(57)【要約】      （修正有）【課題】ボロン酸化合物を金属基板上に安定的に固定し、糖類・糖タンパク質を金属基板上で再現よく測定する。【解決手段】下記の一般式で表されるボロン酸化合物、および当該化合物と金属部を備える基板を有し、当該化合物のチオール基が金属部と結合されているセンサ。なお、式中のｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である。2014234349.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式
【化４】
2014234349.tif 000017
（ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である）
で表されるボロン酸化合物。
【請求項２】
請求項１に記載のボロン酸化合物と、
金属部を備える基板と
を有し、
前記ボロン酸化合物の前記チオール基は、前記金属部と結合されている、
センサ。
【請求項３】
チオール基と、
ボロン酸基を持つベンゼン環と、
前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖と
を有し、
前記アルキル鎖中にチオール−マレイミド結合またはヒドラジド結合を有する、
ボロン酸化合物。
【請求項４】
下記の一般式
【化５】
2014234349.tif 000018
（ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である）
で表される請求項３に記載のボロン酸化合物。
【請求項５】
請求項３または４に記載のボロン酸化合物と、
金属部を備える基板と
を有し、
前記ボロン酸化合物の前記チオール基は、前記金属部と結合されている、
センサ。
【請求項６】
チオール基と、
ボロン酸基を持つベンゼン環と、
前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖と
を有し、
前記アルキル鎖中にイミド結合を有する、
ボロン酸化合物。
【請求項７】
請求項６に記載のボロン酸化合物と、
金属部を備える基板と
を有し、
前記ボロン酸化合物の前記チオール基は、前記金属部と結合されている、
センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はボロン酸化合物のボロン酸基開裂抑制に関する。さらに糖類・糖タンパク質を金属基板上で再現よく測定する事に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類は身体の恒常性維持にとって非常に大切な物質の一つとして挙げられる。その糖類の代表例として、グルコース（Ｄ−グルコース、ブドウ糖）が挙げられる。このグルコースは、身体を構成する各種の組織細胞のエネルギー源として大切である。しかし、糖が過剰に血液に流れた状態が続くと生命の危険を伴う意識障害を促すケトアシドーシスが引き起こされかねない。そのため、生体のグルコース維持は、生体恒常性にとって非常に大切な現象である。
【０００３】
現在研究がよく進んでいるグルコース検出手段の一つとして、ボロン酸化合物を用いたグルコースセンサーが幅広く知られている。ここで示されるボロン酸化合物とは、例えば化１や化２で示されるようなボロン酸基を有する化合物を指す。
【０００４】
【化１】
2014234349.tif 000002
【０００５】
【化２】
2014234349.tif 000003
【０００６】
ボロン酸基は、グルコースの持つジオール基と加水分解結合できることがよく知られている。この反応過程を詳しく示したのが化３である。なお、ここではボロン酸化合物の代表としてフェニルボロン酸の反応過程について記載している。
【０００７】
【化３】
2014234349.tif 000004
【０００８】
ｐＨの低い状態では化３（Ａ）のようにボロン酸基はＢ（ＯＨ）２状態を大多数の分子はとっているものの、ｐＨが高い状態では、化３（Ｂ）のようにボロン酸基が遊離の水酸化物イオンと結合してＢ（ＯＨ）３−の状態をとりやすくなる。なお、二種類の分子の比が１：１になるｐＨを本発明ではｐＫａと定義することとする。そして、化３（Ｂ）のようにボロン酸基がＢ（ＯＨ）３−状態の時、グルコースなどが持つジオール基と結合し、化３（Ｃ）のような分子構造をとりやすいことがよく知られている。
【０００９】
こういったボロン酸基の性質を利用して、グルコース濃度を光学的に測定した系が特許文献１である。ボロン酸化合物をチオール基によって予め金基板と結合させた状態にしておく。彼らは、ボロン酸基がグルコースと加水分解結合することで、表面増強ラマン信号（ＳＥＲＳ）のピーク強度またはラマンシフトが一部変化することを発見し、これらの変化量を読み取ることで、グルコース濃度を測定できたと報告した。こういった金属基板の持つ特異な現象を利用してグルコース濃度を光学的に検出する手法は、近年確立されてきた非常に有力な手法の一つである。
【００１０】
しかし、前記の金属基板上でのグルコース信号測定手法は再現性よく検出するという点で課題をいくつか有している。その課題の一つとして、Ｄａｖｉｄ  Ｂａｒｒｉｅｔの研究が挙げられる（非特許文献１）。彼らは、シンプルな構造を有する４−メルカプトフェニルボロン酸（４ＭＰＢＡ，化１）がチオール基を介して金と直接結合されると、水溶液に数時間浸けただけでボロン酸基がベンゼン環から開裂したという結果を報告している。さらに彼らは、金基板に浸す溶液の水素イオン濃度が高い程、ボロン酸基開裂が顕著に進むという結果も合わせて報告している。
