(57)【要約】【課題】リグノセルロース系バイオマスから、高収率でキシロースを得ることができる糖化溶液の製造方法を提供する。【解決手段】アンモニア分離後、糖化前処理物の温度が耐熱性β−キシロシダーゼを添加することによる糖化阻害反応を無視できる温度に降下するまでの第１の温度範囲にある間に、糖化前処理物に耐熱性キシラナーゼを添加して第１の基質・糖化酵素混合物を得た後、基質の少なくとも一部を糖化処理してオリゴ糖を生成させる。第１の基質・糖化酵素混合物の温度が前記糖化阻害反応を無視できる温度から該耐熱性β−キシロシダーゼが機能不能となる温度に降下するまでの第２の温度範囲にある間に、第１の基質・糖化酵素混合物に耐熱性β−キシロシダーゼを添加して第２の基質・糖化酵素混合物を得た後、基質及びオリゴ糖を糖化処理して単糖を生成させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質としてのリグノセルロース系バイオマスにアンモニア水を混合してなる基質混合物を所定温度に所定時間保持して前処理した後、アンモニアを気化させて分離することにより糖化前処理物を得る工程と、
該糖化前処理物に糖化酵素を添加してなる基質・糖化酵素混合物を糖化処理することにより糖化溶液を得る工程とを備える糖化溶液の製造方法において、
該アンモニアを分離した後、該糖化前処理物の温度が耐熱性β−キシロシダーゼを添加することによる糖化阻害反応を無視できる温度に降下するまでの第１の温度範囲にある間に、該糖化前処理物に耐熱性キシラナーゼを添加して第１の基質・糖化酵素混合物を得た後、該基質の少なくとも一部を糖化処理してオリゴ糖を生成させる工程と、
該第１の基質・糖化酵素混合物の温度が該糖化阻害反応を無視できる温度から該耐熱性β−キシロシダーゼが機能不能となる温度に降下するまでの第２の温度範囲にある間に、該第１の基質・糖化酵素混合物に該耐熱性β−キシロシダーゼを添加して第２の基質・糖化酵素混合物を得た後、該基質及び該オリゴ糖を糖化処理して単糖を生成させる工程とを備えることを特徴とする糖化溶液の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の糖化溶液の製造方法において、前記第１の温度範囲は８０〜５０℃の範囲であり、前記第２の温度範囲は５０〜３０℃の範囲であることを特徴とする糖化溶液の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の糖化溶液の製造方法において、前記耐熱性キシラナーゼは、好熱菌Thermoascus aurantiacus由来であることを特徴とする糖化溶液の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の糖化溶液の製造方法において、前記耐熱性β−キシロシダーゼは、好熱菌Thermotoga maritima由来であることを特徴とする糖化溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
稲藁等のリグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖を発酵させることによりエタノールを製造する方法が知られている。
【０００３】
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロース又はヘミセルロースにリグニンが強固に結合した構成を備えている。そこで前記糖化に当たっては、まず、前記リグノセルロース系バイオマスを前処理し、該リグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンが解離され、又は該リグノセルロース系バイオマスが膨潤された糖化前処理物を得る。
【０００４】
尚、本願では、「解離」との用語は、セルロース又はヘミセルロースとリグニンとの結合の少なくとも一部を切断することを意味する。又、「膨潤」との用語は、液体の浸入によって結晶性セルロースを構成するセルロース若しくはヘミセルロースに空隙を生じ、又はセルロース繊維の内部に空隙を生じて、該結晶性セルロースを膨張させることを意味する。
【０００５】
前記リグノセルロース系バイオマスの前処理は、例えば基質としての前記リグノセルロース系バイオマスにアンモニア水を混合して基質混合物とし、該基質混合物を例えば２５℃の温度に１００時間保持することにより行う。前記前処理の終了後、前記基質混合物をアンモニアの沸点以上の温度、例えば８０℃の温度に加熱することにより、アンモニアを気化させて分離し、前記糖化前処理物を得ることができる。
【０００６】
前記糖化前処理物の糖化の際には、より多くの糖を得るために、前記セルロースの糖化によりグルコースを得るのみならず、前記ヘミセルロースの糖化によりキシロースをも得ることが望ましい。そこで、従来、前記ヘミセルロースの糖化のための糖化酵素として、耐熱性キシラナーゼ及び耐熱性β−キシロシダーゼを用いて糖化溶液を得る方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１０６３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記前処理後、アンモニアを気化させて分離することにより得られた前記糖化前処理物に、耐熱性キシラナーゼ及び耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加すると、十分な量のキシロースを得ることができないという不都合がある。
