(57)【要約】【課題】天然物由来の有効成分を用いることにより、副作用を伴うことのない安全安心な反芻動物用の血中コルチゾール上昇抑制剤等を提供する。【解決手段】ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した乳酸菌発酵物、及び、乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製したプロピオン酸菌発酵物を有効成分とすることにより、反芻動物用の血中コルチゾール上昇抑制剤等を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を有効成分としてなること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制剤。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
【請求項２】
下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を有効成分としてなること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制及び飼料摂取量減少・体重減少抑制剤。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
【請求項３】
反芻動物がウシであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
ウシが出生直後から３２か月齢までのウシであること、を特徴とする請求項３に記載の剤。
【請求項５】
ウシが出生直後から１２か月齢までの仔ウシであること、を特徴とする請求項３に記載の剤。
【請求項６】
該乳酸菌発酵物及び／又は該プロピオン酸菌発酵物が、該菌体破砕物及び／又は該菌体培養物を固液分離処理して得た発酵液、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
ホエー蛋白質誘導体が、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白質分離物（ＷＰＩ）、これらの酵素処理物から選ばれる少なくとも１以上であること、を特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤。
【請求項８】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＯＬＬ ２７１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）であること、を特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
プロピオン酸菌がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＥＴ−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１５）株であること、を特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１０】
下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を離乳期前及び／又は離乳期直後の反芻動物に１０〜５００ｇ／日・個体で経口投与すること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇を抑制する方法。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
【請求項１１】
反芻動物の飼料摂取量の減少及び／又は体重減少を併せて抑制すること、を特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制剤等に関する。詳細には、反芻動物のストレス環境下等における血中コルチゾール上昇を抑制し、及び／又は、反芻動物の飼料摂取量・体重減少を抑制する剤及び方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾールは、副腎皮質から分泌される糖質コルチコイドの一種であり、ストレスに敏感に反応して分泌量が増加することから、ストレスホルモンとも呼ばれている。
【０００３】
コルチゾールは炭水化物・脂肪・タンパク質代謝の制御に関わるホルモンであることから、生体には必須のホルモンであるが、過剰なストレスにより多量に分泌された場合、ヒトにおいて脳の海馬を萎縮させることが近年ＰＴＳＤ患者の脳のＭＲＩなどを例として観察されている（非特許文献１）。
【０００４】
そして、ヒトを含む哺乳動物のストレス予防治療法としては、加水分解コンキオリンやクロレラエキスを用いてストレスホルモン作用を緩和する方法（特許文献１）、生薬成分を用いる方法（特許文献２）などが開示されているが、当業界においては、簡便且つ効率的であり安全性も高いストレス改善ができる成分等の開発が引き続き求められている。これは、反芻動物（特に反芻家畜）を扱う業界においても同じことが言える。
【０００５】
一方、乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌発酵物の混合物は、生きている乳酸菌などを摂取させるプロバイオティクスとは異なり、動物自身の腸管内に生息する乳酸菌またはビフィズス菌を増殖させるプレバイオティクス効果を有することが知られており、家畜の体型改良効果やコクシジウム症予防治療効果などを発揮することも知られている（特許文献３、４）。また、プレバイオティクス効果を発揮する素材として、他にもオリゴ糖、酵母細胞壁成分（グルコマンナン）、酵母細胞膜成分（β−グルカン）といったものがある。しかし、いずれも血中コルチゾール濃度や飼料摂取量・体重に対する影響に言及しているものは現段階で見当たらない。
