(57)【要約】【課題】真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質及びその製造方法を提供する。【解決手段】真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質及び微細藻類にストレスを付与しながら培養する培養工程と、前記培養工程によって微細藻類が生産した水溶性カロテノイド結合タンパク質を微細藻類から抽出する抽出工程と、前記抽出工程で得た抽出液を精製する精製工程と、を有する、真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法により解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項２】
前記水溶性カロテノイド結合タンパク質が、一重項酸素消去活性を有する、
請求項１に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項３】
前記水溶性カロテノイド結合タンパク質が、耐熱性を有する、
請求項１又は２に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項４】
前記微細藻類が緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｓｅ）に属する球形の藻類（ｃｏｃｃｏｉｄ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項５】
前記水溶性カロテノイド結合タンパク質のタンパク質部分のアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項６】
前記カロテノイドがアスタキサンチンと、アドニキサンチン、ルテイン、カンタキサンチンからなる群から選ばれる少なくとも１種以上のカロテノイドとを含有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項７】
前記水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３３ｋＤａ及びゲルろ過によって４２〜４３ｋＤａである、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が糖タンパク質である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質。
【請求項９】
微細藻類にストレスを付与しながら培養する培養工程と、
前記培養工程によって微細藻類が生産した水溶性カロテノイド結合タンパク質を微細藻類から抽出する抽出工程と、
前記抽出工程で得た抽出液を精製する精製工程と、
を有する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
前記微細藻類が、緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｓｅ）に属する球形の藻類（ｃｏｃｃｏｉｄ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株である、
請求項９に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
前記培養工程が、光照射強度が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ以上の強光を照射し、かつ、微細藻類を寒天培地上で培養することによって寒天培地中の水分が徐々に低下することを利用する乾燥ストレス付与培養又は培地に塩化ナトリウムを添加して培養する塩ストレス付与培養である、
請求項９又は１０に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
前記塩化ナトリウムの添加濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌである、
請求項１１に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
前記培養工程において、光の照射と非照射とを周期的に行い、その光照射強度が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ以上であって、明暗周期が光照射１２〜１６時間後、光非照射１２〜８時間である、
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産能を有する微細藻類であって、
緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｓｅ）に属する球形の藻類（ｃｏｃｃｏｉｄ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、カロテン類やキサントフィル類の色素化合物の総称であり、キサントフィル類の一種であるアスタキサンチンは、微細藻類、酵母、細菌等の微生物類、サケやイクラ、タイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類、フラミンゴ、ニワトリ等の鳥類等、自然界に広く存在している。カロテノイドは、生物に鮮やかな色彩を与えることが特徴であり、脂溶性の着色剤として広く食品、健康食品、医薬品等に利用されている。
【０００３】
また、カロテノイドは高い抗酸化作用をもつことが知られている。中でもアスタキサンチンは、抗酸化作用の中でも特に一重項酸素消去活性が他の抗酸化物質と比べて高く、健康食品、化粧品や皮膚外用剤、医薬品等への利用が注目されている（特許文献１）。
【０００４】
従来、アスタキサンチンは、オキアミを酵素処理し、残渣を乾燥粉砕した後、アセトンで抽出した抽出液を精製することで生産される。また、近年では、アスタキサンチンを安定して多量に生産することのできる微生物、例えば、微細藻類（特許文献２及び３）、酵母（特許文献４）や細菌（特許文献５）を用いた製造方法が開発されている。
【０００５】
しかし、アスタキサンチン等のカロテノイドは脂溶性であり、水に対しては難溶又は不溶である。そのため、健康食品、化粧品や皮膚外用剤、医薬品等に利用する場合には、その用途や使用方法が限定される。
【０００６】
ところで、カニやエビ等の表皮には、アスタキサンチンとタンパク質であるクラスタシアニン（ｃｒｕｓｔａｃｙａｎｉｎ）とが結合したアスタキサンチン結合タンパク質が存在することが知られている。また、ロブスターの卵巣にはリポプロテインであるオボベルディン（ｏｖｏｖｅｒｄｉｎ）やオボルビン（ｏｖｏｒｕｂｉｎ）が、サケの筋肉にはアクトミオシン（ａｃｔｏｍｙｏｃｉｎ）が、アスタキサンチン結合タンパク質として存在することが知られている。さらに、クラスタシアニンなど一部のタンパク質は水溶性を示すことも知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらのアスタキサンチン結合タンパク質は、細胞骨格や筋肉などに強固に結合しており、カニやエビ等の甲殻やサケの筋肉からアスタキサンチン結合タンパク質を抽出・精製するには、数多くの精製工程を経る必要があり、多大な労力とコストを費やすため、アスタキサンチン結合タンパク質を多量に安価で生産することは困難である。
【０００７】
