(57)【要約】      （修正有）【課題】生体適合性等絹本来の特性を有しつつも、強度、弾力性に優れ、末梢血管等小口径の血管へ利用できる管状構造物を提供する。【解決手段】絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含有する管状構造物のコーティング用組成物を準備する。絹フィブロインとポリウレタン系樹脂は水、有機溶媒又はこれらの混合物に分散又は溶解し、コーティング溶液とする。絹フィブロイン繊維の管状構造物を該コーティング溶液に浸漬した後、凍結、熱処理し、次いで乾燥することによりコーティング管状構造物を製造する。【選択図】図１
2014050412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含有する管状構造物のコーティング用組成物。
【請求項２】
絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を水、有機溶媒又はこれらの混合物に分散又は溶解したものである請求項１記載の管状構造物のコーティング用組成物。
【請求項３】
有機溶媒が、ヘキサフロロイソプロパノール及び／又はヘキサフロロアセトンである請求項２記載の管状構造物のコーティング用組成物。
【請求項４】
ポリウレタン系樹脂が、水性ポリウレタン系樹脂である請求項１〜３のいずれか１項記載の管状構造物のコーティング用組成物。
【請求項５】
管状構造物が、絹フィブロイン繊維が編、組、織及び絡から選ばれる１又は２以上の方法により巻かれてなる管状構造物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の管状構造物のコーティング用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のコーティング用組成物により管状構造物をコーティングする、コーティング管状構造物の製造方法。
【請求項７】
コーティングを、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を水、有機溶媒又はこれらの混合物に分散又は溶解したコーティング溶液に管状構造物を浸漬した後、凍結、熱処理し、次いで乾燥することにより行う請求項６記載のコーティング管状構造物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コーティング用組成物及びこれを用いた人工血管の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動脈硬化症等血管疾患の増加に伴い人工血管の重要性は確実に高まっている。人工血管においては、（１）安全性（急性毒性、皮内反応試験、溶血性試験、発熱性物質試験、皮膚感作性試験、細胞毒性等）、（２）機能性（伸縮性、縫合し易さ、柔軟性、切断端のほつれ難さ、人工血管壁からの出血し難さ）、（３）耐久性等が要求される。また、人工血管は、体内に移植する部位によって様々な種類が必要とされる。
【０００３】
人工血管のうち大口径のものは既に実用化され臨床使用に耐えられるものとなっている。しかしながら、口径５ｍｍ以下の小口径人工血管は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリテトラフロロエチレン（ＰＴＦＥ）等代表的な人工素材の生体不適合性による血管内膜の肥厚や血栓形成による閉塞が原因で、未だ実用化されるに至っていない。そのため、現行では、膝関節末梢等へのバイパス術は自家静脈移植が行われているが、患者への負担が大きいこと、適合する血管を持たず自家静脈移植を行うことができない患者が多数いる等問題は多い。近年、患者の高齢化や糖尿病の増加に伴い、細小血管の再生治療の需要は増加している。従って、特に末梢血管等小口径の血管に利用できる抗血栓性のある人工血管の開発が以前から強く望まれていた。
【０００４】
一方、絹糸は、高い生体親和性を有しており、細くて強く適度な弾性と柔軟性を持ち、糸の滑りがよく、結びやすくほつれ難い特性を持っていることから、手術用の縫合糸として用いられる天然繊維である。これまでに絹の高い生体適合性を利用した様々な再生絹材料が開発され、医療、生化学、食品、化粧料等幅広い分野での利用が期待されている。特に、再生医療のための材料として注目されている。
【０００５】
絹を用いた人工血管作製の試みとしては、組紐作製原理により編み込む動作を組み合わせて巻かれ、且つ繭糸相互や混繊維相互が繭糸表面に保有されているセリシンにより膠着されてなる繭糸構造物が知られている（特許文献１）。この繭糸構造物は繭糸相互がセリシンで膠着されることで、実用に耐え得る引っ張り強度になっている。
