(57)【要約】      （修正有）【課題】薬物と化学的に共役する細胞結合剤を含み、十分に高い純度及び安定性を有する複合体の調製方法の提供。【解決手段】抗体と二官能性架橋試薬とを接触させ、抗体にリンカーを共有結合させ、リンカーが結合した抗体を含む第一混合物を調製し、第一混合物とメイタンシノイドを、ｐＨ４〜９の溶液中で反応させ、メイタンシノイドを第一混合物中のリンカーが結合した抗体と複合化させて、メイタンシノイドとリンカーを介して化学的に共役した抗体、遊離メイタンシノイド、及び、反応副産物を含む第二混合物を調製し、該第二混合物から抗体−メイタンシノイド複合体を精製するが、第一混合物は精製に供されないことを条件とする、抗体−メイタンシノイド複合体の調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞結合剤−薬物複合体の調製方法であって、該方法が、工程：
（ａ）細胞結合剤と二官能性架橋試薬とを接触させ、細胞結合剤にリンカーを共有結合させ、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、
（ｂ）第一混合物を、接線流濾過、選択的沈殿、吸着濾過、又は吸着クロマトグラフィ樹脂に供し、それによって、精製されたリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、
（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤と薬物とを、ｐＨ約４〜約９の溶液中で反応させることによって、薬物を、精製された第一混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合化させて、（ｉ）リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、及び（ｉｉｉ）反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、並びに
（ｄ）第二混合物を、接線流濾過、選択的沈殿、吸着濾過、又は吸着クロマトグラフィ樹脂に供し、リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤を、第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製すること、
を含む、方法。
【請求項２】
吸着クロマトグラフィー樹脂が、ヒドロキシアパタイト、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、接線流濾過が用いられる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、吸着クロマトグラフィー樹脂が用いられる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において接線流濾過が用いられ、工程（ｃ）がｐＨ６〜６．５の間で行われ、工程（ｄ）において用いられる吸着クロマトグラフィー樹脂がイオン交換樹脂ではない、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）において、吸着クロマトグラフィー樹脂が用いられ、工程（ｄ）において、接線流濾過が用いられる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）における溶液がｐＨ約４〜約６である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）における溶液がｐＨ約６．５〜約９である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞結合剤が、抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びトランスフェリンから成る群から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞結合剤が抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗体がヒト化モノクロナール抗体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
薬物が細胞毒性剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞毒性剤が、メイタンシノイド類、タキサン類、及びＣＣ１０６５から成る群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
薬物がメイタンシノイドである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
メイタンシノイドがＤＭ１である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
メイタンシノイドがＤＭ４である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
細胞結合剤が、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼに不安定な結合から成る群から選択される化学結合を介して、化学的に薬物と共役する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）における溶液がスクロースを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）における溶液が更に、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液から成る群から選択される緩衝化剤を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
細胞結合剤−薬物複合体の調製方法であって、該方法が、工程：
（ａ）細胞結合剤と二官能性架橋試薬とを接触させ、細胞結合剤にリンカーを共有結合させ、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、
（ｂ）第一混合物を、接線流濾過、選択的沈殿、吸着濾過、又は吸着クロマトグラフィ樹脂に供し、それによって、精製されたリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、
（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤と薬物とを、ｐＨ約４〜約６又はｐＨ約６．５〜９の溶液中で反応させることによって、薬物を、精製された第一混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合化させて、（ｉ）リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、及び（ｉｉｉ）反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、並びに
（ｄ）第二混合物を、接線流濾過、選択的沈殿、吸着濾過、又は吸着クロマトグラフィ樹脂に供し、リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤を、第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製すること、を含む方法。
【請求項２４】
吸着クロマトグラフィー樹脂が、ヒドロキシアパタイト、疎水性電荷誘導クロマトグラ
フィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、接線流濾過が用いられる、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、吸着クロマトグラフィー樹脂が用いられる、請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）において、吸着クロマトグラフィー樹脂が用いられ、工程（ｄ）において、接線流濾過が用いられる、請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２８】
細胞結合剤が、抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びトランスフェリンから成る群から選択される、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
細胞結合剤が抗体である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
抗体がヒト化モノクロナール抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブから成る群から選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
薬物が細胞毒性剤である、請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
細胞毒性剤が、メイタンシノイド類、タキサン類、及びＣＣ１０６５から成る群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
薬物がメイタンシノイドである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
メイタンシノイドがＤＭ１である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
メイタンシノイドがＤＭ４である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
細胞結合剤が、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼに不安定な結合から成る群から選択される化学結合を介して、化学的に薬物と共役する、請求項２３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
工程（ｃ）における溶液がスクロースを含む、請求項２３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｃ）における溶液が更に、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液から成る群から選択される緩衝化剤を含む、請求項２３〜４０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複合体が、薬物と化学的に共役する細胞結合剤を含み、十分に高い純度及び安定性を有する複合体の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌の処置は、より効率良く癌細胞を標的とし、死滅させる医薬品の発展により、非常に進歩してきた。この目的を達成するために、研究者らは、腫瘍特異的又は腫瘍関連薬剤に結合する抗体に基づいた薬物を開発するため、癌細胞によって選択的に発現される細胞表面受容体及び抗原を利用してきた。これに関し、バクテリア及び植物性毒素、放射性核種、並びに特定の化学療法薬といった細胞毒性分子が、腫瘍特異的又は腫瘍関連細胞表面抗原に結合するモノクロナール抗体に化学的に結合されてきた（例、国際特許出願ＷＯ００／０２５８７、ＷＯ０２／０６０９５５、及びＷＯ０２／０９２１２７、米国特許第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、及び同第６，１７１，５８６号、米国特許出願公開番号２００３／０００４２１０  Ａ１、並びにＧｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１２：２６７−２７７（１９８８）参照）。このような化合物は概して、各々、毒素、放射性核種、及び薬物「複合体」と称される。しばしばそれらは又、免疫複合体、放射性免疫複合体（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、及び免疫毒素とも称される。腫瘍細胞の死滅は、薬物複合体の腫瘍細胞への結合並びに薬物の細胞毒性活性の放出又は／及び活性化に基づき起こる。薬物複合体によりもたらされる選択性は、正常細胞に対する毒性を最小化し、それにより、患者において薬物の耐性を促進する。
【０００３】
メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）のようなスルフヒドリル基含有細胞毒性剤に対する抗体を複合化させる方法は、以前に記述がなされている（例、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び同第６，４４１，１６３号参照）。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号及び同第５，４１６，０６４号は、米国特許第４，１４９，００３号、同第４，５６３，３０４号及び米国特許出願公開番号２００４／０２４１１７４  Ａ１中で記述されているようなヘテロ二官能性試薬で、抗体がはじめに修飾された、抗体−メイタンシノイド複合体の製造方法を開示している。米国特許第５，２０８，０２０号及び同第５，４１６，０６４号は、ｐＨ７における過量のスルフヒドリル基含有細胞毒性剤での修飾抗体の複合化、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５クロマトグラフィーカラム上での精製について更に記述している。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による抗体−薬物の精製も又、記述がなされている（例、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ（ＵＳＡ），９３：８６１８−８６２３（１９９６）、及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２）参照）。
【０００４】
