(57)【要約】      （修正有）【課題】マルトース存在下におけるマルトース取り込みが増強された下面ビール酵母を提供する。【解決手段】ｉ）特定な配列から成る塩基配列または前記配列と高い配列同一性を有する配列を含み、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、および、ii）前記核酸分子の３’末端に接続された、特定な配列から成るアミノ酸配列または前記配列と高い配列同一性を有する配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、を含む核酸分子が導入された下面ビール酵母。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１３に記載された塩基配列を含み、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、または、
ii）配列番号１３に記載された塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸分子であって、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項２】
ａ）請求項１のi）またはii）に記載の核酸分子、および、
ｂ）ａ）記載の核酸分子の３’末端に接続された、マルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
を含む核酸分子が導入された下面ビール酵母。
【請求項３】
ａ）請求項１のi）またはii）に記載の核酸分子、および、
ｂ）ａ）記載の核酸分子の３’末端に接続された、
ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、または、
ii）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有する前記ポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、
を含む核酸分子が導入された、請求項２記載の下面ビール酵母。
【請求項４】
核酸分子が配列番号１記載の配列を含む、請求項４記載の下面ビール酵母。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項記載の下面ビール酵母による発酵工程を含むことを特徴とする、ビール飲料の製造方法。
【請求項６】
ａ）１）のi）またはii）記載の核酸分子および、
ｂ）ａ）記載の核酸分子の3'末端に接続された、
ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、または、
ii）配列番号２記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、
を含む核酸分子を酵母、特に下面ビール酵母に導入する工程を含む、
マルトース取り込みが増強された下面ビール酵母を造成する方法。
【請求項７】
ａ）請求項１のi）またはii）に記載の核酸分子、および、
ｂ）ａ）記載の核酸分子の３’末端に接続された、マルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
を含む核酸分子を下面ビール酵母に導入する工程を含む、マルトース取り込みが増強された下面ビール酵母を造成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母、特に下面ビール酵母のマルトース取り込み能を改善することに関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度醸造は、発酵設備の有効利用等で魅力的な発酵方法である。高濃度醸造であると、発酵初期の発酵液には極めて高濃度の種々の糖が存在するが、特にビール醸造ではマルトースの取り込みが発酵の律速段階であるとの報告がある（非特許文献１）。また、ビールの高濃度醸造において、初期発酵液には高濃度のグルコースが存在することが一般的であるが、高濃度のグルコースによって酵母によるマルトースの消費が抑制される傾向がある。そこで、マルトース誘導性の強いマルトース取り込み遺伝子が望まれていた。
一方、上面酵母のマルトース取り込みに関与する遺伝子の中で、非常に効率よくマルトースおよびマルトトリースを輸送するポリペプチドをコードする遺伝子としてAGT1が知られている。AGT1によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は非特許文献６に記載されている（配列番号２）。下面ビール酵母にも対応する遺伝子が存在するが、下面ビール酵母ではAGT1遺伝子のタンパク質をコードする領域にフレームシフト変異があり、コードされるポリペプチドがマルトース取り込み能を有していないことが報告されている（非特許文献２）。また、下面ビール酵母のこのような変異AGT1遺伝子を上面酵母のAGT1遺伝子の断片を用いて修復し、構成的プロモーターの制御下に置くことによって下面ビール酵母の発酵能が改善されたことが報告されている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第4560581号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kodama, Y. et al. J. Am. Soc. Brew. Chem. Vol.51, p24-29 (1995)
