(57)【要約】      （修正有）【課題】水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規物質の提供。【解決手段】下記一般式（I）：2014218456.tif 000023、又は、下記一般式（II）：2014218456.tif 000024で表される化合物のハロゲン化水素塩。【選択図】図４
2014218456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）：
【化１】
2014218456.tif 000020
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ3はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｎは０〜３の整数であり、ｍは０〜４の整数である］、又は、
下記一般式（II）：
【化２】
2014218456.tif 000021
［式中、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立して０〜４の整数である］で表される化合物のハロゲン化水素塩。
【請求項２】
前記一般式（I）又は前記一般式（II）で表される化合物の塩酸塩又は臭化水素酸塩であることを特徴とする請求項１に記載のハロゲン化水素塩。
【請求項３】
前記一般式（I）中のＲ1及びＲ2、並びに、前記一般式（II）中のＲ4及びＲ5が、炭素数１〜３のアルキル基であることを特徴とする請求項１又は２に記載のハロゲン化水素塩。
【請求項４】
前記一般式（I）中のＲ1及びＲ2、並びに、前記一般式（II）中のＲ4及びＲ5が、メチル基であることを特徴とする請求項３に記載のハロゲン化水素塩。
【請求項５】
前記一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のハロゲン化水素塩。
【請求項６】
下記化学式（III）：
【化３】
2014218456.tif 000022
で表される化合物の塩酸塩又は臭化水素酸塩であることを特徴とする請求項５に記載のハロゲン化水素塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハロゲン化水素塩、特には、水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能なハロゲン化水素塩に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物発光系の中でも、ホタルの発光系は、発光効率に優れた系として知られている。該ホタルの発光系においては、発光基質であるホタルルシフェリンが、発光酵素のホタルルシフェラーゼと、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在下、励起状態のオキシルシフェリンに変換され、該オキシルシフェリンが基底状態へと失活する際に波長が約５６０ｎｍの黄緑色の蛍光が発せられる。
【０００３】
また、昨今、かかるホタルの発光系の発光基質の類似体として、多彩な発光波長を実現する化合物が合成されている。例えば、下記特許文献１には、ホタルルシフェリンのフェノール性水酸基を２級又は３級アミノ基で置換したルシフェリン誘導体が開示されている。また、下記特許文献２及び３には、ホタルルシフェリンと類似の分子構造を有するルシフェラーゼの発光基質が開示されている。
【０００４】
これらのホタルルシフェリン類似体の中でも、長波長の光、特には、波長が６５０ｎｍ以上の赤色の光を発する発光基質は、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有望であり、例えば、和光純薬工業株式会社から商品名「アカルミネ」として、長波長光を発するホタルルシフェリン類似体が市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−９１６９５号公報
【特許文献２】特開２００９−１８４９３２号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／０２７７７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
また、本発明者らは、更に検討を進め、ホタルルシフェリンと類似の分子構造を有しつつ、分子構造内に２つの芳香環を有する化合物がホタル生物発光系における発光基質として機能し、更に、長波長の光を発することを見出している。
【０００７】
しかしながら、上記ホタル発光系の発光基質類似体は、多彩な発光波長を実現できるものの、水溶性が低く、特に、生体内深部の可視化に有用な６５０ｎｍ以上の波長の光を発する発光基質で顕著である。一般に、マウスやラット等の実験動物の生体内への投与においては、発光基質は１０〜１５ｍｇ／ｍｌ程度の溶解度を有することが必要であるが、上記の長波長光を発する発光基質は、水への溶解度が約０．１ｍｇ／ｍｌであり、実用性に問題が有った。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の問題を解決し、水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、特定の分子構造を有し、ホタル生物発光系における発光基質として機能する水に難溶性の発光基質を、ハロゲン化水素で塩化することで、ホタル生物発光系における発光能を保持しつつ、水溶性が大幅に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、下記一般式（I）：
【化１】
2014218456.tif 000003
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ3はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｎは０〜３の整数であり、ｍは０〜４の整数である］、又は、
下記一般式（II）：
【化２】
2014218456.tif 000004
