(57)【要約】  【課題】多くのカテキン種を認識する抗カテキン抗体の提供。  【解決手段】カテキン類に対する抗体であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン類に対する抗体であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的改変からなるアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ      （１）
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を用いるカテキン類の検出又は測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の抗体を含むカテキン類の検出又は測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々なカテキン種と反応性を有する抗カテキン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテキン類は、緑茶に含まれるポリフェノールの一種であり、緑茶の渋味を構成する成分の一つである。これまでの研究から、カテキン類は、抗酸化作用、抗癌作用、抗アレルギー作用、抗菌作用、腹部脂肪低減作用等、多様な作用を有することが知られている。
【０００３】
したがって、カテキン類が各種薬理作用を発揮するための作用メカニズムを解析することは、薬理作用の向上や新たな作用物質を探索する上で重要であり、そのためには、カテキン類の体内分布、臓器内分布、細胞内分布等を把握することが必要となる。例えば、カテキンの抗菌作用に対する作用メカニズム解析のために菌体表層の局在を把握すること、抗癌作用のメカニズム解析のために体内動態を把握すること等は重要であり、従ってカテキン類を正確且つ簡便に解析するための手法が求められている。
【０００４】
しかしながら、カテキン類は、これまで、特異的な化学的特性が知られておらず、カテキン類を分析するための簡便な化学的手法が開発されてこなかった。また、カテキンのような低分子物質は抗体の取得が容易ではなく、これまでに、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）を特異的に認識する抗体（非特許文献１）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を特異的に認識する抗体（非特許文献２）、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣＧ３”Ｍｅ）を特異的に認識する抗体（特許文献１）、ガレート基を有するカテキン類を特異的に認識する抗体（特許文献２）の如く、特定のカテキン種に対する抗体が報告されているに過ぎない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−３７７５９号公報
【特許文献２】特開２００９−８４１９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yoshichika Kawai et. al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 347 527-532(2008)
【非特許文献２】Takashi Kuzuhara et.al., Biol.Parm.Bull.31(5)816-819(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、多くのカテキン種を認識する抗カテキン抗体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、カテキン類に対する抗体について、鋭意検討した結果、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣg）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣg）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（Ｃg）、ガロカテキンガレート（ＧＣg）の８種のカテキン種に反応性を有するモノクローナル抗体を得ることに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）カテキン類に対する抗体であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体。
２）Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的改変からなるアミノ酸配列を含む上記１）の抗体。
ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ      （１）
３）上記１）又は２）の抗体を用いるカテキン類の検出又は測定方法。
４）上記１）又は２）の抗体を含むカテキン類の検出又は測定試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗カテキン抗体は、８種のカテキン種に対して反応性を有することから、緑茶等に含まれるカテキン類の体内分布、臓器内分布、細胞内分布やその存在量を、包括的に把握することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｂ−１５６５、ｂ−１０５８及びｂ−２１０６のＨ鎖アミノ酸配列の比較
【図２】ｂ−１５６５、ｂ−１０５８及びｂ−２１０６のＬ鎖アミノ酸配列の比較
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗体（「抗カテキン抗体」とも称する）は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレートの８種のカテキン種に反応性を有する。尚、本明細書においては、斯かる８種のカテキン種をカテキン類とも称する。
ここで、「反応性を有する」とは、抗原抗体反応を示すことをいう。
【００１３】
本発明の抗カテキン抗体は、上記反応性を有する限り、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含み、更にモノクローナル抗体のフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆ（ａｂ'）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）を含む。
【００１４】
本発明の抗カテキン抗体は、Ｈ鎖（重鎖）のＮ末端側領域に、下記（１）のアミノ酸配列又はその保存的改変からなるアミノ酸配列を含むものが好ましい。
ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ      （１）
（１）中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載している。ここで、Ｍはメチオニン、Ａはアラニン、Ｖはバリン、Ｇはグリシン、Ｌはロイシン、Ｃはシステイン、Ｔはスレオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリンを示す。
【００１５】