【非特許文献２】Vidgren, V. et al. Appl. Environ. Microbiol. Vol.71, p7846-7857 (2005)
【非特許文献３】Ogata, T. et al. J. Gen. Appl. Microbiol. Vol.39, p285-294 (1993)
【非特許文献４】Murakami, N. et al. Yeast Vol.29, p155-165 (2012)
【非特許文献５】Vidgren, V. et al. Yeast Vol.28, p579-594 (2011)
【非特許文献６】Han, E-K. et al. Molecular Microbiology Vol.17, p1093-1107 (1995)
【非特許文献７】Vidgren V. et al. Appl. Environment. Microbiol. Vol.75 p2333-2345 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はマルトース存在下におけるマルトース取り込みが増強された酵母、特に下面ビール酵母を提供する。
さらに、本発明はマルトース存在下におけるマルトース取り込みが増強された酵母、特に下面ビール酵母を造成または取得するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１）本発明の一つの特徴は、マルトース取り込みが増強された酵母を造成するために利用できる、酵母、特に下面ビール酵母で機能するマルトース誘導性プロモーターである。
一側面において本発明のこの特徴は、
ｉ）配列番号１３に記載された塩基配列を含み、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、または、
ii）配列番号１３に記載された塩基配列と高い配列同一性を有する塩基配列を含む核酸分子であって、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、
である。
高い配列同一性とは、80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性をいう。
【０００７】
２）本発明の別の特徴は、上記マルトース誘導性プロモーターの下流に酵母で機能するマルトース取り込みに関与する酵素をコードする核酸配列を接続した核酸分子が導入された下面ビール酵母である。特に、本発明のこの特徴において前記マルトース取り込みに関与する酵素はAGT1である。
本発明の一側面において、前記AGT1は、
ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
ii）配列番号２記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチド、
である。
アミノ酸配列についても、高い配列同一性とは、80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性をいう。
より具体的には、一側面において本発明のこの特徴は、
ａ）１）のi）またはii）記載の核酸分子、および
ｂ）ａ）記載の核酸分子の3'末端に接続された、
ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、または、
ii）配列番号２記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、
が導入された酵母、特に下面ビール酵母でもある。
アミノ酸配列についても、高い配列同一性とは、80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性をいう。
さらに別の側面において、本発明は、配列番号１記載の配列を含む核酸分子が導入された酵母、特に下面ビール酵母でもある。
【０００８】
３）また、本発明は１）または２）に記載の下面ビール酵母による発酵工程を含むことを特徴とする、ビール飲料の製造方法でもある。
【０００９】
４）本発明の別の特徴は、マルトース取り込みが増強された酵母、特に下面ビール酵母を造成する方法である。
具体的には、一側面において本発明のこの特徴は、上記マルトース誘導性プロモーターの下流に酵母、特に下面ビール酵母で機能するマルトース取り込みに関与する酵素をコードする核酸配列を接続した核酸分子を酵母、特に下面ビール酵母に導入する工程を含む。具体的には本発明は以下の工程を含む：
ａ）１）のi）またはii）記載の核酸分子および、
ｂ）ａ）記載の核酸分子の3'末端に接続された、
ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、または、
ii）配列番号２記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、
