(57)【要約】【課題】  長期間の服用や摂取をしても副作用の心配が少なく、肝臓でのコレステロールエステル合成、コレステロール合成、アポリポタンパクＢ１００合成、アポリポタンパクＢ１００分泌、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成に対する抑制作用などを有する、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物を提供すること。【解決手段】  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。
【請求項２】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制用経口組成物及び／又は肝コレステロール合成抑制用経口組成物。
【請求項３】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制用経口組成物。
【請求項４】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝アポリポタンパクＢ１００合成抑制用経口組成物及び／又は肝アポリポタンパクＢ１００分泌抑制用経口組成物。
【請求項５】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制及び／又は肝コレステロール合成抑制による、請求項１に記載の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。
【請求項６】
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを有効成分とするオリーブ果実抽出物を含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制、肝コレステロール合成抑制及び／又は肝アポリポタンパクＢ１００分泌抑制による、請求項１に記載の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴とする、肝臓でのＶＬＤＬ合成抑制に用いる経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＬＤＬ（ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：超低比重リポタンパク）は、肝臓で合成されるリポタンパクの１種である。ＶＬＤＬには、コレステロールやコレステロールエステル、トリグリセリド（中性脂肪）、リン脂質などが含まれ、構成するアポリポタンパクとしてアポリポタンパクＢ１００などがある。
【０００３】
肝臓で合成されたＶＬＤＬは、肝臓から分泌された後の代謝によりトリグリセリドを失い、レムナントリポタンパクであるＩＤＬ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：中間比重リポタンパク）を経た後に、コレステロールやコレステロールエステルの比率が増えたＬＤＬ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：低比重リポタンパク）に異化（変質）していく。ＬＤＬは酸化や糖化されやすく、酸化ＬＤＬや糖化ＬＤＬなどはＬＤＬ受容体への親和性を失い、スカベンジャー受容体などを経てマクロファージに取り込まれ、マクロファージの機能を変化させることにより動脈硬化症を発症する原因の一つと考えられている。特に、小型ＬＤＬ（ｓｄ−ＬＤＬ）はＬＤＬ受容体への親和性を失いやすく、血管壁に浸透しやすく、虚血性心疾患に大きく関与していることが知られている。また、ＶＬＤＬに含まれるコレステロールやコレステロールエステルは、動脈硬化巣の初期病変であるプラークの内部に沈着しているコレステロールの由来成分であることも知られている。
【０００４】
従って、動脈硬化症を予防するためには、ＨＤＬ−コレステロールを含む総コレステロールよりも、ＶＬＤＬ−コレステロールやＬＤＬ−コレステロールをコントロールすることが重要であり、多くの研究によって指示されている。
【０００５】
ＶＬＤＬ−コレステロールやＬＤＬ−コレステロールをコントロールする方法としては、肝臓でのコレステロール合成やコレステロールエステル合成を抑制する医薬品や、肝臓でのＶＬＤＬ合成を抑制する医薬品を用いる方法が有用である。このような医薬品としては、スタチン系医薬品やフィブラート系医薬品などがある。
【０００６】
スタチン系医薬品は、肝細胞のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害し、肝細胞内コレステロール含量を減らしてＶＬＤＬ合成を抑制する。さらにＬＤＬ受容体を増加させることによって血液からのコレステロール取り込みを図ることにより効果を示す。スタチン系医薬品としては、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチンなどが挙げられる。
【０００７】
フィブラート系医薬品は、核内受容体のＰＰＡＲ−αに作用し、肝細胞内脂質合成に関わるタンパク合成を制御してＶＬＤＬ合成を抑制する。さらにリポタンパクリパーゼの発現を増やすことによって血管内皮でのＶＬＤＬやカイロミクロンの異化（変質）を促進させることにより効果を示す。フィブラート系医薬品としては、フェノフィブラート、ベザフィブラート、クロフィブラート、クリノフィブラートなどが挙げられる。
【０００８】
しかし、これらの医薬品には、横紋筋融解症、末梢神経障害、ミオパシー、肝機能障害、血小板減少などの副作用があり、特に横紋筋融解症に注意を払う必要がある。特にフィブラート系医薬品とスタチン系医薬品との併用は横紋筋融解症をひき起こしやすいなどの課題があり、問題となっている。これらのことから、長期間の服用や摂取による副作用の心配が少なく、安全な肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物の開発が求められている。
【０００９】