「保存的配列改変」とは、（１）のアミノ酸配列を含む抗体の反応性に有意な影響を及ぼさない又は変化させないアミノ酸改変を意味する。そのような保存的改変には、１〜数個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基（アミノ酸残基のファミリー）に置換されている置換である。斯かるアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β-分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００１６】
本発明の抗体としては、更に好適には、Ｈ鎖が、配列番号２若しくは６で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
そして更に、Ｈ鎖が配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものであり、更にＬ鎖が配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるもの、又はＨ鎖が配列番号６で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものであり、更にＬ鎖が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものであるのが好ましい。
【００１７】
すなわち、本発明においては、別の一態様として以下の抗体構成分及びその遺伝子が提供される。
１）以下の（ａ）又は（ｂ）のＨ鎖タンパク質
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
（ｂ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
２）以下の（ｃ）又は（ｄ）のＬ鎖タンパク質。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
（ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
３）以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡからなるＨ鎖タンパク質遺伝子。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
４）以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡからなるＬ鎖タンパク質遺伝子。
（ｇ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
ここで、アミノ酸配列及び塩基配列間の同一性とは、２つのアミノ酸配列又は塩基配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基又は塩基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数又は塩基数に対する割合（％）をいう。具体的には、例えばリップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖を有する抗カテキン抗体としては、後述のモノクローナル抗体ｂ−１０５８が挙げられ、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖を有する抗カテキン抗体としては、モノクローナル抗体ｂ−１５６５が挙げられる。モノクローナル抗体ｂ−１０５８及びｂ−１５６５においては、上記（１）で表されるアミノ酸配列は、配列番号２及び６で示されるアミノ酸配列の１〜１９番目の１９アミノ酸残基からなる領域に該当する。当該領域はＨ鎖の中の可変領域の全部又は一部と考えられる。
【００２０】
本発明の抗カテキン抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマから産生されるもの、及び周知の遺伝子工学的手法、例えばＨ鎖タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１又は５で示される塩基配列からなるＤＮＡ）と、Ｌ鎖タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３又は７で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体から、Ｈ鎖タンパク質及びＬ鎖タンパク質を製造し、これらを可能性のあるペプチドで連結させて生産するものが包含される（MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554, 1990、Tim Clackson et al, Nature, 352, 642-628, 1991等参照）。
【００２１】
抗カテキン抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。例えば、３−スクシニルエピカテキンを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２２】
感作抗原として使用される３−スクシニルエピカテキンは、キャリアタンパク質を化学的に結合させたものを使用するのが好ましい。ここで、キャリアタンパク質としては、それ自身は免疫源性に乏しく、かつ高分子量のタンパク質であるものが好ましく、具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、カブトガニヘモシアニン（ＫＬＨ）等を挙げることができ、このうちＫＬＨが好ましい。キャリアタンパク質を結合させるための化学的手法としては、抗原物質に化学的な変化をもたらさない化学反応であれば、特に限定されない。ＫＬＨを結合させた３−スクシニルエピカテキン（ＫＬＨ−３−スクシニルＥＣ）は、例えば前記非特許文献１に記載の方法によって調製することができる。
【００２３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００２４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から採血し、血清成分を精製することでポリクローナル抗体を得ることができる。血清成分を精製する際には、感作抗原を固定化したアフィニティーカラム等を使用することができる。
【００２５】
モノクローナル抗体を作製する際には、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。
【００２６】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜６０００のＰＥＧ、３０〜６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。
【００２７】
融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。  得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
【００２８】
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
【００２９】
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法又はアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
