(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質又は異物の光の信号の少なくとも一部を排除する手法を提供すること。【解決手段】  本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、そのデータに於いて、発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号をノイズ信号であると判定することを特徴とする。【選択図】図３
2014149195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて前記検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部に於いて、前記個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、前記光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの前記個別に検出された信号がノイズ信号であると判定されることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記所定の範囲が前記光検出領域の位置の移動経路上に於ける前記ノイズ信号を発生する物質の寸法に基づいて設定されることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１又は２の装置であって、前記光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にあり、前記光検出領域の位置の移動速度が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、前記光検出領域の位置の移動周期が前記発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域の位置の移動経路が円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であることを特徴とする装置。
【請求項５】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する過程と、
前記個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、前記光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの前記個別に検出された信号をノイズ信号であると判定する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記所定の範囲が前記光検出領域の位置の移動経路上に於ける前記ノイズ信号を発生する物質の寸法に基づいて設定されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５又は６の方法であって、前記光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にあり、前記光検出領域の位置の移動速度が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、前記光検出領域の位置の移動周期が前記発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置の移動経路が円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する手順と、
前記個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、前記光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの前記個別に検出された信号をノイズ信号であると判定する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９のコンピュータプログラムであって、前記所定の範囲が前記光検出領域の位置の移動経路上に於ける前記ノイズ信号を発生する物質の寸法に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１１】
請求項９又は１０のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にあり、前記光検出領域の位置の移動速度が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、前記光検出領域の位置の移動周期が前記発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置の移動経路が円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であることを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。
【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献９〜１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【特許文献９】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献１０】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献１１】国際公開第２０１１／１０８３７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の走査分子計数法に於いては、既に触れた如く、典型的には、走査型光学顕微鏡の対物レンズの先端の前方に置かれた容器内の試料溶液中にて光検出領域の位置を移動させながら、発光粒子からの光の強度の測定が行われる。従って、対物レンズの光の入出端面と光検出領域との間の光路は、試料容器の壁（底面、頂面若しくは側面）を通過することとなる。その場合、試料容器の壁の表面上に塵や埃などの汚染物質が付着していると、かかる汚染物質からの蛍光や散乱光が対物レンズへ入射して光検出器により検出され、光強度の時系列の計測データ（時系列光強度データ）上に信号として現れてしまうことがある。時系列光強度データ上に於いて、汚染物質からの光を表す信号（ノイズ信号）は、多くの場合、観測されるべき発光粒子の光の信号とは、プロファイル等の特性が異なるので、時系列光強度データ上から発光粒子の信号を抽出する処理過程に於いて排除される。しかしながら、汚染物質由来のノイズ信号の一部には、発光粒子の信号と区別のつきにくい信号も存在し、そのようなノイズ信号は、誤って発光粒子の信号として認識されてしまい、その結果、検出結果の精度を悪化させることと成り得る。
