(57)【要約】【課題】Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）抗原に対する抗体を用いて卵巣癌および腎臓癌を処置する方法。【解決手段】本明細書中に記載される本発明は、抗原ＴＩＭ−１に指向される抗体と、このような抗体の癌（例えば、腎臓癌および卵巣癌）の処置のための使用に関する。特に、抗原ＴＩＭ−１に指向される完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする単離されたポリヌクレオチド配列、ならびに、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域（ＦＲ）および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）（具体的には、ＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）にまたがる連続した重鎖および軽鎖の配列に対応する配列が提供される。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株もまた提供される。【選択図】図１
2014240430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本明細書において開示される本発明は、抗原であるＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）タンパク質に指向される抗体、ならびにこのような抗体の使用に関する。具体的には、抗原ＴＩＭ−１に指向される完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子コードするヌクレオチド配列ならびに重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）にわたって連続する重鎖および軽鎖の配列（特に、ＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に対応する配列が提供される。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ）タンパク質をコードする遺伝子の新規ファミリー（ヒトにおいて３つ、マウスにおいて８つ）が、最近、免疫において明らかになった役割と共に記載されている。非特許文献１；脾特許文献２。ＴＩＭ遺伝子ファミリーのメンバーは、ヒトにおいて５ｑ３３．２、そして、マウスにおいては１１ＨＢ１．１の染色体領域にあり、アレルギー疾患および自己免疫疾患に関連付けられている。非特許文献３；非特許文献４。
【０００３】
１つのＴＩＭファミリーメンバーであるＴＩＭ−１はまた、Ａ型肝炎ウイルスの細胞レセプター（ＨＡＶｃｒ−１）としても公知であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のついてのレセプターとして最初に発見された（非特許文献５）。この遺伝子は後に、腎臓損傷性分子１（ＫＩＭ−１）としてクローニングされた（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００４】
Ｋａｐｌａｎらは、このレセプターを発現する初代のアフリカミドリザル腎臓（ＡＧＭＫ）細胞株に由来するｃＤＮＡライブラリーからＡ型肝炎ウイルスについての細胞レセプターを単離した。特許文献１を参照のこと。ポリペプチドおよび核酸の開示される有用性は、Ａ型肝炎ウイルスによる感染を診断すること、サンプル中の不純物からＡ型肝炎ウイルスを分離すること、Ａ型肝炎ウイルスによる感染を処置すること、ならびに、Ａ型肝炎ウイルスによる感染を防止すること、であった。さらに、ポリペプチドは、形質転換された細胞において発現され得、そして、抗Ａ型肝炎ウイルス結合アッセイにおいて化合物の効能を試験するために使用され得る。
【０００５】
ヒトホモログであるｈＨＡＶｃｒ−１（ＴＩＭ−１としても公知）は、非特許文献８により記載された。同じ分子が、腎臓を損傷した後に腎臓組織においてアップレギュレートされたことが見出された腎臓損傷関連分子（ＫＩＭ）として、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載された。この分子は、特に、腎臓の疾患、障害または損傷の種々の治療的介入において有用であるものとして記載された。例えば、特許文献５は、ＫＩＭに対する抗体を記載し、そして、ＫＩＭ−１を発現する細胞（例えば、腎細胞または腎臓癌細胞）からのＫＩＭ−１ポリペプチドの脱皮（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を阻害する抗体を記載する。
【０００６】
ＴＩＭ−１は、新規の６システイン免疫グロブリン様ドメインと、ムチンであるスレオニン／セリン／プロリンリッチ（Ｔ／Ｓ／Ｐ）ドメインとを含む、１型の膜タンパク質である。ＴＩＭ−１は、最初にラットにおいて同定された。ＴＩＭ−１は、マウス、アフリカミドリザルおよびヒトにおいて発見されている（非特許文献８）。アフリカミドリザルのオルソログは、ヒトＴＩＭ−１に対して最も密に関連しており、３５８の整列されたアミノ酸にわたり、７７．６％のアミノ酸同一性を示す。ラットおよびマウスのオルソログは、それぞれ、５０％（１５５／３１０）および４５．６％（１２６／２７６）のアミノ酸同一性を示すが、アフリカミドリザルよりも整列される配列のセグメントが短い。ＴＩＭ−１のＩｇ様ドメインに対するモノクローナル抗体は、インビトロにおいてＡ型肝炎ウイルス感染に対して防御的であることが示されている。非特許文献９。さらに、ＫＩＭ−１は、正常な腎臓において低いレベルで発現されることが示されたが、その発現は、虚血後の腎臓において劇的に上昇する。非特許文献６。ＨＡＶＣＲ−１もまた、クリアな細胞癌腫およびこの癌腫に由来する癌細胞株において上昇したレベルで発現される。
【０００７】
ＴＩＭ−１は、Ｐ型の「三葉型」ドメインに対して相同性を示し、他のＰ型三葉型ファミリーメンバーと類似する生物学的活性を有し得ることが示唆される。三葉型ドメインを含むタンパク質のいくつかは、腎臓、結腸および胸部の腫瘍細胞株を処置するために使用されるとき、細胞の散乱および浸潤を誘導することが示されている。非特許文献１０。さらに、三葉型ドメインを含むタンパク質のいくつかは、上皮における足場に関連するアポトーシス現象であるアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）に対して細胞の抵抗性を与える。非特許文献１１。
【０００８】
ＴＩＭ−１は、喘息に関与しているマウスのシンテニー領域内のＴａｐｒとして知られる、ヒト第５染色体の領域にマッピングされる。Ｔａｐｒ（主要Ｔ細胞調節遺伝子座）は、気道の過反応性の発生を制御する。非特許文献１２；非特許文献２。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，６２２，８６１号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／４４４６０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／５３０７１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，６６４，３８５号明細書
【特許文献５】国際公開第０２／０９８９２０号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｕｃｈｒｏｏら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４５４−４６２（２００３）
【非特許文献２】ＭｃＩｎｔｉｒｅら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：１１０９−１１１６（２００１）
【非特許文献３】Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：３８９−４００（２００２）
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１０５０−１０５２（２００３）
【非特許文献５】Ｋａｐｌａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １５（１６）：４２８２−９６（１９９６）
【非特許文献６】Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：４１３５−４１４２（１９９８）
【非特許文献７】Ｈａｎら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６２：２３７−２４４（２００２）
【非特許文献８】Ｆｅｉｇｅｌｓｔｏｃｋら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（８）：６６２１−６６２８（１９９８）
【非特許文献９】Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５（２）：７１７−２５（２００１）
【非特許文献１０】Ｐｒｅｓｔら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６（６）：５９２−４（２００２）
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７４（３）：５７６−８２（２０００）
【非特許文献１２】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：１０９５−１０９６（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本明細書に記載される本発明の実施形態は、ＴＩＭ−１に結合し、そして、ＴＩＭ−１の機能に影響するヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメントの開発に基づく。ＴＩＭ−１は、新生物および炎症性疾患のような病理において上昇したレベルで発現される。従って、ＴＩＭ−１の生物学的活性の阻害は、炎症を防止し得、そして、他に望ましい作用（ＴＩＭ−１により誘導される細胞の増殖を含む）を及ぼし得る。本発明の実施形態は、ＴＩＭ−１に特異的に結合する単離された抗体またはその結合フラグメントの生成および同定に基づく。
【００１２】
従って、本発明の１つの実施形態は、ＴＩＭ−１に特異的に結合する単離された抗体またはこの抗体のフラグメントを包含する。当該分野で公知であるように、抗体は、有利なように、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体および／または完全ヒト抗体であり得る。本明細書に記載される本発明の実施形態はまた、これらの抗体を産生するための細胞を提供する。
【００１３】
本明細書に記載される本発明のいくつかの実施形態は、ＴＩＭ−１に結合し、そしてＴＩＭ−１の機能に影響するモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、治療的な観点から望ましい特性（ＴＩＭ−１に対する強い結合親和性、インビトロおよびインビボにおいてＴＩＭ−１を中和する能力、ならびに、ＴＩＭ−１により誘導される細胞の増殖を阻害する能力を含む）を有する完全ヒト抗ＴＩＭ−１抗体および抗ＴＩＭ−１抗体調製物に関する。
【００１４】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体は、非常に高い親和性（Ｋｄ）でＴＩＭ−１に結合する。例えば、ヒト抗体、ウサギ抗体、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体は、１０−７Ｍ未満のＫｄ、１０−８Ｍ未満のＫｄ、１０−９Ｍ未満のＫｄ、１０−１０Ｍ未満のＫｄ、１０−１１Ｍ未満のＫｄ、１０−１２Ｍ未満のＫｄ、１０−１３Ｍ未満のＫｄもしくは１０−１４Ｍ未満のＫｄ、または、これらの値内のあらゆる範囲もしくは値で、ＴＩＭ−１に結合し得る。親和性および／またはアビディティの測定は、本明細書に記載されるように、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定され得る。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）に特異的に結合し、そして、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８および配列番号５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを有する単離された抗体を提供する。
【００１７】
なお別の実施形態において、本発明は、ＴＩＭ−１に特異的に結合し、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有し、そして、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８および配列番号５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを有する、単離された抗体を提供する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、ＴＩＭ−１に特異的に結合し、そして、表４に示される配列のうちの１つを含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する、完全ヒト抗体である。ＣＤＲの決定は、当業者により容易に達成され得ることに注意されたい。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ［１９９１］，第１〜３巻を参照のこと。
【００１９】
なお別の実施形態は、ＴＩＭ−１に特異的に結合し、そして、表５に示される配列のうちの１つを含むＣＤＲを含むアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。特定の実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２０】
さらなる実施形態は、ＴＩＭ−１に結合し、表４に示されるＣＤＲ配列のうちの１つを含むアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有し、かつ、表５に示されるＣＤＲ配列のうちの１つを含むアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。特定の実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、ＴＩＭ−１のオルソログに結合する完全ヒト抗体である。本明細書におけるさらなる実施形態は、本明細書に記載される完全ヒト抗体と、ＴＩＭ−１への結合について交差競合する抗体である。
【００２２】
他の実施形態は、ヒトＴＩＭ−１を用いて哺乳動物を免疫化することによって、ＴＩＭ−１に対して高い親和性の抗体、または、そのフラグメント、および、その１以上のオルソログ配列またはフラグメントを産生する方法を包含する。
【００２３】
本発明の実施形態は、いかなる特定の形態の抗体にも限定されないことが理解される。例えば、抗ＴＩＭ−１抗体は、全長抗体（例えば、インタクトなヒトＦｃ領域を有する）、または、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、または単鎖抗体）であり得る。さらに、抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、抗体をコードする遺伝子を用いて形質転換もしくはトランスフェクトされた組換え的に産生された細胞から、製造され得る。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ−１抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子、抗ＴＩＭ−１抗体をコードする単離された核酸分子を有するベクター、および、このような核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞を包含する。さらに、本発明の１つの実施形態は、核酸分子を発現させて抗体を産生させる条件下で宿主細胞を培養し、その後、この宿主細胞から抗体を回収することによって、抗ＴＩＭ−１抗体を産生する方法である。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、抗体またはその機能的なフラグメントと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との混合物において抗ＴＩＭ−１抗体の有効量を有する薬学的組成物を包含する。なお他の実施形態において、抗ＴＩＭ−１抗体またはそのフラグメントは、治療剤に結合される。治療剤は、例えば、毒素、放射性同位元素または化学療法因子であり得る。好ましくは、このような抗体は、例えば、腫瘍および癌（例えば、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌）、ならびに、他の炎症性状態を含む病理の処置のために使用され得る。より好ましくは、抗体は、腎臓癌および卵巣癌を処置するために使用され得る。
【００２７】
なおさらなる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、動物におけるＴＩＭ−１により誘導された細胞の増殖の効率的な処置のための医薬の調製のために使用され得、この場合、上記モノクローナル抗体は、ＴＩＭ−１に対して特異的に結合する。
【００２８】
なお別の実施形態は、新生物および炎症性状態のような疾患の処置のための医薬の調製における抗ＴＩＭ−１抗体の使用である。１つの実施形態において、新生物としては、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌のような、腫瘍および癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
なお別の局面において、本発明は、ＴＩＭ−１の発現に関連する病理を効率的に処置するための方法を包含する。これらの方法は、ＴＩＭ−１の発現に関連する状態のための処置を必要とする動物を選択する工程、および、完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を上記動物に投与する工程を包含し、ここで、上記抗体は、ＴＩＭ−１に対して特異的に結合する。
【００３０】
好ましくは、哺乳動物、そして、より好ましくは、ヒトは、抗ＴＩＭ−１抗体を受ける。好ましい実施形態において、新生物（腎腫瘍および膵臓腫瘍、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、直腸癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌および脳腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない）が処置される。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、動物における新生物疾患の効率的な処置のための医薬の調製における抗体の使用を包含し、ここで、上記モノクローナル抗体はＴＩＭ−１に特異的に結合する。処置可能な新生物疾患としては、例えば、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌が挙げられる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＩＭ−１の発現に関連する細胞増殖を阻害するための方法を包含する。これらの方法は、ＴＩＭ−１により誘導された細胞の増殖のための処置を必要とする動物を選択する工程、および、完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を上記動物に投与する工程を包含し、ここで、上記抗体はＴＩＭ−１に特異的に結合する。他の実施形態において、ＴＩＭ−１を発現する細胞は、抗ＴＩＭ−１抗体またはそのフラグメントの有効量で処置される。この方法は、インビボにおいても実施され得る。
【００３３】
この方法は、インビボにおいて実施され得、そして、患者は、好ましくはヒト患者である。好ましい実施形態において、この方法は、新生物疾患（例えば、腎腫瘍、膵臓癌、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌および脳腫瘍のような腫瘍および癌）の処置と関係がある。
【００３４】
いくつかの実施形態において、抗ＴＩＭ−１抗体は患者に投与され、その後、過剰に循環する抗体を血液から除去するために清浄剤が投与される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、抗ＴＩＭ−１抗体は、その補体を固定する能力と補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与する能力とを増強するように改変され得る。１つの実施形態において、抗ＴＩＭ−１抗体は、アミノ酸置換などによって改変されて、身体からのそのクリアランスを変更し得る。あるいは、いくつかの他のアミノ酸置換は、身体からの抗体のクリアランスを遅くし得る。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、容器を含めた製造品を提供する。容器は、抗ＴＩＭ−１抗体を含む組成物と、その組成物が、ＴＩＭ−１の過剰発現により特徴付けられる新生物または炎症性疾患を処置するために使用され得ることを示す包装挿入物またはラベルとを備える。
【００３７】
なお別の実施形態は、患者のサンプルにおけるＴＩＭ−１のレベルをアッセイするための方法を提供し、この方法は、抗ＴＩＭ−１抗体を患者からの生物学的サンプルと接触させる工程、および、上記抗体と上記サンプルにおけるＴＩＭ−１との間の結合のレベルを検出する工程を包含する。より具体的な実施形態において、生物学的サンプルは血液である。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物の組織または細胞においてＴＩＭ−１およびＴＩＭ−１のオルソログを検出して、新生物疾患または炎症性状態をスクリーニングするためのアッセイキットを包含する。このキットは、ＴＩＭ−１に結合する抗体と、ＴＩＭ−１が存在する場合に、この抗体のＴＩＭ−１との反応を示すための手段とを備える。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、ＴＩＭ−１に結合する抗体は標識される。別の実施形態において、抗体は、標識されていない一次抗体であり、そして、キットはさらに、この一次抗体を検出するための手段を備える。１つの実施形態において、この手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで標識される。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、疾患または状態を診断する方法を包含し、この方法において、本明細書に記載されるように調製した抗体は、患者サンプルにおけるＴＩＭ−１のレベルを検出するために利用される。１つの実施形態において、患者サンプルは、血液または血清である。さらなる実施形態において、危険因子の同定、疾患の診断、および疾患のステージ分けのための方法が提示され、これらの方法は、抗ＴＩＭ−１抗体を用いてＴＩＭ−１の過剰発現を同定することを必要とする。
【００４０】
本明細書に記載される本発明の実施形態はまた、ＴＩＭ−１アゴニスト（模倣物）またはＴＩＭ−１アンタゴニストのいずれかとして機能するＴＩＭ−１タンパク質の改変体に関する。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、抗腫瘍治療薬のような細胞傷害性の化学療法因子または放射性療法因子に結合された、ＴＩＭ−１抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の使用である。
【００４２】
１つの実施形態は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する抗体によるＴＩＭ−１抗原への同時の結合をブロックする単離された抗体を提供する。別の実施形態は、ＴＩＭ−１抗原に結合し、そして、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する抗体と交差反応する単離された抗体を提供する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、配列番号５４のＴＩＭ−１抗原上にある配列番号８７のエピトープに結合し、そして、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する抗体と交差反応する単離された抗体を提供する。なお別の実施形態において、本発明は、配列番号５４のＴＩＭ−１抗原上にある配列番号８７のエピトープに結合する単離された抗体を提供し、上記抗体は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６および配列番号５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有する抗体によるＴＩＭ−１への同時の結合をブロックする。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
卵巣癌を効率的に処置する方法であって、該方法は、処置を必要とする患者にＴ細胞の免疫グロブリンドメインまたはムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントの治療有効用量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記抗体が配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記抗体が１０−７Ｍと１０−１４Ｍとの間のＫｄでＴＩＭ−１に対して結合する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗体または結合フラグメントが治療剤に結合される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記治療剤が毒素である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記治療剤が放射性同位元素である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記治療剤が化学療法因子である、項目５に記載の方法。
（項目９）
腎臓癌を効率的に処置する方法であって、該方法は、処置を必要とする患者にＴ細胞の免疫グロブリンドメインまたはムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントの治療有効用量を投与する工程を包含する、方法。
（項目１０）
前記抗体が配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体が１０−７Ｍと１０−１４Ｍとの間のＫｄでＴＩＭ−１に対して結合する、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記抗体または結合フラグメントが治療剤に結合される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記治療剤が毒素である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記治療剤が放射性同位元素である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記治療剤が化学療法因子である、項目１３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＴＩＭ−１抗原に対する抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体１．２９、２．５６．２、２．５９．２および２．４５．１のＥＬＩＳＡアッセイの結果の棒グラフである。
【図２】図２は、無関係なタンパク質に対する抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体１．２９、２．５６．２、２．５９．２および２．４５．１のＥＬＩＳＡアッセイの結果の棒グラフである。
【図３】図３は、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２を用いた、腎細胞癌（３Ａ）および膵臓癌（３Ｂ）の染色を示す。
【図４】図４は、ＡＣＨＮ腎臓癌細胞株における、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体により媒介される毒素殺傷のクローン原性アッセイ結果の棒グラフである。
【図５】図５は、ＢＴ５４９乳癌細胞株における、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体により媒介される毒素殺傷のクローン原性アッセイ結果の棒グラフである。
