(57)【要約】      （修正有）【課題】開花前のシクラメン属植物において、八重咲き形質の個体をより正確に識別する方法を提供する。【解決手段】シクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる領域の有無を検出することを含む、八重咲きシクラメンの識別方法：（Ａ）特定の塩基配列；（Ｂ）特定の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列；（Ｃ）特定の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる領域の有無を決定することを含む、八重咲きシクラメンの識別方法：
（Ａ）配列番号１の塩基配列；
（Ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列；
（Ｃ）配列番号１の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列。
【請求項２】
さらに、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる領域が、シクラメン属植物のゲノムＤＮＡの対立遺伝子上にホモで存在するか否かを決定することを含む、請求項１に記載の識別方法。
【請求項３】
前記決定がＰＣＲを用いて行われる、請求項１又は２に記載の識別方法。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｄ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う、請求項３に記載の識別方法：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列；
（Ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつ、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列；
（Ｃ）配列番号１の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加され、かつ、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列。
【請求項６】
八重咲きシクラメンの識別に用いる、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれるオリゴヌクレオチドからなる核酸増幅用プライマーであって、八重咲きシクラメンの識別に用いるプライマー：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｄ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとからなる核酸増幅用プライマーセットであって、八重咲きシクラメンの識別に用いるプライマーセット：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、八重咲き形質を発現しうるシクラメンの早期識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクラメン（C.persicum  Mill.）は冬を代表する鉢花として古くから親しまれている。シクラメンはサクラソウ科シクラメン属に属する植物で、原種は欧州から北アフリカ、中近東の地中海沿岸を中心に１５種自生しており、園芸品種は１９世紀半ば以降にヨーロッパを中心に原種「シクラメン・ペルシカム」を改良して作り出された。
近年、自然突然変異により花弁の数が増加した「八重咲き」と呼ばれる形質のシクラメンが出現した。この八重咲きシクラメンでは、本来は雄しべになるはずの器官が花弁となることで、本来は５枚であるはずの花弁が１０枚程度にまで増加している。
【０００３】
高等植物における花器官の形態形成は、ＭＡＤＳボックスファミリーに属するＡ、Ｂ、Ｃのクラスの遺伝子の転写制御により決定されると考えられている（非特許文献１）。雄しべや雌しべの形態形成に関与することが知られているＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）はＣクラス遺伝子に分類される。ＡＧ遺伝子はシクラメン属植物では２種類存在し、ＣｐＡＧ１が雄しべの形態形成、ＣｐＡＧ２が雌しべの形態形成に関与している（非特許文献２）。そして、ＣｐＡＧ１の発現が抑制されると雄しべの花弁化（八重咲き化）が誘導されることが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】花の形態形成の分子遺伝学，新版「植物の形を決める分子機構」（酒井一，秀潤社）150-163，2000
【非特許文献２】Plant  Biotechnology  28号、167-172頁、2011年
【非特許文献３】第28回日本植物細胞分生生物学会大会講演要旨集、84頁、2010年
【非特許文献４】最新農業技術、花卉編、4巻、153-158頁、2012年、農山漁村文化協会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
シクラメンにおいて八重咲き形質は鑑賞用として商品価値が高い。しかし、八重咲き形質の発現は劣性遺伝子によることが知られており、一重咲き品種（花弁数５枚の品種）との交配による交雑育種法においては、交配第一世代では八重咲きの形質が出現しない。つまり、交配第一世代では全て一重咲き形質を示し、交配第二世代になって初めて八重咲きの形質が現れる（非特許文献４）。
このような八重咲きシクラメンの育種、販売にあたっては、労力軽減の面から、開花前に八重咲きを識別することが望まれていたが、開花前の八重咲き形質の識別は不可能であった。
【０００６】
