(57)【要約】【課題】  ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止することができる、試験片を含むキットを提供すること。【解決手段】  本発明のターゲット遺伝子を検出するためのキットは、試験片、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を含み、該試験片には、該ターゲット遺伝子とＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度でハイブリダイズ可能な少なくとも第１検出用プローブおよび第２検出用プローブが固定化されて、かつＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度で該ターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とするものであり、該第１のスタンダード遺伝子は、所定の第１部分を含むオリゴヌクレオチドであり、該第２のスタンダード遺伝子は、と所定の第２部分を含むオリゴヌクレオチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット遺伝子を検出するためのキットであって、
該キットは、試験片、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を含み、
該試験片には、該ターゲット遺伝子とＴｍａｘ℃以下の温度でハイブリダイズ可能な少なくとも第１検出用プローブおよび第２検出用プローブが固定化され、かつＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度で該ターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とするものであり、
該第１のスタンダード遺伝子が、第１部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、
Ｔｍａｘ℃よりも低い温度において、該第１のスタンダード遺伝子の該第１部分が該第１検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、該第１のスタンダード遺伝子の該第１部分が該第１検出用プローブとハイブリダイズせず、
該第２のスタンダード遺伝子が、第２部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、該第２のスタンダード遺伝子の該第２部分が該第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃以上の温度において、該第２のスタンダード遺伝子の該第２部分が該第２検出用プローブとハイブリダイズしない、
キット。
【請求項２】
前記第１のスタンダード遺伝子および前記第２のスタンダード遺伝子が、前記第１のスタンダード遺伝子の前記第１部分と前記第２のスタンダード遺伝子の前記第２部分とが連続した１つのオリゴヌクレオチドを構成する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１のスタンダード遺伝子の前記第１部分および前記第２のスタンダード遺伝子の前記第２部分のヌクレオチド長が、それぞれ１０ヌクレオチド長から３０ヌクレオチド長である、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
前記第１のスタンダード遺伝子の前記第１部分が、前記第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列であり、
前記第２のスタンダード遺伝子の前記第２部分が、前記第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列であるが、ほぼ中央の位置のみ１つのミスマッチ塩基が導入された配列である、請求項１から３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
ハイブリダイズ温度の判定方法であって：
ターゲット遺伝子とＴｍａｘ℃以下の温度でハイブリダイズ可能な少なくとも第１検出用プローブおよび第２検出用プローブが固定化され、かつＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度で該ターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とする試験片に、少なくとも第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を付与する工程；ならびに
該試験片から該第１検出用プローブと該第１のスタンダード遺伝子および該第２検出用プローブと該第２のスタンダード遺伝子とのハイブリダイズの状態を確認する工程；を含み、
ここで、
該第１のスタンダード遺伝子が、第１部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍａｘ℃よりも低い温度において、該第１のスタンダード遺伝子の該第１部分が該第１検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、該第１のスタンダード遺伝子の該第１部分が該第１検出用プローブとハイブリダイズせず、
該第２のスタンダード遺伝子が、第２部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、該第２のスタンダード遺伝子の該第２部分が該第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃以上の温度において、該第２のスタンダード遺伝子の該第２部分が該第２検出用プローブとハイブリダイズせず、
該試験片から該第１検出用プローブと該第１のスタンダード遺伝子および該第２検出用プローブと該第２のスタンダード遺伝子とのハイブリダイズの状態を確認する工程が、
（ｉ）第１の検出用プローブに第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズし、かつ第２の検出用プローブに第２のスタンダード遺伝子がハイブリダイズした場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が低すぎると判断し、
（ｉｉ）第１の検出用プローブに第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズするが、第２の検出用プローブに第２のスタンダード遺伝子はハイブリダイズしない場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が適正であると判断し、
（ｉｉｉ）第１の検出用プローブに第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズせず、かつ第２の検出用プローブに第２のスタンダード遺伝子もハイブリダイズしない場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が高すぎると判断する、
方法。
【請求項６】