しかし、セリシンはアレルギー反応を引き起こす可能性が高いため、そのリスクを低減する観点からセリシンを除去することが望ましい。また、前記繭糸構造物は柔軟性が十分ではなく、切断端もほつれ易いため、生体適合性と術時の要求特性等絹本来の特性を保持しつつもより機能性に優れた人工血管が要望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１７３７７２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１３７０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
繭糸や生糸等を精練して得られる絹フィブロイン繊維を用いた管状構造物はセリシンによるアレルギーリスクが低く、生体適合性に優れるものの、機能性の点で十分ではない。
そこで、本発明者が検討したところ、絹水溶液にポリグリコールを混合した水溶液から得られる絹フィブロインスポンジで絹フィブロインからなる管状構造物をコーティングすれば弾力性を付与できることを見出し、先に出願した（特許文献２）。
しかしながら、実用を考慮すると、未だ弾力性等の点で満足できるものではなく、より一層機能性に優れた人工血管が要望されていた。
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、生体適合性等絹本来の特性を有しつつも、強度、弾力性に優れ、末梢血管等小口径の血管へ利用できる管状構造物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、絹の特性を活かした管状構造物について種々検討したところ、管状構造物を絹フィブロインとポリウレタン系樹脂の混合物でコーティングすれば、十分な引っ張り強度、優れた弾力性を有し、柔軟で、生体適合性と術時の要求特性を満足するより小口径の人工血管に適した管状構造物が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含有する管状構造物のコーティング用組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記コーティング用組成物により管状構造物をコーティングする、コーティング管状構造物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、絹本来の特性、すなわち高い生体適合性を有しつつも、十分な引っ張り強度、優れた弾力性を有し、柔軟で血管吻合し易く、血液の漏出が少ない管状構造物を提供することができる。この管状構造物は、抗血栓性に優れるため、特に直径５ｍｍ以下の小口径人工血管に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】家蚕絹人工血管のコーティング工程を示す図である。
【図２（ａ）】コーティング家蚕絹人工血管の走査型電子顕微鏡像を示す図である。（ａ）実施例１−４
【図２（ｂ）】コーティング家蚕絹人工血管の走査型電子顕微鏡像を示す図である。（ｂ）比較例１−３
【図３】コーティング家蚕絹人工血管の透水率を示す図である。
【図４】コーティング家蚕絹人工血管の圧縮弾性率を示す図である。
【図５】コーティング家蚕絹人工血管の吻合糸保持強度を示す図である。
【図６】術前、術後２週間の各種パラメータの変化を比較した図である。ＰＲＥ：術前の生来の頸動脈のデータ、ＰＯＳＴ  ＰＲＯＸ：術後の人工血管の近位側で得られたデータ、ＰＯＳＴ  ＤＩＳＴＡＬ：術後の人工血管の遠位側で得られたデータ、ＰＳＶ：収縮期最大流速（ｃｍ／ｓ）、ＥＤＶ拡張末期流速（ｃｍ／ｓ）、ＰＩ拍動指数（単位なし）、ＲＩ抵抗係数（単位なし）、ＣＳＤ：血管径（ｍｍ）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のコーティング用組成物は、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含む、管状構造物のコーティングに用いられる組成物である。
本発明に用いられる絹フィブロインは、家蚕又は遺伝子組み換え蚕、及びエリ蚕、柞蚕、天蚕等の野蚕の繭層から得た繭糸や生糸等を精練したものである。当該精練処理によりセリシンが除去される。
【００１４】
精練方法は、特に制限されず、公知の方法を使用できる。例えば１００℃に加熱した１２ｗ／ｖ％マルセル石鹸、８ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム混合水溶液、及び上述した繭層や繭糸、生糸等を入れ、操糸後、撹拌しながら１２０分煮沸し、その後２ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム水溶液で１０分煮沸、更に１００℃に加熱した蒸留水中で洗浄する操作を３回行った後、乾燥することでフィブロインを覆う蛋白質（セリシン）や、その他脂肪分等を除去できる。
【００１５】
