(57)【要約】【課題】マイクロドロップ法による細胞培養において、多様な培養液量に対応可能であり、かつ安定な培養液のドロップを形成できる細胞培養容器を提供する。【解決手段】本発明は、上面が開口した細胞培養容器であって、底部に、細胞および培養液を収容するための凹部、および凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなる培養液収容部、を有し、凹部の側面が、凹部の底面から外縁に進むに従って高くなるように形成されており、凹部の底面と側面とのなす角度θ１が、培養液収容部の壁面と凹部の底面とのなす角度θ２より大きく、θ１が７５°以下である、前記細胞培養容器に関する。【選択図】図１
2014207897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上方が開口した細胞培養容器であって、
底部に、細胞および培養液を収容するための凹部、および
凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなる培養液収容部、
を有し、
凹部の側面が、凹部の底面から外縁に進むに従って高くなるように形成されており、
凹部の底面と側面とのなす角度θ１が、培養液収容部の壁面と凹部の底面とのなす角度θ２より大きく、θ１が７５°以下である、
前記細胞培養容器。
【請求項２】
θ２が１０°以上である、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
凹部の底面の面積が２０ｍｍ２以下である、請求項１または２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
凹部の容量が１０〜１００μｌであり、凹部と培養液収容部の合計の容量が２００μ〜３ｍｌである、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項５】
凹部の底面に、細胞の位置決めをするための窪みが形成されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項６】
凹部と培養液収容部の組み合わせを複数有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記培養液収容部の壁部の外縁から前記培養液収容部を囲うように下方に延びる内壁と、
前記内壁の下端から外方に張り出した外縁底部と、
前記外縁底部の外縁から上方に延びる外壁と、
を更に備え、
前記外壁の上端の上下方向位置は、前記培養液収容部の壁部の外縁の上下方向位置よりも上方にあり、
前記外壁の上端は、前記細胞培養容器の開口端を形成し、
前記細胞培養容器の開口の最小幅をＢとし、前記培養液収容部の壁部の外縁と前記外壁の上端との間の上下方向距離をＥとしたとき、以下の条件：
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）
を満足する、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記培養液収容部の開口の最大幅をｂとしたとき、
Ｂ、ｂ及びＥが以下の条件：
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）＋１／４［（ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）］
を満足する、請求項７記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記培養液収容部の壁部の外縁から前記培養液収容部を囲うように下方に延びる内壁と、
前記内壁の下端から外方に張り出した外縁底部と、
前記外縁底部の外縁から上方に延びる外壁と、
を更に備え、
前記培養液収容部を構成する前記壁部の壁面の外縁上の点と、前記壁面上の、前記外縁上の点よりも上下方向位置が０．３ｍｍ下方にある点のうち前記外縁上の点からの直線距離が最も短い点とを結んだ直線と、前記凹部の底面とがなす角度θ３が８０°以下である、請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロドロップ法などの少量の培養液中での細胞培養に適した細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。
【０００３】
体外受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、この中に受精卵を入れて体外培養するマイクロドロップ法が用いられることが多い。従来、このマイクロドロップ法には、細胞培養容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用され、シャーレの底面に、培養液のドロップを、間隔をあけて複数個作製する方法が使用されてきた。
【０００４】
この培養液ドロップの作製については、定められた手段は確立されておらず、培養液の使用量も各クリニックや病院の経験に基づき、多様な培養液量が用いられている。そのため、用いられている培養液量の範囲は、数十μｌ〜数百μｌとかなりの幅がある。しかし、そのような多様な培養液量にそれぞれ対応する細胞培養容器を準備するのはコストの点で問題があり、通常のシャーレで多様な大きさのドロップを作成しているのが現状である。
【０００５】
一方、通常のシャーレでドロップを作成するとドロップ形成位置が定まらず、振動等でドロップがずれてしまうといった問題があった。ドロップがずれてしまうと、その中で培養して観察していた受精卵の特定が難しくなるという問題があった。また、複数のドロップが合流してしまうと、さらに受精卵の特定が難しくなるという問題があった。したがって、ドロップの位置が制御でき、受精卵培養作業時や培養時の振動による影響を抑制できる手段が求められていた。
【０００６】
例えば、特許文献１には、マイクロドロップ法のように少量の培養液中での細胞培養を目的とした使用方法においても、収容区画内を底部下方から顕微鏡観察が可能であり、容器内部を無駄なく区画して使用できる細胞培養容器として、収容区画の壁面を底面の鉛直方向に対して傾斜した状態で配置し、さらに収容区画を小容量に設計した細胞培養容器が記載されている。しかし、この容器では、培養液の最小使用量と想定される１０μｌの容量に対応するように収容区画を設計した場合、１００μｌ〜２００μｌ等のより大容量に対応するには収容区画の側壁をかなりの高さにする必要があり、作業性に悪影響を与えてしまう。また、５０μｌ程度を上限とした設計とすると、より大容量の培養液を収容しようとすると収容区画から溢れてしまうという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４６６５５８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、マイクロドロップ法による細胞培養において、多様な培養液量に対応可能であり、かつ安定な培養液のドロップを形成できる細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を行った結果、細胞培養容器の培養液収容部の側面を傾斜させることにより培養液の安定なドロップを形成でき、さらに側面の傾斜を多段構造とすることにより多様な培養液量に対応できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）上方が開口した細胞培養容器であって、
