(57)【要約】【課題】、ＭｅｔＳモデルラット由来の多能性幹細胞を提供する。【解決手段】Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、メタボリックシンドロームのモデルラット由来の多能性幹細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリックシンドロームのラットモデル由来の多能性幹細胞。
【請求項２】
前記メタボリックシンドロームのラットモデルは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項３】
レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項４】
メタボリックシンドロームのラットモデル由来の多能性幹細胞と、
非メタボリックシンドロームのラット由来の多能性幹細胞と、
を含む、キット。
【請求項５】
前記メタボリックシンドロームのモデルラットは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記コントロールラットは、非メタボリックシンドロームのラットである、請求項４又は５に記載のキット。
【請求項７】
ラット由来の多能性幹細胞の製造方法であって、
前記ラットから採取した脂肪組織に由来する体細胞を取得する工程と、
前記脂肪組織由来体細胞と核初期化因子とを接触させる工程と、
前記核初期化因子と接触後の前記体細胞を多能性幹細胞に誘導する工程と、
を備える、方法。
【請求項８】
前記ラットは、メタボリックシンドロームのラットモデルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メタボリックシンドロームのラットモデルは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞は、レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、メタボリックシンドロームモデルラット誘導多能性幹細胞及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）は、生活習慣に起因するものとされている。ＭｅｔＳは、内蔵脂肪蓄積によるインスリン抵抗性を基盤として、高血圧、糖尿病、脂質異常症のうち２つ以上を合併した症候群であり、全身及び組織のレニン・アンジオテンシン・アルドステロン（ＲＡＡ）系、交感神経系、及び酸化ストレスや炎症の関与が考えられている。ＭｅｔＳにおいて誘導された動脈硬化が進展すると心筋梗塞や脳血管障害の発症リスクが高くなることが知られている。
【０００３】
ＭｅｔＳの研究のためには、例えば、ＭｅｔＳのモデルラットが確立されている（非特許文献１）。このモデルラットは、Ｄａｈ１食塩感受性ラット（自然発生）とＺｕｃｋｅｒ肥満ラット（ｆａ／ｆａ、ｆａ：Ｌｅｐｔｉｎ受容体のミスセンス変異、自然発生）の交配により確立したコンジェニック系統である。運動プログラムによるＭｅｔＳの改善には、こうしたモデルラットを用いた研究が有用である。
【０００４】
一方、ＭｅｔＳの研究としては、モデルラットにおける運動生理学的研究のほか、細胞レベルの細胞生理学的研究や細胞分化の研究も必須である。また、細胞を用いたＭｅｔＳに有用な薬剤の大規模スクリーニングも重要である。こうした研究やスクリーニングのためには、ＭｅｔＳモデルラット由来の細胞の安定供給が重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T.Hattoriら、Nutrition and Diabetes(2011), e1;doi:10.1038
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＭｅｔＳモデルラット由来の細胞株が樹立されていないのが現状である。この理由は、モデルラットの肥満の原因が、Ｌｅｐｔｉｎ受容体の遺伝子異常であることがわかっているものの、食塩感受性の原因遺伝子が不明であるため、遺伝子工学的に細胞株を樹立することができないからである。また、ラットからの多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）については、その樹立がマウスに比較して難しいからである。
【０００７】
本明細書は、ＭｅｔＳモデルラット由来の多能性幹細胞及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、種々の検討を重ねた結果、ＭｅｔＳモデルラットからｉＰＳ細胞を樹立した。本明細書の開示は、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【０００９】
（１）メタボリックシンドロームのモデルラット由来の多能性幹細胞。
（２）前記メタボリックシンドロームのモデルラットは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、（１）に記載の多能性幹細胞。
（３）レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている、（１）又は（２）に記載の多能性幹細胞。
（４）メタボリックシンドロームのモデルラット由来の多能性幹細胞と、コントロールラット由来の多能性幹細胞と、を含む、キット。
（５）前記メタボリックシンドロームのモデルラットは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、（４）に記載のキット。
