(57)【要約】【課題】ポックス・ウイルスのベクターを単離する方法を提供する。【解決手段】ゲルろ過および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含めた１つ以上のクロマトグラフの工程を使用する、ポックス・ウイルスを精製する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックス・ウイルスの粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供して、実質的に混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物を生成する工程を有してなる、ポックス・ウイルスを精製する方法。
【請求項２】
ポックス・ウイルスの粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供して、本質的に混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物を生成する工程を有してなる、ポックス・ウイルスを精製する方法。
【請求項３】
ポックス・ウイルスの粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供して、混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物を生成する工程を有してなる、ポックス・ウイルスを精製する方法。
【請求項４】
前記ポックス・ウイルスの粗調製物を最初にゲルろ過に供し、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成することを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ポックス・ウイルスの粗調製物をヌクレアーゼで処理し、かつ、ゲルろ過に供して、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成することを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ポックス・ウイルスを精製する方法であって、
混入物質と比較して、ポックス・ウイルスとマトリクスとの選択的相互作用を提供する条件下で、ポックス・ウイルスおよび少なくとも１つの混入物質を含むサンプルを、イオン交換クロマトグラフィーのマトリクスと接触させ、
前記ポックス・ウイルスを前記マトリクスから溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項７】
サンプルからポックス・ウイルスを精製する方法であって、
混入物質と比較して、前記ポックス・ウイルスと選択的に結合するイオン交換マトリクスを含む固体担体を提供し、
前記マトリクスを洗浄緩衝液で洗浄して混入物質を除去し、
前記結合したポックス・ウイルスを前記固体担体から溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項８】
前記溶出が、前記固体担体に結合した前記ポックス・ウイルスを、高濃度塩溶液に接触させることによって行われることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが細胞溶解物であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記固体担体がクロマトグラフィーカラムに提供されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ある程度精製されたサンプルからポックス・ウイルスを単離する方法であって、
（ａ）ポックス・ウイルスを含む、ある程度精製されたサンプルを提供し、
（ｂ）前記ある程度精製されたサンプルを、イオン交換マトリクスを含む固体担体と、前記ポックス・ウイルスが前記マトリクスと結合する条件下で接触させ、
（ｃ）前記結合したポックス・ウイルスを前記固体担体から溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項１２】
前記ある程度精製されたサンプルが、工程（ａ）の前に、硫安塩析、透析、サイズ排除分画法、密度勾配分画法、およびショ糖クッション超遠心分離法からなる群より選択される方法によって、ある程度精製されていることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記固体担体が、クロマトグラフィーカラムに提供されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させる工程が、溶液中で行われることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記イオン交換マトリクスが、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、および弱陽イオン交換体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記イオン交換マトリクスが、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＳＰセファロース（商標）ファスト・フロー、ＣＭセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローからなる群より選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記イオン交換マトリクスがＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養物からポックス・ウイルスを精製する方法であって、
ａ）ポックス・ウイルス含有細胞を採取し、
ｂ）前記細胞を崩壊させてポックス・ウイルスの粗調製物を生成し、
ｃ）前記ポックス・ウイルスの粗調製物をゲルろ過に供して、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成し、
ｄ）前記半精製したポックス・ウイルス調製物を、陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、精製ポックス・ウイルス調製物を生成する、
各工程を有してなる方法。
【請求項１９】
細胞培養物からポックス・ウイルスを精製する方法であって、
ａ）ポックス・ウイルスに感染した細胞を溶解させて、ポックス・ウイルスの粗調製物を生成し、
ｂ）工程ａ）で得られた前記ポックス・ウイルスの粗調製物を、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化したセファロース（商標）４ファスト・フローまたはセファロース（商標）６ファスト・フローの樹脂上でゲルろ過に供して、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成し、
ｃ）工程ｂ）で得られた前記半精製したポックス・ウイルス調製物を、ポックス・ウイルスが前記樹脂に吸着するように、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化したＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フロー樹脂上で陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、
ｄ）工程ｃ）において吸着された前記ポックス・ウイルスを、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０／１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２０】
工程ｂ）を行う前に、前記ポックス・ウイルスの粗調製物を清澄することを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
混入物質から組換えポックス・ウイルスのビリオンを精製する方法であって、
（ａ）ポックス・ウイルスのベクターを適切な宿主細胞内に導入し、
（ｂ）前記宿主細胞を培養してポックス・ウイルスのビリオンを産生し、
（ｃ）工程（ｂ）の宿主細胞から溶解物を調製し、
（ｄ）前記溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィーのマトリクスに通し、それによって前記前記組換えポックス・ウイルスを陰イオン交換クロマトグラフィーのマトリクスに結合させ、
（ｆ）前記陰イオン交換クロマトグラフィーのマトリクスから前記ポックス・ウイルスを溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）の溶解物が超音波分解によって調製され、工程（ｄ）を行う前に、前記溶解物がヌクレアーゼで処理されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）を行う前に、工程（ｃ）の溶解物がゲルろ過クロマトグラフィーに供されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の溶解物が超音波分解によって調製され、ゲルろ過を行う前に前記溶解物がヌクレアーゼ処理されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記イオン交換マトリクスが、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、および弱陽イオン交換体からなる群より選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
前記イオン交換マトリクスが、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＳＰセファロース（商標）ファスト・フロー、ＣＭセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローからなる群より選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
前記イオン交換マトリクスがＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
精製されたポックス・ウイルス調製物の生成方法であって、
（ａ）細胞培養サンプルからポックス・ウイルス採取物を入手し、
（ｂ）前記サンプルに含まれる細胞から細胞内のポックス・ウイルスを放出してポックス・ウイルスの粗調製物を生成し、
（ｃ）前記ポックス・ウイルスの粗調製物をろ過によって清澄し、
（ｄ）工程（ｃ）の調製物をヌクレアーゼで処理し、
（ｅ）工程（ｄ）の調製物をゲルろ過に供して、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成し、
（ｆ）前記半精製したポックス・ウイルス調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供し、精製ポックス・ウイルス調製物を生成する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２９】
工程（ｆ）が、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、および弱陽イオン交換体からなる群より選択されるイオン交換マトリクスを使用することを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｆ）が、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＳＰセファロース（商標）ファスト・フロー、ＣＭセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローからなる群より選択されるイオン交換マトリクスを使用することを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｆ）が、イオン交換マトリクスＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローを使用することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００８年２月１２日出願の米国特許出願第６１／０６５，４８４号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本願は、ポックス・ウイルスのベクターおよびアビポックス（例えば、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ）ベクターなどのベクターを単離する方法について記載する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスの精製には、さまざまな種類のクロマトグラフ法が用いられている。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ウイルスの精製に使用する、最も一般的なクロマトグラフィーカラム精製方法である。それは、ＨＩＶ−１（非特許文献１）、センダイウイルス（非特許文献２）、組換えアデノ随伴ウイルス（非特許文献３〜４）、およびレンチウイルス（非特許文献５）を含めた種々のウイルスを精製するために用いられる。陽イオン交換クロマトグラフィーもまた使用されている（非特許文献６）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ウイルス精製の一般的な方法となる可能性があることが証明された（非特許文献７）。組換えアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスは、結合および溶出方法のいずれか（非特許文献３）、またはフロースルー法（非特許文献８）において、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノ随伴ウイルスの精製に使用されている疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して単離されている。さらには、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）を使用して、モロニーマウス白血病ウイルスが首尾よく精製されている（非特許文献９）。親和性精製もまた、多くの種類のウイルス、特に、脂質エンベロープを有するものの精製に有用であることが示されている（非特許文献１０〜１２）。ヘパリン系の親和性クロマトグラフィー樹脂は、ウイルスの精製に使用されており、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（非特許文献１３〜１６）、および単純ヘルペスウイルス（非特許文献１７）が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Prior et al., 1995; 1996
【非特許文献２】Eveleth et al, 2000
【非特許文献３】Huyghe et al., 1995
【非特許文献４】Kaludov et al., 2002
【非特許文献５】Yamada et al., 2003
【非特許文献６】Gao et al, 2000
【非特許文献７】Braas et al., 1996
【非特許文献８】Snyder and Flotte, 2002
【非特許文献９】Kuiper et al., 2002
【非特許文献１０】Millipore Data Sheet
【非特許文献１１】O’Neil and Balkovic, 1993
【非特許文献１２】Tamayose et al., 1996
【非特許文献１３】Clark et al., 1999
【非特許文献１４】Zolotukhin et al., 1999
【非特許文献１５】Auricchio et al., 2001
【非特許文献１６】Summerford and Samulski, 1999
