(57)【要約】【課題】特定の酵素を用いることで、高温の加熱等の処理を必要とせず、ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏでヒドラジンを合成する方法を提供する。【解決手段】酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質である基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、当該酵素触媒として、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とを用いることを特徴とするヒドラジン合成方法。【選択図】  図２
2014207879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、
酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質が、下記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つのタンパク質であり、
当該酵素触媒が、下記タンパク質（１ａ）、タンパク質（１ｂ）およびタンパク質（１ｃ）のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ）と、
下記タンパク質（２ａ）およびタンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）を用いることを特徴とするヒドラジン合成方法。
（イ）タンパク質（１ａ）は配列番号１、タンパク質（１ｂ）は配列番号２、タンパク質（１ｃ）は配列番号３、タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ロ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質
（ハ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
前記酵素触媒が、上記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つの酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質をコードする遺伝子から発現したタンパク質によってなる組み換えヒドラジン合成酵素（Ｉ）と組み換えヒドラジン合成酵素（ＩＩ）である請求項１記載のヒドラジン合成方法。
【請求項３】
酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質である基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、
当該酵素触媒として、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、
Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とを用いることを特徴とするヒドラジン合成方法。
【請求項４】
前記酵素（Ｉ´）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子質量が、９１．５〜９６．５ｋＤａ、４０．５〜４５．５ｋＤａ、３４．５〜３９．５ｋＤａであり、前記酵素（ＩＩ´）をトリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子質量が、１１〜１７ｋＤａ、８〜１４ｋＤａである請求項３記載のヒドラジン合成方法。
【請求項５】
酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）が、前記Ａｎａｍｍｏｘ菌の細胞を破砕後、遠心分離し、その上澄みを塩析後、遠心分離し、得られる上澄みを疎水カラムクロマトグラフィーにより精製したものである請求項３または４に記載のヒドラジン合成方法。
【請求項６】
前記酵素（Ｉ´）および（ＩＩ´）が、前記疎水カラムクロマトグラフィーにより精製したとき、波長２８０ｎｍにおける吸光度と、波長４０８ｎｍにおける吸光度とをモニタリングすることで確認されるヘムタンパク質の、第一のピーク周辺の画分と、第二のピーク周辺の画分とから得られる酵素である請求項５記載のヒドラジン合成方法。
【請求項７】
酵素（ＩＩ´）が、難還元性であり、かつ酵素（Ｉ´）が、還元型としたとき、ｃ型ヘムタンパク質に特徴的なα帯、β帯およびソーレ帯に吸光極大を有するものである請求項３〜６のいずれか１項に記載のヒドラジン合成方法。
【請求項８】
緩衝液としてトリス塩酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液あるいはＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いてヒドラジンの合成を行う請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒドラジン合成方法。
【請求項９】
前記基質（Ｂ）が、ヒドロキシルアミンである請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒドラジン合成方法。
【請求項１０】
前記ヒドラジン合成方法が、還元剤存在下にて行われることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒドラジン合成方法。
【請求項１１】
サブユニットのタンパク質が、下記（イ´）、（ロ´）または（ハ´）の少なくとも一つのタンパク質であり、下記タンパク質（２ａ）および下記タンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であることを特徴とするヒドラジン合成用のヒドラジン合成酵素（ＩＩ）。
（イ´）タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ロ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質
（ハ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１２】
ヒドラジン合成用の酵素が、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であることを特徴とするヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素触媒を用いたヒドラジンの合成方法に関するものである。より詳しくは、当該酵素触媒としてはＡｎａｍｍｏｘ菌に由来し、酵素触媒反応によりヒドラジンを得ることができるヒドラジンの合成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドラジンは、ロケット燃料、燃料電池等に使用される有用な化学物質であり、従来から、アンモニアと次亜塩素酸ソーダを加熱し、高温下で化学合成することにより製造されているが、この方法は、エネルギーの多量投入を必要とし、より温和な条件でヒドラジンを合成する方法の開発が望まれていた。
【０００３】
高温下での化学合成によらないヒドラジンの合成に関連する方法として、微生物や酵素触媒を用いる方法が考えられる。近年、嫌気性アンモニア酸化菌（Ａｎａｍｍｏｘ菌）が、嫌気的な条件で、アンモニアを脱窒することが注目されている。一般的に、微生物等により有機窒素（Ｏｒｇ−Ｎ）やアンモニアを、無機物である窒素に生体内で窒素循環する過程は、アンモニアを亜硝酸や硝酸に好気性の条件下で変換させる硝化反応と、その亜硝酸や硝酸を窒素ガスに嫌気性の条件下で変換させる脱窒反応のプロセスを経ていると考えられていた。この窒素循環は、好気性の条件と嫌気性の条件の場が必要なものであった。しかし、前述のＡｎａｍｍｏｘ菌は、嫌気性の条件下のみでもアンモニアを窒素に変換する嫌気性アンモニア酸化反応を行うことが知られている。この嫌気性アンモニア酸化反応においては、中間体としてヒドラジンが合成されていると考えられている（図１参照）。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ）の細胞に外部からアンモニウム塩と亜硝酸塩（安定同位体の15Ｎからなる15ＮＯ2-）、およびヒドラジン（28Ｎ2Ｈ4）を加えたところ、29Ｎ2Ｈ4の生成が認められたことが記載されている。すなわち、Ａｎａｍｍｏｘ菌はその脱窒工程でヒドラジン合成を行っており、ｉｎ  ｖｉｖｏでアンモニウム塩と亜硝酸塩の窒素原子がカップリングし、ヒドラジンが合成されることが確認されている。そして、Ａｎａｍｍｏｘ菌が有するタンパク質を解明し、特定の酵素にヒドラジン合成酵素（ＨＺＳ）と命名されている。しかし、ＨＺＳの名称は上述の反応における推定機能から命名されたものであって、この酵素のみによってヒドラジン合成を触媒することができることは証明されていない。
【０００５】
さらに、Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓの前記ＨＺＳと電子受容体のＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃを用いて、アンモニウム塩と一酸化窒素（ＮＯ）から中間体のヒドラジンを経由し、窒素ガスが生成されたことが記載されている。しかし、これらの研究において、中間体と推定されるヒドラジン自体の濃度上昇は確認されておらず、微生物や酵素を用いてヒドラジンを製造する方法は知られていなかった。
【０００６】
非特許文献２には、Ａｎａｍｍｏｘ菌から見出されたタンパク質ＮａｘＬＳの配列等が特定されているが、その具体的な用途については記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation, BoranKartal etal, Nature 479,127-130(2011)
【非特許文献２】A heterodimeric cytochrome c complex with a very low redoxpotential from ananaerobic ammonium-oxidizing enrichment culture, S.Ukita etal, FEMS Microbiol Lett313,61-67(2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のヒドラジンの合成方法は、高温による加熱等の処理を必要とする化学合成方法等によるものであった。一方、微生物によるヒドラジン合成の可能性について前記非特許文献１にみられるように研究されてきたが、ヒドラジンを効率よく合成していることが確認されているものはなかった。また、上記非特許文献１で中間体のヒドラジンから窒素ガスが生成されたとしても、窒素ガス生成から求まるヒドラジンの合成速度（ＨＺＳの分子活性）は非常に小さい値と推定されていた。かかる状況下、本発明は、特定の酵素触媒を用いて、ヒドラジンを合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、
酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質が、下記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つのタンパク質であり、
当該酵素触媒が、下記タンパク質（１ａ）、タンパク質（１ｂ）およびタンパク質（１ｃ）のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ）と、
下記タンパク質（２ａ）およびタンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）を用いるヒドラジン合成方法。