【０００６】
かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法に於いて試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質の光の信号の少なくとも一部を排除できる手法を提供することである。
【０００７】
この点に関し、本発明の発明者は、試料容器の壁の表面上に固着した汚染物質の一部については、それらが有限の寸法を有している点に着目し、そのような汚染物質の光の信号は、その時系列光強度データ上に於ける出現位置と光検出領域の移動経路との関係から決定される信号の光検出領域の軌跡上に於ける発生位置を参照することにより判別可能であることを見出した。かかる知見は本発明に於いて利用される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて前記検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部に於いて、前記の個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号がノイズ信号であると判定されることを特徴とする装置によって達成される。
【０００９】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
【００１０】
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる構成に於いて、既に述べた如く、対物レンズの光の入出端面と光検出領域との間の光路が通過する試料容器の壁に塵、埃、汚れ等の異物が存在し、かかる異物が光を発する場合には、時系列光強度データ上に異物からの光を表す信号が出現することとなる。かかる異物の光の信号は、その多くは、発光粒子の信号とは異なる特徴を有しているので、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の特徴、特に、信号のプロファイル（光強度の時間変化）を有する信号を検出する場合にノイズ信号として判定され、除外されるが、発光粒子の信号の特徴と良く似た特徴を有する信号は、異物の光の信号であっても、発光粒子の信号として誤判定され得ることとなる。
【００１１】
しかしながら、そのような場合であっても、上記の如き異物は、試料容器の壁に付着しており、異物の光の信号は、光検出領域の移動に伴って光路が異物の位置と重なる度に発生することとなるので（典型的には、異物の光の信号の発生は周期的となる）、異物の光の信号の発生位置は、光検出領域の軌跡上に於いて、所定の範囲内となり、その範囲は、時系列光強度データ上に於ける信号の出現位置と光検出領域の移動経路との関係によって決定可能である。そこで、本発明の信号処理部は、上記の如く、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号が検出されたときには、それらの信号がノイズ信号であると判定されることとし、これにより、検出結果からのノイズ信号の排除ができるよう構成される。なお、試料容器の壁上の異物は、有限の大きさを有しているので、異物の光の信号の発生位置の間隔は、異物の寸法に依存して決定される。従って、上記の構成に於いて、「所定の範囲」は、光検出領域の位置の移動経路上に於けるノイズ信号を発生する物質（異物）の寸法に基づいて設定されてよい。
【００１２】
上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、時系列光強度データ上での発光粒子の信号の特徴は、典型的は、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状となっている点である。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよい。この点に関し、単一の発光粒子からの光の強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよい。
【００１３】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度が、発光粒子のブラウン運動による移動速度よりも遅い場合、発光粒子のブラウン運動によるよりランダムな動きにより、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。しかしながら、一方、光検出領域の位置の移動経路が循環軌道である場合であって、発光粒子が拡散により光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも光検出領域の位置の移動周期が短くなるほど光検出領域の位置の移動速度が速い場合、同一の発光粒子が光検出領域の位置の移動周期毎に複数回光検出領域内へ進入して、検出され易くなることにより、やはり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となると共に、試料容器に対して不動の異物からの信号との区別がつき難くなる。そこで、本発明の装置に於いて、好適には、光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にある場合、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、光検出領域の位置の移動周期が発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されてよい。
【００１４】
試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であってよい。
【００１５】
