(57)【要約】【課題】非小細胞肺がんの治療のためのＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の組合せを提供すること。【解決手段】本発明は、低投与量のｐａｎＨＥＲ阻害剤と組み合わせたＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の組合せを投与することにより、非小細胞肺がんを治療する方法に関する。本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の組合せを投与することにより、非小細胞肺がんを治療する方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量の不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、有効量のＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項２】
不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、ｐａｎＨＥＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含み、ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、非標準臨床投与レジメンに従って投与される、方法。
【請求項８】
非標準臨床投与レジメンが、非標準臨床用量または非標準投与スケジュールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非標準臨床投与レジメンが、低投与量のｐａｎＨＥＲ阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
非標準臨床投与レジメンが間欠的投与レジメンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、相乗作用量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項１７】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤、および
（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤
の相乗的組合せであって、成分（ａ）および成分（ｂ）が相乗的である、組合せ。
【請求項２３】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項２２に記載の組合せ。
【請求項２４】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤が、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である、請求項２２に記載の組合せ。
【請求項２５】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項２２から２４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２６】
ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される、請求項２２から２４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２７】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である、請求項２２から２４のいずれかに記載の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低投与量のｐａｎＨＥＲ阻害剤と組み合わせたＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の組合せを投与することにより、非小細胞肺がんを治療する方法に関する。本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせた不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の組合せを投与することにより、非小細胞肺がんを治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺がんは、世界的にがんによる死亡の主な原因であり、毎年推定１４０万の新たな症例が診断されている。非小細胞肺がんの最も一般的な形態である肺線癌において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）において変異を有する患者は、全人口の１０〜３０％の間を構成する。エルロチニブまたはゲフィチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤が最も有効となり得るのは、この区分の患者である（Ｐａｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；Ｌｙｎｃｈら、ＮＥＪＭ  ２００４；Ｐａｏら、ＰＮＡＳ  ２００４）。これらの阻害剤への良好な応答に関連する最も一般的な活性化変異は、エクソン１９内の欠失（例えばＥ７４６−Ａ７５０）および活性化ループにおける点変異（エクソン２１、特にＬ８５８Ｒ）である。程度は低いがこれまでに同定されている追加の体細胞変異は、エクソン２０内の点変異：Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１および小挿入を包含する（Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕら、ＪＮＣＩ  ２００５；Ｆｕｋｕｏｋａら、ＪＣＯ  ２００３；Ｋｒｉｓら、ＪＡＭＡ  ２００３およびＳｈｅｐｈｅｒｄら、ＮＥＪＭ  ２００４）。
【０００３】
これらの作用物質はＥＧＦＲ変異体部分母集団の有効な治療となり得るが、最初応答する患者の大多数は耐性を生じる。患者のおよそ５０％において観察される耐性の一次機構は、ゲートキーパートレオニン残基において発生する第二の変異（Ｔ７９０Ｍ）によるものである（Ｋｏｓａｋａら、ＣＣＲ  ２００６；Ｂａｌａｋら、ＣＣＲ  ２００６およびＥｎｇｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４
【非特許文献２】Ｌｙｎｃｈら、ＮＥＪＭ  ２００４
【非特許文献３】Ｐａｏら、ＰＮＡＳ  ２００４
【非特許文献４】Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕら、ＪＮＣ  ２００５
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｏｋａら、ＪＣＯ  ２００３
【非特許文献６】Ｋｒｉｓら、ＪＡＭＡ  ２００３
【非特許文献７】Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、ＮＥＪＭ  ２００４
【非特許文献８】Ｋｏｓａｋａら、ＣＣＲ  ２００６
【非特許文献９】Ｂａｌａｋら、ＣＣＲ  ２００６
【非特許文献１０】Ｅｎｇｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７
【非特許文献１１】Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）
【非特許文献１２】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒ、Ｐａ．、第１５版（１９７５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非小細胞肺がんの治療のための改善された療法は、満たされていない大きな医学的ニーズを含み、治療結果を改善するために、新規組合せレジメンの同定が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
後述する実施形態のそれぞれを、それが組み合わせられる実施形態と矛盾しない、本明細書において記述されている任意の他の実施形態と組み合わせてよい。さらに、本明細書において記述されている実施形態のそれぞれは、その範囲内に、本明細書において記述されている化合物の薬学的に許容できる塩を想定している。したがって、語句「または薬学的に許容できるその塩」は、本明細書において記述されているすべての化合物の記述に内在する。
【０００７】
本明細書において記述されているいくつかの実施形態は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量の不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、有効量のＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法に関する。
【０００８】
本発明の方法のさらなる実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【０００９】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１０】
本発明の方法のある特定の実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１１】
本発明の方法のさらなる実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１２】
本発明の方法の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００１３】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００１５】
本発明の方法のある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１７】
本発明の方法の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１８】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００１９】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、可逆的ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００２０】
本発明の方法のさらなる実施形態において、可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブおよびラパチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００２１】
本発明の方法の実施形態において、可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００２２】
本発明の方法のさらなる実施形態において、可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００２３】
本発明の方法の追加の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００２４】
本発明の方法の実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の方法のさらなる実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００２６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、ｐａｎＨＥＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含み、ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、非標準臨床投与レジメンに従って投与される、方法に関する。
【００２８】
本発明の方法のさらなる実施形態において、非標準臨床投与レジメンは、非標準臨床用量または非標準投与スケジュールである。
【００２９】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、非標準臨床投与レジメンは、低投与量のｐａｎＨＥＲ阻害剤である。
【００３０】
本発明の方法の実施形態において、非標準臨床投与レジメンは、間欠的投与レジメンである。
【００３１】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００３２】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００３３】
本発明の方法の実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００３４】
本発明の方法の追加の実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００３５】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００３６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００３７】
本発明の方法のある特定の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００３８】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００３９】
本発明の方法の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４０】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００４１】
本発明の方法のある特定の実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００４２】
本発明の方法の実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４４】
本発明のある特定の実施形態は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、相乗作用量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法に関する。
【００４５】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４７】
本発明の方法の実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４８】
本発明の方法のある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００４９】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００５０】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の方法のある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００５３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００５４】
本発明の方法の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００５５】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤はｐａｎＨＥＲ阻害剤である。
【００５６】
本発明の方法のさらなる実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００５７】
本発明の方法の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００５８】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００５９】
本発明の方法の追加の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６０】
本発明の方法の追加の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００６１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００６２】
本発明の方法の実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６３】
本発明の方法のある特定の実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態は、（ａ）ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤、および（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤の相乗的組合せであって、成分（ａ）および成分（ｂ）が相乗的である、組合せに関する。
【００６５】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００６６】
本発明の組合せのさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６７】
本発明の組合せの実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６８】
本発明の組合せの追加の実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド、または薬学的に許容できるその塩である。
【００６９】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン、または薬学的に許容できるその塩である。
【００７０】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブ、カネルチニブ、セツキシマブおよびパニツムマブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００７１】
本発明の組合せの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００７２】
本発明の組合せの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００７３】
本発明の組合せのある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００７４】
本発明の組合せのさらなる実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００７５】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤はｐａｎＨＥＲ阻害剤である。
【００７６】
本発明の組合せのさらなる実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００７７】
本発明の組合せの追加の実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００７８】
本発明の組合せの実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００７９】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００８０】
本発明の組合せの実施形態において、ｐａｎＨＥＲ阻害剤は不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００８１】
本発明の組合せの追加の実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブ、または薬学的に許容できるその塩からなる群から選択される。
【００８２】
本発明の組合せのいくつかの実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、アファチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【００８３】
本発明の組合せの実施形態において、不可逆的ｐａｎＨＥＲ阻害剤は、ダコミチニブ、または薬学的に許容できるその塩である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】サンガー配列決定法によりＲＰＣ９クローン３およびクローン６においてＣ＞Ｔ  ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を同定したことを示す図であり、示されている百分率は、ｃａｓｔＰＣＲにより全ＥＧＦＲ対立遺伝子に対してＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子を定量したものを表す。
【図２】種々の濃度のダコミチニブ（図２Ａ）またはエルロチニブ（図２Ｂ）で処理したＰＣ９およびＲＰＣ９クローン３および６について、細胞生存アッセイにおける用量応答曲線を示す図である。
【図３】ＲＰＣ９クローン６細胞生存アッセイにおける用量応答曲線を示す図である。図３Ａは、化合物Ａ（「ｃｏｍｐｄ  Ａ」）およびダコミチニブ（「ｄａｃｏ」）の単独および組合せでの用量応答曲線を示す。図３Ｂは、化合物Ａおよびエルロチニブ（「ｅｒｌｏ」）の単独および組合せでの用量応答曲線を示す。図３Ｃは、化合物Ａの選択された濃度における、単剤としての、ならびにダコミチニブおよびエルロチニブとの組合せでの阻害のパーセントを示す。
【図４】ＲＰＣ９クローン６細胞生存アッセイにおける用量応答曲線を示す図である。図４Ａは、化合物Ｂ（「ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）およびダコミチニブ（「ｄａｃｏ」）の単独および組合せでの用量応答曲線を示す。図４Ｂは、化合物Ｂおよびエルロチニブ（「ｅｒｌｏ」）の単独および組合せでの用量応答曲線を示す。図４Ｃは、化合物Ｂの選択された濃度における、単剤としての、ならびにダコミチニブおよびエルロチニブとの組合せでの阻害のパーセントを示す。
【図５】ＲＰＣ９クローン６細胞生存アッセイにおける用量応答曲線を示す図である。図５Ａは、化合物Ａ（「ｃｏｍｐｄ  Ａ」）単独の、およびダコミチニブ（「ｄａｃｏ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図５Ｂは、化合物Ａ単独の、およびゲフィチニブ（「ｇｅｆｉ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図５Ｃは、化合物Ａ単独の、およびアファチニブ（「ａｆａｔ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図５Ｄは、化合物Ａの選択された濃度における、単剤としての、ならびにダコミチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブとの組合せでの阻害のパーセントを示す。
【図６】ＲＰＣ９クローン６細胞生存アッセイにおける用量応答曲線を示す図である。図６Ａは、化合物Ｂ（「ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）単独の、およびダコミチニブ（「ｄａｃｏ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図６Ｂは、化合物Ｂ単独の、およびゲフィチニブ（「ｇｅｆｉ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図６Ｃは、化合物Ｂ単独の、およびアファチニブ（「ａｆａｔ」）との組合せでの用量応答曲線を示す。図４Ｄは、化合物Ｂの選択された濃度における、単剤としての、ならびにダコミチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブとの組合せでの阻害のパーセントを示す。
【図７】ＲＰＣ９クローン６細胞におけるＥＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化レベルのウエスタン免疫ブロットを示す図である。ＧＡＰＤＨは、タンパク質負荷対照として包含されていた。図７Ａは、ＤＭＳＯ、ダコミチニブ、化合物Ａ、またはダコミチニブ＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞を示す。図７Ｂは、ＤＭＳＯ、エルロチニブ、化合物Ａ、またはエルロチニブ＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞を示す。
【図８】ＤＭＳＯ、ダコミチニブ、化合物Ａ、またはダコミチニブ（「Ｄａｃｏ」）＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞のウエスタン免疫ブロット（図７Ａ）のバンドについてのデンシトメトリー結果を示す図である。ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８（図８Ａ）、ｐＡＫＴ  Ｓ４７３（図８Ｂ）およびｐＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（図８Ｃ）の阻害は、ＤＭＳＯ対照との比較によって決定した。
【図９】ＤＭＳＯ、エルロチニブ、化合物Ａ、またはエルロチニブ（「Ｅｒｌｏ」）＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞のウエスタン免疫ブロット（図７Ｂ）のバンドについてのデンシトメトリー結果を示す図である。ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８（図９Ａ）、ｐＡＫＴ  Ｓ４７３（図９Ｂ）およびｐＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（図９Ｃ）の阻害は、ＤＭＳＯ対照との比較によって決定した。
【図１０】ＲＰＣ９クローン６細胞におけるＥＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化レベルのウエスタン免疫ブロットを示す図である。ＧＡＰＤＨは、タンパク質負荷対照として包含されていた。図１０Ａは、ＤＭＳＯ、ダコミチニブ、化合物Ｂ、またはダコミチニブ＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞を示す。図１０Ｂは、ＤＭＳＯ、エルロチニブ、化合物Ｂ、またはエルロチニブ＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞を示す。
【図１１】ＤＭＳＯ、ダコミチニブ、化合物Ｂ、またはダコミチニブ（「Ｄａｃｏ」）＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞のウエスタン免疫ブロット（図１０Ａ）のバンドについてのデンシトメトリー結果を示す図である。ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８（図１１Ａ）、ｐＡＫＴ  Ｓ４７３（図１１Ｂ）およびｐＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（図１１Ｃ）の阻害は、ＤＭＳＯ対照との比較によって決定した。
【図１２】ＤＭＳＯ、エルロチニブ、化合物Ｂ、またはエルロチニブ（「Ｅｒｌｏ」）＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）の組合せで処理したＲＰＣ９クローン６細胞のウエスタン免疫ブロット（図１０Ｂ）のバンドについてのデンシトメトリー結果を示す図である。ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８（図１２Ａ）、ｐＡＫＴ  Ｓ４７３（図１２Ｂ）およびｐＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（図１２Ｃ）の阻害は、ＤＭＳＯ対照との比較によって決定した。
【図１３】無作為化し、ビヒクル、ダコミチニブ、化合物Ａ、またはダコミチニブ（「Ｄａｃｏ」）＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）で毎日および経口的に処置したＲＰＣ９クローン６担腫瘍ＳＣＩＤマウスを用いる異種移植モデルの結果をグラフ化した図である。図１３Ａは、腫瘍体積をグラフ化しており、これは、週３回測定し、平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。図１３Ｂは、各群の体重をグラフ化しており、これは、毎日記録し、百分率変化を平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。
【図１４】無作為化し、ビヒクル、ダコミチニブ、化合物Ｂ、またはダコミチニブ（「Ｄａｃｏ」）＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）で毎日および経口的に処置したＲＰＣ９クローン６担腫瘍ＳＣＩＤマウスを用いる異種移植モデルの結果をグラフ化した図である。図１４Ａは、腫瘍体積をグラフ化しており、これは、週３回測定し、平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。図１４Ｂは、各群の体重をグラフ化しており、これは、毎日記録し、百分率変化を平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。
【図１５】無作為化し、ビヒクル、ダコミチニブ、化合物Ｂ、またはダコミチニブ（「Ｄａｃｏ」）＋化合物Ｂ（「Ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）で毎日および経口的に処置したＲＰＣ９クローン６担腫瘍ＳＣＩＤマウスを用いる異種移植モデルの結果をグラフ化した図である。図１５Ａは、単剤処置群の腫瘍体積をグラフ化している。図１５Ｂは、組合せ処置群の腫瘍体積をグラフ化している。
【図１６】無作為化し、ビヒクル、エルロチニブ、化合物Ａ、またはエルロチニブ（「Ｅｒｌｏ」）＋化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）で毎日および経口的に処置したＲＰＣ９クローン６担腫瘍ＳＣＩＤマウスを用いる異種移植モデルの結果をグラフ化した図である。図１６Ａは、腫瘍体積をグラフ化しており、これは、週３回測定し、平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。図１６Ｂは、各群の体重をグラフ化しており、これは、毎日記録し、百分率変化を平均および該平均の標準誤差とともにグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
受容体のヒト上皮成長因子受容体／上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ｅｒｂＢ−２、ＨＥＲ３／ｅｒｂＢ−３およびＨＥＲ４／ｅｒｂＢ−４を包含する。
【００８６】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲの一般的な活性化変異（Ｌ８５８ＲおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）を有効に阻害する。一般的な活性化変異は、単一変異体または単一変異型とも称される。ＥＧＦＲ阻害剤の例は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブを包含する。セツキシマブおよびパニツムマブ等のＥＧＦＲのモノクローナル抗体阻害剤も、本発明において定義されている通り、ＥＧＦＲ阻害剤である。
【００８７】
