(57)【要約】      （修正有）【課題】ｉｐ細胞及びＥＳ細胞等の細胞が培養可能な新規な基材を提供する。【解決手段】基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする細胞培養基材。（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。2014207878.tif 000026【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする細胞培養基材。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000022
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ａ1およびＡ2は、結合して環を形成してもよい。）
2014207878.tif 000023
（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ｂ1〜Ｂ4は、任意の２つの基が結合して環を形成してもよい。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【請求項２】
基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする細胞培養基材。
（ａ）−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
【請求項３】
前記構造単位と、前記基板とが連結している化学結合、および、前記構造単位と、他の構造単位とが連結している化学結合が、それぞれ独立に、−Ｓｉ−Ｏ−結合、−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−結合であることを特徴する請求項１または２記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記構造単位と、他の構造単位とが連結している化学結合が、−Ｓｉ−Ｏ−結合であることを特徴する請求項１乃至３いずれか記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記構造単位と、前記基板とが連結している化学結合が、−Ｓｉ−Ｏ−結合または−Ｓ−結合であることを特徴する請求項１乃至４のいずれか記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基が、−ＮＨ−ＣＯ−基に連結した基であることを特徴する請求項１乃至５のいずれか記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記基板を構成する材料が、ガラス又は有機高分子化合物であることを特徴する請求項１乃至６のいずれか記載の細胞培養基材。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか記載の細胞培養基材の少なくとも一部にラミニンを被覆してなるラミニンコート細胞培養基材。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか記載の細胞培養基材または請求項８記載のラミニンコート細胞培養基材の表面上で細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞が、多能性幹細胞であることを特徴とする請求項９記載の細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１乃至７のいずれか記載の細胞培養基材または請求項８記載のラミニンコート細胞培養基材の表面上で培養された液で全体が浸された細胞を、細胞の少なくとも一部を液面から露出させることにより、細胞培養基材から剥離し、回収する工程を含むことを特徴とする細胞の取得方法。
【請求項１２】
前記細胞が、多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１１記載の細胞の取得方法。
【請求項１３】
基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする多能性幹細胞培養基材。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000024
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ａ1およびＡ2は、結合して環を形成してもよい。）
2014207878.tif 000025
（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ｂ1〜Ｂ4は、任意の２つの基が結合して環を形成してもよい。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、細胞の製造方法および細胞の取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進医療として、細胞を体外で培養して組織や臓器を作成することが検討され、実用化が近くなっている。細胞の中でも幹細胞は重要であり、多分化能を有するｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）およびＥＳ細胞（胚性幹細胞）は特に注目されている（例えば、特許文献１および特許文献２）。
【０００３】
ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞は、既存の細胞培養基材では、分化した細胞に比べ、培養が比較的困難であり、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞が培養できる新規な細胞培養基材が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／０５７８３１号
【特許文献２】国際公開第２００９／０７５１１９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞が培養可能な新規な基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況下、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下の本発明に至った。すなわち、本発明は、基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする細胞培養基材を提供する。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000002
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。）
2014207878.tif 000003
（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【０００７】
また、本発明は、基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする多能性幹細胞培養基材を提供する。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000004
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ａ1およびＡ2は、結合して環を形成してもよい。）
2014207878.tif 000005
（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ｂ1〜Ｂ4は、任意の２つの基が結合して環を形成してもよい。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞培養基材は、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞をはじめとする、多様な細胞が培養可能である。もちろん、他の幹細胞や分化した細胞の培養も可能であり、先進医療分野において、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞培養基材を示す模式図である。要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む膜を含む。
【図２】本発明の細胞培養基材を示す模式図である。要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位を含む膜を含む。
【図３】本発明の細胞培養基材を製造するのに好適な前駆体または本発明の多能性幹細胞培養基材を示す模式図である。
【図４】本発明の好適な細胞培養基材を示す模式図である。
【図５】実施例１で作成した細胞培養基材の前駆体を示す模式図または実施例７で作成した多能性幹細胞培養基材を示す模式図である。
【図６】実施例１で作成した細胞培養基材を示す模式図である。
【図７】実施例４で作成した細胞培養基材を示す模式図である。
【図８】実施例５および６で作成した細胞培養基材を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の細胞培養基材は、基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000006
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。）
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（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【００１１】
また、本発明の多能性幹細胞培養基材は、基板と、その表面上に形成された、以下の要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに以下の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位を含む膜とを有することを特徴とする。
（ａ）下記式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有すること。（ここで、Ｒは下記式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。）
