい。
【００３２】
また、上記生体適合性粒子は、ＰＬＧＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体を用いて製造してもよい。ＰＬＧＡの表面をＰＥＧで修飾すると、血中安定性が向上する点で好ましい。
【００３３】
上記生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーとｍＰＴＰ開口抑制剤を、例えば、レーザー回折・散乱法等で測定したときに１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜３００ｎｍ、最も好ましくは１００〜２５０ｎｍの個数平均粒子径を有する粒子に加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造することができる。生体適合性粒子は、例えば、球形晶析法で製造することができる。球形晶析法は、晶析操作中に析出する結晶を球状に造粒する方法である。球形晶析法によれば、製造する化合物の物性を制御して化合物を加工できる。例えば、球形晶析法には、エマルジョン溶媒拡散法（以下、単に「ＥＳＤ法」とする）がある。
【００３４】
ＥＳＤ法では、物質、例えばｍＰＴＰ開口抑制剤等を封入する生体適合性ポリマーを溶解する良溶媒と、生体適合性ポリマーを溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、生体適合性ポリマーを溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒及び貧溶媒の種類は、封入される物質の種類等に応じて決定されるものであり、特に限定されるものではない。本実施形態に係る生体適合性粒子は、主に人体に作用させる医薬製剤の原料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、かつ環境負荷の少ないものを用いることが好ましい。
【００３５】
貧溶媒としては、水又は界面活性剤を添加した水が挙げられる。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール水溶液が好ましい。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。なお、ポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去の後に、遠心分離等によりポリビニルアルコールを除去してもよい。
【００３６】
良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ又はアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。
【００３７】
ＥＳＤ法では、まず、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、生体適合性ポリマーが析出しないように、ｍＰＴＰ開口抑制剤溶解液を良溶媒中へ添加混合する。生体適合性ポリマーとｍＰＴＰ開口抑制剤を含む混合液を、攪拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、直径数μｍほどの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマー及びｍＰＴＰ開口抑制剤の溶解度が低下する。最終的には、ｍＰＴＰ開口抑制剤を封入した球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離又は減圧留去し、生体適合性粒子粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、又は必要に応じて凍結乾燥等により再分散可能な凝集粒子に複合化される。複合化された粒子は、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子として、容器内に充填される。このようにして得られたｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子には、好ましくは、ｍＰＴＰ開口抑制剤が０．１〜９９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましく２〜３％（ｗ／ｖ）封入される。
【００３８】
上記球形晶析法では、得られるｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子が略球形であるため触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要がない。また、球形晶析法によれば、粒子径のばらつきが少ないｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を容易に形成することができる。
【００３９】
なお、生体適合性粒子内部へのｍＰＴＰ開口抑制剤の封入率を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子を貧溶媒中に添加した場合は、生体適合性粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルション滴表面に存在するｍＰＴＰ開口抑制剤と相互作用し、貧溶媒中へのｍＰＴＰ開口抑制剤の漏出を抑制することができると考えられる。
【００４０】
カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）等が挙げられる。特にキトサン又はその誘導体が好適に用いられる。
【００４１】
キトサンは、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合した天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性等の特徴を有するため、化粧品、食品、衣料品及び医薬品等の原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、生体への悪影響がなく、安全性の高いｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を製造することができる。
【００４２】
以上のようにして得られたｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子は、凍結乾燥等により粉末化させる際に再分散可能な凝集粒子（ナノコンポジット）に複合化できる。このとき、有機又は無機の物質を再分散可能に複合化させ、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子と共に乾燥させることが好ましい。例えば、糖アルコールやショ糖を用いることにより、封入率のばらつきを効果的に防止するとともに、糖アルコール等が賦形剤となりｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子の取り扱いやすさを高めることができる。糖アルコールとしては、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトース、キシリトース等が挙げられ、この中でも特にトレハロースが好ましい。
【００４３】
この複合化により、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子が集まった、取り扱いやすい凝集粒子となっている。そして、使用時に水分に触れることでｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子は、粒子に戻って高反応性等の特性を示す。なお、凍結乾燥法に代えて、例えばアグロマスタＡＧＭ（ホソカワミクロン社製）を使用した流動層乾燥造粒法により複合化して、再度分離可能な状態で一体化することもできる。
【００４４】
本実施の形態に係るｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）のｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む。
【００４５】
本実施の形態に係るｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤等が好ましい。このとき、当該医薬組成物は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として酸化ストレス疾患治療薬に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００４６】
賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ‐マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等である。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ‐マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等である。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等である。
