(57)【要約】【課題】表面プラズモン増強を利用した蛍光検出方法において、広い検出範囲のまま一分子レベルの高感度検出を可能とする。【解決手段】表面プラズモン増強を利用した蛍光検出方法において、誘電体プリズム２２の一面に設けられた金属膜１２を含む検出部に電場増強場Ｅｗを発生せしめ、この電場増強場Ｅｗの励起効果によって生じる、被検出物質Ａに付与された蛍光標識Ｆからの蛍光を、光検出器３０により検出する際に、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させる。【選択図】図１
2014006266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質及び複数の金属微粒子を含む試料を供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質を含む試料を供給し、
前記試料を供給した後、蛍光標識を前記検出部に供給し、
前記被検出物質および前記蛍光標識を前記検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を前記検出部に供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された前記蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項３】
前記金属微粒子の粒径が４０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記金属微粒子がナノロッドであることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記検出部が、前記誘電体プリズムがある反対側の前記金属膜表面に、疎水性材料からなる膜厚１０〜１００ｎｍの不撓性膜を有するものであることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記不撓性膜が、ポリマー材料から構成されるものであることを特徴とする請求項６に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出方法に関するものであり、特に詳細には表面プラズモンを利用した蛍光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光  ５２５ｎｍ、蛍光量子収率  ０．６）やＣｙ５（蛍光  ６８０ｎｍ、蛍光量子収率  ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。
【０００４】
さらに、特許文献１や非特許文献１に示すように、プラズモンによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより１ｐＭを切るような高感度検出が可能である蛍光法、いわゆる表面プラズモン電場増強蛍光分光法も報告されている。
【０００５】
しかしながら、上記のような方法では分子の個数に換算すると未だ１０５個レベルであり、一分子の検出には程遠いのが現状である。
【０００６】
そこで、非特許文献２等に示されているように、一分子レベルでの検出が可能である金属プローブを用いたラマン分光法が挙げられる。これは、金属プローブ先端に光を入射して、この先端に局在プラズモンを生じさせ、これにより基板とプローブの間に生じる局所的な電場増強場を利用するものである。これにより、プローブ直下にある分子によるラマン過程の散乱断面積を実効的に増大し、理論的には入射光強度の数１０倍から１０６倍の増強度が得られると考えられている（非特許文献２  ｐｐ．２７７  ２．２．１節）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特願２００６−２５５３７４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【非特許文献２】井上康志、河田聡，分光研究，第５１巻，第６号，ｐ．２７６−２８５（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ラマン信号は、溶媒などの被検出物質が置かれている状態及び環境に大きく左右され、また夾雑物の振動もスペクトルに現れるため、定性分析としては有用であるが定量性は期待できない。また、金属プローブによる局所的な強電場の幅はせいぜい数十ｎｍ程度であって測定できる領域が小さいため、金属プローブの走査が必要となり測定が面倒である。さらには、一般的にラマン分光装置は、大型かつ高価であり操作性も良くない。
【００１０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法によって、一分子レベルでの高感度検出を可能とし、かつ広い検出範囲を有する蛍光検出方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明による第１の蛍光検出方法は、
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質及び複数の金属微粒子を含む試料を供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
【００１２】
そして、本発明による第２の蛍光検出方法は、
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質を含む試料を供給し、
試料を供給した後、蛍光標識を検出部に供給し、
被検出物質および蛍光標識を検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を検出部に供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
【００１３】
ここで、「検出部」とは、誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む、試料等を供給して接せしめる場所であって、励起光を、誘電体プリズム基板と金属膜との界面に対して、この界面での全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板を通し入射して、この界面表面にエバネッセント波を発生させ、このエバネッセント波との共鳴により金属膜中に表面プラズモンを発生せしめるように配されたものである。
【００１４】
「電場増強場」とは、誘電体プレートと金属膜との界面に対してこの界面で全反射条件を満たすように励起光を照射することによって生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜の上面に発生する電場の増強作用を有する領域を意味するものとする。
