(57)【要約】      （修正有）【課題】ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する手段を提供する。【解決手段】ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法であって、ＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列からなるＡＴＰ依存キナーゼにおいて、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換することを含む、前記方法に関する。【選択図】図２
2014135930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法であって、
ＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列からなるＡＴＰ依存キナーゼにおいて、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＡＴＰ依存キナーゼがＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＴＰ依存キナーゼがγプロテオバクテリアに由来する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基が、配列番号１を参照配列としたときの７５位に相当する位置のＡｓｎ残基である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＡＴＰ依存キナーゼをコードするＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基がＴｈｒ残基に置換されたアミノ酸配列からなる、ポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体。
【請求項６】
ＡＴＰ依存キナーゼがＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼであり、キナーゼ変異体がＮＡＤキナーゼ変異体である、請求項５記載のキナーゼ変異体。
【請求項７】
ＡＴＰ依存キナーゼがγプロテオバクテリアに由来する、請求項５または６記載のキナーゼ変異体。
【請求項８】
ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基が、配列番号１を参照配列としたときの７５位に相当する位置のＡｓｎ残基である、請求項５〜７のいずれか１項記載のキナーゼ変異体。
【請求項９】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質からなるキナーゼ変異体：
（ａ）配列番号８または１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号８または１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、ＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸を利用してＮＡＤをリン酸化する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号８または１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されているがＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸を利用してＮＡＤをリン酸化する活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項記載のキナーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０記載のＤＮＡを含む形質転換体。
【請求項１２】
ＮＡＤＰの製造方法であって、ポリリン酸またはその塩およびＮＡＤを基質とし、請求項５〜９のいずれか１項記載のキナーゼ変異体を用いてリン酸化反応を行うことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法、およびポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、有用なリン酸化化合物を生産する場合、ＡＴＰのみを利用するリン酸化酵素（ＡＴＰ依存キナーゼ）およびリン酸供与体（エネルギー担体）としてＡＴＰが用いられてきた。しかし、ＡＴＰは高価であり、ＡＤＰなどの反応副成生物も生ずる上に、生産物と未反応ＡＴＰおよび副成生物ＡＤＰとの分離が困難な事例もあるため、ＡＴＰを用いた生産系は必ずしも理想的ではない。一方、ポリリン酸はリン酸がリン酸エステル結合で結合した高分子化合物であり、エステル結合あたりのエネルギーがＡＴＰのそれと等しいとされている。ポリリン酸は、工業的観点から、リン酸化化合物の酵素的産生のための理想的なリン酸供与体として期待されている。なぜなら、ポリリン酸は、ＡＴＰよりも安価であり、高純度の最終産物を容易かつ経済的に得られるからである。
【０００３】
非特許文献１では、ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤキナーゼを用いてＮＡＤＰの大規模工業生産に成功したことが報告されている。ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤキナーゼは、ポリリン酸とＡＴＰを利用してＮＡＤをリン酸化する酵素である。しかしながら、現存するリン酸化酵素（キナーゼ）のほとんどはＡＴＰ依存キナーゼであり、ポリリン酸を利用できる酵素の種類は限られている。ポリリン酸依存ＮＡＤキナーゼや同グルコキナーゼ（ポリリン酸を利用して、それぞれ、ＮＡＤまたはグルコースをリン酸化してＮＡＤＰまたはグルコース−６−リン酸を生産する）の他、１０種類ほどの酵素が知られているにすぎない（非特許文献２）。この中、ポリリン酸依存ＮＡＤキナーゼとポリリン酸を用いたＮＡＤＰ生産法が報告されている（特許文献１）。このＮＡＤＰ生産法は、ＡＴＰを用いていた従来法と比較して、より低コストで、より高純度のＮＡＤＰを生産する優れた方法である。
【０００４】
