(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来の抗酸化作用を有する成分に関して、細胞内酸化ストレスを抑制する抗酸化剤を提供する。また、該植物由来成分を含有する皮膚外用剤または化粧料を抗老化用、整髪用、養毛用もしくはヘアトニックとして用いる。【解決手段】カラコギカエデの葉および／または幹から水、メタノール、エタノールまたは含水エタノール等の親水性有機溶媒を用いて抽出した抗酸化剤。該抗酸化剤は、生体内抗酸化作用及び細胞内酸化ストレス抑制作用を促す。カラコギカエデからの抽出物である抗酸化剤を皮膚外用薬化粧料として用いる。【選択図】図１
2014172888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラコギカエデ（Acer ginnala）の抽出物を有効成分とする、抗酸化剤。
【請求項２】
カラコギカエデの抽出物を有効成分とする生体内抗酸化剤。
【請求項３】
カラコギカエデの抽出物を有効成分とする、細胞内酸化ストレス抑制剤。
【請求項４】
抽出物が、水、親水性有機溶媒、またはそれらの混合物を溶媒として得られたものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の剤。
【請求項５】
抽出物が、カラコギカエデの幹および／または葉の抽出物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の剤。
【請求項６】
カラコギカエデ属の植物の抽出物を、皮膚へ適用し、細胞内の酸化ストレスを抑制する工程を含む、美容方法。
【請求項７】
カラコギカエデの葉の、メタノール、エタノールまたは含水エタノールを溶媒とした抽出物を、固形分として0.012〜1.2μg/ml含む、皮膚外用剤または化粧料。
【請求項８】
アスコルビン酸もしくはその誘導体、および／またはトコフェロールもしくはその誘導体をさらに含む、請求項7に記載の皮膚外用剤または化粧料。
【請求項９】
抗老化用、整髪用、養毛用もしくはヘアトニックとして用いる、請求項7または8に記載の皮膚外用剤または化粧料。
【請求項１０】
カラコギカエデ（Acer ginnala）の葉の含水エタノールによる抽出物を有効成分とする細胞内酸化ストレス抑制剤が添加された、皮膚外用剤または化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラコギカエデの抽出物を有効成分とする、抗酸化剤または細胞内酸化ストレス抑制に関する。本発明は、化粧品製造分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
カラコギカエデ（学名：Acer ginnala）は、カエデ科カエデ属に属する落葉木である。葉はタンニンに富み、灰黒色の染料として用いられている。
【０００３】
特許文献1は、カエデ属に属する植物からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする保湿剤、特にイロハモミジ（Acer palmatum）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤（抗炎症の用途を除く）を開示する。また、特許文献2は、カエデ科植物の樹液から分離され、活性酸素消去（SOD様）作用を有するフェノール性化合物またはその化合物を含む画分を有効成分として含有してなることを特徴とする皮膚外用剤を開示する。カエデ科植物の例として、レッドメープル(Red maple: Acer rubrum)、シルバーメープル(Silver Maple: Acer saccharum)、マニトバメープル（Manitoba Maple: Acer negrundo）、ブラックメープル(Black maple：accernigrum），Norway  Maple(Acer  platanoides)、Sycamore  Maple  (Acer  pseudoplatanus)、Canyon  Maple (Acer grandidentatum)およびBigleaf Maple (Acer macreophyllum)が挙げられているが、カラコギカエデに関する言及はない。
【０００４】
一方、細胞の酸化は、皮膚の老化の原因の一つとして知られている。また抗酸化作用を有する成分を、養毛のために利用することも試みられている（特許文献3および4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】2003-113068（特許04567278号）
【特許文献２】特開2009-67718
【特許文献３】特開平11-246361
【特許文献４】国際公開WO2009/099167
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、抗酸化作用を有する植物由来の成分について検討してきた。とりわけ、細胞内において有効である成分について鋭意検討してきた。その結果、カラコギカエデ抽出物が、他のカエデ属に属する植物の抽出物に比較して、極めて優れた細胞内酸化ストレス抑制能を有することを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
