(57)【要約】【課題】ホルムアミド含む電気泳動で用いる複数試薬が封入された、有機材料からなる核酸分析カートリッジにおいて、汚染物質混入を低減し、保存安定性が高く、低コストであるカートリッジとカートリッジ梱包キットを提供する。【解決手段】試薬が接する空間と導通する少なくとも一つの通気口を持つ核酸分析カートリッジを水蒸気透過性低い梱包袋内に減圧パーケージする。減圧パーケージすることで梱包袋内の水蒸気濃度を低減するとともに、水蒸気透過性低い梱包袋を用いることで輸送、保管時に大気から梱包袋内への水蒸気の透過を低減する。水蒸気濃度低減により、保管時のホルムアミド加水分解を減らし、電気泳動時のＤＮＡフラグメント分離能の低下を防ぎ保存安定性を高める。【選択図】図４
2014081329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルムアミドを含む電気泳動で用いる複数の試薬が内蔵された核酸分析カートリッジにおいて、
大気に開放された第１の開口部を有し前記試薬を封入する試薬封入部と、
該試薬封入部からの試薬を送通する流路を介して接続され大気に開放された第２の開口部を有する試薬混合部と、
前記試薬混合部と前記試薬封入部との大気の移動を可能とする空気穴と、を備え、
少なくとも前記第１及び第２の開口部を含む領域が、前記大気が含有する水蒸気に対して透過性の低い材料からなる梱包袋で被覆され、該梱包袋内が前記大気が有する大気圧より低く減圧されていることを特徴とする核酸分析カートリッジ。
【請求項２】
前記試薬封入部および前記試薬混合部を含む領域は、カートリッジ材とフィルム材から構成され、
前記フィルム材は水蒸気の透過性が低い材料からなり、
少なくとも前記第１の開口部を被覆するように前記フィルム材が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析カートリッジ。
【請求項３】
前記第２の開口部は、弁構造を持つことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析カートリッジ。
【請求項４】
前記試薬封入部は、前記試薬が封入された第１の封入部屋と前記第１の開口部を有し前記空気穴に連接された第２の封入部屋からなり、
前記第１の封入部屋と前記第２の封入部屋とがオリフィスを介して積層され、前記オリフィスは前記第１の封入部屋と前記第２の封入部屋が対向する面の断面積より小さい断面積を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸分析カートリッジ。
【請求項５】
前記試薬封入部および前記試薬混合部を含む領域において、前記試薬と前記カートリッジ材と前記フィルム材に囲まれた空間の大気が窒素、アルゴン、ヘリウムから選ばれる少なくとも１種類以上のガスで置換されていることを特徴とする請求項２または４に記載の核酸分析カートリッジ。
【請求項６】
前記カートリッジ材と前記梱包袋のそれぞれが有機材料、または有機材料と無機材料からなる混合材料、または有機材料と金属材料からなる混合材料、または有機材料と無機材料と金属材料からなる混合材料のいずれかの材料から成ることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか一つに記載の核酸分析カートリッジ。
【請求項７】
前記梱包袋、または前記フィルム材の水蒸気透過度が１気圧下２４時間で１００．０ｇ／ｍ２以下であること特徴とする請求項２乃至６のいずれか一つに記載の核酸分析カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析カートリッジに係り、例えば、それを梱包する梱包キット、及びそれを用いた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析を用いたアプリケーションが法医科学、個別化医療、バイオテロなどの分野で実用化されている。
【０００３】
法医科学分野では、ＳＴＲ(Short Tandem Repeat)解析が実用化されている。ＳＴＲ解析はゲノム中のある領域の繰返し塩基配列を分析する。ＳＴＲ塩基配列の長さが個人固有であることを用い、個人識別や親子鑑定などＤＮＡ鑑定を行う。
【０００４】
特許文献１には、米ＦＢＩが指定する１３種類の領域を一度に解析するプロセスが開示されている。その解析プロセスは、ＤＮＡサンプル採取、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡフラグメントの分離、ＤＮＡフラグメントの検出の各プロセスからなる。その中のＤＮＡ増幅プロセスでは、一つの測定ＤＮＡサンプルに対して、１３種類のプライマセットを用いて多重ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)増幅を行う。ＤＮＡ増幅中に増幅産物であるＤＮＡフラグメントをラベル化する。ＤＮＡフラグメント分離プロセスでは、ラベル化ＤＮＡフラグメントを電気泳動で分離する。ＤＮＡフラグメントの検出プロセスでは、得られた分離ＤＮＡフラグメントの電気泳動パターンを検出、分析する。
【０００５】
特許文献２には、ＤＮＡフラグメント分離プロセスにアクリルアミドゲルを用いる方法が開示されている。その方法は、増幅産物であるＤＮＡフラグメント溶液に９５％ホルムアミドを混合した後、混合溶液を９０℃で２分間変性し、変性済みＤＮＡフラグメント溶液をアクリルアミドゲルにロードした後で電気泳動を行うことを特徴とする。
【０００６】
非特許文献１には、分離プロセスにキャピラリを用いる方法が開示されている。前出のアクリルアミドゲルと同様、増幅産物であるＤＮＡフラグメント溶液にホルムアミドを混合した後、混合溶液を９５℃で３分間変性することを特徴とする。
