(57)【要約】      （修正有）【課題】標的細胞中におけるＰＤＸ−１オンコジーンの発現をノックダウンするための、二機能性ｓｈＲＮＡに基づく組成物及び方法、ＰＤＸ−１オンコジーンを過剰発現する組織を標的とするｓｈＲＮＡ含有発現ベクターを送達する方法の提供。【解決手段】プロモーターと、前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートとを含む発現ベクターであって、前記核酸インサートが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができ、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する、１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、発現ベクター。治療薬担体と、プロモーター、及び前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートを含む発現ベクターとを含む治療薬送達系。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと、
前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートと
を含む発現ベクターであって、前記核酸インサートが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができ、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する、１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、発現ベクター。
【請求項２】
ｓｈＲＮＡに１又は２以上のｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１オンコジーン発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ｓｈＲＮＡが二機能性ｓｈＲＮＡとしてさらに定義される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
１又は２以上のｓｈＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
標的とされる領域が、ＰＤＸ−１オンコジーン転写物の３’ＵＴＲ領域配列である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
治療薬担体と、
プロモーター、及びＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートを含む発現ベクターと
を含む治療薬送達系。
【請求項８】
治療薬担体が凝縮ＤＮＡナノ粒子である、請求項７に記載の送達系。
【請求項９】
ＤＮＡナノ粒子が、１又は２以上のポリカチオンで凝縮されている、請求項８に記載の送達系。
【請求項１０】
１又は２以上のポリカチオンが、１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）である、請求項８に記載の送達系。
【請求項１１】
凝縮ＤＮＡナノ粒子がさらにリポソーム中に封入されている、請求項８に記載の送達系。
【請求項１２】
リポソームが２層中空小胞（ＢＩＶ）である、請求項１１に記載の送達系。
【請求項１３】
リポソームが、可逆的にマスクされたリポソームである、請求項１１に記載の送達系。
【請求項１４】
リポソームが、１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分で装飾されている、請求項１１に記載の送達系。
【請求項１５】
１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項１４に記載の送達系。
【請求項１６】
治療薬担体がリポソームである、請求項７に記載の送達系。
【請求項１７】
リポソームが、１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分で装飾されている２層中空小胞（ＢＩＶ）であり、前記リポソームが可逆的にマスクされているリポソームである、請求項１６に記載の送達系。
【請求項１８】
「スマート」レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項１７に記載の送達系。
【請求項１９】
１又は２以上のｓｈＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む、請求項７に記載の送達系。
【請求項２０】
ＰＤＸ−１オンコジーンを発現する標的組織に１又は２以上のｓｈＲＮＡを送達する方法であって、
プロモーターと、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する前記１又は２以上のｓｈＲＮＡをコードする、前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートとを含む発現ベクターを調製するステップと、
前記発現ベクターを治療薬担体と組み合わせるステップであって、前記治療薬担体が１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分で装飾されているリポソームであるステップと、
治療有効量の前記発現ベクターと治療薬担体との複合体を、それを必要とする患者に投与するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
治療薬担体が凝縮ＤＮＡナノ粒子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡナノ粒子が１又は２以上のポリカチオンで凝縮されており、前記１又は２以上のポリカチオンが１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）又は３０ｍｅｒリジン縮合ペプチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
凝縮ＤＮＡナノ粒子がリポソーム中にさらに封入されており、前記リポソームが、２層中空小胞（ＢＩＶ）であり、１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分で装飾されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
リポソームが、可逆的にマスクされているリポソームである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
リポソームが２層中空小胞（ＢＩＶ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
リポソームが、可逆的にマスクされているリポソームである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
１又は２以上のｓｈＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
１又は２以上の標的細胞中のＰＤＸ−１オンコジーンの発現をサイレンシングする方法であって、
前記１又は２以上の標的細胞を選択するステップと、
前記ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターを前記標的細胞にトランスフェクトするステップと
を含み、前記１又は２以上の標的細胞への前記ベクターのトランスフェクションがＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーンの発現を阻害する方法。
【請求項３１】
ｓｈＲＮＡにｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ｓｈＲＮＡが二機能性ｓｈＲＮＡとしてさらに定義される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
標的とされる領域が、ＰＤＸ−１オンコジーン転写物の３’ＵＴＲ領域配列である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
１又は２以上のｓｈＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト対象における、腫瘍細胞成長の抑制、膵島新生物障害の治療又は両方の方法であって、
腫瘍細胞成長の抑制、膵島新生物障害の治療又は両方を必要とする前記ヒト対象を特定するステップと、
治療薬担体複合体中の発現ベクターを、腫瘍細胞成長の抑制、膵島新生物障害の治療又は両方に十分な量で、前記ヒト対象に投与するステップと
を含み、前記発現ベクターが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現し、前記ハイブリダイゼーションが腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止、又は侵襲性の低下をもたらす方法。
【請求項３７】
膵島新生物障害が、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、インスリノーマ及びカルチノイドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
二機能性ｓｈＲＮＡにｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
二機能性ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
１又は２以上のｓｈＲＮＡが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
標的とされる領域が、ＰＤＸ−１転写物の３’ＵＴＲ領域配列である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
膵島新生物障害が、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
治療薬担体が、凝縮ＤＮＡナノ粒子、又は１若しくは２以上の「スマート」レセプター標的化部分で装飾された、可逆的にマスクされたリポソームである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
ＤＮＡナノ粒子が、１又は２以上のポリカチオンで凝縮されており、前記１又は２以上のポリカチオンが、１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）又は３０ｍｅｒリジン縮合ペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
可逆的にマスクされたリポソームが２層中空小胞（ＢＩＶ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
１又は２以上の「スマート」レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
凝縮ＤＮＡナノ粒子がリポソーム中にさらに封入されている、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、遺伝子を標的とするがん療法の分野に、より詳しくは、膵臓神経内分泌腫瘍の治療のための新規な治療法及び薬物送達系の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を、膵臓神経内分泌腫瘍の治療としての、ＰＤＸ−１オンコジーンの発現を標的とするｓｈＲＮＡに基づく治療法の設計及び送達に関連して記載する。
【０００３】
膵島新生物（islet neoplasia）は、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、インスリノーマ
及びカルチノイドなどの、膵島細胞から生じる障害の総称である。膵島細胞腫瘍の５年生存率は３５〜５０％である（Hirshberg, B., et al., Malignant insulinoma: spectrum of unusual clinical features. Cancer, 2005. 104(2): pp. 264-72、Pavelic, K., et al., Molecular genetics of malignant insulinoma. Anticancer Res, 1996. 16(4A): pp. 1707-17）。膵島新生物は、比較的若年の患者（診断時年齢５０才）に発症する（Kaltsas, G.A., G.M. Besser, and A.B. Grossman, The diagnosis and medical management of advanced neuroendocrine tumors. Endocr Rev, 2004. 25(3): pp. 458-511、Pelengaris, S. and M. Khan, Oncogenic co-operation in beta-cell tumorigenesis. Endocr Relat Cancer, 2001. 8(4): pp. 307-14）。インスリノーマ患者は特に、効果的な治療が
ない、コントロール不能な低血糖症に非常に苦しむ。低血糖症は、高インスリン血症によって起こり、神経低糖症の症状、例えば、頭痛、めまい感、嗜眠、複視、発作及び交感神経活性化と共に現れる（Kaltsas, G.A., G.M. Besser, and A.B. Grossman, The diagnosis and medical management of advanced neuroendocrine tumors. Endocr Rev, 2004. 25(3): pp. 458-511）。外科手術が依然として最も効果的な治療法であり、効果的な術後
補助療法はない。原発腫瘍及び転移の同時摘除が可能であるとはいえ、再発率は依然として高い。さらに、生存率は全身療法で改善されていない（House, M.G. and R.D. Schulick, Endocrine tumors of the pancreas. Curr Opin Oncol, 2006. 18(1): pp. 23-9、Vezzosi, D., et al., Octreotide in insulinoma patients: efficacy on hypoglycemia, relationships with Octreoscan scintigraphy and immunostaining with anti-sst2A and
anti-sst5 antibodies. Eur J Endocrinol, 2005. 152(5): pp. 757-67）。したがって
、ＮＥＴを治療するための新規で効果的な治療方法が必要である。
【０００４】
膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ＰＤＸ−１，pancreatic duodenal homeobox-1）は、膵臓器官形成の胚転写因子であり、大部分のＮＥＴ及び全ての膵島細胞インスリノーマにおいて過剰発現される。転写因子ＰＤＸ−１遺伝子は、良性及び悪性インスリノーマにおけるインスリン分泌の制御に直接関与している（Brennan, M.F., Pancreatic cancer. J Gastroenterol Hepatol, 2000. 15 Suppl: pp. G13-6、Urgell, E., et al., Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19.9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. Eur J Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-75、Willett, C.G., W.J. Daly, and A.L. Warshaw, CA 19-9 is an index of response to neoadjunctive chemoradiation therapy in pancreatic cancer. Am J Surg, 1996. 172(4): pp. 350-2、Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front Biosci, 1998. 3: pp. E214-25）。これは、種々のがんでも認められ、増殖、分化及び移動と関係してい
ると考えられ、ＮＥＴの発生及び膵臓胚形成において主要な役割を担っている（Brennan,
M.F., Pancreatic cancer. J Gastroenterol Hepatol, 2000. 15 Suppl: pp. G13-6、Urgell, E., et al., Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational
analysis and CA 19.9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. Eur J Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-75、Willett, C.G., W.J. Daly, and A.L. Warshaw, CA 19-9 is an index of response to neoadjunctive chemoradiation therapy in pancreatic cancer. Am J Surg, 1996. 172(4):
pp. 350-2、Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front Biosci, 1998. 3: pp. E214-25、Brennan, M., Pancreatic cancer. J. Gastroenterol. Hepatol, 2000. 15: pp. G13-6、Urgell E, P.P., Boadas J, Capella G, Queralto MJM, Boluda R, et al, Prospective evaluation of the contribution of K-ras
mutational analysis and CA 19-9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer Eur. J. Cancer, 2000. 36(16): pp.
2069-2075、Willet C, D.W., Warshaw A., CA19-9 is an index of response to neoadjuvant chemoradiation in pancreatic cancer. Am. J. Surg, 1996. 172: pp. 350-352、Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front. Biosci 1998. 3: pp. 214-225）。成人膵臓において、ＰＤＸ−１はβ細胞の９０％によ
って発現され、インスリン、グルコキナーゼ及び２型グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）の発現を制御することが示されている（Watada, H., et al., PDX-1 induces insulin and glucokinase gene expressions in alphaTC1 clone 6 cells in the presence
of betacellulin. Diabetes, 1996. 45(12): pp. 1826-31、Bretherton-Watt, D., N. Gore, and D.S. Boam, Insulin upstream factor 1 and a novel ubiquitous factor bind
to the human islet amyloid polypeptide/amylin gene promoter. Biochem J, 1996. 313 ( Pt 2): pp. 495-502、Carty, M.D., et al., Identification of cis- and trans-active factors regulating human islet amyloid polypeptide gene expression in pancreatic beta-cells. J Biol Chem, 1997. 272(18): pp. 11986-93、Serup, P., et al., Induction of insulin and islet amyloid polypeptide production in pancreatic islet glucagonoma cells by insulin promoter factor 1. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(17): pp. 9015-20、Watada, H., et al., Involvement of the homeodomain-containing transcription factor PDX-1 in islet amyloid polypeptide gene transcription.
