(57)【要約】【課題】既存の蛍光顕微鏡や蛍光マイクロプレートリーダーを利用することで、単純な光学系で操作が簡便な、高感度蛍光検出を実現できる低価格の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡および蛍光マイクロプレートリーダーを提供する。【解決手段】観測対象の試料（Ａ）を搭載するマイクロプレート（４）は、表面に周期構造を有するベース基板と、ベース基板の周期構造の上に形成された金属層と、金属層の上に形成された保護層とを備え、金属層が、表面プラズモンを発生し得る金属で形成され、マイクロプレート（４）の保護層側（７）から光（Ｌ）を入射させて表面プラズモン共鳴光を発生させるプレートであり、光（Ｌ）の入射角度が、プリズムによって屈曲されなくても、マイクロプレート（４）に入射可能な角度であり、かつ、表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度である。【選択図】図１
2014081385.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とするマイクロプレート。
【請求項２】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることを特徴とする、請求項２に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
前記周期構造が、前記一方向と交差する方向に沿って形成された複数の溝部をさらに備えることを特徴とする請求項４に記載のマイクロプレート。
【請求項６】
前記保護層の厚さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項７】
前記金属層が遷移金属の膜厚１０〜５００ｎｍの薄膜で形成されていることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項８】
前記ベース基板と前記金属層との間、および前記金属層と前記保護層との間に、それぞれ第１の接着保護層および第２の接着保護層をさらに備え、
前記第１の接着保護層および第２の接着保護層のそれぞれが膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜で形成されていることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項９】
前記金属層が銀で形成され、
前記保護層がＳｉＯ2で形成されていることを特徴とする請求項８に記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
前記保護層の厚さが２０〜５０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載のマイクロプレート。
【請求項１１】
前記金属層が金で形成され、
前記保護層の厚さが４０〜７０ｎｍであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のマイクロプレート。
【請求項１２】
前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
１５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１３】
観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記蛍光顕微鏡が、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
【請求項１４】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項１３に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
【請求項１５】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることを特徴とする、請求項１４に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
【請求項１６】
観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記蛍光マイクロプレートリーダーが、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
【請求項１７】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項１６に記載の表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
【請求項１８】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることを特徴とする、請求項１７に記載の表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
【請求項１９】
蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、マイクロプレートを用いて、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出する方法であって、
前記マイクロプレートが、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された保護層とを備え、
