(57)【要約】【課題】脂質チューブ部を有する脂質構造体を、簡易な方法で、効率及び制御性良く作製でき、用いる脂質の選択の幅が広い脂質構造体の製造方法を提供する。【解決手段】リポソームにナノ粒子１２が内包されてなるナノ粒子内包リポソームを準備する工程と、前記ナノ粒子内包リポソーム中のナノ粒子１２を外部場Ｆによって移動させることにより、前記ナノ粒子１２によって前記リポソームの脂質膜の一部を押し出して脂質ナノチューブ部２０を形成する脂質ナノチューブ部形成工程と、を有する脂質構造体の製造方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームに微粒子が内包されてなる微粒子内包リポソームを準備する工程と、
前記微粒子内包リポソーム中の微粒子を外部場によって移動させることにより、前記微粒子によって前記リポソームの脂質膜の一部を押し出して脂質チューブ部を形成する脂質チューブ部形成工程と、
を有する脂質構造体の製造方法。
【請求項２】
前記外部場が、電場、磁場、又は慣性力である請求項１に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項３】
前記脂質チューブ部形成工程において、前記微粒子内包リポソームは、前記外部場中での移動が制限されている請求項１又は請求項２に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項４】
前記脂質チューブ部形成工程において、前記微粒子内包リポソームは、基材上又はゲル中に保持されている請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項５】
前記微粒子の体積平均粒子径が１０ｎｍ〜３００ｎｍである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項６】
前記微粒子内包リポソームの体積平均粒子径が２μｍ〜１００μｍである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項７】
前記外部場が、２．０ｋＶ／ｍ〜１０．０ｋＶ／ｍの強さの電場である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【請求項８】
前記微粒子が、カルボキシレート基で修飾されたポリスチレンナノ粒子である請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は、自己集合して安定な分子集合体を形成し、基礎生物学、医学、薬学、工学分野における基盤材料として用いられている。
天然由来のリン脂質をはじめとする脂質から形成される脂質分子集合体として、リポソームが知られている。リポソームは、超音波照射法、静置水和法等により調製される。
しかしながら、リポソームは球状であるため、その利用分野が制限される。
【０００３】
一方、ナノチューブ状の脂質分子集合体である脂質ナノチューブについては、三次元人工細胞アレイ、バイオチップ、マイクロリアクター、ドラッグキャリアー、無機ナノ構造作製のためのテンプレート等への応用や、神経細胞、免疫細胞等の細胞間コミュニケーションのメカニズム解明に期待が持てることから、近年、盛んに検討が行われている。
【０００４】
そこで、リポソームからナノチューブ状の脂質分子集合体（脂質ナノチューブ）を作製する方法について、種々の検討が行われている。
例えば、特定の構造を有する合成脂質を自己集合させて、脂質ナノチューブを作製する方法が知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
また、マイクロピペット吸引技術を利用して、リポソームの脂質膜の一部をマイクロピペットにて吸引し該一部を物理的に引き伸ばして一本ずつ脂質ナノチューブ部を形成する方法が知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献３参照）。
また、リポソームに特定の生体分子を添加し、生体分子の動きを利用して脂質膜の一部を脂質ナノチューブ構造に成長させる技術（例えば、非特許文献４参照）や、リポソームにガングリオシド等の特定物質を添加して脂質膜の一部を脂質ナノチューブ構造に成長させる技術（例えば、非特許文献５及び６参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５０９７７８号公報
【０００６】
【非特許文献１】Chem.Mater.2008, 20, 625
【非特許文献２】Nature Commun.2010, 1, 20
【非特許文献３】Langmuir 2001, 17, 6754
【非特許文献４】EMBO J.2005, 24, 1537
【非特許文献５】FEBS Lett.2003, 534, 33
【非特許文献６】PNAS 2010, 107, 7781
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１及び２に記載の方法では、脂質ナノチューブの作製に用いる脂質の種類が限定される。
また、特許文献１及び非特許文献３に記載の方法は、熟練が要求される複雑な方法であり、しかも、一本ずつ脂質ナノチューブ部を作製するため、作製効率に乏しい。
また、非特許文献４〜６に記載の方法では、脂質ナノチューブ構造作製の制御性に乏しい。
【０００８】
本発明は上記に鑑みなされたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明の目的は、脂質ナノチューブ部のような脂質チューブ部を有する脂質構造体を、簡易な方法で、効率及び制御性良く作製でき、用いる脂質の選択の幅が広い脂質構造体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を達成するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞  リポソームに微粒子が内包されてなる微粒子内包リポソームを準備する工程と、前記微粒子内包リポソーム中の微粒子を外部場によって移動させることにより、前記微粒子によって前記リポソームの脂質膜の一部を押し出して脂質チューブ部を形成する脂質チューブ部形成工程と、を有する脂質構造体の製造方法。
【００１０】