【非特許文献１７】O’Keeffe et al., 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当技術分野では、さらなる精製方法の改善が依然として必要とされている。このような目的で、ポックス・ウイルスの精製の改善方法を本明細書に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
限定はしないが、ゲルろ過および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含めた１つ以上のクロマトグラフの工程を使用する、ポックス・ウイルスを精製する方法を、本明細書に提供する。ある実施の形態では、ポックス・ウイルスは、アビポックス・ウイルス（例えば、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ）である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】１０Ｌ規模のＡＮＸイオン交換バッチ吸着の図。
【図２】さまざまな動作せん断速度についての最適動作ＴＭＰ。
【図３】さまざまなＴＭＰおよびせん断速度下におけるＴＦＦ性能（ルーメン内径０．５ｍｍ）。
【図４】さまざまなＴＭＰおよびせん断速度下におけるＴＦＦ性能（ルーメン内径１ｍｍ）。
【図５】さまざまなＴＭＰおよびせん断速度−清澄化したＡＬＶＡＣ／ＣＥＦの濃縮下におけるＴＦＦ性能。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
組換えまたは「野生型」のポックス・ウイルスベクター（例えば、ポックス・ウイルスの粒子、ビリオン）を精製する方法を提供する。ポックス・ウイルスの粗調製物（またはそれらの誘導体、例えば、半精製したポックス・ウイルス調製物）を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、混入物質のレベルが低減されたポックス・ウイルス調製物を生成する工程を有してなる。ポックス・ウイルス調製物とは、無傷のポックス・ウイルスの粒子またはビリオン（単純にポックス・ウイルスと称される場合がある）が存在しているものである。ポックス・ウイルスの粒子またはビリオンは、例えば、野生型、弱毒化、非組換え、または組換えされたものであって差し支えない。混入物質（例えば、非ポックス・ウイルス成分）は、無傷のポックス・ウイルス粒子またはビリオン以外の成分である。混入物質は、典型的には生物学的であり（例えば、緩衝液、賦形剤などを含まない）、例えば、非ベクターＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、遊離のベクターＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、非ベクターのペプチドまたはタンパク質、他の遊離のペプチドまたはタンパク質などが挙げられよう。一部の実施の形態では、本方法は、粗ポックス・ウイルス中に存在する、全タンパク質（ペプチドを含む）および／または全核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）混入物質の、およそまたは具体的に８０％〜９９％に至る除去を生じる。一部の実施の形態では、粗ポックス・ウイルス中に存在する、全タンパク質（ペプチドを含む）および／または全核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）混入物質の、およそまたは具体的に８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が除去される。
【０００９】
１つの実施の形態では、本方法は、ポックス・ウイルスの粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供し、実質的に混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物（「実質的に精製されたポックス・ウイルス調製物」）を生成する工程を有してなる。実質的に精製された調製物には実質的に混入物質が存在せず、ここで混入物質は、合計で、調製物のおよそまたは具体的に２０〜３０重量％未満になる（担体、賦形剤などを除く）。ある実施の形態では、調製物は実質的に精製され、ここで混入物質は、調製物全体の中に、またはポックス・ウイルス自体と比較して、合計で、およそまたは具体的に２０〜３０％、２０〜２２．５％、２２．５〜２５％、２５〜２７．５％、または３０重量％未満、存在する。調製物はまた、実質的に精製されているとみなされて差し支えなく、ここで少なくとも、ポックス・ウイルスの粗調製物中に存在する混入物質（ポックス・ウイルスの一部ではない）の、およそまたは具体的に８０％〜８９％は調製物から除去されている。
【００１０】
１つの実施の形態では、本方法は、ポックス・ウイルスの粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーに供し、本質的に混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物（「本質的に精製されたポックス・ウイルス調製物」）を生成する工程を有してなる。本質的に精製された調製物には本質的に混入物質が存在せず、ここでこれらの混入物質は、調製物の、およそまたは具体的に１０〜２０重量％未満である（担体、賦形剤などを除く）。ある事例では、本質的に精製された調製物の混入物質は、調製物全体の中に、またはポックス・ウイルス自体と比較して、合計で、およそまたは具体的に１０〜２０％、１０〜１２．５％、１２．５〜１５％、１５〜１７．５％または２０重量％未満である。調製物はまた、本質的に精製されているとみなされて差し支えなく、ここで少なくとも、およそまたは具体的に９０％〜９５％の混入物質が調製物から除去されている。
【００１１】
１つの実施の形態では、本方法は、ポックス・ウイルスの粗調製物を精製工程に供し、混入物質を含まないポックス・ウイルス調製物（「精製されたポックス・ウイルス調製物」）を生成する工程を有してなる。精製されたポックス・ウイルス調製物には混入物質は存在せず、ここで混入物質は、合計で、調製物の、およそまたは具体的に０〜１０重量％未満（担体、賦形剤などを除く）である。ある実施の形態では、調製物には混入物質は存在せず、ここでそれらの混入物質は、調製物全体の中に、またはポックス・ウイルス自体と比較して、合計で、およそまたは具体的に０〜１０％、７．５〜１０％、５〜７．５％、２．５〜５％、または１重量％未満である。調製物はまた、精製されているとみなされて差し支えなく、ここで少なくとも、ポックス・ウイルスの粗調製物中に存在する混入物質（ポックス・ウイルスの一部ではない）の、およそまたは具体的に９５％〜９９％、または１００％が調製物から除去される。
【００１２】
ポックス・ウイルスを精製する方法であって、ポックス・ウイルスおよび少なくとも１つの混入物質を含むサンプル（例えば、細胞溶解物）を、混入物質と比較して、ポックス・ウイルスとマトリクスとの選択的相互作用を提供する条件下で、イオン交換クロマトグラフィーのマトリクスと接触させ、ポックス・ウイルスをマトリクスから溶出させる、各工程を有してなる方法も提供する。「選択的相互作用」とは、例えば、ポックス・ウイルスを混入物質よりも効率的にマトリクスに結合させる条件下、またはポックス・ウイルスをマトリクスに結合させた状態を維持し、混入物質をマトリクスから放出させる洗浄および／または溶出条件下でサンプルをマトリクスに曝露するなど、任意の方法によって達成して構わない。これらの方法の幾つかでは、ポックス・ウイルスおよび混入物質を含有するサンプル（例えば、細胞溶解物）は、混入物質と比較してポックス・ウイルスと選択的に相互作用するイオン交換マトリクスと接触させ、結合したポックス・ウイルスをマトリクスから溶出させて差し支えない。ポックス・ウイルスをある程度精製されたサンプル（例えば、細胞溶解物、濃縮細胞溶解物）から単離する別の方法は：（ａ）ポックス・ウイルスを含むある程度精製されたサンプルを提供し；（ｂ）前記ある程度精製されたサンプルを、ポックス・ウイルスがマトリクスと結合する条件下で、イオン交換マトリクスを含む固体担体と接触させ；（ｃ）結合したポックス・ウイルスを固体担体から溶出する、各工程を有してなる。
【００１３】
ポックス・ウイルスの粗調製物（例えば、細胞溶解物または濃縮細胞溶解物）は、さらに精製する前にある程度精製して、ある程度精製されたサンプルを提供して差し支えない。次に、ある程度精製されたサンプルを、さらなる精製に供してもよい。ポックス・ウイルスが細胞中で培養され、ある程度精製された調製物が望ましい場合には、次の工程：ポックス・ウイルス含有細胞を採取し；例えば、酵素（例えば、トリプシンおよび／またはヌクレアーゼ）または他の方法によって細胞を溶解させるなどによって、細胞を崩壊し、ポックス・ウイルスの粗調製物を生成し；随意的に、例えば、遠心分離またはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって粗調製物を清澄し；ポックス・ウイルスの粗調製物をゲルろ過などの精製工程に供し、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成し；例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用して半精製したポックス・ウイルス調製物をさらなる精製に供し、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルス調製物を生成する、各工程を使用して差し支えない。ポックス・ウイルスの粗調製物および半精製したポックス・ウイルス調製物は、典型的には、それぞれ、合計で、調製物の、およそまたは具体的に３０重量％よりも多い混入物質（担体、賦形剤などを除く）を含みうる。典型的には、半精製したポックス・ウイルス調製物は、ポックス・ウイルスの粗調製物よりも、含有する混入物質が少ない。他の精製方法を含めて、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルス調製物を生成してもよい。
【００１４】
当業者は、多くの適切なゲルろ過マトリクス（ゲルろ過樹脂とも称される）を利用することができる。これらの樹脂としては、例えば、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）（登録商標）（例えば、Ｓ−１００ ＨＲ、Ｓ−２００ ＨＲ、Ｓ−３００ ＨＲ、Ｓ−４００ ＨＲ）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）（例えば、Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ（ヒドロキシアルコキシプロピル−デキストラン、Ｉ型、ＶＩ型、またはＩＸ型）、Ｇ−１０、Ｇ−１５、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−７５、Ｇ−１００）、「セファロース」（登録商標）（例えば、６Ｂ、ＣＬ−６Ｂ、４Ｂ、ＣＬ−４Ｂ、２Ｂ、ＣＬ−２Ｂ）、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）（登録商標）（例えば、３０、７５、２００）、スーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）（登録商標）（例えば、１２、６）、トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）（登録商標）ＨＷ（例えば、ＨＷ−４０、ＨＷ−５０、ＨＷ−５５、ＨＷ−６５、ＨＷ−７５）、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）（例えば、マトリクス Ａ、ＡｃＡ）などが挙げられる。好ましいゲルろ過マトリクスは、「セファロース」４ファスト・フローまたは「セファロース」６ファスト・フローでありうる。ゲルろ過マトリクスは、当技術分野で周知のように平衡化して差し支えない。例えば、ポックス・ウイルスの精製について本明細書に示すように、約７．０〜９．０のｐＨのトリス塩酸緩衝液（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ）が適切でありうる。ある実施の形態では、およそ７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０のｐＨが好ましいであろう。幾つかの他の実施の形態では、およそ９．０のｐＨが好ましいであろう。他のゲルろ過マトリクスおよび緩衝系の使用は当技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法の実施に適切でありうる。
【００１５】
当業者は、多くの適切なイオン交換クロマトグラフィーマトリクス（イオン交換樹脂とも称される）を利用することができる。イオン交換マトリクスは、例えば、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、および弱陽イオン交換体などの任意の利用可能なものから選択して差し支えない。典型的なマトリクスとしては、中でも、例えば、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＳＰセファロース（商標）ファスト・フロー、ＣＭセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローが挙げられる。好ましい溶媒はＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フロー樹脂であり、これを、例えば、約７．０〜９．０のｐＨのトリス塩酸緩衝液（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ）で平衡化して構わない。緩衝液としては、およそ７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０.のｐＨの１０ｍＭのトリス塩酸が好ましいであろう。他のイオン交換マトリクスおよび緩衝系の使用は当技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法の実施にとって適切でありうる。
【００１６】
本明細書に記載される方法の幾つかでは、溶出は、イオン交換マトリクスに結合するポックス・ウイルスを、溶出緩衝液と接触させることによって行われる。上述のように、ある実施の形態では、マトリクスおよび／または溶出システムは、ポックス・ウイルス選択性であることが好ましい。例えば、混入物質の大部分を樹脂から除去する予備的な溶出工程、続いて、ポックス・ウイルスの粒子をマトリクスから取り出す溶出工程を使用して差し支えない。別の方法として、または前述の溶出工程またはステップの１つ以上と組み合わせて、マトリクスに結合した混入物質を残留させると同時に、ポックス・ウイルスの粒子の大部分をマトリクスからあらかじめ除去する溶出工程を使用してもよい。また、混入物質を除去してマトリクスに結合した材料の大部分がポックス・ウイルスの成分になるように、洗浄工程も使用して差し支えない。そのような場合には、単一の溶出工程を用いて、結合したポックス・ウイルスの粒子を樹脂から除去して構わない。典型的には、塩溶液が溶出緩衝液として用いられる。溶出緩衝液には、任意の適切な塩を使用して差し支えない。ある実施の形態では、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が使用されうる。また、一部の実施の形態では、高塩濃度緩衝液が利用されうる。高塩濃度緩衝液は、典型的には、およそまたは具体的に３００ｍＭ、６００ｍＭまたは１Ｍの塩（例えば、ＮａＣｌ）である。例えば、溶出は、およそまたは具体的に３００ｍＭ、６００ｍＭまたは１ＭのＮａＣｌを含む、適切な緩衝液中で行って差し支えない。例えば、トリスＣＬ（例えば、５、１０、１５または２０ｍＭ）緩衝液などの任意の適切な緩衝液が用いられうる。ある実施の形態では、溶出は、高濃度の塩（例えば、３００ｍＭ、６００ｍＭ、または１Ｍ）を含む、およそまたは具体的に７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０のｐＨのトリスなどの緩衝液を使用して行われることが好ましい。他の溶出緩衝液の使用は当技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法の実施に適切でありうる。
