(57)【要約】【課題】微細流動装置及びそれを採用した標的細胞濃縮方法を提供する。【解決手段】回転駆動部に装着され、回転中心を中心にして回転するものであって、遠心力によって流体の流れを誘発する微細流動装置に係り、該微細流動装置の試料チャンバ内には、その上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、ボトルネック部と、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、それを介して、微細流動装置が正逆回動される混合過程で、試料内の標的細胞と微細粒子とが通過し、該微細流動装置が停止したとき、それを介した半径方向の逆方向への試料の流れを部分的に制限するように形成される。【選択図】図１Ｂ
2014103966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転駆動部に装着され、回転中心を中心に回転するものであって、遠心力によって、流体の流れを誘発する微小流体装置であって、
試料の遠心分離が起きる試料チャンバを含み、
前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、
前記微小流体装置が停止したとき、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介した半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される微小流体装置。
【請求項２】
前記隔壁は、前記半径方向に、前記試料チャンバの内側から外側に行くほど、前記ボトルネック部がだんだんと細くなる形状であることを特徴とする請求項１に記載の微小流体装置。
【請求項３】
前記隔壁は、前記試料チャンバの全体幅を横切って形成されたことを特徴とする請求項２に記載の微小流体装置。
【請求項４】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の幅の一部に形成されたことを特徴とする請求項２に記載の微小流体装置。
【請求項５】
前記試料チャンバの円周方向に、複数の前記隔壁が反復配置され、前記複数の隔壁間に開口が形成されたことを特徴とする請求項２に記載の微小流体装置。
【請求項６】
前記開口は、前記半径方向に、内側から外側に行くほど、だんだんと細くなることを特徴とする請求項５に記載の微小流体装置。
【請求項７】
遠心力によって、内部に収容された流体の流れを誘発する微小流体装置を利用した標的細胞濃縮方法であって、
前記微小流体装置の試料チャンバ内で、標的細胞を含む試料と、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に結合する微小粒子と、を混合し、前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、
流体供給チャネルを介して、前記標的物質を含む流体を、前記標的物質より密度が小さく、前記流体より密度が大きい密度勾配物質が収容された分離チャンバに移送させる段階と、
前記微小流体装置を回転させ、遠心力によって、前記分離チャンバ内で密度差によって、前記標的物質を前記流体から分離、濃縮する段階と、を含み、
前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、
前記微小流体装置が停止したとき、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介した半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される標的細胞濃縮方法。
【請求項８】
前記濃縮する段階は、
遠心分離によって、前記分離チャンバ内で、前記密度勾配物質を間に介在させ、前記標的物質と前記流体とを分離する段階と、
回収チャネルを介して、前記標的物質を回収チャンバに回収する段階と、を含むことを特徴とする請求項７に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項９】
前記標的物質を形成する段階は、
前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する前に、遠心力によって、前記試料チャンバ内で、前記試料を、前記標的細胞を含む標的層と、上部の上層物質層とを含む複数層に遠心分離する段階と、
第２チャネルを介して、前記上層物質層を、前記廃棄物チャンバに排出する段階と、
第１チャネルを介して、前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する段階と、
前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、を含むことを特徴とする請求項７に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１０】
前記排出する段階を遂行した後、前記第２チャネルを閉鎖する段階をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１１】
前記標的物質を形成する段階は、
前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する段階を遂行した後、前記試料チャンバに、前記微小粒子をバッファと共に供給する段階と、
遠心分離を介して、前記バッファを、前記標的層の上層部に位置させる段階と、
前記第２チャネルを開放し、前記第２チャネルを介して、前記バッファを前記廃棄物チャンバに排出する段階と、
前記第２チャネルを閉鎖する段階と、をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１２】
前記標的物質を形成する段階は、
前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する前に、前記試料チャンバに溶解液を供給して特定細胞を溶解する段階をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１３】
前記標的細胞は、血中循環腫瘍細胞、癌幹細胞または癌細胞であることを特徴とする請求項７に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１４】
遠心力によって、内部に収容された流体の流れを誘発する微小流体装置を利用した標的細胞濃縮方法であって、
前記微小流体装置の試料チャンバ内で標的細胞を含む試料と、前記標的細胞より密度が大きい第１密度勾配物質とを収容する段階と、
遠心分離を介して、前記標的細胞を含む標的層を、前記第１密度勾配物質層上に位置させる段階と、
前記標的層を、前記試料チャンバから反応チャンバに移送させる段階と、
前記反応チャンバ内で、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に結合する微小粒子を前記標的層と混合し、前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、
流体供給チャネルを介して、前記標的物質を含む流体を、前記標的物質より密度が小さく、前記流体より密度が大きい密度勾配物質が収容された分離チャンバに移送させる段階と、
前記微小流体装置を回転させ、遠心力によって、前記分離チャンバ内で密度差によって、前記標的物質を前記流体から分離、濃縮する段階と、を含み、
前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、
前記微小流体装置が停止したとき、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介した半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される標的細胞濃縮方法。
【請求項１５】
前記標的細胞は、血中循環腫瘍細胞、癌幹細胞または癌細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の標的細胞濃縮方法。
【請求項１６】
回転駆動部に装着され、回転中心を中心にして回転するものであって、遠心力によって流体の流れを誘発する微小流体装置であって、
試料が収容される試料チャンバを含み、前記試料内の標的細胞に微小粒子が付着した標的物質を含む流体を供給する試料供給部と、
前記標的物質より密度が低い密度勾配物質を収容し、前記試料供給部から前記流体が供給され、密度差によって、前記流体から前記標的物質を分離する密度差分離部と、
前記試料供給部と前記密度差分離部とを連結し、前記流体の移動通路を形成する流体供給チャネルと、
前記流体供給チャネルに設けられ、前記流体の移動を選択的に許容する流体供給弁と、を含み、
前記密度差分離部は、前記試料供給部から前記流体が供給され、前記標的物質は、密度差によって、前記流体から分離される微小流体装置。
【請求項１７】
前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、
前記微小流体装置が停止したとき、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介した半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限されることを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【請求項１８】
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、約０．５ｍｍ〜２０．０ｍｍであることを特徴とする請求項１７に記載の微小流体装置。
【請求項１９】
前記隔壁は、前記半径方向に、前記試料チャンバの内側から外側に行くほど、前記ボトルネック部が徐々に細くなる形状であることを特徴とする請求項１７に記載の微小流体装置。
【請求項２０】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の全体幅を横切って形成されたことを特徴とする請求項１９に記載の微小流体装置。
【請求項２１】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の幅の一部に形成されたことを特徴とする請求項１９に記載の微小流体装置。
【請求項２２】
前記試料チャンバの円周方向に、複数の前記隔壁が反復配置され、前記複数の隔壁の間に開口が形成されたことを特徴とする請求項１７に記載の微小流体装置。
【請求項２３】
前記開口は、前記半径方向に内側から外側に行くほど徐々に細くなることを特徴とする請求項２２に記載の微小流体装置。
【請求項２４】
前記密度差分離部は、
前記密度差分離部は、前記流体供給チャネルによって、前記試料チャンバと連結され、前記密度勾配物質が収容された分離チャンバと、
回収チャネルによって、前記分離チャンバと連結され、前記分離チャンバから、前記標的物質を回収する回収チャンバと、
前記回収チャネルに設けられ、流体の流れを制御する回収弁と、を含むことを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【請求項２５】
廃棄物チャンバと、
前記分離チャンバから、前記標的物質の上層部に位置する流体が排出されるように、前記回収チャネルに比べて、前記半径方向に内側で、前記分離チャンバと前記廃棄物チャンバとを連結する排出チャネルと、
前記排出チャネルに設けられ、流体の流れを制御する排出弁と、を含むことを特徴とする請求項２４に記載の微小流体装置。
【請求項２６】
前記試料供給部は、前記微小粒子を収容する微小粒子チャンバと、前記試料チャンバと前記微小粒子チャンバとを連結する第１チャネルと、前記第１チャネルに設けられ、前記微小粒子の前記試料チャンバへの移動を選択的に許容する第１弁と、を含み、
