(57)【要約】【課題】メソセリンに対してより高い親和性の抗体を提供すること。【解決手段】メソセリンは、卵巣癌、中皮腫およびいくつかの他の型のヒト癌の表面上に存在する分化抗原である。正常な組織においては、メソセリンは、中皮細胞にのみ存在するので、メソセリンは、細胞傷害性薬剤の抗体媒介性送達のための良好な標的に相当する。本発明は、メソセリンに対して特に高い親和性を有するＦｖ分子を含む抗メソセリン抗体、およびその抗体を利用する免疫結合体に関する。また、この抗体を使用した診断方法および治療方法も記載される。この抗メソセリン抗体は、卵巣癌、胃癌、扁平上皮細胞癌、中皮腫およびメソセリンを発現する他の悪性細胞の診断および処置に好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
適用せず。
【０００２】
（連邦政府によって後援された研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関する記述）
適用せず。
【０００３】
（発明の背景）
多くの型の癌細胞において、分化抗原が発現される。これらの抗原は、癌治療における標的として使用されている。例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ２５は、造血悪性腫瘍における標的として首尾良く使用されている（Ｐｒｅｓｓら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：１２１９−１２２４（１９９３）；およびＯｓｔｅｒｂｏｒｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：１５６７−１５７４（１９９７））。しかし、この標的化癌治療は、主に、固形腫瘍で成功していない。なぜなら、この標的化抗原はまた、腫瘍が発生する組織において発現するからである。従って、これらの標的化治療は、健康な細胞ならびに悪性細胞を殺傷する。
【０００４】
米国においては、治療にもかかわらず、推定１５，０００人の女性が、毎年卵巣癌で死亡する。卵巣癌よりも一般的ではないが、中皮腫は、あらゆる化学療法剤に耐性であることが公知であり、従って、高い死亡率を有する。これらの癌の死亡率に起因して、これらの悪性腫瘍に対する新規の治療アプローチが必要とされる。
【０００５】
卵巣の扁平上皮細胞、およびいくつかの胃癌ならびに中皮腫に共通して、細胞表面上にメソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）が発現される（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１８１−１８６（１９９２）；Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６：２５９−２６８（１９９２）；およびＣｈａｎｇら、Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３６−１４０（１９９６）。メソセリンは、中皮細胞の表面上に存在する４０ｋＤのＧＰＩ結合糖タンパク質抗原である。メソセリンは、６９ｋＤの前駆体として合成され、次いで、タンパク質分解性にプロセスされる。この３０ｋＤのアミノ末端が分泌され、そして巨核球増強因子（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）とよばれる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８０５−８０８（１９９４））。この４０ｋＤのカルボキシル末端は、成熟メソセリンとして膜に結合したままである（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３６−１４０（１９９６））。癌細胞上に存在する多くの細胞表面抗原と異なり、メソセリンの膜結合形態は、癌患者の血液中に検出されず、そして培養細胞によって培地中に発散されない（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１８１−１８６（１９９２））。悪性細胞に加えて、メソセリンはまた、卵巣癌を含む中皮起源の細胞の細胞表
面上に見出される。これらの組織における細胞への損傷が、生命を脅かす結果を引き起こさないので、癌細胞の表面上のメソセリンの存在が、標的化治療のための有望な候補となる。
【０００６】
イムノトキシンは、毒性部分に結合する細胞表面抗原に対する抗体である。癌の処置において、抗体は、好ましくは、癌細胞上にのみ発現される細胞表面抗原に対して指向される。しかし、表面抗原もまた発現する正常細胞の死が、悪性腫瘍の存在よりも生命を脅かさない場合、非悪性細胞上に発現される細胞表面抗原に対する抗体は、癌治療において使
用され得る。イムノトキシンの毒性部分は、全身投与後に低い濃度の、非標的化細胞に対して有害ではない任意の毒素であり得る。このような毒素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素（ＰＥ）である。ＰＥを用いた以前の研究は、タンパク質の活性部分が、ドメインＩＩおよびドメインＩＩＩから構成され、これらの両方は、毒素のカルボキシル末端に位置することを実証した。イムノトキシンの毒性部分としての使用のための開発または考慮の下にある他の毒素は、ジフテリア毒素（Ｗａｔｓｏｎら、Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６１：２３３−４０（１９９５））、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｉｎｔｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８（１）：１０６−１１（１９９８））、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（例えば、Ｅｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４（７）：１６４１−７（１９９８）、リシン（例えば、Ｏｈｔｏｍｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（６Ａ）：４３１１−５（１９９８））およびブリオジン１（ｂｒｙｏｄｉｎ１）（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２（３９）：２４１６５−９（１９９７））である。イムノトキシンとしての使用のために、しばしば天然の毒素分子が改変されて、非特異的毒性または他の望ましくない効果を回避する。例えば、リシンのＡ鎖およびＢ鎖が、通常分離されて、その結果、Ｂ鎖によって別の方法で提供される非特異的結合を回避しながら、Ａ鎖の毒性効果が使用され得る。
【０００７】
イムノトキシンを標的化する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体（例えば、キメラまたは可変領域フラグメント）であり得る。抗体が非組換えである場合、イムノトキシンは、抗体の毒性部分へのキメラ結合体化によって形成されるはずである。抗体が、組換え的に産生される場合、この抗体は、化学的結合または組換え融合を介して毒素に結合され得る。組換え融合において、抗体をコードするｃＤＮＡが、インフレームで、毒素をコードするｃＤＮＡをすでに含むプラスミドに挿入される。もちろん、その逆も同様に行われ得る；毒素ｃＤＮＡが、抗体をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミドに挿入され得る。
【０００８】
イムノトキシンの大きさが潜在的に大きいので、時折、毒素部分への抗体フラグメントのみの結合が所望される。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）2フラグメントが、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体から作製され得、次いで、化学的結合を介して毒素に結合される。
【０００９】
あるいは、抗体の可変領域が必須のフレームワーク領域に結合されるｃＤＮＡが、産生され得る。次いで、これらのより小さな抗体が、二重鎖Ｆｖ抗体として分泌されるか、または重鎖および軽鎖領域が、直接的もしくはペプチドリンカーを介してかのいずれかで結合される場合、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）として分泌される。
【００１０】
ｓｃＦｖを作製する１つの方法は、免疫原を用いて免疫されたマウスの脾臓ｍＲＮＡから作製された、ファージディスプレイライブラリーを介した方法である（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９−２０（１９９７））。しかし、タンパク質の免疫原が、哺乳動物において天然に見出されるが、原核生物において組換え的に発現される場合、タンパク質は、正確なグリコシル化パターンを有さず、そして正確な高次構造を有さないかもしれない。この免疫原に応答して、マウスによって発生した抗体は、そのネイティブ状態においてはタンパク質を認識しないかもしれない。この問題に対する１つの解法は、哺乳動物細胞において作製されたネイティブなタンパク質を用いて動物を免疫することであるが、いくつかのタンパク質（特に、細胞表面タンパク質）の十分な量の哺乳動物細胞からの精製は、可能ではないかもしれない。一般的ではないが別の解法は、免疫原をコードするｃＤＮＡを用いて動物を免疫することである。適切なプロモーターの制御下で、ｃＤＮＡが、動物に導入される。注入をブーストした後、そして抗体の力価が最大に達した場合、動物を屠殺し、そして脾臓を取り出し、ファージディスプレイライブラ
リーを作製する。
【００１１】
メソセリン発現悪性腫瘍に対する標的化治療の開発は、良好にインターナライズ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）された高い親和性の抗体の開発が困難なために妨害されていた。本発明者らが、最近の刊行物（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：６６９−６７４（１９９８）（今後は、「Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  １９９８」））において記載するように、哺乳動物細胞からの十分な量のメソセリンの精製は、不可能であり、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃａ  ｃｏｌｉにおいて発現した組換えメソセリンは、メソセリン陽性細胞に対する低い親和性を有する。本発明者らは、この文献において、メソセリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドを用いてマウスを免疫することによって、本発明者らは、抗メソセリン抗体の高い力価を誘発し得ることを報告した。本発明者らはさらに、脾臓ＲＮＡおよびファージディスプレイ技術を使用して、本発明者らが、メソセリンに高い親和性で結合する単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）（本発明者らは、ＳＳ  ｓｃＦｖと呼ぶ）を単離し得たことを報告した。
【００１２】
ＳＳは、免疫結合体（例えば、イムノトキシン）に有用な標的化因子のようであるが、さらに高い親和性の抗体が、メソセリンを発現する癌を検出する能力を改善することおよびイムノトキシンのメソセリンを発現する癌細胞を殺傷する能力を増大することが期待される。従って、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体を作製する改善された手段についての必要性が残存する。特に、メソセリンに対してより高い親和性の抗体についての必要性が残存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、変異した抗体の重鎖可変領域もしくは変異した抗体の軽鎖可変領域またはそれらの両方を含むポリペプチドに関し、ここで、このポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有する。このポリペプチドは、相補性決定領域において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによってこの親抗体と異なる配列を有し、このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである。このアミノ酸置換は、重鎖または軽鎖の可変領域のＣＤＲ３において生じ得るか、あるいはこれらの可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において生じ得る。本発明のいくつかの実施形態において、抗原はメソセリンであり、そして親抗体は、ＳＳｓｃＦｖであり、そしてこのポリペプチドは、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される（すなわち、ＳＳｓｃＦｖについてのアミノ酸残基の標準的なナンバリングに従って、９２位のセリン残基、９３位のグリシン残基または９４位のチロシンから選択される（図１もまた参照のこと））少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態において、軽鎖のＳＳｓｃＦｖ  ＣＤＲ３可変領域の置換は、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（すなわち、９３位のグリシンが、リジンに変化し、そして９４位のチロシンが、ヒスチジンに変化し、これらの変化を、「ＳＳ１」と呼ばれる抗体として規定する）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（すなわち、９２位のセリンが、グリシンに変化し、９３位のグリシンが、フェニルアラニンに変化し、そして９４位のチロシンが、アスパラギンに変化する；これらの変化を、「Ｄ８」と呼ばれるｓｃＦｖと規定する）、ならびにＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（すなわち、９２位のセリンが、グリシンに変化し、９３位のグリシンが、セリンに変化し、そして９４位のチロシンが、ヒスチジンに変化する；これらの変化を、「Ｄ８」と呼ばれるｓｃＦｖと規定する）から選択される。
【００１５】
上記のポリペプチドはまた、免疫結合体の一部を形成し得る。例えば、これらのポリペプチドは、治療的部分または検出可能な標識を含み得る。いくつかの実施形態において、この治療的部分は、毒性部分（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素）またはその細胞傷害性フラグメント（例えば、ＰＥ３８）であり得る。この毒性部分はまた、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはその細胞傷害性フラグメント、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、あるいはブリオジン１またはその細胞傷害性フラグメントであり得る。別の実施形態において、このポリペプチドは、バクテリオファージの表面タンパク質をさらに含み得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、変異した抗体の重鎖可変領域もしくは変異した抗体の軽鎖可変領域またはそれらの両方を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドに関し、ここで、このポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有する。このポリペプチドはまた、相補性決定領域において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによってこの親抗体と異なる配列を有し、このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンであり、親抗体は、抗メソセリン抗体ＳＳであり、そしてポリペプチドは、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する。さらなる実施形態において、この置換は、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（ＳＳ１）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（Ｄ８）、およびＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（Ｃ１０）から選択される。
【００１７】
なお別の局面において、本発明は、上記の核酸分子のうちの１つに作動可能に連結したプロモーターをコードする発現カセットに関する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、抗原を保有する悪性細胞を殺傷する方法に関し、この方法は、標的化部分および毒性部分を含むイムノトキシンと該細胞を接触させる工程を包含し、この標的化部分は、変異した抗体の重鎖可変領域もしくは変異した抗体の軽鎖可変領域またはそれらの両方を含み、このポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有する。このポリペプチドはさらに、相補性決定領域において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによってこの親抗体と異なる配列を有し、このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンである。さらに、いくつかの実施形態において、この標的化部分は、ＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０からなる群より選択される。
【００１９】
本発明はさらに、Ｅ４と名付けられた抗体を提供し、Ｅ４において、ＣＤＲ３  ＶＬは、Ｌ９６Ｔの置換によって、親抗体ＳＳと異なる。Ｅ４はまた、免疫結合体（例えば、使用されるイムノトキシン）の標的化部分として使用され、例えば、インビトロでメソセリンを保有する癌細胞を取り除き得るか、またはインビボで癌細胞を阻害もしくは殺傷し得る。
【００２０】
なおさらなる局面において、本発明は、親抗体よりも高い標的抗原親和性を有するポリペプチドを同定する方法に関する。この方法は、変異した抗体の重鎖可変領域もしくは変異した抗体の軽鎖可変領域またはそれらの両方を含むポリペプチド（このポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、そしてこのポリペプチドは、相補性決定領域において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることに
よってこの親抗体と異なる配列を有し、このアミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ（ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである））を、標的抗原と、抗体とこの標的抗原との間の特異的な結合に適切な条件下で接触させる工程、この親抗体またはそのフラグメントの親和性よりも高い親和性でこの標的抗原に結合しない抗体またはそのフラグメントの全てを取り除く条件下で、このポリペプチドを溶出する工程、ならびにこのポリペプチドが、この抗原に結合したか否かを決定する工程であって、これによって、結合することによって、このポリペプチドがこの親抗体よりも高い標的親和性を有することが確認される工程を包含する。
【００２１】
本発明はさらに、変異した抗体の可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを作製する方法に関し、この方法は、親抗体のＶHドメインまたはＶLドメインのアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する工程であって、この核酸分子が、ホットスポットモチーフの内部に少なくとも１つのヌクレオチドを含む、少なくとも１つの親のホットスポットコドンを含む工程、ならびにこの親のアミノ酸配列とは異なる変異したアミノ酸配列をコードする、複数の変異した核酸分子を生成する工程であって、ここで、各々の変異した核酸配列は、アミノ酸をコードする親のホットスポットコドンとは異なる少なくとも１つの変異したコドンを含み、この変異したコドンは、この親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする工程を包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用される複数の変異した核酸分子は、少なくとも１９のメンバーを含み、ここで、この１９のメンバーの各々は、親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする。なおさらなる実施形態において、本発明の方法は、アミノ酸をコードする少なくとも２つの親のホットスポットコドンとは異なる変異したコドンを含む複数の変異した核酸分子を含み得、この変異したコドンの各々は、この親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする。他の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも３９９のメンバーを含む複数の変異した核酸分子を含み得、これらのメンバーの各々は、親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする。本発明の方法のさらなる実施形態において、この親抗体は、コドンによってコードされる少なくとも１つの保存アミノ酸を有するあるクラスの抗体であり、ここで、この保存アミノ酸をコードするコドン（単数または複数）は変異していない。本発明の方法のなおさらなる実施形態において、このホットスポットモチーフは、ＡＧＣＡ、ＡＧＴＴ、ＡＧＣＴ、ＡＧＴＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＴＴ、ＧＧＣＴ、ＧＧＴＡ、ＡＧＣおよびＡＧＴからなる群より選択される。本発明の方法のなおさらなる実施形態において、この変異した核酸分子は、ＣＤＲを含むＶHドメインまたはＣＤＲを含むＶLドメインの一部分に、少なくとも１つの変異したコドンを含む。このＣＤＲは、ＶHドメインのＣＤＲ３またはＶLドメインのＣＤＲ３であり得る。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）  変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって該親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、ポリペプチド。
（項目２）  上記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
（項目３）  上記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求項１に記載
のポリペプチド。
