(57)【要約】      （修正有）【課題】ナノマテリアルの肺の中での拡散状況、特に肺胞領域深部まで到達するか否か、そして、肺胞領域深部へ到達したナノマテリアルが肺・胸腔を突き破り胸腔へ漏出するか否かを迅速に評価できる装置、及び、方法を提供する。【解決手段】動物から取り出した気管・気管支から両肺を取り付けるための肺設置容器、該肺設置容器の内部を陰圧にするための陰圧発生装置を含むナノマテリアルの拡散評価装置であって、前記陰圧発生装置が、前記肺設置容器内を陰圧と大気圧に交互に繰り返すことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物から取り出した気管・気管支から両肺を取り付けるための肺設置容器、該肺設置容器の内部を陰圧にするための陰圧発生装置を含むナノマテリアルの拡散評価装置。
【請求項２】
前記陰圧発生装置が、前記肺設置容器内を陰圧と大気圧に交互に繰り返すことができるものであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記陰圧と大気圧の交互の繰り返しが、０．１〜６０回／分であること特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記肺設置容器は気密的な容器であり、一端は大気に開放し他端には気管・気管支から両肺が取り付けられる管、並びに陰圧発生装置に接続する孔を含むことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の装置。
【請求項５】
一端は大気に開放し他端は肺設置容器内に位置している管の他端に動物から取り出した気管・気管支から両肺を取り付け、前記肺設置容器内を陰圧と大気圧とに交互に繰り返すことで肺を人工的に呼吸させ、ナノマテリアルの気管・気管支から両肺への拡散状況を評価することを特徴とするナノマテリアルの拡散評価方法。
【請求項６】
前記陰圧と大気圧との繰り返しが、０．１〜６０回／分であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記陰圧が、０．０１〜３．０ｋＰａであることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
気密容器内を陰圧と大気圧とに交互に繰り返すことができる陰圧発生装置。
【請求項９】
前記陰圧と大気圧との繰り返しが、０．１〜６０回／分であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノマテリアルの拡散評価装置、評価方法及び陰圧発生装置に関するもので、特に、天然及び合成ナノマテリアルの肺や胸膜への拡散をｅｘ  ｖｉｖｏで評価するための装置、評価方法及び前記評価するための装置に用いられる陰圧発生装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノメートル（１ｎｍ＝１０-9ｍ）の領域すなわち原子や分子のスケールで物質を自在に制御する技術であるナノテクノロジー（ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の進歩により、ナノメートルスケールで新素材を開発したり、そのようなスケールのデバイスの開発が進められている。
【０００３】
ナノマテリアルは、文字どおりナノスケールの非常に小さな材料であり、同じ素材・重さ・体積の材料であれば表面積は格段に広くなることから反応性が非常に大きくなる。そのため、従来製品やその部品にナノマテリアルを使えば、小型化や高性能化など様々な点で有益であり、例えば、医薬品、化粧品、食品、食品容器包装、繊維、家庭用品・雑貨・スポーツ用品、家電・電気電子製品、塗料・インク等への応用が拡大しつつある。特に、ナノテクノロジーを代表する材料であるカーボンナノチューブ（以下、「ＣＮＴ」と記載することがある。）は、炭素原子のみからなる合成の繊維状新素材であり、１９９１年に発見された。ＣＮＴは、軽量・高強度で、熱伝導性が高く、導体・半導体となるなど多くの優れた特性を有する。
【０００４】
一方、ナノマテリアルの利用の拡大に伴って製造又は取扱いに従事する労働者数も急速に増加するものと考えられる。ナノマテリアルについては、組成単位がごく小さくなることで、既に安全が確認されている素材であっても、従来とは異なる性状を示すことがあり、生体への影響の懸念が高まっている。
【０００５】
例えば、２００８年にはｐ５３ヘテロノックアウトマウスに多層ＣＮＴを腹腔内投与すると、悪性中皮腫が発生することが報告された（非特許文献１参照）。これにより、多層ＣＮＴは既に発がん性が証明されているアスベストと同様の体内動態をとることが示唆され、ＣＮＴの安全性に関して疑義が生じた状況となった。