＜２＞  前記外部場が、電場、磁場、又は慣性力である＜１＞に記載の脂質構造体の製造方法。
＜３＞  前記脂質チューブ部形成工程において、前記微粒子内包リポソームは、前記外部場中での移動が制限されている＜１＞又は＜２＞に記載の脂質構造体の製造方法。
＜４＞  前記脂質チューブ部形成工程において、前記微粒子内包リポソームは、基材上又はゲル中に保持されている＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【００１１】
＜５＞  前記微粒子の体積平均粒子径が１０ｎｍ〜３００ｎｍである＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
＜６＞  前記微粒子内包リポソームの体積平均粒子径が２μｍ〜１００μｍである＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【００１２】
＜７＞  前記外部場が、２．０ｋＶ／ｍ〜１０．０ｋＶ／ｍの強さの電場である＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
＜８＞  前記微粒子がカルボキシレート基で修飾されたポリスチレンナノ粒子である＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の脂質構造体の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、脂質チューブ部を有する脂質構造体を、簡易な方法で、効率及び制御性よく作製でき、しかも用いる脂質の選択の幅が広い脂質構造体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に用いられるナノ粒子内包リポソームの一例を模式的に示す模式断面図である。
【図２】本発明における脂質チューブ部形成工程の一例を模式的に示す模式断面図である。
【図３】本発明の第１の実施形態を模式的に示す概略斜視図である。
【図４】本発明の第２の実施形態を模式的に示す概略斜視図である。
【図５】本発明の第３の実施形態を模式的に示す概略斜視図である。
【図６】本発明の第４の実施形態を模式的に示す概略斜視図である。
【図７】ガラス基板上にリンカーを介して保持されたナノ粒子内包リポソームの一例を示す概念図である。
【図８】本実施例１（電場による脂質ナノチューブ部の形成１）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９】本実施例１（電場による脂質ナノチューブ部の形成１）の結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図１０】本実施例２（電場による脂質ナノチューブ部の形成２）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】本実施例３（電場による脂質ナノチューブ部の形成３）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】本実施例４（電場による脂質ナノチューブ部の形成４）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】本実施例５（磁場による脂質ナノチューブ部の形成）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】本実施例６（慣性力による脂質ナノチューブ部の形成）の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の脂質構造体の製造方法は、リポソームに微粒子が内包されてなる微粒子内包リポソームを準備する工程（以下、「準備工程」ともいう）と、前記微粒子内包リポソーム中の微粒子を外部場によって移動させることにより、前記微粒子によって前記リポソームの脂質膜の一部を押し出して脂質チューブ部を形成する脂質チューブ部形成工程と、を有する。
本発明において、「脂質チューブ」には、両端が開口されている脂質チューブのみならず、少なくとも一端が閉塞されている脂質チューブも含まれるものとする。
【００１６】
以下、本発明の製造方法の一例について、図１及び図２を参照しながら説明する。
なお、以下の図面等において、ナノ粒子は微粒子の好適な一例であり、ナノ粒子内包リポソームは微粒子内包リポソームの好適な一例であり、脂質ナノチューブ部は脂質チューブ部の好適な一例である。また、同一の部材については同一の符号を付して説明を省略することがある。
【００１７】
図１は、本発明の準備工程で準備するナノ粒子内包リポソームの一例を模式的に示す模式断面図である。
図１に示すように、ナノ粒子内包リポソーム１０は、カプセル状の脂質膜１４を備えたリポソームと、該リポソームに内包されたナノ粒子１２と、を含んで構成されている。
脂質膜１４はリン脂質の２分子膜として構成されている。
カプセル状の脂質膜１４の内部は、内水相（水や緩衝液等の水系媒体）で満たされている。
ナノ粒子内包リポソーム１０からナノ粒子１２を除いたリポソームの構成は、公知のリポソームの構成と同様である。
【００１８】
本発明に用いられる微粒子内包リポソーム（例えば、ナノ粒子内包リポソーム１０）を製造する方法としては、例えば、以下に示す方法を用いることができる。
即ち、リン脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を準備し、該溶液から有機溶媒を蒸発させてリン脂質膜を作製する。作製されたリン脂質膜と、ナノ粒子及び水を含む液と、を接触させることにより、リン脂質の自己組織化により、リポソームにナノ粒子が取り込まれた構造のナノ粒子内包リポソームを得ることができる。
本発明における準備工程は、予め製造しておいたナノ粒子内包リポソームを準備する工程であってもよいし、ナノ粒子内包リポソームを製造する工程であってもよい。
【００１９】
図２は、本発明における脂質ナノチューブ部形成工程の一例を模式的に示す模式断面図である。
図２に示すように、上記ナノ粒子内包リポソーム１０（図１）を外部場Ｆに配置すると、該外部場Ｆによってナノ粒子内包リポソーム１０内のナノ粒子１２が前記リポソーム内から前記リポソーム外に向かう方向に移動する。