【０００６】
なお、乳酸菌発酵物を有効成分とする抗ストレス剤は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓで発酵させた酸乳を有効成分としたもの（特許文献５）、麦汁をラクトバチルス・ペントーサスで発酵させた麦汁発酵物（特許文献６）、ローヤルゼリーを乳酸菌（ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ストレプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属）で発酵させた乳酸菌発酵ローヤルゼリー（特許文献７）などが知られている。しかし、乳酸菌発酵物とプロピオン酸菌発酵物の混合物や、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを発酵菌としたものは知られていない。
【０００７】
また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉに属する乳酸菌、該乳酸菌含有物に、胃潰瘍の起因であって胃癌との関連も指摘されているＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（ピロリ菌）に対する抑制作用が発見されており（特許文献８）、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ菌体、その培養物、それから菌体を含む固形物を分離除去した培養物残渣等に、仔ウシをはじめとする仔畜に対する腸内菌そう改善作用、下痢防止作用があることも知られている（特許文献９）が、血中コルチゾール濃度や、飼料摂取量・体重に関する効果については知られていない。
【０００８】
さらには、プロピオン酸菌発酵物としては、例えばビフィズス菌増殖促進物質（Ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ：ＢＧＳ）を産生するＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＥＴ−３株を１０％ホエー粉還元液で発酵させた、プロピオン酸菌発酵物（Ｐｒｏｆｅｃ）などが知られている。
【０００９】
Ｐｒｏｆｅｃ中のＢＧＳの一つに、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＨＮＡ）がある。このＤＨＮＡは、微生物におけるビタミンＫ２（ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）の生合成中間体である。この物質はビフィズス菌のエネルギー代謝過程で生成したＮＡＤＨを効率的に再酸化することにより、増殖を促進する効果が知られている。
【００１０】
Ｐｒｏｆｅｃ（ＤＨＮＡ、ＡＣＮＱ：２−ａｍｉｎｏ−３−ｃａｒｂｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）は特定保健用食品として、ビフィズス菌を増やし、腸内環境を改善して、通じを良好に保つ旨の表示許可を得ているが（非特許文献２）、これを実際にウシ等に投与して血中コルチゾールの上昇を抑制する効果を確認した知見はなく、まして、飼料摂取量の低減や体重の低減を抑制することについては、何ら報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１０−１５０２１６号公報
【特許文献２】特開２００３−０４０７８９号公報
【特許文献３】特開２００９−０４４９７６号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／０２４４１３号
【特許文献５】特開平１０−０４５６１０号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５５７９０号公報
【特許文献７】特開２０１１−１１６６６６号公報
【特許文献８】特開２００１−０００１４３号公報
【特許文献９】特開２００４−３０５１２８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】第１２９回日本医学会シンポジウム記録集「うつ病」、１．うつ病の脳科学的研究：最近の話題（２００５年）
【非特許文献２】ＩＬＳＩ、Ｎｏ．８０、５〜１３（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、天然物由来の有効成分を用いることにより、副作用を伴うことのない安全安心な反芻動物用の血中コルチゾール上昇抑制剤等を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明者らは乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌発酵物が血中コルチゾール濃度、飼料摂取量、体重に与える影響について鋭意検討し、特定の乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌発酵物を有効成分として反芻動物に経口投与することにより、その血中コルチゾール上昇を抑制することに加え、飼料摂取量の減少抑制や体重の減少抑制をすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を有効成分としてなること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制剤。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（２）下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を有効成分としてなること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制及び飼料摂取量減少・体重減少抑制剤。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（３）反芻動物がウシであること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の剤。