前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記方法が、
前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含み、
前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴とする検出方法。
【請求項２０】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることを特徴とする、請求項２０に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下ＳＰＲとも記す）によって発生する表面プラズモン共鳴光により、蛍光物質を励起して蛍光を発生させる表面プラズモン励起増強蛍光（Surface Plasmon Fluorescence）を用いた高感度蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーに関する。
【背景技術】
【０００２】
汎用のエピ蛍光（落射蛍光）顕微鏡を用いて試料の蛍光観察を行う場合、暗くて十分に見えないときや、バックグラウンドが非常に高くて（明るくて）試料が十分に見えないときには、より高感度でＳ／Ｎの高い測定が必要とされる。これまでは全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）や、高分解能を特徴とする共焦点顕微鏡を用いて観測されてきた。
【０００３】
一方、表面プラズモン共鳴顕微鏡に関して、種々の論文や特許出願（下記特許文献１〜５参照）がなされており、装置として市販もされている。しかし、特許文献１〜５に開示されている基本光学系を応用して、蛍光顕微鏡であるＳＰＦＭ（Surface Plasmon Fluorescence Microscopy）を実現することは現状では不可能である。その理由は、市販の表面プラズモン共鳴顕微鏡では、入射光学系に高屈折率対物レンズを用いており、この対物レンズの屈折率の制限によって使用可能な光の波長が近赤外領域に制限されることになり、一般的な蛍光分子の励起光として用いることができないからである。
【０００４】
これに対し、下記特許文献６、７には、プリズムを用いた光学系をもつ表面プラズモン共鳴顕微鏡からＳＰＦＭへの展開が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２４２０７１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００３−８３８８６号公報
【特許文献４】特開２００４−１１７１８１号公報
【特許文献５】特開２００６−３２８２号公報
【特許文献６】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献７】特開２００６−２０８２９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記したように、高感度・高分解能蛍光検出が可能な顕微鏡として、全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡があるが、高出力レーザー等を装備していることが多く、光学系が複雑なシステムであり、そのため操作が複雑であり、且つ高価格であるという問題がある。
【０００７】
上記した特許文献６、７に開示されたＳＰＦＭに関しても、図１０に示すクレッチマン型の配置を採用しているために光学系が複雑であり、操作が複雑である問題がある。
【０００８】
一方、蛍光を観測するための別の装置として、マイクロプレートリーダーがある。従来のマイクロプレートリーダーで蛍光検出する場合、十分な強度の蛍光を発生させるためには、高濃度でかつ微量とは言えない程度の試料を準備する必要がある問題がある。
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決すべく、単純な光学系を採用し操作が簡便であり、且つ低価格の高感度な蛍光検出を実現する表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、既存の蛍光マイクロプレートリーダーよりも高感度な表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、周期構造上に金属および保護膜を調製した基板で発生した表面プラズモンを利用することによって、プリズムを使用しない高感度の蛍光顕微鏡および蛍光マイクロプレートリーダーを実現できることを見出した。
【００１２】
即ち、本発明に係るマイクロプレートは、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートであって、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。
【００１３】
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。
【００１４】
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であることができる。
【００１５】
また、前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることができる。
【００１６】
また、前記周期構造は、前記一方向と交差する方向に沿って形成された複数の溝部をさらに備えることができる。
【００１７】