（６）前記コントロールラットは、非メタボリックシンドロームのラットである、（４）又は（５）に記載のキット。
（７）ラット由来の多能性幹細胞の製造方法であって、前記ラットから採取した脂肪組織に由来する体細胞を取得する工程と、前記脂肪組織由来体細胞と核初期化因子とを接触させる工程と、前記核初期化因子と接触後の前記体細胞を多能性幹細胞に誘導する工程と、を備える、方法。
（８）前記ラットは、メタボリックシンドロームのモデルラットである、（７）に記載の方法。
（９）前記メタボリックシンドロームのモデルラットは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａである、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）前記多能性幹細胞は、レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｍＯＫＳプラスミド（LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G）を示す図である。
【図２】ｐａｃｋａｇｉｎｇプラスミド（ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ）を示す図である。
【図３】Ｒｅｖ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇプラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ）を示す図である。
【図４】ラット多能性幹細胞移植後約１カ月の移植部位に形成された奇形腫の切片を免疫蛍光染色した写真（Ａ〜Ｃ）を示す図である。
【図５】ラット多能性幹細胞移植後約１カ月の移植部位に形成された奇形腫の切片の光学顕微鏡写真と免疫蛍光顕微鏡写真（Ａ〜Ｄ）を示す図である。
【図６】ラット多能性幹細胞移植後約１カ月の移植部位に形成された奇形腫切片の光学顕微鏡写真と免疫蛍光顕微鏡写真（Ａ〜Ｃ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書の開示は、ＭｅｔＳモデルラット由来の多能性幹細胞及びその製造方法に関する。
【００１２】
本明細書の開示によれば、ＭｅｔＳの遺伝的背景を持った特定の細胞種を安定して多数分化誘導することができるようになる。こうして誘導された細胞は、ＭｅｔＳの細胞生理学的研究、細胞分化の研究、スクリーニング等に用いることができる。以下、本明細書の開示について詳細に説明する。
【００１３】
（ＭｅｔＳのモデルラット由来の多能性幹細胞）
本明細書に開示される多能性幹細胞は、ＭｅｔＳのモデルラットに由来し、ＭｅｔＳモデルラットから誘導された多能性幹細胞である。多能性幹細胞がＭｅｔＳのモデルラットに由来していることにより、ＭｅｔＳの遺伝的背景を保持する各種の細胞種が安定的に提供される。こうした細胞種を用いてＭｅｔＳの細胞生理、細胞分化の研究やＭｅｔＳに有用な薬剤のスクリーニングに適用できる。また、これらの多能性幹細胞が由来するＭｅｔＳモデルラットが存在するために、ＭｅｔＳの細胞レベルの研究とＭｅｔＳに関する病態生理学及び運動生理学的な研究とを組み合わせることができる。
【００１４】
多能性幹細胞とは、分化多能性及び自己複製能を有する細胞である。「分化多能性」とは、三胚葉系列すべてに分化できることを意味し、「自己複製能」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる能力を意味する。
【００１５】
本多能性幹細胞は、ＭｅｔＳのモデルラットに由来している。ここで、ＭｅｔＳとは、高血圧、糖尿病及び脂質異常症のうち２つ以上を合併した症候群であるとされている。ＭｅｔＳのモデルラットは、こうした症状をラットにおいて生理学的に検出できるラットをいう。ＭｅｔＳのモデルラットは、ＭｅｔＳを発症しているラットであれば特に限定されないが。こうしたモデルラットとしては、好ましくは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａ（ＤＳ／ｏｂｅｓｅ）が挙げられる（非特許文献１）。このモデルラットは、Ｄａｈ１食塩感受性ラット（自然発生）とＺｕｃｋｅｒ肥満ラット（ｆａ／ｆａ、ｆａ：Ｌｅｐｔｉｎ受容体のミスセンス変異、レプチン受容体遺伝子の第８０６位のヌクレオチドがＡからＣに置換されている。この結果、全てのレプチン受容体の同位体に共通する細胞外ドメインの２６９位のグルタミンがプロリンに置換されている変異（Gln269Pro）を有している）、自然発生）の交配により確立したコンジェニック系統である。このモデルラットは、既に、ＭｅｔＳモデルラットとして確認されている（T. Hattori, et.al., Nutrition and Diabetes (2011), e１;doi:10.1038, T. Murase, et.al., Hypertension 2012, 59:694-704, T. Murase, et.al., Hypertension Research,(2012),35, 186-193, 永田ら、心臓， Vol.45, No.2,(2013）, 147-158）。このモデルラットは、また、日本ＳＬＣ等により商業的にも入手可能である。
【００１６】
