(57)【要約】      （修正有）【課題】カビの存否を確認する検査において、広範囲の種類のカビを精度高く特異的に検出する方法、カビの検出用担体及びカビの検出用キットの提供。【解決手段】以下の（a）、（b）、又は（c）に記載の塩基配列を有するプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。（a）特定な配列からなる塩基配列を有するプローブ。（b）特定な配列からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。（c）（a）又は（b）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）、（b）、又は（c）に記載の塩基配列を有するプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。
（a）配列番号１〜３９に示す塩基配列を有するプローブ。
（b）配列番号１〜３９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（c）（a）又は（b）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項２】
アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号７又は８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１１に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、
アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１３に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、及び、
アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化したことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項３】
フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、
フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、及び、
ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４又は２５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２６又は２７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化したことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項４】
トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２９に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３２又は３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、及び、
フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化したことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項５】
アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１〜３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十二のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十三のプローブ群、
ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十四のプローブ群、
カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十五のプローブ群、及び、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３１に示す塩基配列を有するプローブからなる第十六のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化したことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項６】
コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１７に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８に示す塩基配列を有するプローブからなる第十七のプローブ群、
アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第十八のプローブ群、及び、
ピシウム属菌（Pythium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３８に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十九のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化したことを特徴とする請求項１記載のカビ検出用担体。
【請求項７】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子の両方を用い、
前記標的領域を含む核酸断片の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用し、かつ、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、
得られた増幅産物を請求項１〜４のいずれかに記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項８】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
標的領域として、ＩＴＳ領域を用い、
前記標的領域を含む核酸断片の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、
得られた増幅産物を請求項５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項９】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域として、ＩＴＳ領域、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を用い、
検出対象のカビが、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）の少なくともいずれかの場合、
前記標的領域を含む核酸断片の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用い、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、
検出対象のカビが、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の場合、
前記標的領域を含む核酸断片の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４４に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用い、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４５に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、
得られた増幅産物を請求項６記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項１０】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
検出対象のカビが、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）、フォーマ属菌（Phoma  sp.）の少なくともいずれかであり、
前記プライマーセットが、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを含み、
前記担体が、
アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号７又は８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１１に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、
アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１３に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群、
フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、
フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、
ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４又は２５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２６又は２７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２９に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３２又は３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、及び、
フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化されたものであり、
前記プライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を前記担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させてカビを検出するためのカビ検出用キット。
【請求項１１】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
検出対象のカビが、アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）、カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）の少なくともいずれかであり、
前記プライマーセットが、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを含み、