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
2014207878.tif 000008
（式中、Ａ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ａ1およびＡ2は、結合して環を形成してもよい。）
2014207878.tif 000009
（式中、Ｂ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に、水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表す。Ｂ1〜Ｂ4は、任意の２つの基が結合して環を形成してもよい。（ここで、Ｍは前記と同義である。））
【００１２】
本発明に用いられる膜は、単分子膜であることが好ましい。本発明に用いられる膜は、複数の構造単位から構成されている。構成する構造単位（特に有機物が好ましい）が規則的に配列して膜を形成したものである。規則的とは、構造単位の分子構造が一定の方向または互い違いもしくはさらに高度な幾何構造を形成し、その構造が１箇所だけでなく多くの箇所（好ましくは膜全体において）に存在することを意味する。好ましくは構成する構造単位が一定の方向に配列しそれが二次元的に広がる構造であるが、多少の構造欠陥は機能に影響を与えない。また、複数の構造単位は、一種であっても、複数種であってもよい。
【００１３】
上記要件（ａ）および（ｂ）を満たす構造単位並びに上記の要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位からなる群から選ばれる１種以上の構造単位は、膜を構成する全構造単位に対して、６０モル％以上存在することが好ましく、９０モル％以上存在することがより好ましい。
【００１４】
ここで、
要件（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
における、化学結合は、同種の化学結合であっても、異種の化学結合であってもよい。前記構造単位と、前記基板とが３つ以上の化学結合により連結している場合、全てが同種の化学結合であっても、全てが異種の化学結合であってもよく、一部だけが同種であってもよい。また、要件（ｂ）において、前記構造単位は、前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結していてもよい。
【００１５】
また、要件（ｃ）における、他の構造単位とは、膜を構成する他の構造単位のことを表し、前記構造単位と、他の構造単位とは、同種の構造単位であっても、異種の構造単位であってもよい。
【００１６】
本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、一般式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する。Ｍはカチオンを表す。カチオンとしては、特に制限はないが、金属イオンまたはアンモニウムイオンであることが好ましい。
金属イオンとしては、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンが挙げられる。アルカリ金属イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、セシウムイオン等があげられる。アルカリ土類金属イオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン等があげられる。ただし、アルカリ土類金属イオンは２価カチオンであるので、他のアニオンと結合している。通常、アルカリ土類金属イオン１モルが、−ＣＯＯ-基２モルとイオン結合して静電的に等価となっているか、アルカリ土類金属イオン１モル当たり、−ＣＯＯ-基１モルと他の１価アニオン１モルとがイオン結合して静電的に等価となっている。このような他の１価アニオンとしては、クロロアニオン、ブロモアニオン、ヨードアニオン、水酸化物イオン等があげられる。
金属イオンとしては、アルカリ金属イオンであることが好ましく、アルカリ金属イオンとしてはリチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンであることが好ましく、ナトリウムイオン、カリウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがさらに好ましい。前記Ｍは単一であっても、複数種あってもよいが、好ましくは４種類以内であり、より好ましくは３種類以内であり、さらに好ましくは２種類以内であり、特に好ましくは１種類（単一）である。
【００１７】
式（２１）で表される基におけるＡ1およびＡ2は、それぞれ独立に、水素原子または置換基を有してもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基である。また、Ａ1およびＡ2は、結合して環を形成してもよい。Ａ1およびＡ2として好ましくは、水素原子である。
【００１８】
ヒドロカルビル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ノニル基、ドデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基等のアルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロノニル基、シクロドデシル基、ノルボニル基、アダマンチル基等の環状飽和炭化水素基；エテニル基、プロペニル基、３−ブテニル基、２−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、２−ノネニル基等のアルケニル基；フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、４−プロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、４−ブチルフェニル基、４−ｔ−ブチルフェニル基、４−ヘキシルフェニル基、４−シクロヘキシルフェニル基、４−フェニルフェニル基等のアリール基；フェニルメチル基、１−フェニレンエチル基、２−フェニルエチル基、１−フェニル−１−プロピル基、１−フェニル−２−プロピル基、２−フェニル−２−プロピル基、３−フェニル−１−プロピル基、４−フェニル−１−ブチル基、５−フェニル−１−ペンチル基、６−フェニル−１−ヘキシル基等のアラルキル基があげられる。炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数６〜１２のアリール基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましい。
【００１９】
前記ヒドロカルビル基は、少なくとも１つの水素原子が、ハロゲン原子、水酸基、シアノ基、アミノ基またはスルホ基で置換されていてもよい。
【００２０】
−ＣＯＯＲ基におけるＲは、式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基である。この置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基としては、上記Ａ1およびＡ2の説明におけるヒドロカルビル基と同じである。
【００２１】
式（２２）で表される基におけるＢ1〜Ｂ4は、それぞれ独立に水素原子、−ＳＯ３-Ｍ、または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基であり、Ｍは−ＣＯＯ-Ｍ基の説明におけるＭと同じであり、炭素数１〜２０のヒドロカルビル基は、上記Ａ1およびＡ2の説明における炭素数１〜２０のヒドロカルビル基と同じである。Ｂ1〜Ｂ4として好ましくは水素原子、−ＳＯ３-Ｍまたはメチル基であり、より好ましくは水素原子または−ＳＯ３-Ｍであり、さらに好ましくは水素原子である。Ｂ1〜Ｂ4のうち、３個または４個が水素原子であることが好ましく、すべてのＢが水素原子であることが最も好ましい。
【００２２】
一般式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基は、作成の容易性と膜の化学的安定性の観点から、−ＮＨ−ＣＯ−基に直接または他の基を介して連結した基であることが好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−基に直接または他の基を介して連結した基であることがより好ましい。
【００２３】
本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、上記（ａ）の要件に加え、以下の要件（ｂ）または（ｃ）を満たす。
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
このような連結している化学結合を形成するためには、膜の構造単位となり得る、２つ以上の結合手となり得る官能基を有する化合物を用いる。結合手となり得る第１の候補の官能基としては、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基またはその他のアルコキシシリル基、トリクロロシリル基、トリブロモシリル基またはその他のトリハロシリル基、ハロゲノジアルコキシシリル基、ジハロゲノアルコキシシリル基などの置換シリル基がである。これら第１の候補は後述の第２の候補よりも、本発明に用いられる膜の形成が容易になるため好ましい。
【００２４】
本発明に用いられる膜を形成し得る化合物が有する２つ以上の結合手となり得る官能基の第２の候補は、−ＲＥ（Ｅ１）ｎで表される基である。ただし、ｎは２以上１０以下の整数であり、２以上６以下の整数が好ましく、２または３がより好ましい。複数存在するＥ１は、それぞれ互いに同一でも異なっていてもよいＥ１はメルカプト基（−ＳＨ）、クロロスルホニル基（−ＳＯ２Ｃｌ）、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）、クロロカルボニル基（−ＣＯＣｌ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、ジクロロホスホリル基（−ＰＯＣｌ２）、ホスホノ基（−ＰＯ（ＯＨ）２）、ヒドロキシ基、シアナト基、イソシアナト基、非置換のアミノ基、置換のアミノ基があげられ、メルカプト基、クロロスルホニル基、スルホ基、クロロカルボニル基、カルボキシル基、ジクロロホスホリル基、ホスホノ基が好ましく、クロロスルホニル基、スルホ基、クロロカルボニル基、カルボキシル基、ジクロロホスホリル基、ホスホノ基がより好ましい。ＲＥは上記以外の置換基を有してもよいｎ＋１価の有機基である。ｎ＋１価の有機基としては、脂肪族化合物、芳香族化合物またはヘテロ含有芳香族化合物からｎ＋１個の水素原子を取り除いた構造であることが好ましい。これら第２の候補は上記の第１の候補よりも、化合物の合成が容易になる観点で好ましい。