また、前記保護層の厚さは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることができる。
【００１８】
また、前記金属層は、遷移金属の膜厚１０〜５００ｎｍの薄膜で形成されていることができる。
【００１９】
また、前記ベース基板と前記金属層との間、および前記金属層と前記保護層との間に、それぞれ第１の接着保護層および第２の接着保護層をさらに備え、前記第１の接着保護層および第２接着保護層のそれぞれが膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜で形成されていることができる。
【００２０】
また、前記金属層は銀で形成され、前記保護層はＳｉＯ2で形成されることができる。
【００２１】
また、前記金属層が銀で形成される場合、前記保護層の厚さは２０〜５０ｎｍであることができる。
【００２２】
また、前記金属層が金で形成され、前記保護層の厚さが４０〜７０ｎｍであってもよい。
【００２３】
また、前記ベース基板の表面の前記周期構造は、矩形の周期構造であり、前記金属層は、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
１５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
であることが望ましい。
【００２４】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡は、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記蛍光顕微鏡が、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。
【００２５】
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。
【００２６】
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。
【００２７】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーは、観測対象の試料を搭載して、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出するためのマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記蛍光マイクロプレートリーダーが、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。
【００２８】
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。
【００２９】
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。
【００３０】
本発明に係る検出方法は、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、マイクロプレートを用いて、表面プラズモン励起による増強蛍光を検出する方法であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された保護層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記方法が、前記マイクロプレートの前記保護層側から光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記保護層側のいずれかから検出するステップとを含み、前記保護層側から入射される前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。
【００３１】
ここで、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１０度から２５度の範囲内であることができる。
【００３２】
また、前記光の入射方向と、前記保護層の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、１５度から２０度の範囲内であってもよい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、クレッチマン型のようにプリズムを使用することなく、光の入射角度を小さくすることができるので、従来の落射照明を採用した蛍光顕微鏡を使用することができる。従って、操作が簡単であり、ＮＡの小さい対物レンズを使用することができ、明るい蛍光観測が可能である。
【００３４】
また、蛍光観察において空間選択性を高くすること、即ち、マイクロプレート界面だけ（マイクロプレート表面から２００ｎｍ未満の範囲）を観測することができるので、エピ蛍光顕微鏡に比べてバックグラウンドによるノイズの影響をほとんど受けない。
【００３５】
また、マイクロプレート界面の表面プラズモン共鳴光は入射光強度の１００倍以上に増強されるので、高出力のレーザーを用いる必要がなく、ランプ光源でも既存のエピ蛍光顕微鏡よりも１００倍程度明るい蛍光を観測することができる。
【００３６】
また、ランプ光源を用いることで、適当な光学フィルターを選択することで広範囲に波長選択可能になるので、レーザーを装備した顕微鏡に比べてコンパクトであり、低価格である。
【００３７】