絹フィブロインは、絹フィブロイン繊維を水及び／又は有機溶媒に溶解した絹フィブロイン溶解物を用いるのが好ましい。例えば、絹フィブロイン繊維を水及び／又は有機溶媒に溶解したもの；絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液に溶解、加熱した後、得られた絹フィブロイン／塩水溶液を脱塩処理したもの；脱塩処理後の溶解液を、更に有機溶媒に溶解したもの、等が挙げられる。
【００１６】
ここで、中性塩水溶液としては、例えば臭化リチウム、塩化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウム等が挙げられる。また、脱塩処理の方法としては、公知の方法、例えば透析法、逆浸透法等を採用することができる。脱塩後、必要に応じて水溶液から水を除去し乾燥物としてもよい。この場合、通常は水溶液をプレートに展開し、水を蒸発させて絹フィブロインのフィルムを作製したり、スプレー乾燥等を行ったりして粉末状とする。また、蒸留水を加えて、例えば絹フィブロイン濃度２ｗ／ｖ％以下の水溶液を調製し、凍結乾燥を行ってスポンジ状（多孔質状）としてもよい。これらのうち、取扱性・保存性の点から、凍結乾燥するのが好ましい。
【００１７】
有機溶媒としては、例えばヘキサフロロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフロロアセトン（ＨＦＡ）が挙げられる。通常、ＨＦＡは水和物として安定に存在するため、ＨＦＡ水和物を用いるのが好ましい。ＨＦＩＰとＨＦＡはそれぞれ単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。
水、有機溶媒に溶解する絹フィブロイン濃度は、通常３〜２０ｗ／ｖ％程度であり、好ましくは３〜１５ｗ／ｖ％である。
【００１８】
本発明に用いられるポリウレタン系樹脂は、ポリイソシアネートとポリオールを主原料に、常法に従って反応させることにより得られる樹脂である。ポリウレタン系樹脂としては、特に限定されず、ポリカーボネート系ウレタン樹脂、ポリエステル系ウレタン樹脂、ポリエーテル系ウレタン樹脂、シリコーン変性ウレタン樹脂、フッ素変性ウレタン樹脂、ポリアミノ酸系ウレタン樹脂等が挙げられる。
【００１９】
ポリイソシアネートとしては、分子内に２個以上のイソシアネート基を有する化合物であれば特に限定されず、例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート等の脂肪族ジイソシアネート；イソホロンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、ノルボルナンジイソシアネート等の脂環式ジイソシアネート；トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、トリジンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート等の芳香族ジイソシアネート等が挙げられる。これらは単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
また、ポリオールとしては特に限定されず、例えば、ポリエチレンアジペートジオール、ポリエチレンプロピレンアジペートジオール、ポリブチレンアジペートジオール、ポリエチレンブチレンアジペートジオール、ポリヘキサメチレンアジペートジオール、ポリジエチレンアジペートジオール、ポリエチレンテレフタレートジオール、ポリエチレンイソフタレートジオール、ポリヘキサメチレンイソフタレートアジペートジオール、ポリエチレンサクシネートジオール、ポリブチレンサクシネートジオール、ポリエチレンセバケートジオール、ポリブチレンセバケートジオール、ポリ−ε−カプロラクトンジオール等のポリエステルポリオール；ポリオキシテトラメチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンプロピレングリコール等のポリエーテルポリオール；ポリヘキサメチレンカーボネートジオール等のポリカーボネートポリオール；特開２０００−１１９３６２号公報に記載されているようなアクリルポリオール、ダイマージオールが挙げられる。これらは単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
本発明に用いられるポリウレタン系樹脂は、水性（水溶性又は水分散性）ポリウレタン系樹脂であることが好ましい。
水性ポリウレタン系樹脂は、常法により製造することができるが、ポリウレタン系樹脂に水性を付与する方法として、例えば、ウレタン骨格中にアニオン性基又はカチオン性基のイオン性基を導入するか、ノニオン性基を導入する方法が挙げられる。また、界面活性剤等の乳化剤を使用して強制乳化させてもよい。イオン性基としては、−ＣＯＯ-基、−ＳＯ3-基等のアニオン基、＝Ｎ+＝基、＝Ｐ+＝基等のカチオン基が挙げられ、特に−ＣＯＯ-基が好ましい。
【００２２】