上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、発光粒子の信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動経路の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
【００１６】
上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号がノイズ信号であると判定される光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する手順と、個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号をノイズ信号であると判定する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
【００１７】
かかる構成に於いても、所定の範囲が前記光検出領域の位置の移動経路上に於けるノイズ信号を発生する物質の寸法に基づいて設定されてよい。また、光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にある場合には、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、光検出領域の位置の移動周期が発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されてよい。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であってよい。
【００１８】
また、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよく、時系列の光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出されるよう構成されていてよい。更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
【００１９】
上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析方法であって、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号がノイズ信号であると判定される新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出する過程と、個別に検出された信号が複数個検出されている場合に、光検出領域の軌跡上に於ける発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの個別に検出された信号をノイズ信号であると判定する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。
【００２０】
かかる構成に於いても、所定の範囲が光検出領域の位置の移動経路上に於けるノイズ信号を発生する物質の寸法に基づいて設定されてよい。また、光検出領域の位置の移動経路が循環軌道上にある場合には、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも速い値に設定され、光検出領域の位置の移動周期が発光粒子が拡散により前記光検出領域の大きさよりも長い距離移動する時間よりも長い値に設定されてよい。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線及びこれらの組合せのうちから選択可能であってよい。
【００２１】
また、上記の方法に於いても、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出するよう構成されていてよく、時系列の光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号の特徴を有する信号として検出されるよう構成されていてよい。更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
【００２２】
上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００２３】
かくして、本発明によれば、走査分子計数法に於いて試料容器の壁の表面上に付着した汚染物質又は異物の光の信号であって、発光粒子の信号の特徴を有する信号を排除することが可能となる。かかる構成によれば、光強度データ上に於いて試料容器の壁上で不動の異物の影響を低減できることとなるので、試料容器の壁の近傍で光検出領域による走査をする場合に異物の信号と発光粒子の信号との区別がつき難いという問題が解消又は軽減され、検出結果の精度の向上が期待される。また、これにより、検査前の試料容器の洗浄の負担の軽減も期待される。
【００２４】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、本発明に於ける光学系の光路を変更することによる走査軌道に沿った光検出領域の位置の移動の態様を説明する図である。図２（Ｄ）は、試料溶液の位置の移動の態様を説明する図である。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｃ）は、光検出領域の移動経路上の試料容器の壁に異物が付着している場合の異物と光検出領域の移動経路（ＣＶ経路）との位置関係（上段）とその場合の光強度の時間変化（下段）を模式的に表している。（Ａ）は、光検出領域の移動経路が単純な循環経路（円形など）である場合であり、（Ｂ）は、光検出領域の移動経路が単純な循環経路を組み合わせた経路（図２（Ｄ）参照）である場合である。（Ｃ）は、異物の信号がそのプロファイルから判別できる場合である。図３（Ｄ）は、光検出領域の寸法と発光粒子のブラウン運動による（光検出領域の一周期当たりの）変位との関係を説明する光検出領域の模式図である。
