(57)【要約】      （修正有）【課題】複数のヌクレアーゼサブユニットを単一のベクターによって細胞集団に導入し、変異導入を導入する方法、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複を行う方法を提供する。【解決手段】第１のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、プロモーター配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む第１の作製用ベクター、ならびに第２のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、第１の制限酵素切断部位、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む第２の作製用ベクターを含むベクターセット。上記ベクターセットを用いてヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターを作製する方法、および作製されるヌクレアーゼ発現用ベクター。上記ヌクレアーゼ発現用ベクターを用いてゲノムＤＮＡに変異導入する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターを作製するための、第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターを含むベクターセットであって、
第１の作製用ベクターが、第１のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、プロモーター配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含み、
第２の作製用ベクターが、第２のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、第１の制限酵素切断部位、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含み、
第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、
第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む、
ベクターセット。
【請求項２】
第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターであって、
第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、レポーター遺伝子、第１のリンカー配列、および第２のリンカー配列を含み、
第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、位置Ａ、位置Ｂ、位置Ｃ、位置Ｄ、および位置Ｅが存在するとして、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、およびレポーター遺伝子が、それぞれ、Ａ、Ｃ、およびＥのいずれかに位置し、第１のリンカー配列および第２のリンカー配列が、それぞれ、Ｂ、およびＤのいずれかに位置する、
ヌクレアーゼ発現用ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のヌクレアーゼ発現用ベクターの作製方法であって、
第１のＤＮＡ結合ドメインを導入した請求項１に記載の第１の作製用ベクターに、第１の制限酵素および第２の制限酵素を反応させて、第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第２の制限酵素による切断末端、プロモーター配列、開始コドン、第１のヌクレアーゼサブユニット、および第１の制限酵素による切断末端を含む第１の断片を得る工程、
第２のＤＮＡ結合ドメインを導入した請求項１に記載の第２の作製用ベクターに、第１の制限酵素および第２の制限酵素を反応させて、第２のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第１の制限酵素による切断末端、第２のヌクレアーゼサブユニット、終止コドン、および第２の制限酵素による切断末端を含む第２の断片を得る工程、
ここで、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、かつ、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む、ならびに
得られた第１の断片と得られた第２の断片とを接続する工程、
を含む、方法。
【請求項４】
第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの変異導入を受けた細胞を取得するための方法であって、
請求項２に記載のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程、および
取得された細胞集団に含まれる細胞におけるレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として、当該細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼによる、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複からなる群から選ばれる変異導入を受けた細胞を取得するための方法であって、
請求項２に記載のヌクレアーゼ発現用ベクターである第１のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触し、かつ請求項２に記載のヌクレアーゼ発現用ベクターである第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程、
ここで、第１のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子が、第１のレポーター遺伝子であり、第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子が、第２のレポーター遺伝子である、および