【０００７】
上述した既存ＳＴＲ解析は、解析時間が長く、解析コストが高い課題がある。解析時間としては、ＤＮＡサンプル採取、ＤＮＡ定量に最大３〜４時間、ＤＮＡ増幅に最大３時間３０分、ＤＮＡフラグメントの分離、検出に最大４５分と、合計で最大８時間４５分要する（非特許文献２を参照）。また、複数台の専門装置と専門知識有する技術者が必要であり、解析システムが一般化できない課題もある。
【０００８】
そこで、解析時間が短く、解析コストを低減する方法として、マイクロフルイディクス技術を活用するのが有効である。マイクロフルイディクス技術とは、マイクロチップなどを用い微量液体をハンドリングする技術である。また、ハンドリングする液量を大幅低減することで、ハンドリング時間とコストを低減する。
【０００９】
特許文献３には、マイクロフルイディクス技術を活用してＤＮＡサンプルを採取する自動化システムが開示されている。すなわち、口腔内サンプルや膣内サンプルを採取したスワブを容器に挿入し、マイクロフルイディクス流路を介して試薬容器内の複数試薬をスワブ容器に順次移入して測定サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する。得られたＤＮＡサンプルを増幅した後、ＤＮＡフラグメントを分離して、ＳＴＲ解析可能であることを示している。
【００１０】
非特許文献２には、マイクロフルイディクス技術を活用してＳＴＲ解析を行う自動化システムが開示されている。この解析システムは２種類のマイクロデバイスと１種類のマイクロチップを用いる。マイクロデバイスはＤＮＡサンプル採取用とＤＮＡ増幅用で、１種類のマイクロチップでＤＮＡフラグメントを分離する。解析時間３時間以内を実現している。
【００１１】
特許文献４には、別の形態のＳＴＲ解析を行う自動化システムが開示されている。このシステムは、ＤＮＡサンプルを採取するモジュール、ＤＮＡを増幅するモジュール、増幅産物をクリーンアップするモジュール、キャピラリ電気泳動モジュールからなる。分析には使い捨てのカートリッジを用いる。カートリッジは、チャンバー、連結管、及び微細流路やフルイディスクバルブ持つマイクロチップで構成されている。カートリッジ内チャンバーに測定サンプルが付着したスワブを挿入した後、連結管を介して試薬カートリッジ内の試薬溶液をチャンバーに移入し、チャンバー内で測定サンプルを溶解する。磁性微粒子があるチャンバーに測定サンプル溶解した試薬溶液を移入し、試薬溶液に溶解したＤＮＡを磁性微粒子に付着させる。ＤＮＡ付着した磁性微粒子をフルイディスクバルブ介して複数チャンバーに移動させるともに、複数チャンバーに複数試薬を順次供給して、ＤＮＡ増幅、増幅産物のクリーンアップを行う。最後にクリーンアップされた増幅産物をキャピラリ電気泳動モジュールに導入しＳＴＲ解析を行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６５３１２８２号明細書
【特許文献２】日本国特許出願公表  特表２００１／５１１０１８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０２８５５７８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０００５９３２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】J Forensic Sci 1998;43:164−170
【非特許文献２】Analytica Chimica Acta 2011;687:150−158
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一般に、解析システム周囲の外気にはこれから測定しようとする前の測定で増幅されたＤＮＡや作業者に由来する細胞が浮遊しており、これら汚染物質による誤検出を防ぐため、カートリッジ内部への汚染物質の混入を防ぐ必要がある。汚染物質混入を防ぐためには、カートリッジ内部への持ち込み物質をなるべく減らすシステムが望ましく、その点で、解析に必要な全ての試薬がカートリッジに内蔵されていることが望ましい。ＳＴＲ解析に必要な試薬としては、ＤＮＡ増幅酵素、プライマ、デオキシヌクレオシド、サイズマーカ、変性用ホルムアミドなどが挙げられるが、この中で特に、ホルムアミドは保存時に大気との接触をなるべく減らす必要がある。ホルムアミドは大気中の水蒸気を吸収して加水分解し、アンモニアと蟻酸を生成して電気泳動時のＤＮＡフラグメント分離能を低下させるためである。
【００１５】
さらに、カートリッジにはコスト低減が求められる。コストを低減する方法として、カートリッジ材料、梱包材料にプラスティックなどの有機材料を用いることが望ましい。
しかしながら、一般に、有機材料は水蒸気を透過するため、カートリッジやカートリッジ梱包キットに有機材料を用いる場合、カートリッジに内蔵された試薬が大気との接触を最小化する梱包パッケージが求められる。
【００１６】
そこで、本発明は、ホルムアミド含む電気泳動で用いる複数試薬が封入された、有機材料からなるカートリッジにおいて、汚染物質混入を低減し、保存安定性が高く、低コストであるカートリッジとカートリッジ梱包キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、鋭意研究の結果、ホルムアミド含む電気泳動で用いる複数試薬が封入され、且つ有機材料からなるカートリッジにおいて、汚染物質混入を低減し、保存安定性が高く、低コストであるカートリッジとカートリッジ梱包キットを実現させた。
【００１８】
すなわち、本発明の主たる核酸分析カートリッジの特徴は以下の通りである。
