(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を有する真核細胞及び前記細胞を用いる発酵産物の製造方法を提供する。【解決手段】アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ及びＬ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現する真核細胞及び前記真核細胞を用いるキシロースからエタノールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のヌクレオチド配列：
（ａ）アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＡをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
ｉｖ．遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＢをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
ｉｖ．遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｃ）Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＤをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
ｉｖ．遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と
を発現することができる真核細胞であって、これらのヌクレオチド配列の発現が、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を細胞に与える真核細胞。
【請求項２】
前記ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤヌクレオチド配列のうちの１つ、２つまたは３つが、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種から生じる請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が、酵母細胞、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のうちの１つに属する酵母細胞である請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記酵母細胞が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）種、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）種、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）種、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）種、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）種、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）種、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）種またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）種のうちの１つに属する請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を細胞に与えるために細胞内の対応するヌクレオチド配列の十分な発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結された請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が、キシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、ペントースリン酸経路のフラックスを増大させる遺伝子改変を含む請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の少なくとも１つの遺伝子の過剰発現を含む請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
前記遺伝子が、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子改変が、少なくとも、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、さらに、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変を含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子改変が、キシルロースキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
過剰発現される前記遺伝子が、前記細胞に内因性である請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、細胞内の非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝子改変を含む請求項５〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子改変が、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるか、あるいは不活性化する請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子が、前記遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、あるいは前記遺伝子の破壊によって不活性化される請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
非特異的なアルドースレダクターゼをコードする前記細胞内の各遺伝子の発現が、低下または不活性化される請求項１４または１５に記載の細胞。
【請求項１８】
前記発酵産物が、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
ａｒａＡをコードする核酸配列、ａｒａＢをコードする核酸配列、および／またはａｒａＤをコードする核酸配列（全て、請求項１または２において定義される）を含む核酸構築物。
【請求項２０】
エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１８のいずれか一項に記載の改変された細胞を用いてアラビノース源および任意でキシロース源を含有する培地を発酵させ、前記細胞がアラビノースおよび任意でキシロースを発酵産物に発酵させることと、任意で
（ｂ）前記発酵産物を回収することと
を含む方法。
【請求項２１】
エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞と、キシロースを使用することができる、そして／あるいはキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す細胞とを用いて、少なくともＬ−アラビノース源およびキシロース源を含有する培地を発酵させ、各細胞がＬ−アラビノースおよび／またはキシロースを発酵産物に発酵させることと、任意で
（ｂ）前記発酵産物を回収することと
を含む方法。
【請求項２２】
前記培地が、グルコース源も含有する請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵産物が、エタノールである請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
エタノールの容積生産性が、１時間に１リットルあたり少なくとも０．５ｇのエタノールである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記エタノールの収率が少なくとも３０％である請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が嫌気性である請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が好気性であり、好ましくは、酸素制限条件下で実施される請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を有する真核細胞と、この細胞が使用される発酵産物の製造方法とに関する。
【０００２】
［発明の背景］
燃料エタノールは、化石燃料の価値ある代替品として認められている。植物バイオマスのヘミセルロース画分からの経済的に実行可能なエタノールの製造は、同等の速度および高い収率でのペントースおよびヘキソースの両方の同時発酵性の転換を必要とする。酵母、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種は、好気的にも嫌気的にもヘキソースにおいて急速に増殖および発酵することができるので、この方法のための最も適切な候補である。さらに、これらは（遺伝子改変）細菌よりも、リグノセルロース加水分解物の毒性環境に対して遥かに耐性がある。
【０００３】
欧州特許第１４９９７０８号明細書には、Ｌ−アラビノースからエタノールを産生することができるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株の製造方法が記載されている。これらの菌株は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）遺伝子、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入することによって改変された。さらに、これらの菌株はそのゲノムに付加的な変異を保有しているか、あるいはＴＡＬ１（トランスアルドラーゼ）遺伝子を過剰発現していた。しかしながら、これらの菌株はいくつかの欠点を有する。これらは、酸素制限条件下でアラビノースを発酵させる。さらにこれらは、０．０５ｇ．ｇ−１．ｈ−１という低いエタノール産生速度を有する（ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）およびボーレス（Ｂｏｌｅｓ）、２００３年）。さらにこれらの菌株は、嫌気条件下でＬ−アラビノースを使用することができない。最後に、これらのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株は野生型の背景を有し、そのため、これらはいくつかのＣ５糖を共発酵させるために使用することができない。
【０００４】
国際公開第０３／０６２４３０号パンフレットおよび国際公開第０６／００９４３４号パンフレットは、キシロースをエタノールに転換することができる酵母菌株を開示している。これらの酵母菌株は、キシロースをキシルロースに直接異性化することができる。
【０００５】
依然として、よりよく機能し、そして比較的厳しい産生条件に対してより頑強および耐性である、エタノールを産生するための代替菌株が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ｐＲＷ２３１およびｐＲＷ２４３のプラスミドマップ。
【図２】０．５％ガラクトース（Ａ）および０．１％ガラクトース＋２％Ｌ−アラビノース（Ｂ）を含有する合成培地における菌株ＲＷＢ２１９（白丸）およびＩＭＳ０００１（黒丸）の振とうフラスコ培養の増殖パターン。ガラクトースを有する合成培地（Ａ）において培養物を７２時間増殖させ、次にガラクトースおよびアラビノースを有する合成培地（Ｂ）に移した。増殖は、ＯＤ６６０の測定により決定した。
【図３】２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースを有する合成培地を含有する振とうフラスコ培養物におけるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＭＳ０００１の連続転移（ｓｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）中の増殖速度。各データ点は、（指数関数的な）増殖中に測定したＯＤ６６０から見積もった増殖速度を表す。黒丸および白丸は２通りの連続転移実験を表す。
【図４】２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースを有する合成培地におけるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＭＳ０００１の嫌気性ＳＢＲ発酵中の増殖速度。各データ点は、指数関数的な増殖中にＣＯ２プロファイル（実線）から見積もった増殖速度を表す。
【図５ａ】菌株ＩＭＳ０００２の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、２０ｇｌ−１のアラビノース（Ａ）、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｂ）、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｃ）を補充した１の合成培地中で実施した。菌株ＩＭＳ０００２およびＲＷＢ２１８の混合物による嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｄ）を補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：グルコース（黒丸）、キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、累積的なＣＯ２産生から計算したエタノール（白四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）、キシリトール（黒逆三角）。
【図５ｂ】菌株ＩＭＳ０００２の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、２０ｇｌ−１のアラビノース（Ａ）、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｂ）、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｃ）を補充した１の合成培地中で実施した。菌株ＩＭＳ０００２およびＲＷＢ２１８の混合物による嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｄ）を補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：グルコース（黒丸）、キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、累積的なＣＯ２産生から計算したエタノール（白四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）、キシリトール（黒逆三角）。
【図５ｃ】菌株ＩＭＳ０００２の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、２０ｇｌ−１のアラビノース（Ａ）、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｂ）、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｃ）を補充した１の合成培地中で実施した。菌株ＩＭＳ０００２およびＲＷＢ２１８の混合物による嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｄ）を補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：グルコース（黒丸）、キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、累積的なＣＯ２産生から計算したエタノール（白四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）、キシリトール（黒逆三角）。
【図５ｄ】菌株ＩＭＳ０００２の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、２０ｇｌ−１のアラビノース（Ａ）、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｂ）、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｃ）を補充した１の合成培地中で実施した。菌株ＩＭＳ０００２およびＲＷＢ２１８の混合物による嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノース（Ｄ）を補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：グルコース（黒丸）、キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、累積的なＣＯ２産生から計算したエタノール（白四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）、キシリトール（黒逆三角）。
【図６】キシロースにおける嫌気性増殖のために選択された菌株ＩＭＳ０００２細胞の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）、キシリトール（黒逆三角）。
【図７】菌株ＩＭＳ０００３の嫌気性バッチ発酵中の糖消費および産物形成。発酵は、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロース、および１５ｇｌ−１のアラビノースを補充した１リットルの合成培地中で実施した。記号：グルコース（黒丸）、キシロース（白丸）、アラビノース（黒四角）、累積的なＣＯ２産生から計算したエタノール（白四角）、ＨＰＬＣによって測定したエタノール（黒三角）、累積的なＣＯ２産生（白三角）。
【０００７】
［発明の説明］
［真核細胞］
第１の態様では、本発明は、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＡをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＢをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｃ）Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＤをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
（ｉｉｉ）その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と
を発現することができる真核細胞に関するものであり、これらのヌクレオチド配列の発現は、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換する能力を細胞に与える。