前記担体が、
アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１〜３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十二のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十三のプローブ群、
ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十四のプローブ群、
カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十五のプローブ群、及び、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３１に示す塩基配列を有するプローブからなる第十六のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化されたものであり、
前記プライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を前記担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させてカビを検出するためのカビ検出用キット。
【請求項１２】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
検出対象のカビが、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の少なくともいずれかであり、
検出対象のカビが、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）の少なくともいずれかの場合、前記プライマーセットが、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを含み、
検出対象のカビが、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の場合、前記プライマーセットが、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４４に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４５に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを含み、
前記担体が、
コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１７に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８に示す塩基配列を有するプローブからなる第十七のプローブ群、
アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第十八のプローブ群、及び、
ピシウム属菌（Pythium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３８に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十九のプローブ群から選択された二群のプローブを固定化されたものであり、
前記プライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を前記担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させてカビを検出するためのカビ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範囲の種類のカビを検出するためのカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査、農業現場での植物病害診断など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。
【０００４】
また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取したカビを培養した後、培養されたカビからＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いる方法などが提案されている（特許文献２〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−２７８８４８号公報
【特許文献３】特開２００８−２７８８６１号公報
【特許文献４】特開２０１０−４８８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡチップを用いる場合は、まず検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域に特異的に結合するプローブを作成して、ＤＮＡチップに固定化する。そして、環境もしくは製品や植物の検体中から採取したカビを培養して、カビのＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などによりカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅する。そして、その増幅産物をＤＮＡチップに滴下して、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、増幅産物に含まれる標識の蛍光強度等を測定することでカビを検出する。
ところで、環境中の検出対象のカビには様々な種類があるため、１個のＤＮＡチップにより複数のカビを同時に検出できることが望ましい。そのためには、ＤＮＡチップ上に複数のカビから選択されたプローブを固定化する必要がある。
【０００７】
一方、プローブにハイブリダイズさせる標的領域の増幅産物は、所定のプライマーセットを用いてＰＣＲ法などにより得られるが、カビの種類によっては、単一の標的領域のみでは偽陽性反応が生じやすいものがあるため、複数のプライマーセットにより、複数の標的領域を同時に増幅させることが望ましい場合がある。また、培養したカビの標的領域を個別に増幅させるのではなく、複数種類のカビを同時に増幅し、これら複数種類のカビから選択されたプローブを固定化したＤＮＡチップによるカビの検出を行えば、検査の迅速性は向上する。
しかしながら、複数の標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスを行う場合には、プローブにもより高い精度で機能するものが求められる。また、同時に増幅させる検出対象のカビの数が増加すればする程、プローブに要求される精度は一層高くなる。
【０００８】
ここで、本発明者らは、アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）、ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）、フォーマ属菌（Phoma  sp.）、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の１７種類を検出対象のカビとし、これらを検出可能なカビ検出用担体を作成するために鋭意研究を行った。
これら複数種類のカビのそれぞれのＤＮＡにおける特定の標的領域のうち、それぞれのカビにのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類のカビには結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上は、各プローブによりこれら複数種類のカビをそれぞれ特異的に検出することができると考えられる。
【０００９】
ところが、実際にはこのようにして得られたプローブであっても有効に機能するとは限らない。このため、各プローブを作成するためには、実験によってプローブの効果を確認しつつ、試行錯誤を繰り返すことによって、有効に機能するプローブを見いだすことが必要であった。これまでに、これら１７種類のカビを、それぞれ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを固定化したカビ検出用担体は知られていない。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、従来よりも広範囲の種類のカビを迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能なカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明のカビ検出用担体は、以下の（a）、（b）、又は（c）に記載の塩基配列を有するプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体としてある。
（a）配列番号１〜３９に示す塩基配列を有するプローブ。
（b）配列番号１〜３９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（c）（a）又は（b）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【００１１】
また、本発明のカビ検出用担体は、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号７又は８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１１に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１３に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、及び、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１２】
また、本発明のカビ検出用担体は、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、及び、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４又は２５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２６又は２７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１３】
また、本発明のカビ検出用担体は、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２９に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３２又は３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、及び、フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化した構成とすることが好ましい。