ホルムアミド含む電気泳動で用いる複数試薬が内蔵された核酸分析カートリッジが梱包されたキットにおいて、試薬が接する空間と導通する少なくとも一つの通気口を持つ核酸分析カートリッジが水蒸気透過性が低い梱包袋内に減圧パーケージされていることを特徴とする核酸分析カートリッジ梱包キットを提供する。
【００１９】
減圧パーケージすることで梱包袋内の水蒸気濃度を低減するとともに、水蒸気透過性低い梱包袋を用いることで輸送、保管時に大気から梱包袋内への水蒸気の透過を低減する。通気口は減圧パッケージ中に試薬と接する空間内の水蒸気を効率良く排出し、空間内の水蒸気濃度を低減する。水蒸気濃度低減は、保管時のホルムアミド加水分解を減らし、電気泳動時のＤＮＡフラグメント分離能の低下を防ぎ保存安定性を高める。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、ホルムアミド含む電気泳動で用いる複数試薬が封入された、有機材料からなるカートリッジにおいて、汚染物質混入を低減し、保存安定性が高く、低コストであるカートリッジとカートリッジ梱包キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の核酸分析カートリッジの全体構成の一例を説明するための概念図である。
【図２】本発明の核酸分析カートリッジの構成の一例を説明するための概念図である。
【図３】本発明の核酸分析カートリッジと梱包キットの構成、ならびに梱包キット作製プロセスを説明するための概念図である。
【図４】本発明の核酸分析カートリッジと梱包キットの別の構成、ならびに梱包キット作製プロセスを説明するための概念図である。
【図５】本発明の核酸分析カートリッジの構成の一例を説明するための概念図である。
【図６】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図７】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図８】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図９】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１０】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１１】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１２】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１３】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１４】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１５】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１６】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１７】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１８】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図１９】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【図２０】本発明の核酸分析カートリッジを動作、検出するための核酸分析装置の構成の一例を説明するための概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【実施例１】
【００２３】
図１、及び図２を参照しながら、本発明の核酸分析カートリッジの一例を説明する。
図１は核酸分析カートリッジ１の全体概略を平面図で示す。図１に示す核酸分析カートリッジ１はコントロールサンプルを含む合計８サンプルを同時に解析できる構成例である。
核酸分析カートリッジ１は、試薬が封入されて内部に試薬を保持する試薬封入部屋（２，３）、試薬溶液を分岐するための分岐部屋４、試薬溶液を混合する混合部屋６、加熱される加熱部屋（７，１０）とこれらの部屋を結ぶ流路１３を持つ。ここで、試薬封入部屋としては、Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ封入部屋２、Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ封入部屋３、電気泳動マーカ封入部屋８、ホルムアミド封入部屋９、サンプル溶解液封入部屋１２がある。加熱部屋としては、ＤＮＡ増幅を行うＤＮＡ増幅加熱部屋７、ＤＮＡ変性加熱部屋１０がある。
また、上記の試薬封入部屋、分岐部屋、混合部屋、及び加熱部屋以外の部屋として、測定サンプルを挿入する測定サンプル挿入部屋５とキャピラリが挿入されるキャピラリ挿入部屋１１がある。なお、本図ではキャピラリの一端のみ図示しているが、キャピラリは図に対して奥方向に延在して設けられている。
【００２４】
試薬溶液は、基本的には、図１で示す平面図の左側から右側に向かって流れる。Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ封入部屋２、Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ封入部屋３の試薬は流路を流れ、例えば、本図の下側に位置する分岐部屋４に至り、さらに最下段に配置された測定サンプル５を流れ、同じ最下段に配置された混合部屋６、ＤＮＡ増幅加熱部屋７、電気泳動マーカ封入部屋８、ホルムアミド封入部屋９、ＤＮＡ変性加熱部屋１０の順に流れ、キャピラリ挿入部屋１１に至る。本実施例では、８サンプルを同時に解析できる構成例であり、図中の最下段を流れるサンプルの場合を説明したが、他のサンプルについても試薬の流れは同様である。