前記密度差分離部は、前記試料チャンバと連結されることを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【請求項２７】
前記試料チャンバ内で、前記試料は、遠心力によって複数層に分離され、
前記複数層は、前記標的細胞を含む標的層と、前記標的層の上部に位置する上層物質層と、を含み、
前記微小流体装置は、
廃棄物チャンバと、
前記試料チャンバと前記廃棄物チャンバとを連結する第２チャネルと、
前記第２チャネルを選択的に開放する第２弁と、を含み、
前記上層物質層を、前記第２チャネルを介して、前記廃棄物チャンバに排出することを特徴とする請求項２６に記載の微小流体装置。
【請求項２８】
前記第２チャネルには、前記第２弁より、前記廃棄物チャンバにさらに近い位置に設けられ、前記上層物質層が排出された後、前記第２チャネルを閉鎖する第３弁がさらに設けられたことを特徴とする請求項２７に記載の微小流体装置。
【請求項２９】
前記第２チャネルには、前記第２チャネルを順に閉鎖、開放する第４弁がさらに設けられたことを特徴とする請求項２８に記載の微小流体装置。
【請求項３０】
前記試料チャンバに、前記試料内の特定細胞を溶解する溶解液を供給する溶解液チャンバをさらに具備することを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【請求項３１】
前記試料チャンバには、前記試料と第１密度勾配物質とが収容され、遠心力によって、前記標的細胞を含む標的層が、前記第１密度勾配物質の上部に位置し、
前記試料供給部は、前記試料チャンバから、前記標的層を含む流体を伝達され、前記微小粒子との混合によって、前記標的物質を形成する反応チャンバをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【請求項３２】
前記標的細胞は、血中循環腫瘍細胞、癌幹細胞または癌細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の微小流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料内の標的細胞を分離するための微小流体装置及び標的細胞濃縮方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍に起因する死亡は、大抵は、腫瘍が初めて発生した部位から他の組織及び器官への転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）することによって起こる。従って、癌患者の生存確率を高めるためには、腫瘍の転移を早期に発見することが非常に重要であり、腫瘍の早期発見及び腫瘍の成長をモニタリングすることが、癌患者への治療が成功するための重要な要素であると見られている。一般的に、癌は、組織病理学（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）によって診断される。そのような組織病理学を利用した診断技法は、生検標本から採取された組織試料を用いて腫瘍細胞を直接的に確認（観察）する診断方法である。しかし、生検標本を採取するために選択された組織には、腫瘍が含まれていない可能性があり、生検標本から採取された特定の部位についてのデータしか提供されないため、他の部位に腫瘍が転移していることを確認するには限界がある。したがって、腫瘍を診断またはモニタリングするにあたり、組織病理学を使用するには、多くの制限がある。
【０００３】
血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）は、最初に腫瘍が検出される前に、患者から発見され得ることが知られている。従って、ＣＴＣｓは、癌の早期診断及び予測において、重要な役割を果たす。また、癌は、概して血液を介して転移するため、ＣＴＣｓは、癌の転移を確認するためのマーカーになる。また、手術によって癌細胞が除去された後でさえ、ＣＴＣｓが発見される場合があり、その場合には、癌が再発する可能性が非常に高い。しかし、ＣＴＣｓの量は、血液内において非常に少なく（例えば、血液単位ｍＬ当たり数個のＣＴＣｓ）、かつ細胞自体が非常に壊れやすいため、ＣＴＣｓの数を正確に確認することは困難である。従って、患者の体内に存在するＣＴＣｓ、癌細胞または癌幹細胞を高感度に検出する診断方法が依然として必要である。また、正確な検出のために十分な量のＣＴＣｓを得るには、比較的多量の血液、例えば、２０ｍＬ程度までの血液を扱うことができる装置が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、ＣＴＣｓ、癌細胞または癌幹細胞を分離するために、例えば、赤血球、白血球／ＣＴＣｓ及び血清は、密度勾配により、手動で分離され得る。しかし、白血球／ＣＴＣｓ層は、非常に薄い層であって、密度勾配に基づいて、白血球／ＣＴＣｓ層を手動に分離することは容易ではなく、施術者の熟練度が分離の再現性に影響を及ぼすことになる。
【０００５】
本発明は、生体試料内の標的細胞を、自動化されたプロセスによって分離、濃縮するための微小流体装置及び標的細胞濃縮方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の代表的な応用分野である血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）の分離は、ＣＴＣｓが１ｍＬ当たり数個程度の低い濃度で存在するので、数ｍＬの血液を処理することができる微小流体装置が必要である。これまで、ディスク基盤の研究は、血漿を利用した臨床化学あるいは免疫分析を目的としていたので、数十あるいは数百μＬの血液を処理しても、その機能を遂行するのに問題がなかった。従って、本発明では、１ｍＬ以上２０ｍＬ以下の血液を扱う。
【０００７】
一側面による微小流体装置は、回転駆動部に装着され、回転中心を中心にして回転することにより、遠心力によって流体の流れを誘発する微小流体装置であって、試料の遠心分離が起きる試料チャンバと、を含み、前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、前記間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、前記間隔は、前記微小流体装置が停止したとき、半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される。
【０００８】
前記隔壁は、前記半径方向に、前記試料チャンバの内側から外側に行くほど、前記ボトルネック部がだんだんと細くなる形状であってもよい。
【０００９】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の全体幅を横切って形成されてもよい。
【００１０】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の幅の一部に形成されてもよい。
【００１１】
前記試料チャンバの円周方向に、複数の前記隔壁が反復配置され、前記複数の隔壁間に開口が形成されてもよい。
【００１２】
前記開口は、前記半径方向に、内側から外側に行くほど、だんだんと細くなる。
【００１３】
一側面による標的細胞濃縮方法は、遠心力によって、内部に収容された流体の流れを誘発する微小流体装置を利用した標的細胞濃縮方法であって、前記微小流体装置の試料チャンバ内で、標的細胞を含む試料と、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に結合する微小粒子と、を混合し、前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、流体供給チャネルを介して、前記標的物質を含む流体を、前記標的物質より密度が小さく、前記流体より密度が大きい密度勾配物質が収容された分離チャンバに移送させる段階と、前記微小流体装置を回転させ、遠心力によって、前記分離チャンバ内で密度差によって、前記標的物質を前記流体から分離、濃縮する段階と、を含み、前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、前記間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、前記間隔は、前記微小流体装置が停止したとき、半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される。
【００１４】
前記濃縮する段階は、遠心分離によって、前記分離チャンバ内で、前記密度勾配物質を間に介在させ、前記標的物質と前記流体とを分離する段階と、回収チャネルを介して、前記標的物質を回収チャンバに回収する段階を含んでもよい。
【００１５】
前記標的物質を形成する段階は、前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する前に、遠心力によって、前記試料チャンバ内で、前記試料を、前記標的細胞を含む標的層と、その上部の上層物質層とを含む複数層に遠心分離する段階と、第２チャネルを介して、前記上層物質層を、前記廃棄物チャンバに排出する段階と、第１チャネルを介して、前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する段階と、前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、を含んでもよい。前記方法は、前記排出する段階を遂行した後、前記第２チャネルを閉鎖する段階をさらに含んでもよい。前記標的物質を形成する段階は、前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する段階を遂行した後、前記試料チャンバに、前記微小粒子をバッファと共に供給する段階と、遠心分離を介して、前記バッファを、前記標的層の上層部に位置させる段階と、前記第２チャネルを開放し、前記第２チャネルを介して、前記バッファを前記廃棄物チャンバに排出する段階と、前記第２チャネルを閉鎖する段階と、をさらに含んでもよい。
【００１６】
前記標的物質を形成する段階は、前記微小粒子を前記試料チャンバに移送する前に、前記試料チャンバに溶解液を供給して特定細胞を溶解する段階をさらに含むことができる。
【００１７】
他の側面による標的細胞濃縮方法は、遠心力によって、内部に収容された流体の流れを誘発する微小流体装置を利用した標的細胞濃縮方法であって、前記微小流体装置の試料チャンバ内で標的細胞を含む試料と、前記標的細胞より密度が大きい第１密度勾配物質とを収容し、遠心分離を介して、前記標的細胞を含む標的層を、前記第１密度勾配物質層上に位置させる段階と、前記標的層を、前記試料チャンバから反応チャンバに移送させる段階と、前記反応チャンバ内で、前記標的細胞の表面マーカーに特異的に結合する微小粒子を前記標的層と混合し、前記標的細胞と前記微小粒子とが結合された標的物質を形成する段階と、流体供給チャネルを介して、前記標的物質を含む流体を、前記標的物質より密度が小さく、前記流体より密度が大きい密度勾配物質が収容された分離チャンバに移送させる段階と、前記微小流体装置を回転させ、遠心力によって、前記分離チャンバ内で密度差によって、前記標的物質を前記流体から分離、濃縮する段階と、を含み、前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、前記間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、前記間隔は、前記微小流体装置が停止したとき、半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される。
