(57)【要約】【課題】癌転移の制御に効果を有する化合物を提供し、該化合物を含む癌治療用組成物を提供すること。【解決手段】ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤、該癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物、該癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分を含む製剤とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤、癌転移抑制および癌治療におけるミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の使用、並びにミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を癌疾患であると判定された対象に癌転移抑制に有効な量で投与することを含む癌転移抑制方法および癌治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤。
【請求項２】
癌疾患であると判定された対象由来の癌細胞試料を用い、該試料におけるＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現を測定し、該タンパク質の発現が、対応する正常細胞試料における発現と比較して低下していると判定されたことにより選択された対象に投与される、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる転移抑制剤。
【請求項３】
癌疾患であると判定された対象にミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を投与する前に、該対象由来の癌細胞試料を用いてミルタザピンで処理し、ミルタザピンで処理しないときと比較して、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強すると判定されたことにより選択された対象に投与される、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる転移抑制剤。
【請求項４】
前記Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質が、Ｌｉｎ７Ｃである、請求項２または請求項３に記載の転移抑制剤。
【請求項５】
請求項１に記載の癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物。
【請求項６】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤に、さらに付加的な抗癌活性成分を含む癌治療用組成物。
【請求項７】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分を含む製剤とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤。
【請求項８】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の癌転移抑制における使用。
【請求項９】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の癌治療における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤、該癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物、および該癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤に関する。また本発明は、癌転移抑制および癌治療におけるミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の使用に関する。さらに本発明は、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を、癌転移抑制に有効な量で投与することを含む癌転移抑制方法および癌治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移とは、癌細胞が原発巣から離れて血管やリンパ系を介して移動し、身体の他の部分に到達する過程であり、癌における死亡原因の大半を占めると言われている。従来より、癌転移の分子機構の解明は癌の制御につながると期待され多くの研究がされている。しかし、そのメカニズムの解明は未だ完全ではなく、臨床応用にまで至った例はない。
【０００３】
本発明者らは、癌の浸潤や転移の抑制に働く細胞接着因子βカテニンを含むＬｉｎ７Ｃ−カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＣＡＳＫ）−βカテニン  ネットワークを報告している（非特許文献１）。具体的には、口腔癌細胞と正常口腔粘膜上皮細胞の多数のタンパク質の発現をプロテオミクス解析により網羅的に検索し、発現変動が認められる分子の中からＬｉｎ７Ｃ遺伝子を同定した。そして、Ｌｉｎ７Ｃの発現上昇が癌の浸潤や転移を抑制すること、またＬｉｎ７Ｃが癌の浸潤や転移の抑制に働く細胞接着因子βカテニンを含むＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークを形成していることを見出した。また、ヌードマウスを用いた癌細胞移植実験において、ヒトＬｉｎ７Ｃの完全長ｃＤＮＡを搭載した発現ベクターを導入して癌細胞にＬｉｎ７Ｃを強制発現させると、コントロール（通常の癌細胞株を使用した群）に比較して、顎下腺、肺、肝臓への転移が抑制されることを証明した。
【０００４】
その他にも、癌の転移や浸潤に関連する遺伝子や因子を標的とした実験が報告されている（非特許文献２−３）。しかしながら、標的遺伝子を同定しても、そのインヒビターやエンハンサーとしての化学物質（薬剤）を発見した報告はごく少ない（非特許文献４）。また、同定された標的遺伝子を利用して遺伝子治療を行うには、高価で手続きも煩雑であり、特別な施設でしか行うことができないため、現状では実用化可能な治療法にまで至った研究はない。
【０００５】
ミルタザピンは、四環系抗うつ剤としてうつ病やうつ状態に適用される化合物である。ミルタザピンは、シナプス前α２自己受容体およびヘテロ受容体にアンタゴニストとして作用し、脳内ノルアドレナリンおよびセロトニン（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）の遊離を増大させることが知られている。また、セロトニン受容体（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＴＲ）ファミリーである５−ＨＴ２受容体（ＨＴＲ２）および５−ＨＴ３受容体を遮断する作用があり、そのため選択的に５−ＨＴ１受容体を活性化する。また、ミルタザピンはヒト骨肉腫で細胞毒性剤として作用することが報告されており、腫瘍生育を阻害するその能力は免疫反応の活性化とセロトニン作動性システムの回復を必要とすることが大腸癌細胞において報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Onda T, Uzawa K, Nakashima D, SaitoK, Iwadate Y, Seki N, Shibahara T, TanzawaH. Lin-7C/VELI3/MALS-3: an essentialcomponent in metastasis of human squamouscell carcinoma. Cancer Res. 2007;67:9643-8.
【非特許文献２】Li Y, Zhu CL, Nie CJ, Li JC, ZengTT, Zhou J, Chen J, Chen K, Fu L, Liu H, Qin Y, Guan XY. Investigation of TumorSuppressing Function of CACNA2D3 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One 2013;8(4):e60027.
【非特許文献３】Fan CD, Lum MA, Xu C, Black JD,Wang X. Ubiquitin-dependent regulation of phospho-AKT dynamics by the ubiquitinE3 ligase, NEDD4-1, in the insulin-like growth factor-1 response. J Biol Chem. 2013 Jan 18;288(3):1674-84.
【非特許文献４】Zhang X, Yue P, Page BD, Li T, ZhaoW, Namanja AT, Paladino D, Zhao J, Chen Y, Gunning PT, Turkson J. Orallybioavailable small-molecule inhibitor of transcription factor Stat3 regresseshuman breast and lung cancer xenografts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 ;109:9623-8.