［式中、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立して０〜４の整数である］で表される化合物のハロゲン化水素塩が提供され、該ハロゲン化水素塩は、水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。
【００１１】
本発明のハロゲン化水素塩は、好ましくは前記一般式（I）又は前記一般式（II）で表される化合物の塩酸塩又は臭化水素酸塩である。この場合、ハロゲン化水素塩の水溶性が特に優れる。
【００１２】
本発明のハロゲン化水素塩の他の好適例においては、前記一般式（I）中のＲ1及びＲ2、並びに、前記一般式（II）中のＲ4及びＲ5が、炭素数１〜３のアルキル基である。ここで、前記一般式（I）中のＲ1及びＲ2、並びに、前記一般式（II）中のＲ4及びＲ5は、メチル基であることが更に好ましい。この場合、ハロゲン化水素塩の発光効率が特に優れる。
【００１３】
本発明のハロゲン化水素塩の中でも、前記一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩が好ましく、下記化学式（III）：
【化３】
2014218456.tif 000005
で表される化合物の塩酸塩又は臭化水素酸塩が特に好ましい。この場合、ハロゲン化水素塩の水溶性、発光効率、生体内深部の可視化、入手容易性が特に優れる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規ハロゲン化水素塩を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アカルミネのＩＲスペクトルを示す。
【図２】アカルミネ塩酸塩のＩＲスペクトルを示す。
【図３】アカルミネのＵＶスペクトルを示す。
【図４】アカルミネ塩酸塩のＵＶスペクトルを示す。
【図５】アカルミネ、アカルミネ塩酸塩及びアカルミネ臭化水素酸塩の発光強度を示す。
【図６】アカルミネ、アカルミネ塩酸塩及びアカルミネ臭化水素酸塩の発光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明のハロゲン化水素塩は、上記一般式（I）又は一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩であり、好ましくは下記一般式（IV）：
【化４】
2014218456.tif 000006
［式中、Ｘ1はハロゲン元素であり、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ3はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｎは０〜３の整数であり、ｍは０〜４の整数であり、ａは０を超え且つ２以下である］、又は、
下記一般式（V）：
【化５】
2014218456.tif 000007
［式中、Ｘ2はハロゲン元素であり、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立して０〜４の整数であり、ｂは０を超え且つ２以下である］で表される。本発明のハロゲン化水素塩は、ハロゲン化水素が付加しているため、水溶性に優れ、また、分子構造がホタルルシフェリンと類似しているため、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。
【００１７】
＜一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩、一般式（IV）で表されるハロゲン化水素塩＞
上記一般式（IV）中、Ｘ1はハロゲン元素であり、該ハロゲン元素として、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、これらの中でも、水溶性の観点から、塩素及び臭素が好ましい。即ち、一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩及び一般式（IV）で表されるハロゲン化水素塩としては、塩酸塩及び臭化水素酸塩が好ましい。
【００１８】
上記一般式（I）及び（IV）中、Ｒ1及びＲ2は水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ1及びＲ2は同一でも異なってもよい。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基が挙げられる。なお、Ｒ1及びＲ2としては、発光効率の観点から、炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００１９】
上記一般式（I）及び（IV）中、Ｒ3は炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、Ｒ3が複数存在する場合、各Ｒ3は同一でも異なってもよい。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、オクチル基等が挙げられ、アルケニル基としては、ビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
また、上記一般式（I）及び（IV）中、Ｒ3はベンゼン環の置換基であり、該置換基の数を示すｍは０〜４の整数である。なお、本発明においては、合成の容易性の観点から、ｍが０であること、即ち、ベンゼン環に置換基Ｒ3が存在しないことが好ましい。
【００２０】
上記一般式（I）及び（IV）中、ｎはビニレン単位（−ＣＨ＝ＣＨ−）の繰り返し数を示し、０〜３の整数である。ｎの数が大きい程、発光波長が長くなるため、生体内深部の可視化の観点から、ｎは２又は３であることが好ましく、入手容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。
【００２１】
上記一般式（IV）中、ａはハロゲン化水素（ＨＸ1）の平均付加数を示し、０を超え且つ２以下であり、好ましくは１である。なお、一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩及び一般式（IV）で表されるハロゲン化水素塩においては、分子中の２つの窒素原子にハロゲン化水素が付加し得る。