【００１５】
また、「被検出物質の存在量」とは、被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず定性的な量も意味するものとする。
【００１６】
そして、「ホットスポット」とは、微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域を意味するものとする。
【００１７】
特に金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に形成される「ホットスポット」においては、上記プラズモンによって増強された電場が集中し巨大な電場が形成されるとともに、それによって相手側のプラズモンをさらに強く誘起し合うという相乗効果が生じるため、他の場合（例えば粒子が単独で存在する場合や非金属の粒子が近接する場合）に較べ格段に強い電場増強場が生じる。例えば、２つの金属微粒子が数ｎｍまで近接した場合には、隙間に生じる「ホットスポット」での電場増強度は、非特許文献２にも記載されているように１０６以上にもなることが知られている。
【００１８】
さらに、本発明による蛍光検出方法において、金属微粒子の粒径は４０〜２００ｎｍであることが好ましく、金属微粒子はナノロッドであることが好ましい。また、蛍光標識は消光防止性蛍光物質であることが好ましい。
【００１９】
そして、検出部は、誘電体プリズムがある反対側の金属膜表面に、疎水性材料からなる膜厚１０〜１００ｎｍの不撓性膜を有するものであることが好ましく、この場合、不撓性膜はポリマー材料から構成されるものであることが好ましい。
【００２０】
ここで、金属微粒子の「粒径」とは、微粒子の最大径を意味するものとする。
【００２１】
さらに、「ナノロッド」とは、形状がロッド状（棒状）のナノ微粒子であって、縦軸と横軸との長さの比（アスペクト比）が概ね１〜２０であるものを意味するものとする。
【００２２】
そして、「消光防止性蛍光物質」とは、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる蛍光標識材料を意味するものとする。消光防止性蛍光物質の消光防止材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が消光防止材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。なお、金属消光とは、エネルギーを吸収し励起した蛍光体の近傍に金属が存在する場合、蛍光体から金属へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、無放射的なエネルギー失活現象のことである。
【００２３】
また、「不撓性」とは、検出装置を普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を意味するものとする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明による蛍光検出方法では、複数の金属微粒子を検出部の上に分散させて蛍光を光検出器により検出している。これにより、金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に生じるホットスポットによって、このホットスポット内に存在する蛍光標識から生じる蛍光を増強することができる。一方、複数の金属微粒子を検出部上に広く分散させているため、上記ホットスポットは広い範囲にわたり形成させることができる。この結果、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法を用いても、一分子レベルでの高感度検出が可能となり、さらに電場増強効果を有する領域が金属プローブの先端付近に限られるラマン分光法に比べて、広い範囲にわたる測定を短時間で行うことが可能となる。
【００２５】
また、金属微粒子は同体積の他の微粒子に較べ格段に光を散乱させる力(散乱能)が大きいため、この散乱光を二次的な励起光として用いることにより蛍光色素をさらに効率的に照明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明による蛍光検出方法を実施するための装置の一例を概略的に示す部分断面図である。
【図２】第１の実施形態における蛍光検出工程を示す概略部分断面図である。
【図３】第１の実施形態における金属微粒子を分散させた検出部を示す概略部分断面図である。
【図４】第２の実施形態における金属微粒子を分散させた検出部を示す概略部分断面図である。
【図５】第３の実施形態における金属微粒子を分散させた検出部を示す概略部分断面図である。
【図６Ａ】金属膜上に水溶媒層がある場合の電場Ｅを示す模式図である。
【図６Ｂ】金属膜上に消光防止性蛍光物質がある場合の電場Ｅを示す模式図である。
【図７】図６Ａおよび図６Ｂの場合における入射光の入射角度と反射率との関係を示すグラフである。
【図８】消光防止性蛍光物質の粒径と蛍光量との関係を示す図である。
【図９】消光防止性蛍光物質の検量線データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態及び実施例について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２８】
「蛍光検出方法」
＜第１の実施形態＞
図１は、本実施形態による蛍光検出装置の概略部分断面図である。本実施形態では、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００２９】
図１に示すように、本実施形態による蛍光検出装置は、所定波長の励起光Ｌｉを発する光源２１と、この励起光Ｌｉを一面から透過させるように配された、励起光Ｌｉを透過させる材料からなる誘電体プリズム基板２２と、この誘電体プリズム基板２２の励起光Ｌｉ入射面とは異なる一面に成膜された金属膜１２と、金属膜１２上に形成された不撓性膜１４と、不撓性膜１４上に固定されかつ抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１と、不撓性膜１４に試料Ｓが接するように試料Ｓを保持する試料保持部１３と、蛍光標識Ｆが発する蛍光を検出可能な位置に配された光検出器３０とを備えてなるものである。なお、図中には、検出部の上に分散された金属微粒子Ｐと、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆと、これに施され、かつ抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２も同時に示している。
