(57)【要約】【課題】放線菌におけるタンパク質生産用ベクターを提供すること。【解決手段】放線菌においてタンパク質を発現するためのプラスミドベクターであって、該プラスミドベクターは、プロモーター、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイト、およびターミネーター、ならびにｓｔｉまたはｍｉｎｉ  ｓｔｉ含有断片を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌においてタンパク質を発現するためのプラスミドベクターであって、プロモーター、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイト、ターミネーター、およびｓｔｉ含有断片を含む、プラスミドベクター。
【請求項２】
前記ｓｔｉ含有断片が、配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列を含むＤＮＡ断片；配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得る、ＤＮＡ断片；または配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡ断片である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、ホスホリパーゼＤ遺伝子のプロモーター、メタロエンドペプチダーゼ遺伝子のプロモーターおよびキシロース・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターからなる群より選ばれる少なくとも１のプロモーターを含む断片である、請求項１または２のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
前記クローニングサイトに挿入された前記タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
前記タンパク質が、ホスホリパーゼＡ２、スフィンゴミエリナーゼまたはキトビアーゼである、請求項１から４のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のプラスミドベクターが組み込まれている組換え放線菌。
【請求項７】
放線菌においてタンパク質を生産する方法であって、
請求項４または５に記載のプラスミドベクターで放線菌を形質転換する工程、
形質転換された該放線菌を培地中で培養する工程、および
得られた培養物から、該タンパク質を回収する工程
を含む、方法。
【請求項８】
請求項４または５に記載のプラスミドベクターが導入された組換え放線菌。
【請求項９】
前記ｓｔｉ含有断片が、配列番号１の１位〜４１１位までの塩基配列を含むＤＮＡ断片；配列番号１の１位〜４１１位までの塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得る、ＤＮＡ断片；または配列番号１の１位〜４１１位までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡ断片である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ホスホリパーゼＤ遺伝子のプロモーター、メタロエンドペプチダーゼ遺伝子のプロモーターおよびキシロース・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターからなる群より選ばれる少なくとも１のプロモーターを含む断片である、請求項１または９のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
前記クローニングサイトに挿入された前記タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに含む、請求項１、９または１０のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１２】
前記タンパク質が、ホスホリパーゼＡ２、スフィンゴミエリナーゼまたはキトビアーゼである、請求項１、９〜１１のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のプラスミドベクターが組み込まれている組換え放線菌。
【請求項１４】
放線菌においてタンパク質を生産する方法であって、
請求項１１または１２に記載のプラスミドベクターで放線菌を形質転換する工程、
形質転換された該放線菌を培地中で培養する工程、および
得られた培養物から、該タンパク質を回収する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載のプラスミドベクターが導入された組換え放線菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌におけるタンパク質生産用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌は、抗生物質などの多様な二次代謝産物を生産する放線菌群として工業的に広く利用されており、極めて重要な菌群である。ストレプトマイセス属細菌での有用物質生産の重要性を考慮すると、放線菌においてタンパク質の大量発現技術の開発が望まれる。
【０００３】
ストレプトマイセス属細菌を利用した発現系では、ストレプトマイセス属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１に由来するプラスミドベクターが用いられている（非特許文献１）。このようなプラスミドベクターは、ｐＩＪ１０１の一部分を切り出して構築され得るが、その構築段階において「ｓｔｉ」と称される領域が削除される。ｐＩＪ７０２（非特許文献２）、ｐＩＪ３５０（非特許文献３）などの現在使用されているストレプトマイセス属細菌用ベクターのほぼすべてが、ｓｔｉ領域を欠いたものである（非特許文献１および２）。
【０００４】
「ｓｔｉ」とは、「強い不和合性（strong incompatibility）」を引き起こすことから命名された遺伝子の名称であり、ｐＩＪ１０１の必須複製領域部分ではない約２００ｂｐのＤＮＡセグメント上に位置すると報告された（非特許文献４）。ｐＩＪ１０１の制限酵素地図（非特許文献１、４および５）およびｐＩＪ１０１におけるｓｔｉ領域の位置（非特許文献１および４）は知られている。
【０００５】
ｐＩＪ１０１およびその誘導体のいくつかのコピー数は、４０〜３００の間で変動することが見出されている（非特許文献４）。ｓｔｉ領域を欠くプラスミドは、上記範囲の下方である平均して５０〜１００の間のコピー数を有した（非特許文献４）。ｓｔｉ領域を含む断片をｐＩＪ１０１由来プラスミドに正しい向きに挿入することにより得られたプラスミドベクターの１つであるｐＩＪ２７４３は、約０．６ｋｂの挿入片を有しており、このコピー数は約１０００であり、その親株である、ｓｔｉ領域を含まないｐＩＪ４５２と比べて１０倍多く、ｓｔｉ領域を含むｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３５５またはｐＩＪ６４９（これらのコピー数は約３００である）と比べて３倍多かった（非特許文献４）。
【０００６】
このように、ｓｔｉを含むプラスミド自体の放線菌宿主におけるコピー数について検討されているが、そのようなプラスミドについて、放線菌宿主用の発現ベクターとしての有用性、特にタンパク質の発現および生産量との関係は明らかではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Streptomyces Manual), D.A. Hopwoodら著, John Innes Centre Ltd,  Chapter 11. Plasmids and their use for gene cloning
【非特許文献２】Murookaら, Appl. Environ. Microbiol., 1986年, 52巻, 1382-1385頁
【非特許文献３】Kollerら, J. Bacteriol., 1989年, 171巻, 4953-4957頁
【非特許文献４】Dengら, Mol. Gen. Genet., 1988年, 214巻, 286-294頁
【非特許文献５】Kieserら, Mol. Gen. Genet., 1982年, 185巻, 223-238頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、放線菌においてタンパク質の生産量を増加させる方法およびそのためのベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、放線菌においてタンパク質を発現するためのプラスミドベクターを提供し、このプラスミドベクターは、プロモーター、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイト、ターミネーター、およびｓｔｉ含有断片を含む。
【００１０】