（項目４）  上記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において生じる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）  上記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において生じる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目６）  上記抗原が、メソセリンであり、上記親抗体が、抗メソセリン抗体ＳＳであり、そして上記ポリペプチドが、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）  上記置換が、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（ＳＳ１）；Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（Ｄ８）およびＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（Ｃ１０）から選択される、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）  上記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、項目１に記載のポリペプチド。
（項目９）  上記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、項目６に記載のポリペプチド。
（項目１０）  上記ポリペプチドが、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である
、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１１）  上記ポリペプチドが、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である
、項目６に記載のポリペプチド。
（項目１２）  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１３）  上記治療的部分が、毒性部分である、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）  上記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）  上記毒性部分が、細胞傷害性フラグメントであり、該細胞傷害性フラグメントが、ＰＥ３８である、項目１４に記載のポリペプチド。    （項目１６）  上記毒性部分が、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性フラグメント、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、およびブリオジン１またはその細胞傷害性フラグメントからなる群より選択される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１７）  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、項目６に記載のポリペプチド。
（項目１８）  上記治療的部分が、毒性部分である、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）  上記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）  上記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、項目１９に記載のポリペプチド。
（項目２１）  バクテリオファージの表面タンパク質をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
（項目２２）  抗メソセリン抗体ＳＳのメソセリン結合親和性の少なくとも３倍のメソセリン結合親和性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくともＬ９６Ｔ（Ｅ４）の軽鎖可変領域のＣＤＲ３において、アミノ酸が置換されている点で抗体ＳＳと異なる配列を有する、ポリペプチド。
（項目２３）  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）  上記治療的部分が、毒性部分である、項目２３に記載のポリペプチド。
（項目２５）  上記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）  上記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、項目２５に記載のポリペプチド。
（項目２７）  変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、核酸分子。
（項目２８）  上記抗原が、メソセリンであり、上記親抗体が、抗メソセリン抗体ＳＳであり、そして上記ポリペプチドが、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する、項目２７に記載の核酸分子。
（項目２９）  上記置換が、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（ＳＳ１）；Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（Ｄ８）およびＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（Ｃ１０）から選択される、項目２７に記載の核酸分子。
（項目３０）  抗メソセリン抗体ＳＳのメソセリン結合親和性の少なくとも３倍のメソセリン結合親和性を有するポリペプチドをコードする核酸分子であって、該ポリペプチドは、少なくともＬ９６Ｔ（Ｅ４）の軽鎖可変領域のＣＤＲ３において、アミノ酸が置換されている点で抗体ＳＳと異なる配列を有する、核酸分子。
（項目３１）  項目２７に記載の核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセット。
（項目３２）  項目２８に記載の核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセット。
（項目３３）  抗原を保有する悪性細胞を殺傷する方法であって、該方法は、毒性部分および標的化部分を含むイムノトキシンと該細胞を接触させる工程を包含し、該標的化部分は、変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって該親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、方法。
（項目３４）  上記抗原が、メソセリンである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  上記標的化部分が、ＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０からなる群より選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）  上記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）  上記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）  抗原を保有する悪性細胞を殺傷する方法であって、該方法が、毒性部分および標的化部分を含むイムノトキシンと該細胞を接触させる工程を包含し、ここで、該標的化部分が、抗体Ｅ４である、方法。
（項目３９）  上記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）  上記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）  親抗体よりも高い標的抗原親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）抗体と該標的抗原との間の特異的な結合に適切な条件下で、該標的抗原と項目１
に記載のポリペプチドを接触させる工程；
（ｂ）該親抗体またはそのフラグメントの親和性よりも高い親和性で該標的抗原に結合しない抗体またはそのフラグメントの全てを取り除く条件下で、該ポリペプチドを溶出する工程；ならびに
（ｃ）該ポリペプチドが該抗原に結合したか否かを決定する工程であって、これによって、結合することによって、該ポリペプチドが該親抗体よりも高い標的親和性を有することが確認される、工程、
を包含する、方法。
（項目４２）  変異した抗体の可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）親抗体のＶHドメインまたはＶLドメインのアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する工程であって、該核酸分子は、ホットスポットモチーフの内部に少なくとも１つのヌクレオチドを含む、少なくとも１つの親のホットスポットコドンを含む、工程；ならびに
（ｂ）該親のアミノ酸配列とは異なる変異したアミノ酸配列をコードする、複数の変異した核酸分子を生成する工程であって、ここで、各々の変異した核酸配列は、アミノ酸をコードする親のホットスポットコドンとは異なる少なくとも１つの変異したコドンを含み、該変異したコドンは、該親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする、工程、
を包含する、方法。
（項目４３）  項目４２に記載の方法であって、ここで、上記複数の変異した核酸分子が、少なくとも１９のメンバーを含み、該１９のメンバーの各々は、上記親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする、方法。
（項目４４）  項目４２に記載の方法であって、ここで、上記複数の変異した核酸分子が、アミノ酸をコードする少なくとも２つの親のホットスポットコドンとは異なる変異したコドンを含み、該変異したコドンの各々は、該親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする、方法。
（項目４５）  項目４２に記載の方法であって、ここで、上記複数の変異した核酸分子が、少なくとも３９９のメンバーを含み、該メンバーの各々が、上記親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする、方法。
（項目４６）  項目４２に記載の方法であって、さらにここで、上記親抗体が、コドンによってコードされる少なくとも１つの保存アミノ酸を有するあるクラスの抗体であり、ここで、該保存アミノ酸をコードするコドン（単数または複数）が変異していない、方法。
（項目４７）  上記ホットスポットモチーフが、ＡＧＣＡ、ＡＧＴＴ、ＡＧＣＴ、ＡＧＴＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＴＴ、ＧＧＣＴ、ＧＧＴＡ、ＡＧＣおよびＡＧＴからなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４８）  上記変異した核酸分子が、ＣＤＲを含む上記ＶHドメインまたはＣＤＲを含む上記ＶLドメインの一部分に、少なくとも１つの変異したコドンを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４９）  上記ＣＤＲが、上記ＶHドメインのＣＤＲ３である、請求項４８に記載の方法。
（項目５０）  上記ＣＤＲが、上記ＶLドメインのＣＤＲ３である、請求項４８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、そのヌクレオチド配列から推定されるようなＳＳ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖにおいて、ＶHは、リンカーペプチド（ＧＶＧＧＳＧ4ＳＧ4Ｓ）によりＶLに結合される。フレームワーク領域、ＣＤＲおよびリンカーに印を付けている。Ｈは、重鎖を示し；Ｌは、軽鎖を示し；ＦＲは、フレームワーク領域を示し；ＣＤＲは、相補性決定領域を示す。
【図２】４つのライブラリーの各々をパニングした後選択されるファージクローンのＥＬＩＳＡにより評価されるようなメソセリン結合。図２Ａ：この図は、別々の列において、ＳＳ  ｓｃＦｖの可変軽鎖のＣＤＲ３の、アミノ酸の番号付け、ヌクレオチド配列、およびアミノ酸配列を示す。一番上の列：親ｓｃＦｖ  ＳＳの可変軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸残基の番号。中央の列：ｓｃＦｖ  ＳＳ  ＣＤＲ３のＣＤＲ３におけるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列。長方形は、テトラヌクレオチドホットスポットモチーフを示し：長円形は、この配列中のセリンホットスポットモチーフを示す。一番下の列：１文字コードにおける、ｓｃＦｖ  ＳＳのＣＤＲ３のアミノ酸配列。  図２Ｂから２Ｅは、個々のライブラリー由来のクローンのＥＬＩＳＡの結果を示すパネルである。パネルにおける各文字記号は、単一クローンからのファージ粒子のＥＬＩＳＡシグナルを示す。各パネルにおいて塗りつぶされた四角（矢印により示される）は、内部標準の親ＳＳ（ｓｃＦｖ）ファージを示す。ライブラリーを、各パネルの１番上に示される。図２Ｂ：残基８９、９３、および９４で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｃ：残基８９、９０、および９１で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｄ：残基９２、９３、および９４で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｅ：残基９５、９６、および９７で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。
【図３】異なるライブラリーのパニングの後に得られたいくつかのＥＬＩＳＡ陽性のファージクローンのアミノ酸配列。クローン間で異なる領域の配列のみを示す。アステリスク（*）は、異なるヌクレオチド配列であるが、同じアミノ酸配列を有するいくつかのクローンが見出されたことを示す。
【図４】固定化されたメソセリンへの野生型および変異されたｓｃＦｖイムノトキシンの結合について得られたＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）の比較。左から右へ、イムノトキシンの標的化部分は：親ＳＳ、ならびに変異された改変体ＳＳ１、Ｄ８、Ｃ１０およびＥ４である。Ｋoff、ＫonおよびＫDについての値を、図の下に表にする。「ＲＵ」は、「共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）」を表す。Ｘ軸は、秒で時間を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（Ｉ．概要）
本発明は、ＳＳ（ｓｃＦｖ）と比較して、メソセリンに対する増加した親和性を有するこの抗原に対する抗体を提供する。この抗体は、より有効な免疫結合体（例えば、イムノトキシン）を作製するための標的化部分として使用され得る。これらの免疫結合体は、インビトロでの使用（例えば、生物学的サンプルに存在するメソセリン発現細胞の検出）のために使用され得る。イムノトキシンは、メソセリンを発現する細胞（例えば、細胞の表面上でメソセリンを発現する癌の癌細胞）を殺傷するためにさらに使用され得る。
【００２５】
本発明は、親抗体の標的抗原に対する親和性よりも高い親和性を有する抗体を生成する新しい方法をさらに提供する。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖまたはｄｓＦｖである。ｓｃＦｖの構築物から産生される組換えイムノトキシンの多くは、ＩｇＧ毒素化学的結合体の３分の１の大きさであり、そして組成物において均質である。ｓｃＦｖ由来のＩｇＧ分子の定常部分の除去は、動物（霊長類を含む）に注射後のイムノトキシンのより速いクリアランスを生じ、そしてより小さいサイズのその結合体が、固形腫瘍における薬物の浸透を改善する。総合すると、これらの特性は、イムノトキシン（ＩＴ）が、非標的組織および非常に低いレベルの抗原を発現する組織と相互作用する時間を低減することにより、毒性部分と
関連する副作用を減少させる。
【００２７】
しかし、これらの利点は、ＩｇＧがｓｃＦｖに変換される場合に起こる抗原結合親和性の減少により、いくらかの程度まで相殺される（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：２３９−１２４５（１９９６））。親和性を増加することにより、ｓｃＦｖの選択的腫瘍送達を改善することが示されており（Ａｄａｍｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４８５−４９０（１９９８））、そして腫瘍の画像化および処置における有用性を増加するようである。従って、免疫結合体のｓｃＦｖおよび他の標的部分（例えば、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）2）の親和性の増加は、エフェクター分
子（例えば、毒素および他の治療剤）を意図された標的に送達するこれらの薬剤の効率を改善することが所望される。
【００２８】
親和性における改善は、部位指向性変異誘発またはランダム変異誘発により、インビトロで達成され得る。抗体−抗原結晶構造は、結合を改善するためにはどの残基が変異されるべきかを示し得るが、原子分解構造データは、ほとんどの抗体に対して利用できない。従って、ファージディスプレイ技術に基づくいくつかの戦略が開発され、より高い親和性の抗体を、ＦａｂおよびｓｃＦｖの変異された改変体を発現するライブラリーから選択した（Ｇｒａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０（１９９２）；Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８（１９９６）；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５（１９９５）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，ＥＭＢＯＪ．１２：７２５−７３４（１９９３）；Ｂａｒｂａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：８１２−８２３（１９９３）；Ｓｃｈｉｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３（１９９６）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５）；Ｐｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１７６９−２１７７６（１９９８）；Ｗｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６０３７−６０４２（１９９８））。これらのアプローチは、しばしば得るのが難しく、そして産生するのが高価であり得る、大きくかつ複数のライブラリーの構築を必要とする。
【００２９】
本発明者らは、増加した親和性を有するＦｖを改変体の小さなライブラリーから生成することを可能にする新規な方法を開発した。この方法は、抗体の可変領域をコードするＤＮＡが、突然変異ホットスポット（このホットスポットは、変異が、インビトロの親和性成熟プロセスの間にしばしば集中するヌクレオチド配列である）を含む事実に基づく（ＮｅｕｂｅｒｇｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：２４８−２５４（１９９５）；Ｊｏｌｌｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１５９−１６８（１９９６）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２６１４−１２６１８（１９９４））。可変領域のホットスポットのいくつかの異なる型（例えば、直列反復および逆方向反復、パリンドローム、２次構造ならびに特定のコンセンサス配列）が提示されている（ＮｅｕｂｅｒｇｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：２４８−２５４（１９９５）；Ｊｏｌｌｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１５９−１６８（１９９６）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２６１４−１２６１８（１９９４）；Ｇｏｌｄｉｎｇら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１５：１６９−１７６（１９８７）；Ｋｏｌｃｈａｎｏｖら，ＦＥＢ  Ｌｅｔｔ．２１４：８７−９１（１９８７）；Ｒｏｇｏｚｉｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８９：１７５−１８２（１９９１）；ＩｎｓｅｌおよびＶａｒａｄｅ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１４３７−１４４３（１９９４）；Ｗａｇｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７３２（１９９５））。これら全ての中で、コンセンサスホットスポット配列は、より詳細に研究されている。これらのコンセンサス配列の１つは、テトラヌクレオチドＡ／Ｇ−Ｇ
−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ（Ｐｕ−Ｇ−Ｐｙ−Ａ／Ｔ）である。この他の型は、セリンコドンＡＧＹにより示され、Ｙは、ＣまたはＴであり得（Ｗａｇｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７３２（１９９５）；ＧｏｙｅｎｅｃｈｅａおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３９７９−１３９８４（１９９６））。
【００３０】
最近、本発明者らは、ＳＳ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる単鎖Ｆｖを開発し、これは、卵巣癌、中皮腫およびいくつかの他のヒト癌の表面上に発現されるメソセリン抗原のその認識に基づき、ファージディスプレイライブラリーから選択された（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  １９９８；ＣｈａｎｇおよびＰａｓｔａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１３６−１４０（１９９６））。そのヌクレオチド配列から推定されるような、ＳＳ（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列は、図１として示され、そしてヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。ＳＳ（ｓｃＦｖ）は、組換え手段により、または所望の場合タンパク質を合成するための標準的な技術により合成され得る。
【００３１】
