(57)【要約】【課題】RNAiによる標的遺伝子のノックダウン効果を調節するための手段を提供する。【解決手段】RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、所定の部位特定的組換え酵素認識配列またはトランスポザーゼ認識配列、およびそれらの配列に挟まれた任意配列を含む領域（Ｒ）、ならびに前記領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方を含む領域の転写を制御するための一組のプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えることを特徴とするRNAi用発現ベクター。また、そのようなRNAi用発現ベクターを細胞に導入した後、前記領域（Ｒ）に含まれる配列に対応した部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを発現させ、前記発現カセットの塩基長を変化させる工程を行うことにより、標的遺伝子のノックダウンのレベルを当該工程の前後で変化させることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、
同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）、およびそれらの２箇所の認識配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに
前記領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方を含む領域の転写を制御するための一組のプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）
を含む発現カセットを備えることを特徴とするRNAi用発現ベクター。
【請求項２】
前記任意配列（ｎ）が、レポーター遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子をコードする配列である、請求項１に記載のRNAi用発現ベクター。
【請求項３】
前記プロモーター（Ｐ）、領域（Ｉ）、領域（Ｒ）および第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が５’側末端から３’側末端に向けてこの順序で配置されており、前記領域（Ｒ）に含まれる前記任意配列（ｎ）が前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含んでいる、請求項１または２に記載のRNAi用発現ベクター。
【請求項４】
前記発現カセットが、前記領域（Ｒ）の認識配列（ｒ）または（ｔ）とは異なる種類の、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔｔ）で挟まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のRNAi用発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のRNAi用発現ベクターが備える、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）およびそれらの２箇所の配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに制限酵素部位を含むことを特徴とする、二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクター、あるいはそれらを作製するためのベクターを含むことを特徴とする、RNAi用キット。
【請求項７】
前記複数の状態のRNAi用発現ベクターを作製するためのベクターとして、請求項１〜４のいずれかに記載のRNAi用発現ベクターまたはその作製用ベクターを含む、請求項６に記載のRNAi用キット。
【請求項８】
さらに、前記領域（Ｒ）に含まれる認識配列（ｒ）または（ｔ）に対応した部位特異的組換え酵素発現用ベクターまたはトランスポザーゼ発現用ベクターとを含む、請求項７に記載のRNAi用キット。
【請求項９】
さらに、前記領域（Ｒ）と同一または近い変異型の認識配列（ｒ）および前記領域（Ｒ）とは異なる長さの任意配列（ｎ’）を含む領域（Ｒ’）を備える領域Ｒ組換え用ベクターまたはその作製用ベクターを含む、請求項７または８に記載のRNAi用キット。
【請求項１０】
さらに、前記認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）に対応した部位特異的組換え酵素発現用ベクターまたはトランスポザーゼ発現用ベクターを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のRNAi用キット。
【請求項１１】
RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子のノックダウン方法。
【請求項１２】
前記複数の状態のRNAi用発現ベクターが、
RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、
同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）、およびそれらの２箇所の配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに
前記領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方を含む領域の転写を制御するための一組のプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）
を含む発現カセットを備えたRNAi用発現ベクターによって生み出されるものであり、
前記RNAi用発現ベクターを細胞に導入した後、前記領域（Ｒ）に含まれる認識配列に対応した部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを発現させ、前記発現カセットの塩基長を変化させる工程（調節工程）により、標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前後で変化させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記調節工程が、前記部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを作用させることにより、前記領域（Ｒ）を切除する工程である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記領域（Ｒ）の削除により、発現カセットの塩基長を短縮し、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して向上させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーター（Ｐ）、領域（Ｉ）、領域（Ｒ）および第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が５’側末端から３’側末端に向けてこの順序で配置されており、
前記領域（Ｒ）に含まれる前記任意配列（ｎ）が前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含んでおり、
前記領域（Ｒ）の削除とともに前記第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を除去することにより、発現カセットの末端を前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）へと変更することで当該発現カセットの塩基長を延長し、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して低下させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記調節工程が、前記領域（Ｒ）と同一または近い変異型の認識配列（ｒ）および前記領域（Ｒ）とは異なる長さの任意配列（ｎ’）を含む領域（Ｒ’）を備えるベクターの存在下に、前記部位特異的組換え酵素を作用させることにより、前記領域（Ｒ）に含まれていた任意配列（ｎ）と前記任意配列（ｎ’）とを組み換え、前記発現カセットの塩基長を延長または短縮する工程であり、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して、それぞれ低下または向上させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
