(57)【要約】【課題】細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供する。【解決手段】Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｇａＺＨ遺伝子およびｙｃｈＥ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の発現が非改変株と比べて増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｇａＺＨ遺伝子およびｙｃｈＥ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の発現が非改変株と比べて増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法。
【請求項２】
前記細菌は、Ｌ−システインの生合成系が強化されるよう改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌は、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｙｇａＺＨ遺伝子が、それぞれ下記（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選ばれるタンパク質、並びに下記（Ｃ）および（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記ｙｃｈＥ遺伝子が、下記（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（Ｅ）配列番号１３または１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号１３または１５に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記ｙｇａＺＨ遺伝子が、それぞれ下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれるＤＮＡ、並びに下記（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｂ）配列番号７に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記ｙｃｈＥ遺伝子が、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれるＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１２または１４に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｂ）配列番号１２または１４に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記細菌がパントエア属に属する細菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記関連物質がＬ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記関連物質がＯ−アセチルセリンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたＬ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする細菌酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システインの生産に好適に用いられる微生物としては、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することによりＬ−システイン生産能が向上した微生物が知られている。例えば、Ｌ−システイン生産能を有する微生物として、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。また、セリンによるフィードバック阻害が低減された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献５、６）。
【０００４】
また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン分解系を抑制することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた細菌としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献７）、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特許文献８）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
【０００５】
また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出能を強化することによっても向上させることができる。例えば、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子（非特許文献１、特許文献９）、及びYfiKタンパク質をコードするyfiK遺伝子（非特許文献２、特許文献１０）は、Ｌ−システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるmar−遺伝子座、acr−遺伝子座、cmr−遺伝子座、mex−遺伝子座、bmr−遺伝子座、qacA−遺伝子座（特許文献９）、又はemrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcrもしくはcusA遺伝子（特許文献１１）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。またYeaSタンパク質をコードするyeaS遺伝子およびその変異型遺伝子の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献１２）。
【０００６】
Ｏ−アセチルセリンはＬ−システインの前駆体であり、よってＯ−アセチルセリンの生合成経路はＬ−システインの生合成経路と共通する。そのため、Ｌ−システイン生合成経路の強化はＯ−アセチルセリンの生産にも有効である。例えば、変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ（特許文献４）、変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（特
許文献５、特許文献６）を用いたＯ−アセチルセリンの生産方法が知られている。
【０００７】
また、微生物のＯ−アセチルセリン生産能は、Ｏ−アセチルセリン排出能を強化することによっても向上させることができる。例えば、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子（非特許文献１、特許文献９）、YfiKタンパク質をコードするyfiK遺伝子（非特許文献２、特許文献１０）を強化することでＯ−アセチルセリン生産能を向上させることが知られている。
【０００８】
なお、Ｏ−アセチルセリンは、中性〜アルカリ性のpH領域において自然反応によって容易にＮ−アセチルセリンに変換される。このようなＮ−アセチルセリンへの変換を防ぐため、Ｏ−アセチルセリンを安定に存在させるpH領域においてＯ−アセチルセリンを生産する方法が知られている（特許文献１３）。
【０００９】
ygaZ遺伝子にコードされるYgaZタンパク質とygaH遺伝子にコードされるYgaHタンパク質は複合体を形成し(YgaZH)、分岐鎖アミノ酸排出（branched chain amino acid exporter LIV-E）ファミリーに属するＬ−バリン排出膜タンパク質であることが知られてる。ygaZ遺伝子はygaH遺伝子とオペロンを形成し、ygaZHオペロンの遺伝子発現は転写因子Lrpによって発現調節されていると考えられている（非特許文献３）。また、ygaZHオペロンはアルカリ性環境下で発現が誘導されることが知られている（非特許文献４）。ygaZH遺伝子はその遺伝子発現量をエシェリヒア・コリにおいて高めることにより、高濃度のＬ−バリン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニン、ＤＬ−ｏ−フルオロフェニルアラニン、３，４−ジヒドロプロリン、ＤＬ−チアイソロイシン、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、４−アザロイシンに対する耐性が対照株よりも向上し、Ｌ−アミノ酸生産菌においてその遺伝子発現量を高めることで、Ｌ−バリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニンの生産性が向上することが報告されている（特許文献１４）。
【００１０】
ychE遺伝子にコードされるYchEタンパク質は機能未知の膜タンパク質としてデータベースEcoCyc（http://biocyc.org/ECOLI）に登録されている。また、YchEタンパク質は6回膜貫通型のタンパク質であり、C末端がペリプラズムに向いていると予想されている（非特許文献５）。ychEのパラログとして、yhgN、marCが知られており、marCは多剤耐性に関与していると考えられている。しかしながら、これら遺伝子の三重欠損株は、野性株と比較して種々の薬剤に対する感受性に違いが見られず、よって、これら遺伝子と薬剤耐性との関連はわかっていない（非特許文献６）。ychE遺伝子はその遺伝子発現量をエシェリヒア・コリにおいて高めることにより、高濃度のＤＬ−ｏ−メチルセリン、およびホモセリンに対する耐性が対照株よりも向上し、Ｌ−アミノ酸生産菌においてその遺伝子発現量を高めることで、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリンの生産性が向上することが報告されている（特許文献１４）。
【００１１】
上記のように、ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現量を増強することでいくつかのアミノ酸の生産を向上させることができると知られているが、ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現とＬ−システイン生産との関連については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００２−２３３３８４号公報
【特許文献２】特開平１１−１５５５７１号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号
【特許文献４】米国特許第６２１８１６８号
【特許文献５】米国特許第５８５６１４８号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５０００９１６２号
【特許文献７】特開２００３−１６９６６８号公報
【特許文献８】特開２００５−２４５３１１号公報
【特許文献９】米国特許第５９７２６６３号
【特許文献１０】特開２００４−４９２３７号公報
【特許文献１１】特開２００５−２８７３３３号公報
【特許文献１２】特開２０１０−１８７５５２号公報
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００２０１４６７８３号
【特許文献１４】米国特許第７４７６５３１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Dassler et al., Mol.Microbiol. 36. 1101-1112 (2000)
【非特許文献２】Franke I. et al., J Bacteriol. 2003 Feb;185(4):1161-6
【非特許文献３】Park JH. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 May 8; 104(19): 7797-802
【非特許文献４】Hayes ET. et al., BMC Microbiol. 2006 Oct 6;6:89.