本多能性幹細胞は、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されていることが好ましい。レプチンは、肥満の抑制に関連すると考えられるホルモンである。レプチン受容体タンパク質は、レプチンを細胞表面で結合する受容体タンパク質である。レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている場合、肥満を発症し進展させることになると推定されている。
【００１７】
また、レプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されているとは、この遺伝子が破壊されている、この遺伝子に変異を有していることなどにより、その転写及び翻訳が少なくとも部分的抑制されている状態をいう。実質的にｍＲＮＡが検出できない、あるいは、不完全なｍＲＮＡが検出できるが、機能しないタンパク質に翻訳されているなど、機能的なレプチン受容体タンパク質が実質的に生成されないことが好ましい。生成など、高度にその発現がＤａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａ（ＤＳ／ｏｂｅｓｅ）は、レプチン受容体タンパク質のミスセンス変異をホモで備えており、レプチン受容体タンパク質遺伝子の転写物であるｍＲＮＡが検出されないことが確認されている。
【００１８】
本多能性幹細胞は、ＭｅｔＳのモデルラットは、例えば、レトロウイルスもしくはレンチウイルスを用いた初期化遺伝子（例、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の４因子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子及びＫｌｆ４遺伝子の３因子）の導入により得られていることが好ましい。こうした本多能性幹細胞は、ゲノム上において、これらの核初期化遺伝子を１又は２以上、好ましくは全てを保持している。なお、上記ウイルス由来ベクターに導入形態が限定されるものではない。また、染色体外においてこうした核初期化遺伝子が１又は２以上保持されていてもよい。
【００１９】
なお、「初期化遺伝子」とは、体細胞の核初期化のために作用する外因性遺伝子を意味し、ラット体細胞に「内在する」これらと実質的に同一の遺伝子は、初期化遺伝子には当然含まれない。
【００２０】
本多能性幹細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ＥＳ細胞で報告されている分化誘導法を利用して、本多能性幹細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞、脂肪細胞等）への分化を誘導することができる。
【００２１】
さらに、本多能性幹細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞や脂肪細胞等）は、実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、ＭｅｔＳの細胞レベルでの研究や医薬候補化合物の薬効や毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング等にも好適に用いることができる。
【００２２】
（多能性幹細胞のキット）
本明細書に開示される多能性幹細胞のキットは、本多能性幹細胞と、コントロールラット由来の多能性幹細胞と、を含むことができる。コントロールラット由来の多能性幹細胞を含むことで、こうしたコントロールの多能性幹細胞からも、本多能性幹細胞と同様に、機能的な細胞を誘導し、準備できる。こうしたコントロールラット由来の多能性幹細胞及び本多能性幹細胞から誘導した双方の機能的細胞と対比することで、ＭｅｔＳにおける細胞レベルの研究をより一層進展させることができる。
【００２３】
コントロールラットとしては、ＭｅｔＳの細胞レベルでの研究において対比に好適であれば特に限定されないが、非メタボリックシンドロームのラットであることが好ましい。こうした非メタボリックシンドロームのラットとしては、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒ＋／Ｌｅｐｒ＋（ＤＳ／ｌｅａｎ）（T. Hattori, et.al., Nutrition and Diabetes (2011), e1;doi:10.1038, T. Murase, et.al., Hypertension 2012, 59:694-704, T. Murase, et.al., Hypertension Research,(2012),35, 186-193, T. Murase, et.al., Hypertension 2012, 59:694-704, 永田ら、心臓， Vol.45, No.2,(2013）, 147-158）が挙げられる。このラットは、Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａとは遺伝的に近いにもかかわらず、ＭｅｔＳを呈しないラットであって対象的であると考えられるので、ＭｅｔＳの細胞レベルでのメカニズムの解明に有利であると考えられる。Ｄａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒ＋／Ｌｅｐｒ＋（ＤＳ／ｌｅａｎ）も、同様に、日本ＳＬＣ等から商業的に入手できる。
【００２４】
（ラット由来の多能性幹細胞の製造方法）
本明細書に開示されるラット由来の多能性幹細胞の製造方法は、ラットの脂肪組織から体細胞を取得する工程と、前記体細胞と核初期化因子とを接触させる工程と、前記核初期化因子と接触後の前記体細胞から多能性幹細胞を誘導する工程と、を備えることができる。本製造方法によれば、ラット由来の多能性幹細胞を効率的に取得することができる。