ＥＧＦＲの阻害剤は、可逆的または不可逆的阻害剤であってよい。ＥＦＧＲ分子のチロシンキナーゼドメインの可逆的阻害剤は、受容体に付着し、周期的に脱離する。ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、バンデタニブおよびラパチニブは、可逆的ＥＧＦＲ阻害剤の例である。ＥＦＧＲ分子のチロシンキナーゼドメインの不可逆的阻害剤は、ＥＧＦＲと不可逆的に結合する。ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブは、不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤の例である。
【００８８】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＨＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーの阻害剤である。ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブおよびバンデタニブは、選択的ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。セツキシマブおよびパニツムマブは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１に特異的なモノクローナル抗体である。
【００８９】
ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲファミリーの複数のメンバーをブロックする作用物質である。ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ペリチニブ、ダコミチニブおよびカネルチニブは、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の例である。ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブおよびペリチニブは、ＨＥＲファミリーのＥＧＦＲおよびＨＥＲ２メンバーを阻害する。ダコミチニブおよびカネルチニブは、ＨＥＲファミリーのＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４メンバーを阻害する。
【００９０】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、一般的な活性化変異（Ｌ８５８ＲおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）およびゲートキーパー変異（Ｔ７９０Ｍ）を有効に阻害する。本発明のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、単一変異体（Ｌ８５８ＲおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）よりもＥＧＦＲの二重変異型（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０ＭおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０／Ｔ７９０Ｍ）を優先的に阻害する。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の例は、Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２、ＡＰ２６１１３、ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３を包含する。
【００９１】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍの阻害剤は、可逆的または不可逆的阻害剤であってよい。Ｇｏ６９７６、ＰＫＣ４１２およびＡＰ２６１１３は、可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の例である。ＨＭ６１７１３、ＷＺ４００２、ＣＯ−１６８６およびＴＡＳ−２９１３は、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の例である。
【００９２】
本発明のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤は、１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン（「化合物Ａ」）、Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド（「化合物Ｂ」）、Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド（「化合物Ｃ」）および１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン（「化合物Ｄ」）、または薬学的に許容できるその塩も包含する。化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄは、不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の例である。
【００９３】
下記の略語が本明細書において使用され得る：Ａｃ（アセチル）；ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）；Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）；Ｂｏｃ２Ｏ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート）；ブレットホスパラダサイクル（クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ））；ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（ビス（２−メトキシエチル）アミノ硫黄トリフルオリド）；ＤＩＡＤ（アゾジカルボン酸ジイソプロピル）；ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）；ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）；ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）；ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）；ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＰＰＡ（ジフェニルリン酸アジド）；ＥＧＴＡ（［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］四酢酸）；ｅｑ（当量）；Ｅｔ（エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；Ｅｔ２Ｏ（ジエチルエーテル）；ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）；ＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザンまたはヘキサメチルジシロキサンとしても公知であるビス（トリメチルシリル）アミン）；ＨＯＡｃ（酢酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ｉＰｒ（イソプロピル）；ｉＰｒＭｇＣｌ（イソプロピルマグネシウムクロリド）；ｉＰｒＯＨ（イソプロピルアルコール）；ＫＨＭＤＳ（カリウムビス（トリメチルシリル）アミド）；ＬＡＨ（水素化アルミニウムリチウム）；ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）；ＬｉＨＭＤＳ（リチウムビス（トリメチルシリル）アミド）；Ｍｅ（メチル）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＭｅＣＮ（アセトニトリル）；ＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）；Ｎ（規定）；Ｎ／Ａ（計測不能）；ＮａＨＭＤＳ（ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド）；Ｎ／Ｄ（未決定）；ＮＩＳ（Ｎ−ヨードコハク酸イミド）；ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）；ＮＭＲ（核磁気共鳴）；Ｐｄ２（ｄｂａ）３（トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０））；ＰＧ（保護基）；Ｐｈ（フェニル）；ＰｈＩ（ＯＡｃ）２（ヨードベンゼンジアセテート）；ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ｐｓｉ（重量ポンド毎平方インチ）；Ｒｆ（保持因子）；ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所）；ｒｔ（室温）；ｓａｔ．（飽和）；ＳＣＸ（強カチオン交換）；ＳＥＭ（２−（トリメチルシリル）エトキシメチル）；ＳＥＭ−Ｃｌ（２−（トリメチルシリル）エトキシメチルクロリド）；ＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）；ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）；ＴＢＤＰＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）；ＴＢＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）；ｔ−ＢｕＸＰｈｏｓパラダサイクル（クロロ［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル）］パラジウム（ＩＩ）；ＴＦＡ（トリフルオロアセテート）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；トルエン（メチルベンゼン）；トシル（ｐ−トルエンスルホニル）；およびキサントホス（４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン）。
【００９４】
いくつかの実施形態は、本明細書において記述されている化合物の薬学的に許容できる塩に関する。本明細書において記述されている化合物の薬学的に許容できる塩は、その酸付加および塩基付加塩を包含する。
【００９５】
いくつかの実施形態は、本明細書において記述されている化合物の薬学的に許容できる酸付加塩にも関する。好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。好適な酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容できるアニオンを含有する塩の非限定的な例は、酢酸塩、酸性クエン酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｈｔｈｙｌａｔｅ）、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩およびキシノホ酸塩を包含するがこれらに限定されない。
【００９６】
追加の実施形態は、本明細書において記述されている化合物の塩基付加塩に関する。好適な塩基付加塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。好適な塩基塩の非限定的な例は、アルミニウム塩、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオールアミン塩、グリシン塩、リジン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩および亜鉛塩を包含する。
【００９７】
自然界において塩基性である本明細書において記述されている化合物は、種々の無機および有機酸と多種多様な塩を形成することができる。本明細書において記述されているそのような塩基性化合物の薬学的に許容できる酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、非毒性酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）］等、薬理学的に許容できるアニオンを含有する塩を形成するものである。アミノ基等の塩基性部分を包含する本明細書において記述されている化合物は、上記で言及した酸に加えて、種々のアミノ酸と、薬学的に許容できる塩を形成することができる。
【００９８】
自然界において酸性である本明細書において記述されている化合物の化合物の薬学的に許容できる塩基塩を調製するために試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性塩基塩を形成するものである。そのような非毒性塩基塩は、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）等の薬理学的に許容できるカチオンから誘導されるもの、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）等のアンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、ならびに薬学的に許容できる有機アミンの低級アルカノールアンモニウムおよび他の塩基塩を包含するがこれらに限定されない。
【００９９】
本明細書において記述されている実施形態の化合物は、本明細書において記述されている化合物のすべての立体異性体（例えば、シスおよびトランス異性体）およびすべての光学異性体（例えば、ＲおよびＳ鏡像異性体）、ならびにそのような異性体のラセミ、ジアステレオマーおよび他の混合物を包含する。すべての立体異性体が本発明人らの特許請求の範囲内に網羅されるが、当業者であれば、特定の立体異性体が好ましい場合があることを認識するであろう。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述されている化合物は、エノールおよびイミン形態、ならびにケトおよびエナミン形態、ならびに幾何異性体およびそれらの混合物を包含する数種の互変異性形態で存在し得る。すべてのそのような互変異性形態は、本実施形態の範囲内に包含される。互変異性体は、溶液中の互変異性セットの混合物として存在する。固体形態においては、通常、１つの互変異性体が優勢である。１つの互変異性体について記述されている場合があっても、本実施形態は、本化合物のすべての互変異性体を包含する。
【０１０１】
本実施形態は、本明細書において記述されている化合物のアトロプ異性体も包含する。アトロプ異性体は、回転が制限された異性体に分離され得る化合物を指す。
【０１０２】
酸および塩基のヘミ塩、例えばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩も形成され得る。
【０１０３】
好適な塩に関する総説については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）を参照されたい。本明細書において記述されている化合物の薬学的に許容できる塩を作製するための方法は、当業者に公知である。
【０１０４】
用語「溶媒和物」は、本明細書において、本明細書において記述されている化合物と、１つまたは複数の薬学的に許容できる溶媒分子、例えばエタノールとを含む分子錯体を記述するために使用される。
【０１０５】
本明細書において記述されている化合物は、非溶媒和および溶媒和形態で存在してもよい。したがって、いくつかの実施形態は、本明細書において記述されている化合物の水和物および溶媒和物に関する。
【０１０６】
１つまたは複数の不斉炭素原子を含有する本明細書において記述されている化合物は、２つ以上の立体異性体として存在し得る。本明細書において記述されている化合物がアルケニルまたはアルケニレン基を含有する場合、幾何シス／トランス（またはＺ／Ｅ）異性体が考えられる。構造異性体が低エネルギー障壁を介して相互変換可能である場合、互変異性化（「互変異性」）が発生し得る。これは、例えば、イミノ、ケトもしくはオキシム基を含有する本明細書において記述されている化合物中ではプロトン互変異性の形態を、または芳香族部分を含有する化合物中ではいわゆる原子価互変異性の形態をとり得る。単一の化合物が複数種の異性を呈し得る。
【０１０７】
複数種の異性を呈する化合物およびその１つまたは複数の混合物を包含する、本明細書において記述されている化合物のすべての立体異性体、幾何異性体および互変異性形態が、本実施形態の範囲内に包含される。対イオンが光学活性、例えばｄ−乳酸もしくはｌ−リジン、またはラセミ、例えばｄｌ−酒石酸もしくはｄｌ−アルギニンである酸付加塩または塩基塩も包含される。
【０１０８】
シス／トランス異性体は、当業者に周知である従来の技術、例えばクロマトグラフィーおよび分別結晶によって分離することができる。
【０１０９】
個々の鏡像異性体の調製／単離のための従来の技術は、好適な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、または、例えばキラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用するラセミ体（または塩もしくは誘導体のラセミ体）の分割を包含する。
【０１１０】
代替として、ラセミ体（またはラセミ前駆体）を、好適な光学活性化合物、例えばアルコールと、または、本明細書において記述されている化合物が酸性もしくは塩基性部分を含有する場合、１−フェニルエチルアミンもしくは酒石酸等の塩基もしくは酸と反応させてよい。得られたジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶によって分離することができ、ジアステレオ異性体の一方または両方を、当業者に周知の手段によって、対応する純粋な鏡像異性体（複数可）に変換することができる。
【０１１１】
用語「治療すること」は、本明細書において使用される場合、別段の指示がない限り、そのような用語が当てはまる障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状を、後退させること、緩和すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。用語「治療」は、本明細書において使用される場合、別段の指示がない限り、「治療すること」がすぐ上で定義されている通りに治療する行為を指す。
【０１１２】
本発明に従って治療される患者は、ヒト、サルもしくは他の下等霊長類、ウマ、イヌ、ウサギ、モルモット、またはマウス等であるがこれらに限定されない任意の温血動物を包含する。例えば、患者はヒトである。医療技術分野の当業者であれば、非小細胞肺がんに罹患しており、治療を必要としている個々の患者を容易に同定することができる。
【０１１３】
用語「相加的」は、２つの化合物または標的剤の組合せの結果が各個々の作用物質の和であることを意味する。用語「相乗作用」または「相乗的」は、２つの作用物質の組合せの結果が各作用物質を一緒にした和を超えることを意味するために使用される。「相乗作用量」は、相乗効果をもたらす２つの作用物質の組合せの量である。
【０１１４】
１または２つの成分間の相乗的相互作用を決定して、治療を必要としている患者への、様々なｗ／ｗ比範囲および用量にわたる成分の投与により、効果のための最適な範囲および効果のための各成分の絶対用量範囲を決定的に測定することができる。ヒトでは、患者について臨床研究を行う複雑性および費用が、相乗作用の一次モデルとしてのこの形態の試験の使用を非実用的にしている。しかしながら、インビトロモデルまたはインビボモデルにおける相乗作用の観察により、ヒトおよび他の種における効果を予測することができ、本明細書において記述されている通り、相乗効果を測定するためのインビトロモデルまたはインビボモデルが存在し、そのような研究の結果を使用して、薬物動態／薬力学的方法の適用により、ヒトおよび他の種において必要とされる有効用量および血漿濃度比範囲ならびに絶対用量および血漿濃度を予測することもできる。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明の方法は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、ｐａｎＨＥＲ阻害剤と組み合わせて投与することを含み、ｐａｎＨＥＲ阻害剤が、非標準臨床投与レジメンに従って、相乗効果を達成するのに十分な量で投与される方法に関する。この実施形態において、本発明の方法は、標的治療剤、具体的にはＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤およびｐａｎＨＥＲ阻害剤の相乗的組合せに関する。
【０１１６】
ある実施形態において、本発明の方法は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、低投与量のｐａｎＨＥＲ阻害剤と、相乗効果を達成するのに十分な量で組み合わせて投与することを含む方法に関する。この実施形態において、本発明の方法は、標的治療剤、具体的にはＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤およびｐａｎＨＥＲ阻害剤の相乗的組合せに関する。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明の方法は、非小細胞肺がんを治療する方法であって、それを必要する患者に、有効量の不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を、有効量のＥＧＦＲ阻害剤と、相乗効果を達成するのに十分な量で組み合わせて投与することを含む方法に関する。この実施形態において、本発明の方法は、標的治療剤、具体的には不可逆的ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤の相乗的組合せに関する。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、「有効」量は、本発明の組合せにおいて、腫瘍細胞の成長またはがん転移の進行を予防するまたは阻害するために十分な、物質、作用物質、化合物または組成物の量を指す。用量および投与レジメンの治療的または薬理学的有効性は、特異的な腫瘍を経験している患者において寛解を誘発する、増強する、維持するまたは延ばす能力としても特徴付けされ得る。
【０１１９】
「非標準臨床投与レジメン」は、本明細書において使用される場合、物質、作用物質、化合物または組成物を投与するためのレジメンを指し、これは、ＥＧＦＲの単一変異型（Ｌ８５８ＲおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）を有効に阻害するが、臨床状況において典型的に使用される量または用量とは異なる。「非標準臨床投与レジメン」は、「非標準臨床用量」または「非標準投与スケジュール」を包含する。
【０１２０】
「低投与量」は、本明細書において使用される場合、物質、作用物質、化合物または組成物の量または用量を指し、これは、ＥＧＦＲの単一変異型（Ｌ８５８ＲおよびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）を有効に阻害するが、臨床状況において典型的に使用される量または用量よりも低い量または用量である。
【０１２１】
当業者であれば、公知の方法に従い、年齢、体重、全般的健康、投与される化合物、投与経路、治療を必要としている非小細胞肺がんの性質および進展度、ならびに他の医薬の存在等の要因を考慮して、本発明の組合せにおいて使用されている通りの各化合物の、患者に投与するための適切な量または投薬量を決定することができるであろう。
【０１２２】
本発明の方法の実践は、種々の投与レジメンを介して遂行され得る。本発明の組合せの化合物は、間欠的に、同時発生的にまたは順次に投与することができる。がん細胞の所望の低減または減退を達成するために、投与レジメンの繰り返しを必要に応じて行ってよい。ある実施形態において、本発明の組合せの化合物は、間欠的投与レジメンで投与され得る。
【０１２３】
本発明の組合せの化合物の投与は、作用部位への化合物の送達を可能にする任意の方法によって達成することができる。これらの方法は、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内または注入を包含する）、局所および直腸内投与を包含する。
【０１２４】
本発明の方法または組合せの化合物は、投与前に製剤化してよい。製剤は、好ましくは、特定の投与モードに適合される。これらの化合物は、当技術分野において公知の通りの薬学的に許容できる担体とともに製剤化され、当技術分野において公知の通りの多種多様な剤形で投与される。本発明の医薬組成物を作製する際、活性成分は、通常、薬学的に許容できる担体と混合されるか、または担体によって希釈されるか、または担体内に封入される。そのような担体は、固体賦形剤または充填剤、添加剤、滅菌水媒質および種々の非毒性有機溶媒を包含するがこれらに限定されない。単位剤形または医薬組成物は、錠剤、ゼラチンカプセル剤等のカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、水性および非水性の経口液剤および懸濁剤、ロゼンジ剤、口内錠、ハードキャンディー剤、スプレー剤、クリーム剤、膏薬、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、注射液剤、エリキシル剤、シロップ剤、ならびに個々の用量への細分化に適合されたコンテナ内に包装されている非経口液剤を包含する。
【０１２５】
非経口製剤は、薬学的に許容できる水性液剤または非水性液剤、分散剤、懸濁剤、乳剤、およびそれらの調製のための滅菌粉末を包含する。担体の例は、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルを包含する。流動性は、レシチン、界面活性剤等のコーティングの使用によって、または適切な粒径を維持することによって、維持することができる。例示的な非経口投与形態は、滅菌水性液剤、例えばプロピレングリコール水溶液またはデキストロース水溶液中の、本発明の化合物の液剤または懸濁剤を包含する。そのような剤形は、所望ならば、好適に緩衝化されていてよい。
【０１２６】
加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク等の平滑剤が、多くの場合、錠剤化目的のために有用である。同様の種類の固体組成物は、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤においても用いられ得る。そのために、好ましい材料は、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールを包含する。水性懸濁剤またはエリキシル剤が経口投与用に所望される場合、その中の活性化合物は、種々の甘味剤または香味剤、着色物質または染料、所望ならば、乳化剤または懸濁化剤と、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンまたはそれらの組合せ等の賦形剤と一緒に組み合わせられてよい。
【０１２７】
特定量の活性化合物を用いて種々の医薬組成物を調製する方法は、当技術分野の当業者に公知であるか、または明らかになるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒ、Ｐａ．、第１５版（１９７５）を参照されたい。
【０１２８】
本発明は、本発明の組合せの治療剤および該治療剤の投与のための使用説明書を含むキットにも関する。一実施形態において、使用説明書は、例えば、本発明の治療剤の同時または順次投与のための、治療剤の投与モードを詳細に述べ、条件付けするものである。
【０１２９】
以下で提供する実施例および調製は、本明細書において記述されている化合物およびそのような化合物を調製する方法をさらに例証し例示するものである。本明細書において記述されている実施形態の範囲は、下記の実施例および調製によっていかようにも限定されない。下記の実施例において、単一のキラル中心を持つ分子は、別段の注記がない限り、ラセミ混合物として存在する。２つ以上のキラル中心を持つ分子は、別段の注記がない限り、ジアステレオマーのラセミ混合物として存在する。単一の鏡像異性体／ジアステレオマーは、当業者に公知の方法によって取得することができる。
【０１３０】
示されている実施例において、塩形態は、ＨＰＬＣベースのクロマトグラフィー精製中に、移動相添加物の結果として時折単離された。これらの事例においては、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩等の塩が単離され、さらに処理することなく試験した。当業者であれば、標準的な方法論（イオン交換カラムを使用すること、または弱塩基水溶液を使用する単純な塩基性抽出を実施すること等）によって遊離塩基形態を実現することができると認識されるであろう。
【０１３１】
概して、本明細書において記述されている化合物は、化学技術分野において公知のプロセスによって、特に本明細書に含有される記述を考慮して調製することができる。本明細書において記述されている化合物の製造のためのある特定のプロセスを、実施形態のさらなる特色として提供し、以下で提供される反応スキームおよび実験の項において例証する。
【実施例１】
【０１３２】
１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［５−クロロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル］−４−メトキシ−ピロリジン−１−イル｝プロペノントリフルオロアセテート（「１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オントリフルオロアセテート」および「１−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−（（（５−クロロ−２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ）メチル）−４−メトキシピロリジン−１−イル）プロプ−２−エン−１−オントリフルオロアセテート」としても公知である）（「化合物Ａ」のトリフルオロ酢酸塩）の調製
【０１３３】
【化１】
2014177456.tif 000002
ステップ１：（３Ｓ，４Ｒ）−１−ベンジル−４−メトキシ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの調製
【０１３４】
【化２】
2014177456.tif 000003
０℃の２−Ｍｅ−ＴＨＦ（６００ｍＬ）およびＴＦＡ（６．７ｍＬ）中の（Ｅ）−３−メトキシ−アクリル酸メチルエステル（５０ｇ、４３０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（メトキシメチル）−Ｎ−（トリメチルシリルメチル）−ベンジルアミン（２０４ｇ、２当量）を滴下添加した。添加後、反応物を室温に加温させ、２時間撹拌した。反応物を分液漏斗に移し、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去すると、粗ラセミ生成物が黄色油として残り、これをＳｉＯ２（１０％〜３５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）上で精製して、ラセミトランス生成物を黄色油（８２．７ｇ）として得た。キラルＳＦＣ（キラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）ＡＤ−Ｈ４．６×２５０ｍｍカラム４％ＭｅＯＨｗ／０．１％ジエチルアミン、１４０バール、３．０ｍＬ／分）による鏡像異性体分離により、所望の単一異性体生成物を得、これを公知の標準物質との比較によって検証した（３４ｇ、３１．７％収率）。比旋光度[α]D27 = +23.8°(C=1.3, MeOH).1H NMR
(400MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.55-2.63 (m, 2H) 2.69 (dd, J=9.95, 6.42Hz, 1H)
2.82-2.88 (m, 1H) 2.90-2.96 (m, 1H) 3.23 (s, 3H) 3.51-3.63 (m, 2H) 3.66 (s, 3H)
4.07-4.12 (m, 1H) 7.22-7.39 (m, 5H). (C14H19NO3)のm/z (APCI+) 250.0 (M+H)+.
