(57)【要約】      （修正有）【課題】イソプレンを商業的プロセスの要求に適合し得る生産速度、力価、及び純度でイソプレンを製造することができる方法の提供。【解決手段】イソプレンを製造する方法において、(a)気相中でのイソプレン生成に適した培養条件下でイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている非相同核酸を含む組み換え細胞を培養する工程、(b)気相中にイソプレンを生成させる工程であって、前記気相が不燃の範囲の濃度のイソプレンと気相中に約9.5%(容積)以下の酸素とからなり、前記細胞が約400 nmole/gwcm/hrより多量のイソプレンを生成する工程とから成る方法。【選択図】図１１１Ｃ
2014144007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを製造する方法において、
(a)気相中でのイソプレン生成に適した培養条件下でイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている非相同核酸を含む組み換え細胞を培養する工程、
(b) 気相中にイソプレンを生成させる工程であって、前記気相が不燃の範囲の濃度のイソプレンと気相中に約9.5 % (容積)以下の酸素とからなり、前記細胞が約400 nmole/gwcm/hrより多い量のイソプレンを生成する工程とから成る方法。
【請求項２】
前記気相中のイソプレンの濃度が燃焼限界の下限値（ＬＦＬ）未満である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＬＦＬが約1.5 vol.%から約2.0 vol.%である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記気相中のイソプレンの濃度が燃焼限界の上限値（ＵＦＬ）より高い、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＵＦＬが約2.0 vol.%から約12.0 vol.%である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記イソプレンが約25℃から約55℃の温度の気相でされる、請求項１の方法。
【請求項７】
前記イソプレンが約1 気圧から3気圧の気相でされる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１の方法。
【請求項９】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記細菌細胞が、エシェリキア・コリ(Escherichiacoli)、パントエア・シトレア(Pantoea  citrea)、バシラス・スブチリス(Bacillus  subtilis)、B.リケニフォルミス(lichenformis)、B. lichenformis、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)、S.リビダンス、S.コエリカラー(coelicolor)、またはS.グリセウス(griseus)、シュードモナス (Pseudomonas) 株およびP. アルカリゲンス(alcaligenes) 細胞からなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記細胞が糸状菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糸状菌細胞がアスペルギルス属、酵母、トリコデルマ属、ヤロウイア(Yarrowia)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、A. オリザエ、A. ニガー、サッカロミセス・セレビシアエ (cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)、シゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe、T. レーシ、H.インソレンス(insolens)、H.ラヌギノス(lanuginose)、またはH. グリセア(grisea)、C. ラクノウエンス (lucknowense)、A ソジャエ(sojae)、A.ジャポニカス(japonicus)、A. ニジュランス (nidulans)、A.アクレアタス(aculeatus)、A. アワモリ、F. ロゼウム(roseum)、F. グラミナム  (graminum)、F. セレアリス(cerealis)、F. オキスポルイム(oxysporuim)、F. ベネナタム(venenatum)、N. クラッサ(crassa)、M. ミエヘイ(miehe)、トリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride)、F. オキスポルイム(oxysporuim)、F.ソラニ(solani)細胞からなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記細胞が藻類の細胞である、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記藻類細胞が緑藻類、紅藻類、灰色藻類(glaucophytes)、クロララクニオン藻(chlorarachniophytes)、ユーグレナ(euglenids)、クロミスタ(chromista)、または渦鞭毛藻(dinoflagellates)からなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記細胞が更にイソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ（IDI）ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記IDIポリペプチドをコードする核酸が非相同核酸である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記IDIポリペプチドが酵母IDIポリペプチドである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記IDIポリペプチドをコードしている核酸がIDIポリペプチドをコードしている内因性核酸である、請求項１５の方法。
【請求項１９】
前記細胞が更にl-デオキシキシルロース-5-ホスフェート シンターゼ（DXS）ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記細胞が更にDXSポリペプチドをコードする内因性核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記細胞が更に１つ以上のメバロン酸（MVA）経路ポリペプチドをコードする１つ以上の非相同核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記細胞が更に１つ以上のメバロン酸（MVA）経路ポリペプチドをコードする１つ以上の内因性核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項２３】
前記細胞が更に全メバロン酸（MVA）経路ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項２４】
前記細胞が更に、
（ａ）イソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ（IDI）ポリペプチドをコードする核酸および
（ｂ）（ｉ）l-デオキシキシルロース-5-ホスフェート シンターゼ（DXS）ポリペプチドをコードする核酸及び／又は
（ｉｉ）１つ以上のメバロン酸（MVA）経路ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、を含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
前記ＤＸＳポリペプチドをコードしている核酸が非相同核酸である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記ＤＸＳポリペプチドをコードしている核酸が内因性核酸である、請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のＭＶＡ経路ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が非相同核酸である、請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上のＭＶＡ経路ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が内因性核酸である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、分離された条件下および／または安全操業条件下における、C5炭化水素を含まないイソプレン組成物及びその製造方法に関する。
＜関連する出願とのクロスリファレンス＞
本願は2008年7月2日出願の米国仮出願61/134,094号及び2008年7月2日出願の米国仮出願61/133,947号、及び2008年7月２日出願の米国仮出願61/134,011号に基づく優先権を主張し、これらの出願を参照として本願に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)は種々の合成ポリマー、主要な合成ゴムの重要な原料である。イソプレンは様々な微生物、植物、及び動物から天然に生成されている。特に、イソプレンの生合成に関して、メバロン酸経路(MVA)と非メバロン酸経路(DXP)の2つの経路が明らかにされている(図19参照)。しかし、天然有機体由来のイソプレンの生成量は商業的には魅力が無い。約800,000トン/年のシス-ポリイソプレンが、イソプレンの重合により製造されている。このポリイソプレンの大部分はタイヤ及びゴム工業において使用されている。またイソプレンの共重合体が、履物、機械部品、医療用品、スポーツ用品及びラテックス等の、その他の製品用の合成エラストマーとして用いられている。
【０００３】
現在、タイヤ及びゴム工業は、天然及び合成ゴムの使用により成り立っている。天然ゴムはアフリカの熱帯雨林で見出されたゴムの木や植物のミルク状樹液から得られる。合成ゴムは主にブタジエンポリマーに基づいている。このようなポリマーの場合、ブタジエンはエチレン及びプロピレン製造の際の副産物として得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
石油の分留によりイソプレンを得ることができるが、イソプレンの精製は高価であり、また時間がかかる。炭化水素のC5ストリームの石油分解法からは、イソプレンは僅か約15%しか得られない。従って、より経済的なイソプレン製造方法が求められている。特に、イソプレンを商業的プロセスの要求に適合し得る生産速度、力価、及び純度でイソプレンを製造することができる方法が求められている。また、イソプレンを安価な原料から製造することができるシステムが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、この発明はイソプレンを生成する培養細胞に関する。いくつかの実施形態ではこの発明により、イソプレンを約400nmoleイソプレン／細胞の湿潤重量1グラム／hour (nmole/gwcm/hr)より多く生成する培養細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は(i)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞は炭素源を含有する培養培地で培養され、炭素源の非限定的例示として炭水化物 、グリセロール、グリセリン 、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、ポリペプチド (例えば微生物性または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキスの成分、またはこれらの2以上の組合せ等が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この発明により細胞培養培地中の炭素を約0.002%より多くイソプレンに転換する培養細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は(i)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した、非相同核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞は炭素源を含有する培養培地で培養され、炭素源の非限定的例示として炭水化物 、グリセロール、グリセリン 、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキスの成分、またはこれらの2以上の組合せ等が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、この発明により、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備える培養細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は(i)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した非相同核酸を備える。いくつかの実施形態では、細胞は炭素源を含有する培養培地で培養され、炭素源の非限定的例示として炭水化物 、グリセロール、グリセリン 、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキスの成分、またはこれらの2以上の組合せ等が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。
【０００８】
一態様では、この発明は本願に開示する細胞を用いたイソプレンを製造する方法等の、イソプレンを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、この発明には、細胞により約400 nmole/gwcm/hrを超えるイソプレンが生成される条件下で細胞を培養することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法には、細胞により製造されたイソプレンを回収することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法には、細胞により製造されたイソプレンを精製することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法には、イソプレンを重合することが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は(i)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した、非相同核酸を備える。いくつかの実施形態では、細胞は炭素源を含有する培養培地で培養され、炭素源の非限定的例示として炭水化物 、グリセロール、グリセリン 、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキスの成分、またはこれらの2以上の組合せ等が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。様々な実施形態では、静止期におけるイソプレンの生成量（例えば生成したイソプレンの総量、または、イソプレンの生成量／時間／OD600）が、成長期において同じ時間で生成されるイソプレンの量の2倍以上である。いくつかの実施形態では、気相には約9.5 (容積) %以上の酸素が含まれ、気相中のイソプレンの濃度は燃焼限界の下限値未満であるか、または燃焼限界の上限値より高い。特定の実施形態では、(i) 気相中のイソプレンの濃度は燃焼限界の下限値未満であるか、または燃焼限界の上限値より高く、(ii)細胞により約400 nmole/gwcm/hrを超えるイソプレンが生成される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、この発明の方法には、培養培地に含有される炭素の約0.002% (mol/mol)を超える量をイソプレンに転換可能な条件下で細胞を培養することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法にはまた、細胞により製造されたイソプレンを回収することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法には細胞により製造されたイソプレンを精製することが含まれる。いくつかの実施形態では、この発明の方法にはイソプレンを重合することが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は(i)イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、(ii)プロモータに作動可能に結合した、非相同核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞は炭素源を含有する培養培地で培養され、炭素源の非限定的例示として炭水化物 、グリセロール、グリセリン 、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、酵母エキス、酵母エキスの成分、またはこれらの2以上の組合せ等が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、イソプレンは静止期においてのみ生成される。いくつかの実施形態では、成長期及び静止期において生成される。様々な実施形態では、静止期におけるイソプレンの生成量（例えば生成したイソプレンの総量、または、イソプレンの生成量／時間／OD600）は、同じ時間で比較したとき、成長期におけるイソプレン生成量の2、3、4、5、10、20、30、40、50倍を超えるか、またはそれ以上である。
【００１１】
一態様では、この発明はイソプレンを含む組成物及びシステムに関する。いくつかの実施形態では、組成物にはイソプレンが約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000 mg以上含有されている。いくつかの実施形態では、組成物に含まれる揮発性有機成分の約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g以上のイソプレン(w/w)がイソプレンである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組成物には、組成物に含まれる全C5炭化水素の総重量に対し、イソプレンが約99.90、99.92、99.94、99.96、99.98、または100重量%以上含有されている。いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレン以外のC5炭化水素(例えば1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、またはシス-ペント-3-エン-1-イン)の量は、組成物に含まれる全C5炭化水素の総重量に対し、約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001%以下である。
いくつかの実施形態では、組成物には、組成物に含まれる全C5炭化水素の総重量に対し、約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001%以下の1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、またはシス-ペント-3-エン-1-インが含有されている。特定の実施形態では、組成物には、組成物に含まれる全C5炭化水素の総重量に対し、約99.90、99.92、99.94、99.96、99.98、または100重量%以上のイソプレンが含有され、約2mgを超えるイソプレンが含有されている。 
【００１３】
いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレンの重合を阻害する化合物の含有量が約50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005 μg/L以下である。特定の実施形態では、組成物には2mgを超えるイソプレンが含有されている.
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物にはエタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール、及び10以上の炭素原子から成るイソプレノイド化合物からなる群から選択される化合物が１以上含有されている。いくつかの実施形態では、組成物にはエタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール(例えば3-メチル-3-ブテン-1-オールまたは3-メチル-2-ブテン-1-オール)、またはこれらの2以上が0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、または120μg/L以上含有されている。特定の実施形態では、組成物には約2mgを超えるイソプレンが含有されるとともに、エタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール、及び10以上の炭素原子から成るイソプレノイド化合物からなる群から選択される化合物が１以上含有されている。
【００１５】
いくつかの実施形態では、組成物にはイソプレンと、次の群から選択される1以上の第2化合物とが含まれている。2-ヘプタノン、6-メチル-5-ヘプテン-2-オン、2,4,5-トリメチルピリジン、2,3,5-トリメチルピリジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、酢酸メチル、1-プロパノール、ジアセチル、2-ブタノン、2-メチル-3-ブテン-2-オール、酢酸エチル、2-メチル-1-プロパノール、3-メチル-1-ブタナール、3-メチル-2-ブタノン、1-ブタノール、2-ペンタノン、3-メチル-1-ブタノール、エチルイソブチレート、3-メチル-2-ブテナール、酢酸ブチル、3-メチル酢酸ブチル、3-メチル-3-ブタ-1-エニルアセテート、3-メチル-2-ブタ-1-エニルアセテート、(E)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、(Z)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、及び2,3-シクロヘプテノールピリジン。
様々な実施形態では、これらの第2化合物のいずれか１のイソプレンに対する量は、重量パーセント(すなわち、その化合物の重量をイソプレンの重量で割り、100を掛ける)で表示したとき、約0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または110% (w/w)以上である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、この発明の組成物は、(i)イソプレンを含む気相と、(ii)約400 nmole/gwcm/hrより多くのイソプレンを生成する培養細胞とから成る。いくつかの実施形態では組成物は閉鎖系であり、気相には、1時間培養した1mLの1 OD600に正規化したとき、約5, 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/Lのイソプレンが含まれる。いくつかの実施形態では組成物は開放系であり、1 vvmで通気拡散させたとき、気相には約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L以上のイソプレンが含まれている。いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、揮発性有機成分中の全C5炭化水素の総重量に対し、イソプレンが約99.90、99.92、99.94、99.96、99.98以上、または100%含まれている。いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、揮発性有機成分中の全C5炭化水素の総重量に対し、イソプレン以外のC5炭化水素(例えば1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、または シス-ペント-3-エン-1-イン)が約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005,または0.00001重量%以下含まれている。いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、揮発性有機成分中の全C5炭化水素の総重量に対し、1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、またはシス-ペント-3-エン-1-インが0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001重量%以下含まれている。特定の実施形態では、気相中の揮発性有機成分には約2mgを超えるイソプレンが含まれており、揮発性有機成分中の全C5炭化水素の総重量に対し、約99.90、99.92、99.94、99.96、99.98以上、または100%のイソプレンが含まれている。
【００１７】
いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、イソプレンの重合を阻害する化合物が50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005μg/L以下含有されている。特定の実施形態では、気相中の揮発性有機成分には約2mgを超えるイソプレンが含まれている。
【００１８】
いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、エタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール、及び10以上の炭素原子から成るイソプレノイド化合物からなる群から選択される化合物が１以上含有されている。いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、エタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール(例えば3-メチル-3-ブテン-1-オールまたは3-メチル-2-ブテン-1-オール)、またはこれらの2以上が0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、または120μg/L以上含有されている。特定の実施形態では、組成物には2mgを超えるイソプレンが含有され、またエタノール、アセトン、C5 プレニルアルコール、及び10以上の炭素原子から成るイソプレノイド化合物からなる群から選択される化合物が１以上含有されている。
【００１９】
いくつかの実施形態では、気相中の揮発性有機成分には、イソプレンと、次の群から選択される1以上の第2化合物とが含まれている。2-ヘプタノン、6-メチル-5-ヘプテン-2-オン、2,4,5-トリメチルピリジン、2,3,5-トリメチルピリジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、酢酸メチル、1-プロパノール、ジアセチル、2-ブタノン、2-メチル-3-ブテン-2-オール、酢酸エチル、2-メチル-1-プロパノール、3-メチル-1-ブタナール、3-メチル-2-ブタノン、1-ブタノール、2-ペンタノン、3-メチル-1-ブタノール、エチルイソブチレート、3-メチル-2-ブテナール、酢酸ブチル、3-メチル酢酸ブチル、3-メチル-3-ブタ-1-エニルアセテート、3-メチル-2-ブタ-1-エニルアセテート、(E)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、(Z)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、及び2,3-シクロヘプテノールピリジン。様々な実施形態では、気相中の揮発性有機成分におけるこれらの第2化合物のいずれか１のイソプレンに対する量は、重量パーセント(すなわち、その化合物の重量をイソプレンの重量で割り、100を掛ける)で表示したとき、約0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または110% (w/w)以上である。
【００２０】
この発明の組成物のいくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部が気体状態である。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部が液体状態である(例えば凝縮液)。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部が固体状態である。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部が、シリカおよび／または活性炭等を含有する担体等の固体担体に吸着されている。いくつかの実施形態では、組成物にエタノールが含有されている。いくつかの実施形態では、組成物にはエタノールが約75から約90重量%含有されており、例えばエタノールが約75から約80%,約80から約85%、または約85から約90重量%含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレンが約4から約15重量%含有されており、例えばイソプレンが約4から約8%、約8から約12%、又は約12 から約15重量%含有されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本願に開示する細胞および／または組成物を含む系に関する。いくつかの実施形態では、この系には、イソプレンを約400, 500、600、 700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000nmole/gwcm/hr、またはそれ以上生成する培養細胞をチャンバー内に保有する反応器が含まれている。いくつかの実施形態では、この系は閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部が系から取り出される。いくつかの実施形態では、この系にはイソプレンを含有する気相部が含まれている。様々な実施形態では、気相には本願に開示する組成物のいずれかが含まれている。
【００２２】
一態様では、この発明によりポリイソプレンから成るタイヤが提供される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、(i)本願に開示するいずれかの組成物中のイソプレンを重合するか、または(ii) 本願に開示するいずれかの組成物から回収されたイソプレンを重合することにより製造される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンはシス-1,4-ポリイソプレンから成る。
【００２３】
この発明の組成物、システム、及び方法のいくつかの実施形態では、気相中に燃焼範囲外の濃度のイソプレンが生成する。いくつかの実施形態では、気相中に約9.5 (容積)% 未満の酸素が含有される。いくつかの実施形態では、気相中には約9.5 (容積)% 以上の酸素が含有され、気相中のイソプレンの濃度は燃焼限界の下限値未満であるか、または燃焼限界の上限値より高い。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相部の成分には約0(容積)%から約100(容積)%の酸素が含まれ、例えば約10(容積)%から約100(容積)%の酸素が含まれている。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相部の成分には約0(容積)%から約99(容積)%の窒素が含まれている。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相部の成分には約1(容積)%から約50(容積)%のCO2が含まれている。
【００２４】
この発明のいくつかの実施形態では、培養細胞によりイソプレンが約400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000 nmole/gwcm/hr以上、またはそれ以上生成される。この発明のいくつかの実施形態では、培養細胞は培養培地中の炭素の約0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6%以上、またはそれ以上を、イソプレンに転換する。この発明のいくつかの実施形態では、培養細胞によりイソプレンが、約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000 ng、またはそれ以上のイソプレン／細胞の湿潤重量１グラム／hr (ng/gwcm/h)において生成される。この発明の側面のいくつかの実施形態では、培養細胞により約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000 mg以上またはそれ以上のイソプレン／ブロス1リットル(mg/Lbroth、ここで、ブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる) の累積力価(cumulative titer)(総量)を有するイソプレンが生成される。本願に、他のイソプレン生成速度、及び総イソプレン生成量の例を開示する。
【００２５】
この発明のいくつかの実施形態では、本願に係る細胞にはさらに、IDIポリペプチドをコードする非相同核酸が含まれている。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにIDIポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれている。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにDXSポリペプチドをコードする非相同核酸が含まれている。この発明のいずれかの実施形態では、細胞にはさらにDXSポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれている。この発明のいずれかの実施形態では、細胞にはさらに、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸が含まれている。この発明のいくつかの実施形態では、細胞にはさらに、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1の核酸が含まれている。この発明のいずれかの実施形態では、1のベクターがイソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターには抗生物質耐性核酸等の選択マーカが含まれている。
【００２６】
この発明のいずれかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、培地または高コピープラスミドに含まれたT7プロモータ等の、T7プロモータに作動可能に結合している。この発明のいずれかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、培地または高コピープラスミドに含まれたTrcプロモータ等の、Trcプロモータに作動可能に結合している。この発明のいずれかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、内因性プロモータ等の、Lacプロモータに作動可能に結合している。この発明のいずれかの実施形態では、内因性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモータ等の、内因性プロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸は、選択マーカを備えていない細胞の染色体中に組み込まれている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、MVA経路、IDI、DXP,またはイソプレンシンターゼ核酸のいずれか1以上が、プロモータ、または成長期よりも静止期においてより活性になる因子のいずれかの制御下に置かれている。例えば、MVA経路、IDI、DXP,またはイソプレンシンターゼ核酸のいずれか1以上が、RpoS等の静止期シグマ因子の制御下に置かれている。いくつかの実施形態では、MVA経路、IDI、DXP,またはイソプレンシンターゼ核酸のいずれか1以上が、静止期において活性な応答調節因子により誘導されるプロモータ等の、静止期において誘導されるプロモータの制御下に置かれている。
【００２８】
この発明のいずれかの実施形態では、複数の細胞の少なくとも一部が、連続細胞培養(例えば希釈しない連続細胞培養)において少なくとも約5、10、20、40、50、60、65回またはそれ以上の回数の細胞分裂している間、非相同イソプレンシンターゼ核酸を保持している。この発明のいずれかの実施形態では、本願に係る核酸には、イソプレンシンターゼ、IDI,またはDXS核酸が含有され、さらに抗生物質耐性核酸等の選択マーカが含有されている。
【００２９】
この発明のいずれかの実施形態では、細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド(例えばサッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisia）またはエンテロコッカス・ファエカリス (Enterococcus faecalis)由来のMVA経路ポリペプチド)をコードする非相同核酸が含まれている。この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにMVA経路ポリペプチド(例えばSaccharomyces cerevisiaまたはEnterococcus faecalis由来のMVA経路ポリペプチド)をコードする内因性核酸のコピーの挿入が含まれている。この発明の側面のいくつかの実施形態では、細胞にはさらにイソプレンシンターゼ、DXS、及びMVA経路核酸が含まれている。この発明の側面のいくつかの実施形態では、細胞にはイソプレンシンターゼ核酸、DXS核酸、及びIDI核酸、及び(IDI核酸に加えて)MVA経路核酸が含まれている。
【００３０】
この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、例えばプエラリア(Pueraria) (例えばPueraria モンタナ(montana)またはPueraria ロバタ(lobata))等の植物由来の天然ポリペプチドである。
【００３１】
この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、細胞は、例えばグラム陽性細菌等の細菌性の細胞である(例えばバシラス・スブチリス (Bacillus subtilis)の細胞等のBacillus属の細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、Streptomyces コエリカラー(coelicolor)、またはStreptomyces グリセウス(griseus)等のStreptomyces属の細胞)。この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、細胞はグラム陰性細胞である (例えばエシェリキア・コリ(Escherichia coli)細胞等のEscherichia属の細胞、またはパントエア・シトレア (Pantoea citrea)細胞等のPantoea属の細胞)。この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、細胞は例えば糸状菌の細胞等の菌類の細胞 (例えばトリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei)細胞等のTrichoderma属の細胞、または例えばアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)及びAspergillus ニガー(niger)細胞等のAspergillus属の細胞)。または、酵母細胞である (例えばヤロウイア・ リポリチカ(Yarrowia lipolytica)等のYarrowia属の細胞)。
【００３２】
この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、微生物性ポリペプチド炭素源には、酵母または細菌由来のポリペプチドの1以上が含まれる。この発明のいずれかの側面のいくつかの実施形態では、植物性ポリペプチド炭素源には、
大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドの1以上が含まれる。
【００３３】
一態様では、この発明は、この発明の組成物または方法のいずれかにより生成された産品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】E. coli 中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子の核酸配列を表す図である(SEQ ID NO:1)。atg開始コドンはイタリック体で、終止コドンは太字で示し、追加したPstI部位に下線を付して図示した。
【図２】pTrcKudzuのマップを表す図である。
【図３】pTrcKudzuの核酸配列を表す図である (SEQ ID NO:2)。RBSに下線を付し、 kudzuイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字で、終止コドンは太字・大文字のイタリック体で図示した。ベクターの骨格は pTrcHis2Bである。
【図４】pETNHisKudzuのマップを表す図である。.
【図５】pETNHisKudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:5)。
【図６】pCL-lac-Kudzuのマップを表す図である。
【図７】pCL-lac-Kudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:7)。
【図８Ａ】ベクターを備えていないE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｂ】pCL-lac-Kudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｃ】pTrcKudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｄ】pETN-HisKudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図９Ａ】14リットルの流加培養発酵における、E. coli BL21/pTrcKudzuの発酵中のODの経時変化を表すグラフである。
【図９Ｂ】14リットルの流加培養発酵における、E. coli BL21/pTrcKudzuの発酵中のイソプレン生成の経時変化を表すグラフである。
【図１０Ａ】Panteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。コントロールに用いた細胞は、kudzu組換えイソプレンシンターゼを備えていない。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１０Ｂ】pCL-lac Kudzuを発現するPanteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１０Ｃ】pTrcKudzuを発現するPanteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１１】組換えイソプレンシンターゼを発現するBacillus subtilis中でのイソプレン生成を表すグラフである。BG3594comKは、プラスミド(天然イソプレン生成)を備えていないB. subtilis株である。CF443-BG3594comKは、pBSKudzu(組換えイソプレン生成) を備えたB. subtilis株である。Ｙ軸の ISはイソプレンを表す。
【図１２】pBS Kudzu #2のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:57)。
【図１３】Yarrowia中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼのヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:8)。
【図１４】Yarrowia中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むpTrex3gのマップを表す図である。
【図１５】pSPZ1(MAP29Spb)ベクターのヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:11)。
【図１６】Yarrowia中での発現にコドン最適化した合成kudzu(Pueraria montana)イソプレン遺伝子のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:12)。
【図１７】合成ハイブリッドポプラ(ポプラ・アルバxポプラトレムラ (Populus alba x Populus tremula) )イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:13)。ATG開始コドンは太字で、終止コドンは下線を付して示した。
【図１８Ａ】pYLA 1, pYL1 及びpYL2ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｂ】pYLA(POP1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｃ】pYLA(KZ1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｄ】pYLI(KZ1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｅ】pYLI(MAP29)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｆ】pYLA(MAP29)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１９】イソプレンのMVA 及び DXP代謝経路を表す図である (F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005に基づく)。下記に、各経路における各ポリペプチドの代替名と、そのポリペプチドの活性を測定する方法が記載されている参考文献を示す。（これらの参考文献を、その全内容、特にMVA及びDXP経路における各ポリペプチドの活性を測定する方法に関して、参照として本願に組み込む。）＜メバロン酸経路＞: [AACT]; アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ, MvaE, EC 2.3.1.9. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [HMGS]; ヒドロキシメチルグルタアリール-CoA シンターゼ, MvaS, EC 2.3.3.10. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; [HMGR]; 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoA リダクターゼ, MvaE, EC 1.1.1.34. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [MVK]; メバロン酸塩キナーゼ, ERG12, EC 2.7.1.36. 測定方法: Curr Genet 19:9-14, 1991. [PMK]; ホスホメバロン酸塩キナーゼ, ERG8, EC 2.7.4.2, 測定方法: Mol Cell Biol, 11:620-631, 1991; [DPMDC]; ジホスホメバロン酸塩デカルボキシラーゼ, MVDl, EC 4.1.1.33. 測定方法: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; [IDI]; イソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ, IDI1; EC 5.3.3.2. 測定方法: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. ＜DXP 経路＞ [DXS]; l-デオキシキシルロース-5-ホスフェート シンターゼ, dxs, EC 2.2.1.7. 測定方法: PNAS, 94:12857-62, 1997; [DXR]; 1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェート リダクトイソメラーゼ, dxr, EC 2.2.1.7. 測定方法: Eur. J. Biochem. 269:4446- 4457, 2002; [MCT]; 4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール シンターゼ, IspD, EC 2.7.7.60. 測定方法: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; [CMK]; 4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ, IspE, EC 2.7.1.148. 測定方法: PNAS, 97:1062-1067, 2000; [MCS]; 2C-メチル-D- エリスリトール2,4-シクロジホスフェート シンターゼ, IspF, EC 4.6.1.12. 測定方法: PNAS, 96:11758-11763, 1999; [HDS]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェート シンターゼ, ispG, EC 1.17.4.3. 測定方法: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; [HDR]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)- ブテニル4-ジホスフェート リダクターゼ, IspH, EC 1.17.1.2. 測定方法: JACS, 126:12847-12855, 2004.