【非特許文献５】Fang, C.K. et al. Mirtazapineinhibits tumor growth via immune response and serotonergic system. PLoS One 2012;7:e38886.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌の転移は癌における死亡原因の大半を占めるため、癌の転移を制御することは癌治療におけるキーポイントであり、早期に実現させるべき課題である。
【０００８】
本発明の課題は、癌転移の制御に効果を有する化合物を提供し、該化合物を含む癌治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく、癌転移の制御に効果を有する化合物に関する探索的研究を進めた。その結果、四環系抗うつ剤と知られているミルタザピンが、癌の浸潤や転移の抑制に働く細胞接着因子βカテニンを含むＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現を増強すること、高浸潤性ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ−Ｈ１（以下、ＳＡＳ−Ｈ１細胞と称する）および高浸潤性ヒト培養悪性黒色腫細胞株Ｇ−３６１（以下、Ｇ−３６１細胞と称する）を移植したヌードマウスにおいてそれらの臓器転移をミルタザピンが抑制したこと、およびミルタザピンによる癌転移の抑制効果はミルタザピンによるＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強された癌細胞株で認められたことを見出した。本発明者らは、ミルタザピンの投与により癌の転移が抑制され、ミルタザピンの単独投与あるいは既存の抗癌剤との併用投与が、癌患者に対する有用かつ新規の治療法となる可能性が高いと考え、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤、
２．癌疾患であると判定された対象由来の癌細胞試料を用い、該試料におけるＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現を測定し、該タンパク質の発現が、対応する正常細胞試料における発現と比較して低下していると判定されたことにより選択された対象に投与される、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる転移抑制剤、
３．癌疾患であると判定された対象にミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を投与する前に、該対象由来の癌細胞試料を用いてミルタザピンで処理し、ミルタザピンで処理しないときと比較して、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強すると判定されたことにより選択された対象に投与される、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる転移抑制剤、
４．前記Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質が、Ｌｉｎ７Ｃである、前記２．または３．の転移抑制剤、
５．前記１．の癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物、
６．ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤に、さらに付加的な抗癌活性成分を含む癌治療用組成物、
７．ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分を含む製剤とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤、
８．ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の癌転移抑制における使用、
９．ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の癌治療における使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤、該癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物、および該癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤を提供できる。
【００１２】
ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を癌転移抑制に有効な量で投与することにより癌転移抑制および癌治療が可能になる。また、ミルタザピン処理による副作用はほとんど認められなかったことから、本発明に係る癌転移抑制剤は、この点においても癌転移抑制および癌治療に有用である。
【００１３】
このように、本発明により、薬剤の服用という非常に簡便な方法のみで癌の転移および浸潤を抑制することができる。そのため、癌治療において、手術範囲の軽減による機能温存、放射線療法および化学療法などの治療内容の軽減、並びに生命予後の改善を見込むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−Ａ】四環系抗うつ剤であるミルタザピン（Ｍｉｒｔａｚａｐｉｎｅ）処理により、ＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（βｃａｔｅｎｉｎ）のｍＲＮＡ発現が、著しく上昇したことを説明する図である。別の四環系抗うつ剤であるアポモルフィン（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）、カフェイン（Ｃａｆｆｅｉｎｅ）、リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）、クエチアピン（Ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ）、およびブスピロン（Ｂｕｓｐｉｒｏｎｅ）、並びに溶媒コントロールであるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はいずれも、上記ｍＲＮＡの発現に影響を示さなかった。上記ｍＲＮＡの発現量は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）で表した。（実施例１）
【図１−Ｂ】ミルタザピン処理によるＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）の発現増加がタンパク質レベルでも証明されたことを説明する図である。図中、Ｍｉｒ（−）はミルタザピン非処理癌細胞を、Ｍｉｒ（＋）はミルタザピン処理癌細胞を示す。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）の発現は、内部標準として測定した。ＨＴＲ２Ｃは、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークの上流に位置するセロトニン受容体ファミリータンパク質である。（実施例１）
【図２】ミルタザピンが１０μＭで、ＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンのｍＲＮＡ発現を効果的に増強したことを説明する図である。上記ｍＲＮＡの発現量は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）で表した。（実施例１）
【図３】癌細胞株におけるＬｉｎ７Ｃ遺伝子の発現を定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ｑＲＴ−ＰＣＲと略称する）により解析した結果を示す図である。ミルタザピンはＳＡＳ−Ｈ１細胞でＬｉｎ７Ｃ発現の上方制御に効果を示した（パネルＡ）が、ＳＡＳ細胞には何ら影響を示さなかった（パネルＢ）。また、他のＨＴＲ２Ｃリガンド候補物質はＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ発現に期待した影響を示さなかった（パネルＣ−Ｆ）。結果は、トリプリケートアッセイで得られた値の平均値±該平均値の標準誤差（以下、ｍｅａｎｓ± ＳＥＭと略称する）で表示する。（実施例２）
【図４】Ｌｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の各ｍＲＮＡ発現レベルに対するミルタザピンの効果を検討した結果を示す図である。ミルタザピン１０μＭによる処理で、ＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞におけるこれら遺伝子の上方制御が認められた（パネルＢおよびパネルＣ）が、ＳＡＳ細胞では認められなかった（パネルＡ）。結果は、トリプリケートアッセイで得られた値のｍｅａｎｓ± ＳＥＭで表示する。図中、Ｍｉｒ（−）はミルタザピン非処理、Ｍｉｒ（＋）はミルタザピン処理を表す。（実施例２）
【図５】ＳＡＳ細胞およびＳＡＳ−Ｈ１細胞、並びにＧ−３６１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ遺伝子の機能解析を行った結果を示す図である。パネルＡは、ｑＲＴ−ＰＣＲで解析した結果、ＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ  ｍＲＮＡ発現レベルが、ＳＡＳ細胞のものと比較して有意（Ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー  Ｕ検定）に低かったことを示す。パネルＢは、ミルタザピンの有無におけるＳＡＳ細胞、ＳＡＳ−Ｈ１細胞、およびＧ−３６１細胞のＨＴＲ２Ｃ、Ｌｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）タンパク質発現レベルを、ウエスタンブロット解析した結果を示す。各ブロットは、β−アクチンタンパク質レベルに対して標準化した。これらブロットは、全長ブロット（図８に示す）をトリミングしたものである。図中、Ｍｉｒ（−）はミルタザピン非処理、Ｍｉｒ（＋）はミルタザピン処理を表す。（実施例２）