【非特許文献５】Daley DO. et al., Science. 2005 May 27;308(5726):1321-3.
【非特許文献６】McDermott PF. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2008 Jan;52(1):382-3. Epub 2007 Oct 22.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現量を上昇させることによって、Ｌ−システイン生産能を向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
[１]
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｇａＺＨ遺伝子およびｙｃｈＥ遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子の発現が非改変株と比べて増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法。
[２]
前記細菌は、Ｌ−システインの生合成系が強化されるよう改変されている、前記方法。[３]
前記細菌は、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する、前記方法。
[４]
前記ｙｇａＺＨ遺伝子が、それぞれ下記（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選ばれるタンパク質、並びに下記（Ｃ）および（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、前記方法：
（Ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質。
[５]
前記ｙｃｈＥ遺伝子が、下記（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、前記方法：
（Ｅ）配列番号１３または１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号１３または１５に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質。
[６]
前記ｙｇａＺＨ遺伝子が、それぞれ下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれるＤＮＡ、並びに下記（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるＤＮＡである、前記方法：（ａ）配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｂ）配列番号７に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
[７]
前記ｙｃｈＥ遺伝子が、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれるＤＮＡである、前記方法：
（ａ）配列番号１２または１４に示す塩基配列を有する遺伝子；
（ｂ）配列番号１２または１４に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
[８]
前記細菌がパントエア属に属する細菌である、前記方法。
[９]
前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記方法。
[１０]
前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、前記方法。
[１１]
前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記方法。
[１２]
前記関連物質がＬ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、前記方法。
[１３]
前記関連物質がＯ−アセチルセリンである、前記方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、腸内細菌科に属する細菌のＬ−システイン生産能を向上させることが出来る。また、本発明の細菌を使用することにより、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を効率よく発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜１＞本発明の方法に用いられる細菌
本発明の方法に用いられる細菌（以下、本発明の細菌ともいう）は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子からなる群より選ばれる１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変された、腸内細菌科に属する細菌である。
【００１９】
本発明において、Ｌ−システインとは、フリー体のＬ−システインもしくはその塩、またはそれらの混合物であってもよい。また、本発明において、Ｏ−アセチルセリンとは、フリー体のＯ−アセチルセリンもしくはその塩、またはそれらの混合物であってもよい。後述するその他のＬ−システイン関連物質についても同様である。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【００２０】
本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．２ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。
【００２１】
細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ-スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature,  vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。また、本発明の細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−システインの前駆体が生成することがある。Ｌ−システインの前駆体としては、Ｏ−アセチルセリンや、その異性体であるＮ−アセチルセリンが挙げられる。したがって、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、もしくは前記のようなＬ−システインの前駆体、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力を含むものとする。なお、本発明において、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、および前記のようなＬ−システインの前駆体を総称して「Ｌ−システインの関連物質」ともいう。
【００２２】
Ｌ−システイン生産能を有する細菌は、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００２３】
本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−システインを生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科に属する細菌の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレ
ブシエラ属細菌を用いることが望ましい。
【００２４】
エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００２５】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)が挙げられる。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
【００２７】
パントエア属細菌としては、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea
agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。
【００２８】
パントエア・アナナティスとして、具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、SC17株（FERM BP-11091）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17(0)株は、パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株として構築された株である（WO2008/075483）。
【００２９】
