(57)【要約】      （修正有）【解決手段】ヒトインターロイキン１２（ｈＩＬ−１２）に特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組換えヒト抗体。好ましい抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでｈＩＬ−１２に高い親和性を有し、ｈＩＬ−１２活性を中和する。抗体は、全長抗体またはその抗原結合部分であり得る。【効果】抗体または抗体の一部は、例えばｈＩＬ−１２活性が同定された障害を罹患したヒト被験体におけるｈＩＬ−１２の検出またはｈＩＬ−１２活性の阻害に有用である。組換えヒト抗体発現用の核酸、ベクター、および宿主細胞ならびに組換えヒト抗体の合成法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体が中和抗体である、ヒトＩＬ−１２に結合する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ヒトＩＬ−１２に結合するように、好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させた、ヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項３】
ヒトＩＬ−１２に結合するように、好ましい選択的変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させたヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項４】
前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、１つを超える好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置で活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異された、請求項２に記載の選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項５】
前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、３箇所以下の好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において選択的に変異された、請求項４に記載の選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項６】
前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、２箇所以下の好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置で選択的に変異された、請求項４に記載の選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項７】
前記ヒト抗体またはその抗原結合部分が、ファージディスプレイ技術を用いて同一の抗原に対して抗体を選択した場合に達成可能なレベルを超えるように目標特異性親和性レベルを達成するように選択的に変異される、請求項２に記載の選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項８】
前記選択的変異ヒト抗体が、少なくとも１つの所望の特性または特徴をさらに保持する、請求項７に記載の選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体。
【請求項９】
ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
表面プラスモン共鳴で測定すると１×１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
表面プラスモン共鳴で測定すると１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
表面プラスモン共鳴で測定すると１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
表面プラスモン共鳴で測定すると１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
表面プラスモン共鳴で測定すると１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する、請求項１５に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する、請求項１５に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する、請求項１９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する、請求項１９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、請求項１９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する、請求項２３に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する、請求項２３に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項２６に記載の単離ヒト抗体。
【請求項２８】
前記抗体重鎖定常部がＩｇＧ１である、請求項２７に記載の単離ヒト抗体。
【請求項２９】
Ｆａｂフラグメントである、請求項２６に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３０】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項２６に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３１】
短鎖Ｆｖフラグメントである、請求項２６に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３２】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害するか、
ｂ）配列番号４０４〜配列番号４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有するか、
ｃ）配列番号５３４〜配列番号５７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３３】
配列番号３３５〜配列番号４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２または配列番号５０６〜配列番号５３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３４】
配列番号２８８〜配列番号３３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１または配列番号４７０〜配列番号５０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３６】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項３５に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３７】
前記抗体重鎖定常部がＩｇＧ１である、請求項３６に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３８】
Ｆａｂフラグメントである、請求項３５に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３９】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項３５に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４０】
短鎖Ｆｖフラグメントである、請求項３５に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４１】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４２】
配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する、請求項４１に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４３】
配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する、請求項４１記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４４】
配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４５】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部からなる群から選択される重鎖定常部を含む、請求項４４に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４６】
前記抗体重鎖定常部がＩｇＧ１である、請求項４５に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４７】
Ｆａｂフラグメントである、請求項４４に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４８】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項４４に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４９】
短鎖Ｆｖフラグメントである、請求項４４に記載の単離ヒト抗体。
【請求項５０】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５１】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５２】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５３】
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３をコードする単離核酸。
【請求項５４】
抗体重鎖可変部をコードする、請求項５３に記載の単離核酸。
【請求項５５】
前記抗体重鎖可変部のＣＤＲ２が配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５６】
前記抗体重鎖可変部のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５７】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする、請求項５６に記載の単離核酸。
【請求項５８】
配列番号１８のアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３をコードする単離核酸。
【請求項５９】
抗体軽鎖可変部をコードする、請求項５８に記載の単離核酸。
【請求項６０】
前記抗体軽鎖可変部のＣＤＲ２が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の単離核酸。
【請求項６１】
前記抗体軽鎖可変部のＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の単離核酸。
【請求項６２】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする、請求項６１に記載の単離核酸。
【請求項６３】
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６４】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３をコードする単離核酸。
【請求項６５】
抗体重鎖可変部をコードする、請求項６４に記載の単離核酸。
【請求項６６】
前記抗体重鎖可変部のＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の単離核酸。
【請求項６７】
前記抗体重鎖可変部のＣＤＲ１が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の単離核酸。
【請求項６８】
配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする、請求項６７に記載の単離核酸。
【請求項６９】
配列番号２６のアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３をコードする単離核酸。
【請求項７０】
抗体軽鎖可変部をコードする、請求項６９に記載の単離核酸。
【請求項７１】
前記抗体軽鎖可変部のＣＤＲ２が配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の単離核酸。
【請求項７２】
前記抗体軽鎖可変部のＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の単離核酸。
【請求項７３】
配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする、請求項７２に記載の単離核酸。
【請求項７４】
以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７５】
以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号５９５〜６６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置における活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）配列番号６６９〜６７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７６】
以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＣＯＳ−３生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）ＤＰＬ８生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７７】
以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記軽鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７８】
前記変異が前記重鎖ＣＤＲ３中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７９】
前記変異が前記軽鎖ＣＤＲ３中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８０】
前記変異が前記重鎖ＣＤＲ２中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８１】
前記変異が前記軽鎖ＣＤＲ２中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８２】
前記変異が前記重鎖ＣＤＲ１中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８３】
前記変異が前記軽鎖ＣＤＲ１中に存在する、請求項７４、請求項７５、請求項７６、または請求項７７に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８４】
ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変部を有する抗体重鎖および
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変部を有する抗体軽鎖を含む、組換え発現ベクター。
【請求項８５】
請求項８４に記載の組換え発現ベクターが移入されている、宿主細胞。
【請求項８６】
ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体が細胞によって合成されるまで、培養培地中で請求項８５に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体の合成法。
【請求項８７】
ヒトＩＬ−１２ならびにヒヒＩＬ−１２、マーモセットＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２、およびアカゲザルＩＬ−１２からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するがマウスＩＬ−１２の活性を中和しない、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８８】
請求項１〜５２、請求項７４〜８３、および請求項８７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項８９】
請求項１〜５２、請求項７４〜８３、および請求項８７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分およびさらなる薬剤を含む組成物。
【請求項９０】
前記さらなる薬剤が治療薬である、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記治療薬が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファラジン、アミノサリチレート、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼインヒビター、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化薬、トロンボキサンインヒビター、ＩＬ−１レセプタアンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼインヒビター、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ，およびＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０の抗体またはそのリガンド、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノマイド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼインヒビター、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、捕体インヒビター、アドレナリン作用薬、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ，ｐ３８、ＭＡＰキナーゼインヒビター、ＩＬ−１β変換酵素インヒビター、ＴＮＦα変換酵素インヒビター、Ｔ細胞シグナル伝達インヒビター、メタロプロテイナーゼインヒビター、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、可溶性サイトカインレセプタ、可溶性ｐ５５ＴＮＦレセプタ、可溶性ｐ７５ＴＮＦレセプタ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、およびＴＧＦβからなる群から選択される、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記治療薬が、抗ＴＮＦ抗体およびその抗体フラグメント、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、ＴＡＣＥインヒビター、ＰＤＥ４インヒビター、コルチコステロイド、ブデノシド、デキサメタゾン、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、ＩＬ−１β変換酵素インヒビター、ＩＬ−１ｒａ、チロシンキナーゼインヒビター、６−メルカプトプリン、ならびにＩＬ−１１からなる群から選択される、請求項９０に記載の治療組成物。
【請求項９３】
前記治療薬が、コルチコステロイド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキセート、４−アミノピリジン、チザニジン、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、コポリマー１、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン（ｃｌａｂｒｉｂｉｎｅ）、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５，ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０の抗体またはそのリガンド、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノマイド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼインヒビター、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、捕体インヒビター、アドレナリン作用薬、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼインヒビター、ＩＬ−１β変換酵素インヒビター、ＴＡＣＥインヒビター、Ｔ細胞シグナル伝達インヒビター、キナーゼインヒビター、メタロプロテイナーゼインヒビター、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、可溶性サイトカインレセプタ、可溶性ｐ５５ＴＮＦレセプタ、可溶性ｐ７５ＴＮＦレセプタ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、抗Ｐ７、ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦβからなる群から選択される、請求項９０に記載の治療組成物。
【請求項９４】
ヒトＩＬ−１２活性を阻害するようにヒトＩＬ−１２と請求項４４に記載の抗体とを接触させる工程を包含する、ヒトＩＬ−１２活性の阻害法。
【請求項９５】
ヒト対象におけるヒトＩＬ−１２活性が阻害されるようにヒト対象に請求項４４に記載の抗体を投与する工程を包含する、ＩＬ−１２活性が有害な障害を有するヒト被験体におけるヒトＩＬ−１２活性の阻害法。
【請求項９６】
前記障害が、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、若年型慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、甲状腺炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性もしくは慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的脈管炎、慢性滑動性肝炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、敗血症、敗血症性ショック、敗血症症候群、成人呼吸窮迫症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、重症筋無力症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、線維性肺疾患、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記障害がクローン病である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記障害が多発性硬化症である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記障害が慢性関節リウマチである、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５３、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい選択的変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異することによって変異抗体またはその抗原結合物の第１のパネルを作製する工程と、
ｄ）１つの選択的変異位置の変異により予め同定した目標活性または部分的目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第１のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｆ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的目標活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
ｇ）工程ｄ）または工程ｆ）で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はＨ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０Ａ、およびＬ９６からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にさらに変異して、変異抗体またはその抗原結合部分の第２のパネルを作製する工程をさらに包含し、
ｈ）Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０Ａ、およびＬ９６からなる群から選択される１つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第２のパネルの活性を評価する工程と、
ｉ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程ｇ）の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｊ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
ｋ）工程ｈ）または工程ｊ）で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はＨ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、およびＬ３１Ａからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にさらに変異することによって変異抗体またはその抗原結合部分の第３のパネルを作製する工程をさらに包含し、
ｌ）Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、およびＬ３１Ａからなる群から選択される１つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第３のパネルの活性を評価する工程と、
ｍ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程ｋ）の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｎ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有し、それによって予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるのかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
を包含する、予め同定した目標活性を達成するための抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１０１】
ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）前記所望の抗体活性が得られない場合、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１０２】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記好ましい位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）前記所望の抗体活性が得られない場合、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１０７】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記好ましい選択的変異誘発位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
ａ）組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記適切な発現系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は抗体中で維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１１２】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な抗体からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記好ましい選択的変異誘発位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１６】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
ｆ）少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１１７】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記好ましい選択的変異誘発位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内で接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択した接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１２２】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１２５】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
ｆ）少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１２６】
前記接触位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記好ましい選択的変異誘発位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記接触位置が、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
ａ）親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３１】
ａ）親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６での位置でもないＣＤＲ内の少なくとも１つの他の位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３２】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られるがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択した接触または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３３】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４での位置でもないＣＤＲ内の少なくとも１つの他の位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、２つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および他の特性または特徴を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３４】
ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、を包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、他の特性に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３５】
ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、
ｆ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６での位置でもない少なくとも１つのＣＤＲ位置について工程ｂ）〜工程ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも１つの特性または特徴に影響を与えない少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも１つの特性または特徴を保持した組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、２つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの特性または特徴を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３６】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３７】
ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性および少なくとも１つの他の特性または特徴の保持を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４での位置でもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示し、且つ少なくとも１つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる２つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの他の特性または特徴の保持を評価する工程と、を包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法。
【請求項１３８】
前記他の特性または特徴が、他のタンパク質との非交差反応性の保存、他のヒト組織との非相互反応性の保存、エピトープ認識の保存、および生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体からなる群から選択される、請求項１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
ヒトＩＬ−１２が検出されるように、ＩＬ−１２と請求項１〜５２、７４〜８３、および８７のいずれか１項に記載のヒトＩＬ−１２と抗体またはその抗原結合部分とを接触させる工程を包含する、ヒトＩＬ−１２の検出法。
【請求項１４０】
前記ヒトＩＬ−１２がｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ヒトＩＬ−１２が診断目的で生体サンプル中で検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
治療における請求項１〜５２、７４〜８３、および８７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項１４３】
ＩＬ−１２活性が有害である障害の治療用の薬物製造における請求項１〜５２、７４〜８３、および８７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項１４４】
前記障害が、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、若年型慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、甲状腺炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性もしくは慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的脈管炎、慢性滑動性肝炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、敗血症、敗血症性ショック、敗血症症候群、成人呼吸窮迫症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、重症筋無力症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、線維性肺疾患、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項１４３に記載の使用。
【請求項１４５】
前記障害がクローン病である、請求項１４３に記載の使用。
【請求項１４６】
前記障害が多発性硬化症である、請求項１４３に記載の使用。
【請求項１４７】
前記障害が慢性関節リウマチである、請求項１４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、固有の構造および多面発現効果を有するサイトカインとして最近特徴づけられた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０、８２７〜８４５；Ｓｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、１０１８８〜１０１９２；Ｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５４、１１６〜１２７、；Ｐｏｄｌａｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２９４、２３０〜２３７）。ＩＬ−１２は、免疫および炎症応答に関与するいくつかの疾患に関連する病理学における重要な役割を果たす。ＩＬ−１２、その生物活性、およびその疾患における役割の概要を、Ｇａｔｅｌｙ，ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６、４９５〜５２１に見出すことができる。
【０００２】
構造的には、ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合によって互いに連結している３５ｋＤａサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤａサブユニットを含むヘテロ二量体タンパク質（ｐ４０）（「ｐ７０」サブユニットという）である。ヘテロ二量体タンパク質は、主に単球、マクロファージ、および樹状細胞などの抗原提示細胞によって産生される。これらの細胞型はまた、ｐ７０サブユニットに関連する過剰なｐ４０サブユニットを分泌する。ｐ４０およびｐ３５サブユニットは、一般に関連が無く、どちらも生物活性を有するにもかかわらず、ｐ４０ホモ二量体はＩＬ−１２アゴニストとして機能することができると報告されている。
【０００３】
機能的には、ＩＬ−１２は、抗原特異的Ｔヘルパー型（Ｔｈ１）と２型（Ｔｈ２）リンパ球との間の平衡調節における中心的役割を果たす。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、自己免疫疾患の発症および進行を支配し、ＩＬ−１２はＴｈ１−リンパ球分化および成熟の制御に重要である。Ｔｈ１細胞によって放出されたサイトカインは炎症性であり、これにはインタフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＩＬ−２、およびリンホトキシン（ＬＴ）が含まれる。Ｔｈ２細胞は、ヒトの炎症、アレルギー反応、および免疫抑制を促進するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を分泌する。
【０００４】
自己免疫疾患およびＩＦＮγの炎症促進活動におけるＴｈ１応答と一致して、ＩＬ−１２は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、およびクローン病などの多数の自己免疫疾患および炎症疾患に関連する病理の主要な役割を果たし得る。
【０００５】
ヒトＭＳ患者は、急性ＭＳプラーク中のｐ４０  ｍＲＮＡレベルによって報告されているＩＬ−１２発現の増加を示す。（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２、１９８５〜１９９６）。さらに、ＭＳ患者由来のＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞での抗原提示細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激により、コントロールＴ細胞と比較してＩＬ−１２産生が増加し、これは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用がＩＬ−１２の潜在的なインデューサーであるという所見と一致する。
【０００６】
健常コントロールと比較してＲＡ患者の滑液でＩＬ−１２  ｐ７０レベルの上昇が検出された（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４１、３０６〜３１４）。ＲＡ滑液におけるサイトカインメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現プロフィールは、Ｔｈ１サイトカインで優勢であると同定された。（Ｂｕｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３、３４７〜３６７）。ＩＬ−１２はまた、クローン病（ＣＤ）に関連する病理学に重要な役割を果たすようである。この疾患を罹患した患者の腸粘膜でＩＮＦγおよびＩＬ−１２発現の増加が認められた（Ｆａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．、１４、２３５〜２３８；Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５０、８２３〜８３２；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１２、１１６９〜１１７８、およびＢｅｒｒｅｂｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５２、６６７〜６７２）。ＣＤ患者の固有層由来のＴ細胞のサイトカイン分泌プロフィールは、ＩＦＮγレベルンの大きな上昇を含む優勢Ｔｈ１応答の特徴を示している（Ｆｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７、１２６１〜１２７０）。さらに、ＣＤ患者由来の結腸組織分泌は豊富なＩＬ−１２発現マクロファージおよびＩＦＮγ発現Ｔ細胞を示す（Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５０、８２３〜８３２）。
【０００７】
種々のヒト障害におけるヒトＩＬ−１２の役割によって、ＩＬ−１２活性を阻害または反作用するように治療ストラテジーが設計されている。特に、ＩＬ−１２に結合して中和する抗体は、ＩＬ−１２活性を阻害する手段と考えられている。いくつかの最も初期の抗体は、ＩＬ−１２で免疫化されたマウスリンパ球から調製されたハイブリドーマによって分泌されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった（例えば、Ｓｔｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、による特許出願公開番号ＷＯ９７／１５３２７；Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２、１２８１〜１２９０；Ｄｕｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６、９３４〜９３８を参照のこと）。これらのマウスＩＬ−１２抗体は、ヒトへのマウス抗体の投与に関する問題（血清半減期が短いこと、一定のヒトエフェクター機能を惹起できないこと、およびヒトにおけるマウス抗体に対する望ましくない免疫応答の惹起（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）など）のためにｉｎ  ｖｉｖｏ使用には限りがある。