【図６】図５に示したイムノブロッティングの結果を全長サイズで示した図である。（実施例２）
【図７】細胞増殖の比較をコントロール群（ミルタザピン非処理）およびミルタザピン処理群で行った結果を示す図である。細胞増殖へのミルタザピンの効果を測定するために、ＳＡＳ細胞（パネルＡ）、ＳＡＳ−Ｈ１細胞（パネルＢ）、およびＧ−３６１細胞（パネルＣ）の細胞増殖を７日間に亘って測定した。結果はトリプリケートアッセイで得られた値のｍｅａｎｓ± ＳＥＭで表示する。図中、Ｍｉｒ（−）はミルタザピン非処理、Ｍｉｒ（＋）はミルタザピン処理を表す。また、図中、ｈは時間を表す。（実施例３）
【図８】ヒト転移性癌細胞における抗転移能に関するミルタザピンの機能的効果を検討した結果を示す図である。パネルＡおよびパネルＢは、それぞれＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞についての浸潤アッセイの典型的な結果を示す。孔を通過するミルタザピン処理細胞数はコントロール細胞と比較して有意（Ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー  Ｕ検定）に減少した。元倍率は１００倍であり、スケールバーは１００μｍである。パネルＣおよびパネルＤは、それぞれＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞についての遊走アッセイの結果を示す。元倍率は１００倍であり、スケールバーは１００μｍである。図中、Ｍｉｒ（−）はミルタザピン非処理、Ｍｉｒ（＋）はミルタザピン処理を表す。また、図中、Ｎｏ．ｃｅｌｌは細胞数を意味し、ｈは時間を意味し、Ａｒｅａ（％  ｏｆ  ０ｈ）は面積（培養０時の面積に対する割合）を意味する。（実施例３）
【図９】ＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞を舌部に移植したヌードマウスでは、ミルタザピン投与によりその臓器転移が有意に抑制されたことを説明する図である。細胞の各臓器への転移の測定は、各臓器についてヒト特異的反復配列ＡｌｕをｑＲＴ  Ａｌｕ  ＰＣＲで解析することにより実施した。転移の程度は、マウスＧＡＰＤＨに対して標準化した転移量を、舌中のヒト細胞の実際の数に対する相対値で表した（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）。非投与群（図中、ＮＴと表示）およびコントロール群（図中、Ｔｗｅｅｎ８０と表示）では、顎下腺（Ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｇｌａｎｄ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、および腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）に自発転移が認められたが、ミルタザピン投与群ではこれらの臓器への転移は認められなかった。アステリスクは、コントロール群とミルタザピン投与群との間に有意差（Ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー  Ｕ検定）が認められたことを示す。図中、Ｎ．Ｃ．はヒトゲノムＤＮＡのない陰性コントロールを示す。（実施例４）
【図１０】非投与群、コントロール群（Ｔｗｅｅｎ８０投与）、およびミルタザピン投与群の体重（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）を比較した結果を示す図である。体重は、処置期間の４週間（４Ｗｅｅｋｓ）に亘って測定した。値はｍｅａｎｓ± ＳＥＭ（各群ｎ＝５）で表した。図中、ＮＴはミルタザピンもその溶媒であるＴｗｅｅｎ８０も投与しなかった非投与群を意味する。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物からなる癌転移抑制剤、該癌転移抑制剤を含む癌治療用組成物、および該癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分とを組み合わせたことを特徴とする併用投与用癌治療剤に関する。
【００１６】
用語「癌」は、正常細胞が遺伝子レベルの変化により安定した形質として異常増殖能を獲得した細胞であって、その形態およびその配列が種々の点で正常細胞と異なり、転移性や浸潤性を有する細胞で構成される腫瘍をいい、悪性腫瘍ということもある。用語「癌」は、悪性腫瘍全般、すなわち癌腫および肉腫を含むが、主に癌腫を指す。癌腫は、消化管や呼吸器粘膜、肝臓、腎臓などの実質臓器に発生する上皮性悪性腫瘍をいう。これに対し、肉腫は運動器や軟部組織などの非上皮性（間葉性）悪性腫瘍をいう。
【００１７】
用語「癌転移」とは、癌細胞が原発巣から分離して、別の組織や臓器、例えばリンパ節、肝臓、肺などに移動して定着し、そこで再び増殖して腫瘍（転移性腫瘍）を形成することを意味する。原発巣とは、癌細胞が最初に発生した病変部位をいう。癌転移は、その経路により主に３種類、すなわちリンパ行性転移、血行性転移、および播種性転移に分類できる。リンパ行性転移は、原発巣の癌細胞が周囲にあるリンパ管に侵入し、リンパ流にのってリンパ節に運ばれ、そこで転移性腫瘍を形成することをいう。血行性転移は、原発巣の近くにある毛細血管や細い静脈に癌細胞が侵入し、血流を介して原発巣の存在する部位とは別の臓器に転移することをいう。播種性転移は、胸腔や腹腔に面した臓器に発生した癌細胞が、腹腔や腹腔の別の部位に転移性腫瘍を形成することをいう。癌転移における最初のステップであるリンパ管や血管への癌細胞の移行には、癌の浸潤の過程が必要である。用語「浸潤」とは、原発巣の癌細胞が直接に周囲の組織や臓器に広がっていくことを意味する。
【００１８】
用語「癌転移抑制」は、癌細胞の原発巣からの分離と浸潤、別の組織や臓器への移動、および移動先における定着と増殖を低減させることを意味する。
【００１９】
用語「癌転移抑制剤」は、癌細胞の原発巣からの分離と浸潤、別の組織や臓器への移動、および移動先における定着と増殖を低減させる薬剤を意味する。
【００２０】
ミルタザピンは四環系抗うつ剤としてうつ病やうつ状態に適用されている化合物であり、その化学名は１，２，３，４，１０，１４ｂ−ヘキサヒドロ−２−メチルピラジノ［２，１−ａ］ピリド［２，３−ｃ］［２］ベンゾアゼピン（１，２，３，４，１０，１４ｂ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｏ［２，１−ａ］ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｃ］［２］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ）である。ミルタザピンは、シナプス前α２自己受容体およびヘテロ受容体にアンタゴニストとして作用し、脳内ノルアドレナリンおよびセロトニンの遊離を増大させることが知られている。また、５−ＨＴ２受容体および５−ＨＴ３受容体を遮断する作用があり、そのため選択的に５−ＨＴ１受容体を活性化する。
【００２１】
本発明において、ミルタザピンが癌の浸潤や転移の抑制に働く細胞接着因子βカテニンを含むＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現を増強すること、高浸潤性ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ−Ｈ１および高浸潤性ヒト培養悪性黒色腫細胞株Ｇ−３６１を移植したヌードマウスにおいてそれらの臓器転移をミルタザピンが抑制したこと、およびミルタザピンによる癌転移の抑制効果がミルタザピンによりＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強された癌細胞株で認められたことを見出した。このようにミルタザピンは癌転移の抑制に効果を有するため、癌浸潤抑制剤および癌転移抑制剤として有用である。
【００２２】
ミルタザピンは、遊離体のままでもよく、薬理学的に許容される塩であってもよい。薬理学的に許容される塩として、酸付加塩および塩基付加塩を挙げることができる。酸付加塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、またはリン酸塩などの無機酸塩、およびクエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、またはパラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩を例示できる。塩基付加塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、またはアンモニウム塩などの無機塩基塩、およびトリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩を例示できる。また、ミルタザピンは、遊離体および塩のほか、これらの溶媒和物であってもよい。溶媒和物として、水和物やエタノール和物などを例示できるが、医薬品として許容される他の溶媒との溶媒和物であればいずれの溶媒和物であってもよい。
【００２３】
本発明に係る癌転移抑制剤は、必要に応じて、医薬用に許容される担体（医薬用担体）を含む医薬組成物として製造できる。本発明に係る医薬組成物は癌治療用組成物として有用である。
【００２４】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、目的とする薬剤の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組み合わせて使用される。そのほか、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤などを適宜使用することもできる。安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などのいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などが包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。