【００２２】
上記一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩（特には、上記一般式（IV）で表されるハロゲン化水素塩）は、以下のようにして合成することができる。例えば、特開２００９−１８４９３２号公報（上記特許文献２）に記載のように、出発物質として４−ジメチルアミノシンナミックアルデヒド等のアルデヒドを使用し、カルベトキシメチレントリフェニルホスフォランと反応させてエチルエステル体を得、次いで、該エチルエステル体を水酸化ナトリウム水溶液中でカルボキシル体に変換する。一方、Ｄ−システイン−Ｓ−トリチル化合物を塩化水素、１，４−ジオキサン溶液中で反応させて、メチルエステル体を準備し、次いで、該メチルエステル体を前記カルボキシル体とを反応させて、アミド体を生成させる。次いで、該アミド体をトリフェニルホスフィンオキシド及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物によって環化させて複素環を生成させ、チアゾリン体を得る。次いで、チアゾリン体のメチルエステル部分を加水分解して、チアゾリン環を有するカルボキシル体（即ち、上記一般式（I）で表される化合物）を得る。次いで、チアゾリン環を有するカルボキシル体とハロゲン化水素（塩化水素、臭化水素等）を反応させて、一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩（特には、上記一般式（IV）で表されるハロゲン化水素塩）を得ることができる。また、出発物質を適宜変更したり、種々の置換基を導入する等して、或いは、他の合成経路を利用して、所望のハロゲン化水素塩を得ることができる。なお、チアゾリン環を有するカルボキシル体とハロゲン化水素との反応において、反応温度は、特に限定されず、また、ハロゲン化水素の使用量も目的に応じて変更できるが、好ましくは、ハロゲン化水素をチアゾリン環を有するカルボキシル体に対して過剰量使用することが好ましい。
また、カルボキシル体として市販の商品名「アカルミネ」（和光純薬工業株式会社製、黒金化成株式会社からも入手可、上記化学式（III）で表される化合物）を使用し、該アカルミネとハロゲン化水素を反応させて、上記化学式（III）で表される化合物のハロゲン化水素塩を得ることもできる。
【００２３】
＜一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩、一般式（V）で表されるハロゲン化水素塩＞
上記一般式（V）中、Ｘ2はハロゲン元素であり、該ハロゲン元素として、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、これらの中でも、水溶性の観点から、塩素及び臭素が好ましい。即ち、一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩及び一般式（V）で表されるハロゲン化水素塩としては、塩酸塩及び臭化水素酸塩が好ましい。
【００２４】
上記一般式（II）及び（V）中、Ｒ4及びＲ5は水素又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ4及びＲ5は同一でも異なってもよい。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基が挙げられる。なお、Ｒ4及びＲ5としては、発光効率の観点から、炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００２５】
上記一般式（II）及び（V）中、Ｒ6及びＲ7は炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数２〜８のアルケニル基であり、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ同一でも異なってもよい。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、オクチル基等が挙げられ、アルケニル基としては、ビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
また、上記一般式（II）及び（V）中、Ｒ6及びＲ7は各ベンゼン環の置換基であり、該置換基の数を示すｐ及びｑは０〜４の整数であり、ｐ及びｑはそれぞれ同一でも異なってもよい。なお、本発明においては、合成の容易性の観点から、ｐ及びｑが０であること、即ち、各ベンゼン環に置換基Ｒ6及びＲ7が存在しないことが好ましい。
【００２６】
上記一般式（V）中、ｂはハロゲン化水素（ＨＸ2）の平均付加数を示し、０を超え且つ２以下であり、好ましくは１である。なお、一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩及び一般式（V）で表されるハロゲン化水素塩においては、分子中の２つの窒素原子にハロゲン化水素が付加し得る。
【００２７】
上記一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩（特には、上記一般式（V）で表されるハロゲン化水素塩）は、以下のようにして合成することができる。例えば、出発物質として４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸を使用し、４−ヨード安息香酸エチルと反応させてビフェニルエチルエステル体を得、次いで、該ビフェニルエチルエステル体を水酸化ナトリウム水溶液中でカルボキシル体に変換する。一方、Ｄ−システインメチルエステル塩酸塩をトリフェニルメタノールと反応させて、Ｄ−システイン−Ｓ−トリチル化合物のメチルエステル体を準備し、次いで、該メチルエステル体を前記カルボキシル体をと反応させて、アミド体を生成させる。次いで、該アミド体をトリフェニルホスフィンオキシド及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物によって環化させて複素環を生成させ、チアゾリン体を得る。