【００１８】
一側面による微小流体装置は、回転駆動部に装着されて回転中心を中心にして回転するものであって、遠心力によって流体の流れを誘発する微小流体装置であって、試料が収容される試料チャンバを含み、前記試料内の標的細胞に微小粒子が付着した標的物質を含む流体を供給する試料供給部と、前記標的物質より密度が低い密度勾配物質を収容し、前記試料供給部から前記流体が供給され、密度差によって、前記流体から前記標的物質を分離する密度差分離部と、前記試料供給部と前記密度差分離部とを連結し、前記流体の移動通路を形成する流体供給チャネルと、前記流体供給チャネルに設けられ、前記流体の移動を選択的に許容する流体供給弁と、を含み、前記密度差分離部は、前記試料供給部から前記流体が供給され、前記標的物質は、密度差によって、前記流体から分離される。
【００１９】
前記試料チャンバ内には、上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間にボトルネック部を形成し、流体の半径方向の流れを部分的に制限する隔壁が設けられ、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、毛細管現象を誘発する間隔より広く、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介して、前記微小流体装置が正逆回動される混合工程で、試料内の標的細胞と微小粒子とが通過し、前記微小流体装置が停止したとき、前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔を介した半径方向の逆方向への試料の流れが部分的に制限される。
【００２０】
前記ボトルネック部と、前記上部壁及び下部壁のうち少なくとも一つとの間隔は、約０．５ｍｍ〜２０．０ｍｍでもある。
【００２１】
前記隔壁は、前記半径方向に、前記試料チャンバの内側から外側に行くほど、前記ボトルネック部が徐々に細くなる形状でもある。
【００２２】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の全体幅を横切って形成される。
【００２３】
前記隔壁は、前記試料チャンバの円周方向の幅の一部に形成される。
【００２４】
前記試料チャンバの円周方向に、複数の前記隔壁が反復配置され、前記複数の隔壁の間に開口が形成される。
【００２５】
前記開口は、前記半径方向に内側から外側に行くほど徐々に細くもなる。
【００２６】
前記密度差分離部は、前記流体供給チャネルによって、前記試料チャンバと連結され、前記密度勾配物質が収容された分離チャンバと、回収チャネルによって、前記分離チャンバと連結され、前記分離チャンバから、前記標的物質を回収する回収チャンバと、前記回収チャネルに設けられ、流体の流れを制御する回収弁と、を含んでもよい。
【００２７】
前記微小流体装置は、廃棄物チャンバと、前記分離チャンバから、前記標的物質の上層部に位置する流体が排出されるように、前記回収チャネルに比べて、前記半径方向に内側で、前記分離チャンバと前記廃棄物チャンバとを連結する排出チャネルと、前記排出チャネルに設けられ、流体の流れを制御する排出弁と、を含んでもよい。
【００２８】
前記試料供給部は、前記微小粒子を収容する微小粒子チャンバと、前記試料チャンバと前記微小粒子チャンバとを連結する第１チャネルと、前記第１チャネルに設けられ、前記微小粒子の前記試料チャンバへの移動を選択的に許容する第１弁と、を含み、前記密度差分離部は、前記試料チャンバと連結されてもよい。
【００２９】
前記試料チャンバ内で、前記試料は、遠心力によって複数層に分離され、前記複数層は、前記標的細胞を含む標的層と、前記標的層の上部に位置する上層物質層と、を含み、前記微小流体装置は、廃棄物チャンバと、前記試料チャンバと前記廃棄物チャンバとを連結する第２チャネルと、前記第２チャネルを選択的に開放する第２弁と、を含み、前記上層物質層を、前記第２チャネルを介して、前記廃棄物チャンバに排出することができる。
【００３０】
前記第２チャネルには、前記第２弁より、前記廃棄物チャンバにさらに近い位置に設けられ、前記上層物質層が排出された後、前記第２チャネルを閉鎖する第３弁がさらに設けられる。
【００３１】
前記第２チャネルには、前記第２チャネルを順に閉鎖、開放する第４弁がさらに設けられる。
【００３２】
前記微小流体装置は、前記試料チャンバに、前記試料内の特定細胞を溶解する溶解液を供給する溶解液チャンバをさらに具備することができる。
【００３３】
前記試料チャンバには、前記試料と第１密度勾配物質とが収容され、遠心力によって、前記標的細胞を含む標的層が、前記第１密度勾配物質の上部に位置し、前記試料供給部は、前記試料チャンバから、前記標的層を含む流体を伝達され、前記微小粒子との混合によって、前記標的物質を形成する反応チャンバをさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】第１実施形態に係る細胞濃縮システムの概略構成図である。
【図１Ｂ】第１実施形態に係る、上板が除去された状態の微小流体装置の斜視図である。
【図１Ｃ】廃棄物チャンバをさらに具備する図１Ｂに図示された微小流体装置の斜視図である。
【図２Ａ】第１実施形態に係るノーマルクローズ弁の断面図である。
【図２Ｂ】第１実施形態に係るノーマルクローズ弁の断面図である。
【図３】第２実施形態に係る、粒子チャンバを具備する微小流体装置の平面図である。
【図４】第３実施形態に係る、廃棄物チャンバを具備する微小流体装置の平面図である。
【図５】第４実施形態に係る、ノーマルオープン弁を有する第２チャネルを示す図面である。
【図６Ａ】第４実施形態に係るノーマルオープン弁の断面図である。
【図６Ｂ】第４実施形態に係るノーマルオープン弁の断面図である。
【図７】第５実施形態に係る、開閉弁を有する第２チャネルを示す図面である。
【図８Ａ】第５実施形態に係る開閉弁の断面図である。
【図８Ｂ】第５実施形態に係る開閉弁の断面図である。
【図８Ｃ】第５実施形態に係る開閉弁の断面図である。
【図９】第６実施形態に係る、溶解液チャンバを具備する微小流体装置の平面図である。
【図１０】第７実施形態に係る、反応チャンバを具備する微小流体装置の平面図である。
【図１１】試料チャンバ内に隔壁が配置された微小流体装置の平面図である。
【図１２】図１１のＡ−Ａ’線に沿って切り取られた断面図である。
【図１３】ボトルネック部分の一例を示す断面図である。
【図１４】他の実施形態に係る、試料チャンバ内に設けられる隔壁が配置された微小流体装置の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、添付された図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。それら実施形態は、発明を例示的に説明するためのものであり、発明の範囲がそれら実施形態に限定されるものではない。
【００３６】
図１Ａは、第１実施形態に係る細胞濃縮システムの概略構成図である。図１Ａには、回転駆動部５１０と、電磁波発生器５２０とが図示されている。回転駆動部５１０は、微小流体装置１を回転させることにより、試料の遠心分離と流体の移動とのための遠心力を提供する。回転駆動部５１０は、弁が電磁波発生器５２０と対面する所定位置で、微小流体装置１を停止させる。電磁波発生器５２０は、微小流体装置１の弁を作動させるためのものであり、例えば、レーザ光を照射する。電磁波発生器５２０は、微小流体装置１の半径方向に移動する。回転駆動部５１０は、図１には示されていないが、微小流体装置１の弁を、電磁波発生器５２０と整列させるために、微小流体装置１の角位置（ａｎｇｕｌａｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を制御するモータ駆動装置を含んでもよい。例えば、モータ駆動装置は、ステップモータを利用したものでもよく、直流モータを利用したものでもよい。参照符号５３０は、回転駆動部５１０及び電磁波発生器５２０を制御し、以下で説明する濃縮処理を制御する制御部である。
【００３７】
図１Ｂは、第１実施形態に係る、上板が除去された状態の微小流体装置１の斜視図である。微小流体装置１は、回転時において、遠心力によって、内部に収容された流体の流れを生じさせる。微小流体装置１には、流体を収容する空間と、流体の通路とを提供するための微小流体構造を有する。微小流体装置１は、例えば、図示するように回転可能なディスク形状でもよいが、これに限定されず、周知あるいは所望の他の形状であってもよい。
【００３８】
微小流体装置１は、成形が容易であり、生物学的に不活性な表面を持つ。例えば、アクリル、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むプラスチック素材により形成される。ただし、微小流体装置１は、これに限定されず、化学的、生物学的な安定性、光透過性、及び機械的加工性といった望ましい性質を有する一つ以上の様々な素材を含んでいてもよい。微小流体装置１は、複数のプレートを含んでいてもよい。プレートとプレートとが互いに当接する面に、チャンバやチャネルなどに相当する凹構造が形成され、それらのプレートは、微小流体装置１の内部に、流体を収容する空間と、流体の通路とを提供するように結合される。例えば、微小流体装置１は、上部プレートと下部プレートの２枚構造を有していてもよい。本実施形態においては、空間、流体を収容するチャンバ、流体の移動通路になる通路／チャネルなど、様々な微小流体構造要素が、上部プレート及び／または下部プレートに形成される。また、上部プレート、下部プレート、及びその間に微小流体構造を規定する仕切りプレートを含む３枚構造を有していてもよい。各プレートは、接着剤や両面接着テープを利用して結合されてもよいし、超音波溶着、レーザ溶着、当業者であれば自明な方法など、多様な方法により結合され得る。
【００３９】
微小流体装置１には、一つまたは複数の微小流体構造を有する。例えば、微小流体装置１は、数個の領域に分割され、領域ごとに、互いに独立して作動する微小流体構造、または、一つ又はそれ以上の他の微小流体構造と相互に連携して作動する微小流体構造が設けられる。例えば、本実施形態の微小流体装置１には、微小流体構造をそれぞれ有する２つの領域１０１，１０２が設けられる。２つの領域１０１，１０２に設けられた微小流体構造は、実質的に同一の構造を有するので、以下では、領域１０１に設けられた微小流体構造についてのみ詳細に説明する。
【００４０】
微小流体装置１は、回転駆動部５１０の上に配置、及び、取り付けるために、その回転中心ＲＣに装着部５００を有する。回転中心ＲＣを基準にして、半径方向、すなわち、遠心力の方向に試料供給部１００と密度差分離部２００とが配置される。試料供給部１００と密度差分離部２００は、流体供給チャネル１０によって互いに連結される。流体供給チャネル１０には、流体の流れを制御するための流体供給弁１５が設けられる。
【００４１】
試料供給部１００は、標的細胞・微小粒子複合体、すなわち、標的物質を含む流体を収容または蓄積するために設けられる。試料供給部１００内において、試料内に含まれた標的細胞が微小粒子と接触し、微小粒子が標的細胞に付着することにより、標的細胞・微小粒子複合体が形成される。微小粒子は、例えば、固体微小粒子（ｓｏｌｉｄ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ）、ゲル粒子（ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ）、ポリマー微小粒子（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）などでよい。本実施形態によれば、試料供給部１００は、試料と微小粒子とが共に収容される試料チャンバ１１０を含んでもよい。試料チャンバ１１０には、試料を注入するための注入口ｈ１が設けられる。微小粒子は、標的細胞が濃縮される前に、注入口ｈ１を介して、試料チャンバ１１０に注入される。図１Ｂに示された注入口ｈ１は、代わりに、図示されていない上部プレートに設けられてもよい。もちろん、微小流体装置１が所定の用途のために製造された場合には、その用途に適した微小粒子が、微小流体装置１の製造時に、前もって試料チャンバ１１０に収容されてもよい。本実施形態では、試料チャンバ１１０には、半径方向の流体の流れを、少なくとも部分的に制限するための隔壁４００が設けられる。隔壁４００については、図１１ないし図１４を参照しながら後述する。