【００２５】
脂肪族化合物は、直鎖、分岐または環状のいずれでもよく、炭素原子数が通常１〜２０程度、好ましくは炭素原子数１〜１５であり、より好ましくは１〜１０であり、その具体例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタン、２−メチルプロパン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、２−エチルヘキサン、ノナン、デカン、３，７−ジメチルオクタン、アダマンタンなどがあげられ、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンが好ましい。
【００２６】
芳香族化合物は、縮合環をもつもの、独立したベンゼン環または縮合環２個以上が直接またはビニレン等の基を介して結合したものも含まれる。芳香族化合物は、全炭素原子数が通常６〜６０程度、好ましくは６〜４８である。なお、芳香族化合物の炭素原子数には、置換基の炭素原子数は含まれない。その具体例としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルオレン、ピレンなどがあげられ、ベンゼンが好ましい。
【００２７】
ヘテロ含有芳香族化合物は、炭素原子数は通常４〜６０程度、好ましくは４〜２０である。なお、複素環基の炭素原子数には、置換基の炭素原子数は含まれない。ヘテロ含有芳香族化合物とは、環式構造をもつ有機化合物のうち、環を構成する元素が炭素原子だけでなく、酸素、硫黄、窒素、燐、硼素などのヘテロ原子を環内に含むものをいう。チオフェン、ピロール、フラン、ピリジン、キノリン、イソキノリンなどが例示され、チオフェン、フラン、およびピリジンが好ましい。
【００２８】
ＲＥが有してもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロカルビル基、水酸基、ヒドロカルビルオキシ基、カルボキシル基、ヒドロカルビルカルボニル基、シアノ基、アミノ基、ヒドロカルビルアミノ基、ジヒドロカルビルアミノ基、ホスフィノ基、ヒドロカルビルホスフィノ基、ジヒドロカルビルホスフィノ基、複素環基、ホルミル基、ニトロ基、カルバモイル基、ヒドロカルビルカルバモイル基、ジヒドロカルビルカルバモイル基、スルホ基、ヒドロカルビルスルホ基、ヒドロカルビルスルホニル基、スルフィノ基、ヒドロカルビルスルフィノ基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’で表される基、式：−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’’2で表される基、式：−ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’’2で表される基、式：−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’’2で表される基、式：−ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’’2で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’2で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’2で表される基、２個以上のエーテル結合を有するヒドロカルビル基、２個以上のエステル結合を有するヒドロカルビル基、２個以上のアミド結合を有するヒドロカルビル基、式：−Ｓ-Ｍ1で表される基、式：−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ-Ｍ1で表される基、式：−ＣＳ2Ｍ1で表される基、式：−ＯＭ1で表される基、式：−ＣＯ2Ｍ1で表される基、式：−ＰＯ3-Ｍ1で表される基、式：−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ1）2で表される基、式：−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ1）2で表される基、式：−Ｂ(Ｏ-Ｍ1)2で表される基、式：−ＳＯ3-Ｍ1で表される基、式：−ＳＯ2-Ｍ1で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ1で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）Ｓ-Ｍ1で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｓ）Ｏ-Ｍ1で表される基、式：−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｓ）Ｓ-Ｍ1で表される基およびカチオン化された窒素原子を複素環内に有する複素環基があげられる。（上記式中、Ｒ’’は、水素原子、または、ヒドロカルビル基（例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基）を表し、Ｍ1は、金属カチオンまたはアンモニウムカチオンを表し、Ｍ1’は、アニオンを表す。）また、これらの置換基同士は結合して環を形成してもよい。
【００２９】
前記の置換基のうち好ましい例としては、ハロゲン原子、ヒドロカルビル基、水酸基、ヒドロカルビルオキシ基、ヒドロカルビルカルボニル基、シアノ基、アミノ基、ヒドロカルビルアミノ基、ジヒドロカルビルアミノ基、スルホ基、複素環基、または式：−ＮＲ3Ｍ1’で表される基があげられ、より好ましい例としては、ハロゲン原子、ヒドロカルビル基、水酸基、シアノ基、アミノ基、スルホ基、複素環基があげられ、更に好ましい例としては、ヒドロカルビル基があげられる。
【００３０】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられ、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００３１】
ヒドロカルビル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ノニル基、ドデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基、ドコシル基等の炭素原子数１〜５０のアルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロノニル基、シクロドデシル基、ノルボニル基、アダマンチル基等の炭素原子数３〜５０の環状飽和炭化水素基；エテニル基、プロペニル基、３−ブテニル基、２−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、２−ノネニル基、２−ドデセニル基等の炭素原子数２〜５０のアルケニル基；フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、４−プロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、４−ブチルフェニル基、４−ｔ−ブチルフェニル基、４−ヘキシルフェニル基、４−シクロヘキシルフェニル基、４−アダマンチルフェニル基、４−フェニルフェニル基等の炭素原子数６〜５０のアリール基；フェニルメチル基、１−フェニレンエチル基、２−フェニルエチル基、１−フェニル−１−プロピル基、１−フェニル−２−プロピル基、２−フェニル−２−プロピル基、３−フェニル−１−プロピル基、４−フェニル−１−ブチル基、５−フェニル−１−ペンチル基、６−フェニル−１−ヘキシル基等の炭素原子数７〜５０のアラルキル基があげられる。炭素原子数１〜５０のアルキル基、炭素原子数６〜５０のアリール基が好ましく、炭素原子数１〜１２のアルキル基、炭素原子数６〜１８のアリール基がより好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数６〜１２のアリール基が更に好ましい。
【００３２】
ヒドロカルビルオキシ基、ヒドロカルビルカルボニル基、ヒドロカルビルアミノ基、置換基を有していてもよいヒドロカルビルホスフィノ基、およびヒドロカルビルカルバモイル基とはそれぞれ、オキシ基、カルボニル基、アミノ基、ホスフィノ基、およびカルバモイル基中の水素原子一個がヒドロカルビル基で置換された基をいう。
【００３３】
ジヒドロカルビルアミノ基、ジヒドロカルビルホスフィノ基、およびジヒドロカルビルカルバモイル基とはそれぞれ、アミノ基、ホスフィノ基、およびカルバモイル基中の水素原子二個がヒドロカルビル基で置換された基をいう。
【００３４】
ヒドロカルビルスルホ基およびヒドロカルビルスルフィノ基とはそれぞれ、スルホ基およびヒドロカルビルスルフィノ基中の水素原子一個がヒドロカルビル基で置換された基をいう。
ヒドロカルビルスルホニル基とは、ヒドロカルビル基とスルホニル基との組み合わせからなる基をいう。
【００３５】
式：−ＮＲＣ（＝Ｏ）ＯＲで表される基、式：−ＮＲＣ（＝Ｏ）ＳＲで表される基、式：−ＮＲＣ（＝Ｓ）ＯＲで表される基、式：−ＮＲＣ（＝Ｓ）ＳＲで表される基、式：−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ2で表される基、式：−ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ2で表される基、式：−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ2で表される基、式：−ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ2で表される基、式：−ＮＲＣ（＝Ｏ）ＮＲ2で表される基、および式：−ＮＲＣ（＝Ｓ）ＮＲ2で表される基において、Ｒは前述のとおり水素原子または前記ヒドロカルビル基であり、該ヒドロカルビル基の好ましい例は前述と同じである。
【００３６】