抗体−薬物複合体の製造について以前に記述された方法は、それらの方法が、実施することが面倒な工程によって妨げられるか、又は最も所望されるよりも不純若しくは不安定な免疫複合反応を産生するため、複雑である。例えば、ｐＨ６．０〜６．５の間における複合体化は、純粋且つ安定な複合体を産生するのには最適ではない。更に、これらの状況下の複合化反応は、一般的に遅く、非効率的であり、過度の時間と材料の消費を要求する。
【０００５】
純度及び／又は安定性といった産生物の質を妥協することなく、一以上の製造工程を改
良又は除去することが望まれるであろう。これまで記述されたものよりさらなる精製の選択肢を有することは更に望ましく、それは一部の選択肢が、細胞結合剤、リンカー、及び薬物の特定の組み合わせで、他のものよりも、より効果的になるためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の観点から、実質的に高い純度及び同時により優れた安定性を有する細胞結合剤−薬物複合体組成物を調製する、改良方法を開発する技術が必要である。本発明は、このような方法を提供する。これら及び本発明の他の利点、並びに更なる本発明の特徴は、本明細書中で提供される本発明の記述から明白となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の簡潔な要約
本発明は、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む、実質的に高い純度及び安定性を有する複合体の調製方法を提供する。該方法は、（ａ）細胞結合剤と二官能性架橋試薬とを接触させ、細胞結合剤にリンカーを共有結合させ、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、（ｂ）第一混合物を、接線流濾過、吸着クロマトグラフィ、吸着濾過、選択的沈殿、又はそれらの組合せに供し、それによって、精製された、リンカーが結合した細胞結合剤の第一混合物を調製すること、（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤と薬物とを、ｐＨ約４〜約９の溶液中で反応させることによって、薬物を、精製された第一混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合化させて、（ｉ）リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、及び（ｉｉｉ）反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、並びに（ｄ）第二混合物を、接線流濾過、吸着クロマトグラフィ、吸着濾過、選択的沈殿、又はそれらの組合せに供し、リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤を、第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製すること、を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の詳細な説明
本発明は、実質的に高い純度及び安定性を有する細胞結合剤−複合体の調整方法を提供する。このような組成物は、複合体の高い純度及び安定性のため疾患処置に用いられ得る。抗体といった細胞結合剤が、メイタンシノイドといった薬物と化学的に共役したものを含む組成物は、例えば、米国特許出願公開番号２００４／０２４１１７４  Ａ１中に記述されている。この文脈では、実質的に高い純度とは：（ａ）複合体種の９０％を超える、好ましくは、９５％を超えるものが、単量体である、及び／又は（ｂ）複合体調製物中の遊離薬物レベルが２％未満（全薬物に対して）であることとされている。
【０００９】
この観点において、本発明の方法は、（ａ）細胞結合剤を二官能性架橋試薬で改変し、細胞結合剤にリンカーを共有結合させ、それによってリンカーが結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、（ｂ）第一混合物を、接線流濾過、吸着クロマトグラフィ、吸着濾過、選択的沈殿、又はそれらの組合せに供し、リンカーが結合した細胞結合剤を、第一混合物の他の成分から精製し、それによって、精製された、リンカーが結合した細胞結合剤の第一混合物を調製すること、（ｃ）リンカーが結合した細胞結合剤と薬物とを、ｐＨ約４〜約９の溶液中で反応させることによって、薬物を、精製された第一混合物中のリンカーが結合した細胞結合剤と複合化させて、（ｉ）リンカーを介し薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、及び（ｉｉｉ）反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、並びに（ｄ）第二混合物を、接線流濾過、吸着クロマトグラフィ、吸着濾過、選択的沈殿、又はそれらの組合せに供し、非複合体化薬物、反応物、及び副産物を除去し、かつ実質的に精製された細胞結合剤−薬物複合体を得ること、を含む。
【００１０】
好ましくは、接線流濾過（ＴＦＦ、クロスフロー濾過（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外濾過及びダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）としても又、知られている）、及び／又は吸着クロマトグラフィー樹脂が、精製工程において利用される。しかしながら、ＴＦＦが第一の精製工程（工程ｂ）で用いられ、（工程ｃ）において、ｐＨ６．０〜６．５での複合体化が用いられ、且つ吸着クロマトグラフィー樹脂が、第二の精製工程（工程ｄ）において利用された場合、吸着クロマトグラフィー樹脂は、非イオン交換樹脂であることが望ましい。他の好ましい実施形態において、ＴＦＦが、両精製工程において利用され、又は吸着クロマトグラフィー樹脂が、両精製工程において利用される。あるいは、吸着クロマトグラフィー樹脂が、第一の精製工程において利用され、ＴＦＦが、第二の精製工程において利用される。同様にＴＦＦ及び吸着クロマトグラフィー樹脂の組み合わせが、第一及び／又は第二の精製工程において利用され得る。
【００１１】
ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、ザルトコンカッセトシステム（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）、及びセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）を含む、任意の適したＴＦＦ系が利用され得る。
【００１２】
任意の適した吸着クロマトグラフィー樹脂が利用され得る。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー（ｄｙｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせ用の樹脂が挙げられる。適したヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴタイプＩ及びタイプＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）、及びセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴタイプＩ及びタイプＩＩ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。適したＨＣＩＣ樹脂の例としては、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）が挙げられる。適したＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース、及びオクチルセファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ製）、並びにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  メチル及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。適したイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース、及びＱ−セファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ製）、並びにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。適した混合モードイオン交換器の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）が挙げられる。適したＩＭＡＣ樹脂の例としては、キレーテイングセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。適した色素リガンド樹脂の例としては、ブルーセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びアフィゲルブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。適したアフィニティー樹脂の例としては、細胞結合剤が抗体であるプロテインＡ  セファロース樹脂（例、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
及び細胞結合剤が適当なレクチン結合部位を持つレクチンアフィニティー樹脂、例えばＬｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。あるいは、細胞結合剤特異的抗体が用いられ得る。このような抗体は、例えばセファロース４  ファーストフロー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に固定化され得る。適した逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、及びＣｌ８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）が挙げられる。
【００１３】
本発明の方法に準じ、リンカーが結合した細胞結合剤、並びに反応物及び他の副生成物を含む第一混合物が生成される。第一混合物を精製工程に供することにより、反応物及び他の副生成物からの改変された細胞結合剤の精製が行われる。これに関し、第一混合物は、接線流濾過、例えば、膜ベースの接線流濾過の工程）、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、若しくは選択的沈澱、又は任意の他の適した精製工程、及びそれらの組み合わせを用いて、精製され得る。第一の精製工程は、本発明に準ずる精製の前の第一混合物と比較し、精製された第一混合物（即ち、リンカーが結合した細胞結合剤濃度の上昇及び非結合の二官能性架橋試薬量の減少）をもたらす。
【００１４】
リンカーが結合した細胞結合剤の精製された第一混合物を取得するための第一混合物の精製後、ｐＨ約４〜約９の溶液中、リンカーが結合した細胞結合剤と薬物とを反応させることにより、第一精製混合物中、薬物を、リンカーが結合した細胞結合剤と複合化され、その結果、（ｉ）リンカーを介し薬物に化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、及び（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第二混合物が生成される。複合化反応は、ｐＨ約４〜約９で行われるものの、反応は、好ましくは、ｐＨ約６以下又はｐＨ約６．５以上、最も好ましくは、ｐＨ約４〜約６又はｐＨ約６．５〜約９、特にｐＨ４〜６．５未満又は６．５を超えるｐＨ〜ｐＨ９で、行われる。複合化工程が、ｐＨ約６．５以上で行われた場合、幾つかのスルフヒドリル基（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）含有薬物は、ジスルフィド結合形成によって二量体となる傾向にある。反応混合物からの微量金属及び／又は酸素の除去、並びに抗酸化物質の随意の添加又はより反応性の高い脱離基を有するリンカーの使用、又は１アリコートを超える薬物の添加が、このような状況において、効果的な反応を許容するのに要求され得る。
【００１５】
随意に、修飾された細胞結合剤の精製は、省略され得る。このような状況において、薬物は、架橋試薬と同時に、又はその後のある時点（例えば細胞結合剤に対する架橋試薬の添加後、１、２、３時間後又はこれよりより多くの時間後）において、添加され得る。
【００１６】
本発明の方法は、細胞結合剤−薬物複合体の安定性及び回収を向上させるために、本発明の方法中で用いられる複合化工程にスクロースを添加することを随意に含み得る。望ましくは、スクロースは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、又は２０％（ｗ／ｖ））の濃度にて添加される。好ましくは、スクロースは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約２％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、又は約８％（ｗ／ｖ））の濃度にて添加される。更に、複合化反応は、緩衝剤の添加も又、含み得る。当分野で公知の任意の適した緩衝剤を使用することができる。適した緩衝剤としては、例えば、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液が挙げられる。
【００１７】
複合化工程に次いで、第二混合物は、精製工程に供される。これに関し、第二混合物は、本明細書中に記載される接線流濾過（ＴＦＦ）（例えば、膜ベースの接線流濾過工程）、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、選択的沈澱、又は任意の他の適した精製工程、及びそれらの組み合わせを用いて、精製され得る。この第二精製工程は、本発明に準ずる精
製の前の第二混合物と比較して、精製された第二混合物（即ち、リンカーを介し薬物に化学的に共役した細胞結合剤の濃度の上昇及び第二混合物の１以上の他の成分量の減少）をもたらす。