底部に、細胞および培養液を収容するための凹部、および
凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなる培養液収容部、
を有し、
凹部の側面が、凹部の底面から外縁に進むに従って高くなるように形成されており、
凹部の底面と側面とのなす角度θ１が、培養液収容部の壁面と凹部の底面とのなす角度θ２より大きく、θ１が７５°以下である、
前記細胞培養容器。
（２）θ２が１０°以上である、（１）記載の細胞培養容器。
（３）凹部の底面の面積が２０ｍｍ２以下である、（１）または（２）記載の細胞培養容器。
（４）凹部の容量が１０〜１００μｌであり、凹部と培養液収容部の合計の容量が２００μ〜３ｍｌである、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）凹部の底面に、細胞の位置決めをするための窪みが形成されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（６）凹部と培養液収容部の組み合わせを複数有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（７）前記培養液収容部の壁部の外縁から前記培養液収容部を囲うように下方に延びる内壁と、
前記内壁の下端から外方に張り出した外縁底部と、
前記外縁底部の外縁から上方に延びる外壁と、
を更に備え、
前記外壁の上端の上下方向位置は、前記培養液収容部の壁部の外縁の上下方向位置よりも上方にあり、
前記外壁の上端は、前記細胞培養容器の開口端を形成し、
前記細胞培養容器の開口の最小幅をＢとし、前記培養液収容部の壁部の外縁と前記外壁の上端との間の上下方向距離をＥとしたとき、以下の条件：
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）
を満足する、（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（８）前記培養液収容部の開口の最大幅をｂとしたとき、
Ｂ、ｂ及びＥが以下の条件：
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）＋１／４［（ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）］
を満足する、（７）記載の細胞培養容器。
（９）前記培養液収容部の壁部の外縁から前記培養液収容部を囲うように下方に延びる内壁と、
前記内壁の下端から外方に張り出した外縁底部と、
前記外縁底部の外縁から上方に延びる外壁と、
を更に備え、
前記培養液収容部を構成する前記壁部の壁面の外縁上の点と、前記壁面上の、前記外縁上の点よりも上下方向位置が０．３ｍｍ下方にある点のうち前記外縁上の点からの直線距離が最も短い点とを結んだ直線と、前記凹部の底面とがなす角度θ３が８０°以下である、（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞培養容器。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、マイクロドロップ法による細胞培養において、多様な培養液量に対応可能であり、かつ安定な培養液のドロップを形成できる細胞培養容器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。ａは上面図を示し、ｂは垂直断面図を示す。
【図２】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図３】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図４】本発明の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図５】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図６】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図７】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図８】本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。ａは上面図を示し、ｂは垂直断面図を示す。
【図９】本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。ａは上面図を示し、ｂは垂直断面図を示す。
【図１０】本発明の細胞培養方法の一実施形態を示す概略図である。
【図１１】本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。ａは上面図を示し、ｂは垂直断面図を示す。
【図１２】本発明の細胞培養容器１１０を用いた培養方法を説明する概略図である。
【図１３】本発明の細胞培養容器１１０を用いた培養時の傾きを説明する概略図である。
【図１４】本発明の細胞培養容器１１１の垂直断面図を示す概略図である。
【図１５】本発明の細胞培養容器１１２の垂直断面図を示す概略図である。
【図１６】本発明の細胞培養容器１１３の垂直断面図を示す概略図である。
【図１７】本発明の細胞培養容器１１４の垂直断面図を示す概略図である。
【図１８】ａは本発明の細胞培養容器１１０の培養液収容部を構成する壁部４の外縁近傍の垂直断面図を示す概略図である。ｂは本発明の細胞培養容器１１３の培養液収容部を構成する壁部４の外縁近傍の垂直断面図を示す概略図である。
【図１９】本発明の細胞培養容器１１３に細胞培養液とオイルを収容した状態で振動させた場合のオイルの動きを示す概略図である。
【図２０】本明細書で開示する他の発明に係る細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。ａは上面図を示し、ｂはＩ−Ｉ’垂直断面図を示し、ｃはＩＩ−ＩＩ’垂直断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について説明する。
本発明の細胞培養容器は、例えば、図１および図２に示すように、上方が開口した容器からなる細胞培養容器１であって、底部に、細胞および培養液を収容するための凹部２、および凹部の開口端３２から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部４からなる培養液収容部、を有し、凹部の側面５が、凹部の底面６から外縁に進むに従って高くなるように形成されており、凹部の底面６と側面５とのなす角度θ１が、培養液収容部の壁面４と凹部の底面６とのなす角度θ２より大きく、θ１が７５°以下であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の細胞培養容器においては、細胞および培養液を収容するための側面が傾斜した凹部（以下、細胞収容部と称する場合もある）を囲うように、その外縁に傾斜した壁部を有し、さらなる培養液を収容可能な培養液収容部が形成されている。凹部の側面および培養液収容部の壁面が傾斜していることにより、培養液のドロップを凹部の中心に安定して形成することが可能であり、振動等があってもドロップが移動したり崩れたりするのを防止することができる。なお、ドロップは、その形状は特に制限されず、５ｍｌ以下の液体の塊をさす。