一方、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（以下、ＤＨＰＥ）の有する作用として、血中における総コレステロール高値に対する低下作用（特許文献１）（非特許文献１）、ＬＤＬ−コレステロール高値に対する低下作用、トリグリセリド高値に対する低下作用、ＨＤＬ−コレステロール低値に対する上昇作用（非特許文献２）、血糖高値に対する低下作用（非特許文献３、非特許文献４）が、多くの研究により知られている。また、ＤＨＰＥを含有する天然物抽出物（商品名：Ｈｉｄｒｏｘ、Ｈｙｔｏｌｉｖｅ、Ｏｌｉｖａｃｔｉｖ、Ｏｌｅａｓｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｌｉｖｏｌｓ、Ｏｌｉｖｅｘなどの市販の天然物抽出物を含む）やこれらの酸やアルカリによる加水分解物や酵素処理物を用いた研究においては、膵リパーゼや脂肪分解酵素に対する阻害作用、血中におけるＶＬＤＬに対する減少作用、体脂肪や肥満に対する減少作用、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼの活性作用、血中におけるアディポネクチンに対する増加作用（特許文献２）、肝臓における脂肪合成によって引き起こされる肝疾患（脂肪肝や非アルコール性脂肪性肝炎など）に対する予防作用や改善作用（特許文献３）、脂質合成関連遺伝子の発現変動に対する抑制作用（特許文献４）、これらによる肝臓で脂肪合成抑制作用が報告されている。
【００１０】
しかし、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及び／又はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ抑制用の経口組成物や肝脂肪合成抑制用の経口組成物の発明に用いられたオリーブ果実抽出物には、ＤＨＰＥと同等の抗酸化作用や薬理作用を有するとされる（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）−２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−３−エチリデン−５−（メトキシカルボニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−酢酸２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル（ＣＡＳ登録番号  ３２６１９−４２−４）などＤＨＰＥ以外のポリフェノール類が多く含まれている。従って、ＤＨＰＥ以外のポリフェノール類などによる作用である可能性が高く、膵リパーゼ阻害作用による脂肪吸収量の減少によって肝臓重量減少作用や肝脂質蓄積抑制作用が認められた可能性が高い。また、一連の脂質合成関連遺伝子の発現抑制においても、これらの二次的な影響による可能性が考えられる。
【００１１】
一方、ＤＨＰＥが、肝臓におけるＶＬＤＬ合成抑制作用を有することは知られていない。また、肝コレステロール合成や肝コレステロールエステル合成に対する抑制作用、アポリポタンパクＢ１００合成抑制作用、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制作用を示すことは報告されていないし、これらに伴うアポリポタンパクＢ１００分泌抑制作用も認められていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００７−４５８１４号公報
【特許文献２】特開２００８−２７３９３８号公報
【特許文献３】特開２００９−２６３２５６号公報
【特許文献４】特開２００９−２６３２５７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１８８（1）：３５−４２、２００６
【非特許文献２】Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ. ５５（３）：６２４−６３１、２００７
【非特許文献３】Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５７（１９）:８７９８−８８０４、２００９
【非特許文献４】Ｊ. Ａｇｒｉｃ. Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６０ （２３）：５８５９−５８６５、２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、長期間の服用や摂取をしても副作用の心配が少なく、肝臓でのコレステロールエステル合成やコレステロール合成、アポリポタンパクＢ１００合成、アポリポタンパクＢ１００分泌、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成に対する抑制作用などを有する、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、安全性の高い天然物に含まれる成分の中から成分の探索を行ったところ、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＤＨＰＥ）は、肝臓でのコレステロールエステル合成、コレステロール合成、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成、アポリポタンパクＢ１００合成、アポリポタンパクＢ１００分泌などに対する抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
１）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール含有することを特徴する、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。
２）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制用経口組成物及び／又は肝コレステロール合成抑制用経口組成物。