従来の全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡では、高出力レーザー等を装備していることが多く、また、光学系が複雑なシステムであり、操作の複雑性と高価格が問題となり、一般に広く普及することが難しい状況であったが、本発明によると、これらの問題を解決することができるので、汎用型の高感度蛍光顕微鏡として普及することが期待できる。特に、蛍光標識を行って試料を観測する医療・生物分野の普及に大きく貢献することが期待できる。
【００３８】
また、本発明を蛍光マイクロプレートリーダーに適用した場合、蛍光の増幅が期待できるため、既存のマイクロプレートリーダーでも、低濃度試料や微量試料の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡の特徴部分を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るマイクロプレートの構成を示す断面図である。
【図３】入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図である。
【図４】入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図であり、マイクロプレートが図３の状態から９０度回転されて配置されている。
【図５】２次元周期構造を示す平面図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る蛍光マイクロプレートリーダー用のマイクロプレートの構成を示す断面図および平面図である。
【図７】偏光した入射光を使用する場合におけるマイクロプレートの配置の影響を調査した結果を示す図である。
【図８】ＧＦＰ発現細胞を３種類の基板に吸着させて正立顕微鏡で蛍光を観測した結果を示す顕微鏡写真である。
【図９】ＧＦＰ発現細胞をマイクロプレートに吸着させて正立顕微鏡で格子を回転させて蛍光を観測した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１０】クレッチマン型の光学配置を示す断面図である。
【図１１】ベース基板表面の周期構造を示す断面図である。
【図１２】基板１及び基板２に関する測定結果を示すグラフである。
【図１３】スロープを有する周期構造を示す断面図である。
【図１４】シミュレーション結果を示すグラフである。
【図１５】スロープを有しない周期構造を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に、添付の図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００４１】
図１は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（以下、ＳＰＦＭとも記す）の構成を示すステージ付近の部分図である。下側の図は、上側の図の一部を拡大して示す断面図である。
【００４２】
図１に示したように、本実施の形態に係るＳＰＦＭ１は、本体２と、ステージ３の上に搭載されるマイクロプレート４とを備えている。図１の下側の図は、マイクロプレート４の上に試料Ａが搭載され、光Ｌが入射している状態を示している。
【００４３】
本ＳＰＦＭ１は、マイクロプレート４に特徴を有し、それ以外の蛍光顕微鏡として機能する上で必要な、本体２の構成要素は従来の蛍光顕微鏡と同じである。即ち、本体２の構成要素である光源、対物レンズ、接眼レンズ、干渉ミラー（ダイクロイックミラー）、干渉フィルター（励起フィルター）、蛍光フィルターなどは、公知の落射照明の蛍光顕微鏡と同じものを使用する。従って、それらに関する説明を省略する。
【００４４】
図２は、本実施の形態に係るマイクロプレート４の構成を示す断面図である。マイクロプレート４は、ベース基板５と、ベース基板５の表面に形成された金属層６および保護層７とを備えて構成されている。
【００４５】
ベース基板５は、表面に周期的構造である格子が形成され、観測光に対して透明なガラス、プラスチックなどで形成されている。周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。周期構造の周期、即ち隣接する溝の間隔は、観察に使用する波長以下、例えば１０〜８００ｎｍ（ナノメートル）であり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比は０．００５〜１０である。
【００４６】
なお、ナノスケールの周期構造をもつ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。
【００４７】
金属層６は、金、銀、銅、プラチナ、ニッケルなどの遷移金属であることが好ましく、膜厚は１０〜５００ｎｍであることが好ましい。しかし、遷移金属に限定されず、表面プラズモンを発生可能な金属であればよく、その場合にも膜厚は１０〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００４８】
保護層７には、ポリカーボネートやポリメタクリル酸メチルのような有機高分子やシリカ（ＳｉＯ2）など、観察に用いる入射光や発生する蛍光の波長領域で吸収のない（若しくは吸収の少ない）透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層６から所定距離だけ離隔させることが必要である。そのために、保護層７の膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層６の種類に応じて決定される。たとえば、膜厚の最適値は、金属層６が銀の場合２０〜５０ｎｍ、金の場合４０〜７０ｎｍである。
【００４９】