次いで、チアゾリン体のメチルエステル部分を加水分解して、チアゾリン環を有するカルボキシル体（即ち、上記一般式（II）で表される化合物）を得る。次いで、チアゾリン環を有するカルボキシル体とハロゲン化水素（塩化水素、臭化水素等）を反応させて、一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩（特には、上記一般式（V）で表されるハロゲン化水素塩）を得ることができる。また、出発物質を適宜変更したり、種々の置換基を導入する等して、或いは、他の合成経路を利用して、所望のハロゲン化水素塩を得ることができる。なお、チアゾリン環を有するカルボキシル体とハロゲン化水素との反応において、反応温度は、特に限定されず、また、ハロゲン化水素の使用量も目的に応じて変更できるが、好ましくは、ハロゲン化水素をチアゾリン環を有するカルボキシル体に対して過剰量使用することが好ましい。
【００２８】
上述した一般式（I）又は一般式（II）で表される化合物のハロゲン化水素塩の中でも、水溶性、発光効率、合成の容易性の観点から、上記一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩が好ましい。
【００２９】
また、一般式（I）で表される化合物のハロゲン化水素塩の中でも、水溶性、発光効率、生体内深部の可視化、入手容易性の観点から、上記化学式（III）で表される化合物の塩酸塩及び臭化水素酸塩が好ましく、下記一般式（VI）：
【化６】
2014218456.tif 000008
［式中、ａは０を超え且つ２以下である］で表される塩酸塩、及び、
下記一般式（VII）：
【化７】
2014218456.tif 000009
［式中、ａは０を超え且つ２以下である］で表される臭化水素酸塩が特に好ましい。なお、一般式（VI）及び一般式（VII）中、ａは塩化水素（ＨＣｌ）又は臭化水素（ＨＢｒ）の平均付加数を示し、０を超え且つ２以下であり、好ましくは１である。
【００３０】
本発明のハロゲン化水素塩は、発光甲虫ルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在する系に添加することによって、発光甲虫ルシフェラーゼにより酸化して発光する。なお、本発明のハロゲン化水素塩は、ＡＴＰ及びＭｇ2+と共に発光検出キットとして提供することもでき、また、該発光検出キットには、他の発光基質や適切なｐＨに調整した溶液を含めてもよい。
【００３１】
本発明のハロゲン化水素塩を発光系に応用する場合、好適な発光強度を得るためには、本発明のハロゲン化水素塩を１μＭ以上の濃度で使用することが好ましく、５μＭ以上の濃度で使用することが更に好ましい。また、発光系のｐＨは、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８であり、必要に応じて、ｐＨを安定化するために、リン酸カリウム、トリス塩酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を使用してもよい。
【００３２】
また、本発明のハロゲン化水素塩は、ホタル発光甲虫ルシフェラーゼ発光系において、種々の酸化酵素によって発光させることができる。ルシフェラーゼは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）、鉄道虫（Railroad worm）等から単離されており、いずれも使用できる。また、使用可能な酸化酵素としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ等も挙げられる。
【００３３】
本発明のハロゲン化水素塩を発光基質とする生物発光は、発光系にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ピロリン酸又はマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）が存在すると、その発光が増強される。これらの化合物の発光増強効果は、発光系におけるＣｏＡ、ピロリン酸又はＭｇ2+の濃度がそれぞれ５μＭ以上において顕著であり、濃度の増加にしたがって発光が増強される。
【００３４】
ホタル生物発光系を測定／検出に使用するためには、酵素の失活を防止してプラトーな発光挙動を示すように、発光を安定化させることが好ましく、例えば、発光系にマグネシウムイオンを存在させることが好ましく、マグネシウムイオンとピロリン酸を共存させることが更に好ましい。なお、マグネシウムイオン単独の場合、発光安定化の観点から、発光系のマグネシウムイオン濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、濃度の増加に従って発光の安定性が向上する。また、ピロリン酸マグネシウムを使用する場合、発光安定化の観点から、発光系のピロリン酸マグネシウム濃度は、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上が更に好ましい。なお、ピロリン酸とマグネシウムイオンとの割合は、当量比でなくてもよい。また、好適なマグネシウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸塩、酢酸マグネシウム等の有機酸塩が挙げられる。また、好適なピロリン酸塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属のピロリン酸塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のピロリン酸塩、鉄のピロリン酸塩が挙げられる。
【００３５】
本発明のハロゲン化水素塩は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明のハロゲン化水素塩をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明のハロゲン化水素塩を結合させることができる。
【００３６】