【００４７】
溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール等である。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ‐マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤は、界面活性剤、親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等である。
【００４８】
等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ‐マンニトール等である。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコール等である。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等である。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等である。
【００４９】
本実施の形態に係るｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、ｍＰＴＰの開口が関与する様々な状態、例えば、虚血に起因する障害の治療又は予防に使用するのが好適である。虚血に起因する障害は、例えば、虚血障害、虚血再灌流障害等を含む。虚血に起因する障害には、虚血による組織への酸素供給の低下、細胞及び細胞内小器官の膨化、ミトコンドリア膜及びライソゾーム膜の破壊等を起因とする状態異常、細胞障害、血管障害、臓器傷害等、さらに再灌流によって惹起される状態異常、細胞障害、血管障害、臓器傷害等も含む。ここで、虚血部位は、好ましくは、心臓、肺、腎臓、脳等の臓器である。この場合、虚血に起因する障害は、虚血状態になった臓器における障害となる。
【００５０】
特に、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、下記実施例に示すように、虚血状態になった臓器の梗塞の大きさを小さくする。この点においても、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、虚血に起因する障害の治療又は予防に使用するのが好適である。梗塞の大きさは、ＡＭＩの最も重要な予後規定因子である。このため、当該医薬組成物は、ＡＭＩの予後における心原性ショック、致死性不整脈及び心不全を減少させる。
【００５１】
ＰＬＧＡを含む生体適合性粒子は、下記実施例６に示すように、虚血領域に効率よく選択的に送達される。また、当該生体適合性粒子にｍＰＴＰ開口抑制剤としてシクロスポリンを封入したシクロスポリン封入粒子は、下記実施例７に示すように心筋の虚血領域でｍＰＴＰの開口を抑制する。また、下記実施例９に示すように、シクロスポリン封入粒子は、虚血に起因する障害である左室リモデリングを抑制する。左室リモデリングは、心筋梗塞などの虚血の際、心機能の低下を代償するために左室に進行性の過負荷が加えられ、梗塞部の伸展に引き続き、進行性の左室容積増大から心不全に移行する現象を言う。左室リモデリングは、心室性不整脈、心臓突然死の背景因子とも言われている。このため、左室リモデリングを抑制することで、心不全などの予後を大きく改善することができる。
【００５２】
この他、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位等に移行しやすいため、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓等の臓器移植における拒絶反応の抑制、骨髄移植における拒絶反応及び移植片対宿主病の抑制、ベーチェット病、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬、再生不良性貧血、赤芽球癆及びネフローゼ症候群、炎症細胞が関与する炎症性疾患等に適用されてもよい。
【００５３】
本実施の形態に係るｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子を含む医薬組成物の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。当該医薬組成物は、ｍＰＴＰ開口抑制剤が治療上有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なｍＰＴＰ開口抑制剤の量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。当該医薬組成物の投与量は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。当該医薬組成物を分割して投与する場合、当該医薬組成物は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、当該医薬組成物は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００５４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、下記実施例に示すように、生体適合性粒子に封入されたｍＰＴＰ開口抑制剤が虚血部位に選択的に輸送され、除放的にｍＰＴＰ開口抑制剤を放出する。このため、虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる。
【００５５】
また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ｍＰＴＰ開口抑制剤を生体適合性粒子に封入しない場合と比較して、低濃度で十分な薬効が得られるので、ｍＰＴＰ開口抑制剤の全身的副作用、例えば、ｍＰＴＰ開口抑制剤としてシクロスポリンを用いた場合の腎毒性、高血圧等のリスクを小さくして、安全性を高めることができる。
【００５６】
また、本実施の形態では、ｍＰＴＰ開口抑制剤を封入する生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５〜１０００ｎｍのＰＬＧＡ又はそのＰＥＧ修飾体を含むものでもよいこととした。ＰＬＧＡは、生体に対する刺激や毒性が低い生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性を備えるため、医薬用途、特に人体への投与に適している。また、ＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、血中安定性が向上するため、代謝吸収安定性等の薬物動態プロファイルを最適化するのに有用である。また、ｍＰＴＰ開口抑制剤を封入したＰＬＧＡ及びＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位等に輸送され、蓄積され、封入するｍＰＴＰ開口抑制剤を徐放するので、ｍＰＴＰ開口抑制剤を選択的に安全に対象部位に輸送することができる。
【００５７】
なお、本実施の形態では、生体適合性粒子に封入するｍＰＴＰ開口抑制剤は、シクロスポリンであってもよいこととした。シクロスポリンは、下記実施例において生体適合性粒子に封入することで虚血領域に選択的に輸送され、優れた梗塞面積の縮小作用、すなわち臓器保護作用を発揮する。
【００５８】
また、本実施の形態では、虚血に起因する障害は、虚血状態になった臓器における障害であってもよいこととした。本実施の形態に係る生体適合性粒子は、下記実施例に示すように、血管透過性が高く、炎症細胞の集積する臓器虚血領域に選択的に輸送される。このため、心臓の他、肺、腎臓、脳等の虚血状態になった臓器における障害に対しても臓器保護作用を発揮する。
【００５９】
なお、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子には、１種又は２種以上のｍＰＴＰ開口抑制剤を封入してもよい。また、ｍＰＴＰ開口抑制剤封入粒子には、１種又は２種以上のｍＰＴＰ開口抑制剤とその他の薬剤、例えば抗生物質、抗炎症剤、ビタミン、又はｍＰＴＰ開口抑制剤と併用することが望ましくない薬剤以外のものとを封入してもよい。
【００６０】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
【００６１】