【００４２】
密度差分離部２００は、試料供給部１００より供給される標的物質を含む流体から、標的物質を分離するために設けられる。密度差分離部２００は、密度勾配物質（ＤＧＭ：ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）が収容される分離チャンバ２１０を含んでもよい。密度勾配物質は、密度勾配を利用して、標的物質を含む流体から標的物質を分離するために提供される。密度勾配物質の密度は、標的物質の密度より小さく、標的物質を除いた流体の密度より大きい。その密度の差によって、遠心分離の間、標的物質を流体から分離するように流体と標的物質との間に密度勾配物質が位置するようになる。分離チャンバ２１０には、密度勾配物質を注入するための注入口ｈ２が設けられる。注入口ｈ２は、図示されていない上部プレートに設けられてもよい。微小流体装置１が、特定用途で使用される場合には、その用途に適する密度勾配物質が、微小流体装置１の製造時に前もって分離チャンバ２１０に収容され得る。
【００４３】
遠心力によって、流体が試料チャンバ１１０から分離チャンバ２１０に流れるようにするために、分離チャンバ２１０は、回転中心ＲＣを基準として、半径方向に離れるように、試料チャンバ１１０の外側に配置される。試料チャンバ１１０と分離チャンバ２１０は、流体供給弁１５を含む流体供給チャネル１０によって、互いに連結される。分離チャンバ２１０内では、密度勾配物質を間に介在させ、標的物質が流体から分離される。標的物質は、分離チャンバ２１０の最下層、すなわち、回転中心ＲＣを基準として、半径方向の最も外側に集まる。分離チャンバ２１０には、標的物質を抽出するための抽出口（図示せず）が設けられる。抽出口は、半径方向に分離チャンバ２１０の外側領域に設けられる。例えば、ピペットを利用するなどして、抽出口を介して最下層に集まった標的物質を抽出することにより、標的物質を試料から分離することができる。これにより、試料中に微量存在する標的細胞を、高効率に分離、濃縮することができる。
【００４４】
密度差分離部２００は、標的物質を収容する回収チャンバ２２０をさらに具備することができる。回収チャンバ２２０は、回転中心ＲＣを基準として半径方向に、分離チャンバ２１０の外側に配置される。回収チャンバ２２０は、回収チャネル２０によって、分離チャンバ２１０と連結される。回収チャネル２０には、回収チャネル２０を通る流体の流れを選択的に制御するための回収弁２５が設けられる。分離チャンバ２１０において、標的物質は、分離チャンバ２１０の最下層に集まり、回収弁２５によって、回収チャネル２０が開放されれば、遠心力によって、回収チャンバ２２０に流入する。以下、「最下層」は、回転中心ＲＣから最も遠く離れた物質層を意味する。言い換えれば、流体中の最も重い物質は、遠心分離過程で、回転中心ＲＣから最も遠く離れた位置に集まる。同様に、「最上層」は、回転中心ＲＣに最も近い物質層を意味する。すなわち、流体中の最も軽い物質は、遠心分離過程で、回転中心ＲＣに最も近い位置に集まる。
【００４５】
図１Ｃを参照すれば、微小流体装置１には、廃棄物チャンバ３００がさらに設けられる。分離チャンバ２１０は、排出チャネル３０によって、廃棄物チャンバ３００と連結される。排出チャネル３０は、回収チャネル２０より、回転中心ＲＣにさらに近い位置で、分離チャンバ２１０と連結される。排出チャネル３０には、排出チャネル３０を通る流体の流れを選択的に制御するための排出弁３５が設けられる。このような構成によって、分離チャンバ２１０の最下層に集まった標的物質を除いた上層物質を、排出チャネル３０を介して、廃棄物チャンバ３００に排出し、標的物質は、回収チャネル２０を介して、回収チャンバ２２０に移動させることができる。
【００４６】
流体供給弁１５、回収弁２５、排出弁３５、微小流体装置１に含まれるその他の弁としては、多様な形態の微小流体弁が採用されてもよい。流体供給弁１５、回収弁２５、排出弁３５は、本実施形態においては、外部からエネルギーを伝達されて開放するまでは流体の流れを妨げるノーマルクローズ弁（ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｖａｌｖｅ）である。図２Ａと図２Ｂには、ノーマルクローズ弁の一例および開状態のノーマルクローズ弁がそれぞれ示されている。ノーマルクローズ弁は、常温で固体状態である弁材料Ｖ１を含んでもよい。弁材料Ｖ１は、固体の状態で、チャネルＣに存在することにより、図２Ａに示されるように、チャネルＣを遮断する。弁材料Ｖ１は、高温で溶融されてチャネルＣ内の空間に移動し、図２Ｂに示されるように、チャネルＣを開放したまま固体へ戻る。外部から照射されるエネルギーは、例えば、電磁波であり、エネルギー源は、レーザビームを照射するレーザ光源や、可視光線または赤外線を照射する発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、またはキセノンランプ（ｘｅｎｏｎ  ｌａｍｐ）でよい。レーザ光源の場合、少なくとも１つのレーザダイオード（ｌａｓｅｒ  ｄｉｏｄｅ）を含んでもよい。外部エネルギー源は、弁材料Ｖ１に含まれた発熱粒子が吸収することができる電磁波の波長によって選択される。弁材料Ｖ１は、ＣＯＣ（ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｅｆｉｎ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ＰＭＭＡ（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＳ（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ＰＯＭ（ｐｏｌｙｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ＰＦＡ（ｐｅｒｆｌｕｏｒａｌｋｏｘｙ）、ＰＶＣ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＰＰ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＰＥＴ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ＰＥＥＫ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｔｈｅｒｋｅｔｏｎｅ）、ＰＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）、ＰＳＵ（ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）及びＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）などの熱可塑性樹脂を含でもよい。また、弁材料Ｖ１として、常温で固体状態である相転移物質が採用されてもよい。相転移物質は、ワックス（ｗａｘ）であってもよい。ワックスは、加熱されれば、溶融して液体状態に変わり、体積が膨脹する。ワックスとしては、例えば、パラフィンワックス（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｗａｘ）、マイクロクリスタリンワックス（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｗａｘ）、合成ワックス（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｗａｘ）または天然ワックス（ｎａｔｕｒａｌ  ｗａｘ）などが採用される。相転移物質は、ゲル（ｇｅｌ）または熱可塑性樹脂であってもよい。ゲルとしては、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリアクリレート（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅｓ）、ポリメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｓ）またはポリビニルアミド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｍｉｄｅｓ）などが採用されてもよい。弁材料Ｖ１には、電磁波エネルギーを吸収して発熱する多数の微小発熱粒子が分散される。微小発熱粒子は、ほぼ０．１ｍｍ深と１ｍｍ幅とを有する微細なチャネルＣを自由に通過することができるように、１ｎｍないし１００μｍの直径を有していればよい。微小発熱粒子は、例えば、レーザ光などによって、電磁波エネルギーが供給されれば、温度が急激に上昇して発熱する性質を有し、ワックス内おいて均等に分散される性質を有する。このような性質を有するように、微小発熱粒子は、金属成分を含むコア（ｃｏｒｅ）と、疎水性の表面構造とを有していてもよい。例えば、微小発熱粒子は、複数の界面活性成分（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）が、Ｆｅからなるコアに結合し覆い包む分子構造を有していてもよい。微小発熱粒子は、キャリアオイル（ｃａｒｒｉｅｒ  ｏｉｌ）に分散した状態で保たれる。疎水性の表面構造を有する微小発熱粒子が均等に分散するように、キャリアオイルも疎水性でよい。溶融された相転移物質に、微小発熱粒子が分散されたキャリアオイルを注いで混合し、この混合物質をチャネルＣに注入して凝固させることにより、チャネルＣを塞ぐことができる。微小発熱粒子は、例として先に挙げた重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）粒子に限定されず、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）または磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）の形態でもよい。また、微小発熱粒子は、例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、Ｔａ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４またはＨｆＯ２のような微小金属酸化物であってもよい。一方、ノーマルクローズ弁には、必ずしも微小発熱粒子が含まれている必要はなく、微小発熱粒子なしで、相転移物質のみからなっていてもよい。
【００４７】
標的細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）または癌細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）を含んでもよい。標的細胞は、例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、悪性纎維性組織球腫、纎維肉腫、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、多発骨髓種、神経膠芽細胞腫／星状細胞種、黒色腫、中皮腫及びウィルムス腫瘍などの群から選択される癌または腫瘍細胞でよい。