【００１４】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子の両方を用い、前記標的領域を含む核酸断片の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用し、かつ、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを使用して、前記核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【００１５】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、検出対象のカビが、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）、フォーマ属菌（Phoma  sp.）の少なくともいずれかであり、プライマーセットが、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを含み、担体が、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号７又は８に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１１に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１３に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配��番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４又は２５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２６又は２７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２９に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３２又は３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、及び、フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群から選択された二群以上のプローブを固定化されたものであり、プライマーセットを使用して、核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させてカビを検出する構成とすることが好ましい。
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「プローブ群」は、プローブの集合を意味しており、複数のプローブからなる場合のみを意味するものではなく、一のプローブからなるものを含めてプローブ群と称している。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、広範囲の種類のカビを迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビの標的領域を増幅させるためのプライマーセットの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されたプローブについて検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。標的領域の増幅は、菌株毎に行った。
【図４】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体の試験のための試料に含まれるカビ種、菌株、及び対応する配列番号を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されたプローブについて検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。標的領域の増幅は、複数の菌株について同時に増幅させるマルチプレックスにより行った。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１９】
［カビ検出用担体］
本実施形態のカビ検出用担体は、図１に示す特定のカビを検出するためのプローブ（配列番号１〜３９）の少なくともいずれか１つを、基板上に固定化したものであれば特に限定されるものではなく、例えばスポット型又は合成型のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いることができる。
【００２０】
（対象カビ）
本実施形態のカビ検出用担体により検出する対象のカビは、アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）、ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）、フォーマ属菌（Phoma  sp.）、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の１７種類である。
【００２１】
（プローブ）
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、配列番号１〜３９によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
このうち、配列番号１〜３に示す塩基配列を有するものが、アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブである。特に、配列番号１は、アクレモニウム・ブチリ（Acremonium  butyri）に対して高い特異性を示し、配列番号２は、アクレモニウム・ストリクタム（Acremonium  strictum）に対して高い特異性を示し、配列番号３は、アクレモニウム・チャティコーラ（Acremonium  chaticola）に対して高い特異性を示す。
また、配列番号４に示す塩基配列を有するものが、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号５に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２２】
また、配列番号６〜８に示す塩基配列を有するものが、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号９に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。特に、配列番号６に示す塩基配列を有するものが、アルタナリア・アルタナタ菌（Alternaria  alternata）に対して高い特異性を示し、配列番号７と９は、アルタナリア・ブラシカエ菌（Alternaria  brassicae）に対して高い特異性を示し、配列番号８と９は、アルタナリア・ブラシシコラ菌（Alternaria  brassicicola）に対して高い特異性を示す。
【００２３】
また、配列番号１０に示す塩基配列を有するものが、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号１１に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号１２に示す塩基配列を有するものが、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号１３に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号１４に示す塩基配列を有するものが、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号１５に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２４】
また、配列番号１６に示す塩基配列を有するものが、ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
また、配列番号１７に示す塩基配列を有するものが、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号１８に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２５】
また、配列番号１９に示す塩基配列を有するものが、カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
また、配列番号２０に示す塩基配列を有するものが、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２１に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号２２に示す塩基配列を有するものが、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２３に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２６】
また、配列番号２４と２５に示す塩基配列を有するものが、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２６と２７に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。特に、配列番号２４と配列番号２６は、ペシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces  variotii）に対して高い特異性を示し、配列番号２５と配列番号２７は、ペシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces  linacinus）に対して高い特異性を示す。
また、配列番号２８に示す塩基配列を有するものが、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２９に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２７】
また、配列番号３０と３１に示す塩基配列を有するものが、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３２と３３に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。特に、配列番号３０は、バーティシリウム・ダリエ（Verticillium  dahiae）に対して高い特異性を示す。
【００２８】
また、配列番号３４に示す塩基配列を有するものが、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３５に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号３６に示す塩基配列を有するものが、フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３７に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
また、配列番号３８に示す塩基配列を有するものが、ピシウム属菌（Pythium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号３９に示す塩基配列を有するものが、同菌を検出するための、β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【００２９】