[1]カラコギカエデ（Acer  ginnala）の抽出物を有効成分とする、抗酸化剤。
[2]カラコギカエデの抽出物を有効成分とする、生体内抗酸化剤。
[3]カラコギカエデの抽出物を有効成分とする、細胞内酸化ストレス抑制剤。
[4]抽出物が、水、親水性有機溶媒、またはそれらの混合物を溶媒として得られたものである、[1]〜[3]のいずれか一に記載の剤。
[5]抽出物が、カラコギカエデの幹および／または葉の抽出物である、[1]〜[4]のいずれか一に記載の剤。
[6]カラコギカエデ属の植物の抽出物を、皮膚へ適用し、細胞内の酸化ストレスを抑制する工程を含む、美容方法。
[7]カラコギカエデの葉の、メタノール、エタノールまたは含水エタノールを溶媒とした抽出物を、固形分として0.012〜1.2μg/ml含む、皮膚外用剤または化粧料。
[8]アスコルビン酸もしくはその誘導体、および／またはトコフェロールもしくはその誘導体をさらに含む、[7]に記載の皮膚外用剤または化粧料。
[9]  抗老化用、整髪用、養毛用もしくはヘアトニックとして用いる、[7]または[8]に記載の皮膚外用剤または化粧料。
[10]  カラコギカエデ（Acer ginnala）の葉の含水エタノールによる抽出物を有効成分とする細胞内酸化ストレス抑制剤が添加された、皮膚外用剤または化粧料。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、製造例1〜3および比較例1〜3の抽出物の効果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、「〜」はその前後の数値を含む範囲を意味するものとする。また、%で表記する数値は、特に記載した場合を除き、質量を基準にした値である。
【００１０】
本発明の抗酸化剤または細胞内酸化ストレス抑制剤（以下、「本発明の剤」ということがある。）は、カエデ科カエデ属に属するカラコギカエデ（学名：Acer ginnala）からの抽出物を有効成分とする。
【００１１】
本発明に用いられるカラコギカエデの部位は、特に記載した場合を除き、植物の、全体またはその一部を指す。「一部」には、幹（樹皮、木部を含む。）、葉（葉身、葉柄、托葉を含む。）、根、花（花弁、萼片を含む。）、蕊、果実、種子が含まれる。本発明においては、カラコギカエデとして、好ましくは葉および／または幹、より好ましくは葉を用いる。
【００１２】
本発明の抽出原料としてのカラコギカエデは、生のものであってもよく、乾燥物等であってもよい。抽出工程に供する前に、抽出が効率的に行われるように、裁断・粉砕等の前処理を行ってもよい。
【００１３】
本発明で「抽出物」というときは、特に記載した場合を除き、原料カラコギカエデを抽出溶媒に浸漬して得られた液から固形物を除いたものそのものであってもよく、該液を、濃縮、乾燥等したものであってもよい。抽出物の形態は、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等いずれでもあり得る。また、カラコギカエデの圧搾汁そのものであってもよく、該圧搾汁を、濃縮、乾燥等したものであってもよい。固体状または粉末状とするためには、液状物を、乾燥工程に供することができ、蒸発乾固させて固体状としてもよく、スプレードライにより乾燥させて粉末としてもよく、また凍結乾燥して凍結乾燥物としてもよい。
【００１４】
抽出物を得るための抽出溶媒は特に限定されない。例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール等）、多価アルコール類（グリセロール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール（BG）等）、ケトン類（アセトン、メチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン等からなる群より選択される一種または二種以上を用いることができる。好ましくは水系溶媒、具体的には水、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、グリセロール、1,3-ブチレングリコール）、またはそれらの混合物を抽出溶媒として用いる。混合溶媒を用いる場合、その比率も特に限定されない。本発明に好適に用いることのできる溶媒の例は、水、またはエタノール、グリセロールおよび1,3-ブチレングリコールからなる群より選択される1種以上と水との混合溶媒であり、このとき有機溶媒：水の質量比は、1〜99：99〜1、好ましくは10〜90：90〜10、より好ましくは30〜70：70〜30、例えば50：50である。イオン交換樹脂処理等によって精製することができる。特に好ましい溶媒の例は、メタノール、エタノールまたは含水エタノール（例えば、10〜90％エタノール、好ましくは20〜80％エタノール、より好ましくは40〜60％エタノール）である。
【００１５】