複素環基は、複素環から水素原子を１個取り除いた残りの原子団である。複素環としては、ピリジン環、１，２−ジアジン環、１，３−ジアジン環、１，４−ジアジン環、１，３，５−トリアジン環、フラン環、ピロール環、チオフェン環、ピラゾール環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、オキサジアゾール環、チアジアゾール環、アザジアゾール環等の単環式複素環；単環式芳香環から選んだ２個以上の環が縮合した縮合多環式複素環；２個の複素環、または１個の複素環と１個の芳香環とを、メチレン基、エチレン基、カルボニル基等の２価の基で橋かけした構造を有する有橋多環式芳香環等があげられ、ピリジン環、１，２−ジアジン環、１，３−ジアジン環、１，４−ジアジン環、１，３，５−トリアジン環が好ましく、ピリジン環、１，３，５−トリアジン環がより好ましい。
【００３７】
２個以上のエーテル結合を有するヒドロカルビル基としては、以下の式で表される基があげられる。
【００３８】
2014207878.tif 000010
（式中、Ｒ’はヒドロカーボンジイル基を示し、複数あるＲ’は同一でも異なっていてもよい。ｎ2は２以上の整数である。好ましくはＲ‘＝−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎ2は２〜５の整数である。）
【００３９】
ヒドロカーボンジイル基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、１，２−ブチレン基、１，３−ブチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ノナメチレン基、ドデカメチレン基等の、炭素原子数１〜５０の飽和ヒドロカーボンジイル基；エテニレン基、プロペニレン基、３−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、２−ヘキセニレン基、２−ノネニレン基、２−ドデセニレン基等の、炭素原子数２〜５０のアルケニレン基、および、エチニレン基を含む、炭素原子数２〜５０の不飽和ヒドロカーボンジイル基；シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基、シクロノニレン基、シクロドデシレン基、ノルボニレン基、アダマンチレン基等の、炭素原子数３〜５０の飽和環状ヒドロカーボンジイル基；１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基、２，６−ナフチレン基、ビフェニル−４，４’−ジイル基等の、炭素原子数６〜５０のアリーレン基があげられる。エーテル結合を有するヒドロカルビル基が複数ある場合は、これらの基同士は環を形成してもよい。
【００４０】
２個以上のエステル結合を有するヒドロカルビル基としては、以下の式で表される基があげられる。
【００４１】
2014207878.tif 000011
（式中、Ｒ’およびｎ2は、前述と同義である。）
【００４２】
２個以上のアミド結合を有するヒドロカルビル基としては、以下の式で表される基があげられる。
【００４３】
2014207878.tif 000012
（式中、Ｒ’およびｎ2は、前述と同義である。）
【００４４】
金属カチオンとしては、１価、２価または３価の金属カチオンが好ましく、Li、Na、K、Cs、Be、Mg、Ca、Ba、Ag、Al、Bi、Cu、Fe、Ga、Mn、Pb、Sn、Ti、V、W、Y、Yb、Zn、Zr等由来の金属カチオンがあげられ、Li、Na、K、またはCs由来の金属カチオンが好ましい。
【００４５】
アンモニウムカチオンは、Ｎ＋Ｒ３４の構造が例示でき、複数あるＲ３はそれぞれ独立に水素原子または、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等の炭素原子数１〜１０のアルキル基である。
【００４６】
Ｍ1を有する前記式で表される基には、該基全体の電荷が中和されるように、Ｍ1以外の別の金属カチオンが伴ってもよく、また、アニオンが伴ってもよい。
【００４７】
前記アニオンとしては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、ＯＨ-、ＣｌＯ-、ＣｌＯ2-、ＣｌＯ3-、ＣｌＯ4-、ＳＣＮ-、ＣＮ-、ＮＯ3-、ＳＯ42-、ＨＳＯ4-、ＰＯ43-、ＨＰＯ42-、Ｈ2ＰＯ4-、ＢＦ4-、ＰＦ6-、ＣＨ3ＳＯ3-、ＣＦ3ＳＯ3- 等があげられる。
【００４８】
Ｍ1’で示されるアニオンとしては、前述のアニオンと同様のものがあげられる。
【００４９】
本発明に用いられる膜を形成し得る化合物が有する２つ以上の結合手となり得る官能基の第２の候補の具体的な構造を下記に示す。
2014207878.tif 000013
2014207878.tif 000014
2014207878.tif 000015
（＊は、結合手を表す。）
【００５０】
本発明に用いられる膜を形成し得る化合物が有機化合物である場合は、下記式（１）で表される化合物が好ましい。
Ｄｑ−Ｒ１−Ｅｐ      （１）
（但し、Ｄは上記の結合手となり得る官能基、Ｒ１はｐ＋ｑ価の有機基であり、ｐおよびｑはそれぞれ独立に１以上１０以下の整数であり、Ｅは、式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基またはアミノ基である。Ｒは式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。ｐが２以上である場合、複数あるＤは、互いに同一でも、異なっていてもよい。ｑが２以上である場合、複数あるＥは、互いに同一でも、異なっていてもよい。）
【００５１】
前記ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１以上５以下の整数が好ましく、１、２または３がより好ましく、１が最も好ましい。
【００５２】
ここで、Ｄは結合手であるので、本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、下記式（１’）で表される構造を含むことが好ましい。
−Ｒ１−Ｅｐ        （１’）
（但し、Ｒ１はｐ＋ｑ価の有機基であり、Ｒ１はｑ本の結合手を有する。式中では、便宜上、１本の結合手しか記載していない。ｐおよびｑはそれぞれ独立に１以上１０以下の整数であり、Ｅは、一般式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基またはアミノ基である。Ｒは式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。ｐが２以上である場合、複数あるＤは、互いに同一でも、異なっていてもよい。ｑが２以上である場合、複数あるＥは、互いに同一でも、異なっていてもよい。）
【００５３】
Ｒ１は置換基を有してもよいｐ＋ｑ価の有機基であり、下記式（２）で表される基であることが好ましい。
−（Ｒ１１）ｓ−（Ｒｃ）ｔ−（Ｒ１２）ｕ−      （２）
（但し、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、２価の有機基であり、Ｒｃは２価の接続基であり、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立に、１または０である。Ｒ１１はＤと結合し、Ｒ１２はＥと結合する。）
【００５４】
Ｒ１１およびＲ１２は鎖状の２価の有機基が好ましく、下記式（３）〜（５）の鎖状構造が好ましい。
−（ＣＨ２）ｖ−    （３）
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ（ＣＨ２ＣＨ２）ｗ−      （４）
−Ｐｈｖ−            （５）
（但し、ｖは１〜１０００の整数である。ｗは０または１である。）
【００５５】
前記ｖは、１〜３００が好ましく、１〜１００がより好ましく、１〜３０がさらに好ましく、１〜１５が特に好ましい。上記式（５）においてはｖは１〜５が好ましく、１〜３がより好ましく、１が特に好ましい。但し、Ｅがアミノ基である場合は、ｖは、１〜１００が好ましく、１〜３０がより好ましく、５〜３０がさらに好ましい。
【００５６】
Ｒｃは２価の接続基であり−Ｏ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−または下記式（６）で表される基が好ましく、−Ｏ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−または下記一般式（６）で表される基がより好ましく、−ＮＨＣＯ−で表される基が特に好ましい。
2014207878.tif 000016
（＊は結合手を表す）
【００５７】
本発明に用いられる膜を形成し得る化合物は下記式（１−１）で表されることが好ましい。
Ｄ−（ＣＨ２）ｖ１−ＮＨＣＯ−Ｐｈ−Ｅｐ’（１−１）
（但し、Ｄは上記の結合手となり得る官能基である。ｐ’は１以上５以下の整数であり、
ｑは１以上１０以下の整数であり、ｖ１は１〜１００の整数である。Ｐｈは、ベンゼンからｐ’＋１個の水素原子を除いたｐ’＋１価の基である。Ｅは、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ-Ｍ基である。Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。ｐが２以上である場合、複数あるＤは、互いに同一でも、異なっていてもよい。ｑが２以上である場合、複数あるＥは、互いに同一でも、異なっていてもよい。）
【００５８】
前記ｖ１は、１〜３０が好ましく、１〜１０がより好ましい。
【００５９】
ここで、Ｄは結合手であるので、本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、下記式（１−１’）で表される構造を含むことが好ましい。
−（ＣＨ２）ｖ１−ＮＨＣＯ−Ｐｈ−Ｅｐ’（１−１’）
（但し、ｐ’は１以上５以下の整数であり、ｑは１以上１０以下の整数であり、ｖ１は１〜１００の整数である。Ｐｈは、ベンゼンからｐ’＋１個の水素原子を除いたｐ’＋１価の基である。Ｅは、式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基またはアミノ基である。Ｒは式（２２）で表される基または置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のヒドロカルビル基を表し、Ｍはカチオンを表す。但し、前記カチオンは、２価以上のカチオンである場合、さらに、他のアニオンと結合している。ｐが２以上である場合、複数あるＤは、互いに同一でも、異なっていてもよい。ｑが２以上である場合、複数あるＥは、互いに同一でも、異なっていてもよい。）