SC17株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。また、SC17(0)株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。また、AJ13355株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、AJ13355株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００３０】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００３１】
なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ-プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl
Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアルティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。本発明の細菌は、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。
【００３２】
〔Ｌ−システイン生産能の付与又は増強、及びＬ−システイン生産菌〕
細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であっても、２種又はそれ以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３３】
以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法、及びＬ−システイン生産能を有する細菌について具体的に例示する。
【００３４】
Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−システイン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３５】
細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システインの生合成系を強化することにより付与又は増強することができる。「Ｌ−システインの生合成系を強化する」とは、例えば、Ｌ−システインの生合成に関与する酵素の活性を増強することをいう。Ｌ−システインの生合成に関与する酵素としては、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、およびＬ−システイン生合成経路の基質となる化合物、例えばＬ−セリン、の生成に関与する酵素が挙げられ、具体的には、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）や３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）が挙げられる。酵素活性の増強は、後述するように、目的の酵
素をコードする遺伝子の発現を増強することや、目的の酵素の比活性を増強することにより達成できる。
【００３６】
例えば、SATをコードする遺伝子を好適なベクターに組み込み細菌に導入することや、SATをコードする遺伝子を細菌の染色体上に組み込むことにより、SATをコードする遺伝子の発現を増強することができる。SATをコードする遺伝子としては、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。エシェリヒア・コリのSATをコードする遺伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになっている（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。したがって、その塩基配列（配列番号１６）に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCRによって、SATをコードする遺伝子を取得することができる（特開平11-155571号参照）。他の生物のSATをコードする遺伝子も、同様にして取得される。
【００３７】
また、セリンアセチルトランスフェラーゼはＬ−システインによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼはセリンによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。
【００３８】
本発明において、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解除されたSATを「変異型SAT」ともいう。変異型SATとしては、エシェリヒア・コリの野生型SAT（配列番号１７）の２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するSATが挙げられる（特開平11-155571）。前記リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基、及びロイシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。前記リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基としては、好ましくはイソロイシン残基またはグルタミン酸残基が挙げられる。また、変異型SATとしては、野生型ＳＡＴの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列において１又は複数の変異を有する変異型ＳＡＴ（米国特許公開第20050112731(A1)）、野生型ＳＡＴの９５位のバリン残基及び９６位のアスパラギン酸残基が、各々アルギニン残基及びプロリン残基に置換された変異型ＳＡＴ（変異型遺伝子名cysE5、米国特許公開第20050112731(A1)）、及び、野生型ＳＡＴの１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換された変異型ＳＡＴ（米国特許第6218168号、米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。野生型SAT遺伝子に所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異やオーバーラップエクステンション法が挙げられる。変異後のコドンは、目的のアミノ酸をコードするものであれば特に制限されないが、目的の腸内細菌で使用頻度の高いコドンを使用することが好ましい。２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型SATをコードする変異型cysEを含むプラスミドpCEM256Eを保持するエシェリヒア・コリJM39-8株（E. coli JM39-8(pCEM256E)、プライベートナンバー：AJ13391）は、平成９年11月20日より通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、FERM
P-16527の受託番号のもとで寄託され、2002年７月８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-8112が付与されている。
【００３９】
また、変異型ＳＡＴは、上記のようにＬ−システインによるフィードバック阻害に非感受性になるように改変されたものであってもよいが、元来フィードバック阻害を受けない
ものであってもよい。例えば、シロイヌナズナのSATは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に用いることができる。シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子を含むプラスミドとして、pEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）が知られている。
【００４０】
また、セリンによるフィードバック阻害耐性の変異型ＰＧＤをコードする遺伝子としては、serA5遺伝子（米国特許第６,１８０,３７３号）が知られている。
【００４１】
また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出系を強化することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン排出系は、Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質の活性を増強することにより強化することができる。Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質（特開2002-233384）、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質（特開2004-49237）、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusAの各遺伝子にコードされる各タンパク質（特開2005-287333）、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質（特開2010-187552）が知られている。よって、これらの遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより、Ｌ−システイン排出系を強化することができ、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。また、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基、１３７位のフェニルアラニン残基、および／または１８８位のロイシン残基に変異を導入することによっても、Ｌ−システイン排出系が強化されＬ−システイン生産能を高めることができる（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。具体的には、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基をアスパラギンに置換する変異、１３７位のフェニルアラニン残基をセリン、グルタミン、アラニン、ヒスチジン、システイン、及びグリシンのいずれかに置換する変異、および／または１８８位のロイシン残基をグルタミンに置換する変異が好ましい（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。