【０００９】
本発明は、かかる不都合を解消して、前記リグノセルロース系バイオマスから、高収率でキシロースを得ることができる糖化溶液の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アンモニア分離後の前記糖化前処理物に、耐熱性キシラナーゼ及び耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加したときに、十分な量のキシロースを得ることができない理由について鋭意検討した。この結果、前記糖化前処理物は、前記前処理の終了直後にはアンモニアを気化させて分離することが可能な程度の温度となっており、該温度の前記糖化前処理物に該耐熱性β−キシロシダーゼを添加すると、糖化阻害反応が急激に進行することが判明した。そして、前記糖化阻害反応が急激に進行する結果として、前記基質の一部が失われるものと考えられる。
【００１１】
また、前記糖化阻害反応を回避するために、該糖化阻害反応の影響を無視できる温度まで前記糖化前処理物の温度が降下した後、前記耐熱性キシラナーゼ及び該耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加することが考えられる。しかし、このようにするときには、前記耐熱性キシラナーゼが十分に機能することができず、十分な量のキシロースを得ることができない。
【００１２】
そこで、前記目的を達成するために、本発明は、基質としてのリグノセルロース系バイオマスにアンモニア水を混合してなる基質混合物を所定温度に所定時間保持して前処理した後、アンモニアを気化させて分離することにより糖化前処理物を得る工程と、該糖化前処理物に糖化酵素を添加してなる基質・糖化酵素混合物を糖化処理することにより糖化溶液を得る工程とを備える糖化溶液の製造方法において、該アンモニアを分離した後、該糖化前処理物の温度が耐熱性β−キシロシダーゼを添加することによる糖化阻害反応を無視できる温度に降下するまでの第１の温度範囲にある間に、該糖化前処理物に耐熱性キシラナーゼを添加して第１の基質・糖化酵素混合物を得た後、該基質の少なくとも一部を糖化処理してオリゴ糖を生成させる工程と、該第１の基質・糖化酵素混合物の温度が該糖化阻害反応を無視できる温度から該耐熱性β−キシロシダーゼが機能不能となる温度に降下するまでの第２の温度範囲にある間に、該第１の基質・糖化酵素混合物に該耐熱性β−キシロシダーゼを添加して第２の基質・糖化酵素混合物を得た後、該基質及び該オリゴ糖を糖化処理して単糖を生成させる工程とを備えることを特徴とする。
【００１３】
本発明の糖化溶液の製造方法では、まず、前記前処理後、アンモニアを気化させて分離することにより糖化前処理物を得る。前記糖化前処理物はアンモニアを気化させて分離することが可能な程度の温度となっており、該温度は前記耐熱性β−キシロシダーゼを添加すると糖化阻害反応が急激に進行する温度であるが、前記耐熱性キシラナーゼは該糖化阻害反応を起こすことなく機能することができる。
【００１４】
そこで、前記アンモニアを分離した後、前記糖化前処理物の温度が耐熱性β−キシロシダーゼを添加することによる糖化阻害反応を無視できる温度に降下するまでの第１の温度範囲にある間に、該糖化前処理物に耐熱性キシラナーゼを添加して第１の基質・糖化酵素混合物を得る。前記耐熱性キシラナーゼは、前記糖化前処理物の温度が前記第１の温度範囲にある間の高温域においても、前記糖化阻害反応を起こすことなく基質を糖化することができる。また、前記耐熱性キシラナーゼは、機能可能な温度範囲内であればより高温である方がより効率よく基質を糖化することができるので、前記糖化前処理物の温度が前記糖化阻害反応を無視できる温度まで降下する間の時間及び熱を有効に利用することができる。
【００１５】
この結果、前記基質の少なくとも一部を、前記耐熱性キシラナーゼにより糖化処理して、効率よくオリゴ糖を生成させることができる。
【００１６】
次に、前記第１の基質・糖化酵素混合物の温度が前記糖化阻害反応を無視できる温度から前記耐熱性β−キシロシダーゼが機能不能となる温度に降下するまでの第２の温度範囲にある間に、該第１の基質・糖化酵素混合物に該耐熱性β−キシロシダーゼを添加して第２の基質・糖化酵素混合物を得る。
【００１７】
前記第２の基質・糖化酵素混合物は、前記オリゴ糖と共に前記基質の残部を含む一方、前記糖化酵素として、前記耐熱性キシラナーゼと前記耐熱性β−キシロシダーゼとの両方を含んでいる。ここで、前記耐熱性キシラナーゼは、前記第２の温度範囲においても機能することができる。
【００１８】
そこで、前記第２の基質・糖化酵素混合物では、前記第１の温度範囲において前記耐熱性キシラナーゼにより生成された前記オリゴ糖を前記耐熱性β−キシロシダーゼが糖化して単糖としてのキシロースを生成する。また、前記耐熱性キシラナーゼが前記基質の残部を糖化して新たなオリゴ糖を生成し、該オリゴ糖も前記耐熱性β−キシロシダーゼにより糖化されて単糖としてのキシロースが生成される。
【００１９】
この結果、本発明の製造方法によれば、前記リグノセルロース系バイオマスから、高収率でキシロースを得ることができる。
【００２０】
本発明の製造方法において、前記第１の温度範囲は例えば８０〜５０℃の範囲であり、前記第２の温度範囲は例えば５０〜３０℃の範囲である。
【００２１】