また、本発明のハロゲン化水素塩は、発光基質の発光によって発光甲虫ルシフェラーゼ活性を検出することを利用した測定／検出に利用することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞又は動物に対して本発明のハロゲン化水素塩を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現などを測定／検出することができる。なお、波長の長い光は、光透過性が高く、組織透過性も高い。従って、本発明のハロゲン化水素塩の中でも、長波長の発光を有するハロゲン化水素塩は、生体内深部を可視化するための標識材料として有用である。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３８】
（１）機器分析及び測定装置
ｐＨ測定：東洋濾紙株式会社製ｐＨ試験紙ＵＮＩＶを使用して測定した。また、ｐＨメータとして、堀場社製ｐＨ／ＩＯＮ ＭＥＴＥＲ Ｆ−２３を使用して測定した。
【００３９】
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ）：日本電子社製Ｌａｍｂｄａ−２７０型装置（２７０ＭＨｚ）を使用して測定した。“1Ｈ ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：δケミカルシフト値（水素の数，多重度，スピン結合定数）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルは、ｂｒと記した。スピン結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで記載した。
【００４０】
（２）クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７１５）厚さ０．２５ｍｍを使用した。ＴＬＣ上の化合物の検出はＵＶ照射（２５４ｎｍ又は３６５ｎｍ）及び発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはｐ−アニスアルデヒド（９．３ｍｌ）と酢酸（３．８ｍｌ）をエタノール（３４０ｍｌ）に溶解し、濃硫酸（１２．５ｍｌ）を添加したものを使用した。
【００４１】
分取用薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７４４）厚さ０．５ｍｍを用いるか、又はＥ．Ｍｅｒｃｋ社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル６０ＧＦ254（Ａｒｔ．７７３０）を２０ｃｍ×２０ｃｍのガラスプレート上に、厚さ１．７５ｍｍに調整したものを使用して行った。
【００４２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のシリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．７７３４）を使用して行った。
【００４３】
（３）基本操作
反応溶液の冷却は、冷媒を満たしたジュワー瓶に反応容器を浸して行った。室温から４℃では、氷水、４℃から−９０℃では、液体窒素−アセトンを冷媒として用いた。反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウム又は無水硫酸マグネシウムを加えることで行った。反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ ＮＡ又は陰イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを使用した。溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下（２０〜３０ｍｍＨｇ）、ロータリーエバポレーターを使用して行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ（約１ｍｍＨｇ）を使用して行った。溶媒の混合比は全て体積比で表した。
【００４４】
＜ビフェニル型発光基質の合成＞
（ビフェニル誘導体（２）の合成）
４−ヨード安息香酸エチル（250 μl, 1.5 mmol）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（100 mg, 5%）、炭酸カリウム（539.0 mg, 3.8 mmol）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（6 ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下にした。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸（１）（315.0 mg, 1.9 mmol）を加え、９０℃で１４時間加熱攪拌した。更に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（27 mg, 2%）、炭酸カリウム（125.0 mg, 0.90 mmol）、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸（１）（97.0 mg, 0.58 mmol）を加え、２４時間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル］にて不溶物を除去した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（4:1）→（0:1）］にて精製し、ビフェニル誘導体（２）（229.0 mg, 0.85 mmol, 56%）を白色固体として得た。
【化８】
2014218456.tif 000010
【００４５】
・ビフェニル誘導体（２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ1.40（3H, t, J=6.9 Hz）, 3.00（6H, s）, 4.38（2H, q , J=6.9 Hz）, 6.79（2H, d, J=9.2 Hz）, 7.55（2H, d, J=9.2 Hz）, 7.61（2H, d, J=8.0 Hz）, 8.05（2H, d, J=8.6 Hz）