【０１３５】
ステップ２：（３Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル３−メチルエステルの調製
【０１３６】
【化３】
2014177456.tif 000004
エタノール（５００ｍＬ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−１−ベンジル−４−メトキシ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（３５ｇ、１４０．４ｍｍｏｌ）の溶液を窒素でパージし、次いでＰｄ（ＯＨ）２（２ｇ、０．１当量）を添加し、混合物を、およそ１５ｐｓｉ（水素バルーンによる）の水素ガス雰囲気下で終夜撹拌した。次いで、反応物をセライトに通して濾過し、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３０．９ｇ、１当量）を、得られた濾液に撹拌しながらゆっくり添加した。１時間後、反応物を濃縮し、粗材料を、２体積は１０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、次いで１：１  ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するショートシリカカラムに通して、生成物が完全に溶離されるまで精製した。生成物画分を合わせ、濃縮して、表題化合物を透明油（３５．８１ｇ、９８％収率）として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.39 (s,
9H) 3.17 (br. s., 1H) 3.23-3.28 (m, 4H) 3.35-3.53 (m, 3H) 3.65 (s, 3H) 4.06 (d,
J=4.78Hz, 1H).生成物からBocを引いたもの(C7H13NO3)のm/z (APCI+) 160.1 (M+H)+.  比旋光度: [a]D= -12.5度(C=0.87, MeOH).
【０１３７】
ステップ３：（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシメチル−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製
【０１３８】
【化４】
2014177456.tif 000005
水素化ホウ素リチウム（１２．７ｇ、４当量）を、ＴＨＦ（６００ｍＬ）中の（３Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル３−メチルエステル（３５．８１ｇ、１３８．１ｍｍｏｌ）の溶液に小分けにして添加し、次いで、反応物を６０℃に４時間加熱した。反応物を０℃の水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をＳｉＯ２のプラグ（３：１  ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）に通して精製して、表題化合物を透明油（２９．３５ｇ、９２％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.46 (s, 9H) 2.37-2.47 (m, 1H) 3.19 (dd, J=11.08, 5.29Hz,
1H) 3.33 (d, J=4.03Hz, 4H) 3.50-3.66 (m, 4H) 3.77-3.83 (m, 1H).生成物からBocを引いたもの(C6H13NO2)のm/z (APCI+) 132.2 (M+H)+.  比旋光度: [a]D= +9.3度 (C=0.86, MeOH).
【０１３９】
ステップ４：（３Ｒ，４Ｒ）−３−［５−クロロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル］−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製
【０１４０】
【化５】
2014177456.tif 000006
方法Ａ：（マイクロ波加熱を使用）
マイクロ波バイアル内、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の２，４，５−トリクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（９０４ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）および（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシメチル−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９４０ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（トルエン中２５％ｗ／ｗ、１．６ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を周囲温度で１５分間撹拌した。ＬＣＭＳは、（３Ｒ，４Ｒ）−３−（２，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル）−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの定量的形成を示した。この得られた反応溶液に、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミン（４７４ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＸＰｈｏｓパラダサイクル（１１０ｍｇ、０．０４ｍｏｌ当量）を添加した。反応混合物を撹拌し、マイクロ波を使用して、正常吸収レベルで１００℃に４５分間加熱した。反応混合物をセライトに通して濾過し、濾液を蒸発させて、暗色残留物を得た。粗材料を、ヘプタン中０％〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１．７８ｇ、７６％収率）を得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.50
(br. s., 1H) 9.06 (s, 1H) 7.85 (s, 1H) 7.52 (s, 1H) 7.05 (d, J=2.27Hz, 1H)
4.30-4.53 (m, 2H) 3.86-3.96 (m, 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 (m, 1H) 3.43-3.53
(m, 1H) 3.24-3.31 (m, 3H) 2.71 (br. s., 1H) 1.39 (br. s., 9H).生成物からBocを引いたもの; C16H20ClN7O2のm/z (APCI+) 378.1 (M+H)+(Cl同位体のパターンを示す).
【０１４１】
方法Ｂ：熱加熱を使用
丸底フラスコ内、１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）中の２，４，５−トリクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（９．２８ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）および（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシメチル−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９．６５ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（トルエン中２５％ｗ／ｗ、８０ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応溶液を周囲温度で３０分間撹拌した。ＬＣＭＳは、（３Ｒ，４Ｒ）−３−（２，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル）−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの定量的形成を示した。得られた反応溶液に、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミン（４．８６ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＸＰｈｏｓパラダサイクル（１．１ｇ、１．６７ｍｍｏｌ、０．０４ｍｏｌ当量）を添加した。反応混合物を撹拌し、油浴内、９０℃に１時間加熱した。次いで、反応混合物をセライトに通して濾過し、濾液を蒸発させて揮発物を除去して、暗色ガム状物を得、次いでこれを酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルプラグに通して濾過した。濾液を蒸発させ、残留物を、ヘプタン中０％〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１２．４ｇ、６２％収率）を得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51
(br. s., 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 (s, 1H) 7.52 (s, 1H) 7.06 (d, J=2.20Hz, 1H)
4.31-4.54 (m, 2H) 3.92 (br. s., 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 (m, 1H) 3.44-3.55
(m, 1H) 3.30 (d, J=18.34Hz, 3H) 2.72 (br. s., 1H) 1.39 (br. s., 9H).C21H28ClN7O4のm/z (APCI+) 378.2 (M+H)+(Cl同位体のパターンを示す).
【０１４２】
ステップ５：［５−クロロ−４−（（３Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−３−イルメトキシ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−アミントリフルオロアセテートの調製
【０１４３】
【化６】
2014177456.tif 000007
０℃のＤＣＭ（６０ｍＬ）中の（３Ｒ，４Ｒ）−３−［５−クロロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル］−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２．４０ｇ、２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１０．１ｍＬ、２０８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を周囲温度で２．５時間撹拌した。揮発物を除去し、残留物にエチルエーテル（１５０ｍＬ）を添加した。得られた懸濁液を２時間撹拌し、次いで濾過して、薄桃色固体を生じさせた。これをエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、表題化合物（１５．６９ｇ、定量的）をＴＦＡ塩として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.56
(br. s., 1H) 9.09 (s, 3H) 7.85 (s, 1H) 7.54 (s, 1H) 7.09 (d, J=2.32Hz, 1H) 4.48
(d, J=6.48Hz, 2H) 4.11 (br. s., 1H) 3.81 (s, 3H) 3.46-3.60 (m, 1H) 3.35-3.45
(m, 2H) 3.32 (s, 3H) 3.15 (dq, J=12.01, 6.02Hz, 1H) 2.88 (m, J=6.42, 6.42Hz,
1H).親分子C16H20ClN7O2のm/z (APCI+) 378.2 (M+H)+(Cl同位体のパターンを示す).
【０１４４】
ステップ６：１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［５−クロロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル］−４−メトキシ−ピロリジン−１−イル｝プロペノントリフルオロアセテートの調製
【０１４５】
【化７】
2014177456.tif 000008
［５−クロロ−４−（（３Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−３−イルメトキシ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−アミン（１５．０ｇ（２ＴＦＡ塩））、２４．７ｍｍｏｌ）、酢酸エチル（２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）の混合物を、０℃で１０分間撹拌した。塩化アクリロイル（２．３ｍＬ、２９ｍｍｏｌ、１．１ｍｏｌ当量）を滴下添加し、得られた混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離した。水層を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて固体を得、これをＳＦＣ（ＣＯ２中３５％ＥｔＯＨで溶離するＺｙｍｏｒＳＰＨＥＲ  ＨＡＰ  ５μ  ２１．２×１５０ｍｍカラム、１２０バール、流量６４ｍＬ／分）によって精製して、表題化合物をオフホワイトの固体（８．３ｇ、７８％収率）として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51
(s, 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 (s, 1H) 7.52 (s, 1H) 7.05 (s, 1H) 6.59 (ddd, J=16.75,
10.27, 1.34Hz, 1H) 6.14 (dd, J=16.75, 2.32Hz, 1H) 5.68 (dt, J=10.27, 2.32Hz,
1H) 4.44 (d, J=6.24Hz, 2H) 3.82-4.09 (m, 2H) 3.80 (s, 3H) 3.57-3.76 (m, 2H)
3.47-3.54 (m, 1H) 3.31 (d, J=4.65Hz, 3H) 2.67-2.92 (m, 1H).親分子C19H22ClN7O3のm/z (APCI+) 431.9 (M+H)+(Cl同位体のパターンを示す).
