(57)【要約】【課題】美白作用のある成分の有効性評価方法において、表皮等価物を用いることで、実際のインビボ評価のように紫外線照射による色素沈着を指標とする、目視の判定が可能なインビトロ評価方法を提供すること。【解決手段】表皮等価物としてメラノサイトおよびケラチノサイトを主成分として含む再構成表皮に紫外線を照射することで、色素沈着およびメラニン産生亢進を指標とする美白作用のある成分の有効性を評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮等価物に紫外線を照射することにより、色素沈着を指標として、美白作用のある成分の有効性を評価することを特徴とする評価方法。
【請求項２】
表皮等価物に紫外線を照射することにより、メラニン産生亢進を指標として、美白作用のある成分の有効性を評価することを特徴とする評価方法。
【請求項３】
前記表皮等価物が、メラノサイトおよびケラチノサイトを主成分として含む再構成表皮であることを特徴とする請求項１又は２に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線による色素沈着に対する美白作用のある成分の有効性を評価することを特徴とする評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
美白作用のある成分のインビボ評価は、一般的に紫外線を照射したヒト皮膚に美白作用のある成分を塗布し、色素沈着に対する抑制作用を評価して行う。しかしながら、インビボ評価は、被験者への負担や開発費用がかかることから、インビトロ評価が求められている。一方、美白作用のある成分のインビトロ評価は、標的細胞に直接物質を曝露させてその生理活性をスクリーニングして評価する。しかしながら、細胞を用いて美白作用を評価する場合、培養細胞と実際のヒト皮膚組織中の細胞では環境条件がことなり、応答性が一致するとは限らない。そこで、皮膚に吸収された美白作用のある成分が、実際に標的とする細胞まで送達されるのか、そして、送達された成分が本当に有効性を示すのかを評価する方法として、色素沈着を担うメラノサイトを含む再構成皮膚の角層あるいは培地側から美白作用のある成分あるいは美白作用のある成分を含む溶解液あるいは美白作用のある成分を配合する製剤を曝露させてその色素沈着抑制作用を評価する方法が用いられている。しかしながら、再構成皮膚を用いた評価は、その色素沈着の惹起として、紫外線ではなく、α−ＭＳＨやエンドセリンなどのメラノサイト活性化因子によるものであった。
【０００３】
ところで、実際のインビボ評価と同じ紫外線惹起による再構成皮膚の評価方法として、真皮線維芽細胞の上にメラノサイト及びケラチノサイトを培養して構築させた再構成皮膚よる紫外線応答に関する技術や、これを用いた美白剤の評価方法（特許文献１）が報告されている。しかしながら、実際のインビボ評価のように色素沈着を指標とする目視の判定が可能なものは知られていない。
【０００４】
再構成皮膚による安定かつ効率的に色素沈着を惹起させる条件を見出すには、適切な再構成表皮の選択、培地の最適化、紫外線照射波長、紫外線照射強度、紫外線照射回数、培養期間などに非常に煩雑な調整を要する。
【０００５】
したがって、メラノサイトとケラチノサイトを主成分として含む再構成表皮を用いて、インビボ評価のように色素沈着を惹起した上で、インビトロ評価のように生理活性を指標として美白作用を評価する方法は、とても有益な評価方法であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−９２１７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、美白作用のある成分の有効性評価方法において、実際のインビボ評価のように紫外線照射による色素沈着を指標とする、目視の判定が可能なインビトロ評価方法については知られていない。したがって、本発明は、美白作用のある成分の効果を簡便に測定できる評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、紫外線による色素沈着に対する美白作用のある成分の有効性を評価することによる評価方法について鋭意研究した結果、表皮等価物としてメラノサイトおよびケラチノサイトを主成分として含む再構成表皮に紫外線を照射することで、美白作用のある成分の有効性を評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に記載の評価方法を用いることにより、従来困難であった紫外線による色素沈着に対する美白作用のある成分の有効性評価を、簡便かつ迅速に測定できる。したがって、美白作用のある成分及び／又は美白作用のある成分を含む外用組成物がもつ、皮膚に対する美白効果を直接的に測定できることから、実際に皮膚に塗布して有効に作用する美白作用のある成分及び／又は美白作用のある成分を含む外用組成物の開発を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明に係わる表皮等価物は、メラノサイトおよびケラチノサイトを主成分として含む再構成表皮を用いるものである。本発明に係わる紫外線照射装置は、UVAおよびUVBからなる混合光を照射することができる装置である。
【００１２】