試料を含む水溶液（燐酸緩衝液など）をマイクロプレート４上に搭載して観測する場合が想定される。従って、金属層６に銀を使用する場合には、水中で非常に不安定な銀を保護するために、ベース基板５と銀との間および銀と保護層７（例えば、ＳｉＯ2）との間にさらに、それぞれ第１の接着保護層および第２の接着保護層を形成することが望ましい。例えば、第１および第２の接着保護層は、それぞれ膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。第２の接着保護層は、銀を保護できる材質の層であればよく、例えばクロム（Ｃｒ）、アルミニウム、チタン、パラジウムで形成される。なお、第２の接着保護層は保護層７の接着性を高める役割をもする材質が望ましく、この意味でもクロム（Ｃｒ）が適している。
【００５０】
次に、図３を参照して、入射光の偏光方向と周期構造の方向との関係について説明する。表面プラズモン共鳴光の発生には、ｐ偏光の光が必要である。また、周期構造の配置との関係では、ｐ偏光が、周期構造の方向（格子の溝に垂直な方向）の成分を含んでいることが必要である。
【００５１】
図３の（ａ）は、マイクロプレート４に光が入射する状態を示す斜視図であり、（ｂ）はその平面図である。平面Ｕ１、Ｕ２は、マイクロプレート４の表面に垂直であり、且つマイクロプレート４表面に形成された格子８の方向（格子の溝に垂直な方向）Ｖ１と平行な平面Ｕ１と、それに直交する平面Ｕ２である。入射光Ｌ１、Ｌ２は、光源から出力され、対物レンズによって円錐形に集光されてマイクロプレート４に入射する光のうち、それぞれ平面Ｕ１内、Ｕ２内を進行する光である。ここで、入射光Ｌ１、Ｌ２は、偏光フィルターなどによる偏光を受けていない光であるとする。従って、マイクロプレート４に対する入射光Ｌ１、Ｌ２のｐ偏光成分Ｖ２、Ｖ３の成分のうちＶ１と平行な成分によって表面プラズモン共鳴光が発生する。このように、マイクロプレート４への入射光が偏光していない場合、マイクロプレート４の表面に形成された格子８の方向Ｖ１に平行な成分をもつ入射光のｐ偏光によって表面プラズモン共鳴光が発生する。
【００５２】
その一方、入射光が偏光フィルターなどによって所定の方向に偏光されている場合、マイクロプレート４の配置によっては、表面プラズモン共鳴光がほとんど発生しない場合がある。図４は、図３と同様の斜視図であるが、マイクロプレート４が図３の状態から９０度回転されて配置されている。また、図４では、偏光フィルターなどによって偏光軸Ｓの入射光が対物レンズによって円錐形に集光されているが、平面Ｕ１およびＵ２内を伝播する光Ｌ１、Ｌ２に対しては、平面Ｕ１の面内方向と、平面Ｕ２に対する法線方向にそれぞれ偏光（Ｖ２とＶ４）されることとなる。この場合、ｐ偏光成分Ｖ２が格子の方向Ｖ１と直交しており、Ｖ４はマイクロプレート４に対してｓ偏光になるため、光Ｌ１、Ｌ２の何れによっても表面プラズモン共鳴光が発生しない。Ｌ１、Ｌ２以外の入射光に対してもｐ偏光性とＶ１との平行性が低いために効率よく表面プラズモン共鳴光は発生しない。よって、図４のような偏光軸の入射光と格子の配置では、明るい蛍光画像は得られない。
【００５３】
従来の蛍光顕微鏡において、偏光子を挿入しなくとも、通常組み込まれているフィルターセットの中に偏光依存性のある素子（ダイクロイックミラーなど）が含まれている場合、上記したように表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するように、マイクロプレート４の配置、即ち格子の方向を調節することが必要である。
【００５４】
以上、本発明の実施の形態を、蛍光顕微鏡に適用する場合について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されず、種々変更して実施することができる。また、蛍光マイクロプレートリーダーに対しても同様に適用可能である。
【００５５】
例えば、周期構造の形状は、上記した一方向に溝を有する形状に限定されず、図５に示すような、ベース基板５’の表面に交差する２方向に溝を形成した２次元周期構造や円形の周期構造であってもよい。図５は、２次元周期構造が形成されたベース基板５’の平面図である。ベース基板５’の表面には、複数の溝部９が直交する２方向に、即ち凸部１０が直交する２方向に配列している。なお、溝９を形成する２方向は、直交していなくてもよく、斜めであってもよい。
【００５６】
２次元周期構造が形成されたベース基板を用いる場合、偏光した入射光を使用する場合にも、マイクロプレートの配置による蛍光強度への影響を小さくすることができる。また、偏光していない光を使用する場合、入射光の利用効率が高くなり、より明るい蛍光を観測することができる。
【００５７】
蛍光マイクロプレートリーダーに使用する本発明に係るマイクロプレートに関しては、図６（上側は縦断面図、下側は平面図）に示したように、ベース基板５表面上の、アレイ状に配置された複数の領域１１に周期構造を形成した後、ベース基板５の上に金属層６、保護層７を順に形成すればよい。このとき、全ての領域１１において周期構造の溝を同じ方向になるように形成することが望ましい。蛍光マイクロプレートリーダーで観測する場合、これらの複数の領域１１の上に微量の試料をスポッティングして観測する。
【００５８】
また、図６では、ベース基板５の表面全体に金属層６および保護層７を形成しているが、これに限定されず、少なくとも周期構造が形成された領域１１の上に金属層および保護層が形成されていればよい。また、各領域１１に、図５に示した２次元周期構造を形成してもよい。
【００５９】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴をさらに明らかにする。