【０１４６】
代替的実施例１：１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン（「１−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−（（（５−クロロ−２−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ）メチル）−４−メトキシピロリジン−１−イル）プロプ−２−エン−１−オン」としても公知である）（「化合物Ａ」）の調製
【０１４７】
【化８】
2014177456.tif 000009
ステップ１：メチル（３，４−ｔｒａｎｓ）−１−ベンジル−４−メトキシピロリジン−３−カルボキシレートの調製
【０１４８】
【化９】
2014177456.tif 000010
窒素雰囲気下で磁気撹拌しながら、メチルｔｒａｎｓ−３−メトキシアクリレート（５００ｍＬ、５４０ｇ、４．６５ｍｏｌ）およびベンジルメトキシメチルトリメチルシリルアミン（５９５ｍＬ、５５２．１ｇ、２．３ｍｏｌ）を混合した。この混合物にＴＦＡ（２．７ｍＬ、４．１４ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）を添加し、これにより、３０秒でおよそ９５℃への発熱をもたらした。次いで、得られた混合物を１時間加熱還流した（注記：最初は還流温度はおよそ１０４℃であり、１時間後、およそ９０℃に降下した）。この規模の３つのバッチ、および３２５ｍＬのベンジルメトキシメチルトリメチルシリルアミン化合物を使用するもう１つのバッチを実施した。これらのバッチのうちの２つを合わせ、２Ｎ  ＨＣｌ（５Ｌ）に注ぎ入れた。混合物をＥｔＯＡｃ（３Ｌおよび２Ｌ）で抽出した。氷上で冷却しながら、５０％ＮａＯＨ（水溶液）を添加することによって水層をｐＨ９にした。水層をＥｔＯＡｃ（２．５Ｌ、１．５Ｌおよび１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。残りのバッチについても同じワークアップをした。すべての有機層を濾過し、濾液を真空で濃縮して、粗表題化合物（ラセミ−トランス、１６４０ｇ）を得た。バルブ・ツー・バルブ蒸留（０．１ミリバール、１００℃〜１４５℃）によるバッチ内での精製後、表題化合物が黄色油（６９％全収率）として単離された。
【０１４９】
ステップ２：メチル（３，４−ｔｒａｎｓ）−４−メトキシピロリジン−３−カルボキシレートの調製
【０１５０】
【化１０】
2014177456.tif 000011
メチル（３，４−ｔｒａｎｓ）−１−ベンジル−４−メトキシピロリジン−３−カルボキシレート（４６３．３ｇ、１８５８ｍｍｏｌ）をｉＰｒＯＨ（２Ｌ）に溶解した。この溶液に２０％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（５０ｇ、３７％湿潤、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、混合物を激しく撹拌した。１１．８バールＨ２の圧力を印加し、１Ｈ−ＮＭＲが完全変換を示すまで補給を数回行った。混合物をセライトに通して濾過し、セライトをｉＰｒＯＨですすいだ。濾液を真空で濃縮して、表題化合物を暗黄色液体（２６６ｇ、９０％収率）として得た。次のステップにおいてそのまま使用した。
【０１５１】
ステップ３：（３Ｒ，４Ｓ）−３−メトキシ−４−（メトキシカルボニル）ピロリジニウム（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ビス（ベンジルオキシ）−３−カルボキシプロパノエートの調製
【０１５２】
【化１１】
2014177456.tif 000012
エタノール（５Ｌ）中のＯ，Ｏ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸（１ｋｇ、２．７９ｍｏｌ）の温溶液に、エタノール（１Ｌ）中のメチル（３，４−ｔｒａｎｓ）−４−メトキシピロリジン−３−カルボキシレート（４８０ｇ、２．８４モル）の溶液を添加した。透明な溶液を播種し、終夜結晶化させた。得られた固体を単離し、エタノールで洗浄した。この富化材料をエタノールから５回（２×５Ｌ、４Ｌ、３．５Ｌおよび３Ｌ）再結晶させて、２１６ｇ（１５％収率）の塩を９８％の鏡像体過剰率で生じさせた（以下の条件を使用してＲｔ１２．１８分）。
【０１５３】
キラル純度決定：
試料調製：５ｍｇの塩を、ＤＣＭ（１．５ｍＬ）および２Ｎ  ＮａＯＨ（０．２ｍＬ）と混合した。ＤＣＭ層を乾燥させ、ガスクロマトグラフィーによって分析した。
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔシクロシル（Ｃｙｃｌｏｓｉｌ）Ｂ；３０ｍ×２５０ｃｍ×０．２５ｃｍ
温度：９０℃（０分）から５℃／分から１８０℃（４分）。全操作時間２２分。
注入温度：２５０℃
検出器：２５０℃；ＦＩＤ
注入体積：１．０μＬ
分割比：２５：１
カラム流量：２．２ｍＬ／分（Ｈ２）
【０１５４】
ステップ４：１−ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル（３Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシピロリジン−１，３−ジカルボキシレートの調製
【０１５５】
【化１２】
2014177456.tif 000013
ＤＣＭおよび飽和ＮａＨＣＯ３中の（３Ｒ，４Ｓ）−３−メトキシ−４−（メトキシカルボニル）ピロリジニウム（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ビス（ベンジルオキシ）−３−カルボキシプロパノエート（２１６ｇ、４２０ｍｍｏｌ）の混合物を機械的に撹拌し、Ｂｏｃ２Ｏ（１１９ｇ、５４６ｍｍｏｌ）を小分けにして添加した。混合物を室温で終夜撹拌し、層を分離した。水相をＤＣＭで抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ、濃縮した。これにより、３３％Ｂｏｃ２Ｏと混合された１３８ｇの粗表題生成物（８５％収率）が生じた。次のステップにおいて直接使用した。
【０１５６】
ステップ５：ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０１５７】
【化１３】
2014177456.tif 000014
１−ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル（３Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシピロリジン−１，３−ジカルボキシレート（１３８ｇ、Ｂｏｃ２Ｏを含有、およそ２：１、約０．３５ｍｏｌ）を２ＬのＴＨＦに溶解した。溶液を機械的に撹拌し、−７８℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウムの溶液（ＴＨＦ中２．４Ｍ、２００ｍＬ、０．５ｍｏｌ）を、温度を−７０℃未満に保ちながら３０分間かけて滴下添加した。次いで、温度を−３０℃に上昇させた。酒石酸カリウムナトリウム四水和物の飽和溶液（水溶液、１００ｍＬ）をゆっくり添加して、反応物をクエンチした。固体材料をＮａ２ＳＯ４の床で濾過除去した。濾液を真空で濃縮して、表題化合物（６６ｇ、０．２８ｍｏｌ、約８０％収率）をほぼ無色のシロップとして得た。1H-NMR (300MHz, CDCl3): ppm 3.80 (q,
J=5.1Hz, 1H), 3.62 (d, J=6.2Hz, 2H), 3.56 (m, 1H), 3.52 (d, J=7.4Hz, 1H),
3.40-3.30 (m, 1H), 3.36 (s, 3H), 2.42 (m, 1H), 1.46 (s, 9H).  C11H21NO4のm/z (GCMS) 231.2 (M)+.  C11H21NO4のm/z (APCI+) 132.0 (M+H)+.比旋光度：［ａ］Ｄ＝＋１１．６度（ｃ  ０．７７、ＭｅＯＨ）。キラル純度決定方法：キラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）ＡＤ−Ｈ  ２１．２×２５０ｍｍ  ５ｕカラム、１２％ＭｅＯＨ：８８％ＣＯ２の移動相、３５℃で溶離し、１２０バールに保持した。流量６２ｍＬ／分。Ｒｔ３．３６分。
【０１５８】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０１５９】
【化１４】
2014177456.tif 000015
丸底フラスコ内、１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）中の２，４，５−トリクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（９．２８ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシピロリジン−１−カルボキシレート（９．６５ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（トルエン中２５％ｗ／ｗ、８０ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応溶液を周囲温度で３０分間撹拌した。ＬＣＭＳは、中間体ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−｛［（２，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ］メチル｝−４−メトキシピロリジン−１−カルボキシレートの定量的形成を示した。上記の反応溶液に、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミン（４．８６ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）、ｔ−ＢｕＸＰｈｏｓパラダサイクル（１．１ｇ、１．６７ｍｍｏｌ、０．０４ｍｏｌ当量）を添加し、反応混合物を撹拌し、油浴内、９０℃に１時間加熱した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。反応混合物をセライトに通して濾過し、セライトを酢酸エチル（２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を蒸発させて揮発物を除去して、暗色残留物を得た。この残留物を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルプラグに通して濾過した。濾液を蒸発させ、残留物を、ヘプタン中０〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１２．４ｇ、６２％収率）を得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.51
(br. s., 1H) 9.07 (s, 1H) 7.86 (s, 1H) 7.52 (s, 1H) 7.06 (d, J=2.20Hz, 1H)
4.31-4.54 (m, 2H) 3.92 (br. s., 1H) 3.80 (s, 3H) 3.55-3.68 (m, 1H) 3.44-3.55
(m, 1H) 3.30 (d, J=18.34Hz, 3H) 2.72 (br. s., 1H) 1.39 (br. s., 9H).  C21H28ClN7O4のm/z (APCI+) 378.2 (M+H)+(Cl同位体パターンを示す).旋光度：［ａ］ｄ＝−８．３度（ｃ＝０．２４、ＭｅＯＨ）。
【０１６０】
ステップ７：（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジニウムトリフルオロアセテートの調製
【０１６１】
【化１５】
2014177456.tif 000016
水浴内、ＤＣＭ（６０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−カルボキシレート（１２．４０ｇ、２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１０．１ｍＬ、２０８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を周囲温度で２．５時間撹拌した。揮発物を除去して残留物を得、これにエチルエーテル（１５０ｍＬ）を添加した。得られた懸濁液を２時間撹拌し、薄桃色固体を濾過によって収集し、エチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、表題生成物（１５．６９ｇ、１００％収率）を得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.56
(br. s., 1H) 9.09 (s, 3H) 7.85 (s, 1H) 7.54 (s, 1H) 7.09 (d, J=2.32Hz, 1H) 4.48
(d, J=6.48Hz, 2H) 4.11 (br. s., 1H) 3.81 (s, 3H) 3.46-3.60 (m, 1H) 3.35-3.45
(m, 2H) 3.32 (s, 3H) 3.15 (dq, J=12.01, 6.02Hz, 1H) 2.88 (m, J=6.42, 6.42Hz,
1H).  親分子C16H20ClN7O2のm/z (APCI+) 378.2 (M+H)+(Cl同位体パターンを示す).旋光度：［ａ］ｄ＝−４．１度（ｃ＝０．２４、ＭｅＯＨ）。
【０１６２】
ステップ８：１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［５−クロロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシメチル］−４−メトキシ−ピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オンの調製
【０１６３】
【化１６】
2014177456.tif 000017
（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジニウムトリフルオロアセテート（１５．０ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）、酢酸エチル（２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）の混合物を、０℃で１０分間撹拌した。塩化アクリロイル（２．３ｍＬ、２９ｍｍｏｌ、１．１ｍｏｌ当量）を滴下添加し、得られた混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、水層を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて固体を得、これを、酢酸エチル中０〜５０％エタノールの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、白色固体を得た。次いで、この固体を、ヒートガンを使用して軽く加熱しながら、エタノール（粗製物１ｇにつき１０ｍＬのエタノール）から再結晶させ、種晶を播種した。冷却したら、白色結晶を濾過によって収集し、エタノール（粗製物１ｇにつき３ｍＬのエタノール）で洗浄して、表題化合物（７．４７ｇ、７０％）を白色固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.50
(br. s., 1H) 9.06 (s, 1H) 7.85 (s, 1H) 7.51 (s, 1H) 7.04 (d, J=2.32Hz, 1H) 6.58
(ddd, J=16.78, 10.30, 1.16Hz, 1H) 6.13 (dd, J=16.81, 2.38Hz, 1H) 5.67 (dt,
J=10.33, 2.23Hz, 1H) 4.43 (d, J=6.24Hz, 2H) 3.95-4.05 (m, 1H) 3.68-3.85 (m, 4H)
3.56-3.66 (m, 2H) 3.44-3.53 (m, 1H) 3.30 (d, J=4.65Hz, 3H) 2.68-2.90 (m,
1H).  親分子C19H22ClN7O3のm/z (APCI+) 432.1 (M+H)+(Cl同位体パターンを示す).キラル純度決定：ウェルク（Ｗｈｅｌｋ）−Ｏ１（Ｒ，Ｒ）４．６×２５０ｍｍカラム  ３０％ＥｔＯＨ、１４０バール、３ｍＬ／分。Ｒｔ＝約８．８分、ピーク１、９９％超のｅｅ．旋光度：［ａ］Ｄ２２＝−３．１度（ｃ  ０．１４、ＥｔＯＨ）。元素分析：理論値：Ｃ、５２．８４；Ｈ、５．１３；Ｃｌ、８．２１；Ｎ、２２．７０。測定値：Ｃ、５２．４５；Ｈ、５．３８；Ｃｌ、７．９１；Ｎ、２２．０２。
【実施例２】
【０１６４】
Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミド（「化合物Ｂ」）の調製
【０１６５】
【化１７】
2014177456.tif 000018
ステップ１：２，４−ジクロロ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの調製
【０１６６】
【化１８】
2014177456.tif 000019
ＤＭＦ（２６６ｍＬ、１．０Ｍ）中の２，４−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、（５０．０ｇ、２６６ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、Ｎ−ヨードコハク酸イミド（６２．８ｇ、２７９ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、内部温度が５０℃未満に維持されるような速度で添加した。反応混合物を激しく撹拌し、周囲温度浴内で１．５時間冷却した。反応混合物を氷水（１．５Ｌ）で希釈し、得られた沈殿物を濾過によって単離した。沈殿物を氷水（２×５００ｍＬ）で洗浄し、４５℃の真空で３６時間乾燥させて、表題化合物（８１．５ｇ、９８％収率）をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 13.09
(br. s., 1H), 7.95 (s, 1H). C6H2Cl2IN3のm/z (APCI+) 313.9 (M+H)+.
【０１６７】
ステップ２：２，４−ジクロロ−５−ヨード−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの調製
【０１６８】
【化１９】
2014177456.tif 000020
ＴＨＦ（６００ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（８１．４ｇ、２５９ｍｍｏｌ、１．００当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１０５ｍＬ、５９６ｍｍｏｌ、２．３０当量）の冷却（０℃）溶液に、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルクロリド（５９．５ｍＬ、３３７ｍｍｏｌ、１．３０当量）を、滴下方式で５分間かけて添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌させた。その時点で、反応混合物を濾過し、濾液を真空で濃縮した。得られた濃厚な油をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２×２００ｍＬ）およびブライン（２×２００ｍＬ）で順次に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。得られた材料を、最小体積のＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、ヘプタン（２００ｍＬ）で希釈した。この溶液を濃縮して全体積１５０ｍＬとし、これにより、表題化合物の粉砕を容易にした。この混合物を濾過して表題化合物（８４．１ｇ）を得、濾液を濃縮し、ヘプタン中０〜１５％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して、追加分の表題化合物（２６．５ｇ）を提供した。これらの２部を合わせて、所望生成物（１１０．６ｇ）をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ
ppm 7.50 (s, 1H), 5.57 (s, 2H), 3.61 (t, J=8.0Hz, 2H), 0.95 (t, J=8.0Hz, 2H),
0.01 (s, 9H). C12H16Cl2IN3OSiのm/z (APCI+) 444.0 (M+H)+.
【０１６９】
ステップ３：２，４−ジクロロ−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの調製
【０１７０】
【化２０】
2014177456.tif 000021
ＴＨＦ（３５０ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−５−ヨード−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（３０．０ｇ、６８．０ｍｍｏｌ、１．００当量）の冷却（−７８℃）溶液に、ｉ−ＰｒＭｇＣｌの溶液（４７．３ｍＬ、９４．６ｍｍｏｌ、１．４０当量、１．００Ｍ  ＴＨＦ）を、滴下方式で４分間かけて添加した。反応混合物を−７８℃で２時間撹拌し、次いで、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＺｎＢｒ２（２４．７ｇ、１１０ｍｍｏｌ、１．６２当量、１３０℃で乾燥）の新たに調製した溶液で、滴下方式で１５分間かけて処理した。混合物を−７８℃でさらに１時間撹拌し、次いで周囲温度に加温し、さらに０．５時間撹拌した。この時点で、反応混合物をＰｄ（ＰＰｈ３）４（３．９４ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、０．０５当量）および２−ヨードピリジン（１０．８ｍＬ、１０１ｍｍｏｌ、１．５０当量）で処理し、６５℃に１０時間加熱した。周囲温度に冷却したら、反応混合物を濃縮して約２００ｍＬの体積とし、水（６００ｍＬ）、飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（４×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮した。得られた油を、ヘプタン中０〜３０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（２３．５ｇ、８７％収率）を油として提供し、これを静置して薄黄褐色固体に変換した。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ
ppm 8.76-8.63 (m, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.67 (d, J=7.8Hz, 1H),
7.35-7.29 (m, 1H), 5.68 (s, 2H), 3.61 (dd, J=7.6, 8.9Hz, 2H), 1.03-0.92 (m,
2H), -0.01 (s, 9H). C17H20Cl2N4OSiのm/z (APCI+) 395.1 (M+H)+.
【０１７１】
ステップ４：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロブチル）−カルバメートの調製
【０１７２】
【化２１】
2014177456.tif 000022
ＴＨＦ（１．０Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）カルバメート（６２．０ｇ、３３０ｍｍｏｌ、１．００当量）および４−ニトロ安息香酸（６０．８ｇ、３６０ｍｍｏｌ、１．１０当量）の冷却（０℃）溶液を、ＰＰｈ３（１３０ｇ、４９０ｍｏｌ、１．４８当量）およびアゾジカルボン酸ジエチル（８６．３ｇ、４９０ｍｍｏｌ、１．４８当量）で順次に処理した。添加後、反応混合物を４日間還流させ、周囲温度に冷却し、真空で濃縮した。残留物をｉ−ＰｒＯＨから結晶化させて、白色固体（６３ｇ）を得た。
【０１７３】
ＭｅＯＨ（１．０Ｌ）およびＨ２Ｏ（２００ｍＬ）中の上記で取得した４−ニトロベンゾエートエステル（６３ｇ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（５１．６ｇ、３７０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を２時間還流させ、周囲温度に冷却し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、ＥｔＯＡｃと１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液とに分配した。得られた有機層をブラインで洗浄し、濃縮して、白色固体（３１．０ｇ）を生じさせた。
【０１７４】
ピリジン（１．０Ｌ）中の上記で取得したアルコール（７５．０ｇ、４００ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＴＢＳＣｌ（９１．０ｇ、６００ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加した。反応混合物を周囲温度で２時間撹拌し、次いで真空で濃縮した。得られた残留物を、石油エーテル中の０〜１０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１１１ｇ、９２％収率）を白色固体として提供した。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.13
(d, 1H) 4.38-4.47 (m, 1H) 3.90 (br. s., 1H) 2.00-2.16 (m, 4H) 1.36 (s, 9H)
0.81-0.89 (m, 9H) -0.01-0.01 (m, 6H).  C10H23NOSiのm/z (APCI+) 202.1 (M-Boc+H)+.
【０１７５】
ステップ５：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロブチル）−メチルカルバメートの調製
【０１７６】
【化２２】
2014177456.tif 000023
ＴＨＦ（１．０Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロブチル）カルバメート（１１１ｇ、３７０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＮａＨ（油中６０％分散、２２．２ｇ、５５０ｍｍｏｌ、１．５０当量）を小分けにして添加した。添加後、反応混合物をさらに０．５時間撹拌し、冷却し（０℃）、ヨウ化メチル（３８．２ｍＬ、６１５ｍｍｏｌ、１．６６当量）で滴下方式で処理した。周囲温度でさらに５時間後、反応混合物を真空で濃縮し、得られた残留物を、石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（９７．５ｇ、８４％収率）を油として提供した。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 4.64
(br. s., 1H) 4.29-4.37 (m, 1H) 2.73 (s, 3H) 2.31-2.43 (m, 2H) 1.97-2.08 (m, 2H)
1.37 (s, 9H) 0.86 (s, 9H) -0.01-0.05 (m, 6H). C11H25NOSiのm/z (APCI+) 216.2 (M-Boc+H)+.
【０１７７】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０１７８】
【化２３】
2014177456.tif 000024
ＴＨＦ（１．０Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロブチル）−メチルカルバメート（１９５ｇ、６００ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＴＢＡＦ（９３０ｍＬ、９３０ｍｍｏｌ、１．５５当量、ＴＨＦ中１Ｍ）を添加した。反応混合物を周囲温度で３時間撹拌し、次いで真空で濃縮した。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５００ｍＬ）とに分配した。得られた有機層を真空で濃縮し、得られた残留物を、石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（８８ｇ、７６％収率）を白色固体として提供した。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ
ppm 4.78 (s, 1H), 4.41-4.38 (m, 1H), 2.82 (s, 3H), 2.41-2.38 (m, 2H), 2.23-2.20
(m, 2H), 1.47(s, 9H). C10H18NO3のm/z (ESI+) 146.1 (M-tBu+H)+.
