(57)【要約】【課題】汎用性が高く、かつ検出精度の高い核酸等温増幅方法、核酸等温増幅用マイクロチップ及び核酸等温増幅用試薬を提供すること。【解決手段】蛍光物質で標識されたシトシン〔Ｃ〕又はグアニン〔Ｇ〕が存在する標識プライマーを用いる核酸等温増幅方法。以下の（Ａ）又は（Ｂ）の核酸等温増幅用試薬及び当該試薬が反応領域内に保持される核酸等温増幅用マイクロチップ：（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬；（Ｂ）標標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマー。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在する標識プライマーを用いる核酸等温増幅方法。
【請求項２】
前記標識プライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在し、かつ、前記標識プライマーと標的核酸鎖が二本鎖を形成したときに当該蛍光物質の発光が減少する請求項１記載の核酸等温増幅方法。
【請求項３】
前記蛍光物質で標識されたシトシンが５’末端部分で存在する標識プライマーである請求項１記載の核酸等温増幅方法。
【請求項４】
標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、
前記標識プライマーの蛍光物質の発光の減少を検出する手順と、を含む請求項２記載の等温増幅方法。
【請求項５】
前記増幅産物を得る手順が、標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順である請求項４記載の等温増幅方法。
【請求項６】
前記増幅産物を得る手順の際に、さらに２種類のループプライマーを用いる請求項５記載の核酸等温増幅方法。
【請求項７】
前記増幅産物を得る手順の際に、前記標識プライマーとして、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在するプライマーを添加し用いる請求項４記載の核酸等温増幅方法。
【請求項８】
前記増幅産物を得るために使用する複数のプライマーのうちの少なくとも１種以上のプライマーが、前記標識プライマーとして用いられる請求項４記載の核酸等温増幅方法。
【請求項９】
前記ループプライマーのうちの少なくとも１種が、前記標識プライマーとして用いられる請求項６記載の核酸等温増幅方法。
【請求項１０】
前記標識プライマーの蛍光物質が、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、フルオロセイン及びその誘導体、並びにローダミン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上のものである請求項１記載の核酸等温増幅方法。
【請求項１１】
前記標的核酸鎖がＲＮＡ鎖である請求項１又は３記載の核酸等温増幅方法。
【請求項１２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬が反応領域内に保持される核酸等温増幅用マイクロチップ。
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、
蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
【請求項１３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬。
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、
蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、
前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸等温増幅方法、核酸等温増幅用マイクロチップ及び核酸等温増幅用試薬に関する。より詳細には、蛍光消光現象を利用したプライマーを用いる核酸等温増幅方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅方法として、ＰＣＲ法がよく用いられている。ＰＣＲ法は（１）熱変性、（２）アニーリング、（３）伸長反応の３つの温度ステップからなる温度サイクルと繰り返すことによって、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅を行うものである。
【０００３】
また、遺伝子の発現量解析やｃＤＮＡのクローニングのため、上記のＰＣＲ法の前段反応として、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する反応を加えたＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction）法が用いられてきている。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、前段の逆転写反応と後段の増幅反応とを一連の手順で行う１ステップＲＴ−ＰＣＲ法が普及している。
【０００４】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、まず逆転写反応において、発現解析やクローニングの対象とするＲＮＡ鎖（ｍＲＮＡ）から相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を合成する。この反応は、ＲＮＡ鎖と逆転写酵素、逆転写用のオリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液を通常４２℃前後に保持することによって行われる。続いて、増幅反応では、合成されたＤＮＡ鎖を鋳型として上述したＰＣＲ反応が行なわれる。増幅反応用のプライマーには、一般に、ＲＮＡ鎖（あるいは鋳型ＤＮＡ鎖）の塩基配列のうち、逆転写用のオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位とは異なる部位に結合するものが用いられる。
【０００５】
また、特許文献１には、ＰＣＲ法において、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、核酸プローブのシトシンに結合している蛍光色素の発光が減少することが開示されている。
【０００６】
近年、核酸増幅方法として、温度サイクルの繰り返しを要せず、より簡便な等温増幅と呼ばれる方法が用いられるようになっている。例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法では、オリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、核酸モノマー等の試薬と鋳型核酸鎖を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進行する。
【０００７】
ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法は、増幅対象核酸の６つの領域に対して４種類のプライマーを用いて、等温条件下で、鎖置換反応を利用した連続的な核酸増幅反応を行う方法である。ＬＡＭＰ法では、両端に相補的な配列を持ち、この相補的配列の自己アニールによって両端にループが形成された鋳型が合成される。ＬＡＭＰ法では、このループを介して増幅対象核酸が連続的に配列した増幅産物が得られる。
【０００８】
ＬＡＭＰ法のように増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法では、プローブ核酸が増幅産物と二本鎖形成（ハイブリダイゼーション）できるように、プローブ核酸は増幅産物において一本鎖が維持されているループ形成部位にハイブリダイズするように設計する必要があり、この設計には十分な検討が必要である。