【００３０】
励起光Ｌｉは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、蛍光標識Ｆを励起発光させることが可能なものならば特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
光源２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源２１は、励起光Ｌｉを誘電体プリズム基板２２と金属膜１２の界面１２ａに向けて、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板２２を通して入射させるために、励起光Ｌｉを導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。
【００３２】
誘電体プリズム基板２２は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム基板２２は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。
【００３３】
金属膜１２は、その薄膜材料として、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点からＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。また、金属膜１２の堆積方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法、めっき法、金属コロイドを用いた塗布法やスプレー法などの各種の薄膜作製方法によって形成することができ、これらの方法は使用する材料に応じて適宜選択することができる。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることが望ましい。
【００３４】
不撓性膜１４は、その薄膜材料として、例えばシリコン酸化膜やポリマー材料等を用いることができる。この場合、特に成膜条件や表面処理条件等の観点からポリマー材料が望ましい。例えばこの場合、スピンコート等の簡便な方法により作成することができる。また、本発明のように不撓性膜１４が疎水性材料から形成されている場合には、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる因子が不撓性膜１４の内部にまで入り込むことが無く、これらの消光因子によって蛍光標識Ｆの励起エネルギーが奪われることが防止される。
【００３５】
不撓性膜１４の具体的な材料は、誘電体プリズム基板２２に用いられている材料と比して線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内にあるものを選択することが望ましく、例えば下記表１に挙げたものの中から適宜選択することができる。
【００３６】
【表１】
2014006266.tif 000003
【００３７】
ここで、上記のように線（熱）膨張係数の差を３５×１０−６以内と規定したのは以下の理由による。
【００３８】
環境、特に温度の変動に対する安定性を高める上では、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２は互いに熱膨張係数が近い方が望ましい。つまり、それら両者の熱膨張係数が大きくかけ離れていると、温度変動が生じた際に両者の剥離や密着度の低下等の問題を招きやすい。具体的には、それら両者の線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内の範囲にあることが望ましい。なお、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２との間には金属膜１２が存在しているが、この金属膜１２は温度変動が有ったとき、上下の不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２に追随して伸縮するので、結局、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２の熱膨張係数が近い方が望ましいことに変わりは無い。以上の点を考慮すると、不撓性膜１４をポリマー材料から形成する場合、誘電体プリズム基板２２の材料としても一般にはガラスより樹脂を選択する方がより望ましいと言える。
【００３９】
一方、不撓性膜１４の膜厚は１０ｎｍ〜１００ｎｍとする。ここで、上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは以下の理由による。
【００４０】
金属の近傍に存在する蛍光材料は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして、金属膜の場合は、金属と蛍光材料との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。これにより、本発明では不撓性膜１４の膜厚の下限値を１０ｎｍとする。一方、蛍光材料は、エバネッセント波によって励起される。このエバネッセント波は、金属膜表面から高々励起光の波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際に、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、エバネッセント波が到達するのは波長（６３５ｎｍ）程度である。しかしながら、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光材料を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光材料との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。それにより、本発明では不撓性膜１４の膜厚の上限値を１００ｎｍとする。ただし、後述するように本発明においてホットスポット４０を形成させるために、金属微粒子Ｐと金属膜１２との距離を少なくとも１０ｎｍ程度に保つように不撓性膜１４の膜厚を考慮する必要がある。
【００４１】
なお、ポリマーからなる不撓性膜１４を用いた場合、被検出物質がタンパク等であれば容易に非特異的吸着しやすくなっている。これは、ポリマーとタンパク等が疎水性を有することに起因する疎水性効果による。この場合、非特異的吸着したタンパク等が蛍光検出を行う上で定量性を損なう要因となってしまうため、不撓性膜１４の表面に親水性表面修飾を施すことが望ましい。さらに、この表面修飾は上記のような機能の他に、特異的結合物質を固定するリンカーとしての機能も持たせることができる。