【００４６】
（カルボン酸（３）の合成）
ビフェニル誘導体（２）（148.0 mg, 0.54 mmol）をエタノール（6 ml）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（6 ml）を加えて４時間還流した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（9 ml）を加え中和した後、濾過し水で洗浄し、カルボン酸（３）（122.0 mg, 0.50 mmol, 92%）を黄色個体として得た。
【化９】
2014218456.tif 000011
【００４７】
・カルボン酸（３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＤＭＳＯ−Ｄ６）：δ2.91（6H, s）, 6.77（2H, d, J=6.9 Hz）, 7.54（2H, d, J=7.5 Hz）, 7.49（2H, d, J=7.5 Hz）, 7.89（2H, d, J=7.5 Hz）
【００４８】
（システイン保護体（５）の合成）
Ｄ−システインメチルエステル塩酸塩（４）（308 mg, 1.8 mmol）とトリフェニルメタノール（515 mg, 1.98 mmol）とにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（1.5 ml）を加え溶解させた。室温で２時間撹拌した後、減圧濃縮し、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂をろ過し、得られた溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［シリカゲル 30 g；ヘキサン−酢酸エチル（1:1）］にて精製し、システイン保護体（５）（658 mg, 1.7 mmol, 97%）を薄黄色油状として得た。
【化１０】
2014218456.tif 000012
【００４９】
・システイン保護体（５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（270 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ2.47（1H, dd, J=8.1, 13 Hz）, 2.60（1H, dd, J=5.1, 13 Hz）, 3.21（1H, dd, J=5.1, 8.1 Hz）, 3.66（3H, s）, 7.18-7.32（9H, complex）, 7.40-7.54（6H, complex）
【００５０】
（アミド体（６）の合成）
カルボン酸（３）（15.0 mg, 0.062 mmol）及びシステイン保護体（５）（31.2 mg, 0.082 mmol）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（2 ml）に溶解した。この溶液に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）（21.6 mg, 0.073 mmol）を加え、この混合物を室温で３時間攪拌した。その後、ジクロロメタン（20 ml×3）で抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（2:1）］にて精製し、アミド体（６）（32.9 mg, 0.054 mmol, 87%）を透明油状として得た。
【化１１】
2014218456.tif 000013
【００５１】
・アミド体（６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ2.75（2H, complex）, 3.01（6H, s）, 3.75（3H, s）, 4.85（1H, dd, J=12.6, 4.6 Hz）, 6.81（2H, d, J=8.6 Hz）, 7.15-7.34（9H, complex）, 7.35-7.42（6H, complex）, 7.55（2H, d, J=8.6 Hz）, 7.63（2H, d, J=8.0 Hz）, 7.78（2H, d, J=8.0 Hz）
【００５２】
（環化体（７）の合成）
アミド体（６）（14.0 mg, 0.023 mmol）とトリフェニルホスフィンオキシド（19.0 mg, 0.068 mmol）をアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（1.5 ml）に溶解させ、無水トリフルオロメタンスルホン酸（50 μl, 0.29 mmol）を加え、２．５時間撹拌した。その後、ジクロロメタン（20 ml×2）で抽出し、有機層を飽和食塩水（30 ml）にて洗浄した。更に、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［20 cm×20 cm×1.75 mm×１枚；ヘキサン−酢酸エチル（1:1）］にて精製し、環化体（７）（7.0 mg, 0.020 mmol, 86%）を黄色固体として得た。
【化１２】
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【００５３】
・環化体（７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ3.00（6H, s）, 3.61-3.73（2H, complex）, 3.83（3H, s）, 5.29（1H, t, J=9.2 Hz）, 6.79（2H, d, J=6.3 Hz）, 7.54（2H, d, J=5.9 Hz）, 7.59（2H, d, J=4.6 Hz）, 7.87（2H, d, J=4.6 Hz）
【００５４】
（ビフェニル型発光基質（８）の合成）