【図６】図６は、オーリスタチンＥ（ＡＥ）を結合した抗体を用いて処置されたＣＡＫＩ−１細胞のクローン原性アッセイ結果の棒グラフである。
【図７】図７は、オーリスタチンＥ（ＡＥ）を結合した抗体を用いて処置されたＢＴ５４９細胞のクローン原性アッセイ結果の棒グラフである。
【図８】図８は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２、２．５６．２および２．４５．１が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ１細胞からのＩＬ−４の放出を有意に阻害することを示す棒グラフである。
【図９】図９は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２および２．４５．１が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−４の放出を有意に阻害することを示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ１細胞からのＩＬ−５の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２および１．２９が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−５の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２、１．２９および２．５６．２が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ１細胞からのＩＬ−１０の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２、１．２９および２．４５．１が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−１０の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２、１．２９および２．５６．２が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ１細胞からのＩＬ−１３の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２および１．２９が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−１３の放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮγの放出を阻害しなかったことを示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体２．５９．２および２．４５．１が、コントロールのＰＫＩ  ６．３  ｍＡｂと比較して、Ｔｈ２細胞からのＩＦＮγの放出を有意に阻害したことを示す棒グラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｅ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｆ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｇ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｈ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｉ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｊ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｋ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｌ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｍ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｎ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｏ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｐ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｑ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｒ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｓ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｔ】図１８Ａ〜１８Ｔは、種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和を評価した実験からＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＴＩＭ−１特異的な抗体と無関係な抗体とに結合させた植物毒素であるサポリンを用いて行った、抗体結合体研究の結果を示す線グラフである（図１９Ａ〜１９Ｃ）。毒素なしの無関係な抗体のみのさらなるネガティブコントロールを含めた（図１９Ｄ）。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＴＩＭ−１特異的な抗体と無関係な抗体とに結合させた植物毒素であるサポリンを用いて行った、抗体結合体研究の結果を示す線グラフである（図１９Ａ〜１９Ｃ）。毒素なしの無関係な抗体のみのさらなるネガティブコントロールを含めた（図１９Ｄ）。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＴＩＭ−１特異的な抗体と無関係な抗体とに結合させた植物毒素であるサポリンを用いて行った、抗体結合体研究の結果を示す線グラフである（図１９Ａ〜１９Ｃ）。毒素なしの無関係な抗体のみのさらなるネガティブコントロールを含めた（図１９Ｄ）。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＴＩＭ−１特異的な抗体と無関係な抗体とに結合させた植物毒素であるサポリンを用いて行った、抗体結合体研究の結果を示す線グラフである（図１９Ａ〜１９Ｃ）。毒素なしの無関係な抗体のみのさらなるネガティブコントロールを含めた（図１９Ｄ）。
【図２０】図２０は、４日間毎日４回の処置について６．２５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇでの静脈内投与処置を行った後の、無胸腺マウスにおけるＩＧＲＯＶ１卵巣癌異種移植片の腫瘍増殖の抑制と、完全な後退とを示すグラフである。ビンブラスチン（１．７ｍｇ／ｋｇ  ｑ４ｄ×４静脈内投与）およびパクリタキセル（１５．０ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄ×４静脈内投与）のような参考薬物に対する腫瘍を有する動物の応答もまた示される。コントロール群は、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水のいずれかで処置した。ＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥは、処置１回につき５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１／６）および処置１回につき１００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６／６）において、試験動物に対して毒性であった。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に記載される本発明の実施形態は、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１（ＴＩＭ−１）に特異的に結合する単離された抗体の生成および同定に基づく。以下に考察するように、ＴＩＭ−１は、クリアな細胞癌およびこのような癌に由来する癌細胞株において上昇したレベルで発現される。従って、ＴＩＭ−１に結合する抗体は、癌の処置および阻害に有用である。さらに、ＴＩＭ−１に結合する抗体はまた、細胞の移動を減らし、そして、腎臓癌細胞のアポトーシスを増強するためにも有用である。
【００４６】
従って、本明細書に記載される本発明の実施形態は、ＴＩＭ−１に結合する単離された抗体またはこの抗体のフラグメントを提供する。当該分野で公知であるように、抗体は、有利なように、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体および／またはヒト抗体であり得る。本明細書に記載される本発明の実施形態はまた、これらの抗体を産生するための細胞を提供する。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、診断目的または治療目的のためにこれらの抗体を使用するために提供される。例えば、本発明の実施形態は、細胞増殖に関連するＴＩＭ−１の発現を阻害するための方法および抗体を提供する。好ましくは、抗体は、腎腫瘍および膵臓腫瘍、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌および脳腫瘍のような新生物を処置するために使用される。このような処置に関連して、これらの抗体を含む製造品が提供される。さらに、これらの抗体を含むアッセイキットが、癌または腫瘍についてスクリーニングするために提供される。
【００４８】
さらに、本明細書に記載される核酸ならびにそのフラグメントおよび改変体が、非限定的な例として、（ａ）対応するコードタンパク質、ポリペプチド、フラグメントおよび改変体の、組換えまたは異種遺伝子産物としての生合成を指向するため、（ｂ）本明細書において開示される核酸の検出および定量のためのプローブとして、（ｃ）アンチセンス分子を調製するための配列鋳型として、などで使用され得る。このような用途は、以下の開示においてより完全に記載される。
【００４９】
さらに、本明細書に記載されるＴＩＭ−１タンパク質およびポリペプチド、ならびに、そのフラグメントおよび改変体は、（ａ）抗ＴＩＭ−１抗体の産生を刺激するための免疫原としてはたらくこと、（ｂ）このような抗体についての免疫原性アッセイにおける捕捉抗原として、（ｃ）本明細書に記載されるＴＩＭ−１ポリペプチドに結合する物質についてのスクリーニングのための標的として、そして（ｄ）この抗体を用いた処置が標的により媒介される分子および／または細胞の機能に影響を与えるような、ＴＩＭ−１特異的抗体のための標的として、を含む、種々の方法において使用され得る。ＴＩＭ−１ポリペプチドの発現または活性は、細胞の生存および／または転移の能力を促進し得る。逆に、ＴＩＭ−１ポリペプチド発現の低下またはその機能の阻害は、治療上有益な様式で、腫瘍細胞の生存と浸潤性とを低下させる。
【００５０】
ＴＩＭ−１に特異的な単鎖抗体（ｓｃＦｖ’）および二重特異的抗体は、特に有用である。なぜなら、これらは、その全ＩｇＧ分子と比較してより小さなサイズに起因して、腫瘍塊により容易に貫入し得るからである。全ＩｇＧ分子とｓｃＦｖとの間で腫瘍の貫入を比較する研究は、文献において記載されている。ｓｃＦｖは、ＴＩＭ−１抗原を発現する腫瘍細胞を破壊するために、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の抗ＴＩＭ−１の毒素で標識したかまたは放射性核種で誘導体化したすでに考察した全抗体と類似する様式で、毒素または放射性核種で誘導体化され得るが、ｓｃＦｖは、腫瘍により完全に貫入し得るという利点があり、この利点は、結果として、腫瘍を根絶することにおける効能を増加させ得る。生物学的に活性な抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖの具体的な例は、本明細書において提供される。
【００５１】
（配列表）
代表的なヒト抗ＴＩＭ−１抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列表において提供され、この配列表の内容を、以下の表１に要約する。
【００５２】
【表１−１】
2014240430.tif 000003
【００５３】
【表１−２】
2014240430.tif 000004
【００５４】
【表１−３】
2014240430.tif 000005
。
【００５５】
（定義）
他に規定されない限り、本明細書に記載される本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形の用語を包含し、そして、複数形の用語は単数形の用語を包含する。一般に、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、ならびに、タンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションの技術に関連して利用される命名法は、当該分野で周知でありかつ一般に使用される命名法である。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または、当該分野で一般に達成されるように、または、本明細書に記載されるように、行われる。上記の技術および手順は、一般に、当該分野で周知の従来の方法に従って、そして、本明細書全体にわたり引用および考察される、種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（この文献は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに、医学および薬学的な化学に関連して利用される命名法、ならびに、これらの実験室での手順および技術は、当該分野で周知でありかつ一般に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的な調製、処方および送達、ならびに、患者の処置のために使用される。
【００５６】
本開示に従って利用される場合、以下の用語は、他にそうでないと示されない限り、以下の意味を有するものと理解される：
用語「ＴＩＭ−１」とは、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン１を指す。１つの実施形態において、ＴＩＭ−１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００５７】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、ネイティブなタンパク質、フラグメント、または、ポリペプチド配列のアナログを指す一般的な用語として使用される。従って、ネイティブなタンパク質、フラグメント、およびアナログは、ポリペプチド属の種類である。本発明に従う好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに、重鎖免疫グロブリン分子を、κ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子と共に含む（逆もまた然り）組み合わせにより形成される抗体分子、ならびにこれらのフラグメントおよびアナログを含む。
【００５８】
本明細書において参照される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、または、いずれかの型のヌクレオチドの修飾形態の、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を包含する。
【００５９】
用語「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源、または、これらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その起源の観点から、単離されたポリヌクレオチドは、（１）その単離されたポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全体もしくは一部を伴わない、（２）その単離されたポリヌクレオチドが天然では連結されていないポリヌクレオチドに対して作動可能に連結される、または（３）天然では、より大きな配列の一部として存在しない。
【００６０】
本明細書において参照される用語「単離されたタンパク質」は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、もしくは合成起源、または、これらのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源または誘導体の供給源の観点から、「単離されたタンパク質」は、（１）天然で見出されるタンパク質を伴わない、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質を含まない（例えば、マウスタンパク質を含まない）、（３）異なる種に由来する細胞により発現される、または（４）天然では存在しない。
【００６１】
本明細書において参照される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオチド、および、天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された修飾ヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、一般に２００以下の塩基の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基の長さであり、そして、最も好ましくは、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基または２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プローブのために一本鎖であるが；オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用するために二本鎖であり得る。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００６２】
同様に、他に特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向は、５’方向と呼ばれる。発生しようとするＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にある、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域は、上流配列と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にある、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域は、下流配列と呼ばれる。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「天然に存在する」は、ある対象に対して適用されるとき、その対象が天然では見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得、そして、研究所の人員によって、または、他の方法で意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００６４】
本明細書において参照される用語「天然に存在するヌクレオチドレ」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書において参照される用語「修飾されたヌクレオチド」とは、修飾されたかまたは置換された糖基などを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において参照される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのようなオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）（これらの文献の開示は本明細書により参考として援用される）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望される場合、検出のための標識を備え得る。
【００６５】
用語「作動可能に連結される」は、本明細書において使用される場合、このように記載された成分の位置が、その意図される様式で機能することを可能にする関係にあることをいう。コード配列に対して作動可能に連結された制御配列は、制御配列と適合性のある条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で連結される。
【００６６】
用語「制御配列」は、本明細書において使用される場合、これらが連結されるコード配列の発現およびプロセシングを達成するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して変化する；原核生物においては、このような制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含む；真核生物においては、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。用語制御配列は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須であるあらゆる成分を含み、そしてまた、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得る。
【００６７】
本明細書において参照される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本明細書に記載されるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントは、非特異的な核酸への検出可能な結合の検知できる量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシーの条件は、当該分野で公知であり、かつ、本明細書において考察されるような、選択的なハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般に、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、そして、より代表的には、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％および１００％の増加した相同性を有する。
【００６８】
２つのアミノ酸配列間に部分的または完全な同一性が存在する場合、この２つのアミノ酸配列は相同である。例えば、８５％の相同性とは、２つの配列を最大マッチングのために整列したとき、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。（マッチングされた２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、最大のマッチングを可能にする；５以下のギャップ長さが好ましく、２以下のギャップ長さがより好ましい。あるいは、そして好ましくは、この用語が本明細書において使用される場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸長の、これらの配列に由来するポリペプチド配列）が、変異データマトリックスを含むプログラムＡＬＩＧＮを用いて、（標準偏差単位において）５以上のアラインメントスコアと、６以上のギャップペナルティを有する場合、これら２つのタンパク質配列は、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（第５巻，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻に対する補遺２，ｐｐ．１−１０を参照のこと。これら２つの配列またはその一部は、より好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列したときに、これらのアミノ酸が５０％以上同一である場合に、相同である。
【００６９】
用語「〜に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対して相同である（すなわち、厳密には進化的に関連していないが、同一である）か、または、ポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列に対して同一であることを意味するために使用される。
【００７０】
対照的に、用語「〜に対して相補的」は、本明細書において、相補配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対して相同であることを意味するために使用される。一例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして、参照配列「ＣＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００７１】
以下の用語は、２以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の配列の関係を記載するために使用される：「参照配列」、「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性の％」および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定された配列である；参照配列は、例えば、配列表に与えられる全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして、大きな配列のサブセットであっても、完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでいてもよい。一般に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長または６アミノ酸長であり、頻繁に、少なくとも２４ヌクレオチド長または８アミノ酸長であり、そして、しばしば、少なくとも４８ヌクレオチド長または１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、（１）各々が、２つの分子間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一部）を含み得、そして（２）さらに、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間で異なる配列を含み得るので、２（またはそれ以上）の分子間での配列比較は、代表的には、２つの分子の配列を比較窓を通して比較し、配列が類似する局所的な領域を同定および比較することによって行われる。「比較窓」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１８の連続するヌクレオチド位置または６つのアミノ酸の概念的なセグメントを指し、この比較窓において、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも１８の連続するヌクレオチド配列または６つのアミノ酸配列の参照配列と比較され得、そして、この比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列について参照配列に対して比較されたときに、２０％以下の付加、欠失、置換など（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較窓を整列するための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＧｅｎｅｗｏｒｋｓまたはＭａｃ  ＶｅｃｔｏｒソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または、目視によって、行われ得、そして、種々の方法によって生成された最良のアラインメント（すなわち、比較窓を通した相同性の最も高い％をもたらすもの）が選択される。