【００４２】
また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群をコードするcysPTWAMクラスター遺伝子の発現を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を高めることができる（特開2005-137369号公報、EP1528108号明細書）。
【００４３】
また、硫化物は、cysK遺伝子およびcysM遺伝子それぞれによりコードされるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−ＡおよびＢにより触媒される反応を介してＯ−アセチル−Ｌ−セリンに取り込まれ、Ｌ−システインが産生する。したがって、これらの酵素はＬ−システイン生合成経路の酵素に含まれ、これらの酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。
【００４４】
また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン分解系を抑制することにより向上させることができる。Ｌ−システイン分解系を抑制するとは、細胞内のＬ−システイン分解活性が、野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることを意味する。Ｌ−システイン分解を担うタンパク質としては、metC遺伝子にコードされるシスタチオニン−β−リアーゼ（特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、tnaA遺伝子にコードされるトリプトファナーゼ（特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、cysM遺伝子にコードされるＯ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（cysM遺伝子産物、特開2005-245311）、及び、malY遺伝子にコードされるMalY（特開2005-245311）が知られている。また、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのｄ０１９１遺伝子が知られている（特開2009-232844）。これらのタンパク質の活性を低下させることにより、Ｌ−システイン生産能が向上する。酵素活性の低下は、後述する手法により達成できる。
【００４５】
また、本発明において、特に、Ｏ−アセチルセリンを培地中又は菌体内に蓄積する能力をＯ−アセチルセリン生産能という場合がある。なお、Ｏ−アセチルセリンは、中性〜アルカリ性のpH領域において自然反応によって容易にＮ−アセチルセリンに変換される。しかし、例えば、培養液のpHを酸性に保つことによりＮ−アセチルセリンへの変換を防ぐことができる（US20020146783A1）。こうした技術を組み込むことが可能であるため、発酵による生産においては、Ｎ−アセチルセリンを培地中に蓄積する能力も含めてＯ−アセチルセリン生産能と考えてよい。
【００４６】
Ｏ−アセチルセリンはＬ−システインの前駆体であり、よってＯ−アセチルセリンの生合成経路はＬ−システインの生合成経路と共通する。そのため、細菌のＯ−アセチルセリン生産能は、Ｌ−システイン生合成経路を強化することにより付与又は増強することができる。すなわち、例えば、システインによるフィードバック阻害が低減又は解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼまたはセリンによるフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの利用や、その他Ｌ−システイン生合成経路を強化するような改変がＯ−アセチルセリンの生産に有効である。
【００４７】
Ｏ−アセチルセリンは、硫黄源と反応し、Ｌ−システインに変換される。よって、Ｏ−アセチルセリンを高生産するためには、Ｏ−アセチルセリンからＬ−システインへの反応が過剰に進行しないよう、Ｏ−アセチルセリンからＬ−システインへの反応を触媒するＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−Ａ及びＢ（cysK遺伝子およびcysM遺伝子にそれぞれコードされる）や、当該反応の基質である硫黄源の供給に関与する経路をあえて強化しないほうが好ましい。また、Ｏ−アセチルセリンからＬ−システインへの反応を抑制するため、当該反応の基質である硫黄源の供給を制限してもよい。例えば、チオ硫酸を硫黄源として添加する発酵においてはチオ硫酸の添加を制限することによって、硫酸塩を硫黄源として添加する発酵においては硫酸塩の添加を制限することによって、Ｏ−アセチルセリンを効率的に生産することができる。
【００４８】
Ｏ−アセチルセリン生産能は、Ｏ−アセチルセリン排出能を強化することによっても向上させることができる。上述したようなＬ−システイン排出因子にはＯ−アセチルセリンも排出することができるものが知られている。よって、例えば、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子（Dassler et al., Mol.Microbiol. 36. 1101-1112 (2000)）、またはYfiKタンパク質をコードするyfiK遺伝子（Franke I. et al., J Bacteriol. 2003 Feb; 185(4): 1161-6）の発現を強化することでＯ−アセチルセリン生産能を向上させることができる。
【００４９】
Ｌ−システイン生産菌は、上記のようなＬ−システイン生産能が向上する性質を単独で有していてもよく、任意の組み合わせで有していてもよい。本発明で用いるＬ−システイン生産菌は、上記のようなＬ−システイン生産能が向上する性質の内、少なくともＬ−システインの生合成系が強化されているのが好ましく、変異型ＳＡＴを保持しているのがより好ましい。
【００５０】
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）をコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強されたE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)、ydeD遺伝子、変異型cysE遺伝子、および変異型serA5遺伝子を含むプラスミドpACYC-DES (特開2005-137369 (US20050124049(A1)、EP1528108(A1)))を保持するE. coliなどのエシェリヒア属に属する株が挙げられる
が、これらに限定されない。なお、pACYC-DESは、上記３遺伝子をpACYC184に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はompAプロモーター（PompA）により制御される。
【００５１】
以下、ＳＡＴ等のタンパク質の活性を増大させる手法、およびシステインデスルフヒドラーゼ等のタンパク質の活性を低下させる手法について例示する。
【００５２】
＜タンパク質の活性を増大させる手法＞
本発明において、「タンパク質の活性が増大する」とは、目的のタンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと目的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと目的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。
【００５３】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。
【００５４】
遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００５５】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物への染色体上へ目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への目的遺伝子の導入は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888 EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えを行うことにより達成できる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、P1ファージ等のファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、WO03/040373に記載されているように、染色体上の目的物質生産に不要な遺伝子を標的にして目的遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、目的遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。
【００５６】
染色体上に目的遺伝子が導入されたことの確認は、目的遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は目的遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認出来る。
【００５７】
また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して目的遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、目的遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。腸内細菌科に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229（pHSG、pSTV、pTWVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロン
テック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターRSF1010等が挙げられる。
【００５８】
また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128
(1995)）等に記載されている。
【００５９】
また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００６０】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【００６１】
また、遺伝子の発現の増強は、目的遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、目的遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。目的遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターとしては、Lrpファミリーに属するタンパク質などが知られている（Kutukova et al., FEBS Lett. 579. 4629-4634 (2005)）。また、レギュレーターは、データベースEcoCyc（http://ecocyc.org/）等を利用して見出すことができる。レギュレーターの改変は、目的のタンパク質の活性の増大、目的の遺伝子の転写量の増大、または目的のタンパク質の量の増大を指標として行えばよい。
【００６２】
上記のような遺伝子の発現を増強させる手法は、単独で用いてもよく、任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６３】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、目的のタンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の細菌を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで
高活性型のものを取得してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００６５】
目的のタンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。
【００６６】
目的の遺伝子の発現が増大したことは、目的の遺伝子の転写量が増大したことを確認することや、目的のタンパク質の量が増大したことを確認することにより確認できる。
【００６７】
目的の遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００６８】
目的のタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。目的のタンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００６９】
＜タンパク質の活性を低下させる手法＞
本発明において、「タンパク質の活性が低下する」とは、目的のタンパク質の活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば非改変株と比較して７５％以下、５０％以下、２５％以下、又は１０％以下に低下していることが好ましく、活性が完全に消失しているのが特に好ましい。なお、タンパク質によっては、活性を完全に消失させないのが好ましい場合もある。
【００７０】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、アンチセンスＲＮ
Ａを発現させることによっても達成できる。
【００７１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の同タンパク質をコードする遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００７２】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の同タンパク質をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences, USA
95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００７３】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の同タンパク質をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００７４】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００７５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線もしくは紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による通常の変異処理が挙げられる。
【００７６】
目的のタンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。システインデスルフヒドラーゼ活性は、特開2002-233384号公報に記載された手法により測定することができる。
【００７７】
目的の遺伝子の発現が低下したことは、目的の遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、目的のタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００７８】
目的の遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００７９】
目的のタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的のタンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００８０】
〔ygaZH遺伝子およびychE遺伝子〕
本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように腸内細菌科に属する細菌を改変した後に、Ｌ−システイン生産能を付与することによっても得ることができる。
【００８１】
以下に、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子について説明する。
【００８２】
エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のygaZ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2807639〜2808376位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のygaZ遺伝子は、ECK2676、JW2657と同義である。また、エシェリヒア・コリK12 MG1655株のYgaZタンパク質は、GenBank accession NP_417167 (version NP_417167.1 GI:16130594、locus_tag="b2682")として登録されている。