【０００８】
好ましい実施形態は、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
（ｉｉ）その相補鎖が（ｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＢをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｃ）Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列であって、
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＤをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
（ｉｉｉ）その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と
を発現することができる真核細胞に関し、これらのヌクレオチド配列の発現は、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換する能力を細胞に与える。
【０００９】
［配列同一性および類似性］
配列同一性は、本明細書では、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列の間、または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の、配列の比較により決定される関係と定義される。通常、配列同一性または類似性は、比較される配列の全長にわたって比較される。当該技術分野では、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるようなアミノ酸または核酸配列の間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換体を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、当業者に知られている様々な方法によって容易に計算することができる。
【００１０】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、例えば、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手可能（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、アルトシュール、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４））がある。使用される最も好ましいアルゴリズムはＥＭＢＯＳＳである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ）。ＥＭＢＯＳＳを用いるアミノ酸配列比較のための好ましいパラメータは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  １０．０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  ０．５、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスである。ＥＭＢＯＳＳを用いる核酸配列比較のための好ましいパラメータは、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  １０．０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  ０．５、ＤＮＡ  フルマトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００１１】
任意で、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者には明らかであるように、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示されるアミノ酸配列の置換変異形は、開示される配列内の少なくとも１つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は次の通りである：Ａｌａからｓｅｒへ、Ａｒｇからｌｙｓへ、Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓへ、Ａｓｐからｇｌｕへ、Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａへ、Ｇｌｎからａｓｎへ、Ｇｌｕからａｓｐへ、Ｇｌｙからｐｒｏへ、Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎへ、Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌへ、Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌへ、Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎまたはｇｌｕへ、Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅへ、Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒへ、Ｓｅｒからｔｈｒへ、Ｔｈｒからｓｅｒへ、Ｔｒｐからｔｙｒへ、Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅへ、そしてＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕへ。
【００１２】
［核酸配列のハイブリッド形成］
本発明の細胞内で発現される酵素をコードするヌクレオチド配列は、中程度あるいは好ましくはストリンジェントなハイブリッド形成条件下でこれらが配列番号２、４、６、８、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０のヌクレオチド配列とそれぞれハイブリッド形成できることによっても定義され得る。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、本明細書では、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００、そして最も好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中あるいは同等のイオン強度を有する他の溶液中、約６５℃の温度でハイブリッド形成できるようにし、約０．１Ｍ以下の塩、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液中あるいは同等のイオン強度を有する他の溶液中、６５℃で洗浄する条件であると定義される。好ましくは、ハイブリッド形成は一晩、すなわち少なくとも１０時間実施され、そして好ましくは、洗浄は、洗浄溶液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施される。これらの条件は、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリッド形成を可能にするであろう。
【００１３】
中程度の条件は、本明細書では、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中あるいは同等のイオン強度を有する他の溶液中、約４５℃の温度でハイブリッド形成できるようにし、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中あるいは同等のイオン強度を有する他の溶液中、室温で洗浄する条件であると定義される。好ましくは、ハイブリッド形成は一晩、すなわち少なくとも１０時間実施され、そして好ましくは、洗浄は、洗浄溶液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施される。これらの条件は、通常、５０％までの配列同一性を有する配列の特異的なハイブリッド形成を可能にするであろう。当業者は、同一性が５０％〜９０％の間で異なる配列を特異的に同定するためにこれらのハイブリッド形成条件を変更できるであろう。
【００１４】
［ＡｒａＡ］
本発明の細胞内で発現されるアラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードする好ましいヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列と、
（ｄ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列と
からなる群から選択される。
【００１５】
ａｒａＡをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のａｒａＡ、すなわち、原核生物または真核生物中に天然に存在するａｒａＡのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＡのどちらもコードし得る。本発明者らは、ａｒａＢおよびａｒａＤと共発現されるときに、アラビノースを使用する能力、そして／あるいはアラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換する能力を真核宿主細胞に与える特定のａｒａＡの能力は、ａｒａＡが原核生物起源または真核生物起源のどちらを有するかにあまり依存しないことを発見した。むしろ、これは、配列番号１の配列に対するａｒａＡのアミノ酸配列の関連性に依存する。
【００１６】
［ＡｒａＢ］
本発明の細胞内で発現されるＬ−リブロキナーゼ（ＡｒａＢ）をコードする好ましいヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列と、
（ｄ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列と
からなる群から選択される。
【００１７】
ａｒａＢをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のａｒａＢ、すなわち、原核生物または真核生物中に天然に存在するａｒａＢのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＢのどちらもコードし得る。本発明者らは、ａｒａＡおよびａｒａＤと共発現されるときに、アラビノースを使用する能力、そして／あるいはアラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を真核宿主細胞に与える特定のａｒａＢの能力は、ａｒａＢが原核生物起源または真核生物起源のどちらを有するかにあまり依存しないことを発見した。むしろ、これは、配列番号３の配列に対するａｒａＢのアミノ酸配列の関連性に依存する。
【００１８】
［ＡｒａＤ］
本発明の細胞内で発現されるＬ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードする好ましいヌクレオチド配列は、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｇ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列と、
（ｈ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列と
からなる群から選択される。
【００１９】
ａｒａＤをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のａｒａＤ、すなわち、原核生物または真核生物中に天然に存在するａｒａＤのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＤのどちらもコードし得る。本発明者らは、ａｒａＡおよびａｒａＢと共発現されるときに、アラビノースを使用する能力、そして／あるいはアラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する能力を真核宿主細胞に与える特定のａｒａＤの能力は、ａｒａＤが原核生物起源または真核生物起源のどちらを有するかにあまり依存しないことを発見した。むしろ、これは、配列番号５の配列に対するａｒａＤのアミノ酸配列の関連性に依存する。
【００２０】
驚くことに、コドンバイアス指数（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｉｎｄｅｘ）は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の発現が、欧州特許第１４９９７０８号明細書に記載される原核生物のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子よりも、酵母における発現に好都合であることを示した。
【００２１】
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、食品登録当局（ｆｏｏｄ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）によって安全であると認められるＧｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）生物体であることに注意すべきである。従って、好ましいヌクレオチド配列はそれぞれ、上記で定義されるような配列番号１、３、または５の配列にそれぞれ関連するアミノ酸配列を有するａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードする。好ましいヌクレオチド配列はそれぞれ、真菌のａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤ（例えば、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）から）をコードし、より好ましくはそれぞれ、嫌気性真菌から、例えばネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）科、カエコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）科、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）科、オルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）科、またはルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）科に属する嫌気性真菌からのａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードする。あるいは、好ましいヌクレオチド配列はそれぞれ、好ましくはグラム陽性細菌から、より好ましくはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属から、最も好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種からの細菌のａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードする。好ましくは、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤヌクレオチド配列のうちの１つ、２つまたは３つは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、より好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種が起源である。本発明の細胞内で発現される細菌ａｒａＡは、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示され、配列番号９で与えられるバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｒａＡではない。配列番号１０は、配列番号９をコードするヌクレオチド酸配列を表す。本発明の細胞内で発現される細菌ａｒａＢおよびａｒａＤは、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示され、配列番号１１および配列番号１３で与えられるエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌）のものではない。配列番号１２は、配列番号１１をコードするヌクレオチド酸配列を表す。配列番号１４は、配列番号１３をコードするヌクレオチド酸配列を表す。
【００２２】
（細菌の）ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素が酵母などの本発明の真核宿主細胞においてそれぞれ活性型で発現される可能性を増大させるために、対応するコード化ヌクレオチド配列は、選択された真核宿主細胞に対してそのコドン使用を最適化するように適応され得る。ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素（または本発明の他の酵素、以下を参照）をコードするヌクレオチド配列の、選択された宿主細胞のコドン使用に対する適応性は、コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ、ＣＡＩ）として表すことができる。コドン適応指数は、本明細書では、高度発現遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的な適応性の尺度であると定義される。各コドンの相対的な適応性（ｗ）は、同じアミノ酸のための最も大量のコドンに対する各コドンの使用の比である。ＣＡＩ指数はこれらの相対的な適応値の幾何平均であると定義される。非同義コドンおよび終止コドン（遺伝暗号に依存する）は排除される。ＣＡＩ値は０〜１の範囲であり、より高い値は最も大量のコドンの割合がより高いことを示す（シャープ（Ｓｈａｒｐ）およびリー（Ｌｉ）、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５頁を参照。ジャンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１頁も参照）。適応されたヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６または０．７のＣＡＩを有する。
【００２３】
好ましい実施形態では、本明細書において前に定義したようなａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現は、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸に転換する能力を細胞に与える。理論に束縛されることは望まないが、Ｌ−アラビノースはまずＬ−リブロースに転換され、次に、ペントースリン酸経路に入る主要分子であるキシルロース５−リン酸に転換されることが予想される。本発明との関連では、「Ｌ−アラビノースを使用する」は、好ましくは、少なくとも０．５％のＬ−アラビノースを存在させた好気条件または嫌気条件下で少なくとも２０日間培養された形質転換細胞の６６０ｎｍで測定される光学濃度（ＯＤ６６０）が、約０．５から１．０以上まで増大されることを意味する。より好ましくは、ＯＤ６６０は、０．５から１．５以上まで増大される。より好ましくは、細胞は、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％のＬ−アラビノースの存在下で培養される。最も好ましくは、細胞は、約２％のＬ−アラビノースの存在下で培養される。
