(57)【要約】      （修正有）【課題】糖鎖等の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、タンパク質等の非特異吸着が少なく、かつ、物理的・化学的に安定している高分子物質を提供する。ならびに、当該高分子物質が表面に固定化された担体および糖鎖等を当該高分子物質を介して固定化した複合担体を提供する。【解決手段】疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと糖鎖等を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質や、これらモノマーと親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質が、糖鎖等の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、検出対象物質の非特異的吸着が少なく、かつ、洗浄工程において溶解しにくいなど、物理的・化学的に安定していることを見出した。当該高分子物質で被覆された担体は、バイオチップなどに利用しうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質。
【請求項２】
前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［１］で表されるモノマーである、請求項１に記載の高分子物質。
【化１】
2014102194.tif 000015
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）
【請求項３】
前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメタクリル酸ｎ−ブチルである、請求項１または２に記載の高分子物質。
【請求項４】
前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［２］で表されるモノマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の高分子物質。
【化２】
2014102194.tif 000016
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【請求項５】
前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基がｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項４に記載の高分子物質。
【請求項６】
高分子物質において、さらに、（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが共重合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の高分子物質。
【請求項７】
前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［３］で表されるモノマーである、請求項６に記載の高分子物質。
【化３】
2014102194.tif 000017
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ５は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【請求項８】
前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである、請求項７に記載の高分子物質。
【請求項９】
前記メトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である、請求項８に記載の高分子物質。
【請求項１０】
前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［４］で表されるモノマーである、請求項６に記載の高分子物質。
【化４】
2014102194.tif 000018
（式中Ｒ６は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜１００のアルキレン基を示
す。）
【請求項１１】
前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルである、請求項１０に記載の高分子物質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか1項に記載の高分子物質で表面が被覆された担体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の担体に、糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定化した担体。
【請求項１４】
前記基板がプラスチック製である、請求項１２または１３に記載の担体。
【請求項１５】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである、請求項１４に記載の担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖等の固定に用いられる高分子物質、および当該高分子物質で表面が被覆された担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルスおよびバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００４】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
【０００５】
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製するための方法が種々開発されている。また、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材の開発も行われている（特許文献１、特許文献２）。
【０００６】
特許文献１には、三官能性スペーサーを用いて、第１に官能基を糖鎖に、第２の官能基を固相担体に、第３の官能基を発色団にそれぞれ結合させて糖鎖アレイを作製する方法が開示されている。そして、実施例においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために、ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作を行うことが記載されている。しかしながら、糖鎖固定後にブロッキング操作を行うことは煩雑である。
【０００７】
一方、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が開示されており、スペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。しかしながら、この方法においては、糖鎖の基材への固定化において、固相担体にハロゲン化アセチル基の導入の必要があり、基材の材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルスおよびバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。
【０００８】
このように糖鎖を固定化するための適切な手法および基材の開発の遅れも相俟って、検出対象物質と糖鎖との相互作用の解析に有用な糖鎖が固定化された糖鎖アレイの開発も遅れているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１１５６１６号公報
【特許文献２】特開２００６−０７８４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、糖鎖もしくは糖鎖含有物質の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、タンパク質等の非特異吸着が少なく、かつ、物理的・化学的に安定している高分子物質を提供することを目的とする。また、本発明は、当該高分子物質が表面に固定化された担体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、糖鎖もしくは糖鎖含有物質を当該高分子物質を介して固定化した複合担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと糖鎖等を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質や、これらモノマーと親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合して得られる高分子物質が、糖鎖等の固定化能力に優れ、担体への密着性が高く、かつ、検出対象物質の非特異的吸着が少ないことを見出した。さらに、洗浄工程において溶解しにくいなど、物理的・化学的に安定していることを見出した。このような特質から、本発明者らは、当該高分子物質で被覆された担体が、バイオチップなどに利用する場合に優れた性能を発揮しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