Biochem Biophys Res Commun, 1996. 229(3): pp. 746-51）。これらの遺伝子は、急性
高血糖症及び慢性高血糖症のいずれにおいても、グルコースホメオスタシスの維持に重要な役割を担う。急性高血糖症においては、ＰＤＸ−１はβ−細胞の細胞質から核に移動し、インスリンの産生及び分泌の増加の第１ステップとして、インスリン遺伝子を活性化する（Ballian, N., et al., Proliferation, hyperplasia, neogenesis, and neoplasia in the islets of Langerhans. Pancreas, 2007. 35(3): pp. 199-206、Hagman, D.K., et
al., Palmitate inhibits insulin gene expression by altering PDX-1 nuclear localization and reducing MafA expression in isolated rat islets of Langerhans. J Biol Chem, 2005. 280(37): pp. 32413-8）。
【０００５】
ＰＤＸ−１は多くのがんにおいて過剰発現されることが、本発明者らなどによって示された（Leys CM, N.S., Rudzinski E, Kaminishi M, Montgomery E, Washington MK, Goldenring JR, Expression of PDX-1 in human gastric metaplasia and gastric adenocarcinoma. Hum Pathol., 2006. 37(9): pp. 1162-8、Sakai H, E.Y., Li XL, Akiyama Y, Miyake S, Takizawa T, Konishi N, Tatematsu M, Koike M, Yuasa Y, PDX-1 homeobox protein expression in pseudopyloric glands and gastric carcinomas. Gut, 2004. 53(3): pp. 323-30、Miyatsuka T, K.H., Shiraiwa T, Matsuoka TA, Yamamoto K, et al, Persistent expression of PDX-1 in the pancreas causes acinar-to-ductal metaplasia through Stat3 activation. Genes Dev, 2006. 20(11): pp. 1435-40、Wang, X.P., et al., Tissue MicroArray analyses of pancreatic duodenal homeobox-1 in human cancers. World J Surg, 2005. 29(3): pp. 334-8）。特に、本発明者らは、ＰＤＸ−１が８０を超える膵臓がん及び膵島細胞新生物において過剰発現されることを発見した（Ayala, G.,Prognostic Value of Akt-1 in Prostate Cancer: A Computerized Quantitative Approach with Quantum Dot Technology, in Abstract and presentation. 2007, United States Academy of Pathology: San Diego）。また、インスリノーマの１００％においてＰＤＸ−１過剰発現が認められる。本発明者らは最近になって、ＰＤＸ−１が膵臓がん及びインスリノーマ細胞株の増殖及び浸潤を制御することを実証した（Liu, S., et al., PDX-1
acts as a potential molecular target for treatment of human pancreatic cancer. Pancreas, 2008. 37(2): pp. 210-20）。当業者ならば、がんにおけるＰＤＸ−１の過剰
発現を調節する組成物及び方法が提供されれば、このような組成物及び方法は有益であり、当技術分野への多大な貢献といえることがわかるであろう。同様に、薬物送達技術に精通した者ならば、非標的器官を迂回し、ＰＤＸ−１を過剰発現している標的器官への治療薬の送達を目標とする送達系が提供されれば、このような送達系は医療の実践において臨床的に有用であるといえることがわかるであろう。ＰＤＸ−１を標的とすることによる膵臓腺癌の治療戦略は、Brunicardiに対して発行された米国特許第６，７１６，８２４号明細書（２００４年）に示されている。この特許は、インスリン分泌細胞、例えば、β−細胞、ＰＤＸ−１陽性ヒト膵管癌及び特定の転写因子を含有する他の細胞を選択的に標的とする、ＲＩＰ−ｔｋ（ラットインスリンプロモーター-チミジンキナーゼ）コンストラク
トのための組換え核酸に関する。Brunicardiの発明は、膵臓がん、例えば、β−細胞インスリノーマの治療に有用である。
【０００６】
前臨床試験は、がん関連標的のサイレンシングにＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を使用できることを裏付けている（Scherr, M., et al., Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA. Blood, 2003. 101(4): pp. 1566-9、Brummelkamp, T.R., R. Bernards, and R. Agami, Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell, 2002. 2(3): pp. 243-7、Martinez, L.A., et al., Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(23): pp. 14849-54、Yoshinouchi, M., et al., In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16-positive cervical cancer cells by E6 siRNA. Mol Ther, 2003. 8(5): pp. 762-8、Choudhury, A., et al., Small interfering RNA (siRNA) inhibits the expression of the Her2/neu gene, upregulates HLA class I and induces apoptosis of Her2/neu positive tumor cell lines. Int J Cancer, 2004. 108(1): pp. 71-7、Yang, G., et al., Inhibition of breast and ovarian tumor growth through multiple signaling pathways by using retrovirus-mediated small interfering RNA against Her-2/neu gene expression. J Biol Chem, 2004. 279(6): pp. 4339-45、Farrow, B., et al., Inhibition of pancreatic cancer cell growth and induction of apoptosis with novel therapies directed against protein kinase A. Surgery, 2003. 134(2): pp. 197-205、Yague, E., C.F. Higgins, and S. Raguz, Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1. Gene Ther, 2004. 11(14): pp. 1170-4、Kosciolek, B.A., et al., Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference. Mol Cancer Ther, 2003. 2(3): pp. 209-16、Cioca, D.P., Y. Aoki, and K. Kiyosawa, RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines. Cancer Gene Ther, 2003. 10(2): pp. 125-33、Kawasaki, H. and K. Taira, Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res, 2003. 31(2): pp. 700-7）。インビボの研究もまた、腫瘍細胞の成長（Brummelkamp, T.R., R. Bernards, and R. Agami, Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell, 2002. 2(3): pp. 243-7、Li, K., et al., Use of RNA interference to target cyclin E-overexpressing hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 2003. 63(13): pp. 3593-7、Verma, U.N., et al., Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells. Clin Cancer Res, 2003. 9(4): pp. 1291-300、Aharinejad, S., et al., Colony-stimulating factor-1 blockade by antisense oligonucleotides and small interfering RNAs suppresses growth of human mammary tumor xenografts in mice. Cancer Res, 2004. 64(15): pp. 5378-84、Uchida, H., et al., Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin induced apoptosis and attenuated tumor cell growth in vitro and in vivo. Mol Ther, 2004. 10(1): pp. 162-71）、転移（Salisbury, A.J. and V.M. Macaulay, Development of molecular agents for IGF receptor targeting. Horm Metab Res, 2003. 35(11-12): pp. 843-9、Duxbury, M.S., et al., Focal adhesion kinase gene silencing promotes anoikis and suppresses metastasis of human pancreatic adenocarcinoma cells. Surgery, 2004. 135(5): pp. 555-62、Duxbury, M.S., et al., Systemic siRNA-mediated gene silencing: a new approach to targeted therapy of cancer. Ann Surg, 2004. 240(4): pp. 667-74; discussion 675-6）、血管新生（Filleur, S., et al., SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1 and slows tumor vascularization and growth. Cancer Res, 2003. 63(14): pp. 3919-22、Takei, Y., et al., A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics. Cancer Res, 2004. 64(10): pp. 3365-70）及び化学療法抵抗性（Lakka, S.S., et al., Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion, tumor growth and angiogenesis. Oncogene, 2004. 23(27): pp. 4681-9、Singh, A., et al., RNAi-mediated silencing of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 gene expression in non-small cell lung cancer inhibits tumor growth and increases efficacy of chemotherapy. Cancer Res, 2008. 68(19): pp. 7975-84、Nakahira, S., et al., Involvement of ribonucleotide reductase M1 subunit overexpression in gemcitabine resistance of human pancreatic cancer. Int J Cancer, 2007. 120(6): pp. 1355-63）に重要な成分のＲＮＡｉ標的化によって有益な結果を示した。ＲＮＡｉ技術の適用には、２つの型の分子、化学的に合成された二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はベクターに基づく低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が最初に使用された。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは同様なノックダウン機能を達成できるが、ｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡとは本質的に異なる分子である。天然起源のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と同じ生物発生経路を共有するｓｈＲＮＡは、プロセシングされ、細胞質に輸送され、細胞質においてＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる（Cullen, B.R., RNAi the natural way. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1163-5）。内因性ｍｉＲＮＡの一次転写産物は、核内でゲノムＤＮＡからヘアピン構造を有する長いＲＮＡ鎖として合成され、それが、一連の内因性リボヌクレアーゼ（RNase）III酵素によってプロセシングされて、２１〜２３塩基対の成熟二重鎖ｍｉＲＮＡとなる。少なくとも２つのリボヌクレアーゼIII酵素複合体が成熟プロセスに関与する。最初に、Ｄｒｏｓｈａ／ＤＧＣＲ８複合体が、プレｍｉＲＮＡヘアピン構造を形成し、それが、核外輸送後にＲＬＣに組み込まれる。ＲＬＣにおいて、第２の酵素、Ｄｉｃｅｒが、ループを切り取り、成熟ｍｉＲＮＡを生じる（Zeng, Y. and B.R. Cullen, Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA, 2003. 9(1): pp. 112-23）。これは、ＲＮＡｉのためにＲＩＳＣにロードされるエフェクター分子である（Silva, J.M., et al., Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1281-8）。
【０００７】
アルゴノート（Ａｇｏ，argonaute）ファミリーのタンパク質は一般に、細胞質ＲＩＳＣと関連する。これらのタンパク質は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのロードに関与し、転写型（ヘテロクロマチンを標的とする）遺伝子サイレンシング及び転写後遺伝子サイレンシングにも関わる。Ａｇｏと複合体形成したＲＩＳＣにロードされたｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのガイド鎖は、配列相補性を有する標的ｍＲＮＡを探し出す。エンドヌクレアーゼ活性のあるＡｇｏ−２はｍＲＮＡを切断して、ｍＲＮＡ分解を開始する（Hutvagner, G. and P.D. Zamore, A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 2002. 297(5589): pp. 2056-60、Yekta, S., I.H. Shih, and D.P. Bartel, MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science, 2004. 304(5670): pp. 594-6）。或いは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへの部分的な相補的結合が、プロセシングボディ（Ｐ−ボディ）中への隔離によって翻訳抑制（translational repression）を行う（Pillai, R.S., C.G. Artus, and W. Filipowicz, Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. Rna, 2004. 10(10): pp. 1518-25）。標的ｍＲＮＡの不安定化をもたらす脱アデニル化が、Ｐ−ボディにおいて観察されている（Valencia-Sanchez, M.A., et al., Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev, 2006. 20(5): pp. 515-24、Parker, R. and U. Sheth, P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Mol Cell, 2007. 25(5): pp. 635-46）。現在、多数の動物モデルにおいて、ＲＮＡｉ媒介遺伝子ノックダウンが強力であり、特異的であり、忍容性が高いという確たる証拠がある。これらの知見により、ＲＮＡｉ療法を臨床に移すための科学的論拠が得られる。現在のところ、少なくとも１０種のＲＮＡｉに基づく薬が前期の相の臨床試験中であり（(2008 ) Breakdown of RNAi-Based Drugs in the Clinic. RNAi News Volume.）、そのうち４種はがんに関連している（Heidel, J.D., et al., Potent siRNA inhibitors of ribonucleotide reductase subunit RRM2 reduce cell proliferation in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2007. 13(7): pp. 2207-15、Judge, A.D., et al., Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice. J Clin Invest, 2009. 119(3): pp. 661-73、Zukiel, R., et al., Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for tenascin-C. Cancer Biol Ther, 2006. 5(8): pp. 1002-7、Wyszko, E., et al., A multivariate analysis of patients with brain tumors treated with ATN-RNA. Acta Pol Pharm, 2008. 65(6): pp. 677-84）。別のｓｉＲＮＡもまた、動物モデルにおいて効力を示し（Heidel, J.D., et al., Potent siRNA inhibitors of ribonucleotide reductase subunit RRM2 reduce cell proliferation in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2007. 13(7): pp. 2207-15、Judge, A.D., et al., Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice. J Clin Invest, 2009. 119(3): pp. 661-73、Calvo, A., et al., Identification of VEGF-regulated genes associated with increased lung metastatic potential: functional involvement of tenascin-C in tumor growth and lung metastasis. Oncogene, 2008. 27(40): pp. 5373-84）、ヒト以外の霊長類において安全性（Heidel, J.D., et al., Administration in non-human primates of escalating intravenous doses of targeted nanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(14): pp. 5715-21）を示した。
【０００８】
米国特許出願公開第２００９／０１６３４３１号明細書（Kazhdanら、２００９年）は、ＰＤＸ−１を阻害するための方法及び組成物を開示している。本発明の方法及び組成物に含まれている抗ＰＤＸ−１剤は、抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び／又は阻害化合物を含む。本発明は、ＰＤＸ−１をコードするＲＮＡ分子の特定の領域と非常に又は完全に相補的な有効量の抗ＰＤＸ−１剤と腫瘍細胞を接触させるステップを含む、腫瘍細胞におけるＰＤＸ−１発現の阻害方法を提供する。このような作用剤は、ＰＤＸ−１をコードするＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズし、腫瘍細胞におけるＰＤＸ−１遺伝子の発現を阻害する。抗ＰＤＸ−１  ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを含む組成物が記載されている。本発明による抗ＰＤＸ−１  ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする組換え型の発現コンストラクトが、記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，７１６，８２４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０１６３４３１号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hirshberg, B., et al., Malignant insulinoma: spectrum of unusual clinical features. Cancer, 2005. 104(2): pp. 264-72
【非特許文献２】Pavelic, K., et al., Molecular genetics of malignant insulinoma. Anticancer Res, 1996. 16(4A): pp. 1707-17
【非特許文献３】Kaltsas, G.A., G.M. Besser, and A.B. Grossman, The diagnosis and medical management of advanced neuroendocrine tumors. Endocr Rev, 2004. 25(3): pp. 458-511
【非特許文献４】Pelengaris, S. and M. Khan, Oncogenic co-operation in beta-cell tumorigenesis. Endocr Relat Cancer, 2001. 8(4): pp. 307-14
【非特許文献５】House, M.G. and R.D. Schulick, Endocrine tumors of the pancreas. Curr Opin Oncol, 2006. 18(1): pp. 23-9
【非特許文献６】Vezzosi, D., et al., Octreotide in insulinoma patients: efficacy on hypoglycemia, relationships with Octreoscan scintigraphy and immunostaining with anti-sst2A and anti-sst5 antibodies. Eur J Endocrinol, 2005. 152(5): pp. 757-67
【非特許文献７】Brennan, M.F., Pancreatic cancer. J Gastroenterol Hepatol, 2000. 15 Suppl: pp. G13-6
【非特許文献８】Urgell, E., et al., Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19.9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. Eur J Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-75
【非特許文献９】Willett, C.G., W.J. Daly, and A.L. Warshaw, CA 19-9 is an index of response to neoadjunctive chemoradiation therapy in pancreatic cancer. Am J Surg, 1996. 172(4): pp. 350-2
【非特許文献１０】Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front Biosci, 1998. 3: pp. E214-25
【非特許文献１１】Brennan, M., Pancreatic cancer. J. Gastroenterol. Hepatol, 2000. 15: pp. G13-6
【非特許文献１２】Urgell E, P.P., Boadas J, Capella G, Queralto MJM, Boluda R, et al, Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19-9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer Eur. J. Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-2075
【非特許文献１３】Willet C, D.W., Warshaw A., CA19-9 is an index of response to neoadjuvant chemoradiation in pancreatic cancer. Am. J. Surg, 1996. 172: pp. 350-352
【非特許文献１４】Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front. Biosci 1998. 3: pp. 214-225
【非特許文献１５】Watada, H., et al., PDX-1 induces insulin and glucokinase gene expressions in alphaTC1 clone 6 cells in the presence of betacellulin. Diabetes, 1996. 45(12): pp. 1826-31
【非特許文献１６】Bretherton-Watt, D., N. Gore, and D.S. Boam, Insulin upstream factor 1 and a novel ubiquitous factor bind to the human islet amyloid polypeptide/amylin gene promoter. Biochem J, 1996. 313 ( Pt 2): pp. 495-502
【非特許文献１７】Carty, M.D., et al., Identification of cis- and trans-active factors regulating human islet amyloid polypeptide gene expression in pancreatic beta-cells. J Biol Chem, 1997. 272(18): pp. 11986-93
【非特許文献１８】Serup, P., et al., Induction of insulin and islet amyloid polypeptide production in pancreatic islet glucagonoma cells by insulin promoter factor 1. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(17): pp. 9015-20
【非特許文献１９】Watada, H., et al., Involvement of the homeodomain-containing transcription factor PDX-1 in islet amyloid polypeptide gene transcription. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 229(3): pp. 746-51
【非特許文献２０】Ballian, N., et al., Proliferation, hyperplasia, neogenesis, and neoplasia in the islets of Langerhans. Pancreas, 2007. 35(3): pp. 199-206
【非特許文献２１】Hagman, D.K., et al., Palmitate inhibits insulin gene expression by altering PDX-1 nuclear localization and reducing MafA expression in isolated rat islets of Langerhans. J Biol Chem, 2005. 280(37): pp. 32413-8
【非特許文献２２】Leys CM, N.S., Rudzinski E, Kaminishi M, Montgomery E, Washington MK, Goldenring JR, Expression of PDX-1 in human gastric metaplasia and gastric adenocarcinoma. Hum Pathol., 2006. 37(9): pp. 1162-8
【非特許文献２３】Sakai H, E.Y., Li XL, Akiyama Y, Miyake S, Takizawa T, Konishi N, Tatematsu M, Koike M, Yuasa Y, PDX-1 homeobox protein expression in pseudopyloric glands and gastric carcinomas. Gut, 2004. 53(3): pp. 323-30
【非特許文献２４】Miyatsuka T, K.H., Shiraiwa T, Matsuoka TA, Yamamoto K, et al, Persistent expression of PDX-1 in the pancreas causes acinar-to-ductal metaplasia through Stat3 activation. Genes Dev, 2006. 20(11): pp. 1435-40
【非特許文献２５】Wang, X.P., et al., Tissue MicroArray analyses of pancreatic duodenal homeobox-1 in human cancers. World J Surg, 2005. 29(3): pp. 334-8
【非特許文献２６】Ayala, G., Prognostic Value of Akt-1 in Prostate Cancer: A Computerized Quantitative Approach with Quantum Dot Technology, in Abstract and presentation. 2007, United States Academy of Pathology: San Diego
【非特許文献２７】Liu, S., et al., PDX-1 acts as a potential molecular target for treatment of human pancreatic cancer. Pancreas, 2008. 37(2): pp. 210-20
【非特許文献２８】Scherr, M., et al., Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA. Blood, 2003. 101(4): pp. 1566-9
【非特許文献２９】Brummelkamp, T.R., R. Bernards, and R. Agami, Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell, 2002. 2(3): pp. 243-7
【非特許文献３０】Martinez, L.A., et al., Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(23): pp. 14849-54
【非特許文献３１】Yoshinouchi, M., et al., In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16-positive cervical cancer cells by E6 siRNA. Mol Ther, 2003. 8(5): pp. 762-8
【非特許文献３２】Choudhury, A., et al., Small interfering RNA (siRNA) inhibits the expression of the Her2/neu gene, upregulates HLA class I and induces apoptosis of Her2/neu positive tumor cell lines. Int J Cancer, 2004. 108(1): pp. 71-7
【非特許文献３３】Yang, G., et al., Inhibition of breast and ovarian tumor growth through multiple signaling pathways by using retrovirus-mediated small interfering RNA against Her-2/neu gene expression. J Biol Chem, 2004. 279(6): pp. 4339-45
【非特許文献３４】Farrow, B., et al., Inhibition of pancreatic cancer cell growth and induction of apoptosis with novel therapies directed against protein kinase A. Surgery, 2003. 134(2): pp. 197-205
【非特許文献３５】Yague, E., C.F. Higgins, and S. Raguz, Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1. Gene Ther, 2004. 11(14): pp. 1170-4
【非特許文献３６】Kosciolek, B.A., et al., Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference. Mol Cancer Ther, 2003. 2(3): pp. 209-16
【非特許文献３７】Cioca, D.P., Y. Aoki, and K. Kiyosawa, RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines. Cancer Gene Ther, 2003. 10(2): pp. 125-33
【非特許文献３８】Kawasaki, H. and K. Taira, Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res, 2003. 31(2): pp. 700-7
【非特許文献３９】Li, K., et al., Use of RNA interference to target cyclin E-overexpressing hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 2003. 63(13): pp. 3593-7
【非特許文献４０】Verma, U.N., et al., Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells. Clin Cancer Res, 2003. 9(4): pp. 1291-300
【非特許文献４１】Aharinejad, S., et al., Colony-stimulating factor-1 blockade by antisense oligonucleotides and small interfering RNAs suppresses growth of human mammary tumor xenografts in mice. Cancer Res, 2004. 64(15): pp. 5378-84
【非特許文献４２】Uchida, H., et al., Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin induced apoptosis and attenuated tumor cell growth in vitro and in vivo. Mol Ther, 2004. 10(1): pp. 162-71
【非特許文献４３】Salisbury, A.J. and V.M. Macaulay, Development of molecular agents for IGF receptor targeting. Horm Metab Res, 2003. 35(11-12): pp. 843-9
【非特許文献４４】Duxbury, M.S., et al., Focal adhesion kinase gene silencing promotes anoikis and suppresses metastasis of human pancreatic adenocarcinoma cells. Surgery, 2004. 135(5): pp. 555-62
【非特許文献４５】Duxbury, M.S., et al., Systemic siRNA-mediated gene silencing: a new approach to targeted therapy of cancer. Ann Surg, 2004. 240(4): pp. 667-74; discussion 675-6
【非特許文献４６】Filleur, S., et al., SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1 and slows tumor vascularization and growth. Cancer Res, 2003. 63(14): pp. 3919-22
【非特許文献４７】Takei, Y., et al., A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics. Cancer Res, 2004. 64(10): pp. 3365-70
【非特許文献４８】Lakka, S.S., et al., Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion, tumor growth and angiogenesis. Oncogene, 2004. 23(27): pp. 4681-9
【非特許文献４９】Singh, A., et al., RNAi-mediated silencing of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 gene expression in non-small cell lung cancer inhibits tumor growth and increases efficacy of chemotherapy. Cancer Res, 2008. 68(19): pp. 7975-84
【非特許文献５０】Nakahira, S., et al., Involvement of ribonucleotide reductase M1 subunit overexpression in gemcitabine resistance of human pancreatic cancer. Int J Cancer, 2007. 120(6): pp. 1355-63
【非特許文献５１】Cullen, B.R., RNAi the natural way. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1163-5
【非特許文献５２】Zeng, Y. and B.R. Cullen, Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA, 2003. 9(1): pp. 112-23
【非特許文献５３】Silva, J.M., et al., Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1281-8
【非特許文献５４】Hutvagner, G. and P.D. Zamore, A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 2002. 297(5589): pp. 2056-60
【非特許文献５５】Yekta, S., I.H. Shih, and D.P. Bartel, MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science, 2004. 304(5670): pp. 594-6
【非特許文献５６】Pillai, R.S., C.G. Artus, and W. Filipowicz, Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. Rna, 2004. 10(10): pp. 1518-25
【非特許文献５７】Valencia-Sanchez, M.A., et al., Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev, 2006. 20(5): pp. 515-24
【非特許文献５８】Parker, R. and U. Sheth, P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Mol Cell, 2007. 25(5): pp. 635-46
【非特許文献５９】(2008 ) Breakdown of RNAi-Based Drugs in the Clinic. RNAi News Volume.