【００４８】
試料は、標的細胞が存在することができる限り、いかなる生体試料を含んでもよい。例えば、生体試料は、生検標本、組織試料、分離した細胞を液体媒質に懸濁させた細胞懸濁液、細胞培養及びそれらの組み合わせなどの群から選択されてもよい。生体試料は、血液、骨髄、唾液、涙液、尿、精液、粘膜液、及びそれらの組み合わせなどの群から選択されてもよい。例えば、血液は、血中循環腫瘍細胞を分離する試料として使用されてもよい。
【００４９】
微小粒子には、標的細胞の表面マーカーに特異的に反応する配位子（ｌｉｇａｎｄ）が一つ以上結合されている。微小粒子は、標的細胞と結合することにより、標的細胞の密度を上昇させる。微小粒子は、試料内の標的細胞と、標的細胞を除いた残りの細胞との間に密度差を生じさせることができるほどの密度を持っていてもよい。例えば、標的細胞となる腫瘍細胞が存在する血液を、生体試料として使用する場合には、白血球と赤血球との密度が、それぞれ１．０７ｇ／ｃｍ３と１．１ｇ／ｃｍ３とであるので、それを考慮して、適切な密度を有する微小粒子が選択される。微小粒子は、例えば、ポリスチレン粒子、ポリメチルメタアクリレート粒子、ラテックス粒子、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体）粒子、環状オレフィン共重合体粒子、メラミン粒子、及びそれらの複合体などの群から選択された粒子を含んでもよいが、それらに限定されない。微小粒子の直径は、分離しようとする標的細胞、使用する微小粒子の種類によって多様に選択され、例えば、約１ｎｍないし約１００μｍ、または約１０ｎｍないし約１０μｍの範囲であってもよい。
【００５０】
表面マーカーは、タンパク質、糖、脂質、核酸、及びそれらの組み合わせなどの群から選択されたマーカーを含んでもよい。例えば、表面マーカーは、癌または腫瘍細胞において特異的に発現して細胞膜上に表示されるタンパク質、すなわち、抗原でもあり、例えば、ＥｐＣＡＭ、ｃ−Ｍｅｔ、サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｅｓ）、ＣＤ４５、Ｈｅｒ２、またはそれらの組み合わせであってもよい。また、表面マーカーに特異的に反応する配位子は、抗原タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよい。
【００５１】
以下、図１Ｂ及び図１Ｃに示された微小流体装置１を利用した第１実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第１実施形態では、流血中癌細胞が含まれた血液を、試料として使用する。微小流体装置１は、例えば、約１ｍＬないし約２０ｍＬほどの相対的に多量の血液を収容することができる。このような多量の生体試料は、血漿（ｐｌａｓｍａ）を利用する臨床化学的検査、または免疫学的検査のために典型的に設計され、わずか数μＬほどの生体試料を収容する従来の回転型微小流体装置では、処理が不可能である。
【００５２】
［準備］：標的細胞となる流血中癌細胞が含まれた血液（例えば、約５ｍｍＬ）と、標的細胞の抗原に特異的に結合する抗体を持つ微小粒子（例えば、約１×１０８個以上）とを、注入口ｈ１を介して、試料チャンバ１１０に注入する。また、適切に選定された密度勾配物質を、注入口ｈ２を介して、分離チャンバ２１０に注入する。密度勾配物質は、例えば、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを含んでもよい。白血球と流血中癌細胞は、共通する物理特性を有しており、密度勾配を利用する遠心分離を行えば、同一層に分離される。従って、本実施形態では、微小粒子は流血中癌細胞に結合して、白血球内で密度差を生じさせ、血液から癌細胞のみを分離する。微小粒子は、例えば、メラミン粒子であり、その密度は、例えば、約１．５７ｇ／ｃｍ３ほどであり、血液内の生物学的粒子の密度、すなわち、約１．０５〜１．１ｇ／ｃｍ３より高い。
【００５３】
［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］：微小流体装置１は、回転駆動部５１０に装着された後、所定時間正転／逆転を反復して、標的細胞と共に微小粒子を撹拌および混合することにより、微小粒子を標的細胞に接触させ、微小粒子を標的細胞に付着させる。それによって、試料チャンバ１１０内で、標的物質（例えば、標的細胞・微小粒子複合体）が形成される。
【００５４】
［流体の移送］：流体供給チャネル１０を開放するために、電磁波発生器５２０を利用して、流体供給弁１５に、電磁波、例えば、レーザビームが照射される。例えば、弁材料Ｖ１は溶解し、その結果、流体供給チャネル１０が開放される。微小流体装置１を回転（例えば、正転または反転）させれば、遠心力によって試料チャンバ１１０に収容された流体は、流体供給チャネル１０を通じて、密度勾配物質が収容された分離チャンバ２１０に移送される。
【００５５】
［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］：微小流体装置１は、例えば、３，０００ｒｐｍで約５分間回転させられる。その結果、分離チャンバ２１０内には、試料内の物質の密度勾配によって区分された複数の層が形成される。例えば、分離チャンバ２１０内において、試料は、密度勾配物質層、赤血球層、白血球層、及び血漿層に分かれる。標的細胞と微小粒子との結合によって、標的物質の密度が最大となるので、標的細胞は、微小粒子が結合された標的物質の状態で白血球層から分離し、通常は、分離チャンバ２１０の最下物質層、すなわち、回転中心ＲＣを基準にして、半径方向に最も外側に位置する。密度勾配物質層、赤血球層、白血球層、血漿層は、順に、回転中心ＲＣに向かて、上層物質層に位置する。
【００５６】
［標的物質の回収］：微小流体装置１の回転が止められた後、図示されていない抽出口を介して、例えば、ピペットなどを利用して、分離チャンバ２１０から標的物質が抽出される。標的物質の回収の信頼性を高めるために、付加的な自動化プロセスが利用されてもよい。そのために、電磁波発生器５２０を利用して、回収弁２５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射して、回収チャネル２０を開放する。微小流体装置１をさらに回転させれば、遠心力によって、分離チャンバ２１０の最下層に位置した標的物質は、回収チャネル２０を介して、回収チャンバ２２０に移送される。その場合、回収弁２５は、図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれ示された開閉可能な弁であってもよい。標的物質の移送が完了すれば、微小流体装置１を止め、レーザビームを回収弁２５に照射し、回収チャネル２０を閉鎖することができる。
【００５７】
図１Ｃに示された微小流体装置１を利用する場合、異物の流入を減らし、濃縮率を向上させるために、標的物質層の上部に位置する流体をまず排出させることもできる。例えば、電磁波発生器５２０を利用して、排出弁３５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射する。これにより、弁材料Ｖ１が溶解し、その結果、排出チャネル３０が開放される。微小流体装置１を回転させれば、遠心力によって、分離チャンバ２１０に収容された流体中で標的物質を除いた流体は、排出チャネル３０を介して、廃棄物チャンバ３００に移送される。微小流体装置１の回転を止め、電磁波発生器５２０を利用して、回収弁２５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、回収チャネル２０を開放する。微小流体装置１をさらに回転させれば、遠心力によって、標的物質は、回収チャネル２０を通じて、回収チャンバ２２０に移送される。
【００５８】
標的物質は、回収チャンバ２２０に設けられた抽出口（図示せず）を通じて抽出される。これによって、血液内の標的細胞は、血液から分離し、濃縮される。
【００５９】
標的物質は、血液内の他の細胞に比べて、密度及び大きさが増大し、濾過により容易に分離することができる。従って、後の濾過工程によって、流体から濃縮された標的物質が得られる。
【００６０】
図３は、本実施形態に係る微小流体装置１の平面図である。本実施形態の微小流体装置１は、試料と微小粒子とが分離して収容されるという点で、図１Ｂに示された微小流体装置１とは異なる。図３を参照すれば、試料供給部１００は、試料チャンバ１１０と、粒子チャンバ１２０とを含む。試料チャンバ１１０には、試料が収容される。試料チャンバ１１０には、半径方向への流体の流れを部分的に制限する隔壁４００が設けられ、これについては、図１１ないし図１４を参照して後述する。粒子チャンバ１２０には、微小粒子が収容される。粒子チャンバ１２０は、回転中心ＲＣを基準として、半径方向に沿って、試料チャンバ１１０の内側に位置するべきである。粒子チャンバ１２０は、第１チャネル４０によって、試料チャンバ１１０と連結される。第１チャネル４０には、流体の流れを制御するための第１弁４５が設けられる。第１弁４５は、図２Ａ及び図２Ｂに示されたようなノーマルクローズ弁であり、選択的に活性化され得る。例えば、電磁気エネルギーが伝達されて、第１チャネル４０を開放する。微小粒子は、第１チャネル４０を通じて、試料チャンバ１１０に容易に供給されるようにするため、運搬流体、すなわち、バッファと共に、粒子チャンバ１２０に収容される。粒子チャンバ１２０は、第１領域１０１及び第２領域１０２のそれぞれの近位にある試料チャンバ１１０に連結されてもよい。
【００６１】
以下、図３に図示された微小流体装置１を利用した第２実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第２実施形態では、試料として流血中癌細胞が含まれた血液を使用する。
【００６２】
［準備］：標的細胞となる流血中癌細胞が含まれた血液を、注入口ｈ１を介して、試料チャンバ１１０に注入する。また、適切に選定された密度勾配物質を、注入口ｈ２を介して、分離チャンバ２１０に注入する。また、標的細胞の抗原に特異的に結合する抗体を持つ微小粒子を、バッファと共に注入口ｈ３を介して、粒子チャンバ１２０に注入する。
【００６３】
［微小粒子の移送］：微小流動装置１を回転駆動部５１０に装着し、電磁波発生器５２０を利用して、第１弁４５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、第１チャネル４０を開放する。微小流体装置１を回転させ、遠心力によって、粒子チャンバ１２０から試料チャンバ１１０に、バッファと共に微小粒子を移送させる。
【００６４】
その後、［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程を遂行されることにより、血液内の標的細胞を血液から分離させて濃縮することができる。また、通常は、後の工程として、濾過が遂行されることにより、流体から分離されて濃縮された標的物質が得られる。
【００６５】
微小粒子と標的細胞との特異的結合は、上述のように、抗原・抗体結合に依存する。試料は、多種のタンパク質を含み、それらタンパク質は、微細粒子と標的細胞との特異的結合を妨害することがある。例えば、標的細胞の表面マーカーに、抗原と類似した構造のタンパク質があらかじめ結合されることにより、微小粒子の結合が妨害されることがある。また、微小粒子の配位子に、抗体と類似した構造のタンパク質が結合されることにより、微小粒子と標的細胞の結合が妨害されることがある。このように、試料内のタンパク質は、標的細胞・微小粒子複合体の生成を妨害して、標的細胞濃縮効率を低下させることがある。このような濃縮効率低下を防止するために、微小粒子を試料と混合する前に、試料内のタンパク質を除去してもよい。