【０１７９】
ステップ７：ｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ］シクロブチル｝カルバメートの調製
【０１８０】
【化２４】
2014177456.tif 000025
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメート（１２．９ｇ、６４．０ｍｍｏｌ、１．１５当量）の冷却溶液に、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（１２．４ｇ、６２．３ｍｍｏｌ、１．１２当量）を３回に分けて添加した。添加後、アルコキシド溶液を周囲温度に０．５時間かけて加温させた。別個のフラスコに、２，４−ジクロロ−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２２．０ｇ、５５．６ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＴＨＦ（３００ｍＬ）を投入し、冷却した（０℃）。この溶液を、カニューレによって５分間かけてアルコキシド溶液で処理し、次いで、０℃でさらに０．５時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ブライン（１００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（４×２００ｍＬ）で抽出した。次いで、合わせた有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮した。得られた粘性油（３１．０ｇ）をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０１８１】
１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）中の上記で取得した油（３１．０ｇ）の溶液に、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン（７．５７ｇ、７７．９ｍｍｏｌ、１．４０当量）、Ｐｄ２ｄｂａ３（２．６８ｇ、２．７８ｍｍｏｌ、０．０５当量）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（３．２５ｇ、５．５６ｍｍｏｌ、０．１０当量）およびＣｓ２ＣＯ３（４５．８ｇ、１３９ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。次いで、反応混合物を窒素ガス流で２０分間スパージし、激しく撹拌しながら１０５℃で１０時間加熱した。周囲温度に冷却したら、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、セライトに通して濾過し、真空で濃縮した。得られた残留物を、ヘプタン中０〜８０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（２５．６ｇ、７４％収率）を橙色泡状物として提供した。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.17
(s, 1H), 8.56 (d, J=4.3Hz, 1H), 8.14 (d, J=7.9Hz, 1H), 7.93 (br. s., 1H),
7.87-7.79 (m, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.23 (dd, J=5.0, 7.2Hz, 1H),
5.57 (br. s., 2H), 5.47 (br. s., 1H), 4.84-4.66 (m, 1H), 3.82 (s, 3H),
3.63-3.53 (m, 2H), 2.84 (s, 3H), 2.75-2.62 (m, 2H), 2.47-2.34 (m, 2H), 1.38 (s,
9H), 0.86 (t, J=8.0Hz, 2H), -0.11 (s, 9H). C31H44N8O4Siのm/z (APCI+) 621.3 (M +H)+.
【０１８２】
ステップ８：３−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−｛ｔｒａｎｓ−３−［（２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ］シクロブチル｝プロパンアミドの調製
【０１８３】
【化２５】
2014177456.tif 000026
ＭｅＣＮ（６００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ］シクロブチル｝カルバメート（２５．０ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１．００当量）の冷却（０℃）溶液に、ＴＦＡ（７０．０ｍＬ、９１４ｍｍｏｌ、２２．７当量）を滴下方式で添加した。反応混合物を０℃で撹拌し、次いで周囲温度に終夜加温させた。次いで、反応混合物を冷却し（０℃）、ＮａＯＨ水溶液でｐＨ＝８に調整し、相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮した。得られた残留物を、ＤＣＭ中２〜７％ＭｅＯＨの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって部分的に精製して、４−｛［ｔｒａｎｓ−３−（メチルアミノ）シクロブチル］オキシ｝−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−ピリジン−２−イル−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミンを黄色ガム状物として提供し、これを次のステップにおいて直接使用した。
【０１８４】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の４−｛［ｔｒａｎｓ−３−（メチルアミノ）シクロブチル］オキシ｝−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−ピリジン−２−イル−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−アミンおよびＤＩＰＥＡ（１６．０ｍＬ、９１．９ｍｍｏｌ、１．６１当量）の溶液に、３−クロロプロピオニルクロリド（８．２５ｍＬ、８６．４ｍｍｏｌ、１．５１当量）を滴下方式で添加し、次いで周囲温度で１時間撹拌した。次いで、反応混合物をＨ２Ｏ（２×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮した。得られたガム状物をＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）とともに粉砕し、固体を濾過し、真空で乾燥させて、表題化合物（２４．０ｇ、６８．９％収率）を黄色固体として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm
9.10-9.25 (m, 1H) 8.51-8.61 (m, 1H) 8.10-8.25 (m, 1H) 7.92-8.05 (m, 1H)
7.82-7.91 (m, 1H) 7.67-7.76 (m, 1H) 7.47-7.60 (m, 1H) 7.17-7.30 (m, 1H)
5.55-5.64 (m, 2H) 5.40-5.54 (m, 1H) 4.63-5.31 (m, 1H) 3.83 (s, 3H) 3.74-3.81
(m, 2H) 3.53-3.66 (m, 2H) 2.92-3.08 (m, 3H) 2.81-2.89 (m, 2H) 2.58-2.79 (m, 2H)
2.29-2.46 (m, 2H) 0.75-0.93 (m, 2H) -0.10 (s, 9H). C29H39ClN8O3Siのm/z (APCI+) 611.2 (M +H)+.
【０１８５】
ステップ９：Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロプ−２−エンアミドの調製
【０１８６】
【化２６】
2014177456.tif 000027
ＤＣＭ／ｉＰｒＯＨ（９：１、２５０ｍＬ）中の３−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−｛ｔｒａｎｓ−３−［（２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−（ピリジン−２−イル）−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）オキシ］シクロブチル｝プロパンアミド（２４．０ｇ、３９．２ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＨＣｌ溶液（２５０ｍＬ、１，４−ジオキサン中４Ｍ）を添加した。反応混合物を周囲温度で終夜撹拌し、真空で濃縮して、３−クロロ−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛７−（ヒドロキシメチル）−２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−ピリジン−２−イル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロパンアミドを生じさせ、これを精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０１８７】
前ステップからの中間体を、１，４−ジオキサン（８０ｍＬ）および濃ＮＨ４ＯＨ水溶液（５０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を周囲温度で３時間撹拌し、次いで真空で濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）とともに粉砕し、固体を濾過し、真空で乾燥させて、３−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−ピリジン−２−イル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロパンアミドを黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０１８８】
ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）中の３−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−ピリジン−２−イル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）シクロブチル］プロパンアミドの溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２１．４ｇ、１５５ｍｍｏｌ、３．９５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。反応混合物を濾過して無機塩を除去し、真空で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解した。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を添加して粗生成物を沈殿させ、これを濾過によって収集した。濾液を濃縮し、ＤＣＭ中２〜７％ＭｅＯＨの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、追加分の粗生成物を提供した。合わせた粗材料を、Ｈ２Ｏ中５％ＭｅＣＮ（０．２２５％ＨＣＯＯＨ）からＨ２Ｏ中２５％ＭｅＣＮ（０．２２５％ＨＣＯＯＨ）の勾配で溶離するＹＭＣ−アクタストライアートＣ１８（１５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍ）カラムを使用する逆相クロマトグラフィーによって精製して、表題化合物のギ酸塩（３ステップにわたって７．１４ｇ、３７％）を黄色固体として得た。
【０１８９】
Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）中の表題化合物のギ酸塩（５．１４ｇ）の溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を順次に添加した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（８×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空で濃縮して、表題化合物を非晶質固体として得た。この非晶質固体の一部（約３ｇ）を最小体積のＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃ（約１：１、約１２０ｍＬ）に溶解し、真空で濃縮して約１０ｍＬの体積とし、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈した。この溶液を約５ｍｇの結晶性生成物とともに播種し、周囲温度で終夜撹拌させた。結晶化フラスコを１時間冷却（０℃）して、さらなる結晶化を促進した。生成物を濾過によって収集し、真空で乾燥させて、表題化合物（２．６３ｇ）を、ＥｔＯＡｃ（０．０３８当量）およびＥｔＯＨ（０．０３当量）を含有する白色結晶性材料として得た。融点＝２０４．９℃。1H NMR
(400MHz, DMSO-d6, 30℃) δ ppm 11.65 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.54 (d, J=3.9Hz,
1H), 8.14 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.82 (t, J=7.3Hz, 1H), 7.53 (s, 1H),
7.52 (s, 1H), 7.20 (ddd, J=1.0, 4.9, 7.4Hz, 1H), 6.71 (br. s., 1H), 6.08 (br.
s., 1H), 5.66 (br. s., 1H), 5.53 (br. s., 1H), 5.31-4.79 (m, 1H), 3.82 (s, 3H),
3.15-2.93 (m, 3H), 2.76 (br. s., 2H), 2.46 (br. s., 2H). 1H NMR
(400MHz, DMSO-d6, 80℃) δ ppm 11.41 (br. s., 1H), 8.59 (s, 1H), 8.55-8.52 (m,
1H), 8.13 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.80 (dt, J=1.9, 7.7Hz, 1H), 7.55 (s,
1H), 7.50 (s, 1H), 7.18 (ddd, J=1.0, 4.8, 7.4Hz, 1H), 6.66 (dd, J=10.6, 16.8Hz,
1H), 6.05 (dd, J=2.3, 16.8Hz, 1H), 5.63 (dd, J=2.3, 10.5Hz, 1H), 5.59-5.53 (m,
1H), 5.00 (t, J=8.0Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 2.82-2.71 (m, 2H),
2.55-2.45 (m, 2H). C23H24N8O2のm/z (APCI+) 445.2 (M +H)+.元素分析：測定値Ｃ、６１．９６；Ｈ、５．５０；Ｎ、２４．９３。Ｃ２３Ｈ２４Ｎ８Ｏ２＋０．０３８ＥｔＯＡｃ＋０．０３０当量のＥｔＯＨは、Ｃ、６２．０６；Ｈ、５．４９；Ｎ、２４．９５を必要とする。
【実施例３】
【０１９０】
Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミド（「化合物Ｃ」）
【０１９１】
【化２７】
2014177456.tif 000028
ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメートの調製
【０１９２】
【化２８】
2014177456.tif 000029
ピリジン（１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）カルバメート（１０．５ｇ、５６ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＴＢＳＣｌ（１２．７ｇ、８４ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加した。添加後、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝３／１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗製のｔｅｒｔ−ブチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメートを油として得、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１９３】
粗製のｔｅｒｔ−ブチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメートをＴＨＦ（３００ｍＬ）中で希釈し、小分けにしてＮａＨ（６０％、３．３６ｇ、８４ｍｍｏｌ、１．５０当量）で処理し、室温で３０分間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、ヨウ化メチル（２３．９ｇ、１６８ｍｍｏｌ、３．０当量）で滴下方式で処理した。添加後、反応混合物を周囲温度で５時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）によって精製して、表題化合物（１８ｇ、１００％）を油として得た。
【０１９４】
ステップ２：ｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０１９５】
【化２９】
2014177456.tif 000030
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメート（１８ｇ、５６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＴＢＡＦ（２２．０ｇ、８４ｍｍｏｌ、１．５０当量）を小分けにして添加した。添加後、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝２：１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝２：１）によって精製して、表題化合物（８．９ｇ、７９％収率）を白色固体として生じさせた。
【０１９６】
ステップ３：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アミノシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０１９７】
【化３０】
2014177456.tif 000031
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメート（１８．０ｇ、０．０８９ｍｏｌ、１．０当量）およびトリエチルアミン（３７ｍＬ、０．２６７ｍｏｌ、３．０当量）の激しく撹拌した冷却（−３０℃）溶液に、ＭｓＣｌ（１４．１ｇ、０．１２３ｍｏｌ、１．３８当量）を滴下方式で３０分間かけて添加した。次いで、反応混合物を周囲温度に加温させ、１時間撹拌した。反応混合物を水（１００ｍＬ）およびＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈した。有機相を分離し、水（２×１００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、粗製のｃｉｓ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］シクロブチルメタンスルホネートを黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０１９８】
上記で取得した粗製のｃｉｓ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］シクロブチルメタンスルホネートをＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解し、ＮａＮ３（２８．７７ｇ、０．４４ｍｏｌ、５当量）で処理した。次いで、得られた混合物を７０℃に加熱し、終夜撹拌した。冷却した後、水（１５００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を反応混合物に添加した。相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１００ｍＬ）、水（２×２００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、粗製のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アジドシクロブチル）メチルカルバメートを得、これを次のステップにおいて直接使用した。
【０１９９】
水素雰囲気下、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中の上記の粗製のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アジドシクロブチル）メチルカルバメートおよびＰｄ／Ｃ（２．５ｇ）の混合物に、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中の飽和ＮＨ３をシリンジによって添加した。得られた混合物を周囲温度で３６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。この粗材料を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテル  １／１０から１／１までを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（３ステップにわたって１３．６ｇ、７６．４％収率）を黄色液体として生じさせた。
【０２００】
ステップ４：２，４，５−トリクロロ−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの調製
【０２０１】
【化３１】
2014177456.tif 000032
ＤＭＦ（１８００ｍＬ）中の、実施例２、ステップ１において調製された通りの２，４−ジクロロ−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１００．０ｇ、３１６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、Ｎ−クロロコハク酸イミド（４４．５ｇ、３３２ｍｍｏｌ、１．０５当量）を周囲温度で添加した。次いで、得られた混合物を８０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を周囲温度に冷却し、氷水（３Ｌ）に注ぎ入れた。形成された白色沈殿物を収集し、真空で乾燥させて、表題化合物（９９．７ｇ、９０％収率）を灰色固体として得た。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ
ppm =7.35 (s, 1H), 5.58 (s, 2H), 3.60-3.49 (m, 2H), 1.00-0.89 (m, 2H), -0.02
(s, 9H). C12H16Cl3N3OSiのm/z (APCI+) 352.0 (M+H)+.
【０２０２】
ステップ５：１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミンの調製
【０２０３】
【化３２】
2014177456.tif 000033
ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中の１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン塩酸塩（８００ｍｇ）の溶液を、ヒドロキシド樹脂（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ２樹脂、カタログ番号１４３−１２５５）で、ｐＨ約８が取得されるまで処理した。混合物を１５分間撹拌した。樹脂を濾過除去し、数回に分けてＭｅＯＨで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、表題化合物（６１５．３ｍｇ、９４％収率）を得た。この材料をさらに精製することなく使用した。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm =6.89
(s, 1H) 3.57 (s, 3H) 3.54 (br. s., 2H) 1.96 (s, 3H). C5H9N3のm/z (APCI+) 112.1 (M+H)+.
【０２０４】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（２，５−ジクロロ−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロブチル｝メチルカルバメートの調製
【０２０５】
【化３３】
2014177456.tif 000034
ＭｅＣＮ（２１．０ｍＬ、０．２Ｍ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アミノシクロブチル）メチルカルバメート（１０２０ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ、１．２当量）、２，４，５−トリクロロ−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１５００ｍｇ、４．２５３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２．１２ｍＬ、１２．８ｍｍｏｌ、３．０当量）の混合物を、８０℃で５．５時間加熱した。反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中１０から３０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、表題（ｔｉｌｅ）化合物（２．２２ｇ、１００％収率）を透明ガム状物として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm =7.54
(s, 1H) 7.05 (d, J=5.99Hz, 1H) 5.40 (s, 2H) 4.74 (br. s., 1H) 4.41-4.54 (m, 1H)
3.45-3.54 (m, 2H) 2.83 (s, 3H) 2.52-2.63 (m, 2H) 2.28-2.42 (m, 2H) 1.40 (s, 9H)
0.78-0.89 (m, 2H) -0.08 (s, 9H). C22H35Cl2N5O3Siのm/z (APCI+) 516.2 (M+H)+.
【０２０６】
ステップ７：ｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロブチル｝メチルカルバメートの調製
【０２０７】
【化３４】
2014177456.tif 000035
１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン（５６７ｍｇ、５．１０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（２，５−ジクロロ−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロブチル｝メチルカルバメート（２１９７ｍｇ、４．２５３ｍｍｏｌ、１．００当量）を含有するフラスコに、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（３９３ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ、０．１当量）、キサントホス（２５９ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＣｓ２ＣＯ３（４１６０ｍｇ、１２．８ｍｍｏｌ、３．０当量）を投入した。１，４−ジオキサン（４２ｍＬ、０．１Ｍ）を添加し、混合物を１０５℃に１８時間加熱した。反応物を室温に冷却し、セライトのパッドに通して濾過した。濾液を濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中４０〜６０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、表題化合物（１９５０ｍｇ、７８％収率）を泡状物として得た。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm =8.03
(s, 1H) 7.87 (s, 1H) 7.10 (s, 1H) 6.33 (d, J=6.24Hz, 1H) 5.35 (s, 2H) 4.67 (br.
s., 1H) 4.55 (br. s., 1H) 3.68-3.75 (m, 3H) 3.45-3.53 (m, 2H) 2.85 (s, 3H)
2.52-2.60 (m, 2H) 2.29-2.38 (m, 2H) 2.12 (s, 3H) 1.40 (s, 9H) 0.78-0.88 (m, 2H)
-0.10 (s, 9H). C27H43ClN8O3Siのm/z (APCI+) 591.3 (M+H)+.