前記第１のスタンダード遺伝子および前記第２のスタンダード遺伝子が、前記第１のスタンダード遺伝子の前記第１部分と前記第２のスタンダード遺伝子の前記第２部分とが連続した１つのオリゴヌクレオチドを構成する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験片を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片（特許文献１および２）、結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片（特許文献３および４）、結核菌および非結核性抗酸菌を検出するための試験片（特許文献５）などが報告されている。これらの試験片は、いずれもターゲット遺伝子とのハイブリダイズの有無を検出することによって、薬剤感受性などを迅速・簡便に判定するための手段であるが、試験環境におけるハイブリダイズ温度が適正でない場合、誤った判定に導く場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４２０７５号公報
【特許文献２】特開２００８−１４２０７６号公報
【特許文献３】特開２０１１−８７４６５号公報
【特許文献４】特開２００６−１８０７４６号公報
【特許文献５】特開２００９−１８９２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止することができる試験片を含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、所定の第１部分を含む第１のスタンダード遺伝子および第２部分を含む第２のスタンダード遺伝子を用いることによって、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明のターゲット遺伝子を検出するためのキットは、試験片、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を含み、該試験片には、該ターゲット遺伝子とＴｍａｘ℃以下の温度でハイブリダイズ可能な少なくとも第１検出用プローブおよび第２検出用プローブが固定化され、かつＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度で該ターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とするものであり、上記第１のスタンダード遺伝子が、第１部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍａｘ℃よりも低い温度において、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分が上記第１検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分が上記第１検出用プローブとハイブリダイズせず、上記第２のスタンダード遺伝子が、第２部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分が上記第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃以上の温度において、上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分が上記第２検出用プローブとハイブリダイズしない。
【０００７】
１つの実施態様では、上記第１のスタンダード遺伝子および上記第２のスタンダード遺伝子は、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分と上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分とが連続した１つのオリゴヌクレオチド（以下、「連結スタンダード遺伝子」と称する）を構成する。
【０００８】
１つの実施態様では、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分および上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分は、それぞれ１０ヌクレオチド長から３０ヌクレオチド長である。
【０００９】
１つの実施態様では、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分は、上記第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列であり、上標第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分は、上記第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列であるが、ほぼ中央の位置のみ１つのミスマッチ塩基が導入された配列である。
【００１０】
本発明はまた、ハイブリダイズ温度の判定方法を提供し、該判定方法は、ターゲット遺伝子とＴｍａｘ℃以下の温度でハイブリダイズ可能な少なくとも第１検出用プローブおよび第２検出用プローブが固定化され、かつＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度で該ターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とするものである試験片に、少なくとも第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を付与する工程、ならびに上記試験片から上記第１検出用プローブと上記第１のスタンダード遺伝子および上記第２検出用プローブと上記第２のスタンダード遺伝子とのハイブリダイズの状態を確認する工程を含み、ここで、上記第１のスタンダード遺伝子が、第１部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍａｘ℃よりも低い温度において、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分が上記第１検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分が上記第１検出用プローブとハイブリダイズせず、上記第２のスタンダード遺伝子が、第２部分を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであって、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分が上記第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃以上の温度において、上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分が上記第２検出用プローブとハイブリダイズせず、上記試験片から上記第１検出用プローブと上記第１のスタンダード遺伝子および上記第２検出用プローブと上記第２のスタンダード遺伝子とのハイブリダイズの状態を確認する工程が、（ｉ）上記第１の検出用プローブに上記第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズし、かつ上記第２の検出用プローブに上記第２のスタンダード遺伝子がハイブリダイズした場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が低すぎると判断し、（ｉｉ）上記第１の検出用プローブに上記第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズするが、上記第２の検出用プローブに上記第２のスタンダード遺伝子はハイブリダイズしない場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が適正であると判断し、（ｉｉｉ）上記第１の検出用プローブに上記第１のスタンダード遺伝子がハイブリダイズせず、かつ上記第２の検出用プローブに上記第２のスタンダード遺伝子もハイブリダイズしない場合、試験環境におけるハイブリダイズ温度が高すぎると判断する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記判定方法において、上記第１のスタンダード遺伝子および上記第２のスタンダード遺伝子は、上記第１のスタンダード遺伝子の上記第１部分と上記第２のスタンダード遺伝子の上記第２部分とが連続した１つのオリゴヌクレオチド（連結スタンダード遺伝子）を構成する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止するためのターゲット遺伝子検出用試験片を含むキット、および前記キットを用いた、ハイブリダイズ温度の条件をあらかじめ決定するための方法を提供することができる。本発明のキットは、結核菌をはじめとする病原菌の検出や、それらの菌の薬剤に対する感受性や耐性の確認において、より簡便でより正確な判定を可能にする。特に、東南アジアなど厳しい環境下において技術的に未熟な医療従事者によっても簡単に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のキットを構成する試験片の一例を説明するための当該試験片の模式図である。
【図２】本発明を構成する、ターゲット遺伝子とハイブリダイズ可能な検出用プローブが固定化された試験片から２つの検出用プローブを選択する際の当該試験片の一例を模式的に表す図である。
【図３】本発明を構成する、連結スタンダード遺伝子の作製手順の一例を模式的に表すための図であって、（ａ１）は、選択された２つの検出用プローブの第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列からなる第１部分および第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基が導入された配列からなる第２部分をそれぞれ調製した状態を示すための図であり、（ｂ１）は、当該調製された連結スタンダード遺伝子を作製した状態を説明するための図である。
【図４】本発明を構成する、連結スタンダード遺伝子の作製手順の一例を模式的に表すための図であって、第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列（第１部分）と、第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基が導入された配列（第２部分）とが連続した配列からなる１つのオリゴヌクレオチドを調製して連結スタンダード遺伝子を作製した状態を説明するための図である。
【図５】本発明のキットを用いて、ハイブリダイズに適した温度の判定を行う際の試験片の発色状態の一例を説明するための模式図であって、  （ａ）は、第１検出用プローブおよび第２検出用プローブに連結スタンダード遺伝子を付与した結果、試験片において選択した２つの検出用プローブのいずれの位置も発色し、ハイブリダイズさせるための試験環境におけるハイブリダイズ温度が低すぎる状態であることを示す図であり、  （ｂ）は、第１検出用プローブおよび第２検出用プローブに連結スタンダード遺伝子を付与した結果、試験片において選択した２つの検出用プローブのうち、第１検出用プローブの位置のみが発色し、試験環境におけるハイブリダイズ温度が適した状態であることを示す図であり、そして  （ｃ）は、第１検出用プローブおよび第２検出用プローブに連結スタンダード遺伝子を付与した結果、試験片において選択した２つの検出用プローブのいずれの位置も発色せず、試験環境におけるハイブリダイズ温度が高すぎる状態であることを示す図である。
【図６】実施例１のプローブ２に相補的な配列（第１部分）とプローブ４に相補的な配列のほぼ中央の位置のみ１つのミスマッチ塩基が導入された配列（第２部分）とからなる連結スタンダード遺伝子１を示す模式図である。
【図７】実施例１のプローブ２に相補的な配列（第１部分）とプローブ１９に相補的な配列のほぼ中央の位置のみ１つのミスマッチ塩基が導入された配列（第２部分）とからなる連結スタンダード遺伝子２を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（１．キット）
本発明は、ターゲット遺伝子を検出するためのキットを提供し、上記キットは、試験片および第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を含む。
【００１５】
ターゲット遺伝子としては、特に限定されず、例えば、微生物を同定するための遺伝子、微生物の薬剤感受性または耐性に関する遺伝子が挙げられる。
【００１６】
微生物を同定するための遺伝子としては、特に限定されず、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡが挙げられる。
【００１７】
微生物の薬剤感受性または耐性に関する遺伝子としては、野生型または変異型の遺伝子が挙げられる。薬剤としては、特に限定されず、例えば、結核菌の場合、ピラジナミド（ＰＺＡ）、イソニアジド(ＩＮＨ)、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、およびエタンブトール（ＥＢ）が挙げられる。
【００１８】
（１．１．試験片）
図１は、本発明のキットを構成する試験片の一例を説明するための当該試験片の模式図である。
【００１９】
図１に示すように、本発明のキットを構成する試験片１０には、複数種の検出用プローブ１２がそれぞれ異なる位置に固定化されている。好ましくは、各プローブは一定の間隔で固定化されている。さらに、検出のための発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定化されていてもよい。
【００２０】
（１．１．１．検出用プローブ）
検出用プローブは、ターゲット遺伝子を検出するためのプローブであり、ターゲット遺伝子とＴｍａｘ℃（ハイブリダイズ温度の上限）以下の温度でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなる。好ましくは、ターゲット遺伝子と任意の位置で１塩基異なる（すなわちミスマッチである）遺伝子とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなる。例えば、ターゲット遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチド長は、特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１２ヌクレオチド長〜２６ヌクレオチド長である。
【００２１】
検出用プローブは、検出するターゲット遺伝子の塩基配列に基づき、当業者が適宜設計することができる。少なくとも２つの検出用プローブの塩基配列は、ターゲット遺伝子内の異なる領域を標的とするように選択され得る。これらのそれぞれの検出用プローブが標的とする領域は、一部が重複してもよい。
【００２２】
