(57)【要約】【課題】煩雑な処理操作を用いず、変性しないで、そのままテロメアの一本鎖突出部（以下単にＧテイルという。）配列の長さを特異的、高感度かつ迅速に測定する方法及びそれを用いるキットを提供すること。【解決手段】検体における非変性染色体DNA中のＧテイルと、テロメア反復配列に相補的な配列を有する標識DNAプローブとをハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズしたDNAプローブの化学発光を定量し、その測定値からＧテイル配列の長さを求めるＧテイル配列の長さ測定方法、及びそれに用いるキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載されるＧテイル配列の長さ測定方法、および、そのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇテイル配列の長さ測定方法及び該方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの染色体DNAの末端は、テロメアとよばれる5’-TTAGGG-3’の繰り返し配列からなる二本鎖DNAである。しかし、テロメアの最末端は、3’末端が突出した構造をしていて、75〜300塩基の一本鎖DNA部分（Ｇ-tail；以下単にＧテイルという。）を形成している。前記Ｇテイルは、通常はテロメア延長酵素であるテロメラーゼがアクセスする場合やDNAの複製時以外は、ループを形成して保護された状態となっている（例えば、非特許文献１参照）。
大部分を占めるテロメア２本鎖部分は、細胞分裂が繰り返される度に短くなり細胞老化に関与することが知られているが、細胞分裂が繰り返されても前記Ｇテイルは75〜300塩基の一定の長さに維持されている。ところが、多数回の細胞分裂後のテロメア２本鎖部分の短縮による細胞分裂の停止、すなわち有限分裂寿命に至っても、通常Ｇテイルは75〜300塩基の一定の長さのままであるという報告と有限分裂寿命でGテイルが短縮するという相反した結果が報告された。これは、Ｇテイルがテロメアに比べて極めて短いため、当時、Ｇテイルの長さを正確かつ定量的に測定する方法がなかったためであると思われる。
一方、二本鎖テロメアDNAには結合しないがＧテイルには結合するタンパク質POT1やそれらに結合するタンパク質PIP1などの発見により、テロメアのＧテイルが、２本鎖部分とは全く異なる機能、例えば、下記のように細胞死の直接的シグナルや様々な細胞応答等に関係していることが近年明らかになってきた。
【０００３】
テロメアにはそれに結合するテロメア結合タンパク質が存在し、該テロメア結合タンパク質は、TRF1(Telomere  repeat  binding  factor)およびTRF2が知られているが、癌細胞では、TRF2がないと、Ｇテイルのループ形成ができなくなり、Ｇテイルの短縮が起こることが明らかになった（例えば、非特許文献２参照）。この場合、重要なのはテロメア全長には変化が見られないにもかかわらず、Ｇテイルの短縮がみられ、さらには染色体末端の融合を引き起こしていることである。
正常細胞の場合も、TRF2の機能を細胞内で消失させるとＧテイルの短縮がおこり細胞増殖が停止して、老化してしまう（例えば、非特許文献２参照）。この場合も、テロメア全長は変化しないことから、Ｇテイルの短縮が老化の引き金になっていると考えられる。
【０００４】
上記TRF1やTRF2のみならず、ATM、NBS1、MRNなど様々なタンパク質がＧテイルのループ形成に要求されることが分かってきた。様々なDNA傷害剤や放射線によるDNAの傷害に感受性のシグナルでは、テロメアの短縮が見られなくてもＧテイルの短縮がみられる。これは、DNAの修復に必要なタンパク質（ATM、NBS1及びMRNなど）がリクルートされてくることからも明らかである。
ATMは、血管拡張性疾患の原因遺伝子、NBS1は、ナイミーヘン症候群の原因遺伝子で高発ガン性、免疫不全、染色体不安定性、放射線感受性を特徴とする稀な常染色体劣性遺伝疾患であり、これらがＧテイルにリクルートされることは、上記各疾患との関わりを示している。実際に、Ｇテイルのループののり付けとして機能しているTRF2の機能を阻害すると、ATMに依存したアポトーシスが誘導される（例えば、非特許文献３参照）。
また、Ｇテイルに特異的に作用する抗癌剤は、テロメアの短縮を伴わずＧテイルの短縮を引き起こし、癌細胞を死に至らしめることもわかってきた（例えば、非特許文献４参照）。
これらの結果から、DNA障害をもたらす薬剤やストレスが、Ｇテイルを介して細胞にシグナルを伝え、様々な細胞応答を引き起こしているものと考えられる。
また、多くの癌で変異が知られている癌抑制遺伝子産物p53は、Ｇテイルに結合していることもわかっており（例えば、非特許文献５参照）、癌および老化に伴う疾患でもＧテイルの変化がシグナルとなっていることが明らかである。
【０００５】
ところで、その後、Ｇテイルの長さを測定する方法が開発され、これまで、T-OLA  (テロメア-オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ)、PENT(プライマー・エクステンション／ニックトランスレーション)、３’オーバーハング・プロテクション・アッセイ等が知られている（例えば、非特許文献６、非特許文献７参照）。
しかし、表１を用いて後述するように、いずれも取扱いが面倒な放射性標識（32P等）のオートラジオグラフィーやゲル作製、泳動分離に時間を要する電気泳動を必要とする。そのため、いずれも完了するのに少なくとも２日要する煩雑なアッセイとなる。このことは、特にリアルタイムの分析が求められる癌の進行や予後を迅速に診断するには不適当であった。加えて、それら方法は、大量の試料の分析のハイスループット・スクリーニングに適用するのは困難であった。
【０００６】
また、従来のハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（Hybridization  Protection  Assay（HPA）；例えば、特許文献１、非特許文献８参照）は、染色体DNAを変性後に使用しなければならなかったので、テロメア全長に比べ約100分の1以下の長さしかないＧテイルの長さは操作誤差及び測定誤差の範囲であり測定できなかった。
具体的には、この方法でのＧテイルのシグナル強度はノイズレベル程度に弱いものであり定量的かつ正確に測定することができず、Ｇテイルに特異的なシグナルであるか否かを識別することもできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2001-95586公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】グリフィス・ジェイ・ディー，コミュー・エル，ローゼンフィールド・エス，スタンセル・アール・エム，ビアンチ・エー，モス・エイチ及びデ・ランジェ・ティ(Griffith  JD，Comeau  L，Rosenfield  S，Stansel  RM，Bianchi  A，Moss  H  and  de  Lange  T.），  Cell:  97(1999)，503-14.
【非特許文献２】ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ランジェ・ティ．（van  Steensel  B，Smogorzewska  A  and  de  Lange  T.），92(1998)，Cell  :401-13.
【非特許文献３】カールセダー・ジェイ，ブロッコリ・ディ，ダイ・ワイ，ハーディ・エス及びデ・ランジェ・ティ．（Karlseder  J，Broccoli  D，Dai  Y，Hardy  S  and  de  Lange  T.），Science:  283(1999)，1321-5.
【非特許文献４】ゴメス・ディー，パテルスキ・アール，レマルテリュー・ティー，シン‐ヤ・ケイ，メルグニー  ジェイ・エル及びリュオウ・ジェイ・エフ．（Gomez  D，Paterski  R，Lemarteleur  T，Shin-Ya  K，Mergny  JL  and  Riou  JF.  ），J  Biol  Chem:  279(2004)，41487-94.
【非特許文献５】スタンセル・アール・エム，サブラマニアン・ディー及びグリフィス・ジェイ・ディー．（Stansel  RM，Subramanian  D  and  Griffith  JD.），  J  Biol  Chem:  277(2002)，11625-8.
【非特許文献６】チャイ，ダブリュー．，シャイ，ジェイ．ダブリュー．及びライト，ダブリュー．イー．（Chai，W.，Shay，J.W.  &  Wright，W.E.）Mol  Cell  Biol:    25，2158-2168(2005).
【非特許文献７】サルダンハ，エス．エヌ．，アンドリュース，エル．ジー．及びトレフスボル，ティー．オー．（Saldanha，S.N.，Andrews，L.G.  &  Tollefsbol，T.O.）Eur  J  Biochem  :    270，389-403(2003).