【００１３】
（１）（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質。
【００１４】
（２）前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［１］で表されるモノマーである、（１）に記載の高分子物質。
【００１５】
【化１】
2014102194.tif 000002
【００１６】
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）
（３）前記疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメタクリル酸ｎ−ブチルである、（１）または（２）に記載の高分子物質。
【００１７】
（４）前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［２］で表されるモノマーである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の高分子物質。
【００１８】
【化２】
2014102194.tif 000003
【００１９】
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示す。Ｗは糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（５）前記糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基がｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、（４）に記載の高分子物質。
【００２０】
（６）高分子物質において、さらに、（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが共重合している、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の高分子物質。
【００２１】
（７）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［３］で表されるモノマーである、（６）に記載の高分子物質。
【００２２】
【化３】
2014102194.tif 000004
【００２３】
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ５は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上の整数の場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
（８）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートである、（７）に記載の高分子物質。
【００２４】
（９）前記メトキシポリエチレングリコールアクリレートまたはメトキシポリエチレングリコールメタクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である、（８）に記載の高分子物質。
【００２５】
（１０）  前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［４］で表されるモノマーである、（６）に記載の高分子物質。
【００２６】
【化４】
2014102194.tif 000005
【００２７】
（式中Ｒ６は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜１００のアルキレン基を示
す。）
（１１）前記親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルである、（１０）に記載の高分子物質。
【００２８】
（１２）（１）〜（１１）のいずれか1項に記載の高分子物質で表面が被覆された担体。
【００２９】
（１３）（１２）に記載の担体に、糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定化した担体。
【００３０】
（１４）前記基板がプラスチック製である、（１２）または（１３）に記載の担体。
【００３１】
（１５）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである、（１４）に記載の担体。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、糖鎖等の固定化能力に優れ、担体との密着性が高く、タンパク質等の非特異吸着が少なく、しかも、洗浄工程において溶解しにくい高分子物質を提供できる。また、当該高分子物質で表面が被覆された担体を提供できる。さらに当該担体に糖鎖等を固定することにより、それらが特異的に結合する物質を選択的に捕捉できる複合担体を提供することができる。特に担体を基板とした場合、ＳＮ比の高いバイオチップ用基板を提供することが
【発明を実施するための形態】
【００３３】
＜高分子物質＞
本発明の高分子物質は、（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られることを特徴とする。
【００３４】
この高分子物質においては、（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニット（以下、単に「疎水性基を有するユニット」と称する）が、疎水相互作用により高分子物質を基板に固定化させる役割を果たすとともに、高分子物質が洗浄工程において溶解しにくくする役割を果たし、（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニット（以下、単に「糖鎖等を固定化する官能基を有するユニット」と称する）が、その官能基において糖鎖または糖鎖含有物質を固定化させる役割を果たす。
【００３５】
−  疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー  −
本発明における「疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」は、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。
【００３６】
疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一つの好ましい態様は、一般式［１］で表される化合物である。
【００３７】
【化５】
2014102194.tif 000006
【００３８】
式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示す。また、Ｒ２は炭素数１〜２０のアルキル基を示す。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。
【００３９】
アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは３〜６であり、最も好ましくは４である。
【００４０】
疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの具体例としては、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、フェノキシ（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、２−エチルフェノキシ（メタ）アクリレート、２−エチルチオフェニル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、２−フェニルエチル（メタ）アクリレート、３−フェニルプロピル（メタ）アクリレート、４−フェニルブチル（メタ）アクリレート、２−２−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−３−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−４−メチルフェニルエチル（メタ）アクリレート、２−（４−プロピルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−（１−メチルエチル）フェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−メトキシフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−シクロへキシルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（２−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−クロロフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（４−ブロモフェニル）エチル（メタ）アクリレート、２−（３−フェニルフェニル）エチル（メタ）アクリレートおよび２−（４−ベンジルフェニル）エチル（メタ）アクリレート、メタクリル酸ｎ−ブチル等が挙げられるが、塗布の容易さと重合のしやすさのバランスの観点からメタクリル酸ｎ−ブチルが好ましい。
