(57)【要約】      （修正有）【課題】特定のｍｉＲＮＡ分子をターゲティングする核酸に関連する方法および組成物を提供する。【解決手段】対象において赤血球形成を増大させ、対象においてエリスロポエチンレベルを上昇させ、またはその必要がある対象を貧血症、血友病もしくは鎌状赤血球症について処置するための方法であって、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる有効量の核酸を対象に投与することを含む方法。前記核酸および医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。【選択図】図１
2014050389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞によるエリスロポエチンの発現または分泌を増大させる方法であって、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる核酸を細胞に導入することを含む方法：
（ａ）ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体からなる群から選択される；（ｂ）核酸は、（ｉ）緊縮条件下で該ＲＮＡ分子にハイブリダイズするか、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３８との少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
【請求項２】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８と４核酸塩基より多くは相異しない配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８との１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞が腎細胞、肝細胞、脾細胞、または骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が腎細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞がヒト腎細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が臓器の一部を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
臓器が腎臓、肝臓、または脾臓である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
臓器が腎臓である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその
前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ分子がｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）およびその前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が少なくとも１２核酸塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が１２〜３０核酸塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が、ホスホロアミデート、ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、アルキルホスホネート、およびメチリンメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｉｎｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−アルキルリボ核酸ユニット、２’アミンリボ核酸ユニット、ペプチド核酸ユニット、２’フルオロ−リボ核酸ユニット、モルホリノ核酸ユニット、シクロヘキサン核酸ユニット、およびトリシクロ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、および２’Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニッ
トを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が、ロックされた核酸、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
核酸が、ロックされた核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
対象において赤血球形成を増大させ、対象においてエリスロポエチンレベルを上昇させ、またはその必要がある対象を貧血症、血友病もしくは鎌状赤血球症について処置するための方法であって、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる有効量の核酸を対象に投与することを含む方法：
（ａ）ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体からなる群から選択される；（ｂ）核酸は、（ｉ）緊縮条件下で該ＲＮＡ分子にハイブリダイズするか、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３８との少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
【請求項２７】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８と４核酸塩基より多くは相異しない配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８との１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
対象が哺乳動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその
前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、およびその前駆体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＮＡ分子がｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）およびその前駆体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
核酸が少なくとも１２核酸塩基の長さである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
核酸が１２〜３０核酸塩基の長さである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
核酸が、ホスホロアミデート、ホスホロチエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、アルキルホスホネート、およびメチリンメチルイミノからなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−アルキルリボ核酸ユニット、２’アミンリボ核酸ユニット、ペプチド核酸ユニット、２’フルオロ−リボ核酸ユニット、モルホリノ核酸ユニット、シクロヘキサン核酸ユニット、およびトリシクロ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、および２’Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
核酸が、ロックされた核酸、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
核酸が、ロックされた核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも９０％のロックされた核酸ユニットを含む核酸であって、該核酸は、（ｉ）緊縮条件下でＲＮＡ分子にハイブリダイズするか、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８との少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、該ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体からなる群から選択される核酸。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸および医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４９】
貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置する医薬の製造のための、請求項４７に記載
の核酸の使用。
【請求項５０】
貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置する医薬の製造のための、請求項４７に記載の核酸の使用。
【請求項５１】
貧血症、血友病または鎌状赤血球症に使用するための、請求項４７に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
[0001]  本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもとに米国仮特許出願番号６０／９７７，０１７、２００７年１０月２日出願に基づく優先権を主張し、これを本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定のメッセージをターゲティングしてそれらの翻訳を阻害することによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機序によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセシングされたｍｉＲＮＡ分子より長い。ｍｉＲＮＡは、細胞核内でまず一次転写体、すなわちｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写され、そしてプロセシングされてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる短い約７０ヌクレオチドのステム−ループ構造体になる。このプロセシングは、ヒトにおいては、マイクロプロセッサー複合体として知られるタンパク質複合体により行われ、これはヌクレアーゼであるドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）および二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８を含む。これらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが、次いで細胞質内でエンドヌクレアーゼであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）との相互作用によりＴＲＢＰの補助でプロセシングされて、成熟ｍｉＲＮＡになる；これによりＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）の形成も開始される。この複合体は、ｍｉＲＮＡ発現およびＲＮＡ干渉のため見られる遺伝子サイレンシングに関与する。この経路は、植物においてはそれらがドローシャホモログを欠如するためわずかに異なる。代わりに、ダイサーホモログが単独で幾つかのプロセシング段階に作用する。
【０００３】
[0003]  ドローシャによる効率的なｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのプロセシングには、ヘアピン分子の３’末端および５’末端の両方が延長した一本鎖ＲＮＡの存在が必要である。ドローシャ複合体は、末端ループからほぼ２らせん回転、基本セグメントからほぼ１回転離れた位置でＲＮＡ分子を開裂させる。分析された大部分の分子において、この領域には非対合ヌクレオチドが含まれ、より下流および上流の領域と比較してデュプレックスの自由エネルギーが比較的高い。生成したｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは短いヘアピンループ構造をもち、エクスポーチン５（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ  ５）により、補因子Ｒａｎ、すなわちＧＴＰアーゼからの補助で、細胞質へ輸出される(Gwizdek et al., J. Biol. Chem. 278, 5505-8 (2003); Lund et al., Science 303, 95-8 (2004); Bohnsack et al., RNA 10, 185-91 (2004))。
【０００４】
[0004]  ダイサーがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム−ループを細胞質において開裂すると、２つの相補的な短いＲＮＡ分子が形成されるが、５’末端の安定性に基づいて一方のみがＲＩＳＣ複合体中に統合される。パッセンジャー鎖として知られる残りの鎖は分解される。活性ＲＩＳＣ中に統合された後、ｍｉＲＮＡはそれらに相補的なｍＲＮＡ分子と塩基対合し、ｍｉＲＮＡとこのターゲットｍＲＮＡの間の相補性の程度に応じて、鍵となる２つの機序のうちの１つにより転写体の発現のダウンレギュレーションを誘導する。動物においては、ｍｉＲＮＡとそれらのターゲットｍＲＮＡの間の対合は通常は完全でない；ただし、完全またはほぼ完全な認識が存在する幾つかの例外がある(Yekta et al., Science
304, 594-6 (2004); Mansfield et al. Nat Genet 36, 1079-83 (2004))。ｍｉＲＮＡとターゲットの間の相補性が完全またはほぼ完全であれば、ｍＲＮＡの開裂はＲＩＳＣにおいてＡｇｏ２タンパク質により供給されるエンドヌクレアーゼ（スライサー（ｓｌｉｃｅｒ））活性によって仲介される。ｍｉＲＮＡが不完全な塩基対合によりそれらのターゲッ
トに結合する場合、ｍｉＲＮＡが結合したメッセージは、リボソームは枯渇しているがヌクレアーゼに富むＰ−ボディーまたはプロセシングボディーとして知られる細胞質フォーカスへ向かう可能性がある(Parker et al., Nature Structural & Molecular Biology 11, 121-12 (2004))。Ｐ−ボディーはこれらのメッセージの分解中心または貯蔵溜めとして作用し、そこではそれらの翻訳が阻害される。
【０００５】
[0005]  現在までに５００近いｍｉＲＮＡがヒトにおいて同定されている(Griffiths-Jones, S. Nucleic Acids Res 32, D109-11 (2004))。バイオインフォーマティクス方法により、これらのｍｉＲＮＡは少なくとも３０％のヒト転写体を調節しうると推定されている(Lewis, et al. Cell, 2005.120(1): p. 15-20)。その結果、ｍｉＲＮＡは、調節異常
が種々の疾病状態をもたらす可能性のある多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす潜在性をもつ。多くの生物学的プロセスにおけるそれらの役割を解明するための実験的証拠が蓄積しつつある。これらの寄与により、ｍｉＲＮＡは療法介入のための有望なクラスのターゲットとなっている。しかし、きわめて多くの生物学的プロセスにおいて個々のｍｉＲＮＡが果たす特異的な役割について現在の理解が欠けていることが、ｍｉＲＮＡのターゲティングを混乱させている。
【０００６】
[0006]  エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞を赤血球に成熟させるのに関係する糖タンパク質ホルモンである。それは循環中の赤血球のレベルを調節するのに必須である。天然のエリスロポエチンは、胎児生活中は肝臓により、および成体の腎臓により産生される。ＥＰＯは血液中を循環し、骨髄における赤血球の産生を刺激する。貧血症はほぼ常に、腎損傷の結果、腎臓からのエリスロポエチン産生が減少したことが原因である。エリスロポエチンをコードする遺伝子で形質転換した宿主細胞からのタンパク質生成物の発現を伴う遺伝子工学技術により産生された組換えエリスロポエチンは、慢性腎不全から起きる貧血症の処置に使用した場合に有効であることが認められた。
【０００７】
[0007]  血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成の正のレギュレーターである。Hua et al., MiRNA-Directed Regulation of VEGF and Other Angiogenic Factors under Hypoxia, PloS ONE 1(1): e116, 1-13, 2 (2006)。ＶＥＧＦは血管内皮細胞に対して特異
性の高いマイトジェンである。Neufeld, Cohen et al., Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Its Receptors, FASEB J. 13, 9-22 (1999)。
【０００８】
[0008]  ヒトの尿中に存在するエリスロポエチンは普通は低レベルであるが、再生不良性貧血に罹患している個体は上昇した尿エリスロポエチンレベルを示す。Miyake et al.,
J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)によるヒトの尿のエリスロポエチンの精製には、出
発材料として再生不良性貧血の個体からの尿が用いられた。しかし、現在までに尿エリスロポエチンが療法上有用であることは示されていない。
【０００９】
[0009]  エリスロポエチンをコードする遺伝子の同定、クローニングおよび発現がＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７０３，００８（Lin）に記載されている。細胞培地からの組換
えエリスロポエチンの精製方法の記載は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６６７，０１６（Laiら）に含まれる。組換えプラスミド上にエリスロポエチン遺伝子を含む哺乳動物細胞
宿主からの生物活性組換えエリスロポエチンの発現および回収は、療法用途に適切な量のエリスロポエチンを初めて入手可能にした。さらに、遺伝子配列が分かったこと、およびより多量の精製タンパク質の入手が可能になったことによって、このタンパク質の作用様式がより良く理解されるようになった。
【００１０】
[0010]  療法におけるＥＰＯの有益性が知られているので、ＥＰＯの発現またはＥＰＯの分泌を増大させる方法はＥＰＯ療法を必要とする患者にとって著しく有益であろう。本明細書に記載する方法および組成物は、当技術分野におけるこれらおよび他の要望に対処
する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７０３，００８
【特許文献２】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６６７，０１６
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gwizdek et al., J. Biol. Chem. 278, 5505-8 (2003)
【非特許文献２】Lund et al., Science 303, 95-8 (2004)
【非特許文献３】Bohnsack et al., RNA 10, 185-91 (2004)
【非特許文献４】Yekta et al., Science 304, 594-6 (2004)
【非特許文献５】Mansfield et al. Nat Genet 36, 1079-83 (2004)
【非特許文献６】Parker et al., Nature Structural & Molecular Biology 11, 121-12 (2004)
【非特許文献７】Griffiths-Jones, S. Nucleic Acids Res 32, D109-11 (2004)
【非特許文献８】Lewis, et al. Cell, 2005.120(1): p. 15-20
【非特許文献９】PloS ONE 1(1): e116, 1-13, 2 (2006)
【非特許文献１０】FASEB J. 13, 9-22 (1999)
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)
【発明の概要】
【００１３】
[0021]  特定のｍｉＲＮＡおよびその前駆体にハイブリダイズするように設計された核酸配列は、選択した遺伝子の発現、たとえば限定ではないが細胞におけるエリスロポエチン（“ＥＰＯ”）の発現および／または分泌を増大させ、その必要がある患者において貧血症、血友病および鎌状赤血球症などの疾患を処置し、ならびに赤血球形成を増大させ、あるいはエリスロポエチンレベルを上昇させるのに有用であることが見いだされた。
【００１４】
[0022]  １観点においては、ＥＰＯの発現および／または分泌を増大させるための方法が提供される。この方法は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスである、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的である、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８（本明細書中で“抗−ｍｉＲＮＡ核酸配列”とも言う）のうちの１つの６核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた配列（たとえば近接配列）をもつ核酸を、細胞に導入することを含む。表３に示すように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９〜７７のターゲットｍｉＲＮＡ配列にハイブリダイズする。
【００１５】
[0023]  前記のＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ
−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。ターゲットｍｉＲＮＡとして作動する成熟ｍｉＲＮＡの配列については表３を参照。
【００１６】
[0024]  他の観点においては、対象において赤血球形成を増大させ、対象においてＥＰＯレベルを上昇させ、またはその必要がある対象を貧血症、血友病または鎌状赤血球症について処置するための方法が提供される。この方法は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスである、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的である、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた配列（たとえば近接配列）をもつ、有効量の核酸を、対象に投与することを含む。このＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。他の観点においては、少なくとも９０％のロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ユニットをもつ核酸が提供される。この核酸は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスであり、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的であり、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた
配列（たとえば近接配列）をもつ。このＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】[0011]  図１は、ｍｉＲＮＡ前駆体のターゲット領域の例を示す。
【図２】[0012]  図２は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４００ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図３】[0012]  図３は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４００ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図４】[0012]  図４は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４００ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図５】[0012]  図５は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４００ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図６】[0012]  図６は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４００ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図７】[0013]  図７は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする４０ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図８】[0014]  図８は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする２０ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図９】[0014]  図９は、Ｋｅｌｌｙ細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする２０ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図１０】[0015]  図１０は、ＨＥＰＧ２細胞において、記載したマイクロＲＮＡをターゲティングする２０ｎＭの濃度の核酸のスクリーニングに際して収集したデータを示す。
【図１１】[0016]  図１１は、抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）または抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）の１回量を静脈内投与した後のラットの血漿中におけるＶＥＧＦ量（ｎｇ／ｍｌ）の増加を示す。
【図１２】[0017]  図１２は、抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）または抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）の１回量を静脈内投与した後のラットの血漿中におけるＶＥＧＦ量（ｎｇ／ｍｌ）の増加を示す。
【図１３】[0018]  図１３Ａは被験化合物により誘導されたＥＰＯの量に関して３匹の試験動物の平均を示し、図１３Ｂは個々の試験動物についてのデータを示す。図１３Ｃは被験化合物により誘導されたＶＥＧＦの量に関して３匹の試験動物の平均を示し、図１３Ｄは個々の試験動物についてのデータを示す。データは、ＶＥＧＦまたはＥＰＯのｎｇについての曲線下面積（ＡＵＣ）に時間（１６８時間）を掛けたものとしてｐｅｒ／ｍｌ基準で提示される。“Ａ”はリン酸緩衝化生理食塩水対照であり；“Ｂ”は２０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）であり；“Ｃ”は１０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）であり；“Ｄ”は２０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）である。
【図１４】[0019]  図１４Ａは、個々の動物における２０ｍｇ／ｋｇ用量の抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）についての経時的な血漿クリアランスを示す。図１４Ｂは、個々の動物における２０ｍｇ／ｋｇ用量の抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）についての経時的な血漿クリアランスを示す。
【図１５】[0020]  図１５Ａは表記した投与量（ｍｐｋ＝キログラム当たりの抗−ｍｉＲＮＡ核酸の投与量ミリグラム）における投与後１６８時間目の組織中の抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）のｎｇ／ｍｇを示し、図１５Ｂは抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）のｎｇ／ｍｇを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｉ．定義
[0025]  本明細書中で用いる“核酸”は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその誘導体を意味する。ある態様において、核酸は一本鎖である。修飾には、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および官能基を含む他の化学基を核酸に付与するものを含めることができる。そのような修飾には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ホスホジエステル基の修飾（たとえばホスホロチオエート、メチルホスホネート）、糖の２’−位の修飾、ピリミジンの５−位の修飾、プリンの８−位の修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖の修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなど。修飾には３’および５’の修飾、たとえばキャッピング部分も含めることができる。２’デオキシ核酸リンカーはいずれか適切な長さの二価核酸および／またはヌクレオチド間結合であり、それらにおいてヌクレオチドは２’デオキシヌクレオチドである。“核酸塩基”は、ハイブリダイゼーション（塩基対合）に関係する核酸の部分（１以上）を表わし、窒素塩基、たとえばシトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、およびその誘導体を含むが、これらに限定されない。本明細書中で用いる“核酸ユニット”は、核酸の部分であって、ヌクレオチド間結合により互いに結合しておりかつ核酸塩基（たとえばヌクレオシド）を含む部分を表わす。
【００１９】
[0026]  ある核酸化合物は、溶媒和していない形態または溶媒和した形態（水和した形態を含む）で存在することができる。一般に、溶媒和した形態は溶媒和していない形態と均等である。ある核酸化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在する場合がある。一般に、本明細書中に提供する方法が意図する用途にとって、すべての物理的形態が均等である。
【００２０】
[0027]  ある核酸化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合をもつ場合がある；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体。
[0028]  本発明の核酸化合物は、それらの化合物を構成する１以上の原子において自然界にはない割合の同位体原子を含むこともできる。たとえば、それらの化合物を放射性同位体、たとえばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）で放射性標識することができる。
【００２１】
[0029]  本明細書中で特定のｍｉＲＮＡに関して用いる用語“ｍｉＲＮＡ前駆体”または“その前駆体”は、細胞におけるプロセシングによってその特定のｍｉＲＮＡになるいずれかの前駆体を広く表わす。したがってこの用語には、対応するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはそのバリアントが含まれる。ある態様において、前駆体は対応するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、たとえば４５〜９０、６０〜８０または６０〜７０ヌクレオチドを含むことができる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｍｉＲＮＡ配列全体を含むか、あるいはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’および３’−末端から０〜１６０ヌクレオチドを除いたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列であってもよい。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ヘアピンループの配列を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜２５０、５５〜２００、７０〜１５０または８０〜１００ヌクレオチドを含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または後記の表３に示すｍｉＲＮＡを含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造（たとえば３７〜５０ヌクレオチド）を含むこともできる。たとえば、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）とｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４１）は同じ一次配列をもつ（表３を参照）が、異なる前駆体をもつ可能性がある。
【００２２】
[0030]  用語“ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズしうる”は、核酸の相補鎖の対合を表わし、三本鎖核酸ハイブリダイゼーションも含まれる。対合の機序は水素結合を伴い、これは核酸の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合であってもよい。たとえば、アデニンとチミンは水素結合の形成により対合する相補的核酸塩基である。水素結合は種々の環境下で起きる可能性がある。
【００２３】
[0031]  “特異的にハイブリダイズしうる”もしくは“に特異的にハイブリダイズする”という句また他の類似の句は、核酸とｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体が会合してｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の正常な機能に干渉する（たとえば活性を変化させ、機能を撹乱し、またはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体のレベルを変調させることによる）ことを表わす。核酸がｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体に“特異的にハイブリダイズしうる”場合、特異的ハイブリダイゼーションを望む条件下で（たとえば、インビボアッセイまたは療法処置の場合は生理的条件下で、またインビトロアッセイの場合は標準的なアッセイ条件下で）、その核酸が、意図するｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体以外の核酸配列に非特異的に結合するのを避けるのに十分な程度の相補性がある。その核酸の配列は、特異的にハイブリダイズしうるそれのターゲットｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の配列に対して１００％相補的である必要はない。さらにその核酸は、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーションに関係しない状態で、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の１以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（たとえばバルジ（ｂｕｌｇｅ）、ループ構造またはヘアピン構造）。
【００２４】
[0032]  用語“緊縮ハイブリダイゼーション条件”または“緊縮条件”は、核酸がｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体にハイブリダイズして安定な複合体（たとえばデュプレックス）を形成するけれども他の配列へのハイブリダイゼーションは最小数である条件を表
わす。複合体の安定性は、塩濃度と温度の関数である(参照：たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989);本明細書に援用する)。核酸をｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体にハイブリダイズさせるために用いる緊縮レベルは、当業者が容易に変更できる。“低い緊縮ハイブリダイゼーション条件”という句は、１０％ホルムアミド、５倍Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて１倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０℃での洗浄に等しい条件を表わす。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液およびＳＳＰＥは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者に周知である(参照：たと
えばSambrook et al.)。用語“中等度の緊縮ハイブリダイゼーション条件”は、５０％ホルムアミド、５倍Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、６０℃での洗浄に等しい条件を表わす。用語“高い緊縮ハイブリダイゼーション条件”は、５０％ホルムアミド、５倍Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２倍ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、６５℃での洗浄に等しい条件を表わす。
【００２５】
[0033]  本明細書中で用いる“相補的”は、２つの核酸塩基が厳密に対合する能力（たとえばＡ対Ｔ（またはＵ）、およびＧ対Ｃ）を表わし、核酸またはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体中でそれら２つが存在する場所には関係ない。たとえば、核酸の特定の位置にある核酸塩基がｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の特定の位置にある核酸塩基と水素結合しうる場合、その核酸とそのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体のと間のその水素結合の位置は相補的位置であるとみなされる。各分子中の十分な数の相補的位置が互いに水素結合しうる核酸塩基で占められている場合、その核酸とそのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体は互いに“実質的に相補的”である。したがって、用語“実質的に相補的である”は、核酸とｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体との間で安定かつ特異的な結合が起きるのに十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の厳密な対合を示すために用いられる。したがって“実質的に相補的である”という句は、核酸とｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体をアラインさせた場合に安定かつ特異的な結合が起きるのであれば、それらの間に１以上の不適性塩基対があってもよいことを意味する。用語“不適性塩基対”は、核酸中の核酸塩基と、それとアラインさせるｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体中の核酸塩基とが、相補的ではない部位を表わす。核酸が核酸の全長にわたってｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体に完全に相補的である場合、その核酸とそのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体は互いに“完全に相補的”である。
【００２６】
[0034]  一般に、５’から３’方向に記載してターゲット核酸の対応領域の逆方向相補体を含む場合、核酸はこのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体に対して“アンチセンス”である。“アンチセンス化合物”は、当技術分野で、ターゲットにハイブリダイズした際にターゲット化合物のレベル、発現または機能を調節することができるという制限をさらに含むと定義される場合もしばしばある。
【００２７】
[0035]  本明細書中で用いる“配列同一性”または“同一性”は、２配列中において、特定した比較ウインドウにわたって最大の対応が得られるようにアラインさせた場合に同じである核酸塩基を表わす。本明細書中で用いる“配列同一性のパーセント”は、比較ウインドウ全体にわたって最適状態にアラインさせた２配列を比較することにより決定された数値を意味する；その際、比較ウインドウ中の配列の一部は、それら２配列の最適アラインメントを得るために基準配列（付加または欠失を含まないもの）と比較した付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。このパーセントは、両配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して適正対合位置の数を求め、この適正対合位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その答えに１００を掛けて配列同一性のパーセントを求めることにより計算される。
【００２８】
[0036]  用語“医薬的に許容できる塩類”は、本明細書に記載する化合物にみられる個々の置換基に応じて比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製した有効化合物の塩類を含むものとする。核酸化合物が相対的に酸性の官能基を含む場合、中性形のそのような化合物をそのままでまたは適切な不活性溶媒中で、十分な量の目的塩基と接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。医薬的に許容できる塩基付加塩の例には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、もしくはマグネシウム塩、または類似の塩類が含まれる。核酸化合物が相対的に塩基性の官能基を含む場合、中性形のそのような化合物をそのままでまたは適切な不活性溶媒中で、十分な量の目的酸と接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。医薬的に許容できる酸付加塩の例には、無機酸から誘導されるもの、たとえば塩酸、臭化水素酸塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸一水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸塩、硫酸一水素塩、ヨウ化水素酸塩、または亜リン酸塩など、および比較的無毒性の有機酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などから誘導されるものが含まれる。アミノ酸の塩類、たとえばアルギン酸塩など、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩類も含まれる(参照：たとえばBerge et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci.,
1977, 66, 1-19)。特定の核酸化合物は塩基性および酸性の両方の官能基を含み、これによりこれらの化合物は塩基付加塩または酸付加塩のいずれにも変換できる。
【００２９】
[0037]  常法により塩を塩基または酸と接触させ、そして親化合物を単離することにより、中性形の核酸化合物を再生できる。親形の化合物は、特定の物理的特性、たとえば極性溶媒中での溶解度において種々の塩形と異なる。
【００３０】
[0038]  塩形のほかに、プロドラッグ形の核酸化合物が提供される。本明細書に記載する核酸のプロドラッグは、生理的状態で容易に化学変化を受ける化合物である。さらに、プロドラッグは化学的または生化学的方法によりエクスビボ環境で核酸に変換できる。たとえば、プロドラッグを適切な酵素または化学薬品と共に経皮パッチ溜めに入れた場合、徐々に核酸に変換させることができる。
【００３１】
[0039]  用語“処置”は、傷害、病理または状態の処置または改善における成功の指標を表わし、これにはいずれかの客観的または主観的パラメーターが含まれる：たとえば、寛解；緩解；症状を軽減し、または傷害、病理もしくは状態を患者にとってより耐容しうるものにする；退行または衰退の速度を低下させる；変性の最終点をより衰弱度の低いものにする；患者の身体または精神の健康状態を向上させる。症状の処置または改善は、客観的または主観的パラメーターに基づくことができる；これには、身体検査、神経精神医学的検査、および／または精神医学的評価の結果が含まれる。
【００３２】
[0040]  用語“貧血症”は、赤血球および／またはヘモグロビンが欠乏し、その結果、血液が組織へ酸素を伝達する能力が低下していることを表わす。これには、ホストの状態、たとえば腎機能の低下または喪失（たとえば慢性腎不全、急性腎不全、および終末期腎疾患）、骨髄抑制療法、たとえば化学療法または抗ウイルス薬（たとえばＡＺＴ）、非骨髄性癌の進行、およびウイルス感染症（たとえばＨＩＶ）などから生じる貧血症が含まれる。
【００３３】