【０００８】
一般に、ヒトにおける完全なマウス抗体の使用に関する問題を克服する試みには、より「ヒトに類似した」抗体の操作が含まれている。例えば、抗体鎖の可変部がマウス由来であり、且つ抗体鎖の定常部がヒト由来であるキメラ抗体が調製されている（Ｊｕｎｇｈａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０、１４９５〜１５０２、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８、２６６３〜２６６７；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４、７７３〜７８３）。しかし、これらのキメラおよびヒト化抗体は依然としていくつかのマウス配列を保持しているので、特に長期間投与した場合、これらは依然として望ましくない免疫反応（ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応）を惹起し得る。
【０００９】
マウス抗体またはその誘導体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）に対する好ましいＩＬ−１２阻害剤は、長期間使用してもＨＡＭＡ反応を惹起するはずが無いので、完全にヒト抗ＩＬ−１２抗体であろう。しかし、このような抗体は当該分野で記載されていないので、依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９７／０１５３２７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０、８２７〜８４５
【非特許文献２】Ｓｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、１０１８８〜１０１９２
【非特許文献３】Ｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５４、１１６〜１２７
【非特許文献４】Ｐｏｄｌａｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２９４、２３０〜２３７
【非特許文献５】Ｇａｔｅｌｙ，ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６、４９５〜５２１
【非特許文献６】Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２、１９８５〜１９９６
【非特許文献７】Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４１、３０６〜３１４
【非特許文献８】Ｂｕｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３、３４７〜３６７
【非特許文献９】Ｆａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．、１４、２３５〜２３８
【非特許文献１０】Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５０、８２３〜８３２
【非特許文献１１】Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１２、１１６９〜１１７８
【非特許文献１２】Ｂｅｒｒｅｂｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５２、６６７〜６７２
【非特許文献１３】Ｆｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７、１２６１〜１２７０
【非特許文献１４】Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．、１５０、８２３〜８３２
【非特許文献１５】Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２、１２８１〜１２９０
【非特許文献１６】Ｄｕｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６、９３４〜９３８
【非特許文献１７】Ｊｕｎｇｈａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０、１４９５〜１５０２
【非特許文献１８】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８、２６６３〜２６６７
【非特許文献１９】Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４、７７３〜７８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体を提供する。本発明はまた、本発明のヒト抗ＩＬ−１２抗体を用いた、その病理学がＩＬ−１２に関連する急性または慢性疾患の治療または予防に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合するように、好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させたヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体を提供する。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合するように、好ましい選択的変異位置において活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異させたヒト抗体またはその抗体結合部分を含む、選択的変異ヒトＩＬ−１２抗体を提供する。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、選択的変異ヒト抗体またはその抗原結合部分は、１つを超える好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置においてで活性を向上させるアミノ酸残基により選択的に変異されている。別の好ましい実施形態では、選択的変異ヒト抗体またはその抗原結合部分は、３箇所以下の好ましい選択的変異位置、接触位置、または過剰変異位置において選択的に変異されている。別の好ましい実施形態では、選択的変異ヒト抗体またはその抗原結合部分は２箇所以下の好ましい選択的変異、接触位置、または過剰変異位置で選択的に変異されている。さらに別の好ましい実施形態では、選択的変異ヒト抗体またはその抗原結合部分は、ファージディスプレイ技術を用いて同一の抗原に対して抗体を選択した場合に、達成可能なレベルを超えるような、目標特異性親和性レベルを達成するように選択的に変異され、別の好ましい実施形態では、選択的変異ヒト抗体は、少なくとも１つの所望の特性または特徴（例えば、他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の保存、エピトープ認識、生殖系列免疫グロブリン配列に隣接する抗体の産生）をさらに保持している。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｔｉｎｉｎ  ｂｌａｓｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。より好ましくは、１×１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。より好ましくは、１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単フィトヘムアグルチニン離ヒト抗体またはその抗原結合部分。より好ましくは、１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。より好ましくは、１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。さらにより好ましくは、１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１９】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２１】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２３】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２）（本明細書中で参考として援用される）で考察されているように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部またはその任意の対立遺伝子変異体からなる群から選択される重鎖定常部を含む。より好ましい実施形態では、抗体重鎖定常部はＩｇＧ１である。別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントである。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号４０４〜配列番号４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号５３４〜配列番号５７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２５】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３３５〜配列番号４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号５０６〜配列番号５３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２８８〜配列番号３３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号４７０〜配列番号５０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、上記のように重鎖定常部、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントを含む。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２７】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、上記のように重鎖定常部、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントを含む。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３１】
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。好ましい単離核酸は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３をコードする。抗体重鎖可変部をコードする単離核酸。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部のＣＤＲ２をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部のＣＤＲ１をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号１８のアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３をコードする。抗体軽鎖可変部をコード単離核酸。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部のＣＤＲ２をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部のＣＤＲ１をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３３】
好ましい単離核酸は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３をコードする。抗体重鎖可変部をコードする単離核酸。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部のＣＤＲ２をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部のＣＤＲ１をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変部をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２６のアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３をコードする。抗体軽鎖可変部をコードする単離核酸。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部のＣＤＲ２をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部のＣＤＲ１をコードする。別の実施形態では、単離核酸は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変部をコードする。
【００３４】
別の態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号５９５〜６６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）配列番号６６９〜６７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＣＯＳ−３生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）ＤＰＬ８生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定すると０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基による変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３８】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ３中に変異を有する。別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ３中に変異を有する。別の実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ２中に変異を有する。別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ２中に変異を有する。別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ１中に変異を有する。別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ１中に変異を有する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体コード核酸を保有する組換え発現ベクターを提供し、本発明の宿主細胞の培養による本発明の抗体の作製法と同様に、このようなベクターが移入された宿主細胞もまた本発明の範囲内である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２ならびにヒヒＩＬ−１２、マーモセットＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２、およびアカゲザルＩＬ−１２からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するがマウスＩＬ−１２の活性を中和しない、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、抗体またはその抗原結合部分およびさらなる薬剤（例えば、治療薬）を含む組成物を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２活性を阻害するようにヒトＩＬ−１２と本発明の抗体（例えば、Ｊ６９５）とを接触させる工程を包含する、ヒトＩＬ−１２活性の阻害法を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ヒト対象におけるヒトＩＬ−１２活性が阻害されるようにヒト被験体に本発明の抗体（例えば、Ｊ６９５）を投与する工程を包含する、ＩＬ−１２活性が有害な障害を有するヒト対象におけるヒトＩＬ−１２活性の阻害法を提供する。障害は、例えば、クローン病、多発性硬化症、または慢性関節リウマチであり得る。
【００４５】
別の態様では、本発明は、ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５３、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい選択的変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異することによって変異抗体またはその抗原結合物の第１のパネルを作製する工程と、
ｄ）１つの選択的変異位置の変異により予め同定した目標活性または部分的標的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第１のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｆ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
ｇ）工程ｄ）または工程ｆ）で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０Ａ、およびＬ９６からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にさらに変異して、変異抗体またはその抗原結合部分の第２のパネルを作製する工程をさらに包含し、
ｈ）Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０Ａ、およびＬ９６からなる群から選択される１つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第２のパネルの活性を評価する工程と、
ｉ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程ｇ）の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｊ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有するかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程と、
ｋ）工程ｈ）または工程ｊ）で予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られないか部分的活性のみを有する抗体が得られる場合、前記方法はＨ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、およびＬ３１Ａからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にさらに変異することによって変異抗体またはその抗原結合部分の第３のパネルを作製する工程をさらに包含し、
ｌ）Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、およびＬ３１Ａからなる群から選択される１つのアミノ酸残基の変異により予め同定した目標活性またはその部分的活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるかどうかを決定するために、前記変異抗体またはその抗原結合部分の第３のパネルの活性を評価する工程と、
ｍ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す工程ｋ）の各変異を段階的に組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｎ）前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分が予め同定した目標活性または部分的標的活性を有することによって予め同定した目標活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるのかどうかを決定するために、前記組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、予め同定した目標活性を達成するための抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を特徴とする。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）少なくとも１つの接触位置または過剰変異位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価する工程と、
ｅ）少なくとも１つの他の接触位置または過剰変異位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す各変異を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００４８】
好ましい実施形態では、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、過剰変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、選択的変異誘発位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、ａ）組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記好ましい選択的変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記適切な発現系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含し、前記特性または特徴は抗体中での維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００５０】
好ましい実施形態では、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、過剰変異位置が、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、選択的変異誘発についての残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
ｆ）少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００５２】
好ましい実施形態では、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、過剰変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、選択的変異誘発の残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）内で接触または過剰変異位置を選択することによって選択した接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記接触または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含し、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００５４】
好ましい実施形態では、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、過剰変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、選択的変異誘発の残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内で好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を変異について選択することによって選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置を同定する工程と、
ｃ）前記選択された好ましい変異誘発位置または接触位置または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程であって、前記特性または特徴は維持されなければならないものである、
ｆ）少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置について工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００５６】
好ましい実施形態では、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、過剰変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３、およびＬ９３からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、選択的変異誘発の残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、ａ）親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００５８】
好ましくは、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、ａ）親親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６での位置でもないＣＤＲ内の少なくとも１つの他の位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない組換え抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択した接触または過剰変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、前記非ファージディスプレイ系におけるパネルを発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６１】
好ましくは、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４での位置でもないＣＤＲ内の少なくとも１つの他の位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示す少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、２つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および他の特性または特徴を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６３】
好ましくは、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を変異について選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分を評価する工程と、
ｆ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６での位置でもない少なくとも１つのＣＤＲ位置について工程ｂ）〜工程ｅ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも１つの特性または特徴に影響を与えない少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも１つの特性または特徴を保持した組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して、２つの活性を向上させるアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの特性または特徴を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程とを包含する、他の特性に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について、前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程と、
ｆ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６での位置でもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示すが少なくとも１つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、少なくとも１つの保持された特性または特徴を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｈ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる２つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの他の特性または特徴の保持を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６７】
好ましくは、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、ａ）親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製する工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、少なくとも１つの他の特性または特徴の変化について親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを評価する工程とを包含する、他の特徴に影響を与えない抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、ａ）ファージディスプレイ系での選択によって得られたがその活性を前記ファージディスプレイ系における変異誘発によってさらに改良することができない親抗体またはその抗原結合部分を得る工程と、
ｂ）変異のために、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、およびＬ９６以外の位置で相補性決定領域（ＣＤＲ）内でアミノ酸残基を選択する工程と、
ｃ）前記選択位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基にそれぞれ変異させることによって変異抗体またはその抗原結合部分のパネルを作製し、非ファージディスプレイ系で発現させる工程と、
ｄ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して前記変異抗体またはその抗原結合部分のパネルの活性および少なくとも１つの他の特性または特徴の保持を評価することによって活性を向上させるアミノ酸残基を同定する工程と、
ｅ）工程ｂ）で選択された位置でもＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、およびＬ９４での位置でもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜工程ｄ）を繰り返す工程と、
ｆ）前記親抗体またはその抗原結合部分中に改良された活性を有することを示し、且つ少なくとも１つの他の特性または特徴に影響を与えない少なくとも２つの各活性を向上させるアミノ酸残基を組み合わせて、組み合わせ抗体またはその抗原結合部分を形成させる工程と、
ｇ）前記親抗体またはその抗原結合部分と比較して改良された活性および少なくとも１つの他の保持された特性または特徴を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、前記組換え抗体またはその抗原結合部分と比較して、活性を向上させる２つのアミノ酸残基を有する組み合わせ抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの他の特性または特徴の保持を評価する工程とを包含する、抗体またはその抗原結合部分の活性の改良法を提供する。
【００７０】
好ましくは、他の特性または特徴は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非相互反応性の保存、２）エピトープ認識（すなわち、好ましくは遊離の可溶性ｐ４０由来の結合干渉を防止するＰ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体との関連におけるｐ４０エピトープの認識）の保存、および／または３）生殖系列免疫グロブリン配列に密接な配列を有する抗体の産生からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】生殖系列配列Ｃｏｓ−３／ＪＨ３およびＤｐ１１８  Ｌｖ１０４２と比較した、ヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の重鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１Ｂ】生殖系列配列Ｃｏｓ−３／ＪＨ３およびＤｐ１１８  Ｌｖ１０４２と比較した、ヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の重鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１Ｃ】ヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の軽鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。
【図１Ｄ】ヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の軽鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。
【図２Ａ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｂ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｃ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｄ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｅ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｆ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の軽鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｇ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の軽鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図２Ｈ】部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の軽鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。
【図３】カニクイザルにおける血漿ネオプテリンに対するヒト抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す図である。
【図４】コラーゲンでのマウスの免疫化後に対する平均関節炎スコアのグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
図１Ａ〜図１Ｂは生殖系列配列Ｃｏｓ−３／ＪＨ３およびＤｐ１１８  Ｌｖ１０４２と比較した、ヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の重鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。カバットナンバリングを使用して、アミノ酸位置を同定する。Ｊｏｅ  ９野生型については、全配列を示す。他の抗体については、Ｊｏｅ  ９野生型と異なるアミノ酸位置のみを示す。
【００７３】
図１Ｃ〜図１ＤはヒトＩＬ−１２に結合する一連のヒト抗体の軽鎖可変部アミノ酸アラインメントを示す図である。カバットナンバリングを使用して、アミノ酸位置を同定する。Ｊｏｅ  ９野生型については、全配列を示す。他の抗体については、Ｊｏｅ  ９野生型と異なるアミノ酸位置のみを示す。
【００７４】
図２Ａ〜図２Ｅは部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の重鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。図の右側のグラフは、変異Ｙ６１（白抜きのバー）と比較した置換抗体（黒塗りのバー）についてのｏｆｆ−速度を示す。
【００７５】
図２Ｆ〜図２Ｈは部位特異的変異誘発および各位置での各アミノ酸置換によって変異されたＹ６１抗体の軽鎖におけるＣＤＲ位置を示す図である。図の右側のグラフは、変異Ｙ６１（白抜きのバー）と比較した置換抗体（黒塗りのバー）についてのｏｆｆ−速度を示す。
【００７６】
図３はカニクイザルにおける血漿ネオプテリンに対するヒト抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す図である。
【００７７】
図４はコラーゲンでのマウスの免疫化後に対する平均関節炎スコアのグラフを示す図であり、これは、Ｃ１７．１５での治療によりラットＩｇＧでの治療と比較して関節炎関連症状が有意に減少することを示す。
【００７８】
（発明の詳細な説明）
本発明をより容易に理解するために、最初に一定の用語を定義する。
【００７９】
用語「活性を向上させるアミノ酸残基」には、抗体の活性を改良するアミノ酸残基が含まれる。活性を向上させるアミノ酸残基は、接触位置、過剰変異位置、または好ましい選択的変異誘発位置においてアミノ酸残基と置換することができ、さらに、１つまたは複数のＣＤＲ内に１つを超える活性を向上させるアミノ酸残基が存在することができることを理解すべきである。活性を向上させるアミノ酸残基には、抗体（例えば、ヒトＩＬ−１２に結合する抗ヒトＩＬ−１２抗体）の結合特異性／親和性を改良するアミノ酸残基が含まれる。活性を向上させるアミノ酸残基は、抗体（例えば、ヒトＩＬ−１２を阻害するヒトＩＬ−１２抗体）の中和能力を改良するアミノ酸残基が含まれることも意図される。
【００８０】
用語「抗体」には、ジスルフィド結合によって相互連結された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変部（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常部から構成される。重鎖定常部は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変部（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および重鎖定常部からなる。軽鎖定常部は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）という）に点在する超可変部（相補性決定領域（ＣＤＲ）という）に分けることができる。各ＶＨおよびＬＨは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置している。
【００８１】
用語、抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）には、抗原（例えば、ｈＩＬ−１２）に特異的に結合する能力を保持している抗体のフラグメントが含まれる。抗体の抗原結合を、全長抗体のフラグメントによって機能させることができることが示されている。用語、抗体の「抗原結合部分」に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂ領域を含む２価のフラグメント）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の１つのアームからなるＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６）、および（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別の遺伝子（これらは、組換え法を用いて、１価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成するためにＶＬとＶＨ領域が対になって１つのタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーによって連結することができる）にコードされる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９〜５８８３を参照のこと）。このような単鎖抗体はまた、用語抗体の「抗原結合部分」の範囲内であることが意図される。単鎖抗体の他の形態（ジアボディなど）もまた範囲内である。ジアボディは、短すぎて同一の鎖上の２つのドメイン間で対を形成することができないリンカーを使用しないでＶＨおよびＶＬドメインが１つのポリペプチド鎖上で発現されることにより、ドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させて２つの抗原結合部位を作製する２価で二重特異性の抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２、１１２１〜１１２３を参照のこと）。さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体の一部と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｇｒｉｄｏｍａｓ、６、９３〜１０１）および２価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１、１０４７〜１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体の一部を、全抗体のそれぞれパパインまたはペプシン���化などの従来技術を用いて完全な抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の一部、および免疫接着分子を、本明細書中に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。好ましい抗原結合部分は、完全なドメインまたは完全なドメインの対である。
【００８２】
用語「復帰突然変異」は、ヒト抗体のいくつかまたは全ての体細胞変異アミノ酸が相同な生殖系列抗体配列由来の対応する生殖系列残基に置換されるプロセスをいう。本発明のヒト抗体の重鎖および軽鎖配列を、ＶＢＡＳＥデータベース中の生殖系列配列と個別に整列させて、相同性の高い配列を同定する。本発明のヒト抗体における相違は、このような異なるアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置の変異によって生殖系列配列に戻る。復帰突然変異の候補としてこのように同定された各アミノ酸の役割は抗原結合における直接的または間接的役割について調査すべきであり、ヒト抗体のいずれかの所望の特徴に影響を与えるための変異後に認められるいずれのアミノ酸も最終的な抗体に含まれるべきではない（例として、選択的変異誘発アプローチによって同定された活性を向上させるアミノ酸を復帰突然変異に供さない）。第２の生殖系列配列が本発明のヒト抗体配列の少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸と問題の両アミノ酸部位で同一であり、かつ共直線性である場合、復帰突然変異に供されるアミノ酸数を最小化するために、最も密接な生殖系列配列と異なるが第２の生殖系列配列中の対応するアミノ酸に同一であると認められたこれらのアミノ酸位置は存続し得る。復帰突然変異は、抗体最適化の任意の段階で起こり得る。好ましくは、復帰突然変異は、選択的変異誘発アプローチの直前または直後に起こる。より好ましくは、復帰突然変異は、選択的変異誘発アプローチの直前に起こる。