【００６０】
本発明に用いられる膜を構成する構造単位は複数種あってもよい。特にｖおよびｖ１については多様性がある方が化合物を用意する観点では好ましい。しかし、本発明の機能を優先する場合は、本発明に用いられる膜を構成する構造単位は１０種類以下であることが好ましく５種類以下であることがより好ましく、３種類以下であることがさらに好ましく、２種類以下であることが特に好ましい。
【００６１】
本発明に用いられる基板とは、特に限定されないが、膜を形成する際に用いる溶媒、および、本発明の基材を細胞の培養に用いる時に使用する培養液、洗浄液、消毒液で表面が荒らされないものであることが好ましい。例えば、ガラス、プラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリルなど）、シリカ、シリコン、金属（金、銀、銅、鉄、亜鉛、アルミニウム、ニッケルおよびこれらの合金または酸化物）等の基板があげられる。細胞培養の過程で顕微鏡観察をする場合は透明であることが好ましく、その観点ではガラス、ポリスチレン、アクリルの他、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）や酸化亜鉛などの金属酸化物が好ましく、光透過性を保つために薄く（例えば１０ｎｍ以下）した金属（例えば金や銀）も好ましい。形状については、ミリメートルオーダーからセンチメートルオーダーの面であることが好ましく、細胞の接着性を高める目的でマイクロメーターオーダーからナノメーターオーダーの凹凸があってもよい。また、細胞の浮遊培養の浮遊足場とする目的でガラスやシリカゲルなどの粒子（ナノメーターオーダー〜ミリメートルオーダー）であってもよい。本発明の基材は、シャーレ、ディッシュ、ウェルプレートおよびバッグなどの容器の中に設置するか、容器と一体となってもよい。すなわち、容器の器壁が本発明の基板の役割をなしてもよい。
【００６２】
本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、上記（ａ）の要件に加え、以下の要件（ｂ）または（ｃ）を満たす。
（ｂ）前記構造単位と、前記基板とが２つ以上の化学結合により連結していること。
（ｃ）前記構造単位と、前記基板とが１つの化学結合により連結しており、且つ、前記構造単位と、他の構造単位とが化学結合により連結していること。
【００６３】
前記基板を構成する材料分子の−ＯＨまたは−ＣＯＯＨで表される基と、前記結合手となり得る官能基とが反応して連結し、化学結合を形成することが好ましい。前記基板表面に基板を構成する材料分子の−ＯＨまたは−ＣＯＯＨで表される基がない場合であっても、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、ブラスト処理、プライマー処理またはプラズマ処理によって発生させることができる。また、酸性もしくはアルカリ性の液体で処理することで発生することもできる。また、前記基板の上に重合性モノマーを塗布し、熱または光開始で重合させ、−ＯＨ基または−ＣＯＯＨ基を表面に有する膜を形成させることもできる。前記基板を構成する材料分子に光化学反応する基を持たせ、光により−ＯＨまたは−ＣＯＯＨで表される基を発生させることで、部分的に細胞培養に適した膜を形成させることも可能である。
【００６４】
前記基板を構成する材料分子の−ＯＨまたは−ＣＯＯＨで表される基と、前記結合手となり得る官能基との反応は、以下の化学反応式で代表される反応のいずれかまたは複数の組み合わせであることが好ましい。反応式（５ａ）および(５ｂ)の反応では−Ｓｉ−Ｏ−結合が結合手である。（５ｂ）および（５ｄ）より（５ａ）および（５ｃ）の反応速度の点で好ましい。
2014207878.tif 000017
（ただしＲａはメチル基またはエチル基に代表されるアルキル基、Ｘａ塩素原子または臭素原子に代表されるハロゲン原子を表す。）
【００６５】
前記基板を構成する原子と化合物の結合手となり得る官能基が反応しても結合手となる。原子とは金原子、銀原子、銅原子、鉄原子、亜鉛原子、アルミニウム原子、ニッケル原子などの金属原子または酸素原子である。前記基板表面にこれらの原子が露出していない場合であっても、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、ブラスト処理、プライマー処理またはプラズマ処理によって露出させることができる。また、酸性もしくはアルカリ性の液体で処理することや、研磨でも露出させることもできる。
【００６６】
前記基板を構成する原子と前記結合手となり得る官能基との反応により、金属原子−酸素原子または金属原子−硫黄原子が結合手となる。特に−Ｓ−結合が結合手に含まれることが好ましい。
【００６７】
前記結合手となり得る官能基と、他の構造単位となり得る化合物が有する結合手となり得る官能基との化学結合とは以下の化学反応式で代表される反応のいずれかまたは複数の組み合わせによって生成する結合である。ここでの、結合する２つの構造単位は、同一構造でも、異なる構造でもよいが、同一の構造であることが好ましい。
2014207878.tif 000018
（ただしＲａおよびＲｂはそれぞれ独立にメチル基またはエチル基に代表されるアルキル基、ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立に塩素原子または臭素原子に代表されるハロゲン原子を表す。）
【００６８】
上記化学反応式（６ａ）および（６ｂ）において構造単位同士による化学結合は−Ｓｉ−Ｏ−結合となり、化学反応式（６ｆ）において構造単位同士による化学結合は−Ｓ−Ｓ−結合となる。化学結合の強い−Ｓｉ−Ｏ−結合が好ましい。
【００６９】
上記化学反応式（５ａ）、（５ｂ）、（５ｃ）、（５ｄ）、（６ａ）および（６ｂ）で表される反応は、その途中の反応として、下記の加水分解反応が含まれる。これによって生成するＳｉ−ＯＨ同士の脱水縮合反応によって−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−結合が生成する。
2014207878.tif 000019
【００７０】
本発明に用いられる膜を構成する構造単位は、上記化学結合によって基板に結合している。このとき該構造単位が有する式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミ基からなる群から選ばれる１種以上の基は基板に対して反対側にあることが好ましい。これを模式的に表すと図１または図２のようになる。ただし膜中には図１または図２のそれぞれ単独の構造だけでも、図１と図２の両方の構造があってもよい。
【００７１】
本発明に用いられる膜は、該構造単位が有する基が−ＣＯＯ-Ｍ基とする場合において図１および図２のように化合物が平面状に広がる膜が好ましい。しかし、この膜の上方に化合物を含む膜があることで２層以上の膜となってもよい。その場合は膜の表面に式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基が露出している必要がある。
【００７２】
本発明の膜の表面に式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-Ｍ基およびアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の基があることは、飛行時間二次イオン質量分析計（Time-of-flight secondary ion mass spectrometer: TOF-SIMS）や、Ｘ線光電子スペクトル分析（ESCAまたはXPS）によって、原子および／または化学結合の種類から確認する方法と、接触角計を用いて確認する方法がある。好ましくは、接触角計を用いて確認する方法である。
【００７３】
接触角計を用いる場合は、酸性水溶液での接触角よりもアルカリ性溶液での接触角のほうが小さいことで−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基が表面にあることが確認できる。（Langmuir 10, 3677 (1994)）その接触角の差は１°以上が好ましく、３°以上がより好ましく、５°以上がさらに好ましく、７°以上が特に好ましく１０°以上が最も好ましい。
【００７４】
本発明の細胞培養基材の製造方法に特に制限はないが、その例を下記に示す。
【００７５】
製造方法の第１の例としては、上記２つ以上の結合手となり得る官能基を有する化合物の溶液を基材に塗布することである。溶媒はクロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン等の塩素化炭化水素溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、へプタン、オクタン、ノナン、デカン等の脂肪族炭化水素溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルセルソルブアセテート等のエステル溶媒、エチレングリコール、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジメトキシエタン、プロピレングリコール、ジエトキシメタン、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、グリセリン、１，２−ヘキサンジオール等の多価アルコールおよびその誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、シクロヘキサノール等のアルコール溶媒、水等を用いることができる。前記結合手となり得る官能基がＳｉ原子を有する場合は、一般的なシランカップリング剤を用いた膜の作成と同様に、溶媒中の水濃度が低すぎると上記加水分解が起こりにくく、水濃度が高すぎると脱水縮合反応が起こりにくくなる。溶媒のｐＨも、加水分解および脱水縮合の速さに影響する。また、タンパク質などの不純物を含まないことが好ましい。
【００７６】
上記化合物の溶液を基材に塗布する工程の前に、基材に、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、ブラスト処理、プライマー処理、プラズマ処理、酸性またはアルカリ性の液体での処理等を行うことが好ましく、該処理としては、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、プラズマ処理がより好ましく、ＵＶオゾン処理がさらに好ましい。
【００７７】