一方、微生物によって水に可溶なカロテノイド関連化合物を生産する技術が開発されている。例えば、カロテノイド生合成遺伝子を導入した形質転換微生物を用いたアスタキサンチンジグルコシド等のカロテノイド配糖体の製造方法（特許文献６）や、海洋から分離した新種のパラコッカス属に属する細菌によるアスタキサンチンジグルコシド及びアドニキサンチンジグルコシドの製造方法（特許文献７）がある。また、原核藻類のらん藻では、ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｈｉｎｅｎｏｎというカロテノイドがタンパク質に結合した水溶性オレンジカロテノイドタンパク質（ＯＣＰ）が知られているが、アスタキサンチンを結合する報告例はない。また、らん藻や真核生物である微細藻類、高等植物を含む植物界において、アスタキサンチンを結合する水溶性カロテノイド結合タンパク質については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２８５３６４号公報
【特許文献２】再表２００５−１１６２３８号公報
【特許文献３】特開平８−１０３２８８号公報
【特許文献４】特開２０１２−１００５３５号公報
【特許文献５】特開２０１２−１３９１６６号公報
【特許文献６】特開平１０−３２７８６５号公報
【特許文献７】特開２００７−３３０１０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｇ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，“Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，「Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｇ．，Ｌｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｓ  ａｎｄ  Ｐｆａｎｄｅｒ，Ｈ．）」，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００８，ｐｐ．９９−１１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、簡便で効率的に培養することのできる真核生物である微細藻類に着目し、微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、自然界から単離した真核生物である微細藻類がアスタキサンチンを主要なカロテノイドとして結合する新規な水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、微細藻類にストレスを付与しながら培養する培養工程と、前記培養工程によって微細藻類が生産した水溶性カロテノイド結合タンパク質を微細藻類から抽出する抽出工程と、前記抽出工程で得た抽出液を精製する精製工程と、を有する、真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、高い抗酸化活性を有するアスタキサンチンを主要なカロテノイドとして結合し、水に可溶であり、細胞中に浮遊した状態で存在するために抽出及び精製が容易であり、食品、着色剤、化粧品や皮膚外用剤、医薬品等に幅広く利用することが可能となる。
【００１５】
また、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法によれば、真核生物である微細藻類を用いて簡便に効率的に水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類Ｋｉ−４株の電子顕微鏡写真である。
【図２】水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類Ｋｉ−４株の光学顕微鏡写真である。
【図３】水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類Ｋｉ−４株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統的位置を示す図である。
【図４】水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量を示す図である。
【図５】水溶性カロテノイド結合タンパク質に結合しているカロテノイドのクロマトグラフ及びマススペクトルを示す図である。
【図６】ＰＡＳ染色による水溶性カロテノイド結合タンパク質の糖鎖の有無を示す図である。
【図７】水溶性カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性を示す図である。
【図８】熱処理した水溶性カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質について説明する。
【００１８】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、高い抗酸化活性を有するアスタキサンチンを主要なカロテノイドとして結合し、水に可溶であって、真核生物である微細藻類が生産するものであれば、特に限定されないが、例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質にアスタキサンチンを主要なカロテノイドとして結合し、他のカロテノイドにも結合能を有するものであって、微細藻類にストレスを付与しながら培養することにより生産されるものを挙げることができる。
【００１９】
前記タンパク質に結合するカロテノイドは、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコペン、ニューロスポレン、フィトフルエン、フィトエン、αクリプトキサンチン、βクリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、スピリロキサンチン、アロキサンチン、ジアジノキサンチン、ジアトキサンチン、ペリジニン、スフェロイデン、アンヒドロビブリン等である。
【００２０】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、脂溶性カロテノイドの特徴である１重項酸素消去活性を水溶液中で発揮することが可能なため、水溶性の特性を生かした食品、化粧品、皮膚外用剤、医薬品や科学試薬等に利用することができる。また、該水溶性カロテノイド結合タンパク質は、カロテノイド由来の色彩を有することから、水溶性の着色剤として、食品、化粧品、皮膚外用剤、医薬品等に利用することができる。
【００２１】
また、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、耐熱性を有することから、食品、化粧品、皮膚外用剤、医薬品等に利用することができる。
【００２２】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量は、特に限定されないが、例えば、前記配列番号１に示されたアミノ酸配列からなる水溶性カロテノイド結合タンパク質のタンパク質部分の分子量は、ポリアミノ酸部分のみの推定分子量として２１ｋＤａであり、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３３ｋＤａ、ゲルろ過によって４２〜４３ｋＤａと推定される。なお、タンパク質全体の分子量とは、水溶性カロテノイド結合タンパク質を構成するポリアミノ酸部分に加えて結合しているカロテノイドと糖鎖を含む分子量をいう。
【００２３】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の糖鎖の有無は、特に限定されないが、例えば、前記配列番号１に示されたアミノ酸配列からなる水溶性カロテノイド結合タンパク質は、糖鎖が結合した糖タンパク質である。