RNAi用発現ベクターとして、前記発現カセットが、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔｔ）で挟まれているものを用い、
その認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）に対応する部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを発現させることにより、前記発現カセットを宿主細胞の染色体に組み込む工程をさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法（ただし、前記領域（Ｒ）が認識配列（ｒ）または（ｔ）を含む場合は、前記認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）はそれらとは異なる種類の部位特定的組換え酵素またはトランスポザーゼに対応するものとする）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はRNAi（RNA干渉）用の発現ベクターを用いて標的遺伝子をノックダウンする方法に関する。より詳しくは、本発明はその方法において標的遺伝子のノックダウン効果を調節するための手法、およびそのために好適な機構を備えたRNAi用発現ベクターなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAiは、幅広い真核生物において起こる遺伝子サイレンシングのメカニズムとして知られている。RNAiには、miRNA(micro RNA）が関与する経路とsiRNA（small interfering RNA）が関与する経路がある。それぞれ、標的遺伝子のmRNAと相補的な（miRNAの場合は通常いくつかのミスマッチを含む）塩基配列からなる特定の前駆体から、RNase IIIの一種であるDicerによって比較的短い二本鎖RNAが形成される。この二本鎖RNAがRISC（RNA-Induced Silencing Complex）に取り込まれて一本鎖RNAになった後、それに対応する塩基配列が存在する標的遺伝子のmRNAの所定の部位に、RISCごと結合することによって、そのmRNAの翻訳を抑制したり、mRNAを切断・分解したりして、RNAiの効果が生じるものと考えられている。
【０００３】
このようなRNAiによって、真核細胞中の標的遺伝子の発現を抑制（ノックダウン）するために、miRNAまたはsiRNAの前駆体を生成する塩基配列を含むベクターを真核細胞に導入することが行われている。一般的に、miRNA用のベクターはpre-miRNA（miRNA precursor）またはpre-miRNAの前駆体となるpri-miRNA（primary miRNA）を転写産物とする塩基配列を含み、siRNA用のベクターは、センス鎖およびアンチセンス鎖が一体的になっているshRNA（short hairpin RNA）、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれを転写産物とする塩基配列を含む。miRNA用ベクターからpri-miRNAが転写された場合は、まず核内でDroshaによってpre-miRNAに変換される。これらのmiRNAまたはsiRNAの前駆体は核外（細胞質内）に移送され、そこで前述したようにDicerの働きによって成熟したmiRNAまたはsiRNAとなる。
【０００４】
上記のようにして行われるノックダウン法は、現在、遺伝子機能喪失型の解析ツールとして幅広く利用されており、また遺伝子治療への応用性も期待されている。遺伝子をノックダウンすることによる影響を明確に見るためには、第一に、より強いノックダウン効果を示すコンストラクトを使用することが望ましい。逆に、目的次第では、ノックダウン効果を弱めることも有用となる。
【０００５】
しかしながら、数多く存在するノックダウン用コンストラクトについて、そのノックダウン効果の比較検討を行っている例はほとんどない。
なお、特許文献１には、「ＲＮＡ干渉のオンオフ制御」（コンディショナルターゲティング法）について言及されており、そのための塩基配列の例として下記のようなものが記載されている（段落０１６２、図３，４等）。
Ｉ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター−ｌｏｘＰ−発現が制御される任意配列領域−ｌｏｘＰ−ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
ＩＩ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター−ｌｏｘＰ−ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域−ｌｏｘＰ−発現が制御される任意配列領域
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載された上記のような配列は、RNAiに関与する「ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域」の発現カセットの長さを変化させるものではなく、その発現カセットの長さによってRNAiの効果の強弱を調節できるということは記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１０４９６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、RNAiによる標的遺伝子のノックダウン効果を調節するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、高いノックダウン効果を示す遺伝子発現コンストラクトを見出すために、複数種類の人工miRNA発現コンストラクトを作成して培養細胞に導入することにより、コンストラクト間のノックダウン効果の比較解析を行った。その結果、ノックダウン効果は、コンストラクト内に存在する人工miRNAの位置（3'-UTR上かイントロン内かなど）には影響されないが、miRNA発現カセットの長さが短いときに増強され、遺伝子がより強く抑制されることを見出した。そして、発現カセットの長さを変化させる（短縮または延長させる）ことにより、RNAiのノックダウン効果を調節する（向上または低下させる）ことが可能であること、たとえばベクターを細胞に導入した後にレポーター遺伝子等を発現カセットから削除することにより、削除しないままのときよりもRNAi効果を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、一つの側面においてベクターのRNAi効果を調節することのできる発現ベクターを提供し、もう一つの側面においてその方法を実施するための発現ベクターおよびこれに関連する部材を提供する。それぞれの発明には、具体的には下記の発明が包含される。
【００１１】
［１］  RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）、およびそれらの２箇所の認識配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに前記領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方を含む領域の転写を制御するための一組のプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えることを特徴とするRNAi用発現ベクター。
［２］  前記任意配列（ｎ）が、レポーター遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子をコードする配列である、［１］に記載のRNAi用発現ベクター。