【００１１】
前記のようなボロン酸基のベンゼン環からの開裂課題を捉えた研究が、Ｒａｉｎｅｒらである（非特許文献２）。彼らは、ボロン酸基開裂現象メカニズムの一端を量子化学計算シミュレーション、ガウシアンに基づいて求めた。彼らは、ボロン酸基の主な開裂メカニズムが、溶液中の遊離水酸化物イオンがＢ（ＯＨ）３−の状態にあるボロン酸基へ吸核攻撃することだと考察した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５３２４７号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００７，  ２３，  ８８６６−８８７５
【非特許文献２】Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ａ  ２００６，  １１０，  １２９５−１３０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従来の技術は、ボロン酸化合物からボロン酸基の開裂を抑制することができないという課題を有していた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するために、本発明の構成として以下のものが提供される。
【００１６】
下記の一般式（化４）で表されるボロン酸化合物。なお、ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である。
【００１７】
【化４】
2014234349.tif 000005
【００１８】
チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖とを有し、前記アルキル鎖中にチオール−マレイミド結合またはヒドラジド結合を有する、ボロン酸化合物。
【００１９】
チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、前記チオール基と前記ベンゼン環の間にアルキル鎖とを有し、前記アルキル鎖中にイミド結合を有する、ボロン酸化合物。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の手法によって、ボロン酸化合物からのボロン酸基の開裂が抑制される。これにより、例えば、ボロン酸化合物を金属基板上に安定的に固定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】従来例（化１）のボロン酸基のベンゼン環からの開裂を確認できるＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）による図
【図２】従来例（化１）のＣＨ伸縮振動・ＢＯ伸縮振動由来各々のピーク強度変化図
【図３】化２のボロン酸基のベンゼン環からの開裂を示したＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）図
【図４】化２のベンゼン環・ボロン酸基由来各々のピーク強度変化図
【図５】本発明に従う化６の合成ルート概略図
【図６】本発明に従う化６のＦＴ−ＩＲ（高感度反射測定法）図
【図７】本発明に従う化６の構造安定性を示した解析図
【図８】本発明に従う化６のベンゼン環・ボロン酸基由来、各々のピーク強度解析図
【図９】本発明に従うボロン酸化合物（化１１）の合成ルート概略図
【図１０】本発明に従うボロン酸化合物（化１１）のＦＴ−ＩＲ（高感度反射測定法）図
【図１１】本発明に従うボロン酸化合物（化１１）の初期及び一日ＰＢＳ溶液保存後の図
【図１２】本発明に従うボロン酸化合物（化１１）のベンゼン環・ボロン酸基由来各々のピーク強度解析図
【図１３】本発明に従うボロン酸化合物（化７）のＦＴ−ＩＲ（高感度反射測定法）図
【図１４】本発明に従うボロン酸化合物（化７）の初期及び一日ＰＢＳ溶液保存後の図
【図１５】本発明に従うボロン酸化合物（化７）のベンゼン環・ボロン酸基由来各々のピーク強度解析図
【図１６】本発明に従うボロン酸化合物（化１３）の合成ルート概略図
【図１７】本発明に従うボロン酸化合物（化１３）のＦＴ−ＩＲ（高感度反射測定法）図
【図１８】本発明に従うボロン酸化合物（化１３）の初期及び一日ＰＢＳ溶液保存後の図
【図１９】本発明に従うボロン酸化合物（化１３）のベンゼン環・ボロン酸基由来各々のピーク強度解析図
【図２０】実施の形態２におけるセンサ１００を示す図
【図２１】実施の形態２におけるセンサ１００の使用例を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２３】
（実施の形態１）
まず、金属に直接結合した４ＭＰＢＡのボロン酸基が開裂してしまうという本発明の課題について、本発明者らは、以下を見出した。
【００２４】
すなわち、４ＭＰＢＡが金属に直接繋がれたことによって、金属が４ＭＰＢＡ内部の電子を吸引し、Ｂがより正電荷に帯電される。正電化に帯電したＢは遊離水酸化物イオンとより結合しやすくなり、ボロン酸基がＢ（ＯＨ）３−の状態にある４ＭＰＢＡの分子数が増加する。従って、より多数の４ＭＰＢＡ分子が水酸化物イオンによる吸核攻撃にさらされやすくなることを、本発明者らは見出した。
【００２５】
これに基づけば、ボロン酸基を開裂させないようにする一つの解決手段としては、金属のフェニルボロン酸に対する影響、すなわち電子吸引性を弱めさせればよい。
【００２６】
そこで、本実施の形態１におけるボロン酸化合物は、下記の構造を有する。
【００２７】
本実施の形態１におけるボロン酸化合物の第１の例は、下記の一般式（化４）で表されるボロン酸化合物である。
