(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞のエクトドメインシェディング活性評価を行うための有用な方法を提供する。【解決手段】細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子に対する細胞外ドメイン切断活性（エクトドメインシェディング活性）を評価する方法であって；細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させた細胞を用い、このとき第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するものであり；第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づいて、該活性を評価する。これにより、個々の細胞におけるシェディング活性の経時的な観察が可能である。【選択図】図１
2014135947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子に対する細胞外ドメイン切断活性（エクトドメインシェディング活性）を評価する方法であって；
細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させた細胞を用い、このとき第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するものであり；
第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づいて、該活性を評価する、方法。
【請求項２】
因子が、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）である、請求項１に記載された方法。
【請求項３】
第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づく評価が、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度と、第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度との比を算出し、その比の変化により評価するものである、請求項１または２に記載された方法。
【請求項４】
評価が、画像解析により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載された方法。
【請求項５】
生体において行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載された方法。
【請求項６】
細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子に対するエクトドメインシェディングを生細胞において可視化する方法であって；
細胞において、細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させ、このとき第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するものであり；
エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光が変化し、および／または第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光との強度の
比が変化してエクトドメインシェディングが可視化される、方法。
【請求項７】
HB-EGFの前駆体（proHB-EGF）に対するエクトドメインシェディングを可視化するためのものである、請求項６に記載された方法。
【請求項８】
細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子において、細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合され、細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合されており；
細胞で発現させると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光が変化してエクトドメインシェディングを検知することができる、蛍光バイオセンサー。
【請求項９】
第一の蛍光タンパク質が赤色蛍光タンパク質であり、第二の蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、proHB-EGFにそれらが融合されたものである、請求項８に記載された蛍光バイオセンサー。
【請求項１０】
下記（a）（b）または（c）からなる、請求項９に記載の蛍光バイオセンサー：
（ａ）配列表の配列番号１に記載されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に記載されたポリペプチドと少なくとも80％の配列同一性を有する配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド；または
（ｃ）（ａ）に記載されたポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８〜１０に記載された蛍光バイオセンサーをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１３】
以下の工程を含む、細胞における、少なくとも１種類の因子のエクトドメインシェディングの観察方法：
請求項１２に記載されたベクターで形質転換して得られた蛍光バイオセンサーを膜上に有する細胞を環境の変化に曝して、細胞またはその近傍における蛍光の変化の有無を検出するが、
このとき、候補物質の供与に起因する蛍光の変化が検出されることは候補物質がその因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えたことを意味する、方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、少なくとも１種類の因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えうる物質をスクリーニングする方法：
請求項１２に記載されたベクターで細胞を形質転換して蛍光バイオセンサーを膜上に有する細胞を調製し；そして
調製された細胞に候補物質を供与して、細胞またはその近傍における蛍光の変化の有無を検出するが、
このとき、候補物質の供与に起因する蛍光の変化が検出されることはｍ候補物質がその因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えたことを意味する、方法。
【請求項１５】
proHB-EGFのエクトドメインシェディングの効率に影響を与えうる物質をスクリーニングするためのものである、請求項１４に記載された方法。
【請求項１６】
腫瘍進行に影響を与えうる物質をスクリーニングするためのものである、請求項１５に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子HB-EGF（heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor）は、EGF、アンフィレギュリン、形質転換増殖因子（TGF）-α、ベータセルリン（betacelulin）およびニューレグリンで形成されるEGFファミリーのメンバーの1つである。HB-EGFの発現は、体のほとんどにおいて、特に肺、心臓、脳および骨格筋で、検出されている。HB-EGFは、創傷治癒、眼瞼の形成、胚盤胞移植、肺高血圧、バルーン傷害後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症および腫瘍進行を含む様々な生理的および病的事象に関与している。HB-EGF遺伝子のノックアウトは、頭蓋顔面構造、心臓および腸神経の発生を含むいくつかの神経堤細胞由来組織の発生を障害する。脳特異的ノックアウトマウスは、HB-EGFが精神障害にも寄与していることを示している。