【００１８】
細胞結合剤は、細胞、典型的に且つ好ましくは動物細胞（例、ヒト細胞）に結合する任意の適した薬剤であり得る。細胞結合剤は、好ましくは、ペプチド又はポリペプチドである。適した細胞結合剤としては、例えば、抗体（例、モノクロナール抗体及びその断片）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、栄養素輸送分子（ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（例、トランスフェリン）、及び細胞表面上の標的分子に特異的に結合する他の任意の薬剤又は分子が挙げられる。
【００１９】
本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、細胞表面上の抗原（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）に結合し得る、任意の免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、及びトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）といった任意の免疫グロブリン断片、又は免疫グロブリンキメラを言う。任意の適した抗体が、細胞結合剤として用いられ得る。当業者は、適当な抗体の選択は、標的とされる細胞集団に依存することを理解するであろう。これに関し、特定の細胞集団（典型的に且つ好ましくは病気の細胞集団）において選択的に発現している細胞表面分子（即ち、抗原）のタイプ及び数が、本発明の組成物において用いられる適当な抗体の選択の決定をする。細胞表面発現プロファイルは、腫瘍細胞タイプを含む幅広い細胞タイプで知られている、又は、もし知られていないなら、慣用的な分子生物学及び組織化学的技術を用いて、決定付けられ得る。
【００２０】
抗体は、ポリクロナール又はモノクロナールであり得るが、最も好ましくは、モノクロナール抗体である。本明細書中で用いられる「ポリクロナール」抗体とは、典型的には、免疫動物の血清に含まれる抗体分子の異種集団を言う。「モノクロナール」抗体とは、特定の抗原に対し特異的である抗体分子の同種集団を言う。モノクロナール抗体は、典型的には、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンによって作成される。モノクロナール抗体は、標準的なハイブリドーマ技術（例、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５：５１１−５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ
Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）参照）を含む、当業者に公知の様々な技術を用いて得られ得る。手短には、モノクロナール抗体を作成するハイブリドーマ法は、典型的には、任意の適した動物、典型的に及び好ましくはマウス、に抗原（即ち、「免疫原」）を注射することを含む。該動物はその後、屠殺され、そしてその脾臓から単離されたＢ細胞を、ヒトミエローマ細胞と融合させる。インビトロで、無制限に増殖し、且つ高い力価の、所望の特異性を有する抗体を継続的に分泌する、ハイブリッド細胞（即ち、ハイブリドーマ）が作成される。当分野で公知の任意の適当な方法が、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために用いられ得る。このような方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット解析、及びラジオイムノアッセイが挙げられる。ハイブリドーマ集団は、その各々が抗原に対する単一抗体種を分泌する個々のクローンに単離するために選別される。各ハイブリドーマが、単一Ｂ細胞との融合により派生したクローンであるが故に、それが産生する全ての抗体分子は、それらの抗原結合部位を含む構造及びアイソタイプにおいて同一である。モノクロナール抗体は又、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例、Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）：３６１−６７（１９８４）、及びＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏl，１２１：１４０
−６７（１９８６）参照）、バクテリオファージベクター発現系（例、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）参照）、又はＦａｂ及びｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）といった抗体断片を含むファージディスプレイライブラリ（例、米国特許第５，８８５，７９３号、及び同第５，９６９，１０８号、並びに国際特許出願ＷＯ９２／０１０４７及びＷＯ９９／０６５８７参照）を含む、他の適した技術を用いて作成され得る。
【００２１】
モノクロナール抗体は、任意の適した動物から単離され得、又は作成され得るが、哺乳類において作成されるのが好ましく、マウス又はヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。マウス中で抗体を作成する方法は、当業者によく知られており、本明細書中で記述がされている。ヒト抗体に関しては、ポリクロナール抗体は、適当な抗原を用い、ワクチン接種又は免疫化したヒト被験者の血清から単離され得ることを当業者は理解するであろう。あるいは、ヒト抗体は、マウスといった非ヒト動物中でヒト抗体を作成する公知技術の適応によって作成され得る（例、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開番号２００２／０１９７２６６  Ａ１参照）。
【００２２】
ヒトにおける治療上の適応としては理想的な選択肢であるものの、ヒト抗体、特にヒトモノクロナール抗体は、典型的にはマウスモノクロナール抗体よりも、作成するのが困難である。しかしながら、マウスモノクロナール抗体は、ヒトに投与した場合、治療上又は診断上における抗体−薬物複合体の可能性を減じ得る、迅速な宿主抗体反応を誘発する。これらの問題をさけるために、モノクロナール抗体は、ヒト免疫系によって「異物」として認識されないことが好ましい。
【００２３】
この目的達成のために、ファージディスプレイが、抗体を作成するために用いられ得る。これに関し、抗体の抗原結合可変（Ｖ）領域をコードするファージライブラリが、標準的な分子生物学及び組み換え体ＤＮＡ技術（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）参照）を用いて作成され得る。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージが、所望の抗原に対する特異的結合のために選択され、そして選択された可変領域を含む完全なヒト抗体が、再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、モノクロナール抗体の特性を有するヒト抗体が細胞から分泌されるように、ハイブリドーマの作成に用いられたミエローマ細胞といった、適した細胞系中に導入される（例、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照，Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、及び米国特許第６，２６５，１５０号参照）。あるいは、モノクロナール抗体は、特定のヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子がトランスジェニックなマウスから作成され得る。このような方法は、当分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、中に記述がされている。
【００２４】
最も好ましくは、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書中で用いられる、「ヒト化」抗体とは、抗体の抗原結合ループを形成する、マウスモノクロナール抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体分子のフレームワークに移植されたものをいう。マウス及びヒト抗体のフレームワークの類似性のために、このアプローチにより、抗原的にヒト抗体と全く一致しているが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクロナール抗体と同じ抗原に結合するモノクロナール抗体を産生されることが、当分野で一般的に受け入れられている。ヒト化抗体を作成する方法は、当分野でよく知られており、詳細に記述がされている（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許番号０２３９４００  Ｂ１、並びに英国特許番号２１８８６３８）。ヒト化抗体は、米国特許第５，６３９，６４１号
及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，２３５：９５９−９７３（１９９４）中に記述された、抗体レサーフェイシング技術（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いても又、作成され得る。本発明の組成物の複合化において採用された抗体は、最も好ましくはヒト化モノクロナール抗体であるものの、ヒトモノクロナール抗体及びマウスモノクロナール抗体も又、上記のように、本発明の範囲内である。
【００２５】
少なくとも一つの抗原結合部位を有し、それにより標的細胞表面上に存在する少なくとも一つの抗原又は受容体を認識し、結合する抗体断片も又、本発明の範囲内である。この点に関して、インタクトな抗体分子のタンパク質分解的切断が、抗原を認識、及び結合する能力を保持した、様々な抗体断片を産生し得る。例えば、プロテアーゼのパパインでの抗体分子の限定消化は、典型的に、３つの断片を産生する。その内の２つは、同一であり、親抗体分子の抗原結合活性を保持しているため、Ｆａｂ断片と呼ばれている。酵素ペプシンでの抗体分子の切断は、通常、２つの抗体断片を産生する。その内の１つは、抗体分子の両抗原結合アームを保持しており、従って、Ｆ（ａｂ’）２断片と称される。ジチオスレイトール又はメルカプトエチルアミンでの、Ｆ（ａｂ’）２断片の還元は、Ｆａｂ’断片と呼ばれる断片を産生する。合成ペプチドを介して軽抗体鎖のＶ領域と結合した抗体重鎖の可変（Ｖ）領域を含む、切断型Ｆａｂ断片から成る、一本鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓＦｖ））抗体断片は、慣用的な組み換えＤＮＡテクノロジー技術（参照例、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ
ａｌ．，上記参照）を用いて作成され得る。同様に、ジスルフィド−安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）が、組み換えＤＮＡ技術（例、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４（１９９４）参照）によって調製され得る。しかしながら、本発明の文脈中の抗体断片は、これらの抗体断片の典型例に限定されない。所望の細胞表面受容体又は抗原を認識し、且つ結合する任意の適した抗体断片が、採用され得る。抗体断片は、更に、例えば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３），Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４），及びＮｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０）に記述がされている。抗体−抗原結合は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び競合阻害アッセイ（例、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照，及び米国特許出願公開番号２００２／０１９７２６６  Ａ１参照）といった、当分野で公知の適した任意の方法を用いて評価することができる。
【００２６】
更に、抗体は、キメラ抗体又はその抗原結合断片であり得る。「キメラ」とは、抗体が、少なくとも２つの異なる種から得られた、又は由来する、少なくとも２つの免疫グロブリン、又はそれらの断片（例えば、マウス免疫グロブリン可変領域と結合したヒト免疫グロブリン定常領域といった、２つの異なる免疫グロブリン）を含んでいることを意味する。抗体は又、例えば、ラクダ抗体（例、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，３：７５２，（１９９６）参照）、又は例えば、新規の抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）（例、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５）、及びＳｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１１１０−１１１３（２００４）参照）といったサメ抗体、といったようなドメイン抗体（ｄＡｂ）又はその抗原結合断片であり得る。
【００２７】
任意の適した抗体が、本発明の文脈中で用いられ得る。例えば、モノクロナール抗体Ｊ５は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原（Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＡＬＬＡ））特異的マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：５８３−５８５（１９８０））であり、ＣＡＬＬＡを発現する細胞（例、急性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とする