【００７２】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、比較窓を通して同一（すなわち、ヌクレオチドごと、または、残基ごとを基礎として）であることを意味する。用語「配列同一性％」は、２つの最適に整列された配列を比較窓を通して比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が存在する位置の数を決定してマッチングした位置の数を得、このマッチングした位置の数を、比較窓内の位置の総数（すなわち、窓のサイズ）で割り、そして、この結果を１００倍して配列同一性の％を得ることによって計算される。用語「実質的な同一性」は、本明細書亜において使用される場合、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特徴を示し、このポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較窓を通して、しばしば、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置の比較窓を通して参照配列に対して比較したときに、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜９５％の配列同一性、より通常は、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性％は、比較窓を通して参照配列の合計２０％以下の欠失または付加を含み得る配列に対して、参照配列を比較することによって計算される。この参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。
【００７３】
本明細書において使用される場合、２０個の従来のアミノ酸およびその略称は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（本明細書において参考として援用される）を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸のような非天然アミノ酸、ならびに、他の非従来型のアミノ酸もまた、本明細書に記載されるポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに、他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書において使用されるポリペプチドの表記において、標準的な使用法および慣習に従って、左手方向は、アミノ末端の方向であり、そして、右手方向はカルボキシ末端の方向である。
【００７４】
ポリペプチドに対して適用される場合、用語「実質的な同一性」とは、デフォルトのギャップ重量を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列されたとき、２つのペプチド配列は、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する。おそらく、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンである；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、以下のとおりである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミン。
【００７５】
本明細書において考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さなバリエーションは、そのアミノ酸配列におけるバリエーションが、本明細書に記載される抗体または免疫グロブリン分子に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するという条件で、本明細書に記載される本発明により包含されるものとして企図される。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内での起こるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは以下のとおりである：セリンおよびスレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーである；アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーである；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族ファミリーである；そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族ファミリーである。特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を巻き込まない場合、例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンでの孤立した置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換は、得られる分子の結合または特性に大きな影響を与えないものと予測することは論理的である。アミノ酸の変化が機能的なペプチドを生じるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログは、当業者によって容易に調製され得る。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的ドメインおよび機能的ドメインは、そのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列のデータを、公的または専売の配列データベースと比較することによって同定され得る。好ましくは、コンピュータ化された比較方法が、公知の構造および／または機能の他のタンパク質において存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために使用される。公知の三次元構造へと折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法は公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４（１９９１）。従って、上記の例は、当業者が、本明細書に記載される構造的ドメインおよび機能的ドメインを規定するために使用され得る配列モチーフおよび構造的なコンフォメーションを認識し得ることを実証する。
【００７６】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる、（２）酸化に対する感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、そして（４）このようなアナログの他の生理化学的または機能的な特性を与えるかまたは修正するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側にあるポリペプチドの部分において）作製され得る。保存的アミノ酸置換は、本発明の配列の構造的な特徴を実質的に変更するべきではない（例えば、置換アミノ酸は、本発明の配列内に生じるヘリックスを破壊する傾向、または、本発明の配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向がないべきである）当該分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５（１９９１）（これらは各々が、本明細書において参考として援用される）に記載される。
【００７７】
用語「ポリペプチドフラグメント」は、本明細書において使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば全長ｃＤＮＡ配列に由来する天然に存在する配列における対応する位置に対して同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは代表的には、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長または少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１４アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、通常は、少なくとも５０アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。用語「アナログ」は、本明細書において使用される場合、由来を調べられたアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドをいい、これは、以下の特性のうち少なくとも１つを有する：適切な結合条件下でＴＩＭ−１に特異的に結合すること、（２）適切なＴＩＭ−１の結合をブロックする能力、または、（３）インビトロもしくはインビボにおいてＴＩＭ−１を発現する細胞の増殖および／もしくは生存を阻害する能力。代表的には、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に関して保存的なアミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。アナログは、代表的には、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり、そして、しばしば、全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【００７８】
ペプチドアナログは、一般に、鋳型ペプチドの機能に類似する機能を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において使用される。これらの型の非ペプチド化合物は、ペプチド模倣物と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）（これらは、本明細書中に参考として援用される）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、等価な治療上または予防上の効果を提供するために使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体のようなパラダイム（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当該分野で周知の方法により、以下からなる群より選択される結合によって必要に応じて置き換えられた１以上のペプチド結合を有する：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨ２ＳＯ−−。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸の同じ型のＤ−アミノ酸での系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列のバリエーションを含む束縛されたペプチドは、当該分野で公知の方法によって（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７（１９９２）、本明細書中に参考として援用される）；例えば、分子内ジスルフィド架橋（ペプチドを環化する）を形成し得る内部システイン残基を加えることによって生成され得る。
【００７９】
「抗体」または「抗体ペプチド」は、インタクトな抗体、または、特異的な結合についてインタクトな抗体と競合するその結合フラグメントをいう。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または、インタクトな抗体の酵素的もしくは化学的な切断によって生成される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖抗体が挙げられる。二重特異的または二重機能的抗体以外の抗体は、その同一な結合部位の各々を有するものと理解される。抗体は、過剰な抗体が、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％または少なくとも約８０％だけ、そして、より通常は、約８５％よりも多く（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定した場合）、カウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するレセプターの量を減少させるとき、レセプターの反レセプターへの接着を実質的に阻害する。
【００８０】
酵素パパインを用いた抗体の消化は、「Ｆａｂ」フラグメントとしても知られる２つの同一な抗原結合フラグメントと、抗原結合活性はないが結晶化能は有する「Ｆｃ」フラグメントとをもたらす。酵素ペプシンを用いた抗体の消化は、１つの「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントをもたらし、このフラグメントにおいて、抗体分子の２つのアームは連結されたままであり、そして、２つの抗原結合部位を含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原を架橋する能力を有する。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小フラグメントを指す。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
【００８３】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得るあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から構成され、そして通常、特異的な三次元構造特徴ならびに特異的な電荷特徴を有する。抗体は、解離定数が＜１μＭ、好ましくは、＜１００ｎＭ、そして最も好ましくは＜１０ｎＭである場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００８４】
用語「薬剤」は、本明細書において、化学的な化合物、化学的な化合物の混合物、生物学的な高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を指すために使用される。
【００８５】
用語「薬学的な薬剤」または「薬物」は、本明細書において使用される場合、患者に対して適切に投与されたときに、所望の治療効果を誘導し得る化学的な化合物または組成物をいう。本明細書における他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５）、本明細書により参考として援用される）によって例示されるような当該分野で従来どおりの使用法に従って使用される。
【００８６】
用語「抗腫瘍剤」は、本明細書において、癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病のようなヒトにおける新生物、特に、悪性（癌性）病巣の発生または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤をいうために使用される。転移の阻害は、しばしば、抗腫瘍剤の特性である。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋」とは、対象となる種が、存在する優勢な種であり（すなわち、モル濃度ベースで、組成物中のあらゆる他の個々の種よりも豊富である）、そしてより好ましくは、実質的に純粋な分画が、対象となる種が、存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モル濃度ベースで）を含む組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％より多く、より好ましくは、約８５％より多く、約９０％より多く、約９５％より多く、そして約９９％より多くを含む。より好ましくは、対象となる種は、本質的に均質になるまで精製され（夾雑種は、従来の検出法によって組成物中に検出され得ない）、ここで、この組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。
【００８８】
ＴＩＭ−１ポリペプチドに関して「活性な」または「活性」とは、ネイティブなＴＩＭ−１ポリペプチドの生物学的活性または免疫学的活性を有するＴＩＭ−１ポリペプチドの一部をいう。本明細書において使用される場合、「生物学的に（な）」とは、ネイティブなＴＩＭ−１ポリペプチドの活性から得られる生物学的な機能をいう。好ましい生物学的活性は、例えば、細胞増殖の調節を含む。
【００８９】
「標識」または「標識された」とは、本明細書において使用される場合、ポリペプチドへの検出可能な部分（例えば、放射標識、蛍光標識、酵素的な標識、化学発光標識、またはビオチン基）の付加をいう。放射性同位元素または放射性核種としては、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられ得、蛍光標識としては、ローダミン、ランタニド蛍光体またはＦＩＴＣが挙げられ得、そして、酵素的な標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられ得る。
【００９０】
「哺乳動物」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物と考えられるあらゆる動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９１】
「リポソーム」は、本明細書に記載されるＴＩＭ−１ポリペプチドまたはこのようなＴＩＭ−１ポリペプチドに対する抗体を含み得る薬物の、哺乳動物への送達のために有用であり得る小さな小胞を指す。
【００９２】
用語「患者」は、ヒト被験体および獣医学上の被験体を包含する。
【００９３】
（抗体の構造）
基本的な全抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対から構成され、各対が、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒトの軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。ヒトの重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、そして、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体の同位体を規定する。軽鎖および重鎖において、可変領域と定常領域とは、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続され、重鎖はまた、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（その全体があらゆる目的のために参考として援用される）を参照のこと。軽鎖／重鎖の各々の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００９４】
可変ドメインは全て、３つの超可変領域（相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる）によって接続された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の重鎖および軽鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４のドメインを含む。各領域へのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００９５】
二重特異的抗体または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と、２つの異なる結合部位とを有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的な抗体は、ハイブリドーマの融合、または、Ｆａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。二重特異的抗体は、単一の結合部位を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦｃ）の形態では存在しない。
【００９６】
このような二重特異的抗体または二重機能性抗体は、本発明により企図されかつ包含されることが理解される。ＴＩＭ−１および細胞傷害性Ｔリンパ球上のＣＤ３抗原に対する特異性を有する二重特異的な単鎖抗体は、これらのＴ細胞を、ＴＩＭ−１を発現する腫瘍細胞へと指向させ、そして、腫瘍のアポトーシスおよび根絶を引き起こすために使用され得る。この目的のための２つの二重特異的ｓｃＦｖ構築物が本明細書において記載される。ＴＩＭ−１に特異的なｓｃＦｖ成分は、本明細書に記載される抗ＴＩＭ−１抗体に由来し得る。いくつかの実施形態において、表４および５に開示される抗ＴＩＭ−１抗体の成分は、ＴＩＭ−１に対して指向された生物学的に活性なｓｃＦｖを生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、ｓｃＦｖ成分は、ｍＡｂ  ２．７０に由来する。治療的な二重特異的ｓｃＦｖの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ成分は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託した配列（登録番号ＣＡＥ８５１４８）に由来した。ＣＤ３または他のＴ細胞抗原を標的とすることが公知の代替的な抗体は、単鎖バックボーン上であっても、完全ＩｇＧ上であっても、抗ＴＩＭ−１と結合させたとき、同様に悪性腫瘍を処置するのに有効であり得る。
【００９７】
（ヒト抗体および抗体のヒト化）
本明細書に記載される本発明の実施形態は、ヒト抗体を企図および包含する。ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を有する抗体に関連する一定の問題を回避する。このようなマウスまたはラットに由来するタンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスにつながり得るか、または、げっ歯類以外の哺乳動物による抗体に対する免疫応答の生成につながり得る。
【００９８】
（ヒト抗体）
ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒトの遺伝子座をクローニングし、再構築する能力、および、これらの遺伝子座をマウスの生殖細胞に導入する能力は、非常に大きなまたは粗野にマッピングされた遺伝子座の機能的な成分を明らかにし、ならびに、ヒトの疾患の有用なモデルを作製するための強力なアプローチを提供する。このような戦略の重要かつ実用的な用途は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を、内因性のＩｇ遺伝子が不活性化されたマウスに導入することは、マウスにおいてヒト抗体を発生させる機会を提供する。完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来のＭａｂに固有の免疫原性およびアレルギー性の応答を最小限にし、従って、ヒトに投与される抗体の効能および安全性を高めることが期待される。完全ヒト抗体の使用は、抗体の反復投与を必要とする慢性および再発性のヒト疾患（例えば、炎症、自己免疫および癌）の処置において実質的な利点を提供することが期待され得る。
【００９９】
この目的に向かう１つのアプローチは、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを用いて、マウス抗体産生不全のマウス系統を遺伝子操作することであった。これは、このようなマウスが、マウス抗体の非存在下でヒト抗体の大きなレパートリーを産生することを期待してのものである。この一般的な戦略は、１９９４年に刊行された、本発明者らの最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の作製にと一緒に示された。Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、ヒト重鎖遺伝子座（２４５ｋｂ）およびκ軽鎖遺伝子座（１９０ｋｂ）の生殖細胞系の構成をしたフラグメント（コア可変領域配列およびコア定常領域配列を含んだ）を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて遺伝子操作された。上掲。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から入手可能である。約８０％よりも多いヒト抗体レパートリーが、メガベースサイズの導入により、それぞれヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の生殖細胞系の構成をしたＹＡＣフラグメントが導入され、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスを作製した。
【０１００】
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の作製は、以下においてさらに考察および概説される：米国特許出願第０７／４６６，００８号（１９９０年１月１２日出願）、同第０７／６１０，５１５号（１９９０年１１月８日出願）、同第０７／９１９，２９７号（１９９２年７月２４日出願）、同第０７／９２２，６４９号（１９９２年７月３０日出願）、同第０８／０３１，８０１号（１９９３年３月１５日出願）、同第０８／１１２，８４８号（１９９３年８月２７日出願）、同第０８／２３４，１４５号（１９９４年４月２８日出願）、同第０８／３７６，２７９号（１９９５年１月２０日出願）、同第０８／４３０，９３８号（１９９５年４月２７日出願）、同第０８／４６４，５８４号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６４，５８２号（１９９５年６月５日出願）、同０８／４６３，１９１号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６２，８３７号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５３号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５７号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５９号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６２，５１３号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／７２４，７５２号（１９９６年１０月２日出願）および、同第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第５，９３９，５９８号、ならびに、日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、同第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、および同第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）もまた参照のこと。欧州特許第０  ４６３  １５１  Ｂ１号（１９９６年６月１２日特許公開）、国際特許出願公開ＷＯ  ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、国際特許出願公開ＷＯ  ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ  ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ  ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）もまた参照のこと。上記の引用される特許、出願および参考文献の開示は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【０１０１】