【０００９】
例えば、特許文献１には、ＬＡＭＰ法による増幅産物の遺伝子型判定のためのプローブ核酸を、ＬＡＭＰ反応に特徴的にみられる一本鎖ループにアニーリングするように設計することが必須と記載されている。
【００１０】
また、ＬＡＭＰ法による核酸増幅の検出方法には、濁度検出法及びインターカレーター法を用いるのが一般的である。
濁度検出法は、核酸増幅反応の副産物であるピロリン酸をマグネシウムにて析出した白濁を、透過光の強弱によって濁度として検出する方法である。
インターカレーター法は、核酸増幅反応液中にＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩ等のＤＮＡインターカレーターを共存させておくことで、ＤＮＡ増幅反応を蛍光強度の増加として検出する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許３４３７８１６号公報
【特許文献２】特許３３１３３５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上述の懸濁検出法及びインターカレーター法のような検出方法は、安価であるというメリットがあり、また汎用性が高いものの、非特異的な増幅反応が生じた場合にもシグナルを検出してしまい、検出精度に問題があるのが実状である。
【００１３】
そこで、本技術は、汎用性が高く、かつ検出精度の高い核酸等温増幅方法、核酸等温増幅用マイクロチップ及び核酸等温増幅用試薬を提供することを主な目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本技術は、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在する標識プライマーを用いる核酸等温増幅方法を提供するものである。
前記標識プライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在し、かつ、前記標識プライマーと標的核酸鎖が二本鎖を形成したときに当該蛍光物質の発光が減少してもよい。
前記蛍光物質で標識されたシトシンが５’末端部分で存在する標識プライマーでもよい。
【００１５】
標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、前記標識プライマーの蛍光物質の発光の減少を検出する手順と、を含むものでもよい。
前記増幅産物を得る手順が、標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順でもよい。
前記増幅産物を得る手順の際に、さらに２種類のループプライマーを用いてもよい。
前記増幅産物を得る手順の際に、前記標識プライマーとして、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在するプライマーを添加し用いてもよい。
前記増幅産物を得るために使用する複数のプライマーのうちの少なくとも１種以上のプライマーが、前記標識プライマーとして用いられてもよい。
前記ループプライマーのうちの少なくとも１種が、前記標識プライマーとして用いられてもよい。
前記標識プライマーの蛍光物質が、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、フルオロセイン及びその誘導体、並びにローダミン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上のものでもよい。
前記標的核酸鎖がＲＮＡ鎖でもよい。
【００１６】
本技術は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬が反応領域内に保持される核酸等温増幅用マイクロチップを提供するものである。
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、  蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
【００１７】
本技術は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬を提供するものである。
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、  蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
【００１８】
本技術において、「核酸等温増幅反応」には、温度サイクルを伴わない各種核酸増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（transcription-reverse transcription concerted）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等が挙げられ、核酸の増幅を目的とする等温反応が広く包含されるものとする。
【００１９】
また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイム（ＲＴ）−ＬＡＭＰ法などの核酸鎖の増幅とともに増幅された核酸鎖の定量を伴う反応も含まれ得る。
【００２０】
本技術において、「核酸」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡの双方を含み、天然物及び人工物の何れも含まれる。また、「核酸」は、一般的に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物、微生物組織、細胞、培養物、分泌物（鼻汁等）、咽頭・鼻腔等からの拭い液、血液（血漿等）、髄液、排泄物（尿等）等が挙げられる。さらに、当該生物学的試料には、ウイルス、マイコプラズマのような細胞内寄生体のゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡが含まれる。また、「核酸」は、生物学的試料から含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。例えばｍＲＮＡを元に合成されたｃＤＮＡや、生物学的試料に由来する核酸を増幅された核酸は、本技術の核酸の代表的なものである。
【発明の効果】
【００２１】
本技術により、汎用性が高く、かつ検出精度の高い核酸等温増幅方法、核酸等温増幅用マイクロチップ及び核酸等温増幅用試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本技術の標識プライマーと標的核酸鎖とが二本鎖を形成して、蛍光が消光することを説明する図である。
【図２】核酸等温増幅反応の初期段階における核酸鎖の合成反応を説明する図である。
【図３】核酸等温増幅法による核酸鎖の合成反応を説明する図である。
【図４】本技術に係るマイクロチップの構成を説明するための図である。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図を示す。
【図５】実験例１のＱＰｒｉｍｅｒ、実験例３のＱＰｒｉｍｅｒ、実験例２のＱＰｒｏｂｅ、実験例４のＱＰｒｏｂｅを用いた場合の、それぞれの検出結果を示す図である。
【図６】実験例１のＱＰｒｉｍｅｒ及び実験例３のＱＰｒｉｍｅｒを併用し、さらにループプローブを０，５，１０，２０ｐｍｏｌ添加した場合の、それぞれの検出結果を示す図である。
【図７】実施例５のＱＰｒｉｍｅｒを用いた場合、実施例６のＳＹＢＥＲを用いた場合の、それぞれの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．核酸等温増幅方法