抽出操作は、原料カラコギカエデを室温または加温下で、溶媒中に浸漬することによって実施できる。原料カラコギカエデと溶媒との比は、当業者であれば適宜設計することができるが、例えば、カラコギカエデ原料1質量部に対する溶媒量は、原料が十分に浸漬できる量であればよく、0.5質量部以上であることが好ましく、1質量部以上であることがより好ましく、2質量部以上であることがより好ましい。溶媒量の上限は、経済的な観点から定めることもでき、原料1質量部に対する溶媒量として、例えば、100質量部以下とすることができ、50質量部以下とすることが好ましく、20質量部以下とすることがより好ましい。抽出温度および期間もまた、当業者であれば適宜設計でき、室温または加温下で、1時間〜数か月、好ましくは6時間〜1週間、より好ましくは12時間〜3日間かけて、実施できる。抽出はまた、水蒸気蒸留の方法に拠ってもよい。抽出物が圧搾汁である場合、一般的な方法で調製することができる。例えば、洗浄した原料を、必要に応じpHを調製して破砕し、得られた破砕物に必要であれば酵素処理を施し、固形物を除くことによる。
【００１６】
植物からの抽出物は特有の匂い、着色を有していることがある。また、経時的に変臭、変色が起きたり沈殿が析出したりするなど安定性が乏しいことがある。抽出物は、目的の活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行ってもよい。そのための方法としては、例えば活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理がある。一般に、化粧料は、直接、皮膚や頭髪に塗布し、比較的長い時間塗布した状態を保つとともに、ほぼ毎日連用するものであり、さらに香りは心理的・精神的効果をもたらすことから、化粧料において、香りの影響は非常に大きく、原料成分の臭いには他分野の製品に比べて留意を要する。また外観にも留意を要する。本発明者らの検討によると、実施例で製造したカラコギカエデ抽出物はいずれも、化粧料に添加して用いるのに適した匂い、色であり、化粧料成分としての安定性も期待できるものであった。
【００１７】
本発明は、カラコギカエデ属の植物からの抽出物を、抗酸化剤または細胞内酸化ストレス抑制剤の有効成分として用いる。本発明で「細胞」というときは、特に記載した場合を除き、皮膚（頭皮も含む。）由来の細胞を含む。
【００１８】
ある成分の抗酸化能または細胞内酸化ストレス抑制能の有無またはその程度は、当業者であれば、この分野で慣用されている手法を用いて評価できる。細胞内ストレス抑制能は、典型的には、本明細書の実施の項に記載した方法に基づき、細胞内ストレス消去率（％）またはIC50値として表し、比較・評価することができる。
【００１９】
本発明者らの検討によると、抗酸化能を有する成分であっても、皮膚外用剤や化粧料の場合、経皮的に生体内に取り込まれない場合は意図した効果を発揮できない。生体内に取り込まれても細胞に対して毒性を有する場合等には、意図した効果を発揮することができず、皮膚外用剤または化粧料における有効成分たり得ない。そのためin vitro試験で抗酸化を確認するのではなく、細胞内酸化ストレス抑制能を確認することが重要である。細胞内酸化ストレス抑制能が確認されている本発明の有効成分は、生体内において、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、エラスチンなどの繊維性蛋白質；ヒアルロン酸（ヒアルロナン）、コンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンとプロテオグリカン；フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞接着性蛋白質）の機能維持のために作用しうる。また本発明の有効成分は、細胞自体および細胞内において、細胞膜、細胞内の組織、細胞核内の遺伝子の機能維持のために作用しうる。なお、本発明で細胞内酸化ストレスに関し、「抑制」というときは、特に記載した場合を除き、細胞内において、活性酸素種（ROS）の発生を抑制すること、発生したROS量を低下させることを含む。ROSの発生抑制またはROS量の低下は、有効成分の直接的な抗酸化作用か、または有効成分が細胞内のSOD（スーパーオキサイドディスムターゼ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素群を活性化することよる間接的な作用により、生じうる。
【００２０】
カエデ属（Acer）に属する植物としては、例えば、Acer ginnala（カラコギカエデ、Acer aidzuenseと表記されることもある。）、Acer amoenum（オオモミジ）、Acer argutum（アサノハカエデ）、Acer buergerianum（トウカエデ）、Acer campestre（コブカエデ）、Acer carpinifolium（チドリノキ）、Acer crataegifolium（ウリカエデ）、Acer diabolicum（オニモミジ）、Acer distylum（マルバカエデ）、Acer japonicum（ハウチワカエデ）、Acer mono（イタヤカエデ）、Acer negundo（トネリコバノカエデ）、Acer nigrum（ブラック・メープル）、Acer nikoense（メグスリノキ）、Acer nipponicum（テツカエデ）、Acer palmatum（イロハモミジ）、Acer platanoides（ヨーロッパカエデ）、Acer pseudoplatanus（セイヨウカジカエデ）、Acer pycnanthum（ハナノキ）、Acer rufinerve（ウリハダカエデ）、Acer saccharum（サトウカエデ）、Acer sieboldianum（コハウチワカエデ）、Acer tschonoskii（ミネカエデ）、Acer ukurunduense（オガラバナ）等が挙げられるが、本発明者らの検討によると、これらのうち特にカラコギカエデの抽出物に、高い細胞内酸化ストレス抑制能が認められた。またカラコギカエデの細胞内酸化ストレス消去効果のIC50値は、抗酸化剤として汎用されているビタミンCやビタミンEと比較して1/5程度であり、細胞内においてビタミンCやビタミンEよりも優れた抗酸化作用を示すことが明らかになった。