【図２０】kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を備えない組換えY. lipolytica株(左側)、及び前記遺伝子を備える組換えY. lipolytica株(右側)によるイソプレン生成のGC-MS分析結果を表すグラフである。矢印は基準イソプレン標準サンプルの溶出時間を示す。
【図２１】pTrcKudzu yIDI DXS Kanのマップを表す図である。
【図２２】pTrcKudzu yIDI DXS Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:20)。
【図２３Ａ】BL21/pTrcKudzukan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｂ】BL21/pTrcKudzu yIDI kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｃ】BL21/pTrcKudzu DXS kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｄ】BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｅ】BL21/pCL PtrcKudzu中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｆ】BL21/pCL PtrcKudzu中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｇ】BL21/pCL PtrcKudzu DXS中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｈ】BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。矢印はIPTG (400μmol)で誘導した時点を表す。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。黒色菱形はOD600、黒三角はイソプレンの生産性(μg/L)、白四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２４】pTrcKKDyIkIS kanのマップを表す図である。
【図２５】pTrcKKDyIkIS kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:33)。
【図２６】pCL Ptrc上流経路のマップを表す図である。
【図２７】図27A-27Dは、pCL Ptrc上流経路のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:46)。
【図２８】B. subtilis染色体のnprEローカスに組み込むための、下流MVA 経路及び酵母idiを含むカセットのマップを表す図である。nprE上流／下流は、組み込むnprEローカスからの各配列の1 kbを示す。aprEプロモータ(アルカリ性セリンプロテアーゼプロモータ)は、aprE遺伝子のプロモータ(-35、-10、+1 転写開始部位、RBS)を表す。MVK1は、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を表す。RBS-PMKは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子を表す。RBS-MPDは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を表す。RBS-IDIは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母idi遺伝子を表す。ターミネータは、B. amyliquefaciens (アミリケファシエンス)由来のターミネータアルカリ性セリンプロテアーゼターミネータを表す。SpecRは、スペクチノマイシン耐性マーカを表す。“nprE upstream repeat for amp.”は、増幅に用いる上流領域の重複配列を表す。
【図２９】B. subtilis染色体のnprEローカスに組み込むための、下流MVA 経路及び酵母idiを含むカセットのヌクレオチド配列を表す図である。
【図３０】p9796-poplarのマップを表す図である。
【図３１】p9796-poplarのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:48)。
【図３２】pTrcPoplarのマップを表す図である。
【図３３】pTrcPoplarのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:49)。
【図３４】pTrcKudzu yIDI Kanのマップを表す図である。
【図３５】pTrcKudzu yIDI Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:50)。
【図３６】pTrcKudzuDXS Kanのマップを表す図である。
【図３７】pTrcKudzuDXS Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:51)。
【図３８】pCL PtrcKudzuのマップを表す図である。
【図３９】pCL PtrcKudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:52)。
【図４０】pCL PtrcKudzu A3のマップを表す図である。
【図４１】pCL PtrcKudzu A3のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:53)。
【図４２】pCL PtrcKudzu yIDIのマップを表す図である。
【図４３】pCL PtrcKudzu yIDIのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:54)。
【図４４】pCL PtrcKudzu DXSのマップを表す図である。
【図４５】pCL PtrcKudzu DXSのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:55)。
【図４６】バイオマス原料からのイソプレン生成を表すグラフである。図Ａはトウモロコシ茎葉からのイソプレン生成、図Ｂはバガスからのイソプレン生成、図Ｃは針葉樹パルプからのイソプレン生成、図Ｄはグルコースからのイソプレン生成、図Ｅは追加原料の無い細胞からのからのイソプレン生成を表す。グレイの四角は植菌後の図示した各時間における培養物のOD600測定値を表し、黒三角は植菌後の図示した各時間におけるイソプレン生成を表す。
【図４７Ａ】グルコース無添加の培地における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｂ】1%グルコース原料転化糖における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｃ】1%転化糖原料における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すを表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｄ】1% AFEXトウモロコシ茎葉原料における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４８】酵母エキスがイソプレン生成に及ぼす影響を表すグラフである。図Ａは、異なる量の酵母エキスを転化した培養槽における光学密度の経時変化を表す。図Ｂは、異なる量の酵母エキスを転化した培養槽におけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。図Ｃは、酵母エキスが流加培養法培地中で成長させたE. coliのイソプレン生成に及ぼす影響を表す。
【図４９】500 Lバイオリアクター中での、pTrcKudzu + yIDI + DXSプラスミドを有する E. coli細胞からのイソプレン生成を表すグラフである。図Ａは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での、光学密度の経時変化を表す。図Ｂは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での、イソプレン力価の経時変化を表す。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。図Ｃは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での総イソプレン生成の経時変化を表す
【図５０】pJMupperpathway2のマップを表す図である。
【図５１】pJMupperpathway2のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:56)。
【図５２】pBS Kudzu #2のマップを表す図である。
【図５３Ａ】14リットル流加培養発酵槽での、組換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するBacillusの発酵中の成長を表すグラフである。黒色菱形は組換えイソプレンシンターゼを備えていない(天然イソプレン生成)コントロール株(BG3594comK)を表し、灰色三角はpBSKudzu (組換えイソプレン生成)を備えるBacillusを表す。
【図５３Ｂ】14リットル流加培養発酵槽での、組換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するBacillusの発酵中における、イソプレン生成を表すグラフである。黒色菱形は組換えイソプレンシンターゼを備えていない(天然イソプレン生成)コントロール株(BG3594comK)を表し、灰色三角はpBSKudzu (組換えイソプレン生成)を備えるBacillusを表す。
【図５４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図５５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図５６】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図５７】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である
【図５８】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図５９】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図６０】図60A-60Cはグルコースを添加した150-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６１】図61A-61Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６２】図62A-62Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６３】図63A-63Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６４】図64A-64Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６５】図65A-65Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６６】図66A-66Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６７】図67A-67Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６８】系Aの断熱火炎温度の計算値を、様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。例えば、凡例中の最初の記載(40℃の空気中のイソプレン)は、グラフ中の一番上の曲線に対応する。
【図６９】系Bの断熱火炎温度の計算値を、4%の水を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７０】系Cの断熱火炎温度の計算値を、5%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７１】系Dの断熱火炎温度の計算値を、10%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７２】系Eの断熱火炎温度の計算値を、15%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７３】系Fの断熱火炎温度の計算値を、20%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７４】系Gの断熱火炎温度の計算値を、30%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７５Ａ】系AのCAFT モデルの結果を重量パーセントから容積パーセントに換算した値を示す表である。
【図７５Ｂ】図68に示した、系AのCAFTモデルから得られた燃焼性を容積パーセントで表すグラフである。
【図７６Ａ】系ＢのCAFT モデルの結果を重量パーセントから容積パーセントに換算した値を示す表である。
【図７６Ｂ】図69に示した、系ＢのCAFTモデルから得られた燃焼性を容積パーセントで表すグラフである。
【図７７】燃焼性試験用容器の概略図である。
【図７８Ａ】試験系1の燃焼性曲線を表すグラフである：スチーム 0%、0 psig、40℃。
【図７８Ｂ】試験系1の爆発及び不爆データポイントをまとめた表である。
【図７８Ｃ】試験系1の燃焼性曲線と、CAFTモデルとの比較を示すグラフである。
【図７９Ａ】試験系2の燃焼性曲線を表すグラフである：スチーム4%、0 psig、40℃。
【図７９Ｂ】試験系2の爆発及び不爆データポイントをまとめた表である。
【図７９Ｃ】試験系2の燃焼性曲線と、CAFTモデルとの比較を示すグラフである。
【図８０Ａ】図80A及び80Bは、試験系1の試験条件及び結果の詳細をまとめた表である。
【図８１】試験系2の試験条件及び結果の詳細をまとめた表である。
【図８２】断熱火炎温度の計算値を、圧力3気圧の様々な窒素／酸素比における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。
【図８３】断熱火炎温度の計算値を、圧力1気圧の様々な窒素／酸素比における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。
【図８４】図82のデータと、実施例13に示す方法で求めた燃焼範囲を表すグラフである。実験例のデータ点(丸)は、初期圧力1気圧で行った本願に開示する試験によるものである。
【図８５】図83のデータと、実施例13に示す方法で求めた燃焼範囲を表すグラフである。実験例のデータ点(丸)は、初期圧力1気圧で行った本願に開示する試験によるものである。
【図８６Ａ】発酵オフガスのGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８６Ｂ】図86Bは図86Aを拡大して 発酵オフガス中の少量の揮発成分を示す図である。
【図８７Ａ】-78℃で冷凍トラップしたオフガス中の微量揮発成分のGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８７Ｂ】-196℃で冷凍トラップしたオフガス中の微量揮発成分のGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８７Ｃ】図87C は図87Bの拡大図である。
【図８７Ｄ】図87D は図87Cの拡大図である。
【図８８】図88A及び88Bは、石油から得られたイソプレン(図88A)、及び生物学的に得られたイソプレン(図88B)のGC/MS クロマトグラムを比較して示す図である。標準サンプルには、イソプレンのメインピーク付近に溶出する3種のC5炭化水素の不純物が含有されている(図88A)。これに対し、生物学的に得られたイソプレンには顕著な量のエタノールとアセトン(ランタイム3.41分) が含まれている(図88A)。
【図８９】グルコース及び3 g/Lの酵母エキスを添加した、Kudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli BL21 (DE3) pTrcIS株の発酵オフガスの分析結果を表すグラフである。
【図９０】イソプレンに類似した構造を有し、重合触媒毒として作用するいくつかの不純物の構造を示す図である。
【図９１】pTrcHis2AUpper上流経路(pTrcUpperMVAとも呼ぶ)のマップを表す図である。
【図９２】図92A-92Cは、pTrcHis2A上流経路(pTrcUpperMVAとも呼ぶ) のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:86)。
【図９３】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図９４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図９５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図９６】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図９７】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図９８】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図９９】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１００】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１０１】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレンの比活性度の経時変化を表す図である。
【図１０２】pCLPtrcUpperPathwayHGS2のマップを表す図である。
【図１０３】図103A-103C は、pCLPtrc上流経路HGS2のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:87)。
【図１０４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１０５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１０６】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける総イソプレン生成の経時変化を表す図である。
【図１０７】プラスミドMCM330のマップを表す図である。
【図１０８】図108A-108Cは、プラスミドMCM330のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:90)。
【図１０９】pET24D-Kudzuのマップを表す図である。
【図１１０】図110A及び110Bは、pET24D-Kudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:101)。
【図１１１Ａ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１１１Ｂ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１１１Ｃ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレンの比活性度の経時変化を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
一態様では、この発明は、向上した生成量及び／又は純度でイソプレンを生成させる組成物及び方法に関する。本願で言う「イソプレン」または「2-メチル-1,3-ブタジエン」(CAS# 78-79-5 )とは、3,3-ジメチルアリルピロホスフェート (DMAPP)からピロホスフェートを除去することにより得られる、直接的最終的揮発性C5炭化水素生成物を意味し、1以上のイソペンテニルジホスフェート(IPP)分子の、１以上のDMAPP分子への結合または重合は含まれない。
【００３６】
大部分のイソプレンは、石油化学原料から不純物を含むC5炭化水素留分として得られるが、この留分を重合に適した原料にするためには様々な精製工程が必要である。いくつかの不純物はイソプレンに構造が似ており、重合触媒毒として作用することから、特に問題となる。このような化合物には、1,3-シクロペンタジエン、シス-及びトランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、及びシス-ペント-3-エン-1-イン (図90)が含まれる。いくつかの実施形態では、この発明のイソプレン組成物には、不飽和C5炭化水素が実質的に混入していない。実施例10にさらに示すように、本願に開示する方法で製造されたイソプレン組成物には、検出可能な量のイソプレン以外の不飽和C5炭化水素(1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、又はシス-ペント-3-エン-1-イン等)が含まれていない。本願に開示する方法で製造されたいくつかのイソプレン組成物には、GC/MS分析で測定したとき、エタノール、アセトン及びプレニルアルコールが含まれている。このような化合物はすべて、石油化学原料から得られたイソプレン組成物中に含まれるC5異性体炭化水素留分と比べて、はるかに容易にイソプレンストリームから除去することができる。従って、いくつかの実施形態では、この発明のイソプレン組成物を重合グレードのイソプレンにするために必要な処理が、最小限で済む。
【００３７】
一態様では、この発明の組成物及び方法により、イソプレン生成速度、及びイソプレン生成量が向上する。例えば、イソプレンを4.8 x 104 nmole/gwcm/hrで生成する細胞培養システムが創出された(表1)。これらのシステムの効率は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約2.2%をイソプレンに転換することにより、実証される。実施例及び表2に示すように、ブロス1リットル当たり約3gのイソプレンが生成した。所望により、他の条件、例えば本願に開示する条件により、さらに多くのイソプレンを生成させることもできる。いくつかの実施形態では、イソプレンの製造に再生可能な炭素源を用いることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンの製造は、細胞の培養から切り離される。いくつかの実施形態では、イソプレンの製造または回収時に火災が生じるリスクを軽減または除去するために、イソプレン及び酸化物の濃度を不燃範囲にする。この発明の組成物及び方法により、細胞当りのイソプレン収量が高くなり、高炭素収率、高純度イソプレン、高生産性、低エネルギー消費量、低生産コスト及び低設備投資コスト、低副次反応となるため、好ましい。この高効率、大スケールのイソプレン製造用生合成プロセスにより、合成イソプレンベースゴム用のイソプレン原料が提供され、低コストで理想的な天然ゴム代替物が提供される。
【００３８】
以下に詳しく述べるように、細胞中にイソプレンシンターゼポリペプチド(例えば植物性イソプレンシンターゼポリペプチド)をコードする非相同核酸を導入することにより、細胞から生成するイソプレンの量が大幅に増加する。イソプレンシンターゼポリペプチドはジメチルアリルジホスフェート (DMAPP)をイソプレンに転換する。実施例に示すように、非相同Pueraria Montana (kudzu)イソプレンシンターゼポリペプチドを、Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia lipolytica, 及びTrichoderma reesei等の、様々な宿主細胞中で発現させた。これらの細胞は全て、非相同イソプレンシンターゼポリペプチドを含まない対応する細胞よりも多くのイソプレンを生成した。表1及び2に示すように、本願の方法を用いることにより、大量のイソプレンが製造された。例えば、非相同イソプレンシンターゼ核酸を備えるB. subtilis細胞は、14リットル培養槽において、非相同イソプレンシンターゼ核酸を備えないコントロールのB. subtilis細胞と比較して約10倍以上のイソプレンを生成した(表2)。培養槽中で、E. coliによりブロス１リットル当たり300mg (mg/L、ここでブロスの容積には、細胞培地の容積と細胞の容積の両者が含まれる) のイソプレンが生成され、B. subtilisにより30 mg/Lのイソプレンが生成されることから、大量のイソプレンを製造可能であることが示される(表2)。所望により、さらに大スケールでイソプレンを製造することができ、あるいはイソプレンの生成量をさらに増やすために、本願に開示する別の条件を用いることもできる。表1及び2に示すベクター及び実験条件については、下記及び実施例においてさらに詳しく述べる。
【表１】
2014144007.tif 000003
【表２】
2014144007.tif 000004
【００３９】
また、非相同イソプレンシンターゼ核酸を含む細胞から生成するイソプレンの量は、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチドの量を増やすことにより、及び／又は細胞により発現されるイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ (IDI)ポリペプチドにより増加させることができる。例えば、細胞にDXS 核酸及び／又はIDI核酸を導入することができる。DXS 核酸は、非相同核酸、又は内因性核酸の複製であってよい。同様に、IDI核酸は、非相同核酸、又は内因性核酸の複製であってよい。いくつかの実施形態では、内因性DXS及び／又はIDIプロモータ又は調節領域を、DXS及び／又はIDI核酸の転写を増加させる別のプロモータ及び／又は調節領域で置き換えることにより、DXS及び／又はIDIポリペプチドの量を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド(例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸の複製、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸の複製の両者を備えている。
【００４０】
コードされたDXS及びIDIポリペプチドは、イソプレンの生合成のDXP経路の一部となる(図19)。DXSポリペプチドは、ピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。理論に拘束されることは意図しないが、DXSポリペプチドの量を増やすことにより、DXP経路に流れる炭素の量が増加する結果、イソプレンの生成量が増加すると考えられる。IDIポリペプチドはイソペンテニルジホスフェート (IPP)とジメチルアリルジホスフェート (DMAPP)の相互変換を触媒する。理論に拘束されることは意図しないが、細胞中のIDIポリペプチドを増やすことによりDMAPPに転換されるIPPの量(及び転換率)が増加する結果、イソプレンの生成量が増加すると考えられる。
【００４１】
例えば、kudzuイソプレンシンターゼ、S. cerevisia IDI、及びE. coli DXS核酸を備えるE. coli細胞の発酵により、イソプレンを製造した。イソプレンの濃度は、15時間の間に50から300μg/Lの範囲で変動した(実施例７、パートVII)。
【００４２】
いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、IDI, 及びDXS核酸の存在により、これらの非相同または追加の内因性核酸を1または2しか備えていない対応する細胞と比較して、細胞はより繁殖するか、より長期間生存した。例えば、非相同イソプレンシンターゼ、IDI及びDXS核酸を備える細胞は、非相同イソプレンシンターゼ、及び DXS核酸しか備えていない細胞、又は非相同イソプレンシンターゼ核酸しか備えていない細胞と比較して、より良く成長した。また、非相同イソプレンシンターゼ、IDI及びDXS核酸は、E. coli細胞により維持された高コピープラスミド上の強力なプロモータに作動可能に結合させることができたことから、細胞に過量の毒性を生じることなく、これらのポリペプチドを大量に細胞中で発現可能なことが示唆された。理論に拘束されることは意図しないが、非相同又は追加の内因性イソプレンシンターゼ、及びIDI核酸の存在により、細胞中に非相同又は追加の内因性DXS核酸しか存在しないとき蓄積されるであろう、毒性となりうる１以上の中間体の量が減少すると考えられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、非相同イソプレンシンターゼ核酸を備える細胞によるイソプレンの生成は、細胞により発現されるMVAポリペプチドの量を増やすことにより増加した(図19)。MVA経路ポリペプチドの例として、次の物が挙げられる：
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ (AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ) ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、 メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、IDIポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)。
例えば、細胞に1以上のMVA経路核酸を導入することができる。いくつかの実施形態では、細胞には、AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoA リダクターゼ核酸等の上流MVA 経路が含まれている。 いくつかの実施形態では、細胞にはMVK, PMK, MVD, 及びIDI核酸等の下流MVA 経路が含まれている。いくつかの実施形態では、細胞にはAA-CoA チオラーゼ, HMG-CoAシンターゼ, HMG-CoAリダクターゼ, MVK, PMK, MVD, 及びIDI核酸等の全MVA 経路が含まれている。MVA 経路核酸は非相同核酸又は内因性核酸の複製である。いくつかの実施形態では、MVA経路核酸の内因性プロモータまたは調節領域を、MVA経路核酸の転写を増加させる 別のプロモータ及び／又は調節領域で置き換えることにより、1以上のMVA 経路ポリペプチドの量を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド (例えば植物性イソプレンシンターゼ核酸)をコードする非相同核酸、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内因性核酸の複製の両者を備える。
【００４４】
例えば、kudzuイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸と、Saccharomyces cerevisia MVK, PMK, MVD, 及びIDIポリペプチドとをコードする核酸を備えるE. coli細胞により、イソプレンが6.67 x 10-4 mol/Lbroth/OD600/hr (実施例8参照)で生成された。また、Enterococcus faecalis AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼポリペプチドをコードする核酸を備えるE. coli細胞の14リットルの培養により、22グラムのメバロン酸 (MVA経路の中間体)が生成した。これらの細胞の振蕩フラスコから、1リットル当たり2-4グラムのメバロン酸が生成した。これらの結果から、非相同MVA経路核酸はE. coli中で活性であることが示唆された。上流MVA経路及び下流MVA経路の双方の核酸と、kudzuイソプレンシンターゼ核酸とを備えるE. coli 細胞(MCM 127株)から、下流MVA経路及びkudzuイソプレンシンターゼ核酸しか備えていないE. coli 細胞(MCM 131株)よりも多くのイソプレン(874 μg/L)が生成した(表3及び実施例8, パートVIII参照)。
【００４５】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の少なくとも一部が、連続細胞培養(例えば希釈しない連続細胞培養)において少なくとも約5、10、20、50、75、100、200、300回またはそれ以上の回数の細胞分裂している間、非相同イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、及び／又はMVA経路核酸を保持している。この発明のいくつかの実施形態では、非相同または複製内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、及び／又はMVA 経路核酸を含む核酸には、さらにカナマイシン、アンピリシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール抗生物質耐性核酸等の、選択マーカが含まれている。
【００４６】
実施例7、パートVIに示すように、細胞培養培地に酵母エキスを添加することにより、イソプレン生成量をさらに増加させることができる。この実施例では、試験した濃度範囲において、イソプレン生成量は細胞培地中の酵母エキスの量に直線的に比例した(図48C)。また、酵母エキス及びグルコースを含有する細胞培地から、ブロス1リットル当り約0.11グラムのイソプレンが生成した(実施例7、パートVIII)。この実施例の双方において、イソプレンの製造に kudzuイソプレンシンターゼ、S. cerevisia IDI、及びE. coli DXS核酸を備えるE. coli 細胞を用いた。グルコースの存在下で酵母エキスの量を増やすことにより、酵母エキスの存在下でグルコースを増やした場合よりも多くのイソプレンが生成した。また、酵母エキスの量を増やすことにより、細胞から高レベルのイソプレンが長時間生成され、細胞の健全性が向上する。
【００４７】
また、炭素源に3種類の加水分解したバイオマス(バガス、トウモロコシ茎葉、及び針葉樹パルプ)を用いてイソプレンを製造した(図46A-C)。kudzuイソプレンシンターゼ、S. cerevisia IDI、及び E. coli DXS核酸を備えるE. coli細胞は、加水分解された炭素源から、等量のグルコース (例えば1% グルコース, w/v)を用いたときと同量のイソプレンを生成した。所望により、この発明の組成物及び方法に、これら以外のバイオマス炭素源を用いることができる。バイオマス炭素源は、公知の細胞培地より安価であり、イソプレンの製造を経済的に行えるため好ましい。
【００４８】
また、転化糖もイソプレン製造の炭素源となることが示された(図47C及び96-98)。例えば、MVA経路ポリペプチド及びKudzuイソプレンシンターゼを発現する細胞から、2.4g/Lのイソプレンが生成した (実施例8、パートXV)。また、グリセロールを炭素源に用いて、Kudzuイソプレンシンターゼを発現する細胞からイソプレン2.2mg/Lが生成した(実施例 8、パートXIV)。イソプレンシンターゼ核酸に加え、DXS 核酸、IDI核酸、及び／又は1以上のMVA経路核酸(全MVA経路をコードする核酸等)を発現させることにより、グリセロールからのイソプレン生成を増加させることができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、細胞培地にオイルが含有されている。例えばkudzu イソプレンシンターゼ核酸を備えるB. subtilis細胞をオイル及びグルコース源を含有する細胞培地で培養したとき、イソプレンが生成した(実施例4、パートIII)。いくつかの実施形態では、細胞培地には1種類以上のオイル(例えば2、3、4、5種類またはそれ以上のオイル)が含まれている。理論に拘束されることは意図しないが、 (i)オイルにより、細胞中においてイソプレンへの転換に利用可能な炭素の量が増加する、(ii)オイルにより、細胞中のアセチル-CoAの量が増加することにより、MVA経路に流れる炭素が増加する、及び／又は(iii) オイルが細胞に追加の栄養分を供給すると考えられる。オイルが細胞に追加の栄養分を供給することは、細胞中の多量の炭素が他の産品ではなくイソプレンに転換されるため、望ましい。いくつかの実施形態では、オイルを含有する細胞培地で培養される細胞は、自然にMVA経路によってイソプレンを生成するか、または全MVA経路の核酸を備えるように遺伝子的に修飾される。いくつかの実施形態では、宿主細胞によるオイルの使用を促進するために、オイルを細胞培養培地に添加する前に、オイルを一部または完全に加水分解する。
【００５０】
イソプレン等の小分子を細胞(例えば細菌)中で商業的に製造するときの主なハードルは、その分子の生成と、細胞の成長との分離である。商業的に実施可能なイソプレンの製造のいくつかの実施形態では、原料中のかなりの量の炭素がイソプレンへの転換に消費され、細胞の成長や維持にはあまり使われない(炭素効率)。様々な実施形態では、細胞は細胞培養培地中の炭素の約0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、または8.0%以上をイソプレンに転換する。特定の実施形態では、下流製品に転換された原料に由来する炭素がかなりの割合で、イソプレンに転換される。実施例11に詳しく述べるように、MVA経路及びkudzuイソプレンシンターゼ核酸を発現するE. coli細胞では、イソプレン生成又は中間体のメバロン酸生成と、成長とが分離しており、この結果高い炭素効率が得られた。特に、メバロン酸はEnterococcus faecalis由来の上流MVA経路を発現する細胞から生成された。イソプレンは、Enterococcus faecalis由来の上流MVA経路と、Saccharomyces cerevisiae由来の下流MVA経路と、Pueraria montana (Kudzu)由来のイソプレンシンターゼとを発現する細胞から生成された。このようなイソプレン生成又はメバロン酸生成と、成長との分離は、E. coli: BL21(LDE3), BL21(LDE3) Tuner, FM5, 及びMG1655の4種異なる株において認められた。最初の2種のE. coli株はB株であり、後ろの2種の株はK12株である。生成と成長の分離は、ack及びpta遺伝子が欠損したMG1655の変異体においても認められた。また、この変異体はアセテートの生成が少ないことが認められた。
【００５１】
＜ポリペプチド及び核酸の例＞
この発明の組成物及び方法では、様々なイソプレンシンターゼ、DXS、IDI、及び／又はMVA経路ポリペプチド、及び核酸を用いることができる。
【００５２】
すなわち、プロセスの安全性を確保するために、コンピュータによるモデル化と、実験により、イソプレン(O2、N2、CO2,またはこれらのガスの2以上の存在下でのイソプレン)の燃焼限界を求めた。燃焼範囲は、燃焼限界の下限値(LFL)、燃焼限界の上限値(UFL)、限界酸素濃度 (LOC)、及び燃焼限界温度によって特徴づけられる。燃焼性の系は、最少量の燃焼物(例えばイソプレン)、及び最少量の酸化性物質、通常は酸素が存在していなければならない。LFLは、燃焼を維持するために存在していなければならないイソプレンの最少量であり、UFLは、存在していてもよいイソプレンの最大量である。UFLを超えると混合物は燃焼物リッチになり、燃焼混合物となるには酸素濃度が低くなりすぎる。LOCは、燃焼混合物となるために存在していなければならない酸素の最小濃度である。燃焼限界温度は、イソプレンの引火点に基づいており、イソプレンの燃焼が伝播し得る最も低い温度である。これらの限界値はイソプレンの濃度、酸化性物質の種類及び濃度、系内の非活性物質の有無、温度、及び系の圧力により決まる。燃焼範囲内にある組成物では燃焼が伝播するため、プロセス設備の設計及び操作の両者において、安全に注意する必要がある。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは少なくとも約50、100、150、175、200、250、300、350、400,またはそれ以上のアミノ酸から成る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片には全長ポリペプチドに由来する少なくとも約25、50、75、100、150、200、300,またはそれ以上の隣接アミノ酸(contiguous amino acid)が含まれ、このポリペプチド断片は対応する全長ポリペプチドの活性に対し、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%,または100%の活性を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドには、天然イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列のセグメント、または全アミノ酸配列が含まれている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型（すなわち天然の配列）イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路ポリペプチドの配列と比較して、１以上の突然変異を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。「単離されたポリペプチド」とは、例えば2、5、10、20、50またはそれ以上の異なるポリペプチドから成るポリペプチドのライブラリの一部ではなく、天然においてそのポリペプチドを生成する少なくとも1の成分から分離されたポリペプチドを意味する。単離されたポリペプチドは、例えばそのポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることにより得ることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは非相同ポリペプチドである。「非相同ポリペプチド」とは、同じ宿主細胞中で天然に発現される別のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチドを意味する。特に、非相同ポリペプチドは、同じ宿主細胞中で天然に発現される野生型核酸とは異なる。
【００５６】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態の、2以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、核酸は組み換え核酸である。「組み換え核酸」とは、対象とする核酸が派生される天然有機体のゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する1以上の核酸(例えば遺伝子）を含まない核酸を意味する。この用語には、例えばベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに導入された組み換えDNA、あるいは他の配列から独立して分離された分子(例えばcDNA、ゲノムDNA断片、あるいはPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により生成されたcDNA断片)として存在する組み換えDNAが含まれる。様々な実施形態では、核酸は組換え核酸である。いくつかの実施形態では、組み換え核酸が、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路と、別のポリペプチド（例えばHis-tagのように融合ポリペプチドの精製または検出を促進するペプチド)の一部または全部とを含む融合ポリペプチドをコードするようにして、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、またはMVA経路核酸が別のポリペプチドの全部または一部をコードする別の核酸に作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、組み換え核酸の一部または全部が化学的に合成される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核酸は非相同核酸である。「非相同核酸」とは、その核酸配列が、同じ宿主細胞において見られる天然の核酸の配列とは異なる核酸を意味する。
【００５８】
特定の実施形態では、核酸には天然由来イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列のセグメントまたは全核酸配列が含まれている。いくつかの実施形態では、核酸には天然イソプレンシンターゼ核酸、DXS、IDI,またはMVA経路核酸由来の隣接ヌクレオチドが、少なくとも約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800,またはこれ以上含まれている。いくつかの実施形態では、核酸には、野生型(すなわち天然の配列) イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸と比較して1以上の突然変異体が含まれている。いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸の転写または翻訳を増加させる1以上の突然変異(例えばサイレント突然変異)を有する。いくつかの実施形態では、核酸はイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸をコードする核酸の縮重変異体である。
【００５９】
「縮重コドン」とは、コードされたペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する、遺伝子コードの多様性を意味する。当業者にとって、所与のアミノ酸を特定するためにヌクレオチドコドンを使用するときに特定の宿主が示す「コドン-バイアス」は周知である。従っていくつかの実施形態では、宿主細胞中での発現を改善するための核酸を合成する際、核酸のコドン使用頻度が宿主細胞の好適なコドン使用頻度に近づくようにして核酸を設計することが好ましい。
【００６０】
いくつかのイソプレンシンターゼ、DXS、IDI及び／又はMVA経路ポリペプチド及び核酸の例の登録番号を、Appendix 1に示す (Appendix 1に示す登録番号、及びそれらの対応する配列の全てを本願に参照として組み込み、特にイソプレンシンターゼ、DXS、IDI及び／又はMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について本願に参照として組み込む)。Keggデータベースにも、様々なイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,及び／又はMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列の例が含まれている。(例えば"genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" 及びそこに開示された配列参照。これらを本願に参照として組み込み、特にイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列について、全て本願に参照として組み込む。）  いくつかの実施形態では、１以上のイソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、及び／又はMVA経路ペプチド及び／又は核酸は、例えば2007年12月12日に公知になった、Appendix 1に示す登録番号に対応する配列と同じ配列を有するか、あるいは、Keggデータベースに示された配列と同じ配列を有する。以下、別のイソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、及び／またはMVA経路ペプチドおよび核酸の例を示す。
【００６１】
＜イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、イソプレンシンターゼポリペプチドはジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)をイソプレンに転換する。イソプレンシンターゼポリペプチドの例として、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有する融合ポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのDMAPPをイソプレンに転換する能力を測定する標準的方法を用いて評価することができる。アッセイの一例では、実施例1に示すように、株 (例えば本願に開示するE. coli/pTrcKudzu株)を振蕩フラスコ中で成長させて細胞抽出物を調製する。誘導が完了した後、10mLの細胞を7000 x gで10分間遠心分離してペレット化し、グリセロールを含有しないPEB 5 ml中に再懸濁させる。公知の方法に従ってフレンチプレスを用いて、細胞を溶解させる。あるいは、細胞を-80℃で凍結/解凍した後、リゾチーム(Ready-Lyseリゾチーム溶液; EpiCentre社)で処理する。
【００６２】
細胞抽出液中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えばSilverらのJ. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995と、その引用文献に記載された方法で測定することができる。Silverらの文献を本願に参照として組み込み、特にイソプレンシンターゼポリペプチド活性のアッセイに関する記載を本願に参照として組み込む。DMAPP (Sigma社)を窒素気流下で蒸発乾固させ、pH8.2の100mMリン酸カリウム緩衝液中に濃度100mMで再水和させ、-20℃で保管する。アッセイは、20 ml のヘッドスペースバイアル中で細胞抽出液25 μlに、5μl の1M MgCl2、1mM (250μg/ml) DMAPP、65 μlのPlant Extract緩衝液(PEB) (50mM Tris-HCl、pH 8.0、20mM MgCl2、5%グリセロール、及び2mM DTT) を含有する液を添加し、次に、振蕩しながら37℃で15分間培養することにより行う。ヘッドスペースバイアルは、金属製スクリューキャップと、テフロン（登録商標）コーティングされたシリコーン隔膜(Agilent Technologies社)とを備える。200μlの250mM EDTAを添加して反応を終了させ、GC/MS実施例1、パートIIに記載した方法で定量する。
【００６３】
イソプレンシンターゼ核酸の例として、少なくとも1のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生する突然変異ポリペプチド及び突然変異核酸が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ亜科等のマメ科植物に由来する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al, Plant Physiology 137: 700-712, 2005)、Pueraria lobata, poplar (例えばPopulus alba x tremula CAC35696) (Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001)、アスペン(aspen) (例えばPopulus tremuloides) (Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995)、またはEnglish Oak (Quercus robur) (Zimmer et al., WO 98/02550) 由来のポリペプチドまたは核酸である。これらの文献を全て本願に参照として組み込み、特にイソプレンシンターゼ核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドの発現に関する記載を本願に参照として組み込む。好ましいイソプレンシンターゼの非限定的例示として、ジェンバンク（Genbank）登録番号AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, 及びAY 182241のイソプレンシンターゼが挙げられる。これらのイソプレンシンターゼを本願に参照として組み込み、特にイソプレンシンターゼ核酸及びポリペプチドの配列について本願に参照として組み込む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、Quercus robur由来の天然のポリペプチドまたは核酸ではない (すなわち、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、Quercus robur由来の天然のポリペプチドまたは核酸以外のポリペプチドまたは核酸である)。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、poplar (例えばPopulus alba x tremula CAC35696)由来の天然ポリペプチドまたは核酸ではない。
【００６５】
＜DXSポリペプチド及び核酸の例＞
上記のように、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチドは、ピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する。DXSポリペプチドの例として、少なくとも1のDXSポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドがDXSポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのピルビン酸塩及びD-グリセルアルデヒド-3-ホスフェートを、l-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。DXS核酸の例には、少なくとも1のDXSポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。DXSポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生する突然変異ポリペプチド及び突然変異核酸が挙げられる。
【００６６】
＜IDIポリペプチド及び核酸の例＞
イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド (イソペンテニル-ジホスフェートデルタ- イソメラーゼ、またはIDI)は、イソペンテニルジホスフェート(IPP)と、ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)の相互変換を触媒する (例えばIPPをDMAPPに転換し、および／または、DMAPPをIPPに転換する)。IDIポリペプチドの例として、少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドがIDIポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのIPP 及びDMAPPを相互変換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。IDI核酸の例には、少なくとも1のIDIポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。IDIポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生するポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
【００６７】
＜MVA経路ポリペプチド及び核酸の例＞
MVA経路のポリペプチドの例として、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ (AA-CoA チオラーゼ)ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼ) ポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼ)ポリペプチド、 メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、 ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、IDIポリペプチド、及び2以上のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド(例えば融合ポリペプチド)が挙げられる。特に、MVA経路ポリペプチドには、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが含まれる。MVA経路核酸の例には、少なくとも1のMVA経路ポリペプチド活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。MVA経路ポリペプチド及び核酸の例として、本願に開示するいずれかの有機体由来の天然ポリペプチド及び核酸、あるいは本願に開示するいずれかの有機体から派生するポリペプチド及び核酸の突然変異体が挙げられる。
【００６８】
特に、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼポリペプチド(AA-CoAチオラーゼまたはAACT) は、2分子のアセチル-CoAをアセトアセチル-CoAに転換する。ポリペプチドがAA-CoA チオラーゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセチル-CoAの2分子をアセトアセチル-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００６９】
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAシンターゼ(HMG-CoAシンターゼまたはHMGS)ポリペプチドは、アセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する。ポリペプチドがHMG-CoAシンターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのアセトアセチル-CoAを3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoAに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００７０】
3 −ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aリダクターゼ(HMG-CoAリダクターゼまたはHMGR) ポリペプチドは、3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸塩に転換する。ポリペプチドがHMG-CoAリダクターゼポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドの3 -ヒドロキシ-3 -メチルグルタアリール-Co Aをメバロン酸塩に転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００７１】
メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチドは、メバロン酸塩をリン酸化してメバロン酸-5-ホスフェートにする。ポリペプチドがMVKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸塩をメバロン酸-5-ホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００７２】
ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ホスフェートをリン酸化してメバロン酸-5 -ジホスフェートにする。ポリペプチドがPMKポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ホスフェートをメバロン酸-5 -ジホスフェートに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００７３】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVDまたはDPMDC)ポリペプチドは、メバロン酸-5-ジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート(IPP)に転換する。ポリペプチドがMVDポリペプチド活性を有するか否かは、in vitro、細胞抽出物中、またはin vivoで、そのポリペプチドのメバロン酸-5-ジホスフェートをIPPに転換する能力を測定する標準的方法（例えば本願に開示する方法）によって評価することができる。
【００７４】
IDIポリペプチド及び核酸の例を上記に示した。
【００７５】
＜核酸の単離方法の例＞
イソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸は、標準的方法により単離することができる。対象とする有機体(例えば細菌のゲノム）から所望の核酸を得る方法は一般的であり、分子生物学の分野で周知である（例えばWO 2004/033646とそこに引用された文献が参照される。これらを本願に参照として組み込み、特に核酸を単離する方法を本願に組み込む。）例えば、核酸の配列が公知であれば（例えば本願に開示する公知の核酸）、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なゲノムライブラリを構築して、所望の核酸配列と相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。所望の配列を単離したら、DNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (本願に参照として組み込み、特にPCR法について本願に参照として組み込むU.S.P 4,683,202参照)等の標準的なプライマーによる増幅方法で、適切なベクターを用いた形質転換に適したDNAの相当量を得ることができる。
【００７６】
あるいは、イソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸(例えば公知の核酸配列を備えるイソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸)を、標準的な方法を用いて化学的に合成することもできる。
【００７７】
本願の組成物及び方法に用いることができる別のイソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を、公知の方法で特定することができる。例えば、天然にイソプレンを生成することが知られている有機体の染色体DNAのコスミドライブラリをE. coli等の有機体中に構築し、次にイソプレン生成についてスクリーニングを行うことができる。特に、大きな断片のゲノムDNA (35-45 kb)をベクター中にパッケージングし、適切な宿主細胞の形質転換に用いる際に、コスミドライブラリを構築する。コスミドベクターは、大量のDNAに適応できる点が特徴である。通常、コスミドベクターは、非相同DNAのパッケージング及び環化に必要なcos DNAのコピーを少なくとも1備える。cos配列に加え、これらのベクターはColEI等の複製の起点と、アンピリシリン又はネオマイシンに耐性を示す核酸等の薬品耐性マーカとを備える。適切な細菌性宿主細胞の形質転換におけるコスミドベクターの使用方法は、その全内容、特に形質転換方法について本願に組み込むSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989に詳しく記載されている。
【００７８】
クローン化コスミドでは通常、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて非相同DNAを単離し、適正なリガーゼを用いてコスミドベクターのcos領域の近傍に結紮する。次に、直鎖状にされた非相同DNAを有するコスミドベクターを、バクテリオファージ等のDNAパッケージング媒体と反応させる。パッケージングプロセスの間、cos部位が開裂し、非相同DNAが細菌性ウイルス性粒子の頭部にパッケージングされる。これらの粒子を用いて、E. coli等の適切な宿主細胞をトランスフェクトする。細胞の中に注入されると、非相同DNAは粘着性cos末端の影響により環化する。このようにして、非相同DNAの大きな断片を宿主細胞中に導入し、発現させることができる。
【００７９】
イソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸を得る別の方法では、メタゲノミックライブラリをアッセイ（本願に開示するヘッドスペースアッセイ）するか、または保存アミノ酸の全長（例えば少なくとも3つの保存されたアミノ酸）をコードするヌクレオチドに対するプライマーを用いたPCRによりスクリーニングする。保存アミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列にアライメントさせることにより特定することができる。イソプレンシンターゼポリペプチドの保存アミノ酸は、公知のイソプレンシンターゼポリペプチドのアライメントされた配列に基づき特定することができる。天然にイソプレンを生成することが見出された有機体を標準的タンパク質精製法（周知である）で精製し、得られた精製ポリペプチドの配列を標準的方法で解析する。この他の方法が、文献に記載されている（例えば、その全内容、特にイソプレン合成に関与する核酸の同定方法を本願に参照として組み込むJulsing et al, Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al, Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007を参照)。
【００８０】
さらに、標準的配列アライメント及び/又は構造予測プログラムを用い、公知のイソプレンシンターゼDXS、IDI,及び/又はMVA経路ポリペプチド及び核酸との一次構造及び/又は予測されるポリペプチドの二次構造の類似性に基づいて、別のDXS、IDI,及び/又はMVA経路ポリペプチド及び核酸を特定することもできる。Swissprot-tremblデータベース（"expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH- 1211 Geneva 4, Switzerland）等の標準データベースを用いてイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路ポリペプチド及び核酸を特定することもできる。イソプレンシンターゼ，DXS、IDI,またはMVA経路ポリペプチドの二次および／または三次構造を、PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA) 等の標準構造予測プログラムの初期設定を用いて予測することもできる。または、イソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路ポリペプチドの実際の二次および／または三次構造を、標準的方法を用いて決定することもできる。別のイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸を、公知のイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸から調製したプローブとのハイブリッド化によって特定することもできる。
【００８１】
＜プロモータとベクターの例＞
本願のイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸は、1以上のベクターに含まれていてもよい。すなわち、この発明は、本願のイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸を備えるベクターにも関する。本願で言う「ベクター」とは、宿主細胞中で対象とする1以上の核酸を輸送し、望ましくは発現することができる構築体を意味する。ベクターの非限定的例示としてプラスミド、ウイルス性ベクター、DNAまたはRNA発現ベクター、コスミド、及びファージベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは発現制御配列により制御された核酸を備える。
【００８２】
本願で言う「発現制御配列」とは、対象とする核酸の転写を制御する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモータまたは誘導プロモータ等のプロモータ、またはエンハンサーであってもよい。「誘導プロモータ」とは、環境的または発生的調整において活性なプロモータである。発現制御配列は、転写される核酸セグメントに作動可能に結合している。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ベクターは選択マーカを備える。本願で言う「選択マーカ」とは、宿主細胞中で発現することができ、導入された核酸またはベクターを含む宿主細胞の選別を容易にする核酸を意味する。選択マーカの非限定的例示として抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール)および／または宿主細胞に栄養的利益等の代謝上の利益を付与する核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸は、選択マーカを備えない細胞の染色体に組み込まれる。栄養要求性マーカの例として、amdS, argB, and pyr4として知られているマーカが挙げられる。Trichodermaの形質転換用のベクターシステムに有用なマーカは公知である。(例えばFinkelstein, Chapter 6 in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; 及びKinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London, 1992参照。これらの文献を、その全内容、特に選択マーカに関して本願に参照として組み込む。) いくつかの実施形態では、選択マーカは、アセタミダーゼ酵素をコードし、形質転換された細胞がアセトアミドを栄養源として成長することを可能にするamdS核酸である。A. nidulans amdS核酸を選択マーカとして用いた例が、Kelley et al., EMBO J. 4:475 - 479, 1985及びPenttila et al., Gene 61:155-164, 1987に開示されている。(これらの文献を、その全内容、特に選択マーカに関して本願に参照として組み込む。) いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS, IDI, 又はMVA経路核酸を、選択マーカを備えていない細胞の染色体に組み込む。
【００８４】
好ましいベクターは、使用する宿主細胞とコンパチブルなベクターである。好ましいベクターは、例えば細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージT7またはM-13誘導ファージ等）、コスミド、酵母、または植物から誘導される。このようなベクターを得る方法、及び使用する方法は公知である（例えばその全内容、特にベクターの使用に関して本願に参照として組み込むSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989参照）。
【００８５】
プロモータは周知である。宿主細胞中で機能するプロモータであれば、どのようなものでも宿主細胞中のイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸の発現に用いることができる。様々な宿主細胞においてイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸の発現の推進に有用な開始制御領域またはプロモータは多数存在し、当業者に広く知られている（その全内容、特に対象とする核酸の発現用ベクターに関して本願に参照として組み込むWO 2004/033646、及びそこに引用された文献参照）。これらの核酸を推進可能な全てのプロモータがこの発明に適しており、非限定的例示としてCYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO、及び TPI (Saccharomyces中での発現に有用); AOX1 (Pichia中での発現に有用); 及びlac、trp、λPL、λPR、T7、tac、及び trc (E. coli中での発現に有用)が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータを用いる（例えば、ポリペプチドの発現用のプロモータ及びプラスミド系について、本願に参照として組み込むU.S.P 7,132,527及びそこに引用された文献を参照）。開示されたグルコースイソメラーゼプロモータ変異体(U.S.P 7,132,527)を用いて、グルコースイソメラーゼプロモータに作動可能に結合した核酸によりコードされるポリペプチドの発現の程度を変化させることができる。いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモータは低、中、または高コピープラスミドに含まれている(U.S.P 7,132,527)。
【００８７】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路核酸は、低コピープラスミド(例えば細胞1個当たり1から約4のコピーを保有するプラスミド)、中コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約10から約15のコピーを保有するプラスミド)、または高コピープラスミド(例えば細胞1個当たり約50以上のコピーを保有するプラスミド) に含まれている。いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、T7プロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、T7プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、Trcプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Trcプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、中または高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、Lacプロモータに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、Lacプロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、低コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸が、内因性プロモータに作動可能に結合している。この内因性プロモータは、Escherichia、Panteoa、Bacillus、Yarrowia、Streptomyces、またはTrichodermaの内因性プロモータ、またはアルカリセリンプロテアーゼや、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路の内因性プロモータ等である。いくつかの実施形態では、内因性プロモータに作動可能に結合した非相同または追加の内因性イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸は、高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは細胞中の染色体に組み込まれていない複製型プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターの一部または全部が細胞中の染色体に組み込まれている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、菌類宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれれ、複製されるベクターである。このようなベクターのリストは、Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, the world-wide web at “fgsc.net” 及びそこに引用されたリファレンス。 これらの文献を、その全内容、特にベクターに関して本願に参照として組み込む。) を参照することができる。発現及び／又は組込みベクターに適した別のベクターの例は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18); van den Hondel et al. in Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press pp. 396-428, 1991;及びU.S. Patent No. 5,874,276に開示されている。これらの文献を、その全内容、特にベクターに関して本願に参照として組み込む。特に有用なベクターとして、pFB6, pBR322, PUC18, pUC100, 及びpENTR/Dが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路核酸は、菌類宿主細胞中で転写活性を示す適切なプロモータに作動可能に結合している。このようなプロモータは、宿主細胞に対し内因性または外因性のポリペプチドをコードする1以上の核酸に由来する。いくつかの実施形態では、プロモータはTrichoderma宿主細胞中で有用である。好ましいプロモータの非限定的例示としてcbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1,及びamyが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモータはその宿主細胞本来のものである。例えば、いくつかの実施形態では、T. reeseiが宿主細胞の場合、プロセスは天然のT. reeseiプロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは誘導プロモータであり、GenBankに信託番号D86235で寄託されたT. reesei cbh1である。このプロモータを、本願に参照として組み込む。いくつかの実施形態では、プロモータは菌類宿主細胞に対し非相同のプロモータである。他の有用なプロモータの例として、A. awamori、及び A. niger グルコアミラーゼ (glaA) (Nunberg et al.、Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及び Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, これらの文献を、その全内容、特にプロモータに関し本願に参照として組み込む)；Aspergillus niger アルファアミラーゼ、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、T. reesei xln1、及びT. reesei セロビオヒドロラーゼ1 (EP 137280, この文献の全内容、特にプロモータに関し本願に参照として組み込む) の遺伝子に由来するプロモータが挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは終止配列を備える。終止制御領域は、宿主細胞中の種々の天然遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、終止配列とプロモータ配列は同一起源に由来する。別の実施形態では、終止配列は宿主細胞に対し内因性である。
特に好ましい終止配列はTrichoderma株 (例えばT. reesei)由来のcbh1である。別の有用な菌類の終止配列として、A. nigerまたは A. awamori グルコアミラーゼ核酸 (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及び Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; これらの文献の全内容、特に菌類の終止配列に関し本願に参照として組み込む)が挙げられる。任意に、終結部位が含まれていてもよい。ポリペプチドを効果的に発現させるために、ポリペプチドをコードするDNAを、開始コドンを通して選択した発現制御領域に、発現により適切なメッセンジャーRNAが生成するようにして作動可能に結合する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、プロモータ、コード、領域、及びターミネータの全てが、発現させるイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸を起源とする。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸のコード領域を、発現構築プロモータと終止配列の転写制御下におかれるようにして汎用発現ベクターに挿入する。いくつかの実施形態では、遺伝子の一部または全部を強いcbh1プロモータの下流側に挿入する。
【００９２】
イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸を、標準的方法 (その全内容、特に適切なDNA配列のスクリーニング及びベクターの構築に関して本願に参照として組み込むSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982参照) を用いて、発現ベクター等のベクター中に組み込む。対象とする核酸 (例えばイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸)、プロモータ、ターミネータ、及びその他の配列を備えるDNA 構築体を結紮する方法、及びこれらを適切なベクター中に挿入する方法は周知である。例えば制限酵素を用いて、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸、及びベクターを切り取ることができる。次に、切り取ったイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸と、切り取ったベクターのコンパチブルな末端同士を結紮する。通常、結合は適切な制限酵素認識部位を結紮することにより行う。このような部位が存在しない場合は、公知の方法に従って合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる(その全内容、特にオリゴヌクレオチドリンカーに関して本願に参照として組み込むSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 及び Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991参照)。また、公知の組換え方法によりベクターを構築することができる (例えばInvitrogen Life Technologies社の Gateway Technology) 。 
【００９３】
いくつかの実施形態では、現在天然細胞中で見られるよりもはるかに高いレベルでイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸を過剰発現させることが好ましい。これは、これらのポリペプチドをコードする核酸をマルチコピープラスミド中に選択的にクローン化するか、これらの核酸を強誘導プロモータまたは構築プロモータの下に置くことにより達成できる。所望のポリペプチドを過剰発現させる方法は分子生物学の分野において周知であり、その例は、その全内容、特にクローン化技術に関して本願に参照として組み込むSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載されている。
【００９４】
次の文献に、この発明に関して有用な一般的手法がさらに記載されている。Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990、及びAusubel et al, Eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994。これらの文献を、その全内容、特に分子生物学及びクローン化技術に関して本願に参照として組み込む。
【００９５】
＜有機体源の例＞
イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸 (及びこれによりコードされたポリペプチド）  は、イソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、及び／またはMVA経路核酸を含む天然の有機体から得ることができる。上記のように、イソプレンは細菌、酵母、植物、及び動物等の様々な有機体により天然に生成されている。有機体は、イソプレンを生成するためのMVA経路、 DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備えている（Figure 19）。従って、DXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える任意の有機体からDXS核酸を得ることができる。IDI及びイソプレンシンターゼ核酸は、例えばMVA経路、 例えばDXP経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える任意の有機体から得ることができる。MVA経路核酸は、例えばMVA経路、またはMVA及びDXP経路の双方を備える任意の有機体から得ることができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸の核酸配列は、以下の天然有機体から生成される核酸配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の天然有機体から生成されるポリペプチドの配列と同様である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,またはMVA経路核酸またはポリペプチドは、本願に開示する有機体に由来する核酸の突然変異体またはポリペプチドの突然変異体である。「に由来する」と言うときは、１以上の実施形態ではの突然変異が導入された核酸またはポリペプチドの起源を意味する。例えば、「植物ポリペプチドに由来する」ポリペプチドとは、対象とするポリペプチドが野生型 (すなわち、天然の配列) 植物ポリペプチドに1以上の突然変異を導入して得られたことを意味する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、起源となる有機体は菌類であり、その例として、A. oryzae及びA. niger等のAspergillus属の種、サッカロミセス・セレビシアエ (cerevisiae) 等のSaccharomyces属の種、シゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe) 等のSchizosaccharomyces属の種、及びT. reesei等のTrichoderma属の種が挙げられる。いくつかの実施形態では、起源となる有機体は糸状菌類の細胞である。「糸状菌類」とは、ユーマイコチナ(Eumycotina) (Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York参照) の下位区分の、全ての糸状のものを意味する。これらの糸状菌は、キチン、セルロース、及び他の複合ポリサッカライドから成る植物性菌糸体を供えることを特徴とする。
糸状菌は、形態学的、生理学的、及び遺伝的に酵母とは異なる。糸状菌の植物的成長は分岐菌糸の伸長により、炭素異化は好気的である。
糸状菌の親細胞の非限定的例示として、Trichoderma (例えばT. reesei、以前はT. ロンジブラチアタム(longibrachiatum) として分類されていた無性形態のヒポクレア・ジュコリナ (Hypocrea jecorina)、トリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride)、トリコデルマ・コニンギー(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ハージアナム (Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765及び ATCC No. 26921)；ペニシリウム属、フミコーラ属 (例えばH.インソレンス(insolens)、H.ラヌギノス(lanuginose)、またはH. グリセア(grisea))；クリソスポリウム属 (Chrysosporium) (例えばC. ラクノウエンス (lucknowense))、グリオクラディウム属 (Gliocladium)、 アスペルギルス属 (例えばA. オリザエ、A. ニガー、A ソジャエ(sojae)、A.ジャポニカス(japonicus)、A. ニジュランス (nidulans)、または A. アワモリ) (Ward et al、Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 及び Goedegebuur et al, Genet 41: 89-98, 2002)、フザリウム(Fusarium)属 (例えばF. ロゼウム(roseum), F. グラミナム(graminum)、F. セレアリス(cerealis)、F. オキスポルイム(oxysporuim)、またはF. ベネナタム(venenatum))、ニューロスポラ属(Neurospora) (例えばN. クラッサ(crassa))、ヒポクレア属、 ムコール属(Mucor) (例えばM. ミエヘイ(miehe))、 リゾパス属(Rhizopus)、及びエメリセラ属(Emericella) (Innis et al, Sci. 228: 21-26, 1985参照) 等が挙げられる。
「トリコデルマ」または「トリコデルマ属」または「トリコデルマ種」というときは、過去または現在においてトリコデルマに分類されている菌類を意味する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、菌類はA.ニジュランス、A.アワモリ、A.オリザエ、A.アクレアタス(aculeatus)、 A.ニガー、A.ジャポニカス、T.リーゼイ、T.ビリデ、F.オキシスポラム、またはF.ソラニ(solani)のいずれかである。アスペルギルス株は、その全内容、特に菌類に関して本願に参照として組み込むWard et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993及びGoedegebuur et al., Curr Gene 41 :89-98, 2002に開示されている。特定の実施形態では、菌類はT.リーゼイ等のトリコデルマ株である。T.リーゼイ株は公知であり、非限定的例示としてATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767, 及びNRRL 15709が挙げられる。これらを、その全内容、特にT.リーゼイ株に関して本願に参照として組み込む。いくつかの実施形態では、宿主株はRL-P37の誘導体である。RL-P37は、その全内容、特にT.リーゼイ株に関して本願に参照として組み込むSheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984に開示されている。
【００９９】
いくつかの実施形態では、有機体の起源は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、またはカンジダ属等の酵母である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、有機体の起源は、B.リケニフォルミス(lichenformis)またはB. subtilis等のBacillus株、P. シトレア等のパントエア (Pantoea)株、P. アルカリゲンス(alcaligenes) 等のシュードモナス (Pseudomonas) 株、S.リビダンス (lividans)、またはS.ルビジノサス (rubiginosus)等のストレプトミセス (Streptomyces) 株、またはE. coli等のエシェリキア株等の細菌である。
【０１０１】
「バシラス属」には、当業者に知られている全ての「バシラス」属の種が含まれ、非限定的例示としてB. subtilis、B. lichenformis、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)が挙げられる。
バシラス属に関して、分類学上の見直しが引き続いて行われている。したがって、本願のバシラス属には、現在は「ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス」と呼ばれているB. ステアロサーモフィラス等の、再分類された有機体も含まれる。酸素の存在下で耐性内生胞子を生成することがバシラス属の特徴と考えられるが、このような特徴は最近アリシクロバシラス(Alicyclobacillus)、アンフィバシラス(Amphibacillus)、アニューリニバシラス(Aneurinibacillus)、アノキシバシラス(Anoxybacillus)、ブレビバシラス (Brevibacillus)、フィロバシラス(Filobacillus)、グラシリバシラス(Gracilibacillus)、ハロバシラス(Halobacillus)、パエニバシラス(Paenibacillus)、サリバシラス(Salibacillus)、サーモバシラス(Thermobacillus)、ウレイバシラス(Ureibacillus)、及びバージバシラス (Virgibacillus)と命名されたものにも当てはまる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、有機体の起源はグラム陽性細菌である。非限定的例示として、ストレプトミセス株 (例えばS.リビダンス、S.コエリカラー(coelicolor),またはS.グリセウス(griseus))、及びバシラスが挙げられる。いくつかの実施形態では、有機体の起源はE. coliまたはシュードモナス属等のグラム陰性細菌である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、有機体の起源はマメ亜科等のマメ科由来の植物等の植物である。いくつかの実施形態では、有機体の起源はkudzu(クズ)、poplar(例えばPopulus alba x tremula CAC35696)、aspen (例えばPopulus tremuloides)、またはQuercus robur(ヨーロッパナラ)等である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、有機体の起源は緑藻類、紅藻類、灰色藻類(glaucophytes)、クロララクニオン藻(chlorarachniophytes)、ユーグレナ(euglenids)、クロミスタ(chromista)、または渦鞭毛藻(dinoflagellates)等の藻類である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、有機体の起源は形態に基づき以下に分類されるシアノバクテリアである：クロオコッカス目(Chroococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、スティゴネマ目(Stigonematales)。
【０１０６】
＜宿主細胞の例＞
本願の方法により、種々の宿主細胞を用いてイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させてイソプレンを生成させることができる。宿主細胞の例には前記の「有機体源の例」に示した有機体が含まれる。宿主細胞は、天然においてイソプレンを生成するか、または天然においてイソプレンを生成しない細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然においてDXP経路によりイソプレンを生成し、イソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、および／またはMVA経路核酸の追加により、DXP経路によるイソプレン生成が強化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然においてMVA経路によりイソプレンを生成し、イソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、および／またはMVA経路核酸の追加により、MVA経路によるイソプレン生成が強化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然においてDXP経路によりイソプレンを生成し、イソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、および／またはMVA経路核酸の追加により、MVA経路及びDXP経路の一部または全部を用いることによってもイソプレンを生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は天然においてDXP経路及びMVA経路によりイソプレンを生成し、イソプレンシンターゼ、  ＤＸＳ、  ＩＤＩ、および／またはMVA経路核酸の追加により、DXP経路及びMVA経路のいずれか一方または両方によるイソプレン生成が強化される。
【０１０７】
＜形質転換方法の例＞
標準的方法により、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路核酸、あるいはこれらを含むベクターを宿主細胞(例えば本願に開示する植物性細胞、菌類細胞、酵母細胞、または細菌細胞) 中に挿入し、コードされたイソプレンシンターゼ、DXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドを発現させることができる。
宿主細胞へのDNA構築体又はベクターの導入方法として、形質転換、エレクトロポレーション、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(例えばリポフェクション仲介、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクションまたは組み換えファージウイルスを用いたトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿によるインキュベーション、DNAで被覆したマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃、及びプロトプラスト融合が挙げられる。
一般的な形質転換技術は公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Chapter 9, 1987; Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; 及び Campbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989,参照。これらの文献を、その全内容、特に形質転換の方法に関して本願に参照として組み込む。） 
トリコデルマ中での非相同ポリペプチドの発現が、U.S.P 6,022,725; U.S.P 6,268,328; U.S.P 7,262,041 ;WO 2005/001036; Harkki et al; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al, Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; 及び Nevalainen et al. , "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes " in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129 - 148, 1992 に記載されている。これらの文献を、その全内容、特に形質転換及び発現方法に関して本願に参照として組み込む。
また、アスペルギルス株の形質転換に関しては、Cao et al, (Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023; and Yelton et al, Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 が参照される。この文献を、その全内容、特に形質転換の方法に関して本願に参照として組み込む。
導入された核酸は染色体DNA中に組み込むか、または染色体外の複製用配列として保管する。
【０１０８】
公知の方法により形質転換細胞を選別することができる。非限定的例示において、amdSマーカを含む安定な形質転換細胞は、アセトアミドを含む固形状培地において成長速度が速いこと、及び形成されたコロニーの輪郭形状がギザギザではなくなだらかな円形であることにより、不安定な形質転換細胞から区別することができる。あるいは、形質転換細胞を固形状の非選択的培地（例えばアセトアミドを含まない培地）で培養し、この培地から胞子を回収し、次にアセトアミドを含む選択的固形状培地において発芽し成長する胞子のパーセンテージを測定することにより安定性試験を行なう場合がある。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、菌類細胞をプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換を含む方法により形質転換し、次に公知の方法で細胞壁を再生する。特定の実施形態では、形質転換用のトリコデルマ属の調製において、菌の菌糸体 (その全内容、特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込むCampbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989参照) からプロトプラストを調製する。
いくつかの実施形態では、菌糸体を成長した植物性胞子から得る。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素で処理することによりプロトプラストを得ることができる。次に懸濁媒体中のプロトプラストを、浸透圧安定剤により保護する。浸透圧安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含有する。浸透圧安定剤の濃度は0.8 Mから1.2 Mの間である。懸濁媒体中のソルビトールが約1.2Mの溶液を用いることが好ましい。
【０１１０】
宿主トリコデルマ属株中へのDNAの取込は、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、約10mMのCaCl2及び50mMのCaCl2を含む取り込み溶液が用いられる。通常、取り込み溶液にはカルシウムイオンの他に、TE 緩衝液 (10Mm Tris, pH7.4; 1mM EDTA) または10mM MOPS, pH6.0 緩衝液 (モルフォリンプロパンスルホン酸) 等の緩衝液系、及びポリエチレングリコール (PEG)などの成分が含まれている。理論により限定することは意図しないが、ポリエチレングリコールが細胞膜を溶解させることにより、媒体の成分をトリコデルマ属株の細胞質中へ浸入させ、プラスミドDNAを核に移動させることができると考えられる。この溶解により、宿主染色体中へ多数のプラスミドDNAのコピーを組み込むことができる。
【０１１１】
通常、形質転換には、トリコデルマ属プロトプラスト、または濃度105から107/mL (例えば2×106/mL)において浸透処理された細胞を含む懸濁液が用いられる。これらのプロトプラストまたは細胞を含む適切な溶液（例えば1.2Mソルビトール及び50mM CaCl2）100μLを所望のDNAと混合する。一般に、高濃度のPEGを取込溶液に添加する。0.1から1容積の25% PEG 4000をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。いくつかの実施形態では、約0.25容積をプロトプラスト懸濁液に添加する。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤を取込溶液に添加して、形質転換を補助することもできる。同様の方法を他の菌類宿主細胞に適用することもできる(その全内容、特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込むU.S.P 6,022,725 及び 6,268,328参照)。
【０１１２】
通常、この混合物を約0℃において10から30分間培養する。所望の核酸配列の取り込みを促進するために、混合物にさらにPEGを添加する。通常、形質転換混合物の容積の5から15倍の量の25% PEG 4000を添加する。しかし、これより多い量、又は少ない量であってもよい。好ましくは、形質転換混合物の容積の約10倍の量の25% PEG 4000を添加する。PEGを添加した後、形質転換混合物を室温または氷上で培養し、次にソルビトール及びCaCl2溶液を添加する。次に、プロトプラスト懸濁液を成長培地の溶融アリコート(aliquot)に添加する。培地に成長選択剤（例えばアセトアミドまたは抗生物質）が含まれているとき、形質転換細胞のみが成長する。
【０１１３】
細菌細胞の形質転換は、その全内容、特に形質転換方法に関して本願に参照として組み込むSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982に記載された方法等の、公知の方法に従って行うことができる。
【０１１４】
＜細胞培養培地の例＞
この発明は、イソプレンを生成する培養細胞または細胞の集団にも関する。「培養細胞」とは、細胞が1以上の細胞分裂することを可能にする溶液中（例えば細胞培地）にある2以上の細胞を意味する。「培養細胞」には、植物組織に分化した細胞を含む生きた多細胞植物の一部である植物細胞は含まれない。いくつかの実施形態では、培養された細胞には少なくとも約10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000またはそれ以上の細胞が含まれる。
【０１１５】
宿主細胞の培養には任意の炭素源を用いることができる。「炭素源」とは、1以上の炭素を含む化合物であって、宿主細胞または有機体によって代謝される化合物を意味する。例えば、宿主細胞を培養する細胞培地には、宿主細胞の生存能力または成長を維持することができる炭素源が含まれている。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、炭素源は炭水化物 (例えばモノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、またはポリサッカライド)、転化糖 (例えば酵素処理されたサッカロースシロップ)、グリセロール、グリセリン (例えばバイオディーゼル油またはセッケン製造工程の副産物のグリセリン)、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル (例えばコーン油、パーム油、大豆油等の植物または野菜のオイル)、アセテート、動物油脂、動物オイル、脂肪酸(例えば飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、またはポリ不飽和脂肪酸)、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、ポリペプチド (例えば微生物製または植物性タンパク質またはペプチド)、再生可能な炭素源(例えば加水分解されたバイオマス炭素源等のバイオマス炭素源)、酵母エキス、酵母エキスの成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、アセテート、エタノール、またはこれらの2以上の組合せ等である。
いくつかの実施形態では、炭素源は光合成の生成物であり、例えばグルコースであるが、これに限定されない。
【０１１７】