検出用プローブのオリゴヌクレオチドは、特に限定されないが、例えば、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることによって、当該相補的な塩基配列を適宜設計することができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて適宜合成することができる。
【００２３】
検出用プローブは、試験片に固定化するために、好ましくは５’または３’末端のいずれか一方が修飾されている。
【００２４】
本発明のキットを構成する試験片は例えば、以下のようにして作製される。
【００２５】
（１．１．２．検出用プローブの固定化）
試験片は、上記少なくとも２つの検出用プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定化して作製することができる。担体としては、特に限定されず、例えば、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料が挙げられる。成形加工が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法による検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
【００２６】
担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、特に限定されず、公知の種々の方法が挙げられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法があり、この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定化されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５μＬ／分〜１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５ｍｍ／秒〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１ｍｍ〜２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定化される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。
【００２７】
担体が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することによって、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。
【００２８】
プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、特に限定されず、公知の種々の方法が挙げられる。例えば、担体がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、修飾プローブを含む溶液に担体を２４時間〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによって試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することによって、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることによって、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４時間〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによって固定化することができる。
【００２９】
また、合成されたプローブを固定化するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。
【００３０】
このようにして本発明のキットを構成する試験片が作製される。
【００３１】
本発明においては、図２に示されるように、上記少なくとも２つの検出用プローブが固定化された試験片１００から第１検出用プローブ１０２と第２検出用プローブ１０４とが選択される。
【００３２】
試験片１００にて選択される第１検出用プローブ１０２および第２検出用プローブ１０４の位置関係は特に限定されない。すなわち、第１検出用プローブ１０２および第２検出用プローブ１０４は隣接するプローブであってもよく、両者の間に１つ以上の他のプローブを介したものであってもよい。
【００３３】
（１．２．スタンダード遺伝子）
スタンダード遺伝子は、第１のスタンダード遺伝子と第２のスタンダード遺伝子の２つがあり、ターゲット遺伝子と試験片上の検出用プローブとが適正な温度でハイブリダイズしているかどうかを確認するための遺伝子である。第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子は、第１のスタンダード遺伝子の第１部分と第２のスタンダード遺伝子の第２部分とが連続した配列からなるオリゴヌクレオチド（連結スタンダード遺伝子）であってもよい。
【００３４】
第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子を構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、特に限定されず、ターゲット遺伝子を検出するための第１検出用プローブおよび第２検出用プローブがＴｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度でターゲット遺伝子とハイブリダイズする場合、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、第１のスタンダード遺伝子の第１部分が第１検出用プローブとハイブリダイズし、かつ第２のスタンダード遺伝子の第２部分が第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度において、第１のスタンダード遺伝子の第１部分が第１検出用プローブとハイブリダイズするが、第２のスタンダード遺伝子の第２部分が第２検出用プローブとハイブリダイズせず、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、第１のスタンダード遺伝子の第１部分が第１検出用プローブとハイブリダイズせず、かつ第２のスタンダード遺伝子の第２部分が第２検出用プローブとハイブリダイズしない。換言すれば、第１のスタンダード遺伝子は、Ｔｍａｘ℃よりも低い温度において、第１のスタンダード遺伝子の第１部分が第１検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍａｘ℃以上の温度において、第１のスタンダード遺伝子の第１部分が第１検出用プローブとハイブリダイズせず、第２のスタンダード遺伝子は、Ｔｍｉｎ℃よりも低い温度において、第２のスタンダード遺伝子の第２部分が第２検出用プローブとハイブリダイズし、Ｔｍｉｎ℃以上の温度において、第２のスタンダード遺伝子の第２部分が第２検出用プローブとハイブリダイズしない。Ｔｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃の温度範囲は、第１のプローブおよび第２のプローブが固定された試験片を用いたターゲット遺伝子の変異の有無の測定において、そのターゲット遺伝子の変異の有無を判別可能とするものである限り、特に限定されず、例えば２〜４℃、好ましくは２℃である。