【００２５】
本発明に係る癌転移抑制剤の用量範囲は特に限定されず、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。適当な用量は、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて決定することができるが、一般的には例えば対象の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ乃至１０００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１００ｍｇ程度の範囲である。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができる。
【００２６】
本発明に係る癌転移抑制剤の好ましい用量は、マウスにおける癌転移抑制効果が１０ｍｇ／ｋｇ／日投与で認められている（後述する実施例４および図９参照）ことを基準にすると、１日に１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇである。
【００２７】
本発明に係る癌治療用組成物に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１−７０重量％、好ましくは０．０００１−５重量％程度の範囲である。
【００２８】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路および非経口経路のいずれによっても投与できるが、経口投与がより好ましい。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。あるいは、本発明に係る薬剤は、腫瘍内投与することができる。
【００２９】
剤形は、特に限定されず、種々の剤形とすることができる。例えば、溶液製剤として使用できるほかに、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。また持続性剤形または徐放性剤形であってもよい。
【００３０】
具体的には、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤、経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション、口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤、ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤、坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。
【００３１】
経口用固形製剤を調製する場合は、上記有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などを例示できる。
【００３２】
経口用液体製剤を調製する場合は、上記化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどを挙げることができる。
【００３３】
注射剤を調製する場合は、上記化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。
【００３４】
本発明に係る癌治療用医薬組成物は、上記癌転移抑制剤に加え、癌の治療に有効な付加的な活性成分を含む癌治療用医薬組成物であり得る。本発明において活性成分とは、腫瘍細胞、例えば癌細胞に対し、増殖抑制効果、細胞傷害効果、および転移抑制効果のうちのいずれか１以上の効果を示す化合物をいう。また、本明細書において、癌の治療に有効な付加的な活性成分を抗癌活性成分とも称する。
【００３５】
癌の治療に有効な付加的な活性成分は特に限定されず、癌細胞に対し増殖抑制効果、細胞傷害効果、および転移抑制効果のうちのいずれか１以上の効果を示す化合物であればいずれを用いることもできる。癌の治療に有効な付加的な活性成分として、既に臨床的に癌治療に使用されている薬剤の有効成分、例えば化学療法剤、生物学的応答修飾剤、化学的感作剤などに含まれる活性成分を例示できる。
【００３６】
化学療法剤とは、癌細胞を死滅させるまたはそれらの増殖を遅らせるために用いる薬剤を意味する。したがって、細胞傷害性薬と細胞増殖抑制剤の双方が化学療法薬であるとみなされる。化学療法剤の例は、従来タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル、ＲＰＲ１０９８８１Ａ、ＳＢ−Ｔ−１２１３、ＳＢ−Ｔ−１２５０、ＳＢ−Ｔ−１０１１８７、ＢＭＳ−２７５１８３、ＢＲＴ２１６、ＤＪ−９２７、ＭＡＣ−３２１、ＩＤＮ５１０９、およびＩＤＮ５３９０）、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、およびヒドロビンブラスチン）、ドラスタチン類（ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、ＩＬＸ６５１、ＴＺＴ−１０２７、シンプロスタチン１、シンプロスタチン３、およびＬＵ１０３７９３）、クリプトフィシン類（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン５２）、エポチロン類（例えば、エポチロンＡ、エポチロンＢ、デオキシエポチロンＢ、およびエポチロンＢラクタム）、エレウテロビン、ディスコデルモリド、２−エピ−ディスコデルモリド、２−デス−メチルディスコデルモリド、５−ヒドロキシメチルディスコデルモリド、１９−デス−アミノカルボニルディスコデルモリド、９（１３）−シクロディスコデルモリド、またはラウリマリドである。
【００３７】
具体的には、単剤である化学療法剤として、ニトロソウレア系薬剤（Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａｓ）、窒素マスタード系薬剤（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ）、トリアジン系薬剤（Ｔｒｉａｚｅｎｅｓ）、アンスラサイクリン系薬剤（Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ビンカアルカロイド系薬剤（Ｖｉｎｃａ  ａｌｉｋａｒｏｉｄｓ）、エピポドフィロトキシン系薬剤（Ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、タキサン系薬剤（Ｔａｘａｎｅｓ）、ホルモン類似体（Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ａｎａｌｏｇｓ）および白金製剤（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｄｒｕｇｓ）などを例示できる。ニトロソウレア系薬剤として、カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ）、セムスチン（Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、フォテムスチン（Ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ、ＦＴＭ）およびニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ、ＡＣＮＵ）などを例示できる。窒素マスタード系薬剤として、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ＣＰＡ）を例示できる。トリアジン系薬剤として、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）およびテモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ、ＴＭＺ）などが例示される。アンスラサイクリン系薬剤として、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ＤＸＲ）およびブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、ＢＬＭ）を例示できる。ビンカアルカロイド系薬剤として、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＣＲ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ、ＶＤＳ）およびビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ、ＶＬＢ）などを例示できる。エピポドフィロトキシン系薬剤として、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を例示できる。タキサン系薬剤として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ＰＴＸ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ＴＸＴ）を例示できる。ホルモン類似体として、抗エストロゲン剤（Ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、ＴＡＭ）を例示できる。白金製剤として、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ＣＢＤＣＡ）を例示できる。好ましくは、トリアジン系薬剤を例示できる。
【００３８】