代替的なアプローチは、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用するものであり、このアプローチにおいて、外来性のＩｇ遺伝子座が、そのＩｇ遺伝子座に由来する区画（個々の遺伝子）を含めることによって模倣される。こうして、１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域および第二の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が、動物内への挿入のために、構築物内に形成される。このアプローチは、以下に記載される：Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに、各々がＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号および同第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｍｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号および同第５，７８９，２１５号、ならびに、ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、ならびに、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号（１９９０年８月２９日出願）、同第０７／５７５，９６２号（１９９０年８月３１日出願）、同第０７／８１０，２７９号（１９９１年１２月１７日出願）、同第０７／８５３，４０８号（１９９２年３月１８日出願）、同第０７／９０４，０６８号（１９９２年６月２３日出願）、同第０７／９９０，８６０号（１９９２年１２月１６日出願）、同第０８／０５３，１３１号（１９９３年４月２６日出願）、同第０８／０９６，７６２号（１９９３年７月２２日出願）、同第０８／１５５，３０１号（１９９３年１１月１８日出願）、同第０８／１６１，７３９号（１９９３年１２月３日出願）、同第０８／１６５，６９９号（１９９３年１２月１０日出願）、同第０８／２０９，７４１号（１９９４年３月９日出願）（これらの開示は、本明細書により参考として援用される）。欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号、国際特許出願公開ＷＯ  ９２／０３９１８、同ＷＯ  ９２／２２６４５、同ＷＯ  ９２／２２６４７、同ＷＯ  ９２／２２６７０、同ＷＯ  ９３／１２２２７、同ＷＯ  ９４／００５６９、同ＷＯ  ９４／２５５８５、同ＷＯ  ９６／１４４３６、同ＷＯ  ９７／１３８５２および同ＷＯ  ９８／２４８８４、ならびに、米国特許第５，９８１，１７５号（これらの開示は、その全体が本明細書により参考として援用される）もまた参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒら，１９９２、Ｃｈｅｎら，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９３、Ｃｈｏｉら，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇら，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら，（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎら，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，（１９９６）（これらの開示は、その全体が本明細書により参考として援用される）も参照のこと。
【０１０２】
キメラ抗体は、ヒトの定常領域とマウスの可変領域とを有するが、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）の応答は、特に、抗体の慢性的な利用または複数回の投薬での利用において観察されることが予想される。したがって、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）またはＨＡＣＡの応答の問題および／または効果を無効にするために、ＴＩＭ−１に対する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。
【０１０３】
（ヒト化およびディスプレイの技術）
免疫原性が減少した抗体は、ヒト化およびライブラリーディスプレイの技術を用いて作製され得る。抗体は、当該分野で周知の技術を用いてヒト化または霊長類化され得ることが理解される。例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）ならびにＷｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８（１９９２）を参照のこと。目的の抗体は、組み換えＤＮＡ技術により、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換することによって加工され得る（ＷＯ  ９２／０２１９０ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７９２号、同第５，７１４，３５０号および同第５，７７７，０８５号を参照のこと）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用は、当該分野で公知である（Ｌｉｕら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８４：３４３９（１９８７）およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１（１９８７））。ｍＲＮＡは、ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞から単離され、そして、ｃＤＮＡを生成するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特定のプライマー（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）を用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る。あるいは、発現ライブラリーが作製され、抗体の可変領域をコードする目的の配列を単離するためにスクリーニングされ、次いで、この目的の配列がヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域の配列は、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒトＣ領域の遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体結合、または、抗体依存性の細胞傷害性における活性のような、所望のエフェクター機能によって導かれる。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域のκまたはλのいずれかが使用され得る。キメラのヒト化抗体は、次いで、従来の方法により発現される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどが挙げられる。
【０１０４】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂのような抗体フラグメントは、例えば、プロテアーゼによる切断または化学的な切断により、インタクトなタンパク質を切断することによって調製され得る。あるいは、短縮型の遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含み、その後に翻訳終止コドンが続いて、短縮型の分子を得る。
【０１０５】
Ｈ鎖およびＬ鎖のＪ領域のコンセンサス配列は、その後のＶ領域セグメントのヒトＣ領域セグメントへの連結のために有用な制限酵素部位をＪ領域に導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。Ｃ領域のｃＤＮＡは、ヒト配列における類似の位置に制限酵素部位を配置するように、部位特定突然変異導入法によって改変され得る。
【０１０６】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどが挙げられる。従来のベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコード死、任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入および発現されるように遺伝子操作された適切な制限酵素部位を有するベクターである。このようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域内のスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域に先行するスプライスアクセプター部位との間で生じ、そしてまた、ヒトＣＨエキソン内に生じるスプライシング領域においても生じる。ポリアデニル化および転写の終止は、コード領域の下流にあるネイティブな染色体部位において生じる。この得られたキメラ抗体は、レトロウイルスのＬＴＲ（例えば、ＳＶ−４０早期プロモーター）（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：２８０（１９８３））、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．１９：６１１１（１９８２））、およびモロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ  ４１：８８５（１９８５））を含めた任意の強力なプロモーターへと接続され得る。また、理解されるように、ネイティブなＩｇプロモーターなども使用され得る。
【０１０７】
さらに、ヒト抗体または他の種に由来する抗体は、当該分野で周知の技術を用いて、ディスプレイ型の技術（ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイおよび他の技術が挙げられるがこれらに限定されない）により作製され得、そして、得られた分子は、さらなる成熟（例えば、親和性成熟）に供され得る。このような技術は当該分野で周知である。ＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ，上掲、ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｔｈａｕ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ，ＴＩＢＳ  １７：２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇａｎｂｏｏｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３−６８（１９９２）、ＣｈｉｓｗｅｌｌおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １０：８０−８４（１９９２）、ならびに、米国特許第５，７３３，７４３号。ディスプレイ技術がヒトではない抗体を産生するために利用される場合、このような抗体は、上記のようにヒト化され得る。
【０１０８】
これらの技術を用いて、抗体は、ＴＩＭ−１を発現する細胞、ＴＩＭ−１自体、ＴＩＭ−１の形態、そのエピトープまたはペプチド、およびこれらに対する発現ライブラリー（例えば、米国特許第５，７０３，０５７号を参照のこと）へと生成され得、その後、上記のような活性について、上記のようにスクリーニングされ得る。
【０１０９】
（抗体治療）
特定の局面において、ＴＩＭ−１に対する治療候補としての抗体の生成に関連して、抗体は、補体を結合し得、そして、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与し得ることが望ましくあり得る。このような抗体としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧｌおよびヒトＩｇＧ３。生成される抗体は、最初からこのようなアイソタイプを有する必要はなく、むしろ、生成される抗体は、任意のアイソタイプを有し得、そして、この抗体は、当該分野で周知の従来の技術を用いて、その後に切り替えられたアイソタイプであり得ることが理解される。このような技術としては、とりわけ、直接組換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）、細胞−細胞融合技術（米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号を参照のこと）の使用が挙げられる。
【０１１０】
細胞−細胞融合技術において、任意の所望のアイソタイプを用いて、重鎖を有する骨髄腫または他の細胞株が調製され、そして、軽鎖を有する別の骨髄腫または他の細胞株が調製される。その後、これらのような細胞が融合され得、そして、インタクトな抗体を発現する細胞株が単離され得る。
【０１１１】
一例として、本明細書において考察されるＴＩＭ−１抗体は、ヒト抗ＴＩＭ−１  ＩｇＧ２抗体である。このような抗体がＴＩＭ−１分子に対する所望の結合を有する場合、この抗体は、ヒトＩｇＭアイソタイプ、ヒトＩｇＧ１アイソタイプまたはヒトＩｇＧ３アイソタイプを生成するために容易にアイソタイプが切り替えられ得、その一方で、この抗体は、同じ可変領域（抗体の特異性およびその親和性のいくらかを規定する）を有する。このような分子は、次いで、補体を固定し得、そして、ＣＤＣに関与し得る。
【０１１２】
（他の治療の設計および生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ））
その腎臓腫瘍および膵臓腫瘍、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌および脳腫瘍との関連性に起因して、抗ＴＩＭ−１抗体を含む抗腫瘍剤が、本発明により企図および包含される。
【０１１３】
さらに、ＴＩＭ−１に関して本明細書において製造および特徴づけされた抗体の活性に基づいて、抗体部分以外の他の治療様式の設計が促進される。このような様式としては、二重特異的抗体のような進化した抗体治療、免疫毒素および放射標識治療、ペプチド治療の生成、遺伝子治療（特に、体内）、アンチセンス治療、ならびに低分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
補体結合が所望される特質である進化した抗体治療の生成に関連して、例えば、二重特異的抗体、免疫毒素、または、放射標識を使用することにより、細胞を殺傷するために補体に依存することを回避することが可能となり得る。
【０１１５】
例えば、二重特異的抗体に関連して、（ｉ）ＴＩＭ−１に対する抗体と、第二の分子に対する抗体とが一緒に結合された２つの抗体、（ｉｉ）ＴＩＭ−１に対して特異的な第一の鎖と、第二の分子に対して特異的な第二の鎖とを有する単一の抗体、または（ｉｉｉ）ＴＩＭ−１および他の分子に対する特異性を有する単鎖抗体を含む二重特異的抗体が生成され得る。このような二重特異的抗体は、周知の技術を用いて生成され得、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関連しては、Ｆａｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）ならびにＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ（上掲）を参照のこと；（ｉｉｉ）に関連しては、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。各場合において、第二の特異性は、重鎖活性化レセプター（ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏら、１８：１２７（１９９７）を参照のこと）またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない）に対して獲得され得る。前述の事項に従って調製された二重特異的抗体は、おそらく、ＴＩＭ−１を発現する細胞、特に、本明細書中に記載されるＴＩＭ−１抗体が有効である細胞を殺傷する。
【０１１６】
免疫毒素に関して、抗体は、当該分野で周知の技術を利用して、免疫毒素として機能するように修飾され得る。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照のこと。また、米国特許第５，１９４，５９４号も参照のこと。放射標識抗体の調製に関連して、このような修飾された抗体はまた、当該分野で周知の技術を利用して容易に調製され得る。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（第２版、ＣｈａｆｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照のこと。また、米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０号（ＲＥ  ３５，５００）、同第５，６４８，４７１号および同第５，６９７，９０２号も参照のこと。免疫毒素および放射標識分子の各々は、おそらく、ＴＩＭ−１を発現する細胞、特に、本明細書中に記載されるＴＩＭ−１抗体が有効である細胞を殺傷する。
【０１１７】
ＴＩＭ−１に関連する構造情報、および（低分子に関連して以下に考察されるような）本明細書中に記載される抗体のようなＴＩＭ−１に対する抗体を利用するか、または、ペプチドライブラリーのスクリーニングを介した、治療ペプチドの生成に関連して、ＴＩＭ−１に対して指向される治療ペプチドが生成され得る。ペプチド治療の設計およびスクリーニングは、以下に関連して考察される：Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）、Ｐｉｎａｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：９０１−９０５（１９９２）、ＢｌａｋｅおよびＬｉｔｚｉ−Ｄａｖｉｓ、ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：５１０−５１３（１９９２）。免疫毒素および放射標識された分子はまた、ペプチド部分に関連して類似する様式で、抗体に関連して上で考察されたように調製され得る。
【０１１８】
ＴＩＭ−１分子（または、スプライス改変体または代替的な形態のような形態）が疾患のプロセスにおいて機能的に活性であると仮定すると、従来の技術により、これらに対する遺伝子治療およびアンチセンス治療を設計することもまた可能である。このような様式は、ＴＩＭ−１の機能を調節するために利用され得る。これに関連して、本明細書中に記載される抗体は、これに関連する機能的アッセイの設計および使用を容易にする。アンチセンス治療についての設計および戦略は、国際特許出願公開ＷＯ９４／２９４４４において詳細に考察される。遺伝子治療のための設計および戦略は周知である。しかし、特に、体内に関する遺伝子治療技術の使用は、特に有益であることを証明し得る。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５９５−６０１（１９９４）およびＭａｒａｓｃｏ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５（１９９７）を参照のこと。遺伝子治療の一般的な設計および遺伝子治療に関連する考察はまた、国際特許出願公開第９７／３８１３７号において考察される。
【０１１９】
低分子治療もまた想定され得る。薬物は、本明細書中に記載されるように、ＴＩＭ−１の活性を調節するように設計され得る。本明細書中に記載されるようなＴＩＭ−１分子の構造およびその他の分子との相互作用から収集される知識（例えば、本明細書中に記載される抗体など）は、さらなる治療様式を合理的に設計するために利用され得る。この点に関して、Ｘ線結晶学、コンピュータ補助（またはコンピュータ支援）分子設計（ＣＡＭＭ）、定量的または定性的な構造−活性関係性（ＱＳＡＲ）、および類似のテクノロジーのような合理的な薬物設計技術が、薬物発見の努力に焦点を集めるために利用され得る。合理的な設計は、分子またはその特定の形態と相互作用し得るタンパク質または合成構造体が、ＴＩＭ−１の活性を修正または調節するために使用され得るという予想を可能にする。このような構造体は、化学的に合成されても、生態系において発現されてもよい。このアプローチは、Ｃａｐｓｅｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８））において総説されている。さらに、コンビナトリアルライブラリーは、ハイスループットスクリーニングの努力のようなスクリーニングプログラムにおいて、設計、合成および使用され得る。
【０１２０】
（ＴＩＭ−１のアゴニストおよびアンタゴニスト）
本明細書に記載される本発明の実施形態はまた、ＴＩＭ−１アゴニスト（模倣物）またはＴＩＭ−１アンタゴニストのいずれかとして機能するＴＩＭ−１タンパク質の改変体に関する。ＴＩＭ−１タンパク質の改変体は、突然変異誘発（例えば、ＴＩＭ−１タンパク質の不連続の点変異または短縮によって生成され得る。ＴＩＭ−１タンパク質のアゴニストは、ＴＩＭ−１タンパク質の天然に存在する形態と実質的に同じ生物学的活性か、または、その生物学的活性の一部分を保持し得る。ＴＩＭ−１タンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＴＩＭ−１タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することによって、ＴＩＭ−１タンパク質の天然に存在する形態の１以上の活性を阻害し得る。したがって、特異的な生物学的作用は、限られた機能の改変体を用いた処置により誘引され得る。１つの実施形態において、タンパク質の天然に存在する形状の生物学的活性の一部分を有する改変体を用いた被験体の処置は、ＴＩＭ−１タンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に関して、被験体においてより少ない副作用を有する。
【０１２１】
ＴＩＭ−１アゴニスト（模倣物）またはＴＩＭ−１アンタゴニストのいずれかとして機能するＴＩＭ−１タンパク質の改変体は、ＴＩＭ−１タンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーを、タンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態において、ＴＩＭ−１改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＴＩＭ−１改変体の多様なライブラリーは、例えば、可能性のあるＴＩＭ−１配列の変質したセットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その内部にＴＩＭ−１配列のセットを含むより長い融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイのためのもの）として発現可能となるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列内に酵素的に連結することによって生成され得る。変質したオリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＴＩＭ−１改変体のライブラリーを生成するために使用され得る種々の方法が存在する。変質した遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置において実行され得、そして、この合成遺伝子は、次いで、適切な発現ベクター内へと連結される。遺伝子の変質したセットの使用は、１つの混合物において、可能性のあるＴＩＭ−１改変体配列の所望のセットをコードする配列全体を供給することを可能とする。変質したオリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３（１９８３）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６（１９８４）；Ｉｋｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７（１９８３）を参照のこと）。
【０１２２】
（放射性免疫抗体および免疫化学療法用抗体）
癌の細胞傷害性化学療法または放射線療法は、感受性の高い正常細胞に対する毒性から生じる、深刻な、ときおり、生命にかかわる副作用により制限される。なぜならば、これらの治療は、悪性細胞に選択的ではないからである。それゆえ、その選択性を改善する必要がある。１つの戦略は、腫瘍関連抗原を認識する抗体に、治療薬を結び付けることである。このことにより、リガンド標的化された治療薬に対する悪性細胞の曝露が増加するが、同じ薬剤に対する正常細胞の曝露は減少する。Ａｌｌｅｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２（１０）：７５０−６３（２００２）を参照のこと。
【０１２３】
ＴＩＭ−１抗原は、ＦＡＣＳおよびＩＨＣによって、腫瘍細胞の細胞膜上でのその特異的な発現により示されるように、これらの腫瘍関連抗原のうちの１つである。それゆえ、本発明の１つの実施形態は、抗腫瘍治療薬として細胞傷害性化学療法剤または放射性療法剤に結合されたＴＩＭ−１抗原に対して指向される、モノクローナル抗体を使用することである。
【０１２４】
放射標識は、当該分野において公知であり、そして、診断用または治療用の放射免疫結合体のために使用されている。放射標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、レニウム−１８６、レニウム−１８８、サマリウム−１５３、銅−６４、スカンジウム−４７）。例えば、放射免疫結合体により導かれる臨床診断おいて使用されている放射性核種としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、６７Ｇａならびに１１１Ｉｎ。抗体はまた、標的化免疫療法における可能性のある使用のために、種々の放射性核種で標識されている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、１９８７を参照のこと）。モノクローナル抗体結合体はまた、癌の診断および処置のために使用されている（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５）。これらの放射性核種としては、例えば、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに９０Ｙが挙げられ、そして、より重要でない程度に、１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。Ｉ−（１３１）はまた、治療目的のためにも使用されている。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位元素のリストを提供する。放射性療法キレート化合物およびキレート化合物結合体は当該分野で公知である。米国特許第４，８３１，１７５号、同第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号および同第５，１２４，４７１号を参照のこと。
【０１２５】
抗ＴＩＭ−１抗体を利用する免疫放射性医薬品は、当該分野で周知の技術を利用して調製され得る。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（第２版、ＣｈａｆｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））、米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号（ＲＥ  ３５，５００）、同第５，６４８，４７１号および同第５，６９７，９０２号を参照のこと。
【０１２６】
細胞傷害性免疫結合体は、当該分野で公知であり、そして、治療剤として使用されている。このような免疫結合体は、例えば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（米国特許第６，４４１，１６３号）、チューブリン重合阻害薬、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５（２）：３６７−７２（１９９９）；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４（２００３））、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）誘導体（Ｏｇａｗａら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．１２１（２）：９７−１０６（２００１）；２１（３）７７８−７８４）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；メイタンシノイド（ＤＭＩ）、タキサンまたはメルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用し得る。抗ＴＩＭ−１抗体を利用する免疫毒素は、当該分野で周知の技術により調製され得る。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）；米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。
【０１２７】
二重特異的抗体は、当該分野で周知の技術を用いて作製され得る。例えば、Ｆａｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）；ＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ（上掲）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。各場合において、第一の選択性はＴＩＭ−１に対するものであり、第二の選択性は、重鎖活性化レセプター（ＣＤ１６またはＣＤ６４が挙げられるがこれらに限定されない）に対してつくられ得る（例えば、Ｄｅｏら、１８：１２７（１９９７）を参照のこと）またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照のこと）。上記方法に従って調製した二重特異的抗体は、ＴＩＭ−１を発現する細胞を殺傷する。
【０１２８】