【０００６】
そのため、発明者らは、２０１１年に多層ＣＮＴにおいてその直径と剛性が発がんに極めて関連していることを報告し（非特許文献２参照）、ＣＮＴの留意すべき特性に注意を喚起している。一方で、ＩＳＯ（国際標準化機構）に２００５年に設立されたナノテクノロジー専門委員会（ＴＣ２２９）により、ナノマテリアルが健康や環境に与える影響に関する標準化を行っている。また、ＯＥＣＤにおいても継続的な取り組みがなされている。
【０００７】
しかしながら、上記のとおり、多層ＣＮＴを腹腔内投与することで悪性中皮腫が発生することが報告されているが（非特許文献１参照）、その試験方法は、多層ＣＮＴが一般的に推測される曝露とは異なる腹腔内等へ高用量で投与されていること等から、安全性評価を行うためには、動物における生体内での長期間にわたる残留性等について、さらに詳細な研究が必要であるとの問題がある。
【０００８】
また、多層ＣＮＴをラットの気管に投与し、肺への影響を報告した論文もある（非特許文献３参照）。しかしながら、前記非特許文献３に記載されている実験では、生きているラットに多層ＣＮＴを投与しており、投与後、炎症の発症確認に３〜１５日、線維症の発症確認には６０日程度ラットを飼育した後、組織を取り出して評価する必要があり、多層ＣＮＴの安全性の確認に非常に時間がかかるという問題がある。
【０００９】
更に、多層ＣＮＴをラットの鼻から吸引させ、肺への影響・毒性を調べた論文も知られている（非特許文献４参照）。しかしながら、前記非特許文献４に記載されている実験では、鼻から多層ＣＮＴを吸引させてから約６か月程度ラットを飼育し、その後組織を取り出して評価する必要があり、前記非特許文献２と同様、多層ＣＮＴの安全性の確認に非常に時間がかかるという問題がある。その他、多層ＣＮＴのエアロゾルが充填されているチャンバー内にラットを９０日間（６時間／日、５日／１週間、計１３週間）曝露して鼻から多層ＣＮＴを吸引させ、肺への毒性を調べた論文も知られているが（非特許文献５参照）、上記文献と同様、安全性の確認に非常に時間がかかるという問題がある。
【００１０】
ところで、アスベストは天然のナノマテリアルであるが、６０年代より曝露者において悪性中皮腫の発生が問題となっている。これまで、化学物質の未解明なリスクに関しては、トキシコロジストが主役で解析を行っていたが、その解析は、Ａｍｅｓ  ｔｅｓｔ、染色体異常試験、小核試験及び通常１３週までの動物試験である。ところが、アスベストによる発がんの潜伏期間は３０〜４０年であり、しかもＡｍｅｓ  ｔｅｓｔ陰性である。このように、繊維状ナノマテリアルに関しては、従来の毒性学的手法では対処できない部分があることが近年明らかになってきている。
【００１１】
更に、近年の研究の結果、悪性中皮腫の発生の原因は、吸い込まれたアスベストが肺内で拡散して肺胞領域深部まで到達し、該肺胞領域深部で肺・胸膜を突き破って胸腔に漏出し、中皮細胞を悪性化させると考えられている。今後、様々なナノマテリアルの開発や、量産化技術の確立により、単層・多層ＣＮＴをはじめ多くのナノマテリアルの利用の拡大が予想されるため、従来から行われている動物実験等に加え、ヒトに対する毒性ならびに発がん性を評価する新規で簡便な評価方法の確立が望まれている。特に、ナノマテリアルの肺内での拡散状況、特に肺胞領域深部まで到達するか否か、そして、肺胞領域深部へ到達したナノマテリアルが肺・胸膜を突き破り胸腔へ漏出するか否かを迅速に評価することが安全性を確認するための指標の一つとして重要になると考えられるが、そのような、実験装置、方法等は現在のところ知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｔｓｕｙａ  Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｉｎ  ｐ５３＋／−  ｍｏｕｓｅ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｗａｌｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ．”，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００８  Ｆｅｂ，  Ｖｏｌ．３３，  Ｎｏ．１,  ｐ１０５−１１６
【非特許文献２】Ｎａｇａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉａｍｅｔｅｒ  ａｎｄ  ｒｉｇｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｗａｌｌｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．”，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０８：  ｐ１３３０−１３３８，  ２０１１