【００１５】
また、本発明の細胞培養容器においては、凹部と培養液収容部を有する多段構造を備えることにより、多様な培養液量に対応可能である。したがって、小容量（例えば、１０μｌ〜１００μｌ）の培養液Ｄを用いる場合は、凹部に細胞と培養液を収容して培養を実施することが可能であり（図２ａ）、大容量（例えば、１００μｌ〜３ｍｌ）の培養液Ｄを用いる場合は、凹部に収容しきれない培養液を、凹部の外縁に延在する培養液収容部に収容して培養を実施することが可能である（図２ｂ）。さらに培養液収容部を構成する壁面を水平ではなく傾斜させることで、凹部からあふれた培養液が流れ出たり、ドロップが分離したりするのを防止でき、培養液を重力により凹部の方へ集めることができる。また、培養液の容量が凹部の容量より小さい場合でも、培養液のドロップを培養液収容部の壁面に滴下すれば、自然と凹部内部に収容することができ、操作性において優れている。
【００１６】
細胞培養容器のサイズは、特に制限されないが、開口部の開口幅（例えば、図１のＢ）が、３０〜６０ｍｍのものが好ましく用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、および既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。
【００１７】
図２ｃに凹部と培養液収容部を示す。凹部は、細胞培養容器の底部に形成され、底面６と側面５からなり、開口部７を有する。細胞培養容器は、通常、その底部が水平となる状態で配置されて使用される。凹部の底面も、通常、水平となる状態で使用される。凹部の底面および開口部の外縁の形状は特に制限されないが、好ましくは互いに相似であり、好ましくは円状（円形および楕円形を含む）である。
【００１８】
凹部の側面５は、凹部の底面６から外縁に進むに従って高くなるように傾斜して形成されている。外縁に進むに従って高くなるとは、図２ｃに示すような垂直切断面において、凹部の底面６と側面５との接点３１から、凹部の開口端３２の方へ外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。凹部の側面が、なだらかな傾斜面を形成し、例えば円錐台の側面を形成している場合、円錐台の上面および下面のうち面積の狭いほうが凹部の底面６に該当するように円錐台が配置されるような構成となる。
【００１９】
底面６と側面５とのなす角度θ１は、図２ｃに示すような垂直切断面における底面６と側面５とのなす角度をさす。例えば、図３に示すように、凹部の垂直切断面において、凹部側面が直線でない場合は、底面と側面との接点３１と凹部の開口端３２をつなぐ直線と、底面６とのなす角度をθ１とする。θ１は、７５°以下であり、好ましくは７０°以下、より好ましくは６５°以下である。θ１を７５°以下とすることにより、凹部内の細胞をピペット等により容易に扱うことができ、操作性が高まる。凹部に収容された細胞は、通常、顕微鏡等により観察されるが、凹部の側面が垂直ではなく、ある程度傾斜していることによって、顕微鏡観察下でも、斜めからピペット等を凹部内部に挿入することが可能になる。また、θ１は、好ましくは４０°以上、より好ましくは４５°以上、さらに好ましくは５０°以上である。θ１を４０°以上とすることにより、凹部の側面がドロップを支持し、ドロップが安定に維持され、ドロップが移動したり崩れたりするのを防止できる。
【００２０】
凹部底面の面積は、通常用いられる小容量の培養液、例えば１０μｌ〜１００μｌの培養液のドロップを収容でき、かつ１０μｌ〜１００μｌの培養液のドロップによって凹部底面の全面を覆うことが可能であり、ドロップの高さが０．３５ｍｍ以上、より好ましくは０．５ｍｍ以上となることが好ましい。したがって、凹部の底面の面積は、好ましくは０．７５ｍｍ２以上、より好ましくは３ｍｍ２以上、さらに好ましくは５ｍｍ２以上であり、好ましくは２０ｍｍ２以下、より好ましくは１３ｍｍ２以下、さらに好ましくは１０ｍｍ２以下である。凹部の底面の面積を０．７５ｍｍ２以上とすることにより、複数の細胞、好ましくはヒト受精卵を、互いが重なることなく、凹部の底面に配置して培養することができる。複数の細胞、特に受精卵を、同じ系で培養することにより、培養液内部に蓄積したタンパク質、ホルモン、酵素等の細胞分泌物が互いの細胞に作用するパラクライン効果を期待できる。また、細胞同士が平面上で重なっていると、顕微鏡等による細胞や受精卵の評価が困難であることから、凹部の底面は一定の面積を有することが好ましい。また、凹部の底面に、細胞の位置決めをするための窪みを形成する場合も、底面はある程度の面積を有することが好ましい。また、凹部の底面の面積を、２０ｍｍ２以下とすることにより、小容量の培養液（例えば１０μｌ）のドロップでも、凹部の底面の全面を覆うことが可能になり、すなわち、ドロップが凹部の底面上で大きく移動することを防止できる。
【００２１】
凹部の容量は、凹部の開口端３２を超えない範囲で収容可能な液体の容量であり、通常用いられる小容量の培養液、例えば１０μｌ〜１００μｌ、特に３０μｌ〜７０μｌの培養液を収容できる容量である。凹部の容量を一定以下とすることにより、使用する培養液量を減少させつつ安定に培養させることで低コスト化が期待できる。さらに、培養液のドロップの大きさが小さいことで、細胞分泌物によるオートクライン効果や複数の細胞の相互作用によるパラクライン効果を期待できる。
【００２２】
凹部の深さ８は、凹部の底面の面積および凹部の容量に基づいて、自動的に決定される場合もあるが、通常１〜５ｍｍ、好ましくは２〜４ｍｍである。凹部の深さが一定以下となるように設計することで、凹部内に収容された細胞や培養液をピペット等で容易に取り扱うことができ、操作性の点で有利である。また、顕微鏡によって凹部に収容された細胞を観察することも容易である。例えば、凹部で１００μｌ程度の培地を収容する場合に、作業性を確保するため４５°程度のピペット挿入角度を維持するには、θ１を７５°以下にすることが好ましい。具体的には、凹部開口部の半径が２．５ｍｍであり、その際に凹部の深さが４ｍｍある場合、θ１を９０°とするとピペットの挿入角度は４５°を超えてしまうが、θ１を７５°以下とすることで高さを４〜５ｍｍとしても４５°程度の挿入角度を確保できる。
【００２３】