【００８３】
エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のygaH遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2808366〜2808701位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のygaH遺伝子は、ECK2677、JW2658と同義である。また、エシェリヒア・コリK12 MG1655株のYgaHタンパク質は、GenBank accession NP_417168 (version NP_417168.1 GI:16130595、locus_tag="b2683")として登録されている。
【００８４】
エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のychE遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1297821〜1298468位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のychE遺伝子は、ECK1236、JW1229と同義である。また、エシェリヒア・コリK12 MG1655株のYchEタンパク質は、GenBank accession NP_415758 (version NP_415758.1 GI:16129203、locus_tag="b1242")として登録されている。
【００８５】
エシェリヒア・コリのygaZ遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、８に示す。エシェリヒア・コリのygaH遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９、１０に示す。また、ygaZ遺伝子およびygaH遺伝子はオペロンを形成していることが知られている。エシェリヒア・コリのygaZHオペロンの塩基配列を配列番号１１に示す。なお、エシェリヒア・コリのYgaZタンパク質とYgaHタンパク質は複合体を形成して機能することが知られている。よって、ygaZH遺伝子の発現を増大させる場合、ygaZ遺伝子およびygaH遺伝子の両方の発現を増大させる。ygaZ遺伝子およびygaH遺伝子は、ygaZHオペロンとしてまとめて発現を増大させてもよく、結果として両方の発現が増大する限りそれぞれ別個に発現を増大させてもよい。
【００８６】
エシェリヒア・コリのychE遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１２、１３に示す。パントエア・アナナティスのychE遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４、１５に示す。
【００８７】
ygaZH遺伝子およびychE遺伝子がコードするタンパク質は、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質であり、Ｌ−システインおよびＯ−アセチルセリンを細胞外に排出する活性を有すると推定される。
【００８８】
腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性とは、腸内細菌で発現を上昇させたときに非改変株、例えば野生株または親株よりも多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し、培地に蓄積する能力を付与する活性を意味し、非改変株と比較して好ましくは0.1g/L以上、より好ましくは0.2g/L以上、特に好ましくは0.3g/L以上多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を培地に蓄積する能力を付与する活性を意味する。
【００８９】
腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するかどうかは、腸内細菌に属する菌株を基にその遺伝子の発現が上昇するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に培地中に蓄積するＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に培地中に蓄積するＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の量と比較することで確認することができる。ここでいう非改変株としては、Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を用いることができ、具体的には、E.coli MG1655株にフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードする遺伝子を増強した株が挙げられる。
【００９０】
また、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するかどうかは、Ｏ−アセチルセリン耐性またはＬ−システイン耐性を調べることによっても容易に確認することができる。すなわち、その遺伝子の発現が上昇した細菌において、所定の濃度のＯ−アセチルセリンまたはＬ−システインを含有する培地での生育が非改変株よりも良好になっている場合に、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有すると判断できる。具体的には、0.1〜10mM程度のＯ−アセチルセリンまたはＬ−システインを含む培地に、その遺伝子の発現が上昇した細菌を接種し、10時間後〜120時間後の適当な時間にコロニーの直径を測定し、同様に培養した非改変株のコロニーの直径よりも大きいことを確認すればよい。
【００９１】
細菌が属する属、種、又は菌株によって、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、発現が増大するygaZH遺伝子およびychE遺伝子は、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ上記塩基配列のバリアントであってもよい。なお、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子のバリアントには、同遺伝子のホモログが含まれる。ygaZH遺伝子およびychE遺伝子のホモログは、上記のエシェリヒア・コリの野生型ygaZH遺伝子およびychE遺伝子やパントエア・アナナティスのychE遺伝子を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができ、また、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００９２】
ygaZH遺伝子およびychE遺伝子は、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。この場合、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性は、１又は数個の置換、欠失、挿入又は付加される前のタンパク質に対して、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上が維持される。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【００９３】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００９４】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００９５】
また、ygaZH遺伝子およびychE遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ
、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、腸内細菌で発現を上昇させたときにＬ−システイン生産能を非改変株と比べて向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、より好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００９６】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００９７】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼや３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、およびＹｄｅＤタンパク質等のトランスポーターを含む任意のタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子にも準用される。
【００９８】