【００２４】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の等電点は、特に限定されないが、例えば、前記配列番号１に示されたアミノ酸配列からなる水溶性カロテノイド結合タンパク質は、等電点（ｐＩ）が１０．５である塩基性タンパク質である。
【００２５】
一方、前記微細藻類は、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類であれば特に限定されないが、該水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産性の観点から、本発明者が分離し、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｓｅ）に属する球形の藻類（ｃｏｃｃｏｉｄ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株（以下「Ｋｉ−４株」という。）を用いるのが好ましい。
【００２６】
前記Ｋｉ−４株は、その形態及び１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を用いた系統解析から、最も近縁な種がＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｓ（１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性は９９％）である新種と推察される。微細藻類の同定においては、その形態も重要な指標であるため、１８ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性が９９％であったとしても属種が異なる場合がある。なお、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、Ｋｉ−４株に近縁な菌株も生産することが予想される。Ｋｉ−４株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列やＩＴＳ遺伝子配列と塩基配列全体の相同性が９９％を示す微細藻類としては、ＤＮＡデータベースを用いたＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ解析の結果（Ｅ  ｖａｌｕｅ＝０．０，Ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒ率９９％以上）、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属藻類のほか、Ａｓｔｅｒａｒｃｙｓ属、Ｇｒａｅｓｉｅｌｌａ属、Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ属、Ｃｏｅｌａｓｔｒｏｐｓｉｓ属、Ｃｏｅｌａｓｔｒｕｍ属、Ｅｔｔｌｉａ属、Ｐｅｃｔｉｎｏｄｅｓｍｕｓ属、Ｔｅｔｒａｄｅｓｍｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ属、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属に属する藻類などがある。また、Ｋｉ−４株の１８ｒＲＮＡ遺伝子配列及びＩＴＳ遺伝子配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録されている（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ７３４０９６及びＡＢ７６２６９１）。
【００２７】
前記微細藻類の培養に用いる培地は、微細藻類が生育でき、かつ本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産できる培地であれば特に制限されず、例えば、Ａ−３培地等の液体培地又はこれら液体培地に寒天を添加して調製した寒天平板培地を挙げることができる。
【００２８】
前記微細藻類の培養温度は、微細藻類が生育でき、かつ本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産できる温度であれば特に制限はないが、該水溶性カロテノイド結合タンパク質生産の観点から２５〜３０℃が好ましい。
【００２９】
前記微細藻類の培養時には、光の照射と非照射とを周期的に行うのが好ましい。光照射強度及び明暗周期は、微細藻類が生育でき、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産できれば特に制限はないが、該水溶性カロテノイド結合タンパク質生産の観点から、光照射強度が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ以上、より好ましくは８００〜２０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの強光条件で明暗周期を光照射１２〜１６時間後、光非照射１２〜８時間で行うことが好ましい。なお、光の照射と非照射とを周期的に行わずに光を照射し続けても本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することができる。
【００３０】
前記微細藻類の培養において付与するストレスは、微細藻類が生育でき、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産できれば特に限定されないが、簡便にストレスを付与できる観点から、例えば、温度ストレス、圧力ストレス、酸化ストレス、強光ストレス、光酸化ストレス、乾燥ストレス、塩ストレス等が好ましい。ストレス付与に際して、２種以上のストレスを組み合わせも差し支えない。
【００３１】
本実施形態において、ストレスを付与して培養した微細藻類の細胞を破砕することで細胞内に生産された本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を抽出する。なお、上述のとおり、カロテノイドは水に対しては難溶又は不溶であるため、一般にカロテノイドを抽出する場合には有機溶剤を用いるが、本発明のカロテノイド結合タンパク質は水溶性であるため、水又は水溶液を用いて抽出することができる。
【００３２】
前記細胞の破砕方法は、フレンチプレス、ホモジナイザーや超音波等を用いた物理的な方法や細胞溶解酵素を用いた化学的な方法を挙げることができる。
【００３３】
また、微細藻類の細胞を破砕することで抽出した水溶液に含まれる本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を精製する。
【００３４】
前記の精製方法は、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質が精製できれば特に制限されず、電気泳動、各種クロマトグラフィー、限外ろ過等を挙げることができる。また、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質が溶解している水溶液の溶媒を脱塩カラム（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア社製）や透析膜等を用いて超純水に置換することもできる。なお、該水溶性カロテノイド結合タンパク質は、水に溶けた状態で退色することなく長期間安定である。
【００３５】
また、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質は、真空乾燥、凍結乾燥やスプレードライ等の方法によって粉末化することができる。なお、粉末化した水溶性カロテノイド結合タンパク質は水に添加すると速やかに溶解する。
【００３６】
