(57)【要約】【課題】簡便に、かつ特別な機器を用いることなく、皮膚感作性物質を検出できる方法を提供する。【解決手段】マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップから３６〜８０時間後に、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含む、皮膚感作性物質の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、
一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、
前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップから３６〜８０時間後に、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含む、皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項２】
他方の耳介に被験物質を塗布するステップの前後２４時間以内に一方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップをさらに含む、請求項１に記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項３】
前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップの前後２４時間以内に一方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップが、前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップと同時に一方の耳介にも同じ被験物質を塗布するステップである、請求項２に記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項４】
前記一定期間が７日以上２週間以内である、請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項５】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介リンパ節の重量の測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項６】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量の測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項７】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介の厚みの測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項８】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量の測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項９】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介の重量の測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項１０】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介リンパ節のトリチウムチミジンの取り込みの測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【請求項１１】
惹起反応の検出が、マウスの左右の耳介リンパ節のブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みの測定によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚感作性物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便に、皮膚感作性物質を検出できる新規な手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品、洗剤などの開発において、その主成分の原料、添加剤などとして材料を選択する場合、その材料に触れた消費者などにおいて皮膚免疫応答が惹起される性質を有する（「皮膚感作性」を有する）物質（皮膚感作性物質）は、消費者の感受性によっては重篤なアレルギー反応を引き起こしてしまう場合もあるため、皮膚感作性の有無の検出は特に重要である。
【０００３】
天然物、化学物質の皮膚感作性を検出する方法としては、従来、モルモット、マウスなどの動物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、さらには、ペプチドとの結合性を調べる方法などが開発されている。これらの方法は、いずれも、ヒトにおける皮膚感作性と８０％程度の相関があることが明らかにされており、天然物、化学物質の皮膚感作性の検出に有効であることが示されている。
【０００４】
化学物質などによる感作の成立には、大きく分けて、２つの段階があることが知られている。第一の段階は、化学物質が体内に入って、生体内のタンパク質などと結合し、これを樹状細胞が異物として認識し、一連の免疫応答を開始する「感作段階」である。第二の段階は、感作されたリンパ球が全身に広がり、再び、同一の化学物質などが体内に入ったときに、よりすばやく、より激しい応答を呈する「惹起段階」である。すなわち、上述した従来の皮膚感作性を検出する手法は、感作の成立のいずれかの段階を検出することを目的としている。
【０００５】
たとえば、アジュバントを用いるＧＰＭＴ（Guinea Pig Maximisation Test）法、アジュバントを用いないビューラー法は、「惹起段階」を検出する手法であり、これらの試験で陽性であるということは、原理的かつ原則的に感作が成立していると判断することができる（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６  皮膚感作性、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg406j.pdf＞（非特許文献１）を参照。）。ただし、これらの試験は、惹起を確認するために、試験期間としては、４週間以上の時間を必要としてしまう。また、これらの方法はモルモットを用いる方法であり、動物愛護の観点から代替し得る方法を見出すことが課題とされていた。
【０００６】
近年では、皮膚感作性を検出する方法として、モルモットではなくマウスを用いたＬＬＮＡ（Local Lymph Node Assay、局所リンパ節試験）が主流となっている（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９  皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg429j.pdf＞（非特許文献２）を参照