[0041]  本明細書中で用いる“併用療法”または“補助療法”は、本発明の薬物を必要とする患者がその疾患に対して本発明の核酸と併せて他の薬物で処置され、または他の薬物を投与されることを意味する。この併用療法は、患者をまず一方の薬物で処置し、次いで他方の薬物で処置する逐次療法であってもよく、あるいは２種類の薬物を同時に投与し
てもよい。
【００３４】
[0042]   “患者”は哺乳動物対象（たとえばヒト）を表わす。
ＩＩ．概説
[0043]  一部は、ＥＰＯの発現および／または分泌の低下に関係する特定のｍｉＲＮＡを同定したことに基づく、種々の方法および組成物を本明細書に提示する。同定したこれらのｍｉＲＮＡにハイブリダイズし、したがってＥＰＯなどのタンパク質の発現および／または分泌を増大させることができる抗−ｍｉＲＮＡ核酸は、貧血症などの特定の疾病状態を処置する際に有用である。ＥＰＯの発現および／または分泌の低下に関係することが見いだされたｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体のｍｉＲＮＡ配列を含むｍｉＲＮＡ分子が含まれる。成熟ｍｉＲＮＡの配列については表３を参照。
【００３５】
[0044]  本明細書には、これらのｍｉＲＮＡにハイブリダイズし、したがってそれらの活性を阻害することができる、特定の配列および化学構造をもつ核酸、たとえば本明細書中に多様に定めるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８を開示する。これらの核酸を含有する医薬組成物も提供される。これらの核酸および組成物を用いて、細胞におけるＥＰＯの発現および／または細胞からのＥＰＯタンパク質の分泌を増大させ、ならびに貧血症、血友病もしくは鎌状赤血球症を処置し、赤血球形成を増大させ、および／または赤血球レベルを上昇させることができる。
【００３６】
ＩＩＩ．ＥＰＯの発現または分泌の増大
[0045]  細胞によるＥＰＯの発現および／または分泌を増大させるための方法は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる核酸を細胞に導入することを含み、そのような核酸を本明細書中では抗−ｍｉＲＮＡ核酸とも言う。
【００３７】
[0046]  ターゲットＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。ある態様において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。これらの成熟ｍｉＲＮＡの配列については表３を参照。
【００３８】
[0047]  ある態様において、ＲＮＡ分子は、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡ分子は、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むこともできる。ある態様において、ＲＮＡ分子はｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）またはその前駆体を含む。
【００３９】
[0048]  他の態様において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体を含むこともできる。ある態様において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体を含むことができる。ＲＮ
Ａ分子は、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体；ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体；ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、またはその前駆体；ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５１）、またはその前駆体；ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、またはその前駆体；あるいは単にｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）またはその前駆体を含むこともできる。
【００４０】
[0049]  ＥＰＯの発現および／または分泌の増大は、本発明の核酸の不存在下での細胞によるＥＰＯの発現および／または分泌に対して相対的なものである。したがって、有効量の核酸を細胞に導入すると、細胞によるＥＰＯの発現および／または分泌が増大する。
【００４１】
[0050]  本発明の核酸の配列は、それが特定のｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体またはその領域もしくはセグメントにハイブリダイズするように設計することができる。したがって“ターゲティング”には、ターゲットｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体における、目的とする作用、たとえばレベル、発現または機能の調節が生じるような相互作用が起きるための少なくとも１つのターゲット領域、セグメント、または部位の決定が含まれる。本明細書中で用いる用語“領域”または“ターゲット領域”は、ターゲットｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の、少なくとも１つの同定可能な配列、構造、機能または特性をもつ部分と定義される。
【００４２】
[0051]  ある態様において、核酸は、ターゲットｍｉＲＮＡのいずれか適切な部分内の単一の連続領域にハイブリダイズするように設計される。図１Ａおよび図１Ｂを参照。この近接領域は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの長さであってもよい。他の態様においては、単一の核酸がターゲットｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の２つの異なる近接領域にハイブリダイズするように設計される。図１Ａの核酸（ｅ）を参照。
【００４３】
[0052]  たとえば、いずれか特定の理論により束縛されるわけではないが、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのループの一部とステムの一部をターゲティングすることにより、ダイサーによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのプロセシングを遮断するように核酸を設計することができる（参照：たとえば図１Ａの核酸（ａ）および（ｂ））。他の態様においては、ステムの一部とステムの基底部における一本鎖ＲＮＡのいずれかの部分の一部とをターゲティングすることにより、ドローシャによるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのプロセシングを遮断するように核酸を設計することができる（参照：たとえば図１Ａの核酸（ｃ）および（ｄ））。いずれか特定の理論により束縛されるわけではないが、エクスポーチンによる細胞質へのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの輸出は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをターゲティングすることにより遮断できる。ある態様においては、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列中のステムの基底部の２つの不連続延長配列をターゲティングすることにより、ドローシャによるプロセシングを遮断するように核酸を設計することができる（参照：たとえば図１Ａの核酸（ｅ））。他の態様においては、ｍｉＲＮＡ前駆体のステム部分をターゲティングするように核酸を設計することができる（参照：たとえば図１Ｂの核酸（ｆ））。したがって、核酸がｍｉＲＮＡにハイブリダイ
ズしうると述べた場合、それは核酸がたとえば図１Ａおよび図１Ｂに示すいずれかのコンフィギュレーションでハイブリダイズしうることを意味する。
【００４４】
[0053]  ｍＲＮＡ結合に関与する、ｍｉＲＮＡのいかなる部分をターゲティングすることもできる。ある態様においては、ｍｉＲＮＡの５’末端から最初の６、７または８ヌクレオチドをターゲティングすることができる。ターゲットｍｉＲＮＡまたはその前駆体上において核酸がハイブリダイズするそのような位置を“適切なターゲットセグメント”と言うことができる。本明細書中で用いる用語“適切なターゲットセグメント”は、核酸がターゲティングするターゲット領域の少なくとも６、７または８ヌクレオチドの部分と定義される。１以上のターゲット領域が同定されると、そのターゲットに対して十分に相補的になるように、すなわち目的とする効果を与える（たとえばＥＰＯの発現および／または分泌を増大させる）のに十分なほど良好にかつ十分な特異性でハイブリダイズするように、核酸を設計する。
【００４５】
[0054]  ある態様においては、１以上の抗−ｍｉＲＮＡ核酸を第１のｍｉＲＮＡターゲットにターゲティングさせ、かつ１以上の追加の抗−ｍｉＲＮＡ核酸を第２のｍｉＲＮＡターゲットにターゲティングさせることができる。あるいは、組成物は、同じｍｉＲＮＡターゲットの異なる領域、セグメントまたは部位にターゲティングする２以上の抗−ｍｉＲＮＡ核酸を含有することができる。２以上の組み合わせた抗−ｍｉＲＮＡ化合物を一緒に、または逐次、使用できる。
【００４６】
[0055]  他の態様において、核酸は少なくとも一部はｍｉＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）をターゲティングするように設計される。したがって、この態様において、ターゲット領域はｍｉＲＮＡのシード領域の少なくとも一部または全体を含む。本明細書中で用いる用語“シード領域”は、ｍｉＲＮＡ配列の５’末端のヌクレオチドであって、一般にｍｉＲＮＡファミリーに共通であるヌクレオチドを表わす。特定のｍｉＲＮＡについてシード領域の例を後記の表３に示す（下線を施した部分を参照）。特定の態様において、シード領域はｍｉＲＮＡ配列内の３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続ヌクレオチドを含む。一般に、ｍｉＲＮＡのシード領域はｍｉＲＮＡ配列内の６、７または８個の連続ヌクレオチドである。たとえば、ｍｉＲＮＡ配列のシード領域はｍｉＲＮＡ配列の５’末端からヌクレオチド１〜７、１〜８、２〜７、２〜８、１〜９、１〜１０、２〜９、２〜１０、３〜１０、または４〜１２であってもよい。ある態様において、ｍｉＲＮＡ配列のシード領域は、有利にはｍｉＲＮＡ配列の５’末端からヌクレオチド１〜７、１〜８、２〜７、または２〜８と包括的に定めることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９〜７７のターゲットｍｉＲＮＡ配列について例示シード領域（下線を施した）を示す表３を参照。
【００４７】
[0056]  本明細書に記載する方法（たとえば、ＥＰＯの発現および／または分泌を増大させる方法、ならびに貧血症、血友病および鎌状赤血球症などの疾病状態を処置する方法）は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスである、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的である、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８（本明細書中で“抗−ｍｉＲＮＡ核酸配列”とも言う）のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた配列（たとえば近接配列）をもつ核酸の使用を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８の完全配列については表２を参照。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。特定の態様において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１核酸塩基の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性をもつ配列を含むか、またはそれからなる。これらの核酸は、細胞におけるＥＰＯの発現および／または分泌を、これらの核酸の不存在下に対して相対的に増大させることができる。核酸の能力を調べるのに適切なアッセイ法を後記のセクションＶＩおよびＶＩＩＩに提示する。“核酸塩基の配列”は、関連ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ内の連続核酸塩基を表わす。たとえば、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つと、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０核酸塩基の配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性をもつ配列を含むか、またはそれからなることができる。ある態様において、核酸は抗−ｍｉＲＮＡ配列（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つ）と１００％の配列同一性をもつ配列を含むか、またはそれからなる。
【００４８】
[0057]  ある態様において、核酸は少なくとも１２核酸塩基の長さである。他の態様において、核酸は少なくとも１５核酸塩基の長さである。核酸は２２核酸塩基未満の長さであってもよい。たとえば、ある態様において核酸は７〜２１核酸塩基の長さである。他の態様において、核酸は８から２１まで、９から２１まで、１０から２１まで、１１から２１まで、１２から２１まで、１３から２１まで、１４から２１まで、１５から２１まで、１６から２１まで、１７から２１まで、または１８から２１までの核酸塩基の長さである。ある態様において、核酸は７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１核酸塩基の長さである。
【００４９】
[0058]  ターゲティングされるＲＮＡ分子とそれぞれの核酸である抗−ｍｉＲＮＡ配列の間の一定の相関性を表２に示す。たとえば、表２に示すように、ある態様においてＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体からなる群から選択される配列を含むｍｉＲＮＡ（およびその前駆体）であり、核酸はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８またはそれらのうちの１つに含まれる核酸塩基配列に対して少なくとも７０％の配列同一性をもつ配列を含むか、またはそれからなる。当業者は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２がｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）およびｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）の両方をターゲティングすることを認識するであろう。したがって、そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの数は対応するｍｉＲＮＡの数より１つ少ない。
【００５０】
[0059]  表２に示す相関性の他の態様において、核酸は７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１核酸塩基の配列を含むか、またはそれからなり、それぞれの核酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性をもつ。表２に示す相関性のさらに他の態様において、ＲＮＡ分子は前記に示したｍｉＲＮＡリストの態様のうちの１つから選択されるｍｉＲＮＡである。たとえば、表２に示す相関性の他の態様において、ＲＮＡ分子はｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むことができ、それぞれの核酸は前文に示した適切な数の核酸塩基および適切な配列同一性をもつ。
【００５１】
[0060]  核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のいずれか１つから８核酸塩基（またはヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むことができる。他の態様において、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のいずれか１つから５、６または７核酸塩基（また
はヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むことができる。他の態様において、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のいずれか１つから１、２、３または４核酸塩基（またはヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むことができる。
【００５２】
[0061]  ある態様において、核酸はＶＥＧＦの発現を最小限に抑え、一方ではＥＰＯの発現および／または分泌を増大させるように選択される。たとえば、ある態様において抗−ｍｉＲＮＡ核酸は下記の配列をもつことができる：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、これはｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、これはｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、これはｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、これはｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、これはｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、これはｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）にハイブリダイズしてその活性に拮抗する；またはそれらの前駆体にハイブリダイズしてその活性に拮抗する。したがって、それぞれの対応する核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ  ８〜１２であってよく、その際それぞれの核酸は前記に示した適切な数の核酸塩基および適切な配列同一性をもつ。
【００５３】
[0062]  前記のように、本発明の核酸は緊縮条件下で前記のＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる。ある態様において、核酸は低い緊縮ハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ分子にハイブリダイズする。他の態様において、核酸は中等度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ分子にハイブリダイズする。他の態様において、核酸は高い緊縮ハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ分子にハイブリダイズする。
【００５４】
[0063]  ある態様において、核酸はｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体に対して実質的に相補的である。核酸は、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の中のターゲット領域（たとえばシード領域）に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％の配列相補性であってもよい。他の態様において、核酸はｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の中のターゲット領域（たとえばシード領域）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％の配列相補性を含む。他の態様において、核酸はｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体の中のターゲット領域（たとえばシード領域）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相補性を含む。たとえば、その核酸塩基２０のうち１８がターゲット領域（たとえばシード領域）に対して相補的である核酸は、９０パーセントの相補性になるであろう。核酸がｍｉＲＮＡまたは前駆体に対して実質的に相補的である場合、残りの非相補的な核酸塩基はクラスター形成しているか、または相補的な核酸塩基間に散在することができ、互いに、または相補的な核酸塩基と、隣接している必要はない。したがって、長さ２２核酸塩基であり、６つの非相補的な核酸塩基をもち、それらがターゲットｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体と完全相補性である２領域でフランキングされている核酸は、全体としてそのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体と７２．７％の相補性をもつであろう。ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体のある領域との核酸の相補性パーセントは、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)を用いて日常的に判定できる。ある態様において、核酸はｍｉＲＮ
ＡまたはｍｉＲＮＡ前駆体に対して完全に相補的である。
【００５５】
[0064]  核酸を細胞に導入するためのいずれか適切な方法を使用できる。適切な方法の例には、たとえば細胞トランスフェクション法、たとえば化学的、生物学的または機械的手段が含まれる。認められている方法には、エレクトロポレーション、ウイルスベクターの使用、リポフェクション、遺伝子銃、およびマイクロインジェクションが含まれる。
【００５６】
[0065]  この方法は、いずれか適切な細胞、たとえば植物または動物の細胞を用いて実施できる。ある態様において、細胞は哺乳動物細胞、たとえばヒト細胞である。細胞はＨｅｐＧ２またはＫｅｌｌｙ細胞であってもよい。したがって、ある態様において、核酸を細胞に導入する方法はインビトロで実施される。細胞に導入されると、本発明の核酸はＥＰＯの発現および／または分泌をインサイチューで増大させる。
【００５７】
ＩＶ．対象の処置方法
[0066]  その必要がある対象において貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、対象において赤血球形成を増大させ、ＥＰＯレベルを上昇させるための、多様な方法も提供される。これらの方法には、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスである、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的である、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性をもつ、有効量の抗−ｍｉＲＮＡ核酸を対象に投与することが含まれる。これらの方法において、ターゲティングされるＲＮＡ分子、およびターゲティングされるＲＮＡ分子にハイブリダイズさせるために用いられる核酸は、前記のものと同じである。したがって、セクションＩＩＩに記載したものと同じ核酸の配列、長さその他の特性が、対象において貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、赤血球形成を増大させ、ＥＰＯレベルを上昇させるための方法に同等に適用される。