【００３０】
本発明の抗カテキン抗体を任意の免疫学的測定方法に用いることにより、検体や試料中のカテキン類を特異的に測定・検出することができる。
免疫学的測定法としては、特に制限されないが、定性的分析としては、免疫組織染色法、蛍光抗体法、吸着法、及び中和法を挙げることができ、定量的分析としては、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、及びウエスタンブロッティング法等を挙げることができる。このうち、ＥＬＩＳＡ法は、簡便性の点から好適に用いられる。ＥＬＩＳＡ法には、競合法、サンドイッチ法、直接吸着法がある。
【００３１】
競合法は、抗カテキン抗体をＥＬＩＳＡ用プレートに結合させ、これに、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）やセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素等で標識した一定濃度のカテキン類と共に、試料を添加するものである。試料中のカテキン類と標識したカテキン類が、抗カテキン抗体への結合をめぐって競合し、試料中のカテキン類の濃度に応じて、標識カテキン類が抗カテキン抗体に結合することから、当該標識カテキン類の抗体への結合量により、試料中のカテキン類の濃度を推定することができる。
【００３２】
サンドイッチ法は、抗カテキン抗体と標識抗カテキン抗体を用いるものであり、固定化抗カテキン抗体と標識抗カテキン抗体を用いる方法が好ましい。
固定化抗カテキン抗体としては、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体に抗体を固定化したものが好ましい。
また、標識抗カテキン抗体の標識としては、例えば、放射性同位体（例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム）、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
【００３３】
また、直接吸着法（直接法）は、固相に抗原を吸着させて、標識抗カテキン抗体と反応させる方法である。
【００３４】
試料（検体）中のカテキン類の検出は、試料中のカテキンを固定化抗カテキン抗体と反応させることにより行われるが、例えばサンドイッチ法による場合には、試料含有液と固定化抗カテキン抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させること、或いは固定化抗カテキン抗体と標識抗体とを同時に反応させることにより行うことができる。反応終了後、試料中のカテキン類と固定化抗カテキン抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、試料中のカテキン類量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
【００３５】
本発明の抗カテキン抗体を含む検出又は測定試薬（キット）は、固定化された本発明の抗カテキン抗体の他、例えば検体用希釈液、標識抗カテキン抗体、反応基質等により構成されるのが好ましい。
【００３６】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞カテキン類に対する抗体であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体。
＜２＞Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的改変からなるアミノ酸配列を含む上記＜１＞の抗体。
ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ      （１）
＜３＞Ｈ鎖が配列番号２若しくは６で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる上記＜１＞または＜２＞に記載の抗体。
＜４＞Ｈ鎖が配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＬ鎖が配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる上記＜１＞または＜２＞に記載の抗体。
＜５＞Ｈ鎖が配列番号６で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＬ鎖が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる上記＜１＞または＜２＞に記載の抗体。
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞の抗体を用いるカテキン類の検出又は測定方法。
＜７＞上記＜１＞〜＜５＞の抗体を含むカテキン類の検出又は測定試薬。
＜８＞以下の（ａ）又は（ｂ）のＨ鎖タンパク質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
（ｂ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
＜９＞Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的改変からなるアミノ酸配列を含む上記＜８＞のタンパク質。
ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ      （１）
＜１０＞以下の（ｃ）又は（ｄ）のＬ鎖タンパク質。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
（ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質。
＜１１＞以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡからなるＨ鎖タンパク質遺伝子。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１２＞Ｈ鎖タンパク質遺伝子中に下記（２）の塩基配列からなる領域（配列番号１又は５で示される塩基配列の１〜５７番目の塩基）を有する＜１１＞のＨ鎖タンパク質遺伝子。
atggctgtcctggggctgcttctctgcctggtgacgttcccaagctgtgtcctgtcc  （２）
＜１３＞以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡからなるＬ鎖タンパク質遺伝子。
（ｇ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と８５％以上、好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート及びガロカテキンガレートの何れにも反応性を有する抗体としての機能を担うタンパク質をコードするＤＮＡ。
【実施例】
【００３７】
実施例１  抗体の作成
１．免疫抗原の調製
非特許文献１に従って、（−）−Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ（以下ＥＣ；和光純薬工業、Ｃａｔ．Ｎｏ．０５５−０６７５３、Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＷＫＧ５９５９）をスクシニル化後、カブトガニヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））を化学的に結合させて、ＫＬＨ結合３−スクシニル・ＥＣを作製し、免疫抗原とした。