本発明は、開花前のシクラメン属植物において、八重咲き形質の個体をより正確に識別する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、八重咲きシクラメンをより正確に識別するためのＤＮＡマーカー、及び、当該ＤＮＡマーカーを検出するためのオリゴヌクレオチドないしプライマーセットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を重ねた。その結果、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメン変異体において、特定の遺伝子のコード領域に、当該変異体に特異的な塩基配列が存在することを見い出した。そして、シクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中において、この八重咲きシクラメン変異体に特異的な塩基配列からなる領域の有無を調べることで、開花前であっても、八重咲き形質を発現する個体をより正確に識別できることを見い出した。
本発明は、これらの知見に基づき完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の上記課題は下記の手段により解決された。
＜１＞
シクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中において、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる領域の有無を決定することを含む、八重咲きシクラメンの識別方法：
（Ａ）配列番号１の塩基配列；
（Ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列；
（Ｃ）配列番号１の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列。
＜２＞
さらに、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列からなる領域が、シクラメン属植物のゲノムＤＮＡの対立遺伝子上にホモで存在するか否かを決定することを含む、前記＜１＞に記載の識別方法。
＜３＞
前記決定がＰＣＲを用いて行われる、前記＜１＞又は＜２＞に記載の識別方法。
＜４＞
下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｄ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う、前記＜３＞に記載の識別方法：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
＜５＞
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列；
（Ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつ、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列；
（Ｃ）配列番号１の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加され、かつ、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列。
＜６＞
八重咲きシクラメンの識別に用いる、前記＜５＞に記載のＤＮＡ。
＜７＞
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれるオリゴヌクレオチドからなる核酸増幅用プライマーであって、八重咲きシクラメンの識別に用いるプライマー：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
＜８＞
下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｄ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとからなる核酸増幅用プライマーセットであって、八重咲きシクラメンの識別に用いるプライマーセット：
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【０００９】
本発明において、「八重咲きシクラメン」とは、本来雄しべになるはずの器官が花弁に変化し、花弁数が１０枚程度に増加したシクラメンである。
本発明において、「八重咲きシクラメンの識別」とは、八重咲き形質を発現する個体を識別すること、その世代では八重咲き形質を発現していないが、次世代において八重咲き形質を発現しうる個体を識別すること、その世代でも次世代においても八重咲き形質を発現しない個体と、その世代あるいは次世代において八重咲き形質を発現する個体とを識別すること、を含む意味に用いる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の八重咲きシクラメンの識別方法によれば、開花前において、シクラメン属植物の八重咲き形質をより正確に識別することができる。
より具体的には、本発明の八重咲きシクラメンの識別方法により、交配第二世代を開花させることなく八重咲き形質をもつ個体を選別できるため、育種過程において、労力の大幅な軽減が可能となる。また、本発明の一実施形態によれば、交配第二世代が八重咲き形質を遺伝的にホモで保持する個体であるのか、あるいはヘテロで保持する個体であるのかについても識別ができ、当該ホモ個体と当該ヘテロ個体とを用いた系統維持管理も可能となる。更には、上記ホモないしヘテロ個体に八重咲き形質以外にも優れた形質が現れれば、これらを育種親として用いることにより、八重咲きシクラメンの優良系統を効率よく作成することが出来る。
本発明のＤＮＡは、シクラメン属植物の八重咲き形質の識別に有用である。
本発明の核酸増幅用プライマー及びプライマーセットは、本発明のＤＮＡを検出するのに好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】八重咲きシクラメンの識別のためのＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。レーン１はＡＢ系統、レーン２はＳＷ系統、レーン３はＡＢ系統とＳＷ系統との交配系統の結果を示す。最左レーンは分子量マーカーを示す。