【非特許文献８】ナカムラ，ワイら（Nakamura，Y.  et  al.  ）Clin  Chem:    45，1718-1724(1999).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、煩雑な処理操作を用いず、変性しないで、そのままテロメアの一本鎖突出部（以下単にＧテイルという。）配列の長さを特異的、高感度かつ迅速に測定する方法及びそれを用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、検体中の染色体DNAを変性させることなく、特定のHPA法により化学発光強度を測定し得ること、とりわけＧテイルオリゴマー標準品を用いて検量線を作成しＧテイル長さを定量化することにより、迅速にＧテイルの長さを測定し得ることを見出した。
また、上記化学発光がエキソヌクレアーゼ処理によりＧテイルに特異的であることを確認し得ること、さらには、前記エキソヌクレアーゼ処理及び未処理の発光強度比をシグナル／ノイズ(「S/N」と略す。)比として、S/N比の大きい測定条件を探知し高感度に測定し得ることを見出した。さらに、大きなS/N比となる試料濃度条件を規定し得ることも見出した。本発明者らは、これら知見に基づき本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕検体における非変性染色体DNA中のＧテイルと、テロメア反復配列に相補的な配列を有する標識DNAプローブとをハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズしたDNAプローブの化学発光を定量し、その測定値からＧテイル配列の長さを求めることを特徴とするＧテイル配列の長さ測定方法、
〔２〕前記検体が、血液、培養細胞、新鮮組織、凍結保存組織もしくはホルマリン固定組織の細胞ペレットである前記項目〔１〕記載の方法、
〔３〕前記化学発光が、前記標識DNAプローブとＧテイル配列とのハイブリダイズに基づくものであることをエキソヌクレアーゼを用いて確認することを特徴とする前記項目〔１〕又は〔２〕に記載の方法、
【００１１】
〔４〕前記エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩである、前記項目〔３〕に記載の方法、
〔５〕前記標識が、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、ピロガロール、プロトヘミン、アミノブチルエチル-n-イソルミノール又はアミノヘキシルエチル-n-エチル-イソルミノールによるものである前記項目〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕前記テロメア反復配列に相補的な配列が、(CCCTAA)n  (nは１〜10の整数を表す。)で示される塩基配列である前記項目〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
【００１２】
〔７〕非変性テロメア反復配列に対し相補的な配列を有する標識DNAプローブと、細胞溶解用液と、加水分解用試薬とを少なくとも有するセットとするＧテイル配列の長さ測定用キット、
〔８〕確認試薬としてエキソヌクレアーゼをさらに含む、前記項目〔７〕に記載のキット、
【００１３】
〔９〕前記標識が、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール、ピロガロール、プロトヘミン、アミノブチルエチル-n-イソルミノール又はアミノヘキシルエチル-n-エチル-イソルミノールによるものである前記項目〔７〕又は〔８〕に記載のキット、
〔１０〕前記テロメア反復配列に相補的な配列が、(CCCTAA)n(nは１〜10の整数を表す。)で示される塩基配列である前記項目〔７〕〜〔９〕いずれかに記載の測定用キット、及び
〔１１〕前記検体が、ヒト又はマウス由来の検体である前記項目〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
を提供するものである。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のＧテイル測定方法の概要を示す図である。
【図２】図２は、29塩基のAE標識ＧテイルHPAプローブと一本鎖合成Ｇテイル84塩基との用量応答性試験の結果を示す図である。
【図３】図３は、特異性確認試験結果を示す図である。
【図４】図４は、各組み合わせにおけるAEに基づく化学発光量を示したグラフである。
【図５】図５は、Ｇテイルをアッセイする前にExoIで前処理したゲノムDNAについてのグラフと、ExoIで前処理していないグラフである。
【図６−１】図６−１は、非変性DNAのT7エキソヌクレアーゼ処理時間依存性化学発光量変化を示す図である。
【図６−２】図６−２は、図６−１のグラフを前記図２を検量線として用いてrlu値をＧテイルの平均長さに変換したグラフである。
【００１５】
【図７】図７は、本発明の測定方法の感度限界（特に検出できるＧテイルの最小の長さ）確認試験の結果を示す図である。
【図８】図８は、化学発光量を任意単位でプロットして作成したグラフである。
【図９】図９は、SiHa癌細胞系細胞ペレットに本発明の測定方法を直接適用した結果を示す図である。
【００１６】
【図１０】図１０ａは、各細胞ペレットに本発明の測定方法を直接適用した結果を示す図である。図１０ｂは、比較・確認のため、各細胞ペレットから非変性ゲノムDNAを単離した後、本発明の測定方法を適用した結果を示す図である。
【図１１】図１１ａは、本発明の測定方法によりＧテイルを測定した結果を示す図である。図１１ｂは、比較例として特開2001-95586公報に記載の測定方法によりテロメア全長を測定した結果を示す図である。
【００１７】
【図１２】図１２は、マウスゲノムDNAを用いたＧテイル長を測定の直線性を示す図である。
【図１３】図１３は、マウス組織でのＧテイル長を示す図である。
【００１８】
【図１４−１】図１４−１は、内部標準プローブA1aを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−２】図１４−２は、内部標準プローブA1bを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−３】図１４−３は、内部標準プローブA2aを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−４】図１４−４は、内部標準プローブA2bを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−５】図１４−５は、内部標準プローブB2_1bを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−６】図１４−６は、内部標準プローブB2_2aを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１４−７】図１４−７は、内部標準プローブB2_2bを用いた、マウスゲノムDNAの定量試験における直線性を示す図である。
【図１５】図１５は、96ウエルプレートでのAH標識ＧテイルHPAプローブと一本鎖合成Ｇテイルとの応答性を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＧテイル配列の長さ測定方法は、ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（Hybridization  Protection  Assay；HPA）法を用いて、Ｇテイルを構成するテロメア反復配列に相補的な標識プローブ複数をＧテイルにハイブリダイズさせ、プローブに結合した非放射性標識物質の化学発光量を指標としてＧテイル配列の長さを測定するものである。
一般的にHPA法とは、非放射性標識物質でラベルしたオリゴマーをプローブとして用い、該プローブが検出の対象となるDNA又はRNAにハイブリダイズしたときの当該非放射性標識物質からの発光を検出する手法である。その特徴は、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズせずに遊離しているプローブとを区別するために行われる洗浄などの物理的な分離操作を行う代わりに、遊離のプローブの標識物質を選択的に加水分解させ、その標識物質を失活させてしまうことにある。
したがって、前記HPA法を適用した本発明は、ターゲットであるＧテイルをPCR等により増幅させるような煩雑な操作を用いず、短時間で目的のＧテイルを検出し、標識物質の化学発光量を指標としてＧテイル配列の長さを測定するものである。
【００２０】
以下、非変性DNA含有細胞ペレットの調製について説明する。
本発明の測定方法は、二本鎖染色体DNAの一本鎖部分であるＧテイルがターゲットであるから、非変性染色体DNAを含有する細胞ペレットを検体とすることができる。
本発明において、検体となる上記細胞ペレットとは、細胞もしくは組織を遠心分離（例えば、1,000Gで5分間）し、回収した細胞そのものからなるペレットをいう。
さらに、冷リン酸緩衝食塩水（PBS(-)）で２回洗浄し、液体窒素中で急速凍結し、そして使用まで液体窒素中で急速凍結しそのまま低温（例えば-80℃）で保存したペレットであってもよい。