本実施の形態に係る医薬組成物は、生体適合性粒子に封入される物質がＡＲＢである点が上記実施の形態１に係る医薬組成物と異なる。ＡＲＢは、血圧降下作用を示すため、高血圧患者等に広く使用されている。ＡＲＢは、動物実験において心筋梗塞後の梗塞の大きさ、心筋梗塞後リモデリング、心不全に対する内因性保護因子（ブラジキニン、プロスタグランジン等）の分泌亢進、抗炎症作用等の複数のメカニズムを介して心保護作用をもたらす（非特許文献１１、１２参照）。さらに、ＡＲＢは、ＡＭＩ患者の左室リモデリングを抑制し、生命予後を改善することも明らかにされている（Ｄｉｃｋｓｔｅｉｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｏｓａｒｔａｎ  ａｎｄ  ｃａｐｔｏｐｒｉｌ  ｏｎ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈ‐ｒｉｓｋ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ＯＰＴＩＭＡＡＬ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔｒｉａｌ  ｉｎ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  II  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｌｏｓａｒｔａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２５，６１２‐６１６）。
【００６２】
ＡＲＢは、直接的、あるいは間接的なアンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有するあらゆる物質、例えば、化合物、合成物、天然物、ペプチド、核酸等を含む。例えば、ＡＲＢとしては、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、オルメサルタンメドキソミル等を用いるのが好ましく、イルベサルタンを用いるのがより好ましい。
【００６３】
ＡＲＢは、市販のものを用いることができる。また、ＡＲＢは、既知の合成法、例えば化学反応を利用した合成法で製造することができる（例えば、ロサルタンであれば特表２００６−５０４６１８号公報参照）。この他、化合物ライブラリに含まれる化合物の中から、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有する化合物として選択した化合物を用いてもよい。
【００６４】
アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有する化合物を選択する方法には、既知の方法、例えば蛍光プローブを用いて培養細胞内のＣａ濃度を測定する方法等がある。また、被験物質のアンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を定量する各種キットが市販されており、それを用いてもよい。
【００６５】
ＡＲＢは、例えば、上記実施の形態１のようにＥＳＤ法等によって、ＰＬＧＡから製造した生体適合性粒子に封入される。ＡＲＢを封入した生体適合性粒子は、その個数平均粒子径が１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜３００ｎｍ、最も好ましくは１００〜２５０ｎｍであればよい。また、ＡＲＢを封入した生体適合性粒子には、好ましくは、ＡＲＢが０．１〜９９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましく３〜４％（ｗ／ｖ）封入される。
【００６６】
このようにして得られたＡＲＢ封入粒子を含む医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）のＡＲＢ封入粒子を含む。また、本実施の形態に係るＡＲＢ封入粒子を含む医薬組成物は、上記実施の形態１と同様の用量、投与方法等で用いられる。
【００６７】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、下記実施例に示すように、生体適合性粒子に封入されたＡＲＢが虚血部位に選択的に輸送され、除放的にＡＲＢを放出する。このため、虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる。
【００６８】
また、ＡＲＢによる血圧低下が心筋梗塞を惹起する可能性がある。心筋梗塞は心不全、心原性ショック等の重篤な副作用を引き起こすことが知られている。これに対し、虚血心筋部位に選択的に輸送されるＡＲＢ封入粒子は、ＡＲＢを低濃度で使用することを可能にするため、上記重篤な副作用を回避して安全性を高めることができる。
【００６９】
また、本実施の形態では、ＡＲＢは、イルベサルタンであってもよいこととした。イルベサルタンは、下記実施例に示すように下記実施例において生体適合性粒子に封入することで虚血領域に選択的に輸送され、優れた臓器保護作用を発揮する。また、イルベサルタンは、そのＰＰＡＲγ作動作用により虚血部位でのＰＰＡＲγ活性を亢進させるので、虚血に起因する障害に対するさらなる薬効が得られる。
【００７０】
なお、ＡＲＢ封入粒子には、１種又は２種以上のＡＲＢを封入してもよい。また、ＡＲＢ封入粒子には、１種又は２種以上のＡＲＢとその他の薬剤、例えば、上記ｍＰＴＰ開口抑制剤を封入してもよい。また、ＡＲＢと共に封入され得るその他の薬剤は、抗生物質、抗炎症剤、ビタミン又はＡＲＢと併用することが望ましくない薬剤以外のものであってもよい。
【００７１】
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について説明する。
【００７２】
本実施の形態に係る医薬組成物は、生体適合性粒子に封入される物質がＰＰＡＲγ作動剤である点が上記実施の形態１に係る医薬組成物と異なる。ＰＰＡＲγ作動剤は、ＰＰＡＲγを直接的、あるいは間接的に活性化するあらゆる物質、例えば、化合物、合成物、天然物、ペプチド、核酸等を含む。例えば、ＰＰＡＲγ作動剤は、ロシグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン等を含むチアゾリジンジオン系の物質、非ステロイド性抗炎症薬等であっても、ニトロリノール酸、酸化ＬＤＬ、長鎖脂肪酸、エイコサノイド、リゾリン脂質等の内在性リガンド及びその誘導体等であってもよい。ＰＰＡＲγ作動剤としては、特にピオグリタゾンが好ましい。
【００７３】
また、ＰＰＡＲγ作動剤は、他の作用、例えば、アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有するものであってもよい。アンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有するＰＰＡＲγ作動剤としては、イルベサルタン及びテルミサルタン等が好ましい。特にイルベサルタンは、組織移行性に優れる点で特に好ましい。
【００７４】
ＰＰＡＲγ作動剤は、市販のものを用いることができる。また、ＰＰＡＲγ作動剤は、既知の合成法、例えば化学反応を利用した合成法で製造することができる（例えば、イルベサルタンであれば特表２００８‐５１７８９５号公報参照）。この他、化合物ライブラリに含まれる化合物の中から、ＰＰＡＲγ作動活性を有する化合物として選択した化合物を用いてもよい。
【００７５】
ＰＰＡＲγ作動活性を有する化合物を選択する方法には、既知の方法、例えば培養細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイ法、プレートに固相化したＮｃｏＲと複合体を形成したＰＰＡＲγに被験物質が結合することによるＰＰＡＲγの解離を検出する方法等がある。また、被験物質のＰＰＡＲγ作動活性を定量する各種キットが市販されており、それを用いてもよい。
【００７６】
ＰＰＡＲγ作動剤は、例えば、上記実施の形態１のようにＥＳＤ法等によって、ＰＬＧＡから製造した生体適合性粒子に封入される。ＰＰＡＲγ作動剤を封入した生体適合性粒子は、その個数平均粒子径が１，０００ｎｍ未満、例えば２．５〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜８００ｎｍ、より好ましくは２５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜４００ｎｍ、最も好ましくは２００〜４００ｎｍであればよい。また、ＰＰＡＲγ作動剤を封入した生体適合性粒子には、好ましくは、ＰＰＡＲγ作動剤が０．１〜９９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましく３〜４％（ｗ／ｖ）封入される。
【００７７】
このようにして得られたＰＰＡＲγ作動剤封入粒子を含む医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）のＰＰＡＲγ作動剤封入粒子を含む。また、本実施の形態に係るＰＰＡＲγ作動剤封入粒子を含む医薬組成物は、上記実施の形態１と同様の用量、投与方法等で用いられる。
【００７８】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、下記実施例に示すように、生体適合性粒子に封入されたＰＰＡＲγ作動剤が虚血部位に選択的に輸送され、除放的にＰＰＡＲγ作動剤を放出する。このため、虚血に起因する障害に対する薬効をより確実に得ることができる。
【００７９】