【００８３】
本明細書中で使用される、句「ヒトインターロイキン１２」（本明細書中ではｈＩＬ−１２またはＩＬ−１２と略す）には、主にマクロファージおよび樹状細胞によって分泌されるヒトサイトカインが含まれる。この用語には、ジスルフィド結合で互いに結合している３５ｋＤサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロ二量体が含まれる。ヘテロ二量体タンパク質を、「ｐ７０サブユニット」という。ヒトＩＬ−１２の構造は、例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０、８２７〜８４５；Ｓｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、１０１８８〜１０１９２；Ｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５４、１１６〜１２７；Ｐｏｄｌａｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２９４、２３０〜２３７にさらに記載されている。用語「ヒトＩＬ−１２」には、標準的な組換え発現法によって調製することができる組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈ  ＩＬ−１２）を含むことが意図される。
【００８４】
用語「カバットナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」、「カバット定義（Ｋａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ）」、および「カバット標識（Ｋａｂａｔ  ｌａｂｅｒｉｎｇ）」を、本明細書中では交換的に使用できる。当該分野で認識されるこれらの用語は、抗体または抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変部中の他のアミノ酸残基よりも変化する（すなわち、超可変）アミノ酸残基のナンバリングシステムをいう（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９７１、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９０、３８２〜３９１およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２）。重鎖可変部について、超可変部は、ＣＤＲ１のアミノ酸３１〜３５、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜６５、およびＣＤＲ３のアミノ酸９５〜１０２の範囲である。軽鎖可変部について、超可変部は、ＣＤＲ１のアミノ酸２４〜３４、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜５６、およびＣＤＲ３のアミノ酸８９〜９７の範囲である。
【００８５】
本明細書中でカバットナンバリングを使用して、本発明の抗体中に作製されたアミノ酸修飾の位置を示す。例えば、Ｙ６１抗ＩＬ−１２抗体を重鎖ＣＤＲ１の第３１位でセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異するか（Ｈ３１Ｓ→Ｅ）、または軽鎖ＣＤＲ３の第９４位でグリシン（Ｇ）をチロシン（Ｙ）に変異する（Ｌ９４Ｇ→Ｙ）ことができる。
【００８６】
用語「ヒト抗体」には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２を参照のこと）に記載のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変部または定常部を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体には、例えばＣＤＲ（特に、ＣＤＲ３）中のヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされるアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって移入される変異）を含み得る。本明細書中に記載の「選択的変異誘発アプローチ」を用いて変異を導入することが好ましい。ヒト抗体は、アミノ酸残基（例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされる活性を向上させるアミノ酸残基）と置換された少なくとも１つの位置を有し得る。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基を用いて２０個までの位置で置換することができる。他の実施形態では、１０個まで、５個まで、または２個までの位置で置換される。より好ましい実施形態では、これらの置換は、以下に詳述のＣＤＲ領域の範囲内である。しかし、本明細書中で使用される、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図しない。
【００８７】
句「組換えヒト抗体」には、組換え技術によって調製、発現、作製、または単離されたヒト抗体（宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下の第ＩＩ章にさらに記載）、組換え、結合抗体ライブラリーから単離された抗体（下記第ＩＩＩ章にさらに記載）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０、６２８７〜６２９５を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調整、発現、作製、または単離された抗体など）が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変部および定常部を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２を参照のこと）。しかし、ある実施形態では、このような組換えヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物を使用する場合はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に供するので、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、関連のＶＨおよびＶＬ配列から由来するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列であろう。しかし、ある実施形態では、このような組換え抗体は、選択的変異誘発アプローチまたは復帰突然変異またはその両方の結果である。
【００８８】
「単離抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる（例えば、ｈＩＬ−１２に特異的に結合する単離抗体は、ｈＩＬ−１２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ｈＩＬ−１２に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＩＬ−１２分子に結合し得ない（以下にさらに詳細に考察する）。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学薬品を実質的に含み得ない。
【００８９】
「中和抗体」（または「ｈＩＬ−１２活性を中和した抗体」）には、ｈＩＬ−１２への結合によってｈＩＬ−１２の生物活性が阻害される抗体が含まれる。このｈＩＬ−１２の生物活性の阻害は、ｈＩＬ−１２生物活性の１つまたは複数のインヒビターの測定（フィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡ）におけるヒトフィトヘマグルチニン芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２レセプタ結合アッセイ（実施例３−インターフェロンγ誘導アッセイを参照のこと）におけるレセプタ結合の阻害など）によって評価することができる。これらのｈＩＬ−１２生物活性の指標を、１つまたは複数の当業者に既知のいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって評価することができる（実施例３を参照のこと）。
【００９０】
用語「活性」には、抗原に対する抗体（例えば、ＩＬ−１２抗原に結合する抗ｈＩＬ−１２抗体）の結合特異性／親和性および／または抗体の中和能力（例えば、ｈＩＬ−１２への結合はｈＩＬ−１２の生物活性を阻害する（例えば、ＰＨＡ芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２レセプタ結合アッセイにおけるレセプタ結合の阻害（実施例３を参照のこと）などの抗ｈＩＬ−１２抗体）などが含まれる。
【００９１】
句「表面プラスモン共鳴」には、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による実時間での生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象が含まれる。さらなる説明のためには、実施例５およびＪｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１、１９〜２６；Ｊｏｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１、６２０〜６２７；Ｊｏｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８、１２５〜１３１；およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８、２６８〜２７７を参照のこと。
【００９２】
本明細書中で使用される、用語「Ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことが意図される。
【００９３】
本明細書中で使用される、用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことが意図される。
【００９４】
句「核酸分子」には、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が含まれる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００９５】
本明細書において使用される、ｈＩＬ-１２に結合する抗体または抗体部分（たとえばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）（「単離抗体」を含む）についての句「単離核酸分子」は、前記抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列がｈＩＬ−１２以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他の核酸配列（この他の配列はヒトゲノムＤＮＡにおいて天然において当該核酸に隣接して存在し得る）を含まない核酸分子を含む。したがって、例えば、抗ＩＬ−１２抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離核酸は、ＩＬ−１２以外の抗原に結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。句「単離核酸分子」はまた、２価の二重特異性抗体（ＶＨおよびＶＬ領域が当該ｄｉａｂｏｄｙ配列以外の他の配列を含まないｄｉａｂｏｄｙなど）をコードする配列を含むことが意図される。
【００９６】
用語「ベクター」には、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子が含まれる。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。あるベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、宿主ゲノムと共に複製することができる。さらに、あるベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書中では、「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）という。一般に、組換えＤＮＡ技術に使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を、交換可能に使用することができる。しかし、本発明は、等価に機能するこのような発現ベクターの他の形態（ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など）を含むことが意図される。
【００９７】
句「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）には、組換え発現ベクターが導入された細胞が含まれる。このような用語は、特定の細胞だけでなく、このような細胞の子孫も含むことが意図されることを理解すべきである。変異または環境の影響のいずれかによって継代で一定の修飾が起こり得るので、このような子孫は実際には親細胞と同一ではないが、本明細書中で使用される、用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００９８】
本明細書中で使用される、用語「修飾」は、抗体またはその抗原結合部分中の１つまたは複数のアミノ酸の変化をいうことが意図される。１つまたは複数の位置でのアミノ酸の付加、置換、または欠失によって変化することができる。公知の技術（ＰＣＲ変異誘発）を用いて変化させることができる。
【００９９】
句「接触位置」には、２６の既知の抗体−抗原構造の１つに抗体と接触するアミノ酸によって占められた抗体の重鎖可変部または軽鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸位置が含まれる。抗体−抗原複合体の２６の任意の既知の解析された構造中のＣＤＲアミノ酸が抗原に接触する場合、アミノ酸は接触位置を占めると考えることができる。接触位置は、非接触位置よりも抗原に接触するアミノ酸で占められる可能性が高い。好ましくは、接触位置は、２６個のうち３個を超える（＞１１．５％）構造中で抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である。最も好ましくは、接触位置は、２５個のうち８個を超える（＞３２％）構造中で抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である。
【０１００】
用語「過剰変異位置」には、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ親和性成熟中の体細胞過剰変異の頻度または可能性が高いと考えられる抗体の重鎖可変部または軽鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域中の位置を占めるアミノ酸残基が含まれる。「体細胞過剰変異の高い頻度または可能性」には、上記残基が抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ親和性成熟中の体細胞過剰変異を受ける頻度または可能性が５％〜４０％であることが含まれる。記載したこの範囲内の全ての範囲はまた、本発明の一部であることが意図されることが理解されるべきである（例えば、５％〜約３０％、５％〜約１５％、１５％〜約３０％）。
【０１０１】
用語「好ましい選択的変異誘発位置」には、接触および過剰変異位置であると考えることができる重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３中の位置を占めるアミノ酸残基が含まれる。
【０１０２】
句「選択的変異誘発アプローチ」には、少なくとも１つの好ましい選択的変異誘発位置、過剰変異位位置、および／または接触位置での、ＣＤＲアミノ酸の選択およびそれぞれの変異による、抗体活性の改良法が含まれる。「選択的に変異した」ヒト抗体は、選択的変異誘発アプローチを用いて選択された位置での変異を含む抗体である。別の実施形態では、選択的変異誘発アプローチは、好ましくは抗体の重鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３（以下それぞれＨ１、Ｈ２、およびＨ３）または軽鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３（以下それぞれＬ１、Ｌ２、およびＬ３）中の選択された各アミノ酸残基の変異法を提供することが意図される。アミノ酸残基を、好ましい選択的変異誘発位置、接触位置、または過剰変異位置から選択することができる。軽鎖および重鎖可変部中の位置に基づいて各アミノ酸を選択する。過剰変異位置はまたは接触位置であり得ることが理解されるべきである。用語「目標アプローチ」は、好ましくは目標方式（例えば、「群様式目標アプローチ」または「ＣＤＲ様式目標アプローチ」）における抗体の重鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３（以下それぞれＨ１、Ｈ２、およびＨ３）または軽鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３（以下それぞれＬ１、Ｌ２、およびＬ３）中の選択された各アミノ酸残基の変異法を含むことが意図される。「群様式の目標アプローチ」では、特定の群（群Ｉ（Ｌ３およびＨ２を含む）、群ＩＩ（Ｈ２およびＬ１を含む）、および群ＩＩＩ（Ｌ２およびＨ１を含む）（群は目標として好ましい順に列挙している）を含む）の各アミノ酸残基を、選択的変異誘発用に目標化する。「ＣＤＲ様式目標アプローチ」では、特定のＣＤＲ中の各アミノ酸残基を、選択的変異用にＨ３、Ｌ３、Ｈ２、Ｌ１、Ｈ１、およびＬ２（目標として好ましい順に列挙）で目標化する。選択されたアミノ酸残基を、例えば少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、抗体活性に対する変異の効果を同定する。活性を、抗体の結合特異性／親和性および／または抗体の中和能力の変化として測定する。選択的変異誘発アプローチを、任意の供給源（ファージディスプレイ、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を用いたトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体を含む）由来の任意の抗体の最適化に使用することができることが理解されるべきである。好ましくは、選択的変異誘発アプローチを、ファージディスプレイ技術をさらに用いて最適化することができない抗体について使用することが理解されるべきである。ファージディスプレイ、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を用いたトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体を含む任意の供給源由来の抗体を、選択的変異誘発アプローチの前または後の復帰特全変異に供することができる。
【０１０３】
用語「活性を向上させるアミノ酸残基」には、抗体の活性を改良するアミノ酸残基が含まれる。活性を向上させるアミノ酸残基を、好ましい選択的変異誘発位置、接触位置、または過剰変異位置においてアミノ酸残基と置換することができ、さらに、１つを超える活性を向上させるアミノ酸残基は１つまたは複数のＣＤＲ内に存在し得ることが理解されるべきである。活性を向上させるアミノ酸残基には、抗体（例えば、ヒトＩＬ−１２に結合する抗ヒトＩＬ−１２抗体）の結合特異性／親和性を向上させるアミノ酸残基が含まれる。活性を向上させるアミノ酸残基はまた、抗体（例えば、ヒトＩＬ−１２を阻害するヒトＩＬ−１２抗体）の中和能力を改良するアミノ酸残基を含むことが意図される。
【０１０４】
本発明の種々の態様を、以下の節でさらに詳細に説明する。
【０１０５】
Ｉ．ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体
本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合するヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、本発明のヒト抗体は、組換え中和ヒト抗ｈＩＬ−１２抗体である。ヒトＩＬ−１２に結合する本発明の抗体を、例えば、ｈＩＬ−１２を用いた１つまたは複数のＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（実施例１に記載のファージディスプレイ技術など）によって選択することができる。ヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、一連の抗ＩＬ−１２抗体をまず同定し、本明細書中で「Ｊｏｅ  ９」（「Ｊｏｅ  ９野生型」）という抗体をさらなる展開のために選択した。Ｊｏｅ  ９は、比較的低親和性のヒトＩＬ−１２抗体（例えば、約０．１秒−１のＫｏｆｆ）であるが、ｈＩＬ−１２の特異的結合および検出に有用である。Ｊｏｅ  ９抗体の親和性を、重鎖および軽鎖ＣＤＲの変異誘発の誘導、「混合および適合」ならびにさらに変異させた軽鎖および重鎖可変部パネルの作製によって改良し、ｈＩＬ−１２の親和性が増加した多数のさらなる抗ｈＩＬ−１２抗体を誘導した（実施例１、表２（添付物Ａを参照のこと）、および図１Ａ〜図Ｄの配列アラインメントを参照のこと）。
【０１０６】
これらの抗体のうち、本明細書中でＹ６１というヒト抗ｈＩＬ−１２抗体は、有意な結合親和性の改良を示した（例えば、約２×１０−４ｓｅｃ−１のＫｏｆｆ）。Ｙ６１抗ｈＩＬ−１２抗体を、重鎖および軽鎖ＣＤＲ内の特異的アミノ酸残基のそれぞれの変異によってさらなる親和性成熟について選択した。Ｙ６１のアミノ酸残基を、好ましい選択的変異誘発位置、接触および／または過剰変異位置を占めるアミノ酸残基に基づいた部位特異的変異（選択的変異誘発アプローチ）について選択した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ中の選択した位置での置換のまとめを、図２Ａ〜図２Ｈに示す。Ｙ６１の軽鎖ＣＤＲ２の第５０位でのＧｌｙからＴｙｒへの置換およびＹ６１の軽鎖ＣＤＲ３の第９４位でのＧｌｙからＴｙｒへの置換により、本発明の好ましい組換え中和抗体（本明細書中でＪ６９５という）を得た。
【０１０７】
Ｊｏｅ  ９野生型からＪ６９５までの系列における本発明の抗ＩＬ−１２抗体パネルの重鎖および軽鎖可変部のアミノ酸配列アラインメントを、図１Ａ〜図１Ｄに示す。これらの配列アラインメントにより、Ｊｏｅ  ９野生型からＪ６９５までの系列におけるｈＩＬ−１２に結合する本発明の抗体の好ましい重鎖および軽鎖可変部のコンセンサス配列ならびにＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１のコンセンサス配列の同定が可能となった。さらに、図２Ａ〜図２ＨにまとめたＹ６１変異誘発分析により、良好なｈＩＬ−１２結合特性を未だ保持するＹ６１由来の修飾を有する配列を含むＹ６１からＪ６９５までの系列におけるｈＩＬ−１２に結合する重鎖および軽鎖可変領域のコンセンサス配列ならびにｈＩＬ−１２に結合するＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１のコンセンサス配列の同定が可能となった。添付の配列表における配列決定によって同定された本発明の好ましいＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＬ配列（コンセンサス配列を含む）を、以下にまとめる。
【０１０８】
【表１】
2014138594.tif 000002
2014138594.tif 000003
2014138594.tif 000004
【０１０９】
ＫｄおよびＫｏｆｆ速度を測定するために、Ｊｏｅ  ９の親和性成熟から作製した抗体を、表面プラスモン共鳴分析によって機能的に特徴づけた。約０．１ｓ−１〜約１０−５ｓ−１の範囲内のＫｏｆｆ、より好ましくは１×１０−４ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する一連の抗体を作製した。実施例３に記載のように、抗体を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽細胞増殖の阻害能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴づけた。約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１１Ｍの範囲内、より好ましくは約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０を有する一連の抗体を作製した。
【０１１０】
したがって、１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましい実施形態では、表面プラスモン共鳴で測定したところ１×１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。より好ましい実施形態では、表面プラスモン共鳴で測定したところ１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。より好ましい実施形態では、表面プラスモン共鳴で測定したところ１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。さらにより好ましい実施形態では、表面プラスモン共鳴で測定したところ１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。さらにより好ましい実施形態では、表面プラスモン共鳴で測定したところ１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害する、請求項９に記載の単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【０１１１】
ＩＬ−１２抗体の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を、表面プラスモン共鳴によって同定することができる（実施例５を参照のこと）。全般に、表面プラスモン共鳴分析によって、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によるリガンド（バイオセンサーマトリックス上に固定された組換えヒトＩＬ−１２抗体）と分析物（溶液中の抗体）との間の実時間での結合相互作用を測定する。表面プラスモン分析を、分析物（バイオセンサーマトリックス上の抗体）の固定およびリガンド（溶液中の組換えＩＬ−１２）の提示によっても行うことができる。ＩＬ−１２抗体またはその抗原結合部分の中和活性を、いくつかの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの１つまたは複数を用いて評価することができる（実施例３）。
【０１１２】
抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲは、抗体の抗原との結合特異性／親和性に重要な役割を果たすことが当該分野で周知である。したがって、本発明は、Ｊｏｅ  ９の軽鎖および重鎖ＣＤＲを有するヒト抗体ならびに抗体の結合特異性／親和性を改良するように修飾されているＣＤＲを有する他の抗体を含む。実施例１に示すように、軽鎖および重鎖ＣＤＲに対する一連の修飾により、ヒト抗ｈＩＬ−１２抗体が親和性成熟される。ヒトＩＬ−１２に結合するＪｏｅ  ９野生型からＪ６９５までの範囲の一連のヒト抗体の重鎖および軽鎖可変部アミノ酸配列アラインメントを、図１Ａ〜図１Ｄに示す。抗体のＣＤＲについてのコンセンサス配列モチーフを、配列アラインメント（上記の表にまとめたように）から同定することができる。例えば、Ｊｏｅ  ９からＪ６９５までの系列のＶＨ  ＣＤＲ３についてのコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列（Ｈ／Ｓ）−Ｇ−Ｓ−（Ｈ／Ｙ）−Ｄ−（Ｎ／Ｔ／Ｙ）（配列番号１）（配列番号７に示したコンセンサスＨＣＶＲの９５位〜１０２位の位置のアミノ酸を含む）を含む。ＶＬ  ＣＤＲ３についてのコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列Ｑ−（Ｓ／Ｔ）−Ｙ−（Ｄ／Ｅ）−（Ｓ／Ｒ／Ｋ）−（Ｓ／Ｇ／Ｙ）−（Ｌ／Ｆ／Ｔ／Ｓ）−（Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｈ）−（Ｇ／Ｐ）−（Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｌ）−（Ｒ／Ｓ／Ｍ／Ｔ／Ｌ−Ｖ／Ｉ／Ｔ／Ｍ／Ｌ）（配列番号２）（配列番号８に示したコンセンサスＬＣＶＲの８９位〜９７位の位置のアミノ酸を含む）を含む。
【０１１３】
したがって、別の態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１４】
好ましい実施形態では、抗体は、アミノ酸配列Ｆ−Ｉ−Ｒ−Ｙ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号３）（配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲの５０位〜６５位の位置のアミノ酸を含む）をさらに含み、アミノ酸配列（Ｇ／Ｙ）−Ｎ−（Ｄ／Ｓ）−（Ｑ／Ｎ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号４）（配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの５０位〜６５位の位置のアミノ酸を含む）をさらに含む。
【０１１５】
別の好ましい実施形態では、抗体は、アミノ酸配列Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−（Ｓ／Ｅ）−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｈ（配列番号５）（配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲの２７位〜３５位の位置のアミノ酸を含む）をさらに含み、アミノ酸配列（Ｓ／Ｔ）−Ｇ−（Ｇ／Ｓ）−（ｒ／Ｓ）−Ｓ−Ｎ−Ｉ−（Ｇ／Ｖ）−（Ｓ／Ａ）−（Ｎ／Ｇ／Ｙ）−（Ｔ／Ｄ）−Ｖ−（Ｋ／Ｈ）（配列番号６）（配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの２４位〜３４位の位置のアミノ酸を含む）をさらに含む。
【０１１６】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
【０１１７】
さらなるコンセンサスモチーフを、Ｊ６９５抗体を誘導するＹ６１について行った変異分析に基づいて同定することができる（図２Ａ〜図２Ｈにまとめる）。図２Ａ〜図２Ｈに示したグラフによって示されたように、Ｙ６１の重鎖および軽鎖ＣＤＲの一定の残基は、抗体のｈＩＬ−１２の結合特性を有意に減少させること無く置換を行うことができた。例えば、２０個の異なるアミノ酸残基でのＣＤＲ  Ｈ１中の第３０位での各置換により、抗体のＫｏｆｆ速度は有意に減少せず、これは、この位置で種々の異なるアミノ酸残基を置換することができることを示す。したがって、変異分析（すなわち、他のアミノ酸残基での置換が可能なＹ６１内の位置）に基づいて、コンセンサスモチーフを同定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３のコンセンサスモチーフをそれぞれ配列番号９および１０に示し、重鎖および軽鎖ＣＤＲ２のコンセンサスモチーフをそれぞれ配列番号１１および１２に示し、重鎖および軽鎖ＣＤＲ１のコンセンサスモチーフをそれぞれ配列番号１３および１４に示す。ＶＨおよびＶＬ領域のコンセンサスモチーフを、それぞれ配列番号１５および１６に示す。
【０１１８】
したがって、１つの態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１１９】
好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２をさらに含む。
【０１２０】
別の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＨ  ＣＤＲ１をさらに含む。
【０１２１】
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
【０１２２】
本発明の好ましい抗体であるヒト抗ｈＩＬ−１２抗体Ｙ６１を、ＣＤＲ３のＰＣＲ変異誘発によってＪｏｅ  ９野生型の親和性成熟によって作製した（実施例１に記載）。Ｙ６１は、表面プラスモン共鳴およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイで同定された改良特異性／結合親和性を有していた。Ｙ６１の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１７および１８に示し、Ｙ６１の重鎖および軽鎖ＣＤＲ２をそれぞれ配列番号１９および２０に示し、Ｙ６１の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号２１および２２に示す。Ｙ６１のＶＨは配列番号２３のアミノ酸配列を有し、Ｙ６１のＬＨは配列番号２４のアミノ酸配列を有する（これらの配列はまた、Ｊｏｅ  ９と整列させて図１Ａ〜図１Ｄに示されている）。
【０１２３】
したがって、別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１２４】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２をさらに有する。
【０１２５】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１をさらに有する。
【０１２６】
さらに別の好ましい実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【０１２７】
ある実施形態では、全長抗体は、重鎖定常部（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部など）およびＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２）に記載の任意のアロタイプ変異体を含む。好ましくは、抗体重鎖定常部は、ＩｇＧ１重鎖定常部である。あるいは、抗体の一部は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントであり得る。
【０１２８】
抗体パネルを作製するためのＹ６１の各残基の修飾を、図２Ａ〜図２Ｈに示す。各抗体の特異性／結合親和性を、表面プラスモン共鳴および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイによって同定した。
【０１２９】
したがって、別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害するか、
ｂ）配列番号４０４〜配列番号４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有するか、
ｃ）配列番号５３４〜配列番号５７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１３０】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３３５〜配列番号４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２または配列番号５０６〜配列番号５３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。
【０１３１】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２８８〜配列番号３３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１または配列番号４７０〜配列番号５０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。
【０１３２】
さらに別の好ましい実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む単離ヒト抗体またはその抗原結合部分。
【０１３３】
ある実施形態では、重鎖定常部（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部など）およびＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２）に記載の任意のアロタイプの変異体を含む全長抗体。好ましくは、抗体重鎖定常部は、ＩｇＧ１重鎖定常部である。あるいは、抗体の一部は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントであり得る。
【０１３４】
本発明の特に好ましい組換えられた中和抗体であるＪ６９５を、抗体Ｙ６１の接触および過剰変異アミノ酸残基の部位特異的変異誘発によって作製した（実施例２におよび以下の第ＩＩ節に記載）。Ｊ６９５は、軽鎖ＣＤＲ２の第５０位でのＧｌｙからＴｙｒへの置換および軽鎖ＣＤＲ３の第９４位でのＧｌｙからＴｙｒへの置換という点でＹ６１と異なる。Ｊ６９５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号２５および２６に示し、Ｊ６９５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ２をそれぞれ配列番号２７および２８に示し、Ｊ６９５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号２９および３０に示す。Ｊ６９５のＶＨは配列番号３１のアミノ酸配列を有し、Ｊ６９５のＬＨは配列番号３２のアミノ酸配列を有する（これらの配列はまた、Ｊｏｅ  ９と整列させて図１Ａ〜図１Ｄに示されている）。
【０１３５】
したがって、別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１３６】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。
【０１３８】
さらに別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変部および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有する。
【０１３９】
ある実施形態では、全長抗体は、重鎖定常部（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常部など）およびＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、１９９１、「免疫学上目的のタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ発行番号９１−３２４２）に記載の任意のアロタイプの変異体を含む。好ましくは、抗体重鎖定常部は、ＩｇＧ１重鎖定常部である。あるいは、抗体の一部は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または短鎖Ｆｖフラグメントであり得る。
【０１４０】
本発明のさらなる抗ＩＬ−１２抗体を得るために、Ｊｏｅ  ９からＪ６９５までの系列またはＹ６１からＪ６９５までの系列由来の抗体のＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１の好ましいコンセンサス配列におけるさらなる変異を作製することができる。このような修飾法を、標準的な分子生物学技術（ＰＣＲ変異誘発、軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ中の各接触または過剰変異アミノ酸残基の目標化、その後の本明細書中に記載の修飾抗体の速度および機能的分析（例えば、実施例３に記載の中和アッセイおよび実施例５に記載のＢＩＡコア分析）など）を用いて行うことができる。
【０１４１】
したがって、別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１４３】
当業者はまた、本発明の抗体（例えば、Ｙ６１またはＪ６９５）のＣＤＲ領域に対するさらなる変異を作製して本発明のさらなる抗ＩＬ−１２を得ることができることを認識する。このような変異法を、上記の標準的な分子生物学的技術を使用して行うことができる。修飾抗体の機能的および速度分析を、それぞれ実施例３および実施例５に記載のように行うことができる。Ｊ６９５を同定するＹ６１の各残基の修飾を、図２Ａ〜図２Ｈに示し、実施例２で説明する。
【０１４４】
したがって、別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ４、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１４５】
別の態様では、本発明は、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＨＡアッセイにおいて１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有し、
ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、または好ましい選択的変異誘発位置または過剰変異位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、前記変異体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体より１０倍以下高いｋｏｆｆ速度を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２ならびにヒヒＩＬ−１２、マーモセットＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２、およびアカゲザルＩＬ−１２からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するがマウスＩＬ−１２の活性を中和しない、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１４７】
ＩＩ．組換えヒト抗体の選択
本発明の組換えヒト抗体を、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製した組換え組み合わせ抗体ライブラリー（好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー）のスクリーニングによって単離することができる。このようなライブラリーの調製法およびスクリーニング法は、当業者に既知である。市販のファージディスプレイライブラリー作製用キット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに特に利用することができる方法および試薬の例は、例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／１８６１９；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／２０７９１；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、１３７０〜１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３、８１〜８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１２７５〜１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０、３４８、５５２〜５５４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２、７２５〜７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６、８８９〜８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、ＰＮＡＳ、８９、３５７６〜３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、１３７３〜１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９、４１３３〜４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、ＰＮＡＳ、８８、７９７８〜７９８２に見出すことができる。
