(57)【要約】【課題】走査電子顕微鏡を用いて生物試料を生きたままの状態で高分解能・高コントラストで観察することを可能とする技術を提供すること。【解決手段】導電性薄膜２０１の下に設けられた第１の絶縁性薄膜２０３側には、観察試料１０が溶解等された水溶液２０が挟み込まれている。電子線入射部位がマイナスに帯電すると、水分子の電気双極子が電位勾配に添って配列し、第２の絶縁性薄膜２０４の面にも電荷が生じる。この電荷は端子部２１０により検出されて測定信号となる。電子線１０２が遮蔽された状態では、上述のマイナス電位は消失する。これにより第１の絶縁性薄膜２０３表面の電荷も消失し、端子部２１０から出力される測定信号も０となる。このような電子線のＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で繰り返すことにより、端子部２１０からこれと同様の周波数成分の信号を抽出することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方主面が観察試料の保持面である第１の絶縁性薄膜と該第１の絶縁性薄膜の他方主面に積層された導電性薄膜とを備え、
前記第１の絶縁性薄膜の一方主面側には、前記導電性薄膜側から入射された電子線に起因して生じた前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部が設けられている、走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項２】
前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記端子部との間に第２の絶縁性薄膜が設けられており、
該第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されており、
前記端子部は、前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位を信号として検出する、請求項１に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項３】
前記第１の絶縁性薄膜の厚さが２００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項４】
前記第１の絶縁性薄膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、若しくは、ポリイミド膜からなる、請求項１乃至３の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項５】
前記導電性薄膜の厚さが１００ｎｍ以下である、請求項１乃至４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項６】
前記導電性薄膜は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜である、請求項１乃至５の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項７】
前記金属薄膜は、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とする、請求項６に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項８】
前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記第２の絶縁性薄膜の一方主面との間の間隔を４０μｍ以下に設定し得る、請求項１乃至７の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項９】
前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、内部を密閉する外枠部を備え、該外枠部には内部圧力の調整機構が設けられている、請求項１乃至８の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項１０】
前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、前記第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている、請求項２乃至９の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダ。
【請求項１１】
走査電子顕微鏡と、該走査電子顕微鏡内にセットされる請求項１乃至１０の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡用試料ホルダと、前記端子部により検出された前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号若しくは前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位信号を出力信号として処理する演算装置とを備えている、走査電子顕微鏡像の観察システム。
【請求項１２】