【図４】図４（Ａ）は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。図４（Ｂ）は、ノイズ判定の方式を説明する図である。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図６】図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図７】図７（Ａ）は、９５個のウェルに試料溶液として超純水を分注した試料について、走査分子計数法に従って発光粒子の信号の特徴を有するパルス状信号の検出を行った場合に於ける各ウェルにて検出されたパルス状信号の総数をグラフ化して表した図である。一つのウェルの光の計測時間は、２００秒である。図７（Ｂ）は、（Ａ）中の矢印のウェルの時系列光強度データの一部（初めの２０秒間）を示している。図中、未処理の時系列光強度データ（Raw2ch）、平滑化された時系列光強度データ（Smoothing）、ガウス関数のフィッティング曲線（Fit）が重ねて表示されている。図７（Ｃ）は、（Ｂ）中の矢印のウェルの時系列光強度データの２．４秒付近の時系列光強度データの一部を示している。
【図８】図８（Ａ）は、図７（Ａ）の矢印のウェルに於いて存在していた異物の顕微鏡像である（左：共焦点蛍光顕微鏡像、右：透過光像）。なお、像は、一辺が４５０μｍである。顕微鏡像に於ける励起波長は６３３ｎｍとした。図８（Ｂ）は、図７（Ｂ）中の矢印のウェルの時系列光強度データの１秒付近の時系列光強度データの一部を示している。図中、未処理の時系列光強度データ（Raw2ch）、平滑化された時系列光強度データ（Smoothing）、ガウス関数のフィッティング曲線（Fit）が重ねて表示されている。
【図９】図９（Ａ）は、発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎを１００ａＭにて含む試料溶液について走査分子計数法に従って発光粒子の信号の特徴を有するパルス状信号の検出を行った場合に於ける時系列光強度データ（測定時間：２０秒間）である。図９（Ｂ）は、発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎにて標識されたＤＮＡを１００ａＭにて含む試料溶液について走査分子計数法に従って発光粒子の信号の特徴を有するパルス状信号の検出を行った場合に於ける時系列光強度データ（測定時間：２０秒間）である。図中、未処理の時系列光強度データ（Raw2ch）、平滑化された時系列光強度データ（Smoothing）、ガウス関数のフィッティング曲線（Fit）が重ねて表示されている。
【符号の説明】
【００２６】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェ��１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２９】
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。また、上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させると同時に、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液内に於ける光検出領域の走査軌道の位置が所定の移動経路に沿って移動されてもよい。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００３０】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００３１】
コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
【００３２】
本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、試料容器の壁に付着した異物からの光の信号であって時系列光強度データ上に於いて発光粒子の信号と同様の特徴を有する信号の判別を可能にするノイズ判定機構が採用される。以下、本発明の走査分子計数法及びノイズ信号判別の原理について説明する。
【００３３】
１.走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献９〜１１）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００３４】
上記の走査分子計数法に於ける光検出領域の位置の移動に於いては、既に触れた如く、簡単には、図１のミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａのいずれか一方のみ駆動して、図２（Ｃ）に例示されている如く、光検出領域が単純に（経路の交差がなく）閉じた循環経路（走査軌道）に沿って移動されるようになっていてよく、或いは、図２（Ｄ）の如く、ミラー偏向器１７を駆動して光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させながら、ステージ位置変更装置１７ａを連続的に駆動して、試料溶液の位置を移動し、これにより、試料溶液を基準にして光検出領域の走査軌道の位置を移動し、光検出領域が短時間のうちにできるだけ広い面積を走査できるようになっていてよい。
【００３５】
２．試料容器の壁上に付着した異物からの光の信号（ノイズ信号）の判別
既に述べた如く、試料容器の壁上に塵、埃、汚れ等の汚染物質又は異物が付着しており、その異物の存在位置を、光検出領域又はその光路が通過すると、異物が発光してその光が光検出器により検出される場合がある。そのような試料容器の壁上に発光する異物があるとき、多くの場合、異物からの光の信号のプロファイルは、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号の描くような釣鐘状のプロファイルとはならないので（図３（Ｃ）参照）、後に説明される如き、時系列光強度データに於いて見出されるパルス状の信号の形状的特徴、例えば、ピーク強度、幅、ガウス関数等の釣鐘型関数の形状に対する近似の程度（ガウス関数フィッティングに於ける相関係数）を参照して、発光粒子の信号とノイズ信号とを判別する処理に於いて、異物からの光の信号は、ノイズ信号として判別される。しかしながら、図３（Ａ）又は（Ｂ）に例示されている如く、光検出領域の位置が異物を瞬間的に通過するような場合、異物からの光の信号が発光粒子の信号と同様に釣鐘型のパルス状のプロファイルを有することがあり、その場合には異物からの光の信号を発光粒子の信号と誤判別してしまうこととなる。
【００３６】