【０００２】
HB-EGFは、EGFファミリーの他のメンバーと同様に、最初にproHB-EGFと呼ばれる膜貫通型前駆体として合成される。proHB-EGFは細胞表面でプロテアーゼ、例えばジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ類（ADAM類）により切断されて可溶性型のHB-EGFを放出する。そのプロセスはエクトドメインシェディング（ectodomain shedding）として知られている。proHB-EGFのエクトドメインシェディングは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（12-O-tetradecanoylphorborl-13-estate）、カルシウムイオノフォア、GPCRリガンド、例えばリゾホスファチジン酸および増殖因子を含む様々な生理的または薬理的刺激により刺激される。proHB-EGFのエクトドメインシェディングはHB-EGFの増殖因子活性にとって不可欠な事象である。proHB-EGFの切断不能変異体を発現するマウスは、HB-EGFヌルマウスが示すような重篤な心不全を示す。proHB-EGFの切断不能型は低酸素条件下で心筋のアポトーシスを誘導することも報告されている。一方で、proHB-EGFの膜貫通ドメインを切り詰めた変異体（常に細胞から放出される）を発現するマウスは、心臓および皮膚において重篤な過形成を示す。さらにproHB-EGFシェディングは、腫瘍進行に影響を及ぼすことも知られている。
【０００３】
細胞におけるproHB-EGFのエクトドメインシェディング活性を測定するためには、これまで、(1)サイズが小さくなったproHB-EGFを細胞抽出液からタンパク質として分離し、ウェスタンブロットにより検出するか、または(2)細胞外領域にアルカリホスファターゼ（AP）を融合させたproHB-EGFを細胞上で発現させ、シェディングによって培地中に放出されたAP融合リガンドのAP活性を検出してきた（非特許文献1，2）。それらは様々な条件下で細胞集団のシェディング活性を知るために非常に有用な方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dethlefsen, S.M., Raab, G., Moses, M.A., Adam, R.M., Klagsbrun, M., and Freeman, M.R. (1998) Extracellular calcium influx stimulates metalloproteinase cleavage and secretion of heparin-binding EGF-like growth factor independently of protein kinase C. J Cell Biochem. 69, 143-153
【非特許文献２】Tokumaru, S., Higashiyama, S., Endo, T., Nakagawa, T., Miyagawa, J.I., Yamamori, K., Hanakawa, Y., Ohmoto, H., Yoshino, K., Shirakata, Y., Matsuzawa, Y., Hashimoto, K., and Taniguchi, N. (2000) Ectodomain shedding of epidermal growth factor receptor ligands is required for keratinocyte migration in cutaneous wound healing. J Cell Biol. 151, 209-220
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のエクトドメインシェディング活性を測定するための方法は、いずれも(1) 細胞群として評価する系であるため、個々の細胞や細胞局所についての評価が難しい。また、測定のためには細胞自体または培養上清の採取が必要であるため、同じ細胞について同じ状態を維持したまま、経時的に観察することができず、さらに同じ理由により、生体内での評価が行えないという問題があった。
【０００６】
proHB-EGFのエクドドメインシェディングは、腫瘍進行に影響を及ぼすことが分かっており、腫瘍細胞動態を研究するため、また腫瘍薬の研究・開発において重要である。またこれまでの報告から、シェディング活性の評価は、正常または病的な組織の状態を理解するために重要であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、シェディングを可視化できるプローブについて鋭意研究してきた。本発明者らは、proHB-EGFの細胞外に赤色蛍光タンパク質、細胞内領域に緑色蛍光タンパク質を融合したものを細胞で安定発現させた。そしてこの細胞を、エクトドメインシェディング刺激剤として知られる物質で処理したところ、継時的に二種の蛍光の強度比が変化し、個々の細胞におけるシェディング活性の経時的な観察が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、下記を提供する。
［１］  細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子に対する細胞外ドメイン切断活性（エクトドメインシェディング活性）を評価する方法であって；
細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させた細胞を用い、このとき第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するものであり；
第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づいて、該活性を評価する、方法。
［２］  因子が、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）である、［１］に記載された方法。
［３］  第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づく評価が、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度と、第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度との比を算出し、その比の変化により評価するものである、［１］または［２］に記載された方法。
［４］  評価が、画像解析により行われる、［１］〜［３］のいずれか一に記載された方法。
［５］  生体において行われる、［１］〜［４］のいずれか一に記載された方法。
［６］  細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子に対するエクトドメインシェディングを生細胞において可視化する方法であって；
細胞において、細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させ、このとき第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するものであり；
エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光が変化し、および／または第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光との強度の
比が変化してエクトドメインシェディングが可視化される、方法。
［７］  HB-EGFの前駆体（proHB-EGF）に対するエクトドメインシェディングを可視化するためのものである、［６］に記載された方法。
［８］  細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる因子において、細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合され、細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合されており；