【００２１】
本発明で「剤」というときは、特に記載した場合を除き、カラコギカエデ抽出物自体であることもあり、抽出物に、希釈剤、安定化剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加物を添加した、抽出物と添加物とからなるものであることもある。本発明の剤は、既存の皮膚外用剤、化粧料は含まれない。
【００２２】
本発明の剤は、カラコギカエデ抽出物を、本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物として、例えば0.001％以上含むことができ、0.01％以上含むことが好ましく、0.1以上含むことがより好ましく、1.0％以上含むことがより好ましい。実施例とは異なる抽出物を用いる場合も、同様に設計でき、また液状の抽出物を用いる場合は、固形分を基準に、本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物に当するする量を計算して、設計できる。
【００２３】
本発明の剤は、皮膚外用剤または化粧料に添加して用いることができる。皮膚外用剤には、本発明の剤のうち、特に皮膚外用に適した形態のものが含まれる。化粧料には、化粧品および医薬部外品が含まれ、また基礎化粧品、メイクアップ化粧品、ボディ化粧品、頭髪用化粧品、頭皮用化粧品、養毛料、薬用化粧品、浴用剤、薬用化粧品、育毛剤が含まれる。
【００２４】
皮膚外用剤または化粧料に、本発明の剤が添加される場合、その含量は、適宜とすることができる。例えば、本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物が使用された剤である場合、0.00001％以上含むことができ、0.0001％以上含むことが好ましく、0.001％以上含むことがより好ましい。より高い効果を長期間を維持しうるとの観点からは、0.003％以上含むことが好ましく、0.01％以上含むことがさらに好ましい。また、いずれの場合であっても、上限値は、経済性、溶解性、安定性、有効成分に起因する色または匂い等を考慮して適宜定めることができる。例えば、10％以下とすることができ、7.5％以下とすることが好ましく、5％以下とすることがより好ましい。実施例とは異なる抽出物を用いる場合も、同様に設計でき、また液状の抽出物を用いる場合は、固形分を基準に、本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物に該当する量を計算して、設計できる。
【００２５】
別の観点からは、本発明の皮膚外用剤または化粧料は、カラコギカエデの抽出物を、固形分として0.01μg/ml以上、好ましくは0.02μg/ml以上、より好ましくは0.04μg/ml以上、さらに好ましくは0.05μg/ml以上含んだものとして構成してもよい。いずれの場合においても、カラコギカエデの抽出物の上限は、固形分として50μg/ml以下、好ましくは25μg/ml以下、より好ましくは10μg/ml以下、さらに好ましくは1.0μg/ml以下とすることができる。
【００２６】
本発明の好ましい態様においては、有効成分としてのカラコギカエデ抽出物は、アスコルビン酸またはその誘導体、および／またはトコフェロール（d-α-トコフェロール、またはdl-α-トコフェロール）若しくはその誘導体と併用される。併用とは、一緒に用いることであり、典型的には、一の剤または組成物中に双方を含んだものを用いることであるが、それぞれを別剤（または別組成物）として、同時に、または順に使用することを含む。
【００２７】
本発明で「誘導体」というときは、特に記載した場合を除き、塩、エステル、または配糖体を含み、皮膚外用剤または化粧料として許容されるものをいう。水溶性であっても油溶性であってもよい。アスコルビン酸誘導体の例は、6-ステアリン酸アスコルビル、6-パルミチン酸アスコルビル、2,6-ジパルミチン酸アスコルビル、2,3,5,6-テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビル／トコフェリルリン酸K、アスコルビン酸-2-硫酸2Na、アスコルビン酸Na、アスコルビン酸-2-リン酸Mg、アスコルビン酸-2-リン酸Na、アスコルビル-2-グルコシドである。中でもアスコルビン酸-2-リン酸Mg、アスコルビン酸-2-リン酸Na、アスコルビル-2-グルコシドが好ましく、アスコルビル-2-グルコシドが特に好ましい。
【００２８】