本発明で用いる表皮等価物としては、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ−ＲＨＰＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（ＭａｔＴｅｋ社製）、ＬａｂＣｙｔｅ  ＭＥＬＡＮＯ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）などが挙げられるが、紫外線照射に対する応答性を考慮するとＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ−ＲＨＰＥを用いるのが望ましい。なお、紫外線照射による色素沈着およびメラニン産生亢進を誘導するためには、培地中のメラノサイト活性化因子を除去する必要があるが、メラノサイト活性化因子を含まない培地を用いることで安定かつ効率的に評価することができる。
【００１３】
本発明で用いる紫外線照射装置としては、Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｒｔ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｓｏｌａｒ  Ｌｉｇｈｔ社製）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｏｒｔ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｓｏｌａｒ  Ｌｕｉｇｈｔ社製）、ＳＵＮＴＥＳＴ  ＣＰＳ＋（ＡＴＬＡＳ社製）などが挙げられる。
【００１４】
本発明に使用する美白作用のある成分としては、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、コウジ酸、アルブチン、トラネキサム酸及びその誘導体、エラグ酸、ルシノール、ハイドロキノンなどの美白剤、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、各種ビタミン類やその誘導体、ＳＯＤ、β−カロテン、カテキン、ポリフェノールなどの抗酸化剤、カフェイン、カモミラ、シソ、機能性多糖などの抗炎症剤、ベンゾフェノン系化合物、パラアミノ安息香酸化合物、ケイ皮酸系化合物などの紫外線吸収剤、酸化チタン、酸化亜鉛などの紫外線散乱剤などが挙げられる。
【００１５】
また、美白作用のある成分がより効率的に経皮吸収され、有効性がより発現される化粧品又は医薬部外品又は医薬品の剤型を検討するための方法としても利用できるため、化粧品又は医薬部外品又は医薬品の処方設計の検討に利用すると非常に効率的にそれらの開発を進めることができる。
【００１６】
美白作用のある成分の紫外線による色素沈着を指標とする測定には、紫外線を照射し、美白作用のある成分あるいは美白作用のある成分を含む溶解液あるいは美白作用のある成分を配合する製剤を適用し、これを複数回繰り返し、一定期間培養した後の表皮等価物を角層側から目視で観察する。目視判定は、インビボ評価で用いられる手法であり、黒化の程度を５段階のスコア化（絶対評価）および試験群間の相対評価により測定する。同時に美白作用のある成分の紫外線によるメラニン産生亢進を指標とする測定も行うことができる。例えば、表皮等価物を回収し、アルカリ可溶化法によりメラニン量を測定することで、紫外線によるメラニン産生亢進に対する抑制効果を評価することができる。
【００１７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
コウジ酸の美白試験
【００１９】
１．試験の概要
紫外線を照射した表皮等価物に対して、美白作用のある成分であるコウジ酸を適用し、一定期間培養した後の色素沈着の目視判定及びメラニン産生量を測定した。
【００２０】
２．実験方法
試験開始する前日に、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＰＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）をメラノサイト活性化因子を含まないＧｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）を用いて、プレインキュベーションした。ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＰＥに対して、０．３７５ＭＥＤのエネルギー量の紫外線を照射した後、角層側から５０ｍｇの試料（ＰＢＳコントロール、０．１％コウジ酸を含むＰＢＳ、０．５％コウジ酸を含むＰＢＳ）を適用した。２４時間後に試料を取り除き、再度、紫外線照射を照射し、これを4日間繰り返し、合計７日間インキュベーションした。すなわち、７日間の培養期間中にトータル１．５ＭＥＤの紫外線を４回に分けて照射した。培養後に、角層側から色素沈着の程度を目視判定した（白：１、黒：５とする５段階スコア）。さらに、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＰＥをリン酸緩衝液、トリクロロ酢酸、エタノール、ジエチルエーテルにて洗浄し、組織中のメラニンを水酸化ナトリウム水溶液にて加熱溶解することで抽出した。メラニン抽出液は、９６ウェルプレートに分注し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。同時にメラニン標準液についても測定し、検量線を用いて各サンプルのメラニン量を求めた。
【００２１】
３．結果
培養後のＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＰＥの色素沈着の様子と目視判定結果を図１に、メラニン量を図２に示した。紫外線による色素沈着の黒化スコアが増加し、コウジ酸濃度依存的に減少した。また、紫外線によってメラニン量が増加し、コウジ酸濃度依存的に減少した。
本結果より、本評価方法は、紫外線照射による色素沈着およびメラニン産生亢進を指標とする美白作用のある成分の有効性を評価できることが明らかとなった。
【表１】
2014149152.tif 000002
【表２】
2014149152.tif 000003