イオン性基を有する水性ポリウレタン系樹脂は、例えば、上記ポリイソシアネート、ポリオール、イオン性親水基を付与する化合物、必要により公知の鎖伸張剤等を適宜用いて、ワンショット法やプレポリマー法等により製造することができる。
ここで、イオン性親水基を付与する化合物としては、特に限定されないが、アニオン性親水基を付与するものとして、例えば、２，２−ジメチロールプロピオン酸、２，２−ジメチロールブタン酸等を挙げることができる。これらはトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ−ｎ−プロピルアミン、トリブチルアミン、トリエタノールアミン等のアミン類、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、アンモニア等で中和して用いられる。
また、カチオン性基を付与するものとして、アルカノールアミン類が好ましく、例えばＮ−メチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン等を挙げることができる。これらは塩酸、硝酸、蟻酸、酢酸等の各種有機酸や無機酸等で中和して、あるいはジメチル硫酸、ジエチル硫酸、塩化ベンジル、エピクロルヒドリン等で４級化して用いられる。
これらは単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２３】
水性ポリウレタン系樹脂は、市販品を用いてもよい。例えば、ネオステッカー１００Ｃ（日華化学）、エバファノール（日華化学）等の水分散性ポリウレタン系樹脂を用いることができる。
【００２４】
本発明のコーティング用組成物中、絹フィブロインの含有量は生体適合性の点から、０．１〜１０質量％が好ましく、０．２〜５質量％が好ましい。
【００２５】
また、本発明のコーティング用組成物中、ポリウレタン系樹脂の含有量は、樹脂の種類によって相違するが、例えば水分散性ポリウレタン系樹脂の場合、５〜５０質量％が好ましく、１５〜３０質量％が好ましい。
【００２６】
絹フィブロインとポリウレタン系樹脂の配合比（質量比）は、５０：１〜１：１００の範囲とすることが引っ張り強度、弾力性向上の点から好ましく、更に１０：１〜１：１００、特に１：１〜１：１００が好ましい。
【００２７】
本発明のコーティング用組成物は、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を水、有機溶媒又はこれらの混合物に溶解又は分散したものであるのが好ましい。
ポリウレタン系樹脂として水性ポリウレタン系樹脂を用いる場合は、水に溶解又は分散したものであるのが好ましく、他方、非水性ポリウレタン系樹脂を用いる場合は、有機溶媒に溶解したものであるのが好ましい。なかでも、引っ張り強度、弾力性向上の点から、絹フィブロインと水性ポリウレタン系樹脂を水に溶解乃至分散させた組成物が好ましい。
この場合、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂はどちらか一方を先に水及び／又は有機溶媒に溶解又は分散した後に、他方を溶解又は分散してもよく、両者を混合してから溶解又は分散させてもよい。また、例えば、上記のように絹フィブロイン繊維を水、有機溶媒に溶解させた絹フィブロイン溶解物と、ポリウレタン系樹脂を混合してもよい。
なお、有機溶媒としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００２８】
本発明のコーティング管状構造物は、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含有するコーティング液を調製し、該コーティング液で管状構造物の最内壁及び／又は最外壁をコーティングすることにより製造される。当該コーティング液には、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂の他、適宜任意成分を含有させることができる。例えば、ヘパリン等の抗血栓剤、内皮細胞成長因子等を含有させることができる。
【００２９】
本発明における管状構造物は、特に限定されず、種々の素材から構成された管状構造物を用いることができる。例えば、ＰＥＴやＰＴＦＥ製、絹フィブロイン製のもの等が挙げられる。なかでも、絹フィブロインからなる管状構造物が好ましい。
【００３０】
絹フィブロインからなる管状構造物としては、例えば絹フィブロイン繊維が編、組、織及び絡から選ばれる１又は２以上の方法により巻かれてなる管状構造物が挙げられる。絹フィブロイン繊維を管状に構成するには、公知の編法、組法、織法、絡法を用いることができる。また、絹フィブロイン繊維を用いて予め作製した編物や織物、その筒状物等を用いてもよい。繭糸、生糸を用いる場合は、管状に形成した後、セリシンを除去するのが好ましい。
【００３１】