【０１４８】
本方法で使用した抗体ライブラリーは、ヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡから調製したｓｃＦｖライブラリーであることが好ましい。ＩＬ−１２に対する結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択するために、抗原として組換えヒトＩＬ−１２を用いてｓｃＦｖ抗体ライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットまたはｐ７０へテロ二量体に特異的な抗体を選択するために、過剰な遊離ｐ４０サブユニットの存在下でスクリーニングアッセイを行った。実施例１に記載のように、サブユニットの優先度を、例えばミクロフリケット滴定によって同定することができる。
【０１４９】
一旦最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントが選択されると、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択するために「混合および適合」実験を行い、ＩＬ−１２結合について選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対をスクリーニングする。さらに、ｈＩＬ−１２結合の親和性および／または低い解離速度定数をさらに改良するために、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、天然の免疫応答中の抗体の親和性成熟を担うｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異プロセスに類似のプロセスで無作為に（好ましくは、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で）変異することができる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟を、それぞれＶＨ  ＣＤＲ３またはＶＬ  ＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマー（このプライマーは、得られるＰＣＲ産物がＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ３領域に無作為変異が導入されているＶＨおよびＶＬセグメントをコードするように一定の位置で４個のヌクレオチド塩基の無作為な混合物で「スパイク」されている）を用いたＶＨおよびＶＬ領域の増幅によって行うことができる。これらの無作為に変異させたＶＨおよびＶＬセグメントを、ｈＩＬ−１２への結合について再選択および再スクリーニングすることができ、ＩＬ−１２結合について高い親和性および低い分離速度を示す配列を選択することができる。表２（添付物Ａを参照のこと）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟の結果として結合特異性／親和性の変化を示す抗体を示す。
【０１５０】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの本発明の抗ｈＩＬ−１２抗体の選択、単離、およびスクリーニング後、選択された抗体をコードする核酸を、ファージ粒子から（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローン化する。所望ならば、本発明の他の抗体形態を作製するために、核酸をさらに操作することができる（さらなる定常部などのさらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸に結合する核酸）。組換えライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクターにクローン化して、哺乳動物宿主細胞に導入する（以下の第ＩＶ節にさらに詳述）。
【０１５１】
ファージディスプレイ技術およびＣＤＲ領域の無作為または部位特異的変異誘発によって選択された抗体の親和性成熟によるヒトＩＬ−１２結合抗体の選択法を、実施例１にさらに詳述する。
【０１５２】
実施例１に記載のように、ヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、一連の抗ＩＬ−１２抗体を同定し、Ｊｏｅ  ９抗体をさらなる展開のために選択した。Ｊｏｅ  ９の重鎖可変領域とＶＢＡＳＥデータベース由来の重鎖生殖系列配列との比較により、Ｊｏｅ  ９がＣＯＳ−３生殖系列配列と類似することが明らかとなった。ＣＯＳ−３は、生殖系列配列のＶＨ３ファミリーに属する。
【０１５３】
ＶＨ３ファミリーは、ヌクレオチド配列相同性に基づいてＶＨ１〜ＶＨ７の７つのファミリーに分類されるヒトＶＨ生殖系列レパートリーの一部である（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７、７７６〜７９８およびＣｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１６、２３７〜２４２）。ＶＨ３ファミリーは、最も多数のメンバーを含み、生殖系列レパートリーに最も寄与する。任意の所与のヒトＶＨ３生殖系列抗体配列について、ＶＨ３ファミリー内のアミノ酸配列同一性は高い（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７、７７６〜７９８およびＣｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１６、２３７〜２４２を参照のこと）。ＶＨ３ファミリーの任意の２つの生殖系列ＶＨ配列間のアミノ酸同一性範囲は、約１００個のＶＨ残基中６９〜９８個の残基で変化する（すなわち、任意の２つの生殖系列ＶＨ配列間で６９〜９８％のアミノ酸配列相同性）。ほとんどの生殖系列配列について、少なくとも８０個以上の同一のアミノ酸残基が存在する（すなわち、少なくとも８０％のアミノ酸配列相補性）。ＶＨ３ファミリーメンバー間の高い程度のアミノ酸配列相同性によって、ＶＨ鎖のＣＤＲおよびフレームワーク領域中の重要な部位に存在する一定のアミノ酸残基が存在する。これらのアミノ酸残基は、ＣＤＲに構造的特徴を付与する。
【０１５４】
抗体構造の研究により、ＣＤＲの高次構造を、ＣＤＲおよびフレームワーク領域中の一定の位置を占める重要なアミノ酸残基に基づいて、標準ＣＤＲ構造のファミリーに分類することができることが示されている。したがって、同一の重要なアミノ酸残基を有する標準構造を有する異なる抗体中の類似の局所的ＣＤＲ高次構造が存在する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、９０１〜９１７およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７〜８８３）。ＶＨ３ファミリー内に、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２標準構造について重要な部位にアミノ酸残基の同一性が保存されている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、２２７、７９９〜８１７）。
【０１５５】
ＣＯＳ−３生殖系列ＶＨ遺伝子は、ＶＨ３ファミリーメンバーであり、３〜３０（ＤＰ−４９）生殖系列ＶＨ対立遺伝子の変異体である。ＣＯＳ−３は、Ｊｏｅ  ９  ＶＨアミノ酸配列と５つの位置のみで異なる。Ｊｏｅ９ＶＨとＣＯＳ−３との間およびＪｏｅ９  ＶＨと他のＶＨ３ファミリーメンバーとの間の高度なアミノ酸配列相同性はまた、高度なＣＤＲ構造の相同性を付与する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、９０１〜９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、９０１〜９１７；およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７〜８８３）。
【０１５６】
当業者は、Ｊｏｅ  ９とのアミノ酸配列および標準構造の高い類似性に基づいて、他のＶＨ３ファミリーメンバーを使用してヒトＩＬ−１２に結合する抗体を作製することができることを認識する。これを、例えば、鎖シャフリング技術による適切なＶＬの選択（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、４３３〜５５）または本発明の抗体由来のＣＤＲを含む齧歯類または他のヒト抗体由来のＣＤＲのＶＨ３ファミリーフレームワークへの移植によって行うことができる。
【０１５７】
ヒトＶλ生殖系列レパートリーは、ヌクレオチド配列相同性に基づいて１０ファミリーに分類される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４、２２０〜２３２）。Ｊｏｅ  ９の軽鎖可変領域とＶＢＡＳＥデータベースから選択された軽鎖生殖系列配列との比較によって、Ｊｏｅ  ９はＤＰＬ８λ生殖系列に類似することが明らかとなった。Ｊｏｅ９  ＶＬは、ＤＰＬ８配列とフレームワーク位置のみが異なり、他のＶλ１ファミリーメンバーのフレームワーク配列と相同性が高い。Ｊｏｅ  ９とのアミノ酸配列および標準構造の高い類似性に基づいて、他のＶλ１ファミリーメンバーを使用してヒトＩＬ−１２に結合する抗体を作製することができる。これを、例えば、鎖シャフリング技術による適切なＶＬの選択（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前出）または本発明の抗体由来のＣＤＲを含む齧歯類または他のヒト抗体由来のＣＤＲのＶλ１ファミリーフレームワークへの移植によって行うことができる。
【０１５８】
本発明の方法は、生殖系列配列のＶＨ３ファミリーメンバー由来の重鎖可変部および生殖系列配列のＶλ１ファミリーメンバー由来の軽鎖可変部を含むことが意図される。さらに、当業者は、任意のＶＨ３ファミリー重鎖配列メンバーを任意のＶλ１ファミリー軽鎖配列と組み合わせることができることを認識する。
【０１５９】
当業者はまた、生殖系列のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多形が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを認識する。このような生殖系列配列中の遺伝的多形性は、天然の対立遺伝子の変異によって、集団内の個体間に存在し得る。このような天然の対立遺伝子の変異により、典型的には、遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％が変異し得る。天然の対立遺伝子変異の結果である任意のおよび全てのこのようなヌクレオチド変異および得られた生殖系列配列中のアミノ酸多形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１６０】
したがって、１つの態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ０．１ｓ−１のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は接触または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１６１】
好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ３中に変異を有する。
【０１６２】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ３中に変異を有する。
【０１６３】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ２中に変異を有する。
【０１６４】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ２中に変異を有する。
【０１６５】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、重鎖ＣＤＲ１中に変異を有する。
【０１６６】
別の好ましい実施形態では、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分は、軽鎖ＣＤＲ１中に変異を有する。
【０１６７】
当業者は、ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー間および軽鎖Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバー間の高いアミノ酸配列の類似性に基づいて、生殖系列配列の変異によりヒトＩＬ−１２に結合するさらなる抗体を得ることができることを認識する。表１（添付物Ａを参照のこと）は、ＶＨ３ファミリーメンバーの生殖系列配列を示し、ファミリーメンバー内に有意な配列相同性を示す。表１はまた、Ｖλ１ファミリーメンバーの生殖系列配列を示す。比較のために、Ｊｏｅ  ９の重鎖および軽鎖配列を示す（例えばＪｏｅ  ９における変異）。生殖系列配列のＶＨ３またはＶλ１ファミリーメンバーへの変異を、例えば、本発明の抗体中で作製した同一のアミノ酸位置で作製することができる。このような修飾法を、標準的な分子生物学技術（ＰＣＲ変異誘発、軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ中の各接触または過剰変異アミノ酸残基の標的化、その後の本明細書中に記載の修飾抗体の速度および機能的分析（例えば、実施例３に記載の中和アッセイおよび実施例５に記載のＢＩＡコア分析）など）を用いて行うことができる。
【０１６８】
したがって、１つの態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）配列番号５９５〜６６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
ｂ）配列番号６６９〜６７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１６９】
当業者は、Ｊｏｅ  ９とＣＯＳ−３重鎖生殖系列配列との間およびＪｏｅ  ９とＤＰＬ８λ生殖系列配列との間の高いアミノ酸配列の類似性に基づいて、これらの生殖系列配列のＣＤＲ領域への変異によりヒトＩＬ−１２に結合するさらなる抗体を得ることができることを認識する。このような修飾法を、上記の標準的な分子生物学技術を用いて行うことができる。
【０１７０】
したがって、１つの態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＣＯＳ−３生殖系列アミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
ｃ）ＤＰＬ８生殖系列アミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１７１】
軽鎖および重鎖可変領域中のＣＤＲおよびフレームワーク領域中に重要な部位を示す一定のアミノ酸残基により、これらの領域に構造的特徴が付与される。特に、ＣＤＲ２およびＣＤＲ１領域を、標準構造分類に供する。ファミリーメンバー間のアミノ酸配列の相同性が高いので、これらの標準構造の特徴は、ファミリーメンバー間に存在する。当業者は、これらの標準構造を付与するアミノ酸残基での修飾により、ＩＬ−１２に結合するさらなる抗体が得られることを認識する。上記の標準的な分子生物学的技術を用いて修飾を行うことができる。
【０１７２】
したがって、１つの態様では、本発明は、以下の特徴：
ａ）ヒトＩＬ−１２に結合し、表面プラスモン共鳴で測定したところ０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１２から解離するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏフィトヘマグルチニン芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡアッセイ）において１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０でフィトヘマグルチニン芽細胞増殖を阻害し、
ｂ）ＶＨ３生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変部を有し、前記重鎖可変部は他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶＨ３生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記重鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有し、
ｃ）Ｖλ１生殖系列ファミリーメンバーから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を有し、前記軽鎖可変部は他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ２に構造的に類似したＣＤＲ２および他のＶλ１生殖系列ファミリーメンバー由来のＣＤＲ１に構造的に類似したＣＤＲ１を含み、前記軽鎖可変部は好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過剰変異位置での活性を向上させるアミノ酸残基との変異を有する、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【０１７３】
本発明の組換えヒト抗体は、ＶＢＡＳＥデータベースから選択されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列である可変部および定常部を有する。組換えヒト抗体への変異（例えば、無作為変異誘発またはＰＣＲ変異誘発による）により、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸が得られる。また、ヒトドナー由来の組換え抗体ライブラリーは、Ｂ細胞の発達の間に起こる体細胞変異の正常な工程による対応する生殖系列配列と異なる抗体配列を含む。ＰＣＲ増幅によって得られた「生殖系列」配列が真の生殖配列構成由来のフレームワーク領域中の異なるアミノ酸（すなわち、真の生殖系列配列と比較して異なる増幅配列）をコードする場合、これらのアミノ酸の相違を真の生殖系列配列に戻すように変化させる（すなわち、フレームワーク残基の生殖系列構成への「復帰突然変異」）ことが望ましいことに留意すべきである。したがって、本発明は、任意選択的に復帰突然変異工程を含み得る。これを行うために、最初に生殖系列によってコードされる軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（例として、ＶＢＡＳＥデータベースに見出される）を、変異した免疫グロブリン重鎖および軽鎖フレームワークアミノ酸配列と比較して、最も密接な生殖系列配列と異なる変異免疫グロブリンフレームワーク配列中のアミノ酸残基を同定する。次いで、どのヌクレオチドを変化させるべきであるかどうかを決定するために、変異免疫グロブリン配列の適切なヌクレオチドを、遺伝コードを用いて生殖系列配列に対応するように復帰変異させる。変異免疫グロブリンフレームワーク配列の変異誘発を、標準的な方法（ＰＣＲ媒介変異誘発（ＰＣＲ産物が変異を含むように変異ヌクレオチドをＰＣＲプライマーに組み込む）または部位特異的変異誘発など）によって行う。復帰突然変異の候補として同定された各アミノ酸の役割を抗原結合における直接的または間接的役割について調査すべきであり、ヒト抗体の任意の所望の特徴に影響を与える変異後に見出されるいかなるアミノ酸も最終ヒト抗体に含まれるべきではない（例として、選択的変異誘発アプローチによって同定された活性を向上させるアミノ酸を復帰突然変異に供さない）。変異誘発に起因する抗体の特徴の同定アッセイには、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ、および／または種々の供給源（ヒト、霊長類、および／または他の種を含む）由来の組織片を用いた免疫組織化学（例えば、実施例３を参照のこと）を含み得る。
【０１７４】
復帰突然変異に供されるアミノ酸数を最小化するために、第２の生殖系列配列が本発明のヒト抗体配列の少なくとも１０個、好ましくは２０個のアミノ酸と問題の両アミノ酸部位で同一であり、かつ共直線性である場合、最も密接な生殖系列配列と異なるが第２の生殖系列配列中の対応するアミノ酸に同一であると認められたアミノ酸位置を存続させ得る。これにより、本発明のヒト抗体で治療された対象中の専門的抗原提示細胞により免疫系に提示された任意のエピトープは外来でなく、自己抗原（すなわち、第２の生殖系列配列によってコードされる免疫グロブリン）とは同一であることを確実にするであろう。復帰突然変異は、抗体最適化の任意の段階で起こり得る。好ましくは、復帰突然変異は、選択的変異誘発アプローチの直前または直後に起こる。より好ましくは、復帰突然変異は、選択的変異誘発アプローチの直前に起こる。
【０１７５】
ＩＩＩ．好ましい選択的変異誘発位置、接触位置および／または過変異位置に対する修飾
典型的には、親和性が改善された抗体の選択は、上記の第ＩＩ節に記載されているようにファージディスプレー法を使用して行うことができる。これは、ＣＤＲ残基の組合せをランダムに変異させて、異なる配列の抗体を含む大きなライブラリーを作製することによって達成することができる。しかし、これらの選択法が機能するためには、抗体抗原反応が、より大きな親和性を有する抗体の抗原に対する優先的な結合が、時間経過にわたって可能にする平衡になるようにならなければならない。平衡を達成させるための選択条件は、ファージディスプレー法が、達成された特定の親和性レベル（すなわち、抗体Ｙ６１の親和性レベル）を得る際に、選択された抗ＩＬ−１２抗体の親和性を改善するために使用された場合、（おそらくは、抗原とファージ粒子との間でのさらなる非特異的な相互作用のために）決定することができない。従って、さらにより大きな親和性を有する抗体は、ファージディスプレー法によって選択することができない。このため、少なくともある種の抗体または抗原の場合、ファージディスプレー法は、大きく改善された結合特異性／親和性を有する抗体を選択するその能力に限界がある。従って、抗体のファージディスプレー親和性成熟化を必要としない選択的変異誘発法と名付けられた方法が、このような限界を克服するために確立されており、本発明により提供される。この選択的変異誘発法は、ファージディスプレーシステムを使用する限界を克服するために開発されたが、この方法はまたファージディスプレーシステムとともに使用できることに留意しなければならない。さらに、選択的変異誘発法は、任意の抗体の活性を改善するために使用することができる。
【０１７６】
抗体の活性（例えば、親和性または中和活性）を改善するために、理想的には、重鎖および軽鎖の両方におけるすべてのＣＤＲ位置をすべての他の可能なアミノ酸残基に変異させることが考えられる。しかし、平均して７０個のＣＤＲ位置が抗体内に存在するために、そのような方法は、非常に時間がかかり、かつ手間のかかるものである。従って、本発明の方法は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲにおいて特定の選択された残基のみを変異させることによって抗体の活性を改善することができる。さらに、本発明の方法は、抗体の他の望ましい性質に影響を及ぼすことなく抗体の活性を改善することができる。
【０１７７】
抗体可変領域のどのアミノ酸残基が抗原と接触しているかを決定することは、一次配列または可変領域内のその位置に基づいて正確に予測することができない。それにもかかわらず、種々の特異性を有する抗体に由来する配列のＫａｂａｔらによって行われた配列比較により、様々なＣＤＲが、抗体間で著しく異なる可変領域内の局所領域として同定された（Ｋａｂａｔら（１９７１）、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２〜３９３；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）。構造的研究により、抗原結合表面が、ＣＤＲに存在にするアミノ酸残基によって形成されることが明らかにされている。ＣＤＲの外側に位置する他のアミノ酸残基もまた、構造的役割を果たしていること、または抗原結合に直接関わっていることが知られている。従って、それぞれの抗原−抗体ペアについて、ＣＤＲ内またはＣＤＲ外に存在するアミノ酸残基が重要であり得る。
【０１７８】
Ｔｏｍｌｉｓｏｎらによる配列比較研究により、体細胞変異の頻発部位である多数の位置が、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、そしてκ鎖ＣＤＲ３の一部において同定された（Ｔｏｍｌｉｓｏｎら（１９９６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：８１３〜８１７）。特に、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３３、Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３１Ａ、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３およびＬ９４の位置が体細胞変異の頻発部位として同定された。しかし、この分析は、重要な重鎖のＣＤＲ３領域、および抗体結合部位の中心に位置することが知られ、そして抗原との重要な相互作用を潜在的にもたらす軽鎖ＣＤＲ３の選択が含まれていない。さらに、Ｔｏｍｌｉｓｏｎらは、体細胞の多様性のみから抗原結合における特定のアミノ酸の役割は必ずしも予測されないことを提案し、そして抗原と接触する保存されたアミノ酸残基、および抗原と接触しない種々のアミノ酸残基を示唆している。この結論は、抗体親和性に対する体細胞変異の役割に関する変異研究によってさらに裏付けられている（Ｓｈａｒｏｎ（１９９０）、ＰＮＡＳ、８７：４８１４〜７）。高親和性の抗ｐ−アゾフェニルアルソナート（Ａｒｓ）抗体における１９個の体細胞変異が、その対応する生殖細胞残基と同時に置換された。これにより、活性が２００分の１に低下した生殖細胞型の抗Ａｒｓ抗体が作製された。抗Ａｒｓ抗体の完全な親和性は、１９個の体細胞変異のうちの３つのみを元に戻すことによって回復させることができる。このことは、抗原結合活性に寄与していない多くの体細胞変異が可能であり得ることを示している。
【０１７９】
この結果は、抗体多様性自身の性質によって一部が説明され得る。未成熟なＢ細胞は、多数の自己抗原または非自己抗原を認識する低親和性の抗体を最初に産生し得る。さらに、抗体は、自己反応性を生じさせ得る配列変化を親和性成熟化の途中で受けることがある。そのような低親和性抗体の過変異は、自己反応性の破棄（「ネガティブ選択」）をもたらし、外来抗原に対する親和性を増大させるために役立ち得る。従って、非常に多数の抗体の一次構造データを分析することにより、（１）望ましくない抗原に対する親和性を低下させるプロセスに対する親和性成熟化プロセスにおける体細胞の過変異部位の役割、または（２）特定のアミノ酸が特異的な抗原−抗体ペアの性質にどのように寄与しているか、のいずれかを予測する方法は得られない。
【０１８０】
抗原認識における特定のアミノ酸残基の役割を明らかにする他の試みが、抗原抗体複合体の多数の結晶構造を分析することによって行われた（ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５）。ＣＤＲ内およびＣＤＲ外に存在する位置の潜在的な役割が示された。２６個の分析された構造のうち１０個を越える構造において抗原結合に関与するＣＤＲ内の位置は、重鎖内のＨ３１、Ｈ３３、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８およびＨ１００、ならびに軽鎖内のＬ３０Ａ、Ｌ３２、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６を含んでいた。しかし、著者らは、これらおよび他の構造データを使用する抗原接触部の予測は接触位置を過大または過少に予測し得ることを認めた。これにより、異なる方法が種々の抗原に対して適用され得なければならないという考えに至った。
【０１８１】
Ｐｉｎｉらは、抗体の親和性を迅速に増大させるために、大きなファージディスプレーライブラリーにおいて抗体ＣＤＲ配列内の多数の残基をランダム化することを記載している（Ｐｉｎｉら（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１７６９〜２１７７６）。しかし、Ｐｉｎｉらにより議論された高親和性抗体は、合計で８カ所の位置に変異を有していたが、どの変化が抗体の親和性を改善するために絶対的に必要とされるかに関する還元的分析は、必要とされる最小数のアミノ酸について試験しなければならない可能な組合せが非常に多いために実施可能になっていない。
【０１８２】
さらに、多数の残基をランダム化することにより、抗体の他の所望する性質は必ずしも維持され得ない。抗体の望ましい性質または特性は当分野では認識されており、これには、例えば、非交差反応性（例えば、他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性）の維持、およびヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に近い抗体配列の維持、中和能の改善が含まれる。他の望ましい性質または特性には、種間反応性を維持する能力、エピトープ特異性を維持する能力、および哺乳動物細胞におけるタンパク質の高発現レベルを維持する能力が挙げられる。これらの望ましい性質または特性は、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ（例えば、実施例３を参照のこと）、ヒト、霊長類または必要とされ得る場合には他の供給源を含む種々の供給源に由来する組織切片を用いた免疫組織化学、および一過性発現または安定発現を使用する哺乳動物細胞における発現に対する研究（これらに限定されない）を含む当分野で認識されている技術を使用して観測または測定することができる。
【０１８３】
さらに、Ｐｉｎｉらの方法は、親和性を改善するために実際に必要とされる最小数よりも多くの変化が導入されることがあり、そしてヒト対象における抗体誘発抗ヒト抗体（ＨＡＭＡ）形成をもたらし得る。
さらに、随所に議論されているように、本明細書中で明らかにされているファージディスプレー、またはリボソームディスプレーを含む他の関連する方法は、抗体と抗原との間におけるある種の親和性に達する際には適切に機能しないことがあり、そして平衡に達するために必要とされる条件は、他のファージ成分またはリボソーム成分と抗原との相互作用を含むさらなる相互作用のために合理的な時間枠で確立することができない。
【０１８４】
当業者は、上記に議論された参考の教示から、抗体多様性の起源に関する注目される科学的情報を少しずつ集めることができる。しかし、本発明は、特異的な抗原−抗体ペアの抗体親和性を、抗体の他の関連する特徴または望ましい特性を維持しながら増大させる方法を提供する。これは、抗原結合性を含む特定の抗体に関する多数の種々の特性が付与されるという望ましさを考慮する場合には特に重要である。
【０１８５】
出発抗体が、保持しなければならない望ましい性質または特性を有する場合、選択的変異誘発法は、抗体の活性を改善しながら、これらの望ましい性質を維持させるための最良の方法であり得る。例えば、Ｙ６１の変異誘発において、その目的は、ｈＩＬ−１２に対する親和性を増大させることであり、そして所望する性質を維持しながら抗体の中和能を改善することであった。Ｙ６１の所望される性質には下記が含まれる：（１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、（２）細かいエピトープ特異性の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０（ｐ４０／ｐ３５）ヘテロダイマーの状況下で認識し、それにより、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること；および（３）その個々の生殖系列の免疫グロブリン配列にできる限り近い重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体の生成。
【０１８６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、抗体の望ましい性質または特性を維持し、同時にその親和性および／または中和能を改善するための方法としての選択的変異誘発法を提供する。用語「選択的変異誘発法」は、上記に定義されている通りであり、選択されたアミノ酸残基を個々に変異させる方法を含む。変異させるアミノ酸残基は、好ましい選択的変異誘発位置から最初に選択され、次いで接触位置から選択され、次いで過変異位置から選択され得る。個々の選択された位置は少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させることができ、そして抗体の所望する性質と抗体活性における改善との両方に対する変異の影響が明らかにされる。
【０１８７】
この選択変異誘発法は下記の工程を含む：
候補位置を、１）好ましい選択的変異誘発位置；２）接触位置；３）過変異位置の順で選択して、その位置を抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域における位置の場所（ＣＤＲ１よりもＣＤＲ２が好ましく、ＣＤＲ２よりもＣＤＲ３が好ましい）に基づいて評価する工程；
活性増強アミノ酸残基を決定するために、候補の好ましい選択的変異誘発位置、過変異位置および／または接触位置を、評価した順にすべての可能な他のアミノ酸残基に個々に変異させ、そして抗体の活性について個々の変異の影響を分析する工程；
必要な場合には、個々の活性増強アミノ酸残基の段階的な組合せを行い、抗体の活性に対する様々な組合せの影響を分析する工程；活性増強アミノ酸残基を有する変異型抗体を選択して、その免疫原能に関してアミノ酸置換の存在位置および正体に基づいて変異型抗体を評価する工程。最も大きな評価付けが、生殖系列データベースに記載されている可変領域配列にほぼ一致するアミノ酸配列を含む変異型抗体、あるいは他のヒト抗体に匹敵し得るアミノ酸配列を有する変異型抗体に与えられる。低い評価付けが、生殖系列配列または他のヒト抗体の配列のいずれかにおいて稀にしか見出されないアミノ酸置換を含有する変異型抗体に与えられる。最も低い評価付けが、生殖系列配列または他のヒト抗体の配列において見出されないアミノ酸置換を有する変異型抗体に与えられる。上記に示されているように、ＣＤＲ３内に存在する活性増強アミノ酸残基を少なくとも１つ含む変異型抗体はＣＤＲ２よりも好ましく、ＣＤＲ２はＣＤＲ１よりも好ましい。重鎖可変領域のＣＤＲは、軽鎖可変領域のＣＤＲよりも好ましい。
【０１８８】
変異型抗体はまた、例えば、その対応する元の抗体と比較した場合、活性の改善について調べることができる。変異型抗体の活性の改善は、例えば、中和アッセイによって、あるいは表面プラズモン共鳴分析（実施例３を参照のこと）による結合特異性／親和性によって測定することができる。好ましくは、活性の改善は、元の抗体よりも少なくとも２倍〜２０倍大きくなり得る。活性の改善は、元の抗体よりも少なくとも「ｘ１」倍〜「ｘ２」倍大きくなり得るが、この場合、「ｘ１」および「ｘ２」は、２〜２０の間および２〜２０を含む整数であり、定められた範囲内の様々な範囲（例えば２〜１５、例えば５〜１０）を含む。
【０１８９】
活性増強アミノ酸残基を有する変異型抗体はまた、少なくとも１つの他の望ましい性質が変異後に保持されているかどうかを明らかにするために調べることができる。例えば、抗ｈＩＬ−１２抗体を用いて、（１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、（２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０（ｐ４０／ｐ３５）ヘテロダイマーの状況下で認識し、それにより、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること；および（３）その個々の生殖系列の免疫グロブリン配列にできる限り近い重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体の生成について、そして生殖系列配列との差の数に基づいて、どれがヒト免疫応答を引き出す可能性が最も低いかを決定するために調べられる。同じ観察を、望ましい性質または特性の保持が生じているかどうかを明らかにするために、２つ以上の活性増強アミノ酸残基、例えば、少なくとも２つまたは少なくとも３つの活性増強アミノ酸残基を有する抗体について行うことができる。
【０１９０】
Ｙ６１の変異誘発における「選択的変異誘発法」の使用例が下記に記載されている。Ｈ３１Ｓ→Ｅ、Ｌ５０→ＹまたはＬ９４Ｇ→Ｙのそれぞれの変異は、抗体の中和活性をそれぞれ改善した。しかし、混合クローンを調べた場合、Ｈ３１Ｓ→Ｅ＋Ｌ５０→Ｙ＋Ｌ９４Ｇ→Ｙの混合クローンの活性は、Ｌ５０→Ｙ＋Ｌ９４Ｇ→Ｙ（Ｊ９６５）と同じくらいにすぎなかった。従って、ＣＤＲ１の３１位における生殖系列アミノ酸残基をＳｅｒからＧｌｕに変化させることは、Ｙ６１を越えるＪ９６５の改善された活性には必要なかった。従って、選択的変異誘発法により、最終的な活性に寄与し、それにより最終的な抗体の免疫原能を低下させ、かつ抗体の他の所望する性質を維持する変化の最小数が確認された。
【０１９１】
選択的変異誘発法によって得られるＶＨおよびＶＬをコードする単離されたＤＮＡは、第ＩＶ節に記載されているように、全長の抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、またはｓｃＦＶ遺伝子に変換することができる。選択的変異誘発法によって得られるＶＨ領域およびＶＬ領域を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、第ＩＶ節に詳しく記載されているように様々な宿主細胞にトランスフェクションすることができる。好ましい宿主細胞には、原核生物宿主細胞（例えば、大腸菌）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のいずれかが含まれる。最も好ましい真核生物宿主細胞は、第ＩＶ節に詳しく記載される哺乳動物宿主細胞である。
【０１９２】
選択的変異誘発法は、他の手段による抗体の事前の親和性成熟化を伴うことなく改善された活性を有する抗体の産生方法を提供する。選択的変異誘発法は、活性が改善され、かつ復帰変異にさらされた抗体の産生方法を提供する。選択的変異誘発法はまた、親和性が成熟した抗体の活性を改善する方法を提供する。
【０１９３】
当業者は、選択的変異誘発法が、当分野で知られている標準的な抗体操作技術において使用できることを認識している。例として、ＣＤＲグラフト化抗体、キメラ抗体、ｓｃＦＶフラグメント、全長抗体のＦａｂフラグメント、および他の供給源（例えば、トランスジェニックマウス）に由来するヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
抗体の迅速で大規模な変異分析には、リボソームディスプレー技術を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳が含まれる（例えば、Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７〜４９４２；Ｄａｌｌ  Ａｃｑｕａら（１９９８）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．８：４４３〜４５０；Ｈｅら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：５１３２〜５１３４；ならびに米国特許第５，６４３，７６８号および同第５，６５８，７５４号（ともにＫａｗａｓａｋｉ）を参照のこと）。選択的変異誘発法はまた、リボソームディスプレー技術を使用して選択することができる改善された活性を有する抗体の産生方法を提供する。
【０１９５】
本発明の方法において、抗体またはその抗原結合部分は、ＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲのＣＤＲにおいて個々の位置を変化させることによってさらに改変される。このような改変はファージディスプレー抗体において行うことができるが、この方法は、細菌発現系、酵母発現系または哺乳動物細胞発現系などの他のタイプの宿主系において発現される抗体を用いて実施され得るという点で好都合である。改変のために選択されるＣＤＲ内の個々の位置は、接触位置および／または過変異位置である位置に基づく。
【０１９６】
好ましい接触位置および過変異位置は、本明細書中に定義されているが、表３（付録Ａ参照）に示されており、本発明の方法によるその改変は実施例２に詳しく記載される。好ましい接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される。好ましい過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択される。より好ましいアミノ酸残基（これは「好ましい選択的変異誘発位置」と呼ばれる）は、接触位置および過変異位置の両方であり、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群から選択される。特に好ましい接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される。
好ましい活性増強アミノ酸残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される位置に存在するアミノ酸残基と置換される。より好ましい活性増強アミノ酸残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４の位置に存在するアミノ酸残基と置換される。特に、好ましい活性増強アミノ酸残基は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される位置に存在するアミノ酸残基と置換される。
【０１９７】
一般に、本発明の方法は、目的とする元の抗体の重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲまたはその抗原結合部分の内部における特に好ましい選択変異誘発位置、接触位置および／または過変異位置を選択すること、活性増強アミノ酸残基の発現を同定するために、そのような個々の位置を（例えば、改変された抗体の「ミニライブラリー」を作製するために変異誘発オリゴヌクレオチドを使用する遺伝子手段によって）ランダムに変異させるか、または位置を特定の所望するアミノ酸に変異させること、および改変された抗体を（例えば、非ファージディスプレー宿主系において）精製すること、抗原に対する改変された抗体の活性を（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるｋｏｆｆ速度を測定することによって）測定すること、必要な場合には他のＣＤＲ位置についてこれらの工程を繰り返すこと、および改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を組み合わせること、およびこの組合せにより、元の抗体またはその抗原結合部分よりもさらに大きな活性（例えば、親和性または中和能）を有する抗体が得られるかどうかを調べることを含む。
【０１９８】
従って、１つの実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の、１）好ましい選択的変異誘発位置、２）接触位置、または３）過変異位置を変異のためにこの順で選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定するすること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること；
ｅ）必要な場合には、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程ａ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。好ましくは、選択された抗体（１つまたは２つ以上）は、上記に記載されているように、元の抗体の少なくとも１つの望ましい特性または性質を失っていないか、または元の抗体の少なくとも１つの望ましい特性または性質を保持している改善された活性を有する。そのような望ましい特性または性質は、当分野で認識されている技術を使用して当業者によって測定または観察され得る。
