(57)【要約】      （修正有）【課題】充分に濃色化され、イムノクロマトグラフ法を含む免疫測定法の着色ラテックス粒子として使用した際に、目視判定性や検出感度に優れた診断薬用着色ラテックス粒子および該粒子を用いた免疫測定試薬を提供する。【解決手段】合成高分子からなる粒子を油溶性色素で着色した着色ラテックス粒子において、下記式（１）により算出された値が２０％以上の診断薬用着色ラテックス粒子。重量色素量率（％）＝油溶性色素量(ｇ)／｛油溶性色素量(ｇ)＋ラテックス乾燥重量(ｇ)｝×１００・・・（１）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成高分子からなる粒子を油溶性色素で着色した着色ラテックス粒子において、下記式（１)により算出された値が２０％以上の診断薬用着色ラテックス粒子。
重量色素量率（％）＝油溶性色素量（ｇ）／｛油溶性色素量（ｇ）＋ラテックス乾燥重量（ｇ）｝×１００・・・（１）
【請求項２】
合成高分子がスチレンおよびスチレンスルホン酸塩、親水性カルボキシモノマーからなる請求項１記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
【請求項３】
油溶性色素が下記式（２）において０．３重量％以上の値をとることができる油溶性色素である請求項１又は２記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
色素溶液の重量％濃度＝油溶性色素（ｇ）／｛油溶性色素量（ｇ）＋水溶性有機溶媒（ｇ）｝×１００・・・（２）
【請求項４】
油溶性色素がフタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素からなる請求項１〜３のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
【請求項５】
抗原または抗体を化学吸着により担持することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
【請求項６】
上記請求項１〜５のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子を用いる免疫測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油溶性色素を含有する診断薬用着色ラテックス粒子及びこれを用いた免疫測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法とは、抗原抗体反応（または免疫反応）に基づき被検出物質を特異的に検出する方法である。免疫測定法に区分される各種方法は、測定原理が抗原抗体反応に基づくという共通点はあるが、その検出方法によって多岐に分類される。各種方法の例としては、ラテックス免疫比濁法等に代表される免疫凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、イムノクロマトグラフ法、フロースルーメンブレンイムノアッセイ法などが挙げられる。
【０００３】
これら各種方法のうち、免疫反応とクロマトグラフィーの原理を併せもつイムノクロマトグラフ法（免疫クロマトグラフ法）が、簡易迅速検査法として臨床検査などの領域で広く用いられている。イムノクロマトグラフ法とは、被検出物質と結合する抗体（または抗原）により感作された粒子（以下、感作粒子ということがある）と試料を混合して被検出物質と感作粒子の複合体を形成させ、これを被検出物質と結合する抗体（または抗原）が固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、固定相ということがある）上を移動させて固定化された抗体に捕捉させ、当該複合体を検出する測定法である。前記したように、被検出物質と感作粒子の複合体は固定相に固定化された抗体（または抗原）と結合して捕捉され、クロマトグラフ媒体上の固定化された抗体（または抗原）の位置に留まるため、当該位置における感作粒子に由来する色調等の変化を観察することで被検出物質の存在の有無を目視判定することができる。
【０００４】
上記のイムノクロマトグラフ法を含む免疫測定法において、被検出物質の検出に用いる粒子としては目視判定を容易にするため、着色された粒子（以下、着色粒子ということがある）が使用されることがある。この着色粒子の例として、ポリマー系ラテックス粒子を着色してなる着色ラテックス粒子等が挙げられる。
【０００５】
特許文献１には、油溶性色素をメタノールに溶解した染料溶液を用いてポリマー系ラテックス粒子を着色し、粒子内の染料の含有率を12.0重量%、15.6重量％（実施例１，２）としたものが記載されている。
【０００６】
しかし、特許文献１で示されたこれら着色剤含量では充分に濃色な着色ラテックス粒子を得ることができず、イムノクロマトグラフ法を含む免疫測定法用の着色ラテックス粒子として使用した場合、低濃度領域（高感度領域）における目視判定性が悪いという問題点があった。また、着色剤の添加量を増加させることにより、理論的にはより濃色な着色ラテックス粒子が得られると考えられるが、実際には着色剤の溶媒に対する溶解度が課題となり、余剰の着色剤は沈殿し、粒子の濃色化に寄与しないという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４２４９４６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑み、充分に濃色化され、イムノクロマトグラフ法を含む免疫測定法の着色ラテックス粒子として使用した際に、目視判定性や検出感度に優れた着色ラテックス粒子及びこれを用いた免疫測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ポリマー系ラテックス粒子と水溶性有機溶媒に対し高溶解性の油溶性色素からなる着色ラテックス粒子であって、重量色素量率が２０％以上の診断薬用着色ラテックス粒子である。すなわち、本発明は、以下のものである。