を含む核酸分子を常酵母、特に下面ビール酵母に導入する工程を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によりマルトース誘導性の高いAGT1遺伝子を有する酵母（例えばビール酵母）、特に下面ビール酵母を造成することができ、高濃度醸造等で発酵期間の短縮が期待される。また、マルトース誘導性の高いAGT1遺伝子を有する下面ビール酵母等は遺伝子組換え手法のみならず変異誘発およびそれに続く選抜によっても得ることができ、そのような酵母は接合法等を利用して更に他の有用な特性を有する酵母の育種に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、上面ビール酵母NCYC1006とそのAGT1遺伝子破壊株の麦汁発酵試験の結果を示す。
【図２】図２はNCYC1006とA60のAGT1遺伝子プロモーター領域のDNA塩基配列（上段：NCYC1006、下段：A60）の比較を示す。
【図３】図３はNCYC1320とA60のAGT1遺伝子プロモーター領域のDNA塩基配列（上段：NCYC1320、下段：A60）を示す。
【図４】図４は各上面ビール酵母のAGT1プロモーター領域の配列の模式図である。
【図５】図５はNCYC1006およびNCYC1320のAGT1プロモーターのマルトース誘導性の測定結果を示す。
【図６】マルトース誘導性であるNCYC1006のAGT1遺伝子を挿入した下面ビール酵母のマルトース消費速度を示す。グラフ中、実線はNCYC1006のAGT1遺伝子を挿入させた下面ビール酵母のマルトース消費速度、点線が、親株に空のベクターを挿入させた下面ビール酵母のマルトース消費速度を示す。
【図７】図７は、NCYC1320またはNCYC1006由来AGT1を導入した下面ビール酵母の2-DOG含有培地上の生育性を示す。（A）2mM 2-DOG含有2% マルトース培地上の生育。（B）2mM 2-DOG含有2% グルコース培地上の生育。  パネル（A）および（B）において、上段はW-ura3/YEp24（対照株）を培養後、10倍ずつ希釈し、1μLずつ添加した結果を示す。下段はW-ura3/YEp24-AGT1(NCYC1006)を培養後、10倍ずつ希釈し、1μLずつ添加した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、上面ビール酵母にマルトース誘導性のマルトース取り込み遺伝子AGT1が存在することを見いだしたことに基づく。酵母にマルトース誘導性が高いマルトース取り込み遺伝子AGT1を導入することにより、マルトース取り込み能力が高まり、高濃度醸造に適した酵母、特に下面ビール酵母を造成できる。
ビール酵母は大きく分けて上面ビール酵母と下面ビール酵母に分類される。上面ビール酵母は主としてサッカロミセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)に分類され、下面ビール酵母はサッカロミセス・セレビシアエとサッカロミセス・バヤナス(S. bayanus)との交雑体であってサッカロミセス・パストリアヌス(S. pastorianus)に分類される。一般に下面ビール酵母ではマルトース取り込み遺伝子AGT1にフレームシフト変異があり、コードされるポリペプチドがマルトース取り込み活性を有していない。
【００１３】
本発明では、強いマルトース誘導性を有し、かつ、下面ビール酵母で機能するプロモーター活性を有する核酸分子が利用される。そのようなプロモーター活性を有する核酸断片は酵母ゲノムを鋳型として、たとえば配列番号１１（5’-aaatcagttctagaagcctccggcaaacac-3’）および配列番号１２(5'-aaatttcagtattgaaaacctcctgttgg)をプライマーとしてPCRを行い、さらに、得られた増幅断片にlacZ等のレポーター遺伝子配列断片を接続し、マルトースの存在下および非存在下でlacZ活性を測定することによってマルトース誘導性を測定し、マルトース誘導性を示す断片を選抜することによって得ることができる。このような断片は「マルトース誘導性プロモーター」または「マルトース誘導性プロモーター活性を有する核酸分子」である。本発明のマルトース誘導性プロモーター活性を示す核酸分子は、レポーター遺伝子として発現させたlacZの活性(U)として測定すると、マルトース存在下ではマルトース非存在およびグルコース存在下におけるプロモーター活性に比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１５倍のプロモーター活性を示す。
本発明において配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸分子をマルトース誘導性プロモーター活性を有する核酸分子」として利用できるが、配列番号１３に記載の塩基配列と高い配列同一性を有する配列、例えば80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性を有する配列を含み、かつ酵母においてマルトース誘導性プロモーター活性を示す核酸分子も利用することができる。マルトース誘導性は、前述のように適切なレポーター遺伝子とプロモーターを接続して、レポーター遺伝子の発現をマルトース存在下および非存在下で測定することによって確認することができる。本発明の上面酵母由来のAGT1遺伝子プロモーター（配列番号１３）は下面ビール酵母においてもプロモーター活性を有し、かつ、強いマルトース誘導性を有する。
【００１４】