抗体の意図される用途（すなわち、診断試薬または治療試薬として）に依存して、放射標識は当該分野で公知であり、そして、同様の目的のために使用されている。例えば、臨床診断において使用されている放射性核種としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１Ｔｃ、６７Ｇａならびに１１１Ｉｎが挙げられるがこれらに限定されない。抗体はまた、標的化免疫治療における可能性のある用途のために、種々の放射性核種で標識されている。Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、（１９８７）を参照のこと。モノクローナル抗体結合体はまた、癌の診断および処置のために使用されている。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５を参照のこと。これらの放射性核種としては、例えば、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに９０Ｙが挙げられ、そして、より重要でない程度に、１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。Ｉ−（１３１）もまた、治療目的のために使用されている。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位元素のリストを提供する。
【０１２９】
放射性療法キレート化合物およびキレート化合物結合体に関連する特許は、当該分野で公知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミンペンタ酢酸キレート化合物、および、このキレート化合物を含むタンパク質結合体と、これらの調製方法とに関する。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号および同第５，１２４，４７１号もまた、多置換ＤＴＰＡキレート化合物に関連する。
【０１３０】
細胞傷害性化学療法は、当該分野で公知であり、そして、同様の目的のために使用されている。例えば、米国特許第６，４４１，１６３号は、メイタンシノイドと抗体との細胞傷害性結合体の生成のためのプロセスを記載する。チューブリン重合阻害薬であるオーリスタチンＰＥの抗腫瘍活性は、当該分野で公知である。Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ｊｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５（２）：３６７−７２（１９９９年８月）。
【０１３１】
（抗体の調製）
簡単に述べると、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を、ＴＩＭ−１タンパク質で免疫し、抗体を発現するマウスからリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を回収し、そして、骨髄細胞株と融合して、不死性のハイブリドーマ細胞株を調製し、そして、このようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＴＩＭ−１に対して特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定した。あるいは、骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを生成する代わりに、マウスの免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統から単離した、ＴＩＭ−１に対する反応性を有する（例えば、ＴＩＭ−１−Ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより決定）回収したＢ細胞を、次いで、ＴＩＭ−１特異的な溶血斑形成法を用いて単離した。Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ，９３：７８４３−７８４８（１９９６）。このアッセイにおいて、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のような標的細胞を、ＴＩＭ−１抗原でコーティングした。抗ＴＩＭ−１抗体および補体を分泌するＢ細胞培養物の存在下における斑の形成は、標的細胞の特異的なＴＩＭ−１媒介性の溶解を示す。斑の中心にある単一抗原特異的な形質細胞を単離し、そして、抗体の特異性をコードする遺伝子情報を、単一の形質細胞から単離した。
【０１３２】
逆転写酵素ＰＣＲを用いて、分泌された抗体の可変領域をコードするＤＮＡがクローニングされ、そして、適切な発現ベクター（好ましくは、ｐｃＤＮＡのようなベクターカセット、より好ましくは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインを含むｐｃＤＮＡ）内に挿入された。この作製したベクターは、次いで、宿主細胞（好ましくは、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトされ、そして、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または、所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地において培養した。
【０１３３】
一般に、上述の細胞株により生成された抗体は、ヒトκ軽鎖を含む完全ヒトＩｇＧ２重鎖を有した。これらの抗体は、高い親和性を有し、固相および液相のいずれかにより測定した場合、代表的には、約１０−６Ｍ〜約１０−１１ＭのＫｄを有した。これらのｍＡｂは、以下に考察されるような、抗原結合競合研究に基づいて、群または「ビン（ｂｉｎ）」へと層化され得る。
【０１３４】
理解されるように、本明細書に記載される抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用され得る。形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法によって行われ得、これらの方法としては、例えば、ウイルス内（またはウイルスベクター内）にポリヌクレオチドを封入することによって、および、ウイルス（またはベクター）を用いて宿主細胞を形質導入することによって、または、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、本明細書により本明細書中に参考として援用される）により例示されるような当該分野で公知のトランスフェクション手順によって、が挙げられる。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。異種性のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当該分野で周知であり、そして、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、および、ＤＮＡの核内への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１３５】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そして、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞株が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、構成的なＴＩＭ−１結合特性を有する抗体を生成するかを決定することによって選択される。
【０１３６】
（治療的な投与および処方物）
本発明の化合物は、キャリアビヒクル内において調製するなどの標準的な操作に従って処方される。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、１種以上の、天然または合成の、有機または無機の成分を意味し、これと共に、変異プロトオンコジーンまたは変異癌原タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が合わせられて、その用途を助ける。適切なキャリアとしては滅菌生理食塩水が挙げられるが、薬学的に受容可能であることが公知の他の水性および非水性の等張滅菌溶液および滅菌懸濁液は、当業者に公知である。この点について、用語「キャリア」は、リポソームおよび抗体（Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：１６８−１７５（１９９５）を参照のこと）、ならびに、あらゆるプラスミドおよびウイルス発現ベクターを包含する。
【０１３７】
本発明のあらゆる新規ポリペプチドは、薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。本発明のポリペプチドと塩を形成し得る適切な酸および塩基は、当業者に周知であり、そして、無機酸および有機酸、ならびに無機塩基および有機塩基が挙げられる。
【０１３８】
本発明の化合物は、治療上有効な量で被験体に投与される。この治療上有効な量とは、医学的に望ましい結果を生じるか、または、処置される特定の状態に対して影響を及ぼす化合物の量を意味する。本発明の化合物の有効量は、罹患状態、変性状態または損傷状態を軽減するか、または、これらの状態の進行を遅延することができる。有効量は、個人ベースで決定され得、そして、部分的に、被験体の身体的特性、処置される症状および求められる結果の考慮に基づいている。有効量は、このような要因を用いて、そして、慣用的に過ぎない実験を用いて、当業者により決定され得る。
【０１３９】
本発明の化合物は、医学的に受容可能なあらゆる様式で投与され得る。この投与様式としては、注射、非経口経路（例えば、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、心室内、硬膜内など）ならびに、経口経路、経鼻経路、眼経路、直腸経路または局所経路が挙げられ得る。デポー注射または腐食性移植片のような手段による、持続放出投与もまた、本明細書中に具体的に包含される。カテーテルを介した１以上の動脈（例えば、腎動脈または限局性の腫瘍に供給する血管）への送達のような手段による、局所送達も、具体的に意図される。
【０１４０】
本明細書中に記載される生物学的に活性な抗ＴＩＭ−１抗体は、血清のＴＩＭ−１レベルを低下させ、それにより、例えば、血清ＴＩＭ−１が異常に上昇した病理学的状態を効率的に処置するために、滅菌の薬学的調製物または処方物において使用され得る。抗ＴＩＭ−１抗体は、好ましくは、ＴＩＭ−１を標的とする治療範囲内まで強く抑制するために適切な親和性を有し、そして、好ましくは、少ない回数の投薬を可能にするために適切な作用期間を有する。作用期間の延長は、皮下または筋肉内注射のような代替的な非経口経路による、少ない頻度でかつより簡便な投薬スケジュールを可能にする。
【０１４１】
インビボ投与のために使用される場合、抗体処方物は滅菌でなければならない。これは、例えば、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって容易に達成される。抗体は、通常、凍結乾燥形態または溶液中で保存される。治療用抗体組成物は、一般に、滅菌のアクセスポートを有する容器（例えば、皮下注入用注射針により穿刺可能な栓のような処方物の回収を可能にするアダプタを有する静脈内溶液用のバッグまたはバイアル）内に入れられる。
【０１４２】
抗体の投与経路は、公知の方法（例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、くも膜下腔内、吸入、もしくは病巣内の経路による注射もしくは注入、または、以下に記載されるような持続放出システムによって）に従ってなされる。抗体は、好ましくは、注入または大量注射によって連続投与される。
【０１４３】
治療上用いられる抗体の有効量は、例えば、治療対象、投与経路、および患者の状態に依存する。したがって、治療専門家は、必要な場合、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価測定し、そして、投与経路を修正することが好ましい。代表的には、医師は、所望の硬化を達成する投薬量に到達するまで抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイまたは本明細書中に記載されるアッセイにより容易にモニターされる。
【０１４４】
本明細書中に記載される抗体は、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物において調製され得る。この治療用組成物は、好ましくは、液体または粉末のエアロゾル（凍結乾燥）として、静脈内、または、鼻もしくは肺を介して投与され得る。この組成物はまた、所望される場合、非経口、または皮下で投与され得る。全身投与される場合、治療用組成物は、滅菌で、発熱物質を含まず、そして、ｐＨ、等張性および安定性の点から、非経口投与に受容可能な溶液中にあるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。簡単に述べると、本明細書中に記載される化合物の投薬処方物は、所望の程度の純度を有する化合物を、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することによって、保存または投与のために調製される。このような物質は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、そして、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸および他の有機酸の塩のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化物質；ポリアルギニンのような低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのような低分子量タンパク質；ポリビニルピロリジノンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖質；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン、および／あるいは、ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣまたはポリエチレングリコールのような非イオン性が挙げられる。
【０１４５】
注射用の滅菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３）に記載されるような従来の薬学的な実務に従って処方され得る。例えば、水もしくは天然に存在する植物油（ゴマ油、ピーナッツ油または綿花油など）もしくは合成脂肪質ビヒクル（オレイン酸エチルなど）中への活性化合物の溶解または懸濁が望ましくあり得る。緩衝液、保存料、抗酸化物質などが、容認される薬学的な実務に従って組み込まれ得る。
【０１４６】
持続放出調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、これらのマトリックスは、成形された物品、フィルム、またはマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，（１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，（１９８２）１２：９８−１０５により記載されるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、または、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３）２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上掲）、ＬＵＰＲＯＮ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマーが挙げられる。
【０１４７】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたる分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたりタンパク質を放出する。封入されたタンパク質が長時間にわたり体内に残るとき、これらは、３７℃において湿気に対して曝露された結果、変性または凝集して、生物学的活性の減損、および、免疫原性の潜在的な変化をもたらし得る。関与する機構に依存して、タンパク質の安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機構がジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かった場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加物を使用し、そして、特定のポリマーマトリックス組成を開発することによって達成され得る。
【０１４８】
持続放出組成物はまた、結晶を懸濁液中に維持し得る適切な処方物中に懸濁された抗体の結晶の調製物を包含する。これらの調製物は、皮下または腹腔内注射されるとき、持続放出作用を生じ得る。他の組成物としてはまた、リポソームにより捕捉された抗体が挙げられる。このような抗体を含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製される：米国特許ＤＥ  ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４０３０−４０３４；ＥＰ  ５２，３２２；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９；ＥＰ  １４２，６４１；日本国特許出願昭５８−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ  １０２，３２４。
【０１４９】
所定の患者のための抗体処方物の投薬量は、薬物の作用を変更することが知られる種々の要因（疾患の重篤度および型、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の医薬、ならびに、他の関連する臨床上の要因を含む）を考慮して、主治医により決定される。治療上有効な投薬量は、インビトロまたはインビボのいずれかの方法により決定され得る。
【０１５０】
治療的に使用される、本明細書に記載される抗体の有効量は、例えば、治療対象、投与経路、および患者の状態に依存する。したがって、必要に応じて、最適な治療効果を得るように、治療専門家が投薬量を力価測定し、そして、投与経路を修正することが好ましい。代表的な１日の投薬量は、上述の要因に依存して、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。代表的には、医師は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、治療用抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイによって、または本明細書中に記載されるようにして容易にモニターされる。
【０１５１】
本明細書中の組成物および方法に従った治療物質の投与は、適切なキャリア、賦形剤、および、転移、送達、耐性などの改善を提供するために処方物中に組み込まれた他の因子と共に投与される。これらの処方物としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、ベシクルを含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸着ペースト、水中油エマルジョンおよび油中水エマルジョン、エマルジョン炭素含有蝋（ｃａｒｂｏｗａｘ）（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、炭素含有蝋を含む半固形混合物が挙げられる。処方物中の活性成分が処方により不活性化されず、そして、処方物が、生理学的に適合性であり、かつ投与経路に対して許容されるという条件で、上記の混合物のいずれもが、本発明に従う処置および治療において適切であり得る。薬学分野の化学者に周知の処方物、賦形剤およびキャリアに関するさらなる情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ」Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ「Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ」Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌら「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、および、上記文献における引用文献もまた参照のこと。
【０１５２】
本明細書中に記載される抗体は、ＴＩＭ−１発現から生じる症状および状態の処置に良好な治療効果を有することが期待される。特定の実施形態において、本明細書中の抗体および方法は、ＴＩＭ−１の発現から生じる症状（癌の症状を含む）の処置に関連する。さらなる実施形態は、肺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、または卵巣癌のような癌を処置するために、本明細書中に記載される抗体および方法を使用することに関する。
【０１５３】
（診断的な用途）
ＴＩＭ−１は、正常な腎臓において低いレベルで発現されることが分かっているが、その発現は、虚血後の腎臓において劇的に増加する。Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（７）：４１３５−４２（１９９８）。抗ＴＩＭ−１抗体を用いた免疫組織化学染色は、腎臓癌、前立腺癌および卵巣癌の陽性染色を示し（以下を参照のこと）、正常な組織に対するＴＩＭ−１の過剰発現は、このような疾患の診断マーカーとして機能し得る。
【０１５４】
抗体フラグメントを含む抗体は、ＴＩＭ−１タンパク質の発現を定性的または定量的に検出するために使用され得る。上述のように、抗体は、好ましくは、検出可能な物質（例えば、蛍光標識）を備え、そして、結合は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオリメトリー（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）、または、当該分野で公知の他の技術によりモニターされ得る。これらの技術は、増幅された遺伝子が細胞表面タンパク質（例えば、増殖因子）をコードする場合、特に適切である。このような結合アッセイは、当該分野で公知であるように実施される。
【０１５５】
ＴＩＭ−１タンパク質に対する抗体の結合のインサイチュでの検出は、例えば、免疫蛍光顕微鏡法または免疫電子顕微鏡法により実施され得る。この目的のために、組織生検が患者から取り出され、そして、標識された抗体が、好ましくは、生物学的サンプルの上に抗体を重ねることによって、この生検に対して適用される。この手順はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子生成物の分布を決定することを可能にする。広範な種々の方法が、インサイチュ検出のために容易に利用可能であることが、当業者には明らかである。
【０１５６】
（エピトープマッピング）
抗体により認識されるタンパク質の免疫原の特異的な部分は、タンパク質の部分（例えば、Ｎ末端側半分およびＣ末端側半分）に対する抗体の反応性をアッセイすることによって決定され得る。この得られた反応性フラグメントは、次いで、最小の反応性ペプチドが規定されるまで、抗体を用いて免疫原の連続したより小さい部分をアッセイすることにより、さらに細かく分析され得る。抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２は、抗原配列から設計された重なりペプチドに対する反応性についてアッセイされ、そして、ＴＩＭ−１免疫原（配列番号５４）のアミノ酸１８９〜２０２に対応するアミノ酸配列ＰＬＰＲＱＮＨＥ（配列番号９６）を特異的に認識することが分かった。さらに、アラニン走査技術を用いて、２番目のプロリン残基とアスパラギン残基とが、ｍＡｂ  ２．７０．２結合に重要であるようであるということが決定された。
【０１５７】
あるいは、本発明の抗ＴＩＭ−１抗体により結合されるエピトープは、還元剤の非存在下または存在下のいずれかにおいて、ＴＩＭ−１免疫原をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することにより決定され、そして、免疫ブロット法により解析され得る。エピトープマッピングもまた、ＳＥＬＤＩを用いて実施され得る。ＳＥＬＤＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）（ＬｕｍｉＣｙｔｅ）アレイを使用して、タンパク質−タンパク質相互作用の部位を規定した。ＴＩＭ−１タンパク質抗原またはそのフラグメントは、ＰＲＯＴＥＩＮＣＨＩＰアレイ表面上に共有結合性に固定された抗体により特異的に捕捉され得る。結合した抗体は、レーザー誘起脱着プロセスにより検出され、そして、直接解析されて、その質量を決定され得る。
【０１５８】
本明細書中に記載される抗ＴＩＭ−１抗体により認識されるエピトープは、ＰＲＯＴＥＩＮＣＨＩＰアレイを、Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上にディスプレイしたランダムな１２マーのペプチドのコンビナトリアルライブラリーに対して曝露することにより決定され得る。抗体の結合したファージは溶出され、次いで、増幅され、そして、さらなる結合および増幅のサイクルを行って、結合配列の観点からプールを富化する。３または４ラウンドの後、個々の結合クローンは、さらに、抗体をコーティングしたウェル上で行う、ファージＥＬＩＳＡアッセイにより結合について調べられて、陽性クローンの特異的ＤＮＡ配列決定により特徴付けられる。
【実施例】
【０１５９】
行った実験および達成された結果を含む以下の実施例は、本明細書に記載される本発明を例示する目的のためだけに提供され、本明細書に記載される本発明を制限するものとしてはみなされるべきではない。
【０１６０】
（実施例１  ＴＩＭ−１に結合するモノクローナル抗体の調製）
ＴＩＭ−１の可溶性細胞外ドメインを、免疫原として用いて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物における免疫応答を刺激した。ＴＩＭ−１細胞外ドメイン（推定Ｎ末端シグナルペプチドを除く）についてのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ＣＧ５７００８−０２）を、バキュロウイルス発現ベクターであるｐＭｅｌＶ５Ｈｉｓ（ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）にサブクローニングし、ｐＢｌｕｅＢａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて発現させ、そして、ウェスタンブロット解析により確認した。以下のヌクレオチド配列が、抗体を生成するために使用したポリペプチドをコードする：
【０１６１】
【数１】
2014240430.tif 000006
。
【０１６２】
このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【０１６３】
【数２】
2014240430.tif 000007
。
【０１６４】
組換えＴＩＭ−１の精製を容易にするために、発現構築物は、Ｖ５結合ドメインＶ５およびＨＩＳタグについてのコード配列を組み込み得る。ＴＩＭ−１に対して指向された完全ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、マウス抗体産生を不全にし、そして、Ｙａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９９）において以前に記載されたようなヒト重鎖およびκ軽鎖遺伝子座からのメガベースサイズのフラグメントに関するヒト抗体遺伝子レパートリーの大部分を含むように遺伝子操作された、ヒト抗体を産生するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統から生成した。２つのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統、ｈＩｇＧ２（ｘｍｇ−２）系統およびＩｇＧ４（３Ｃ−１）系統を、ＴＩＭ−１抗原（配列番号５４）で免疫した。両方の系統は、免疫処置に対して十分に応答した（表２および３）。
【０１６５】
【表２】
2014240430.tif 000008
【０１６６】
【表３】
2014240430.tif 000009
。
【０１６７】
免疫したマウスからハイブリドーマ細胞株を生成した。１．２９、１．３７、２．１６、２．１７、２．２４、２．４５、２．５４、２．５６、２．５９、２．６１、２．７０および２．７６と名付けた、選択したハイブリドーマ（およびそのサブクローン）をさらに特徴付けた。細胞株１．２９および１．３７により産生される抗体は、完全ヒトＩｇＧ２重鎖とヒトκ軽鎖とを有し、一方で、細胞株２．１６、２．１７、２．２４、２．４５、２．５４、２．５６、２．５９、２．６１、２．７０および２．７６により産生される抗体は、完全ヒトＩｇＧ４重鎖とヒトκ軽鎖とを有する。