前記演算装置は、前記出力信号を処理して、該出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、該抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて画像を形成する、請求項１１に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
【請求項１３】
前記強度変化周波数の信号成分の抽出は、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法の何れかの方法で行われる、請求項１１又は１２に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
【請求項１４】
前記端子部を複数個異なる位置に設け、前記演算装置は、前記複数の端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から前記画像の傾斜角度を求め、該傾斜角度にもとづいて前記画像に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する、請求項１１乃至１３の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システム。
【請求項１５】
請求項１１乃至１４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記導電性薄膜を前記走査電子顕微鏡のグランド電位とした状態で観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
【請求項１６】
請求項１１乃至１４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を、該入射電子線が前記第１の絶縁性薄膜をほぼ透過しない電圧に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
【請求項１７】
請求項１１乃至１４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
【請求項１８】
請求項１１乃至１４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線を１ｋＨｚ以上の周波数でオン／オフし、前記抽出される強度変化周波数を１ｋＨｚ以上に設定して観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
【請求項１９】
請求項１１乃至１４の何れか１項に記載の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面に、水溶液と一緒に観察試料を支持させた状態で観察を行う、走査電子顕微鏡像の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査電子顕微鏡による観察技術に関する。より詳細には、生物試料を生きたままの状態で観察することも可能な走査電子顕微鏡観察技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査電子顕微鏡は、生物試料や有機材料を高分解能で観測する際のツールとして広く用いられている。従来、走査電子顕微鏡で生物試料や有機材料を観察する場合には、観察対象試料の電子線ダメージを低下させ、コントラストの高い画像を得るために、試料をホルムアルデヒド等で固定化した後に、表面に金やプラチナ、カーボン等をコーティングしたり、あるいは、重金属による染色を施す等の処理が必須とされていた。
【０００３】
しかし、近年、生物試料をコーティングや染色なしに高コントラストで観察できる方法が開発された（特許文献１および非特許文献１を参照）。
【０００４】
この新規な方法では、カーボン膜などの薄い試料支持膜の下部表面に試料を付着させ、この試料支持膜の上部より低い加速電圧の電子線を照射する。照射された電子線は試料支持膜の内部で拡散しながら広がり、膜の下面付近に到達し、試料支持膜の下部表面より２次電子が放出される。この２次電子は、試料支持膜直下の試料に吸収され、これにより極めて高いコントラスの画像を得ることができる。
【０００５】
この方法では、上述の２次電子のエネルギが１０ｅＶ程度となるように条件設定される。かかる極めて弱い２次電子であれば、観察対象試料に対する電子線ダメージは顕著に低くなるため、生物試料のような損傷を受けやすい試料であっても、試料本来の形状や構造を高いコントラストの画像で観察乃至解析することが可能となる。こうした観察条件は、「間接２次電子コントラスト条件」と呼ばれる。
【０００６】
このような観察手法をさらに進展させ、絶縁薄膜層の下部に導電性膜を形成し、電子線入射による帯電効果を利用して、分解能やコントラストをさらに向上させる方法も開発されている（特許文献２および非特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−０９７８４４号公報
【特許文献２】特許第５１１５９９７号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】T. Ogura “A high contrast method of unstained biological samples under a thin carbon film by scanning electron microscopy” Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377, p79-84 (2008)
