(57)【要約】【課題】個人におけるＡＳＤの危険性を決定する方法を提供するものである。【解決手段】ＳＨＡＮＫ３の遺伝子において、１つまたは複数のゲノム変異の存在を特定することを含む方法を提供する。【選択図】図１
2014155507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＤ関連遺伝子ＳＨＡＮＫ３におけるゲノム配列の変異を同定する方法であって、
核酸含有試料を探索するステップと、および、
ＳＨＡＮＫ３遺伝子中の欠失であるゲノム配列の変異を同定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記欠失が１００ｋｂより大きいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記欠失が２７６ｋｂであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記欠失が、少なくとも第２２番染色体の第４９,２４３,２４７番から第４９,５１９,９４９番目の核酸までの核酸の領域内の部位を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記欠失が、第２２番染色体の第４９,２４３,２４７番の核酸から第４９,５１９,９４９番目の核酸までの領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記欠失が、第２２番染色体の第４９,２４３,２４７番の核酸から第４９,５１９,９４９番目の核酸までの領域であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、体液または分泌物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記体液または前記分泌物が、血液、血清、唾液、尿、および精液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第２２番染色体中の配列の変異を分析するために、前記核酸含有試料が配列を決定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＳＤ関連遺伝子ＳＨＡＮＫ３の遺伝子産物の異常なレベルの決定をする方法であって、
タンパク質を含有する試料のＳＨＡＮＫ３によって発現した前記遺伝子産物または前記変異のあるＳＨＡＮＫ３遺伝子によって発現した前記遺伝子産物の異常なレベルをスクリーニングするステップと、および、
健康な非ＡＳＤの個体における発現レベルとは異なるレベルで前記遺伝子産物が発現されることを決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記試料が、体液または分泌物であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液または前記分泌物が、血液、血清、唾液、尿、および精液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）用の遺伝子マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症は、社会的コミュニケーションにおける障害および反復行動を好むことを特徴とする、遺伝性の神経系発達障害である。自閉症は、明確な範疇に属する障害ではなく、広汎性発達障害（ＰＤＤ）または自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）として定義される障害群の原型であり、アスペルガー障害、小児期崩壊性障害、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）およびレット症候群を含む。ＡＳＤは、女性と比較すると男性でおよそ４倍高い発症率を有し、あらゆる人種、民族および社会経済的背景の家系で診断される。全体的に見た自閉症の集団罹患率は、最新の概算では１０，０００人中２０人までに近年上昇しており、全ての自閉症スペクトラム障害については１０，０００人中６０人という高い発症率である。
【０００３】
双子および家系のいくつかの疫学的調査から得られたデータにより、自閉症が重大かつ複雑な遺伝的病因を有するという実質的証拠が提供される。一卵性双生児における一致率は、６０〜９０％であり（Bailey 1995）、罹患した発端者の同胞における再発率は、５〜１０％の間と報告されており（Jones＆Szatmari 1988）、一般集団と比較して危険性が５０倍上昇することを表している。自閉症スペクトラム障害は、もっとも遺伝的に複雑な障害の１つだが、遺伝的危険性は単純なメンデルの法則では明らかに導かれない。
【０００４】
少数の症例（約１０％）では、自閉症は、より広範なはっきりとした障害（例えば、脆弱Ｘ症候群、結節性硬化症）の一部であり、または細胞遺伝学的に検出可能な染色体異常に関連する。その上、微小欠失症候群（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群およびＳｏｔｏｓ症候群）、およびその他のゲノム障害（例えば、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群）を伴う自閉症の共罹患は、染色体の不均衡が、根本的な病因に関係していることを示唆している。もっとも頻繁に見られる細胞遺伝学的異常は、Ｐｒａｄｅｒ Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群に決定的な領域を含む、１５ｑ１１−１３（１〜３％）の中間部の母系遺伝の重複である。第２２染色体のｑ１１．２およびｑ１３．３領域中の欠失を有する多数の症例も存在する。２２ｑ１１．２領域は、口蓋心臓顔面症候群に関係しており、２２ｑ１３．３での欠失も臨床的に定義可能な症候群を表すようである。両欠失は、自閉症の表現型に関係する。ＡＳＤの症候性形態で観察される、より高頻度の現象を有する異常に関係する、その他の染色体遺伝子座には、７ｑ（ＴＣＡＧ、ｗｗｗ．ｃｈｒ７．ｏｒｇを参照されたい）、２ｑ３７、５ｐ１４−１５、１７ｐ１１．２が挙げられる。さらに、Ｗｉｌｌｉａｍ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群の欠失領域と重なる相互重複は、自閉症の表現型に関係している。
【０００５】
全ゲノム連鎖解析により、ほとんど全ての染色体上に感受性遺伝子座の証拠が見出されており、７ｑがもっとも一貫した結果をもたらす。重要な連鎖を有するその他の遺伝子座には、２ｑ（ＩＭＧＳＡＣ２００１）、３ｑ、およびごく最近では１１ｐ（ＡＧＰ１０Ｋ研究）が挙げられる。いくつかの症例では、７ｑのように、細胞遺伝学的異常と連鎖結果との間にかなりのオーバーラップが存在する。しかし、１５ｑ１１−１３および２２ｑ１３．３遺伝子座で見出された連鎖の欠如は、ＡＳＤにおけるかなりの不均一性を反映し、これらの再配列が、細胞遺伝学的に正常な患者の表現型に影響しない遺伝子を含む、特定のＡＳＤ亜型に関与していることを示唆する。期待できる結果であるにも関わらず、これらの連鎖ピーク内にある特異的遺伝子は、自閉症に関与しないことが明白に示された。
【０００６】