細胞で発現させると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光が変化してエクトドメインシェディングを検知することができる、蛍光バイオセンサー。
［９］  第一の蛍光タンパク質が赤色蛍光タンパク質であり、第二の蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、proHB-EGFにそれらが融合されたものである、［８］に記載された蛍光バイオセンサー。
［１０］  下記（a）（b）または（c）からなる、［９］に記載の蛍光バイオセンサー：
（ａ）配列表の配列番号１に記載されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に記載されたポリペプチドと少なくとも80％の配列同一性を有する配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド；または
（ｃ）（ａ）に記載されたポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド。
［１１］  ［８］〜［１０］に記載された蛍光バイオセンサーをコードする、ポリヌクレオチド。
［１２］  ［１１］に記載されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［１３］  以下の工程を含む、細胞における、少なくとも１種類の因子のエクトドメインシェディングの観察方法：［１２］に記載されたベクターで形質転換して得られた蛍光バイオセンサーを膜上に有する細胞を環境の変化（例えば、低酸素環境、酸化環境、紫外線照射などの組織環境変化）に曝して、細胞またはその近傍における蛍光の変化の有無を検出するが、このとき、候補物質の供与に起因する蛍光の変化が検出されることは候補物質がその因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えたことを意味する、方法。
［１４］  以下の工程を含む、少なくとも１種類の因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えうる物質をスクリーニングする方法：［１２］に記載されたベクターで細胞を形質転換して蛍光バイオセンサーを膜上に有する細胞を調製し；そして調製された細胞に候補物質を供与して、細胞またはその近傍における蛍光の変化の有無を検出するが、  このとき、候補物質の供与に起因する蛍光の変化が検出されることは候補物質がその因子のエクトドメインシェディングの効率に影響を与えたことを意味する、方法。
［１５］  proHB-EGFのエクトドメインシェディングの効率に影響を与えうる物質をスクリーニングするためのものである、［１４］に記載された方法。
［１６］  腫瘍進行に影響を与えうる物質をスクリーニングするためのものである、［１５］記載された方法。
【０００９】
［１７］  ［１］〜［６］のいずれか一の方法を実施するための、装置。
［１８］  蛍光を発する細胞がインターバル撮像された複数の細胞画像を入力する画像入力部と、入力された複数の細胞画像から、蛍光変化を算出する算出部と、を備える細胞画像解析装置。
［１９］  蛍光変化に関する閾値を予め記憶する閾値記憶部、算出された蛍光変化と閾値とを比較して、エクトドメインシェディングがある、またはその効率が変化していると特定する、エクトドメインシェディング特定部をさらに備える、［１８］に記載の細胞画像解析装置。
［２０］  コンピュータに対し、蛍光を発する細胞がインターバル撮像された複数の細胞画像を入力する、画像入力ステップと、入力された複数の細胞画像から、蛍光変化を算出する、算出ステップと、を実行させるためのプログラム。
［２１］  コンピュータが、蛍光変化に関する閾値を予め記憶する閾値記憶部を備えており、算出された蛍光変化と閾値を比較して、エクトドメインシェディングがある、またはその効率が変化していると特定するステップをさらに実行させるための、［２０］に記載のプログラム。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Fluhemb（Fluorescent proHB-EGF-based metalloprotease biosensor）の生化学的特徴および細胞内局在。（A）Fluhembの構造。（B〜D）Fluhemb発現HT1080細胞の共焦点レーザー顕微鏡分析。細胞をPBS中4％パラホルムアルデヒドにより15分間固定し、Fluhembの蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡A1Rにより検出した。（B）mAG1、（C）mCherry、（D）重ね合わせ。下のパネル：X-Z断面、右のパネル：Y-Z断面。スケールバーは20μmを示す。（E）血清飢餓後、Fluhemb発現HT1080細胞を50nMの12-o-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）で60分間刺激した。メタロプロテアーゼの阻害のため、細胞をTPA刺激の前に20μMのGM-6001またはKB-R7785で30分間処理した。全細胞溶解物のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実施した。Fluhembを抗mCherryまたは抗単量体Azami Green（mAG）抗体により検出した。ローディング対照としてベータアクチンも検出した。
【図２】Fluhemb発現HT1080細胞に対するTPA刺激。（AおよびB）血清飢餓の後、Fluhemb発現HT1080細胞を50nMの12-o-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）により60分間刺激した。メタロプロテアーゼの阻害のため、細胞をTPA刺激の前に20μMのGM-6001またはKB-R7785で30分間処理した。タイムラプス画像をBiostation IMにより1分ごとに1時間得た。mAG1のmCherryに対する蛍光強度の比率をNIS-elementsにより算出した（比率の範囲：0〜2）。（B）（A）における高倍率視野の比率画像。矢印はその細胞の前縁部（leading ledges）を示す。スケールバーは100μm（A）および20μm（B）を示す。
【図３】HT1080またはHaCaT細胞に対する他のタイプのシェディング刺激。Fluhemb発現HT1080（A）またはHaCaT（B）細胞を20μMのカルシウムイオノフォアA23187で処理した。（C）Fluhemb発現HaCaT細胞を血清飢餓後に10nMのEGFにより刺激した。その刺激の後にタイムラプスアッセイをBiostation IMにより1分ごとに1時間実施し、蛍光の画像をBiostation IMにより得て、mAG1のmCherryに対する蛍光強度の比率をNIS-elementsにより算出した（比率の範囲：0〜2）。スケールバーは10μm（AおよびB）および20μm（C）を示す。
【図４】Fluhemb発現細胞に対するシェディングの生理的刺激。（A）Fluhemb発現HaCaT細胞をイエローチップにより引っかき、Biostation IMによりタイムラプスアッセイを実施した。その時間は細胞を引っかいた後の経過時間を示す。（B〜D）Fluhemb発現HT1080細胞を、μスライド3D走化性の1つのチャンバーの上に播種し、そのチャンバーの反対側にある血清を含有する培地によりBD Matrigel中への浸潤を誘導し、Biostation IMによりタイムラプスアッセイを実施した。（D）アクチンをAlexa Fluor 647コンジュゲートファロイジンにより検出した。矢印はアクチンに富む偽足を示す。mAG1のmCherryに対する蛍光強度の比率をNIS-elementsにより算出した（比率の範囲：0〜2）。スケールバーは50μm（AおよびB）および20μm（CおよびD）を示す。