酵母で機能するマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子は、たとえば、配列番号３（5’-atcttaattttttatataaagcggtttggt-3’）および配列番号４（5’-aatcgctcacgtttagcatatagggcgtta-3’）をプライマーとし、酵母、特にサッカロミセス属酵母、例えばS.cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことによって得ることができる。増幅された核酸断片を解析すればその断片にコードされるポリペプチドのコード領域およびアミノ酸配列を得ることができる。前記核酸を適切な宿主、たとえば酵母細胞内で発現させれば酵母で機能するマルトース取り込み活性を有するポリペプチドを得ることができる。
前記ポリペプチドのマルトース取り込み活性は、前記ポリペプチドを発現させた酵母を適切な培地で培養し、培地中のマルトース濃度の経時変化を測定することにより簡便に評価することもできる。対照としては前記ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作されていない同種同株の酵母例えば同種同株の野生型酵母を利用することができる。対照と比較して統計的に有意（たとえば有意水準５％）なマルトース取り込みまたはマルトース消費が測定された場合は、前記ポリペプチドは「マルトース取り込み活性を有する」ポリペプチドとして同定することができる。
そのようなポリペプチドの例は配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明において酵母で機能するマルトース取り込み活性を有するポリペプチドには、配列番号２に記載したアミノ酸配列からなるポリペプチド（Agt1）が含まれる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有する配列、例えば80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチドも利用することができる。このようなポリペプチドをコードする核酸を酵母細胞内で発現させることによって、マルトース取り込み活性が増強された酵母が得られる。
【００１５】
配列同一性は、配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸の割合（特に百分率）を示す。配列同一性は、例えばBLASTN、FASTA等の当業者によく知られたプログラムを標準的なパラメーターと共に用いて計算することができる。配列同一性を計算するためのプログラムは国立遺伝学研究所  生命情報・DDBJ研究センター(DDBJ/CIB)（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）等の世界各国の公共的機関から標準的パラメーターと共に提供されている。そのような配列同一性の高い核酸分子は、一般には、参照される核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸分子が含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言う。ストリンジェントな条件の例には、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄条件が50℃、２ｘSSC、0.1％ SDS、好ましくは１ｘSSC、0.1％ SDS、より好ましくは0.1ｘSSC、0.1％ SDSという条件が含まれる。このような条件は当業者によく知られたものであり、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York等にも記載されている。
【００１６】
上述したマルトース誘導性プロモーターの下流に酵母で機能するマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする核酸断片を接続した核酸を含む核酸分子を酵母、たとえば下面ビール酵母に導入することにより、マルトース存在下におけるマルトース取り込みが増強された酵母が得られる。酵母に導入される前記核酸分子には、たとえば、
ｉ）配列番号１３に記載された塩基配列を含み、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、または、
ii）配列番号１３に記載された塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸分子であって、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を有する核酸分子、
の３’末端に接続された、
ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、を含む核酸分子、または、
ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、酵母においてマルトース取り込み活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸分子、
を含む核酸分子が含まれる。
そのような核酸分子は、たとえば配列番号１記載の配列を含む。