１つの実施形態では、上記ｓｔｉ含有断片は、配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列を含むＤＮＡ断片；配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得る、ＤＮＡ断片；または配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含み、かつ上記ベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡ断片である。
【００１１】
１つの実施形態では、上記プロモーターが、ホスホリパーゼＤ遺伝子のプロモーター、メタロエンドペプチダーゼ遺伝子のプロモーターおよびキシロース・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターからなる群より選ばれる少なくとも１のプロモーターである。
【００１２】
１つの実施形態では、上記プラスミドベクターは、上記クローニングサイトに挿入された上記タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに含む。
【００１３】
１つの実施形態では、上記タンパク質は、ホスホリパーゼＡ２、スフィンゴミエリナーゼまたはキトビアーゼである。
【００１４】
本発明はまた、上記タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに含む上記プラスミドベクターが組み込まれている組換え放線菌を提供する。ここで、組み込まれている、とはプラスミドベクターが放線菌の染色体ＤＮＡにインテグレートしている状態、細胞質中に遊離のプラスミド状態で含まれている状態、およびその両方が併存している状態を含む意味である。
【００１５】
本発明はさらに、放線菌においてタンパク質を生産する方法を提供し、この方法は、
上記タンパク質をコードするＤＮＡ断片をさらに含む上記プラスミドベクターで放線菌を形質転換する工程、
形質転換された該放線菌を培地中で培養する工程、および
得られた培養物から、該タンパク質を回収する工程
を含む。
【００１６】
本発明はまた、上記プラスミドが導入された組換え放線菌である。導入された、とは、プラスミドベクターが放線菌の染色体ＤＮＡにインテグレートしている状態、細胞質中に遊離のプラスミド状態で含まれている状態、およびその両方が併存している状態を含む意味である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、放線菌においてタンパク質の生産量を増加させる方法およびそのためのベクターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＩＪ７０２の構造を示す模式図である。
【図２】（ａ）ｐＩＪ７０２ＰＬＤおよび（ｂ）ｐＰＬＤＨの構造を示す模式図である。
【図３】（ａ）ｐＩＪ７０２ＳＳＭＰおよび（ｂ）ｐＳＳＭＰＨの構造を示す模式図である。
【図４】（ａ）ｐＩＪ７０２ＸＹＬおよび（ｂ）ｐＸＹＬＨの構造を示す模式図である。
【図５】ｐＰＬＤＨｍｉｎｉの構造を示す模式図である。
【図６】ｓｔｉ，ｍｉｎｉ  ｓｔｉを保持するプラスミドで形質転換した放線菌のＰＬＡ２活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、タンパク質を放線菌において発現するためのプラスミドベクターを提供する（以下、単に「本発明のプラスミドベクター」とも称する）。本発明のベクターは、プロモーター、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイト、およびターミネーター、ならびにｓｔｉ含有断片を含む。以下、ベクターを構成する各要素について説明する。
【００２０】
本発明のプラスミドベクターは、ｓｔｉ含有断片を含む。ｓｔｉ含有断片は、自律複製可能な領域（以下に説明する）に対して特定方向でベクター内に含まれる。「ｓｔｉ」は、ストレプトマイセス属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１の必須複製領域部分ではない約２００ｂｐのＤＮＡセグメントとしてそもそも見出された（非特許文献１および４）。「ｓｔｉ」は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列の２７位〜２２６位までの領域からなる。ｓｔｉ含有断片は、この「ｓｔｉ」領域を含む任意の断片であり得、例えば、配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列またはその変異型を含むＤＮＡ断片である。ＤＮＡ断片の大きさは、例えば、１６０ｂｐ〜１３００ｂｐ、好ましくは、１８０ｂｐ〜１２５０ｂｐ、より好ましくは、２００ｂｐ〜１２３０ｂｐ、さらに好ましくは、２００ｂｐ〜５００ｂｐである。ｓｔｉ含有断片の「ｓｔｉ」領域以外の領域は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列に由来する。「配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列を含む断片」は、配列番号１の塩基配列の全長（配列番号１の１位〜１２２３位）を含む断片を包含する。
【００２１】
変異型は、宿主に導入されてベクターのコピー数を増大し得る限り、限定されない。宿主導入によるベクターのコピー数の増大は、例えば、以下の実施例に記載の手順に基づいて、コピー数もしくはその指標となり得る発現タンパク質の活性を調べることにより確認することができる。１つの実施形態では、このような変異型は、ベクターのコピー数を増大し得る限り、配列番号１の２７位〜２２６位、１位〜４１１位または１位〜１２２３位までの塩基配列のうち１個または複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された配列であってもよい。例えば、ｓｔｉ含有断片は、配列番号１の２７位〜２２６位までの塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡを含むＤＮＡ断片であり得る。１つの実施形態では、ｓｔｉ含有断片は、配列番号１の１位〜１２２３位までの塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡを含むＤＮＡ断片であり得る。「配列同一性」について、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした推定アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて配列の検索および配列同一性の決定を行うことができる。その際の条件、例えば、期待値、Ｗｏｒｄｓｉｚｅ、Ｇａｐなどの設定は、当該技術分野で一般的な手法で行われ得る。また、ｓｔｉ含有断片は、配列番号１の２７位〜２２６位または１位〜４１１位までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含み、かつベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡ断片であり得る。１つの実施形態では、ｓｔｉ含有断片は、配列番号１の１位〜１２２３位までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含み、かつベクターのコピー数を増大し得るＤＮＡ断片であり得る。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡ」とは、ハイブリダイゼーション目的の塩基配列中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０個、６０個または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system（Amersham Biosciences社製）を用いて、マニュアルに記載の条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩（ナトリウム）濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件が挙げられるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者で��ればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。変異の導入は、Kunkel法やGappedduplex法などの公知の手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等（タカラバイオ社製））、Quik ChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、Gene TailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）などを用いて行うことができる。
【００２２】