【非特許文献３】Ｊｕｌｉｅ  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｗａｌｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ”，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ２０７，（２００５），  ｐ２２１−２３１
【非特許文献４】Ｊｕｒｇｅｎ  Ｐａｕｌｕｈｎ，“Ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ  １３−Ｗｅｅｋ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｒａｔｓ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ：  Ｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ａｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｎｏｔ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，ＴＯＸＩＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１１３（１），  ｐ２２６−２４２（２０１０）
【非特許文献５】Ｍａ−Ｈｏｃｋ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｗａｌｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｆｏｒ  ３  ｍｏｎｔｈｓ”，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．  ２００９  Ｄｅｃ，１１２（２），ｐ４６８−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、動物から取り出した気管・気管支から両肺（以下、「肺等」と記載することがある。）を気密容器内に取り付け、該容器内を陰圧→大気圧→陰圧→大気圧に繰り返すことでｅｘ  ｖｉｖｏで肺呼吸を人工的に作り出すことができ、ナノマテリアルの肺等への拡散状況、特に肺胞領域深部まで到達するか否か、そして、肺胞領域深部へ到達したナノマテリアルが肺・胸膜を突き破り胸腔へ漏出するか否かを迅速に評価できることを新たに見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明の目的は、ナノマテリアルの拡散評価装置、評価方法及び陰圧発生装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下に示す、ナノマテリアルの拡散評価装置、評価方法及び陰圧発生装置に関する。
【００１６】
（１）動物から取り出した気管・気管支から両肺を取り付けるための肺設置容器、該肺設置容器の内部を陰圧にするための陰圧発生装置を含むナノマテリアルの拡散評価装置。
（２）前記陰圧発生装置が、前記肺設置容器内を陰圧と大気圧に交互に繰り返すことができるものであることを特徴とする上記（１）に記載の装置。
（３）前記陰圧と大気圧の交互の繰り返しが、０．１〜６０回／分であること特徴とする上記（２）に記載の装置。
（４）前記肺設置容器は気密的な容器であり、一端は大気に開放し他端には気管・気管支から両肺が取り付けられる管、並びに陰圧発生装置に接続する孔を含むことを特徴とする上記（１）〜（３）の何れか一項に記載の装置。
（５）一端は大気に開放し他端は肺設置容器内に位置している管の他端に動物から取り出した気管・気管支から両肺を取り付け、前記肺設置容器内を陰圧と大気圧とに交互に繰り返すことで肺を人工的に呼吸させ、ナノマテリアルの気管・気管支から両肺への拡散状況を評価することを特徴とするナノマテリアルの拡散評価方法。
（６）前記陰圧と大気圧との繰り返しが、０．１〜６０回／分であることを特徴とする上記（５）に記載の方法。
（７）前記陰圧が、０．０１〜３．０ｋＰａであることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載の方法。
（８）気密容器内を陰圧と大気圧とに交互に繰り返すことができる陰圧発生装置。