使用時には、例えば、後述するハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁し、懸濁液をピペッティングによって混合し、26Ｇシリンジでせん断したものを使用することができる。
本発明において、S/N比の大きい条件で実施する観点から、細胞ペレットを検体とする場合には、検体中の細胞数は1x105〜3.5x106が好ましく、3x105〜7x105がより好ましい。
また、非変性染色体DNAを用いる場合、非変性染色体DNA量は0.5μg〜40μgが好ましく、1μg〜20μgがさらに好ましく、3μg〜7μgが特に好ましい。
【００２１】
細胞検体の種類は非変性染色体DNAを含有する限り特に制限されるものではないが、血液、培養細胞、各種組織を挙げることができる。
上記組織は、器官の由来を問わず、任意に選択することができる。例えば、脳神経系、筋肉・骨格系、消化器系、呼吸器系、造血系、リンパ系などの器官の組織が挙げられる。また、これらの組織は新鮮組織（生検により得られた直後もの）、凍結保存組織又はホルマリン固定組織などあらゆる状態のものを使用することができる。
本発明の測定方法は、個体間のＧテイル長さの比較評価だけでなく、単一個体内における異なる組織間の血液細胞もしくは組織細胞のＧテイル長さの比較評価に有用である。例えば、単一個体内における肝臓細胞、心筋細胞、脳神経細胞等のＧテイル長さの比較評価が挙げられる。
【００２２】
さらに、上記組織は正常のものに限定されず、各種疾患（癌、肝疾患など）の組織を使用することができる。例えば、癌由来のものとして、大腸癌、肝臓癌などの癌組織のほか、頸管癌、大腸癌、肝臓癌、子宮頸癌、慢性骨髄性白血病、膠芽腫、乳癌、繊維肉腫などの癌細胞系、例えばSiHa、K562、MKN1、HeLa、U937、U373MG、T98G、A172、MCF-7、HT-1080、LoVo、WiDr、SW857、VA-4等が挙げられる。
【００２３】
本発明の測定方法において、前述のように細胞ペレットをそのまま用いることができるので、培養細胞又はヒト組織から非変性染色体DNAを精製して使用する必要はないが、精製非変性染色体DNAを使用してもよく、後述のハイブリダイゼーションバッファーに溶解して使用する。非変性染色体DNAの精製は、任意の方法であってよい（例えば、タハラ・ヒデトシら“オンコジーン”（Tahara  H.  et  al.，Oncogene），15(1997)，1911-1920）。
【００２４】
本発明において、検体、後述するプローブ等を溶解するハイブリダイゼーションバッファーは、細胞そのものを検体とする観点から、細胞膜、核膜等を溶解するバッファーであることが好ましい。例えば、ラウリル硫酸塩、塩化リチウム、EDTA及びEGTAを含むコハク酸リチウムバッファー等を挙げることができる。
【００２５】
以下、本発明に用いる標識HPAプローブについて説明する。
本発明に用いる標識HPAプローブとしては、(CCCTAA)n(nは１〜１０の整数を表す。)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの非放射性標識物質でラベルしたオリゴヌクレオチドである。nは、目的とする染色体DNAに応じて適宜選択されるが、２〜８が好ましく、３〜５がさらに好ましい。
プローブに用いるオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等任意のDNA製造法により市販のDNA合成機を用いて製造することができる。なお、化学合成の際に、非放射性標識物質により標識するためのアミノリンカーを導入しておくのが好ましい。
ホスホアミダイト法を用いた場合、アミノリンカーを導入する試薬として、例えば、下記リンカー導入試薬１〜３を挙げることができる。
【００２６】
【化１】
2014050407.tif 000002
【００２７】
前記アミノリンカーを導入したオリゴヌクレオチドは、例えば、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて製造することができる。
【００２８】
本発明において、アクリジニウム・エステル（以下単にAEという。）とは、フェニルエステル基を有する下記化合物４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム９−カルボキシレートをいう。
【００２９】
【化２】
2014050407.tif 000003
【００３０】
前記AEは、前述のように導入したアミノリンカーのアミノ基と、AEのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により前記アミノリンカーを導入したオリゴヌクレオチドを標識することができ、これにより本発明に用いる標識HPAプローブが構築される。
AEによる標識方法及び操作手順については、例えば、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて行なうことができる。
AE等の標識位置は、DNA合成時に導入するアミノリンカーの位置によって自由に設定することができる（特表平2-502283号公報)。
【００３１】
前記標識HPAプローブは、例えば、ジェン・プローブ社から入手でき、AE標識ＧテイルHPAプローブ(5'-CCCTAACCCTAACC*CTAACCCTAACCCTA-3’、配列番号１、29塩基)が例として挙げられる。*はAE標識位置であり、前述のようにリンカー導入試薬１、２又は３を用いて構築されたオリゴヌクレオチドに導入されたアミノリンカーのアミノ基がAEのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により標識されている。
【００３２】
前記非放射性標識物質としては、前記AEの他に、ルミノール（Luminol)、イソルミノール(Isoluminol)、ピロガロール(Pyrogallol)、プロトヘミン(Protohaemin)、アミノブチルエチル-n-イソルミノール(Aminobutylethyl-n-isoluminol)又はアミノヘキシルエチル-n-エチル-イソルミノール(Aminohexylethyl-n-ethyl-isoluminol)が挙げられる。前記非放射性標識物質はオリゴヌクレオチドに導入されたアミノリンカーのアミノ基と化学結合しうる置換基を有する。そのような置換基として、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基が挙げられる。
なお、上記標識物質に限定されるものではなく、例えば、下記一般式(Ｉ)：
【００３３】
【化３】
2014050407.tif 000004
（[一般式Ｉ中、Ｘはハロゲン又は下記一般式(II)：
【００３４】
【化４】
2014050407.tif 000005
【００３５】
（式(II)中、Ｘ1は窒素原子、リン原子、ホウ素原子又はヒ素原子を表し、Ｒ1はアルコキシ若しくはアリールオキシ、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアリールを表し、Ｒ2は水素原子、アルコキシ若しくはアリールオキシ、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアリールを表す。）
若しくは下記一般式(III):
−Ｘ2−Ｒ2    (III)
（一般式(III)中、Ｘ2は酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｒ2は前記と同様である。）で示される基を表し、Ｙは酸素原子、硫黄原子又はNHを表し、Ｒ3は水素原子、アミノ、ヒドロキシ、チオール、カルボン酸、ハロゲン、ニトロ、アルコキシ若しくはアリールオキシ、又は置換若しくは非置換のアセチル、アルキル、アルケニル若しくはアリールを表し、Ｒ4は置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアリールを表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4の少なくとも１つは前記アミノリンカーと化学結合できる反応性部位を含む。]）で示されるアクリジン誘導体を使用することもできる。
【００３６】
ここで、ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素又はアスタチンが挙げられる。アルキルとしては炭素数１〜20、好ましくは１〜５のもの、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、アミル等が挙げられる。アルケニルとしては炭素数１〜10、好ましくは１〜５のもの、例えばビニル、アリル等が挙げられる。アリールとしては、例えばフェニル、トリル、ナフチル、キシリル等が挙げられる。アルコキシとしては、炭素数１〜10、好ましくは１〜５のもの、例えばメトキシ、エトキシ等が挙げられ、アリールオキシとしては、例えばフェノキシ、ナフトキシ等が挙げられる。
【００３７】
図１を参照して本発明のＧテイル配列の長さ測定方法について説明する。
図１は本発明のＧテイル測定方法の概要を示す図であり、図中の符番について説明すると、１はＧテイル、２はテロメアＧ鎖、３はテロメアＣ鎖、４は２本鎖テロメア部分、５は標識（HPA）プローブ、６はAE、７はハイブリダイズしなかったプローブ、８は加水分解して失活したプローブ、を各々意味する。Ｇテイル１は染色体DNA末端のテロメアＧ鎖２及びＣ鎖３からなるテロメア２本鎖部分４のＧ鎖末端に位置する。
