(57)【要約】【課題】過活動膀胱を予防又は改善する、過活動膀胱の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】下記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤。2014144942.tif 000011【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤。
【化１】
2014144942.tif 000008
【請求項２】
過活動膀胱の予防又は改善がＡＴＰ放出抑制によるものである、請求項１記載の過活動膀胱の予防又は改善剤。
【請求項３】
下記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、ＡＴＰ放出抑制剤。
【化２】
2014144942.tif 000009
【請求項４】
下記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、頻尿の予防又は改善剤。
【化３】
2014144942.tif 000010
【請求項５】
頻尿の予防又は改善がＡＴＰ放出抑制によるものである、請求項４記載の頻尿の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過活動膀胱の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過活動膀胱（overactive  bladder:  OAB）は泌尿器系の疾患で、頻尿、尿意切迫感、切迫性尿失禁といった症状を伴う。これらの症状は、日常生活に大きな支障を与え生活の質を低下させる。その程度は、糖尿病と同程度とも言われている。有病率は加齢に伴い上昇し、超高齢化社会の日本では４０歳以上の罹患者は約８１０万人にものぼると推定されている。
近年、過活動膀胱の原因として、膀胱の求心性神経活動の亢進が指摘されている。求心性神経活動の亢進は、蓄尿に伴う膀胱の伸展刺激を受けて膀胱上皮細胞から放出されるアデノシン三リン酸（adenosine  triphosphate:以下ＡＴＰと略記する）やアセチルコリン（acetylcholine）等の神経伝達物質により起こると考えられている。ヒトは加齢に伴い膀胱上皮細胞から放出されるＡＴＰ量が増加すること、及び過活動膀胱患者では膀胱伸展時のＡＴＰ放出量が増大することが報告されている（非特許文献１参照）。また、ラットの膀胱にＡＴＰを投与すると、排尿筋過活動が誘発され、排尿間隔が短縮することも報告されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
現在、過活動膀胱の薬物治療には、抗コリン薬が用いられている。抗コリン薬は、膀胱の排尿筋の収縮を促進するアセチルコリンの作用を阻害する。しかし、抗コリン薬は、患者によっては明確な症状改善効果が見られない、副作用として口渇や便秘等の症状を呈する等、問題点も多く、より効果的な予防・改善方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本脊髄障害医学会雑誌，2005年，第18巻，p．18-19
【非特許文献２】Journal  of  Urology，2002年，第168巻，p．1230-1234
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗コリン薬は、放出されたアセチルコリンが膀胱平滑筋の受容体へ結合するのを阻害するが、これはいわゆる対症療法であり、効果の点から十分な治療法とは言い難い。また、抗コリン薬には、上述のような副作用もある。これに対し、過活動膀胱の原因である膀胱上皮細胞からの過度のＡＴＰ放出を抑制することができれば、過活動膀胱の原因療法となり得る。
【０００６】
本発明は、膀胱上皮細胞からの異常なＡＴＰ放出を抑制しうる、過活動膀胱の予防又は改善剤を提供することを課題とする。また、本発明は、過活動膀胱の症状、すなわち頻尿、尿意切迫感又は切迫性尿失禁の予防又は改善剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、膀胱上皮細胞からのＡＴＰ放出を抑制する、ＡＴＰ放出抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み、過活動膀胱の原因となる膀胱上皮細胞からのＡＴＰ放出を抑制しうる物質について鋭意検討を行った。その結果、特定の化合物にＡＴＰ放出を抑制する作用があり、過活動膀胱の予防又は改善に有用であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
本発明は、下記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤に関する。
【０００９】
【化１】
2014144942.tif 000002
【００１０】
また、本発明は、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、ＡＴＰ放出抑制剤に関する。
さらに、本発明は、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、頻尿の予防又は改善剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の過活動膀胱の予防又は改善剤は、膀胱上皮細胞からのＡＴＰ放出を抑制し、過活動膀胱とそれに伴う症状である頻尿、尿意切迫感、切迫性尿失禁を予防又は改善することができる。また、本発明のＡＴＰ放出抑制剤は、膀胱上皮細胞からのＡＴＰの放出を抑制することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の過活動膀胱の予防又は改善剤、頻尿の予防又は改善剤（以下、これらをまとめて「本発明の予防・改善剤」ともいう）、及びＡＴＰ放出抑制剤は、前記式（１）〜（４）のいずれかで表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする。
【００１３】