【００２５】
ただし、一部の部屋と部屋の間では、一度進んだ溶液を元の部屋に戻したり、また再度先の部屋に進めたりする往復送液を行って、効率的な試薬溶液の混合を行う。この様な往復送液を行う部屋と部屋の組み合わせとして、サンプル溶解液封入部屋１２と測定サンプル挿入部屋５、ＤＮＡ増幅加熱部屋７と混合部屋６、ホルムアミド封入部屋９と混合部屋６、などが挙げられる。
【００２６】
図２は、核酸分析カートリッジ１の概略を断面図で示す。この断面図は、図１の切断線Ａ−Ａ，に沿うものである。核酸分析カートリッジ１は、下から順に、メンブレン１５、カートリッジ本体１４、上蓋１６、フィルム１７で構成される。作製方法としては、カートリッジ本体１４と上蓋１６を接合した後、カートリッジ本体１４とメンブレン１５を接合、または接着する。その後、封入部屋９上部の開口を介して試薬を封入部屋に封入した後、フィルム１７を貼り合わせて完成する。
【００２７】
核酸分析カートリッジ１は、核酸分析装置のカートリッジホルダに設置して使用する。カートリッジホルダにメンブレンを変動させる機構を持たせておき、メンブレンを変動させて試薬溶液を部屋から部屋へと移動させる。また、カートリッジホルダに加熱する機構を持たせることで、カートリッジ内の試薬溶液を加熱して、ＤＮＡ増幅やＤＮＡ変性を行う。なお、試薬の送液方法に関しては、図１１〜図２０を用いて後述する。
【００２８】
図３を用いて、本発明の核酸分析カートリッジ梱包キット、及び梱包キット作製プロセスの概要を説明する。図３（ａ）は核酸分析カートリッジ１の断面図であり、特に、図１内で示す切断線Ａ−Ａ，に沿う断面箇所を強調したものである。また、図３（ｄ）は、図３（ａ）で示す核酸分析カートリッジ１を本発明の核酸分析カートリッジの梱包キットで梱包した状態を示す。
【００２９】
図３の（ａ）から（ｄ）までを順に説明する。先ず、ホルムアミド２４が封入された核酸分析カートリッジ１のゴム栓１８を取り外し通気口２１を設ける（図３（ａ））。ゴム栓を外した核酸分析カートリッジ１を梱包袋２２に梱包した後（図３（ｂ））、梱包袋２２に減圧操作行い、梱包袋排出口２３から核酸分析カートリッジ１内、及び梱包袋２２内の水蒸気含む空気を排出する（図３（ｃ））。その後、梱包袋排出口を溶着させて、梱包袋内を密閉して、本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットを完成させる（図３（ｄ））。
【００３０】
図３（ｃ）で示すような減圧パーケージにすることで梱包袋２２内の水蒸気濃度を低減するとともに、水蒸気透過性低い梱包袋２２を用いることで輸送、保管時に大気から梱包袋２２内への水蒸気の透過を低減する。通気口２１及び空気穴２０は減圧パッケージ中にホルムアミド封入部屋９内のホルムアミド２４と接する空間内の水蒸気を効率良く排出することで試薬と接する空間の水蒸気濃度を低減する。水蒸気濃度低減は、輸送、保管時のホルムアミド加水分解を減らし、電気泳動時のＤＮＡフラグメント分離能の低下を防ぎ保存安定性を高める。
【００３１】
次に、図４を用いて、本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットのさらなる形態を説明する。図４の核酸分析カートリッジは、ゴム栓１８と通気口２１による弁構造を持つ。図４（ｃ）に示すように、減圧時に図中の幅広の通気口２１にゴム栓１８が下降すると、もう一つの幅が狭い通気口２１から空気などの気体が排出され減圧される。ゴム栓１８は幅広の通気口２１と幅が狭い通気口２１の双方を塞ぎ核酸分析カートリッジを密閉する（図４（ｄ））。
【００３２】
前述の図３の核酸分析カートリッジの通気口２１は梱包袋２２で封止されるのに対して、図４で示す核酸分析カートリッジの通気口２１は、ゴム栓１８及び梱包袋２２により二重に封止されるため、外気からホルムアミド封入部屋９空間への水蒸気透過をより確実に低減することができる。そのため、より高い保存安定性を得ることができる。
【００３３】
また、本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットは、梱包前（図３（ａ）、図４（ａ））に、試薬とカートリッジ材とフィルム材に囲まれた空間を窒素、アルゴン、ヘリウムから選ばれる少なくとも１種類以上のガスで置換してもよい。梱包前のカートリッジ内部空間の水蒸気濃度を低減できるため、減圧パッケージ後のカートリッジ内部空間の水蒸気濃度も低減でき、さらにホルムアミドの加水分解を防止することができる。
【００３４】
本発明で用いる水蒸気透過性が低い梱包袋に用いられる材料としては、特に制限はないが、比重が小さく、曲げ強度が小さいプラスティック材料が望ましい。この様なプラスティック材料として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、アクリル、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリ酢酸ビニル及びこれらの共重合体が挙げられる。これら材料からなるシートを複数種類重ねて一つの梱包材としても良い。複数種類シートを重ねた梱包材について、梱包袋の最内層のプラスティック材料は、梱包袋を低温、短時間で溶着しやすい点で、軟化点が低いプラスティック材料を用いるのが望ましい。この様なプラスティック材料として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、アクリルやこれらの共重合体が挙げられる。また、複数種類シートを重ね合わせた梱包材について、水蒸気透過性を低減するために、アルミニウムなどの金属やシリカの様な無機材料からなる層を梱包材内部に導入しても良い。