もし、他のＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法論が確立されれば、多様な有用リン酸化化合物を、より低コストで、より高純度に生産することが可能になると期待される。しかし、かかるポリリン酸利用能付与に関する方法論は知られておらず、実際に可能かどうかすら不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０８８２５１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｗａｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２，４４７−４５２（２００１）
【非特許文献２】Ｒａｏ，Ｎ．Ｎ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｒ．＆Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８，６０５−６４７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＮＡＤキナーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびジアシルグリセロールキナーゼを含むリン酸化酵素の一次構造において、ＧＧＤＧモチーフが高度に保存されていること、ＡＴＰ依存キナーゼにおいてＧＧＤＧモチーフに隣接するＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換することにより、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法であって、
ＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列からなるＡＴＰ依存キナーゼにおいて、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換することを含む、前記方法。
（２）ＡＴＰ依存キナーゼがＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼである、（１）記載の方法。
（３）ＡＴＰ依存キナーゼがγプロテオバクテリアに由来する、（１）または（２）記載の方法。
（４）ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基が、配列番号１を参照配列としたときの７５位に相当する位置のＡｓｎ残基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ＡＴＰ依存キナーゼをコードするＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基がＴｈｒ残基に置換されたアミノ酸配列からなる、ポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体。
（６）ＡＴＰ依存キナーゼがＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼであり、キナーゼ変異体がＮＡＤキナーゼ変異体である、（５）記載のキナーゼ変異体。
（７）ＡＴＰ依存キナーゼがγプロテオバクテリアに由来する、（５）または（６）記載のキナーゼ変異体。
（８）ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基が、配列番号１を参照配列としたときの７５位に相当する位置のＡｓｎ残基である、（５）〜（７）のいずれかに記載のキナーゼ変異体。
（９）以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質からなるキナーゼ変異体：
（ａ）配列番号８または１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号８または１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、ＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸を利用してＮＡＤをリン酸化する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号８または１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されているがＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸を利用してＮＡＤをリン酸化する活性を有するタンパク質。
（１０）（５）〜（９）のいずれかに記載のキナーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
（１１）（１０）記載のＤＮＡを含む形質転換体。
（１２）ＮＡＤＰの製造方法であって、ポリリン酸またはその塩およびＮＡＤを基質とし、（５）〜（９）のいずれかに記載のキナーゼ変異体を用いてリン酸化反応を行うことを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与でき、ポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体を取得できる。それにより、多様な有用リン酸化化合物を、より低コストで、より高純度に生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＡＴＰ−ＮＡＤＫ、ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫおよびγ−プロテオバクテリアＮＡＤＫホモログの一次構造のアライメントを示す。
【図２】野生型または変異体ＮＡＤＫのＡＴＰ依存ＮＡＤＫ活性またはポリリン酸依存ＮＡＤＫ活性をアッセイした結果を示す。上向き矢印および下向き矢印は、それぞれ、各置換によるＮＡＤＫ活性の上昇および低下を示す。
【図３】ｅｃｏＮＡＤＫ変異体の、ＡＴＰ依存ＮＡＤＫ活性に対するポリリン酸依存ＮＡＤＫ活性の比（％）を示す棒グラフである。