【図５】balb／c  nu／nuマウス中のFluhemb発現HT1080細胞のproHB-EGFシェディングイメージング。  10の6乗個のFluhemb発現HT1080細胞を6週齢のメスのbalb／c  nu／nuマウスに皮下移植した。移植の10日後、腫瘍のイメージングを共焦点顕微鏡A1R（ニコン）により実施した。腫瘍血管をAngiosense680（Visen）により検出した。（A）HT1080細胞中のFluhembの蛍光比率画像。（B）（A）の高倍率視野画像。破線は血管を示す。スケールバーは100μm（A）および50μm（B）を示す。
【図６】実施例で使用した、蛍光バイオセンサーFluhemb（Fluorescent proHB-EGF-based metalloprotease biosensor）を挿入したベクターのマップ。レンチウイルスベクターpCSII-IRES2-Bsdの、EcoRIおよびNotI部位にFluhembを挿入した。
【図７】実施例で使用した蛍光バイオセンサーFluhembのヌクレオチド配列。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で「n1〜n2」で範囲を表すときは、特に記載した場合を除き、両端の値を含む。
本発明で「細胞」というときは、特に記載した場合を除き、生細胞を指す。細胞は、培養細胞、組織の一部、および／または生体の一部である場合がある。
【００１２】
本発明は、細胞において、少なくとも一つの因子に対する細胞外ドメイン切断活性（エクトドメインシェディング活性）を評価する方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法は、EGFファミリー、特にHB-EFGのエクトドメインシェディングについて評価するために好適であるが、それ以外にも、細胞外領域と細胞内領域とを有する膜結合型の前駆体として合成され、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて分泌型となる種々の増殖因子を対象としても実施しうる。膜結合型因子の代表的な例は、EGF ファミリー以外では、TNF-alpha（tumor necrosis factor）、c-kit ligand（Sl 因子、stem cell factor）、CSF-1、IL-1、Ephrin-Bである。細胞において、生体においてエクトドメインシェディングされる種々の因子について評価できる。なお、本明細書では、膜結合型因子がHB-EFGである場合を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、他の膜結合型因子用いた場合にも当てはまる。
【００１４】
本発明の方法は、細胞外領域に第一の蛍光タンパク質が融合し、かつ細胞内領域に第二の蛍光タンパク質が融合した、膜結合型の因子を発現させた細胞を用いる。
【００１５】
第一および第二の蛍光タンパク質は、細胞評価のために用いられている既存のもの、例えば下記のものから選択して用いることができる。蛍光タンパク質の例：Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami Green 1(mAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGR。
【００１６】
本発明においては、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光と第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光とに基づいて、エクトドメインシェディングが評価される。蛍光に基づいて評価するとは、全体としての蛍光色調の変化の有無または程度、少なくとも一方の物質の蛍光強度の変化の有無または程度、第一の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度と、第二の蛍光タンパク質に由来する蛍光の強度との比を算出し、その比の変化の有無または程度を検出して指標として用いることをいう。
【００１７】
本発明では、エクトドメインシェディングが生じた際には、細胞外では、第一の蛍光タンパク質は膜上より遊離しうる。また細胞内では、第二の蛍光タンパク質はしばらく膜上に留まったのちに、分解代謝されうる。そのため、それぞれの蛍光タンパク質に起因する蛍光が変化しうる。
【００１８】
蛍光の変化は、既存の装置を用いてタイムラプス画像を得て、得られた画像を、所望により適切なソフトウェアを用いて、分析することにより、捉えることができる。
【００１９】
本発明においては、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質とは互いに区別可能な波長特性を有するペアとすることが好ましい。一般には、複数種類の蛍光物質を用いる方法において、蛍光エネルギー移動(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)が利用される場合がある。一方、本発明ではそれぞれの波長を単独に測定することにより、エクトドメインシェディングが可視化されるので、二種類の蛍光タンパク質のそれぞれの蛍光シグナルの波長は、大きく離れているほうが、評価がより正確になることが期待できる。
【００２０】
本発明において使用される蛍光タンパク質の好ましいペアの例は、mAG1とmCherryとからなる。なお、本明細書では、蛍光タンパク質ペアとしてmAG1とmCherryとを用いた場合を例に説明する場合があるが、その説明は、特に記載した場合を除き、他の蛍光ペアを用いた場合にも当てはまる。
【００２１】
本発明においては、第一の蛍光タンパク質は細胞内領域に融合され、第二の蛍光タンパク質は細胞外領域に融合される。HB-EGFの膜結合型前駆体（proHB-EGF）に対してこのような融合を施すことにより得られた蛍光バイオセンサー（「蛍光プローブ」ということもある。）を特に、Fluhemb（Fluorescent proHB-EGF-based metalloprotease biosensor）と称する。
【００２２】
融合は、因子をコードするポリヌクレオチドにおいて、蛍光タンパク質をコードするタンパク質を、適切な位置に、挿入または置換し、得られた改変ポリヌクレオチドを発現させることにより、達成できる。特に好ましい態様においては、細胞外領域ではEGF領域を蛍光タンパク質に置換する。EGF領域を残した場合、導入したバイオセンサーによって細胞増殖などの特性が強化される、すなわち導入細胞の特性変化が生じうるが、当該置換により、そのような不都合を防止しうる。特に好ましい態様においてはさらに、細胞内領域では、蛍光タンパク質は、置換ではなく挿入される。挿入により、膜局在などの機能に関与する細胞内領域が維持することができる。
【００２３】
二種の蛍光タンパク質遺伝子の置換または挿入のための位置は、当業者であれば適宜選択しうる。細胞外領域では、シェディング部位近傍に分子を挿入するとシェディング活性を変化させる可能性があることを考慮するとよい。また細胞内領域では、本発明者らの検討では、proHB-EGFに関しては、193番目と194番目のアミノ酸の間に蛍光タンパク質を配することが、膜への局在性とタンパクの安定性に優れることが判明している。このような観点から作成されたFluhembの構造は、図１(A)に示されており、またそのヌクレオチド配列は、図7および配列表の配列番号1に示されている。
【００２４】
本発明により、蛍光バイオセンサーFluhembまたはその改変体が提供される。Fluhembまたはその改変体は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかからなる：
（ａ）配列表の配列番号１に記載されたヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）に記載されたポリペプチドと、少なくとも70％、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97．5％以上さらに好ましくは99％以上の配列同一性を有する配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド；または