【００２８】
【化４】
2014234349.tif 000006
【００２９】
なお、ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である。
【００３０】
また、本実施の形態１におけるボロン酸化合物の第２の例は、チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、チオール基とベンゼン環の間にアルキル鎖とを有し、アルキル鎖中にチオール−マレイミド結合またはヒドラジド結合を有する、ボロン酸化合物である。
【００３１】
この第２の例のさらに具体的な構造としては、下記の一般式（化５）で表されるボロン酸化合物である。
【００３２】
【化５】
2014234349.tif 000007
【００３３】
なお、ｎは、アルキル鎖の鎖長であり、ｎ≧１である。
【００３４】
また、本実施の形態１におけるボロン酸化合物の第３の例は、チオール基と、ボロン酸基を持つベンゼン環と、チオール基とベンゼン環の間にアルキル鎖とを有し、アルキル鎖中にイミド結合を有する、ボロン酸化合物である。
【００３５】
以上の第１〜第３の例のボロン酸化合物であれば、ボロン酸基の開裂が抑制される。これにより、例えば、ボロン酸化合物を金属基板上に安定的に固定できる。
【００３６】
アルキル鎖の鎖長ｎは１以上であれば、後述するセンサの基板上に接着できうる限り、ｎはどれ程大きくても本発明の範疇に含まれる。一例として、上述の第１の例の化合物が、ｎ＝６の化６が挙げられる。
【００３７】
【化６】
2014234349.tif 000008
【００３８】
また、別の一例として、上述の第１の例の化合物が、ｎ＝１６の化７が挙げられる。この化合物はアルキル鎖長が長いため、稠密性が高くなり、金からの脱離が抑制される。
【００３９】
【化７】
2014234349.tif 000009
【００４０】
ただし、本発明は、この例にのみ限定されるべきものではなく、ｎは任意の自然数に対して含まれる。
【００４１】
ボロン酸基のベンゼン環上の置換配置は、ベンゼン環から向かってメタ位、オルト位、パラ位のいずれに配置されていても本発明の範疇に含まれる。一例として示したのが、化８である。
【００４２】
【化８】
2014234349.tif 000010
【００４３】
上述の第１〜第３の例のボロン酸化合物は、ベンゼン環が置換基を有していてもよく、そのような置換基（誘導体）も本発明に含まれる。置換基の例としては、メトキシ基、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基、アミノ基、フェニル基が挙げられる。
【００４４】
さらに、上述の第２の例および第３の例の場合では、ベンゼン環への置換基の一例として、化９が挙げられる。
【００４５】
【化９】
2014234349.tif 000011
【００４６】
化９で示される置換基のフルオロ基は、電子吸引性の高い置換基である。従って、フルオロ基はボロン酸基の前記ｐＫａを下げさせる効果を持つ。前記ｐＫａが下がれば、ボロン酸基はＢ（ＯＨ）３−状態によりなりやすくなる。このＢ（ＯＨ）３−状態のボロン酸基が、グルコースと化学的に結合できる。そのため、化９のグルコースへの結合性が、フェニルボロン酸の結合性よりも高くなる。
【００４７】
このようにボロン酸基とジオール基との特異的結合性を高めさせる置換基を置くことは、糖ならびに糖タンパク質の効果的な検出においても非常に有用である。
【００４８】
上述の第１〜第３の例のボロン酸化合物は、ボロン酸基を有するベンゼン環の代わりに、ボロン酸基を有するベンゼン環群（複数のベンゼン環）を有していても良い。
【００４９】
ベンゼン環群の数は金属上に安定的に結合できる限り、いくつ連なっていても本発明の範疇に含まれる。ベンゼン環群数の例として、ベンゼンの代わりにナフタレン（化１０）、アントラセン（化１１）といった構造が挙げられる。
【００５０】
【化１０】
2014234349.tif 000012
【００５１】
【化１１】
2014234349.tif 000013
【００５２】
ボロン酸基の結合部位は、ベンゼン環群上の任意の位置で置換されていても本発明の範疇に含まれる。また、ボロン酸基が複数置換されていても本発明に含まれる。合わせて、この環上のどの位置にボロン酸基以外の置換基が含まれていても本発明の範疇に含まれる。
【００５３】
これらのベンゼン環の連なった化合物は、一般に蛍光特性を有するため、グルコース等の糖類が結合した際に、蛍光波長が変化する特性を持つ。そこで、この波長変化を読み取ることでグルコース濃度を定量化可能なため、有用である。
【００５４】
ボロン酸基を有するベンゼン環に一つ以上置換基を含むような化合物も本発明の範疇に含まれる。一例として、化１２が挙げられる。ただし本発明は化１２にのみ限定されるべきものではなく、任意の置換基と結合部位について本発明の範疇に含まれる。
【００５５】
【化１２】
2014234349.tif 000014
【００５６】
本実施の形態１のボロン酸化合物のチオール基は、金属Ｍと特異的に結合するため用いられている。金属Ｍの例として、金、銀、銅、アルミニウム、亜鉛といったものが挙げられる。ただし、金属Ｍの種類はこれらの金属にのみ限定されるものではなく、Ｔ部位が結合可能な金属であれば、どのような金属の種類でも本発明の範疇に含まれる。
【００５７】
保存水溶液の種類も本発明化合物の構造が著しく変化してしまうような溶液を適用しない限り、任意の水溶液でも本発明の範疇に含まれる。
【００５８】