［３］  前記プロモーター（Ｐ）、領域（Ｉ）、領域（Ｒ）および第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が５’側末端から３’側末端に向けてこの順序で配置されており、前記領域（Ｒ）に含まれる前記任意配列（ｎ）が前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含んでいる、［１］または［２］に記載のRNAi用発現ベクター。
【００１２】
［４］  前記発現カセットが、前記領域（Ｒ）の認識配列（ｒ）または（ｔ）とは異なる種類の、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔｔ）で挟まれている、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のRNAi用発現ベクター。
［５］  ［１］〜［４］のいずれか一項に記載のRNAi用発現ベクターが備える、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）およびそれらの２箇所の配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに制限酵素部位を含むことを特徴とする、二本鎖オリゴヌクレオチド。
［６］  RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクター、あるいはそれらを作製するためのベクターを含むことを特徴とする、RNAi用キット。
【００１３】
［７］  前記複数の状態のRNAi用発現ベクターを作製するためのベクターとして、［１］〜［４］のいずれかに記載のRNAi用発現ベクターまたはその作製用ベクターを含む、［６］に記載のRNAi用キット。
［８］  さらに、前記領域（Ｒ）に含まれる認識配列（ｒ）または（ｔ）に対応した部位特異的組換え酵素発現用ベクターまたはトランスポザーゼ発現用ベクターとを含む、［７］に記載のRNAi用キット。
［９］  さらに、前記領域（Ｒ）と同一または近い変異型の認識配列（ｒ）および前記領域（Ｒ）とは異なる長さの任意配列（ｎ’）を含む領域（Ｒ’）を備える領域Ｒ組換え用ベクターまたはその作製用ベクターを含む、［７］または［８］に記載のRNAi用キット。
［１０］  さらに、前記認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）に対応した部位特異的組換え酵素発現用ベクターまたはトランスポザーゼ発現用ベクターを含む、［７］〜［９］のいずれか一項に記載のRNAi用キット。
【００１４】
［１１］  RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子のノックダウン方法。
［１２］  前記複数の状態のRNAi用発現ベクターが、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）、およびそれらの２箇所の配列に挟まれた任意配列（ｎ）を含む領域（Ｒ）、ならびに前記領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方を含む領域の転写を制御するための一組のプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えたRNAi用発現ベクターによって生み出されるものであり、前記RNAi用発現ベクターを細胞に導入した後、前記領域（Ｒ）に含まれる認識配列に対応した部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを発現させ、前記発現カセットの塩基長を変化させる工程（調節工程）により、標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前後で変化させる、［１１］に記載の方法。
【００１５】
［１３］  前記調節工程が、前記部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを作用させることにより、前記領域（Ｒ）を切除する工程である、［１２］に記載の方法。
［１４］  前記領域（Ｒ）の削除により、発現カセットの塩基長を短縮し、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して向上させる、［１３］に記載の方法。
［１５］  前記プロモーター（Ｐ）、領域（Ｉ）、領域（Ｒ）および第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が５’側末端から３’側末端に向けてこの順序で配置されており、前記領域（Ｒ）に含まれる前記任意配列（ｎ）が前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含んでおり、前記領域（Ｒ）の削除とともに前記第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を除去することにより、発現カセットの末端を前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）へと変更することで当該発現カセットの塩基長を延長し、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して低下させる、［１３］に記載の方法。
【００１６】
［１６］  前記調節工程が、前記領域（Ｒ）と同一または近い変異型の認識配列（ｒ）および前記領域（Ｒ）とは異なる長さの任意配列（ｎ’）を含む領域（Ｒ’）を備えるベクターの存在下に、前記部位特異的組換え酵素を作用させることにより、前記領域（Ｒ）に含まれていた任意配列（ｎ）と前記任意配列（ｎ’）とを組み換え、前記発現カセットの塩基長を延長または短縮する工程であり、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して、それぞれ低下または向上させる、［１２］に記載の方法。
［１７］  RNAi用発現ベクターとして、前記発現カセットが、前記領域（Ｒ）が認識配列（ｒ）または（ｔ）を含む場合はそれらとは異なる種類の、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒｒ）または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔｔ）で挟まれているものを用い、その認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）に対応する部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを発現させることにより、前記発現カセットを宿主細胞の染色体に組み込む工程をさらに含む、［１１］〜［１６］のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
なお、本発明において「RNAi関連転写産物」とは、転写された後に細胞内で所定のプロセッシングを受けることにより最終的にRNAiを誘導しうる転写産物を総称する用語である。本発明では主としてmiRNAが関与するRNAiを想定しており、最終的に成熟したmiRNAを生成することのできる、pri-miRNA、pre-miRNA、およびこれらに類似するヘアピン状の構造を有する人工miRNAもしくはshRNAなどが「RNAi（miRNA）関連転写産物」に包含される。しかしながら、本発明はsiRNAが関与するRNAiにおける可能性を排除するものではなく、たとえば、複数のsiRNAが生成するlong hairpin RNAのような転写産物が「RNAi（siRNA）関連転写産物」に包含されてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により提供されるRNAi用発現ベクター、およびそこに含まれるRNAi発現カセットの長さを調節する手法を使用することにより、RNAiによる標的遺伝子のノックダウンのレベルを任意に調節することができるようになる。これにより、ノックダウン効果が弱い場合にこれを向上させる、逆に強い場合にこれを低下させて、所期の目的を達成しやすくしたり、ノックダウン効果の強弱を通じて遺伝子の多様な機能解析を行えるようにしたりと、RNAiの応用の幅を広げることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１の概要。（ａ）miRNA発現ベクター(1)〜(4)の構成。（ｂ）宿主細胞（eGFP発現ES細胞）のeGFP発現強度のFACS解析結果。