生物学的応答修飾薬とは、疾病と闘う免疫系の能力を刺激するまたは回復させる薬剤を意味する。すべてではないがいくつかの生物学的応答修飾薬は、癌細胞の増殖を遅らせることができ、したがって化学療法剤であるともみなされる。生物学的応答修飾薬として、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン−２、リツキシマブ、およびトラスツズマブなどを例示できる。
【００３９】
化学感作剤とは、化学療法剤の効果に対する癌細胞の感受性をより高くさせる薬剤を意味する。
【００４０】
本発明に係る癌転移抑制剤はまた、癌の治療に有効な付加的な活性成分、例えば上記抗癌活性成分と組み合わせて、併用投与用癌治療剤として提供できる。本発明に係る癌転移抑制剤と、癌の治療に有効な付加的な活性成分との併用は、同時に行っても良いし、または分離して行うことができる。具体的には、本発明に係る癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分との併用は、これらを別々に製剤化して得られる２種類の製剤を同時に投与する方法、当該２種類の製剤を別々に時間差をおいて投与する方法のいずれによっても実施できる。当該２種類の製剤の投与経路は同一経路であっても良いし、それぞれの製剤に適した別々の経路であっても良い。好ましくは、本発明に係る癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分とは、それらを別々に製剤化して得られる２種の製剤をそれぞれに適する投与経路および投与頻度で、同時に、または時間差をおいて投与する。
【００４１】
本発明に係る癌転移抑制剤と付加的な抗癌活性成分とを組み合わせて併用することにより、該抗癌活性成分の投与による癌の増殖抑制効果や縮小効果に加え、本発明に係る癌転移抑制剤による癌転移抑制効果を得ることができる。そのため、かかる併用投与は、該抗癌活性成分の単独投与による治療効果と比較して、癌治療においてより高い治療効果を与える。
【００４２】
本発明において使用される付加的な抗癌活性成分として、既に臨床的に癌治療に使用されている薬剤の有効成分、具体的には上記化学療法剤、生物学的応答修飾剤、化学的感作剤などに含まれる活性成分を例示できるが、これらの投与経路、投与頻度、および投与量は当業者に明らかである。好適な用法および用量は、癌の種類や症状によって異なり、各薬剤の添付文書の記載を参照にして決定することができる。あるいは、好適な用法および用量に関する情報は、医薬品に関する各種情報データベース、例えば日本の医薬品医薬機器情報提供ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏ．ｐｍｄａ．ｇｏ．ｊｐ）や、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）提供のオレンジブック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｏｒａｎｇｅ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）などのデータベースから容易に入手可能である。
【００４３】
本発明はまた、癌転移抑制におけるミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の使用に関する。さらに本発明は、癌治療におけるミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物の使用に関する。
【００４４】
本発明はさらに、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を、癌疾患であると判定された対象に、癌転移抑制に有効な量で投与することを含む癌転移抑制方法に関する。また本発明は、ミルタザピン若しくはその薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を、癌疾患であると判定された対象に、癌転移抑制に有効な量で投与することを含む癌治療方法に関する。
【００４５】
本発明は、いずれの癌疾患にも適用できるが、好ましくは高浸潤性あるいは高転移性の癌、さらに好ましくは口腔扁平上皮癌などの頭頚部扁平上皮癌や、悪性黒色腫に適用される。より好ましくは、癌細胞において、対応する正常細胞と比較して、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現の低下、好ましくはＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、βカテニンの発現の低下、さらに好ましくはＬｉｎ７Ｃの発現の低下が認められる癌細胞を含む癌に適用される。癌細胞における各種タンパク質発現は、対象に由来する癌細胞試料を用いて、公知の遺伝子発現検出方法やタンパク質発現検出方法により測定することができる。癌細胞試料として、生検などで得られた組織試料を好ましく使用することができる。
【００４６】
本発明はまた、対象に由来する癌細胞試料を用いてミルタザピンに対する感受性を評価し、該癌細胞試料中にミルタザピンに対する感受性を有する癌細胞が含まれると判定された対象を選択して適用することができる。「ミルタザピンに対する感受性を有する癌細胞」とは、ミルタザピン処理により、非処理のときと比較して、遺伝子発現、機能、形態などの変化が観察される癌細胞をいう。例えば、ミルタザピン処理により、非処理のときと比較して、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強する癌細胞を、ミルタザピンに対する感受性を有する癌細胞として挙げることができる。具体的には、本発明を適用する前に、対象由来の癌細胞試料を用いてミルタザピンで処理し、ミルタザピンで処理しないときと比較して、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現が増強すると判定された対象を選択し、本発明を適用することが好ましい。Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質として、Ｌｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンを、好ましくはＬｉｎ７ＣおよびＣＡＳＫを例示できる。ミルタザピン処理により癌細胞試料でこれらタンパク質のうちいずれか１以上の発現が増強した場合に、該癌細胞試料はミルタザピン対する感受性を有する癌細胞を含むと判定できる。Ｌｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンを含め、Ｌｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質はよく知られており、それらタンパク質の発現増強の測定は、自体公知の遺伝子検出法またはタンパク質検出法により実施できる。遺伝子検出法として具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を例示できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの遺伝子発現検出法を例示できる。タンパク質検出法として具体的には、ウエスタンブロッティングを例示できる。
【００４７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４８】
実施例ではヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ、高浸潤性ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ−Ｈ１、およびヒト培養悪性黒色腫細胞株Ｇ−３６１を使用した。Ｇ−３６１細胞は浸潤性を有することが知られている。ＳＡＳ細胞およびＳＡＳ−Ｈ１細胞は、１０％  牛胎児血清（以下、ＦＢＳと略称する）および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）中で維持した。Ｇ−３６１細胞は、１０％牛胎児血清および抗生物質を補充したマッコイ５Ａ改変培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）中で生育させた。すべての細胞株は５％の二酸化炭素と９５％の空気の存在下で湿度が維持された雰囲気の条件下で、３７℃にて培養した。
【００４９】
実施例では、ヤギ抗ヒトＬｉｎ７Ｃポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ヤギ抗ヒトＨＴＲ２Ｃポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトＣＡＳＫポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）ポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）、およびマウス抗ヒトβ−アクチンモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製）を使用した。ＨＴＲ２Ｃアゴニストであるアポモルフィン、並びにＨＴＲ２Ｃアンタゴニストであるミルタザピン、カフェイン、リスペリドン、およびクエチアピンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。
【実施例１】
【００５０】
癌の浸潤や転移の抑制に働く細胞接着因子βカテニンを含むＬｉｎ７Ｃ−ＣＡＳＫ−βカテニン  ネットワークに関与するタンパク質の発現を調節する作用を有する化合物の探索を行った。化合物の探索は、該ネットワークの上流に位置する遺伝子であるＨＴＲ２Ｃ遺伝子（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２Ｃ  ｇｅｎｅ）の作用薬剤を対象に実施した。
【００５１】
具体的には、Ｌｉｎ７Ｃに着目した標的遺伝子をＩＰＡソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）の細胞経路マップ上に重ね合わせた。また、ＩＰＡを使用して、Ｌｉｎ７Ｃおよび／またはそれと相互作用する分子を調節し得る候補化合物を同定を行った。