【０１６８】
１２の抗ＴＩＭ−１抗体の重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列を、そのそれぞれの生殖細胞系列の配列と共に以下の表４に示す。対応する軽鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列を以下の表５に示す。「Ｘ」は、任意のアミノ酸、好ましくは、対応するアミノ酸位置における生殖細胞系列の配列を示す。免疫グロブリンにおけるＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）を、それぞれの欄の表題の下に示す。
【０１６９】
【表４】
2014240430.tif 000010
【０１７０】
【表５】
2014240430.tif 000011
。
【０１７１】
ヒト抗体重鎖ＶＨ３−３３は、ＴＩＭ−１に対して首尾よく結合する抗体を産生するための、増殖性再配列において頻繁に選択された。ＴＩＭ−１に対する抗体を作製する増殖性再配列におけるヒト抗体ＶＨ３−３３生殖細胞系のあらゆる改変体は、本発明の範囲内である。ＴＩＭ−１に結合する抗体において選択される他の重鎖Ｖ領域は、以下を含んだ：ＶＨ４−３１、ＶＨ３−１５、ＶＨ４−６１、ＶＨ３−７およびＶＨ３−４８。選択される軽鎖Ｖ領域は、以下を含んだ：Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ２３、Ｏ１２、Ｏ１およびＡ２６。λκ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が、λＶ領域を利用して抗ＴＩＭ−１抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【０１７２】
１２の抗ＴＩＭ−１抗体の、重鎖可変ドメインの生殖細胞系列の利用を表６に示す。軽鎖可変ドメインの生殖細胞系列の利用を表７（以下）に示す。
【０１７３】
【表６】
2014240430.tif 000012
【０１７４】
【表７】
2014240430.tif 000013
。
【０１７５】
モノクローナル抗体１．２９、１．３７、２．１６、２．１７、２．２４、２．４５、２．５４、２．５６、２．５９、２．６１、２．７０および２．７６をコードする配列（それぞれが、重鎖ヌクレオチド配列（Ａ）、重鎖アミノ酸配列（Ｂ）および軽鎖ヌクレオチド配列（Ｃ）およびそのコードされるアミノ酸配列（Ｄ）を含む）を、上記表１にまとめるように、配列表において提供する。特定のモノクローナル抗体２．７０を、さらにサブクローニングし、そして、２．７０．２と名付けた。表１を参照のこと。
【０１７６】
（実施例２  ＦＡＣＳによるＴＩＭ−１タンパク質に結合した膜との抗体の反応性）
蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）解析を行って、細胞膜に結合するＴＩＭ−１抗原に対する抗ＴＩＭ−１抗体の特異性を実証し、そして、治療剤または診断剤としての使用に好ましい抗体を同定した。２つの腎癌細胞株ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１６１１）およびＣＡＫＩ−２（ＡＴＣＣ＃：ＨＴＢ−４７）について、解析を行った。ＴＩＭ−１抗原を発現しない乳癌細胞株ＢＴ５４９をコントロールとして使用した。表８は、抗体２．５９．２および２．７０．２の両方が、ＡＣＨＮ細胞およびＣＡＫＩ−２細胞上に発現されるＴＩＭ−１抗原に特異的に結合するが、抗原ネガティブなＢＴ５４９細胞には結合しないことを示す。無関係な抗体アイソタイプコントロール（ｐＫ１６）に対して正規化した幾何平均割合に基づいて、ＡＣＨＮ細胞は、ＣＡＫＩ−２細胞よりも高い、ＴＩＭ−１タンパク質の細胞表面発現を有した。
【０１７７】
【表８】
2014240430.tif 000014
。
【０１７８】
（実施例３  抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の特異性）
抗ＴＩＭ−１抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＴＩＭ−１タンパク質に特異的に結合するが、無関係なタンパク質には結合しない。４つの抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（１．２９、２．５６．２、２．５９．２および２．４５．１）ならびに、アイソタイプの一致するコントロールｍＡｂであるＰＫ１６．３についてのＴＩＭ−１抗原（Ｖ５−ＨＩＳタグあり）の特異的な結合の結果を図１に示す。Ｘ軸は、上に列挙した順序で使用した抗体を示し、そして、Ｙ軸は、光学濃度である。無関係なタンパク質（これらもまたＶ５−ＨＩＳタグあり）に対するこれらの抗体のそれぞれの結合を、図２に示す。
【０１７９】
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
９６ウェルの高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３５９０）を、コーティング緩衝液（０．１Ｍ  炭酸塩、ｐＨ９．５）中で希釈した５０μＬのＴＩＭ−１抗原（濃度５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、そして、４℃にて一晩インキュベートした。次いで、これらのウェルを、２００〜３００μＬのＰＢＳ中０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した。次に、プレートを、２００μＬのアッセイ希釈物（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号２６４１１Ｅ）を用いて、室温にて少なくとも１時間ブロッキングした。次いで、抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体をアッセイ希釈物中で、最終濃度が７ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３１．３ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈した。抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を１：１０００で用いて、ＥＬＩＳＡについてのポジティブコントロールとして、Ｖ５を含むペプチドを検出した。次いで、プレートを再度上記のように洗浄した。次に、５０μＬの各抗体希釈物を適切なウェルに加え、次いで、室温にて少なくとも２時間インキュベートした。プレートを再度上記のように洗浄し、次いで、５０μＬの二次抗体（ヤギ抗ヒトＨＲＰ）を１：１０００で加え、そして、室温にて１時間インキュベートさせた。プレートを再度上記のように洗浄し、次いで、１ウェルごとに１００μＬのＴＭＢ基質溶液（１：１の比の溶液Ａ＋Ｂ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号２６４２ＫＫ）を用いて発色させた。最後に、５０μＬの硫酸で反応を停止させ、そして、４５０ｎｍでプレートを読み取り、５５０ｎｍで補正を行った。
【０１８０】
（実施例４  抗体の配列）
本明細書中に記載されるように抗体の構造を解析するために、特定のハイブリドーマからの重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをコードする遺伝子をクローニングした。遺伝子のクローニングおよび配列決定は、以下のようにして達成した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスに由来する約２×１０５個のハイブリドーマ細胞から単離した。ランダムにプライムしたｃＤＮＡの生成の後、ＰＣＲを行った。ヒトＶＨまたはヒトＶκファミリー特異的な可変ドメインプライマー（Ｍａｒｋｓら、１９９１）またはユニバーサルヒトＶＨプライマーであるＭＧ−３０（ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＩＧＧ）（配列番号８３）を、以下のヒトに特異的なプライマー：
【０１８１】
【数３】
2014240430.tif 000015
または、ヒトＣκ定常ドメイン（ｈκＰ２；Ｇｒｅｅｎら、１９９４に以前記載されたもの）と組み合わせて使用した。ハイブリドーマからのヒトＭＡｂ由来の重鎖およびκ軽鎖の転写物の配列を、上記プライマーを用いて、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡから生成したＰＣＲ生成物の直接的な配列決定により得た。ＰＣＲ生成物をまた、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲＩＩにクローニングし、そして、両方の鎖を、Ｐｒｉｓｍ色素−終結部位配列決定キットおよびＡＢＩ３７７配列決定装置を用いて配列決定した。全ての配列を、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓソフトウェアプログラムを用いて、「Ｖ  ＢＡＳＥ配列ディレクトリー」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に対するアラインメントにより解析した。
【０１８２】
上記表４〜７の各々において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、ＣＤＲドメインを決定した。Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））を参照のこと。
【０１８３】
（実施例５  エピトープビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）およびＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）親和性の決定）
本明細書中に記載される特定の抗体を、２００３年８月２１日に公開された、米国特許出願公開第２００３０１５７７３０号（発明の名称「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」）に記載されるプロトコールに従って、「ビン（ｂｉｎ）」した。
【０１８４】
一次抗体に結合させるための、ｍｘｈＩｇＧ結合ビーズを調製した。必要とされる上清の容積を、以下の式を用いて計算した：（ｎ＋１０）×５０μＬ（この式において、ｎは、プレート上のサンプルの総数である）。濃度が既知である場合、０．５μｇ／ｍＬを使用した。ビーズストックを、穏やかにボルテックスし、次いで、１ウェルあたり２５００個の各ビーズの濃度、すなわち、０．５×１０５／ｍＬの濃度まで、上清中で希釈し、そして、室温にて一晩、または、０．５μｇ／ｍＬの既知濃度の場合は２時間、暗所にてシェーカー上でインキュベートした。吸引後、５０μＬの各ビーズをフィルタープレートの各ウェルに加え、次いで、１ウェルあたり１００μＬの洗浄緩衝液を加えることによって一度洗浄し、そして、吸引した。１ウェルあたり５０μＬで抗原およびコントロールをフィルタープレートに加え、次いで、蓋をし、そして、暗所にて１時間、シェーカー上でインキュベートさせた。洗浄工程の後、一次抗体について用いたものと同じ希釈（または既知の場合、同じ濃度）を用いて、１ウェルあたり５０μＬで、未知の二次抗体を加えた。次いで、このプレートを、室温にて２時間、シェーカー上でインキュベートし、その後、洗浄工程を行った。次に、１：５００に希釈した、ビオチン化ｍｘｈＩｇＧを１ウェルあたり５０μＬ加えて、室温にて１時間、暗所にてシェーカー上でインキュベートさせた。洗浄工程の後、１ウェルあたり５０μＬのストレプトアビジン−ＰＥを１：１０００で加え、そして、室温にて１５分間、暗所にてシェーカー上でインキュベートさせた。洗浄工程の後、各ウェルを、８０μＬのブロッキング緩衝液中に再懸濁し、そして、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを用いて読み取った。
【０１８５】
表９は、生成されたモノクローナル抗体が、８個の別個のビン（ｂｉｎ）に属することを示す。抗体は、ＴＩＭ−１抗原上の少なくとも３つの別個のエピトープに結合した。
【０１８６】
（ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）解析を用いた抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ親和性の決定）
ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）解析を用いて、抗ＴＩＭ−１抗体のＴＩＭ−１抗原に対する結合親和性を決定した。この解析は、研究等級ＣＭ５センサチップを備えたＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）２０００バイオセンサを用いて、２５℃にて行った。慣用的なアミンカップリングを用いて、ＣＭ５  ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）チップの上に高濃度ヤギαヒト抗体表面を調製した。抗体上清を、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１０ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルデキストランを含有するＨＢＳ−Ｐ流動緩衝液中、約５μｇ／ｍＬに希釈した。次いで、これらの抗体を、２分の接触時間を用いて分離表面上で個々に捕捉し、そして、抗体の基線の安定化のために５分の洗浄を行った。
【０１８７】
ＴＩＭ−１抗原を、各表面上に７５秒間にわたり２９２ｎＭで注入し、その後、３分間分離させた。コントロールの流動細胞からの信号を減算し、そして、ＴＩＭ−１注入の直前に注入した緩衝液の基線の流れを減算することにより、二重に関係付けた結合データを得た。各ｍＡｂについてのＴＩＭ−１結合データを、各表面上に捕捉されたｍＡｂの量について正規化した。この正規化された流れにより補正した応答もまた測定した。２５℃における抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ結合の運動性解析結果を以下の表９に列挙する。
【０１８８】
【表９】
2014240430.tif 000016
。
【０１８９】
（実施例６  エピトープマッピング）
抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２を、ＴＩＭ−１抗原配列から設計した重なりペプチドに対する反応性についてアッセイした。アッセイプレートをＴＩＭ−１フラグメントペプチドでコーティングし、無関係なペプチドまたはペプチドなしをコントロールとして用いた。抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２をこのプレートに加え、インキュベートし、洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇ  ＨＲＰ結合対を用いて結合した抗体を検出した。ＴＩＭ−１に対する特異性のないヒト抗体、アイソタイプコントロール抗体、または、抗体なし、をコントロールとして用いた。結果は、ｍＡｂ  ２．７０．２が、ＴＩＭ−１免疫原（配列番号５４）のアミノ酸１８９−２０２に対応するアミノ酸配列ＰＭＰＬＰＲＱＮＨＥＰＶＡＴ（配列番号８７）を有するペプチドと特異的に反応したことを示した。
【０１９０】
以下のペプチド：
【０１９１】
【数４】
2014240430.tif 000017
に対してアッセイすることによって、ｍＡｂ  ２．７０．２の特異性をさらに規定した。
【０１９２】
結果は、ｍＡｂ  ２．７０．２がペプチドＡ、Ｂ、ＣおよびＦに特異的に結合することを示し、抗体のエピトープの範囲をＰＬＰＲＮＨＥ（配列番号９６）に限定した。
【０１９３】
表１０に示すように、合成ペプチドを作製し、これらの合成ペプチドにおいて、エピトープの各アミノ酸残基を、アラニンで置き換え、そして、ｍＡｂ  ２．７０．２との反応性についてアッセイした。この実験において、３番目のプロリン残基およびアスパラギン残基が、ｍＡｂ  ２．７０．２結合に決定的であると決定した。さらに、さらにＮ末端残基またはＣ末端残基を除いたペプチドのアッセイは、ｍＡｂ  ２．７０．２の結合が、最小エピトープＬＰＲＱＮＨ（配列番号９７）により保持されることを示した。
【０１９４】
【表１０】
2014240430.tif 000018
。
【０１９５】
（実施例７  正常組織および腫瘍組織におけるＴＩＭ−１発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）の解析）
正常組織生検および腫瘍組織生検におけるＴＩＭ−１発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を、当該分野で公知の技術を用いて行った。ビオチン化した完全ヒト抗ＴＩＭ−１抗体２．５９．２、２．１６．１および２．４５．１を解析した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを検出のために使用した。
【０１９６】
簡単に述べると、組織を、従来の技術を用いて脱パラフィン処理し、次いで、熱誘発性のエピトープ回復プロセスを用いてプロセシングして、組織サンプル内の抗原性エピトープを露出させた。切片を、１０％正常ヤギ血清と共に１０分間インキュベートした。正常ヤギ血清溶液の水気を切り、そして、拭いて、過剰な溶液を除いた。切片を、５μｇ／ｍＬのビオチン化した抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂと共に、２５℃にて３０分間インキュベートし、そして、ＰＢＳで徹底的に洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体と共に１０分間インキュベートした後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液をこの切片の上に加えて、免疫反応性を可視化した。アイソタイプコントロールについては、切片を、ビオチン化した抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂの代わりに、５μｇ／ｍＬのビオチン化したアイソタイプの一致するネガティブコントロールｍＡｂと共に、２５℃で３０分間インキュベートした。ＩＨＣ研究の結果を、表１１および１２にまとめる。
【０１９７】
生検を、０〜３のスケールで等級分けし、１＋のスコアは、染色が、アイソタイプコントロールである無関係な抗体で染色されたコントロール組織において観察されたものを上回ることを示す。１つの腎腫瘍および膵臓腫瘍からの対応する組織学的生検を、図３（ＡおよびＢ）に示す。これらの腎腫瘍および膵臓腫瘍に加えて、頭頚部癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌および脳腫瘍、ならびに、対応する正常組織からの生検を、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２で染色した。全体的に、腎臓癌組織サンプルおよび膵臓癌組織サンプルは、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２で染色したとき、高度に陽性であった。正常組織においては染色は観察されなかった。これらの結果は、ＴＩＭ−１が、これらの組織における癌のマーカーであり、そして、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂが、正常組織から癌を区別して、インビボにおいてＴＩＭ−１を発現する細胞を標的とするために使用され得ることを示す。
【０１９８】
【表１１】
2014240430.tif 000019
【０１９９】
【表１２】
2014240430.tif 000020
2014240430.tif 000021
2014240430.tif 000022
。
【０２００】
（実施例８  抗体による媒介される毒素殺傷）
当該分野において記載されるクローン原性アッセイを用いて、サポリン毒素を結合した二次抗体試薬と組み合わせて使用したときに、一次抗体が、癌細胞死を誘導し得るかどうかを決定した。ＫｏｈｌｓおよびＬａｐｐｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（１）：１６２−５（２０００）。
【０２０１】
（アッセイプロトコル）
ＡＣＨＮ細胞およびＢＴ５４９細胞を、１ウェルあたり３０００細胞の濃度で、平底組織培養プレートにプレーティングした。２日目、または細胞が約２５％のコンフルエンシーに到達したとき、１００ｎｇ／ウェルの二次ｍＡｂ−毒素（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−サポリン；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＨＵＭ−ＺＡＰ；カタログ番号ＩＴ−２２）を加えた。次いで、ポジティブコントロール抗ＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ  ２．７．２、ｍＡｂ  ２．５９．２またはアイソタイプコントロールｍＡｂを各ウェルに所望の濃度（代表的に、１〜５００ｎｇ／ｍＬ）で加えた。５日目に、細胞をトリプシン処理し、１５ｃｍ組織培養皿に移し、そして、３７℃にてインキュベートした。プレートを毎日観察した。１０〜１２日目に、全てのプレートをギムザ染色し、そして、プレート上のコロニーをカウントした。１５ｃｍプレートに移す前の細胞数と、最終的に形成されたコロニーの数とを比較することによって、プレーティングの効率を決定した。
【０２０２】
抗原陽性のＡＣＨＮ細胞株および抗原陰性のＢＴ５４９細胞株における生存割合を、それぞれ、図４および図５に示す。この研究において、細胞傷害性化学療法試薬である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）をポジティブコントロールとして使用し、そして、ほぼ完全な殺傷を誘導した。その一方で、サポリンを結合したヤギ抗ヒト二次抗体単独では効果がなかった。両方の細胞株により発現されるＥＧＦレセプターに対して生成したモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ  ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ）を用いて、一次抗体および二次抗体−サポリン結合体の特異的な殺傷を実証した。結果は、両方の細胞株が、１００ｎｇ／ｍＬにおいてＥＧＦＲ  ｍＡｂ媒介性の毒素殺傷に対して感受性であったことを示す。同じ用量において、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２および抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２の両方が、ＢＴ５４９細胞死が０％であったのに対し、９０％を超えるＡＣＨＮ細胞死を誘導した。
【０２０３】
（抗体毒素結合体により媒介される殺傷：クローン原性アッセイ）
ＣＡＫＩ−１細胞およびＢＴ５４９細胞を、１ウェルあたり３０００細胞の濃度で、平底組織培養プレート上にプレーティングした。２日目、または細胞が約２５％のコンフルエンシーに到達したとき、種々の濃度（代表的には、１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の非結合ｍＡｂおよびアウリスタチンＥ（ＡＥ）結合ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲｍＡｂ、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７．２、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２またはアイソタイプコントロールｍＡｂ）を細胞に加えた。これらの抗体の各々をＡＥに結合させた。両方の細胞株により発現されるＥＧＦＲに対して生成したモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ  ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ）をポジティブコントロールとして使用して、ＡＥ結合抗体により媒介される特異的な殺傷を実証した。５日目に、細胞をトリプシン処理し、１５ｃｍ組織培養皿に移し、そして、３７℃でインキュベートした。プレートを毎日観察した。１０〜１２日目に、全てのプレートをギムザ染色し、そして、プレート上のコロニーをカウントした。１５ｃｍプレートに移す前の細胞をカウントし、最終的に形成されたコロニーの数と比較することによって、プレーティングの効率を決定した。
【０２０４】
抗原陽性のＣＡＫＩ−１細胞株および抗原陰性のＢＴ５４９細胞株における生存割合を、それぞれ、図６および図７に示す。
【０２０５】
結果は、非結合アイソタイプコントロールｍＡｂおよびＡＥ結合アイソタイプコントロールｍＡｂが、ＣＡＫＩ−１細胞およびＢＴ５４９細胞の両方の増殖に対して効果がなかったことを示す。しかし、両方の細胞株は、用量依存性の様式でＡＥ−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ媒介性の毒素殺傷に対して感受性であった。最大用量において、両方の抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ（２．５９．２および２．７０．２）が、その非結合相対物と比較して、９０％を超えるＣＡＫＩ−１細胞死を誘導した。この応答は、用量依存性であった。同じ用量範囲において、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９．２および２．７０．２の両方は、ＢＴ５４９細胞の生存に影響を及ぼさなかった。
【０２０６】
（実施例９  ヒト腫瘍異種移植片の増殖遅延アッセイ）
標準的な試験法に従って、腫瘍増殖阻害モデルを使用した。Ｇｅｒａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−１０４（１９７２）。無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、既存の宿主からの腫瘍細胞または腫瘍フラグメントのいずれかを移植した。特に、腎臓（ＣａＫｉ−１）または卵巣（ＯＶＣＡＲ）癌腫瘍フラグメントを使用した。これらの動物を、次いで、体重１ｋｇあたり１〜２０ｍｇの範囲の用量で、２週間の期間にわたり週に２回、抗ＴＩＭ−１抗体免疫毒素結合体（例えば、ｍＡｂ  ２．７０．２  ＡＥ結合体）で処置した。処置した動物についての腫瘍容積を評価し、そして、未処置のコントロール腫瘍と比較し、こうして、腫瘍増殖の遅延を決定した。
【０２０７】
容積が１００ｍｍ３に達した後、動物を無作為抽出し、そして、個々に、１ケージあたり５匹の固体の群に割り当てた。目的のタンパク質または抗体を、２週間の期間にわたり、従来の経路（腹腔内、皮下、静脈内または筋肉内）を介して投与した。週に２回、動物を、カリパスを用いて腫瘍サイズについて評価した。投薬期間全体にわたり、そして、その後は週に２回、個々の動物の体重を毎日記録する。以下の式を用いて腫瘍容積を決定する：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（長さ×幅×高さ）×０．５３６。処置群について決定された容積を、未処置の担腫瘍コントロール群と比較する。処置された腫瘍についてのintimeでの差を、５００ｍｍ３、１０００ｍｍ３、１５００ｍｍ３および２０００ｍｍ３について計算する。未処置の担腫瘍コントロール動物と比較したときの変化について、体重を評価する。データは、時間に対してプロットした容積での、腫瘍増殖として報告する。各実験群についての体重もまた、グラフの形態でプロットする。
【０２０８】
結果は、処置がマウスによって十分に耐えられることを示す。具体的には、ＩＧＲＯＶ１卵巣（６．２５ｍｇ／ｋｇ，ｑ４ｄ×４静脈内投与）およびＣａｋｉ−１（３．３ｍｇ／ｋｇ，ｑ４ｄ×４静脈内投与）腎臓細胞癌モデルの両方において、完全な退行が顕著であった。２５ｍｇ／ｋｇまでの用量（１００ｍｇ／ｋｇの累積用量）では、マウスにおいて明白な毒性は観察されなかった。これらのデータは、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ＡＥ結合体により処置が、確立されたＣａＫｉ−１腫瘍およびＯＶＣＡＲ腫瘍の腫瘍増殖を阻害し、したがって、これらの抗体が、卵巣癌および腎臓癌の処置において有用にすることを示す。
【０２０９】
（実施例１０  抗ＴＩＭ−１抗体を用いた腎臓癌の処置）
腎臓癌の処置を必要とする患者に、細胞傷害性化学療法剤または放射性療法剤に結合した抗ＴＩＭ−１抗体の静脈内注射を与える。患者の進行をモニターし、そして、腎臓癌の増殖を阻害するために、必要に応じて、抗ＴＩＭ−１抗体の追加の投与を与える。このような処置の後、患者における癌のレベルが減少する。
【０２１０】