【非特許文献６０】Heidel, J.D., et al., Potent siRNA inhibitors of ribonucleotide reductase subunit RRM2 reduce cell proliferation in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2007. 13(7): pp. 2207-15
【非特許文献６１】Judge, A.D., et al., Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice. J Clin Invest, 2009. 119(3): pp. 661-73
【非特許文献６２】Zukiel, R., et al., Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for tenascin-C. Cancer Biol Ther, 2006. 5(8): pp. 1002-7
【非特許文献６３】Wyszko, E., et al., A multivariate analysis of patients with brain tumors treated with ATN-RNA. Acta Pol Pharm, 2008. 65(6): pp. 677-84
【非特許文献６４】Calvo, A., et al., Identification of VEGF-regulated genes associated with increased lung metastatic potential: functional involvement of tenascin-C in tumor growth and lung metastasis. Oncogene, 2008. 27(40): pp. 5373-84
【非特許文献６５】Heidel, J.D., et al., Administration in non-human primates of escalating intravenous doses of targeted nanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(14): pp. 5715-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、標的の翻訳抑制及び転写後ｍＲＮＡ分解を同時に誘発するためのＰＤＸ  ｂｉ−ｓｈＲＮＡを含む。ＰＤＸ  ｂｉ−ｓｈＲＮＡコンストラクトは、同じｍＲＮＡ標的特異性を有するｓｉＲＮＡと比較して、高い効力及び長期間にわたる活性を達成する。本発明者らは、ＰＤＸ−１ノックダウンがアポトーシスを誘発し、増殖を停止し、ＮＥＴがん細胞の侵襲性を低下させ、癌腫異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存率を改善することを示した。本発明者らはまた、ＩＶ（静脈内）ＢＩＶリポソームＰＤＸ−１  ｓｈＲＮＡの複数回処理が、ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＰＣ異種移植片をほぼ完全に消失させたことを示し、マウスインスリノーマモデルにおいて応答及び延命効果を確認している。
【００１２】
２層中空小胞（ＢＩＶ，Bilamellar invaginated vesicle）は、一時的にマスクされた標的リポソームを使用して、細胞膜との融合による細胞への治療薬の送達を行う送達系である。これらのマスクされたステルスリポソーム（stealthed liposome）は、エンドサイトーシス経路を回避することによって、より高いトランスフェクション効率を達成する。Copernicusの凝縮核酸送達技術は、別の非ウイルス性の合成的モジュラープラットフォームであり、単一分子又はＤＮＡ若しくはＲＮＡが、ポリカチオンによって凝縮されて、非常に高いトランスフェクション効率を有するナノ粒子が生じる。本発明者らは、マスクされたステルスＢＩＶリポソーム中への凝縮ｓｈＲＮＡ含有ＤＮＡナノ粒子のパッケージングによる新規ながん治療法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、プロモーターと、プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートとを含む発現ベクターであって、前記核酸インサートが、ＰＤＸ−１転写因子をコードする転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする発現ベクターを含む。転写物へのｓｈＲＮＡの結合は、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１発現を阻害する。ｓｈＲＮＡは二機能性であって、ｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフとｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフの両方が同時に組み込まれていてもよい。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある。ｓｈＲＮＡが標的とするｍＲＮＡ配列は、ＰＤＸ−１ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳（ＵＴＲ）領域に限定されず、本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡはコード配列を標的とすることができる。一態様において、１又は２以上のｓｈＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態（modification）からなる群から選択される配列を含む。
【００１４】
本発明はまた、ｓｈＲＮＡをＰＤＸ−１ｍＲＮＡ標的に送達する系を提供する。この送達系は、プロモーターとプロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートとを含む発現ベクターにカップリングされているリポソームなどの治療薬担体を含み、該インサートは、ＰＤＸ−１転写因子をコードする転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。１又は２以上のｓｈＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む。転写物へのｓｈＲＮＡの結合は、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１発現を阻害する。ｓｈＲＮＡは二機能性であって、ｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフとｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフの両方を組み込むことができる。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある。ｓｈＲＮＡが標的とするｍＲＮＡ配列は、ＰＤＸ−１ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳（ＵＴＲ）領域に限定されず、本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡはコード配列を標的とすることができる。治療薬担体は、凝縮されたＤＮＡナノ粒子とすることができる。一実施形態において、発現ベクターのＤＮＡは、ポリカチオンと組み合わせることによって凝縮できる。より詳しくは、ＤＮＡは、Ｎ末端システイン残基及び３０リジン残基を含むペプチドで修飾された１０ｋＤポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋと組み合わせることによって、凝縮できる。治療薬担体はリポソームであってもよく、その中で、ＤＮＡは、３０ｍｅｒリジン縮合ペプチドと組み合わされることによって凝縮され得る。一実施形態において、リポソームは、２層中空小胞（ＢＩＶ）とすることができる。リポソームは、「スマート」レセプター標的化部分で装飾することによって、標的組織を特異的に標的とすることができる。一例において、標的化部分は、低分子二価βターン模倣体とすることができる。リポソームは、非標的器官を迂回させるために、可逆的にマスクすることができる。一例において、可逆的マスキングは、リポソームをｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドなどの低分子量脂質（分子量約５００以下）でコーティングすることによって実施できる。本発明の別の実施形態において、凝縮ＤＮＡナノ粒子とリポソーム送達系とを組み合わせることができる。したがって、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する凝縮ＤＮＡナノ粒子を、リポソームに封入することができる。これらの凝縮ＤＮＡ−ナノ粒子含有リポソームは、ＢＩＶとすることができる。リポソームは、標的化部分で装飾することができ、可逆的にマスクすることもできる。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ＰＤＸ−１を発現する標的組織にｓｈＲＮＡを送達する方法であって、（ｉ）プロモーターと、ＰＤＸ−１をコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上のｓｈＲＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結されている核酸のインサートとを含む発現ベクターを調製するステップと、（ii）前記発現ベクターを治療薬担体と組み合わせるステップと、（iii）治療有効量の発現ベクターと治療薬担体との複合体を、それを必要とする患者に投与するステップとを含む方法である。治療薬担体は、凝縮ＤＮＡナノ粒子とすることができる。一実施形態において、発現ベクターのＤＮＡは、ポリカチオンと組み合わせることによって凝縮することができる。より詳しくは、ＤＮＡは、ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋと組み合わせることによって凝縮することができる。治療薬担体は、リポソームであってもよい。一実施形態において、リポソームはＢＩＶとすることができる。リポソームは、「スマート」レセプター標的化部分で装飾することによって、標的組織を特異的に標的とすることができる。一例において、標的化部分は、低分子二価βターン模倣体とすることができる。リポソームは、非標的器官を迂回させるために、可逆的にマスクすることができる。一例において、可逆的マスキングは、リポソームをｎ−ドデシル−Ｄ−マルトピラノシドなどの低分子量脂質（分子量約５００以下）でコーティングすることによって実施できる。本発明の別の実施形態において、凝縮ＤＮＡナノ粒子とリポソーム送達系とを組み合わせることができる。したがって、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する凝縮ＤＮＡナノ粒子を、リポソームに封入することができる。これらの凝縮ＤＮＡナノ粒子含有リポソームは、ＢＩＶとすることができる。リポソームは、標的化部分で装飾することができ、可逆的にマスクすることもできる。一態様において、１又は２以上のｓｈＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、標的細胞中のＰＤＸ−１発現をサイレンシングする方法であって、（ｉ）標的細胞を選択するステップと、（ii）ＰＤＸ−１をコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上のｓｈＲＮＡを発現するベクターを標的細胞にトランスフェクトするステップとを含み、がん細胞への前記ベクターのトランスフェクションがＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１発現を阻害する方法を提供する。ｓｈＲＮＡは二機能性であって、切断依存性モチーフと切断非依存性モチーフの両方が同時に組み込まれていてもよい。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある。ｓｈＲＮＡが標的とするｍＲＮＡ配列は、ＰＤＸ−１ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳（ＵＴＲ）領域に限定されず、本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡはコード配列を標的とすることができる。１又は２以上のｓｈＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、がん患者における腫瘍細胞成長の抑制方法であって、（ｉ）腫瘍の治療を必要とする患者を特定するステップと、（ii）ＰＤＸ−１をコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上のｓｈＲＮＡを発現するベクターを前記腫瘍細胞にトランスフェクトするステップとを含み、前記ベクターがトランスフェクトされたがん細胞が、アポトーシス、増殖停止、又は侵襲性の低下をもたらす方法を含む。ｓｈＲＮＡは、二機能性であって、切断依存性モチーフと切断非依存性モチーフの両方が同時に組み込まれていてもよく、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びそれらの組合せ又は修飾形態からなる群から選択される配列を含む。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＰＤＸ−１発現の切断依存性阻害因子でもあり、切断非依存性阻害因子でもある。ｓｈＲＮＡが標的とするｍＲＮＡ配列は、ＰＤＸ−１ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳（ＵＴＲ）領域に限定されず、本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡはコード配列を標的とすることができる。より詳しくは、標的のがんは、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）とすることができる。
【００１８】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のために、添付図面と共に本発明の詳細な説明に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ−１Ｂ】ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１ベクターのインビボ成長阻害活性を示すグラフである。図１Ａは、ＣＣＬ−２４７腫瘍異種移植片に対して、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１リポプレックス（pGBI2）若しくはスクランブル対照リポプレックス（pGBI5）又は懸濁液（Ｄ５Ｗ）の単回腫瘍内注射を行った場合に観察される阻害を示す。値は平均±ＳＥＭを表す。図１Ｂは、ＳＣＩＤマウスにおける原発骨肉腫異種移植片に対するｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１の成長阻害活性を示す。ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１リポプレックス又は対照の連日腫瘍内注射を６回行った。
【図２】ｂｉ−ｓｈ−ＳＴＭＮ１とｓｉＲＮＡＳＴＭＮ１とを比較する、ＳＴＭＮ１ｍＲＮＡ標的切断と細胞成長阻害との相関を示すグラフである。ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１（赤色）及びｓｉＲＮＡＳＴＭＮ１（黄色）の複合用量反応曲線は、ＳＴＭＮ１ｍＲＮＡ切断と相関した。ｘ軸は、左から右へと増加するプラスミド／ｓｉＲＮＡ濃度の用量である。ｙ軸は、２４時間処理後のパーセント細胞生存率である。各データ点は、三重反復試料の平均を表す。ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１の濃度範囲は、１．４４×１０−１２Ｍ〜５．６３×１０−１５Ｍであった。ｓｉＲＮＡＳＴＭＮ１の濃度範囲は、５×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍであった。電気泳動図挿入部分は、トランスフェクトされたＣＣＬ−２４７細胞から検出される５’ＲＡＣＥ産物を示し、これは切断生成物を示している。
【図３Ａ−３Ｂ】過剰発現されたヒト（図３Ａ）及びマウス（図３Ｂ）ＰＤＸ１ｍＲＮＡ（配列番号１及び２）に対する二機能性ｓｈＲＮＡの効果を示すグラフである。結腸がんＣＣＬ−２４７細胞に、ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡ発現ベクターのみをトランスフェクトするか、又はＰＤＸ−１  ｃＤＮＡ及びｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターを同時トランスフェクトした。pUMVC3は、インサートを含まない発現ベクター対照（配列番号９）である。トランスフェクションの２４，４８，７２及び９６時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲのために全ＲＮＡを単離した。ＰＤＸ−１ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに基準化した。各試料の比較ＰＤＸ−１ｍＲＮＡレベルは、培地のみの試料（トランスフェクションなし）に規準化した。
【図４】ヒトＰＤＸ−１（配列番号１）に対する二機能性ｓｈＲＮＡのサイレンシング効果を示す図である。結腸がんＣＣＬ−２４７細胞に、種特異的ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡ発現ベクターのみをトランスフェクトするか、又は種特異的ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡとｂｉｓＲＮＡ発現ベクターとを同時トランスフェクトした。pUMVC3は、インサートを含まない対照発現ベクターである。トランスフェクションの４８、７２及び９６時間後に、細胞を収集し、ＰＤＸ−１及びβ−アクチンに特異なモノクローナル抗体によるウエスタン免疫ブロットを行った。
【図５Ａ−５Ｂ】ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるヒト（図５Ａ）ＰＤＸ１及びマウス（図５Ｂ）ＰＤＸ１（配列番号１及び２）の標的特異的切断の同定を示す図である。結腸がんＣＣＬ−２４７細胞に、ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡ発現ベクターのみをトランスフェクトするか、又はＰＤＸ−１  ｃＤＮＡとｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターとを同時トランスフェクトした。pUMVC3は、インサートを含まない発現ベクター対照である。トランスフェクションの２４及び９６時間後に、５’ＲＡＣＥアッセイのために全ＲＮＡを単離して、標的部位切断産物を検出した。ＲＴ−ＰＣＲで増幅された切断産物が、アガロースゲル電気泳動図上に示された。
【図６Ａ−６Ｃ】ＣＡＴレポーター遺伝子産生に対するマスキング剤の効果を示すグラフである。図６Ａは肺に対する効果を示し、図６Ｂは心臓に対する効果を示し、図６Ｃは肝臓に対する効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスへの静脈内注射後に、マスキングの増加につれて、肺（図６Ａ）及び心臓（図６Ｂ）における非特異的局在化の減少が見られる。マスキングは、目的とする標的部位へのＣＡＴレポーター遺伝子の局在化の増加と関連する（肝臓；図６Ｃ）。
【図７Ａ−７Ｃ】凝縮ＤＮＡナノ粒子の構造及び機能を示す図とグラフである。図７Ａは、楕円体又は棒状として凝縮されたＤＮＡナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。バーは、１００ｎｍである。図７Ｂは、対数期の又は成長が停止した神経芽細胞腫細胞に、裸のＤＮＡ又は凝縮ＤＮＡのリポソーム混合物を加えたことを示している。凝縮ＤＮＡは、遺伝子発現を、有糸分裂後細胞で１０００倍超、対数期細胞で６〜８倍改善する。図７Ｃは、ＩＶ投与によって又は腫瘍内（ＩＴ）注射として投与された、結腸がん隣接外植片（colon cancer flank explant）を有するＳＣＩＤマウスにおける、凝縮ＤＮＡ遺伝子導入（gene transfer）を示す。ＩＴ注射は、高レベルのルシフェラーゼ活性を生じたが、ＩＶ投与は生じなかった。
【図８】トランスフェクションの４８時間後におけるＰＤＸ−１タンパク質発現の減少に対する配列特異性を示す図である。結腸がんＣＣＬ−２４７細胞に、種特異的ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡ発現ベクターのみをトランスフェクトするか、又は種特異的ＰＤＸ−１  ｃＤＮＡとｂｉｓＲＮＡ発現ベクターとを同時トランスフェクトした。pUMVC3は、インサートを含まない対照発現ベクターである。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を収集して、ＰＤＸ−１及びβ−アクチンに特異的なモノクローナル抗体によるウエスタン免疫ブロットを行った。
【図９Ａ−９Ｂ】インビボにおけるｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１リポプレックスによる処理後のＳＣＩＤマウス異種移植片モデル：β−ＴＣ−６細胞インスリノーマモデル（図９Ａ）及びＰＡＮＣ−１膵臓がんモデル（図９Ｂ）の血糖値を経時的に示すグラフである。ＳＣＩＤマウスに腫瘍細胞を移植後に２週間、ｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１リポプレックス５０μｇによる処理を３サイクル行った。処理及び非処理マウスの空腹時血糖値を、処理後９０日まで一定時間間隔で監視した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ＰＡＮＣ−１膵臓がんモデル（図１０Ａ）及びβ−ＴＣ−６細胞インスリノーマモデル（図１０Ｂ）のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）生存率分析を示すグラフである。腫瘍細胞を移植したＳＣＩＤマウスは、処理を行わないか、又は対照ベクターリポプレックス（pUMVC3）若しくはｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１リポプレックスで処理する（３０μｇ／サイクルで３サイクル）かのいずれかとした。処理後９０日まで、マウスを生存について監視した。