【０２０８】
ステップ８：Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−（｛５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝アミノ）シクロブチル］−Ｎ−メチルプロプ−２−エンアミドの調製
【０２０９】
【化３５】
2014177456.tif 000036
ＤＣＭ（４２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−３−［（５−クロロ−２−［（１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］シクロブチル｝メチルカルバメート（１９５０ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１．０当量）の冷却（０℃）溶液に、ＴＦＡ（３１ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温にさせて、さらに１６時間撹拌した。次いで、反応混合物をトルエン（３０ｍＬ）で希釈し、濃縮乾固した。得られた粗残留物を、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）および濃ＮＨ４ＯＨ水溶液（２０ｍＬ）に溶解し、周囲温度で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を蒸発乾固した。得られた粗固体を、ＥｔＯＡｃ（１４０ｍＬ）と飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１４０ｍＬ）とに分配し、激しく撹拌しながら塩化アクリロイル（０．４２０ｍＬ、５．１９ｍｍｏｌ、１．５８当量）で１時間処理した。この時点で、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、トルエン（３０ｍＬ）で希釈し、蒸発乾固した。得られた固体を、２０〜４０％ＥｔＯＨを４％／分、１４０バール、５５ｍＬ／分で用いるＺｙｍｏｒＳｐｈｅｒ  ＨＡＰ  １５０×２１．２ｍｍカラムを使用するＳＦＣによって精製して、表題化合物（９５０ｍｇ、６９％収率）を灰色粉末として生じさせた。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 26℃) δ ppm
=11.16 (br. s., 1H), 7.80 (br. s., 1H), 7.77 (s, 1H), 6.88 (d, J=2.4Hz, 1H),
6.74 (dd, J=10.5, 16.7Hz, 1H), 6.32 (br. s., 1H), 6.07 (d, J=15.9Hz, 1H), 5.66
(d, J=10.4Hz, 1H), 5.30-4.75 (m, 1H), 4.59 (br. s., 1H), 3.71 (s, 3H),
3.15-2.88 (m, 3H), 2.62 (br. s., 2H), 2.40 (br. s., 2H), 2.08 (s, 3H). 1H
NMR (400MHz, DMSO-d6, 80℃) δ ppm =10.93 (br. s., 1H), 7.73 (s, 1H), 7.41 (br.
s., 1H), 6.82 (d, J=2.2Hz, 1H), 6.68 (dd, J=10.5, 16.9Hz, 1H), 6.16 (d,
J=5.9Hz, 1H), 6.05 (dd, J=2.4, 16.8Hz, 1H), 5.63 (dd, J=2.4, 10.5Hz, 1H), 4.94
(t, J=8.0Hz, 1H), 4.60 (dd, J=4.0, 8.7Hz, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.04 (s, 3H),
2.72-2.57 (m, 2H), 2.41 (ddd, J=4.5, 8.9, 13.6Hz, 2H), 2.10 (s, 3H). C19H23ClN8O3のm/z (APCI+) 415.1 (M+H)+.
【実施例４】
【０２１０】
１−｛（３Ｒ，４Ｒ）−３−［（｛５−クロロ−２−［（３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル｝オキシ）メチル］−４−メトキシピロリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン（「化合物Ｄ」）の調製
【０２１１】
【化３６】
2014177456.tif 000037
１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミンを３−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミンおよび他の重大でない代用品で代用し、実施例１に類似する方式で調製した。
【０２１２】
重要中間体のための実験手順
調製１．  ｔｅｒｔ−ブチル−３−（ヒドロキシメチル）−４−（メトキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０２１３】
【化３７】
2014177456.tif 000038
ステップ１：エチル（２Ｅ）−４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝ブタ−２−エノエートの調製
【０２１４】
【化３８】
2014177456.tif 000039
ＤＩＥＡ（２．７５ｍＬ、１６．６ｍｍｏｌ）およびＬｉＣｌ（５．５４ｇ、１２９ｍｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ（４０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシアセトアルデヒド（３．２２ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）およびジエチルホスホノ酢酸メチル（４．６６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を水（５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を無色油（３．２７ｇ、７２％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 6.91 (dt, J=15.42, 3.49Hz, 1H) 6.01 (dt, J=15.61, 2.27Hz,
1H) 4.25 (dd, J=3.27, 2.27Hz, 2H) 4.12 (q, J=7.22Hz, 2H) 1.21 (t, J=7.18Hz, 3H)
0.84 (s, 9H) 0.00 (s, 6H).
【０２１５】
ステップ２：ｔｒａｎｓ−エチル−１−ベンジル−４−（｛［ｔｅｒｔブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−３−カルボキシレートの調製
【０２１６】
【化３９】
2014177456.tif 000040
ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のエチル（２Ｅ）−４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝ブタ−２−エノエート（３．２７ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）およびＮ−ベンジル−１−メトキシ−Ｎ−（（トリメチルシリル）メチル）メタンアミン（４．１４ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．２８０ｍＬ、３．６４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応物を室温で終夜撹拌した。混合物を水（５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を淡黄色油（２．６１ｇ、５３％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 7.08-7.41 (m, 5H), 4.10 (q, J = 7.13Hz, 2H), 3.42-3.73 (m,
4H), 2.37-2.90 (m, 6H), 1.22 (t, J = 7.05Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.00 (d, J =
1.26Hz, 6H).
【０２１７】
ステップ３：ｔｒａｎｓ−１−ｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−１，３−ジカルボキシレートの調製
【０２１８】
【化４０】
2014177456.tif 000041
ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中のｔｒａｎｓ−エチル−１−ベンジル−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−３−カルボキシレート（トランス混合物）（３．２５ｇ、８．６１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２（３００ｍｇ）およびＢｏｃ２Ｏ（１．９０ｇ、８．６１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＨ２（５０ｐｓｉ、５０℃）下で終夜撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、濾液を濃縮した。残留物を、５％〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を無色油（３．０８ｇ、９２％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 4.13-4.25 (m, 2H) 3.65 (m, 5H) 3.14-3.29 (m, 1H) 2.84-3.00
(m, 1H) 2.47-2.70 (m, 1H) 1.46 (s, 9H) 1.27 (td, J=7.11, 2.64Hz, 3H) 0.85-0.92
(m, 9H) 0.05 (s, 6H).
【０２１９】
ステップ４：ｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０２２０】
【化４１】
2014177456.tif 000042
ＬｉＢＨ４（９１１ｍｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のｔｒａｎｓ−１−ｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）ピロリジン−１，３−ジカルボキシレート（３．０８ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を３時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、次いで水（１５ｍＬ）でクエンチし、室温で１時間撹拌した。混合物を水（６０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×８０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮して、無色油を得た。粗生成物を、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を無色油（２．３４ｇ、８６％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 3.73 (m, 1H), 3.61 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.45 (m, 1H),
2.90-3.09 (m, 2H), 2.04-2.32 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.10 (d, J =
1.01Hz, 6H).
【０２２１】
ステップ５：ｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−４−（メトキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０２２２】
【化４２】
2014177456.tif 000043
テトラブチルアンモニウムヨージド（０．１１０ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、５０％ＮａＯＨ水溶液（２０ｍＬ）および硫酸ジメチル（０．３２５ｍＬ、３．４１ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（０．９８２ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を室温で終夜撹拌した。ＴＬＣはいくらかの出発材料が残っていることを示したため、追加の硫酸ジメチル（０．１５０ｍＬ）を反応混合物に添加し、室温で３時間撹拌した。ＮＨ３ＯＨ水溶液（３０ｍＬ）を反応混合物に添加し、室温で１時間撹拌した。混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物を、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を無色油（４５１ｍｇ、４４％収率）として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ ppm 3.60-3.70 (m, 1H), 3.55 (br. s., 2H), 3.37-3.48 (m, 1H),
3.34 (m, 4H), 3.05-3.23 (m, 2H), 2.22-2.40 (m, 1H), 2.07-2.21 (m, 1H),
1.43-1.49 (m, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H).
【０２２３】
ステップ６：ｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（ヒドロキシメチル）−４−（メトキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレートの調製
【０２２４】
【化４３】
2014177456.tif 000044
ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、２．４５ｍＬ、２．４５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−４−（メトキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２９０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を精製することなく後続ステップにおいて使用した。
【０２２５】
調製２．  ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アミノシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０２２６】
【化４４】
2014177456.tif 000045
ステップ１：３−メチリデンシクロブタンカルボン酸の調製
【０２２７】
【化４５】
2014177456.tif 000046
エタノール（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）中の３−メチリデンシクロブタンカルボニトリル（１１０ｇ、１．１８ｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム（２６４ｇ、４．７ｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を終夜還流させた。エタノールを減圧下で除去し、次いで溶液を１０℃未満に冷却し、濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性化した。混合物をＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、化合物表題化合物（１３２ｇ、１００％収率）を黄色油として生じさせた。
【０２２８】
ステップ２：ｔｅｒｔ−ブチル（３−メチリデンシクロブチル）カルバメートの調製
【０２２９】
【化４６】
2014177456.tif 000047
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１Ｌ）中の３−メチリデンシクロブタンカルボン酸（１３２ｇ、１．１７ｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１７８ｇ、１．７６ｍｏｌ）の溶液に、ＤＰＰＡ（５７４ｇ、１．４１ｍｏｌ）を滴下添加し、得られた混合物を終夜還流させた。次いで、混合物を水（１００ｍＬ）でクエンチした。ｔｅｒｔ−ブチルアルコールの除去後、残留物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）で処理し、得られた固体沈殿物を収集し、飽和ＮＨ４Ｃｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄して、表題化合物（１６５ｇ、７７％収率）を白色固体として得た。
【０２３０】
ステップ３：ｔｅｒｔ−ブチル（３−オキソシクロブチル）カルバメートの調製
【０２３１】
【化４７】
2014177456.tif 000048
ＣＨ２Ｃｌ２（１０００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−メチリデンシクロブチル）カルバメート（１６５ｇ、０．９１ｍｏｌ）の溶液に、Ｏ３を−７８℃で、溶液が青色になるまで吹き込んで発泡させた。ＴＬＣ（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。次いで、窒素ガスを反応物に吹き込んで発泡させて、過剰なＯ３を除去し、その後、混合物をＭｅ２Ｓ（２００ｍＬ）でクエンチし、１時間撹拌した。溶液を濃縮して残留物を得、これを飽和ＮａＨＣＯ３および水で洗浄して、表題化合物（１１８ｇ、７０％収率）を白色固体として得た。
【０２３２】
ステップ４：ｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）カルバメートの調製
【０２３３】
【化４８】
2014177456.tif 000049
−７２℃のＴＨＦ（２０００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−オキソシクロブチル）カルバメート（１００ｇ、５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中のリチウムトリｓｅｃ−ブチルヒドリドボレート（６４８ｍＬ、１Ｍ）の溶液を１．５時間かけて滴下添加した。得られた溶液を室温まで加温させ、もう１時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝２：１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。反応物をＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした。水（１０００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（２０００ｍＬ）を混合物に添加した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗材料を得、これを、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ  １０：１から１：２までを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（６２ｇ、６１％収率）を白色固体として生じさせた。
【０２３４】
ステップ５：ｔｅｒｔ−ブチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメートの調製
【０２３５】
【化４９】
2014177456.tif 000050
ピリジン（１Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）カルバメート（６２ｇ、０．３３ｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＳＣｌ（１５９ｇ、１．０５６ｍｏｌ）を添加した。添加後、混合物を周囲温度で終夜撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝２：１）は、出発材料が完全に消費されたことを示した。次いで、反応物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で希釈し、有機層を分離し、水（３×３００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固して粗表題化合物（１０８ｇ）を得、これをさらに精製することなく次のステップに直接使用した。
【０２３６】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメートの調製
【０２３７】
【化５０】
2014177456.tif 000051
ＴＨＦ（１Ｌ）中の粗製のｔｅｒｔ−ブチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメート（１０８ｇ）の溶液に、ＮａＨ（油中６０％、３９．６ｇ、０．９９ｍｏｌ）を小分けにして添加し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、混合物を０℃に冷却し、ヨードメタン（１４０．５８ｇ、０．９９ｍｏｌ）を滴下添加した。添加後、混合物を０℃から室温までで終夜撹拌した。混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、水を添加し（２００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで蒸発させて粗生成物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（６８．９ｇ、８７％収率）を油として得た。
【０２３８】
ステップ７：ｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０２３９】
【化５１】
2014177456.tif 000052
ピリジン（８００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルメチル｛ｃｉｓ−３−［１−メチル−１−（トリメチルシリル）エトキシ］シクロブチル｝カルバメート（６８．９ｇ、０．２１７ｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（６２ｇ、０．２４ｍｏｌ）を小分けにして添加した。添加後、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を蒸発乾固し、残留物を１０００ｍＬの酢酸エチルに溶解し、濃ＮＨ４Ｃｌ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して粗生成物を得、これを、１／２０から１／５までのＥｔＯＡｃ／石油エーテルを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（２６．３ｇ、６０％収率）を白色固体として生じさせた。
【０２４０】
ステップ８：ｃｉｓ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］シクロブチルメタンスルホネートの調製
【０２４１】
【化５２】
2014177456.tif 000053
