(57)【要約】      （修正有）【課題】キシロース消費能力及び発酵能力の高いキシロース資化能を有する酵母の提供。【解決手段】ヤマトシロアリの腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）の特定の配列で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、それぞれ表される第１〜第６のモチーフをＮ末端側に近い側からのこの順序で有し、かつ前記第６のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン（Ｎ）に変えて他のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、以下の第１〜第６のモチーフをＮ末端側に近い側からのこの順序で有し、かつ前記第６のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン（Ｎ）に変えて他のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。
第１のモチーフ：FXXXXKXXXXXXXXHDXD（配列番号２）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第２のモチーフ：XXXXXXXWGGREGYXXLXNT（配列番号３）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第３のモチーフ：XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号４）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第４のモチーフ：LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH（配列番号５）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第５のモチーフ：XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP（配列番号６）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第６のモチーフ：GGXＮFDXKXRR（配列番号７）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
【請求項２】
前記第１のモチーフは、FXXXXKXGXXXXXFHDXD（配列番号８）で表され、
前記第２のモチーフはXXXXXVFWGGREGYXXLLNT（配列番号９）で表され、
前記第３のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号１０）で表され、
前記第４のモチーフは、LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH（配列番号１１）で表され、
前記第５のモチーフは、XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１２）で表され、
前記第６のモチーフは、GGXNFDXKXRR（配列番号１３）で表される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記第１のモチーフは、FEXXXKXGXXXXCFHDXD（配列番号１０２）（ただし、３位： F or I or L、４位：A or M、５位： E or Q or S or T、７位： L or M、９位： I or V、１０位： E or K or P、１１位： F or Y、１２位： F or Y、１７位： A or I or V である。）で表され、
前記第２のモチーフはGXXXYVFWGGREGYXXLLNT（配列番号１０３）（ただし、２位： A or G、３位： V or K or E、４位： G or N、１５位： E or M、１６位： S or T
である。）で表され、
前記第３のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号１０）（ただし、１位： G or N、２位： F or H、３位： K or D or L、４位： G or P、５位： D or T or I
７位： L or Y、１３位： K or M、１６位： M or T、１７位： K or T、２２位： F or V
である。）で表され、
前記第４のモチーフは、LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH（配列番号１０４）（ただし、２位： D or Eであり、４位： D or Yであり、７位： L or M or Vであり、９位： I or Lであり、１１位： A or T or Vであり、１５位： T or Wであり、２２位： Q or Eである。）で表され、
前記第５のモチーフは、XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１０５）（ただし、１位： F or L、４位： I or V、８位： Q or R or T、１０位： D or N、１１位： P or Y
１２位： L or N or Q、１３位： L or N、１９位： E or Qである）で表され、
前記第６のモチーフは、GGXNFDXKXRR（配列番号１３）（ただし、３位： I or L or T
７位： A or S、９位： T or Vである）で表される、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記第６のモチーフにおけるアスパラギン（Ｎ）に替えてシステイン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を有している、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
前記アスパラギンに替えてスレオニン又はシステインを有している、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第１のモチーフは、配列番号２４で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第２のモチーフは、配列番号２５で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第３のモチーフは、配列番号２６で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第４のモチーフは、配列番号２７で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第５のモチーフは、配列番号２８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第６のモチーフは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含む真核細胞用の形質転換用ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡを保持する真核細胞。
【請求項１０】
酵母である、請求項９に記載の真核細胞。
【請求項１１】
前記酵母は、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hancenula、Klocckera、Schwanniomyces、Yarrowia、及びIssatchenkiaからなる群から選択されるいずれかに属する、請求項１０に記載の真核細胞。
【請求項１２】
セルラーゼを分泌生産する、請求項９〜１１のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１３】
エタノール、乳酸、酢酸、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン、グリセロール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール及びスクアレンからなる群から選択されるいずれかを生産する外因性又は内因性の遺伝子を備えている、請求項９〜１２のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１４】
キシロース利用性が付与ないし向上された真核細胞の作製方法であって、請求項７に記載のＤＮＡを真核細胞に導入して形質転換する工程を備える、作製方法。
【請求項１５】
有用物質を生産する方法であって、キシロースの存在下、請求項９〜１３のいずれかに記載の真核細胞を培養する工程を備える、生産方法。
【請求項１６】
前記有用物質は、エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールからなる群から選択されるいずれかである、請求項１５記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、新規なキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及び当該タンパク質を用いてキシロースを炭素源として用いて有用物質を生産する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースエタノール生産プロセスの発酵微生物である酵母Saccharomyces cerevisiaeは、植物バイオマスに多く含まれるキシロースを利用する能力を持たない。そのためSaccharomyces cerevisiaeにキシロース資化能力を付与する研究が進められている。この目的のため、２種類の経路が酵母に導入することが検討されている。一つはキシロースレダクターゼ(XR)とキシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH)を用いた経路（ＸＲ−ＸＤＨ経路）である。この経路では中間代謝物が蓄積し、エタノールの収率低下が問題となる。一方、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）を用いた経路（ＸＩ経路）はその問題が生じないが、ＸＲ−ＸＤＨ経路と比べてキシロースの代謝速度が遅いという問題がある。そこで、高機能なＸＩについて種々検討されている。
【０００３】
酵母で機能するＸＩとして初めて報告されたルーメンカビPiromyces sp. E2由来のＸＩの改良が行われている（特許文献１、非特許文献１）。また、Ruminococcus flavefaciens由来のＸＩの改良も行われている（特許文献２）。さらに、Lactococcus lactis由来のＸＩの改良も行われている（特許文献３）。さらにまた、従来のＸＩと比べて酵母のキシロース消費能力が高いヤマトシロアリ腸内原生生物由来のＸＩも報告されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−７９５６４号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１１／１５０３１３号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１０／０７０５４９号
【特許文献４】特開２０１１−１４７４４５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lee S, Jellison T, Alper HS.Appl Environ Microbiol, 2012; 78(16):5708-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び非特許文献１のＸＩは依然としてキシロースの消費速度が遅かった。また、特許文献１のＸＩでは、酵母における活性が明らかにされてない。さらに、特許文献２のＸＩは、導入酵母のキシロース培地での増殖活性向上は認められているものの、発酵性能については明らかでない。さらに、特許文献３のＸＩは、キシロース培地での増殖性や発酵性能については不明である。さらにまた、特許文献４に記載のＸＩでは酵母においてＸＩ発酵能を向上させるもののさらなる向上が求められている。
【０００７】
以上のことから、酵母でのキシロース消費能力の向上及び発酵能力の向上に関して有利なＸＩが依然として求められている。
【０００８】