ＳＳ（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８は、ＳＳ（ｓｃＦｖ）を、ＰＥ３８と呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの３８ｋＤａの短縮された変異体と融合することにより作製されるイムノトキシンである。メソセリン陽性ヒト腫瘍を保有するマウスに注射される場合、ＳＳ（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８は、腫瘍の退化を引き起こし、そしてヒト癌を処置するために開発されている。メソセリンに対するＳＳ（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８の親和性は、１１ｎＭであることが見出されている（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙｌ９９８）。これは比較的高い親和性であるが、さらに高い親和性が、治療において、診断において、およびインビトロでの使用においてＳＳ抗体に基づく免疫結合体（ＳＳ（ｓｃＦｖ）を含む）の動作を増強するために望ましいと考えられる。
【００３２】
抗体親和性を改善する以前の試みは、とりわけ、ＣＤＲの残基のランダムな変異または結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌｌａｇｒａｐｈｉｃ）分析から見出される特定のアミノ酸を変異させて抗原接触に影響を与えることに頼っていた。免疫およびＤＮＡ免疫を介した親和性の改善はまた、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  １９９８に報告される結果を考慮していないようであった。上記これらの方法における不利のうちのいくつかを克服するために、本発明者らは、新しいアプローチを作製した。本発明者らは、ＣＤＲにおけるホットスポットを標的化し、ここで本発明者らは、ランダムな変異を作製した。任意のＣＤＲが、このアプローチにおいて変更され得るが、本発明者らは、軽鎖可変部領域のＣＤＲ３を使用して、この方法を試験した。一部分、ＣＤＲ３を選択した。なぜなら、ＣＤＲ３は、抗原結合部位において中心に位置し、そして抗原認識および親和性においてより大きい影響を有するからである。しかし、ＣＤＲ２およびＣＤＲ１はまた、抗原結合親和性に影響することが知られ（述べられる順序で）、そしてＣＤＲ３の代わりにかまたはＣＤＲ３に加えて使用され得る。
【００３３】
このアプローチを使用して、本発明者らは、約８０００の独立したクローンのみの小さいライブラリーから、１５〜５５倍の親和性を増加したｓｃＦＶを生成し、かつ単離し得た。これらの高い親和性の改変体を用いて作製されたイムノトキシンは、細胞傷害性活性において１０倍よりも大きい増加を有した。本発明者らは、以下に詳細に報告される研究において軽鎖ＣＤＲ３を使用したが、本発明者らは、同じアプローチを使用してＳＳの重鎖ＣＤＲ３からｓｃＦｖを生成した。ＳＳの軽鎖ＣＤＲ３を変異することにより生成されるｓｃＦＶのように、ＥＬＩＳＡ結合研究において、多数のこれらの変異された重鎖ｓｃＦＶが、親ＳＳ  ｓｃＦＶが示すより高いメソセリンに対する親和性を示す。さらに、本発明者はまた、ＳＳ以外の抗体（この場合、上皮増殖因子の変異体形態に結合する抗体）に対してこの技術を使用した。これらの結果を考慮して、本発明者らは、この手段は、親抗体の親和性と比較して、それらの標的抗原に対する増加した親和性を有する有するＦｖ、Ｆａｂまたは他の組換え抗体を迅速に得るのに一般的に有用であると予想する。この研
究の過程において、本発明者らはまた、ホットスポットモチーフの外側の変異により作製された、ＳＳのメソセリンに対する親和性の約３．７倍の親和性を有するｓｃＦｖ（Ｅ４と命名される）を生成した。その親和性は、ホットスポット変異方法により作成されるｓｃＦｖの親和性より際だって低いが、その親和性は、以前に既知の最も良い抗メソセリンｓｃＦｖの親和性よりさらに数倍大きい。
【００３４】
以下の節で、本明細書中で使用される用語が、さらなる明確さのために規定される。本願方法が、より詳細に記載される。最終的に、この実施例は、本願方法および特異的に改善される抗メソセリン抗体のＣＤＲ３の配列を実施するための特定の実験手順を示す。
【００３５】
（ＩＩ．定義）
単位、接頭辞（ｐｒｅｆｉｘ）、および記号が、それらの国際単位系（ＳＩ）で認証された形態において示される。数量範囲は、範囲を規定した数を含む。その他で示されない場合、核酸は、５’から３’の方向で、左から右に書かれる；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。本明細書中で提供される表題は、本発明の種々の局面または実施形態の限定ではなく、これは、全体として明細書に対する参考とされ得る。従って、直ぐ下に定義される用語は、その全体が明細書に対する参考としてより十分に定義される。
【００３６】
用語「メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）」は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、霊長類、または特にヒト）の細胞の表面上に存在し得るメソセリンタンパク質およびそのフラグメントをいう。メソセリンの好ましい核酸およびアミノ酸の配列は、以下に記載される：ＰＣＴ公開出願ＷＯ９７／２５，０６８，米国出願０８／７７６，２７１および米国仮出願６０／０１０，１６６。さらに、以下を参照のこと：Ｃｈａｎｇ，Ｋ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：９０（１９９４）；Ｃｈａｎｇ，Ｋ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３６（１９９６）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：６３８（１９９７）；ならびにＣｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９（１９９７）。メソセリンはまた、細胞内のままであるメソセリンタンパク質またはメソセリンペプチド、ならびに分泌されたかまたは単離された細胞外タンパク質をいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応性の免疫グロブリンに対する言及を含み、そしてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、遺伝的に操作された形態（例えば、キメラ抗体）例えば、ヒト化されたマウス抗体）、異種結合抗体（例えば、双特異性抗体）および組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント（本明細書中に参考として援用される、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／０７７，２５２を参照のこと）、またはｐＦｖフラグメント（米国仮特許出願６０／０４２，３５０および６０／０４８，８４８）を含む。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態を含む（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎ
ｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）もまた参照のこと。
【００３８】
特定の抗原に免疫学的に反応性の免疫抗体が、組換え方法（例えば、ファージまたは類似のベクターでの組み換え抗体のライブラリーの選択）（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）を参照のこと）により、または抗原もしくは抗
原をコードするＤＮＡを用いて動物を免疫することにより生成され得る。
【００３９】
代表的に、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常部領域および可変領域（この領域はまた、「ドメイン」として公知である）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、３つの超可変領域により分断される「フレームワーク」領域を含み、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレークワーク領域およびＣＤＲの範囲は、規定されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，米国厚生省（１９８７）（これらは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、比較的種内で保存されている。抗体のフレームワーク領域（これは、構成する軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である）は、３次元空間においてＣＤＲの位置を定めて整列するように働く。
【００４０】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合の主な原因である。各鎖のＣＤＲは、代表的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をいい、Ｎ末端から連続して始まって番号を付けられ、そしてまた代表的には、特定のＣＤＲが位置する鎖により同定される。従って、ＶHＣ
ＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方ＶLＣＤＲ１は、
それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００４１】
「ＶH」または「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂを含む免
疫グロブリン重鎖の可変領域をいう。「ＶL」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦ
ｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂを含む免疫グロブリンの軽鎖の可変領域をいう。
【００４２】
句「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、伝統的な二鎖抗体の重鎖の可変領域および軽鎖の可変ドメインが１つの鎖を形成するように連結される、抗体をいう。代表的に、リンカーペプチドは、２つの鎖の間に挿入され、適切なホールディングおよび活性な結合部位の作製を可能にする。
【００４３】
用語「リンカーペプチド」は、軽鎖の可変ドメインへの重鎖の可変ドメインの間接的な結合を与える抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）内のペプチドに対する言及を含む。
【００４４】
用語「親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、親抗体として同じエピトープに結合するがより高い親和性を有する抗体またはそのフラグメントを得るために、変異または改変される目的の任意の抗体を意味する。
【００４５】
用語「ホットスポット」は、ＣＤＲのヌクレオチド配列の一部または特に高度な天然の改変体の部分である可変ドメインのフレームワーク領域の一部を意味する。ＣＤＲは、それ自身が超可変性の領域であると考えられるが、変異がＣＤＲを通して均一に分布しないことが確認された。特定の部位、すなわちホットスポットは、集中した変異が起こる位置として同定された。ホットスポットは、構造の特徴の数および配列によって特徴付けられる。これらの「ホットスポットモチーフ」は、ホットスポットを同定するために使用され得る。特に十分特徴付けられる２つのコンセンサス配列モチーフは、テトラヌクレオチド配列ＲＧＹＷおよびセリン配列ＡＧＹである（ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである）。
【００４６】
「標的化部分」は、目的の細胞へ免疫結合体を標的化することが意図される免疫結合体の部分である。代表的に、標的化部分は、抗体、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である。
【００４７】
「毒性部分」は、イムノトキシン（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）を目的の細胞に対して細胞傷害性にするイムノトキシンの部分である。
【００４８】
「治療的部分」は、治療剤として作用することが意図される免疫結合体の部分である。
【００４９】
用語「治療剤」は、任意の数の、抗腫瘍性、抗炎症、サイトカイン、抗感染症、酵素のアクチベーターまたはインヒビター、アロステリック変更因子、抗体または患者において所望の治療効果を誘導するために投与される他の因子として作用することが現在公知または今後開発される化合物が含まれる。治療剤はまた、毒素または放射性同位体であり得、ここで意図される治療効果は、例えば、癌細胞を殺傷することである。
【００５０】
「検出可能な標識」は、免疫結合体に関して、自身の存在を検出可能にする特性を有する免疫結合体の部分を意味する。例えば、免疫結合体は、細胞（この中に免疫結合体が存在する）を免疫組織化学アッセイにおいて検出可能にする放射性同位体を用いて標識され得る。
【００５１】
用語「エフェクター部分」は、標的化部分によって標的化される細胞に対して効果を有するか、または免疫結合体の存在を同定することが意図される、免疫結合体の部分を意味する。従って、エフェクター部分は、例えば、治療的部分、毒素、放射性標識または蛍光標識であり得る。
【００５２】
用語「免疫結合体」は、抗体に対するエフェクター分子の共有結合に対する言及を含む。エフェクター分子は、イムノトキシンであり得る。
【００５３】
用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「有効量（ａｍｏｕｎｔ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｏ）」または「治療有効量」は、所望の結果（例えば、細胞のタンパク質合成を少なくとも５０％阻害すること、または細胞を殺傷すること）を生じるに十分な治療剤の投薬量に対する言及を含む。
【００５４】
用語「毒素」は、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、またはこれらの改変された毒素に対する言及を含む。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的に肝臓毒性を介して死をもたらす非常に毒性の化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴは、毒素のネイティブな標的化成分（例えば、ＰＥのＩａドメインまたはＤＴのＢ鎖）を除去し、そしてそれを異なる標的化部分（例えば、抗体）で置換することによって、イムノトキシンとして使用するための形態に改変され得る。
【００５５】
用語「接触する（接触）」は、直接的な物理的会合での配置に対する言及を含む。
【００５６】
「発現プラスミド」は、分子または目的物（これは、プロモーターに作動可能に連結されている）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
本明細書中に使用される場合、抗体に関して用語「抗メソセリン」とは、メソセリンに対して生成された抗体に対する言及を含む。好ましい実施形態において、メソセリンは、ヒトメソセリンのような霊長類のメソセリンである。特に好ましい実施形態において、抗体は、ヒトメソセリンをコードするｃＤＮＡの非霊長類哺乳動物への導入後にその動物によって合成されたヒトメソセリンに対して、生成される。
【００５８】
本明細書中に使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、そしてアミノ酸残基のポリマーに対する言及を含む。この用語
は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸および天然に存在するアミノ酸ポリマーの人工的な化学アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、タンパク質が機能的なままであるような保存的アミノ酸置換を含むポリマーに対して適用される。
【００５９】
用語「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（総称して「ペプチド」）に組込まれるアミノ酸に対する言及を含む。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり得、他に制限されない限り、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能し得る天然のアミノ酸の既知のアナログを含み得る。
【００６０】
本明細書中に参照されるアミノ酸およびアナログは、以下の表１のような速記の指定によって記載される：
（表１：アミノ酸の名称）
【００６１】
【表１】
2014050409.tif 000002
「保存的置換」は、タンパク質を記載する場合、タンパク質の活性を実質的に変化させないタンパク質のアミノ酸組成における変化をいう。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」は、タンパク質活性に重要ではないこれらのアミノ酸のアミノ酸置換をいうか、または重要なアミノ酸の置換であっても活性を実質的に変化さ
せないような、アミノ酸の類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正に荷電または負に荷電、極性または非極性など）を有する他のアミノ酸とのアミノ酸置換という。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。以下の表２の６つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
（表２）
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）もまた参照のこと。
【００６２】
ペプチドの文脈において、用語「実質的に類似した」は、１０〜２０アミノ酸の比較ウィンドウ上で、参照配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むペプチドを示す。配列同一性の割合は、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に関して、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）に対して比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基または同一のアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、そしてその結果に１００を掛けることによって計算され、これによって配列同一性の割合か出される。
【００６３】
句「ジスルフィド結合」または「システイン−システインジスルフィド結合」は、システインのイオウ原子が酸化されてジスルフィド結合を形成する２つのシステイン間の共有相互作用をいう。ジスルフィド結合の平均結合エネルギーは、水素結合に対する１〜２ｋｃａｌ／モルと比較して、約６０ｋｃａｌ／モルである。本発明の文脈において、ジスルフィド結合を形成するシステインは、単鎖抗体のフレームワーク領域内であり、そして抗体のコントロールフォメーションを安定化するようにはたらく。
【００６４】
用語「結合体化（する）（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」、「結合（する）（ｊｏｉｎｉｎｇ）」、「結合（する）（ｂｏｎｄｉｎｇ）」または「連結（する）（ｌｉｎｋｉｎｇ）」は、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることをいう。本発明の文脈において、この用語は、抗体部分をエフェクター分子（ＥＭ）に結合することに対する言及を含む。連結は、化学手段または組換え手段のいずれかにより得る。化学手段は、抗体部分とエフェクター部分との間の反応をいい、その結果、１つの分子を形成する２つの分子間で形成されたの共有結合が存在する。
【００６５】
本明細書中に使用される場合、「組換え」は、そのネイティブな状態ではタンパク質を発現し得ない内因性のＤＮＡコピーを有さない細胞を用いて産生されるタンパク質に対する言及を含む。この細胞は、組換えタンパク質を産生する。なぜなら、この細胞は、適切な単離された核酸配列の導入によって遺伝的に改変されているからである。この用語はまた、異種核酸の導入によってかまたはその細胞に対してネイティブではない形態にネイティブな核酸を変化することによって改変されたか、あるいは細胞がそのように改変されたか細胞から誘導される、細胞または核酸またはベクターに対する言及を含む。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、ネイティブな形態内に見出される変異体の遺伝子を発現するか、または他の異
常に発現されるか、発現不足であるネイティブな遺伝子を発現するか、または全く発現されない。
【００６６】
本明細書中に使用される場合「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーに対する言及を含み、そして他に指定されない限り限定されないが、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む。他に示されない限り、特定の核酸配列は、その相補鎖配列ならびに保存的改変体（すなわち、コドンおよび改変体のゆらぎ位置（ｗｏｂｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に存在する核酸（これは、タンパク質に翻訳された場合、アミノ酸の保存的置換を生じる））を含む。
【００６７】
本明細書中に使用される場合、特定の核酸に関して「コード（する）」は、特定されたタンパク質への翻訳情報を含む核酸に対する言及を含む。この情報は、コドンの使用によって特定される。代表的に、アミノ酸配列は、「ユニバーサル」遺伝暗号を用いて核酸によってコードされる。しかし、ユニバーサルコードの改変体（例えば、いくつかの植物、動物および真菌ミトコンドリア、細菌Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２３０６−２３０９（１９８５））または繊毛虫Ｍａｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ中に存在する改変体）は、核酸がこれらの生物の翻訳機構を用いて発現される場合に使用され得る。
【００６８】
句「インフレームで融合する」は、ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を結合することをいい、その結果、結合された核酸配列は、独自のポリペプチド鎖を含む一本鎖タンパク質に翻訳される。
【００６９】
本明細書中に使用される場合、「発現された」は、核酸のタンパク質への翻訳に対する言及を含む。タンパク質は、発現されて細胞内性のままであり得るか、細胞表面膜の成分となり得るか、または細胞外マトリックスもしくは培地に分泌され得る。
【００７０】
「宿主細胞」は、発現ベクターの複製または発現を支持しうる細胞を意味する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞であり得るか、または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、または哺乳動物細胞のような真核生物細胞であり得る。
【００７１】
句「ファージディスプレイライブラリー」は、バクテリオファージの集団をいい、これらの各々は、表面タンパク質にインフレームで組換え融合された外来ｃＤＮＡを含む。このファージは、ｃＤＮＡによってコードされる外来タンパク質をその表面上に提示する。細菌宿主（代表的に、Ｅ．ｃｏｌｉ）が複製された後、目的の外来ｃＤＮＡを含むファージが、外来タンパク質のこのファージ表面上での発現によって選択される。