トコフェロール誘導体の例は、酢酸トコフェロール（酢酸d-α-トコフェロールまたは酢酸dl-α-トコフェロール）、ニコチン酸トコフェロール（ニコチン酸d-α-トコフェロール、ニコチン酸dl-α-トコフェロール）、トコフェリルリン酸Na、アスコルビル／トコフェリルリン酸K、マレイン酸アスコルビルトコフェリンである。中でも酢酸トコフェロール、ニコチン酸トコフェロールが好ましく、酢酸トコフェロールが特に好ましい。
【００２９】
併用の際の各成分それぞれの配合量や比は、当業者であれば適宜設定できる。併用の場合の、カラコギカエデ抽出物と併用成分との比は、カラコギカエデ抽出物固形分（本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物に相当する量）1質量部に対し、0.0025〜25,000質量部とすることができ、0.025〜2,500質量部とすることが好ましく、0.25〜250質量部とすることがより好ましい。
【００３０】
本発明の皮膚外用剤または化粧料（これらをまとめて「本発明の組成物」ということもある。）は、本発明の剤の効果を損なわない範囲で、化粧料または医薬として許容される種々の機能性の成分を配合することができる。このような成分の例は、美白剤、紫外線防御剤、抗菌剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、活性酸素除去剤、保湿剤、皮膚を清浄にする成分、ニキビ、アセモを防ぐ成分である。
【００３１】
本発明の組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の剤以外に、化粧料または医薬として許容される、種々の添加物を配合することができる。この例は、水（精製水、温泉水、海洋深層水等）、界面活性剤（乳化剤、可溶化剤、懸濁化剤、安定剤等）、酸化防止剤、防腐剤、ゲル化剤、アルコール類、皮膜形成剤、着色料、香料、消臭剤、塩類、pH調整剤、清涼剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ビタミン類等がある。
【００３２】
本発明の組成物はまた、その使用目的に応じて、固形剤、半固形剤、液剤等の各種剤形の組成物に調製することができる。より具体的には、本発明の組成物は、基礎化粧品として、クレンジング、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、マッサージ製品、パック製品、美容液・ジェル、リップケア製品等；ベースメイク化粧品として、ファンデーション、フェイスパウダー、化粧下地、コンシーラー等；ポイントメイク化粧品として、口紅、リップグロス・ライナー、チーク製品、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、アイブロウ製品等；ボディ用化粧品として石鹸、液体洗浄料、日焼け止めクリーム、入浴剤等；頭髪用化粧品または頭皮用化粧品としてシャンプー、リンス、ヘアトリートメント、整髪料、ヘアトニック、養毛料、スキャルプトリートメント等とすることができる。また、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、塗布剤、貼付剤、エアゾール剤（スプレー薬）とすることができる。
【００３３】
本発明の組成物はまた、キットまたはコマーシャルパッケージとすることができる。これらの態様は、本発明の組成物以外に、使用方法や上述したような目的の効果・効能が記載されたもの（例えば、箱、容器、ラベル、使用説明書、タグ）を含んでもよい。
【００３４】
本発明の剤またはそれを添加した皮膚外用剤もしくは化粧料は、抗酸化により、または細胞内酸化ストレス抑制により改善される状態の処置のため、例えば、抗老化、養毛、美容のために用いることができる。本発明で「養毛」というときは、特に記載した場合を除き、脱毛および／または薄毛の予防・防止、発毛の促進、育毛、毛髪の伸びを速めること、養毛等の目的で頭皮および／または頭髪にうるおいを与えること、および養毛等の目的で皮膚をすこやかに保つことを含む。
【００３５】
本発明で「美容（方法）」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトに対する医療行為（医師法により、医師および医師の指示を受けた看護師・助産師などの医療従事者のみ行うことが認められている治療や処置。）を含まない。また「皮膚」または「肌」というときは、特に記載した場合を除き、その場所は限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。本発明の抗老化のための方法、養毛方法、美容方法は、他人に対して実施する場合を含む。本発明はまた、カラコギカエデ抽出物を添加・強化する工程を含む、抗酸化剤若しくは細胞内酸化ストレス抑制剤、または皮膚外用剤もしくは化粧料の製造方法を提供する。本発明でカラコギカエデ抽出物を化粧料等に「添加する工程」というときは、化粧料等の商業的な製造において、カラコギカエデ抽出物を原料として用いることを含む。本発明の方法は、医師（医師の指示を受けた看護師・助産師などの医療従事者も含む。）以外の者、例えば、化粧品または医薬品の製造者、販売者、メイクアップ・アーティスト、美容スタッフ、またはエステティシャン等が行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００３７】
［製造例1]