。）。ＬＬＮＡは、「感作段階」を検出する手法であり、試験開始１日目、２日目、３日目に、マウスの両耳に被験物質を塗布した後、６日目に、マウスから耳介リンパ節を採取する。被験物質が皮膚感作性物質であれば、耳介リンパ節においてリンパ球の増殖を惹起する。リンパ球の増殖は適用された用量（アレルゲンの効力）に比例するため、ＬＬＮＡでは、短い試験期間で、客観的かつ定量的に簡単に皮膚感作性を検出することができる。
【０００７】
しかしながら、上述のＬＬＮＡは、感作性の検出にラジオアイソトープ（ＲＩ）である３H-thymidineを用いることから、日本においては実施できる施設に制限があるという実
情があった。このため、その改良法として、放射性物質を用いずに、生物発光によりＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで、リンパ球の増殖の指標とする、ＬＬＮＡ：ＤＡ（modified LLNA of Daicel based on ATP）が提案されている（たとえば、「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ  皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg442aj.pdf＞（非特許文献３）を参照。）。
【０００８】
ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡのいずれの場合でも、一部の皮膚刺激性物質（皮膚に一過性の刺激を与える性質（皮膚刺激性）を有する物質）、界面活性剤などを試験に供した場合に、偽陽性（ある試験法で、被験物質が実際は陰性または非活性であるにもかかわらず、誤って陽性または活性と判定されること）になることが報告されている（たとえば、Christine Garcia et al., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307（非特許文献４）を参照）。したがって、マウスを用いて皮膚刺激性物質や界面活性剤を評価するときには、試験濃度と皮膚刺激性の関係や、構造情報も含めて、総合的な判断が必要とされている（たとえば、David Basketter et al., "Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets:Implications for REACH", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96（非特許文献５）を参照）。
【０００９】
また、たとえば、G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker(B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428（非特許文献６）には、マウスを用いた試験法
として、フローサイトメーターを用いて、細胞表層抗原を検出することにより、皮膚感作性物質と皮膚刺激性物質とを識別する手法が提案されている。しかしながら、このような非特許文献６に記載された手法を実施するためには、特別な装置が必要となってしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４０６  皮膚感作性、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg406j.pdf＞
【非特許文献２】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４２９  皮膚感作：局所リンパ節試験、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg429j.pdf＞
【非特許文献３】「経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の化学物質の試験に関するガイドライン」、４４２Ａ  皮膚感作性：局所リンパ節試験：ＤＡ、［平成２４年１０月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecd/tgj/tg442aj.pdf＞
【非特許文献４】Christine Garcia et al., "Comparative testing for the identification of skin-sensitizing potentials of nonionic sugar lipid surfactants", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 58, 2010, p301-307
【非特許文献５】David Basketter et al., "Application of a weight of evidenceapproach to assessing discordant sensitisation datasets:Implications for REACH", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 55, 2009, p90-96
【非特許文献６】G. Frank Gerberick et al., "Use of a B Cell Marker(B220) to Discriminate between Allergens and Irritants in the Local Lymph Node Assay", Toxicological Sciences, 68, 2002, p420-428
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、簡便に、かつ特別な機器を用いることなく、皮膚感作性物質を検出できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法は、マウスの一方の耳介に被験物質を塗布するステップと、一定期間後に、他方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップと、前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップから３６〜８０時間後に、前記他方の耳介における惹起反応を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法においては、他方の耳介に被験物質を塗布するステップの前後２４時間以内に、一方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップをさらに含むことが好ましい。
【００１４】
また本発明の皮膚感作性物質の検出方法では、前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップの前後２４時間以内に一方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップが、前記他方の耳介に被験物質を塗布するステップと同時に一方の耳介にも同じ被験物質を塗布するステップであることが好ましい。
【００１５】
上述した本発明の皮膚感作性物質の検出方法における一定期間は、７日以上２週間以内であることが好ましい。
【００１６】
また本発明の方法は、惹起反応の検出を、以下の（ａ）〜（ｇ）の少なくともいずれかの方法によって行うことが好ましい。
【００１７】
（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定する、