また、本発明の製造方法では、前記耐熱性キシラナーゼとしては、例えば、好熱菌Thermoascus aurantiacus由来の耐熱性キシラナーゼを用いることができる。また、前記耐熱性β−キシロシダーゼとしては、例えば、好熱菌Thermotoga maritima由来の耐熱性β−キシロシダーゼを用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】耐熱性キシラナーゼ及び耐熱性β−キシロシダーゼを用いてキシランを糖化することにより得られた糖化溶液の濃度を示すグラフ。
【図２】本発明の製造方法により得られた糖化溶液の濃度を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００２４】
本実施形態の糖化溶液の製造方法では、まず、稲藁を目開き３ｍｍのメッシュを通過する大きさに粉砕し、基質としてのリグノセルロース系バイオマスとする。
【００２５】
次に、前記リグノセルロース系バイオマスの乾燥質量に対し、２５質量％の濃度のアンモニア水を、１：１の質量比となるように混合して基質混合物を得る。そして、前記基質混合物を例えば２５℃の温度に１００時間保持することにより、前記リグノセルロース系バイオマスの前処理を行う。前記前処理の結果、前記リグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンが解離され、又は該リグノセルロース系バイオマスが膨潤される。
【００２６】
前記前処理が終了したならば、次に前記基質混合物をアンモニアの沸点以上の温度、例えば８０℃の温度に加熱することにより、アンモニアを気化させて分離し、糖化前処理物を得る。前記糖化前処理物は、その全量に対し例えば１０〜２６質量％の濃度の前記基質を含んでいる。
【００２７】
次に、前記糖化前処理物の温度が、前記８０℃の温度から、耐熱性β−キシロシダーゼを添加することによる糖化阻害反応を無視できる温度、例えば５０℃の温度に降下するまでの第１の温度範囲にある間に、該糖化前処理物に耐熱性キシラナーゼを添加して第１の基質・糖化酵素混合物を得る。前記第１の基質・糖化酵素混合物は、その全量に対し例えば０．０１５〜０．５質量％の濃度の前記耐熱性キシラナーゼを含んでいる。
【００２８】
前記耐熱性キシラナーゼとしては、例えば、好熱菌Thermoascus aurantiacus由来のものを用いることができる。また、前記耐熱性β−キシロシダーゼとしては、例えば、好熱菌Thermotoga maritima由来のものを用いることができる。
【００２９】
耐熱性キシラナーゼは、その機能可能な温度範囲内であれば温度が高いほど活発に機能するので、前記糖化前処理物の温度が前記第１の温度範囲のうち、できるだけ高い温度にあるときに該糖化前処理物に添加することが好ましい。
【００３０】
次に、前記第１の基質・糖化酵素混合物を、前記第１の温度範囲に１２〜３６時間の範囲の時間、例えば２４時間保持する。このようにすることにより、前記第１の基質・糖化酵素混合物に含まれる基質の一部を前記耐熱性キシラナーゼにより糖化し、オリゴ糖としてのキシロビオースを生成させる。
【００３１】
次に、前記第１の基質・糖化酵素混合物の温度が前記糖化阻害反応を無視できる温度、例えば５０℃の温度に降下したならば、該第１の基質・糖化酵素混合物に該耐熱性β−キシロシダーゼを添加して第２の基質・糖化酵素混合物を得る。前記耐熱性β−キシロシダーゼは、前記第１の基質・糖化酵素混合物の温度が該耐熱性β−キシロシダーゼが機能不能となる温度、例えば３０℃の温度に降下するまでの第２の温度範囲にある間に、該第１の基質・糖化酵素混合物に添加する。
【００３２】
次に、前記第２の基質・糖化酵素混合物を、前記第２の温度範囲に２４〜７２時間の範囲の時間、例えば４８時間保持する。このようにすることにより、前記第２の基質・糖化酵素混合物に含まれるオリゴ糖としてのキシロビオースを前記耐熱性β−キシロシダーゼにより糖化し、単糖としてのキシロースを生成させる。
【００３３】
また、前記第２の基質・糖化酵素混合物は、前記第１の基質・糖化酵素混合物に含まれていた基質のうち、前記耐熱性キシラナーゼによりオリゴ糖に糖化されなかった基質の残部と、該耐熱性キシラナーゼとを含んでいる。そこで、前記基質の残部は、前記第２の基質・糖化酵素混合物が前記第２の温度範囲に保持されている間に、前記耐熱性キシラナーゼによりオリゴ糖に糖化され、さらに該オリゴ糖が前記耐熱性β−キシロシダーゼにより糖化され、単糖としてのキシロースが生成される。
【００３４】
従って、本実施形態の糖化溶液の製造方法によれば、前記リグノセルロース系バイオマスから、高収率でキシロースを得ることができ、高濃度のキシロースを含む糖化溶液を得ることができる。
【００３５】
次に、本発明の実施例及び比較例を示す。
【実施例】
【００３６】
〔実施例１〕
本実施例では、前記糖化前処理物のモデルとして、５質量％の濃度のキシラン（シグマアルドリッチ社製）水溶液を用いて糖化溶液を製造した。
【００３７】
本実施例では、まず、前記キシラン水溶液を第１の温度範囲に相当する７５℃の温度に加熱し、終濃度が０．１質量％となるように好熱菌Thermoascus aurantiacus由来の耐熱性キシラナーゼを添加し、該温度に２４時間保持した。前記耐熱性キシラナーゼは自社内で構築したキシラナーゼ生産麹菌の培養液を濃縮して作製した。前記耐熱性キシラナーゼの構築は次のようにして行った。
【００３８】