（イ）タンパク質（１ａ）は配列番号１、タンパク質（１ｂ）は配列番号２、タンパク質（１ｃ）は配列番号３、タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ロ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質
（ハ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
＜２＞  前記酵素触媒が、上記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つの酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質をコードする遺伝子から発現したタンパク質によってなる組み換えヒドラジン合成酵素（Ｉ）と組み換えヒドラジン合成酵素（ＩＩ）である前記＜１＞記載のヒドラジン合成方法。
＜３＞  酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質である基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、
当該酵素触媒として、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、
Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とを用いるヒドラジン合成方法。
＜４＞  前記酵素（Ｉ´）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子質量が、９１．５〜９６．５ｋＤａ、４０．５〜４５．５ｋＤａ、３４．５〜３９．５ｋＤａであり、前記酵素（ＩＩ´）をトリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子質量が、１１〜１７ｋＤａ、８〜１４ｋＤａである前記＜３＞記載のヒドラジン合成方法。
＜５＞  酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）が、前記Ａｎａｍｍｏｘ菌の細胞を破砕後、遠心分離し、その上澄みを塩析後、遠心分離し、得られる上澄みを疎水カラムクロマトグラフィーにより精製したものである前記＜３＞または＜４＞に記載のヒドラジン合成方法。
＜６＞  前記酵素（Ｉ´）および（ＩＩ´）が、前記疎水カラムクロマトグラフィーにより精製したとき、波長２８０ｎｍにおける吸光度と、波長４０８ｎｍにおける吸光度とをモニタリングすることで確認されるヘムタンパク質の、第一のピーク周辺の画分と、第二のピーク周辺の画分とから得られる酵素である前記＜５＞記載のヒドラジン合成方法。
＜７＞  酵素（ＩＩ´）が、難還元性であり、かつ、酵素（Ｉ´）が、還元型としたとき、ｃ型ヘムタンパク質に特徴的なα帯、β帯およびソーレ帯に吸光極大を有するものである前記＜３＞〜＜６＞のいずれかに記載のヒドラジン合成方法。
＜８＞  緩衝液としてトリス塩酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液あるいはＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いてヒドラジンの合成を行う前記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のヒドラジン合成方法。
＜９＞  前記基質（Ｂ）が、ヒドロキシルアミンである前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のヒドラジン合成方法。
＜１０＞  前記ヒドラジン合成方法が、還元剤存在下にて行われることを特徴とする前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のヒドラジン合成方法。
＜１１＞  サブユニットのタンパク質が、下記（イ´）、（ロ´）または（ハ´）の少なくとも一つのタンパク質であり、下記タンパク質（２ａ）および下記タンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成用のヒドラジン合成酵素（ＩＩ）。
（イ´）タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ロ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質
（ハ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
＜１２＞  ヒドラジン合成用の酵素が、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特定の酵素を用いることで、高温の加熱等の処理を必要とせず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒドラジンを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】自然界の生物地球科学的窒素循環の概要を示す図である。
【図２】本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）をゲル濾過クロマトグラフィーで分画するときの吸光度のモニタリング例である。
【図３】本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）をゲル濾過クロマトグラフィーで分画するときの吸光度のモニタリング例である。
【図４】本発明のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）（ＮａｘＬＳ）の立体構造模式図である。
【図５】本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）およびその還元型のヘムタンパク質を含有する精製液の吸光スペクトルである。
【図６】本発明のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）およびその還元型のヘムタンパク質を含有する精製液の吸光スペクトルである。
【図７】本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分子質量測定したときの測定結果例である。
【図８】本発明のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分子質量測定したときの測定結果例である。
【図９】本発明のヒドラジン合成方法により、ヒドラジンが合成されていることを確認するためのＴＯＦ−ＭＳ試験を行ったときの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を超えない限り、以下の内容に限定されない。尚、本発明において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。
【００１４】
本発明は、酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、
酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質が、下記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つのタンパク質であり、
当該酵素触媒が、下記タンパク質（１ａ）、下記タンパク質（１ｂ）および下記タンパク質（１ｃ）のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ）と、
下記タンパク質（２ａ）および下記タンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）を用いることを特徴とするヒドラジン合成方法；
（イ）タンパク質（１ａ）は配列番号１、タンパク質（１ｂ）は配列番号２、タンパク質（１ｃ）は配列番号３、タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ロ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質；（ハ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質に係るものである。この合成方法により、ヒドラジンを酵素触媒作用で生合成することができる。
【００１５】
また、本発明は、酵素触媒を用いて、アンモニウム塩からなる基質（Ａ）と、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法であって、当該酵素触媒として、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とを用いることを特徴とするヒドラジン合成方法に係るものである。
【００１６】
すなわち、本発明は、基質（Ａ）と基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成する方法である。以下、各基質について説明する。基質（Ａ）としては、アンモニウム塩を用いる。ここで、アンモニウム塩とは、アンモニアと酸との結合によって生じる塩であって、具体的には塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。本発明の合成方法は、一般的に水溶液中で行われるため、水溶液中でアンモニウムイオンとして解離しやすく、溶解したときにｐＨが極端に変化しにくいものが好ましく用いられる。また、水溶液中等で有機窒素が微生物等により分解されアンモニウムイオンとして存在しているアンモニウムイオンを基質として用いてもよく、アンモニウムイオンを含めて本発明の基質（Ａ）であるアンモニウム塩と呼ぶ。
【００１７】
本発明の基質（Ｂ）としては、ヒドロキシルアミン、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素からなる群から選択される少なくとも一つの基質を用いることができる。基質（Ｂ）として選択されるこれらの物質は、Ａｎａｍｍｏｘ菌の生成する酵素によって硝酸イオンを還元することで生成される物質であって、特にＡｎａｍｍｏｘ菌が脱窒する工程に関連性が高い物質である。これらのなかでも、ヒドロキシルアミンを用いることで、本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）、およびヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）の酵素によって効率よくヒドラジンを合成することができるため好ましい。その他の、硝酸塩、亜硝酸塩および一酸化窒素を用いる場合、他の化学的方法や酵素触媒作用等によって、ヒドロキシルアミンに転換する工程を設けることが好ましい。なお、このヒドロキシルアミンに転換する工程は、ヒドラジンを合成する反応と同一の場（一般的には水溶液中）で行っても良い。酵素触媒作用によってヒドロキシルアミンに転換する酵素としては、例えば、ヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）、亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）等が挙げられる。
【００１８】
前述したように、本発明においては、基質（Ｂ）として、ヒドロキシルアミンを用いることが好ましい。本発明者らは、ヒドロキシルアミンを用いることで、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）、およびヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）によって効率的に製造することができることを見出した。
【００１９】
また、本発明においては、還元剤存在下にて、ヒドラジンの合成を行うことが好ましい。すなわち、本発明のヒドラジン合成反応を行う反応の場に還元剤を存在させた状態で行うことが好ましい。より具体的には、本発明は主に基質、酵素等を混合させた液中で行われるが、この液に還元剤を混合することで、還元剤存在下の状態とすることができる。この還元剤を反応の場に混合した状態でヒドラジン合成することで、より高い効率でヒドラジンを合成することができる。