【００３５】
第１のスタンダード遺伝子の第１部分および第２のスタンダード遺伝子の第２部分のオリゴヌクレオチド長は、特に限定されず、例えばそれぞれ１０ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、好ましくは１０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である。
【００３６】
第１のスタンダード遺伝子の第１部分は、好ましくは第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列である。第２のスタンダード遺伝子の第２部分は、好ましくは第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列であるが、第２部分の塩基配列のほぼ中央に位置する塩基にミスマッチ塩基を有する。ミスマッチ塩基の位置は、ミスマッチ塩基を含む第２部分の配列の長さに依存し得るが、第２部分の全長に対して「ほぼ中央」の位置であればよい。ミスマッチ塩基を含む第２部分のオリゴヌクレオチドの長さが１８ヌクレオチドの場合、例えば７〜１０位、好ましくは、８〜９位にミスマッチ塩基を導入し得る。
【００３７】
ここで、ミスマッチ塩基とは、相補的でない塩基、すなわち、塩基対を形成しない塩基をいう。例えば、対合する塩基Ａに対して、相補的な塩基であるＴ以外の塩基、例えば、Ｃ、ＧまたはＡである。好ましくは、対合する塩基と同じ塩基である。例えば、対合する塩基Ａに対して、同じ塩基Ａが好ましい。
【００３８】
第１のスタンダード遺伝子の第１部分と第２のスタンダード遺伝子の第２部分とが連続した配列からなる１つのオリゴヌクレオチドの作製については、特に限定されないが、例えば、連結スタンダード遺伝子を直接合成してもよく、あるいは、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子をそれぞれ合成した後で、これらを連結してもよい。スタンダード遺伝子の合成方法については、特に限定されないが、例えば、上記検出用プローブのオリゴヌクレオチドの合成方法を用いてもよい。第１のスタンダード遺伝子の第１部分と第２のスタンダード遺伝子の第２部分とを連結する方法については、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いてもよい。
【００３９】
ミスマッチ塩基が導入されたオリゴヌクレオチド作製方法としては、特に限定されないが、例えば、第２部分のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基を導入するように予め設計した塩基配列を適宜設計し、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて適宜合成する方法が挙げられる。
【００４０】
本発明のキットを構成する連結スタンダード遺伝子の作製方法の例について説明する。
【００４１】
図３は、本発明を構成する、連結スタンダード遺伝子の作製手順の一例を模式的に表す図である。
【００４２】
図３の（ａ１）に示すように、連結スタンダード遺伝子は、上記選択された第１検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列からなる第１部分と第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの相補配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基２０８が導入された配列からなる第２部分２０４とが別々に調製される。次いで、図３の（ｂ１）に示すように、第１のスタンダード遺伝子の第１部分２０２と第２のスタンダード遺伝子の第２部分２０４とが連結点２０６を介して互いに連結される。このような第１のスタンダード遺伝子の第１部分２０２と第２のスタンダード遺伝子の第２部分２０４とを連結する手段としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡリガーゼが使用されてもよい。
【００４３】
本発明のキットを構成する連結スタンダード遺伝子の作製方法の他の例について説明する。
【００４４】
図４は、本発明を構成する、連結スタンダード遺伝子の作製手順の他の例を模式的に表す図である。
【００４５】
図４に示すように、連結スタンダード遺伝子は、第１検出用プローブの塩基配列に相補的な配列（第１部分）３０２と、第２検出用プローブのオリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基３０８が導入された配列（第２部分）３０４とが連続した配列からなるオリゴヌクレオチドを調製することによって作製される。
【００４６】
第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子は、試験片上のプローブとのハイブリダイズを検出するために、好ましくは５’または３’末端のいずれか一方が放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾されている。なお、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子が、連結スタンダード遺伝子である場合は、当該連結スタンダード遺伝子の５’または３’末端のいずれか一方が放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾することになる。
【００４７】
（１．３．その他の試薬）
試験片上のプローブとのハイブリダイズを検出するための試薬としては、特に限定されず、例えば、アルカリホスファターゼ標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いる場合は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色試薬が挙げられる。
【００４８】
本発明のキットは、上記試験片、上記第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子もしくは連結スタンダード遺伝子以外に、さらに、例えば、検体から遺伝子ＤＮＡを抽出するための試薬、遺伝子増幅用試薬、遺伝子変性用試薬、ハイブリダイズ用試薬、プローブと遺伝子とのハイブリダイズを検出するための試薬を含む。
【００４９】
遺伝子ＤＮＡを抽出するための方法としては、特に限定されず、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法が挙げられる。遺伝子ＤＮＡを抽出するための試薬は、これらの方法で一般的に用いられる試薬であり得る。
【００５０】
遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅用プライマー対を含み、遺伝子増幅用プライマーは、増幅する遺伝子とプローブとのハイブリダイズを検出するために、好ましくは放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、またはビオチンなどで修飾されている。遺伝子増幅法としては、特に限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、およびＩＣＡＮ法が挙げられる。
【００５１】