（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定する、
（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定する、
（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定する、
（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定する、
（ｆ）マウスの左右の耳介リンパ節のトリチウムチミジン取り込み量を測定する、
（ｇ）マウスの左右の耳介のリンパ節のブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み量を測定する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、マウスを用いて、簡便かつ短期間で、特別な装置を必要とせずに、従来と比較して格段に高い感度での皮膚感作性物質の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の皮膚感作性物質の検出方法の好ましい第１の例を模式的に示す図である。
【図２】本発明の皮膚感作性物質の検出方法の好ましい第２の例を模式的に示す図である。
【図３】実験例１の結果を示すグラフであり、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図４】実験例２の結果を示すグラフであり、図４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図５】実験例３のケージ１２、１３についての結果を示すグラフであり、図５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図６】実験例３のケージ１４、１５についての結果を示すグラフであり、図６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図７】実験例３のケージ１６、１７についての結果を示すグラフであり、図７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図８】実験例３のケージ１８、１９についての結果を示すグラフであり、図８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図９】実験例３のケージ２０、２１についての結果を示すグラフであり、図９（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図９（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１０】実験例３のケージ２２、２３についての結果を示すグラフであり、図１０（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１０（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１１】実験例３のケージ２４、２５についての結果を示すグラフであり、図１１（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１１（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１２】実験例３のケージ２６〜２９についての結果を示すグラフであり、図１２（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１２（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１３】実験例４のケージ３０、３１についての結果を示すグラフであり、図１３（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１３（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１４】実験例５のケージ３２、３３についての結果を示すグラフであり、図１４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１５】実験例５のケージ３４、３５についての結果を示すグラフであり、図１５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１６】実験例５のケージ３６、３７についての結果を示すグラフであり、図１６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１７】実験例５のケージ３８、３９についての結果を示すグラフであり、図１７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１８】実験例５のケージ４０、４１についての結果を示すグラフであり、図１８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図１９】実験例５のケージ４２、４３についての結果を示すグラフであり、図１９（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１９（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２０】実験例５のケージ４４、４５についての結果を示すグラフであり、図２０（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２０（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２１】実験例５のケージ４６、４７についての結果を示すグラフであり、図２１（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２１（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２２】実験例５のケージ４８、４９についての結果を示すグラフであり、図２２（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２２（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２３】実験例５のケージ５０、５１についての結果を示すグラフであり、図２３（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２３（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２４】実験例５のケージ５２、５３についての結果を示すグラフであり、図２４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２５】実験例５のケージ５４、５５についての結果を示すグラフであり、図２５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２６】実験例５のケージ５６、５７についての結果を示すグラフであり、図２６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２７】実験例５のケージ５８、５９についての結果を示すグラフであり、図２７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【図２８】実験例５のケージ６０、６１についての結果を示すグラフであり、図２８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明の皮膚感作性物質の検出方法の好ましい第１の例を模式的に示す図である。本発明の皮膚感作性物質の検出方法は、以下のステップを含む。