【図２】実施例２の概要。（ａ）miRNA発現ベクター(1)〜(7)およびeGFP発現ベクターの構成。（ｂ）これらのベクターを導入後の宿主細胞におけるeGFP発現強度のFACS解析結果。（ｃ）同じく蛍光顕微鏡による撮影画像。
【図３】実施例３の概要。（ａ）miRNA発現ベクターおよび宿主細胞（eGFP発現ES細胞）内に挿入されているeGFP発現コンストラクトの構成。(1)はDre作用前、(2)はDre作用後。（ｂ）宿主細胞におけるeGFP発現強度のFACS解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
−RNAi用発現ベクター−
本発明の発現ベクターは、領域（Ｒ）に部位特異的組換え酵素等を作用させる前の初期状態において、RNAi関連転写産物をコードする配列からなる領域（Ｉ）、所定の認識配列およびそれに挟まれた任意配列からなる領域（Ｒ）、プロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含むRNAi用発現カセットを備えている。
【００２１】
領域Ｉおよび領域Ｒが配置される位置は、本発明の作用効果が奏される限り、すなわちRNAi関連転写産物をコードする配列を転写するRNAi用発現カセットの塩基長を変化させることができれば、特に限定されるものではない。たとえば、５’末端から３’末端に向かって、Ｐ―［領域Ｉ］―［領域Ｒ］―Ａの順序であっても、Ｐ―［領域Ｒ］―［領域Ｉ］―Ａの順序であってもよい。領域Ｉは、イントロン内に存在していても、３’ＵＴＲ内に存在していてもよい。各領域および要素の間には、適切な長さのスペーサー配列が存在してもよい。
【００２２】
また、領域Ｒは、RNAi用発現ベクター内に一つだけ存在してもよいし、領域Ｒを介した発現カセットの長さを多段階で変化させることができるように複数存在してもよい。たとえば、発現カセットがＰ―［領域Ｉ］―［領域Ｒ１］―［領域Ｒ２］―Ａという構成の場合、１段階目で［領域Ｒ１］に含まれる認識配列（ｒ１）に対応する部位特異的組換え酵素を作用させることにより、発現カセットの長さを短縮し、２段階目で［領域Ｒ２］に含まれる認識配列（ｒ２）に対応する部位特異的組換え酵素を作用させることにより、発現カセットの長さをさらに短縮することが可能である。なお、このような場合、各段階の部位特異的組換え系は、互いに相違するものとすることが適切である。
【００２３】
RNAi用発現カセット以外にも、本発明の発現ベクターは、一般的な発現ベクターが有する要素（たとえば、マルチクローニングサイトや、大腸菌用の複製起点および選択マーカー）を必要に応じて含んでいてもよい。発現ベクターの全長は、用いるプラスミド、ウイルス等の種類によって適切な範囲が異なるので、それを考慮しながら、RNAi用発現カセット（特に領域Ｉおよび領域Ｒ）の長さを調節することが適切である。
【００２４】
発現ベクターは、プラスミドに代表される非ウイルスベクターであっても、ウイルスベクターであってもよく、また環状であっても、アデノウイルスのゲノム（二本鎖ＤＮＡ）のように非環状（直線状）であってもよい。発現ベクターの用途などを考慮して、それに適した発現ベクターを作製すればよい。
【００２５】
本発明で用いるベクターに関する、基本的な構成や作製方法、宿主細胞への導入方法、発現方法などの詳細は具体的なプロトコールは、当業者にとって周知慣用の技術的事項といえるので、本発明に特徴的な部分について適宜改変した上で、そのような技術的事項を準用することができる。
【００２６】
［領域Ｉ］
領域Ｉ、すなわちRNAi関連転写産物をコードする配列は、miRNA、siRNAそれぞれについて、発現を抑制（ノックダウン）しようとする標的遺伝子に応じて、公知の手法により設計することができる。一般的に、領域Ｉには、ｉ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同の塩基配列（センス配列）、ｉｉ）前記センス配列および後記配列アンチセンス配列を連結し、Dicerによって切断されるループ構造を形成する塩基配列（ループ配列）、およびｉｉｉ）前記センス配列と相補的な塩基配列（アンチセンス配列）からなるヘアピン状の構造体が含まれる。このような構造体は、領域Ｉの中に１個だけ含まれていてもよいし、pri-miRNAに見られるように複数個含まれていてもよい。
【００２７】
［領域Ｒ］
領域Ｒは、同方向で２箇所に配置された部位特定的組換え酵素の認識配列（ｒ）、または逆方向で２箇所に配置されたトランスポザーゼの認識配列（ｔ）と、前記認識配列（ｒ）または（ｔ）によって挟まれた任意配列（ｎ）からなる。
【００２８】
本発明における、RNAi効果の調節方法の第１の実施形態（第１調節方法）により、RNAi用発現カセットの長さを短縮する場合、（以下に述べる領域Ｒ置換用ベクターの非存在下に）適切な部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを作用させることにより、領域Ｒは当該発現カセットから切除される。
【００２９】
本発明における、RNAi効果の調節方法の第２の実施形態（第２調節方法）において、RNAi用発現カセットの長さを延長または短縮する場合、領域Ｒ置換用ベクターの存在下に適切な部位特異的組換え酵素を作用させることにより、領域Ｒは領域Ｒ置換用ベクターに備えられている領域Ｒ’（延長の場合は領域Ｒより長く、短縮の場合は領域Ｒより短く設定されている）と置き換えられる。
【００３０】
なお、第２調節方法で用いる領域Ｒ置換用ベクターが備える領域Ｒ’は、RNAi用発現ベクターの領域Ｒと同様に構成することができるため、部位特異的組換え酵素認識配列や任意配列について後述する事項は、RNAi用発現ベクターについてだけでなく、領域Ｒ置換用ベクターについて準用することが可能である。
【００３１】
本発明において、部位特異的組換え酵素認識配列およびトランスポザーゼ認識配列は、領域Ｒにおいて任意配列を挟むためだけでなく、RNAi用発現カセット全体を挟むために用いられる場合がある。したがって、領域Ｒにおいて任意配列を挟むための認識部位（ｒ）および（ｔ）としての部位特異的組換え酵素認識配列およびトランスポザーゼ認識配列について後述する事項は、発現カセット全体を挟むための認識部位（ｒｒ）および（ｔｔ）について準用することが可能である。
【００３２】
ただし、領域Ｒにおいて任意配列を挟むために用いられる部位特異的組換え酵素認識配列（ｒ）またはトランスポザーゼ認識配列（ｔ）と、RNAi用発現カセット全体を挟むために用いられる部位特異的組換え酵素認識配列（ｒｒ）またはトランスポザーゼ認識配列（ｔｔ）とは、意図しない組換え等を防いでそれぞれ所期の目的を果たせる挙動とするために、異なる部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼに対応するもの（同一の部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼが同時に作用しないもの）を用いることが適切である。
【００３３】
（ｒ）部位特異的組換え酵素認識配列
第１調節方法において、部位特異的組換え酵素を作用させると、同方向で２箇所に配置された部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれていた任意配列（ｎ）および当該認識配列の一方を含む断片が切除され（この際、切除された断片はループ状に連結されてベクターから分離する）、当該認識配列の残されているもう一方が切除された断片の部分を詰めてベクターにつなぎ直される。このとき、通常はRNAi用発現カセットの長さが短縮されることになるが、後述するような特殊な様式においては、RNAi用発現カセットの長さが延長されることになる。
【００３４】
なお、部位特異的組換え酵素認識配列を逆方向に配置した場合は、部位特異的組換え酵素を作用させたときに、それに挟まれた任意配列の逆位は起きる（一旦切断された後に逆方向で連結し直される）が切除はされないため、第１調節方法においてRNAi用発現カセットの長さを短縮することにはならない。