遺伝子変性用試薬としては、遺伝子を１本鎖ＤＮＡに変性できる限り、特に限定されない。
【００５２】
ハイブリダイズ用試薬は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドどうしがハイブリダイズするように塩および界面活性剤を含み、その濃度は適宜設定される。
【００５３】
試験片上のプローブとのハイブリダイズを検出するための試薬としては、特に限定されず、例えば、遺伝子増幅用プライマーがアルカリホスファターゼで修飾されている場合は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色試薬が挙げられる。
【００５４】
（２．ターゲット遺伝子を検出するための方法）
（２．１．検体）
検体としては、特に限定されず、例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、およびこれらから培養して得られた培養物ならびにこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００５５】
（２．２．遺伝子ＤＮＡの抽出）
上記検体から遺伝子ＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法が挙げられる。この工程は省略してもよい。
【００５６】
（２．３．ターゲット遺伝子の増幅）
遺伝子増幅法としては、特に限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法が挙げられる。遺伝子増幅用プライマーは、プローブと遺伝子とのハイブリダイズを検出するために、好ましくは放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾されている。検体から遺伝子ＤＮＡを抽出することなく、検体から直接ターゲット遺伝子を増幅してもよい。検出感度を上げるために、例えば、検体から直接ターゲット遺伝子を増幅する場合、ＰＣＲ法の前にNestedＰＣＲ法（特公平６−８１６００号公報）などでターゲット遺伝子を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーには、通常、ＰＣＲ法で用いるプライマーよりもターゲット遺伝子の上流または下流に位置する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。
【００５７】
（２．４．ターゲット遺伝子を検出するためのハイブリダイズ温度の判定）
ターゲット遺伝子の検出前に、ターゲット遺伝子が試験片上の検出用プローブとハイブリダイズするのに適正な温度（Ｔｍｉｎ℃からＴｍａｘ℃）を決定するために、第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子もしくは連結スタンダード遺伝子を試験片とハイブリダイズ処理させる。
【００５８】
第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子もしくは連結スタンダード遺伝子は、試験片上の第１検出用プローブおよび第２検出用プローブの両方ともがアプローチされるように付与される。１片の試験片上の第１検出用プローブおよび第２検出用プローブに対し、２つのスタンダード遺伝子または連結スタンダード遺伝子が付与される。
【００５９】
ハイブリダイズ処理とは、簡潔には、遺伝子と試験片とを一定条件下で混合することであり、好ましくは上記ハイブリダイズ用試薬存在下で混合することである。ハイブリダイズ処理の結果、例えば、５’または３’末端がビオチンで修飾されている第１のスタンダード遺伝子および第２のスタンダード遺伝子もしくは連結スタンダード遺伝子は、試験片上のプローブとハイブリダイズすると、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、次いでＮＢＴ／ＢＣＩＰを反応させることによって、試験片上のプローブにアルカリホスファターゼが結合し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにより発色する。
【００６０】
このような各試験片の発色の有無を観察することにより、各試験環境におけるハイブリダイズに適した温度か否かの判定が以下のようにして行われる。
【００６１】
すなわち、図５の（ａ）に示すように、試験片１００において、第１検出用プローブ１０２および第２検出用プローブ１０４といずれの位置も発色した場合は、ハイブリダイズさせるための当該試験環境のハイブリダイズ温度が低すぎる状態である。このため、当業者は、そのような試験環境下ではターゲット遺伝子のハイブリダイズには適さない温度環境にあると認識することができる。
【００６２】
また、例えば、試験片１００において第１検出用プローブ１０２または第２検出用プローブ１０４のいずれか一方が発色した場合（図５の（ｂ）では第１検出用プローブ１０２の位置のみが発色した場合を示し、破線で示される第２検出用プローブ１０４の位置は発色していないことを示す）、当該試験環境がハイブリダイズに適した状態である。このため、当業者は、そのような試験環境下ではターゲット遺伝子のハイブリダイズに適した温度環境にあると認識することができる。
【００６３】
さらに、図５の（ｃ）に示すように、試験片１００において破線で示しているように、第１検出用プローブ１０２および第２検出用プローブ１０４のいずれの位置も発色しなかった場合は、ハイブリダイズさせるための当該試験環境におけるハイブリダイズ温度が高すぎる状態である。このため、当業者はそのような試験環境下ではターゲット遺伝子のハイブリダイズには適さない温度環境にあると認識することができる。
【００６４】
（２．５．ターゲット遺伝子の検出）
増幅したターゲット遺伝子を１本鎖ＤＮＡに変性させ、上記で決定した適正なハイブリダイズ温度にて試験片とのハイブリダイズ処理を行う。例えば、ターゲット遺伝子の遺伝子増幅用プライマーがビオチンで修飾されている場合、増幅したビオチン標識ターゲット遺伝子は、試験片に固定された検出用プローブとハイブリダイズすると、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、次いでＮＢＴ／ＢＣＩＰを反応させることによって、試験片上のプローブにアルカリホスファターゼが結合し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにより発色する。発色する場合、ターゲット遺伝子が、試験片に固定された検出用プローブとハイブリダイズしているため、ターゲット遺伝子が検出されたことを示す。
【００６５】
上記検出の結果に基づいて、例えば、結核菌をはじめとする病原菌の存在の有無の確認、およびそれらの菌の薬剤に対する感受性や耐性の確認をすることができる。さらにその確認した結果に基づいて、例えば、治療方針を決定することが可能となる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１：試験片の作製）
（プローブの選択）