（１）本技術の標識プライマー
（２）核酸等温増幅反応
（２−１）ＬＡＭＰ法
（２−２）第１〜第４のプライマー及び第１〜第２のループプライマー
（２−３）反応条件
２．核酸等温増幅用試薬
３．核酸等温増幅用マイクロチップ
【００２４】
１．核酸等温増幅方法
本技術に係る核酸等温増幅方法は、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在する標識プライマーを用いることを特徴とする。
図１に示すように、核酸等温増幅反応の際に、前記標識プライマーと標的核酸鎖が二本鎖を形成したときに、前記標識プライマーの蛍光物質の発光が減少する。
これは、二本鎖を形成したときに、当該標識プライマーの標識されたシトシンが標的核酸鎖のグアニンと対合すること、又は標識されたグアニンが標的核酸鎖のシトシンと対合することにより生じる現象を利用したものである。
これにより、核酸等温増幅反応の前後における蛍光物質の発光の減少を測定することにより、核酸の測定を行うことも可能である。このとき、本技術は、標的核酸鎖を、定量的に測定することも可能であり、また陽性−陰性判定することも可能である。
【００２５】
（１）本技術に用いる標識プライマー
本技術に用いる標識プライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）が塩基配列の何れかに存在するものである。
【００２６】
本技術の標識プライマーは、上述のように二本鎖を形成したときに、標識されたシトシン又はグアニンと対合する塩基及びその塩基から１〜３塩基以内にグアニン又はシトシンが少なくとも１塩基以上存在するように、標識プライマーの塩基配列が設計されている。
【００２７】
好ましくは、前記標識プライマーの５’末端部分が蛍光物質で標識されたものである。当該末端部分として、末端塩基及び末端塩基から１〜３塩基離れている部分が好適である。さらに、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンを前記標識プライマーの末端塩基に存在させることが好ましい。より好ましくは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニン（好適にはシトシン）を標識プライマーの５’末端に存在させることである。
【００２８】
本技術に係る蛍光物質は、一般的に核酸プライマーを蛍光標識化して核酸増幅の測定・検出に用いられるものが望ましい。このとき、当該蛍光物質は、蛍光物質で標識された核酸プライマーが標的核酸鎖とハイブリダイゼーションする前は蛍光物質にて発光し、ハイブリダイゼーションしたときにその発光が減少する蛍光物質が好適である。
前記蛍光物質は、例えば、ＢＯＤＩＰＹシリーズ、フルオロセイン又はその誘導体、フルオロセイン及びその誘導体、並びにローダミン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上のものであるのが好ましい。使用する蛍光物質に応じて、核酸増幅の検出を適宜選択すればよい。例えば、励起波長４５０−４９０ｎｍ、測定波長５１５−５３０ｎｍにて検出可能な蛍光物質が好適である。
【００２９】
前記フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類として、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）等が挙げられる。
また、前記ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体として、例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine)、テキサスレッド(Texas red)及びＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ等を挙げることができる。
前記ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズとして、ボデピーFL(商標名)、ボデピーFL/C3（商標名）、ボデピーFL/C6（商標名）、ボデピー5-FAM（商標名）、ボデピーTMR（商標名）又はその誘導体（例えば、ボデピーTR（商標名）、ボデピーR6G（商標名）、ボデピー564（商標名）及びボデピー581（商標名）等が挙げられる。これらは、モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製から購入することが可能である。
【００３０】
これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピーFL/C3、ボデピーFL/C6等が好適である。
さらに、FITC、TMR、6-jeo、ボデピーFL/C3、ボデピーFL/C6をより好適なものとして挙げることができる。
なお、これらを単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
本技術に係る標識プライマーの塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、より好ましくは１０〜２０である。
【００３２】
本技術の標識プライマーは、公知の蛍光物質で標識されたプライマーを製造する方法にて得ることができるし、標的核酸鎖に対応可能なものを購入してもよい。
【００３３】
また、本技術の標識プライマーは、公知の標識方法により、標的核酸鎖とハイブリダイゼーションするプライマー中のシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）に、蛍光物質を標識することにより得ることが可能である。例えば、Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic acids Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年参照。
【００３４】
例えば、標的核酸鎖と結合させるプライマーの末端部分のシトシン又はグアニンに蛍光物質を結合させればよい。また、標的核酸鎖と結合させるプライマーの末端部分がシトシン又はグアニンになるように削除、置換、付加等の手法により調製し、そのプライマーの末端部分のシトシン又はグアニンに蛍光物質を結合させてもよい。また、標的核酸鎖と結合するプライマーの末端に、シトシン又はグアニンに蛍光物質を標識した１〜３塩基を付加してもよい。
【００３５】
本技術の標識プライマーとして、後述するＬＡＭＰ法における、第１〜第４のプライマー、第５〜第６のプライマー（ループプライマー）、これら以外に添加するプライマーを、上述のような標識プライマーに調製して、使用することが可能である。
ここで、ＬＡＭＰ法における第１〜第６のプライマーを、総称して「ＬＡＭＰ用プライマー」という。また、このＬＡＭＰ用プライマーに上述の如く「Ｃ−蛍光物質」又は「Ｇ−蛍光物質」が少なくとも存在する本技術の標識プライマーを、ＬＡＭＰ用標識プライマーともいう。
【００３６】
（２）核酸等温増幅反応
本技術の核酸等温増幅反応の手順では、標的核酸鎖を対象として増幅反応を行う。このとき、本技術の標識プライマーを用い、当該標識プライマーの蛍光物質の発光の減少を検出する。当該標的核酸鎖として、ＲＮＡ及びＤＮＡ等が挙げられる。
後記実施例に示すように、本技術は、異なる本技術の標識プライマーセットを２種以上組み合わせて、同一標的核酸鎖（特にＲＮＡ鎖）に対して使用することが可能である。このように複数の標識プライマーセットを用いることが可能であることから、本技術は、ＲＮＡウイルス（特に変異性の高いウイルス）の検出に対して有効である。このように、本技術は、核酸等温増幅において、設計の可能な本技術の標識プライマーを用いることで、変異性の高いウイルスの検出にも使用可能である。すなわち、本技術は、汎用性が高く、かつ検出精度の高い優れた技術である。