ＡＳＤに関連する変異が、２つのニューロリギン（ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４）遺伝子、およびより最近ではＳＨＡＮＫ３において報告されている。しかし、これらはＡＳＤの稀な原因を説明するだけである。その他の遺伝子も関係してきたが、稀な現象を表すか、他の研究によってまだ検証されていない。
【０００７】
まとめると、これらのデータは、実質的な遺伝的不均一性を示唆しており、非症候性の特発性ＡＳＤのもっとも可能性の高い原因には、優位に相互作用する多数の遺伝子座が関与する。
【０００８】
大規模なコピー数多型（ＣＮＶ）の同定により、表現型の変異と、自閉症の家系での小さな遺伝性欠失と判明し、感受性遺伝子座の可能性も示唆する疾患感受性とに対して一因となる、ヒトゲノムにおける重要な遺伝子変異源が得られる。
【０００９】
個人におけるＡＳＤの危険性の決定を容易にするＡＳＤの遺伝子マーカーを同定し、さらに状態の診断に役立てることが所望される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Risi et al. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 2006;45(9):1094-103
【非特許文献２】Falush et al. Genetics 2003;164(4):1567-87
【非特許文献３】Pritchard et al. Genetics 2000;155(2):945-59
【非特許文献４】Kennedy et al. 2003 Nat Biotechnol. 21:1233-7
【非特許文献５】Li and Wong 2001 Genome Biology 2: 0032.1-0032.11
【非特許文献６】Nannya 2005 Cancer Res. 2005;65:6071-9
【非特許文献７】Komura 2006 Genome Res. 2006;16:1575-84
【非特許文献８】Zhao et al 2005 Cancer Res. 65:5561-70
【非特許文献９】Komura et al. Genome Res 2006;16(12):1575-84
【非特許文献１０】Krawczak et al. Community Genet 2006; 9(1):55-61
【非特許文献１１】Redon et al. Nature. 444:444-54
【非特許文献１２】Nannya et al. Cancer Res 2005;65(14):6071-9
【非特許文献１３】Pinto et al. Hum Mol Genet 2007;16 Spec No 2:R168-73
【非特許文献１４】Iafrate et al.Nat Genet 2004;36(9):949-51
【発明の概要】
【００１１】
個人におけるＡＳＤの危険性を評価するのに有用であり、状態の診断にも有用ないくつもの遺伝子マーカーが、現在、同定されている。マーカーは、個々においても、ＡＳＤの危険性について個人をスクリーニングするためのマイクロアレイの形態においても、有用である。
【００１２】
したがって、本発明の一態様では、
ＰＴＣＨＤ１をコードする遺伝子について、個人から得た核酸含有試料を探索するステップであって、前記遺伝子が、エクソン１の少なくとも一部分の欠失を含むとの決定により、その個人におけるＡＳＤの危険性を示すステップ
を含む、個人におけるＡＳＤの危険性を決定する方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様では、
ＰＴＣＨＤ１、ＳＨＡＮＫ３、ＮＦＩＡ、ＤＰＰ６、ＤＰＰ１０、ＧＰＲ９８、ＰＱＢＰ１、ＺＮＦ４１およびＦＴＳＪ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を変化させる変異について、個人から得た核酸含有試料を探索するステップであって、前記遺伝子の少なくとも１つの発現を変化させる変異を同定することにより、ＡＳＤの危険性を示すステップ
を含む、個人におけるＡＳＤの危険性を決定する方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様では、
ＰＴＣＨＤ１、ＳＨＡＮＫ３、ＮＦＩＡ、ＤＰＰ６、ＤＰＰ１０、ＧＰＲ９８、ＰＱＢＰ１、ＺＮＦ４１およびＦＴＳＪ１からなる群から選択される遺伝子によって発現する、少なくとも１つの遺伝子産物の異常なレベルについて、個人から得た生体試料をスクリーニングするステップであって、前記遺伝子産物の少なくとも１つが、ＡＳＤではない健康な個人におけるレベルとは異なるレベルで発現するとの決定により、ＡＳＤの危険性を示すステップ
を含む、個人におけるＡＳＤの危険性を決定する方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様では、
ＰＴＣＨＤ１の発現を変化させる、ゲノムの配列の変異について、個人から得た核酸含有試料をスクリーニングするステップ
を含む、個人におけるＡＳＤの危険性を決定する方法を提供する。
【００１６】
本発明のこれらの態様およびその他の態様は、以下の図を参照することにより説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＳＤ特異的ＣＮＶを同定するために用いる方法論を描いたフローチャートである。
【図２】表３に記載のように、ＡＳＤ特異的ＣＮＶのゲノム全域分布を示す図である。
【図３】自閉症染色体再配列データベースで描かれているような、染色体１６ｐ１１．２領域を示す図である。
【図４】多数の新規の現象を有する発端者（ａ）、ＳＨＡＮＫ３遺伝子における再構成（ｂ）、女性保因者由来のＸ染色体の（ＰＴＣＨＤ１での）欠失（ｃ）、または関係のない新規の欠失に加えて遺伝性の転座（ｄ）を有する発端者、ＤＰＰ６遺伝子座での、関係のない発端者における、新規（ｅ）または遺伝性（ｆ）のいずれかのオーバーラップ現象、および関係のない発端者における、染色体１６ｐ１１．２での増加（ｈ）または減少（ｇ）のいずれかの再発性の新規の現象を含む、ＡＳＤの家系で観察されたＣＮＶの例を示す図である。
【図５】ＤＰＰ６およびＤＰＰ１０のＡＳＤ関連ＣＮＶの例を示す図である。
【図６】染色体２２ｑ１１．２および１６ｐ１１．２のＡＳＤ関連ＣＮＶの例を示す図である。
【図７Ａ−１】ＰＴＣＨＤ１遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図７Ａ−２】ＰＴＣＨＤ１遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図７Ｂ】ＰＴＣＨＤ１遺伝子のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】表７において同定されたＡＳＤ関連のミスセンス変異を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＰＴＣＨＤ１、ＳＨＡＮＫ３、ＮＦＩＡ、ＤＰＰ６、ＤＰＰ１０、ＤＰＹＤ、ＧＰＲ９８、ＰＱＢＰ１、ＺＮＦ４１およびＦＴＳＪ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を変化させることができる変異について、個人から得た生体試料をスクリーニングすることを含む、個人における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の危険性を決定する方法を提供する。かかる遺伝子は、本明細書では「ＡＳＤ関連」遺伝子と呼ぶ。