（ｃ）（ａ）に記載されたポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞で発現すると、第一の蛍光タンパク質が細胞内領域に、第二の蛍光タンパク質が細胞外に配され、エクトドメインシェディングにより第一の蛍光タンパク質を含む細胞外部分が切断されることにより、少なくとも一方の蛍光タンパク質に由来する蛍光の変化が検出可能となる、ポリペプチド。
【００２５】
本発明はまた、上記の蛍光バイオセンサーFluhembまたはその改変体をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
本発明でアミノ酸配列に関し、「1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのポリペプチドにおいてもそのアミノ酸配列からなるポリペプチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個または1〜4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
【００２７】
本発明でアミノ酸配列に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al．，J．Mol．Biol．215（1990）403−410に記載されるNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組込まれている。より具体的には、アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者にはよく知られている。
【００２８】
本発明のポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびに蛍光バイオセンサーFluhembまたはその改変体は、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。
【００２９】
本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む、ベクターも提供する。ベクターの好ましい例はレトロウイルスベクターであり、より具体的にはレンチウイルスベクターである。本発明により構成されるベクターの一例を図6に示す。ベクターは、本発明の蛍光バイオセンサーをコードする領域以外に種々の領域を含みうる。例えば、増幅用宿主細胞で機能可能な選択マーカー、対象細胞のゲノムへ所望の部分を組み込むための領域、特定の遺伝子発現を制御するプロモーターを含んでいてもよい。
【００３０】
ベクターの調製は、具体的には次のように行うことができる。市販のクローニングキットにより、proHB-EGFのcDNAのEGF様領域をmCherry cDNAで置換し、また単量体mAG1のcDNAをproHB-EGFのcDNAの579番目および580番目の核酸の間の位置に挿入した、FluhembのcDNAを得る。このcDNAを含有する断片を、レンチウイルスベクターに、制限酵素領域や相同組換えを利用して挿入する。得られたFluhembのcDNAを含有するレンチウイルスを、ベクター増幅用宿主細胞を用いて増幅する。
【００３１】
得られたウイルスベクターは、対象細胞に感染させることにより、蛍光バイオセンサーを膜上に発現した形質転換細胞を得ることができる。対象細胞は、各種の生物由来、例えば哺乳動物由来でありうる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれる。細胞の由来する組織も限定的でなく、例えば、皮膚、肝臓、腎臓、副腎、精巣（精細胞を含める）、肺、筋肉、心臓、腸、卵巣および脾臓、脳、胚もしくは胚組織、脂肪組織であり得る。
【００３２】
蛍光バイオセンサーを発現した細胞は、元の細胞と同様の条件で培養することができる。培養には、例えば、非必須アミノ酸、L-グルタミンおよび／またはウシ胎児血清を含有する培地を用いることができる。細胞を用いたアッセイの具体的な実施方法は、本明細の実施例の項に記載の条件および手順方法を参考にして行うことができる。
【００３３】
本発明により得られる蛍光バイオセンサーは、それが由来する因子と同様にシェディングされうる。また、二種類の蛍光シグナルの比を利用することにより、個々の細胞におけるシェディングの活性に関する情報を得ることができる。
【００３４】
さらに本発明により、シェディングを刺激しうる種々の物質の影響を観察することができる。proHB-EGFは、カルシウムイオノフォアおよびEGFのような様々な刺激により切断されることが知られているが、本発明者らの検討によると、カルシウムイオノフォアA23187の刺激の後、Fluhemb発現HT1080およびHaCaTの両方において、mAG1／mCherryの蛍光比が時間経過依存の様式で増大した。その上、Fluhembは、A23187に対する応答がHaCaTにおいてHT1080におけるよりもはるかに速いことも示した。さらに、EGF刺激もFluhemb発現HT1080においてmAG1／mCherry比を増大させた。特に、そのシェディングは細胞間接着領域で開始する傾向があった。本発明により得られるこのような情報は、本発明が様々な物質のシェディング刺激物質としての評価および細胞におけるシェディング反応の理解のために有用である可能性があることを示している。
【００３５】
本発明により、in vivoでのシェディングの局所的な細胞活性を観察することができる。本発明者らは、Fluhembがin vivoでも働くかどうかを評価するため、Fluhemb発現HT1080をbalb／c  nu／nuのメスのマウス中に皮下移植し、10日後に共焦点レーザー顕微鏡により観察した。そして、ほとんどの腫瘍細胞はFluhembの増大しているmAG1／mCherry比を示さないが、血管上のいくつかのHT1080細胞においてその比率の局所的な増大を認めた。これらの情報から、血管上の腫瘍細胞は血管と接触していない腫瘍細胞よりもproHB-EGFシェディングにおいてより活性である可能性があることを明らかにしている。本発明はまた、シェディングのin vivoでの評価にも適している。
【００３６】
本発明は、本発明の方法を実施するための装置、コンピュータプログラムも提供する。
装置は、蛍光を発する細胞がインターバル撮像された複数の細胞画像を入力する画像入力部と、入力された複数の細胞画像から、蛍光変化を算出する算出部と、
を備えることができる。さらに、蛍光変化に関する閾値を予め記憶する閾値記憶部、
算出された蛍光変化と閾値とを比較して、エクトドメインシェディングがある、またはその効率が変化していると特定する、エクトドメインシェディング特定部を備えていることが好ましい。プログラムは、蛍光を発する細胞がインターバル撮像された複数の細胞画像を入力する、画像入力ステップと、入力された複数の細胞画像から、蛍光変化を算出する、算出ステップと、を実行させるためのものとすることができる。さらに、コンピュータが、蛍光変化に関する閾値を予め記憶する閾値記憶部を備えており、算出された蛍光変化と閾値を比較して、エクトドメインシェディングがある、またはその効率が変化していると特定するステップを実行できることが好ましい。
【００３７】
本発明は、種々の利点を有する。本発明は、シェディングを可視化するために蛍光バイオセンサーを提供するが、蛍光バイオセンサーを用いることにより、細胞中のシェディングを時間的に可視化することができる。特にproHB-EGFシェディングは腫瘍進行に重要であることが知られているので、本発明の方法は、抗癌薬としてのproHB-EGFシェディング阻害剤を開発するための薬物の作用の評価においての利用が期待できる。また、低酸素環境、酸化環境、紫外線照射などの組織環境変化が細胞におけるシェディング活性に影響を与えるか否かを評価するための利用が期待できる。
【００３８】
さらにEGFファミリーには、そのシェディングがいくつかのプロテアーゼ、例えばADAM類により制御されているいくつかの構成要素が知られているが、ADAM類の間の機能的相関ははっきりしないままである。本発明に基づき蛍光バイオセンサーを調製して用いることにより、EGFファミリーのシェディング系のさらなる研究の発展が期待できる。