本明細書は、酵母のキシロース発酵能向上に有用なＸＩ活性を有するタンパク質及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）の腸内原生生物由来のＸＩ（以下、ＲｓＸＩという。）に着目し、当該ＸＩに他のアミノ酸で置換する点変異を導入して改変することで、酵母のキシロース発酵能が向上するという知見を得た。また、当該ＸＩに導入したアミノ酸置換変異が類似のアミノ酸配列を有する他のＸＩにおいても有効であるという知見を得た。本明細書によれば、本知見に基づき以下の手段が開示される。
【００１０】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、以下の第１〜第６のモチーフをＮ末端側に近い側からのこの順序で有し、かつ前記第６のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン（Ｎ）に変えて他のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。
第１のモチーフ：FXXXXKXXXXXXXXHDXD（配列番号２）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第２のモチーフ：XXXXXXXWGGREGYXXLXNT（配列番号３）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第３のモチーフ：XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号４）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第４のモチーフ：LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH（配列番号５）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第５のモチーフ：XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP（配列番号６）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
第６のモチーフ：GGXＮFDXKXRR（配列番号７）
（ただし、Ｘは天然アミノ酸を表す。）
（２）前記第１のモチーフは、FXXXXKXGXXXXXFHDXD（配列番号８）で表され、
前記第２のモチーフはXXXXXVFWGGREGYXXLLNT（配列番号９）で表され、
前記第３のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号１０）で表され、
前記第４のモチーフは、LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH（配列番号１１）で表され、
前記第５のモチーフは、XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１２）で表され、
前記第６のモチーフは、GGXNFDXKXRR（配列番号１３）で表される、（１）に記載のタンパク質。
（３）前記第１のモチーフは、FEXXXKXGXXXXCFHDXD（配列番号１０２）（ただし、３位： F or I or L、４位：A or M、５位： E or Q or S or T、７位： L or M、９位： I or V、１０位： E or K or P、１１位： F or Y、１２位： F or Y、１７位： A or I or V である。）で表され、
前記第２のモチーフはGXXXYVFWGGREGYXXLLNT（配列番号１０３）（ただし、２位： A or G、３位： V or K or E、４位： G or N、１５位： E or M、１６位： S or T
である。）で表され、
前記第３のモチーフは、XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号１０）（ただし、１位： G or N、２位： F or H、３位： K or D or L、４位： G or P、５位： D or T or I
７位： L or Y、１３位： K or M、１６位： M or T、１７位： K or T、２２位： F or V
である。）で表され、
前記第４のモチーフは、LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH（配列番号１０４）（ただし、２位： D or Eであり、４位： D or Yであり、７位： L or M or Vであり、９位： I or Lであり、１１位： A or T or Vであり、１５位： T or Wであり、２２位： Q or Eである。）で表され、
前記第５のモチーフは、XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１０５）（ただし、１位： F or L、４位： I or V、８位： Q or R or T、１０位： D or N、１１位： P or Y
１２位： L or N or Q、１３位： L or N、１９位： E or Qである）で表され、
前記第６のモチーフは、GGXNFDXKXRR（配列番号１３）（ただし、３位： I or L or T
７位： A or S、９位： T or Vである）で表される、（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（４）前記第６のモチーフにおけるアスパラギン（Ｎ）に替えてシステイン、スレオニン、バリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を有している、（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質。
（５）前記アスパラギンに替えてスレオニン又はシステインを有している、（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質。
（６）前記第１のモチーフは、配列番号２４で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第２のモチーフは、配列番号２５で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第３のモチーフは、配列番号２６で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第４のモチーフは、配列番号２７で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第５のモチーフは、配列番号２８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記第６のモチーフは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）（７）に記載のＤＮＡを含む真核細胞用の形質転換用ベクター。
（９）（７）に記載のＤＮＡを保持する真核細胞。
（１０）酵母である、（９）に記載の真核細胞。
（１１）前記酵母は、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hancenula、Klocckera、Schwanniomyces、Yarrowia、及びIssatchenkiaからなる群から選択されるいずれかに属する、（１０）に記載の真核細胞。
（１２）セルラーゼを分泌生産する、（９）〜（１１）のいずれかに記載の真核細胞。
（１３）エタノール、乳酸、酢酸、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン、グリセロール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール及びスクアレンからなる群から選択されるいずれかを生産する外因性又は内因性の遺伝子を備えている、（９）〜（１１）のいずれかに記載の真核細胞。
（１４）キシロース利用性が付与ないし向上された真核細胞の作製方法であって、（７）に記載のＤＮＡを真核細胞に導入して形質転換する工程を備える、作製方法。
（１５）有用物質を生産する方法であって、キシロースの存在下、（９）〜（１３）のいずれかに記載の真核細胞を培養する工程を備える、生産方法が提供される。
（１６）前記有用物質は、エタノール、乳酸、酢酸、1,3−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールからなる群から選択されるいずれかである、（１５）記載の生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】酵母で活性があるＸＩとＲｓＸＩのアミノ酸配列との同一性を示す図である。
【図２】ＲｓＸＩと酵母で活性を有する他のＸＩとの配列ロゴ解析結果及びモチーフ解析結果を示す図である。
【図３】ＲｓＸＩと酵母で活性を有する他のＸＩのアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図４】酵母で活性を有する他のＸＩの各モチーフに対する同一性を示す図である。を示す図である。
【図５】キシロースを炭素源とした増殖試験結果（比増殖速度）を示す図である。
【図６】キシロースを炭素源とした発酵試験結果（キシロース及びエタノールの経時変化）を示す図である。
【図７】キシロースを炭素源とした発酵試験結果（７２時間目のキシロース消費量）を示す図である。
【図８】発酵７２時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す図である。
【図９】各種変異株における発酵７２時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す図Ａ〜Ｄである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）の腸内原生生物に由来するキシロースイソメラーゼであるＲｓＸＩと一定の関係にあって酵母等の真核細胞のキシロース資化能向上に有用な新規なＸＩに関する。本発明者らによれば、ＲｓＸＩにおいて見出した酵母におけるキシロース資化能向上に有効な置換変異が、他のＸＩにおいても、同様に真核細胞のキシロース資化能向上に有効であることを見出した。ＲｓＸＩと共通のモチーフを有する他のＸＩは、ＲｓＸＩとは機能的に類似のＸＩと考えられる。そして、その１つのモチーフ中のアスパラギンに対して置換変異を導入した改変ＸＩを真核細胞で発現させたとき、キシロースイソメラーゼ活性を発揮するとともに、その宿主真核細胞のキシロース資化能を向上させることができる。以下、本明細書の開示について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
（キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質）
本タンパク質は、ＲｓＸＩの配列番号１で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、以下に示す第１のモチーフ〜第６のモチーフ（配列番号２〜７）のうち１又は２以上を備えることができる。第１のモチーフ〜第６のモチーフは、本タンパク質においてアミノ酸配列のＮ末端側から順に含まれうる。
【００１４】
これらのモチーフは、いずれもＲｓＸＩにおいて見出されるものであり、本発明者らが、他のＸＩとのマルチプルアラインメントによるモチーフ解析によって他のＸＩにおいても見出したものである。
【００１５】
本タンパク質は、第１のモチーフ〜第６のモチーフのうち、少なくとも第６のモチーフを備えることが好ましい。また、好ましくは、さらに、第４のモチーフを備えており、さらに好ましくは、第５のモチーフを備えており、一層好ましくは第３のモチーフを備えており、より一層好ましくは第１のモチーフを備えており、さらに一層好ましくは第２のモチーフを備えている。
【００１６】
このモチーフ解析にあたっては、RsXIのアミノ酸配列をProtein BLASTで検索し（DatabaseはNon-redundant protein sequenceを使用し、Algorism parameterはデフォルト設定とした。）、得られた上位500種の他の類似のアミノ酸配列およびRsXI-C1のアミノ酸配列をもとにアライメント解析を行った。このアライメント解析の結果から、特徴的な６領域の共通配列をモチーフ配列として定義した。
【００１７】
類似のアミノ酸配列としてヒットした他のＸＩとしては、例えば、図１に例示する酵母で活性のある１０種のＸＩが挙げられる。これらのＸＩは、ＲｓＸＩである配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性は、４６％〜６３％と必ずしも高くないが、第１〜第６のモチーフを共通して有するとともに配列番号１における各モチーフと高い同一性を有している。こうした他のＸＩは、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列を利用して公知のデータベースを利用することで見出すことできる。