【００７２】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する文脈において、用語「同一である」またはパーセント「同一性」は、同じであるか、あるいは以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてかまたは視覚的な検査によって測定される場合に（最大の一致で比較され、そして整列された際に）同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合を有する、２つ以上の配列またはサブ配列をいう。
【００７３】
句「実質的に同一である」は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてかまたは視覚的な検査によって測定される場合に（最大の一致で比較され、そして整列された際に）少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２つ以上の配列またはサブ配列をいう。好ましくは、この実質的な同一性は、少なくと
も約５０残基の長さである配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域の領域にわたって存在し、そして最も好ましくはこの配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、この配列は、コード領域の全体の長さにわたって実質的に同一である。
【００７４】
配列比較に関して、代表的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、配列座標が指定され、そして、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムによって、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して試験配列に関してパーセント配列同一性が計算される。
【００７５】
比較に関する配列の最適なアラインメントは、例えば、以下のように実施され得る：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する検索方法によって、コンピューターによるこれらのアルゴリズムの実行によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または視覚的な検査によって（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の連帯のベンチャー（１９９５、補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）。
【００７６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズム（これは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載される）である。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して市販されている。このアルゴリズムは、最初に、問い合わせ配列中の短いワード長Ｗを同定することによって高いスコアの配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を包含する（これは、データベース配列中で同じ長さのワードで整列された場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴを一致させるかまたはこれを満たすかのいずれかである）。Ｔは、近接ワードスコアの閾値としていわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各々の配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（一致した残基対に対する報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびパラメーターＮ（一致しない残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列に関して、スコアマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向でのワードヒット拡大を以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大に達成される値から量Ｘだけ落ちる場合；１つ以上のネガティブスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが０またはそれより下になる場合；あるいは、配列のいずれかの末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターのＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関する）ＢＬＡ
ＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００７７】
パーセント配列同一性を算出するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性測定の１つは、最小の和の確率（ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））（これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する）である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の和の確率が約０．１より小さい、好ましくは約０．０１より小さい、そして最も好ましくは約０．００１より小さい場合に、核酸は参照配列に類似すると考えられる。
【００７８】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。従って、ポリペプチドは、代表的に、例えば、これらの２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドに実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子が互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするということである。
【００７９】
用語「インビボ」は、細胞が得られる生物の体の内側に対する言及を含む。「エキソビボ」および「インビトロ」は、細胞が得られる生物の体の外側を意味する。
【００８０】
句「悪性細胞」または「悪性腫瘍」は、浸潤性である腫瘍もしくは腫瘍細胞および／または転移を引き起こし得る腫瘍もしくは腫瘍細胞、すなわち癌性細胞をいう。
【００８１】
本明細書中に使用される場合、「哺乳動物細胞」は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジーまたはマカクを含む哺乳動物に由来する細胞に対する言及を含む。この細胞は、インビボまたはインビトロで培養され得る。
【００８２】
用語「選択的に反応性」は、抗原に関して、抗体（全体または一部）の（抗原を欠く細胞または組織に対してではなく）抗原を保有する細胞または組織との優先的な結合をいう。これは、当然、ある程度の非特異的相互作用が分子と非標的細胞もしくは組織との間に生じ得ることを認識する。それにもかかわらず、選択的反応性は、抗原の特異的認識を介して媒介される場合、識別され得る。選択的に反応性である抗体は抗原に結合するが、この抗体はまた低い親和性でそのように結合し得る。一方、特異的結合は、抗体と抗原保有細胞との間に、結合抗体と抗原を欠く細胞との間よりも、より強い結合を引き起こし得る。特異的結合は、代表的に、メソセリンを欠く細胞または組織に対する場合と比較して、２倍よりも大きく、好ましくは５倍よりも大きく、より好ましくは１０倍よりも大きく、そして最も好ましくは１００倍よりも大きいメソセリン保有細胞または組織に対する抗体結合の量における（単位時間当たりの）増加を引き起こす。そのような条件下でのタンパク質に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。種々の免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性な抗体を選択するのに適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを慣用的に使用して、あるタンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択する。特定の免疫
反応性を決定するのに使用され得る、免疫アッセイ形式および条件に関する説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【００８３】
用語「免疫学的に反応性である条件」は、特定のエピトープに対して産生された抗体をそのエピトープへ、実質的に全ての他のエピトープに対する結合よりも検出可能に大きい程度で結合させる条件、および／または実質的に全ての他のエピトープに対する結合を実質的に排除するように結合させる条件に対する言及を含む。免疫学的に反応性である条件は、抗体結合反応の形式に依存し、そして代表的には、免疫アッセイプロトコールに使用される条件またはインビボで遭遇する条件である。免疫アッセイ形式および条件の説明に関しては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）を参照のこと。好ましくは、本発明の方法に使用される免疫学的に反応性である条件は、代表的に生きている哺乳動物または哺乳動物細胞の内側の条件（例えば、温度、容量オスモル濃度、ｐＨ）に対する言及を含む「生理学的条件」である。いくらかの生物は、極限状態に供されるが、生物体内および細胞内環境は通常ｐＨ７辺りにあり（すなわち、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、より代表的にはｐＨ６．５〜７．５）、優勢な溶媒として水を含み、そして約０℃より高く５０℃より低い温度で存在することが理解される。容量オスモル濃度は、細胞の生存性および増殖を支持する範囲内である。
【００８４】
用語「ＳＳ」または「ＳＳ（ｓｃＦｖ）」は、メソセリンに高い親和性で結合するｓｃＦｖをいい、これは、図１に示されるアミノ酸配列を有する。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  １９９８を参照のこと。
【００８５】
（ＩＩＩ．より高い親和性を有する抗体の生成）
上記のように、本発明は、親抗体から、親抗体の標的抗原に対する親和性よりも高い親和性を有する１つ以上の変異体抗体を生成するための新規な方法を提供する。以前の技術（これは、ＣＤＲ内に無作為に変異を作製する）と対照的に、本発明者らは、本発明者らがホットスポットモチーフ内に少なくとも１つのヌクレオチドを含むコドン（参照を簡単にするために、これらはこの議論に関して「ホットスポットコドン」と名付ける）に対する変異を標的化することによる努力が著しく少なくても、より高い親和性抗体を得ることができることを見出した。変異体の複数の相互作用（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）は、それらの変異が、１９個の他の天然のアミノ酸の各々をコードするコドンによって（１度に）置換されるホットスポットコドンを生じるように、作製される。都合のよいことに、これは、このプロセスを無作為化することによってなされ得、その結果、変異は、従来のホットスポットコドンの代わりに無作為に表れる全部で２０アミノ酸（従来のアミノ酸のものも含む）をコードするコドンを生じる（すなわち、アラニンは、ある変異形態ではグリシンで置換され、別の変異形態はアルギニンで置換され、第３の変異形態はシステインで置換される、など）。
【００８６】
ＣＤＲは、代表的に１つより多くのホットスポットコドンを含む。１、２、３より多くのそのようなコドンは、ＣＤＲ内で変異され得、より高い親和性を獲得した抗体を生成する。本発明者らの結果は、２つのホットスポットコドン変異させるよりも、３つのホットスポットコドンを１度に変異させることによってより良い結果が得られ得ることを示す。
【００８７】
任意のＣＤＲ中のホットスポットコドンは、より高い親和性の抗体を作製するために変異され得る。所望する場合、１つのＣＤＲ中の１つ以上のホットスポットコドンは、他のＣＤＲの内の１つ由来の１つ以上のホットスポットコドンと同じときに変異され得る。各抗体がたった６個のＣＤＲしか含まないこと、ＣＤＲは制限された長さであること（例えば、図１に示されるように、ＳＳｓｃＦｖのＣＤＲは、５〜１７アミノ酸の長さの範囲で
ある）、そしてこれらのアミノ酸をコードするコドンのいくつかのみが、ホットスポットモチーフ内に位置するヌクレオチドを含むということに、注意すべきである。例えば、図２Ａは、ＳＳｓｃＦｖのＶＬ  ＣＤＲ３中の９アミノ酸内の５アミノ酸のみが、ホットスポットコドンによってコードされることを示す。
【００８８】
可変ドメインのフレームワーク領域は、抗体−抗原結合相互作用に穏やかに寄与する。必要に応じて、フレームワーク領域内のホットスポットコドンは、結合活性におけるさらなる改善をなすために変異され得る。
【００８９】
Ｋａｂａｔ（前出）は、抗体の重鎖および軽鎖をサブグループおよびファミリーに分類することに関する情報を提供する。例えば、Ｋａｂａｔの分類下において、ＳＳｓｃＦｖのＶHは、サブグループＩＩＡおよびファミリーＶに属し、そしてＶLは、サブグループＶＩおよびファミリーＸＩに属する。特定の位置でのアミノ酸残基が、特定のサブグループに保存されることは、当該分野で公知である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＷＥＩＲ’Ｓ
ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  Ｉ．ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第５版、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、第６章、６．１−６．２１（１９９６）（Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの全体は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本発明者らの結果によって、これらの保存された残基をコードするコドンを変異しないほうか好ましいこと（たとえ、そのコドンがホットスポットモチーフ内のヌクレオチドを含み、そしてさもなければ変異に対する候補物であったとしても）が示される。
【００９０】
以下の実施例は、これらの原理の使用を実証し、変異されたホットスポットコドンを有する抗体を生成する。本発明者らは、ある部分、モデル抗体として抗メソセリン抗体ＳＳｓｃＦｖを選択した。なぜなら、ＳＳｓｃＦｖを標的部分として使用するイムノトキシンは、動物モデルにおいて、ヒト腫瘍に対して良好な影響を与えることを示されたからである。本発明者らは、ＣＤＲ３を選択した。なぜなら、ＣＤＲ３は、抗原相互作用の主要な部分であるからである。本発明者らは、重鎖に対して可変軽鎖を選択した。なぜなら、本発明者らは、重鎖よりも、軽鎖は正常な親和性成熟の間に抗原親和性に対してほとんど最適化されていないようであるとみたからである。ＳＳｓｃＦｖの軽鎖のＣＤＲ３は、９アミノ酸残基を含み、これは、慣例として８９〜９７と番号を付ける（図２Ａを参照のこと）。２つのテトラヌクレオチドホットスポットモチーフ中の３つのコドン（残基８９、９３および９４）が同時に変異されるライブラリーを作成し、そしてセリンホットスポットコドンおよびテトラヌクレオチドホットスポットモチーフ中のコドン（残基９２、９３および９４）が同時に変異されるライブラリーを作成した。これらのライブラリー由来のクローンを抗原に対するこれらの親和性についてスクリーニングした場合、これらのライブラリー中のほとんどの変異は、親抗体（ＳＳｓｃＦｖ）が示すよりも、抗原に対して高い親和性を示した。対照的に、残基Ｑ９０（これは、ＳＳｓｃＦｖが分類される軽鎖のサブグループにおいて保存されている）の中に変異を含むコントロールライブラリーは、親抗体の親和性とほとんど同じまたはそれより低い親和性を有する変異体を生じた。図２Ｃを参照のこと。同様に、変異がホットスポット内のヌクレオチドを含まないコドン内で作製されたライブラリーは、従来の親のＳＳｓｃＦｖとほとんど同じまたは中程度に良好な抗原に対する親和性を示した。図２Ｅを参照のこと。
【００９１】
親和性結合研究により、変異された抗体の親和性に厳格な差異が存在したことを確認した。保存残基をコードしないホットスポットコドンを変異することによって作製されたＳｃＦｖによって、これらが由来する既に高い親和性の親抗体よりも、１５倍から５５倍もの高い範囲の標的抗原に対する親和性を有するいくつかの抗体の生成が生じた。対照的に、ホットスポットモチーフ内の少なくとも１つのヌクレオチドを有さないコドンによって
コードされるアミノ酸から生じる最良のクローンは、たった３．７倍の親和性の増加しか有さなかった。さらに、これらの高い親和性の抗体の生成およびスクリーニングは、ＣＤＲ変異を含む以前の方法に必要とされるサイズよりも、かなり低い桁の大きさのライブラリーを必要とした。
【００９２】
最も高い親和性を有する変異された抗体（Ｃ１０と命名する）は、残基９２、９３および９４以外は親のＳＳｓｃＦｖのアミノ酸配列を有する。位置９２において、ＳＳｓｃＦｖの「Ｓ」（セリン）は、「Ｇ」（グリシン）に変化される。位置９３において、ＳＳｓｃＦｖ配列の「Ｇ」は、「Ｓ」に変化される。位置９４において、「Ｙ」（チロシン）は、「Ｈ」（ヒスチジン）に変化される。各変異クローンへの変化（他の２つの高い親和性のクローン（ＳＳ１およびＤ８）を含む）を、図３に示す。慣用として、これらのアミノ酸置換はまた、本来の配列中のアミノ酸がその一文字コードで列挙される短縮化形態で記載され得、続いて、その位置の番号および変化された配列で置換されたアミノ酸に対する標準的な一文字コードで記載される。従って、上記のクローンＣ１０の変化はまた、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈと記載され得る。同様に、クローンＳＳ１のｓｃＦｖは、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈとして記載され得、そしてクローンＤ８のｓｃＦｖは、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎによって記載され得る。Ｅ４クローンのｓｃＦｖ（これは、ホットスポットモチーフ内にヌクレオチド変異を有さない）は、Ｌ９６Ｔとして示され得る。
【００９３】
（ＩＶ．抗メソセリン抗体）
本発明は、メソセリンに対して、先行技術の抗体よりも高い親和性で結合する抗体を提供する。特に、本発明は、本発明者らがＳＳ１、Ｃ１０、およびＤ８と命名した、それぞれ、メソセリンについて、これらの親抗体ＳＳ（ｓｃＦｖ）の親和性より１５倍、５５倍および３７倍高い親和性を有する抗体を提供する。ＳＳ（ｓｃＦｖ）は、以前は、メソセリンと特異的に反応性である、最も親和性が高い公知の抗体であった。本発明はさらに、メソセリンおよび目的の他の抗原に対する他の高親和性抗体を生成するための方法を提供する。下記に開示される免疫結合体は、本発明の抗体を用いてメソセリンを標的化する。これらの抗体は、哺乳動物細胞の表面に提示されるメソセリンの決定基に対して免疫学的条件下で選択的に反応性であり、そして細胞外環境由来の抗体にアクセス可能である。本発明はさらに、Ｅ４と命名した抗体を提供し、この抗体は、本発明の方法によって生成されておらず、そして本発明の方法によって生成される抗体ほどメソセリンについての親和性が高くないが、メソセリンについてのＳＳの約３．７倍の親和性をなお有する。
【００９４】
本発明において生成される抗メソセリン抗体は、ＥＭカルボキシル末端、ＥＭアミノ末端、ＥＭの内部アミノ酸残基（例えば、システイン）、またはそれらの任意の組み合わせを通してエフェクター分子（ＥＭ）に連結され得る。同様に、ＥＭは、抗体の重鎖、軽鎖、Ｆｃ（定常領域）またはフレームワーク領域に直接連結され得る。連結は、抗体のアミノ末端もしくはカルボキシル末端を通して、または内部アミノ酸残基を通して生じ得る。さらに、複数のＥＭ分子（例えば、２〜１０のいずれか１つ）は、抗メソセリン抗体に連結され得、そして／または複数の抗体（例えば、２〜５のいずれか１つ）は、ＥＭに連結され得る。本発明の多価免疫結合体組成物において用いられる抗体は、同じかまたは異なるメソセリンエピトープに対して指向され得る。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、抗メソセリン抗体は、組換え抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体）である。Ｆｖ抗体は代表的に、約２５ｋＤａであり、そして重鎖および軽鎖あたり３つのＣＤＲを有する、完全な抗原結合部位を含む。ＶH
鎖およびＶL鎖が連続せずに発現される場合、Ｆｖ抗体の鎖は代表的に、非共有結合相互
作用によって一緒に保持される。しかし、これらの鎖は、希釈によって解離する傾向があり、それゆえ、これらの鎖をグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィドまたはペプチドリンカーを通して架橋する方法が開発されている。
【００９６】
特に好ましい実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体のＶH領域およびＶL領域は、２本鎖の抗体に見出されるのと同様の抗原結合部位を作製するように折り畳まれる単鎖を含む。一旦折り畳まれると、非共有結合相互作用は、単鎖抗体を安定化する。より好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、組換え産生される。なお別の好ましい実施形態では、ＶH領域は、図１に示す通りのアミノ酸配列を有する。当業者は、本
発明の抗体の保存的改変体が作製され得ることを理解する。ｓｃＦｖフラグメントにおいて用いられるこのような保存的改変体は、正確な折り畳みおよびＶH領域とＶL領域との間の安定化に必要な重要なアミノ酸残基を保持する。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ抗体は、軽鎖を通してＥＭへと直接連結される。しかし、ｓｃＦｖ抗体は、そのアミノ末端またはカルボキシル末端を通してＥＭへと連結され得る。
【００９８】