【００２４】
本発明との関連では、Ｌ−アラビノース（好ましい濃度は前の段落と同じ）を存在させた好気条件または嫌気条件下で少なくとも２０日間培養された細胞において、適切なアッセイを用いて検出可能な量のＬ−リブロースが検出されるときに、細胞は「Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに転換」することができる。好ましくは、アッセイは、Ｌ−リブロースに対するＨＰＬＣである。
【００２５】
本発明との関連では、Ｌ−アラビノース（好ましい濃度は前の段落と同じ）を存在させた好気条件または嫌気条件下で少なくとも２０日間培養された細胞において、適切なアッセイを用いてキシルロース５−リン酸の少なくとも２％の増大が検出されるときに、細胞は「Ｌ−アラビノースをキシルロース５−リン酸に転換」することができる。好ましくは、キシルロース５−リン酸に対するＨＰＣＬに基づくアッセイは、ザルディバル（Ｚａｌｄｉｖａｒ）Ｊ．ら（（２００２年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５９：４３６−４４２頁）において記載されている。このアッセイは実験部分に簡単に記載される。より好ましくは、増大は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上である。
【００２６】
もう１つの好ましい実施形態では、本明細書において前に定義したようなａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現は、Ｌ−アラビノース（好ましい濃度は前の段落と同じ）を存在させた好気条件または嫌気条下で少なくとも１ヶ月から１年までの間培養されるときに、Ｌ−アラビノースを所望の発酵産物に転換する能力を細胞に与える。より好ましくは、適切なアッセイを用いて検出可能な量の所望の発酵産物が検出されるとき、そして前文で与えられる条件下で細胞が培養されるときに、細胞はＬ−アラビノースを所望の発酵産物に転換することができる。さらにより好ましくは、アッセイはＨＰＬＣである。さらにより好ましくは、発酵産物はエタノールである。
【００２７】
それぞれ上記に記載されるａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素をコードするヌクレオチド配列による形質転換のための細胞は、好ましくは、細胞内への能動的または受動的なキシロース輸送および細胞内でのキシロース異性化が可能である宿主細胞である。細胞は、好ましくは、活性な解糖が可能である。細胞はさらに内因性ペントースリン酸経路を含有することができ、そしてキシロースから異性化されたキシルロースがピルベートに代謝されるような内因性キシルロースキナーゼ活性を含有することができる。細胞はさらに、好ましくは、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物にピルベートを転換するための酵素を含有する。細胞は、国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレットに開示されるようなブタノール経路の１つまたは複数の遺伝子の導入によって、ブタノールを産生できるようにされてもよい。
【００２８】
好ましい細胞は、アルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵が自然に可能である。宿主細胞はさらに、好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低ｐＨ（すなわち、５、４、３、または２．５よりも低いｐＨで増殖することができる）、ならびに乳酸、酢酸またはギ酸のような有機酸およびフルフラールやヒドロキシ−メチルフルフラールなどの糖分解産物に対する高い耐性、そして高温に対する高い耐性を有する。宿主細胞のこれらの特徴または活性はどれも宿主細胞内に天然に存在してもよいし、あるいは遺伝子選択または遺伝子改変によって導入または改変されてもよい。適切な宿主細胞は、例えば真菌のような真核微生物であるが、宿主細胞として最も適切なのは酵母または糸状菌である。
【００２９】
酵母は本明細書では真核微生物と定義され、単細胞形態で優勢に増殖する細分類ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）（アレクソプーロス（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ），Ｃ．Ｊ．、１９６２年、Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク）の全ての種を含む。酵母は単細胞性葉状体（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈａｌｌｕｓ）の出芽によって増殖されるか、あるいは生物体の分裂によって増殖され得る。宿主細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のうちの１つに属する。好ましくは、酵母は、嫌気性発酵、より好ましくは嫌気性アルコール発酵をすることが可能である。
【００３０】
糸状菌は、本明細書では、細分類ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の全ての糸状形態を含む真核微生物であると定義される。これらの真菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖で構成される栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理学的、および遺伝的に酵母とは異なる。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化は偏性好気性である。宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のうちの１つに属する。
【００３１】
長年にわたって、穀物糖からバイオエタノールを生産するために種々の生物体の導入について提言されてきた。しかしながら、実際には、主要なバイオエタノールの生産工程は全て、エタノール産生体としてサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を使用し続けている。これは、工業工程のためのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の多数の魅力的な特徴、すなわち、高い酸耐性、エタノール耐性および浸透圧耐性、嫌気性増殖能力、そしてもちろんその高いアルコール発酵能力のためである。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、上記で定義したａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換された宿主細胞である。１つのより好ましい実施形態では、宿主細胞は、３つの核酸構築物で同時形質転換され、各核酸構築物は、ａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列を含む。ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤコード配列を含む核酸構築物は、宿主細胞内でａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤ酵素を発現することができる。このために、核酸構築物は、例えば、国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットに記載されるように構築され得る。宿主細胞は各核酸構築物の単一のコピーを含むこともできるが、好ましくは多数のコピーを含む。核酸構築物はエピソームに保持され、従って、ＡＲＳ配列などの自己複製のための配列を含むことができる。適切なエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（フリール（Ｆｌｅｅｒ）ら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５頁）プラスミドに基づくことができる。しかしながら、好ましくは、各核酸構築物は、宿主細胞のゲノムへ１つまたは複数のコピーで組み込まれる。真菌分子遺伝学的分野においてよく知られている（例えば、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照）ように、宿主細胞のゲノムへの組込みは非正統的組換えによってランダムに生じてもよいが、好ましくは、核酸構築物は、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれる。従って、より好ましい実施形態では、本発明の細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤコード配列を含む核酸構築物を含み、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤ酵素を発現することができる。さらにより好ましい実施形態では、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤのコード配列はそれぞれ、細胞内で対応するヌクレオチド配列の十分な発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結され、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸に転換する能力を細胞に与える。好ましくは、細胞は酵母細胞である。従って、さらなる態様では、本発明は、本明細書で前に概説された核酸構築物も包含する。好ましくは、核酸構築物は、ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードする核酸配列を含む。ａｒａＡ、ａｒａＢ、またはａｒａＤをコードする核酸配列は全て本明細書において前に定義されている。さらにより好ましくは、細胞内の対応するヌクレオチド配列の発現は、本明細書において後で定義される所望の発酵産物にＬ−アラビノースを転換する能力を細胞に与える。さらにより好ましい実施形態では、発酵産物はエタノールである。さらにより好ましくは、細胞は酵母細胞である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド要素（すなわち、コード配列または核酸配列）の連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるときに「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与えれば、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結されている核酸配列が通常連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合には連続して読み枠内にあることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流側に位置する１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位と、転写開始部位と、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびに直接または関節的に作用してプロモーターからの転写の量を調節するための当業者に既知の任意の他のヌクレオチド配を含む（しかし、限定されない）任意の他のＤＮＡ配列との存在によって構造的に同定される。「構成的な」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生規制下で活性なプロモーターである。
【００３５】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用され得るプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に対してネイティブでない、すなわち、作動可能に連結されたヌクレオチド配列（コード配列）に対して異種であるプロモーターである。プロモーターは、好ましくは、作動可能に連結されたコード配列に対して異種であるが、プロモーターが相同である、すなわち宿主細胞に対して内因性であることも好ましい。好ましくは、アラビノース、またはアラビノースおよびグルコース、またはキシロースおよびアラビノース、またはキシロースおよびアラビノースおよびグルコースが、炭素源として、より好ましくは主要炭素源（すなわち、アラビノース、またはアラビノースおよびグルコース、またはキシロースおよびアラビノース、またはキシロースおよびアラビノースおよびグルコースからなる利用可能な炭素源の５０％よりも多い）として、最も好ましくは唯一の炭素源として利用可能である条件下で、異種プロモーター（ヌクレオチド配列に対して）は、コード配列に対してネイティブであるプロモーターよりも高い定常状態レベルの、コード配列を含む転写物を産生することができる（あるいは、単位時間あたりにより多くの転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。これに関連して適切なプロモーターは、構成的および誘導性の天然プロモーターならびに操作されたプロモーターを含む。本発明で使用するための好ましいプロモーターはさらに異化産物（グルコース）抑制に対して非感受性であり、そして／あるいは、好ましくは誘導のためにアラビノースおよび／またはキシロースを必要としないであろう。
【００３６】
これらの特徴を有するプロモーターは広く利用可能であり、当業者に知られている。このようなプロモーターの適切な例としては、例えば、酵母または糸状菌からのホスホフルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルベートキナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどの解糖遺伝子からのプロモーターが挙げられ、このような酵母からのプロモーターについてのさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）において見出すことができる。その他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４など）、エノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＧＩ１、ハウフ（Ｈａｕｆ）ら、２０００年）、またはヘキソース（グルコース）トランスポータープロモーター（ＨＸＴ７）、もしくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）である。ＰＧＩ１プロモーターの配列は配列番号５１で与えられる。ＨＸＴ７プロモーターの配列は配列番号５２で与えられる。ＴＤＨ３プロモーターの配列は配列番号４９で与えられる。その他のプロモーター、（構成的および誘導性の両方）およびエンハンサーまたは上流活性化配列は当業者には既知であろう。本発明の宿主細胞において使用されるプロモーターは所望される場合にはその制御特性に影響を与えるように改変されてもよい。
【００３７】
本発明の好ましい細胞は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子で形質転換された真核細胞である。より好ましくは、真核細胞は酵母細胞であり、さらにより好ましくは、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子で形質転換されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株である。最も好ましくは、細胞はＣＢＳ１２０３２７またはＣＢＳ１２０３２８のいずれかであり、いずれも２００６年９月２７日にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オランダ国）に寄託された。
【００３８】
所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と、所与の宿主生物体または宿主細胞との間の関係を示すために使用される場合の「相同」という用語は、本質的に、核酸またはポリペプチド分子が同じ種、好ましくは同じ変種または菌株の宿主細胞または生物体によって産生されることを意味するものと理解される。宿主細胞に対して相同であれば、ポリペプチドをコードする核酸配列は、通常、自然の環境におけるよりも、別のプロモーター配列、あるいは適用できる場合には別の分泌性シグナル配列、および／または終結配列に作動可能に連結されるであろう。２つの核酸配列の関連性を示すために使用される場合、「相同」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列とハイブリッド形成し得ることを意味する。ハイブリッド形成の程度は、配列間の同一性の量、ならびに前に示したような温度および塩濃度などのハイブリッド形成条件を含む多数の因子に依存し得る。好ましくは、同一性の領域は約５ｂｐよりも大きく、より好ましくは同一性の領域は１０ｂｐよりも大きい。
【００３９】
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関連して使用される場合の「異種」という用語は、それが存在している生物体、細胞、ゲノム、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部として天然に存在しない核酸またはタンパク質、あるいはそれが天然に見出されるものとは異なる細胞、あるいはゲノムもしくはＤＮＡまたはＲＮＡ配列内の１つまたは複数の位置において見出される核酸またはタンパク質を指す。異種核酸またはタンパク質は、それが導入された細胞に対して内因性でなく、別の細胞から得られたか、あるいは合成または組換えで産生されたものである。一般に、必ずしも必要ではないが、このような核酸は、ＤＮＡが転写または発現される細胞によって普通は産生されないタンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞において普通は発現されないタンパク質をコードする。異種核酸およびタンパク質は、外来性核酸またはタンパク質と呼ばれることもある。それを発現する細胞に対して異種または外来性であると当業者が認識し得る核酸またはタンパク質は、本明細書では、異種核酸またはタンパク質という用語によって包含される。異種という用語は、核酸またはアミノ酸配列の天然でない組み合わせ、すなわち、組み合わせられた配列のうちの少なくとも２つが互いに外来性である組み合わせにも適用される。
【００４０】
［Ｌ−アラビノースおよびキシロースを使用および／または転換することができる好ましい真核細胞］