【００１７】
細胞溶解物などのある程度精製されたサンプルを、例えば、硫安塩析、透析、サイズ排除分画法、密度勾配分画法、ショ糖クッション超遠心分離を含めた任意の幾つかの手段に供するか、または酵素に曝露して差し支えない。典型的な酵素としては、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）、または他の酵素が挙げられる。これらの手法のいずれかを、任意の他の手法の前に、単独で、または組み合わせて使用して差し支えなく、サンプルをイオン交換クロマトグラフィーに供して、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルスの調製物を生成する前に、用いてもよい。
【００１８】
本明細書に記載される方法は、ウイルスを単離するために用いられて差し支えなく、限定はしないが、ポックス・ウイルスが挙げられる（Smith, et al.  1983, Gene, 25 (1): 21-8; Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38; Moss, et al.  1991.  Science, 252: 1662-1667）。典型的なポックス・ウイルスは、ワクシニアおよびそれらの誘導体であり、とりわけ、ＮＹＶＡＣおよび修飾アンカラウイルス（ＭＶＡ）、アビポックス、鶏痘、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ（２）が挙げられる。ポックス・ウイルスは、ポックス・ウイルスゲノムが内部に外因性の核酸配列を含むことを意味する、組換えでありうる。組換えポックス・ウイルスは、例えば、組換えポックス・ウイルスの粒子（あるいは組換えビリオンと称される）の形態をとりうる。
【００１９】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、既知のまたは潜在的な病原因子をコードするゲノムの必須でない６つの領域を欠失させることにより、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株から誘導された（例えば、米国特許第５，３６４，７７３号および同第５，４９４，８０７号明細書を参照のこと）。欠失遺伝子座はまた、外来遺伝子の挿入のための受容体遺伝子座として設計された。欠失領域は：チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）；Ａ型含有身体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）；血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）；宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）；および、大サブユニット、リボヌクレオチド還元酵素（Ｉ４Ｌ）である。ＮＹＶＡＣは、病原性および宿主域と関係のある遺伝子産物をコードする１８のオープン・リーディング・フレームの特異的欠失によって生じた、遺伝子操作されたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは、腫瘍抗原の発現に有用であることが示されている（例えば、米国特許第６，２６５，１８９号明細書を参照のこと）。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌｒｅｖｅｒｓｅ、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢもまた、ブダペスト条約の下、それぞれ寄託番号ＶＲ−２５５９、ＶＲ−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７９１２、およびＡＴＣＣ−９７９１４としてＡＴＣＣに寄託された。
【００２０】
修飾ウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）は、例えば、米国特許第５，１８５，１４６号および同第６，４４０，４２２号の各明細書に記載されている；Sutter, et al.  (B. Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84:195-200 (1995)); Antoine, et al.  (Virology 244: 365-396, 1998); Sutter et al.  (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851, 1992); Meyer et al. (J. Gen. Virol. 72: 1031-1038, 1991); Mahnel, ett al. (Berlin Munch. Tierarztl. Wochenschr. 107: 253-256, 1994); Mayr et al. (Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167: 375-390 (1987); およびStickl et al. (Dtsch. med. Wschr. 99: 2386-2392 (1974)）。ＭＶＡは、寄託番号ＶＲ−１５０８およびＶＲ−１５６６の下、ＡＴＣＣから入手可能である。
【００２１】
ＡＬＶＡＣ系の組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）もまた、本明細書に記載される方法を用いて精製して差し支えない（例えば、米国特許第５，７５６，１０３号明細書参照）。ＡＬＶＡＣ（２）は、ＡＬＶＡＣ（２）ゲノムが、ワクシニアプロモーターの制御下でワクシニアＥ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を含むことを除けば、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である（米国特許第６，１３０，０６６号明細書；Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬＶＡＣ（２）は、両方とも、ＴＡｓなどの外来ＤＮＡ配列の発現に有用であることが実証されている（Tartaglia et al., 1993 a,b ；米国特許第５，８３３，９７５号明細書）。ＡＬＶＡＣは、ブダペスト条約の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１所在）に、ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−２５４７として寄託された。
【００２２】
ＴＲＯＶＡＣウイルスもまた、本明細書に記載される方法を使用して精製して構わない。ＴＲＯＶＡＣとは、１日齢のひよこのワクチン接種として認可されている、鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン株から誘導されたプラーク−クローン化した分離株である、弱毒化した鶏痘のことをいう。ＴＲＯＶＡＣは、同様に、ブダペスト条約の下、ＡＴＣＣに寄託番号２５５３として寄託された。
【００２３】
本明細書に記載される方法で精製したウイルスを含有する医薬組成物もまた、本明細書に提供される。適切な医薬組成物は、典型的には、少なくとも、ウイルスおよび、薬学的に許容される担体および／または賦形剤（例えば、混入物質とはみなされないもの）を含みうる。本明細書では「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載の薬剤の送達を達成する、または促進するのに適切な１つ以上の製剤材料のことをいう。製剤は、緩衝液、塩、糖、および／または、当技術分野で周知の同様の化合物を含みうる。適切な組成物は、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与用に殺菌して調製した、殺菌懸濁液、シロップ、エマルション、またはエリキシル剤などの液体調製物を含みうる。加えて、組成物は、薬剤と同時投与または連続投与することができる。ヒトまたは他の哺乳動物に適切な日用量は、投与されるウイルスの種類、患者の病状、および他の因子に応じて大きく変化しうるが、日常的な方法を用いて決定して差し支えない。
【００２４】
本明細書に記載される方法を使用する、ウイルスを精製するための試薬を含めたキットもまた提供される。キットには、熟練者が本明細書に記載される方法を行いうるように、例えば、緩衝液、フィルタなどが含まれうる。さらに、キットには、本明細書に記載される方法を行うための使用説明書を含めてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される略語には次のものがある：ＣＰＥ：細胞変性効果；ＣＣＩＤ50：細胞培養感染用量５０％；ＣＥＦ：ニワトリ胚線維芽細胞；ＣＨＴ：セラミックハイドロキシアパタイト；ＣＩＭ：対流相互作用溶媒（Convective Interaction Media）；ＣＶ：カラム体積；ＥＢＡ：膨張床吸着；ＥＢ１４細胞株：ＶＩＶＡＬＩＳ社（フランス国所在）がニワトリ胚性幹細胞から誘導した安定した２倍体細胞株；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸；ＥＥＶ：細胞外エンベロープウイルス；ＥＬＩＳＡ：酵素免疫吸着測定法；ＦＢＳ：ウシ胎仔血清；ＦＦ：ファスト・フロー；Ｇ：遠心分離ユニット；ＧＥＱ：ゲノムの等価性；ＩＭＶ：細胞内の成熟ウイルス；ＬＭＨ：リットル／平方メートル／時間；ＭＯＩ：感染の多重度；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＱＴ３５：日本ウズラから化学的に誘発した線維肉腫；ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ：室温；ＴＦＦ：タンジェンシャルフローろ過；ＴＭＰ：膜間差圧；ＷＦＩ：注射用蒸留水。
【００２６】
細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ウイルス感染に起因する、細胞円形化および基質からの剥離、細胞溶解、融合細胞形成、および封入体形成などの細胞構造における形態学的変化の観察として定義される。ＣＣＩＤ50とは、植菌した細胞培養の所定のバッチの５０％を感染させるのに必要とされるウイルスの希釈のことをいう。アッセイは、細胞を破壊するウイルス粒子の存在および検出にかかっている。宿主細胞は、９６ウェルプレートにおける、一定分量のウイルス希釈物を加えた融合性の健全な単層で増殖させる。ウイルスが複製し、子孫ビリオンが放出されて、インキュベーションの間に健康な細胞を感染させる。ある期間にわたりＣＰＥを発現させて、各ウェルのＣＰＥの有無について記録する。単位体積あたりの感染単位で発現したウイルスの懸濁液の「力価」は、規定の条件下、感染または細胞変性効果の病巣を生じる能力のある、懸濁液中のウイルスの粒子の数の評価である。ポックス・ウイルスの力価は、使用する細胞の種類、感染の方法、およびインキュベーション条件に伴って変化するであろう。「ＧＥＱ」またはゲノムの等価性は、０．３フェムトグラムのＤＮＡと同程度の１ゲノム等価性を示した。
【００２７】
例示の目的で与えられる以下の実施例から、本発明およびその多くの利点がさらに良好に理解されよう。
【実施例】
【００２８】
本明細書に記載される方法は、ポックス・ウイルスなどのウイルスの精製に有用である。本方法は、ワクチンの安全性、一貫性および有効性についての規制上の要件を満たす、非アビポックスＤＮＡのレベルが低減された、ＡＬＶＡＣなどのアビポックス・ウイルスを含有する組成物を調製するための、クロマトグラフィーに基づいた精製方法である。以下に、ウイルスを精製するための材料、最適化実験、および幾つかの典型的な方法について説明する。
【００２９】
Ｉ．材料
３つの実施例に使用した緩衝液としては、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４；１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．０；１０ｍＭのトリス塩酸／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４；１０ｍＭのトリス塩酸／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０が挙げられる。用いた他の試薬としては、０．５Ｍ ＭｇＣｌ2、１Ｍ ＥＤＴＡ、ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ｉｎｃ．社製、カタログ番号１．０１６９４．０００２および１．１６９７．０００２）、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ１５２１）／ＥＢ１４採取物、ＡＬＶＡＣ黒色腫（ｖＣＰ２２６４）／ＣＥＦ採取物、Ｔｒｏｖａｘ／ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびＴｒｏｖａｘ／アヒル細胞株（Ｃｅｌｌ ＆ Ｖｉｒａｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ社製（カナダ国ＡｖＰ所在））が挙げられる。本明細書で使用したクロマトグラフのマトリクスとしては、「セファロース」４ＦＦ弱陰イオン交換体（例えば、ＡＮＸ「セファロース」４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、カタログ番号１７−１２８７−０１および１７１２８７−０４））、「セファロース」４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、カタログ番号１７−０１４９−０１および１７−０１４９−０５）、および「セファロース」６ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、カタログ番号１７−０１５９−０１）が挙げられる。
【００３０】
次に、以下に記載する方法に使用する機器の非限定的なリストを示す：ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）；ＢＰＧクロマトグラフィーカラム１００／５００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）；遠心分離機（Ｊｏｕａｎ社製ＫＲ４２２、機器番号ＣＥＮ１１２２ ＲＳＭ １１６７）；Ｅａｓｙ Ｌｏａｄ ＩＩ Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、モデル７７２００−０６２、およびモデル７５２９−１０）；冷凍庫、−７０℃（サンヨー社製、ＢＩＦ０３０９）；５μｍの深さのプロファイル・スターフィルタ（ＰＡＬＬ社製、カタログ番号ＢＹＡ０５０Ｐ６）；３μｍの深さのプロファイル・スターフィルタ（ＰＡＬＬ社製、カタログ番号ＢＹＡ０３０Ｐ６）；シリコーン製チューブ（３／１６インチおよび３／８インチ、Ｔｙｇｏｎ社製、カタログ番号ＡＢＷ００１３）；Ｖｉｒｓｏｎｉｃ６００超音波細胞破壊器（超音波処理装置）；Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ｆｌｏｃｅｌｌ連続流チャンバ；ＴＦＦカートリッジ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、モデル番号ＵＰＦ−５００−Ｃ−３×２ＭＡ）；オートクレーブ（Ｋｕｈｌｍａｎ社製、ＫＧ２１１９）、ミリポア社製ポリガードｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ５のデプスフィルタ（カタログ番号ＫＮ１ＨＡ０５ＨＨ１）；インキュベーター（サンヨー社製、ＩＤ番号２２６４、３８±１℃に設定）；および、水浴（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製、モデル番号Ｇ−５６０）。