【図４】ＮＡＤＫ反応混合物をインキュベートし、ＴＬＣで解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態において本発明は、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与する方法に関し、該方法は、ＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列からなるＡＴＰ依存キナーゼ（以下、ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存キナーゼと称する場合がある）において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換することを特徴とする。
【００１３】
本発明においてキナーゼは、高エネルギーリン酸結合を有するリン酸供与体からリン酸基を基質に転移する（リン酸化する）活性を有する酵素をさす。ポリリン酸利用能を付与する対象となるＡＴＰ依存キナーゼは、ＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列からなり、ＡＴＰからリン酸基を基質に転移する活性を有する酵素であれば特に制限されない。
【００１４】
ＡＴＰ依存キナーゼ（ＡＴＰ−ＮＡＤＫ）におけるＡＴＰ依存とは、リン酸化反応におけるリン酸供与体として、実質的にＡＴＰのみを利用することを意味する。ＡＴＰ依存キナーゼは、リン酸供給体としてポリリン酸を実質的に利用できず、例えば、ポリリン酸に対する反応率がＡＴＰに対する反応率の１５％以下、特に１２％以下である。
【００１５】
ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存キナーゼとしては、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼが挙げられる。ＮＡＤキナーゼは、リン酸供与体のリン酸基をＮＡＤのアデニル酸のリボースの２’位に転移し、ＮＡＤＰを生成する活性を有する酵素である。すなわち、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼは、リン酸供与体としてＡＴＰを利用して、ＮＡＤからＮＡＤＰを生成する以下のリン酸化反応を触媒することができる。
【００１６】
【化１】
2014135930.tif 000003
【００１７】
ＮＡＤは、酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで，還元型はＮＡＤＨである。ジホスホピリジンヌクレオチド（ＤＰＮ、ＤＰＮＨ）、補発酵素、補酵素Ｉ（ＣｏＩ）などとも呼称され、体内に最も多量に存在する補酵素である。ＮＡＤは、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）とアデニル酸がホスホジエステル結合した構造を有する。酸化型ＮＡＤにおけるピリジン環の窒素原子はピリジウムイオンとして存在するので、これをＮＡＤ＋と表現する。ＮＡＤ＋の生合成は、動物ではおもに肝臓でトリプトファンが、植物ではグリセロールとアスパラギン酸が、それぞれ前駆体となり、キノリン酸を経て合成される。また、ビタミンのニコチン酸、ニコチンアミドからも合成される。ＮＡＤ＋の重要な機能は生体エネルギー産生機構（酸化反応）にＮＡＤ＋の還元が共役している点にある。
【００１８】
ＮＡＤＰは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに作用する補酵素である。ＮＡＤＰの構造は、基本的にはＮＡＤと共通であり、ＮＡＤのアデニル酸のリボースの２’位にさらにリン酸がエステル結合した構造である。ＮＡＤＰは、生体内では肝臓に多く存在するが、その含量はＮＡＤの約半量である。ＮＡＤＰの酸化型と還元型の変換様式はＮＡＤと同一であり、酸化型ＮＡＤＰはピリジニウムイオンによるプラス（＋）の電荷を有する（ＮＡＤＰ＋）。ＮＡＤＰとＮＡＤの構造と反応様式は類似しているが、酵素はこれらを厳格に識別する。ＮＡＤＰの関与する反応としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ等がある。
【００１９】
ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼとしては、γプロテオバクテリアに由来するもの、およびそのホモログが挙げられる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌、Ｓｅｒｒａｔｉａ属細菌、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属細菌、Ｅｒｗｉｎｉａ属細菌、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属細菌、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ属細菌、Ｂｕｃｈｎｅｒａ属細菌、Ｓｏｄａｌｉｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属細菌、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属細菌、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｖｉｂｒｉｏ属細菌、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属細菌、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｄｉｃｋｅｙａ属細菌に由来するものが挙げられる。
【００２０】
具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｆｏｖｏｒａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ、Ｓｏｄａｌｉｓ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉに由来するものが挙げられる。
【００２１】
ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼの具体例としては、ｅｃｏＮＡＤＫ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ｓｔｙＮＡＤＫ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ｖｃｈＮＡＤＫ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ｓｆｌ＿ＳＦ２６７４Ｋ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ｋｐｎ＿ＫＰＮ＿０２９３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ｅｓａ＿ＥＳＡ＿００６４１（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、およびｄｄａ＿Ｄｄ７０３＿３２１７（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）が挙げられる。上記ｅｃｏＮＡＤＫ、ｓｔｙＮＡＤＫ、ｖｃｈＮＡＤＫ、ｓｆｌ＿ＳＦ２６７４Ｋ、ｋｐｎ＿ＫＰＮ＿０２９３７、ｅｓａ＿ＥＳＡ＿００６４１、およびｄｄａ＿Ｄｄ７０３＿３２１７のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１〜７で表される。なお、公知のＮＡＤキナーゼのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＮＣＢＩのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）より入手できる。
【００２２】
本発明でポリリン酸利用能を付与しうるＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼとしては、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＡＤキナーゼ）が挙げられる。配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質、例えば、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、ＧＧＤＧＮモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼの活性を有するタンパク質にも、本発明を適用できる。さらに、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されているがＧＧＤＧＮモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼの活性を有するタンパク質にも、本発明を適用できる。数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個をさす。
【００２３】
ＧＧＤＧＮモチーフは、ＡＴＰ依存キナーゼをコードするアミノ酸配列における「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ」からなる部分配列であり、本発明者らは、ＡＴＰ依存キナーゼ、特にＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼの一次構造において、このＧＧＤＧＮモチーフが高度に保存されていること、およびその触媒作用に関与していることを見出した。例えば、ｅｃｏＮＡＤＫをコードする配列番号１のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは、７１位〜７５位に位置する（７１ＧＧＤＧＮ７５）。
【００２４】
本発明は、ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存キナーゼにおいて、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基（Ｎ）をＴｈｒ残基（Ｔ）に置換することにより、ＡＴＰ依存キナーゼにポリリン酸利用能を付与するものであり、それによりポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体が得られる。本発明において、ポリリン酸利用能を付与することには、ポリリン酸利用能を増大させることも包含される。ポリリン酸利用能を増大させるとは、野生型キナーゼのポリリン酸に対する比活性と比較して、キナーゼ変異体のポリリン酸に対する比活性が増大していることをさす。好ましくは、ＧＧＤＧＮモチーフを含むＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼにおいて、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基（Ｎ）をＴｈｒ残基（Ｔ）に置換することにより、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼにポリリン酸利用能を付与し、それによりポリリン酸利用能を有するＮＡＤキナーゼ変異体を得る。
【００２５】
置換の対象となるＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基は、好ましくは配列番号１を参照配列としたときの７５位に相当する位置のＡｓｎ残基である。本明細書において、「配列番号１を参照配列としたときのＸ位に相当する位置の」という表現は、配列番号１を参照配列として、ＧＧＤＧＮモチーフを有する任意のＡＴＰ依存キナーゼのアミノ酸配列中の所定のアミノ酸残基の位置を指定するために使用される。すなわち、ＧＧＤＧＮモチーフを有する任意のＡＴＰ依存キナーゼのアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ｙと称する）を、配列番号１のアミノ酸配列とアラインメントしたときに、配列番号１の１番目のアミノ酸残基から数えてＸ番目のアミノ酸残基に対してアラインされる（すなわち、アラインメントにおいて同じ縦列に整列される）、アミノ酸配列Ｙ中のアミノ酸残基を意味する。上記アミノ酸残基の位置は、特に、アライメントソフトとしてＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））およびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０（１９９４））を用いてアライメントをとったときのアミノ酸残基の位置を意味する。これらのプログラムは、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  ｓｅｒｖｅｒ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ）から入手可能である。