【００３５】
第２調節方法において、領域Ｒ置換用ベクターの存在下に適切な部位特異的組換え酵素を作用させると、RNAi用発現ベクターの領域Ｒと、領域Ｒ置換用ベクターの領域Ｒ’の間で組換えが起きるため、これらの領域の長短によって、RNAi用発現カセットの長さを延長または短縮することができる。
【００３６】
部位特異的組換え酵素およびその認識配列の組み合わせからなる系は宿主細胞において機能するものを用いればよく、特に限定されるものではない。たとえば、哺乳動物細胞においては、Dre-rox系、Cre-loxP系、FLP-FRT系、φC31インテグラーゼ系（attP、attBによる）などを利用することができるので、これらの部位特異的組換え酵素認識配列を領域Ｒの両端に配置することができる。
【００３７】
ここで、部位特異的組換え酵素（Ｒ）の認識配列には大抵バリエーション（通常型およびいくつかの変異型）があるが、同一の部位特異的組換え酵素が認識できるものであれば、一つの部位特異的組換え系において複数の種類の認識配列を用いることができる。
【００３８】
Cre-loxP系については、部位特異的組換え酵素（Cre）の認識配列として、通常型のloxP配列のほか、変異型のJT15/JTZ17、lox2272などの配列を用いることができる。JT15およびJTZ17は「近い変異型」であり、これらの間で組換えが可能である。なお、部位特異的組換え酵素として、通常型のCreの他、改良型のiCreなどを用いることもできる。
FLP-FRT系については、部位特異的組換え酵素（FLP）の認識配列として、通常型のFRT配列のほか、変異型のF14、F15などの配列を用いることができる。
【００３９】
（ｔ）トランスポザーゼ認識配列
トランスポザーゼ認識配列は、様々な真核細胞から見つかっているトランスポゾンの両末端に位置する逆向きの反復配列であり、トランスポザーゼはこの配列を認識して、トランスポゾンを特定の配列を有する他の部位に移動させる。したがって、トランスポザーゼ認識配列およびこれに挟まれた任意の配列からなる領域Ｒは、トランスポザーゼを作用させることによって発現カセットから切除する（他の部位に移動させる）ことができる。
【００４０】
トランスポザーゼ認識配列は宿主細胞において機能するものを用いればよく、特に限定されるものではない。たとえば、哺乳動物細胞においては、piggyBac、Sleeping Beauty（SB）、Tol2などのトランスポゾンの認識配列を用いることができる。
【００４１】
（ｎ）任意配列
ここでいう「任意配列」は、特に言及しない限り（たとえば後述する特殊な実施形態を除き）、発現カセット内に含まれる他の要素、すなわち領域Ｉ、部位特異的組換え酵素認識配列（ｔ）、トランスポザーゼ認識配列（ｒ）、プロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナルとは異なる配列（それらを含まない配列）である。
【００４２】
任意配列は特に限定されるものではないが、RNAi効果の変動は、発現カセットに着脱される任意配列の長さの影響を受けるので、所望の変化が現れるような長さの任意配列を選択することが適切である。
【００４３】
任意配列の一例として、ベクターの導入に成功してRNAi関連転写産物を発現していることの指標となる、「レポーター遺伝子」または「薬剤耐性遺伝子」をコードする塩基配列が挙げられる。任意配列には、レポーター遺伝子および薬剤耐性遺伝子のいずれか一方が含まれていても、両方が含まれていてもよい。
【００４４】
これらの遺伝子は、たとえばRNAi関連転写産物を安定的に発現している細胞を選択するためのいわゆるマーカー遺伝子として用いられることがあるが、そのような細胞を選択する工程を終えた後は、マーカー遺伝子は不要となり、それをコードする遺伝子を発現カセットから削除しても問題とはならないため、領域Ｒに含める任意配列として用いることができる。
【００４５】
レポーター遺伝子および薬剤耐性遺伝子としては、たとえば、ａ）励起光を照射したときに特定の蛍光を発する蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｔｄＴｏｍｏａｔｏなど）をコードする遺伝子、ｂ）特定の基質から発色物質等を生成する酵素（ホタル、ウミシイタケル、ガウシア（カイアシ）等のルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）をコードする遺伝子、ｃ）特定の薬剤（宿主細胞が真核生物の場合、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジンなど）への耐性を賦与する遺伝子が挙げられる。
【００４６】
あるいは、上記のマーカー遺伝子のような機能的な意味を有さない塩基配列であって、転写されても細胞の生存やRNAiに悪影響のないものを、領域Ｒに含める任意配列としてもよい。このような任意配列は、マーカー遺伝子のように所定の機能を果たし終えるまでは発現カセットから削除することのできない配列と異なり、任意のタイミングで発現カセットから切除したり、逆に発現カセットに挿入したりすることができる。たとえば、まずは意図的に弱いノックダウン効果を示す発現カセットを用いて解析を行い、その後に領域Ｒを切除してノックダウン効果を高めることにより、２段階（または多段階）のノックダウン効果で機能解析を行うことが考えられる。
【００４７】
［Ｐ：プロモーター］
前記領域ＩおよびＲの上流（５’末端側）には、これらの両方を含む領域の転写を制御（開始）するプロモーター（Ｐ）が配置される。必要に応じてさらに、当該プロモーターの活性を高めるためのエンハンサーが配置されてもよい。
【００４８】
プロモーターは、RNAiの目的や期待する効果の強さを考慮しながら、ベクターを導入する細胞の種類（ヒト、マウス、ラット等）や組織に応じて適切なものを選択すればよい。たとえば、幅広い培養細胞中で恒常的に発現させるためのプロモーターであってもよいし、生体内に投与したときに組織・時期特異的に発現させるためのプロモーターであってよい。本発明では、RNAi関連転写産物（たとえばpri-miRNA）とともに任意配列を含む、比較的長い配列を転写するので、そのような活性を有する、RNA Polymerase II用のプロモーター（CMV、SV40等）を用いることが好ましい（RNA Polymerase III用のプロモーター（U6、ヒトH1、マウスH1等）は、比較的短いRNA鎖の転写活性は高いが、上記のような比較的長い配列を転写する場合には適さないことがある）。
【００４９】
［Ａ：ｐｏｌｙＡ付加シグナル］
前記領域ＩおよびＲの下流（３’末端側）には、これらの両方を含む領域の転写を制御（終結）するｐｏｌｙＡ付加シグナル（ポリアデニル化シグナル）が配置される。真核細胞において遺伝子を発現させる場合、特殊なウイルスベクターを用いる場合を除いてほとんどの場合は、正常にmRNAの転写を終了して3'末端をポリアデニル化するためのｐｏｌｙＡ付加シグナルが必要とされるためである。
【００５０】
ｐｏｌｙＡ付加シグナルは特に限定されるものではなく、公知のものの中から適切なものを選択すればよいが、たとえばSV40由来のｐｏｌｙＡ付加シグナルが挙げられる。
なお、ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーターおよびサイトメガロウイルスＩＥエンハンサー、ならびにウサギβグロビン遺伝子のｐｏｌｙＡ付加シグナルの組み合わせからなるＣＡＧプロモーター発現カセットは強力な発現カセットとして知られており、これらのプロモーター、エンハンサーおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルは本発明のベクターにおいても好適である。
【００５１】
なお、次に述べる特殊な実施形態のような場合を除いて基本的に、本発明のRNAi用発現ベクターは、初期状態において、領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方に対して上流となるプロモーター（Ｐ）（当該ベクター上にそのようなプロモーターが複数存在する場合は、最も領域（Ｉ）および（Ｒ）に近いもの）と、領域（Ｉ）および（Ｒ）の両方に対して下流となるｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）（当該ベクター上にそのようなｐｏｌｙＡ付加シグナルが複数存在する場合は、最も領域（Ｉ）および（Ｒ）に近いもの）との間の領域に、その他のプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルを含まない。