【００３８】
２．免疫工程
（１）免疫
ＫＬＨ結合３−スクシニル・ＥＣをマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ  ６週令、♀（日本エスエルシー株式会社））６匹に免疫した。
【００３９】
（２）抗カテキン抗体の免疫誘導評価
抗原投与７日目に免疫マウス尾静脈より採血を行い、遠心分離により血清成分を獲得した。得られた血清成分について、キャリア蛋白質（ＯＡＶ）結合３−スクシニル・ＥＣと免疫マウス抗血清との結合に対するカテキン抗原（３−スクシニル・ＥＣ、（−）−Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）の結合阻害により、カテキン特異的抗体の免疫誘導を評価した。
【００４０】
３. 抗カテキン抗体産生ハイブリドーマの調製
（１）細胞融合
抗体価の上昇したマウスに最終免疫を行ない、最終免疫から３−４日後にマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞株ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ．８．６．５．３をＰＧＥ法にて融合した。１０％  ＦＢＳ−ＨＡＴ  ｍｅｄｉｕｍに懸濁した融合細胞を、脾臓細胞数換算で１．５〜２．０×１０  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように９６  ｗｅｌｌ  プレートに播きこみ、ＣＯインキュベーターで培養した。融合後１０〜１４日後からスクリーニングを行い、目的の抗体産生ハイブリドーマを選別した。
【００４１】
（２）抗カテキン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ＯＶＡ結合３−スクシニル・ＥＣを固相としたＥＬＩＳＡでハイブリドーマ培養上清との反応を評価し、陽性を示したハイブリドーマを抗カテキンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
【００４２】
（３）取得抗体産生ハイブリドーマの性状解析
（２）で得られた抗体産生ハイブリドーマについて、茶カテキン８種類（（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ３７６８−５ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．０３８Ｋ１６６８）、（−）−エピカテキンガレート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ３８９３−１０ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．０４８Ｋ１１７７）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｊａｐａｎ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＳＩ０５０５０００３）、（−）−カテキン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＯ５６７−５ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．１１７Ｋ１３８１）、（−）−ガロカテキン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ６６５７−５ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．０４８Ｋ１６８０）、（−）−カテキンガレート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＯ６９２−５ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．０８７Ｋ１５５１）、（−）−ガロカテキンガレート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ６７８２−５ＭＧ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．０８８Ｋ１１８３））及び免疫源である３−スクシニル・ＥＣによる競合阻害ＥＬＩＳＡを用いて性状解析を行った。
【００４３】
４．単クローン化
上記３で得られたハイブリドーマを限界希釈法によって単一のコロニーが得られるように培養することにより、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行ない、上記８種のカテキン種の全てに反応性を有する抗体を産生するｂ−１０５８株及びｂ−１５６５株、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）のみに反応性を有する抗体を産生するｂ−２１０６株を樹立した。
得られた抗体産生ハイブリドーマの保存は、当該ハイブリドーマを培養し、対数増殖期に回収し後、ＦＢＳ含有細胞凍結液にて細胞濃度が１×１０6  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した後、１×１０6  ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅとなるように凍結チューブ［Ｎｕｎｃ社］に分注し、バイセル中にて−８０℃に冷却し窒素タンクで保存することによって行った。
【００４４】
５．抗体生産
得られた抗体産生ハイブリドーマ（ｂ−１０５８株、ｂ−１５６５株、ｂ−２１０６株）をＢｏｖｉｎｅ  ＩｇＧ除去ｍｅｄｉｕｍにて培養し、培養上清を回収し、Ｂｏｖｉｎｅ  ＩｇＧ除去ｍｅｄｉｕｍを用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ法によりモノクローナル抗体を精製した（表１）。
【００４５】
【表１】
2014172824.tif 000002
【００４６】
６．ＥＬＩＳＡ法によるカテキン類との反応性
得られたカテキンのモノクローナル抗体とカテキン類の反応性をＥＬＩＳＡ法により確認した。
（１）カテキン溶液の調製
３．（３）で記載したカテキン８種についてＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。
（２）直接ＥＬＩＳＡ法