【非特許文献２】T. Ogura “Direct observation of the inner structure of unstained atmospheric cells by low-energy electrons” Meas. Sci. Technol. Vol.23, 085402(8pp) (2012)
【非特許文献３】S.Thiberge et al. “Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions” PNAS. Vol.101, p3346-3351 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在では、水溶液中の生物試料の観察を可能とするための専用ホルダ（非特許文献３を参照）や、大気圧下での生物試料観察が可能な電子顕微鏡システムも開発されてきているが、これらの手法でも電子線による生物試料へのダメージは深刻であり、しかも、電子線と生物試料との相互作用が極めて弱いため、水溶液中の生物試料を生きた状態のままで高いコントラストで観察することは極めて困難である。
【００１０】
このような事情から、生物試料を鮮明に観察するためには、様々な染色処理や固定化処理を施し、電子線のダメージを低減させるとともに、観察画像のコントラストを向上させる必要がある（非特許文献３）。
【００１１】
しかし、このような処理を施すと、観察対象である生物試料は死滅してしまい、生きている状態での観察はできなくなる。しかも、染色処理等に伴う様々なアーティファクが生じ、観察で得られた画像の信頼性も損なわれる。加えて、こうした染色処理等は熟練の技術を必要とするだけでなく、染色剤としては主に酢酸ウラン等の有害物質が用いられるため、環境保護という観点からも好ましくない。
【００１２】
上述の「間接２次電子コントラスト条件」で観察された画像は、コントラストが極めて高いという利点の反面、分解能が比較的低いという問題がある。さらに、通常、低エネルギの２次電子では、数μｍ以上の厚さ（深さ）の水溶液を透過させることが困難なため、この水溶液中にある生物試料を観察することは難しい。
【００１３】
このように、従来の観察技術では、水溶液中の生物試料を生きたままの状態で観察し、本来の形態や構造を正しく反映した高い分解能の画像を得ることが極めて困難である。
【００１４】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、染色処理や固定化処理を施すことなく、走査電子顕微鏡を用いて生物試料を生きたままの状態で高分解能・高コントラストで観察することを可能とする走査電子顕微鏡観察技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
かかる課題を解決するために、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダは、一方主面が観察試料の保持面である第１の絶縁性薄膜と該第１の絶縁性薄膜の他方主面に積層された導電性薄膜とを備え、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面側には、前記導電性薄膜側から入射された電子線に起因して生じた前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部が設けられている。
【００１６】
例えば、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記端子部との間に第２の絶縁性薄膜が設けられており、該第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されており、前記端子部は、前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位を信号として検出する。
【００１７】
好ましくは、前記第１の絶縁性薄膜の厚さが２００ｎｍ以下である。
【００１８】
例えば、前記第１の絶縁性薄膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、若しくは、ポリイミド膜からなる。
【００１９】
好ましくは、前記導電性薄膜の厚さが１００ｎｍ以下である。
【００２０】
また、好ましくは、前記導電性薄膜は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜である。
【００２１】
例えば、前記金属薄膜は、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とする。
【００２２】
好ましくは、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面と前記第２の絶縁性薄膜の一方主面との間の間隔を４０μｍ以下に設定し得る。
【００２３】
また、好ましくは、前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、内部を密閉する外枠部を備え、該外枠部には内部圧力の調整機構が設けられている。
【００２４】