【００３５】
また、減圧パッケージ時の梱包袋内の真空度については、特に制限はないが、０．０１〜０．９ａｔｍ程度が望ましい。０．０１ａｔｍ未満は、パッケージ時の梱包袋内の水蒸気排出効果は高いが、減圧パッケージ後の核酸分析カートリッジの変形量が大きくなる。一方、０．９ａｔｍより大きいと水蒸気排出効果が小さくなる。このような理由により、望ましい真空度の範囲が決定される。
【００３６】
また、梱包袋、またはフィルム材の水蒸気透過度について、特に制限はないが、１気圧下２４時間で１００．０ｇ／ｍ２以下であることが望ましい。一般的なポリアセタール、ＡＢＳ樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの樹脂フィルムの水蒸気透過度は約５０．０ｇ／ｍ２である。口が開いたガラス製容器に入ったホルムアミドをこれらの樹脂を用いたフィルム材に梱包し、温度２５℃、湿度６０％の環境下で１年間保持すると、ホルムアミドの加水分解が生じる。一方、５０．０ｇ／ｍ２以下のフィルム材を用いることで、大気中から混入する水蒸気を低減することができ、ホルムアミドの分解を減らすことができる。このような理由により、上述した望ましい水蒸気透過度の範囲が決定される。
【００３７】
また、カートリッジ本体１４や上蓋１６に用いる材料としては、値段が安く、大量生産に適した成型加工可能な熱可塑性のプラスティック材料が望ましい。この様なプラスティック材料として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、アクリル、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリ酢酸ビニル、シクロオレフィン及びこれらの共重合体が挙げられる。また、これらの熱可塑性プラスティック材料に熱硬化性のプラスティック材料、無機材料、または金属材料などを内部に微細分散させた複合材料を用いることもできる。
【００３８】
また、メンブレン１５に用いる材料としては、後述するカートリッジホルダ機構に適した弾性体が望ましい。この様な弾性体としては、イソプレンゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、ニトリルゴム、クロロプレンゴム、ハイパロンゴム、ウレタンゴム、多硫化ゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴム、アクリルゴム、エチレン酢酸ビニルゴム、ヒドリンゴム、及びこれらの共重合体が挙げられる。
【００３９】
また、フィルム１７に用いる材料としては、特に制限はないが、梱包袋に用いられる材料と同様、比重が小さく、曲げ強度が小さいプラスティック材料が望ましい。この様なプラスティック材料として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、アクリル、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリ酢酸ビニル及びこれらの共重合体が挙げられる。これらの材料からなるシートを複数種類重ねて一つのフィルムとしても良い。また、複数種類シートを重ね合わせたフィルムについて、水蒸気透過性を低減するために、アルミニウムなどの金属やシリカの様な無機材料からなる層を内部に導入しても良い。
【００４０】
また、核酸分析カートリッジを組み立てるための、カートリッジ本体１４とメンブレン１５、カートリッジ本体１４と上蓋１６、上蓋１６とフィルム１７の接着、または接合についても特に制限はなく、接着剤や両面テープを用いた接着、熱溶着、超音波溶着、レーザ溶着などの接合、シランカップリング材や溶剤などを用いた化学的接合を用いることができる。
【００４１】
図５に、本発明の核酸分析カートリッジ１のさらなる一例を示す。図２に示す核酸分析カートリッジとの違いは、ホルムアミド封入部屋９はホルムアミド２４が保持される部屋と上部のもう一つの部屋に分割されていることであり、さらに、二つの部屋の間に二つのオリフィス３３が設けられていことである。二つの部屋の間に空間断面積が小さいオリフィスが存在するため、ホルムアミド２４が空気穴２０を介して隣の混合部屋６などに飛散するのを防止することができる。従って、飛散防止できるため、最初に封入する試薬容量を低減することができ、解析コストを低減することができる効果がある。
【実施例２】
【００４２】
本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットの作製プロセスの一例を図１〜３を用いて説明する。本実施例では、射出成型プロセスを用いて、図２に示すカートリッジ本体１４と上蓋１６を作製する。ここで、それぞれの材質はポリプロピレンとする。
【００４３】
次に、カートリッジ本体１４と上蓋１６を超音波溶着を用いて接合した後、両面テープ（本実施例では、日東電工社製を使用）を用いて、カートリッジ本体１４とメンブレン１５を貼り合わせる。メンブレン１５には、厚さ０．２ｍｍｔのシリコンゴムシート（品名：T_30、イノアックコーポレーション社製）を用いる。試薬封入部屋にＳＴＲ解析用キット（品名：AmpFlSTR Identifiler Direct PCR Amplification Kit、ライフテクノロジーズ社製）、細胞溶解液（品名：Prep-n-GoTM Buffer、ライフテクノロジーズ社製）、ホルムアミド（品名：Hi-Di Formamide、ライフテクノロジーズ社製）、及び電気泳動マーカ（品名：GeneScan 500LIZ、ライフテクノロジーズ社製）を封入する。その後、上蓋１６上にフィルム１７（品名：プレートシールMS-30020、秋田住友ベーク株式会社製）を貼り合わせる。その後、図３に示すように梱包袋２２（品名：アルミラミジップ、アズワン株式会社製）に核酸分析カートリッジ１を梱包した後、抜気シーラ（品面：FCB-200、富士インパルス販売株式会社製）を用いて溶着し、本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットを作製する。