本発明のプラスミドベクターは、放線菌の宿主において自律複製可能な領域を含み得る。放線菌の宿主において自律複製可能な領域は、該領域を含むプラスミドを宿主に導入したときに、プラスミドが複製できる最小限の領域を含みさえすればよく、特に制限されない。自律複製可能な領域としては、例えば、ストレプトマイセス属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１またはｐＩＪ１０１に由来するプラスミドベクターに由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）および複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）が挙げられる。
【００２３】
本発明のベクターは、放線菌の菌体内でベクターの複製が可能になり、放線菌の増殖によってベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。また、放線菌の菌体内でのベクターのコピー数を増加させることができる。
【００２４】
本発明のプラスミドベクターは、プロモーター、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイト、およびターミネーターを含む。クローニングサイトは、プロモーターの下流に設けられる。ターミネーターは、クローニングサイトの下流に連結されている。下流側とは、転写されるポリヌクレオチド鎖の３’側のことであり、上流側とは、転写されるポリヌクレオチド鎖の５’側のことである。
【００２５】
プロモーターは、プロモーター活性を有していればよく、「プロモーター活性」とは、プロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性をいう。プロモーターは、所望のプロモーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーターを化学合成してもよい。
【００２６】
プロモーターは、宿主菌中で活性を発揮し得るものであればいずれの遺伝子に由来するプロモーターを用いてもよい。例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus）由来のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子のプロモーター、ストレプトマイセス・セプタタス（Streptomyces septatus）由来メタロエンドペプチダーゼ（ＳＳＭＰ）遺伝子のプロモーター、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のキシロース・イソメラーゼ（ＸｙｌＡ）遺伝子のプロモーターなどを用いることができる。ストレプトマイセス・シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus）由来のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子のプロモーター、ストレプトマイセス・セプタタス（Streptomyces septatus）由来メタロエンドペプチダーゼ（ＳＳＭＰ）遺伝子のプロモーターおよびストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）由来のキシロース・イソメラーゼ（ＸｙｌＡ）遺伝子のプロモーターの塩基配列をそれぞれ、配列番号２（１位〜１３６６位）、配列番号３（１位〜４１２位）および配列番号２１（１位〜１５５位）に示す。プロモーター活性を有する限り、プロモーターの変異体（変異型プロモーター）を使用することも可能である。このような変異型プロモーターとしては、以下の（ａ）および（ｂ）のいずれかのものを含む：
（ａ）所望のプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号２、３および２１）のうち１個または数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度、より好ましくは１個〜４個、特に好ましくは１個〜３個である）の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された変異型プロモーターＤＮＡであって、プロモーター活性を有するＤＮＡ；または
（ｂ）所望のプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号２および３）または上記（ａ）のＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ。「ストリンジェントな条件」とは、上述したとおりである。
【００２７】
本発明のプラスミドベクターは、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイトを含む。クローニングサイトは、プロモーターの下流に設けられている。このクローニングサイトは、特定の種類の制限酵素（またはその組合せ）によって、ユニークに切断されるサイトである。その特定の種類の制限酵素（またはその組合せ）で切断した箇所に、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入することができる。
【００２８】
クローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）としてもよい。ＭＣＳは、複数種類の制限酵素部位を有するＤＮＡ断片であり、発現の目的遺伝子をＭＣＳに連結してベクターに挿入するために使用される。例えば、ＭＣＳは、NdeI、EcoRI、XbaI、HindIII、BglII、BamHIなどの制限酵素部位（少なくとも１個）を有する。
【００２９】
ターミネーターは、ターミネーター活性を有していればよく、「ターミネーター活性」とは、ターミネーター領域において転写を終結させる活性をいう。ターミネーターは、ターミネーター活性を有しさえすればよく、所望のターミネーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のターミネーター領域を増幅することによりターミネーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているターミネーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のターミネーターを化学合成してもよい。
【００３０】
ターミネーターは、宿主菌中で活性を発揮し得るものであればいずれの遺伝子に由来するターミネーターを用いてもよい。例えば、ＴＨ−３  ｃｏｌｌターミネーター、ストレプトマイセス・シンナモネウス由来のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子のターミネーター、ｆｄファージのターミネーター（ｆｄ−ｔｅｒ）、Ｔ４ターミネーター（Ｔ４−ｔｅｒ）などを用いることができる。好ましくは、上記ＰＬＤターミネーターが用いられ得る。この塩基配列を配列番号４（１位〜２００位）に示す。
【００３１】
本発明においては、タンパク質をコードするＤＮＡ断片（構造遺伝子）を上記ベクターのクローニングサイトに組み込んで用いることができる。発現させるべきタンパク質をコードするＤＮＡ断片（構造遺伝子）は、本発明のプラスミドベクターにおいてプロモーターの下流に設けられたクローニングサイトに挿入される。
【００３２】
本発明において、発現させるべきタンパク質は、宿主菌で発現可能なタンパク質であれば特に制限されない。タンパク質としては、所望の酵素、構造タンパク質、調節因子などであってよく、天然のタンパク質、変異タンパク質、人工的に作り出したタンパク質などであってもよい。タンパク質をコードする遺伝子の由来は、例えば、動物由来遺伝子、植物由来遺伝子、微生物由来遺伝子、ウイルス由来遺伝子および化学合成した遺伝子から任意に選択することができ、限定されない。所望の構造遺伝子保有生物からの遺伝子のクローニングは、公知の任意の手法により行われ得る。必要に応じて制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで増幅することにより、構造遺伝子のＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、ホスホリパーゼＡ２、スフィンゴミエリナーゼ、キトビアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼなどが挙げられる。以下、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭ）およびキトビアーゼ（ＣＴＢ）について説明する。
【００３３】