すると、図２中の実線の矢印で示すように、ナノ粒子１２によって脂質膜１４の一部が押し出されて脂質ナノチューブ部２０が形成される。これにより、脂質ナノチューブ部２０を有する脂質構造体１０Ａが得られる。図２では、脂質ナノチューブ部が形成された後の脂質膜（図１中の脂質膜１４）を、脂質膜１４Ａとした。
【００２０】
本発明では、脂質構造体（例えば脂質構造体１０Ａ）のうち、脂質チューブ部（例えば脂質ナノチューブ部２０）以外の部分をリポソーム部ということがある。
即ち、本発明における脂質構造体は、脂質チューブ部とリポソーム部とを有する構成ということができる。ここで、脂質チューブ部の内部とリポソーム部の内部とは連通されており、これらの内部は内水相で満たされている。
【００２１】
図２に示すように、本発明の製造方法は、外部場による微（ナノ）粒子の移動、微（ナノ）粒子の移動による脂質膜の押し出し、及び脂質膜の伸縮性を利用して、脂質膜の一部を押し出して脂質（ナノ）チューブ部を形成する方法である。
本発明の製造方法は、リポソームの一部をマイクロピペットにて吸引し物理的に引き延ばして一本ずつ脂質ナノチューブ部を形成する従来の方法と比較して、簡易であり、かつ、効率の良い（生産性に優れた）製造方法である。
【００２２】
また、本製造方法では、外部場の強さや外部場を与える時間などを制御することにより、脂質（ナノ）チューブ部のサイズ（長さ）を容易に制御できる。
更に、本製造方法では、Chem.Mater.2008, 20, 625やNature Commun.2010, 1, 20に記載された方法とは異なり、用いる脂質の種類が限定されることもなく、脂質の選択の幅が広い。また、上記文献に記載された、特定の脂質を用いて作製された脂質ナノチューブ部では、脂質ナノチューブとして要求される柔軟性が損なわれる場合があるが、本製造方法では、上記文献に記載された方法と比較して、柔軟性が損なわれにくい。
【００２３】
更に、本発明の製造方法により製造された脂質構造体をゲル（アガロースゲル等）中に含ませ、得られた脂質構造体含有ゲルを凍結させ、凍結された脂質構造体含有ゲルから、脂質（ナノ）チューブ部を含む部分を切り出すことにより、容易に脂質（ナノ）チューブを得ることができる。
また、本発明の製造方法により、微（ナノ）粒子内包リポソームの脂質膜の一部を、別のリポソームに到達するまで押し出すことにより、２つのリポソームが脂質（ナノ）チューブで結合され、該２つのリポソームの内部が連通された構造の脂質構造体を作製することもできる。
さらには、２つ以上のリポソームが、脂質（ナノ）チューブによって三次元ネットワーク状に結合された構造の脂質構造体を作製することもできる。
このようにして作製された三次元ネットワーク状の脂質構造体は、三次元人工細胞アレイやバイオチップとして利用することができる。
【００２４】
なお、図１及び図２では、模式的に、ナノ粒子内包リポソーム１０及び脂質構造体１０Ａが５個のナノ粒子１２を内包し、このうちの１個のナノ粒子が移動する例を示しているが、本発明においては微（ナノ）粒子内包リポソームに内包される微（ナノ）粒子の個数及び移動する微（ナノ）粒子の個数には特に限定はない。微（ナノ）粒子内包リポソームに複数の微（ナノ）粒子が含まれている場合には、該複数の微（ナノ）粒子のうちの少なくとも一部が移動すればよい。
また、図１及び図２では、一部のナノ粒子のみに符号「１２」を付している。
【００２５】
また、本発明において、微（ナノ）粒子の移動による脂質（ナノ）チューブ部の形成性をより向上させる観点からは、前記脂質（ナノ）チューブ部形成工程において、前記微（ナノ）粒子内包リポソームは、前記外部場中での移動が制限されていることが好ましい。
これにより、微（ナノ）粒子内包リポソームの移動が制限された状態で、微（ナノ）粒子内包リポソームの内部の微（ナノ）粒子が移動するので、脂質（ナノ）チューブ部の形成性をより向上させることができる。
前記微（ナノ）粒子内包リポソームの移動が制限されている具体的な形態としては、前記微（ナノ）粒子内包リポソームが、基材上又はゲル中に保持されている形態が挙げられる。これらのより具体的な形態については、第１〜第４の実施形態として後述する。
【００２６】
＜リポソーム＞
本発明におけるリポソーム（即ち、本発明における微（ナノ）粒子内包リポソームのうちナノ粒子を除いた部分）の構成には特に限定はなく、公知のリポソームを用いることができる。
例えば、リン脂質の２分子膜を主体として構成されたカプセル状の脂質膜と、該カプセル状の脂質膜内に存在する内水相とを有する構成の公知のリポソームを特に制限無く用いることができる。
本発明におけるリポソームは、図１及び図２に示したような一枚膜のリポソームであってもよいし、多重層リポソームであってもよい。
リポソームの体積平均粒子径としては、脂質ナノチューブ部の形成性の観点からは、２μｍ〜１００μｍが好ましく、２μｍ〜５０μｍがより好ましく、５μｍ〜２０μｍが特に好ましい。
【００２７】
前記リン脂質としては特に限定はなく、グリセロリン脂質であってもスフィンゴリン脂質であってもよい。
前記リン脂質の具体例としては、レシチン（ホスファチジルコリン）、セファリン（ホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
また、リン脂質には、ビオチン、ローダミン等のその他の物質が結合されていてもよい。
【００２８】
本発明におけるリポソームの内水相及び外水相については、水や各種緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（「HEPES」）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（「TRIS」）、ホウ酸、リン酸等の緩衝水溶液）等の水系媒体を特に制限なく用いることができる。
【００２９】
＜外部場＞
本発明において「外部場」は、微（ナノ）粒子を移動させることができる場であれば特に限定はないが、例えば、電場、磁場、又は慣性力であることが好ましい。
【００３０】
前記電場の強さは、脂質ナノチューブ部の形成性の観点から、２．０ｋＶ／ｍ〜１０．０ｋＶ／ｍが好ましく、４．０ｋＶ／ｍ〜７．０ｋＶ／ｍがより好ましい。
即ち、前記電場の強さが２．０ｋＶ／ｍ以上であることにより、ナノ粒子の移動による脂質膜の押し出し性をより向上させることができる。