【００２０】
この還元剤としては、ヒドラジン合成を阻害するものでなければよく、公知の無機系、有機系いずれの還元剤も用いることができる。具体的な還元剤としては、亜ジチオン酸ナトリウム（ジチオナイト）や、チオグリコール酸又はその塩、グリセリンモノチオグリコレート、２−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトエチルアミン、チオ乳酸、チオグリセリン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、ヒドロキノン、ベンジルビオロゲンまたはメチルビオロゲン等を用いることができ、いずれか単独、または適宜組み合わせて用いてもよい。還元剤は、ヒドラジン合成の場となる水溶液に分散するように水溶性のものを用いることが好ましい。また、比較的低い標準酸化還元電位を有する還元剤であることが好ましく、標準酸化還元電位が−３００ｍＶ以下、−７５０ｍＶ以上の還元剤が特に好ましい。好ましく用いられる還元剤としては、有機系で水溶性であり、標準酸化還元電位が前述の範囲のものが好ましく、具体的にはジチオナイトが好ましい還元剤としてあげられる。還元剤の添加量は、その標準酸化還元電位や、ヒドラジン合成反応に用いる基質や酵素に応じて適宜設定されるが、例えば、ヒドラジン合成の反応の場となる溶液中（使用時濃度）に、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度とすることができる。還元剤の濃度が低い場合、ヒドラジン合成活性が向上しにくい場合がある。還元剤としてジチオナイトを用いる場合、その使用時濃度の下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、３ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましい。またその使用時濃度の上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。
【００２１】
基質（Ｂ）は、前述のように、Ａｎａｍｍｏｘ菌の生成する酵素によって亜硝酸イオンを還元することで生成される物質であって、特にＡｎａｍｍｏｘ菌が脱窒する工程に関連性が高い物質である。ここで、この基質（Ｂ）は、基質（Ａ）であるアンモニウム塩と、本願発明のヒドラジン合成酵素との存在下でヒドラジンとなるものであるが、ヒドラジンの窒素原子の酸化数−２に対して、一酸化窒素の窒素原子の酸化数は＋２であることから還元を補助することが有効に機能するものと考えられる。また、本発明において見出されたヒドラジン合成に用いられるタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）および（ＩＩ´）は、難還元性を有するが、前述した還元剤によって僅かに還元され、還元型の酵素（ＩＩ）や（ＩＩ´）がヒドラジン合成酵素（Ｉ）や（Ｉ´）の低い標準酸化還元電位を持つ補欠分子族のヘムに電子をわたす事ができ、（Ｉ）や（Ｉ´)がより有効に機能するものと考えられる。よって、酸化数がヒドラジンの窒素原子の酸化数に近いヒドロキシルアミンを基質として用いる場合でもヒドラジン合成効率が向上するものと考えられる。
【００２２】
本発明の合成方法は、酵素触媒として、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）とを併せて用いることを特徴とする。
本発明に用いるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とはＡｎａｍｍｏｘ菌より得ることができ、ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）はヘテロ３量体ヘムタンパク質の酵素であり、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）はヘテロ２量体ヘムタンパク質の酵素である。
一方、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）とヒドラジン合成酵素（ＩＩ）とは、Ａｎａｍｍｏｘ菌より得られるものと同一の塩基配列、または一定の同一性等の要件を満たすように製造されたタンパク質から得ることができる酵素である。
【００２３】
［ヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）（ＨＺＳ）］
ヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）は、ヒドラジン合成酵素と推定される酵素（ＨＺＳ）として知られていて、前述の非特許文献１等にも開示されていたものである。本発明においては、酵素触媒の一つとして、このヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）を用いることを特徴とする。
【００２４】
［ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）（ＮａｘＬＳ）］
ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）は、Ａｎａｍｍｏｘ菌のタンパク質として、前述の非特許文献２等にも開示されていたが、その機能、用途が不明だったものである。本発明においては、酵素触媒の一つとして、このヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）を用いることを特徴とする。
このヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）は、ヘテロ２量体ヘムタンパク質の酵素であって、各タンパク質のユニットは、ＮａｘＬ、ＮａｘＳとして知られているものである。なお、ヘテロ２量体ヘムタンパク質全体をＮａｘＬＳと呼ぶ場合もある。
【００２５】
本発明では、特に、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）（または（Ｉ´））と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）（または（ＩＩ´）とを組み合わせて、特定の基質を用いて酵素触媒反応をすることでヒドラジンが合成され、合成されたヒドラジンは単に中間体として存在するのみでなく、水溶液中でその濃度が上昇することから、生産方法として利用できる。
【００２６】
ここで、本発明は、酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質が、下記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つのタンパク質であり、かつ、当該酵素触媒が、下記タンパク質（１ａ）、下記タンパク質（１ｂ）および下記タンパク質（１ｃ）のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ）と、下記タンパク質（２ａ）および下記タンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）を用いることを特徴とするヒドラジン合成方法である。ここで、（イ）タンパク質（１ａ）は配列番号１、タンパク質（１ｂ）は配列番号２、タンパク質（１ｃ）は配列番号３、タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ロ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質；（ハ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２７】
すなわち、例えば、タンパク質（１ａ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドロキシルアミンヒドラジン合成活性を有するタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質に対して、同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質の少なくともいずれか一つであり、（ロ）と（ハ）とを同時に満足することもできるし、（ハ）において同一性が１００％のときはまさに（イ）も同時に満足するものである。タンパク質（１ａ）はこのように配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ロ）、（ハ）のように配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と所定の関係を有するタンパク質を包括的に表現した概念であり、他の、タンパク質（１ｂ）、（１ｃ）、（２ａ）、（２ｂ）もそれぞれ対応する配列番号からなるタンパク質および、それと所定の関係を有するタンパク質を包括する概念として、それぞれ表現されたものである。
【００２８】
本発明の酵素触媒は、複数のサブユニットのタンパク質からなる。すなわち、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）は３量体ヘムタンパク質であり、３つのサブユニットのタンパク質からなり、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）は２量体ヘムタンパク質であり、２つのサブユニットのタンパク質からなる。
【００２９】
本発明に用いるヒドラジン合成酵素（Ｉ）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）とは、以下の要件（イ）を満足するサブユニットのタンパク質から構成される酵素とすることができる。すなわち、（イ）タンパク質（１ａ）は配列番号１、タンパク質（１ｂ）は配列番号２、タンパク質（１ｃ）は配列番号３、タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３０】
配列番号１で表されるタンパク質、配列番号２で表されるタンパク質および配列番号３で表されるタンパク質は、後述するＡｎａｍｍｏｘ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＳＵ−１（以下、「Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１」と略記する。）由来のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）からアミノ酸配列を特定したものである。配列番号４で表されるタンパク質、配列番号５で表されるタンパク質は、後述するＡｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１由来のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）からアミノ酸配列を特定したものである。
【００３１】
配列番号１、２、４、５で表されるアミノ酸配列のタンパク質は、それぞれｃ型ヘム結合モチーフを有しており、これらのアミノ酸配列のタンパク質にヘム結合してなるヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）は、いずれも酵素として機能するときは、ヘムタンパク質からなる酵素である。
【００３２】