【図２】八重咲きシクラメンの識別のためのＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。レーン１はＡＢ系統、レーン２はＳＷ系統、レーン３はＡＢ系統とＳＷ系統との交配系統の結果を示す。最左レーンは分子量マーカーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
［八重咲きシクラメンの識別方法］
本発明の八重咲きシクラメンの識別方法（以下、単に、「本発明の識別方法」という。）では、シクラメン属植物のゲノム中において、特定の塩基配列からなる領域の有無を決定する。ゲノムＤＮＡ中に当該領域が存在する場合には、八重咲き形質を発現する個体又は次世代で八重咲き形質を発現する個体（潜在的八重咲き形質）として識別される。一方、ゲノムＤＮＡ中に当該領域が存在しない場合には、非八重咲き形質（通常は一重咲き形質）の個体として識別される。これにより、開花前においても八重咲き形質をより正確に識別することが可能になる。
【００１４】
本発明の識別方法において、検出対象とする、シクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中の領域は、配列番号１の塩基配列からなる領域、又はその特定のバリアントである。配列番号１の塩基配列からなる領域の特定のバリアントとして、例えば、下記（Ｉ）〜（III）が挙げられる。
【００１５】
（Ｉ）配列番号１の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなる領域。
本明細書において、塩基配列の「同一性」とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）並びにＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１６】
（II）配列番号１の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列であって、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中に存在する塩基配列からなる領域。
本明細書において、配列番号１の塩基配列において「１又は数個」とは、好ましくは１〜１００の整数、より好ましくは１〜５０の整数、さらに好ましくは１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数、さらに好ましくは１〜１０の整数である。
【００１７】
（III）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列からなる領域。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、６０℃、２×ＳＳＣ、より好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣの洗浄条件下でハイブリダイズすることを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、通常の方法で行うことができる。
【００１８】
配列番号１の塩基配列は、雄しべが花弁化した八重咲きシクラメンのゲノムＤＮＡ中のＣｐＡＧ１遺伝子が存在する領域に特異的に存在する。配列番号１の塩基配列は、一重咲き系統のシクラメンのゲノムＤＮＡ中には見い出されていない。配列番号１の塩基配列からなる領域は、シクラメン属植物のＣｐＡＧ１遺伝子を分断するように存在する。したがって、ＣｐＡＧ１遺伝子の正常な働きを阻害し、雄しべの花弁化を誘発すると考えられる。配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの単離ないし同定する方法は後述の実施例において詳細に説明する。
また、この知見は、自然突然変異の蓄積等によって、配列番号１の塩基配列との同一性が所定のレベルにある塩基配列からなる領域（上記（Ｉ）〜（III））が、雄しべが花弁化したシクラメン植物体のＣｐＡＧ１遺伝子領域に存在しうることを示す。この場合にも、ＣｐＡＧ１遺伝子の働きが抑えられて八重咲き形質となることは当業者であれば当然に予測しうる事象である。
配列番号１の塩基配列からなる領域又はそのバリアントがゲノムＤＮＡの対立遺伝子上にホモで存在する場合、その個体において八重咲きが発現する。
【００１９】
本発明の識別方法において、ゲノムＤＮＡ中の検出対象領域は、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法）等の遺伝子工学的手法により検出することができる。
すなわち、本発明において、特定の「塩基配列からなる領域の有無を決定する」とは、当該領域の塩基配列をシークエンス法によって解析することまでを要するものではなく、当該領域の一部又は全部を含みうる領域を核酸増幅法により特異的に増幅し、目的とする分子量の増幅産物の有無を調べることや、当該領域の一部又は全部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション等を行うことにより、当該領域の有無を調べること等を含む意味に用いる。
【００２０】
上記遺伝子工学的手法は通常の方法を採用することができる。上記各手法のなかでもＰＣＲ法が好適である。
ＰＣＲでは、例えば二倍体品種であれば、後述の実施例に示されるように、用いるプライマーの組み合わせにより、配列番号１の塩基配列からなる領域又はそのバリアントをゲノムＤＮＡ上に１個保有するのか（相同染色体のうち１本の染色体上にのみ存在するのか、言い換えれば、対立遺伝子上にヘテロで存在するのか）、あるいは２個保有するのか（相同染色体を構成する２本の染色体上のいずれにも存在するのか、言い換えれば、対立遺伝子上にホモで存在するのか）をも識別することができる（本明細書において、上記の対立遺伝子上にヘテロで存在する個体を単に「ヘテロ個体」ということがある。また、上記の対立遺伝子上にホモで存在する個体を単に「ホモ個体」ということがある。）
【００２１】