【００２６】
なお、ｓｔｙＮＡＤＫをコードする配列番号２のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７１位〜７５位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７５位に位置する。ｖｃｈＮＡＤＫをコードする配列番号３のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７２位〜７６位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７６位に位置する。ｓｆｌ＿ＳＦ２６７４Ｋをコードする配列番号４のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７１位〜７５位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７５位に位置する。ｋｐｎ＿ＫＰＮ＿０２９３７をコードする配列番号５のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７１位〜７５位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７５位に位置する。ｅｓａ＿ＥＳＡ＿００６４１をコードする配列番号６のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７１位〜７５位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７５位に位置する。ｄｄａ＿Ｄｄ７０３＿３２１７をコードする配列番号７のアミノ酸配列においてＧＧＤＧＮモチーフは７１位〜７５位に位置し、置換対象であるＡｓｎ残基は７５位に位置する。
【００２７】
ＡＴＰ依存キナーゼのアミノ酸配列において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基をＴｈｒ残基に置換してキナーゼ変異体を得る方法としては、当技術分野で公知の方法を使用でき、化学合成による方法、および遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドンを変化させる方法を含むが、これらに限定されない。本発明において変異体とは、もとの酵素のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有し、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変された酵素をいう。
【００２８】
本発明のキナーゼ変異体は、例えば、ＡＴＰ依存キナーゼをコードする野生型遺伝子に変異を導入し、得られた変異遺伝子をクローニングベクターにクローン化し、得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を適切な培地で培養し、最後に、得られたキナーゼ変異体を分離、精製することを含む方法で製造することができる。
【００２９】
遺伝子への変異の導入は、特に限定されないが、部位特異的変異導入法などの公知のインビトロ変異技術を利用して行うことができる。例えば、野生型遺伝子を含む組換えプラスミドに対し、変異を含むプライマーをアニールさせ、次にＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより変異を含むＤＮＡをインビトロにて合成し、最後に宿主細胞を形質転換することにより、変異を含むクローンを分離する方法を利用できる（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４８８．；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１．；Ｗｅｉｎｅｒ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ．Ｄｅｃ  ３０；１５１（１−２）：１１９−２３．；ＷＯ９７／２０９５０）。市販の部位特異的変異導入キットを用いてもよい。そのようなキットとしては、例えば、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡社）、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔなどが挙げられる。
【００３０】
なお、クローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等は、周知の遺伝子組み換え技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（２０１２）を参照）を適宜採用して実施することができる。
【００３１】
上記方法によって得られるポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体、好ましくはＮＡＤキナーゼ変異体は、ＡＴＰ依存キナーゼをコードするＧＧＤＧＮモチーフを含むアミノ酸配列において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基がＴｈｒ残基に置換されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸利用能を有する。
【００３２】
