(57)【要約】【課題】酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物における酵素を安定化すること。【解決手段】４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを含む酵素組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを含む酵素組成物。
【請求項２】
４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを酵素と共存させることを特徴とする、酵素の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物は、その基質特異性や簡便性により様々な用途に応用されている。一例を挙げると、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などである。
【０００３】
上記のような酵素を含む組成物を長期間使用可能な状態にするためには、言うまでもなく酵素活性を安定的に保持する事が重要である。安定化法としては、これまで種々の方法が検討されてきた（たとえば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２４２５２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物における酵素を安定化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル（以下、ＡＡＱ−２とも記載する。）に、酵素を安定化する効果があることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のような構成からなる。
【０００７】
［項１］
４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを含む酵素組成物。
［項２］
４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカルを酵素と共存させることを特徴とする、酵素の安定化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により酵素が安定化するため、酵素の機能を利用した分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などの組成物を、長期間使用可能な状態にすることが出来る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（ＡＡＱ−２）
本発明に用いる４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル（ＡＡＱ−２）（ＣＡＳ番号２８９６−７０−０）は、同仁化学社、東京化成工業などから市販品を入手可能である。
【００１０】
（酵素組成物）
本発明の安定化の対象となる酵素は、その種類や濃度、存在形態などは特に限定されない。
例えば、酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物中に存在するものであれば、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などの組成物が例示できる。
これらの組成物は、既にそれぞれの産業分野において製造技術、利用技術が確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種組成物中に存在する酵素を安定化することができ、その態様は特に制限されない。
これらの試薬に適用する酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体とのコンジュゲート化等を受けることもある。
以下に、いくつかの産業分野を採り上げて例示する。
【００１１】
（分子生物学用途の分析用試薬）
分子生物学用途の分析用試薬や研究用試薬に用いられる酵素としては、特に限定されないが、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼが挙げられる。一般に、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼは基質との酵素反応により、発色、発光、または蛍光を生じ、定性、定量を可能とする。発色基質としては各種トリンダー試薬と４−アミノアンチピリン、テトラゾリウム塩類とフエナジンメトサルフェートなどの電子キャリヤー、ロイコ系試薬などの色素類などが利用できる。発光基質としてはＥＣＬ（電気化学発光）試薬や、蛍光物質である１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンなどが利用できる。
分子生物学用途の分析用試薬において、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼは、酵素標識化合物の状態であっても良い。例えば、抗体とコンジュゲート化されたもの、抗原とコンジュゲート化されたもの、色素やビオチン、またはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどの化合物を標識したもの等であっても、本書ではそれぞれペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに含まれる。
【００１２】
分子生物学用途の分析用試薬や研究用試薬に用いられる他の酵素としては、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲ、およびその周辺分野で用いられるＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、レポーターアッセイおよびその周辺分野で用いられるルシフェラーゼ、遺伝子操作やクローニングおよびその周辺分野で用いられるリガーゼ、ヌクレアーゼ、制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素、糖鎖解析およびその周辺分野で用いられる各種グリコシダーゼ、蛋白質解析およびその周辺分野で用いられる各種プロテアーゼなどが挙げられる。
【００１３】
（生体成分測定試薬）
生体成分測定試薬には、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬などが含まれる。また、広義には、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極なども含まれる。
【００１４】
例えば、酵素法による生体成分測定方法に用いる試薬であって、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬（以下、発色剤とも表記する。）系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する試薬が挙げられる。
このような生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）などの生体成分等を測定するための試薬が例示できる。
上記の系において、酸化還元系発色試薬は、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーの組み合わせ（いわゆるトリンダー試薬）、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
【００１５】
例えば、ＵＡ測定試薬は、ＵＡを基質とするウリカーゼの反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量するよう設計されているので、試薬にはウリカーゼおよびペルオキシダーゼが含まれる。
他方、ＣＲＥ測定試薬は、ＣＲＥを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを、さらにクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンをサルコシンオキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＣＲＥ濃度の定を可能にしている。したがって、この試薬には、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが含まれる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるＴＧ濃度の定量が可能になる。したがって、この試薬には、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼが含まれる。
このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、過酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。