また、前記電場の強さが１０．０ｋＶ／ｍ以下であることにより、温度上昇をより抑制できることに加え、ナノ粒子が脂質膜を突き破る現象（即ち、脂質ナノチューブ部の形成性が損なわれる現象）をより抑制できる。
【００３１】
前記磁場の強さは、脂質ナノチューブ部の形成性の観点から、１００ＫＡ／ｍ〜１０００ＫＡ／ｍが好ましく、２００ＫＡ／ｍ〜５００ＫＡ／ｍがより好ましい。
即ち、前記磁場の強さが１００ＫＡ以上であることにより、ナノ粒子の移動による脂質膜の押し出し性をより向上させることができる。
また、前記電場の強さが１０００ＫＡ／ｍ以下であることにより、ナノ粒子が脂質膜を突き破る現象（即ち、脂質ナノチューブ部の形成性が損なわれる現象）をより抑制できる。
【００３２】
前記慣性力は、例えば、遠心力によって得ることができる。
前記慣性力の強さは、脂質ナノチューブ部の形成性の観点から、１０ｋｍ／ｓ２〜１００ｋｍ／ｓ２が好ましく、３０ｋｍ／ｓ２〜１００ｋｍ／ｓ２がより好ましい。
即ち、前記慣性力の強さが１０ｋｍ／ｓ２以上であることにより、ナノ粒子の移動による脂質膜の押し出し性をより向上させることができる。
また、前記慣性力の強さが１００ｋｍ／ｓ２以下であることにより、ナノ粒子が脂質膜を突き破る現象（即ち、脂質ナノチューブ部の形成性が損なわれる現象）をより抑制できる。
【００３３】
＜微粒子＞
本発明において微粒子は、例えば体積平均粒子径５μｍ以下の粒子を指す。
微粒子の体積平均粒子径としては、脂質ナノチューブ部の形成性の観点からは、好ましくは１０ｎｍ〜３００ｎｍであり、より好ましくは１０ｎｍ〜９０ｎｍであり、特に好ましくは２０ｎｍ〜８０ｎｍである。
前記微粒子としては、有機微粒子（樹脂微粒子等）でも無機微粒子（金属微粒子、金属酸化物微粒子、半導体微粒子等）でもよい。
また、前記微粒子は、後述のアニオン性基やカチオン性基によって表面修飾されていてもよい。
【００３４】
前記無機微粒子としては、シリカナノ粒子、アルミナナノ粒子、磁気ナノ粒子（酸化鉄ナノ粒子等）が好ましい。
【００３５】
前記樹脂微粒子としては、ポリスチレンナノ粒子、ＳＢＲ（スチレン・ブタジエンゴム）ナノ粒子、ヒドロゲルナノ粒子が好ましい。
前記樹脂微粒子は、懸濁液の形態で用いることが好適である。
【００３６】
前記外部場として電場を用いる場合、前記微粒子は電荷を有することが好ましい。
前記電荷は、正電荷であっても負電荷であってもよい。
電荷を有する微粒子の具体的な形態としては、アニオン性基（又はカチオン性基）で修飾された形態や、帯電性を有する微粒子を正又は負に帯電させた形態が挙げられる
【００３７】
アニオン性基（又はカチオン性基）を有する樹脂微粒子としては、例えば、（１）アニオン性基（又はカチオン性基）を有するモノマーを、単独重合させて、又は、他のモノマーとともに共重合させて得られた樹脂ナノ粒子や、（２）アニオン性基（又はカチオン性基）を有しない樹脂ナノ粒子に対し、アニオン性基（又はカチオン性基）を有するモノマーを付加重合させて得られた樹脂ナノ粒子、（３）アニオン性基（又はカチオン性基）を有しないナノ粒子をアニオン性基（又はカチオン性基）を有する高分子化合物で表面修飾して得られたナノ粒子、などが挙げられる。
【００３８】
前記アニオン性基としては、カルボキシレート基（−ＣＯＯ−基）、スルホネート基（−ＳＯ３−基）、ホスフェート基（−ＰＯ４２−基）、シラノール基などが挙げられる。
前記カチオン性基としては、無置換のアンモニウム基、アルキル基（好ましくは炭素数１〜６のアルキル基）で置換されたアンモニウム基、グアニジニウム基）などが挙げられる。
【００３９】
アニオン性基を有する微粒子の具体例としては、カルボキシレート基（ＣＯＯ−基）で修飾されたポリスチレンナノ粒子、シラノール基を有するシリカナノ粒子が挙げられる。
中でも、入手容易性などの観点からは、カルボキシレート基で修飾されたポリスチレンナノ粒子が好ましい。
【００４０】
カチオン性基を有する微粒子の具体例としては、アンモニウム基で修飾されたポリスチレンナノ粒子などが挙げられる。
【００４１】
電荷を有する微粒子としては、電場による脂質ナノチューブ部の形成性の観点から、ｐＨ７．４におけるゼータ電位が、アニオン性基を有する微粒子の場合には−６０ｍＶ〜−５ｍＶ（より好ましくは−５０ｍＶ〜−１０ｍＶ）、カチオン性基を有する微粒子の場合には＋６０ｍＶ〜＋５ｍＶ（より好ましくは＋５０ｍＶ〜＋１０ｍＶ）であることが好ましい。
【００４２】
また、電荷を有する微粒子としては、市販品を用いることもできる。
電荷を有する微粒子の市販品としては、ポリサイエンス社製粒子、Thermo Fisher社製粒子、Micromod 社製粒子などが挙げられる。
【００４３】
前記外部場として磁場を用いる場合、前記微粒子は磁性（磁気）を有することが好ましい。
微粒子に磁性（磁気）を持たせる方法としては、酸化鉄からなる微粒子を用いることなどが挙げられる。
【００４４】
また、磁性（磁気）を有する微粒子としては、市販品を用いることもできる。
磁性（磁気）を有する微粒子の市販品としては、Merck社製粒子、Micromod 社製粒子などが挙げられる。
【００４５】
＜脂質チューブ部＞
本発明における脂質チューブ部は、前記脂質膜の一部がチューブ状に変形して得られた部位である。
脂質チューブ部の内径は、前記微粒子の体積平均粒子径と同程度（即ち、好ましくは１０ｎｍ〜５μｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜１μｍ、特に好ましくは２０ｎｍ〜１００ｎｍである形態が好適である。
【００４６】
以下、本発明の製造方法の具体的な実施形態について説明する。
各実施形態を示す図３〜図６では、複数のナノ粒子内包リポソームのうち、一部のみに符号を付している。
【００４７】
＜第１の実施形態＞
図３は、本発明の第１の実施形態として、本発明の製造方法に好適な脂質構造体製造装置３０を模式的に示す概略斜視図である。
図３に示すように、脂質構造体製造装置３０は、カバーガラス３２（基材）と、カバーガラス３２上に配置されたゲル３４（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等）と、ゲル３４中に含まれるナノ粒子内包リポソーム３１と、ゲル３４中に挿入された陽極３６Ａ及び陰極３６Ｂと、陽極３６Ａ−陰極３６Ｂ間に直流電圧を印加するための電圧印加手段（電源）と、を備えている。