のに用いられ得る。モノクロナール抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））であり、ＣＤ３３を発現する細胞（例、急性骨髄性性白血病（ＡＭＬ）細胞）を標的とするのに用いられ得る。
【００２８】
同様に、抗−Ｂ４モノクロナール抗体（Ｂ４とも称される）は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、ＣＤ１９を発現するＢ細胞又は病気の細胞（例、非ホジキンリンパ腫細胞及び慢性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに用いられ得る。Ｎ９０１は、小細胞肺腫瘍を含む神経内分泌起源の細胞上に見られるＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原に結合するマウスモノクロナール抗体であり、神経内分泌起源の細胞に薬物を標的化させるのに、複合体中に用いられ得る。Ｊ５、ＭＹ９、及びＢ４抗体は、複合体の一部としてそれらが使用される前に、レサーフェイス又はヒト化されるのが好ましい。抗体のレサーフェシング又はヒト化については、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−７３（１９９４）に記述がされている。
【００２９】
更に、モノクロナール抗体Ｃ２４２は、ＣａｎＡｇ抗原に結合し（例、米国特許第５，５５２，２９３号参照）、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び胃癌といった、ＣａｎＡｇを発現する腫瘍へと複合体を標的化するのに用いられ得る。ＨｕＣ２４２は、モノクロナール抗体Ｃ２４２のヒト化された形態である（例、米国特許第５，５５２，２９３号参照）。ＨｕＣ２４２を産生するハイブリドーマは、ＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲ−移植法（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）（例、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号参照）又はレサーフェシング技術（例、米国特許第５，６３９，６４１号参照）を用いて調製することができる。ＨｕＣ２４２は、例えば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び胃癌の癌細胞といった、ＣａｎＡｇ抗原を発現する腫瘍細胞へと複合体を標的化するのに用いられ得る。
【００３０】
卵巣癌及び前立腺癌細胞を標的化するために、抗−ＭＵＣｌ抗体が、複合体における細胞結合剤として用いられ得る。抗−ＭＵＣｌ抗体としては、例えば、抗−ＨＭＦＧ−２（例、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８：１７−２１（１９８１）参照）、ｈＣＴＭＯｌ（例、ｖａｎ  Ｈｏｆ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５１７９−５１８５（１９９６）参照）、及びＤＳ６が挙げられる。前立腺癌細胞も又、細胞結合剤として、Ｊ５９１（例、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３６２９−３６３４（１９９７）参照）のような抗前立腺特異的膜抗原（ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ））を用いることによって複合体を用いて、標的化され得る。更に、乳癌、前立腺癌、及び卵巣癌といった、Ｈｅｒ２抗原を発現する癌細胞が、抗体トラスツズマブを用いることで、標的化され得る。インシュリン様成長因子受容体に結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体も又、複合体中で用いられ得る。
【００３１】
特に好ましい抗体は、ヒト化モノクロナール抗体であり、その例としては、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、及びリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられる（例、米国特許第５，６３９，６４１号、及び同第５，６６５，３５７号、米国仮特許出願番号６０／４２４，３３２（米国特許出願公開番号２００５／０１１８１８３  Ａ１に関連する）、国際特許出願ＷＯ０２／１６４０１，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照，Ｃｏｌｏ
ｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９：４９−５６（２００１），Ｈｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：２３８５−２３９１（１９９５），Ｗｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，１２：１１９３−１２０３（１９９４），並びにＭａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７）参照）。最も好ましくは、抗体は、ｈｕＮ９０１ヒト化モノクロナール抗体又はｈｕＭｙ９−６ヒト化モノクロナール抗体である。他の好ましい抗体としては、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、ｈｕＢ４、及びｈｕＣ２４２が挙げられる。他のヒト化モノクロナール抗体は、当業者に公知であり、且つ本発明に関連して用いられ得る。
【００３２】
細胞結合剤は、好ましくは抗体であるが、細胞結合剤は又、非抗体分子でもあり得る。適した非抗体分子としては、例えば、インターフェロン（例、α、β、又はγインターフェロン）、リンフォカイン（例、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、又はＩＬ−６）、ホルモン類（例、インシュリン）、成長因子（例、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ（例、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，５：１５５−１５８（１９８４）参照）、ソマトスタチン、及びトランスフェリン（例、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ
ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：９３２−９３７（１９８５）参照）が挙げられる。例えば、ミエローマ細胞と結合するＧＭ−ＣＳＦが、急性骨髄性白血病細胞を標的化するために細胞結合剤として用いられ得る。更に、活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植の移植片拒絶反応を予防するため、移植片対宿主を治療及び予防するため、並びに急性Ｔ細胞白血病の処置のために、用いられ得る。上皮成長因子（ＥＧＦ）は、肺癌及び頭頸部癌といった、扁平上皮癌を標的化するために用いられ得る。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫細胞及び他の腫瘍細胞型を標的化するために用いられ得る。
【００３３】
複合体は、任意の適した薬物、典型的には、細胞毒性剤を含み得る。本明細書中で用いられる「細胞毒性剤」とは、細胞死をもたらす、細胞死を誘導する、又は細胞の生存能力の減少させる任意の化合物を言う。適した細胞毒性剤としては、例えば、メイタンシノイド類及びメイタンシノイド類似体、タキソイド類、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体、並びにドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）及びドラスタチン類似体が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、細胞毒性剤は、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）及びメイタンシノール類似体を含むメイタンシノイドである。メイタンシノイド類は、微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に対し強い毒性を示す化合物である。適したメイタンシノール類似体の例としては、修飾された芳香環を有するもの、及び他の部位に修飾を有するものが挙げられる。このようなメイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、及び同第６，３３３，４１０号に記述がされている。
【００３４】
修飾された芳香環を有するメイタンシノール類似体の例としては、：（１）Ｃ−１９−デクロロ（ｄｅｃｈｌｏｒｏ）（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２のＬＡＨ還元により調製）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル（ｄｅｍｅｔｈｙｌ））＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号、及び同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス若しくはアクチノマイセスを用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素化によって調製）、及び（３）Ｃ−２０−デメトキシ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ）、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いた
アシル化によって調製）が挙げられる。
【００３５】
芳香環以外の部位での修飾を有するメイタンシノール類似体の例としては、：（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５との反応によって調製）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから調製）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換により調製）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同第４，３１５，９２９号）（トゥルイア  ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化により調製）、並びに（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールのチタニウム三塩化物／ＬＡＨ還元による調製）が挙げられる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、複合体は、細胞毒性剤として、Ｎ２’-デアセチ
ル−Ｎ２’−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシンとしても又知られる、チオール‐含有メイタンシノイドＤＭ１を利用する。ＤＭ１の構造は、式（Ｉ）で表される：
【００３７】
【化１】
2014196307.tif 000002
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態において、複合体は、細胞毒性剤として、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−ｌ−オキソペンチル）−メイタンシンとして知られる、チオール−含有メイタンシノイドＤＭ４を利用する。ＤＭ４の構造は、式（ＩＩ）で表される：
【００３９】
【化２】
2014196307.tif 000003
【００４０】
本発明の文脈中で、例えば、硫黄原子を有する炭素原子上にモノ又はジ−アルキル置換を有するチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイドを含む、他のメイタンシンが用いられ得る。メイタンシノイドが、Ｃ−３の位置に（ａ）Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、又はＣ−２０デスメチル官能基、及び（ｂ）チオール官能基を有するアシル基の炭素原子が、一又は二つの置換基を有しており、当該置換基が、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖のアルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、更に、置換基の一つがＨであり得、アシル基がカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３炭素原子の直鎖長を有する、ヒンダードサルフヒドリル基を有するアシル基を持つアシル化アミノ酸側鎖、を有しているものが特に好ましい。
【００４１】
本発明の文脈中で用いられる更なるメイタンシンは、式（ＩＩＩ）で表される化合物を含む：
【００４２】
【化３】
2014196307.tif 000004
【００４３】
〔式中、Ｙ’は、
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐＣ＝ＣｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ＝Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−ＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキル
ラジカルであり、
ここでＲ２は又、Ｈであり得、