配列表の配列番号１に表されたピラジナミド（ＰＺＡ）耐性遺伝子（ｐｎｃＡ遺伝子）の塩基配列に相補的な配列の、第−１１位、第３位、第８位、第１１位、第１４位、第１９位、第２０位、第２３位、第２４位、第２６位、第２８位、第２９位、第３５位、第４０位、第４１位、第４２位、第６８位、第６９位、第７４位、第７５位、第７７位、第７８位、第８３位、第１００位、第１０２位、第１０４位、第１３４位、第１３７位、第１３９位、第１４３位、第１４６位、第１５１−２３０位、第１５２位、第１５３位、第１５７位、第１５８位、第１６１位、第１６２位、第１６９位、第１７０位、第１７２位、第１８１位、第１８２位、第１８５位、第１８７位、第１９０位、第１９９位、第２０２位、第２０３位、第２１２位、第２１６位、第２２６位、第２２７位、第２３１位、第２３３位、第２５４位、第２６１位、第２８６位、第２８７位、第２８８位、第２９０位、第２９５位、第２９６位、第３０７位、第３０８位、第３０９位、第３０７−３１１位、第３４１位、第３５１位、第３５６位、第３６２位、第３６３位、第３６９位、第３８１−３８２位、第３８３位、第３８２−３９０位、第３８６位、第３８６−３８９位、第３９２位、第３９３位、第４０３位、第４０６位、第４１０位、第４１２位、第４１５位、第４１６位、第４２１位、第４２２位、第４３６位、第４４２位、第４４９位、第４５２位、第４６４位、第４６６位、第４６７位、第４７６位、第４８１位、第４８６−４９６位、第４９４位、第５１５位、第５２５位、第５３３位または第５３８位のいずれかの塩基の変異を検出し得るプローブとして、以下に示すプローブ１〜４７（それぞれ、配列番号２〜４８に対応）をそれぞれ調製する。
【００６８】
プローブ１：5'-cgcatacgtccaccatacgttcgg-3'（配列番号２）
プローブ２：5'-atgatcaacgcccgcatac-3'（配列番号３）
プローブ３：5'-cacgtcgacgatgatcaacg-3'（配列番号４）
プローブ４：5'-gtcgttctgcacgtcgac-3'（配列番号５）
プローブ５：5'-ccaccctcgcagaagtcgtt-3'（配列番号６）
プローブ６：5'-cgagccaccctcgcagaag-3'（配列番号７）
プローブ７：5'-gttaccgccagcgagccacc-3'（配列番号８）
プローブ８：5'-agcgcggcgccaccggttaccg-3'（配列番号９）
プローブ９：5'-gtagtcgctgatggcgcgggccagcgcg-3'（配列番号１０）
プローブ１０：5'-gccaggtagtcgctgatggcgc-3'（配列番号１１）
プローブ１１：5'-tggtagtccgccgcttcggccaggta-3'（配列番号１２）
プローブ１２：5'-gtatgcgggcgttgatcatgtcgacgtgccgaacgac-3'（配列番号１３）
プローブ１３：5'-gtatgcgggcgttgatcatcaccgcattgggtcagcg-3'（配列番号１４）
プローブ１４：5'-cgcatacgtccaccatacgttcgg-3'（配列番号１５）
プローブ１５：5'-atgatcaacgcccgcatac-3'（配列番号１６）
プローブ１６：5'-cacgtcgacgatgatcaacg-3'（配列番号１７）
プローブ１７：5'-gtcgttctgcacgtcgac-3'（配列番号１８）
プローブ１８：5'-ccaccctcgcagaagtcgtt-3'（配列番号１９）
プローブ１９：5'-cgagccaccctcgcagaag-3'（配列番号２０）
プローブ２０：5'-gttaccgccagcgagccacc-3'（配列番号２１）
プローブ２１：5'-agcgcggcgccaccggttaccg-3'（配列番号２２）
プローブ２２：5'-gtagtcgctgatggcgcgggccagcgcg-3'（配列番号２３）
プローブ２３：5'-gccaggtagtcgctgatggcgc-3'（配列番号２４）
プローブ２４：5'-tggtagtccgccgcttcggccaggta-3'（配列番号２５）
プローブ２５：5'-cgcatacgtccaccatacgttcgg-3'（配列番号２６）
プローブ２６：5'-atgatcaacgcccgcatac-3'（配列番号２７）
プローブ２７：5'-cacgtcgacgatgatcaacg-3'（配列番号２８）
プローブ２８：5'-gtcgttctgcacgtcgac-3'（配列番号２９）
プローブ２９：5'-ccaccctcgcagaagtcgtt-3'（配列番号３０）
プローブ３０：5'-cgagccaccctcgcagaag-3'（配列番号３１）
プローブ３１：5'-gttaccgccagcgagccacc-3'（配列番号３２）
プローブ３２：5'-agcgcggcgccaccggttaccg-3'（配列番号３３）
プローブ３３：5'-gtagtcgctgatggcgcgggccagcgcg-3'（配列番号３４）
プローブ３４：5'-gccaggtagtcgctgatggcgc-3'（配列番号３５）
プローブ３５：5'-tggtagtccgccgcttcggccaggta-3'（配列番号３６）
プローブ３６：5'-gtatgcgggcgttgatcatgtcgacgtgccgaacgac-3'（配列番号３７）
プローブ３７：5'-gtatgcgggcgttgatcatcaccgcattgggtcagcg-3'（配列番号３８）
プローブ３８：5'-cgcatacgtccaccatacgttcgg-3'（配列番号３９）
プローブ３９：5'-atgatcaacgcccgcatac-3'（配列番号４０）
プローブ４０：5'-cacgtcgacgatgatcaacg-3'（配列番号４１）
プローブ４１：5'-gtcgttctgcacgtcgac-3'（配列番号４２）
プローブ４２：5'-ccaccctcgcagaagtcgtt-3'（配列番号４３）
プローブ４３：5'-cgagccaccctcgcagaag-3'（配列番号４４）
プローブ４４：5'-gttaccgccagcgagccacc-3'（配列番号４５）
プローブ４５：5'-agcgcggcgccaccggttaccg-3'（配列番号４６）
プローブ４６：5'-gtagtcgctgatggcgcgggccagcgcg-3'（配列番号４７）
プローブ４７：5'-gccaggtagtcgctgatggcgc-3'（配列番号４８）
【００６９】
（プローブの固定化）
上記の配列番号２〜４８に示されるオリゴヌクレオチドプローブ１〜４７のそれぞれの５’末端にターミナルトランスフェラーゼを用いて、ポリチミンの付加を行う。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、精製水３．６μＬを添加して反応溶液を調製し、３７℃にて４時間反応させ、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを加えることで、ポリチミンが付加された各オリゴヌクレオチドプローブ１ｐｍｏｌ／μＬを調製する。
【００７０】
次いで、ポリチミンが付加された各オリゴヌクレオチドプローブをポリエステル膜上に一定間隔でそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、試験片を作製する。
【００７１】
（連結スタンダード遺伝子の調製）
温度確認用遺伝子として、下記配列番号４９および５０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる連結スタンダード遺伝子１および２を調製する。連結スタンダード遺伝子１および２を表す模式図を、それぞれ図６および図７に示す。図６および７において、大文字で示した塩基はミスマッチ塩基を表す。
【００７２】