ナノ粒子内包リポソーム３１は、電荷を有するナノ粒子がリポソームに内包された構成となっている。ナノ粒子やリポソームの好ましい形態は前述のとおりである。
なお、図３では、複数のナノ粒子内包リポソームのうち、一部のナノ粒子内包リポソームのみに符号（３１）を付している。後述の図４〜６についても同様である。
【００４８】
この脂質構造体製造装置３０において、ナノ粒子内包リポソーム３１は、ゲル３４によって保持されるとともに、陽極３６Ａ及び陰極３６Ｂにより生じた電場の中に配置されている。
ナノ粒子内包リポソーム３１がゲル３４によって保持されているので、ナノ粒子内包リポソーム３１のうち、脂質ナノチューブ部となる一部を除いた部分については電場による移動が制限される。これに対し、脂質ナノチューブ部となる一部は、電場によるナノ粒子の移動によって押し出されて脂質ナノチューブ部となる。
【００４９】
＜第２の実施形態＞
図４は、本発明の第２の実施形態として、本発明の製造方法に好適な脂質構造体製造装置４０を模式的に示す概略斜視図である。
図４に示すように、脂質構造体製造装置４０は、カバーガラスチャンバー４２（第１の基材）と、カバーガラス４９（第２の基材）と、カバーガラスチャンバー４２とカバーガラス４９との間に挟持されたナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４と、ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４の一端の外側に配置された陽極４６Ａと、ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４の他端の外側に配置された陰極４６Ｂと、陽極４６Ａ−陰極４６Ｂ間に直流電圧を印加するための電圧印加手段と、を備えて構成されている。カバーガラスチャンバー４２とカバーガラス４９とは、封止剤４８（例えば、シリコーンシール）によって固定されている。
ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４は、本発明におけるナノ粒子内包リポソームを含んだゲルである。ゲルとしては、第１の実施形態におけるゲル３４として例示したゲルと同様のものを用いることができる。
ナノ粒子内包リポソームとしては、第１の実施形態におけるナノ粒子内包リポソーム３１と同様のものを用いることができる。
【００５０】
この脂質構造体製造装置４０において、ナノ粒子内包リポソームは、ゲルによって保持されるとともに、陽極４６Ａ及び陰極４６Ｂにより生じた電場の中に配置されている。
これにより、ナノ粒子内包リポソームのうち、脂質ナノチューブ部となる一部を除いた部分が電場による移動が制限される一方で、脂質ナノチューブ部となる一部が、ナノ粒子の移動によって押し出されて脂質ナノチューブ部となる。
【００５１】
＜第３の実施形態＞
図５は、本発明の第３の実施形態として、本発明の製造方法に好適な脂質構造体製造装置５０を模式的に示す概略斜視図である。
図５に示すように、脂質構造体製造装置５０は、互いに連通された陽極槽と陰極槽とを有するセル５２と、前記セル５２の陽極槽と陰極槽との連通部に配置されたゲル５４（例えばアガロースゲル）と、陽極槽に収容された陽極液５５Ａ（例えば、水、緩衝液などの水系媒体）と、陰極槽に収容された陰極液５５Ｂ（例えば、水、緩衝液などの水系媒体）と、陰極液５５Ｂ中に存在する（例えば分散されている）ナノ粒子内包リポソーム５１と、陽極液５５Ａに浸漬された陽極５６Ａと、陰極液５５Ｂに浸漬された陰極５６Ｂと、陽極５６Ａ−陰極５６Ｂ間に直流電圧を印加するための電圧印加手段（電源）と、を備えて構成されている。
ここで、ゲル５４としては、第１の実施形態におけるゲル３４と同様のものを用いることができる。
ナノ粒子内包リポソーム５１としては、リポソームに負電荷を有するナノ粒子が内包された構造のナノ粒子内包リポソームを用いる。
【００５２】
この脂質構造体製造装置５０においては、陽極５６Ａ→陽極液５５Ａ→ゲル５４→陰極液５５Ｂ→陰極５６Ｂの経路で電場が生じる。
また、この脂質構造体製造装置５０においては、ナノ粒子内包リポソーム５１は陰極液５５Ｂ中を自由に移動できるが、ゲル５４中を移動することはできない。一方、ナノ粒子単体は、ゲル５４中を移動できることが実験的に確認されている。この違いは、ナノ粒子内包リポソームとナノ粒子とのサイズの違いによるものと推測される。
従って、脂質構造体製造装置５０では、以下のようにして、脂質ナノチューブ部が形成される。
まず、前記電場により、ナノ粒子内包リポソーム５１が陰極液５５Ｂ中を移動して、ゲル５４との界面まで移動する。
次に、界面に到達したナノ粒子内包リポソーム５１の脂質膜の一部が、ナノ粒子によってゲル５４中に押し出され、ゲル５４中に脂質ナノチューブ部が形成される。
【００５３】
この第３の実施形態の変形例としては、正電荷を有するナノ粒子が内包された構造のナノ粒子内包リポソームを陽極液５５Ａに添加する例が挙げられる。
この場合においても、脂質構造体製造装置５０と同様の原理により、陽極液５５Ａとゲル５４との界面に到達したナノ粒子内包リポソームの脂質膜の一部が、ナノ粒子によってゲル５４中に押し出され、ゲル５４中に脂質ナノチューブ部が形成される。
【００５４】
＜第４の実施形態＞
図６は、本発明の第４の実施形態として、本発明の製造方法に好適な脂質構造体製造装置６０を模式的に示す概略斜視図である。
図６に示すように、脂質構造体製造装置６０は、スライドガラス６２（基材）と、スライドガラス６２にリンカー６５を介して保持されたナノ粒子内包リポソーム６１と、ナノ粒子内包リポソーム６１に電場を与えるための陽極６６Ａ及び陰極６６Ｂと、陽極６６Ａ−陰極６６Ｂ間に直流電圧を印加するための電圧印加手段（電源）と、を備えている。
図６中の破線は、スライドガラス６２のナノ粒子内包リポソーム６１を保持する側の面及びナノ粒子内包リポソーム６１を浸漬する水系媒体（水や緩衝液等）である。図６では、ナノ粒子内包リポソーム６１を保持する側の面を見やすくするために、当該水系媒体を破線で表している。
ナノ粒子内包リポソーム６１は、電荷を有するナノ粒子がリポソームに内包された構成となっている。
ナノ粒子内包リポソーム６１としては、第１の実施形態におけるナノ粒子内包リポソーム３１と同様のものを用いることができる。