【００３７】
前記ＲＮＡウイルスとしては、例えば、アレナウイルス科（ラッサウイルス等）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルス等）、カリシウイルス科（ノロウイルス、サポウイルス等）、コロナウイルス科（ＳＡＲＳウイルス等）、トガウイルス科（風疹ウイルス等）、ノダウイルス科（ウイルス性神経壊死症ウイルス等）、パラミクソウイルス科（ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス等）、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス等）、フィロウイルス科（マールブルグウイルス、エボラウイルス等）、ブニヤウイルス科（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス等）、フラビウイルス科（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス等）、ラブドウイルス科（狂犬病ウイルス等）、レオウイルス科、レトロウイルス科（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ＳＴＬＶ等）等が挙げられる。
このうち、変異性が高いウイルスである、ヒト（Ａ−Ｃ型）やトリ等のインフルエンザウイルス；免疫不全ウイルス（ヒト（ＨＩＶ）、サル、ネコ、ウマ等）等が、本技術では有利である。
【００３８】
本技術の核酸等温増幅反応は、ＬＡＭＰ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法等行うことができる。増幅反応により目的増幅核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物が得られる。この核酸等温増幅反応において、本技術の標識プライマーを用い、当該標識プライマーの蛍光物質の発光の減少を検出する。
【００３９】
（２−１）ＬＡＭＰ法
ＬＡＭＰ法を用いて核酸等温増幅反応を行う場合、標的核酸鎖の６つ又は８つの領域に対して４種又は６種のプライマー（以下、「第１〜第４のプライマー」ともいう）を設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることができる。好適には、標的核酸鎖の８つの領域に対して６種のプライマーである。
、後述する第１及び／又は第２のループプライマーを用いるのが好適である場合がある。
【００４０】
増幅反応は、第１〜第４のプライマー、（第１〜第２のループプライマー）、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質（核酸モノマー）、反応緩衝液（バッファー）等を混合し、一定温度（６５℃）で保持することで反応が進み、標的核酸鎖がループを介して連続的に配置した増副産物が得られる。
【００４１】
なお、ＬＡＭＰ法に用いる各種プライマーは、種々のＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトウェアにて作成することが可能である。例えば、株式会社富士通システムソリューションズが提供するインターネットサイト（http://primerexplorer.jp/index.html）の、「Primer Explorer V3」「Primer Explorer V4」のソフトウェアを用いて設計することが可能である。
【００４２】
（２−２）第１〜第４のプライマー及び第１〜第２のループプライマー
図２には、第１〜第２のプライマー及び第３〜４のプライマーを示している。第１プライマーは「ＦＩＰ」と示し、第２プライマーは「Ｆ３」と示している。第３プライマーは「ＢＩＰ」と示し、第２プライマーは「Ｂ３」と示している。
【００４３】
「ＦＩＰプライマー」は、Ｆ２ｃ領域に相補的な配列であるＦ２配列と、Ｆ１ｃと同一の配列を含むものであり、例えば、Ｆ２の５’側に、Ｆ１ｃ配列の３’側が連結した構造を有するものが挙げられる。このＦＩＰプライマーをＦ２ｃにアニールさせることとなる。
ここで、「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリックモデルに基づく塩基対結合によって二本鎖を形成することをいう。
【００４４】
「Ｆ３プライマー」は、Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマーである。このＦ３ｃプライマーを鋳型核酸鎖のＦ３ｃ配列にアニールさせることとなる。そして、アニールさせたＦ３プライマーを合成起点として鎖置換型ＤＮＡ合成を行わせる。
ここで、「鎖置換型ＤＮＡ合成」とは、プライマーを合成起点とする相補鎖合成反応の鋳型に他のポリヌクレオチドがすでに二本鎖構造となっているときに、そのポリヌクレオチドを鋳型から分離しながら相補鎖合成が進行する反応をいう。
【００４５】
「ＢＩＰプライマー」は、Ｂ２ｃ領域に相補的な配列であるＢ２配列と、Ｂ１ｃと同一の配列を含むものであり、例えば、Ｂ２の５’側に、Ｂ１配列に対して相補的な配列Ｂ１ｃの３’側が連結した構造を有するものが挙げられる。このＢＩＰプライマーをＢ２ｃにアニールさせることとなる。
【００４６】
「Ｂ３プライマー」は、Ｂ３ｃに相補的な配列Ｂ３を含むプライマーである。このＢ３プライマーを鋳型核酸鎖のＢ３ｃ配列にアニールさせることとなる。そして、アニールさせたＢ３プライマーを合成起点として鎖置換型ＤＮＡ合成を行わせる。
【００４７】
なお、上述したＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーの４種類のプライマーを用いて等温増幅反応を行うものである。
なお、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーを使用せずに、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーの２種のプライマーのみを使用することによっても、等温増幅反応を起こさせることが可能である。その場合には、反応系中にベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド等の融解温度（Ｔｍ）調整剤を共存させることが好ましい。
【００４８】
そして、ＬＡＭＰ法では、さらに第５及び／又は第６のプライマーとして、ループ形成部分に対するループプライマー（以下、「第１及び／又は第２のループプライマー」ともいう）を用いるのが好適である（図示せず）。
第１のループプライマー（ループプライマーＦ）は、Ｆ２を含むループに相補鎖合成の起点を与えることができ、第２のループプライマー（ループプライマーＲ）はＲ２を含むループに相補鎖合成の起点を与えることができる。このループプライマーＦ（又はＲ）は、Ｆ２（又はＲ２）を含むループに対してアニールする。
【００４９】
好ましくは、ループプライマーはＲ１−Ｒ２間（又はＦ１−Ｆ２間）の領域に相補鎖合成の起点を与えるものが好適である。このループは、標的核酸鎖におけるＲ１−Ｒ２間（又はＦ１−Ｆ２）にかけての領域で構成されている。このようなループに対して、第１〜第２のループプライマーは、ループを構成する塩基配列に相補的な塩基配列を含む任意の塩基配列からなるヌクレオチドをループプライマーとすることができる。
ループプライマーを用いることで、２種類又は４種類のプライマーのみを用いる場合に比べて増幅反応の起点となるプライマーのアニーリング部位を増やして増幅反応時間を短縮することができる。