【００５８】
[0067]  有効量は、記載した目的の達成、たとえば貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、赤血球形成を増大させ、ＥＰＯレベルを上昇させるのに有効な量である。ある態様において、有効量は治療に有効な量または予防に有効な量である。“治療に有効な量”は、疾病状態（たとえば貧血症）または症状、特に疾病状態に関連する状態または症状を治療するのに十分な量、あるいは疾病状態またはいかなるものであっても疾病状態に関連する他の望ましくない何らかの症状の進行を阻止、阻害、遅延または回復させるのに十分な量である。“予防に有効な量”は、対象に投与した場合に意図する予防効果をもつ量、たとえば特定の疾病状態の開始（または再発）を阻止もしくは遅延させ、または特定の疾病状態もしくは疾病の特定の症状の開始（または再発）の可能性を少なくする量である。完全な予防効果が必ずしも１回量の投与により起きる必要はなく、一連の用量の投与後に初めて起きてもよい。したがって、予防に有効な量は１回以上の投与で投与することができる。
【００５９】
[0068]  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８の核酸配列は、表３に従ってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９〜７７のターゲットｍｉＲＮＡ配列にハイブリダイズする。したがって、核酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）にハイブリダイズし、核酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）にハイブリダイズするなど（本明細書中に多様に記載したとおり）。
【００６０】
[0069]  前記のセクションにおいて考察したＲＮＡ分子にハイブリダイズする抗−ｍｉＲＮＡ核酸分子の態様が、貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置する方法に同等に適用される。たとえば、ある態様において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０
７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むことができる。他の態様において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、およびその前駆体を含むこともできる。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）であってもよい。
【００６１】
[0070]  本発明の核酸は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスであり、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的であり、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた配列をもつ。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８の配列については表２を参照。ＲＮＡ分子の態様に関して、前記のセクションＩＩＩにおいて考察した核酸の態様が、対象において貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、ＥＰＯレベルを上昇させ、赤血球形成を増大させる方法に同等に適用される。したがって、たとえば、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つ内の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２１核酸塩基の配列との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性をもつことができる。あるいは、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つから８核酸塩基（またはヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むか、またはそれからなることができる。他の態様において、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つから５、６または
７核酸塩基（またはヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むことができる。他の態様において、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つから１、２、３または４核酸塩基（またはヌクレオチド）より多くは相異しない配列を含むことができる。
【００６２】
[0071]  本発明の核酸は、貧血症、血友病および鎌状赤血球症の処置に有効ないずれか適切な方法で投与することができる。したがって、たとえば、投与は経口、直腸、局所、非経口もしくは静脈内への投与、または注入によるものであってもよい。有効量を適用する方法は、処置される障害または疾患によっても異なる。適用を容易にするための適切なキャリヤー、追加の化合物もしくは化合物類、または希釈剤を配合した核酸を静脈内、皮下または筋肉内へ投与することによる非経口処置は、本発明の核酸を対象に投与するのに適切な別法である。
【００６３】
[0072]  本発明の核酸を、併用療法に使用するための他の有効薬剤と組み合わせる（たとえば共投与する）ことができる。たとえば、ある態様においては、本発明の核酸を他の貧血症、血友病および鎌状赤血球症の療法と組み合わせる。たとえば、本明細書に記載する核酸と併用できる他の療法には、核酸を適切な薬剤、たとえば鉄、ＨＩＶの処置に使用する薬剤（たとえばＡＺＴ）、貧血症に使用する薬剤、癌の処置に使用する薬剤（たとえばシスプラチン）、高血圧症および血栓性事象に使用する薬剤と共投与することが含まれる。
【００６４】
[0073]  核酸の有効性は既知の細胞系を用いてインビトロおよびインビボの両方で日常的なスクリーニングにより確認できることを、当業者は認識しているであろう。細胞系はアメリカン・ティッシュー・タイプ・カルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）または他の研究室から入手できる。
【００６５】
[0074]  本明細書に記載する方法および組成物は、ヒトを含む哺乳動物について実施するエリスロポエチン療法において、哺乳動物におけるＥＰＯに起因するいずれかまたはすべての作用を発現させるために使用するのに適切である；たとえば、哺乳動物における網状赤血球応答の刺激、鉄動態作用（たとえば血漿鉄ターンオーバー作用および骨髄通過時間作用）の発現、赤血球質量の変化、ヘモグロビンＣ合成の刺激（参照：Eschbach, et al.、前掲）、組織の保護作用（たとえば心臓の保護）、およびヘマトクリットレベルの上昇。本発明の生成物で処置しうるクラスの対象には、一般に輸血を必要とする患者が含まれ、これには外傷被害者、外科処置患者、腎疾患患者（透析患者を含む）、および血液組成に影響を及ぼす多様な障害、たとえば血友病、鎌状赤血球症、生理的貧血症などを伴う患者が含まれる。ＥＰＯ療法の採用により輸血療法の必要性を最小限に抑えられることは、感染因子の伝播を減らす結果になると期待される。これらの方法および組成物は、低酸素環境条件下にある個体の酸素運搬能を増大させ、おそらく有益な心血管効果をもたらすのにも有用である。
【００６６】
[0075]  したがって本発明の方法および組成物は、赤血球産生を刺激し、低下した赤血球レベルを補正するために使用できる。最も一般的には、赤血球レベルは貧血症のため低下する。本発明により処置しうる状態には、腎機能の低下または喪失（たとえば慢性腎不全、急性腎不全、および終末期腎疾患）に関連する貧血症、骨髄抑制療法、たとえば化学療法または抗ウイルス薬（たとえばＡＺＴ）に関連する貧血症、非骨髄性癌の進行に関連する貧血症、およびウイルス感染症（たとえばＨＩＶ）に関連する貧血症が含まれる。他の点では健康な個体において貧血を生じる可能性のある状態、たとえば外科処置中に予想される血液喪失も処置できる。本発明の核酸は、随時の（緊急ではない、ｅｌｅｃｔｉｖｅ）心臓以外、血管以外の外科処置を受ける予定の貧血症患者の処置に使用して、同種輸血の必要性を減らすこともできる。一般に、ｒＨｕＥＰＯおよび／またはＮＥＳＰで処置
しうる状態はいずれも、本明細書に記載する方法および組成物を用いて処置することもできる。
【００６７】
Ｖ．核酸および一般的な核酸合成
Ａ．核酸のタイプ
[0076]  本発明の核酸を修飾して、ヌクレアーゼに対する核酸の安定性を高め、ハイブリダイゼーション安定性を高め、またはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体の機能の阻害を高めることができる。ある態様において、核酸は、天然または非修飾核酸中にみられる標準的なホスホジエステル結合に対する修飾を含む。リン原子を含む修飾された核酸主鎖（ヌクレオチド間結合）には、たとえば下記のものが含まれる：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルその他のアルキルホスホネート：３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む、ホスフィネート、ホスホルアミデート：３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートであって、普通の３’−５’結合をもつもの、これらの２’−５’結合類似体、ならびに１以上のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’、または２’−２’結合である逆転極性をもつもの。前記のリン含有結合については後記およびたとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，１９４，５９９；５，５６５，５５５；５，５２７，８９９；５，７２１，２１８；５，６７２，６９７および５，６２５，０５０中に、より詳細に考察されており、これらのそれぞれを本明細書に援用する。ある態様において、核酸はホスホロアミデート、ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、アルキルホスホネート、およびメチリンメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｉｎｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）から選択される１以上の修飾されたヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合を含む。メチリンメチルイミノヌクレオシド間結合の詳細な記述については、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０および５，６１０，２８９を参照；これらのそれぞれを本明細書に援用する。標準的なホスホジエステル結合または１以上の異なる修飾されたヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合を含む適切な混合主鎖核酸結合が、本明細書に記載する方法に有用である。
【００６８】
[0077]  本発明の核酸は、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−アルキルリボ核酸ユニット（２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニットおよび２’Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットを含む）、２’アルキルリボ核酸ユニット、２’アミンリボ核酸ユニット、ペプチド核酸ユニット、２’フルオロ−リボ核酸ユニット、モルホリノ核酸ユニット、シクロヘキサン核酸ユニット、またはトリシクロ核酸ユニットから選択される修飾された核酸ユニットを含むこともできる。修飾された核酸ユニットに関する、より詳細な情報については、Ｕ．Ｓ．Ａｐｐ．Ｎｏ．２００５／０１８２００５を参照；これを本明細書に援用する。ある態様において、核酸はロックされた核酸（すなわち、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のロックされた核酸ユニットを含む核酸）、２’−Ｏ−メチルリボ核酸（すなわち、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の２’−Ｏ−メチル核酸ユニットを含む核酸）、または２’−メトキシ−
エチルリボ核酸（すなわち、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の２’−Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットを含む核酸）である。ある態様において、核酸は、ロックされた核酸、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸（すなわち、少なくとも５０％のロックされた核酸ユニットを含み、残りのユニットはリボ核酸ユニットまたはデオキシリボ核酸ユニットである核酸）である。さらに他の態様において、核酸は、ロックされた核酸、または混合型の核酸−ロックされた核酸である。
【００６９】
[0078]  ある態様においては、少なくとも８０％、８５％、または９０％のロックされた核酸ユニットをもつ核酸が提供される。ある関連態様において、残りのユニットはリボ核酸ユニットまたはデオキシリボ核酸ユニット、一般にリボ核酸ユニットである。他の態様において、核酸は少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のロックされた核酸ユニットを含む。これらの核酸は、ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ分子に対してアンチセンスであり、ＲＮＡ分子に対して実質的に相補的であり、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６核酸塩基（またはヌクレオチド）以上の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を備えた配列をもつ。ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ｍｉＲ−１０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ｍｉＲ−１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ｍｉＲ−３３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ｍｉＲ−５２０−ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ｍｉＲ−５２０−ｇ，ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ｍｉＲ−１９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ｍｉＲ−２９９−３ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ｍｉＲ−２９９−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ｍｉＲ−４９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ｍｉＲ−５１８−ｆ＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｌｅｔ−７−ａ−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｌｅｔ−７−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ｌｅｔ−７−ｇ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ｍｉＲ−７−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ｍｉＲ−９＊−１，２，３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ｍｉＲ−３０−ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ｍｉＲ−３４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ｍｉＲ−９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ｍｉＲ−１２８−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ｍｉＲ−１３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ｍｉＲ−１３３−ａ，ｂ，１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｍｉＲ−２１６（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６３）、ｍｉＲ−４４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｍｉＲ−４５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ｍｉＲ−４９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｍｉＲ−４９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ｍｉＲ−５２０−ｂ，ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ｍｉＲ−１３０−ａ，ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ｍｉＲ−１９３−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ｍｉＲ−５０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ｍｉＲ−５２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ｍｉＲ−５２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ｍｉＲ−５２６−ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ｍｉＲ−５２６−ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ｍｉＲ−５１８−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、およびその前駆体から選択されるｍｉＲＮＡ配列を含むことができる。核酸が規定したパーセントのロックされた核酸ユニットを含む場合、そのパーセントはロックされた核酸ユニットの数を核酸ユニットの総数で割り、１００％を掛けたものである。ある態様においては、１、２、３、４または５つの核酸ユニット（たとえばヌクレオチド）を除いて、核酸内のすべての核酸ユニットがロックされた核酸ユニットである。ある態様において、ヌクレオチド間結合はホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合である。ロックされた核酸ユニットではない核酸はいずれも、リボ核酸ユニット、デオキシリボ核酸ユニット、および２’−Ｏ−メチル核酸ユニットから選択できる。核酸は前記のセクションＩＩＩに記載した適切な長さのいずれであってもよい（たとえば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０または２１核酸塩基の長さ）。ある態様において、核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちのいずれか１つとの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８のうちの１つの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０核酸塩基の配列に対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性をもつ。
【００７０】
[0079]  本発明の核酸は、核酸の能動もしくは受動輸送、局在化またはコンパートメント形成を促進する、結合またはコンジュゲートした１以上の部分をもつことができる。細胞内局在化には、核、核小体または細胞質内への局在化が含まれるが、これらに限定されない。コンパートメント形成には、核、核小体、ミトコンドリアを含めた細胞コンパートメントへの核酸化合物の何らかの指向性移動、または細胞膜中への埋込みが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
[0080]  本発明の核酸に加えることができる置換のひとつは、得られる核酸の活性、細胞内分布または細胞による取込みを増大させる１以上の部分またはコンジュゲートの結合を伴う。１態様において、そのような修飾された核酸は、コンジュゲート基をヒドロキシル基またはアミノ基などの官能基に共有結合させることにより製造される。コンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基が含まれる。一般的なコンジュゲート基には、コレステロール類、炭水化物、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、および色素が含まれる。薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの取込みを改善し、分解に対するオリゴマーの抵抗性を増大させ、および／またはＲＮＡとのハイブリダイゼーションを増強する基が含まれる。薬物動態特性を高める基には、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６、１９９２年１０月２３日出願に開示されており、その開示内容全体を本明細書に援用する。コンジュゲート部分には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：脂質部分、たとえばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med.
Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、たとえばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et
al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、たとえばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et
al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)。
【００７２】
[0081]  本発明の核酸を、たとえば下記の有効薬物にコンジュゲートさせることもできる：アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔａｚｏｎｅ）、
イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン（ｓｕｐｒｏｆｅｎ）、フェンブフェン（ｆｅｎｂｕｆｅｎ）、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン（（Ｓ）−（＋）−ｐｒａｎｏｐｒｏｆｅｎ）、カルプロフェン（ｃａｒｐｒｏｆｅｎ）、ダンシルサルコシン（ｄａｎｓｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フォリン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンゾチアジアジド（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｉｄｅ）、クロロチアジド（ｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、ジアゼピン類、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈｉｃｉｎ）、バルビツレート（ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ）、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質。核酸−薬物コンジュゲートおよびそれらの製造は米国特許出願Ｎｏ．０９／３３４，１３０（１９９９年６月１５日出願）に記載されており、これの全体を本明細書に援用する。
【００７３】
[0082]  そのような核酸コンジュゲートの製造を教示した代表的な米国特許には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７，５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１，５，３９１，７２３；５，４１６，２０３，５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８および５，６８８，９４１；これらのそれぞれをあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００７４】
[0083]  核酸は１以上の安定化基をもつように修飾することもでき、これらを一般に核酸の一方または両方の末端に結合させて、たとえばヌクレアーゼ安定性などの特性を向上させる。安定化基にはキャップ構造が含まれる。“キャップ構造または末端キャップ部分”とは、核酸のいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する（参照：たとえばＷｉｎｃｏｔｔら，ＷＯ  ９７／２６２７０；本明細書に援用する）。これらの末端修飾は、末端核酸分子をもつ核酸をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達および／または局在化を補助することができる。キャップは５’−末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）に存在することができ、あるいは両方の末端に存在することができる。二本鎖核酸については、キャップはいずれの鎖の一方または両方の末端にも存在することができる。限定ではない例において、５’−キャップには下記のものが含まれる：逆方向脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルリウクレオチド（ａｃｙｃｌｉｃ  ３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔｙｌ  ｒｉｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−３’−逆方向脱塩基部分；３’−２’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−２’−逆方向
脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分（参照：たとえばＷｉｎｃｏｔｔら，ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ  ９７／２６２７０；本明細書に援用する）。
【００７５】
[0084]  有用な３’−キャップ構造には、たとえば下記のものが含まれる：４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−逆方向ヌクレオチド部分；５’−５’−逆方向脱塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分(これ以
上の詳細については、Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照;本明細書に援用する)。ヌクレアーゼ安定性を付与するために核酸の一方または両方の末端をキャ
ッピングするために使用できる他の３’および５’−安定化基には、ＷＯ  ０３／００４６０２、２００３年１月１６日公開に開示されるものが含まれる。
【００７６】
Ｂ．一般的な核酸合成
[0085]  修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化は、文献方法に従って実施される：適宜、ＤＮＡ様化合物について(参照：たとえばProtocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)および／またはＲＮＡ様化合物について(参照：たとえばScaringe, Methods (2001), 23, 206-217; Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36; Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)の合成。さらに、核酸の合成に
ついてのプロトコルの若干例を以下に示す。
【００７７】
[0086]  ＲＮＡは本明細書に記載する方法により合成でき、あるいは種々のＲＮＡ合成企業（たとえばＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ））から購入できる。
【００７８】
[0087]  使用する個々のプロトコルに関係なく、本明細書中で用いる核酸は周知の固相合成法によって簡便かつ日常的に製造できる。そのような合成のための装置は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスター・シティー）を含めた幾つかの業者により販売されている。当技術分野で既知のそのような合成のための他のいずれかの手段を、さらに、または代わりに使用できる。
【００７９】
[0088]アミダイトおよびそれらの中間体を含めた下記の化合物は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，４２６，２２０および公開ＰＣＴ  ＷＯ  ０２／３６７４３の記載に従って製造できる；５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン：５−メチル  ｄＣアミダイトの中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン：５−メチル−ｄＣアミダイトの中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン：５−メチル  ｄＣアミダイトの前中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５
−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（５−メチル  ｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン前中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ  Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン前中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ  ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ  Ａアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＭＯＥ  Ｇアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチル−ウリジン、２’−Ｏ−（（２−フタルイミドキシ）エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ  ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル））−５−メチルウリジンおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル−））−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト。
【００８０】
[0089]  非置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）核酸は、自動核酸合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３９４）で標準的なホスホルアミダイト化学を用いてヨウ素による酸化により合成できる。一般に、核酸を固体支持体（たとえば制御ポアガラスカラム）から開裂させ、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロックし、次いでＮＨ４ＯＡｃを用いてエタノールで沈殿させることにより回収できる。合成された核酸をエレクトロスプレー質量分析（分子量測定）およびキャピラリーゲル電気泳動により分析することができる。
【００８１】
[0090]  ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、下記の点を除いてホスホジエステル核酸と同様に合成できる：チエーション（ｔｈｉａｔｉｏｎ）は、ホスファイト結合の酸化のためにアセトニトリル中の１０％  ｗ／ｖ  ３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液を用いて行われる。このチエーション反応工程時間を１８０秒に延長し、その前に普通のキャッピング工程を行なう。固体支持体から開裂させ、濃水酸化アンモニウム中、適切な温度で脱ブロックした後、エタノールを用いて１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ溶液から沈殿させることにより核酸を回収できる。ホスフィネート核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５０８，２７０の記載に従って製造でき、これを本明細書に援用する。
【００８２】
[0091]  アルキルホスホネート核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４６９，８６３の記載に従って製造でき、これを本明細書に援用する。
[0092]  ３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネート核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６１０，２８９または５，６２５，０５０の記載に従って製造でき、これらを本明細書に援用する。
【００８３】
[0093]  ホスホルアミダイト核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２５６，７７５またはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３６６，８７８の記載に従って製造でき、これらを本明細書に援用する。
【００８４】
[0094]  アルキルホスホノチオエート核酸は、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ  ９４／１７０９３およびＷＯ  ９４／０２４９９として公開）の記載に従って製造でき、これらを本明細書に援用する。
【００８５】
[0095]  ３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミダイト核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．
Ｎｏ．５，４７６，９２５の記載に従って製造でき、これを本明細書に援用する。
[0096]  ホスホトリエステル核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０２３，２４３の記載に従って製造でき、これを本明細書に援用する。
【００８６】
[0097]  ボラノホスフェート核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３０，３０２および５，１７７，１９８の記載に従って製造でき、これらの両方を本明細書に援用する。
[0098]  メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても認識される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても認識される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても認識される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても認識される）、ならびに、たとえば交互にＭＭＩとＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合をもつ混合主鎖核酸は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０および５，６１０，２８９の記載に従って製造でき、これらのすべてを本明細書に援用する。
【００８７】
[0099]  ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２６４，５６２および５，２６４，５６４の記載に従って製造でき、これらを本明細書に援用する。
【００８８】
[00100]  エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，
２２３，６１８の記載に従って製造でき、これを本明細書に援用する。
[00101]  一般に、ＲＮＡ合成化学は、肝要な中間反応における種々の保護基の選択的
取込みに基づく。当業者は有機合成における保護基の使用を理解しているであろうが、有
用なクラスの保護基にはシリルエーテルが含まれる。特に、嵩高いシリルエーテルは５’−ヒドロキシルの保護のために、２’−ヒドロキシル上の酸不安定オルトエステル保護基と組み合わせて使用できる。その際、この一組の保護基は、標準的な固相合成法で用いられる。他のすべての合成工程の後、最後に酸不安定オルトエステル保護基を除去することが重要である。さらに、合成に際して初期にシリル保護基を使用すると希望する時点で確実に容易に除去でき、２’−ヒドロキシルが不都合に脱保護されることがない。
【００８９】
[00102]  異なる方法で除去できかつ異なる化学的不安定性にすることができる保護基
による２’−ヒドロキシルの保護と組み合わせた５’−ヒドロキシルの逐次保護のためのこの操作に従って、ＲＮＡ核酸を合成することができる。
【００９０】
[00103]  ＲＮＡ核酸は段階方式で合成できる。この方法では、固体支持体に結合した
核酸に各ヌクレオチドを逐次（３’−から５’−方向へ）付加する。鎖の３’−末端の第１ヌクレオシドを固体支持体に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体リボヌクレオシドホスホルアミダイト、および活性化剤を添加し、この第２塩基を第１ヌクレオシドの５’−末端に結合させることができる。支持体を洗浄し、いずれかの未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸でキャッピングして、５’−アセチル部分を得ることができる。次いでこの結合を酸化して、より安定な最終目的Ｐ（Ｖ）結合にする。ヌクレオチド付加サイクルの終了時に、５’−シリル基をフッ化物で開裂させる。このサイクルを後続のヌクレオチドそれぞれについて繰り返す。合成後、ホスフェート上のメチル保護基をＤＭＦ中の１Ｍジナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート３水和物（Ｓ２Ｎａ２）により開裂させることができる。この脱保護溶液を、固体支持体に結合した核酸から水により洗浄除去する。次いで支持体を水中の４０％メチルアミンで処理する。これによりＲＮＡ核酸を溶液中へ放出させ、環外アミンを脱保護し、そして２’−基を修飾する。この段階で核酸をアニオン交換ＨＰＬＣにより分析することができる。
【００９１】
[00104]  ２’−オルトエステル基は除去すべき最後の保護基にすることができる。Ｄ
ｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）が開発したエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、有用なオルトエステル保護基の一例であり、これは下記の重要な特性をもつ。それはヌクレオシドホスホルアミダイト合成および核酸合成の条件に対しては安定である。しかし、核酸合成の後、核酸をメチルアミンで処理すると、これにより核酸が固体支持体から開裂するだけでなく、オルトエステルからアセチル基も除去される。オルトエステル上に生じる２−エチル−ヒドロキシル置換基は、アセチル化された前駆体より電子求引性が低い可能性がある。その結果、この修飾オルトエステルは酸触媒加水分解に対して、より不安定になる。具体的には、開裂速度はアセチル基が除去された後に約１０倍速くなる。このため、このオルトエステルは核酸合成に適合するのに十分な安定性をもち、なおかつ、その後修飾されると最終ＲＮＡ核酸生成物に適合する比較的緩和な水性条件下で脱保護を行なうことができる。
【００９２】
[00105]  さらに、ＲＮＡ合成方法は当技術分野で周知である(Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996; Scaringe, S. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett.,
1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J., et al., Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641;