【００１８】
また、図２には、配列番号１で表されるアミノ酸配列と図１に例示する１０種のＸＩのアミノ酸配列（配列番号１４〜２３）とのマルチプルアラインメントによる配列ロゴ解析及びモチーフ解析の結果と、各モチーフにおける同一性とを示す。なお、図２において、同一性に関しては、同一性％の降順で記載している。図３には、ＲｓＸＩ及び他１０種のＸＩとのマルチプルアラインメント解析結果を示す。図４には、酵母で活性を有する他のＸＩの各モチーフに対する同一性を示す。
【００１９】
なお、当業者であれば、マルチプルアライメントは、既に説明した公知のデータベースであるProtein BLASTのほか、各種公知のデータベースを利用することにより実施可能である。マルチプルアライメントに用いる手法やコンセンサス配列を取得する手法は特に限定されない。例えば、ClustalW: http://align.genome.jp/； HMMER(隠れマルコフモデル)： http://hmmer.wustl.edu/；
MultiAlin:http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html； mkdom/xdom:
http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/xdom/等各種の手法を採用することができる。さらに、マルチプルアラインメントから保存性の高いアミノ酸を抽出することができる。このような手法も当業者において公知である。例えば、Ｗｅｂｌｏｇｏ３．３（http://weblog.berkeley.esu/）を用いて保存性の高いアミノ酸をロゴ化することができる。図２に示す配列ロゴ解析においては、保存性の高いアミノ酸ほど大きく表示されている。さらに、こうした配列ロゴ解析から、高度保存領域（モチーフ）を規定するモチーフ解析が可能である。
【００２０】
なお、本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００２１】
（第１のモチーフ）
第１のモチーフは、FXXXXKXXXXXXXXHDXD（配列番号２）で表される。第１のモチーフは、１８アミノ酸からなり、配列番号１で表されるアミノ酸配列の８８位〜１０５位に相当している。このモチーフにおいては、第１５位（Ｈ）及び第１８位（Ｄ）のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている（Hu, H., H. Liu, and Y. Shi. 1997. The reaction pathway of the isomerization of D-xylose catalyzed by the enzyme D-xylose isomerase: a theoretical study. Proteins 27:545-55.）。
【００２２】
配列番号２で表される第１のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
２位： D or E
３位： F or I or L or M
４位： A or C or F or I or L or M or Y
５位： D or E or H or N or Q or S or T
７位： L or M
８位： D or G or N or S
９位： A or I or L or T or V
１０位： D or E or G or K or P
１１位： F or H or Y
１２位： F or L or W or Y
１３位： A or C or S or T
１４位： F or W
１７位： A or I or K or R or T or V
【００２３】
第１のモチーフは好ましくはFXXXXKXGXXXXXFHDXD（配列番号８）で表される。なお、配列番号８〜１３で表される第１のモチーフ〜第６のモチーフは、RsXI-C1のアミノ酸配列（配列番号１）および図１に示す酵母で活性が確認されている１０種のXIのアミノ酸配列（配列番号１４〜２３）に限定して既に行ったのと同様のアライメント解析を行い、上位５００種のアライメント解析から得られたモチーフ配列と一致する領域について定義したものである。
【００２４】
配列番号８で表される第１のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
２位： D or E
３位： F or I or L
４位：A or M
５位： E or Q or S or T
７位： L or M
９位： I or V
１０位： E or G or K or P
１１位： F or H or Y
１２位： F or W or Y
１３位： C or T
１７位： A or I or K or R or V 
【００２５】
第１のモチーフはより好ましくはFEXXXKXGXXXXCFHDXD（配列番号１０２）で表される。配列番号１０２で表される第１のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。この第１のモチーフは、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくものである。
３位： F or I or L
４位：A or M
５位： E or Q or S or T
７位： L or M
９位： I or V
１０位： E or K or P
１１位： F or Y
１２位： F or Y
１７位： A or I or V 
【００２６】
第１のモチーフは、FEFMSKLGVEYFCFHDAD（配列番号２４）で表されるＲｓＸＩにおける第１のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第１のモチーフは配列番号２４で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００２７】
図２に示すように、第１のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、アミノ酸配列同一性に関し、６６％以上の同一性を有していることが好ましく、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上であることがわかる。
【００２８】
（第２のモチーフ）
第２のモチーフは、XXXXXXXWGGREGYXXLXNT（配列番号３）で表される。第２のモチーフは、２０アミノ酸からなり、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列の１８２位〜２０１に相当している。
【００２９】
配列番号２で表される第２のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： D or G or K or N
２位： A or G or S
３位： A or E or K or Q or S or T or V
４位： G or N
５位： F or Y
６位： V or T
７位： F or L
１５位： A or D or E or H or M
１６位： C or N or S or T
１８位： H or L or W
【００３０】
第２のモチーフは好ましくはXXXXXVFWGGREGYXXLLNT（配列番号９）で表される。配列番号９で表される第２のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： G or N
２位： A or G
３位： V or K or E or T
４位： G or N
５位： F or Y
１５位： E or M or H
１６位： S or T
【００３１】
第２のモチーフは、より好ましくはGXXXYVFWGGREGYXXLLNT（配列番号１０３）で表される。配列番号１０３で表される第２のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。この第２のモチーフは、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくものである。
２位： A or G
３位： V or K or E
４位： G or N
１５位： E or M
１６位： S or T
【００３２】
第２のモチーフは、GGVGYVFWGGREGYETLLNT（配列番号２５）で表されるＲｓＸＩにおける第２のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第２のモチーフは配列番号２５で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００３３】
図２に示すように、第２のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、７５％以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましく、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上であることがわかる。
【００３４】
（第３のモチーフ）
第３のモチーフは、XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号４）で表される。第３のモチーフは、２３アミノ酸からなり、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列の２２５位〜２４７位に相当している。このモチーフにおいては、第９位（Ｅ）及び第１１位（Ｋ）のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
【００３５】
配列番号４で表される第３のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： G or N
２位： F or H or Y
３位： D or E or K or L or N or Q or R or T
４位： G or P
５位： A or D or I or N or Q or T
６位： F or L or M
７位： F or L or Y
８位： I or L
１３位： K or M or Q
１６位： M or S or T
１７位： K or S or T
２２位： F or T or V or Y
【００３６】
第３のモチーフは好ましくはXXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD（配列番号１０）で表される。配列番号１０で表される第３のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： G or N
２位： F or H
３位： K or D or T or E or L
４位： G or P
５位： D or Q or T or I
７位： F or L or Y
１３位： K or M
１６位： M or S or T
１７位： K or T
２２位： F or V or Y
【００３７】
第３のモチーフは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくと、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： G or N
２位： F or H
３位： K or D or L
４位： G or P
５位： D or T or I
７位： L or Y
１３位： K or M
１６位： M or T
１７位： K or T
２２位： F or V
【００３８】
第３のモチーフは、GFKGDFYIEPKPKEPTKHQYDFD（配列番号２６）で表されるＲｓＸＩにおける第３のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第３のモチーフは配列番号２６で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００３９】
図２に示すように、第３のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、６５％以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましく、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上であることがわかる。
【００４０】
（第４のモチーフ）