ＰＬＡ２構造遺伝子は、ＰＬＡ２活性を有する任意の生物から得ることができる。ＰＬＡ２構造遺伝子を有する生物としては、ストレプトマイセス・エバメチルス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）、ベルコシスポラ・マリス（Verrucosispora maris）、ミクロモノスポラ・オーランシアカ（Micromonospora aurantiaca）、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Actinoplanes missouriensis）、アミコラトプシス・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）などが挙げられる。ＳＭ構造遺伝子は、ＳＭ活性を有する任意の生物から得ることができる。ＳＭ構造遺伝子を有する生物としては、ストレプトマイセス・シンナモネウス、ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）、キタサトスポトラ・セタエ（Kitasatospora setae）、サリニスポラ・トロピカ（Salinispora tropica）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）などが挙げられる。ＣＴＢ構造遺伝子は、ＣＴＢ活性を有する任意の生物から得ることができる。ＣＴＢ構造遺伝子を有する生物としては、ストレプトマイセス・シンナモネウス、ストレプトマイセス・エバメチルス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）などが挙げられる。
【００３４】
ストレプトマイセス・エバメチルス由来ＰＬＡ２の構造遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、そのアミノ酸配列を配列番号６に示す。ストレプトマイセス・シンナモネウス由来ＳＭの構造遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。ストレプトマイセス・コエリカラー由来ＣＴＢの構造遺伝子の塩基配列を配列番号２４に示し、そのアミノ酸配列を配列番号２５に示す。これらの酵素遺伝子の変異体（変異型遺伝子）を使用することも可能である。このような変異型遺伝子としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのものを含む：
（ａ）上記酵素のアミノ酸配列（ＰＬＡ２、ＳＭおよびＣＴＢについてそれぞれ配列番号６、８および２５）において１個または数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）上記酵素のアミノ酸配列（ＰＬＡ２、ＳＭおよびＣＴＢについてそれぞれ配列番号６、８および２５）と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらになおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、当該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）上記酵素遺伝子の塩基配列（ＰＬＡ２、ＳＭおよびＣＴＢについてそれぞれ配列番号５、７および２４）のうち１個または数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された変異型遺伝子であって当該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；または
（ｄ）上記酵素遺伝子の塩基配列（ＰＬＡ２、ＳＭおよびＣＴＢについてそれぞれ配列番号５、７および２４）または上記（ａ）から（ｃ）のいずれかの遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ、当該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。「配列同一性」および「ストリンジェントな条件」は、上述したとおりである。
【００３５】
ＰＬＡ２、ＳＭおよびＣＴＢの酵素活性は、それぞれ以下の参考例３、４および実施例１５に記載の手順に準じて測定および確認され得るが、活性の確認手段はこれらに限定されない。
【００３６】
本発明のベクターは、挿入された遺伝子がコードするタンパク質を分泌するように、予めベクター中に分泌シグナル配列をコードしていてもよい。例えば、分泌タンパク質を本発明のベクターを利用して発現させれば、このタンパク質を培養液中に分泌させることができる。天然には分泌されないタンパク質であっても、分泌シグナルを付加した融合タンパク質として発現させることで、そのタンパク質を菌体外に分泌させることができる。分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ断片は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ断片の上流に「機能的に」連結され得る。「機能的に」とは、ＤＮＡ断片が発現または機能するように、という意味であり、宿主に導入したときにそれぞれの遺伝子が発現し得る状態を意味する。
【００３７】
本発明のベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適切な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などの選択用マーカー遺伝子を含むことが好ましい。選択用マーカー遺伝子としては、チオストレプトン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられ、これらはいずれも当業者には周知である。薬剤マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合には、対応する抗生物質を含む培地で放線菌を培養することにより、放線菌の菌体内からベクターが落ちてしまうことを抑制し得る。好ましくは、チオストレプトン耐性遺伝子が用いられる。ｐＩＪ１０１に由来する汎用プラスミドベクターのｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性遺伝子を有するので、骨格プラスミドとして好適に用いられ得る。本発明のベクターは、必要に応じて他のエレメント（例えば、転写活性化配列、発現調節配列（オペレーター、エンハンサー、ＳＤ配列など）を含んでいてもよい
【００３８】
プラスミドベクターの骨格として、放線菌宿主に対して通常用いられるプラスミドを使用し得る。例えば、ｐＩＪ１０１に由来する汎用プラスミドベクターおよび他の放線菌に適した公知のプラスミドベクターが用いられ得る。例えば、ｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２、およびｐＩＪ４８７が挙げられる。ｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性遺伝子およびｐＩＪ１０１に由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）および複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）を有するので、骨格プラスミドとして好適に用いられ得る。
【００３９】
ｐＩＪ７０２（図１）を骨格プラスミドとして用いた場合の本発明のベクターの例を図２（ｂ）、図３（ｂ）および図４に示す。図１、図２（ｂ）、図３（ｂ）および図４中の各領域は以下の通りである：「ｓｔｉ」、ｓｔｉ含有断片；「ｒｅｐ  ｐＩＪ１０１」、ｐＩＪ１０１に由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）および複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）；「ＰＬＤｐ」、ストレプトマイセス・シンナモネウス由来のＰＬＤ遺伝子のプロモーター；「ＳＳＭＰｐ」、ストレプトマイセス・セプタタス由来ＳＳＭＰ遺伝子のプロモーター；「ＰＬＤｔｅｒ」、ストレプトマイセス・シンナモネウス由来のＰＬＤ遺伝子のターミネーター；「ｔｓｒ」、チオストレプトン耐性遺伝子；「ｍｅｌＣ１」および「ｍｅｌＣ２」、ストレプトマイセス・アンチビオチクス（Streptomyces antibioticus）由来チロシナーゼ遺伝子；「ＸｙｌＡｐ」、キシロース・イソメラーゼ遺伝子のプロモーター。図２（ｂ）、図３（ｂ）および図４（ｂ）に見られるように、ｓｔｉ含有断片は、「プロモーターおよびターミネーター」とｐＩＪ１０１に由来する自律複製領域との間に配置され得る。タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためのクローニングサイトは、図２（ｂ）のベクターでは、例えば、「ＰＬＤｐ」と「ＰＬＤｔｅｒ」との間の制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉの切断サイト、そして図３（ｂ）のベクターでは、例えば、「ＳＳＭＰｐ」と「ＰＬＤｔｅｒ」との間の制限酵素ＳｔｕＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉの切断サイト、図４（ｂ）のベクターでは、例えば、「ＸｙｌＡｐ」と「ＰＬＤｔｅｒ」との間の制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉの切断サイトに設けられる。
【００４０】
ベクターを構成する各要素の連結は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。結合は、適切な制限酵素、リンカー、ＤＮＡリガーゼなどを用いて行うことができる。
【００４１】