式（１）で表される化合物は、リナロールである。式（１）で表される化合物には、光学異性体が存在する（Chirality，2010  Jan，22(1)，110-9参照）。本発明において、式（１）で表される化合物にはこれらの異性体が包含され、各異性体を単独又は混合して用いることができる。
【００１４】
式（２）で表される化合物は、リナロールオキシドである。式（２）で表される化合物には、光学異性体が存在する（Chirality，2010  Jan，22(1)，110-9参照）。また、式（２）で表される化合物には、下記に示す構造異性体が存在する。本発明において、式（２）で表される化合物にはこれらの異性体が包含され、各異性体を単独又は混合して用いることができる。
【００１５】
【化２】
2014144942.tif 000003
【００１６】
式（３）で表される化合物は、ミルセンである。
【００１７】
式（４）で表される化合物は、ボルネオールである。式（４）で表される化合物には、光学異性体が存在する（Biochem.  Pharmacol.，2005  Apr  1，69(7)，1101-11参照）。本発明において、式（４）で表される化合物にはこれらの異性体が包含され、各異性体を単独又は混合して用いることができる。
【００１８】
前記式（１）〜（４）で表される化合物の製造方法に特に制限はなく、通常の有機化学的合成により得ることもできるし、天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、試薬として市販されているものを式（１）〜（４）で表される化合物として用いることもできる。
式（１）で表される化合物は、例えば、香料化学総覧ＩＩ（廣川書店、１９８０年、Ｐ５４１）に記載の方法を参考に、メチルヘプテノンにアセチレンを、ナトリウムアミド（ＮａＮＨ２）存在下で縮合させてデヒドロリナロールとし、これをエーテル溶液中、金属ナトリウムで還元することにより得られる。
式（２）で表される化合物は、例えば、香料化学総覧ＩＩ（廣川書店、１９８０年、Ｐ６９５）に記載の方法を参考に、リナロールを過モノフタル酸などの有機過酸化物で酸化し、生成物を加熱することにより得られる。この方法では、まず式（２）で現されるリナロールモノエポキサイドが生成し、異性化により上記４つのフラノイド型又はピラノイド型の異性体が単離される。
【００１９】
式（３）で表される化合物は、例えば、香料化学総覧ＩＩ（廣川書店、１９８０年、Ｐ３９５）に記載の方法を参考に、リナロールを銅触媒上、１３０〜１４０℃で通過させて脱水することにより得られる。
式（４）で表される化合物は、例えば、香料化学総覧ＩＩ（廣川書店、１９８０年、Ｐ６０５）に記載の方法を参考に、ショウノウを金属ナトリウムとアルコールで還元することにより得られる。
【００２０】
本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤には、前記式（１）〜（４）の化合物のいずれかを単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。
【００２１】
前述のように、過活動膀胱患者では膀胱伸展時のＡＴＰ放出量が増大していること、ラットの膀胱にＡＴＰを投与すると、排尿筋過活動が誘発され排尿間隔が短縮すること、が報告されている。さらに、ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｘ３）のアンタゴニストをラット静脈内へ投与すると、排尿間隔が延長されるとの報告もなされている（J.  Chin.  Med.  Assoc.，2007年，第70巻，p．439-444）。これらの報告から、過活動膀胱患者に見られる膀胱伸展時のＡＴＰ放出量の増大を抑制することで、過活動膀胱及びその症状である頻尿、尿意切迫感、切迫性尿失禁を予防・改善し得ると考えられる。
後記実施例でも示すように、前記式（１）〜（４）の化合物は、膀胱の伸展刺激による膀胱上皮細胞からのＡＴＰ放出を抑制する作用を有する。そのため、これらの化合物は、膀胱上皮細胞からのＡＴＰの放出を抑制し、過活動膀胱及びその症状である頻尿、尿意切迫感、切迫性尿失禁を予防・改善するために使用することができる。
上記使用は、治療的使用（即ち医療行為）であっても非治療的使用（非医療的な行為）であってもよい。また、上記使用の対象は、ヒト、非ヒト動物、又はそれらに由来する検体であり得る。なお、前記「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００２２】
前記式（１）〜（４）のいずれかで表される化合物を有効成分とする過活動膀胱又は頻尿の予防・改善剤、及びＡＴＰ放出抑制剤は、上記使用の具体的態様の１つであり、治療的用途（医療用途）、非治療用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。具体的には、医薬品、医薬部外品等としての使用することができる他、各種の飲食品、飼料、ペットフード等に有効成分としてこれらの剤を配合することもできる。
本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤は、液状、固形状、乳液状、ペースト状、ゲル状、パウダー状（粉末状）、顆粒状、ペレット状、スティック状等、ヒトや動物に適用されうる各種剤型をとることができる。
また、本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤は、有効成分である前記式（１）〜（４）のいずれかで表される化合物のみからなるものであってもよいし、効果に影響を与えない範囲で他の成分を含有するものであってもよい。
【００２３】
本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤を医薬品、医薬部外品に適用する場合、前記式（１）〜（４）の化合物を有効量含有させ、必要により添加剤を配合して各種剤形に調製することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶剤、トローチ剤、ドリンク剤等の経口医薬として、又は、注射剤、坐剤、経皮吸収剤、外用剤等といった非経口医薬として調製することができる。これらの形態のうち、好ましい形態は経口医薬である。