３）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制用経口組成物。
４）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝アポリポタンパクＢ１００合成抑制用経口組成物及び／又は肝アポリポタンパクＢ１００分泌抑制用経口組成物。
５）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制及び／又は肝コレステロール合成抑制による、（１）に記載の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物。
６）  ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを有効成分とするオリーブ果実抽出物を含有することを特徴する、肝コレステロールエステル合成抑制、肝コレステロール合成抑制及び／又は肝アポリポタンパクＢ１００分泌抑制による、請求項１に記載の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＤＨＰＥを含有することを特徴とする肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物を、長期間の服用や摂取しても副作用の心配が少ない医薬品などとして供給することが可能となった。これらは、過剰な肝ＶＬＤＬ合成により引き起こされる症状及び／又は疾病に対する改善、予防、緩和、軽減や治療に用いる経口組成物として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明におけるＤＨＰＥとは、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＣＡＳ登録番号１０５９７−６０−１）を示し、フェノール類構造を有する物質である。本発明の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物に用いるＤＨＰＥとしては、化学合成品のみでなく、ＤＨＰＥを含有する天然物や天然物加工品からの抽出物を用いても良く、容易に入手することが可能な市販の抽出物でもよい。
【００１９】
また、（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）−２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−３−エチリデン−５−（メトキシカルボニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−酢酸２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル（ＣＡＳ登録番号３２６１９−４２−４）を加水分解してもよいし、これらを含む天然物や天然物加工品からの加水分解物でもよい。
【００２０】
ＤＨＰＥを含有する天然物としては、オリーブやブドウなどが挙げられ、オリーブが好ましい。天然物加工品としては、オリーブオイルやテーブルオリーブやワイン、これらの製造工程（抽出処置、酸やアルカリによる加水分解処置、酵素処理などを含む工程）により得ることができる中間産物やＤＨＰＥを含むオリーブ搾油工場廃水などが挙げられる。
【００２１】
本発明におけるオリーブとは、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）オリーブ属のオリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）を意味する。オリーブの品種としては、アーベキーナ、アザパ、アスコラーナ、アスコラーナ・テレナ、アスラーノ、アスラーノ・テネラ、アメリカン、アルベキナ、ウエストオーストラリア、エルグレコ、オークラン、オヒブランカ、カザリーバ、カラマタ、クライスト、コラチナ、コラティーナ、ゴルダル、コルニカブラ、コレッジョッラ、コロネイキ、サウスオーストラリア、ジェンティーレ・ディ・キエーティ、シプレッシーノ、セビラーノ、タジャスカ、チプレッシーノ、ティニーオイル  カラマタ、ネバディロ・ブランコ、ネバディロブロンコ、ハーディズ・マンモス、パラゴン、バルネア、バロウニ、ピクアル、ピクード、ピッチョリーネ、ブラックイタリアン、フラントイオ、フラントイオ、ベルダル、ベルダル、ヘレナ、ペンドリーノ、ペンドリノ、ホジブランコ、ホワイト、マウリィーノ、マンザニリャ、マンザニロ、ミッション、モロイオロ、ラ・タンシュ、ラキーノ、ルッカ、レッチーノ、ロシオーラ、ワシントン、ワッガベルダル、ワン・セブン・セブン、Ｊ５などが挙げられる。好ましい品種としては、テーブルオリーブやオリーブオイルの製造に用いる品種であるが、特に限定されない。
【００２２】
オリーブの使用部位としては、果実、果皮、種子、種皮、葉、茎、芽などが挙げられるが、主として果実や葉を用いるのが好ましく、特に好ましいのは果実である。これらは、そのまま又は乾燥して用いることができる。
【００２３】
抽出物としては、前記天然物の使用部位、好ましくは果実を、そのままあるいは乾燥した後に適当な大きさに切断したり、粉砕加工したりしたものや天然物加工品から抽出して得られる物質や果汁の他、加水分解物、さらに分離精製して得られるより活性の高い画分や成分が包含される。前記の使用部位などからの抽出は、室温又は加熱した状態で溶剤に含浸させるか又はソックスレー抽出器などの抽出器具を用いて行われる溶剤抽出の他に、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、炭酸ガスを超臨界状態にして行う超臨界抽出法、あるいは圧搾して抽出物を得る圧搾法などを用いることができる。
【００２４】