非特許文献１に示されるように、特に化１のボロン酸基が開裂してしまうと報告されている水素イオン濃度が高い水溶液条件下でも、本発明に適合する化合物はボロン酸基が開裂しないことを特徴とする。
【００５９】
本実施の形態１の最大の特徴は、金属に結合した際にボロン酸基の開裂が起こらないことである。従って、この化合物はボロン酸基の持つ単糖類の検出といった機能を金属上で安定的に実施可能である。本発明利用上の利点は、従来の電気化学的手法のみならず、金属基板の特徴を活かした光学的手法でも、安定的な糖類検出が実施できる点である。後者の好例として特許文献１が挙げられる。特許文献１では、ボロン酸化合物を予め表面増強ラマン（ＳＥＲＳ）用金基板上に結合させておき、ボロン酸に結合したグルコース濃度をＳＥＲＳスペクトラム変化により定量化できると報告されている。以上のように、グルコース濃度を安定的に定量化するためには、ボロン酸基が金基板上に存在することが必要条件である。従って、本発明はこのようなグルコース濃度検出にも非常に有用である。
【００６０】
本発明は、生体を傷つけることなく体内における糖濃度を測定する技術に展開できる。一例として下記のような方法が検討できる。予め生体にボロン酸化合物を吸着させた光学センサーを埋め込んでおく。このセンサーに生体外部から適切な光を照射することによってボロン酸基と結合した糖濃度を測定できる。このようにして得た体内の糖に関する情報を連続的にモニターすることによって臨床学的に有用なデータを取得することもできる。また、このようなセンサーにより、糖尿病患者はいつでもどこでも自身の血糖値を容易に測定可能になる。さらに、患者のＱＯＬを高めることにも繋がりうる。また、ボロン酸基開裂を抑制する本発明手法は、所望の糖・糖タンパク質を測定可能な次世代バイオセンサにも多大な影響を与える。
【００６１】
（実施の形態２）
実施の形態２が、図２０および図２１を参照しながら説明される。
【００６２】
実施の形態２においては、実施の形態１で示されたボロン酸化合物を用いたセンサが提案される。
【００６３】
図２０は、実施の形態２におけるセンサ１００を示す図である。
【００６４】
実施の形態２におけるセンサ１００は、ボロン酸化合物１０１と、基板１０３とを有する。
【００６５】
ボロン酸化合物１０１は、実施の形態１において示されたボロン酸化合物である。
【００６６】
基板１０３は、金属部１０２を備える。
【００６７】
ボロン酸化合物１０１のチオール基は、金属部１０２と結合されている。
【００６８】
以上の構成によれば、ボロン酸化合物からのボロン酸基の開裂が抑制される。これにより、例えば、ボロン酸化合物をセンサに安定的に固定できる。例えば、保存水溶液中または被検体の内部において、センサのボロン酸化合物からのボロン酸基の開裂を抑制することができる。
【００６９】
ボロン酸化合物１０１は、例えば、図２０（ａ）に示されるように、金属部１０２の上面に、膜状に設けられていても良い。
【００７０】
もしくは、ボロン酸化合物１０１は、例えば、図２０（ｂ）に示されるように、パターン化された金属部１０２（金属パターン）に近接するように設けられていても良い。
【００７１】
金属パターンとしては、例えば、粒子状に形成された金属部などが挙げられる。金属パターンとしては、表面増強ラマン散乱を生じさせる構造であっても良い。
【００７２】
図２１は、実施の形態２におけるセンサ１００の使用例を示す図である。
【００７３】
実施の形態２におけるセンサ１００は、被検体の内部に埋め込まれる。
【００７４】
検出装置２００は、センサ１００を用いて、被検体の内部の被検物質を検出する検出装置である。
【００７５】
検出装置２００は、励起光を出射する発光手段２０１と、散乱光を検出する検出手段２０２と、演算手段２０３とを具備する。
【００７６】
検出装置２００は、発光手段２０１からの励起光を、被検体の内部に埋め込まれたセンサーチップ１００に照射し、散乱光を発生させる。
【００７７】
ここで、散乱光としては、例えば、表面増強ラマン散乱光や、蛍光などが挙げられる。
【００７８】
検出装置２００は、発生した散乱光を検出手段２０２で検出し、散乱光の強度を得る。
【００７９】
検出装置２００は、得られた散乱光の強度に基づき、演算手段２０３により、被検物質の存在の有無を判定する。もしくは、検出装置２００は、得られた散乱光の強度に基づき、演算手段２０３により、被検物質の濃度を測定しても良い。
【００８０】
なお、実施の形態２においては、被検体は、人体や動物などの生体であっても良い。
【００８１】
もしくは、被検体は、無生物であっても良い。すなわち、センサ１００は、例えば、被検溶液の中に配置されても良い。このとき、検出装置２００は、被検溶液の中に含有される被検物質を検出しても良い。このとき、被検溶液は、生体から摘出された液であっても良い。例えば、被検溶液は、血液、汗、涙、尿、唾液などであっても良い。
【００８２】
なお、被検物質としては、例えば、グルコースなどの糖類または糖タンパク質などが挙げられる。
【００８３】
以下、本発明の特徴を一層明らかにするため実施例に沿って本発明を説明していく。
【実施例１】
【００８４】
＜自己集積膜吸着実験＞
ベンゼン環からのボロン酸基の開裂を再現できるか確認するために、化１の４ＭＰＢＡ及び、ボロン酸基のベンゼン環上の位置が開裂にどのような影響を与えるか検証するために、化２の３ＭＰＢＡの計二種類の化合物について構造安定性を検証することに決めた。
【００８５】
そこで、まず本実施例では、前記の３ＭＰＢＡと４ＭＰＢＡ計二種類を金基板に吸着させる方法について記載する。
【００８６】