例えば、第１のループプライマーは、前記ＦＩＰプライマーの伸長生成におけるこのＦＩＰプライマーに由来する領域と、前記ＦＩＰプライマーに対して任意に設定した領域の間において相補鎖合成の起点を与えることが可能となる。
【００５０】
（２−３）反応条件
本技術の核酸等温増幅方法は、本技術の標識プライマーを用いて行う方法であれば特に限定されない。例えば、以下の方法(i)及び（ii）が挙げられる。
方法（i）ＬＡＭＰ法の各種プライマー（ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、プライマーＦ３及びプライマーＲ３、ループプライマーＦ及びループプライマーＲ）に、本技術の標識プライマーを配合すること。
方法（ii）この各種プライマーのうち少なくとも１種以上のプライマーを、そのプライマー内に上述のように「シトシン−蛍光物質」及び／又は「グアニン−蛍光物質」を形成し、本技術の標識プライマーとして、利用すること。
そして、本技術の方法であれば、特に特殊な反応条件設定をすることもなく、通常用いられているＬＡＭＰ法にて、核酸増幅を検出することが可能である。このため、本技術の方法は汎用性が高いと言え、簡便な操作で行うことが可能である。
【００５１】
通常用いられているＬＡＭＰ法について、以下説明する。
このＬＡＭＰ法を行うとき、本技術の標識プライマーからの蛍光を検出することとなるため、本技術の標識プライマーを利用した後述する核酸等温増幅用試薬を使用するのが好適である。
ＬＡＭＰ法における反応は、緩衝液中にて、鋳型となる一本鎖の核酸に対して、以下の成分（i）〜（iii）を加える。これら成分に本技術の標識プライマーを配合してもよいし、成分（i）のプライマーの一部又は全部を本技術の標識プライマーに改変してもよい。
これにより、ＦＩＰ及びＢＩＰを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。
インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
成分（i）４種類のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、プライマーＦ３及びプライマーＲ３。さらに好適には、２種のループプライマーＦ及び／又はループプライマーＲ。
成分（ii）鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ。
成分（iii）ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチド。
なお、上記２つの態様のＬＡＭＰ法において使用するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーをインナープライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーをアウタープライマーともいう。
アウタープライマーからのヌクレオチド鎖合成は、インナープライマーからのヌクレオチド鎖合成よりも後に開始される必要がある。これを達成する方法として、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く設定する方法などが挙げられる。具体的には、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも、２〜５０倍、好ましくは４〜２５倍高く設定することにより実施することができる。
【００５２】
また、上記鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ（鎖置換型ポリメラーゼともいう）としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、E.coli DNA ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Deep Vent DNAポリメラーゼ、Deep Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Deep Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）等が挙げられる。
【００５３】
このＬＡＭＰ反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行う。
緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整する。塩類としてはMgCl2、KCl、NaCl、（NH4)2SO4等が挙げられ、酵素の活性維持と核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。
【００５４】
融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ベタイン（N,N,N,-トリメチルグリシン）、トリメチルアミンＮ−オキシド（TMANO）、プロリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ホルムアミドが利用される。融解温度（Ｔｍ）の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。
特に、ベタイン及びトリメチルアミンＮ−オキシド（TMANO）は、その安定（isostabilize）作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。
【００５５】
一般的なＬＡＭＰ法の等温増幅反応の過程を説明する。
標的核酸鎖と本技術の核酸等温増幅用試薬（全試薬）を混合し、６５℃でインキュベートすることにより、以下に示す反応手順が進行する。そして、本技術の標識プライマーを用い、当該標識プライマーに結合している蛍光物質の発光を検出する。
〔ステップ１〕  ６５℃付近にすることで、第１〜第４のいずれかのプライマーが二本鎖ＤＮＡの相補的な部分にアニールし、そこから伸長することで片側の鎖がはがされて一本鎖状態になる（図３Ａ参照）。なお、６５℃付近では、二本鎖ＤＮＡは動的平衡状態にある。
〔ステップ２〕  鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
〔ステップ３〕  ＦＩＰの外側にＦ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長していく（図３Ｂ参照）。
〔ステップ４〕  Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
〔ステップ５〕  ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなる。このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１を持つため、自己アニールを起こしてループを形成する。
〔ステップ６〕  上記〔ステップ６〕のループ形成ＤＮＡ鎖に対してＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡの合成が行われる。この過程でループは剥がされて伸びることとなる（図３Ｃ参照）。
さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールする。その３’末端を起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長していく。
〔ステップ７〕  上記〔ステップ６〕の過程により２本鎖ＤＮＡができる。