上述の核酸分子で酵母を形質転換することによりマルトース取り込みが増強された酵母、特に下面ビール酵母が得られる。また、上面ビール酵母は上述のように一般にAGT1は機能しているが、マルトース誘導性のマルトース取り込みを示さないあるいはマルトース取り込み活性が低い上面ビール酵母を上述した核酸分子で形質転換することにより、マルトース存在下でマルトース取り込みが増強された上面ビール酵母を得ることもできる。
さらに、マルトース取り込みに関与するポリペプチド、たとえば配列番号２記載のアミノ酸配列または前記配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域を、配列番号１３または前記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含み、酵母においてマルトース誘導性のプロモーター活性を示す配列に置き換えることによっても、上面ビール酵母のマルトース存在下におけるマルトース取り込みを増強することができる。
【００１７】
酵母の形質転換は当業者によく知られたいずれの方法で行ってもよく、それらには酢酸リチウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが含まれる。得られた形質転換体は適切な培地、たとえばSMal培地(2% マルトース、 0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)中で培養し、さらに、初発酵母濃度2×107細胞/mlとなるように、5%マルトース含有合成培地(5% マルトース, 0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)に植菌し、25℃で培養し、培地中のマルトース濃度を経時的に測定することができる。マルトース濃度の測定は、市販の適切なカラムを用いて液体クロマトグラフィー等でおこなうことができる。AGT1遺伝子（プロモータ領域を含む）の改変を受けていない同種および同株酵母（たとえば非形質転換体または野性株）を対照としてマルトース消費速度を比較し、対照に比べて形質転換体のマルトース消費速度が増大していることを確認することができる。
本発明の酵母はマルトース消費速度が増大している。本発明の酵母をマルトース存在下で培養した場合、培養液中のマルトース濃度は、たとえば、AGT1遺伝子（プロモータ領域を含む）の改変を受けていない同種同株の酵母を同条件で培養した場合の培養液中のマルトース濃度に対して、培養２４時間の時点において７５％以下、培養４８時間の時点において６０％以下、好ましくは５０％以下である。
このようにマルトース消費速度が増大した本発明の下面ビール酵母を用いて、通常の発酵工程にしたがってビール飲料を製造することができる。本明細書において、ビール飲料とは発酵工程を経て製造される飲料を広く意味する。したがって、本発明との関連において、ビール飲料はアルコール飲料であってもよく、アルコール含量が１容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよく、さらにアルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。ビール飲料の例には、ビール、発泡酒、ビール又は発泡酒をアルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類が含まれる。
【００１８】
以下の実施例は本発明の理解を助けるための例示であって、いかなる意味においても本発明を限定するものと解すべきではない。
【実施例１】
【００１９】
マルトース誘導性の高いマルトース取り込み遺伝子の取得
１）マルトース取り込み遺伝子AGT1を破壊した上面ビール酵母の造成
上面ビール酵母のAGT1遺伝子破壊カセットは、以下のように作製した。なお、上面ビール酵母には、二つ以上のAGT1遺伝子が存在すると考えられたので、AGT1遺伝子破壊カセットを二つ作製した。
AGT1遺伝子のプロモーター領域を含むDNA塩基配列として配列番号１に記載の配列に基づいてプライマーを設計した。配列番号１によってコードされるAgt1のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
プライマー S contig38_4322 (5’-atcttaattttttatataaagcggtttggt-3’)（配列番号３）とプライマー S contig38_6017R (5’-aatcgctcacgtttagcatatagggcgtta-3’)（配列番号４）を用いて、上面ビール酵母NCYC1006及びNCYC1320のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、プラスミドpCR2.1 (Life Technologies)に、いわゆるTAクローニングをおこなった。クローニングしたAGT1遺伝子内にある制限酵素Hinc II部位（塩基番号１の塩基配列中の塩基番号2331)に、ADH1プロモーターに抗生物質G-418耐性遺伝子接続させたDNA断片（配列番号５）を挿入し、AGT1遺伝子破壊カセット(agt1ΔG-418r)とした。配列番号５によってコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示した。ADH1プロモーターに抗生物質G-418耐性遺伝子接続させたDNA断片は、J. Gen. Appl. Microbiol. Vol.39, p285-294 (1993)に記載された方法に従って作製した。