より好ましい実施形態では、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現する本発明の細胞は、Ｌ−アラビノースを使用し、そして／あるいはそれをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または本明細書において前に定義したような所望の発酵産物に転換することができ、さらに、キシロースを使用し、そして／あるいはキシロースをキシルロースに転換する能力を示す。キシロースのキシルロースへの転換は、好ましくは一段階の異性化ステップ（キシロースからキシルロースへの直接異性化）である。従って、このタイプの細胞は、Ｌ−アラビノースおよびキシロースの両方を使用することができる。キシロースを「使用する」は、好ましくは、本明細書において前に定義されたＬ−アラビノースを「使用する」と同じ意味を有する。
【００４１】
キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）、キシルロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）、リブロース５−リン酸エピメラーゼ（５．１．３．１）、リブロース５−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．６）、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）、トランスアルドラーゼ（ＥＣ２．２．１．２）、およびアルドースレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２１）についての酵素の定義は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットにおいて使用された通りである。
【００４２】
好ましい実施形態では、本明細書において前に定義したａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現する本発明の真核細胞は、例えば国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットまたは国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載されるように、キシロースをキシルロースに異性化する能力を有する。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物による宿主細胞の形質転換によって宿主細胞に与えられる。キシロースをキシルロースに異性化する形質転換宿主細胞の能力は、キシロースからキシルロースへの直接異性化である。これは、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼによりそれぞれ触媒されるキシリトール中間体を介するキシロースからキシルロースへの２段階の転換とは対照的に、キシロースイソメラーゼにより触媒される単一の反応でキシロースがキシルロースに異性化されることを意味するものと理解される。
【００４３】
ヌクレオチド配列は、本発明の形質転換宿主細胞内で好ましくは活性型で発現されるキシロースイソメラーゼをコードする。従って、宿主細胞内のヌクレオチド配列の発現は、３０℃でタンパク質１ｍｇあたり少なくとも１０Ｕのキシロースイソメラーゼ活性、好ましくは、３０℃で１ｍｇあたり少なくとも２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００または５００Ｕの比活性を有するキシロースイソメラーゼを産生する。形質転換宿主細胞において発現されるキシロースイソメラーゼの比活性は、本明細書では、宿主細胞の無細胞ライセート、例えば無酵母細胞ライセートのタンパク質１ｍｇあたりのキシロースイソメラーゼ活性単位の量と定義される。キシロースイソメラーゼ活性の決定は、本明細書において以前に既に記載された。
【００４４】
好ましくは、宿主細胞内のキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現は、５０、４０、３０または２５ｍＭ未満であるキシロースに対するＫｍを有するキシロースイソメラーゼを産生し、より好ましくは、キシロースに対するＫｍは約２０ｍＭ以下である。
【００４５】
キシロースイソメラーゼをコードする好ましいヌクレオチド配列は、
（ｅ）配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｇ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列と、
（ｈ）遺伝暗号の縮重のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列と
からなる群から選択することができる。
【００４６】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のキシロースイソメラーゼ、すなわち、原核または真核生物体中に天然に存在するキシロースイソメラーゼと同一であるアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼのどちらもコードすることができる。本発明者らは、キシロースをキシルロースに異性化する能力を真核宿主細胞に与える特定のキシロースイソメラーゼの能力は、イソメラーゼが原核生物起源または真核生物起源のどちらを有するかにあまり依存しないことを発見した。むしろ、これは、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）配列（配列番号７）に対するイソメラーゼのアミノ酸配列の関連性に依存する。驚くことに、真核生物ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）イソメラーゼは、他の既知の真核生物イソメラーゼよりも原核生物のイソメラーゼに関連する。そのため、好ましいヌクレオチド配列は、上記で定義したピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）配列に関連するアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼをコードする。好ましいヌクレオチド配列は、真菌キシロースイソメラーゼ（例えば、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）から）、より好ましくは嫌気性真菌からのキシロースイソメラーゼ、例えば、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）科、カエコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）科、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）科、オルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）科、またはルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）科に属する嫌気性真菌からのキシロースイソメラーゼをコードする。あるいは、好ましいヌクレオチド配列は、細菌キシロースイソメラーゼ、好ましくはグラム陰性細菌、より好ましくはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）綱、またはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、最も好ましくはＢ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（配列番号１５）からのイソメラーゼをコードする。
【００４７】
キシロースイソメラーゼが酵母などの真核宿主細胞において活性型で発現される可能性を増大せるために、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において前に定義された真核宿主細胞に対してそのコドン使用を最適化するように適応され得る。
【００４８】
上記のキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列で形質転換するための宿主細胞は、好ましくは、細胞内への能動的または受動的なキシロース輸送が可能な宿主である。宿主細胞は、好ましくは、活性な解糖を含有する。宿主細胞はさらに内因性ペントースリン酸経路を含有することができ、そしてキシロースから異性化されたキシルロースがピルベートに代謝されるような内因性キシルロースキナーゼ活性を含有することができる。宿主はさらに、好ましくは、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物にピルベートを転換するための酵素を含有する。好ましい宿主細胞は、アルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵が自然に可能な宿主細胞である。宿主細胞はさらに、好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低ｐＨ（すなわち、５、４、３、または２．５よりも低いｐＨで増殖することができる）、ならびに乳酸、酢酸またはギ酸のような有機酸およびフルフラールやヒドロキシ−メチルフルフラールなどの糖分解産物に対する高い耐性、そして高温に対する高い耐性を有する。宿主細胞のこれらの特徴または活性はどれも宿主細胞内に天然に存在してもよいし、あるいは遺伝子改変によって導入または改変されてもよい。適切な細胞は、例えば真菌のような真核微生物であるが、宿主細胞として最も適切なのは酵母または糸状菌である。好ましい酵母および糸状菌は、本明細書において既に定義されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、宿主細胞という表現は細胞と同じ意味を有する。
【００５０】
本発明の細胞は、好ましくは、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換される。使用するのが好ましい核酸構築物は、ａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列を含んで使用される核酸構築物と同じである。
【００５１】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、
本明細書において前に定義したように、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、そしてキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す
本発明の細胞は、さらに、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載されるように、ペントースリン酸経路のフラックスを増大させる遺伝子改変を含む。特に、遺伝子改変は、非酸化的部分のペントースリン酸経路のフラックスの増大を引き起こす。ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスの増大を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、遺伝子改変がフラックスの増大を引き起こす以外は遺伝的に同一である菌株におけるフラックスと比べて、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍にフラックスを増大させる改変を意味すると理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、単独の炭素源としてのキシロース上で改変宿主を増殖させ、キシロース比消費速度を決定し、そしてキシリトールが産生される場合にはキシロース比消費速度からキシリトール比産生速度を差し引くことによって測定することができる。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、唯一の炭素源としてのキシロースにおける増殖速度に比例し、好ましくは、唯一の炭素源としてのキシロースにおける嫌気性増殖速度に比例する。唯一の炭素源としてのキシロースにおける増殖速度（μｍａｘ）と、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスとの間には直線的な関係がある。糖におけるバイオマスの収率は一定なので、キシロース比消費速度（Ｑｓ）は、
糖におけるバイオマスの収率（Ｙｘｓ）によって除した増殖速度（μ）に等しい（所与の一連の条件：嫌気性、増殖培地、ｐＨ、菌株の遺伝的背景などの下で、すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）。そのため、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスの増大は、これらの条件下での最大増殖速度の増大から推定することができる。好ましい実施形態では、細胞はペントースリン酸経路のフラックスを増大させる遺伝子改変を含み、少なくとも３４６ｍｇキシロース／ｇバイオマス／ｈであるキシロース比消費速度を有する。
【００５２】
ペントースリン酸経路のフラックスを増大させる遺伝子改変は、様々な方法で宿主細胞内に導入することができる。これらには、例えば、キシルロースキナーゼおよび／または非酸化的部分のペントースリン酸経路の１つまたは複数の酵素のより高い定常状態活性レベル、ならびに／もしくは非特異的なアルドースレダクターゼ活性の低減された定常状態レベルを達成することが含まれる。定常状態活性レベルにおけるこれらの変化は、変異体（自発性、あるいは化学物質または放射線により誘発）の選択によって、そして／あるいは組換えＤＮＡ技術によって、例えば、それぞれこれらの遺伝子を調節する酵素または因子をコードする遺伝子の過剰発現または不活性化によってもたらされ得る。
【００５３】
より好ましい宿主細胞では、遺伝子改変は、（非酸化的部分の）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは、酵素は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載されるように、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。
【００５４】
（非酸化的部分の）ペントースリン酸経路の酵素の種々の組み合わせが過剰発現されてもよい。例えば、過剰発現される酵素は、少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスアルドラーゼの酵素、または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスケトラーゼの酵素であり得る。本発明の１つの実施形態では、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素のそれぞれが宿主細胞において過剰発現される。より好ましいのは、遺伝子改変がトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの両方の酵素の過剰発現を少なくとも含む宿主細胞であり、それは、このような宿主細胞は既にキシロースにおける嫌気性増殖が可能だからである。実際、いくつかの条件下では、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は既に、４つ全ての酵素、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じキシロースにおける嫌気性増殖速度を有することが発見された。さらに、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両方の酵素を過剰発現する宿主細胞は、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞よりも好ましく、それは、これらの酵素のうちの１つだけの過剰発現は、代謝の不均衡を生じ得るからである。
【００５５】
当該技術分野には本発明の細胞における酵素の過剰発現のために利用可能な種々の手段がある。特に、宿主細胞において酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大させることによって、例えば、宿主細胞のゲノムに遺伝子の追加のコピーを組み込むことによって、エピソームマルチコピー発現ベクターから遺伝子を発現することによって、あるいは遺伝子の多数のコピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することによって、酵素を過剰発現させることができる。
【００５６】
あるいは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現される酵素をコードする配列に対してネイティブでないプロモーター、すなわち作動可能に連結されたコード配列に対して異種であるプロモーターを用いることによって達成することもできる。この目的で適切なプロモーターは本明細書において既に定義されている。
【００５７】
酵素の過剰発現のために使用されるコード配列は、好ましくは、本発明の主細胞と相同である。しかしながら、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットで言及されるように、本発明の宿主細胞に対して異種であるコード配列も同様に適用することができる。
【００５８】
本発明の宿主細胞においてリブロース−５−リン酸イソメラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列はリブロース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号１７と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号１８のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００５９】
本発明の宿主細胞においてリブロース−５−リン酸エピメラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列はリブロース−５−リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号１９と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号２０のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６０】
本発明の宿主細胞においてトランスケトラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列はトランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号２１と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号２２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６１】