【００２１】
（１）マウス１の一方の耳介２に被験物質を塗布するステップ（ステップＳ１）、
（２）一定期間後に、他方の耳介３に同じ被験物質を塗布するステップ（ステップＳ２）、
（３）前記ステップＳ２から３６〜８０時間後に、前記他方の耳介３における惹起反応を検出するステップ（ステップＳ３）。
【００２２】
ここで、本発明の皮膚感作性物質の検出方法に用いるマウスについては特に限定されないが、これまで世界的に多くの統計データが蓄積されてきたＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡとの相関性が高ければ、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡと試験結果を照合しやすくなることから、たとえばＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスなど、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡに従来よりよく用いられているマウスを用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法におけるステップＳ１では、まず、マウス１の一方の耳介２に被験物質を塗布する。ここで、「耳介」は、マウスの外耳のうち外側に張り出している部分を指す。被験物質を塗布する部分は耳介に含まれるいずれの領域であってもよいが、塗布のしやすさ、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで蓄積されたデータと比較しやすいなどの観点から、耳背部の領域が好ましい。
【００２４】
本発明において用いられる「被験物質」は、溶媒または分散媒に溶解または分散させることでマウスの耳介に塗布可能となる被験物質塗布液に調製できるものであればよく、皮膚感作性物質、皮膚刺激性物質、その他皮膚感作性、皮膚刺激性のいずれも示さない物質など、未知の材料、公知の材料のいずれもを包含する。なお、被験物質は、非特許文献３
に記載された定義に沿って、単一の化合物であってもよく、また、多成分（最終製品、調製物など）からなるものであってもよい。溶媒、分散媒などは、当分野において用いられている公知の溶媒、分散媒を被験物質に応じて用いればよく、たとえば、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メチルエ
チルケトン、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。中でも、陽性対照（ＰＣ）として用いた場合に一貫した応答を示すことから、アセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）が好ましい。
【００２５】
「皮膚感作性物質」とは、個体が誘導性アレルゲンに局所的に曝露された際に生じる免疫学的過程によって皮膚免疫応答を惹起し、その結果、接触感作性の発現に至る性質（皮膚感作性）を有する物質を指す。このような皮膚感作性物質としては、たとえば、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）、イソオイゲノール、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、オイゲノール、パラフェニレンジアミン、コバルトクロライド、シトラル、イミダゾリジニルウレア、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧ）、ヘキサン、サリチル酸、イソプロパノール、２−メルカプトベンズチアゾール、メチルメタクリレート、シトラール、クロロベンゼン、乳酸、塩化ニッケル、塩化コバルト、フェニルベンゾエート、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン（ＣＭＩ）、シンナミルアルコール（ＣＡ）などが知られている。また、「皮膚刺激性物質」とは、皮膚に対し一過性の刺激を与える性質（皮膚刺激性）を有する物質を指し、このような皮膚刺激性物質として、たとえば、塩化ベンザルコニウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどが知られている。なお、上記に例示したイソオイゲノール、ＤＮＣＢ、ＤＮＦＢ、ＥＧ、サリチル酸などのように、皮膚感作性を有し、かつ、皮膚刺激性を有するものも知られている。
【００２６】
なお、後述するように、従来、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡなどでの試験結果では偽陽性であると判定され、皮膚感作性を有さないと一般的に考えられていた塩化ベンザルコニウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）について、本発明の皮膚感作性物質の検出方法によって初めて皮膚感作性を有することが確認された。このことは、本発明の皮膚感作性物質の検出方法が従来法と比較して極めて高い感度を有する方法であることを示している。
【００２７】
本発明の皮膚感作性物質の方法において、ステップＳ１で一方の耳介２に塗布する被験物質の量（投与量）は、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで採用される基準（非特許文献２、３などを参照）で調製されることが好ましいが、これに限定されるものではない。被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても特に制限されるものではないが、耳介が欠損するなどの著しい毒性、腐食性を示さない濃度であれば、０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、また、たとえば、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡなどで求めたＥＣ３の値の、０．２倍から５０倍の範囲内であることがより好ましい。これは、化学物質などの、刺激性および感作性にはばらつきがあるが、本試験法では、感作の判定に影響を与える刺激性の影響を無視して、感作性を評価できるためであると共に、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡで得られた結果を有効に活用できるためである。
【００２８】
また本発明において、ステップＳ１における被験物質塗布液の塗布回数は、１回の塗布量、被験物質塗布液中の被験物質の濃度、感作性の強さにも依存するが、１〜１０回であることが好ましく、１〜３回であることがより好ましく、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡとの相関性を高めることができる観点からは３回であることが特に好ましい。なお、被験物質を塗布する耳介の領域は、複数回の塗布ごとに（たとえば１回目の塗布と２回目の塗布とで）同じであってもよいし、同じ側の耳介であれば異なっていてもよい。また、ステップＳ１における塗布の間隔についても特に制限されないが、ＬＬＮＡとの相関性を高めることができることから、ＬＬＮＡで採用されているように１日目、２日目、３日目に塗布することが好ましい。この場合、各塗布の間に少なくとも１２時間以上の間隔をあけること