ここで、八重咲き形質の識別対象が四倍体品種であった場合には、相同染色体を２組持つため、ヘテロ個体としては、１組の相同染色体が「ホモ・ヘテロ」で残りの組の相同染色体が「ヘテロ・ヘテロ」となる個体、１組の相同染色体が「ホモ・ヘテロ」で残りの組の相同染色体も「ホモ・ヘテロ」となる個体など、複数の遺伝的な組み合わせ個体が出現しうる。プライマーの組み合わせを後述の実施例に示されるように工夫しても、四倍体品種のヘテロ個体において、上記のようなヘテロ形態の具体的態様までをも、単純なＰＣＲ（非定量的ＰＣＲ）によって正確に識別するのは難しい場合がある。
一方、後述の実施例に示されるように特定のプライマーの組み合わせを採用することにより、単純なＰＣＲ（非定量的ＰＣＲ）によって、四倍体品種の純粋なホモ個体（２組の相同染色体がいずれも「ホモ・ホモ」の個体）を、上記四倍体品種のヘテロ個体と区別して識別することは容易にできる。
【００２２】
本発明において、八重咲きの識別対象となるシクラメン属植物には何ら制限はないが、八重咲きシクラメンを子房親として、一重咲きシクラメンの花粉を交配して得られた交配雑種系統がしばしば識別対象とされる。八重咲きシクラメンの育種方法としては、通常は、八重咲きシクラメンと一重咲きシクラメンとを交配させて、その中から八重咲きシクラメン形質の個体、あるいは次世代で八重咲きを発現しうる個体を選抜して育種する手法がとられる。これは、八重咲きシクラメンは雄しべが花弁化しており、花粉が無いことから、八重咲きシクラメン同士の交配ができないことによる。
なお、八重咲きシクラメンの管理方法としては、不定芽培養などの栄養生殖の手法がとられることもある。
八重咲きの遺伝的形質をより詳細に識別できる観点からは、本発明において、八重咲きの識別対象とするシクラメン属植物は二倍体品種であることが好ましい。
【００２３】
［核酸増幅用プライマー］
本発明の識別方法では、ゲノムＤＮＡ中における配列番号１の塩基配列からなる領域の有無の決定、又はゲノムＤＮＡ中における当該領域の上記特定のバリアントの有無の決定は、好ましくは、配列番号１の塩基配列からなる領域又は当該領域のバリアントがゲノムＤＮＡ中に存在する場合に、これら領域の全部又は一部を特異的に増幅することができる核酸増幅用プライマーを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、特定の増幅産物の有無を調べることで行われる。当該核酸増幅用プライマーとして、例えば、下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００２４】
配列番号３の塩基配列は、雄しべが花弁化したシクラメン属植物のゲノムＤＮＡ中に存在する配列番号２の塩基配列において、塩基番号２０２〜２２８の領域と同一の塩基配列である。同様に、配列番号４及び５の塩基配列は、配列番号２の塩基配列において、それぞれ塩基番号６７３〜６９５の領域及び塩基番号１１５３〜１１８０の領域と同一である。
また、配列番号６の塩基配列は、配列番号２の塩基配列において、塩基番号７３３３〜７３６２の領域の相補配列と同一の塩基配列である。同様に、配列番号７〜９の塩基配列は、配列番号２の塩基配列において、それぞれ塩基番号６８９１〜６９１７の領域の相補配列、塩基番号５９４１〜５９７０の領域の相補配列、及び塩基番号２９９４〜３０２３の領域の相補配列と同一である。
配列番号２の塩基番号１１８８〜６７３５の領域が、雄しべが花弁化したシクラメン変異体に特定的な配列番号１の塩基配列である。
【００２５】
本発明の核酸増幅用プライマーにおいて、配列番号３〜９の各塩基配列において、「１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列」の「１もしくは数個」とは、５’側に塩基が付加される場合においては１〜１０の整数であることが好ましく、１〜５の整数であることがより好ましく、１〜３の整数であることがさらに好ましく、１又は２であることが特に好ましい。また、３’側に塩基が付加される場合並びに塩基の欠失、置換及び／又は挿入の場合においては、１〜５の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがより好ましく、１又は２であることがさらに好ましい。
配列番号３〜９の各塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３〜９の各塩基配列の相補配列を含むＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。
【００２６】
本発明の核酸増幅用プライマーは、目的に応じて、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識して用いることもできる。
【００２７】
また、本発明の核酸増幅用プライマーを構成する上記オリゴヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等やこれらのキメラ核酸の他、ＤＮＡやＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の一部又は全部をホスホロチオエート結合等の他の結合に置き換えた核酸が含まれる。このことは、後述の核酸増幅用プライマーセットでも同様である。
本発明のプライマーは、通常の方法で化学合成することができるし、試薬メーカーから購入することもできる。
【００２８】
［核酸増幅用プライマーセット］
核酸増幅においては、通常には、ペアとなって標的核酸を増幅するために、少なくとも２種類のプライマーをプライマーセットとして用いる。本発明の識別方法においては、好ましくは、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｄ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅反応が行われる。
【００２９】
（ａ）配列番号３の塩基配列、又は配列番号３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号４の塩基配列、又は配列番号４の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｄ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００３０】
本発明の核酸増幅用プライマーセットを用いたＰＣＲは、通常には、下記（i）〜（iii）の工程を少なくとも含む。