【００１０】
[１]合成高分子からなる粒子を油溶性色素で着色した着色ラテックス粒子において、下記式（１)により算出された値が２０％以上の診断薬用着色ラテックス粒子。
重量色素量率（％）＝油溶性色素量（ｇ）／｛油溶性色素量（ｇ）＋ラテックス乾燥重量（ｇ）｝×１００・・・（１）
[２]合成高分子がスチレンおよびスチレンスルホン酸塩、親水性カルボキシモノマーからなる上記[１]に記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[３]油溶性色素が下記式（２）において０．３重量％以上の値をとることができる油溶性色素である上記[１]又は[２]に記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
色素溶液の重量％濃度＝油溶性色素（ｇ）／｛油溶性色素量（ｇ）＋水溶性有機溶媒（ｇ）｝×１００・・・（２）
[４]油溶性色素がフタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素からなる上記[１]〜[３]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[５]抗原または抗体を化学吸着により担持することを特徴とする上記[１]〜[４]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[６]上記[１]〜[５]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子を用いる免疫測定試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の診断薬用着色ラテックス粒子は充分に濃色化されており、イムノクロマトグラフ法等の免疫測定法に使用した場合、目視判定性や検出感度の著しい向上が見られるため、判定が簡便となる。これにより、疾患の早期診断、誤判定の防止に寄与する。また、測定感度を従来程度とすれば、使用する抗体量も減少するため、コストダウンにもつながる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、水溶性有機溶媒に対し、高溶解度をもつ油溶性色素の使用により、溶液中に存在する色素量が増加し、ラテックス粒子内に既存よりも多量の色素を含有させることができることを見出した。また、ポリマー系ラテックス粒子が所持するカルボキシ基量がラテックス粒子の被着色度合いに影響し、表面におけるカルボキシ基が特定量のラテックス粒子はカルボキシ基量依存的に濃色化されることを見出した。これらの知見の組み合わせから、充分に濃色な着色ラテックス粒子が得られ、本発明を完成するに至った。
【００１３】
また、従来の着色ラテックス製造方法においてはポリマー系ラテックス粒子と油溶性色素を溶解した有機溶媒を混合、加温した後、色素溶液の濃度を維持するため、有機溶媒を蒸発させる濃縮工程が行われていたが、本発明では濃縮工程が着色ラテックス粒子の濃色化に寄与しないことを見出し、濃縮工程を省略することで、製造工程を大幅に短縮することを可能にした。
【００１４】
本発明の診断薬用着色ラテックス粒子はポリマー系ラテックス粒子からなる。ポリマー系ラテックス粒子を構成するポリマーとしては特に限定はないが、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、イタコン酸重合体、スチレン−親水性カルボキシモノマー共重合体：例えば、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−イタコン酸共重合体等が挙げられる。その中で、好ましくはスチレン−メタクリル酸共重合体もしくはスチレン−イタコン酸共重合体、スチレンおよびスチレンスルホン酸塩共重合体である。特に好ましくはスチレンおよびスチレンスルホン酸塩、親水性カルボキシルモノマーからなるポリマーである。
【００１５】
本発明に使用されるスチレンスルホン酸塩の塩としては、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸ナトリウムが好ましく用いられる。本発明に使用される親水性カルボキシルモノマーとしては、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などを用いることができる。好ましくは、メタクリル酸、アクリル酸を用いることができる。
【００１６】
本発明において、親水性カルボキシルモノマーを用いる際には、ポリマー系ラテックス粒子が所持するカルボキシ基量がラテックス粒子の被着色度合いに影響するので、表面におけるカルボキシ基量を0.001〜0.6meq/gとすると、ラテックス粒子はカルボキシ基量依存的に濃色化される。表面におけるカルボキシ基量は、好ましくは0.1〜0.6 meq/g、より好ましくは0.2〜0.6 meq/gである。粒子表面のカルボキシル基量は、通常の測定方法により測定できる。例えば、電位差自動滴定装置を用いて測定できる。
【００１７】
上記ポリマー系ラテックス粒子の平均粒子径に特に限定はなく、診断薬用着色ラテックス粒子として使用できればいかなる平均粒子径でもよい。なかでもクロマトグラフィーで展開されれば特段問題はないが、小径な粒子を使用すると、充分な検出感度が得られないことがあるため、より好ましくは300nm以上1000nm以下の粒子である。
【００１８】
上記粒子の粒子径の変動係数（CV値）は、20％以下であることが好ましい。20％を超えると、試薬調製時のロット再現性が悪く、測定試薬の再現性が低下することがある。より好ましくは15％以下である。尚、上記粒子径の変動係数は、次の式により算出される。