環化体（７）（7.7 mg, 0.023 mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）：蒸留水（2:1, 2 ml）に溶解した。この溶液に水酸化リチウム一水和物（2.0 mg, 0.047 mmol）を加え、室温で３０分撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（30 ml）を加え、生成物を水（20 ml×2）で抽出した。更に、水層を合わせ、１Ｍ塩酸を加え酸性にした後、酢酸エチル（20 ml×2）で抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、ビフェニル型発光基質（８）（4.0 mg, crude）を赤色固体として得た。
【化１３】
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【００５５】
・ビフェニル型発光基質（８）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ3.01（6H, s）, 3.73（2H, m）, 5.34（1H, t, J=9.2 Hz）, 6.80（2H, d, J=8.0 Hz）, 7.55（2H, d, J=8.6 Hz）, 7.62（2H, d, J=8.5 Hz）, 7.86（2H, d, J=8.0 Hz）
【００５６】
（実施例１）
＜塩の生成＞
アカルミネ（黒金化成株式会社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．００２２）１ｍｇと、以下の酸又は塩基の水溶液５０μｌを混合し、室温で１時間静置させた。
【化１４】
2014218456.tif 000016
【００５７】
・塩基：
ターシャリブチルナトリウム（ｔＢｕＯＮａ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
ターシャリブチルカリウム（ｔＢｕＯＫ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
アンモニウム−メタノール（ＮＨ3 in ＭｅＯＨ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
トリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）（０．１Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
【００５８】
・酸：
リン酸（Ｈ3ＰＯ4）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
塩酸（ＨＣｌ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
臭化水素酸（ＨＢｒ）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
トリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯＯＨ）（０．１Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）（０．１Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
硫酸（Ｈ2ＳＯ4）（６．６×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
【００５９】
続いて、不溶物を沈殿させるため、遠心分離を１３，０００ｒｐｍで、３分間行った。上澄み液を採取し、アカルミネの塩化物溶液を得た。
【００６０】
＜溶解度測定＞
上記のようにして得た上澄み液（飽和溶液）２５μｌを、純水で１００倍に希釈し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量測定を行った（ｎ＝３)。結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2014218456.tif 000017
【００６２】
酸性水溶液及び塩基水溶液から調製したアカルミネの塩はすべて、アカルミネ（塩調製前）より溶解度の改善が見られたが、その中でも特に塩化水素及び臭化水素の水溶液から調製した塩は、５０倍以上溶解度が改善した。
なお、アカルミネの塩酸塩及び臭化水素酸塩については、水溶液の色がアカルミネの塩酸塩及び臭化水素酸塩に由来する濃赤色で不透明であり、沈殿が形成されているかどうかの判別が難しく、溶液が飽和していない可能性がある。そのため、塩酸塩及び臭化水素酸塩については、測定した溶解度よりも高い可能性がある。
【００６３】
＜物質測定＞
ＩＲ測定及びＵＶ測定により、生成した物質がアカルミネの塩であることを確認した。
【００６４】
・ＩＲ測定
アカルミネ（黒金化成株式会社製）のみ（媒質なし）及びアカルミネ塩酸塩に対し、ＩＲ測定を行った。測定機器としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＮｉｃｏｌｅｔ ６７００を使用し、試料１ｍｇ以下をＡＴＲ法により測定した。アカルミネのＩＲスペクトルを図１に、アカルミネ塩酸塩のＩＲスペクトルを図２に示す。
【００６５】
図１と図２との比較から、アカルミネとアカルミネの塩酸塩とで、ＩＲの指紋領域（１３００〜６５０ｃｍ-1）が異なることが分かる。また、アカルミネでは、１５５０ｃｍ-1、アカルミネの塩酸塩では、１７５０ｃｍ-1に吸収が見られ、これらは分子構造中のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）に由来し、アカルミネでは、分子内のジメチルアミノ基（−ＮＭｅ2基）により脱プロトン化された−ＣＯＯ−の吸収が見られるのに対し、アカルミネの塩酸塩ではＨＣｌにより脱プロトン化されることなく、ＣＯＯＨの吸収が見られるためと考えられる。
【００６６】
・ＵＶ測定
アカルミネ（黒金化成株式会社製）及びアカルミネ塩酸塩に対し、ＵＶ測定を行った。測定機器としては、Ｖａｒｉａｎ社製のＣａｒｙ ５０を使用し、１．０×１０-5 Ｍの基質溶液を用い、セルホルダー温度を２５℃とし、ＵＶ測定用石英セル（光路長は１ｃｍ）を使用した。アカルミネのＵＶスペクトルを図３に、アカルミネ塩酸塩のＵＶスペクトルを図４に示す。