モノサッカライドの例にはグルコースとフルクトースが含まれる。オリゴサッカライドの例にはラクトースとサッカロースが含まれる。ポリサッカライドの例には澱粉とセルロースが含まれる。炭水化物の例にはC6糖(例えばフルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース)及びC5糖(例えばキシロースまたはアラビノース)が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と炭水化物以外の炭素源(例えばグリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、1-炭素源、オイル、動物油脂、動物オイル、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、再生可能な炭素源、または酵母エキスの成分)とが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培地には炭水化物と、ポリペプチド(例えば細菌性または植物性タンパク質またはペプチド)とが含まれる。いくつかの実施形態では、細菌性ポリペプチドは、酵母または細菌由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物性ポリペプチドは、大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、ブロス1リットルについて少なくとも約5グラム(g/L、ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400g/L以上、またはこれら以上である。いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は約50から約400g/L、例えば約100から約360g/L、約120から約360g/L、約200から約300g/Lである。いくつかの実施形態では、この炭水化物の濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した炭水化物の総量に基づく濃度である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、細胞をグルコース制限条件下で培養する。「グルコース制限条件」と言うときは、添加するグルコースの量が、細胞により消費されるグルコースの量の約105% (例えば約100%)以下であることを意味する。特定の実施形態では、培養培地に添加するグルコースの量は、特定の時間内に細胞が消費するグルコースの量とほぼ同量である。いくつかの実施形態では、細胞が細胞培地に含有されるグルコースの量で維持され得る速度で成長するように、添加するグルコースの量を制限することにより、細胞の成長速度をコントロールする。いくつかの実施形態では、細胞の培養中に、グルコースは蓄積しない。様々な実施形態では、細胞をグルコース制限条件下で約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、または70時間以上培養する。様々な実施形態では、細胞の総培養時間の約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95、または100%の時間において、細胞をグルコース制限条件下で培養する。理論により限定することは意図しないが、グルコース制限条件により細胞を管理しやすくなると考えられる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、細胞を過剰なグルコースの存在下で培養する。特定の実施形態では、添加するグルコースの量は、特定の期間中に細胞が消費するグルコースの量の約105%、又はこれより多い (例えば約110、120、150、175、200、250、300、400、または500%以上)。いくつかの実施形態では、細胞の培養中にグルコースが蓄積する。
【０１２１】
脂質の例は、C4以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸を1以上含む物質である。
【０１２２】
オイルの例は、室温で液体の脂質である。いくつかの実施形態では、脂質にはC4以上の脂肪酸(例えば炭素数が4以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸の1以上)が1以上含まれる。いくつかの実施形態では、オイルは大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼまたはこれらの2以上の組み合わせから成る。
【０１２３】
脂肪酸の例には、式RCOOHで表される化合物が含まれ、ここで「R」は炭化水素である。不飽和脂肪酸の例には、「R」に少なくとも1の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。不飽和脂肪酸の非限定的例示としてオレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。多価不飽和脂肪酸の例には、「R」に複数の炭素−炭素二重結合を有する化合物が含まれる。飽和脂肪酸の例には、「R」が飽和脂肪族基である化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、炭素源には1以上のC2からC22の脂肪酸が含まれ、例えばC12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸が含まれる。ひとつの実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。いくつかの実施形態では、炭素源は脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の塩 (例えば不飽和脂肪酸)、脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体、または脂肪酸 (例えば不飽和脂肪酸) の誘導体の塩である。好ましい塩の非限定的例示として、リチウム塩、カリウム塩、及びナトリウム塩等が挙げられる。ジ-及びトリ-グリセロールは、グリセロールの脂肪酸エステルである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度はブロス1リットル当り少なくとも1グラム(g/L、ここでブロスの容積には細胞の容積及び細胞培地の容積が含まれる) であり、例えば少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400g/L以上、またはこれら以上である。いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの濃度は約10から約400g/Lであり、例えば約25から約300g/L、約60から約180g/L、または約75から約150g/Lである。いくつかの実施形態では、この濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの総量に基づく濃度である。いくつかの実施形態では、炭素源には(i)脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド、及び(ii)グルコース等の炭水化物が含まれる。いくつかの実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドと炭水化物との比率は、炭素を基準として（すなわち、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライド中の炭素1個に対する炭水化物中の炭素の数）約1:1である。特定の実施形態では、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、またはトリグリセライドの量は約60から180g/Lで、炭水化物の量は約120から360 g/Lである。
【０１２５】
微生物ポリペプチド炭素源の例には、酵母または細菌由来のポリペプチドの1以上が含まれる。植物性ポリペプチド炭素源の例には、大豆、コーン、キャンーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、菜種、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、または亜麻仁由来のポリペプチドの1以上が含まれる。
【０１２６】
再生可能な炭素源の例には、チーズホエーパーミエイト(cheese whey permeate)、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、シュガービートモラセス(sugar beet molasses)、大麦モルト、及びこれらに由来する成分が含まれる。また再生可能な炭素源の例には、例えばコーン、スイッチグラス、サトウキビ、発酵プロセスにおける廃細胞、及び大豆、コーン、または小麦製粉時のタンパク質副産物等のバイオマス中のグルコース、ヘキソース、ペントース、及びキシロースが含まれる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリノグリセルロース系、ヘミセルロース系、またはセルロース系の基質であり、その非限定的例示として草、小麦、麦わら、 バガス、サトウキビバガス、針葉樹パルプ、コーン、コーン穂軸または皮、コーン穀粒、コーン穀粒繊維、コーン茎葉、スイッチグラス、籾殻、または穀物(例えばコーン、ソルガム、ライ麦、トリティケイト(triticate)、大麦、小麦、および／または蒸留酒穀物残渣)の湿式または乾式製粉における副産物が挙げられる。セルロース系基質の例には、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、及び果肉が含まれる。いくつかの実施形態では、炭素源には柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が含まれる。いくつかの実施形態では、次の植物の一部または全部を炭素源として用いる：コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビおよび／またはタピオカ。いくつかの実施形態では、炭素源はバイオマス加水分解物であり、例えばキシロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物、またはサッカロースとグルコースの両者を含むバイオマス加水分解物である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源 (例えばバイオマス)を細胞培地に添加する前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理には酵素的前処理、化学的前処理、及び酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせ (例えば、その全内容、特に再生可能な炭素源の前処理に関して本願に参照として組み込むFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; U.S.P  6,176,176; U.S.P 6,106,888参照)が含まれる。いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えばコーン茎葉）を細胞培地に添加する前に、アンモニア繊維膨潤(AFEX)前処理する（例えばFarzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005参照）。AFEX前処理の間、再生可能な炭素源を、液状無水アンモニアにより中程度の温度（例えば約60から約100℃）において高圧（例えば約250から約300psi）で約5分間処理する。次に、圧力を急激に下げる。このプロセスでは、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース非結晶化、及び表面積増加等の化学的及び物理的効果の組み合わせにより、セルロースとヘミセルロースを酵素転換してほぼ完全に発酵性糖へ転換することができる。AFEX前処理ではアンモニアのほぼ全量を回収して再使用することができるとともに、残量を下流側プロセス中の細菌の窒素源として用いることができる。また、AFEX前処理では洗浄ストリームは不要である。AFEX処理後の乾燥物質の回収率は実質的に100%である。基本的にAFEXは乾燥状態から乾燥状態へのプロセスである。処理された再生可能な炭素源は長期間安定であり、酵素加水分解または発酵プロセスへ高固形成分率で供給することができる。AFEX処理中、ヘミセルロース及びセルロースは殆ど分解せず、十分保存される。AFEX前処理した再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要は無い。AFEX処理炭素源を酵素加水分解することにより、次の発酵工程で使用するための清浄な糖ストリームを製造することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、少なくとも約0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、または50%グルコース(w/v) に等しい量である。グルコースに等しい量は、標準的HPLC法においてグルコースを参照として用いて炭素源から生成するグルコースの量を測定することにより、求めることができる。いくつかの実施形態では、炭素源（例えば再生可能な炭素源）の濃度は、約0.1から約20%グルコースであり、例えば約0.1から約10%グルコース、約0.5から約10%グルコース、約1から約10%グルコース、約1から約5%グルコース、または約1から約2%グルコースである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス、または酵母エキスの1以上の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り少なくとも1グラム（g/L、ここでブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる）であり、例えば少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300g/Lまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、ブロス1リットル当り約1から約300g/L、例えば約1から約200g/L、約5から約200g/L、約5から約100g/L、約5から約60g/Lである。いくつかの実施形態では、酵母エキスの濃度は、宿主細胞の培養の前および／または途中に添加した酵母エキスの総量に基づく濃度である。いくつかの実施形態では、炭素源には酵母エキス（またはその成分の1以上）と、グルコース等の他の炭素源との両者が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母エキスと他の炭素源の比率は約1 :5、約1 : 10、または約1 :20 (w/w)である。
【０１３１】
あるいは、炭素源は二酸化炭素やメタノール等の1炭素基質でもよい。メチロトローフ酵母  (その全内容、特に炭素源に関して本願に参照として組み込むYamada et al, Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989参照)  や細菌  (その全内容、特に炭素源に関して本願に参照として組み込むHunter et al, Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985参照)  により、1炭素基質  (例えばメタノール、ホルムアルデヒド、またはギ酸塩)  からグリセロールが生成されることが報告されている。これらの有機体はメタンからギ酸塩の範囲の酸化状態にある1炭素基質を取り込んでグリセロールを生成することができる。炭素の取り込み経路は、リブロースモノホスフェート経由の経路、セリン経由の経路、またはキシロースモノホスフェート経由の経路(その全内容、特に炭素源に関して本願に参照として組み込むGottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York, 1986参照)のいずれかである。リブロースモノホスフェート経路では、リブロース-5-ホスフェートによりギ酸塩が縮合されてフルクトースと成る炭素数6の糖が形成され、最終的に炭素数3のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートとなる。またセリン経路では、1炭素基質をメチレンテトラヒドロフォレートを経由して糖分解経路に取り込む。
【０１３２】
炭素数が1または2の基質の他に、メチロトローフ有機体は、例えばメチルアミン、グルコースアミン、及び代謝活性に関与する種々のアミノ酸等、様々な種類の炭素含有化合物を利用できることが知られている。例えばメチロトローフ酵母はメチルアミンの炭素からトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている(例えばその全内容、特に炭素源に関して本願に参照として組み込むBellion et al, Microb. Growth Cl Compd, [Int. Symp.], 7th ed., 415-32. Editors: Murrell et al, Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993参照)。また、種々のカンジダ(Candida)属の種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（その全内容、特に炭素源に関して本願に参照として組み込むSulter et al, Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990参照）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、細胞を生理食塩水と栄養源とを含む標準的培地で培養する（例えば、その全内容、特に細胞培地に関して本願に参照として組み込むPourquie, J. et al, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al, Academic Press, pp. 71-86, 1988 and Ilmen et al, Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306, 1997参照）。培養培地の例として、Luria Bertani (LB) ブロス、Sabouraud Dextrose (SD)ブロス、またはYeast medium (YM)ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。これ以外の合成培地を用いることもできる。分子生物学または発酵の分野の当業者であれば、特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【０１３４】
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン生成を促進すること（例えば、その全内容、特に細胞培地及び培養条件に関して本願に参照として組み込むWO 2004/033646及びWO 96/35796及びこれらに引用された文献参照）が当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸が誘導プロモータの制御下にある場合、イソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドの発現を誘発させるために有効な濃度の誘発剤（例えば糖、金属塩、または抗菌剤）を培地に添加することが望ましい。いくつかの実施形態では細胞培地には抗生物質（例えばカナマイシン）が含まれ、この抗生物質は、1以上のイソプレンシンターゼDXS、IDI,および／またはMVA経路核酸を有するベクターに含まれる抗生物質耐性核酸（例えばカナマイシン耐性核酸）に対応する。
【０１３５】
＜細胞培養条件の例＞
細菌培地の維持及び培養に適した物質と方法は公知である。一例として、例えば、その全内容、特に細胞培養技術に関して本願に参照として組み込むManual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) または Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MAを参照することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞に挿入した核酸によりコードされるイソプレンシンターゼDXS, IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドが発現される条件下で、細胞培地において細胞を培養する。
【０１３６】
細胞の培養には、標準的な細胞培養条件を用いることができる（例えば、その全内容、特に細胞培養及び発酵に関して本願に参照として組み込むWO2004/033646及びそこに引用された文献参照）。細胞は適切な温度、ガス組成、及びpH(例えば約20から約37℃、CO2約6%から約84%、pH 約5から約9)において培養され、維持される。いくつかの実施形態では、細胞を適切な培地において35℃で培養する。いくつかの実施形態では、所望の量のイソプレンが生成されるまで、振蕩培地または培養中の適切な培地において約28℃で細胞を培養する。いくつかの実施形態では、発酵時のpHは約pH5.0から約pH9.0の範囲（例えば約pH6.0から約pH8.0、または約pH6.5から約pH7.0）である。反応は、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で行う。糸状菌類の培養条件は公知であり、科学技術文献、および／またはAmerican Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center等の菌類の供給源から情報を得ることができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞をバッチ法、流加培養法、または連続法等の公知の発酵方法を用いて培養する。いくつかの実施形態では、バッチ法を用いて培養する。従来のバッチ法発酵はクローズドシステムであり、発酵開始時に培地組成物に仕込み、発酵中人為的な変更は行わない。すなわち、発酵開始時に所定の宿主細胞を細胞培地に植菌し、何も添加せずに発酵させる。しかし、一般には「バッチ法」発酵は炭素源の添加に関してバッチであり、通常はpHや酸素濃度等の制御が行われる。バッチシステムでは、システムの代謝体とバイオマス組成が発酵を停止するまで連続的に変化する。バッチ法の培地では、細胞は穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する静止期に至る。いくつかの実施形態では、対数増殖期の細胞が大部分のイソプレンを生成する。いくつかの実施形態では、静止期の細胞がイソプレンを生成する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、流加培養法等の標準的バッチ法を一部変更して実施する。流加培養法発酵プロセスは、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する点を除き、通常のバッチ法と同様にして行う。流加培養法は、異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向があり、細胞培地中の炭素源の量を制限することが好ましい場合に有効である。流加培養法発酵は、制限された量または過剰な量の炭素源（例えばグルコース）を用いて行うことができる。流加培養法において実際の炭素源濃度を測定することは難しいため、pH、溶存酸素、またはCO2等の廃ガスの分圧等の測定可能な項目の変化から推定する。バッチ法及び流加培養法培養は一般的であり公知である。これらの例は、その全内容、特に細胞培地と発酵条件に関して本願に参照として組み込むBrock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.に記載されている。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、連続培養法を用いる。連続発酵は、バイオリアクターに所定量の発酵培地を連続的に供給しながら、同量の処理された培地を回収してさらに加工する。連続培養法では培養物を一定の高密度に保ち、細胞は主に対数増殖期にある。
【０１４０】
連続培養法では、細胞の成長やイソプレンの生成に影響する1以上の因子を調節することができる。例えば、一例では炭素源または窒素のレベル等の制限栄養素を一定値に保ちながら他の因子を調節する。別の例では、細胞濃度（例えば培養液の懸濁度から求めた濃度）を一定に保ちながらその他の細胞の成長に影響する複数の因子を調節する。連続培養法では、安定な成長状態を維持するようにする。すなわち、培地の抜き出しによる細胞の減少を、発酵による細胞の増加で補う。連続培養法における栄養素と成長因子の調節方法と製品の生成速度を最大にする方法は分子生物学の分野では公知であり、その全内容、特に細胞培地と発酵条件に関して本願に参照として組み込むBrock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.に記載されている。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞を担体上に固定して全細胞触媒とし、イソプレンを生成するための発酵条件下におく。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ボトルに入れた培養液を振蕩機に取り付け、酸素を培養液に導入するとともに、培養液を均一にする。いくつかの実施形態では、インキュベータを用いて細胞を成長させる際の温度、湿度、振蕩速度および／または他の条件を制御する。最も簡単なインキュベータは断熱された箱と調整可能なヒーターから成り、通常約65℃まで加熱できる。より洗練されたインキュベータは（冷凍機により）温度を下げる機能を備え、あるいは湿度またはCO2濃度を調整する機能を備える。大多数のインキュベータはタイマーを備え、温度、湿度等のサイクルをプログラム可能なインキュベータもある。インキュベータのサイズは卓上型から小さな部屋程度の大きさまで様々である。
【０１４３】
所望により、細胞培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給、および／または悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物と死んだ細胞の蓄積を防ぐことができる。懸濁培養液の場合、培養液から細胞を遠心分離または濾過により分離し、次に新鮮な培養液中に分離した細胞を再懸濁させることができる。粘着性の培養物の場合、培養液をアスピレーションにより直接除去して入れ換えることができる。いくつかの実施形態では、連続培養法（例えば希釈しない連続培養法）において、細胞培地中で細胞の少なくとも一部を少なくとも約5回,または 10、20、40、50、60、65回またはそれ以上細胞分裂させることができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、構成的プロモータまたは漏出型（leaky）プロモータ（例えばTrcプロモータ）を用い、プロモータに作動可能に結合したイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸の発現を誘発するための化合物（例えばIPTG）は添加しない。いくつかの実施形態では、化合物（例えばIPTG）を添加してプロモータに作動可能に結合したイソプレンシンターゼDXS、IDI,またはMVA経路核酸の発現を誘導する。
【０１４５】
＜イソプレン生成と、細胞成長とを分離する方法の例＞
原料中の炭素を、細胞の成長及び維持ではなく、イソプレンへの転換に利用することが望ましい。いくつかの実施形態では、細胞を低または中程度のOD600まで成長させ、次にイソプレンの生成を開始させるか、または増加させる。この手順により、かなりの量の炭素をイソプレンに転換することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、細胞がそれ以上分裂しないか、または分裂は非常にゆっくりであるが、イソプレンの生成が数時間(例えば約2、4、6、8、10、15、20、25、30時間,またはそれ以上)続くような光学密度に達する。例えば、図60A-67Cは、細胞がそれ以上分裂しないか、または分裂は非常にゆっくりであるが、相当な量のメバロン酸またはイソプレンの生成が数時間続くような光学密度に達することを示している。いくつかの場合では、550nmの光学密度が経時的に低下 (例えば細胞の溶解により、細胞が対数成長期を過ぎたことによる光学密度の低下、成長の停止、栄養の欠乏、または細胞の成長を阻害する他の要因による光学密度の低下) し、一方、細胞は相当な量のメバロン酸またはイソプレンを生成し続ける。
いくつかの実施形態では、ある期間中(例えば約5、10、15、20、25、30、40、50または60時間以上)、細胞の550nmの光学密度の増加が約50%以下(例えば約40、30、20、10、5、または0%)であり、この期間において、細胞からイソプレンが約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000; 1,250; 1,500; 1,750; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000 nmole/細胞の湿潤重量1グラム/時間(nmole/gwcm/hr)、またはそれ以上生成する。
いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約2から約5000 nmole/gwcm/hr、約2から約100 nmole/gwcm/hr、約100から約500 nmole/gwcm/hr、約150から約500 nmole/gwcm/hr、約500から約1000 nmole/gwcm/hr、約1000から約2000 nmole/gwcm/hror、約2000から約5000 nmole/gwcm/hrである。
いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約20から約5000 nmole/gwcm/hr、約100から約5000 nmole/gwcm/hr、約200から約2000 nmole/gwcm/hr、約200から約1000 nmole/gwcm/hr、約300から約1000 nmole/gwcm/hrまたは約400から約1000 nmole/gwcm/hrである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ある期間中(例えば約5、10、15、20、25、30、40、50または60時間以上)、細胞の550 nmの光学密度の増加が約50%以下(例えば約40、30、20、10、5、または0%)であり、この期間において、細胞から生成するイソプレンの力価（合計）が約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000 mg /ブロス1L (mg/Lbroth、ここでブロスの容積には細胞及び細胞培地の容積が含まれる)以上、またはこれ以上である。
いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約2から約5,000 mg/Lbroth、例えば約2から約100 mg/Lbroth、約100から約500 mg/Lbroth、約500から約1,000 mg/Lbroth、約1,000から約2,000 mg/Lbroth、または約2,000から約5,000 mg/Lbrothである。
いくつかの実施形態では、イソプレンの量が約20から約5,000 mg/Lbroth、約100から約5,000 mg/Lbroth、約200から約2,000 mg/Lbroth、約200から約1,000 mg/Lbroth、約300から約1,000 mg/Lbroth、または約400から約1,000 mg/Lbrothである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ある期間中(例えば約5、10、15、20、25、30、40、50または60時間以上)、細胞の550 nmの光学密度の増加が約50%以下(例えば約40、30、20、10、5、または0%)であり、この期間において、細胞により細胞培地中の炭素の約0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0,または8.0%がイソプレンに転換される。
いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から約4.0%、約0.002から約3.0%、約0.002から約2.0%、約0.002から約1.6%、約0.002から約0.005%、約0.005から約0.01%、約0.01から約0.05%、約0.05から約0.15%、0.15から約0.2%、約0.2から約0.3%、約0.3から約0.5%、約0.5から約0.8%、約0.8から約1.0%、または約1.0から約1.6%である。
いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から約0.4%、0.002から約0.16%、0.04から約0.16%、約0.005から約0.3%、約0.01から約0.3%、または約0.05から約0.3%である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、イソプレンは静止期においてのみ生成される。いくつかの実施形態では、イソプレンは成長期と静止期との双方で生成される。様々な実施形態では、静止期において生成されるイソプレンの量(例えば総イソプレン生成量、または、イソプレン生成量/ブロス1リットル/hr/ OD600)は、同じ長さの時間で比較したとき、成長期の約2、3、4、5、10、20、30、40、50倍またはそれ以上である。様々な実施形態では、総イソプレン生成量の約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99%以上またはそれ以上が、細胞が静止期にあるときに生成される(例えばある期間、例えば20時間の発酵におけるイソプレン生成)。
いくつかの実施形態では、総イソプレン生成量の約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99%以上またはそれ以上が、細胞がゆっくり分裂するか、または全く分裂しておらず、細胞の550nmの光学密度の増加が50%以下(例えば約40、30、20、10、5、または0%以下)であるときに生成される(例えばある期間、例えば20時間の発酵におけるイソプレン生成)。
いくつかの実施形態では、イソプレンは成長期においてのみ生成される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、1以上のMVA経路、IDI、DXPまたはイソプレンシンターゼ核酸は、成長期よりも静止期においてより活性となるプロモータ又は因子の制御下に置かれる。例えば、1以上のMVA経路、IDI、DXPまたはイソプレンシンターゼ核酸は、RpoS等の静止期シグマ因子の制御下に置かれる。いくつかの実施形態では、1以上のMVA経路、IDI、DXPまたはイソプレンシンターゼ核酸は、例えば静止期において活性な応答調節因子により誘導されるプロモータ等の、静止期において誘導されるプロモータの制御下に置かれる。
【０１５１】
＜安全操業範囲でのイソプレン生成＞
イソプレンの燃焼性に基づいた安全操業範囲内でのイソプレンの製造は、商用設備の設計及び製造を簡素化し、操業の安全性を大幅に向上させ、火災発生のの可能性を低減させる。特に、イソプレン製造の最適範囲は安全ゾーン、すなわち、イソプレン濃度の非燃焼性範囲内にある。一態様では、この発明は非燃焼性範囲内(イソプレンの燃焼範囲外)のイソプレン濃度においてイソプレンを製造する方法に関する。
【０１５２】
すなわち、プロセスの安全性を確保するために、コンピュータによるモデル化と、実験により、イソプレン(O2、N2、CO2,またはこれらのガスの2以上の存在下でのイソプレン)の燃焼限界を求めた。燃焼範囲は、燃焼限界の下限値(LFL)、燃焼限界の下限値(UFL)、限界酸素濃度(LOC)、及び燃焼限界温度によって特徴づけられる。燃焼性の系は、最少量の燃焼物(例えばイソプレン)、及び最少量の酸化性物質、通常は酸素が存在していなければならない。LFLは、燃焼を維持するために存在していなければならないイソプレンの最少量であり、UFLは、存在していてもよいイソプレンの最大量である。UFLを超えると混合物は燃焼物リッチになり、燃焼混合物となるには酸素濃度が低くなりすぎる。LOCは、燃焼混合物となるために存在していなければならない酸素の最小濃度である。燃焼限界温度は、イソプレンの引火点に基づいており、イソプレンの燃焼が伝播し得る最も低い温度である。これらの限界値はイソプレンの濃度、酸化性物質の種類及び濃度、系内の非活性物質の有無、温度、及び系の圧力により決まる。燃焼範囲内にある組成物では燃焼が伝播するため、プロセス設備の設計及び操作の両者において、安全に注意する必要がある。
【０１５３】
以下の条件について、コンピュータシミュレーション、数値解析、及び実験を行った。所望により、他の条件(例えば別の温度、圧力、及び永久ガス成分)について、本願に開示する方法を用いてLFL、UFL、及びLOC濃度を求めることができる。
(1) コンピュータシミュレーション及び数値解析
テスト第1組： 
イソプレン: 0 wt% - 14 wt% 
O2: 6 wt% - 21 wt% 
N2: 79 wt% - 94 wt% 
テスト第2組： 
イソプレン: 0 wt% - 14 wt% 
O2: 6 wt% - 21 wt% 
N2: 79 wt% - 94 wt% 
H2O で飽和
テスト第3組：
イソプレン: 0 wt% - 14 wt% 
O2: 6 wt% - 21 wt% 
N2: 79 wt% - 94 wt% 
CO2: 5 wt% - 30 wt% 
(2) 燃焼限界を最終的に求めるための実験
テスト第1組： 
イソプレン: 0 wt% - 14 wt% 
O2: 6 wt% - 21 wt% 
N2: 79 wt% - 94 wt% 
テスト第2組： 
イソプレン: 0 wt% - 14 wt% 
O2: 6 wt% - 21 wt% 
N2: 79 wt% - 94 wt% 
飽和 H2O 
【０１５４】
シミュレーションソフトウエアを用いて、いくつかの異なる試験条件についてその系の燃焼特性を評価した。CO2は系の燃焼限界にほとんど影響しないことが示された。テスト第1及び第2組について、実地試験を行った。モデル化の結果は、実地試験の結果と一致した。水を添加した場合にのみ、僅かな違いが認められた。
【０１５５】
40℃、1気圧において、イソプレン，O2、N2、及びCO2 を含む混合物のLOC は9.5 vol%であることが分かった。CO2を30%まで添加しても、イソプレン，O2、及びN2混合物の燃焼特性には殆んど影響しなかった。乾燥イソプレン、O2及びN2から成る系と、水蒸気飽和イソプレン、O2及びN2から成る系との間に、燃焼特性の僅かな違いが認められた。燃焼限界温度は約-54℃であった。-54℃より低温では、温度が低すぎてイソプレンの燃焼が伝播しなかった。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、系内の酸素濃度に応じて、イソプレンのLFLは約1.5 vol.%から約2.0 vol%の範囲となり、イソプレンのUFLは約2.0 vol.%から約12.0 vol.%の範囲となる。いくつかの実施形態では、LOCは酸素約9.5 vol%である。いくつかの実施形態では、温度が約25℃から約55℃(例えば約40℃)で、圧力が約1 気圧から3気圧のとき、イソプレンのLFLは約1.5 vol.%から約2.0 vol%の範囲であり、イソプレンのUFLは約2.0 vol.%から約12.0 vol.%の範囲で、LOCは酸素約9.5 vol%ある。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、約9.5 vol%未満の酸素(すなわち、イソプレンの燃焼混合物とするために必要なLOCより低い濃度)の存在下でイソプレンを製造する。約9.5 vol%以上の酸素の存在下でイソプレンを製造するいくつかの実施形態では、イソプレンの濃度をLFLより低くする(例えば約1.5 vol.%未満)。例えば、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することによって、イソプレンの濃度をLFLより低く保つ(例えば窒素等の不活性ガスを連続的または定期的に添加することにより、イソプレン組成物をLFLより低く保つ)。約9.5 vol%以上の酸素の存在下でイソプレンを製造するいくつかの実施形態では、イソプレンの濃度をUFLより高くする(例えば約12vol.%より高くする)。例えば、イソプレンをUFLより高い濃度で製造するシステム(例えば本願に開示する細胞培養システム)を用いて、イソプレン濃度をUFLより高く保つことができる。所望により、酸素濃度を低くすることにより、UFLを低くすることもできる。この場合、低濃度のイソプレンでも、UFLより高くすることができる。
【０１５８】
約9.5 vol%以上の酸素の存在下でイソプレンを製造するいくつかの実施形態では、イソプレン濃度を燃焼範囲内にする(例えばLFLとUFLの間)。イソプレン濃度が燃焼範囲内にあるいくつかの実施形態では、火災又は爆発を防ぐために、1以上の対策を行う。例えば、1以上の着火源(例えばスパークを生じ得る材料)を避ける。いくつかの実施形態では、1以上の対策として、イソプレンの濃度が燃焼範囲内となる期間を短縮する。いくつかの実施形態では、イソプレンの濃度が燃焼範囲内又はその近くにあることを検出するセンサーを用いる。所望により、細胞を培養している間にイソプレン濃度を1以上の時点で測定し、イソプレン濃度が燃焼範囲内又はその近くにあるときは、細胞培地の状態及び／又は不活性ガスの量を公知の方法により調整する。特定の実施形態では、細胞培地の状態(例えば発酵状態)を調整して、イソプレン濃度をLFLより低くするか、または、イソプレン濃度をUFLより高くする。いくつかの実施形態では、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することにより、イソプレン濃度をLFLより低く保つ(例えば不活性ガスを連続的または定期的に添加してイソプレン組成物をLFLより低く保つ)。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、イソプレン以外の揮発性成分(例えば1以上の糖類)の量は、生成するイソプレンの量の約2、5、10、50、75、または100分の一より少ない。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外のガス相は約0%から約100% (容積)の酸素から成り、例えば約0%から約10%、約10%から約20%、約20%から約30%、約30%から約40%、約40%から約50%、約50%から約60%、約60%から約70%、約70%から約80%、約90%から約90%、または約90%から約100%(容積)の酸素から成る。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外のガス相は約0%から約99% (容積)の窒素から成り、例えば約0%から約10%、約10%から約20%、約20%から約30%、約30%から約40%、約40%から約50%、約50%から約60%、約60%から約70%、約70%から約80%、約90%から約90%、or約90%から約99% (容積)の窒素から成る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外のガス相は約1%から約50% (容積)のCO2から成り、例えば約1%から約10%、約10%から約20%、約20%から約30%、約30%から約40%、約40%から約50% (容積)のCO2から成る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物にはエタノールも含有されている。例えば、エタノールはイソプレンの抽出蒸留に用いられ、この結果、イソプレン及びエタノールの両者を含む組成物(例えば中間製品ストリーム等)が生じる。エタノールの量は、エタノールの燃焼範囲外であることが望ましい。例えば約1気圧で約華氏60度の標準条件(その全内容、特にLOC、LFL、及びUFLの値に関し本願に組み込む NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems, 2008 edition参照)におけるエタノールのLOCは約8.7 vol%で、エタノールのLFLは約3.3 vol%である。いくつかの実施形態では、イソプレン及びエタノールを含む組成物は、エタノールの燃焼混合物となるために必要なLOC (例えば約8.7% vol%未満)より低い条件で製造される。イソプレン及びエタノールを含む組成物が、エタノールの燃焼混合物となるために必要なLOC以上の条件で製造されるいくつかの実施形態では、エタノールの濃度をLFL未満(例えば約3.3 vol.%未満)にする。
【０１６２】
様々な実施形態では、酸化性物質の量(例えば酸素)は、系内のいずれかの燃焼物(例えばイソプレン又はエタノール)のLOCより低い。様々な実施形態では、、酸化性物質の量(例えば酸素)は、イソプレン又はエタノールのLOCの約60、40、30、20、10、または5%未満である。様々な実施形態では、酸化性物質の量(例えば酸素)は、イソプレン又はエタノールのLOCに対し、パーセンテージ (vol %)の絶対値が少なくとも2、4、5ポイントまたはそれ以上低い。特定の実施形態では、酸素濃度は、イソプレン又はエタノールのLOCに対し、パーセンテージ (vol %)の絶対値が少なくとも2ポイント低い。(例えばイソプレンのLOCが9.5 vol%のとき、酸素濃度は7.5 vol%未満である。) 様々な実施形態では、燃焼物の量 (例えばイソプレン又はエタノール) は、その燃焼物のLFLの約25、20、15、10 または5%以下である。
【０１６３】
＜イソプレン生成の例＞
いくつかの実施形態では、細胞をイソプレンが生成される条件下の細胞培地において培養する。「ピーク絶対生産性」とは、細胞を特定の期間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときのオフガス中のイソプレンの最大絶対量を意味する。「ピーク絶対生産性時点」とは、発酵操業時における或る時点であって、細胞を特定の期間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときにオフガス中のイソプレンの絶対量が最大になる時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク絶対生産性時点において測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク絶対生成は、ほぼ本願に開示するイソプレンの量のいずれである。
【０１６４】
「ピーク比生産性」とは、細胞を特定の期間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときの、細胞当りのイソプレン生成の最大量を意味する。「ピーク比生産性時点」とは、細胞を特定の期間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養したときに、細胞当りのイソプレン生成が最大になる時点を意味する。ピーク比生産性は、総生産性を、600nmにおける光学密度(OD600)により求められる細胞の量で割り算して求めることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンの量をピーク比生産性時点において測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比生産性は、ほぼ本願に開示する細胞当りのイソプレンの量のいずれかである。
【０１６５】
「累積総生産性」とは、細胞を特定の期間（例えば特定の発酵操業時の細胞の培養）培養しているときに生成されたイソプレンの累積総量を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累積総量を測定する。いくつかの実施形態では、細胞の累積総生産性は、概略本願に開示するイソプレンの量のいずれかである。
【０１６６】
「相対検出器レスポンス」とは、1の成分(例えばイソプレン)の検出器レスポンス (例えばGC/MS面積)と、1以上の成分(例えば全C5炭化水素)の検出器レスポンス (例えばGC/MS面積)との比率を意味する。検出器レスポンスは本願に開示する方法で測定することができ、例えばAgilent HP-5MS GC/MSカラム(30 m x 250μm; 0.25μm フィルム厚)を備えたAgilent 6890 GC/MS測定装置によるGC/MS分析により測定することができる。所望により、相対検出器レスポンスを、各成分の応答ファクターを用いて重量パーセントに変換することができる。応答ファクターは、特定の成分の所与の成分により、どの程度のシグナルが生じるか (すなわち、特定の成分に対し検出器がどの程度敏感であるか) の指標である。比較する各成分に対する検出器の感度が異なる場合、相対検出器レスポンスを重量パーセントに変換する際の補正係数として応答ファクターを用いることができる。あるいは、比較する各成分の応答ファクターは同じであると見なすことにより、重量パーセントの概算値を求めることができる。すなわち、重量パーセントは相対検出器レスポンスとほぼ同じであると見なすことができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、培養細胞はイソプレンを約1 nmole/gwcm/hr(イソプレン1  nm/細胞の湿潤重量1g/時間)以上、または 約10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000 nmole/gwcm/hr以上、またはこれ以上生成する。
いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約2から約5,000 nmole/gwcm/hr、例えば約2から約100 nmole/gwcm/hr、約100から約500 nmole/gwcm/hr、約150から約500 nmole/gwcm/hr、約500から約1,000 nmole/gwcm/hr、約1,000から約2,000 nmole/gwcm/hr、約2,000から約5,000 nmole/gwcm/hrである。
いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約20から約5,000 nmole/gwcm/hr、約100から約5,000 nmole/gwcm/hr、約200から約2,000 nmole/gwcm/hr、約200から約1,000 nmole/gwcm/hr、約300から約1,000 nmole/gwcm/hr、または約400から約1,000 nmole/gwcm/hrである。
【０１６８】
単位nmole/gwcm/hrで表されるイソプレン量は、その全内容、特にイソプレンの生成量測定法を本願に参照として組み込むU.S.P 5,849,970に開示されている。例えば、2mLのヘッドスペース（例えば、密封したバイアル中で2mLの培地を32℃で3時間200rpmで振蕩しながら培養したときのヘッドスペース）中のイソプレンを標準的ガスクロマトグラフィーで分析する。ここで標準的ガスクロマトグラフィーは、等温(85℃)で操作され、n-オクタン/Porasil Cカラム(Alltech Associates, Inc社., Deerfield, Ill.)を備えるとともに、RGD2酸化水銀還元ガス検出器(Trace Analytical社, Menlo Park, CA)に接続されている(例えば、その全内容、特にイソプレンの生成量測定法を本願に参照として組み込むGreenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al, Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991参照)。ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、標準イソプレン濃度検量線を用いてイソプレン量（nmol）に換算する。いくつかの実施形態では、細胞の湿潤重量のグラム数は、細胞培地のサンプルのA600の値を測定し、このA600の値を既知の細胞の湿潤重量に対するA600の値の検量線に基づいて換算することにより求める。いくつかの実施形態では、A600の値が1である1リットルのブロス（細胞及び細胞培地の容積が含まれる）には、湿潤重量が1グラムの細胞が含まれているとみなすことにより、細胞のグラム数を求める。また、この値を培養時間、例えば3時間で割る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、培養細胞はイソプレン約1 nmole/gwcm/hr以上、または 約10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000 nmole/gwcm/hr以上、またはこれら以上のイソプレンを生成する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約2から約5,000ng/gwcm/h、例えば約2から約100ng/gwcm/h,約100から約500ng/gwcm/h,約500から約1,000ng/gwcm/h、約1,000から約2,000ng/gwcm/h、又は約2,000から約5,000ng/gwcm/hである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は約20から約5,000ng/gwcm/h、約100から約5,000ng/gwcm/h、約200から約2,000ng/gwcm/h、約200から約1,000ng/gwcm/h、約300から約1,000ng/gwcm/h、又は約400から約1,000ng/gwcm/hである。ng/gwcm/hで表されるイソプレンの量は、上記の単位がnmole/gwcm/hrのイソプレン生成量の値に68.1を掛けることにより求めることができる（下記の式5参照）。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、培養細胞は累積力価（総生成量）が約1 mg/Lbroth以上でイソプレンを生成し、あるいは約10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000 mg/Lbroth以上、またはこれ以上でイソプレンを生成する。（ここでmg/Lbrothはブロス1リットルあたりから生成されるイソプレンのmg（ミリグラム）数を表し、ブロスの容積には細胞及び培地の容積が含まれる。）
いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約2から約5,000 mg/Lbroth、例えば約2から約100 mg/Lbroth、約100から約500 mg/Lbroth、約500から約1,000 mg/Lbroth、約1,000から約2,000 mg/Lbroth、または約2,000から約5,000 mg/Lbrothである。いくつかの実施形態では、イソプレンの生成量は約20から約5,000mg/Lbroth、約100から約5,000mg/Lbroth、約200から約2,000mg/Lbroth、約200から約1,000mg/Lbroth、約300から約1,000mg/Lbroth,、又は約400から約1,000mg/Lbrothである。
【０１７１】
振蕩フラスコまたは同様の培地におけるイソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数で表されるイソプレンの比生産性は、OD600の値が約1の細胞培地から1 mlのサンプルを採取し、このサンプルを20 mLのバイアルに入れ、30分間培養し、次にヘッドスペース中のイソプレンの量を測定して求めることができる（例えば実施例I、パートII参照）。OD600の値が1.0でないときは、OD600の値で割ることにより、OD600の値が1.0のときの値に正規化する。イソプレンのmg数/ヘッドスペースのリットル(L)数の値に38を掛けることにより、培養ブロスのmg/Lbroth/hr/OD600に換算することができる。単位mg/Lbroth/hr/OD600で表される値に時間数とOD600の値とを掛けることにより、単位がイソプレンのmg数/ブロスのリットル(L)数で表される累積力価を求めることができる。
【０１７２】