抽出に用いられる溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類の他、多価アルコール類、ケトン類、エステル類、鎖状及び環状エーテル類、ポリエーテル類、ハロゲン化炭化水素類などが挙げられ、超臨界二酸化炭素、油脂、ワックス、その他オイルなどを用いてもよい。このうち、水、アルコール類を用いるのが好ましく、水やエタノールを用いるのがより好ましい。抽出物の分離精製手段としては、例えば、活性炭処理、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、フィルター濾過、精密蒸留などを挙げることができる。
【００２５】
本発明に用いる抽出物や天然物加工品としては、斯くして得られる抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮抽出物や乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。例えば、オリーブの果実を圧搾し、必要に応じて溶剤や酸（クエン酸、酢酸、リン酸など）を加え、得られた搾汁液や中間体を遠心分離により油層（オリーブオイル）と水層に分離し、得られた水層を溶剤、カラム、フィルターなどを用いて精製や濃縮した抽出物なども含む。
【００２６】
本発明に用いる抽出物などは、乾燥することにより粉末として用いることもでき、果汁などはそのまま噴霧乾燥などの処理をしてもよい。必要に応じてデキストリンを添加してもよい。本発明に用いる抽出物などとしては、ＤＨＰＥを２質量％以上９５質量％以下、好ましくは４質量％以上４０質量％以下、より好ましくは５質量％以上２０質量％以下、さらに好ましくは６質量％以上１０質量％以下、最も好ましくは６質量％以上９質量％以下を含有するものが望ましい。
【００２７】
オリーブ果実やオリーブ葉からの抽出物には、ＤＨＰＥのみでなく、（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）−２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−３−エチリデン−５−（メトキシカルボニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−酢酸２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチルや２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノール（ＣＡＳ登録番号５０１−９４−０）、その他のポリフェノール類が含まれる可能性がある。
有効性と安全性の観点から、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物に用いることが好ましい抽出物として、（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）−２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−３−エチリデン−５−（メトキシカルボニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−酢酸２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチルの含有濃度は、ＤＨＰＥより低濃度であり、２質量％以下が好ましく、１質量％以下がさらに好ましく、０．５％以下であることが最も好ましい。
また、２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノールの含有濃度は２０質量％以下であり、５質量％以下が好ましく、４質量％以下がさらに好ましく、３質量％以下であることが最も好ましい。
また、総ポリフェノールの含有濃度は、カテキン換算量として、６０質量％以下が好ましく、５５質量％以下がより好ましく、５０質量％以下がさらに好ましく、４５質量％以下であることが最も好ましい。
【００２８】
ＤＨＰＥは、肝コレステロールエステル合成抑制作用、肝コレステロール合成抑制作用、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク遺伝子発現抑制作用、アポリポタンパクＢ１００遺伝子発現抑制作用、アポリポタンパクＢ１００分泌抑制作用を有することが見いだされた。このことから、ＤＨＰＥはＶＬＤＬ合成抑制作用を有すると考えられる。
【００２９】
従って、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物として使用することができ、さらに肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
また、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、肝コレステロールエステル合成抑制用経口組成物として使用することができ、さらに肝コレステロールエステル合成抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
また、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、肝コレステロール合成抑制用経口組成物として使用することができ、さらに肝コレステロール合成抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
また、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制用経口組成物として使用することができ、さらにミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
また、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、アポリポタンパクＢ１００合成抑制用経口組成物として使用することができ、さらにアポリポタンパクＢ１００合成抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