また、ＰＰＡＲγ作動剤には、肝臓毒性、過剰体液貯留または浮腫を含む用量依存的な有害な副作用が知られている。本実施の形態に係る医薬組成物は、ＰＰＡＲγ作動剤を生体適合性粒子に封入しない場合と比較して、低濃度で十分な薬効が得られるので、ＰＰＡＲγ作動剤の副作用のリスクを小さくして、安全性を高めることができる。
【００８０】
また、本実施の形態では、ＰＰＡＲγ作動剤は、イルベサルタンであってもよいこととした。イルベサルタンは、下記実施例に示すように下記実施例において生体適合性粒子に封入することで虚血領域に選択的に輸送され、優れた臓器保護作用を発揮する。また、イルベサルタンは、そのＰＰＡＲγ作動作用により虚血部位でのＰＰＡＲγ活性を亢進させ、かつ上述のようにアンジオテンシンIIタイプ１受容体拮抗作用を有するので、虚血に起因する障害に対するさらなる薬効が得られる。
【００８１】
また、本実施の形態では、ＰＰＡＲγ作動剤は、ピオグリタゾンであってもよいこととした。ピオグリタゾンは、下記実施例に示すように下記実施例において生体適合性粒子に封入することで虚血領域に選択的に輸送され、優れた梗塞面積の縮小作用、すなわち臓器保護作用を発揮する。
【００８２】
なお、ＰＰＡＲγ作動剤封入粒子には、１種又は２種以上のＰＰＡＲγ作動剤を封入してもよい。また、ＰＰＡＲγ作動剤封入粒子には、１種又は２種以上のＰＰＡＲγ作動剤とその他の薬剤、例えば、上記ｍＰＴＰ開口抑制剤及びＡＲＢを封入してもよい。ＰＰＡＲγ作動剤と共に封入され得るその他の薬剤は、抗生物質、抗炎症剤、ビタミン又はＰＰＡＲγ作動剤と併用することが望ましくない薬剤以外のものであってもよい。
【００８３】
なお、上記実施の形態１と同様に、本実施の形態及び上記実施の形態２に係る医薬組成物は、薬理的に許容される担体を含んでもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として酸化ストレス疾患治療薬に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００８４】
（実施の形態４）
次に、本発明の実施の形態４について説明する。
【００８５】
本実施の形態に係る医薬組成物は、生体適合性粒子に封入される物質が造影剤である点が上記実施の形態１に係る医薬組成物と異なる。造影剤は、特に限定されず、体内での位置を外部から検出可能な物質であればよい。造影剤は、例えば、標識物質、蛍光物質、放射性物質、磁性物質、ガドリニウム化合物、ヨード造影剤等である。
【００８６】
造影剤は、例えば、上記実施の形態１のようにＥＳＤ法等によって、ＰＬＧＡから製造した生体適合性粒子に封入される。
【００８７】
造影剤封入粒子を含む医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として約０．１％〜９９％、約１％〜約５０％、好ましくは１〜２０％（％は重量％）の造影剤封入粒子を含む。本実施の形態に係る造影剤封入粒子を含む医薬組成物は、虚血に起因する障害の診断に用いられる。当該造影剤封入粒子は、静脈又は動脈に投与されてもよいし、経口投与されてもよいし、チューブ等を用いて消化管内に注入されてもよい。また、当該造影剤封入粒子は臓器等に注射されてもよい。封入した造影剤に対応する検出装置又は検出方法で体内の当該造影剤封入粒子を検出することで、虚血に起因する障害の診断が可能である。
【００８８】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、下記実施例１４に示すように、虚血部位に選択的に輸送され滞留するため、封入した造影剤を外部から効率よく検出できる。これにより、虚血部位の検出感度が向上するため、虚血に起因する障害の診断をより正確にできる。また、当該医薬組成物は、虚血部位に選択的に輸送されるので、造影剤の投与量を減らすことができるため、安全性も高まる。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００９０】
（実施例１：薬剤封入粒子の作製）
１．２ｇのＰＬＧＡ（和光純薬社製、ＰＬＧＡ７５２０、乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００）と０．０５ｇのシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ社製）とを、アセトン４０ｍＬ及びエタノール２０ｍＬの混合溶媒に溶解しポリマー溶液とした。これを４０℃、４００ｒｐｍで攪拌した０．５ｗｔ％ＰＶＡ溶液１２０ｍＬ中に一定速度（４ｍＬ／ｍｉｎ）で滴下し、シクロスポリン封入粒子懸濁液を得た。続いて減圧下４０℃、１００ｒｐｍで攪拌を続けながら、混合溶媒を留去した。約２時間の混合溶媒留去後、懸濁液をフィルターろ過（目開き３２μｍ）し、ろ液を一晩凍結乾燥し、シクロスポリン封入粒子の乾燥粉末を得た。得られた乾燥粉末は、個数平均粒子径が２２１ｎｍ、ＰＬＧＡに対するシクロスポリンの封入率は、２．６７％（ｗ／ｖ）であった。
イルベサルタン封入粒子は、１５０ｍｇのイルベサルタン（塩野義製薬社製）を用いて同様に作製した。得られたイルベサルタン封入粒子の乾燥粉末は、個数平均粒子径が２３４ｎｍ、ＰＬＧＡに対するイルベサルタンの封入率は、３．２９％（ｗ／ｖ）であった。
ピオグリタゾン封入粒子は、１００ｍｇのピオグリタゾン（武田薬品社製）を用いて同様に作製した。得られたピオグリタゾン封入粒子の乾燥粉末は、個数平均粒子径が３８０ｎｍ、ＰＬＧＡに対するピオグリタゾンの封入率は、３．７％（ｗ／ｖ）であった。
また、蛍光マーカー（ＦＩＴＣ）を封入したＦＩＴＣ封入粒子及び何も封入していないＰＬＧＡ粒子を同様に製造した。ＦＩＴＣ封入粒子の乾燥粉末は、個数平均粒子径が２２５ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＦＩＴＣの封入率は、５％（ｗ／ｖ）であった。なお、以下実施例４及び実施例５においては、ＰＬＧＡに対するＦＩＴＣの封入率が４．０６％（ｗ／ｖ）のＦＩＴＣ封入粒子を用いた。
ここで、個数平均粒子径の定義は以下のように定義した。その粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を累積中位径（平均粒子径）として一般的に粒度分布を評価するパラメータとして定義した。平均粒子径は、ナノ粒子を蒸留水に懸濁したサンプルをＭｉｃｒｏｔｒａｃｋ  ＵＰＡ１５０（日機装社製）を用いて光散乱法で計測した。
【００９１】
（実施例２：心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるシクロスポリン封入粒子の評価）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８‐１０週齢、雄、２５‐３０ｇ、ｎ＝８）の腹腔内にペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与し麻酔した。手技中は、人工呼吸器管理を行った（１回の換気量：０．５ｍＬ、呼吸数１４０回／分）。手技中は、加温パッドを用いてマウスを保温し、直腸温を３６．８℃から３７．２℃に維持した。第３−４肋間の高さで水平に切開し、心膜を開いた。外径１ｍｍのシリコンチューブに８‐０シルクを通してスネア状にし、左心耳の下縁で左前下行枝を結紮した。心電図のＳＴ変化、心筋の色調変化を観察し、心筋の虚血を確認した。結紮から３０分経過後にシリコンチューブを除去し、再灌流を行い、同時に被験物質の溶液を静脈に注射した。５‐０シルクにて閉胸後、自発呼吸を確認して抜管した。静脈に注射した被験物質は、生理食塩水、ＦＩＴＣ封入粒子、シクロスポリン（１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇ）、シクロスポリン封入粒子（１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇ）とした。なお、対照としてのＦＩＴＣ封入粒子は、シクロスポリン封入粒子と同等のＰＬＧＡを含む濃度で用いた。
再灌流から２４時間後、再度麻酔し、気管内挿管後に開胸した。左前下行枝を上記と同じ部位で同様に結紮し、虚血領域（Ａｒｅａ  ａｔ  Ｒｉｓｋ；ＡＡＲ）を明瞭にするために、２％のエバンスブルーを下大動脈から投与した。続いて速やかに心臓を摘出し、−８０℃で凍結させた。左室を１ｍｍの厚さに短軸方向にスライスし、切片を切り出した。得られた切片における心筋を、１％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）溶液内で染色した（３７℃、１０分間）。各切片の梗塞（白色部位）、ＡＡＲ（赤色部位）及び左室心筋全体の面積を計測し、梗塞面積／ＡＡＲの面積とＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積とを算出した。
【００９２】
（結果）
ＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積は、４群で同等であった。図１は、算出した梗塞面積／ＡＡＲの面積を示す。生理食塩水投与群と比較して、シクロスポリン（Ｃｓ）封入粒子投与群では、１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇの濃度で梗塞面積が有意に縮小した（Ｐ＜０．００１）。一方、シクロスポリン（Ｃｓ）投与群では、１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇの濃度で生理食塩水投与群と比較して梗塞面積の有意な縮小は見られなかった。なお、ＦＩＴＣ封入粒子投与群は、生理食塩水投与群と比較して梗塞面積の有意な縮小は見られなかったため、ＰＬＧＡの粒子による梗塞面積の縮小が否定された。
【００９３】
（実施例３：心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるＦＩＴＣ封入粒子の動態）
上記心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、再灌流と同時に生理食塩水、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ封入粒子を静脈に注射した１０分後にマウスから心筋組織を採取し、凍結病理標本を作製した。病理標本の評価において光学及び蛍光顕微鏡はＳＭＺ１５００（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いた。また、ＦＩＴＣ投与群の標本では、核染色用試薬としてＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｈ１２００）を用いた。ＨＥ染色にはマイヤー・ヘマトキシリン（武藤科学社製）及びエオシンＹ１％液（武藤科学社製）を用いた。
【００９４】
（結果）
凍結病理標本の光学及び蛍光顕微鏡画像を図２Ａに示す。蛍光画像において、光学画像で確認される冠動脈閉塞部及び冠動脈閉塞部領域にＦＩＴＣ蛍光が観察できる。図２Ｂは、凍結病理標本の短軸断面像を示す。ＦＩＴＣ投与群の標本では、エバンスブルー／ＴＣＣ染色で確認された梗塞部位（白色）に、ＦＩＴＣの蛍光が確認されなかった。一方、ＦＩＴＣ封入粒子投与群の標本では、梗塞部位（白色）に一致してＦＩＴＣの蛍光が観察された。図２Ｃは、ＦＩＴＣ投与群の標本の蛍光画像、免疫染色画像及びＨＥ染色画像を示す。ＦＩＴＣ封入粒子が心筋細胞内に移行していることがこれらの画像から確認できる。凍結病理標本の画像解析の結果から、ＰＬＧＡの粒子が虚血領域に選択的に輸送されることが明らかになった。
【００９５】
以上の結果をまとめると、シクロスポリン封入粒子は、単独で用いられたシクロスポリンが梗塞面積に対する縮小作用を発揮しない濃度でも有意に梗塞面積を縮小した。ＰＬＧＡの粒子は、選択的に虚血領域に輸送されるため、シクロスポリン封入粒子が虚血領域に効率よく輸送され、集積したものと考えられる。さらに、ＰＬＧＡの粒子は封入するシクロスポリンを虚血領域で除放するため、梗塞面積の縮小作用が増強されたと考えられる。
【００９６】
（実施例４：心筋虚血再灌流モデルマウスの心筋におけるＦＩＴＣ封入粒子の分布）
ＦＩＴＣ封入粒子の細胞内分布を調べるために、上記心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、再灌流と同時に生理食塩水（５．０ｍｌ／ｋｇ）、ＦＩＴＣ（生理食塩水５．０ｍｌ／ｋｇに０．０６ｍｇ）及びＦＩＴＣ封入粒子（生理食塩水５．０ｍｌ／ｋｇに０．０６ｍｇ／ｋｇでＦＩＴＣを含有するＰＬＧＡ１．４ｍｇ）を静脈に注射し、再灌流５分後の虚血心筋からミトコンドリアを単離した(各群ｎ＝３)。ミトコンドリアは、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ（ａｂ１１０１６８、Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州）を使用して、当該キットのプロトコールに従って単離した。再灌流５分後にマウスから心臓を摘出し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化した。ホモジネートを４℃で５分間、１０００×ｇで遠心分離し、得られた上清をさらに１５分間、１５００×ｇで遠心分離し、沈殿物としてミトコンドリア画分を得た。最終的に得られた上清は、細胞画分として用いた。
【００９７】
（結果）
図３Ａは、ミトコンドリア画分の光学画像、蛍光画像及びミトコンドリアの量に対するＦＩＴＣの量を示す。ミトコンドリア画分におけるＦＩＴＣ封入粒子では、封入していないＦＩＴＣより多くの蛍光が観察された。ミトコンドリアの量に対するＦＩＴＣの量は、封入してないＦＩＴＣに対してＦＩＴＣ封入粒子で有意に高かった。図３Ｂは、細胞画分の光学画像、蛍光画像及びミトコンドリアの量に対するＦＩＴＣの量を示す。細胞画分においても、ＦＩＴＣ封入粒子でより多くの蛍光が観察され、ミトコンドリアの量に対するＦＩＴＣの量は、封入してないＦＩＴＣに対してＦＩＴＣ封入粒子で有意に高かった。
【００９８】
（実施例５：初代培養心筋細胞におけるＦＩＴＣ封入粒子の取り込み）
細胞へのＦＩＴＣ封入粒子の取り込み及びＦＩＴＣ封入粒子の細胞内局在を調べるため、初代培養のラット心筋細胞を用いた。新生ラットの心室筋細胞は、Ｆｕｊｉｎｏらの方法を参考にして、新生のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの心室から調製した（Ｆｕｊｉｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，２０１２，１２，４４９−４５８）。
【００９９】
新生ラットをイソフルラン麻酔下で安楽死させ、素早く心臓を摘出し分解した。トリプシン（和光純薬社製）及びコラゲナーゼタイプ２（ワーシントン社製、米国ニュージャージー州）で組織を分解後、１０％ウシ胎仔血清（以下単に「ＦＢＳ」とする。サーモサイエンティフィック社製、米国マサチューセッツ州）、ペニシリン（インビトロジェン社製、米国カリフォルニア州）及びストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下単に「ＤＭＥＭ培地」とする、シグマ−アルドリッチ社製）に、細胞を懸濁した。懸濁した細胞を１００ｍｍの培養皿（Ｃｅｌｌｓｔａｒ（商標）、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製、米国ノースカロライナ州）に２回播き、それぞれ７０分間静置して、非心筋細胞の数を減らした。非接着性の心筋細胞を培養皿（Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）、ファルコン社）に各実験に最適な密度となるように播き、３７℃、５％Ｃｏ２を含む加湿空気環境下で３６時間維持した。
【０１００】
続いて、心筋細胞をＨＢＳＳで洗浄し、培養培地において２５０ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）  Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社製）で３０分間処理した。次に、培養培地を交換し、生理食塩水又は１００μＭの過酸化水素に心筋細胞を３０分間暴露した。培養皿を洗浄し、ＦＩＴＣ封入粒子（２．５３μｇ／ｍｌのＦＩＴＣを含有する５９．０μｇ／ｍｌのＰＬＧＡ）を含む新たな培地を培養皿に加えた。３０分後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、−２０℃のメタノールで２０分間固定した。その後、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を含む培地を用いて標識し、共焦点顕微鏡（Ａ１、ニコン社製）で観察した。
【０１０１】
（結果）
図４に示すように、生理食塩水で処理した場合と比較して、１００μＭの過酸化水素で処理した心筋細胞には、ＦＩＴＣ封入粒子が多く取り込まれていた(各群１００個の心筋細胞を評価)。また、ＦＩＴＣの蛍光は、ミトコンドリアに局在していた。
【０１０２】
実施例４の結果から、ＰＬＧＡの粒子は、虚血再灌流モデルマウスの心筋内のミトコンドリアに到達することが示された。また、本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても虚血再灌流の酸化ストレスをモデルとした過酸化水素への暴露によって、ＰＬＧＡの粒子は、ラット心筋細胞のミトコンドリアへの取り込みが誘導された。心筋での虚血再灌流は静止形質及びミトコンドリア膜電位の消失に起因することが報告されており、これによって、虚血再灌流の心筋細胞及びミトコンドリアに輸送される陰イオン性のＰＬＧＡの粒子が相対的に多くなったと考えられる。
【０１０３】
（実施例６：心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるシクロスポリン封入粒子の動態解析）