第４のモチーフは、LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH（配列番号５）で表される。第３のモチーフは、２３アミノ酸からなり、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列の２６０位〜２８２位に相当している。このモチーフにおいては、第１０位（Ｅ）及び第１３位（Ｈ）のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
【００４１】
配列番号５で表される第４のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
２位： D or E or K or L or N or Q
３位： D or E or G or K or N or P or Q
４位： D or E or H or Y
５位： F or I or V
６位： K or R
７位： F or I or L or M or V
９位： I or L
１１位： A or G or P or T or V
１４位： A or T
１５位： N or T or W
１７位： A or S
１８位： F or G or Q
２０位： C or D or S or T
２１位： F or H or M or Y
２２位： D or E or H or M or Q
【００４２】
第４モチーフは好ましくはLXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH（配列番号１１）で表される。配列番号１１で表される第４のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
２位： D or E or N
３位： K or Q
４位： D or Y
７位： I or L or M or V
９位： I or L
１１位： A or P or T or V
１４位： A or T
１５位： T or W
２０位： C or T
２１位： F or H
２２位： Q or E
【００４３】
第４のモチーフは、より好ましくはLXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH（配列番号１０４）で表される。配列番号１０４で表される第４のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。この第４のモチーフは、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくものである。
２位： D or E
４位： D or Y
７位： L or M or V
９位： I or L
１１位： A or T or V
１５位： T or W
２２位： Q or E
【００４４】
第４のモチーフは、LEKDFKLNIEANHATLAGHTFQH（配列番号２７）で表されるＲｓＸＩにおける第４のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第４のモチーフは配列番号２７で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００４５】
図２に示すように、第４のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、７３％以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましく、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上であることがわかる。
【００４６】
（第５のモチーフ）
第５のモチーフは、XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP（配列番号６）で表される。第５のモチーフは、２１アミノ酸からなり、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列の２９３位〜３０３位に相当している。このモチーフにおいては、第５位（Ｄ）、第１６位（Ｄ）及び第１８位（Ｄ）のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
【００４７】
配列番号６で表される第５のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： F or L
４位： I or L or V
６位： A or S
８位： M or Q or R or T
１０位： D or H or N or S
１１位： A or K or L or M or P or T or V or Y
１２位： L or N or Q or D
１３位： I or L or N
１７位： I or T
１９位： E or Q
２０位： F or Y
【００４８】
第５モチーフは好ましくはXGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１２）で表される。配列番号１２で表される第５のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
１位： F or L
４位： I or V
６位： A or S
８位： Q or R or T
１０位： D or N or S
１１位： L or M or P or Y
１２位： D or L or N or Q
１３位： L or N
１９位： E or Q
【００４９】
第５のモチーフは、より好ましくはXGSXDANXGXXXXGWDTDXFP（配列番号１０５）で表される。配列番号１０５で表される第５のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。この第５のモチーフは、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくものである。
１位： F or L
４位： I or V
８位： Q or R or T
１０位： D or N
１１位： P or Y
１２位： L or N or Q
１３位： L or N
１９位： E or Q
【００５０】
第５のモチーフは、LGSVDANTGDPLLGWDTDEFP（配列番号２８）で表されるＲｓＸＩにおける第５のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第５のモチーフは配列番号２８で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００５１】
図２に示すように、第５のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、７１％以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましく、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上であることがわかる。
【００５２】
（第６のモチーフ）
第６のモチーフは、GGXNFDXKXRR（配列番号７）で表される。第６のモチーフは、１１アミノ酸からなり、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列の３３５位〜３４５位に相当している。このモチーフにおいては、第６位（Ｄ）のアミノ酸残基が活性部位を構成する残基と推定されている。
【００５３】
配列番号７で表される第６のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
３位： F or I or L or M or T or V
７位： A or C or S or T
９位： I or L or P or T or V
【００５４】
第６モチーフは好ましくはGGXNFDXKXRR（配列番号１３）で表される。配列番号１３で表される第６のモチーフにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。
３位： F or I or L or T
７位： A or C or S
９位： T or V
【００５５】
第６のモチーフは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列及びにおける各Ｘ（天然アミノ酸）については、以下のアミノ酸であることが好ましい。この第６のモチーフは、RsXIのアミノ酸配列（配列番号１）と、Piromyces sp.E2、Clostridium phytofermentans、Bacteroides thetaiotaomicron及びLactococcus lactisのそれぞれに由来するXIのアミノ酸配列とをアライメント解析を行った結果に基づくものである。
３位： I or L or T
７位： A or S
９位： T or V
【００５６】
第６のモチーフは、GGLNFDSKVRR（配列番号２９）で表されるＲｓＸＩにおける第６のモチーフ相当部分のアミノ酸と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。より好ましくは、第６のモチーフは配列番号２９で表されるアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは７５％以上である。また８０％以上であってもよいし、８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに９５％以上であってもよい。
【００５７】
図２に示すように、第６のモチーフに関し、図１に示した酵母で活性のある１０種のＸＩは、７２％以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましく、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上であることがわかる。
【００５８】
本タンパク質は、第６のモチーフ中のアスパラギン（Ｎ）以外の他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有している。すなわち、第６のモチーフ中のアスパラギンが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有している。第６のモチーフ中のアスパラギンは、ＲｓＸＩと一定の関係にあるＸＩによる真核細胞のキシロース資化（発酵）能向上に重要な意義を有していると考えられる。
【００５９】
第６のモチーフ中のＮを置換する他のアミノ酸は、特に限定しないが、当業者であれば第６のモチーフ中のアスパラギンの部位につき公知の変異導入法を用いて点変異を導入して改変タンパク質を創出し、その改変タンパク質を酵母等の真核細胞に導入して、キシロース資化能の向上を野生型タンパク質と対比することにより、特定することができる。
【００６０】
例えば、他のアミノ酸としては、システイン、スレオニン、バリン及びアラニンが挙げられる。これらのうちいずれかのアミノ酸でアスパラギンを置換する変異が好ましい。システイン又はスレオニンが好ましい場合がある。
【００６１】
本タンパク質は、第１〜第６のモチーフにおいて、前記同一性がいずれも６５％以上であることが好ましく、より好ましくは、前記同一性がいずれも７０％以上である。
【００６２】
本タンパク質は、また、第２〜第４のモチーフにおいて、前記同一性がいずれも７５％以上であることも好ましく、より好ましくは８０％以上である。
【００６３】
さらに、本タンパク質は、配列番号１で表されるＲｓＸＩのアミノ酸配列と４５％以上のアミノ酸配列を有することが好ましく、より好ましくは、５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有している。
【００６４】
上記した各種モチーフの各アミノ酸配列及びＲｓＸＩの配列番号１で表されるアミノ酸配列に対する所定の同一性範囲内のアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列である。アミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特定される同一性範囲内である限り特に限定されない。
【００６５】