【００２０】
もう一つのAGT1遺伝子破壊カセットは以下のように作製した。プライマーS contig38_2687 (5’-aaatcagttctagaagcctccggcaaacac-3’)（配列番号７ とプライマーS contig38_6527R (5’-atcaatatccaggcacaagtaccaggtgct-3’)（配列番号８）を用いて、上面ビール酵母NCYC1006及びNCYC1320のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、プラスミドpCR2.1(Life Technologies)に、いわゆるTAクローニングをおこなった。クローニングしたAGT1遺伝子内にある二つの制限酵素Hinc II部位（配列番号１の塩基配列中の塩基番号1632と2331)間に、TDH3プロモーターに抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子接続させたDNA断片（配列番号９）を挿入し、AGT1遺伝子破壊カセット(agt1Δhygro)とした。TDH3プロモーターに抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子接続させたDNA断片は、Yeast Vol. 29, p155-165 (2012)の記載に従って作製した。配列番号９によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に記載した。
AGT1遺伝子破壊カセット(agt1ΔG-418r,, agt1Δhygro)を用いて、上面ビール酵母NCYC1006及びNCYC1320のAGT1遺伝子破壊株を作製し、麦汁の発酵試験をおこなった。麦汁の発酵試験は、エキス12度の麦汁を用い、初発酵母の濃度2×107 細胞/ml、12℃でおこない、外観エキスは、密度比重計DA-510（京都電子工業）を用いて測定した。NCYC1006のAGT1遺伝子破壊株(NCYC1006Δagt1)は、親株NCYC1006に比べて外観エキスで比較した麦汁エキスの消費速度が低下していた（図１）。一方、NCYC1320のAGT1遺伝子破壊株(NCYC1320Δagt1)では、親株NCYC1320に比べて、外観エキスで比較した麦汁エキスの消費速度には変化がなかった。
【００２１】
２）マルトース誘導性が強いAGT1遺伝子プロモーターのDNA塩基配列の決定
上面ビール酵母NCYC1006のAGT1遺伝子破壊株(NCYC1006Δagt1)は、親株NCYC1006に比べて、外観エキスで比較した麦汁エキスの消費速度が低下していたことから（図１）、上面ビール酵母NCYC1006のAGT1遺伝子は、マルトースで強い遺伝子転写が誘導される可能性が考えられた。そこで、NCYC1006のAGT1遺伝子の遺伝子転写に関連するプロモーター領域のDNA塩基配列を決定した。プライマーS contig38_2687 (5’-aaatcagttctagaagcctccggcaaacac-3’)（配列番号１１）とプライマーS contig38_4558R (5’-aaattttcagtattgaaaacctcctgttgg-3’)（配列番号１２）を用いて、上面ビール酵母NCYC1006及びNCYC1320のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、プラスミドpCR2.1 (Life Technologies)に、いわゆるTAクローニングをおこなった。クローニングしたAGT1遺伝子のプロモーターの塩基配列を常法に従って決定した。上面ビール酵母NCYC1006のAGT1遺伝子プロモーター領域の配列（配列番号１３）はこれまでに報告のない配列であった。図２は、これまでの報告のあった上面ビール酵母A75 060株（本明細書においてはA60株と略記する）（Vidgren, V. et al. Yeast Vol.28, p579-594 (2011)）のプロモーター領域配列（NCBIデータベース、アクセッション番号GI 194 740 078）との比較を示している。NCYC1006では、これまで報告のあったA60株のプロモーター領域の配列（配列番号１５）に比べて、プロモーター領域の配列での繰り返し配列の数が多かった。例えば、NCYC1006では、10bpの繰り返しが10回あったのに対し、A60株では、9回であり、NCYC1320では、6回であった（図２、図３で破線の括弧書きで示した）。また、94bpの繰り返しが、NCYC1006では４回あったのに対し、A60株及びNCYC1006では２回であった。なお、NCYC1320とこれまでの報告にあったA60株のAGT1プロモーター配列の比較を図３に示した。NCYC1320の配列（配列番号１４）はA60株の配列とよく類似していた。これらのプロモーター領域の塩基配列の差異を図４に模式的に示した。
【００２２】
３）AGT1遺伝子プロモーターのマルトース誘導性の測定