（i）シクラメン属植物のゲノムＤＮＡと、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼと、本発明のプライマーセットとを混合してＰＣＲ用反応液を調製する工程、
（ii）上記ＰＣＲ用反応液をＰＣＲに付する工程、
（iii）増幅されたＤＮＡを検出する工程。
ＰＣＲ用反応液にはプライマーと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションや使用するＤＮＡポリメラーゼに適した緩衝液等の他の成分を含ませてもよい。また、リアルタイムＰＣＲ法では、目的に応じて、さらに蛍光標識等がなされた標識プローブを含ませてもよい。
【００３１】
ＰＣＲ法の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０℃〜９８℃程度で１０〜６０秒間程行い、プライマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６５℃程度で数秒〜数分間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を６５〜７５℃程度で数秒〜数分間行い、これらを１サイクルとしたものを３０〜４０サイクル程度行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いれば、標的ＤＮＡを精度よく定量することもでき、これにより検出対象であるシクラメン属植物の変異（ＣｐＡＧ１遺伝子変異）が、ヘテロ型であるかホモ型であるかを識別することもできる。
【００３２】
核酸増幅反応により増幅したＤＮＡ断片（増幅産物）の確認は通常の方法で行うことができる。例えば核酸増幅反応時に蛍光物質や放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法、増幅産物である２本鎖ＤＮＡに蛍光物質を入り込ませて発光させる方法、増幅産物による反応液の濁度を検出する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。
【００３３】
ＰＣＲ法において、２種類のプライマー（１種類のプライマーペア）からなるプライマーセットを用いると、増幅される塩基配列は１種類であり、３種類以上のプライマー（２種類以上のプライマーペア）からなるプライマーセットを用いると、増幅される塩基配列は２種類以上となる。
【００３４】
本発明のプライマーセットは、該プライマーセットを構成するプライマーが混合された状態のものであってもよいし、別々により分けられた状態であってもよい。また、乾燥状態であっても、緩衝液等の水溶液に溶解した状態であってもよい。また、無機塩、有機塩、防腐剤、安定化剤等と共存させた状態であってもよい。
【００３５】
最後に、本発明の核酸増幅用プライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの組み合わせの好適な例を以下に列挙するが、本発明はこれらの組み合わせに限定されるものではない。
（組み合わせ例）
・配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７又は８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。配列番号３と７の組み合わせによりホモ個体とヘテロ個体との識別もできる。
・配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６、８又は９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。配列番号４と６の組み合わせによりホモ個体とヘテロ個体との識別もできる。
・配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６〜８のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。配列番号５と６又は５と７の組み合わせによりホモ個体とヘテロ個体との識別もできる。
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。また、下記実施例の実験操作は特に断わりのない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載された手順に従った。
【実施例】
【００３７】
［材料］
シクラメン属植物の一重咲きＡＢ系統、雄しべが花弁化した八重咲き変異ＧＭ系統及びＳＷ系統、並びにＡＢ系統とＳＷ系統との交配雑種（いずれも二倍体品種）を材料として下記実験に用いた。
【００３８】
参考例１  ゲノムＤＮＡ抽出
上記の各系統の植物体から葉を採取した。その葉５０ｍｇを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．５）３００μｌを添加し、これを磨砕した。磨砕物に２０％ＳＤＳを２０ｍｌ加えて、６５℃で１０分間加温した。得られた混合物に５Ｍ酢酸カリウムを１００μｌ加え、氷中に２０分間置いた後、１７０００ｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清にイソプロパノール２００μｌを加え、転倒攪拌し、これを再び１７０００ｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を減圧下で乾燥した。１００μｌのＴＥ緩衝液にそのＤＮＡを溶解した。
【００３９】
実施例１  八重咲きシクラメンに特異的なＤＮＡの取得
以下に記載の八重咲きシクラメンのＣｐＡＧ１遺伝子の単離操作は、制限酵素処理を施したゲノムＤＮＡ断片にアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い未知の領域をクローニングするための市販されたキットである、株式会社ベックス製のＲｉｇｈｔＷａｌｋ  ＫｉｔＴＭを用いて実施した。
【００４０】