（９）前記陰圧と大気圧との繰り返しが、０．１〜６０回／分であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、動物から取り出した気管・気管支から両肺を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで人工的な呼吸系を再現できるので、生きている動物を使用することなく、ナノマテリアルの気管・気管支から両肺への拡散を評価することができる。
また、肺の呼吸速度等を任意にコントロールすることができるので、ナノマテリアルの生体投与では長時間かかった評価を短時間で行うことができる。
更に、肺等を設置する容器内の溶液を定期的にサンプリングすることができるので、生体では評価することが困難であった肺を突き破り胸腔へ漏出したナノマテリアルの継時的変化を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明のナノマテリアルの拡散評価装置１０、及び陰圧発生装置２０の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、陰圧発生装置２０の上面図である。
【図３】図３は、図面代用写真で、実施例１で作成した病理標本の光学顕微鏡写真である。
【図４】図４は、図面代用写真で、比較例１で作成した病理標本の光学顕微鏡写真である。
【図５】図５は、図面代用写真で、実施例２で作成した病理標本の光学顕微鏡写真である。
【図６】図６は、図面代用写真で、比較例２で作成した病理標本の光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明のナノマテリアルの拡散評価装置、評価方法及び陰圧発生装置について詳しく説明する。
【００２０】
図１は、本発明のナノマテリアルの拡散評価装置、及び陰圧発生装置の一例を示している。本発明のナノマテリアルの拡散評価装置１０は、陰圧発生装置２０及び肺設置容器３０を少なくとも含んでいる。
【００２１】
陰圧発生装置２０は、後述する肺設置容器３０の内部を陰圧にするためのもので、図１に示す例では、モーター２１、該モーター２１の駆動力により回転する回転盤２２、該回転板２２に設けられ回転盤２２への取付位置を調整することで肺設置容器内の空気の吸引容量（肺設置容器内の圧力）を調整することができる調整ピン２３、シリンジ２４、前記調整ピン２３が挿通する長孔を有し前記シリンジ２４のプランジャに連結している可動板２５、該可動板２５のガイド２６を含んでいる。
【００２２】
肺設置容器３０は、一端が大気に開放し他端には肺等を取り付けることができる管３１、及び孔３２を含んでいる。肺設置容器３０内を陰圧にするためには、一端が前記陰圧発生装置２０のシリンジ２４に接続しているチューブ２７等の他端を前記孔３２に管等を用いて接続することで肺設置容器３０と陰圧発生装置２０を気密的に接続すればよい。前記管３１及び孔３２は肺設置容器３０の本体に設けてもよいし、肺設置容器３０の開口部に気密的に封をすることができる蓋に設けてもよい。また、図示はしていないが、肺設置容器３０内の圧力を示す圧力ゲージを肺設置容器３０に接続してもよい。
【００２３】
次に、上記陰圧発生装置２０の動作、及び上記ナノマテリアルの拡散評価装置１０を用いたナノマテリアルの拡散評価方法について説明する。
【００２４】
先ず、図１に示すように、肺設置容器３０内に肺を突き破ったナノマテリアルを回収するとともに肺等を湿潤状態に保つための溶液３３を、肺設置容器３０に注入する。前記溶液３３は、市販されている細胞培養液、生理食塩水等を用いればよい。次に、動物から取り出した肺等の気管を、糸等を用いて管３１に気密状態に取り付ける。前記管３１の開口している部分を評価すべきナノマテリアルが飛散している雰囲気中に配置することでナノマテリアルが肺に取り込まれるようにしてもよいし、前記管３１の開口からナノマテリアルを投与してもよいし、ナノマテリアルを予め気管に投与した後、肺等を管３１に取り付けてもよい。
【００２５】
肺等は、ラット、マウス、ウサギ、豚、ヤギ等、動物から取り出された肺等であれば特に制限はなく、用いる肺等の大きさに応じて、肺設置容器３０の大きさ、管３１の直径、溶液３３の注入量、及び後述する陰圧発生装置が吸引する空気の量を適宜調整すればよい。
【００２６】
評価すべきナノマテリアルは、ナノメートルスケール（１ｎｍ〜９９９ｎｍ）の材料であれば特に制限はなく、例えば、カーボンブラック、シリカ、酸化チタン、酸化亜鉛、フラーレン、単層・多層ＣＮＴ、デンドリマー、銀／金＋無機微粒子、ナノクレイ等が挙げられる。なお、評価すべき材料としては、前記のナノマテリアルに限定されるものではなく、今後新たに開発された材料であってもよい。また、大きさもナノメートルスケールに限定をされるものではなく、本発明の肺等を用いて生体への影響が評価できるものであればナノメートルスケール以上であってもよい。
【００２７】