【００５５】
この脂質構造体製造装置６０において、ナノ粒子内包リポソーム６１は、リンカー６５によってスライドガラス６２（基材）に保持されるとともに、陽極６６Ａ及び陰極６６Ｂにより生じた電場の中に配置されている。
これにより、ナノ粒子内包リポソーム６１のうち、脂質ナノチューブ部となる一部を除いた部分は電場による移動が制限される一方で、脂質ナノチューブ部となる一部は、ナノ粒子の移動によって水系媒体中に押し出されて脂質ナノチューブ部となる。
【００５６】
図７は、ガラス基板上にリンカーを介して保持されたナノ粒子内包リポソームの一例を示す概念図である。
図７に示す一例では、ＤＯＰＥ−ビオチン（DOPE-Biotin）によって修飾されたナノ粒子内包リポソーム１０のＤＯＰＥ−ビオチンと、ＢＳＡ−ビオチン（BSA-Biotin）によって修飾されたガラス基板（Glass substrate）のＢＳＡ−ビオチンと、がストレプトアビジン（streptavidin）を介して結合されている。換言すれば、ナノ粒子内包リポソーム１０が、ＤＯＰＥ−ビオチン、ストレプトアビジン、及びＢＳＡ−ビオチンからなるリンカーを介して、ガラス基板に保持されている。
このように、本発明におけるリンカーとしては、ビオチン及びアビジンを含むリンカーを用いることができる。
但し、本発明におけるリンカーはビオチン及びアビジンに限定されることはなく、生体分子と基材とを接続する公知のリンカー（例えば、リンカーＤＮＡ、ジスルフィド結合、等）を特に制限なく利用できる。
【００５７】
以上、本発明の第１〜第４の実施形態について説明したが、本発明は上記各実施形態に限定されることはない。
例えば、上記第１〜第４の実施形態において、磁性を有する微（ナノ）粒子を含む微（ナノ）粒子内包リポソームを用い、陽極、陰極、及び電圧印加手段に変えて、磁石等の磁場付与手段を用いて微（ナノ）粒子内包リポソームに磁場を付与することで、磁場を利用した脂質構造体の製造を行うことができる。
また、上記第１、第２、及び第４の実施形態に係る脂質構造体製造装置に対し、遠心分離機によって慣性力（遠心力）を付与することで、慣性力（遠心力）を利用した脂質構造体の製造を行うことができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下において、「室温」は２５℃を指す。また、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、特に断りのない限り、１０ｍＭ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液である。
【００５９】
〔実施例１〕
＜電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成１＞
図３に示す脂質構造体製造装置３０と同様の構成の脂質構造体製造装置を用い、電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成を行った。
具体的な操作を以下に示す。
【００６０】
（ナノ粒子含有リポソーム分散液Ａの調製）
まず、1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（リン脂質）およびRhodamine-DMPE（蛍光色素）を、クロロホルムに溶解させて溶液Ａを調製した。次に、溶液Ａからクロロホルムを乾燥させて除去し、蛍光色素含有リン脂質薄膜を得た。
次に、カルボキシレート基で修飾されたポリスチレンナノ粒子（ポリサイエンス社製Fluoresbrite Carboxylate Microspheres；体積平均粒子径５０ｎｍ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液に添加してナノ粒子含有液Ｂを調製した。
ここで、上記ポリスチレンナノ粒子のｐＨ７．４におけるゼータ電位は、−４０ｍＶである。
得られたナノ粒子含有液Ｂを上記リン脂質薄膜に添加し、２７℃で１時間以上静置し、薄膜を水和することにより、ナノ粒子含有リポソーム分散液Ａ（ナノ粒子含有リポソームの濃度１．０ｍＭ）を得た。
光学顕微鏡による観察の結果、粒径１０μｍ〜２０μｍ程度の、ナノ粒子を含有したリポソームが形成されたことが確認された。
【００６１】
（アガロースゲルＡの調製）
上記分散液Ａと、アガロース水溶液と、を４５℃で混合し、室温下で除冷してゲル化させ、ナノ粒子含有リポソームを含むアガロースゲル（ここでは、「アガロースゲルＡ」とする）を調製した。
ここで、各成分の量は、アガロースゲルＡにおける組成が、２．０質量％アガロースゲル中に、リポソーム０．０５ｍＭ、Rhodamine-DMPE０．２５μＭと、ナノ粒子０．３２ｍｇ／ｍＬ（４．６２×１０１２個／ｍＬ）と、が含まれる組成となるように調整した。      
【００６２】
（脂質構造体製造装置の作製）
図３に示す脂質構造体製造装置３０と同様の構成の脂質構造体製造装置を作製した。
各部材としては、以下のものを用いた。
ここで、陽極３６Ａ−陰極３６Ｂ間の距離は、１０ｍｍとした。
−脂質構造体製造装置の部材−
・カバーガラス３２    …  ２４ｍｍ×６０ｍｍ×０．１２ｍｍｔのカバーガラス
・ゲル３４及びナノ粒子内包リポソーム３１  …  上記アガロースゲルＡ（５．０ｇ）
・陽極３６Ａ及び陰極３６Ｂ  …  １ｍｍφの白金（Ｐｔ）電極
【００６３】
（脂質構造体の作製（脂質ナノチューブ部の形成））
上記脂質構造体製造装置３０において、ゲル３４の温度を２５℃に調温し、かつ、ゲルに浸漬した陽極３６Ａ−陰極３６Ｂ間に３．０ｋＶ／ｍの電界強度（電流０．１ｍＡ）となる電圧を印加した状態で、蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡写真（電圧印加開始から６０秒後）を図８に、光学顕微鏡写真を図９にそれぞれ示す。
図８に示すように、電圧の印加によって脂質ナノチューブ部が形成されたことが確認された。
図８において、筋状に見える部分が脂質ナノチューブ部である。また、脂質ナノチューブの屈曲又は湾曲は、アガロースゲルが不均一であることにより、脂質ナノチューブが屈曲又は湾曲しながら成長したために生じたものと考えられる。
【００６４】