【００１９】
「自閉症スペクトラム障害」または「ＡＳＤ」の用語は、本明細書では、自閉症、アスペルガー障害、小児期崩壊性障害、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）およびレット症候群（ＡＰＡ ＤＳＭ−ＩＶ ２０００）などの個人の発達遅延を引き起こす、少なくとも１つの状態を呼ぶのに用いる。
【００２０】
個人におけるＡＳＤの危険性を決定する本方法では、個人から得た生体試料を利用する。適切な生体試料には、例えば、核酸含有試料またはタンパク質含有試料を挙げることができる。適切な生体試料の例には、唾液、尿、精液、その他の体液または分泌物、上皮細胞、頬細胞、髪などが挙げられる。非観血的に得た、かかる生体試料が本方法での使用に好ましいが、当業者は、例えば、血液、血清、骨髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、ならびに小脳、脊髄、前立腺、胃、子宮、小腸および乳腺試料由来の組織などの組織生検を含む、観血的に得た生体試料も、本方法で使用できることを理解されよう。かかる試料を得る観血的な方法についての技法は、当業者に知られている。本方法は、羊水および絨毛膜絨毛などの適切な生体試料を使用する、ＡＳＤの危険性のための出生前検査に利用することもできる。
【００２１】
一態様では、ＡＳＤに関連する変異を検出するために、選択した遺伝子をコードする核酸について、生体試料をスクリーニングする。試料をスクリーニングする前に、生体試料から核酸を抽出することが必要または好ましい場合がある。核酸の抽出方法は、当業者によく知られており、フェノールクロロホルム（Sambrookら、1989）、グアニジン含有溶液またはＣＴＡＢ含有緩衝液を利用する化学的抽出技法が挙げられる。なお、便宜上、市販のＤＮＡ抽出キットも、実験用試薬供給会社から幅広く入手でき、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）から入手できるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキットまたはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手できるＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ血液キットが挙げられる。
【００２２】
適切な核酸試料を得た後、ＡＳＤを示す遺伝的変異、すなわちＡＳＤ関連変異を検出するために、以下の具体的な実施例に記載されている方法などの、十分に確立したスクリーニング方法に試料を掛ける。ＤＮＡセグメント、例えば、約３００と５００ｋｂの間のＤＮＡセグメントなどの、約１ｋｂより大きいＤＮＡセグメントの増加および欠失を含む、ゲノムのコピー数多型（ＣＮＶ）などの変異、ならびに遺伝子のコード領域および調節領域の両方での配列変異を含む、ナンセンス変異、ミスセンス変異およびスプライス部位変異などの塩基対変異が、ＡＳＤを示すことが判明した。
【００２３】
ＣＮＶなどのＡＳＤ関連変異は、１本の染色体に制限されず、むしろＸ染色体、第１５染色体および第２１染色体などの多数の染色体上、ならびにＸｐ１１およびＸｐ２２などでの同じ染色体の様々な領域上でも検出されている。ＡＳＤに関連することを決定したＣＮＶの例には、ＰＴＣＨＤ１遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分を含む、染色体Ｘｐ２２上の欠失、染色体１５ｑ１１上の重複、およびＳＨＡＮＫ３遺伝子内での欠失が挙げられる。
【００２４】
異なる遺伝子における様々なタイプのゲノム配列変異が、ＡＳＤを示すものとして同定された。１０５ｋｂのイントロンの増加などのイントロンの増加、および４７８ｋｂのエクソンの減少などのエクソンの減少は、共に表１でより具体的に特定されているが、これらを含むＤＰＰ１０遺伝子におけるＣＮＶを同定し；エクソン２および３を含む６６ｋｂの減少、ならびにＤＰＰ６遺伝子全体を含むＣＮＶ、２７０ｋｂのエクソンの増加（エクソン１）、および１６ｋｂのイントロンの増加などの増加など、ＤＰＰ６遺伝子におけるＣＮＶ（表１を参照されたい）；２７６ｋｂの減少などのＳＨＡＮＫ３遺伝子におけるＣＮＶ；遺伝子全体の減少などのＤＹＰＤ遺伝子におけるＣＮＶを同定した。
【００２５】
一実施形態では、ＰＴＣＨＤ１の発現を阻害するゲノム配列変異が、ＡＳＤに関連している。「発現を阻害する」という専門用語は、転写および／または翻訳、ならびにＰＴＣＨＤ１タンパク質の活性のいずれか１つを、阻害または少なくとも低下させることができる配列変異を幅広く呼ぶ。例えば、ＰＴＣＨＤ１タンパク質の発現を少なくとも低下させる結果を引き起こす、コード領域の大きな欠失を含む、ＰＴＣＨＤ１遺伝子におけるＣＮＶが、ＡＳＤを示すことが判明した。ＣＮＶは特に制限されないが、ＣＮＶの欠失には、例えば、エクソン１の少なくとも一部分を含んでもよいが、さらに、全体的もしくは部分的なイントロン１、またはその上流領域の一部分もしくは複数部分などの周辺領域も含むことができる。
【００２６】
ＣＮＶ以外のゲノム配列変異もＡＳＤを示すことが判明したが、その変異には、例えば、タンパク質の発現にも影響し得る、タンパク質におけるアミノ酸の変化を引き起こすミスセンス変異が挙げられる。一実施形態では、ＡＳＤを示す、ＰＴＣＨＤ１遺伝子におけるミスセンス変異が同定されており、Ｐｔｃｈｄ１タンパク質における次のアミノ酸の置換：Ｌ７３Ｆ、Ｉ１７３Ｖ、Ｖ１９５Ｉ、ＭＬ３３６−３３７ＩＩおよびＥ４７９Ｇを引き起こすミスセンス変異が挙げられる。
【００２７】
個人におけるＡＳＤの危険性を決定するために、前述に示すようなＣＮＶおよびその他の変異を含む、多数のゲノム変異について、アレイ技術を適用して、スクリーニングすることが有利である場合がある。この点に関して、具体的な実施例で本明細書に例示するような十分に確立した技術を用いるゲノムのシークエンシングおよびプロファイリングを、評価対象の個人から得た適切な生体試料を用いて、ＡＳＤの危険性／診断についてその個人に対して実施することができる。ＡＳＤに関連する１つまたは複数の変異を同定することにより、ＡＳＤの危険性が示されると思われ、またはＡＳＤの診断を示すことができる。この解析は、評価されている個人の、例えば表現型特性を含む他の特性の評価と組み合わせて、実施することができる。
【００２８】
ＡＳＤに関連する遺伝子変異の決定を考慮して、ＡＳＤ関連遺伝子変異の産物の発現または活性を、個人から得たタンパク質含有生体試料において決定する、個人におけるＡＳＤの危険性を決定するための方法も提供する。遺伝子産物の異常なレベル、またはその活性の異常なレベル、すなわちＡＳＤではない健康な個人に存在するレベルと比較して低下または上昇したレベルは、ＡＳＤの危険性を示し、またはＡＳＤを示すことができる。したがって、ＰＴＣＨＤ１、ＳＨＡＮＫ３、ＮＦＩＡ、ＤＰＰ６、ＤＰＰ１０、ＤＹＰＤ、ＧＰＲ９８、ＰＱＢＰ１、ＺＮＦ４１およびＦＴＳＪ１の１つまたは複数の遺伝子産物のレベルおよび／または活性の決定は、個人におけるＡＳＤの危険性の決定、またはＡＳＤの診断に用いることができる。当業者であれば理解されるように、選択した遺伝子産物の存在および／または活性を同定および定量化するために、標準的アッセイを用いることができる。