本実施形態のカビ検出用担体では、上記の通り、プローブとして、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβチューブリン遺伝子から選択されたものを用いている。
ＩＴＳ領域は、ＲＮＡに転写後にスプライシングされる部分である。このため、コーディング領域に比べると保存性が低く、変化に富んでいるが、カビの種類間の類似性が高く、偽陽性反応が生じる場合が比較的多い。このため、ＤＮＡチップに数多くの種類のカビのプローブを固定化してカビの識別に用いる場合には、カビの種類によっては、ＩＴＳ領域から選択されたプローブのみを使用すると、検出精度の低下を招く場合がある。一方、β−チューブリン遺伝子には、カビの種類毎にユニークな配列が比較的多く存在している。そこで、本実施形態のカビ検出用担体では、カビの種類によっては、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を標的領域として用いることで、偽陽性反応を低減させることを可能にしている。
【００３０】
具体的には、以下のグループ（Ａ）のカビについては、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方を用いて、これらの両方において陽性反応が得られた場合のみに当該カビが検出されたと判定することが好ましい。これらのカビについては、このようにすることで、偽陽性反応にもとづく過誤判断のリスクを低減することが可能となっている。
【００３１】
グループ（Ａ）：ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
アウレオバシジウム属菌，アルタナリア属菌，アスペルギルス・シルクムダティ節菌，アスペルギルス・ニグリ節菌，アスペルギルス・テレイ節菌，フザリウム・グラミネアラム菌，フザリウム・オキシスポラム菌、ペシロマイセス属菌，トリコフィトン属菌，バーティシリウム属菌，フォーマ属菌
【００３２】
グループ（Ｂ）のカビについては、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。これらのカビについては、βチューブリン遺伝子のデータベースが未整備か、又はβチューブリン遺伝子において有効に機能するプローブを見いだすことができなかった。しかしながら、これらのカビのＩＴＳ領域から選択されたプローブは特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのカビについては、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブを用いて検出を行うことが可能となっている。
【００３３】
グループ（Ｂ）：ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
アクレモニウム属菌，アルタナリア属菌，ケトミウム属菌，カーブラリア属菌，バーティシリウム属菌
【００３４】
グループ（Ｃ）のカビについては、少なくともＩＴＳ領域又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブのいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。これらのカビには、本実施形態のカビ検出用担体におけるＩＴＳ領域から選択されたプローブ又はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの一方でしか検出できない種類のカビが含まれるが、それぞれのプローブの特異性は高く、偽陽性反応を生じることなく検出することが可能となっている。
【００３５】
グループ（Ｃ）：ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
コレトトリカム属菌，アースリニウム属菌，ピシウム属菌
【００３６】
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体によれば、カビの種類毎に検出に用いるプローブの組み合わせを適切に設定することで、検出の精度をより向上させることが可能になっている。なお、アルタナリア属菌とバーティシリウム属菌については、グループ（Ａ）に該当するプローブの他、グループ（Ｂ）に該当するプローブも作成した。
【００３７】
したがって、本実施形態のカビ検出用担体は、グループ（Ａ）のカビについては、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブを共に固定化し、両方のプローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することが好ましい。グループ（Ｂ）のカビについては、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブを固定化し、当該プローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することができる。グループ（Ｃ）のカビについては、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブを共に固定化することが好ましいが、少なくともいずれか一方のプローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定することができる。
【００３８】
（プローブの合成）
本実施形態のカビ検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも２０〜４４塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例でカビ検出用担体に固定化した配列番号１〜３９に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号４０〜４５に示す塩基配列からなるプライマーも１９〜２６塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００３９】
また、本実施形態における配列番号１〜３９に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜３９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜３９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜３９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００４０】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００４１】
なお、図２に示す配列番号４０〜４５の塩基配列からなる各プライマー（配列番号４０及び４１のプライマーセット、配列番号４２及び４３のプライマーセット、配列番号４４及び４１のプライマーセット、及び配列番号４５及び４３のプライマーセットにおける各プライマー）についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号４０〜４５に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号４０〜４５に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号４０〜４５に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号４０〜４５に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。
【００４２】
（カビ検出用担体の作成）
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜３９に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００４３】
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜３９に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。
また、本実施形態のカビ検出用担体は、上記グループ（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることができる。また、その他の数種類ずつのカビからなるグループ毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることもできる。
さらに、本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜３９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部を固定化したものとすることも、配列番号１〜３９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜３９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもできる。
【００４４】
［カビの検出方法］
本実施形態のカビの検出方法は、一又は二以上の検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を用い、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、及び／又は、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを使用して、上記核酸断片を増幅させ、得られた増幅産物を上述したカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させる方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば（１）カビの採取、（２）ＤＮＡの抽出、（３）標的領域の増幅、及び（４）増幅産物の確認を含むものとすることができる。
【００４５】
（１）カビの採取
例えば空中浮遊カビを採取する場合、検査対象の環境中における室内又は屋外の空気を採取する。そして、採取した空気を専用培地に吹き付けて、空気中に含まれるカビの培養を行う。培地としては、所定の寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
次に、ストリップにおいて培養されたカビのコロニーを、コロニー毎に個別に採取し、又は二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。
例えば植物検体のカビを採取する場合、ハサミやカッターなどを用いて、検査対象の罹病組織片あるいは健全組織片を採取する。そして採取した植物組織片を次亜塩素酸やエタノールで表面殺菌後、専用培地に置床して、植物組織中に含まれるカビの培養を行う。培養条件としては、２０℃〜２５℃の範囲内で６５時間以上静置することが好ましい。
【００４６】
（２）ＤＮＡの抽出
次に、このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