本タンパク質は、キシロースイソメラーゼ活性を有している。キシロースイソメラーゼ活性（ＸＩ活性）とは、キシロースをキシルロースに異性化する活性である。ＸＩ活性は、この異性化反応の基質であるキシロースの減少量又は生成物であるキシルロースの生成量等として公知の方法で測定することができる。また、「ＸＩ活性を有する」とは、ＸＩ活性を有してれば足りる。好ましくは、配列番号１、配列番号１４〜２３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等程度あるいはそれ以上のＸＩ活性を有している。ＸＩ活性は、例えば、本タンパク質あるいは当該タンパク質を酵母などの真核細胞で発現させたときに得られる細胞破砕物などのＸＩ含有画分によるキシロース消費量や速度あるいはキシルロースの生成量等を指標として評価できる。本タンパク質のＸＩ活性は、配列番号１、配列番号１４〜２３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質あるいは本タンパク質において前記特定部位がアスパラギンであるタンパク質（典型的には野生型のキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質）の７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、もっとも好ましくは１００％以上である。
【００６６】
本タンパク質は、酵母などの真核細胞において発現させた際、その真核細胞のキシロース資化能が、本タンパク質において前記特定部位がアスパラギンであるタンパク質（典型的には野生型のキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質（野生型タンパク質））を同一条件で評価して得られるキシロース資化能よりも大きいことが好ましい。キシロース資化能は、例えば、キシロース存在下における真核細胞の増殖量（速度）、キシロース消費量（速度）や発酵生産物量（例えばエタノールなど）等で評価される。キシロース資化能が最終的に要請される機能であるからである。キシロース資化能は野生型タンパク質の１１０％以上であることが好ましく、より好ましくは１２０％以上であり、さらに好ましくは１３０％以上であり、一層好ましくは１５０％以上であり、より一層好ましくは２００％以上であり、さらに一層好ましくは２５０％以上であり、さらに好ましくは３００％以上である。
【００６７】
本タンパク質としては、例えば、配列番号１及び配列番号１４〜２３において、前記第６のモチーフ中のアスパラギン部位においてアスパラギン以外の他のアミノ酸を備えるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。すなわち、ＲｓＸＩに関しては配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Clostridium phytofermentans由来のＸＩとしては、配列番号３１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Clostridium difficile由来のＸＩとしては、配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Fusobacterium mortiferum由来のＸＩとしては、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Bacteroides thetaiotaomicron由来のＸＩとしては、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Cyllamyces aberensis由来のＸＩとしては、配列番号３５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Bacteroides fragilis由来のＸＩとしては、配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Orpinomyces sp.ukk1由来のＸＩとしては、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Piromyces sp.E2由来のＸＩとしては、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、Lactococcus lactis由来のＸＩとしては、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質及びCiona intestinals由来のＸＩとしては、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
【００６８】
さらに、本タンパク質としては、例えば、配列番号１、配列番号１４〜２３で表されるアミノ酸配列のいずれかと７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、さらにまた好ましくは９８％以上の同一性のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１の３３７位に相当する位置のアスパラギンがアスパラギン以外（好ましくはシステイン、スレオニン、バリン及びアラニンが挙げられる。これらのうちいずれかのアミノ酸でアスパラギンを置換する変異が好ましい。システイン又はスレオニンが好ましい場合がある。）のアミノ酸で置換されている、タンパク質も包含される。なお、前記「相当する位置」とは、配列番号１等など基礎となるアミノ酸配列に対して一定のアミノ酸配列同一性の対比すべきアミノ酸配列とをアラインメントしたとき、対比すべきアミノ酸配列において基礎アミノ酸配列の特定位置に対応づけられる位置をいう。配列番号１４〜２３で表されるアミノ酸配列においては、前記３３７位に相当する位置は、３３７位、３３７位、３３５位、３３９位、３３８位、３３９位、３３８位、３３８位、３３７位及び３５７位である。
【００６９】
本タンパク質としては、配列番号１のほか、配列番号１４，１７、２１及び２２のアミノ酸配列のいずれかと７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、さらにまた好ましくは９８％以上の同一性のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１の３３７位に相当する位置のアスパラギンがアスパラギン以外（好ましくはシステイン、スレオニン、バリン及びアラニンが挙げられる。これらのうちいずれかのアミノ酸でアスパラギンを置換する変異が好ましい。システイン又はスレオニンが好ましい場合がある。）のアミノ酸で置換されている、タンパク質であることが好ましい。
【００７０】
本タンパク質は、各種方法で取得できる。例えば、配列番号１及び１４〜２３からなる群から選択される１つのアミノ酸配列や当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を問い合わせ配列とする公知のホモロジー検索等及びモチーフ解析等により第１〜第５のモチーフを一定以上の同一性で備えるタンパク質を抽出し、当該タンパク質における第５のモチーフ中のアスパラギン部位に変異を導入することにより得ることができる。アミノ酸配列への部位特異的な変異の導入は当業者において公知の手法によって可能である。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法(Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350,1987)が挙げられる。
【００７１】
また、配列番号１及び１４〜２３において特定アスパラギン部位が他のアミノ酸で置換された、例えば配列番号３０〜４０又はこれらをコードする塩基配列を問い合わせ配列として、特定アスパラギンがアスパラギン以外の他のアミノ酸であるタンパク質を抽出してもよい。自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。
【００７２】
さらに、配列番号１、１４〜２３、３０〜４０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はその相補鎖をプローブとして用いてハイブリダイゼーション技術によってＤＮＡを単離して、当該ＤＮＡによってコードされる本タンパク質の野生型を取得し改変してもよいし、本タンパク質を直接取得してもよい。また、こうしたＤＮＡ又は相補鎖に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲ反応により本タンパク質の野生型を取得し改変してもよいしあるいは本タンパク質を取得してもよい。このようにして本タンパク質を取得することは当業者において通常行い得ることである。
【００７３】
なお、ハイブリダイゼーション技術においては、好ましくは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントな条件については、後述する。
【００７４】
また、本タンパク質は、本タンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物によって真核細胞等の適当な宿主を形質転換し、形質転換宿主細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から本回収することによって得られる。このような技術には、当業者に周知である。
【００７５】
（本タンパク質をコードするＤＮＡ）
本ＤＮＡは、本タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。本ＤＮＡは、本タンパク質をコードするＤＮＡを、合成的に取得するほか、既に説明したように、部位特異的変異導入法や、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ等により取得できる。
【００７６】
ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００７７】
なお、特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に従い、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。従って、本ＤＮＡは、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換された塩基配列をコードするＤＮＡも包含している。また、本ＤＮＡは、酵母などの真核細胞における発現に最適化された塩基配列で構成されていてもよい。
【００７８】
（形質転換用ベクター）
本明細書に開示される形質転換用ベクターは、本ＤＮＡを適切なプロモーターの下流に当該プロモーターにより作動可能に保持されている。プロモーターとしては、後述する真核細胞等において機能する各種プロモーターほか、ＧＡＬプロモーター等の誘導的プロモーターが挙げられる。このほか、形質転換用の組換えベクターは、ターミネーター、エンハンサー、複製開始点（ori）、マーカー等を備えることができ、これらの要素が必要に応じ適宜選択される。また、組換えベクターが、遺伝子置換等、染色体への所望のＤＮＡ断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有している。本ベクターは、商業的に入手可能な酵母発現ベクター等を適宜選択して利用することで構築できる。
【００７９】
こうした組換えベクターの作製に必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００８０】
（真核細胞）
本明細書に開示される真核細胞は、本ＤＮＡを含む真核細胞である。本真核細胞は、典型的には、本ベクターにより形質転換された形質転換真核細胞である。本ＤＮＡは、宿主細胞の染色体外において保持されていてもよいが、好ましくは染色体上に保持されている。また、高いキシロース資化能力を発揮するために、例えば、複数コピー保持されていることが好ましい。
【００８１】
本明細書に開示される形質転換体の宿主である真核細胞は、特に限定されない。物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母などの微生物細胞が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
【００８２】
本ＤＮＡは、発現可能に宿主内に保持されている。すなわち、適当なプロモーターの制御下に連結され、さらに、ターミネーター、エンハンサー、複製開始点（ori）、マーカー等も併せて備えられていてもよい。プロモーターは、誘導的であっても構成的であってもよい。例えば、酵母における構成的プロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）プロモーター、ヒスチジン栄養性機能遺伝子（ＨＩＳ３）プロモーター、チトクロームｂｃ１コンプレックス（ＣＹＣ１）プロモーター及び高浸透圧応答遺伝子（ＨＯＲ７）プロモーター及びこれらの改変体が挙げられる。
【００８３】