【実施例３】
【００４４】
図６を用いて、ＳＴＲ解析を行い、核酸分析カートリッジを検出するための核酸分析装置の概要を説明する。
核酸分析装置は、カートリッジホルダ２６、送液・温調ユニット２７、送液ポンプ２８、電気泳動キャピラリ２９、レーザユニット３０、検出ユニット３１、コントロール基板ユニット３２からなる。
【００４５】
カートリッジホルダ２６は、核酸分析カートリッジ１を保持する。また、カートリッジ内の試薬溶液を移送するためにカートリッジ下部のメンブレン１５を変動する機構、ならびにカートリッジを温調する機構を持つ。送液・温調ユニット２７は、カートリッジホルダ２６のメンブレン変動機構と温調機構、及び送液ポンプ２８を制御する。
【００４６】
電気泳動キャピラリ２９は、核酸分析カートリッジ１に接続し、カートリッジ内で増幅、蛍光ラベル化されたＤＮＡフラグメントを吸引した後、高電圧下でＤＮＡフラグメントを分離する。レーザユニット３０は、電気泳動キャピラリ２９にレーザを照射して電気泳動キャピラリ２９内の蛍光分子を励起する。検出ユニット３１は、励起された蛍光分子を検出する。
【００４７】
図７を用いて、送液・温調ユニット２７（図６参照）に内蔵されている、カートリッジ下部のメンブレン１５（図２参照）を変動させる空気圧制御システムの構成を説明する。空気圧の駆動源となる送液ポンプ２８が空気の吸引・吐出を行う。吐出された空気は、配管を通りフィルタ３４、空気圧調整弁３５を通り、三方弁マニホールド３６のＩＮ側に接続される。三方弁マニホールド３６には三方弁３７が連なって搭載されており、同じ流路でそれぞれ接続される。三方弁３７からはそれぞれ配管が接続され、それぞれスピードコントローラ３８を通り、カートリッジホルダ２６（図６参照）へと接続される。三方弁マニホールド３６には大気解放となっている排気用のＯＵＴ側流路もある。そのＯＵＴ側流路の出口にはサイレンサ３９を取り付ける。
【００４８】
送液ポンプ２８から吐出された空気がフィルタ３４を通ることで、空気に含まれるゴミや埃を取り除く。これにより、三方弁３７やスピードコントローラ３８への異物混入を防ぐ。また、空気圧調整弁３５にて、カートリッジホルダ２６へ与えられる空気圧を適切な圧力に調整することが可能となる。三方弁３７は、三方弁マニホールド３６に搭載することで、配管の接続を１箇所に纏めることが出来る。仮に三方弁３７の数が増えても配管の接続は１つで済むため、よりコンパクトに収めることができる。三方弁３７に接続される配管にそれぞれスピードコントローラ３８を接続することで、空気圧の流量を制御することが出来る。今回は空気圧にて送液を行うため、流量の管理が重要となる。また、圧力の高まった配管を大気解放した際に音が発生するため、ＯＵＴ側出口にサイレンサ３９を設け、音を小さくする。
【００４９】
図８は、空気圧制御システムに構成される三方弁３７の方向制御を示した図である。今回の配管は、ＩＮ側からカートリッジホルダ２６（図６参照）側へ繋がる空気圧流路４０、カートリッジホルダ２６側からＯＵＴ側へ繋がる空気圧流路４１がそれぞれ三方弁３７にて切り替えられるようになる。三方弁３７はノーマルクローズとし、通常状態では空気圧流路４０が閉じた状態になり、空気圧流路４１が繋がるようになる。この時、ＩＮ側から来た空気は三方弁マニホールド３６に接続されるが、空気圧流路４０が閉じているため、カートリッジホルダ２６側には空気圧はかからない。だが、空気圧流路４１が開放しているため、カートリッジホルダ２６側とＯＵＴ側の流路は大気解放となる。三方弁３７を通電状態にすると、空気圧流路４０が開放となり、空気圧流路４１が閉じる。この時、ＩＮ側から来た空気は三方弁マニホールド３６に接続され、空気圧流路４０が開放しているためカートリッジホルダ２６側に空気を送ることが出来る。また、空気圧流路４１が閉じているため、カートリッジホルダ２６側に空気圧を与えることが可能となる。それぞれ、三方弁３７を介してカートリッジホルダ２６側へ配管を接続しているので、任意の流路に空気圧を与えることが可能となる。
【００５０】
図９は、カートリッジホルダ２６（図６参照）内のメンブレン変動による送液機構を示す。カートリッジホルダ本体５０には、核酸分析カートリッジ１をセットした時に、空気圧制御システムで駆動させ、弁の働きをさせるピン５１、ピン５２が内蔵される。ピン５１、ピン５２にはそれぞれにパッキン５３、パッキン５５が取り付けられる。ピン５１、ピン５２先端部には、カートリッジホルダ本体５０側にパッキン５４、パッキン５６が内蔵される。カートリッジホルダ本体５０には、核酸分析カートリッジ１をセットした時にメンブレン１５を潰して、核酸分析カートリッジ１の流路１３周りを塞ぐことができるような封止用突起５７を設けておく。また、カートリッジホルダ本体５０には、空気圧制御システムと接続される空気圧ポート５８、５９、６０、６１、６２が形成される。それぞれの空気圧ポートが空気圧制御システムの三方弁３７と接続されるため、それぞれを別々に制御することが可能となる。
【００５１】