また、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は良好な耐熱性を有する。すなわち、精製カロテノイド結合タンパク質の水溶液を１００℃で１時間の熱処理を行った場合においても、水溶液中に不溶物は観察されず、また、熱処理した精製カロテノイド結合タンパク質水溶液の色調は、熱処理していない場合と比べて色調の変化は観察されない。このように、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は１００℃で１時間の熱処理によっても水溶解性及び退色性の変化は認められず、実用上十分な耐熱性を有する。
【００３７】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、食品（機能性食品、健康食品等）、食品添加物、着色剤、医薬品、化粧品や皮膚外用剤、飼料等の原料として広く利用することができる。なお、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を利用する場合、上述のように微細藻類を培養することによって該水溶性カロテノイド結合タンパク質を菌体内に生産した微細藻類の菌体自体や該菌体を破砕して得た菌体破砕物を用いてもよい。
【００３８】
次に、本発明の真核生物である微細藻類が生産する水溶性カロテノイド結合タンパク質の製造方法の好適な実施形態について説明する。
【００３９】
本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、前記水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類にストレスを付与しながら培養する培養工程と、前記培養工程によって微細藻類が生産した水溶性カロテノイド結合タンパク質を微細藻類から抽出する抽出工程と、前記抽出工程で得た抽出液を精製する精製工程と、を順次実施することにより効率的に製造することができる。
【００４０】
まず始めに、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類を準備し、これを液体培地又は寒天平板培地を用いて、ストレスを付与しながら培養する。
【００４１】
前記微細藻類としては、上述のとおり、Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株を用いるのが好ましい。このＫｉ−４株は、先に示したように、最も近縁な種がＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｓ（１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性は９９％）である新種と推察される。
【００４２】
前記微細藻類の培養に用いるに好適な培地としては、Ａ−３培地等の液体培地又はこれら液体培地に寒天を添加して調製した寒天平板培地が用いられる。
【００４３】
前記微細藻類の培養温度は、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質生産の観点から２０〜３５℃、特に２５〜３０℃が好ましい。
【００４４】
前記微細藻類の培養時の光照射強度及び明暗周期は、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質生産の観点から、光照射強度が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ以上、より好ましくは８００〜２０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓの強硬条件で明暗周期を光照射１２〜１６時間後、光非照射１２〜８時間で行うことが好ましい。なお、光の照射と非照射とを周期的に行わずに光を照射し続けても本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することができる。
【００４５】
前記微細藻類の培養において付与されるストレスは、上述した各ストレスの中でも、強光条件（光照射強度が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓ以上）下で、かつ、微細藻類を寒天培地上で培養することによって寒天培地中の水分が徐々に低下することを利用する乾燥ストレスや塩化ナトリウムを添加した液体培地で培養する塩ストレスが好ましい。培地に塩化ナトリウムを添加して塩ストレスを付与する場合は、塩化ナトリウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌ〜０．７ｍｏｌ／ＬとすることでＫｉ−４株の水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産性を向上させることができるので特に好適である。
【００４６】
次いで、ストレスを付与して培養した微細藻類の細胞を水又は水溶液中で破砕することで細胞内に生産された本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を抽出する。なお、上述のとおり、カロテノイドは水に対しては難溶又は不溶であるため、一般にカロテノイドを抽出する場合には有機溶剤を用いるが、本発明のカロテノイド結合タンパク質は水溶性であるため、水又は水溶液を用いて抽出することができる。
【００４７】
前記細胞の破砕方法は、フレンチプレス、ホモジナイザーや超音波等を用いた物理的な方法や細胞溶解酵素を用いた化学的な方法を挙げることができる。
【００４８】
次いで、細胞を破砕して抽出した水溶液に含まれる本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の精製を行う。
【００４９】
前記の精製方法は、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質が精製できれば特に制限されず、電気泳動、各種クロマトグラフィー、限外ろ過等を挙げることができる。また、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質が溶解している水溶液の溶媒を脱塩カラム（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア社製）や透析膜等を用いて超純水に置換することもできる。
【００５０】
また、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質は、真空乾燥、凍結乾燥やスプレードライ等の方法によって粉末化することができる。
【００５１】
このような工程によって、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を製造することができる。
【実施例】
【００５２】
１．水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する微細藻類の検索及び同定
（１）微細藻類の検索
砂漠土壌、塩堆積物、真夏時のアスファルト等を試料として、目的に適う真核生物である微細藻類のスクリーニングを行った。すなわち、試料をＡ−３寒天平板培地（純水１Ｌ中にＫＮＯ３  １２５ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ７５ｍｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ７５ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １７５ｍｇ、ＮａＣｌ  ２５ｍｇ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３ｍｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｍｇ及びＮａＭｏＯ４  ０．１ｍｇ、Ａｇａｒ  １５ｇを含む）に塗布した後、室内の自然光照射下に放置した。その後、寒天上に増殖した微細藻類と思われる緑色又は赤色のコロニーを採取し、再度、上記同様に１．５％寒天を含むＡ−３寒天培地に塗布した。なお、コロニーが単一になるまでこの操作を繰り返すことで微細藻類を純粋分離した。