さらに、実施例４、実施例８で金基盤へのボロン酸化合物の固定化に使用する際の足場となるアルキル鎖として６−アミノ−１−へキサンチオールをエタノール（６ＡＨＴ）、１６−アミノ−１−ヘキサデカンチオール（１６ＡＨＴ）、１，８−オクタンジチオール（ＯＤＴ）の金基板への吸着方法も本実施例に併記した。
【００８７】
５ｎｍのチタンと１００ｎｍの金をＳｉウエハー上にスパッタリング法を用いて薄膜形成させた金基板を準備した。前記金基板を２−プロパノール（ＩＰＡ）溶液中で１０分間超音波洗浄した。その後、前記金基板をアセトン溶液中で１０分間超音波洗浄した。さらに前記金基板をアセトン溶液から取り出し、大量の超純水で洗浄した後、洗浄後の金基板を１００Ｗ、５分間の条件でＵＶオゾン処理をした。このように洗浄された金基板を１ｍＭのエタノール溶液に溶かしたチオール系化合物と反応させた。前記チオール系化合物とは、６−アミノ−１−へキサンチオール（６ＡＨＴ）、１６−アミノ−１−ヘキサデカンチオール（１６ＡＨＴ）、１，８−オクタンジチオール（ＯＤＴ）、化１で示される４ＭＰＢＡ、化２で示される３ＭＰＢＡの計５種類の化合物を指す。以上の洗浄方法によって、金基板に自己集積膜（ＳＡＭ）を吸着させた。
【００８８】
これらのチオール系化合物のうち４ＭＰＢＡ、３ＭＰＢＡが金基板上に吸着していることをＦＴ−ＩＲ（高感度ＲＡＳ法）によって確認し、その主な帰属を表１に記した。
【００８９】
【表１】
2014234349.tif 000015
【実施例２】
【００９０】
＜４ＭＰＢＡと３ＭＰＢＡに対する構造安定性評価試験＞
実施例１で金基板上に固定化された化合物、すなわち４ＭＰＢＡと３ＭＰＢＡについて２５℃条件下でリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に浸した状態で１日保管して、化合物の構造安定性を評価した。
【００９１】
リン酸（１０ｍＭ）と塩化ナトリウム（１５４ｍＭ）を含有するＰＢＳ溶液中に実施例１で得られた２種類のボロン酸化合物、すなわち４ＭＰＢＡ、３ＭＰＢＡが吸着された金基板を浸した。そして、ボロン酸化合物の構造変化をＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって調べた。測定方法は以下の２ステップからなる。まず、金基板は下記の経過時間に応じＰＢＳ溶液からとり出され、ＦＴ−ＩＲ装置ＦＲＯＮＴＩＥＲ  ＦＴ−ＩＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定された。そして、同じＰＢＳ保存溶液に測定済みの金基板を浸した。前記の経過時間とは、実施例１のＳＡＭ形成直後（初期）及びＰＢＳ溶液に浸した後各々４、８、２４時間経過後を指す。
【００９２】
また、得られたＦＴ−ＩＲの吸収ピーク強度変化を定量的に検証するために、得られたスペクトラムのうち、所望のピークを吸収強度が最大である波数からみて周辺３０／ｃｍ程度抽出した。抽出後のピークを一次直線でピークの傾きを補正した。その補正されたピークの強度を解析ソフトＯｒｉｇｉｎＰｒｏ９．０Ｊに含まれるローレンツ関数によって見積もった。なお、抽出ピークとローレンツ関数との相関係数がＲ２≧０．９であれば、正しくフィッティングなされていると判断した。その正しいフィッティングで示されるピーク強度値を本発明では解析データとして採用した。下記の図２、４、８、１２、１５、１９では、初期サンプルのピーク強度に対するＰＢＳ溶液に浸けた時間毎のピーク強度比を算出してグラフ上にプロットした。なお、本発明ではこの解析手法を「ピーク強度解析手法」と定義する。
【００９３】
まず、非特許文献１でボロン酸基の開裂が既に報告された４ＭＰＢＡについて、本実施例でもボロン酸基の開裂を検知できるかを確認した。
【００９４】
図１に実施例１で吸着させた直後の初期状態と１日ＰＢＳ溶液に浸けた後の状態の計２状態についてＩＲスペクトラムを記した。
【００９５】
まず、ベンゼン環が金から開裂していないかどうか確認するために、ベンゼン環由来の代表的なピークであるＣＨ伸縮振動について検証した。ＣＨ伸縮振動は非特許文献１の解析結果から主に２９１９［／ｃｍ］だと帰属される。このＣＨ伸縮振動の吸収強度を前記ピーク強度解析手法により表したグラフが、図２（Ａ）である。図２（Ａ）によると、ＰＢＳ溶液に一日浸すことによるＣＨ伸縮振動のピーク強度変化は１３％だった。これらの結果から、ＣＨ伸縮振動による吸収強度比が凡そ同じ値をとっていると判断できる。
【００９６】
次に、ボロン酸基のベンゼン環からの開裂の有無を調べた。１３５４［／ｃｍ］という非特許文献１の結果からＢＯ伸縮振動だと帰属される。そこで、このＢＯ伸縮振動の吸収強度比を前記ピーク強度解析手法に基づきプロットしたグラフが図２（Ｂ）である。図２（Ｂ）によると、ＰＢＳ溶液に一日保存することによるＢＯ伸縮振動のピーク強度は凡そ６８％減少した。従って、ＣＨ伸縮振動のピーク強度変化と比較すると、ＢＯ伸縮振動由来のピーク吸収強度比が時間と共に減少していると言える。
【００９７】
これらの２つの実験結果から、４ＭＰＢＡは、ベンゼン環そのものが金から解離していないものの、ボロン酸基のベンゼン環からの開裂が生じていると考えられる。本実験結果は非特許文献１の結果とよく合致するため、本実施例に基づく方法はボロン酸基の開裂の有無を観察可能とみなせる。
【００９８】
ベンゼン環に対するボロン酸基の置換位置とボロン酸基開裂の関係を明らかにするために、３ＭＰＢＡのボロン酸基開裂の有無を確認した。
【００９９】
図３に実施例１で吸着させた直後の初期状態と１日ＰＢＳ溶液に浸けた後の状態の計２種類についてＩＲスペクトラムを示した。