乾燥したAcer  ginnala（カラコギカエデ）の葉10gを細切し、メタノール100mLに浸漬し攪拌しながら24時間抽出を行った。抽出液をろ過分離した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、凍結乾燥して抽出物を得た。収量は2.2g（収率22％）であった。
【００３８】
［製造例2]
乾燥したAcer  ginnala（カラコギカエデ）の葉10gを細切し、95％エタノール水溶液100mLに浸漬し攪拌しながら24時間抽出を行った。抽出液をろ過分離した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、凍結乾燥して抽出物を得た。収量は1.3g（収率13％）であった。
【００３９】
［製造例3］
乾燥したAcer  ginnala（カラコギカエデ）の葉10gを細切し、50％エタノール水溶液100mLに浸漬し攪拌しながら24時間抽出を行った。抽出液をろ過分離した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、凍結乾燥して抽出物を得た。収量は1.2g（収率12％）であった。
【００４０】
［比較例1］
同じカエデ属であるAcer  palmatum（イロハモミジ）の葉10gについて、製造例1と同様の方法で抽出を行い、比較例1の抽出物を得た。収量は2.3g（収率23％）であった。
【００４１】
［比較例2］
同じカエデ属であるAcer  palmatum（イロハモミジ）の幹10gについて、製造例1と同様の方法で抽出を行い、比較例2の抽出物を得た。収量は0.8g（収率8％）であった。
【００４２】
［比較例3］
同じカエデ属であるAcer  negundo（トネリコバノカエデ）の葉10gについて、製造例1と同様の方法で抽出を行い、比較例3の抽出物を得た。収量は1.6g（収率16％）であった。
【００４３】
［細胞内抗酸化活性の測定について］
本方法は細胞内ROSと反応し蛍光を発する2'，7'−Dichlorofuorescein  diacetate（DCFH−DA）を用いるものであり、後掲非特許文献1に記載の方法を参考にしている。細胞膜透過性の高いDCFH−DAは容易に細胞内に浸透し、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されて非蛍光性のDCFHとして細胞内に滞留する。DCFHは細胞内のROSにより酸化されて蛍光性のDCFへと変換されるため、測定されるDCFの蛍光強度がすなわち細胞内ROS量の指標となる。過酸化水素処理により細胞内ROS量は増加するが、測定試料の直接的な抗酸化作用または、測定試料により細胞自身の抗酸化酵素群が活性化されることによる間接的な作用により細胞内ROSが消去されROS量が低下すると、コントロールと比較した蛍光強度の低下として観測される。
【００４４】
非特許文献1：
Kelly L. Wolfe, Rui Hai Liu, Cellular Antioxidant Activity (CAA) Assay for Assessing Antioxidants, Foods, and Dietary Supplements. J Agric Food Chem 2007, 55, p8896,
【００４５】
［試験例1］
HepG2細胞を10％FBS含有MEM培地で37℃、5％CO2存在下、1週間培養した。1週間後に0.125％トリプシン−EDTA溶液を用いて細胞を回収して24ウェルプレートに3×105個／cm2の濃度で播種した。37℃、5％CO2存在下で24時間培養した後、各ウェルをPBS（−）で1回洗浄し、新たな培地1mLを加えた。続いて、製造例1〜3のAcer ginnala（カラコギカエデ）抽出物または比較例1〜3をDMSOに溶解し最終濃度10ug／mLになるように添加した。さらにDCFH−DA（シグマ−アルドリッチジャパン株式会社製）をPBS（−）で希釈して最終濃度25μMになるように加えた。37℃、5％CO2存在下で1時間培養した後に、過酸化水素（和光純薬株式会社製）をPBS（−）で希釈し最終濃度が200μMになるよう添加し、室温暗所で1時間静置した。1時間後に各ウェルをPBS（−）で洗浄し、PBS（−）1mLを加えて励起波長485nmで538nmにおける蛍光強度を測定した。式（1）に従って、細胞内酸化ストレス消去率を算出した。
【００４６】
【数１】
2014172888.tif 000003
【００４７】
結果を下表および図1に示す。
【００４８】
【表１】
2014172888.tif 000004
【００４９】
製造例1〜3のAcer  ginnala抽出物は比較例1〜3の他のカエデ属植物の抽出物と比較して細胞内酸化ストレス消去効果が高く、優れた抗酸化作用を有することが示された。
【００５０】
［試験例2：IC50］