また土壌中から直接カビのＤＮＡを抽出することもできる。ＤＮＡの抽出は直接溶菌法（Direct  Lysis  Method）による方法や土壌ＤＮＡ抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００４７】
（３）標的領域の増幅
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態のカビの検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各種カビの標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００４８】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【００４９】
本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβチューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅が行われる。
このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図２に示す配列番号４０及び４１の塩基配列からなるもの（配列番号４０：フォワードプライマー、配列番号４１：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
また、βチューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、同図に示す配列番号４２及び４３の塩基配列からなるもの（配列番号４２：フォワードプライマー、配列番号４３：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
【００５０】
ただし、これらのプライマーセットでは、ピシウム属菌（Pythium  sp.）のＩＴＳ領域とβチューブリン遺伝子を増幅させることができない。
そこで、ピシウム属菌（Pythium  sp.）のＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、配列番号４４及び４１に示す塩基配列からなるもの（配列番号４４：フォワードプライマー、配列番号４１：リバースプライマー）を使用することが好ましい。
また、ピシウム属菌（Pythium  sp.）のβチューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、配列番号４５及び４３に示す塩基配列からなるもの（配列番号４５：フォワードプライマー、配列番号４３：リバースプライマー）を使用することが好ましい。
【００５１】
（４）増幅産物の確認
次に、増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下し、このカビ検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているカビを特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００５２】
［カビ検出用キット］
本実施形態のカビ検出用キットには、カビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定されたカビ検出用担体とが含まれる。
プライマーセット及びカビ検出用担体は、上述したカビのグループ（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）毎に、それぞれ以下の構成とすることが好ましい。
【００５３】
グループ（Ａ）：ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
検出対象のカビが、アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）、アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）、アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）、フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）、ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）、トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）、フォーマ属菌（Phoma  sp.）の少なくともいずれかの場合であり、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００５４】
また、検出対象のカビがグループ（Ａ）の場合、カビ検出用担体としては、これらのカビの少なくともいずれかを検出するためのプローブを固定化したものが用いられる。具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
【００５５】
アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号７又は８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号９に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１１に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、
アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１３に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群、
フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、
フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、
ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４又は２５に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２６又は２７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２９に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３２又は３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、及び、
フォーマ属菌（Phoma  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブからなる第十一のプローブ群から選択された一又は二群以上のプローブを固定化されたカビ検出用担体。
なお、上記の「プローブ群」とは、プローブの集合を意味し、複数のプローブからなる場合のみを意味するものではなく、一のプローブからなるもの含まれる。以下においても同様である。
【００５６】
すなわち、グループ（Ａ）のカビについてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下し、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００５７】
グループ（Ｂ）：ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
検出対象のカビが、アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）、アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）、ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）、カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）、バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）の少なくともいずれかの場合であり、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００５８】
また、検出対象のカビがグループ（Ｂ）の場合、カビ検出用担体としては、これらのカビの少なくともいずれかを検出するためのプローブを固定化したものが用いられる。具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１〜３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十二のプローブ群、
アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十三のプローブ群、
ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十四のプローブ群、
カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十五のプローブ群、及び、
バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３１に示す塩基配列を有するプローブからなる第十六のプローブ群から選択された一又は二群以上のプローブを固定化されたカビ検出用担体。
すなわち、グループ（Ｂ）のカビについてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下し、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００５９】
グループ（Ｃ）：ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するもの
検出対象のカビが、コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）、アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）、ピシウム属菌（Pythium  sp.）の少なくともいずれかの場合である。
プライマーセットとしては、検出対象のカビが、コレトトリカム属菌、アースリニウム属菌の場合は、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４０に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４２に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
また、検出対象のカビが、ピシウム属菌の場合は、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号４４に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、及び／又は、β−チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号４５に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【００６０】