ところで、例えば、光検出領域の位置の移動経路が単純な循環経路で有る場合（図２（Ｃ））には、図３（Ａ）の如く、光検出領域は、循環周期毎に異物を通過することとなるので、異物からの光の信号は、循環経路上の所定の範囲内にて発生する。また、図２（Ｄ）の如く、単純な循環経路が移動して成る経路上に沿って光検出領域の位置が移動する場合には、図３（Ｂ）の如く、光検出領域の位置が不動の異物上を横切る範囲内にあるときにのみ異物上を通過する度に異物からの光の信号が発生する。即ち、時系列光強度データ上に於いて異物からの光の信号が複数回出現する場合、それらの信号は、互いに光検出領域の移動経路上の位置に於いて所定の範囲内に収まることとなる。
【００３７】
そこで、本発明に於いては、時系列の光強度データ上に於いて複数の発光粒子の信号の特徴を有する信号が検出された場合に、それらの信号の（光検出領域の移動経路上に於ける）発生位置の間隔が所定の範囲内にあるときには、それらの信号がノイズ信号であると判定し、これにより、発光粒子の信号の釣鐘型のパルス状のプロファイルを有するか否かによる判別に加えて、発光粒子の信号とノイズ信号との更なる判別処理を行い、検出結果の精度の向上が図られる。具体的な処理では、後により詳細に説明される如く、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の特徴を有する信号が検出された後、検出された信号の全てについて、二つの信号間の発生位置の間隔が算出され、発生位置の間隔が所定の範囲内にある二つの信号がノイズ信号として判別される。所定の範囲の設定は、光検出領域の位置の移動経路の形状と、想定される異物の寸法とによって適宜設定される（詳細は後述される。）。
【００３８】
なお、上記の構成によれば、或る発光粒子が光検出領域内に包含された後、光検出領域がその移動経路を一巡する間に、発光粒子が光検出領域の在った空間から脱出していないと、同じ発光粒子が再び光検出領域内に包含され、その光が検出されることとなる。そうすると、上記のノイズ信号の判別の構成では、発光粒子の信号がノイズ信号として判別されることとなってしまう。かかる誤判別は、特に、寸法の大きい（拡散係数が比較的小さい）発光粒子の場合に生じ易い。そこで、発光粒子の信号がノイズ信号として判別されることを回避すべく、好適には、光検出領域の移動周期は、発光粒子が拡散により光検出領域の大きさを移動するのに要する時間よりも長く設定される。具体的には、例えば、図３（Ｄ）を参照して、光検出領域の（ｋ−１）回目の周回の或る場所のときに、拡散係数Ｄの発光粒子が光検出領域内に在ったとすると、ｋ回目の周回の同じ場所に於いて、発光粒子の移動距離ｌが光検出領域の直径２ｒを越えているときには、
（２ｒ）２＜ｌ＝６Ｄ・Ｔ      …（１）
の関係が成立するので、光検出領域の移動周期Ｔは、
Ｔ＞２ｒ２／３Ｄ      …（２）
を満たすよう設定されてよい。
【００３９】
走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図４（Ａ）は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
【００４０】
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
【００４１】
（２）試料溶液の光強度の測定（図４（Ａ）−ステップ１００）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら実行される。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）及び／又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００４２】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図５（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４４】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ      …（３）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（４）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（５）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４５】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
【００４６】
（ｉ）発光粒子の信号の個別検出（ステップ１１０〜１６０）
時系列光強度データが生成されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００４７】
光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４（Ａ）−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４８】
次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００４９】
しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
【００５０】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００５１】
（iii）ノイズ信号の判別処理
上記の如く発光粒子の信号として検出された信号は、厳密には、発光粒子の信号に於いて想定される特徴を有する信号であり、既に述べた如く、かくして検出された信号群の中には、発光粒子の信号の特徴を有するノイズ信号が含まれている可能性がある。そして、そのようなノイズ信号のうち、特に、試料容器の壁に付着した異物からの信号であれば、その発生位置は、光検出領域の移動経路上に於いて所定の範囲内に収まることとなる。そこで、本実施形態に於いては、発光粒子の信号として検出された信号の発生位置の座標を算出し、しかる後、信号の全ての二つの組合せの位置間隔の距離を算出し、位置間隔距離が所定の範囲内にある組合せの信号がノイズ信号であると判別される。
【００５２】
具体的には、まず、発光粒子の信号の検出後（ステップ１６０）、検出された信号の全ての光検出領域の移動経路上に於ける発生位置の算出が実行される（ステップ１７０）。信号の発生位置の算出は、具体的には、以下の如く行われてよい。（顕微鏡下に於ける光検出領域の移動経路の位置の座標は把握されている。）