【００２９】
本発明の実施形態を、以下の具体的な実施例を参照することにより説明するが、これを限定的であると解釈すべきではない。
【実施例１】
【００３０】
ＤＮＡ試料および集団の構造
本研究には４２６人のＡＳＤの家系が含まれていた。全ての発端症例は、自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）および自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）基準を満たすか、臨床の最良推定値（例えば非特許文献１参照）を満たした。これらのうち３２人が、細胞遺伝学的な染色体再構成を保因した。１８人は、トロントのＨｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｓｉｃｋ Ｃｈｉｌｄｒｅｎの小児診断センターおよびニューファンドランド州のセントジョンズに由来する４１２試料のうち３２８試料を核型分析することにより検出され、１４人は、核型異常を保因することがすでに分かっていた（この３２人の患者の情報については表１を参照されたい）。罹患した、および罹患していない同胞も評価し、５６％（２３７／４２６）がＡＳＤを有する１人の子供（単一性）を有し、４４％（１８９／４２６）がＡＳＤを有する２人以上の子供（多重性）を有した。ほとんどの症例を脆弱Ｘ染色体変異についてスクリーニングし（７５％）、検出された場合、その人たちは本研究に含めなかった。ほとんどの実験を、血液のゲノムＤＮＡで行い（８０％）、そうでない場合は、例えばリンパ芽球細胞系の細胞系をソースにした。集団の祖先を、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（非特許文献２、非特許文献３）を使用して評価した。
【００３１】
【表１】
2014155507.tif 000003
【００３２】
【表２】
2014155507.tif 000004
【００３３】
【表３】
2014155507.tif 000005
【００３４】
【表４】
2014155507.tif 000006
【００３５】
【表５】
2014155507.tif 000007
【００３６】
【表６】
2014155507.tif 000008
【００３７】
【表７】
2014155507.tif 000009
【００３８】
【表８】
2014155507.tif 000010
【００３９】
【表９】
2014155507.tif 000011
【００４０】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ５００Ｋアレイセット
各試料について、製造業者の取扱説明書にしたがって、以前に記載されたように（非特許文献４、内容は参照により本明細書に組み込まれる）、組み合わせた２つのチップＮｓｐｌおよびＳｔｙｌ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ＡｒｒａｙまたはＥａｒｌｙ Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用い、およそ５００，０００のＳＮＰの遺伝子型を同定した。簡潔には、２５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＮｓｐｌおよびＳｔｙｌの制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で消化し、アダプターに連結させて、ＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＤＮａｓｅＩで２５０ｂｐから２，０００ｂｐの範囲の大きさに断片化し、標識して、アレイにハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎでアレイを洗浄し、染色して、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７ＧおよびＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてスキャンした。データは、遺伝子発現オムニバスデータベースに提出している（登録はＧＳＥ９２２２）。標準的な臨床の診断プロトコールを用いて、核型を作成した。
【００４１】
コピー数多型の特徴付け
ＮｓｐｌおよびＳｔｙｌのアレイのスキャンを、ＤＮＡ Ｃｈｉｐ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｄＣｈｉｐ）（非特許文献５）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ用のコピー数解析（ＣＮＡＧ）（非特許文献６）、および遺伝子型解析マイクロアレイに基づくＣＮＶ解析（ＧＥＭＣＡ）（非特許文献７）を組み合わせて用い、コピー数多型について解析した。これらの各参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
ｄＣｈｉｐ（ｗｗｗ．ｄｃｈｉｐ．ｏｒｇ）を用いる解析を、約１００人からなる発端者バッチ（複数）に分けて、以前に記載されたように行った（非特許文献８）。簡潔には、不変集合の正規化方法を用いて、プローブ強度のレベルで、アレイのスキャンを正規化した。正規化の後、モデルベース法（ＰＭ／ＭＭ）を用いて、各ＳＮＰについて信号値を計算した。このアプローチでは、異常値検出のアルゴリズムによって画像アーチファクトを同定し、除去した。アレイの両セットについて、各ＳＮＰについて全ての試料にわたって、結果として生じる信号値の平均値をとり、二倍体ゲノムの平均の信号を得た。未処理のコピー数から、ＳＮＰごとに推定したコピー数を、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて評価した。
【００４３】
ＣＮＡＧ２．０版（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｍｉｎ．ｊｐ）を用いて解析するために、参照プールには全ての試料が含まれることになり、性別が一致する対照を用いて、自動的なバッチ式一対解析を行った。テスト試料を、参照プール内の全ての試料と比較し、シグナル強度の標準偏差に基づいて整合させた。各「テスト」試料についてのスキャン強度を、参照試料の平均強度（通常は５〜１２試料の平均）と比較して、未処理のコピー数変化を計算するのに用いた。次いで、内在するコピー数変化を、ＣＮＡＧに組み込まれている隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて推定した。
【００４４】
２つの指定されたＤＮＡ試料（ＮＡ１０８５１およびＮＡ１５５１０）を、全ての発端者の実験と対比較するための基準として用いたことは例外として、ＧＥＭＣＡ解析を本質的に記載されているように（非特許文献９）行った。両方の対比較実験に共通した、これらのＣＮＶのみを含めることによって、これらの結果をさらに選別した。
【００４５】
プローブの外側境界を用いる２つ以上のアルゴリズムによって、ＣＮＶが同じ個人において検出された場合、それらのＣＮＶを１つにまとめた。
【００４６】
対照および自閉症染色体再配列データベース（ＡＣＲＤ）