【０１９９】
好ましい接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される。好ましい過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択される。より好ましい選択的変異誘発位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３およびＬ９４からなる群から選択される。特に好ましい接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される。
【０２００】
別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）必要な場合には、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程ａ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２０１】
好ましい接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される。好ましい過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択される。より好ましい選択的変異誘発位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３およびＬ９４からなる群から選択される。特に好ましい接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される。
【０２０２】
別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）必要な場合には、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程ａ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた３つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２０３】
好ましくは、活性増強アミノ酸残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される位置に存在するアミノ酸残基と置換される。
【０２０４】
個々の選択された位置を変異誘発させた後、変異クローンは、どのアミノ酸残基がそれぞれのクローンにおいて選択された位置に導入されているかを同定するために配列決定することができる。少数のクローン（例えば、約２４個）が配列決定のために選択され得るが、これにより１０個〜１５個の重複しない抗体が統計学的に得られるはずであり、これに対して、より多くの数のクローン（例えば、６０個を越える）が、選択された位置にすべての可能な置換を有する抗体を確実に同定するために配列決定され得る。
【０２０５】
１つの実施形態において、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３領域内の接触位置および／または過変異位置が変異誘発のために最初に選択される。しかし、ファージディスプレー選択によるＣＤＲ３領域のランダム変異誘発によって既にｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性の成熟化が生じた抗体の場合には、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１内またはＣＤＲ２内の接触位置および／または過変異位置を最初に選択することが好ましいと考えられる。
【０２０６】
より好ましい実施形態において、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３領域内の好ましい選択的変異誘発位置が変異誘発のために最初に選択される。しかし、ファージディスプレー選択によるＣＤＲ３領域のランダム変異誘発によって既にｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性の成熟化が生じた抗体の場合には、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１内またはＣＤＲ２内の好ましい選択的変異誘発位置を最初に選択することが好ましいと考えられる。
【０２０７】
別の実施形態において、選択的変異誘発法による選択された抗体の最適化が、下記のように連続的に行われる：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置が、それぞれが少なくとも２つの他のアミノ酸（好ましくは、５個〜１４個の他のアミノ酸）に最初に変異させられ、得られた抗体は、増大した親和性、中和能について（そして可能であれば、本明細書中で議論されている少なくとも１つの他の保持された特性または性質についても）特徴付けが行われる。１つの好ましい選択変異誘発位置の変異により、親和性または中和能が全くかまたは十分に増大しない場合、そして好ましい選択的変異誘発位置においてアミノ酸を置換する多数の活性増強アミノ酸を組合せることによってさえも、目標とする活性（親和性および／または中和能を含む）を満たす混合抗体が得られない場合には、さらなるアミノ酸残基が、選択的変異誘発のために、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０ＡおよびＬ９６からなる群から選択され、それぞれが少なくとも２つの他のアミノ酸（好ましくは、５個〜１４個の他のアミノ酸）に変異させられ、そして得られた抗体は、増大した親和性、中和能について（そして可能であれば、本明細書中で議論されている少なくとも１つの他の保持された特性または性質についても）特徴付けが行われる。
【０２０８】
Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０ＡおよびＬ９６からなる群から選択される１個のアミノ酸残基の変異により、活性（親和性および／または中和能を含む）が全くかまたは十分に増大しない場合、そしてそのような位置においてアミノ酸を置換する多数の活性増強アミノ酸を組合せることによってさえも、目標とする活性（親和性および／または目標中和能を含む）を満たす混合抗体が得られない場合には、さらなるアミノ酸残基が、選択的変異誘発のために、Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２Ｂ、Ｌ３１Ａからなる群から選択され、それぞれが少なくとも２つの他のアミノ酸（好ましくは、５個〜１４個の他のアミノ酸）に変異させられ、そして得られた抗体は、増大した親和性、中和能について（そして可能であれば、本明細書中で議論されている少なくとも１つの他の保持されている特性または性質についても）特徴付けが行われる。
【０２０９】
連続した選択的変異誘発法は、所望する活性（親和性および中和能を含む）を有する抗体が同定されると、上記に概略された任意の工程で終了してもよいことを理解しなければならない。予め選択された位置の変異誘発により、活性増強アミノ酸残基が同定され、しかし混合抗体が、活性（親和性および中和能を含む）について示された目標を依然として満たさない場合、および／または同定された活性増強アミノ酸もまた他の所望する特性に影響を及ぼし、従って同定された活性増強アミノ酸が受け入れられない場合には、残ったＣＤＲ残基を変異誘発に供することができる（第ＩＶ節を参照のこと）。
【０２１０】
本発明の方法は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善して、所定の目標とする活性（例えば、所定の親和性および／もしくは中和能、ならびに／または所望する性質もしくは特性）を得るために使用することができる。
【０２１１】
従って、本発明は、所定の目標とする活性を得るために抗体またはその抗原結合部分の活性を改善する方法であって、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群から選択される好ましい選択的変異誘発位置を選択すること；
ｃ）選択された選択的変異誘発位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、これにより変異抗体またはその抗原結合部分の第１の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記第１の集団の活性を評価して、１個の選択的変異誘発位置の変異により、所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られているかどうかを明らかにすること；
ｅ）改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；
ｆ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有するかどうかを明らかにすること；
ｇ）工程ｄ）またはｆ）により、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られない場合、または部分的な活性のみを有する抗体が得られる場合には、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０ＡおよびＬ９６からなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の第２の集団を作製すること；
ｈ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記第２の集団の活性を評価して、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０ＡおよびＬ９６からなる群から選択される１個のアミノ酸残基の変異により、所定の目標とする活性または部分的な活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られているかどうかを明らかにすること；
ｉ）改善された活性を有することが明らかにされた工程ｇ）の個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；
ｊ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性または部分的な目標とする活性を有するかどうかを明らかにすること；
ｋ）工程ｈ）またはｊ）により、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られない場合、または部分的な活性のみを有する抗体が得られる場合には、Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２ＢおよびＬ３１Ａからなる群から選択されるさらなるアミノ酸残基を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の第３の集団を作製すること；
ｌ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記第３の集団の活性を評価して、Ｈ３３Ｂ、Ｈ５２ＢおよびＬ３１Ａからなる群から選択される１個のアミノ酸残基の変異により、所定の目標とする活性または部分的な活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られたかどうかを明らかにすること；
ｍ）改善された活性を有することが明らかにされた工程ｋ）の個々の変異を段階的な様式で元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；
ｎ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を評価して、混合抗体またはその抗原結合部分が所定の目標とする活性を有するかどうかを明らかにし、それにより、所定の目標とする活性を有する抗体またはその抗原結合部分を作製することを含む方法を提供する。
【０２１２】
多数の変異誘発方法を使用することができ、これには、ＰＣＲアセンブリー、Ｋｕｎｋｅｌ（ｄｕｔ−ｕｎｇ−）およびチオホスファート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｃｕｌｐｔｏｒキット）オリゴヌクレオチド特異的変異誘発が含まれる。
【０２１３】
広範囲の宿主発現系を、変異抗体を発現させるために使用することができ、これには、細菌発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系および哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレー発現系）が含まれる。好適な細菌発現ベクターの例として、ｐＵＣ１１９（Ｓｆｉ）が挙げられる。他の抗体発現系が、当分野では知られており、かつ／または下記の第ＩＶ節に記載されている。
【０２１４】
本発明の方法によって作製された改変抗体またはその抗原結合部分は、選択のためにファージディスプレー法に頼ることなく同定することができる。従って、本発明の方法は、ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性をファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分の活性を改善することに関して特に好都合である。
【０２１５】
従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の親和性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること；
ｅ）必要な場合には、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた個々の変異を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｅ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２１６】
好ましい接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択される。好ましい過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択される。より好ましい選択的変異誘発位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３およびＬ９４からなる群から選択される。特に好ましい接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択される。
【０２１７】
利用可能な方法の場合、増大した結合親和性および中和能を有し、同時に上記で議論されているような抗体の他の性質または特性を保持した抗体を得ることは不可能であるか、または極めて手間のかかることである。しかし、本発明の方法は、そのような抗体を容易に同定することができる。本発明の方法に供される抗体は任意の供給源から得ることができる。
【０２１８】
従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を適切な発現系において発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、抗体において保持されなければならない少なくとも１つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２１９】
好ましい実施形態において、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２０】
別の好ましい実施形態において、過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２１】
より好ましい実施形態において、選択的変異誘発のための残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群からの選択的変異誘発位置から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２２】
より好ましい実施形態において、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２３】
従って、特定の抗原に対する抗体の親和性を改善しなければならない場合、しかし、ファージディスプレー法（またはリボソームディスプレーを含む関連した系）がもはや適用することができず、そして他の望ましい性質または特性を保持しなければならない場合に、本発明の方法を使用することができる。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を同定すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を、保持されなければならない少なくとも１つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること；
ｆ）必要な場合には、工程ａ）〜ｅ）を、少なくとも１つの他の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について繰り返すこと；
ｇ）改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されたことが明らかにされた少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｈ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２２４】
好ましい実施形態において、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群の好ましい選択的変異誘発位置から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２５】
別の好ましい実施形態において、過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群からの好ましい選択的変異誘発位置から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２６】
より好ましい実施形態において、選択的変異誘発のための残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群からの好ましい選択的変異誘発位置から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２７】
より好ましい実施形態において、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２２８】
別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、保持されなければならない少なくとも１つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること；
を含む方法を提供する。
【０２２９】
好ましい実施形態において、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３０】
別の好ましい実施形態において、過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３１】
より好ましい実施形態において、選択的変異誘発のための残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３２】
より好ましい実施形態において、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３３】
別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）内の好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を変異のために選択し、それにより、選択された接触位置または過変異位置を同定すること；
ｃ）前記の選択された好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、保持されなければならない少なくとも１つの他の性質または特性について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること；
ｆ）必要な場合には、工程ａ）〜ｅ）を、少なくとも１つの他の選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置について繰り返すこと；
ｇ）改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの性質または特性が保持されたことが明らかにされた少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組み合わせて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｈ）混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２３４】
好ましい実施形態において、接触位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３５】
別の好ましい実施形態において、過変異位置は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５３およびＬ９３からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３６】
より好ましい実施形態において、選択的変異誘発のための残基は、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ５０、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３７】
より好ましい実施形態において、接触位置は、Ｌ５０およびＬ９４からなる群から選択され、そして他の特性は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２３８】
ＩＶ．他のＣＤＲ残基の改変
最後には、所与の抗体抗原ペアにおけるすべてのＣＤＲ残基が、活性増強アミノ酸残基として必要であり、かつ／または抗原に対する結合のために、直接的または間接的に必要であり、および／または抗体の他の望ましい性質もしくは特性の保持のために必要であるいずれかの手段により同定される。そのようなＣＤＲ残基は「好ましい選択的変異誘発位置」として示される。特定の状況では、そのような好ましい選択的変異誘発残基はまた、抗体と抗原との同時結晶化および分子モデル化を含む他の手段によって同定できることに留意しなければならない。
【０２３９】
上記に記載されている好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置に注目して活性増強アミノ酸を同定する好ましい試みが検討し尽された場合、またはさらなる改善が必要とされる場合には、残ったＣＤＲ残基を下記に記載されているように改変することができる。抗体は、上記に議論されている実施形態に従って任意の１つまたは２つ以上の接触位置または過変異位置において既に改変されていてもよいが、さらなる改善が必要とされ得ることを理解しなければならない。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を、例えば、少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより、変異抗体、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）前記変異抗体の活性、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）前記変異抗体、または変異抗体もしくはその抗原結合部分の前記集団を、少なくとも１つの他の性質または特性における変化について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２４０】
好ましくは、他の特性または性質は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２４１】
１個の残基の変異誘発が十分でない場合、他の残基を含めることができる。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）工程ｂ）で選択された位置、またはＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６における位置のいずれでもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２４２】
上記に記載されている接触位置または過変異位置に注目して活性増強アミノ酸を同定する好ましい試みが検討し尽された場合、またはさらなる改善が必要とされ、そして問題とする抗体が変異誘発およびファージディスプレー（または関連したリボソームディスプレー）法によってさらに最適化できない場合には、残ったＣＤＲ残基を下記に記載されているように改変することができる。抗体は、上記に議論されている実施形態に従って任意の１つまたは２つ以上の好ましい変異誘発位置、接触位置または過変異位置において既に改変されていてもよいが、さらなる改善が必要とされ得ることを理解しなければならない。
【０２４３】
従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善できない元の組換え抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された接触位置または過変異位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして前記集団を非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、少なくとも１つの他の性質または特性における変化について元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２４４】
好ましくは、他の特性または性質は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２４５】
１個の変異誘発が抗体の親和性を増大させるために十分でない場合には、他の残基を変異誘発に含めることができる。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）工程ｂ）で選択された位置、またはＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４における位置のいずれでもない少なくとも１つの他の位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされた少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および他の性質または特性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２４６】
好ましくは、他の特性または性質は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２４７】
記載されている好ましい選択的変異誘発位置、接触位置または過変異位置に注目して活性増強アミノ酸を同定する好ましい試みを徹底的に検討することができるか、あるいはさらなる改善が必要とされ得るが、抗体の他の性質または特性を保持することが重要である。
【０２４８】
従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を、他の特性に影響を及ぼすことなく改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ他の性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも１つの他の性質または特性における変化について評価すること
を含む方法を提供する。
【０２４９】
好ましくは、他の特性または性質は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２５０】
１残基の変異誘発が十分でない場合には、他の残基を含めることができる。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの他の性質または特性が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製すること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも１つの他の性質または特性における変化について評価すること
ｅ）工程ｂ）で選択された位置、またはＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６における位置のいずれでもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜ｅ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有することが明らかにされ、かつ少なくとも１つの他の性質または特性に影響を及ぼさない少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの他の性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２５１】
好ましい選択的変異誘発位置、接触残基および過変異残基の変異誘発は、抗体の親和性を十分に増大させることができず、従って変異誘発およびファージディスプレー法（または関連するリボソームディスプレー法）はもはや有用ではあり得ず、そして抗体の少なくとも１つの他の特性または性質は保持されなければならない。
【０２５２】
従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の親和性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して改善された活性を有する抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団を、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、少なくとも１つの他の性質または特性における変化について評価すること
を含む方法を提供する。
【０２５３】
好ましくは、他の特性または性質は、１）他のタンパク質またはヒト組織との非交差反応性の維持、２）エピトープ認識の維持、すなわち、ｐ４０エピトープを、好ましくはｐ７０ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーの状況下で認識して、遊離している可溶型ｐ４０からの結合妨害を防止すること、および／または３）生殖系列の免疫グロブリン配列に類似した抗体を生成することから選択される。
【０２５４】
１残基の変異誘発が十分でない場合には、他の残基を含めることができる。従って、別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合部分の活性を改善するための方法であって、元の抗体またはその抗原結合部分に対して、改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの他の特性または性質が保持されている抗体またはその抗原結合部分が得られるまで、
ａ）ファージディスプレーシステムにおける選択によって得られたが、その活性を前記ファージディスプレーシステムにおける変異誘発によってさらに改善することができない元の抗体またはその抗原結合部分を提供すること；
ｂ）Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６とは異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸残基を変異のために選択すること；
ｃ）前記の選択された位置を少なくとも２つの他のアミノ酸残基に個々に変異させ、それにより変異抗体またはその抗原結合部分の集団を作製し、そして非ファージディスプレーシステムにおいて発現させること；
ｄ）変異抗体またはその抗原結合部分の前記集団の活性および少なくとも１つの他の性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価し、それにより活性増強アミノ酸残基を同定すること；
ｅ）工程ｂ）で選択された位置、またはＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３１Ｂ、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２Ａ、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１０１、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５２、Ｌ５３、Ｌ５５、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６における位置のいずれでもない少なくとも１つの他のＣＤＲ位置について工程ｂ）〜ｄ）を繰り返すこと；
ｆ）改善された活性を有し、かつ少なくとも１つの他の性質または特性に影響を及ぼさないことが明らかにされた少なくとも２つの個々の活性増強アミノ酸残基を元の抗体またはその抗原結合部分において組合せて、混合抗体またはその抗原結合部分を作製すること；および
ｇ）２つの活性増強アミノ酸残基を有する混合抗体またはその抗原結合部分の活性および少なくとも１つの性質または特性の保持を元の抗体またはその抗原結合部分に対して評価すること
を含む方法を提供する。
【０２５５】
Ｖ．抗体の発現
本発明の抗体または抗体の一部は、免疫グロブリンの軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の宿主細胞における組換え発現によって調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１つまたは２つ以上の組換え発現ベクターでトランスフェクションされ、その結果、軽鎖および重鎖が宿主細胞において発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地に分泌され、そしてそのような培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が得られ、これらの遺伝子が組換え発現ベクターに組み込まれ、そしてベクターが宿主細胞に導入される。そのような方法論は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）；および米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）に記載されている。
【０２５６】
Ｊｏｅ９ｗｔ抗体またはＪｏｅ９ｗｔ関連抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るために、ヒトＩＬ−１２に特異的な抗体が、第ＩＩ節に記載されているように、ヒトライブラリーからスクリーニングされ、そして変異されられた。Ｊｏｅ９ｗｔまたはＪｏｅ９ｗｔ関連のＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが一旦得られると、これらの配列の変異誘発が、ＰＣＲ部位特異的変異誘発（ＰＣＲ産物が変異を含有するように変異ヌクレオチドがＰＣＲプライマーに取り込まれているＰＣＲ媒介変異誘発）または他の部位特異的な変異誘発法などの標準的な方法によって行われる。望ましい一定レベルの活性および結合特異性／親和性を示したヒトＩＬ−１２抗体、例えばＪ６９５は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、例えば、可変領域遺伝子を全長の抗体鎖遺伝子またはＦａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するためにさらに操作された。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに機能的に連結される。これに関連して使用されている用語「機能的に連結される」は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列の読み枠が合い続けるように２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味するものである。
【０２５７】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することによって全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒトの重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野では知られている（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照のこと）。また、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）に記載されているように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域およびその任意のアロタイプ変化体であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することができる。
【０２５８】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することによって全長の軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒトの軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野では知られている（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照のこと）。また、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ定常領域またはλ定常領域であり得るが、最も好ましくはλ定常領域である。
【０２５９】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、ＶＨ配列およびＶＬ配列が、柔軟なリンカーにより結合されたＶＬ領域およびＶＨ領域を有する連続した単一鎖タンパク質として発現され得るように、柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに機能的に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）、３４８：５５２〜５５４を参照のこと）。
【０２６０】
本発明の抗体または抗体の一部を発現させるために、上記に記載されているようにして得られた部分長または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、それらの遺伝子が転写制御配列および翻訳制御配列に機能的に連結されるように発現ベクターに挿入される。これに関連して、用語「機能的に連結される」は、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するその意図された機能を果たすように抗体遺伝子がベクター内に連結されることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができる。あるいは、より典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントとベクターにおける相補的な制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には平滑端連結）によって発現ベクターに挿入される。Ｊ６９５またはＪ６９５関連の軽鎖配列または重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは抗体の定常領域配列を既に有していてもよい。例えば、Ｊ６９５またはＪ６９５関連のＶＨ配列およびＶＬ配列を全長の抗体遺伝子に変換する１つの方法は、そのような配列を、重鎖定常領域および軽鎖定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能的に連結され、かつＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能的に連結されるように挿入することである。さらにあるいは代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に読み枠を合わせて連結されるようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリンでないタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。
【０２６１】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子の宿主細胞における発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０年）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを当業者は理解している。哺乳動物宿主細胞での発現に好ましい調節配列には、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現をもたらすウイルスエレメントが含まれ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが挙げられる。ウイルスの調節エレメントのさらなる説明およびその配列については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Ｓｔｉｎｓｋｉ）、米国特許第４，５１０，２４５号（Ｂｅｌｌら）、および米国特許第４，９６８，６１５号（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら）、米国特許第５，４６４，７５８号（Ｂｕｊａｒｄら）および米国特許第５，６５４，１６８号（Ｂｕｊａｒｄら）を参照のこと。
【０２６２】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号、これらはすべてＡｘｅｌらによる）を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートによる選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用される）、およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択の場合）が含まれる。
【０２６３】
軽鎖および重鎖を発現させる場合、軽鎖および重鎖をコードする発現ベクター（１つまたは２つ以上）は標準的な方法で宿主細胞にトランスフェクションされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核生物または真核生物の宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するために広く使用されている広範囲の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの技術を包含するものとする。本発明の抗体を原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかで発現させることは理論的には可能であるが、真核生物細胞（最も好ましくは哺乳動物宿主細胞）における抗体の発現が最も好ましい。これは、そのような真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞）は、正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が原核生物細胞よりも大きいからである。本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入された場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【０２６４】