いくつかの抗体の実施形態のＶH領域およびＶL領域は直接一緒に連結され得るとはいえ、当業者は、これらの領域が、１以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって隔てられ得ることを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：５８７９（１９８８）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３６（１９８８）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３６２（１９９０）；米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２５６−２６５（１９９３）（全て、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を連結すること、またはこれらの間のいくらかの最小の距離もしくは他の空間的関係を保つこと以外に特定の生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成要素であるアミノ酸は、分子のいくつかの特性（例えば、折り畳み、正味の電荷、または疎水性）に影響を与えるように選択され得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は必要に応じて、５０以下のアミノ酸の、一般的に４０以下のアミノ酸の、好ましくは３０以下のアミノ酸の、そしてより好ましくは２０以下のアミノ酸の長さのペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのコンカテマー（好ましくは、２、３、４、５または６個のこのような配列）である。しかし、リンカー内のいくつかのアミノ酸置換が行われ得ることが認識されるべきである。例えば、バリンで、グリシンを置換し得る。
【００９９】
（Ａ．抗体産生）
ポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に公知である。手短に述べると、免疫原（好ましくは、単離されたメソセリンまたは細胞外メソセリンエピトープ）はアジュバントと混合され、そして動物がこの混合物で免疫される。免疫原に対する適切に高い力価の抗体が得られた場合、血液がこの動物から収集され、そして抗血清が調製される。所望の場合、さらに、このポリペプチドに対して反応性の抗体について濃縮するための抗血清の分画が行われる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ（１９９１）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出（これらは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１００】
モノクローナル抗体は、当業者に慣用的な種々の技術によって得られ得る。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第４版）、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびその中で引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、ＭＯＮＯＣＬ
ＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８６）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；ならびに特にモノクローナル抗体を作製する１つの方法を議論するＣｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９（１９９７）に見出され得る。
【０１０１】
親のモノクローナル抗体が、標的抗原、または所望の免疫原（例えば、メソセリン）をコードする核酸配列で動物を免疫することによって作製されることが好ましい。異種タンパク質をコードする非複製性転写単位での免疫は、抗原特異的免疫応答を惹起する。外来タンパク質への翻訳後、このタンパク質は、プロセシングされ、そして他の細胞性タンパク質と同様に免疫系に対して提示される。このタンパク質は外来性であるので、このタンパク質およびこれから誘導されるペプチドエピトープに対して免疫応答がマウントされる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７６：１４５−１５２（１９９４）；およびＢｏｙｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．２５：２４２−２５０（１９９６））。この技術は、タンパク質ベースの免疫に対して２つの顕著な利点を有する。第１の利点は、これは、タンパク質精製を必要としないことである。タンパク質精製は、いくらよくても、時間がかかり、そして多くの膜タンパク質の場合、非常に困難である。第２の利点は、この免疫原が哺乳動物宿主内で合成されるので、これは、正確な翻訳後修飾を受け、そしてそのネイティブな構造に折り畳まれることである。
【０１０２】
メソセリンコードＤＮＡで免疫するために、メソセリンコードｃＤＮＡは、コード配列の転写がプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下にあるように、プラスミド中に導入される。次いで、このプラスミドは、動物内に、皮下、皮内、腹腔内などのいずれかによって注射される。結果として、このメソセリンｃＤＮＡは動物内でｍＲＮＡへと転写され、メソセリンはこのｍＲＮＡから翻訳され、この翻訳されたタンパク質は正確な翻訳後修飾を受け、そしてメソセリンを合成した細胞の表面に発現される。この動物はメソセリンに対する抗体を惹起し、そして血清が抗体力価についてモニタリングされる。
【０１０３】
必要に応じて、コード領域および調節エレメントに加えて、このプラスミドは、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子を保有する。Ａｍｐ遺伝子は、抗体産生の増加に必要なＴｈ１応答についての免疫刺激配列を有することが公知である（Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７３：３５２−３５４（１９９６））。
【０１０４】
上記のように、好ましい実施形態では、このモノクローナル抗体はｓｃＦｖである。ｓｃＦｖ抗体を作製する方法は、記載されている。Ｈｕｓｅら、前出；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎら、前出を参照のこと。手短に述べると、Ｂ細胞由来のｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製される。このｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて、周知の技術（例えば、ＰＣＲ）によって増幅される。ＰＣＲ産物は、例えば、アガロースゲル電気泳動によって精製され、そしてこの核酸配列は連結される。リンカーペプチドが所望される場合、ペプチドをコードする核酸配列は、重鎖の核酸配列と軽鎖の核酸配列との間に挿入される。この配列は、当該分野で公知の技術（例えば、平滑末端連結、ＰＣＲ産物の末端での制限部位の挿入、または重複伸張によるスプライシングによって）によって連結され得る（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９（１９９７））。増幅後、ｓｃＦｖをコードする核酸は、さらに当該分野で周知の技術によってベクター中に挿入される。好ましくは、このベクターは、原核生物中で複製され得、そして真核生物および原核生物の両方において発現され得る。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、ファージディスプレイライブラリーによって選択される。ｓｃＦｖを合成するための上記の手順は、以下に続く。ＰＣＲによる増幅後、ｓ
ｃＦｖ核酸配列は、繊維状ファージのマイナーな表面タンパク質ｇＩＩＩｐをコードする、遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０（１９９２）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．９１：６−１２（１９９２）；およびＢｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５））とインフレームで融合される。このファージは、得られる融合タンパク質をその表面に発現する。ファージ表面のタンパク質は機能的であるので、メソセリン結合抗体を保有するファージは、パニングまたは抗原アフィニティークロマトグラフィー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））によって非結合性かまたはより低い親和性のファージから分離され得る。
【０１０６】
好ましい実施形態では、メソセリンに特異的に結合するｓｃＦｖは、パニングによって見出される。パニングは、固体表面をメソセリンでコーティングし、そしてこのファージを適切な時間、適切な条件下でこの表面上でインキュベートすることによって行われる。結合していないファージは、固体表面から洗浄除去され、そして結合したファージが溶出される。最大の親和性を有する抗体を見出すことは、選択プロセスの効率によって指図され、そしてスクリーニングされ得るクローン数およびそれが行われるストリンジェンシーに依存する。代表的に、より高いストリンジェンシーは、より選択的なパニングに対応する。しかし、条件があまりにもストリンジェントである場合、ファージは結合しない。１回のパニング後、メソセリンコーティングプレートに結合するファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増やされ、そして別の回のパニングに供される。このようにして、２０００倍の富化が３回のパニングにおいて行われる。従って、各回の富化が低い場合でさえ、複数回のパニングは、稀なファージの単離をもたらし、そしてその中に含まれる遺伝物質は、最大の親和性抗体の配列をコードする。ファージディスプレイによって提供される遺伝子型と表現型との間の物理的連鎖は、大きなライブラリーのクローンを用いてさえ、ｃＤＮＡライブラリーの全てのメンバーを抗原に対する結合について試験することを可能にする。
【０１０７】
（Ｂ．抗体の結合親和性）
本発明の抗体は、それらの標的抗原に、それらの親抗体の親和性よりも少なくとも５倍良好な親和性で結合する。１つの実施形態では、この抗体は、メソセリンの細胞外エピトープに結合する抗メソセリン抗体である。標的抗原についての結合親和性は代表的に、標準的な抗体−抗原アッセイ（例えば、競合アッセイ、飽和アッセイまたはイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ））によって測定または決定される。
【０１０８】
このようなアッセイを用いて、抗体の解離定数を決定し得る。語句「解離定数」とは、抗原についての抗体の親和性をいう。抗体の解離定数（ＫD＝１／Ｋ、ここで、Ｋは、親
和定数である）が＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、そして最も好ましくは＜０．１ｎＭである場合、抗体と抗原との間に結合の特異性が存在する。抗体分子は代表的に、より低い範囲のＫDを有する。ＫD＝［Ａｂ−Ａｇ］／［Ａｂ］［Ａｇ］、ここで、［Ａｂ］は平衡状態での抗体の濃度であり、［Ａｇ］は平衡状態での抗原の濃度であり、そして［Ａｂ−Ａｇ］は平衡状態での抗体−抗原複合体の濃度である。代表的に、抗原と抗体との間の結合相互作用は、可逆的非共有結合的会合（例えば、静電引力、ファンデルワールス力および水素結合）を含む。結合特異性を規定するこの方法は、メソセリンに単独でまたは組み合わせて結合する場合にメソセリンに特異的である、単一の重鎖および／もしくは軽鎖、ＣＤＲ、融合タンパク質または重鎖および／もしくは軽鎖のフラグメントに適用される。
【０１０９】
（Ｃ．イムノアッセイ）
抗体は、充分に認識された多数の免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，
８３７，１６８号を参照のこと）のうちのいずれかを用いて検出および／または定量され得る。一般的イムノアッセイの概説については、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第３７巻、Ａｓａｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第７版、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編（１９９１）をまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は代表的に、リガンド（例えば、メソセリン）を利用して抗体に特異的に結合させ、そしてしばしば、この抗体を固定化する。本発明のイムノアッセイにおいて用いられる抗体は、上記でさらに詳細に考察される。
イムノアッセイはまたしばしば、標識化剤を利用して、リガンドおよび抗体によって形成される結合複合体に特異的に結合させ、そしてこの結合複合体を標識する。標識化剤は、それ自体が、抗体／分析物複合体（すなわち、抗メソセリン抗体）を含む部分のうちの１つであり得る。あるいは、標識化剤は、抗体／メソセリンタンパク質複合体に特異的に結合する第３の部分（例えば、別の抗体）であり得る。
【０１１０】
１つの局面では、標識化剤が、標識を保有する第２の抗メソセリン抗体である競合アッセイが意図される。次いで、この２つの抗体は、固定化されたメソセリンに対する結合について競合する。あるいは、非競合形式において、メソセリン抗体は標識を欠くが、抗メソセリン抗体を誘導した種（例えば、マウス）の抗体に特異的であってそして抗メソセリン抗体に結合する第２の抗体が標識される。
【０１１１】
免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）もまた、標識剤として用いられ得る。これらのタンパク質は、連鎖球菌細菌の細胞壁の通常の構成要素である。これらは、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性反応性を示す（一般的に、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）を参照のこと）。
【０１１２】
アッセイ全体を通して、インキュベーションおよび／または洗浄の工程は、試薬の各組み合わせの後で必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間〜数時間まで、好ましくは約５分間〜約２４時間まで変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイの形式、抗体、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、アッセイは、室温で実施されるが、アッセイは、一定の範囲の温度（例えば、１０℃〜４０℃）で実施され得る。
【０１１３】
本発明のイムノアッセイの詳細は、用いられる特定の形式に伴って変動し得るとはいえ、抗体を含むサンプル中の抗メソセリン抗体を検出する方法は、一般的に、サンプルを、免疫学的に反応性の条件下で、メソセリン／抗体複合体に対して特異的に反応する抗体と接触させる工程を包含する。
【０１１４】
（Ｖ．免疫結合体の産生）
免疫結合体としては、抗体に対する治療剤の共有結合が存在する分子が挙げられるがこれに限定されない。治療剤は、特定の標的分子または標的分子を保有する細胞に対して指向された特定の生物学的活性を有する薬剤である。当業者は、治療剤が、種々の薬物（例えば、ビンブラスチン、ダウノマイシンなど）、細胞毒（例えば、ネイティブかまたは改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはＤｉｐｈｔｈｅｒｉａ毒素）、それ自体が薬理学的組成物を含むカプセル化剤（例えば、リポソーム）、放射性薬剤（例えば、125
Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓ）ならびに他の標識、標的部分およびリガンドを含み得
ることを認識する。
【０１１５】
特定の治療剤の選択は、特定の標的分子または細胞に依存し、そして生物学的効果は、誘起することが所望される。従って、例えば、治療剤は、特定の標的細胞の死をもたらす
ために用いられる細胞毒であり得る。逆に、非致死的な生物学的応答を誘発することが単に所望される場合、治療剤は、非致死的な薬理学的薬剤に対して、または非致死的な薬理学的薬剤を含むリポソームに対して結合体化され得る。
【０１１６】
本明細書中で提供される治療剤および抗体を用いて、当業者は、機能的に等価な核酸（例えば、配列が異なるが、同じＥＭまたは抗体の配列をコードする核酸）を含む種々のクローンを容易に構築し得る。従って、本発明は、抗体および結合体、ならびにそれらの融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１１７】
（Ａ．組換え方法）
本発明の核酸配列は、任意の適切な方法によって調製され得る。このような方法としては、例えば、適切な配列のクローニングまたは以下のような方法による直接化学合成が挙げられる：例えば、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９（１９７９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）のジエチルホスホルアミダイト法；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８１）によって記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法（例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載される通りの自動化合成機を用いる）；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これらは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖をテンプレートとして用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって二本鎖ＤＮＡへと変換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に制限されるとはいえ、より長い配列は、より短い配列の連結によって入手され得ることを認識する。
【０１１８】
好ましい実施形態では、本発明の核酸配列は、クローニング技術によって調製される。適切なクローニングおよび配列決定の技術、ならびに多くのクローニング練習を通して当業者に指示するに充分な指示書の例は、以下に見出される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（編）、ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９８７））またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ（１９８７）。生物学的試薬および実験装置の製造業者による製品情報もまた、有用な情報を提供する。このような製造業者としては、以下が挙げられる：ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源。
【０１１９】
ネイティブなＥＭまたは抗メソセリン抗体をコードする核酸は、ＥＭ、抗体、または本発明の免疫結合体を形成するように改変され得る。部位特異的変異誘発による改変は、当該分野で周知である。ＥＭまたは抗メソセリン抗体をコードする核酸は、インビトロ方法によって増幅され得る。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自己保持配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。広範な種々のクローニング方法、宿主細胞およびインビトロ増幅方法論は、当業者に周知である。
【０１２０】
好ましい実施形態では、免疫結合体は、抗メソセリンｓｃＦｖ抗体をコードするｃＤＮＡを、ＥＭをコードするｃＤＮＡを含むベクター中に挿入することによって調製される。挿入は、機能的Ｆｖ領域および機能的ＥＭ領域を含む１つの連続したポリペプチドにおいて、ｓｃＦｖおよびＥＭがインフレームで読まれるように行われる。特に好ましい実施形態では、ジフテリア毒素フラグメントをコードするｃＤＮＡは、ｓｃＦｖのカルボキシル末端に毒素が配置されるように、ｓｃＦｖへと連結される。最も好ましい実施形態では、ＰＥをコードするｃＤＮＡは、ｓｃＦｖのアミノ末端に毒素が配置されるように、ｓｃＦｖへと連結される。
【０１２１】
一旦、本発明のＥＭ、抗メソセリン抗体、または免疫結合体をコードする核酸が単離され、そしてクローン化されると、組換えによって操作された細胞（例えば、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞）において所望のタンパク質を発現し得る。当業者は、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母および種々のより高等な真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびミエローマ細胞株）を含む、タンパク質の発現に利用可能な多数の発現系を良く知っていることが予想される。原核生物または真核生物におけるタンパク質の発現について公知の種々の方法を詳細に記載する試みは行われない。手短に述べると、本発明の単離されたタンパク質をコードする天然または合成の核酸の発現は代表的に、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（これは、構成性または誘導性のいずれかである）に対して作動可能に連結し、続いて発現カセットに組み込むことによって達成される。このカセットは、原核生物または真核生物のいずれかへの複製および組込みに適切であり得る。代表的な発現カセットは、転写および翻訳のターミネーター、開始配列、およびタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用なプロモーターを含む。クローニングされた遺伝子の高レベル発現を得るために、少なくとも、転写を指向する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写／翻訳ターミネーターを含む発現カセットを構築することが所望される。Ｅ．ｃｏｌｉについては、これは、プロモーター（例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはλプロモーター）、リボソーム結合部位および好ましくは転写終結シグナルを含む。真核生物細胞については、制御配列は、プロモーターを、そして好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス由来のエンハンサーおよびポリアデニル化配列を含み得、そしてスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列を含み得る。本発明のカセットは、Ｅ．ｃｏｌｉについては塩化カルシウム形質転換またはエレクトロポレーション、そして哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクションのような周知の方法によって選択された宿主細胞へと移入され得る。このカセットによって形質転換された細胞は、カセット中に含まれる遺伝子（例えば、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子）によって付与される、抗生物質に対する耐性によって選択され得る。
【０１２２】
当業者は、その生物学的活性を減少させることなく、本発明のポリペプチド（すなわち、抗メソセリン抗体、ＰＥまたはこれらの組み合わせによって形成された免疫結合体）をコードする核酸に対して改変が行われ得ることを認識する。いくつかの改変が行われて、標的化分子のクローニング、発現または融合タンパク質への組込みを容易にし得る。このような改変は当業者に周知であり、そして例えば、終止コドン、アミノ末端に付加されて
開始部位を提供するメチオニン、いずれかの末端に配置されて便利に配置された制限部位を作製するさらなるアミノ酸、または精製工程を補助するさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を含む。