また、ＤＨＰＥ又はそれを含む抽出物などは、アポリポタンパクＢ１００分泌抑制用経口組成物として使用することができ、さらにアポリポタンパクＢ１００分泌抑制用経口組成物を製造するために使用することができる。
【００３０】
本発明の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物は、肝臓でのコレステロールエステル合成、コレステロール合成、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成、アポリポタンパクＢ１００合成、アポリポタンパクＢ１００分泌、ＶＬＤＬ合成などを抑制するための、ヒト若しくは動物用の医薬品などとして使用可能である。
また、肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物は、肝臓でのコレステロールエステルやコレステロール、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク、アポリポタンパクＢ１００、ＶＬＤＬなどの合成に対する抑制作用を有することなどを特徴とし、その作用機序や関連する医学的用語を、上記ヒト若しくは動物用の医薬品などに表示することができる。
さらには、脂質代謝異常（高脂血症）やメタボリックシンドローム、動脈硬化症の改善、予防、緩和、軽減又は治療をコンセプトとし、その旨や関連する医学的用語などを、上記ヒト若しくは動物用の医薬品などに表示することができる。
【００３１】
本発明の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物を医薬品などとして用いる場合の形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤などが挙げられる。
また、このような種々の剤型の製剤を製造するにおいて、許容される範囲にて賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤などを適宜組み合わせて用いることができる。
【００３２】
これらの医薬品などに含有されるＤＨＰＥ量は、その使用形態により異なるが、成人１日あたりの２ｍｇ以上１００ｍｇ、好ましくは４ｍｇ以上７０ｍｇであり、より好ましくは５ｍｇ以上６０ｍｇであり、さらに好ましくは６ｍｇ以上４８ｍｇ以下であり、１２ｍｇ以上３６ｍｇ以下が最も好ましい。本発明の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物は、１日における服用（摂取）の回数は特に限定されないが、好ましくは１日あたり１回から４回である。また、本発明の肝ＶＬＤＬ合成抑制用経口組成物は、１日の服用（摂取）の時間として就寝の数時間前（通常夕食時）に服用（摂取）することが好ましいが、食事とともに服用（摂取）してもよく、特に限定されない。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
実験１：ＤＨＰＥの細胞内コレステロールエステル合成及びトリグリセリド合成に及ぼす影響
（実験方法）
セミコンフルエントになったヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、前培養として１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（正常群）もしくは０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（対照群、ＤＨＰＥ群）で２４時間培養した。
その後、正常群（１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地、[14Ｃ]酢酸１８．５ｋＢｑ）、対照群（０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地、[14Ｃ]酢酸１８．５ｋＢｑ）、ＤＨＰＥ群（０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地、[14Ｃ]酢酸１８．５ｋＢｑ、３０μＭ  ＤＨＰＥ）を設けて２４時間培養後、細胞及び培地を回収して分析に供した。
細胞及び培地の脂質はＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に従い抽出・濃縮し、薄層クロマトグラフィーにより脂質を分画した。分画した部分の放射活性はバイオイメージングアナライザ（ＢＡＳ１０００、富士写真フィルム、神奈川）を用いてカウントし、脂質抽出液の放射活性にて補正した。
【００３５】
（結果）
細胞内のコレステロールエステル合成量及びトリグリセリド合成量は、オレイン酸無添加培地（正常群）に比べてオレイン酸を添加した培地での培養（対照群）により増加したのに対し、ＤＨＰＥを同時添加した培地での培養（ＤＨＰＥ群）により有意に減少した（表１及び表２を参照）。特に、コレステロールエステル合成量はＤＨＰＥにより対照群と比較して著しく減少しており、ＶＬＤＬ合成抑制に大きく影響を与えることが明らかとなった。
【００３６】
【表１】
2014101351.tif 000002
【００３７】
【表２】
2014101351.tif 000003
【００３８】
実験２：ＤＨＰＥのアポリポタンパクＢ１００分泌量に及ぼす影響]
（実験方法）
セミコンフルエントになったヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、前培養として０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、対照群（０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＤＨＰＥ）３０μＭ群  （０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地）を設けて２４時間培養後、細胞及び培地を回収して分析に供した。