【００２５】
（ラットからの体細胞取得工程）
多能性幹細胞を製造するのに用いるラットについては特に限定されないが、いわゆる実験用して商業的に提供されているラットが好ましい。また、各種の病態のモデルラットを好ましく用いることができる。病態モデルラットについて任意の機能的細胞種の入手が容易になることにより、病態の細胞レベルでの研究や薬剤のスクリーニング等が容易になる。病態モデルラットしては、ＭｅｔＳのモデルラットが好ましく、より具体的には、既述のＤａｈ１Ｓ．Ｚ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｌｅｐｒｆａが挙げられる。このラットモデルを用いることでレプチン受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現が不活性化されている多能性幹細胞を容易に得ることができる。
【００２６】
多能性幹細胞を製造するためのラット由来の体細胞は、特に限定されないで、任意のラット体細胞を用いることができる。例えば、胎児期の体細胞を用いることができるほか、成熟した体細胞を用いることもできる。具体的には、脂肪組織由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、筋芽細胞、線維芽細胞等の既に分化した細胞等を用いることができる。多能性幹細胞の樹立効率の高さという観点から、好ましい一実施態様においては、ラットから採取した脂肪組織から脂肪組織由来間葉系（幹）細胞を含有する細胞集団が用いられる。特に、ＭｅｔＳのラットモデルにおいては、脂肪組織の採取が脂肪組織に由来することが容易であるため、好ましい。ラットからの体細胞の取得は、当業者において周知であり、当業者であれば、意図する体細胞の種類に応じてこれらを適宜取得できる。
【００２７】
なお、多能性幹細胞の選択を容易にするために、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４等）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）及び／又はレポーター遺伝子（例、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ）遺伝子）をターゲッティングした組換え体細胞を用いることもできる。
【００２８】
また、ラットから分離した体細胞は、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２９】
また、ラットから取得した体細胞は、その継代が２回未満であるものを使用することが好ましい。２回以上の継代を行ったものは多能性幹細胞の樹立効率が著しく低下する傾向がある。また、一旦凍結解凍した体細胞を用いないことも好ましい。凍結解凍後の体細胞は、多能性幹細胞の樹立効率が著しく低下する傾向がある。
【００３０】
（核初期化因子との接触工程）
本明細書における核初期化因子とは、ラット体細胞の核初期化を誘導する因子であり、ラット体細胞に分化多能性及び自己複製能を備えさせることができる、ラット多能性幹細胞への変換物質である。該核初期化因子としては、特に限定されないが、例えば、核酸（遺伝子）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物又はこれらの混合物等を用いることができる。核初期化因子がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、ラット体細胞の核初期化を促すシグナル伝達経路を活性化させるという観点から転写因子であることが好ましい。該転写因子の中でも、具体的には、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子の組合せが特に好ましい。また、より好ましくは、ｃ−Ｍｙｃを除くＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３因子の組合せである。
【００３１】
また、上記４因子又は３因子をすべて含み、且つ任意の他の因子をさらに含む組み合わせも、核初期化因子の好ましい態様に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が、上記４因子の一部を核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該因子を除いた残りの因子のみの組み合わせもまた、本発明における核初期化因子の好ましい態様に含まれ得る。核初期化因子には前記４因子以外の他の因子も含まれる。具体的には、他の因子として、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原等が挙げられる。
【００３２】
Ｏｃｔ３／４としては、具体的には、ラットのＯｃｔ３／４、あるいは他の哺乳動物由来のＯｃｔ３／４（例、マウスＯｃｔ３／４、ヒトＯｃｔ３／４）が挙げられる。また、Ｓｏｘ２としては、具体的には、ラットのＳｏｘ２、あるいは他の哺乳動物由来のＳｏｘ２（例、マウスＳｏｘ２、ヒトＳｏｘ２）が挙げられる。また、Ｋｌｆ４としては、具体的には、ラットのＫｌｆ４、あるいは他の哺乳動物由来のＫｌｆ４（例、マウスＫｌｆ４、ヒトＫｌｆ４）が挙げられる。また、ｃ−Ｍｙｃとしては、具体的には、ラットのｃ−Ｍｙｃ、あるいは他の哺乳動物由来のｃ−Ｍｙｃ（例、マウスｃ−Ｍｙｃ、ヒトｃ−Ｍｙｃ）が挙げられる。ラット、マウス及びヒト由来の上記４因子のアミノ酸配列及びｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ等を用いたり、通常の検索方法を用いてＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で参照することにより取得することができる。