〔ステップ８〕  また、〔ステップ６〕の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため自己アニールし、ループを形成してダンベル型の構造となる（図３Ｄ参照）。この〔ステップ８〕のダンベル型の構造を形成したＤＮＡ鎖は、ＬＡＭＰ法における増幅サイクルの起点構造となるものである。
【００５６】
以下にＬＡＭＰ法の増幅サイクルを説明する。
〔ステップ９〕  〔ステップ８〕のダンベル型の構造で、３’末端のＦ１領域を起点として自己を鋳型としたＤＮＡ合成が伸長する。この時、５’末端側のループは剥がされて伸びる。
さらに、３’末端側のループのＦ２ｃ領域は一本鎖であるためＦＩＰがアニールすることができる。そのＦ２領域の３’末端を起点として、Ｆ１領域から先に合成されているＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長していく。
〔ステップ１０〕  〔ステップ９〕において、ＦＩＰから伸長合成されたＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖となったＦ１領域から伸長したＤＮＡ鎖は、その３’末端側に相補的な領域を持つためループを形成する。
このループのＢ１領域の３’末端から、一本鎖となった自己を鋳型としてＤＮＡ合成が開始される。そして、そのＤＮＡ鎖が２本鎖部分となっているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながら伸長し、〔ステップ１０〕の構造となる。
〔ステップ１１〕  上記の過程によって、ＦＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は一本鎖となり、その両端にそれぞれ相補的な領域Ｆ１、Ｆ１ｃ及びＢ１ｃ、Ｂ１を持っている。このため、自己アニールしてループを形成し、〔ステップ１１〕の構造となる。
この〔ステップ１１〕の構造は、前記〔ステップ８〕の構造と全く相補的な構造となる。
〔ステップ１２〕  〔ステップ１１〕の構造では、〔ステップ８〕の場合と同様にＢ１領域の３’末端を起点として自己を鋳型としたＤＮＡ合成が行われる。さらに一本鎖となっているＢ２ｃ領域にＢＩＰがアニールしてＢ１領域からのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が行われる。そして、〔ステップ８〕〔ステップ９〕〔ステップ１１〕と同様の過程を経て再び〔ステップ８〕の構造が形成される。
〔ステップ１３〕  〔ステップ１０〕の構造において、一本鎖となっているＢ２ｃ領域にＢＩＰがアニールし、２本鎖部分を剥がしながらＤＮＡ鎖が合成される。そして、これらの過程の結果、同一鎖上に互いに相補的な配列を繰り返す構造の増幅産物がいろいろなサイズで形成される。
【００５７】
なお、標的核酸鎖としてＲＮＡ鎖を使用する場合には、逆転写反応におけるＤＮＡ合成反応を行えばよい。逆転写反応のときに使用する反応溶液には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素（例えば、Ｂｓｔ酵素）、逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ酵素）、プライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、緩衝液溶液等が含まれる。
逆転写反応では、目的ＲＮＡ鎖と反応溶液とを混合し反応温度に保持して、目的ＲＮＡ鎖から鋳型ＤＮＡ鎖を合成する。
例えば、目的ＲＮＡ鎖の領域Ｂ３ｃ或いは領域Ｆ３ｃにプライマーＢ３或いはプライマーＦ３によって、ＲＮＡを鋳型にしたＲＴ−ＬＡＭＰでの1st-stanrad  ＤＮＡ合成が行われる。また、目的ＲＮＡ鎖の領域Ｂ２ｃ或いは領域Ｆ２ｃにプライマーＢＩＰ或いはプライマーＦＩＰがアニール（結合）し、逆転写酵素によって目的ＲＮＡ鎖に相補的な鋳型ＤＮＡ鎖が合成される場合も有り得る。
なお、目的ＲＮＡ鎖をセンス鎖としたときにアンチセンス鎖となるＲＮＡ鎖が存在する場合には、アンチセンスＲＮＡ鎖の領域Ｆ２ｃに結合したプライマーＦＩＰを起点として同様の逆転写反応が進行する。
逆転写反応は、所定の反応温度（例えば、４０〜６５℃）で行われる。反応温度は、逆転写酵素が活性を示す温度範囲内において任意の温度が選択できる。
そして、順次、等温増幅が行われ、増幅産物が形成される。
【００５８】
ここで、一般的に、蛍光消光現象を利用した核酸プローブがＰＣＲによる核酸増幅反応検出の際に利用されており、この蛍光消光現象を利用した核酸プローブがＰＣＲ増副産物に結合し、結合したときの蛍光消光率により核酸増幅の定量が行われている。この核酸プローブは特異性が高いために、精度のよい検出ツールとして多用されている。
一方、蛍光消光現象を利用した核酸プライマーがＰＣＲによる核酸増幅反応検出に利用されているが、この核酸プライマーから伸長してＰＣＲ増幅産物が形成され、このＰＣＲ増幅産物が二本鎖の状態で蛍光が消光したときの蛍光消光率により定量を行っている。
しかしながら、蛍光消光現象を利用した核酸プライマーのＰＣＲ増幅反応の際に、この核酸プライマー同士でハイブリダイゼーションが発生し、消光が生じることがある。このため、蛍光消光現象を利用した核酸プライマーは、蛍光消光現象を利用した核酸プローブと比較して、検出精度が悪い検出方法として当業者によって認識されている。
【００５９】
このような実状から、検出精度を向上させるため、増幅核酸対象との特異性の高い核酸プローブを当業者であれば選択し、この核酸プローブが好適になる条件を種々検討するのが当業者の技術常識と言える。
しかしながら、後記実施例に示すように、核酸等温増幅検出において、蛍光消光現象を利用した核酸プローブを用いたにも拘わらず、精度よく蛍光検出ができなかった。
このような場合には、当業者であれば、核酸等温増幅検出において、蛍光消光現象を利用する場合には、核酸プローブの再設定を検討するのが一般的である。
【００６０】
しかしながら、後記実施例に示すように、本発明者は、当業者であれば検出精度を向上させるためには着目しないであろう蛍光消光現象を利用した核酸プライマーに着目し、核酸等温増幅反応に試みた。そして、当業者でも全く予測し得ないことに、本技術の標識プライマーを利用すると等温増幅反応を定性的に測定することも可能であることを見出した。なお、本技術では、定量的に測定することも可能である。
しかも、後記実施例に示すように、本技術の標識プライマーを、通常の等温増幅検出用試薬と一緒に使用しても、核酸等温増幅検出を行うことが可能であった。その上、本技術の標識プライマーを用いた場合には、核酸等温増幅検出において用いられているインターカレーター法と比較して、より検出精度が向上することも見出した。
【００６１】
さらに、本発明者は、等温増幅検出用試薬のループプライマーと同一の塩基配列を有する本技術の標識プライマーを作成し、これを用いて等温増幅検出を行うことができた。よって、ループプライマーを用いても検出阻害されることがないことも見出した。
このことは、等温増幅反応において、増幅核酸対象の６つの領域に対して設定された４〜６種類のプライマー及びループプライマーのいずれかのプライマーを本技術のような標識プライマーに改変してもよいことを示唆している。
【００６２】
また、後記実施例に示すように、本技術の標識プライマーは、ＲＮＡウイルスのような変異性の高いウイルスを検出する場合に、複数の本技術の標識プライマーセットを用いても良好に検出することができた。
このため、測定対象物（標的核酸鎖）に応じて、本技術の標識プライマーセットを複数設定し、これらを用いることも可能である。また、変異性の高いものを検出するための試薬キットの検出精度を向上させることが困難な場合もあるが、本技術を用いれば容易に検出精度を向上させることが可能である。このように本技術は、通常の核酸等温増幅法（特にＬＡＭＰ法）に本技術の標識プライマーを簡便に適用することができ、医薬品認証が必要となる医薬用途では有益と言える。