本発明の宿主細胞においてトランスアルドラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列はトランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号２３と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号２４のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６２】
酵素の過剰発現は、遺伝子改変宿主細胞における酵素の産生に関する場合、同一条件下で非改変宿主細胞と比較してより高い酵素比活性レベルで酵素が産生されることを意味する。通常これは、同一条件下で非改変宿主細胞と比較して、酵素活性タンパク質（または多サブユニット酵素の場合はタンパク質）がより多量に、というよりもより高い定常状態レベルで産生されることを意味する。同様にこれは通常、同一条件下で非改変宿主細胞と比較して、酵素活性タンパク質をコードするｍＲＮＡがより多量、というよりもやはりより高い定常状態レベルで産生されることを意味する。従って、酵素の過剰発現は、好ましくは、本発明において記載される適切な酵素アッセイを用いて宿主細胞内の酵素の比活性レベルを測定することによって決定される。あるいは、酵素の過剰発現は、例えば酵素に特異的な抗体を用いて酵素タンパク質の特異的な定常状態レベルを定量化することによって、あるいは酵素をコードするｍＲＮＡの特異的な定常レベルを定量化することによって間接的に決定されてもよい。後者は、酵素のための基質が市販されていないために酵素アッセイが容易に実行できないペントースリン酸経路の酵素のために特に適切であり得る。本発明の宿主細胞において、過剰発現される酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一である菌株と比べて少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍過剰発現されるのが好ましい。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルにも適用することができると理解されるべきである。
【００６３】
さらに好ましい実施形態では、
ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、そしてキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示し、そして任意で
本明細書において前に定義したように、ペントース経路のフラックスを増大させる遺伝子改変を含む
本発明の宿主細胞は、さらに、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変を含む。好ましくは、遺伝子改変は、例えば、キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によってキシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は宿主細胞に対して内因性であってもよいし、あるいは宿主細胞に対して異種のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞においてキシルロースキナーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号２５と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号２６のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６４】
特に好ましいキシルロースキナーゼは、国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットで言及されるピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）からのキシルロースキナーゼｘｙｌＢに関連するキシロースキナーゼである。本発明の宿主細胞においてキシルロースキナーゼの過剰発現で使用するためにより好ましいヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号２７と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号２８のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６５】
本発明の宿主細胞において、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変は上記のペントースリン酸経路のフラックスを増大させる改変のいずれかと組み合わせることができるが、この組み合わせは本発明に必須ではない。従って、本明細書において定義されるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素の発現に加えて、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変を含む本発明の宿主細胞は特に本発明に含まれる。本発明の宿主細胞においてキシルロースキナーゼの過剰発現を達成および分析するために当該技術分野において利用可能な種々の手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上記で記載されたものと同じである。本発明の宿主細胞において、過剰発現されるキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一である菌株と比べて少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０または２０倍過剰発現されるのが好ましい。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルにも適用することができると理解されるべきである。
【００６６】
さらに好ましい実施形態では、本明細書において前に定義したように、
ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、そしてキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示し、そして任意で
ペントース経路のフラックスを増大させる遺伝子改変を含み、そして／あるいは
特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝子改変をさらに含む
本発明の宿主細胞は、さらに、宿主細胞において非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝子改変を含む。好ましくは、非特異的なアルドースレダクターゼ活性は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載されるように、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるまたは不活性化する１つまたは複数の遺伝子改変によって宿主細胞において低下される。好ましくは、遺伝子改変は、宿主細胞において非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子のそれぞれの内因性コピーの発現を低下させるまたは不活性化する。宿主細胞は、二倍性、倍数性または異数性の結果として、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の多数のコピーを含むことができ、そして／あるいは宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、異なる遺伝子によってそれぞれコードされるアルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含有することができる。このような場合にも、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現は低下または不活性化されるのが好ましい。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、あるいは遺伝子の破壊によって不活性化され、これに関連して、遺伝子という用語はコード配列の上流側または下流側の任意の非コード配列も含み、その（部分的な）欠失または不活性化は、宿主細胞における非特異的なアルドースレダクターゼ活性の発現の低下をもたらす。本発明の宿主細胞においてその活性が低下されるべきアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、このポリペプチドが、配列番号２９と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいはヌクレオチド配列が中程度の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で配列番号３０のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる。
【００６７】
本発明の宿主細胞において、本明細書において定義されるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素の発現は、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝子改変と組み合わせられる。非特異的なアルドースレダクターゼ活性の低下をもたらす遺伝子改変は、上記の宿主細胞において、ペントースリン酸経路のフラックスを増大させる改変のいずれか、および／または特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる改変のいずれかと組み合わせることができるが、これらの組み合わせは本発明に必須ではない。従って、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる付加的な遺伝子改変を含むａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを発現する宿主細胞は特に本発明に含まれる。
【００６８】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、２００６年９月２７日にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オランダ国）に寄託されたＣＢＳ１２０３２７である。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおいて、好ましくは唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースおよび任意でキシロースにおいて、より好ましくは嫌気条件下で増殖するために自発性の変異体または誘発された変異体（例えば、放射線または化学物質によって）を選択することによって、Ｌ−アラビノース（Ｌ−アラビノースを使用する、そして／あるいはそれをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物に転換する）および任意でキシロースの利用にさらに適応された改変宿主細胞に関する。変異体の選択は、例えば、カイパー（Ｋｕｙｐｅｒ）ら（２００４年、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４頁）によって記載されるような培養物の連続継代によって、および／または国際公開第０６／００９４３４号パンフレットの実施例４に記載されるようなケモスタット培養物における選択圧下での培養によって実施することができる。この選択工程は必要な限り継続させることができる。この選択工程は、好ましくは、１週間から１年までの間実行される。しかしながら、選択工程は必要であればより長い期間実行されてもよい。選択工程の間、細胞は、好ましくは、約２０ｇ／ｌのＬ−アラビノースおよび／または約２０ｇ／ｌのキシロースの存在下で培養される。この選択工程の最後に得られる細胞は、Ｌ−アラビノースおよび／またはキシロースを使用する、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換するその能力に関して改善されることが予想される。これに関連して、「改善された細胞」は、得られた細胞が、それが由来する細胞よりも効率的な方法でＬ−アラビノースおよび／またはキシロースを使用できることを意味し得る。例えば、得られる細胞は、より良く増殖する（同じ条件下でそれが由来する細胞よりも少なくとも２％の比増殖速度の増大）ことが予想される。好ましくは、増大は、少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上である。比増殖速度は、当業者には知られているようにＯＤ６６０から計算することができる。そのため、ＯＤ６６０を監視することによって比増殖速度を推定することができる。これに関連して、「改善された細胞」は、得られた細胞が、それが由来する細胞よりも効率的な方法でＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換することも意味し得る。例えば、得られる細胞は、より大量のＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）を産生する（同じ条件下でそれが由来する細胞よりも、これらの化合物の少なくとも１つの増大が少なくとも２％である）ことが予想される。好ましくは、増大は少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上である。これに関連して、「改善された細胞」は、得られた細胞が、それが由来する細胞よりも効率的な方法でキシロースをキシルロースおよび／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換す��ことも意味し得る。例えば、得られる細胞は、より大量のキシルロースおよび／または所望の発酵産物（エタノールなど）を産生する（同じ条件下でそれが由来する細胞よりも、これらの化合物の少なくとも１つの増大が少なくとも２％である）ことが予想される。好ましくは、増大は、少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上である。
【００７０】
本発明の好ましい宿主細胞では、変異体の選択によって得られる改変を含む上記の遺伝子改変の少なくとも１つは、炭素源として、好ましくは唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースおよび任意でキシロースにおいて、そして好ましくは嫌気条件下で増殖する能力を宿主細胞に与える。好ましくは、改変宿主細胞は本質的にキシリトールを産生せず、例えば産生されるキシリトールは検出限界よりも低く、あるいは例えばモルベースで消費される炭素の５、２、１、０．５、または０．３％未満である。
【００７１】
好ましくは、改変宿主細胞は、好気条件下少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．２、０．２５または０．３ｈ−１の速度で、あるいは適用できる場合には、嫌気条件下少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１５または０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースおよび任意でキシロースにおいて増殖する能力を有する。好ましくは、改変宿主細胞は、好気条件下少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．２、０．２５または０．３ｈ−１の速度で、あるいは適用できる場合には、嫌気条件下少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．１２、０．１５、または０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのグルコースおよびＬ−アラビノースおよび任意でキシロース（１：１重量比）の混合物において増殖する能力を有する。
【００７２】
好ましくは、改変宿主細胞は、少なくとも３４６、３５０、４００、５００、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００または１０００ｍｇ／ｇ細胞／ｈであるＬ−アラビノースおよび任意でキシロースの比消費速度を有する。好ましくは、改変宿主細胞は、グルコースにおける発酵産物（エタノールなど）の宿主細胞の収率の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５または９８％である、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおける発酵産物（エタノールなど）の収率を有する。より好ましくは、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおける発酵産物（エタノールなど）の改変宿主細胞の収率は、グルコースにおける発酵産物（エタノールなど）の宿主細胞の収率に等しい。同様に、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおける改変宿主細胞のバイオマス収率は、好ましくは、グルコースにおける宿主細胞のバイオマス収率の少なくとも５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５または９８％である。より好ましくは、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおける改変宿主細胞のバイオマス収率は、グルコースにおける宿主細胞のバイオマス収率に等しい。グルコースにおける収率と、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースにおける収率との比較において、両方の収率は好気条件または嫌気条件下で比較されると理解される。
【００７３】
より好ましい実施形態では、宿主細胞は、２００６年９月２７日にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オランダ国）に寄託されたＣＢＳ１２０３２８、または２００７年９月２０日にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オランダ国）に寄託されたＣＢＳ１２１８７９である。
【００７４】
好ましい実施形態では、細胞は、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される少なくとも１つの発酵産物を産生する能力を細胞に与える１つまたは複数の酵素を発現する。より好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、エタノールの産生ための宿主細胞である。もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、エタノール以外の発酵産物の産生のための形質転換宿主細胞に関する。このような非エタノール性発酵産物には、原則として、酵母または糸状菌などの真核微生物によって産生可能なバルクまたはファインケミカルが含まれる。このような発酵産物としては、例えば、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンがある。非エタノール性発酵産物の産生のための本発明の好ましい宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。