HepG2細胞を10％FBS含有MEM培地で37℃、5％CO2存在下、1週間培養した。1週間後に0.125％トリプシン−EDTA溶液を用いて細胞を回収して24ウェルプレートに3×105個／cm2の濃度で播種した。37℃、5％CO2存在下で24時間培養した後、各ウェルをPBS（−）で1回洗浄し、新たな培地1mLを加えた。続いて、製造例1〜3のAcer ginnala（カラコギカエデ）抽出物をDMSOに溶解し最終濃度がそれぞれ50ug／mL、16.7ug／mL、5.6ug／mL、1.9ug／mL、0.6ug／mL、0.2ug／mL、0.07ug／mL、0.02ug／mLになるように添加した。さらにDCFH−DA（シグマ−アルドリッチジャパン株式会社製）をPBS（−）で希釈して最終濃度25μMになるように加えた。37℃、5％CO2存在下で1時間培養した後に、過酸化水素（和光純薬株式会社製）をPBS（−）で希釈し最終濃度が200μMになるよう添加し、室温暗所で1時間静置した。1時間後に各ウェルをPBS（−）で洗浄し、PBS（−）1mLを加えて励起波長485nmで538nmにおける蛍光強度を測定した。試料の各添加濃度における蛍光強度から（1）式に従って細胞内酸化ストレス消去率を計算し、続いてIC50（細胞内ROS量を半減させるために必要な試料濃度）を算出し比較した。比較対象としてビタミンCおよび水溶性ビタミンE（Trolox：  シグマ-アルドリッチジャパン株式会社製）を用い同様に試験した。
【００５１】
結果を下表に示した。
【００５２】
【表２】
2014172888.tif 000005
【００５３】
製造例1〜3のAcer  ginnala抽出物は抗酸化剤として汎用されているビタミンCやビタミンEと比較してIC50が低く、細胞内においてビタミンCやビタミンEよりも優れた抗酸化作用を示すことが明らかになった。
【００５４】
［処方例］
［化粧水1］
(製法)
A. 下記成分(1)〜(8)を混合溶解する。
B. 下記成分(9)〜(15)を混合溶解する。
C. BにAを加え混合し、化粧水を得る。
(成分)(質量％)
(1)メドウホーム油  0.1
(2)ホホバ油  0.05
(3)香料  適量
(4)フェノキシエタノール  0.1
(5)モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタン  0.5
(6)イソステアリン酸ポリオキシエチレン(50E.O.)硬化ヒマシ油  1.0
(7)エタノール  8.0
(8)酢酸トコフェロール  0.05
(9)グリチルリチン酸ジカリウム  0.1
(10)グリセリン  5.0
(11)1，3−ブチレングリコール  5.0
(12)ポリエチレングリコール1500  0.1
(13)カラコギカエデ抽出液(＊1)  0.001
(14)加水分解コラーゲン  0.001
(15)精製水  残量
(＊1)製造例3により調製されたもの
【００５５】
［化粧水2］
(製法)
A. 下記成分(1)〜(9)を混合溶解する。
B. 下記成分(10)〜(13)を混合溶解する。
C. AにBを加え混合し、化粧水を得る。
(成分)(質量％)
(1)水酸化ナトリウム  0.3
(2)クエン酸  0.1
(3)リン酸一水素ナトリウム  0.1
(4)エデト酸二ナトリウム    0.05
(5)アスコルビン酸グルコシド  2.0
(6)カラコギカエデ抽出液(＊2)  0.0001
(7)グリセリン  3.0
(8)ジプロピレングリコール  8.0
(9)精製水  残量
(10)エタノール  10.0
(11)香料適量
(12)ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油  0.05
(13)テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタエリトリット  0.2
(＊2)製造例3により調製されたもの
【００５６】
［乳液］
(製法)
A. 下記成分(11)の一部を加熱し、70℃に保つ。
B. 下記成分(1)〜(10)を加熱混合し、70℃に保つ。
C. BにAを加えて混合し、均一に乳化する。
D. Cを冷却後、下記成分(12)〜(16)と(11)の残部を混合してから加え、均一に混合して乳液を得た。
(成分)(質量％)
(1)ポリオキシエチレン(10E.O.)ソルビタンモノステアレート  1.0
(2)ポリオキシエチレン(60E.O.)ソルビタントリオレエート  0.5
(3)グリセリルモノステアレート  1.0
(4)ステアリン酸  0.5
(5)ベヘニルアルコール  0.5
(6)スクワラン  8.0
(7)エタノール  5.0
(8)パルミチン酸レチノール  0.1
(9)グリチルレチン酸ステアリル  0.1
(10)フェノキシエタノール  0.1
(11)精製水  残量
(12)カルボキシビニルポリマー  0.2
(13)水酸化ナトリウム  0.1
(14)ヒアルロン酸  0.1
(15)カラコギカエデ抽出液(＊3)  0.003
(16)香料適量
(＊3)製造例3により調製されたもの
【００５７】
［リキッドファンデーション(水中油型乳液状)］
(製造方法)
A. 成分(6)〜(11)を分散する。
B. Aに成分(12)〜(17)を加え70℃で均一に混合する。
C. 成分(1)〜(5)を70℃で均一に混合する。
D. CにBを加え乳化し、室温まで冷却する。
E. Dに成分(18)、(19)を添加し均一に混合して水中油型クリーム状リキッドファンデーションを得た。
(成分)(質量％)
(1)アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合(注1)  0.5
(2)トリエタノールアミン  1.5
(3)精製水  残量