取得された細胞集団に含まれる細胞における第１のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超え、かつ第２のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として、当該細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼを発現させるためのベクター、およびベクターセット、ならびに変異導入を受けた細胞を取得するための方法に関する。より具体的には、本発明は、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターに関する。また、本発明は、ヌクレアーゼ発現用ベクターを作製するための作製ベクターである第１の作製ベクターおよび第２の作製ベクターを含むベクターセットに関する。さらに、本発明は、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの変異導入を受けた細胞を取得するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインからなるヌクレアーゼサブユニットを複数含む人工ヌクレアーゼが存在する。たとえば、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）やＺＦＮ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）が知られている（特許文献１〜４）。これらのヌクレアーゼにおいては、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において複数のＤＮＡ切断ドメインが近接して多量体を形成することによって、ＤＮＡの二本鎖切断が起こる。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含む。それぞれのＤＮＡ結合モジュールは、ＤＮＡ鎖中の特定の塩基対を認識する。そこで、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、目的とする配列の特異的な切断を行うことができる。配列特異的な切断の修復の際に生じるエラーや組換えを利用すれば、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の欠失、挿入、変異導入が可能であり、これらのヌクレアーゼは、ゲノム編集などの様々な遺伝子改変に応用することができる（非特許文献１参照）。
【０００３】
このような人工ヌクレアーゼを用いてＤＮＡ二本鎖切断を導入するためには、複数のヌクレアーゼサブユニットをペアーで発現させる必要がある。これまでは、これらを独立した別々のベクター上に載せて導入する手法が用いられてきた（たとえば、非特許文献２参照）。それは、複数のヌクレアーゼサブユニットを同一のベクターに載せるのが技術的に困難であることに起因する。これらの人工ヌクレアーゼを構築する際には、ＤＮＡ結合リピートの挿入にＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法（非特許文献３および４参照）を利用する手法が一般的であるが、この手法を同一ベクター上で２箇所に同時に適用することは難しい。またリピートの挿入が目的通りに行われたかどうかの判定が困難である。更に、繰り返し配列を多く有する人工ヌクレアーゼの特性上、ＰＣＲ法を用いるとエラーが頻発するため、ＰＣＲ増幅を介する構築法を使用することができない。これらの問題点に加え、単一のベクター上に複数のヌクレアーゼサブユニットを載せるとベクターサイズが巨大となるため、遺伝子導入の効率を下げる要因にもなり得る。
【０００４】
しかしながら、２種類のベクターを導入するのが困難な生物や細胞では、複数のヌクレアーゼサブユニットを単一のベクターで発現させることが重要である。また、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複などの変異導入を目的とする場合にも、単一のベクターで複数のヌクレアーゼサブユニットを発現させることが重要となる。
【０００５】
また、ヌクレアーゼサブユニットを導入するベクターを細胞集団に接触させる操作を行っても、変異導入細胞は低い確率でしか得られなかった。そのため、従来、目的とする変異導入細胞を取得するには、煩雑な選択工程を経なければならなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７２２４６号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１５４３９３号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１５９３６９号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０９３８３３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ２２；１４６（２）：３１８−３１．
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ７；１２（２）：２３８−５１．
【非特許文献３】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００８；３（１１）：ｅ３６４７．
【非特許文献４】Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２０１３  Ａｐｒ；１８（４）：３１５−２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、複数のヌクレアーゼサブユニットを単一のベクターを用いて簡便な操作によって細胞集団に導入して、煩雑な選択を行うことなく、変異導入された細胞を高頻度で取得することを目的とする。また、本発明は、簡便な手法によって、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複などの変異導入を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、プロモーター配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む第１の作製用ベクター、および第１の制限酵素切断部位、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む第２の作製用ベクターを含むベクターセットであって、第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、かつ第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含むベクターセットを用いれば、複数のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼ発現用ベクターを簡便かつ効率的に作製することができること、および作製されたヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団に含まれる細胞におけるレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として当該細胞を選択することによって、煩雑な選択を行うことなく、変異導入を受けた細胞を高頻度で取得することができ、ヌクレアーゼ発現用ベクターを複数用いることによって、簡便にゲノム上の領域の欠失などの変異導入を行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、第１の態様において、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるための、第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターを含むベクターセットであって、