【００３１】
ＩＩ．方法
Ａ．典型的な方法
本明細書に記載の精製方法は、ポックス・ウイルス系のワクチンの精製に有用である。このようなポックス・ウイルスとしては、限定はしないが、ＡＬＶＡＣ−２などのＡＬＶＡＣウイルスおよびそれらの誘導体が挙げられる。一般に、本方法は、次の工程を有してなる：
１．例えばバイオリアクターを使用して、細胞中に生じたサンプルからポックス・ウイルス採取物を入手し、その採取物を遠心分離によって濃縮する（すなわち１０倍）；
２．直接的な超音波分解による細胞破壊などの適切な方法によって細胞内のポックス・ウイルスを放出し、ポックス・ウイルスの粗調製物を生成する；
３．例えば、５μｍおよび３μｍのデプスフィルタを用いた逐次的ろ過などを使用して、前記ポックス・ウイルスの粗調製物を清澄する；
４．ベンゾナーゼ・ヌクレアーゼなどの試薬を使用して、前記清澄化したポックス・ウイルスの粗調製物内に存在する遊離のＤＮＡを分解する；
５．「セファロース」４ＦＦ／６ＦＦなどの適切なクロマトグラフのマトリクスおよび緩衝系を使用してゲルろ過することにより、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成する；
６．「セファロース」４ＦＦ（ＡＮＸ）などの適切なイオン交換マトリクスを使用して、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルス調製物を精製する；
７．ろ過（すなわち、タンジェンシャルフローろ過）によって緩衝液を濃縮および交換する。
【００３２】
本方法の特定の実施の形態を下記に記載する。そこに示すように、精製したポックス・ウイルス調製物（ＡＬＶＡＣ）は、ポックス・ウイルス採取物から首尾よく単離された。
【００３３】
Ｂ．ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶベクターの精製
例えばバイオリアクター中で生成したサンプルからのポックス・ウイルス採取物の入手、および遠心分離による濃縮（１０倍）
ＡＬＶＡＣ ＨＩＶを、バイオリアクター（例えば１０Ｌのバイオリアクター）において、鳥細胞系ＥＢ１４／０７４内で増殖させた。培養液を採取し、１Ｌの殺菌した遠心分離ボトル（７００ｍＬ／ボトル）に等分して入れ、Ｊｏｕａｎ ＫＲ４２２遠心分離機を使用して４０００×ｇで４０分間、４℃で遠心分離にかけた。上清を廃棄し、５０ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０（ボトルあたり）に細胞を再懸濁した。混合物を強攪拌し、１Ｌの殺菌したナルゲンボトルに移した。１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０を用いて、濃縮した材料の最終体積を、最初の採取体積の１／１０にし、１０倍（１０×）濃度の採取物を生成した。さらに使用するまで、濃縮採取物を−８０℃の冷凍庫に保管した。
【００３４】
２．ポックス・ウイルスの粗調製物の生成のため、直接的な超音波分解などによる細胞破壊などの適切な方法による細胞内のポックス・ウイルスの放出
注入／排出管を備えた超音波処理装置をオートクレーブにかけた。Ｅａｓｙｌｏａｄ ＩＩ Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプを超音波処理装置の注入ラインに接続した。２００ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０緩衝液を、５０ｍＬ／分の流量でポンプで送り出すことにより、超音波処理装置を平衡化し、ラインを結びつけた。１０×濃縮した採取物を、５０ｍＬ／分の流量で超音波処理装置にポンプで通した。サンプルが超音波処理装置の注入口に達したら、超音波処理装置を５５〜６５ワットの出力で起動させた。次に、超音波分解した採取物を、超音波処理装置の排出口を通じて滅菌ボトル内に回収した。これがポックス・ウイルスの粗調製物である。
【００３５】
３．例えば５μｍおよび３μｍのデプスフィルタを用いた逐次的ろ過を使用する、ポックス・ウイルスの粗調製物の清澄
注入／排出管に連結させて設置した５μｍ／３μｍのフィルタ（ＰＡＬＬ社製、ＢＹ０５０Ｐ６およびＢＹ０３０Ｐ６）をオートクレーブにかけた。Ｅａｓｙｌｏａｄ ＩＩ Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプを５μｍフィルタの注入ラインに接続した。２００ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０を２００ｍＬ／分のポンプ流量で、ポンプで送り込むことにより、デプスフィルタを平衡化した。超音波分解した採取物を、等量の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０緩衝液で希釈した。最大５００ｍＬの希釈採取物を、２００ｍＬ／分の流量、続いて４００ｍＬ／分の流量で、一連の５μｍ／３μｍのデプスフィルタ（５μｍ、続いて３μｍフィルタ）を通じてポンプで送り込み、残りのサンプルを回収した。５０ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０でデプスフィルタをすすぎ、ホールドアップサンプルを排出させた。さらに使用するまで、清澄化したポックス・ウイルスの粗調製物を−８０℃の冷凍庫に保管した。
【００３６】
４．ベンゾナーゼ・ヌクレアーゼなどの試薬を使用する清澄化したポックス・ウイルスの粗調製物内に存在する遊離のＤＮＡの分解
ベンゾナーゼ・ヌクレアーゼを、１０〜５０単位／ｍｌの最終濃度まで、あらかじめ選択された量の清澄化したポックス・ウイルス調製物に加えた。ＭｇＣｌ2（ヌクレアーゼ触媒）を、２．０ｍＭの最終濃度に至るまで加えた。混合容器内の成分を、マグネティックスターラー撹拌子で、２０±３℃で１〜２時間（特定の調製物に応じて決まる）混合した。消化の終わりに、５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを加え、酵素反応を停止させた。
【００３７】
５．「セファロース」４ＦＦ／６ＦＦなどの適切なクロマトグラフのマトリクスおよび緩衝系を用いたゲルろ過による半精製したポックス・ウイルス調製物の生成
カラム、アダプターおよびそれに関連する管類を、カラムに１Ｍ ＮａＯＨを充填することによって一晩浄化した。次に、ＮａＯＨを排出し、カラム、アダプターおよび関連するラインを２−カラム体積の注射用蒸留水（ＷＦＩ）ですすぎ、続いて、１−カラム体積の７０％エタノールで浄化した。次に、カラムを１０ｃｍのＷＦＩで満たすか、または緩衝液で平衡化し、所望の体積の樹脂（「セファロース」４ＦＦまたは「セファロース」６ＦＦ）をカラムに注ぎ、２０ｃｍの高さのカラムに充填した。ＷＦＩを「セファロース」４ＦＦまたは「セファロース」６ＦＦの溶媒と混合して均質な溶液を生成した。高さ調節ハンドルを使用して、最上部のアダプターを液体の表面の３〜１０ｃｍ上に配置した。最上部のアダプターの注入管をＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに取り付け、ポンプを通じて７０％エタノールを通し、ラインを浄化し、カラムネットを湿らせ、ＡＫＴＡシステムを用いて閉じ込められた空気を排除した。上部に１〜２ｃｍの透明な液体層が見えるまで、樹脂を静置した。最上部のアダプターを透明な液体層の下１〜２ｃｍまで下げて、アダプターのＯ−リングを封止した。カラム排出ラインをＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに取り付けた。カラムを充填するため、ＷＦＩまたは平衡緩衝液のいずれかを、ＡＫＴＡシステムを使用して、ポンプで、２３〜３０ｃｍ／時間の速度で送り出した。樹脂がおよそ２０ｃｍの高さまで充填されたら、最上部のアダプターを落ち着かせた樹脂床の上およそ０．５ｃｍまで下げ、封止調節ノブを時計回りに回転させてアダプターのＯ−リングを封止した。
【００３８】
すべてのバルブに側路を設けて、高流量における背圧を低減するように、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを適合させた。１００ｍＬの７０％ＥｔＯＨを用いて手動でサンプルのラインを浄化し、２００ｍＬのＷＦＩですすぎ、１００ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化した。上述のようにカラム充填し、すべての処理パラメータ（伝導性およびｐＨ）の曲線が安定するまで、樹脂を２−カラム体積の緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０）で１５〜２３ｃｍ／時間、平衡化した。生物学的に封じ込めた容器の内部のカラム上に負荷されるように、ＡＫＴＡのサンプルラインを清澄化したポックス・ウイルス調製物内に設置した。サンプルの負荷体積は、カラム体積の１５〜２０％であった。
【００３９】
ＢＰＧ１００（１．５Ｌの「セファロース」４ＦＦまたは６ＦＦ）クロマトグラフィーを、次のパラメータを有するあらかじめプログラムした方法下で行った：
・１５ｃｍ／時間の流量
・５０ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化
・サンプル負荷体積：カラム体積の１５％
・２−カラム体積の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で溶出
最初の溶出ピークは、７０〜９０％のウイルス（５００ｍＬ）を含むことを示し、これを５００ｍｌの殺菌したナルゲンボトル内に回収し、この半精製したポックス・ウイルスの調製物を、さらに使用するまで、４℃で保管した。
【００４０】
６．「セファロース」４ＦＦ（ＡＮＸ）などの適切なイオン交換マトリクスを使用した、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルス調製物の精製
適切な体積（ゲルろ過ウイルス含有画分の体積と等しい乾燥樹脂体積）のＡＮＸ「セファロース」４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、カタログ番号１７−１２８７−０１および１７１２８７−０４）樹脂スラリー（２０％エタノール中）を、２Ｌのナルゲンボトルに注ぎ（マグネティックスターラー攪拌子を含む）、樹脂を落ち着かせた。Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプを使用して２００ｍＬ／分の流量でポンプによって送り出すことにより、エタノールをを除去した。２−樹脂体積のＷＦＩで樹脂を２回洗浄後、２−樹脂体積の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０を用いて平衡化した（２回）。樹脂を落ち着かせ、２００〜５００ｍＬ／分の速度で、ポンプによって送り出すことにより、緩衝液を除去した。落ち着かせた樹脂に等量のサンプルを加え、２０±３℃で１時間混合した。樹脂を落ち着かせ、２００〜５００ｍＬ／分のポンプ速度でポンプによって送り出すことにより、結合していないサンプルをを除去した。次に、２−樹脂体積の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で樹脂を２回洗浄した。次に、樹脂を落ち着かせ、得られた洗浄サンプルを、２００〜５００ｍＬ／分のポンプ速度でポンプによって除去した。ウイルスを２−樹脂体積の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０／１Ｍ ＮａＣｌで３回、溶出させて、精製ポックス・ウイルス調製物を生成した。次に樹脂を落ち着かせ、溶出液を、２００〜５００ｍＬ／分の流量で、ポンプによって滅菌ボトル内に移した。５４μｍのフィルタ（ミリポア社製ポリガードＣＮ ｏｐｔｉｃａｌ ＸＬ５）を使用して、５００〜１０００ｍＬ／分のポンプ速度で、残留樹脂を溶出液から除去した。
【００４１】
７．ろ過（すなわち、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ））による緩衝液の濃縮および交換
ＴＦＦカートリッジの注入（供給）ラインをＭａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプに繋がる管に接続し、透過排出口の１つをクランプで固定した。カートリッジを通じて７０％エタノールをポンプで送り出し、カートリッジおよび関連するラインを一晩、溶解した貯蔵グリセロールに浸漬し、システムを浄化した。カートリッジを１０〜１２ＬのＷＦＩを用いて、２００ｍＬ／分のポンプ速度、０．２〜０．４バールの膜間差圧（ＴＭＰ）ですすぎ、エタノールを除去し、水分フラックスについて試験した。透過流量およびＴＭＰを測定することにより、清浄な水分フラックス試験を行った：
フラックス［リットル、平方メートル、時間（ＬＭＨ）／バール］＝
｛［透過流量（ｍＬ／分）／カートリッジ面積（ｍ2）］×０．０６｝／ＴＭＰ（バール）
フラックスは、分析証明書に示されるように、新しいカートリッジでは３９９ＬＭＨ／バールよりも大きくなくてはならない。カートリッジは、浸透ラインをクランプで固定することにより、０．５〜１Ｌの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０を、２００ｍＬ／分のクロスフロー流量で３０分間、循環させることによって平衡化した。８０００〜１００００秒-1のせん断速度および０．４〜１バールのＴＭＰで、溶出液の最初の体積の１／１０〜１／３までサンプルを濃縮した。３体積の１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で連続的なダイアフィルトレーションをすることにより緩衝液の交換を行った。ダイアフィルタにかけたサンプルを所望の体積まで濃縮した。浸透ラインをクランプ固定し、濃縮物を５〜１０分間、上記せん断速度で循環させた。濃縮サンプルの体積を回収し、測定した。２００ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で、上記せん断速度でポンプによる送り出しによってシステムを洗浄し、洗浄液を回収した。１Ｌの７０％エタノールを通すことによってシステムを浄化した。
【００４２】
この実施の形態の概要を次に示す：
【００４３】
【表１】
2014138622.tif 000002
【００４４】
８．ＤＮＡ抽出、ゲル電気泳動、および分析
Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡＢｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキットを用いて、本質的に上述の通りにＤＮＡ抽出を行った。基本的な手順の例外として：
１．Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（５０）（カタログ番号６９５０４）を使用した；
２．ＡＴＬ緩衝液、プロテイナーゼＫおよび２−メルカプトエタノール（ＳＯＰのように）および出発物質サンプルを含む組織溶解工程には、２−メルカプトエタノールを使用しなかった；
３．出発サンプルのサイズは２００μｌであった（ＳＭ）；
４．２回目の洗浄工程においてサンプルを１３，２００ｒｐｍ（１４，０００ｒｐｍの代わりに）で遠心分離にかけた。
【００４５】
下記のように１．２％のアガロースゲル（１００ｍＬ）を調製することにより、ＤＮＡゲル電気泳動を行った：
１．２ｇのアガロースを２５０ｍＬの三角フラスコ内に入れ；
１００ｍＬの１×ＴＡＥを加えて攪拌混合し；
混合物を１．５分間、マイクロ波に供してアガロースを溶解させ；
加熱混合物を〜５分間、約６０℃まで冷却し；
１０μｌの臭化エチジウムを加えて攪拌混合し；
アガロース溶液をゆっくりとタンクに注いでコームを挿入し；
ゲルを３０分間、固化させ；
１×ＴＡＥの緩衝液をゲルタンク内に注ぎ、ゲルを２〜５ｍｍの深さに沈めた。各ＤＮＡサンプルの適正な量（１８μｌ）を新しいマイクロチューブ内に移し；
１０×負荷緩衝液（２μｌ）を適正な量で各管内に加え；
サンプルを負荷して、７５Ｖで〜４０分間、ゲルを泳動させることによって、電気泳動を行った。次に、ＵＶ光の下でゲルの写真を撮影し、サンプルを観察した。