【０１００】
代表的なピークとして、２９２２［／ｃｍ］は４ＭＰＢＡの帰属結果からベンゼン環由来のＣＨ伸縮振動だと帰属される。このＣＨ伸縮振動の吸収強度を前記ピーク強度解析手法を実施したものが、図４（Ａ）である。図４（Ａ）によると、ＰＢＳ溶液に一日保存することによるＣＨ伸縮振動のピーク強度変化はたった８％だった。この結果からベンゼン環由来の吸収強度が初期とほとんど変化していないと言える。
【０１０１】
一方、１３４８［／ｃｍ］は４ＭＰＢＡの帰属結果よりＢＯ伸縮振動だと帰属される。このＢＯ伸縮振動の吸収強度を前記ピーク強度解析を実施してまとめた結果が図４（Ｂ）である。図４（Ｂ）によると、ＰＢＳ溶液に一日保存することによるＢＯ伸縮振動のピーク強度は凡そ７５％も下がった。従って、ＰＢＳ溶液に保存する時間に応じて、ＢＯ伸縮振動のピーク吸収強度の減少が本実施例で初めて認められた。
【０１０２】
この実験結果から、３ＭＰＢＡもまたＰＢＳ溶液に浸せば、ベンゼン環部位の金からの解離はほぼ認められないものの、ボロン酸基のベンゼン環からの開裂が生じると解釈できる。
【０１０３】
さらに前記４ＭＰＢＡの実験結果とあわせると、このボロン酸基開裂現象が、ボロン酸基のベンゼン環上での置換位置には大きく依存しないことも明らかになった。
【実施例３】
【０１０４】
＜ＥＤＣ／ＮＨＳ法によるリンカー結合実験＞
まず、本実施例では本発明に従うボロン酸化合物として前記の化合物、すなわち化６、化７、化１２を金基板上で作製した。
【０１０５】
化６、化７、化１２の金基板上での作製方法について以下に詳細を述べる。
【０１０６】
まず、化６、化７を作製するための合成ルート概略図を図５に示した。ただし化６と化７の合成方法はほぼ同じなので、図中は化６にのみ特化して記載してある。図５（Ａ）で示されるように３−カルボキシ−フェニルボロン酸（３ＣＰＢＡ）を購入し、準備した。
【０１０７】
１００ｍＭ  ＭＥＳと０．１％塩化ナトリウムを加えたｐＨ４．７の溶液中に２５℃において、１ｍＭ  ３ＣＰＢＡを溶かした。Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と２時間室温条件下で反応させた（経路（ｉ））。前記反応溶液のｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウム溶液によって７．０まで上昇させた。その後、実施例２で示されるように、化６が必要な場合６ＡＨＴ、化７が必要な場合１６ＡＨＴを吸着させた金基板に、この反応溶液を加えた（経路（ｉｉ））。４時間反応溶液に浸けた後に、前記金基板を前記反応溶液から取り出した。未反応成分を前記金基板表面から除去するために、表面を超純水でよく洗浄した。そして、前記金基板上に図５（Ｃ）で示される化合物を作製した。ここで便宜上、化６で示される化合物の名称をＣ６−ＡＰＢＡ、化７で示される化合物の名称をＣ１６−ＡＰＢＡと定義する。
【０１０８】
また化１２を作製するための合成ルート概略図を図９に示した。ただし、図９（Ａ）で示される５−カルボキシ−２−メトキシ−フェニルボロン酸（５ＣＭＰＢＡ）を新たに準備する以外は、前記図５と同じ合成方法を利用して、化１２を金基板上に作製した。化１２で示される化合物の名称をＣ６−ＡＭＰＢＡと定義する。
【０１０９】
化６、化７、化１２の化合物が金基板上で作製できていることをＦＴ−ＩＲ（高感度反射法）によって同定した。この同定に使用したグラフが、化６、化７、化１２の各々に対して図６、図１３、図１０の三種類である。
【実施例４】
【０１１０】
＜Ｃ６−ＡＰＢＡに対する構造安定性評価試験＞
本発明に従う化６で示されるＣ６−ＡＰＢＡのＰＢＳ溶液条件下での構造安定性評価試験を実施した。
【０１１１】
化６のＰＢＳ溶液保存する前と保存１日後の計二種類のＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図７に示す。ほぼ全ての種類のピーク強度がＰＢＳ溶液保存前後で大きく変化していないように観察される。そこで、Ｃ６−ＡＰＢＡが構造変化しているかを定量的に判断するために、ここでは２つのピークにのみ絞って、ピーク強度解析手法を実施した。
【０１１２】
一つ目のピークとして、アルキル鎖由来のＣＨ伸縮振動と帰属される２９２６［／ｃｍ］に着目する。これはアルキル基が金表面から脱離して遊離していないかどうかを調べるためである。このＣＨ伸縮振動の吸収強度変化を前記ピーク強度解析手法に基づいて作成したグラフが、図８（Ａ）である。図８（Ａ）よりサンプルの初期状態のＣＨ伸縮振動ピーク強度と一定保存時間後のピーク強度比の変化が最大で８％程度しか変わっていなかった。この解析結果から、ＣＨ伸縮振動の吸収強度がＰＢＳ溶液を浸ける前と一日保存後で、ほぼ変化していないと判断できる。
【０１１３】
一方、二つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動だと帰属される１３７２［／ｃｍ］に注目した。これはボロン酸基がベンゼン環から開裂するかを検証するためである。このＢＯ伸縮振動の吸収強度を前記ピーク強度解析手法に基づいて作成したグラフが図８（Ｂ）である。図８（Ｂ）によると、ボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸す前の状態と１日保存後の状態とを比較して、最大で１２％しか変わらなかった。この結果は実施例２で示される４ＭＰＢＡや３ＭＰＢＡの結果と比較して、ほぼ定値をとっていると判断できる。
【０１１４】
これらの解析結果から、Ｃ６−ＡＰＢＡは、ＰＢＳ溶液に一日保存していても構造変化しないと解釈される。