第１の作製用ベクターが、第１のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、プロモーター配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含み、
第２の作製用ベクターが、第２のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、第１の制限酵素切断部位、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含み、
第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、
第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む、
ベクターセットを提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、第２の態様において、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターであって、
第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、レポーター遺伝子、第１のリンカー配列、および第２のリンカー配列を含み、
第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、位置Ａ、位置Ｂ、位置Ｃ、位置Ｄ、および位置Ｅが存在するとして、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、およびレポーター遺伝子が、それぞれ、Ａ、Ｃ、およびＥのいずれかに位置し、第１のリンカー配列および第２のリンカー配列が、それぞれ、Ｂ、およびＤのいずれかに位置する、
ヌクレアーゼ発現用ベクターを提供するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、第３の態様において、上記の第２の態様におけるヌクレアーゼ発現用ベクターの作製方法であって、
第１のＤＮＡ結合ドメインを導入した上記の第１の態様における第１の作製用ベクターに、第１の制限酵素および第２の制限酵素を反応させて、第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第２の制限酵素による切断末端、プロモーター配列、開始コドン、第１のヌクレアーゼサブユニット、および第１の制限酵素による切断末端を含む第１の断片を得る工程、
第２のＤＮＡ結合ドメインを導入した上記の第２の態様における第２の作製用ベクターに、第１の制限酵素および第２の制限酵素を反応させて、第２のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第１の制限酵素による切断末端、第２のヌクレアーゼサブユニット、終止コドン、および第２の制限酵素による切断末端を含む第２の断片を得る工程、
ここで、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、かつ、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む、ならびに
得られた第１の断片と得られた第２の断片とを接続する工程、
を含む、方法を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、第４の態様において、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの変異導入を受けた細胞を取得するための方法であって、
上記の第２の態様におけるヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程、および
取得された細胞集団に含まれる細胞におけるレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として、当該細胞を選択する工程、
を含む、方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、第５の態様において、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインとを含む第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のＤＮＡ結合ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼによる、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複からなる群から選ばれる変異導入を受けた細胞を取得するための方法であって、
上記の第２の態様におけるヌクレアーゼ発現用ベクターである第１のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触し、かつ上記の第２の態様におけるヌクレアーゼ発現用ベクターである第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程、
ここで、第１のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子が、第１のレポーター遺伝子であり、第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子が、第２のレポーター遺伝子である、および
取得された細胞集団に含まれる細胞における第１のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超え、かつ第２のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として、当該細胞を選択する工程、