カートリッジホルダ本体５０は、アクリル樹脂が好ましい。核酸分析カートリッジ１の送液箇所が増えれば増えるほど、カートリッジホルダ本体５０の空気圧用の流路が複雑となる。アクリルなら接合や接着が可能なため、複雑な流路にも対応できる。送液箇所の増加に伴い、ピン５１、ピン５２の数も増えるため、ＰＰＳ樹脂等の剛性のある樹脂で成形するのが望ましい。ただし、成形で作った場合にはパーティングラインより空気がリークする恐れがあるため注意が必要である。パッキン５３、パッキン５４、パッキン５５、パッキン５６は空気圧往復運動用のパッキンとし、摺動部分には真空グリスも塗布する。これにより、ピン５１、ピン５２を駆動させた時の摺動抵抗を減らす。
【００５２】
図１０は、核酸分析カートリッジ１（図１参照）をカートリッジホルダ２６（図６参照）にセットした時の図である。セットした時、カートリッジホルダ本体５０にある封止用突起５７にてメンブレン１５を潰し、流路１３周りを塞ぐ。カートリッジホルダ２６にはピン５１を押しこむための空気圧ポート６０、ピン５１を元の位置に戻すための空気圧ポート５９、ピン５２を押しこむための空気圧ポート６２、ピン５２を元の位置に戻すための空気圧ポート６１があり、各ポートにそれぞれ空気圧制御システムからの配管を接続させる。これにより、空気圧制御システムにて各ポートに空気圧を供給して、エアシリンダのように各ピンをそれぞれ駆動させる。また、流路１３にメンブレン１５を押しつけるための空気圧ポート５８も形成してある。ただし、各ポートに空気圧制御システムの配管を接続しただけではカートリッジホルダ２６へ空気圧は与えられない。先に説明した三方弁３７の方向制御により、通常状態ではカートリッジホルダ２６の各ポートは全て大気解放となる。
【００５３】
図７、及び図１１〜２０にて、本発明の核酸分析カートリッジ１内での送液の流れを示す。
送液を行う前準備として、まずは、カートリッジホルダ２６と空気圧制御システムを接続させる前に送液ポンプ２８を駆動させる。三方弁３７はノーマルクローズのため、送液ポンプ２８と三方弁３７間の圧力が高まる。その状態で圧力調整弁３５にて適切な圧力に調整する。その後、各三方弁３７を通電し、空気圧流路４０を開放し、空気圧流路４１を閉じる。すると、カートリッジホルダ２６に接続される配管に空気が送られるため、その状態でスピードコントローラ３８にてカートリッジホルダ２６へ接続される各配管の流量を調整する。空気の圧力、流量の調整が終了してから、カートリッジホルダ２６に空気圧制御システムを接続し、カートリッジホルダ２６に核酸分析カートリッジ１をセットする。
【００５４】
以下、空気圧の制御方法、それに伴うピンや流体の動きを説明する。まず、空気圧ポート５９の三方弁３７、空気圧ポート６１の三方弁３７を開放する。これにより、図１１のように、ピン５１、ピン５２が下がる。この状態をピンの初期位置とする。
【００５５】
次に空気圧ポート６０の三方弁３７を開放し、空気圧ポート５９の三方弁３７を閉じる。これにより、空気圧ポート５９側に溜まった空気圧が大気解放となり、空気圧ポート６０側から空気圧がかかるため、図１２のように、空気圧でピン５１が核酸分析カートリッジ１に押し付けられる。ピン５１はメンブレン１５を介してホルムアミド封入部屋９を塞ぐ栓１９を押し上げる。すると、ホルムアミド封入部屋９を塞いでいた栓１９が開放される。一度開放した栓１９は押し上げられた位置から動かないようにしておくことで、今後ずっと開放しっぱなしとなる。だが、ピン５１がホルムアミド封入部屋９と流路１３の間に押し付けられているので、ホルムアミド封入部屋９と流路１３の間は塞がったままとなる。
【００５６】
次に、空気圧ポート５８の三方弁３７を開放する。すると、図１３のように、メンブレン１５が空気圧で押され、流路１３に密着する。これにより、元々流路１３に入っていた空気を混合部屋６に押し出すことが出来る。核酸分析カートリッジ１は内部が密閉されているため、この間は核酸分析カートリッジ１内部の圧力が高まる。ホルムアミド封入部屋９と混合部屋６の間には部屋上部を通る空気穴２０があるため、各部屋の圧力は同じとなる。
【００５７】
次に、空気圧ポート６２の三方弁３７を開放し、空気圧ポート６１の三方弁３７を閉じる。これにより、空気圧ポート６１側に溜まった空気圧が大気解放となり、空気圧ポート６２側から空気圧がかかるため、図１４のように、空気圧でピン５２が核酸カートリッジ１に押し付けられる。ピン５２がメンブレン１５を介して混合部屋６と流路１３の間に押し付けられるため、混合部屋６と流路１３の間を塞ぐ。
【００５８】
次に、空気圧ポート６０の三方弁３７を閉じ、空気圧ポート５９の三方弁３７を開放する。これにより、空気圧ポート６０側に溜まった空気圧が大気開放となり、空気圧ポート５９側から空気圧がかかるため、図１５のように、ピン５１が元の位置に戻る。メンブレン１５は、空気圧ポート５８から空気圧がかかったままなので、流路１３に押し付けられたままとなる。
【００５９】
次に、空気圧ポート５８の三方弁３７を閉じる。これにより、空気圧ポート５８側に溜まった空気圧が大気開放となり、図１６のように、流路１３に押し付けられたメンブレン１５が自身の弾性力と、核酸カートリッジ１内部の圧力により元の位置に戻る。その際、ピン５２により混合部屋６と流路１３は塞がったままなので、ホルムアミド封入部屋９から試薬が流路１３に流れ込み、ホルムアミド封入部屋９へ混合部屋６の空気が空気穴２０を通り移動する。
【００６０】
次に、空気圧ポート６０の三方弁３７を開放し、空気圧ポート５９の三方弁３７を閉じる。これにより、空気圧ポート５９側に溜まった空気圧が大気開放となり、空気圧ポート６０側から空気圧がかかるため、図１７のように、再度ピン５１が核酸カートリッジ１に押し付けられる。この時、ピン５１にて再度ホルムアミド封入部屋９と流路１３の間が塞がるが、流路１３には試薬が入ったままとなる。
【００６１】