例えば、絹フィブロイン繊維を編組する方法としては、特に制限されず、例えば八つ打ち、十二打ち、十六打ち等公知の組紐技術を用いることができる。具体的には、煮繭から解いた繭糸又は精錬糸を熱可塑性樹脂製芯棒等に巻き付け、絹フィブロイン繊維を組むことにより行われる。ここで、熱可塑性樹脂製芯棒は、目的とする管状構造物の大きさに応じて、外径１〜５ｍｍ、好ましくは２〜５ｍｍのものを用いることができる。熱可塑性樹脂としては、特に制限されず、例えばポリオレフィン、ポリエステル、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。
【００３２】
また、絹フィブロイン繊維をニット編みして管状に形成すれば、弾力性に富み、且つ柔軟で、引っ張り強度に優れ、切断端のほつれ難い管状構造物とできる。ニット編みには、例えば、丸編（横編）、縦編、フルファッション、ラッシェル、トリコット等がある。ニット編み機は、特に制限されない。得られた絹布を前記熱可塑性樹脂製芯棒等に巻き付けて管状に形成すればよい。
【００３３】
本発明のコーティング用組成物で管状構造物をコーティングする方法は、特に限定されるものでないが、上記コーティング液に管状構造物を浸漬した後、凍結、熱処理し、次いで乾燥するのが好ましい。
浸漬処理は、特に制限されないが、常温、常圧下或いは減圧下で行われる。浸漬時間は、５〜３０分間、特に１０〜２０分間が好ましい。
【００３４】
浸漬後、−２０℃〜−１９６℃、好ましくは−５０℃〜−１００℃で、０．５分〜２時間凍結させる。凍結処理後、さらに凍結真空乾燥してもよい。凍結真空乾燥をする場合、絹フィブロインと水性ポリウレタン系樹脂を水に溶解乃至分散させたコーティング液を用いるのが好ましく、これにより、絹フィブロインが不溶化し微細な多孔質構造となって、より弾力性屈曲性に優れた管状構造物が得られる。
【００３５】
熱処理は、１００℃以上の温度で行うことが好ましく、１２０℃以上がより好ましい。熱処理は、オートクレーブ等の密閉加圧装置を用いてもよい。オートクレーブを用いる場合、１２０℃以上で２０〜４０分間が好ましい。
【００３６】
乾燥処理は、例えば、天然乾燥、加熱乾燥、真空乾燥等の方法が挙げられる。乾燥温度は、１５℃〜１５０℃、好ましくは５０℃〜８０℃で、時間は３０分〜１時間するのが好ましい。
【００３７】
このようにして、管状構造物の最内壁及び／又は最外壁がコーティングされる。
本発明において、管状構造物に形成されるコーティング層は、単層でもよいが、二層や三層、四層等の多層のコーティング層を有するコーティング管状構造物としてもよい。
コーティング層の厚さは、特に限定されないが、最内壁部は０．００５〜０．５ｍｍ、最外壁部は０．１〜１．０ｍｍが好ましい。
【００３８】
本発明のコーティング管状構造物は、管状構造物の最内壁、最外壁のどちらか一方だけが、絹フィブロインとポリウレタン系樹脂を含有するフィルムコーティング用組成物でコーティングされていてもよく、両方がコーティングされていてもよい。血液の漏洩を防ぐ点、引っ張り強度・弾力性向上の点からは、管状構造物の最内壁が該フィルムコーティング用組成物でコーティングされているのが好ましい。この場合、他方は任意のコーティング剤でコーティングされていてもよい。このような他のコーティング剤として、一般的なコーティング剤、例えば、ポリウレタン系樹脂、ゼラチン等が挙げられる。
【００３９】
このようにして得られる本発明のコーティング管状構造物は、例えば人工血管、人工気管、ステントグラフト、その他動物の生体の管状構造物の代用品として用いることができる。特に、絹の優れた生体適合性及び抗血栓性から、直径５ｍｍ以下、好ましくは１〜５ｍｍ以下の小口径人工血管に好適である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００４１】
製造例１
＜家蚕絹フィブロイン溶解物の調製＞
家蚕繭を鋏で細かく切断（約２ｍｍ×１０ｍｍ程度）又は家蚕繭を繰糸し、定法により精練して、フィブロインを覆うタンパク質（セリシン）やその他脂肪分等を除去した絹フィブロイン繊維を得た。
次いで、この絹フィブロイン繊維を９Ｍ臭化リチウム水溶液に１５ｗ／ｖ％となるように溶解した。この水溶液を、セルロース透析膜（ＶＩＳＫＡＳＥＳＥＬＥＳ  ＣＯＡＰ社製  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｔｕｂｉｎｇ  ３６／３２）を用いて、３日間純水で透析を行い、塩化リチウムを取り除き、さらに遠心分離にて、溶け残りやゴミ等を除去し、家蚕絹フィブロイン溶解物を得た。家蚕絹フィブロイン溶解物中の絹フィブロイン濃度は３〜８ｗ／ｖ％であった。
【００４２】
製造例２
＜家蚕絹人工血管の作成＞
１．組み機を用いた小口径絹グラフトの作製
人工血管の作製には、組紐作製装置（１６打）（（株）コクブンリミテッド製）を用いた。ボビンには、上記定法により精練した絹フィブロイン繊維を巻いた。同機の中心部部分に、外径１〜５ｍｍの塩化ビニル、または、ポリテトラフルオロエチレン製芯棒を装着し、芯棒の周囲に絹フィブロイン繊維を組み、家蚕絹人工血管（内径１．５〜５ｍｍφ）を得た。