本発明において使用される宿主は、放線菌である。本明細書において、放線菌とは、放線菌目（order Actinomycetales）に属する菌をいう。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌などに生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。
【００４２】
放線菌目には、フランキア科（Frankiaceae）、ミクロモノスポラ科（Micromonosporaceae）、プロピオニバクトリウム科（Propionibacteriaceae）、シウドノカルジア科（Psuodonocardiaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomyceae）、ストレプトスポランギウム科（Streptosporanguaceae）、テルモモノスポラ科（Thermomonosporaceae）、コリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）、マイコバクテリウム科（Mycobacteriuaceae）、およびノカジア科（Nocaudiaceae）が含まれる。好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する菌である。ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Streptomyces septus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginia）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）が挙げられる。本発明においては、宿主菌体として、特にストレプトマイセス・リビダンスが好適に用いられる。
【００４３】
このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、IFOカタログ、ATCCカタログ、JCMカタログなどの種々のカタログに記載されており、例えば、微生物寄託分譲機関から分譲を受けることによって当業者であれば容易に入手可能である。
【００４４】
宿主放線菌について、突然変異を導入するように処理を行うこともできる。このような処理としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による変異株の作製が挙げられ、ＮＴＧ変異株の作製は、例えば、Mutation research/fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis (1970) vol.9, 167-182に記載の手順に準じて行われ得る。
【００４５】
宿主への発現ベクターの導入（形質転換）は、公知の方法により行うことができる。また、放線菌宿主の形質転換法としては、プロトプラスト／ＰＥＧ法が挙げられるが、これに限定されない。宿主にベクターＤＮＡが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えば、チオストレプトン耐性遺伝子）を用いて行うことができる。
【００４６】
本発明において、発現産物としての目的のタンパク質は、宿主に当該タンパク質をコードする目的遺伝子が導入された形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４７】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００４８】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、宿主菌が増殖し、目的のタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、１０℃〜４０℃、好ましくは２８℃で１２〜１２０時間行われる。ｐＨは、４から１０、好ましくは６から８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。
【００４９】
遺伝子発現が誘導されるプロモーターを用いる場合には、使用するプロモーターおよび発現させるタンパク質の性質に応じて、培養初期から誘導物質（例えば、キシロース等）を添加するか、一定程度増殖してから誘導物質を添加して発現を誘導する、または、集菌して誘導物質を含有する培地に移植して遺伝子発現を誘導する方法等を選択することができる。毒性を有するタンパク質を発現させる場合等には誘導物質無しで培養後、誘導する条件が好ましく用いられる。
【００５０】
タンパク質が宿主菌体内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。発現したタンパク質が細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製することができる。
【００５１】
本発明のプラスミドベクターを用いて放線菌宿主を形質転換することにより、放線菌宿主に導入された目的とするタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増大させ、そしてそのタンパク質の発現および生産量を増大させることができる。本発明のプラスミドベクターは、宿主放線菌において安定に保持され得る。
【００５２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
（実施例１および比較例１）
ストレプトマイセス・シンナモネウス由来ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子のプロモーター断片（配列番号２の１位〜１３６６位）およびターミネーター断片（配列番号４の１位〜２００位）を、鋳型としてストレプトマイセス・シンナモネウスから抽出したＤＮＡを用いてそれぞれ、フォワードプライマー（配列番号９）およびリバースプライマー（配列番号１０）のプライマー対、フォワードプライマー（配列番号１１）およびリバースプライマー（配列番号１２）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＬＤプロモーター断片取得のためのＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて９０秒）を３０サイクル行った。ＰＬＤターミネーター断片取得のためのＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて３０秒）を３０サイクル行った。ＰＬＤプロモーター断片をＰｓｔＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、そしてＰＬＤターミネーター断片をＥｃｏＴ２２ＩおよびＫｐｎＩで処理した。ｐＩＪ７０２（図１）をＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、この切断後のプラスミドに、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉ処理ＰＬＤプロモーター断片と、ＥｃｏＴ２２ＩおよびＫｐｎＩ処理ＰＬＤターミネーター断片とをＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＩＪ７０２ＰＬＤ（ｓｔｉなしのプラスミド：比較例１、図２（ａ））を完成した。
【００５４】
ｓｔｉ含有断片（配列番号１の１位〜１２２３位）を、鋳型としてｐＩＪ１０１を用いて、フォワードプライマー（配列番号１３）およびリバースプライマー（配列番号１４）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて６０秒）を３０サイクル行った。得られたｓｔｉ含有断片をＫｐｎＩで処理し、ｐＩＪ７０２ＰＬＤをＫｐｎＩで処理後、アルカリホスファターゼで処理し、これにＫｐｎＩ処理ｓｔｉ含有断片をＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＰＬＤＨ（ｓｔｉ保有プラスミド：実施例１、図２（ｂ））を完成した。
【００５５】
（実施例２および比較例２）
ストレプトマイセス・セプタタス由来メタロエンドプロテアーゼ（ＳＳＭＰ）遺伝子のプロモーター断片（配列番号３の１位〜４１２位）を、鋳型としてストレプトマイセス・セプタタスから抽出したＤＮＡを用いて、フォワードプライマー（配列番号１５）およびリバースプライマー（配列番号１６）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて３０秒）を３０サイクル行った。このＳＳＭＰプロモーター断片および上記ＰＬＤターミネーター断片、ならびにｐＩＪ７０２を実施例１と同様にして連結し、ｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ（ｓｔｉなしのプラスミド：比較例２、図３（ａ））を完成した。
【００５６】
上記ｓｔｉ含有断片、およびｐＩＪ７０２ＳＳＭＰを、実施例１と同様にして連結し、ｐＳＳＭＰＨ（ｓｔｉ保有プラスミド：実施例２、図３（ｂ））を完成した。
【００５７】