【０１１５】
本実施例により、ボロン酸基の開裂が抑制されることが示された。
【実施例５】
【０１１６】
＜Ｃ６−ＡＭＰＢＡに対する構造安定性評価試験＞
本実施例では、ベンゼン環上にボロン酸基以外の置換基が存在した場合でも、ボロン酸基の開裂が抑制されることを示す。
【０１１７】
ボロン酸基以外の置換基が存在した場合、例えばグルコースとの結合性が上昇するといった効果が認められる。従って、前記置換基をベンゼン環上に設置することは非常に有効である。
【０１１８】
そこで、本実施例では、置換基の代表例としてメトキシ基を新たに置換させた化１２で示されるＣ６−ＡＭＰＢＡのＰＢＳ溶液条件下での安定性評価試験を実施した。
【０１１９】
化１２のＰＢＳ溶液保存条件下でのＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図１１に示す。図１１を観察すると、ほぼ全ての種類のピーク強度が少なくとも大きく変化していないように判断できる。そこで、Ｃ６−ＡＭＰＢＡが構造変化しているかを定量的に検証するために、ここでは実施例４と同様に、２つのピークにのみ絞って、ピーク強度解析手法を実施した。
【０１２０】
一つ目のピークとして、フェニル基由来のＣＣ伸縮振動を意味する１４８８［／ｃｍ］に着目した。このＣＣ伸縮振動の吸収強度変化を示したグラフが、図１２（Ａ）である。図１２（Ａ）よりサンプル初期状態のＣＣ伸縮振動ピーク強度と一定保存時間後のピーク強度比の変化が最大で９％程度しか変わっていなかった。この解析結果からＣＣ伸縮振動の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸ける前と一日保存後ではほぼ変化していないと判断できる。
【０１２１】
一方、二つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動と帰属される１３５８［／ｃｍ］に注目した。このＢＯ伸縮振動の吸収強度変化を前記ピーク強度解析手法に基づいてまとめたグラフが図１２（Ｂ）である。この解析結果からボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液を浸ける前と一日保存した状態とでは最大で１０％程度しか変わらず、ほぼ定値をとっているとみなせる。
【０１２２】
これらの解析結果からＣ６−ＡＰＢＡと同様に、Ｃ６−ＡＭＰＢＡはＰＢＳ溶液に一日保存していても構造変化しないと解釈される。
【０１２３】
従って、ボロン酸化合物に置換基を置換させたとしても、ボロン酸基の開裂抑制の効果が得られることが本実施例により示された。
【実施例６】
【０１２４】
＜Ｃ１６−ＡＰＢＡに対する構造安定性評価試験＞
本実施例では、アルキル鎖の鎖長を変えた場合でも、ボロン酸基の開裂が抑制されることを示す。
【０１２５】
そこで、本実施例では、アルキル鎖の鎖長を変化させた場合の代表例として化７で示されるＣ１６−ＡＰＢＡのＰＢＳ溶液条件下での安定性評価試験を実施した。
【０１２６】
化７のＰＢＳ溶液保存条件下でのＦＴ−ＩＲスペクトラム結果を図１４に示す。図１４を観察すると、ほぼ全ての種類のピーク強度が少なくとも大きく変化していないように判断できる。そこで、Ｃ１６−ＡＰＢＡが構造変化しているかを定量的に検証するために、ここでは実施例４と同様に、２つのピークにのみ絞って、ピーク強度解析手法を実施した。
【０１２７】
一つ目のピークとして、アルキル基由来のＣＨ伸縮振動を意味する２９１９［／ｃｍ］に着目した。このＣＨ伸縮振動の吸収強度変化を示したグラフが、図１５（Ａ）である。図１５（Ａ）よりサンプル初期状態のＣＨ伸縮振動ピーク強度と一定保存時間後のピーク強度比の変化が最大で９％程度しか変わっていなかった。この解析結果からＣＨ伸縮振動の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸ける前と一日保存後でほぼ変化していないと判断できる。
【０１２８】
一方、二つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動と帰属される１３７０［／ｃｍ］に注目した。このＢＯ伸縮振動の吸収強度を解析したグラフが図１５（Ｂ）である。この解析結果からボロン酸基由来の吸収強度がＰＢＳ溶液を浸ける前と一日浸けた状態とでは最大で６％しか変わらず、ほぼ定値をとっているとみなせる。
【０１２９】
これらの解析結果からＣ６−ＡＰＢＡと同様に、Ｃ１６−ＡＰＢＡはＰＢＳ溶液に一日保存していても構造変化しないと解釈される。
【０１３０】
従って、アルキル鎖長を変化させたとしても、ボロン酸基の開裂抑制の効果が得られることが本実施例により示された。
【実施例７】
【０１３１】
＜ＢＭＰＨ法によるリンカー結合実験＞
本発明に従うボロン酸化合物として下記の化１３の化合物を金基盤上で作製した。
【０１３２】
【化１３】
2014234349.tif 000016
【０１３３】
化１３は化６と比べると、アルキル鎖上結合部分の種類が異なる。このため、実施例４、５で示された構造だけでは、結合できない種類のボロン酸化合物とも結合できるようになる。言い換えれば、金基板上で作製可能なボロン酸化合物の種類が、増えることを意味している。
【０１３４】
この点で、化６よりも化１３は優れているため、化１３のＰＢＳ溶液条件下での構造安定性を調べることに決めた。
【０１３５】
本実施例では化１３の金基板上での作製方法について述べる。
【０１３６】
合成ルート概略は図１６に示す通りである。
【０１３７】