トリエチルアミン（４．１４ｍＬ、２９．７９ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｃｉｓ−３−ヒドロキシシクロブチル）メチルカルバメート（２．０ｇ、９．９３ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた混合物を、激しく撹拌しながら−３０℃に冷却した。塩化メシル（１．３６ｇ、１１．９１ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって滴下添加した。次いで、混合物を室温に加温させ、ＴＬＣ分析（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１５）が、反応が完了したことを示すまで、１時間撹拌した。次いで、反応混合物を、水（２×１０ｍＬ）、ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して表題化合物（２．５ｇ、９１％収率）を黄色固体として得、これを次のステップに直接使用した。
【０２４２】
ステップ９：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アジドシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０２４３】
【化５３】
2014177456.tif 000054
ｃｉｓ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］シクロブチルメタンスルホネート（２．５ｇ、８．９４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、ＮａＮ３（２．８４ｇ、４３．６９ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、得られた混合物を７０℃に加熱し、終夜撹拌した。冷却した後、水（１５０ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（３×２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空で濃縮して表題化合物（１．８ｇ、８９％収率）を黄色液体として得、これをさらに精製することなく使用した。
【０２４４】
ステップ１０：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アミノシクロブチル）メチルカルバメートの調製
【０２４５】
【化５４】
2014177456.tif 000055
水素雰囲気（水素バルーン）下、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−３−アジドシクロブチル）メチルカルバメート（１．８ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ（２００ｍｇ）の混合物に、ＮＨ３（ｇ）／ＭｅＯＨ（飽和、５０ｍＬ）をシリンジによって添加した。得られた混合物を室温で３時間、ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル＝１：２）が、反応が完了したことを示すまで撹拌した。Ｐｄ／Ｃを濾過除去し、得られた溶液を濃縮し、真空で乾燥させて粗表題化合物（１．６ｇ）を生じさせ、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０２４６】
【表１−１】
2014177456.tif 000056
【０２４７】
【表１−２】
2014177456.tif 000057
【０２４８】
【表１−３】
2014177456.tif 000058
【０２４９】
生物学的実施例
【実施例５】
【０２５０】
ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８  ＥＬＩＳＡアッセイ
異なるＥＧＦＲ変異状態を持つ細胞におけるＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤の効果をプロファイルするために、野生型ＥＧＦＲ変異体およびＥＧＦＲ二重変異体（Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＋Ｔ７９０Ｍ）を持つ細胞において、Ｔｙｒ１０６８におけるＥＧＦＲのリン酸化の阻害を決定した。Ｙ１０６８におけるＥＧＦＲのリン酸化は、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）リン酸−ＥＧＦ受容体（Ｔｒｙ１０６８）サンドイッチＥＬＩＳＡキット（７２４０番、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）によって測定した。ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）リン酸−ＥＧＦ受容体（Ｔｙｒ１０６８）サンドイッチＥＬＩＳＡキットは、リン酸−ＥＧＦ受容体（Ｔｙｒ１０６８）タンパク質の内因性レベルを検出する固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。下記の細胞株をこのアッセイにおいて評価した：Ａ５４９（ＥＧＦＲ野生型、内因性）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ、内因性）、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲ＿野生型、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０ＭおよびＰＣ９−ＤＲＨ（ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＋Ｔ７９０Ｍ）。ＮＩＨ／３Ｔ３親、Ａ５４９、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。すべての細胞を、ＡＴＣＣ推奨に従って培養した。Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で成長させた。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、１０％新生ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させ、ＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＲ変異細胞は、５μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた完全培地中で成長させた。ＰＣ９−ＤＲＨを、実施例６に記載のように発生させ、培養した。種々のＥＧＦＲ構築物を持つプラスミド（ｐＬＰＣＸ）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって作製し、これらの構築物を発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞の安定なプールをＰｆｉｚｅｒ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａで作製した。細胞を、透明な組織培養物で処理したマイクロタイタープレート（３５９５番、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の底面の完全培養培地（５０μＬ／ウェル）中で平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２で終夜接着させた。細胞を下記の濃度で播種した：（Ａ５４９：４０，０００／ウェル、ＮＣＩ−Ｈ１９７５：４０，０００／ウェル、ＮＩＨ３Ｔ３：２０，０００／ウェル、ＰＣ９−ＤＲＨ：５０，０００／ウェル）。翌日、化合物希釈プレートを、９６ウェル透明Ｖ底０．５ｍＬポリプロピレンブロックプレート（３９５６番、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ）内で調製した。各化合物についてすべての細胞株���評価したわけではない。評価した各化合物は、ＤＭＳＯストック溶液（１０ｍＭ）として調製した。１１点連続希釈曲線（１：３希釈）を用い、化合物を各プレートについて２連で試験した。化合物処理（５０μＬ）を、化合物希釈プレートから細胞プレートへ添加した。最高化合物濃度は１または１０μＭ（最終）であり、０．３％の最終ＤＭＳＯ（Ｄ−５８７９番、Ｓｉｇｍａ）濃度であった。次いで、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。ＮＩＨ３Ｔ３／野生型アッセイでは、化合物処理前の２４時間、細胞を血清飢餓させ、細胞を無血清培地内で記述した通りに処理し、次いで、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）で１０分間刺激した。Ａ５４９／野生型アッセイでは、化合物処理前の２４時間、細胞を完全血清（１０％）培地中で平板培養し、細胞を完全血清培地内で記述した通りに処理し、次いで、ＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ／飢餓培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０分間刺激した。インキュベーション終了の直前に、氷冷溶解緩衝液（１×細胞溶解緩衝液（９８０３番、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４、９６５０８番、Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ、５２３３２、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、完全ミニ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（１錠／１０ｍＬ、１１８３６１７０００１番、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠（１錠／１０ｍＬ、０４９０６８３７００１番、Ｒｏｃｈｅ）を純水中で調製した。２時間の終わりに、培地を払い落とし、細胞をＰＢＳ中の氷冷した１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４（１００μＬ／ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄した。次いで、洗浄液を払い落とし、氷冷溶解緩衝液を細胞に添加した（５０μＬ／ウェル）。プレートを４℃で２０〜３０分間振とうして、細胞を完全に溶解させた。試料希釈物（５０μＬ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに添加し、溶解物（５０μＬ）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェル内で試料希釈物中に希釈した。プレートを密封し、振とうしながら４℃で終夜インキュベートした。翌日、ウェルを１×洗浄緩衝液で４回洗浄し、最終洗浄後にプレートをリントフリー紙にテープで貼った後、添加検出抗体（Ａｄｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（緑色、１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを記述した通りに洗浄した。ＨＲＰ連結二次抗体（赤色、１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを記述した通りに洗浄した。ＴＭＢ基質（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１０分間または最大室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに停止溶液（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、プレートを数秒間穏やかに振とうした。４５０ｎｍにおける吸光度を、停止溶液の添加後３０分以内に、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒエン��ジョンエキサイトマルチラベルリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｅｘｃｉｔｅ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ）吸光度法で、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓスペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）３８４吸光度リーダーで読み取った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの４パラメーターフィットを使用して、データを分析した。
【０２５１】
試験された化合物についてのｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８  ＥＬＩＳＡアッセイの結果を、表２に収載する。Ｔ７９０Ｍ＿Ｌ８５８Ｒについて表２において示されているｐＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０データは、別段の指示がない限り、３Ｔ３細胞株のものである。
【０２５２】
【表２】
2014177456.tif 000059
【実施例６】
【０２５３】
ＲＰＣ９およびＰＣ９−ＤＲＨ細胞の発生および特徴付け
ステップ１：ＰＣ９細胞からのＲＰＣ９細胞の発生
親ＰＣ９細胞において、ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０変異体対立遺伝子は増幅され、野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子は検出することができなかった。ＲＰＣ９細胞の発生において、親ＰＣ９細胞を利用した。ＰＣ９細胞を、１０％の加熱不活性化したＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＥＧＦＲ阻害剤耐性細胞株を発生させるために、ＰＣ９細胞を最初に０．５ｎＭのダコミチニブで処理した。細胞が９０％の集密に成長したら、分割し、薬物濃度を２倍ずつ段階的に増大させた。そのような処理の６週間後、ＰＣ９細胞は２ｎＭのダコミチニブ中で成長することができた。単一細胞クローンを発生させ、さらなる特徴付けのために１０を選択した。それらの耐性細胞を、２μＭのエルロチニブを含有する成長培地中に維持し、耐性（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）ＰＣ９を表すＲＰＣ９と命名した。
【０２５４】
ステップ２：ＣａｓｔＰＣＲ分析
Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニキットを製造業者の推奨に準じて使用して、ゲノムＤＮＡをＲＰＣ９細胞のクローンから抽出し、ｃａｓｔＰＣＲ（プライマーセット：Ｈｓ０００００１０６＿ｗｔおよびＨｓ０００００１０５）に製造業者（ＡＢＩ）のプロトコールに準じて供した。ＡＢＩ変異検出ソフトウェアによってデータを分析した。
【０２５５】
ステップ３：細胞生存ＩＣ５０決定
ウェル当たり３０００のＲＰＣ９細胞を、９０μＬの成長培地中、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の２連のウェルに播種した。２４時間後、細胞を、ダコミチニブまたはエルロチニブにより、１０μＬの成長培地中３倍希釈の１１点滴定で処理した。最高最終濃度は１０μＭであった。処理の７２時間後、細胞を、ＣＴＧアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、製造業者の使用説明書に準じて分析した。
【０２５６】
ステップ４：ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を有するＲＰＣ９細胞の特徴付け
ステップ１において発生した１０のクローンにおいて、サンガー配列決定法は、ＥＧＦＲエクソン２０中にＣ＞Ｔ変異を同定し、これは、臨床的に意義のあるＴ７９０Ｍ変異に相当する。代表的なクローン、ＲＰＣ９クローン３およびクローン６の配列を、図１に示す。ｃａｓｔＰＣＲによるさらなる検証は、ＲＰＣ９クローン３および６中にそれぞれ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を有する１０．２％および１１．９％のＥＧＦＲ対立遺伝子があったことを示した（図１）。ＰＣ９細胞は、ダコミチニブに対して非常に感受性が高い（図２Ａ）。最低濃度（０．１７ｎＭ）のダコミチニブであっても、９６％のＰＣ９細胞生存を阻害した（図２Ａ）。ＩＣ５０は、用量応答曲線に従って算出することができなかった。ＲＰＣ９クローン３および６は、７３および６４ｎＭのＩＣ５０で、より耐性があった（図２Ａ）。ＲＰＣ９クローン３および６をエルロチニブで処理した場合、ＲＰＣ９クローン３および６は、細胞生存アッセイにおけるＰＣ９細胞と比較して、２００倍より大きいＩＣ５０の増大を示した（図２Ｂ）。
【０２５７】
このようにして、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を有しており、ダコミチニブおよびエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤に耐性があるＲＰＣ９細胞が発生した。ＲＰＣ９細胞は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子がＲＰＣ９細胞中の全ＥＧＦＲ対立遺伝子の約１０％を構成することから、単一変異体（ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０）および二重変異体（ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＴ７９０Ｍ）ＥＧＦＲ対立遺伝子の両方の混合物を含有する。
【０２５８】
ステップ５：ＰＣ９−ＤＲＨ細胞の発生および特徴付け
ＲＰＣ９細胞に加えて、ＰＣ９−ＤＲＨ細胞（ＤＲＨ＝ダコミチニブ耐性高（ｄａｃｏｍｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｉｇｈ）Ｔ７９０Ｍ）も発生させた。２ｎＭのダコミチニブに耐性のあるＲＰＣ９細胞プールに、ステップ１において記述されている通り、２ｎＭから２μＭまでの漸増濃度のダコミチニブで８週間、負荷をかけた。ＰＣ９−ＤＲＨ細胞を、ステップ１において記述されている通り、２μＭのダコミチニブを含有する成長培地中に維持した。ＰＣ９−ＤＲＨ細胞を、ステップ２、３および４において記述されている通りに分析した。ＰＣ９−ＤＲＨ細胞は、それらのＥＧＦＲ対立遺伝子の７０％を、二重変異体ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＴ７９０Ｍとして含有している。ＲＰＣ９細胞と同様に、ＰＣ９−ＤＲＨ細胞は、ダコミチニブ（ＩＣ５０＝１，６５１ｎＭ）、エルロチニブ（ＩＣ５０＞１０，０００ｎＭ）およびゲフィチニブ（ＩＣ５０＞１０，０００ｎＭ）に耐性がある。実施例５において記述されている通りのｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した場合、２μＭのダコミチニブを成長培地から除去し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用する前に細胞を３６時間成長させた。
【実施例７】
【０２５９】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を単独でまたはダコミチニブもしくはエルロチニブと組み合わせて利用するＲＰＣ９細胞生存
ウェル当たり３０００の、実施例６において調製された通りのＲＰＣ９細胞を、９０μＬの成長培地中、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の２連のウェルに播種した。２４時間後、細胞を、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃまたは化合物Ｄの１つにより、１０μＬの成長培地中４ｎＭのダコミチニブまたは３００ｎＭのエルロチニブのいずれかを加えたまたは加えていない３倍希釈の１１点滴定で処理した。最高最終濃度は、１０μＭの化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃまたは化合物Ｄであった。処理の７２時間後、細胞を、ＣＴＧアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、製造業者の使用説明書に準じて分析した。
【０２６０】
ダコミチニブおよびエルロチニブの標準臨床投与レジメンからの定常状態における遊離血漿濃度は、それぞれ４ｎＭおよび３００ｎＭである。それらの濃度において、ダコミチニブおよびエルロチニブは、親ＰＣ９細胞生存を完全に阻害した（図２Ａおよび２Ｂ）。いずれの薬物も、同じ濃度でＲＰＣ９細胞生存を著しく阻害しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０２６１】
ＲＰＣ９クローン６細胞における生存の阻害は、化合物Ａとダコミチニブまたはエルロチニブのいずれかとの組合せによって強化された（図３Ａおよび３Ｂ）。化合物Ａの生存ＩＣ５０は、４ｎＭのダコミチニブと組み合わせた場合は１７ｎＭであり、３００ｎＭのエルロチニブと組み合わせた場合は１５ｎＭであった（表３）。組み合わせた化合物Ａの生存ＩＣ５０は、化合物Ａ処理単独のものと比較して１１分の1未満に減少する。同様に、ＲＰＣ９クローン６細胞を化合物Ｂで処理した場合、ダコミチニブおよびエルロチニブもＲＰＣ９クローン６を化合物Ｂに感作した（図４Ａおよび４Ｂ）。化合物ＢのＩＣ５０は、ダコミチニブとの組合せでは４ｎＭであり、エルロチニブとの組合せでは５ｎＭであった（表３）。生存ＩＣ５０は、化合物Ｂ処理単独のものと比較して９．５分の１および７．６分の１に減少した。重要なことには、化合物Ａへの推定されるヒト暴露は１９０ｎＭであり、この濃度において、化合物Ａ単独は細胞生存を約４０％阻害した。ダコミチニブまたはエルロチニブと組み合わせた場合、同じ濃度の化合物Ａは、最大阻害（８３％）を達成した（図３Ａおよび３Ｂ）。同様に、化合物Ｂでは、推定されるヒト暴露は９０ｎＭであり、この濃度において、化合物Ｂ単独は６４％阻害を達成した。組合せは、阻害を最大８４％までさらに強化した（図４Ａおよび４Ｂ）。故に、ダコミチニブまたはエルロチニブとの組合せは、化合物Ａおよび化合物Ｂに対する生存効果を増強する。化合物Ａおよび化合物Ｂに加えて、化合物Ｃおよび化合物Ｄは、臨床的に意義のある濃度のダコミチニブおよびエルロチニブと相乗的であった（表３）。
【０２６２】
【表３】
2014177456.tif 000060
【０２６３】
結論として、それらの臨床的に意義のある濃度で使用した、ダコミチニブおよびエルロチニブ等のＥＧＦＲの単一変異型を特異的に標的とする化合物は、ＥＧＦＲの二重変異型および単一変異型の両方を有する臨床的に意義のあるモデルにおいて、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよび化合物Ｄ等のＥＧＦＲの二重変異体型を優先的に阻害する化合物を強化した。
【実施例８】
【０２６４】
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤を単独でまたはダコミチニブ、ゲフィチニブもしくはアファチニブと組み合わせて利用するＲＰＣ９クローン６細胞生存
実施例７の方法を使用して、細胞を、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤、化合物Ａまたは化合物Ｂの１つで、４ｎＭのダコミチニブ、２０ｎＭのゲフィチニブまたは２０ｎＭのアファチニブのいずれかを加えてまたは加えずに処理した。
【０２６５】
ダコミチニブの標準臨床投与レジメンからの定常状態における遊離血漿濃度は、４ｎＭである。ゲフィチニブおよびアファチニブの標準臨床投与レジメンからの定常状態における遊離血漿濃度は、２０ｎＭである。
【０２６６】