【実施例１】
【００６０】
ベース基板としてガラス基板を使用し、その表面に観測波長オーダー以下の周期構造をもつ格子を形成し、さらにその上に金属薄膜、Ｃｒ、ＳｉＯ2薄膜を形成してマイクロプレートを製作した。
【００６１】
ｐ偏光入射光を使用する場合におけるマイクロプレートの配置の影響を調査した結果を図７に示す。図７の右側に、入射光の偏光面と格子の方向との関係を示す。左側に、観測した反射率（％）の結果を示す。
【００６２】
左側に示した観測結果のグラフから、入射角度φと、入射光の偏光面および格子の方向の成す角度Ψとによって、反射率が大きく変化することが分かる。即ち、Ψが小さくなるほど反射率が減少し、表面プラズモン共鳴光の発生が観測できる。図７では、Ψ＝０（度）、φ＝１５（度）である場合に、表面プラズモン共鳴光が最も強く発生している。従って、ＮＡの小さい対物レンズでも十分明るい蛍光観測が可能になることを示唆している。その一方で、このような表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するのはｐ偏光入射光のときのみならず、角度Ψ回転させた光を用いて入射した場合にも発生させることができる。図７左側では、格子を角度Ψ回転させた場合の表面プラズモン光は効率が減少しているが、偏光軸を角度Ψ回転させた入射光を用いることで補償され、角度φの位置に変化なく角度Ψ＝０（度）の共鳴光と同じ強さの表面プラズモン共鳴光が発生することもわかっている。
【００６３】
よって、図７の結果は、実験条件、即ち使用する蛍光顕微鏡の光学系およびマイクロプレートに依存するので、全ての表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡においてΨ＝０（度）であることが最適条件ではない。実際には、試料を搭載したマイクロプレートの配置および入射光の角度を調節し、最適状態を決定することが望ましい。
【実施例２】
【００６４】
さらに、（１）一般的なスライドガラス、（２）ガラス（LaSFN9）／金／ＳｉＯ２基板（周期構造なし）、（３）周期構造を形成したガラス／金／ＳｉＯ２マイクロプレートの３種類を用い、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）発現細胞を基板に吸着させて正立顕微鏡で蛍光を観測した。蛍光観測においては、ハロゲンランプとＧＦＰ対応フィルター（励起側４６０〜４８０ｎｍ、蛍光側４９５〜５４０ｎｍ）を用いた。
【００６５】
観測結果を図８に示す。図８の（１）〜（３）はそれぞれ、上記した３種類の基板を用いて得られた写真である。何れも同じ縮尺であり、上段は落射光の写真、下段は落射蛍光の写真である。図８の下段の写真から、（３）周期構造ガラス／金／ＳｉＯ２基板に吸着した細胞からの蛍光が、他の基板の細胞よりも強く観測されていることが分かる。
【実施例３】
【００６６】
周期構造を形成したガラス／金／ＳｉＯ２マイクロプレートを用い、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）発現細胞を基板に吸着させて正立顕微鏡で蛍光を観測した。蛍光観測においては、ハロゲンランプとＧＦＰ対応フィルター（励起側４６０〜４８０ｎｍ、蛍光側４９５〜５４０ｎｍ）を用い、偏光子を挿入して、対物レンズ通過前の偏光軸がΨ＝０（度）のときの格子の溝方向と直交する方向になるように入射光を調整した。Ψ＝０（度）、９０（度)で観測した蛍光画像の結果が図９の（１）、（２）である。Ψ＝０（度）のときの画像が明るく、マイクロプレートの配置の調節が重要であることを証明することができた。
【実施例４】
【００６７】
さらに本願発明者は、類似した周期構造を形成した基板を用いても、増強蛍光効果を生じさせる表面プラズモン共鳴場を発生しない基板が存在することを見出した。これについて、実験結果とシミュレーション結果との比較検討を行い、表面プラズモン共鳴発生の条件として、周期構造のデューティ比（duty ratio）、溝部の深さ、形状が重要であることを見出した。そして、シミュレーションにより、これら条件の望ましい範囲を決定することができた。以下に、具体的に説明する。
【００６８】
（１）まず、類似した周期構造をもつ次の２枚のベース基板（ＳｉＯ２）を用いて、スパッター法により、ベース基板の周期構造上に金属層および保護層を調製してマイクロプレートを製作した。具体的には、周期構造の上に約200nmの厚さで銀薄膜を形成し、さらにその上に約20nmの厚さで保護層としてＳｉＯ２を形成した。そして、これらのマイクロプレートを用いて、図３を参照して上記で説明したように表面プラズモン共鳴を観測した。
基板１：周期が480nm、溝部の深さが31nm、デューティ比が0.4
基板２：周期が480nm、溝部の深さが39nm、デューティ比が0.54
ここで、ベース基板表面の周期構造は、断面形状が図１１に示した矩形状である。デューティ比は、周期に対する凸部の長さの割合をＭ％、周期に対する凹部の長さの割合をＶ％として、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）である。
【００６９】
観測結果を図１２に示す。図１２の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１及び基板２に関する観測結果である。図１２から分かるように、基板１では表面プラズモン共鳴が観測されたが、基板２では表面プラズモン共鳴が観測されなかった。
【００７０】