また、検出対象のカビがグループ（Ｃ）の場合、カビ検出用担体としては、これらのカビの少なくともいずれかを検出するためのプローブを固定化したものが用いられる。具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１７に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８に示す塩基配列を有するプローブからなる第十七のプローブ群、
アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブからなる第十八のプローブ群、及び、
ピシウム属菌（Pythium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３８に示す塩基配列を有するプローブ、及び／又は、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３９に示す塩基配列を有するプローブからなる第十九のプローブ群から選択された一又は二群以上のプローブを固定化されたカビ検出用担体。
すなわち、カビのグループ（Ｃ）についてのカビ検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該カビ検出用担体に滴下し、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
【００６１】
本実施形態のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットによれば、上記１７種類のカビを特異的に識別できるプローブを用いることにより、これらのカビを適切に検出することができる。このため、カビの存否を確認するための環境検査等において、従来よりも広範囲の種類のカビを迅速かつ精度高く検出することが可能になっている。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明の実施形態に係るカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの実施例の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００６３】
［試験１］
カビ検出用担体としては、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１に示される配列番号１〜３９のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、オペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【００６４】
検出対象のカビとしては、独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室（Japan  Collection  of  Microorganisms）及び独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NITE  Biological  Resource  Center）から入手した菌株を使用した。具体的には、図３に示すように、以下の１７種類のカビにつき、２４種類の菌株を使用した。
【００６５】
（１）アクレモニウム属菌（Acremonium  sp.）  NBRC6615，NBRC102318，NBRC8952
（２）アウレオバシジウム属菌（Aureobasidium  sp.）  NBRC100716
（３）アルタナリア属菌（Alternaria  sp.）  NBRC4026，NBRC9766，NBRC31226
（４）アスペルギルス・シルクムダティ節菌（Aspergillus  Section  Circumdati）  NBRC31221
（５）アスペルギルス・ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri）  JCM10254
（６）アスペルギルス・テレイ節菌（Aspergillus  Section  Terrei）  NBRC6346
（７）ケトミウム属菌（Chaetomium  sp.）  NBRC6347
（８）コレトトリカム属菌（Colletotrichum  sp.）  NBRC104617
（９）カーブラリア属菌（Curvularia  sp.）  NBRC100165
（１０）フザリウム・グラミネアラム菌（Fusarium  graminiarum）  NBRC9873
（１１）フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium  oxysporum）  JCM11502
（１２）ペシロマイセス属菌（Paecilomyces  sp.）  NBRC32038，NBRC5752
（１３）トリコフィトン属菌（Trichophyton  sp.）  NBRC5807
（１４）バーティシリウム属菌（Verticillium  sp.）  NBRC9435，NBRC9470
（１５）アースリニウム属菌（Arthrinium  sp.）  NBRC100562，NBRC30798
（１６）フォーマ属菌（Phoma  sp.）  NBRC104600
（１７）ピシウム属菌（Pythium  sp.）  NBRC100125
【００６６】
これらのカビを上記菌株毎に培養した。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
さらに、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
【００６７】
ここで、グループ（Ａ）の各カビ（アウレオバシジウム属菌，アルタナリア属菌，アスペルギルス・シルクムダティ節菌，アスペルギルス・ニグリ節菌，アスペルギルス・テレイ節菌，フザリウム・グラミネアラム菌，フザリウム・オキシスポラム菌，ペシロマイセス属菌，トリコフィトン属菌，バーティシリウム属菌，フォーマ属菌）については、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子を同時に増幅させた。
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号４０の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号４２の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。
【００６８】
また、グループ（Ｂ）の各カビ（アクレモニウム属菌，アルタナリア属菌（配列番号６），ケトミウム属菌，カーブラリア属菌，バーティシリウム属菌（配列番号３１））については、ＩＴＳ領域のみを増幅させた。
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号４０の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。
【００６９】
また、グループ（Ｃ）の各カビ（コレトトリカム属菌，アースリニウム属菌，ピシウム属菌）については、ＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を増幅させた。
このとき、コレトトリカム属菌とアースリニウム属菌については、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号４０の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４１の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号４２の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４３の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。
ピシウム属菌については、これらのプライマーセットを用いても、標的領域を増幅させることができない。このため、ピシウム属菌の配列番号３８についての試験は、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして配列番号４４と４１に示す塩基配列からなるプライマーを用いて、ＩＴＳ領域のみを増幅して行った。また、ピシウム属菌の配列番号３９についての試験は、βチューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして配列番号４５と４３に示す塩基配列からなるプライマーを用いて、βチューブリン遺伝子のみを増幅して行った。
なお、以上のプライマーは、オペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。
【００７０】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、バーティシリウム属菌の菌株（NBRC9470）とピシウム属菌の菌株（NBRC100125）を除く、２２種類の菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer（配列番号４０）(2.5μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer（配列番号４１）(2.5μM)  1.0μl
７．BtF  primer（配列番号４２）(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer（配列番号４３）(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA  1.0μl
１０．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００７１】
バーティシリウム属菌の菌株（NBRC9470）を増幅するためのＰＣＲ用反応液としては、次の組成のものを作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer（配列番号４０）（10μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer（配列番号４１）(10μM)  1.0μl
７．Template  DNA  1.0μl
８．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００７２】
ピシウム属菌の菌株（NBRC100125）のＩＴＳ領域を増幅するためのＰＣＲ用反応液としては、次の組成のものを作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．Pyu1-1  primer（配列番号４４）(10μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer（配列番号４１）(10μM)  1.0μl
７．Template  DNA  1.0μl
８．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００７３】