本発明で得られるポリリン酸利用能を有するＮＡＤキナーゼ変異体としては、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列において、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基がＴｈｒ残基に置換されたアミノ酸配列、すなわち配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質からなるものが挙げられる。配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＧＧＤＧＮモチーフのＡｓｎ残基がＴｈｒ残基に置換されたＧＧＤＧＴモチーフを有する。すなわち、ＧＧＤＧＴモチーフは、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ」からなる部分配列である。配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質、例えば、配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、ＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸利用能を有し、ＮＡＤキナーゼの活性を有するタンパク質も、本発明のキナーゼ変異体に包含される。さらに、配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されているがＧＧＤＧＴモチーフが保持されたアミノ酸配列からなり、ポリリン酸利用能を有し、ＮＡＤキナーゼの活性を有するタンパク質も、本発明のキナーゼ変異体に包含される。数個とは、２〜３０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個をさす。
【００３３】
ポリリン酸利用能を有するキナーゼとは、リン酸化反応におけるリン酸供与体として、ポリリン酸を利用する能力を有するキナーゼをさす。ポリリン酸とＡＴＰの双方をリン酸供給基質として利用するものも包含される。
【００３４】
ポリリン酸は、ＡＴＰのリン酸結合とエネルギー的に同等の無水リン酸結合を介した無機オルトリン酸残基のポリマーであり、例えば、以下の式で表される。
【００３５】
【化２】
2014135930.tif 000004
【００３６】
上記式においてｎは縮合度を表す。ｎは特に限定されないが、好ましくはｎ＝３〜５０００、より好ましくは３〜３２である。ポリリン酸はＡＴＰと比較して非常に低価格で大量に商業的に入手可能である。ポリリン酸の具体例としては、トリポリリン酸（リン酸残基数：３）、テトラポリリン酸（リン酸残基数：４）、トリメタリン酸（環状ポリリン酸、リン酸残基数：３）、ヘキサメタリン酸（長鎖ポリリン酸混合物）、およびメタリン酸（長鎖ポリリン酸混合物）が挙げられる。ポリリン酸には、上記のようなポリリン酸の塩も包含される。ポリリン酸は、例えば、和光純薬工業、シグマアルドリッチ、メルク社などより入手可能である。
【００３７】
メタリン酸は、氷状リン酸とも呼ばれ、一般式（ＨＰＯ３）ｎで表される。普通、三量体、四量体の環状または直鎖のポリメタリン酸などの重合体として存在する。本明細書においてメタリン酸には、このような三量体、四量体の環状または直鎖のポリメタリン酸も包含される。ポリメタリン酸はリン酸基が酸無水結合によって環状に連なった化合物であり、一般式ＨｎＰｎＯ３ｎで表される。室温で粘稠な液体で、冷却するとガラス状固溶体となる。水溶液は酸性で加熱すると容易に正リン酸に分解する。メタホスファターゼにより加水分解を受けて開環し、ポリリン酸となる。生物界では、高分子量のものは細菌、真菌、藻類などにみられ、酵母やある種の細菌ではトリメタリン酸のような縮合度の低いメタリン酸も存在する。そのリン酸無水結合は、いわゆる高エネルギーリン酸結合である。
【００３８】
ポリリン酸利用能を有するＮＡＤキナーゼ変異体は、リン酸供与体をとしてポリリン酸を利用して、ＮＡＤからＮＡＤＰを生成する以下のリン酸化反応を触媒することができる。
【００３９】
【化３】
2014135930.tif 000005
【００４０】
本発明のポリリン酸利用能を有するキナーゼ変異体は、好ましくはポリリン酸に対する反応率がＡＴＰに対する反応率の４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは１２０％以上、最も好ましくは１５０％以上である。本発明のキナーゼ変異体は、野生型キナーゼのポリリン酸に対する比活性と比較して、ポリリン酸に対する比活性が、好ましくは１．５倍、より好ましくは２倍、さらに好ましくは３倍以上に増大している。
【００４１】
本発明はまた、ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の製造方法に関し、該方法は、ポリリン酸またはその塩およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を基質とし、上記ＮＡＤキナーゼ変異体を用いてリン酸化反応を行うことを含む。
【００４２】
リン酸化反応の際の温度、ｐＨ、ポリリン酸の種類、反応溶液中のポリリン酸の濃度、金属イオンの濃度、金属イオンの種類等の種々の条件は、当業者であれば適宜決定できる。反応溶液中のポリリン酸またはその塩の濃度は、反応溶液の０．１〜１５重量％である。ポリリン酸の種類は特に限定されない。例えば、先に記載したメタリン酸、ヘキサメタリン酸等から適宜選択可能である。ＮＡＤキナーゼ変異体の上記反応では、金属イオン、特に二価の金属イオンを存在させることが好ましい。反応溶液中の二価の金属イオンの濃度は５〜１５０ｍＭである。二価の金属イオンは特に限定されないが、好ましくはマグネシウムイオンまたはマンガンイオンから選択される。特に好ましくはマグネシウムイオンである。金属イオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩または硝酸塩として反応溶液に含まれる。
【００４３】
さらに、反応終了後ＮＡＤＰを高い収率で得るためには、ＮＡＤからのリン酸転移効率が高いこととともに、いったん合成されたＮＡＤＰを安定に保つことが重要である。ＮＡＤＰは、ＮＡＤよりも熱やｐＨに対して不安定であることが知られている（例えば、オリエンタル酵母２０００年カタログ）。そのために、反応条件をＮＡＤＰが安定な組成で行うことが好ましい。限定されるわけではないが、反応条件として、温度は好ましくは２０〜３７℃、より好ましくは３７℃で行う。ｐＨは好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６〜７で行う。
【００４４】
本発明に使用するＮＡＤキナーゼ変異体の形態としては、組換え宿主細胞より精製した可溶化タンパク質でよく、又は可溶化タンパク質を固定化した固定化酵素でもよい。あるいは、ＮＡＤキナーゼ変異体を発現する菌体を直接、アクリルアミドなどの化学処理により固定化したような固定化菌体酵素を用いてもよい。酵素の固定化方法は既知の方法を用いて行うことが可能である。例えば、精製したＮＡＤキナーゼを活性化ゲルと失活しない温和な条件下で混和し、懸濁し、精製ＮＡＤキナーゼを不溶化ゲルに固定化することができる。微生物菌体を固定化する方法としては、カラギン酸やアクリルアミドを用いる方法が知られている。