本発明において、「遺伝子の発現が増大する」とは、目的の遺伝子の発現量が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。遺伝子の発現量は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「遺伝子の発現が増大する」とは、もともと目的の遺伝子が発現している菌株において発現量を増大させることだけでなく、もともと同遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、例えば、目的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００９９】
遺伝子の発現が増大するような改変は、上述の＜タンパク質の活性を増大させる手法＞において例示した遺伝子の発現を増大させる手法により達成できる。
【０１００】
遺伝子の発現が増大したことは、例えば、上述したように、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の転写量が増大したことを確認することで、あるいは、ウェスタンブロットによりタンパク質の量が増大したことを確認することで、確認することができる。また、Ｌ−システイン生産能、Ｏ−アセチルセリン耐性、またはＬ−システイン耐性が向上したことを確認することによっても確認することができる。
【０１０１】
＜２＞本発明のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養することで、該培地にはＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物が蓄積する。よって、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を製造することができる。
【０１０２】
Ｌ−システインの関連物質としては、上述したように、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン
の誘導体、およびＬ−システインの前駆体が挙げられる。例えば、後述するように、上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養することで、該培地にはＯ−アセチルセリンが蓄積する場合がある。その場合、該培地からＯ−アセチルセリンを採取することによりＯ−アセチルセリンを製造することができる。Ｏ−アセチルセリンはアミノ酸の一種であり、Ｌ−システイン生合成の前駆物質である。Ｏ−アセチルセリンはキラル中心を有し、よって、特に有用物質の合成のための構成要素等として使用でき、有用である。Ｏ−アセチルセリンは単独で製造されてもよく、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物との任意の組み合わせで製造されてもよい。
【０１０３】
なお、Ｏ−アセチルセリンは、中性〜アルカリ性のpH領域において自然反応によって容易にＮ−アセチルセリンに変換される。よって、Ｏ−アセチルセリンを製造する場合には、このようなＮ−アセチルセリンへの変換を防止するのが好ましい。このようなＮ−アセチルセリンへの変換は、例えば、培養液のpHを酸性に保つことにより防ぐことができる（US20020146783A1）。
【０１０４】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
【０１０５】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、グリセロール、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【０１０６】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【０１０７】
硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。
【０１０８】
その他の有機成分としては、有機微量栄養素が挙げられる。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。また、これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【０１０９】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【０１１０】
培養終了後の培地からの産物、すなわちＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の採取は、イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al.:Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【０１１１】
本発明において採取される産物は、目的とする物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された産物の純度は、通常50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である。
【０１１２】
上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。Ｌ−システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カ
ルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が含まれる。
【０１１３】
また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ-スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。
【実施例】
【０１１４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１１５】
〔実施例〕ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現強化によるＬ−システイン生産増加効果
Escherichia coli、およびPantoea ananatisにおいてygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現を増強することがＬ−システイン生産に及ぼす効果を調べるために、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードする遺伝子cysE5（米国特許出願公開第20050112731号）が導入され、かつ、ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現が強化された株を構築し、Ｌ−システイン生産培養を行った。手順を以下に示す。
【０１１６】
（１）発現プラスミドの構築
ygaZH遺伝子またはychE遺伝子の発現を増強するための発現ベクターとしては、pMIV-5JS（特開2008-99668）を基に構築したpMIV-Pnlp23-ter（以下、pMIV-Pnlp23ともいう）、およびpMIV-Pnlp8-YeaS7（以下、pMIV-Pnlp8ともいう）を用いた。pMIV-Pnlp8およびpMIV-Pnlp23の構築方法は特開2010-187552に開示されている。また対照としては、空ベクターであるpMIV-5JS（特開2008-99668）を使用した。
【０１１７】
pMIV-Pnlp23は、強力なプロモーターであるPnlp23とrrnBターミネーターを有し、Pnlp23とrrnBターミネーターの間にはSalIとXbaI部位が存在する。よって、目的の遺伝子の5’側に制限酵素サイトSalIを、3’側に制限酵素サイトXbaIをデザインしておくことで、目的の遺伝子をプロモーターとターミネーターの間にクローニングし、目的の遺伝子の発現プラスミドを構築することができる。
【０１１８】
pMIV-Pnlp8は、強力なプロモーターであるPnlp8とrrnBターミネーターを有し、さらに、E.coli K12株由来のyeaS遺伝子がSalIとXbaI部位を介してPnlp8とrrnBターミネーターの間にクローニングされている。よって、目的の遺伝子の5’側に制限酵素サイトSalIを、3’側に制限酵素サイトXbaIをデザインしておくことで、当該ベクター上のyeaS遺伝子断片を目的の遺伝子断片に置換し、目的の遺伝子の発現プラスミドを構築することができる。
【０１１９】
「Pnlp23」および「Pnlp8」は、E.coli K12株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターである「Pnlp0」を基に、発現強度を調節するために構築された変異型プロモーターである。Pnlp8とPnlp23では発現強度が異なり（Pnlp8＞Pnlp23）、発現させる遺伝子に応じて適した強度のプロモーターを選択することができる。
【０１２０】
ygaZH（E.coli由来）、ychE（E.coli由来）、およびychE（P.ananatis由来）を、それぞれ上記発現ベクターにクローニングした。なお、ygaZHは2つの遺伝子ygaZおよびygaHがオペロンを形成しているため、両遺伝子を含むオペロンを発現ベクターにクローニングした。各遺伝子のクローニングは、E.coli MG1655株またはP.ananatis SC17株のゲノムDNAをテンプレートとしたPCRによって行った。使用したプライマーを以下に示す。ygaZH（E.coli由来）：ygaZH(Ec)SalI-F／ygaZH(Ec)XbaI-R（配列番号１、２）、ychE（E.coli由来）：ychE(Ec)SalI-F／ychE(Ec)XbaI-R（配列番号３、４）、ychE（P.ananatis由来）：yc