宿主細胞はまた、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの完全な抗体の一部を産生させるために使用することができる。上記手順における様々な変化は本発明の範囲に含まれることが理解される。例えば、宿主細胞を、本発明の抗体の軽鎖または重鎖の（両方ではなく）いずれかをコードするＤＮＡでトランスフェクションすることが望ましい。組換えＤＮＡ技術はまた、ｈＩＬ−１２への結合に対して必要でない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを除くために使用することもできる。そのような短縮型ＤＮＡ分子から発現された分子もまた、本発明の抗体によって包含される。さらに、１つの重鎖および１つの軽鎖が本発明の抗体であり、それ以外の重鎖および軽鎖がｈＩＬ−１２以外の抗原に対して特異的である二官能性抗体を、標準的な化学的架橋法により本発明の抗体を別の抗体に架橋することによって作製することができる。
【０２６５】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現に好ましい系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内において、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子はそれぞれ、遺伝子の高レベルの転写をもたらすエンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来し、例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターの調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターの調節エレメント）に機能的に連結される。組換え発現ベクターはまた、ベクターでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の選択を、メトトレキサートによる選択／増幅を使用して可能にするＤＨＦＲ遺伝子を有する。選択された形質転換体の宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖が発現されるように培養され、そして完全な抗体が培養培地から回収される。標準的な分子生物学的技術を使用して、組換え発現ベクターが調製され、宿主細胞がトランスフェクションされ、形質転換体が選択され、宿主細胞が培養され、そして抗体が培養培地から回収される。本発明の抗体またはその抗原結合部分を、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子組換えである動物（例えば、マウス）において発現させることができる（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５を参照のこと）。植物細胞もまた、本発明の抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニック植物を作製するために改変することができる。
【０２６６】
上記を考慮すれば、本発明の別の態様は、本発明の抗体または抗体の一部を組換え発現させるために使用され得る核酸、ベクターおよび宿主細胞の組成物に関する。好ましくは、本発明は、Ｊ６９５のＣＤＲをコードするか、あるいはＪ６９５の完全な重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする単離された核酸を特徴とする。従って、１つの実施形態において、本発明は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＪ６９５の重鎖ＣＤＲ３をコードする抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸を特徴とする。好ましくは、抗体重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＪ６９５重鎖ＣＤＲ２をさらにコードする。より好ましくは、抗体重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＪ６９５重鎖ＣＤＲ１をさらにコードする。さらにより好ましくは、単離された核酸は、配列番号３１のアミノ酸配列（Ｊ６９５の全ＶＨ領域）を含む抗体重鎖可変領域をコードする。
【０２６７】
他の実施形態において、本発明は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＪ６９５軽鎖ＣＤＲ３をコードする抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸を特徴とする。好ましくは、抗体軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＪ６９５軽鎖ＣＤＲ２をさらにコードする。より好ましくは、抗体軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＪ６９５軽鎖ＣＤＲ１をさらにコードする。さらにより好ましくは、単離された核酸は、配列番号３２のアミノ酸配列（Ｊ６９５の全ＶＬ領域）を含む抗体軽鎖可変領域をコードする。
【０２６８】
本発明はまた、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は、
ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体重鎖；および
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体軽鎖
をコードする組換え発現ベクターを提供する。
【０２６９】
本発明はまた、本発明の組換え発現ベクターの１つまたは２つ以上が導入されている宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり、より好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＣＯＳ細胞である。なおさらに、本発明は、本発明の組換えヒト抗体を、本発明の組換えヒト抗体が合成されるまで本発明の宿主細胞を好適な培養培地で培養することによって合成する方法を提供する。この方法は、組換えヒト抗体を培養培地から単離することをさらに含むことができる。
【０２７０】
ＶＩ．薬学的組成物および薬学的投与
本発明の抗体および抗体の一部は、患者への投与に好適な薬学的組成物に配合することができる。典型的には、薬学的組成物は、本発明の抗体または抗体の一部と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本明細書中で使用されている「薬学的に許容可能なキャリア」には、生理学的に適合し得る任意のすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容可能なキャリアの例には、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つまたは２つ以上、ならびにそれらの組合せが含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めることは好ましい。薬学的に許容可能なキャリアはさらに、抗体または抗体の一部の保存寿命または有効性を高める、湿潤化剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの補助物質を微量含むことができる。
【０２７１】
本発明の抗体および抗体の一部は、非経口投与に好適な薬学的組成物に配合することができる。好ましくは、抗体または抗体の一部は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む注射可能な溶液として調製される。注射可能な溶液は、フリントガラスまたはアンバー色のバイアル、アンプルあるいは充填済みシリンジにおける液体投薬形態または凍結乾燥投薬形態のいずれかから構成され得る。緩衝剤は、ｐＨが５．０〜７．０（最適にはｐＨ６．０）であるＬ−ヒスチジン（１ｍＭ〜５０ｍＭ）、最適には５ｍＭ〜１０ｍＭであり得る。他の好適な緩衝剤には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。塩化ナトリウムが、溶液の毒性を改変するために、０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度（最適には、液体投薬形態の場合には１５０ｍＭ）で使用され得る。凍結保護剤、主として０％〜１０％のスクロース（最適には０．５％〜１．０％）を凍結乾燥投薬形態の場合には含めることができる。他の好適な凍結保護剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。増量剤、主として１％〜１０％のマンニトール（最適には２％〜４％）を凍結乾燥投薬形態の場合には含めることができる。安定化剤、主として１ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には５ｍＭ〜１０ｍＭ）を液体投薬形態または凍結乾燥投薬形態の両方において使用することができる。他の好適な増量剤には、グリセリン、アルギニンが含まれ、好適な増量剤は０％〜０．０５％のポリソルベート−８０（最適には０．００５％〜０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、ポリソルベート２０界面活性剤およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７２】
好ましい実施形態において、薬学的組成物は抗体を約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で含む。抗体のより好ましい投薬量には、隔週毎に投与される場合には１ｍｇ／ｋｇが含まれ、あるいは毎週投与される場合には０．３ｍｇ／ｋｇが含まれる。
【０２７３】
本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体および固体の形態が含まれ、例えば、液体溶液剤（例えば、注射可能な溶液剤および注入可能な溶液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、ピル剤、粉末剤、リポソーム剤および坐薬などが含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体を用いてヒトの受動免疫化のために使用される組成物に類似する組成物などの注射可能な溶液剤または注入可能な溶液剤の形態である。好ましい投与様式は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、抗体は静脈内への注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【０２７４】
治療用組成物は、典型的には、製造条件および保存条件で無菌で安定でなければならない。組成物は、大きな薬物濃度に対して好適な溶液剤、マイクロエマルション剤、分散剤、リポソーム剤または他の指示された構造体として配合することができる。無菌の注射可能な溶液剤は、必要量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体の一部）を適切な溶媒に、必要な場合には上記に列記された成分の１つまたは組合せとともに配合し、その後、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を、分散媒体基剤と、上記に列記された成分に由来する必要とされる他の成分とを含有する無菌のビヒクルに配合することによって調製される。無菌の注射可能な溶液剤を調製するための無菌の凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と、事前に無菌ろ過されたその溶液に由来するその任意のさらなる所望成分との粉末を作製する真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持され得る。注射可能な組成物の持続した吸収が、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０２７５】
本発明の抗体および抗体の一部は、当分野で知られている様々な方法で投与することができるが、多くの治療的適用の場合、好ましい投与経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または静脈内注入である。当業者は理解しているように、投与経路および／または投与様式は、所望する結果に依存して変化する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出配合物などの、迅速な放出から化合物を保護するキャリアとともに調製することができる。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などを使用することができる。そのような配合物を調製するための多くの方法が特許化され、あるいは当業者には一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８）を参照のこと。
【０２７６】
ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗体の一部は、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な食用キャリアとともに経口投与することができる。化合物（および所望する場合には他の成分）はまた、硬殻ゼラチンカプセルまたは軟殻ゼラチンカプセルに充填することができ、あるいは錠剤に圧縮成型することができ、あるいは患者の食事に直接加えることができる。経口的な治療投与の場合、化合物は、賦形剤とともに配合され、そして摂取可能な錠剤、頬錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる。本発明の化合物を非経口投与以外で投与するためには、化合物をその不活化を防止する物質でコーティングすること、または化合物をその不活化を防止する物質とともに同時投与することが必要であり得る。
【０２７７】
補助的な活性化合物もまた組成物に配合することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗体の一部は、ＩＬ−１２活性が有害である疾患を処置するために有用である１つまたは２つ以上のさらなる治療剤とともに同時に配合され、かつ／または同時に投与される。例えば、本発明の抗ＩＬ−１２抗体またはその抗体の一は、他の標的と結合する１つまたは２つ以上のさらなる抗体（例えば、他のサイトカインと結合する抗体、または細胞表面分子と結合する抗体）とともに同時に配合され、かつ／または同時に投与され得る。さらに、本発明の１つまたは２つ以上の抗体は２つ以上の上記の治療剤との組合せで使用することができる。そのような組合せ治療は、投与された治療剤のより少ない投薬量を都合良く利用することができ、従って、様々な単独療法に伴う考えられる毒性または合併症を避けることができる。本発明の抗体が組合せ療法の一部として使用された場合、抗体が単独で患者に投与されるときよりも少ない用量の抗体が望ましいと考えられると当業者は理解している（例えば、所望する治療効果を達成するために、相乗的な治療効果が、より少ない用量の抗体の使用を可能にする組合せ療法の使用によって達成され得る）。
【０２７８】
インターロイキン１２は、様々な免疫因子および炎症性因子を含む様々な疾患に伴う病理学において重要な役割を果たしている。このような疾患を下記に挙げるが、それらに限定されない：慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、硬皮性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性または慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、汎発性血管内凝固、川崎病、グレーヴズ病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ−スエーンライン紫斑病、腎臓の顕微鏡的脈管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生虫病、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、発作、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散在性のＩ型多腺性欠損症およびＩＩ型多腺性欠損症、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、セロネガティブ関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸性滑膜炎、クラミジア菌、エルシニア菌およびサルモネラ菌が関連する関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームズ陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、突発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全病症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、雌性不妊症、卵巣不全、早期の卵巣不全、線維性肺疾患、突発性線維性肺胞炎、後炎症性間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患に関連する間質性肺疾患、混合型結合組織疾患に関連する肺疾患、全身性硬化症に関連する間質性肺疾患、慢性関節リウマチに関連する間質性肺疾患、全身性エリテマトーデスに関連する肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋症に関連する肺疾患、シェーグレン病に関連する肺疾患、強直性脊椎炎に関連する肺疾患、血管炎性散在性肺疾患、ヘモジデリン沈着症に関連する肺疾患、薬物誘導の間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後の間質性肺疾患、痛風、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的な自己免疫性肝炎またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介の低血糖症、黒色表皮肥厚症を伴うＢ型インスリン耐性、上皮小体低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患（ＮＯＳ）、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的脈管炎、ライム病、円盤状エリテマトーデス、雄性不妊症（特発性またはＮＯＳ）、精子自己免疫性、多発性硬化症（すべてのサブタイプ）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、結合組織疾患に対して二次的な肺性高血圧症、グッドパスチャー症候群、多発性動脈炎の肺発現、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液浮腫、水晶体近因性ブドウ膜炎、原発性の脈管炎および白斑。本発明のヒト抗体および抗体の一部は、リウマチ様脊椎炎、アレルギー、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎を含む自己免疫疾患を処置するために、特に、炎症を伴う自己免疫疾患を処置するために使用することができる。
【０２７９】
好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、第ＶＩＩ節にさらに詳しく記載されているように、慢性関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病および乾癬を処置するために使用される。
【０２８０】
本発明のヒト抗体または抗体の一部は、自己免疫性疾患および炎症性疾患の処置において有用な１つまたは２つ以上のさらなる治療剤とともに投与することができる。
【０２８１】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、そのような疾患を処置するために、単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、単独で、あるいはさらなる薬剤、例えば治療剤と組合せて使用できることを理解しなければならない。そのようなさらなる薬剤は、意図された目的のために当業者によって選択される。例えば、さらなる治療剤は、本発明の抗体によって処置される疾患または状態を処置するために有用であるとして当分野で認識されている治療剤であり得る。さらなる薬剤はまた、有益な属性を治療組成物に付与する薬剤であり、例えば、組成物の粘性をもたらす薬剤であり得る。
【０２８２】
本発明に含まれ得る組合せ物は、意図された目的に関して有用であるそのような組合せ物であることをさらに理解しなければならない。下記に示される薬剤は例示目的のためであり、限定することを意図していない。本発明の一部である組合せ物は、本発明の抗体、および下記の列記から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤であり得る。本発明の組合せ物はまた、形成された組成物がその意図された機能を発揮し得るように組合せがなされている場合には２つ以上のさらなる薬剤、例えば、２つまたは３つのさらなる薬剤を含むことができる。
【０２８３】
好ましい組合せ物は、イブプロフェンのような薬物を含む、ＮＳＡＩＤＳと呼ばれることもある非ステロイド性抗炎症薬である。他の好ましい組合せ物は、プレドニソロンを含むコルチコステロイド類である；本発明の抗ＩＬ−１２抗体と組み合わせて患者を処置した場合、必要とされるステロイド用量を徐々に減らすことによってステロイド使用のよく知られた副作用を低下させることができ、あるいは除去することさえできる。本発明の抗体または抗体の一部と組み合わることができる慢性関節リウマチに対する治療剤の非限定的な実施例を下記に挙げる：サイトカイン抑制抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；他のヒトサイトカインまたは成長因子（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＰＤＧＦ）に対する抗体またはアンタゴニスト。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０またはそれらのリガンド（ＣＤ１５４（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）を含む）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。
【０２８４】
治療薬の好ましい組合せは、様々な点で自己免疫及びその後の炎症カスケードに干渉しうる；好ましい例は、キメラ、ヒューマナイズ又はヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（１９９６年２月９日出願の米国特許出願番号第０８／５９９，２２６号）、ｃＡ２（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体断片（例えばＣＤＰ８７０）、及び可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦレセプタのようなＴＮＦ拮抗物質、それらの誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）又はｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、可溶性ＩＬ−１３レセプタ（ｓＩＬ−１３）、そしてＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害因子も含む；同様にＩＬ−１阻害因子（例えばＶｘ７４０のようなインターロイキン−１−変換酵素阻害因子、又はＩＬ−ＩＲＡ等）も同じ理由から有効と考えられる。他の好ましい組合せは、インターロイキン１１、抗Ｐ７ｓ及びｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）を含む。さらにもう１つの好ましい組合せは、ＩＬ−１２機能と平行して、依存して又は協力して作用しうる、自己免疫応答の他のキープレイヤーである；特に好ましいのは、ＩＬ−１８抗体又は可溶性ＩＬ−１８レセプタを含むＩＬ−１８拮抗物質、あるいはＩＬ−１８結合タンパクである。ＩＬ−１２とＩＬ−１８はオーバーラップするが異なる機能を持つことが示されており、両者に対する拮抗物質の組合せが最も有効であると考えられる。さらにもう１つの好ましい組合せは、非枯渇性（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗ＣＤ４阻害因子である。さらなる他の好ましい組合せは、抗体、可溶性レセプタ又は拮抗性リガンドを含む共同刺激経路、ＣＤ８０（Ｂ７．１）又はＣＤ８６（Ｂ７．２）を包含する。
【０２８５】
本発明の抗体、又はその抗原結合部分は、メトトレキセート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオマレート（筋肉内及び経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注入）、β−２アドレナリン作動性レセプタ左様物質（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリケート、ネドクロミル、ケトティフェン、イプラトロピウム及びオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害因子、アデノシン作用物質、抗血栓薬、補体阻害因子、アドレナリン作動薬、ＴＮＦα又はＩＬ−１（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害因子）のような前炎症性サイトカインによりシグナル伝達に干渉する物質、ＩＬ−１β変換酵素阻害因子（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７ｓ、ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害因子、キナーゼ阻害因子のようなＴ細胞シグナル伝達阻害因子、メタロプロテイナーゼ阻害因子、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、可溶性サイトカインレセプタ及びその誘導体（例えば可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦレセプタ及びその誘導体、Ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）又はｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３レセプタ（ｓＩＬ−１３））、及び抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）のような物質とも組み合わせることができる。好ましい組合せは、メトトレキセート又はレフルノミド、そして中等度又は重度の慢性関節リウマチの症例ではシクロスポリンを含む。
【０２８６】
本発明の抗体又は抗体部分と組み合わせることができる炎症性腸疾患のための治療薬の非制限的な例は次のものを含む：ブデノシド；表皮成長因子；コルチコステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリシレート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポオキシゲナーゼ阻害因子；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化薬；トロンボキサン阻害因子；ＩＬ−１レセプタ拮抗物質；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；成長因子；エラスターゼ阻害因子；ピリジニル−イミダゾール化合物；他のヒトサイトカイン又は成長因子に対する抗体又は拮抗物質、例えばＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦ。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０又はそれらのリガンドのような細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害因子、アデノシン作用物質、抗血栓薬、補体阻害因子、アドレナリン作動薬、ＴＮＦα又はＩＬ−１（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害因子）のような前炎症性サイトカインによりシグナル伝達に干渉する物質、ＩＬ−１β変換酵素阻害因子（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７ｓ、ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素阻害因子、キナーゼ阻害因子のようなＴ細胞シグナル伝達阻害因子、メタロプロテイナーゼ阻害因子、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、可溶性サイトカインレセプタ及びその誘導体（例えば可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦレセプタ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３レセプタ（ｓＩＬ−１３））、及び抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）のような物質とも組み合わせることができる。
【０２８７】
抗体又は抗原結合部分と組み合わせることができるクローン病のための治療薬の好ましい例は次のものを含む：ＴＮＦ拮抗物質、例えば抗ＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（１９９６年２月９日出願の米国特許出願番号第０８／５９９，２２６号）、ｃＡ２（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体断片（例えばＣＤＰ８７０）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）及びｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、抗Ｐ７ｓ、ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）、可溶性ＩＬ−１３レセプタ（ｓＩＬ−１３）、及びＰＤＥ４阻害因子。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、コルチコステロイド、例えばブデノシド及びデキサメタゾンと組み合わせることができる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸及びオルサラジン、及びＩＬ−１のような前炎症性サイトカインの合成又は作用に干渉する物質、例えばＩＬ−１β変換酵素阻害因子（例えばＶｘ７４０）及びＩＬ−１ｒａのような物質と組み合わせることもできる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、Ｔ細胞シグナル伝達阻害因子、例えばチロシンキナーゼ阻害因子、６−メルカプトプリンと共に使用することもできる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はＩＬ−１１と組み合わせることができる。
【０２８８】
本発明の抗体又は抗体部分と組み合わせることができる多発性硬化症のための治療薬の非制限的な例は次のものを含む：コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキセート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロン−β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；コポリマー１（Ｃｏｐ−１；Ｃｏｐａｘｏｎｅ；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラブリビン；ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦ。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０又はそれらのリガンドのような細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はまた、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害因子、アデノシン作用物質、抗血栓薬、補体阻害因子、アドレナリン作動薬、ＴＮＦα又はＩＬ−１（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害因子）のような前炎症性サイトカインによりシグナル伝達に干渉する物質、ＩＬ−１β変換酵素阻害因子（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７ｓ、ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＡＣＥ阻害因子、キナーゼ阻害因子のようなＴ細胞シグナル伝達阻害因子、メタロプロテイナーゼ阻害因子、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、可溶性サイトカインレセプタ及びその誘導体（例えば可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦレセプタ、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３レセプタ（ｓＩＬ−１３））、及び抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）のような物質とも組み合わせることができる。
【０２８９】
当該抗体又は抗体部分と組み合わせることができる多発性硬化症のための治療薬の好ましい例は、インターフェロン−β、例えばＩＦＮβ１ａ及びＩＦＮ−β１ｂ；コパキソン、コルチコステロイド、ＩＬ−１阻害因子、ＴＮＦ阻害因子、及びＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体を含む。
【０２９０】
本発明の製薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療上の有効量」又は「予防上の有効量」を含みうる。「治療上の有効量」は、所望する治療成績を達成するための、必要な用量と期間での有効量をさす。抗体又は抗体部分の治療上の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびに抗体又は抗体部分が個体において所望する応答を誘発する能力のような因子に従って変化しうる。治療上の有効量はまた、抗体又は抗体部分の治療上の有益な作用が毒性又は有害作用に勝る量である。「予防上の有効量」は、所望する予防成績を達成するための、必要な用量と期間での有効量をさす。典型的には、予防用量は疾患の発症前又は疾患の早期に被験者において使用されるので、予防上の有効量は治療上の有効量よりも低いであろう。
【０２９１】
用量レジメンは至適所望応答（例えば治療又は予防応答）を提供するように調節することができる。例えば、単回のボーラスで投与するか、経時的に数回の分割用量を投与するか、又は治療状況の緊急性によって求められるように比例的に減少又は増加することができる。投与の容易さと用量の均一性のために投与単位形態の非経口組成物を製剤することは特に好都合である。ここで使用するとき投与単位形態は、治療する哺乳類被験者の単位投与として適した物理的に分離したユニットを指す；各々のユニットは、必要な製薬担体と結合して所望する治療効果を生じるように計算された、あらかじめ定められた量の活性化合物を含む。本発明の投与ユニット形態についての規格は、（ａ）活性化合物の独自特性と達成すべき特定の治療又は予防効果、及び（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を調合する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０２９２】
本発明の抗体又は抗体部分の治療上又は予防上の有効量の例示としての非制限的な範囲、０．０１−２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは０．３−１ｍｇ／ｋｇである。用量の数値は、軽減すべき状態の種類と重症度によって変化しうることに留意しなければならない。さらに、個々の被験者について、個体の必要性及び組成物の投与を行う又は投与を監視する者の専門的判断に従って時間の経過と共に個々の用量レジメンを調節すべきであること、またここに示す用量範囲は単なる例示であり、特許請求される組成物の範囲又は実施を制限することを意図しないことは明白である。
【０２９３】
ＶＩＩ．本発明の抗体の使用
ｈＩＬ−１２に結合する能力を考慮すると、本発明の抗ｈＩＬ−１２抗体又はその部分は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）又は免疫組織化学のような従来の免疫測定法を使用して、ｈＩＬ−１２を検出する（例えば血清又は血漿のような生物学的サンプルにおいて）ために使用できる。本発明は、生物学的サンプルを本発明の抗体又は抗体部分に接触させ、ｈＩＬ−１２に結合した抗体（又は抗体部分）又は結合していない抗体（又は抗体部分）のいずれかを検出し、それによって生物学的サンプル中のｈＩＬ−１２を検出することを含む、生物学的サンプルにおいてｈＩＬ−１２を検出するための方法を提供する。結合又は非結合抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で抗体を直接又は間接的に標識する。適当な検出可能物質は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、及び放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプタビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンを含む；発光材料の例はルミノールを含む；そして適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈを含む。
【０２９４】
抗体を標識する代わりに、検出可能な物質で標識したｒｈＩＬ−１２標準と標識していない抗ｈＩＬ−１２抗体を使用する競合免疫測定法により、ｈＩＬ−１２を生物学的液体中で検定することができる。このアッセイでは、生物学的サンプル、標識ｒｈＩＬ−１２標準及び抗ｈＩＬ−１２抗体を一緒にして、非標識抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１２標準の量を測定する。生物学的サンプル中のｈＩＬ−１２の量は、抗ｈＩＬ−１２抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１２標準の量に反比例する。
【０２９５】
本発明のＹ６１及びＪ６９５抗体もヒト以外の種から、特に霊長類からＩＬ−１２を検出するために使用できる。例えば、Ｙ６１は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）ザル及びアカゲザルにおいてＩＬ−１２を検出するために使用できる。Ｊ６９５は、カニクイザルザル、アカゲザル及びヒヒにおいてＩＬ−１２を検出するために使用できる。しかし、いずれの抗体もマウスあるいはラットのＩＬ−１２とは交叉反応しない（実施例３、Ｆ項参照）。
【０２９６】
本発明の抗体及び抗体部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（実施例３参照）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（実施例４参照）でｈＩＬ−１２活性を中和することができる。従って、本発明の抗体及び抗体部分は、例えばｈＩＬ−１２を含む細胞培養において、本発明の抗体が交叉反応するＩＬ−１２を持つヒト被験者あるいは他の哺乳類被験者（例えばヒヒ、カニクイザル及びアカゲザルのような霊長類）において、ＩＬ−１２活性を阻害するために使用することができる。好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１２、及びヒヒＩＬ−１２、マルモセット（キヌザル）ＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２及びアカゲザルＩＬ−１２から成る群から選択される少なくとも１つのさらなる霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するが、マウスＩＬ−１２の活性は中和しない、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。例えば、ｈＩＬ−１２を含む又は含むことが疑われる細胞培養において、本発明の抗体又は抗体部分を細胞培地に加えて、培地中のｈＩＬ−１２活性を阻害することができる。
【０２９７】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２活性が有害である疾患に罹病している被験者においてＩＬ−１２活性を抑制するための方法を提供する。ＩＬ−１２は極めて多様な疾患の病態生理に関係づけられてきた（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６；Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：３０６−３１４；Ｂｕｃｈｔら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３４７−３６７；Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８；Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２：１１６９−１１７８、及びＢｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５２：６６７−６７２；Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２）。本発明は、そのような疾患に罹病している被験者においてＩＬ−１２活性を抑制するための方法を提供し、かかる方法は、被験者においてＩＬ−１２活性が抑制されるように本発明の抗体又は抗体部分を被験者に投与することを含む。好ましくは、ＩＬ−１２はヒトＩＬ−１２であり、被験者はヒト被験者である。その代わりに、被験者は、本発明の抗体と交叉反応するＩＬ−１２を発現する哺乳類でもありうる。さらに被験者は、ｈＩＬ−１２を導入された（ｈＩＬ−１２の投与によって又はｈＩＬ−１２トランスジーンの発現によって）哺乳類でもありうる。本発明の抗体は治療のためにヒト被験者に投与することができる（下記でさらに論じる）。さらに、本発明の抗体は、獣医学的目的のため又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体と交叉反応するＩＬ−１２を発現するヒト以外の哺乳類に投与することができる。後者に関しては、そのような動物モデルは本発明の抗体の治療効果を評価するために有用であると考えられる（例えば用量の試験及び投与の時間的経過）。
【０２９８】
ここで使用するとき、「ＩＬ−１２活性が有害である疾患」の語句は、疾患に罹病している被験者におけるＩＬ−１２の存在が、疾患の病態生理の原因である又は疾患の悪化に寄与する因子であることが示されているか若しくは疑われる疾病及び他の障害を含むことが意図されている。従って、ＩＬ−１２活性が有害である疾患は、ＩＬ−１２活性の抑制が疾患の症状及び／又は進行を軽減することが期待される疾患である。そのような疾患は、例えば、上述したような抗ＩＬ−１２抗体を用いて検出することができる、疾患に罹病している被験者の生体液中のＩＬ−１２の濃度上昇（例えば被験者の血清、血漿、滑液等におけるＩＬ−１２の濃度上昇）によって明らかにされうる。ＩＬ−１２活性が有害である疾患の数多くの例が存在する。１つの実施形態では、当該抗体又はその抗原結合部分は、ここで述べる疾病又は障害を治療するために使用できる。もう１つの実施形態では、当該抗体又はその抗原結合部分は、ここで述べる疾病又は障害を治療するための薬剤の製造のために使用できる。いくつかの非制限的特定疾患の治療における本発明の抗体及び抗体部分の使用を下記でさらに論じる：
Ａ．慢性関節リウマチ