【００３８】
本発明に用いるAE標識プローブ５はAE６で標識されており、Ｇテイルにおける反復配列と相補的な配列を有するため、反復配列の反復回数に応じた数の前記プローブが図１中（ａ）のハイブリダイゼーションによりハイブリダイズする。
前記AE標識プローブ５とＧテイル１とのハイブリダイゼーションは、具体的にはAE６で標識されたプローブを含むハイブリダイゼーション溶液を細胞ペレットに加え、例えば60〜65℃で５〜30分間インキュベート（保温保持）することにより行うことができる。
Ｇテイル１とハイブリダイズしたAE標識プローブ５は、AEが安定化し、図１中（ｂ）の一定時間加水分解を行ってもAEのエステル結合は保護されるため、アルカリ及び過酸化水素を加えることでAEは化学発光することができ、その発光量を図１中（ｃ）のように定量することによりＧテイル１の長さを測定することができる。
【００３９】
一方、プローブとＧテイル１とハイブリダイズしなかったプローブ７において、AEは安定化しない。この状態で（ｂ）の加水分解を行うとAEのエステル結合は加水分解を受け失活したプローブ８となり、化学発光は全く起こらず、失活したプローブ８は検出されない。
未反応のプローブに基づく化学発光を除くため加水分解（ｂ）について具体的には、加水分解試薬を加え、さらに60℃で５〜10分間インキュベートすることにより行なうことができる。インキュベート後の図１中（ｃ）のようなAEの化学発光量の測定は、ルミノメーター（例えばLeader  Ｉ（商品名、ジェン・プローブ社製））を用いて行なうことができる。特に96ウェルルミノメーターは、本発明の測定方法を用いたハイスループット・スクリーニングのために使用するのに好ましい。
【００４０】
本発明の測定方法において、DNA試料を3’→5’方向に一本鎖ヌクレオチドを選択的に除去するようにエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理しＧテイル配列を選択的に削除し前記化学発光がＧテイル特異的であることを確認することが好ましい。
また、ExoIで処理していない試料のシグナルとExoIで処理した試料のシグナルの比をＳ／Ｎ比として算出することもできる。これにより検体中にいかなる夾雑物が存在していてもＧテイル長さを特異的に測定することができる。
さらに、T7エキソヌクレアーゼで処理し、5’→3’方向にテロメアC鎖３を除去し、テロメアＧ鎖２のＧテイルを増加させることで前記化学発光がＧテイル配列特異的であることを確認することもできる。
【００４１】
以上説明した本発明の方法において、例えば、Ｇテイルの反復配列の基本単位となる配列（5'-TTAGGG-3'）が24回反復しており、プローブとして(5'-CCCTAA-3')の配列を4回反復させたもの[5'-(CCCTAA)4-3']を使用すると仮定すると、Ｇテイルにはプローブが理論上6個ハイブリダイズすることができる。従って、プローブ6個分の標識が検出されることとなる。長さの分かっているDNA標準品に上記プローブをハイブリダイズさせたときに検出される標識の強度を予め求めておいて検量線を作成しておけば、Ｇテイル配列の長さに換算することができる。
【００４２】
標識としてAE以外のアクリジン誘導体、その他の非放射性標識物質（例えば、ルミノール、イソルミノール、ピロガロール、プロトヘミン、アミノブチルエチル-n-イソルミノール、アミノヘキシルエチル-n-エチル-イソルミノール）を用いた場合も同様に化学発光量を定量しＧテイル長さを測定することができる。すなわち、細胞ペレットに前記アクリジン誘導体もしくはその他の非放射性標識物質で標識したプローブを適量加えて反応させ、反応終了後、加水分解等の処理を行った後、化学発光量を定量するものである。
【００４３】
以下、本発明のＧテイル配列の長さ測定用キットについて説明する。
本発明のキットは、非変性テロメア反復配列に相補的な配列（例えば、(CCCTAA)n  (nは１〜10の整数を表す。)）を有する標識DNAプローブと、細胞溶解用液と、加水分解用試薬とを少なくとも有するセットとするものである。このような標識DNAプローブは、標識HPAプローブとして前述したものが挙げられ、具体例、好ましい範囲とも前述したものと同様である。
前記細胞溶解用液としてラウリル硫酸塩、塩化リチウム、EDTA及びEGTAを含むコハク酸リチウムバッファーが挙げられる。前記加水分解用試薬としては、トリトンX-100を含む四ホウ酸ナトリウムバッファーが挙げられる。
【００４４】
本発明のキットには、Ｇテイル長さ検量線作成用の標準品（好ましくは20塩基以上、より好ましくは30〜100塩基のＧテイル配列）を含めることが好ましい。
染色体DNA量標準化検量線作成用の標準品（好ましくは20塩基以上、より好ましくは30〜100塩基のAlu配列の合成DNA）及び染色体DNA量標準化用Alu・HPAプローブ（例えば、5'-TGTAATCCCA*GCACTTTGGGAGGC-3'；*AE標識の位置、配列番号２)を含めることがより好ましい。
確認試薬としてエキソヌクレアーゼ（例えば、ExoＩ、T7エキソヌクレアーゼ等が挙げられ、好ましくはExoＩ）を含めることがさらに好ましい。
さらにポジティブコントロールDNAとして、例えば任意の癌細胞の精製染色体DNA等も含めることもできる。
【００４５】
Alu配列とは、5'-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACA-3'（配列番号３）で示される塩基配列を有し、染色体DNAあたりの量は培養細胞でも組織でも一定であることが知られている（J.D.ワトソン著、遺伝子の分子生物学、p668）。そこで、Ｇテイルを測定する際に各サンプルごとに内部標準としてAlu配列量も測定し、Ｇテイル配列とAlu配列との測定比を求めることにより、染色体DNA一定量あたりのＧテイル配列量を求めることができる。これにより平均Ｇテイル配列の長さを算出することができる。
【００４６】
【表１】
2014050407.tif 000006
【００４７】
上記表１を参照して本発明の測定方法と従来法と比較を示す。
表１から明らかなように、従来法はいずれも取扱いが面倒な放射性標識(RI)やゲル作製、泳動分離に時間を要する電気泳動を必要とし、いずれも完了するのに少なくとも２日要する煩雑なアッセイであり、細胞をそのまま測定に用いることもできない。また、それら従来方法は、大量の試料の分析のハイスループット・スクリーニングに適用できない。
一方、本発明の方法では、放射性物質を使用しないため特殊な廃棄処理設備を必要とせず、従来のように反応産物と取り込まれなかった放射性物質とを分離させる電気泳動等も必要ない。また、僅か１つの容器（例えば、試験管）を用いて、組織採取から短時間（40分以内程度）に20ヌクレオチドまで短い長さのＧテイルを特異的、定量的かつ高感度に測定できる。さらに、測定結果にばらつきが少ないため、再現性よくＧテイル長を測定することができ、大量のサンプルを容易に取り扱うことができる。さらに本発明の測定方法は、非変性染色体DNAだけでなく細胞を直接測定でき、大量の試料の分析のハイスループット・スクリーニング等に適用できる。
【００４８】
また、ゲノムDNAをインタクト（未切断）な状態で採取する必要がないため、培養細胞、新鮮組織などのほか、長期保存された組織（例えばホルマリン固定されたもの）におけるＧテイル長を測定することが可能となる。さらに、本発明の方法により、従来の検出方法と比較して高感度の検出結果が得られる。すなわち、感度は精製DNAではサザン法の約1000倍であり、数ngのゲノムDNAを測定することができる。
【００４９】
本発明の効果について以下に説明する。本発明のＧテイル配列の長さ測定方法によれば、テロメアを変性せずに、かつ煩雑な処理操作を用いず、僅か３工程で20ヌクレオチドまで短い長さのＧテイルを特異的、定量的かつ高感度に測定できる。
また、本発明の測定方法は、非変性染色体DNAだけでなく細胞そのものを検体として直接測定できるので迅速化が可能となり、大量の試料の分析のハイスループット・スクリーニング等に適用することができる。
【００５０】
さらに、5x105細胞数以下の少量の細胞をそのまま直接的に測定できるので、試料調製により染色体DNAを損失することがなく、例えば、血液検査、微穿刺吸引もしくは尿中癌細胞からの臨床試料等に起こり得るような入手細胞数に限界がある場合に有用である。
本発明のＧテイル配列の長さ測定用キットは、僅か１つの容器（例えば、試験管）を用いて検体のＧテイル配列の長さを40分未満で測定できる。
本発明の測定方法は、Ｇテイル損失の結果として生じる、癌や老化に伴う様々な疾患の患者に対して臨床的に使用できる。
本発明の測定方法は癌、加齢、テロメア異常の生物学的影響についての基礎研究に有用である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕
〈１−１〉一本鎖合成Ｇテイル用量応答性確認試験
本発明の測定方法の用量応答性を確認するために、一本鎖合成Ｇテイル84塩基、5’-(TTAGGG)14-3’（プロリゴ社製）の種々の濃度の下記ハイブリダイゼーションバッファー希釈液を、化学発光量3x107  relative  light  units  (以下単にrluという。)のAE標識ＧテイルHPAプローブ（5'-CCCTAACCCTAACC*CTAACCCTAACCCTA-3’、配列番号１、*AE標識の位置、29塩基）とともに下記ハイブリダイゼーションバッファー100μＬ中60℃で20分間インキュベートし、ハイブリダイズした。