培地へのアポリポタンパクＢ１００分泌量は、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｔｅｉｎ  Ｂ  Ｋｉｔ、  ＡＬｅｒＣＨＥＫ  Ｉｎｃ.）により測定した。データは細胞タンパク質あたりの数値で示し、細胞タンパク量はＢｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ.）により測定した。
【００３９】
（実験結果）
培地中へのＤＨＰＥの３０μＭ添加により、対照群と比較してアポリポタンパクＢ１００分泌の抑制が認められた（表３を参照）。これより、ＤＨＰＥは、アポリポタンパクＢ１００の合成及び／又は分泌を抑制することが明らかとなった。
さらには、ＤＨＰＥによりＶＬＤＬ合成及び／又は分泌が抑制されることが確かとなった。
【００４０】
【表３】
2014101351.tif 000004
【００４１】
実験３：ＤＨＰＥの細胞内ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
（実験方法）
セミコンフルエントになったＨｅｐＧ２細胞を、前培養として０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、対照群（０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地）及びＤＨＰＥ群（０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地、３０μＭ  ＤＨＰＥ）を設けて２４時間培養後、細胞及び培地を回収して分析に供した。
ＨｅｐＧ２細胞からの総ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙは、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調製した。ｍＲＮＡ発現量の定量は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ-ＰＣＲ法によって行った。
脂肪酸合成タンパク（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＦＡＳ）、アポリポタンパクＢ１００（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１００、ＡＰＯＢ）、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク（Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＴＰ）の増幅プライマー及び検出用ＴａｑＭａｎプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社のＡｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ（ＦＡＳ：Ｈｓ００１８８０１２_m1、ＡＰＯＢ：Ｈｓ００１８１１４２_ｍ１、ＭＴＰ：Ｈｓ００１６５１７７_ｍ１）を使用した。また内部標準として１８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ《Ｈｓ９９９９９９０１_ｓ１）を使用し、各遺伝子の発現量は内部標準との比を算出後、対照群の平均値を１００とした相対量で示した。
【００４２】
（結果）
培地中へのＤＨＰＥの添加により、対照群と比較してＦＡＳ、ＡＰＯＢ及びＭＴＰのｍＲＮＡ発現量は何れも低下した（表４を参照）。  これより、ＤＨＰＥは、脂肪酸合成タンパク、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク、アポリポタンパクＢ１００の遺伝子発現及び合成を抑制することが明らかとなった。
【００４３】
【表４】
2014101351.tif 000005
【００４４】
上記実験１〜３で得たデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ-ｔｅｓｔもしくはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法を用いて棄却率５％で有意差検定を行った。
尚、実験培地の細胞増殖への影響（細胞毒性）については、Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ法（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、（株）同人化学研究所）を用いて評価した。培地中へのＤＨＰＥの添加は、３０μＭの濃度で細胞内タンパク質量及びＷＳＴ−８活性に影響せず、細胞増殖能に悪影響はないものと考えられた。
【００４５】
以上より、ＤＨＰＥは、ヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いた試験において、コレステロールエステル合成、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク遺伝子発現、アポリポタンパクＢ１００遺伝子発現を抑制し、さらにはアポリポタンパクＢ１００分泌を抑制した。
【００４６】
実験４：ＤＨＰＥを含有するオリーブ果実抽出物の細胞内コレステロール量に及ぼす影響
（実験方法）
実験１と同様の方法を用いて培養を行い、セミコンフルエントになったヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、前培養として１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（正常群）もしくは０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（対照群、ＤＨＰＥ群、オリーブ果実抽出物群）で２４時間培養した。
【００４７】
試験には、オリーブ果実よりオリーブオイルを採取する際に副次的に生産されるオリーブ果実果汁より高分子ポリフェノールを除去した後に、濃縮及び精製し、デキストリン添加により粉末化したオリーブ果実抽出物を用いた。