上記化合物の溶液を基材に塗布する工程の後には洗浄することが好ましい。洗浄液は上記溶媒を用いることができる。タンパク質などの不純物を含まないことが好ましい。
【００７８】
製造方法の第２の例としては、上記化合物の式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有しない前駆体の溶液を基材に塗布し、前駆体の膜を作成し、さらに化学反応を起こさせて式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を膜上に付加する方法である。以下にその方法の一例を示す。
【００７９】
まず、例えば、下記化合物（１１）の溶液を基板に触れさせる。溶媒については前記の溶媒を用いることができるが、一般的なシランカップリング剤を用いた膜の作成と同様に、溶媒中の水濃度が低すぎると上記加水分解が起こりにくく、水濃度が高すぎると脱水縮合反応が起こりにくくなる。溶媒のｐＨも、加水分解および脱水縮合の速さに影響する。また、タンパク質などの不純物を含まないことが好ましい。
（ＲａＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｖ１−ＮＨ２        （１１）
（式中複数あるＲａは炭素原子数１〜６のアルキル基である。ｖ１は１〜１００の整数である。）
【００８０】
前記炭素原子数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等があげられ、メチル基またはエチル基が好ましい。）
【００８１】
上記化合物の溶液を基材に塗布する工程の前に、基材に、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、ブラスト処理、プライマー処理、プラズマ処理、酸性またはアルカリ性の液体での処理等を行うことが好ましく、該処理としては、ＵＶオゾン処理、コロナ放電処理、プラズマ処理がより好ましく、ＵＶオゾン処理がさらに好ましい。
【００８２】
上記化合物の溶液を基材に塗布する工程の後には洗浄することが好ましい。洗浄液は上記溶媒を用いることができる。タンパク質などの不純物を含まないことが好ましい。
【００８３】
この工程により図３に示す構造が生成する。この構造は、式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、-ＣＯＯＲ基、−ＣＯＯＨ基および−ＣＯＯ-Ｍ基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する細胞培養基材の前駆体であり、アミノ基を有する多能性幹細胞培養基材となる。この図では一層の膜となっているが、部分的に２層以上になる場合がある。一層の膜である方が、次の工程の反応が起こりやすくなるので好ましい。一層の膜にするために、超音波洗浄機を用いることが好ましい。
【００８４】
こうして得られた構造に−ＣＯＯＨ基を２個以上有する化合物またはその無水物を、反応させることによって、表面に−ＣＯＯＨ基を有する膜が生成される。−ＣＯＯＨ基を２個以上有する化合物の例を下記に示す。目的の膜が得られやすい観点では、下記１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１５１、２０１、１５７、２０７、１５９、２０９に示される化合物が好ましく、１０１、１０３、１０５、１０６、１５１、２０１に示される化合物がより好ましく、１０１、１０３、１０５、１５１、２０１に示される化合物がさらに好ましく、１０１、１０３、１５１に示される化合物が特に好ましく、１０１に示される化合物が最も好ましい。これらの無水物を用いる方が反応が進みやすい場合がある。無水物が得られやすいことも踏まえると、１０３、１０７、１０９、１５７、２０７に示される化合物が好ましく、１０３、１５７、２０７に示される化合物がより好ましく、１０３に示される化合物がさらに好ましい。
2014207878.tif 000020
【００８５】
この反応には溶媒を用いることができる。反応の進行を妨げないという観点からは、-ＯＨ基を有しない溶媒や水分を含みにくい溶媒が好ましく、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン等の塩素化炭化水素溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、へプタン、オクタン、ノナン、デカン等の脂肪族炭化水素溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルセルソルブアセテート等のエステル溶媒などを用いることができる。ただし、溶解性を確保するために、上記−ＣＯＯＨ基を２個以上有する化合物またはその無水物に脂溶性置換基（例えば炭素数４以上のアルキル基）などを導入することが好ましい。上記−ＣＯＯＨ基を２個以上有する化合物またはその無水物の溶解性を考慮すればメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール等のアルコール溶媒または水が好ましい。ただし、反応が遅くなるので、縮合剤（例えば4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride）などを添加することが好ましい。アルコール溶媒や水以外の溶媒であっても反応を加速させる目的で、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate、O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate、O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate、diphenylphosphorylazideなどの縮合剤を用いることが好ましい。
【００８６】
この反応は室温でも進行するが溶媒が揮発しない温度以下で過熱することで、反応が加速される。
【００８７】
この工程により、図４に示す構造が生成する。
【００８８】
上記の反応後に−ＣＯＯＨ基を−ＣＯＯ-Ｍにするために、Ｍの金属（ナトリウム、カリウムなど）、Ｍ１の水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、Ｍ１の塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなど）を直接またはアルコール溶媒若しくは水の溶液として触れさせることで得ることができる。
【００８９】
また、前記図３の構造に、下記式（２１−１）で表される化合物を、前述の方法と同様に、反応させることによって、表面に式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基または-ＣＯＯＲ基を有する膜が生成される。
Ｒ’ＯＯＣ−Ｒ１−Ｇｐ    （２１−１）
（但し、Ｒ’は水素原子、ヒドロカルビル基または式（２２）で表される基であり、Ｒ１はｐ＋ｑ価の有機基であり、ｐおよびｑはそれぞれ独立に１以上１０以下の整数であり、Ｇは、式（２１）で表される基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基または-ＣＯＯＲ基である。）
【００９０】
本発明の細胞培養基材の表面で培養する細胞は、あらゆる動物種の初代培養細胞、株化細胞、遺伝子改変細胞、組織幹細胞、多能性幹細胞や、幹細胞から分化させた細胞を含む。また、本発明の多能性幹細胞培養基材の表面では、多能性幹細胞を培養する。
【００９１】
本発明において用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調整することができる。基礎培地としては、例えばBME培地、DMEM培地、アルファMEM培地、ハム培地、RPMI1640培地、Medium 199、Williams’ E培地などが挙げられ、これらの混合培地や、血清あるいは血清成分、核酸、タンパク質やペプチド、サイトカインや化合物、無機塩類などを添加した培地でも、動物細胞の培養に用いることができる培地であれば特に限定されず、当業者の自由な選択が可能である。
【００９２】
本発明の細胞培養基材または多能性幹細胞培養基では、あらゆる基材での培養を経て得た細胞を利用することが可能である。例えば、細胞培養基材または多能性幹細胞培養基材として、細胞外マトリクスなどのタンパク質を塗布・吸着させたコート表面や、プラスチックやガラス表面などを化学的修飾した表面、高分子化合物を塗布あるいは固定化した表面などが挙げられる。本発明の細胞培養基材または多能性幹細胞培養基材は、少なくとも一部が、タンパク質、好ましくはラミニンで被覆されていることが好ましい。タンパク質は、細胞培養基材の表面に、化学結合などによって固定化されていても、付着しているだけもよい。タンパク質による被覆の方法としては、細胞培養前に、タンパク質を液に分散させて、該液を細胞培養基材または多能性幹細胞培養基に添加し、一定時間経過後に、該液を抜き去ることによって被覆することが好ましい。液は、特に制限はなく、細胞培養基材表面を荒らさないものであることが好ましく、培地、PBS、HBSSなどの生理学的に許容される液体を利用できる。また、細胞培養中に被覆の操作を行ってもよい。
【００９３】
ここで、本発明に用いることができる「ラミニン」とは、基底膜の主要成分であり、複数のドメイン構造を持つ３本のポリペプチド鎖からなる。ポリペプチド鎖の組み合わせによりアイソフォームが多数あり、体内では組織により異なるアイソフォームのラミニンが存在することが知られている。また、培養細胞でも、好みのアイソフォームがあることが知られている。ラミニンを好んで接着する細胞を培養するために、あらかじめラミニンコートされたポリスチレンディッシュが市販されている。この場合、用いられているラミニンは、培養マウス腫瘍細胞由来のラミニンが利用される。本発明においてはこの培養マウス腫瘍細胞由来のラミニンを用いることが出来る。また、本発明においては、ラミニン-511、ラミニン-521、ラミニン-332等を用いることができ、これらタンパク質やその一部の活性部位のみでも培養に用いることができ、当業者の自由な選択が可能である。
【００９４】
本発明で製造した細胞は、再生医療などの細胞を用いる治療や治療法の開発、細胞特性の基礎研究など、細胞移植を含む再生医療分野で考慮されるあらゆる目的と、細胞と細胞を利用した研究に利用できる。例えば、多能性幹細胞の場合は、分化誘導因子を培地に加えるなどにより、分化細胞を作製し、細胞移植用の細胞として調整することも可能である。
【００９５】