図２は、上記陰圧発生装置２０の上面図で、図１と同じ番号は同じ部材を示す。モーター２１が回転すると、回転盤２２に取り付けられた調整ピン２３は、例えば時計回り方向に回転する。可動板２５に設けられている長孔２８に調整ピン２３が挿通していることから、前記調整ピン２３の回動に伴い、可動板２５は図２の左右方向への運動を繰り返すことになり、更に、可動板２５の一部はシリンジ２４のプランジャに接続していることから、可動板２５の運動に伴いプランジャを引いたり、押したりする動作を繰り返す。そして、シリンジ２４の先端と肺設置容器３０は気密性のあるビニール、シリコンチューブ等で接続されていることから、その結果、肺設置容器３０内の圧力を、陰圧、大気圧に交互に繰り返すことができる。肺等は、肺設置容器３０内で管３１に気密的に取り付けられていることから、プランジャが引かれ肺設置容器３０内が陰圧になると膨らみ、プランジャが押されて大気圧に戻ると元の大きさに戻る。更に、肺等を取り付けた管３１の他端は大気に開口しているので、ｅｘ  ｖｉｖｏで動物の呼吸系を再現することができる。
【００２８】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの呼吸系は、ヒトが通常に呼吸をする際の肺の伸縮に近い環境にすることが好ましく、肺設置容器３０内の陰圧が０．４〜０．８ｋＰａとなるように、肺設置容器３０の容量等を考慮しながら吸引する空気の量を調整すればよい。なお、本発明における「陰圧」とは、圧力の絶対値ではなく、大気圧（約１０１．３ｋＰａ）からの差分の圧力を意味する。圧力の調整は、例えば、回転盤２２の半径方向に溝を設け調整ピン２３をスライド可能に係合し調整ピン２３を任意の位置で螺子等を用いて固定、或いは、半径方向に複数の孔を設け調整ピン２３を任意の孔に嵌合することで、可動板２５の可動範囲を調整すればよい。また、調整ピン２３の位置を変えるのではなく、シリンジ２４の直径を変えることで、吸引する空気の量を変えてもよい。また、プランジャの押引回数は、ヒトが通常に呼吸する際の肺呼吸回数である１０〜１２回／分程度行うように、モーター２１の回転速度を調整すればよい。
【００２９】
なお、上記の陰圧発生装置２０は機械的に空気を吸引することで肺設置容器３０内を陰圧にしているが、例えば、真空ポンプで一定量の空気を吸引し、吸引後に肺設置容器３０に設けた弁等を開放することで肺設置容器３０内の圧力を大気圧に戻すようにしてもよい。
【００３０】
また、上記の圧力、押引回数は、ヒトの通常の呼吸を再現する場合であるが、例えば、ナノマテリアルの肺胞領域深部や胸膜への拡散性のスクリーニングを短期間で行う場合や、より緩やかな条件下での拡散等を評価する場合は上記の値である必要はなく、例えば、肺設置容器３０内の陰圧が０．０１〜３．０ｋＰａ程度になるように調整してもよいし、プランジャの押引回数を０．１〜６０回／分程度に適宜調整してもよい。
【００３１】
ナノマテリアルを投与し一定時間人工的に呼吸をさせた後は、肺等を取り出し、通常の固定、包埋、薄切、塗抹、染色の手順で病理標本を作成し、顕微鏡観察を行うことでナノマテリアルの拡散の有無を評価すればよい。また、肺・胸膜を突き破って溶液３３に漏出したナノマテリアルは、溶液３３を遠心分離して、その沈渣にナノマテリアルが含まれているか否か、顕微鏡で観察すればよい。
【００３２】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
１２週齢のブラウン・ノルウェー系統とフィッシャー系統の雑種第１代雄性ラットを麻酔下に開胸、開腹して、右心房よりリン酸緩衝生理的食塩水で還流したあと、気管・気管支ならび両肺を一塊として傷つけないように丁寧に取り出した。ナノマテリアルサンプルとしては、ＵＩＣＣ（Ｕｎｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｓ  Ｃｏｎｔｒａ  Ｃａｎｃｒｕｍ：国際対がん連合）から入手可能でラットへの腹腔内投与により中皮腫発がん性が確認されているクロシドライト（青石綿）を使用した。取り出したラットの肺の気管内にクロシドライト１ｍｇを投与後、滅菌済みブレードエスロン縫合糸（ＵＳＰ３−０、秋山製作所）を用いて、気管を直ちに本発明の肺設置容器内の管に気密的に取り付けた。大きさが、７．５（幅）×７．０（奥行き）×４．５ｃｍ（高さ）の肺設置容器に約１１０ｍｌ（体積の約半分）のＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れた。次いで、陰圧発生装置のシリンジのプランジャを約１２ｍｌのストロークで１分間に１５回の割合で動かし、それに伴って肺設置容器内の圧力が大気圧〜最大２ｋＰａ程度の陰圧になることで、呼吸時の肺の動きを人工的に作り出し、５時間動作を継続した。