【００７５】
［方法］
さらなる態様では、本発明は、Ｌ−アラビノース源および任意でキシロース源を含む炭素源の発酵のために本発明の宿主細胞が使用される発酵方法に関する。好ましくは、Ｌ−アラビノース源およびキシロース源は、Ｌ−アラビノースおよびキシロースである。さらに、発酵培地中の炭素源は、グルコース源を含むこともできる。Ｌ−アラビノース源、キシロース源またはグルコース源は、Ｌ−アラビノース、キシロースまたはグルコース自体でもよいし、あるいは例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプン、アラビナンなどのＬ−アラビノース、キシロースまたはグルコース単位を含む炭水化物オリゴマーまたはポリマーでもよい。このような炭水化物からキシロースまたはグルコース単位を放出するために、適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）が発酵培地に添加されるか、あるいは改変宿主細胞によって産生され得る。後者の場合、改変宿主細胞は、このようなカルボヒドラーゼを産生および排出するように遺伝子操作され得る。オリゴマーまたはポリマーのグルコース源を用いる付加的な利点は、例えば、律速量のカルボヒドラーゼを用いることによって、発酵中に（より）低い濃度の遊離グルコースを保持できることである。これは、次に、キシロースなどの非グルコース糖の代謝および輸送のために必要とされる系の抑制を防止するであろう。好ましい方法では、改変宿主細胞はＬ−アラビノース（任意でキシロース）およびグルコースの両方を好ましくは同時に発酵させ、この場合、ジオーキシー増殖を防止するためにグルコース抑制に対して非感受性である改変宿主細胞が使用されるのが好ましい。炭素源としてのＬ−アラビノース源、任意でキシロース（およびグルコース）源に加えて、発酵培地はさらに、改変宿主細胞の増殖のために必要とされる適切な成分を含み得る。酵母または糸状菌などの微生物の増殖のための発酵培地の組成は当該技術分野においてよく知られている。
【００７６】
好ましい方法では、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を産生するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）本明細書において定義される改変宿主細胞によりＬ−アラビノース源および任意でキシロース源を含有する培地を発酵させるステップであって、宿主細胞がＬ−アラビノースおよび任意でキシロースを発酵産物に発酵させるステップと、任意で
（ｂ）発酵産物を回収するステップと
を含む。
【００７７】
発酵方法は、例えば、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリンＧまたはペニシリンＶ、およびその発酵誘導体）、および／またはセファロスポリンのような発酵産物を産生するための方法である。発酵方法は、好気性発酵方法でも嫌気性発酵方法でもよい。嫌気性発酵方法は、本明細書では、酸素を存在させずに実行される発酵方法、あるいは実質的に酸素が消費されない、好ましくは５、２．５または１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される（すなわち、酸素消費が検出できない）発酵方法、そして有機分子が電子供与体および電子受容体としての機能を果たす発酵方法であると定義される。酸素が存在せずに解糖およびバイオマス形成において産生されるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化させることができない。この問題を解決するために、多くの微生物は電子受容体および水素受容体としてピルベートまたはその誘導体の１つを使用し、それによりＮＡＤ＋が再生される。従って、好ましい嫌気性発酵方法では、電子（および水素受容体）としてピルベートが使用され、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンなどの発酵産物に還元される。好ましい実施形態では、発酵方法は嫌気性である。嫌気性の方法は好気性の方法よりも安価であり、あまり特別な装置が必要とされないので有利である。さらに、嫌気性の方法は、好気性の方法よりも高い産物収率を与えることが予想される。好気条件下では、通常、バイオマス収率は嫌気条件下よりも高い。結果として、通常好気条件下で予想される産物収率は、嫌気条件下よりも低い。本発明者らによると、本発明の方法は、これまでに開発されたＬ−アラビノース源を含む培地による最初の嫌気性発酵方法である。
【００７８】
もう１つの好ましい実施形態では、発酵方法は酸素制限条件下で行われる。より好ましくは、発酵方法は好気性であり、酸素制限条件下で行われる。酸素制限発酵方法は、気体から液体への酸素の転移によって酸素消費が制限される方法である。酸素制限の程度は、入ってくるガス流の量および組成と、使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性とによって決定される。好ましくは、酸素制限条件下での方法において、酸素消費速度は、少なくとも５．５、より好ましくは少なくとも６、さらにより好ましくは少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
【００７９】
発酵方法は、好ましくは、改変細胞にとって最適な温度で実行される。従って、ほとんどの酵母または真菌細胞のために、発酵方法は、４２℃よりも低い、好ましくは３８℃よりも低い温度で実施される。酵母または糸状菌宿主細胞のために、発酵方法は、３５、３３、３０または２８℃よりも低い温度、そして２０、２２、または２５℃よりも高い温度で実施されるのが好ましい。
【００８０】
好ましい方法はエタノールの産生のための方法であり、この方法は、（ａ）本明細書において定義される改変宿主細胞によりＬ−アラビノース源および任意でキシロース源を含有する培地を発酵させるステップであって、宿主細胞がＬ−アラビノースおよび任意でキシロースをエタノールに発酵させるステップと、任意で（ｂ）エタノールを回収するステップとを含む。発酵培地は、グルコース源（これもエタノールに発酵される）を含むこともできる。好ましい実施形態では、エタノールを産生するための発酵方法は嫌気性である。嫌気性は既に、本明細書において前に定義されている。もう１つの好ましい実施形態では、エタノールを産生するための発酵方法は好気性である。もう１つの好ましい実施形態では、エタノールを産生するための発酵方法は酸素制限条件下で行われ、より好ましくは好気性であり、酸素制限条件下で行われる。酸素制限条件は既に、本明細書において前に定義されている。
【００８１】
この方法において、エタノールの容積生産性は、好ましくは、１時間に１リットルあたり少なくとも０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、５．０または１０．０ｇのエタノールである。この方法においてＬ−アラビノースおよび任意でキシロース、ならびに／もしくはグルコースにおけるエタノール収率は、好ましくは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５または９８％である。エタノール収率は、本明細書では、理論的な最大収率の百分率であると定義され、グルコースおよびＬ−アラビノースおよび任意でキシロースについては、グルコースまたはキシロース１ｇあたり０．５１ｇのエタノールである。もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を産生するための方法に関する。この方法は、好ましくは、（ａ）本明細書において上記で定義した改変宿主細胞によりＬ−アラビノース源および任意でキシロース源を含有する培地を発酵させるステップであって、宿主細胞が、Ｌ−アラビノースおよび任意でキシロースを発酵産物に発酵させるステップと、任意で（ｂ）発酵産物を回収するステップとを含む。好ましい方法では、培地はグルコース源も含有する。
【００８２】
エタノールの産生をもたらす本発明の発酵方法では、既知のエタノール発酵方法との比較によって、いくつかの利点：
嫌気性の方法が可能であること
酸素制限条件も可能であること
より高いエタノール収率およびエタノール産生速度を得ることができること
使用される菌株がＬ−アラビノースおよび任意でキシロースを使用可能であり得ること
に言及することができる。
【００８３】
上記の発酵方法の代わりに、本発明のさらなる態様としてもう１つの発酵方法が提供され、Ｌ−アラビノース源、キシロース源およびグルコース源からなる群から選択される（しかし、これらに限定されない）少なくとも２種の炭素源を含む炭素源の発酵のために少なくとも２種の別個の細胞が使用される。この発酵方法において、「少なくとも２種の別個の細胞」は、この方法が好ましくは共発酵方法であることを意味する。１つの好ましい実施形態では、２種の別個の細胞が使用され、一方は前に定義した本発明の細胞であり、Ｌ−アラビノースを使用することができ、そして／あるいはそれをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／または所望の発酵産物（エタノールなど）に転換することができ、そして任意でキシロースを使用することができる。他方の細胞は、例えば、国際公開第０３／０６２４３０号パンフレットおよび／または国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに定義されるように、キシロースを使用することができ、そして／あるいはそれをエタノールなどの所望の発酵産物に転換することができる菌株である。キシロースを使用することができる細胞は、好ましくは、本明細書において前に定義したように、キシロースをキシルロースに直接異性化する（１段階で）能力を示す菌株である。これらの２種の別個の菌株は、好ましくは、Ｌ−アラビノース源、キシロース源および任意でグルコース源の存在下で培養される。少なくとも１種の細胞が存在する少なくとも１種の炭素源を使用することができる、そして／あるいはそれをエタノールなどの所望の発酵産物に転換することができるならば、３種以上の別個の細胞が共培養されてもよく、そして／あるいは３種以上の炭素源が使用されてもよい。「少なくとも１種の炭素源を使用する」という表現は、「Ｌ−アラビノースの使用」という表現と同じ意味を有する。「それ（すなわち、炭素源）を所望の発酵産物に転換する」という表現は、「Ｌ−アラビノースを所望の発酵産物に転換する」と同じ意味を有する。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明は、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を産生するための方法に関し、この方法は、
（ａ）本明細書において前に定義された本発明の細胞と、キシロースを使用することができ、そして／あるいはキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す細胞とによって、少なくともＬ−アラビノース源およびキシロース源を含有する培地を発酵させるステップであって、各細胞がＬ−アラビノースおよび／またはキシロースを発酵産物に発酵させるステップと、任意で
（ｂ）発酵産物を回収するステップと
を含む。
【００８５】
上記の発酵方法の全ての好ましい実施形態はこのさらなる発酵方法の好ましい実施形態（発酵産物の同一性、Ｌ−アラビノース源およびキシロース源の同一性、発酵条件（好気条件または嫌気条件、酸素制限条件、方法が実行されている温度、エタノールの生産性、エタノールの収率））でもある。
【００８６】
［遺伝子改変］
上記の本発明の宿主細胞において酵素を過剰発現させるため、そして宿主細胞、好ましくは酵母をさらに遺伝子改変するために、宿主細胞は、当該技術分野においてよく知られている方法によって、本発明の種々の核酸構築物で形質転換される。このような方法は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７年）などの標準的なハンドブックから分かる。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変のための方法は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレットおよび国際公開第００／３７６７１号パンフレットから分かる。
【００８７】
本発明の宿主細胞において酵素の過剰発現のために核酸構築物において使用するためのプロモーターについては上記に記載した。過剰発現のための核酸構築物において、酵素をコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、好ましくは、転写終結配列に作動可能に連結される。好ましくは、終結配列は、例えば選択した酵母種などの選択した宿主細胞において作動可能である。いずれの場合も、ターミネーターの選択は重要ではなく、例えば、酵母遺伝子から選択され得るが、非酵母真核生物遺伝子から選択されてもターミネーターは機能することもある。転写終結配列は、さらに、ポリアデニル化シグナルを含むことが好ましい。好ましい終結配列は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）およびＰＧＩ１ターミネーターである。より好ましくは、ＡＤＨ１およびＰＧＩ１ターミネーターはいずれもＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する（それぞれ、配列番号５０および配列番号５３）。
【００８８】
任意で、選択可能なマーカーが核酸構築物中に存在してもよい。本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であることが可能であり、形質転換されていない細胞の中から形質転換細胞を選択するために適切な抗生物質を使用することができる。しかしながら、好ましくは、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）などの非抗生物質耐性マーカーが使用される。好ましい実施形態では、核酸構築物で形質転換された宿主細胞は、マーカー遺伝子を含まない。組換えマーカー遺伝子を含まない微生物宿主細胞を構築するための方法は欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書に開示されており、双方向性マーカーの使用に基づく。あるいは、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーが本発明の核酸構築物に取り込まれて、形質転換細胞のスクリーニングを可能にしてもよい。
【００８９】
本発明の核酸構築物中に存在し得る任意でさらなる要素には、１つまたは複数のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメアおよび／またはマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が含まれるが、これらに限定されない。本発明の核酸構築物は、さらに、ＡＲＳ配列などの自己複製のための配列を含むことができる。適切なエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（フリールら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５頁）プラスミドに基づくことができる。あるいは、核酸構築物は、好ましくは相同組換えによって組込みのための配列を含むこともできる。従って、このような配列は、宿主細胞のゲノムにおける組込みのための標的部位に対して相同の配列であり得る。本発明の核酸構築物は、核酸／核酸配列の制限および連結などの技術を通常含む本質的に既知の方法で提供することができ、そのために、サムブルックおよびラッセル（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどの標準的なハンドブックが参照される。
【００９０】
酵母または真菌における不活性化および遺伝子破壊の方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、フィンチャム（Ｆｉｎｃｈａｍ）、１９８９年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．５３（１）：１４８−７０頁および欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書を参照）。
【００９１】
本明細書およびその特許請求の範囲において、「含む」という動詞およびその活用はその非限定的な意味で使用され、その語句に続く項目が含まれるが、明確に言及されていない項目が排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、内容が明らかに１つおよびただ１つの要素の存在を必要としない限り、１つよりも多い要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００９２】
本発明は、本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない以下の実施例によってさらに記載される。
【００９３】
［実施例］
［プラスミドおよび菌株の構築］
［菌株］
この研究で記載されるＬ−アラビノース消費性サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｈｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株は、菌株ＲＷＢ２２０に基づいており、それ自体はＲＷＢ２１７の誘導体である。ＲＷＢ２１７は、ペントースリン酸経路における酵素の発現をコードする４つの遺伝子、ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１、ＲＫＩ１が過剰発現されているＣＥＮ．ＰＫ菌株である（カイパーら、２００５年ａ）。さらにアルドースレダクターゼをコードする遺伝子（ＧＲＥ３）が欠失されている。菌株ＲＷＢ２１７は、キシルロキナーゼ（ＸＫＳｌ）の過剰発現のためのＬＥＵ２マーカーを有する単一コピープラスミドと、キシロースイソメラーゼＸｙｌＡの発現のためのマーカーとしてのＵＲＡ３を有するエピソームマルチコピープラスミドとの２つのプラスミドも含有する。カイパーら（２００５年ｂ）に記載されるキシロースにおける増殖の改善のための選択手順をＲＷＢ２１７に受けさせた。この手順によって、ＲＷＢ２１８（カイパーら、２００５年ｂ）およびＲＷＢ２１９の２種の純粋な菌株を得た。ＲＷＢ２１８とＲＷＢ２１９の間の違いは、選択手順の後、ＲＷＢ２１８は炭素源としてグルコースを有するミネラル培地におけるプレーティングおよび再ストリーキングによって得られたが、ＲＷＢ２１９のためにはキシロースを使用したことである。
【００９４】