Reddy, M. P., et al., Tetrahedron Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron,
1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331)
。
【００９３】
[0100]  少なくとも１つの２’−Ｏ−保護ヌクレオシドを含む核酸を製造することもで
きる。２’−Ｏ−保護ヌクレオシドを取り込ませ、適切に脱保護した後、取り込ませた位置においてリボヌクレオシドに変換することができる。最終核酸中の２−リボヌクレオシドユニットの数および位置は、いずれかの部位における１つから変動させることができ、あるいはこの方法を用いて完全２’−ＯＨ修飾核酸まで製造することができる。核酸の合成に従うすべての２’−Ｏ−保護基が本発明に含まれる。
【００９４】
[0101]  一般に、保護されたヌクレオシドを、たとえばスクシネートリンカーにより固体支持体に付着させる。次いでこの核酸を、５’−末端ヒドロキシル基の脱保護、追加ヌクレオシドユニットの結合、キャッピングおよび酸化（あるいは硫化）の反復サイクルにより延長する。比較的頻繁に用いられる合成方法においては、アンモニア溶液で処理することにより、ホスフェート保護基および環外アミノ保護基の除去と共に、完成した核酸を固体支持体から開裂させる。次いで普通は、２’−ヒドロキシル基の保護のために用いたより特殊な保護基のためにさらに脱保護工程が必要であり、これによって完全に脱保護された核酸が得られるであろう。
【００９５】
[0102]  有効な２’−Ｏ−保護基は、２’−Ｏ−位置に一般に選択的に導入でき、合成後に不都合な副生物の形成なしに容易に除去できる。この保護基は、オリゴリボヌクレオチド合成に必要な普通の脱保護、結合およびキャッピングの工程に対して通常は不活性である。保護基の例には、下記のものが含まれる：テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、ピペリジン誘導体（たとえばＦｐｍｐ）(Reese et al., Tetrahedron Lett., 1986, (27), 2291)、標準的な５’−ＤＭＴ（ジメトキシト
リチル）基、ｔ−ブチルジメチルシリル基(Ogilvie et al., Tetrahedron Lett., 1974, 2861; Hakimelahi et al., Tetrahedron Lett., 1981, (22), 2543; およびJones et al., J. Chem. Soc. Perkin I., 2762)、フッ化物不安定および光不安定な保護基（たとえば２−（ニトロベンジル）オキシ）メチル（ｎｂｍ）保護基(Schwartz et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1992, (2), 1019))、ホルムアルデヒドアセタール誘導２’−Ｏ−保護
基、２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドホスホルアミダイト：２’−Ｏ−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル（２’−Ｏ-ＣＨ２−Ｏ−−Ｓｉ（ｉＰｒ）３ＴＯＭ）、
フッ化物不安定５’−Ｏ−保護基（非−酸不安定）および酸不安定２’−Ｏ−保護基(Scaringe, Stephen A., Methods, 2001, (23) 206-217)。特に有用な保護スキームは、５’
−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）である。この方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡ合成に日常的には用いられないある異なる試薬が必要な点で改変されたホスホルアミダイト合成法を採用する。
【００９６】
[0103]  商業的に用いられるＲＮＡ合成方法には、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル）（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）、および５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）が含まれる。現在ＲＮＡ製品を提供している幾つかの主要な企業の現在のリストには、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．が含まれる。
【００９７】
[0104]  核酸は、９６ウェルフォーマットで９６の配列を同時に組み立てることができる自動合成装置での固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学によっても合成できる。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素による酸化により得ることができる。
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を用いる硫化により形成できる。標準的な塩基保護したベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、業者（たとえばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスター・シティー、またはＰｈａｒｍａｃｉａ，ニュージャージー州ピスカッタウェイ）から購入できる。標準的ではないヌクレオシドは、標準法または特許方法により合成できる。それらを塩基保護したベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして使用できる。
【００９８】
[0105]  リン原子を含まない修飾核酸の主鎖（ヌクレオシド間結合）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合型のヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合により形成された主鎖をもつ。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合したＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分をもつ他のものが含まれる。
【００９９】
[0106]  前記のオリゴヌクレオシドの製造を教示する代表的な米国特許には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９および５，６７７，４３９；これらのそれぞれを本明細書に援用する。
【０１００】
[0107]  本明細書に提示する方法に従う他のグループの核酸には、核酸模倣体が含まれる。核酸に適用した模倣体という用語は、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方を新規な基で交換することができる核酸を含むものとし、フラノース環のみの交換を当技術分野で糖代替（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）とも言う。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切なターゲット核酸とのハイブリダイゼーションのために維持されている。卓越したハイブリダイゼーション特性をもつことが示されているそのような核酸模倣化合物のひとつは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われている。ＰＮＡ核酸において、核酸の糖−主鎖はアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で交換されている。核酸塩基を保持し、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ核酸の製造を教示する代表的な米国特許にはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれるが、これらに限定されない；これらのそれぞれを本明細書に援用する。ＰＮＡ核酸の考察は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500中にある
。
【０１０１】
[0108]  使用できる他の核酸模倣体には、二環式である糖部分をもつことにより糖のコンホメーション形状がロックされるヌクレオシドが含まれる。そのようなヌクレオチドの一例は、４’−ＣＨ２−−Ｏ−２’橋をもつ二環式糖部分である。２’−Ｏ−−がメチレン基により４’炭素に結合している（参照：米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／００８７
２３０）。このキシロ（ｘｙｌｏ）類似体も製造されている（参照：米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／００８２８０７）。ロックされた核酸（ＬＮＡ）の橋は４’−（−ＣＨ２−）２−Ｏ−２’であってもよく、ここでｎは１または２である(Ｋａｎｅｋｏら，米国
特許出願公開Ｎｏ．ＵＳ  ２００２／０１４７３３２、Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456、同様にＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２６８，４９０および６，６７０
，４６１ならびに米国特許出願公開Ｎｏ．ＵＳ  ２００３／０２０７８４１も参照されたい)。しかし、ロックされた核酸という用語は、より全般的な意味で、ロックされたコン
ホメーションをもついかなる二環式糖部分をも記述するために使用できる。
【０１０２】
[0109]  ＬＮＡを含む有効かつ無毒性のアンチセンス核酸が記載されている(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638.)。ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および製造、ならびにそれらのオリゴマー化、ならびに核酸認識特性が記載されている(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630)。ＬＮＡおよびその製造もＷＯ  ９８／３９３５２およびＷＯ  ９９／１４２２６に記載されている。ＬＮＡの最初の類似体であるホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡも製造されている(Kumar
et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222)。核酸ポリメラーゼに対する基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチドデュプレックスを含むロックされたヌクレオシド類似体の調製も記載されている（Ｗｅｎｇｅｌら、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ  ９８−ＤＫ３９３  １９９８０９１４）。さらに、２’−アミノ−ＬＮＡ、すなわちハンドルをもつコンホメーション制限された新規な高親和性の核酸類似体の合成が当技術分野で記載されている(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)。さらに、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＬＮＡが製造され、それらと相補的なＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖とのデュプレックスの熱安定性がこれまでに報告されている。米国特許出願Ｎｏ．２００５０２６１２１８も参照されたい。
【０１０３】
ＶＩ．アッセイ法
[0110]  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３８の抗−ｍｉＲＮＡ核酸は、ＶＥＧＦおよびＥＰＯなどの遺伝子の数を増加させるアッセイに使用できる。次いでこれらのアッセイを用いてＥＰＯのアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【０１０４】
[0111]  他の態様において、抗−ｍｉＲＮＡ核酸がＲＮＡ分子にハイブリダイズしてＥＰＯなど種々の遺伝子の発現および／または分泌を増大させる能力を、当技術分野で周知の本明細書に記載するアッセイ法を用いて容易に調べることができる。
【０１０５】
[0112]  たとえば、ＥＰＯの発現および／または分泌が増大するかを調べるためのあるアッセイにおいては、検出可能なレベルのＥＰＯを発現する細胞を用いる。この検出可能なＥＰＯを修飾して、イメージベースの計測器プラットフォームを用いて検出しうるようにすることができる。たとえば、蛍光タンパク質タグを含む組換えＥＰＯタンパク質を発現するように細胞を設計することができる。あるいは、検出可能な抗−ＥＰＯ抗体を用いてＥＰＯレベルを検出することができる。この抗体は、蛍光性または化学発光性のタグを含むことができる。実施例３を参照。
【０１０６】
[0113]  種々の特性をもつ多数の蛍光タンパク質が市販されている。重要な考慮事項は、そのタンパク質の蛍光特性が検出装置に適合し、したがってプラットフォームの光源によって効果的に励起され、かつ発光波長を検出することが可能でなければならないということである。蛍光タンパク質をターゲットタンパク質トランスロケーションのマーカーとして使用する場合、蛍光タンパク質自体がＥＰＯの発現および／または分泌を指令しないことが重要である。必要な分子数を最小限にするために、蛍光タンパク質は試験条件下で強い蛍光をもつべきである。哺乳動物細胞においては、増強グリーン蛍光タンパク質（Ｅ
ｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ）が望ましい場合がある。組換えＥＰＯの検出に適切なイメージベースの計測器プラットフォームには、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ３０００、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ、Ｅｖｏｔｅｃ  Ｏｐｅｒａ、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ  ＩＣｙｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｔｔｏ  Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ  ＨＴ、その他を含めることができる。主要なイメージングプラットフォームの製造業者はそれらの計測器と共に標準的なアルゴリズムを提供している。あるいは、プログラミング専門知識をもつ利用者はＭＡＴＬＡＢなどのプログラムを用いて特注アルゴリズムを作成することができる。
【０１０７】
[0114]  ある態様においては、細胞を核酸で一過性トランスフェクションする。使用する核酸の濃度は細胞系毎に異なる。特定の細胞系に最適な核酸濃度を判定するためには、それらの細胞をある濃度範囲の陽性対照核酸で処理する。
【０１０８】
[0115]  細胞ベースのアッセイには、全細胞または細胞画分を使用できる。本明細書に開示する方法およびアッセイ法に従って使用できる細胞タイプの例には、たとえば当技術分野で既知のＫｅｌｌｙ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、肝細胞、腎細胞、および脾細胞、または他のいずれか適切な細胞が含まれる。
【０１０９】
[0116]  ＲＮＡ分子への核酸のハイブリダイゼーションをインビトロで検出するのに有用な多様なアッセイ法が当技術分野で既知である。ハイブリダイゼーションアッセイ法には、たとえばノーザンブロット法およびＲＮアーゼ保護アッセイ法、およびサザンブロット法が含まれる。核酸またはＲＮＡ分子をいずれか適切な検出可能な部分、たとえば放射性同位体、蛍光色素、化学発光性マーカー、ビオチン、または分析法により検出しうる当技術分野で既知の他の検出可能な部分で標識することができる。バイオチップを用いるハイスループット法は、大きな母集団の核酸をスクリーニングするために使用できる。バイオチップは、核酸またはＲＮＡ分子が付着した固体支持体を含むことができる。付着した化合物は、支持体上の空間的に規定されたアドレスに位置することができる。１より多い核酸またはＲＮＡ分子配列を使用できる。当業者に認識されるように、核酸またはＲＮＡ分子を多様な方法でバイオチップに付着させることができる。
【０１１０】
ＶＩＩ．医薬組成物
[0117]  本発明の核酸は、有効量を医薬的に許容できる適切な希釈剤またはキャリヤーに添加することにより、医薬組成物中に使用できる。これらの核酸は場合により予防的に使用できる。得られた医薬組成物を用いて、その必要がある対象において貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、対象において赤血球形成を増大させ、ＥＰＯレベルを上昇させることができる。したがって、本発明の核酸は、対象において貧血症、血友病または鎌状赤血球症を処置し、赤血球形成を増大させ、ＥＰＯレベルを上昇させるための医薬の製造に使用できる。
【０１１１】
[0118]  本明細書に多様に定めた核酸、およびその組成物は、取込み、分布および／または吸収を補助するために、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物、たとえばリポソーム、受容体ターゲティング分子、経口用、直腸用、局所用その他の配合物に、混合、封入、コンジュゲートその他の形で会合させることもできる。そのような取込み、分布および／または吸収を補助する配合物の製造を教示する代表的な米国特許には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５
，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；および５，５９５，７５６；これらのそれぞれを本明細書に援用する。
【０１１２】
[0119]  医薬組成物は、局所または全身のいずれの処置を希望するか、および処置すべき領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は局所（眼および粘膜を含む；膣および直腸送達が含まれる）、肺、たとえば散剤またはエアゾール剤の吸入または吹入によるもの、これはネブライザーによるものを含む；気管内、鼻内、上皮および経皮）、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入；または頭蓋内、たとえばクモ膜下もしくは脳室内への投与が含まれる。局所投与のための医薬組成物および配合物には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤を含めることができる。一般的な医薬用キャリヤー、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用な可能性がある。
【０１１３】
[0120]  対象は動物またはヒトであってよい。動物対象は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、イヌ、モルモット、サル、ヒト以外の霊長類、ネコまたはブタであってもよい。ヒト以外の霊長類には、サルおよびチンパンジーが含まれる。適切な動物対象は、実験動物、たとえばマウス、ラット、マウス、ラット、イヌ、サル、ヒト以外の霊長類、ネコまたはブタであってもよい。
【０１１４】