【００４６】
ウイルスの出発物質および精製された生成物のＤＮＡを、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によって決定した。キットの基本的な指示書に関して、唯一の例外は、プレートにおける連続希釈の前に、粗サンプルから抽出したＤＮＡを１：５に希釈したことである。
【００４７】
９．ＭｉｃｒｏＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いた全タンパク質定量化
１．ＰＢＳ中、タンパク質標準ＢＳＡの７種類の希釈を、試験すべきタンパク質溶液の代表として調製した。２５０μｇ／ｍＬの保管ＢＳＡを使用して、このマイクロタイタープレートアッセイにおけるＢＳＡの範囲は、２．５〜２０μｇ／ウェルであった。タンパク質溶液を２回アッセイした。
２．各ウェル内のタンパク質含量が標準曲線の範囲内になるように、適切な体積の各サンプルを２回、隣接したマイクロタイタープレートウェル内に負荷した。
３．適切な体積のＰＢＳを全体積が２００μｌになるまで各ウェル内に加えた。各サンプルウェルに５０μｌの濃縮色素試薬を加えた。マルチチャンネルピペッターを使用してサンプルおよび試薬を完全に混合した。
４．プレートを、室温で１５分間、インキュベートした。
５．ＣｕｒｖｅＥＸ回帰を用いて、Ｄｙｎｅｘプレートリーダー上の５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４８】
１０．ＥＬＩＳＡを用いた鳥類タンパク質の定量化
１．マイクロタイタープレートプレートに１００μｌの抗ＥＢ１４抗体を５μｇ／ｍｌでコーティングし、０．０５ＭのＮａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６において１８時間、室温でインキュベートした。
２．プレートを３００μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断し、室温で１時間インキュベートし、続いて０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。
３．０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、希釈した１００μｌの抗原を加え、その後、室温で１時間、インキュベーションし、その後、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。
４．０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中の１００μｌのビオチン−抗ＥＢ１４ 抗体を０．４／ｍｌで加え、その後、 室温で１時間インキュベーションし、その後、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。
５．０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中、１／２００００に希釈した１００μｌのアビジン−ＨＲＰを加え、その後、室温で１時間インキュベーションし、その後、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。
６．１００μｌのＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2（１：９）を加えて室温で１０分間インキュベートし、５０μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した。
７．Ｄｙｎｅｘプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
１１．ＡＬＶＡＣ定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および鳥類ｑＰＣＲ
ＡＬＶＡＣ特異的な定量的ＰＣＲを使用して、ＡＬＶＡＣ ＤＮＡおよびゲノムの等価性の定量化（ＧＥＱ）を行った。詳細については、QO SOP New：Quantification of ALVAC DNA using Quantitative PCRを参照されたい。鳥類ｑＰＣＲはフランス国ＡｖＰにおいて開発されている。
【００５０】
１２．ベンゾナーゼＥＬＩＳＡ
１．ＥＭＤ ＥＬＩＳＡキットから提供される、２つの異なる範囲のベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ標準の６種類の希釈物を調製した。範囲は、５μｇ／ｍＬの保管ベンゾナーゼを使用して０．１〜１００ｎｇ／ｍｌであった。サンプルを２回アッセイした。体積の各ウェルが１００μｌになるように希釈した緩衝液１を用いて、標準をプレート上に負荷した。
２．１００μｌの各サンプル溶液を、別々のマイクロタイタープレートウェルに負荷した。
３．１００μｌの緩衝液１を各ブランクウェルに加えた。
４．サンプルを室温で２時間インキュベートした。
５．何回もプレートのタッピングを繰り返しながら、プレートをペーパータオル上に逆さにして空け、液体の完全な移動を確実にした。次にウェルを緩衝液１で満たし、再び空にする前に１分間インキュベートした。ステップ５を３回繰り返した。
６．保管試薬Ｂ（西洋わさびペルオキシダーゼ複合抗体）に由来する緩衝液１で１：１００に希釈した１００μｌの試薬Ｂとともに、室温で１時間、サンプルをインキュベートした。
７．次に、プレートをステップ６に記載したように洗浄した。
８．６０μｌの試薬Ｃを各ウェルに加え、その後、１５分間インキュベーションした（インキュベーションの間、プレートを光から保護するべきである）。
９．１４０μｌの停止試薬（０．２Ｍ Ｈ2ＳＯ4）を各ウェルに加えることによって、酵素反応を停止した。
１０．次に、Ｄｙｎｅｘプレートリーダーを使用して、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００５１】
１３.ＣＣＩＤ50アッセイを使用したウイルス滴定
ＱＴ３５細胞を使用するＣＣＩＤ50アッセイによって、ＡＬＶＡＣウイルスの力価を測定した。詳細については、ＳＯＰ番号２２ＰＤ−０３９バージョン４．０を参照のこと。例外：精製工程の間のオープンシステムへのサンプルの曝露に起因する、ＣＣＩＤ50アッセイにおける汚染を排除するため、ＳＯＰに記載される２倍の感染溶媒中の抗生物質を使用した。試験サンプルは間接的に超音波分解した。
【００５２】
１４．結果
上述の手順は、９０％を超える不純物（例えば、限定はしないが、鳥類ＤＮＡおよび／または非ベクタータンパク質を含むものなど）を除去した組成物（精製された調製物）を提供する。３つの実施の形態では（表２）、精製工程からの全般的なウイルス回収は２０〜５２％であった。清澄化の工程は、全タンパク質の５５〜７１％を除去した。続くゲルろ過工程では、全タンパク質の６１〜７２％を除去した。さらには、ＡＮＸイオン交換バッチ吸着工程では６８〜７８％を除去し、その後のＴＦＦの工程では、バッチ吸着で得られた材料から、さらに全タンパク質の３３〜４１％を除去した。結果として、全タンパク質の全般的な除去は、およそ９７．６〜９８．２％であった。最終的な精製された生成物中の鳥類タンパク質は、９８〜９９％除去された。タンパク質全体（ｐｇ）のＣＣＩＤ50に対する比は１１対１７であった（表２）。
【００５３】
遊離の鳥類ＤＮＡの分解および除去はまた、精製工程を通じて有効であることが判明した。ベンゾナーゼ処理およびゲルろ過の後、清澄化した材料から、わずかに１〜１．５％の鳥類ＤＮＡしか回収されなかった（表２）。加えて、ＴＦＦの工程の後、わずかに２．７〜１４％の鳥類ＤＮＡしか回収されず、追加のＤＮＡ（８５〜９７％）がＴＦＦの工程に続くＡＮＸイオン交換によって除去されたことを示唆している（表２）。最終生成物中の鳥類ＤＮＡ含量の９９％が除去された（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号Ｐ１１４９６、製造業者の使用説明書を使用）。
【００５４】
製造業者の使用説明書を使用する、ベンゾナーゼＥＬＩＳＡ（ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼＥＬＩＳＡキット、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｉｎｃ．社、カタログ番号１．０１６８１．０００２）を使用して、ゲルろ過から得られたサンプル、ＡＮＸバッチ吸着精製された材料、ならびに最終的に精製された生成物中の残留するベンゾナーゼを試験した。データは、すべての試験サンプルにおいて、ベンゾナーゼが、ゲルろ過の工程によって検出限界未満のレベル（０．２ｎｇ／ｍｌ）まで除去されることを示した。
【００５５】
【表２−１】
2014138622.tif 000003
【００５６】
【表２−２】
2014138622.tif 000004
【００５７】
Ｃ．ＡＬＶＡＣ−黒色腫ベクターの精製
１．材料
以下の研究に用いられた材料には次のものが挙げられる：ＱＴ３５細胞；ＱＴ３５成長培地：ＳＯＰ番号２２ＰＤ−０３９；ハムＦ−１０培地（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１１５５０−０４３）；Ｈａｎｋ'ｓ溶液を用いた培地１９９（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１２３５０−０３９）；ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＪＲＨ社カタログ番号１２１０７−７８Ｐ；トリプトースリン酸ブイヨン粉末（Ｄｉｆｃｏ社製、ＢＤ２６０３００）；ペニシリン・ジヒドロストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）；ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ、ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ｉｎｃ．社カタログ番号１．０１６９４．０００２および１．１６９７．０００２；ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼＥＬＩＳＡキット、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｉｎｃ．社カタログ番号１．０１６８１．０００２；ＤＮＡｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ社製、カタログ番号６９５０４；Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号Ｐ１１４９６；ＰＢＬトリプチケースソイブロス、Ｂｅｃｋｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製；５％のヒツジ血液を含むトリプティックソイ寒天培地（ＴＳＡ ＩＩ）；ＡＮＸ「セファロース」４ＦＦ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号１７−１２８７−０１および１７１２８７−０４；および、「セファロース」４ＦＦ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号１７−０１４９−０１および１７−０１４９−０５。
【００５８】
２．方法
ａ．超音波分解を使用するウイルス放出
ＡＬＶＡＣ−黒色腫採取物を、遠心分離（４０００×ｇ、４℃で４０分間）を用いて最初に清澄化し、その後、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶウイルスについて上述したように、５μｍ／３μｍのデプスフィルタを用いてろ過した。冷凍した場合には、ウイルスサンプルをＷＦＩ水を含む３７℃の水浴で解凍した。ＣＣＩＤ50アッセイで試験する前に、ウイルスを超音波分解した。サンプルを１５ｍｌまたは５０ｍＬの試験管に入れて、冷却した氷水で満たしたＶｉｒｔｉｓソニケーターのカップホーン内で１分間を２回、１秒オン／１秒オフのパルスおよび７．５の出力を用いて、超音波分解した。超音波分解の後、サンプルを氷上で冷却し、超音波分解の間水温をモニタした。必要に応じて少量の氷を加えた。
【００５９】
ｂ．ウイルスの滴定
ＱＴ３５細胞を使用するＣＣＩＤ50アッセイによってＡＬＶＡＣウイルスの力価を測定した。詳細については、ＳＯＰ番号２２ＰＤ−０３９バージョン４．０を参照のこと。例外：精製工程の間のオープンシステムへのサンプルの曝露に起因する、ＣＣＩＤ50アッセイにおける汚染を排除するため、ＳＯＰに記載される２倍の感染溶媒中の抗生物質を使用した。試験サンプルは間接的に超音波分解した。
【００６０】
ｃ．電子顕微鏡法
下記のように電子顕微鏡法を用いてサンプルをを試験した：
１．出発物質を−８０℃の冷凍庫から取り出し、３７℃の水浴で解凍した。
２．出発物質を、必要に応じて、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ８．０；９．０；または１０．０で１０倍に希釈した。
３．サンプルを間接的に超音波分解した。
４．適用時、室温で２時間、または２〜８℃で一晩のいずれかで、サンプルをインキュベートした。
５．適切なインキュベーション時間の後、インキュベートしたウイルスの懸濁液に対して１：１の体積比でパラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む固定緩衝液を用いて、ウイルスを固定した。トロント大学の電子顕微鏡の研究室で検査するまで、固定化したウイルスサンプルを２〜８℃で保管した。
６．直接滴定法を使用する逆染色法による透過型電子顕微鏡での検査のためのサンプルを調製した。サンプルの液滴（５μｌ）をカーボン−フォルムバーでコーティングした４００メッシュの銅格子上に直接置いた。サンプルは、２％のリンタングステン酸ＰＴＡ（ｐＨ６．５）または２％の酢酸ウラニル（ＵＡ）の液滴（１０μｌ）を準備した格子の上に加えることによってネガティブ染色した。３０秒〜１分後、格子をペーパーフィルタでブロット乾燥させた。サンプルを、７５ＫｖにおけるＨｉｔａｃｈｉ Ｈ ７０００透過型電子顕微鏡で検査し、写真撮影した。
【００６１】
ｄ．遊離の核酸（ＤＮＡ）のベンゾナーゼ・ヌクレアーゼ分解
ウイルスのサンプルを３７℃の水浴で解凍し、セクション５．２．１に記載されるように間接的に超音波分解した。所望の量の清澄化した材料を、２０±３℃で所望の期間、さまざまな量（Ｕ／ｍｌ）のベンゾナーゼで処理した。別記しない限り、ＭｇＣｌ2を２．０ｍＭの最終濃度になるまで加えた。攪拌子を用いて成分を混合し、規定の条件に従って、懸濁液をインキュベートした。指定されたインキュベーション時間の後、さらなる分析のため、サンプルを−８０℃に維持した。
【００６２】
ｅ．ＤＮＡ抽出、ゲル電気泳動、および分析
Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡＢｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキットを使用して、本質的に記載されるとおりに、ＤＮＡ抽出を行った。基本的な手順の例外として、下記のものが挙げられる：
１．Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（５０）（カタログ番号６９５０４）を使用した；
２．ＡＴＬ緩衝液、プロテイナーゼＫおよび２−メルカプトエタノール（ＳＯＰの通り）および出発物質サンプルを含む組織溶解工程には２−メルカプトエタノールは使用しなかった；
３．出発サンプルサイズは２００μｌであった（ＳＭ）；
４．２回目の洗浄工程において、１３，２００ｒｐｍ（１４，０００ｒｐｍの代わりに）で、サンプルを遠心分離にかけた。
【００６３】
下記のように１．２％のアガロースゲル（１００ｍＬ）を調製することにより、ＤＮＡゲル電気泳動を行った：
１．２ｇのアガロースを２５０ｍＬの三角フラスコ内に入れ；
１００ｍＬの１×ＴＡＥを加えて攪拌混合し；
混合物を１．５分間、マイクロ波に供してアガロースを溶解させ；
加熱混合物を〜５分間、約６０℃まで冷却し；