【００４１】
高分子物質に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基板に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうことを防止することができる。
【００４２】
高分子物質に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は、２０〜９９ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９５ｍｏｌ％である。組成割合が下限値を下回ると塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。一方、上限値を上回ると糖鎖等を固定化する官能基を有するユニットが減少するためにシグナルが低減したり、非特異吸着が増加するおそれが出てくる。
【００４３】
−  糖鎖等を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー  −
本発明における「糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」は、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に糖鎖等を固定化する官能基が結合した構造であることが好ましい。官能基としては、特に限定されないが、アミノ基やヒドラジド基、オキシルアミノ基など糖鎖の還元末端と反応する官能基や、糖鎖または糖鎖含有物質に付随する官能基や物質と反応する官能基が好ましい。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、マレイミド基、アジド基、スルホネート基、受容体基、ビオチンなどが挙げられる。
【００４４】
これらの中でも糖鎖の多くが還元末端を有することから、アミノ基、ヒドラジド基、オキシルアミノ基が好ましい。また、アミノ基を有する糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定化する場合は、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基が好ましく、アミノ基との反応性と保存安定性のバランスから活性エステル基が最も好ましい。
【００４５】
なお、１級アミンなどラジカル重合の阻害剤として働く官能基やイソシアネートなど加熱により反応が進行しやすい官能基については、予め保護基で保護するのが好ましい。保護基の種類は、その官能基が保護されれば特に制限はない。アミノ基、オキシルアミノ基、ヒドラジド基などの１級アミンを有する官能基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）が用いられる。中でも、脱保護のしやすさからｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）が好ましい。また、イソシアネートはピラゾールやピラゾール誘導体で保護することができる。
【００４６】
脱保護条件は保護基に応じて適宜選択してよい。例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ基）の脱保護は、トリフルオロ酢酸、塩酸、塩酸−ジオキサン溶液、塩酸−酢酸エチル溶液など強酸を作用させるとよい。脱保護のタイミングは任意であるが、より活性の高い状態で糖鎖または糖鎖含有物質と反応させる方が有利であることから、それらとの反応の直前に行うのが好ましい。
【００４７】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００４８】
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
【００４９】
本発明に使用する、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキレン基を介して結合した化合物であることが好ましい。
【００５０】
【化６】
2014102194.tif 000007
【００５１】
式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基を示す。また、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、好ましくは２〜１８の整数であり、より好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは３〜１４の整数である。繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００５２】
高分子物質に含まれる糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの組成割合は、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。組成割合が下限値を下回るとシグナルが低減するおそれがでてくる。一方、当該モノマーが上限値を上回る組成割合の高分子物質においては、糖鎖をより高密度に固定化しうるが、糖鎖と比較して巨大な分子（例えば、レクチン）を検出対象物質とする場合には、高分子物質において検出対象物質との結合に関与しない糖鎖が増加してしまう。従って、当該モノマーの組成割合を高めても、シグナルの増加に結びつかないおそれが出てくる。また、上限値を上回ると、相対的に疎水性基を有するユニットが減少するため、塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に該高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。
【００５３】
−  親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー  −
本発明の高分子物質においては、さらに（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが共重合していてもよい。この場合、（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、検出対象物質が高分子物質に非特異的に吸着することを抑制する役割を果たす。
【００５４】
本発明における「親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー」としては、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基残基に親水性基が結合した構造であることが好ましい。
【００５５】
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの一つの好ましい態様は、一般式［３］で表される化合物である。
【００５６】
【化７】
2014102194.tif 000008
【００５７】
式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ５は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。また、アルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、好ましくは２〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００５８】
具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００５９】
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの他の好ましい態様は、一般式［４］で表される化合物である。
【００６０】
【化８】
2014102194.tif 000009
【００６１】
式中Ｒ６は水素原子またはメチル基を示す。また、Ｚは炭素数１〜１００のアルキレン基を示す。アルキレン基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは２〜４であり、最も好ましくは２である。
【００６２】