さらに、好ましくは、前記走査電子顕微鏡用試料ホルダは、前記第２の絶縁性薄膜の一方主面と前記第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている。
【００２５】
本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムは、走査電子顕微鏡と、該走査電子顕微鏡内にセットされる上述の走査電子顕微鏡用試料ホルダと、前記端子部により検出された前記第１の絶縁性薄膜の一方主面の電位に基づく信号若しくは前記第２の絶縁性薄膜の他方主面の電位信号を出力信号として処理する演算装置とを備えている。
【００２６】
好ましくは、前記演算装置は、前記出力信号を処理して、該出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、該抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて画像を形成する。
【００２７】
例えば、前記強度変化周波数の信号成分の抽出は、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法の何れかの方法で行われる。
【００２８】
好ましくは、前記端子部を複数個異なる位置に設け、前記演算装置は、前記複数の端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から前記画像の傾斜角度を求め、該傾斜角度にもとづいて前記画像に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する。
【００２９】
本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記導電性薄膜を前記走査電子顕微鏡のグランド電位とした状態で観察を行う。
【００３０】
また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を、該入射電子線が前記第１の絶縁性薄膜をほぼ透過しない電圧に設定して観察を行う。
【００３１】
また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定して観察を行う。
【００３２】
また、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記入射電子線を１ｋＨｚ以上の周波数でオン／オフし、前記抽出される強度変化周波数を１ｋＨｚ以上に設定して観察を行う。
【００３３】
さらに、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察方法は、上述の走査電子顕微鏡像の観察システムを用い、前記第１の絶縁性薄膜の一方主面に、水溶液と一緒に観察試料を支持させた状態で観察を行う。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、水溶液中の生物試料を、簡便に、しかも、染色処理や固定化処理を施すことなく、極めて高いコントラストで観察することが可能となる。加えて、電子線による試料へのダメージも生じないため、細胞やバクテリア、ウイルス、タンパク質複合体等の生物試料をはじめ、ダメージを受けやすい有機材料についても、本来の形態や構造を知ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムの構成例を説明するためのブロック図である。
【図２】本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダの構成例を説明するための断面概略図である。
【図３】厚みが５０ｎｍの窒化シリコン薄膜の上部に、厚さ５ｎｍのニッケルと厚さ２０ｎｍのタングステンを積層させ、ニッケル／タングステンの積層膜に電子線を入射させた際の散乱状態を、モンテカルロシミュレーションにより計算した結果である。
【図４】本発明に係る試料ホルダに、矩形波状に強度変化する電子線が入射した際に、端子部で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図で、図４（ａ）は電子線が入射する状態（ＯＮ状態）、図４（ｂ）は電子線が絞りで遮られて入射しない状態（ＯＦＦ状態）を示している。
【図５】電子線が観察試料である生物試料に照射された場合の、端子部で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図である。
【図６】本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ内に、水溶液中に溶解させたバクテリアを収容して観察して得られた観察画像である。
【図７】本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ内に、水溶液中に溶解させた酵母を収容して観察して得られた観察画像であり、図７（ａ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合の観察画像、図７（ｂ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が８０ｋＨｚの場合の観察画像である。
【図８】端子部を複数個異なる位置に設けた態様の走査電子顕微鏡像の観察システム構成例である。