ＲＰＣ９クローン６細胞における生存の阻害は、化合物Ａとダコミチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブのいずれかとの組合せによって強化された（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）。同様に、ＲＰＣ９クローン６細胞を化合物Ｂで処理した場合、ダコミチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブもＲＰＣ９クローン６を化合物Ｂに感作した（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。故に、化合物Ａおよび化合物Ｂのそれぞれは、臨床的に意義のある濃度のダコミチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブと相乗的であった（図５および６）。実施例７における考察と同様に、化合物Ａの生存ＩＣ５０は、ゲフィチニブおよびアファチニブと組み合わせた場合、それぞれ１９分の１および１４分の１に減少した。化合物ＢのＩＣ５０は、ゲフィチニブおよびアファチニブと組み合わせた場合、それぞれ１０分の１および８分の１に減少した。
【０２６７】
結論として、それらの臨床的に意義のある濃度で使用した、ダコミチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブ等のＥＧＦＲの単一変異型を特異的に標的とする化合物は、ＥＧＦＲの二重変異型および単一変異型の両方を有する臨床的に意義のあるモデルにおいて、化合物Ａおよび化合物Ｂ等のＥＧＦＲの二重変異型を優先的に阻害する化合物を強化した。
【実施例９】
【０２６８】
対立遺伝子混合モデルにおける、ダコミチニブまたはエルロチニブと組み合わせたＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤
方法論
細胞培養：ＲＰＣ９クローン６細胞を発生させ、実施例６において記述されている通りにサブクローニングした。細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ中で培養し、選択圧下に維持した（２ｎＭのダコミチニブ）。実験のために、選択圧を除去し、細胞を１０ｃｍのシャーレに平板培養し、終夜インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）して、処理のために７０〜８０％集密を達成した。
【０２６９】
処理：ダコミチニブ、エルロチニブ、化合物Ａおよび化合物Ｂを、１００％ＤＭＳＯに溶解した。ダコミチニブ（４ｎＭ）およびエルロチニブ（３００ｎＭ）を、標準臨床投与レジメンからのそれらの遊離血漿暴露で使用した。化合物Ａおよび化合物Ｂを、標的モジュレーションＩＣ５０値未満から出発し、各化合物の予測される臨床遊離血漿暴露までの範囲でそれぞれ使用した。細胞を、ダコミチニブもしくはエルロチニブおよび／または化合物Ａもしくは化合物Ｂの滴定で、または対照（ＤＭＳＯ）で処理した。処理は６時間適用し、インキュベーション期間の終わりに、細胞ペレットを収集し、分析の準備が整うまで凍結させた。
【０２７０】
免疫ブロット法：細胞ペレットを、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％グリセロール、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．５％ＮＰ−４０）で処理した。細胞溶解物のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、製造業者の使用説明書により決定した。タンパク質（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）システム、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上に移した。関心対象のタンパク質を検出するために、一次抗体を用いてブロットを探査した。ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ  Ｙ１０６８、ＡＫＴ、ｐＡＫＴ  Ｓ４７３、ＥＲＫおよびｐＥＲＫ  Ｔ２０２／２０４抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。ＧＡＰＤＨ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。二次抗体とともにインキュベーション後、化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって膜を可視化し、デンシトメトリーをフルオロケム（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ）Ｑイメージングシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で実施した。
【０２７１】
結果
ダコミチニブおよび化合物Ａの両方で処理した細胞は、２つの最低用量において組合せ対単剤療法のより大きい効果と一致するｐＥＧＦＲシグナル伝達の減少を呈した（ダコミチニブで７７％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで２４％阻害対ダコミチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで９１％；３０ｎＭの化合物Ａで２１％阻害対ダコミチニブ＋３０ｎＭの化合物Ａで９９％）（図７Ａ、８Ａ）。これらの組合せは、最低用量においてｐＥＲＫシグナル伝達の相加的より大きい阻害（ダコミチニブで３４％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで２７％阻害対ダコミチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで１００％）および次の化合物Ａの最高用量において相加効果（ダコミチニブで３４％阻害、３０ｎＭの化合物Ａで６４％阻害対ダコミチニブ＋３０ｎＭの化合物Ａで９９％）を呈した（図７Ａ、８Ｃ）。単剤療法での用量が高くなるにつれて、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫシグナル伝達の阻害は大きくなり；相加性算出は、アッセイにおいて観察された最大阻害によって制約された。対照的に、ｐＡＫＴの阻害は、化合物Ａの最低濃度において相加的なようであった（ダコミチニブで３７％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで２２％阻害対ダコミチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで６４％）が、より高い用量であっても６０〜６５％より大きい阻害を達成しなかった（図７Ａ、８Ｂ）。
【０２７２】
エルロチニブおよび化合物Ａの両方で処理した細胞は、化合物Ａの３つの最低濃度において単剤療法の相加効果よりも大きいｐＥＧＦＲシグナル伝達の減少を呈した（エルロチニブで６１％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで４１％阻害対エルロチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで８６％阻害；３０ｎＭの化合物Ａで２７％阻害対エルロチニブ＋３０ｎＭの化合物Ａで９１％阻害；１００ｎＭの化合物Ａで１６％阻害対エルロチニブ＋１００ｎＭの化合物Ａで９５％阻害）（図７Ｂ、９Ａ）。これらの処理は、２つの最低用量においてｐＥＲＫシグナル伝達の相加的より大きい阻害を呈した（エルロチニブで３１％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで３８％阻害対エルロチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで１００％；３０ｎＭの化合物Ａで５４％阻害対エルロチニブ＋３０ｎＭの化合物Ａで１００％；図７Ｂ、９Ｃ）。単剤療法での用量が高くなるにつれて、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫシグナル伝達の阻害は大きくなり；相加性算出は、アッセイにおいて観察された最大阻害によって制約された。対照的に、ｐＡＫＴの阻害は、化合物Ａの最低濃度において相加的より大きく（エルロチニブで１８％阻害、１０ｎＭの化合物Ａで３％阻害対エルロチニブ＋１０ｎＭの化合物Ａで４８％；図７Ｂ、９Ｂ）、次の最高用量において相加的なようであった（エルロチニブで１８％阻害、３０ｎＭの化合物Ａで３１％阻害対エルロチニブ＋３０ｎＭの化合物Ａで４９％）（図７Ｂ、９Ｂ）が、より高い用量であっても５０％より大きい阻害を達成しなかった。
【０２７３】
ダコミチニブおよび化合物Ｂの両方で処理した細胞は、２つの最低用量において単剤療法の相加効果よりも大きい（ダコミチニブで５４％阻害、３ｎＭの化合物Ｂで４６％阻害対ダコミチニブ＋３ｎＭの化合物Ｂで８１％；１０ｎＭの化合物Ｂで１７％阻害対ダコミチニブ＋１０ｎＭの化合物Ｂで９０％）、および次の最高用量において相加的な（ダコミチニブで５４％阻害、３０ｎＭの化合物Ｂで３３％阻害対ダコミチニブ＋３０ｎＭの化合物Ｂで９０％）ｐＥＧＦＲシグナル伝達の減少を呈した（図１０Ａ、１１Ａ）。これらの同じ細胞は、最低用量においてｐＥＲＫシグナル伝達の相加的阻害を呈した（ダコミチニブで５７％阻害、３ｎＭの化合物Ｂで５５％阻害対ダコミチニブ＋３ｎＭの化合物Ｂで１００％）（図１０Ａ、１１Ｃ）。単剤療法での用量が高くなるにつれて、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫシグナル伝達の阻害は大きくなり；相加性算出は、アッセイにおいて観察された最大阻害によって制約された。対照的に、ｐＡＫＴの阻害は、より高い用量であっても７２％より大きい阻害を達成せず、部分的な相加的結果も相加的より大きい結果も達成しなかった（図１０Ａ、１１Ｂ）。
【０２７４】
エルロチニブおよび化合物Ｂの両方で処理した細胞は、化合物Ｂのすべての濃度において単剤療法の相加効果より大きいｐＥＧＦＲシグナル伝達の減少を呈した（エルロチニブで１２％阻害、３ｎＭの化合物Ｂで２％阻害対エルロチニブ＋３ｎＭの化合物Ｂで７４％；１０ｎＭの化合物Ｂで８％阻害対エルロチニブ＋１０ｎＭの化合物Ｂで６６％阻害；３０ｎＭの化合物Ｂで２２％阻害対エルロチニブ＋３０ｎＭの化合物Ｂで８２％；１００ｎＭの化合物Ｂで６０％阻害対エルロチニブ＋１００ｎＭの化合物Ｂで８４％）（図１０Ｂ、１２Ａ）。これらの処理は、化合物Ｂの最低用量においてｐＥＲＫシグナル伝達の相加的より大きい阻害を呈した（エルロチニブで４１％阻害、３ｎＭの化合物Ｂで３９％阻害対エルロチニブ＋３ｎＭの化合物Ｂで９９％；図１０Ｂ、１２Ｃ）。単剤療法での用量が高くなるにつれて、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫシグナル伝達の阻害は大きくなり；相加性算出は、アッセイにおいて観察された最大阻害によって制約された。対照的に、ｐＡＫＴの阻害は、化合物Ｂの最低濃度において相加的より大きいようであった（エルロチニブで２９％阻害、３ｎＭの化合物Ｂで１５％阻害対エルロチニブ＋３ｎＭの化合物Ｂで５４％）が、より高い用量であっても６２％より大きい阻害を達成しなかった（図１０Ｂ、１２Ｂ）。
【実施例１０】
【０２７５】
ＲＰＣ９クローン６（ダコミチニブおよびエルロチニブ耐性）異種移植モデルにおける、ダコミチニブまたはエルロチニブと組み合わせたＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤
背景：
ＲＰＣ９クローン６細胞は、実施例６において記述されている通りに、親ＰＣ９細胞から発生させた。親ＰＣ９細胞はＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０を含有し、ダコミチニブおよびエルロチニブの処理に対して感受性が高い。ＲＰＣ９クローン６細胞株は、ダコミチニブ（「ｄａｃｏ」）による用量段階的増大処理によって発生した、選択された耐性クローンの１つであった。ＲＰＣ９クローン６細胞は、およそ１０％のＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＴ７９０Ｍならびに９０％のＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０対立遺伝子を含有している。したがって、インビトロアッセイにおいて、ＲＰＣ９クローン６は、ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＴ７９０Ｍ対立遺伝子によりダコミチニブ／エルロチニブ単剤処理に耐性があり、ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０対立遺伝子により化合物Ａ（「Ｃｏｍｐｄ  Ａ」）および化合物Ｂ（「ｃｏｍｐｄ  Ｂ」）単剤処理にも耐性があった。化合物Ａまたは化合物Ｂと臨床的に意義のある濃度のダコミチニブまたはエルロチニブとの組合せは、ＥＧＦＲシグナル経路の相乗的阻害によって、細胞生存に対する相乗効果を発生させた。したがって、化合物Ａまたは化合物Ｂとダコミチニブまたはエルロチニブとの組合せがＲＰＣ９クローン６異種移植モデルにおいて相乗的抗腫瘍効果を発生させるか否かを評価するために、インビボ動物研究を実施した。
【０２７６】
方法：
４から６週齢のＳＣＩＤベージュ雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂから入手し、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ動物施設で加圧換気ケージ内に維持した。すべての研究は、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認された。再構成基底膜（マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１（ｖ／ｖ）で懸濁させた５×１０６のＲＰＣ９クローン６細胞を皮下注射することにより、腫瘍を確立した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）研究のために、約３００ｍｍ３の腫瘍が確立されたマウスを選択し、無作為化し、次いで、単剤としての、またはダコミチニブもしくはエルロチニブとの組合せでのＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ阻害剤で、示されている用量およびレジメンを使用して処置した。腫瘍寸法をノギスで測定し、式π／６×大きいほうの直径×（小さいほうの直径）２を使用して腫瘍体積を算出した。腫瘍成長阻害百分率（ＴＧＩ％）を、１００×（１−ΔＴ／ΔＣ）として算出した。腫瘍退縮百分率を、１００×（１−ΔＴ／出発腫瘍サイズ）として算出した。
【０２７７】
化合物Ａは、ｐＨ７．４の０．５％メトセル（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）／２０ｍＭのトリス緩衝液中の噴霧乾燥分散懸濁液に配合した。化合物Ｂは、０．５％メトセルを加えたインサイチュ乳酸塩溶液に配合した。ダコミチニブは、ｐＨ４．５の０．１Ｍ乳酸溶液に配合した。エルロチニブは、４０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）に配合した。すべての薬物を配合し、１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投薬した。担腫瘍マウスに、示されている処置を経口的に毎日投与し、体重および健康の観察を毎日記録した。
【０２７８】
結果：
研究Ｉ：化合物Ａおよびダコミチニブの組合せ
この研究において、ＲＰＣ９クローン６担腫瘍マウスを無作為化し、化合物Ａもしくはダコミチニブのいずれかの単剤、またはダコミチニブと組み合わせた化合物Ａで処置した。５ｍｇ／ｋｇのダコミチニブは、マウス血漿において４ｎＭの平均非結合薬物濃度をもたらし、これは、４５ｍｇ／ｋｇ／日の臨床用量からの平均臨床暴露に合致するものである。体重変化百分率を図１３Ｂにおいてプロットすると、この研究のすべての用量群が、１０％未満の体重減少で良好な耐容性を示すことを示していた。化合物Ａは、５００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇで、単剤としてまたは５ｍｇ／ｋｇのダコミチニブと組み合わせて、図１３Ａにおいて示されている通りに投薬した。ビヒクル群の腫瘍サイズが平均１２００ｍｍ３に達した研究３９日目、図１３Ａおよび表４において例証されている通り、ダコミチニブの単剤処置は腫瘍成長停止を発生させ、化合物Ａの単剤処置は用量依存的な腫瘍成長阻害を発生させた。すべての用量範囲の化合物Ａとダコミチニブとの組合せは、表４において例証されている通り、完全な腫瘍退縮を発生させた。
【０２７９】
腫瘍退縮に対する組合せ効果をさらに評価するために、２００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの単一および組合せ処置群のマウスに、研究６１日目まで処置を受けさせ続けた。腫瘍成長阻害および腫瘍退縮を算出し、表４において例証した。結果は、（１）化合物Ａとダコミチニブとの組合せが、両方の用量範囲において完全な腫瘍退縮を発生させたこと、（２）２００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ両方の化合物Ａの単剤処置群の腫瘍が、ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０対立遺伝子によっておそらく駆動されたインビトロ耐性を模倣する用量依存的な方式で進行したこと、ならびに（３）ダコミチニブの単一処置群の腫瘍も、このＲＰＣ９クローン６異種移植モデルにおいてＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＴ７９０Ｍ対立遺伝子によっておそらく駆動されたインビトロ耐性を模倣する方式で進行したことを示している。
【０２８０】
単剤処置および組合せ処置によるインビボ耐性を評価するために、処置期間をさらに延長した。ダコミチニブの単一処置群は進行し続け、腫瘍サイズが１２００ｍｍ３超に達した７４日目に終了した。同様に、２００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの単一処置群は進行し続け、腫瘍サイズが１４００ｍｍ３超に達した９５日目に終了した。したがって、ダコミチニブまたは化合物Ａいずれかの単一処置群の腫瘍は進行し続け、インビトロ特徴と同様のインビボ耐性を実証した。図１３Ａおよび表４において示される通り、ダコミチニブおよび５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの組合せ群は、１００％ＴＧＩを達成することができ、さらに、ダコミチニブおよび２００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの組合せは、１２０日目の研究の終わりまで腫瘍退縮を維持した。
【０２８１】
【表４】
2014177456.tif 000061
【０２８２】
研究ＩＩ：化合物Ｂおよびダコミチニブの組合せ
この研究において、ＲＰＣ９クローン６担腫瘍マウスを無作為化し、化合物Ｂもしくはダコミチニブのいずれかの単剤、またはダコミチニブとの組合せでの化合物Ｂで処置した。ダコミチニブは、５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇで投薬した。化合物Ｂは、図１４Ａにおいて示されている通り、５０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇで投薬した。体重変化百分率を図１４Ｂにおいてプロットすると、この研究のすべての用量群が、１０％未満の体重減少で良好な耐容性を示すことを示していた。ビヒクル群の腫瘍サイズが平均１０００ｍｍ３に達した研究３６日目、図１５Ａにおいて例証されている通り、ダコミチニブの単剤処置は用量依存的な腫瘍成長阻害を発生させた。図１５Ａにおいて示されている通り、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂの単剤処置は、極めて低い投薬量により著しく有効というわけではなかったのに対し、５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂの単剤処置は、４７％のＴＧＩをもたらした。化合物Ｂおよびダコミチニブの組合せは、図１５Ｂにおいて示されている通り、用量依存的な腫瘍退縮を発生させた。腫瘍成長阻害および退縮を算出し、表５において例証した。
【０２８３】
【表５】
2014177456.tif 000062
【０２８４】
研究ＩＩＩ：化合物Ａおよびエルロチニブの組合せ
この研究において、ＲＰＣ９クローン６担腫瘍マウスを無作為化し、化合物Ａまたはエルロチニブのいずれかの単剤、またはエルロチニブとの組合せでの化合物Ａで処置した。２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブは、マウス血漿において３００ｎＭの平均非結合薬物濃度をもたらし、これは、平均臨床暴露に合致するものである。体重変化百分率を図１６Ｂにおいてプロットすると、この研究のすべての用量群が、１０％未満の体重減少で良好な耐容性を示すことを示していた。化合物Ａは、４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇで、単剤としてまたは２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブと組み合わせて、図１６Ａにおいて示されている通りに投薬した。ビヒクル群の腫瘍サイズが１５００ｍｍ３超に達した研究４５日目、図１６Ａおよび表６において例証されている通り、エルロチニブの単剤処置は５１％の腫瘍成長阻害を発生させ、化合物Ａの単剤処置は用量依存的な腫瘍成長阻害を発生させた。すべての用量範囲の化合物Ａとエルロチニブとの組合せは、表６において例証されている通り、腫瘍退縮を発生させた。
【０２８５】
腫瘍退縮に対する組合せ効果をさらに評価するために、２００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの単一および組合せ処置群のマウスに、研究７３日目まで処置を受けさせ続けた。腫瘍成長阻害および腫瘍退縮を算出し、表６において例証した。ダコミチニブと組み合わせた研究Ｉの結果と同様に、この研究の結果も、化合物Ａとエルロチニブとの組合せは、両方の用量範囲において腫瘍退縮を発生させ、化合物Ａまたはエルロチニブの単剤処置群の腫瘍は進行し続けることを示し、ｄｅｌまたはｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子のいずれかによって駆動されたインビボ耐性を示す。
【０２８６】
したがって、結論として、化合物Ａとダコミチニブまたはエルロチニブのいずれかとの組合せは、耐性ＲＰＣ９クローン６異種移植モデルにおいて、腫瘍退縮を誘発する相乗的抗腫瘍活性を達成した。
【０２８７】
【表６】
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【０２８８】
結論：
ＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０およびＥＧＦＲ  ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０／Ｔ７９０Ｍ対立遺伝子の両方を有するＲＰＣ９クローン６異種移植モデルは、化合物Ａ、化合物Ｂ、ダコミチニブまたはエルロチニブで単剤処置として処置した場合、腫瘍進行を呈した。該モデルは、臨床的に意義のある用量のダコミチニブまたはエルロチニブを加えた高用量の化合物Ａで組合せ療法として処置した場合に完全な退縮を示し、ダコミチニブと組み合わせた低用量の化合物Ｂで処置した場合に用量依存的な腫瘍退縮を実証した。したがって、現在の前臨床動物研究は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ選択的阻害剤とダコミチニブまたはエルロチニブとの組合せ戦略が、原発性および後天性ＥＧＦＲ変異の両方を持つＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ臨床候補を開発するための作用機序に基づく潜在的に臨床的に変換可能な戦略であることを実証することに成功した。
【符号の説明】
【０２８９】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【外国語明細書】
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