【００４３】
製造例３
＜コーティング用組成物の調製＞
製造例１で得た家蚕絹フィブロイン溶解物（ＳＩ）と水分散性ポリウレタン（ＰＵ、ネオステッカー１００ｃ、日華化学（株）製、ポリウレタン濃度３０ｗ／ｖ％）を体積比で１：１０、１０：１０、１：４、１：２の割合でそれぞれ混合して、コーティング用組成物（１）、（２）、（３）及び（４）を得た。
さらに、前記水分散性ポリウレタンのみを用いたコーティング用組成物（５）と、家蚕絹フィブロイン溶解物のみを用いたコーティング用組成物（６）を得た。
【００４４】
実施例１
＜家蚕絹人工血管のコーティング＞
コーティング用組成物（５）中に、芯棒を装着したままの家蚕絹人工血管（内径４ｍｍφ）を常圧下で１０分浸漬した後、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。この操作をもう一度繰り返した。次いで、凍結させた家蚕絹人工血管を１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理した後、芯棒から分離し、５０℃に設定した乾燥機中にて１時間乾燥することで家蚕絹人工血管の外壁を二層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
その後、シリンジを利用して家蚕絹人工血管の内壁にコーティング用組成物（１）を６ｍＬ流した後、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。この操作をもう一度繰り返した。次いで、室温で３０分乾燥した後、１２０℃に設定した乾燥機中にて２時間乾燥して家蚕絹人工血管の内壁を二層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。コーティング条件を表１に示す（以下、同じ）。
【００４５】
比較例１
＜家蚕絹人工血管のコーティング＞
実施例１と同様にして、家蚕絹人工血管の最外壁を、コーティング用組成物（５）で二層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
その後、コーティング用組成物（１）をコーティング用組成物（６）に代えた以外は実施例１と同様にして家蚕絹人工血管の内壁を二層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
【００４６】
実施例２〜３並びに比較例２〜３
＜家蚕絹人工血管のコーティング＞
図１に示すように、コーティング用組成物（５）中に、芯棒を装着したままの家蚕絹人工血管（内径４ｍｍφ）を常圧下で１０分間浸漬した後、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。−８０℃の冷凍庫に１時間保存し、凍結真空乾燥にて１２時間処理を行なった。１０分間の浸漬から凍結乾燥までを２回繰り返した。次いで、該家蚕絹人工血管を１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理した後、純水に１５分間浸漬して芯棒から分離し、５０℃に設定した乾燥機中にて１時間乾燥することで家蚕絹人工血管の外壁をニ層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
その後、シリンジを利用して家蚕絹人工血管の内壁に、コーティング用組成物（１）、（２）、（５）又は（６）をそれぞれ６ｍＬ流し、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。−８０℃の冷凍庫に１時間保存し、凍結真空乾燥にて１２時間処理を行なった。それから、１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理を施した。
次いで、家蚕絹人工血管を５０℃の純水に浸漬、１２時間放置する操作を、水を替えて６回繰り返した。次いで、５０℃で乾燥して、家蚕絹人工血管の最内壁を単層コーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
【００４７】
実施例４
＜家蚕絹人工血管のコーティング＞
コーティング用組成物（５）中に、芯棒を装着したままの家蚕絹人工血管（内径４ｍｍφ）を常圧下で１０分間浸漬した後、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。−８０℃の冷凍庫に１時間保存し、凍結真空乾燥にて１２時間処理を行なった。次いで、該家蚕絹人工血管を１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理した後、純水に１５分間浸漬して芯棒から分離し、５０℃に設定した乾燥機中にて１時間乾燥することで家蚕絹人工血管の最外壁を単層コーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