実施例２と同様に、マウス（ｎ＝３）の心筋を虚血させ、３０分経過後に再灌流を行い、同時に２．５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン又は２．５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを含むシクロスポリン封入粒子を静脈に注射した。所定の時点で、ＥＤＴＡ−２Ｋ入りのチューブ（シグマ−アルドリッチ社製）を用いてマウスから血液を採取し、各マウスからサンプル（心臓、脳、肺、肝臓、脾臓及び腎臓）を収集した。実施例４と同様に、虚血心筋及び非虚血心筋からミトコンドリアを単離した。全てのサンプルの重さを量り、それぞれ均質化した。血液及び収集したサンプルのホモジネートに含まれるシクロスポリンの濃度は、ＨＰＬＣ法と高い相関性を示す公知の放射免疫測定法で測定した。
【０１０４】
（結果）
図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ虚血心筋及び非虚血心筋におけるシクロスポリン（ＣｓＡ）及びシクロスポリン封入粒子（ＣｓＡ−ＮＰ）の濃度を示す。虚血心筋では、投与５分後及び３０分後におけるシクロスポリンの濃度は、シクロスポリン封入粒子の投与群のほうがシクロスポリンの投与群よりも高かった。これに対し、非虚血心筋では、シクロスポリンの濃度は、シクロスポリンの投与群のほうがシクロスポリン封入粒子の投与群よりも高かった。シクロスポリンは、ミトコンドリアで機能すると考えられるため、ミトコンドリア画分でのシクロスポリンの濃度を調べた（図５Ｃ参照）。その結果、再灌流後５分後及び３０分後におけるミトコンドリア画分のシクロスポリン濃度は、シクロスポリンをＰＬＧＡの粒子に封入することで、約５倍に増加した。
【０１０５】
表１は、マウスの血液、脳、肺、肝臓、脾臓及び腎臓におけるシクロスポリンの濃度を示す。
【０１０６】
シクロスポリン単独の投与群とシクロスポリン封入粒子の投与群とを比較すると、血液、脳、肺、肝臓、脾臓及び腎臓におけるシクロスポリンの濃度は、同程度であった。これらの結果から、シクロスポリン封入粒子は、虚血再灌流における心筋の虚血領域のミトコンドリアに選択的に輸送されることが示唆された。
【０１０７】
【表１】
2014196281.tif 000003
【０１０８】
図５Ａ及び図５Ｂに示すように、シクロスポリンを単独で投与した場合、シクロスポリンの濃度は、非虚血心筋よりも虚血心筋において低かった。虚血再灌流障害及びシクロスポリンで誘導される血管収縮の少なくとも一方に起因する微小血管機能障害のために、静脈に投与されたシクロスポリンが虚血再灌流後の心筋に十分輸送されないと考えられる。このため、虚血再灌流後の心筋、特にミトコンドリアに効率的にシクロスポリンを輸送すれば、ｍＰＴＰの開口を阻害することで、再灌流障害を抑制できる。
【０１０９】
心保護のためにミトコンドリアに生体適合性粒子を輸送するには、心臓の血管壁の内皮層、心筋細胞の細胞膜及びミトコンドリア膜を生体適合性粒子がこえなければならない。心血管内皮は、ｓｙｎｄｅｃａｎ−１及びヘパラン硫酸などの糖タンパク質に覆われていて、ヘパラン硫酸は、内皮表面の陰イオン電荷の主な原因である。虚血再灌流は、内皮細胞間の細胞間結合の解離及び冠動脈の上皮からの糖タンパク質の放出の要因となることが報告されている。これらの知見は、陰イオン性のシクロスポリン封入粒子が非虚血心筋よりも、虚血心筋に選択的に輸送された本実施例の結果を支持する。一方、表１に示すように、シクロスポリン単独の投与群とシクロスポリン封入粒子の投与群とでは、血液、脳、肺、肝臓、脾臓及び腎臓におけるシクロスポリンの濃度が同程度であったことから、虚血再灌流に依存する血管透過性の向上がシクロスポリン封入粒子の心筋への輸送を促進したことが考えられる。
【０１１０】
（実施例７：虚血再灌流障害に対するシクロスポリン封入粒子の心保護作用の機序解析）
上記心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、再灌流と同時に生理食塩水、ＦＩＴＣ封入粒子、シクロスポリン（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びシクロスポリン封入粒子（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈に注射し、再灌流３０分後の時点で得られた虚血心筋及び非虚血心筋の心臓サンプル由来の細胞内ミトコンドリア画分と細胞画分とからタンパク質を抽出した(各群ｎ＝８)。サンプルを、溶解緩衝液に加え、４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでタンパク質（ミトコンドリア画分：２．０μｇ、細胞画分：５．０μｇ）を分離し、ＰＶＤＦ膜を用いて検出した。一次抗体として、シトクロムＣ（上清；１／１０００、ミトコンドリア画分；１／２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｂａｘ（１／１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＧＡＰＤＨ（１／１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＶＡＤＣ（１／１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
【０１１１】
（結果）
ｍＰＴＰの開口によってミトコンドリアから細胞質にシトクロムＣが漏出する。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）、ＦＩＴＣ封入粒子（ＦＩＴＣ−ＮＰ）及び１ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（ＣｓＡ  １ｍｇ／ｋｇ）を投与した群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（ＣｓＡ  １０ｍｇ／ｋｇ)及びシクロスポリン封入粒子（ＣｓＡ−ＮＰ）を投与した群では、ミトコンドリア画分から細胞画分へのシトクロムＣの漏出が抑制された。Ｂａｘは、アポトーシス促進に重要なタンパク質であって、細胞質からミトコンドリアへのＢａｘの転移は、ミトコンドリア外膜の透過を介したアポトーシスを引き起こし、これによってシトクロムＣの漏出が誘導される。いずれの群でもＢａｘの転移が見られなかったので（図６Ａ、図６Ｄ参照）、本実験で観察されたシトクロムＣの漏出は、主にｍＰＴＰの開口に依存しており、シクロスポリン封入粒子によってｍＰＴＰの開口が抑制されたことが示された。なお、ｍＰＴＰを構成するＶＤＡＣに対するシトクロムＣ及びＢａｘは、いずれの群でも差はなかった（図６Ｃ、図６Ｅ参照）。また、非虚血心筋では、シトクロムＣの漏出及びＢａｘの転移はいずれも見られなかった。
【０１１２】
このため、実施例２で示されたシクロスポリン封入粒子による梗塞面積の有意な縮小は、シクロスポリン封入粒子によるｍＰＴＰの開口の抑制によることが示唆された。
【０１１３】
（実施例８：シクロフィリンＤノックアウトマウスにおけるシクロスポリン封入粒子の評価）
ｍＰＴＰの主な制御因子であるシクロフィリンＤを欠損させたマウスを用いて、シクロスポリン封入粒子の治療効果を評価した。シクロフィリンＤノックアウトマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。実施例２と同様に、マウスの心筋を虚血させ、４５分経過後に再灌流を行い、再灌流と同時に１．０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを含むシクロスポリン封入粒子を静脈に注射した。再灌流から２４時間後、梗塞面積／ＡＡＲの面積とＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積とを算出した（ｎ＝７〜８）。
【０１１４】
（結果）
図７Ａは、ＡＡＲの面積に対する梗塞面積を示す。野生型（ＷＴ）及びシクロフィリンＤノックアウトマウス（ＣｙｐＤ−／−）の双方において、シクロスポリン封入粒子（ＣｓＡ−ＮＰ）群は、非投与群に対して有意に梗塞面積を縮小させた。また、シクロフィリンＤノックアウトマウスでは、シクロスポリン封入粒子を投与しなくても野生型の非投与群よりも有意に梗塞面積が縮小しており、さらに、シクロスポリン封入粒子を投与しても梗塞面積のさらなる縮小は見られなかった。なお、ＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積は、４群で同等であるのを確認した（図７Ｂ）。このことから、シクロスポリン封入粒子の心保護作用は、シクロフィリンＤに依存する、すなわち、ｍＰＴＰの阻害によることが示唆された。
【０１１５】
（実施例９：心エコー検査による評価）