１０μｌの臭化エチジウムを加えて攪拌混合し；
アガロース溶液をゆっくりとタンクに注いでコームを挿入し；
ゲルを３０分間、固化させ；
１×ＴＡＥの緩衝液をゲルタンク内に注ぎ、ゲルを２〜５ｍｍの深さに沈めた。各ＤＮＡサンプルの適正な量（１８μｌ）を新しいマイクロチューブ内に移し；
１０×負荷緩衝液（２μｌ）を適正な量で各管内に加え；
サンプルを負荷して、７５Ｖで〜４０分間、ゲルを泳動させることによって、電気泳動を行った。次に、ＵＶ光の下でゲルの写真を撮影し、サンプルを観察した。ウイルスの出発物質および精製された生成物のＤＮＡを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（分子プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ社製（米国オレゴン州所在））によって決定した。キットの基本的な指示書に関して、唯一の例外は、プレートにおける連続希釈の前に、粗サンプルから抽出したＤＮＡを１：５に希釈したことである。
【００６４】
ｆ．ＭｉｃｒｏＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いた全タンパク質の定量化
標準として、タンパク質標準（ＰＢＳ中に溶解したＢＳＡ）の８種類の希釈物を、試験すべきタンパク質溶液の代表として使用した。このマイクロタイタープレートアッセイにおけるＢＳＡの範囲は、低濃度のサンプルでは１．２５〜１０.０μｇ／ウェルであり、高濃度のサンプルでは１０．０〜６０．０μｇ／ウェルである。保管ＢＳＡ溶液（２５０μｇ／ＭＬ）を使用した。タンパク質溶液を２回アッセイした。適切な体積の各サンプルを、各ウェル内のタンパク質含量が標準曲線内に入るように、２回、隣接したマイクロタイタープレートウェルに負荷した。全体積が２００μｌになるように、適切な体積のＰＢＳを各ウェルに加え、５０μＬの濃縮した色素試薬を各サンプルウェルに加えた。マルチチャンネルピペッターを使用してサンプルおよび試薬を完全に混合し（およそ１０回）、室温で１５分間インキュベートし、ＣｕｒｖｅＥＸ直線回帰を使用し、Ｄｙｎｅｘプレートリーダー上で、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６５】
ｇ．ＡＮＸイオン交換バッチ吸着クロマトグラフィー
樹脂を下記のように調製した：
１．樹脂６２５ｍＬ（５００ｍＬの乾燥樹脂）を２Ｌのナルゲンボトルに注ぎ、落ち着かせた。
２．Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘデジタル標準駆動を使用して、および／またはピペットにより、ポンプによって送り出すことにより可能な程度まで、エタノールを除去した。
３．２体積（１０００ｍＬ）のＷＦＩ水を加えることによって樹脂を洗浄し、攪拌プレート上で１０分間混合した。落ち着かせた後、ＷＦＩをポンプおよび／またはピペットによって除去した。次に、この工程を繰り返した。
４．２体積（１０００ｍＬ）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を用いて樹脂を平衡化し、１０分間混合した。落ち着かせた後、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を、ポンプおよび／またはピペットによって除去した。次に、この工程を繰り返した。
【００６６】
およそ５００ｍＬの試験サンプル（すなわち、ＡＬＶＡＣ出発物質）を平衡化した樹脂と合わせて、攪拌プレート上で６０分間混合した。次に、混合物を落ち着かせ、結合していないサンプルを、ポンプおよび／またはピペットによって除去した。
【００６７】
次に、混合物を、２体積（１０００ｍＬ）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４で、１０分間混合することによって洗浄した。落ち着かせた後、洗浄サンプルを、別々の容器にポンプで送り出した。その後、これを１回繰り返した。
【００６８】
サンプルを１０ｍＭのトリス ｐＨ７．４／１Ｍ ＮａＣｌと１０分間混合することによって溶出を達成した。落ち着かせた後、ポンプによる送り出しまたはピペット操作によって、溶出サンプルを別々の容器に取り出した。これをさらに２回繰り返し、合わせたろ過溶出液を得た。次に、溶出液を、できれば−８０℃、または４℃で保管した。
【００６９】
ｈ．スピナーフラスコ（１０Ｌ規模）を用いたバッチ吸着
バッチ吸着システムを図１に示すように配置した。樹脂は、次のように調製した：エタノールを、６．２５Ｌの樹脂（５．０Ｌの乾燥樹脂）を含む１５Ｌのスピナーフラスコの外にポンプで送り出した；２体積（１０Ｌ）のＷＦＩ水を用いて樹脂を洗浄し、１０分間混合した；落ち着かせた後、ＷＦＩを１Ｌ／分で、ポンプで送り出し、この工程を１回繰り返した。次に、２体積（１０Ｌ）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を用いて樹脂を平衡化し、１０分間混合した。落ち着かせた後、次に、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４緩衝液を１Ｌ／分の速度で、ポンプで送り出し、この工程を１回繰り返した。攪拌プレートを用いて、５Ｌのサンプルを、平衡化した樹脂と６０分間混合した。落ち着かせた後、結合していないサンプルを、７５０ｍＬ／分の速度でポンプにより送り出すことにより、別々の容器に取り出した。次いで、サンプルを、２体積（１０Ｌ）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４で、１０分間混合することにより、洗浄した。落ち着かせた後、洗浄したサンプルを、１Ｌ／分の速度で、ポンプで送り出した。次にこの工程を繰り返し、合わせた洗浄１／２サンプルを得た。サンプルを１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４／１Ｍ ＮａＣｌと１０分間混合することによって、ウイルスを樹脂から溶出させた。落ち着かせた後、溶出サンプルを、１Ｌ／分の速度で、３０μｍフィルタを通じてポンプにより送り出すことにより、別々の容器に取り出した。この工程をさらに２回繰り返し、合わせたろ過溶出液を得た。溶出サンプルをできれば−８０℃、または４℃で保管した。
【００７０】
ｉ．大規模ＢＰＧ１００／２００カラム（直径１０ｃｍ／２０ｃｍ）の充填
より簡便な溶液排出のため、２４サイズのシリコーン製チューブを、ＢＰＧカラムの底部排出口に接続した。カラム、アダプターおよび関連する管類を、カラムに０．１Ｍ ＮａＯＨを一晩充填することによって浄化した。ＮａＯＨを排出し、カラムを２−カラム体積のＷＦＩですすいだ。カラムネットを７０％エタノールで湿らせ、閉じ込められた空気を排除した。カラムを、１０〜１５センチのＷＦＩで満たすか、または緩衝液で平衡化した。樹脂を強振とうして均質な溶媒スラリーを調製した。充填カラムの毎リットルにつき、１．２５Ｌまたは溶媒スラリーをポンプで送り出すか、または注入する。よって、２０ｃｍの高さのカラムを充填するためには、ＢＰＧ１００（１０ｃｍ直径のカラム）では１．５Ｌ、ＢＰＧ２００（２０ｃｍ直径のカラム）では６．５Ｌの充填した樹脂が必要とされる。均質な溶媒スラリーをカラムに注入し、それをＷＦＩと混合／緩衝液で平衡化した。１．５Ｌの充填したカラム床に、１．８８Ｌの溶媒スラリーを注いだ。６．５Ｌの充填したカラム床に、８．１３Ｌの溶媒スラリーを注いだ。１〜２ｃｍの上部の透明な液体層が見られるまで、樹脂を落ち着かせた。底部の排出口を開放し、液体をゆっくりと排出し、上部の透明な液体層が維持されることを確実にした。アダプターを挿入し、樹脂を所望のカラムの高さに落ち着かせるときに、液体の表面の３〜１０ｃｍ上になることを確実にした。次に、最上部のアダプター注入管をＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに接続した。７０％エタノールを用いてラインを浄化し、カラムネットを湿らせ、ＡＫＴＡシステムを用いて任意の閉じ込められた空気を排除した。次に、液体が最上部のアダプターネットから出始めたときにＡＫＴＡシステムポンプを停止した。次いで、アダプターを、落ち着かせた樹脂床の上およそ０．５ｃｍまで下げ、封止調節ノブを時計回りに回転させることにより、アダプターのＯ−リングを封止した。２４サイズのシリコーン排出管をＡＫＴＡ適合性の排出管に交換し、ＡＫＴＡシステムに接続した。２−ＣＶの平衡化する緩衝液をポンプで送り出すことにより、樹脂を平衡化した。次いで、３Ｌの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９／１５０ｍＭ ＮａＣｌを、２０ｍＬ／分の速度で、ＢＰＧ１００カラムに、１３Ｌの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９／１５０ｍＭ ＮａＣｌを８０ｍＬ／分の速度で、ＢＰＧ２００カラムに、それぞれポンプで送り出した。
【００７１】
ｊ．２Ｌのバイオリアクター規模（ＢＰＧ１００）におけるゲルろ過クロマトグラフィー
１．すべてのバルブに側路を設けて、高流量における背圧を低減するように、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを適合させた。
２．サンプルライン（Ａ１５）を、１００ｍＬの７０％ＥｔＯＨを用いて手動で浄化し、２００ｍＬのＷＦＩですすぎ、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを用いて、１００ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ９／１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。バイオフード内の廃棄物ラインを使用して廃棄物を回収し、そのラインを浄化し、平衡化した。
３．上述のようにカラムを充填した。
４．ＢＰＧ１００充填カラム（１．５Ｌの「セファロース」４ＦＦ）をＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに接続した。
５．すべての処理パラメータ（伝導性およびｐＨ）の曲線が安定するまで、２ＣＶ（３．０Ｌ）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０／１５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で樹脂を手動で平衡化した。
６．バイオフード内で、サンプルライン（Ａ１５）を、カラムに負荷すべき清澄化した採取物サンプルに挿入した；サンプル負荷体積は、カラム体積の１２〜１８％の範囲内でなくてはならない。
７．あらかじめプログラムした方法を使用してクロマトグラフィーを行った：
・開始条件：流量 ２０ｍＬ／分
・５０ｍＬの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９／１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化
・負荷：２２５ｍＬ（１５％）のベンゾナーゼ処理した清澄化採取物
・溶出：１８００ｍＬの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９／１５０ｍＭ ＮａＣｌ
・浄化：１８００ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ
・すすぎ：３０００ｍＬのＷＦＩ
・保管：２０００ｎｍＬの２０％ＥｔＯＨ
注記：浄化、すすぎおよび保管の工程は、将来的に、同一の樹脂を再生する場合にのみ必要とされる。
８．ウイルス（〜５００ｍＬ）を含む最初のピークを０．５Ｌの殺菌したナルゲンボトル内に回収し、さらに使用するまで４℃の冷蔵庫で保管した。
【００７２】
ｋ．最小システムを使用する小規模ＴＦＦ
カートリッジ調製物は次のように達成した：
１．ＴＦＦカートリッジ、ＵＦＰ−５００−Ｅ−Ｈ２２ＬＡを、クランプ固定した透過排出口の１つを用いて最小システム上に接続した。
２．管類およびカートリッジに７０％エタノールを、３barg以下のＴＭＰで１分間流した。
３．浸透ラインを開放し、およそ１０分間流し続けてグリセロールを溶解し、カートリッジを浄化した。
４．ポンプを停止し、すべてのラインをクランプ固定した。次に、それを一晩、静置した。
５．浸透ラインを閉鎖してシステムにＷＦＩ水を１分間流し、エタノールを除去し、フローを確立した。
６．浸透ラインを開放し、５〜１０分間、連続的に流して、残留エタノールを除去した。
７．最小ＴＭＰで水分フラックス試験を行った（水分フラックスは分析証明書に示される値以上でなければならない（≧３９９ＬＭＨ／barg））。
【００７３】
プライミングおよび平衡は次のように達成した：
１．３０ｍＬの溶媒を、２０分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させた。
２．浸透ラインを閉鎖してシステムに１５０〜２５０ｍＬの１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．４を流すことによって溶媒を除去した。
３．浸透ラインを開放し、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を用いて、２０分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させた。
【００７４】
サンプル濃度は次のように達成した：
１．浸透ラインを閉鎖して、サンプルを１分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させてフローを確立した。
２．浸透ラインを開放して濃縮を開始し、別々の廃棄物容器に回収した。
【００７５】
ダイアフィルトレーションは次のように達成した：
１．所望の濃度達成時に、１ダイアフィルトレーション体積をサンプル容器に加えることによって、ダイアフィルトレーションを開始した。
２．濃度達成時に、工程１をさらに２回繰り返して、３ダイアフィルトレーション体積を完了した。
３．ほぼゼロ体積までサンプルを濃縮し、空気がカートリッジ内に入らないように注意すると同時に、副産物を別々の容器に回収した。
４．十分な体積の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４緩衝液を、元のサンプル容器に加えて、サンプルを希釈し、濃度を補正した。
５．サンプルを−８０℃で保管した。
【００７６】
およそ２５ｍＬの１０ｍＭ トリス ｐＨ７．４緩衝液をシステムに通すことによってシステムを洗浄し、別々の洗浄容器に回収し、４℃で保管した。２００ｍＬの７０％ＥｔＯＨをカートリッジ内に通して浄化し、カートリッジを廃棄した。
【００７７】
lｉ．ＡＫＴＡクロスフローシステムを使用する小規模ＴＦＦ
１．貯蔵グリセロールの除去を容易にするため、クロスフローカートリッジ（ＵＦＰ−５００−Ｃ−Ｈ２４Ｕ）を、２５％ＥｔＯＨに一晩浸漬した。
２．クロスフローカートリッジを１５５０ｍＬのＷＦＩですすぎ、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるPreproduct stepsから選択される、あらかじめプログラムした方法を使用して、４２０ｍＬの１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０で平衡化した。
３．膜システム評価、続いて、Method Editor windowにおける正規化水分フラックスを選択することにより、すすいだカートリッジを使用して水分フラックスをチェックし、水分フラックスが分析証明書に示される以上（≧３９９ＬＭＨ／barg）になることを確実にした。所望の水分フラックスに達しなかった場合には、追加のすすぎを行った。
４．４００ｍＬのＡＮＸ溶出液を４０ｍＬまで濃縮し、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０緩衝液を用いて連続的なダイアフィルトレーションを行った。あらかじめプログラムした方法は、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるProduct stepsから選択した。