対照試料は、（ｉ）ドイツのＰｏｐＧｅｎプロジェクト（非特許文献１０）に由来する５００人のヨーロッパ人において観察されたＣＮＶ、およびオンタリオ集団に由来する１０００人のコーカソイド非疾患対照のコホートにおいて見出したＣＮＶ（２４を参照）からなっていた。８３４人の推定ＣＮＶ、またはゲノムにマップしたブレイクポイントを有するＡＣＲＤを確立した。少なくとも３つのプローブを含むＣＮＶが１０ｋｂより大きかった場合、およびＣＮＶの全長の少なくとも２０％が、対照と比較したときに固有であった場合、そのＣＮＶはＡＳＤに特異的であるとみなした。
【００４７】
ＣＮＶの検証実験および均衡型再構成ブレイクポイントのマッピング
ＡＣＣＮ１、ＣＦＴＲまたはＦＯＸＰ２遺伝子座（ＰＭＩＤ：１４５５２６５６）での対照を用いて、短い蛍光性断片の定量的多重ＰＣＲ（ＱＭＰＳＦ）（非特許文献１１）、またはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ１ベースのリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ＣＮＶ決定のＰＣＲ検証を行った。両方法のために、プログラムＰＲＩＭＥＲ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を用いてプライマーを設計した。ＦＩＳＨ（非特許文献１２）を用いて、均衡型再構成を最初にマップした。ＣＮＶの減少を記録するために、ｍｉｃｒｏｄｅｌプログラム（Ｋｏｍｕｒａら、ｉｂｉｄ）を用いた。
【００４８】
ＱＭＰＳＦのために、推定したＣＮＶ内の短いゲノム配列（１４０〜２２０ｂｐ）を、独自の塩基配列に対応する、染色標識したプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。各反応には、１７ｑ１１．２および７ｑ３１．２にそれぞれ位置する、ＡＣＣＮ１またはＣＦＴＲのいずれかに対応する、共増幅した対照の増幅産物も含まれていた。簡潔には、（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社がＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに製造した）ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、４０ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって最終量を２５μｌとして増幅した。最初のステップとして９５℃で５分間変性した後、２５回のＰＣＲサイクルを９４℃で３０秒間、アニーリングを６０℃で４５秒間、伸長を７２℃で３０秒間という条件で行った。最後の伸長のステップは７２℃で１５分間続いて起きた。ＱＭＰＳＦの増幅産物をＡＢＩ３７３０ｘｌＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上に分け、ＡＢＩ ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）ソフトウェア３．７版（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。対照の増幅産物を同じ高さに調整した後、テストＤＮＡから発生したＱＭＰＳＦパターンを、対照ＤＮＡのＱＭＰＳＦパターンと重ね合わせた。推定された各ＣＮＶの遺伝子座について、テストＤＮＡから得た基準化したピークの高さを、対照ＤＮＡの正規化したピークの高さで割って、コピー数の比率を決定した。ピークの比率が１．４より大きい、および０．７より小さいとき、それぞれコピー数の増加および減少を示した。少なくとも２つの独立したＱＭＰＳＦアッセイを、ＣＮＶの確認のために必要とした。
【００４９】
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを用いるリアルタイムｑＰＣＲ増幅を、Ｍｘ３００５Ｐ定量的ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）を用いて行った。非蛍光プライマーを、推定したＣＮＶ遺伝子座において、短いゲノム断片（＜１４０ｂｐ）を増幅するように設計した。各アッセイには、比較のために、７ｑ３１．１のＦＯＸＰ２に対応する対照の増幅産物の増幅も含めた。「Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、対照のゲノムＤＮＡと一体になったプライマーセットを最適化した後、７．５μｌの反応混合物、１．８μｌのプライマー、１．２ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡを６．０ｎｇ、１：５００で希釈した０．２２５μｌの参照色素、および０．４７５μｌの水を含む、９６穴プレート中の１５μｌの反応混合物中で、テスト試料をアッセイした。ＰＣＲの条件を９５℃で１０分間のポリメラーゼの活性化で構成し、後に４０サイクルを９５℃で１５秒間、ならびにアニーリングおよび伸長のために６０℃で１分間の単一のステップを続けた。次いでこれらのステップの後に、最後のサイクルを９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、および９５℃で３０秒間続けた。コピー数変化を計算するために、ＭｘＰｒｏ−Ｍｘ３００５Ｐソフトウェア（３．２０版Ｂｕｉｌｄ３４０）によって、標準曲線の定量化を解析した。変動係数（ＣＶ）を全試料のＣｔ値を元に計算し、ＣＶが１％より大きかったときの可能な異常値を除去した。推定されたＣＮＶ遺伝子座の平均量を、ＦＯＸＰ２上の対照の増幅産物の平均量で割った。１．４より大きく、０．７より小さい比率は、それぞれコピー数の増加および減少を示した。推定された各ＣＮＶ遺伝子座は、少なくとも２つの独立したアッセイを有した。
【００５０】
結果
ＡＳＤ症例における構造変異特性
３９４人の通常の特発性症例、および細胞遺伝学的異常を有するという予備知識に基づいて登録されたその他の３２人を含む、４２６人のＡＳＤの発端症例の全てを、ＣＮＶ内容について検査した。ＳＮＰの遺伝子型およびＣＮＶデータの両方でもっとも解像度の高い画像をもたらすので、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ５００ｋ ＳＮＰアレイを使用した。ＳＮＰを使用して、各試料の祖先を分類した（対照の選択を導くため）。試料のバックグラウンドは、９０．３％、４．５％、４．５％および０．７％が、それぞれヨーロッパ人、ヨーロッパ人／混血、アジア人またはヨルバ人であることが分かった。
【００５１】
ＣＮＶの発見を最大にするために、コーリング（calling）アルゴリズムを前述のように使用し（図１を参照されたい）、それらの間での共通の結果をまとめて、３３８９の独立したＣＮＶの「完全な」データセットを同定した（ゲノムにつき約８種のＣＮＶ、平均サイズは３９０ｋｂ）（以下の表４を参照されたい）。潜在的擬陽性の可能性を最小にするために、第２のデータセットを作り、それにより２つ以上のアルゴリズムによって、および／またはＮｓｐＩもしくはＳｔｙＩマイクロアレイ上の両方で、ＣＮＶを検出することを必要とした（非特許文献１３）。
【００５２】