【００４２】
試料保持部１３は、試料Ｓを検出部上（本実施形態において、より正確には不撓性膜１４上）に接するように保持でき、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光の検出を妨げないような形状や材料であれば特に制限されるものではない。蛍光を上方から検出する場合には、例えば図１中に示すような、光を透過させない側面と光をよく透過させる上端面からなる試料保持部１３等を用いることができる。ここで、光を透過させない側面を用いているのは、意図しない外部からの光を遮断するためである。
【００４３】
光検出器３０は、蛍光標識Ｆが発する特定波長の蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。
【００４４】
１次抗体Ｂ１は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原ＡがＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原Ａと特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、ポリマー材料からなる場合の不撓性膜１４に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
【００４５】
（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）１次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。
（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。
【００４６】
一方、図２に示すように、本発明の第１の実施形態による蛍光検出方法は、誘電体プリズム基板２２の一面に成膜された金属膜１２と、この金属膜１２上の不撓性膜１４とからなる検出部上に、１次抗体Ｂ１を固定し、抗原Ａを含む試料Ｓを流して（図２Ａ）、この抗原Ａを１次抗体Ｂ１に固定し（図２Ｂ）、その後蛍光標識Ｆを流し（図２Ｃ）、１次抗体Ｂ１に結合した抗原Ａに、２次抗体Ｂ２を介して蛍光標識Ｆを結合させて、いわゆるサンドイッチ方式により蛍光標識Ｆを検出部に固定し（図２Ｄ）、蛍光標識Ｆを励起発光可能な波長の励起光Ｌｉを、誘電体プリズム基板２２と金属膜１２との界面１２ａに対して、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板２２を通し入射して、この界面１２ａ表面に生じる電場増強場Ｅｗにより、検出部表面に固定された蛍光標識Ｆを励起させ、これにより発せられる蛍光を検出する（図２Ｅ）ものであって、図３に示すように、蛍光を光検出器３０により検出する際、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて行うものである。
【００４７】
ここで、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、基本的に前処理によって、この蛍光標識Ｆには抗原Ａが結合しているものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。
【００４８】
蛍光標識Ｆは、励起光Ｌｉによって励起されて所定波長の蛍光を発するものであり、特に制限なく、検出条件に応じて適宜選択することができる。例えば、励起光Ｌｉの波長が６５０ｎｍの場合、Ｃｙ５色素等を用いることができる。この場合、蛍光標識Ｆをモノクロナール抗体等（２次抗体Ｂ２であって、１次抗体Ｂ１とはエピトープが異なるもの。）に修飾することにより、抗原抗体反応を用いて、蛍光標識Ｆを抗原Ａと特異的に結合可能にすることができる。なお、上記の蛍光標識Ｆおよび２次抗体Ｂ２の供給のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を１次抗体Ｂ１に結合させる前に、予め試料Ｓに蛍光標識Ｆを添加しておいてもよい。
【００４９】
金属微粒子Ｐの材料は特に制限はないが、局在プラズモンを効果的に誘起することができ、化学的安定性（試料Ｓに対する安定性）にも優れることから、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ等が好ましい。また、金属微粒子Ｐの形状は特に制限はないが、球状およびロッド状等が好ましく、金属微粒子Ｐを検出部の上に密に分散させる点から、ロッド状（ナノロッド）が好ましい。金属微粒子Ｐの粒径は、局在プラズモンを効果的に誘起することから、励起光Ｌｉの波長より小さいことが好ましく、４０〜２００ｎｍが特に好ましい。なお、ここで言う粒径とは微粒子の最大径を意味する。そして、金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させるタイミングは特に制限されるものではないが、蛍光を検出する前に金属微粒子Ｐを供給し分散させることが好ましく、本実施形態のような場合にあっては特に抗原Ａおよび蛍光標識Ｆを検出部に固着させる工程が終わった後に行うことがより好ましい。さらに、検出部に分散させる金属微粒子Ｐの量は、密に分散させることと光を効率よく取出すこととのバランスから、１０６個/ｍｍ２程度であることが好ましい。
【００５０】
さらに本実施形態では、上記金属微粒子Ｐは誘電体材料からなる誘電体層４１によって覆われている。これにより、金属消光が起きてしまう程度にまで金属微粒子Ｐが蛍光標識Ｆに近接してしまうことを防ぐことができる。
【００５１】
上記の金属微粒子Ｐを覆う誘電体層４１の形成方法は、例えば以下に示す２つの方法が挙げられる。なお、以下の２つの場合において共に金属微粒子Ｐとして金微粒子を扱っている。
【００５２】
まず第１の方法は、誘電体層４１をＳｉＯ２膜から形成するものであり、大きく分けて次の（１）〜（３）の工程からなる。
【００５３】
（１）金微粒子となる金コロイドの合成
（２）金コロイド表面分散剤の置換（クエン酸→シロキサン）
５×＝１０−４ｍｏｌの金コロイド水溶液５００ｍｌ（ミリ・リットル）に、ＡＰＳ（（3-Aminopropyl）trimethoxysilane）水溶液（２．５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
（３）金コロイド表面のＳｉＯ２修飾