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又は環状アルケニル、単なる若しくは置換されたアリール、又は複素環芳香族、又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、及びＲ１２は、各々独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも二つが同時にゼロではないという条件で、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは各々独立して、ゼロ、又は任意の１〜５の整数であり、
且つＺはＨ、ＳＲ又はＣＯＲであり、ここでＲは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環状アルキル又はアルケニル、又は単なる若しくは置換されたアリール又は複素環芳香族、又はヘテロシクロアルキルラジカルである〕。
【００４４】
式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、且つＺがＨ、（ｂ）Ｒ１及びＲ２がメチル且つＺがＨ、（ｃ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、且つＺが−ＳＣＨ３、及び（ｄ）Ｒ１及びＲ２がメチル、且つＺが−ＳＣＨ３、である式（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。
【００４５】
このような更なるメイタンシンは又、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、又は（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）で表される化合物を含む：
【００４６】
【化４】
2014196307.tif 000005
【００４７】
〔式中、Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１及びＲ２は各々独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖又は環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、ここでＲ２は又、Ｈ３であり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖又は環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
１、ｍ、及びｎは各々独立して１〜５の整数であり、更に、ｎはゼロであり得、
ＺはＨ、ＳＲ、又はＣＯＲであり、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、あるいは単なる又は置換されたアリール又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、且つ
ＭａｙはＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、又はＣ−２０デスメチルにおいて、側鎖を有するメイタンシノイドを表す。〕
【００４８】
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが各々１、ｎが０、且つＺがＨ、（ｂ）Ｒ１及びＲ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ8が各々Ｈ
、ｌ及びｍが１、ｎが０、且つＺがＨ、（ｃ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが各々１、ｎが０、且つＺが−ＳＣＨ３、又は（ｄ）Ｒ１及びＲ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが１、ｎが０、且つＺが−ＳＣＨ３である式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。
【００４９】
好ましくは、細胞毒性剤は式（ＩＶ−Ｌ）で表される。
【００５０】
更なる好ましいメイタンシンは又、式（Ｖ）で表される化合物も含む：
【００５１】
【化５】
2014196307.tif 000006
【００５２】
〔式中、Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、
Ｒ１及びＲ２は各々独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、ここで
Ｒ２は又、Ｈであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、及びｎは各々独立して１〜５の整数であり、更に、ｎはゼロであり得、
且つＺがＨ、ＳＲ又はＣＯＲであり、ここで、Ｒが１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、あるいは単なる若しくは置換されたアリール又は複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルである〕。
【００５３】
式（Ｖ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が各々Ｈ；ｌ及びｍが各々１；ｎが０；且つＺがＨ、（ｂ）Ｒ１及びＲ２がメチル；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが１；ｎが０；且つＺがＨ、（ｃ）Ｒ１がＨ、Ｒ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが各々１、
ｎが０、且つＺが−ＳＣＨ３、又は（ｄ）Ｒ１及びＲ２がメチル、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈ、ｌ及びｍが１、ｎが０、且つＺが−ＳＣＨ３である式（Ｖ）の化合物が挙げられる。
【００５４】
なお更に好ましいメイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）としては、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、又は（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）で表される化合物が挙げられる：
【００５５】
【化６】
2014196307.tif 000007
【００５６】
〔式中、Ｙ２は（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、
Ｒ１及びＲ２は各々独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、且つＲ２は又、Ｈであり得、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖環状アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、及びｎは各々独立して１〜５の整数であり、更に、ｎはゼロであり得、
Ｚ２がＳＲ又はＣＯＲであり、ここで、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、あるいは単なる又は置換されたアリール又は複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、且つＭａｙは、メイタンシノイドである〕。
【００５７】
更なる好ましいメイタンシンとしては、式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる：
【００５８】
【化７】
2014196307.tif 000008
【００５９】
〔式中、Ｙ２’は、
（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ10）ｐ（Ｃ＝Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ＝Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２
で表され、ここで、Ｒ１及びＲ２は各々独立してＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖分岐鎖又はアルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、更に、Ｒ２はＨであり得、
Ａ、Ｂ、及びＤは各々独立して、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル若しくは環状アルケニル、単なる若しくは置換されたアリール、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、あるいは複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも二つが同時にゼロではないという条件で、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは各々独立して、ゼロ、又は任意の１〜５の整数であり、且つ
Ｚ２はＳＲ又は−ＣＯＲであり、ここで、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐鎖、若しくは環状アルキル又はアルケニル、あるいは単なる又は置換されたアリール又は複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルである〕。
【００６０】
式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態としては、Ｒ１がＨであり、且つＲ２がメチルである式（ＶＩＩ）の化合物が挙げられる。
【００６１】
メイタンシノイドに加えて、複合体中に用いられる細胞毒性剤は、タキサン又はその誘導体であり得る。タキサンは、いずれも広く癌に対する処置に用いられる、細胞毒性を有する天然産物であるパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、及び半合成誘導体であるドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、を含む化合物ファミリーである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死をもたらす、紡錘体毒である。ドセタキセル及びパクリタキセルは、癌の処置において、有用な薬剤ではあるが、通常の細胞に対する、それらの非特異的毒性が原因で、それらの抗腫瘍活性には限界がある。更に、パクリタキセル及びドセタキセル自体といった化合物は、細胞結合剤の複合体中に用いるには、効果が不十分である。
【００６２】
細胞毒性複合体の調製に用いられる好ましいタキサンは、式（ＶＩＩＩ）のタキサンである：
【００６３】
【化８】
2014196307.tif 000009
【００６４】
抗体といった細胞結合剤に対し、タキサンを複合化させる方法と共に、本発明の文脈中に用いられ得る、タキサンを合成する方法が、米国特許第５，４１６，０６４号、同第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、同第６，４３６，９３１号、同第６，５９６，７５７号、同第６，７０６，７０８号、及び同第６，７１６，８２１号、並びに米国特許出願公開番号２００４／００２４０４９  Ａ１に詳細に記述がされている。
【００６５】
細胞毒性は、ＣＣ−１０６５又はその誘導体でも又、あり得る。ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、インビトロで、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンクリスチンといった、通常用いられる抗癌薬に比べ、約１０００倍強力である（Ｂｈｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２：３５３２−３５３７（１９８２））。ＣＣ−１０６５及びその類似体は、米国特許第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，３４０，７０１号、及び同第６，３７２，７３８号により開示されている。ＣＣ−１０６５の細胞毒性の力価は、アルキル化活性及びそのＤＮＡ結合又はＤＮＡ挿入活性と相関している。これらの二つの活性は、分子内の別々の部分に存在する。これに関して、アルキル化活性は、シクロプロパピロロインドール（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ）（ＣＰＩ）サブユニット中に含まれ、且つＤＮＡ結合活性は、ＣＣ−１０６５の二つのピロロインドール（ｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ）サブユニットに存在する。
【００６６】
幾つかのＣＣ−１０６５類似体が、当業者に知られており、複合体中における細胞毒性剤としても又、用いられ得る（例、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１：５９０−６０３（１９８８）参照）。ＣＰＩ部分がシクロプロパベンズインドール（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｂｅｎｚｉｎｄｏｌｅ）（ＣＢＩ）部分に置き換えられた一連のＣＣ−１０６５類似体が開発されている（Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８２３−５８３３（１９９０）、及びＢｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，１：１１５−１２０（１９９１））。これらのＣＣ−１０６５類似体は、マウスでの遅発性毒性を引き起こすことなく、インビトロで、親薬物の高い効力を維持する。ＣＣ−１０６５のように、これらの化合物は、細胞死を引き起こす、ＤＮＡのマイナー・グルーブに共有結合するアルキル化剤である。
【００６７】