【００５２】
ＩＰＡソフトウエアにより、ＨＴＲ２ＣがＬｉｎ−７Ｃと結合できることが明らかに示され、さらに、アポモルフィン、カフェイン、リスペリドン、クエチアピン、およびミルタザピンが、ＨＴＲ２Ｃのリガンドとしての特性を示した。このことから、これらはＬｉｎ−７Ｃ発現に影響を及ぼす可能性があることが示唆された。
【００５３】
そこで、被検薬剤としては、ミルタザピン、アポモルフィン、カフェイン、リスペリドン、およびクエチアピン、並びにブスピロンの６種を選択し、また、コントロールとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。
【００５４】
具体的には、ＳＡＳ−Ｈ１細胞を、３７℃に維持したインキュベーター内で、５％の二酸化炭素と９５％の空気で湿度が維持された雰囲気の条件下で、１００×２０ｍｍ  ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、１０％  牛胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と５０単位／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて培養した。細胞が８０％  コンフルエントになった状態で被検薬剤をそれぞれ１０μＭの濃度で作用させ、２４時間後に細胞を回収した。回収した細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンの発現を、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで測定した。ｍＲＮＡレベルの発現の測定に際し、トータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡはメーカーのプロトコルに従って、回収した細胞からトリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使って抽出した。トータルＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写には、レディ−トゥ−ゴー  ユー−プライム  ファースト−ストランド  ビーズ（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｅａｄｓ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ；北海道システムサイエンス社製）を用いた。タンパク質の抽出は、培養細胞を７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含む溶解バッファーによって処理し、超音波処理を氷上で３×１０ｓパルスで行うことにより溶解した。サンプルは２０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、タンパク質を含んでいる上清を採取した。タンパク質濃度はプロテイン  アッセイ  キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）によって測定し、溶解バッファーによって１ｍｇ／ｍｌに調節した。タンパク質サンプルは３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８．５に調整した。
【００５５】
ｍＲＮＡの発現レベルを測定するための定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は以下の方法で行った。Ｌｉｎ７Ｃ遺伝子のｍＲＮＡ発現を確認するためのプライマーとして、５’−ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣ−３’（配列番号２）を設計した。ＣＡＳＫ遺伝子のプライマーは、５’−ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  Ａ−３’（配列番号４）を、βカテニンのプライマーは、５’−ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号５）及び５’−  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  Ｃ−３’（配列番号６）を設計した。内在性コントロールとして用いたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のプライマーは、５’−ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  Ｃ−３’（配列番号７）及び５’−ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号８）を設計した。ＲＴ−ＰＣＲの試薬は、ライトサイクラー（登録商標）  ファストスタート  ＤＮＡ  マスター  ＳＹＢＲ  グリーンＩ  キット（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて行った。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用したＰＣＲ反応は、通常の方法に従い１０μｌのＦｉｒｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  ｍｉｘ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μ１のプライマーを含む最終反応容量２０μｌの混合液を使用した。反応条件として、初期変性は９５℃３分、増幅のためのサイクル数は４５回で、変性９５℃３０秒、アニーリング６３℃３０秒、伸長反応７２℃３０秒とした。目的遺伝子のｍＲＮＡ量は、コントロールとして用いたＧＡＰＤＨの発現量に対する相対値として表現した。
【００５６】
Ｌｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンのタンパク質レベルでの測定はウエスタンブロッティング法を用いた。タンパク質抽出溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ転写した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄後、ブロッキングワン（ナカライテスク社製）でブロッキングを３０分行い、Ｌｉｎ７Ｃ抗体、ＣＡＳＫ抗体、βカテニン抗体を４℃にて１６時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで洗浄後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合２次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を室温で１時間インキュベーションし、スーパー  シグナル  ウエスト  ピコ  ケミルミネッセント  サブストレート（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で発光し可視化させた。シグナル強度は、ＣＳ  アナライザー（ＣＳ  ａｎａｌｙｚｅｒ；ＡＴＴＯ社製）にて定量化し、コントロールとして測定したＧＡＰＤＨのタンパク質レベルとの相対値で表現した。
【００５７】
図１−Ａおよび図１−Ｂに結果を示す。６種の被検薬剤の中で、ミルタザピンが最も効果的にＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンのｍＲＮＡ発現を上昇させた（図１−Ａ）。ミルタザピン処理によるＳＡＳ−Ｈ１細胞でのＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンの発現増加は、ウエスタンブロッティングによりタンパク質レベルでも証明された（図１−Ｂ）。
【００５８】
また、図２に示すように、ミルタザピンは１０μＭで最も効果的にＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）のｍＲＮＡ発現を増強した。
【実施例２】
【００５９】
実施例１で、被検薬剤６種の中で、ミルタザピンが最も効果的にＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニンのｍＲＮＡ発現を上昇させること、並びに、ミルタザピンは１０μＭで最も効果的にＬｉｎ７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）のｍＲＮＡ発現を増強することを明らかにした。
【００６０】
そこで、高転移性癌細胞株であるＳＡＳ−Ｈ１細胞におけるＬｉｎ７Ｃの発現への、ミルタザピン、アポモルフィン、カフェイン、リスペリドン、およびクエチアピンの効果を、各薬剤のさまざまな濃度で検討した。ミルタザピンについては、転移性の低い癌細胞株であるＳＡＳ細胞におけるＬｉｎ−７Ｃの発現への効果も検討した。
【００６１】
細胞は、各薬剤で処理し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。コントロール細胞は薬剤の代わりにＤＭＳＯで処理した。Ｌｉｎ７Ｃの発現は、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によるｍＲＮＡ発現レベルの測定、および、イムノブロッティングによるタンパク質レベルの測定により行った。
【００６２】