[0121]  ある態様においては、核酸を対象に経口投与経路で投与することができる。経口用核酸組成物は、１種類以上の“粘膜透過増強剤”を含むことができ、これらは“吸収増強剤”または単に“透過増強剤”としても知られる。したがって、ある態様は、少なくとも１種類の核酸を少なくとも１種類の透過増強剤と組み合わせたものを含む。一般に透過増強剤は、目的とする投与様式に関連する粘膜、たとえば腸上皮膜を通した薬物の輸送を容易にする物質である。したがって、１種類以上の核酸の取込みを増強し、その化合物の活性を妨害しない、１種類以上の透過増強剤を選択することが望ましい；この方法で、毒性、刺激またはアレルギー反応など許容できない副作用なしに、その化合物を動物の体内へ導入することができる。特定の薬物の生物学的利用能を改善するために、特定の透過増強剤が用いられている。参照：Muranishi, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1、およびLee et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91。
【０１１５】
[0122]  非経口性ではない核酸および組成物を投与するための経口用組成物は、錠剤、カプセル剤、シロップ液剤、軟ゲル剤、坐剤および浣腸剤など、種々の剤形で配合できるが、これらに限定されない。用語“消化管送達（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）”には、たとえば経口、直腸、内視鏡、および舌下／口腔内投与が含まれる。これらの投与様式に共通の要件は、こうして投与した核酸（１以上）が消化管の一部または全体にわたって吸収されること、および効果的に粘膜透過される必要があることである。
【０１１６】
[0123]  経口核酸組成物に添加しうる他の賦形剤には、サーファクタント（または“界面活性剤”）が含まれる；これらは、水溶液に溶解すると溶液の表面張力または水溶液と他の液体との間の界面張力を低下させて、消化管粘膜および他の上皮膜を通した核酸の吸収を増大させる化学物質である。サーファクタントには、胆汁酸塩および脂肪酸のほか、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92);ならびにペルフルオロ化学物質エマルジョン
、たとえばＦＣ−４３(Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252)が含まれる。
【０１１７】
[0124]  ある態様において、経口送達用の核酸組成物は少なくとも２つの識別される相を含み、これらの相には粒子、カプセル、ゲル−カプセル、マイクロスフェアなどが含まれる。各相は、１種類以上の核酸、透過増強剤、サーファクタント、生体接着剤、発泡剤、または他の佐剤、賦形剤もしくは希釈剤を含有することができる。ある態様において、１つの相は少なくとも１種類の核酸および少なくとも１種類の透過増強剤を含む。ある態様において、第１相は少なくとも１種類の核酸および少なくとも１種類の透過増強剤を含み、一方、第２相は少なくとも１種類の透過増強剤を含む。ある態様において、第１相は少なくとも１種類の核酸および少なくとも１種類の透過増強剤を含み、一方、第２相は少なくとも１種類の透過増強剤を含み、核酸を実質的に含まない。ある態様において、少なくとも１つの相には少なくとも１種類の分解遅延剤、たとえばその相の内容物の放出を遅らせるコーティングまたはマトリックスが配合されている。ある態様において、第１相は少なくとも１種類の核酸、少なくとも１種類の透過増強剤を含み、一方、第２相は少なくとも１種類の透過増強剤および放出遅延剤を含む。具体的な態様において、経口核酸組成物は、核酸および透過増強剤を含有する粒子を含む第１相、ならびに放出遅延剤でコーティングされかつ透過増強剤を含有する粒子を含む第２相を含む。
【０１１８】
[0125]  多様な胆汁酸塩が、薬物の取込みおよび生物学的利用能を高める透過増強剤としても機能する。胆汁の生理的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収を容易にすることが含まれる(Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, N.Y., 1996, pages 934-935)。多様な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体が、透過増強剤として作用する。したがって、用語“胆汁酸塩”には、天然の胆汁成分のいずれか、およびそれらの合成誘導体のいずれかが含まれる。胆汁酸塩には、たとえば下記のものが含まれる：コール酸（またはそれの医薬的に許容できるナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏ−２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｆｕｓｉｄａｔｅ）（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 : Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579)。
【０１１９】
[0126]  他の賦形剤には、キレート化剤、すなわち金属イオンをそれとの錯体を形成することにより溶液から除去して、消化管および他の粘膜を通した核酸の吸収を増強する化合物が含まれる。キレート化剤は、透過増強剤としてのそれらの使用に関して、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用する追加の利点をもつ；解明されている大部分のＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがってキレート化剤により阻害さ
れるからである(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315)。キレート化剤には下記の
ものが含まれるが、これらに限定されない：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（たとえば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ベータ−ジケトン類のラウレス−９およびＮ−アミノアシル誘導体（エナミン類）(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43)。
【０１２０】
[0127]  ある経口核酸組成物は、配合物中にキャリヤー化合物をも含有する。本明細書中で用いる“キャリヤー化合物”または“キャリヤー”は、核酸またはその類似体を表わすことができ、それらは不活性（すなわち、それ自体は生物活性をもたない）であってもよく、あるいは輸送、認識または経路の活性化もしくは仲介のために必要であってもよく、あるいはたとえば生物活性核酸の分解または循環からのそれの除去を促進することによって、生物活性をもつ核酸の生物学的利用能を低下させる核酸としてインビボプロセスにより認識される。核酸とキャリヤー化合物の共投与（一般に、過剰の後者の物質と共に）は、肝臓、腎臓、または他の循環外溜めにおいて回収される核酸の量を実質的に減少させることができる；これは、おそらく共通の受容体に対するキャリヤー化合物と核酸の間の競合によるものであろう。たとえば、肝臓組織における部分ホスホロチオエート核酸の回収は、それをポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与すると、低下させることができる(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177)。
【０１２１】
[0128]   “医薬用キャリヤー”または“賦形剤”は、１種類以上の核酸を動物に送達
するための、医薬的に許容できる溶剤、懸濁化剤、または薬理学的に不活性な他のいずれかのビヒクルであってもよい。賦形剤は液体または固体であってよく、計画している投与様式を考慮して、その医薬組成物の核酸および他の成分と組み合わせた際に目的とする嵩、稠度などを提供するように選択される。一般的な医薬用キャリヤーには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：結合剤（たとえばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（たとえば乳糖および他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえばデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、ＥＸＰＬＯＴＡＢ）；および湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウムなど）。
【０１２２】
[0129]  局所その他の投与のために、核酸および組成物をリポソームに封入するか、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームに、複合体形成させることができる。あるいは、それらを脂質、特にカチオン性脂質に、複合体形成させることができる。局所配合物は米国特許出願Ｎｏ．０９／３１５，２９８、１９９９年５月２０日出願に詳述されており、これの全体を本明細書に援用する。
【０１２３】
[0130]  他の態様において、核酸組成物は、第１のｍｉＲＮＡターゲットをターゲティングする１種類以上の抗−ｍｉＲＮＡ核酸および組成物、ならびに第２のｍｉＲＮＡターゲットをターゲティングする１種類以上の追加の核酸を含有することができる。あるいは組成物は、同じｍｉＲＮＡターゲットの異なる領域、セグメントまたは部位をターゲティングする２種類以上の核酸および組成物を含有することができる。組み合わせた２種類以
上の化合物を一緒に、または逐次、使用できる。
【０１２４】
[0131]  医薬組成物を、それが身体によってより容易に分散または可溶化されるように微細化または粉末化することができる。たとえばハンマーミルまたはこれに類する摩砕装置を用いて薬物を摩砕または微粉砕するための方法は当技術分野で周知である。
【０１２５】
[0132]  内部投与に適切な剤形（組成物）は、単位当たり約１．０ミリグラムから約５０００ミリグラムまでの有効成分を含有する。これらの医薬組成物中に、有効成分は組成物の総重量を基準として約０．５〜約９５重量％の量で存在することができる。投与量を表わすための他の慣例は、体表面積（ＢＳＡ）平方メートル当たりのｍｇ（ｍｇ／ｍ２）によるものである。一般に、成人は約１．７５ｍ２のＢＳＡをもつであろう。患者の体重に基づいて、この用量を１回量または多数回量で、毎日もしくは毎週数回、投与することができる。療法有効量に達するために複数の投与単位を必要とする場合がある。たとえば、剤形が１０００ｍｇであり、患者の体重が４０ｋｇである場合、１個の錠剤またはカプセル剤はその患者に２５ｍｇ／ｋｇの量を供給するであろう。８０ｋｇの患者には１２．５ｍｇ／ｋｇの量を供給するにすぎないであろう。
【０１２６】
[0133]  一般的な指針として、ヒトには約０．２５ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｋｇ）（体重）の少量から約６００ｍｇ／ｋｇ（体重）までの用量が療法有効量として適切である。特定の態様においては、約１ｍｇ／ｋｇから約６００ｍｇ／ｋｇ（体重）までを用いる。他の態様には、５０ｍｇ／ｋｇから約６００ｍｇ／ｋｇ（体重）まで、１００ｍｇ／ｋｇから約６００ｍｇ／ｋｇ（体重）まで、２００ｍｇ／ｋｇから約６００ｍｇ／ｋｇ（体重）まで、３００ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）までの用量範囲が含まれる。ある態様においては、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量が用いられる。
【０１２７】
[0134]  静脈内の場合、一定速度での注入期間中、特定の投与速度は約１ｍｇ／ｋｇ／分から約１０００ｍｇ／ｋｇ／分までの範囲であってよい。医薬組成物は１日量を１回で投与でき、あるいは１日量全体を１日２、３または４回の分割量で投与してもよい。核酸は一般に１日１回以上の基準で、または週１〜３回、投与される。
【０１２８】
[0135]  医薬組成物は、医薬と組み合わせて使用できるいずれか一般的な手段で、個々の療法薬として、または他の療法薬と組み合わせて投与できる。
[0136]  他の観点においては、医薬キットが提供される。この医薬キットは、たとえば貧血症、血友病もしくは鎌状赤血球症の処置に有用であり、療法有効量の核酸を含む医薬組成物を収容する１以上の容器を含む。そのようなキットは、当業者に自明のとおり、さらに所望により１以上の種々の一般的な医薬キット構成要素、たとえば１種類以上の医薬的に許容できるキャリヤーを入れた容器、追加の容器などを含むことができる。投与すべき成分の量、投与のための指針、および／または成分を混合するための指針を示す印刷した指示書も、挿入物またはラベルとしてキットに収容することができる。本明細書に記載する方法を実施する際には特定した物質および条件が重要であるけれども、特定していない物質および条件は、実現される方法の有益性をそれらが妨げない限り除外されないことを理解すべきである。
【０１２９】
[0137]  本明細書中で用いる用語および表現は記述のための用語として用いられ、限定のためのものではなく、したがってそのような用語および表現を用いる際に、提示および記載した特徴またはその一部の均等物を除外する意図はない；特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内で多様な改変が可能であることを認識すべきである。さらに、適切であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明のいずれかの態様の１以上の特徴を本発明の他のいずれかの態様の１以上の特徴と組み合わせることができる。
【実施例】
【０１３０】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１：インビトロでの抗−ｍｉＲＮＡのスクリーニングおよび分析
[0138]  以下の実施例は、本明細書に開示する技術の特定の態様を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１３１】
[0139]  ロックされた核酸（ＬＮＡ）ホスホルアミダイトを用いて、２８８の配列特異的な抗−ｍｉＲＮＡ核酸のライブラリーを合成した。ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を含むＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成のために用いた一般法を以下に示す。ＬＮＡ合成は、Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ（登録商標）から購入したＬＮＡホスホルアミダイトを用いて下記の固相合成装置のうちのひとつで実施された：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）モデルＡＢＩ  ３９００またはＡＢＩ  ３９４またはＭｅｒＭａｓｅ−１２。ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を形成するための脱保護／活性化／結合および酸化の反復サイクルを用いて、オリゴヌクレオチド鎖を３’−ｄＴ−カラム支持体上で構築した。最終結合の後、Ｃ−１８カラム支持体上での固相抽出による後続の精製を容易にするために、５’−ジメトキシトリチル保護基をそのまま残した。３６９のヒトｍｉＲＮＡ配列のコレクションをターゲティングするために、完全塩基対合により抗−ｍｉＲＮＡ核酸ライブラリーを設計した（参照：表１；http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_summary.pl?org=hsa)。ＬＮＡ化学基をもつ核酸配列は、それらの相補的ｍｉＲＮＡ配列に対する高親和性の結合をもたらし、かつこのクラスのｍｉＲＮＡアンタゴニストにヌクレアーゼ安定性をもたらす。これらのＬＮＡベースの抗−ｍｉＲＮＡ核酸ライブラリーを既知のヒトｍｉＲＮＡの約８０％にターゲティングさせた。
【０１３２】
[0140]  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ドイツ、ブラウンシュバイヒから入手したＫｅｌｌｙ細胞を用いる細胞ベースの表現型スクリーニングのために、これらのＬＮＡベースの抗−ｍｉＲＮＡ核酸を９６ウェルプレートに並べた。
【０１３３】
【表１−１】
2014050389.tif 000003
【０１３４】
【表１−２】
2014050389.tif 000004
【０１３５】
[0141]  神経芽細胞腫の細胞系Ｋｅｌｌｙを低酸素条件下で刺激してＥＰＯを分泌させることができる。転写因子ＨＩＦがこの細胞系においてＥＰＯの分泌に関与することは、ＨＩＦ−プロリルヒドロキシラーゼ、すなわちＨＩＦ中の特定のプロリン残基をヒドロキシル化することにより酸化する酵素をダウンレギュレートし、結果的に起きるプロテアソームによる分解を阻止した際に、正常酸素条件下でＥＰＯを産生しうることにより支持される。ＨＩＦの安定化は、上流プロモーターエレメント中にＨＩＦ結合部位を含む多数の遺伝子のアップレギュレーションをもたらす。特に、ＨＩＦにより制御される遺伝子にはエリスロポエチン（ＥＰＯ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０１３６】
[0142]  Ｋｅｌｌｙ細胞においてＥＰＯ産生を刺激する、ＨＩＦ−プロリルヒドロキシラーゼ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＨＤ２）を用いて、マイクロＲＮＡ干渉スクリーニングのためのアッセイ条件を最適化した。これにより、２０ｎＭのｓｉＰＨＤ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした約６０，０００個のＫｅｌｌｙ細胞について、７２時間後にバックグラウンドより約１５００倍高いウインドウが同定された。これらの条件をスクリーニングに用い、その際ｓｉＰＨＤ２を陽性対照とした。
【０１３７】
[0143]  １０％のウシ胎仔血清および非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中において３７℃および５％ＣＯ２で増殖させたＫｅｌｌｙ細胞を、トランスフェクションの前日に９６ウェル培養プレートに約６０，０００個／ウェルの密度で播種した。ＬＮＡベースｍｉＲＮＡ干渉ライブラリーの各プレートを二つ組のＫｅｌｌｙ細胞プレート（ｄｕｐｕｌｉｃａｔｅ  Ｋｅｌｌｙ  ｃｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）上で、０．２４％のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。ＥＰＯおよびＶＥＧＦのレベルをＭＳＤ  ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。要約すると、トランスフェクションの７２時間後に採集した細胞培養上清を用いて、ＥＰＯおよびＶＥＧＦの産生を測定した。これらのサイトカインを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；メリーランド州ガイザースバーグ）からのエレクトロ−化学発光マルチプレックスシステムＳｅｃｔｏｒ  ２４００イメージャーにより定量した。上清を、ＥＰＯおよびＶＥＧＦに対する抗体でプレコーティングした９６プレート内でインキュベートした。結合したサイトカインを、スルホ−タグ（ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ）（ＭＳＤ商品）とコンジュゲートした第２の捕獲用抗体で、エレクトロルミネセンス信号を用いて検出した。ＥＰＯおよびＶＥＧＦ標準品の系列希釈液を各スクリーニングプレートに含めた。
【０１３８】