インターロイキン−１２は、慢性関節リウマチのような炎症性疾患において役割を果たすことが示唆されてきた。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０メッセージが慢性関節リウマチ患者からの滑液において検出され、ＩＬ−１２が慢性関節リウマチ患者の滑液中に存在することが示された（例えば、Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：３０６−３１４参照）。ＩＬ−１２陽性細胞が慢性関節リウマチ滑膜の下内層に存在することが認められた。本発明のヒト抗体及び抗体部分は、例えば、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ライム関節炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症及び痛風性関節炎を治療するために使用できる。典型的には、当該抗体又は抗体部分は全身的に投与されるが、一部の疾患については抗体又は抗体部分の局所投与が有益であると考えられる。本発明の抗体又は抗体部分は、自己免疫疾患の治療において有用な１つ又はそれ以上の追加治療薬と共に投与することもできる。
【０２９９】
慢性関節リウマチのためのコラーゲン誘発の関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて、関節炎に先立って抗ＩＬ−１２ｍＡｂ（ラット抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体、Ｃ１７．１５）でマウスを処置すると、発症が強く抑制され、疾患の発生率と重症度が低下した。関節炎発症後早期に抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処置すると重症度が低下したが、疾患の発症後、より後期に抗ＩＬ−１２ｍＡｂでマウスを処置した場合には、ごくわずかしか疾患の重症度に作用を及ぼさなかった。
【０３００】
Ｂ．クローン病
インターロイキン−１２は、炎症性腸疾患であるクローン病においても役割を果たす。クローン病の患者の腸粘膜ではＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の発現上昇が起こる（例えばＦａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８；Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：８２３−８３２；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２：１１６９−１１７８；Ｂｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：６６７−６７２参照）。抗ＩＬ−１２抗体は、大腸炎のマウスモデル、例えばＴＮＢＳ誘発大腸炎のＩＬ−２ノックアウトマウスにおいて、また最近ではＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて疾患を抑制することが示された。それ故、本発明の抗体及び抗体部分は炎症性腸疾患の治療において使用することができる。
【０３０１】
Ｃ．多発性硬化症
インターロイキン−１２は、多発性硬化症の鍵となるメディエイタとして示唆されてきた。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０メッセージ又はＩＬ−１２自体の発現を多発性硬化症の患者の病巣において明らかにすることができる（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６、Ｄｒｕｌｏｖｉｃら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４７：１４５−１５０）。多発性硬化症の慢性進行性患者はＩＬ−１２の高い循環レベルを有している。多発性硬化症の患者からのＴ細胞と抗原呈示細胞（ＡＰＣ）を検討すると、Ｔｈ１型免疫応答を導く進行性多発性硬化症の基礎として、自己永続系の免疫相互作用が明らかになった。Ｔ細胞からのＩＮＦ−γの分泌上昇がＡＰＣによるＩＬ−１２産生の上昇を導き、それがＴｈ１型免疫の活性化と疾患の慢性状態へと導くサイクルを永続化させた（Ｂａｌａｓｈｏｖら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５９９−６０３）。多発性硬化症におけるＩＬ−１２の役割は、多発性硬化症のマウス及びラットの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを使用して検討されてきた。マウスにおける多発性硬化症の再発性−弛張性ＥＡＥモデルにおいて、抗ＩＬ−１２ｍＡｂによる前処置は麻痺を遅延させ、臨床スコアを低下させた。麻痺のピーク時又はその後の寛解期の間に抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処置すると、臨床スコアを低下させた。従って、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ヒトにおける多発性硬化症に関連する症状を軽減するのに役立つと考えられる。
【０３０２】
Ｄ．インスリン依存性糖尿病
インターロイキン−１２は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の重要なメディエイタとして示唆されてきた。ＩＤＤＭはＩＬ−１２の投与によりＮＯＤマウスにおいて誘発され、抗ＩＬ−１２抗体はＩＤＤＭの養子免疫伝達モデルにおいて保護的であった。早期発症のＩＤＤＭ患者はしばしば、ある程度の残存膵島細胞機能が維持される、いわゆる「ハネムーン期間」を経験する。これらの残存膵島細胞はインスリンを産生し、投与されるインスリンよりも良好に血中グルコースレベルを調節する。抗ＩＬ−１２抗体でこれらの早期発症患者を治療することは、膵島細胞のさらなる破壊を予防し、それによってインスリンの内因性ソースを維持すると考えられる。
【０３０３】
Ｅ．乾癬
インターロイキン−１２は乾癬の鍵となるメディエイタとして示唆されてきた。乾癬は、ＴＨ１型サイトカイン発現プロフィールに関連する急性及び慢性皮膚病変を含む。（Ｈａｍｉｄら（１９９６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２５−２３１；Ｔｕｒｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６９０−６９９）。罹病ヒト皮膚サンプルにおいてＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０ｍＲＮＡが検出された。それ故、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、乾癬のような慢性皮膚疾患を軽減するのに役立つと考えられる。
【０３０４】
下記の実施例により本発明をさらに説明するが、かかる実施例はいかなる意味においても制限と解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用される、文献参照、発行済特許、及び公開特許願を含めたすべての引用参考文献の内容は、明白に参照してここに組み込まれる。さらに、ここに添付するすべての表（付属物Ａ参照）の内容が参照して組み込まれることは明白であろう。
【０３０５】
【表２】
2014138594.tif 000005
2014138594.tif 000006
2014138594.tif 000007
【０３０６】
【表３】
2014138594.tif 000008
2014138594.tif 000009
2014138594.tif 000010
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2014138594.tif 000015
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【０３０７】
【表４】
2014138594.tif 000017
【０３０８】
【表５】
2014138594.tif 000018
【実施例】
【０３０９】
実施例１：抗ＩＬ−１２抗体単離
ヒト扁桃（ｓｃＦｖ１と称される）、扁桃と末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（ｓｃＦｖ２と称される）、及び骨髄由来リンパ球（ＢＭＤＬと称される）から誘導されるｍＲＮＡからのヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製した３つの別個のファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによってｈＩＬ−１２に対する抗体を単離した。ライブラリーの構築と選択のための方法は、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４に記述されている。
【０３１０】
抗原、ヒトＩＬ−１２ｐ７０サブユニット、ヒトＩＬ−１２ｐ４０サブユニット、キメラＩＬ−１２（マウスｐ４０／ヒトｐ３５）、マウスＩＬ−１２、ビオチニル化ヒトＩＬ−１２及びビオチニル化キメラＩＬ−１２を使用して、ライブラリーをスクリーニングした。標準的な手順を用いて（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）抗原をイムノチューブ上に被覆することにより、ＩＬ−１２特異性抗体を選択した。ＩＬ−１２又はビオチニル化ＩＬ−１２を用いてｓｃＦｖライブラリー２をスクリーニングし、有意の数のＩＬ−１２特異性結合剤を生成した。５つの異なるクローン型を選択し、ＢｓｔＮ１酵素消化パターンによって測定して、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。主要なクローン型は、ＶＨＤＰ５８／ＶＬＤＰＬ１１、ＶＨＤＰ７７／ＶＬＤＰＫ３１、ＶＨＤＰ４７／ＶＬ及びＶＨＤＰ７７／ＶＬＤＰＫ３１でり、これらすべてがＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを認識した。
【０３１１】
ＩＬ−１２ｐ７０によるＢＭＤＬライブラリーのスクリーニングは３つの異なるクローン型を生じた。これらのうち２つは交叉反応性クローンであることが認められた。支配的なクローンを配列決定すると、ＶＨＤＰ３５／ＶＬＤＰで構成されていた。このクローンはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを認識する。ＩＬ−１２ｐ７０を用いたｓｃＦｖライブラリー１のスクリーニングは特異的ＩＬ−１２抗体を生じなかった。
【０３１２】
ｐ４０サブユニットではなく、ＩＬ−１２のｐ７０ヘテロダイマー又はｐ３５サブユニットに選択的に結合するＩＬ−１２抗体を同定するため、結合ｓｃＦｖ１＋２ライブラリー及びＢＭＤＬライブラリーを使用した。ｐ７０ヘテロダイマー又はｐ３５サブユニットを認識するＩＬ−１２抗体を選択するため、ファージライブラリーを遊離ｐ４０の存在下で予備インキュベーションして、選択した。単離したクローンを配列決定すると、９種類の異なる抗体系列を明らかにした。サブユニットの選択性を「ｍｉｃｒｏ−Ｆｒｉｇｕｅｔ」滴定によってさらに分析した。ｓｃＦｖを含む上清をＥＬＩＳＡにおいてビオチン捕獲ＩＬ−１２上で滴定し、ＥＤ５０を決定した。５０％ＥＤを生じるｓｃＦｖの濃度を、遊離ｐ７０又はｐ４０（阻害因子）の濃度を上昇させながら予備インキュベーションした。ビオチン−ＩＬ−１２被覆したプレート上のＥＬＩＳＡシグナルの低下を測定し、遊離ｐ７０又はｐ４０の濃度に対してプロットした。これは、ｐ７０とｐ４０に関して各々のクローンについてのＩＣ５０を提供した。両者のサブユニットについての滴定がオーバーラップする場合は、ｓｃＦｖはｐ４０とｐ７０の両方に結合する。これからの何らかの変位は、ｐ４０に対するｐ７０の選択性の度合を示す。
【０３１３】
Ｂ．ＩＬ−１２に特異的な抗体系列（Ｊｏｅ９）の親和性成熟
クローンを、ＩＬ−１２レセプタ結合アッセイ（ＲＢＡと称する）においてＩＬ−１２がそのレセプタに結合するのを阻害する能力に関して試験し、また実施例３で述べるように、ＩＬ−１２が誘発する、ＰＨＡ刺激ヒト芽細胞の増殖を阻害する能力に関して試験した（ＰＨＡアッセイ）。クローンＪｏｅ９はＲＢＡ及びＰＨＡアッセイの両方でＩＣ５０値が最も低く、両方のアッセイにおいてＩＣ５０値は１×１０−６Ｍであった。さらに、Ｊｏｅ９のＨ鎖可変領域（ＶＨ）は、ＶＢＡＳＥデータベースから同定された最も近い生殖細胞系配列、ＣＯＳ−３と比べて最小の変化を有していた。表１（付属物Ａ参照）は、ＣＯＳ−３がそのメンバーである生殖細胞系配列のＶＨ３ファミリー、ならびに生殖細胞系配列のＶλ１ファミリーのメンバーを示している。それ故、Ｊｏｅ９を親和性成熟のために選択した。Ｊｏｅ９野生型（Ｊｏｅ９ｗｔ）抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を図１Ａ−１Ｄに示す。
【０３１４】
Ｊｏｅ９の親和性を高めるため、Ｈ鎖とＬ鎖の両方の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の様々な突然変異を誘起した。Ｈ鎖ＣＤＲ３（「Ｈ３」と称する）又はＬ鎖ＣＤＲ３（「Ｌ３」と称する）のいずれかに特異的な縮重オリゴヌクレオチドを使用し、各々のＣＤＲ３中平均３個の塩基置換（「スパイク」と称する）で、部位特定ＰＣＲ突然変異導入法によってＣＤＲ３変異体を作製した。Ｈ鎖ＣＤＲ３のＰＣＲ突然変異導入は、４個のヌクレオチドすべてのランダム混合物、
【０３１５】
【化１】
2014138594.tif 000019
を含む縮重Ｈ鎖オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドｐＵＣリバースタグ
【０３１６】
【化２】
2014138594.tif 000020
を使用して実施し、Ｈ鎖ＣＤＲ３突然変異体のリストを作製した。親Ｌ鎖をＪｏｅ９逆向きオリゴヌクレオチド
【０３１７】
【化３】
2014138594.tif 000021
及びｆｄｔｅｔｅｓｅｑ２４＋２１オリゴヌクレオチド
【０３１８】
【化４】
2014138594.tif 000022
を使用して増幅した。
【０３１９】
２つのＰＣＲ産物を相補性を用いて、ＰＣＲ構築反応における２個の断片のアニーリングを推進し、完全長の組換えｓｃＦｖライブラリーをｐＵＣリバースタグ（配列番号５８１）とｆｄタグ
【０３２０】
【化５】
2014138594.tif 000023
で増幅した。４個のヌクレオチドすべてのランダム混合物、
【０３２１】
【化６】
2014138594.tif 000024
を含むＬ鎖オリゴヌクレオチドと、Ｊｏｅ９逆向きオリゴヌクレオチド
【０３２２】
【化７】
2014138594.tif 000025
を使用してＬ鎖のＰＣＲ突然変異導入を実施し、Ｌ鎖ＣＤＲ３突然変異体のリストを作製した。親Ｈ鎖をｐＵＣリバースタグ（配列番号５８１）及びＨｕＪＨ３ＦＯＲオリゴヌクレオチド
【０３２３】
【化８】
2014138594.tif 000026
で増幅した。２つのＰＣＲ産物を相補性を用いて、ＰＣＲ構築反応における２個の断片のアニーリングを推進し、完全長の組換えｓｃＦｖライブラリーをリバースタグ
【０３２４】
【化９】
2014138594.tif 000027
及びＨｕＪλ２−３ＦＯＲ  ＮＯＴオリゴヌクレオチド
【０３２５】
【化１０】
2014138594.tif 000028
で増幅した。
【０３２６】
１ｎＭビオチニル化ＩＬ−１２を用いてＨ鎖ＣＤＲ３突然変異体を選択し、遊離ＩＬ−１２又はｐ４０を７ｎＭの濃度で含むＰＢＳ中、室温で１時間洗浄した。クローンをファージＥＬＩＳＡによって分析し、ＩＬ−１２に結合したものを、低密度ＩＬ−１２チップを使用してＢＩＡコア反応速度結合試験において検討した（実施例５のＢＩＡコア分析の手順参照）。一般にＢＩＡコア分析は、ＢＩＡコアシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によりリガンド（バイオセンサーマトリックス上に固定された組換えヒトＩＬ−１２）と分析物（溶液中の抗体）間のリアルタイムの結合相互作用を測定する。このシステムは、デキストランバイオセンサーマトリックス内のタンパク濃度の変化を検出するためにＳＰＲの光学特性を利用する。タンパクを既知の濃度でデキストランマトリックスに共有結合させる。デキストランマトリックスを通して抗体を注入すると、注入した抗体と固定されたリガンド間の特異結合によりマトリックスのタンパク濃度が上昇し、ＳＰＲシグナルの変化を生じさせる。これらのＳＰＲシグナルの変化を共鳴単位（ＲＵ）として記録し、センサーグラムのｙ軸に沿って経時的に表示する。オフ速度（ｋｏｆｆ）、オン速度（ｋｏｎ）、結合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）定数を測定するため、ＢＩＡコア反応速度評価ソフトウエア（２．１バージョン）を使用した。ｋｏｆｆ速度の改善を示したクローンを中和アッセイによって分析した。中和アッセイは、抗体によるＩＬ−１２のレセプタへの結合の阻害（ＲＢＡアッセイ）、ＰＨＡ刺激ヒト芽細胞におけるＩＬ−１２誘導の増殖の阻害（ＰＨＡアッセイ）、及びヒト芽細胞によるＩＬ−１２誘導のインターフェロンγ産生の阻害（ＩＦＮγアッセイ）を含んだ。Ｈ鎖ＣＤＲ３のスパイククローン、７０−１から７０−１３までについての、中和アッセイからの解離速度及び／又はＩＣ５０値の要約を表２に示す（付属物Ａ参照）。クローン７０−１は、親であるＪｏｅ９クローンよりも良好なｋｏｆｆ速度を示し、２．０×１０−７Ｍという最も低いＩＣ５０値を有していた。それ故、クローン７０−１を完全なＩｇＧ１への変換のために選択した。
【０３２７】
１ｎＭビオチン−ＩＬ−１２を用いてＬ鎖ＣＤＲ３突然変異体を選択し、７ｎＭの遊離ｐ４０を含むＰＢＳで洗浄した。クローンをファージＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＩＬ−１２に結合したものを、低密度ＩＬ−１２チップを使用してＢＩＡコア結合分析において試験した。親Ｊｏｅ９クローンよりも良好なオフ速度を示したクローンを、ＩＬ−１２レセプタ結合の阻害又はＰＨＡ芽細胞増殖の阻害のいずれかを測定する中和アッセイにおいて試験した。Ｌ鎖ＣＤＲ３の突然変異体クローン、７８−３４から７９−１までについての、中和アッセイからの解離速度及び／又はＩＣ５０値の要約を表２に示す（付属物Ａ参照）。
【０３２８】
ｋｏｆｆ速度に基づくと、クローン７８−３４と７８−３５は親Ｊｏｅ９クローンと比較して改善されたｋｏｆｆ速度を示した。これらのクローンの両方をＨ鎖突然変異体との組合せ分析のために選択した。
【０３２９】
Ｃ．組合せクローン
最良の結合特性を示した突然変異体Ｌ鎖及びＨ鎖クローンを、組合せとｓｃＦｖの構築のために使用した。改善された効力特性を持つ突然変異体クローンを、上述したような突然変異を生じたＶＨ及びＶＬセグメントのＰＣＲオーバーラップ伸長とプル・スルー（ｐｕｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ）によって組み合わせた。表２（付属物Ａ参照）に示すクローン１０１−１４から２６−１までが、Ｈ鎖突然変異体（７０−２、７０−１３及び７０−１）とＬ鎖突然変異体（７８−３４、７８−３５及び７９−１）の組合せから生成された。これらのクローンに関する中和アッセイからのｋｏｆｆ速度及び／又はＩＣ５０を表２に示す。
【０３３０】
ＢＩＡコア結合分析により、Ｈ鎖ＣＤＲ３突然変異体クローン７０−１とＬ鎖ＣＤＲ３突然変異体クローン７８−３４の組合せから生成されたクローン１０１−１１は、０．００４５ｓ−１のオフ速度を持つと同定された。このｋｏｆｆ速度は、Ｈ鎖ＣＤＲ３突然変異体クローン７０−１（０．０１３４ｓ−１）あるいはＬ鎖ＣＤＲ３突然変異体クローン７８−３４（０．０１６４ｓ−１）単独についてのｋｏｆｆ速度に比べて有意の改善であった。さらに、クローン１０１−１１は中和アッセイにおいて有意の改善を示した。それ故、クローン１０１−１１を下記に述べるような親和性成熟のために選択した。
【０３３１】
Ｄ．クローン１０１−１１の親和性成熟
クローン１０１−１１のさらなる親和性成熟は、スパイクオリゴヌクレオチドプライマーを使用した１０１−１１のＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲ３の両方のＰＣＲ突然変異導入のサイクルの繰り返しから成るものであった。ビオチニル化ＩＬ−１２（ｂｉｏ−ＩＬ−１２）の濃度が低いクローンを選択した。突然変異を生じたクローンの結合特性をＢＩＡコア結合アッセイ及びＲＢＡ、ＰＨＡ中和アッセイによって評価した。クローン１３６−９から１７０−２５までについてのｋｏｆｆ速度及び／又はＩＣ５０値を表２に示す（付属物Ａ参照）。クローン１０３−１４は、レセプタ結合アッセイとＰＨＡ芽細胞アッセイの両方で改善されたＩＣ５０値を示した。クローン１０３−１４は低いｋｏｆｆ速度も示し、それ故、さらなる親和性成熟のための選択した。
【０３３２】
Ｅ．クローン１０３−１４のＬ鎖ＣＤＲ３のランダム化ライブラリーの作製と選択
クローン１０３−１４のＬ鎖ＣＤＲ３（ＱＳＹＤＲＧＦＴＧＳＭＶ（配列番号５９０））を、下記に概説する３つの異なるライブラリーを使用して系統的にランダム化した。Ｘは、配列ＮＮＳ配列のランダム化コドンによってコードされ、Ｎは何らかのヌクレオチド、Ｓはデオキシシトシン又はデオキシグアニジンのいずれかである。
Ｌ３．１＝ＸＸＸＸＸＸＦＴＧＳＭＶ（配列番号５９１）
Ｌ３．２＝ＱＳＹＸＸＸＸＸＸＳＭＶ（配列番号５９２）
Ｌ３．３＝ＱＳＹＤＲＧＸＸＸＸＸＸ（配列番号５９３）
【０３３３】
クローン１０３−１４の３つのＬ鎖ＣＤＲ（Ｌ３．１、Ｌ３．２及びＬ３．３と称する）すべてのランダム化突然変異誘発を実施した。クローン１０３−１４のＨ鎖ＣＤＲ３（Ｈ３と称する）は突然変異を起こさなかった。クローン１０３−１４に基づく４つのランダム化ライブラリー（Ｈ３及びＬ３．１、Ｌ３．２＆Ｌ３．３）を構築し、抗原濃度の制限及び過剰の遊離抗原（ｐ４０及びｐ７０）の存在又は不在を使用することを含む、幅広い選択条件に供した。選択からの産物（クローン７３−Ｂ１から９９−Ｇ１１まで）を主としてＢＩＡコアによって、また場合によってはＲＢＡでスクリーニングして、表２に示している（付属物Ａ参照）。
【０３３４】
１０３−１４のＬ鎖ＣＤＲのランダム突然変異誘発はクローンＹ６１を生じ、かかるクローンは、親クローン１０３−１４に比べてＩＣ５０値の有意の改善を示した。Ｙ６１を全体的ＩｇＧ１への変換のために選択した。全体的Ｙ６１−ＩｇＧ１は、ＰＨＡアッセイにより約１３０ｐＭと測定されたＩＣ５０値を持つ。ＩＣ５０値は５０倍モル過剰の遊離ｐ４０によっても影響されず、遊離ｐ４０がＹ６１抗ＩＬ−１２抗体と交叉反応せず、ヘテロダイマーへの抗体結合を低下させないことを明らかにした。Ｙ６１Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の完全長配列を下記に示す。
【０３３５】
Ｙ６１Ｈ鎖可変領域ペプチド配列
【０３３６】
【化１１】
2014138594.tif 000029
【０３３７】
Ｙ６１Ｌ鎖可変領域ペプチド配列
【０３３８】
【化１２】
2014138594.tif 000030
ＣＤＲ残基はＫａｂａｔの定義に従って割り当てている。
【０３３９】
実施例２：過突然変異及び接触位置におけるＹ６１の突然変異
典型的には、改善された親和性を持つ組換え抗体の選択はファージディスプレイ法を用いて実施できる。これは、ＣＤＲ残基の組合せをランダムに突然変異させて、異なる配列の一本鎖抗体を含む大きなライブラリーを作製することによって実現される。典型的には、抗体−抗原反応において平衡に達する能力に基づいて、改善された親和性を持つ抗体を選択する。しかし、Ｙ６１ｓｃＦＶがファージ表面に発現されて、ＩＬ−１２と共にインキュベーションしたとき、系が正常な抗体−抗原平衡に達することを可能にする選択条件を見出すことができなかった。精製Ｙ６１ｓｃＦｖは正常な解離動態を示すので、ｓｃＦＶ−ファージは、おそらく非特異的相互作用のためにＩＬ−１２に結合したままであった。Ｙ６１へのファージディスプレイ親和性成熟の通常の方法（すなわち多数のＣＤＲ残基の突然変異誘発によるライブラリーの作製と選択）が使用できなかったため、個々のＣＤＲ位置を突然変異させる新しい戦略を開発した。
【０３４０】
この戦略は、突然変異のための適切なＣＤＲ位置の選択を含み、好ましい選択突然変異位置、接触位置、及び／又は過突然変異位置であるアミノ酸の同定と選択に基づく。接触位置は、抗原が抗体と相互作用するとき抗原と接触する確率の高い残基と定義され、一方過突然変異位置は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の親和性成熟の間に体細胞過突然変異を起こす確率が高いとみなされる残基と定義される。好ましい選択突然変異誘発位置は、接触と過突然変異の両方の位置にあたるＣＤＲ位置である。Ｙ６１抗体は実施例１で述べた手順を用いてＣＤＲ３領域で既に至適化されており、それ故、ファージディスプレイ選択法を使用して抗体結合部位の中心にある領域をさらに改善することは困難であった。有害な抗原−抗体接触を取り除くことによって、又は新しい接触を設計することによって、ＣＤＲ３領域の外側の潜在的接触位置の突然変異によって活性のより大きな改善を得た。
【０３４１】
抗原との接触点とみなされるＹ６１のアミノ酸残基及びｉｎ  ｖｉｖｏ親和性成熟の間の体細胞過突然変異の部位であるそれらのＣＤＲ位置を表３に示す（付属物Ａ参照）。Ｙ６１親和性成熟のために、ＣＤＲ３の外側の１５残基、Ｌ３ループ内の３残基、及びＨ３ループの５残基をＰＣＲ突然変異誘発のために選択した。
【０３４２】
Ｙ６１ｓｃＦｖ遺伝子を突然変異誘発のためにｐＵＣ１１９（Ｓｆｉ）プラスミドベクターにクローニングした。各々の選択位置に突然変異を生じさせるためにランダム化コドンでオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。ＰＣＲ突然変異誘発後、少数のクローン（〜２４個）を配列決定し、宿主細胞、例えば細菌、酵母又は哺乳類宿主細胞において発現した。発現された抗体を精製し、ＢＩＡコアシステムを用いてｋｏｆｆを測定した。次にＹ６１と比較して改善されたオフ速度を持つクローンを中和アッセイにおいて試験した。この手順を他のＣＤＲ位置についても繰り返した。改善された中和活性を持つことを示す個々の突然変異を組み合わせて、さらに一層大きな中和潜在能を持つ抗体を作製した。
【０３４３】
中和効力を改善するために突然変異させたＹ６１のＣＤＲ位置、及び各位置でのそれぞれのアミノ酸置換を図２Ａ−２Ｈに示す。ＢＩＡコア分析によって測定したオフ速度を示している。これらのオフ速度は各々の表の右側のヒストグラムにも示している。
【０３４４】
Ｈ３０、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ５０、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ１０１、Ｌ５０、Ｌ９２、Ｌ９３の位置でのこれらの置換の結果は、検討したすべてのアミノ酸置換がＹ６１よりも低いオフ速度を持つ抗体を生じたことを明らかにした。Ｈ５２、Ｌ３２、及びＬ５０の位置で、１個のアミノ酸置換だけがＹ６１のオフ速度を改善することが認められ、他の変化はすべて活性に好ましくない作用を及ぼした。Ｌ５０については、この１個のＧｌｙ→Ｔｙｒ変化はＹ６１の中和効力を有意に（５−１０倍）改善した。結果はＹ６１活性へのこれらの位置の重要性を明らかにしており、ほとんどの場合にファージディスプレイが至適残基を選択できたことを示唆している。しかし、Ｈ３１、Ｈ５６、Ｌ３０、及びＬ９４の位置では、いくつかの置換がＹ６１のオフ速度を改善することが認められ、ファージディスプレイアプローチでは至適残基を選択できなかったが、これらの位置も抗原結合にとって重要であることを示唆した。
【０３４５】
Ｙ６１の接触位置及び過突然変異位置の選択突然変異は、Ｙ６１の中和能力を改善する、Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸残基Ｌ５０、及びＬ鎖ＣＤＲ３の残基Ｌ９４を同定した。これらの突然変異の組合せは付加的な効果を生み出し、中和能力の有意の上昇を示す抗体、Ｊ６９５を生じた。Ｊ６９５のＨ鎖及びＬ鎖可変領域配列の完全長配列を下記に示す。
【０３４６】
Ｊ６９５のＨ鎖可変領域ペプチド配列
【０３４７】
【化１３】
2014138594.tif 000031
【０３４８】
Ｊ６９５のＬ鎖可変領域ペプチド配列
【化１４】
2014138594.tif 000032
【０３４９】
ＣＤＲ残基はＫａｂａｔの定義に従って割り当てている。
【０３５０】
Ｊｏｅ９からＪ６９５までの経路にあるクローンの系列発生を示すＨ鎖及びＬ鎖可変領域配列の整列の要約を図１Ａ−１Ｄに示す。ＣＤＲ及び残基の番号付けはＫａｂａｔに従っている。
【０３５１】
実施例３：抗ｈＩＬ−１２抗体の機能的活性
本発明のヒト抗ヒトＩＬ−１２抗体の機能的活性を調べるため、抗体がＩＬ−１２活性を阻害する能力を測定するいくつかのアッセイにおいて抗体を使用した。
【０３５２】
Ａ．ヒトＰＨＡ活性化リンパ芽球の調製
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ７．１に述べられているように１５００ｒｐｍで４５分間のフィコール−ハイパック比重差遠心によって健常ドナーから採集したロイコパックから、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。水性血液溶液とリンパ球分離媒質の界面でＰＢＭＣを採集し、１５００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄してフィコール−パック粒子を除去した。
【０３５３】
次にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６．１６に述べられているようにＰＢＭＣを活性化してリンパ芽球を形成した。洗浄したＰＢＭＣを、０．２％（ｖ／ｖ）ＰＨＡ−Ｐ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を補足したＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０培地、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中に０．５−１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、５％ＣＯ２大気中３７℃で４日間培養した。４日後、細胞培養を、ＲＰＭＩ完全培地プラス０．２％（ｖ／ｖ）ＰＨＡ−Ｐ及び５０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２中、容量ベースで１：１に分けた。組換えヒトＩＬ−２は、ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡを担う発現ベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクションすることによって生成し（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４４８４−４４９０参照）、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１３８２号に述べられているように精製した。次に細胞培養をさらに１−３日間インキュベーションした。ＰＨＡ芽細胞を採集し、ＲＰＭＩ完全培地で２回洗浄して、９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯ中１０×１０６細胞／ｍｌで冷凍した。
【０３５４】
ＩＬ−１２レセプタ結合アッセイ（Ｂ項参照）に使用するＰＨＡ芽細胞は、ＩＬ−２の存在下で１日培養したあと採集し、一方ＰＨＡ芽細胞増殖アッセイ（Ｃ項参照）及びインターフェロン−γ誘導アッセイ（Ｄ項参照）に使用するＰＨＡ芽細胞は、ＩＬ−２の存在下で３日間の培養後に採集した。
【０３５５】
Ｂ．ＩＬ−１２レセプタ結合アッセイ
抗ＩＬ−１２抗体が、ＰＨＡ芽細胞上のＩＬ−１２レセプタへの放射標識ＩＬ−１２の結合を阻害する能力を次のように分析した。種々の濃度の抗ＩＬ−１２抗体を、結合緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０、５％ＦＢＳ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４）中で５０−１００ｐＭの１２５Ｉ−ｈＩＬ−１２（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ標識法を使用してＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔからヨウ素標識ｈＩＬ−１２を２０−４０ｍＣｉ／ｍｇの比活性で調製した）と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。上述したように分離したＰＨＡ芽細胞を１回洗浄して、結合緩衝液中に２×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。ＰＨＡ芽細胞（１×１０６細胞）を抗体／１２５Ｉ−ｈＩＬ−１２混合物に加え、室温で２時間インキュベーションした。アッセイ混合物を室温で３０秒間遠心分離にかけ、液体を吸引して、０．１ｍｌ結合緩衝液で洗ったあと、１０，０００×ｇで４分間、４℃で遠心分離して、細胞結合放射能を遊離１２５Ｉ−ｈＩＬ−１２から分離した。ガンマカウンターを使用して、細胞ペレットを細胞結合放射能に関して検査した。抗体不在下で総結合を測定し、アッセイに２５ｎＭ非標識ＩＬ−１２を含めることによって非特異的結合を測定した。インキュベーションは２回実施した。
【０３５６】
Ｙ６１及びＪ６９５ヒト抗ＩＬ−１２抗体を用いたＩＬ−１２レセプタ結合アッセイでは、両方の抗体がＩＬ−１２レセプタ結合の同等の阻害を示した。Ｙ６１は約１．６×１０−１１ＭのＩＣ５０値でＩＬ−１２レセプタ結合を阻害し、Ｊ６９５は約１．１×１０−１１ＭのＩＣ５０値であった。
【０３５７】
Ｃ．ヒトＰＨＡ芽細胞増殖アッセイ
抗ＩＬ−１２抗体を、ＰＨＡ芽細胞増殖（かかる増殖はＩＬ−１２によって刺激される）を阻害する能力に関して評価した。抗ＩＬ−１２抗体の連続希釈を、マイクロタイタープレート（Ｕ底、９６穴、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の１００ｍｌ  ＲＰＭＩ完全培地中で、２３０ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ−１２と共に５％ＣＯ２、３７℃で１時間プレインキュベーションした。上述したように分離したＰＨＡ芽細胞を１回洗浄し、ＲＰＭＩ完全培地中に３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。ＰＨＡ芽細胞（１００ｍｌ、３×１０４細胞）を抗体／ｈＩＬ−１２混合物に加え、５％ＣＯ２、３７℃で３日間インキュベーションし、０．５ｍＣｉ／穴（３Ｈ）−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で４−６時間標識した。培養内容物をセルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）によってガラス繊維フィルター上に採集し、細胞ＤＮＡへの（３Ｈ）−チミジンの取込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。すべてのサンプルを２回検定した。
【０３５８】
種々の濃度のｐ７０：ｐ４０（すなわちＩＬ−１２ヘテロダイマー対遊離ｐ４０サブユニットの比率）の存在下での中和の結果を表４に示す（付属物Ａ参照）。
【０３５９】
ＰＨＡ芽細胞増殖アッセイにおけるＹ６１ヒト抗ＩＬ−１２抗体の分析は、過剰のｐ４０を含まないＩＬ−１２ｐ７０だけの存在下で（ｐ７０：ｐ４０の比率は１：０）、抗体が約１．８×１０−１０ＭのＩＣ５０値でＰＨＡ芽細胞増殖を阻害したことを明らかにした。５０倍過剰の遊離ｐ４０の存在下では（ｐ７０：ｐ４０の比率は１：５０）、Ｙ６１抗体は約１．８×１０−１０ＭのＩＣ５０値でＰＨＡ芽細胞増殖を阻害した。この結果は、Ｙ６１が芽細胞増殖を阻害する能力は過剰のｐ４０の存在によって損なわれないことを示している。
【０３６０】
ヒト抗ＩＬ−１２抗体、Ｊ６９５は、１：０の比率のｐ７０：ｐ４０の存在下で、約１．０×１０−１１ＭのＩＣ５０値でＰＨＡ芽細胞増殖を阻害した。１：５０の比率のｐ７０：ｐ４０の存在下では、この抗体は約５．８±２．８×１０−１２Ｍ（ｎ＝２）のＩＣ５０値でＰＨＡ芽細胞増殖を阻害し、過剰のｐ４０が抗体に対してごくわずかな阻害作用を及ぼすことを明らかにした。全体的な結果は、Ｌ５０及びＬ９４での突然変異により、Ｙ６１と比較してＪ６９５の改善された中和活性を示している。
【０３６１】
Ｄ．インターフェロン−γ誘導アッセイ
抗ＩＬ−１２抗体が、ＰＨＡ芽細胞によるＩＦＮγの産生（かかる産生はＩＬ−１２によって刺激される）を阻害する能力を次のように分析した。種々の濃度の抗ＩＬ−１２抗体を、マイクロタイタープレート（Ｕ底、９６穴、Ｃｏｓｔａｒ）の１００ｍｌ  ＲＰＭＩ完全培地中で、２００−４００ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ−１２と共に５％ＣＯ２、３７℃で１時間プレインキュベーションした。上述したように単離したＰＨＡ芽細胞を１回洗浄し、ＲＰＭＩ完全培地中に１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。ＰＨＡ芽細胞（１×１０６細胞  １００μｌ）を抗体／ｈＩＬ−１２混合物に加え、５％ＣＯ２、３７℃で１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞不含上清１５０μｌを各穴から取り出し、産生されたヒトＩＦＮγのレベルをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＡ，Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって測定した。
【０３６２】
このアッセイにおけるヒト抗ｈＩＬ−１２抗体、Ｙ６１の分析は、Ｙ６１が約１．６×１０−１０ＭのＩＣ５０値でヒトＩＦＮγの産生を阻害したことを明らかにし、一方ヒト抗ＩＬ−１２抗体、Ｊ６９５は約５．０±２．３×１０−１２Ｍ（ｎ＝３）のＩＣ５０値でヒトＩＦＮγの産生を阻害した。この結果は、Ｌ５０とＬ９４における修飾の結果としてＪ６９５の親和性の実質的な改善を示している。
【０３６３】
Ｅ．分離したＰＢＭＣからの非ヒトＩＬ−１２の誘導
ヒト抗ｈＩＬ−１２抗体と他の種からのＩＬ−１２の交叉反応性を調べるため、非ヒトＩＬ−１２を次のように生成した。カニクイザル、ヒヒ及びイヌ、ＰＢＭＣについてはリンホプレップ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、イヌＰＢＭＣについてはＡｃｃｕ−ｐａｑｕｅ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉ．Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、あるいはラットＰＢＭＣについてはＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−ｒａｔ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｃｉａｌ  ＆  Ｓｃｉ．Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して、上述したような密度勾配遠心分離によって新鮮ヘパリン化血からＰＢＭＣを分離した。
【０３６４】
次にＰＢＭＣを上述したように誘導してＩＬ−１２を生成した（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７６，１３８７−１３９８、Ｖｉｌｌｉｎｇｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，３９４６−３９５４、Ｂｕｅｔｔｎｅｒら（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０，２４１−２４８）。洗浄したＰＢＭＣを、０．００７５％（ｗ／ｖ）のＳＡＣ（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）又は１−５ｍｇ／ｍｌ  ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）プラス０．００７５％ＳＡＣを補足したＲＰＭＩ完全培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、５％ＣＯ２大気中３７℃で１８時間インキュベーションした。細胞不含でＳＡＣ不含の培地を、遠心分離と０．２ｍｍフィルターを通して濾過することによって採集した。
【０３６５】
アカゲザルからのＩＬ−１２は、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡから組換えアカゲザルＩＬ−１２として入手した。
【０３６６】
Ｆ．マウス２Ｄ６細胞増殖アッセイ
マウスＴ細胞クローン２Ｄ６はマウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−１２に応答して増殖する（Ｍａｒｕｏら（１９９７）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６１，３４６−３５２）。ラットＩＬ−１２を含むラットＰＢＭＣ上清に応答した有意の増殖も検出された。かかる細胞はイヌ、カニクイザル、ヒヒ又はヒトＩＬ−１２には応答しない。５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（βＭＥ）と３０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１２を補足したＲＰＭＩ完全培地中でマウス２Ｄ６細胞を増殖させた。アッセイの１日前に、マウスＩＬ−１２を洗い出し、細胞をＲＰＭＩ完全培地プラスβＭＥ中でひと晩インキュベーションした。
【０３６７】
抗ＩＬ−１２抗体の連続希釈を、マイクロタイタープレート（Ｕ底、９６穴、Ｃｏｓｔａｒ）において１００ｍｌ  ＲＰＭＩ完全培地プラスβＭＥ中で、４０ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１２と共に５％ＣＯ２、３７℃で１時間プレインキュベーションした。２Ｄ６細胞を１回洗浄し、βＭＥを含むＲＰＭＩ完全培地に１×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。２Ｄ６細胞（１００μｌ、１×１０４細胞）を抗体／ｈＩＬ−１２混合物に加え、５％ＣＯ２、３７℃で３日間インキュベーションし、０．５ｍＣｉ／穴（３Ｈ）−チミジンで４−６時間標識した。培養内容物を採集し、液体シンチレーションカウンターで計数した。すべてのサンプルを２回検定した。
【０３６８】
Ｇ．非ヒトＩＬ−１２とＪ６９５の種交叉反応性
いくつかのヒト以外の種から分離したＰＢＭＣを使用して非ヒトＩＬ−１２とＪ６９５の種交叉反応性を分析した。ラット、イヌ、カニクイザル及びヒヒＰＢＭＣ上清中の非ヒトＩＬ−１２活性の存在を、マウス２Ｄ６細胞増殖アッセイ、ヒトＰＨＡ芽細胞増殖アッセイ、及びマウス及び／又はヒトＩＬ−１２に対するウサギ及び／又はヒツジポリクローナル抗体で非ヒトＰＢＭＣ誘導の応答を遮断することによるインターフェロン−γ誘導アッセイのような、上述したいくつかのバイオアッセイを用いて確認した。ヒト抗ｈＩＬ−１２抗体Ｙ６１及びＪ６９５と、ＰＢＭＣ上清中の非ヒトＩＬ−１２又は精製マウス及びアカゲザルＩＬ−１２の交叉反応性を、応答の５０％阻害が認められるＪ６９５抗体の独活を測定することにより、同じバイオアッセイにおいて評価した。種交叉反応性の結果を表５に要約する。結果は、Ｙ６１とＪ６９５がそれぞれサルからのＩＬ−１２（例えばＹ６１についてはカニクイザル及びアカゲザルＩＬ−１２、Ｊ６９５についてはカニクイザル、アカゲザル及びヒヒ）を認識することができ、Ｊ６９５はイヌＩＬ−１２に対して約３５倍活性が低く、Ｙ６１及びＪ６９５のいずれもがマウス又はラットＩＬ−１２と交叉反応しないことを示している。
【０３６９】
Ｈ．Ｊ６９５のヒトサイトカイン特異性
ヒトサイトカインのパネルを、可溶性Ｊ６９５の固定ヒトＩＬ−１２への結合に干渉する能力に関して試験する、競合ＥＬＩＳＡにおいてＪ６９５の特異性を検討した。ヒトサイトカインのパネルは、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ＩＬ−２（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＩＬ−８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＴＮＦα及びリンホトキシン、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６レセプタ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｍ−ＣＳＦ、及びＬＩＦを含む。Ｂリンパ球においてエプスタイン−バーウイルス感染によって誘導されるＩＬ−１２ｐ４０関連タンパクであるＥＢＩ−３（Ｄｅｖｅｒｇｎｅら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１１４３−１１５３）は、ヒトＩｇＧ−Ｆｃキメラ（ＥＢＩ−３／Ｆｃ）として発現された。一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）も試験した。