種々の剤型に調製するには、添加剤を用いて常法に従って製造すればよい。添加剤は、通常用いられているものを使用することができる。添加剤の例としては、薬学的に許容される賦形剤（ソルビトール、グルコース、乳糖、デキストリン、澱粉等の糖類、炭酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、ゴマ油、とうもろこし油、オリーブ油、菜種油等）、液体担体（蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、油性担体（各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等）、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、崩壊剤、滑沢剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、矯臭剤、細菌抑制剤等が挙げられる。
【００２４】
本発明の予防・改善剤、ＡＴＰ放出抑制剤を飲食品、飼料、ペットフード等に適用する場合、食用又は飲料用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して提供することができる。さらに、前記飲食品は、一般飲食品の他、過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品の形態とすることができる。
飲食品の例としては、パン、麺類等に代表される小麦粉加工食品、お粥、炊き込みご飯等の米加工食品、ビスケット、ケーキ、ゼリー、チョコレート、せんべい、アイスクリーム等の菓子類、豆腐、その加工食品等の大豆加工食品、清涼飲料、果汁飲料、乳飲料、炭酸飲料等の飲料類、ヨーグルト、チーズ、バター、牛乳等の乳製品、醤油、ソース、味噌、マヨネーズ、ドレッシング等の調味料、ハム、ベーコン、ソーセージ等の蓄肉、蓄肉加工食品、はんぺん、ちくわ、魚の缶詰等の水産加工食品、調理油ならびにフライ用油等が挙げられる。また、錠剤（タブレット）、カプセル等の錠剤食、濃厚流動食、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク栄養食等の経口経腸栄養食品、機能性食品等の形態としてもよい。
飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
【００２５】
これらの飲食品は、本発明の予防・改善剤又はＡＴＰ放出抑制剤を含有し、これに食品原料、例えば、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料、ミネラル等の添加剤、タンパク質、脂質、糖質、炭水化物、食物繊維等を適宜組み合わせて、常法に従って調製することができる。
【００２６】
本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤における前記有効成分の配合量は、その使用形態により異なるが、医薬品、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合は、固形分濃度として０．００１質量％以上が好ましく、０．００３質量％以上がより好ましく、０．０１質量％以上がさらに好ましく、９０質量％以下が好ましく、５０質量％がより好ましい。あるいは、０．００１〜９０質量％が好ましく、０．００３〜９０質量がより好ましく、０．０１〜９０質量がさらに好ましく、０．０１〜５０質量％がよりさらに好ましい。飲食品やペットフード等に配合する場合は、固形分濃度として０．００１質量％以上が好ましく、０．００３質量％以上がより好ましく、０．０１質量％以上がさらに好ましく、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい。あるいは、０．００１〜５０質量％が好ましく、０．００３〜５０質量がより好ましく、０．０１〜５０質量がさらに好ましく、０．０１〜１０質量％がよりさらに好ましい。
【００２７】
本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤の投与又は摂取量は、個体の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って適宜選択、決定できる。例えば、成人（６０ｋｇ）の１日の投与又は摂取量としては、前記有効成分の乾燥物換算として、０．００１ｍｇ以上が好ましく、１ｍｇ以上がより好ましく、１００ｍｇ以上がさらに好ましく、８００００ｍｇ以下が好ましく、４００００ｍｇ以下がより好ましく、１５０００ｍｇ以下がさらに好ましい。あるいは、０．００１〜８００００ｍｇが好ましく、１〜４００００ｍｇがより好ましく、１００〜１５０００ｍｇがさらに好ましい。また、本発明の予防・改善剤及びＡＴＰ放出抑制剤は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で摂取・投与され得る。
【００２８】
上記医薬品、医薬部外品又は食品の摂取又は投与対象として特に限定されないが、過活動膀胱、及びその主な症状である頻尿、尿意切迫感、切迫性尿失禁等の予防、改善、治療を目的とするヒトやヒト以外の哺乳動物が好ましい。なお、摂取又は投与対象には、過活動膀胱の症状が認められるヒトやヒト以外の哺乳動物、及びそのおそれがあるヒトやヒト以外の哺乳動物、その疾患・症状の予防を期待するヒトやヒト以外の哺乳動物も含まれる。
【００２９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の予防又は改善剤、ＡＴＰ放出抑制剤、製造方法、方法及び使用を開示する。
【００３０】
＜１＞前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤。
【００３１】
＜２＞前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、頻尿の予防又は改善剤。