本発明で製造した細胞は、研究材料や移植細胞として基材から剥離して利用することも可能である。この場合、剥離した細胞を単細胞化してから培養したり、細胞凝集塊を作製して培養したり、担体となる構造物を用いて培養したり、さまざまな培養法に利用可能である。移植に用いる場合には、剥離した細胞をバッファーや培地などの溶液、あるいは天然物や合成物のゲルまたはゾルに懸濁する方法、構造物に含有させるなどの方法が挙げられ、用途に応じて当業者が自由に選択できる。
【００９６】
本発明における「多能性幹細胞」は、自己複製能を有し、多分化能（多能性）を有する幹細胞であり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、または人工多能性幹細胞（iPS細胞:induced pluripotent stem cell）であり得るが、それらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織細胞は、組織再生が可能なことからわかるように、生体に近い正常な細胞を分化できることが知られている
【００９７】
幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞であるEB5細胞は、独立行政法人理化学研究所より、D3株はATCCより入手可能である。
【００９８】
幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（FCS）、knockout serum replacement (KSR)、LIFを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
【００９９】
本発明における胚性幹細胞（ES細胞）とは、自己複製能を有し、多分化能、すなわち多能性「pluripotency」を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1998年にはヒト胚性幹細胞も樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
【０１００】
本発明における「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、線維芽細胞などの分化した細胞を、Oct3/4、Sox2、Klf4、Mycなど数種類の遺伝子を人工的に発現させることにより、直接初期化して多分化能を誘導した細胞である。人工多能性幹細胞は、2006年に山中らによりマウス細胞（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）で樹立され、翌年にはヒト線維芽細胞でも樹立が報告され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する細胞である（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318(5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。
【０１０１】
本発明で製造した細胞は、マウス線維芽細胞などのフィーダー細胞上で培養する共培養、細胞由来マトリクスコートや化合物をベースとしたコート上で未分化維持培養することも可能である。例えば、市販の細胞由来マトリクスとしてマトリゲルや、合成物としてはラミニンペプチドやアクリルアミドとペプチドの混合物であるシンセマックスなどが挙げられる。
【０１０２】
本発明で製造した細胞は、分化細胞の作製に利用できる。細胞の分化方法は、公知の条件から適宜選択して設定することができ、目的の分化細胞へ分化させるための培地組成や培養条件は、特に限定されない。
【０１０３】
本発明により、生体や細胞由来因子を足場として用いることなく、完全な化合物のみから成る基材上での多能性幹細胞培養が可能となる。使用する培地の選択により、細胞は、完全に既知組成条件下で培養できるため、潜在的な汚染の回避や、培養バッチ間のばらつきが減少し、再現性を向上できる。特に、細胞移植治療などの再生医療分野で利用する場合に、安全性が高い細胞を供給できる点で大きな意義を有する。
【０１０４】
本発明の細胞培養基材表面または多能性幹細胞培養基材表面で培養された細胞は、公知の方法である、剥離液による化学的剥離やセルスクレーパーなどによる物理的剥離で回収できる。例えば、化学的剥離における剥離液とは、細胞と細胞培養基材のアンカーとなるタンパク質を切断する酵素や、タンパク質の結合に必要なイオンのキレート剤が挙げられる。酵素には、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼなど、キレート剤にはEDTAなどが挙げられ、細胞剥離には、これらの酵素やキレート剤の単独溶液あるいは混合溶液が利用可能である。物理的剥離では、細胞が培養されている培養基材表面をシリコーンゴムやプラスチック樹脂などのブレードで擦ることにより、細胞の剥離・回収が可能である。
【０１０５】
また、本発明の細胞培養基材表面または多能性幹細胞培養基材表面で培養された細胞は、液で全体が浸された細胞を、細胞の少なくとも一部を液面から露出させることにより、細胞培養基材から剥離して回収することができる。液は、特に制限はなく、細胞培養基材表面を荒らさないものであることが好ましく、培地、PBS、HBSSなどの生理学的に許容される液体を利用できる。細胞培養基材表面で培養された細胞全体が、液に浸されるよう、細胞培養基材に液を添加することが好ましい。その後、液を除去する等により、細胞の少なくとも一部、好ましくは、細胞全体を、液面から露出させることにより、細胞を剥離することができる。元々、細胞が培養状態にあり、既に細胞全体が培養液に浸されている場合は、ただ、液を除去する等により、細胞の少なくとも一部が液面から露出するので、そのまま剥離することが可能である。この場合、細胞は、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞）であることが好ましい。
【０１０６】
剥離した細胞は、PBSなどのバッファーや培地に懸濁して遠沈管に回収し、遠心操作あるいは自然沈降により沈殿させたのち、上清を取り除くことで回収細胞を単離できる。
【０１０７】
回収した細胞は、本発明で使用した培養基材または異なる基材を用いた継代培養、細胞移植やその他アッセイに用いるなど、さまざまな用途に利用可能である。
【０１０８】
本発明により製造された多能性幹細胞は、前述のごとく、培養培地を除去することで剥離できので、培養中の培地交換は、細胞の少なくとも一部が液面から露出しないように、例えば、半量除去した上で新鮮培地を半量加えることが好ましい。
【０１０９】
本発明の細胞培養基材または多能性幹細胞培養基材で培養された多能性幹細胞は、細胞間が結合したコロニーの形状を保ったままの回収あるいは細胞が単一細胞化された形状の回収が可能である。
【０１１０】
本発明の細胞培養基材または多能性幹細胞培養基材で培養された多能性幹細胞は、フィーダー細胞を用いる培養とは異なり、多能性幹細胞中のフィーダー細胞の混在を防止できるため、細胞のコンタミネーション防止やフィーダー細胞除去操作時間の削減により、簡便な操作が可能である。
【０１１１】
回収した多能性幹細胞を用いて分化細胞を作製し、治療用の移植細胞や培養疾患モデル細胞としても利用可能である。
【実施例】
【０１１２】
以下、本発明の実施例をさらに詳細に説明する。
【０１１３】
実施例１
＜細胞培養基材＞
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％トルエン溶液に一晩浸した。この工程により図５に示す構造が生成した。次にメタノールで洗浄し、 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride（DMT-MM）（36.7mM）とテレフタル酸（10ｍM）のメタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で洗浄した。この工程により図６に示す構造が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１１４】
＜細胞培養＞
1. フィーダー細胞 (MEF; mouse embryonic fibroblast)上で培養された未分化ES細胞をPBSで洗浄後、剥離液によりコロニーの形状のまま剥離し、遠沈管に回収した。
2.遠心操作により回収細胞を沈殿させ、上清を除去して、再び培地に懸濁した。培地は、DMEM/F12培地に 20% knockout serum、non essential amino acid、2 mM L-グルタミン、0.1 mM  メルカプトエタノール および 10 ng/mL basic FGF を加えた培地を用いた。
3. 0.1% ゼラチンコートの培養皿に、上記細胞懸濁液を加え、37℃、2% CO2のインキュベーター内に静置し、ES細胞懸濁液に混在するフィーダー細胞を接着させた。
4. 静置から1.5時間後、培養皿に接着せずに浮遊しているES細胞塊を培地と共に遠沈管に回収し、遠心操作で細胞塊を沈殿させたのち上清を除去した。
5. 遠沈管に新鮮な培地を1 mL 加えてピペッティング操作することで細胞塊をある程度の大きさに破壊し、さらに新鮮な培地を加えて希釈したのち、実施例1に記した基材表面上に培地と共に播種した。培地は、あらかじめ取得した MEF の培養上清に、10 μＭ ROCK inhibitor (Y27632) と basic FGFとを添加して使用した。
6. 細胞播種から3時間、24時間、72時間後に細胞を顕微鏡により観察し、接着の有無や未分化ES細胞特有の細胞形態を評価した。細胞塊の状態で播種した細胞は、本発明の培養基材表面に接着してから、24時間目以降徐々に伸展し、72時間後には正常な未分化ES細胞のコロニーの形態を示すことが確認された。
【０１１５】
比較例１
＜細胞培養基材＞
ガラス底のディッシュをメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。このディッシュにGlycerol Dimethacrylate（194mg）、アクリル酸（14mg）、ＢＡＳＦ製光開始剤Irgacure2959（20mg）およびメタノール999mgの混合溶液を加えて、窒素雰囲気下で紫外線を５分間照射してポリアクリル酸架橋膜を得た。この膜は下記式に示す構造Ａと構造Ｂが多数結合した高分子架橋膜であり、単分子膜ではなく、ガラス底のディッシュとは化学結合がない。これをイオン交換水で洗浄し、さらにイオン交換水を入れて１時間おき、ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で洗浄した。