八重咲き変異ＧＭ系統の葉から抽出した２８０ｎｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＳａｕIIIＡＩ（タカラバイオ社製）の５Ｕで、３７℃で３０分間不完全消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。その後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ  ＫｉｔＴＭ付属のＲＷＡ−１アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、ＰＣＲ反応の鋳型ゲノムＤＮＡとした。
【００４１】
次に、公知のＣｐＡＧ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ５４８８８９）に基づき、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーＡ）を、株式会社ファスマックのカスタムＤＮＡ合成受託サービスを利用して作製した。以降、特に記述がない限りプライマーの合成は、同社を利用して行った。
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノムＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ  ＫｉｔＴＭ付属のプライマーＷＰ−１、及び、プライマーＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９８℃で１０秒、アニーリングと伸長を６８℃で８分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液はＫＯＤ−ＦＸバッファー中に、最終濃度０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．３μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−ＦＸ（東洋紡績社製）を含んでいる。
【００４２】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ  ＫｉｔＴＭ付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＡを用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
この反応産物を、ＧＭＣｐＡＧ１−１とし、株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンシングサービスを用いて塩基配列を決定した。その結果、ＧＭＣｐＡＧ１−１はＣｐＡＧ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列の一部を含む７３６２ｂｐ（配列番号２）のゲノムＤＮＡ配列であって、その中に八重咲きシクラメン系統に特異的な配列（配列番号１の塩基配列）が存在することを確認した。
以降、特に記述がない限り塩基配列の決定は同社のシーケンシングサービスを用いて行った。
【００４３】
実施例２  八重咲きシクラメンに特異的なＤＮＡの検出
一重咲きＡＢ系統および八重咲き変異ＧＭ系統のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として用いてＰＣＲ反応を行なった。プライマーセットとして、上記プライマーＡと、上記ＧＭＣｐＡＧ１−１の塩基配列に基づき新たに合成した配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９８℃で１０秒、アニーリングと伸長を６８℃で８分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液はＫＯＤ−ＦＸバッファー中に、最終濃度０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．３μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−ＦＸ（東洋紡績社製）を含んでいる。
【００４４】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４５】
一重咲きＡＢ系統由来の上記ＰＣＲ反応産物をＡＢ−１、八重咲き変異ＧＭ系統由来の上記ＰＣＲ反応産物をＧＭ−１と命名し塩基配列を決定した。その結果、ＡＢ−１はＣｐＡＧ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を一部含む６９３ｂｐの塩基配列であった。これに対しＧＭ−１は、ＡＢ−１の塩基配列中に５５４８ｂｐ（配列番号１）の新たな塩基配列が挿入され、かつ、３１ｂｐが欠損した、６２１０ｂｐの塩基配列からなることが確認された。すなわち、上記５５４８ｂｐの塩基配列は、八重咲き変異ＧＭ系統のＣｐＡＧ１ゲノム遺伝子上に特異的に存在するＤＮＡ断片であることがわかった。
【００４６】
実施例３  八重咲きシクラメンの識別−１
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの一部を含む領域（配列番号２の塩基番号２０２〜５９７０の領域）を増幅し得るプライマーセットとして、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーＣ）と、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーＤ）とをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ法により、シクラメン属植物の一重咲きＡＢ系統１個体、八重咲き変異ＳＷ系統１個体および両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）１個体の識別を行った。