NCYC1006のAGT1プロモーターを、レポーター遺伝子であるlacZ遺伝子（大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）に接続させた。lacZ遺伝子を有する酵母用プラスミドは、pBY546を用いた。このプラスミドpBY546は、酵母用プラスミドであるYCp50の制限酵素BamHI部位にlacZ遺伝子を挿入させたものである。このlacZ遺伝子には翻訳開始コドンであるATGが付加されていないので、挿入するプロモーターの配列にはlacZ遺伝子と翻訳のコドン枠が合うようにする必要がある。プライマーpBY546_PAGT1(5’-cccgtcctgtggatccagttctagaagcctccggcaaca-3’)とプライマーpBY546R_PAGT1R(5’-aaaacgacgggatcCATattataatattttttttagttgt-3’)を用いて、上面ビール酵母NCYC1006及びNCYC1320のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、制限酵素BamHIで処理したプラスミドpBY546に導入した。この導入には、In-Fusion HD Cloning Kit （タカラバイオ）を用いた。プライマーpBY546_PAGT1の5’側16bは、プラスミドpBY546 BamHI上流16bの配列に由来している。下線の配列はBamHI部位である。プライマー pBY546_PAGT1の3’側23bはAGT1プロモーター上流配列由来である。プライマー pBY546R_PAGT1Rの5’側15bはプラスミドpBY546 BamHI下流15bの相補配列に由来しており、下線の配列はBamHI部位である。プライマーpBY546R_PAGT1Rの3’側23bは、AGT1プロモーターの翻訳開始点周辺の相補配列由来であり、大文字で示した配列CATはlacZ遺伝子の翻訳開始となるコドンの相補配列となるように設計した（プライマーpBY546R_PAGT1Rは相補配列である）。このようにして作製したプラスミド、上面ビール酵母NCYC1006のAGT1プロモーターが挿入されたプラスミドは、pBY546-PAGT1(NCYC1006)、上面ビール酵母NCYC1320のAGT1プロモーターが挿入されたプラスミドはpBY546-PAGT1(NCYC1320)と命名した。それぞれのプラスミドを、下面ビール酵母のura3変異株（ウラシル要求性株）RAK6174に導入した。下面ビール酵母のura3変異株（ウラシル要求性株）RAK6174は、Yeast Vol.29 p155-165 (2012)に記載されている。
NCYC1006のAGT1プロモーターをレポーター遺伝子であるlacZ遺伝子に接続させたプラスミドpBY546-PAGT1(NCYC1006)が導入された下面ビール酵母RAK6174/pBY546-PAGT1(NCYC1006)では、マルトースを炭素源とする培地に移すとそのlacZ活性は大きく上昇することがわかった（図５、表１中 NCYC1006）。
【００２３】
表１．NCYC1006およびNCYC1320のAGT1プロモーターのマルトース誘導性の測定
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【００２４】
一方、NCYC1320のAGT1プロモーターをレポーター遺伝子であるlacZ遺伝子に接続させたプラスミドpBY546-PAGT1(NCYC1320)が導入された下面ビール酵母RAK6174/pBY546-PAGT1(NCYC1320)では、マルトースを炭素源とする培地に移すと、そのlacZ活性は上昇するものの、その程度はNCYC1006のAGT1プロモーターを接続させたプラスミドpBY546-PAGT1(NCYC1006)が導入された場合と比較すると小さいものであった（図５ NCYC1320）。
酵母のlacZ活性は次のように測定した。RAK6174/pBY546-PAGT1(NCYC1006)及びRAK6174/ pBY546-PAGT1(NCYC1320)を、SD培地(2% グルコース、0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)で培養し、活性を測定する次の培地の培養液量の1%を植菌した。活性を測定する培地は、マルトースを炭素源とするSMal培地(2% マルトース、0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)あるいは、グルコースを炭素源とするSD培地とした。lacZ活性測定は、酵母遺伝子実験マニュアル（丸善）の131ページに記載されている、「浸透性細胞によるアッセイ」に従って実施した。
lacZ活性を測定したこの実験より、上面ビール酵母NCYC1006のAGT1プロモーターは極めて強いマルトース誘導性があること、および、前記プロモーターが下面ビール酵母においても強いマルトース誘導性を有するプロモーターとして機能することが明らかにされた。
【実施例２】
【００２５】
マルトース誘導性が強いAGT1遺伝子を導入した下面ビール酵母の造成