【００６６】
図４は、第３実施形態に係る微小流体装置１の平面図である。本実施形態の微小流体装置１は、試料チャンバ１１０内の試料を遠心分離した後、標的細胞が含まれた標的層の上側に位置する上層物質層を除去するように構成された点で、図３に示された微小流体装置１とは異なる。試料チャンバ１１０には、半径方向への流体の流れを部分的に制限する隔壁４００が設けられ、これについては、図１１ないし図１４を参照して後述する。図４を参照すれば、廃棄物チャンバ３００が図示されている。廃棄物チャンバ３００は、第２チャネル５０によって、試料チャンバ１１０と連結される。廃棄物チャンバ３００は、回転中心ＲＣを基準として、半径方向に沿って、試料チャンバ１１０の外側に配置される。本実施形態では、廃棄物チャンバ３００が、分離チャンバ２１０及び試料チャンバ１１０と連結されているが、分離チャンバ２１０及び試料チャンバ１１０とそれぞれ連結された２つの廃棄物チャンバが設けられてもよい。第２チャネル５０と試料チャンバ１１０との連結位置は、試料内の上層物質層の量に依存する。例えば、試料として、血液が採用された場合、血液から血漿を除去してもよい。その場合、人によって、血液の構成比が異なり、血漿の量が異なることがある。本実施形態の第２チャネル５０は、２つの連結チャネル５１，５２をそれぞれ具備することができる。２つの連結チャネル５１，５２は、回転中心ＲＣを中心にして、半径方向において互いに異なる位置で、試料チャンバ１１０と連結される。連結チャネル５１，５２には、それぞれ第２弁５５が設けられる。第２弁５５は、図２Ａ及び図２Ｂに示されたようなノーマルクローズ弁であり、電磁気エネルギーが伝達されて連結チャネル５１，５２を開放する。除去する上層物質層の量により、２つの連結チャネル５１，５２のうち適切なチャネルを開放することができる。上層物質層の量が少ない場合には、回転中心ＲＣに近い連結チャネル５１を開放し、上層物質層の量が多い場合には、回転中心ＲＣから遠い連結チャネル５２を開放することができる。連結チャネルの数は、三つ以上であってもよい。
【００６７】
以下、図４に示された微小流体装置１を利用した第３実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第３実施形態では、試料として、流血中癌細胞が含まれた血液を使用する。
【００６８】
［準備］：標的細胞となる流血中癌細胞が含まれた血液を、試料チャンバ１１０に注入する。また、標的細胞の抗原に特異的に結合する抗体を持つ微小粒子を、バッファと共に粒子チャンバ１２０に注入する。また、適切に選定された密度勾配物質を分離チャンバ２１０に注入する。密度勾配物質が分離チャンバ２１０にあらかじめ注入されもよいことは、前述の通りである。第１チャネル４０は、第１弁４５によって閉鎖された状態であるので、微小粒子は、その試料と分離された状態である。
【００６９】
［試料の遠心分離］：微小流体装置１を回転駆動部５１０に装着した後、約１，０００〜約８，０００ｒｐｍ、例えば、約３，０００ｒｐｍで約５分間回転させる。これにより、試料チャンバ１１０内で血液は、物質の密度差によって、複数層に分離される。最も重い赤血球を含む赤血球層が半径方向において最も外側に位置する。その内側には、白血球と標的細胞とを含む標的層が位置し、さらにその内側には、上層物質層として、血漿層が順に位置する。血球を除いた血液内のタンパク質は、概して血球に比べて軽いので、血漿層に位置する。
【００７０】
［血漿の排出］：微小流体装置１の回転を止め、血漿の量により、連結チャネル５１，５２のうち適切なチャネルに配置された第２弁５５に、電磁波発生器５２０を利用して、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、第２チャネル５０を開放する。血漿を排出している間、血球は、廃棄物チャンバ３００に排出されるべきではない。連結チャネル５１，５２のうちいずれのチャネルを開放するかということは、例えば、試料チャンバ１１０内に収容される試料の量によって決定される。また、試料の遠心分離後、試料の吸光度を測定し、吸光度の測定結果に基づいて、試料チャンバ１１０内で血漿層の位置を検出することができる。検出された血漿層の位置に基づいて、連結チャネル５１，５２のうち適切なチャネルを開放することができる。さらに、微小流体装置１を回転させれば、遠心力によって、血漿は、第２チャネル５０を介して、廃棄物チャンバ３００に排出される。この過程で、血漿と共に、標的細胞と微小粒子との結合を妨害する血液内のタンパク質の全部または一部が、廃棄物チャンバ３００に排出される。
【００７１】
［微小粒子の移送］：血漿の排出が完了すれば、微小流体装置１の回転を止め、電磁波発生器５２０を利用して、第１弁４５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、第１チャネル４０を開放する。微小流体装置１を回転させれば、遠心力によって、微小粒子がバッファと共に、粒子チャンバ１２０から試料チャンバ１１０に移送される。
【００７２】
［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］：所定時間、微小流体装置１の正転／逆転を反復し、微小粒子を標的細胞に接触させることにより、微小粒子を標的細胞に付着させる。これによって、試料チャンバ１１０内には、標的細胞・微小粒子複合体、すなわち、標的物質が形成される。血液内のタンパク質が、血漿と共に廃棄物チャンバ３００に排出されたので、微小粒子と標的細胞との結合効率を向上させることができる。
【００７３】
その後、前述の第１実施形態の［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程が遂行されることにより、血液内の標的細胞を、血液から分離させて濃縮することができる。また、後の工程として、濾過工程を経て、流体から濃縮された標的物質が得られる。
【００７４】
微小粒子は、バッファと共に、試料チャンバ１１０に移送された後、微小流体装置１が順転／逆転されることによって試料と混合される。このとき、試料チャンバ１１０内の流体の水位（ｌｅｖｅｌ）は上がり、標的細胞は、流体と共に、開放された第２チャネル５０を介して、廃棄物チャンバ３００に流出することがある。このような流体の漏れを防止するために、第２チャネル５０には、図５に示すような、選択的に活性化（例えば、流体の流れを妨げるために閉じられる）され得る第３弁５６が設けられる。第３弁５６は、第２弁５５より、廃棄物チャンバ３００にさらに近い位置に配置される。第３弁５６は、いわゆる、ノーマルオープン弁（ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｏｐｅｎ  ｖａｌｖｅ）であり、外部からエネルギーが伝達されてチャネルを閉鎖し、それまでは、流体が流れるように、チャネルを開放している弁である。
【００７５】
図６Ａと図６Ｂは、ノーマルオープン弁の一例を示す断面図である。ノーマルオープン弁は、チャネルＣ、チャネルＣの幅方向にチャネルＣから延長された弁チャンバＶＣ、及び弁チャンバＶＣ内に充填される弁材料Ｖ１を含む。図６Ａに示されるように、外部エネルギーが供給される前には、弁材料Ｖ１が、弁チャンバＶＣ内に存在するので、チャネルＣは、開放された状態で維持される。しかし、弁材料Ｖ１に外部エネルギーが供給されれば、弁材料Ｖ１は、溶融して、膨脹する。その結果、チャネルＣに流入し、さらに凝固する。これにより、チャネルＣを通過する流体の流れを遮断する。
【００７６】
以下、図５に示された微小流体装置１を利用した第４実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第４実施形態では、試料として、流血中癌細胞が含まれた血液を使用する。
【００７７】
第３実施形態に係る標的細胞濃縮方法の［準備］、［試料の遠心分離］、［血漿の排出］の工程が遂行される。
【００７８】
［第２チャネル５０の閉鎖］
電磁波発生器５２０を利用して、第３弁５６に、電磁波、例えば、レーザビームを照射する。これにより、図６Ｂに示されるように、弁材料Ｖ１が溶融及び再固化して、第２チャネル５０が閉鎖される。
【００７９】
その後、前述の第３実施形態の［微小粒子の移送］、［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］、［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程が遂行されることにより、血液内の標的細胞を血液から分離させて濃縮することができる。
【００８０】
また、後の工程として、濾過工程を経て、流体から濃縮された標的物質が得られる。［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］工程が遂行されるとき、第２チャネル５０を介して、試料チャンバ１１０から、標的細胞を含んだ流体が廃棄物チャンバ３００に漏れることはない。
【００８１】
前述のように、微小粒子と共に、試料チャンバ１１０に移送されたバッファによって、試料チャンバ１１０の水位は高くなる。［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］工程で、微小粒子と標的細胞との接触確率を高めるためには、試料チャンバ１１０内の流体の量が少ないほどよい。微小粒子と共に、試料チャンバ１１０に供給されたバッファは、除去されてもよい。バッファは、試料チャンバ１１０内で、遠心分離工程が遂行される場合、上層物質層になる。従って、血漿を分離した後、二次遠心分離工程を経て、第２チャネル５０を介しバッファを廃棄物チャンバ３００に排出することができる。血漿を除去する工程では、第２チャネル５０は、開放された状態である。従って、二次遠心分離工程が進められる間、第２チャネル５０は、閉鎖された状態で維持され、二次遠心分離工程後に、バッファが、第２チャネル５０を介して、廃棄物チャンバ３００に排出されるように、第２チャネル５０が開放される必要がある。
【００８２】
そのために、図７に示されるように、第２チャネル５０には、第４弁５７がさらに配置される。第４弁５７は、開状態から閉状態そして開状態に順に転換される開閉弁（ｏｐｅｎ／ｃｌｏｓｅ  ｖａｌｖｅ）である。図７に示される第４弁５７は、第３弁５６よりも、廃棄物チャンバ３００から遠くに位置しているが、第３弁５６が、第４弁５７よりも、廃棄物チャンバ３００から遠くに位置してもよい。
【００８３】
図８Ａないし図８Ｃは、開閉弁の一例を示す断面図である。図８Ａに示すように、開閉弁は、チャネルＣ、チャネルＣの上部に位置する弁チャンバＶＣ、弁チャンバＶＣ内に充填される弁材料Ｖ１、及びチャネルＣ内部の弁チャンバＶＣの下側に弁チャンバＶＣと部分的に重なる位置で突き出された段差部ＶＳを含む。図８Ａに示されるように、外部エネルギーが供給される前には、弁材料Ｖ１が弁チャンバＶＣ内に存在するので、チャネルＣは、開放された状態で維持される。弁材料Ｖ１に外部エネルギーが供給されれば、弁材料Ｖ１が溶融して、膨脹する。その結果、弁材料Ｖ１が段差部ＶＳに流入し、凝固する。これにより、図８Ｂに示されるように、チャネルＣを通過する流体の流れを遮断する。さらに強い外部エネルギーが、凝固された弁材料Ｖ１に供給されれば、段差部ＶＳの弁材料Ｖ１が再溶融し、流動性が生まれる。弁材料Ｖ１は、段差部ＶＳを外れ、チャネルＣに流れる。これによって、図８Ｃに示されたように、チャネルＣは、再び開放される。
【００８４】
以下、図７に示された微小流体装置１を利用した第５実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第５実施形態では、試料として、流血中癌細胞が含まれた血液を使用する。