が好ましく、同一の時刻に塗布するようにすることが特に好ましい。
【００２９】
なお、ＬＬＮＡ：ＤＡにおいて、被験物質を塗布する前に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを予め被験物質を塗布する耳介に塗布しておくことで、検出の感度が上昇することが知られており、本発明の方法においても、これを採用してもよい。ＳＤＳを用いる場合、その濃度は、０．０１〜１０％の範囲が好ましく、０．１〜１％の範囲がより好ましい。
【００３０】
続くステップＳ２では、一定期間後に、他方の耳介３に同じ被験物質を塗布する。この「一定期間」について特に制限するものではないが、被験物質が皮膚感作性物質である場合には、この一定期間が当該皮膚感作性物質による感作開始から惹起までの期間となることから、７日以上２週間以内であることが好ましく、９日以上１２日以内であることがより好ましく、１０日以上１１日以内であることが特に好ましい。一定期間が７日未満であると、被験物質が皮膚感作性物質であった場合に、感作されたリンパ球の伝播による全身の感作が未だ起こっていないか起こっていたとしても検出には不十分であると言う傾向にあり、また、２週間を超えても、皮膚感作性物質の検出は可能であると考えるが、従来のモルモットを用いた試験と比較して、試験期間の短縮というメリットが薄れてしまう。
【００３１】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法において、ステップＳ２で他方の耳介３に塗布する被験物質の量（投与量）、被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても特に制限はされないが、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡの豊富なデータを活用するという理由からは、ステップＳ１において一方の耳介２に塗布した１回分の被験物質の量、濃度と同程度であることが好ましい。また、ステップＳ２における被験物質塗布液の塗布回数について特に制限されないが、１回であることが好ましい。
【００３２】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法におけるステップＳ３では、ステップＳ２で被験物質を塗布した他方の耳介３における惹起反応を検出する。本発明においては、この惹起反応の検出を、ステップＳ２から３６〜８０時間後に行なうことを大きな特徴とする。惹起反応の検出がステップＳ２から３６時間未満である場合には、耳介３のリンパ節の増殖が感作反応を科学的に検出するには不十分である場合があるためであり、８０時間を超える場合には、試験期間が十分な検出を行うのに必要以上に長期化するためである。感作期間を十分に確保し、なおかつ試験を２週間以内に実施することでモルモットを用いる方法より短期間で試験結果を得るという観点からは、好ましくはステップＳ２から４０〜７２時間後、特に好ましくはステップＳ２から４２〜５２時間後に惹起反応の検出を行なうことが好ましい。
【００３３】
ステップＳ３における惹起反応を検出する方法は、耳介リンパ節の増殖、皮膚反応を定量化できるのであれば特に制限されるものではなく、公知の方法を必要に応じて適宜組み合わせて行うことができるが、以下の（ａ）〜（ｇ）の少なくともいずれかの方法によって行い、コントロール群と比較することが好ましい。
【００３４】
（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定する、
（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定する、
（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定する、
（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定する、
（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定する、
（ｆ）マウスの左右の耳介リンパ節のトリチウムチミジン取り込み量を測定する、
（ｇ）マウスの左右の耳介のリンパ節のブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み量を測定する。
【００３５】
上述した（ａ）〜（ｇ）の方法は、いずれも公知であり、たとえば非特許文献２、３を含めた公知文献を適宜参照することで当業者であれば容易に実施可能である。なお、（ａ）マウスの左右の耳介リンパ節の重量を測定することで惹起反応を検出する場合には、汎用されている安価な精密電子天秤が使用できるという利点があり、（ｂ）マウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定することで惹起反応を検出する場合には、ＬＬＮＡ：ＤＡのデータと比較することにより、感作の程度を類推できるという利点がある。また、（ｃ）マウスの左右の耳介の厚みを測定することで惹起反応を検出する場合には、２０１０年７月に改定されたＴＧ４２９、ＴＧ４４２Ａ、ＴＧ４４２Ｂの実施の過程で取得できる耳介厚のデータが活用できるという利点があり、（ｄ）マウスの左右の耳介リンパ節のＤＮＡ量を測定することで惹起反応を検出する場合には、豊富に市販されているＤＮＡ精製キットを用いることにより、施設間でばらつきの少ないデータが取得できるという利点がある。（ｅ）マウスの左右の耳介の重量を測定することで惹起反応を検出する場合には、汎用されている安価な精密電子天秤が使用でき、また、作業者の熟練度の差が生じにくい可能性が高いという利点がある。（ｆ）マウスの左右の耳介リンパ節のトリチウムチミジン取り込み量を測定する場合には、ＬＬＮＡ法（ＴＧ４２９）で十分確立されている手法が応用可能である。（ｇ）マウスの左右の耳介のリンパ節のブロムデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み量を測定する場合には、ＬＬＮＡ−ＢｒｄＵ法（ＴＧ４４２Ｂ）で十分確立されている手法が応用可能である。
【００３６】
上述したステップＳ１〜Ｓ３を含む本発明の皮膚感作性物質の検出方法によれば、マウスを用いて、簡便かつ短期間で、特別な装置を必要とせずに、従来と比較して格段に高い感度での皮膚感作性物質の検出が可能となる。
【００３７】
ここで、図２は、本発明の皮膚感作性物質の検出方法の好ましい第２の例を模式的に示す図である。本発明の皮膚感作性物質の検出方法は、上述したステップＳ１〜Ｓ３に加え、他方の耳介に被験物質を塗布するステップの前後２４時間以内に、一方の耳介に同じ被験物質を塗布するステップ（ステップＳ２’）をさらに含むことが好ましい。このようなステップＳ２’をさらに含むことで、上述のように、ステップＳ３において、他方の耳介で惹起反応を検出するとともに、一方の耳介で十分な感作が成立していることを確認することができる。
【００３８】