親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸３−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸４−ヒドロキシブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等が挙げられるが、非特異吸着抑制の観点から（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルが好ましい。
【００６３】
高分子物質に含まれる親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの組成割合は、０〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜４０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜３０ｍｏｌ％である。組成割合が上限値を上回ると相対的に糖鎖等を固定化する官能基を有するユニットが減少するためにシグナルが低減したり、相対的に疎水性基を有するユニットが減少するため、塗布した際にムラが発生したり、アッセイ中に高分子物質が溶出してしまうおそれが出てくる。
【００６４】
本発明の高分子物質の化学構造は、上記のモノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００６５】
（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質の特に好ましい態様は、下記の化学構造を有する高分子物質である。
【００６６】
【化９】
2014102194.tif 000010
【００６７】
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数ｑおよび各ユニットの組成割合であるｘとｙは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが８０〜９５ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５〜２０ｍｏｌ％である。
【００６８】
（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質の特に好ましい態様は、下記の化学構造を有する２つの高分子物質である。
【００６９】
【化１０】
2014102194.tif 000011
【００７０】
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数であるｐおよびｑ、ならびに各ユニットの組成割合であるｘ、ｙおよびｚは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが１０〜３０ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５〜２０ｍｏｌ％であり、組成割合ｚが５０〜８５ｍｏｌ％である。
【００７１】
【化１１】
2014102194.tif 000012
【００７２】
ここで、アルキレングリコール残基の繰返し数であるｑ、ならびに各ユニットの組成割合であるｘ、ｙおよびｚは、上記の通りであるが、好ましくはｑが平均３〜１４単位であり、組成割合ｘが１０〜３０ｍｏｌ％であり、組成割合ｙが５０〜８５ｍｏｌ％であり、組成割合ｚが５〜２０ｍｏｌ％である。
【００７３】
本発明の高分子物質の分子量は、高分子物質と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００７４】
＜高分子物質の合成法＞
本発明の高分子物質の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも（ａ）疎水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および（ｂ）糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。ラジカル重合させるための混合物には、さらに（ｃ）親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含むことができる。
【００７５】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルエチルケトン、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子物質を塗布する場合は、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒が基材を変性させないため好ましい。
【００７６】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００７７】
＜高分子物質による担体表面の被覆＞
本発明の高分子物質で担体表面を被覆することにより、特定の糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。高分子物質が親水性基を有するユニットを含む場合には、該担体にタンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を付与することが可能である。
【００７８】
担体表面への高分子物質の被覆は、例えば有機溶媒に高分子物質を０．０５〜１０重量％ 濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で担体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００７９】
有機溶媒としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶媒が使用される。中でも、エタノール、メタノール、２−ブタノン、およびこれらの混合溶媒がプラスチック担体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００８０】
＜高分子物質で表面が被覆された担体＞
本発明に使用する担体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。
【００８１】
担体の形状は特に制限を受けるものではないが、バイオチップとして用いる場合、例えばスライドガラス形状の基板や、マルチウェルプレート等が好適に用いられる。
【００８２】
担体をバイオチップとして用いる場合、熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００８３】
担体表面と被覆される高分子物質との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【００８４】
本発明の担体を使用して各種の糖鎖または糖鎖含有物質を固定化することができる。固定化する糖鎖または糖鎖含有物質は、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などがある。担体表面に被覆した高分子物質における糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が、糖の還元末端と反応する官能基である場合は、還元末端を有する糖をｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できる。
【００８５】
一方、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化する官能基が、活性エステル基などアミノ基と反応する基である場合は、糖鎖または糖鎖含有物質にアミノ基が必要である。アミノ基を有する糖鎖や糖アミノ酸、糖ペプチドまたは糖タンパク質をｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中に溶解し、担体上でその溶液を室温〜１００℃、１０分〜２４時間静置することで固定できるが、アミノ基を持たない糖鎖の場合はそれを導入する必要がある。この場合、アミノ基は還元末端側に導入されていることが好ましい。
【００８６】
＜糖鎖等が固定化された担体＞
こうして得られた糖鎖または糖鎖含有物質を固定化した担体は、十分な量の糖鎖または糖鎖含有物質が化学結合で強固に固定化され、さらにタンパク質等の非特異吸着が少ないことから、該糖鎖または糖鎖含有物質と特異的に結合する物質を選択的に捕捉することができる。特に、担体が基板である場合、バイオチップとして好適に用いることができる。
【００８７】
本発明において糖鎖または糖鎖含有物質をバイオチップ用基板上に固定化する際には、糖鎖または糖鎖含有物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。点着後、静置すると、糖鎖または糖鎖含有物質が基板上の官能基と化学的に結合し、糖鎖または糖鎖含有物質が表面に固定化される。例えばアミノ基を有する糖鎖を用いた場合は、前に示した方法を適用できる。
【００８８】