ＣＣ−１０６５類似体の治療上の有効性は、腫瘍部位に対する標的送達を通して、インビボの分布を変化させることによって、大きく改良され得、その結果、非標的化組織に対するより低い毒性をもたらし、従って、全身へのより低い毒性をもたらす。この目的を達成するために、特に腫瘍細胞を標的とする、ＣＣ−１０６５の類似体及び誘導体の、細胞結合剤との複合体が作成されてきた（例、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、及び同第５，８４６，５４５号参照）。これらの複合体は、典型的に、インビトロで、高い標的特異的細胞毒性を示し、且つマウスにおける、ヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性を示す。（例、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：４０７９−４０８４（１９９５）参照）。
【００６８】
ＣＣ−１０６５類似体を合成する方法は、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，５３４，６６０号、同第６，５８６，６１８号、及び同第６，７５６，３９７号、並びに米国特許出願公開番号２００３／０１９５３６５  Ａ１に詳細に記述がされている。
【００６９】
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、チューブリ
シン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）及びチューブリシン類似体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類似体、ドラスタチン及びドラスタチン類似体といった薬物も又、本発明の文脈中で用いられ得る。ドキソルビシン（Ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）及びダウノルビシン化合物（例、米国特許第６，６３０，５７９号参照）も又、薬物として用いられ得る。
【００７０】
薬物複合体は、インビトロの方法によって調製され得る。薬物又はプロドラッグを抗体に結合させるために、連結基が用いられる。適した連結基は、当業者によく知られており、ジスルフィド基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、及びエステラーゼに不安定な基が挙げられる。好ましい連結基は、ジスルフィド基である。例えば、複合体は、抗体と薬物又はプロドラッグとの間のジスルフィド交換反応を用いて、作成され得る。薬物分子は又、血清アルブミンといった、中間担体分子を介して細胞結合剤と結合し得る。
【００７１】
本発明に準じ、細胞結合剤は、二官能性架橋試薬と細胞結合剤との反応により修飾され、それにより、細胞結合剤へのリンカー分子の共有結合がもたらされる。本明細書中で用いられる「二官能性架橋試薬」は、細胞結合剤を、本明細書中で記述したような薬物に共有結合させる、任意の化学的な部分をいう。本発明の好ましい実施形態において、結合部の一部は、薬物によって提供される。この点に関して、本薬物は、薬物に細胞結合剤を結合させるために用いられるより大きなリンカー分子の一部である結合部を含む。例えば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するために、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基における側鎖は、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾される。メイタンシンのチオール化された形体は、複合体を形成するために修飾させた細胞結合剤と反応し得る。従って、最終的なリンカーは、二つの成分から組み立てられ、その一つは、架橋試薬によって提供され、もう一方は、ＤＭ１由来側鎖によって提供される。
【００７２】
結合試薬が、各々薬物及び細胞結合剤の、治療上（例えば、細胞毒性）及び標的化の特徴の保持を提供する限り、任意の適した二官能性架橋試薬が、本発明と関連して用いられ得る。好ましくは、薬物及び細胞結合剤が互いに化学的に共役している（例、共有結合している）ように、リンカー分子は、薬物を細胞結合剤に化学結合（上述のような）を介し、結合させる。好ましくは、結合剤は、切断可能なリンカーである。より好ましくは、温和な条件（即ち、薬物活性が影響を受けないような細胞内の条件）の下、リンカーは切断される。適した切断可能なリンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸に不安定なリンカー、光に不安定なリンカー、ペプチダーゼに不安定なリンカー、及びエステラーゼに不安定なリンカーが挙げられる。ジスルフィドを含むリンカーは、生理学的条件の下で起こり得るジスルフィド交換を通じて切断可能なリンカーである。酸に不安定なリンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソーム及びリソソームといった、特定の細胞内コンパートメントは、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸に不安定なリンカーを切断するのに適した条件を提供する。光に不安定なリンカーは、光に暴露可能な体表面及び多くの体腔において、有用である。更に、赤外線光は、組織を透過し得る。ペプチダーゼに不安定なリンカーは、細胞内又は外の特定のペプチドを切断させるのに用いられ得る（例、Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６２６−６２９（１９８２）、及びＵｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４３：６７７−６８４（１９８９）参照）。
【００７３】
好ましくは、薬物は、ジスルフィド結合を介して、細胞結合剤と結合する。リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。更に、リンカー分子は、薬物と反応し、ジスルフィド結合を形成し得る、反応性化学基、好ましくは、ジチオピリジル基を含む。特に好ましいリンカー分子としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例
、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例、米国特許第４，５６３，３０４号参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ番号３４１４９８−０８−６参照）、及び米国特許第６，９１３，７４８号に記述がされている、他の反応性架橋剤が挙げられ、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００７４】
切断可能なリンカーが、好ましくは、本発明の方法中で用いられるものの、切断不可能なリンカーも又、上述の複合体を作成するのに用いられ得る。切断不可能なリンカーは、メイタンシノイド、タキサン、又はＣＣ−１０６５類似体といった薬物を、細胞結合剤に安定に共有結合させることができる任意の化学的部分である。従って、切断不可能なリンカーは、薬物又は細胞結合剤が活性を維持した条件下で、実質上、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断、及びジスルフィド結合の切断に耐性を示す。
【００７５】
薬物と細胞結合剤との間に切断不可能なリンカーを形成する、適した架橋試薬は、当業者によく知られている。切断不可能なリンカーの例としては、細胞結合剤と反応するＮ−スクシンイミジルエステル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、及び薬物と反応するマレイミド又はハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）に基づいた部分を有するリンカーが挙げられる。マレイミドに基づいた部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖（ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ）」類似体であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチルに基づいた部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。
【００７６】
切断不可能なリンカーを形成する硫黄原子を欠く他の架橋試薬も又、本発明の方法中で用いられ得る。このようなリンカーは、ジカルボン酸に基づく部分から誘導され得る。適したジカルボン酸に基づく部分としては、一般式（ＩＸ）：
【００７７】
【化９】
2014196307.tif 000010
【００７８】
〔式中、Ｘは、２〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり、Ｙは３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル基であり、Ｚは６〜１０個の炭素原子を有する芳香族基、又はヘテロ原子がＮ
、Ｏ、若しくはＳから選択され、且つｌ、ｍ、及びｎが各々０若しくは１である（但し、同時にｌ、ｍ、及びｎの全てがゼロではない、置換又は非置換の複素環基である〕
のα，ω−ジカルボン酸が挙げられるが、これに限られない。
【００７９】
本明細書中に開示した切断不可能なリンカーの多くは、米国特許出願公開番号２００５／０１６９９３３  Ａ１に対応する、米国特許出願番号１０／９６０，６０２に詳細に記述がされている。
【００８０】
あるいは、米国特許第６，４４１，１６３  Ｂ１号に開示されているように、薬物は最初に、細胞結合剤と反応するのに適した、反応性エステルを誘導するために修飾され得る。活性化結合部分を含むこれらのメイタンシノイドと細胞結合剤との反応は、切断可能な、又は切断不可能な細胞結合剤メイタンシノイド複合体の別の製造方法を提供する。
【００８１】
メイタンシノイド、メイタンシノイドを含む細胞毒性剤、薬物複合体、及び関連する調製方法に関する更なる情報が、米国特許出願番号１１／３５２，１２１及び米国特許出願公開番号２００４／０２３５８４０  Ａ１に対応する、米国特許出願番号１０／８４９，１３６に記載がされている。
【００８２】
以下の実施例は更に本発明を説明するものであるが、もちろんその範囲をいかなる方法によっても限定するものとして解されるべきではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１
本実施例は、ＴＦＦを用いた、ヘテロ二官能性修飾試薬により修飾された抗体の精製について立証する。
【００８４】
ｈｕＮ９０１モノクロナール抗体（最終濃度８ｍｇ／ｍｌ）を、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ，５．６倍モル濃度過剰）とともに、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中、およそ１８０分、２０℃でインキュベートした。第一群において、反応混合物を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）中で平衡化及び溶出した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製した。第二群において、反応混合物を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦ  システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて精製し、抗体を、１０，０００分子量カットオフ膜（Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、５０ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ中にダイアフィルターした（５  容積）。両試料を、１８時間、ｐＨ６．５で、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び最終濃度３％のＤＭＡを含む、リン酸カリウム緩衝液中で、ＤＭ１（結合していないリンカーに対し、１．７倍モル濃度過剰）と複合化した。
【００８５】
両群において、収率を、修飾及び精製の工程の組み合わせにおいて、分光光度法（波長２８０ｎｍ）で決定した。リンカー／抗体比を又、３４３ｎＭで８，０８０Ｍ−１cｍ−
１の減衰係数を有するピリジン−２−チオンを放出させる、ジチオスレイトールでの処置によって決定した。複合化工程の薬物／抗体比を、分光光度法（波長２８０ｎｍ及び２５２ｎｍ）で決定した。更に、ＳＰＰ関連低分子種の除去を、Ｈｉｓｅｐ  ＨＰＬＣにより測定した。
【００８６】
得られたデータを、表１に述べる。
【００８７】
【表１】
2014196307.tif 000011
【００８８】
表１で示したように、ＴＦＦの使用は、より簡便で測定可能でありながら、非吸着クロマトグラフィー（Ｇ２５）方法と少なくとも同等の質の薬物複合体産物を産生する。
【００８９】
実施例２
本実施例は、吸着クロマトグラフィーを用いた、ヘテロ二官能性修飾試薬により修飾された抗体の精製について立証するものである。
【００９０】
ｈｕＢ４抗体を、１２０分間、室温で、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ，５．４倍  モル濃度過剰）で修飾した。第一群において、実施例１で述べたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂を用い、反応混合物を精製した。第二群において、反応混合物を、１２．５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化し、８０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）にて溶出させたセラミック製ヒドロキシアパタイトのカラム（ＣＨＴ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上にロードした。