１％  ＢＳＡを２００μｌずつ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社、Ｆ９６  ｍａｘｉｐｏｒｐ）に分注し、４℃で２４時間静置後、上清を捨て、各ウェルを４００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。各カテキン溶液を５０μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置することで各カテキン種をプレートに固定化した。その後上清を除去し、４００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後に１％ＢＳＡで希釈した各抗体（ｂ−１０５８、ｂ−１５６５、ｂ−２１０６）を５０μｌ添加し、３７℃で１時間静置した。上清を除去後、４００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し二次抗体溶液（Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）１／４，０００  ｉｎ  ＰＢＳ（−））を添加し３７℃で１時間静置後上清を除去しさらに４００μｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。各ウェルに基質溶液（０．０６％（ｗ／ｖ）ＡＢＴＳ、０．０２７％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏ2  ｉｎ  ０．１  Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4）を添加し、３７℃で１５分間遮光条件下にて静置した。反応停止液として１Ｍ  シュウ酸を添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。各抗体の各種カテキンとの反応性は吸光度測定結果からＡ：＞０．５、Ｂ：０．１≦ｘ＜０．５、Ｃ：０．０５≦ｘ＜０．１、及びＤ：＜０．０５で表記した。
【００４７】
【表２】
2014172824.tif 000003
【００４８】
表２より、ｂ−１５６５及びｂ−１０５８は全てのカテキン種に対して高い反応性を示した。一方、ｂ−２１０６はＥＣｇに対してのみ反応性を示した。
【００４９】
実施例２  Ｈ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列の解析
実施例１で得られた８種のカテキン種に対して反応性を有するｂ−１０５８及びｂ−１５６５、及びＥＣｇに対してのみ反応性を有するｂ−２１０６について、Ｈ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列を決定した。
（１）配列決定
常法に従い、各ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行ない、これを鋳型としてｃＤＮＡを調製した。表３に示すプライマーを用いて、表４に示す条件で、ＰＣＲを行い、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子を増幅した。
すなわち、得られたｃＤＮＡ（Ｈ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒにより合成）を鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）Ｈ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒをｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｋｉｔに含まれるＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒをｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとしてＰＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行なった。同様にｃＤＮＡ（Ｌ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒにより合成）を鋳型に、Ｌ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒを用いてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬを使用した。得られたＰＣＲ産物をＣｌｏｎｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＭＤ２０−Ｔにライゲーションを行い、常法の形質転換により、ＰＣＲ産物ごとに４８  ｃｌｏｎｅ取得した。
【表３】
2014172824.tif 000004
【００５０】
【表４】
2014172824.tif 000005
【００５１】
取得したＣｌｏｎｅはプライマーＭ１３−４７（cgccagggttttcccagtcacgac（配列番号１７））を用いてＰｌａｓｍｉｄ領域の片側から解析した。シーケンシングは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて付属のプロトコールに従って行ない、配列を決定した（配列番号１〜１２）。ここで、配列番号１及び２：ｂ−１０５８のＨ鎖塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号３及び４：ｂ−１０５８のＬ鎖塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号５及び６：ｂ−１５６５のＨ鎖塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号７及び８：ｂ−１５６５のＬ鎖塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号９及び１０：ｂ−２１０６のＨ鎖塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号１１及び１２：ｂ−２１０６のＬ鎖塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
また、ｂ−１５６５、ｂ−１０５８、及びｂ−２１０６のアミノ酸配列をＨ鎖及びＬ鎖でそれぞれ比較した結果を、図１及び図２に示す。
【００５２】
（２）配列解析
ａ）決定された各アミノ酸配列について、ClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja)を用いてアライメントを行い、配列同一性を調べた結果を表５及び表６に示す。
【００５３】
【表５】
2014172824.tif 000006
【００５４】
【表６】
2014172824.tif 000007
【００５５】
ｂ−１５６５とｂ−１０５８は、Ｈ鎖では８７％、Ｌ鎖では９８％の同一性があり、特にＬ鎖において高い同一性を有していた。一方、ｂ−２１０６は、Ｈ鎖及びＬ鎖において、ｂ−１５６５及びｂ−１０５８のいずれのアミノ酸配列とも同一性は低かった（５６−６４％）。
【００５６】
ｂ）ｂ−１５６５及びｂ−１０５８における共通アミノ酸配列
ｂ−１５６５及びｂ−１０５８のＨ鎖においては、Ｎ末端から１８〜４５番目のアミノ酸残基は共に「ＭＡＶＬＧＬＬＬＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳ」であり共通配列となっている。
斯かるアミノ酸配列についてBLAST（http://blast.ddbj.nig.ac.jp/blast/blastn?lang=ja）検索を行なった結果、及びこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドは発見されなかった。このアミノ酸配列は、ｂ−１５６５及びｂ−１０５８に特異的で新規なアミノ酸配列であることが示唆され、また本配列には、ｂ−１５６５及びｂ−１０５８の可変領域の一部又は全部が含まれる可能性が示唆された。
【図１】
2014172824.tif 000008
【図２】
2014172824.tif 000009
【配列表】
2014172824000001.app