【００６７】
図３と図４との比較から、アカルミネは３２０ｎｍと４９０ｎｍに２つの吸収極大を有するのに対し、アカルミネの塩酸塩は４６０ｎｍに１つの吸収極大を有し、スペクトルが異なることが分かる。
【００６８】
＜発光測定＞
アカルミネ（５００μＭ）、並びに、実施例で得たアカルミネの塩酸塩（５００μＭ）及びアカルミネの臭化水素酸塩（５００μＭ）を用いて、発光強度及び発光スペクトルの測定を行った。
【００６９】
・発光強度測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を２０μｌ、各発光基質の溶解液を２０μｌ、発光基質を分解する酵素である０．０１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを４０μｌ混合し、発光強度測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−２２７０）で１８０秒間発光測定を行った。結果を図５に示す。
【００７０】
図５から、アカルミネの塩酸塩及び臭化水素酸塩は、アカルミネと発光強度がほぼ同程度であることが分かる。なお、アカルミネの総発光量を１００とした場合に、アカルミネの塩酸塩の総発光量は９１、アカルミネの臭化水素酸塩の総発光量は８１であった。
【００７１】
・発光スペクトル測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を５μｌ、各発光基質の溶解液を５μｌ、発光基質を分解する酵素である０．１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを１０μｌ混合し、発光スペクトル測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−１８５０）で１８０秒間発光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
【００７２】
図６から、アカルミネの発光スペクトルにおける発光極大は６７５ｎｍで、アカルミネの塩酸塩の発光スペクトルにおける発光極大は６７５ｎｍで、アカルミネの臭化水素酸塩の発光スペクトルにおける発光極大は６８０ｎｍであり、アカルミネの塩酸塩及び臭化水素酸塩は、アカルミネと発光スペクトルがほぼ同じであることが分かる。
【００７３】
（実施例２）
＜塩の生成＞
上記のように合成して得たビフェニル型発光基質（８）１ｍｇと、以下の酸又は塩基の水溶液５０μｌを混合し、室温で１時間静置させた。
【化１５】
2014218456.tif 000018
【００７４】
・塩基：
ターシャリブチルナトリウム（ｔＢｕＯＮａ）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
ターシャリブチルカリウム（ｔＢｕＯＫ）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
アンモニウム−メタノール（ＮＨ3 in ＭｅＯＨ）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
【００７５】
・酸：
リン酸（Ｈ3ＰＯ4）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
塩酸（ＨＣｌ）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
臭化水素酸（ＨＢｒ）（６．２×１０-2 Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））
【００７６】
続いて、不溶物を沈殿させるため、遠心分離を１３，０００ｒｐｍで、３分間行った。上澄み液を採取し、ビフェニル型発光基質（８）の塩化物溶液を得た。
【００７７】
＜溶解度測定＞
上記のようにして得た上澄み液（飽和溶液）１００μｌを、純水で１００倍に希釈し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量測定を行った（ｎ＝３)。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2014218456.tif 000019
【００７９】
酸性水溶液及び塩基水溶液から調製したビフェニル型発光基質（８）の塩はすべて、ビフェニル型発光基質（８）（塩調製前）より溶解度の改善が見られたが、その中でも特に塩化水素及び臭化水素の水溶液から調製した塩は、２０倍以上溶解度が改善した。
なお、ビフェニル型発光基質（８）の塩酸塩及び臭化水素酸塩については、水溶液の色がビフェニル型発光基質（８）の塩酸塩及び臭化水素酸塩に由来する濃黄色により濃く不透明であり、沈殿が形成されているかどうかの判別が難しく、溶液が飽和していない可能性がある。そのため、塩酸塩及び臭化水素酸塩については、測定した溶解度よりも高い可能性がある。
【００８０】
上記の実施例の結果からも明らかなように、アカルミネは、他の塩では水溶性の向上は充分でなく、塩酸塩、臭化水素酸塩等のハロゲン化水素塩についてのみ水溶性が著しく向上した。更に、その塩酸塩、臭化水素酸塩の水溶性のレベルが、実用上要求されるレベル（溶解度が１０ｍｇ／ｍｌ）を充足していた。なお、アカルミネに関して、塩の中で塩酸塩、臭化水素酸塩等のハロゲン化水素塩のみ水溶性が著しく向上し、実用上価値のあることを見出したのは初めてである。また、ハロゲン化水素（塩化水素、臭化水素）塩として調製すると、アカルミネだけでなくビフェニル型発光基質についても、溶解度を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のハロゲン化水素塩は、水溶性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。
【図１】
2014218456.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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