まず、配列番号１の好熱菌Thermoascus aurantiacus由来のエンドキシラナーゼ遺伝子を、好熱菌Thermoascus aurantiacus由来のエンドキシラナーゼ遺伝子（タカラバイオ株式会社製）を鋳型とし、配列番号２，３のプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）とを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて精製し、エンドキシラナーゼ遺伝子ＥＸを得た。
【００３９】
次に、麹菌Aspergillus oryzae由来の硝酸還元酵素遺伝子を、麹菌ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型とし、配列番号４，５のプライマーと前記ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物とプラスミドベクターｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社製）とを、制限酵素ＡｖａＩ、ＮｄｅＩを用いて３７℃で処理した後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて行った。
【００４０】
次に、前記ＰＣＲ増幅産物と前記プラスミドベクターｐＢＲ３２２とを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。この結果、プラスミドｐＢＲ−ｎｉａＤを得た。
【００４１】
次に、麹菌由来のａｇｄＡターミネーター遺伝子を、麹菌ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型とし、配列番号６，７のプライマーと前記ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物と前記プラスミドｐＢＲ−ｎｉａＤとを、制限酵素ＳａｌＩ、ＡｖａＩを用いて３７℃で処理した後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、前記ゲル抽出キットを用いて行った。
【００４２】
次に、前記ＰＣＲ増幅産物と前記プラスミドｐＢＲ−ｎｉａＤとを、前記ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。この結果、プラスミドｐＢＲ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを得た。
【００４３】
次に、麹菌由来のｅｎｏＡプロモーター遺伝子を、麹菌ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型とし、配列番号８，９のプライマーと前記ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物と前記プラスミドｐＢＲ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤとを、制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩを用いて３７℃で処理した後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、前記ゲル抽出キットを用いて行った。
【００４４】
次に、前記ＰＣＲ増幅産物と前記プラスミドｐＢＲ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤとを、前記ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。この結果、プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを得た。
【００４５】
次に、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを、制限酵素ＳｍａＩを用いて３０℃で処理した後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、前記ゲル抽出キットを用いて行った。この結果、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤの制限酵素ＳｍａＩ処理断片を得た。
【００４６】
次に、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤの制限酵素ＳｍａＩ処理断片と前記エンドキシラナーゼ遺伝子ＥＸとを、ディレクショナルクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、商品名：Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて連結し、エンドキシラナーゼ麹菌発現用ベクターとして配列番号１０のプラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＥＸ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを得た。次に、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＥＸ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを、Ｓｔｅｌｌａｒ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質転換し、エンドキシラナーゼ大腸菌形質転換株を得た。次に、得られたエンドキシラナーゼ大腸菌形質転換株を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地で３７℃、１８０ｒｐｍで１晩培養し、得られた培養物からミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いて、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＥＸ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを大量調整した。