【００１６】
ところで、これらの方法では、血清などの試料中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて、いわゆる消去系など種々の対策が検討され、克服されてきた。例えば、アスコルビン酸に対しては、試料にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させることにより消去できる。また、ビリルビンに対しては、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させることにより消去できる。
さらに、数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が試料に含まれることにより正誤差を発生するので、これらについても消去系が検討されている。代表的な方法は、測定対象物質に直接作用する酵素以外の酵素を試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去した後、測定対象物質に直接作用する酵素を反応系に追加して過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させると同時に、カタラーゼの作用を事実上停止させて比色定量する方法である。ＣＲＥ測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素（クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ）を試料に作用させて、反応中間体（クレアチンなど）に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるＣＲＥに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する（このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。）方法である。
このような方法を採用した試薬には、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、カタラーゼなどが含まれる。
【００１７】
上記の方法を実施するための手段としては、汎用の自動分析機（例えば、日立７１７０形自動分析機）に適用できるよう構成された液状試薬（またはキット）を用いる方法、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）を用いる方法、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサーを用いる方法など種々の形態が例示できる。
好ましくは、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第二試薬またはＲ２とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
【００１８】
ＡＡＱ−２の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい下限は２．０ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい上限は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。
【００１９】
２試薬系の場合、ＡＡＱ−２は第一試薬に添加することが好ましい。なぜなら、当初は予測できなかったことであるが、後述の実施例に記載したとおり、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を用いて生体成分を測定する方法において、反応系へのＡＡＱ−２の添加によりドブタミンの影響を回避できるからである。ドブタミンは強心剤として用いられる医薬品で、静脈注射により患者に投与されるため、血清などの体液に混入して測定値に影響を与える可能性がある。
すなわち、本発明は、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定方法におけるドブタミンの影響低減法、および／または、ドブタミンの影響を低減した生体成分測定方法（試薬）としての一局面も有している。
ここで、前記ドブタミン影響低減法の対象となる生体成分測定方法（試薬）は特に限定されない。たとえば上述のＵＡ、ＣＲＥ、ＴＧ、ＣＨＯなどの測定に用いられる生体成分測定方法（試薬）などが挙げられる。
前記ドブタミンの影響低減法等におけるＡＡＱ−２の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい下限は２．０ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましい上限は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。また、ドブタミンの影響低減法においては、２試薬系の場合、ＡＡＱ−２は上述のとおり第一試薬に添加することが好ましい。
上記の生体成分測定方法（試薬）は、以下の（１）〜（３）の成分を含むものであれば特に限定されるものではない。上記のとおり種々の形態をとることができ、その試薬組成などの構成は当業者であれば本明細書の説明に基づいて適宜設定することができる。
（１）ペルオキシダーゼ
（２）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（３）４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル
上記の生体成分測定方法（試薬）において、測定対象の生体成分を含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。なかでも、ドブタミン投与患者の体液（たとえば、血清・血しょうなど血液に由来する試料）を測定対象とした場合に、ドブタミンの影響が低減される効果が得られるという点で好ましい。
【００２０】
本発明の組成物には、緩衝液成分、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを添加してもよい。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・７日間、１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
【００２２】
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２９） ４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２） １０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．６ｇ／Ｌ
【００２３】
【表１】
2014155488.tif 000002
【００２４】
結果を表１に示す。ＡＡＱ−２を添加した実施例の方が、無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＡＡＱ−２添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。
【００２５】
（酵素活性測定法）
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）
下記条件下で1分間に1マイクロモルのアスコルビン酸を酸化する酵素量を1単位(Ｕ)とする。
試薬
（Ａ）１．０ｍＭアスコルビン酸溶液〔１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液を１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４溶液で１０倍希釈する〕（用時調製）
１０ｍＭのＬ−アスコルビン酸溶液は１７６ｍｇのＬ−アスコルビン酸（試薬特級，ＭＷ＝１７６．１３）を精秤し１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１．０ｍＭ  ＨＣｌ溶液１００ｍＬに溶解して調製する。
（Ｂ）１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液
（Ｃ）０．２Ｎ  ＨＣｌ溶液
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した蒸留水で溶解（６０Ｕ／ｍＬ以上）し、分析直前に０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（氷冷）で０．１５〜０．２５Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に下記反応混液を調製し、３０℃で約５分間予備加温する。
０．５ｍＬ  基質溶液（Ａ）