【図１１】ヒトインスリノーマ腫瘍及びマウスＴＣ−６インスリノーマ細胞におけるＰＤＸ−１の過剰発現率を示す図である。
【図１２】ｍＰＤＸ−１  ＲＮＡサイレンシング後のβ−ＴＣ−６細胞周期タンパク質発現率を示すグラフである。
【図１３】マウスインスリノーマＳＣＩＤモデルにおける、Ｌ−ｍＰＤＸ−１  ｓｈＲＮＡ処理されたマウスの生存率を示すグラフである。
【図１４】腫瘍体積の比較データを示すグラフである。
【図１５】本発明の新規ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１を製造するためのプラスミドコンストラクトを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の種々の実施形態の製造及び使用を以下に詳細に記載するが、本発明は、種々の具体的状況で具体化し得る多くの応用可能な発明概念を提供するものと理解すべきである。本明細書中に記載した具体的な実施形態は、本発明の具体的な製造及び使用方法の単なる実例であって、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【００２１】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。本明細書中で定義する用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの用語は、単一の構成要素を指すだけでなく、その一般的種類を含み、その具体例を説明するために使用できるものとする。本明細書中の専門用語を使用して、本発明の具体的な実施形態を説明するが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説される場合を除いて、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【００２２】
本明細書中で使用する「核酸」又は「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されるフラグメントを指す。核酸分子は、天然起源のヌクレオチドであるモノマー（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、若しくは天然起源のヌクレオチドのアナログ（例えば、天然起源のヌクレオチドのα−エナンチオマー型）、又は両方の組合せから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分が変更されているものとすることができる。糖修飾形態は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による、１若しくは２以上のヒドロキシル基の置換を含み、又は糖はエーテル若しくはエステルとして機能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体配置的及び電子的に類似した構造、例えば、アザ糖及び炭素環式糖アナログと置き換えられることもできる。塩基部分の修飾形態の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン又は他の周知の複素環代替物が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はこのような結合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。「核酸分子」という用語はまた、ポリアミド主鎖に天然起源又は修飾核酸塩基が付着している、いわゆる「ペプチド核酸」を含む。核酸は一本鎖でも、二重鎖でもよい。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲中で使用する「発現ベクター」という用語は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子を含む。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターにコントロールされ、このような遺伝子は、プロモーターに「作動可能に連結されている」と言われる。同様に、制御エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合には、制御エレメントとコアプロモーターとは、作動可能に連結されている。「プロモーター」という用語は、宿主酵母細胞中で構造遺伝子と関連する場合に、適切な成長条件下で１）転写、２）翻訳又は３）ｍＲＮＡ安定性の１又は２以上を、プロモーター配列の非存在下での転写、翻訳又はｍＲＮＡ安定性（ｍＲＮＡのより長い半減期）と比較して増加させる、その構造遺伝子に関する任意のＤＮＡ配列を指す。
【００２４】
本明細書中で使用する「オンコジーン」という用語は、悪性新生物細胞の形成及び生存を可能にする遺伝子を指す（Bradshaw, T.K.: Mutagenesis 1, 91-97（1986）。
【００２５】
本明細書中で使用する「レセプター」という用語は、「リガンド」と称される生物活性分子と結合する細胞関連タンパク質（cell-associated protein）を意味する。この相互
作用が、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。レセプターは、膜結合レセプター、細胞質レセプター又は核内レセプター；モノマーレセプター（例えば、甲状腺刺激ホルモンレセプター、βアドレナリン作動性レセプター）又は多量体レセプター（例えば、ＰＤＧＦレセプター、成長ホルモンレセプター、ＩＬ−３レセプター、ＧＭ−ＣＳＦレセプター、Ｇ−ＣＳＦレセプター、エリスロポエチンレセプター及びＩＬ−６レセプター）とすることができる。膜結合型レセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含むマルチドメイン構造を特徴とし、シグナル変換に典型的に関与する。特定の膜結合レセプターにおいては、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内エフェクタードメインとは、完全な機能性レセプターを含む別個のポリペプチド中に位置する。
【００２６】
「ハイブリダイズする」という用語は、核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。
【００２７】
「トランスフェクション」という用語は、真核細胞中への外来ＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、当技術分野で知られている種々の手段、例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び微粒子銃によって行うことができる。
【００２８】
本明細書中で使用する「リポソーム」という用語は、内部水性空間を取り囲む脂質二重層からなる閉鎖構造を指す。本明細書中で使用する「ポリカチオン」という用語は、同一分子内に第４級アンモニウムラジカルなどの複数のカチオン部分を有する物質を意味し、遊離塩基及びそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【００２９】
本発明は、標的の翻訳抑制と転写後ｍＲＮＡ分解とを同時に誘発するために開発されたＰＤＸ  ｂｉ−ｓｈＲＮＡを含む。プロトタイプのコンストラクトは、同じｍＲＮＡ標的特異性を有するｓｉＲＮＡと比較して高い効力及び長期間にわたる活性を達成する。本発明者らは、ＰＤＸ−１ノックダウンがＮＥＴがん細胞のアポトーシスを誘発し、増殖を停止し、侵襲性を低下させ、癌腫異種移植片を有するＳＣＩＤマウスの生存率を改善することを示している。本発明者はまた、ＩＶ（静脈内）ＢＩＶリポソームＰＤＸ−１  ｓｈＲＮＡの複数の処理が、ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＰＣ異種移植片をほぼ完全に消失させたことを示し、マウスインスリノーマモデルにおいて応答及び延命効果を確認している。
【００３０】
ｂｉ−ｓｈＲＮＡ：本発明者らは、二機能性ｓｈＲＮＡとして知られている第３の独特のＲＮＡｉプラットフォームを開発した。概念的には、ｓｈＲＮＡがロードされたＲＩＳＣによってＲＮＡｉを達成して、切断依存性又は切断非依存性ｍＲＮＡノックダウンを促進できる。両立体配置のｓｈＲＮＡの同時発現（それゆえに、二機能性ｓｈＲＮＡと命名されている）は、ｓｉＲＮＡと比較して、サイレンシングのより急速な開始時に、より効果的な標的遺伝子ノックダウンを達成する（ｍＲＮＡ及びタンパク質の代謝回転率にもかかわらず）と共に、耐久性が大きいことを本発明者らは示した。二機能性ｓｈＲＮＡ発現単位の基本設計は、２つのステムループｓｈＲＮＡ構造を含む。これらのステムループの１つは、切断依存性ＲＩＳＣロードのための完全にマッチしたパッセンジャー鎖及びガイド鎖から構成され、もう１つのステムループは、切断非依存性ＲＩＳＣロードのためのミスマッチパッセンジャー鎖（９〜１２位）を有する。この二機能性設計は、第１に、二機能性設計は、異なるＲＩＳＣ型へのガイド鎖のロードを促進し、したがって、ｍＲＮＡターゲティングを促進する；第２に、同一標的ｍＲＮＡに対して切断依存性ＲＩＳＣ及び切断非依存性ＲＩＳＣが存在することにより、分解と翻訳阻害／隔離プロセスの両方によってサイレンシングが促進されるという２つの理由で、はるかに効率的である。強力な遺伝子ノックダウンエフェクターは、単一Ｐｏｌ  IIプロモーターのコントロール下で多重化ｓｈＲＮＡによって空間的及び時間的コントロールを達成する。本発明者らが設計したプラットフォームは、天然のプロセスを模倣している。他の研究者による多数の研究及び文献は、本発明者らのアプローチを裏付けている（Okamura, K., et al., Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev, 2004. 18(14): pp. 1655-66、Miyoshi, K., et al., Slicer function of Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev, 2005. 19(23): pp. 2837-48、Tomari, Y., T. Du, and P.D. Zamore, Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell, 2007. 130(2): pp. 299-308、Forstemann, K., et al., Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct argonaute complexes after production by dicer-1. Cell, 2007. 130(2): pp. 287-97、Landthaler, M., et al., Molecular characterization of human Argonaute-containing ribonucleoprotein complexes and their bound target mRNAs. RNA, 2008. 14(12): pp. 2580-96）。
【００３１】
本発明者らは、ｍｉＲ３０骨格を用いて、オンコプロテインであるスタスミン（stathmin）（ＳＴＭＮ１、オンコプロテイン１８、プロソリン（prosolin）、ｐ１９、ｏｐ１８）を再構築する微小管に対する新規な二機能性（ｂｉ−ｓｈＲＮＡ）を調製した。ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１は、同じ標的部位に対して、ｓｉＲＮＡと比較して、より効果的なサイレンシング活性を示した。ＳＴＭＮ１は、有糸分裂紡錘体形成に大きく関与する（Rana, S., et al., Stathmin 1: a novel therapeutic target for anticancer activity. Expert Rev Anticancer Ther, 2008. 8(9): pp. 1461-70、Iancu, C., et al., Effects of stathmin inhibition on the mitotic spindle. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 5): pp. 909-16）。本発明のｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１コンストラクトは、同じ標的に対するｓｉＲＮＡと比較した場合に、安全で効果的な標的ノックダウン及び腫瘍細胞死滅における有意な用量有利性を示している。さらに、インビボにおいてｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１リポプレックスによって、有意な腫瘍成長コントロール及び延命効果が示された（図１Ａ及び１Ｂ）。本発明者らは、マッチパッセンジャー鎖とミスマッチパッセンジャー鎖とを区別できるＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して、成熟分子及びエフェクター分子（完全マッチ鎖を有するｄｓＲＮＡ及び特定のミスマッチを有するｄｓＲＮＡ）の両方の細胞内転写及びプロセシングを検証した（Chen, C., et al., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res, 2005. 33(20): pp. e179）。ほとんどのがん細胞には、高いＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒ発現が見られる。がん細胞の内因性Ｄｉｃｅｒレベルに関しては議論がある（Merritt, W.M., et al., Dicer, Drosha, and outcomes in patients with ovarian cancer. N Engl J Med, 2008. 359(25): pp. 2641-50）。しかし、大部分の研究は、Ｄｉｃｅｒ発現が低レベルであっても、ｓｈ又はｂｉ−ｓｈＲＮＡｉノックダウンはがん細胞において非常に効果的であることを示している（Senzer, N., D. Rao, and J. Nemunaitis, Letter to the Editor: Does Dicer expression affect shRNA processing? Gene Regulation and Systems Biology (in press)）。本発明者らは、対照ｓｉＲＮＡＳＴＭＮ１処理細胞中では完全マッチパッセンジャー鎖のみがより合わされるのとは対照的に、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１に対する成熟ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ成分に対応する、予測されるマッチ及びミスマッチｓｈＲＮＡの発現を確認した（Rao, D.R., Maples, P.B., Senzer, N., Kumar, P., Wang, Z., Pappen, B.O., Yu, Y., Haddock, C., Tong, A., Nemunaitis, J., Bifunctional shRNA: A novel approach of RNA interference. (submitted), 2009）。ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１の機構をさらに裏付けるために、５’ＲＡＣＥ法による本発明の研究の成果から、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１のｓｉＲＮＡ（マッチ）成分の標的切断部位に相当すると予想される配列を有するＳＴＭＮ１切断産物の存在が確認された。ＳＴＭＮ１発現腫瘍細胞の効果的なノックダウン（９３％）が観察された。これは、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１の切断依存性及び非依存性媒介ノックダウンの結果を反映している。さらに、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１（ＧＢＩ−２）と比較して、別個の成分である切断依存性（ＧＢＩ−１）及び切断非依存性（ＧＢＩ−３）ベクターによるノックダウン後に観察されるＳＴＭＮ１ｍＲＮＡ動態は、予測される機構と一致していた。
【００３２】
ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１ベクターのエフェクター機構及び機能的効力を実証後、本発明者らは、インビトロでの抗がん活性をさらに探求し、いくつかのがん細胞株において効果的な細胞死滅の実証に成功した。同じ配列を標的とするにもかかわらず、ｂｉ−ｓｈＲＮＡＳＴＭＮ１はｓｉＲＮＡＳＴＭＮ１よりも５ｌｏｇ低いモル濃度でＩＣ５０を達成した（図２）。
【００３３】
インスリノーマは、最も一般的な型の膵島細胞腫瘍である。悪性インスリノーマは、重度の形態の高インスリン血症であり、コントロールできない低血糖症につながる。前述のように、膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ＰＤＸ−１）は、ホメオドメイン含有転写因子ファミリーに属し、膵臓器官形成において主要な役割を担う。ＰＤＸ−１は、インスリン、グルコキナーゼ及び２型グルコーストランスポーターの転写を制御することによって、β細胞機能を維持する。ＰＤＸ−１は、インスリノーマにおいて過剰発現され、高インスリン血症をもたらす。ＰＤＸ−１は、膵臓腫瘍において一般に過剰発現されることも認められている。転移性膵臓がんは、診断からの生存期間が４〜６カ月である。
【００３４】
マウスインスリノーマモデルにおけるｓｈＲＮＡノックダウンＰＤＸ−１：インスリノーマにおけるＰＤＸ−１の発現を実証するために、Dr.Brunicardiの研究室は、ＰＤＸ−１に対する強力な抗体を開発した。本発明者らは、この抗体を用いて、ＰＤＸ−１がマウスインスリノーマにおいてヒトインスリノーマと同様なレベルまで顕著に過剰発現されることを実証した（図１１）。本発明者らは、マウスモデルにおけるノックダウン効果を試験するために、マウス（ｍｕ）ｓｈＲＮＡを調製した。しかし、インスリノーマのサイズが増加するので、コントロールできない低血糖症によりこれらのマウスの寿命は２〜３カ月であるため、研究は制限される。最初の研究においては、インビトロにおいてβＴＣ−６細胞をｍｕ−ｓｈＰＤＸ−１  ｓｈＲＮＡで処理し、ＭＴＳアッセイを行って、細胞生存率を評価した。空ベクターと比較して、ｍｕ−ｓｈＰＤＸ−１処理細胞は、複数の時点にわたって細胞増殖のかなりの減少を示した。本発明者らは、ＤＮＡ合成がノックダウンによって複数の時点において有意に減少することをさらに実証し、ＰＤＸ−１ノックダウンに応答するいくつかの細胞周期関連タンパク質のウエスタンブロットによってノックダウンを実証した（図１２）。
【００３５】
ＰＤＸ−１発現のサイレンシングは、腫瘍成長を阻害するための魅力的な方法といえる。本発明者らは、ＰＤＸ−１遺伝子発現のサイレンシングのための二機能性ｓｈＲＮＡを設計した。ヒトＰＤＸ−１（配列番号１）又はマウスＰＤＸ−１（配列番号１）のいずれかに対するＭｉＲ３０をベースとする二機能性ｓｈＲＮＡカセットを、pUMVC3ベクター中にクローニングした。図１５は、新規ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１を製造するためのプラスミドコンストラクトを示す。マウス又はヒトＰＤＸ−１を標的とする二機能性ｓｈＲＮＡを、マウス又はヒトＰＤＸ−１のいずれかを発現する発現ベクターと共に、ヒトの結腸がん細胞株に同時にエレクトロポレートした。ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、ヒト及びマウスＰＤＸ１ｍＲＮＡの、可能性のある切断産物を調べた。ＲＴ−ＱＰＣＲ及び免疫ブロット法を使用して、ヒトＰＤＸ−１又はマウスＰＤＸ−１のいずれかの発現のノックダウンを調べた。
【００３６】
ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）ｍＲＮＡ（配列番号１）：  
【００３７】
2014207907.tif 000002
【００３８】
前記配列において、コード領域はボールドイタリック体で示され、第１及び第２標的部位はそれぞれ、下線及び太字で示されている。
【００３９】
マウス膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）ｍＲＮＡ（配列番号２）：  
【００４０】
2014207907.tif 000003
【００４１】
前記配列において、コード領域は太字のイタリック体で示され、標的部位は下線で示されている。
【００４２】
図３Ａ及び３Ｂはそれぞれ、強制的に過剰発現されたヒト及びマウスＰＤＸ１に対する二機能性ｓｈＲＮＡの効果を示す。トランスフェクションの２４時間後にヒトＰＤＸ−１に対する二機能性ｓｈＲＮＡのサイレンシング効果が観察され、少なくとも９６時間持続した（図４）。最大のサイレンシング効果、ヒトＰＤＸ−１の８０％ノックダウンは、トランスフェクションの７２時間後に達成された。さらに、マウスＰＤＸ−１を標的とする二機能性ｓｈＲＮＡ（ヒトの配列との相同性が６８％である）は、ヒトＰＤＸ−１の発現に影響を及ぼさなかった（図８）。同様に、マウスＰＤＸ−１の発現は、トランスフェクションの２４時間後にサイレンシングを受け、このサイレンシング効果は少なくとも９６時間持続した（図４）。最大のサイレンシング効果、マウスＰＤＸ−１発現の９５％が、トランスフェクションの４８時間後に観察された。さらに、ヒトＰＤＸ−１を標的とする二機能性ｓｈＲＮＡ（マウスの配列との配列相同性が７９％）もまた、マウスＰＤＸ−１の発現を変化させなかった（図８）。