【００４５】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）ホモロジーおよび配列アライメント解析
ゲノム配列が決定されているすべての種についてＮＡＤキナーゼ（ＮＡＤＫ）に相同なタンパク質を同定し、ｅｃｏＮＡＤＫのＡｓｎ−７５に対応するアミノ酸残基を確認するために、ＢＬＡＳＴおよびＣＬＵＳＴＡＬＷを使用した。
【００４７】
図１に、ＡＴＰ−ＮＡＤＫ、ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫおよびγ−プロテオバクテリアＮＡＤＫホモログの一次構造のアライメントを示す（上から順に、配列番号１〜７および配列番号１５〜２１）。ＡＴＰ−ＮＡＤＫは、ＡＴＰ依存ＮＡＤキナーゼ、すなわちリン酸供与体として実質的にＡＴＰのみを利用するＮＡＤキナーゼをさし、ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫは、リン酸供与体として、ポリリン酸とＡＴＰの双方を利用するＮＡＤキナーゼをさす。
【００４８】
ｅｃｏＮＡＤＫ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ｓｔｙＮＡＤＫ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ｖｃｈＮＡＤＫ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ｓｐｈ＿ＮＡＤＫ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ａ１）、ｈｓａ＿６５２２０（ｈｕｍａｎ）、およびｓｃｅ＿ＹＪＲ０４９Ｃ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はＡＴＰ−ＮＡＤＫである。Ｐｐｎｋ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ｂｓｕ＿ＢＳＵ１１６１０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｍｊａ＿ＭＪ＿０９１７（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびｐｈｏ＿ＰＨ１０７４（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）は、ポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫである。ｅｃｏＮＡＤＫ、ｓｔｙＮＡＤＫ、ｖｃｈＮＡＤＫ、ｓｆｌ＿ＳＦ２６７４Ｋ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ｋｐｎ＿ＫＰＮ＿０２９３７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ｅｓａ＿ＥＳＡ＿００６４１（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、およびｄｄａ＿Ｄｄ７０３＿３２１７（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）は、γ−プロテオバクテリア由来ＮＡＤＫのホモログである。
【００４９】
ｅｃｏＮＡＤＫのＡｓｎ−７５を矢印で示す。このＡｓｎ−７５に対応する残基は、γプロテオバクテリアＮＡＤＫホモログにおいてはＡｓｎ残基として保存されているが、他のＡＴＰ−ＮＡＤＫおよびポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫにおいては、Ｔｈｒ残基である。ｅｃｏＮＡＤＫの７１ＧＧＤＧ７４モチーフに隣接するＡｓｎ−７５は、ｓｔｙＮＡＤＫおよびｖｃｈＮＡＤＫを含むγプロテオバクテリアのＮＡＤＫホモログの一次構造において、ＧＧＤＧＮとして保存されている。一方、その他のＡＴＰ−ＮＡＤＫおよびポリリン酸／ＡＴＰ−ＮＡＤＫにおいては、Ａｓｎ−７５はＴｈｒに対応し、ＧＧＤＧＴモチーフを形成している。ＧＧＤＧモチーフは、ＮＡＤＫの一次構造において高度に保存されており、その触媒作用に関与していると考えられる。
【００５０】
（実施例２）ＮＡＤＫ変異体の構築
実施例１において、ＧＧＤＧＮモチーフが、γプロテオバクテリアのＮＡＤＫホモログにおいて高度に保存されていることから、このＧＧＤＧＮモチーフの機能を解明するため、ｅｃｏＮＡＤＫのＡｓｎ−７５およびｖｃｈＮＡＤＫのＡｓｎ−７６をＴｈｒ残基に置換した変異体を構築した。また、Ｐｐｎｋ（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＮＡＤ  ｋｉｎａｓｅ）のＴｈｒ−８７をＡｓｎ残基に置換した変異体も構築した。合わせて、各種ｅｃｏＮＡＤＫ変異体（ｅｃｏＮＡＤＫ  Ｅ３６Ａ、Ｅ１６３Ｖ、Ｒ２３２Ｄ、Ｌ２５９Ｅ、Ｅ３６Ａ／Ｅ１３６Ｖ、Ｒ２３２Ｄ／Ｌ２５９Ｅ、Ｅ３６Ａ／Ｅ１３６Ｖ／Ｒ２３２Ｄ／Ｌ２５９Ｅ、Ｒ９５Ｌ、Ｎ９７Ｒ、Ｒ９５Ｌ／Ｎ９７Ｒ、および変異体４）を構築した。変異体４は、ｅｃｏＮＡＤＫ  Ｅ３６Ａ／Ｅ１３６Ｖ／Ｒ２３２Ｄ／Ｌ２５９Ｅである。
【００５１】
まず、ｅｃｏＮＡＤＫ（配列番号１）、ｖｃｈＮＡＤＫ（配列番号２）およびＰｐｎｋ(配列番号１８)をｐＥＴ−１４ｂまたはｐＥＴ−３ａにクローニングした。各種ＮＡＤＫ変異体は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（東洋紡）を用いて構築した。ただし、ポリメラーゼとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏポリメラーゼ（東洋紡）を用いた。プラスミドｐＥＴ−１４ｂ＿ｅｃｏＮＡＤＫ、ｐＥＴ−１４ｂ＿ｖｃｈＮＡＤＫ、またはｐＥＴ−３ａ＿Ｐｐｎｋを、ＰＣＲテンプレートとして使用した。得られた遺伝子の塩基配列をＤＮＡシークエンシングによって確認した。野生型または変異体ＮＡＤＫは、すべてＨｉｓ−ｔａｇなしで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現させ、文献に記載のとおり精製した（Ｋａｗａｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，４３５９−４３６５（２００１）；Ｋａｗａｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７６，５７−６３（２０００））。ただし、ＫＮＤバッファの代わりに、ＫＮＤＥバッファ［１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ  ＮＡＤ＋、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸］を使用した。