【図９】外枠部に内部の圧力を調整するための機構を設けた態様の試料ホルダの構造を説明するための図である。
【図１０】第２の絶縁性薄膜の一方主面と第１の絶縁性薄膜の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている試料ホルダの構成例で、図１０（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、斜視図、上面図、断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下に、図面を参照して、本発明を実施するための形態について説明する。
【００３７】
図１は、本発明に係る走査電子顕微鏡像の観察システムの構成例を説明するためのブロック図である。
【００３８】
この図に示した例では、当該システムは、走査電子顕微鏡１００と、この走査電子顕微鏡１００の内部にセットされる走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００と、ファンクションジェネレータ３００と、ロックインアンプ４００と、データレコーダ５００と、演算装置としてのＰＣ６００を備えている。
【００３９】
走査電子顕微鏡１００には、電子銃１０１から射出された電子線１０２の観察試料への照射強度を制御するためのビームブランキング装置１０３が設けられている。ビームブランキング装置１０３は、観察試料への入射電子線の強度変化を得るためのもので、鏡体外に設けられたファンクションジェネレータ３００から、例えば、１ｋＨｚ以上の周波数のＯＮ／ＯＦＦ信号が矩形波状の制御信号として入力される。また。ファンクションジェネレータ３００は、ロックインアンプ４００に対し、リファレンス信号（参照信号）を出力する。
【００４０】
ファンクションジェネレータ３００からＯＦＦの制御信号が入力されると、電子銃１０１から射出された電子線１０２は直進し、その全てが絞り１０４を透過して、試料ホルダ２００内に収容されている観察試料（不図示）に照射される。
【００４１】
一方、ファンクションジェネレータ３００からＯＮの制御信号が入力されると、ビームブランキング装置１０３の近傍に電界が生じ、電子銃１０１から射出された電子線１０２はその軌道が曲げられ、その全て（若しくは一部）が絞り１０４により遮られる。
【００４２】
その結果、制御信号がプラス電位の時は、ビームブランキング装置１０３に電界が生じ、電子線がクーロン力により曲げられて絞り１０４により遮蔽されて観察試料に入射する電子線はＯＦＦとなる一方、制御信号がゼロ電位の時は、電子線は絞り１０４を通過して観察試料に照射される。
【００４３】
こうした制御信号によるＯＮ／ＯＦＦを繰り返すことで、観察試料へ照射される電子線の強度が変化する。このときの制御信号の周波数は１ｋＨｚ以上であることが好適であり、ここでは一般には、２０〜１００ｋＨｚの範囲で設定する。
【００４４】
つまり、ファンクションジェネレータ３００から入力される制御信号により、試料ホルダ２００内に収容されている観察試料（不図示）に照射される電子線強度は、制御信号と同じ周波数で変化することとなる。
【００４５】
試料ホルダ２００内に収容されている観察試料に電子線が照射されると、後述する理由により、試料ホルダ２００内で、電子線の入射に起因して生じる電位に基づく信号が生成する。この信号は、試料ホルダ２００の下部に設けられた端子部２１０によって検出され、アンプ１０５で増幅されて測定信号としてロックインアンプ４００へと出力される。つまり、ロックインアンプ４００には、ファンクションジェネレータ３００からのリファレンス信号とアンプ１０５からの測定信号が入力される。
【００４６】
ロックインアンプ４００は、リファレンス信号を用いて、測定信号の中から、ファンクションジェネレータ３００のリファレンス信号の周波数成分のみを抽出し、これを出力信号としてデータレコーダ５００に送信する。
【００４７】
演算装置としてのＰＣ６００は、上述の出力信号を処理して、この出力信号から強度変化周波数の信号成分を抽出し、抽出された強度変化周波数の信号成分に基づいて、電子線の走査信号に従い画像を形成する。ここで、上述の強度変化周波数の信号成分の抽出は、例えば、バンドパスフィルタ法、ロックインアンプ法、自己相関解析法、フーリエ変換解析法などの手法により行うことができる。
【００４８】
図２は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダの構成例を説明するための断面概略図である。
【００４９】
この試料ホルダ２００は、一方主面が観察試料１０の保持面である第１の絶縁性薄膜２０３と、この第１の絶縁性薄膜２０３の他方主面に積層された導電性薄膜２０１とを備えている。この積層体は、真空中の観察に耐えられる程度の耐圧性を備えている。つまり、電子顕微鏡体内でも、ホルダ内は大気圧状態を保持することができる。そして、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面側には、導電性薄膜２０１側から入射された電子線１０２に起因して生じた第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面の電位に基づく信号を検出する端子部２１０が設けられている。
【００５０】