【００９１】
両群において、収率及びリンカー／抗体比を、実施例１で述べたように決定した。第一群は、９１％の収率及び４．２のリンカー／抗体比を有した。第二群は、８９％の収率及び４．２のリンカー／抗体比を有した。
【００９２】
ＣＮＴＯ９５抗体（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を、２．７％スクロース及び５％エタノールを含む、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中、１２０分間、２０℃にて、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ，４．５倍モル濃度過剰）で修飾した。第一群において、反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂を用い、１２．５ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１２．５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中で、精製した。第二群において、反応混合物を、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で平衡化し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出したＳＰ  セファロースファーストフローカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上にロードした。
【００９３】
両群において、収率及びリンカー／抗体比を、実施例１で述べたように決定した。第一群は、９６％の収率及び４．０のリンカー／抗体比を示した。第二群は、９７％の収率及び４．１のリンカー／抗体比を示した。
【００９４】
本実施例で得られたデータは、吸着クロマトグラフィが、ヘテロ二官能性修飾試薬で修
飾された抗体を精製するのに用いられ得ることを立証するものである。
【００９５】
実施例３
本実施例は、６．５より高いｐＨにおいて、修飾抗体と薬物とを複合化させる有益な効果について立証するものである。
【００９６】
第一の実験において、ＣＮＴＯ９５抗体を、実施例２で述べたように修飾及び精製した。修飾抗体を、次いで二つの群に分割した。第一群では、２０℃で、１２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％ＤＭＡ、及びリンカーあたり１．７倍モル濃度過剰の薬物を含む、ｐＨ６．５の１２．５ｍＭ  リン酸カリウム中で複合化を行った。第二群では、複合化反応を、ｐＨ７．５で行った。複合化抗体を、ＮＡＰ−ＩＯカラムで精製した。
【００９７】
薬物／抗体比を両群において測定した。得られたデータを表２中に述べる。
【００９８】
【表２】
2014196307.tif 000012
【００９９】
表２中のデータによって示されるように、ｐＨ６．５よりも、ｐＨ７．５において、複合化がより早く進行する。
【０１００】
第二の実験において、ｈｕＢ４ヒト化モノクロナール抗体を、（ａ）抗体に対し、４．９倍モル濃度過剰のＳＰＤＢ、又は（ｂ）抗体に対し、４．８倍モル濃度過剰のＳＰＤＢのいずれかを用い、修飾した。両方の場合において、反応は、５％エタノール中の５０ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  塩化カリウム、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で、合計１２０分、室温で行った。試料（ａ）を、ｐＨ６．５にて、５０ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂カラムにより、精製した。クロマトグラフィ緩衝液をｐＨ７．５に調整した点を除き、試料（ｂ）を同様に精製した。両試料を、１８時間、室温で、最終濃度３％のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で、ＤＭ４（結合したリンカーに対し、１．７倍モル濃度過剰）と複合化させた。
【０１０１】
従って、試料（ａ）はｐＨ６．５で複合化し、試料（ｂ）はｐＨ７．５で複合化した。次いで試料を、ｐＨ６．５の９．６ｍＭ  リン酸カリウム及び４．２ｍＭ  塩化ナトリウム中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ  樹脂のカラムにて精製した。両試料を、４℃で最大７ヶ月までインキュベートし、放出された遊離薬物の分析に、ある間隔で供した。得られたデータを、表３中に述べる。
【０１０２】
【表３】
2014196307.tif 000013
【０１０３】
表３で述べたデータが示すように、遊離薬物の放出は、ｐＨ６．５で複合化した試料（ａ）と比べて、ｐＨ７．５で複合化した試料（ｂ）からの方が、実質的に遅かった。従って、ｐＨ７．５で調製した薬物複合体産物は、ｐＨ６．５で調製した薬物複合体産物に比べ、遊離薬物の経時的な放出に関し、より安定であることが示された。ｐＨ７．５での複合化は又、ｐＨ６．５に比べ、より良好な薬物の取り込みを示し、それによってより少量の薬物の使用が必要となる。
【０１０４】
実施例４
本実施例は、ｐＨ６．０未満における、薬物と修飾抗体との複合化の有益な効果について立証するものである。
【０１０５】
ｈｕＮ９０１モノクロナール抗体（最終濃度８ｍｇ／ｍｌ）を、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ，５．６倍モル濃度過剰）と共に、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、およそ１８０分間、２０℃でインキュベートした。第一群において反応混合物を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で平衡化及び溶出した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ  樹脂のカラムを用い精製した。第二群において、反応混合物を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化及び溶出したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用い精製した。両試料を、ＤＭ４（結合したリンカーに対し、１．７倍モル濃度過剰）と共に、最終濃度３％のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中で、室温にて、３、１９、２５、４８、及び１２０時間複合化した。
【０１０６】
従って、試料の第一群は、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で複合化し、試料の第二群は、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で複合化した。試料を次いで、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化及び溶出されたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂カラムを用いて精製した。
【０１０７】
両群において、リンカー／抗体比を、８，０８０Ｍ−１ｃｍ−１（３４３ｎＭ）の減衰係数を有するピリジン−２−チオンを放出させる、ジチオスレイトールでの処置により決定した。複合化工程の薬物／抗体比を、分光光度法（２８０ｎｍ及び２５２ｎｍの波長）によって、決定した。
【０１０８】
第一群は、４．３のリンカー／抗体比を有した。第二群は、４．２のリンカー／抗体比
を有した。
【０１０９】
二つの群についての経時的な薬物／抗体比を、表４中に述べる。
【０１１０】
【表４】
2014196307.tif 000014
【０１１１】
表４で述べたデータから明らかなように、ｐＨ５．０において、薬物と修飾抗体との複合化により形成される複合体は、ｐＨ６．５の複合化で形成される複合体に比べ、複合化反応の過程を通じ、より高くかつより安定な結合薬物のレベルに達する。安定性の向上に加え、本結果は、ｐＨ６．５の複合化において同量の薬物を用いた場合よりも、ｐＨ５．０での複合化の方が、より高い薬物／抗体レベルに達することを示し、それにより、ｐＨ５．０における、薬物のより効率的な利用を示した。
【０１１２】
両群において、複合体単量体の量を経時的に決定した。得られたデータを表５中に述べる。
【０１１３】
【表５】
2014196307.tif 000015
【０１１４】
表５で述べたデータから明らかなように、ｐＨ６．５での複合化により形成された複合体に比べ、ｐＨ５．０において薬物と修飾抗体との複合化により形成された複合体は、より高い複合体単量体レベルを有する。
【０１１５】
実施例５
本実施例は更に、ｐＨ６未満において、薬物を修飾抗体と複合化させることの利点を立証するものである。
【０１１６】
ＢＩＷＡ  ４抗体を、ＳＰＰ（表６で示したようなＳＰＰの過剰モル濃度）を用い、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５％エタノール中、１２０〜１４０分間、室温にて修飾を行った。修飾抗体のアリコートを、様々なｐＨ値（ｐＨ４．６〜６．５）を有する緩衝液中で平衡化した別々のＮＡＰ  ２５カラムで精製した。ｐＨ４．６〜５．９の緩衝液は、３５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡからなった。ｐＨ６．５の緩衝液は、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳであった。
【０１１７】
各ｐＨでの修飾抗体を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中、ＤＭ１（リンカーの１．７倍モル濃度過剰）と、複合化した。室温で、１７〜１８時間のインキュベーション後、複合化した抗体試料を、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＮＡＰ  ２５カラムでのクロマトグラフィにより精製した。リンカー／抗体比（表６中、Ｌ／Ａ）を、３４３ｎＭで、８，０８０Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数を有するピリジン−２−チオンを放出させる、ジチオスレイトールでの処置により決定した。複合化工程での薬物／抗体比を、分光光度法（波長２８０ｎｍ及び２５２ｎｍ）により決定した。複合体単量体、高分子量種、及び低分子量種を、０．２Ｍ  塩化カリウム及び２０％イソプロパノールを含む０．２Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化、及び展開させたＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラムを用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０１１８】
この分析結果は、表６中で述べる。
【０１１９】
【表６】
2014196307.tif 000016
【０１２０】
表６中で述べられたデータは、ＤＭ１とＳＰＰ修飾ＢＩＷＡ４の複合化が、ｐＨ６未満において、ｐＨ６．５における複合化と比較して効率的であったことを立証するものである。特定の最終薬物／抗体比に到達するのに必要なリンカー及び薬物、特にＳＰＰリンカー及びＤＭ１、の量は、より低いｐＨにて減少した。更により低いｐＨにおいて、複合体単量体、高分子量種、及び低分子量種のレベルが、より至適であり、収率が改善された。
【０１２１】
実施例６
本実施例は、修飾抗体を精製する工程は、任意で除去され得ることを立証するものである。薬物は、二官能性修飾試薬と同時に、又は後ほど添加され得る。
【０１２２】
修飾試薬添加後の薬物添加の実施例において、ヒト化モノクロナール抗体ＣＮＴＯ９５を、二官能性修飾試薬ＳＰＤＢを用い、抗体の４．６モル濃度過剰のＳＰＤＢにて、１２０分、２０℃にて、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で修飾を行った。修飾緩衝液は、５．３％スク
ロース及び５％エタノールを含む４４ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）であった。修飾抗体の１アリコートを、１２．５ｍＭ  ＮａＣｌを含む１２．５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で平衡化及び溶出したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂にて精製し（標準的な４工程の方法）、その後、１２．５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％  ＤＭＡを含む１２．５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中、１０ｍｇ／ｍＬの修飾抗体の最終濃度で、２０時間、室温にて、ＤＭ４（結合したリンカーに対し、１．７倍モル濃度過剰の薬物）と複合化させた。修飾抗体の第２のアリコートを、１２０分の修飾反応（３工程の方法）の終わりに、すぐに更なる精製を行わず、複合化させた。
【０１２３】
修飾反応混合物の、タンパク質及び緩衝液の濃度を、１０ｍｇ／ｍＬの修飾タンパク質濃度、及び５．９ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．７％  スクロースを含む２８ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．５）の緩衝液組成となるように調整した。次いでＤＭ４を添加し（開始ＳＰＤＢに対し、１．７倍モル濃度過剰）、ＤＭＡを最終濃度１０％に調整した。室温にて、２０時間のインキュベーションの後、複合化抗体の両アリコートを、ｐＨ５．５にて、１０ｍＭ  ヒスチジン及び１０％スクロース中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂にて精製した。
【０１２４】