【００５３】
その結果、微細藻類を４０菌株得ることができ、この中から、乾燥や塩ストレスに対する耐性を有し、かつ水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産する菌株として東京都世田谷区桜丘１丁目の東京農業大学前のアスファルト道路から分離した緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｓｅ）に属する球形の藻類（ｃｏｃｃｏｉｄ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）Ｋｉ−４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２４４）株（以下「Ｋｉ−４株」という。）を選抜した。
【００５４】
（２）微細藻類の同定
選抜したＫｉ−４株の形態について、電子顕微鏡及び光学顕微鏡を用いて観察したところ、図１及び２に示したように、Ｋｉ−４株は単球菌という特徴を有していた。
【００５５】
また、常法に従って、Ｋｉ−４株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を調べ、系統解析を行ったところ、Ｋｉ−４株の系統的位置は、図３に示したように、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録されているＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｓ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５６１０４）株が最も近縁な菌株であった。また、Ｋｉ−４株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と上記Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｓ株の１８ｒＲＮＡ遺伝子配列とを比較したところ、その相同性は９９％であった。
【００５６】
一般に、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属は２〜４個の細胞が連結した連鎖球菌であることや１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の系統解析の結果から、Ｋｉ−４株はＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｓに近縁の新種であると推察された。なお、Ｋｉ−４株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ７３４０９６）。
【００５７】
２．微細藻類の培養方法
（１）前培養
乾熱滅菌（１８０℃、２時間）した綿栓付きガラス管が施された１Ｌ容三角フラスコに、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）したＡ−３培地７００ｍＬを入れ、Ｋｉ−４株を３白金耳植菌した。これを１日の明暗周期が１０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで１５時間後、０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで９時間となるように設定した植物用恒温器（トミー精工社製：ＣＦ−３０５）内に入れ、スターラーバーを用いて撹拌を行いながら培養温度２６℃で５日間の撹拌培養を行った。また、培養終了後の菌体濃度（Ｏ．Ｄ．７５０ｎｍ）値は、１．０〜１．２であった。
【００５８】
次に、前記培養液をＡ−３培地７００ｍＬに菌体濃度（Ｏ．Ｄ．７５０ｎｍ）が０．１〜０．２となるように添加し、前記同様の培養条件で３日間培養を行い、前培養液を調製した。
【００５９】
（２）乾燥ストレス付与培養
まず始めに、乾燥ストレス付与培養を行うための寒天平板培地を調製した。すなわち、Ａ−３培地１０００ｍＬをｐＨ６．８に調整した後、寒天１５ｇを添加してオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）を行った。このＡ−３寒天培地７０ｍＬを直径１５０ｍｍ×高さ１５ｍｍのシャーレに注ぎ、Ａ−３寒天平板培地を調製した。
【００６０】
一方、上記２．（１）で調製した前培養液５０ｍＬを遠沈管に入れて遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行った後、遠心分離によって菌体と上清液とに分離し、該菌体を該上清液５ｍＬに懸濁することで菌体懸濁液を調製した。
【００６１】
前記菌体懸濁液５００μＬをエタノールで滅菌したコンラージ棒を用いてあらかじめ調製した前記Ａ−３寒天平板培地に塗布した。これを明暗周期が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで１６時間後、０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで８時間となるように設定した植物用恒温器（トミー精工社製：ＣＦ−３０５）内に入れ、培養温度２６℃で５日間培養した（本培養）。
【００６２】
次いで、前記本培養で得た寒天平板培地に生育した菌体を用いて、乾燥ストレス付与培養試験を行った。すなわち、菌体が生育した寒天平板培地を無菌的に４．９ｃｍ×２．８ｃｍに切り取り、直径９０ｍｍ×高さ１５ｍｍのシャーレに入れた。これを１日の明暗周期が７００〜１０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで１６時間後、照度０（０ルクス）で８時間となるように設定した植物用恒温器（トミー精工社製：ＣＦ−３０５）内に入れ、培養温度２８℃で乾燥ストレス付与培養を行った。また、経日的に培養期間中の寒天平板培地上の微細藻類の菌体（コロニー）の色調を肉眼観察した。なお、Ｋｉ−４株は、水溶性カロテノイド結合タンパク質を菌体内に生成すると菌体が赤色となる。
【００６３】
その結果、乾燥ストレス付与培養開始後から寒天培地中の水分含量が徐々に低下し、寒天平板培地上の微細藻類Ｋｉ−４株の菌体が培養開始２日後から徐々に赤色に変化し、乾燥ストレス付与培養開始６日後に菌体が濃い赤色に呈色した。また、その後の約一ヶ月間は濃い赤色を維持した。
【００６４】
このように、微細藻類を乾燥ストレス条件下で培養することによって本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することができた。
【００６５】
（３）塩ストレス付与培養
まず始めに、乾熱滅菌（１８０℃、２時間）した綿栓付きガラス管が施された１Ｌ容三角フラスコに、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）したＡ−３培地７００ｍＬを入れ、ここに上記２．（１）で調製した前培養液を菌体濃度（Ｏ．Ｄ．７５０ｎｍ）が０．１〜０．２となるように添加した。これを１日の明暗周期が５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで１５時間、０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで９時間となるように設定した植物用恒温器（トミー精工社製：ＣＦ−３０５）内に入れ、スターラーバーを用いて撹拌を行いながら培養温度２６℃で３日間の撹拌培養を行った（本培養）。