【００４３】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって同定されたヒト及びマウスＰＤＸ−１ｍＲＮＡの切断産物はそれぞれ、図５Ａ及び５Ｂに示されている。図５Ａ及び５Ｂは、ヒトＰＤＸ１ｍＲＮＡ及びマウスＰＤＸ１ｍＲＮＡがいずれも、予測された標的領域の中央で正確に切断されることを示した。加えて、ヒトＰＤＸ−１を標的とする二機能性ｓｈＲＮＡは、マウスＰＤＸ−１ｍＲＮＡの切断を引き起こさず、逆の場合も同じであった。
【００４４】
前述の研究は、ヒト又はマウスＰＤＸ１のいずれかを標的とする二機能性ｓｈＲＮＡの効力及び種特異性を実証した。ｂｉ−ｓｈＲＮＡｈＰＤＸ１は、ヒトＰＤＸ１の発現をノックダウンしたが、マウスＰＤＸ１の発現に対するサイレンシング効果を示さなかった。同様に、ｂｉ−ｓｈＲＮＡｍＰＤＸ１はマウスＰＤＸ１の発現をノックダウンしたが、ヒトＰＤＸ１の発現に対するサイレンシング効果を示さなかった。
【００４５】
リポソーム送達系：本発明者らが以前に検証したリポソーム送達系は、１，２−ジオレイル−３−トリメチル-アンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロールを含んでいた（Ruponen M, H.P., Ronkko S, Pelkonen J, Tammi M, Urtti A, Extracellular and intracellular barriers in non-viral gene delivery J Control Release, 2003. 93(2): pp. 213-217）。この配合物は、ＤＮＡと組み合わされて、２層中空小胞（リポソームＢＩＶ）内に核酸を封入する複合体を形成する。本発明者らのうちの一人は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡｉプラスミドの送達を改善するために、ＢＩＶ送達系のいくつかの特徴を最適化した。リポソームＢＩＶは融合性であるので、核酸分解（Simberg D, W.A., Barenholz Y, Reversible mode of binding of serum proteins to DOTAP/cholesterol Lipoplexes: a possible explanation for intravenous lipofection efficiency. Hum Gene Ther, 2005. 16(9): pp. 1087-1096）及びＴＬＲ媒介オフターゲット効果をもたらし得るエンドサイトーシス媒介ＤＮＡ細胞移入を回避する。このリポソーム送達系は、本発明者らなどが臨床試験での使用に成功した（Jay, C., et al., Preclinical Assessment of wt GNE Gene Plasmid for Management of Hereditary Inclusion Body Myopathy 2 (HIBM2). Gene Regulation & Systems Biology, 2008. 2: pp. 243-52、Frank O, R.C., Heberlein C, Neuhoff Nv, Schrock E, Schambach A, et al., Tumor cells escape suicide gene therapy by genetic and epigenetic instability. Blood 2004. 104(12): pp. 3543-3539、Ito I, J.L., Tanaka F, Saito Y, Gopalan B, Branch CD, Xu K, Atkinson EN, Bekele BN, Stephens LC, Minna JD, Roth JA, Ramesh R Liposomal vector mediated delivery of the 3p FUS1 gene demonstrates potent antitumor activity against human lung cancer in vivo. Cancer Gene Ther, 2004. 11(11): pp. 733-9、Templeton, N.S., Reversible masking of liposomal complexes for targeted delivery, USPTO, Editor. 2006, Baylor College of Medicine: USA、Phadke, A.P., et al., Safety and in vivo expression of a GNE-transgene: A novel treatment approach for Hereditary Inclusion Body Myopathy-2. Gene Regulation & Systems Biology, 2009. 3: pp. 89-101）。過去１０年にわたる累積的な研究は、血清アルブミンなどの負電荷を持つ血清タンパク質への非特異的結合（オプソニン化）を最小化する（Tong, A.W., et al., Systemic therapeutic gene delivery for cancer: crafting paris' arrow. Curr Gene Ther, 2009. 9(1): pp. 45-60）ためには、最適化送達媒体が、効率的な血管内輸送のためにゼータ電位１０ｍＶ以下のステルス化（一般にＰＥＧ化によって達成される）ナノ粒子である必要がある（Pirollo, K.F. and E.H. Chang, Targeted delivery of small interfering RNA: approaching effective cancer therapies. Cancer Res, 2008. 68(5): pp. 1247-50、Khalil, I.A., et al., Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. Pharmacol Rev, 2006. 58(1): pp. 32-45、Li, S.D., et al., Tumor-targeted delivery of siRNA by self-assembled nanoparticles. Mol Ther, 2008. 16(1): pp. 163-9）ことを示している。標的化部分、例えば、抗体及びそれらの単鎖誘導
体（ｓｃＦｖ）、糖又はペプチドの組込みは、導入遺伝子の標的細胞への局在化をさらに増加できる。
【００４６】
本発明者らは、インビボでのＰＥＧを用いない複合体の標的化送達を創出し、それによって、過度に長期の循環半減期を回避した（Li, S.D., et al., Tumor-targeted delivery of siRNA by self-assembled nanoparticles. Mol Ther, 2008. 16(1): pp. 163-9、Simoes, S., et al., Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides. Gene Ther, 1999. 6(11): pp. 1798-807、Simoes, S., et al., Cationic liposomes for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv, 2005. 2(2): pp. 237-54、Sapra, P., P. Tyagi, and T.M. Allen, Ligand-targeted liposomes for cancer treatment. Curr Drug Deliv, 2005. 2(4): pp. 369-81）。ＰＥＧ化は、膜透過性を改善するＤＮＡ又はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド送達に関連するが、本発明者らは、この方法はＢＩＶリポソーム構造に立体障害をもたらし、結果としてＤＮＡ封入が非効率的になり、遺伝子発現が減少することを示した。さらにまた、ＰＥＧ化された複合体は、主にエンドサイトーシス経路を通って細胞に入り、リソソーム中で核酸の大部分を分解する。ＰＥＧは循環において極めて長い半減期を示すが、これは、細胞毒性薬ドキソルビシンを封入するＰＥＧ化リポソーム製剤ドキシルによって例証されるように、患者に対して問題を引き起こした（Sapra, P., P. Tyagi, and T.M. Allen, Ligand-targeted liposomes for cancer treatment. Curr Drug Deliv, 2005. 2(4): pp. 369-81、Sapra, P., B., et al., Ligand-targeted liposomes for cancer treatmentLiposomal doxorubicin: antitumor activity and unique toxicities during two complementary phase I studies. Curr Drug DelivJ Clin Oncol, 20051995. 213(47): pp. 369-811777-85、Uziely, B., et al., Liposomal doxorubicin: antitumor activity and unique toxicities during two complementary phase I studies. J Clin Oncol, 1995. 13(7): pp. 1777-85）。特異的細胞表面レセプター（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）への送達のためにドキシルにリガンドを付加する試みは、腫瘍特異的送達を増加しなかった（Park, J.W., et al., Tumor targeting using anti-her2 immunoliposomes. J Control Release, 2001. 74(1-3): pp. 95-113）。
【００４７】
この推論に基づき、本発明のＢＩＶは、ＤＯＴＡＰ及び合成コレステロールを用い、専有の手動押出プロセスを使用して調製した（Bartlett, D.W., N. S., et al., Impact of tumor-specific targetingImproved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and dosing schedule on tumor growth inhibition after intravenous administration of siRNA-containing nanoparticlesgene expression. Nat Biotechnol Bioeng, 20081997. 9915(47): pp. 975-85647-52）。さらにまた、可逆的マスキング技術を使用して送達を最適化した。可逆的マスキングは、荷電してないためにＢＩＶ複合体の表面と緩く結合する低分子量脂質（分子量約５００以下；例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）を使用し、結果として正電荷を持つＢＩＶ複合体を一時的に遮蔽して、非標的化器官を迂回する。これらの小脂質は、血流において剪断力によって除去される。それらが標的細胞に到達するまでに、電荷が再曝露されて（最適には約４５ｍＶ）、移入が促進される。図６Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＡＴ−封入プラスミドを封入しているＢＩＶを用いた、静脈内投与による肺のトランスフェクションの最適化を、図６Ｂは、静脈内投与による心臓のトランスフェクションの最適化を示す。逆マスキング複合体が全身的に循環する場合には、ゼータ電位アナライザーで測定される電荷が４．８ｍＶであるにもかかわらず、トランスフェクションは最小であった。マスキングがＢＩＶから複合体を可逆的に解離するので、これらの複合体は本来の荷電状態（４５．５ｍＶ）に戻り、結果として肝臓の肝細胞において膜融合による細胞移入及び高レベルの導入遺伝子（ＣＡＴ）発現を促進した（図６Ｃ）。「ジェネリック」ＢＩＶ複合体を使用して、導入遺伝子の発現を１００倍超増加させ、ほぼ一致したＣＡＴレベルを肺で生じさせた。可逆的マスキングを使用して、他の器官ではＣＡＴ産生は観察されなかった。
【００４８】
本発明のＢＩＶ送達系が他に類を見ないほど効率的な理由は、１つには、複合体が治療薬を細胞膜との融合によって細胞中に送達し、エンドサイトーシス経路を回避するためである。リポソーム移入の２つの主要な移入機構は、エンドサイトーシス又は細胞膜との直接融合による。マウス肺胞マクロファージにおけるポリエチレン−アミン（ＰＥＩ）を用いた比較研究によって示されるように、本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方において送達されるＢＩＶ複合体に封入された核酸が、直接融合によって細胞に移入すること、並びにＢＩＶが主にエンドソーム取込みを回避することを発見した。トランスフェクション後２〜３時間以内におけるローダミン標識オリゴヌクレオチドの９５％以上の局在化によって示される（Kirpotin, D.B., et al., Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res, 2006. 66(13): pp. 6732-40、Maeda, N., et al., Enhancement of anticancer activity in antineovascular therapy is based on the intratumoral distribution of the active targeting carrier for anticancer drugs. Biol Pharm Bull, 2006. 29(9): pp. 1936-40、Bartlett, D.W., et al., Impact of tumor-specific targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured by multimodality in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(39): pp. 15549-54）ように、ＰＥＩは、エンドソーム中に急速且つ旺盛に取り込まれることが知られている。
【００４９】
装飾ＢＩＶを用いたがん標的化送達：最近になって、Bartlett及びDavisは、腫瘍を標的とするナノ粒子（ＮＰ）によって全身に送達されるｓｉＲＮＡが、皮下腫瘍の成長阻害において、非装飾ＮＰと比較して有意に効果的であることを示した（Bartlett, D.W. and M.E. Davis, Impact of tumor-specific targeting and dosing schedule on tumor growth inhibition after intravenous administration of siRNA-containing nanoparticles. Biotechnol Bioeng, 2008. 99(4): pp. 975-85）。標的化送達は、薬物動態又は生体内分布に大きく影響を与えず、これは依然として大部分がＥＰＲ（血管透過性−滞留性亢進）効果の結果であった（Kirpotin, D.B., et al., Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res, 2006. 66(13): pp. 6732-40）が、細胞取込みの増加によって導入遺伝子発現を改善するようであった（Kirpotin, D.B., et al., Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res, 2006. 66(13): pp. 6732-40、Maeda, N., et al., Enhancement of anticancer activity in antineovascular therapy is based on the intratumoral distribution of the active targeting carrier for anticancer drugs. Biol Pharm Bull, 2006. 29(9): pp. 1936-40、Bartlett, D.W., et al., Impact of tumor-specific targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured by multimodality in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(39): pp. 15549-54）。
【００５０】
実のところ、治療用ＢＩＶの開発において重要な「欠けている部分（missing piece）」は、ＢＩＶ−複合体の表面に位置してそれらを標的細胞に誘導することができるような非免疫原性リガンドの同定であった。これは、リポソーム表面で多量体化される小ペプチドによって行える可能性もあるが、小ペプチドは、反復注射後に免疫応答を発生する可能性がある。抗体、抗体フラグメント、タンパク質、部分タンパク質などを含む比較的大きい他のリガンドは、リポソーム表面における標的化送達に関しては、小ペプチドを使用する場合よりもはるかに扱いにくい。よって、本発明の複合体は、腫瘍脈管構造の内皮孔及び固形腫瘍の間質圧勾配を含む厳重なバリアを透過する（Ramesh, R., et al., Successful treatment of primary and disseminated human lung cancers by systemic delivery of tumor suppressor genes using an improved liposome vector. Mol Ther, 2001. 3(3): pp. 337-50）だけでなく、腫瘍細胞を直接的に標的とする限りにおいて、独特である。したがって、本発明の治療方法は、ＥＰＲ効果にのみ依存する送達に限定されず、腫瘍を直接的に標的とする（Hashizume, H., et al., Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am J Pathol, 2000. 156(4): pp. 1363-80、Netti, P.A., et al., Effect of transvascular fluid exchange on pressure-flow relationship in tumors: a proposed mechanism for tumor blood flow heterogeneity. Microvasc Res, 1996. 52(1): pp. 27-46、Yuan, F., et al., Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res, 1994. 54(17): pp. 4564-8）。
【００５１】
本発明には、タンパク質を選択的に結合するように設計された小分子を使用できる。重要なことに、調製される小分子は「二価」であるので、細胞表面レセプターを結合するのに特に適し、タンパク質−リガンド相互作用においてホットスポットに見られる二次構造モチーフに類似している。Burgessのグループは、細胞表面レセプターに対して親和性を有する二価βターン模倣体の設計に成功した（Feng, Y., et al., Solid-phase SN2 macrocyclization reactions to form beta-turn mimics. Org Lett, 1999. 1(1): pp. 121-4、Bruno, M.A., et al., Long-lasting rescue of age-associated deficits in cognition and the CNS cholinergic phenotype by a partial agonist peptidomimetic ligand of TrkA. J Neurosci, 2004. 24(37): pp. 8009-18、Zaccaro, M.C., et al., Selective small molecule peptidomimetic ligands of TrkC and TrkA receptors afford discrete or complete neurotrophic activities. Chem Biol, 2005. 12(9): pp. 1015-28）。本発明者らは、糖尾部を有する二価分子を生成するようにこの戦略を適合させ、これらの適合小分子から機能化ＢＩＶ複合体を調製した。ライブラリーをスクリーニングする効率的なハイスループット技術を開発し、実施した。
【００５２】