（実施例１１  ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＴＩＭ−１タンパク質の発現のＦＡＣＳ解析）
Ｆｉｃｏｌｌを通して２０分間スピンさせることによって、ＰＢＳ中で１：１に希釈したヒト血液から単核細胞を単離した。この単核細胞を、ＰＢＳ−ＭｇおよびＣａと共に１０００ｒｐｍで２回洗浄し、そして、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）；ＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に、約１０８細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞１０７個あたり２０μＬのＣＤ４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズを加え、そして、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を１０倍過剰容量のＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液で洗浄した。ポジティブ選択カラム（ＶＳ＋型）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を、３ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液で洗浄した。ペレット状の細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液１ｍＬあたり１０８細胞で再懸濁し、そして、洗浄したＶＳカラムにアプライした。次いで、このカラムを、３ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液で洗浄した。この後、ＶＳカラムを磁場から取り出し、そして、５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液を用いてＣＤ４＋細胞を溶出した。単離されたＣＤ４＋リンパ球をペレット状にし、そして、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ＋添加物（非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、メルカプトエタノール、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン）中に、１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１×１０６の新しく単離した休止ＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリー管に移し、そして、ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％  ＮａＮ３を含有する２ｍＬ／管のＦＡＣＳ染色緩衝液（ＦＳＢ）で洗浄した。細胞をスピンダウンし、そして上清を除いた。細胞を、ＦＢＳ中の２０％ヤギ血清を用いて、氷上で３０分間ブロッキングした。細胞を上述のように洗浄し、そして、氷上で４５分間、ＦＢＳ（２００μＬ）中１０μｇ／ｍＬの一次ヒト抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはコントロールＰＫ１６．３  ｍＡｂと共にインキュベートし、その後、洗浄した。暗所、氷上にて４５分間、二次ヤギ抗ヒトＰＥ結合抗体を１：５０の希釈で加え、戦場し、１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（５００μＬ）中に再懸濁し、そして、フローサイトメトリー解析を行うまで、４℃に維持した。
【０２１１】
ＦＡＣＳ解析を行って、ヒトおよびマウスの休止ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびに、ヒトの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞およびヒト分極ＣＤ４＋Ｔ細胞における、５つの抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（２．５９．２、１．２９、２．７０．２、２．５６．２、２．４５．１）を用いて検出された、ＴＩＭ−１タンパク質の発現を決定した。これらの解析は、新しく単離した休止ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＴＩＭ−１を発現しない一方、分極したヒトＴｈ２細胞およびＴｈ１細胞の主な画分はＴＩＭ−１を発現することを示す。
【０２１２】
５つの抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体を用いた、ヒトＣＤ４＋Ｔｈ２細胞におけるＴＩＭ−１タンパク質の発現のＦＡＣＳ解析を表１３に示す。実験は左の欄に記載し、そして、標識した抗体を上の行に沿って特定する。データを、蛍光強度の幾何平均として報告する。
【０２１３】
【表１３】
2014240430.tif 000023
。
【０２１４】
表１４は、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２により測定したとき、５日の時間経過にわたり、Ｔ細胞の継続的な刺激が、コントロールのＰＫ１６．３抗体と比較して、ＴＩＭ−１の発現の増加をもたらすことを実証する。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（ＭＭＰ１）の添加は、測定可能なほどにはＴＩＭ−１の発現を増加させず、この実験条件下では、レセプターがＴ細胞から脱皮されないことを実証した。したがって、ＴＩＭ−１タンパク質の発現および特異的な抗体の結合は、活性化されたＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞に特異的であり、同様に、炎症性応答（具体的には、喘息）に特徴的である。
【０２１５】
【表１４】
2014240430.tif 000024
。
【０２１６】
（実施例１２  サイトカインアッセイ）
標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて、活性化Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮγの産生レベルを、抗ＴＩＭ−１抗体で処理した培養物の上清において測定した。抗ＴＩＭ−１抗体で処理したＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞によるサイトカインの産生を、コントロールのＰＫ１６．３抗体で処理したＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞と比較した。さらに、以下のサンプルを内部コントロールとして平行して行った：ｉ）抗ＣＤ３処理したＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞（同時刺激を行わなかったので、サイトカインの産生は予想されない）、ｉｉ）抗ＣＤ３／抗Ｃｄ２８で刺激したＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞（検出可能なサイトカインの産生を示すと予想される）、およびｉｉｉ）未処理のＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、上記実施例に記載したように単離した。単離したＣＤ４＋リンパ球を、次いで、スピンダウンし、そして、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ＋添加物（非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、メルカプトエタノール、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン）中に、１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｆａｌｃｏｎ  ６ウェル非組織培養処理プレートを、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中合計６００μｌ）で、４℃にて一晩事前コーティングした。このプレートを、ＰＢＳで洗浄し、そして、ＣＤ４＋リンパ球をＴｈ２培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳ＋添加物ならびにＩＬ−２  ５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４  ５ｎｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγ  ５μｇ／ｍＬ）中に５００，０００細胞／ｍＬで懸濁し、そして、細胞を、ＴＩＭ−１タンパク質またはアイソタイプの一致したネガティブコントロールｍＡｂ  ＰＫ１６．３を認識するｍＡｂ（５μｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃および５％  ＣＯ２にて、４〜６日間刺激した。
【０２１７】
実験の別のセットにおいて、ＣＤ４＋リンパ球を、Ｔｈ１培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳ＋添加物ならびにＩＬ−２  ５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ１２  ５ｎｇ／ｍＬ、抗ＩＬ−４  ５μｇ／ｍＬ）中に５００，０００細胞／ｍＬで懸濁し、そして、５μｇ／ｍＬのＴＩＭ−１またはアイソタイプの一致するコントロールｍＡｂ  ＰＫ１６．３の存在下、３７℃および５％  ＣＯ２にて、４〜６日間刺激した。細胞を、ＤＭＥＭ中で２回洗浄し、そして、５μｇ／ｍＬのＴＩＭ−１  ｍＡｂまたはコントロールのＰＫ１６．３  ｍＡｂの存在下、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ＋添加物および２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２中に再懸濁し（５００，０００細胞／ｍＬ）、３７℃および５％  ＣＯ２にて４〜６日間培養した（休止させた）。細胞のＦＡＳ媒介性のアポトーシスを防止するために抗ＣＤ９５Ｌ（抗ＦＡＳリガンド）を加えて、活性化および休止のプロセスを上記のように少なくとも１回以上繰り返した。５００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび５μｇ／ｍＬの同時刺激分子Ｂ７Ｈ２（Ｂ７ホモログ２）で一晩事前コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ９６ウェル非組織培養処理プレートを洗浄し、そして、各ウェルに、１００μＬのＴＩＭ−１  ｍＡｂで処理したＴｈ１またはＴｈ２（２００，０００細胞）を加えた。培養から３日後、上清を除去し、そして、ＥＬＩＳＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮγのレベルを決定した。
【０２１８】
以下に実証されるように、抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞による調べたサイトカインの放出を有意に阻害した（図８〜１７を参照のこと）。サイトカイン産生の阻害が有意（ｐ＝０．０２〜０．００８）であった結果については、棒グラフにアスタリスクで印をつけている。表１５および１６は、図８〜１７の棒グラフを要約する。
【０２１９】
【表１５】
2014240430.tif 000025
【０２２０】
【表１６】
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。
【０２２１】
異なるドナーを用いた複数の実験から得られたＴｈ２サイトカイン阻害データのまとめを、表１７に提供する。各実験は、２人の異なるドナーからの全血サンプルから単離した、精製ＣＤ４＋細胞を使用した。サイトカイン産生は、コントロールＰＫ１６．３  ｍＡｂを用いて検出されたサイトカイン産生の割合として報告する。各実験において使用した抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂを、下の行に沿って特定する。有意なサイトカイン阻害を報告する結果は、以下の表１７において下線を付す。「ＮＤ」の使用は、実験を行わなかったことを意味する。これらの結果は、ドナー依存性の変化を反映するが、ｍＡｂ  ２．５９．２および１．２９が、１以上のＴｈ２サイトカインを再現可能にブロックすることを示す。
【０２２２】
【表１７】
2014240430.tif 000027
。
【０２２３】
（実施例１３  抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖの構築、発現および精製）
ｍＡｂ  ２．７０のＶＬドメインおよびＶＨドメインを用いて、ｓｃＦｖ構築物を作製した。抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖの配列は、当該分野で公知の方法により合成した。
【０２２４】
抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０２２５】
【数５】
2014240430.tif 000028
。
【０２２６】
成熟な抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０２２７】
【数６】
2014240430.tif 000029
。
【０２２８】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペリプラズムでの発現のために、合成したＤＮＡを、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）発現ベクター内に挿入し得る。細胞を増殖させ、そして、ペリプラズムのタンパク質を、標準的なプロトコールを用いて調製した。抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖの精製は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーカラムを製造業者の指示にしたがって用いて達成する。成熟なタンパク質の予想される分子量は、３０２２２．４ダルトンである。この精製したｓｃＦｖを、以下に記載するアッセイにおいて使用し、生物学的活性について試験する。ｓｃＦｖ構築物は、シグナルペプチド（ＳＰ）、ｍＡｂ  ２．７０に由来するＶＬ（ＶＬ１）、２５個のアミノ酸リンカー２０５Ｃに基づくリンカー（Ｌ４）、ｍＡｂ  ２．７０に由来するＶＨ（ＶＨ１）およびタグ（この場合、ＦＬＡＧタグ）から構成される。他のＳＰ、リンカーおよびタグの配列が、本明細書に記載される抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖ抗体と同じ活性を得るために利用され得ることは、当業者に明らかである。
【０２２９】
（実施例１４  抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的なｓｃＦｖ１の構築、発現および精製）
この治療用タンパク質の構築物についての基本式は以下のとおりである：
ＳＰ１−ＶＬ１−Ｌ１−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−Ｌ３−ＶＬ２−Ｔａｇ。
【０２３０】
シグナルペプチドＳＰ１は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＭＲＣ）Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫからの、ＩｇＧκシグナルペプチドＶＫＩＩＩ  Ａ２７と同じである。
【０２３１】
他のシグナルペプチドもまた使用され得、そして、他のシグナルペプチドは、当業者に明らかである。このタンパク質は、哺乳動物細胞から発現されるように設計される。成熟な切断タンパク質の予想される分子量は、５４８３３．３ダルトンである。Ｌ１は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーに対応し、一方で、リンカー２（Ｌ２）は、短いリンカー配列：ＧＧＧＧＳに対応する。Ｌ３は、１８アミノ酸のリンカーである。ＶＨ２は、Ｇｅｎｂａｎｋからの抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン（アクセッション番号ＣＡＥ８５１４８）に対応し、一方で、ＶＬ１は、Ｇｅｎｂａｎｋからの抗ＣＤ３可変軽鎖ドメイン（アクセッション番号ＣＡＥ８５１４８）に対応する。この構築物に使用されるタグは、この新規タンパク質の精製および検出を容易にするＨｉｓタグである。標準的なプロトコールを使用して、このＨｉｓタグ化タンパク質を発現および精製し、そして、これを、以下に記載されるプロトコールにおいて、活性および腫瘍細胞殺傷について試験する。
【０２３２】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ１を含む成分についてのアミノ酸および核酸の番号付けは以下のとおりである：
【０２３３】
【数７】
2014240430.tif 000030
。
【０２３４】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ１のヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０２３５】
【数８】
2014240430.tif 000031
。
【０２３６】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ１のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０２３７】
【数９】
2014240430.tif 000032
。
【０２３８】
（実施例１５  抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ２の構築、発現および精製）
この新規治療用タンパク質の構築物についての基本式は以下のとおりである：
ＳＰ１−ＶＬ１−Ｌ４−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−Ｌ４−ＶＬ２−Ｔａｇ。
【０２３９】
シグナルペプチドＳＰ１は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＭＲＣ）Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫからの、ＩｇＧκシグナルペプチドＶＫＩＩＩ  Ａ２７である。さらなる情報についえは、ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１を参照のこと。他のシグナルペプチドおよびリンカーもまた、さらなる生物学的に活性な二重特異的単鎖抗体を得るために使用され得る。この例に記載されるタンパク質はまた、哺乳動物細胞から発現されるように設計され、そして、上の基本式において示されるのとは異なるリンカーを利用すること（Ｌ４、先に記載される）、および、最初の例におけるＨｉｓタグの代わりにＦｌａｇタグが使用されること以外は、抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ１と同様である。
【０２４０】
成熟な切断タンパク質の予想される分子量は、５８０７０．０ダルトンである。この構築物に使用されるタグは、この新規タンパク質の精製および検出を容易にするＦＬＡＧタグである。標準的なプロトコールを使用して、この分泌されるタンパク質を発現させ、そして精製して、そして、これを、以下に記載されるプロトコールにおいて、活性および腫瘍細胞殺傷について試験する。
【０２４１】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ２を含む成分についてのアミノ酸および核酸の番号付けは以下のとおりである：
【０２４２】
【数１０】
2014240430.tif 000033
。
【０２４３】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ２のヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０２４４】
【数１１】
2014240430.tif 000034
。
【０２４５】
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ２のアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０２４６】
【数１２】
2014240430.tif 000035
。
【０２４７】
（実施例１６  抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖ種の生物学的活性のＥＬＩＳＡ解析）
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的なｓｃＦｖ１抗体およびｓｃＦｖ２抗体が特定の抗原に結合するかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡ解析を行い、１μｇ／ｍｌの特異的抗原（ＣＧ５７００８−０２）を、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ約９．２〜９．４）中で一晩ＥＬＩＳＡプレートに結合させる。プレートを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入したアッセイ希釈緩衝液でブロッキングし、そして、種々の濃度の抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖ二重特異的抗体を室温にて１時間添加する。プレートを、ＰＢＳ中０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０において洗浄し、その後、アッセイ希釈液中の６−Ｈｉｓタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＦＬＡＧペプチドタグ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のいずれかに対して、ＨＲＰ結合したｍＡｂを、室温にて６０分間加えた。ＴＭＢ基質（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて発色させ、そして、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止する。プレートを、Ａ４５０ｎｍにて読み取り、そして、このＯ．Ｄ．値をタンパク質結合の指標とみなす。
【０２４８】
（ＦＡＣＳ解析）
抗ＴＩＭ−１かつ抗ＣＤ３二重特異的なｓｃＦｖ１抗体およびｓｃＦｖ２抗体、ならびに、抗ＴＩＭ−１  ｓｃＦｖ抗体の、抗ＴＩＭ−１ヒトｍＡｂにより認識される抗原を発現する細胞に対する結合を、ＦＡＣＳ解析により調べる。細胞（例えば、ＡＣＨＮ）を、ＰＢＳ中で洗浄し、そして、１％ＢＳＡまたは１％ＦＢＳを加えた氷冷ＰＢＳから構成されるＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。この再懸濁した細胞を、次いで、種々の濃度の二重特異的抗体と共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄して、非結合抗体を除去する。結合抗体を、二重特異的な抗体の配列上で遺伝子操作された６−ｈｉｓタグまたはＦＬＡＧタグを特異的に認識する二次標識ｍＡｂ（フィコエリスリン標識またはＦＩＴＣ標識）の結合により検出する。細胞を洗浄し、そして、ＦＡＣＳ解析により抗タグｍＡｂの結合のために解析する。二重特異的ｍＡｂ＋抗タグｍＡｂの結合を、抗タグｍＡｂ単独の結合と比較する。
【０２４９】
（細胞傷害性解析）
二重特異的抗体が、Ｔ細胞にＴＩＭ−１を発現する正常細胞もしくは腫瘍細胞を標的とさせる、二重特異的な能力により規定される機能的活性を有するかどうかを決定するために、二重特異的抗体を細胞傷害性アッセイにおいて試験する。Ｔ細胞を、濃度分離媒体（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）（特定濃度１．０７７）を通した血液の遠心分離から誘導される低密度の細胞から得る。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞画分（Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球も含む）に由来する異種性混合物で使用されても、ＭＡＣＳ分離およびネガティブもしくはポジティブ選択を用いて、低濃度の細胞からさらに精製されてもよい。血液から直接誘導したＴ細胞を用いるアッセイにおける殺傷は、ＰＨＡ、サイトカイン、活性化モノクローナル抗体、または、他のポリクローナルＴ細胞活性化の刺激因子により、インビトロで刺激された細胞よりも少ない細胞溶解活性を有する。それゆえ、これらの活性化因子は、機能的アッセイにおいてＴ細胞の活性をさらに高めるために使用される。細胞傷害性アッセイの多くのバリエーションが利用可能である。細胞傷害性アッセイは、溶解の際に、細胞代謝の本来の生成物（例えば、ＬＤＨ）の放出を測定する。他のアッセイは、放射性クロム（５１Ｃｒ）、ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ、ＣＳＦＥ、または、類似の標識剤のような種々の薬剤での細胞の標識、および、これらの薬剤により結合される生細胞における放出または変化の検出に基づくものである。
【０２５０】
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）は、細胞媒介性の細胞傷害性研究において使用される、非放射性の方法を提供する。この方法は、蛍光増強リガンドのアセトキシメチルエステルを用いた細胞の負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）に基づく。リガンドが細胞膜を貫通した後、エステル結合が、細胞内で加水分解されて、親水性リガンドを形成し、これはもはや、膜を通過できない。細胞溶解後、この放出されたリガンドは、ユーロピウム溶液へと導入されて、蛍光キレートを形成する。測定されるシグナルは、溶解した細胞の量と直接相関する。標的細胞を、２×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁する。１０μｌのＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡを、製造業者の説明書に従って、チューブ内で２ｍｌの標的細胞と混合した。種々の濃度のＴ細胞を、９６ウェルの丸底プレート内の一定濃度の標識した標的細胞（１ウェルあたり５０００細胞）に加え、そして、３７℃にて少なくとも２時間インキュベートする。このプレートを、約２００ｇにてスピンダウンし、その後、２０μｌの上清を吸引し、この上清を次いで、別のプレート内のユーロピウム溶液（２００μｌ）に加えた。このプレートを室温で１５分間インキュベートし、その後、製造業者の説明書に従って、ＳＡＦＩＲＥ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて解析を行った。試験ウェルにおけるシグナルを、１００％溶解のウェル（Ｔ細胞の代わりに１０％溶解緩衝液）および培地のみの細胞（自然な放出）と比較し、そして、特異的溶解％を以下の式から計算する：
特異的溶解％＝（試験−自然な放出）／１００％溶解  ×１００。
【０２５１】
（ｓｃＦｖ構築物のＢＩＡｃｏｒｅ運動性解析）
ｓｃＦｖ構築物（モノマー、かつ、二重特異的、少なくとも１つのＴＩＭ−１に結合するｓｃＦｖ部分を含む）についての親和性を決定するための運動性測定を、本発明の全抗体について先に記載した方法を用いて測定する。ｓｃＦｖを含む抗体タンパク質のＴＩＭ−１に対する親和性は、ｍＡｂ  ２．７０について与えられる親和性の１０の係数内（すなわち、０．２７１ｎＭ〜２７．１ｎＭ）であると予想される。
【０２５２】
（実施例１７  抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂのヒト卵巣癌細胞の増殖を阻害する能力）
いくつかの完全ヒトモノクローナル抗体クローンを、上記の免疫処置から単離し、そして、そのＯＶＣＡＲ−５（ヒト卵巣癌）細胞の増殖能を阻害する能力を、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイ（国際特許出願公開ＷＯ  ０１／２５４３３に記載される）を用いて解析した。
【０２５３】