基板１、２を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で検査したところ、ベース基板表面は矩形状の周期構造であるが、その上に形成された金属層の表面は、図１３に示すように周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープという）していることが分かった。図１３では、金属層の上の保護層は省略している。周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率は、基板１に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝33：39：14であり、基板２に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝24：60：8であった。
【００７１】
そこで、公知の厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。その結果を図１４に示す。図１４の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１、２に関するシミュレーション結果であり、実験データである図１２（ａ）、（ｂ）を再現できていることが分かる。なお、シミュレーションは、実際のマイクロプレートとは異なり、銀薄膜の上に形成されたＳｉＯ２が銀薄膜の平らな山及び谷のみに存在し、スロープ上には存在しない条件で行った。
【００７２】
（２）次に、図１３に示した形状において、周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率を変化させて、厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。
【００７３】
その結果、次のことが分かった。
i）  図１５のように表面がほぼ垂直なスロープ（傾斜角度αが90度）をもつ周期構造では、表面プラズモン共鳴はデューティ比に敏感に依存し、プラズモン共鳴場が発生する条件が制限されるが、図１３のような表面にスロープ（高さ１０〜５０ｎｍ、且つＳＬ＝４０〜１００ｎｍ、即ち傾斜角度αが６〜５０度）のある構造では、表面プラズモン共鳴発生のデューティ比への依存度が小さく、限られた一部の条件でプラズモン共鳴が発生しないことが分かった。特にスロープの傾斜が緩い程、表面プラズモン共鳴のデューティ比への依存度は小さくなる。
ii）  金属層表面にスロープをもたせた構造にすることで、表面プラズモン共鳴の溝部の深さへの依存度も軽減される。
iii）  表面プラズモン共鳴は周期にはあまり依存しない。
【００７４】
金属層（特に銀薄膜）の厚さが約２００ｎｍの場合の望ましい条件を具体的に示せば、次のとおりである。
金属層表面にスロープが無く垂直な段差が形成されている（α＝９０°）場合、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５以上１５未満）、且つ、１５≦Ｍ＜４５、４５＜Ｍ＜８５、若しくは８５＜Ｍ＜１００、
ｄ＝２０±５（１５以上２５未満）、且つ、１０≦Ｍ＜１００、
ｄ＝３０±５（２５以上３５未満）、且つ、１０≦Ｍ≦４０、６０≦Ｍ≦７０、若しくは７５≦Ｍ≦９５、
ｄ＝４０±５（３５以上４５未満）、且つ、０＜Ｍ≦４０、４５≦Ｍ≦５５、若しくは６０≦Ｍ≦７０
である。
金属層表面がスロープを有し（α＜９０°）、ＳＬ＝１０±５の場合（ベース基板はα＝９０°）、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５ｎｍ以上１５ｎｍ未満、即ちαが約１２度）、且つ、０＜Ｍ＜７０、または７０＜Ｍ＜１００
ｄ＝２０±５（１５ｎｍ以上２５ｎｍ未満、即ちαが約２３度）、且つ、０＜Ｍ＜８０、または８０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（２５ｎｍ以上３５ｎｍ未満、即ちαが約３２度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（３５ｎｍ以上５５ｎｍ未満、即ちαが約４０度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
である。
【符号の説明】
【００７５】
１    表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（ＳＰＦＭ）
２    本体
３    ステージ
４    マイクロプレート
５、５’  ベース基板
６    金属層
７    保護層
８    周期構造
９    溝部
１０  凸部
Ａ    試料
Ｌ１、Ｌ２    入射光
Ｖ１  格子の方向
Ｖ２、Ｖ３  入射光のｐ偏光成分
Ｖ４  入射光のｓ偏光成分
φ    入射角度
Ｕ１、Ｕ２    入射平面
【図２】
2014081385.tif 000003
【図３】
2014081385.tif 000004
【図４】
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【図５】
2014081385.tif 000006
【図６】
2014081385.tif 000007
【図７】
2014081385.tif 000008
【図１０】
2014081385.tif 000009
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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