この図に示した構成例では、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と端子部２１０との間に、第２の絶縁性薄膜２０４が設けられており、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面とが所定の間隔の隙間を有するように配置されている。従って、この構成の場合は、端子部２１０は、第２の絶縁性薄膜２０４の他方主面の電位を信号として検出することになる。この端子部２１０は、試料支持膜としての第１の絶縁性薄膜２０３および第２の絶縁性薄膜２０４からは電気的に絶縁した状態で、これらと離間させて設けられている。
【００５１】
なお、第２の絶縁性薄膜２０４は必須のものではなく、例えば、観察試料を極薄の水の層中に溶解等させることができれば、その表面張力により観察試料は保持されるから、第２の絶縁性薄膜２０４が無くとも、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面の電位に基づく信号を端子部２１０で検出することが可能である。
【００５２】
観察試料１０は、水溶液２０の中にある生物試料であってよく、第１の絶縁性薄膜２０３と第２の絶縁性薄膜２０４の間に封入され、導電性パッキン２０６やＯリング２０７で内部がシールされた導電性の外枠部２０８に収容されている。つまり、水溶液と一緒に生物試料を支持させた状態での観察が可能である。
【００５３】
なお、後述するように、外枠部２０８には、内部の圧力を調整するための機構を設けるようにしてもよい。また、符号２０９で示したものは端子部２１０を外枠部２０８から絶縁するための絶縁部材であり、符号２０２および２０５で示したものは強度維持等の目的で設けられているフレーム部であり、符号３０は入射した電子線２０１の拡散領域である。
【００５４】
図２に示した例では、パッキン２０６と外枠部２０８は何れも導電性であり、導電性薄膜２０１は走査電子顕微鏡１００のグランド電位とされ、この状態で観察が行われる。
【００５５】
電子銃１０１から射出される電子線１０２の加速電圧は、入射電子線が第１の絶縁性薄膜２０３をほぼ透過しない電圧に設定することが好ましい。具体的には、入射電子線が導電性薄膜２０１の内部で、ほぼ散乱乃至吸収されてしまうような加速電圧とすることが好ましい。このような電圧設定により、第１の絶縁性薄膜２０３側に１次電子がほぼ透過せず、観察試料１０への電子線ダメージを完全に防ぐことができる。
【００５６】
一般に、入射電子線の加速電圧を１０ｋＶ以下に設定すれば、上記条件が実現される。
【００５７】
第１の絶縁性薄膜２０３が厚すぎると、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、第１の絶縁性薄膜２０３の厚さは、２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００５８】
第１の絶縁性薄膜２０３の材質としては、窒化シリコン膜、カーボン膜、ポリイミド膜を例示することができる。
【００５９】
導電性薄膜２０１が厚すぎても、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、導電性薄膜２０１の厚さは、１００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００６０】
導電性薄膜２０１は、比重が１０ｇ／ｃｍ３以上の金属を主成分とする金属薄膜であることが好ましい。これは、電子線の遮蔽性と入射電子の内部拡散を効率的に抑えるためである。このような金属薄膜としては、タンタル、タングステン、レニウム、モリブデン、オスミウム、金、プラチナのうちの何れかを主成分とするものを例示することができる。
【００６１】
図３は、厚みが５０ｎｍの窒化シリコン薄膜の上部に、厚さ５ｎｍのニッケルと厚さ２０ｎｍのタングステンを積層させ、ニッケル／タングステンの積層膜に加速電圧３ｋＶの電子線を入射させた際の散乱状態を、モンテカルロシミュレーションにより計算した結果である。
【００６２】
入射電子の殆どは、比重が１９．３ｇ／ｃｍ３のタングステン膜内で散乱乃至吸収されている。極一部の電子は窒化シリコン薄膜へと散乱するが、この電子の全ては窒化シリコン薄膜内で吸収されている。つまり、１次電子が第１の絶縁性薄膜である窒化シリコン薄膜を透過することはない。
【００６３】
第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の間隔が厚すぎる場合にも、端子部２１０で検知される信号の強度が低下する。このため、当該間隔は、４０μｍ以下に設定し得ることが好ましい。
【００６４】
このような試料ホルダ２００内に観察試料１０を収容し、電子線１０２を１ｋＨｚ以上の周波数でＯＮ／ＯＦＦさせながら入射し、ロックインアンプ４００により抽出される強度変化周波数を電子線１０２の上記周波数（１ｋＨｚ以上）に設定して観察を行う。
【００６５】
図４は、本発明に係る試料ホルダ２００に、矩形波状に強度変化する電子線１０２が入射した際に、端子部２１０で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図で、図４（ａ）は電子線が入射する状態（ＯＮ状態）、図４（ｂ）は電子線が絞りで遮られて入射しない状態（ＯＦＦ状態）を示している。
【００６６】
図４（ａ）に示した様に、電子線１０２が入射する状態（ＯＮ状態）では、ほぼ全ての入射電子は導電性薄膜２０１で散乱乃至吸収される。これにより、電子線の入射部位に電子が蓄積され、当該部位がマイナス電位となる。