【００３３】
なお、該４因子は、ラット体細胞に導入することによってラット多能性幹細胞を製造することができるという特徴を有する限り、前記アミノ酸配列において一又は数（２〜５）個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、極めて高い相同性を有するものであってよい。
【００３４】
「極めて高い相同性を有する」遺伝子とは、具体的には該４因子をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意味し、具体的には前記配列番号に示された該４因子と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性を有する遺伝子である。
【００３５】
核初期化因子のラット体細胞への導入方法は、特に限定されることはなく、該核初期化因子がラット体細胞と接触可能であればいかなる方法であってもよい。例えば、核初期化因子が転写因子等をコードする核酸であれば、該核酸を発現することが可能なベクターを用いてラット体細胞に導入する方法を採用することができる。このようなベクターを用いる場合、本発明の核初期化因子が二種以上の核酸であれば、一つのベクターに該二種以上の核酸を組み込んでラット体細胞内で同時に発現させてもよく、また複数のベクターを用いて該二種以上の核酸を発現させてもよい。前者の場合、効率的なポリシストロニック発現を可能にするために、口蹄疫ウイルスの２Ａ ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（Science, 322, 949-953 (2008)等参照）やＩＲＥＳを各核酸の間に連結することが望ましい。
【００３６】
遺伝子を発現することが可能なベクターとしては、特に限定されないが、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シルビスウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス等のウイルスベクター；ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等の人工染色体ベクター；プラスミドベクター；宿主細胞内で自律複製可能なエピゾーマルベクター等が挙げられる。該ベクターを本発明のラット体細胞に導入する場合は、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等の方法を用いることができる。
【００３７】
また、該ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合は、パッケージング細胞を利用することもできる。パッケージング細胞とは、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であって、この細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスＤＮＡを導入すると、該組換えウイルス粒子を産生するものをいう。それゆえパッケージング細胞としては、ウイルス粒子の構成に必要なタンパク質を組換えウイルスベクターに対して補給する細胞であればいかなるものも用いることができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースにしたパッケージング細胞；Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ｅ細胞、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ａ細胞、及び水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−ＧＰ細胞等を用いることができる（Ｐｌａｔ−Ｅ細胞、Ｐｌａｔ−Ａ細胞及びＰｌａｔ−ＧＰ細胞は、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社より購入することができる）。これらの中でも、ラット体細胞に対して組換えウイルスベクターを導入する場合には、２９３ＦＴ細胞が特に好ましい。該パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の従来公知の方法を利用することができるが、ウイルスの作製効率を考慮すると、リポフェクションが好ましい。
【００３８】
また、該ベクターを用いて遺伝子を導入する場合は、該遺伝子の導入を確認するため同時にマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子全般をいい、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。また、発光酵素遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられ、発色酵素遺伝子としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。これらのマーカー遺伝子については一種又は二種以上を組み合わせて用いることができ、また、ネオマイシン耐性遺伝子とβガラクトシダーゼ遺伝子との融合遺伝子であるβｇｅｏ遺伝子等のような、二種以上のマーカー遺伝子を含む融合遺伝子も用いることができる。