ステップＳ２’は、ステップＳ２の前後２４時間以内に行なう。２４時間を超えてステップＳ２よりも前にステップＳ２’を行なった場合には、ステップＳ２’で投与した被験物質１が他方の耳介へ直接影響を与える可能性があるという虞があるためであり、また、２４時間を超えてステップＳ２よりも後にステップＳ２’を行なった場合には、ステップ２で投与した被験物質１が他方の耳介へ影響を与え、被験物質１による感作レベルが正確に評価できなくなるという虞があるためである。被験物質の皮膚感作性を正確に評価するためには、ステップＳ２’は、ステップＳ２の前後２４時間以内に行なうことがより好ましく、１２時間以内に行なうことがさらに好ましい。また、効率的に、連続的な作業で無駄なく本発明の皮膚感作性評価方法を行なう観点からは、ステップＳ２’は、ステップＳ２と同時に行なうことが好ましい。
【００３９】
本発明の皮膚感作性物質の検出方法において、ステップＳ２’において一方の耳介２に塗布する被験物質の量（投与量）、被験物質塗布液中の被験物質の濃度についても特に制限されるものではないが、ＬＬＮＡ、ＬＬＮＡ：ＤＡの豊富なデータを活用するという理由からは、ステップＳ１において一方の耳介２に塗布した１回分の被験物質の量、濃度と同程度であることが好ましい。また、ステップＳ２’における被験物質塗布液の塗布回数についても特に制限されないが、１回であることが好ましい。
【００４０】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
【００４１】
＜実験例１＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに５匹個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。
【００４２】
また、溶媒としてアセトン／オリーブオイル（４：１（ｖ／ｖ））(ＡＯＯ）を用い、
被験物質としてα−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）（皮膚感作性を有する）を用い、２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液（被験物質塗布液）を調製した。
【００４３】
以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００４４】
・ケージ１：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳にＡＯＯを塗布し、１０日目の同じ時刻に左耳にＡＯＯを塗布した後、１１日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量（発光量：Relative Light Unit（ＲＬＵ））を測定、
・ケージ２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１１日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定、
・ケージ３：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定、
・ケージ４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１２日目の同じ時刻に左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１３日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定、
・ケージ５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定（１、２、３日目の右耳への塗布なし）、
・ケージ６：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、調製したマウスの左右の耳介リンパ節懸濁液のＡＴＰ量を測定（１、２、３日目の右耳への塗布なし）。
【００４５】
それぞれ、摘出した耳介リンパ節は、リン酸バッファー中に懸濁して耳介リンパ節懸濁液を調製し、ルミテスターＣ−１００Ｎおよびルシフェール２５０プラス（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）を用いて、各耳介リンパ節懸濁液中のＡＴＰ量を測定した。
【００４６】
図３は、この実験例１の結果を示すグラフであり、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図３に示す結果から、１０日目惹起、１１日摘出の場合（ケージ２）よりも、１０日目惹起１２日目摘出の場合（ケージ３）の方が左の耳介リンパ節の惹起反応が明確であることが分かった。また、１２日目惹起、１３日目摘出の場合（ケージ４）には、ケージ２の場合と比較しても、左右とも耳介リンパ節の大きさの減少が認められ、検出感度が下がっていることが示された。
【００４７】
＜実験例２＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに５匹個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。また、実験例１と同様に、溶媒としてＡＯＯを用い、被験物質としてＨＣＡを用い、２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液（被験物質塗布液）を調製した。
【００４８】
以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００４９】
・ケージ７：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出して重量を測定（精密化学天秤を使用）後、実験例１と同様してそれぞれのＡＴＰ量を測定（１０日目の左耳への塗布なし）（以下、「Ｒ３Ｌ０」（右耳３回、左耳０回の意）とも表記）、
・ケージ８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に左耳のみに２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、ケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（以下、「Ｒ３Ｌ１」（右耳３回、左耳１回の意）とも表記）、
・ケージ９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、ケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（１、２、３日目の右耳への塗布なし）（以下、「Ｒ０Ｌ１」（右耳０回、左耳１回の意）とも表記）、
・ケージ１０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、ケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（以下、「Ｒ４Ｌ１」（右耳４回、左耳１回の意）とも表記）、
・ケージ１１：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳のみに２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、ケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（以下、「Ｒ４Ｌ０」（右耳４回、左耳０回の意）とも表記）。
【００５０】