本発明の細胞培養容器は、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された壁部からなる培養液収容部を有する。凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるとは、例えば図２ｃに示すような垂直切断面において、凹部の開口端３２に対して凹部の中心側を内側としたときに凹部の開口端よりも外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。例えば、凹部が複数存在する場合には、各凹部において各凹部の開口端よりも外側に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっている壁面からなる培養液収容部がそれぞれ形成されることが好ましい。壁面４は、なだらかな傾斜面であってもよいし、階段状に傾斜を構成していてもよい。培養液収容部の壁部が、なだらかな傾斜面を形成し、例えば円錐台の側面を形成している場合、円錐台の上面および下面のうち面積の狭いほうが細胞培養容器の底部側にくるように円錐台が配置されるような構成となる。
【００２４】
本発明の細胞培養容器においては、凹部の底面と側面とのなす角度θ１が、培養液収容部の壁面と凹部の底面とのなす角度θ２より大きい。θ２は、図２ｃに示すような垂直切断面において、培養液収容部の壁面４と凹部の底面６とのなす角度をさす。例えば図３に示すように、垂直切断面において、培養液収容部の壁面が直線でない場合は、凹部開口端３２と培養液収容部の開口端３３をつなぐ直線と、底面６とのなす角度をθ２とする。
【００２５】
θ２は、好ましくは１０°以上、より好ましくは１５°以上、さらに好ましくは２０°以上である。θ２を１０°以上とすることにより、培養液のドロップを凹部の方へ集めることができる。θ２の角度が小さすぎると、ドロップが凹部の方へ流れず、培養液収容部の壁面に残ってしまうおそれがある。また、θ２の角度が小さすぎると、培養液の量が、凹部の容量より大きい場合、培養液が凹部がある中心部にうまく集まらず、ドロップが片側に偏った状態となったり、ドロップが分離したりするおそれがあり、安定性の高いドロップを形成できない場合がある。θ２を１０°以上とすることにより、重力を駆動源として、培養液を凹部の中心方向へ移動させやすい。すなわち、培養液が凹部内部に収容されるような小容量の場合（例えば、１０〜１００μｌ）、振動等によってドロップが一時的に凹部から溢れても、重力によって自然に凹部の方へ流れて凹部内部に収容でき、安定なドロップを維持することができる。また、培養液が凹部の容量を超える大容量の場合（例えば、１００μｌ〜３ｍｌ）、振動等によってドロップが一時的に片側に偏っても、重力によって培養液が、自然に凹部がある中心部へ流れて集まり、安定なドロップを維持することができる（図４）。θ２は、好ましくは６０°以下、より好ましくは５５°以下、さらに好ましくは５０°以下である。θ２を６０°以下とすることにより、１００μｌ〜３ｍｌといった大容量の培養液を収容することが可能になる。また、θ２を６０°以下とすることにより、開口面積が広がるため、凹部内部の細胞や培養液のピペット等による操作性が高まる。また、凹部内部の細胞を顕微鏡等に観察する際にも都合がよい。
【００２６】
θ１とθ２は、θ１＞θ２の関係を満たすように選択されるが、θ１とθ２の差は、好ましくは１５°〜４０°、より好ましくは２０°〜３５°である。より具体的には、θ１が４５°〜７５°であり、かつθ２が１０°〜４０°であるような細胞培養容器が好ましく、θ１が４５°〜６５°であり、かつθ２が１０°〜３０°であるような細胞培養容器がさらに好ましい。θ１とθ２間の角度差が４０°以下の場合、培養液量が培養液収容部にまで培養液が入った場合、急激な角度変化がないことで、より安定的に培養液のドロップを中心に保持可能となる。角度差が１５°以上の場合には培養液収容部の容量が多い設計がしやすくなる。
【００２７】
凹部と培養液収容部の合計の容量は、培養液収容部の開口端３３を超えない範囲で収容可能な液体の容量であり、通常用いられる大容量の培養液、例えば１００μｌ〜３ｍｌ、特に２００μｌ〜１ｍｌの培養液を収容できる容量である。この容量を一定以下とすることにより、細胞分泌物によるオートクライン効果や複数の細胞の相互作用によるパラクライン効果を期待できる。また、たとえば受精卵培養時には２日間培養後に培養液を半分だけ新しい培養液に交換するなどの作業を行う培養手法を実施することもある。これらの作業時には、培養液が２００μｌ以上あることで作業がやりやすくなる。
【００２８】
また、図５に示すように、培養液収容部の壁面４に、同心円状に線５０を付けることによって、その線を目印として、培養液量および培養液層の厚みを測ることができる。目印は、傾斜面に凹凸による線を形成してもよく、単にインク等で線を描いてもよい。線の数は特に制限されないが、２〜５の同心円を設けることが好ましい。例えば、凹部開口端から一番近い同心円まで培養液を添加すれば２００μｌ、二番目に近い同心円まで培養液を添加すれば３００μｌ添加することになるといったように、計量線の機能を果たす同心円を描くことができる。なお、線５０は同心円状に限らず、凹部の形態に応じて、点、直線、同心円状を含む曲線状、または文字や記号といった種々の形態を採用することができる。
【００２９】
上記のような目印を付けることによって、常に一定量の培養液を添加することができる。結果として、細胞培養容器ごとに培養液の量が異なるといったことがなく、細胞培養を同条件でばらつきなく実施することができる。また細胞の種類や状態ごとに好適な培養液量が異なる場合もあるので、細胞の種類や状態ごとにどの目印まで培養液を注入するのがよいか記録することにより、その後の作業性を高めることができる。さらに特定の細胞や状態に対する好適な培養液添加量と目印との関係を記載したマニュアルを添付することもできる。
【００３０】
本発明の細胞培養容器は、凹部、ならびにその周囲に培養液収容部を有するが、それらの外周は、例えば、図１に示すように、培養液収容部の開口端３３と同じ高さで、凹部の底面に平行な面、換言すれば、θ２が０°であるような面を形成していてもよい。このような構造とすることで、ピペットの先端の洗浄や気泡抜きを行う別のドロップを製造するスペースにすることができる。また、図６に示すようにそのまま外縁に進むに従って高くなるように形成されていてもよい。このような構造とすることで、培養液を被覆するための使用するオイルの容量も減少させることができるためコスト削減につなげることができる。あるいは、図７に示すように凹部の底面と同じ高さで、凹部の底面に平行な面７０を形成していてもよい。このような面７０と外壁９により形成される空洞部分は、中心部分のみを培養液とオイルで覆った部分として培養することで空洞部を洗浄用スペースなどに使用できる。
【００３１】
本発明の細胞培養容器は、凹部、ならびにその周囲に培養液収容部を有するが、それらの外周に、細胞培養容器全体を囲うように構成された外壁９を有することが好ましい。外壁を設けることにより、培養液を被覆するためのミネラルオイルを収容することができる。培養液をミネラルオイルで被覆することにより、培養液の蒸発を避け、ｐＨと浸透圧を安定させることが可能であり、顕微操作が容易となる他、マイクロドロップによる乏精子症患者の媒精、培養液の節約などの利点がある。また、細胞培養容器に蓋をかぶせる場合に、外周を囲う外壁により蓋を支持することができる。