単位mg/Lbroth/hrで表される発酵槽中におけるイソプレン生成速度は、発酵槽オフガスのサンプルを採取し、このサンプル中のイソプレンの量（単位はイソプレンmg/Lgas）を本願に開示する方法、例えば実施例I、パートIIに開示する方法で測定し、この測定値にブロス1リットル当りのオフガス流量(例えば1 vvm (気体容積/ブロス容積/分)これは60 Lgas/hourに等しい)を掛けて求めることができる。すなわち、1 mg/Lgasのオフガス濃度は、1 vvmの気体流量における生成速度60 mg/Lbroth/hrに相当する。
所望により、単位mg/Lbroth/hrの値をOD600の値で割ることにより、単位がmg/Lbroth/hr/ODである、比速度を求めることができる。イソプレンmg/Lgasの平均値は、このイソプレン濃度の平均値に発酵中に発酵ブロス1リットルから放出されたオフガスの全量を掛けることにより、全製品生産性(発酵ブロス1リットル当りのイソプレングラム数、mg/Lbroth)に変換することができる。すなわち、1 vvmにおいて平均オフガスイソプレン濃度0.5 mg/Lbroth/hrで10時間製造したときの全製品濃度はイソプレン300mg/Lbrothである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、培養細胞は培地中の炭素の約0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、または8.0%以上をイソプレンに転換する。いくつかの実施形態では、イソプレンに転換される炭素のパーセントは約0.002から約4.0%、約0.002から約3.0%、約0.002から約2.0%、約0.002から約1.6%、約0.002から約0.005%、約0.005から約0.01%、約0.01から約0.05%、約0.05から約0.15%、0.15から約0.2%、約0.2から約0.3%、約0.3から約0.5%、約0.5から約0.8%、約0.8から約1.0%、または約1.0から約1.6%である。いくつかの実施形態では、イソプレンへ転換される炭素のパーセントは約0.002から約0.4%、0.002から約0.16%、0.04から約0.16%、約0.005から約0.3%、約0.01から約0.3%、または約0.05から約0.3%である。
【０１７４】
炭素からイソプレンへの転換パーセント（「炭素収率%」とも呼ぶ）は、生成されたイソプレン中の炭素モル数を、炭素源中の炭素モル数（例えばバッチ中と供給されたグルコース及び酵母エキス中の炭素モル数）で割ることにより求めることができる。（式1に示すように）この数字に100を掛けてパーセントの値とする。
＜式１＞
炭素収率% = (生成されたイソプレン中の炭素モル数)/(炭素源中の炭素モル数)×100
【０１７５】
この計算では、酵母エキスは炭素を50% w/w含むとみなすことができる。
例えば実施例7パートVIIIの500リットルの例の場合、炭素からイソプレンへの転換は式2に示すようにして求めることができる。
＜式2＞
炭素収率% = (39.1gイソプレン×l/68.1モル/g×5C/モルmol)/[(181221gグルコース×1/180モル/g×6 C/モル) + (17780g酵母エキス×0.5×1/12モル/g)]×100 = 0.042% 
【０１７６】
本願に開示する2例の500リットルの発酵（実施例7のパートVII及びVIII）では、イソプレンへの炭素転換率は0.04-0.06%であった。本願に開示するように、14リットルの系で0.11-0.16%の炭素収率が得られた。実施例11、パートVに示すように、本願に開示する方法により炭素の1.53%がイソプレンに転換された。
【０１７７】
当業者であれば、イソプレン生成速度または生成したイソプレンの量を、容易に他の単位に変換することができるであろう。以下に、単位変換式の例を示す。
＜イソプレン生成の単位（全または比）＞
＜式3＞
イソプレン1 g/Lbroth/hr = 14.7ミリモルイソプレン/Lbroth/hr (全容積速度)
＜式4＞
イソプレン1 nmol/gwcm/hr = イソプレン1 nmol/Lbroth/hr/OD600(この変換式では、OD600の値が1のブロス1リットル中には湿潤重量1グラムの細胞が含まれているとみなす）。
＜式5＞
イソプレン1 nmol/gwcm/hr = イソプレン68.1ナノグラム/gwcm/hr (イソプレンの分子量に基づく)
＜式６＞
イソプレン1 nmol/Lgas O2/hr = イソプレン90 nmol/Lbroth/hr （培養ブロス1リットル当りのO2流量が90 L/hrのとき）
＜式7＞
イソプレン1μg/オフガス中のイソプレンLgas = イソプレン60μg/Lbroth/hr （Lbroth 当りの流量が60 Lgasのとき(1 vvm)）
＜力価の単位＞（全及び比）
＜式8＞
イソプレン1  nmol/タンパク質細胞mg = イソプレン150  nmol/Lbroth/OD600 (この変換式では、OD600の値が1のブロス1リットル中には、約150ミリグラムの全タンパク質細胞が含まれるとみなす) (比生産性)
＜式9＞
イソプレン1 g/Lbroth = イソプレン14.7ミリモル/Lbroth (全力価)
【０１７８】
所望により、式10によって細胞の湿潤重量に基づくいずれかの単位を、細胞の乾燥重量に基づく単位に変換することができる。
＜式10＞
細胞の乾燥重量 = （細胞の湿潤重量）/3.3
【０１７９】
所望により、式11によってppmからμg/Lへ単位を換算することができる。特に、「ppm」はμg/g (w/w)またはμL/L (vol/vol)に関して100万分の1を意味する。μg/Lからppm (例えば分析物のμg/ガス1g)への換算は、オフガス1リットルの質量(すなわちガスの密度)に基づいて行うことができる。例えばSTPの1リットルの空気の密度は約1.2 g/Lである。従って、STP における濃度1 ppm (μg/g)は、0.83μg/Lに相当する(式11)。ppm (μg/g)からμg/Lへの換算は、圧力、温度及びオフガスの全体的組成の関数となる。
＜式11＞
1 ppm (μg/g)は、標準温度及び圧力(STP; 101.3 kPa (1 bar)及び273.15K)において0.83μg/Lに等しい。
【０１８０】
μg/Lからppmv (例えばガス1リットル中の分析物のuL)への換算は、理想気体の状態方程式(式12)により行うことができる。例えば、濃度が1000μg/Lgasのオフガスは、14.7μmol/Lgasに相当する。気体定数は0.082057 L.atm K-1mol-1であり、式12により、STPにおいて14.7μmolのHGで占められる容積は0.329 mLである。従って、STPにおける濃度1000μg/L HGは、329 ppmvまたは0.0329% (v/v)に相当する。
＜式12＞
PV = nRT、ここで“P”は圧力、“V”は容積、“n”はガスのモル数、“R”は気体定数、“T” はケルビン温度である。
【０１８１】
本願では、イソプレン組成物中の不純物の量は重量/容積(w/v)で表し、単位はμg/L等である。所望により、式13を用いて単位μg/Lを単位mg/m3に換算することができる。
＜式13＞
1 μg/L = 1 mg/m3
【０１８２】
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸を備えていない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍またはそれ以上の量のイソプレンを生成する。
【０１８３】
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする非相同核酸及び1以上のDXS、IDI,および／またはMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を備える細胞は、実質的に同じ条件で培養したこれらの非相同核酸を備えない対応する細胞と比較して、少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍またはそれ以上の量のイソプレンを生成する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には、組成物中の全C5炭化水素の総重量に対し、イソプレンが約重量99.90、99.92、99.94、99.96、99.98以上または100%含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物におけるイソプレンの相対検出器レスポンスは、組成物中の全C5炭化水素の相対検出器レスポンスの約99.90、99.91、99.92、99.93、99.94、99.95、99.96、99.97、99.98、99.99以上、または100%である。いくつかの実施形態では、組成物中の全C5炭化水素の総重量に対し、イソプレンが約99.90から約99.92、約99.92から約99.94、約99.94から約99.96、約99.96から約99.98、約99.98から100重量%含まれている。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には、イソプレン以外のC5炭化水素(例えば1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、または シス-ペント-3-エン-1-イン)が、組成物中の全C5炭化水素の総重量に対し、約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001重量%以下含まれている。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物におけるイソプレン以外のC5炭化水素の相対検出器レスポンスは、組成物中の全C5炭化水素の相対検出器レスポンスの約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001%以下である。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物における1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、またはシス-ペント-3-エン-1-インの相対検出器レスポンスは、組成物中の全C5炭化水素の相対検出器レスポンスの約0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、または0.00001%以下である。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には、イソプレン以外のC5炭化水素(例えば1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、または シス-ペント-3-エン-1-イン)が、組成物中の全C5炭化水素の総重量に対し、約0.02から約0.04重量%、約0.04から約0.06重量%、約0.06から0.08重量%、約0.08から0.10重量%、または約0.10から約0.12重量%含まれている。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物に含有されるイソプレンの重合を阻害する成分の量が約50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005μg/L以下である。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物に含有されるイソプレンの重合を阻害する成分の量が約0.005から約50、例えば約0.01から約10、約0.01から約5、約0.01から約1、約0.01から約0.5、または約0.01から約0.005μg/Lである。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物中のイソプレン以外の炭化水素(例えば1,3-シクロペンタジエン、シス-1,3-ペンタジエン、トランス-1,3-ペンタジエン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ペンテン、2-メチル-1-ブテン、3-メチル-1-ブチン、トランス-ピペリレン、シス-ピペリレン、ペント-4-エン-1-イン、トランス-ペント-3-エン-1-イン、またはシス-ペント-3-エン-1-イン)の含有量が、約50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005μg/L以下である。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物中のイソプレン以外の炭化水素の含有量が、約0.005から約50、例えば約0.01から約10、約0.01から約5、約0.01から約1、約0.01から約0.5、又は約0.01から約0.005μg/Lである。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物中のタンパク質または脂肪酸(例えば天然ゴムに天然に含まれているタンパク質又は脂肪酸)の含有量が50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005μg/L以下である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には約10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005 ppm以下のアルファアセチレン、ピペリレン、アセトニトリル、または1,3-シクロペンタジエンが含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には約5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005 ppm以下のイオウまたはアレンが含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には約30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、または0.005 ppm以下の全アセチレン(ペンチン-1、ブチン-2、2MB1-3イン、及び1-ペンチン-4-イン等)が含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には約2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、又は0.005 ppm以下の環状イソプレン二量体(例えば2つのイソプレンユニットの二量体化により誘導された環状C10化合物)等の、イソプレン二量体が含有されている。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には、エタノール、アセトン、C5プレニルアルコール(3-メチル-3-ブテン-1-オール又は3-メチル-2-ブテン-1-オール等)、またはこれらの2以上が含有されている。特定の実施形態では、イソプレン組成物には、エタノール、アセトン、C5プレニルアルコール(3-メチル-3-ブテン-1-オール又は3-メチル-2-ブテン-1-オール等)、またはこれらの2以上が、約0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、又は120μg/L以上含有されている。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には、エタノール、アセトン、C5プレニルアルコール、またはこれらの2以上が、約0.005から約120、約0.01から約80、約0.01から約60、約0.01から約40、約0.01から約30、約0.01から約20、約0.01から約10、約0.1から約80、約0.1から約60、約0.1から約40、約5から約80、約5から約60、または約5から約40μg/L含有されている。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には以下の成分の1以上が含有されている：2-ヘプタノン、6-メチル-5-ヘプテン-2-オン、2,4,5-トリメチルピリジン、2,3,5-トリメチルピリジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、酢酸メチル、1-プロパノール、ジアセチル、2-ブタノン、2-メチル-3-ブテン-2-オール、酢酸エチル、2-メチル-1-プロパノール、3-メチル-1-ブタナール、3-メチル-2-ブタノン、1-ブタノール、2-ペンタノン、3-メチル-1-ブタノール、エチルイソブチレート、3-メチル-2-ブテナール、酢酸ブチル、3-メチル酢酸ブチル、3-メチル-3-ブタ-1-エニルアセテート、3-メチル-2-ブタ-1-エニルアセテート、(E)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、(Z)-3,7-ジメチル-1,3,6-オクタトリエン、2,3-シクロヘプテノールピリジン、または直鎖状イソプレンポリマー (例えば複数のイソプレンユニットを重合して誘導された直鎖状イソプレン二量体、または直鎖状イソプレン二量体)。
様々な実施形態では、これらの成分の内の1の含有量を、イソプレンの量に対し重量パーセントの単位で表すと(すなわち、その成分の重量をイソプレンの重量で割り、100を掛けた値)、約0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または110% (w/w)以上となる。
いくつかの実施形態では、この第2成分の相対検出器レスポンスの、イソプレンの相対検出器レスポンスに対する比が、約0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または110%以上である。様々な実施形態では、これらの成分の内の1の含有量を、イソプレンの量に対し重量パーセントの単位で表すと(すなわち、その成分の重量をイソプレンの重量で割り、100を掛けた値)、約0.01から約105%(w/w)、例えば約0.01から約90、約0.01から約80、約0.01から約50、約0.01から約20、約0.01から約10、約0.02から約50、約0.05から約50、約0.1から約50、または0.1から約20%(w/w)となる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には次の1以上が含有されている：アルコール、アルデヒド、またはケトン(例えば本願に記載するいずれかのアルコール、アルデヒド、またはケトン)。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には (i) アルコール及びアルデヒド、(ii) アルコール及びケトン、(iii) アルデヒド及びケトン、または(iv) アルコール、アルデヒド、及びケトンが含有されている。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には次の1以上が含有されている：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、1-ブタノール、3-メチル-1-プロパノール、アセトン、酢酸、2-ブタノン、2-メチル-1-ブタノール又は インドール。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には次の1以上が1ppm以上含有されている：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、1-ブタノール、3-メチル-1-プロパノール、アセトン、酢酸、2-ブタノン、2-メチル-1-ブタノール又は インドール。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物(例えば精製前のオフガス)には、次の1以上が約1ppmから約10000ppmの濃度で含有されている：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、1-ブタノール、3-メチル-1-プロパノール、アセトン、酢酸、2-ブタノン、2-メチル-1-ブタノール又は インドール。
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物(例えば1以上の精製工程を経たオフガス)には、次の1以上が約1から約100ppm、例えば約1から約10ppm、約10から約20ppm、約20から約30ppm、約30から約40ppm、約40から約50ppm、約50から約60ppm、約60から約70ppm、約70から約80ppm、約80から約90ppm、又は約90から約100ppmの濃度で含有されている：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、1-ブタノール、3-メチル-1-プロパノール、アセトン、酢酸、2-ブタノン、2-メチル-1-ブタノール又は インドール。
細胞培地から生成する揮発性有機化合物(細胞培地のヘッドスペース中の有機化合物等)は、本願に開示する方法、または陽子移動反応質量分析(その全内容、特に有機化合物の分析について本願に参照として組み込むBunge et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(7):2179-2186, 2008参照)等の公知の方法により分析することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物には約2 mgより多いイソプレンが含まれ、例えばイソプレンが約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000 mg以上含まれている。いくつかの実施形態では、この組成物にはイソプレンが約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g以上含まれている。
いくつかの実施形態では、この組成物中のイソプレンの量は約2から約5,000mgであり、例えば約2から約100mg、約100から約500mg、約500から約1,000mg、約1,000から約2,000mg,または約2,000から約5,000mgである。いくつかの実施形態では、この組成物中のイソプレンの量は約20から約5,000mg、約100から約5,000mg、約200から約2,000mg、約200から約1,000mg、約300から約1,000mg,または約400から約1,000mgである。
いくつかの実施形態では、この組成物中の揮発性有機化合物の約20、25、30、40、50、60、70、80、90、または95重量%以上がイソプレンである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、組成物にはエタノールが含有されている。いくつかの実施形態ではこの組成物にはエタノールが約75から約90重量%含有され、例えばエタノールが約75から約80重量%、約80から約85重量%、または約85から約90重量%含有されている。組成物がエタノールを含有するいくつかの実施形態では、組成物には約4から約15重量%、例えば約4から約8重量%、約8から約12重量%、または約12から約15重量%のイソプレンも含有されている。
【０１９４】
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、DXSポリペプチド、IDIポリペプチド、及び／又はMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を1以上備える細胞が生成するイソプレノイド化合物(1以上のIPP分子と1以上のDMAPP分子との反応により生成する10以上の炭素原子を有する化合物等)の量は、1以上の非相同核酸を備えない対応する細胞を実質的に同一条件で培養したときのイソプレノイド化合物生成量の約2-倍、3-倍、5-倍、10-倍、25-倍、50-倍、100-倍、150-倍、200-倍、400-倍以上、またはそれ以上である。
この発明のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、DXSポリペプチド、IDIポリペプチド、及び／又はMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を1以上備える細胞が生成するC5プレニルアルコール(3-メチル-3-ブテン-1-オール又は3-メチル-2-ブテン-1-オール等)の量は、1以上の非相同核酸を備えない対応する細胞を実質的に同一条件で培養したときのC5プレニルアルコール生成量の約2-倍、3-倍、5-倍、10-倍、25-倍、50-倍、100-倍、150-倍、200-倍、400-倍以上、またはそれ以上である。
【０１９５】
＜イソプレン精製方法の例＞
いくつかの実施形態では、本願の方法にはイソプレンの回収工程が含まれる。
例えば、本願の方法及び組成物により生成したイソプレンを、標準的方法を用いて回収することができる。このような標準的方法の例は、ガスストリッピング、膜強化分離(membrane enhanced separation)、分留、吸着／脱着、パーベーパレーション、熱または真空によるイソプレンの固相からの脱着、または固相に固着または吸着させたイソプレンの溶媒による抽出 (その全内容、特にイソプレンの回収及び精製方法に関して本願に参照として組み込むU.S.P. 4,703,007 及び4,570,029参照)等である。特定の実施形態では、アルコール(エタノール、メタノール、プロパノール、又はこれらの組み合わせ等)を用いた抽出蒸留によりイソプレンを回収する。いくつかの実施形態では、イソプレンの回収工程には、イソプレンを液相状態(例えばイソプレンのみの液体、またはイソプレンを含む溶媒)で回収することが含まれる。ガスストリッピングでは、発酵オフガスから連続的に気体状イソプレンを回収する。このような気体状イソプレンの回収は種々の方法で行うことができ、非限定的例示として固相への吸着、液相への分離、または直接凝縮(冷却コイルとの接触による凝縮、または圧力増加による凝縮等)させることが挙げられる。いくつかの実施形態では、露点以上の希釈された気体状イソプレンを膜により濃縮して、イソプレンを液相で凝縮させることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンを圧縮して凝縮させる。
【０１９６】
イソプレンの回収は一段階または多段階で行うことができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換を同時に行う。例えば、イソプレンをオフガスから直接凝縮させて液相にすることができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからの気体状イソプレンの分離と、イソプレンの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンを固相に吸着させ、次に溶媒で固相から抽出することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本願の方法にはさらにイソプレンを精製する工程が含まれる。例えば、本願の組成物と方法により生成したイソプレンを標準的方法で精製することができる。精製とは、イソプレンを生成させるときに介在していた1以上の他の成分からイソプレンを分離する工程である。いくつかの実施形態では、実質的に純粋な液体のイソプレンが得られる。精製方法の例として、(i) 液相抽出物からの蒸留による分離、及び(ii)クロマトグラフィーが挙げられる。本願では、「精製されたイソプレン」とは、イソプレンを生成させるときに介在していた1以上の他の成分から分離されたイソプレンを意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンはイソプレンを生成させるときに介在していた1以上の他の成分中に少なくとも約20重量%含まれる。様々な実施形態では、イソプレンの純度は少なくとも約25重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、90重量%、95重量%、または99重量%である。純度は、カラムクロマトグラフィー、HPLC分析、またはGC- MS分析等の適切な方法によって求めることができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、イソプレンを除去する1以上の回収工程の後に残った気相の少なくとも一部を、細胞培養システム(例えば発酵槽)に導入することによりリサイクルして、イソプレンを製造する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本願に開示する方法にはさらに、イソプレンを重合する工程が含まれる。例えば、精製されたイソプレンを公知の方法により重合して、シス-ポリイソプレン、または公知の方法によりその他の下流製品を製造することができる。従って、この発明は、本願に開示するイソプレン組成物にいずれかにより製造されたシス-1,4- ポリイソプレン、及び／又は、トランス-1,4-ポリイソプレン等のポリイソプレンから成るタイヤにも関する。
【０２００】
＜実施例＞
実施例はこの発明の例示を目的とするものであり、本願発明を限定するものではない。また実施例は、上記に説明した発明の実施形態と詳細を説明するものである。特に断りの無い限り、温度は摂氏であり、圧力はほぼ大気圧である。以下の実施例と詳しい説明はこの発明の説明を目的としており、この発明を限定するものではない。本願に引用する刊行物、特許出願、及び特許は参照として本願に組み込まれる。特に、この発明において用いられるであろう方法と組成物に関連して本願に引用する刊行物、特許出願、及び特許を、本願に参照として組み込む。以下、本願発明の理解を容易にするため実施例に基づき詳しく説明するが、当業者であれば本願の開示内容に照らし、本願の要旨から逸脱しない範囲で本願発明を種々変更して実施できることは明らかであろう。
【０２０１】
＜実施例1：組換えKudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli中でのイソプレンの生成＞
＜I. E. coli中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
kudzu (プエラリア・モンタナ) イソプレンシンターゼ遺伝子(IspS)のタンパク質配列は、GenBank (AAQ84170)から入手した。
E. coliコドンでの使用に最適化されたkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子（SEQ ID NO:1）は、DNA2.0から購入した。購入したプラスミドからイソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I /PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製した後、NcoI/PstIで消化されたpTrcHis2B (Invitrogen社)に結紮した。この構築体は、イソプレンシンターゼ遺伝子中の終止コドンがPstI部位に対し5’になるように設計した。この結果、構築体を発現させたときHis-Tagはイソプレンシンターゼタンパク質に結合していない。得られたプラスミドpTrcKudzuの配列をシーケンス解析により検証した(図2及び3）。
【０２０２】
また、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b (Novagen社)中にクローン化した。このとき、組換えイソプレンシンターゼタンパク質がN-末端His tagを含むようにして、イソプレンシンターゼ遺伝子をpET16b中に挿入した。イソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーセットを用いたPCRによりpTrcKudzuから増幅した。用いたプライマーセットは、
pET-His-Kudzu-2F
【化１】
2014144007.tif 000005
及び
pET-His- Kudzu-R
【化２】
2014144007.tif 000006
であった。これらのプライマーにより、遺伝子の5 '-末端にNdeI部位が付加され、3'末端にBamH1部位がそれぞれ付加された。
上記のpTrcKudzuプラスミドをテンプレートDNAとして用い、Herculaseポリメラーゼ(Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用い、プライマーを濃度が10 ピコモルになるように添加した。PCRは全容積25μlで行なった。PCR産品をNdeI/BamHlで消化し、同じ酵素で消化したpET16b中にクローン化した。結紮混合物をE. coli Top10 (Invitrogen社)中に形質転換し、正規のクローンをシーケンシングにより選択した。これにより得られ、T7プロモータからkudzuイソプレンシンターゼを発現するプラスミドを、pETNHisKudzu (図4及び5)と命名した。 
【０２０３】
また、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、低コピー数プラスミドpCL1920 中にクローン化した。プライマーを用いて、上記のpTrcKudzuからkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を増幅した。フォワードプライマーにより、5'末端にHindIII部位及びE. coliコンセンサスRBSを付加した。PstIクローン化部位は既にpTrcKudzuno中の終止コドンの3'に存在しているので、リバースプライマーは最終PCR産品にPstI部位が含まれる様にして構築した。
プライマーの配列は以下の通りである。
HindIII-rbs-Kudzu F: 
【化３】
2014144007.tif 000007
及び
BamH1-Kudzu R:
【化４】
2014144007.tif 000008
【０２０４】
PCR産品の増幅は、プライマーの濃度10ピコモル、及び1ナノグラムのテンプレートDNA (pTrcKudzu)のHerculaseポリメラーゼを用いて行った。
増幅は、(95℃で1分間、60℃で1分間、72℃で2分間)のサイクルを30回繰り返すことにより行った。PCR産品をHindIII及びPstIにより消化し、Hindlll及びPstIで消化したpCL1920に結紮した。結紮混合物をE. coli Top10中に形質転換した。いくつかの形質転換体をシーケンシングによりチェックした。得られたプラスミドを、pCL-lac-Kudzu (図6及び7)と命名した。
【０２０５】
＜II. イソプレン生成の評価＞
振蕩フラスコでの培養の場合、1 mlの培養物を振蕩フラスコから20 ml CTCヘッドスペースバイアル(Agilent社、 バイアルのカタログ# 5188 2753; キャップのカタログ# 5188 2759)へ移した。キャップを強くねじ込み、バイアルを250 rpmで振蕩しながら、一定温度で培養した。30分後、バイアルをインキュベータから取り外し、下記のようにして分析した（この分析結果のいくつかを表1に示す）。
【０２０６】
培養槽でのイソプレン生成の評価では、培養槽のオフガスからサンプルを採取し、下記のようにして直接分析した（この分析結果のいくつかを表2に示す）
【０２０７】
分析はAgilent 6890 GC/MSシステムと、このシステムに接続され、ヘッドスペースモードで作動するCTC Analytics (Switzerland) CombiPALオートサンプラーを用いて行った。サンプル中の被検体の分離には、Agilent ΗP-5MS GC/MS カラム(30 m×0.25 mm; フィルム厚み0.25μm)を用いた。サンプルとして、ヘッドスペースガス500μLを注入した。GC/MS測定ではヘリウムをキャリヤガスとして用い、1 ml/分で流通させた。インジェクションポートを250℃に保ち、分割比を50:1とした。2分間の分析中、オーブンの温度を37℃に保った。Agilent 5793N質量分析選択検出器を、シングルイオンモニタリング(SIM)モードでm/z 67で用いた。この検出器のスイッチを1.4から1.7分間オフにして、永久気体を流出させた。これらの条件下で、イソプレン(2-メチル-1,3-ブタジエン)は1.78分後に流出することが観察された。イソプレンの絶対量の定量には検量表を用いた。この結果、1 μg/Lから200μg/Lの範囲では直線的であることが確認された。この方法の検出限界は50から100 ng/Lと見積もられた。
【０２０８】
＜III.  組み換えイソプレンシンターゼを発現するE. coli細胞を入れた振蕩フラスコにおけるイソプレン生成＞
上記のベクターをE. coli株BL21 (Novagen社)に導入し、BL21/ptrcKudzu株、 BL21/pCL-lac-Kudzu株、及びBL21/pETHisKudzu株を生成させた。これらの株を単離するために、LA (Luriaアガー)及びカルベニシリン(50μg/ml)上に線状に塗布し、37℃で一晩培養した。単一コロニーを、20 mlのLuria Bertaniブロス(LB)とカルベニシリン(100μg/ml)を入れたバッフル付きの250 ml振蕩フラスコに植菌した。200rpmで振蕩しながら、20℃で一晩培養物を成長させた。一夜養培物のOD600を測定し、養培物を、30mlのMagicMedia (Invitrogen社)とカルベニシリン(100μg/ml)を入れたバッフル付き250ml振蕩フラスコ中で、OD600が約0.05になるまで希釈した。養培物を200rpmで振蕩しながら、30℃で培養した。OD600が約0.5- 0.8になったとき、400μMのIPTGを添加し、細胞をさらに200rpmで振蕩しながら30℃で6時間培養した。IPTGで誘導した0、2、4 及び6時間後に、培養物のサンプル1 mlを採取し、OD600を測定し、上記のようにしてイソプレン生成量を測定した。結果を表8に示す。
【０２０９】
＜IV.  14リットルの培養槽でのBL21/ptrcKudzuからのイソプレン生成＞
組み換えkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むE. coliからの大スケールでのイソプレン生成を、流加培養法により行った。発酵培地(TM2)1リットルの組成は次の通りであった：K2HPO4 13.6 g、KH2PO4 13.6 g、 MgSO4 * 7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、(NH4) 2SO4 3.2 g、酵母エキス 5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1ml。全成分を一度に添加し、diH2Oに溶解させた。水酸化カリウム(KOH)でpHを6.8に調整し、定容した。最終産品を0.22μ フィルター(フィルターのみ、加熱滅菌せず)で濾過滅菌した。
1000X Modified Trace Metal Solutionの組成は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０２１０】
実験は14 Lのバイオリアクターにおいて温度34℃、pH6.7で発酵させ、グルコースからのイソプレンの生成をモニターしながら行った。接種菌株のE. coli株BL21/ptrcKudzuはソイトン(soytone) -酵母エキス-グルコース培地で調製した。この接種菌株は凍結させたバイアルから採取した。この接種菌株がOD550 = 0.6になるまで成長させた後、2つの600 mlフラスコを遠心分離し、細胞ペレットをバイオリアクターに移すために、内容物を70 mlの上清に再懸濁させた(70 mlのOD 3.1の材料)。接菌した後、所定時間毎にサンプルを採取し、上記の方法でイソプレン生成量を測定した。結果を図9に示す。
【０２１１】
＜実施例2＞
＜組み換えポプライソプレンシンターゼを発現するE. coliによるイソプレン生成＞
ポプラ(Populus alba x Populus tremula)イソプレンシンターゼ (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) のタンパク質配列をGenBank (CAC35696) から入手した。遺伝子、E. coliに最適化させたコドンは、DNA2.0 (p9796-poplar, 図30及び31参照) から購入した。
購入したプラスミドから、イソプレンシンターゼ遺伝子をBspLU11I/PstIによる制限エンドヌクレアーゼ消化で分離し、ゲル精製し、NcoI/PstIで消化したpTrcHis2Bに結紮した。構築体は、終止コドンがPstI部位の前に挿入されるようにクローン化し、この結果、His-Tagがイソプレンシンターゼタンパク質に結合していない構築体が得られた。得られたプラスミドpTrcPoplar(図32及び33)の配列をシーケンシングにより検証した。
【０２１２】
＜実施例3＞
＜組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するPanteoa citreaにおけるイソプレンの生成＞
実施例1に記載したpTrcKudzuプラスミド及びpCL-lac KudzuプラスミドをP. citrea (U.S.P 7,241,587) 中にエレクトロポレートした。形質転換体はそれぞれ、カルベニシリン(200μg/ml)またはスペクチノマイシン(50μg/ml)を含むLAにおいて選択した。振蕩フラスコによるイソプレン生成と、生成されたイソプレンの量の測定は、実施例1の組み換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli株の場合と同様にして行った。結果を図10に示す。
【０２１３】
＜実施例4＞
＜組換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するBacillus subtilisによるイソプレン生成＞
＜I. kudzuイソプレンシンターゼの発現用プラスミドを複製するB. subtilisの構築＞
aprE プロモータで制御された複製プラスミド(クロラムフェニコール耐性カセットを有するpBS19)を用いて、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子をBacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK株(BG3594comK)中で発現させた。
イソプレンシンターゼ遺伝子、aprE プロモータ、及び転写ターミネータを別々に増幅し、PCRにより融合させた。この構築体をpBS19中にクローン化し、B. subtilis中に形質転換した。
【０２１４】
a)   aprEプロモータの増幅
aprEプロモータは、以下のプライマーを用いて、Bacillus subtilis由来の染色体DNAから増幅した：
CF 797 (+)  開始aprEプロモータMfel
【化５】
2014144007.tif 000009
CF 07-43 (-)  aprEプロモータをKudzu ispSに融合
【化６】
2014144007.tif 000010
【０２１５】
b)  イソプレンシンターゼ遺伝子の増幅
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子は、プラスミドpTrcKudzu (SEQ ID NO:2)から増幅した。この遺伝子はコドンがE. coliに最適化され、DNA 2.0によって合成されたものであった。
次のプライマーを用いた。
CF 07-42 (+)  aprEプロモータをkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に融合(GTG 開始コドン) 
【化７】
2014144007.tif 000011
CF 07-45 (-)  kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子の3'末端をターミネータに融合
【化８】
2014144007.tif 000012
【０２１６】
c)  転写ターミネータの増幅
Bacillus amyliquefaciensのアルカリセリンプロテアーゼ由来のターミネータを、以下のプライマーを用いて、予め配列同定したプラスミドpJHPms382により増幅した：
CF 07-44 (+)   kudzuイソプレンシンターゼの3'末端をターミネータに融合
【化９】
2014144007.tif 000013
CF 07-46 (-)   B. amyliquefaciensのターミネータの末端(BamHI)
【化１０】
2014144007.tif 000014
【０２１７】
以下のプライマーを用いて、PCRによりkudzu断片をターミネータ断片に融合した：
CF 07-42 (+)  aprEプロモータをkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子(GTG開始コドン)に融合 
【化１１】
2014144007.tif 000015
CF 07-46 (-)  B. amyliquefaciensのターミネータの終端(BamHI)
【化１２】
2014144007.tif 000016
【０２１８】
以下のプライマーを用いて、PCRによりkudzu-ターミネータ断片をプロモータ断片に融合した：
CF 797 (+)  開始aprEプロモータMfeI
【化１３】
2014144007.tif 000017
CF 07-46 (-)B. amyliquefaciensのターミネータの終端(BamHI)
【化１４】
2014144007.tif 000018
【０２１９】
融合PCR断片をQiagenキットを用いて精製し、制限酵素MfeI及びBamHIで消化した。消化したDNA断片をQiagenキットを用いてゲル精製し、pBS19として知られているベクターに結紮した。pBS19はEcoRI及びBamHIで消化され、ゲル精製されている。
【０２２０】
結紮混合物をE. coli Top 10細胞中に形質転換し、コロニーをLA及び50カルベニシリンプレート上で選択した。全部で6個のコロニーを選び、LB 及び50カルベニシリン上で一晩培養し、次にQiagenキットを用いてプラスミドを単離した。挿入を確認するためプラスミドをEcoRI及びBamHIで消化し、正規の3つのプラスミドについて次のプライマーによるシーケンシングを行った：
CF 149 (+)  aprEプロモータのEcoRI開始
【化１５】
2014144007.tif 000019
CF 847 (+)  pXX 049中の配列 (aprEプロモータの終端) 
【化１６】
2014144007.tif 000020
CF 07-45 (-)  kudzuイソプレンシンターゼの3’末端をターミネータに融合
【化１７】
2014144007.tif 000021
CF 07-48 (+)  kudzuイソプレンシンターゼのシーケンシングプライマー 
【化１８】
2014144007.tif 000022
CF 07-49 (+)  イソプレンシンターゼ中のシーケンシング
【化１９】
2014144007.tif 000023
【０２２１】
シーケンシングにより正規にものであることを確認し、pBS Kudzu #2 (図52及び12) と命名したプラスミドを、Bacillus subtilis宿主細胞であるBG 3594 comK中に形質転換した。選択は、LA及び5クロラムフェニコールプレート上で行った。形質転換体を選択し、LA及び5クロラムフェニコールにシングルコロニーを植菌し、OD600が1.5に達するまでLA及び5クロラムフェニコール中で培養した。これをバイアルに入れて-80℃で凍結し、グリセロールの存在下で保管した。得られた株をCF 443と命名した。
【０２２２】
＜II.  振蕩フラスコ中での組み換えイソプレンシンターゼを発現するB. subtilis細胞によるイソプレン生成＞
一夜培養物に、LA及びクロラムフェニコール(Cm, 25μg/ml)からのCF 443のシングルコロニーを植菌した。培養物を200rpmで振蕩しながら、37℃でLB及びCmにおいて成長させた。一夜培養物(1 ml)を、25mlのGrants II培地と最終濃度が25μg/mlのクロラムフェニコールとを入れた250mlのバッフル付き振蕩フラスコに植菌した。Grants II培地の組成は、10g ソイトン、3mlの1M K2HPO4 、75g グルコース、3.6 g  尿素、100 ml 10X MOPS, H2Oで容積を1 Lに調整、pH 7.2である。
10X MOPSの組成は、83.72g MOPS、7.17g トリシン、 12g KOHペレット、10mlの0.276M K2SO4溶液、10 mlの0.528M MgCl2溶液、29.22 g NaCl、100mlの100X微量栄養素、H2Oでに容積を1 L調整；また100X微量栄養素の組成は次の通りである。1.47g CaCl2*2H2O、0.4g FeSO4*7H20、0.1g MnSO4*H20、0.1g ZnSO4*H2O、0.05g CuCl2*2H2O、0.1g CoCl2*6H2O、0.1g Na2MoO4*2H2O、H2Oで容積を1 Lに調整。振蕩フラスコを37℃でインキュベートし、サンプルを18、24及び44時間後に採取した。18時間後に、CF443のヘッドスペースのサンプルと、コントロール株のサンプルとを採取した。これは18時間で累積したイソプレンのサンプルである。イソプレンの量は、実施例1に示したガスクロマトグラフィーにより求めた。組み換えイソプレンシンターゼの発現によってイソプレン生成量が顕著に増加した(図11)。
【０２２３】
＜III.  14 L培養槽中でのCF443によるイソプレン生成＞
複製プラスミド上に組換えkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を備えるB. subtilisを用いた大スケールでのイソプレン生成を、流加培養法により評価した。Kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現するバシラス株CF 443、またはkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現しないコントロール株を、流加培養法で培養した。流加培養法の栄養培地には、大豆ミール(Cargill社)、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、及びクエン酸、塩化鉄、塩化マグネシウムを含む溶液が含まれていた。発酵させる前に、培地をセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及びペクチナーゼ(WO95/04134参照)を含む酵素混合物により90分間軟浸させた。14-Lの発酵バッチに60%wt/wtのグルコース(Cargill社のDE99 デキストロース、ADM社のVersadex greens又はDanisco社の転化糖)と、99% wt/wtのオイル(Western Family社の大豆油、ここで、99% wt/wt は細胞培地に添加する前のオイルの濃度である)を添加した。バッチ中のグルコース濃度が検出限界以下になったとき、供給を開始した。供給速度を数時間にわたり変化させ、等炭素ベースでオイルを添加するようにして調整した。28% w/v水酸化アンモニウムを用いて、pHを6.8 - 7.4に調整した。泡が生じたときは、培地に消泡剤を添加した。発酵温度を37℃に制御し、発酵培養物を750rpmで撹拌した。発酵操作中、pH、DO%、空気流量、及び圧力等のその他のパラメータを常時監視した。DO%を20以上に維持した。サンプルを36時間にわたり所定時間毎に採取し、細胞の成長(OD550)、及びイソプレン生成量を分析した。これらの実験結果を図53 A及び53Bに示す。
【０２２４】
＜IV.   kudzuイソプレンシンターゼ(ispS)のB. スブチリス中への組込み＞
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、aprEプロモータで制御された組込みプラスミド(pJH101- cmpR) 中にクローン化した。試験した条件下では、イソプレンは検出されなかった。
【０２２５】
＜実施例5＞
＜トリコデルマ中でのイソプレン生成＞
＜I.  トリコデルマ・リーゼイ中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
DNA 2.0 (SEQ ID NO: 8) (図13)により、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)コドン最適化kudzu IS遺伝子が合成された。このプラスミドを、以下のPCR増幅反応のテンプレートとして用いた：1μl プラスミドテンプレート(20 ng/μl)、1μl プライマーEL-945 (10μM)、1μl プライマーEL-965 (10μM)、1 μl dNTP (10mM)、5μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA ポリメラーゼ緩衝液、 1 μl PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ、 40μl 水、全反応容積50μl。
プライマーEL-945  
【化２０】
2014144007.tif 000024
プライマーEL-965 
【化２１】
2014144007.tif 000025
フォワードプライマーの5 '-末端には、Y. リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に対応しないが、pENTR/D- TOPOベクター中へのクローン化に必要な追加の4つのヌクレオチドが含まれていた。
リバースプライマーの5 '-末端には、Y. リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子に対応しないが、他のベクターの骨格にクローン化するために挿入した21個のヌクレオチドが含まれていた。
PCR反応は、MJ Research PTC-200 Thermocyclerを用いて次の手順で行った：95℃で2分間 (最初のサイクルのみ)、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間、(このサイクルを27回繰り返す)、最終サイクルの後72℃で1分間。
1.2% E-gel によりPCR産品を分析し、Y.リポリチカコドン最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子が正常に増幅されたことを確認した。
【０２２６】
次に、製造者の取扱説明書に従ってTOPO pENTR/D-TOPO Cloningキットを用いて、PCR産品をクローン化した：1μl PCR反応、1μl塩溶液、1μlTOPO pENTR/D- TOPOベクター、及び3μl水、全反応容積6μl。反応物を室温で5分間インキュベートした。1マイクロリットルのTOPO反応物を、TOP10化学的コンピテントE. coli細胞中に形質転換した。形質転換体を、カナマイシンを50μg/ml添加したLAプレート上で選択した。いくつかのコロニーを拾い出して、それぞれを、カナマイシンを50μg/ml添加したLBを入れた5 mlチューブ中に植菌し、200 rpmで振蕩しながら37℃で一晩培養した。製造者の取扱説明書に従ってQIAprep Spin Miniprepキットを用いて、プラスミドを一夜培養チューブから単離した。いくつかのプラスミドについてシーケンシングを行い、DNA配列が正しいことを検証した。
【０２２７】
Y. リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子をコードするシングルpENTR/D-TOPO プラスミドを、GatewayTM CloningでカスタムメイドしたpTrex3gベクター中へクローン化に用いた。