[0144]  この初期スクリーニングにより、４００ｎＭの濃度でＥＰＯの発現および／または分泌を増大させる一次ＬＮＡ配列が同定された。図２〜６を参照。この最初の４００ｎＭスクリーニングにおいて、各プレートの平均の平均値より１標準偏差（ＳＴＤＶ）高い信号を与えるＬＮＡを陽性ヒットと表示した。陽性ヒットと同定された核酸の抗−ｍｉＲＮＡ部分を表２に示す。合成に際してデオキシチミジン（ｄＴ）カラムを用いたため、この実施例１で同定された核酸は、表２に示す配列とそれらの配列の３’末端にあるデオキシ−Ｔからなる。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８自体がこの３’ｄＴを含まないこと、および前記のセクションＩ〜ＶＩＩでＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８のうちのひとつについて主張または言及した場合にその核酸配列にこの３’ｄＴは含まれないものとすることを、当業者は直ちに認識するであろう。ターゲットｍｉＲＮＡの配列を表３に示す。
【０１３９】
【表２】
2014050389.tif 000005
【０１４０】
【表３−１】
2014050389.tif 000006
【０１４１】
【表３−２】
2014050389.tif 000007
【０１４２】
[0145]  後続のスクリーニングにおいて、４００ｎＭスクリーニングで一次ヒットとして表示されたＬＮＡ配列を、１００ｎＭ、４０ｎＭおよび２０ｎＭでトランスフェクションした。図７、８および９を参照。図８には、下記の表４においてＶＥＧＦよりＥＰＯを優先的に増大させる選択したマイクロＲＮＡについての結果を示す。Ｋｅｌｌｙ細胞について２０ｎＭスクリーニングにおける特定のＬＮＡ配列を、次いでＨＥＰＧ２細胞において試験した。結果を図１０に示す。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
実施例２：インビボでの抗−ｍｉＲＮＡの試験
インビボでの抗−ｍｉＲＮＡ核酸配列の試験を実施して、ＥＰＯおよびＶＥＧＦなどの遺伝子をダウンレギュレートするｍｉＲＮＡを阻害することによる遺伝子調節の概念の証拠を確立した。この試験では、２種類のｍｉＲＮＡ配列ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：４０）およびｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）をインビボで、下記に示すそれらの相補的抗−ｍｉＲＮＡ配列によりターゲティングした。
【０１４５】
【表５】
2014050389.tif 000009
【０１４６】
これらのｍｉＲＮＡはそれらの５’シード領域が１７−ｎｔ抗−ｍｉＲＮＡ配列によりターゲティングされた。上に示した抗−ｍｉＲＮＡ配列は完全にホスホロチオエート化され（＊で示す）、下記のとおり化学修飾されていた：太字のヌクレオチドはＬＮＡ修飾をもち、斜体のヌクレオチドは２’−ＯＭｅ修飾をもつ。エキソヌクレアーゼによるヌクレアーゼ開裂を阻止するために逆方向デオキシチミジン残基を３’末端に取り込ませ、小文字ｔにより示す。
【０１４７】
ＬＮＡ−修飾された抗−ｍｉＲＮＡ配列を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に配合し、静脈内注射（尾静脈）により約２００〜２２５ｇの体重の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。実験計画はグループ当たり３匹を含む４グループからなっていた：
グループＡ：  ＰＢＳビヒクル対照
グループＢ：  抗−ｍｉＲ−５２４＊  ２０ｍｇ／ｋｇ
グループＣ：  抗−ｍｉＲ−１０３−１，２  １０ｍｇ／ｋｇ
グループＤ：  抗−ｍｉＲ−１０３−１，２  ２０ｍｇ／ｋｇ
抗−ｍｉＲＮＡ配列を投与する３日前に血液試料を採取して（１５０〜２００ｕＬ／時点）、ＥＰＯおよびＶＥＧＦのベースラインレベルを確認した。抗−ｍｉＲＮＡ配列を１
回投与した。投与後、４、６、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間目に血液試料をＥＤＴＡマイクロテイナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）中へ採集した。確立されているプロトコル、アッセイキット、およびＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）（メリーランド州ガイザースバーグ）からの計測器を用いて、血漿ＶＥＧＦレベル（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。ｍｉＲＮＡまたは対照を投与したラットからの血漿試料につき、Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマウス／ラット血清／血漿低酸素パネルアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，メリーランド州ガイザースバーグ，カタログ番号Ｋ１１１２３Ｃ−３）を行なった。このアッセイは、ラットの血漿中ＥＰＯについて１６ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌまで直線的動態範囲を示し、一般的な定量下限は約１０ｐｇ／ｍｌであった。血漿中のＶＥＧＦの直線的動態範囲は６０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌまでであり、一般的な定量下限は約４０ｐｇ／ｍｌであった。このアッセイは、製造業者の指示に従って実施された。要約すると、試料または校正物質（２５ｕＬ）をまず希Ｈアッセイ緩衝液中に２倍希釈し、次いで２５ｕＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で撹拌しながら２時間インキュベートし、次いで３００μＬのＰＢＳで３回、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，バーモント州ウィノースキー）を用いて洗浄した。次いで２５μｌのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウス／ラットＥＰＯ抗体プラスＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウス／ラットＶＥＧＦ抗体（抗体希釈剤ＧＦ１中に希釈）を添加し、プレートを室温で撹拌しながら２時間インキュベートした。プレートを再び３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、１５０μＬのＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを添加した。プレートを直ちにＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，メリーランド州ガイザースバーグ）で読み取った。バックグラウンド信号を差し引き、ラットのＥＰＯおよびＶＥＧＦ標準曲線の内挿から循環ＥＰＯおよびＶＥＧＦの濃度を求めた。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０１で分析を行なった。
【０１４８】
注目すべきことに、抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）および抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）両配列について、１回の静脈内投与により２時間以内にラット血漿中のＶＥＧＦの増加が生じた。図１１は、ＶＥＧＦのｎｇ／ｍｌを投与後の時間数との関係で示す。抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）に対しては、ＶＥＧＦの刺激／安定化の増大により測定して明らかな用量応答がある。ＶＥＧＦレベルは経時的に減衰し、２４時間以内にバックグラウンドレベルに達した。図１２は、経時的なＥＰＯレベル（ｎｇ／ｍｌ）の変化を示す。
【０１４９】
図１３Ａは誘導されたＥＰＯの量（３匹の試験動物の平均）を示し、図１３Ｂは個々の試験動物について誘導されたＥＰＯの量を示す。図１３Ｃは誘導されたＶＥＧＦの量（３匹の試験動物の平均）を示し、図１３Ｄは個々の試験動物について誘導されたＶＥＧＦの量を示す。データは、ＶＥＧＦまたはＥＰＯのｎｇについての曲線下面積（ＡＵＣ）に時間（１６８時間）を掛けたものとしてｐｅｒ／ｍｌ基準で提示される。“Ａ”はリン酸緩衝化生理食塩水対照であり；“Ｂ”は２０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）であり；“Ｃ”は１０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）であり；“Ｄ”は２０ｍｇ／ｋｇの抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）である。ＥＰＯに関するインビボデータは統計的にアッセイのノイズを上回って有意ではないと判定されたが、ＶＥＧＦ誘導に関するインビボデータは統計的に有意であり、インビトロで観察された結果（前記）と一致する。これらの実験は、抗−ｍｉＲＮＡ核酸が適正な条件下では（インビトロ分析により示すように）ＶＥＧＦおよびＥＰＯなどの選択した遺伝子を増加および／または安定化させることができるという仮説の証明を提供する。
【０１５０】
血漿薬物レベルについての薬物動態試験を各時点で測定した。さらに、組織試料を投与後１６８時間目に採取し、その後の分析のために液体窒素中で瞬間凍結した。組織試料に
は、肝臓、腎臓、脾臓、心臓および骨髄が含まれていた。
【０１５１】
血漿および組織試料中のｍｉＲｎａレベルを標準ＥＬＩＳＡ法により分析した。要約すると、標準的な９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートをストレプトアビジン溶液でコーティングした（たとえば、５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、または他の適切な緩衝液中に希釈した、２．５μｇ／ｍｌの市販ストレプトアビジン）。プレートをシールし、２〜８℃で一夜インキュベートした。プレートを標準法により洗浄した。約１５０μｌのＩ−Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスター・シティー）を各ウェルに添加した。プレートをシールし、室温で１〜２時間インキュベートし、次いで洗浄した。系列希釈した組織溶解液および血漿試料をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチニル化した捕獲用オリゴ（分析される抗−ｍｉＲＮＡ配列の一部に対して相補的であるオリゴ）およびジゴキシン標識した検出用オリゴ（分析される抗−ｍｉＲＮＡ配列の一部に対して相補的であるが、捕獲用オリゴとはオーバーラップしないオリゴ）を適切な緩衝液中に希釈し、適宜なウェルに添加し、室温で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、標準品および試料（すなわち測定すべき抗−ｍｉＲＮＡを含有するもの）を添加し、室温で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ジゴキシンポリクローナル抗体を適切な緩衝液、たとえば１×ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中に希釈し、プレートに添加し、室温で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ’ｓ  Ｆｅｍｔｏ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード）からの標準試薬およびプロトコルを用いて基質を調製し、プレートに添加し、発生した信号を分析した。
【０１５２】
図１４Ａは、個々の動物について２０ｍｇ／ｋｇ用量の抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）の血漿クリアランスｎｇ／ｍｌを、投与後の時間数に対して示す。図１４Ｂは、個々の動物について２０ｍｇ／ｋｇ用量の抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）の血漿クリアランスｎｇ／ｍｌを投与後の時間数に対して示す。図１５Ａは表記した投与量（ｍｐｋ＝キログラム当たりの抗−ｍｉＲＮＡ核酸の投与量ミリグラム）における投与後１６８時間目の組織中の抗−ｍｉＲ−１０３−１，２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）のｎｇ／ｍｇを示し、図１５Ｂは抗−ｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：７９）のｎｇ／ｍｇを示す。
【図１】
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【図１３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞によるエリスロポエチンの発現または分泌を増大させるための医薬組成物であって、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる核酸を含む、ここで：
（ａ）該ＲＮＡ分子はｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体であり；そして
（ｂ）該核酸は、（ｉ）緊縮条件下で該ＲＮＡ分子にハイブリダイズするか、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む；
前記医薬組成物。
【請求項２】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と４ヌクレオチド以下の相違を有する配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と１００％配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
細胞が、腎細胞、肝細胞、脾細胞または骨髄細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞が腎細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞がヒト腎細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細胞が臓器の一部を形成している、請求項１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
臓器が腎臓、肝臓または脾臓である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
臓器が腎臓である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
核酸が少なくとも１２核酸塩基の長さである、請求項１−９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
核酸が１２〜３０核酸塩基の長さである、請求項１−１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
核酸が、ホスホロアミデート、ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、アルキルホスホネート、およびメチリンメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｉｎｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１−１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−アルキルリボ核酸ユニット、２’アミンリボ核酸ユニット、ペプチド核酸ユニット、２’フルオロ−リボ核酸ユニット、モルホリノ核酸ユニット、シクロヘキサン核酸ユニット、およびトリシクロ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項１−１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、および２’Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１−１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１−１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象において赤血球形成を増大させ、対象においてエリスロポエチンレベルを上昇させ、またはその必要がある対象を貧血症、血友病もしくは鎌状赤血球症について処置するための医薬組成物であって、ＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる核酸を含む、ここで：
（ａ）該ＲＮＡ分子はｍｉＲ−５２４＊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、またはその前駆体であり；そして
（ｂ）該核酸は、（ｉ）緊縮条件下で該ＲＮＡ分子にハイブリダイズするか、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む；
前記医薬組成物。
【請求項１８】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と４ヌクレオチド以下の相違を有する配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９と１００％配列同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
対象が哺乳動物である、請求項１７−１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項１７−１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
核酸が少なくとも１２核酸塩基の長さである、請求項１７−２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
核酸が１２〜３０核酸塩基の長さである、請求項１７−２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
核酸が、ホスホロアミデート、ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、アルキルホスホネート、およびメチリンメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｉｎｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−アルキルリボ核酸ユニット、２’アミンリボ核酸ユニット、ペプチド核酸ユニット、２’フルオロ−リボ核酸ユニット、モルホリノ核酸ユニット、シクロヘキサン核酸ユニット、およびトリシクロ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、および２’Ｏ−メトキシ−エチルリボ核酸ユニットからなる群から選択される修飾された核酸ユニットを含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、２’−Ｏ−メチルリボ核酸ユニット、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
核酸が、ロックされた核酸ユニット、または混合型の核酸−ロックされた核酸である、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。