【００３９】
上記核初期化因子の導入操作は、１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上（たとえば３回又は４回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間が挙げられる。
【００４０】
一方、核初期化因子が転写因子等のタンパク性因子である場合、ラット体細胞と核初期化因子との接触は、自体公知の蛋白質導入法により行うことができる。タンパク質導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、１回以上１０回以下、又は１回以上５回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を２回以上（たとえば３回又は４回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間が挙げられる。
【００４１】
そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）もしくは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたＢｉｏＰＯＴＥＲ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｏ−ＪｅｃｔＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ）及びＰｒｏＶｅｃｔｉｎ（ＩＭＧＥＮＥＸ）、脂質をベースとしたＰｒｏｆｅｃｔ−１（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、膜透過性ペプチドをベースとしたＰｅｎｅｔｒａｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｑ ｂｉｏｇｅｎｅ）及びＣｈａｒｉｏｔ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したＧｅｎｏｍＯＮＥ（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化因子を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５〜１５分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【００４２】
ＰＴＤとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ＨＩＶ由来のＴＡＴ、ＨＳＶ由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。ＰＴＤ由来のＣＰＰとしては、１１Ｒ（Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)）や９Ｒ（Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)）等のポリアルギニンが挙げられる。核初期化因子のｃＤＮＡとＰＴＤもしくはＣＰＰ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００４３】
マイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００４４】
接触工程は、適切な密度で播種されたラット体細胞に対して、核初期化因子を接触させ一定期間、ラット体細胞の培養に好適な条件（例えば、５％ＦＢＳ、ドキシサイクリン含有ＤＭＥＭ培地、３７℃、５％ＣＯ2）で培養することができる。
【００４５】
（体細胞から多能性幹細胞を誘導する工程）
ラット体細胞を核初期化因子と接触させた後、ラット体細胞は、適切なタイミングで多能性幹細胞誘導用の培地を用いた工程に供される。核初期化因子と接触させた後、ラット体細胞は、例えば７日以内（好ましくは６、５、４、３日以内）、特に好ましくは４８時間以内に本工程に供される。
【００４６】
本工程における培養条件は、用いられる培地により適宜設定することができる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。培養は、約３週間以上、好ましくは３〜５週間程度行うことができ、この間にＥＳ細胞様のコロニーが形成され、細胞が増殖する。
【００４７】
また、本工程においては、核初期化因子との接触から２〜４日経過後に、フィーダー細胞上でコロニーが出現するまで約７日〜１４日間程度培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞としては、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させた線維芽細胞（例、イヌ胎仔由来の線維芽細胞、マウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ））等が挙げられる。ＭＥＦとしては、例えばＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62: 1073-1085 (1990)）等が用いられ得る。