【００５３】
（ａ）光検出領域の移動経路が円の場合（図２（Ｃ）参照）
光検出領域の移動経路の円の中心を原点として、移動経路上の座標（Ｘ、Ｙ）は、半径ｒ、角度をθとを用いて
Ｘ＝ｒｃｏｓθ；Ｙ＝ｒｓｉｎθ      …（６）
により与えられる。θは、周期Ｔと信号発生の時間ｔｎを用いて、θ＝２π×（ｔｎ／Ｔ）と表すことができるので、信号発生の位置の座標（Ｘｎ、Ｙｎ）は、
Ｘｎ＝ｒｃｏｓ（２π×（ｔｎ／Ｔ））；Ｙｎ＝ｒｓｉｎ（２π×（ｔｎ／Ｔ））…（７）
となる。
【００５４】
（ｂ）光検出領域の移動を円軌道と円軌道の組合せで行う場合（図２（Ｄ）参照）
ミラー偏向器１７を駆動して光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させながら、ステージ位置変更装置１７ａを連続的に駆動して、試料溶液の位置を移動し、これにより、試料溶液を基準にして光検出領域の走査軌道の位置を移動する態様にて、光検出領域の移動が行われる場合、信号の発生時間ｔｎにおける座標は、一方の円軌道の半径ｒ１及び周期Ｔ１と、もう一方の円軌道の半径ｒ２及び周期Ｔ２とを用いて、
Ｘn＝ｒ１ｃｏｓ（２π×（ｔn／Ｔ１））＋ｒ２ｃｏｓ（２π×（ｔn／Ｔ２））;
Ｙn＝ｒ１ｓｉｎ（２π×（ｔn／Ｔ１））＋ｒ２ｓｉｎ（２π×（ｔn／Ｔ２））
…（８）
となる。
【００５５】
（ｃ）光検出領域の移動を直線軌道で行う場合
光検出領域をＸ軸方向に直線移動する場合、信号の発生時間ｔｎにおける座標は、移動速度ｖを用いて、
Ｘｎ＝ｖｔn−ｋＬ      …（９）
となる。なお、上記の式は、直線走査の移動距離が一定値Ｌになった時点で開始点に戻って同一方向の走査を繰り返す時に用いる（ｋは繰り返した回数）。ただし、直線走査の移動距離が一定値になった時点で折り返しても良く、全く異なる位置を移動しても良い。
【００５６】
（ｄ）光検出領域の移動を直線軌道と円軌道の組合せで行う場合
光検出領域を、ミラー偏向器１７とステージ位置変更装置１７ａとのうちの一方により速度ｖにてＸ軸方向に直線移動し、ミラー偏向器１７とステージ位置変更装置１７ａとのうちの他方により半径ｒ１及び周期Ｔ１の円軌道に沿って移動する場合、信号の発生時間ｔｎにおける座標は、
Ｘn＝ｖｔn−ｋＬ＋ｒ１ｃｏｓ（２π×（ｔn／Ｔ１））；
Ｙn＝ｒ１ｓｉｎ（２π×（ｔn／Ｔ１））…（１０）
となる。なお、上記の式は、直線走査の移動距離が一定値Ｌになった時点で開始点に戻って同一方向の走査を繰り返す際に用いられる。
【００５７】
かくして、光検出領域の移動経路に対応した上記の式のいずれかを用いて、時系列光強度データ上の全ての信号の発生位置の座標が算出されると、全ての信号の発生位置の座標に於いて、それらのうちの二つの信号の組合せの全ての位置の座標間距離が下記の式を用いて算出される（ステップ１８０）。
Ｄｉ＝（（Ｘn−Ｘm）２＋（Ｙn−Ｙm）２）１／２      …（１１）
なお、二つの信号の組合せの数は、Ｎ（Ｎ−１）／２である（Ｎは総信号数）。
【００５８】
上記の如く、二つの信号の組合せの全ての位置の座標間距離Ｄｉが算出されると、ノイズ信号は、光検出領域が有限の大きさの異物上を通過したときのみ発生することを考慮して、全ての座標間距離Ｄｉについて、各座標間距離Ｄｉが異物の大きさの範囲内（所定の範囲内）にあるか否かが判定される（ステップ１９０）。具体的には、各座標間距離Ｄｉが異物の大きさＤｏとの比較が行われ、座標間距離Ｄｉが異物の大きさＤｏよりも小さいとき（Ｄｉ＜Ｄｏ）には、その座標間距離Ｄｉを与える二つの信号がノイズ信号（ノイズ）として判定され、座標間距離Ｄｉが異物の大きさＤｏよりも大きいとき（Ｄｉ＞Ｄｏ）には、その座標間距離Ｄｉを与える二つの信号が発光粒子の信号（シグナル）として判定される。なお、異物の大きさＤｏは、実験又は経験を参考にして、適宜設定されてよい。そして、全ての座標間距離Ｄｉについて、異物の大きさＤｏとの比較が為されると、各信号は、図４（Ｂ）に模式的に描かれている如く、他の信号との間で、ノイズ信号である場合、発光粒子の信号（シグナル）である場合の複数の判定結果が割り当てられることとなる。この段階に於いて、本実施形態に於いては、一回でもノイズ信号と判定された信号は、ノイズ信号として判定されてよい（ステップ２００）
【００５９】
かくして、各信号についての、発光粒子の信号とノイズ信号との判別が為されると、ノイズ信号を除外して、発光粒子の信号の計数等が実行される（ステップ２１０）。
【００６０】
（iv）発光粒子濃度の決定
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定可能となる。
【００６１】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（１２）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（１３）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（１２））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００６２】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００６３】
試料溶液として超純水を用いて（発光粒子が溶液中に無い場合）、走査分子計数法に於ける、試料容器の壁に付着した異物からの光の信号の発生の態様を確認した。
【００６４】