【０３７０】
【表６】
2014138594.tif 000033
【０３７１】
平底ＥＬＩＳＡ免疫測定マイクロタイタープレート（９６穴、高度結合、Ｃｏｓｔａｒ）を、０．１ｍｌヒトＩＬ−１２（０．１Ｍカーボネート被覆緩衝液（４容の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３プラス８．５容の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）中２μｇ／ｍｌ）により４℃でひと晩被覆した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを２回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）２００μｌにより室温で１時間遮断して、再びＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ）中にＩＬ−１２抗体Ｊ６９５（１００ｎｇ／ｍｌ）と各サイトカイン（２ｎＭ）を含むサンプル（１００μｌ）を加えて、室温２時間インキュベーションした。プレートを４回洗浄し、１００μｌのマウス抗ヒトλ−ＨＲＰ（ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中１：５００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）と共に室温で１時間インキュベーションした。プレートを４回洗浄し、暗所において２０−３０分間、ＡＢＴＳ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で展開した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。可溶性サイトカインが全く存在しない状態でのＩＬ−１２被覆プレートへのＪ６９５結合と比較して、パーセント結合を測定した。
【０３７２】
結果は、固定ヒトＩＬ−１２へのＪ６９５結合がヒトＩＬ−１２ｐ７０、そしてより低い度合でヒトＩＬ−１２ｐ４０によってのみ遮断され、試験した他のいずれのサイトカインによっても遮断されないことを明らかにした。
【０３７３】
Ｉ．新規ＩＬ−１２分子への結合
ｐ３５サブユニットが新規ｐ１９分子で置換された代替的なＩＬ−１２ヘテロダイマーが記述されている。ｐ１９は、ＩＬ−６／ＩＬ−１２ファミリーメンバーに関する３Ｄ相同性検索を用いて同定されたもので、活性化樹状細胞によって合成される。ｐ１９はｐ４０に結合して、ＩＬ−１２様活性を持つｐ１９／ｐ４０ダイマーを形成するが、ＩＦＮγ誘導におけるｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーほど強力ではない。ｐ４０だけを認識する抗体であるが、好ましくはｐ７０分子（例えばＪ６９５及びＹ６１、実施例３Ｈ参照）に関連して、ｐ３５／ｐ４０分子とｐ１９／ｐ４０分子の両方を中和することも予想される。
【０３７４】
実施例４：抗ｈＩＬ−１２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
カニクイザルにおける末梢血液学へのヒトＩＬ−１２の作用を調べるため、Ｂｒｅｅらが使用したものから改変したモデルにおいてＩＬ−１２誘導応答へのＩＬ−１２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ作用を検討した（Ｂｒｅｅら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０４：１１５０−１１５７）。それらこれまでの試験では、１μｇ／ｋｇ／日のヒトＩＬ−１２の５日間にわたる投与は、２４時間後に白血球数（ＷＢＣ）、特にリンパ球と単球のサブセットの低下を生じた。ＩＦＮ−γに応答した単球活性化のマーカーである血漿ネオプテリンのレベルが２４時間目に上昇し始め、７２時間目に最も高くなった。
【０３７５】
ヒト抗ｈＩＬ−１２抗体に関する最初の試験では、平均体重５ｋｇの１５匹の健康なカニクイザルザルを鎮静させ、５群（ｎ＝３）に分けた。第１群は、１０ｍｇ／ｋｇのヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ，Ｍｉｌｅｓ，Ｅｃｋｈａｒｔ，ＩＮ，プロテインＡセファロースを用いて精製）の静脈内（ＩＶ）投与を受けた。第２群は、１ｍｇ／ｋｇのＣ８．６．２（マウス抗ヒトＩＬ−１２モノクローナル抗体を中和する）の静脈内投与を受けた。第３群は、１０ｍｇ／ｋｇのＣ８．６．２の静脈内投与を受けた。第４群は、１ｍｇ／ｋｇのＹ６１（ヒト抗ヒトＩＬ−１２抗体、ＣＨＯ細胞順化培地から精製）の静脈内投与を受けた。第５群は、１０ｍｇ／ｋｇのＹ６１の静脈内投与を受けた。
【０３７６】
抗体投与の１時間後、全動物にヒトＩＬ−１２（１μｇ／ｋｇ）の単回皮下（ＳＣ）注射を実施した。次の時点で血液サンプルを採取し：基線、８、２４、４８、９６及び２１６時間、白血球分画を伴う完全血球算定と血清化学に関して分析した。血清ヒトＩＬ−１２、Ｃ８．６．２抗体、Ｙ６１抗体、サルＩＦＮ−γ、サルＩＬ−１０、サルＩＬ−６及び血漿ネオプテリンレベルも測定した。
【０３７７】
ＩＬ−１２プラスＩＶＩＧ対照抗体で処置した動物（第１群）は、ＷＢＣ、血小板、リンパ球数及び単球数の低下を含めて、予想された血液学的変化の多くを示した。これらの低下は、１又は１０ｍｇ／ｋｇのＣ８．６．２又はＹ６１抗体で処置した動物（第２−５群）では見られないか、若しくは度合がより低かった。
【０３７８】
サルＩＦＮ−γ及びサルＩＬ−１０（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、サルＩＬ−６（Ｅｎｄｏｇｅｎ）及び血漿ネオプテリン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）に特異的なＥＬＩＳＡにより、血清又は血漿サンプルを分析した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０あるいはＩＬ−６は、ＩＬ−１２プラスＩＶＩＧで処置した対照動物を含めて、ＩＬ−１２処置動物のいずれにおいても検出されなかった。これはおそらくＩＬ−１２への接触レベルが低い（１μｇ／ｋｇの１回投与のみ）ことによるものであった。それにもかかわらず、血漿ネオプテリンレベルは、ＩＬ−１２プラスＩＶＩＧ処置動物では約３倍上昇したが、より低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のＹ６１処置動物を含めてすべてのＣ８．６．２又はＹ６１処置動物において変化がなく、Ｙ６１がｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１２に対するこの感受性応答を遮断する上で有効であることを示した。
【０３７９】
第二の試験では、カニクイザルにおけるＪ６９５のｉｎ  ｖｉｖｏ活性と薬力学（ＰＤ）を、外因性ｒｈＩＬ−１２を投与し、通常ｒｈＩＬ−１２投与に結びつくを応答をＪ６９５が遮断又は低減しうるかどうかを判定することによって検討した。雄性カニクイザル（群当りｎ＝３）に０．０５、０．２、又は１．０ｍｇ／ｋｇのＪ６９５あるいは１ｍｇ／ｋｇの静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の１回用量を、伏在静脈を通してボーラス静脈内（ＩＶ）注入として又は背側皮膚への皮下（ＳＣ）注射によって投与した。Ｊ６９５又はＩＶＩＧの投与から１時間後、すべての動物に背側皮膚への１μｇ／ｋｇ  ｒｈＩＬ−１２の単回ＳＣ投与を実施した。Ｊ６９５投与後２８日目まで、大腿静脈を通して血液サンプルを採取した。各血液サンプルから血清を分離し、ＩＬ−１２、Ｊ６９５、ＩＦＮ−γ、及び抗Ｊ６９５抗体に関してＥＬＩＳＡで検定した。ネオプテリンは逆相高速液体クロマトグラフィーによって検定した。
【０３８０】
Ｊ６９５又はｒｈＩＬ−１２の投与前に測定したネオプテリンレベルに対して基準化したネオプテリンのレベルを図３に示す。群間でのネオプテリンの抑制を比較するために、ネオプテリンレベルに関して基準化した曲線下面積（ＡＵＣ）を各動物について計算した（表６）。ネオプテリン接触（ＡＵＣ）は、ＩＶＩＧ対照群と比較してＩＶ群では約７１−９３％、ＳＣ群では７１−１００％、用量依存的に抑制された。これらの結果は、ネオプテリン応答の５０％抑制に必要なＪ６９５の用量（ＥＤ５０）が、ＩＶ又はＳＣ経路で投与したときには０．０５ｍｇ／ｋｇ未満であったことを示唆している。
【０３８１】
【表７】
2014138594.tif 000034
【０３８２】
Ｊ６９５による処置は、通常ｒｈＩＬ−１２投与に結びつく血液学的変化（白血球減少及び血小板減少）も予防若しくは軽減した。ｒｈＩＬ−１２投与後２４時間目に、対照ＩＶ及びＳＣ  ＩＶＩＧ処置群では基線値と比較して約５０％リンパ球数が減少した。ＳＣ又はＩＶによるＪ６９５投与は３つの用量レベルすべてでこの減少を予防し、２４時間目のリンパ球数は基線値とほぼ同じであった。ＩＬ−１２投与後４８時間目には、ＩＶ及びＳＣ  ＩＶＩＧで処置した群における血小板数は基線値と比較して約２５％減少した。
【０３８３】
血清レベルを９０％有効レベル以上に維持することを目標とした例示的な投与スケジュールは、ほぼ１週間おきに１ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ投与、又はほぼ毎週０．３ｍｇ／ｋｇの投与であり、反復投与期間中わずかに蓄積が推定される。この試験は、抗体がそのような用量でサルに安全に投与しうることを明らかにしている。独立した毒性試験では、さらに１００ｍｇ／ｋｇまでの抗体がサルに安全に投与しうることが認められた。
【０３８４】
Ｊ６９５はまた、マウスｐ３５サブユニットをヒトＩＬ−１２ｐ４０サブユニットと結合した分子である、キメラＩＬ−１２で処置したマウスにおいてＩＦＮ−γの産生を予防する上でも有効であった。マウスでは生物学的に不活性なヒトＩＬ−１２と異なって、このキメラＩＬ−１２はＩＦＮ−γの誘導を含めてマウスにおいて生物学的機能を保持する。さらに、ヒトｐ４０サブユニットは、この分子がＪ６９５によって結合され、中和されることを可能にする。０．０５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量のキメラＩＬ−１２を雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（１０匹／実験群）に、１日１回ずつ５回にわたって０、１、２、３及び４日目に投与した。Ｊ６９５は、０、２及び４日目にＩＬ−１２注射の３０分前に、０．０５、０．０１、０．００２、０．０００４、０．００００８、及び０．００００１６ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量で投与した。対照ｈｕＩｇＧ１γは、０、２、及び４日目に０．０５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＰ投与した。５日目にマウスから採血し、ＥＬＩＳＡによって血清ＩＦＮ−γレベルを測定した。結果は、Ｊ６９５が約０．００１ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０でＩＦＮ−γの産生を用量依存的に阻害したことを明らかにした。全体として、これらの結果は、Ｊ６９５がｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１２活性の強力な阻害因子であることを示している。
【０３８５】
実施例５：組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）へのヒト抗体の結合の反応速度分析
捕獲したリガンド（ヒト抗ｒｈＩＬ−１２抗体Ｊ６９５、バイオセンサーマトリックス上で捕獲）と分析物（溶液中のｒｈＩＬ−１２）間のリアルタイムでの結合相互作用を、ＢＩＡコアシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。このシステムは、ＳＰＲの光学特性を利用してデキストランバイオセンサーマトリックス内のタンパク濃度の変化を検出する。デキストランマトリックスを通して抗体を注入すると、注入した抗体と固定されたリガンド間の特異結合がマトリックスタンパク濃度の上昇をもたらし、ＳＰＲシグナルの変化を生じさせる。ＳＰＲシグナルのこれらの変化は共鳴ユニット（ＲＵ）として記録され、センサーグラムのｙ軸に沿って経時的に表示される。
【０３８６】
バイオセンサーマトリックスへのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，カタログ番号２０４０−０１、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）の固定を容易にするため、最初にマトリックス上のカルボキシル基を１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）及び４００ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化することにより、遊離アミン基を通してヤギ抗ヒトＩｇＧをデキストランマトリックスに共有結合する。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧを活性化マトリックスを越えて注入する。酢酸ナトリウム中で希釈した３５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（２５μｇ／ｍｌ）、ｐＨ４．５を、活性化バイオセンサーを越えて注入し、タンパク上の遊離アミンを活性化カルボキシル基に直接結合する。１Ｍエタノールアミンを注入して未反応マトリックスＥＤＣ−エステルを不活性化する。標準アミンカップリングキットは市販のものを使用した（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，カタログ番号ＢＲ−１０００−５０，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０３８７】
ヤギ抗ヒトＩｇＧを通してマトリックス上に捕獲するため、Ｊ６９５を流動ＨＢＳ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢカタログ番号ＢＲ−１００１−８８，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で希釈した。ｒｈＩＬ１２−特異性抗体が固定ヤギ抗ヒトＩｇＧに結合する能力を調べるため、次のように結合アッセイを実施した。Ｊ６９５のアリコート（２５μｌ／ｍｌ；２５μｌアリコート）を、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体結合デキストランマトリックスを通して５μｌ／分の流速で注入した。タンパクの注入前と注入直後に、ＨＢＳ緩衝液だけを各フローセルに通過させた。基線とＪ６９５注入終了後約３０秒に相当する時点とのシグナルの正味差を、結合ＩｇＧ１  Ｊ６９５の量を表すものとみなした（約１２００ＲＵ）。可溶性ｒｈＩＬ−１２へのｒｈＩＬ−１２特異性抗体の直接結合を測定した。サイトカインを流動ＨＢＳ緩衝液中で希釈し、５０μｌアリコートを固定タンパクマトリックスを通して５μｌ／分の流速で注入した。使用したｒｈＩＬ−１２の濃度は、１０、２０、２５、４０、５０、８０、１００、１５０及び２００ｎＭであった。ｒｈＩＬ−１２の注入前と注入直後に、ＨＢＳ緩衝液だけを各フローセルに通過させた。基線シグナルとサイトカイン注入終了後のシグナルとの正味差を、個々のサンプルの結合値を表すものとみなした。次のサンプルの注入前に１００ｍＭ  ＨＣｌを用いてバイオセンサーマトリックスを再生した。解離定数（オフ速度）、結合定数（オン速度）を調べるため、ＢＩＡコア反応速度評価ソフトウエア（２．１バージョン）を使用した。
【０３８８】
ＣＯＳ由来のＪ６９５と比較したＣＨＯ由来Ｊ６９５のｒｈＩＬ−１２への結合の代表的結果を表７に示す。
【０３８９】
【表８】
2014138594.tif 000035
【０３９０】
捕獲Ｊ６９５と可溶性ｒｈＩＬ−１２間の分子反応速度相互作用をＢＩＡコアテクノロジーを用いて定量的に分析した。いくつかの独立した実験を実施し、表８に示すような、反応速度定数を引き出すために使用可能なＢＩＡコア数理分析ソフトウエアによって結果を解析した。
【０３９１】
【表９】
2014138594.tif 000036
【０３９２】
ＣＨＯ由来Ｊ６９５（Ｋｄ＝１．３４−１０Ｍ−１）とＣＯＳ由来Ｊ６９５（Ｋｄ＝９．７４×１０−１１Ｍ−１）抗体間の相互作用に関する算定見かけ定数（Ｋｄ）には小さな差があった。Ｊ６９５とｒｈＩＬ−１２間の見かけ解離定数（Ｋｄ）は、認められた速度定数から次の式によって推定した：Ｋｄ＝オフ速度／オン速度。
【０３９３】
Ｊ６９５とｒｈＩＬ−１２間の相互作用についての見かけ結合及び解離速度定数を調べるため、固定量のＪ６９５（２μｇ／ｍｌ）と種々の濃度のｒｈＩＬ−１２を使用していくつかの結合反応を実施した。捕獲Ｊ６９５と可溶性ｒｈＩＬ−１２間のリアルタイム結合相互作用センサーグラムは、２つの形態の抗体が結合と解離期の両方について非常に類似していることを示した。
【０３９４】
捕獲ＩｇＧ１  Ｊ６９５ｍＡｂが可溶性組換えサイトカインに結合する能力をさらに評価するため、直接ＢＩＡコア法を使用した。この方法では、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（２５μｇ／ｍｌ）結合カルボキシメチルデキストランセンサー表面をＩｇＧ１  Ｊ６９５（２μｇ／ｍｌ）で被覆し、その後組換えサイトカインを加えた。ＣＨＯ又はＣＯＳ由来のＩｇＧ１  Ｊ６９５で捕獲されたバイオセンサー表面を通して可溶性ｒｈＩＬ−１２を注入したとき、溶液中のサイトカインの濃度が上昇すると共にシグナルの量も増大した。１０００ｎＭまでの試験濃度ではｒｍＩＬ１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４１９−ＭＬ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）あるいはｒｈＩＬ１２との結合を認めなかった。これらの結果は、ＩｇＧ１  Ｊ６９５抗体がｒｈＩＬ−１２上の別個の決定基を認識するという結論を裏付けている。
【０３９５】
表９は、ヒトＩｇＧ１  Ｊ６９５ｍＡｂが可溶性ｒｈＩＬ１２だけと結合し、他のいずれの組換えサイトカインとも結合しないことを明らかにするためのＢＩＡコアを用いた実験の結果を示している。
【０３９６】
【表１０】
2014138594.tif 000037
【０３９７】
実施例６：ＩＬ−１２に対するＪ６９５の親和性についてのさらなる試験
Ｊ６９５抗体とヒトＩＬ−１２間の分子反応速度相互作用をＢＩＡコアプラスモン共鳴テクノロジーを用いて定量的に分析し、見かけ反応速度定数を推定した。
【０３９８】
ＢＩＡコアテクノロジーを使用して、固相捕獲Ｊ６９５への可溶性ｒｈＩＬ−１２の結合を測定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をバイオセンサーチップ上に固定し、次に固定量のＪ６９５を注入して表面に捕獲した。種々の濃度のｒｈＩＬ−１２を適用し、種々の濃度のＩＬ−１２のＪ６９５への結合を時間の関数として測定した。ゼロ次数解離と一次次数結合反応速度、ならびにＪ６９５とＩＬ−１２間の単純な１：１分子相互作用を仮定して、見かけ解離及び結合速度定数を算定した。３回の独立した実験を行い、３回の実験の平均値を示している。これらの測定から、見かけ解離（ｋｄ）及び結合（ｋａ）速度定数を推定し、相互作用についてのＫｄを算定するために使用した（表１０参照）。結果は、Ｊ６９５がｒｈＩＬ−１２に高い親和性を持つことを示した。
【０３９９】
【表１１】
2014138594.tif 000038
【０４００】
実施例７：マウスインターロイキン−１２に対するラットモノクローナル抗体Ｃ１７．１５の特性と中和活性
マウスＩＬ−１２に特異的なモノクローナル抗体を使用した炎症と自己免疫のマウスモデルにおけるＩＬ−１２処置試験の、ヒト疾患での同様のアプローチとの関連性を評価するため、ラット抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体、Ｃ１７．１５とマウスＩＬ−１２の相互作用を検討した。ＰＨＡ芽細胞増殖アッセイにおいてＣ１７．１５がマウスＩＬ−１２活性を中和し、マウスＩＬ−１２が細胞表面レセプタに結合するのを遮断する能力を、Ｃ１７．１５−マウスＩＬ−１２結合相互作用の動態として評価した。
【０４０１】
ヒトＰＨＡ芽細胞増殖アッセイ（実施例３参照）では、Ｃ１７．１５又はラットＩｇＧ２ａ（対照抗体）の連続希釈を２３０ｐｇ／ｍＬのマウスＩＬ−１２と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。ＰＨＡ刺激芽細胞を抗体−ＩＬ−１２混合物に加え、３７℃で３日間インキュベーションした。その後細胞を１μＣｉ／穴［３Ｈ］−チミジンで６時間標識した。培養を採集し、［３Ｈ］チミジンの取込みを測定した。マウスＩＬ−１２を加えずにバックグラウンドの非特異的増殖を測定した。すべてのサンプルを２回検定した。このアッセイにおける組換えマウスＩＬ−１２についてのＣ１７．１５のＩＣ５０（Ｍ）は１．４×１０−１１であることが認められ、これに比して、同じ条件下で組換えヒトＩＬ−１２についてＪ６９５で認められたＩＣ５０値は５．８×１０−１２であった（表１１参照）。
【０４０２】
【表１２】
2014138594.tif 000039
【０４０３】
Ｃ１７．１５が、マウスＩＬ−１２の細胞レセプタへの結合を阻害する応力も測定した。Ｃ１７．１５の連続希釈を結合緩衝液中で１００ｐＭ［１２５Ｉ］−マウスＩＬ−１２と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。２Ｄ６細胞（２×１０６）を抗体／［１２５Ｉ］−マウスＩＬ−１２混合物に加え、室温で２時間インキュベーションした。細胞結合放射能を遊離［１２５Ｉ］−ＩＬ−１２から分離し、残りの細胞結合放射能を測定した。２Ｄ６細胞上のレセプタへの標識マウスＩＬ−１２の総結合を抗体不在下で測定し、２５ｎＭ非標識マウスＩＬ−１２をアッセイに含めることによって非特異的結合を測定した。総結合から非特異的結合を差し引いて特異的結合を算定した。インキュベーションは２回実施した。結果は、Ｃ１７．１５が、マウスＩＬ−１２の細胞レセプタへの結合阻害に関して１．５×１０−１０のＩＣ５０（Ｍ）を持つことを示した。
【０４０４】
組換えマウスＩＬ−１２に対するＣ１７．１５の親和性を生体分子相互作用分析によって評価した。ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体をバイオセンサーチップに固定し、次に固定量のＣ１７．１５を注入して、チップの表面にＣ１７．１５を捕獲した。種々の濃度の組換えマウスＩＬ−１２をＣ１７．１５表面に適用し、固定Ｃ１７．１５へのマウスＩＬ−１２の結合を時間の関数として測定した。ゼロ次数解離と一次次数結合反応速度、ならびに固定Ｃ１７．１５とマウスＩＬ−１２間の単純な１：１分子相互作用を仮定して、見かけ解離及び結合速度定数を算定した。これらの測定から、見かけ解離（ｋｄ、オフ速度）及び結合（ｋａ、オン速度）速度定数を算定した。これらの結果を使用して相互作用についてのＫｄ値を算定した。組換えマウスＩＬ−１２−Ｃ１７．１５相互作用に関して、２．８×１０５Ｍ−１ｓ−１のオン速度、１．８４×１０−４ｓ−１のオフ速度、そして４．８×１０−１０のＫｄを認めた。
【０４０５】
マウスＩＬ−１２の活性及び細胞表面レセプタへの結合を中和する上でのＣ１７．１５の観察された活性、ならびにマウスＩＬ−１２へのＣ１７．１５の結合の動態は、Ｊ６９５−ｒｈＩＬ−１２相互作用についての同様の測定と相関する。これは、オン速度、オフ速度、Ｋｄ、ＩＣ５０及びＰＨＡ芽細胞アッセイに基づくと、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体Ｃ１７．１５と抗ヒトＩＬ−１２抗体Ｊ６９５の作用機序がほとんど同じであることを示唆している。それ故、炎症と自己免疫疾患のマウスモデルにおいて、これらのモデル動物における疾患の初発と進行へのＩＬ−１２の遮断作用を検討するために、Ｃ１７．１５をＪ６９６の相同抗体として使用した（実施例８参照）。
【０４０６】
実施例８：α−マウスＩＬ−１２抗体の投与によるマウスでの自己免疫又は炎症に基づく疾患の治療
Ａ．α−ＩＬ−１２抗体Ｃ１７．１５によるマウスでの膠原誘発関節炎の抑制
ＩＬ−１２レベルと慢性関節リウマチ（ＲＡ）の相関が明らかにされている。例えば、健常対照と比較してＲＡ患者の滑液におけるＩＬ−１２ｐ７０レベルの上昇が検出された（Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：３０６−３１４）。それ故、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体、Ｃ１７．１５がマウスにおいて膠原誘発関節炎を抑制する能力を評価した。
【０４０７】
雄性ＤＢＡ／１マウス（１０匹／群）を０日目にＩＩ型コラーゲンで免疫し、−１日目（コラーゲン免疫の１日前）から１２日目まで１日おきに１０ｍｇ／ｋｇのＣ１７．１５又は対照ラットＩｇＧを腹腔内投与した。９０日目まで足における関節炎の発現に関して動物を臨床的に監視した。関節炎を次のように等級づけた：０−正常；１−１関節に限局された関節炎；２−１関節以上を含むが足全体には及ばない；３−足全体を含む；４−足の変形；５−罹患関節の強直。マウスの関節炎スコアは、マウスの個別の足における関節炎等級の合計とした（最大値＝２０）。結果は各群について平均±ＳＥＭで表わしている。
【０４０８】
図４に示す結果は、関節炎スコアがＣ１７．１５処置マウスでは処置後５０日目から初めて測定可能になったこと、そしてＣ１７．１５処置マウスで得られたピーク平均関節炎スコアはＩｇＧ処置マウスで測定されたものよりも少なくとも５倍低かったことを示している。これは、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体Ｃ１７．１５がマウスにおいて膠原誘発関節炎の発現を予防したことを明らかにしている。
【０４０９】
Ｂ．ラットα−マウスＩＬ−１２抗体Ｃ１７．１５によるマウスでの大腸炎の抑制
ＩＬ−１２が大腸炎の発症／病理において役割を果たすことも明らかにされた。例えば、抗ＩＬ−１２抗体は、大腸炎のマウスモデルにおける疾患、例えばＩＬ−２ノックアウトマウスにおけるＴＮＢＳ誘発の大腸炎を抑制することが示されている（Ｓｉｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（８）：１２２５−３４）。同様に、抗ＩＬ−２抗体はＩＬ−１０ノックアウトマウスにおける大腸炎を抑制することが明らかにされている。ラット抗マウスＩＬ−１２抗体、Ｃ１７．１５がマウスにおいてＴＮＢＳ大腸炎を抑制する能力を２つの試験で評価した（Ｄａｖｉｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（６）：３１４３−９）。
【０４１０】
最初の試験では、小児科用臍動脈カテーテルを通して直腸に送達した、ＴＮＢＳ  ２．０ｍｇを含む５０％エタノール溶液１５０μＬの投与により、病原体不含のＳＪＬマウスにおいて大腸炎を誘発した。対照動物は５０％エタノール溶液１５０μＬだけで処置した。１１日目に尾静脈を通して０．７５、０．５、０．２５、又は０．１ｍｇのＣ１７．１５又は０．７５ｍｇの対照ラットＩｇＧ２ａを静脈内投与し、１１日目と１７日目に動物の体重を測定し、１７日目に組織学的スコアリングを実施して、処置の治療効果を評価した。Ｃ１７．１５で処置したマウスの体重は抗体処置後４８時間以内に上昇し、処置後６日目に正常化した。Ｃ１７．１５による処置の効果が組織学的に確認された。さらに、処置マウスの脾及び結腸からのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌、ならびに処置マウスの脾又は結腸由来マクロファージからのＩＬ−１２レベルの評価も行った（表１２参照）。
【０４１１】
第二の試験では、投与を至適化し、０．１ｍｇ又は０．５ｍｇのＣ１７．１５又は０．１ｍｇの対照ＩｇＧ２ａの総用量で、それぞれ１２日目と１４日目に分割してマウスを処置した。０．１ｍｇ／マウス又は０．２５ｍｇ／マウスの用量の単回投与において、Ｃ１７．１５の投与はＴＮＢＳ誘発の大腸炎の部分的改善だけを導き、未処置対照と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の有意の低下は生じなかったが、ＩＬ−１２分泌の有意の低下をもたらした。０．５ｍｇ／マウス又はそれ以上の単回投与で応答が認められた。試験した抗体の最小用量を採用し、それを２回の分割注入（１２日目と１４日目）で投与すると、投与レジメンが改善され、低用量の多回投与が単回のボーラス投与よりも有効でありうることを示唆した。得られたデータを表１２に示す。
【０４１２】
【表１３】
2014138594.tif 000040
【０４１３】
Ｃ１７．１５モノクローナル抗ＩＬ−１２を、総量０．１ｍｇ／マウス又は０．０５ｍｇ／マウスを１日の間隔をおいて２回の分割用量で投与すると、結腸の消耗と肉眼的外観によって評価したとき、大腸炎の完全な逆転を導いた。さらに、この投与スケジュールは、固有層Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生及びマクロファージのＩＬ−１２産生の有意の下方調節を導き、後者はＴＮＢＳ−大腸炎のない対照エタノール処置マウスで見られたレベルと同等であった。従って、ＴＮＢＳ大腸炎に関するマウスモデルへのＣ１７．１５の投与は用量依存的に疾患の進行を逆転した。
【０４１４】
Ｃ．α−ＩＬ−１２抗体によるマウスでの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の抑制
ＩＬ−１２は多発性硬化症（ＭＳ）の病因において役割を果たすと一般的に信じられている。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０メッセージがＭＳ患者の急性斑において発現されるが、炎症性脳梗塞病巣では発現されないことが示された（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ，Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６）。ＭＳ患者からのＴ細胞は、調節されないＣＤ４０Ｌ発現を通して抗原呈示細胞からのＩＬ−１２産生を刺激する（対照Ｔ細胞は刺激しない）（Ｂａｌａｓｈｏｖ，Ｋ．Ｅ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５９９−６０３）。ＭＳ患者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでα−ＩＬ−１２抗体によって遮断されうる高いＩＦＮ−γ分泌を有する（Ｂａｌａｓｈｏｖ，Ｋ．Ｅ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５９９−６０３）。ＭＳ患者では高いレベルの血清ＩＬ−１２が検出されるが、これは他の神経学的疾患では見られない（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｆ．ら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７０：８７−９０）。ＭＳ患者ではＩＬ−１２産生の上昇は疾患の活動と相関することが示された（Ｃｏｒｍａｂｅｌｌａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：６７１−６７８）。多発性硬化症のマウスモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の病因におけるＩＬ−１２の役割が検討されている（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２８１−３８６；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．（１９９８）４１：Ｓ３３；及びＳｅｇａｌ，Ｂ．Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：５３７−５４６）。このモデルにおける疾患は、ＴＨ１サブセットのＴ細胞によって誘発されることが知られている。それ故、α−ＩＬ−１２抗体が急性ＥＡＥの発症を予防する能力を評価した。
【０４１５】
α−ＩＬ−１２抗体は、自己抗原であるミエリン塩基性タンパク（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．（１９９８）４１：Ｓ３３）で免疫したマウスにおいて急性ＥＡＥの発症を阻害し、発症後の疾患を抑制し、再発の重症度を低下させうることが認められた。
【０４１６】
マウスにおけるα−ＩＬ−抗体処置の有益な作用は、治療停止後２ヵ月以上持続した。また抗ＩＬ−１２抗体が、養子免疫伝達による脳炎誘発性Ｔ細胞のレシピエントであるマウスにおいて疾患を抑制することも明らかにされた（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２８１−３８６）。
【０４１７】
実施例９：Ｊ６９５の臨床薬理
二重盲検交叉試験試験において、ヒト男性被験者に漸増用量のＪ６９５又はプラセボを投与した。投与前と１５分後の補体断片Ｃ３ａの測定は補体系の活性化を示さなかった。併発感染の症状が認められた被験者においてのみＣＲＰとフィブリノーゲンレベルが上昇した。
【０４１８】
すべの被験者が生存し、Ｊ６９５の全体的な耐容性は非常に良好であった。有害事象（ＡＥ）のために治療を中止しなければならない症例はなかった。最も一般的に認められたＡＥは頭痛と普通の風邪／気管支炎で、どちらも重度とは分類されなかった。
【０４１９】
試験被験者のうちの１名、３３歳の独身男性が試験開始時に滴状乾癬に罹患した。無作為化試験デザインに従って、この被験者は偶然に、ＳＣ投与により５ｍｇ／ｋｇのＪ６９５を摂取した。抗体投与の１０日前に、被験者は両腕と両脚に小さな散在性丘疹状病変だけを示した。抗体投与の時点で、被験者は発赤の増大、紅斑性プラークの肥厚、及び角質増殖の増大を示した。Ｊ６９５投与の１週間後、被験者は、病巣の平坦化と板状鱗屑の減少を含めた皮膚状態の改善を報告した。Ｊ６９５の２回目の投与（５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）後まもなく、局所治療を全く行わずに、被験者の皮膚から乾癬病巣が完全に消失した。抗体の２回目の投与後、予想されたＪ６９５のクリアランスに付随して、白色鱗屑でおおわれた紅斑性プラークが再発現した。
【０４２０】
実施例１０：２つのＣＨＯ細胞系統によって産生されたＪ６９５の比較
Ｊ６９５の組換え発現のために、抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．とＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子を各々エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素又はＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素のような、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等から誘導した）に作動可能に連結して、高いレベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も担い、かかる遺伝子は、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。
【０４２１】
ヒト抗体Ｊ６９５のペプチド配列をコードする発現ベクター１５０μｇを、５０ｍｌ円錐管において水２．７ｍｌに溶解した。２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ３００μＬを加え、このＤＮＡ混合物を５０ｍｌ円錐管中の２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水３ｍｌに滴下して加えた。５秒間渦動撹拌し、室温で２０分間インキュベーションしたあと、１ｍＬを各プレートに均一に分配し（まだＦ１２培地中で）、プレートを３７℃で４時間インキュベーションした。吸引によって液体を除去し、Ｆ１２中１０％ＤＭＳＯ  ２ｍｌを各プレートに加えた。ＤＭＳＯショックを１時間継続し、その後各プレートにＰＢＳ  ５ｍｌを加えてＤＭＳＯを希釈した。プレートをＰＢＳ中で２回洗浄し、Ｈ／Ｔと５％ＦＢＳ（ＤＨＦＲを発現する細胞に対して選択性）を補足したαＭＥＭ  １０ｍｌを加えて３７℃でひと晩インキュベーションした。１００細胞／穴の密度で９６穴プレートに細胞を接種し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、週に１回培地を交換して２週間インキュベーションした。
【０４２２】
最後の培地交換から５日後、培養上清を１：５０に希釈し、ヒトＩｇＧγ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを用いて試験した。最も高いＥＬＩＳＡシグナルを生じたクローンを９６穴プレートから１２穴プレートの１．５ｍｌ／穴のαＭＥＭ＋５％透析血清中に移した。３日後、もう１つ別のヒトｇＧγ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを実施して、最大活性を持つ１２クローンをαＭＥＭ＋５％透析血清と２０ｎＭ  ＭＴＸに分割した。細胞系統０３１８９８２１８は２０ｎＭ  ＭＴＸの存在下で、見かけ上の細胞死又は増殖率の低下を伴わずに増殖し、３日間のアッセイで１．８μｇ／ｍｌ  ｈＩｇＧを産生した。ＭＴＸを含む培地で増殖した０３１８９８２１８のＴ−２５培養は平均１１．９μｇ／ｍｌのＪ６９５を産生した。ＡＬＰ９０３と称される系統を無血清条件下の懸濁液中での増殖に適合させ、かかる系統は７．５ｐｇ  Ｊ６９５／細胞／２４時間を産生した。
【０４２３】
αＭＥＭ／５％ＦＢＳ／２０ｎＭ  ＭＴＸ中での初期選択後、ＡＬＰ９０３細胞を再び２０ｎＭ  ＭＴＸ中で継代した。１００ｎＭ  ＭＴＸ選択下で細胞を培養し、その後の３０日間に２回５００ｎＭ  ＭＴＸ中で継代した。その時点で細胞は３２μｇのＪ６９５／ｍＬ／２４時間を産生していた。細胞を限界希釈によってサブクローニングした。サブクローン２１８−２２は、９６穴プレートにおいて２日間で１６．５μｇ／ｍＬ、１２穴プレートでは２日間で５０．３μｇ／ｍＬのＪ６９５を産生した。クローン２１８−２２をαＭＥＭ／５％透析ＦＢＳ／５００ｎＭ  ＭＴＸ中で３８日間培養し、次いで上述したように無血清スピナー培養に適応させた。ＡＬＰ９０５と称される、無血清懸濁液培養の細胞特異的生産能の平均は５８ｐｇ／細胞／２４時間であった。
【０４２４】
Ｊ６９５を生成するために使用した最初の細胞系統（ＡＬＰ９０３）は、第二の細胞系統、ＡＬＰ９０５よりも低い収量の培養からの抗体を生じた。ＡＬＰ９０５産生Ｊ６９５がＡＬＰ９０３から生成されるものと機能的に同じであることを確認するために、両方のバッチの抗体を、ＩＬ−１２親和性、細胞レセプタへのＩＬ−１２結合を遮断する能力、ＩＬ−１２によるＩＦＮ−γ誘発を阻害する能力、及びＩＬ−１２が仲介するＰＨＡ芽細胞増殖を阻害する能力に関して評価した。
【０４２５】
Ｊ６９５のバッチＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５のＩＬ−１２に対する親和性を、表面プラスモン共鳴試験（ＢＩＡコア分析）によりＩＬ−１２への結合速度反応定数を測定して検討した。ｒｈＩＬ−１２への結合に関する抗体バッチＡＬＰ９０３とＡＬＯＰ９０５のオフ速度定数（ｋｄ）とオン速度定数（ｋａ）を３つの実験（実施例３で述べたような）において測定した。ＩＬ−１２への結合の親和性、Ｋｄは、オフ速度定数をオン速度定数で割って算定した。Ｋｄを各々別々の実験について算定し、それらを平均した。その結果は、測定した反応速度パラメータとｒｈＩＬ−１２への結合の親和性が、Ｊ６９５バッチＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５について非常に類似していることを示した：算定したＫｄは、バッチＡＬＰ９０３については１．１９±０．２２×１０−１０Ｍ、バッチＡＬＰ９０５については１．４９±０．４７×１０−１０Ｍであった（表１３参照）。
【０４２６】
ＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５から誘導したＪ６９５が、ヒトＰＨＡ活性化Ｔリンパ芽球上のＩＬ−１２レセプタへのｒｈＩＬ−１２の結合を遮断する能力を評価した（実施例３参照）。Ｊ６９５の各々のサンプルを、出発濃度を１×１０−８として１０倍の連続希釈で試験した。抗体を結合緩衝液中で５０ｐＭ［１２５Ｉ］−ヒトＩＬ−１２と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。ＰＨＡ芽細胞を抗体／［１２５Ｉ］−ヒトＩＬ−１２混合物に加えて室温で２時間インキュベーションした。遠心分離と洗浄ステップによって細胞結合放射能を遊離［１２５Ｉ］−ＩＬ−１２から分離し、％阻害を計算した。４−パラメータ曲線適合を用いて阻害曲線からＪ６９５のＩＣ５０値を推定し、２つの独立した実験によって確認した。インキュベーションは２回実施した。Ｊ６９５の２つのバッチに関する結果は非常に類似していた（表１３参照）。
【０４２７】
ＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５細胞からのＪ６９５が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＰＨＡ活性化Ｔリンパ芽球によるｒｈＩＬ−１２誘発のＩＦＮ−γ産生を阻害する能力を評価した。Ｊ６９５の連続希釈を２００ｐｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１２と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。ＰＨＡリンパ芽球を加えて３７℃で１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、無血清上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＦＮ−γのレベルを測定した。４−パラメータ曲線適合を用いて阻害曲線からのＩＣ５０値を抗体濃度に対してプロットした。結果は、２つのバッチのＩＦＮ−γ産生を阻害する能力が極めて類似することを明らかにしている。
【０４２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＨＡ芽細胞増殖アッセイを使用して、ｒｈＩＬ−１２に関するＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５  Ｊ６９５の中和能力を測定した。各々のタイプのＪ６９５の連続希釈を２３０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１２と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。次にＰＨＡ芽細胞を加えて３７℃で３日間インキュベーションした。次に細胞を１γＣｉ／穴［３Ｈ］−チミジンで６時間標識した。培養物を回収し［３Ｈ］−チミジン取り込みを測定した。ｒｈＩＬ−１２の不在下で非特異的増殖（バックグラウンド）を測定した。ＡＬＰ９０３とＡＬＰ９０５  Ｊ６９５に関するＩＣ５０値は非常に類似することが認められ、表１３に示している。
【０４２９】
ｒｈＩＬ−１２活性を中和し、細胞表面レセプタへのＩＬ−１２結合を遮断し、ｒｈＩＬ−１２に結合する上でのＪ６９５抗体の活性は、バッチＡＬＰ９０３とバッチＡＬＰ９０５で有意に異ならず、従ってこれら２つの異なる細胞型から産生される抗体は等価であった。
【０４３０】
【表１４】
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【０４３１】
等価物
当業者は、常套的な実験だけを用いてここで述べた本発明の特定実施形態の多くの等価物を認識する、若しくは確認できるであろう。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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