まず、図１６中（Ａ）に示されるＮ−β−２−マレイミドプロピオン酸−ヒドラジド−トリフルオロ酢酸塩（ＢＭＰＨ）と、実施例２の方法でＯＤＴを吸着させた金基板を準備した。
【０１３８】
１０ｍＭになるようにＢＭＰＨをＮ，Ｎ−ジメチルホルアミド（ＤＭＦ）に溶かした。前記ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）をｐＨ７．２になるように１％塩酸で調整した。前記ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で１ｍＭになるように前記ＢＭＰＨ溶液を希釈した。従って希釈されたＢＭＰＨ溶液は、１０％のＤＭＦと９０％のＰＢＳを含有している。この希釈したＢＭＰＨ溶液中にＯＤＴを吸着させた金基板を浸けて、２５℃、２時間反応させた（経路（ｉ））。次に、５ＦＭＰＢＡをＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）に１ｍＭになるよう溶かした。金基板を希釈したＢＭＰＨ溶液から取り出し、表面の水滴を軽く飛ばした後、１ｍＭの５ＦＭＰＢＡ溶液に浸し、２５℃で二時間反応させた（経路（ｉｉ））。この反応済み金基板を１ｍＭの５ＦＭＰＢＡ溶液から取り出して、多量の超純水で金基板表面を洗浄した。さらに金基板表面についた水滴をＮ２でフローした。
【０１３９】
以上のような過程を経て、図１６（Ｃ）で示される化合物を金基板上に作製した。ここでは、便宜上、図１６（Ｃ）のような化合物の名称をＣ８−ＢＭＰＢＡとここでは定義する。
【０１４０】
Ｃ８−ＢＭＰＢＡが金基板上に作製できていることをＦＴ−ＩＲ（高感度ＲＡＳ法）によって同定した。この同定を示したグラフが図１７である。
【実施例８】
【０１４１】
＜Ｃ８−ＢＭＰＢＡに対する構造安定性評価試験＞
本実施例では、本発明に従うＣ８−ＢＭＰＢＡをＰＢＳ溶液に一日保存することによるボロン酸基開裂の有無を調べた。その結果を図１８に示す。
【０１４２】
図１８からほぼ全ての種類のピークが大きく変化していないように見受けられる。そこで、Ｃ８−ＢＭＰＢＡが構造変化しているかを定量的に把握するために、本実施例では２種類のピークに絞って、ピーク強度解析手法を実施した。
【０１４３】
一つ目のピークとして、フェニル基由来の代表的なＣＣ伸縮振動を意味する１４９０［／ｃｍ］に着目した。このＣＣ伸縮振動の吸収強度を前記ピーク強度解析手法に基づき作成したグラフが、図１９（Ａ）である。この解析結果からベンゼン環由来の吸収強度が初期と最大で１０％しか変わらなかった。この解析結果からＣＣ伸縮振動の吸収強度がＰＢＳ溶液に浸ける前と一日保存後でほぼ変化していないと判断できる。
【０１４４】
一方、二つ目のピークとして、ボロン酸基由来のＢＯ伸縮振動である１３５８［／ｃｍ］に注目した。これは、ボロン酸基の開裂の有無を直接的に調べるためである。このＢＯ伸縮振動の吸収強度を解析したものが図１９（Ｂ）である。この解析結果からボロン酸基の吸収強度が初期のものと最大で１０％しか変わらなかった。この結果は、４ＭＰＢＡや３ＭＰＢＡの実施例２の結果と比べると、定値をとっているとみなせる。
【０１４５】
これらの解析結果から３ＭＰＢＡとは異なり、Ｃ８−ＢＭＰＢＡもまたＰＢＳ溶液に一日保存したことによって構造変化が起こらないと解釈できる。
【０１４６】
以上のように、ボロン酸基のベンゼン環からの開裂が抑制されることが本実施例により示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は、例えば、ボロン酸化合物を安定に固定できることで糖・糖タンパク質を再現よく測定可能なセンサー作製に利用できる。
【０１４８】
本発明は、多くの用途が考えられるものの、例えば、金属上でのボロン酸化合物を用いた糖類・糖タンパク質の再現性ある検出に好適であり、さらにはバイオセンサにも応用可能な技術である。
【符号の説明】
【０１４９】
１００    センサ
１０１    ボロン酸化合物
１０２    金属部
１０３    基板
２００    検出装置
２０１    発光手段
２０２    検出手段
２０３    演算手段
【図１】
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【図２】
2014234349.tif 000021
【図３】
2014234349.tif 000022
【図４】
2014234349.tif 000023
【図６】
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【図７】
2014234349.tif 000025
【図８】
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【図１０】
2014234349.tif 000027
【図１１】
2014234349.tif 000028
【図１２】
2014234349.tif 000029
【図１３】
2014234349.tif 000030
【図１４】
2014234349.tif 000031
【図１５】
2014234349.tif 000032
【図１７】
2014234349.tif 000033
【図１８】
2014234349.tif 000034
【図１９】
2014234349.tif 000035
【図２０】
2014234349.tif 000036
【図２１】
2014234349.tif 000037
【図５】
2014234349.tif 000038
【図９】
2014234349.tif 000039
【図１６】
2014234349.tif 000040