【００６７】
導電性薄膜２０１の下に設けられた第１の絶縁性薄膜２０３側には、観察試料１０が溶解等された水溶液２０が挟み込まれている。この水溶液２０の水分子そのものは分極しているため、電子線入射部位がマイナスに帯電すると、水分子の電気双極子が電位勾配に添って配列する。この電気双極子配列により、水溶液２０の下側にある第２の絶縁性薄膜２０４の面にも電荷が生じる。この電荷は第２の絶縁性薄膜２０４の主面に生じた電位信号として、端子部２１０により検出されて測定信号となる。
【００６８】
一方、図４（ｂ）に示した様に、電子線１０２が遮蔽された状態（ＯＦＦ状態）では、導電性薄膜２０１内の入射電子はＧＮＤへと直ちに流れ込み、上述のマイナス電位は消失する。これにより水溶液２０中の電気双極子の配列はバラバラに崩れ、第１の絶縁性薄膜２０３表面の電荷も消失し、端子部２１０から出力される測定信号も０となる。
【００６９】
このような電子線のＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で繰り返すことにより、端子部２１０からこれと同様の周波数成分の信号を抽出することができる。
【００７０】
図５は、電子線１０２が観察試料１０である生物試料に照射された場合の、端子部２１０で信号が検出されるメカニズムを概念的に説明するための図である。
【００７１】
ＯＮ／ＯＦＦを１ｋＨｚ以上の周波数で電子線１０２が照射されると、生物試料の誘電率は水に比べて極めて低いため、電気双極子の配列は弱くなり、測定信号の強度も低下する。
【００７２】
水分子の誘電率は約８０と大きいため、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面に電位変化が生じると、これを水溶液２０中での伝播力が強い信号として利用できる。一方、生物試料１０の誘電率は一般に低く、例えばタンパク質の誘電率は２〜３であるため、当生物試料中での電位変化信号の伝播力は弱い。従って、このような大きな誘電率の差（伝播力の差）によって、高いコントラストを得ることができる。
【００７３】
その結果、生物試料１０中と水溶液２０中とで、誘電率の差に起因する電位変化信号の伝播力に差が生じ、これを第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面側に設けた端子部２１０で検出することで、生物試料を染色すること無く、高いコントラストで観察することが可能となる。しかも、生物試料１０には、電子線が直接照射されることがないため、観察試料１０が電子線照射によりダメージを受けることがない。
【００７４】
なお、観察により得られる画像の分解能は、略、電子線の照射径に依存する。このため、電子線の照射径を１ｎｍ程度にまで絞り込めば、これと略同等の分解能（１ｎｍ）を達成することも可能である。その結果、バクテリア、ウイルス、タンパク質、或いは、タンパク質複合体からなる生物試料も、生きた状態での高分解能・高コントラストでの観察が可能となる。
【実施例】
【００７５】
以下に、観察試料であるバクテリアおよび酵母を水溶液に溶解させ、試料ホルダ２００内に封入して走査電子顕微鏡観察を行った例について説明する。
【００７６】
図６は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００内に、水溶液２０中に溶解させたバクテリア１０を収容して観察して得られた観察画像である。観察時の電子線の加速電圧は３ｋＶ、入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数は３０ｋＨｚである。
【００７７】
ここで、サンプル支持膜である第１の絶縁性薄膜２０３は、厚みが５０ｎｍの窒化シリコン膜であり、その上部には、図３に示したように、厚み５ｎｍのニッケルと厚み２０ｎｍのタングステンが薄膜形成された導電性薄膜２０１が積層されている。
【００７８】
水溶液試料は、第１の絶縁性薄膜２０３と５０ｎｍの厚みの第２の絶縁性薄膜２０４との間で挟み込み、第２の絶縁性薄膜２０４の下方に、空隙を設けて端子部２１０を設置した。
【００７９】
この観察画像からは、細長い５ｎｍ程のバクテリアと球状のバクテリアが明瞭に確認できる。この観察に際しては、染色処理や固定処理は全く施していないが、極めて高いコントラストの画像が得られている。
【００８０】
図７は、本発明に係る走査電子顕微鏡用試料ホルダ２００内に、水溶液２０中に溶解させた酵母１０を収容して観察して得られた観察画像であり、図７（ａ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合の観察画像、図７（ｂ）は入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が８０ｋＨｚの場合の観察画像である。なお、観察時の電子線の加速電圧は３ｋＶである。
【００８１】
入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数が３０ｋＨｚの場合でも、サイズが１０μｍ前後の酵母が、極めて高いコントラストで観察できているが、入射電子線のＯＮ／ＯＦＦ周波数を８０ｋＨｚとした場合には、観察画像は更にクリアとなっている。
【００８２】