凝縮ＤＮＡナノ粒子：有糸分裂後細胞における安全で効率的なＤＮＡ送達：Copernicusの核酸送達技術は、非ウイルス性の合成的モジュラープラットフォームであり、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの単一分子がポリカチオンによって凝縮されて、最小可能体積を有するナノ粒子を生成する（Liu, G., et al., Nanoparticles of compacted DNA transfect postmitotic cells. J Biol Chem, 2003. 278(35): pp. 32578-86）。インビボ送達のために最適化されたポリカチオンは、Ｎ末端システイン残基及び３０リジン残基を含むペプチドで修飾された１０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）である。これらの複合体の形状は、ＤＮＡ凝縮時のリジン対イオンにある程度左右される（Fink, T.L., et al., Plasmid size up to 20 kbp does not limit effective in vivo lung gene transfer using compacted DNA nanoparticles. Gene Ther, 2006. 13(13): pp. 1048-51）。棒状ナノ粒子の最小断面直径は、ペイロードプラスミドの寸法に関係なく８〜１１ｎｍであるが、楕円体の最小直径は、典型的な発現プラスミドの場合、２０〜２２ｎｍである（図７Ａ）（Fink, T.L., et al., Plasmid size up to 20 kbp does not limit effective in vivo lung gene transfer using compacted DNA nanoparticles. Gene Ther, 2006. 13(13): pp. 1048-51）。重要なことに、これらのＤＮＡナノ粒子は、培養中の非分裂細胞に大量にトランスフェクトすることができる。凝縮ＤＮＡのリポソーム混合物は、リポソームの裸のＤＮＡ混合物と比較して、遺伝子発現レベルを１，０００倍超増加させる（図７Ｂ）。インビボ投与後、凝縮ＤＮＡは、肺（Ziady, A.G., et al., Transfection of airway epithelium by stable PEGylated poly-L-lysine DNA nanoparticles in vivo. Mol Ther, 2003. 8(6): pp. 936-47）、脳（Yurek, D.M., et al., Long-term transgene expression in the central nervous system using DNA nanoparticles. Mol Ther, 2009. 17(4): pp. 641-50、Yurek, D.M., et al., Compacted DNA nanoparticle gene transfer of GDNF to the rat striatum enhances the survival of grafted fetal dopamine neurons. Cell Transplant, 2009）及び眼（Farjo, R., et al., Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles. PLoS One, 2006. 1: pp. e38、Cai, X., et al., A partial structural and functional rescue of a retinitis pigmentosa model with compacted DNA nanoparticles. PLoS One, 2009. 4(4): pp. e5290）において有糸分裂後細胞に大量にトランスフェクトする。これらの各系において、有糸分裂後細胞にトランスフェクトする凝縮ＤＮＡの注目すべき能力は、これらのナノ粒子のサイズが小さく、ナノ粒子が２５ｎｍの核膜細孔を通過できることによると考えられる（Liu, G., et al., Nanoparticles of compacted DNA transfect postmitotic cells. J Biol Chem, 2003. 278(35): pp. 32578-86）。
【００５３】
これらのＤＮＡナノ粒子に関する１つの取込み機構は、細胞表面ヌクレオリン（２６ｎｍ  ＫＤ）との結合に基づく。ＤＮＡナノ粒子は、その後の細胞質輸送によって非分解経路を経て核に入り、核内でほどけて、生物活性ＤＮＡを放出する（Chen, X., et al., Cell surface nucleolin serves as receptor for DNA nanoparticles composed of pegylated polylysine and DNA. Mol Ther, 2008. 16(2): pp. 333-42）。遺伝子導入後１年にもわたる長期インビボ発現が実証された。これらのナノ粒子は、無害の毒性プロフィールを有し、トール様レセプターを刺激しないので毒性サイトカイン応答を回避し、凝縮ＤＮＡが何百ものＣｐＧアイランドを有し、リポソームと混合される場合であっても、毒性作用は観察されていない（Ziady, A.G., et al., Minimal toxicity of stabilized compacted DNA nanoparticles in the murine lung. Mol Ther, 2003. 8(6): pp. 948-56、Ding, X.-Q., et al., Ocular delivery of compacted DNA-nanoparticles does not elicit toxicity in the mouse retina. Plos One, 2009. In press）。ＤＮＡナノ粒子が、嚢胞性線維症試験においてヒトに投与されたところ、結果は期待の持てるものであり、ナノ粒子に起因する有害事象なく、ほとんどの患者はＣＦＴＲタンパク質の生物活性を示した（Konstan, M.W., et al., Compacted DNA nanoparticles administered to the nasal mucosa of cystic fibrosis subjects are safe and demonstrate partial to complete cystic fibrosis transmembrane regulator reconstitution. Hum Gene Ther, 2004. 15(12): pp. 1255-69）。
【００５４】
本発明者らとCopernicus（Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）との初期の共同研究において、結腸がん腫瘍外植片を有するＳＣＩＤマウスに、尾静脈又は腫瘍内（ＩＴ）注射によって凝縮ＤＮＡを投与した（図７Ｃ）。ＩＶ注射は遺伝子導入をもたらさなかったが、ＩＴ投与後には著しく高いレベルの遺伝子導入が認められた。これは、これらのＤＮＡナノ粒子が、局所送達後における腫瘍へのトランスフェクトに高い活性を有することを示している。
【００５５】
新規送達系：原発腫瘍及び転移部位への全身的遺伝子導入が望ましいので、凝縮ＤＮＡの腫瘍への送達は、３０ｍｅｒリジン縮合ペプチドと組み合わせることによって凝縮されたＤＮＡからなるこれらのナノ粒子を、有標ＢＩＶリポソーム中にパッケージングすることによって促進できる。凝縮ＤＮＡとマスクされたステルスリポソームとのこの新規なカップリングは、新規ながん遺伝子治療法といえる。
【００５６】
前述のように、膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ−１におけるＲＮＡ干渉によるＰＤＸ−１発現のサイレンシングは、インビトロでは細胞増殖を阻害し、インビボでは腫瘍成長を抑制すると共に腫瘍細胞アポトーシスを増加させた。この戦略に基づき、本発明者らは、インスリノーマ、膵臓がん及び神経内分泌腫瘍の治療への臨床応用のための二機能性ｓｈＲＮＡ（ｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１）を開発した。さらに、本発明者らは、インビトロでの効力並びにインスリノーマ／ＳＣＩＤモデル及びＰＡＮＣ−１／ＳＣＩＤ膵臓腫瘍モデルを用いたインビボでの効力を実証する。
【００５７】
インビトロでのノックダウン効力は、ＰＤＸ−１及びｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターの同時トランスフェクションによる、ＰＤＸ−１陰性ヒトがん細胞株（ＨＣＴ１１６）におけるＰＤＸ−１発現のウエスタン免疫ブロット及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価した（図３Ａ、３Ｂ、４及び８）。動物モデルは、インビボインスリノーマモデルに関しては１×１０６個のβ−ＴＣ−６細胞の、又はＰＣモデルに関しては５×１０５個のＰＡＮＣ−１細胞の腹腔内（ＩＰ）注射によって調製した。接種２週間後に、マウスを、各モデルについて無作為に２群に分け；尾静脈注射によって、１つの群には３５μｇの対照ベクター（ｓｈＲＮＡインサートを含まないプラスミド）を含有するリポプレックス（ＤＯＴＡＰ：コレステロールリポソームプラスミド複合体）を、第２の群にはマウス特異的ｂｉ−ｍｓｈ−ＰＤＸ−１（インスリノーマモデルの場合）又はヒト特異的ｂｉ−ｈｓｈ−ＰＤＸ−１（ＰＣモデルの場合）を３５μｇ含有するリポプレックスを与えた。２つの反復送達を、２週間毎に合計３回の注射で行った。血中インスリン値及び血糖値を、定期的な時間間隔で監視した。３回目の注射の２、１０及び１８週間後に、病理評価及び腫瘍評価のために、各群６匹のマウスを屠殺した。
【００５８】
ＨＣＴ１１６ヒトがん細胞に、プラスミドを１：１の比率でエレクトロポレートした。ＰＤＸ−１ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてΔΔＣｔ法によって定量的に比較した（図３Ａ及び３Ｂ）。ｍＲＮＡレベルを空ベクター対照と比較して、表１に要約する％発現率を得た。ＰＤＸ−１ｍＲＮＡは、トランスフェクションの２４、４８及び７２時間後に分析した。
【００５９】
【表１】
2014207907.tif 000004
【００６０】
ヒト及びマウス特異的ｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１は、インビトロにおいてＰＤＸ−１ｍＲＮＡ発現の効果的で種特異的なノックダウンを示す。
【００６１】
絶食マウスの血糖値を、最初の２サイクルの各処理の７日後、４５日目及び９０日目に測定した。マウスインスリノーマモデルにおいて、ｍｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１による処理は、β−ＴＣ−６細胞によって誘発された低血糖症からマウスを効果的にレスキューした（図９Ａ）が、ｈｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１は、膵臓がんモデルの場合に血糖値に対して効果がなかった（図９Ｂ）。β−ＴＣ−６インスリノーマモデルにおいて、未処理マウスは全て、９０日目の測定の前に死亡した。ＰＡＮＣ−１膵臓がんモデルの結果を、図９Ｂに示す。
【００６２】
カプラン−マイヤー生存率分析は、ＰＡＮＣ−１モデル（図１０Ａ）及びβ−ＴＣ−６インスリノーマモデル（図１０Ｂ）に対するｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１処理の有益性をさらに示す。インスリノーマモデルについては、処理群のマウス（ｍｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１リポプレックス各３０μｇで３サイクル処理）１０匹及び対照群のマウス（ｂｉ−ｓｈＲＮＡインサートを含まないpUMVC3ベクターを含有するリポプレックス各３０μｇで３サイクル処理）１０匹を、生存について監視した。生存は９５日間監視した。ＰＣモデルについては、ＰＡＮＣ−１接種マウス５匹は処理せず、マウス１０匹は、ｂｉ−ｓｈＲＮＡインサートを含まないpUMVC3ベクターを含有するリポプレックス各３０μｇで３サイクル処理し、マウス１５匹は、ｈｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１リポプレックス各３０μｇで３サイクル処理した。腫瘍体積の比較のために、各群５匹のマウスを、６０及び９０日目に屠殺した。処理の６０日後に、非処理マウスは１００％が平均１３３０．７５ｍｍ３のサイズの腫瘍を発現したが、処理マウスは５０％のみが、平均５０．５ｍｍ３のサイズの目視可能な腫瘍を有していた。処理の９０日後に、処理マウスの３７．５％は目視可能な腫瘍を有さず、残りのマウスは平均サイズ３６．７ｍｍ３の腫瘍を有していた。腫瘍体積の比較研究の結果を、表２及び図１４に示す。
【００６３】
生存率は、ＳＣＩＤマウスでも、ＢＩＶリポソーム送達されたｓｈＲＮＡＰＤＸ−１（Ｌ−ｍｕ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１）のＩＶ注入後に向上し、Ｌ−ｍｕ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１注射の回数と相関するようであった（図１３）。リポプレックス（即ち、インビボ研究のために使用される脂質−プラスミド複合体）を、ベクターそのものと区別するために接頭語「Ｌ−」で表す。インスリン値の減少及び血糖値の増加は、インスリノーマ成長阻害というＬ−ｍｕ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１処理の結果に対応する。Ｌ−ｍｕ−ｓｈＰＤＸ−１による処理後の動物の腫瘍応答は、フローサイトメトリーによるインスリノーマ細胞のＰＤＸ−１ノックダウンの検出並びに細胞周期タンパク質（サイクリンＥ、ｃｄｋ４、ｃｄｋ２）のノックダウン及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｐ２７）の上方制御と相関した。アポトーシスも示された。本発明者らはさらに、ＰＤＸ−１発現性ヒト膵臓がんマウス異種移植片モデルにおいて、ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１リポプレックスのＩＶ注入の用量依存的な延命効果をさらに実証した。
【００６４】
【表２】
2014207907.tif 000005
【００６５】
新規ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１：二機能性ｓｈＲＮＡ戦略を適用するために、本発明者らは、マウス（ｍｕ）−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１を調製し、検証した。ｍｕ−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１は、ｍｉＲ−３０ａ主鎖を有する２つのステムループ構造からなる。第１のステムループ構造は、完全相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有し、第２のステムループ構造は、パッセンジャー鎖の１０及び１１位に２つの塩基対ミスマッチを有する。ｍｕ−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１は、マウスＰＤＸ−１ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００８８１４）のヌクレオチド＃７２３〜＃７４１を標的とする。
【００６６】
ｍｕ−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１発現単位を、オリゴヌクレオチドの組合せと共に構築した。５’及び３’末端それぞれにSalI及びNotI部位を有する構築発現単位を、pUMVC3のSalI及びNotI部位に挿入した。インサートに隣接するプライマーで両方向から配列決定することによって、インサート配列を確認した。マイクロＲＮＡの検出のために開発されたステムループＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｍｕ−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１をトランスフェクトした細胞中の成熟ｓｈＲＮＡを検出した。本発明者らはさらに、５’ＲＡＣＥアッセイによってｍｕ−ｂｉ−ｓｈＲＮＡＰＤＸ−１の活性を検証して、標的部位切断を検出した。
【００６７】
本発明のｂｉ−ｓｈＲＮＡプラスミドのインサート配列を以下に示す。
【００６８】
pGBI-20：ヒトｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ１（配列番号３）：
【００６９】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATTCAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATCTAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００７０】
配列番号３の下線部分（２５〜４３の核酸残渣を含む）は、主要標的部位を表す。
【００７１】
pGBI-21：ヒトｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１（配列番号４）：
【００７２】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATTCAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００７３】
pGBI-22：ヒトｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１（配列番号５）：
【００７４】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTACAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTCTAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００７５】
pGBI-23：ヒトｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１（配列番号６）：
【００７６】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTACAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００７７】
pGBI-24：マウスｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１（配列番号７）：
【００７８】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAGAAACGTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAACAACATAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００７９】
配列番号４の下線部分（２５〜４３の核酸残渣を含む）は、主要標的部位を表す。
【００８０】
pGBI-25：マウスｂｉ−ｓｈＲＮＡ−ＰＤＸ−１（配列番号８）：
【００８１】
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAGAAACGTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
【００８２】
本発明の新規ｂｉ−ｓｈＲＮＡ治療薬の調製は、転写後の遺伝子ノックダウンによって効果的な治療結果を達成するのに必要な有効全身用量を減少させることができる最先端の方法といえる。ＰＤＸ−１過剰発現腫瘍の全身標的化へと迅速に移行できる効果的で臨床的に応用可能な送達法が整っている。
【００８３】
本明細書中に記載した実施形態はいずれも、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施可能であり、逆の場合も同様であると考えられる。さらにまた、本発明の組成物は、本発明の方法の実施に使用できる。
【００８４】
本明細書中に記載した特定の実施形態は一例として示すのであって、本発明を限定するものとして示すのではないことがわかるであろう。この発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、種々の実施形態で実施可能である。当業者ならば、常法にすぎない実験を使用すれば、本明細書中に記載した具体的な方法の多数の均等物を認識、又は確認できるであろう。このような均等物を、本発明の範囲内であるとみなし、特許請求の範囲によって保護する。
【００８５】
本明細書中に記載した全ての公表文献及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の技術レベルを示す。全ての公表文献及び特許出願は、個々の公表文献又は特許出願が参照によって明確且つ個別に組み込まれていることが示された場合と同程度まで、参照によって本明細書中に組み入れる。
【００８６】
単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書中で用語「含む（comprising）」と共に使用する場合、「１の」を意味することができるが、「１又は２以上の」、「少なくとも１の」及び「１又は１超の」の意味とも矛盾しない。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、選択肢のみを指すことが明確に示されているか又は選択肢が相互排他的である場合を除いて、「及び／又は（and/or）」を意味して使われるものであるが、本開示は選択肢のみ及び「及び／又は」を指す定義も支持する。本出願の全体を通じて、「約」という用語は、値が、その値の測定に用いられた装置、方法の誤差の固有変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すのに用いる。
【００８７】
本明細書及び特許請求の範囲中で使用する「含む（comprising）」（並びにｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「有する（having）」（並びにｈａｖｉｎｇの任意の形、例えば、「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」）、「含む（including）」（並びにｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」）又は「含有する（containing）」（並びにｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」）という用語は、包括的又は非限定的であり、列挙していない追加の要素又は方法のステップを排除しない。
【００８８】
本明細書中で使用する「又はそれらの組合せ」という用語は、この用語の前に記載された用語の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の状況で順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例に続いて、１又は２以上のアイテム又は用語の反復、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどを含む組合せも明白に含まれる。当業者は、状況から明らかでない限り、典型的には、任意の組合せ中のアイテム又は用語の数に制限がないことがわかるであろう。