さらに、本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）は、「（ロ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質」または、「（ハ）上記（イ）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質」のように、それぞれの３量体ヘムタンパク質や、２量体ヘムタンパク質としたときヒドラジン合成の酵素活性を有するものとしても達成することができる。前述のように、配列番号１、２、３、４、５とで表されるタンパク質はＡｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１株から特定したヒドラジン合成酵素の配列であるが、他のＡｎａｍｍｏｘ菌も、同様に各々のヒドラジン合成酵素を有しており、また、生体由来に限定されることなく同様のアミノ酸配列を有するタンパク質としても達成することができる。特に、欠失、置換もしくは付加される場合、本タンパク質のヘムとの結合性に影響を与える配列は同一であることが好ましく、その他の部分で欠失、置換、付加が許容される。より具体的には、公知の、他の菌株由来のヒドラジン合成酵素と推定されてきたタンパク質配列や、本発明により開示されるヒドラジン合成酵素（ＩＩ）および（ＩＩ´）に相当するタンパク質配列とを比較し、その共通性が低いところについては、欠失、置換、付加が許容される傾向がある。
【００３３】
また、上記（ハ）において、配列番号１、２、３、４および５で表されるタンパク質との同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｙ）は、それぞれ対応する配列番号のタンパク質と５５％以上であり、６０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。配列番号１〜５で表されるタンパク質は、前述したようにＡｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１から特定されたアミノ酸配列であり、他の菌株であるＡｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓのタンパク質から特定されたアミノ酸配列との同一性が８４〜５９％（サブユニットにより異なる）である。また、これらのアミノ酸配列は、アミノ酸数として１２６〜８１０と比較的長く、これらとの同一性が３０％以上であるタンパク質は、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来でヒドラジン合成酵素と推定されてきたタンパク質しか発見されていない特徴的なアミノ酸配列である。一般的に、この程度の配列長があるタンパク質の場合、同一性が４０％以上であれば、同様の機能を奏することが期待される。なお、本発明においてアミノ酸配列の同一性を求めるアルゴリズムとしては、この分野で汎用されているアルゴリズムの一つであるＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)を用いた。
【００３４】
より具体的には、Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ由来のタンパク質である配列番号６、７、８で表されるタンパク質と、配列番号１、２、３との同一性はそれぞれ、８２％、８４％、７９％である。また、配列番号６、７、８で表されるタンパク質も、Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ内で脱窒反応における中間体のヒドラジンを合成するヒドラジン合成酵素であり、本発明のヘテロ３量体ヘムタンパク質の酵素として、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）として使用することができる。
【００３５】
また、Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ由来のタンパク質として、配列番号９、１０が挙げられ、これらのタンパク質と、配列番号４、５との同一性はそれぞれ、７５％、５９％である。また、配列番号９、１０で表されるタンパク質も、ヘテロ２量体ヘムタンパク質の酵素として、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）として使用することができる。
【００３６】
また、酵素触媒を構成するサブユニットのタンパク質は、下記（イ）、（ロ）または（ハ）の少なくとも一つの条件を満たせばよいが、（ロ）の要件と（ハ）の要件を同時に満たし、上記（イ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつそれぞれのタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質とするものであることが好ましい。
【００３７】
ヒドラジン合成酵素（Ｉ）、（ＩＩ）に示すタンパク質の製造方法について特に制限はなく、生体由来のもの、遺伝子組み換え法によりＥ．Ｃｏｌｉ等の微生物に産生させたもののいずれも使用できる。
【００３８】
上記ヒドラジン合成酵素（Ｉ）の上記（イ）、（ロ）または（ハ）のタンパク質（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（２ａ）、（２ｂ）をコードする遺伝子から発現したタンパク質によってなる組み換えヒドラジン合成酵素（Ｉ）とヒドラジン合成酵素（ＩＩ）とを用いることができる。各タンパク質をコードする遺伝子の例として、配列番号１１〜１５があげられる。この配列番号１１〜１５、前述のＡｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１株から抽出したヒドラジン合成酵素の合成に関する遺伝子として特定されたものである。配列番号１１〜１５で示すＤＮＡの塩基配列は、それぞれコードする遺伝子のｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔの配列である。配列番号１１がタンパク質（１ａ）の一つである配列番号１に、配列番号１２がタンパク質（１ｂ）の一つである配列番号２に、配列番号１３がタンパク質（１ｃ）の一つである配列番号３に、配列番号１４がタンパク質（２ａ）の一つである配列番号４に、配列番号１５がタンパク質（２ｂ）の一つである配列番号５に対応する。
【００３９】
なお、本発明の配列番号１〜５および１１〜１５で表される、Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１株のアミノ酸および遺伝子の配列は、核酸データベースにＢＡＦＨ０１０００００４の番号で、登録されている。配列番号１および１１は「ＧＡＢ６３７４８  ＫＳＵ１Ｄ＿４３９  （ＺＰ  １０１００８６７）」、配列番号２および１２は「ＧＡＢ６３７４９  ＫＳＵ１ｄ＿４４０  （ＺＰ  １０１００８６８）」、配列番号３および１３は「ＧＡＢ６３７５０  ＫＳＵ１Ｄ＿４４１  （ＺＰ  １０１００８６９）」、配列番号４および１４は、「ＧＡＢ６３５４７  ＫＳＵ１ｄ＿２３８  （ＺＰ  １０１００６６６）」、そして配列番号５および１５は「ＧＡＢ６３５４８  ＫＳＵ１ｄ＿２３９  （ＺＰ  １０１００６６７）」として登録されている。
【００４０】
また、本発明は、酵素触媒として、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ３量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（Ｉ´）と、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とを用いる態様でも達成することができる。
【００４１】
本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）および（ＩＩ´）は、Ａｎａｍｍｏｘ菌から得ることができるＡｎａｍｍｏｘ菌由来の酵素である。ここでＡｎａｍｍｏｘ菌とは、嫌気性アンモニア酸化反応（ａｎａｅｒｏｂｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を行う菌の総称である。Ａｎａｍｍｏｘ菌は単離培養されておらず、一般的には集積培養したＡｎａｍｍｏｘ汚泥を不織布に付着させて、連続培養したものから、Ａｎａｍｍｏｘ菌が優先的に培養されているＡｎａｍｍｏｘ菌優先汚泥として得ることができる。Ａｎａｍｍｏｘ菌としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ（本明細書中では、通称である「Ａｎａｍｍｏｘ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ」と記載することがある。）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｊｅｔｔｅｎｉａ  ａｓｉａｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｎａｍｍｏｘｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｂｒｏｃａｄｉａ  ａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓが挙げられる。
【００４２】
また、海水中に存在するＡｎａｍｍｏｘ菌として、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｂｒｏｄａｅ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｗａｇｎｅｒｉが挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明者らが有するＡｎａｍｍｏｘ菌の株であるＡｎａｍｍｏｘ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＳＵ−１（「Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１」と略記することがある。）、Ａｎａｍｍｏｘ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＲＷ−１（「Ａｎａｍｍｏｘ  Ａｓａｈｉ  ＢＲＷ−１」と略記することがある。）等が挙げられる。
【００４４】
これらの中でも、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｊｅｔｔｅｎｉａ  ａｓｉａｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｎａｍｍｏｘｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｂｒｏｃａｄｉａ  ａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓ、Ａｎａｍｍｏｘ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＳＵ−１、Ａｎａｍｍｏｘ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＲＷ−１由来のヒドラジン合成酵素は、海水中に存在するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｂｒｏｄａｅ、等と異なり、塩化ナトリウム濃度が低い水溶液中で反応しやすいヒドラジン合成酵素を有していると考えられるため好ましく用いられる。より好ましくは、Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１、Ａｎａｍｍｏｘ  Ａｓａｈｉ  ＢＲＷ−１由来のヒドラジン合成酵素を用いることができる。なお、Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１、Ａｎａｍｍｏｘ  Ａｓａｈｉ  ＢＲＷ−１は、後述するように学校法人君ヶ淵学園崇城大学生物生命学部内にて馴養されており入手することができる。