左室の機能と拡張（リモデリング）を調べるために心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、虚血前及び再灌流から１、２、４週間後に経胸壁２次元心エコー検査を行った。マウスは、再灌流と同時に生理食塩水、シクロスポリン（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びシクロスポリン封入粒子（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈に注射した群で構成した（ｎ＝１０）。心エコー検査には、イソフラン（１〜１．５％）の吸入麻酔下のマウスに対して４０ｍＨｚのプローブ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社製）を用いた。マウスの心拍数は、約５００ｂｐｍに維持した。左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）が最大となるレベルにおける短軸像において、Ｍモード検査を胸骨傍で行った、ＬＶＥＤＤ及び左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）を決定し、％短縮率（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ：ＦＳ）と駆出率（Ｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＥＦ）とを算出した。ＦＳは、数式｛（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ｝×１００を用いて算出した。ＥＦは、数式｛（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ｝×１００を用いて算出した。なお、ＬＶＥＤＶは左室拡張末期容積で、ＬＶＥＳＶは左室収縮末期容量である。
【０１１６】
（結果）
表２は、心エコー検査の結果を示す。１ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンの投与群では、生理食塩水投与群と同様に、左室の機能不全及びリモデリングが観察された。一方、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン又は１ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン封入粒子を投与した群では、左室の機能不全及びリモデリングが抑制された。
【０１１７】
【表２】
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【０１１８】
図８Ａは、生理食塩水、１ｍｇ／ｋｇシクロスポリン（ＣｓＡ）、１０ｍｇ／ｋｇシクロスポリン及び１ｍｇ／ｋｇシクロスポリンを含むシクロスポリン封入粒子（ＣｓＡ−ＮＰ）投与群におけるＭモード検査の代表的な心エコー図を示す。虚血再灌流から４週後のシクロスポリン封入粒子投与群では、虚血前の状態までほぼ回復していた。図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ及び図８Ｅは、それぞれ再灌流４週後のＬＶＥＤＤ、ＬＶＥＳＤ、ＦＳ及びＥＦを示す。生理食塩水投与群に対して、シクロスポリン封入粒子投与群では、ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤが有意に低下した。また、シクロスポリン封入粒子投与群では、左室が形態的にどれだけ収縮したかの指標であるＦＳ及び心機能の指標であるＥＦが、生理食塩水投与群に対して大きく改善した。
【０１１９】
本実施例の結果と実施例２の結果と合わせると、シクロスポリン封入粒子は、梗塞サイズの縮小に伴って心機能を改善し、左室リモデリングを抑制することが示唆された。なお、各群の間で血圧と心拍数に有意な違いはなかった。
【０１２０】
（実施例１０：カルシニューリン活性に対するシクロスポリン封入粒子の影響）
シクロスポリンは、タンパク質ホスファターゼの一種であるカルシニューリンをＴ細胞において阻害するため、免疫抑制剤として広く使用されている。一方、シクロスポリンは、心筋細胞でカルシニューリンパスウェイを阻害することによって、ＡＭＩ後の左室機能障害を引き起こしうることが動物実験で示されている（Ｏｉｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，２７８，Ｈ２１１５−２１２３）。
【０１２１】
そこで、本実施例では、シクロスポリン封入粒子が、再灌流から３時間後の非虚血心筋におけるカルシニューリンの活性に与える影響を評価した。マウスは、再灌流と同時に生理食塩水、シクロスポリン（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びシクロスポリン封入粒子（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈に注射した群で構成した。凍結しておいた心筋組織を、プロテアーゼ阻害剤を含む冷却した溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＤＴＴ；及び０．２％  ＮＰ−４０）内で均質化した。サンプルを４℃で４５分間、１００，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。溶解緩衝液で平衡化した脱塩カラム（Ｐ６  ＤＧ脱塩樹脂）に上清を通すことで、上清に含まれる遊離したリン酸基を除去した。カルシニューリン特異的なＲＩＩホスホペプチドを用いて、回収した抽出液（各サンプルで５μｇ）のカルシニューリン活性を決定した。カルシニューリン活性の決定は、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  Ｑｕａｎｔｉｚｙｍｅ（商標）  アッセイシステム（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ＡＫ−８１６，Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌ．Ｐ．社製）を用いて製造者のプロトコールに従って行った。
【０１２２】
（結果）
表３は、各群のカルシニューリン活性を示す。シクロスポリン封入粒子の単回、静脈投与では、カルシニューリン活性に影響はなかった。また、シクロスポリン封入粒子を投与しても全身性の有害事象は現れなかった。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
本実施例の結果により、シクロスポリン封入粒子は、薬効が得られる濃度で使用しても、カルシニューリン活性を阻害しないため、カルシニューリンパスウェイに関連する左室機能障害などの重篤な有害事象の発生リスクが極めて低いことが示唆された。また、上記実施例において実験動物にシクロスポリン封入粒子を投与しても、全身性の有害事象が現れなかったことからも、シクロスポリン封入粒子は、安全性の高い薬剤であることが示唆された。
【０１２５】
（実施例１１：ＦＩＴＣ封入粒子を用いたフローサイトメトリー解析）
上記実施例２に従ってイルベサルタン封入粒子（３．０ｍｇ／ｋｇ）、ＦＩＴＣ封入粒子、ＦＩＴＣ又は何も封入していないＰＬＧＡ粒子を投与したマウスを再灌流６時間後又は１２時間後に安楽死させた(各群ｎ＝３)。心臓、血液及び脾臓における白血球（単球/マクロファージ、好中球及びリンパ球）をフローサイトメトリーで解析した。単球/マクロファージは、ＣＤ１１ｂｈｉ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ‐６Ｇ）ｌｏＬｙ‐６Ｃｈｉ／ｌｏ、好中球は、ＣＤ１１ｂｈｉ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ‐６Ｇ）ｈｉＬｙ‐６Ｃｉｎｔ、リンパ球は、ＣＤ１１ｂｌｏ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ‐６Ｇ）ｈｉと定義した。測定にはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、解析はＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で行った。
【０１２６】
（結果）
図９は、再灌流６時間後の心臓、血液及び脾臓における白血球に対するフローサイトメトリー解析で検出したＦＩＴＣシグナルを示す。貪食機能を持つ単球／マクロファージ、好中球では、ＦＩＴＣ投与群と比較して、ＦＩＴＣ封入粒子投与群で強いＦＩＴＣシグナルを認めた。特に、単球／マクロファージにおいて、ＦＩＴＣシグナルの増加を認めた。
図１０は、フローサイトメトリーによる再灌流１２時間後の心臓における単球/マクロファージ及び炎症マーカーに対するイルベサルタン封入粒子の影響を示す。対照群には、何も封入していないＰＬＧＡ粒子を投与した。イルベサルタン（Ｉｒｂ）封入粒子投与群は、ＰＬＧＡ粒子投与群と比較して、虚血心臓での単球／マクロファージ数が低下した。また、Ｉｒｂ封入粒子投与群では、炎症マーカーであるＬｙ６Ｃ陽性細胞が減少した。以上の結果から、イルベサルタン封入粒子は、虚血心臓への単球／マクロファージ及び炎症細胞の浸潤を抑制することが示唆された。
【０１２７】
（実施例１２：心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるイルベサルタン封入粒子の評価）