【００５２】
（発現カセットを延長するための一実施形態）
本発明のRNAi用発現ベクターの一実施形態として、前記プロモーター（Ｐ）、領域（Ｉ）、領域（Ｒ）および第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が５’側末端から３’側末端に向けてこの順序で配置されており、前記領域（Ｒ）に含まれる前記任意配列（ｎ）が前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含んでいるものが挙げられる。なお、第１のｐｏｌｙＡ付加シグナルと同一の第２のｐｏｌｙＡ付加シグナルとを同一にするのは、条件を保持することによりノックダウンの効果を正確に評価できるようにするためである。
【００５３】
このようなRNAi用発現ベクターを用いた場合、後述する調節工程において、前記領域（Ｒ）の削除とともに前記第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を除去することにより、発現カセットの末端を前記第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）へと変更することで当該発現カセットの塩基長を延長し、それによって標的遺伝子のノックダウン効率を当該工程の前と比較して低下させることができる。
【００５４】
この場合、領域（Ｒ）は実質的に第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）およびこれを挟む認識配列（ｒ）または（ｔ）のみからなるもの、つまり領域（Ｒ）の任意配列（ｎ）は実質的に第２のｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）のみであってもよい。
【００５５】
また、領域（Ｒ）と第１のｐｏｌｙＡ付加シグナル（下流側）との間に、発現カセットの長さをどの程度延長するべきかを考慮して、適切な長さの第２の任意配列（ｎ２）を配置するようにしてもよい。
【００５６】
（発現ベクターの作製方法）
発現ベクターの作製方法は、本発明において必要とされる要素がすべて揃ったベクターを作製できる方法であれば、特に限定されるものではない。
【００５７】
たとえば、プロモーター、ｐｏｌｙＡ付加シグナル、制限酵素部位（マルチクローニングサイト）等からなる基本的な構成を有する各種のベクターは市販されており、容易に入手可能なので、これを利用して本発明の発現ベクターを作製することができる。すなわち、領域Ｉ、領域Ｒおよび制限酵素部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば、制限酵素部位―［領域Ｉ］―［領域Ｒ］―制限酵素部位）を別途合成し、その制限酵素部位に対応した制限酵素を用いて、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを前記ベクターのプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルの間にライゲーションすればよい。
【００５８】
さらに、プロモーター、ｐｏｌｙＡ付加シグナルおよび制限酵素部位に加えて、ライブラリ化されたRNAi関連転写産物をコードする領域を予め含む発現ベクターも市販されている。これらを利用して本発明の発現ベクターを作製する場合は、領域Ｒおよび制限酵素部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（制限酵素部位―［領域Ｒ］―制限酵素部位）を別途合成し、その制限酵素部位に対応した制限酵素を用いて、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを、前記ベクターのRNAi関連転写産物をコードする領域の上流（プロモーターとの間）か下流（ｐｏｌｙＡ付加シグナルとの間）にライゲーションすればよい。
【００５９】
（RNAi用キット）
本発明のRNAi用キットは、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクター、あるいはそれらを作製するためのベクターを含むことを特徴とする。このようなキットは、本発明による標的遺伝子のノックダウン方法を実施するために好適なものである。
【００６０】
本発明のRNAi用キットの第１実施形態は、前述したような本発明のRNAi用発現ベクターを用いて構成することができる。このキットは、完成した状態の本発明のRNAi用発現ベクター、すなわち領域（Ｉ）、領域（Ｒ）、プロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えたRNAi用発現ベクターを、一つまたは複数含んでいてもよい。また、そのかわりに、別途作製した任意の配列からなる領域（Ｉ）および／または領域（Ｒ）を含む二本鎖のオリゴヌクレオチドをライゲーションすることによりRNAi用発現ベクターを完成させることのできる作製用ベクターを、一つまたは複数含んでいてもよい。このようなRNAi用発現ベクターまたはその作成用ベクターを用いることにより、前述したような複数の状態を生み出すことができる。
【００６１】
本発明のRNAi用キットの第２実施形態は、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数のRNAi用発現ベクター、あるいはそれらを作製するためのベクターにより構成される。このようなRNAi用キットは、本発明のRNAi用発現ベクターが備える領域（Ｒ）を利用することなく、前述したような複数の状態を生み出すものである。
【００６２】
また、本発明のキットの第１実施形態は、RNAi用発現ベクターが備える領域（Ｒ）に含まれる認識配列（ｒ）に対応した部位特異的組換え酵素または認識配列（ｔ）に対応したトランスポザーゼの発現用ベクターをあわせて含むことが好適である。これらの発現用ベクターは、本発明による標的遺伝子のノックダウン方法における調節工程において用いられる。
【００６３】
本発明のキットの第１実施形態はさらに、前記領域（Ｒ）と同一または近い変異型の認識配列（ｒ）および前記領域（Ｒ）とは異なる長さの任意配列（ｎ’）を含む領域（Ｒ’）を備える領域Ｒ組換え用ベクターまたはその作製用ベクターを含んでいてもよい。領域Ｒ組換え用ベクターは、本発明による標的遺伝子のノックダウン方法における調節工程の第２実施形態において用いられる。
【００６４】
本発明のキットは、必要に応じてさらに、RNAi用発現カセットが前記認識配列（ｒｒ）または（ｔｔ）に挟まれている場合は、それらの認識配列に対応した部位特異的組換え酵素発現またはトランスポザーゼの発現用ベクターを含んでいてもよい。これらの発現ベクターは、本発明による標的遺伝子のノックダウン方法における染色体組換え工程において用いられる。
【００６５】
そのほかにも、本発明のキットには、本発明を実施する上で用いられる各種の部材、たとえば、宿主細胞への導入工程で用いられる導入試薬、選択マーカーに対応した発光基質や薬剤、発現ベクターがウイルスベクターの形態の場合のパッケージングベクターやエンベロープベクター、標的遺伝子のノックダウン効率を測定するためのコントロール用ベクター、本発明のキットの使用方法（本発明の標的遺伝子のノックダウン方法）のプロトコールを記載した説明書などを、必要に応じて含んでいてもよい。
【００６６】
−標的遺伝子のノックダウン方法−
本発明の標的遺伝子のノックダウン方法は、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）が同一であるが、それら以外の塩基配列の長さが異なることで発現カセット全体の長さが相違しており、それにより標的遺伝子のノックダウン効率が相違している、複数の状態のRNAi用発現ベクターを用いることを特徴とする。
【００６７】