また、これらの単独の菌由来の酵素として用いても良いし、組み合わせて用いてもよい。ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）とヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とは、それぞれの酵素同士の補完関係が高くなるため、同一の菌由来の酵素を用いた方がよい。
【００４５】
本発明のヒドラジン合成酵素は、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のタンパク質であって、ヒドラジン合成活性を有する。
【００４６】
本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）はｃ型ヘム結合モチーフが存在し、ｃ型ヘムタンパク質である。また、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）にもｃ型ヘム結合モチーフが存在し、ｃ型ヘムタンパク質である。
【００４７】
酵素（Ｉ´）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）により測定した分子質量は、９１．５〜９６．５ｋＤａ（代表値は９４ｋＤａ）のタンパク質と、４０．５〜４５．５ｋＤａ（代表値は４３ｋＤａ）のタンパク質と、３４．５〜３９．５ｋＤａ（代表値は３７ｋＤａ）のタンパク質のヘテロ３量体である。酵素（ＩＩ´）のトリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した分子質量は、１１〜１７ｋＤａ（代表値は１４ｋＤａ）のタンパク質と、８〜１４ｋＤａ（代表値は１１ｋＤａ）のタンパク質のヘテロ２量体である。酵素（Ｉ´）の分子質量の測定は、当業者が通常行うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定することができる。一方、見かけの分子質量が小さい酵素（ＩＩ´）の分子質量の測定は、当業者が通常行う、陰極側電極液にトリシンを用いるトリシン  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行うことができる。酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）の各タンパク質の分子質量は、酵素の由来となるＡｎａｍｍｏｘ菌の種や属、株、またタンパク質のアミノ酸配列等によって幅があるが、概ね、上記範囲のヘテロ３量体またはヘテロ２量体として、各々の分子質量が求まる。なお、酵素（ＩＩ´）のサブユニットを構成するタンパク質の分子質量は、Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したとき、分子量マーカーとの位置関係で値が変わることがあるが、それぞれサブユニットのタンパク質の分子質量差は、約３ｋＤａであり、ヘテロ２量体として確認することができる。
【００４８】
また、本発明のヒドラジン合成酵素を構成する各タンパク質の分子質量を、それぞれの遺伝子配列からわかる、アミノ酸配列から求めた値を表１に示す。このように、酵素の由来となる種や属、株によって分子質量は変化するし、また、アミノ酸の欠失、置換、付加さらには、同一性の程度によっても変化する。なお、前述のように、本発明のヒドラジン合成酵素を構成するタンパク質は、ヘムタンパク質のため、アミノ酸配列から求められる分子質量に、ヘムの分子質量を追加したものがそのヘムタンパク質としての分子質量となる。本発明において、このアミノ酸配列からなる分子質量は、好ましくは、酵素（Ｉ）および酵素（Ｉ´）を構成するタンパク質のサブユニットは、ヘムの分子質量を併せて、８９．６〜９３．６ｋＤａ、３７．５〜４１．５ｋＤａ、３９．２〜４３．２ｋＤａであり、酵素（ＩＩ）および酵素（ＩＩ´）を構成するタンパク質のサブユニットは１４．８〜１６．８ｋＤａ、１３．３〜１５．３ｋＤａである。
【００４９】
【表１】
2014207879.tif 000003
※表１において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓを“Ｋｕｅｎｅｎｉａ”と略記する。
【００５０】
本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）はＡｎａｍｍｏｘ菌から得ることができるタンパク質であるが、後述するような精製方法で得るとき、精製過程に疎水カラムクロマトグラフィーを用いた場合、いずれの画分に含まれるタンパク質であるかを確認することが重要となる。図２に示すように、それぞれの画分中にタンパク質が含まれるかを確認する方法としては、前記酵素（Ｉ´）および（ＩＩ´）が、前記疎水カラムクロマトグラフィーにより精製したとき、波長２８０ｎｍにおける吸光度と、波長４０８ｎｍをモニタリングすることで確認されるヘムタンパク質の、第一のピーク周辺の画分と、第二のピーク周辺の画分とから得られる酵素であることで確認する方法がある。タンパク質を含むことを確認するときによく用いられる波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ280）と、本発明の酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）とがヘムタンパク質であることからヘムの有無を観察することに適した波長４０８ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ408）をモニタリングすることで確認するものである。このとき、後述するような疎水カラムクロマトグラフィーを用いて精製するときは、Ａｂｓ280とＡｂｓ408が併せて高くなり始める変異点付近の第一のピーク周辺の画分（図２中、ｉｉで示す）に酵素（ＩＩ´）は多く含まれ、Ａｂｓ280とＡｂｓ408とが併せて特徴的なピークを示す第二ピーク付近の画分（図２中、ｉで示す）に酵素（Ｉ´）は多く含まれる。よって、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のタンパク質を、疎水カラムクロマトグラフィーを用いて精製するときは、Ａｂｓ280とＡｂｓ408が高くなり始める変異点（または図３中、ｉｉに示すように明確なピークと観察される）付近を第一のピーク、第一のピークの次にＡｂｓ２８０とＡｂｓ４０８とがともに特徴的なピークを示す付近を第二のピークとして、酵素（ＩＩ´）、酵素（Ｉ´）を得ることができる。
【００５１】
本発明のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）は、難還元性のヘムタンパク質であることを確認することができる。ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）が難還元性であることを確認する方法としては、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の精製液中にジチオナイトを添加したときの吸光スペクトルから確認することができ、具体的には酸化型のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の精製液の吸光スペクトルを観察したとき波長約４１９ｎｍにみられる特徴的なピークがジチオナイト添加後もほとんど変化しないことから確認する方法がある（図６のスペクトル参照）。これは、前述の非特許文献２においても記載されており、ヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）（非特許文献においてはＮａｘＬＳ）のそれぞれのサブユニットであるタンパク質のヘムがタンパク質内でヒスチジンとシステイン側鎖によって６配位した立体構造を有していることと併せて詳述されている（図４参照）。
【００５２】
本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）は、還元型でα帯、β帯およびソーレ帯に吸光極大を有する（ピークが現れる）ことを確認することができる。すなわち、図５に示すスペクトル図のように、酸化型の酵素（Ｉ´）は４０８ｎｍにあったピークが、ジチオナイトにより還元した還元型では４１９ｎｍにピークがシフトし、さらに波長５２３ｎｍ付近（α帯）および波長５５３ｎｍ（β帯）にピークが現れることから確認することができる。
【００５３】
［酵素を得る方法］
生体由来の方法で、本発明のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）を得る場合、嫌気性アンモニア酸化菌（Ａｎａｍｍｏｘ菌）より得ることができる。例えば、嫌気性アンモニア酸化菌を培養（馴養）した汚泥を原料とし、細胞膜を破壊、遠心分離、塩析処理、液体クロマトグラフィーによる分画等の処理を行うことで精製された嫌気性アンモニア酸化菌のタンパク質からヒドラジン合成酵素（Ｉ´）およびヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）をそれぞれ得ることができる。
【００５４】
本発明のヒドラジン合成酵素を精製する具体的な方法を以下に詳述する。
Ａｎａｍｍｏｘ菌を含む汚泥（以下、「Ａｎａｍｍｏｘ汚泥」と略記する。）の馴養は、集積培養したＡｎａｍｍｏｘ汚泥を不織布等に付着させて連続培養する等の方法で馴養されている。具体的には、亜硝酸とアンモニアを主成分とする脱気した無機培地を連続的に供給するリアクター内で選択的に培養することができる。例えば、Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１株の場合、馴養が進むとリアクター内が赤色になる。Ａｎａｍｍｏｘ菌は、前述のように、単独で培養することができていない菌だが、このような方法で馴養することでＡｎａｍｍｏｘ菌優占の汚泥を得ることができる。
【００５５】
Ａｎａｍｍｏｘ汚泥内のＡｎａｍｍｏｘ菌の細胞の破壊は、例えば、超音波処理や乳鉢によりすりつぶすことで行うことができる。具体的には、Ａｎａｍｍｏｘ汚泥に無細胞抽出液調製用緩衝液を加え、超音波処理し汚泥をほぼ均一なペースト状とし、その後、乳鉢ですりつぶし、さらに超音波処理することで、細胞を破壊したものとすることができる。
【００５６】
細胞を破壊した後、遠心分離することで、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のタンパク質を含む細胞抽出液の上澄み（無細胞抽出液）とすることで、本発明に用いるタンパク質と細胞残渣等とをより効率的に分離することができる。
【００５７】
さらに、上記無細胞抽出液を、硫酸アンモニウム等で塩析処理し、撹拌後、遠心分離することで、不純物を沈殿させることで除去し、さらに、目的とするヒドラジン合成酵素（Ｉ´）やヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）といったタンパク質の濃度が高い上澄み（高タンパク質抽出液）を得ることができる。
【００５８】
この高タンパク質抽出液を、疎水カラムクロマトグラフィー等により分画することで、精製されたヒドラジン合成酵素（Ｉ´）やヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）をそれぞれ得ることができる。それぞれのタンパク質が含まれる画分かを確認するためには、ヘムの吸光度（Ａｂｓ４０８）と、タンパク質の吸光度（Ａｂｓ２８０）とをそれぞれモニタリングすることで確認することができ、十分に条件を確立したのちは、単純に分画のナンバーで管理することもできる。
【００５９】
さらに、疎水カラムクロマトグラフィーにより分画された画分を、さらに遠心濾過器で濃縮や、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することでより高濃度に精製されたヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とすることができる。
【００６０】