（実施例３および比較例３：実施例１または比較例１の放線菌用プラスミドベクターを用いたＰＬＡ２発現用ベクターの構築）
ストレプトマイセス・エバメチルス由来ＰＬＡ２遺伝子（塩基配列を配列番号５に示し、そのアミノ酸配列を配列番号６に示す）を、鋳型としてストレプトマイセス・エバメチルスから抽出したＤＮＡを用いてフォワードプライマー（配列番号１７）およびリバースプライマー（配列番号１８）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて３０秒）を３０サイクル行った。取得したＰＬＡ２遺伝子をＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、実施例１のｐＰＬＤＨをＡｏｒ５１ＨＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、これらをＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２（実施例３）を得た。
【００５８】
他方、ＰＬＡ２発現用コントロールプラスミドベクターｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２（比較例３）を、実施例１のｐＰＬＤＨを比較例１のｐＩＪ７０２ＰＬＤに代えた以外は、上記と同様にして調製した。
【００５９】
（実施例４および比較例４：実施例２または比較例２の放線菌用プラスミドベクターを用いたＰＬＡ２発現用ベクターの構築）
上記ＰＬＡ２遺伝子をＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、ｐＳＳＭＰＨをＳｔｕＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、これらをＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＳＳＭＰＨ−ＰＬＡ２（実施例４）を得た。
【００６０】
他方、ＰＬＡ２発現用コントロールプラスミドベクターｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ−ＰＬＡ２（比較例４）を、実施例２のｐＳＳＭＰＨを比較例２のｐＩＪ７０２ＳＳＭＰに代えた以外は、上記と同様にして調製した。
【００６１】
（実施例５および比較例５：実施例１または比較例１の放線菌用プラスミドベクター１を用いたスフィンゴミエリナーゼ発現用ベクターの構築）
ストレプトマイセス・シンナモネウス由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子（塩基配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す）を、鋳型としてストレプトマイセス・シンナモネウスから抽出したＤＮＡを用いてフォワードプライマー（配列番号１９）およびリバースプライマー（配列番号２０）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて６０秒）を３０サイクル行った。取得したスフィンゴミエリナーゼ遺伝子をＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、ｐＰＬＤＨをＡｏｒ５１ＨＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、これらをＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＰＬＤＨ−ＳＭ（実施例５）を得た。
【００６２】
他方、スフィンゴミエリナーゼ発現用コントロールプラスミドベクターｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＳＭ（比較例５）を、実施例１のｐＰＬＤＨを比較例１のｐＩＪ７０２ＰＬＤに代えた以外は、上記と同様にして調製した。
【００６３】
（参考例１）
実施例１または比較例１の放線菌用プラスミドベクターをベースにした酵素発現用ベクターを用いた形質転換放線菌の調製の手順および本形質転換に用いた各培地の組成を以下に示す：
ＴＳＢ培地：トリプチックソイブロス  ３％含有（ベクトン・ディッキンソン製）
発現用培地：グルコース２％、Ｋ２ＨＰＯ４０．８％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５％、イーストエキストラクト（Difco製）０．５％、ｐＨ７．０。
【００６４】
活性測定に供するまでの形質転換放線菌の調製手順は以下のとおりである：
ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株（独立行政法人 製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）：ＮＢＲＣ番号１５６７５）を各プラスミドで形質転換した。放線菌の形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manupulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manupulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。ＴＳＢプレート（チオストレプトン５０μｇ／ｍＬ含む）で得られたコロニーを６ｍＬのＴＳＢ培地に移植し、試験管培養（２８℃にて７２時間）し、５０ｍＬの発現用培地に試験管培養液を０．４％植菌し、バッフルフラスコ培養（２８℃にて４８時間）した。その後、１ｍＬの培養液を分取し、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により上清を回収し、この上清を活性測定に供する。
【００６５】
（参考例２）
実施例２または比較例２の放線菌用プラスミドベクターをベースにした酵素発現用ベクターを用いた形質転換放線菌の調製の手順を以下に示す。なお、本形質転換に用いた各培地の組成は参考例１と同様である。
【００６６】
活性測定に供するまでの形質転換放線菌の調製手順は以下のとおりである：
ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株を参考例１と同様にして各プラスミドで形質転換し、ＴＳＢプレート（チオストレプトン５０μｇ／ｍＬ含む）で得られたコロニーを６ｍＬのＴＳＢ培地に移植し、試験管培養（２８℃にて７２時間）し、５０ｍＬの発現用培地に試験管培養液を３％植菌し、バッフルフラスコ培養（２８℃にて１２０時間）した。１ｍＬの培養液を分取し、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により上清を回収し、この上清を活性測定に供する。
【００６７】
（参考例３：ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性測定）
レシチン１．０ｇを正確に量り、４％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）溶液５０ｍＬに攪拌しながら、徐々に加えて溶かし、基質溶液とする。試験管に基質溶液０．５ｍＬ、０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）０．２５ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液０．０５ｍＬを正確に入れ、３７±０．５℃で約５分間予熱する。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、試料液０．１ｍＬを正確に加えてよく混ぜた後、この液０．０３ｍＬを別の試験管に正確に量り、発色試液３ｍＬを正確に加えてよく混ぜ、覆いをして、３７±０．１℃で１０分間放置する。この液について、水を対照として６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。その酵素活性の単位は、操作法の条件で試験をするとき、１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。
【００６８】
（参考例４：スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭ）活性測定）
０．５ｍＬの１０ｍＭｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（Sigma製）に、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．２％牛血清アルブミンおよび０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる溶液を０．４ｍＬ加え、３５℃で５分間インキュベートした。次いで、酵素溶液を０．１ｍＬ加え、３５℃で３０分間インキュベート後、５％トリクロロ酢酸を０．１ｍＬ加えることにより上記酵素を失活させた。さらに、１ｍＬの０．０８Ｎ水酸化ナトリウムを加えて遊離したｐ−ニトロフェノールを発色させ、波長４００ｎｍの吸光度を測定した。スフィンゴミエリナーゼについては、上記条件において１時間に１ｎｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットとした。