【００６６】
次いで、前記本培養液を用いて、塩ストレス付与培養試験を行った。すなわち、本培養液に滅菌したＮａＣｌを０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．７ｍｏｌ／Ｌ又は１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した後、本培養と同様の培養条件で培養を行い、経日的に培養液の色調を肉眼観察した。なお、Ｋｉ−４株は、水溶性カロテノイド結合タンパク質を菌体内に生成すると菌体が赤色となる。
【００６７】
その結果、塩化ナトリウム０．５ｍｏｌ／Ｌを培地に添加した場合、微細藻類Ｋｉ−４株は、塩ストレス付与培養開始２日後から培養液が徐々に赤色に変化し始めた。一方、塩化ナトリウム０．７ｍｏｌ／Ｌを培地に添加した場合、微細藻類Ｋｉ−４株は塩ストレス付与培養開始直後から増殖を開始し、塩ストレス付与培養開始１日後から培養液が徐々に赤色に変化し始めた。他方、塩化ナトリウム１．０ｍｏｌ／Ｌを添加した場合、塩ストレス付与培養開始２〜４日後に培養液が僅かに赤色に呈色したが、０．５ｍｏｌ／Ｌ又は０．７ｍｏｌ／Ｌを添加した場合と比べて微細藻類Ｋｉ−４株の増殖速度が遅く、培養液の赤色の呈色度も低かった。
【００６８】
このように、培地に塩化ナトリウムを添加した塩ストレス付与培養では、培地に添加する塩化ナトリウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌとすることで本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を生産することができた。また、培地に添加する塩化ナトリウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌ〜０．７ｍｏｌ／ＬとすることでＫｉ−４株の水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産性を向上させることができ、培地の塩化ナトリウム濃度は０．７ｍｏｌ／Ｌとすることが水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産には最適であった。
【００６９】
３．水溶性カロテノイド結合タンパク質の精製
（１）菌体の調製
前培養は、上記２．（１）と同様に行った。なお、前培養培地の液量は１．６Ｌとした。また、一重項酸素消去活性を有する水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産におけるストレスの付与は、塩化ナトリウムを用いた塩ストレス付与培養とした。すなわち、乾熱滅菌（１８０℃、２時間）した綿栓付きガラス管が施された５Ｌ容三角フラスコに、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）したＡ−３培地４Ｌを入れ、ここに前培養液を菌体濃度（Ｏ．Ｄ．７５０ｎｍ）が０．１〜０．２となるように添加した。これを１日の明暗周期が７００〜１０００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで１６時間後、０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓで８時間となるように設定した植物用恒温器（トミー精工社製：ＣＦ−３０５）内入れ、スターラーバーを用いて撹拌を行いながら培養温度２８℃で撹拌培養を行った（本培養）。
【００７０】
本培養後、この本培養液に滅菌したＮａＣｌを０．７ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、本培養と同様の培養条件で塩ストレス付与培養を行い、塩ストレス付与培養開始６日間後に培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することで菌体を回収した。
【００７１】
（２）精製
前記回収した菌体１５ｇをプロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９.０）４５ｍＬに懸濁した後、フレンチプレス（ＡＭＩＮＣＯ社製：ＦＲＥＮＣＨ  ＰＲＥＳＳＵＥＲ  ３０，０００ｐｓｉ）を用いて破砕し、得られた菌体破砕液を超遠心分離（５００００ｒｐｍ、２時間、４℃）することで、微細藻類が生産した水溶性カロテノイド結合タンパク質を含有する水溶液を調製した。
【００７２】
次に、前記で調製した水溶液に含まれる水溶性カロテノイド結合タンパク質を２種類のカラムクロマトグラフィーによって精製した。すなわち、前記水溶液をＰＭＳＦが３４ｍｇ／Ｌとなるように添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２０ｍｍ×３００ｍｍ、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎ）に供試し、吸着画分を０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液４００ｍＬによる直線濃度勾配法で分画した。
【００７３】
さらに、前記ＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて分画した水溶性カロテノイド結合タンパク質画分を５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲル濾過カラム｛Ｈｉｐｒｅｐ  ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲカラム（１６ｍｍ×６００ｍｍ、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ）｝に供試し、同緩衝液で溶出した。
【００７４】
前記Ｈｉｐｒｅｐ  ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲカラムを用いて分画した水溶性カロテノイド結合タンパク質画分について、常法に従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という。）を行ったところ、単一のバンドが得られた。
【００７５】
このように、上記精製方法によって本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質を電気泳動的に単一となるまで精製することができた。
【００７６】
４．水溶性カロテノイド結合タンパク質の性質
（１）分子量
上記３．で精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲルろ過クロマトグラフィーによって測定した。すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２．５％ポリアクリルアミドスラブゲルを用いたトリス緩衝液系（Ｌａｅｍｍｌｉ系）で行った。なお、分子量マーカーは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いた。また、ゲルの染色はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いたＣＢＢ染色法によって行った。また、その結果を図４に示した。