【実施例】
【００３９】
1. 実験手順
1.1. 材料
12-o-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）はSigma Aldrichから購入した。上皮増殖因子（EGF）、A23187およびGM6001はCalbiochemから購入した。KB-R7785はCarnabio co.から提供して頂いた。
【００４０】
1.2. Fluhemb発現レンチウイルスベクターの構築および細胞への感染
Fluhemb（Fluorescent proHB-EGF-based metalloprotease biosensor）のcDNAを構築するため、In-Fusion HDクローニングキット（Clontech）により、proHB-EGFのcDNAのEGF様領域をmCherry cDNA（Invitrogen）で置き換えた。単量体Azami Green 1（mAG1）のcDNA（Medical and Biological Laboratories Co., LTD（MBL））をproHB-EGFのcDNAの579番目および580番目の核酸の間の位置に挿入した。この2種類の蛍光タンパク質のcDNAを含有する断片を、レンチウイルスベクターpCSII-IRES2-Bsd（Dr.Miyoshiにより提供して頂いた）の、EcoRIおよびNotI部位に挿入した。FluhembのcDNAを含有するレンチウイルスを293T細胞（理研バイオリソースセンター）中で産生させ、20の感染多重度（m.o.i.）で細胞に感染させた。
【００４１】
1.3. 細胞培養およびシェディング刺激物質アッセイ
ヒト線維芽細胞肉腫細胞株であるHT1080細胞およびヒトケラチノサイト細胞株であるHaCaTは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Tissue and Cell Collection）（ATCC）により提供された。HT1080細胞は、非必須アミノ酸（Life Technologies）、L-グルタミン（Life Technologies）および10％ウシ胎児血清を含有するイーグル最小必須培地（和光）で維持した。HaCaT細胞は、L-グルタミン（Life Technologies）および10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ最小必須培地（Dalbeco’s minimum essential medium）（和光）中で培養した。TPAまたはEGFによる刺激の前に、HT1080細胞またはHaCaT細胞を無血清培地中で30分間培養した。タイムラプスアッセイをBiostation IM（ニコン）により実施し、mAG1のmCherryに対する蛍光強度比をNIS-elementsソフトウェア（ニコン）により分析した。
【００４２】
1.4. HT1080細胞中のFluhembの局在の同定
HT1080細胞をPBS中4％パラホルムアルデヒド(ナカライテスク)で15分間固定した。その細胞の蛍光3D画像を共焦点レーザー顕微鏡A1R（ニコン）により得た。その画像データをNIS-elementsソフトウェアにより分析した。
【００４３】
1.5. ウェスタンブロッティングアッセイ
試料にSDS-PAGEを施し、PVDF膜（Bio-rad）に転写し、適切な抗体で調べた。抗体は、抗mCherry（クローン：1C51,abcam）、抗Azami Green（MBL）、およびローディング対照として抗ベータアクチン（クローン：AC-15,Sigma-Aldrich）である。
【００４４】
1.6. Matrigel浸潤アッセイ
Fluhemb発現HT1080細胞を、無血清培地を有する3D走化性μスライド（ibidi）の1つのチャンバーの上に播種した。血清を含有する培地を別のチャンバーに入れた。2つのチャンバーの間の空間をBD Matrigel（Becton, Dickinson and Company）により満たした。次の日に、matrigel中に浸潤しているHT1080細胞のタイムラプス画像をBiostation IMにより10分ごとに24時間実施し、mAG1のmCherryに対する蛍光強度比をNIS-elementsソフトウェアにより分析した。
Fluhemb発現HT1080細胞を播種した48時間後に、その細胞を4％PFAで固定し、Alexa Fluor 647コンジュゲートファロイジン（Invitrogen）で染色した。Fluhembおよびアクチンを共焦点レーザー顕微鏡A1Rにより検出し、mAG1のmCherryに対する蛍光強度比をNIS-elementsソフトウェアにより分析した。
【００４５】
1.7. スクラッチアッセイ
Fluhemb発現HaCaT細胞をμ-Dish 35mm（ibidi）上に播種した。次の日に、その細胞をイエローチップにより引っかき、タイムラプスアッセイをBiostation IMにより10分ごとに24時間実施し、mAG1のmCherryに対する蛍光強度比をNIS-elementsソフトウェアにより分析した。
【００４６】
1.8. Fluhemb発現HT1080細胞のヌードマウスへの移植アッセイ
10の6乗個のFluhemb発現HT1080細胞を6週齢のメスのbalb／c  nu／nuマウスに皮下移植し、そのマウスを10日間飼育した。画像分析の日に、イソフルラン（Mylan）で麻酔したマウス中の腫瘍細胞の蛍光画像をA1Rにより経皮的に得て、mAG1のmCherryに対する蛍光強度比をNIS-elementsソフトウェアにより分析した。
【００４７】
2. 結果
2.1. 蛍光性のproHB-EGFに基づくメタロプロテアーゼバイオセンサー（Fluhemb）はproHB-EGFと同様にシェディングされた
単量体Azami GreenのcDNAをproHB-EGF遺伝子のC末端領域中に挿入し、過剰発現するプローブの細胞増殖へのあらゆる影響を回避するために、上皮増殖因子領域をmCherryのcDNAと置換した。そのシェディングバイオセンサーをFluhembと名付けた（図1A）。Fluhembをヒト線維芽細胞肉腫細胞株HT1080にレンチウイルス感染系により安定導入した。共焦点顕微鏡分析は、完全長Fluhembの細胞内局在が野生型proHB-EGFのように主に細胞膜にあることを明らかにした（図1B〜D）。Fluhembは定常状態のFluhemb発現HT1080において70kDaの辺りで検出された。しかし、Fluhemb発現HT1080を強いシェディング誘導物質である12-o-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）により刺激した際、その70kDaのバンドは減少し、残りの断片であるmAG1を含む30kDaのバンドが明瞭に検出された（図1E）。さらに、proHB-EGFシェダーゼ（sheddase）阻害剤であるGM-6001（非特許文献7）およびKB-R7785（非特許文献8）の処理はTPA刺激の作用を打ち消した（図1E）。そのデータは、Fluhembが活性化されたメタロプロテアーゼ、例えばADAM類によりproHB-EGFに類似した方式で切断されたことを示している。
【００４８】
2.2. Fluhembにおける2種類の蛍光シグナルの比率は、個々の細胞におけるTPA刺激によるシェディングの活性化を示した
次に、Fluhemb発現HT1080を用いてTPAの処理の下でタイムラプスアッセイを実施した。mCherryの蛍光シグナルはTPAの刺激後に時間経過に依存して徐々に減少し、mAG1のmCherryに対する蛍光比（mAG1／mCherry）が増大した（図2AおよびB）。特に、その比率は前縁部においてより高くなる傾向があった（図2B）。GM6001またはKB-R7785の処理は、TPA刺激によるmAG1／mCherryの比率の増大を阻害した（図2A）。これらのデータは、その蛍光比の変化は個々の細胞におけるシェディングの活性化を示していることを示唆している。
【００４９】
2.3. proHB-EGFシェディングの様々な刺激物質もまた、様々な細胞株においてFluhembのmAG1／mCherry比の増大を誘導した