前記AE標識Ｇテイルプローブは、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて、前記リンカー導入試薬３を用いて製造したアミノリンカー導入オリゴヌクレオチド（配列番号１）をAE標識することにより調製した。
【００５２】
【表２】
2014050407.tif 000007
なお、EDTAはエチレンジアミン四酢酸、EGTAはエチレングリコールビス（２‐アミノエチルエーテル）四酢酸である。
【００５３】
〈１−２〉ハイブリダイズしなかったプローブの加水分解及び化学発光検出
ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解は、300μLの加水分解バッファー(50mL/LのトリトンX-100を含有する0.6mol/L四ホウ酸ナトリウムバッファー、pH8.5)を各反応チューブに添加し、ボルテックス  ミキサーでよく撹拌し、60℃で10分間インキュベートすることにより行なわれた。ハイブリダイズしたプローブのAEは、上記条件では加水分解しなかった。それらチューブは、1分以上氷冷し、化学発光はルミノメーター(商品名Leader  1、ジェン-プローブ社製)で１つのチューブ当り2秒間測定した。
〈１−３〉結果
図２は上記29塩基のAE標識ＧテイルHPAプローブと一本鎖合成Ｇテイル84塩基との用量応答性試験の結果を示す図である。図２から明らかなように0.05fモル〜10fモルの範囲にわたるオリゴヌクレオチド用量の増加に伴って、シグナル強度の直線的増加が得られた。
【００５４】
〈２−１〉特異性確認試験
前記29塩基のAE標識ＧテイルHPAプローブが、Ｇテイルを構成する5’-TTAGGG-3’反復配列を特異的に検出することを確認した。WT（野生型）に一塩基を置換させた次に示す種々の84塩基のＧテイル一本鎖DNA(10fモル）を前記29塩基のAE標識ＧテイルHPAプローブで前記〈１−１〉と同様な条件でハイブリダイズした。：WT[5’-(TTAGGG)14-3’]、変異ＧテイルオリゴA[5’-(TTGGGG)14-3’]、Ｇテイル変異オリゴB[5’-(TTAAGG)14-3’]、Ｇテイル変異オリゴC[5’-(TTCGGG)14-3’]、及びＧテイル変異オリゴD[(5’-(TTAGGC)14-3’]（各ＧテイルDNAはいずれもプロリゴ社製である。）。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
〈２−２〉結果
図３は、特異性確認試験結果を示す図である。図３中、WTは野生型一本鎖Ｇテイル配列を、変異ＧテイルオリゴAは5’-(TTGGGG)14-3’を、変異ＧテイルオリゴBは5’-(TTAAGG)14-3’を、変異ＧテイルオリゴCは5’-(TTCGGG)14-3’を、及び変異ＧテイルオリゴDは5’-(TTAGGC)14-3’を、NCはネガティブコントロールを示している。NCはこの試験におけるバックグラウンドシグナルレベルを示す。図３から明らかなように、本発明に用いるHPAプローブは、目的の哺乳類Ｇテイル配列を特異的にかつ高いＳ／Ｎ比で検出することがわかる。
【００５５】
〈３−１〉AEのアルカリ処理抵抗性確認試験
AEの化学発光にはＧテイルとAE標識ＧテイルHPAプローブ（２９塩基）の間のハイブリダイゼーションにおいて何個の完全なヌクレオチド塩基対が必要か、アルカリ処理抵抗性確認試験を行なった。  前記AE標識ＧテイルHPAプローブと同様な塩基長２９塩基の一本鎖Ｇテイル（ＷＴ）と、前記プローブ側標識位置から５塩基離れた位置に点変異を有する２９塩基の下記変異Ｇテイル（Ｍｕ）と、通常の前記AE標識ＧテイルHPAプローブと、下記３種の変異AE標識ＧテイルHPAプローブ（Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２及びＭｕｔ３）とを用いて図４に示した組み合わせ(i)、(ii)、（iii）、（iv）及び（v）で前記〈１−１〉と同様な条件でハイブリダイズしAEに基づく化学発光量を測定した。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
【００５６】
Ｍｕ：5'-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG  -3'（配列番号４、変異Ｇテイル）
Ｍｕｔ１：5'-CCCTAAC*CATAACCCTAACCCTAACCCTA-3’（配列番号５、*AE標識の位置、下線が点変異位置、29塩基)
Ｍｕｔ２：5'-CCCTAACCA*TAACCCTAACCCTAACCCTA-3’（配列番号６、*AE標識の位置、下線が点変異位置、29塩基)
Ｍｕｔ３：5'-CCCTAACCATAACC*CTAACCCTAACCCTA-3’（配列番号７、*AE標識の位置、下線が点変異位置、29塩基)
【００５７】
〈３−２〉結果
図４は各組み合わせにおけるAEに基づく化学発光量を示したグラフである。  図４から明らかなように、AE標識位置がミスマッチ（iv）及びAE標識位置から１塩基離れた箇所がミスマッチ（iii）の組み合わせでは、化学発光がほとんど検出されなかった。また、AE標識位置から5塩基離れた箇所のミスマッチ((ii)及び(v))は若干化学発光が低下した程度であった。よってAE標識位置から6塩基程度離れた箇所のミスマッチはHPA化学発光に影響しないことがわかった。
【００５８】
〈４−１〉非変性ゲノムDNA用量応答性及びＧテイル特異性確認試験（１）
本発明の測定方法の非変性ゲノムDNA用量応答性を確認するために、種々の量のSiHa癌細胞系由来非変性ゲノムDNA(1μg、3μg、5μg、10μg及び20μg)と3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブとをハイブリダイズした。すなわち、ゲノムDNA中テロメア3’突出部（Ｇテイル）の検出のため、ファルコン352053チューブ（商品名）中のDNA溶液の総量は、滅菌水もしくはTEバッファー（10mM  Tris/HCl、1mM  EDTA、pH8.0）で100μLに調節した。100μＬの前記ハイダブリゼーション・バッファー中の3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブをDNA溶液に添加し、ボルテックス  ミキサーでよく撹拌し、60℃で20分間インキュベートした。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
【００５９】
〈４−２〉非変性ゲノムDNAの単離
本発明において、非変性ゲノムDNAを単離して用いる必要はないが、上記〈４−１〉確認試験に使用した非変性ゲノムDNAとしては下記のように単離したものを使用した。Ｇテイル長さ測定に使用する非変性ゲノムDNAは、フェノール-クロロホルム抽出法を用いて各細胞系から単離した。すなわち、細胞は、エッペンドルフ・マイクロ遠心管中6000rpm、4℃で5分間遠心分離することによりマイクロ・チューブ中にペレット化した。ペレットはPBS(-)で1回洗浄し、10mMトリスバッファー(pH7.6)、150mMNaCl及びNP-40を含有する抽出バッファーに最終濃度が0.5%となるように再懸濁した。プロテイナーゼK処理後、フェノール-クロロホルム抽出は２回行なった。ゲノムDNAはエタノール沈殿し、RNアーゼAで処理後TEバッファー中に溶解した。  
【００６０】
〈４−３〉Ｇテイル特異性確認のためのエキソヌクレアーゼI処理
非変性ゲノムDNAを3’→5’方向に一本鎖ヌクレオチドを選択的に除去するエキソヌクレアーゼI(ExoI)で処理し、Ｇテイル配列を選択的に削除し化学発光がＧテイル特異的であることを確認した。非変性ゲノムDNAのエキソヌクレアーゼI処理は下記のように行なった。  1xエキソヌクレアーゼ・バッファー(67mMグリシン-KOH(pH9.5)、6.7mM  MgCl2、10mM  2-メルカプトエタノール)中37℃で2時間ExoI(ニュー・イングランド・バイオラボズ社製、0.2U/μgDNA)で処理し、そしてＧテイルをアッセイする前に80℃で20分間熱失活させた。
【００６１】
〈４−４〉結果
図５にＧテイルをアッセイする前にExoIで前処理したゲノムDNAについての結果のグラフと、ExoIで前処理していない結果のグラフを示す。後述の方法により各量の1/20量の非変性ゲノムDNAを変性させ、3x106rluのAE標識AluプローブでハイブリダイズしゲノムDNA総量をノーマライズして任意単位をプロットして得られたグラフである。図５から明らかなように非変性ゲノムDNA1μg〜20μgの濃度範囲における直線的応答を得た。この結果から、非変性ゲノムDNA5μgを典型的に使用できることが分かる。図５から全ての試料はExoI感受性であることが分かり、検出された化学発光が一本鎖Ｇテイルに特異的であることが確認され、かつExoIで前処理したグラフと、ExoIで前処理していないグラフの対比から上記測定範囲内であれば、極めて大きいＳ／Ｎ比を示すことが分かる。
【００６２】
〈５−１〉Ｇテイル特異性確認試験（２）及びＧテイル配列の長さ測定