精製条件にもよるが、疎水カラムクロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等によって精製されたタンパク質の各画分に、ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）が含まれるか否かは、簡易的には前述したような波長４１９ｎｍにおける吸光度を測定することや、ヘムタンパク質であることからＡｂｓ２８０やＡｂｓ４０８を測定することにより確認できる。
【００６１】
より正確に確認する方法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察したとき、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）は、前述したようにＴｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、代表値として１４ｋＤａ、１１ｋＤａの位置にバンドがみられる。なお、このことからも、当該酵素はヘテロ２量体ヘムタンパク質であることが確認できる。一方、ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）は代表値として９４ｋＤａ、４３ｋＤａ、３７ｋＤａにバンドが確認される。なお、このことからも、当該酵素ヘテロ３量体ヘムタンパク質であることが確認できる。
【００６２】
本発明のヒドラジン合成酵素（ＩＩ）および（ＩＩ´）は、機能未知のアミノ酸配列のみが特定されたタンパク質であった。本発明においては、これらのタンパク質の未知の特性を見出したものである。また、これらの酵素は単独でも一定のヒドラジン合成活性を有する。すなわち、本発明は、「サブユニットのタンパク質が、下記（イ´）、（ロ´）または（ハ´）の少なくとも一つのタンパク質であり、下記タンパク質（２ａ）および下記タンパク質（２ｂ）とのヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成用のヒドラジン合成酵素（ＩＩ）。（イ´）タンパク質（２ａ）は配列番号４、タンパク質（２ｂ）は配列番号５でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ロ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒドラジン合成酵素（ＩＩ）の構成によってヒドラジン合成活性を有するタンパク質；（ハ´）上記（イ´）において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列番号との同一性が５５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質」としても達成することができる。また、本発明は、Ａｎａｍｍｏｘ菌由来のヘテロ２量体ヘムタンパク質であるヒドラジン合成用のヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）としても達成することができる。
【００６３】
［酵素反応の条件］
本発明は、前述の特定の酵素触媒を用いて、基質（Ａ）と基質（Ｂ）とからヒドラジンを合成するヒドラジン合成方法である。本合成方法は、一般的に基質と酵素とを水溶液中に溶存させた状態で行うことができる。
【００６４】
本発明の合成方法を行う際、基質は、水溶液中に溶存させた状態で用いることが一般的であり、水溶液中で基質（Ａ）であるアンモニウムイオン（ＮＨ4+）と、基質（Ｂ）から必要に応じて転換等されて得られるヒドロキシルアミン（ＮＨ2Ｏ）として溶存している。
【００６５】
水溶液中における、これらの基質の濃度は、反応が進行する濃度であれば問わないが、たとえば、アンモニウムイオンとして５０〜５００μｍｏｌ／Ｌ、ヒドロキシルアミンとして５０〜１０００μｍｏｌ／Ｌ程度である。濃度が低すぎる場合、反応が進行しにくく、ヒドラジンの合成活性が低下する。一方、濃度は一定の濃度より高すぎても反応速度の向上に資さないことがある。
【００６６】
また、本発明のヒドラジン合成方法においては、当該反応を行う例えば水溶液中等に、ヒドラジン合成酵素（Ｉ）または（Ｉ´）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ）または（ＩＩ´）とが存在（溶存）する状態で行われる。これらの酵素の濃度は、反応溶液中でそれぞれ０．１〜５μｍｏｌ／Ｌ、１〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。酵素濃度が低すぎる場合、十分な合成速度を得ることができず、また、濃度が高すぎても合成速度は速くならないことがある。
【００６７】
本発明の方法を行う溶液のｐＨは、反応が進行すればよいが、本発明の酵素が好適に反応する至適ｐＨとして、６〜９が好ましく、より好ましくは、６．５〜８．５程度の中性付近であることが好ましい。
【００６８】
本発明の方法を行う温度は、タンパク質の変性等が生じず、酵素反応が進行すれば何度でもよいが、２０℃〜５０℃で行うことが好ましく、より好ましくは２５℃〜４０℃である。
【００６９】
ｐＨを安定させて、本発明の反応を安定して進行させるために、酵素反応を阻害しないような緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、ＭＯＰＳ緩衝液（ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ）、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等が好適に使用される。
【００７０】
［評価方法］ヒドラジンの検出
本発明により製造されるヒドラジンは、公知のヒドラジン検出方法により検出することができる。例えば、実施例に後述する、ヒドラジンとＤＭＢＡとがジアゾカップリング反応し、その生成物が波長４７０ｎｍに特徴的な吸光度を示すことを利用した光学的手法による検出法などがあげられる。
【００７１】
本発明の酵素反応によるヒドラジン合成方法を水溶液中で行った場合、水溶液中の製造されたヒドラジンを蒸留、ヒドラジン類の包接錯体を用いた分離方法（特開平１−１９２７１１号公報参照）等によって濃縮することで純度が高いヒドラジンを得ることができる。
【００７２】
本発明の製造方法により得られたヒドラジンは、燃料の推進薬等や、燃料電池（水素の代替物質、あるいは水素の貯蔵物質）、プラスチック成型時の発泡剤、エアバッグ起爆剤、脱酸素剤、防食剤等としても使用することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
［評価項目］
Ｎ2Ｈ4濃度の測定操作、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、トリシン  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの評価方法を、以下に示す。
【００７５】
１．Ｎ2Ｈ4濃度の測定操作（生成したＮ2Ｈ4の測定）
＜ヒドラジン濃度定量試薬＞
・４％  ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液（ＤＭＢＡ溶液）
ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（和光純薬社製）０．４ｇを、９９％エタノール１０ｍＬに溶解させ４重量％濃度のＤＭＢＡ溶液とした。
・１ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液
炭酸ナトリウム（株式会社同仁化学研究所製）を、純水に溶解させ濃度が１ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。
・酵素反応停止薬
濃度２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（和光純薬社製）と、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（株式会社同仁化学研究所製）の混合溶液を酵素反応停止薬として用いた。
＜操作方法＞
（１）反応終了溶液３００μＬに、トリクロロ酢酸２００μＬを加えることでタンパク質を変性させ反応を止めた。その後、遠心分離（１４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し変性したタンパク質の除去を行った。
（２）（１）の上清から２００μＬ取り、別のエッペンに移した。
（３）（２）に４％ＤＭＢＡ溶液１ｍＬを加えて混和した。（ＤＭＢＡを反応溶液中に添加することでＮ2Ｈ4とジアゾカップリング反応し、カップリング生成物の吸光度Ａ470（波長４７０ｎｍにおける吸光度）を測定することで、Ｎ2Ｈ4濃度を得ることができる。）
（４）常温で２０ｍｉｎインキュベートし、Ａ470を測定した。
【００７６】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、見かけの分子質量が大きい酵素（Ｉ）の分子質量を測定した。
【００７７】
３．Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
見かけの分子質量が小さい酵素（ＩＩ）の分子質量の測定は、トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行った。
【００７８】
［菌株的事項］
「Ａｎａｍｍｏｘ  Ａｓａｈｉ  ＢＲＷ」（以下、単に「ＢＲＷ」と略記することがある。）
Ａｎａｍｍｏｘ菌である、Ａｎａｍｍｏｘ  Ａｓａｈｉ  ＢＲＷは、学校法人君ヶ淵学園崇城大学生物生命学部内にて馴養しており、このＡｎａｍｍｏｘ汚泥（ＢＲＷ汚泥）を調製して用いた。
「Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１」（以下、単に「ＫＳＵ−１」と略記することがある。）
なお、Ａｎａｍｍｏｘ菌である、Ａｎａｍｍｏｘ  ＫＳＵ−１は、学校法人君ヶ淵学園崇城大学生物生命学部内にて馴養しており、このＡｎａｍｍｏｘ汚泥（ＫＳＵ−１汚泥）を調製して用いた。
【００７９】
［ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）の精製］
ＢＲＷ株とＫＳＵ−１株のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）、（ＩＩ´）の精製方法を以下に示す。
「使用試薬・機器」
＜Ａｎａｍｍｏｘ汚泥＞
・ＢＲＷ汚泥
・ＫＳＵ−１汚泥
【００８０】
＜疎水性カラムクロマトグラフィー＞
・ＴＯＹＯＰＥＡＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ
【００８１】
＜ゲルろ過カラムクロマトグラフィー＞
・Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ
・Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ
【００８２】
＜精製用バッファー＞
・Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ  調製バッファー
１００  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、２０％（ｗ／ｖ）グリセリンと、１ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦと、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡとを混合して調製した。
・ＴＯＹＯＰＥＡＬ  Ｂｕｔｙｌ  平衡化バッファー
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、１０％（ｗ／ｖ）グリセリンと、４０％飽和硫酸アンモニウムとを混合して調製した。
・ＴＯＹＯＰＥＡＬ  Ｂｕｔｙｌ  流出バッファー
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、１０％（ｗ／ｖ）グリセリンとを混合して調製した。