次に、空気圧ポート６２の三方弁３７を閉じ、空気圧ポート６１の三方弁３７を開放する。これにより、空気圧ポート６２側に溜まった空気圧が大気開放となり、空気圧ポート６１側から空気圧がかかるため、図１８のように、ピン５２が元の位置に戻る。
【００６２】
次に、再度空気圧ポート５８の三方弁３７を開放する。これにより、図１９のように、メンブレン１５が空気圧で押され、流路１３に密着する。その際、ピン５１によりホルムアミド封入部屋９と流路１３の間が塞がったままなので、流路１３に溜まった試薬は混合部屋６に流れ込む。その結果、封入されていたサンプルに試薬が混合される。
【００６３】
次に、再度空気圧ポート６１の三方弁３７を閉じ、空気圧ポート６２の三方弁３７を開放する。これにより、空気圧ポート６１側に溜まった空気圧が大気開放となり、空気圧ポート６２側から空気圧がかかるため、図２０のように、ピン５２が核酸分析カートリッジ１に押し付けられる。この時、ピン５２にて混合部屋６と流路１３の間を塞ぐ。
【００６４】
図１４〜図２０と、本動作を繰り返すことで、ホルムアミド封入部屋９に封入してある試薬を、混合部屋６へ送液することができる。これにより、密閉された核酸分析カートリッジ１内部で、流体と非接触のまま送液を行うことが可能となる。本動作を何回も繰り返すことで、微量の試薬でも、容量の大きい試薬でも、部屋の中にある全ての試薬を送液することができる。ただし、精製や反応などを行った後等は、部屋にある試薬全てではなく、ある容量のみを送液したい場合がある。その際は、本動作を繰り返す回数を管理することで、規定の容量のみの送液が可能となる。
【００６５】
この構造を各部屋間の流路毎に持たせ、同様の動作を行うことで、様々な試薬を任意のタイミングで送液することが可能となる。また、精製や反応、攪拌を行う際、各部屋間を任意に封止しておくことが出来るため、流体の制御を安定させることが出来る。
【００６６】
遺伝子解析における前処理に必要な試薬の種類は多数ある。それに対し、本システムを取ることで、駆動源は空気圧制御システムに構成される送液ポンプ２８のみのまま、多数の試薬に対応できる。また、装置上での核酸分析カートリッジ１の増設などがあった場合も、本システムに三方弁３７と配管の接続を増設することで、駆動源を増やすことなく対応できる。このため、汎用性があるシステムだと言える。さらに、装置原価の低減や装置小型化も可能となる。
【実施例４】
【００６７】
本発明の核酸分析カートリッジ梱包キットと実施例２の核酸分析装置を用いてＳＴＲ解析を行う方法を説明する。
【００６８】
スワブ（品名：４Ｎ６TM  ＦＬＯＱ  Ｓｗａｂｓ（登録商標）、ＣＯＰＡＮ社製）を用いて、被験者の口腔細胞を採取する。梱包袋の中から核酸分析カートリッジを取りだした後、核酸分析カートリッジ上の測定サンプル挿入部屋５に口腔細胞が付着したスワブを挿入した後、ゴム栓１８で測定サンプル挿入部屋５を封止した後、核酸分析カートリッジ１をカートリッジホルダ２６に装着する。その後、核酸分析装置は自動で作動し、（１）ＤＮＡサンプル採取、（２）ＤＮＡ増幅、（３）ＤＮＡ変性、（４）ＤＮＡフラグメントの分離、検出からなるＳＴＲ解析を行う。なお、装置の動作条件は以下の通りとする。
○装置の動作条件
（１）ＤＮＡサンプル採取：  口腔細胞をＰｒｅｐ−ｎ−ＧｏTM  Ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）に５分間浸漬する。
（２）ＤＮＡ増幅：  ９５℃／１０分保持→温度サイクル（サイクル数：２５回、１サイクル条件：９４℃／２０秒→５９℃／２分→７２℃／１分）→６０℃／２５分保持→４℃／２５分保持
（３）ＤＮＡ変性：ホルムアミドを混合後、９５℃／３分保持
（４）ＤＮＡフラグメントの分離、検出：インジェクション１．２ｋＶ／１５ｓｅｃ
【符号の説明】
【００６９】
１…核酸分析カ−トリッジ、
２…Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ封入部屋、
３…Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ封入部屋、
４…分岐部屋、
５…測定サンプル挿入部屋、
６…混合部屋、
７…ＤＮＡ増幅加熱部屋、
８…電気泳動マーカ封入部屋、
９…ホルムアミド封入部屋、
１０…ＤＮＡ変性加熱部屋、
１１…キャピラリ挿入部屋、
１２…サンプル溶解液封入部屋、
１３…流路、
１４…カートリッジ本体、
１５…メンブレン、
１６…上蓋、
１７…フィルム、
１８…ゴム栓、
１９…栓、
２０…空気穴、
２１…通気口、
２２…梱包袋、
２３…梱包袋排出口、
２４…ホルムアミド、
２５…弁構造、
２６…カートリッジホルダ、
２７…送液・温調ユニット、
２８…送液ポンプ、
２９…電気泳動キャピラリ、
３０…レーザユニット、
３１…検出ユニット、
３２…コントロール基板ユニット、
３３…オリフィス、
３４…フィルタ、
３５…空気圧調整弁、
３６…三方弁マニホールド、
３７…三方弁、
３８…スピードコントローラ、
３９…サイレンサ、
４０…空気圧流路
５０…カートリッジホルダ本体、
５１，５２…ピン、
５３，５４，５５，５６…パッキン、
５７…封止用突起、
５８，５９，６０，６１，６２…空気圧ポート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2014081329.tif 000016
【図１５】
2014081329.tif 000017
【図１６】
2014081329.tif 000018
【図１７】
2014081329.tif 000019
【図１８】
2014081329.tif 000020
【図１９】
2014081329.tif 000021
【図２０】
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