lacZ活性を測定した実験より、NCYC1006のAGT1遺伝子が強いマルトース誘導性を有することが明らかになったので、NCYC1006のAGT1遺伝子の下面ビール酵母への導入を行った。プライマーYEp24_AGT1(5’-cccgtcctgtggatccaaatcagttctagaagcctccggca-3’)とプライマーYEp24R_AGT1R(5’-tccggcgtagaggatccatttaattctcgctgttTTAtgctt-3’)を用いて、上面ビール酵母NCYC1006のゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、制限酵素BamHIで処理したプラスミドYEp24に導入した。この導入には、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いた。プライマー YEp24_AGT1の5’側16bは、プラスミドYEp24 BamHI部位上流16bの配列に由来しており、下線の配列ggatccは、BamHI部位である。プライマーYEp24_AGT1の3’側25bは、AGT1プロモーター上流配列由来である。プライマーYEp24R_AGT1Rの5’側17bは、プラスミドYEp24 BamHI下流17bの相補配列に由来しており、下線の配列ggatccは、BamHI部位である。プライマーYEp24R_AGT1Rの3’側25bは、AGT1遺伝子の翻訳終止点周辺の相補配列由来であり、大文字で示した配列TTAは、AGT1遺伝子の翻訳終止となるコドンの相補配列である（プライマーYEp24R_AGT1Rは、相補配列である）。このようにして作製したプラスミド、上面ビール酵母NCYC1006のAGT1遺伝子が挿入されたプラスミドは、YEp246-AGT1(NCYC1006)と、対照であるプラスミドYEp24の、それぞれのプラスミドを、下面ビール酵母のura3変異株（ウラシル要求性株）RAK6174に導入した。得られた形質転換酵母を、それぞれ、RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)、RAK6174/YEp24と命名した。
形質転換酵母RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)、RAK6174/YEp24を、SMal培地(2% マルトース、0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)で培養させ、初発酵母濃度2×107細胞/mlとなるように、5%マルトース含有合成培地(5% マルトース, 0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)に植菌し、25℃で培養し、培地中のマルトース濃度を経時的に測定した。マルトース濃度の測定は、島津製作所液体クロマトグラフィーLC-20Aのシステムでおこなった。カラムは、アミネックスHPX-42A （バイオラッド）、検出器は示差屈折計 RID-10A（島津製作所）、移動層は蒸留水、流速は、0.5 ml/分で行った。
NCYC1006のAGT1遺伝子が導入された下面ビール酵母RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)は、対照であるRAK6174/YEp24に比べて、5%マルトース含有合成培地(5% マルトース, 0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)でのマルトース消費速度が上昇していることがわかった（図５）。
【実施例３】
【００２６】
マルトース消費速度が上昇した酵母の2-デオキシ-D-グルコース(2-DOG)に対する耐性
マルトース消費速度が上昇した酵母株RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)及び、対照株であるRAK6174/YEp24を、SMal培地 (2% マルトース、0.67% yeast nitrogenbase w/oアミノ酸)で培養し、細胞懸濁液の１０倍希釈列を調製し、グルコースまたはマルトースを炭素源とする、合成寒天培地（2% グルコースまたは2% マルトース, 0.67％ yeast nitrogenbase w/oアミノ酸, 2% 寒天）にそれぞれスポットした。スポットした寒天培地を25℃にて72時間インキュベートし、RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)および対照株RAK6174/YEp24の生育を調べた。
マルトース存在下の合成寒天培地で酵母株RAK6174/YEp24-AGT1(NCYC1006)は対照に比較して2-DOGに対する耐性が上昇するが、グルコース存在下では2-DOG耐性はほとんど上昇しないことが明らかになった（図７）。
したがって、酵母を突然変異処理し、マルトース存在下における2-DOG耐性の上昇およびグルコース存在下における2-DOG耐性上昇の欠如を指標としてマルトース消費速度が上昇した酵母の候補株を選抜し、さらに上述したような方法でマルトース消費速度を測定することにより、直接的な遺伝子操作技術を用いることなく、マルトース消費速度が上昇した酵母を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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【図７】
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【配列表】
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