この「厳密な」データセットは、１３１２のＣＮＶ（ゲノムにつき約３種のＣＮＶ、平均サイズは６０３ｋｂ）を含んでいた。ｑ−ＰＣＲを用いて、４８％（１２／２６）および９６％（４８／５０）のランダムのＣＮＶを、完全なコレクションおよび厳密なコレクションにおいてそれぞれ検証した。
【００５３】
【表１０】
2014155507.tif 000012
【００５４】
５００人のヨーロッパ人の対照試料を、かれらのＣＮＶ内容について検査し、類似のＣＮＶの数（完全なデータセット中の３６９５種、および厳密なデータセット中の１５５８種）を、ＡＳＤ症例中のものに見出した（表４）。これは、生殖系列染色体の不安定性が、重大に寄与する機構ではないことを示唆した。ＡＳＤのＣＮＶを次いで５００人のヨーロッパ人／コーカソイド対照、およびゲノム変異データベース（「疾患のない」集団における構造変異の保管庫）（非特許文献１４）と比較し、自閉症に特異的なＣＮＶのデータセットを確立した。次いでそれに続く解析では、詳細は以下の表３にある、２３染色体の全てにわたってマップした（図２）、厳密な自閉症特異的カテゴリーにおける２７６のＣＮＶに焦点を当てた。ＡＳＤに関連するさらなるＣＮＶデータも、表５の他のカテゴリー中にある（後述した）。
【００５５】
【表１１】
2014155507.tif 000013
【００５６】
【表１２】
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【００５７】
【表１３】
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【００５８】
【表１４】
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【００５９】
【表１５】
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【００６０】
【表１６】
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【００６１】
細胞遺伝学的に検出可能なＡＳＤにおける染色体異常の、広範囲にわたる普及の頻発、およびマイクロアレイのスキャンで均衡した異常を見つけられないことにより、核型分析の実行が促進した。核型分析（およびＦＩＳＨ）は、いくつかのＣＮＶ領域の染色体構成（例えば、環状染色体）を特徴付けること、すなわちマイクロアレイの使用だけでは不可能なこともできるようにした。したがって、血液が得られる３１３人の無作為の特発性症例を検査し、５．８％（１８／３１３）の症例が、均衡した（１１）または不均衡な（７）核型（全ての不均衡した核型変化（７）はマイクロアレイ分析でも発見され、ＣＮＶ統計に含まれる）を有することが分かった。全ＣＮＶのゲノムの特徴を、自閉症染色体再構成データベース（図３を参照されたい）に示している。本研究では、ＣＮＶの減少および増加は、通常、標準の欠失または重複と同じであろう。いくつかの症例では、ある遺伝子の部分のみの重複により、その破壊が引き起こされる場合があり（表５）、遺伝子発現への位置的な影響も考慮しなければならない。
【００６２】
新規、オーバーラップ／再発性、および遺伝性の構造変異体
もし、ＡＳＤ症例で見つかった構造変異体が対照になければ、それらの変異体を、（ｉ）元々新規（２５症例）（以下の表５を参照されたい）、（ｉｉ）２つ以上の関係のない試料におけるオーバーラップ（１３遺伝子座で２７症例）（以下の表７を参照されたい）、（ｉｉｉ）２つ以上の関係のない試料における再発性（２遺伝子座で４症例）（同じブレイクポイント）、（ｉｖ）または遺伝性（残り）と、病因の可能性で最初に優先順位付けをした。原則証明解析では、それぞれカテゴリーｉ、ｉｉ、ｉｉｉおよびｉｖ中の既知のＡＳＤ遺伝子座：ＮＬＧＮ４および２２ｑ、１５ｑ、ＳＨＡＮＫ３ならびにＮＲＸＮ１でＣＮＶを発見した。対照で発見したＡＳＤの構造変異体（例えば、ＮＲＸＮ１）も関与し得た。
【００６３】
【表１７】
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【００６４】
【表１８】
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【００６５】
【表１９】
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【００６６】
親のＤＮＡを試験し、ＣＮＶを検証することによって、７．１％（４／５６）および２．０％（１／４９）の新規の変異率を、特発の単一性および多重性の家系でそれぞれ観察した。細胞遺伝学的異常を保因することを発見した、１８症例のうち１３症例については親の情報があり、これらのうち７症例（単一性が６、多重性が１）が元々新規であった。これらのうちたった１／７（単一性の家系に由来）が均衡であり、遺伝子を直接妨害していたため、この再構成の種類は、本コホートにおける新規の構造の合計変異率への関与が、ＣＮＶよりずっと小さいことが予測された。
【００６７】
集めたデータは２５の新規の症例を同定し（表５）、３つのうち２つ以上の現象を同定した。とりわけ、ＳＫ０１５２の家系（図４ａ）では、４つの新規の現象があった。ＭＭ０１９（図４ｂ）では、２つの新規の欠失があり、１つはＳＨＡＮＫ３のハプロ不全を引き起こしていた。
【００６８】
ＡＳＤに特異的なＣＮＶにオーバーラップすることを発見した１３の遺伝子座は、それらが２組以上の関係のない家系で生じるため、おそらくＡＳＤ感受性を示しているであろう。６つの遺伝子座では、しばしば遺伝子全体を含む増加および減少が、同じ遺伝子座で観察され（表６）、一般的な遺伝子の調節不全が関与していることを示唆した。
【００６９】
ｑ−ＰＣＲを用いるか、ＳＮＰパターンを評価することによって、１９６の遺伝性ＣＮＶ（９０が母系性、１０６が父系性）を確認した。これらのサブグループ化で、明らかな親起源の影響（検出された染色体１５ｑ１１−ｑ１３の２つの重複は共に元々新規であった）を実際に示すものはなかった。発端者およびその二卵性双生児の兄弟においてＰＴＣＨＤ１欠損を引き起こす、１６０ｋｂの欠失を、保因者である母親から遺伝した男性で検出した（図４ｃ）。明らかに均衡した遺伝性の転座が、子孫における新規の欠失に付随して起こる事例もあった（例えば、ＤＰＹＤ）（図４ｄ）。
【００７０】
同定された候補ＡＳＤ感受性遺伝子および遺伝子座
同定された新しいＡＳＤ候補は、ＡＮＫＲＤ１１、ＤＬＧＡＰ２、ＤＰＰ６、ＤＰＰ１０、ＤＰＹＤ、ＰＣＤＨ９およびＰＴＣＨＤ１を含む、その遺伝子に特異的な構造変化（新規の、もしくは２つ以上の関係のないＡＳＤ症例で見つかったもののいずれか、またはＸ染色体について、罹患していない保因者から母系遺伝した対立遺伝子）を有するものであった（表５および６）。前述の通り、ＮＬＧＮ４、ＳＨＡＮＫ３およびＮＲＸＮ１も同定した。ＤＧＶ（ゲノム変異データベース）中の対照において、ＰＣＤＨ９およびＮＲＸＮ１遺伝子もＣＮＶとして見出される。
【００７１】
同定されたさらなる位置的な候補遺伝子は、ＮＥＧＲ１、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＧＡＢＲＧ１、ＫＬＨＬ３、ＳＴＫ３、ＳＴ７、ＳＡＴＢ２を含め、均衡した細胞遺伝学的ブレイクポイントによって妨害されていることが分かった遺伝子であった（表１）。その上、厳密なデータセット中の７７のＣＮＶは、関与の証拠となる第２の系を提供する、自閉症染色体再配列データベースとオーバーラップした（図２）。例えば、Ｘｐ１１．２３−１１．２２での４．６Ｍｂの新規の重複を、女性ＳＫ０３０６−００４（表５）およびデータベース中の男性で検出した。