粒子径の変動係数（CV値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径
【００１９】
本発明に用いられるポリマー系ラテックス粒子の懸濁液を調製する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、乳化剤（界面活性剤）を使用しないソープフリー乳化重合法が最も好ましい。この乳化重合法に用いられる重合開始剤としては過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどが挙げられるが、好ましくは過硫酸カリウムが良い。本発明では、反応容器にイオン交換水、例えば、モノマー、重合開始剤を仕込み、攪拌しながら反応容器内を窒素置換した後、65℃〜80℃で24〜42時間反応を行うことにより製造することができる。得られた粒子は均一な粒度分布、優れた分散安定性を有する。
【００２０】
例えば、スチレンおよびスチレンスルホン酸ナトリウム、親水性カルボキシルモノマーとしてメタクリル酸を用いた場合は、得られた粒子は均一な粒度分布、優れた分散安定性を有し、分散安定性は、各々のポリマー系ラテックス粒子の表面に存在するスチレンスルホン酸由来のスルホン酸基同士の静電的な反発力によるものである。また、粒子表面にカルボキシ基が存在する場合には、分散安定性に寄与する一方で、抗体との化学結合部位となり好ましい。
【００２１】
本発明の着色ラテックス粒子において、着色が完成した着色ラテックス粒子に含有される色素量を下記式（１）の重量色素量率（％）とし、この重量色素量率が２０％以上であることが重要である。重量色素量率が２０％未満であると、測定試薬としたとき、満足する目視判定や検出感度が得られない。
重量色素量率（％）＝油溶性色素量(ｇ)／｛油溶性色素量(ｇ)＋ラテックス乾燥重量(ｇ)｝×１００・・・（１）
ここで、実際の重量色素量率は次のようにして算出する。色素溶液の吸収スペクトルを測定し、色素の最大吸収波長を測定しておく。色素と着色前の粉体化したラテックス粒子粉体を任意の割合で有機溶媒に溶解し、色素の最大吸収波長での吸光度を測定する。色素濃度と吸光度測定値から検量線が作成できる。作製した着色ラテックスを粉体化して秤量し、有機溶媒に溶解させて最大吸収波長での吸光度を測定することで着色ラテックス粒子に含まれる色素量を検量線から算出し重量色素量率とする。
【００２２】
本発明に使用される色素は、水溶性有機溶媒に可溶な油溶性色素を用いることができる。好ましくは、下記式（２）で示す色素溶液の重量％濃度が0.3重量％以上となることができる油溶性色素であれば特に限定されない。そのような色素として、フタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素であり、具体的には、OIL GREEN 201（中央合成化学社製）、OIL BLUE BOM（中央合成化学社製）などが挙げられる。
色素溶液の重量％濃度＝油溶性色素（ｇ）／｛油溶性色素量（ｇ）＋水溶性有機溶媒（ｇ）｝×１００・・・（２）
使用しようとする油溶性色素の上記式（２）の値が0.3重量％以上のものであるか否かは、油溶性色素の水溶性有機溶媒溶液をろ過し、溶解せずにろ取される油溶性色素の重量を測定することにより判定することができる。
【００２３】
また、色素を溶解させる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜３の低級アルコール、アセトンおよびその混合溶媒などが挙げられるが、好ましくはメタノールである。
【００２４】
着色ラテックス粒子製造時のポリマー系ラテックスの乾燥重量と油溶性色素重量の仕込み量重量比（以下色素仕込み量）は、式（１)が20％を満たせば任意に決定して良いが、製造時のロス等を考慮し、40％以上とすることが好ましい。色素仕込み量は下記式（３）により定義される。
色素仕込み量（％）＝仕込み油溶性色素量(ｇ)／｛仕込み油溶性色素量(ｇ)＋ラテックス乾燥重量(ｇ)｝×１００・・・（３）
【００２５】
従来、着色ラテックス粒子に含有される色素量である重量色素量率（％）が20%を上回る着色ラテックス粒子の報告はなく、充分に濃色な着色粒子は製造できなかった。この理由としては、従来用いられていたどの油溶性色素をメタノールに溶解させても、色素溶液の重量％濃度は0.3重量％未満であるため、色素仕込み量（％）も、20％未満にしかならないためである。つまり、着色に用いる油溶性色素のメタノール溶液（以下、色素溶液と呼称）の濃度が低く色素仕込み量（％）も低いため、濃色な着色粒子が得られなかったと考えられる。一方、本発明で用いたフタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素の色素仕込み量（％）は最大55％（色素溶液の重量％濃度は最大0.7重量％）である。これにより、比較するとメタノール中の油溶性色素濃度を格段に大きくすることができ、従来の着色ラテックス粒子よりも充分に濃色化された着色ラテックス粒子を得ることができる。
【００２６】
本発明の着色ラテックス粒子の製造方法としては特に限定はされず、一例としては以下の方法が挙げられる。ポリマー系ラテックス粒子を油溶性色素が溶解された有機溶媒の溶液に加えて混合、加温、攪拌し、油溶性色素分子をラテックス粒子内に包含させる。その後、溶媒を水へ置換し、着色ラテックス粒子を得る。
【００２７】
本発明の着色ラテックス粒子は、表面に抗原（または抗体）を結合することにより、抗原-抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフ法等の生物学的反応を利用した種々の方法に好適に用いることができる。