・ゲルろ過バッファー
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌとを混合して調製した。
【００８３】
＜超音波処理＞
Ａｓｔｒａｓｏｎ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ
【００８４】
＜濃縮＞
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＹＭ−５０
【００８５】
＜吸光度測定＞
分光光度計  ＭＰＳ−２４００（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製）
【００８６】
＜遠心分離＞
遠心分離機  Ａｖａｎｔｉ  ＨＰ−２５（ＢＥＣＫＭＡＮ製）
【００８７】
「実施例１」
精製工程１［無細胞抽出液（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ）の調製］
Ａｎａｍｍｏｘ汚泥としてＢＲＷ汚泥をビーカーに入れＣｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ調製バッファーを加え、Ａｎａｍｍｏｘ菌の細胞膜を超音波により破壊した。さらに、乳鉢を用いてすり潰し、超音波処理を行って細胞膜を破壊した。その後、細胞膜を破壊したＡｎａｍｍｏｘ汚泥を遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ、ＪＡ１４）し、無細胞抽出液（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ：遠心分離後の上澄み)を得た。
【００８８】
精製工程２［硫酸アンモニウムによる塩析］
前記無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを添加し塩析を行った。無細胞抽出液と混合後の、硫酸アンモニウム濃度が４０％飽和溶液となるように加え、添加後、３０分スターラーで攪拌した。攪拌後、遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、３０  ｍｉｎ、ＪＡ１４）を行い、その上澄みを用いて、次の段階である疎水カラムクロマトグラフィーによる精製を行った。
【００８９】
精製工程３［疎水カラムクロマトグラフィーによる精製］
オープンカラムに洗浄済ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍを詰め、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、４０％飽和硫酸アンモニウムと、１０％グリセリンで平衡化した。このカラムを用いてｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔを精製した。洗浄は５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）と、２０％グリセリンと、４０％飽和硫酸アンモニウムを用いた。５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、４０％飽和硫酸アンモニウムと５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、１０％グリセリンを用いてリニアグラジエント溶出を行った。各画分のスペクトルを分光光度計で測定しながらモニタリングを行った。
【００９０】
（精製液の特性：疎水カラムクロマトグラフィー）
硫酸アンモニウム上澄みを疎水カラムクロマトグラフィーによりグラジエントし、各画分のスペクトルを測り、ヘムの吸光度（Ａ408）とタンパク質の吸光度（Ａ280）とのグラフの結果を図２に示す。
【００９１】
図２に示すように、ＢＲＷ汚泥を疎水カラムクロマトグラフィーで分画したとき、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．５２、５５、６４、７２にメジャーなピークが現れた。これらのピークのスペクトルをそれぞれ測った。
【００９２】
疎水カラムクロマトグラフィーによるピーク（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．５２、５５、６４、７２）のスペクトルを測ったところ、図２中のＮｏ．５２（「ｉｉ」と矢印で示す）の第一のピークスペクトルがヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）に、図２中のＮｏ．６４（「ｉ」と矢印で示す）の第二のピークのスペクトルがヒドラジン合成酵素（Ｉ´）に相当する。
【００９３】
精製工程４［ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製（１）］
それぞれのピークとその周辺（Ｎｏ．５１〜５５、Ｎｏ．６３〜６６）を別々にゲル濾過カラムクロマトグラフィー（流速１ｍｌ／ｍｉｎ)にかけ、溶出したヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）とヒドラジン合成酵素（Ｉ´）のピークを別々に集め、これらをＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＹＭ−５０を用いて濃縮した。
【００９４】
精製工程５［ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製（２）］
精製工程４後、さらに、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。そして、Ａ419（波長４１９ｎｍにおける吸光度）が高いところを貯留し、再びＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＹＭ−５０を用いて濃縮した。
これにより、ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）の精製液（Ｉ´−１）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の精製液（ＩＩ´−１）を得た。
【００９５】
「実施例２」
実施例１において、Ａｎａｍｍｏｘ汚泥として、ＢＲＷ汚泥の代わりにＫＳＵ−１汚泥を用いた以外は、前記精製工程１〜５に準じてＫＳＵ−１のヒドラジン合成酵素（Ｉ´）の精製液（Ｉ´−２）と、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の精製液（ＩＩ´−２）とを得た。なお、実施例２においては、前記精製工程３の工程を実施例１よりも遅い流速（低速で精製）としたため、この精製によって得られる画分のピークは、図３に示すものとなった。このため、精製工程４、５の画分は、第一のピークに相当しヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）を含有する画分（図３中「ｉｉ」で示す。）はＮｏ．１８５〜１９４、第二のピークに相当しヒドラジン合成酵素（Ｉ´）を含有する画分はＮｏ．２５１〜２７１（図３中「ｉ」で示す。）、として精製工程を行った。
【００９６】
［ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）の性質］
＜分光学的性質＞
酸化型（図５中に実線で示す。）で４０８ｎｍにあったピークが、還元型（図５中に点線で示す。）で４１９ｎｍにピークがシフトした。また、還元型でα帯が５２３ｎｍ、β帯が５５３ｎｍにそれぞれピークが出現した。
【００９７】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥから分かる性質＞
精製液（Ｉ´−１）、（Ｉ´−２）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子質量の測定を行ったところ、ＫＳＵ−１およびＢＲＷ由来の精製液両方に、９４ｋＤａ、４３ｋＤａ、３７ｋＤａにバンドが出現し、ヘテロ３量体であることが確認された。（図７に測定結果を示す。）
【００９８】
［ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の性質］
＜分光学的性質＞
前述の精製液（ＩＩ´−１）の酸化型と、ジチオナイトにより還元させた還元型のスペクトルを測定した。結果を図６にしめす。酸化型（図６中に実線で示す。）の状態で、ソーレ吸収帯は４２０ｎｍにあり、本発明においてヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）であるＮａｘＬＳに特徴的な３５０ｎｍ付近のピークが出現した。還元剤としてジチオナイトを添加した時（図６中に点線で示す。）に５５０ｎｍ付近で、ヘムタンパク質の還元型特有のα、β帯のピークが出現しなかった。このことは難還元性を示し、ＮａｘＬＳの特徴的な現象であった。
【００９９】
＜Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分かる性質＞
精製液（ＩＩ´−１）、（ＩＩ´−２）について、Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子質量の測定を行ったところ、ＫＳＵ−１およびＢＲＷ由来の精製液両方に、１４ｋＤａと１１ｋＤａの位置にバンドが見られた。（図８に測定結果を示す。）
【０１００】
＜精製液中の酵素濃度の測定＞
精製液中のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)で重量濃度として測定し、その値を酵素のアミノ酸配列から求まる分子質量で割り、酵素のモル濃度を算出した。
【０１０１】
［ヒドラジン合成酵素の活性測定試験］
＜酵素を含有する精製液＞
・精製液（Ｉ´−１）
実施例２より得られるＢＲＷ由来の酵素含有精製液（９６．２μｍｏｌ／Ｌ）
・精製液（ＩＩ´−１）
実施例２より得られるＢＲＷ由来の酵素含有精製液（４３２μｍｏｌ／Ｌ)
・精製液（Ｉ´−２）
実施例１より得られるＫＳＵ−１由来の酵素含有精製液（１０６μｍｏｌ／Ｌ）
・精製液（ＩＩ´−２）
実施例１より得られるＫＳＵ−１由来の酵素含有精製液（６００μｍｏｌ／Ｌ）
【０１０２】
＜基質＞
・１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ヒドロキシルアミン溶液
・１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化アンモニウム溶液
【０１０３】
＜溶液系の調製＞
・１ｍｏｌ／Ｌグルコース
・酸素消費剤
溶液中の濃度が１０μｍｏｌ／Ｌグルコースオキシダーゼと、１５０μｍｏｌ／Ｌカタラーゼである混合溶液となるように調整した。グルコースとともに添加することで、溶液内の酸素を消費し嫌気状態で反応を行う。
・５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）
ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（株式会社同仁化学研究所製）
【０１０４】
「実施例３、比較例１〜３」
［ヒドラジン合成反応］
＜反応液組成＞
ｐＨ緩衝液として、ヒドラジン定量法に影響のないＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。基質にはヒドロキシルアミン塩酸塩、塩化アンモニウムを使用した。ヒドラジン合成酵素として、前記精製液（Ｉ´−１）と精製液（ＩＩ´−１）の２種類の酵素精製液を使用した。表２に、試験に用いた溶液の組成を示し、調整方法を後述する。
【０１０５】
【表２】
2014207879.tif 000004
【０１０６】
＜反応手順＞
（１）  あらかじめ、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）をバイアルビンに入れ、３０分以上アルゴンガスを吹き込み脱気した。