まず、上記のように処理した細胞を使用してｍＲＮＡ発現レベルの測定を行った。処理後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）で２回洗浄し、トータルＲＮＡの抽出を行った。トータルＲＮＡの抽出は、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使って製造者仕様書に従って行った。相補的ＤＮＡは、５μｇのトータルＲＮＡから、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）と、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（北海道システムサイエンス社製）を用い、製造者仕様書に従って作製した。Ｌｉｎ７Ｃ、ＨＴＲ２Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）のｍＲＮＡ発現レベルの評価は、ｑＲＴ−ＰＣＲを行って実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、ユニバーサルプローブライブラリー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）により設計されたプライマーとプローブを使用して行った。データの値はコントロール細胞について標準化した。Ｌｉｎ７Ｃ  ｍＲＮＡの増幅用に、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、およびユニバーサルプローブ＃７７を使用した。ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの増幅用に、配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマー、およびユニバーサルプローブ＃２７を使用した。ＣＡＳＫ  ｍＲＮＡの増幅用に、配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマー、およびユニバーサルプローブ＃２を使用した。βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）  ｍＲＮＡの増幅用に、配列番号１７に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１８に記載の塩基配列からなるプライマー、およびユニバーサルプローブ＃１７を使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲの全工程は、ライトサイクラー（登録商標）  ４８０  ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して実施した。増幅は、９５℃での１０分間の予備インキュベーションにより開始し、次いで、鋳型変性のために９５℃１０秒およびプライマーのアニーリング／伸長のために５５℃３０秒を４５サイクル行い、そして冷却工程を４０℃で３０秒行った。転写量は、各標準曲線から推定し、対応する試料で測定したグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の転写物に対して標準化した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの増幅は、配列番号１９に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２０に記載の塩基配列からなるプライマー、およびユニバーサルプローブ＃６０を使用した。
【００６３】
次に、上記のように処理した細胞を使用して、イムノブロッティングを行った。まず、細胞を冷却ＰＢＳで２回洗浄して遠心処理を行った。細胞沈査を、プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社製）と共に、溶解緩衝液（７Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、４％（重量／容量）ＣＨＡＰＳ、および１０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４））中で４℃にて３０分間インキュベーションした。タンパク質濃度はバイオラッド  プロテイン  アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用して測定した。タンパク質抽出物（２０μｇ）はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により４−１２％のゲル中で分離し、ニトロセルロース  メンブレンに転写し、ブロッキング  ワン（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ；ナカライテスク社製）中で室温にて１時間ブロッキングした。当該メンブレンは、第１抗体で室温にて４時間インキュベーションした。メンブレンは０．１％  ツイーン２０を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、第２抗体と共に室温で１時間インキュベーションして、ホースラディッシュ  パーオキシダーゼを結合させた、抗ウサギＩｇＧ、抗ヤギＩｇＧ、または抗マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と結合させた。タンパク質の検出は、スーパーシグナル  ケミルミネッセント  サブストレート（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）により行った。最後に、イムノブロッティング解析の結果を、上記メンブレンを、冷却したＣＣＤカメラシステム（ＡＴＴＯ社製）に曝すことにより可視化した。シグナル強度は、ＣＳアナライザー  ソフトウエア  バージョン３．０（ＡＴＴＯ社製）を使用して定量化した。
【００６４】
検討した薬剤のうち、ミルタザピン（１０μＭ）で処理したＳＡＳ−Ｈ１細胞ではＬｉｎ７Ｃ  ｍＲＮＡレベルが有意に上昇（約４倍増加）し、一方、ＳＡＳ細胞ではミルタザピンによる明らかな影響は認められなかった（図３のパネルＡおよびパネルＢ）。これに対し、アポモルフィン、カフェイン、およびクエチアピンで処理したＳＡＳ−Ｈ１細胞では、Ｌｉｎ７Ｃ  ｍＲＮＡ発現に関する感受性の著しい増加は、ミルタザピン処理細胞と比較して認められなかった（図３のパネルＣ−Ｆ）。
【００６５】
また、Ｌｉｎ−７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の発現レベルは、ＳＡＳ細胞ではミルタザピン処理の有無に拘らず変化がなかった（図４のパネルＡ）。これに対し、ＳＡＳ−Ｈ１細胞では、ミルタザピン処理により未処理のものと比較して、これら３つの遺伝子すべての高発現が認められた（図４のパネルＢ）。ミルタザピン処理したＧ−３６１細胞では、ミルタザピン処理により、ＣＡＳＫ発現は意外にも変化しなかったが、Ｌｉｎ−７ＣおよびＣＡＳＫの発現上昇が検出された（図４のパネルＣ）。
【００６６】
ミルタザピンは検討した細胞株のいずれにおいてもＨＴＲ２Ｃタンパク質発現に影響を及ぼさなかった（図５のパネルＢおよび図６）。しかしながら、ＨＴＲ２Ｃの下流の分子であるＬｉｎ−７Ｃ、ＣＡＳＫ、およびβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の有意な発現上昇が、ミルタザピン（１０μＭ）で２４時間処理した高転移性癌細胞（ＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞）でのみ検出された。これに対し、ＳＡＳ細胞ではＬｉｎ−７Ｃ発現上昇は検出されなかった（図５のパネルＡおよびパネルＢ、並びに図６）。
【実施例３】
【００６７】
癌細胞の増殖、浸潤能、および遊走能へのミルタザピンの作用を、高浸潤性癌細胞株であるＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞、並びに浸潤性の低い癌細胞株であるＳＡＳ細胞を用いて検証した。
【００６８】
［細胞増殖アッセイ］
細胞を６ウエルプレートに、生細胞１×１０４／ウエルの密度で播種した。試験は７日間行い、２４時間ごとに細胞を計数した。細胞の計数は、細胞をトリプシン処理した後、ヘモサイトメーターを使用して行った。計数はトリプリケートサンプルについて行った。そして、ミルタザピン処理細胞とコントロール細胞との間で、細胞数の比較を行った。
【００６９】
［浸潤アッセイ］
総数２×１０５個の各細胞株（ＳＡＳ、ＳＡＳ−Ｈ１、およびＧ−３６１）を、ミルタザピン（１０μＭ）または溶媒で２４時間処理した。次いで、細胞を無血清培地に再懸濁し、トランスウエル  アパラタス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）中に設置した孔サイズ３μｍのポリエチレンテレフタレート  メンブレンインサート（製品名：ＢＤセルカルチャーインサート；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に播種した。下部チャンバーに、ミルタザピン（１０μＭ）または溶媒を含む２ｍｌの無血清培地を化学遊走物質として添加した。細胞を３７℃で７２時間インキュベーション後、該インサートをＰＢＳで洗浄し、該インサートの上部表面上の細胞を綿棒で除去した。該メンブレンの下部表面に接着している細胞をクリスタルバイオレット／メタノールで染色し、該孔を通過した細胞数を、光学顕微鏡１００倍の視野にて５か所のランダムな視野で計数した。
【００７０】
［遊走アッセイ］
ミルタザピンの抗遊走能を検討するために、細胞（ＳＡＳ、ＳＡＳ−Ｈ１、およびＧ−３６１）を１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭを加えた６ウエルプレートに播種し、コンフルエントな単層が形成されるまでインキュベーションした。マイクロピペットチップを使用して、各ウエルの中央に１つの傷口（ｗｏｕｎｄ）を作った。ミルタザピンで処理後に、培地を無血清培地に交換し、５％  二酸化炭素の雰囲気下で３７℃にてインキュベーションした。結果は、細胞のない傷口の面積をレナラフ  ２２０ｂ  ソフトウエア（Ｌｅｎａｒａｆ  ２２０ｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｊａｐａｎ社製）を使用して測定することにより可視化した。３つの別箇のチャンバーから得られたデータより平均値を算出した。
【００７１】