ピシウム属菌の菌株（NBRC100125）のβチューブリン遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用反応液としては、次の組成のものを作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．Pu-bete1  primer（配列番号４５）(10μM)  1.0μl
６．BtR  primer（配列番号４３）(10μM)  1.0μl
７．Template  DNA  1.0μl
８．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００７４】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【００７５】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ），東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図３に示す。
【００７６】
同図に示されるように、配列番号１〜３９に示される塩基配列をそれぞれ有するプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性と判断できる。したがって、これらのプローブは、いずれも陽性と判断され、ぞれぞれの対象カビを検出するために、有効に機能していることがわかる。
【００７７】
具体的には、グループ（Ａ）の各カビ（アウレオバシジウム属菌，アルタナリア属菌，アスペルギルス・シルクムダティ節菌，アスペルギルス・ニグリ節菌，アスペルギルス・テレイ節菌，フザリウム・グラミネアラム菌，フザリウム・オキシスポラム菌，ペシロマイセス属菌，トリコフィトン属菌，バーティシリウム属菌，フォーマ属菌）については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて、両方共に陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図３に示すように、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方におけるＳ／Ｎ比値が、陽性反応を示している。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００７８】
グループ（Ｂ）の各カビ（アクレモニウム属菌，アルタナリア属菌，ケトミウム属菌，カーブラリア属菌，バーティシリウム属菌）については、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図３に示すように、ＩＴＳ領域から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値が、陽性反応を示しており、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００７９】
グループ（Ｃ）の各カビ（コレトトリカム属菌，アースリニウム属菌，ピシウム属菌）については、ＩＴＳ領域又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定される。
これらのカビについては、図３に示すように、コレトトリカム属菌では、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方におけるＳ／Ｎ比値が、それぞれ陽性反応を示している。また、アースリニウム属菌については、アースリニウム・ファエオスパムムの菌株では、ＩＴＳ領域から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値が陽性反応を示し、アースリニウム・ジャポニカムの菌株では、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブにおけるＳ／Ｎ比値が陽性反応を示している。さらに、ピシウム属菌では、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方におけるＳ／Ｎ比値が、それぞれ陽性反応を示している。したがって、これらのカビを検出対象とする各プローブは、いずれも有効に機能していることがわかる。
【００８０】
［試験２］
検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
【００８１】
カビ検出用担体は、試験１と同じものを使用した。また、検出対象のカビも試験１と同じく１７種類のカビについて、２４種類の菌株を使用した。
本試験では、図４に示すように、これらのカビをランダムに４又は５種類ずつ組み合わせ、以下の６つのグループの試料を作成し、それぞれの試料毎にカビの培養を行った。したがって、一部のカビは、複数の試料に重複して含まれている。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
【００８２】
（試料１）
アクレモニウム・チャティコーラ（Acremonium  charticola）  NBRC8952
アルタナリア・アルタナタ（Alternaria  alternata）  NBRC4026
アースリニウム・ファエオスパムム（Arthrinium  phaeospermum）  NBRC100562
アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium  pullulans）  NBRC100716
コレトトリカム・クロイオスポリオイデス（Colletotrichum  gloeosporioides）  NBRC104617
【００８３】
（試料２）
アクレモニウム・ブチリ（Acremonium  butyri）  NBRC6615
ケトミウム・グロボサム（Chaetomium  globosum）  NBRC6347
ペシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces  variotii）  NBRC32038
フォーマ・エグジグア（Phoma  exigua）  NBRC104600
【００８４】
（試料３）
アクレモニウム・ストリクタム（Acremonium  strictum）  NBRC102318
アースリニウム・ファエオスパムム（Arthrinium  phaeospermum）  NBRC100562
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）  JCM10254
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus  terreus）  NBRC6346
トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton  rubrum）  NBRC5807
【００８５】
（試料４）
アクレモニウム・ブチリ（Acremonium  butyri）  NBRC6615
アルタナリア・アルタナタ（Alternaria  alternata）  NBRC4026
アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus  ochraceus）  NBRC31221
アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium  pullulans）  NBRC100716
ケトミウム・グロボサム（Chaetomium  globosum）  NBRC6347
【００８６】
（試料５）
アルタナリア・ブラシカエ（Alternaria  barassicae）  NBRC9766
アルタナリア・ブラシシコラ（Alternaria  brassicicola）  NBRC31226
ピシウム・ウルティマム（Pythium  ultimum）  NBRC100125
バーティシリウム・ダリエ（Verticillium  dahiae）  NBRC9435
【００８７】
（試料６）
アースリニウム・ジャポニカム（Arthrinium  japonicum）  NBRC30798
カーブラリア・ルナータ（Curvularia  lunata）  NBRC100165
フザリウム・オキシスポラム（Fusarium  oxysporum）  JCM11502
フザリウム・グラミネアラム（Fusariumgraminiarum）  NBRC9873
ペシロマイセス・リラシナス（Paecilomyces  lilacinus）  NBRC5752
【００８８】
そして、試料毎に培養したカビのコロニーを一括して採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に試料毎に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーセットは、試験１におけるものと同一である。すなわち、試料１〜４，６については、ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号４０及び４１に示される塩基配列を有するプライマーを使用し、βチューブリン遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号４２及び４３に示される塩基配列を有するプライマーを使用した。また、ピシウム・ウルティマム菌が含まれる試料５については、これらのプライマーセットの他、さらにβチューブリン遺伝子を増幅するための専用のフォワードプライマーとして、配列番号４５に示される塩基配列を有するプライマーも含有させた。なお、本試験では、ピシウム・ウルティマム菌のＩＴＳ領域を増幅するための専用のフォワードプライマーとして、配列番号４４に示される塩基配列を有するプライマーを使用しなかった。したがって、ピシウム・ウルティマム菌のＩＴＳ領域は増幅されず、配列番号３８に関しては、マルチプレックスによる効果の確認は、本試験によっては行っていない。
【００８９】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、試料毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。ただし、試料５についてのみさらにピシウム属菌のβチューブリン遺伝子を増幅するためのPu-beta1  primer(10μM)  1.0μlも含有させた。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(2.5μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer(2.5μM)  1.0μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA（1.0μl／菌株）  1.0μl×菌株数
１０．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００９０】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、試験１と同様に、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【００９１】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（GenePix4100A  Molecular  Devices社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図５に示す。