【００４７】
次に、ＰＥＧ−カルシウム法により定法に従って、前記プラスミドｐＢＲ−ＰｅｎｏＡ−ＥＸ−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤを用い、独立行政法人酒類総合研究所から入手した麹菌Aspergillus oryzaeｎｉａＤ３００株を形質転換した。次に、ツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（３質量／容量％デキストリン、０．１質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．２質量／容量％塩化カリウム、０．０５質量／容量％硫酸マグネシウム、０．００１質量／容量％硫酸鉄、０．３質量／容量％硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択し、エンドキシラナーゼ麹菌形質転換株を得た。
【００４８】
次に、前記エンドキシラナーゼ麹菌形質転換株を、前記ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。次に、５００ｍＬ三角フラスコにＰＤ液体培地（２質量／容量％デキストリン、１質量／容量％ポリペプトン、０．１質量／容量％カザミノ酸、０．５質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．０５質量／容量％硫酸マグネシウム、０．１質量／容量％硝酸ナトリウム）１００ｍＬを取り、これに前記胞子を最終胞子濃度１×１０４／ｍＬとなるように植菌した。次に、３０℃で３日間の液体培養を行って、目的遺伝子であるエンドキシラナーゼが培地中に分泌発現されたキシラナーゼ生産麹菌の培養液を得た。
【００４９】
次に、前記耐熱性キシラナーゼを添加したキシラン水溶液を冷却し、その温度を、７５℃から第２の温度範囲に相当する３０℃に、３０分かけて降下させた。そして、前記３０℃の温度で、終濃度が０．１質量％となるように好熱菌Thermotoga maritima由来の耐熱性β−キシロシダーゼを添加し、該温度に４７．５時間保持して、糖化溶液を得た。
【００５０】
前記耐熱性β−キシロシダーゼは自社内で構築したβ−キシロシダーゼ生産大腸菌の培養液をタンパク質抽出試薬（メルク社製、商品名：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）で処理し、得られたタンパク質抽出液を濃縮して作製した。前記耐熱性β−キシロシダーゼの構築は次のようにして行った。
【００５１】
まず、配列番号１１の好熱菌Thermotoga maritima由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子ＢＸを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した好熱菌Thermotoga maritimaのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２，１３のプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ）とを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて精製した。
【００５２】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物とプラスミドベクターｐＥＴ２８（ａ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とを、制限酵素ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩを用いて３７℃で処理した後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて行った。この結果、前記プラスミドベクターｐＥＴ２８（ａ）と好熱菌Thermotoga maritima由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子ＢＸとの制限酵素処理断片である配列番号１４のプラスミドｐＥＴ２８（ａ）−ＢＸを得た。
【００５３】
次に、前記プラスミドｐＥＴ２８（ａ）−ＢＸを、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株に形質転換した。この結果、プラスミドｐＥＴ２８（ａ）−ＢＸ−ｐＥＴ２８（ａ）の制限酵素ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ間に好熱菌Thermotoga maritima由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子ＢＸが導入された形質転換体を得た。