hE(Pa)SalI-F／ychE(Pa)XbaI-R（配列番号５、６）。遺伝子上流側の各プライマーには制限酵素サイトSalIが、遺伝子下流側の各プライマーには制限酵素サイトXbaIがデザインされており、SalIとXbaIによりPCR産物を発現プラスミドpMIV-Pnlp8、pMIV-Pnlp23にクローニングすることができる。なお、ychE（E.coli由来）とychE（P.ananatis由来）の開始コドンGTGをそれぞれATGに変更するよう、プライマーをデザインした。PCRにはPrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara社製）を用い、PCRサイクル（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 90秒を30サイクル、最後に4℃保温）で行った。PCR産物をSalIとXbaIにより処理し、同じくSalIとXbaIにより処理したpMIV-Pnlp8とpMIV-Pnlp23にそれぞれライゲーションし、各目的遺伝子の発現プラスミドを作製した。
【０１２１】
（２）Ｌ−システイン生産菌の構築
Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE（cysE5；US20050112731A1）を導入することで著量のＬ−システイン及びＯ−アセチルセリン（OAS）を生産するＬ−システイン生産菌を構築することができる。そこで、cysE5が搭載されたプラスミドpACYC-E1（特開2010-207194）をEscherichia coli MG1655株（ATCC No. 47076）及びPantoea ananatis SC17株（FERM BP-11091）にそれぞれ導入することでE.coliシステイン生産菌及びP.ananatisシステイン生産菌を構築した。
【０１２２】
（３）Ｌ−システイン生産培養
上記で構築したE.coliシステイン生産菌及びP.ananatisシステイン生産菌に各目的遺伝子の発現プラスミドを導入し、Ｌ−システインの発酵生産培養を行いＬ−システインの生産量を比較した。培養には下記組成の生産培地を用いた。
【０１２３】
〔Ｌ−システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
(NH4)2SO4 15g/L
KH2PO4 1.5g/L
MgSO4・7H2O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分２：
FeSO4・7H2O 1.7mg/L
Na2MoO4・2H2O 0.15mg/L
CoCl2・6H2O 0.7mg/L
MnCl・4H2O 1.6mg/L
ZnSO4・7H2O 0.3mg/L
CuSO4・5H2O 0.25mg/L
成分３：
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
NaCl 0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム 20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム 6g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分８：
グルコース 40g/L
【０１２４】
各成分について、各々10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100／6倍（成分３）、100倍（成分５）、350/6倍（成分６）、1000倍（成分７）、10倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。滅菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行った。プラスミドを保持させるため12.5mg/L テトラサイクリン、25mg/L クロラムフェニコールを添加した。なお、E.coliの培養には上記培地を用い、P.ananatisの培養には上記培地に以下の変更を加えて用いた。すなわち、P.ananatisの培養用には、窒素源として成分１の(NH4)2SO4の代わりにアンモニウムイオンが同モル濃度となるようNH4Clを使用し、硫黄源として成分６のチオ硫酸ナトリウムを8g/Lに変更した。
【０１２５】
Ｌ−システインの生産培養は以下の手順で行った。各生産菌をLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を1回掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだ生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。32℃にて振とう培養を行い、23時間後（E.coliの場合）もしくは30時間後（P.ananatisの場合）に培養を終了した。培地中に生産されたＬ−システイン（Ｌ−シスチンやＬ−システインの誘導体を含む）の定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。
【０１２６】
また、Ｌ−システイン排出因子はＯ−アセチルセリンも排出することができることが知られているため、培地中に生産されたＯ−アセチルセリンの定量も行った。Ｏ−アセチルセリンの定量は以下の方法で行った。Ｏ−アセチルセリンはアルカリ条件下でＮ−アセチルセリン（NAS）に変換されるため、まず、培養終了後の培養液を200mM Tris/HCl (pH9.0)を用いて20倍に希釈し室温に置くことで、生産されたＯ−アセチルセリンを全てＮ−アセチルセリン（NAS）に変換した。こうして調製されたサンプルをHPLC（カラム：Inertsil ODS-3 （GL science製）、流速： 1.0ml/min、カラム温度：40oC、ディテクター：UV210mm、サンプル量：10μl、バッファー：0.1M K2PO4-H3PO4 (pH2.2) 5mM sodium 1-octanesulfonate）によって分析し、標品と比較することでＯ−アセチルセリン（Ｎ−アセチルセリンを含む）濃度を算出した。
【０１２７】
各株とも４連で実験を行った。培地中に生産されたＬ−システインおよびＯ−アセチルセリンの濃度の平均値と標準偏差を表１〜表４に示す。表中、「cystein」はＬ−システイン（Ｌ−シスチンやＬ−システインの誘導体を含む）の濃度を、「OAS(NAS)」はＯ−アセチルセリン（Ｎ−アセチルセリンを含む）の濃度を示す。また、表中、「genes」は発現を強化した遺伝子を示し、「vector」は対照として用いた空ベクターpMIV-5JSを意味する。また、E.coliシステイン生産菌及びP.ananatisシステイン生産菌について、発現を強化した遺伝子と用いたプロモーターの組み合わせを表５に示す。
【０１２８】
E.coli生産菌においてはygaZH（E.coli由来）、ychE（E.coli由来）、またはychE（P.ananatis由来）の発現強化によりＬ−システイン、およびＯ−アセチルセリンの蓄積量が増加することが明らかとなった。P.ananatis生産菌においても同様に、ygaZH（E.coli由来）、ychE（E.coli由来）、またはychE（P.ananatis由来）の発現強化によりＬ−システイン、およびＯ−アセチルセリンの蓄積量が増加することが明らかとなった。以上よりygaZH、またはychEの発現強化はＬ−システイン（Ｌ−シスチンやＬ−システインの誘導体を含む）、およびＯ−アセチルセリン（Ｎ−アセチルセリンを含む）の生産に有効であることが明らかとなった。
【０１２９】
【表１】
2014131487.tif 000002
【０１３０】
【表２】
2014131487.tif 000003
【０１３１】
【表３】
2014131487.tif 000004
【０１３２】
【表４】
2014131487.tif 000005
【０１３３】
【表５】
2014131487.tif 000006
【０１３４】
〔配列表の説明〕
配列番号１〜６： プライマー
配列番号７：E.coli ygaZ遺伝子の塩基配列
配列番号８：E.coli YgaZのアミノ酸配列
配列番号９：E.coli ygaH遺伝子の塩基配列
配列番号１０：E.coli YgaHのアミノ酸配列
配列番号１１：E.coli ygaZHオペロンの塩基配列
配列番号１２：E.coli ychE遺伝子の塩基配列
配列番号１３：E.coli YchEのアミノ酸配列
配列番号１４：P.ananatis ychE遺伝子の塩基配列
配列番号１５：P.ananatis YchEのアミノ酸配列
配列番号１６：E.coli 野生型cysEの塩基配列
配列番号１７：E.coli 野生型CysEのアミノ酸配列
【配列表】
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