【００９２】
試料１に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号３〜６，１７，１８，３４に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号３，６に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはいずれもＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号４，５に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらは共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
【００９３】
配列番号１７，１８，３４に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｃ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、配列番号１７に示す塩基配列を有するプローブは、Ｓ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。配列番号１８に示す塩基配列を有するプローブは、Ｓ／Ｎ比値が３未満である。したがって、当該プローブについては、複数のカビのＤＮＡを同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲでは十分に機能しなかった。ただし、Ｓ／Ｎ比値は０．５５であり、全く反応してない他のＳ／Ｎ比値と比較すれば、微弱ながら反応していることがわかる。配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブは、Ｓ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料１に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【００９４】
試料２に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号１，１６，２４，２６，３６，３７に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１，１６に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはいずれもＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２４，２６に示す塩基配列を有するプローブ、及び配列番号３６，３７に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはそれぞれ共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料２に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【００９５】
試料３に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号２，１２−１５，２８，２９，３４に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号２に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、このプローブのＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１２，１３に示す塩基配列を有するプローブ、配列番号１４，１５に示す塩基配列を有するプローブ、及び配列番号２８，２９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはそれぞれ共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
【００９６】
配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｃ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、このプローブのＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料３に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【００９７】
試料４に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号１，４−６，１０，１１，１６に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１，６，１６に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはいずれもＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号４，５に示す塩基配列を有するプローブ、及び配列番号１０，１１に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはそれぞれ共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料４に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【００９８】
試料５に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号７−９，３０−３３，３８，３９に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号７，９に示す塩基配列を有するプローブ、配列番号８，９に示す塩基配列を有するプローブ、配列番号３０，３２に示す塩基配列を有するプローブ、及び配列番号３０，３３に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはそれぞれ共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号３１に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、このプローブのＳ／Ｎ比値は３未満である。したがって、当該プローブについては、複数のカビのＤＮＡを同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲでは十分に機能しなかった。ただし、Ｓ／Ｎ比値は１．７４であり、全く反応してない他のＳ／Ｎ比値と比較すれば、微弱ながら反応していることがわかる。
【００９９】
配列番号３８，３９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｃ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、配列番号３９に示す塩基配列を有するプローブのＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。なお、本試験では、配列番号３８に示す塩基配列を有するプローブの効果の確認は行っていないが、別途行った試験により、当該プローブについては、マルチプレックスによる効果は十分ないことが確認されている。ただし、試験１に示す通り、ＩＴＳ領域を単独で増幅した場合は、有効に機能することがわかっている。また、試験２により、当該プローブが、偽陽性反応を生じないことが示されている。
さらに、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料５に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１００】
試料６に含まれるカビを検出するためのプローブは、図４に示されるように、配列番号１９−２３，２５，２７，３５に示す塩基配列を有するプローブである。
配列番号１９に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｂ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブが陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、このプローブのＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２０，２１に示す塩基配列を有するプローブ、配列番号２２，２３に示す塩基配列を有するプローブ、及び配列番号２５，２７に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ａ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブが共に陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、これらはそれぞれ共にＳ／Ｎ比値が３以上であり、陽性反応を示している。
【０１０１】
配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブは、図１に示されるように、グループ（Ｃ）のカビを検出するためのプローブであり、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ及びβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方が陽性反応を示した場合に、検出対象のカビが存在すると判定するものである。図５に示す通り、このプローブのＳ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応が生じておらず、試料６に含まれるカビを検出するためのプローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【０１０２】
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブは、一部のものを除き、検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合でも、有効に機能することが明らかとなった。また、これらのプローブは、特異性が高く、偽陽性反応が見られないことも明らかとなった。
【０１０３】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ固定化しても良い。また、本実施形態の検出対象カビ以外のカビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共に本実施形態のカビ検出用担体に固定化されていても良く、適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、複数のカビを特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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