(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、皮膚のバリア機能及び水分保持機能を高めるため、シスタチンＡの産生を促進し、皮膚バリアを強化し、皮膚角化を正常化し、肌をしっとりさせ、小ジワを減少させ、肌荒れを防止する製剤を得ることにある。【解決手段】  褐藻のイシゲの抽出物を有効成分とすることによって、シスタチンＡ産生促進剤、皮膚バリア強化剤、皮膚角化機能強化剤、肌荒れ防止剤を得ることができた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イシゲを有効成分とするシスタチンＡ産生促進剤。
【請求項２】
イシゲを有効成分とする皮膚バリア強化剤。
【請求項３】
イシゲを有効成分とする皮膚角化機能強化剤。
【請求項４】
イシゲを有効成分とする肌荒れ防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シスタチンＡの産生を促進し、皮膚バリアを強化し、皮膚角化を正常化し、肌荒れを防止する製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚においては、表皮細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて角化し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ（天然保湿因子）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。
皮膚のバリア機能の一角を担う、コーニファイドエンベロープを形成するタンパク質  の１つにシスタチンがあり、細胞内システインプロテアーゼであるカテプシン群の特異的阻害剤として作用し、カテプシン類と複合体を形成し、それらのプロテアーゼ活性を効果的に阻害する性質を持つている。これらの生物活性はコーニファイドエンベロープに架橋された後も失われず、コーニファイドエンベロープが生物学的バリアとしての機能を維持することに役だっている。
【０００３】
また、イシゲは、褐藻植物門、褐藻網、ナガマツモ目、イシゲ科、イシゲ属の海藻で、学名Ishige okamurai Yendoといい、茨城以南の沿岸で広く分布する褐藻類である。食用には硬いので適さない。
すでに、美白、育毛、痩身或いは抗菌・防腐等の目的で皮膚外用剤や食品に利用されている。（特許文献１〜４）
【０００４】
【特許文献１】特開平０４−９５０１２号公報
【特許文献２】特開平０７−２７８００３号公報
【特許文献３】特開平１１−１８０８１３号公報
【特許文献４】特開２０００−２３６８４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はシスタチンＡの産生を促進し、皮膚バリアを強化し、皮膚角化を正常化し、肌荒れを防止する製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、イシゲの抽出物が上記目的を達することがわかった。
イシゲは、必要に応じて乾燥した後、抽出効率を考えると、細切、粉砕等の処理を行った後に抽出する。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
【０００７】
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
本発明者らが検討した結果、本発明の効果を発揮する物質は、水にも、８０％のエタノール抽出されるので、ある程度精製する場合は、水で抽出したのち、不溶物を取り除き、等量〜５倍量のエタノールを加えてさらに抽出するとよいこともわかった。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【０００８】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【０００９】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１０】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１１】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１２】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００１３】
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
【実施例】
【００１４】
次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００１５】
製造例
イシゲ５０ｇ（湿重量）に精製水５００ｇを加え、ミキサーを用いてホモジナイズした。これを遠心分離し濾液を得た。この濾液に４倍量のエタノール２Lを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間後に濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これを凍結乾燥した。
【００１６】
確認試験
２継代目のヒト包皮由来ケラチノサイト（クラボウ）を７０−８０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地で培養後、試験品を加えた培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２４時間培養した。
【００１７】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、RNeasy mini kit(QIAGEN)を用い、添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００１８】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
１．０μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ReverTra Ace qPCR RT Kit（東洋紡社）を用い、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、StepOneplus リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、以下のように実施した。Taqman Fast Advanced Master Mix（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびシスタチンＡのTaqmanプライマー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝８）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてβ−Actin（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００１９】
確認試験は、シスタチンＡに関しては製造例０．０１％と０．０２％作用させて実験し、その結果を図１に示す。
結果を見ると、製造例はシスタチンＡの遺伝子発現量を、０．０１％で約２．７倍に、０．０２％で約４．８倍に増加させることがわった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】製造例の終濃度０．０１％と０．０２％での確認試験結果でシスタチンＡの遺伝子発現量変化を示す図である。  縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【００２１】
また、製造例を配合した外用剤以下のように作成した。（重量部）
外用剤１
グリセリン                  ５．０
１、３ブチレングリコール    ５．０
パラオキシ安息香酸メチル    ０．２
製造例                      １．０
精製水                    ８８．８
【００２２】
女性１８名に２か月間、左右一方に外用剤１を、もう一方に比較外用剤（外用剤１に製造例を配合せず、その分、精製水を増やした外用剤）を１日１回以上塗布してもらった。（特に使用量等は任意とした）
２か月後にアンケートをとり、表１のような回答を得た。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
上記のように肌荒れ防止、肌のしっとり感の維持、小ジワの防止に非常に有効なことがわかった。さらに下記のような外用剤２、外用剤３のような製剤を作成し、評価してもらった結果、非常に良好な評価を得た。
【００２５】
外用剤２
オリーブ油                                                    ０．５
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                ２．０
エタノール                                                  １０．０
製造例                                                        ０．５
１．０％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液                          ５．０
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
精製水                                                      ７９．８
【００２６】
外用剤３
Ａ
スクワラン                                                  ２０．０
オリーブ油                                                    ２．０
ミンク油                                                      １．０
ホホバ油                                                      ５．０
ミツロウ                                                      ５．０
セトステアリルアルコール                                      ２．０
グリセリンモノステアレート                                    １．０
ソルビタンモノステアレート                                    ２．０
Ｂ
精製水                                                      ４６．７
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                １．０
製造例                                                        ０．２
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                            ２．０
グリセリン                                                    ５．０
１．０  ％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液                        ５．０
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
【図１】
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