【００４８】
本工程における培地には、白血病抑制因子が含まれる。誘導工程で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００４９】
また、該培地は、血清含有培地又は無血清培地とすることができる。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地や血清代替試薬（例えば、KSR（Invitrogen社）等）が添加されている培地などは無血清培地に該当するものとする。
【００５０】
該培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有することができる。
【００５１】
白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）は、インターロイキン６ファミリーに属するサイトカインであり、白血病細胞の増殖阻害、血小板の増加、胚性幹細胞の分化抑制や未分化造血系前駆細胞の増殖等に機能するものである。白血病抑制因子は、白血球阻害因子、白血球遊走阻止因子等とも呼ばれている。本工程で用いられる白血病抑制因子は、ラット由来の多能性幹細胞を作製し得るものであれば特に限定されず、いかなる哺乳動物由来の白血病抑制因子でも用いることができ、例えば、ラット、マウス、ヒト、ウシ、チンパンジー由来の白血病抑制因子などが挙げられるが、好ましくはマウス又はラット由来の白血病抑制因子を用いることができる。これらの白血病抑制因子は、自体公知のいかなる方法によって取得されてもよいが、好ましくは、哺乳動物の組織から調製したＲＮＡを鋳型とし、公共のデータベース等から提供される白血病抑制因子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより取得することができる。また、組換えマウス及びヒト白血病抑制因子はミリポア社等から購入することもできる。本誘導工程においては、白血病抑制因子の濃度を、好ましくは１×１０3Ｕｎｉｔ/ｍＬとすることができる。
【００５２】
イヌｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択法としては、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、前述した、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換えイヌ体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。また、核初期化因子として核酸を遺伝子導入する場合には、上記に示したように同時に導入された薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等のマーカー遺伝子の発現を指標とすることもできる。
【００５３】
選択されたコロニーの細胞が多能性幹細胞であることの確認は、例えば、アルカリフォスファターゼ染色法により行うことができる。例えば、本工程で形成されたコロニーの細胞を分取してプレート又はウェルに固定し、その後、該細胞を基質と接触させ発色を確認すればよい。さらに、各種ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ等により解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成能を確認する等の試験を実施することもできる。
【００５４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００５５】
１．使用細胞
iPS細胞作製には脂肪組織中に含まれる間葉系幹細胞を使用した。間葉系幹細胞の採取は以下の手順に従って行った。
【００５６】
メタボリックシンドロームモデルラット（以下obese Rat；DahlS.Z-Leprfa/Leprfa）（日本ＳＬＣ）とコントロールである痩せ型ラット（DS/lean Rat ；DahlS.Z-Lepr+/Lepr+）（日本ＳＬＣ）の鼡径部の脂肪組織を採取し、メスで細かく刻んだ。その後、３７℃に温めた１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩ溶液中で６０分間攪拌し組織を分解した。
【００５７】
６０分後にすばやく４℃に冷やした倍量のＰＢＳで不活化する。不活化された溶液は３００Ｇで１０分間遠心分離され、その上清を除去する。沈殿した細胞分画を培養液（１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）で再縣濁し、プラスティックシャーレに播種する。播種した２４時間後、浮遊細胞を除去し、プラスティックシャーレに接着している細胞を脂肪組織由来間葉系幹細胞としてこの先の実験に使用した。
【００５８】
２．レンチウイルスベクターの作製〜リポフェクション法〜