０．５ｍＬ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（Ｂ）
（反応混液のｐＨは５．６）
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３０℃で正確に５分間反応させた後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき２４５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（４）盲検は反応混液（１）を３０℃で５分間放置後、ＨＣｌ溶液（Ｃ）３．０ｍＬを加えて混和し，次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｂｌａｎｋ−ＯＤｔｅｓｔ）×４．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（１０．０×１．０×５（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．８２×希釈倍率
１０．０：アスコルビン酸の上記測定条件下（ｐＨ１．０）でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
【００２６】
ザルコシンオキシダーゼ（ＳＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．２Ｍサルコシン溶液〔１．７８ｇのサルコシン（ＭＷ＝８９．０９）を８０ｍＬの０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１．０ＮのＮａＯＨあるいはＨＣｌでｐＨを８．０に調整（２５℃）し，蒸留水で１００ｍＬとする〕
（Ｂ）０．１％４−ＡＡ水溶液（１００ｍｇの４−アミノアンチピリンを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｃ）０．１％フェノール水溶液（１００ｍｇのフェノールを１００ｍＬの蒸留水に溶解する）
（Ｄ）ペルオキシダーゼ水溶液〔２５ｍｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（１１０プルプロガリン単位／ｍｇ）を蒸留水１００ｍＬに溶解する〕
（Ｅ）０．２５％ＳＤＳ水溶液〔１．２５ｇのｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を５００ｍＬの蒸留水に溶解する〕
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した２．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し、分析直前に同緩衝液で０．０７−０．１７Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）下記反応混液を調製する（褐色瓶にて氷冷保存）。
５０ｍＬ  サルコシン溶液（Ａ）
１０ｍＬ  ４−ＡＡ水溶液（Ｂ）
２０ｍＬ  フェノール水溶液（Ｃ）
２０ｍＬ  ペルオキシダーゼ水溶液（Ｄ）
（２）反応混液１．０ｍＬを試験管に採り，３７℃で約５分間予備加温する。
（３）被検酵素溶液０．０５ｍＬを加え，反応を開始する。
（４）３７℃で正確に１０分間反応させた後，ＳＤＳ水溶液（Ｅ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液につき５００ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（２．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用い、上記同様に操作を行って吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍＬ）×希釈倍率）／（１３．３×（１／２）×１．０×１０（分）×０．０５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×０．９１７×希釈倍率
１３．３：Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１／２分子である事による係数
１．０：光路長（ｃｍ）
【００２７】
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＣＲＨ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）０．１Ｍクレアチン溶液〔１．４９ｇのクレアチン（ナカライテスク製）を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、１００ｍＬとする〕
（Ｂ）ＤＡＢ溶液（２．０ｇのｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを１００Ｐのジメチルスルホキシドに溶解させた後、濃塩酸１５ｍＬを加える）
被検酵素溶液：酵素を含む標品を予め氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、分析直前に同緩衝液で２．０〜３．０Ｕ／ｍＬに希釈する。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを採り、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１０分間反応させた後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）２５℃で２０分間放置後、４３５ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ａ）１．０ｍＬを３７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液（Ｂ）２．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率）／（０．３２１×１．０×１０（分）×０．１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×９．６５×希釈倍率
０．３２１：黄色色素のミリモル分子吸光係数（Ｆ／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０：光路長（ｃｍ）
【００２８】
カタラーゼ（ＣＡＯ）
下記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を加水分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
試薬
（Ａ）１０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．０（２５℃における）
（Ｂ）Ｈ２Ｏ２溶液  １６ｍＭ（０．１８２ｍｌの３０％（Ｗ／Ｖ）を１００ｍＬの（Ａ）で溶解する。））
（Ｃ）チタン試薬  １．０ｇのＴｉＯ２と１０ｇのＫ２ＳＯ４とを１５０ｍＬの濃硫酸とともに、マントルヒーター上で１８０−２２０℃で２−３時間混ぜる。混合液を冷却して、溶液部分を水で１．５Ｌに希釈する。
（Ｄ）酵素希釈液  （Ａ）を用いる。
手順
（１）試験管に基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを採り、２５℃で約５分間予備加温する。
（２）被検酵素溶液０．２５ｍＬを加えて混ぜる。
（３）２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて反応を停止させる。
（４）４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｔｅｓｔ）。
（５）盲検は基質溶液（Ｂ）０．２５ｍＬを２５℃で５分間放置後、チタン試薬（Ｃ）２．５ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．２５ｍＬを加えて調製する。（ＯＤｂｌａｎｋ）。
計算式
Ｕ／ｍＬ＝（ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０（ｍＬ）×希釈倍率）／（Ｆ×１．０×５（分）×０．２５（ｍＬ））＝ΔＯＤ×２．４×（１／Ｆ）×希釈倍率
Ｆ：１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在により生じるＴｉｔａｎｉｕ  ｃｏｌｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔの吸光係数（普通は約７．０であるが、既知濃度のＨ２Ｏ２の濃度を用いて、各々のロットにおいて決める。）
１．０：光路長（ｃｍ）
【００２９】
（実施例２）
実施例１に記載のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製して測定試薬とし、調製直後、３５℃・７日間保存後および３５℃・１４日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。