を含む、方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のベクターセットを用いる方法は、まず別々のプラスミド上で複数のヌクレアーゼサブユニットを構築するため、従来のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法を用いたリピートの挿入が可能であり、簡便な操作による実施が可能である。また、本発明の方法においては、リピートの挿入が正しく行われたかをコロニーＰＣＲで容易にチェックでき、簡易かつ迅速な実施が可能である。さらに、本発明において用いられる第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターにおいては、それぞれのベクター上のヌクレアーゼサブユニットの発現ベクターの構造を保った構造に設計することができるため、複数のヌクレアーゼサブユニットを含むベクターを作製する前に、各ヌクレアーゼサブユニットの活性のチェックを行うことができ、望ましくない結果が生じたことを早期に確認することができるため、無駄な操作が少ない。また、本発明の方法によれば、単一のレポーター遺伝子の発現する細胞を選択することによって、変異導入した細胞を高頻度で取得することができ、指標とするレポーター遺伝子の数が単一でもよいので、簡易な設備によって高頻度で目的とする細胞を取得することができる。本発明の方法においては、レポーター遺伝子の発現量を指標とした選択による変異導入細胞の濃縮が行われるので、用いるヌクレアーゼ発現用ベクターのサイズが大きくベクターの導入効率が低い場合であっても、高頻度に目的とする細胞を取得することができる。さらに、本発明の方法によれば、導入に用いるヌクレアーゼ発現用ベクターは単一でよいので、２種類のヌクレアーゼ発現用ベクターを導入するのが困難な生物や細胞についても、変異導入した細胞を簡便な操作によって高頻度で取得することができる。また、本発明の方法によれば、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複などの変異導入を目的とする場合においても、選択の指標とするレポーター遺伝子の数が少なくてよいので、簡易な装置によってこれらの目的とする細胞を高頻度で取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明のベクターセットを用いて本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを作製する手順の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明のベクターを用いて変異導入細胞を取得する手順の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、実施例において得られた変異導入細胞における欠失変異、およびその欠失変異を確認するプライマーを示す模式図である。
【図４】図４は、実施例において行われたセルソーティングの結果を示す図である。
【図５】図５は、図４のセルソーティングによって分画された細胞集団における欠失変異細胞の検出を行う実験の結果を示す写真である。
【図６】図６は、図４のセルソーティングによる分画前の細胞集団における欠失変異細胞の割合を調べた実験の結果を示す写真である。
【図７】図７は、図４のセルソーティングによって分画されたｈｉｇｈの細胞集団における欠失変異細胞の割合を調べた実験の結果を示す写真である。
【図８】図８は、本発明の方法を用いることによって導入することができる変異の種類の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のベクターセットは、第１のヌクレアーゼサブユニット、および第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターを作製するためのものである。
【００１８】
第１のヌクレアーゼサブユニットは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第１のＤＮＡ切断ドメインを含む。第２のヌクレアーゼサブユニットは、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインを含む。
【００１９】
ＤＮＡ結合ドメインの由来としては、植物病原菌ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、塩基対を特異的に認識する１または複数のＤＮＡ結合モジュールを含む。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの数は、たとえば、１２〜２０である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、たとえば、ＴＡＬエフェクターリピート（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｐｅａｔ）などが挙げられる。
【００２０】
より好ましくは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインが結合したＤＮＡ部位において、第１のＤＮＡ切断ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインは、接近して多量体を形成し、向上したヌクレアーゼ活性を取得する。このようなＤＮＡ切断ドメインとしては、ＦｏｋＩに由来するものなどが挙げられる。
【００２１】
第１のＤＮＡ結合ドメイン第２のＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、由来、特性などが同一である。また、第１のＤＮＡ切断ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインは、好ましくは、由来、特性などが同一である。
【００２２】
本発明において、第１の作製用ベクターは、第１のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、プロモーター配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む。また、本発明において、第２の作製用ベクターは、第２のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、第１の制限酵素切断部位、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含む。第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターにおいては、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および開始コドンの位置がこのような関係にあるため、連結後に終止コドンおよび開始コドンを除くことができ、継ぎ目のない連結が可能となる。
【００２３】
さらに、本発明において、第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかは、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含む。また、本発明において、第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターのいずれかは、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む。転写産物の翻訳の際に分断されるリンカー配列としては、２Ａ配列などが挙げられる。
【００２４】