本真核細胞は、セルラーゼやヘミセルラーゼを細胞表層あるいは細胞外に分泌発現するものであってもよい。例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの各種セルラーゼのほか、ヘミセルラーゼ等のその他のバイオマス分解酵素も挙げられる。こうしたタンパク質を発現させることで、リグノセルロースに由来するリグニン以外の糖類を効果的に利用できるようになる。また、本真核細胞は、このほか、必要に応じて外来遺伝子の導入、内在性遺伝子の破壊などの遺伝子工学的な改変がなされたものであってもよい。
【００８４】
本真核細胞は、後段で説明するように発酵により所望の有用物質を生産可能であってもよい。有用物質を生産可能な真核細胞は、有用物質生産に関する内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子を備えることができる。また、所定の内在性遺伝子が破壊されていてもよい。酵母は通常嫌気性発酵によりエタノールを生産するが、適宜遺伝子工学的な改変等により他の有用物質を生産可能に形質転換された宿主であってもよい。有用物質としては、エタノールのほか、乳酸、酢酸、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールが挙げられる。これらのうち１種又は２種以上を有用物質として生産可能であるこことが好ましい。本明細書に開示される形質転換体の宿主は、例えば、乳酸などの有機酸を生産する酵母（特開２００３−２５９８７８号公報、特開２００６−００６２７１号公報、特開２００６−２０６０２号公報、特開２００６−７５１３３号公報、特開２００６−２９６６３７７号公報、特開２００７−８９４６６号公報に記載）等における遺伝的改変等を備えることができる。
【００８５】
本ベクターの宿主への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。このような手法は、上記した実験書等に記載される。ベクターを導入した酵母等につき、マーカー遺伝子を用いた選抜及び活性発現による選抜により本真核細胞を得ることができる。
【００８６】
（有用物質を生産する方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、キシロースの存在下、本真核細胞を培養する工程を備えることができる。本生産方法によると、本真核細胞はキシロース資化能力が向上しているため、炭素源としてキシロースを含んでいれば、それを有効利用して、有用物質に変換することができる。したがって、キシロースを含有するリグノセルロースの糖化物を培地に含む場合であっても、こうしたバイオマス炭素源を有効利用して、有用物質に変換できる。リグノセルロースの透過物には、キシロースほか、グルコースを含んでいてもよく、さらにヘミセルロースの分解物を含んでいてもよい。
【００８７】
キシロースは、アラビノキシラン、グルクロノキシランなどのキシランに含まれる。これらのポリマーは、天然には、ヘミセルロースの一成分を構成しており、リグノセルロースなどのバイオマス等に存在している。キシランを、エンドキシラナーゼ、キシロシダーゼ等により分解すると、キシロースを得ることができる。
【００８８】
有用物質としては特に限定しないが、酵母等が通常グルコースを利用して生産可能なものであればよい。有用物質は、酵母におけるグルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物であってもよい。具体的には、エタノールなどの低級アルコール、乳酸、酢酸などの有機酸の他、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールのほか、イソプレノド合成経路の追加によるテルペノイド系のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、スクアレン、さらには、ファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。酵母は、アルコール発酵能が高いため、本真核細胞は、キシロース含有炭素源を培地に用いてエタノールを効率的に生産することができる。また、アルコール発酵能力が高い酵母は、その解糖系を改変して他の有機酸等の有用物質を生産する場合にも、当該有用物質の生産能力も高いと考えられる。
【００８９】
培養工程では、炭素源として、キシロースを含有する培地を用いることができる。培地は、さらに、グルコースを含むことができ、好ましくは、炭素源は、リグノセルロースなどのバイオマスに由来している。なお、酵母が、各種セルラーゼを発現するものであってセルロース資化能力を有する場合には、培地中にセルロース又はその部分分解物を含んでいてもよい。
【００９０】
培養工程では、本真核細胞の宿主に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００９１】
こうした培養工程の実施により、本真核細胞が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。例えば、本真核細胞がエタノール生産能力を有している場合には、エタノールであり、乳酸を生産可能に改変されている場合には、乳酸等となる。発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【００９２】
発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【００９３】
（キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法）
本明細書によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法も提供される。本スクリーニング方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、既に説明した第１〜第６のモチーフをＮ末端側に近い側からのこの順序で有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の前記第６のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン（Ｎ）に変えて他のアミノ酸を有する改変体タンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定する工程、を備えることができる。この方法によれば、キシロースイソメラーゼ活性に関し改善された改変体タンパク質を取得できる。特に、酵母において発現させるのに有効な改変タンパク質を得ることができる。置換すべき他のアミノ酸としては、各種の天然アミノ酸が挙げられ、なかでも、システイン、スレオニン、バリン及びアラニンを適用することができ、特には、システイン、スレオニンが挙げられる。また、第１〜第６のモチーフについても、既に説明した好ましい態様を適用することができる。
【００９４】
こうした改変体タンパク質を得るための元のタンパク質としては、RsXIのアミノ酸配列をProtein BLASTで検索し（DatabaseはNon-redundant protein sequenceを使用し、Algorism parameterはデフォルト設定とした。）、得られた上位500種の他の類似のアミノ酸配列などを利用でき、なかでも、上位４００種、さらには上位３００種、さらには上位２００種、さらには上位１００種のタンパク質が挙げられる。また、第６のモチーフにおけるアスパラギンの位置は、既に説明したアラインメント解析を利用して特定することができる。なお、スクリーニングに供する改変体タンパク質は、既に説明した公知のタンパク質の取得方法により取得できる。
【００９５】
（キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法）
本明細書によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法も提供される。本製造方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、既に説明した第１〜第６のモチーフをＮ末端側に近い側からのこの順序で有し、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の前記第６のモチーフのアミノ酸配列におけるアスパラギン（Ｎ）に変えて他のアミノ酸を有する改変体タンパク質であってキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程、を備えることができる。この方法によれば、キシロースイソメラーゼ活性を有する改変体タンパク質を容易に製造できる。他のアミノ酸、元タンパク質、モチーフの各種態様については、既述のスクリーニング方法同様、既に本明細書において説明した各種態様を適用することができる。
【実施例】
【００９６】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。
【００９７】
なお、以下の実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。
ＳＤ液体培地：６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２０ｇ／ｌ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ
ＳＤ寒天培地：６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２０ｇ／ｌ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｇ／ｌ Ａｇａｒ
ＳＸ液体培地：６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２０ｇ／ｌ Ｄ−Ｘｙｌｏｓｅ
ＳＸ寒天培地：６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２０ｇ／ｌ Ｄ−Ｘｙｌｏｓｅ、２０ｇ／ｌ Ａｇａｒ
ＳＸ液体培地５０：６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、５０ｇ／ｌ Ｄ−Ｘｙｌｏｓｅ
【実施例１】
【００９８】
（エラープローンＰＣＲによるＲｓＸＩ遺伝子への変異導入）
酵母コドンに最適化してヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子ＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＶ４３８１４３）が挿入されたｐＲＳ４３６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１−Ｏを鋳型にＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。反応は、９５℃で２分の後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクル実施後、７２℃で１０分とした。なお、使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
ｐＲＳＳａｃＩＩ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−Ｆ４：5’-GAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAACCGCGGAAAATG-3’（配列番号４１）
ｐＲＳＸｈｏＩ−ＴＡＡ−Ｒ３：5'-GTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCGAGTTA-3'（配列番号４２）
【００９９】
増幅したＤＮＡ断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて，ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯにクローニングし、挿入されたＤＮＡ断片を解析した。その結果、ＤＮＡ断片には１０００塩基あたり、平均３箇所の変異（エラー率０．３％）がランダムに導入されていることを確認した。
【実施例２】
【０１００】
（酵母遺伝子発現用基本プラスミドの作製）
低コピー型の遺伝子導入用ベクターｐＲＳ３１６ＧＡＰを作製した。ｐＲＳ４３６ＧＡＰ（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＢ３０４８６２）を鋳型に、プライマーＴＤＨ３ｐ−ＣＹＣ１ｔ−ＩＦ−Ｆ及びＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクル実施した。使用したプライマーの配列は以下の通りであった。
ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＣ１ｔ−ＩＦ−Ｆ：5'-TCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC -3'
（配列番号４３）
ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＣ１ｔ−ＩＦ−Ｒ：5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC -3'（配列番号４４）
【０１０１】
得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（タカラバイオ）を用いて、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化したｐＲＳ３１６（ＮＢＲＰアクセッション番号：ＢＹＰ５６２）に挿入した。得られたプラスミドを、ｐＲＳ３１６ＧＡＰと称した。
【実施例３】
【０１０２】
（変異ＸＩ遺伝子ライブラリ由来ＤＮＡの酵母への導入）
エラープローンＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片と、ｐＲＳ４３６−ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１−Ｏを鋳型に、プライマーｐＲＳＳａｃＩＩ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−Ｆ４及びｐＲｓＸｈｏＩ−ＴＡＡ−Ｒ３、ポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いたＰＣＲで得られたＤＮＡ断片（コントロール）と、制限酵素ＳａｃＩＩとＸｈｏＩで消化したｐＲＳ３１６ＧＡＰとそれぞれ混合し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeＷ６００Ｗ株（特開２０１１−１４７４４５号公報参照）に導入して、ＳＤ液体培地５ｍｌで培養した。
【実施例４】
【０１０３】
（キシロースを炭素源とした培地での集積培養）
２日間培養した実施例３のＳＤ培養液をＳＸ液体培地５ｍｌに添加し、バイオフォトレコーダーＴＶＳ０６２ＣＡ（アドバンテック）を用いて３０℃、７０ｒｐｍで培養した。培養開始７日目の培養液から菌体を回収し、新しいＳＸ液体培地５ｍｌに、初期培養液濃度がＯＤ（６００ｎｍ）が０．１となるように菌体を添加した。バイオフォトレコーダーを利用して３０℃で７０ｒｐｍで７日間培後、培養液から菌体を回収してＳＸ寒天培地に塗布し、３０℃で培養した。ＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔのＤＮＡ断片を導入した酵母よりも早く生育してきたコロニーを選抜し、ＳＤ寒天培地に画線培養してコロニーを純化し、選抜株とした。
【実施例５】
【０１０４】
（選抜株からのプラスミドの抽出及び配列解析）
実施例４の増殖試験で比増殖速度が高かった上位１０株及びＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔを導入した株について、Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドのＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔ遺伝子領域を解析した結果、５種類の変異配列を確認した。変異ＸＩ遺伝子をそれぞれ、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｔ７６Ｉ、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｅ１２５Ｇ、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｉ２８６Ｆ、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｎ３３７Ｔ及びＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｋ３８４Ｅと命名し、各遺伝子の酵母導入ベクターをｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸｌＣ１Ｏ−Ｔ７６Ｉ、ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｅ１２５Ｇ、ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｉ２８６Ｆ、ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｎ３３７Ｔ、ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１０−Ｋ３８４Ｅと命名した。また、野生型であるＲｓＸｌ−Ｃ１−ｏｐｔの酵母導入用プラスミドをｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏと命名した。
【実施例６】
【０１０５】
（変異遺伝子の酵母への導入）
実施例５で作製したプラスミドを、実施例３と同様にしてＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeＷ６００Ｗ株（特開２０１１−１４７４４５号公報参照）に導入し、ＳＤ寒天培地に塗布し、３０℃で培養した。生育したコロニーを新たなＳＤ培地で画線培養してコロニーを純化した。純化して得られた選択株の名称と使用したプラスミドを以下に示す。
【０１０６】
ＷＲ７０１ｌｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸｌＣ１Ｏ−Ｔ７６Ｉ
ＷＲ７０２Ｇｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｅ１２５Ｇ
ＷＲ７０３Ｆｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｉ２８６Ｆ
ＷＲ７０４Ｔｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｎ３３７Ｔ
ＷＲ７０５Ｅｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１０−Ｋ３８４Ｅ
ＷＲ７００ｓ：ｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏ
【実施例７】
【０１０７】
（遺伝子組換え酵母のキシロースを炭素源とした増殖試験）
実施例６で取得した酵母のキシロース資化能力を評価するため、キシロースを炭素源とした培地での増殖試験を行った。実施例６で作製した５種類の株をＳＤ液体培地で２４時間培養し、菌体を回収して滅菌水で施錠後、Ｌ字型試験管に調製したＳＸ液体培地に菌体を加え、増殖試験を開始した。増殖試験はバイオフォトレコーダーＴＶＳＯ６２ＣＡを用い、培養条件は３０℃、７０ｒｐｍで、２０分間隔で培養液のＯＤ（６６０ｎｍ）を測定した。各株の比増殖速度の比較を図５に示す。
【０１０８】
図５に示すように、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｉ２８６Ｆを導入したＷＲ７０３Ｆｓ株、ＲｓＸＩＣ１Ｏ−Ｎ３３７Ｔを導入したＷＲ７０４Ｔｓ株、ＲｓＸＩＣ１０−Ｋ３８４Ｅを導入したＷＲ７０５Ｅｓ株は野生型のＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔを導入したＷＲ７００ｓ株より比増殖速度が高いことを確認した。中でもＷＲ７０４Ｔｓ株の比増殖速度はＷＲ７００ｓ株の１．６倍となった。
【実施例８】
【０１０９】
（遺伝子組換え酵母のキシロースを炭素源とした発酵試験）
ＷＲ７００ｓ株及びＷＲ７０４Ｔｓ株を５ｍｌのＳＤ液体培地に接種して２４時間培養した。次に５０ｍｌのＳＤ液体培地に培養液１ｍｌを加えて２４時間培養し、菌体を回収して滅菌水で２回洗浄した。発酵試験にはブチルゴムで密栓したねじ口の耐圧試験管を用いた。発酵培地の最終ＯＤ（６００ｎｍ）が１０となるように酵母懸濁液を加えたＳＸ液体培地５０を５ｍ１調製し、３０℃、１８０ｒｐｍで発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。液体クロマトグラフィーのカラムはＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）を６０℃で使用し、検出器は示差屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所）を用いた。移動相には０．０５％硫酸溶液を用い、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで送液した。図６に各株の発酵培地中のキシロース濃度、エタノール濃度の経時変化を示す。なお、発酵試験は４回実施し、その平均値を記している。
【０１１０】
図６に示すように、ＷＲ７０４Ｔｓ株のキシロースの消費速度、エタノール生産速度はＷＲ７００ｓ株と比べて約２．５倍速く、発酵７２時間目のキシロース消費量はＷ７００ｓ株で約１２ｇ／ｌとなったが、ＷＲ７０４Ｔｓ株では約３０ｇ／１であった。以上の結果から、ＲｓＸＩＣｌＯｐｔの３３７位のアスパラギンをスレオニンに置換することで、酵母のキシロース資化能力が向上することが明らかとなった。
【実施例９】
【０１１１】
（アミノ酸点変異ライブラリの作製と酵母への導入）
酵母においてキシロース資化能力の向上効果が確認されたＲｓＸＩＣ１０の３３７番目のアミノ酸（アスパラギン）をターゲットに、アミノ酸点変異ライブラリの作製を行った。実施例５に記載のｐＲＳ３１６ＧＡＰ−ＲｓＸＩＣ１Ｏを鋳型に、以下の表１に示すプライマー、およびＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（アジレント・テクノロジー）を用い、キットに付属のプロトコルに従い反応を行った。得られた反応液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ニッポンジーン）の形質転換を行い、生育したコロニーからプラスミドを抽出した。シーケンシングにより変異導入部位を確認し、アスパラギンとトレオニンを除く１８種類（アラニン；Ａ、アルギニン；Ｒ、アスパラギン酸；Ｄ、システイン；Ｃ、グルタミン；Ｇ、グルタミン酸；Ｅ、グリシン；Ｇ、ヒスチジン；Ｈ、イソロイシン；Ｉ、ロイシン；Ｌ、リジン；Ｋ、メチオニン；Ｍ、フェニルアラニン；Ｆ、プロリン；Ｐ、セリン；Ｓ、トリプトファン；Ｗ、チロシン；Ｙ、バリン；Ｖ）の変異を有する変異ＸＩのそれぞれについて、酵母導入用のプラスミドを、獲得した（表１）。次に、得られたプラスミドをＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩを用いてＷ６００Ｗ株に導入し、ＳＤ寒天培地に塗布した。生育したコロニーを新たなＳＤ寒天培地に画線培養してコロニーを純化した。得られた遺伝子組換え酵母、変異Ｘｌの酵母への導入に用いたプラスミド及び導入された変異ＸＩ遺伝子を表１に示す。
【０１１２】
【表１】
2014207884.tif 000002
【実施例１０】
【０１１３】
（遺伝子組換え酵母のキシロースを炭素源とした発酵試験）
表１で示す１８種の組換え酵母、およびＷＲ７００ｓ株とＷＲ７０４Ｔｓ株を、１ウェル当たり２ｍｌ容量の９６ウェルストレージブロック（コーニング）に調製した１ｍＬのＳＤ液体培地に接種し、恒温振とう培養機Ｍ・ＢＲ−０２２ＵＰ（タイテック）にて３０℃、１５００ｒｐｍ、２４時間培養した。次に９６ウェルストレージブロックに調製した１ｍｌのＳＤ液体培地に培養液２００μ１を加えて同様の条件で２４時間培養し、菌体を回収して滅菌水で２回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。発酵試験は以下の条件で行った。発酵培地の最終ＯＤ（６００ｎｍ）が１となるように酵母懸濁液を加えたＳＸ液体培地を９６ウェルストレージブロックに１ｍｌ調製した。嫌気的な条件とするため、タイタースティックＨＣ（カジックス）を用いて各ウェルを密閉し、Ｍ・ＢＲ−０２２ＵＰにて３０℃、１５００ｒｐｍの条件で発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、実施例８と同様にして液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。図７に発酵７２時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す。なお、発酵試験は２回以上実施し、その平均値を記している。