２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＤＬコートしたディッシュに４×１０６の密度で６皿に播種し２４時間培養する。２９３ＦＴ細胞を播種した翌日、ｍＯＫＳプラスミド（東京大学医科学研究所ＭＴＡにより分与、図１参照）４５μｇ，ｐａｃｋａｇｉｎｇプラスミド（ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ、図２参照）３０μｇ，Ｒｅｖ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇプラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ、図３参照）３０μｇ（上記２つのプラスミドは理研筑波ＭＴＡにより分与）の割合で混合したプラスミド溶液とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２１６μＬ、１８ｍＬのＦＢＳと抗生剤を含まない２９３ＦＴ細胞培地を穏やかに混合し、２０分間室温でインキュベートした後、ＦＢＳと抗生剤を含まない４２ｍＬの２９３ＦＴ細胞用培地と混合して６皿の２９３ＦＴ細胞の培養皿へ均一に播種し、５時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００５９】
５時間のインキュベートの後、培養上清を完全に除去し、５％ＦＢＳと抗生剤、Ｇ４１８を含む２９３ＦＴ細胞用培地を加えさらに２０時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００６０】
プラスミドトランスフェクションの翌日、２９３ＦＴ細胞の培養上清をシリンジで回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、ウイルス濃縮用キット、Ｌｅｎｔｉ Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｃｌｏｎｅ ｔｅｃｈ）を全体量の１／３量加え、４℃で一晩インキュベートする。その翌日、濃縮キットを含んだウイルス液を１８００Ｇで４５分間遠心し、沈殿したウイルスを３００μＬのＰＢＳに再縣濁し、すぐに使用した。
【００６１】
３．脂肪組織由来間葉系幹細胞へのウイルス感染
６ｗｅｌｌディッシュに５×１０４／１ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その２４時間後に５％ＦＢＳとＤｏｘを含んだＤＭＥＭ ２ｍＬにレンチウイルス濃縮液を１ｗｅｌｌに対して３００μＬづつ加え２４時間３７℃５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ），５％マウスＬＩＦを含むＤＭＥＭと培地交換した。ウイルスを感染させた２日後にフィーダー細胞上にまきなおし、コロニーが出現するまで約１０日間培養を続ける。約１０日後にＥＧＦＰ発現したｉＰＳ細胞が出現し、これを採取してクローンとして増殖させた。
【００６２】
４．ｉＰＳ細胞である事の確認
ＳＣＩＤマウスの前脛骨筋に多能性幹細胞を移植し、約１月後に形成された奇形腫を採取して、三胚葉性細胞の形成を形態学的に確認した（図４〜６）。図４に示すように、外胚葉由来である神経組織が形成されていたことを示している。すなわち、神経線維が赤、細胞の核が青く蛍光染色されており（図４Ａ）、移植細胞に由来する細胞である事を示す緑の蛍光が神経繊維と同一部位に発色しており、緑と神経線維の赤が重なってオレンジ色に染まっていた（図４Ｂ）。また、青い核を持つ神経細胞が神経線維の赤と移植細胞の緑を共に発色していた（図４Ｃ）。以上のことから、これらの細胞は移植した多能性幹細胞が神経細胞に分化したことが確認された。
【００６３】
図５に示すように、中胚葉由来の組織である、軟骨や骨格筋が形成されていたことを示している。すなわち、軟骨の形成を示す光学顕微鏡写真と同じ部位に軟骨の特徴である二型コラーゲンが免疫蛍光染色で赤く染まり、これが軟骨であることを示している（図５Ａ、Ｂ）。また、移植した部位に長く横に伸びる細胞認められた。これらの細胞が緑色に染まったことから移植細胞である事が確認された（図５Ｃ）。青は細胞の核である。さらに、図５Ｃの同じ部位は骨格筋に特異的な筋線維タンパクが存在し、赤く染まり、骨格筋に特徴的な縞模様も見られた（図５Ｄ）。以上のことから、これらは移植した細胞が骨格筋に分化したことが確認された。
【００６４】
図６に示すように、内胚葉由来の組織である消化管が形成されていたことを示している。すなわち、消化管の上皮と管腔を示す光学顕微鏡写真と同じ部位はすべての細胞が緑色に染まり、移植した細胞から分化したことを示している（図６Ａ、Ｂ）。青は細胞の核を示している。また、赤い蛍光は消化管に特徴的な転写因子であり、これが緑の細胞の核にあることから、青と赤が重なってピンクに見える。図６Ｂの切片を青と赤だけで表すと、赤く染まる消化管に特異的な物質は転写因子なので青い核の中にあることが分かる（図６Ｃ）。以上のことから、移植細胞が消化管に分化したことが確認された。
【００６５】
また未分化多能性幹細胞より、ｍＲＮＡを採取し、未分化維持に必要とされる幹細胞マーカーの発現、三胚葉のマーカーの発現をＰＣＲで調べた（図４〜６）。調べたｍＲＮＡは多能性幹細胞マーカーである、ＲａｔＯｃｔ4，ＲａｔＫｌｆ4，ＲａｔＳｏｘ2，ＲａｔＦｇｆ4，ＲａｔＲｅｘ-1，ＲａｔＴＤＧＦ2，ＲａｔＮａｎｏｇである。これらはすべて発現が見られた。また、ｉＰＳ細胞から作成した胚葉体に三胚葉由来の細胞が分化したことを示す、ｍＲＮＡとして、Ｓｏｘ17，ＡＦＰ，ＮＣＡＭ，Ｐａｘ6，ＳＭ22，ＭｙｏＤの発現が認められた。さらに、ＬｅｐｔｉｎのｍＲＮＡ発現について、確認したところ、コントロールｉＰＳには発現が認められたが、ｏｂｅｓｅ Ｒａｔでは発現が見られなかった。そして、ｉＰＳ細胞は５回以上継代すると、レンチウィルスは検出されなくなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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