（４）ウシが出生直後から３２か月齢までのウシであること、を特徴とする（３）に記載の剤。
（５）ウシが出生直後から１２か月齢までの仔ウシであること、を特徴とする（３）に記載の剤。
（６）該乳酸菌発酵物及び／又は該プロピオン酸菌発酵物が、該菌体破砕物及び／又は該菌体培養物を固液分離処理して得た発酵液、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上であること、を特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の剤。
（７）ホエー蛋白質誘導体が、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白質分離物（ＷＰＩ）、これらの酵素処理物から選ばれる少なくとも１以上であること、を特徴とする（１）〜（６）のいずれか１つに記載の剤。
（８）乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＯＬＬ  ２７１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９９９）であること、を特徴とする（１）〜（７）のいずれか１つに記載の剤。
（９）プロピオン酸菌がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＥＴ−３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１５）株であること、を特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載の剤。
（１０）下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を離乳期前及び／又は離乳期直後の反芻動物に１０〜５００ｇ／日・個体で経口投与すること、を特徴とする反芻動物の血中コルチゾール上昇を抑制する方法。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（１１）血中コルチゾール上昇抑制だけでなく、反芻動物の飼料摂取量の減少及び／又は体重減少を併せて抑制すること、を特徴とする（１０）に記載の方法。
【００１６】
（１２）下記する（Ａ）乳酸菌発酵物、及び、（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物を有効成分としてなること、を特徴とする反芻動物の飼料摂取量減少及び／又は体重減少抑制剤。
（Ａ）乳酸菌発酵物：
ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
（Ｂ）プロピオン酸菌発酵物：
乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、その濃縮物、その乾燥物、そのペースト化物、その液状物、その希釈物、その殺菌物から選ばれる少なくとも１以上。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、特定の乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌発酵物（プロピオン酸菌による乳清発酵物）を有効成分とする剤を反芻動物に経口投与するだけで、ストレス環境下等における反芻動物の血中コルチゾール濃度上昇を抑制することができ、輸送などによるストレスを軽減させることができる。さらに、反芻動物の飼料摂取量減少・体重減少も併せて抑制することができる。本発明は、出生直後から３２か月齢までの個体（特にウシ）に対して極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の試験における、仔ウシの輸送前から輸送２日後における血中コルチゾールの濃度変化を示す。なお、縦軸が血中コルチゾール濃度、横軸が経過時間を示し、黒丸が試験群、白丸が対照群を示す。
【図２】実施例１の試験における、仔ウシの輸送前から輸送３日後における仔ウシ用配合飼料（スターター）の摂取量を示す。なお、縦軸が輸送前を１としたときのスターター摂取量増加度、横軸が日数を示し、黒が試験群、白が対照群を示す。
【図３】実施例２の試験における、仔ウシの輸送前後における体重の減少率を示す。なお、縦軸が体重減少率（％）を示し、黒が試験群、白が対照群を示す。
【図４】実施例２の試験における、仔ウシの輸送前後における血中コルチゾールの濃度変化を示す。なお、縦軸が血中コルチゾール濃度を示し、黒が試験群、白が対照群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明においては、ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した発酵物、及び／又は、その発酵物の濃縮物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物の少なくともひとつ）、ペースト化物、液状物、希釈物、殺菌物から選ばれる少なくとも１以上（以下、これらを総称して乳酸菌発酵物と言う場合もある）と、乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製した発酵物、及び／又は、その発酵物の濃縮物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物の少なくともひとつ）、ペースト化物、液状物、希釈物、殺菌物から選ばれる少なくとも１以上（以下、これらをプロピオン酸菌発酵物あるいはプロピオン酸菌による乳清発酵物と言う場合もある）の両方を反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制剤等の有効成分として使用する。