試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。
また、実施例１と同様に試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように塩酸ドブタミンを加え、塩酸ドブタミンを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
【００３０】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３１】
【表２】
2014155488.tif 000003
【００３２】
結果を表２に示す。ＡＡＱ−２を添加した場合、ドブタミンの影響については、３５℃、７日間および１４日間保存後も影響を回避できる結果であった。
実施例のブランク値および感度は、３５℃、７日間および１４日間保存後も良好であった。
【００３３】
（実施例３）
実施例１に記載のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるように塩酸ドブタミンを加え、塩酸ドブタミンを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していないクレアチニン測定試薬で同様の検討を行なった。
【００３４】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３５】
【表３】
2014155488.tif 000004
【００３６】
結果を表３に示す。比較例およびＡＡＱ−２の添加量が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下または５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の場合と比較し、添加量が１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの場合はドブタミンの影響を回避できる結果であった。添加量が２．０〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌの場合は、さらに好ましい結果が得られた。
【００３７】
（実施例４）
下記の尿酸測定試薬（ＵＡ）、中性脂肪測定試薬（ＴＧ）、総コレステロール測定試薬（ＴＣ）、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）の各々の第一試薬に、ＡＡＱ−２を試薬中終濃度で３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。
試料として、液状ネスコールＮ（アルフレサファーマ社）に試料中終濃度が２０μｇ/ｍＬとなるように塩酸ドブタミンを加え、塩酸ドブタミンを加えていない液状ネスコールＮを対照として影響度を確認した。
比較例として、ＡＡＱ−２を添加していない各測定試薬で同様の検討を行なった。
【００３８】
（試薬の調製）
尿酸測定試薬（ＵＡ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．０
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（同仁化学社製）  ０．４ｇ／Ｌ
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１）  ０．８Ｕ／ｍＬ
中性脂肪測定試薬（ＴＧ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ６．６
ＭｇＣｌ２    １ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩    １ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩    ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製）  ２００Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
ＡＳＯ（東洋紡績製ＡＳＯ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１）  ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２）  １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．６ｇ/Ｌ
総コレステロール測定試薬（ＴＣ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）  ３Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１）  １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２９）  ４０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９）  １３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン  ０．１４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１）  ４００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０２）  １０／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．６ｇ/Ｌ
ＨＤＬ−Ｃ測定試薬（ＨＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
ジギトニン（同仁化学社製）  ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）  ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．４ｇ／Ｌ
ＬＤＬ−Ｃ測定試薬（ＬＤＬ）
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）  ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）  ０．４ｇ／Ｌ
【００３９】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料に第一試薬を添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で所定の波長における吸光度を測定した。
各々以下のサンプル（Ｓ）、試薬量（Ｒ１、Ｒ２）、測定波長を用いた。（Ｓ/Ｒ１、Ｒ２/測定波長）
ＵＡ  ２．７μＬ  ／１２０μＬ、６０μＬ／  ６００ｎｍ
ＴＣ  １．５μＬ  ／１２０μＬ、６０μＬ／  ６００ｎｍ
ＴＧ  １．５μＬ  ／１２０μＬ、６０μＬ／  ６００ｎｍ
ＨＤＬ  １．６μＬ  ／１５０μＬ、５０μＬ／  ６００ｎｍ
ＬＤＬ  １．６μＬ  ／１５０μＬ、５０μＬ／  ６００ｎｍ
濃度の算出は、精製水および各項目の標準液の測定吸光度より算出して求めた。
各項目の標準液濃度は以下を用いた。
ＵＡ  ６．９ｍｇ／ｄＬ
ＴＣ  ２２１ｍｇ／ｄＬ
ＴＧ  １２４ｍｇ／ｄＬ
ＨＤＬ  ８９ｍｇ／ｄＬ
ＬＤＬ  ９１ｍｇ／ｄＬ
【００４０】
【表４】
2014155488.tif 000005
【００４１】
結果 表４に示す。比較例と比較し、いずれの試薬もＡＡＱ−２を添加した実施例では、ドブタミンの影響を低減できる結果であった。
【００４２】
（実施例５）
実施例１と同様の実験を、ＡＡＱ−２の濃度を１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で表５に記載のように変え、調製直後試薬の測定値を１００％として３５℃・１４日間保存後の試薬中の成分活性または残量を確認した。
【００４３】
【表５】
2014155488.tif 000006
【００４４】
結果を表５に示す。ＡＡＱ−２を添加した実施例の方が、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で無添加の比較例に比べ各酵素とも３５℃保存試薬中の酵素活性が高い結果となった。特にアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼについてはＡＡＱ−２添加により保存安定性が著しく向上する結果であった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
酵素の機能を利用した分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などの組成物に適用できる。