pTrex3gの構築方法は、WO 2005/001036 A2に記載されている。反応は、Gateway LR Clonase II Enzyme Mixキット(Invitrogen社) の取扱説明書に従い、次のようにして行った：1μl Y.リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子pENTR/D-TOPOドナーベクター、1μl pTrex3g目的ベクター、6μl TE緩衝液、 pH 8.0、全反応容積8μl。
反応物を室温で1時間インキュベートし、次にプロテイナーゼK溶液1 μlを添加し、37℃で10分間インキュベーションを継続した。反応物1μlをTOP10化学的コンピテントE. coli細胞中に形質転換した。
形質転換体を、カルベニシリンを50μg/ml添加したLAプレート上で選択した。いくつかのコロニーを拾い出して、それぞれを、カルベニシリンを50μg/ml添加したLB及を入れた5 mlチューブ中に植菌し、200rpmで振蕩しながら37℃で一晩培養した。QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen, Inc.社)を製造者の取扱説明書に従って用いて、プラスミドを一夜培養チューブから単離した。いくつかのプラスミドについてシーケンシングを行い、DNA配列が正しいことを検証した。
【０２２８】
Biolistic PDS-1000/HE Particle Delivery System (WO 2005/001036 A2参照) を用いて、Y. リポリチカコドン-最適化kudzuイソプレンシンターゼpTrex3gプラスミド (図14) の4欠失トリコデルマ・リーゼイ株中への遺伝子銃形質転換を行った。安定な形質転換体の単離と、振蕩フラスコによる評価は、WO 2005/001036 A2の実施例11に記載された方法に従って行った。
【０２２９】
＜T.リーゼイの組み換え株中でのイソプレン生成＞
上記のイソプレンシンターゼ形質転換体を15時間及び36時間培養した培養物1 mlを、ヘッドスペースバイアルに入れた。バイアルを密封し、30℃で5時間培養した。ヘッドスペースガスを測定し、実施例1に記載した方法でイソプレンを測定した。2種の形質転換体から痕跡量のイソプレンが認められた。イソプレンの量は、14時間培養することにより増加させることができた。2種の陽性のサンプルは、14時間の培養により約0.5μg/Lの濃度のイソプレンを生じた。形質転換されていないコントロールからは、検出可能な濃度のイソプレンは生じなかった。
この実施例は、T. reeseiは外因性イソプレンシンターゼを賦与されたとき、内因性前駆体からイソプレンを生成することができることを示している。
【０２３０】
＜実施例6＞
＜Yarrowia属におけるイソプレン生成＞
＜Yarrowia lipolytica中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築＞
Yarrowia lipolytica中でkudzuイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築の出発点はpSPZl(MAP29Spb)ベクターであった。このベクター(SEQ ID No:11)の全配列を図15に示す。
【０２３１】
Y. lipolytica株GICC 120285の染色体DNAをテンプレートに用いて、次の断片をPCRにより増幅した：プロモータの無い形態のURA3遺伝子、18SリボソームRNA遺伝子の断片、Y. lipolytica XPR2遺伝子の転写ターミネータ、及びXPR2遺伝子のプロモータとICL1遺伝子のプロモータを含む2つのDNA断片。
以下のPCRプライマーを用いた。
ICLl 3 
【化２２】
2014144007.tif 000026
ICLl 5
【化２３】
2014144007.tif 000027
XPR 3
【化２４】
2014144007.tif 000028
XPR 5
【化２５】
2014144007.tif 000029
XPRT3
【化２６】
2014144007.tif 000030
XPRT 5
【化２７】
2014144007.tif 000031
Y18S3
【化２８】
2014144007.tif 000032
Y18S 5
【化２９】
2014144007.tif 000033
YURA3
【化３０】
2014144007.tif 000034
YURA 50
【化３１】
2014144007.tif 000035
YURA 51
【化３２】
2014144007.tif 000036
【０２３２】
PfuUltraIIポリメラーゼ(Stratagene社)のPCR増幅では、製造者が供給した緩衝液及びdNTPs、2.5μMのプライマー、及び指定されたテンプレートDNAを、製造者の取扱説明書に従って用いた。増幅は次のサイクルで行った：95℃で1 分間、34×(95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間)、及び72℃で10分間、次いで4℃でのインキュベーション。
【０２３３】
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子、Yarrowiaでの発現に最適化されたコドンをコードする合成DNA分子は、DNA 2.0 (図16; SEQ ID NO:12) から入手した。合成kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を備え、それぞれXPR2及び ICLlプロモータで制御されるpYLA(KZl)及びpYLI(KZl)プラスミドの構築方法の詳細を図18に示す。イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりに接合因子遺伝子(MAP29)が挿入されたコントロールプラスミドも構築した(図18E及び18F)。
【０２３４】
同様のクローン化方法を、ポプラ(Populus alba x Populus tremula)イソプレンシンターゼ遺伝子の発現に用いることもできる。ポプライソプレンの配列は、Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487に記載されており、図17に示す(SEQ ID NO:13)。合成ポプライソプレンシンターゼ遺伝子を備え、それぞれXPR2及び ICL1プロモータで制御されるpYLA(POP1)及びpYLI(POP1)プラスミドの構築方法の詳細を図18 A 及びBに示す。
【０２３５】
＜II.  組み換えY. lipolytica株によるイソプレン生成＞
pYLA(KZl), pYLI(KZl), pYLA(MAP29) 及びpYLI(MAP29)ベクターをSacIIで消化し、Y. lipolytica CLIB 122株の、標準的リチウムアセテート/ポリエチレングリコール法によるウリジンプロトトロフィーへの変換に用いた。YEPD (1%酵母エキス、2% ペプトン, 2% グルコース)で一晩培養した酵母細胞を遠心分離(4000 rpm, 10分間)により回収し、滅菌水で1回洗浄し、pH 6.0の0.1 M 酢酸リチウム溶液中に懸濁させた。この細胞懸濁液のサンプル200μlと、線状化プラスミドDNA溶液(10-20μg)とを混合し、室温で10分間インキュベートした後、同じ緩衝液中の50% PEG 4000溶液1mlと混合した。この懸濁液を室温でさらに1時間インキュベートした後、42℃で2分間のヒートショックを与えた。細胞をSC his leuプレート(0.67% 酵母窒素ベース、2%グルコース、ロイシン及びヒスチジンがそれぞれ100 mg/L)上に線状に塗布した。30℃で3-4日間インキュベートした後、形質転換体が得られた。
【０２３６】
pYLA(KZl)形質転換体からの3種の単離物、pYLI(KZl) 形質転換体からの3種の単離物、pYLA(MAP29) 形質転換体からの2種の単離物、及びpYLI(MAP29) 形質転換体からの2種の単離物を、YEP7培地(1% 酵母エキス、2%ペプトン、pH 7.0) を用いて振蕩しながら30℃で24時間培養した。各培養物の10mlから細胞を遠心分離で回収し、新鮮なYEP7で再懸濁させ、それぞれ15mlのスクリューキャップバイアルに入れた。各バイアルを穏やかに振蕩(60 rpm)しながら、室温で一晩インキュベートした。各バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度を、実施例1に記載のマススペクトル検出器を備えたガスクロマトグラフィーで分析した。pYLA(KZl)及び pYLI(KZl)から得られた全ての形質転換体は、容易に検出可能な量のイソプレンを生成した(0.5μg/Lから1μg/L、図20)。
イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりにフィターゼ遺伝子を備えたコントロール株のヘッドスペースからは、イソプレンは検出されなかった。
【０２３７】
＜実施例7＞
＜Kudzuイソプレンシンターゼ及びidi、またはdxsまたはidi及びdxsを発現するE. coliにおけるイソプレン生成＞
＜I.   E. coli中でイソプレンを生成させるためのkudzuイソプレンシンターゼ及びidi、またはdxsまたはidi及びdxsをコードするベクターの構築＞
i)   pTrcKudzuKanの構築
pTrcKudzu (実施例1に記載)のbla遺伝子を、カナマイシン耐性を賦与する遺伝子で置換した。bla遺伝子を除去するために、pTrcKudzuをBspHIで消化し、Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)で処理し、65℃で熱殺菌し、次にKlenow断片とdNTPで末端処理した。5kbpの大きさの断片をアガロースゲルで精製し、kanr 遺伝子に結紮した。kanr 遺伝子は、pCR-Blunt-II-TOPOから
プライマーMCM22
【化３３】
2014144007.tif 000037
と、プライマーMCM23
【化３４】
2014144007.tif 000038
とを用いてPCR増幅し、HindIII及びPvuIで消化し、末端処理したものである。
カナマイシン耐性(pTrcKudzuKan)を賦与されたプラスミドを備える形質転換体を、カナマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。
【０２３８】
ii)   pTrcKudzu yIDI Kanの構築
pTrcKudzuKanをPstIで消化し、SAPで処理し、熱殺菌し、ゲル精製した。次にS. cerevisiae由来のidiをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーは
NsiI-YIDI 1 F
【化３５】
2014144007.tif 000039
及びPstI- YIDI 1 R
【化３６】
2014144007.tif 000040
＜ＩＭＡＧＥ ＳＲＣ＝"c:\html\化36 Danisco&Goodyear-C.bmp"＞
であり、テンプレートはS. cerevisiaeのゲノムDNAであった。
PCR産品をNsiI及びPstIで消化し、結紮の前にゲル精製した。結紮混合物を化学的コンピテントTOP10細胞中に形質転換し、カナマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、シーケンシングを行い、得られたプラスミドをpTrcKudzu-yIDI(kan) (図 34及び35)と命名した。
【０２３９】
iii)   pTrcKudzu DXS Kanの構築
プラスミドpTrcKudzuKanをPstIで消化し、SAPで処置し、熱殺菌し、ゲル精製した。次に、E. coli由来のdxsをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーは
MCM 13
【化３７】
2014144007.tif 000041
及びMCM14
【化３８】
2014144007.tif 000042
であり、テンプレートはE. coliのゲノムDNAであった。
PCR産品をNsiI及びPstIで消化し、結紮の前にゲル精製した。得られた形質転換反応物をTOP10細胞中に形質転換し、カナマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、シーケンシングを行い、得られたプラスミドをpTrcKudzu- DXS(kan) (図36及び37)と命名した。
【０２４０】
iv)  pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)の構築
pTrcKudzu-yΙDI(kan) をPstIで消化し、SAPで処理し、熱殺菌し、ゲル精製した。次に、E. coli由来のdxsをコードし合成RBSを備えるPCR産品に結紮した。
PCRに用いたプライマーは
MCM 13
【化３９】
2014144007.tif 000043
及びMCM14
【化４０】
2014144007.tif 000044
であり、テンプレートは、予めNsiI及びPstIで消化し、ゲル精製しておいたTOP 10細胞であった。得られたプラスミドをpTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) (図 21及び22)と命名した。
【０２４１】
v)  pCL PtrcKudzuの構築
上記の実施例1のプロモータ、構造遺伝子、及びターミネータを備えるDNAの断片を、Ssplを用いてpTrcKudzuから消化し、ゲル精製した。次に、pCL1920に結紮した。pCL1920は、PvuIIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。得られた結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シーケンシングを行い、2種類を選択した。pCL PtrcKudzu及びpCL PtrcKudzu (A3) は、反対方向の挿入を備えていた(図38-41)。
【０２４２】
vi)   pCL PtrcKudzu yIDIの構築
上記(ii)のNsiI-PstI消化、ゲル精製、IDI PCRアンプリコンをpCL PtrcKudzuに結紮した。pCL PtrcKudzuは、予めPstIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シーケンシングを行い、得られたプラスミドをpCL PtrcKudzu yIDI (図42及び43)と名付けた。
【０２４３】
vii)  pCL PtrcKudzu DXSの構築
上記(iii)のNsiI-PstI消化、ゲル精製、DXS PCRアンプリコンをpCL PtrcKudzu (A3) に結紮した。pCL PtrcKudzu (A3)は、予めPstIで消化され、SAPで処理され、熱殺菌されていた。結紮混合物をTOP 10細胞中に形質転換し、スペクチノマイシンを50μg/ml含むLA上で選択した。いくつかのクローンを単離し、シーケンシングを行い、得られたプラスミドをpCL PtrcKudzu DXS (図44及び45)と名付けた。
【０２４４】
＜II.  異なるコピー数のkudzuイソプレンシンターゼ、idi、及び／又はdxsを発現する培養物のヘッドスペースにおけるイソプレンの測定＞
プラスミドpTrcKudzu(kan) (A)、pTrcKudzu-yIDI kan (B)、pTrcKudzu-DXS kan (C)、pTrcKudzu-ylDI-DXS kan (D)で形質転換したE. coli BL21(λDE3)の培養物を、LB カナマイシン50μg/mLを含むLBにおいて成長させた。
pCL PtrcKudzu (E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI (F)及び pCL PtrcKudzu-DXS (G)の培養物を、スペクチノマイシン50μg/mLを含むLBにおいてで成長させた。
時間0(OD600は約0.5)において、培養物を400μM IPTGにより誘導し、ヘッドスペースのイソプレンを測定するために、複数のサンプルを採取した(実施例1参照)。結果を図23A-23Gに示す。
【０２４５】
プラスミドpTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)を形質転換によりE. coli株BL21中に導入した。得られたBL21/pTrc Kudzu IDI DXS株を、カナマイシン(50μg/ml)を含むLBにおいて20℃で一夜培養し、次に、振蕩フラスコ中の1%グルコースを含むTM3 (13.6 g K2PO4、13.6 g KH2PO4、2.0 g MgSO4*7H2O)、2.0 g クエン酸一水和物、0.3 gクエン酸第二鉄アンモニウム、3.2 g (NH4) 2SO4、0.2 g 酵母エキス、1.0 ml 1000x Modified Trace Metal Solution、pH 6.8に調整、H2Oで容積調整、濾過滅菌) に植菌した。振蕩フラスコをOD600が0.8になるまで30℃で培養し、400μM IPTGで誘導した。誘導後、所定時間ごとにサンプルを採取し、実施例1に示した方法でヘッドスペース中のイソプレンの量を測定した。結果を図23Hに示す。
【０２４６】
＜III.   E. coli/pTrcKudzu yIDI DXSによるバイオマスからのイソプレン生成＞
BL21 pTrcKudzuIDIDXS株について、バガス、トウモロコシ茎葉、針葉樹パルプの3種のバイオマスからのイソプレン生成能力を、グルコースをコントロールに用いて試験した。酵素加水分解法 (Brown, L and Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") により、バイオマスの加水分解物を調製し、等価グルコースになるように希釈して用いた。この実施例では、等価グルコースはグルコース1%に等しい。
新たに形質転換したBL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)細胞のプレートからシングルコロニーを採取し、LBとカナマイシン(50μg/ml)を含む培養液5 mlに植菌した。培養物を25℃で一晩、振蕩しながらインキュベートした。翌日、一夜培養物を25 mlのTM3、0.2% YE、1%フィードストック溶液中のOD600が0.05になるように希釈した。フィードストックは、トウモロコシ茎葉、バガス、または針葉樹パルプであった。
グルコースを陽性コントロールに用い、グルコース無添加を陰性コントロールに用いた。培養物を180rpmで振蕩しながら、30℃でインキュベートした。培養物のOD600を監視し、OD600が約0.8に達したら、実施例1に記載した方法により、培養物の1時間目と3時間目のイソプレン生成を分析した。培養物の誘導は行わなかった。フィードストックを添加した培養物は、いずれもグルコースの陽性コントロールと同等量のイソプレンを生成した。実験は2回繰り返した。結果を図46に示す。
【０２４７】
＜IV.  E. coli/pTrcKudzuIDIDXSによる転化糖からのイソプレン生成＞
BL21 (λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (kan)の新たに形質転換した細胞のプレートからシングルコロニーを採取し、LBとカナマイシン(50μg/ml)を含む培養液5 mlに植菌した。培養物を25℃で一晩、振蕩しながらインキュベートした。翌日、一夜培養物を25 mlのTM3、0.2% YE、1%フィードストック溶液中のOD600が0.05になるように希釈した。フィードストックは、グルコース、転化糖、またはトウモロコシ茎葉であった。
転化糖フィードストック(Danisco Invert Sugar)は、ショ糖シロップを酵素処理して調製した。AFEXトウモロコシ茎葉は下記の方法で調製した(パートV)。細胞を30℃で成長させ、培養物のOD600が約0.8-1.0(0 時間目)になったとき、最初のサンプルの測定を行った。0、1 及び3時間目に、培養物について細胞の成長をOD600で測定し、イソプレン生成を実施例1に記載した方法で分析した。結果を図47に示す。
【０２４８】
＜V.  AFEX前処理トウモロコシ茎葉からの加水分解物の調製＞
AFEX前処理トウモロコシ茎葉は、Michigan Biotechnology Instituteから入手した。前処理は、湿度60%、1 : 1アンモニアにより90℃において30分間処理、その後風乾することにより行った。AFEX前処理トウモロコシ茎葉の水分は21.27%であった。AFEX前処理トウモロコシ茎葉中のグルカン及びキシラン含有量はそれぞれ31.7%及び19.1% (乾燥ベース) であった。
糖化プロセスは次の通りであった； 5 mlの1Mクエン酸緩衝液(pH4.8)、2.25 ml のAccellerase 1000、0.1 mlのGrindamyl H121 (Danisco 社の製パン用のAspergillus niger由来キシラナーゼ製品) 、及び72.65 mlの脱イオン水を入れた500 mlフラスコに、AFEX前処理トウモロコシ茎葉20 gを投入した。このフラスコをオービタルシェーカーに取り付け、50℃で96時間インキュベートした。シェーカーのフラスコからサンプルを採取し、HPLCで分析した。加水分解物には、グルコース38.5 g/L、キシロース21.8 g/L、及びグルコースおよび／またはキシロースのオリゴマー10.3 g/Lが含まれていた。
【０２４９】
＜VI.   流加培養法で培養したE. coliによるイソプレン生成における酵母エキスの効果＞
上記のプラスミドpTrcKudzu yIDI DXSを含むE. coli細胞を用いて、上記の14-Lスケールの発酵を行った。酵母エキス(Bio Springer社, Montreal, Quebec, Canada)を指数関数的に添加した。40時間の発酵の間に発酵槽に添加した酵母エキスの総量は、70-830gの間で変化した。
波長550 nmにおいて発酵ブロスの光学密度を測定した。発酵槽の最終的光学密度は、添加した酵母エキスの量に比例した(図48A)。発酵槽からのオフガス中のイソプレン濃度は、前記の方法で測定した。発酵している間、イソプレンの力価が増加した(図48B)。イソプレンの生成量は、酵母エキスの添加量に直線的に比例した(図48C)。
【０２５０】
＜VII.  pTrcKudzu DXS yIDIの500 Lスケールの発酵におけるイソプレン生成＞
Kudzuイソプレンシンターゼ、S. cerevisiae IDI、及びE. coli DXS核酸(E. coli BL21 (λDE3) pTrc Kudzu dxs yidi)を備えるE. coli細胞を500リットルスケールで発酵させて、イソプレンを生成させた。15時間の発酵中、イソプレンの濃度は50から300μg/Lの範囲で変動した。平均イソプレン濃度、装置における平均流量、及びイソプレンの破過の程度に基づき、回収されたイソプレンは計算により約17 gと見積もられた。
【０２５１】
＜VIII.  流加培養法で成長させたE. coliの500 Lスケールの発酵におけるイソプレン生成＞
【０２５２】
＜培地の組成＞
K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。 
すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。アンモニアガス(NH3)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０２５３】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの組成＞
【０２５４】
クエン酸* H2O 40g、MnSO4 * H2O 30g、NaCl 10g、FeSO4 * 7H2O 1g、CoCl2 * 6H2O 1g、ZnSO4 * 7H2O 1g、CuSO4 * 5H2O 100mg、H3BO3 100mg、NaMoO4 * 2H2O 100mg。 
すべての成分を同時に添加してDI H2O中に溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0に調整し、所定容積にし、0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。
【０２５５】
pTrcKudzu yIDI DXSプラスミドを備えるE. coli細胞を用い、500-Lバイオリアクター中で発酵させた。
この実施例は、所望のpH 7.0、温度30℃で発酵させて行い、グルコースと酵母エキスから生成されるイソプレンの量を監視した。凍結したバイアルから採取したE. coli株接種材料は、ソイトン-酵母エキス-グルコース培地により調製した。550nmにおける光学密度が0.15になるまで接種材料を成長させた。次に、その20mlをソイトン-酵母エキス-グルコース培地が入れられた2.5-Lバイオリアクターに植菌した。2.5-Lバイオリアクターを30℃において光学密度が1.0になるまで培養し、2.0Lを500-Lバイオリアクターへ移した。
【０２５６】
酵母エキス(Bio Springer社、Montreal, Quebec, Canada)及びグルコースを、指数関数的に供給した。50時間の発酵中にバイオリアクターに供給したグルコース及び酵母エキスの量は、それぞれ181.2kg及び17.6 kgであった。バイオリアクター内の光学密度の経時変化を図49Aに示す。バイオリアクターのオフガス中のイソプレン濃度は、前記の方法で測定した。発酵中、イソプレン力価が増加した(図49B)。50時間の発酵中に生成されたイソプレンの総量は55.1gであった。イソプレン生成量の経時変化を図49Cに示す。
【０２５７】
＜実施例8＞
＜kudzuイソプレンシンターゼ及び組み換えメバロン酸経路遺伝子を発現するE. coliによるイソプレンの生成＞
＜I.  下流MVA経路のクローン化＞
以下の方法で下流メバロン酸経路をクローン化した。
4種のメバロン酸生合成経路の遺伝子；メバロン酸キナーゼ (MVK)、ホスホメバロン酸キナーゼ (PMK)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ (MVD)、及びイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼを、S. cerevisiae染色体DNAによるPCRで増幅し、それぞれpCR BluntII TOPOプラスミド (Invitrogen社) 中にクローン化した。いくつかの例では、idi遺伝子をE. coli染色体DNAにより増幅した。
プライマーは、E. coliのコンセンサスRBS
【化４１】
2014144007.tif 000045
または
【化４２】
2014144007.tif 000046
が5'末端において開始コドンの8 bp上流に挿入され、PstI部位が3'末端に付加されるように設計した。これらの遺伝子をpTrcHis2Bベクター中に１つずつクローン化して、全経路を形成した。
【０２５８】
S. cerevisiae S288C由来の染色体DNAは、ATCC (ATCC 204508D) から入手した。MVK遺伝子を、S. cerevisiaeの染色体により増幅した。このとき、プライマーには
MVKF
【化４３】
2014144007.tif 000047
及びMVK-PstI-R
【化４４】
2014144007.tif 000048
を用い、PfuTurboを製造者の取扱説明書に従って用いた。
1.2% E-gel (Invitrogen社)を用いた電気泳動により、PCR産品(1370 bp)が正規のサイズであることを確認し、pZeroBLUNT TOPO中にクローン化した。得られたプラスミドをpMVK1と命名した。
プラスミドpMVK1をSacI及びTaq1制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片をゲル精製し、SacI及びBstBIで消化したpTrcHis2Bと結紮した。得られたプラスミドをpTrcMVK1と命名した。
【０２５９】
メバロン酸生合成経路の2番目の遺伝子であるPMKは、プライマーにPstI-PMK1 RとBsiHKA I-PMK1 Fを用いたPCRで増幅した。
PstI-PMK1 R
【化４５】
2014144007.tif 000049
BsiHKA I-PMK1 F
【化４６】
2014144007.tif 000050
PCR反応は、Pfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene社)を製造者の取扱説明書に従って用いて行った。正規のサイズの産品(1387 bp)をPstIとBsMKIで消化し、PstIで消化したpTrcMVK1と結紮した。得られたプラスミドをpTrcKKと命名した。
MVD及びidi遺伝子を同様にしてクローン化した。PCRは、MVD遺伝子を増幅するためにPstI-MVD 1 R及びNsiI-MVD 1 Fのプライマーのペアを用い、yIDI遺伝子を増幅するためにPstI- YIDI 1 R及びNsiI- YIDI 1 Fのプライマーのペアを用いた。
PstI-MVD 1 R
【化４７】
2014144007.tif 000051
NsiI-MVD 1 F
【化４８】
2014144007.tif 000052
PstI- YIDI 1 R
【化４９】
2014144007.tif 000053
NsiI- YIDI 1 F
【化５０】
2014144007.tif 000054
いくつかの例では、IPPイソメラーゼ遺伝子、E. coli由来のidiを用いた。E. coli染色体DNA由来のidiを増幅するために、以下のプライマーのセットを用いた。
PstI-CIDI 1 R
【化５１】
2014144007.tif 000055
NsiI-CIDI 1 F
【化５２】
2014144007.tif 000056
テンプレートDNAは、標準的な方法でE. coli FM5 (その全内容、特に核酸の単離に関して本願に参照として組み込まれるWO 96/35796 及びWO 2004/033646参照) から単離した染色体DNAであった。
最終的に得られた酵母のidi遺伝子をコードする構築体のプラスミドをpKKDIyと命名した。また、最終的に得られたE. coliのidi遺伝子をコードする構築体のプラスミドを、pKKDIcと命名した。
このプラスミドをE. coli宿主細胞BL21中に形質転換して、以後の分析に用いた。いくつかの実施例では、kudzu由来のイソプレンシンターゼをpKKDIy中にクローン化して、プラスミドpKKDIylSを得た。
【０２６０】
また、下流MVA経路を、カナマイシン抗生物質耐性マーカを備えるpTrc中にクローン化した。プラスミドpTrcKKDIyを制限エンドヌクレアーゼApaI及びPstIで消化して、5930 bpの断片を1.2%アガロース E-gelで分離し、Qiagen Gel Purificationキットを製造者の取扱説明書に従って用いて精製した。実施例7に記載したプラスミドpTrcKudzuKanを制限エンドヌクレアーゼApaI及びPstIで消化して、ベクターを含む3338 bpの断片を、Qiagen Gel Purificationキットを用いて1.2% E-gelから精製した。3338 bpのベクターの断片と、5930 bpの下流MVA経路の断片を、Roche Quick Ligationキットを用いて結紮した。結紮混合物をE. coli TOP10細胞中に形質転換し、形質転換体を37℃で一晩成長させ、カナマイシン(50μg/ml)を含むLAで選択した。形質転換体を制限酵素消化で検証し、1をストックとして凍結保管した。このプラスミドをpTrcKanKKDIyと命名した。
【０２６１】
＜II.  kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子のpTrcKanKKDIy中へのクローン化＞
kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、実施例1に示したように、プライマーMCM50及びMCM53を用いたPCRによりpTrcKudzuから増幅した。
MCM50
【化５３】
2014144007.tif 000057
MCM53
【化５４】
2014144007.tif 000058
得られたPCR断片を、pCR2.1中にクローン化して、E. coli TOP10中に形質転換した。この断片は、kudzuイソプレンシンターゼのコード配列、及びE. coli由来のRBSを含む上流側領域を備える。形質転換体を37℃で一晩培養し、カルベニシリン (50μg/ml)を含むLAで選択した。断片が正しく挿入されていることをシーケンシングで検証した。この株をMCM93と命名した。
【０２６２】
株MCM93由来のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼNsiI及びPstIで消化して、RBS及びkudzuイソプレンシンターゼを含む1724 bpの挿入部分を放出させた。この1724 bpの断片を1.2%アガロースE-gelで分離し、Qiagen Gel Purification キットを製造者の取扱説明書に従って用いて精製した。プラスミドpTrcKanKKDIyを制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、SAPにより37℃で30分間処理し、Qiagen PCR cleanupキットを用いて精製した。DNA断片をコードするプラスミドとkudzuイソプレンシンターゼをRoche Quick Ligationキットを用いて結紮した。結紮混合物をE. coli TOP10細胞中に形質転換し、形質転換体を37℃で一晩培養し、カナマイシン50μg/mlを含むLAで選択した。正規の形質転換体であることを制限酵素消化で検証した。このプラスミドをpTrcKKDylklSKan (図24 及び25) と命名した。このプラスミドを、BL21(λDE3)細胞 (Invitrogen社) 中に形質転換した。
【０２６３】
＜III.組み換え下流メバロン酸経路及びkudzu由来のイソプレンシンターゼを発現するE. coliによるメバロン酸塩からのイソプレン生成＞
BL21/pTrcKKDyIkISKan株をMOPS培地 (Neidhardt et al, (1974) J. Bacteriology 119:736-747)で培養した。MOPS培地は、pH 7.1に調整され、0.5%グルコースと0.5%メバロン酸が添加されていた。0.5%メバロン酸が添加されていない点を除き同様の条件のコントロール培養物を調製した。
培養は1%の接種材料の一夜種培養物から開始し、培養物のOD600が0.3から0.5に達したとき、500μMのIPTGで誘導した。培養物を250rpmで振蕩しながら、30℃で成長させた。誘導してから3時間後に、イソプレンの生成を実施例1に記載したヘッドスペース法により分析した。イソプレンの最大生成は6.67×104 nmol/Lbroth/OD600/hrであった。ここで、Lbrothはブロスの容積であり、細胞培地容積と細胞容積の両者を含む。メバロン酸無添加のコントロール培地からは、検出可能な量のイソプレンは生成されなかった。
【０２６４】
＜IV.  上流MVA経路のクローン化＞
3種の酵素活性をコードする2種の遺伝子を備える上流メバロン酸生合成経路を、Enterococcus faecalisからクローン化した。mvaE遺伝子は、この経路における1番目と3番目のタンパク質であるアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ、及び3-ヒドロキシ-3- メチルグルタアリール-CoA (HMG-CoA) リダクターゼの双方の酵素活性を備えるタンパク質をコードし、mvaS遺伝子は、この経路の2番目の酵素であるHMG-CoAシンターゼをコードする。
mvaE遺伝子は、E. coliリボソームの結合部位及びその前方のスペーサを供えるE. faecalisのゲノムDNA (ATCC 700802D-5) から、下記のプライマーを用いて増幅した。
CF 07-60 (+)  mvaE w/ RBSの開始端+ATG開始コドンSacI
【化５５】
2014144007.tif 000059
CF 07-62 (-)  mvaEとmvaSとをRBSを介して融合
【化５６】
2014144007.tif 000060
【０２６５】
mvaS遺伝子は、RBS及びその前方のE. coli由来のスペーサを供えるE. faecalisのゲノムDNA (ATCC 700802D-5) から、下記のプライマーを用いて増幅した。
CF 07-61 (+)  RBSを介してmvaEとmvaSとを融合
【化５７】
2014144007.tif 000061
CF 07-102 (-)  mvaS gene BglIIの終端
【化５８】
2014144007.tif 000062
【０２６６】
PCRとともに、各PCR断片を以下のプライマーを用いて融合した。
CF 07-60 (+)  mvaE w/ RBSの開始端+ ATG 開始コドンSacI
【化５９】
2014144007.tif 000063
CF 07-102 (-)  mvaS gene BglIIの終端
【化６０】
2014144007.tif 000064
【０２６７】
融合PCR断片をQiagenキットを用いて精製し、制限酵素SacI及びBglIIにより消化した。消化したDNA断片をQiagenキットを用いてゲル精製し、市販のベクターであり、予め制限酵素SacI及びBglIIにより消化してゲル精製しておいたpTrcHis2Aに結紮した。
【０２６８】
結紮混合物をE. coli Top 10細胞中に形質転換し、コロニーをカルベニシリン50μg/mlを含有するLAプレート上で選択した。全部で6つのコロニーを選択し、カルベニシリン50μg/mlを含有するLB中で培養し、Qiagenキットを用いてプラスミドを単離した。挿入状態を確認するために、これらのプラスミドをSacI及びBglIIで消化し、次のプライマーにより1の正規のプラスミドについてシーケンシングを行った。
CF 07-58 (+)  mvaE遺伝子の開始端
【化６１】
2014144007.tif 000065
CF 07-59 (-)  mvaE遺伝子の終端
【化６２】
2014144007.tif 000066
CF 07-82 (+)  mvaS遺伝子の開始端
【化６３】
2014144007.tif 000067
CF 07-83 (-)  mvaS遺伝子の終端
【化６４】
2014144007.tif 000068
CF 07-86 (+)  mvaE中の配列
【化６５】
2014144007.tif 000069
CF 07-87 (+)  mvaE中の配列
【化６６】
2014144007.tif 000070
CF 07-88 (+)  mvaE中の配列
【化６７】
2014144007.tif 000071
CF 07-89 (+)  mvaS中の配列
【化６８】
2014144007.tif 000072
【０２６９】
シーケンシングによりpTrcHis2A上流経路#lと呼ばれるプラスミドが正規のものであることを確認し、市販のE. coli株BL21中に形質転換した。カルベニシリン50μg/mlを含有するLA上で選択を行った。2つの形質転換体を選択し、カルベニシリン50μg/ml を含有するLB中で、OD600が1.5になるまで培養した。この2つの株を、グリセロールを添加したバイアルに入れ、-80℃で凍結させた。この2つの株について、BL21中に形質転換したpTrcHis2A上流経路#lの単離したサンプル#1をCF 449と命名し、BL21中に形質転換したpTrcHis2A上流経路#lの単離したサンプル#2をCF 450と命名した。いずれのクローンも、分析により同一の挙動を示すことが確認された。
【０２７０】
＜pCL1920中への上流MVA経路のクローン化＞
プラスミドpTrcHis2A上流経路を、制限エンドヌクレアーゼSspIで消化してpTrc-mvaE-mvaS-(His tag)-ターミネータを含む断片を放出させた。この断片では、his-tagは翻訳されなかった。この平滑末端の4.5 kbpの断片を、Qiagen Gel Purificationキットにより1.2% E-gelを用いて精製した。ベクターを制限エンドヌクレアーゼPvuIIで消化し、SAPで処理し、Qiagen Gel Purificationキットにより1.2% E-gelを用いて精製することにより、pCL1920由来の脱リン酸化した平滑末端の4.2 kbpの断片を調製した。2つの断片をRoche Quick Ligationキットを用いて結紮し、TOP10化学的コンピテント細胞中に形質転換した。形質転換体を、スペクチノマイシン(50μg/ml)を含むLA上で選択した。正しく挿入されていることをPCRによりスクリーニングして、正規のコロニーを特定した。このプラスミドをpCL Ptrc上流径路 (図26及び図27 A-27D) と命名した。
【０２７１】
＜VI.  上流及び下流メバロン酸経路の組合せを発現する株＞
全メバロン酸経路及びkudzuイソプレンシンターゼを備える株を得るため、プラスミドpTrcKKDyIkISkan及びプラスミドpCLpTrc上流経路を、BL21(λDE3) コンピテント細胞 (Invitrogen社) 中に形質転換した。この形質転換体を、カナマイシン(50μg/ml)及びスペクチノマイシン(50μg/ml)を含むLA上で選択した。形質転換体をプラスミドプレップで検査して両プラスミドが宿主中に組み入れられたことを確認した。この株をMCM127と命名した。
【０２７２】
＜VII.   E. coli上流経路 エラー! 参照元が見つかりません。におけるグルコースからのメバロン酸の生成＞
BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaSまたはFM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaSの各シングルコロニーを、カルベニシリン (100μg/ml)を含むLBにそれぞれ植菌し、200 rpmで振蕩しながら、37℃で一晩成長させた。これらの培養物を250 mlのバッフル付きフラスコ中の50 ml培地中に入れ、OD600が0.1になるまで希釈した。
用いた培地の組成は、TM3+1または2%グルコース、カルベニシリン(100μg/ml)、または、TM3+1%グルコース、加水分解大豆油、及びカルベニシリン(100μg/ml)、または、TM3+バイオマス(調製したバガス、トウモロコシ茎葉、またはスイッチグラス)であった。
培養物を200rpmで振蕩しながら、OD600が0.4になるまで、30℃で約2-3時間成長させた。この時点でIPTG (400μM) を添加することにより、mvaE mvaS構築体からの発現を誘導した。培養物をさらに20または40時間インキュベートした。誘導後6時間目まではサンプルを2時間おきに採取し、その後は必要に応じて24、36 及び48時間後に採取した。サンプリングでは培養物1 mlを採取し、OD600を測定し、細胞をmicrofuge遠心分離機でペレット化し、次いで上清を採取してメバロン酸を分析した。
【０２７３】
Enterococcus faecalis AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、及びHMG-CoAリダクターゼポリペプチドをコードする核酸を備えるE. coli 細胞を、細胞培地としてグルコースを2%含むTM3培地を用いて14リットルスケールで発酵させたところ、22グラムのメバロン酸が生成した。
細胞培地としてグルコースを1%含むLB培地を用いて振蕩フラスコで発酵させたところ、1リットル当たり2-4グラムのメバロン酸が生成した。これらの株でメバロン酸が生成されたことから、E. coli中でMVA経路が機能していることが確認された。
【０２７４】
＜VIII.  上流及び下流MVA経路とkudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli BL21によるイソプレン生成＞
上記の上流及び下流MVA経路とkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子と、実施例7に記載したidi, dxs, 及びdxr、及びイソプレンシンターゼ遺伝子を含むプラスミドとを様々に組み合わせて、以下の株を作った。使用した宿主細胞は化学的コンピテントBL21(λDE3)であった。形質転換は標準的な方法で行った。形質転換体を、カナマイシン(50μg/ml)を含むLアガー、またはカナマイシンとスペクチノマイシン (両者とも濃度は50μg/ml) を含むLアガーにより選択した。これらのプレートに線状に塗布した細胞を、37℃で培養した。得られた株を以下のように命名した。
カナマイシンとスペクチノマイシンで培養 (各50μg/ml) 
MCM 127 - BL21(λDE3)中のpCL上流MVA及びpTrcKKDyIkIS (kan)
MCM 131 - BL21(λDE3)中のpCL1920及びpTrcKKDyIkIS (kan)
MCM 125 - BL21(λDE3)中のpCL上流MVA及びpTrcHis2B (kan)
カナマイシンで培養 (50μg/ml)
MCM64 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu yIDI DXS (kan)
MCM50 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu (kan)
MCM123 - BL21(λDE3)中のpTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan)
【０２７５】
上記の各株の凍結保管した試料を、LAと適切な抗生物質を含むプレートに線状に塗布し、37℃で一晩培養した。各プレートのシングルコロニーを（25mlのLBと適切な抗生物質が入れられた）振蕩フラスコに植菌した。振蕩フラスコを200rpmで振蕩しながら、22℃で一晩培養した。翌朝、振蕩フラスコを37℃のインキュベータに移し、200rpmで振蕩しながら、37℃でさらに4.5時間培養した。
25mlの培養物を遠心分離して細胞をペレット化して、適切な抗生物質を含む5mlの LB中に再懸濁させた。次に、1%グルコース及び適切な抗生物質を含む25mlのLBを用いて、培養物をOD600が0.1になるまで希釈した。各株について、2つのフラスコで試験した。1つのフラスコではIPTG (800μM)による誘導を行い、もう1つのフラスコでは誘導を行わなかった。各培養物を250rpmで振蕩しながら、37℃で培養した。1.50時間後に、1つのフラスコの培養物を(サンプリング時点1の後直ちに)誘導した。各サンプリング時点でOD600を測定し、実施例1に記載した方法でイソプレンの量を測定した。結果をTable 3に示す。産出されたイソプレンの量は、その株のピーク産出における量で示した。
【表３】
2014144007.tif 000073
【０２７６】
＜IX.  メバロン酸の分析＞
Sigma- Aldrich社製 (WI, USA) の、水(7.7 mL) に溶解されたシロップ状のメバロノラクトン(1.0 g、7.7 mmol) (CAS# 503-48-0)を水酸化カリウム(7.7 mmol)で処理して、メバロン酸のカリウム塩を生成させた。メバロン酸への転換は、1H NMR分析で確認した。
HPLC分析用のサンプルの調製では、先ず14,000rpmで5分間遠心分離して細胞を除去した後、得られた上清300μlを900μlのH2Oに添加した。次に、過塩素酸(70%溶液36μl)を添加して混合した後、氷上で5分間冷却した。サンプルを再度遠心分離(14,000rpmで5分間)し、上清をHPLCに注入した。同様にして、メバロン酸標準液(20、10、5、1 及び0.5 g/L)を調製した。
メバロン酸の分析(注入容積20μL)では、BioRad Aminex 87-H+ カラム(300mm×7.0 mm)を用い、5 mM硫酸を0.6 mL/分で流通させて溶出させ、屈折率(RI)検出器により測定した。この条件下で、メバロン酸がラクトンの形態で18.5分後に溶出した。
【０２７７】
＜X.  上流MVA経路及びkudzuイソプレンシンターゼを含むE. coli BL21からのイソプレン生成＞
メバロン酸経路ポリペプチド及びKudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliの15リットルスケールの発酵により、流加発酵培養物中の細胞からイソプレンを生成させた。この実験では、グルコース制限条件下で成長する細胞から2.2 g/Lのイソプレンが生成することが示された。
【０２７８】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０２７９】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０２８０】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０２８１】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０２８２】
発酵は、pCL Ptrc上流経路(図26) 及び pTrcKKDyIkIS プラスミドを含有するBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度30℃の発酵においてグルコースから生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LBブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、ソイトン-酵母エキス-グルコース培地に植菌した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、500 mLを5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０２８３】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。54時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は3.7kgであった。誘導は、イソプロピル-ベータ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG) を添加することにより行った。550nmにおける光学密度(OD550)が10になったとき、IPTGの濃度を25μMにした。OD550が190になったとき、IPTGの濃度を50μMに増加させた。発酵38時間目に、IPTGの濃度を100μMまで増加させた。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図54に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に2.2 g/L に達した(図55)。54時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は15.9 gであった。図56に、イソプレン生成の経時変化を示す。
【０２８４】
＜XI.   15リットルスケールの流加発酵培養物中で成長させた、メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliからのイソプレン発酵＞
メバロン酸経路ポリペプチド及びKudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliの15リットルスケールの発酵により、流加発酵培養物中の細胞からイソプレンを生成させた。この実験では、グルコース制限条件下で成長する細胞から3.0 g/Lのイソプレンが生成することが示された。
【０２８５】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０２８６】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０２８７】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０２８８】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０２８９】
発酵は、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを含有するBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度30℃の発酵においてグルコースから生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LBブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、500 mLを5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０２９０】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。59時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は2.2kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。550nmにおける光学密度(OD550)が10になったとき、IPTGの濃度を25μMにした。OD550が190になったとき、IPTGの濃度を50μMに増加させた。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図93に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に3.0 g/L に達した(図94)。59時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は22.8 gであった。図95に、イソプレン生成の経時変化を示す。発酵中に、イソプレン生成に消費された炭素のモル収率は2.2%であった。グルコースからのイソプレン収率は1.0重量%であった。
【０２９１】
＜XII.   15リットルスケールの流加発酵培養物中で成長させた、メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliからのイソプレン発酵＞
メバロン酸経路ポリペプチド、Pueraria lobataイソプレンシンターゼ、及び Kudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliの15リットルスケールの発酵により、流加発酵培養物中の細胞からイソプレンを生成させた。この実験では、グルコース制限条件下で成長する細胞から3.3 g/Lのイソプレンが生成することが示された。
【０２９２】
＜i) pCLPtrcUpperPathwayHGS2の構築＞
pTrcKKDyIkISをテンプレートとして用い、NsiI-RBS-HGS F及びpTrcRプライマーにより、Pueraria lobata由来のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子をPCR増幅した。
NsiI-RBS-HGS Fプライマー
【化６９】
2014144007.tif 000074
pTrcRプライマー
【化７０】
2014144007.tif 000075
得られたPCR産品をNsiI及びPstIで制限酵素消化し、ゲル精製した。プラスミドpCL PtrcUpperPathwayをPstIで制限酵素消化し、rAPidアルカリ性ホスファターゼ(Roche)を製造者の取扱説明書に従って用いて脱リン酸化した。