【００２１】
乳酸菌発酵物、プロピオン酸菌発酵物の含有成分としては、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ又はＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを培養して得た発酵物（菌体、培地成分、代謝分泌物等を含む培養物全体）、それから分離した菌体の破砕物、該発酵物（菌体培養物）から菌体を含む固形物を固液分離処理により除去した発酵液（培養物残渣；培養液の混濁した部分ではなく澄んだ部分である培養上澄液を包含する）から選ばれる少なくとも１以上が挙げられる。本発明においては、これら発酵物中にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉが生菌として存在する必要がない（菌体成分、菌体分泌物から選ばれる１以上のみであっても充分な効果を奏する）ことが特徴である。
【００２２】
本発明の乳酸菌発酵物を調製する際に用いる発酵菌は、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌である。特に、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ ２７１６株を用いることが好ましい。
なお、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ ２７１６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、２０００年（平成１２年）１月１４日付けで国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９である。
【００２３】
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの培養方法は、ｐＨを一定範囲（例えばｐＨ４．０〜８．０）に保持して所定菌数に達するまで（例えば２０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃で２４〜４８時間程度）の中和培養を行う。この高濃度培養法では、菌体および代謝産物の多い培養物が得られる。その他の培養条件は、常法に従えば良い。
【００２４】
培地としては、ホエー蛋白質誘導体含有培地を使用するが、好適なＬ．ｇａｓｓｅｒｉの高濃度培養液は、ホエー蛋白質誘導体及び乳糖を含有する培地、特にホエー蛋白質誘導体及び乳糖を主成分とする培地を使用し、ｐＨを４．５〜７．０の範囲に保持して、菌数が１０８〜１０１１、好ましくは１０９から１０１０となるまで中和培養して得られる。なお、通常の培養方法の場合では、培養物中の菌数は１０９以下にしかならない。
【００２５】
ホエー蛋白質誘導体としては、ホエー蛋白質濃縮物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＷＰＣ）、ホエー蛋白質分離物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅ、ＷＰＩ）、これらの加水分解物から選ばれる少なくともひとつが使用され、市販品も適宜使用可能である。
【００２６】
ＷＰＣは、チーズやカゼインを製造する際に生じるホエーを限外濾過・ゲル濾過・乳糖結晶分離などの方法で処理し、蛋白質含量を通常３５〜８５％（固形分換算）まで高めたものである。ＷＰＩは、ＷＰＣと区別されるものであって、イオン交換法などの方法で蛋白質含量を９５％（固形分換算）程度まで高めたものである。
【００２７】
加水分解物としては、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ホエー、ホエー蛋白質から選ばれる少なくともひとつを、ペプシン、トリプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素等の酵素で処理した酵素処理物が使用される。
【００２８】
乳酸菌発酵物は、菌体成分及び／又は代謝成分（有機酸、ペプチド、オリゴ糖など）による生理作用を有し、また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉは、乳酸やバクテリオシンを産生するだけでなく、オリゴＤＮＡも産生し、これら産生物質の生理作用などが有機的に働いて本発明の効果を奏するものと、現時点では考えられている。
【００２９】
本発明に係る乳酸菌発酵物は、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ菌体由来成分、その他のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ由来物（代謝成分、分泌成分など）だけからなり、これをそのまま、あるいはこれに賦形剤（デンプン、デキストリン、乳成分、ケイ酸等）、飼料成分、飲料水等を添加したものも包含する。本発酵物は、液状、ペースト状、固体状のいずれの状態にもすることができる。
【００３０】