交配第一代雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）から得られた種子を１００粒蒔き、苗を得た。これらの苗の葉から上記と同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲは、シクラメン属植物の一重咲きＡＢ系統、八重咲き変異ＳＷ系統および両系統の交配第一代雑種系統（ＡＢ×ＳＷ：一重咲き）のゲノムＤＮＡ約１００ｎｇ、上記プライマーセットを構成するオリゴヌクレオチド各１５ｐＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−ＦＸ、ＴＯＹＯＢＯ社製）１．０ユニット、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各２０００μＭを加えた増幅用緩衝液５０μｌ中で行った。ＰＣＲサイクルは９４℃で２分熱変性させ、変性：９８℃１０秒間、アニーリングと伸長：６８℃７分間のサイクルを３５サイクル繰り返した。次にＰＣＲ産物を分離させるために、１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ＰＣＲ反応液９μｌと１μｌのローディングバッファーを混合した後、１．５％アガロースゲルで、１００Ｖにて１時間電気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むＴＡＥバッファー溶液に約３０分浸漬し、アガロースゲル内のＤＮＡを染色した。その後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを検出した。
【００４７】
図１に示すように、ＳＷ系統のゲノムＤＮＡからは八重咲き特異的なＰＣＲ産物のバンド（矢印）が観察されたが、ＡＢ系統のゲノムＤＮＡからは特異的なＰＣＲ産物は観察されなかった。また、両者の交配雑種系統のゲノムＤＮＡからはＳＷ系統と同様の八重咲き特異的なＰＣＲ産物が検出された。
【００４８】
上記交配第一代雑種系統の苗を栽培して、開花させて形態調査を行なったところ、すべての個体とも一重咲き花であった。このことから、交配雑種系統の花は一重咲きの形態を示すにもかかわらず子房親ＳＷ系統の八重咲きの遺伝子を持っていることが判明した。次に、交配第一代雑種系統の株において自殖により採種を行い交配第二世代雑種系統の種を得た。これらのなかから約１００粒を蒔き、苗を得て、栽培、開花させて形態調査を行なったところ、八重咲き花が認められた。
【００４９】
実施例４  八重咲きシクラメンの識別−２
プライマーセットとして、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例３と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統ないし両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【００５０】
実施例５  八重咲きシクラメンの識別−３
プライマーセットとして、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例３と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統ないし両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【００５１】
実施例６  八重咲きシクラメンの識別−４
プライマーセットとして、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例３と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統ないし両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【００５２】
実施例７  八重咲きシクラメンの識別−５
プライマーセットとして、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて実施例３と同様の実験を行った。その結果、図２に示すようにＡＢ系統では、正常なＣｐＡＧ１遺伝子の存在を示すバンド（矢印Ｂ）のみが検出された。一方、ＳＷ系統では配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの存在を示すバンド（矢印Ａ）のみが検出され、さらに、両者の交配雑種系統のゲノムＤＮＡからは正常なＣｐＡＧ１を示すバンド（矢印Ｂ）と配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの存在を示すバンド（矢印Ａ）の双方が検出された。
このことから、配列番号１の塩基配列のすべてを含む領域を増幅しうるプライマーセットを用いることで、識別対象個体の八重咲き形質が当該個体の世代において発現してくるものか、あるいは潜在的なもの（次世代で発現してくるもの）かどうかについても簡便に識別可能であることがわかった。
【００５３】
実施例８  八重咲きシクラメンの識別−６
プライマーセットとして、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例７と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統と、両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【００５４】
実施例９  八重咲きシクラメンの識別−７
プライマーセットとして、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例７と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統と、両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【００５５】
実施例１０  八重咲きシクラメンの識別−８
プライマーセットとして、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合も、上記実施例７と同様に、一重咲きＡＢ系統と、八重咲き変異ＳＷ系統と、両系統の交配雑種系統（ＡＢ×ＳＷ）との識別を行うことができた。
【図１】
2014155448.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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