【００８９】
本明細書中で使用する近似の単語、例えば、限定するものではないが、「約」、「実質的な」又は「実質的に」が指す状態は、それによって修飾される場合に、必ずしも絶対的又は完全でないと理解されるが、その状態が存在しているとするに値する、当業者にとっては十分に近いとみなされるであろう状態を指す。記載が変動し得る程度は、可能な変化の大きさと、修飾された特徴が修飾されていない特徴に必須の特性及び能力を依然として有すると当業者が認めることができる変化の大きさによるであろう。しかし、一般に、前記説明を受けて、「約」などの近似の単語で修飾された本明細書中の数値は、記載された値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％変動してもよい。
【００９０】
本明細書中に開示され且つ特許請求の範囲に記載された組成物及び／又は方法は全て、必要以上の実験を行わずに本開示を踏まえて製造及び実施可能である。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱せずに、本明細書中に記載した組成物及び／又は方法に対して、並びに方法のステップ又は一連のステップにおいて、変形形態が適用されてもよいことは、当業者には明白であろう。当業者に明白なこのような類似した置換形態及び変更形態は全て、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内とみなされる。
【００９１】
（参考文献）
U.S.Patent Application No. 2009/0163431: Compositions and Methods for Modulation
of PDX-1
U.S.Patent No. 6,716,824: Treatment of Pancreatic Adenocarcinoma by Cytotoxic Gene Therapy
1. Hirshberg, B., et al., Malignant insulinoma: spectrum of unusual clinical features. Cancer, 2005. 104(2): pp. 264-72
2. Pavelic, K., et al., Molecular genetics of malignant insulinoma. Anticancer Res, 1996. 16(4A): pp. 1707-17
3. Kaltsas, G.A., G.M. Besser, and A.B. Grossman, The diagnosis and medical management of advanced neuroendocrine tumors. Endocr Rev, 2004. 25(3): pp. 458-511
4. Pelengaris, S. and M. Khan, Oncogenic co-operation in beta-cell tumorigenesis. Endocr Relat Cancer, 2001. 8(4): pp. 307-14
5. House, M.G. and R.D. Schulick, Endocrine tumors of the pancreas. Curr Opin Oncol, 2006. 18(1): pp. 23-9
6. Vezzosi, D., et al., Octreotide in insulinoma patients: efficacy on hypoglycemia, relationships with Octreoscan scintigraphy and immunostaining with anti-sst2A and anti-sst5 antibodies. Eur J Endocrinol, 2005. 152(5): pp. 757-67
7. Brennan, M.F., Pancreatic cancer. J Gastroenterol Hepatol, 2000. 15 Suppl: pp. G13-6
8. Urgell, E., et al., Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19.9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. Eur J Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-75
9. Willett, C.G., W.J. Daly, and A.L. Warshaw, CA 19-9 is an index of response to neoadjunctive chemoradiation therapy in pancreatic cancer. Am J Surg, 1996. 172(4): pp. 350-2
10. Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front Biosci, 1998. 3: pp. E214-25
11. Brennan, M., Pancreatic cancer. J. Gastroenterol. Hepatol, 2000. 15: pp. G13-6
12. Urgell E, P.P., Boadas J, Capella G, Queralto MJM, Boluda R, et al, Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19-9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer Eur. J. Cancer, 2000. 36(16): pp. 2069-2075
13. Willet C, D.W., Warshaw A., CA19-9 is an index of response to neoadjuvant chemoradiation in pancreatic cancer. Am. J. Surg, 1996. 172: pp. 350-352
14. Blaszkowsky, L., Treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Front. Biosci 1998. 3: pp. 214-225
15. Watada, H., et al., PDX-1 induces insulin and glucokinase gene expressions in alphaTC1 clone 6 cells in the presence of betacellulin. Diabetes, 1996. 45(12): pp. 1826-31
16. Bretherton-Watt, D., N. Gore, and D.S. Boam, Insulin upstream factor 1 and a novel ubiquitous factor bind to the human islet amyloid polypeptide/amylin gene promoter. Biochem J, 1996. 313 ( Pt 2): pp. 495-502
17. Carty, M.D., et al., Identification of cis- and trans-active factors regulating human islet amyloid polypeptide gene expression in pancreatic beta-cells. J Biol Chem, 1997. 272(18): pp. 11986-93
18. Serup, P., et al., Induction of insulin and islet amyloid polypeptide production in pancreatic islet glucagonoma cells by insulin promoter factor 1. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(17): pp. 9015-20
19. Watada, H., et al., Involvement of the homeodomain-containing transcription factor PDX-1 in islet amyloid polypeptide gene transcription. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 229(3): pp. 746-51
20. Ballian, N., et al., Proliferation, hyperplasia, neogenesis, and neoplasia in the islets of Langerhans. Pancreas, 2007. 35(3): pp. 199-206
21. Hagman, D.K., et al., Palmitate inhibits insulin gene expression by altering PDX-1 nuclear localization and reducing MafA expression in isolated rat islets of Langerhans. J Biol Chem, 2005. 280(37): pp. 32413-8
22. Leys CM, N.S., Rudzinski E, Kaminishi M, Montgomery E, Washington MK, Goldenring JR, Expression of PDX-1 in human gastric metaplasia and gastric adenocarcinoma. Hum Pathol., 2006. 37(9): pp. 1162-8
23. Sakai H, E.Y., Li XL, Akiyama Y, Miyake S, Takizawa T, Konishi N, Tatematsu M, Koike M, Yuasa Y, PDX-1 homeobox protein expression in pseudopyloric glands and gastric carcinomas. Gut, 2004. 53(3): pp. 323-30
24. Miyatsuka T, K.H., Shiraiwa T, Matsuoka TA, Yamamoto K, et al, Persistent expression of PDX-1 in the pancreas causes acinar-to-ductal metaplasia through Stat3 activation. Genes Dev, 2006. 20(11): pp. 1435-40
25. Wang, X.P., et al., Tissue MicroArray analyses of pancreatic duodenal homeobox-1 in human cancers. World J Surg, 2005. 29(3): pp. 334-8
26. Ayala, G., Prognostic Value of Akt-1 in Prostate Cancer: A Computerized Quantitative Approach with Quantum Dot Technology, in Abstract and presentation. 2007, United States Academy of Pathology: San Diego
27. Liu, S., et al., PDX-1 acts as a potential molecular target for treatment of human pancreatic cancer. Pancreas, 2008. 37(2): pp. 210-20
28. Scherr, M., et al., Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA. Blood, 2003. 101(4): pp. 1566-9
29. Brummelkamp, T.R., R. Bernards, and R. Agami, Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell, 2002. 2(3): pp. 243-7
30. Martinez, L.A., et al., Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(23): pp. 14849-54
31. Yoshinouchi, M., et al., In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16-positive cervical cancer cells by E6 siRNA. Mol Ther, 2003. 8(5): pp. 762-8
32. Choudhury, A., et al., Small interfering RNA (siRNA) inhibits the expression of the Her2/neu gene, upregulates HLA class I and induces apoptosis of Her2/neu positive tumor cell lines. Int J Cancer, 2004. 108(1): pp. 71-7
33. Yang, G., et al., Inhibition of breast and ovarian tumor growth through multiple signaling pathways by using retrovirus-mediated small interfering RNA against Her-2/neu gene expression. J Biol Chem, 2004. 279(6): pp. 4339-45
34. Farrow, B., et al., Inhibition of pancreatic cancer cell growth and induction of apoptosis with novel therapies directed against protein kinase A. Surgery, 2003. 134(2): pp. 197-205
35. Yague, E., C.F. Higgins, and S. Raguz, Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1. Gene Ther, 2004. 11(14): pp. 1170-4
36. Kosciolek, B.A., et al., Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference. Mol Cancer Ther, 2003. 2(3): pp. 209-16
37. Cioca, D.P., Y. Aoki, and K. Kiyosawa, RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines. Cancer Gene
Ther, 2003. 10(2): pp. 125-33
38. Kawasaki, H. and K. Taira, Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res, 2003. 31(2): pp. 700-7
39. Li, K., et al., Use of RNA interference to target cyclin E-overexpressing hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 2003. 63(13): pp. 3593-7
40. Verma, U.N., et al., Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells. Clin Cancer Res, 2003. 9(4): pp. 1291-300
41. Aharinejad, S., et al., Colony-stimulating factor-1 blockade by antisense oligonucleotides and small interfering RNAs suppresses growth of human mammary tumor xenografts in mice. Cancer Res, 2004. 64(15): pp. 5378-84
42. Uchida, H., et al., Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin induced apoptosis and attenuated tumor cell growth in vitro and in vivo. Mol Ther, 2004. 10(1): pp. 162-71
43. Salisbury, A.J. and V.M. Macaulay, Development of molecular agents for IGF receptor targeting. Horm Metab Res, 2003. 35(11-12): pp. 843-9
44. Duxbury, M.S., et al., Focal adhesion kinase gene silencing promotes anoikis and suppresses metastasis of human pancreatic adenocarcinoma cells. Surgery, 2004. 135(5): pp. 555-62
45. Duxbury, M.S., et al., Systemic siRNA-mediated gene silencing: a new approach to targeted therapy of cancer. Ann Surg, 2004. 240(4): pp. 667-74; discussion 675-6
46. Filleur, S., et al., SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1 and slows tumor vascularization and growth. Cancer Res, 2003. 63(14): pp. 3919-22
47. Takei, Y., et al., A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics. Cancer Res, 2004. 64(10): pp. 3365-70
48. Lakka, S.S., et al., Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion, tumor growth and angiogenesis. Oncogene, 2004. 23(27): pp. 4681-9
49. Singh, A., et al., RNAi-mediated silencing of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 gene expression in non-small cell lung cancer inhibits tumor growth and increases efficacy of chemotherapy. Cancer Res, 2008. 68(19): pp. 7975-84
50. Nakahira, S., et al., Involvement of ribonucleotide reductase M1 subunit overexpression in gemcitabine resistance of human pancreatic cancer. Int J Cancer, 2007. 120(6): pp. 1355-63
51. Cullen, B.R., RNAi the natural way. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1163-5
52. Zeng, Y. and B.R. Cullen, Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA, 2003. 9(1): pp. 112-23
53. Silva, J.M., et al., Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nat Genet, 2005. 37(11): pp. 1281-8
54. Hutvagner, G. and P.D. Zamore, A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 2002. 297(5589): pp. 2056-60
55. Yekta, S., I.H. Shih, and D.P. Bartel, MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science, 2004. 304(5670): pp. 594-6
56. Pillai, R.S., C.G. Artus, and W. Filipowicz, Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. Rna, 2004. 10(10): pp. 1518-25
57. Valencia-Sanchez, M.A., et al., Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev, 2006. 20(5): pp. 515-24
58. Parker, R. and U. Sheth, P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Mol Cell, 2007. 25(5): pp. 635-46
59. (2008 ) Breakdown of RNAi-Based Drugs in the Clinic. RNAi News Volume. 