一方、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉによる乳清発酵物（Ｐｒｏｆｅｃ等）は、ヒトの腸内のビフィズス菌（ビフィドバクテリウム：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を特異的に増やすことから、特定保健用食品の関与成分として認可され、現在、実際に利用されている。
【００３１】
プロピオン酸菌による乳清発酵物としては、上記Ｐｒｏｆｅｃが使用できるほか、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉに属するプロピオン酸菌を乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地で培養し、得られた発酵物、単離した菌体の破砕物、培養液（培養上清）などを広く使用することができる。
【００３２】
Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉに属するプロピオン酸菌としては、ＢＧＳ産生菌が適宜使用され、その非限定例としては、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ６２０７、同ＡＴＣＣ  ８２６２、同ＩＦＯ  １２４２４、同ＩＦＯ  １２４２６、同ＩＦＯ  １２３９１が例示され、また、Ｐｒｏｆｅｃに使用されているＥＴ−３株も入手、使用可能である。
なお、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、２００２年（平成１４年）７月１１日付けで国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−８１１５である。
【００３３】
Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの培養は、乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地を使用すること（好ましくは１〜２０％、更に好ましくは５〜１５％）以外は、常法にしたがって好気的又は嫌気的（例えば、窒素ガス加圧下（０．５ｋｇ／ｃｍ２））培養によればよい。通常、２０〜４０℃、ｐＨ６〜８程度で液体培養すればよい。
【００３４】
なお、このようにして調製したＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉによる乳清発酵物も、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ菌体由来成分、その他のＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ由来物（代謝成分、分泌成分など）だけからなり、そのまま、あるいは賦形剤（脱脂粉乳、デンプン、穀粉、糖類等）、飼料成分、飲料水等を添加したものも包含する。本発酵物も、液状、ペースト状、固体状のいずれの状態にもすることができる。
【００３５】
本発明においては、通常、上記した乳酸菌発酵物とプロピオン酸菌発酵物を併用して用いるが、これらの発酵物は別々に使用してもよいし、両発酵物の混合物（共存物）を使用してもよい。乳酸菌発酵物とプロピオン酸菌発酵物の混合比は、１：１０〜１００：１が好ましく、１：５〜５０：１（乾物重量比）が更に好ましい。
【００３６】
なお、両発酵物の混合物は、これを有効成分として組成物とすることができる。当該組成物は、そのまま、あるいは賦形剤や飼料成分と混合して飼料として、反芻動物に経口にて投与・給与される。例えば、飲料水に混ぜたり、代用乳に混合したりすることができる。その投与量は後記するようにそれほど多くなく、反芻動物に負担がかからない点でも本発明は極めて特徴的である。
【００３７】
これら両発酵物の混合物としては、市販品も使用することができる。市販品としては、例えばラクトバチルス・ガッセリＯＬＬ ２７１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）発酵物とＰｒｏｆｅｃ（プロフェック：株式会社明治  商品名）の混合物を含有するプレビオサポート（明治飼糧株式会社登録商標、ＰＳ）が使用できる。
【００３８】
本有効成分の経口投与量としては、動物の体重１ｋｇあたり両発酵物の混合物として０．１〜５．０ｇ／日（好ましくは、動物の体重１ｋｇあたり０．４〜２．０ｇ／日）で、特に、出生直後〜３２か月齢までの個体に経口投与又は給与するのが好ましい。経口投与量が当該範囲より多い場合には、その効果という点において特段の問題はないが、当該範囲より少ない場合には、本発明の効果が十分発揮されない恐れがあるため好ましくない。例えば、仔ウシ（体重５０〜１００ｋｇ程度）を例とすると、１日あたり１０〜５００ｇ／頭、好ましくは２０〜１００ｇ／頭が好適な経口投与量として示される。
【００３９】
本発明の対象動物は、反芻動物である。特に、その乳あるいは乳加工品が食用となる反芻家畜が好適例として示され、例えば、牛（特にホルスタイン種、ジャージー種などの乳牛）、羊、山羊などであるが、これに限定されるものではない。その他、ラクダ、ラマなども例示され、特に、出生直後から３２か月齢程度の個体、好ましくは出生直後から１２か月齢程度の個体（仔畜）、更に好ましくは４日齢から１２０日齢程度の個体を対象とするのが好適である。
【００４０】
以上述べてきたように、本発明は、乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌発酵物の有用性に関して更に研究を重ねた結果、遂に完成されたものであって、乳酸菌培養物およびプロピオン酸菌発酵物の両方を有効成分とし、ストレス環境下等における反芻動物の血中コルチゾール上昇抑制及び飼料摂取量減少抑制・体重減少抑制をする技術を基本的技術思想とするものである。