【００３２】
本発明の細胞培養容器は、その底部に、凹部を１つだけ有していてもよく、複数有していてもよい。凹部が複数存在する場合、各凹部の外縁には、傾斜した構造の培養液収容部がそれぞれ形成されていることが好ましい。凹部および培養液収容部の組み合わせが２個整列して配置された一態様について図８に示す。
【００３３】
凹部の底面には、例えば図９に示すように、細胞Ａを位置決めするための窪み９０が形成されていることが好ましい。窪み内に細胞を配置することにより、細胞の移動を抑制することができ、細胞をそれぞれ特定した上で評価や判定を行うことができる。この窪みの形状は特に制限されないが、開口部の外縁が円形であり、窪みの壁面が、最も低い位置から外縁に進むに従って高くなるように傾斜した曲面を有することが好ましい。窪みの壁面は、好ましくは円錐状または円錐台状の部分を含む。円錐状または円錐台状の部分は、培養容器の底部側に、円錐の頂点または円錐台の上面および下面のうち面積の狭い方がくるように形成される。円錐状には、円錐および楕円錐、これらに類似の形状、例えば、円錐または楕円錐の頂点が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。円錐台状には、円錐台および楕円錐台、これらに類似の形状、例えば、円錐台または楕円錐台の上面または下面と円錐面との接合部が丸みを帯びている形状、円錐面が外側に膨らんでいる形状、円錐面が内側に凹んでいる形状などが含まれる。なお、窪み部９０は、上記に限らず、多角錐状、多角錐台状などの形態であってもよい。
【００３４】
窪みの寸法は、少なくとも１つの細胞を収容可能な寸法であれば特に制限されない。ここで、窪みの寸法は、窪みの開口部の外縁が形成する図形の最長径の長さをさす。従って、窪みの開口部の外縁が円形である場合、その直径は、培養する細胞の最大寸法と同じかそれより大きいものとなる。本発明の細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、円形の開口部の直径は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。胚盤胞の段階の細胞の最大寸法は通常１００μｍ〜２８０μｍであることから、円形の開口部の直径は、通常１００μｍ以上である。
【００３５】
例えば、ヒト受精卵の場合、窪みの開口部の直径は、通常１００μｍ以上、好ましくは２００μｍ以上、さらに好ましくは２５０μｍ以上であり、通常１０００μｍ以下、好ましくは９００μｍ以下、さらに好ましくは８００μｍ以下である。また、上記窪みの開口部の直径は、Ｘ＋α（ここでＸは細胞の最大寸法を表す）と規定することもできる。ここで、αは、好ましくは０．０１ｍｍ以上、さらに好ましくは０．０２ｍｍ以上である。
【００３６】
なお、本発明において「上下方向」とは、細胞培養容器の凹部底面に垂直な方向を指す。そして本発明において、細胞培養容器の凹部底面から凹部の開口に向かう方向を上方、凹部の開口から底面に向かう方向を下方とする。また本発明において、特に断りのない限り、ある部位の「高さ」とは、該部位の上下方向位置を、凹部底面を原点とし、凹部底面よりも上方をプラス、凹部底面よりも下方をマイナスとして、凹部底面から該部位までの上下方向に沿った距離を表示したものである。
【００３７】
図１１には、本発明の細胞培養容器の好適な実施形態の概略図を示す。本形態の細胞培養容器１１０は培養液収容部の壁部４の壁面の外縁（開口端３３）から培養液収容部を囲うように下方に延びる内壁１０９と、内壁１０９の下端から細胞培養容器の外方に向け張り出す外縁底部１０８と、外縁底部１０８の外縁から上方に立設された外壁９とを備える。外壁９の上端の上下方向位置は、壁部４の壁面の外縁の上下方向位置（開口端３３の上下方向位置、及び、内壁１０９の上端の上下方向位置と同じである）よりも上方である。外壁９と内壁１０９と外縁底部１０８に囲まれた外縁空間１２０が形成される。外縁底部１０８の外縁空間１２０に臨む面（外縁底面１２１と称する）が、凹部２の底面６と同じ高さで凹部２の底面６に平行である場合、外縁底面１２１は図７に示す面７０に相当する。
【００３８】
図１２には、細胞培養容器１１０の凹部２に培養液Ｄ（細胞を含み得る）を収容し、オイル１００によりそれを被覆した場合の模式図を示す。
【００３９】
細胞培養容器１１０の開口の最小幅をＢ、培養液収容部の開口の最大幅をｂとする。なお、細胞培養容器１１０の開口の最小幅Ｂとは、細胞培養容器１１０の開口端を画定する外壁９の上端の容器内側の輪郭を平面視したときの図形において、該図形の重心を間に介して対向する、該図形の周縁上の一対の点の間の距離の最小値（例えば該図形が円の場合は直径の長さ、楕円の場合は短径の長さ）を指す。培養液収容部の開口の最大幅ｂとは、培養液収容部の開口端３３の輪郭を平面視したときの図形において、該図形の重心を間に介して対向する、該図形の周縁上の一対の点の間の距離の最大値（例えば該図形が円の場合は直径の長さ、楕円の場合は長径の長さ）を指す。
【００４０】
更に、外壁９の上端とオイル１００の液面との間の上下方向距離をＦ、オイル１００の液面と壁部４の壁面の外縁（開口端３３）との間の上下方向距離（Ｅ−Ｆに等しい）をＧとする。
【００４１】
オイル１００の液面の高さ位置が、壁部４の壁面の外縁（開口端３３）の高さ位置と同じ又はそれよりも上方であるとき、培養液収容部を覆うオイルの液面と、外縁空間１２０を覆うオイルの液面とがつながり同じ高さとなり、容器１１０の全体にオイル１００を満たすことができる。すなわち、容器１１０内の全体にオイル１００を均一に満たすにはＧ≧０を満足する必要がある。
【００４２】
そして図１３に示すようにオイル１００を充填した状態で容器１１０を水平方向に対し角度θラジアン傾けたときオイル１００の液面が外壁９を乗り越えないようにするためには次式
Ｆ≧（Ｂ／２）ｔａｎθ    （式１）
を満足する必要がある。
【００４３】
一般的に細胞培養容器１１０は、水平方向に対し最大で１６°（すなわち１６π／１８０ラジアン）程度の傾きが使用時に生じ得る。そこで、使用時に水平方向に対し１６°の傾きが生じた場合にもオイル１００が外壁９の上端を乗り越えないようにするためには次式
Ｆ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）    （式２）
を満足することが必要である。
【００４４】
上記の通り、容器１１０内の全体にオイル１００を均一に満たすにはＧは少なくとも０である。Ｇ＝０のとき、Ｅ＝Ｆであるから、次式
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）    （式３）
を満足する細胞培養容器１１０は、内部の全体にオイル１００を均一に満たすことができ、なお且つ、水平方向に対し１６°まで傾けた場合であってもオイル１００が容器外にあふれることがない、という効果を有する。
【００４５】
また、
Ｇ＜（ｂ／２）ｔａｎθ    （式４）