レポーター遺伝子は、好ましくは、検出可能な発現の標識を細胞において提示するタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現量の測定を生存状態のままの細胞を用いて簡便に行うことができ、多数の細胞における発現量の測定に適している点で、好ましくは、光シグナルによる発現の測定が可能なタンパク質をコードする遺伝子である。光シグナルによる発現の測定が可能なタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはＤｓＲｅｄ）、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質；ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質；アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの化学発光基質を変換する酵素などが挙げられる。
【００２５】
したがって、本発明のベクターセットの一例において、第１の作製用ベクターは、第１のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、プロモーター配列、レポーター遺伝子、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列、第１のＤＮＡ切断ドメイン、第１の制限酵素切断部位、終止コドン、および第２の制限酵素切断部位を含むベクターであり、かつ、第２の作製用ベクターは、第２のＤＮＡ切断ドメインの転写方向の順に、第１の制限酵素切断部位、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列、第２のＤＮＡ切断ドメイン、終始コドン、および第２の制限酵素切断部位を含むベクターであってよい。図１には、このようなベクターセットの一例が記載されている。
【００２６】
本発明において、第１の制限酵素切断部位は、２Ａ配列などの転写産物の翻訳の際に分断されるリンカー配列による翻訳産物の分断を効率化できる点で、ＧＳリンカーなどのリンカーとして機能する配列が好ましい。そのような第１の制限酵素切断部位としては、たとえば、ＢａｍＨＩ切断部位などが挙げられる。第１の制限酵素としてＢａｍＨＩを用いる場合には、痕跡配列はＧＧＡＴＣＣとなり、これがＧＳリンカーとして機能する。
【００２７】
本発明の第１の作製用ベクターおよび第２の作製用ベクターを含むベクターセットを用いれば、第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のヌクレアーゼサブユニットを含むヌクレアーゼを細胞内に発現させるためのヌクレアーゼ発現用ベクターを作製することができる。
【００２８】
本発明のベクターセットによって作製できるヌクレアーゼ発現用ベクターは、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、レポーター遺伝子、第１のリンカー配列、および第２のリンカー配列を含み、第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、位置Ａ、位置Ｂ、位置Ｃ、位置Ｄ、および位置Ｅが存在するとして、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、およびレポーター遺伝子が、それぞれ、Ａ、Ｃ、およびＥのいずれかに位置し、第１のリンカー配列および第２のリンカー配列が、それぞれ、Ｂ、およびＤのいずれかに位置するものである。このベクターのプロモーターからの転写によって、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、レポーター遺伝子、第１のリンカー配列、および第２のリンカー配列を含む融合転写産物が得られる。得られた融合転写産物の翻訳の際に、リンカー配列の作用によって、第１のヌクレアーゼサブユニット、第２のヌクレアーゼサブユニット、およびレポーター遺伝子のタンパク質が、それぞれ、別異の翻訳産物として細胞内において発現する。
【００２９】
本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを作製するための方法において、第１のＤＮＡ結合ドメインを導入した第１の作製用ベクター、および第２のＤＮＡ結合ドメインを導入した第２の作製用ベクターが用いられる。これらのＤＮＡ結合ドメインの導入は、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法などの公知の方法によって行うことができる。
【００３０】
本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを作製するための方法においては、これらの作製用ベクターに第１の制限酵素および第２の制限酵素を反応させることによって、第１の断片および第２の断片を得る。第１の断片は、第１のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第２の制限酵素による切断末端、プロモーター配列、開始コドン、第１のヌクレアーゼサブユニット、および第１の制限酵素による切断末端を含む。また、第２の断片は、第２のヌクレアーゼサブユニットの転写方向の順に、第１の制限酵素による切断末端、第２のヌクレアーゼサブユニット、終止コドン、および第２の制限酵素による切断末端を含む。また、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第１のリンカー配列に接続したレポーター遺伝子を含み、かつ、第１の断片および第２の断片のいずれかが、転写産物の翻訳の際に分断される第２のリンカー配列を含む。このような第１の断片と第２の断片とを接続することによって、本発明のベクターを作製することができる。
【００３１】
第１の断片と第２の断片との連結後のチェックは、第１のＤＮＡ切断ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインが共通の制限酵素切断部位を有する場合には、当該制限酵素による処理を行い、切断断片の長さを確認することによって、容易に行うことができる。たとえば、第１のヌクレアーゼサブユニットおよび第２のヌクレアーゼサブユニットがいずれもＴＡＬＥＮである場合には、たとえば、ＸｂａＩ処理によって容易に連結後のチェックを行うことができる。ＸｂａＩ処理によって現れる切断断片のサイズは、第１のヌクレアーゼサブユニットにおけるＤＮＡ結合モジュールのリピート数に応じた長さとなる。
【００３２】
以上の作製用ベクター、ベクターセット、およびヌクレアーゼ発現用ベクターにおいて、ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。また、ベクターの成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡなどの核酸アナログなどが挙げられる。ベクターは、糖類などの核酸以外の成分によって修飾されていてもよい。ベクターとして、ゲノムＤＮＡに取り込まれずに細胞内で分解されるＲＮＡを用いてもよい。この場合、二本鎖切断の後に、ベクターの分解が生じ、細胞内に安定的にベクターが残存せず、安全性が高い。
【００３３】