【００４１】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例１】
【００４２】
ホルスタイン種新生仔ウシ（１４頭）に対し、出生直後から３日齢までＩｇＧを強化した人工初乳を与えた。４日齢より仔ウシを２群に分け、４２日齢に達するまで試験群（７頭）に乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌による乳清発酵物の混合物であるプレビオサポート（２０ｇ／日）を含有した代用乳を、対照群（７頭）に代用乳のみを給与した。試験期間中は、全ての動物に仔ウシ用配合飼料（スターター）を自由摂取させた。
４２日齢時において各群で健康状態の良い動物を６頭ずつ選抜して車両に乗せ、一般道１時間、高速道路３時間輸送し、輸送前後における血中のコルチゾール濃度とスターター摂取量を調査した。
【００４３】
なお、人工初乳は、ＩｇＧ含量が２６．７％（６０ｇ／２２５ｇ）のバイエルメディカル株式会社製品（商品名：ヘッドスタート、成分値：蛋白質４５％）を使用した。更に、代用乳は乳蛋白および植物性油脂を主原料とした明治飼糧株式会社製品（商品名：プレミアムメイラック、成分値：蛋白質２４％、脂肪２０％）を使用した。仔ウシ用配合飼料は、とうもろこしおよび大豆油粕を主原料とした明治飼糧株式会社製品（商品名：ミルキースターターＰＦ、成分値：蛋白質２５％、可消化養分総量７６％）を使用した。
【００４４】
試験の結果、試験群において輸送直後（輸送０時間）、輸送１日後、輸送２日後の血中コルチゾール濃度が対照群より低く抑えられていることが明らかとなった（図１）。また、スターター摂取量は、輸送１日後以降では対照群と比較して試験群に於いて有意に高くなった（図２）。従って、乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌による乳清発酵物の両方を哺乳中の期間（３８日間）に経口投与することにより、輸送後における血中コルチゾール濃度の上昇が抑制されると同時にスターターの摂取量が上昇し、輸送による影響を極めて少なくすることが示された。
【実施例２】
【００４５】
離乳直後（４２日齢）のホルスタイン種仔ウシ（１２頭）を２群に分け、試験群（６頭）に乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌による乳清発酵物の混合物であるプレビオサポート（１００ｇ／回）を含有した代用乳を２回給与し、対照群（６頭）には代用乳のみを２回給与した。この間、全ての動物に仔ウシ用配合飼料（スターター）を自由摂取させた。
給与終了後、全ての仔ウシを車両に乗せ、一般道１時間、高速道路３時間輸送し、輸送前後における血中コルチゾール濃度と体重を調査した。
【００４６】
なお、代用乳は乳蛋白および植物性油脂を主原料とした明治飼糧株式会社製品（商品名：プレミアムメイラック、成分値：蛋白質２４％、脂肪２０％）を使用した。仔ウシ用配合飼料は、とうもろこしおよび大豆油粕を主原料とした明治飼糧株式会社製品（商品名：ミルキースターターＰＦ、成分値：蛋白質２５％、可消化養分総量７６％）を使用した。
【００４７】
試験の結果、対照群において輸送直後における体重の減少率が平均５．５％であったのに対し、試験群では平均３．１％と低く抑えられた（図３）。また、輸送後における血中コルチゾール濃度は対照群と比較して試験群に於いて低く抑えられた（図４）。従って、乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌による乳清発酵物の両方を輸送前のわずか２回の経口投与により、輸送後における体重の減少が抑制され、更に血中コルチゾール濃度の上昇が抑制された。
【００４８】
以上より、本発明に係る乳酸菌発酵物及びプロピオン酸菌による乳清発酵物の混合物を４日齢から４２日齢程度の仔ウシに経口投与することにより、車両輸送時及び輸送後の血中コルチゾール上昇を抑制し、且つ、スターター摂取量減少、体重減少も抑制し、その輸送ストレスを軽減することが示された。
【００４９】
なお、本発明を要約すれば次のとおりである。
【００５０】
すなわち、本発明は、天然物由来の有効成分を用いることにより、副作用を伴うことのない安全安心な反芻動物用の血中コルチゾール上昇抑制剤等を提供することを目的とする。
【００５１】
そして、ホエー蛋白質誘導体含有培地でラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌を中和培養して調製した乳酸菌発酵物、及び、乳清（ホエー及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地でプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属するプロピオン酸菌を培養して調製したプロピオン酸菌発酵物を有効成分とすることにより、反芻動物用の血中コルチゾール上昇抑制剤等を提供することができる。
【受託番号】
【００５２】
本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ ２７１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９９９）。
（２）プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１１５）。
【図１】
2014172836.tif 000002
【図２】
2014172836.tif 000003
【図３】
2014172836.tif 000004
【図４】
2014172836.tif 000005