【０１２３】
組換え法に加えて、本発明の免疫結合体、ＥＭおよび抗体はまた、標準的なペプチド合成を用いて全体としてまたは部分的に構築され得る。約５０アミノ酸長未満の本発明のポリペプチドの固相合成は、この配列のＣ末端アミノ酸を、不溶性支持体へと連結し、続いてこの配列内の残りのアミノ酸を順次付加することによって達成され得る。固相合成のための技術は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ＴＨＥ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ，ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＢＩＯＬＯＧＹ．第２巻：ＳＰＥＣＩＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第Ａ部、３〜２８４頁；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）およびＳｔｅｗａｒｔら、ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４）によって記載される。より大きな長さのタンパク質は、より短いフラグメントのアミノ末端およびカルボキシル末端の縮重によって合成され得る。カルボキシル末端の活性化によってペプチド結合を形成する方法（例えば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）は当業者に公知である。
【０１２４】
（Ｂ．精製）
一旦発現されると、本発明の組換え免疫結合体、抗体、および／またはエフェクター分子は、当該分野の標準的な手順に従って精製され得る。このような手順としては、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。少なくとも約９０％〜９５％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９８％〜９９％以上の均質性が、薬学的用途に最も好ましい。所望に応じて、部分的にまたは均質になるまで（治療に用いられる場合）一旦精製されると、このポリペプチドは、内毒素を実質的に含まないはずである。
【０１２５】
細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）からの単鎖抗体の発現および／または適切な活性形態（単鎖抗体を含む）への再折り畳みのための方法は、記載されており、そして周知であり、そして本発明の抗体に適用可能である。Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０（１９９２）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５（１９９１）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）およびＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４（１９８９）（全て本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１２６】
しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌由来の機能的異種タンパク質は、封入体から単離され、そして強力な変性剤を用いた可溶化およびその後の再折り畳みを必要とする。可溶化工程の間、当該分野で周知であるように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を含む例示的な緩衝液は以下である：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、６Ｍグアニジン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）。ジスルフィド結合の再酸化は、本明細書中に参考として援用される、Ｓａｘｅｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９：５０１５−５０２１（１９７０）に記載され、そして特にＢｕｃｈｎｅｒら、前出によって記載されるように、還元型および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で生じ得る。
【０１２７】
再生は代表的に、変性しそして還元されたタンパク質の、再折り畳み緩衝液中への希釈（例えば、１００倍）によって達成される。代表的な緩衝液は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐ
Ｈ８．０、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡである。
【０１２８】
二本鎖抗体精製プロトコルへの改変物として、重鎖領域および軽鎖領域は、別々に可溶化および還元され、次いで、再折り畳み溶液中で合わされる。これらの２つのタンパク質が、他方に対して一方のタンパク質が５倍モル過剰を超えないようなモル比で混合される場合、好ましい収率が得られる。過剰の酸化型グルタチオンまたは他の酸化性低分子量化合物を、レドックスシャッフリングが完了した後の再折り畳み溶液に添加することが望ましい。
【０１２９】
（ＶＩ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素および他の毒素）
毒素を、本発明の抗体と共に用いて、イムノトキシンを産生し得る。例示的な
毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびそれらのサブユニッ
ト、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は、商業的供給
源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。リシンは、Ｒｉｃｉｎ
ｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマの実（Ｃａｓｔｏｒ  ｂｅａｎ））由来のレ
クチンＲＣＡ６０である。この用語はまた、それらの毒性改変体も参照する。例
えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６８９，４０１号を参照
のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ）は２つの形態で生
じ、それぞれ、それらの約６５ｋＤおよび約１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣ
Ａ60およびＲＣＡ120と称される（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉ
ｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２６６：５４３（１９７
２））。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活化および細胞の殺傷を担う。Ｂ鎖は、細
胞表面のガラクトース残基にリシンを結合させ、そして細胞質ゾル内へのＡ鎖の
輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２４９：６２７−６３１（１
９７４）および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１３０】
アブリンは、Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む
。毒性の本質である、アブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄは、約６３ｋＤから、約６
７ｋＤの分子量を有し、そして２つのジスルフィド結合ポリペプチド鎖Ａおよび
Ｂから構成される。Ａ鎖は、タンパク質合成を阻害し；Ｂ鎖（アブリンｂ）は、
Ｄガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．５２：１０９５（１９８８）；およびＯｌｓｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．５０：３３０−３３５（１９７８）を参照のこと）。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態では、毒素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ
）である。用語「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、本明細書中で使用される
場合、全長のネイティブな（天然に存在する）ＰＥ、または改変されているＰＥ
をいう。このような改変としては、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩ、
およびＩＩＩにおける種々のアミノ酸の欠失、単一のアミノ酸置換、およびカル
ボキシル末端での１以上の配列（例えば、ＫＤＥＬおよびＲＥＤＬ）の付加が挙
げられ得るが、これらに限定されない。Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１（１９８９）を参照のこと。好ましい実
施形態では、ＰＥの細胞障害性フラグメントは、ネイティブなＰＥの細胞傷害性
の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そ
して最も好ましくは９５％を保持する。最も好ましい実施形態では、細胞傷害性
フラグメントは、ネイティブなＰＥよりも毒性が高い。
【０１３２】
ネイティブなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって分泌される、極めて活性なモノマー性の
タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、これは、真核生物細胞中におけるタンパ
ク質合成を阻害する。ネイティブなＰＥ配列は、同一人に譲渡された米国特許第
５，６０２，０９５号（本明細書中で参考として援用される）に提供される。作
用の方法は、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活化である。外
毒素は、細胞傷害性を引き起こすのに提携して作用する３つの構造ドメインを含
む。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は、細胞結合を媒介する。ドメインＩ
Ｉ（アミノ酸２５３〜３６４）は、細胞質ゾル内へのトランスロケーションを担
い、そしてドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は、伸長因子２のＡＤＰ
リボシル化を媒介する。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は、未
だ決定されていないが、その大部分であるアミノ酸３６５〜３８０は、細胞傷害
性の損失を伴なわずに欠失され得る。Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９）、前出を参
照のこと。
【０１３３】
本発明において使用されるＰＥとしては、ネイティブな配列、ネイティブな配
列の細胞傷害性フラグメント、ならびにネイティブなＰＥおよびその細胞傷害性
フラグメントの保存的に改変された改変体が挙げられる。ＰＥの細胞傷害性フラ
グメントは、標的細胞中における引き続くタンパク質分解性または他のプロセシ
ングを伴なって、または伴なわずに、細胞傷害性であるフラグメントを含む（例
えば、タンパク質またはプレタンパク質として）。ＰＥの細胞傷害性フラグメン
トとしては、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が挙げられる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、ＰＥは、米国特許第４，８９２，８２７号において教
示されるように、しばしばドメインＩａを欠失させることによって改変され、非
特異的な細胞結合を減少または除去されるが、これはまた、例えば、ドメインＩ
ａの特定の残基を変異させることによっても達成され得る。例えば、米国特許第
５，５１２，６５８号は、変異されたＰＥ（ここでは、ドメインＩａが存在する
が、ドメインＩａの５７位、２４６位、２４７位、および２４９位の塩基性残基
が、酸性残基（グルタミン酸（すなわち、「Ｅ」）で置換されている）が、非常
に減少した非特異的細胞傷害性を示すことを開示している。ＰＥのこの変異形態
は、時折、ＰＥ４Ｅと呼ばれる。
【０１３５】
ＰＥ４０は、当該分野で以前に記載されたように、ＰＥの短縮化（ｔｒｕｎｃ
ａｔｅｄ）誘導体である。Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ  ８８：３３５８−６２（１９９１）；およびＫｏｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５（１９８８）を参照のこと。ＰＥ
３５は、ＰＥの３５ｋＤのカルボキシル末端フラグメントであり、ここでは、ア
ミノ酸残基１〜２７９が欠失しており、そしてこの分子は、２８０位のｍｅｔで
開始し、ネイティブなＰＥのアミノ酸２８１〜３６４および３８１〜６１３が続
く。ＰＥ３５およびＰＥ４０は、例えば、米国特許第５，６０２，０９５号およ
び同第４，８９２，８２７号に開示される。
【０１３６】
いくつかの好ましい実施形態では、細胞傷害性フラグメントＰＥ３８が使用さ
れる。ＰＥ３８は、アミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３から構成され
る短縮化ＰＥプロタンパク質であり、これは、細胞内でのプロセシングに際して
、その細胞傷害性形態へと活性化される（例えば、米国特許第５，６０８，０３
９号およびＰａｓｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３
３３：Ｃ１−Ｃ６（１９９７）を参照のこと）。
【０１３７】
上述のように、いくつかまたはすべてのドメイン１ｂが欠失され得、そして残
りの部分が、リンカーによってか、またはペプチド結合によって直接的に連結さ
れ得る。ドメインＩＩのいくつかのアミノ酸部分は、欠失され得る。そして、Ｃ
末端は、残基６０９〜６１３のネイティブな配列（ＲＥＤＬＫ）を含み得るか、
または構築物を細胞質ゾル内にトランスロケーションする能力を維持することが
見出されているバリエーション（例えば、ＲＥＤＬまたはＫＤＥＬ）、およびこ
れらの配列の反復を含み得る。例えば、米国特許第５，８５４，０４４号；同第
５，８２１，２３８号；および同第５，６０２，０９５号、ならびにＷＯ９９／
５１６４３を参照のこと。好ましい実施形態では、ＰＥは、ＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０
、またはＰＥ３８であるが、非標的細胞への顕著な毒性が生じないレベルまで、
非特異的細胞傷害性が除去または減少されている任意の形態のＰＥが、標的化細
胞においてトランスロケーションし得、そしてＥＦ−２をリボシル化し得るまま
である限り、本発明のイムノトキシンに使用され得る。
【０１３８】
（Ａ．ＰＥの保存的に改変された改変体）
ＰＥまたはその細胞傷害性フラグメントの保存的に改変された改変体は、目的
のＰＥ（例えば、ＰＥ３８）と、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％の配列類
似性、好ましくは、少なくとも８５％の配列類似性、より好ましくは、少なくと
も９０％の配列類似性、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を
有する。
【０１３９】
用語「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に
適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一また
は本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列をいうか、または核酸がア
ミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な核酸配列をいう。遺伝暗号
の縮重性が理由で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のポリペプチドを
コードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、ア
ミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによってアラニンが特定されるす
べての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、
記載された任意の対応するコドンに変更し得る。このような核酸のバリエーショ
ンは、「サイレントなバリエーション」であり、これは、保存的に改変されたバ
リエーションの一種である。ポリペプチドをコードする、本明細書中のすべての
核酸配列はまた、核酸のすべての可能なサイレントなバリエーションを記載する
。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（これは、通常、メチオニンについての
唯一のコドンである）を除く）が、機能的に同一な分子を産生するように改変さ
れ得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントな
バリエーションの各々が、各々記載された配列中において含意される。
【０１４０】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列において単一のアミノ酸
または低いパーセンテージのアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸配列
、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠
失、または付加が、「保存的に改変された改変体」であることを認識し、ここで
変更は、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる。
【０１４１】
（Ｂ．ＰＥの細胞傷害性についてのアッセイ）
本発明で使用されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、当業者に周知のアッセ
イによって、所望されるレベルの細胞傷害性についてアッセイし得る。例示的な
毒性アッセイは、本明細書中において、例えば、実施例２に記載される。従って
、ＰＥの細胞傷害性フラグメントおよびこのようなフラグメントの保存的に改変
された改変体は、細胞傷害性について容易にアッセイされ得る。多数の候補ＰＥ
分子を、当該分野において周知の方法によって、細胞傷害性について同時にアッ
セイし得る。例えば、候補分子のサブグループを、細胞傷害性についてアッセイ
し得る。候補分子の中で、ポジティブに反応するサブグループを継続的に細分し
得、そして所望の細胞傷害性フラグメントが同定されるまで、再度アッセイし得
る。このような方法は、ＰＥの多数の細胞傷害性フラグメントまたは保存的改変
体の迅速なスクリーニングを可能にする。
【０１４２】
（Ｃ．他の治療的部分）
本発明の抗体はまた、かなり多数の異なる診断用または治療用化合物を、表面
上にメソセリンを発現する細胞に標的化するために使用され得る。従って、本発
明の抗体（例えば、抗メソセリンｓｃＦｖ）は、メソセリンを保有する細胞に直
接的に送達されるべき薬物に対して、直接的に結合され得るか、またはリンカー
を介して結合され得る。治療剤としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ
酸、または誘導体、糖タンパク質、ラジオアイソトープ、脂質、炭水化物、また
は組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸の治療用および診断用部分
としては、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡと共有結合的に架橋す
る誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げら
れる。
【０１４３】
あるいは、抗メソセリン抗体に連結される分子は、治療用組成物（例えば、薬
物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または循環系への直接曝露から、好ま
しくは遮蔽される別の治療的部分）を含む、リポソームまたはミセルのようなカ
プセル系であり得る。抗体に結合したリポソームを調製する手段は、当業者に周
知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒら、
Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５（１９８５）を参照のこと。
【０１４４】
（Ｄ．検出可能標識）
本発明の抗体は、必要に応じて、検出可能な標識に共有結合的にか、または非
共有結合的に連結され得る。このような用途に適切な検出可能標識としては、分
光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学
的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発
明において有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、
蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ロ
ーダミン、グリーン蛍光タンパク質など）、放射能標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、
35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて通常使用される他の酵素）、お
よび比色定量標識（例えば、金コロイドあるいは呈色（ｃｏｌｏｒｅｄ）ガラス
またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど
）ビーズ）が挙げられる。
【０１４５】
このような標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、放
射能標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出さ
れ得、蛍光マーカーは、光検出器を使用して検出して、放射された照度を検出し
得る。酵素学的標識は、代表的に、酵素に基質を提供すること、そしてその基質
に対する酵素の作用によって生成される反応生成物を検出することによって検出
される。比色定量標識は、単純に、呈色した標識を可視化することによって検出
される。
【０１４６】
（Ｅ．抗体への結合体化）
本発明の非組換え的実施形態では、エフェクター分子（例えば、治療的部分、
診断用部分、または検出用部分）を、当業者に公知のかなり多数の手段を使用し
て、本発明の抗メソセリン抗体に連結する。共有結合手段および非共有結合手段
の両方が、本発明の抗メソセリン抗体で使用され得る。
【０１４７】
エフェクター分子を抗体に結合させるための手順は、ＥＭの化学的構造に従っ