【００５２】
（実施例３）ＮＡＤＫ活性のアッセイ
実施例２で作製した野生型または変異体ＮＡＤＫのＡＴＰ依存ＮＡＤＫ活性またはポリリン酸依存ＮＡＤＫ活性を、文献に記載の方法により、３７℃で連続的にアッセイした（Ｏｈａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５５，５７−６４（２０１１））。ただし、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の代わりに、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用した。
【００５３】
具体的には、５．０ｍＭ  ＮＡＤ、５．０ｍＭ  ＡＴＰ、５．０ｍＭ  グルコース−６−リン酸、０．５Ｕ  Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、適当量のＮＡＤＫを含む反応溶液１ｍｌを３７℃で保温し、ＮＡＤＰＨの生成量を３４０ｎｍで連続的にモニターした。ポリリン酸依存活性測定時は、ＡＴＰの替わりに、５ｍＭのトリポリリン酸またはテトラポリリン酸、１ｍｇ／ｍ１のヘキサメタリン酸またはメタリン酸を用いた。１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）を生産し得る酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。
【００５４】
ｅｃｏＮＡＤＫにおいてＡｓｎ−７５をＴｈｒに置換すると、ＡＴＰに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）は２８から７．４に低下し、ポリリン酸のうち、テトラポリリン酸（Ｐｏｌｙ（Ｐ）４）に対する比活性は０．５１から２．０に上昇し、ヘキサメタリン酸（ｈｅｘａｍｅｔａ（Ｐ）ｎ）に対する比活性は０．８５から３．６に上昇し、メタリン酸（ｍｅｔａ（Ｐ）４）に対する比活性は０．８から３．２に上昇した（図２ａ）。ｖｃｈＮＡＤＫ変異体の比活性（Ｕ／ｍｇ）も同様の挙動を示し、ＡＴＰに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）は１１から５．１に低下し、トリポリリン酸（Ｐｏｌｙ（Ｐ）３）に対する比活性は０．０７６から０．５０に上昇し、テトラポリリン酸に対する比活性は０．６９から３．０に上昇し、ヘキサメタリン酸に対する比活性は１．１から７．３に上昇し、メタリン酸に対する比活性は１．２から７．８に上昇した（図２ａ）。なお、ヘキサメタリン酸およびメタリン酸は、鎖長の異なるポリリン酸の混合物である。
【００５５】
ｅｃｏＮＡＤＫおよびｖｃｈＮＡＤＫのＡＴＰ依存ＮＡＤＫ活性に対するポリリン酸依存ＮＡＤＫ活性の比（％）は、それぞれ、置換により２．８から４３に上昇し（ｅｃｏＮＡＤＫ）、１１から１５４に上昇したが（ｖｃｈＮＡＤＫ）（図２ｂ）、その他の置換では上昇しなかった（図３）。一方、Ｐｐｎｋ  Ｔ８７Ｎは、野生型と比較して、ＡＴＰ依存ＮＡＤＫ活性およびポリリン酸依存ＮＡＤＫ活性の双方が低下していた（図２）。
【００５６】
これらの結果から、Ａｓｎ残基（ｅｃｏＮＡＤＫのＡｓｎ−７５またはｖｃｈＮＡＤＫのＡｓｎ−７６）が、ＡＴＰに対する特異性を決定する残基であり、この位置におけるＴｈｒ残基は、少なくともｅｃｏＮＡＤＫおよびｖｃｈＮＡＤＫ、そしてＧＧＤＧＮモチーフを有するその他のγプロテオバクテリアＮＡＤＫホモログにおける、ポリリン酸利用能に重要であることがわかる。
【００５７】
また、ＮＡＤＫ反応混合物（５μｌ）を３７℃でインキュベートし、ＴＬＣで解析した。ＴＬＣ解析は、溶媒系としてイソブチレートおよび５００ｍＭ  ＮＨ４ＯＨを５：３（ｖ／ｖ）で用い、２５４ｎｍで検出を行うことにより実施した（Ｋａｗａｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４，１８５−１９６（２００４））。反応混合物の組成は、以下のとおりである：５ｍＭ  ＮＡＤ＋、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＡＴＰまたは１．０ｍｇ／ｍｌメタリン酸、および０．４３μｇ／ｍｌ  ｅｃｏＮＡＤＫまたはｅｃｏＮＡＤＫ  Ｎ７５Ｔ。コントロールとして、以下の反応混合物（５μｌ）を使用した：５ｍＭ  ＮＡＤ＋、５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、５ｍＭ  ＡＴＰ、および５ｍＭ  ＡＤＰ。結果を図４に示す。
【００５８】
ＴＬＣ解析により、メタリン酸をリン酸供与体とした場合において、ｅｃｏＮＡＤＫ  Ｎ７５Ｔが、野生型より多くのＮＡＤＰ＋を生産することが確認された（図４）。
【００５９】
また、各酵素のテトラポリリン酸に対するｋｃａｔ値は、この単一の置換によって増加した（表１）。
【００６０】
【表１】
2014135930.tif 000006
【００６１】
以上から、ｅｃｏＮＡＤＫ  Ｎ７５ＴおよびｖｃｈＮＡＤＫ  Ｎ７６Ｔは、リン酸供与体としてのＡＴＰに対する特異性を失う代わりに、ポリリン酸利用能を獲得したことがわかった。このポリリン酸利用能は、Ｐｐｎｋのポリリン酸利用能に匹敵するか、それより高いものであった（図２ａおよび図２ｂ、表１）。これは、ＡＴＰ依存キナーゼに対して、ポリリン酸利用能を生物工学的に付与することに成功した初めての例である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明により、より高純度な有用リン酸化物質（ＮＡＤＰ、診断薬、試薬、医薬、各種化合物の中間体など）の酵素法による大規模生産を、より低コストで実施することが可能になると期待される。
【図１】
2014135930.tif 000007
【図２】
2014135930.tif 000008
【図３】
2014135930.tif 000009
【図４】
2014135930.tif 000010
【配列表】
2014135930000001.app