proHB-EGFは、カルシウムイオノフォアおよびEGFのような様々な刺激により切断される（前掲非特許文献1）（非特許文献4）。Fluhemb発現HT1080またはヒトヒトケラチノサイト細胞株HaCaTにおいてmAG1／mCherryのより高い比率を誘導するためにカルシウムイオノフォアまたはEGFの処理を試みた。カルシウムイオノフォアA23187の刺激の後、Fluhemb発現HT1080およびHaCaTの両方において、mAG1／mCherryの蛍光比が時間経過依存の様式で増大した（図3AおよびB）。Fluhembは、A23187に対する応答がHaCaTにおいてHT1080におけるよりもはるかに速いことも示した。さらに、EGF刺激もFluhemb発現HT1080においてmAG1／mCherry比を増大させた（図3C）。特に、そのシェディングは細胞間接着領域で開始する傾向があった。これらのデータは、Fluhembが様々な因子のproHB-EGFシェディング刺激物質としての評価および細胞内proHB-EGFシェディング反応の理解のために有用である可能性があることを示している。
【００５０】
2.4. Fluhembはin vivoで物理的条件においてproHB-EGFシェディングの局所的な細胞活性を示した
物理的条件においてproHB-EGFシェディング活性を見るため、Fluhemb発現HT1080またはHaCaTを用いて2つのタイプの細胞培養実験を実施した。最初に、Fluhemb発現HaCaTを用いてスクラッチアッセイを実施した。そのmAG1／mCherry比は細胞を引っかいた直後に引っかいた領域にあるHaCaTにおいて最も高かった（図4A）。その後、FluhembのmAG1／mCherry比は引っかいた細胞シートの縁にあるHaCaTにおいて徐々に減少していた。一方で、その縁の内側の細胞のその比率は増大した（図4A）。次に、Fluhemb発現HT1080のmatrigel中への浸潤アッセイを行った。mAG1／mCherryの比率はmatrigel中のHT1080のアクチンに富む偽足形成領域において優位に増大した（図4B、CおよびD）。その結果は、proHB-EGFシェディング活性は浸潤突起において高いことを示唆している。
浸潤性腫瘍細胞がFluhembによりin vivoで検出される可能性がある。
Fluhembがin vivoでも働くかどうかを評価するため、Fluhemb発現HT1080をbalb／c  nu／nuのメスのマウス中に皮下移植し、10日後に共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ほとんどの腫瘍細胞はFluhembの増大しているmAG1／mCherry比を示さなかった（図5A）。しかし、血管上のいくつかのHT1080細胞においてその比率の局所的な増大が示された（図5Aおよび5B）。これらのデータは、血管上の腫瘍細胞は血管と接触していない腫瘍細胞よりもproHB-EGFシェディングにおいてより活性である可能性があることを明らかにしている。図4B、CおよびDと合わせて考えると、proHB-EGFシェディングのより高い活性を有する細胞はより浸潤性であることを示している可能性がある。
なお、本実施例で使用したベクター（CSII-EF-MCS-IRES2-BsdにFluhembをコードするポリヌクレオチドを導入した。）のマップを図6に、Fluhembのヌクレオチド配列を図7および配列表の配列番号1に示した。
【００５１】
3. 考察
蛍光バイオセンサーにおける最近の進歩は、生細胞における酵素活性および分布の研究を可能にした（35〜37）。蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）により活性化を可視化するために、メタロプロテアーゼ類のバイオセンサーも開発されてきた（38,39）。膜貫通型のメタロプロテアーゼ、例えばADAM類は、EGFファミリーのエクトドメインシェディングを行う。しかし、エクトドメインシェディングのFRETに基づくバイオセンサーを作るのは難しいように思われる。proHB-EGFが含まれるEGFファミリーのエクトドメインシェディングは細胞膜に近い限られた領域で行われるため、この膜近傍（jaxtamembrane）領域におけるあらゆる改変がエクトドメインシェディングの効率に影響を及ぼす（40,41）。単純にEGFドメインの代わりにmCherryおよび細胞質ドメイン中に挿入されたmAG1からなるproHB-EGFに基づく蛍光プローブを生成し（図1A）、エクトドメインシェディングに対する様々な刺激後のmAG1のmCherryに対する蛍光強度比の変化を予想した。TPAはproHB-EGFシェディングに関する最も強い誘導物質の1つである（非特許文献3）。最初に、FluhembがHT1080細胞においてTPA刺激に応答することができる（responsible）ことを実証した（図2AおよびB）。その蛍光強度比はTPA刺激の約10分後に変化し始めた。FluhembのTPAに対する応答は、Goishiらによる報告（非特許文献3）と比較して、proHB-EGFのエクトドメインシェディングの可視化に関して理にかなっているように思われる。proHB-EGFに基づくプローブの細胞への増殖作用を最小限にするため、EGFドメインをmCherryに置き換えた。そのデータは、この置き換えがエクトドメインシェディングの制御にほとんど影響を有しないようであることも示唆している。
【００５２】
次に、proHB-EGFシェディングに関する異なる刺激物質を用いて他の細胞株でFluhembが働くことを確かめた。カルシウムイオノフォアA23187はproHB-EGFのエクトドメインシェディングの刺激物質として報告されている（前掲非特許文献1）。FluhembはHT1080およびHaCaT細胞の両方においてA23187の刺激に応答した（図3AおよびB）。さらに、その結果はこれらの細胞株の間の応答速度の違いを示した。以前に、増殖因子、例えばEGFまたは塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）がケラチノサイトにおいて増殖因子受容体に仲介されるシグナル伝達を通してproHB-EGFのエクトドメインシェディングを誘導することを報告した（非特許文献4）。この実験において、HaCaT細胞で発現させたFluhembはEGF刺激にも応答した。これらのデータは、FluhembがproHB-EGFシェディングの刺激物質として報告されている化学的または体液性刺激物質の処理の下で働くことができるだけでなく、proHB-EGFシェディングの様々な刺激物質に対する、または／および様々なタイプの細胞における応答における違いも伝えることができるであろうことを示している。
【００５３】
Fluhembの生理的刺激に対する応答も確認した。HB-EGFは細胞運動性に関する強い活性を有することが報告されている（非特許文献9）。眼瞼の発生および皮膚の創傷の治癒において、HB-EGFは細胞増殖よりもむしろ細胞運動性に寄与している（非特許文献10および11）。MDCK細胞において、切断不能なproHB-EGF変異体の発現は細胞-マトリックスおよび細胞-細胞相互作用を促進し、細胞移動、肝細胞増殖因子（HGF）に誘導される細胞分散（cell scattering）および管状構造の形成を減少させた（非特許文献12）。対照的に、可溶性HB-EGFの発現は細胞移動の増大、細胞-マトリックス生成（production）および細胞-細胞相互作用の減少を誘導し、促進した。proHB-EGFシェディングの阻害も、創傷に誘導されるEGF受容体の活性化を抑止し、ケラチノサイトの移動の抑制を引き起こした（前掲非特許文献2）。そのデータは、proHB-EGFのエクトドメインシェディングは細胞移動に関して重要な役割を担っていることを示唆している。Fluhemb発現HaCaT細胞を用いたインビトロ創傷治癒アッセイも実施し、図4Aにおけるその結果は、以前に報告されたように（前掲非特許文献2）、創傷の形成はproHB-EGFのエクトドメインシェディングを強く誘導したことを示した。Fluhemb発現HT1080細胞を用いたMatrigel浸潤アッセイにおいてproHB-EGFの局所的なエクトドメインシェディング活性も実証した。proHB-EGFシェディングの活性は、図4Bにおいて浸潤している細胞の浸潤突起様の突起において強いように見える。その結果は、proHB-EGFシェディングは頭部および首の扁平上皮細胞癌における浸潤突起形成に寄与している（非特許文献13）ため、理にかなっている可能性がある。最後に、in vivoで腫瘍組織においてproHB-EGFシェディングを可視化した（図5AおよびB）。生きた動物において浸潤している腫瘍細胞を同定することは極めて難しかった。しかし、この方法は浸潤している腫瘍細胞の生体内同定および追跡に有用である可能性がある。