図８は、端子部２１０ａ〜ｃを複数個異なる位置に設けた態様の走査電子顕微鏡像の観察システム構成例である。端子部２１０ａ〜ｃを複数個設けたことに対応して、アンプ１０５ａ〜ｃおよびロックインアンプ４００ａ〜ｃも複数個設けられている。
【００８３】
演算装置は、各端子部のそれぞれから抽出される強度変化周波数の信号成分ごとに画像を形成し、電子線の入射位置と端子部が設けられている位置との関係から画像の傾斜角度を求め、この傾斜角度にもとづいて画像（傾斜画像）に補正を行い、補正後の複数の画像に基づいて観察試料の３次元構造情報を解析する。
【００８４】
例えば、端子部を３つ設けた場合には、左側に設けた端子部１０５ａからの傾斜画像と右側に設けた端子部１０５ｃからの傾斜画像、および、観察試料を正面から観察する位置にある中央の端子部１０５ｂからの傾斜画像を、一回の観察で得ることができる。これら３つの画像は、各画像の傾斜角度に従い、３次元再構成アルゴリズムを用いて３次元画像として構築される。
【００８５】
図９は、外枠部２０８に、内部の圧力を調整するための機構を設けた態様の試料ホルダ２００の構造例を説明するための図で、図９（ａ）は大気圧下での様子、図９（ｂ）は真空中（顕微鏡体内）での様子を図示してある。この図に示した例では、減圧膜２１１を圧力調整機構とし、これを外枠部２０８の下面側に設けている。
【００８６】
試料ホルダ２００の減圧膜２１１は、顕微鏡体内で外側に膨らみ、ホルダ内の圧力が減少する。導電性薄膜２０１側も外側に湾曲するが、減圧膜２１１の効果により、湾曲度は緩和される。
【００８７】
なお、第２の絶縁性薄膜２０４の下方の領域はＯリング２０７により密閉されており、大気圧を保持している。そのため、第２の絶縁性薄膜２０４は、下方ではなく上方へと湾曲し、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の隙間が広がって観察試料１０の保持に支障が生じることがない。
【００８８】
このような試料ホルダ２００において、第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面と第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路を設け、試料ホルダ２００内に複数種の溶液を封入し、溶液の切り替えを行いながら観察するようにしてもよい。
【００８９】
図１０は、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面との間の所定間隔の隙間に、水溶液を潅流させるための流路が設けられている試料ホルダ２００の一部構成の例で、図１０（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、斜視図、上面図、断面図である。
【００９０】
この図に示した例では、水溶液を潅流させるための流路が３つ設けられている。試料ホルダ２００の外枠部２０８は上部２０８ａと下部２０８ｂを有している。この上部２０８ａには、３つの流路２１２に対応付けられた注入孔２１３が形成されており、これらの流路２１２に導入された溶液は、表面張力の作用により、第２の絶縁性薄膜２０４の一方主面と第１の絶縁性薄膜２０３の一方主面との間の所定間隔の隙間にまで導入される。
【００９１】
また、この試料ホルダ２００の側部には、注入孔２１３から溶液を押し出すための圧力印加部としてのダンパ２１４が設けられており、これらのダンパ２１４の先端には圧力印加弁２１５が設けられている。
【００９２】
このような複数の流路２１２を設けることとすると、予め細胞やバクテリアといった観察試料１０を収容した試料ホルダ２００内に、新たに試薬等を送り込み、これによる反応を詳細に観察する等の実験等も容易となる。なお、図中に符号２１６で示したものは、排出液タンクである。このような溶液の送り込みは、圧力印加部によらず、電気泳動的に行うこととしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
以上説明したように、本発明により、水溶液中の生物試料を、簡便に、しかも、染色処理や固定化処理を施すことなく、極めて高いコントラストで観察することが可能となる。加えて、電子線による試料へのダメージも生じないため、細胞やバクテリア、ウイルス、タンパク質複合体等の生物試料をはじめ、ダメージを受けやすい有機材料についても、本来の形態や構造を知ることが可能となる。
【符号の説明】
【００９４】
１０  観察試料
２０  水溶液
３０  拡散領域
１００  走査電子顕微鏡
２００  試料ホルダ
３００  ファンクションジェネレータ
４００  ロックインアンプ
５００  データレコーダ
６００  ＰＣ
１０１  電子銃
１０２  電子線
１０３  ビームブランキング装置
１０４  絞り
１０５  アンプ
２０１  導電性薄膜
２０２、２０５  フレーム部
２０３  第１の絶縁性薄膜
２０４  第２の絶縁性薄膜
２０６  導電性パッキン
２０７  Ｏリング
２０８  外枠部
２０９  絶縁部材
２１０  端子部
２１１  減圧膜
２１２  流路
２１３  注入孔
２１４  ダンパ
２１５  圧力印加弁
２１６  排出液タンク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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