て変動する。ポリペプチドは、代表的に、種々の官能基（例えば、カルボン酸（
ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ2）、またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含
む；これらは、エフェクター分子の結合を生じさせるための、抗体における適切
な官能基との反応に利用可能である。
【０１４８】
あるいは、抗体は、さらなる反応性官能基に曝露されるか、または結合される
ように誘導体化される。誘導体化は、多数の任意のリンカー分子（例えば、Ｐｉ
ｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎ
ｏｉｓから入手可能なリンカー）の結合を包含し得る。
【０１４９】
「リンカー」は、本明細書中で使用される場合、抗体をエフェクター分子に連
結するために使用される分子である。リンカーは、抗体とエフェクター分子の両
方に対して共有結合を形成し得る。適切なリンカーは、当業者に周知であり、そ
してこれには、直鎖もしくは分枝の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、また
はペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。抗体およびエフェ
クター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側鎖を通して（例
えば、システインへのジスルフィド結合を通して）、構成要素のアミノ酸に連結
され得る。しかし、好ましい実施形態では、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素
アミノ基およびカルボキシル基に連結される。
【０１５０】
いくつかの状況では、免疫結合体がその標的部位に到達した時点で、抗体から
エフェクター分子を遊離させることが所望され得る。従って、これらの状況では
、免疫結合体は、標的部位の近傍で切断可能である結合を含む。抗体からエフェ
クター分子を放出するためのリンカーの切断は、免疫結合体が、標的細胞の内側
または標的部位の近傍のいずれかで供される酵素学的な活性または条件によって
刺激され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下で（例え
ば、腫瘍に関連した酵素または酸性ｐＨに曝露された場合に）切断可能なリンカ
ーが使用され得る。
【０１５１】
種々の放射線診断用化合物、放射線療法化合物、薬物、毒素、および他の薬剤
を抗体に結合させることに関して報告されている多数の方法に照らして、当業者
は、所定の薬剤を抗体または他のポリペプチドに結合させるために適切な方法を
決定し得る。
【０１５２】
（ＶＩＩ．薬学的組成物および投与）
本発明の抗体および／または免疫結合体組成物（すなわち、抗体Ｅ４と共に、
その親抗体の少なくとも５倍の抗原親和性を有する抗体に連結されたＰＥ）は、
非経口投与（例えば、静脈内投与、あるいは体腔または器官の内腔内への投与）
に特に有用である。例えば、卵巣悪性疾患は、腫瘍を取り囲んでいる組織への静
脈内投与または局所送達によって処置され得る。中皮腫を処置するためには、抗
メソセリン抗体を含む本発明の薬学的組成物は、胸膜腔または腹膜腔内に直接的
に投与され得る。
【０１５３】
投与のための組成物は、通常、薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、水
性キャリア）中に溶解された抗体および／または免疫結合体の溶液を含む。種々
の水性キャリア（例えば、緩衝化生理食塩水など）が使用され得る。これらの溶
液は滅菌され、そして一般的には、所望されない物質を含まない。これらの組成
物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、ほぼ生理的条件
に必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および
緩衝化剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。これらの処方物
における融合タンパク質の濃度は広範に変動し得、そして選択された特定の投与
様式および患者の必要性に従って、主に液量、粘性、体重などに基づいて選択さ
れる。
【０１５４】
従って、静脈内投与のための本発明の代表的な薬学的イムノトキシン組成物は
、１日あたり１患者あたり約０．１〜１０ｍｇである。特に、隔離された部位（
そして、循環系またはリンパ系ではない）（例えば、体腔内または器官の内腔内
）に薬物が投与される場合、１日あたり１患者あたり０．１から約１００ｍｇま
での投薬量が使用され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、
当業者に公知であるか、または明らかであり、そして、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ
ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ
（１９９５）のような刊行物において、より詳細に記載されている。
【０１５５】
本発明の組成物は、治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、
組成物は、疾患に罹患している患者に対して、その疾患およびその合併症を治癒
するか、または少なくとも部分的に抑制するに十分な量で投与される。これを達
成するために十分な量を、「治療的有効用量」と規定する。この用途のために有
効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の全身的状態に依存する。化合物の有
効量は、臨床医または他の有資格観察者によって観察されるような、症状の主観
的緩和または客観的に同定可能な改善のいずれかを与える量である。
【０１５６】
組成物の単回投与または複数回投与は、患者によって必要とされ、かつ耐容さ
れるような、投薬量および頻度に依存して投与される。いずれにしても、組成物
は、患者を有効に処置するために十分な量の本発明のタンパク質を提供するべき
である。好ましくは、投薬量は一度に投与されるが、治療的結果が達成されるか
、または副作用によって、治療の中断が正当化されるかのいずれかまで、周期的
に適用され得る。一般的に、用量は、患者に対して受容不可能な毒性を産生する
ことなく、疾患の症状または徴候を処置または改善するに十分である。
【０１５７】
本発明の免疫結合体組成物の徐放性非経口処方物は、インプラントとしてか、
油性注射剤、または粒子系として作製され得る。タンパク質送達系の広範な概説
については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＥＰＴＩＤＥ
Ｓ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＣＥＳＳＩＮ
Ｇ，ＡＮＤ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９
９５）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。粒子系としては、
ミクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア（
ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）、およびナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）が挙げ
られる。マイクロカプセルは、中心コアとして、治療用タンパク質を含む。ミク
ロスフェアでは、治療剤は、粒子全体にわたって分散される。約１μｍ未満の粒
子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルを、一般的に、それぞれ、ナノ粒
子、ナノスフェア、およびナノカプセルという。キャピラリーは、約５μｍの直
径を有し、その結果、ナノ粒子のみが静脈内に投与される。微小粒子は、代表的
に、直径約１００μｍであり、そして皮下的または筋内に投与される。例えば、
Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．、ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  Ｓ
ＹＳＴＥＭＳ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．
、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２１９〜３４２頁（１９９４）；ならびに、Ｔｉｃ
ｅおよびＴａｂｉｂｉ、ＴＲＥＡＴＩＳＥ  ＯＮ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＤＲ
ＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋ
ｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３１５−３３９頁（１９９２）（こ
れらの両方とも、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１５８】
ポリマーが、本発明の免疫結合体組成物のイオン制御された放出のために使用
され得る。制御された薬物送達における使用のための、種々の分解可能および分
解不可能ポリマーマトリクスが、当該分野において公知である（Ｌａｎｇｅｒ，
Ｒ．、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２（１９９３
））。例えば、ブロックコポリマーであるポロキサマー４０７（ｐｏｌａｘａｍ
ｅｒ  ４０７）は、低温では粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、
体温では、半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２および
ウレアーゼの処方物および持続型送達のために有効なビヒクルであることが示さ
れている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４（１
９９２）；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）
：５８−６５（１９９０））。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質
の徐放のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４（１９９４））。さらに別の局
面では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の徐放および薬物標的化のために使
用されている（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、ＬＩＰＯＳＯＭＥ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶ
ＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．
，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９３））。治療用タンパク質の制
御された送達のための多数のさらなる系が、公知である。例えば、米国特許第５
，０５５，３０３号、同第５，１８８，８３７号、同第４，２３５，８７１号、
同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３
５号、および同第５，０１９，３６９号、同第５，０５５，３０３号；同第５，
５１４，６７０号；同第５，４１３，７９７号；同第５，２６８，１６４号；同
第５，００４，６９７号；同第４，９０２，５０５号；同第５，５０６，２０６
号；同第５，２７１，９６１号；同第５，２５４，３４２号；ならびに同第５，
５３４，４９６号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）を参
照のこと。
【０１５９】
とりわけ本発明のイムノトキシンの種々の用途には、融合タンパク質の毒性作
用によって除去され得る、特定のヒト細胞によって引き起こされる種々の疾患状
態が含まれる。本発明のイムノトキシンについて１つの好ましい適用は、メソセ
リンを発現する悪性細胞の処置である。例示的な悪性細胞としては、卵巣癌、胃
癌、および扁平上皮癌、ならびに中皮腫が挙げられる。
【０１６０】
（ＶＩＩＩ．診断用キットおよびインビトロ用途）
別の実施形態では、本発明は、生物学的サンプルにおいてメソセリンまたはそ
の免疫反応性フラグメント（すなわち、集合的に「メソセリンタンパク質」）を
検出するためのキットを提供する。「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用
される場合、メソセリンを含む生物学的組織または流体のサンプルである。この
ようなサンプルとしては、生検からの組織、痰、羊水、血液、および血球（例え
ば、白血球）が挙げられるが、これらに限定されない。流体サンプルは、幾分興
味深いものであり得るが、一般的には、本発明においては好ましくない。なぜな
ら、検出可能な濃度のメソセリンが、このようなサンプル中で見出されることは
稀であるからである。生物学的サンプルはまた、組織の切片（例えば、組織学的
目的のために採取された凍結切片）を含む。生物学的サンプルは、代表的に、多
細胞真核生物（好ましくは、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、
モルモット、またはウサギ）、そしてより好ましくは霊長類（例えば、マカク、
チンパンジー、またはヒト）から得られる。
【０１６１】
キットは、代表的に、本発明の抗メソセリン抗体を備える。いくつかの実施形
態では、抗メソセリン抗体は、抗メソセリンＦｖフラグメント（例えば、ｓｃＦ
ｖフラグメント）である。キットは、Ｅ４抗体を備え得る。
【０１６２】
さらに、キットは、代表的に、本発明の抗体の使用手段（例えば、サンプル中
の中皮細胞の検出のため）を開示する、指示資料を備える。キットはまた、その
キットが設計された特定の適用を容易にするために、さらなる成分を備え得る。
従って、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素学的標識につい
て酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次標識（例
えば、ヒツジ抗マウス−ＨＲＰ、など）をさらに備え得る。キットは、特定の方
法を実施するために慣用的に使用される、緩衝液および他の試薬をさらに備え得
る。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【０１６３】
本発明の１つの実施形態では、診断用キットは、イムノアッセイを含む。上述
のように、本発明のイムノアッセイの詳細は、使用される特定の様式に応じて変
動し得るが、生物学的サンプル中でメソセリンを検出する方法は、一般的に、生
物学的サンプルを、免疫学的反応条件下でメソセリンに特異的に反応する抗体と
接触させる工程を包含する。抗体は、免疫学的反応条件下で、メソセリンへの結
合を可能にされ、そして結合した抗体の存在が、直接的または間接的に、検出さ
れる。
【０１６４】
本明細書中で教示される方法によって開発された抗体（そして特に、ＳＳ１、
Ｄ８、およびＣ１０と称される抗体）の親和性の増加に起因して、本明細書中に
提供される抗体は、特に、診断用薬剤として、そして生物学的サンプル中におい
てメソセリンの存在を検出するためのインビトロアッセイにおいて、有用である
。例えば、本明細書中に教示される方法によって作製された、抗体ＳＳ１、Ｄ８
、Ｃ１０および他の抗体は、サンプルが、メソセリンを発現する細胞を含むか否
かを決定するための免疫組織化学アッセイにおいて、免疫結合体の標的化部分と
して使用され得る。サンプルが、通常メソセリンを発現しないはずの患者の組織
から採取されたサンプルである場合、メソセリンの検出は、その患者が、メソセ
リン発現細胞の存在によって特徴付けられる癌を有すること、または、このよう
な癌の処置が未だ、癌を根絶するのに成功していないこと、のいずれかを示す。
抗体Ｅ４もまた、これらの目的のために使用され得る。
【０１６５】
本発明の別のセットの用途では、本発明の抗体によって標的化されるイムノト
キシンを使用して、培養物中の細胞集団から標的化細胞を一掃し得る。従って、
例えば、メソセリンを発現する癌を有する患者から培養された細胞は、標的化部
分としてＳＳ１  ｓｃＦｖ、Ｄ８  ｓｃＦｖ、またはＣ１０  ｓｃＦｖを使用す
るイムノトキシンと培養物とを接触させることによって、癌細胞を一掃され得る
。Ｅ４  ｓｃＦｖもまた、これらの目的のための標的化部分として使用され得る
。
【０１６６】
本発明を、理解の明確さの目的で、例示および実施例によって幾分詳細に記載
してきたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で
実施され得ることが明らかである。
【実施例】
【０１６７】
（ＩＸ．実施例）
（実施例１  ライブラリーの構築）
ＳＳ（ｓｃＦｖ）中の３２個のホットスポットに関して、１４個はＶＨ中に、
１８個はＶＬ中に配置した。本発明者らは、変異誘発を開始するためにＣＤＲ３
を選択した。なぜなら、ＣＤＲ３は、抗原との相互作用の主要な部位だからであ
る。本発明者らは、本発明者らの開始研究に関して、ＶＨ  ＣＤＲ３に対してＶ
Ｌ  ＣＤＲ３を選択した。なぜなら、ＶＬ  ＣＤＲ３は、より少ない組換え事象
を受け、故に生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）より近いからである。ＶＬのＣＤＲ
３の場合、２つのＡ／Ｇ−Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ型のホットスポットおよび１つの
ＡＧＴセリンコドンが存在する。本発明者らは、ＶＬ  ＣＤＲ３においてテトラ
ヌクレオチドホットスポット上で集中することによって本発明者らの実験を開始
した。本発明者らの研究において、本発明者らは、そのようにしない特別の理由
がない限り、テトラヌクレオチドモチーフの全体または部分を形成するコドンの
全てのヌクレオチドを無作為化した（以下に議論する）。
【０１６８】
最初のファージライブラリー（Ｌｉｂ  ８９／９３／９４）は、２つのテトラ
ヌクレオチドホットスポット（１つはＶＬ中の残基８９および９０をコードし、
他方は残基９３および９４をコードする）の一部であるコドンの無作為化を含ん
だ。Ｑ９０は、サブグループＶＩ（ＳＳ  ＶＬが属する）中で非常に高く保存さ
れている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＷＥＩＲ’Ｓ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰ
ＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  Ｉ．ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴ
ＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第５版、Ｈｅｒｚ
ｅｎｂｅｒｇら、編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、第６章、６．１−６．２１頁（１９９６））ので、本発明
者らは、これを変化させないままで、残基８９、９３および９４を無作為化する
ように選択した。３つのアミノ酸が無作為化されるライブラリーは、８×１０3
個の異なるタンパク質改変体を有するべきであり、そして全ての異なるヌクレオ
チドの組み合わせに関して（ＮＮＳオリゴを用いる）、完全なレパートリーは３
×１０4個の異なるクローンを含む。本発明者らの作製したライブラリーは、６
×１０4個のクローンを含み、そして実質的に全ての可能性を包含すると予想さ
れる。
【０１６９】
Ｌｉｂ  ８９／９３／９４をパニングし、そして分析した後、本発明者らは、
Ｑ８９は全ての結合剤において保存されるが、置換が９３位および９４位におい
て許容されたことを見出した。この情報を用いて、本発明者らは、第２のライブ
ラリーのＬｉｂ  ９２−９４（この中で、Ｓ９２に対するＡＧＴコドン（別の型
のホットスポット）が、Ｇ９３およびＹ９４に対するコドンと共に変異された）
を構築した。このライブラリーの大きさは、１×１０5であった。
【０１７０】
本発明者らの実験のコントロールとして、本発明者らは、２つのライブラリー
（Ｌｉｂ  ８９−９１およびＬｉｂ  ９５−９７）を作製した。Ｌｉｂ  ８９−
９１を作製してホットスポット内での保存残基の無作為化の効果を試験し、そし
てＬｉｂ  ９５−９７を作製してホットスポット外での残基の無作為化の効果を
研究した。これらのライブラリーにおいて、３つのコドンを無作為化し、他の２
つのライブラリー（この中で、合理的に選択されたホットスポット中に位置する
３つのコドンが無作為化された）との比較を可能にした。これらの各々のライブ
ラリーの大きさはまた、１×１０5であった。
【０１７１】
（実施例２  ライブラリーのパニングおよび結合剤の濃縮）
ライブラリーを固定化された組換えメソセリンにパニングした。パニング実験
の結果は、表３に示す。２〜６×１０11のファージの入力を用いると、バックグ
ラウンドが通常５〜６×１０4辺りであることを、本発明者らは理解する。Ｌｉ
ｂ  ８９／９３／９４およびＬｉｂ  ９２−９４に関して、本発明者らは、２×
１０5のファージを最初のパニングから得た。これは、メソセリンに結合するフ
ァージの約３倍の濃縮を示す。第２回目において、それぞれ、１５０および１３
０倍である大きな濃縮の増加が存在した。これらのライブラリーに対する第３回
目のパニング後の濃縮は、約５倍であった。全体の濃縮は約２０００であった。
対照的に、コントロールライブラリーに関して、第１回目のパニング後に濃縮は
存在しなかったが、その後に、漸進的な濃縮における増加が存在した（第２回目
のパニング後に１０倍、そして第３回目の後に２００倍）。コントロールライブ
ラリーの両方に関する全体の濃縮はまた、約２０００倍であった。全てのライブ
ラリーに対する全体の濃縮は類似していたが、濃縮のパターンは、著しく異なっ
た。２つのライブラリー（Ｌｉｂ  ８９／９３／９４およびＬｉｂ  ９２−９４
の初期でありかつ迅速な濃縮は、両方が多数の結合剤を含んでいたことを示す。
対照的に、コントロールライブラリー（Ｌｉｂ  ８９−９１およびＬｉｂ  ９５
−９７）のゆっくりとした漸進的な濃縮は、これらがより少ない結合剤（これは
、連続回のパニングの間にゆっくりと濃縮される）を含んでいたことを示唆する
。
【０１７２】
（表３）
組換えメソセリン上のパニングによるライブラリーからのメソセリン結合ファ
ージの濃縮。*２〜６×１０11の入力ファージ数に対して５〜６×１０4であるバ
ックグラウンドレベルのファージ結合を超える濃縮に関する。
【０１７３】
【表２】
2014050409.tif 000003
（実施例３  メソセリン結合に対するクローンのスクリーニング）
次に、本発明者らは、異なるライブラリーの各々から選択されたファージの結
合特性を調べた。各ライブラリーに対して、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって
、第２回目および第３回目のパニングから２３個のクローンをスクリーニングし