【００７７】
図４に示すように、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量は約３３ｋＤａであった。
【００７８】
一方、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量の測定は、試料を１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉｐｒｅｐＰ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲカラム（１６ｍｍ×６００ｍｍ、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ）に供試し、同緩衝液で溶出することで行った。一方、分子量マーカーについても同様に溶出を行い、試料及び分子量マーカーが溶出した液量（溶出液量）又は溶出時間とをそれぞれ比較することで試料の分子量を算出した。なお、標準分子量マーカーは、Ｂｌｕｅ  ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００（分子量２０００ｋＤａ）、Ａｌｄｏｌａｓｅ（分子量１５８ｋＤａ）、Ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ（分子量７５ｋＤａ）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４４ｋＤａ）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（分子量２９ｋＤａ）及びＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ（分子量１３．７ｋＤａ）を使用した。
【００７９】
その結果、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量は約４２〜４３ｋＤａであった。
【００８０】
これらのことから、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３３ｋＤａ、ゲルろ過によって４２〜４３ｋＤａと推定された。
【００８１】
（２）等電点
精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質の等電点は、常法に従い、等電点電気泳動法によって調べた。なお、等電点電気泳動装置はＭａｌｔｉｐｈｏｒｅ  ＩＩ（ファルマシア社製）、ゲルはｃｌｅａｎ  ｇｅｌ  ＩＥＦゲルを用いた。
【００８２】
その結果、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の等電点（ｐＩ）は１０．５と、強度の塩基性であることが分かった。
【００８３】
（３）結合色素
精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質に結合しているカロテノイドの同定は、常法に従い、以下の方法により行った。すなわち、フォトダイオードアレイ検出器を備えたＨＰＬＣ（日立社製）を用い、試料の溶出時間及びスペクトルを測定し、試料の溶出時間及びスペクトルと標準品の溶出時間及びスペクトルとを比較した。また、上記で溶出されたピークに含まれるカロテノイドの分子量について、高分解能ＬＣ／ＭＳ（島津製作所社製）を用いて測定した。それらの結果を図５に示した。
【００８４】
図５に示したように、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質に結合しているカロテノイドとして、主にＰ１〜Ｐ４の４つのピークが認められ、標準品の溶出時間及びスペクトルとの比較並びに高分解能ＬＣ／ＭＳ（島津製作所社製）を用いた分子量測定によって、Ｐ１が分子量５９６のアスタキサンチン、Ｐ３が分子量５６８のルテイン、Ｐ４が分子量５６４のカンタキサンチンと同定された。また、Ｐ２については、アドニキサンチンの分子量５８２と同じであるが、使用した標準品のアドニキサンチン（３Ｓ，３’Ｓ）−３，３’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−β，β−ｃａｒｏｔｅｎ−４−ｏｎｅ（Ｃａｒｏｔｅｎａｔｕｒｅ社製）とは若干溶出時間（ｒｅｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）が異なるため、アドニキサンチンの構造異性体であることが推定された。これらのことから、水溶性カロテノイド結合タンパク質カロテノイドは、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ルテイン及び／又はカンタキサンチンであることが分かった。
【００８５】
（４）タンパク質のアミノ酸配列
精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の方法によって調べた。すなわち、まず始めに、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって得た精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質のバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、常法に従い、Ｎ末端アミノ酸シーケンサー（島津製作所社製）を用いて該水溶性カロテノイド結合タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列を調べ、得られたＮ末端アミノ酸配列（配列番号２）から遺伝子配列を予測し、ＰＣＲによって部分遺伝子の増幅を行った。全長配列は、全発現ｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、クローニングを行った。また、クローニングされたｃＤＮＡを解析することでアミノ酸配列（一次構造）を調べた。
【００８６】
その結果、クローニングされたｃＤＮＡは、開始コドンＡＴＧから終止コドンＴＧＡまでの６７２ｂｐの遺伝子にコードされており、配列番号３に示した２２３のアミノ酸残基から構成されたアミノ酸配列（一次構造）を有することが分かった。また、とＮ末端アミノ酸解析及び各種データベース解析の結果、最初の２０アミノ酸残基がシグナル配列であることが推察された。なお、水溶性カロテノイド結合タンパク質をコードする遺伝子配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録されている（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ７３１７５６及びＡＢ７３１７５７）。
【００８７】
これらのことから、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列からなることが分かった。
【００８８】
（５）糖鎖
精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質に糖鎖が結合しているかどうかについて、ＰＡＳ染色によって調べた。すなわち、精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１０％酢酸及び３５％メタノールを含有する水溶液１００ｍＬに３０分間浸漬した。これをトリクロロ酢酸１２ｇを含有する水溶液１００ｍｌで洗浄した後、１％過ヨウ素酸水溶液１００ｍＬに１時間浸漬した。さらに、これを超純粋で洗浄した後、１５％酢酸水溶液１００ｍＬで洗浄し、シッフ試薬を用いて精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質のバンドが発色するかどうかを調べた（図６）。なお、糖鎖のないタンパク質であるＢＳＡ及び糖鎖が結合する糖タンパク質であるＦｅｔｕｉｎを対照とした。