【００６９】
（実施例６および比較例６）
実施例３のｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２または比較例３のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２を用いて、参考例１に記載の手順に従ってストレプトマイセス・リビダンスを形質転換して、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株（実施例６）またはｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換株（比較例６）を作出し、各形質転換株について参考例３に記載の手順に従ってＰＬＡ２活性を測定した。
【００７０】
ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株（実施例６）およびｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換株（比較例６）の平均活性はそれぞれ３２１２ユニット／ｍＬおよび２１９０ユニット／ｍＬ（ｎ＝４）であり、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２株に対する活性比は１．５であった。
【００７１】
（実施例７および比較例７）
実施例４のｐＳＳＭＰＨ−ＰＬＡ２または比較例４のｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ−ＰＬＡ２を用いて、参考例２に記載の手順に従ってストレプトマイセス・リビダンスを形質転換して、ｐＳＳＭＰＨ−ＰＬＡ２形質転換株（実施例７）またはｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ−ＰＬＡ２形質転換株（比較例７）を作出し、各形質転換株について参考例３に記載の手順に従ってＰＬＡ２活性を測定した。
【００７２】
ｐＳＳＭＰＨ−ＰＬＡ２形質転換株（実施例７）およびｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ−ＰＬＡ２形質転換株（比較例７）の平均活性はそれぞれ５１６７ユニット／ｍＬおよび４３５２ユニット／ｍＬ（ｎ＝６）であり、ｐＳＳＭＰＨ−ＰＬＡ２形質転換株のｐＩＪ７０２ＳＳＭＰ−ＰＬＡ２形質転換株に対する活性比は１．２であった。
【００７３】
（実施例８および比較例８）
実施例５のｐＰＬＤＨ−ＳＭまたは比較例５のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＳＭを用いて、参考例１に記載の手順に従ってストレプトマイセス・リビダンスを形質転換して、ｐＰＬＤＨ−ＳＭ形質転換株（実施例８）またはｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＳＭ形質転換株（比較例８）を作出し、各形質転換株について参考例４に記載の手順に従ってＳＭ活性を測定した。
【００７４】
ｐＰＬＤＨ−ＳＭ形質転換株（実施例８）およびｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＳＭ形質転換株（比較例８）の平均活性はそれぞれ３２０３ユニット／ｍＬおよび２４６２ユニット／ｍＬ（ｎ＝８）であり、ｐＰＬＤＨ−ＳＭ形質転換株のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＳＭ形質転換株に対する活性比は１．２であった。
【００７５】
（実施例９）
実施例６のｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株および比較例６のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換株について発現されたプラスミドのＤＮＡ量をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計を用いて測定したところ、それぞれ１５４．０ｎｇ／μＬおよび１０４．９ｎｇ／μＬ（平均：ｎ＝４）であった。ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２とｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２とのプラスミドのＤＮＡサイズ比は１．１６：１であるので、このＤＮＡサイズ比と上記ＤＮＡ量とに基づいてそれぞれのコピー数を算出したところ、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換株に対するコピー数比は１．２７であった。
【００７６】
（実施例１０）
実施例３のｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２または比較例３のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２を参考例１に記載の手順に従ってｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換放線菌株またはｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換放線菌株を作出し、各形質転換放線菌株を含むバッフルフラスコ培養の培養液１ｍＬに対し５０％グリセロールを２５０μＬ添加し、−８０℃にてグリセロールストックとして各２本保存した。
【００７７】
５０ｍＬ  参考例１の発現用培地（５００ｍＬ整流フラスコ）に、試験菌株（ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換株またはｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２）のグリセロールストックを０．２ｍＬ植菌し、２８℃にて７２時間、振とう培養した後、培養液のＰＬＡ２活性を参考例３に記載の手順に従って測定した（１継代目）。
【００７８】
次いで、５０ｍＬ  参考例１の発現用培地（５００ｍＬバッフルフラスコ）に、上記７２時間培養後の培養液を０．１５ｍＬ植菌し、２８℃にて２４時間、振とう培養した後、培養液のＰＬＡ２活性を上記と同様に測定した（２継代目）。
【００７９】
さらに、５０ｍＬ  参考例１の発現用培地（５００ｍＬバッフルフラスコ）に、上記２４時間培養後の培養液を１．５ｍＬ植菌し、２８℃にて４８時間、振とう培養した後、培養液のＰＬＡ２活性を上記と同様に測定した（３継代目）。この結果を以下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
表１から分かるように、実施例３のプラスミドおよび比較例３のプラスミドのどちらの場合においても、ＰＬＡ２活性は３継代にわたって低下しなかった。本実施例におけるｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換放線菌株の３代目菌株のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換放線菌株の３代目菌株に対するＰＬＡ２活性比は、実施例６の比較例６に対するＰＬＡ２活性比と同様、１．５であった。よって、実施例３のｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２は、宿主放線菌に安定に保持されていることが確認された。
【００８２】
（実施例１１）
ストレプトマイセス・リビダンス1326株について、Mutation research/fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis (1970) vol.9, 167-182に記載の手順に準じて、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による変異株（「ＮＴＧ変異株」）を作出した。このＮＴＧ変異株を宿主に、実施例３のｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２または比較例３のｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２を用いて、参考例１に記載の手順に従って形質転換して、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換ＮＴＧ変異株またはｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換ＮＴＧ変異株を作出し、各形質転換株について参考例３に記載の手順に従ってＰＬＡ２活性を測定した。この結果、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２形質転換ＮＴＧ変異株では、ｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２形質転換ＮＴＧ変異株に比べて約２倍程度高いＰＬＡ２活性が観察された。
【００８３】
（実施例１２ｐＸＹＬＨの構築）