【００７２】
ＤＰＰ６およびＤＰＰ１０は、位置的および機能的な候補として明らかになっている。ＤＰＰ６（２ｑ１４．１にある約１．５Ｍｂの大きさ）およびＤＰＰ１０（７ｑ３６．２にある約１．３Ｍｂの大きさ）は、Ｋｖ４．２チャンネル（ＫＣＮＤ２）の発現およびゲート開閉に影響する、アクセサリー膜貫通ジペプチジルペプチダーゼ様サブユニットをコードする。Ｋｖ４．２チャンネルは、ＳＨＡＮＫ３およびＮＬＧＮ遺伝子産物が見つかる同じ部位の、グルタミン酸作動性シナプス中で、神経伝達物質の放出、および神経細胞の興奮性の調節に働く。さらに、自閉症の均衡したブレイクポイントは、７ｑ３１のＫＣＮＤ２付近にマップされている。
【００７３】
ＤＰＰ１０については、遺伝性のＣＮＶ増加および減少が存在する（表５、図４）。新規で遺伝性のＣＮＶを、多重転写物ＤＰＰ６遺伝子で発見した。エクソン２およびエクソン３を含む、６６ｋｂの新規の減少は、家系ＮＡ０００２の男性で見つかる（図４ｅ）。家系ＳＫ０１９０では、男性発端者および罹患していない女性姉妹の両方が、ＤＰＰ６全体を含む、罹患していない母から遺伝したＣＮＶ増加を保因する（図４ｆ）。（機能性遺伝子を破壊することができる）第１エクソンにわたる２７０ｋｂの増加を、ＳＫ０１１５−００３で発見した。ＳＫ００５８−００３は、母系遺伝性の１６ｋｂのイントロンのＣＮＶ増加を保因する（表１、図５）。
【００７４】
遺伝医学
ワーデンブルグ型ＩＩＡ（３ｑ１４．１）、発話および言語障害（７ｑ３１）、精神遅滞（ＭＲ）（１５ｑ２３−ｑ２４、１６ｐ１１．２）および口蓋心臓顔面症候群（ＶＣＦＳ）（２２ｑ１３）をとりわけ含む、遺伝医学的な状態に関与する、構造変異体のオーバーラップ遺伝子座を同定した（表５）。これらの遺伝子座において構造変異体を同定することにより、臨床の再評価、およびさらなる症候性の特色について、診断の同定または改良のいずれかをもたらした。その他の事例（例えば、ＳＫ０１８６−ＰＴＣＨＤ１の欠失）（図４ｃ）により、家系全体の再テストが促進され、以前に診断未確定の同胞における軽症のＡＳＤの診断がようやく促進された。次いでこの家系を、単一性とは反対に多重性と再指定した。
【００７５】
２人のＡＳＤの兄弟において、２２ｑ１１．２の新規の欠失（２．７Ｍｂ）を同定することにより、かれらの再検査およびＶＣＦＳについての診断につながった。再テストにより、兄弟がＡＳＤスペクトラムとは正反対の位置関係にあることもさらに定義した（図６）。その他の２組のＡＳＤの家系（ＳＫ０２８９およびＳＫ００９１）において、この同じ領域のより大きな重複（４．３Ｍｂ）は、ＶＣＦＳを引き起こさなかった（表６）が、ＳＫ００９１では、この変異が正常な父親から遺伝し、罹患した男性兄弟では見つからなかった。
【００７６】
２組のＡＳＤの家系（ＳＫ０１０２およびＮＡ０１３３）における、１６ｐ１１．２の再発性の約５００ｋｂの重複（図４および図５）も発見した。ＤＰＰ６／ＤＰＰ１０および２２ｑ１１．２と同様に、ＡＳＤではなくてこれらの構造の変異をもつ保因者が存在した。３組目の家系（ＭＭ００８８）では、発端者はより大きな６７６ｋｂの新規の欠失を有し、これは、２人のＡＳＤの同胞のうち１人のみで検出されている（図４ｇ）。
【００７７】
つまり、ゲノム全域スキャン手法を用いて、多数の新しい推定ＡＳＤ遺伝子座（表４および表５、図２）を同定した。一般的に、ＡＳＤ遺伝子座には、（ｉ）ＰＳＤで機能する遺伝子、（ｉｉ）および／または精神遅延に関与することが以前に示されている染色体領域を含み、（ｉｉｉ）遺伝子発現の調節不全を伴う遺伝子座が含まれる。
【００７８】
ＡＳＤの遺伝子座に関係しているＣＮＶは、ＳＨＡＮＫ３、ＮＬＧＮおよびＮＲＸＮ１−ＰＳＤの各遺伝子を含み、（完全なデータセットから、とりわけＰＣＤＨ９、ＲＰＳ６ＫＡ２、ＲＥＴを含む）ＤＰＰ６およびＤＰＰ１０にある新しい遺伝子座も同定した。
【００７９】
最後に、ＳＨＡＮＫ３およびＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群の遺伝子座にある遺伝子などで、遺伝子の領域での遺伝子発現が、発話および言語の発達、および／またはヒトの社会コミュニケーションに関連していることを示す、同じ遺伝子座のＣＮＶの増加または減少のいずれかを有する、６つの関係のないＡＳＤの症例を同定した（表６）。
【実施例２】
【００８０】
ＡＳＤのマーカーとしてのＰＴＣＨＤ１
上述したように、ＰＴＣＨＤ１遺伝子のエクソン１に及ぶ、染色体Ｘｐ２２．１１上のＣＮＶの欠失を同定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ５００Ｋ ＳＮＰ Ａｒｒａｙを用いるゲノムスキャンを使用した。ヌクレオチド位置１−３５９に及ぶエクソン１を、図７にボールド体で示す。ＰＴＣＨＤ１遺伝子のＣｄｎａ配列（ＮＭ＿１７３４９５）、および対応するコード化タンパク質のアミノ酸配列を図７に例示し、５９３２５のゲノムの大きさ、エクソン／７８３アミノ酸からなるタンパク質をコードする３つのコードエクソンを例示する。
【００８１】
この欠失が、男性発端者のＸｐ２２．１１上の約１５６ｋｂの欠失であることを決定した。このＣＮＶの物理的位置は、ｃｈｒＸ：２２，９６２，８００〜２３，１１９，０００（ＵＣＳＣ ２００４ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）である。欠失は、ＳＮＰのプローブｒｓ７０５５９２８およびｒｓ１９１８５６０（それぞれＸｐ終端から２２．９５６および２３．１３３Ｍｂにある）に挟まれている。欠失領域内で（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰマイクロアレイから）もっとも近位および遠位のＳＮＰは、ＳＮＰマイクロアレイ解析で決定したように、ｒｓ７８７９０６４（２３．１１９Ｍｂ）およびｒｓ４８２８９５８（２２．９７２Ｍｂ）である。欠失領域内からのＰＣＲ増幅産物を使用し、Ｑｐｃｒによって欠失を確認した（ＰＣＲプライマーおよび位置は以下の通りである）。この欠失は、ＰＴＣＨＤ１遺伝子のエクソン１全体に及ぶ（ＮＭ＿１７３４９５）。ＳｔｙおよびＮｓｐチップの両データを解析することにより、この現象を同定し、ＰＣＲおよびＱＰＣＲ技法を用いてさらに検証した。以下のプライマーを使用した。
ＰＴＣＨＤ−ＣＮＶ１Ｆ ＡＴＴＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＴＣＴＴ（配列番号１）
ＰＴＣＨＤ−ＣＮＶ１Ｒ ＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＣ（配列番号２）
ＰＴＣＨＤ−ＣＮＶ２Ｆ ＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣ（配列番号３）
ＰＴＣＨＤ−ＣＮＶ２Ｒ ＣＴＡＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＴ（配列番号４）
【００８２】
ＣＮＶがゲノム変異データベース（ＤＧＶ）およびその他の対照に存在しなかったとき、このＣＮＶは自閉症に特異的である。さらに、この欠失の分離は、家系において特徴付けられ、欠失がヘテロ接合型の母親から伝達されることを特定した。男性の兄弟も言語障害を有した。