＜３＞前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、尿意切迫感の予防又は改善剤。
＜４＞前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、切迫性尿失禁の予防又は改善剤。
【００３２】
＜５＞過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善がＡＴＰ放出抑制によるものである、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の予防又は改善剤。
＜６＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００１質量％以上であり、０．００３質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、９０質量％以下であり、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の予防又は改善剤。
【００３３】
＜７＞前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、ＡＴＰ放出抑制剤。
【００３４】
＜８＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００１質量％以上であり、０．００３質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、９０質量％以下であり、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい、＜７＞項記載のＡＴＰ放出抑制剤。
【００３５】
＜９＞  前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を、過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善剤として使用する方法。
＜１０＞  過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善剤としての、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
＜１１＞  過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善のための、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の非医薬的（非治療的）な使用。
＜１２＞  過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善剤の製造のための、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
＜１３＞  過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善のために用いる、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
＜１４＞  前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を投与することを含む、過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁の予防又は改善方法。
【００３６】
＜１５＞ＡＴＰの放出を抑制することで過活動膀胱、頻尿、尿意切迫感、又は切迫性尿失禁を予防又は改善する、＜９＞〜＜１４＞項のいずれか記載の化合物、使用又は方法。
＜１６＞前記予防又は改善剤中の、前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００１質量％以上であり、０．００３質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、９０質量％以下であり、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい、＜９＞〜＜１５＞項のいずれか記載の化合物、使用又は方法。
＜１７＞前記化合物を食品又は飲料の形態で適用する、＜９＞〜＜１６＞項のいずれか記載の化合物、使用又は方法。
【００３７】
＜１８＞  前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を、ＡＴＰ放出抑制剤として使用する方法。
＜１９＞  ＡＴＰ放出抑制剤としての、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
＜２０＞  ＡＴＰ放出の抑制のための、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の非医薬的（非治療的）な使用。
＜２１＞  ＡＴＰ放出抑制剤の製造のための、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
＜２２＞  ＡＴＰ放出抑制のために用いる、前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
＜２３＞  前記式（１）〜（４）で表される化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を投与することを含む、ＡＴＰ放出の抑制方法。
【００３８】
＜２４＞前記ＡＴＰ放出抑制剤中の、前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００１質量％以上であり、０．００３質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、９０質量％以下であり、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい、＜１８＞〜＜２３＞項のいずれか記載の化合物、使用又は方法。
＜２５＞前記化合物を食品又は飲料の形態で適用する、＜１８＞〜＜２４＞項のいずれか記載の化合物、使用又は方法。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