【００６３】
２．核酸等温増幅用試薬
本技術の核酸等温増幅用試薬は、上述した本技術の標識プライマー及びＬＡＭＰ用プライマー等を利用したものである。例えば、以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬が挙げられる。なお、「標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬」とは、上記ＬＡＭＰ法にて説明した試薬である。使用方法は、上記「１．核酸等温増幅方法」のとおりである。
【００６４】
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
【００６５】
前記（Ａ）試薬において、前記標識プライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンを有するＬＡＭＰ用プライマーを除くものであってもよい。
また、前記（Ｂ）〜（Ｄ）試薬において、本技術の標識プライマー（ＬＡＭＰ用標識プライマーを除く）を配合してもよい。
また。前記（Ｃ）試薬において、本技術の標識プライマー（ＬＡＭＰ用第１〜第４の標識プライマーを除く）を配合してもよい。
また。前記（Ｄ）試薬において、本技術の標識プライマー（ＬＡＭＰ用第１〜第２の標識ループプライマーを除く）を配合してもよい。
【００６６】
３．核酸等温増幅用マイクロチップ
また、本技術の核酸等温増幅用マイクロチップは、上述した本技術の標識プライマー及びＬＡＭＰ用プライマー等を利用したものが反応領域内に保持されるチップが好適である。より具体的には、本技術の核酸等温増幅用マイクロチップは、前記「２．核酸等温増幅用試薬」で説明した（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬が反応領域内に保持されるチップが好適である。
使用方法は、マイクロチップ１のウェルにサンプル液を導入させた後は、上記「１．核酸等温増幅方法」のとおりである。
【００６７】
本技術に係る核酸等温増幅用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を図５に示す。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する。
断面図を示す。
【００６８】
マイクロチップ１には、外部から液体（サンプル溶液）が導入される導入部２と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル（反応領域）４１，４２，４３，４４，４５と、一端において導入部２に連通する流路３１，３２，３３，３４，３５が配設されている。ここでは、マイクロチップ１に縦横５例で合計２５個のウェルを均等間隔で配設する場合を例として、これら２５個のウェルを５区分し、１区分のウェル５つに同一の符号を付した。流路３１の他端は、５つ配設されたウェル４１のそれぞれに接続されている。同様に、流路３２，３３，３４，３５の他端も、各５つ配設されたウェル４２，４３，４４，４５のそれぞれに接続されている。
【００６９】
導入部２から導入されたサンプル溶液は、流路３１，３２，３３，３４，３５を送液され、ウェル４１，４２，４３，４４，４５の内部に供給される。サンプル溶液には、塩基配列の解析を行う増幅対象核酸が含まれ得る。
【００７０】
マイクロチップ１は、導入部２、流路３１，３２，３３，３４，３５、ウェル４１，４２，４３，４４，４５を形成した基板層１１に基板層１２を貼り合わせて構成されている。
【００７１】
前記基板層１１，１２の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とすることができる。
前記基板層の材料は、光学検出部から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいため光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
また、好ましくは、基板層をガス不透過性を備える材料で構成する。マイクロチップの外面を構成する基板層をＰＣなどのガス不透過性を備える材料とすることで、ウェル内に導入された試料溶液が、核酸増幅反応における加熱によって気化し、基板層を透過して消失（液抜け）するのを防止できる。また、マイクロチップの試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、マイクロチップ外からの空気の浸透を防いで内部の負圧を保持するためにも、基板層をガス不透過性を備える材料で構成することが好ましい。また、試料を導入するシリンジ等の針で穿通できるものが好ましい。
【００７２】
ウェル４１，４２，４３，４４，４５内には、本技術の核酸等温増幅用試薬が保持されている。
本技術の核酸等温増幅用試薬は、増幅産物を得るために必要な物質を含むものである。具体的には、例えばＬＡＭＰ法を用いて増幅反応を行う場合、上述したプライマー（本技術の標識プライマー、ＬＡＭＰ用プライマー等）、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質（核酸モノマー）、反応緩衝液（バッファー）溶質等とされる。
【００７３】
標的核酸鎖を含むサンプル液をウェル内に導入後、上述した増幅反応手順を行う。そして、本技術の標識プライマーの蛍光物質の発光が検出できるように検出器にて測定すればよい。
【００７４】
本技術のマイクロチップは、公知の製造方法で製造することが可能である。例えば、マイクロチップは、基板層にウェル等を形成後に、ウェル内に試薬等を入れて、基板層を貼り合わせて形成することができる。
前記基板層のウェル、流路等の形成は、ウェットエッチングやドライエッチングによって、またナノインプリントや射出成形、機械加工によって行うことが可能である。
【００７５】
なお、本技術は以下のような構成を採用することも可能である。
〔１〕  蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在する標識プライマーを用いる核酸等温増幅方法。
〔２〕  前記標識プライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが存在し、かつ、前記標識プライマーと標的核酸鎖が二本鎖を形成したときに当該蛍光物質の発光が減少する前記〔１〕記載の核酸等温増幅方法。
〔３〕  前記蛍光物質で標識されたシトシンが５’末端部分で存在する標識プライマーである前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸等温増幅方法。
〔４〕  標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、
前記標識プライマーの蛍光物質の発光の減少を検出する手順と、を含む前記〔１〕又は〔２〕記載の等温増幅方法。
〔５〕  前記増幅産物を得る手順が、標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順である前記〔４〕記載の等温増幅方法。
〔６〕  前記増幅産物を得る手順の際に、さらに２種類のループプライマーを用いる前記〔５〕記載の核酸等温増幅方法。
〔７〕  前記増幅産物を得る手順の際に、前記標識プライマーとして、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在するプライマーを添加し用いる前記〔１〕〜〔４〕の何れか１項記載の核酸等温増幅方法。
〔８〕  前記増幅産物を得るために使用する複数のプライマーのうちの少なくとも１種以上のプライマーが、前記標識プライマーとして用いられる前記〔４〕〜〔７〕の何れか１項記載の核酸等温増幅方法。