その後、シリンジを利用して家蚕絹人工血管の内壁に、コーティング用組成物（１）を６ｍＬ流し、実施例２と同様にして家蚕絹人工血管の最内壁を単層コーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
【００４８】
【表１】
2014050412.tif 000003
【００４９】
試験例１  形態観察試験
実施例１〜４並びに比較例１〜３で得られた各コーティング家蚕絹人工血管の形態観察を走査型電子顕微鏡（（株）キーエンス製ＶＥ７８００）を用いて行った。
図２に示すように、各コーティング家蚕絹人工血管の外表面、内表面、断面は、管状構造物に沿って微細な多孔質で覆われた構造を形成していた。特に、真空乾燥の操作をコーティングの途中に入れることによって、殆ど、穴の認められない人工血管を作製することができた。他方、絹フィブロインのみで人工血管の内壁をコーティングしたもの（比較例１）は、大きな穴が開いていた。
【００５０】
試験例２  透水率の測定
実施例１〜３並びに比較例１で得た各コーティング家蚕絹人工血管の側壁からの漏水量を定量的に測定するため、ＩＳＯ７１９８のガイダンスに沿って試験を行った。各コーティング家蚕絹人工血管の側壁に、１２０ｍｍＨｇの水圧がかかるように水を落下させ、人工血管を通過して固定治具から放出された１分間単位面積あたりの漏水量（透水率）を測定した。５回試験を行い、その平均値を求めた。結果を図３に示す。
【００５１】
漏水量は、実施例１で９０．６４(ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎ）、実施例２で３．１２(ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎ）、実施例３で０．２４(ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎ）、実施例４で７．３２(ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎ）であった。真空乾燥の操作をコーティングの途中に入れることによって、漏水量は大幅に減少した。他方、比較例１で６４７．２(ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎ）であった。
なお、市販の人工血管でプレクロッティング(前血処理)が必要ないダクロン製人工血管の透水率は公表値１〜１０ｍＬ/ｃｍ2/ｍｉｎである。
【００５２】
試験例３  圧縮弾性率の測定
実施例２〜３並びに比較例２〜３で得た各コーティング家蚕絹人工血管を０．５cｍの長さにカットして、圧縮力を周軸方向にかけた。人工血管の直径を１０％減少させるまでの圧縮弾性率（Ｎ／ｍｍ2）（直径の変化を横軸に、圧縮力を縦軸としてプロットし、その傾きから求める）を求めた。５回試験を行い、その平均値を求めた。結果を図４に示す。
【００５３】
図４より、実施例２及び３で得たコーティング家蚕絹人工血管の弾性率は、絹フィブロインのみで人工血管の内壁をコーティングしたもの（比較例２）と比べて、周軸方向の柔軟性が向上したことが確認された。
【００５４】
試験例４  吻合糸保持強度の測定
実施例２〜３並びに比較例２〜３で得た各コーティング家蚕絹人工血管を、ＩＳＯ７１９８のガイダンスに沿って試験を行った。５回試験を行い、その平均値を求めた。結果を図５に示す。
【００５５】
図５より、実施例２及び３で得たコーティング家蚕絹人工血管は、絹フィブロインのみで人工血管の内壁をコーティングしたもの（比較例２）と同等の吻合糸保持強度を有していることが確認された。
【００５６】
実施例５
＜家蚕絹人工血管のコーティング＞
コーティング用組成物（５）中に、芯棒を装着したままの家蚕絹人工血管（内径４ｍｍφ）を常圧下で１０分間浸漬した後、液体窒素に１分間浸漬して凍結させた。−８０℃の冷凍庫に１時間保存し、凍結真空乾燥にて１２時間処理を行なった。コーティング用組成物（３）、（４）、（２）の順に代えて、１０分間の浸漬から凍結真空乾燥までを４回繰り返した。次いで、該家蚕絹人工血管を１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理した後、純水に１５分間浸漬して芯棒から分離し、５０℃に設定した乾燥機中にて１時間乾燥することで家蚕絹人工血管の外壁を四層にコーティングしたコーティング家蚕絹人工血管を得た。
【００５７】
試験例５  イヌへの移植試験
＜術式＞