両方のプラスミドの損失を促進するために、炭素源としてグルコースを有するＹＰ（ＹＰＤ）において菌株ＲＷＢ２１９を非選択的に増殖させた。ＹＰＤ上にプレーティングした後、ウラシルおよびロイシンの栄養要求性を見ることによってプラスミド損失について単一のコロニーを試験した。ＲＫＩ１過剰発現構築物を組み込んだ後でも存在するＫａｎＭＸカセットを除去するために、両方のプラスミドを失った菌株を、ｃｒｅリコンビナーゼを含有するｐＳＨ４７で形質転換した（グルデネル（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ）ら、１９９６年）。プラスミドを有するコロニーを、１％のガラクトースを有する酵母ペプトン培地（ＹＰ）（１０ｇ／ｌの酵母抽出物および２０ｇ／ｌのペプトン、いずれもＢＤ  Ｄｉｆｃｏ  ベルギーから）中に再懸濁させ、３０℃で１時間インキュベートした。約２００個の細胞をＹＰＤ上にプレーティングした。得られたコロニーをＫａｎＭＸマーカー（Ｇ４１８耐性）およびｐＳＨ４７（ＵＲＡ３）の損失について検査した。次に、ＫａｎＭＸマーカーおよびｐＳＨ４７プラスミドの両方を失った菌株をＲＷＢ２２０と命名した。本特許において試験される菌株を得るために、ｐＲＷ２３１およびｐＲＷ２４３（表２）でＲＷＢ２２０を形質転換し、菌株ＩＭＳ０００１を得た。
【００９５】
構築中、複合ＹＰ：１０ｇｌ−１の酵母抽出物（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇｌ−１のペプトン（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）、またはプレートの場合は炭素源としてグルコース（２％）が補充された合成培地（ＭＹ）（ＹＰＤまたはＭＹＤ）（ヴァーダイン（Ｖｅｒｄｕｙｎ）ら、１９９２年）および１．５％の寒天上に菌株を保持した。プラスミドによる形質転換の後、菌株をＭＹＤ上にプレーティングした。
【００９６】
酵母の形質転換は、ギーツ（Ｇｉｅｔｚ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）（２００２年）に従って行った。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＸＬ−１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州ラホーヤ）においてプラスミドを増幅した。イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）ら（１９９０年）に従って形質転換を実施した。プラスミドを単離するためにＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートまたは液体ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）培地において大腸菌を増殖させた（サムブルックら、１９８９年）。
【００９７】
［プラスミド］
Ｌ−アラビノースにおいて増殖するために、酵母は３種の異なる遺伝子、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（ＡｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（ＡｒａＢ）、およびＬ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ（ＡｒａＤ）を発現する必要がある（ベッカーおよびボーレス、２００３年）。この研究では、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのＡｒａＡ、ＡｒａＢ、およびＡｒａＤを発現させることが選択された。最終的な目的は、Ｄ−キシロースのような他の糖と組み合わせてＬ−アラビノースを消費することなので、同じプラスミドにおいて、細菌Ｌ−アラビノース経路をコードする遺伝子を、Ｄ−キシロース消費をコードする遺伝子と組み合わせた。
【００９８】
高レベルの発現を得るために、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＡｒａＡおよびＡｒａＤ遺伝子をプラスミドｐＡＫＸ００２（２μＸｙｌＡを支持する支持プラスミド）内に連結させた。
【００９９】
ＳｐｅＩ５’Ｐｔｄｈ３および５’ＡｒａＡＰｔｄｈ３を有するＴＤＨ３プロモーター（配列番号４９）、Ｐｔｄｈ５’ＡｒａＡおよびＴａｄｈ３’ＡｒａＡを有するＡｒａＡ遺伝子、ならびに３’ＡｒａＡＴａｄｈ１および３Ｔａｄｈ１−ＳｐｅＩを有するＡＤＨ１ターミネーター（配列番号５０）の切断バージョンを増幅することによって、ＡｒａＡカセットを構築した。ゲルから３種の断片を抽出し、ほぼ等モル量で混合した。この混合物において、ＳｐｅＩ−５’Ｐｔｄｈ３および３’Ｔａｄｈ１ＳｐｅＩオリゴを用いてＰＣＲを実施した。得られたＰＴＤＨ３−ＡｒａＡ−ＴＡＤＨ１カセットをゲル精製し、５’および３’ＳｐｅＩ部位で切断し、次にＮｈｅＩで切断したｐＡＫＸ００２内に連結させ、プラスミドｐＲＷ２３０を得た。
【０１００】
ＡｒａＤ構築物は、まず、オリゴＳａｌＩ５’Ｐｈｘｔ７および５’ＡｒａＤＰｈｘｔを有するＨＸＴ７プロモーター（配列番号５２）、Ｐｈｘｔ５’ＡｒａＤおよびＴｐｇｉ３’ＡｒａＤを有するＡｒａＤ遺伝子、ならびに３’ＡｒａＤＴｐｇｉおよび３’ＴｐｇｉＳａｌＩオリゴを有するＧＰＩ１ターミネーター（配列番号５３）領域の切断バージョンを増幅することによって作成した。得られた断片をゲルから抽出し、ほぼ等モル量で混合し、その後、ＳａｌＩ５’Ｐｈｘｔ７および３’Ｔｐｇｉ１ＳａｌＩオリゴを用いてＰＣＲを実施した。得られたＰＨＸＴ７−ＡｒａＤ−ＴＰＧＩ１カセットをゲル精製し、５’および３’ＳａｌＩ部位で切断し、次に、ＸｈｏＩで切断したｐＲＷ２３０内に連結させ、プラスミドｐＲＷ２３１（図１）を得た。
【０１０１】
Ｌ−リブロキナーゼの高すぎる発現は増殖に有害なので（ベッカーおよびボーレス、２００３年）、組込みプラスミドにおいて、ＡｒａＢ遺伝子を、キシルロキナーゼをコードするＸＫＳ１遺伝子と組み合わせた。このために、ｐ４１５ＡＤＨＸＫＳおよびｐＲＳ３０５の両方をＰｖｕＩで切断し、ｐ４１５ＡＤＨＸＫＳからのＡＤＨＸＫＳ含有ＰｖｕＩ断片をｐＲＳ３０５からのベクター骨格に連結させることによって、まずｐ４１５ＡＤＨＸＫＳ（カイパーら、２００５年ａ）をｐＲＷ２２９に変化させ、ｐＲＷ２２９を得た。
【０１０２】
ＳａｃＩ５’Ｐｐｇｉ１および５’ＡｒａＢＰｐｇｉ１オリゴを有するＰＧＩ１プロモーター、Ｐｐｇｉ５’ＡｒａＢおよびＴａｄｈ３’ＡｒａＢオリゴを有するＡｒａＢ遺伝子、ならびに３’ＡｒａＢＴａｄｈ１および３’Ｔａｄｈ１ＳａｃＩオリゴを有するＡＤＨ１ターミネーターを増幅することによって、ＰＧＩ１プロモーター（配列番号５１）とＡＤＨ１ターミネーター（配列番号５０）との間にＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＡｒａＢ遺伝子を含有するカセットを作成した。ゲルから３種の断片を抽出し、ほぼ等モル量で混合した。この混合物において、ＳａｃＩ−５’Ｐｐｇｉ１および３’Ｔａｄｈ１ＳａｃＩオリゴを用いてＰＣＲを実施した。得られたＰＰＧＩ１−ＡｒａＢ−ＴＡＤＨ１カセットをゲル精製し、５’および３’ＳａｃＩ部位で切断し、次にＳａｃＩで切断したｐＲＷ２２９内に連結させ、プラスミドｐＲＷ２４３（図１）を得た。
【０１０３】
ｐＲＷ２３１およびｐＲＷ２４３（表２）で菌株ＲＷＢ２２０を形質転換し、菌株ＩＭＳ０００１を得た。
【０１０４】
制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州ビバリー、およびＲｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）およびＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）は、製造業者の仕様書に従って使用した。Ｑｉａｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、独国ヒルデン）を用いて、大腸菌からのプラスミドの単離を実施した。１×ＴＢＥ中の１％アガロース（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）ゲルにおいてＤＮＡ断片を分離した（サムブルックら、１９８９年）。Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルからの断片の単離を実行した。ＡｒａＡ、ＡｒａＢおよびＡｒａＤカセット（の要素）の増幅は、製造業者の仕様書に従ってＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行った。テンプレートは、プロモーターおよびターミネーターについてはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、あるいはＡｒａ遺伝子についてはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ２０２０５の染色体ＤＮＡであった。以下の設定：５５℃、６０℃または６５℃で１分のアニーリング、予想される断片サイズに応じて７５℃で１〜３分の延長、そして９４℃で１分の変性の３０サイクルを有するＢｉｏｍｅｔｒａ  ＴＧｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、独国ゲッティンゲン）においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。
【０１０５】
［培養および培地］
振とうフラスコ培養を合成培地において３０℃で実施した（ヴァーダインら、１９９２年）。滅菌の前に、２ＭのＫＯＨで培地のｐＨを６．０に調整した。固体合成培地の場合は１．５％の寒天を添加した。５００ｍｌの振とうフラスコ内の適切な糖を含有する１００ｍｌの培地に凍結貯蔵培養物を播種することによって前培養物を調製した。オービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）における３０℃でのインキュベーションの後、この培養物を用いて、振とうフラスコ培養物または発酵槽培養物のいずれかに播種した。嫌気性培養のための合成培地に、エタノール中に溶解した０．０１ｇｌ−１のエルゴステロールおよび０．４２ｇｌ−１のＴｗｅｅｎ８０を補充した（アンドレアセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）およびスティア（Ｓｔｉｅｒ）、１９５３年、アンドレアセンおよびスティア、１９５４年）。１ｌの作業容積を有する２ｌの実験用発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、オランダ国スヒーダム）において３０℃で嫌気性（連続）バッチ培養を実行した。２ＭのＫＯＨの自動添加によって培養物のｐＨをｐＨ５．０に保持した。培養物を８００ｒｐｍで攪拌し、０．５ｌ分−１の窒素ガスでスパージした（１０ｐｐｍ未満の酸素）。酸素の拡散を最小限にするために、発酵槽にノルプレン（Ｎｏｒｐｒｅｎｅ）管類を備えた（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｃｏｍｐａｎｙ、米国バーノンヒルズ）。酸素電極を用いて溶解した酸素を監視した（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ、オランダ国スヒーダム）。約０．０５ｌ分−１におけるヘッドスペースの通気によって、同じ実験設定で酸素制限条件を達成した。
【０１０６】
［乾燥重量の決定］
予め秤量したニトロセルロースフィルタ（細孔サイズ０．４５ｌｍ、Ｇｅｌｍａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国アナーバー）によって培養サンプル（１０．０ｍｌ）をろ過した。培地を除去した後、フィルタを脱塩水で洗浄し、３６０Ｗの電子レンジ（Ｂｏｓｃｈ、独国シュトゥットガルト）で２０分間乾燥させて秤量した。２通りの決定の変動は１％未満であった。
【０１０７】
［ガス分析］
排出ガスを冷却器（２℃）で冷却し、Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ乾燥器タイプＭＤ−１１０−４８Ｐ−４（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ、米国トムズリバー）で乾燥させた。ＮＧＡ２０００アナライザー（Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、米国オービル）でＯ２およびＣＯ２の濃度を決定した。既に記載されたように、排出ガス流の速度および酸素の比消費速度および二酸化炭素産生速度を決定した（バン・ウルク（Ｖａｎ  Ｕｒｋ）ら、１９８８年、ウォイスイス（Ｗｅｕｓｔｈｕｉｓ）ら、１９９４年）。これらのバイオマス比速度の計算において、培養サンプルを取り除くことにより生じる容積変化を考慮した。
【０１０８】
［代謝産物の分析］
ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ、米国ハーキュリーズ）、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率検出器、およびＷａｔｅｒｓ２４８７ＵＶ検出器が搭載されたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、米国ミルフォード）を用いるＨＰＬＣによって、グルコース、キシロース、アラビノース、キシリトール、有機酸、グリセロールおよびエタノールを分析した。０．６ｍｌ／分の流速で０．５ｇｌ−１の硫酸によりカラムを６０℃で溶出させた。
【０１０９】
［キシルロース５−リン酸のためのアッセイ（サルジバル（Ｚａｌｄｉｖａｒ）Ｊ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、（２００２年）、５９：４３６−４４２頁）］
キシルロース５−リン酸などの細胞内代謝産物の分析のために、グルコースの枯渇の前（２２および２６時間の培養）およびグルコースの枯渇の後（４２、７９および１３１時間の培養）に、反応器から５ｍｌのブロスを２通り採取した。
【０１１０】
代謝の停止、代謝産物の固相抽出および分析のための手順は、スミツ（Ｓｍｉｔｓ）Ｈ．Ｐ．ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６１：３６−４２頁（１９９８年））によって詳細に記載されている。しかしながら、細胞抽出物を分析するために使用されるパルスアンペロメトリック検出法と結合した高圧イオン交換クロマトグラフィによる分析を少し修正した。使用した溶液は、溶離液Ａ（７５ｍＭのＮａＯＨ）および溶離液Ｂ（５００ｍＭのＮａＡｃ）であった。溶離溶液中の炭酸塩の汚染を防止するために、ＮａＯＨペレットの代わりに炭酸塩濃度の低い５０％のＮａＯＨ溶液（Ｂａｋｅｒ  Ａｎａｌｙｓｅｄ、オランダ国デーベンテール）を使用した。溶離液をヘリウム（Ｈｅ）で３０分間脱気してから、Ｈｅ雰囲気下に保持した。グラジエントポンプをプログラムして、以下のグラジエントを生じさせた：１００％Ａおよび０％Ｂ（０分）、７０％までのＡの直線的減少および３０％までのＢの直線的増加（０〜３０分）、３０％までのＡの直線的減少および７０％までのＢの直線的増加（３０〜７０分）、０％までのＡの直線的減少および１００％までのＢの直線的増加（７０〜７５分）、０％Ａおよび１００％Ｂ（７５〜８５分）、１００％までのＡの直線的増加および０％までのＢの直線的減少（８５〜９５分）。移動相を１ｍｌ／分の流速で流した。他の条件は、スミツら（１９９８年）に従った。
【０１１１】
［炭素の回収率］
炭素の回収率は、形成された産物中の炭素を消費した糖炭素の全量で除したものとして計算し、４８％のバイオマスの炭素含量に基づいた。発酵中のエタノールの蒸発を補正するために、産生したエタノールの量は、測定したＣＯ２の累積的産生量から、バイオマス合成により生じたＣＯ２産生量（バイオマス１グラムあたり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２（ヴァーダインら、１９９０年））と、アセテート形成に関連するＣＯ２とを引いた値に等しいと仮定した。
【０１１２】
［Ｌ−アラビノースにおける増殖のための選択］
キシロース（ＸｙｌＡおよびＸＫＳ１）およびアラビノース（ＡｒａＡ、ＡｒａＢ、ＡｒａＤ）の両方の代謝のための経路をコードする遺伝子を含有する菌株ＩＭＳ０００１（２７／０９／０６にＣＢＳに寄託されたＣＢＳ１２０３２７）を上記の手順に従って構築した。キシロースにおいて増殖することができる（データは示されない）が、菌株ＩＭＳ０００１は、２％のＬ−アラビノースが補充された固体合成培地において増殖することができないようであった。Ｌ−アラビノースを増殖のための炭素源として用いることができるＩＭＳ０００１の変異体を、振とうフラスコにおける連続転移および発酵槽における連続バッチ培養（ＳＢＲ）によって選択した。
【０１１３】
連続転移実験のために、０．５％のガラクトースを含有する１００ｍｌの合成培地を含有する５００ｍｌの振とうフラスコに、菌株ＩＭＳ０００１または基準菌株ＲＷＢ２１９のいずれかを播種した。７２時間後（６６０ｎｍにおける光学濃度が３．０）、培養物を用いて、０．１％のガラクトースおよび２％のアラビノースを含有する新しい振とうフラスコに播種した。較正標準としてＤ−リブロースを用いたＨＰＬＣ決定に基づいて、ガラクトース／アラビノース混合物を含有する培地における菌株ＩＭＳ０００１の最初の培養中に既に、アラビノースの一部はリブロースに転換され、続いて上澄みに排出されることが決定された。これらのＨＰＬＣ分析は、ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ、米国ハーキュリーズ）、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率検出器、およびＷａｔｅｒｓ２４８７ＵＶ検出器が搭載されたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、米国ミルフォード）を用いて実施した。０．６ｍｌ／分の流速の０．５ｇｌ−１の硫酸を用いて６０℃でカラムを溶出させた。基準菌株ＲＷＢ２１９とは対照的に、菌株ＩＭＳ０００１の培養物のＯＤ６６０は、ガラクトースの枯渇後に増大した。約８５０時間後に菌株ＩＭＳ０００１によるアラビノースにおける増殖が観察された場合（図２）には、この培養物を、２％アラビノースを含有する振とうフラスコに１．７のＯＤ６６０で連続的に移した。次に、２〜３のＯＤ６６０で２％のアラビノースを含有する新しい培地に培養物を移した。アラビノースの利用は、時折ＨＰＬＣによってアラビノース濃度を測定することによって（データは示されない）確認した。これらの培養物の増殖速度は、約３６００時間で０から０．１５ｈ−１まで上昇した（図３）。
【０１１４】
酸素制限条件下でのバッチ発酵は、２％のアラビノースが補充された１ｌの合成培地に、２％のＬ−アラビノースにおける最大増殖速度が約０．１２ｈ−１のアラビノース増殖ＩＭＳ０００１細胞の１００ｍｌ振とうフラスコ培養物を播種することによって開始した。アラビノースにおける増殖が観察される場合には、窒素ガスでスパージすることによって培養物を嫌気条件にさらした。嫌気性バッチ培養の連続サイクルは、手動または自動のいずれかで２０ｇｌ−１のアラビノースを有する合成培地で培養物の９０％を置換することによって開始した。ＳＢＲ発酵中のそれぞれのサイクル毎に、ＣＯ２プロファイルから指数関数的な増殖速度を評価した（図４）。１３サイクルで、指数関数的な増殖速度は０．０２５から０．０８ｈ−１まで増大した。２０サイクルの後、サンプルを採取し、２％のＬ−アラビノースを補充した固体合成培地にプレーティングし、３０℃で数日間インキュベートした。別個のコロニーをＬ−アラビノースを有する固体合成培地に２回再ストリーキングした。最後に、２％のＬ−Ｌ−アラビノースを有する合成培地を含有する振とうフラスコに単一のコロニーを播種し、３０℃で５日間インキュベートした。この培養物は、菌株ＩＭＳ０００２と命名した（２７／０９／０６にＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ（ＣＢＳ）に寄託されたＣＢＳ１２０３２８）。培養サンプルを採取し、３０％のグリセロールを添加し、サンプルを−８０℃で貯蔵した。