【００２８】
上記着色ラテックス粒子の表面に抗原（または抗体）を結合させる方法としては特に限定はされず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抗原（または抗体）を含む緩衝液中に着色ラテックス粒子を浸漬させ、一定温度で一定時間インキュベートするなどの物理吸着による結合方法や、化学吸着による結合方法がある。なかでも、着色ラテックス粒子のカルボキシ基と抗体の含有するアミノ基を架橋させ、結合させる化学吸着がより好ましい。
【００２９】
本発明によれば、充分に濃色な着色ラテックス粒子を作製できることにより、着色ラテックス粒子を免疫測定用試薬として使用した際に、目視判定性が格段に向上し、検出感度を向上させることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例、比較例により本発明の詳細について説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００３１】
［実施例１]
本発明で着色されるポリマー系ラテックス粒子はソープフリー乳化重合法を用いて作製した。まず、反応容器にイオン交換水1200mL、モノマーとして、スチレン120mL、メタクリル酸16mLを加え攪拌し、その後、反応容器内を窒素置換した。反応容器内の温度が70℃に達した後、3%（ｗ/ｖ）過硫酸カリウム水溶液13mLを滴下した。3%（ｗ/ｖ）過硫酸カリウム水溶液の滴下から24時間後、反応を停止し、濾過してポリマー系ラテックス粒子懸濁液を得た。
【００３２】
上記ソープフリー乳化重合により得られた粒子は透過型電子顕微鏡 JEM-1010型（日本電子社製）により粒子径を、また、電位差自動滴定装置  AT610（京都電子社製）により粒子表面のカルボキシ基量を測定した。その結果、粒子径は302nm(CV値 6.8%)、粒子表面のカルボキシ基量は0.51meq/gであった。
【００３３】
油溶性色素（OIL GREEN 201）1.5gをメタノール397.5gに溶解させ、45℃で一晩攪拌して濾過し、色素溶液を得た。この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。スチレンおよび親水性カルボキシモノマーからなるラテックス粒子が乾燥重量2.25gとなるよう秤量し、遠心分離機（himac CR22GII）により沈降させた。沈降させたラテックス粒子を色素溶液により超音波処理で再分散させて水からメタノールへと溶媒置換した(この場合の式（３）による色素仕込み量（％）=1.5/（1.5+2.25）×100=40％、色素溶液の重量％濃度=1.5/（1.5+397.5）×100=0.38重量％となる）。41℃で加温、攪拌し、18時間後、精製水250mLを添加し、その後、再び水へと溶媒置換し着色ラテックス粒子を得た。
【００３４】
得られた着色ラテックス粒子の重量色素量率(%)を算出した。着色ラテックス粒子を95℃で2時間加熱し、乾燥させる。メノー乳鉢で擂りつぶし、均一な着色ラテックス粒子の粉体を得た。粉体を秤量し、有機溶媒（OIL GREEN 201色素にはトルエン、OIL BLUE BOM色素にはアセトンを用いた。）に溶解させた。油溶性色素のλmaxで吸光度を測定し、油溶性色素、ラテックス粒子を同有機溶媒に溶解させて調製した希釈系列から作成した検量線により重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００３５】
[実施例２]
油溶性色素（OIL GREEN 201）2.5gをメタノール397.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た (色素仕込み量(%)＝2.5/(2.5+2.25)×100=53％、色素溶液の重量％濃度=2.5/(2.5+397.5)×100=0.63重量％となる。)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００３６】
[実施例３]
油溶性色素（OIL GREEN 201）1.5gを油溶性色素（OIL BLUE BOM）2.5gに変更しメタノール397.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝2.5/（2.5+2.25）×100=53％、色素溶液の重量％濃度=2.5/（2.5+397.5）×100=0.63重量％となる)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００３７】
[比較例１]
油溶性色素（OIL GREEN 201）0.5gをメタノール397.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝0.5/（0.5+2.25）×100=18％、色素溶液の重量％濃度=0.5/（0.5+397.5）×100=0.13重量％となる)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００３８】
[比較例２]
油溶性色素（OIL GREEN 201）2.5gをメタノール1987.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝2.5/（2.5+2.25）×100=53％、色素溶液の重量％濃度=2.5/（2.5+1987.5）×100=0.13重量％となる)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００３９】
[比較例３]