なお、本実施例の陰圧は、ヒトの生理的な胸腔陰圧と比較した場合、約３倍である。５時間経過後、肺等を注意深く回収し、１０％中性ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し、病理標本の作成を常法で行った。ヘマトキシリン・エオジン染色ならびに鉄染色を行い、光学顕微鏡で肺等の組織のどの部位にクロシドライトが認められるのか評価を行った。また、同時に、肺設置容器内の溶液を回収し、３，５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その沈渣を顕微鏡で観察し、クロシドライトが肺外へ漏れ出ていないか評価した。
【００３４】
図３（１）は、実施例１で作成した病理標本の低倍率の光学顕微鏡写真で、（１）の上方の矢印は気管支内のクロシドライトを示している。（２）は、（１）の□で囲った部分の拡大写真で、（２）の矢印は、肺胞領域深部及び肺の外側の膜である胸膜に到達したクロシドライトを示している。
【００３５】
また、実施例１の肺設置容器内の溶液の沈渣を顕微鏡で観察したところ、クロシドライトが確認された。
【００３６】
＜比較例１＞
陰圧発生装置を作動させなかった以外は、実施例１と同様の手順で実験を行い、病理標本を作成した。
【００３７】
図４（１）は、比較例１で作成した病理標本の低倍率の光学顕微鏡写真で、（２）は（１）の下方の□で囲った部分の拡大写真で、矢印は気管支内のクロシドライトを示している。（３）は、（１）の上方の□で囲った部分の拡大写真で、写真から明らかなように、肺胞領域深部へのクロシドライトの到達は認められなかった。
【００３８】
また、比較例１の肺設置容器内の溶液の沈渣を顕微鏡で観察したところ、クロシドライトは確認されなかった。
【００３９】
＜実施例２＞
ナノマテリアルサンプルとして、クロシドライトに代え、多層ＣＮＴ（直径５０ｎｍ、平均長約５μｍ、昭和電工社製ＶＧＣＦ−Ｓ）を使用した以外は、実施例１と同様の手順で実験をおこなった。
【００４０】
図５（１）は、実施例２で作成した病理標本の低倍率の光学顕微鏡写真で、矢印は気管支内の多層ＣＮＴを示している。（２）は（１）の上方の□で囲った部分の拡大写真、（３）は（１）の下方の□で囲った部分の拡大写真である。（２）及び（３）の矢印は、肺胞領域深部及び肺の外側の膜である胸膜に到達した多層ＣＮＴを示している。
【００４１】
また、実施例２の肺設置容器内の溶液の沈渣を顕微鏡で観察したところ、多層ＣＮＴが確認された。
【００４２】
＜比較例２＞
陰圧発生装置を作動させなかった以外は、実施例２と同様の手順で実験を行い、病理標本を作成した。
【００４３】
図６（１）は、比較例２で作成した病理標本の低倍率の光学顕微鏡写真で、（２）は（１）の上方の□で囲った部分の拡大写真で、矢印は気管支内の多層ＣＮＴを示している。（３）は、（１）の下方の□で囲った部分の拡大写真で、写真から明らかなように、肺胞領域深部への多層ＣＮＴの到達は認められなかった。
【００４４】
また、比較例２の肺設置容器内の溶液の沈渣を顕微鏡で観察したところ、多層ＣＮＴは確認されなかった。
【００４５】
上記実施例１及び２、並びに比較例１及び２を以下のように総合評価した。
グレード０：サンプルは気管支内のみに存在する。
グレード１：サンプルは肺胞に到達するが胸膜までの近位１／２までに留まる。
グレード２：サンプルは肺胞の遠位１／２に到達するが胸膜には到達していない。
グレード３：サンプルは胸膜に到達しているが、肺外では検出されない。
グレード４：サンプルは胸膜を超えており、肺の外側の溶液内から検出される。
【００４６】
実施例１（クロシドライト）及び実施例２（多層ＣＮＴ）は、いずれもグレード４であったのに対し、比較例１及び２は、グレード０であった。この結果より、本発明の評価装置を用いることで、ナノマテリアルを吸引した場合、肺胞領域深部や胸膜並びに胸膜を超え肺の外側への拡散をｅｘ  ｖｉｖｏで迅速且つ適切に評価することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の、ナノマテリアルの拡散評価装置を用いることで、ｅｘ  ｖｉｖｏでありながら、ナノマテリアルが生体に吸引された場合に非常に近い環境で肺胞領域深部や胸膜への拡散を評価することができるので、ナノマテリアルの研究開発機関、ナノマテリアルを使用している製造メーカー、医療機関等において、ナノマテリアルの安全性を総合評価する際に、他の評価とは独立した新たな評価指標として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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