５．次に、濃縮したサンプルを試験用に採取した。
６．必要な場合には、ＴＦＦ濃縮化サンプルを使用し、各せん断速度についてＴＭＰ最適化またはフラックス最適化を行った。あらかじめプログラムした方法は、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるUF process optimizationから選択した。
７．膜システム評価、続いて、Method Editor windowにおけるProcess optimizationにおいて生じたＴＭＰに対するフラックスのグラフから最適なフラックスを決定した。
８．カートリッジを浄化し、ＡＫＴＡクロスフローシステムに、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるPostproduct stepsのあらかじめプログラムした方法を使用した。
【００７８】
ｍ．２Ｌまたは１０Ｌ規模におけるタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）
１．ＴＦＦカートリッジ、ＵＦＰ−５００−Ｃ−３×２ＭＡおよびＵＦＰ−５００−Ｃ−６Ａを、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘデジタル規格駆動ポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、モデル７７２０１−６２、２Ｌ規模用）およびＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｉ／Ｐ Ｅａｓｙ ｌｏａｄポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、モデル７５２９−１０、１０Ｌ規模用）を、クランプ固定した透過排出口の１つ（供給側に近い）に接続した。
２．カートリッジを７０％エタノールに一晩浸漬してグリセロールを溶解し、同時にカートリッジを浄化した。
３．１Ｌ／分のクロスフロー流量および最小ＴＭＰで、カートリッジを１０Ｌ（２Ｌ規模）または１００Ｌ（１０Ｌ規模）のＷＦＩですすぎ、エタノールを排除した。
４．透過流量およびＴＭＰを測定することにより、清浄な水分フラックス試験を行った。フラックス（ＬＭＨ／バール）＝｛［透過流量（ｍＬ／分）／カートリッジ面積（ｍ2）］×０．０６｝／ＴＭＰ（バール）。分析証明書によれば、新しいカートリッジでは、≧３９９ＬＭＨ／bargでなければならない。
５．浸透ラインを約２０分間クランプで固定することによって、１Ｌ（２Ｌ規模）および６Ｌ（１０Ｌ規模）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０／１．０Ｍ ＮａＣｌを１Ｌ／分のクロスフロー流量で循環させることにより、カートリッジを平衡化した。
６．イオン交換バッチ吸収溶出液から得られたウイルス材料をプールした。
７．副産物の管にはクランプ固定をすることなく、供給流量を徐々に増大させることによって、すなわち１Ｌ／分で１０分間、１．５Ｌ／分で１０分間、２．１Ｌ／分で１０分間および４．３Ｌ／分で残りの濃縮工程を流すことによって、サンプルを、溶出液の体積の１／３まで濃縮した。透過流量および供給圧を測定した。
８．等量の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９.０を３倍濃縮したサンプルに加えて、ダイアフィルトレーションおよび、出発体積の１／３まで濃縮を行った。
９．ダイアフィルトレーションを３回繰り返した。
１０．およそ１００ｍＬ（２Ｌ規模用）、５００ｍＬ（１０Ｌ規模用）までサンプルをさらに濃縮した。
１１．ダイアフィルタにかけた濃縮物を、少し速い供給速度で５〜１０分間、循環させた。
１２．濃縮したサンプルを回収および測定した。
１３．次に、２００ｍＬ（２Ｌ規模用）および１Ｌ（１０Ｌ規模用）の１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９.０を通すことによって、システムを洗浄した。
１４．次にその体積の洗浄サンプルを回収した。
１５．１Ｌの７０％エタノールを通すことによって、システムを洗浄した。
【００７９】
３．結果
本明細書に記載の精製方法は、次の工程を有してなる：（ａ）遠心分離を使用する粗採取物の濃縮、（ｂ）細胞の溶解、凝集物の粉砕、およびウイルスの放出のためのｓｏｎｉｔｕｂｅを使用する直接的な超音波分解、（ｃ）５μｍ／３μｍフィルタを使用するディプスフィルトレーションによる材料の清澄化、（ｄ）ベンゾナーゼ処理による遊離のＤＮＡの分解、（ｅ）「セファロース」４ＦＦゲルろ過クロマトグラフィーによるウイルスの精製および残留ベンゾナーゼの除去、（ｆ）ＡＮＸイオン交換バッチ吸着によるウイルスのさらなる精製、および（ｇ）タンジェンシャルフローろ過によるウイルス材料の精製および濃縮、および緩衝液の交換。本方法の各工程を、後にＣＥＦに生じるＡＬＶＡＣ黒色腫のＤＮＡの低減について評価した。
【００８０】
Ａ．遊離の核酸（ＤＮＡ）のベンゾナーゼ消化
ベンゾナーゼ濃度を、ＥＢ１４（上述）内で増殖するＡＬＶＡＣ ＨＩＶにおける遊離のＤＮＡの分解のための、２０±３℃で２時間の反応時間を有する、５０Ｕ／ｍＬと規定した。これらの条件を、３つの別々のロットのＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦ（ｖＣＰ１５８４、ＰＸ−０６０２５、およびＰＸ−０６０２６）における遊離のＤＮＡの消化に適用したデータは、ベンゾナーゼ処理後のこれらの調製物からのウイルス回収が、２３％〜７９％変化することを示し、これはＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４について観察されるよりも低かった。結果は、ＡＬＶＡＣ／ＥＢ１４について規定されたベンゾナーゼの消化条件を、ＡＬＶＡＣ／ＣＥＦ用に修正すべきであることを示唆した。
【００８１】
【表３】
2014138622.tif 000005
【００８２】
清澄化した材料を分析して、ウイルスの力価および不純物を決定した。表４に示すように、ＥＢ１４において生じた清澄化ＡＬＶＡＣ ＨＩＶのウイルス力価（logＣＣＩＤ50）は６〜７であり、ＣＣＩＤ50の全ＤＮＡ（ｐｇ）に対する比は、０．１４対１．４であった。ＣＥＦにおいて生じた清澄化ＡＬＶＡＣ黒色腫のlogＣＣＩＤ50は、７．７〜８．３であった。しかしながら、これらのサンプルにおける力価の不純物に対する比は１１〜６４であり、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４のものよりも１０〜５０倍高かった。
【００８３】
【表４】
2014138622.tif 000006
【００８４】
Ｂ．ゲルろ過クロマトグラフィー
ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４について規定される条件を用いて、次に、ゲルろ過クロマトグラフィーを、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの精製について評価した。清澄化したサンプル（２２５ｍｌ）を、２０ｍＬ／分の流量で、直径１０ｃｍの１．５Ｌ（樹脂）カラムに負荷した。ゲルろ過からの２つのロットにおけるウイルス回収は、それぞれ８４％および８７％であり、ＤＮＡ全体の除去は９０％を超えた（表５）。データは、ＡＬＶＡＣ／ＥＢ１４について規定される条件を用いたゲルろ過クロマトグラフィーが、同様のウイルス収量および不純物除去を伴って、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦを精製するのに適していることを示唆した。
【００８５】
【表５】
2014138622.tif 000007
【００８６】
Ｃ．ＡＮＸ「セファロース」４ＦＦイオン交換バッチ吸着
ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４について規定される条件を用いたＡＮＸ「セファロース」４ＦＦイオン交換バッチ吸着を、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの精製について評価した。１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９.０緩衝液中、ゲルろ過から得られる画分を等量のＡＮＸ「セファロース」４ＦＦ樹脂と混合した。１Ｍ ＮａＣｌを含む、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０を用いて、ウイルスを溶出した。２つの研究から得られたウイルスの回収率は、それぞれ、７６％および１００％であった。マイクロＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した全タンパク質、およびＰｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイによって測定した全ＤＮＡは、アッセイの検出限界未満であった。それにもかかわらず、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４について規定された条件を用いたＡＮＸ「セファロース」４ＦＦイオン交換バッチ吸着は、ＣＥＦにおいて生じたＡＬＶＡＣ黒色腫の精製に使用することができる。
【００８７】
【表６】
2014138622.tif 000008
【００８８】
Ｄ．緩衝液を濃縮および交換するためのＴＦＦ
ＡＮＸイオン交換バッチ吸着からの溶出液の濃縮および緩衝液の交換に、ＴＦＦを使用した。ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４について開発したＴＦＦ工程をＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの溶出液の濃縮に用いる場合、ウイルス回収率は１６〜１７％であり（表７）、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４のものよりも低かった。ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４の溶出液（ＴＦＦ用の出発物質）のウイルス力価（logＣＣＩＤ50）が５〜６であるのに対し、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦのものは６〜７であることは知られていた。しかしながら、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４の溶出液における全タンパク質レベルはおよそ１０μｇ／ｍｌであるのに対し、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦのものはＢｒａｄｆｏｒｄアッセイの検出限界未満（１．２５μｇ／ｍｌ）であった。さらには、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦに由来するＴＦＦ濃縮物の全タンパク質濃度は１５．２〜４０μｇ／ｍｌであり、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４のものより低かった（１０９〜２２６μｇ／ｍｌ）。よって、不純物に対するウイルス力価の比は、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦにおいて高く、これは、ＴＦＦ工程の間のウイルスの必要以上の損失の原因でありうる。
【００８９】
【表７】
2014138622.tif 000009
【００９０】
Ｅ．ＣＥＦにおいて生じるＡＬＶＡＣ黒色腫の改良および再最適化の方法
１．遊離のＤＮＡのベンゾナーゼ分解の最適化の方法
さまざまな濃度のベンゾナーゼを、室温で２時間、遊離のＤＮＡの消化について試験した。表８に示すように、１０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを使用する場合、ＤＮＡ全体で４．２倍低減された。ベンゾナーゼ濃度を２５Ｕ／ｍｌまたは９０Ｕ／ｍｌに増大させた場合、ＤＮＡの低減は、それぞれ、わずかに５．５倍または５．８倍に増加したが、ベンゾナーゼを０Ｕ／ｍｌから１０Ｕ／ｍｌに増大させた結果のように顕著ではなかった。加えて、１０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼを使用した場合、ベンゾナーゼ消化後の最も高いウイルス回収率（７７％）を得た。したがって、１０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを、ＣＥＦにおいて生じるＡＬＶＡＣ中の遊離のＤＮＡの消化用に選択した。
【００９１】
【表８】
2014138622.tif 000010
【００９２】
さらに、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦについて、２０±３℃（室温）で、消化または処理時間を評価した。表９に示すように、２５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ濃度におけるＤＮＡの低減レベルは、３０分〜１２０分の処理時間の範囲内では、同様であった（６．４〜６．８倍の低減）。５０Ｕ／ｍｌにおけるベンゾナーゼ処理についても同様に、７．１〜７．９倍のＤＮＡの低減を示した。これらのデータは、室温で３０分間の、遊離のＤＮＡのベンゾナーゼ消化は、２時間の場合と同じく有効であったことを示唆した。上述の結果に基づき、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦのＤＮＡ消化の条件を、１０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼで２０±３℃で１時間と規定した。
【００９３】
【表９】
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【００９４】
２．精製工程における１０ｍＭのトリス塩酸，ｐＨ７．４の評価
ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４に伝開発した精製工程において、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９.０をゲルろ過およびＡＮＸイオン交換バッチ吸着に使用した。安定性試験から得たデータは、ＡＬＶＡＣが、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４中で、同等またはそれ以上に安定であるように見えることを示唆した。精製工程における緩衝液の使用を単純化するため、２つのｐＨ条件下でウイルス回収率を比較した。
【００９５】
１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４中、同一の出発物質、清澄化したＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦ（ロット番号ＰＸ−０６０２６）を使用して、２種類の精製を行った。ゲルろ過工程は、両方について、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を使用して行った。１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４／１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０／１Ｍ ＮａＣｌを、２種類の精製工程におけるＡＮＸイオン交換バッチ吸着およびＴＦＦにおいて比較した。２種類の精製工程から得られたゲルろ過工程からのウイルス収率は、それぞれ、８９％および１００％であり、これは、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０を使用した場合と一致した。１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を使用する、イオン交換およびＴＦＦの工程におけるウイルスの回収率は、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０を使用したものに近かった（表１０）。１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４を使用する、３工程の精製後のＤＮＡ全体の回収率もまた、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０を使用したものに近かった。結論として、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ９．０は、精製工程の３工程のすべてにおいて、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．４と交換して、同様のウイルス収率およびＤＮＡ全体の除去を達成しうる。