2014207878.tif 000021
（＊は結合手を表す。）
【０１１６】
＜細胞培養＞
1. フィーダー細胞 (MEF; mouse embryonic fibroblast)上で培養された未分化ES細胞をPBS(-)で洗浄後、剥離液によりコロニーの形状のまま剥離し、遠沈管に回収した。
2.遠心操作により回収細胞を沈殿させ、上清を除去して、再び培地に懸濁した。培地は、DMEM/F12培地に 20% knockout serum、non essential amino acid、2 mM L-グルタミン、0.1 mM  メルカプトエタノール および 10 ng/mL basic FGF を加えた培地を用いた。
3. 0.1% ゼラチンコートの培養皿に、上記細胞懸濁液を加え、37℃、2% CO2のインキュベーター内に静置し、ES細胞懸濁液に混在するフィーダー細胞を接着させた。
4. 静置から1.5時間後、培養皿に接着せずに浮遊しているES細胞塊を培地と共に遠沈管に回収し、遠心操作で細胞塊を沈殿させたのち上清を除去した。
5. 遠沈管に新鮮な培地を1 mL 加えてピペッティング操作することで細胞塊をある程度の大きさに破壊し、さらに新鮮な培地を加えて希釈したのち、比較例1に記した基材表面上に培地と共に播種した。培地は、あらかじめ取得した MEF の培養上清に、10 μＭ ROCK inhibitor (Y27632) と basic FGFとを添加して使用した。
6. 細胞播種から3時間、24時間、72時間後に細胞を顕微鏡により観察し、接着の有無や未分化ES細胞特有の細胞形態を評価した。播種した細胞は播種後72時間を経ても全く接着せず、培養は不可能であった。
【０１１７】
実施例２
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％エタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で洗浄した。この工程により図５に示す構造を有する細胞培養基材（１）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１１８】
実施例３
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％エタノール溶液に一晩浸した。この工程により図５に示す構造が生成した。次にメタノールおよび高純度水で洗浄し、 DMT-MM（36.7mM）およびテレフタル酸（16.7ｍM）のメタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で洗浄した。この工程により図６に示す構造を有する細胞培養基材（２）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１１９】
実施例４
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％エタノール溶液に一晩浸した。この工程により図５に示す構造が生成した。次にメタノールおよび高純度水で洗浄し、 DMT-MM（36.7mM）およびピロメリット酸（16.7ｍM）のメタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、高純水で洗浄した。この工程により図７に示す構造を有する細胞培養基材（３）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１２０】
＜細胞培養＞
1. フィーダー細胞 (MEF; mouse embryonic fibroblast)上で培養された未分化ES細胞をPBS(-)で洗浄後、剥離液によりコロニーの形状のまま剥離し、遠沈管に回収した。
2.遠心操作により回収細胞を沈殿させ、上清を除去して再び培地に懸濁した。培地は、ES細胞の培養によく利用される、DMEM/F12培地に 20% knockout serum、non essential amino acid、2 mM L-グルタミン、0.1 mM  メルカプトエタノール および 10 ng/mL basic FGF を加えた培地を用いた。
3. 0.1% ゼラチンコートの培養皿に、上記細胞懸濁液を加え、37℃、2% CO2のインキュベーター内に静置し、ES細胞懸濁液に混在するフィーダー細胞を接着させた。
4. 静置から1.5時間後、培養皿に接着せずに浮遊しているES細胞塊を培地と共に遠沈管に回収し、遠心操作で細胞塊を沈殿させたのち上清を除去した。
5. 遠沈管に Innovative Cell Technologies 製 Accumax を 1 mL 添加し、37℃にて5分間インキュベートしたのちにピペッティングすることにより、細胞を単一化した。
6.  遠心操作により細胞を沈殿させたのち上清を除去し新鮮な培地を加えて希釈したのち、実施例２の細胞培養基材（１）、実施例３の細胞培養基材（２）および実施例４の細胞培養基材（３）に培地と共に播種した。培地は、前記未分化ES細胞の培養と同様の培地を使用した。
７. 細胞播種から3時間、24時間と72時間以降の数日間、顕微鏡により細胞を観察し、接着の有無や未分化ES細胞特有の細胞形態を評価した。細胞は、実施例２の細胞培養基材（１）、実施例３の細胞培養基材（２）および実施例４の細胞培養基材（３）のそれぞれの表面において、播種してから接着し、24時間目以降徐々に伸展し、72時間後には正常な未分化ES細胞のコロニー、さらに4日後には正常な形態かつ継代が可能な大きさのコロニーに成長したことが確認された。
【０１２１】
実施例５
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％エタノール溶液に一晩浸した。この工程により図５に示す構造が生成した。次にメタノールおよび高純度水で洗浄し、 同仁化学研究所製ＧＭＢＳ（N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide）（0.5mM）のメタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、高純水で洗浄した。この工程により図８に示す構造を有する細胞培養基材（４）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１２２】
実施例６
ＧＭＢＳの濃度を2.0mMにする以外は実施例５と同じ方法で図８に示す構造を有する細胞培養基材（５）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１２３】
実施例７
ガラス板をメタノールで洗浄し、ＵＶオゾン洗浄機で１５分間洗浄した。これを3-(Trimethoxysilyl)propylamineの0.1重量％エタノール溶液に一晩浸した。これをメタノールで洗浄し、高純水で洗浄した。この工程により図５に示す構造を有する細胞培養基材（６）が生成した。得られた細胞培養基材は、前記要件（ａ）および（ｃ）を満たす構造単位を含む。
【０１２４】
比較例２
BDファルコン製マルチウェルセルカルチャープレート(ポリスチレン）の１ウェルに対し、（株）ニッピ製ラミニン iMatrix-511 をＧＩＢＣＯ製PBS(-) で希釈して0.01 μｇ/ｃｍ２となるように、ラミニン希釈溶液を接触させた。４℃で一晩静置し、使用直前にGIBCO製PBS(-)で洗浄した。
【０１２５】
＜細胞培養＞
1. フィーダー細胞 (MEF; mouse embryonic fibroblast)上で培養された未分化ES細胞をPBS(-)で洗浄後、剥離液によりコロニーの形状のまま剥離し、遠沈管に回収した。
2.遠心操作により回収細胞を沈殿させ、上清を除去して、再び培地に懸濁した。培地は、DMEM/F12培地に 20% knockout serum、non essential amino acid、2 mM L-グルタミン、0.1 mM  メルカプトエタノール および 10 ng/mL basic FGF を加えた培地を用いた。
3. 0.1% ゼラチンコートの培養皿に、上記細胞懸濁液を加え、37℃、2% CO2のインキュベーター内に静置し、ES細胞懸濁液に混在するフィーダー細胞を接着させた。
4. 静置から1.5時間後、培養皿に接着せずに浮遊しているES細胞塊を培地と共に遠沈管に回収し、遠心操作で細胞塊を沈殿させたのち上清を除去した。
5. 遠沈管に Innovative Cell Technologies 製 Accumax を 1 mL 添加し37℃にて5分間インキュベートしたのち、ピペッティングすることにより、細胞を単一化した。
6.  遠心操作により細胞を沈殿させたのち上清を除去し、ES細胞やiPS細胞培養用培地であるDSファーマバイオメディカル製  S-Medium に10 ng/mL basic FGFと2０μM  Y276327とを加えた培地に懸濁した。
7.（株）ニッピ製ラミニンiMatrix-511をＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で希釈し、実施例５の細胞培養基材（５）、実施例６の細胞培養基材（６）、実施例７の細胞培養基材（７）、実施例４の細胞培養基材（３）および比較例２のポリスチレンプレートに0.01μｇ/cm2になるよう接触させ、４℃で一晩静置し、ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ(-)で洗浄し、そこへ細胞塊を培地と共に播種した。培地は、ES細胞やiPS細胞培養用培地であるDSファーマバイオメディカル製  S-Medium に10 ng/mL basic FGFと2０μM  Y276327を加えた培地を使用した。
6. 細胞播種から２日後に細胞を顕微鏡により観察し、接着の有無や未分化ES細胞特有の細胞形態を評価した。単一化させた細胞は、本発明の培養基材表面に接着し、播種後３時間目以降徐々に伸展し、48時間後は正常な未分化ES細胞のコロニーの形態を示すことが確認された。それと比較して、比較例２のポリスチレンプレート上での細胞の状態は明らかに劣っていた。
【０１２６】
上記の結果より、本発明の細胞培養基材は、ES細胞などの通常培養困難な多能性幹細胞を培養可能であり、細胞が培養可能な新規な基材を提供できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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