まず、非変性ゲノムDNAをT7エキソヌクレアーゼで処理し、5’→3’方向にテロメアC鎖を除去し、テロメアＧ鎖のＧテイルを増加させることで化学発光がＧテイル特異的であることを確認した。SiHa癌細胞系由来非変性ゲノムDNA(5μg)は下記のようにT7エキソヌクレアーゼ処理した。1xNEBuffer4（50mM酢酸カリウム、20mMトリス酢酸、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトール、pH7.9）中25℃で図中に示した時間、T7エキソヌクレアーゼ(ニュー・イングランド・バイオラボズ社製、1U/μgDNA)とインキュベートした。反応は、25mMの最終濃度となるようにEDTA(pH8.0)を添加することにより停止した。
〈５−２〉Ｇテイルの検出のための前記ハイダブリゼーション・バッファー中での前記AE標識ＧテイルHPAプローブと非変性DNAとのインキュベーション及びハイブリダイゼーションは、前記〈４−１〉と同様な条件で行なった。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
〈５−３〉結果
【００６３】
図６−１は非変性DNAのT7エキソヌクレアーゼ処理時間依存性化学発光量変化を示す図である。ExoI処理をしたグラフとExoIで前処理をしなかったグラフとの対比から、極めて大きいS/N比を示すことが分かる。図６−２は、図６−１のグラフを前記図２を検量線として用いてrlu値をＧテイルの平均長さに変換したグラフを示す図である。図６−１から明らかなように、T7エキソヌクレアーゼで処理し、5’→3’方向にテロメアC鎖を除去することで時間依存的に化学発光量が増加し、Ｇテイル配列が増加したことが分かる。
図６−２から明らかなようにSiHa癌細胞系は通常約220nt（ntはヌクレオチド数）の平均長さのＧテイル配列を有することが分かる。また、SiHa癌細胞系由来非変性ゲノムDNAをT7エキソヌクレアーゼ処理すると化学発光量が増加した90秒で、観察されたrlu値は、図６−２から明らかなようにほぼ平均1600ntの長さを有するＧテイルが生成したことを示している。
これら結果から、本発明の測定方法が特異的にＧテイル配列の長さを測定できることがわかる。
【００６４】
〈６−１〉本発明の感度限界確認試験
下記10nt、20nt、26nt、43nt及び62ntのＧテイルを有する合成テロメア末端構築物（T7 TEL Gt10、Gt20、Gt26、Gt43及びGt62）を用いて本発明の測定方法の感度限界、特に検出できるＧテイルの最小の長さを決定した。0.5、1.0、5.0及び10fモルの合成テロメア末端構築物を各試験に用いた（測定回数各2回）。なお、各合成テロメア末端構築物は配列番号８のDNAと、配列番号９〜１３のDNA（いずれもプロリゴ社製）をアニーリングし、ゲル電気泳動で精製することで調製した。
【００６５】
【化５】
2014050407.tif 000008
【００６６】
なお、Ｇテイルの検出のための前記ハイダブリゼーション・バッファー中での前記AE標識ＧテイルHPAプローブと非変性DNAとのインキュベーション及びハイブリダイゼーションは、前記〈４−１〉と同様な条件で行なった。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
〈６−２〉結果
図７は、感度限界確認試験の結果を示すグラフである。
図７から明らかなように、HPAプローブが29塩基の長さを有するにもかかわらず、ＧテイルDNA29塩基よりも短いＧテイルDNAを用いたとき、すなわち10ntのＧテイルも検出できたが、直線性は20nt〜62ntにおいて得られ、本発明の測定方法は20nt以上のＧテイル長を定量的に測定できることが分かる。
【００６７】
〈７−１〉内部標準試験（ゲノムDNA総量の標準化（normalization））
本発明の測定方法を実施する前に細胞数を調整したときでも、AluDNA配列を内部標準として用いてゲノムDNA総量をノーマライズすることができる。ＧテイルとAluとの測定比を求めるために、本発明の測定試験に使用する非変性DNAを熱変性させ、Alu・HPAプローブを用いハイブリダイズした。使用するAlu・HPAプローブについては、5'-TGTAATCCCA*GCACTTTGGGAGGC-3'(*AE標識の位置、配列番号２)である。なお、前記Alu・HPAプローブは、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて、前記リンカー導入試薬３を用いて製造したアミノリンカー導入オリゴヌクレオチド（配列番号２）をAE標識することにより調製した。
〈７−２〉結果
図８は化学発光量を任意単位でプロットして作成したグラフである（測定回数３回）。図８から明らかなようにAluDNA配列による発光量について、0.005μg〜1μgの濃度のゲノムDNAで直線的応答が得られた。
【００６８】
〔実施例２〕
〈８−１〉細胞ペレットを直接用いたＧテイル配列の長さ測定（１）
細胞ペレット中のＧテイル長さを測定するための下記〈８−２〉のように調製したSiHa癌細胞系細胞ペレットは100μLの前記ハイダブリゼーション・バッファー中再懸濁し、懸濁液をピペッティングによって混合し、26Gシリンジでせん断して使用した。3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブと細胞ペレットとのインキュベーション及びハイブリダイゼーションは、前記〈４−１〉と同様な条件で行なった。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。さらに前記〈７−１〉と同様に変性して細胞ペレット(1/10体積)を3x106rluのAE標識Aluプローブでハイブリダイズして、ゲノムDNA総量をノーマライズした。
【００６９】
〈８−２〉細胞ペレットの調製
前記SiHa癌細胞系細胞ペレットは、SiHa癌細胞系を1,000Gで5分間遠心分離し回収し、冷PBS(-)で２回洗浄し、液体窒素中で急速凍結し調製した。そして使用まで-80°Cで保存した。
〈８−３〉結果
図９は、SiHa癌細胞系細胞ペレットに本発明の測定方法を直接適用した結果を示す図である（測定回数2回）。
【００７０】
図９のグラフのrlu値を前記図２を検量線として用いてＧテイルの平均長さに変換したところ、SiHa癌細胞系のＧテイルの平均長さは２２０ｎｔであった。また、図９から明らかなように、本発明の測定方法は1x105〜3.5x106細胞の範囲で良い直線性を示したことから、Ｇテイルの測定に5x105程度の細胞数の細胞ペレットが典型的に使用できることが分かる。
【００７１】
〈９−１〉細胞ペレットを直接用いたＧテイル配列の長さ測定（２）
各々5x105細胞数の種々の細胞ペレット（各種TIG-3ヒトフィブロブラスト、各種SV40形質転換細胞及び各種SiHa癌細胞）へ本発明のＧテイル測定方法に直接適用し、各細胞のＧテイル長さを測定しかつ各細胞間Ｇテイル長さの差から生物学的評価を行なった。前記〈８−２〉と同様にして調製した各細胞ペレット(5x105細胞)は100μLの前記ハイブリダイゼーション・バッファー中に再懸濁し、懸濁液をピペッティングによって混合し、26Gシリンジでせん断して使用した。
【００７２】
3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブと細胞ペレットとのインキュベーション及びハイブリダイゼーションは、前記〈４−１〉と同様な条件で行なった。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。さらに前記〈７−１〉と同様に変性して細胞ペレット(1/10体積)を3x106rluのAE標識Aluプローブでハイブリダイズして、ゲノムDNA総量をノーマライズした。また、比較・確認のため、各細胞ペレット（各種TIG-3ヒトフィブロブラスト、各種SV40形質転換細胞及び各種SiHa癌細胞）から前記〈４−２〉と同様な方法によって非変性ゲノムDNAを単離した後、各細胞の非変性ゲノムDNAについても本発明の測定方法を適用した。
【００７３】
〈９−２〉使用細胞の培養
本発明の測定方法を適用した各細胞は下記のように培養保存しているものを使用した。
通常ヒトフィブロブラストTIG-3、SVts9-3(SV40形質転換TIG-3)、TIG-3-hTERT  (ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）cDNA感染TIG-3)、ヒト頸管癌細胞系SiHa及びレトロウイルスパッケージング細胞系PT67は、10%ウシ胎児仔血清(ハイクローン社製)で補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養保存した。
〈９−３〉ドミナント・ネガティブ対立遺伝子（TRF2ΔBΔM）を感染させたSiHa細胞の調製
本発明の測定方法を適用した細胞のうち、（TRF2ΔBΔM）を感染させたSiHa細胞（SiHa  dn  TRF2）の調製については、まず、レトロウイルス上清作製のため、pBabe-N-mycTRF2ΔBΔMレトロウイルス構築物（Titia  de  Langeロックフェラー大学教授から譲受した。その製造方法は、ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ランジェ・ティ．“セル”（van  Steensel  B，Smogorzewska  A  and  de  Lange  T.  Cell），92(1998)，401-13に記載の方法に準じて行なった。）はPT67パッケージング細胞系(BDクロンテック社製)にフュージェーン6トランスフェクション試薬(ロシュ社製)によりトランスフェクションした。2日後、上清を回収し、6μg/mlの最終濃度になるようポリブレン添加後0.22μmフィルター(ミリポア社製)に通した。ろ過した上清はSiHa癌細胞系の感染に用いた。翌日、培地を新鮮なピューロマイシン(0.5μg/ml)含有コンプリート培地に置き換え、4日間培養を続けTRF2ΔBΔMを感染させたSiHa細胞系を調製した。