油溶性色素（OIL GREEN 201）0.5gをメタノール79.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝0.5/（0.5+2.25）×100=18％、色素溶液の重量％濃度=0.5/（0.5+79.5）×100=0.63重量％となる)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００４０】
[比較例４]
油溶性色素（OIL GREEN 201）1.5gを油溶性色素（OIL GREEN 502（オリエント化学工業社製））0.5gに変更し、メタノール397.5gに溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝0.5/（0.5+2.25）×100=18％、色素溶液の重量％濃度=0.5/（0.5+397.5）×100=0.13重量％となる)。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表１参照）。
【００４１】
[比較例５]
油溶性色素（OIL GREEN 201）1.5gを油溶性色素（OIL GREEN 502）2.5gに変更し、メタノール397.5gに溶解させたこと以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子作製を試みた。この時、色素仕込み量(%)＝2.5/（2.5+2.25）×100=53％、色素溶液の重量％濃度=2.5/（2.5+397.5）×100=0.63重量％となる。しかし、濾紙上には沈渣が残り、色素溶液は飽和溶解度に達しており、色素仕込み量（％）53%および重量％濃度0.63重量％には至らず、製造途中で凝集し、着色ラテックス粒子を得ることはできなかったので表中重量色素量率を「×」と表記した。また、試薬性能評価を行うことはできなかった（表１参照）。
【００４２】
[比較例６]
油溶性色素（OIL GREEN 201）1.5gを油溶性色素（OIL GREEN 502（オリエント化学工業社製））2.5gに変更し、メタノールを397.5gから1987.5gに変更し、溶解させたこと（この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。）以外は、実施例１と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)＝2.5/（2.5+2.25）×100=53％、色素溶液の重量％濃度=2.5/（2.5+1987.5）×100=0.13重量％となる）。また、同様に、重量色素量率（％）を算出した（表1参照）。
【００４３】
[適用例]
＜インフルエンザウィルス測定用イムノクロマトグラフ法試薬の作製＞
１.青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体の調製
（１）下記(i)から(iv)を準備し、(i)5mL、(ii)0.2ｍＬ及び（iii）0.8mLを加えて攪拌後、これに(iv)を4mL添加し、室温で2時間攪拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去後、10%スクロース含有2%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を10mL添加し、さらに2時間攪拌後、13,000rpmで10分間遠心分離し、コンジュゲートを得た。
（３）上記（２）により得られたコンジュゲートに対し、10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体を得た。
(i)2%青色着色ラテックス粒子を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
(ii)20mM MES(pH6.5)緩衝液
(iii)架橋剤1-ethl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC) 15mg/mL
(iv)2.5mg/mL抗A型インフルエンザウィルスモノクロナール抗体を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液試薬性能評価において、コンジュゲートの吸光度の測定は、669nm(青色着色ラテックス粒子の最大吸収波長)で測定した。
【００４４】
２.緑色着色ラテックス粒子標識KLH（カコ貝ヘモシアニン:Keyhole-limpet hemocyanin）の調製
（１）下記(i)から(iv)を準備し、(i)5mLに、(ii)1.4mL、(iii)1.6mLを加えて攪拌後、(iv)2mLを添加し、室温で2時間攪拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を13,000rpm10分間遠心分離し、上清を除去後、10%スクロース含有2％BSA水溶液を10mL添加し、さらに2時間後、13,000rpmで10分間遠心分離し、コンジュゲートを得た。
（３）上記（２）で得られたコンジュゲートに対し、10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加しコンジュゲートを懸濁させて、緑色着色ラテックス粒子標識KLHを得た。
(i)2%緑色着色ラテックス粒子を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
(ii)20mM MES(pH6.5)緩衝液
(iii)架橋剤1-ethl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC) 15mg/mL
(iv)0.5mg/mL KLHを含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
試薬性能評価において、コンジュゲートの吸光度の測定は、678nm（緑色着色ラテックス粒子の最大吸収波長）で測定した。