【００９６】
【表１０】
2014138622.tif 000012
【００９７】
３．ＴＦＦ工程の最適化
ａ．ＡＬＶＡＣのＴＦＦカートリッジへの吸着の評価
ＴＦＦの工程からのＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの低い収率に内在する潜在的なメカニズムを理解するため、精製工程の間のＡＬＶＡＣのＴＦＦ膜への吸着を最初に検査した。ウイルスを、クランプで固定した透過ポートを有するＴＦＦシステム内に、さまざまな期間で循環させた。膜にはＴＭＰを適用しておらず、ウイルスの損失はウイルスの膜への吸着か、またはせん断損傷に起因しているに違いない。ＴＦＦの間のウイルスの損失について、２つのせん断速度を比較した。力価の低下は循環時間の長さと関連付けられ、循環時間が長いほど力価の低下が大きいことが判明した。８０００秒-1または１２０００秒-1のせん断速度で３０分間の循環後、同様のウイルスの損失が観察され（それぞれ１３％および１５％の損失）、損失は主にウイルスの膜への吸着に起因しうることが示唆された。さらには、ウイルスを２時間循環させた場合、せん断速度が大きいほどウイルスの損失が大きい、すなわち、８０００秒-1の場合と比較して１２０００秒-1のせん断速度におけるウイルスの損失は１５％を超える（表１１）。これらの結果は、ＡＬＶＡＣがＴＦＦ膜に吸着されうること、およびより高いせん断速度が長期に及ぶ工程においてさらなる生成物の損失を生じうることを示唆した。したがって、ＴＦＦ工程の所要時間はできるだけ短くすべきであり、せん断速度は８０００秒-1〜１２０００秒-1に調節して、ＴＦＦ工程の間のウイルスの損失を最小限に抑えるべきである。
【００９８】
【表１１】
2014138622.tif 000013
【００９９】
ｂ．さまざまなせん断速度についての最適な膜間差圧（ＴＭＰ）の動作の決定
最適な動作ＴＭＰを確立するため、２種類のカートリッジ（１ｍｍおよび０．５ｍｍのルーメン内径）を使用するＴＦＦのフラックスＬＭＨ（リットル／メートル2／時間）を、さまざまな動作せん断速度について評価した（表１０）。ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦのＡＮＸイオン交換溶出液をＴＦＦのための材料として用い、３８ｃｍ2のカートリッジを使用して、ＴＦＦ試験を行った。データは、ルーメン内径１ｍｍのカートリッジを使用し、せん断速度が８０００秒-1である場合、ＴＭＰが０．７５バールまで増大したときにフラックス（ＬＭＨ）がプラトーに達したことを示した。さらに高いせん断速度１００００秒-1を使用すると、フラックスは、より遅く、ＴＭＰが１．５バールに達したときに、プラトーに達した（図２）。性能曲線の線形範囲（図２）に基づいて、８０００、１００００および１２０００秒-1のせん断速度についての最適な動作ＴＭＰは、それぞれ＜０．５バール、＜０．７５バールおよび＜０．７５バールであることが示された。同様に、０．５ｍｍのルーメン内径を有するカートリッジを使用する、異なるせん断速度についての動作ＴＭＰは、８０００秒-1および１２０００秒-1のせん断速度について、それぞれ、＜０．５バールおよび＜０．６バールであることが示唆された。
【０１００】
【表１２】
2014138622.tif 000014
【０１０１】
ｃ．さまざまなＴＭＰおよびせん断速度下におけるＴＦＦ性能の評価
異なるせん断速度についての最適なＴＦＦ動作範囲の決定後、ＴＦＦの性能、すなわち、所定のせん断速度およびＴＭＰについて、フラックスの濃度係数に対する曲線を試験した。８０００秒-1のせん断速度および０．５バールのＴＭＰ（最適なＴＭＰ範囲＜０．７５バール）を用いる場合（０．５ｍｍのルーメン内径を有するカートリッジについて）、フラックスは、サンプルを２倍に濃縮した場合に、１０５ＬＭＨから５８ＬＭＨまで降下し（およそ２倍）、濃縮工程の最初における膜のファウリングが示唆された。ＴＦＦ性能の乏しさは、高いＴＭＰに起因すると考えられ、したがって、以後の試験には、より低いＴＭＰである０．２バールを用いた。しかしながら、同様のフラックスの低下が観察され、より低いＴＭＰが膜のファウリングを予防する助けにならなかったことを示唆した（図３）。０．５ｍｍのルーメン内径を有するＴＦＦカートリッジを、さまざまなせん断速度下における性能についても評価した（図４）。８０００秒-1または１００００秒-1のせん断速度において、サンプルを２倍濃縮したときに、フラックスの約２倍の低下が観察された。これらの結果は、膜のファウリングが、せん断速度、ＴＭＰまたはルーメン内径にかかわらず生じることを示唆している。
【０１０２】
ｄ．ＴＦＦからの最適なウイルス回収のための膜−プライミングの評価
上述の試験から、ＡＬＶＡＣウイルスをＴＦＦ膜に吸着させると、ルーメン内径、ＴＭＰおよびせん断速度にかかわらず、膜のファウリングが生じることが判った。次の試験すべき因子は、ウイルスの吸着および膜のファウリングを低減することを目的として、膜をウイルスに曝露する前に、膜が特定の試薬を受けることができるか否かであった。ウイルス感染に使用した溶媒およびＣＥＦにおいて生じた清澄化ＡＬＶＡＣを、ＴＦＦ膜のプライミング試薬として評価した。ウイルス材料に導入する前に、上記試薬をＴＦＦ中に２０分間、循環させた。溶媒または清澄化したウイルスの材料を受けた膜を用いたＴＦＦからのウイルス回収は、プライミングなしにＴＦＦから回収したものと同様であり（データ示さず）、ＴＦＦ膜のプライミングはウイルスの収率を増大させないことが示唆された。
【０１０３】
ｅ．ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの精製
ＣＥＦ ｖｃｐ ２２６４（ロット番号ＰＸ−０６０２５）において生じたＡＬＶＡＣ黒色腫を、ＡＬＶＡＣ ＨＩＶ／ＥＢ１４についての修正した精製工程を使用して精製した。遊離ＤＮＡのベンゾナーゼ消化、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＡＮＸイオン交換バッチ吸着およびＴＦＦを含めた精製工程からのウイルス回収は、それぞれ、１００％、６６％、１００％および４０％であった。ベンゾナーゼ処理およびＡＮＸイオン交換からのウイルスの収率は、工程の最適化で著しく改善された。しかしながら、ＴＦＦの工程からのウイルス回収は、２０％から４０％にわずかに上昇した。非特異的吸着および膜のファウリングは、ＴＦＦの性能の劣化につながりうる。全般的なウイルス収率は２８％であった。タンパク質全体の除去は９９％であり、タンパク質全体の最終濃度は８．９μｇ／回であった。ＤＮＡ全体の除去は９５．７％であり、最終的なＤＮＡ濃度は１７２ｎｇ／回であった。ＥＢ１４において生じたＡＬＶＡＣの精製から得られた先のデータは、精製された生成物における鳥類ＤＮＡのＤＮＡ全体に対する平均比が１．７％であったことを示した。同一の鳥類ＤＮＡのＤＮＡ全体に対する比であると仮定すると、精製されたＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦにおける鳥類ＤＮＡレベルは、２．９ｎｇ／回と推定することができる（１７２ｎｇ／ｍｌ×１．７％＊１０＾７／１０＾７．２９＝２．９ｎｇ／回、１回あたりのＣＣＩＤ50を１０＾７と仮定）。ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの精製から得られた結果を表１３にまとめた。
【０１０４】
【表１３−１】
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【０１０５】
【表１３−２】
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【０１０６】
ｆ．ＴＦＦを用いた、清澄化ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦの濃縮
清澄化したＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦ（logＣＣＩＤ50＞８．５に達する）を、安定性試験のために濃縮した。ＴＦＦを濃度手法として評価し、２種類のＴＦＦシステム（ＡＫＴＡ−クロスフローおよび最小ＴＦＦ）、異なるせん断速度、およびＴＭＰを比較した。ウイルスが、８．７〜９．０の最終的なtire logＣＣＩＤ50で試験したすべての条件から、１００％回収されることを見出した。タンパク質全体の除去は１５〜３０％であったが、ＤＮＡ全体が１００％維持された（表１４）。よって、宿主細胞ＤＮＡ（ＣＥＦなどの初代細胞に由来する）の低減が大きな懸案事項でない場合には、ＣＥＦにおいて生じたＡＬＶＡＣ採取物を、ＴＦＦを使用して濃縮し、力価／ｍｌを増大させることができる。
【０１０７】
次に、精製された材料の濃縮物からの回収と比較して、ＴＦＦを使用する清澄化した材料の濃縮物からのより高いウイルス回収を理解するため、ＴＦＦ性能曲線、すなわちフラックスの濃度係数に対する曲線を試験した。性能曲線（図５）は、１２０００秒-1のせん断速度において、サンプルを２倍濃縮した場合、フラックスが１０５ＬＭＨから８５ＬＭＨに低下した（およそ１．２倍）ことを示した。同様に、１００００秒-1のせん断速度において、サンプルを２倍濃縮した場合、フラックスは１．２〜１．３倍低下した。対照的に、精製サンプルを２倍濃縮した場合には、フラックスの２倍の低下が観察された（図３および４）。これらのデータは、清澄化した材料を濃縮すると、精製された材料よりも良好なＴＦＦ性能が見られたことを示した。ウイルスの不純物に対する比が低いと、ＴＦＦからのウイルス回収率を上昇させることに寄与しうる。
【０１０８】
【表１４】
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【０１０９】
方法の再最適化を伴う、ＡＬＶＡＣ／ＥＢ１４についてのプラットフォーム精製方法を使用する、ＡＬＶＡＣ黒色腫／ＣＥＦについて開発されたＤＮＡの低減方法については、表１５を参照されたい。
【０１１０】
【表１５】
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【０１１１】
本明細書に引用、列記、または別の方法で言及されるすべての参考文献は、参照することによってその全体が本明細書に援用される。本明細書に記載される方法のある実施の形態についての説明には、それらのバリエーションが意図されていることが理解されるべきである。
【参考文献】
【０１１２】
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・米国特許第６，５９３，１２３号明細書
【図１】
2014138622.tif 000019
【図２】
2014138622.tif 000020
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月6日(2014.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物からポックスウイルスを精製する方法であって、
ａ）ポックスウイルスを含む細胞を採取し、
ｂ）超音波処理によって前記細胞を破砕し、およびヌクレアーゼで処理することにより、粗ポックスウイルス調製物を生成し、
ｃ）前記粗ポックスウイルス調製物をゲルろ過に供して、半精製ポックスウイルス調製物を生成し、
ｄ）前記半精製ポックスウイルス調製物を、陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、精製ポックスウイルス調製物を生成する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２】
１）ポックスウイルスに感染した細胞を溶解させて粗ポックスウイルス調製物を生成することにより、前記工程ｂ）において粗ポックスウイルス調製物を生成し、
２）工程１）で得られた粗ポックスウイルス調製物を、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化したセファロース（商標）４ファスト・フローまたはセファロース（商標）６ファスト・フローの樹脂でのゲルろ過に供して、半精製ポックスウイルス調製物を生成し、
３）工程２）で得られた半精製ポックスウイルス調製物を、ポックスウイルスが樹脂に吸着するように、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０で平衡化したＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フロー樹脂での陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、
４）工程３）で吸着されたポックスウイルスを、１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．０〜９．０／１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出させる、
各工程からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程２）を行う前に、前記粗ポックスウイルス調製物が清澄化されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該方法が、混入物質から組換えポックスウイルスのビリオンを精製するために使用され、前記工程ａ）の前に、ポックスウイルスベクターを適切な宿主細胞内に導入し、および該宿主細胞を培養して、ポックスウイルスのビリオンを生成し、前記宿主細胞から粗ポックスウイルス調製物を調製する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、強陰イオン交換体および弱陰イオン交換体からなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローからなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記イオン交換マトリクスがＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
精製ポックスウイルス調製物の生成方法であって、
（ｉ）細胞培養サンプルからポックスウイルス採取物を得て、
（ii）前記サンプルに含まれる細胞から細胞内のポックスウイルスを放出させて、粗ポックスウイルス調製物を生成し、
（iii）前記粗ポックスウイルス調製物をろ過によって清澄化し、
（iv）工程（iii）の調製物をヌクレアーゼで処理し、
（v）工程（iv）の調製物をゲルろ過に供して、半精製ポックスウイルス調製物を生成し、
（vi）前記半精製ポックスウイルス調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、精製ポックスウイルス調製物を生成する、
各工程を有してなり、
前記精製ポックスウイルス調製物における無傷のポックスウイルス粒子以外の成分が１０重量％未満であることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、強陰イオン交換体および弱陰イオン交換体からなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローからなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われる、請求項８記載の方法。