であると、容器１１０を水平方向に対し角度θ傾けたとき内壁１０９の上端（壁部４の外縁）がオイル１００の液面から露出してしまいオイルが分断されるため望ましくない。ただし、壁部４の外縁によりオイルが分断されたとしても、容器１１０を水平方向に戻せばオイルの状態は元の状態に回復することができるから、必ず避けなければならない問題とまでは言えない。次式
Ｇ≧１／４［（ｂ／２）ｔａｎθ］      （式５）
を満足する場合、容器１１０を角度θ傾けた場合であっても壁部４の外縁によるオイルの分断を十分に軽減することができる。
【００４６】
上記の通り式１を満たすことが好ましく且つＥ＝Ｆ＋Ｇであるから、次式
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎθ＋１／４［（ｂ／２）ｔａｎθ］      （式６）
を満足するとき、容器１１０を角度θ傾けた場合にオイル１００が外壁９の上端を超えて漏えいすることがなく尚且つ壁部４の外縁によるオイルの分断も軽減されるということができる。
【００４７】
したがって、容器１１０は次式
Ｅ≧（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）＋１／４［（ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）］      （式７）
を満足するとき、容器１１０を角度１６°傾けた場合であってもオイル１００が外壁９の上端を超えて漏えいすることがなく尚且つ壁部４の外縁によるオイルの分断が軽減されるという効果を奏するため好ましい。
【００４８】
次に、細胞培養容器１１０の他の好ましい実施形態について説明する。培養液収容部を構成する壁部４の該収容部内側の壁面は、垂直断面形状が直線、曲線、階段状の屈曲線等の様々な形状を取り得る。例えば図１６に示す細胞培養容器１１３では、壁部４’は屈曲部１６０を有しており、屈曲部１６０から壁部４’の外縁である開口端３３’に至るまでの面は略垂直な面であり、該面の屈曲部１６０から開口端３３’までの上下方向距離（垂直面の高さＨ）は０．７７ｍｍである。なおこの実施形態では壁部４’の上端近傍と内壁１０９’の上端近傍とが共通している。図１７に示す細胞培養容器１１４も同様の構造を有する。細胞培養容器１１３、１１４のように、壁部４’、４’’の培養液収容部側の壁面が、その外縁である開口端３３’、３３’’から始まり下方に０．３ｍｍ以上延びた垂直に近い切り立った面である場合、以下の問題がある。すなわち、図１９に示すように細胞培養容器１１３に培養液Ｄを収容しオイル１００で全体を被覆した状態で、細胞培養容器１１３を振動させると、内壁１０９’の内側（培養液収容部）と外側（外縁空間１２０）にあるオイルが相互に激しく流動し、内側において培養液Ｄを巻き込んで懸濁してしまうという問題がある。この問題はＧが０．６ｍｍ以下の場合に特に顕著である。懸濁は培養物の観察に支障を来す。
【００４９】
そこで本発明は上記問題点を解決する手段として図１８（ａ）に例示する構成を開示する。すなわち、培養液収容部を構成する壁部４の壁面（培養液収容部の内側に臨む面）の外縁である開口端３３上の点Ｐ１と、前記壁面上の、Ｐ１よりも上下方向位置が０．３ｍｍ下方にある点のうちＰ１からの直線距離が最も短い点Ｐ２とを結んだ直線と、凹部底面６とがなす角度θ３を８０°以下とする。Ｐ１は、好ましくは、壁部４の壁面の外縁である開口端３３の全周のどの位置にとってもθ３が８０°以下となるように構成することが好ましい。θ３はより好ましくは７５°以下であり、更に好ましくはθ２と同じ又はθ２よりも小さい角度である。本発明の更に好ましい実施形態では、培養液収容部を構成する壁部４の壁面（培養液収容部の内側に臨む面）のうち開口端３３の近傍部分は、凹部底面６とのなす角度がθ２と同じ又はθ２よりも小さい角度である傾斜面により形成される。なお図１８（ｂ）に示すように、細胞培養容器１１３ではＰ３とＰ４とを結んだ直線と凹部底面６とがなす角度θ３は略９０°である。
【００５０】
本発明の細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本発明の培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。
【００５１】
本発明の細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理または表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。
【００５２】
培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）およびｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚および８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞および脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性または全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。
【００５３】
本発明の細胞培養容器は、好ましくは哺乳動物および鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。本発明の細胞培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。
【００５４】
通常、凹部、または凹部と培養液収容部に培養液Ｄを添加した後、培養液を覆うようにオイル１００を添加し、さらに培養液中に細胞Ａを添加する。これらの作業は、通常ピペットやガラスキャピラリー等の器具を用いて実施される。本発明の細胞培養容器は、開口が大きいので、これらの操作を比較的容易に実施できる（図１０）。
【００５５】
培養は、通常、細胞培養容器を培養細胞の発育および維持に必要なガスを含む環境雰囲気および一定の環境温度をもたらすインキュベーターに入れることにより実施される。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）が含まれる。環境温度とＣＯ２含有量を調節することにより、培養液のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と比較することにより、培養の際の温度、ガスおよび培地などの培養条件を調節することもできる。
【００５６】
例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は自動で行ってもよいし、顕微鏡等により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０に記載された処理を利用できる。
【００５７】
本明細書では更に以下の発明を開示する。