ｐＨ１０〜１１に調整したsodium silicate０．５４重量％水溶液２０ｍｌを工程（２）の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。２４時間経過すると、厚さが約４ｎｍのＳｉＯ２膜が形成される。この溶液を遠心分離により３０ｍｌまで濃縮した溶液に、１７０ｍｌのエタノールを添加する。さらに０．６ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２８％）を滴下し、８０μｌ（マイクロ・リットル）のＴＥＳ（テトラエトキシシラン）を添加し、２４時間ゆっくり攪拌すると、厚さ２０ｎｍのＳｉＯ２膜からなる誘電体層４１が形成される。
【００５４】
次に第２の方法として、誘電体層４１をポリマー膜から形成する場合について説明する。この方法は、大きく分けて次の（１）〜（２）の工程からなる。
【００５５】
（１）金微粒子となる金ナノ粒子のＤＭＦへの再分散
平均粒径が役３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約３６０ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含む水分散液を１ｍｌ用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み０．９５ｍｌを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を１ｍｌのＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）に再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、ＤＭＦを加える前に水で洗浄した方が良い。
【００５６】
（２）金ナノ粒子のカプセル化
上記（１）の工程で得られた、平均粒径（粒径は、透過型電子顕微鏡による直接観察や、光吸収スペクトルから換算する方法にて決定することができる。）が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を約６４８ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含むＤＭＦ分散液１ｍｌに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体（ポリスチレンが約１００量体、ポリアクリル酸が約１３量体)のＤＭＦ溶液(約１０−２ｇ／ｍｌ)１０μｌを加え、シリンジポンプにより８．３μｌ／ｍｉｎの流量で水２００μｌを加えて激しく撹拌する。１０分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで１重量％のドデカンチオールＤＭＦ溶液５μｌを加え、２４時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、２ｍｌ／ｈの流量で水３ｍｌを加える。
【００５７】
次に透析により２４時間かけてＤＭＦを除去する。次いで撹拌しながら７２μｌのＥＤＣ溶液（水に対して０．１重量％：２４ｎｍｏｌ）を一気に添加し、３０分撹拌したところで１４４μｌのＥＤＯＤＥA溶液（水に対して０．１重量％：９６ｎｍｏｌ）を一気に添加し、撹拌する。
【００５８】
その後、透析により２４時間かけて試薬を除去し、次いで４０００Ｇで３０分間遠心分離を行い、体積で８０％に相当する上澄みを捨てる。次に捨てた上澄みと同体積の水を加えて同様に遠心分離を行う。この遠心分離から遠心分離までの操作を３回以上繰り返すことにより、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体の架橋物からなる被膜が金ナノ粒子（金微粒子）の周りに誘電体層４１として形成される。
【００５９】
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【００６０】
不撓性膜１４上には、抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１が固定化されている。そして試料保持部１３の中において試料Ｓが流され、試料Ｓ中の抗原Ａは１次抗体Ｂ１に結合し固定される。次いで同様に抗原Ａと特異的に結合するよう施された蛍光標識Ｆが流され、先ほどの１次抗体Ｂ１に結合した抗原Ａと２次抗体Ｂ２を介して上記蛍光標識Ｆが検出部に固定される（サンドイッチ方式）。
【００６１】
その後、光源２１から発せられる励起光Ｌｉを、誘電体プリズム基板２２と金属膜１２の界面１２ａに対して、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように基板を通し入射する。このとき、この界面１２ａ表面にエバネッセント波が発生し、このエバネッセント波との共鳴により金属膜１２中に表面プラズモンが発生する。そして、この表面プラズモンによる電場増強効果を受けて電場増強されたエバネッセント波（電場増強場Ｅｗ）により、検出部に固定された蛍光標識Ｆが励起されることとなる。この蛍光標識Ｆは所定波長の蛍光を発し、この蛍光検出によって抗原Ａの検出を行うことができる。
【００６２】
本実施形態による蛍光検出方法ではこの蛍光を検出する際、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出している。これにより、金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に生じるホットスポット４０によって、このホットスポット４０内に存在する蛍光標識Ｆからの蛍光を増強することができる。ホットスポットとは、金属微粒子Ｐと金属膜１２が１０ｎｍ程度に近づいたときに微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域である。
【００６３】
特に金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に形成される「ホットスポット」においては、上記プラズモンによって増強された電場が集中し巨大な電場が形成されるとともに、それによって相手側のプラズモンをさらに強く誘起し合うという相乗効果が生じるため、他の場合（例えば粒子が単独で存在する場合や非金属の粒子が近接する場合）に較べ格段に強い電場増強場が生じる。例えば、２つの金属微粒子が数ｎｍまで近接した場合には、隙間に生じる「ホットスポット」での電場増強度は、非特許文献２にも記載されているように１０６以上にもなることが知られている。
【００６４】
以上の結果、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法を用いても、一分子レベルでの高感度検出が可能となる。