(4)グリセリン  5
(5)パラオキシ安息香酸メチル  0.1
(6)1，3ブチレングリコール  5
(7)水素添加大豆リン脂質  0.5
(8)テフロン（登録商標）処理酸化チタン  5
(9)オクチルシリル化処理ベンガラ  0.1
(10)シリコーン処理黄酸化鉄  1
(11)無水ケイケイ酸処理黒酸化鉄  0.05
(12)ステアリン酸  0.9
(13)モノステアリン酸グリセリン  0.3
(14)セトステアリルアルコール  0.4
(15)モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタン  0.2
(16)トリオレイン酸ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタン  0.2
(17)パラメトキシケイ皮酸2―エチルヘキシル  5
(18)カラコギカエデ抽出液(＊4)  0.1
(19)香料  0.02
(＊4)製造例3により調製されたもの
(注1)ペミュレンTR−2(NOVEON社製)
【００５８】
(製造方法)
A. 成分(1)〜(6)を均一に分散する。
B. 成分(7)〜(11)を均一に分散する。
C. 成分(12)〜(16)を均一に分散する。
D. AとBを均一に混合後、徐々にCを加えて乳化し、油中水型クリーム状日焼け止め化粧料を得た。
(成分)(質量％)
(1)シリコン・イソプロピルトリイソステアロイルチタネート処理酸化亜鉛  10
(2)ハイドロゲンジメチコン処理微粒子酸化チタン  5.0
(3)ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン  3.5
(4)PEG−9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン(注2)  3
(5)デカメチルシクロペンタシロキサン  20
(6)イソノナン酸イソトリデシル  5
(7)パラメトキシケイ皮酸2−エチルヘキシル  8
(8)ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルテトラメチルブチルフェノール  3.5
(9)ジメチルステアリルアンモニウムヘクトライト  1.2
(10)(ジメチコン/ビニルジメチコン)クロスポリマー  2.5
(11)トコフェロール    0.001
(12)精製水  残量
(13)エタノール  6.5
(14)塩化ナトリウム  0.3
(15)カラコギカエデ抽出液(＊5)  0.005
(16)アスコルビルリン酸マグネシウム  3
(＊5)製造例3により調製されたもの
(注2)KF−6028(信越化学工業社製)
【００５９】
(製造方法)
A. 成分(1)〜(4)を加熱混合し、75℃に保つ。
B. 成分 (5)〜(9)を加熱混合し、75℃に保つ。
C. AにBを徐々に加え軟膏剤を得た。
(成分)(質量％)
(1)ステアリン酸  18.0
(2)セタノール  4.0
(3)酢酸dl−α―トコフェロール(注3)  0.2
(4)パラオキシ安息香酸メチル  0.1
(5)トリエタノールアミン  2.0
(6)グリセリン  5.0
(7)グリチルリチン酸ジカリウム(注4)  0.5
(8)カラコギカエデ抽出液(＊6)0. 01 
(9)精製水  残量
(＊6)製造例3により調製されたもの
(注3)エーザイ社製
(注4)和光純薬工業社製
【００６０】
［ローション剤］
(製造方法)
A. 成分(4)〜(7)を混合溶解する。
B. 成分(1)〜(3)を混合溶解する。
C. AとBを混合して均一にし、ローション剤を得た。
(成分)(質量％)
(1)グリセリン  5.0
(2)1，3−ブチレングリコール  6.5
(3)精製水  残量
(4)ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタンモノラウリン酸エステル  1.2
(5)エチルアルコール  8.0
(6)カラコギカエデ抽出液(＊7)  0.00005
(7)パラオキシ安息香酸メチル  0.2
(＊7)製造例3により調製されたもの
【００６１】
［養毛用化粧料］
(製造方法)
A. 成分(1)〜(5)を混合溶解する。
B. 成分(6)〜(10)を混合溶解する。
C. AとBを混合して均一にし、養毛用化粧料を得た。
(成分)(質量％)
(1)エチルアルコール  50.0
(2)ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(80E.O.)  0.5
(3)メントール  0.05
(4)カンファ  0.01
(5)フェノキシエタノール  0.05
(6)精製水  残量
(7)カラコギカエデ抽出液(＊8)  1
(8)オタネニンジン抽出物(注5)  0.5
(9)パントテニルアルコール(注6)  0.1
(10)グリセリン  5.0
(＊8)製造例3により調製されたもの
(注5)一丸ファルコス社製
(注6)関東化学社製
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、天然物由来の、細胞内酸化ストレス抑制剤、並びにそれらを含む皮膚外用剤または化粧料、抗老化用もしくは養毛用として用いる皮膚外用剤または化粧料が提供される。
【図１】
2014172888.tif 000006