試料容器として、９６穴（ウェル）ガラスボトムプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社，７７０６−１３６５）を用いて、ウェルのうち、光学調整に使用する１ウェルを除いた９５ウェルの全てに超純水を１００μＬずつ入れ、各ウェルについて、走査分子計数法によって光の計測及びパルス状信号の検出を行った。光の計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、各ウェルについて時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６４２ｎｍのレーザ光（出力１ｍＷ）を用いて照射し、検出光波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて６６０〜７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の移動は、ミラー偏向器によって９０００ｒｐｍ（周期は６．６７ｍ秒）にて円軌道（走査軌道）に沿って光検出領域を移動すると共に、ステージの移動によって１．３１秒の移動周期にて円軌道に沿って光検出領域の走査軌道の位置を移動することにより行った（図２（Ｄ）参照）。また、フォトンカウンティングのＢＩＮ  ＴＩＭＥは１０μ秒とし、測定時間は、２００秒間とした。光強度の測定後、各ウェルについて取得された時系列のフォトンカウントデータに於いて、「（ｉ）発光粒子の信号の個別検出」及び図４のステップ１１０〜１６０に記載された処理に従って、発光粒子の信号の特徴を有する信号を検出した。データのスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は１１個として、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定し、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９０
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。
【００６５】
図７（Ａ）は、各ウェルに於いて上記の条件を満たすパルス信号の総数を示している。本実施例では、全てのウェル中の溶液は超純水であり、得られるパルス数は略０になるはずであるが、実際には、図中矢印で示した明らかに数の多いウェルを含め複数のウェルで有意なパルス数が得られた。これらのウェルに於けるパルス状信号は、ノイズ信号である可能性が高いと考えられる。そこで、図中矢印で示したウェルの時系列光強度データを参照すると、まず、初めから２０秒間のデータ上に於いては（図７（Ｂ））、２８個のパルス状信号が検出され、これらの信号は、約１．３秒毎に集中的に発生した。この約１．３秒の信号の集中的な発生の周期は、ステージによる走査軌道の移動周期に概ね一致している。また、図７（Ｂ）の２．４秒付近を更に細かく参照すると（図７（Ｃ））、光検出領域の走査軌道の周期と概ね一致する約６．７ｍ秒の周期にてパルス状信号の発生が起きていた。そこで、かかる信号の発生源（異物）の存在を確認すべく、光学顕微鏡像を参照すると、透過光像（図８（Ａ）右）において、異物の存在が確認され、蛍光像（図８（Ａ）左）に於いて、その異物が蛍光を発していることが確認された。
【００６６】
また、更に、図７（Ｂ）の１秒付近のデータ（図８（Ｂ））に於いて、パルス状信号の検出された時間からそれらの位置座標を求め、パルス状信号の発生位置の間隔を算出した。その結果、図８（Ｂ）中の信号II及びIIIの距離は、３５．７μｍであり、信号III及びIVの距離は、３２．７μｍであった。図８（Ａ）に於ける異物の大きさは、約１００μｍであったので、発生位置の間隔は、異物の大きさよりも短く、信号II、III及びIVは、ノイズ信号として判別できる。また、図８（Ｂ）中の信号IIと図７（Ｃ）中の信号Ｖの発生位置の間隔距離は、１６．９μｍであったので、信号Ｖもノイズ信号として判別できる。かくして、信号発生位置の間隔距離が異物の大きさよりも大きいか否かによる判別によれば、２８個の信号中、２７個の信号がノイズ信号と判別された。本実施例では、発光粒子を含まない超純水を用いた計測であるところ、９６％の割合にて、ノイズ信号の判別が可能となった。
【実施例２】
【００６７】
発光粒子を含む試料溶液について、本発明によりノイズ信号が除去できることを検証した。
【００６８】
９６穴ガラスボトムプレート（Ｗｈａｔｍａｎ，７７０６−１３６５）のウェルのうち、ノイズが検出されるウェルに、０．１％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７を含むリン酸バッファーで調製した１００ａＭのＡＴＴＯ６４７Ｎ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ）を含む溶液を１００μＬ入れ、走査分子計数法によって計測を行った。光の計測及び信号の検出は、実施例１と同様に行った。また、測定時間は２０秒とした。
【００６９】
図９（Ａ）を参照して、パルス状信号は３７個検出された。これら全てについて信号の発生位置座標及び位置の間隔距離を算出し、異物の大きさ（１００μｍ）と比較を行った結果、３１個の信号がノイズ信号と判定された。本実施例の条件では、２０秒間で数個の発光粒子の信号が検出されることが期待されるので、６個の信号が発光粒子の信号として判別されたことは妥当な結果である。
【実施例３】
【００７０】
発光粒子として蛍光標識された核酸を含む試料溶液について、本発明によりノイズ信号が除去できることを検証した。
【００７１】
９６穴ガラスボトムプレート（Ｗｈａｔｍａｎ，７７０６−１３６５）のウェルのうち、ノイズが検出されるウェルに、０．０５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリスバッファーで調製した１００ａＭのＡＴＴＯ６４７Ｎ標識ＤＮＡ（シグマジェノシス）を含む溶液を１００μＬ入れ、走査分子計数法によって計測を行った。光の計測及び信号の検出は、実施例１と同様に行った。また、測定時間は２０秒とした。なお、ＤＮＡの塩基配列は、下記の通りである。
ATTO647N-agttgaggggactttcccaggc
【００７２】
図９（Ｂ）を参照して、パルス状信号は４１個検出された。これら全てについて信号の発生位置座標及び位置の間隔距離を算出し、異物の大きさ（１００μｍ）と比較を行った結果、３５個の信号がノイズ信号と判定された。本実施例の条件では、２０秒間で数個の発光粒子の信号が検出されることが期待されるので、６個の信号が発光粒子の信号として判別されたことは妥当な結果である。
【００７３】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて発光粒子の信号の特徴を有する信号のうち、光検出領域の移動経路上の位置の間隔が所定の範囲内にある二つの信号をノイズ信号として判別することによって、試料容器の壁に付着する不動の異物からの光の信号を判別し排除できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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