【０２９３】
各DNA断片を結紮し、結紮反応物をE. coli Top10化学的コンピテント細胞 (Invitrogen社)中に形質転換し、スペクチオマイシン(50μg/ml)を含有するLアガー上に線状に塗布し、37℃で一夜培養した。
正規のクローンをシーケンシングにより選択した。これにより得られ、T7プロモータからkudzuイソプレンシンターゼを発現するプラスミドを、pETNHisKudzu (図4及び5)と命名した。 Qiaquick Spin Mini-prepキットを用いて、 6種のクローンからプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを、制限酵素EcoRV及びMluIにより消化し、正しい挿入方向(すなわち、遺伝子の方向がpTrcプロモータと同じ方向)のクローンを特定した。
【０２９４】
得られた正しいプラスミドを、pCLPtrcUpperPathwayHGS2と命名した。このプラスミドを、本願に開示するヘッドスペースアッセイにより評価したところ、E. coli Top10中でイソプレンの生成が認められ、遺伝子の機能が立証された。このプラスミドを、pTrcKKDyIkISを備えるBL21(LDE3)中に形質転換して、BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS株を得た。
この株は、BL21/pCL PtrcUpperMVA株、及びpTrc KKDyIkIS株(実施例8、パートXI)との比較において、イソプレンシンターゼの追加のコピーを備えている。また、この株は実施例8、パートXIで用いたBL21/pCL PtrcUpperMVA株、及び pTrc KKDyIkIS株と比較して、向上した活性及び発現性を有していた。
【０２９５】
＜ii) 15リットルスケールの流加発酵培養物中で成長させた、pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkISを発現するE. coliからのイソプレン発酵＞
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０２９６】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０２９７】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０２９８】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０２９９】
発酵は、pCLPtrcUpperPathwayHGS2 及び pTrc KKDyIkISプラスミドを含有するBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度30℃の発酵においてグルコースから生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LBブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、500 mLを5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０３００】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。58時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は2.1kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。550nmにおける光学密度(OD550)が9になったとき、IPTGの濃度を25μMにした。OD550が170になったとき、IPTGの濃度を50μMに増加させた。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図104に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に3.30 g/L に達した(図105)。58時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は24.5 gであった。図106に、イソプレン生成の経時変化を示す。発酵中に、イソプレン生成に消費された炭素のモル収率は2.5%であった。グルコースからのイソプレン収率は1.2重量%であった。分析の結果、CL PtrcUpperMVAプラスミド及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するBL21(データは示していない)と比較して、イソプレンシンターゼの活性が約3-4倍であることが明らかになった。
【０３０１】
＜XIII.   E. coli.中への下流メバロン酸経路の染色体組込み＞
メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ホスフェートキナーゼ、メバロン酸ピロホスフェートデカルボキシラーゼ、及びIPPイソメラーゼを備える合成オペロンを、E. coliの染色体に組み込んだ。所望により、オペロンの5’位に別のプロモータを組み込むことにより、発現を変化させることができる。
【０３０２】
Table 9に、この実験で用いたプライマーを示す。
【表４】
2014144007.tif 000076
【０３０３】
＜ i)  標的ベクターの構築＞
組み込み位置としてattTn7部位を選択した。相同性上流側領域(attTn7 up) (プライマーMCM78及びMCM79)と、相同性下流側領域(attTn7 down) (プライマーMCM88及びMCM89)を、MG1655細胞を用いてPCRにより増幅した。1 μL 10μM プライマー、3μL ddH2O、45μL Invitrogen社 Platinum PCR Supermix High Fidelity、及び採取したMG1655のコロニーを含む50μLの反応液を94℃で2時間変成し、サイクル(94℃で2時間、50℃で30分間、及び68℃で1時間)を25回繰り返し、さらに72℃で7時間反応させた後、4℃に冷却した。得られたDNAを製造者の取扱説明書に従ってpCR2.1 (Invitrogen社)中にクローン化し、プラスミドMCM278 (attTn7 up)、及びプラスミドMCM252 (attTn7 down)を得た。MCM252由来の、消化し精製した832 bp Apal-Pvul断片を、Apal- Pvulで消化しゲル精製したプラスミドpR6K中にクローン化してプラスミドMCM276を得た。
MCM278由来の、消化し精製した825bp PstI- NotI断片を、PstI- NotIで消化しゲル精製したプラスミドMCM276中にクローン化してプラスミドMCM281を得た。
【０３０４】
＜ ii)  下流経路及びプロモータのクローン化＞
MVK-PMK-MVD-IDI遺伝子を、MCM 104 及びMCM 105プライマーを備えるpTrcKKDyIkISを用い、Roche Expand Long PCR Systemを製造者の取扱説明書に従って用いて増幅した。この産品をNotI 及びApaIを用いて消化し、予めNotI 及びApaIで消化しゲル精製しておいたMCM281中にクローン化した。プライマーMCM 120及びMCM127を、Stratagene Pfu Ultra IIを用いたGeneBridges FRT-gb2-Cm-FRTテンプレートDNA由来のCMRカセットの増幅に用いた。PCR反応液の組成は、1μL 〜10ng/μLテンプレート、プライマー各1μL 、1.25μL 10mM dNTPs、5μL 10x buffer、1μL 酵素、及び39.75μL ddH20であった。PCRは、95℃で4時間変成、95℃で20分間、55℃で20分間、72℃で2時間のサイクルを5回、 95℃で20分間、58℃で20分間、72℃で2時間、72℃で10時間のサイクルを25回、その後4℃で冷却する手順で行った。反応液を貯留し、Qiagen PCR精製カラムで精製し、水洗されプラスミドMCM296を含むPir1細胞のエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーションは、2 mMのキュベット中で、2.5V及び200オームの条件で行った。エレクトロポレーション反応物は、LBを用いて30℃で3時間処理して回収した。MCM330形質転換体を、CMP5とKan50を含むLA上で選択した(図107、及び図108A-108C)。
【０３０５】
＜ iii)   E. coli染色体中への組込み＞
MCM330由来のMiniprepped DNA (Qiaquick Spinキット)をSnaBIで消化し、GeneBridgesプラスミドpRedET Carbを含むBL21(DE3) (Novagen社)またはMG 1655のエレクトロポレーションに用いた。
細胞を30℃で〜OD1になるまで培養し、次に0.4% L-アラビノースを用いて37℃で1.5時間誘導した。これらの細胞を4℃のddH2Oで3回洗浄した後、2μLのDNAでエレクトロポレーションした。クロラムフェニコール (5μg/ml)を含むLアガー上で組込み体を選択し、次にLアガー+カナマイシン (50μg/ml)では成長しないことを確認した。次いで、BL21組込みMCM331、及びMG 1655組込みMCM333を凍結した。
【０３０６】
iv)   KudzuイソプレンシンターゼをコードするpET24D-Kudzuの構築
kudzuイソプレンシンターゼを、pCR2.1ベクター(Invitrogen社)由来のpET24dベクター(Novagen)中にサブクローン化した。特に、kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を、MCM50及びMCM53プライマーを用いてpTrcKudzuテンプレートDNAから増幅した。
MCM50プライマー
【化７１】
2014144007.tif 000077
MCM53プライマー
【化７２】
2014144007.tif 000078
Taq DNA Polymerase (Invitrogen社)を用いてPCR反応を行い、得られたPCR産品をpCR2.1-TOPO TAクローン化ベクター中にクローン化し、E. coli Top10 化学的コンピテント細胞(Invitrogen社)中に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン (50μg/ml)を含有するLアガー上に線状に塗布し、37℃で一夜培養した。単一の形質転換体を、カルベニシリン (50μg/ml)を含有するルリアブロス培地5 mlに植菌し、37℃で一夜培養した。1 mlの液体培地(ルリアブロス)から単離し、QIAprep Spin Mini-prepキット(Qiagen社)で精製したプラスミドDNAのシーケンシングにより、5つのコロニーについて正しい挿入体をスクリーニングした。得られたプラスミドは、pCR2.1骨格中にイソプレンシンターゼコード配列を備えていた。このプラスミドをMCM93と命名した。
【０３０７】
Kudzuコード配列を、PciI及びBamH1 (Roche社)制限エンドヌクレアーゼによる消化で除去し、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen社)を用いてゲル精製した。pET24dベクターDNAをNcoI及びBamHI (Roche社)で消化し、シュリンプアルカリ性ホスファターゼ(Roche社)で処理し、QIAprep Spin Mini-prepキット(Qiagen社)を用いて精製した。kudzuイソプレンシンターゼ断片を、全容積20μlで断片対ベクターの比5:1において、Rapid DNA Ligationキット(Roche社)を用いてNcoI/BamH1消化pET24dに結紮した。結紮混合物(5μl)の一部を、E. coli Top 10化学的コンピテント細胞中に形質転換し、カナマイシン (50μg/ml)を含有するLアガーに線状に塗布した。シーケンシグにより正しく形質転換されたことを確認し、化学的コンピテントBL21(λDE3)pLysS細胞(Novagen社)中に形質転換した。カナマイシン (50μg/ml)を含有するLアガー上で37℃において一夜培養した後、単一のコロニーを選択した。得られたプラスミドのマップを図109に示す。このプラスミドをpET24D-Kudzuと命名した。pET24D-Kudzu(SEQ ID NO:101)の配列を図110A 及び110Bに示す。イソプレンシンターゼの活性は、ヘッドスペースアッセイにより確認した。
【０３０８】
＜v)   生成株＞
MCM331及びMCM333株を、pCLPtrcupperpathwayプラスミドと、pTrcKudzu 又は pETKudzuプラスミドのいずれかとにより同時形質転換し、Table 10に示す株を得た。
【表５】
2014144007.tif 000079
【０３０９】
＜vi)   15リットルスケールの流加発酵培地で成長させた、メバロン酸経路由来のの遺伝子を発現するE. coliによるイソプレン発酵＞
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０３１０】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０３１１】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０３１２】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した
【０３１３】
発酵は、上記のgi1.2組込み下流MVA経路と、pCL PtrcUpperMVA及びpTrcKudzuプラスミドとを備えるBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度30℃の発酵においてグルコースから生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LBブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、500 mLを5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０３１４】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。57時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は3.9kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。二酸化炭素の発生量が100 mmol/L/hrに達したとき、IPTGの濃度を100μMにした。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図111Aに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に1.6 g/L に達した(図111B)。発酵中のイソプレンの比生産性を図111Cに示す。比生産性のピークは1.2 mg/OD/hrであった。57時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は16.2 gであった。発酵中に、イソプレン生成に消費された炭素のモル収率は0.9%であった。グルコースからのイソプレン収率は0.4重量%であった。
【０３１５】
＜XIV.  グリセロールを炭素源として用いたときの、kudzuイソプレンシンターゼを備えるE. coli BL21からのイソプレンの生成＞
Kudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliの15リットルスケールの発酵により、グリセロールを添加した流加発酵培養細胞からイソプレンを生成させた。この実験では、グリセロールの存在下（グルコース無添加）で培養した細胞から、2.2 mg/Lのイソプレンが生成することが示された。
【０３１６】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０３１７】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。
すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０３１８】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０３１９】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０３２０】
発酵は、pTrcKudzuプラスミドを備えるBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度35℃の発酵においてグルコースから生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LAブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、ソイトン-酵母エキス-グルコース培地に植菌し、35℃で培養した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、600 mLを7.5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０３２１】
細胞の550nmの光学密度(OD550)が153に達するまで、グリセロールを指数関数的に供給した。36時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグリセロールの総量は1.7kgであった。接種材料中のグルコースを除き、バイオリアクターにはグルコースを添加しなかった。誘導は、IPTG を添加することにより行った。OD550が50になったとき、IPTGの濃度を20μMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図57に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に2.2 mg/L に達した(図58)。54時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は20.9mgであった。図59に、イソプレン生成の経時変化を示す。
【０３２２】
＜XV.   転化糖を炭素源として用い、15リットルスケールの流加発酵培地中で成長させた、メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliからのイソプレンの生成＞
メバロン酸経路ポリペプチド及びKudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coliの15リットルスケールの発酵により、転化糖を添加した流加発酵培養細胞からイソプレンを生成させた。この実験では、転化糖の存在下で培養した細胞から、2.4 g/Lのイソプレンが生成することが示された。
【０３２３】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞   
【０３２４】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０３２５】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０３２６】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０３２７】
発酵は、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを備えるBL21 (DE3) E. coli細胞を用いて、15Lのバイオリアクター中で行った。この実験は、pH7.0で温度30℃の発酵において転化糖から生成するイソプレンを測定するために行った。凍結したバイアルからE.coli株の接種材料を採取し、LBブロス寒天プレート(抗生物質を含有する)に植菌し、37℃で培養した。シングルコロニーを、トリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550nmにおけるODが1.0に達したとき、500 mLを5-Lバイオリアクターに植菌した。
【０３２８】
細胞が静止期に至るまで、転化糖を指数関数的に供給した。その後、転化糖供給量を代謝上必要な量まで低下させた。44時間の発酵の間、バイオリアクターに供給した転化糖の総量は2.4kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。550nmにおける光学密度(OD550)が9になったとき、IPTGの濃度を25μMにした。OD550が200になったとき、IPTGの濃度を50μMに増加させた。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図96に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に2.4 g/L に達した(図97)。44時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は18.4 gであった。図98に、イソプレン生成の経時変化を示す。発酵中に、イソプレン生成に消費された炭素のモル収率は1.7%であった。グルコースからのイソプレン収率は0.8重量%であった。
【０３２９】
＜実施例９＞
＜Bacillus subtilisに組み込むための上流及び下流MVA経路の構築＞
＜I. Bacillus subtilisにおける上流MVA経路の構築＞
Enterococcus faecalis由来の上流MVA経路を、aprEプロモータで制御されたB. subtilis中に組み込んだ。このMVA上流経路は、AACT及びHMGRをコードするmvaEと、HMGSをコードするmvaSとの、2種の遺伝子から成る。この2種の遺伝子は、これらの間に位置する終止コドンを介して融合されており、mvaSの前方にはRBSが位置し、aprEプロモータで制御されている。mvaE遺伝子の後方には、ターミネータが位置する。mvaE遺伝子と構築体を、相同の隣接領域を用いて二重交差によりaprEローカスに組み込んだ後、 クロラムフェニコール耐性マーカをクローン化した。
【０３３０】
4種のDNA断片を、これらの断片の各々がPCR反応により互いに融合できるようにするオーバーハングを備えるようにして、PCRで増幅した。PCR増幅は、Herculase polymeraseを製造者の取扱説明書に従って用いて行った。
1: PaprE
CF 07-134 (+)  aprE プロモータPstIの開始端 
【化７３】
2014144007.tif 000080
CF 07-94 (-)  PaprEをmvaEに融合
【化７４】
2014144007.tif 000081
テンプレート：Bacillus subtilis染色体DNA
2: mvaE
CF 07-93 (+)  mvaEをaprEプロモータに融合 (GTG開始コドン)
【化７５】
2014144007.tif 000082
CF 07-62 (-)  RBSを間に介してmvaEをmvaSに融合
【化７６】
2014144007.tif 000083
テンプレート：Enterococcus faecalis染色体DNA (ATCCから)
3. mvaS
CF 07-61 (+)  RBSを間に介してmvaE をmvaSに融合
【化７７】
2014144007.tif 000084
CF 07-124 (-)  mvaSの末端をターミネータに融合
【化７８】
2014144007.tif 000085
テンプレート：Enterococcus faecalis染色体DNA
4. Bacillus amyliquefaciens アルカリセリンプロテアーゼ・ターミネータ
CF 07-123 (+)  mvaSの末端をターミネータに融合
【化７９】
2014144007.tif 000086
CF 07-46 (-)  Bacillus amyliquefaciensターミネータBamHIの末端
【化８０】
2014144007.tif 000087
テンプレート：Bacillus amyliquefaciens染色体DNA
PCR融合反応
5. mvaEとmvaSの融合
CF 07-93 (+)  mvaEをaprEプロモータに融合 (GTG開始コドン)
【化８１】
2014144007.tif 000088
CF 07-124 (-)  mvaSの末端をターミネータに融合
【化８２】
2014144007.tif 000089
テンプレート：上記の#2及び3
6.  mvaE-mvaSをaprEプロモータに融合
CF 07-134 (+)  aprEプロモータPstIの開始端
【化８３】
2014144007.tif 000090
CF 07-124 (-)  mvaSの末端をターミネータに融合
【化８４】
2014144007.tif 000091
テンプレート：上記の#1及び#4
7.  PaprE-mvaE-mvaSをターミネータに融合
CF 07-134 (+)  aprEプロモータPstIの開始端
【化８５】
2014144007.tif 000092
CF 07-46 (-)  Bacillus amyliquefaciensターミネータBamHIの末端
【化８６】
2014144007.tif 000093
テンプレート：上記の#4及び#6
【０３３１】
産品を制限エンドヌクレアーゼPstI/BamHIで消化し、PstI/BamHIで消化したpJM102に結紮した (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, 及びR. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.参照)。
結紮体をE.coli TOP 10化学的コンピテント細胞中に形質転換し、形質転換体をカルベニシリン (50μg/ml)を含有するLA上で選択した。シーケンシングにより正しいプラスミドを特定し、pJMUpperpathway2 (図50及び51) と命名した。精製したプラスミドDNAを、Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK中に形質転換し、形質転換体をクロラムフェニコール (5μg/ml)を含有するLアガー上で選択した。
正しいコロニーを選択し、クロラムフェニコールを10、15 及び25μg/ml含有するLアガー上に順次線状に塗布して、上流経路を含むカセットの多数のコピーを増幅した。
【０３３２】
得られた株を、1%グルコース及び1%を含有するLBにおいて成長させて、メバロン酸生成の試験を行なった。培養物をGCで分析してメバロン酸生成の分析を行った。
【０３３３】
次に、この株を宿主として用いて、下流メバロン酸経路を組み込んだ。
【０３３４】
上記の種々の構築体のシーケンシングには、以下のプライマーを用いた。
シーケンシングプライマー：
CF 07-134 (+)  aprEプロモータPstIの開始端
【化８７】
2014144007.tif 000094
CF 07-58 (+)  mvaE遺伝子の開始端
【化８８】
2014144007.tif 000095
CF 07-59 (-)  mvaE遺伝子の末端
【化８９】
2014144007.tif 000096
CF 07-82 (+)  mvaS遺伝子の開始端
【化９０】
2014144007.tif 000097
CF 07-83 (-)  mvaS遺伝子の末端
【化９１】
2014144007.tif 000098
CF 07-86 (+)  mvaE中の配列
【化９２】
2014144007.tif 000099
CF 07-87 (+)  mvaE中の配列
【化９３】
2014144007.tif 000100
CF 07-88 (+)  mvaE中の配列
【化９４】
2014144007.tif 000101
CF 07-89 (+)  mvaSの配列
【化９５】
2014144007.tif 000102
【０３３５】
形質転換体を、クロラムフェニコールを5μg/ml含有するLA上で選択した。シーケンシングにより、1つのコロニーが正しい組込みを有することが確認された。このコロニーを、クロラムフェニコールの濃度が次第に増加し、最終的に25μg/mlに達するLA上に線状に塗布して、数日にわたり培養した。これにより、対象とする遺伝子を含むカセットを増幅させた。得られた株を、CF 455: pJMupperpathway#l X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comKと命名した (クロラムフェニコールを25μg/ml含有するLA上で成長するように増幅)。
【０３３６】
＜II.   Bacillus subtilis中の下流MVA経路の構築＞
mvkl, pmk, mpd 及び idi遺伝子を含む下流MVA経路を、B. subtilis染色体 (組込み部位) のnprE領域由来の隣接DNA領域、aprEプロモータ、及びスペクチノマイシン耐性マーカを含むカセット中に組み込んだ(図28及び29参照)。このカセットを、aprEローカスに組み込まれた上流MVA経路を有するB. subtilis染色体中に組み込んだ。このカセットはDNA2.0により合成されたものである。実施例4に記載した複製プラスミドからkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を発現させて、上流及び下流経路の両者の組合せを備える株中に形質転換した。
【０３３７】
＜実施例10：イソプレン組成物の例と、その製造方法＞
＜I.  イソプレンを含有する発酵オフガスの組成分析＞
イソプレノイド前駆体生合成の全メバロン酸経路、酵母由来イソプレニルピロホスフェートイソメラーゼ、及びKudzu由来イソプレンシンターゼをコードする2種のプラスミド(pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)を含有する組換えE. coli BL21 (DE3)株の発酵を14Lスケールで行った。ピークイソプレン生成時(29時間の発酵経過時間“EFT”)において、14Lタンクから発生した発酵オフガスを20mLのヘッドスペースバイアル中に回収し、揮発性成分をヘッドスペースGC/MSにより分析した。
【０３３８】
ヘッドスペース分析は、Agilent HP-5MS GC/MSカラム(30 m x 250μm; 0.25μm フィルム厚)を備えるAgilent 6890 GC/MS装置により行った。combiPALオートインジェクターを用いて、 20 mLのヘッドスペースバイアルから500 μLのサンプルを採取した。GC/MS分析では、流量1 mL/分のヘリウムをキャリヤガスに用いた。
インジェクションポートを250℃に保ち、分割比を50:1とした。全分析時間の10分間のうち最初の2分間はオーブンの温度を37℃に保ち、次に昇温速度25℃/分で237℃まで温度を上げた。Agilent 5793N質量分析選択検出器により、m/z 29からm/z 300までスキャンした。この装置の検出限界は約0.1μg/Lgasまたは約0.1 ppmであった。所望により、より高感度で検出限界がより低濃度の装置を用いることができる。
【０３３９】
オフガスには、99.925 % (v/v)の永久ガス(N2、CO2 及びO2)、約0.075%のイソプレン (2-メチル-1,3-ブタジエン) (~750 ppmv、2100μg/L)、及び少量(<50 ppmv)のエタノール、アセトン、及び2種類のC5プレニルアルコールが含まれていた。水蒸気の量は測定しなかったが、0℃における平衡蒸気圧に等しいと見積もられる。GC/MSクロマトグラム(図86A及び86B)のピークの下の面積の積分値から求めた揮発性有機成分の組成を、Table 6に示す。標準的方法を用いて、エタノール及びアセトン標準サンプルの検量線により、GCの面積を気相中の濃度（単位μg/L）に換算した。
【表６】
2014144007.tif 000103
【０３４０】
＜II.  組換えE. coli株の発酵中にイソプレンとともに生成した、微量の揮発性有機成分(VOC)の分析＞
イソプレノイド前駆体生合成の全メバロン酸経路、酵母由来イソプレニルピロホスフェートイソメラーゼ、及びKudzu由来イソプレンシンターゼをコードする2種のプラスミド(pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)を含有する組換えE. coli BL21 (DE3)株の発酵を14Lスケールで行った
【０３４１】
発酵オフガスを冷却したヘッドスペースバイアルに通して微量の揮発性有機成分を凝縮させ、分析した。この発酵で生成したオフガスを、石英ウール(2g)を充填しドライアイスで-78℃に冷却したヘッドスペースバイアルに、流量1 L/分で10分間流通させることにより、サンプルを採取した。新品のバイアルの蓋でこのバイアルに蓋をし、採取したVOCを、実施例10のパートIに記載した条件下でヘッドスペースGC/MSにより分析した。図87A-87Dに示す各成分の比は、発酵オフガス中の全濃度、-78℃における相対的蒸気圧、及び質量分析計の検出器レスポンスに依存する。例えば、酸素含有揮発成分(例えばアセトン及びエタノール)に対するイソプレンの濃度が低いのは、この物質の揮発性が高く-78℃ではヘッドスペースバイアル中に蓄積されないことによる。
【０３４２】
このような化合物が含有されていることは、生物学的原料から生成したイソプレン組成物の特徴である。結果を図87A-87Dに示し、Table 7Aと7Bにまとめて示した。
【表７Ａ】
2014144007.tif 000104
【表７Ｂ】
2014144007.tif 000105
【０３４３】
＜III.  発酵から生成したイソプレン中におけるC5炭化水素の不存在＞
液体窒素で冷却した2 mLヘッドスペースバイアルを用いて、発酵オフガス中のイソプレンを低温捕捉した。まず、オフガス(1 L/分)を、2 mLバイアル(-196 oC)中での氷と固体状CO2の蓄積を最小限にするために水酸化ナトリウムのペレットを入れた20 mLのバイアルに通した。バイアルに約10Lのオフガスを通し、換気しながらバイアルの温度を-78℃まで上げ、次に新品の蓋で密封してGC/MSで分析した。
【０３４４】
GC/MSヘッドスペース分析は、ヘッドスペースモードの100μL気密シリンジを用い、Agilent 6890 GC/MS装置により行った。被分析物の分離には、Zebron ZB-624 GC/MSカラム(30 m x 250μm; 1.40μmフィルム厚)を用いた。GCオートインジェクターに気密100 μLシリンジを取付け、針の高さを2 mL GCバイアルから50μLのヘッドスペースサンプルを注入可能な高さに調整した。GC/MS分析では、流量1 mL/分のヘリウムをキャリヤガスに用いた。
インジェクションポートを200℃に保ち、分割比を20:1とした。10分間の分析中、オーブンの温度を37℃に保った。Agilent 5793N質量分析選択検出器を用いて、シングルイオンモニタリング(SIM)モードでm/z 55、66、67 及び70において測定した。この条件下では、2.966分後にイソプレンの流出が認められた(図88B)。この方法により、石油から製造されたイソプレンの標準サンプル(Sigma-Aldrich社)も行ったところ、メインピークの前後に流出する別の複数のC5炭化水素異性体が検出された。これらのC5炭化水素異性体を、補正したGC面積に基づいて定量した(図88A)。
【表８Ａ】
2014144007.tif 000106
【表８Ｂ】
2014144007.tif 000107
【０３４５】
別の実験では、C5炭化水素の標準混合物の分析により、各成分に対する検出器レスポンスが同じであるかを検討した。検討した成分は、2-メチル-1-ブテン、2-メチル-1,3-ブタジエン、(E)-2-ペンテン、(Z)-2-ペンテン、及び(E)-1,3-ペンタジエンであった。この分析は、50℃に15分間保持したAgilent DB-Petroカラム(100 m x 0.25 mm、0.50μmフィルム厚)により行った。GC/MS分析では、流量1 mL/分のヘリウムをキャリヤガスに用いた。インジェクションポートを200℃に保ち、分割比を50:1とした。Agilent 5793N質量分析選択検出器を用いて、フルスキャンモードでm/z 19からm/z 250において測定した。この条件下において、100μg/Lの濃度の各標準サンプルの検出器レスポンスは実験誤差内で同一と認められた。
【０３４６】
＜IV.  固相に吸着させたイソプレンを含む組成物＞
生物学的に生成させたイソプレンを活性炭に吸着させることにより、50から99.9%の炭素、0.1%から50%のイソプレン、0.01%から5%の水、及び微量(<0.1%)の他の揮発有機成分を含む、固相組成物を得た。
【０３４７】
発酵オフガスを、0℃に保った銅製の凝縮コイルに流通させ、次に粒状シリカ乾燥フィルターに流通させて水蒸気を除去した。この乾燥させたオフガスをカーボンが充填されたフィルター(Koby Jr, Koby Filters, MA)に供給し、フィルターからの排気中にイソプレンの破過がGC/MSにより認められるまで流通させた。カートリッジに吸着されたイソプレンの量は、オフガス中の濃度、全流量、及び捕集期間中の破過パーセントに基づいて、計算により間接的に求めることができる。あるいは、吸着されたイソプレンを、熱、真空または溶媒脱着により、フィルターから回収することもできる。
【０３４８】
＜V.  凝縮したイソプレンの捕集と分析＞
適切な吸着体(例えばアスカライト)によるフィルター処理により、発酵オフガスを乾燥させ、CO2を除去する。得られたオフガスを液体窒素で冷却した凝縮器に流通させて、オフガス中のVOCを凝縮させる。回収容器には、得られるイソプレン凝縮液の重合を防ぐため、t-ブチルカテコールを入れておく。この凝縮液を、例えば本願に開示する標準的方法により、GC/MS及びNMRで分析して純度を求める。
【０３４９】
＜VI.  発酵によるプレニルアルコールの生成＞
Kudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli BL21 (DE3)株から生成するオフガスの分析により、イソプレン及び3-メチル-3-ブテン-1-オール (イソプレノール)の両者の存在が認められた。ヘッドスペースGC/MSにより測定した、発酵中の発酵オフガス中のこれら2種の化合物の濃度を図89に示す。この実験で認められたイソプレノール(3-メチル-3-ブテン-1-オール、3-MBA)の濃度は約10μg/Loffgasであった。別の実験では、発酵オフガス中の濃度は約20μg/Loffgasであった。
【０３５０】
＜実施例11：流加培養培地で発酵され、メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliにおける、成長とイソプレン生成の分離＞
実施例11に、細胞の成長と、メバロン酸及びイソプレン生成との分離を例示する。
【０３５１】
＜I.  発酵条件＞
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０３５２】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０３５３】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０３５４】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０３５５】
発酵には、pTrcHis2AUpperPathway (図91 及び図92A-92C参照、pTrcUpperMVAとも呼ぶ) (50μg/ml カルベニシリン)プラスミド、またはpCL PtrcUpperMVA (pCL PtrcUpperPathwayとも呼ぶ (図26)) (50μg/ml スペクチノマイシン)プラスミドを備えるE. coliを用いた。イソプレンをが生成した実験では、E. coli細胞にはpTrc KKDyIkIS (50μg/ml カナマイシン)も含まれていた。これらの実験は、pH 7.0、温度30℃で発酵させ、グルコースから生成されるメバロン酸又はイソプレンの生成量を監視しながら行った。凍結したバイアル中から採取した接種材料のE.coli株をLAブロス寒天プレート(抗生物質添加)に線状に塗布し、37℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550nmで測定した光学密度が1.0に達したとき、バイオリアクターにこの接種材料を植菌した。
【０３５６】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。誘導は、IPTGを添加することにより行った。発酵ブロス中のメバロン酸濃度は、過塩素酸(Sigma-Aldrich # 244252)処理したサンプル(0.3 M、4℃で5分間インキュベートした)を有機酸HPLCカラム (BioRad # 125-0140) に通すことにより分析した。濃度は、ブロスのメバロン酸のピークの大きさを、メバロノールアセトン(Sigma-Aldrich # M4667)を過塩素酸で処理してD,L-メバロン酸塩を生成させることにより作成した検量線と比較して求めた。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。イソプレン力価とは、発酵ブロス1リットルから生成するイソプレンの量と定義される。
【０３５７】
＜150-LスケールでのpTrcUpperMVAプラスミドを発現するE. coli BL21 (DE3)細胞からのメバロン酸生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させたBL21 (DE3)細胞を、トリプトン-酵母エキス培地45 mLを入れたフラスコ内に植菌し、170 rpmで振蕩しながら30℃で5時間培養した。この溶液を、トリプトン-酵母エキス培地を入れた5-Lのバイオリアクターに移し、30℃及び27.5 rpmの条件下で、OD550が1.0になるまで成長させた。この5 Lの接種材料を、培地45-kgを入れた150-Lのバイオリアクターに植菌した。
OD550が10になったとき、IPTGの濃度を1.1 mMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図60Aに示す。発酵中、メバロン酸の力価が経時的に増加し、最終的な値は61.3 g/L (図60B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 60Cに示す。図60Aとの比較から、成長とメバロン酸生成とが分離されていることが分かる。52.5時間の発酵において、14.1 kgのグルコースの消費により生成したメバロン酸の総量は4.0 kgであった。
発酵中にメバロン酸生成に消費された炭素のモル収率は、34.2%であった。
【０３５８】
＜III.  15-LスケールでのpTrcUpperMVAプラスミドを発現するE. coli BL21 (DE3)細胞からのメバロン酸生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させたBL21 (DE3)細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が10になったとき、IPTGの濃度を1.0 mMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図61Aに示す。発酵中、メバロン酸の力価が経時的に増加し、最終的な値は53.9 g/L (図61B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 61Cに示す。図61Aとの比較から、成長とメバロン酸生成とが分離されていることが分かる。46.6時間の発酵において、2.1 kgのグルコースの消費により生成したメバロン酸の総量は491 gであった。発酵中にメバロン酸生成に消費された炭素のモル収率は、28.8%であった。
【０３５９】
＜IV.  15-LスケールでのpTrcUpperMVAプラスミドを発現するE. coli FM5細胞からのメバロン酸生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させたFM5細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が30になったとき、IPTGの濃度を1.0 mMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図62Aに示す。発酵中、メバロン酸の力価が経時的に増加し、最終的な値は23.7 g/L (図62B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 62Cに示す。図62Aとの比較から、成長とメバロン酸生成とが分離されていることが分かる。51.2時間の発酵において、1.1 kgのグルコースの消費により生成したメバロン酸の総量は140 gであった。発酵中にメバロン酸生成に消費された炭素のモル収率は、15.2%であった。
【０３６０】
＜V.  15-Lスケールでの、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli BL21 (DE3)細胞からのイソプレン生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させた、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するBL21 (DE3)細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が190になったとき、IPTGの濃度を50μMにした。38時間発酵させたとき、IPTGの濃度を100μMまで上げた。
バイオリアクター内のOD550の経時変化を図63Aに示す。発酵中、イソプレンの力価が経時的に増加し、最終的な値は2.2 g/Lブロス(図63B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 63Cに示す。図63Aとの比較から、成長とイソプレン生成とが分離されていることが分かる。54.4時間の発酵において、2.3 kgのグルコースの消費により生成したイソプレンの総量は15.9 gであった。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は、1.53%であった。
【０３６１】
＜VI.  15-Lスケールでの、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli BL21 (DE3) Tuner細胞からのイソプレン生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させた、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli BL21 (DE3) Tuner細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が10になったとき、IPTGの濃度を26μMにした。OD550が175になったとき、IPTGの濃度を50μMまで上げた。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図64Aに示す。発酵中、イソプレンの力価が経時的に増加し、最終的な値は1.3 g/Lブロス(図64B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 64Cに示す。図64Aとの比較から、成長とイソプレン生成とが分離されていることが分かる。48.6時間の発酵において、1.6 kgのグルコースの消費により生成したイソプレンの総量は9.9 gであった。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は、1.34%であった。
【０３６２】
＜VII.  15-Lスケールでの、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli MG1655細胞からのイソプレン生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させた、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli MG1655細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が45になったとき、IPTGの濃度を24μMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図65Aに示す。発酵中、イソプレンの力価が経時的に増加し、最終的な値は393 mg/Lブロス(図65B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 65Cに示す。図65Aとの比較から、成長とイソプレン生成とが分離されていることが分かる。67.4時間の発酵において、520 gのグルコースの消費により生成したイソプレンの総量は2.2 gであった。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は、0.92%であった。
【０３６３】
＜VIII.  15-Lスケールでの、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli MG1655ack-pta細胞からのイソプレン生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させた、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli MG1655ack-pta細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が10になったとき、IPTGの濃度を30μMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図66Aに示す。発酵中、イソプレンの力価が経時的に増加し、最終的な値は368 mg/Lブロス(図66B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 66Cに示す。図66Aとの比較から、成長とイソプレン生成とが分離されていることが分かる。56.7時間の発酵において、531 gのグルコースの消費により生成したイソプレンの総量は1.8 gであった。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は、0.73%であった。
【０３６４】
＜IX.  15-Lスケールでの、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli FM5細胞からのイソプレン生成＞
実施例11、パートIで説明した方法によりプレート上で成長させた、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを発現するE. coli FM5細胞を、トリプトン-酵母エキス培地500mLを入れたフラスコ内に植菌し、30℃において160 rpmで振蕩しながらOD550 が1.0になるまで培養した。この接種材料を、培地4.5-kgを入れた15-Lのバイオリアクターに植菌した。OD550が15になったとき、IPTGの濃度を27μMにした。バイオリアクター内のOD550の経時変化を図67Aに示す。発酵中、イソプレンの力価が経時的に増加し、最終的な値は235 mg/Lブロス(図67B)となった。発酵中の比生産性の変化を図 67Cに示す。図67Aとの比較から、成長とイソプレン生成とが分離されていることが分かる。52.3時間の発酵において、948 gのグルコースの消費により生成したイソプレンの総量は1.4 gであった。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は、0.32%であった。
【０３６５】
＜実施例12： メバロン酸経路由来の遺伝子を発現するE. coliを流加培養培地で発酵させたときの、対数成長期におけるイソプレン生成＞
実施例12では、細胞の対数成長期におけるイソプレン生成について例示する。
【０３６６】
＜培地の組成(発酵培地1リットル当り)＞
【０３６７】
培地は、発酵培地1リットル当りについて次の処方を使用して調製した：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H2O 2 g、クエン酸一水和物 2 g、クエン酸第二鉄アンモニウム0.3 g、酵母エキス 0.5 g、1000X Modified Trace Metal Solution 1 ml。すべての成分を同時に添加し、diH2O中に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した。水酸化アンモニウム(30%)でpHを7.0に調整し、所定容積にした。滅菌及びpH調整後、グルコース10 g、チアミン* HCl 0.1g、及び抗生物質を添加した。
【０３６８】
＜1000X Modified Trace Metal Solutionの処方＞
【０３６９】
1000X Modified Trace Metal Solutionの処方は以下の通りである：クエン酸* H 2O 40 g、MnSO4 * H2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4 * 7H2O 1 g、CoCl2 * 6H2O 1 g、ZnSO * 7H2O 1 g、CuSO4 * 5H2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4 * 2H2O 100 mg。
各成分を一度にdiH2Oに添加して溶解させ、HCl/NaOHでpHを3.0にし、次に定容し、0.22μのフィルターで濾過滅菌した。
【０３７０】
発酵は15Lのバイオリアクター中で、pCL PtrcUpperMVA及びpTrc KKDyIkISプラスミドを備えるATCC11303 E. coli細胞を用いて行った。この試験は、pH 7.0で温度30℃の発酵においてグルコースから産出されるイソプレンを測定するために行った。
凍結したバイアルから採取したE. coli株接種材料を、LBブロスアガープレート(抗生物質添加)に線状に塗布し、37℃でインキュベートした。550nmで測定した接種材料のODが1.0に達したとき、初期容積を5Lにした15Lのバイオリアクターに接種材料50mLを植菌した。単一コロニーをトリプトン-酵母エキス培地に植菌した。接種材料の550 nmで測定したODが1.0に達した後、この接種材料500 mLを5-Lのバイオリアクターに植菌した。
【０３７１】
細胞が静止期に至るまで、グルコースを指数関数的に供給した。その後、グルコース供給量を代謝上必要な量まで低下させた。50時間の発酵の間、バイオリアクターに供給したグルコースの総量は2.0kgであった。誘導は、IPTGを添加することにより行った。550nmにおける光学密度(OD550)が10になったとき、IPTGの濃度を25μMにした。OD550が190になったとき、IPTGの濃度を50μMに増加させた。バイオリアクター中のOD550の経時変化を図99に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度は、本願に開示する方法により測定した。発酵中イソプレンの力価が増加し、最終的に1.4 g/L に達した(図100)。50時間の発酵の間に生成されたイソプレンの総量は10.0 gであった。図101に、バイオリアクターにおけるイソプレン比生産性の経時変化を示す。発酵中にイソプレン生成に消費された炭素のモル収率は1.1%であった。グルコースに対するイソプレンの収率（重量パーセント）は0.5%であった。