【００８３】
Ｎ＝４００の自閉症患者における、ＰＴＣＨＤ１の変異スクリーニングは、通常の方法で行った。以下のプライマーを使用した。
ＰＴＣＨＤ１−ｘ１Ｆ ＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴ（配列番号５）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ１Ｒ ＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡ（配列番号６）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ１Ｂｆ ＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号７）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ１Ｂｒ ＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡ（配列番号８）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ２−Ｆ ＧＡＡＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡ（配列番号９）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ２−Ｒ ＡＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴ（配列番号１０）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ａ−Ｆ ＣＴＴＴＧＡＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号１１）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ａ−Ｒ ＧＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡ（配列番号１２）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ｂ−Ｆ ＴＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号１３）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ｂ−Ｒ ＡＧＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１４）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ｃ−Ｆ ＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣ（配列番号１５）
ＰＴＣＨＤ１−ｘ３ｃ−Ｒ ＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴ（配列番号１６）
変異スクリーニングにより、Ｉ１７３Ｖ変異が明らかになった。
【実施例３】
【００８４】
さらなるＡＳＤマーカーの同定
９００の関係のないＡＳＤ症例において、ＰＴＣＨＤ１のコード領域全体をシークエンスすることによって、６人の関係のないＡＳＤ発端者において、６つのミスセンス変異を同定した（表７、図８）。臨床的な詳細については表８を参照されたい。 
【００８５】
【表２０】
2014155507.tif 000022
【００８６】
【表２１】
2014155507.tif 000023
【００８７】
これらの全ての変異は、高度に保存されたアミノ酸の置換を引き起こし、罹患していない保因する母親から遺伝した。コンピューター内でのタンパク質モデリングに基づくと、３つの変異（Ｌ７３Ｆ、Ｉ１７３Ｖ、Ｖ１９５Ｉ）が、細胞膜の外側に位置する、予測されたアミノ酸ループに存在する。このループは、リガンドであるＨｈと相互作用することが推測される。別の変異である２つのアミノ酸の置換ＭＬ３３６−３３７ＩＩが、予測された膜貫通領域内に存在した。最後に、Ｅ４７９Ｇの変異が、予測された細胞質内のアミノ酸ループ内に存在した。６組のうち５組の家系において、これらの変異が表現型でわかれた。Ｉ１７３ＶおよびＶ１９５Ｉの変異については対照（４３９）、ＭＬ３３６−３３７ＩＩについては５００の対照、およびＬ７３ＦおよびＥ４７９Ｇについては２８２の対照を試験した。これらの変異は対照では存在しなかった。さらに、これらの変異が全て、男性発端者への母系遺伝であり、我々の対照集団では観察されなかったという事実は、これらの変異がＡＳＤに関連していることを示す。したがって、これらの変異が自閉症の病因に関与しており、おそらくその他の疾患に関連する遺伝子座との組合せにより、ＡＳＤの表現型を生じると仮定することは理にかなっている。
【００８８】
興味深いことに、表７／８に報告したＡＳＤの家系のうち２組（家系２および家系４）では、その他のＡＳＤ関連ＣＮＶを同定した。家系２では、Ｉ１７３Ｖの変異に加えて、ＤＰＹＤ遺伝子全体の欠失を引き起こす、１ｐ２１．３の約１．０Ｍｂの新規の減少を同定した（ＮＭ＿０００１１０．３）。ＤＰＹＤは、ピリミジン代謝に関与する律速酵素であるジヒドロピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）をコードする。完全なＤＰＤの欠損は、痙攣性障害、運動遅滞、およびもっとも頻繁な所見である精神遅滞を伴う、非常に多様な臨床結果を引き起こす。家系４では、Ｖ１９５Ｉの変異に加えて、ＤＰＰ６のエクソン３、およびＤＰＰ６タンパク質のＮ末端の終末側の３３アミノ酸の欠失を引き起こす、７ｑ３６．２の６６Ｋｂの新規の減少を同定した。これらの症例はＡＳＤへの２つの遺伝子の（ｄｉｇｅｎｉｃ）関与を証明する。
【００８９】
Ｇｌｉ２の発現を抑制するこれらのＰＴＣＨＤ１変異体の能力を、野生型と比較して、変異体において機能の減少が見られるかどうかを決定した。線維芽細胞ＮＩＨ１０Ｔ１／２にＣＭＶの空ベクター、ルシフェラーゼ遺伝子と融合したＧｌｉ応答性プロモーター（Ｇｌｉ２ ｐｒｏ）、β−Ｇａｌ（正規化）、およびＰＴＣＨＤ１変異体発現プラスミドをトランスフェクトした。少なくともＥ４７９ＧおよびＭＬ３３６−７ＩＩ変異体の機能の軽度の減少により、野生型と比較してＧｌｉ２の発現の増加が引き起こされた。
【図１】
2014155507.tif 000024
【図２】
2014155507.tif 000025
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014155507.tif 000028
【図６】
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【図７Ａ−１】
2014155507.tif 000030
【図７Ａ−２】
2014155507.tif 000031
【図７Ｂ】
2014155507.tif 000032
【図８】
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【配列表】
2014155507000001.app