糖鎖または糖鎖含有物質をバイオチップ用基板上に固定化した後は、糖鎖または糖鎖含有物質を固定化した部分以外の基板表面の官能基を不活性化処理するのが好ましい。基板の官能基が活性エステル基やアルデヒド基などの場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
【００８９】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。
【００９０】
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどが好ましく、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。
【００９１】
また、前記不活性化処理工程では、基板の官能基と結合しなかった糖鎖または糖鎖含有物質も同時に洗浄・除去することができることが多い。除去できない場合は、不活性化処理前に基板を洗浄することで除去することが好ましい。例えば基板を超純水、界面活性剤含有緩衝液等で１〜５分間浸漬し洗浄することで、除去できる。
【００９２】
このように糖鎖または糖鎖含有物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。
【実施例】
【００９３】
[ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成]
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００（ｎ＝４）、日本油脂（株）製）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬（株）製）およびクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、さらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が平均４．５単位含まれていることを確認した。
【００９４】
[高分子物質の合成例１]
メタクリル酸ｎ―ブチル（以下、「ＢＭＡ」と記載する。関東化学株式会社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載する）を２−ブタノンに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は１．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０である。そこにさらに０．０２４ｍｏｌ／Ｌになるように２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載する。和光純薬工業株式会社製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００９５】
【表１】
2014102194.tif 000013
【００９６】
[高分子物質の合成例２]
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下、「ＰＥＧＭＡ」と記載する。数平均分子量Ｍｎ＝約４７０、新中村化学株式会社製）、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰを２−ブタノンに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．８５ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２２：６８：１０である。そこにさらに０．０１７ｍｏｌ／ＬになるようにＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をヘキサンとアセトンの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００９７】
[高分子物質の合成例３]
アクリル酸ヒドロキシエチル（以下、「ＨＥＡ」と記載する。和光純薬工業株式会社製）、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰを２−ブタノンとエタノールとの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は１．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２２：６８：１０である。そこにさらに０．０２４ｍｏｌ／ＬになるようにＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をヘキサンとアセトンの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子物質を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子物質の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００９８】
[固定化基板の作製]
マイクロアレイの作製には、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板（住友ベークライト株式会社製）を使用した。そして、このプラスチックス基板を、高分子物質の合成例にて得られた高分子物質の１．０重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面に高分子物質を含む層を導入した。
【００９９】
[糖鎖の固定化]
２種類の糖鎖（ＥＬＩＣＩＴＹＬ社、ＧＭ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ（品番：ＧＬＹ０９０ＡＰ、以下、「ＧＭ３」と記載する）、Ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｔｒｉａｓｏｓｅ−ａｍｉｎｏｐｒｏｒｙｌ（品番：ＧＬＹ０３４ＡＰ、以下、「Ａ」と記載する））を溶液１で５０μＭに調製し、基板上にスポットした後に室温で１時間静置して基板に糖鎖を固定化した。
＜溶液１＞３００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）＋０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０
[活性エステルの不活性化処理]
基板を溶液２に１時間浸漬した後に純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
＜溶液２＞１００ｍＭ  ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，２５ｍＭ  Ｅｔｈａｎｏｌｅａｍｉｎｅ
【０１００】
[レクチンの検出]
フコースと特異的に結合するレクチンであるＡＡＬレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン(Ｊ−オイルミルズ社、Ｊ２０１)を、下記溶液で１０ｕｇ／ｍＬに調製した。
【０１０１】
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
基板上に溶液を展開し、室温で２時間反応した。
【０１０２】
反応後、下記溶液で洗浄後にさらに純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
【０１０３】
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア社、ＰＡ４３００１）を下記溶液で０．５μｇ／ｍＬに調製し、室温で１時間、基板上で反応させた。
【０１０４】
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、下記溶液で洗浄後にさらに純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
【０１０５】
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２
測定はマイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝５０）
表２に結果を示した。フコースを含む糖鎖“Ａ”を特異的に検出できた。
【０１０６】
【表２】
2014102194.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、高機能な糖鎖固定用の高分子物質および当該高分子物質で被覆された担体を製造することが可能になった。さらに該糖鎖固定用担体に糖鎖もしくは糖鎖含有物質を固定した複合担体を用いることによりバイオチップを簡便に製造することが可能になった。こうして製造されたバイオチップは、免疫診断システム、糖鎖マイクロアレイシステム、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。