【００６５】
一方、複数の金属微粒子Ｐを検出部上に広く分散させているため、上記ホットスポット４０を広い範囲にわたり形成させることができる。この結果、電場増強効果を有する領域が金属プローブの先端付近に限られるラマン分光法に比べて、広い範囲にわたる測定を短時間で行うことが可能となる。
【００６６】
また、金属微粒子は同体積の他の微粒子に較べ格段に光を散乱させる力(散乱能)が大きいため、この散乱光を二次的な励起光として用いることにより蛍光色素をさらに効率的に照明することができる。
【００６７】
さらに本実施形態による蛍光検出方法では、不撓性膜１４が形成されているので、蛍光標識Ｆから金属膜１２へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、いわゆる金属消光を防止することができる。これにより、励起した蛍光標識Ｆから効率よく蛍光を得ることができる。
【００６８】
そして、誘電体層４１が金属微粒子Ｐを覆うように形成されているため、上記と同様な効果により蛍光の金属微粒子Ｐによる金属消光を防止することができる。
【００６９】
また、電場増強場Ｅｗは、界面１２ａから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため、上記１次抗体Ｂ１を用いて蛍光標識Ｆと抗原Ａの対を検出部に集約させることにより、電場増強場Ｅｗにより励起される蛍光標識Ｆの量を増やすことが可能である。これにより、多くの蛍光量を得ることができ、結果としてより定量性の高い蛍光検出が可能となる。なお、上記のよう電場増強場Ｅｗの到達領域に関する特性により、意図せず試料Ｓ中に残ってしまった不純物９０からの散乱や浮遊蛍光標識Ｆ’からの発光等の影響を大幅に低減することができるため、さらにＳ／Ｎ比のよい蛍光検出が可能となる。
【００７０】
＜第２の実施形態＞
図４は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Ｐを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図１に示す第１の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、入射する励起光Ｌｉの波長として、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起することが可能である特定の波長を用いている点で第１の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１および図２に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００７１】
本実施形態による蛍光検出方法では、前述したとおり、入射する励起光Ｌｉの波長として、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起することが可能である特定の波長を用いていることにより、金属微粒子Ｐに局在プラズモンが生じる。
【００７２】
励起光Ｌｉの波長は特に制限されるものではないが、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起できるように、かつ測定条件特に測定対象とする被検出物質や蛍光標識等に応じて適宜選択できる。
【００７３】
金属微粒子Ｐは第１の実施形態と同様のものであるが、励起光Ｌｉの波長に応じて局在プラズモンを誘起できるようにその粒径は適宜選択する。
【００７４】
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【００７５】
本実施形態においても、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００７６】
さらに、本実施形態では局在プラズモンが生じた結果、図４に示すように、この局在プラズモンによって増強された近接場光ＮＬが金属微粒子Ｐの周囲に染み出すこととなる。この近接場光ＮＬは、前述したホットスポット４０とは独立して発生するものであるため、ホットスポット４０の形成には影響を及ぼさない。すなわち、本実施形態では金属微粒子Ｐによるホットスポット４０の形成と近接場光ＮＬの発生の両方が起こる。したがって、ホットスポット４０のみならず、この近接場光ＮＬによっても蛍光標識Ｆを励起させることができるので、より高感度の蛍光検出が可能となる。
【００７７】
＜第３の実施形態＞
図５は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Ｐを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図１に示す第１の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、被検出物質を標識する蛍光標識として、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いている点と、金属微粒子Ｐを覆う誘電体層４１を必要としない点で第１の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１および図２に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００７８】
本実施形態による蛍光検出方法では、前述したとおり、被検出物質を標識する蛍光標識Ｆとして、蛍光色素分子１５を、蛍光色素分子１５から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料１６により包含してなる消光防止性蛍光物質ＦＢを用いている。
【００７９】
消光防止性蛍光物質ＦＢは、粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、５００ｎｍ以下のものがさらに好ましく、１３０〜５００ｎｍのものが特に好ましい。上記の好ましい粒経は以下のようにして算出された。
【００８０】
表面プラズモン励起による蛍光検出にあたり、消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱を考慮する必要がある。
【００８１】
消光防止性蛍光物質の材質には水溶媒より屈折率の高い材料を用いている。例えばポリスチレンの屈折率ｎは、１．５９〜１．６である。このような高屈折率の消光防止性蛍光物質が金属膜近傍に位置することによって表面プラズモンの発生が阻害されうる。この現象をプリズム層１０１、金属膜１０２、溶媒層１０３の三層に分けた多層膜近似で考察した。図６Ａは金属層１０２上に水溶媒層のみである場合、図６Ｂは金属膜１０２にポリスチレンの消光防止性蛍光物質１０４が存在する場合に、プリズム層１０１側から光ビームを入射させた場合に金属膜表面に生じる電場Ｅを模式的に示している。