【００５４】
次に、前記形質転換体を、カナマイシン３０μｇ／ｍＬとクロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬとを含むＬＢ培地で１晩培養し、得られた培養物１００μＬをＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時間培養した。次に、培養液にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるように加え、さらに２時間培養し、前記β−キシロシダーゼ生産大腸菌の培養液を得た。
【００５５】
次に、本実施例で得られた糖化溶液中のキシロビオース及びキシロースの濃度を高速液体クロマトグラフィによって定量した。結果を図１に示す。
【００５６】
〔比較例１〕
本比較例では、前記キシラン水溶液を第１の温度範囲に相当する７５℃の温度に加熱し、前記耐熱性キシラナーゼと前記耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加し、該温度に７２時間保持した以外は実施例１と全く同一にして糖化溶液を得た。
【００５７】
次に、本比較例で得られた糖化溶液中のキシロビオース及びキシロースの濃度を高速液体クロマトグラフィによって定量した。結果を図１に示す。
【００５８】
〔比較例２〕
本比較例では、前記キシラン水溶液を第２の温度範囲に相当する３０℃の温度に加熱し、前記耐熱性キシラナーゼと前記耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加し、該温度に７２時間保持した以外は実施例１と全く同一にして糖化溶液を得た。
【００５９】
次に、本比較例で得られた糖化溶液中のキシロビオース及びキシロースの濃度を高速液体クロマトグラフィによって定量した。結果を図１に示す。
【００６０】
図１から、本実施例の製造方法によれば、高収率でキシロースを得ることができ、高濃度のキシロースを含む糖化溶液を得ることができることが明らかである。これに対し、第１の温度範囲に相当する７５℃の温度で前記耐熱性キシラナーゼと前記耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加した比較例１の製造方法では、実施例１で得られた糖化溶液に対し、キシロースの濃度が著しく低いことが明らかである。これは、前記第１の温度範囲に相当する温度で前記耐熱性β−キシロシダーゼを添加したために、糖化阻害反応が起きて前記基質（キシラン）の一部が失われたためと考えられる。
【００６１】
また、第２の温度範囲に相当する３０℃の温度で前記耐熱性キシラナーゼと前記耐熱性β−キシロシダーゼを同時に添加した比較例２の製造方法では、キシロースの濃度は比較例１で得られた糖化溶液に比較すれば高いものの、実施例１で得られた糖化溶液には及ばないことが明らかである。これは、前記糖化阻害反応は回避し得るものの、前記第２の温度範囲に相当する温度で前記耐熱性キシラナーゼを添加したために、該耐熱性キシラナーゼが十分に機能しなかったためと考えられる。
【００６２】
〔実施例２〕
本実施例では、まず、稲藁を目開き３ｍｍのメッシュを通過する大きさに粉砕し、基質としてのリグノセルロース系バイオマスを調製した。次に、前記リグノセルロース系バイオマスの乾燥質量に対し、２５質量％の濃度のアンモニア水を、１：１の質量比となるように混合して基質混合物を得た。そして、前記基質混合物を２５℃の温度に１００時間保持して、前記リグノセルロース系バイオマスの前処理を行い、該リグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンを解離させ、又は該リグノセルロース系バイオマスを膨潤させた。
【００６３】
次に、前記前処理後の前記基質混合物をアンモニアの沸点以上の８０℃の温度に加熱することにより、アンモニアを気化させて分離し、糖化前処理物を得た。前記糖化前処理物は、その全量に対し例えば２０質量％の濃度の前記基質を含んでいた。
【００６４】
次に、前記基質混合物の温度が、第１の温度範囲に相当する７５℃の温度に降下した時点で、終濃度が０．１５質量％となるように実施例１で用いたものと同一の耐熱性キシラナーゼを添加して、第１の基質・糖化酵素混合物を得た。そして、前記第１の基質・糖化酵素混合物を前記７５℃の温度に２４時間保持した。
【００６５】
次に、第１の基質・糖化酵素混合物を冷却し、その温度を、７５℃から第２の温度範囲に相当する３０℃に、３０分かけて降下させた。そして、前記３０℃の温度で、終濃度が０．１５質量％となるように実施例１で用いたものと同一の耐熱性β−キシロシダーゼを添加した。また、同時に終濃度が０．５質量％となるように、セルロース分解酵素としてアクレモニウム・セルロリティカスの培養液を添加して、第２の基質・糖化酵素混合物を得た。そして、前記第２の基質・糖化酵素混合物を前記３０℃の温度に４７．５時間保持した糖化溶液を得た。
【００６６】
次に、本実施例で得られた糖化溶液中のセルロース及びキシロースの濃度を高速液体クロマトグラフィによって定量した。結果を図２に示す。
【００６７】
図２から、本実施例の製造方法によれば、単糖としてグルコースと共に高濃度のキシロースを含む糖化溶液を得ることができることが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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