【０１１４】
図７に示すように、野生型のＸＩ（ＲｓＸＩ−Ｃ１−ｏｐｔ）を導入したＷＲ７００ｓ株の発酵７２時間目におけるキシロース消費量は２．６ｇ／Ｌとなり、実施例７で示したＷＲ７０４Ｔｓ株のキシロース消費量は７．２ｇ／Ｌであった。点変異ライブラリで得られた１８種類の株では、ＷＲ７０４Ｃｓ、ＷＲ７０４Ｖｓ、ＷＲ７０４Ａｓの４株で野生型のＸＩよりキシロース消費量が向上していることを確認した（それぞれ８．９ｇ／Ｌ、５．３ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ）。中でもＷＲ７０４Ｃｓ株のキシロース消費量はＷＲ７０４Ｔｓ株を上回っており、野生型とくらべて３．５倍向上していることを確認した。以上の結果から、ＲｓＸｌ−Ｃ１−ｏｐｔの３３７位のアスパラギンをスレオニン、システイン、バリン及びアラニン（これらのタンパク質をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号７１〜７４で表される。）のいずれかに置換することで、酵母のキシロース資化能力が１．５倍以上向上することが明らかとなった。
【実施例１１】
【０１１５】
（他のＸＩへのアミノ酸点変異導入）
ＲｓＸＩＣｌＯの３３７番目のアミノ酸に対する変異により得られたキシロース資化能力の向上効果が、他の生物種由来のＸＩにおいても得られるかについて評価を行った。酵母コドンに最適化されたPiromyces sp.E2由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子及びClostridium phytofermentans由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子（特開２０１１−１４７４４５号公報））を鋳型に、以下の表２に示すプライマーを用いてＲｓＸｌの３３７番目のアミノ酸残基に相当するアスパラギンをスレオニンに置換する変異を導入したＤＮＡ断片、ＰｉＸＩＯ−Ｎ３３８ＴおよびＣｐＸＩＯ−Ｎ３３７Ｔ（配列番号７５及び配列番号７６）を合成した。また、コントロールとして変異を導入していないＤＮＡ断片、ＰｉＸＩＯおよびＣｐＸＩＯも同時に合成した。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（タカラバイオ）を用いて制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＲＳ３１６ＧＡＰに挿入し、遺伝子導入用プラスミドを獲得した。次に、得られたプラスミドをＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｌｌを用いてＷ６００Ｗ株に導入し、ＳＤ寒天培地に塗布した。生育したコロニーを新たなＳＤ寒天培地に画線培養してコロニーを純化した。得られた遺伝子組換え酵母、変異Ｘｌの酵母への導入に用いたプラスミド、および導入された変異ＸＩ遺伝子を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
2014207884.tif 000003
【実施例１２】
【０１１７】
（遺伝子組換え酵母のキシロースを炭素源とした発酵試験）
表２に示す４種の組換え酵母を、５ｍｌのＳＤ液体培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍで２４時間培養した。培養液を新しく調製した５ｍｌのＳＤ液体培地に２００μ１を加えて同様の条件で２４時間培養し、菌体を回収して滅菌水で２回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。発酵試験は以下の条件で行った。発酵培地の最終ＯＤ（６００ｎｍ）が、ＷＰ７００ｓ株及びＷＰ７０４Ｔｓ株では１０、ＷＣ７００ｓ株及びＷＣ７０４Ｔｓ株では５０となるように酵母懸濁液を加えたＳＸ液体培地を９６ウェルストレージブロックに１ｍｌ調製した。嫌気的な条件とするため、タイタースティックＨＣを用いて各ウェルを密閉し、３０℃、１５００ｒｐｍの条件で発酵を行った。任意の時間に発酵液を分取し、実施例８と同様にして液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。図８に発酵７２時間目における発酵培地中のキシロース濃度を示す。なお、発酵試験は２回以上実施し、その平均値を記している。
【０１１８】
図８Ａに示すように、野生型Piromyces sp.E2由来のＸＩ遺伝子（ＰｉＸＩＯ）を導入したＷＰ７００ｓ株の発酵７２時間目におけるキシロース消費量は２．４ｇ／Ｌであったが、変異型Ｘｌ遺伝子（ＰｉＸＩＯ−Ｎ３３８Ｔ）を導入したＷＰ７０４Ｔｓ株のキシロース消費量は７．３ｇ／Ｌとなった。このことから、ＷＰ７０４Ｔｓ株のキシロース消費量はＷＰ７００ｓ株と比べて３．１倍向上していることを確認した。
【０１１９】
また、図８Ｂに示すように、野生型のClostridium phytofermentans由来ＸＩ遺伝子（ＣｐＸＩＯ）を導入したＷＣ７００ｓ株の発酵７２時間目におけるキシロース消費量は１．８ｇ／Ｌであったが、変異型Ｘｌ遺伝子（ＣｐＸＩＯ−Ｎ３３７Ｔ）を導入したＷＣ７０４Ｔｓ株のキシロース消費量は２．２ｇ／Ｌとなった。このことから、ＷＣ７０４Ｔｓ株のキシロース消費量はＷＣ７００ｓ株と比べて１．２倍向上していることを確認した。以上の結果から、ＲｓＸＩと同様に、ＰｉＸＩやＣｐＸＩにおいてもＲｓＸＩの３３７位相当部位に変異を導入することにより酵母のキシロース資化能力が向上することが明らかとなった。
【実施例１３】
【０１２０】
（他の生物種由来のXIへの変異導入）
酵母での活性が報告されているPiromyces sp. E2由来のXI（PiXI）、Clostridium phytofermentans由来のXI（CpXI）、Bacteroides thetaiotaomicron由来のXI（BtXI）、およびLactococcus lactis由来のXI（LlXI）について、RsXIC1Oの337番目のアスパラギンと対応するアミノ酸をアラニン、システイン、スレオニンおよびバリンに置換し、キシロース資化能力の向上効果が得られるか評価を行った。表３に、変異導入に用いた株、プラスミド、遺伝子及びプライマーを示し、表４にプライマー配列を示す。
【０１２１】
【表３】
2014207884.tif 000004
【０１２２】
【表４】
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（鋳型DNAの調製）
点変異を導入するための鋳型DNAの調製は以下のように行った。PiXIおよびCpXIについては、実施例１１と同様に、酵母での発現用にコドンを適合させたPiromyces sp.E2由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子及びClostridium phytofermentans由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子(特開2011-147445号公報)を鋳型に、表４に示すプライマー（配列番号７７、７８、７９、８０）を用いてそれぞれのDNA断片を合成した。得られたDNA断片を、In-Fusion HD PCR Cloning kitを用いて、制限酵素SacIIおよびXhoIで消化したpRS316GAPに挿入してpRS316GAP-PiXIO、pRS316GAP-CpXIOを作製した（表３）。
【０１２３】
BtXIについては、ATCC（American Type Culture Collection）より取得したB. thetaiotaomicron VPI 5482 由来のゲノムDNA （ATCC 29148D）を鋳型とし、DNA断片を合成した。使用したプライマー（配列番号８１、８２）を表４に記す。得られたDNA断片を、In-Fusion HD PCR Cloning kitを用いて、制限酵素SacIIおよびXhoIで消化したpRS316GAPに挿入してpRS316GAP-BtXIを作製した（表３）。
【０１２４】
LlXIについては、特許文献３に記載のアミノ酸配列およびGenbankより取得したアミノ酸配列（Genbank：AAD20249）をもとに、酵母での発現用にコドンを適合させた合成遺伝子、LlXIO（配列番号８３）を合成した（Genscript Corporation（www. Genscript.com））。次に、作製したLlXIOを鋳型として、表４に記載のプライマー（配列番号８４、８５）を用いてDNA断片を合成した。得られたDNA断片を、In-Fusion HD PCR Cloning kitを用いて、制限酵素SacIIおよびXhoIで消化したpRS316GAPに挿入してpRS316GAP-LlXIOを作製した（表３）。
【０１２５】
pRS316GAP-PiXIO、pRS316GAP-CpXIO、pRS316GAP-LlXIOおよびpRS316GAP-BtXIを鋳型に、表４に示すプライマー（配列番号８６〜１０１）、およびQuickChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis kit（アジレント・テクノロジー）を用い、キットに付属のプロトコルに従い反応を行った。得られた反応液を用いてECOSTM Competent E. coli DH5α （ニッポンジーン）の形質転換を行い、生育したコロニーからプラスミドを抽出した。シーケンシングにより変異導入部位を確認し、それぞれのXIについて、アスパラギンが、システイン、スレオニン、バリンおよびアラニンに置換された4種類の変異型XI遺伝子導入用プラスミドを獲得した（表３）。
【０１２６】
次に、得られたプラスミドをFrozen-EZ Yeast Transformation IIを用いてW600W株に導入し、SD寒天培地に塗布した。生育したコロニーを新たなSD寒天培地に画線培養してコロニーを純化した。
【実施例１４】
【０１２７】
（遺伝子組換え酵母のキシロースを炭素源とした発酵試験）
表３で示す20種の組換え酵母を、96ウェルストレージブロックに調製した1 mLのSD液体培地に接種し、恒温振とう培養機M・BR-022UPにて30℃、1500 rpm、24時間培養した。次に新しい96ウェルストレージブロックに調製した1mlのSD液体培地に培養液200μlを加えて同様の条件で24時間培養し、菌体を回収して滅菌水で２回洗浄した後、滅菌水で懸濁して酵母懸濁液を調製した。
【０１２８】
発酵試験は以下の条件で行った。発酵培地の最終OD600が10となるように酵母懸濁液を加えたSX培地（6.7 g/l Yeast Nitrogen Base without amino acids、20 g/l Xylose）を96ウェルストレージブロックに1 ml調製した。以下、実施例１２と同様に発酵を行い、液体クロマトグラフィーによりキシロースおよびエタノールの分析を行なった。図９に各種XI導入酵母の発酵開始から72時間目のキシロース消費量を示す。なお、発酵試験は２回以上実施し、その平均値を記している。 
【０１２９】
図９のAにおいて、WP700s株の発酵72時間目におけるキシロース消費量は2.8g/Lであったが、アスパラギンがシステイン、スレオニンおよびバリンに置換された変異型XI遺伝子を導入したWP704Cs、WP704Ts株およびWP704Vs株のキシロース消費量は、それぞれ5.1 g/L、4.1 g/Lおよび3.9 g/Lとなり、キシロース資化能力が向上することを確認した。また他のXIについても、CpXIではシステインおよびバリン（図９A）、BtXIではシステインおよびスレオニン（図９C）、LlXIではシステイン、スレオニンおよびアラニン（図９D）にアスパラギンを置換した変異型XI遺伝子を導入した株について、キシロース資化能力が向上することを確認した。
【０１３０】
以上の結果から、RsXIと同様に、PiXIやCpXI、BtXI、LlXIなどの他の生物由来のXIにおいても、RsXIC1Oにおける337位のアスパラギンに相当する部位に変異を導入することにより酵母のキシロース資化能力が向上することが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
配列番号２〜１３、１０２〜１０５：キシロースイソメラーゼにおけるコンセンサス配列
配列番号３０〜４０：キシロースイソメラーゼ変異体
配列番号４１〜７０、７７〜１０１：プライマー
配列番号７１〜７６：  キシロースイソメラーゼ変異体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014207884.tif 000014
【配列表】
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