また、図９に示すように、光学顕微鏡写真による観察の結果、電圧印加時においても、ナノ粒子含有リポソーム（のリポソーム部）自体は球形を保っており、ゲル中に保持されていることが確認された。
なお、脂質ナノチューブの外形は光学顕微鏡の分解能よりも小さいため、光学顕微鏡写真では脂質ナノチューブは観察されない。
【００６５】
〔実施例２〕
＜電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成２＞
図４に示す脂質構造体製造装置４０と同様の構成の脂質構造体製造装置を用い、電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成を行った。
具体的な操作を以下に示す。
【００６６】
（アガロースゲルＢの調製）
実施例１のアガロースゲルＡの調製において、アガロースゲル中におけるアガロースの濃度が０．８質量％、リポソームの濃度が０．０５ｍＭとなるように、各成分の量をそれぞれ調整したこと以外は実施例１のアガロースゲルＡの調製と同様にして、アガロースゲルＢを得た。
【００６７】
（脂質構造体製造装置の作製）
図４に示す脂質構造体製造装置４０と同様の構成の脂質構造体製造装置を作製した。
各部材としては、以下のものを用いた。
−脂質構造体製造装置の部材−
・カバーガラスチャンバー４２  …  ２０ｍｍ×４５ｍｍ×０．１２ｍｍｔのスライドガラスを底面に有するカバーガラスチャンバー（IWAKIガラス社製、5202-001）
・カバーガラス４９  …  １０ｍｍ×１０ｍｍ×０．１２ｍｍｔのカバーガラス
・ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４  …  上記アガロースゲルＢ（０.０１ｇ）
・陽極４６Ａ及び陰極４６Ｂ  …  １ｍｍφの白金（Ｐｔ）電極
【００６８】
（脂質構造体の作製（脂質ナノチューブ部の形成））
上記脂質構造体製造装置において、ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル４４をＨＥＰＥＳ緩衝液に浸漬し、その温度を２５℃に調温し、かつ、陽極４６Ａ−陰極４６Ｂ間に３．０ｋＶ／ｍの電界強度（電流２〜３ｍＡ）となる電圧を印加した状態で、蛍光顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡写真（電圧印加開始から６０秒後）を図１０に示す。
図１０に示すように、実施例２においても実施例１と同様に、電圧の印加によって脂質ナノチューブ部が形成されたことが確認された。
【００６９】
〔実施例３〕
＜電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成３＞
図５に示す脂質構造体製造装置５０と同様の構成の脂質構造体製造装置を用い、電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成を行った。
具体的な操作を以下に示す。
【００７０】
（陰極液Ａの調製）
実施例１におけるナノ粒子含有リポソーム分散液Ａの調製において、リポソーム濃度が０．１ｍＭ（Rhodamine-DMPEを５μＭ含む）、ナノ粒子の濃度が０．３２ｍｇ／ｍＬ（４．６２×１０１２個／ｍＬ）となるように各成分の量を調整したこと以外は実施例１と同様にして、ナノ粒子含有リポソーム分散液である陰極液Ａを得た。
【００７１】
（アガロースゲルＣの調製）
実施例１におけるアガロースゲルＡの調製において、ナノ粒子含有リポソーム分散液Ａを用いなかったこと以外はアガロースゲルＡの調製と同様にして、２．０質量％アガロースゲルであるアガロースゲルＣを得た。
【００７２】
（脂質構造体製造装置の作製）
図５に示す脂質構造体製造装置５０と同様の構成の脂質構造体製造装置を作製した。
各部材としては、以下のものを用いた。
−脂質構造体製造装置の部材−
・セル５２  …  容積０．１ｍＬの陽極槽及び容積０．１ｍＬの陰極槽を有し、陽極槽と陰極槽との連通部のサイズが、長さ１７ｍｍ×幅４．８ｍｍ×高さ０．４ｍｍであるプラスチックセルを用いた。ここで、連通部の長さは、陽極槽と陰極槽との最近接距離に相当する。
・ゲル５４  …  上記連通部に収容された上記アガロースゲルＣ
・陽極液５５Ａ  …  容積０.０６ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液
・陰極液５５Ｂ  …  容積０.０６ｍＬの上記陰極液Ａ
・陽極５６Ａ及び陰極５６Ｂ  …  １ｍｍφの白金（Ｐｔ）電極
【００７３】
（脂質構造体の作製（脂質ナノチューブ部の形成））
上記脂質構造体製造装置において、ゲル５４の温度を２５℃に調温し、かつ、陽極５６Ａ−陰極５６Ｂ間に６．０ｋＶ／ｍの電界強度（電流２〜３ｍＡ）となる電圧を印加した状態で、蛍光顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡写真（電圧印加開始から６０秒後）を図１１に示す。
図１１において、右下の大面積の明るい部分はリポソームの集合体であり、リポソーム集合体から延びる筋状の部分が脂質ナノチューブ部である。暗い部分はゲル５４である。
図１１に示すように、実施例３では、電圧の印加により、ゲル５４中に脂質ナノチューブ部が形成されていた。
【００７４】
次に、本実施例３の脂質構造体製造装置において、ナノ粒子含有リポソームを、カルボキシレート基で修飾されたナノ粒子を着色して得られたナノ粒子に置き換えた装置を作製し、上記と同様に電圧印加を行った。
すると、目視により、着色されたナノ粒子がゲル中に進出することが確認された。
この結果と上記の脂質ナノチューブ部の形成とから、マイクロサイズのリポソーム部はゲル中を移動できないが、ナノサイズの物質はゲル中を移動できることが確認され、実施例３における脂質ナノチューブ部形成のメカニズムが立証された。
【００７５】
〔実施例４〕
＜電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成４＞
図６に示す脂質構造体製造装置６０と同様の構成の脂質構造体製造装置を用い、電場を利用した脂質ナノチューブ部の形成を行った。
【００７６】
（ナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラスの作製）