【００７４】
〈９−４〉結果
図１０ａは、各細胞ペレットに本発明の測定方法を直接適用した結果を示す図である。一方、図１０ｂは、比較・確認のため、各細胞ペレットから非変性ゲノムDNAを単離した後、本発明の測定方法を適用した結果を示す図である。図１０ｂ中、右の棒グラフはテロメアＧテイル特異的に化学発光していることを確認するためにＧテイル測定をする前にExoI処理をした結果を示すグラフであり、左の棒グラフはExoIで前処理をしなかったグラフである。図１０ａ及び１０ｂにおいて、「TIG-3(Y)」は細胞集団倍化数（PDL）28の健常で若い細胞を、「TIG-3(S)」は81PDLの老化細胞を、「TIG-3-hTERT」はhTERT導入細胞をそれぞれ意味し、「SVts9-3(50)」は50PDLの若いSV40形質転換細胞を、「SVts9-3(121)」は121PDLの破局状態の細胞を意味し、及び「SiHa」はコントロールベクターを感染させたSiHa細胞を、「SiHa  dn  TRF2」はドミナント・ネガティブ対立遺伝子（TRF2ΔBΔM）を感染させたSiHa細胞を意味する。
【００７５】
図１０ａ及び１０ｂから明らかなように、細胞ペレットからのデータは精製ゲノムDNAからのデータと整合していた。また、ExoI処理をしたグラフとExoIで前処理をしなかったグラフとの対比から、極めて大きいＳ／Ｎ比を示すことが分かる。図１０ａの各グラフの縦軸を前記図２を検量線として用いてＧテイルの平均長さに変換したところ、下記表３のような結果が得られた。
【００７６】
【表３】
2014050407.tif 000009
【００７７】
図１０及び表３から明らかなようにテロメアＧテイルの平均の長さが特にSV40形質転換破局時細胞で縮小することが分かり、破局時にヒトテロメアＧテイルが縮小するという従来の知見（例えば、非特許文献６を参照。）と整合していることが分かる。なお、hTERT発現TIG-3細胞において、Ｇテイルの縮小は観察されなかった。また、TRF2のドミナント・ネガティブ対立遺伝子（TRF2ΔBΔM）はＧテイルの長さを縮小することが知られている（例えば、非特許文献２、参照。）が、SiHa細胞の結果から、Ｇテイルにおいて予想された縮小が確認された。以上の結果から本発明の測定方法は細胞ペレットを用いて直接的にＧテイルの長さを測定でき、その測定されたＧテイルの長さの細胞間の差から生物学的評価を行なうことができる。
【００７８】
〔実施例３〕
〈１０−１〉本発明の測定方法と特開2001-95586公報に記載の測定方法との比較試験
種々の細胞（HeLa癌細胞、SiHa癌細胞、MCF-7癌細胞、MRC-5-hTERT正常線維芽細胞、及び90p正常乳腺上皮細胞）に前記〈９−３〉と同様な手順によりドミナント・ネガティブ対立遺伝子（TRF2ΔBΔM）を感染させた後、各々の細胞（HeLa癌細胞、SiHa癌細胞、MCF-7癌細胞、MRC-5-hTERT正常線維芽細胞、及び90p正常乳腺上皮細胞）から前記〈４−２〉と同様な手順により非変性DNAを単離し、各非変性DNA（5μg）を本発明のＧテイル測定方法に適用し、各細胞のＧテイル長さを測定しかつ比較例として特開2001-95586公報に記載の測定方法を各変性DNA（0.5μg）に適応し、テロメア全長の測定を行なった。なお、ExoI処理については前記〈４−３〉に記載の手順、使用細胞の培養については前記〈９−２〉に記載の手順と同様である。
【００７９】
図１１ａは、本発明の測定方法によりＧテイルを測定した結果を示す図である。図１１ｂは、比較例として特開2001-95586公報に記載の測定方法によりテロメア全長を測定した結果を示す図である。図１１ａ中「Ｃ」はコントロールを示し、「Ｔ」はＧテイルを短縮させる薬剤テロメスタチン5μMで48時間処理した細胞を示し、＋は、ExoI処理した細胞、−は処理していない細胞を示す。ExoI処理をしたグラフとExoIで前処理をしなかったグラフとの対比から極めて大きいＳ／Ｎ比を示すことが分かる。図１１ｂ中「Ｃ」はコントロールを示し、「Ｔ」はＧテイルを短縮させる薬剤テロメスタチン5μMで48時間処理した細胞を示す。
【００８０】
まず、図１１ａ及び１１ｂについて概観する。縦軸の任意単位は同一のプローブ及び同一の装置を用いて測定された発光強度を内部標準としてのAlu配列に対する比として表したグラフであるから、図１１ａ及び１１ｂを比較評価することができる。図１１ａ及び図１１ｂを比較すると、図１１ａはおおよそ任意強度２程度である一方、図１１ｂは任意強度７０程度であり、図１１ａのシグナル強度は図１１ｂの約1/35程度しかないことがわかる。さらに、図１１ａは非変性DNAを5μg用いた一方、図１１ａは0.5μg用いたグラフであるので、同一濃度とした場合は約1/350程度しかないことになる。
【００８１】
よって、特許文献１（特開2001-95586公報）に記載の測定方法においてはＧテイルの長さは操作誤差及び測定誤差の範囲のノイズレベル程度のシグナル強度でありＧテイルは測定できないことが分かる。次に、図１１ａの各グラフの縦軸を前記図２を検量線として用いてＧテイルの平均長さに変換し、図１１ｂの各グラフの縦軸についてはテロメア全長に変換したところ、下記表４のような結果が得られた。
【００８２】
【表４】
2014050407.tif 000010
【００８３】
表３及び図１１ｂから明らかなように、全体の長さが４kbpから数十kbpであるテロメアの長さに比べて、Ｇテイルの長さは、75〜300塩基であるため、テロメスタチンで強制的に染色体末端のＧテイルを短縮させた場合に、100塩基ほどのＧテイルの短縮がみられたとしても、従来のテロメアHPA法である特許文献１（特開2001-95586公報）に記載の測定方法では差が観察されなかった。一方、表３及び図１１ａから明らかなように、本発明の測定方法によればHeLa癌細胞、SiHa癌細胞、MCF-7癌細胞は、dnTRF2によりＧテイルが短縮されたことが分かり、20塩基の違いでも測定できることが分かる。また、MRC-5-hTERT正常線維芽細胞、90p正常乳腺上皮細胞は、dnTRF2で短縮しないことが分かる。
【００８４】
〔実施例4〕マウスの培養細胞を用いたＧテイル長さ測定
〈１１−１〉非変性ゲノムDNAの単離
本発明において、非変性ゲノムDNAを単離して用いる必要はないが、下記〈１１−２〉確認試験に使用した非変性ゲノムDNAとしては下記のように単離したものを使用した。Ｇテイル長さ測定に使用する非変性ゲノムDNAは、フェノール-クロロホルム抽出法を用いて各細胞系から単離した。すなわち、細胞は、エッペンドルフ・マイクロ遠心管中6000rpm、4℃で5分間遠心分離することによりマイクロ・チューブ中にペレット化した。ペレットはPBS(-)で1回洗浄し、10mMトリスバッファー(pH7.6)、150mMNaCl及びNP-40を含有する抽出バッファーに最終濃度が0.5%となるように再懸濁した。プロテイナーゼK処理後、フェノール-クロロホルム抽出は２回行なった。ゲノムDNAはエタノール沈殿し、RNアーゼAで処理後TEバッファー中に溶解した。
【００８５】
〈１１−２〉非変性ゲノムDNA用量応答性及びＧテイル特異性確認試験
本発明の測定方法の非変性ゲノムDNA用量応答性を確認するために、種々の量のNIH3T3マウス繊維芽細胞由来非変性ゲノムDNA(0.001μg、0.003μg、0.005μg、0.01μg、0.03μg、0.05μg、0.1μg、0.3μg、0.5μg、1μg、3μg、5μg及び10μg)と3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブとをハイブリダイズした。すなわち、ゲノムDNA中テロメア3’突出部（Ｇテイル）の検出のため、ファルコン352053チューブ（商品名）中のDNA溶液の総量は、滅菌水もしくはTEバッファー（10mM  Tris/HCl、1mM  EDTA、pH8.0）で100μLに調節した。これを65℃の水浴中で5分間加温し、100μＬの前記ハイダブリゼーション・バッファー中の3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブをDNA溶液に添加し、ボルテックス  ミキサーでよく撹拌し、60℃で20分間インキュベートした。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、実施例の前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
【００８６】
〈１１−３〉結果
図１２から明らかなように非変性ゲノムDNA  0.001μg〜10μgの濃度範囲における直線的応答を得た。この結果から、非変性ゲノムDNA  0.01μgを典型的に使用できることが分かる。
【００８７】
〈１２−１〉  マウス組織を用いたＧテイル長さ測定
マウスの組織、例えば肝臓、腎臓、胃、大腸、胸腺などからゲノムDNAを単離し、ゲノムDNAを１μｇから５μｇ用いてＧテイルを測定した。