【００８２】
プリズム層１０１、溶媒層１０３（１０３’）は十分な膜厚があり、プリズム層１０１の屈折率、金属膜１０２の屈折率、膜厚がすでに決まっていると仮定すると、金属膜表面上に誘起されるプラズモンの状態は金属膜上の溶媒屈折率によって決まる。図７は、金属膜１０２上に水溶媒層のみである場合（実線で示す）と、金属層上にポリスチレン層が存在する場合（破線で示す）について、励起光の界面への入射角度と反射率との関係をシミュレーションにより求めたグラフである。このグラフから溶媒側に水溶媒層(屈折率ｎ＝１．３３）がある場合には、表面プラズモンが発生する共鳴角が存在するが、ポリスチレン層（屈折率ｎ＝１．５９）がある場合には表面プラズモンが発生しない（共鳴角が現れない）ことがわかる。すなわち、図６Ｂに示すように消光防止性蛍光物質１０４により点線で示す領域１０５の電場が乱されている。このことから、屈折率の高い消光防止性蛍光物質(ポリスチレンやガラス製)を用いてアッセイを行い、金属膜近傍に消光防止性蛍光物質が固定されると、表面プラズモンが阻害されて低減してしまい、ＳＰＦ測定ができなくなると推察される。
【００８３】
このような、消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱を考慮に入れ、消光防止性蛍光物質の粒径と蛍光量との関係をシミュレーションした結果を図８に示す。粒径が大きくなれば内包される蛍光分子数が増えるので、粒径が４００ｎｍまでは蛍光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径５００ｎｍを超えると急激に蛍光量が減少していくことが分かった。これは、粒径５００ｎｍを超えると上述の消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱が大きくなってくるためである。図８から、消光防止性蛍光物質の径の増加による蛍光量の増加と消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱とを考慮し、蛍光量が最大ピークを示した粒径３００ｎｍの蛍光量から１桁程度以上蛍光量が落ちないようにするためには、消光防止性蛍光物質の粒径を７０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲とすることが望ましい。なお、上記においては、消光防止性蛍光物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、消光防止性蛍光物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。
【００８４】
さらに、検出部上に１次抗体を固定するため２次元平面上で蛍光検出を行うとき、消光防止性蛍光物質の粒径の好ましい範囲を２次元充填密度の観点から以下のように導出した。
【００８５】
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として１ｐＭ（ピコモーラ：×１０-12ｍｏｌ／ｌ）程度は必要であるといわれている。そこで、この１ｐＭ以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ２桁、すなわち、１００ｐＭまで検出できる感度特性を目標値として消光防止性蛍光物質の好ましい粒径を導出した。
【００８６】
１ｐＭの抗原濃度の検体について、アッセイ時の条件を検出領域の直径を１ｍｍ（面積３．１ｍｍ2）、流路を流下する検体量を３０μｌ（この検体量は一般的な簡易血液診断装置において、流路に流す前の前処理後、あるいはメンブレンフィルターによって血球分離された後の標準的な値である。）、抗原捕捉率を０．２％（一般的に抗原捕捉率は、０．２％〜２％程度であることから、ここでは、捕捉率が最低であった場合でも検出可能とするため、０．２％に設定した。）とすると、１．２×１０4個／ｍｍ2の抗原を検出領域に固定し検出できればよい。ここで、１．２×１０4個／ｍｍ2を目標固定量とする。一方、落射蛍光検出装置（ＬＡＳ−４０００、落射蛍光式、富士フイルム社製）を用いて測定した、前述の手順で作製した消光防止性蛍光物質（直径３００ｎｍ、励起波長５４２ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍ）の検量線データを図９に示す。ここでは中心波長５２０ｎｍの緑色ＬＥＤの励起光を用い、緑色蛍光用フィルタを通して蛍光を検出した結果を示している。このときの検出限界密度はエラーバーが蛍光検出装置のバックグラウンド値の３σ(σは標準偏差)と交わった１.０×１０3個／ｍｍ2であった。
【００８７】
この結果、φ３００ｎｍの消光防止性蛍光物質を用いると目標固定量（１．２×１０4個／ｍｍ2）の１２分の１の固定量で検出可能であるといえ、１ｐＭ以下の抗原濃度で抗原検出が可能となる高感度化が達成できていることが明らかとなった。また、この結果から、消光防止性蛍光物質の粒径を３００ｎｍより小さくしても１ｐＭの検体について測定可能であることが明らかである。同一密度で蛍光色素分子が内包されている場合、消光防止性蛍光物質１個あたりの蛍光発光量は消光防止性蛍光物質半径の三乗（ｒ3）に比例する。従って、φ１３０ｎｍの消光防止性蛍光物質を用いた場合、１個あたりの蛍光量はφ３００ｎｍの消光防止性蛍光物質の１／１２倍になるが１ｐＭの抗原濃度での検出が十分可能であるといえる。ここから、１ｐＭの抗原濃度での検出を行うための消光防止性蛍光物質粒径の下限値はφ１３０ｎｍ程度と定められる。なお、ここでは、消光防止性蛍光物質中の蛍光色素分子密度が略一定であると想定している。
【００８８】
一方、消光防止性蛍光物質の粒径を大きくすると内包される蛍光色素分子量が増加するため蛍光信号強度も増大し検出光量の点で有利になるが、２次元平面上の一定面積に固定できる消光防止性蛍光物質の個数は立体障害の観点から固定量に限界がある。ダイナミックレンジ２桁として１００ｐＭを検出上限濃度とすると、固定量は１．２×１０6個／ｍｍ2となる。このとき、１つの抗原に対し１つの消光防止性蛍光物質が結合するとして最密充填となる大きさは、φ５００ｎｍである。このことから目標固定量を実現できる消光防止性蛍光物質の上限サイズはφ５００ｎｍである。
【００８９】
以上の観点から、消光防止性蛍光物質のさらに好ましい粒径は１３０ｎｍ〜５００ｎｍである。
【００９０】