た。この実験の結果は、図２に示す。
【０１７４】
図２Ｂは、Ｌｉｂ  ８９／９３／９４のパニング後に選択されたクローンのメ
ソセリン結合活性を示す。図から明らかなように、全て４６個のクローンは、メ
ソセリンに結合し、そして４つの型に分類され得る：（ｉ）２７個のクローンは
、非常に高いＥＬＩＳＡシグナルを有した（２．３〜２．７）；（ｉｉ）高いＥ
ＬＩＳＡシグナルを有する１２個のクローン（１．７５〜２．２）；（ｉｉｉ）
６個のクローンは、親のＳＳ（ｓｃＦｖ）ファージ（黒四角によって示される）
に匹敵するＥＬＩＳＡシグナルを有した、そして（ｉｖ）１個のクローンは、野
生型の親のファージよりも低いＥＬＩＳＡシグナルを有した。
【０１７５】
図２Ｃは、Ｌｉｂ  ８９−９１由来のファージクローンのメソセリン結合活性
を示す。試験された４６個のクローンのうち、３９個がメソセリンに結合した。
いずれも、親のクローンよりも大きいＥＬＩＳＡシグナルを有さなかった。これ
らの３９個のクローンのうちの２８個は、親のクローンと類似したＥＬＩＳＡシ
グナル（１．２５〜１．５）を有した。残りの１１個のクローンは、親の型より
も低いＥＬＩＳＡシグナルを有した。
【０１７６】
図２Ｄは、Ｌｉｂ  ９２−９４由来の選択されたファージクローンのメソセリ
ン結合活性を示す。Ｌｉｂ  ８９／９３／９４ライブラリー由来の結合活性と同
様に、試験された全ての４６個のクローンは、メソセリンに結合し、そして、以
下の４群に分類され得る。（ｉ）３１個は、非常に高いＥＬＩＳＡシグナル（２
．３−２．９）を与えた；（ｉｉ）８個のクローンは、高いＥＬＩＳＡシグナル
（１．８−２．２）を有した；（ｉｉｉ）５個のクローンは、親の型と類似した
ＥＬＩＳＡシグナルを与えた；そして（ｉｖ）２個のクローンは、親の型のシグ
ナルよりも低いＥＬＩＳＡシグナルを有した。
【０１７７】
図２Ｅは、Ｌｉｂ  ９５−９７のパニング後に選択されたクローンのメソセリ
ン結合活性を示す。試験された全ての４６個のクローンは、メソセリンに結合す
ることが見出され、そして、ＥＬＩＳＡシグナルに基づく３つの群に整理するこ
とができた。（ｉ）２２個は、親の型よりもわずかに良好なＥＬＩＳＡシグナル
を与えた；（ｉｉ）２０個のクローンは、野生型に類似したＥＬＩＳＡシグナル
を与えた；そして（ｉｉｉ）４個のクローンは、親の型よりも下のＥＬＩＳＡシ
グナルを有した。
【０１７８】
各ライブラリーからの１２個のファージプレップの滴定をし、そして、ＣＦＵ
（コロニー形成単位）によって決定されるようなそれらの数は、２倍未満まで変
化することが見出され、これは、ＥＬＩＳＡシグナルにおける差異が、入力ファ
ージの数における差異に起因しないことを示す（データには示さない）。また、
ＢＳＡに対する結合は、任意のクローンからのファージ粒子については、検出さ
れなかった（データには示さない）。これらの結果は：（ｉ）用いたスクリーニ
ングアッセイは、メソセリンに対する良好な結合を有するファージを作製するク
ローンの同定に関して信頼できたこと、および（ｉｉ）合理的に選択されたホッ
トスポットに対して無作為変異を標的化することは、ＣＤＲの全てのコドンを無
作為に変異することよりもより簡単に、良好な結合剤の単離を導く、ということ
を示唆する。
【０１７９】
（実施例４  クローンの多様性）
２４個のＥＬＩＳＡ陽性クローンを、各ライブラリーから配列決定した。この
結果は図３に示す。
【０１８０】
ライブラリー、Ｌｉｂ  ８９／９３／９４から、４個の異なる配列を得た。全
てのクローンは、位置８９において親の残基（グルタミン）が保存されていた。
位置９３および９４における残基は変化していた。最も豊富なクローンは、Ｇ９
３Ｋ−Ｙ９４Ｈ変異を有した。これはまた、最も高いＥＬＩＳＡシグナルを有し
たクローンであり、ＳＳ１と命名した。
【０１８１】
Ｌｉｂ  ８９−９１から、配列決定された全ての２４個のクローンは、野生型
ＳＳ（ｓｓＦｖ）に類似したＥＬＩＳＡシグナルを有し、そして２４個は全て、
野生型残基を有した。
【０１８２】
Ｌｉｂ  ９２−９４から、７個の異なるアミノ酸配列が得られた（図３）。最
も豊富なクローンは、Ｄ８（Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ）およびＣ１０（Ｓ
９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ）であった。このライブラリーから、本発明者らは
、Ｌｉｂ  ８９／９３／９４由来のＳＳ１およびＤ７に対して同一のアミノ酸配
列を有する２個のクローン（Ｅ９およびＥ２）を得た。Ｄ８、Ｃ１０およびＳＳ
１は、最も高いＥＬＩＳＡシグナルを有したクローンであった。
【０１８３】
ライブラリーＬｉｂ  ９５−９７から、ＳＳ（ｓｃＦｖ）と類似またはそれよ
り大きいＥＬＩＳＡシグナルを有する２４個のクローンを配列決定した。１７個
のクローンは、Ｌ９６Ｔ変異を有した。他の７個のクローンは、野生型のアミノ
酸を有した。本発明者らは、Ｌ９６Ｔ変異体をＥ４（ｓｃＦｖ）と呼ぶ。
【０１８４】
全ての場合において、全体のｓｃＦｖコード領域を配列決定し、他の変異が生
じていないことを確認した。タンパク質配列に関して、１０個の異なる型の変異
体を得た。これらの多くは、いくつかの異なるヌクレオチド配列によってコード
された。これら１０個のうちの９個の変異体は、変異が合理的に選択されたホッ
トスポットに対して標的化されたライブラリー（Ｌｉｂ  ８９／９３／９４およ
びＬｉｂ  ９２−９４）から得た。従って、これらのライブラリー由来の結合活
性を有するいくつかのクローンの存在は、これらのライブラリーに見出される迅
速な濃縮パターンと一致する。対照的に、Ｌｉｂ  ８９−９１（これは、ホット
スポット中に保存された残基を有する）は、親のクローン以外にいずれの結合剤
も生じることができず、そして、Ｌｉｂ  ９５−９７（この中において、変異は
、非ホットスポット領域に対して標的化される）は、単一の改変体を生じた。こ
れらのライブラリーにおける結合剤の希少性はまた、ゆっくりとでありかつ漸進
的な濃縮パターンと一致する。
【０１８５】
（実施例５  イムノトキシンの構築および精製）
イムノトキシンにおいて、癌細胞表面抗原に対するｓｃＦｖを、毒素（例えば
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの短縮変異体）とインフレームで融合する。
イムノトキシンの抗原結合特性は、ｓｃＦｖによって決定したが、毒素部分は、
ｓｃＦｖが結合する細胞を殺傷するエフェクター機能を提供する。従って、変異
体Ｆｖｓを含むイムノトキシンを作製しそして精製する事によって、本発明者ら
は、ｓｃＦｖの抗原結合運動性を決定し得、そしてまた細胞培養におけるその細
胞傷害性活性を研究し得る。異なるクローンの精製されたファージ調製物を用い
たより詳細なＥＬＩＳＡに基づいて（結果は示さない）、本発明者らは、４個の
ｓｃＦｖを選択し、イムノトキシンを構築して精製した。これらの４個の間にお
いて、ＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０は、合理的に選択されたホットスポットが無作
為化されるライブラリーから得られた最良のクローンを示し、そして、Ｅ４は、
コントロールライブラリーから得られた親のＳＳ（ｓｃＦｖ）よりも良好な結合
を有する唯一のクローンを示す。イムノトキシンは、９５％の均質性を超えて精
製され、そしてＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーにおけるモノマーとして溶出
した（結果は示さず）。これらの精製されたイムノトキシンを使用して、ｓｃＦ
ｖの親和性を決定し、そしてまた、これらの細胞殺傷活性を研究した。
【０１８６】
（実施例６  イムノトキシンの結合特徴）
ファージライブラリーをパニングすることによって選択されたｓｃＦｖの結合
特徴は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）研究に対して対応する精製され
たイムノトキシンを用いることによって決定した。図４は、メソセリンに対する
イムノトキシンの結合の代表的なセンサーグラムを示し、そしてｋｏｎ、ｋｏｆ
ｆおよびＫＤに関する値を列挙する。全ての変異体（ＳＳ１、Ｄ８、Ｃ１０およ
びＥ４）が、親のＳＳ（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも、メソセリンに対する良好
な結合を有することは、明らかである。ＳＳ１およびＣ１０のオンの速度（ｏｎ
ｒａｔｅ）は、約１．５倍高いが、Ｄ８およびＥ４のオンの速度は、親のＳＳ
（ｓｃＦｖ）とほぼ同じであった。ＳＳ１、Ｄ８、Ｃ１０およびＥ４のオフの速
度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）は、親のＳＳ（ｓｃＦｖ）に比較して、それぞれ、１０
、３７、３５および３．８倍減少した。他の者が報告したことと類似して、本研
究に観察された変異体の増加した結合は、主にそれらのオフの速度における減少
に起因する（Ｓｃｈｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３（１
９９６）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４−２００
４（１９９５）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３
（１９９５））。これらのデータによって、合理的に選択されたホットスポット
が変異されるライブラリーから誘導されるＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０が、それぞ
れ、親のＦｖを超えて、１５、３７および５５倍の親和性における増加を示し、
一方、Ｅ４（これは、コントロールライブラリーから単離された唯一の変異体で
ある）は、親のＳＳ（ｓｃＦｖ）を超えて、親和性においてより緩やかな３．７
倍の増加を示した。
【０１８７】
（実施例７  イムノトキシンの細胞傷害性活性）
高い親和性のｓｃＦｖを癌治療における標的因子としての有用性を評価するた
めに、本発明者らは、異なるｓｃＦｖを用いて作製されたイムノトキシンの細胞
傷害性を決定した。表４は、種々のイムノトキシンの抗原陽性Ａ１８４７細胞株
および抗原陰性ＨＵＴ  １０２細胞株に対する細胞傷害性活性を示す。Ａ１８４
７細胞において、ＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０のｓｃＦｖ−ＰＥ３８は、野生型Ｓ
Ｓ（ｓｃＦｖ）イムノトキシンよりも１０倍を超えてより活性であったが、Ｅ４
（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８は、たった約２倍の活性であった。ＨＵＴ  １０２（抗
原陰性細胞）に対する細胞傷害性は、明らかでなかった。従って、変異を合理的
に選択されたホットスポットに標的化することによって得られた親和性における
増加は、細胞傷害性における大きな増加を引き起こす。しかし、細胞傷害性にお
けるこの増加は、親和性における増加と比例的に関連するわけではない。例えば
、ＳＳｌ（Ｆｖ）−ＰＥ３８およびＣ１０（Ｆｖ）−ＰＥ３８のＩＣ50は、非常
に類似していたが、一方これらの親和性は約３倍異なる（ＩＣ50は、タンパク質
合成を５０％阻害するのに必要であるイムノキシンの量である）。この差異は、
親和性はＥ．ｃｏｌｉ中で作製された組換えタンパク質を用いて測定され、一方
、細胞傷害性は抗原を発現する卵巣癌細胞株上で測定されると言う事実に起因し
得る。
【０１８８】
この戦略は、本発明者らの実験室において、上皮増殖因子レセプターの変異体
形態に結合する他の抗体に対して適用された。本研究においてまた、より高い親
和性を有する変異体を単離することが可能である（Ｂｅｅｒｓ，Ｒ．，Ｃｈｏｗ
ｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．調製における原稿）。本発明者
らはまた、ＳＳのＣＤＲ３重鎖を変異させた。これらの変異体のＥＬＩＳＡ研究
によって、親のＳＳ  ｓｃＦｖの親和性よりも高いメソセリンに対する親和性が
示された。これらの結果は、現在使用されている方法によって作製されるライブ
ラリーよりも、変異を合理的に選択されたホットスポットに対して標的化するこ
とによって作製された小さなライブライリーから良好な結合ファージ選択するこ
とがより簡単であるはずであるということを示す。
【０１８９】
本研究において、本発明者らは、無作為化に対して４つの位置を選択し（３つ
のホットスポットの内側であり１つは外側である）、そして改変された変異体は
、有用であることが見出された。本発明者らのアプローチによって得られた改善
は、文献（Ｓｃｈｉｅｒ  ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３（１
９９６）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４−２００
４（１９９５）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３
（１９９５）；Ｐｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１７６９−２
１７７６（１９９８）；Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ  ９５：６０３７−６０４２（１９９８））に記載される大きいファージライ
ブラリーから得られる改善に匹敵する。本発明者らは、天然の体細胞過剰変異（
ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）プロセスを模倣することによっ
て、免疫化ライブラリーまたは非免疫化ライブラリーのいずれか由来の抗原に対
する増加した親和性を有する組換え抗体を容易に得ることができることを示唆す
る。
【０１９０】
（表４）
ヒト卵巣線癌細胞株Ａ１８４７およびＴ細胞白血病株ＨＵＴ１０２上での、親
のｓｃＦｖおよび変異ｓｃＦｖを用いて作製されたイムノトキシンの細胞傷害性
。比較のために、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって得られたＫD値および野生型イム
ノトキシンに対する変異体の親和性における相対的増加を含めた。
【０１９１】
【表３】
2014050409.tif 000004
（実施例８  ライブラリーの構築）
ファージミドｐＰＳＣ  ７−１は、メソセリン結合ＳＳ（ｓｃＦｖ）をコード
するファージ抗体ディスプレイベクターである（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｌ９９８
）。ＳＳ（ｓｃＦｖ）のヌクレオチド配列の分析によって、３２個のホットスポ
ットを明らかにした。これらの３２個のホットスポットに関して、標的化変異に
対して３個選択した。これらは、ＣＤＲ３のＶＬコード残基８９、９０、９２、
９３および９４中に位置した。ｐＰＳＣ  ７−１の一本鎖のウラシルを含むＤＮ
Ａは、以前に記載されたように調製した（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２８１：９１７−９２８（１９９８））。終止コドンおよび診断のＨ
ｐａｌ制限部位を、Ｋｕｎｋｅｌ’ｓ変異誘発によってＶＬのＣＤＲ３に導入し
（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  
８２：４８８−４９２（１９８５））、ファージミドｐＰＳＣ  ７−１−９４を
生成した。終止コドンは、ライブラリーの野生型配列の提示を防ぐように導入し
た。なぜなら、この変異誘発アプローチは、１０〜１２％のバックグラウンドを
与えるからである。ウラシルを含むｐＰＳＣ７−１−９４のｓｓＤＮＡは、変性
オリゴを用いた２つの実験ライブラリーおよびコントロールライブラリーを構築
するためのテンプレートとして使用した。オリゴＳＳ  ＶＬ  ８９／９３／９４
【０１９２】
【化１】
2014050409.tif 000005
ライブラリーＬｉｂ  ８９／９３／９４を作製するために使用した。このオリゴ
は、ＶＬのコドン８９、９３および９４を、全てが２０個のアミノ酸が異なるＳ
Ｓ（ｓｃＦｖ）中の無作為化する。以下に記載される他の全てのライブラリーと
同様に、このオリゴは、終止コドンを位置９４においてチロシンのオリゴと置換
され、オケアー（ｏｃｈｅｒ）コドンおよびオパールコドンを作製しない。
【０１９３】
第２のライブラリーのＬｉｂ  ９２−９４は、オリゴＳＳ  ＶＬ  Ｍｕｔ  ９
２−９４
【０１９４】
【化２】
2014050409.tif 000006
（これは、残基９２−９４を無作為化する）を用いて作製した。残基９２−９４
は、並んで配置される２つの異なるホットスポットによってコードされる。第３
および第４のライブラリーをコントロールとして作製した。第３のライブラリー
のＬｉｂ  ８９−９１は、オリゴＳＳ  ＶＬ  Ｍｕｔ  ８９−９１
【０１９５】
【化３】
2014050409.tif 000007
（これは、残基８９−９１を無作為化する）を用いて作製した。残基９０は、ホ
ットスポット中で保存された残基である。残基９１は、ホットスポットの外側に
あたる。第４のライブラリーであるＬｉｂ  ９５−９７は、オリゴＳＳ  ＶＬ  
Ｍｕｔ  ９５−９７
【０１９６】
【化４】
2014050409.tif 000008
を用いて作製した。これは、残基９５−９７（これらの全ては、ホットスポット
の外側にあたる）を無作為化する。
【０１９７】
（実施例９  ライブラリーのパニングおよび選択されたファージクローンの分
析）
ライブラリーのパニングは、以前に記載されたように行った（Ｃｈｏｗｄｈｕ
ｒｙ  １９９８）。各ライブラリーからの、第２回目のパニング後の２３個のク
ローンおよび第３回目のパニング後の２３個のクローンを、以下のようにメソセ
リン結合に対してＥＬＩＳＡによって分析した。単一のコロニーを、９６ウェル
のマイクロタイタープレートに存在する１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび
２％のグルコースを含む１２５μｌの２ＸＹＴ培地に接種した。このプレートを
、加湿されたインキュベーター中、３７℃／２００ｒｐｍで３．５時間インキュ
ベートした。これらのプレート（マスタープレート）の各ウェルからの２５μｌ
の培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２％グルコースおよび約４×１
０9ｐｆｕ／ｍｌのＭ１３ＫＯ７を有する１２５μｌの２ＸＹＴ培地を含む別の
マイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。次いで、このプレート（
ファージプレート）を、上記と同じ条件下で２時間インキュベートした。次いで
、ファージプレートを、２０００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離した。各ウェル
からの上清を、逆位でプレートを穏やかに振盪することによって除去した。各ウ
ェル中の細胞ペレットを、１００μｌ／ｍｌのアンピシリン、および５０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含む２００μｌの２ＸＹＴ培地中に再懸濁した。次いで、
プレートを、上記のように一晩インキュベートした。１４〜１６時間後、ファー
ジプレートを氷上で冷却し、次いで３０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し
た。この上清をファージＥＬＩＳＡおよびファージ滴定に使用した。
【０１９８】
（実施例１０  イムノトキシンの発現および精製のためのプラスミドの構築）
ファージミドのｐＰＳＣ  ７−１−１、７−１−２、７−１−３および７−１
−４は、それぞれ、ＶＬ中の以下の変異を有するＳＳ（ｓｃＦｖ）をコードする
：Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−
Ｙ９４ＨおよびＬ９６Ｔ。これらのファージミドベクター由来のｓｃＦｖは、プ
ライマー対のＮｅｗ  Ｇ２  Ｎｄｅ  ＩおよびＮｅｗ  Ｇ２  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ
を用いてＰＣＲ増幅した（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙｌ９９８）。精製後、ＰＣＲ産物
を以前に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化した（Ｂｒｉ
ｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６
１６−８６２０（１９９１））。生じたプラスミドのｐＰＳＣ  ７−２−１、ｐ
ＰＳＣ  ７−２−２、ｐＰＳＣ  ７−２−３およびｐＰＳＣ  ７−２−４は、ド
メインＩＩおよびドメインＩＩＩを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素（ＰＥ
）の３８ｋＤａフラグメントとインフレームで融合されたｓｃＦｖを有した。組
換えタンパク質は、以前に記載されるように封入体から生成した（Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６−
８６２０（１９９１））。
【０１９９】
（実施例１１  表面プラズモン共鳴アッセイ）
ｓｃＦｖの親和性は、精製されたイムノトキシンのメソセリンに対する結合運
動性を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）技術によって研究することによ
って決定した。別々の実験において、異なる量の組換えメソセリン（２００〜１
０００ＲＵ）をＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ、ＣＭ５上に固定化した。次いで
、各々のイムノトキシンを３８０ｎＭの濃度で、固定化されたメソセリンの上を
通過させた。ｋonを（ｌｎ（ｄＲ／ｄｔ）／ｔ対濃度のプロット（ここで、Ｒは
応答であり、そしてｔは時間である）から決定した。ｋoffは、センサーグラム
（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）の解離期の最初の１〜２分間に算出した。これらの会
合および解離の速度は、１０μｌ／分の連続した流速下で測定した。ＫＤは、ｋ
offをｋonで割って算出した。
【０２００】
（実施例１２  細胞傷害性アッセイ）
イムノトキシンの細胞傷害性活性は、以前に記載されたように（Ｃｈａｕｄｈ
ａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４−３９７（１９８９））、メソセリン
陽性ヒト卵巣癌腫株Ａ１８４７およびメソセリン陰性Ｔ細胞白血病株ＨＵＴ  １
０２ににおけるタンパク質合成の阻害によって決定した。ＩＣ50は、タンパク質
合成を５０％阻害するのに必要なイムノトキシンの量である。
【０２０１】
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許は、本明細書中において、あ
たかも各個々の刊行物および特許が詳細かつ個々に本明細書中において参考とし
て援用されて示されるのと同じ程度に、本明細書中へ参考として援用される。
【図１】
2014050409.tif 000009
【図２】
2014050409.tif 000010
【図３】
2014050409.tif 000011
【図４】
2014050409.tif 000012
【配列表】
2014050409000001.app
【外国語明細書】
2014050409000001.pdf