連結スタンダード遺伝子１については以下のように調製する。プローブ４の塩基配列に相補的な配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基が導入された配列（第２部分）からなる第２のスタンダード遺伝子およびプローブ２の塩基配列に相補的な配列（第１部分）からなる第１のスタンダード遺伝子をそれぞれ設計して調製し、第２のスタンダード遺伝子の第２部分の３’末端に第１のスタンダード遺伝子の第１部分を連結させる。次いで、連結スタンダード遺伝子１の５’末端にビオチンを結合させる。
【００７３】
連結スタンダード遺伝子１：5'-cagcaagＣcgtgcagctgtactagttgcgggcgtatg-3'（配列番号４９：「Ｃ」がミスマッチ塩基）
【００７４】
連結スタンダード遺伝子２については以下のように調製する。プローブ１９の塩基配列に相補的な配列のほぼ中央の位置にミスマッチ塩基が導入された配列（第２部分）を含む第２のスタンダード遺伝子と、プローブ２の塩基配列に相補的な配列（第１部分）を含む第１のスタンダード遺伝子とが連続した配列からなるオリゴヌクレオチド（連結スタンダード遺伝子）を設計して調製し、次いで、スタンダード遺伝子の５’末端にビオチンを結合させる。
【００７５】
連結スタンダード遺伝子２：5'-gcgactgＧgttacgccactactagttgcgggcgtatg-3'（配列番号５０：「Ｇ」がミスマッチ塩基）
【００７６】
（実施例２：ピラジナミド耐性を検出するためのハイブリダイズ温度の判定）
（２−１：連結スタンダード遺伝子１を用いたハイブリダイズ温度の判定）
上記連結スタンダード遺伝子１を含有するハイブリダイズ用試薬中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液１ｍＬおよび実施例１で作製する検出用試験片１枚を加え、３０分間振とうして反応させる。アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出用試験片上の各プローブとハイブリダイズした、ビオチンを含む連結スタンダード遺伝子１に結合したアルカリホスファターゼを発色させる。検出用試験片の第１検出用プローブの位置のみが発色することで、試験環境の温度がハイブリダイズに適した状態であると判定することができる。
【００７７】
（２−２：連結スタンダード遺伝子２を用いたハイブリダイズ温度の判定）
上記連結スタンダード遺伝子２を含有するハイブリダイズ用試薬中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液１ｍＬおよび実施例１で作製する検出用試験片１枚を加え、３０分間振とうして反応させる。アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出用試験片上の各プローブとハイブリダイズしたビオチンを含む連結スタンダード遺伝子２に結合したアルカリホスファターゼを発色させる。検出用試験片の第１検出用プローブの位置のみが発色することで、試験環境の温度がハイブリダイズに適した状態であると判定することができる。
【００７８】
（実施例３〜１４：ピラジナミド耐性の検出）
（ｐｎｃＡ遺伝子の抽出）
本実施例では、結核菌そのものを検体とし、ターゲット遺伝子としてのｐｎｃＡ遺伝子の変異検出を行う。各実施例に用いる検体の結核菌を下記の表１に示す。各検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製し、試料とする。
【００７９】
【表１】
2014155451.tif 000002
【００８０】
（ｐｎｃＡ遺伝子の増幅）
配列表の配列番号５１に示される塩基配列からなるフォワードプライマー、同様に配列番号５２に示される塩基配列からなり、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いるＰＣＲ法により、試料に含まれるｐｎｃＡ遺伝子の増幅を行う。プライマーの塩基配列は以下に示すとおりである。
【００８１】
フォワードプライマー：5'-ggcgtcatggaccctatatc-3'（配列番号５１）
リバースプライマー：5'-caacagttcatcccggttc-3'（配列番号５２）
ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃にて３０秒、アニール過程を５５℃にて２０秒、鎖伸長過程を７２℃にて２０秒とし、このサイクルを３０サイクル行い、増幅を行う。これにより増幅するＤＮＡにはビオチンが結合している。
【００８２】
（プローブを用いた検出）
増幅するＤＮＡを含む溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液１０μＬを加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅するＤＮＡを１本鎖に変性する。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液１ｍＬおよび実施例１で作製する検出用試験片１枚を加え、実施例２で決定される温度にて３０分間振とうして反応させる。次いで、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出用試験片上の各プローブとハイブリダイズしたビオチンを含む増幅ＤＮＡに結合したアルカリホスファターゼを発色させる。
【００８３】
（検出結果）
実施例３〜１５の結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
2014155451.tif 000003
【００８５】
本発明のキットを用いると、ｐｎｃＡ遺伝子の変異の位置のいずれか少なくとも１つが変異することにより生じるＰＺＡ薬剤耐性菌を適正なハイブリダイズ温度にて検出することができる。その結果、結核患者が保有する菌を正確にモニタリングすることができ、ＰＺＡ耐性菌を保有する結核患者に対して適切な治療方法を提供することができる。このことにより、不要な薬剤投与を防ぐことができ、患者の負担が軽減され、さらに無駄な医療費を削減することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止するためのターゲット遺伝子検出用試験片を含むキットを提供することができる。本発明のキットは、結核菌をはじめとする病原菌の検出や、それらの菌の薬剤に対する感受性や耐性の確認において、より簡便でより正確な判定を可能にする。特に、東南アジアなど厳しい環境下において技術的に未熟な医療従事者によっても簡単に使用することができる。
【符号の説明】
【００８７】
１０，１００      試験片
１２              検出用プローブ
１０２            第１検出用プローブ
１０４            第２検出用プローブ
２００，３００    連結スタンダード遺伝子
２０２，３０２    第１のスタンダード遺伝子の第１部分
２０４，３０４    第２のスタンダード遺伝子の第２部分
２０６            連結点
２０８，３０８    ミスマッチ塩基
【図１】
2014155451.tif 000004
【図２】
2014155451.tif 000005
【図３】
2014155451.tif 000006
【図４】
2014155451.tif 000007
【図５】
2014155451.tif 000008
【図６】
2014155451.tif 000009
【図７】
2014155451.tif 000010
【配列表】
2014155451000001.app