上記実施例２と同様に、心筋の虚血を確認後、結紮から２５分経過後に被験物質を静脈に注射した。静脈に注射した被験物質は、生理食塩水、ＦＩＴＣ封入粒子、イルベサルタン（１０．０ｍｇ／ｋｇ）、イルベサルタン封入粒子（３．０ｍｇ／ｋｇ）、ピオグリタゾン封入粒子（０．１ｍｇ／ｋｇ）とした。そして、結紮から３０分経過した時点で、シリコンチューブを除去し、再灌流を行い、５‐０シルクにて閉胸後、自発呼吸を確認して抜管した。次に、心臓切片の梗塞面積、ＡＡＲの面積及び左室心筋全体の面積を計測し、梗塞面積／ＡＡＲの面積とＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積とを算出した。
【０１２８】
（結果）
図１１Ａに算出した梗塞面積／ＡＡＲの面積を示す。生理食塩水投与群と比較して、ＦＩＴＣ封入粒子投与群、イルベサルタン（Ｉｒｂ）投与群では梗塞面積の縮小作用は見られなかった。一方、イルベサルタン（Ｉｒｂ）封入粒子投与群及びピオグリタゾン（Ｐｉｏ）封入粒子投与群では、梗塞面積が有意に縮小した（Ｐ＜０．０５）。また、ＡＡＲの面積／左室心筋全体の面積に関しては、５群間で同等であった（図１１Ｂ参照）。
【０１２９】
（実施例１３：心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるイルベサルタン封入粒子の作用機序の検討）
イルベサルタン封入粒子による虚血心筋でのＰＰＡＲγ活性を確認するために、再灌流６時間後における虚血心筋のＰＰＡＲγ活性を測定した。再灌流前の左前下行枝の結紮前にイルベサルタン封入粒子（３．０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与する点を除いては、上記実施例２と同様の実験を行った。対照として生理食塩水を用いた。
心臓組織は、虚血領域と非虚血領域に分けＮＥ‐ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を使用して、各々の領域の細胞質タンパク質と核タンパク質とを抽出した。抽出したタンパク質は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣ社製)を使用して定量した。総タンパク質量として同等量の核タンパク質に対してＴｒａｎｓＡＭ（商標）ＰＰＡＲγ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社製）を使用してＰＰＡＲγ活性を測定した。
【０１３０】
（結果）
図１２は、虚血心筋でのＰＰＡＲγ活性を示す。Ｉｒｂ封入粒子投与群は、有意にＰＰＡＲγ活性を亢進させた。このことから、イルベサルタン封入粒子の梗塞面積の縮小作用は、虚血心筋におけるＰＰＡＲγの活性化によることが示された。
【０１３１】
これまでにシクロスポリンの再灌流障害抑制に関して、用量作用関係を解析した研究がされておらず、薬剤の用量が不十分であることが再灌流障害抑制薬としてのシクロスポリンの役割が確立されていないことの一因であると考えられる。上記実施例で示されたシクロスポリン封入粒子は、虚血領域の心筋細胞、心筋組織に選択的に輸送され、除放的にシクロスポリンを放出する。このため、シクロスポリン封入粒子は、シクロスポリンの梗塞面積の縮小作用を高め、低濃度で薬効を得ることができる。これにより、シクロスポリンを低濃度で使用できるので、シクロスポリンの全身的副作用（腎毒性、高血圧等）のリスクを小さくして、安全性を高めることができる。
【０１３２】
また、上記実施例１３の結果から、イルベサルタン封入粒子は、ＰＰＡＲγの活性化を介してイルベサルタンの梗塞面積の縮小作用を高めることが明らかとなった。上記のように、ＰＰＡＲγ作動剤による心保護効果は、虚血前に投与されることを前提としたものであったが、上記実施例１２においては、心筋の虚血後のイルベサルタンの投与で梗塞面積の縮小作用を得ることができることを実証した。
【０１３３】
イルベサルタンは、ＡＲＢでもあるため、イルベサルタン封入粒子による梗塞面積の縮小作用には、アンジオテンシンIIタイプ１受容体活性の抑制も寄与していると考えられる。また、ＡＲＢを高い濃度で用いることで血圧が低下することが知られており、この血圧低下が心筋梗塞を惹起し、その結果、心不全、心原性ショック等の重篤な副作用を引き起こす可能性がある。虚血心筋部位に選択的に輸送されるイルベサルタン封入粒子は、イルベサルタンを低濃度で使用することを可能にするため、上記重篤な副作用を回避することができる。
【０１３４】
また、イルベサルタン封入粒子は、虚血心臓への単球／マクロファージ及び炎症細胞の浸潤を抑制することにより心保護作用を有するため、ＡＭＩの発症を抑制することができる。
【０１３５】
ピオグリタゾン封入粒子においても梗塞面積の縮小作用が得られた。ピオグリタゾンはＡＲＢではないため、アンジオテンシンIIタイプ１受容体活性の抑制がなくても、ＰＰＡＲγ作動剤封入粒子が梗塞面積を縮小させるのに有効であることが明らかとなった。
【０１３６】
（実施例１４：心筋虚血障害モデルマウスにおけるＦＩＴＣ封入粒子の動態）
虚血障害が発生した心筋におけるＦＩＴＣ封入粒子の分布を評価した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８週齢、雄）にイソフルラン（エア・ウォーター社製）吸入麻酔下、人工呼吸器管理を行った（１回の換気量：０．５ｍＬ、呼吸数１４０回／分）。手技中は、加温パッドを用いてマウスを保温し、直腸温を３６．８℃から３７．２℃に維持した。第３−４肋間の高さで水平に切開し、心膜を開き、左心耳の下縁で左前下行枝を結紮した。結紮直後にＦＩＴＣ封入粒子又はＦＩＴＣ（１０％ＤＭＳＯ）の溶液を虚血部に筋肉内注射した。閉胸後、自発呼吸を確認し抜管した。なお、ＦＩＴＣ封入粒子は、生理食塩水で調製した３％溶液を４０μｌ（１．２ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣに相当）又は３．７５ｍｇ／ｍｌの溶液を２０μｌ（０．１５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣの相当）注射した。ＦＩＴＣは、０．１５ｍｇ／ｍｌの溶液を２０μｌ注射した。なお、ｓｈａｍには、結紮を除く処置を行い、ＦＩＴＣ封入粒子を投与した。注射から３時間後又は２４時間後にマウスから心筋組織を採取し、実施例２と同様に、凍結病理標本を作製した。
【０１３７】
（結果）
図１３の上段は、注射から３時間後の虚血させた心臓の光学画像及び蛍光画像を示す。蛍光画像において、光学画像で確認される梗塞部位（白色部位）に対応する部位にＦＩＴＣの蛍光が観察できる。一方、図１３の下段は、注射から３時間後のｓｈａｍの心臓の光学画像及び蛍光画像を示す。光学画像で梗塞部位はなく、蛍光画像においてＦＩＴＣ蛍光は、ほとんど認められない。この結果から、ＰＬＧＡの粒子が虚血に起因する梗塞領域に選択的に輸送されることが明らかになった。
【０１３８】
図１４の上段は、ＦＩＴＣ封入粒子溶液の注射から２４時間後の心臓の光学画像及び蛍光画像を示す。２４時間後でも蛍光画像において、光学画像で確認される梗塞部位に対応する部位にＦＩＴＣの蛍光が観察できる。一方、図１４の下段は、ＦＩＴＣ溶液の注射から２４時間後の心臓の光学画像及び蛍光画像を示す。光学画像で確認される梗塞部位に対応する部位には、蛍光画像においてＦＩＴＣ蛍光は認められない。ＦＩＴＣ封入粒子溶液の注射から２４時間後の心臓の光学画像を拡大すると、梗塞部位の心筋細胞にＦＩＴＣの蛍光を確認できる（図１５）。これらの結果から、ＰＬＧＡの粒子が虚血に起因する梗塞領域に選択的に輸送され、少なくとも２４時間は梗塞領域に滞留することが明らかになった。また、ＰＬＧＡの粒子に封入されたＦＩＴＣは、梗塞部位の心筋細胞に選択的に輸送されることが示された。なお、本実施例１４と同様の実験において、ＦＩＴＣ封入粒子を静脈内に投与しても梗塞領域に選択的にＦＩＴＣの蛍光が観察された。
【０１３９】
本実施例の結果からＰＬＧＡの粒子に封入されたＦＩＴＣ等の造影剤は、心筋梗塞等の虚血に起因する障害のある部位に効率よく選択的に輸送され、当該部位を選択的に造影できるため、適切な造影剤をＰＬＧＡ等の生体適合性粒子に封入した医薬組成物は、虚血再灌流障害を含む虚血に起因する障害の診断に使用することができる。
【０１４０】
また、本実施例及び上記実施例２乃至１３の結果から、ｍＰＴＰ開口抑制剤、ＡＲＢ及びＰＰＡＲγ作動剤をＰＬＧＡ等の生体適合性粒子に封入した医薬組成物は、虚血に起因する障害のある部位に効率よく選択的に輸送されるので、虚血に起因する障害の治療又は予防においても高い有効性を有する。
【０１４１】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明は、虚血に起因する障害の治療、予防及び診断に好適である。本発明を適用することにより、虚血に起因する障害の治療及び予防の成績が向上し、患者の生活の質が確保される。
【図１】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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