キシロース・イソメラーゼ（ＸｙｌＡ）遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡは、ストレプトマイセス・コエリカラーの全ＤＮＡを用いて、フォワードプライマー（配列番号２２）およびリバースプライマー（配列番号２３）を用い、ＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて３０秒）を３０サイクル行った。増幅されたＸｙｌＡプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰｓｔＩとＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、ＰＬＤターミネーター断片をＥｃｏＴ２２ＩおよびＫｐｎＩで処理した。ｐＩＪ７０２（図１）をＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、この切断後のプラスミドに、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉ処理ＸｙｌＡプロモーター断片と、ＥｃｏＴ２２ＩおよびＫｐｎＩ処理ＰＬＤターミネーター断片とをＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＩＪ７０２ＸＹＬ（図４（ａ））を完成した。
【００８４】
ｓｔｉ含有断片（配列番号１の１位〜１２２３位）を、鋳型としてｐＩＪ１０１を用いて、フォワードプライマー（配列番号１３）およびリバースプライマー（配列番号１４）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて６０秒）を３０サイクル行った。得られたｓｔｉ含有断片をＫｐｎＩで処理し、ｐＩＪ７０２ＸＹＬをＫｐｎＩで処理後、アルカリホスファターゼで処理し、これにＫｐｎＩ処理ｓｔｉ含有断片をＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＸＹＬＨ（ｓｔｉ保有プラスミド：実施例１、図４（ｂ））を完成した。
【００８５】
（実施例１３：酵素活性測定用ベクターの構築）
キトビアーゼ（Ｃｈｉｔｏｂｉａｓｅ、ＣＴＢ）遺伝子を含むＤＮＡは、ストレプトマイセス・コエリカラーの全ＤＮＡを用いて、フォワードプライマー（配列番号２６）およびリバースプライマー（配列番号２７）を用い、ＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて１２０秒）を３０サイクル行った。ＣＴＢ遺伝子をＥｃｏｔ２２Ｉで処理し、断片１を得た。ｐＩＪ７０２ＸＹＬとｐＸＹＬＨを、それぞれ、Ａｏｒ５１ＨとＥｃｏＴ２２Ｉで処理し、断片２と断片３を得た。
【００８６】
断片１と２、および断片１と３をＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅで結合し、ｐＩＪ７０２ＸＹＬ−ＣＴＢおよびｐＸＹＬＨ−ＣＴＢを得た。
【００８７】
（実施例１４：培養方法）
ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株を各プラスミドで形質転換した。形質転換は参考例１と同様にして行った。得られたコロニーをＴＳＢプレート（チオストレプトン５０μｇ／ｍｌ含む）に移植し、プレートから、６ｍｌのＴＳＢ培地に移植し、２８℃で７２時間試験管培養した。試験管培養液０．２ｍｌを５０ｍｌの発現用培地（表２）に移植し、バッフルフラスコで２８℃、１２０時間培養した。１ｍｌの培養液を分取し、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により上清を回収し、活性測定に用いた。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
（実施例１５：キトビアーゼ活性測定）
＜キトビアーゼ活性測定法＞
０．７５ｍｌの０．５ｍＭ p-ニトロフェニル N-アセチル-β-D-グルコサミニド（Sigma製）に、２０ｍＭ リン酸二水素カリウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、酵素溶液を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間インキュベート後、０．５Ｍ 炭酸ナトリウムを１．４ｍｌ加えることにより上記酵素を失活させた。さらに、遊離したp-ニトロフェノールを定量するため、波長４００ｎｍの吸光度を測定した。本キトビアーゼについては、上記条件において1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量を1ユニットとした。表３に測定結果を示す。表中のキトビアーゼ活性の平均値を比較すると、ｓｔｉ領域を含むプラスミドｐＸＹＬＨを用いた場合、ｓｔｉ領域を含まないｐＩＪ７０２ＸＹＬ−ＣＴＢに比べ、平均１／平均２＝１．９６倍と約２倍に活性が上昇していた。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
（実施例１６：ｍｉｎｉ  ｓｔｉの増幅とｐＰＬＤＨｍｉｎｉの構築）
ｍｉｎｉ  ｓｔｉ含有断片（配列番号１の１位〜４１１位）を、鋳型としてｐＩＪ１０１を用いて、フォワードプライマー（配列番号２８：TTTTGGTACCAGTCATCCTGACCGACTGTG）およびリバースプライマー（配列番号２９：TTTTGGTACCGCGGCAGCAGGTGCTCCCCA）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応条件は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて１０秒，５５℃にて１０秒，６８℃にて６０秒）を３０サイクル行った。得られたｍｉｎｉ  ｓｔｉ含有断片をＫｐｎＩで処理し、ｐＩＪ７０２ＰＬＤをＫｐｎＩで処理後、アルカリホスファターゼで処理し、これにＫｐｎＩ処理ｍｉｎｉ  ｓｔｉ含有断片をＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＰＬＤＨｍｉｎｉ（ｍｉｎｉ  ｓｔｉ保有プラスミド：図５）を完成した。
【００９２】
（実施例１７：酵素活性測定用ベクターの構築）
ＰＬＡ２遺伝子を段落００５７と同様にしてＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＤＮＡ断片と、ｐＰＬＤＨｍｉｎｉをＡｏｒ５１ＨＩとＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＤＮＡ断片とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅで結合することにより、ｐＰＬＤＨｍｉｎｉ−ＰＬＡ２を構築した。同様に、ＰＬＡ２遺伝子を段落００５７と同様にしてＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＤＮＡ断片と、ｐＰＬＤＨをＡｏｒ５１ＨＩとＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＤＮＡ断片とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅで結合することにより、ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２（ｓｔｉ）を構築した。
【００９３】
（実施例１７：ｍｉｎｉ  ｓｔｉ含有プラスミド保持放線菌の酵素活性測定）
１３２６株のプロトプラストを、プラスミドｐＩＪ７０２ＰＬＤ−ＰＬＡ２（コントロール），ｐＰＬＤＨ−ＰＬＡ２（ｓｔｉ）およびｐＰＬＤＨｍｉｎｉ−ＰＬＡ２（ｍｉｎｉ  ｓｔｉ）を用いてそれぞれ形質転換した。形質転換株を釣菌し、ＴＳＢ（ｔｓ５０）プレートに移植し培養した。増殖した菌をＰＬＤ培地７ｍｌに植菌し、培養した（各４株ずつ）。定常期に達した培養物０．２ｍｌをＰＬＤ培地５０ｍｌを含むバッフルフラスコで培養した。７２時間培養後にＰＬＡ２の活性測定を行った。その結果を表４および図６に示す。表４に示すように、ｓｔｉおよびｍｉｎｉ  ｓｔｉを挿入したプラスミドで形質転換した放線菌は、非形質転換体のコントロールに比べ約１．５倍の活性を示した。このことは、ｓｔｉまたはｍｉｎｉ  ｓｔｉを挿入することにより、プラスミドの細胞あたりのコピー数が増加し、タンパク質生産性を向上させたことを示していると考えられた。
【００９４】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明によれば、放線菌においてタンパク質の発現量を増加させることができる。したがって、本発明のプラスミドベクターを用いることにより、所望のタンパク質を大量に発現させることが可能になる。特に、放線菌は、有用な酵素の生産において非常に重要な微生物であるため、本発明の方法により、酵素などのタンパク質をより効率よく提供できるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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