本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを用いれば、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの変異導入を受けた細胞を取得することができる。このような細胞の取得方法は、本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程、および取得された細胞集団に含まれる細胞におけるレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として当該細胞を選択する工程を含む。このような選択工程を行うことによって、ヌクレアーゼ発現用ベクターから発現した第１のヌクレアーゼサブユニット、および第２のヌクレアーゼサブユニットによるゲノムＤＮＡ上の塩基配列特異的な二本鎖切断を受けた細胞を高頻度で取得することができる。選択の指標としての発現量の所定の値は、取得する細胞の数と目的とする細胞の取得頻度の可能性を考慮して、発現量を測定する実験系に応じて適宜設定すればよい。取得する細胞の由来としては、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの哺乳類などの動物、シロイヌナズナなどの植物、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの培養細胞などが挙げられる。上記の本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団は、本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターの接触と同時に、または接触の後に、電気的刺激、化学的刺激、物理的刺激などの刺激を受けたものであってもよい。このような細胞は、他人が接触を行ったものを譲り受けることによって取得してもよい。レポーター遺伝子が、光シグナルによって発現を測定することができるタンパク質をコードするものである場合には、レポーター遺伝子の発現量の測定は、たとえば、細胞集団における細胞を１個以下含む液滴などの分画に離隔して、離隔された分画における光シグナルを測定することによって行ってもよい。レポーター遺伝子の発現量を指標とする細胞の選択は、フローサイトメトリーによって行ってもよい。この場合、大量の細胞について正確かつ自動的な計測が可能であり、簡便かつ正確に目的とする細胞を取得することができる。
【００３４】
本発明の細胞の取得のための方法は、相同組換えを利用したゲノム編集にも応用可能である。ヌクレアーゼによる二本鎖切断を受けた細胞においては、相同組換え、または非相同末端連結による修復が生じるが、細胞内に適切なＤＮＡ断片が存在する場合には、組換えによって、ゲノム上の遺伝子において欠失、挿入、破壊などの改変を行うことができる。したがって、たとえば、本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターの２種類以上に接触した細胞集団を用いて、同様の方法を行えば、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複からなる群から選ばれる変異導入を受けた細胞を高頻度で取得することができる。すなわち、本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを１種類用いることによって、ゲノム上の塩基配列特異的な二本鎖切断を１箇所受けた細胞を取得することができる。本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを２種類用いれば、２箇所以上の二本鎖切断を受けた細胞を取得することができる。２箇所以上の二本鎖切断を行った場合、ゲノム上の領域の欠失、多重遺伝子破壊、染色体の転座、染色体の逆位、および染色体の重複などの変異を導入することができる。
【００３５】
２種以上の本発明のヌクレアーゼ発現用ベクターを用いる場合において、説明の便宜のために、用いるベクターに含まれるヌクレアーゼ発現用ベクターを、第１のヌクレアーゼ発現用ベクター、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターと称する。第１のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子を、第１のレポーター遺伝子と称する。また、第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに含まれるレポーター遺伝子を、第２のレポーター遺伝子と称する。
【００３６】
第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子は異なることが望ましい。これにより、第１のヌクレアーゼ発現用ベクターによって発現されるヌクレアーゼ、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターによって発現されるヌクレアーゼを区別することができ、両者を導入した細胞を取得する効率を向上させることができる。たとえば、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子の組合せとしては、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの組合せが挙げられる。
【００３７】
このような変異導入を受けた細胞を取得する方法は、第１のヌクレアーゼ発現用ベクター、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターに接触した細胞集団を取得する工程を含む。第１のヌクレアーゼ発現用ベクターとの接触、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターとの接触は、同時に行ってもよいし、別異の工程において行ってもよい。第１のヌクレアーゼ発現用ベクターとの接触、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターとの接触は、たとえば、細胞集団を含む容器に、第１のヌクレアーゼ発現用ベクターを含む液体、および第２のヌクレアーゼ発現用ベクターを含む液体を、同時にまたは別異に、添加することによって行うことができる。
【００３８】
目的とする細胞の取得は、取得された細胞集団に含まれる細胞における第１のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超え、かつ、第２のレポーター遺伝子の発現量が所定の値を超えることを指標として、当該細胞を選択することによって行うことができる。
【００３９】
このような細胞の取得のための方法において、第１のレポーター遺伝子の発現量、および第２のレポーター遺伝子の発現量は、同一の方法によって測定してもよいし、異なる方法によって測定してもよい。光シグナルの測定によってレポーター遺伝子の発現量の測定を行う場合において、第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子の発現量の指標となる光シグナルの波長が異なる場合には、同一の測定操作において、両者の発現量を同時に測定することができ、より簡便である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１  ベクターセットの作製：