中央に細胞を培養するための凹部と培養液収容部を備え、その外周に外縁空間１２０を有する細胞培養容器１１０を用いた細胞の培養は、図１２に示すように、中央の凹部に細胞を含む培養液Dを収容し、培養液収容部と外縁空間１２０の全体をオイル１００で被覆した状態で行われる。培養液Dとは別に区分けして培養を行いたい場合には、外縁底面１２１上に独立した培養液のドロップを形成し、該ドロップ中で培養を行う。特に、複数の受精卵のグループを中央の凹部で培養する場合には、発育の悪い受精卵を同一のドロップに配置し続けることによって発育の良好な他の受精卵の発育を阻害する可能性があるため、発育の悪い受精卵は別のドロップ中に収容して培養する。このような場合、一般的には１０〜３０μLの培養液量のドロップが用いられる。一方、培養液を充填しやすくするために、培養容器の表面を親水化することがある。細胞培養容器１１０において表面を親水化する場合、外縁底面１２１も親水化されるため培養液のドロップを形成することが難しい。
【００５８】
そこで本発明者らは図２０に示す細胞培養容器２００を発明した。細胞培養容器２００は、上方に開口しており、底部２０１と、底部２０１の周縁から、外縁に進むにしたがって高くなるように形成された第一周壁２０２とにより形成される、細胞及び培養液を収容するための凹部と、凹部の開口端から外縁に進むに従って高くなるように形成された、培養液収容部を構成する第二周壁２０３と、第二周壁２０３の外縁から下方に延びる内壁２０４と、内壁２０４の下端から外方に張り出した外縁底部２０５と、外縁底部２０５の外縁から上方に延びる外壁２０６とを備える。細胞培養容器２００の特徴は、外縁底部２０５の、細胞培養容器２００の内部に臨む側の面である外縁底面２０７上に、複数の培養液保持部２１０が形成されていることである。なお、図２０（ａ）は細胞培養容器２００の平面図であり、図２０（ｂ）は細胞培養容器２００のＩ−Ｉ’断面図であり、図２０（ｃ）は細胞培養容器２００のＩＩ−ＩＩ’断面図である。各培養液保持部２１０は、中央から外縁に近づくに従って高さが上昇するように構成された底部２１１と、底部２１１の周縁から上方に向け立設された周壁２１２とを備える。培養液保持部２１０の数は図示するように複数であってもよいし、単数であってもよい。細胞培養容器２００の中央部分の凹部及び培養液収容部は、本明細書の他の部分に開示した凹部及び培養液収容部の特徴を有するものを図示したがこれには限定されず、細胞及び培養液を収容できるものであればどのような構成のものであってもよい。
【００５９】
各培養液収容部２１０は、中央の凹部からは隔離した状態で培養液を収容することができ、その中で細胞の培養を行うことができる。底部２１１が提供する底面は、図示するように傾斜した面、特に７°前後の傾斜面、を有することが好ましいが、これには限定されず平坦面であってもよい。図示するように中央部が最も低い底面の場合、中央部に培養細胞が配置されるため操作が容易である。各培養液収容部２１０の容量は１０〜３０μＬであることが好ましい。各培養液収容部２１０の内径ｄは１．５〜５ｍｍであることが好ましく、周壁２１２の高さｈは０．２〜３ｍｍであることが好ましい。内径及び高さがこの範囲であると容量１０〜３０μＬの細胞培養液を均一に広げつつ保持しやすい。周壁２１２の厚さｔは０．１〜２ｍｍが好ましい。厚さがこの範囲であると液が漏れにくく邪魔になりにくい。
【００６０】
以下、本発明の一実施形態を示す実施例を記載するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
図１および２に示す細胞培養容器において、細胞培養容器の開口部の開口幅Ｂが３５ｍｍであり、凹部底面６から外壁９の最上部までの高さＣが９．５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が４．１ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が８ｍｍであり、培養液収容部の開口端３３が形成する円の直径が１８ｍｍであり、θ１が５０°であり、θ２が２０°である細胞培養容器を製造した。凹部の深さ８は２．３５ｍｍであり、培養液収容部の開口端３３から凹部底面までの深さは４．３５ｍｍであり、凹部の容量は約５０μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は３ｍｌである。
【００６２】
上記のような細胞培養容器に、１０μｌの培養液をピペットにより注入すると、凹部内に底面全体を覆うようにして培養液の安定なドロップが形成された。
【００６３】
また、１００μｌの培養液をピペットにより注入すると、培養液の表面張力によって凹部から溢れることなくドロップが形成され、１００μlまで保持可能であることがわかった。また、細胞培養容器に振動を与えると、培養液は一時的に凹部から培養液収容部の方に溢れたが、重力により再び凹部内に収容された。さらに、２００μｌの培養液をピペットにより注入すると溢れた培養液は培養液収容部において偏りなく安定に収容された。細胞培養容器に振動を与えると、培養液収容部の内部で一時的に培養液の偏りが生じたが、重力により再び偏りない安定な形状にもどった。
【００６４】
［実施例２］
図１１に示す形状の細胞培養容器１１０を用意した。図１２に示す通り、細胞培養容器１１０において、細胞培養容器１１０の開口の最小幅をＢ、培養液収容部の開口の最大幅をｂ、内壁１０９の高さ（すなわち、凹部底面６と、培養液収容部の壁部４の外縁である開口端３３との間の上下方向距離）をＬ、外壁９の高さ（すなわち、凹部底面６と、外壁９の上端との間の上下方向距離）をＣとする。各寸法を以下の通りとした。細胞培養容器の開口幅Ｂ：３５．５ｍｍ、培養液収容部の開口幅ｂ：１７．７ｍｍ、外壁９の高さＣ：９．９５ｍｍ、内壁１０９の高さＬ：２ｍｍ。
【００６５】
上記容器に次表に示す８つの異なる深さ（図１２でのＭ）でオイルを満たし、容器を手で運んで通常の観察動作を行った場合に、オイルの漏れにくさを、漏れにくいものを○、中程度のものを△、漏れやすいものを×と評価し、オイルの容器内での均一性を、均一なものを○、中程度のものを△、均一でないものを×と評価した。結果を次表に示す。Ｅ、Ｆ、Ｇの定義は図１２に基づいて既に説明した通りである。
【００６６】
【表１】
2014207897.tif 000003
【００６７】
上記結果からオイルの容器外への漏出を抑制するには、Ｆを５ｍｍ以上とすることが好ましいことがわかる。
【００６８】
また操作時の容器内のオイルの均一性を保つためにはＧは０以上であれば十分であるが、０．６ｍｍ以上がより好ましいことがわかる。
【００６９】
本試験で用いた容器では
（Ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）＝約５．０９ｍｍ、
１／４［（ｂ／２）ｔａｎ（１６π／１８０）］＝約０．６３ｍｍ
である。
【００７０】
上記試験結果は、Ｆが上記式２を満足する場合にオイルの容器外への漏出を防止することができ、Ｇが０以上の場合、好ましくは上記式５（θ＝１６π／１８０とする）を満足する場合に、容器内のオイルの均一性を保つことができることを示している。
【００７１】
［実施例３］
本実験では、凹部及び培養液収容部の寸法・形状が異なる５種類の容器１１０（図１１）、１１１（図１４）、１１２（図１５）、１１３（図１６）、１１４（図１７）を用意し、各容器に所定の深さとなるようにオイルを満たし、容器を手で運んで通常の観察動作を行った場合に、オイルの漏れにくさを、漏れにくいものを○、中程度のものを△、漏れやすいものを×と評価し、オイルの容器内での均一性を、均一なものを○、中程度のものを△、均一でないものを×と評価した。なお図面中で同じ特徴を有する構成は同じ符号を付したため、説明を省略する。