【０１１５】
［混合培養物の発酵］
工業バイオテクノロジーのための所望の原料であるバイオマス加水分解物は、種々の糖からなり、その中でもグルコース、キシロースおよびアラビノースが一般にかなりの画分で存在する複雑な混合物を含有する。グルコースおよびアラビノースだけでなくキシロースのエタノール発酵も達成するために、アラビノース発酵性菌株ＩＭＳ０００２およびキシロース発酵性菌株ＲＷＢ２１８の混合培養物を用いて嫌気性バッチ発酵を実施した。３０ｇｌ−１のＤ−グルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースが補充された８００ｍｌの合成培地を含有する嫌気性バッチ発酵槽に１００ｍｌの菌株ＩＭＳ０００２の前培養物を播種した。１０時間後、１００ｍｌのＲＷＢ２１８の播種菌を添加した。唯一の菌株ＩＭＳ０００２による混合糖発酵とは対照的に、グルコースの枯渇後にキシロースおよびアラビノースの両方が消費された（図５Ｄ）。混合培養物は全ての糖を完全に消費し、８０時間以内に５６４．０±６．３ｍｍｏｌｌ−１のエタノール（ＣＯ２産生から計算）が産生され、糖１ｇあたり０．４２ｇという高い全収率であった。キシリトールは、４．７ｍｍｏｌＬ−１の濃度までのほんの少量で産生された。
【０１１６】
［菌株ＩＭＳ０００２の特徴付け］
唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースか、あるいはグルコース、キシロースおよびＬ−アラビノースの混合物のいずれかを有する合成培地における嫌気性バッチ発酵中に菌株ＩＭＳ０００２の増殖および産物形成を決定した。菌株ＩＭＳ０００２の−８０℃の凍結貯蔵物を播種し、３０℃で４８時間インキュベートすることによって、２％のＬ−アラビノースを有する１００ｍｌの合成培地を含有する振とうフラスコ中で、これらの嫌気性バッチ発酵のための前培養物を調製した。
【０１１７】
図５Ａは、菌株ＩＭＳ０００２が約７０時間の嫌気性バッチ発酵中に２０ｇｌ−１のＬ−アラビノースをエタノールに発酵できることを示す。唯一の炭素源としてＬ−アラビノースを有する嫌気条件下での比増殖速度は、０．０５±０．００１ｈ−１であった。バッチ発酵中のエタノールの蒸発を考慮して、２０ｇｌ−１のアラビノースからのエタノール収率は、０．４３±０．００３ｇｇ−１であった。蒸発補正をしないと、エタノール収率、はアラビノースの０．３５±０．０１ｇｇ−１であった。アラビノースにおける嫌気性増殖中、アラビニトールの形成は観察されなかった。
【０１１８】
図５Ｂには、菌株ＩＭＳ０００２による２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物のエタノール発酵が示される。Ｌ−アラビノースの消費はグルコースの枯渇後に始まった。７０時間以内に、グルコースおよびＬ−アラビノースの両方が完全に消費された。糖全体からのエタノール収率は、０．４２±０．００３ｇｇ−１であった。
【０１１９】
図５Ｃには、菌株ＩＭＳ０００２による３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物の発酵プロファイルが示される。アラビノースの消費はグルコースの枯渇後に始まった。８０時間以内に、グルコースおよびアラビノースの両方が完全に消費された。菌株ＩＭＳ０００２によって１００ｍＭのキシロースからわずか２０ｍＭしか消費されなかった。さらに、２０ｍＭのキシリトールの形成が観察された。明らかに、菌株ＩＭＳ０００２によってキシロースはキシリトールに転換された。従って、糖全体からのエタノール収率は上記の発酵の場合よりも低く、０．３８±０．００１ｇｇ−１であった。グルコースおよびアラビノース全体からのエタノール収率は他の発酵と同様であり、０．４３±０．００１ｇｇ−１であった。
【０１２０】
表１は、菌株ＩＭＳ０００２の嫌気性バッチ発酵について観察されたアラビノース消費速度およびエタノール産生速度を示す。アラビノースは、バイオマス乾燥重量１ｇあたり０．２３〜０．７５ｇｈ−１の速度で消費された。アラビノースから産生されるエタノールの速度は、バイオマス乾燥重量１ｇあたり０．０８〜０．３１ｇｈ−１で変動した。
【０１２１】
初めは、構築された菌株ＩＭＳ０００１はキシロースを発酵することができた（データは示されない）。我々の予想とは対照的に、選択した菌株ＩＭＳ０００２はキシロースをエタノールに発酵することができなかった（図５Ｃ）。キシロースを発酵させる能力を取り戻すために、菌株ＩＭＳ０００２のコロニーを、２％のＤ−キシロースを有する固体合成培地に移し、嫌気性のビンの中、３０℃で２５日間インキュベートした。続いて、２％のアラビノースを有する固体合成培地にコロニーを再度移した。３０℃でのインキュベーションの４日後、２％のアラビノースを有する合成培地を含有する振とうフラスコにコロニーを移した。３０℃で６日間インキュベーションした後、３０％のグリセロールを添加し、サンプルを採取し、−８０℃で貯蔵した。２％のアラビノースを有する１００ｍｌの合成培地を含有する振とうフラスコをこのような凍結貯蔵物で播種し、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを有する合成培地における嫌気性バッチ発酵のための前培養物として使用した。図６には、このバッチ発酵の発酵プロファイルが示される。キシロースおよびアラビノースは同時に消費された。アラビノースは７０時間以内に完了されたが、キシロースは１２０時間で完全に消費された。エタノールの蒸発を考慮に入れずに、糖全体から少なくとも２５０ｍＭのエタノールが産生された。３．２ｇｌ−１の最終バイオマス乾燥重量を仮定する（糖１ｇあたり０．０８ｇのバイオマス収率を仮定）と、累積的なＣＯ２の産生（３５５ｍｍｏｌｌ−１）から見積もった最終エタノール濃度は約３３０ｍｍｏｌｌ−１であり、ペントース糖１ｇあたり０．４１ｇのエタノール収率に相当した。エタノール、グリセロール、および有機酸に加えて、少量のキシリトールが産生された（約５ｍＭ）。
【０１２２】
［菌株ＩＭＳ０００３の選択］
最初は、構築された菌株ＩＭＳ００１はキシロースを発酵することができた（データは示されない）。我々の予想とは対照的に、選択した菌株ＩＭＳ０００２はキシロースをエタノールに発酵することができなかった（図５Ｃ）。キシロースを発酵させる能力を取り戻すために、菌株ＩＭＳ０００２のコロニーを、２％のＤ−キシロースを有する固体合成培地に移し、嫌気性のビンの中、３０℃で２５日間インキュベートした。続いて、２％のアラビノースを有する固体合成培地にコロニーを再度移した。３０℃でのインキュベーションの４日後、２％のアラビノースを有する合成培地を含有する振とうフラスコにコロニーを移した。３０℃で６日間インキュベーションした後、３０％のグリセロールを添加し、サンプルを採取し、−８０℃で貯蔵した。
【０１２３】
この凍結貯蔵物から、２％のＬ−アラビノースを有する固体合成培地にサンプルを広げ、３０℃で数日間インキュベートした。Ｌ−アラビノースを有する固体合成培地に別個のコロニーを２回再ストリーキングした。最後に、２のＬ−アラビノースを有する合成培地を含有する振とうフラスコに単一のコロニーを播種し、３０℃で４日間インキュベートした。この培養物は、菌株ＩＭＳ０００３と命名した（２０／０９／０７にＣＢＳに寄託されたＣＢＳ１２１８７９）。培養サンプルを採取し、３０％のグリセロールを添加し、サンプルを−８０℃で貯蔵した。
【０１２４】
［菌株ＩＭＳ０００３の特徴付け］
３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロースおよび１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を有する合成培地における嫌気性バッチ発酵中の菌株ＩＭＳ０００３の増殖および産物形成を決定した。菌株ＩＭＳ０００３の−８０℃の凍結貯蔵物を播種し、３０℃で４８時間インキュベートすることによって、２％のＬ−アラビノースを有する１００ｍｌの合成培地を含有する振とうフラスコ中で、この嫌気性バッチ発酵のための前培養物を調製した。
【０１２５】
図７には、菌株ＩＭＳ０００３による３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物の発酵プロファイルが示される。アラビノースの消費はグルコースの枯渇後に始まった。７０時間以内に、グルコース、キシロースおよびアラビノースが完全に消費された。キシロースおよびアラビノースは同時に消費された。エタノールの蒸発を考慮に入れずに、糖全体から少なくとも４０６ｍＭのエタノールが産生された。累積的なＣＯ２産生から計算される最終エタノール濃度は５７２ｍｍｏｌｌ−１であり、糖全体１ｇあたり０．４６ｇのエタノール収率に相当した。菌株ＩＭＳ０００２によるグルコース、キシロースおよびアラビノースの混合物の発酵（図５Ｃ）、あるいは菌株ＩＭＳ０００２およびＲＷＢ２１８の混合培養（図５Ｄ）とは対照的に、菌株ＩＭＳ０００３は検出可能な量のキシリトールを産生しなかった。
【０１２６】
［表］
【０１２７】
【表１】
2014094011.tif 000002
【０１２８】
【表２】
2014094011.tif 000003
【０１２９】
【表３】
2014094011.tif 000004
【０１３０】
【表４】
2014094011.tif 000005
【０１３１】
【表５】
2014094011.tif 000006
【０１３２】
参考文献リスト
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【図１】
2014094011.tif 000007
【図２】
2014094011.tif 000008
【図３】
2014094011.tif 000009
【図４】
2014094011.tif 000010
【図５ａ】
2014094011.tif 000011
【図５ｂ】
2014094011.tif 000012
【図５ｃ】
2014094011.tif 000013
【図５ｄ】
2014094011.tif 000014
【図６】
2014094011.tif 000015
【図７】
2014094011.tif 000016
【配列表】
2014094011000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月17日(2014.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のヌクレオチド配列：
（ａ）アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＡをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号２の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＢをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号４の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
（ｃ）Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＤをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号６の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と
を発現することができる酵母細胞であって、これらのヌクレオチド配列の発現が、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／またはエタノールに転換する能力を酵母細胞に与え、
前記ハイブリッド形成が、２００ヌクレオチドの核酸配列が１Ｍの塩を含む溶液中、６５℃の温度でハイブリッド形成できるようにし、０．１Ｍの塩を含む洗浄溶液中、６５℃で洗浄することを含むストリンジェントなハイブリッド形成条件下で行われ、
前記ハイブリッド形成が１０時間実施され、前記洗浄が洗浄溶液を２回変えて１時間実施され、
Ｌ−アラビノースに適応している、酵母細胞。
【請求項２】
前記ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤヌクレオチド配列のうちの１つ、２つまたは３つが、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属から生じる請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のうちの１つに属する、請求項１または２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
サッカロミセスセレビシエ種、サッカロミセスブルデリ種、サッカロミセスバルネッチ種、サッカロミセスエクシグウス種、サッカロミセスウバラム種、サッカロミセスディアスタティカス種、クルイベロミセスラクティス種、クルイベロミセスマルキシアヌス種またはクルイベロミセスフラギリス種のうちの１つに属する、請求項３に記載の酵母細胞。
【請求項５】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｌ−アラビノースを使用する能力、そして／あるいはＬ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／またはエタノールに転換する能力を細胞に与えるために細胞内の対応するヌクレオチド配列の十分な発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結された請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
キシロースイソメラーゼを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子が過剰発現している、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項８】
少なくとも、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子が過剰発現している、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項９】
キシルロースキナーゼをコードする遺伝子が過剰発現している、請求項８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
過剰発現される前記遺伝子が、前記酵母細胞に内因性である請求項７〜９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
アルドースレダクターゼ遺伝子が、前記アルドースレダクターゼ遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、あるいは前記アルドースレダクターゼ遺伝子の破壊によって不活性化される請求項６〜１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
アルドースレダクターゼをコードする前記酵母細胞内の各遺伝子の発現が、前記アルドースレダクターゼ遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、あるいは前記アルドースレダクターゼ遺伝子の破壊によって不活性化される請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列、および／またはＬ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、
前記ａｒａＡをコードするヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＡをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号２の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列であり、
前記ａｒａＢをコードするヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＢをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号４の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
ａｒａＤをコードするヌクレオチド配列であって、
ｉ．配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むａｒａＤをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
ｉｉｉ．その相補鎖が配列番号６の配列の核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列であり、
前記ハイブリッド形成が、２００ヌクレオチドの核酸配列が１Ｍの塩を含む溶液中、６５℃の温度でハイブリッド形成できるようにし、０．１Ｍの塩を含む洗浄溶液中、６５℃で洗浄することを含むストリンジェントなハイブリッド形成条件下で行われ、
前記ハイブリッド形成が１０時間実施され、前記洗浄が洗浄溶液を２回変えて１時間実施される、核酸構築物。
【請求項１４】
エタノールを産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母細胞を用いてアラビノース源およびキシロース源を含有する培地を発酵させ、前記酵母細胞がアラビノースおよびキシロースをエタノールに発酵させることと、
（ｂ）前記エタノールを回収することと
を含む方法。
【請求項１５】
エタノールを産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母細胞と、キシロースを使用することができる、そして／あるいはキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す細胞とを用いて、少なくともＬ−アラビノース源およびキシロース源を含有する培地を発酵させ、各細胞がＬ−アラビノースおよび／またはキシロースをエタノールに発酵させることと、
（ｂ）前記エタノールを回収することと
を含む方法。
【請求項１６】
前記培地が、グルコース源も含有する請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
エタノールの容積生産性が、１時間に１リットルあたり少なくとも０．５ｇのエタノールである請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が嫌気性である請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が酸素制限条件下で実施される請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2014094011000001.pdf