【００５４】
この研究において、proHB-EGFシェディングを可視化するために蛍光バイオセンサーFluhembを開発した。Fluhembを用いることにより細胞中のproHB-EGFシェディングを時間的に可視化することができる。proHB-EGFシェディングは腫瘍進行に重要であることが知られている（非特許文献6）。従って、この方法は抗癌薬としてのproHB-EGFシェディング阻害剤を開発するための薬物の作用の評価において利点を有する可能性がある。EGFファミリーには、そのシェディングがいくつかのプロテアーゼ、例えばADAM類により制御されているいくつかの構成要素が存在する（非特許文献4）。しかし、それぞれのEGFファミリーのシェディングにおけるADAM類の間の機能的相関ははっきりしないままである。さらに、他のファミリーの構成要素に基づくFluhembのような蛍光バイオセンサーを用いれば、EGFファミリーのシェディング系を深く理解することができるであろう。
【００５５】
4. 実施例の項で引用した文献
(非特許文献3) Goishi, K., Higashiyama, S., Klagsbrun, M., Nakano, N., Umata, T., Ishikawa, M., Mekada, E., and Taniguchi, N. (1995) Phorbol ester induces the rapid processing of cell surface heparin-binding EGF-like growth factor: conversion from juxtacrine to paracrine growth factor activity. Mol Biol Cell. 6, 967-980
(非特許文献4) Higashiyama, S., Nanba, D., Nakayama, H., Inoue, H., and Fukuda, S. (2011) Ectodomain shedding and remnant peptide signalling of EGFRs and their ligands. J Biochem. 150, 15-22
(非特許文献5) Nanba, D., Inoue, H., Shigemi, Y., Shirakata, Y., Hashimoto, K., and Higashiyama, S. (2008) An intermediary role of proHB-EGF shedding in growth factor-induced c-Myc gene expression. Journal of cellular physiology. 214, 465-473
(非特許文献6) Miyazono, K. (2012) Ectodomain shedding of HB-EGF: a potential target for cancer therapy. J Biochem. 151, 1-3
(非特許文献7) Xu, K.P., Ding, Y., Ling, J., Dong, Z., and Yu, F.S. (2004) Wound-induced HB-EGF ectodomain shedding and EGFR activation in corneal epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 813-820
(非特許文献8) Asakura, M., Kitakaze, M., Takashima, S., Liao, Y., Ishikura, F., Yoshinaka, T., Ohmoto, H., Node, K., Yoshino, K., Ishiguro, H., Asanuma, H., Sanada, S., Matsumura, Y., Takeda, H., Beppu, S., Tada, M., Hori, M., and Higashiyama, S. (2002) Cardiac hypertrophy is inhibited by antagonism of ADAM12 processing of HB-EGF: metalloproteinase inhibitors as a new therapy. Nature medicine. 8, 35-40
(非特許文献9) Higashiyama, S., Abraham, J.A., and Klagsbrun, M. (1993) Heparin-binding EGF-like growth factor stimulation of smooth muscle cell migration: dependence on interactions with cell surface heparan sulfate. J Cell Biol. 122, 933-940
(非特許文献10) Shirakata, Y., Kimura, R., Nanba, D., Iwamoto, R., Tokumaru, S., Morimoto, C., Yokota, K., Nakamura, M., Sayama, K., Mekada, E., Higashiyama, S., and Hashimoto, K. (2005) Heparin-binding EGF-like growth factor accelerates keratinocyte migration and skin wound healing. Journal of cell science. 118, 2363-2370
(非特許文献11) Mine, N., Iwamoto, R., and Mekada, E. (2005) HB-EGF promotes epithelial cell migration in eyelid development. Development. 132, 4317-4326
(非特許文献12) Singh, A.B., Tsukada, T., Zent, R., and Harris, R.C. (2004) Membrane-associated HB-EGF modulates HGF-induced cellular responses in MDCK cells. Journal of cell science. 117, 1365-1379
(非特許文献13) Hayes, K.E., Walk, E.L., Ammer, A.G., Kelley, L.C., Martin, K.H., and Weed, S.A. (2012) Ableson kinases negatively regulate invadopodia function and invasion in head and neck squamous cell carcinoma by inhibiting an HB-EGF autocrine loop. Oncogene.
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号1：Fluhembのヌクレオチド配列
【図１】
2014135947.tif 000003
【図２】
2014135947.tif 000004
【図３】
2014135947.tif 000005
【図４】
2014135947.tif 000006
【図５】
2014135947.tif 000007
【図６】
2014135947.tif 000008
【図７】
2014135947.tif 000009
【配列表】
2014135947000001.app