リンカー／抗体比（Ｌ／Ａ）を、３４３ｎＭにて、８，０８０Ｍ−１cｍ−１の減衰係
数を有するピリジン−２−チオンを放出するジチオスレイトールを用いた処置により決定した。複合化工程の薬物／抗体（Ｄ／Ａ）比及び収率を、分光光度法（波長２８０ｎｍ及び２５２ｎｍ）により、決定した。単量体パーセンテージを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。遊離薬物のパーセンテージを、ＨｉｓｅｐカラムによるＨＰＬＣにより分析した。これらの分析結果を、表７中に述べる。
【０１２５】
【表７】
2014196307.tif 000017
【０１２６】
表７で述べた結果によって立証されるように、修飾抗体の精製工程は、本発明の文脈中において除去され得る。
【０１２７】
実施例７
本実施例は、ヘテロ二官能性修飾試薬を用いて修飾し、次いでメイタンシノイドと複合化した抗体を精製するための改良方法について立証するものである。
【０１２８】
ＳＰＰ（７倍モル濃度過剰）を用いて修飾し、且つ実施例１で述べたようにＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂により精製したｈｕＮ９０１抗体を、メイタンシノイドＤＭ１（リンカーに対し１．７倍モル濃度過剰、最終濃度が３％のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に溶解）と複合化した。
【０１２９】
第一の複合体試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）中、Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ（登録商標）Ｇ２５Ｆ樹脂での標準的なクロマトグラフィにより精製した。
【０１３０】
第二の複合体試料を、実施例１で述べたように、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦ  システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により精製した。
【０１３１】
第三の複合体試料を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で平衡化し、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で溶出したＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌ樹脂のカラムを用いて精製した。
【０１３２】
第四の複合体試料を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中で平衡化し、０．２Ｍ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で溶出した、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂のカラムを用いて精製した。
【０１３３】
第五の複合体試料を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中で平衡化し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で溶出した、ＣＨＴ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のカラムを用いて精製した。
【０１３４】
第六の複合体試料を、３５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）中で平衡化し、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出した、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂のカラムを用いて精製した。
【０１３５】
複合体単量体を、０．２Ｍ  塩化カリウム及び２０％イソプロパノールを含む、０．２Ｍ  リン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化、及び展開させたＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬ樹脂のカラムを用いて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。複合化抗体の収率を、複合化した修飾抗体の量で割ることによって複合化工程の収率を決定した（２８０ｎｍの波長で分光光度法にて決定）。
【０１３６】
これらの分析結果を、表８中に述べる。
【０１３７】
【表８】
2014196307.tif 000018
【０１３８】
表８中の結果は、本発明の全ての精製方法（グループ２〜６）が、コントロールの方法（グループ１）によって得られたものと、同等の収率であることを示すものである。本発明の各クロマトグラフ法は、複合体単量体のレベルを改善し、容易にスケールアップされ得る。
【０１３９】
ＣＨＴ（セラミックヒドロキシアパタイト）に加え、ＣＦＴ（セラミックフルオロアパ
タイト）も又、同様のクロマトグラフィの条件の下、用いられ得る。あるいは、所望される産物（実質的に単量体である複合体）は樹脂によって保持されないが、高分子量種は保持され、それによって所望される産物から分離されるように、ＣＨＴ及びＣＦＴの両方を、非吸着方法で使用してもよい。
【０１４０】
標準的な複合化用の緩衝液／溶媒組成物は、ｐＨ６．５で、３％ＤＭＡ、５０ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むが（実施例１で用いたように）、他の組成物が、本明細書中で述べた幾つかのクロマトグラフィ工程に、より適合し、標準的な方法に対して他の利点を提供する。例えば、複合化は、ｐＨ６．５にて、３％ＤＭＡ、１２．５ｍＭ  リン酸カリウム、１２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ中で行われ得る。これらの条件の下、ｈｕＢ４抗体に組み込まれたリンカー量に対して組み込まれたＤＭ４量は、標準的な条件よりも、約１０％高かった。更に、これらの条件は、カチオン交換及びＣＨＴ樹脂といった樹脂へのロードに、より適合する。
【０１４１】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が本明細書中に示されるのと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
【０１４２】
本発明を記述する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）、用語、「ひとつの（ａ）」、及び「ひとつの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」並びに同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注記されない限り、オープン・エンドな用語（すなわち、「含むが、限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他に示されない限り、範囲内の各個々の値に対して個別に言及する略記方法としての役割を意図されているのみであり、各個々の異なる値は、あたかもそれぞれが本明細書中に列挙されるかのように、本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記述される全ての方法は、本明細書中で他に示されるか、又は文脈と明らかに矛盾していない限り、任意の適切な順序において、行われうる。本明細書中に提供される任意及び全ての例、又は例示的な言語  （例えば、「といった（ｓｕｃｈ  ａｓ）」の使用は、本発明を単により明らかにすることを意図するものであり、他に特許請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言葉も、任意の主張されていない要素を本発明の実施に必須なものとして示すとして解釈されるべきではない。
【０１４３】
本発明を実施するために本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、前記の記載を読めば、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形形態を必要に応じて使用することを予期しており、本発明者らは本明細書中に具体的に記載されているものとは違うように本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添えた特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、これら全ての可能な変形形態において、本明細書中に他に示されない限り、又は他の文脈と明らかに矛盾していない限り、先に記載した要素の任意の組み合わせが、本発明に包含される。
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月4日(2014.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−メイタンシノイド複合体の調製方法であり、該方法が、工程：
（ａ）抗体と二官能性架橋試薬とを接触させ、抗体にリンカーを共有結合させ、それによってリンカーが結合した抗体を含む第一混合物を調製すること、
（ｂ）リンカーが結合した抗体とメイタンシノイドとを、ｐＨ４〜９の溶液中で反応させることによって、メイタンシノイドを、第一混合物中のリンカーが結合した抗体と複合化させて、（ｉ）リンカーを介しメイタンシノイドと化学的に共役した抗体、（ｉｉ）遊離メイタンシノイド、及び（ｉｉｉ）工程（ｂ）の間に産生された反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、並びに
（ｃ）第二混合物を、接線流濾過、選択的沈殿、吸着濾過、吸着クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせに供し、リンカーを介しメイタンシノイドと化学的に共役した抗体を、第二混合物の他の成分から精製し、それによってリンカーを介しメイタンシノイドと化学的に共役した抗体の精製された第二混合物を調製すること、
を含み、
但し、第一混合物が、精製に供されないことを条件とする、方法。
【請求項２】
吸着クロマトグラフィーが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）における溶液がｐＨ４〜６．０である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）における溶液がｐＨ６．５〜９である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）における溶液がｐＨ６．０未満又はｐＨ６．５を超える、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）における溶液がスクロースを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）における溶液が、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液から成る群から選択される緩衝化剤を含む、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗体がヒト化モノクロナール抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、トラスツズマブである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、キメラ抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、マウスモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
メイタンシノイドがＮ２’-デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
メイタンシノイドがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−ｌ−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
抗体が、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼに不安定な結合から成る群から選択される化学結合を介して、化学的にメイタンシノイドと共役する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
二官能性架橋試薬が、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）から成る群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
二官能性架橋試薬が、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、及びＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から成る群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
二官能性架橋試薬がＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
抗体がトラスツズマブであり、二官能性架橋試薬がＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）であり、メイタンシノイドがＮ２’-デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【外国語明細書】
2014196307000001.pdf
2014196307000002.pdf
2014196307000003.pdf