60. Heidel, J.D., et al., Potent siRNA inhibitors of ribonucleotide reductase subunit RRM2 reduce cell proliferation in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2007. 13(7): pp. 2207-15
61. Judge, A.D., et al., Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice. J Clin Invest, 2009. 119(3): pp. 661-73
62. Zukiel, R., et al., Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for tenascin-C. Cancer Biol Ther, 2006. 5(8): pp. 1002-7
63. Wyszko, E., et al., A multivariate analysis of patients with brain tumors treated with ATN-RNA. Acta Pol Pharm, 2008. 65(6): pp. 677-84
64. Calvo, A., et al., Identification of VEGF-regulated genes associated with increased lung metastatic potential: functional involvement of tenascin-C in tumor growth and lung metastasis. Oncogene, 2008. 27(40): pp. 5373-84
65. Heidel, J.D., et al., Administration in non-human primates of escalating intravenous doses of targeted nanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(14): pp. 5715-21
66. Okamura, K., et al., Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev, 2004. 18(14): pp. 1655-66
67. Miyoshi, K., et al., Slicer function of Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev, 2005. 19(23): pp. 2837-48
68. Tomari, Y., T. Du, and P.D. Zamore, Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell, 2007. 130(2): pp. 299-308
69. Forstemann, K., et al., Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct argonaute complexes after production by dicer-1. Cell, 2007. 130(2): pp. 287-97
70. Landthaler, M., et al., Molecular characterization of human Argonaute-containing ribonucleoprotein complexes and their bound target mRNAs. RNA, 2008. 14(12): pp. 2580-96
71. Rana, S., et al., Stathmin 1: a novel therapeutic target for anticancer activity. Expert Rev Anticancer Ther, 2008. 8(9): pp. 1461-70
72. Iancu, C., et al., Effects of stathmin inhibition on the mitotic spindle. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 5): pp. 909-16
73. Chen, C., et al., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res, 2005. 33(20): pp. e179
74. Merritt, W.M., et al., Dicer, Drosha, and outcomes in patients with ovarian cancer. N EnglJ Med, 2008. 359(25): pp. 2641-50
75. Senzer, N., D. Rao, and J. Nemunaitis, Letter to the Editor: Does Dicer expression affect shRNA processing? Gene Regulation and Systems Biology (in press)
76. Rao, D.R., Maples, P.B., Senzer, N., Kumar, P., Wang, Z., Pappen, B.O., Yu, Y., Haddock, C., Tong, A., Nemunaitis, J., Bifunctional shRNA: A novel approach of RNA interference. (submitted), 2009
77. Ruponen M, H.P., Ronkko S, Pelkonen J, Tammi M, Urtti A, Extracellular and intracellular barriers in non-viral gene delivery J Control Release, 2003. 93(2): pp. 213-217
78. Simberg D, W.A., Barenholz Y, Reversible mode of binding of serum proteins to DOTAP/cholesterol Lipoplexes: a possible explanation for intravenous lipofection efficiency. Hum Gene Ther, 2005. 16(9): pp. 1087-1096
79. Jay, C., et al., Preclinical Assessment of wt GNE Gene Plasmid for Management of Hereditary Inclusion Body Myopathy 2 (HIBM2). Gene Regulation & Systems Biology, 2008. 2: pp. 243-52
80. Frank O, R.C., Heberlein C, Neuhoff Nv, Schrock E, Schambach A, et al., Tumor cells escape suicide gene therapy by genetic and epigenetic instability. Blood 2004. 104(12): pp. 3543-3539
81. Ito I, J.L., Tanaka F, Saito Y, Gopalan B, Branch CD, Xu K, Atkinson EN, Bekele BN, Stephens LC, Minna JD, Roth JA, Ramesh R Liposomal vector mediated delivery of the 3p FUS1 gene demonstrates potent antitumor activity against human lung cancer in vivo. Cancer Gene Ther, 2004. 11(11): pp. 733-9
82. Templeton, N.S., Reversible masking of liposomal complexes for targeted delivery, USPTO, Editor. 2006, Baylor Collegeof Medicine: USA
83. Phadke, A.P., et al., Safety and in vivo expression of a GNE-transgene: A novel treatment approach for Hereditary Inclusion Body Myopathy-2. Gene Regulation & Systems Biology, 2009. 3: pp. 89-101
84. Pirollo, K.F. and E.H. Chang, Targeted delivery of small interfering RNA: approaching effective cancer therapies. Cancer Res, 2008. 68(5): pp. 1247-50
85. Khalil, I.A., et al., Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. Pharmacol Rev, 2006. 58(1): pp. 32-45
86. Li, S.D., et al., Tumor-targeted delivery of siRNA by self-assembled nanoparticles. Mol Ther, 2008. 16(1): pp. 163-9
87. Tong, A.W., et al., Systemic therapeutic gene delivery for cancer: crafting paris' arrow. Curr Gene Ther, 2009. 9(1): pp. 45-60
88. Simoes, S., et al., Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides. Gene Ther, 1999. 6(11): pp. 1798-807
89. Simoes, S., et al., Cationic liposomes for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv, 2005. 2(2): pp. 237-54
90. Sapra, P., P. Tyagi, and T.M. Allen, Ligand-targeted liposomes for cancer treatment. Curr Drug Deliv, 2005. 2(4): pp. 369-81
91. Sapra, P., B., et al., Ligand-targeted liposomes for cancer treatmentLiposomal doxorubicin: antitumor activity and unique toxicities during two complementary phase I studies. Curr Drug DelivJ Clin Oncol, 20051995. 213(47): pp. 369-811777-85
92. Uziely, B., et al., Liposomal doxorubicin: antitumor activity and unique toxicities during two complementary phase I studies. J Clin Oncol, 1995. 13(7): pp. 1777-85
93. Park, J.W., et al., Tumor targeting using anti-her2 immunoliposomes. J Control Release, 2001. 74(1-3): pp. 95-113
94. Bartlett, D.W., N. S., et al., Impact of tumor-specific targetingImproved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and dosing schedule on tumor growth inhibition after intravenous administration of siRNA-containing nanoparticlesgene expression. Nat Biotechnol Bioeng, 20081997. 9915(47): pp. 975-85647-52
95. Kirpotin, D.B., et al., Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res, 2006. 66(13): pp. 6732-40
96. Maeda, N., et al., Enhancement of anticancer activity in antineovascular therapy is based on the intratumoral distribution of the active targeting carrier for anticancer drugs. Biol Pharm Bull, 2006. 29(9): pp. 1936-40
97. Bartlett, D.W., et al., Impact of tumor-specific targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured by multimodality in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(39): pp. 15549-54
98. Bartlett, D.W. and M.E. Davis, Impact of tumor-specific targeting and dosing schedule on tumor growth inhibition after intravenous administration of siRNA-containing nanoparticles. Biotechnol Bioeng, 2008. 99(4): pp. 975-85
99. Ramesh, R., et al., Successful treatment of primary and disseminated human lung cancers by systemic delivery of tumor suppressor genes using an improved liposome vector. Mol Ther, 2001. 3(3): pp. 337-50
100. Hashizume, H., et al., Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am J Pathol, 2000. 156(4): pp. 1363-80
101. Netti, P.A., et al., Effect of transvascular fluid exchange on pressure-flow relationship in tumors: a proposed mechanism for tumor blood flow heterogeneity. Microvasc Res, 1996. 52(1): pp. 27-46
102. Yuan, F., et al., Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res, 1994. 54(17): pp. 4564-8
103. Feng, Y., et al., Solid-phase SN2 macrocyclization reactions to form beta-turn mimics. Org Lett, 1999. 1(1): pp. 121-4
104. Bruno, M.A., et al., Long-lasting rescue of age-associated deficits in cognition and the CNS cholinergic phenotype by a partial agonist peptidomimetic ligand of TrkA. J Neurosci, 2004. 24(37): pp. 8009-18
105. Zaccaro, M.C., et al., Selective small molecule peptidomimetic ligands of TrkC and TrkA receptors afford discrete or complete neurotrophic activities. Chem Biol, 2005. 12(9): pp. 1015-28
106. Liu, G., et al., Nanoparticles of compacted DNA transfect postmitotic cells. J Biol Chem, 2003. 278(35): pp. 32578-86
107. Fink, T.L., et al., Plasmid size up to 20 kbp does not limit effective in vivo lung gene transfer using compacted DNA nanoparticles. Gene Ther, 2006. 13(13): pp. 1048-51
108. Ziady, A.G., et al., Transfection of airway epithelium by stable PEGylated poly-L-lysine DNA nanoparticles in vivo. Mol Ther, 2003. 8(6): pp. 936-47
109. Yurek, D.M., et al., Long-term transgene expression in the central nervous system using DNA nanoparticles. Mol Ther, 2009. 17(4): pp. 641-50
110. Yurek, D.M., et al., Compacted DNA nanoparticle gene transfer of GDNF to the rat striatum enhances the survival of grafted fetal dopamine neurons. Cell Transplant, 2009
111. Farjo, R., et al., Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles. PLoS One, 2006. 1: pp. e38
112. Cai, X., et al., A partial structural and functional rescue of a retinitis pigmentosa model with compacted DNA nanoparticles. PLoS One, 2009. 4(4): pp. e5290
113. Chen, X., et al., Cell surface nucleolin serves as receptor for DNA nanoparticles composed of pegylated polylysine and DNA. Mol Ther, 2008. 16(2): pp. 333-42
114. Ziady, A.G., et al., Minimal toxicity of stabilized compacted DNA nanoparticles in the murine lung. Mol Ther, 2003. 8(6): pp. 948-56
115. Ding, X.-Q., et al., Ocular delivery of compacted DNA-nanoparticles does not elicit toxicity in the mouse retina. Plos One, 2009. In press
116. Konstan, M.W., et al., Compacted DNA nanoparticles administered to the nasal mucosa of cystic fibrosis subjects are safe and demonstrate partial to complete cystic fibrosis transmembrane regulator reconstitution. Hum Gene Ther, 2004. 15(12): pp. 1255-69
【図１Ａ】
2014207907.tif 000006
【図１Ｂ】
2014207907.tif 000007
【図２】
2014207907.tif 000008
【図３Ａ】
2014207907.tif 000009
【図３Ｂ】
2014207907.tif 000010
【図４】
2014207907.tif 000011
【図５Ａ】
2014207907.tif 000012
【図５Ｂ】
2014207907.tif 000013
【図６Ａ】
2014207907.tif 000014
【図６Ｂ】
2014207907.tif 000015
【図６Ｃ】
2014207907.tif 000016
【図７Ａ】
2014207907.tif 000017
【図７Ｂ】
2014207907.tif 000018
【図７Ｃ】
2014207907.tif 000019
【図８】
2014207907.tif 000020
【図９Ａ】
2014207907.tif 000021
【図９Ｂ】
2014207907.tif 000022
【図１０Ａ】
2014207907.tif 000023
【図１０Ｂ】
2014207907.tif 000024
【図１１】
2014207907.tif 000025
【図１２】
2014207907.tif 000026
【図１３】
2014207907.tif 000027
【図１４】
2014207907.tif 000028
【図１５】
2014207907.tif 000029
【配列表】
2014207907000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月2日(2014.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと、
前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートと
を含む発現ベクターであって、前記核酸インサートが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができ、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する、１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードし、前記ｓｈＲＮＡに１又は２以上のｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、前記発現ベクター。
【請求項２】
ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲ領域配列とハイブリダイズする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
治療薬担体と、
プロモーター、及びＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーン発現を阻害する１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートを含む発現ベクターと
を含む治療薬送達系であって、前記ｓｈＲＮＡに１又は２以上のｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、前記治療薬送達系。
【請求項４】
治療薬担体が凝縮ＤＮＡナノ粒子である、請求項３に記載の送達系。
【請求項５】
凝縮ＤＮＡナノ粒子が、１又は２以上のポリカチオンで凝縮されている、請求項４に記載の送達系。
【請求項６】
１又は２以上のポリカチオンが、１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）である、請求項５に記載の送達系。
【請求項７】
凝縮ＤＮＡナノ粒子がさらにリポソーム中に封入されている、請求項４〜６のいずれかに記載の送達系。
【請求項８】
リポソームが２層中空小胞（ＢＩＶ）である、請求項７に記載の送達系。
【請求項９】
リポソームが、可逆的にマスクされたリポソームである、請求項７に記載の送達系。
【請求項１０】
リポソームが、１又は２以上のレセプター標的化部分で装飾されている、請求項７に記載の送達系。
【請求項１１】
１又は２以上のレセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項１０に記載の送達系。
【請求項１２】
治療薬担体がリポソームである、請求項３に記載の送達系。
【請求項１３】
リポソームが、１又は２以上のレセプター標的化部分で装飾されている２層中空小胞（ＢＩＶ）であり、前記リポソームが可逆的にマスクされているリポソームである、請求項１２に記載の送達系。
【請求項１４】
レセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項１３に記載の送達系。
【請求項１５】
１又は２以上の標的細胞中のＰＤＸ−１オンコジーンの発現をインビトロでサイレンシングする方法であって、
前記１又は２以上の標的細胞を選択するステップと、
前記ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターを前記標的細胞にトランスフェクトするステップと
を含み、前記１又は２以上の標的細胞への前記ベクターのトランスフェクションがＲＮＡ干渉によってＰＤＸ−１オンコジーンの発現を阻害し、前記ｓｈＲＮＡに１又は２以上のｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、前記方法。
【請求項１６】
ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲ領域配列とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療薬担体と、
ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の領域とハイブリダイズすることができる１又は２以上の二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現する発現ベクターと
を含む腫瘍細胞成長の抑制及び／又は膵島新生物障害の治療剤であって、前記ハイブリダイゼーションが腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止、又は侵襲性の低下をもたらし、前記ｓｈＲＮＡに１又は２以上のｓｉＲＮＡ（切断依存性）モチーフ及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフが組み込まれている、前記抑制及び／又は治療剤。
【請求項１８】
膵島新生物障害が、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、インスリノーマ及びカルチノイドを含む、請求項１７に記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項１９】
ｓｈＲＮＡが、ＰＤＸ−１オンコジーンをコードするｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲ領域配列とハイブリダイズする、請求項１７又は１８に記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２０】
膵島新生物障害が、膵臓神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）である、請求項１７に記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２１】
治療薬担体が、凝縮ＤＮＡナノ粒子、又は１若しくは２以上のレセプター標的化部分で装飾された、可逆的にマスクされたリポソームである、請求項１７〜２０のいずれかに記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２２】
凝縮ＤＮＡナノ粒子が、１又は２以上のポリカチオンで凝縮されており、前記１又は２以上のポリカチオンが、１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）又は３０ｍｅｒリジン縮合ペプチドである、請求項２１に記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２３】
可逆的にマスクされたリポソームが２層中空小胞（ＢＩＶ）である、請求項２１又は２２に記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２４】
１又は２以上のレセプター標的化部分が低分子二価βターン模倣体である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の抑制及び／又は治療剤。
【請求項２５】
凝縮ＤＮＡナノ粒子がリポソーム中にさらに封入されている、請求項２１〜２４のいずれかに記載の抑制及び／又は治療剤。