Ａｄｄｇｅｎｅから入手したｐｃＤＮＡ−ＴＡＬ−ＮＣ２ベクターと、ＥＧＦＰ遺伝子と、２Ａ配列とを用いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック）の手法によって、配列番号１に示す配列のベクター（第１の作製用ベクター）を作製した。また、同様の方法によって、配列番号２に示す配列のベクター（第２の作製用ベクター）を作製した。
【００４２】
実施例２  ＤＮＡ結合ドメインの挿入：
実施例１において作製した第１の作製用ベクターに、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＫｉｔおよびＹａｍａｍｏｔｏ  Ｌａｂ  ＴＡＬＥＮ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐａｃｋ（共にＡｄｄｇｅｎｅ）を用いて、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法によって、ＤＮＡ結合ドメインを挿入して、配列番号３に示す配列のベクターを作製した。同様の手法によって、第２の作製用ベクターにＤＮＡ結合ドメインを挿入して、配列番号４に示す配列のベクターを作製した。作製したそれぞれのベクターを、リポフェクション法によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して、ヌクレアーゼサブユニットの発現を行い、シングル・ストランド・アニーリングアッセイによって、挿入されたヌクレアーゼサブユニットが活性を有することを確認した。
【００４３】
実施例３  ヌクレアーゼ発現用ベクターの作製：
実施例２によって作製されたベクターを、公知の手法によって、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩによって消化して、得られた５２４４ｂｐの断片と、６９３５ｂｐの断片をＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン）によってライゲーションして、大腸菌への形質転換によって両者が結合して得られたベクターを単離した。得られたベクターをＸｂａＩによって消化して、２９５５ｂｐの断片が得られたことから、所望のベクターが得られたことが確認された。かくして、配列番号５に示す配列のヌクレアーゼ発現用ベクターを得た。実施例１〜３におけるベクターの作製の手順を図１に図示する。
【００４４】
実施例４  ヌクレアーゼ発現用ベクターの作製：
実施例１〜３と同様の方法によって、配列番号６に示す配列のヌクレアーゼ発現用ベクターを作製した。
【００４５】
実施例５  変異導入細胞の取得：
（１）セルソーティング：
実施例３および実施例４で得られたヌクレアーゼ発現用ベクターを用いて、図３に示すＡＴＭ遺伝子座の欠失細胞を取得した。取得方法の概略を図２に図示する。具体的な工程を以下に示す。
実施例３および実施例４で得られたヌクレアーゼ発現用ベクターを、リポフェクション法によって、ＨＣＴ１１６の細胞集団に接触させた。接触後の細胞集団における個々の細胞におけるＥＧＦＰの発現量およびｍＣｈｅｒｒｙの発現量を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン）を用いてセルソーティングの手法によって調べた。
結果を図４に示す。図４においてｈｉｇｈは、ＥＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両者の発現量が高い細胞を示し、ｎｅｇは、両者の発現量が低い細胞を示す。
（２）細胞集団内における変異導入の確認：
セルソーティング後の細胞集団のうち、図４中のｈｉｇｈ、Ｌｏｗ、ｎｅｇの細胞集団および蛍光による選別を行わない細胞集団を取得し、それぞれの細胞集団から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＡＴＭ遺伝子座のプライマー（配列番号７〜８）を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）によって、ＰＣＲ増幅を行った。用いたプライマーは、欠失が生じた細胞をテンプレートとする場合、図３に示すように約９００ｂｐのＰＣＲ増幅断片が得られるよう設計されている。
結果を図５に示す。図５において、ＮＣは、ＴＡＬＥＮを導入せず、蛍光による選別も行わない細胞集団についての結果を示す。また、図５において、Ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄは、ＴＡＬＥＮを導入し、蛍光による選別を行わない細胞集団についての結果を示す。ＥＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙにおける−／−は、図４のｎｅｇに、＋／＋は、図４のｈｉｇｈに対応する。図５に示すように、ＥＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙの＋／＋の場合には、約９００ｂｐの増幅断片が強く観察され、図４におけるｈｉｇｈの細胞集団を取得することによって、目的とする欠失変異導入細胞が高頻度で取得できることが分かる。
（３）変異導入頻度の計算：
実施例５（２）において増幅されたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジーズ）にクローニングし、ＨｙｂｒｉＰｏｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（バイオライン）によって、配列番号９および１０のプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、細胞集団内における目的とする変異導入細胞の頻度を計算した。
結果を図６および図７に示す。図６は、実施例５（１）におけるセルソーティング前の細胞集団についての結果である。図７は、セルソーティングによって取得された図４のｈｉｇｈの細胞集団についての結果である。図６においては、約９００ｂｐの増幅断片が得られたコロニーは、３５コロニー中４つにとどまり、頻度は、１１．４％であった。これに対して、図７では、１７コロニーのうち１３コロニーにおいて目的とする増幅断片が得られ、頻度は、７６．４％であった。このことから、高頻度で目的とする欠失変異体が得られたことが分かる。なお、目的とする増幅断片が得られなかった４コロニーにおいても、図８に示すような欠失変異以外の変異が導入されている可能性があり、変異導入細胞の取得効率は、７６．４％を上回ると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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