ＨＰＬＣ法による定量分析によりＤＨＰＥ含有量は約６．５（６．４〜６．６）％であった。また、（２Ｓ，３Ｅ，４Ｓ）−２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−３−エチリデン−５−（メトキシカルボニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−酢酸２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル含有量は約０．１５％であり、２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノール含有量は約２．２％であり、総ポリフェノール含有量はカテキン換算量として約３３％であった。
ＤＨＰＥ及びオリーブ果実抽出物は、ＤＨＰＥとして濃度１０ｍMになるように培地に溶解した。次に１００μMまで培地にて希釈し、直ちに試験に供した。
【００４８】
細胞内総コレステロール及びコレステロールエステル量は、細胞から脂質成分を抽出し、抽出液についてＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ Ｅｓｔｅｒ Ｑｕｅｎｔｉｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を用いて測定した。
また、細胞内脂質成分を抽出し、コレステストＴＧ（積水メディカル社）を用いてトリグリセリドを測定した。
測定に際して蛍光光度計（ＴＥＣＡＮ, ＳｐｅｃｔｒａＦｌｏｕｒ Ｐｌｕｓ）若しくは吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ, Ｅｍａｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ）で測定した。
【００４９】
（結果）
細胞内の総コレステロール量及びコレステロールエステル量は、ＤＨＰＥ又はオリーブ果実抽出物を同時添加した培地での培養（ＤＨＰＥ群、オリーブ果実抽出物群）により対照群と比較して有意に減少した（表５及び表６を参照）。特に、コレステロールエステル量は著しく減少しており、ＶＬＤＬ合成抑制に大きく影響を与えることが明らかとなった。
【００５０】
【表５】
2014101351.tif 000006
【００５１】
【表６】
2014101351.tif 000007
一方、細胞内のトリグリセリド量に対して、ＤＨＰＥは顕著な減少作用を示さなかった。これらより、ＤＨＰＥ又はオリーブ果実抽出物は肝臓でのコレステロール合成に対する抑制作用を有するが、トリグリセリド合成に対する抑制作用は非常に弱いことが明らかとなった。
【００５２】
実験５：ＤＨＰＥを含有するオリーブ果実抽出物のアポリポタンパクＢ１００分泌量に及ぼす影響
（実験方法）
実験１と同様の方法を用いて培養を行い、セミコンフルエントになったヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、前培養として１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（正常群）もしくは０．５ｍＭオレイン酸、１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ培地（対照群、ＤＨＰＥ群、オリーブ果実抽出物群）で２４時間培養した。
培養上清中のアポリポタンパクＢ１００濃度は、細胞培養液を回収し、Ｈｕｍａｎ ＡｐｏＢ−１００ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（免疫生物研究所社製）を用いて測定した。
測定に際して蛍光光度計（ＴＥＣＡＮ, ＳｐｅｃｔｒａＦｌｏｕｒ Ｐｌｕｓ）若しくは吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ, Ｅｍａｘ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ）で測定した。
【００５３】
（実験結果）
アポリポタンパクＢ１００分泌量は、オレイン酸無添加培地（正常群）に比べてオレイン酸を添加した培地での培養（対照群）により増加した。
培地中へのＤＨＰＥ又はオリーブ果実抽出物の同時添加により、対照群と比較してアポリポタンパクＢ１００分泌量の減少が認められた（表７を参照）。
【００５４】
【表７】
2014101351.tif 000008
【００５５】
以上より、ＤＨＰＥ及びＤＨＰＥを含有するオリーブ果実抽出物は、ヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いた試験において、細胞内の総コレステロール量、コレステロールエステル量を減少させ、アポリポタンパクＢ１００分泌を抑制した。
【００５６】
従って、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＤＨＰＥ）を含有することを特徴し、肝臓でのコレステロールエステル合成抑制、コレステロール合成抑制、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成抑制、アポリポタンパクＢ１００合成抑制、アポリポタンパクＢ１００分泌抑制などによる肝ＶＬＤＬ合成抑制のために用いる医薬品などを提供することが可能となった。さらには、過剰な肝ＶＬＤＬ合成に伴う症状や疾病に対する改善、予防、緩和、軽減又は治療に用いる経口組成物を提供することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により肝臓でのコレステロールエステル合成の抑制、コレステロール合成の抑制、アポリポタンパクＢ１００合成の抑制、アポリポタンパクＢ１００分泌の抑制及び／又はミクロソームトリグリセリド転送タンパク合成の抑制により、肝ＶＬＤＬ合成を抑制する医薬品などを提供することが可能となった。さらには、過剰な肝ＶＬＤＬ合成に伴う症状や疾病に対する改善、予防、緩和、軽減又は治療に用いる経口組成物を提供することが可能となった。