【００４５】
３.コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１.および上記２.で調製したコンジュゲートを青色6.4 OD/mL、緑色6.5 OD/mLとなるように、0.5%カゼイン及び10%スクロース含有トリス緩衝液(pH8.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製した。次に、22.0mm×254mm×0.56mm（幅×長さ×厚さ）のグラスファイバー製パッド(Lydall社製)にイムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用いて該コンジュゲート溶液を10μl/cmで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で70℃、30分間加温して乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。また、界面活性剤（例えば、エマルゲン150（花王社製）、アミート320（花王社製））などを添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加後、同様の操作を行えばよい。
【００４６】
４.抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜の作製
25.0mm×254mm×0.235mm（短辺×長辺×厚さ）のニトロセルロース膜(Sartorius社製)に、0.75mg/mLに調製した前記青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体とはエピトープを異にする抗A型インフルエンザウィルス抗体、0.75mg/mLに調製した抗KLH抗体、及び2.5%スクロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を、幅約1mmのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用い、吐出量を1uL/cmとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で70℃、45分間乾燥させ、抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜とした。
【００４７】
５.テストストリップの作製
プラスチック製粘着シートに上記抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜を貼り、上記３.で作製したコンジュゲート塗布パッドを配置装着し、反対側の端には吸収パッド(Whatman社製、740-E)を配置装着した。最後に、抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルムを配置装着し、ラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を4mm幅に切断し、テストストリップを作成した。該テストストリップの該寸は、4mm×98mm（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。
【００４８】
６.検体抽出液の調製
200mM 塩化カリウム、150mM L-アルギニン、0.5% Brij35、0.25% BSA、及び0.05% プロクリン（登録商標）950を含む50mM トリス緩衝液(pH8.5)を検体抽出液とした。
【００４９】
７.サンプルの調製
a.鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒1本を浸し、検体をしみこませた綿棒を320uLのPBSへ入れて、検体成分をPBSへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。
b.鼻腔拭い検体の場合
綿棒2本で鼻腔を拭い、綿棒を320uLのPBSへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。
【００５０】
８.試薬性能評価測定
サンプルに上記５.で作製したテストストリップを浸し、10分後にAライン、コントロールラインの発色強度を測定し、試薬性能評価とした。発色強度測定には、青、緑の各色の発色見本から0.25を単位として0.25〜4.0の数値をつけたカラーチャートを用い、n=3で測定した。重量色素量率が２０％以上の着色ラテックス粒子の場合、試薬性能評価が２．８以上であるならば、免疫凝集法において目視判定や検出感度に優れたものである。好ましくは、３．０以上である。
【００５１】
【表１】
2014081369.tif 000002
【００５２】
実施例１〜３および比較例１〜６によれば、重量色素量率が２０％以上の着色ラテックス粒子を用いた実施例１〜３では、試薬性能評価が重量色素量率２０％未満の着色ラテックス粒子を用いた比較例１〜４，６に比べて格段に優れていた。比較例５は、色素が充分溶解せず、色素溶液は飽和溶解度に達していない。この場合、色素仕込み量（％）53％および色素溶液重量％濃度0.63重量％には至らず、製造途中で凝集し、着色ラテックス粒子を得ることはできなかったものである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の診断薬用着色ラテックス粒子及びこれを用いた免疫測定試薬を用いることにより、イムノクロマト法等の免疫測定法の着色ラテックス粒子として使用した場合、目視判定性や検出感度に優れるため、疾患の早期診断、誤判断の防止に貢献する。また、測定感度を従来程度とすれば、使用する抗体量を減少させることができ、コストダウンにもつながり有用である。