調製例１  式（１）で表される化合物
リナロール（和光純薬工業より入手、純度９８％（ＤＬ体））を９９．５％エタノールに濃度３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、用いた。
【００４１】
調製例２  式（２）で表される化合物
リナロールオキシド（東京化成工業より入手、純度９８％）を９９．５％エタノールに濃度３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、用いた。
【００４２】
調製例３  式（３）で表される化合物
ミルセン（SIGMA-ALDRICHより入手、純度９５％）を９９．５％エタノールに濃度３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、用いた。
【００４３】
調製例４  式（４）で表される化合物
ボルネオール（SIGMA-ALDRICHより入手、純度９７％）を９９．５％エタノールに濃度３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、用いた。
【００４４】
実施例１  ＡＴＰ放出抑制試験
［膀胱上皮細胞］
ヒト膀胱上皮癌細胞であるＨＴ−１３７６（ATCC社より入手）を使用した。細胞情報を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2014144942.tif 000004
【００４６】
［培地］
Ｅａｒｌｅ’ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、ピルビン酸ナトリウム（０．０５５ｇ／５００ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（０．１４６ｇ／５００ｍＬ）を添加したものを使用した。
【００４７】
１．低浸透圧刺激によるＡＴＰ放出
９６ｗｅｌｌプレートに、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＨＴ−１３７６を播種し、上記培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。培地を吸引除去して、等浸透圧液（組成を表２に示す）で細胞を２回洗浄した。調製例１〜４で調製した各化合物を下記表３に示す濃度となるよう添加した等浸透圧液を、７５μＬ／ｗｅｌｌ加えて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で６０分インキュベートした。その後、調製例１〜４で調製した各化合物を下記表３に示す濃度となるよう添加した低浸透圧液（組成を表２に示す）を７５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で６０分インキュベートした。低浸透圧刺激により培地中に放出されたＡＴＰ量を測定するため、細胞培養液５０μＬをサンプルとして回収した。
また、等浸透圧液及び低浸透圧液に式（１）〜（４）の化合物を添加しない以外は上記と同様にして細胞培養を行い、回収した培養液をコントロールサンプルとした。
【００４８】
【表２】
2014144942.tif 000005
【００４９】
２．ＡＴＰ放出量の測定
回収したサンプル溶液中のＡＴＰ濃度を、ATP  Bioluminescent  Assay  Kit（SIGMA社製）を用いてルシフェリン・ルシフェラーゼ法により測定した。サンプル溶液と、ATP  Bioluminescent  Assay  Kit中のTP  Assay  Mix  solutionとを等量で混合し、撹拌後にホタルルシフェラーゼ活性を１秒間測定してＡＴＰ量を測定した。同様に、コントロールサンプル中のＡＴＰ量を測定した。
ルシフェリン・ルシフェラーゼ法によるＡＴＰ濃度の測定では、サンプル溶液中に含まれている式（１）〜（４）のいずれかの化合物にクエンチング効果がある場合、ＡＴＰ濃度が低く計算されてしまう。そこで、下記式（Ａ）により、測定したサンプル中のＡＴＰ量をＡＴＰ添加回収率で補正した値を、ＡＴＰ放出率とした。なお、ＡＴＰ添加回収率とは、既知ＡＴＰ量を含有する溶媒に式（１）〜（４）の化合物を添加した場合の、該溶媒中における既知ＡＴＰ量の測定可能割合をいい、式（Ａ）におけるＡＴＰ添加回収率は、溶媒対照（化合物添加なし）のＡＴＰ量に対する相対値とした。結果を表３に示す。
式（Ａ）
ＡＴＰ放出率＝式（１）〜（４）のいずれかの化合物を添加したサンプル中のＡＴＰ量／｛（ＡＴＰ添加回収率）×（コントロールサンプル中のＡＴＰ量）｝
【００５０】
参考例１
式（１）〜（４）の化合物にかえて、下記構造式で表されるリモネンを用いた以外は、実施例１と同様にしてＡＴＰ放出抑制試験を行った。
【００５１】
【化３】
2014144942.tif 000006
【００５２】
なお、リモネンは、リモネン（和光純薬工業より入手、純度９５％以上）を９９．５％エタノールに濃度３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、用いた。
結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
2014144942.tif 000007
【００５４】
表３に示すように、前記式（１）〜（４）のいずれかの化合物を添加したサンプルのＡＴＰ放出率は、コントロールと比較して有意な差が見られた。すなわち、等浸透圧から低浸透圧へと浸透圧を変化させて膀胱上皮細胞を伸展させると、前記式（１）〜（４）の化合物を添加しないコントロールサンプルではＡＴＰの放出が亢進するのに対し、前記式（１）〜（４）のいずれかの化合物を添加したサンプルでは、このＡＴＰ放出が抑制された。また、参考用化合物リモネンを添加したサンプルでは、濃度０．００３％でも、コントロールと比較してＡＴＰ放出率に有意な差は見られなかった。
これらの結果から、前記式（１）〜（４）の化合物は、膀胱上皮細胞の伸展時に亢進するＡＴＰ放出を抑制する作用を有することが確認された。