【００８９】
図６に示したように、レーン１の水溶性カロテノイド結合タンパク質を示すバンドがレーン３の糖タンパク質であるフェチュイン（Ｆｅｔｕｉｎ）と同様にシッフ試薬によって赤色に発色していた。したがって、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質には糖鎖が存在していることが推察された。
【００９０】
５．一重項酸素消去活性
カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性はＥＳＲ法によって評価した。すなわち、精製カロテノイド結合タンパク質水溶液（ＯＤ４８４ｎｍ＝２．８６、タンパク質濃度０．６５±０．０３μｇ／μＬ、アスタキサンチン濃度換算値として約２３μＭ、５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ７．５）２．５、５、１０、２５又は５０μＬを５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて全量を１００μＬとした精製カロテノイド結合タンパク質水溶液をそれぞれ調製した。これらを６．２５μＭ  リボフラビン及び２５ｍＭ  ＴＭＰＤを含む５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）７００μＬにそれぞれ添加したものを各評価検体として、以下の試験に供した。なお、カロテノイド結合タンパク質水溶液の代わりに５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いた場合を対照とした。
【００９１】
各評価検体及び対照をそれぞれＥＳＲ測定管に入れ、これら評価検体及び対照に対してそれぞれＥＳＲ測定管から１ｃｍの距離でＵＶｌａｍｐ（８Ｗ、２５０−４００ｎｍ、ＰＵＶ−１、ＴＯＰＣＯＮ社製）を１８０秒間の光照射を行った。また、光照射直後の各評価検体及び対照のＥＳＲシグナル強度をＥＳＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ社製Ｅ５００）を用いてそれぞれ測定し、各評価検体のＥＳＲシグナル強度Ｓ１及び対照のＥＳＲシグナル強度Ｓ２として一重項酸素消去率（％）を一重項酸素消去率（％）＝（１−Ｓ１／Ｓ２）×１００から算出した。また、その結果を図７に示した。
【００９２】
図７に示したように、精製カロテノイド結合タンパク質水溶液は一重項酸素消去活性が認められた。また、カロテノイド結合タンパク質の濃度が高いほど一重項酸素消去活性が向上した。
【００９３】
６．一重項酸素消去活性及び水溶解性並びに色調に及ぼす熱処理の影響
上記３．で精製した水溶性カロテノイド結合タンパク質の熱安定性を調べることを目的に、該水溶性カロテノイド結合タンパク質を１００℃で１時間保持した後、この熱処理された水溶性カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性を測定した。なお、一重項酸素消去活性の測定は、蛍光プローブ法（ＳＯＳＧ法）によって評価した。すなわち、カロテノイド結合タンパク質の濃度が０．６５±０．０３μｇ／μＬの精製カロテノイド結合タンパク質水溶液（５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ７．５）２０又は１００μＬを５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて全量を１００μＬとした精製カロテノイド結合タンパク質水溶液をそれぞれ調製した。
【００９４】
一方、一重項酸素検出蛍光試薬であるＳＯＳＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をメタノールに溶解し５ｍＭとした試薬を超純水で１０倍希釈して０．５ｍＭとしたＳＯＳＧ試薬を調製した。
【００９５】
次いで、一重項酸素発生剤であるローズベンガル１μＭを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に、前記精製カロテノイド結合タンパク質水溶液１００μＬ及び前記ＳＯＳＧ試薬２０μＬ（終濃度５μＭ）を添加し、最終溶液量を２０００μＬとした。この溶液を石英ガラスの容器に入れ、容器側面にランプ（東芝社製；ＥＦＤ２１ＥＤ）を用いて１３０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ/ｍ２/ｓの光量があたるように距離を調整して照射することで該溶液が発する蛍光の経時変化をＳＯＳＧ試薬の蛍光測定条件である４８８ｎｍのエキサイテーション及び５２５ｎｍのエミッションに設定した蛍光測定器（ＳＯＭＡ社製；Ｓ３３７０）を用いて測定した。なお、測定は、光照射開始直前を０分とし、１分間隔で１０分後まで行った。
【００９６】
また、精製カロテノイド結合タンパク質水溶液の代わりに１００ｍＭのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）水溶液（５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ７．５）を０、２０又は１００μＬを５．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて全量を１００μＬとしたものを用いた場合を対照とした。その結果を図８に示した。
【００９７】
図８に示したように、１００℃で１時間の熱処理をした精製カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性は、熱処理をしていない精製カロテノイド結合タンパク質水溶液と活性値の９０％以上の値を保持していた。
【００９８】
また、カロテノイド結合タンパク質の水溶解性及び色調に対する熱処理の影響について調べたところ、上記の１００℃で１時間の熱処理した精製カロテノイド結合タンパク質水溶液中には不溶物は観察されず、また、該熱処理した精製カロテノイド結合タンパク質水溶液の色調は、熱処理していない場合と比べて色調の変化は観察されず、精製カロテノイド結合タンパク質の水溶解性及び色調に及ぼす熱処理の影響は認められなかった。
【００９９】
このように、本発明の水溶性カロテノイド結合タンパク質の一重項酸素消去活性及び水溶解性並びに色調は熱に対して安定であり、該水溶性カロテノイド結合タンパク質が耐熱性を有することが分かった。
【０１００】
７．水に対する溶解性
水に対する溶解性について検討した。すなわち、精製したカロテノイド結合タンパク質の水溶液の溶媒をＰＤ−１０や透析によって超純水に置換した後、該精製カロテノイド結合タンパク質水溶液（ＯＤ４８４ｎｍ＝１．０、タンパク質濃度が約０．２ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを真空乾燥法によって乾燥させ、この水溶性カロテノイド結合タンパク質粉末に再度純水１０μＬを添加したところ、溶液中には不溶物が観察されず、該精製カロテノイド結合タンパク質が速やかに溶解した。この結果から、精製したカロテノイド結合タンパク質の水への溶解性は２０ｍｇ／ｍＬ以上であることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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