【００７２】
試験９及び１０に用いた容器１１０は図１１に示した形状を有し、開口幅Ｂが３５．５ｍｍであり、培養液収容部の開口幅ｂが１７．７ｍｍであり、外壁９の高さＣが９．９５ｍｍであり、内壁１０９の高さＬ（凹部底面６と、培養液収容部の壁部４の外縁である開口端３３との間の上下方向距離）が４．３５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が３．８ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が７．８ｍｍであり、θ１が５０°であり、θ２が２２°である。凹部の深さ８は２．３５ｍｍであり、凹部の容量は約６５μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は０．３３ｍｌである。
【００７３】
試験１１で用いた容器１１１は、培養液収容部以外は、容器１１０と同じ構造を有する。すなわち、開口幅Ｂが３５．５ｍｍであり、培養液収容部の開口幅ｂが１２．８ｍｍであり、外壁９の高さＣが９．９５ｍｍであり、内壁１０９の高さＬが３．３５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が３．８ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が７．８ｍｍであり、θ１が５０°であり、θ２が２２°である。凹部の深さ８は２．３５ｍｍであり、凹部の容量は約６５μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は０．１５ｍｌである。
【００７４】
試験１２で用いた容器１１２は、培養液収容部以外は、容器１１０と同じ構造を有する。すなわち、開口幅Ｂが３５．５ｍｍであり、培養液収容部の開口幅ｂが１０．３ｍｍであり、外壁９の高さＣが９．９５ｍｍであり、内壁１０９の高さＬが２．８５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が３．８ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が７．８ｍｍであり、θ１が５０°であり、θ２が２２°である。凹部の深さ８は２．３５ｍｍであり、凹部の容量は約６５μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は０．０９７ｍｌである。
【００７５】
試験１３で用いた容器１１３は、凹部及び培養液収容部以外は、容器１１０と同じ構造を有する。すなわち、開口幅Ｂが３５．５ｍｍであり、培養液収容部の開口幅ｂが１０．３ｍｍであり、外壁９の高さＣが９．９５ｍｍであり、培養液収容部の壁部４’の外縁である開口端３３’の高さ（内壁１０９’の高さ）Ｌが２．８５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が３．８ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が５．８ｍｍである。壁部４’の壁面は屈曲部１６０から開口端３３’までの部分では垂直な面であり、該部分の高さＨは０．７７ｍｍである。θ１が５０°であり、壁部４’の凹部開口端３２から屈曲部１６０までの部分と凹部底面６とがなす角度が２２°であり、θ２（凹部開口端３２と培養液収容部開口端３３’とをつなぐ直線と凹部底面６とがなす角度）が３７°である。凹部の容量は約２２μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は０．１３ｍｌである。
【００７６】
試験１４で用いた容器１１４は、培養液収容部以外は、試験１３で用いた容器１１３と同じ構造を有する。すなわち、開口幅Ｂが３５．５ｍｍであり、培養液収容部の開口幅ｂが１０．３ｍｍであり、外壁９の高さＣが９．９５ｍｍであり、内壁１０９’’の高さＬが２．４５ｍｍであり、凹部底面６が形成する円の直径が３．８ｍｍであり、その凹部開口端３２が形成する円の直径が５．８ｍｍである。壁部４’’の壁面は屈曲部１７０から開口端３３’’までの部分では垂直な面であり、該部分の高さＨは０．３７ｍｍであり、θ１が５０°であり、壁部４’’の凹部開口端３２から屈曲部１７０までの部分と凹部底面６とがなす角度が２２°であり、θ２（凹部開口端３２と培養液収容部開口端３３’’とをつなぐ直線と凹部底面６とがなす角度）が３０°である。凹部の容量は約２２μｌであり、凹部と培養液収容部を合計した容量は０．０９９ｍｌである。
【００７７】
評価結果を次表に示す。Ｅを５．６ｍｍとした場合、オイルの量を若干減らす（試験９）ことによりオイルの漏れは発生しにくいがオイルの均一性が得られない。一方、オイルの量を増やすとオイルがやや漏れ易い傾向はあるが扱うことができ且つオイルの均一性が得られる（試験１０）。
【００７８】
Ｅを６．６ｍｍ、７．１ｍｍ、７．５ｍｍとした試験１１〜１４では、適量のオイルを使用した場合にオイルが漏れにくく且つオイルの均一性が得られる。
【００７９】
試験９、１０に用いた容器１１０では、Ｅの値は式３を満足するが式７を満足しない。試験１１〜１４に用いた容器１１１〜１１４では、Ｅの値は式３と式７を共に満足する。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
［実施例４］
細胞培養容器１１０（図１１）、１１１（図１４）、１１２（図１５）、１１３（図１６）、１１４（図１７）のそれぞれに、６０μＬの培養液Ｄを収容し、次いで、オイル１００を液面が内壁１０９、１０９’、１０９’’の上端よりも０．１ｍｍ高くなるように収容した。各容器を振動させたところ、壁部４’、４’’の外縁である開口端３３’、３３’’の直下に高さ０．３ｍｍ以上の垂直壁を有する細胞培養容器１１３及び１１４では、該垂直壁の近傍で懸濁が発生した。この理由は、垂直壁の存在により内壁の内外のオイルが相互に激しく流動したためと考えられる。
【００８２】
【表３】
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【符号の説明】
【００８３】
１、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４：細胞培養容器
２：凹部
３１：凹部の底面と側面の接点
３２：凹部開口端
３３、３３’、３３’’：培養液収容部開口端
４、４’、４’’：壁部
５：凹部側面
６：凹部底面
７：凹部開口部
８：凹部深さ
９：外壁
５０：計量線
９０：細胞の位置決めをするための窪み
１０９：内壁
１０８：外縁底部
１００：オイル
Ａ：細胞
Ｂ：細胞培養容器の開口幅
Ｃ：細胞培養容器の高さ
Ｄ：培養液
ｂ：培養液収容部の開口幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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