透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、この蛍光色素１５からの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。消光防止性蛍光物質ＦＢは蛍光色素分子１５が透光材料１６で覆われているものであるため、金属膜１２上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜１２と蛍光色素分子１５との距離をある程度を離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。消光防止性蛍光物質ＦＢの透光材料１６に含まれる蛍光色素分子１５の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。
【００９１】
なお、光源２１と消光防止性蛍光物質ＦＢの好適な組合せの具体例としては以下の組合せが挙げられる。
【００９２】
例えば、波長６５５ｎｍのＬＤ光源(品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製)に対して消光防止性蛍光物質(品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製)あるいは消光防止性蛍光物質（品番Ｆ８８０７、直径２００ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、もしくは波長６３５ｎｍのＬＤ光源（品番ＤＬ−３１４８−０２３、ＤＬ−３０３８−０１１、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製）に対して、消光防止性蛍光物質（品番Ｆ８８１６、直径１０００ｎｍ、励起波長６２５ｎｍ、蛍光波長６４５ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）の組合せがある。
【００９３】
消光防止性蛍光物質ＦＢへの２次抗体Ｂ２修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
【００９４】
消光防止性蛍光物質溶液（品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクロナール抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより消光防止性蛍光物質ＦＢへの抗体の修飾がなされる。
【００９５】
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
【００９６】
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
【００９７】
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により消光防止性蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、消光防止性蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００９８】
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【００９９】
本実施形態においても、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１００】
さらに、本実施形態のように蛍光標識として消光防止性蛍光物質ＦＢを用いた場合には、金属微粒子Ｐに金属消光防止のための膜を設けなくても、金属微粒子Ｐと蛍光色素分子との距離をある程度を離間させることができる。第１および第２の実施形態において金属微粒子Ｐによる金属消光を防止するために必要であった誘電体層４１を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
【０１０１】
また、本実施形態の場合には、一つの抗原Ａに対して多くの蛍光色素分子１５が標識されていることになる。一方、金属膜１２から距離があり電場増強場Ｅｗでは充分に励起されない蛍光色素分子１５は、金属微粒子Ｐによる電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓによって励起することができる。以上により本実施形態では、第１の実施形態と同様のホットスポット４０の効果に加え、より多くの蛍光色素分子１５を励起することができるので、より高感度の蛍光検出が可能となる。
【０１０２】
＜設計変更＞
以上すべての実施形態において、金属微粒子Ｐを試料Ｓ中の溶媒に分散させて蛍光を検出する場合について説明してきたが、本発明は上記の場合に限られず、溶媒を乾燥させた後に蛍光を検出する方法としても本発明における課題を解決できる。
【０１０３】
溶媒を乾燥させる方法は特に制限されるものではなく、静置乾燥および減圧乾燥等を用いことができる。
【０１０４】
この場合、金属微粒子Ｐを検出部の表面に凝集させることができるため、より金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間を密にすることができ、蛍光の増強度を向上させることが可能となる。また周囲の媒質が水（１．３３）から空気（１．０）となる、すなわち周囲の媒質の屈折率が下がることにより、プラズモンおよびホットスポットにおける電場増強が強くなるというメリットもある。
【符号の説明】
【０１０５】
１２         金属膜
１２ａ       誘電体プリズムおよび金属膜の界面
１３         試料保持部
１４         不撓性膜
１５         蛍光色素分子
１６         透光材料
２１         光源
２２         誘電体プリズム
３０         光検出器
４０         ホットスポット
４１         誘電体層
９０         試料中の不純物
Ｓ           試料
Ａ           抗原
Ｂ１         １次抗体
Ｂ２         ２次抗体
Ｆ・Ｆ’      蛍光標識
ＦＢ         消光防止性蛍光物質
Ｌｉ         励起光
Ｌｓ         散乱光
Ｐ           金属微粒子
Ｅｗ         エバネッセント波
ＮＬ         近接場光
ＳＰ         表面プラズモン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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