〈１２−２〉非変性ゲノムDNAの単離
本発明において、非変性ゲノムDNAを単離して用いる必要はないが、上記〈１２−１〉確認試験に使用した非変性ゲノムDNAとしては下記のように単離したものを使用した。
Ｇテイル長さ測定に使用する非変性ゲノムDNAは、フェノール-クロロホルム抽出法を用いて各組織から単離した。すなわち、組織は、−80℃にて凍結させたものあるいは組織単離後すぐにホモジナイズし、10mMトリスバッファー(pH7.6)、150mMNaCl及びNP-40を含有する抽出バッファーに最終濃度が0.5%となるように再懸濁した。プロテイナーゼK処理後、フェノール-クロロホルム抽出は２回行なった。ゲノムDNAはエタノール沈殿し、RNアーゼAで処理後TEバッファー中に溶解した。
【００８８】
〈１２−３〉非変性ゲノムDNA用量応答性及びＧテイル特異性確認試験
本発明の測定方法の非変性ゲノムDNA用量応答性を確認するために、種々のマウス組織由来非変性ゲノムDNA0.5μgと3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブとをハイブリダイズした。すなわち、ゲノムDNA中テロメア3’突出部（Ｇテイル）の検出のため、ファルコン352053チューブ（商品名）中のDNA溶液の総量は、滅菌水もしくはTEバッファー（10mM  Tris/HCl、1mM  EDTA、pH8.0）で100μLに調節した。これを65℃の水浴中で5分間加温し、100μＬの前記ハイダブリゼーション・バッファー中の3x106rluの前記AE標識ＧテイルHPAプローブをDNA溶液に添加し、ボルテックス  ミキサーでよく撹拌し、60℃で20分間インキュベートした。また、ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解及び化学発光検出は、前記〈１−２〉と同様な条件で行なった。
【００８９】
〈１２−４〉結果
小腸、大腸、精巣などの組織で本測定方法でＧテイルのシグナルが検出できた。小腸や精巣では長いＧテイルが検出されたが、大腸はそれに比べて短い。図１３から全ての試料はExoI感受性であることが分かり、検出された化学発光が一本鎖Ｇテイルに特異的であることが確認され、かつExoIで前処理したグラフと、ExoIで前処理していないグラフの対比からマウス組織においてもＧテイルが十分に測定できる。
【００９０】
〈１３−１〉マウスを用いた場合の内部標準試験（ゲノムDNA総量の標準化）
本発明の測定方法を実施する前に細胞数を調整したときでも、マウスに存在する繰り返し配列A1またはB２を内部標準として用いてマウスゲノムDNA総量をノーマライズすることができる。ＧテイルとA1、A2またはB２との測定比を求めるために、本発明の測定試験に使用する非変性DNAを熱変性させ、A1、A2またはB２・HPAプローブを用いハイブリダイズした。使用するA1、A2またはB２・HPAプローブについてはA1a  probe：5’−GAA  CAG  TGT  ATA  T*C  AAT  GAG  TTA  CAA  T−3’（配列番号14）、A1b  probe：5’−GAA  CAG  TGT  ATA  TCA  A*T  GAG  TTA  CAA  T−3’（配列番号15）、A2a  probe：5’−CGT  TGG  AA*  ACG  GGA  TTT  GTA  GAA  CA−3’（配列番号16）、A2b  probe：5’−CGT  TGG  AAA  CGG  GA*  TTT  GTA  GAA  CA−3’（配列番号17）、B2_1b  probe：5’−GTC  TGA  AGA  CA*  GCT  ACA  GTG  TA−3’（配列番号18）、B2-2a  probe：5’−CCG  ACT  G*C  TCT  TCT  GAA  GGT  C−3’（配列番号19）、B2_2b  probe：5’−CCG  ACT  GCT  CTT  C*T  GAA  GGT  C−3’（配列番号20）(配列中の「*」印は、AE標識の位置を示す。)、である。
【００９１】
なお、前記A1、A2またはB1・HPAプローブは、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて、前記リンカー導入試薬３を用いて製造したアミノリンカー導入オリゴヌクレオチド（配列番号２）をAE標識することにより調製した。
【００９２】
〈１３−２〉結果
図１４−１〜図１４−７は化学発光量を任意単位でプロットして作成したグラフである（測定回数３回）。図１４−１〜１４−７より明らかなようにA1、A2またはB2DNA配列による発光量について、0.5μg〜10μgの濃度のゲノムDNAで直線的応答が得られた。
【００９３】
〔実施例５〕  96ウエルプレートを用いたＧテイル長の測定
〈１４−１〉96マルチウエルプレートでの一本鎖合成Ｇテイル用量応答性確認試験
本発明の測定方法の用量応答性を確認するために、一本鎖合成Ｇテイル84塩基、5’-(TTAGGG)14-3’（プロリゴ社製）の種々の濃度のハイブリダイゼーションバッファー希釈液（30μＬ）を、化学発光量3x106  relative  light  units  (以下単にrluという。)のAE標識ＧテイルHPAプローブ（5'-CCCTAACCCTAACC*CTAACCCTAACCCTA-3’、配列番号１、*AE標識の位置、29塩基）とともに実施例１〈１−１〉項に記載のハイブリダイゼーションバッファー30μＬ中70℃で30分間、プレート用ブロックヒーターでインキュベートし、ハイブリダイズした。例えば、サーモミキサーコンフォート（エッペンドルフ株式会社）。使用する機器によって温度、時間は変更可能である。
【００９４】
前記AE標識Ｇテイルプローブは、特許第3483829号公報に記載の方法に準じて、前記リンカー導入試薬３を用いて製造したアミノリンカー導入オリゴヌクレオチド（配列番号１）をAE標識することにより調製した。
【００９５】
〈１４−２〉ハイブリダイズしなかったプローブの加水分解及び化学発光検出
ハイブリダイズしなかったプローブのAEの加水分解は、90μLの加水分解バッファー(50mL/LのトリトンX-100を含有する0.6mol/L四ホウ酸ナトリウムバッファー、pH8.5)を各反応チューブに添加し、よく撹拌し、70℃で25分間、プレート用ブロックヒーターでインキュベートすることにより行なわれた。ハイブリダイズしたプローブのAEは、上記条件では加水分解しなかった。それらチューブは、室温に２分程度放置し、96ウェルプレート対応型ルミノメーター（２つの試薬を同時に加えることのできるタイプ、GloMax（商標）  96  Microplate  Luminometer  w/Dual  Injectors（商品名）、Promega社製）で、60μＬのリーダーI液を加えてその２秒後に60μＬのリーダーII液を加え、測定時間２秒で、その発光を測定する。
【００９６】
〈１４−３〉結果
図１５は、上記29塩基のAE標識ＧテイルHPAプローブと一本鎖合成Ｇテイル84塩基との96ウエルプレートを用いた方法でのＧテイル測定において、用量応答性試験の結果を示す図である。図１５から明らかなように0.05fモル〜10fモルの範囲にわたるオリゴヌクレオチドの用量の増加に伴って、シグナル強度の直線的増加が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によれば、煩雑な処理操作を用いず、変性しないで、そのままテロメアの一本鎖突出部（Ｇテイル）配列の長さを特異的、高感度かつ迅速に測定する方法、及びその測定キットを提供する。
本発明の測定方法は、Ｇテイル損失を伴う疾患とされている、癌、老化に伴う種々の疾患の患者の検査試薬として有用である。また、加齢に伴う疾患、癌、テロメア異常の生理的基礎研究に有用である。
【００９８】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
【図２】
2014050407.tif 000011
【図５】
2014050407.tif 000012
【図１４−３】
2014050407.tif 000013
【図１５】
2014050407.tif 000014
【図１】
2014050407.tif 000015
【図３】
2014050407.tif 000016
【図４】
2014050407.tif 000017
【図６−１】
2014050407.tif 000018
【図６−２】
2014050407.tif 000019
【図７】
2014050407.tif 000020
【図８】
2014050407.tif 000021
【図９】
2014050407.tif 000022
【図１０】
2014050407.tif 000023
【図１１】
2014050407.tif 000024
【図１２】
2014050407.tif 000025
【図１３】
2014050407.tif 000026
【図１４−１】
2014050407.tif 000027
【図１４−２】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
2014050407.tif 000030
【図１４−６】
2014050407.tif 000031
【図１４−７】
2014050407.tif 000032
【配列表】
2014050407000001.app