【０３７２】
＜実施例13：  イソプレンの燃焼性のモデル化と試験＞
＜I.  イソプレンの燃焼性のモデル化と試験の概要＞
種々の炭化水素/酸素/窒素/水/二酸化炭素混合物について、燃焼性のモデル化と試験を行った。このモデル化と試験の目的は、ある一定の圧力及び温度において、指定されたスチーム及び二酸化炭素濃度下でのイソプレン及び酸素/窒素混合物の燃焼性曲線を求めることである。モデル条件のマトリックスをTable 4に示す。又、試験に用いた混合物をTable 5に示す。
【表９】
2014144007.tif 000108
【表１０】
2014144007.tif 000109
【０３７３】
＜II.  予測断熱火炎温度(CAFT)モデルについて＞
燃焼の伝播に関する予測断熱火炎温度(CAFT)と、これに随伴する選択された限界火炎温度(limit flame temperature)を用いてイソプレンの燃焼範囲を求めた。この検討で火炎温度の計算に用いたコンピュータプログラムはNASA Glenn Research Center CEA (Chemical Equilibrium with Applications)ソフトウエアである。
【０３７４】
均一な燃焼機構(燃焼物及び酸化物の両者が気相状態である)の断熱火炎温度モデルを用いた燃焼範囲の計算は、所望の反応物の選択、試験条件の選択、限界火炎温度の選択、反応物の修正、及び計算に基づいた燃焼範囲の決定の、5つのステップで行う。
【０３７５】
最初のステップ、すなわち所望の反応物の選択では、系内に存在するであろう各反応物の種類とその量を決める必要がある。多くの場合、計算に用いるコンピュータプログラムは、反応物種と生成種のリストが含まれている。検討する化学種のデータが無い場合は、JANAFテーブルやインターネット等の他の情報源から得ることができる。本願のモデルでは、水、窒素、酸素及び二酸化炭素のデータがプログラムのデータベースに含まれている。プログラムのデータベースには、化学種としてイソプレンが含まれていなかったため、熱力学的特性を手で入力した。
【０３７６】
次のステップは、燃焼プロセスが生じる初期圧力及び初期温度条件であるか否かを決めることである。本願のモデルでは、初期圧力は1気圧(絶対圧)で、初期温度はイソプレンの沸点の40℃であった。
【０３７７】
燃焼の限界火炎温度は、理論に基づいて選択するか、または実験的に決めることができる。いずれの方法も、それ自身の限界を有する。
【０３７８】
従来の研究に基づけば、炭化水素の限界火炎温度は1000 Kから1500 Kの範囲内にある。本願のモデルでは、1500 Kを選択した。この温度は、一酸化炭素と二酸化炭素の反応(強い発熱反応であり火炎エネルギーの大部分を占める)が自燃性となる温度である。
【０３７９】
限界火炎温度を決めたら、所与の反応混合物(化学種濃度)についてモデル計算を行い、断熱火炎温度を求める。火炎の伝播は、温度が限界火炎温度より高いときのみ生じると考えられる。このため、反応混合物の組成を修正して、火炎伝播混合物と非火炎伝播混合物のデータセットを作成する。
【０３８０】
このタイプのモデルは、実験的に求めた燃焼限界とほぼ一致した。得られた燃焼範囲から外れる領域では非燃焼性であり、燃焼範囲内の領域は燃焼性である。燃焼範囲は、突出部を有する形状である。燃焼範囲の突出部は、気体燃焼物の限界酸素濃度(LOC)と関連がある。
【０３８１】
＜予測断熱火炎温度(CAFT)モデルの結果＞
系AからGのCAFTモデルの結果を、それぞれ図68から74に示す。これらの図に、予測断熱火炎温度(NASA CEAプログラムを使用)と、いくつかの酸素/窒素比率(重量比)における燃焼物濃度(重量濃度)との関係を示す。この図において、選択した限界火炎温度である1500Kより上の曲線部では、火炎伝播に十分な濃度の燃焼物が含まれている。CAFTモデルの結果を、図68から74に示すような形で解釈することが容易ではない。また、このような形を、通常は容積パーセントで表される実験データとの比較に用いることはできない。
【０３８２】
例えば系Aの場合、図68に示したデータを、従来の燃焼範囲の形でプロットすることができる。図68を用いて、各曲線(酸素と窒素の比)と、縦軸に示す温度が1500Kのラインとの交点から横軸へ垂線を下ろすことにより、その限界火炎温度における燃焼物濃度を求めることができる。これらの値を、酸化剤の所与の重量パーセントにおける燃焼物の重量パーセントとして表にまとめる(図75A)。次に、燃焼物の組成値(100 wt.% イソプレン)と、(水、酸素、及び窒素に対する)酸化剤の組成値とから、モル濃度を求めることができる。
【０３８３】
これらのモル濃度から、容積濃度を計算することができる。容積パーセントで表された濃度をプロットすることにより、燃焼範囲の図を作成することができる(図75B)。燃焼範囲で囲まれる領域は爆発範囲であり、燃焼範囲の外側の領域は非爆発範囲である。燃焼範囲の「突起部」は限界酸素濃度である。図76Aと76Bに、図69に示すデータから求めた系Bの燃焼範囲の容積濃度の計算値を示す。図70-74に示したデータについても、同様にして計算した。
【０３８４】
＜IV.  燃焼試験の実験装置と方法＞
4リットルの高圧容器を用いて燃焼実験を行った。この高圧容器は内径が6”での高さが8.625”の円筒形であった。この高圧容器（及び内部の気体）の温度を、PID制御された実験用ヒーターを用いて維持した。熱損失を防ぐため、高圧容器の周囲をセラミックウールと反射断熱材で覆った。高圧容器及び気相部の温度を、タイプK熱電対で測定した。図77に試験容器の概略図を示す。
【０３８５】
試験を行なう前に、その前の試験のガスを除去するために、容器内のガスを抜き、窒素でパージした。次に、容器を真空にした。真空引きしたときの圧力は、約0.06 bar(a)であった。窒素パージしているため、この初期圧力は窒素ガスによるものと考えられる。分圧を調整しながら適切な量の水、イソプレン、窒素及び酸素を添加して、所定の試験条件にした。容器内の磁気駆動撹拌翼により、内容物のガスを撹拌した。撹拌翼によりガスを2分間撹拌し、点火約1分前に撹拌翼を停止した。
【０３８６】
点火装置は、1.5オームのニクロムコイルと、タイマー回路を備えるAC電源とで構成した。オシロスコープにより、点火装置に34.4 VACが3.2秒間供給されたことを確認した。最大電流3.8アンペアが点火サイクルのほぼ中間時に生じた。すなわち、最大電力は131Wで、点火サイクルにおける全エネルギーは約210Jであった。
【０３８７】
爆燃データは、データ採取システムに接続した可変リラクタンスValidyne DP215圧力トランスデューサを用いて収集した。圧力上昇が5%以上のとき、ガス混合物が爆燃したと見なした。
【０３８８】
＜V.  燃焼試験の結果＞
最初の実験系(系１)は、スチームを添加せずに40℃、0 psigで行なった。イソプレンと酸素の濃度を種々変更して試験して、図78Aに示す燃焼曲線を得た。この燃焼曲線において、図示したデータポイントは、燃焼曲線の境界のものだけである。この実験系における全データポイントの詳細なリストを図80Aと80Bに示す。
【０３８９】
図78Bに、図78Aに示した爆発データポイントをまとめて示す。図78Cは、実験データとCAFTモデル予測燃焼範囲との比較を表す図である。このモデルは、実験データと非常によく一致している。誤差は、試験容器の非断熱性とモデルの限界に起因すると思われる。CAFTモデルでは酸化反応が無限の時間続くようであり、反応の動力学的限界が考慮されていない。
【０３９０】
さらに、CAFTモデルは、データベースに含まれている平衡化学種の数に限界があるため、熱分解化学種を正しく予測することはできない。また、CAFTモデルで作られた燃焼範囲では、1の限界火炎温度(1500K)を用いている。限界火炎温度は反応化学種に応じて1,000Kから1,500Kの範囲の値に成りうる。CAFTモデルではこのシステムの燃焼範囲の上限を正確に予想できない理由のひとつは、化学量論的燃焼物/酸化剤濃度以上の燃焼物濃度において形成される熱分解化学種の複雑な性状である。
【０３９１】
第2の実験系(系2)はスチーム濃度を4%に固定して、40℃及び0 psigで行った。イソプレン及び酸素濃度を種々変更して実験を行い、図79Aに示す燃焼曲線を得た。この燃焼曲線において、図示したデータポイントは、燃焼曲線の境界のものだけである。この実験系における全データポイントの詳細なリストを図81に示す。系1のデータと類似性があるため、下限燃焼限界、限界酸素濃度、上限燃焼限界の重要なポイントのみについて試験した。試験混合物へ4%スチームを添加しても、燃焼範囲の重要な限界値の顕著な変化は認められなかった。なお、より高濃度のスチーム/水、及び／又は他の不活性物質は、燃焼範囲に影響しうる。
【０３９２】
図79Bに、図79Aに示した爆発性データポイントをまとめて示す。図79Cは、実験データとCAFTモデル予測燃焼範囲との比較を表す図である。このモデルは、実験データと非常によく一致している。誤差は、系1と同様の要因によるものと考えられる。
【０３９３】
＜V.  圧力3気圧の空気中におけるイソプレンの燃焼限界の予測＞
実施例13、パートIからIVに記載した方法を用いて、40℃で絶対圧力3気圧におけるイソプレンの燃焼限界を予測した。これらの結果を、実施例13、パートIからIVの40℃で絶対圧力1気圧における結果と比較した。より高い圧力で試験した理由は、システムの初期圧力が増加すると燃焼範囲が拡大するか、または大きくなることによる。上限燃焼限界が最も影響を受けやすく、次に限界酸素組成が影響を受けやすい。下限燃焼限界が最も影響を受けにくい(例えばその全て、特に燃焼限界に関して本願に参照として組込む、Michael G. Zabetakis著、US Bureau of Mines 刊(1965)の"Bulletin 627 - Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors"参照)。
【０３９４】
図82に、システムの初期圧力が3気圧の場合の、全燃焼物／窒素／酸素を重量パーセントで表したイソプレン(燃焼物)濃度に対する断熱火炎温度の予測値を図示する。火炎温度の予測値は、先ず1気圧のシステム(図83)で求めたものとほぼ同一であった。この結果、断熱燃焼性のデータの予測値を用いて燃焼範囲を作成したとき、各燃焼曲線はほぼ同一になる(図84と85参照)。すなわち、これらの理論計算によれば、システムの圧力を1気圧から3気圧に上げた場合でも、燃焼範囲の顕著な増加/拡大は生じない。所望により、これらの結果を燃焼実験により検証することができる(例えば本願に開示する1気圧における燃焼実験)。
【０３９５】
＜VII.    燃焼性の検討のまとめ＞
40℃で0 psigのイソプレン／酸素／窒素／水／二酸化炭素のシステムにおける燃焼範囲の予測断熱温度モデルを開発した。開発したCAFTモデルは、本願で行った燃焼試験から作成した実験データとよく一致した。系1及び2の実験結果により、系A及びBのモデルの結果の正当性が確認された。
【０３９６】
特に断りの無い限り、本願では全ての技術用語及び科学用語を、この発明の属する技術分野の当業者が理解している通常の意味で用いる。本願で用いる用語の一般的意義はSingleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) に従う。この発明は本願に開示した特定の方法、手段、試薬に限定されず、種々変更することができる。当業者であれば、本願に開示した方法及び材料と同様または均等の方法及び材料を用いてこの発明を実施できることを理解できよう。
【０３９７】
文中の見出しは、本願の明細書を参酌して全体として理解されるこの発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。
【０３９８】
特に断りの無い限り、原文で"a"、"an,"というときは単数または複数を意味する。
【０３９９】
数値またはパラメータについて「約」というときは、その値についての実施形態も含む。例えば、「約X」というときは、「X」についての記載も含まれる。数値範囲には、その範囲を規定する値も含まれる。
【０４００】
本願に開示する態様及び実施形態には、原文で“comprising”,“consisting,”及び“consisting essentially of”と規定する態様及び実施形態も含まれる。
【表１１】
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2014144007.tif 000161
2014144007.tif 000162
【図１】
2014144007.tif 000163
【図２】
2014144007.tif 000164
【図３Ａ】
2014144007.tif 000165
【図３Ｂ】
2014144007.tif 000166
【図３Ｃ】
2014144007.tif 000167
【図４】
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【図５Ａ】
2014144007.tif 000169
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2014144007.tif 000171
【図６】
2014144007.tif 000172
【図７Ａ】
2014144007.tif 000173
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
2014144007.tif 000180
【図１０Ａ】
2014144007.tif 000181
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
2014144007.tif 000189
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
2014144007.tif 000193
【図１７】
2014144007.tif 000194
【図１８Ａ】
2014144007.tif 000195
【図１８Ｂ】
2014144007.tif 000196
【図１８Ｃ】
2014144007.tif 000197
【図１８Ｄ】
2014144007.tif 000198
【図１８Ｅ】
2014144007.tif 000199
【図１８Ｆ】
2014144007.tif 000200
【図１９】
2014144007.tif 000201
【図２０】
2014144007.tif 000202
【図２１】
2014144007.tif 000203
【図２２Ａ】
2014144007.tif 000204
【図２２Ｂ】
2014144007.tif 000205
【図２２Ｃ】
2014144007.tif 000206
【図２２Ｄ】
2014144007.tif 000207
【図２３Ａ】
2014144007.tif 000208
【図２３Ｂ】
2014144007.tif 000209
【図２３Ｃ】
2014144007.tif 000210
【図２３Ｄ】
2014144007.tif 000211
【図２３Ｅ】
2014144007.tif 000212
【図２３Ｆ】
2014144007.tif 000213
【図２３Ｇ】
2014144007.tif 000214
【図２３Ｈ】
2014144007.tif 000215
【図２４】
2014144007.tif 000216
【図２５Ａ】
2014144007.tif 000217
【図２５Ｂ】
2014144007.tif 000218
【図２５Ｃ】
2014144007.tif 000219
【図２５Ｄ】
2014144007.tif 000220
【図２６】
2014144007.tif 000221
【図２７Ａ】
2014144007.tif 000222
【図２７Ｂ】
2014144007.tif 000223
【図２７Ｃ】
2014144007.tif 000224
【図２７Ｄ】
2014144007.tif 000225
【図２８】
2014144007.tif 000226
【図２９Ａ】
2014144007.tif 000227
【図２９Ｂ】
2014144007.tif 000228
【図２９Ｃ】
2014144007.tif 000229
【図２９Ｄ】
2014144007.tif 000230
【図３０】
2014144007.tif 000231
【図３１Ａ】
2014144007.tif 000232
【図３１Ｂ】
2014144007.tif 000233
【図３２】
2014144007.tif 000234
【図３３Ａ】
2014144007.tif 000235
【図３３Ｂ】
2014144007.tif 000236
【図３３Ｃ】
2014144007.tif 000237
【図３４】
2014144007.tif 000238
【図３５Ａ】
2014144007.tif 000239
【図３５Ｂ】
2014144007.tif 000240
【図３５Ｃ】
2014144007.tif 000241
【図３６】
2014144007.tif 000242
【図３７Ａ】
2014144007.tif 000243
【図３７Ｂ】
2014144007.tif 000244
【図３７Ｃ】
2014144007.tif 000245
【図３８】
2014144007.tif 000246
【図３９Ａ】
2014144007.tif 000247
【図３９Ｂ】
2014144007.tif 000248
【図３９Ｃ】
2014144007.tif 000249
【図４０】
2014144007.tif 000250
【図４１Ａ】
2014144007.tif 000251
【図４１Ｂ】
2014144007.tif 000252
【図４１Ｃ】
2014144007.tif 000253
【図４２】
2014144007.tif 000254
【図４３Ａ】
2014144007.tif 000255
【図４３Ｂ】
2014144007.tif 000256
【図４３Ｃ】
2014144007.tif 000257
【図４４】
2014144007.tif 000258
【図４５Ａ】
2014144007.tif 000259
【図４５Ｂ】
2014144007.tif 000260
【図４５Ｃ】
2014144007.tif 000261
【図４５Ｄ】
2014144007.tif 000262
【図４６Ａ】
2014144007.tif 000263
【図４６Ｂ】
2014144007.tif 000264
【図４６Ｃ】
2014144007.tif 000265
【図４６Ｄ】
2014144007.tif 000266
【図４６Ｅ】
2014144007.tif 000267
【図４７Ａ】
2014144007.tif 000268
【図４７Ｂ】
2014144007.tif 000269
【図４７Ｃ】
2014144007.tif 000270
【図４７Ｄ】
2014144007.tif 000271
【図４８Ａ】
2014144007.tif 000272
【図４８Ｂ】
2014144007.tif 000273
【図４８Ｃ】
2014144007.tif 000274
【図４９Ａ】
2014144007.tif 000275
【図４９Ｂ】
2014144007.tif 000276
【図４９Ｃ】
2014144007.tif 000277
【図５０】
2014144007.tif 000278
【図５１Ａ】
2014144007.tif 000279
【図５１Ｂ】
2014144007.tif 000280
【図５１Ｃ】
2014144007.tif 000281
【図５２】
2014144007.tif 000282
【図５３Ａ】
2014144007.tif 000283
【図５３Ｂ】
2014144007.tif 000284
【図５４】
2014144007.tif 000285
【図５５】
2014144007.tif 000286
【図５６】
2014144007.tif 000287
【図５７】
2014144007.tif 000288
【図５８】
2014144007.tif 000289
【図５９】
2014144007.tif 000290
【図６０】
2014144007.tif 000291
【図６１】
2014144007.tif 000292
【図６２】
2014144007.tif 000293
【図６３】
2014144007.tif 000294
【図６４】
2014144007.tif 000295
【図６５】
2014144007.tif 000296
【図６６】
2014144007.tif 000297
【図６７】
2014144007.tif 000298
【図６８】
2014144007.tif 000299
【図６９】
2014144007.tif 000300
【図７０】
2014144007.tif 000301
【図７１】
2014144007.tif 000302
【図７２】
2014144007.tif 000303
【図７３】
2014144007.tif 000304
【図７４】
2014144007.tif 000305
【図７５Ａ】
2014144007.tif 000306
【図７５Ｂ】
2014144007.tif 000307
【図７６Ａ】
2014144007.tif 000308
【図７６Ｂ】
2014144007.tif 000309
【図７７】
2014144007.tif 000310
【図７８Ａ】
2014144007.tif 000311
【図７８Ｂ】
2014144007.tif 000312
【図７８Ｃ】
2014144007.tif 000313
【図７９Ａ】
2014144007.tif 000314
【図７９Ｂ】
2014144007.tif 000315
【図７９Ｃ】
2014144007.tif 000316
【図８０Ａ】
2014144007.tif 000317
【図８０Ｂ】
2014144007.tif 000318
【図８１】
2014144007.tif 000319
【図８２】
2014144007.tif 000320
【図８３】
2014144007.tif 000321
【図８４】
2014144007.tif 000322
【図８５】
2014144007.tif 000323
【図８６Ａ】
2014144007.tif 000324
【図８６Ｂ】
2014144007.tif 000325
【図８７Ａ】
2014144007.tif 000326
【図８７Ｂ】
2014144007.tif 000327
【図８７Ｃ】
2014144007.tif 000328
【図８７Ｄ】
2014144007.tif 000329
【図８８】
2014144007.tif 000330
【図８９】
2014144007.tif 000331
【図９０】
2014144007.tif 000332
【図９１】
2014144007.tif 000333
【図９２Ａ】
2014144007.tif 000334
【図９２Ｂ】
2014144007.tif 000335
【図９２Ｃ】
2014144007.tif 000336
【図９３】
2014144007.tif 000337
【図９４】
2014144007.tif 000338
【図９５】
2014144007.tif 000339
【図９６】
2014144007.tif 000340
【図９７】
2014144007.tif 000341
【図９８】
2014144007.tif 000342
【図９９】
2014144007.tif 000343
【図１００】
2014144007.tif 000344
【図１０１】
2014144007.tif 000345
【図１０２】
2014144007.tif 000346
【図１０３Ａ】
2014144007.tif 000347
【図１０３Ｂ】
2014144007.tif 000348
【図１０３Ｃ】
2014144007.tif 000349
【図１０４】
2014144007.tif 000350
【図１０５】
2014144007.tif 000351
【図１０６】
2014144007.tif 000352
【図１０７】
2014144007.tif 000353
【図１０８Ａ】
2014144007.tif 000354
【図１０８Ｂ】
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【図１０８Ｃ】
2014144007.tif 000356
【図１０９】
2014144007.tif 000357
【図１１０Ａ】
2014144007.tif 000358
【図１１０Ｂ】
2014144007.tif 000359
【図１１１Ａ】
2014144007.tif 000360
【図１１１Ｂ】
2014144007.tif 000361
【図１１１Ｃ】
2014144007.tif 000362
【配列表】
2014144007000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月7日(2014.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図１】E. coli 中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子の核酸配列を表す図である(SEQ ID NO:1)。atg開始コドンはイタリック体で、終止コドンは太字で示し、追加したPstI部位に下線を付して図示した。
【図２】pTrcKudzuのマップを表す図である。
【図３】pTrcKudzuの核酸配列を表す図である (SEQ ID NO:2)。RBSに下線を付し、 kudzuイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字で、終止コドンは太字・大文字のイタリック体で図示した。ベクターの骨格は pTrcHis2Bである。
【図４】pETNHisKudzuのマップを表す図である。.
【図５】pETNHisKudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:5)。
【図６】pCL-lac-Kudzuのマップを表す図である。
【図７】pCL-lac-Kudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:7)。
【図８Ａ】ベクターを備えていないE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｂ】pCL-lac-Kudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｃ】pTrcKudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図８Ｄ】pETN-HisKudzuを備えたE. coli BL21細胞中でのイソプレン生成を表すグラフである。
【図９Ａ】14リットルの流加培養発酵における、E. coli BL21/pTrcKudzuの発酵中のODの経時変化を表すグラフである。
【図９Ｂ】14リットルの流加培養発酵における、E. coli BL21/pTrcKudzuの発酵中のイソプレン生成の経時変化を表すグラフである。
【図１０Ａ】Panteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。コントロールに用いた細胞は、kudzu組換えイソプレンシンターゼを備えていない。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１０Ｂ】pCL-lac Kudzuを発現するPanteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１０Ｃ】pTrcKudzuを発現するPanteoa citrea中でのイソプレン生成を表すグラフである。グレイの菱形はイソプレンシンターゼを表し、黒い四角は OD600を表す。
【図１１】組換えイソプレンシンターゼを発現するBacillus subtilis中でのイソプレン生成を表すグラフである。BG3594comKは、プラスミド(天然イソプレン生成)を備えていないB. subtilis株である。CF443-BG3594comKは、pBSKudzu(組換えイソプレン生成) を備えたB. subtilis株である。Ｙ軸の ISはイソプレンを表す。
【図１２】pBS Kudzu #2のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:57)。
【図１３】Yarrowia中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼのヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:8)。
【図１４】Yarrowia中での発現にコドン最適化したkudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を含むpTrex3gのマップを表す図である。
【図１５】pSPZ1(MAP29Spb)ベクターのヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:11)。
【図１６】Yarrowia中での発現にコドン最適化した合成kudzu(Pueraria montana)イソプレン遺伝子のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:12)。
【図１７】合成ハイブリッドポプラ（ポプラ・アルバxポプラトレムラ (Populus alba x Populus tremula) )イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:13)。ATG開始コドンは太字で、終止コドンは下線を付して示した。
【図１８Ａ】pYLA 1, pYL1 及びpYL2ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｂ】pYLA(POP1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｃ】pYLA(KZ1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｄ】pYLI(KZ1)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｅ】pYLI(MAP29)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１８Ｆ】pYLA(MAP29)ベクターの構築方法の概略を表す模式図である。
【図１９】イソプレンのMVA 及び DXP代謝経路を表す図である (F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005に基づく)。下記に、各経路における各ポリペプチドの代替名と、そのポリペプチドの活性を測定する方法が記載されている参考文献を示す。（これらの参考文献を、その全内容、特にMVA及びDXP経路における各ポリペプチドの活性を測定する方法に関して、参照として本願に組み込む。）＜メバロン酸経路＞: [AACT]; アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ, MvaE, EC 2.3.1.9. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [HMGS]; ヒドロキシメチルグルタアリール-CoA シンターゼ, MvaS, EC 2.3.3.10. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; [HMGR]; 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタアリール-CoA リダクターゼ, MvaE, EC 1.1.1.34. 測定方法: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; [MVK]; メバロン酸塩キナーゼ, ERG12, EC 2.7.1.36. 測定方法: Curr Genet 19:9-14, 1991. [PMK]; ホスホメバロン酸塩キナーゼ, ERG8, EC 2.7.4.2, 測定方法: Mol Cell Biol, 11:620-631, 1991; [DPMDC]; ジホスホメバロン酸塩デカルボキシラーゼ, MVDl, EC 4.1.1.33. 測定方法: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; [IDI]; イソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ, IDI1; EC 5.3.3.2. 測定方法: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. ＜DXP 経路＞ [DXS]; l-デオキシキシルロース-5-ホスフェート シンターゼ, dxs, EC 2.2.1.7. 測定方法: PNAS, 94:12857-62, 1997; [DXR]; 1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェート リダクトイソメラーゼ, dxr, EC 2.2.1.7. 測定方法: Eur. J. Biochem. 269:4446- 4457, 2002; [MCT]; 4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール シンターゼ, IspD, EC 2.7.7.60. 測定方法: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; [CMK]; 4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ, IspE, EC 2.7.1.148. 測定方法: PNAS, 97:1062-1067, 2000; [MCS]; 2C-メチル-D- エリスリトール2,4-シクロジホスフェート シンターゼ, IspF, EC 4.6.1.12. 測定方法: PNAS, 96:11758-11763, 1999; [HDS]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェート シンターゼ, ispG, EC 1.17.4.3. 測定方法: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; [HDR]; l-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)- ブテニル4-ジホスフェート リダクターゼ, IspH, EC 1.17.1.2. 測定方法: JACS, 126:12847-12855, 2004.
【図２０】kudzuイソプレンシンターゼ遺伝子を備えない組換えY. lipolytica株(左側)、及び前記遺伝子を備える組換えY. lipolytica株(右側)によるイソプレン生成のGC-MS分析結果を表すグラフである。矢印は基準イソプレン標準サンプルの溶出時間を示す。
【図２１】pTrcKudzu yIDI DXS Kanのマップを表す図である。
【図２２】pTrcKudzu yIDI DXS Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:20)。
【図２３Ａ】BL21/pTrcKudzukan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｂ】BL21/pTrcKudzu yIDI kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｃ】BL21/pTrcKudzu DXS kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｄ】BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｅ】BL21/pCL PtrcKudzu中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｆ】BL21/pCL PtrcKudzu中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｇ】BL21/pCL PtrcKudzu DXS中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。時間0はIPTG (400μmol)で誘導した時点である。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。菱形はOD600、丸はイソプレンの総生産性(μg/L)、四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２３Ｈ】BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中でのグルコースによるイソプレン生成を表すグラフである。矢印はIPTG (400μmol)で誘導した時点を表す。X軸は誘導後の時間である。Y軸はOD600 で、Y2軸はイソプレンの総生産性(μg/Lヘッドスペース、または比生産性 (μg/Lヘッドスペース/OD))を表す。黒色菱形はOD600、黒三角はイソプレンの生産性(μg/L)、白四角はイソプレンの比生産性(μg/L/OD)を表す。
【図２４】pTrcKKDyIkIS kanのマップを表す図である。
【図２５】pTrcKKDyIkIS kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:33)。
【図２６】pCL Ptrc上流経路のマップを表す図である。
【図２７】図27A-27Dは、pCL Ptrc上流経路のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:46)。
【図２８】B. subtilis染色体のnprEローカスに組み込むための、下流MVA 経路及び酵母idiを含むカセットのマップを表す図である。nprE上流／下流は、組み込むnprEローカスからの各配列の1 kbを示す。aprEプロモータ(アルカリ性セリンプロテアーゼプロモータ)は、aprE遺伝子のプロモータ(-35、-10、+1 転写開始部位、RBS)を表す。MVK1は、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を表す。RBS-PMKは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子を表す。RBS-MPDは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を表す。RBS-IDIは、開始部位の上流のBacillus RBSを備える酵母idi遺伝子を表す。ターミネータは、B. amyliquefaciens (アミリケファシエンス)由来のターミネータアルカリ性セリンプロテアーゼターミネータを表す。SpecRは、スペクチノマイシン耐性マーカを表す。“nprE upstream repeat for amp.”は、増幅に用いる上流領域の重複配列を表す。
【図２９】B. subtilis染色体のnprEローカスに組み込むための、下流MVA 経路及び酵母idiを含むカセットのヌクレオチド配列を表す図である。
【図３０】p9796-poplarのマップを表す図である。
【図３１】p9796-poplarのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:48)。
【図３２】pTrcPoplarのマップを表す図である。
【図３３】pTrcPoplarのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:49)。
【図３４】pTrcKudzu yIDI Kanのマップを表す図である。
【図３５】pTrcKudzu yIDI Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:50)。
【図３６】pTrcKudzuDXS Kanのマップを表す図である。
【図３７】pTrcKudzuDXS Kanのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:51)。
【図３８】pCL PtrcKudzuのマップを表す図である。
【図３９】pCL PtrcKudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:52)。
【図４０】pCL PtrcKudzu A3のマップを表す図である。
【図４１】pCL PtrcKudzu A3のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:53)。
【図４２】pCL PtrcKudzu yIDIのマップを表す図である。
【図４３】pCL PtrcKudzu yIDIのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:54)。
【図４４】pCL PtrcKudzu DXSのマップを表す図である。
【図４５】pCL PtrcKudzu DXSのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:55)。
【図４６】バイオマス原料からのイソプレン生成を表すグラフである。図Ａはトウモロコシ茎葉からのイソプレン生成、図Ｂはバガスからのイソプレン生成、図Ｃは針葉樹パルプからのイソプレン生成、図Ｄはグルコースからのイソプレン生成、図Ｅは追加原料の無い細胞からのからのイソプレン生成を表す。グレイの四角は植菌後の図示した各時間における培養物のOD600測定値を表し、黒三角は植菌後の図示した各時間におけるイソプレン生成を表す。
【図４７Ａ】グルコース無添加の培地における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｂ】1%グルコース原料転化糖における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｃ】1%転化糖原料における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すを表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４７Ｄ】1% AFEXトウモロコシ茎葉原料における、BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)によるイソプレン生成を表すグラフである。四角はOD600を表し、三角はイソプレン生成(μg/ml)を表す。
【図４８】酵母エキスがイソプレン生成に及ぼす影響を表すグラフである。図Ａは、異なる量の酵母エキスを転化した培養槽における光学密度の経時変化を表す。図Ｂは、異なる量の酵母エキスを転化した培養槽におけるイソプレン力価の経時変化を表す。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。図Ｃは、酵母エキスが流加培養法培地中で成長させたE. coliのイソプレン生成に及ぼす影響を表す。
【図４９】500 Lバイオリアクター中での、pTrcKudzu + yIDI + DXSプラスミドを有する E. coli細胞からのイソプレン生成を表すグラフである。図Ａは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での、光学密度の経時変化を表す。図Ｂは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での、イソプレン力価の経時変化を表す。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。図Ｃは、グルコースと酵母エキスを添加した500 Lバイオリアクター中での総イソプレン生成の経時変化を表す
【図５０】pJMupperpathway2のマップを表す図である。
【図５１】pJMupperpathway2のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:56)。
【図５２】pBS Kudzu #2のマップを表す図である。
【図５３Ａ】14リットル流加培養発酵槽での、組換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するBacillusの発酵中の成長を表すグラフである。黒色菱形は組換えイソプレンシンターゼを備えていない(天然イソプレン生成)コントロール株(BG3594comK)を表し、灰色三角はpBSKudzu (組換えイソプレン生成)を備えるBacillusを表す。
【図５３Ｂ】14リットル流加培養発酵槽での、組換えkudzuイソプレンシンターゼを発現するBacillusの発酵中における、イソプレン生成を表すグラフである。黒色菱形は組換えイソプレンシンターゼを備えていない(天然イソプレン生成)コントロール株(BG3594comK)を表し、灰色三角はpBSKudzu (組換えイソプレン生成)を備えるBacillusを表す。
【図５４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図５５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図５６】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図５７】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である
【図５８】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図５９】グリセロールを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図６０】図60A-60Cはグルコースを添加した150-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６１】図61A-61Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６２】図62A-62Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、メバロチン酸力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６３】図63A-63Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６４】図64A-64Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６５】図65A-65Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６６】図66A-66Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６７】図67A-67Cはグルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度、イソプレン力価、及び比生産性の経時変化を表す図である。
【図６８】系Aの断熱火炎温度の計算値を、様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。例えば、凡例中の最初の記載(40℃の空気中のイソプレン)は、グラフ中の一番上の曲線に対応する。
【図６９】系Bの断熱火炎温度の計算値を、4%の水を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７０】系Cの断熱火炎温度の計算値を、5%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７１】系Dの断熱火炎温度の計算値を、10%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７２】系Eの断熱火炎温度の計算値を、15%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７３】系Fの断熱火炎温度の計算値を、20%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７４】系Gの断熱火炎温度の計算値を、30%のCO2を含む様々な酸素濃度における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。グラフ中の凡例は、グラフ上の曲線の順に記載してある。
【図７５Ａ】系AのCAFT モデルの結果を重量パーセントから容積パーセントに換算した値を示す表である。
【図７５Ｂ】図68に示した、系AのCAFTモデルから得られた燃焼性を容積パーセントで表すグラフである。
【図７６Ａ】系ＢのCAFT モデルの結果を重量パーセントから容積パーセントに換算した値を示す表である。
【図７６Ｂ】図69に示した、系ＢのCAFTモデルから得られた燃焼性を容積パーセントで表すグラフである。
【図７７】燃焼性試験用容器の概略図である。
【図７８Ａ】試験系1の燃焼性曲線を表すグラフである：スチーム 0%、0 psig、40℃。
【図７８Ｂ】試験系1の爆発及び不爆データポイントをまとめた表である。
【図７８Ｃ】試験系1の燃焼性曲線と、CAFTモデルとの比較を示すグラフである。
【図７９Ａ】試験系2の燃焼性曲線を表すグラフである：スチーム4%、0 psig、40℃。
【図７９Ｂ】試験系2の爆発及び不爆データポイントをまとめた表である。
【図７９Ｃ】試験系2の燃焼性曲線と、CAFTモデルとの比較を示すグラフである。
【図８０Ａ】図80A及び80Bは、試験系1の試験条件及び結果の詳細をまとめた表である。
【図８０Ｂ】図80A及び80Bは、試験系1の試験条件及び結果の詳細をまとめた表である。
【図８１】試験系2の試験条件及び結果の詳細をまとめた表である。
【図８２】断熱火炎温度の計算値を、圧力3気圧の様々な窒素／酸素比における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。
【図８３】断熱火炎温度の計算値を、圧力1気圧の様々な窒素／酸素比における燃焼物の濃度の関数として表すグラフである。
【図８４】図82のデータと、実施例13に示す方法で求めた燃焼範囲を表すグラフである。実験例のデータ点(丸)は、初期圧力1気圧で行った本願に開示する試験によるものである。
【図８５】図83のデータと、実施例13に示す方法で求めた燃焼範囲を表すグラフである。実験例のデータ点(丸)は、初期圧力1気圧で行った本願に開示する試験によるものである。
【図８６Ａ】発酵オフガスのGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８６Ｂ】図86Bは図86Aを拡大して 発酵オフガス中の少量の揮発成分を示す図である。
【図８７Ａ】-78℃で冷凍トラップしたオフガス中の微量揮発成分のGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８７Ｂ】-196℃で冷凍トラップしたオフガス中の微量揮発成分のGC/MS クロマトグラムを表す図である。
【図８７Ｃ】図87C は図87Bの拡大図である。
【図８７Ｄ】図87D は図87Cの拡大図である。
【図８８】図88A及び88Bは、石油から得られたイソプレン(図88A)、及び生物学的に得られたイソプレン(図88B)のGC/MS クロマトグラムを比較して示す図である。標準サンプルには、イソプレンのメインピーク付近に溶出する3種のC5炭化水素の不純物が含有されている(図88A)。これに対し、生物学的に得られたイソプレンには顕著な量のエタノールとアセトン(ランタイム3.41分) が含まれている(図88A)。
【図８９】グルコース及び3 g/Lの酵母エキスを添加した、Kudzuイソプレンシンターゼを発現するE. coli BL21 (DE3) pTrcIS株の発酵オフガスの分析結果を表すグラフである。
【図９０】イソプレンに類似した構造を有し、重合触媒毒として作用するいくつかの不純物の構造を示す図である。
【図９１】pTrcHis2AUpper上流経路(pTrcUpperMVAとも呼ぶ)のマップを表す図である。
【図９２】図92A-92Cは、pTrcHis2A上流経路(pTrcUpperMVAとも呼ぶ) のヌクレオチド配列を表す図である(SEQ ID NO:86)。
【図９３】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図９４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図９５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図９６】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図９７】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図９８】転化糖を添加した15-Lバイオリアクターから生成した総イソプレンの経時変化を表す図である。
【図９９】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１００】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１０１】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレンの比活性度の経時変化を表す図である。
【図１０２】pCLPtrcUpperPathwayHGS2のマップを表す図である。
【図１０３】図103A-103C は、pCLPtrc上流経路HGS2のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:87)。
【図１０４】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１０５】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１０６】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける総イソプレン生成の経時変化を表す図である。
【図１０７】プラスミドMCM330のマップを表す図である。
【図１０８】図108A-108Cは、プラスミドMCM330のヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:90)。
【図１０９】pET24D-Kudzuのマップを表す図である。
【図１１０】図110A及び110Bは、pET24D-Kudzuのヌクレオチド配列を表す図である (SEQ ID NO:101)。
【図１１１Ａ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおける光学密度の経時変化を表す図である。
【図１１１Ｂ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレン力価の経時変化を表す図である。力価とは、発酵ブロス1リットル当りのイソプレン生成量と定義される。
【図１１１Ｃ】グルコースを添加した15-Lバイオリアクターにおけるイソプレンの比活性度の経時変化を表す図である。