イヌ（ビーグル犬、雌性、１歳齢）への麻酔はアトロピン（０．１ｍｌ／ｋｇ、アトロピン注）、ミダゾラム（０．０４ｍｌ／ｋｇ、ミダゾラム注１０ｍｇ「サンド」）、ブトルファノール（０．０４ｍｌ／ｌｇ、ベトルファール注）の前処置後、プロポフォール（ベトルファール）を用いて導入、挿管し、麻酔の維持はイソフルランを用いて行った。術野を刈毛後、アルコール、クロルヘキシジンを用いて消毒し、ドレーピングした。血管にアプローチする前にヘパリン（１００ＩＵ／ｋｇ、ヘパリン注）を静脈内投与し、活性化凝固時間（ＡＣＴ）が２００以上になっていることを確認後、血管への操作を開始した。術中は２０分おきにＡＣＴを確認し、２００以下になっていることが確認された場合にはヘパリンを追加投与した。
頚部正中切開にてアプローチ後、右側総頸動脈を約５ｃｍにわたり剥離し、絹糸にて支持した。ブルドッグ鉗子にて剥離した血管の両端を鉗圧して、血行を遮断後、約３ｃｍの頸動脈を鋏にて切除し、切除した血管を置き換える形で実施例５作製したコーティング家蚕絹人工血管を移植した。人工血管の縫合は手術用ルーペを用いた拡大視野下にて行い、血管縫合は９ｍｍ、３／８の丸針付きの７／０の太さのポリフッ化ビニリデンモノフィラメント（ＰＲＥＭＩＯ，２６ＳＺ０５ＡＧ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＳＵＲＧＩＣＡＬ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて１０−１２カ所の結節縫合にて端々吻合を実施した。縫合後は血液の漏れがないことを確認し、漏れが確認された部位に関しては、Ｚ縫合を追加して出血のコントロールを行った。出血のコントロールが確認された後に皮下組織、および真皮を３／０の吸収糸（グリコライド・ジオキサノン・トリメチレンカーボネート、バイオシン１／２丸針  針長２２ｍｍ）を用いて縫合閉鎖した。
【００５８】
＜術後管理＞
術後は一般的な術創の消毒、全身的な抗生物質の投与に加え、抗凝固療法を行った。低分子ヘパリン（ダルテパリンナトリウム注射液、ヘパクロン注５０００、エール薬品）の皮下投与２５００ＩＵ／ｄａｙ  ＢＩＤ  を２１日間、Ａｓｐｉｒｉｎ（０，５ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）の投与を継続して実施した。
【００５９】
＜移植血管のエコーによる評価＞
移植血管の開存性と血管内腔の血流の評価を行うために、超音波画像診断装置（Ａｌｏｋａ  ＰｒｏＳｏｕｎｄＳＳＤ−α１０）を用いた観察を経時的に行った。測定は動物の体動の影響を除外するために、プロポフォールの静脈内微量投与下における鎮静下で実施した。使用した電子リニア探蝕子は浅部表在用のＵＳＴ−５５２４−７．５であり、収縮期最大流速（Ｐｅａｋ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ：  ＰＳＶ）、拡張末期流速（Ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ：ＥＤＶ）、拍動指数  （Ｐｕｌｓａｔｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ：ＰＩ）、抵抗係数（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ：ＲＩ）、収縮期加速時間（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＡＴ）、人工血管内径の測定を人工血管の前後を含めて計７カ所（１．総頸動脈近位部、２．近位吻合部、３．人工血管近位部、４．人工血管中部、５．人工血管遠位部、６．遠位吻合部、７．総頸動脈遠位部）で行った。同時にカラードプラ、ｅ−ｆｌｏｗ、ソナゾイドを用いた超音波造形検査も駆使し、乱流、狭窄、プラークの形成についても評価した。
【００６０】
＜結果＞
植え込み時におけるトラブルはなく、順調に移植手術は終了し、術後の動物の一般状態には問題がなかった。エコーによる評価の結果は、術後２週間で観察された像では乱流、狭窄、プラークの形成も認められず、良好な血流が保たれていた。各種エコーパラメータによる評価においても、術前と術後２週間では各パラメータ値の変動は認められず、術後の狭窄や閉塞が認められなかっただけでなく、術前の生来の血管壁と類似したパラメータ値が、植え込み後２週間の人工血管においても確認された（図６）。
血管において、血流は拍動に合わせて間欠的に流れ、またその際に血管壁は伸展を繰り返すことによって生理的な血流を作り出している。このように、高い生体適合性を有しつつも、生来の血管壁に近い物理学的性質を有する人工血管は、より生理的な環境を提供することで血管の機能を維持することが可能であると考えられた。
【図１】
2014050412.tif 000004
【図２（ａ）】
2014050412.tif 000005
【図２（ｂ）】
2014050412.tif 000006
【図３】
2014050412.tif 000007
【図４】
2014050412.tif 000008
【図５】
2014050412.tif 000009
【図６】
2014050412.tif 000010