このような本発明のノックダウン方法の第１実施形態では、複数の状態のRNAi用発現ベクターが、前述したような本発明のRNAi用発現ベクターによって、好適には前記RNAi用キットの第１実施形態を用いて生み出される。そのために、第１実施形態では、RNAi用発現ベクターが備える発現カセットの長さを調節する「調節工程」が行われ、一つの宿主細胞において、当該工程の前後で相違する状態を生み出すことができる。この調製工程を実施するためには、あらかじめ、本発明のRNAi用発現ベクター等を宿主細胞に導入するための「導入工程」が行われる。また、必要に応じて、調節工程の前に（導入工程と一体化して、または導入工程と調節工程の間に）あるいは調節工程の後に、RNAi用発現カセットを宿主細胞の染色体に組み込むための「染色体組換え工程」を行ってもよい。
【００６８】
本発明のノックダウン方法の第２実施形態は、複数の状態のRNAi用発現ベクターが、本発明のRNAi用発現ベクターを用いることなく、好適には前記RNAi用キットの第２実施形態を用いて生み出されるものである。個々のRNAi用発現ベクターは、公知の手法により、互いに発現カセットの長さを相違させながら作製することができる。このような第２実施形態においては、第１実施形態のような「調節工程」は行われず、所望の複数のRNAi用発現ベクターをそれぞれの宿主細胞に導入するための「導入工程」が行われる。また、必要に応じて、導入工程と一体化して、または導入工程の後に、RNAi用発現カセットを宿主細胞の染色体に組み込むための「染色体組換え工程」を行ってもよい。
【００６９】
［導入工程］
本発明のノックダウン方法の第１実施形態および第２実施形態に共通して行われる導入工程には、たとえば、宿主細胞にRNAi用発現ベクターを導入するための操作を行うステップ、当該ステップによりRNAi用発現ベクターが導入されて安定的に発現する細胞を選択するためのステップなどが含まれる。
【００７０】
（宿主細胞）
宿主細胞は特に限定されるものではなく、RNAi効果が発揮されうる真核細胞であればよい。たとえば、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット等の実験動物）は、RNAiに関する幅広い用途を想定することができ、本発明の適用対象として好適である。また、線虫、ショウジョウバエなどの非哺乳動物の細胞、あるいは植物細胞も、本発明の適用対象として挙げられる。
【００７１】
細胞の種類も特に限定されるものではなく、たとえば哺乳動物であれば、受精卵、ES細胞（胚性幹細胞）、iPS細胞を含む各種の幹細胞、あるいは非分裂細胞（肝細胞以外の体細胞）が挙げられる。細胞は、in vitro（ex vivo）であっても、in vivoであってもよい。
【００７２】
ここで、発現ベクターによるRNAi効果を局所的な一過性のものとせず、一個体の全身において長期間にわたって、あるいは世代を超えてRNAi効果を発揮させるために、トランスジェニック動物を作製するという態様で発現ベクターを宿主細胞に導入してもよい。
【００７３】
トランスジェニック動物の作製方法としては公知の方法を用いることができる。たとえば、受精卵（雄性前核内）にプラスミドをマイクロキャピラリーで注入する顕微注入（マイクロインジェクション）法、受精卵にレンチウイルスやレトロウイルスを感染させるウイルス感染法、またはES細胞にエレクトロポレーション等によりプラスミドを導入する方法などが挙げられる。
【００７４】
（発現ベクターの導入方法）
RNAi用発現ベクターの導入方法は、宿主細胞（すなわち標的遺伝子を発現する真核細胞）への導入に適した方法であれば、特に限定されるものではない。持続的に標的遺伝子をノックダウンする効果を発揮するためには、宿主細胞の染色体に組み込むことのできる方法が好ましい。RNAi用発現ベクターの用途に応じて、適切な手法を採用することができる。
【００７５】
たとえば、ウイルスベクターを用いる方法、細胞融合法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、エレクトロポレーション法、リポソームやポリエチレンイミンを用いるトランスフェクションなどが挙げられる。それぞれの方法の詳細、具体的なプロトコールは、当業者にとって公知である。
【００７６】
このうち、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、（ガンマ）レトロウイルスベクターなどが挙げられ、それぞれ異なる特徴を有する。
【００７７】
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞を含む広範な細胞種に対して高い遺伝子導入能を持ち、さらに高力価のウイルスが回収可能であることから、遺伝子治療への利用が特に期待されているウイルスベクターの一つであるが、染色体に遺伝子を組み込む性質を持たないため遺伝子の発現（RNAi効果）は一過性である。単純ヘルペスウイルスベクターは、ウイルスが神経細胞に感染するものであることから主に神経細胞への遺伝子導入に用いられている。しかしながら、アデノウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターは、染色体に遺伝子を組み込む性質を持たないため、遺伝子の発現（RNAi効果）は一過性である。そのため、後述するようにトランスポゾンを利用してRNAi用発現カセットを染色体に組み込むことにより、RNAi効果を持続化することが好ましい。
【００７８】
一方、（ガンマ）レトロウイルスベクターは、非分裂細胞への遺伝子の導入には不向きだが、分裂細胞に対しては遺伝子を染色体に組み込むことによって持続的にRNAi効果を発揮することが可能である。レンチウイルスベクターは、レトロウイルス化に属するヒト免疫不全ウイルスやサル免疫不全ウイルス等を基にしたベクターであり、（ガンマ）レトロウイルスベクターとは異なり、非分裂細胞に対しても遺伝子を染色体に組み込むことができる。ただし、通常のレンチウイルスベクターは、転写が活性化している内在遺伝子の近傍に遺伝子を組み込む危険性が高いため、染色体に遺伝子を組み込む性質を失う代わりにそのような危険性を排除したインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターも用いられる。インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを用いる場合は、前記アデノウイルスベクター等と同様、トランスポゾンを併用することが好ましい。
【００７９】
［調節工程］
本発明のノックダウン方法の第１実施形態のみで行われる調節工程では、RNAi用発現カセットの領域Ｒの長さを短縮または延長するための操作を行う。具体的には、RNAi用発現カセットの領域Ｒに、部位特異的組換え酵素認識配列が用いられているか、トランスポザーゼ認識配列が用いられているかに応じて、それぞれ、部位特異的組換え酵素発現ベクターか、トランスポザーゼ発現ベクターを、宿主細胞に導入する。
【００８０】
また、前述した第２調節方法を実施する場合には、調節工程において、部位特異的組換え酵素発現ベクターとともに、領域Ｒ置換用ベクターを宿主細胞に導入する。これらのベクターは、互いに別個のベクターであってもよいし、一つのベクター（部位特異的組換え酵素の発現カセットと、領域Ｒ置換用の配列（領域Ｒ’）の両方を備えたもの）であってもよい。
【００８１】
調節工程で用いるベクターの作製方法および導入方法は、公知の手順に従って行うことができる。特に導入方法については、導入工程において前述したような発現ベクターの導入方法を準用することができる。
【００８２】
［染色体組換え工程］
本発明のノックダウン方法の第１実施形態および第２実施形態に共通して、分析の目的や発現ベクターの導入方法などに応じて必要な場合、RNAi用発現カセットを宿主細胞の染色体に組み込むための「染色体組換え工程」を行ってもよい。染色体組換え工程を行う場合には、導入工程において、RNAi用発現カセットが部位特異的組換え酵素認識部位（ｒｒ）またはトランスポザーゼ認識部位（ｔｔ）で挟まれたRNAi用ベクターを用いるようにして、それに対応する部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼを当該工程で用いるようにする。
【００８３】