（２）  表２に従いエッペンに脱気したＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を９００μＬ、酸素消費剤（グルコースオキシダーゼ１０μｍｏｌ／Ｌ、カタラーゼ１５０μｍｏｌ／Ｌ）を１０μＬ、精製液（ＩＩ´−２）（４３２μｍｏｌ／Ｌ）、精製液（Ｉ´−１）（９６．２μｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ１０μＬ入れた。
なお、ブランクとして精製液（ＩＩ´−１）を抜いたもの、精製液（Ｉ´−１）を抜いたもの、精製液（Ｉ´−１）（ＩＩ´−１）の両方を抜いたものをそれぞれ作成し、反応溶液の合計が１０００μＬとなるようにミリＱ水を添加した。
（３）  １００ｍｍｏｌ／ＬのＮＨ2ＯＨ溶液、ＮＨ4Ｃｌ溶液を１０μＬずつエッペンのフタ裏に乗せた。
（４）  溶液内を嫌気状態にする為にグルコースをそれぞれに５０μＬ添加した。
（５）  エッペンのフタを閉め、３ｍｉｎ後に転倒混和し３５℃、１時間反応させた。
（１）〜（５）によって、得られた反応後の反応液を反応終了液とした。
（６）  反応終了後、Ｎ2Ｈ4濃度の測定を行った。
【０１０７】
［ヒドラジン精製濃度］
ヒドラジン合成反応の試験結果である、ヒドラジン生成量を表３に示す。
【０１０８】
【表３】
2014207879.tif 000005
合成反応の結果より、ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）もヒドラジン合成酵素（Ｉ´）も添加していない比較例３においては、ヒドラジンは全く合成されなかった。また、ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）だけである比較例１においてもヒドラジンは全く生成されなかった。ヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）のみを酵素として添加した比較例２では、わずかに合成されたが、比較例３と大差がなく、測定値のバラツキの範囲であった。ヒドラジン合成酵素（Ｉ´）とヒドラジン合成酵素（ＩＩ´）の両方を添加した反応液では、他の反応液とは違い、明らかにヒドラジンを生成していた。
１時間で１６μｍｏｌ／Ｌのヒドラジンを生成したことから、その活性値は（ヒドラジン生成量）／（酵素（Ｉ´）濃度）・反応時間＝１６．０／０．９６２・１＝１６．６／ｈｏｕｒより、１６．６／６０ｍｉｎ＝０．２８／ｍｉｎとなった。
【０１０９】
「実施例４」
前述の実施例３において、精製液（Ｉ´−１）の代わりに精製液（Ｉ´−２）、精製液（ＩＩ´−１）の代わりに精製液（ＩＩ´−２）を用いた以外は同様の操作によって、ＫＳＵ−１株由来の酵素による実験を行い、実施例４とした。
ＫＳＵ−１株を用いた試験結果では、その活性値は０．７１／ｍｉｎであった。
【０１１０】
「実施例５〜７」
［ＮＨ2ＯＨ濃度依存性］
基質であるヒドロキシルアミン（ＮＨ2ＯＨ）の濃度を変化させることで、ヒドラジンの生成量に変化が現れるかを実験した。実験は、実施例３に準じて行い、ヒドロキシルアミンンの濃度のみ、表４に示す濃度となるように調整した。
【０１１１】
【表４】
2014207879.tif 000006
【０１１２】
＜ヒドロキシルアミン濃度の変化によるヒドラジン生成量の変化＞
ヒドロキシルアミン添加量１０００μｍｏｌ／Ｌの場合は、ヒドラジン生成量１６μｍｏｌ／Ｌであった。ヒドロキシルアミンの添加量を半分にした実施例５の５００μｍｏｌ／Ｌでは、２．５倍である２８μｍｏｌ／Ｌが生成した。ヒドロキシルアミン添加量を１／５にした実施例６の２００μｍｏｌ／Ｌでは約４倍の４３μｍｏｌ／Ｌのヒドラジンが生成した。ヒドロキシルアミン添加量を１／１０にした実施例７の１００μｍｏｌ／Ｌでは約３倍の３１μｍｏｌ／Ｌのヒドラジンが生成した。最も多くのヒドラジンを生成したのはヒドロキシルアミンを２００μｍｏｌ／Ｌ添加した時（実施例６）で、４３μｍｏｌ／Ｌの場合で、（ヒドラジン生成量）／｛（ＨＺＳ濃度)・反応時間）＝４３．０／０．９６２・１＝４４．７／ｈｏｕｒ、よって４４．７／６０ｍｉｎ＝０．７４／ｍｉｎとなった。
前述の通りＫＳＵ−１株のデータは０．７１／ｍｉｎであるため、基質濃度を調整することで同程度の活性値が得られることを確認した。
【０１１３】
［ヒドラジン合成酵素の活性測定試験（還元剤添加系）］
本発明のヒドラジン合成法において、さらに還元剤を混合することで、還元剤存在下でヒドラジン合成活性を向上させた試験方法およびその結果を以下に示す。
【０１１４】
＜酵素を含有する精製液＞
・精製液（Ｉ´−３）
実施例２より得られる精製液（Ｉ´−２）を、ミリＱ水（超純水）で希釈したＫＳＵ−１由来の酵素含有精製液（９５μｍｏｌ／Ｌ）
・精製液（ＩＩ´−３）
本発明のタンパク質（２ａ）、（２ｂ）である、通称“ＮａｘＬＳ”に対応する遺伝子（配列番号１４、１５）を繋いだプラスミド、およびｃ型ヘムタンパク質成熟遺伝子群を繋いだ別のプラスミドにより大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株）をＨａｎａｈａｎ法によって調整したコンピテントセルを同時形質転換し、ＮａｘＬＳを合成する遺伝子組み換え大腸菌を作成した。この遺伝子組み換え大腸菌より、精製液（ＩＩ´−２）を得る方法に準じて、ＮａｘＬＳにあたる酵素の、酵素含有精製液（濃度１．３２ｍｍｏｌ／Ｌ）を得た。この酵素含有精製液を、精製液（ＩＩ´−３）として用いた。
【０１１５】
＜基質＞
・２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＯ飽和水溶液
アルゴンガスを通気して脱気した後のミリＱ水を用いて、濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるように水酸化ナトリウム（和光純薬株式会社製）を溶解させることで調製した水溶液中に、ＮＯガスを通気することで、ＮＯガス飽和水溶液を調整した。この飽和水溶液中のＮＯ濃度は、約２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１１６】
＜還元剤＞
・１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ジチオナイト溶液
亜ジチオン酸ナトリウム（“ジチオナイト”と略記：和光純薬工業株式会社製）を、ミリＱ水にて希釈し、ジチオナイト濃度が１００ｍｍｏｌ／Ｌのジチオナイト溶液を調製した。これを、還元剤として使用した。
【０１１７】
「実施例８〜１１」
［ヒドラジン合成反応］
＜反応液組成＞
ｐＨ緩衝液として、ヒドラジン定量法に影響のないＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。基質にはＮＯ（飽和水溶液に調整して使用）、塩化アンモニウムを使用した。ヒドラジン合成酵素として、前記精製液（Ｉ´−３）と精製液（ＩＩ´−３）の２種類の酵素精製液を使用した。さらに、還元剤としてジチオナイト溶液を用いたときのヒドラジン合成量を評価した。以下の表５に、実施例８〜１１試験に用いたヒドラジン合成反応液の組成を示す。
【０１１８】
＜反応手順＞
（１）  あらかじめ、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）をバイアルビンに入れ、３０分以上アルゴンガスを吹き込み脱気した。
（２）  以下、表５に従い各試薬、溶液等を混合した。まず、エッペンに脱気したＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）、酸素消費剤（グルコースオキシダーゼ１０μｍｏｌ／Ｌ、カタラーゼ１５０μｍｏｌ／Ｌ）、精製液（ＩＩ´−３）、精製液（Ｉ´−３）、ジチオナイト溶液をそれぞれ添加した。
（３）  ＮＯ飽和溶液、ＮＨ4Ｃｌ溶液をそれぞれエッペンのフタ裏に乗せた。
（４）  溶液内を嫌気状態にする為にグルコース溶液を添加した。
（５）  エッペンのフタを閉め、転倒混和し３５℃にて、１０分間反応させた。
（１）〜（５）によって、得られた反応後の反応液を反応終了液とした。
【０１１９】
【表５】
2014207879.tif 000007
【０１２０】
［基質としてＮＯを用いたときのヒドラジン濃度測定］
ヒドラジン合成反応後、反応液中のＮＯを還元除去するために、液中のジチオナイト濃度が２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、１００ｍｍｏｌ／Ｌジチオナイト溶液と、ミリＱ水を用いて希釈した。これは、ヒドラジン濃度測定にあたり、ＮＯが吸光度測定を阻害する恐れがあるためである。このＮＯ除去後に、実施例８〜１１の各液中のヒドラジン濃度を測定した結果を表６に示す。
【０１２１】
【表６】
2014207879.tif 000008
【０１２２】
表中の、酵素（Ｉ´）のヒドラジン合成分子活性は、前述の実施例３〜７と同様に、（ヒドラジン生成量）／｛（ＨＺＳ濃度)・反応時間）｝の式より求めたものである。これらに示すように、基質（Ｂ）としてＮＯを用いて、かつ還元剤を用いた実施例８〜１１は非常に優れたヒドラジン合成活性を示した。
【０１２３】
［ヒドラジン合成の確認試験］
ヒドラジンが、本発明の酵素を用いた合成方法により得られていることを確認するために、同位体標識された塩化アンモニウムを用いて、以下の合成試験を行った。
【０１２４】
「実施例１２」  基質（Ｂ）として、同位体標識された塩化アンモニウム（15ＮＨ4Ｃｌ）を用いた以外は、実施例１１に準じて、ヒドラジン合成反応を行った。
反応後に、ジチオナイト溶液を混合してＮＯを還元除去し、トリクロロ酢酸を加えて混合し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃、１０ｍｉｎ）することで、同位体標識された塩化アンモニウムを用いたヒドラジン合成反応液の上澄みを得た。
この上澄み２００μＬに対して、１ｍＬの１％ＤＭＢＡを添加し、２０分間発色反応させた。発色反応後、発色反応液と当量のＣＨＣＡ溶液を混合し、ＴＯＦ−ＭＳ用プレート上にて乾燥させ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを用いて質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳにて質量分析を行う際、ヒドラジンはＤＭＢＡとの化合物として検出される。このＤＭＢＡとの化合物は、同位体標識された塩化アンモニウムが利用されヒドラジンが合成された場合、29Ｎ2Ｈ4-ＤＭＢＡ化合物の２９６ＭＷとして表れる。一方、同位体標識されていない通常のヒドラジンを用いた28Ｎ2Ｈ4-ＤＭＢＡ化合物は、２９５ＭＷとして表れる。
【０１２５】
質量分析を行った結果を図９に示す。なお、ブランクとして和光純薬株式会社製のヒドラジン28Ｎ2Ｈ4用いた。28Ｎ2Ｈ4のｍ／ｚと比較すると、本発明の酵素にあたるＨＺＳ酵素とＮａｘＬＳ酵素を用いて合成したヒドラジンは、２９６ＭＷの比率が増えていた。このことから、同位体標識された塩化アンモニウムを原料とした29Ｎ2Ｈ4であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明は、酵素触媒を用いたヒドラジンの合成方法に関する。本発明の酵素触媒による合成によることで、従来の高温処理等を行う必要がないため、新規なヒドラジン合成方法として有用である。
【図１】
2014207879.tif 000009
【図２】
2014207879.tif 000010
【図３】
2014207879.tif 000011
【図４】
2014207879.tif 000012
【図５】
2014207879.tif 000013
【図６】
2014207879.tif 000014
【図７】
2014207879.tif 000015
【図８】
2014207879.tif 000016
【図９】
2014207879.tif 000017
【配列表】
2014207879000001.app