ＢｒｄＵアッセイにおいて、ＯＶＣＡＲ−５癌細胞（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、それぞれ、１０％胎仔ウシ血清または１０％仔ウシ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において培養した。卵巣癌細胞株を、１０％  ＣＯ２／空気にて３７℃でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ中で２４時間飢餓状態にした。富化した馴化培地（培養１００μＬあたり１０μＬ）を１８時間加えた。次いで、ＢｒｄＵ（１０μＭ）を加え、そして、細胞と共に５時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みを、製造業者の仕様書に従って、色素性イムノアッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によりアッセイした。
【０２５４】
種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体の中和能力を評価した。図１８Ａ〜１８Ｔに提供される結果は、棒グラフの形式で提示され、本明細書中に記載される種々のヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体への曝露時のＯＶＣＡＲ５細胞におけるＢｒｄＵ取り込みのレベルを比較するのに役立つ。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして、ＯＶＣＡＲ５細胞を、完全培地（完全）または限られた血清を含有する培地（飢餓）のいずれかにおいて培養した。さらに、モノクローナル抗体ＰＫ１６．３を、無関係な特異性のヒトＩｇＧ抗体を表すネガティブ処理コントロールとして含めた。本明細書中に記載されるヒト抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体は、種々の濃度で利用するコントロールの実験と比較するために、種々の用量（１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ）で使用した。
【０２５５】
（実施例１８  抗体結合研究）
抗ＴＩＭ−１特異的なｍＡｂ（１．２９および２．５６．２）および種々の無関係な抗体（ＰＫ１６．３を含む）に対して結合した植物毒素サポリンを用いて、さらなる抗体結合研究を行った（図１９Ａ〜１９Ｃ）。さらなるネガティブコントロールとして、毒素なしの抗ＴＩＭ−１特異的ｍＡｂ２．５６．２および無関係な抗体ＰＫ１６．３を含めた（図１９Ｄ）。４つの癌細胞株（うち、３つが腎臓癌細胞株（ＡＣＨＮ、ＣＡＫＩおよび７８６０）で、１つが乳癌細胞株（ＢＴ５４９））を、サポリン−抗体結合体または抗体単独で７２時間処理し、この時間の後、ＢｒｄＵを加えて、２４時間の期間にわたり増殖をモニターした。結果を、腎臓癌細胞株については図１９Ａ〜２０Ｃに、そして、乳癌細胞株については、図１９Ｄに記載する。３つ全ての腎臓癌細胞株は、ＢｒｄＵ取り込みにおける顕著な現象により実証されるように、サポリン−ＴＩＭ−１特異的抗体結合体での処理に対して感受性であった。同じ細胞株の無関係な抗体への結合体での処理は、抗原依存性の抗増殖作用を示す効果がほとんどなかったか、または全くなかった。ＢＴ５４９細胞株を用いて行った同様の研究は、ＴＩＭ−１特異的抗体２．５６．２が、単独で、または、サポリンと結合した場合のいずれも、抗増殖作用を示さなかったことを示した。これらの研究のためのネガティブコントロールは、細胞傷害作用なしに、十分に機能しているようであった。
【０２５６】
（実施例１９  配列）
以下は、ＴＩＭ−１に対するモノクローナル抗体に関する配列である。アミノ酸配列に関しては、太字は、フレームワーク領域を示し、下線はＣＤＲ領域を示し、そして、斜体は定常領域を示す。
【０２５７】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  １．２９）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２５８】
【数１３】
2014240430.tif 000036
。
【０２５９】
配列番号１によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２６０】
【数１４】
2014240430.tif 000037
。
【０２６１】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２６２】
【数１５】
2014240430.tif 000038
。
【０２６３】
配列番号３によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２６４】
【数１６】
2014240430.tif 000039
。
【０２６５】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  １．３７）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２６６】
【数１７】
2014240430.tif 000040
。
【０２６７】
配列番号５によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２６８】
【数１８】
2014240430.tif 000041
。
【０２６９】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２７０】
【数１９】
2014240430.tif 000042
。
【０２７１】
配列番号７によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２７２】
【数２０】
2014240430.tif 000043
。
【０２７３】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．１６）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２７４】
【数２１】
2014240430.tif 000044
。
【０２７５】
配列番号９によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２７６】
【数２２】
2014240430.tif 000045
。
【０２７７】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２７８】
【数２３】
2014240430.tif 000046
。
【０２７９】
配列番号１１によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２８０】
【数２４】
2014240430.tif 000047
。
【０２８１】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．１７）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２８２】
【数２５】
2014240430.tif 000048
。
【０２８３】
配列番号１３によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２８４】
【数２６】
2014240430.tif 000049
。
【０２８５】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２８６】
【数２７】
2014240430.tif 000050
。
【０２８７】
配列番号１５によりコードされる、軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２８８】
【数２８】
2014240430.tif 000051
。
【０２８９】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．２４）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２９０】
【数２９】
2014240430.tif 000052
。
【０２９１】
配列番号１７によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２９２】
【数３０】
2014240430.tif 000053
。
【０２９３】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２９４】
【数３１】
2014240430.tif 000054
。
【０２９５】
配列番号１９によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０２９６】
【数３２】
2014240430.tif 000055
。
【０２９７】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．４５）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０２９８】
【数３３】
2014240430.tif 000056
。
【０２９９】
配列番号２１によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３００】
【数３４】
2014240430.tif 000057
。
【０３０１】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３０２】
【数３５】
2014240430.tif 000058
。
【０３０３】
配列番号２３によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３０４】
【数３６】
2014240430.tif 000059
。
【０３０５】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５４）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３０６】
【数３７】
2014240430.tif 000060
。
【０３０７】
配列番号２５によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３０８】
【数３８】
2014240430.tif 000061
。
【０３０９】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３１０】
【数３９】
2014240430.tif 000062
。
【０３１１】
配列番号２７によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３１２】
【数４０】
2014240430.tif 000063
。
【０３１３】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５６）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３１４】
【数４１】
2014240430.tif 000064
。
【０３１５】
配列番号２９によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３１６】
【数４２】
2014240430.tif 000065
。
【０３１７】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３１８】
【数４３】
2014240430.tif 000066
。
【０３１９】
配列番号３１によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３２０】
【数４４】
2014240430.tif 000067
。
【０３２１】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．５９）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３２２】
【数４５】
2014240430.tif 000068
。
【０３２３】
配列番号３３によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３２４】
【数４６】
2014240430.tif 000069
。
【０３２５】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３２６】
【数４７】
2014240430.tif 000070
。
【０３２７】
配列番号３５によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３２８】
【数４８】
2014240430.tif 000071
。
【０３２９】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．６１）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３３０】
【数４９】
2014240430.tif 000072
。
【０３３１】
配列番号３７によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３３２】
【数５０】
2014240430.tif 000073
。
【０３３３】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３３４】
【数５１】
2014240430.tif 000074
。
【０３３５】
配列番号３９によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３３６】
【数５２】
2014240430.tif 000075
。
【０３３７】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３３８】
【数５３】
2014240430.tif 000076
。
【０３３９】
配列番号４１によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３４０】
【数５４】
2014240430.tif 000077
。
【０３４１】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３４２】
【数５５】
2014240430.tif 000078
。
【０３４３】
配列番号４３によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３４４】
【数５６】
2014240430.tif 000079
。
【０３４５】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７０．２）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３４６】
【数５７】
2014240430.tif 000080
。
【０３４７】
配列番号１３６によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３４８】
【数５８】
2014240430.tif 000081
。
【０３４９】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３５０】
【数５９】
2014240430.tif 000082
。
【０３５１】
配列番号１３８によりコードされる軽鎖可変領域および部分的な定常領域のアミノ酸配列：
【０３５２】
【数６０】
2014240430.tif 000083
。
【０３５３】
（抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂ  ２．７６）
重鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３５４】
【数６１】
2014240430.tif 000084
。
【０３５５】
配列番号４５によりコードされる重鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３５６】
【数６２】
2014240430.tif 000085
。
【０３５７】
軽鎖可変領域および定常領域の一部のヌクレオチド配列：
【０３５８】
【数６３】
2014240430.tif 000086
。
【０３５９】
配列番号４７によりコードされる軽鎖可変領域および定常領域の一部のアミノ酸配列：
【０３６０】
【数６４】
2014240430.tif 000087
。
【０３６１】
（実施例２０  卵巣癌の処置のための抗ＴＩＭ−１抗体の有用性を実証するインビボ研究）
インビボ研究を行って、無胸腺マウスにおける、確立されたヒトＩＧＲＯＶ−１卵巣異種移植片に対する、抗体−薬物結合体であるＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥの潜在能力および治療的効能を評価した。
【０３６２】
（材料および方法）
試験動物：５〜６週齢の無胸腺マウス（ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ  雌性）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手し、これをヒト腫瘍異種移植片のために使用した。動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のガイドラインに従って、特定の病原体を含まない条件下で飼育した。試験動物に、固形飼料と水を自由に与え、そして、通気（ＨＶＡＣ）、温度（２２℃±２℃）、相対湿度（５５％±１５％）および光周期（１２時間）が制御された室内に維持した。全ての研究を、承認された施設の動物管理および使用のプロトコールを用いて行った。Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｓ。インビボでの実験は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）において行った。
【０３６３】
ヒト卵巣癌異種移植片モデル。ＣＲ０１４−ＭＭＡＥ免疫結合体の腫瘍阻害活性を、刊行された方法（Ｇｅｒａｎ  ＲＩ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＮＨ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＭＭ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＡＭ  ａｎｄ  Ａｂｂｏｔｔ  ＢＪ（１９７２）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｉｍａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ３：１−１０４）に従って、無胸腺マウスを用いて、抗腫瘍異種移植モデルにおいて測定した。
【０３６４】
簡単に述べると、試験動物に、トロカールにより、無胸腺マウスの腫瘍ドナーから切除したＩＧＲＯＶ１癌の小さな断片（３０〜６０ｍｇ）を皮下移植した。腫瘍が確立されると（２０日目、９５ｍｇ）、これらの動物を対にマッチングさせて２群に分け（ｎ＝６マウス／群）、そして、処置を静脈内投与（尾静脈）により投与した。
【０３６５】
ＩＧＲＯＶ１卵巣癌は、１９８５年に４７歳の女性に由来するものであり、そして、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。処置の効果を、Ｖｅｒｎｉｅｒカリパスを用いた２つの直径にわたる腫瘍の繰り返し測定によりモニターした；腫瘍サイズ（ｍｇ）を、比重を１．０と仮定して、標準的な式（Ｗ２×Ｌ）／２を用いて算出した。腫瘍サイズおよび体重を１週間に２回評価した。しかし、マウスは毎日観察し、そして、瀕死の動物は、過度な疼痛または苦痛の臨床上の兆候が顕著である場合（すなわち、衰弱、姿勢の湾曲、麻痺／不全麻痺、腹部膨張、潰瘍形成、膿瘍、てんかん、および／または、出血）は、人道的に安楽死させた。２，０００ｍｇを超える腫瘍を有する動物は、研究から除外し、そして人道的に安楽死させた。
【０３６６】
無胸腺マウスにおける異種移植片研究は、種々の薬剤についての抗腫瘍効果を効率的に実証することが示され、これらの薬剤は、その後、臨床上の癌に対する活性を有することが見出された。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＩ，Ｄｅｃｋｅｒ  Ｓ，Ｚａｈａｒｅｖｉｔｚ  Ｄ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＬＶ，Ｖｅｎｄｉｔｔｉ  ＪＭ，Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ  Ｓ，Ｋａｌｙａｎｄｒｕｇ  Ｓ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｍ，Ａｒｂｕｃｋ  Ｓ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ  ＭおよびＳａｕｓｖｉｌｌｅ  ＥＡ（２００１）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＮＣＩ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４：１４２４−１４３１。
【０３６７】
結果：
ＩＧＲＯＶ１に対するインビボでの抗腫瘍効果。ＴＩＭ−１発現細胞に対するＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥのインビトロでの効能及び細胞傷害性に基づいて、抗腫瘍効果をインビボで検証した。
【０３６８】
皮下ヒトＩＧＲＯＶ１卵巣癌の増殖に対する、ビヒクル対照群、基準薬剤、ＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥ免疫結合体の効果を図２０に示す。
【０３６９】
生理食塩水又はＰＢＳで処置した動物の腫瘍は、腫瘍の質量が２，０００ｍｇに達するまで徐々に増殖したが、この時点で動物を試験から除外して、人道的に安楽死させた。免疫不全宿主におけるＩＧＲＯＶ１腫瘍の「定着」率は高く（９３％）、自然退縮率は非常に低い（０％）（Ｄｙｋｅｓ  ＤＪ、Ａｂｂｏｔｔ  ＢＪ、Ｍａｙｏ  ＪＧ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｊｒ．ＳＤ、Ｌａｓｔｅｒ  Ｊｒ  ＷＲ、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  ＬおよびＧｒｉｓｗｏｌｄ  Ｊｒ．ＤＰ（１９９２）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｄｒｕｇｓ，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４２（Ｆｉｅｂｉｇ  ＨＨおよびＢｅｒｇｅｒ  ＤＰｅ編）ｐｐ．１〜２２，Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ）。
【０３７０】
基準となる既知の抗腫瘍薬２種類、硫酸ビンブラスチン（１．７ｍｇ／ｋｇ，ｑ４ｄ×４静脈内投与）及びパクリタキセル（２４ｍｇ／ｋｇ，ｑ２ｄ×４静脈内投与）を本研究において使用した；予備試験で定めた最大耐許容投与量（ＭＴＤ）でこれらの薬剤を投与した。ビンブラスチンは、ごく軽微であり、有意ではない抗腫瘍効果を生じた（ｐ＜０．２０）；一方、パクリタキセルは、有意な腫瘍増殖抑制を示し、卵巣腫瘍の完全退縮が認められた（ｎ＝６／６）；観察期間中（処置開始後１０１日間）に腫瘍の再増殖は認められなかった。臨床での卵巣癌に対するパクリタキセルの有効性は周知であるが、ビンブラスチンについては不明である（Ｍａｒｋｍａｎ，Ｍ．，Ｔａｘｏｌ：ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，１９９１．６４（６）：ｐ．５８３−９０）。
【０３７１】
ＩＧＲＯＶ１担癌マウスへのＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥ静脈内投与の抗腫瘍効果は顕著であった。一方、高用量のＣＲ０１４免疫抱合体を投与した場合、５０ｍｇ／ｋｇ／処置（１／６＝１７％）および１００ｍｇ／ｋｇ／処置（６／６＝１００％）において、致死毒性が生じた。それでも、５０ｍｇ／ｋｇ／処置を投与した動物６匹中５匹においてヒト卵巣癌の完全退縮が認められた。２５ｍｇ／ｋｇ／処置、１２．５ｍｇ／ｋｇ／処置、６．２５ｍｇ／ｋｇ／処置などの低用量では治療効果のある腫瘍増殖抑制が認められ、被験動物の大半において完全退縮が認められた。観察期間中に、退縮した腫瘍は再増殖しなかった。
【０３７２】
本研究（ＣＲ０１４−ＯＮＣ−１，ＣＧＣ−１７）の動物において、１００ｍｇ／ｋｇ以下の用量では肉眼所見において治療効果の異常は認められず、５０ｍｇ／ｋｇではマウス６匹中１匹のみに体重抑制及び致死的毒性が認められた。５０ｍｇ／ｋｇ／処置以下では、週２回の体重測定において、ＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥを用いた処置の体重または体重増加に対する観察可能な効果や統計学的に有意な効果は認められなかった。
【０３７３】
結論：ＣＲ０１４−ｖｃＭＭＡＥは、実質的に用量依存性の抗腫瘍効果を生じる。この抗腫瘍効果は、腫瘍増殖の阻害として始まったが、すぐに、確立されたヒト卵巣異種移植片の完全な退行をもたらした；この退行は、観察期間中（処置開始後１０１日間）に首尾よい治療が認められなかった後の、長期生存および腫瘍の再増殖であった。
【０３７４】
（参考としての援用）
本明細書において引用される全ての参考文献（特許、特許出願、論文、教科書などを含む）およびこれらの文献において引用される参考文献は、それらがもはやそうではない程度までに、その全体が本明細書において参考として援用される。さらに、以下の参考文献もまた、このような参考文献において引用される参考文献を含め、その全体が本明細書において参考として援用される：
（等価物）
本発明の好ましい実施形態が例示および記載されてきたが、本発明は、本発明が属する分野の当業者により変更および改変され得、それゆえ、示される正確な用語に限定されないが、このような変更および改変がまた本発明を種々の用途および条件に適用させるためになされ得ることが理解されるべきである。したがって、このような変更および改変は、等価物の全範囲内であり、それゆえ、添付の特許請求の範囲の全範囲内であることが適切に意図される。
【０３７５】
本発明、ならびに、本発明を作成および使用する様式およびプロセスは、本発明が属する分野、または、本発明を作成および使用することに最も密接に関連のある分野のあらゆる当業者が実施できるように、このように完全、明瞭、簡潔かつ正確な用語で記載された。
【数１０１】
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【数１０２】
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【数１０３】
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【数１４８】
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【数１４９】
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【数１５０】
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【数１５１】
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【数１５２】
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【数１５３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１８Ｍ】
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【図１８Ｎ】
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【図１８Ｏ】
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【図１８Ｐ】
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【図１８Ｑ】
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【図１８Ｒ】
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【図１８Ｓ】
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【図１８Ｔ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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