図７に示したビオチン−アビジンの相互作用を利用して、ナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラスを作製した。
具体的な操作は以下のとおりである。
エタノール、ＨＥＰＥＳ緩衝液により洗浄したスライドガラス上に、２mg/ml BSA-Biotin溶液を滴下し10分静置した。この滴下操作をもう一度繰り返した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。次に、200 mM NaCl/10 mM Tris-HCl（pH 7.5）溶液で当該濃度のCaseinを溶解(5mg./ml)した後、超遠心（55000rpm）をほどこした上澄みを滴下し、10分静置した。この滴下操作をもう一度繰り返した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。
以上のようにして、BSA-Biotin、Caseinにより基板表面をコーティングした後、1 mg/ml Streptavidin溶液を滴下し40分静置した。この滴下操作についてももう一度繰り返した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。ここに、ＤＯＰＥ−ビオチンを導入したナノ粒子含有リポソーム溶液を滴下し、10分静置の操作を２回繰り返した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、目的の基板（ナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラス）を得た。
【００７７】
（脂質構造体製造装置の作製）
図６に示す脂質構造体製造装置６０と同様の構成の脂質構造体製造装置を作製した。
各部材としては、以下のものを用いた。
−脂質構造体製造装置の部材−
・スライドガラス６２、リンカー６５、及びナノ粒子内包リポソーム６１  …  上記で作製したナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラスを用いた。
・陽極６６Ａ及び陰極６６Ｂ  …  １ｍｍφの白金（Ｐｔ）電極。電極間の距離は１０ｍｍとした。
・水系媒体（図６中の破線部）  …  ＨＥＰＥＳ緩衝液
【００７８】
（脂質構造体の作製（脂質ナノチューブ部の形成））
上記脂質構造体製造装置において、２５℃の環境下、陽極６６Ａ−陰極６６Ｂ間に４．０ｋＶ／ｍの電界強度（電流３ｍＡ）となる電圧を印加した状態で、蛍光顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡写真を図１２に示す。
図１２中、写真（ａ）は電圧無印加時の様子を撮影したものであり、写真（ｂ）〜（ｈ）は電圧を継続して印加し続けたときの様子を、０．１秒間隔で連続的に撮影したものである。即ち、写真（ｂ）と（ｃ）との間隔等、連続する２枚の写真の間隔は０．１秒である。撮影の順序は、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）の順である。
図１２に示すように、電圧印加開始から時間が経過するにつれ、脂質ナノチューブ部が成長する様子が確認された。
この結果から、電圧印加時間を変化させることにより、脂質ナノチューブ部の長さを制御できることが示唆された。
【００７９】
〔実施例５〕
＜磁場を利用した脂質ナノチューブ部の形成＞
実施例４で作製した、ナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラスのナノ粒子含有リポソームに対し、電磁石（株式会社ギガテコ社製、ＴＭＮ電磁石）を用いて２００ＫＡ／ｍ〜５００ＫＡ／ｍの磁場を印加した。
磁場の印加開始から６０秒後の様子を図１３の写真（ａ）〜（ｄ）に示す。
図１３中の写真（ａ）〜（ｄ）（破線で囲った部分）に示すように、磁場の印加によっても、電場を印加した場合と同様に、脂質ナノチューブ部が形成された。
【００８０】
〔実施例６〕
＜慣性力を利用した脂質ナノチューブ部の形成＞
実施例４で作製した、ナノ粒子含有リポソームを保持したスライドガラスのナノ粒子含有リポソームに対し、遠心分離機（Beckman社製GS-15R）を用い、２０ｋｍ／ｓ２の慣性力（遠心力）を印加した。
慣性力（遠心力）の印加開始から３分後の様子を図１４に示す。
図１４（破線で囲った部分）に示すように、慣性力（遠心力）の印加によっても、電場を印加した場合と同様に、脂質ナノチューブ部が形成された。
【００８１】
以上の実施例で示したように、ナノ粒子内包リポソームに対して、外部場（電場、磁場、及び慣性力）を印加することにより、脂質ナノチューブ部を有する脂質構造体を、簡易に、効率よく、制御性よく作製することができた。
【符号の説明】
【００８２】
１０、３１、５１、６１  ナノ粒子内包リポソーム
１０Ａ  脂質構造体
１２  ナノ粒子
１４  脂質膜
２０  脂質ナノチューブ部
３０、４０、５０、６０  脂質構造体製造装置
３２  カバーガラス
３４、５４  ゲル
３６Ａ、４６Ａ、５６Ａ、６６Ａ  陽極
３６Ｂ、４６Ｂ、５６Ｂ、６６Ｂ  陰極
４２  カバーガラスチャンバー
４４  ナノ粒子内包リポソーム含有ゲル
４８  封止剤
４９  カバーガラス
５２  セル
５５Ａ  陽極液
５５Ｂ  陰極液
６２  スライドガラス
Ｆ  外部場
【図１】
2014101273.tif 000003
【図２】
2014101273.tif 000004
【図３】
2014101273.tif 000005
【図４】
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【図５】
2014101273.tif 000007
【図６】
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【図７】
2014101273.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014101273.tif 000012
【図１１】
2014101273.tif 000013
【図１２】
2014101273.tif 000014
【図１３】
2014101273.tif 000015
【図１４】
2014101273.tif 000016