染色体組換え工程を導入工程と一体化して行う場合は、導入工程において、本発明のRNAi用発現ベクターとともに、部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼの発現用ベクターを宿主細胞に導入すればよい。また、染色体組換え工程を導入工程の後、調節工程の前に行う場合、あるいは調節工程の後に行う場合は、そのような段階で部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼの発現用ベクターを宿主細胞に導入すればよい。
【００８４】
そのような発現用ベクターから発現した部位特異的組換え酵素またはトランスポザーゼの作用により、RNAi用発現カセットを含む所定の領域が宿主細胞の染色体に組み込まれることとなる。
【００８５】
染色体組換え工程で用いるベクターの作製方法および導入方法も、公知の手順に従って行うことができる。特に導入方法については、導入工程において前述したような発現ベクターの導入方法を準用することができる。
【００８６】
［評価工程］
上述したような手法を通じて、本発明のRNAi効果調節方法における調節工程の前後（有無）でRNAi効果が変化していれば、本発明の作用効果が奏されたものと評価することができる。たとえば、所定の発現ベクターを宿主細胞に導入したのち、部位特異的組換え酵素発現用ベクター等を用いてRNAi用発現カセットを短縮する調節工程を行ったサンプルと、そのような調節工程を行わなかったコントロールとを比較したときに、前者のRNAi効果が高くなることが期待される。逆に言えば、本発明に係る各種の条件は、上述したような手法を通じたときに本発明の作用効果が奏されたとの評価結果が得られるよう、適宜設定することが可能である。
【００８７】
RNAiによる標的遺伝子のノックダウン効果を評価するためには、細胞をベースにしたアッセイ、酵素を利用したアッセイ、アレイ解析など、公知の各種の手法を用いることができる。上記の効果は、標的遺伝子のmRNAレベルで評価してもよいし、タンパク質レベルで評価してもよい。
【００８８】
本発明を用いて標的遺伝子のノックダウン効果を向上または低下させ、それを評価することの用途は特に限定されるものではない。たとえば、個体レベルでハイポモルフの解析（遺伝子発現量を下げて表現型への影響を見るなど）を行う際に、様々なレベルで遺伝子発現量が異なる個体を作製して表現度への影響を見るために用いることができる。
【００８９】
（ノックダウン効率の比較方法）
それぞれ同一の、RNAi関連転写産物をコードする領域（Ｉ）、ならびに前記領域（Ｉ）の転写を制御するためのプロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含み、これら以外の領域の塩基配列の長さが異なることにより発現カセット全体の長さの異なる、複数のRNAi用発現ベクターを用いることにより、標的遺伝子のノックダウン効率を比較したり、あるいはこれらのノックダウン効率が異なることを前提とした実験系を組んだりすることができる。
【００９０】
発現カセット全体の長さの異なる発現ベクターは、前述したように、あらかじめ領域Ｒも含む発現ベクターを用いて、その領域Ｒを切除するまたは組換えることによって作製してもよいが、初めから領域Ｒを設けることなく、適当な部位の塩基配列の長さを相違させることにより作製してもよい。すなわち、領域Ｉ、領域Ｒ、プロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えた発現ベクターと、領域Ｉ、プロモーター（Ｐ）およびｐｏｌｙＡ付加シグナル（Ａ）を含む発現カセットを備えた一または複数の発現ベクターとを組み合わせて用いることができる。
【００９１】
このような対比実験において、RNAi用発現カセットは、宿主細胞の染色体に組み込まれた状態であってもよいが、組み込まれずに一時的な（transientな）状態であってもよい。
【実施例】
【００９２】
［実施例１］eGFP発現ES細胞を用いた、人工miRNA発現コンストラクト間におけるノックダウン効果の比較（図１参照）
eGFP遺伝子に対する人工miRNAが含まれている発現ベクター(1)〜(4)を作製し、eGFP発現ES細胞に導入した。導入2日後、FACS解析によりeGFP発現強度の比較を行った。その結果、レポーター遺伝子を含んでいないコンストラクト(2)で最も高いノックダウン効果が得られた。
【００９３】
なお、eGFP遺伝子に対する人工miRNAとしては、‘BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP'（K4936-00, Invitrogen）由来の配列を用いている。これは、miR155のmiRNAバックボーンを使用したものとなっており、このキットを利用してオリゴを挿入し、その後、独自の発現ベクターにクローニングし直して作製している。eGFPに対するmiRNAの配列は、ウェブサイトのBLOCK-iT RNAi Designerを用いて設計したものであり、２種類をタンデムに繋いでいる（計４種類のオリゴを使用）。その配列は次の通りである（eGFP_123_topおよびbottomはMiura et al. Anal Biochem 2011に発表済みである）。
【００９４】
eGFP_123_top:
5′-TGCTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAAGCTGACTGAAGTTCAT-3′
eGFP_123_bottom:
5′-CCTGATGAACTTCAGTCAGCTTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC-3′
eGFP_419_top:
5′-TGCTGTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGTTTTGGCCACTGACTGACACAAGCTGGTACAACTACA-3′
eGFP_419_bottom:
5′-CCTGTGTAGTTGTACCAGCTTGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACAAGCTGGAGTACAACTACAC-3′。
【００９５】
［実施例２］野生型ES細胞を用いた、人工miRNA発現コンストラクト間におけるノックダウン効果の比較
eGFP遺伝子に対する人工miRNAが含まれている発現ベクター(1)〜(5)とeGFP発現ベクターを、野生型ES細胞に共導入した。導入2日後、FACS解析、及び蛍光顕微鏡によりeGFP発現強度の比較を行った。その結果、実施例１と同様にレポーター遺伝子を含んでいないコンストラクト(2)および(5)で最も高いノックダウン効果が得られた。（図２参照）
【００９６】
［実施例３］レポーター遺伝子除去によるノックダウン効果の比較（図３参照）
実施例１および２で得られた結果からは、ノックダウン効果の差が生じる可能性として、（Ａ）トランスフェクション効率の差による可能性、又は（Ｂ）転写単位の長さによる可能性、の2つが考えられた。そこで、（Ｂ）の影響を明らかにするため、以下の実験を行った。
【００９７】
まず、CAGプロモーターの直下に人工miRNA、2つのrox配列に挟まれたtdTomatoレポーター遺伝子、及びpolyA付加シグナル（pA）を含む発現カセット作製し、piggyBacトランスポゾン配列（背矢印）に挟まれるようにコンストラクトを設計・作製した。次に、本ベクターをpiggyBacトランスポゼース発現ベクター、ネオマイシン耐性遺伝子発現トランスポゾンベクターと共にeGFP発現ES細胞に導入した。G418セレクション後、得られた安定発現細胞株の中から、tdTomato遺伝子発現（赤蛍光の有無）を指標として、このノックダウンコンストラク卜がゲノム上に挿入された細胞クローンを選別した(1)。得られた細胞クローンに関して、Dre発現プラスミドを導入し、tdTomato遺伝子部分が除かれた細胞を得た(2)。なお、部位特異的組換え酵素Dreはrox配列を認識し、2つのrox配列間の組換えを触媒する働きを持つ。最後に、これら(1)、(2)のそれぞれの細胞におけるeGFP発現強度の比較解析をFACSにて行った。その結果、tdTomatoレポーター遺伝子を除いた細胞(2)では、それを除いていない細胞(1)よりも、eGFPノックダウン効果が高くなることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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