〔９〕  前記ループプライマーのうちの少なくとも１種が、前記標識プライマーとして用いられる前記〔６〕記載の核酸等温増幅方法。
〔１０〕  前記標識プライマーの蛍光物質が、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、フルオロセイン及びその誘導体、並びにローダミン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上のものである前記〔１〕〜〔９〕の何れか１項記載の核酸等温増幅方法。
〔１１〕  標的核酸鎖がＲＮＡ鎖である前記〔１〕〜〔１０〕の何れか１項記載の核酸等温増幅方法。
【００７６】
〔１２〕  以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬が反応領域内に保持される核酸等温増幅用マイクロチップ。
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、  蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
また、前記標識プライマーが、前記〔１〕〜〔１２〕の何れか１項記載のものであるのが好適である。
また、前記核酸等温増幅用試薬が、後記〔１３〕記載のものであるのが好適である。
【００７７】
〔１３〕  以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の核酸等温増幅用試薬
（Ａ）標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、  蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーとを含む核酸等温増幅用試薬。
（Ｂ）標標的核酸鎖を該核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  この増幅に用いるプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｃ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記４種類のプライマーの少なくとも１種以上のプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
（Ｄ）標的核酸鎖の６つの領域に対して設定された４種類のプライマーとループプライマーを用いて標的核酸鎖がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬であり、  前記ループプライマーは、蛍光物質で標識されたシトシン又はグアニンが５’末端部分で存在する標識プライマーである核酸等温増幅用試薬。
また、前記標識プライマーが、前記〔１〕〜〔１２〕の何れか１項記載のものであるのが好適である。
【実施例】
【００７８】
以下、本技術を具体的に説明するために実験例等を挙げるが、本技術はこれに限定されるものではない。
【００７９】
＜実験例１〜４＞
実験例１〜４では、Ｈ１ｐｄｍインフルエンザのＲＮＡを鋳型核酸鎖（配列番号１）（Influenza A virus）として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行った。
実験例１及び２について、プライマーＦ３，Ｂ３，ＦＩＰ，ＢＩＰ，ＬＦ，ＬＢの塩基配列（配列番号２−７）を使用した。
また、実験例３及び４について、プライマーＦ３，Ｂ３，ＦＩＰ，ＢＩＰ，ＬＦ，ＬＢの塩基配列（配列番号８−１３）を使用した。これらを表１に示した。このＬＡＭＰ法用試薬は、栄研化学から購入したものを使用した。
実施例１及び３で使用したＱＰｒｉｍｅｒの塩基配列１４及び１５を表２に示した。また、実施例２及び４で使用したＱＰｒｏｂｅの塩基配列１６及び１７を表２に示した。これらは、日鉄環境エンジニアリングから購入した。実験例１〜４では、励起４５０−４９０ｎｍ、測定５１５−５３０ｎｍにて、蛍光検出を行った。
市販品のＬＡＭＰ法用試薬のプロトコルに従って、検出を行った。反応条件は、以下の＜反応条件＞のとおりである。
図５に示すように、ＱＰｒｉｍｅｒを使用した実験例１及び３の何れとも精度よく検出することが可能であった。しかし、Ｑｐｒｏｂｅを使用した実験例２及び４の何れとも、検出不可能であった。
【００８０】
＜反応条件＞
反応温度：６３℃
使用機器：Chromo4 (BioRad)
検出：１回／１分  チャンネル１
陽性コントロールサンプル：  A/Narita/1/2009(H1N1)pdm由来ＲＮＡ
【００８１】
【表１】
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【００８２】
【表２】
2014093996.tif 000004
【００８３】
【表３】
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【００８４】
【表４】
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【００８５】
【表５】
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【００８６】
＜実験例５＞
実験例１及び３で使用したQPrimerを併用し、さらにループプライマー２種を０、５、１０、５ｐｍｏｌ添加した以外は、上記実験例１と同様にして検出を行った。このループプライマーは、上述したQPrimer及びQProbeで使用した配列番号１４（１７）及び１６（１８）と全く同じ塩基配列で、蛍光物質等の修飾を施していないプライマー（配列番号１４及び１５：オペロンバイオテクノロジー社）である。その結果を図６に示す。
Qprimerでの検出反応に、同配列の通常のループプライマーを添加して反応速度を上げてもQprimerでの検出は阻害されなかった。
また、インフルエンザのような変異しやすい微生物は、プライマーセット等の検出キットが、変異により機能しなくなる恐れがある。しかし、実験例１及び３のプライマーを混合しても良好な検出結果であった。このことから、本技術であれば、標的核酸の変異により片方のプライマーセットが機能しなくなっても、もう片方が相補できることを確認した。このような点から、本技術では、一つの標的核酸に対して本技術の標識プライマーを二セット以上用いることが可能と考え、このため本技術の核酸等温増幅方法は、標的核酸鎖がＲＮＡ、特に変異性の高いウイルスのＲＮＡに対して有益といえる。
よって、市販品のランプ用試薬に本技術の標識プライマーを使用することができることが確認できた。これにより、複雑なモデル設計を検討しなくとも簡便に測定することができ、汎用性も高いと言える。また、本技術の標識プライマーを用いた場合、検出精度が高いと言える。
【００８７】
＜実験例６〜７＞
鋳型核酸を入れず、上記表６に示すプライマーセットを使用する以外は、実験例１と同様にして検出を行った。この結果を図７の上図に示す。また、Qprimerに変えて、SYBER Green Iを用いい、この結果を図７の下図に示す。
SYBER Green Iを用いた場合には鋳型核酸が存在しないにも拘わらず、蛍光の増加が認められたが、QPrimerを使用した場合いは、ほぼ直線的であった。
よって、Qprimerによる検出が、SYBER Green Iによる蛍光検出よりも、検出の特異性が高いと言える。
よって、複雑なモデル設計を検討しなくとも簡便に測定することができ、汎用性も高いと言える。また、本技術の標識プライマーを用いた場合、検出精度が高いと言える。
【００８８】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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