ミルタザピンの細胞増殖への効果を検討するために、細胞の生育を７日間観察したところ、検討したすべての細胞株において、ミルタザピンで処理した細胞と処理しなかった細胞の差異は何ら認められなかった（図７）。
【００７２】
次に、細胞の浸潤挙動へのミルタザピンの効果を検討したところ、ミルタザピンを含む培地中でインキュベーションしたＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞は、処理しなかった細胞と比較して、いずれも有意（Ｐ＜０．０５）な浸潤性の低減を示した（図８のパネルＡおよびパネルＢ）。
【００７３】
さらに、細胞の遊走能へのミルタザピンの効果を検討したところ、ミルタザピンを含む培地中でインキュベーションしたＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞は、処理しなかった細胞と比較して、いずれも有意（Ｐ＜０．０５）な遊走能の低減を示した（図８のパネルＣおよびパネルＤ）。
【００７４】
これら結果は、ミルタザピンが癌細胞の転移能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで有意に防止できることを示唆する。
【実施例４】
【００７５】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるミルタザピンの癌転移抑制効果を検討した。具体的には、ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ、高浸潤性ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ−Ｈ１、並びに浸潤性を有するヒト培養悪性黒色腫細胞株Ｇ−３６１を用いた異種移植モデルを作製し、検討を行った。
【００７６】
細胞２×１０５個をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮｃｒｊ−ｎｕ／ｎｕ  ｍｉｃｅ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ社）の舌部分に直接的に注入し、ランダムに非投与群（ｎ＝５）、コントロール群（ｎ＝５）、およびミルタザピン投与群（ｎ＝５）の３群に分けた。ミルタザピンは１％  Ｔｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ社製）水溶液中に懸濁し、１０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間に亘って毎日１回経口投与した。コントロール群には、全実験期間を通じて溶媒を投与した。実験動物の管理と使用は機関のガイドラインに従って実施した。
【００７７】
移植４週間後に、舌、顎下腺、肺、肝臓、および腎臓の各臓器をマウスから採取した。体重は４週間の処置の期間を通して測定した。各ゲノムＤＮＡを、それぞれのホモジネートから、ウィザード  ＳＶ  ゲノミック  ＤＮＡ  ピューリフィケーション  システム  キット（Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて直ちに抽出した。各組織における腫瘍細胞由来ＤＮＡを測定するために、２０ｎｇのＤＮＡを対象としてｑＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＡｌｕ配列の検出を行った。Ａｌｕ  ＰＣＲシグナル量（およびそれによるヒト腫瘍細胞転移量）を増幅されたゲノムＤＮＡ量（およびそれによるマウス組織量）と関連付けるため、マウスＧＡＰＤＨ遺伝子を内部コントロールとして使用した。
【００７８】
ヒト特異的反復配列Ａｌｕの解析に用いたプライマーは、配列番号９に記載のプライマーおよび配列番号１０に記載のプライマーである。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ（登録商標）  グリーン  ｑＲＴ−ＰＣＲ  マスター  ミックス  キットを使用して製造者の手順書（Ｒｏｃｈｅ社）に従って実施した。ＰＣＲの反応条件として、９５℃で３分のポリメラーゼ活性、次いで９５℃３０秒、６３℃３０秒、および７２℃３０秒のサイクルを４０回行った。各アッセイは、陰性コントロール（ＲＮＡ分解酵素を含まない水）、陽性コントロール（ヒトゲノムＤＮＡ）、および実験サンプルについてトリプリケートで行った。マウスＤＮＡの定量測定は、マウスＧＡＰＤＨ  ＤＮＡ配列を増幅することで実施した。ＧＡＰＤＨ  ＤＮＡ配列の増幅は、マウス  ＧＡＰＤＨプライマー（配列番号１１および配列番号１２）を使用して、ＡＬｕのためのＰＣＲ条件と同じ条件で行った。各サンプルのＣｔ値を、ライトサイクラー（登録商標）  ４８０  ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して、サンプル中のＰＣＲ産物量の定量尺度（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）として記録した。Ａｌｕシグナルは、マウスＧＡＰＤＨの相対量に対して標準化し、そしてΔＣｔ＝（ＣｔＡｌｕ−ＣｔＧＡＰＤＨ）として表示した。マウスの総ゲノムＤＮＡ量に相対的なＡｌｕシグナルの変化はΔΔＣｔ＝ΔＣｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ΔＣｔｃｏｎｔｒｏｌとして表示した。そして、転移の相対的変化を２−ΔΔＣｔとして算出した。
【００７９】
統計解析はＳＰＳＳ  １７．０  ソフトウエア（ＳＰＳＳ社製）またはマイクロソフト  エクセル（マイクロソフト社製）を使用して実施した。単一群のデータはマン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）を使用して評価した。各組織の転移レベルの統計的有意差は、一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）と多重比較のための対比事後テューキー−クレーマー法（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）とを使用して評価した。両側Ｐ値が＜０．０５であるとき、有意差があるとみなした。データは、平均±標準誤差で表示した。
【００８０】
可視転移病巣は遠隔臓器で観察されなかったが、Ａｌｕ  ＰＣＲの結果から、ＳＡＳ−Ｈ１細胞を移植したマウスおよびＧ−３６１細胞を移植したマウスでは、顎下腺、肺、肝臓、および腎臓に、ＳＡＳ細胞を注入したマウスの組織と比較して、有意（Ｐ＜０．０５）に多くのヒトゲノムＤＮＡが含まれていることが示された（図９）。
【００８１】
この結果から、ミルタザピンがｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌細胞転移を阻害する作用を有することが明らかになった。実施例２に示したように、ＳＡＳ−Ｈ１細胞およびＧ−３６１細胞ではＬｉｎ−７Ｃが低発現であること（図５のパネルＡ）、およびミルタザピン処理によりＬｉｎ−７Ｃの発現が増加したこと（図５のパネルＢ）から、ミルタザピンの癌細胞転移抑制作用はＬｉｎ−７Ｃの発現増加を介すると考えることができる。したがって、ミルタザピンは特にＬｉｎ−７Ｃの低発現が認められる癌細胞の転移の抑制に有用であると考える。
【００８２】
また、ミルタザピン投与による副作用はほとんど認められず、ミルタザピン投与群のマウスの平均体重は、投与後のいずれの時においても、コントロール群のものと比較して低下することはなかった（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明に係る癌転移抑制剤、癌治療用組成物、および併用投与用癌治療剤は、薬剤の服用という非常に簡便な方法のみで癌の転移および浸潤を抑制する効果を示す。このように、本発明は、癌に対する新規治療薬として極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１：ヒトＬｉｎ７Ｃ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２：ヒトＬｉｎ７Ｃ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３：ヒトＣＡＳＫ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ヒトＣＡＳＫ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：ヒトβカテニン遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ヒトβカテニン遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：ヒトＡｌｕ配列の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ヒトＡｌｕ配列の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ヒトＨＴＲ２Ｃ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ヒトＨＴＲ２Ｃ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ヒトＣＡＳＫ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１６：ヒトＣＡＳＫ遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１７：ヒトβカテニン遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：ヒトβカテニン遺伝子の増幅用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：マウスＧＡＰＤＨ遺伝子の解析用プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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