【００８５】
第３実施形態に係る標的細胞濃縮方法の［準備］、［試料の遠心分離］、［血漿の排出］の工程までが遂行される。
【００８６】
［バッファ除去］
血漿を排出した後、電磁波発生器５２０を利用して、第４弁５７に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、図８Ｂに示されるように、第２チャネル５０を閉鎖する。この状態で、微小流体装置１を回転させ、二次遠心分離工程を遂行する。これにより、最も密度の低いバッファが上層物質層になる。次に、再び電磁波発生器５２０を利用して、第４弁５７に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、図８Ｃに示されるように、第２チャネル５０を開放する。その後、微小流体装置１を回転させ、遠心力によって、第２チャネル５０を介して試料チャンバ１１０のバッファを廃棄物チャンバ３００に排出する。
【００８７】
次に、第４実施形態で説明したように、［第２チャネル５０の閉鎖］工程を遂行する。その後、前述の第３実施形態の［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］、［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程を遂行することにより、血液内の標的細胞を血液から分離して濃縮することができる。また、後の工程として、濾過工程を経て、流体から濃縮された標的物質が得られる。
【００８８】
試料中に、比較的大きい細胞が含まれた場合、標的細胞・微小粒子複合体を形成する工程で、微小粒子と標的細胞との接触可能性が低下することがある。従って、試料中に特定の細胞を溶解させる溶解液（ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投入し、比較的大きい細胞を除去することにより、微小粒子と標的細胞との接触可能性を向上させる。例えば、血液の場合、赤血球が血液を構成する細胞のうち最も大きい。試料チャンバ１１０内で、微小粒子と標的細胞との接触可能性を向上させるために、血液内の赤血球を除去することができる。例えば、試料チャンバ１１０内に、赤血球を溶解する赤血球溶解液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投入することにより、赤血球を溶解させることができる。赤血球溶解液に長期間触れると、白血球及び癌細胞は活性を失うことがあるが、赤血球の場合、細胞膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）がないので、相対的に早く溶解される。例えば、１０分ほど赤血球溶解液に触れれば、赤血球は溶解され、白血球と癌細胞とは溶解されない。
【００８９】
図９には、第６実施形態に係る微小流体装置１が示されている。図９を参照すれば、微小流体装置１は、溶解液チャンバ１３０をさらに具備することができる。溶解液チャンバ１３０は、遠心力によって、溶解液が試料チャンバ１１０に供給されるように、回転中心ＲＣを基準として、試料チャンバ１１０より半径方向内側に位置する。溶解液チャンバ１３０は、第３チャネル６０によって、試料チャンバ１１０と連結される。第３チャネル６０には、流体の流れを制御するための第５弁６５が設けられる。第５弁６５は、図２Ａ及び図２Ｂに示されたようなノーマルクローズ弁である。図９には、第２チャネル５０に第２弁５５だけが設けられているが、図５及び図７に示されたように、第３弁５６と第４弁５７が設けられてもよい。試料チャンバ１１０には、半径方向の流体の流れを部分的に制限する隔壁４００が設けられ、これについては、図１１ないし図１４を参照して後述する。
【００９０】
以下、図９に示された微小流体装置１を利用した第６実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。
【００９１】
［準備］：上記の第２実施形態ないし第５実施形態に係るは、第６実施形態に係る標的細胞濃縮方法にも適用され得る。前述の第２実施形態に係る標的細胞濃縮方法の［準備］工程に加え、溶解液チャンバ１３０（例えば、不図示の開口部）に溶解液を注入する。
【００９２】
［溶解液の移送］：微小流体装置１を回転駆動部５１０に装着し、電磁波発生器５２０を利用して、第５弁６５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、第３チャネル６０を開放する。その後、微小流体装置１を回転させ、遠心力によって、溶解液を試料チャンバ１１０に注入する。溶解液の注入が完了すれば、微小流体装置１を正転／逆転させて試料と溶解液とを混合した後、一定時間維持することにより、試料内の大きな細胞、例えば、血液中の赤血球を溶解させる。
【００９３】
［溶解液の移送］工程を遂行した後、第２実施形態ないし第５実施形態で説明したように［試料の遠心分離］、［血漿の排出］、［微細粒子の移送］、［バッファ除去］、［第２チャネルの閉鎖］、［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］、［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程を遂行することにより、血液内の標的細胞を血液から分離させて濃縮することができる。また、後の工程として、濾過工程を経て、流体から濃縮された標的物質が得られる。
【００９４】
前述の実施形態では、分離チャンバ２１０が、試料チャンバ１１０の外側に配置され、試料チャンバ１１０内の全て、あるいは、ほとんど全ての流体が、分離チャンバ２１０に提供される微小流体装置１について説明したが、これに限定されない。例えば、試料チャンバ１１０に、標的細胞より高密度の第１密度勾配物質を投入することにより、標的細胞を含む標的層、または標的層とその上部物質層とを、第１密度勾配物質の上部に位置させ、標的層を試料チャンバ１１０から抽出することができる。第１密度勾配物質は、例えば、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）などであってもよい。その後、抽出された流体に微小粒子を投入し、標的細胞・微小粒子複合体、すなわち、標的物質を形成し、標的物質を含む流体を分離チャンバ２１０に移送し、密度差によって標的物質を分離することもできる。
【００９５】
図１０は、本発明による微小流体装置の一実施形態である。本実施形態の微小流体装置は、試料チャンバ１１０において標的物質を含む一部の流体だけが、分離チャンバ２１０に提供されるように構成される。図１０を参照すれば、試料供給部１００は、試料チャンバ１１０と反応チャンバ１４０とを含む。試料チャンバ１１０には、第１密度勾配物質と試料とが共に収容される。第１密度勾配物質が試料チャンバ１１０に収容された状態で、微小流体装置１が製造されてもよい。また、第１密度勾配物質は、標的細胞を濃縮するために、注入口ｈ１を通じて、試料チャンバ１１０に注入される。試料も、注入口ｈ１を通じて、試料チャンバ１１０に注入されてもよい。第１密度勾配物質は、試料に含まれた標的細胞よりも高密度である。従って、遠心分離工程において、標的細胞を含む流体は、第１密度勾配物質の上部、すなわち、第１密度勾配物質よりも回転中心ＲＣの近くに位置する。例えば、試料が血液である場合、第１密度勾配物質は、赤血球より密度が小さく、標的細胞より密度が大きい物質であってもよい。これにより、標的細胞および白血球を含む標的層と、血漿層とは、第１密度勾配物質の上部に位置する。試料チャンバ１１０には、半径方向への流体の流れを部分的に制限する隔壁４００が設けられ、それについては、図１１ないし図１４を参照して後述する。
【００９６】
反応チャンバ１４０では、標的細胞と微小粒子との結合によって、標的細胞・微小粒子複合体、すなわち、標的物質が形成される。反応チャンバ１４０は、移送チャネル７０によって、試料チャンバ１１０と連結される。移送チャネル７０は、第１密度勾配物質層の上部水面に隣接するように、試料チャンバ１１０に連結される。例えば、移送チャネル７０と試料チャンバ１１０の連結位置は、第１密度勾配物質の体積及び試料チャンバ１１０内の試料の体積に基づいて決定される。移送チャネル７０には、流体の流れを制御するための移送弁７５が配置される。移送弁７５は、図２Ａ及び図２Ｂに示されたようなノーマルクローズ弁である。反応チャンバ１４０には、微小粒子が収容されてもよい。また、図１０に点線で示すように、微小粒子は、第１弁４５が配置された第１チャネル４０によって、反応チャンバ１４０に連結された粒子チャンバ１２０に収容される。
【００９７】
以下、密度差分離部２００の構成は、図１Ｂ、図３、図４及び図９に示された構造と、実質的に同一であり得る。分離チャンバ２１０に収容される密度勾配物質は、第１密度勾配物質と同一でもよいし、異なってもよい。例えば、第１密度勾配物質の密度が標的物質の密度より小さければ、第１密度勾配物質と密度勾配物質は、同一である。
【００９８】
廃棄物チャンバ３００は、試料チャンバ１１０から排出される上層物質層の一部、例えば、血液の場合、血漿を収容する。また、廃棄物チャンバ３００は、反応チャンバ１４０から排出される密度勾配物質を含む流体を収容することができる。
【００９９】
以下、図１０に示された微小流体装置１を利用した第７実施形態に係る標的細胞濃縮方法について説明する。第７実施形態では、試料として、流血中癌細胞が含まれた血液を使用する。
【０１００】
［準備］：標的細胞となる流血中癌細胞が含まれた血液と、第１密度勾配物質とを試料チャンバ１１０に注入する。標的細胞の抗原に特異的に結合する抗体を持つ微小粒子を、バッファと共に粒子チャンバ１２０または反応チャンバ１４０に注入する。適切に選定された密度勾配物質を分離チャンバ２１０に注入する。第１密度勾配物質と密度勾配物質が、それぞれ試料チャンバ１１０と分離チャンバ２１０とにあらかじめ注入されていてもよいことは、前述の通りである。
【０１０１】
［試料の遠心分離］：微小流体装置１を回転駆動部５１０に装着した後、例えば、約２，３００ｒｐｍで約８分間回転させる。これにより、最も重い赤血球を含む赤血球層は、試料チャンバ１１０における血液の密度差により、半径方向の最も外側に位置する。その内側には、第１密度勾配物質層と、白血球および標的細胞を含む標的層と、血漿層を含む上層物質層とが順に位置する。
【０１０２】
必要によって、前述の［血漿の排出］、［バッファ除去］の工程が遂行される。
【０１０３】
［標的細胞の移送］：電磁波発生器５２０を利用して、移送弁７５に、電磁波、例えば、レーザビームを照射し、移送チャネル７０を開放する。その後、微小流体装置１を回転させ、遠心力によって、第１密度勾配物質層の上部の標的細胞を含む流体を反応チャンバ１４０に移送させる。
【０１０４】
微小粒子が粒子チャンバ１２０に収容された場合、前述の［微細粒子の移送］工程を遂行することができる。
【０１０５】
［標的物質（標的細胞・微小粒子複合体）の形成］：所定時間、微小流体装置１の正転／逆転を反復し、微小粒子を標的細胞に接触させることにより、微小粒子を標的細胞に付着させる。これによって、反応チャンバ１４０内には、標的細胞・微小粒子複合体、すなわち、標的物質が形成される。
【０１０６】
その後、前述の［流体の移送］、［分離チャンバ２１０内での密度勾配を利用した標的物質の分離］及び［標的物質の回収］の工程を遂行することにより、血液内の標的細胞を血液から分離して濃縮することができる。また、後の工程として、濾過工程を経て、流体から濃縮された標的物質が得られる。
【０１０７】
微小流体装置１において、試料チャンバ１１０に収容された試料が、密度勾配によって、複数層に遠心分離された後、標的層を移送するため、または標的層の上部に位置する上層物質層を廃棄物チャンバ３００へ排出するためには、微小流体装置１の回転を停止させた後、弁を開放する必要がある。この工程では、微小流体装置１が回転しないので、試料チャンバ１１０内の試料には、遠心力が作用せず、経時的に試料内の分子運動によって、複数層が徐々に混合される可能性がある。これにより、標的細胞が上層物質層と混ざり、細胞濃縮効率を低下させるか、あるいは標的細胞が上層物質層と混じり、共に廃棄物チャンバ３００に排出される。このような問題は、バッファを除去する工程でも発生することがある。また、図１０に示された微小流体装置１において、標的細胞を含む標的層を、反応チャンバ１４０に移送する工程でも、微小流体装置１の回転を停止させて移送弁７５を開放する工程が必要であり、この工程で、試料チャンバ１１０内の標的層が他の層と混ざって、反応チャンバ１４０に移送される標的細胞の量が減ることがあり、試料内の標的層に不要な物質が混合することもある。
【０１０８】
図１Ｂ、図３、図４、図９、図１０によれば、試料チャンバ１１０内には、遠心分離後に、複数層が重力により互いに混じることを防止するための隔壁４００が設けられる。隔壁４００の詳細な構成は、以下、図１１を参照しながら説明する。
【０１０９】
図１１は、本実施形態に係る微小流体装置１の平面図である。図１２は、図１１のＡ−Ａ’断面図である。本実施形態の微小流体装置１は、試料チャンバ１１０内で、流体の半径方向への移動を隔壁４００によって一部制限するように構成される。つまり、図１１及び図１２を参照すれば、試料チャンバ１１０内には、試料の半径方向への流れを部分的に制限する隔壁４００が設けられる。隔壁４００は、図１２に示されるように、例えば、試料チャンバ１１０の下部壁１００２から上部壁１００１に向かって延長される。図１１に示されるように、隔壁４００は、試料チャンバ１１０の円周方向の全幅に対し、一部に形成される。もちろん、図１１に点線に示されるように、隔壁４００は、試料チャンバ１１０の円周方向の全幅にわたって形成されてもよい。隔壁４００によって、試料チャンバ１１０は、半径方向に、回転中心ＲＣに近い内側領域１１１と、回転中心ＲＣから遠い外側領域１１２とに区分される。隔壁４００は、上部壁１００１との間に、ボトルネック部４０１を形成する。ボトルネック部４０１によって、内側領域１１１と外側領域１１２とが互いに連結される。図面に示されていないが、隔壁４００は、試料チャンバ１１０の上部壁１００１から下部壁１００２に向かって延長され、下部壁１００２との間にボトルネック部４０１を形成することもできる。
【０１１０】
試料の遠心分離工程では、試料は、遠心力によって、ボトルネック部４０１を横切り、内側領域１１１から外側領域１１２へと移動し、試料チャンバ１１０内には、密度勾配に基づき複数の層が形成される。微小流体装置１の回転が停止し、遠心力が働かない状態では、ボトルネック部４０１によって、内側領域１１１と外側領域１１２の間での試料の移動は制限される。すなわち、試料チャンバ１１０内で、半径方向への流体の流れが隔壁４００によって制限され、遠心分離した層同士の混合を低減あるいは防ぐことができる。ボトルネック部４０１の内側間隔Ｇ１および外側間隔Ｇ２、すなわち、ボトルネック部４０１と上部壁１００１との間隔は、ボトルネック部４０１を介して流体の移動が可能になる毛細管現象を誘発する間隔より広い。遠心分離工程では、サンプル流体は、内側領域１１１から外側領域１１２へと移動できなければならず、微小粒子と標的細胞とを混合するときには、内側領域１１１と外側領域１１２との間を両方向に移動できなければならない。また、例えば、血液の遠心分離後に、内側領域１１１に位置した血漿を除去するとき、外側領域１１２に存在する血球及び癌細胞粒子の内側領域１１１への拡散を防止する。一方、血漿を除去した後には、外側領域１１２の流体がボトルネック部４０１を通過し、試料チャンバ１１０内の全領域に動きながら、癌細胞と微小粒子との結合が行われるようにする。従って、ボトルネック部４０１で毛細管現象が発生してはならない。もし、ボトルネック部４０１で、毛細管現象が発生すれば、ボトルネック部４０１が閉塞または詰まり、遠心分離および撹拌工程での流体の移動が円滑ではなくなるからである。本実施形態によれば、ボトルネック部４０１の内側間隔Ｇ１および外側間隔Ｇ２が、毛細管現象を誘発する間隔より広いので、遠心分離工程では、遠心力によって、内側領域１１１から外側領域１１２への流体の移動が円滑に起こり、遠心分離後には、比較的狭い内側間隔Ｇ１および外側間隔Ｇ２によって、内側領域１１１と外側領域１１２との間の流体の移動が部分的に制限される。微小粒子と標的細胞との混合工程で、微小粒子と標的細胞は、内側領域１１１と外側領域１１２とを両方向に移動しつつ混合される。微小粒子と標的細胞との結合は、内側領域１１１及び外側領域１１２のいずれでも行われる。外側間隔Ｇ２は、微小粒子と結合された標的細胞（大きさ約５０μｍほど）、白血球、赤血球、標的細胞群体（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ）（大きさ約３００μｍほど）などの流れが許容されるように決定される。例えば、外側間隔Ｇ２は、０．５ｍｍ〜２０ｍｍ（さらに良好な性能のために、望ましくは１ｍｍ〜２０ｍｍ）ほどでよい。外側間隔Ｇ２が過度に狭ければ、微小粒子と標的細胞とを含む試料流体を混合できなくなるか、あるいは、混合効率が低下する。
【０１１１】
遠心分離工程では、内側領域１１１から外側領域１１２への試料の移動を円滑にする必要がある。そのために、図１２に示されるように、隔壁４００は、ボトルネック部４０１が、試料チャンバ１１０の内側（例えば、内側領域１１１）から外側（例えば、外側領域１１２）に行くほど細くなるように形成される。すなわち、ボトルネック部４０１によって形成される流体通路は、内側間隔Ｇ１が外側間隔Ｇ２より広く形成される。遠心分離工程で、遠心力によって、試料は、内側領域１１１から外側領域１１２に流れるが、広い内側間隔Ｇ１から狭い外側領域Ｇ２の方に流れ、ボトルネック部４０１を通過し、外側領域１１２に移動する。一方、停止状態では、遠心力がないので、狭い外側間隔Ｇ２によって、試料がボトルネック部４０１を円滑に通過することができない。従って、遠心分離工程では、内側領域１１１から外側領域１１２への試料の流れを比較的円滑に行うことができ、停止状態では、その反対方向への試料の流れを制限できる。ボトルネック部４０１を形成するための隔壁の断面形状は、図１２に示されたように、頂点（ａｐｅｘ）４０４を有する三角形状であってもよい。その場合、外側領域１１２側の斜辺４０６の傾斜角度Ａ２は、内側領域１１１側の斜辺４０５の傾斜角度Ａ１より大きい。このような構成によれば、外側領域１１２から内側領域１１１への試料の流れをさらに容易に制限できる。また、斜辺４０５と、内側領域１１１の底面１１３との間に段差をなくすことにより、遠心分離時に、内側領域１１１から外側領域１１２への試料の流れをさらに円滑にすることができる。ボトルネック部４０１を形成する隔壁４００の断面形状は、曲線状などの他の形状でもよい。
【０１１２】
図１２では、隔壁４００の断面形状が三角形である場合について説明したが、これに限定されない。図１３に示されたように、隔壁４００の断面形状は、斜辺４０５，４０６と、上部壁１００１に対して平行な上部辺４０７を具備する台形状であってもよい。それ以外にも、隔壁４００の断面形状は多様であるが、いかなる場合にも、ボトルネック部４０１の最小間隔は、毛細管現象を誘発する間隔よりは広い。
【０１１３】
例えば、流血中癌細胞が含まれた血液を、試料チャンバ１１０内において遠心分離する場合、試料チャンバ１１０の内側から外側に、血漿層、白血球及び流血中癌細胞層、赤血球層の順序で遠心分離される。隔壁４００は、血漿層、白血球及び流血中癌細胞層の間に位置する。すなわち、隔壁４００は、血漿層が内側領域１１１に、白血球及び流血中癌細胞層、並びに赤血球層が外側領域１１２に位置するように、試料チャンバ１１０を区分することができる。さらに、隔壁４１０の外側領域１１２側の斜辺４０６が、血漿層、白血球及び流血中癌細胞層の間に位置するように形成される。これによって、遠心分離後、流血中癌細胞と微小粒子との結合を阻害するタンパク質が含まれた血漿層と、流血中癌細胞が含まれた層との混合可能性を低減できる。
【０１１４】
図１４は、他の実施形態に係る微小流体装置の平面図である。図１４を参照すれば、試料チャンバ１１０の円周方向に沿って、複数の隔壁４１０が互いに離隔されて配置され、複数の隔壁４１０間に、一つ以上の開口４２０が形成される。開口４２０の幅は、例えば、約２００μｍないし１ｃｍほどである。複数の隔壁４１０は、その長さが同一であってもよいし、あるいは複数の隔壁４１０のうち少なくとも一つは、残りと長さが異なってもよい。複数の隔壁４１０は、例えば、下部壁１００２から上部壁１００１に向かって延長されて形成される。これによって、試料チャンバ１１０は、半径方向に、回転中心ＲＣに近い内側領域１１１と、回転中心ＲＣから遠い外側領域１１２とに区分される。開口４２０によって、内側領域１１１と外側領域１１２とが互いに連結される。
【０１１５】
図１４に示されたように、開口４２０は、試料チャンバ１１０の内側から外側に行くほど細くなるように形成される。これによって、内側領域１１１から外側領域１１２への試料の流れを比較的円滑にでき、その反対方向への試料の流れを制限できる。さらに、複数の隔壁４１０のうち少なくとも一つは、図１２及び図１３に示されたように、上部壁１００１との間にボトルネック部４０１を形成することができる。図面には示されていないが、複数の隔壁４１０は、試料チャンバ１１０の上部壁１００１から下部壁１００２に向かって延長されてもよい。このような形態の隔壁４１０と、開口４２０は、図１Ｂ、図３、図４、図９、図１０に示された微小流体装置１にも適用される。
【０１１６】
前述の説明で多くの事項が具体的に記載されているが、それらは、発明の範囲を限定するものではなく、実施可能な構成の例示として解釈されなければならない。従って、本発明の範囲は、説明された実施形態によって決められるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的思想によって決められなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の微小流体装置及びそれを採用した標的細胞濃縮方法は、例えば、悪性腫瘍転移早期発見関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【符号の説明】
【０１１８】
１  微小流体装置、
１０  流体供給チャネル、
１５  流体供給弁、
２０  回収チャネル、
２５  回収弁、
３０  排出チャネル
３５  排出弁、
４０  第１チャネル、
４５  第１弁、
５０  第２チャネル、
５１，５２  連結チャネル、
５５  第２弁、
５６  第３弁、
５７  第４弁、
６０  第３チャネル、
６５  第５弁、
７０  移送チャネル、
７５  移送弁、
１００  流体供給部、
１０１，１０２  領域、
１１０  試料チャンバ、
１１１  内側領域、
１１２  外側領域、
１１３  底面、
１２０  粒子チャンバ、
１３０  溶解液チャンバ、
１４０  反応チャンバ、
２００  密度差分離部、
２１０  分離チャンバ、
２２０  回収チャンバ、
３００  廃棄物チャンバ、
４００，４１０  隔壁、
４０１  ボトルネック部、
４０４  頂点、
４０５，４０６  斜辺、
４０７  上部辺、
４２０  開口、
５００  装着部、
５１０  回転駆動部、
５２０  電磁波発生器、
５３０  制御部、
１００１  上部壁、
１００２  下部壁。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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