図４は、この実験例２の結果を示すグラフであり、図４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図４に示す結果から、右耳に３回、左耳に１回塗布した場合（Ｒ３Ｌ１（ケージ８））と右耳に０回、左耳に１回塗布した場合（Ｒ０Ｌ１（ケージ９））とを比較すると、左耳への塗布で惹起反応が起こっていることが確認された。また、１０日目に４回目の右耳への塗布を行うことで（Ｒ４Ｌ１（ケージ１０））、これを行なわなかった場合（Ｒ３Ｌ１（ケージ８））と比較して、感作のレベルが確認できるようになったことが分かる。さらに、左耳への塗布を行なわなかった場合（Ｒ３Ｌ０（ケージ７）およびＲ４Ｌ０（ケージ１１）の左耳の結果、左耳のみに塗布した場合（Ｒ０Ｌ１（ケージ９））の左耳の結果、さらには、右耳に３回、左耳に１回塗布した場合（Ｒ３Ｌ１（ケージ８））および右耳に４回、左耳に１回塗布した場合（Ｒ４Ｌ１（ケージ１０））の結果を比較すると、右耳３回塗布の場合でも右耳４回塗布の場合でも、左耳のリンパ節の増殖には影響しないことが分かる。このように、１０日目に左耳だけでなく右耳にも被験物質塗布液を塗布することで、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できることが示された。
【００５１】
＜実験例３＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに５匹個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。以下の被験物質塗布液をそれぞれ調製した。
【００５２】
・０．２５％（ｗ／ｖ）  ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）／ＡＯＯ溶液、
・０．２５％（ｗ／ｖ）  ２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）／ＡＯＯ溶液、
・１０％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液、
・５０％（ｗ／ｖ）  エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧ）／メチルエチルケトン（ＭＥＫ）溶液、
・４０％（ｗ／ｖ）  イミダゾリジニルウレア／ＡＯＯ溶液、
・２．５％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液、
・１０％（ｗ／ｖ）  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液、
・２５％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート（Methyl Salytilate）／ＡＯＯ溶液、
・５０％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液。
【００５３】
以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００５４】
（０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ１２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ１３：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）
ＤＮＣＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００５５】
図５はこのケージ１２、１３についての結果を示すグラフであり、図５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図５に示されるように、被験物質としてＤＮＣＢを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００５６】
（０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＦＢ／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ１４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＦＢ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）  ＤＮＦＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ１５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に０．２５％（ｗ／ｖ）
ＤＮＦＢ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００５７】
図６はこのケージ１４、１５についての結果を示すグラフであり、図６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図６に示されるように、被験物質としてＤＮＦＢを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認し
つつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００５８】
（１０％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ１６：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１０％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１０％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ１７：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１０％（ｗ／ｖ）  イソオイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００５９】
図７はこのケージ１６、１７についての結果を示すグラフであり、図７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図７に示されるように、被験物質としてイソオイゲノールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００６０】
（５０％（ｗ／ｖ）  ＥＧ／ＭＥＫ溶液を用いた場合）
・ケージ１８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に５０％（ｗ／ｖ）  ＥＧ／ＭＥＫ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に５０％（ｗ／ｖ）  ＥＧ／ＭＥＫ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ１９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に５０％（ｗ／ｖ）  ＥＧ／ＭＥＫ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００６１】
図８はこのケージ１８、１９についての結果を示すグラフであり、図８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図８に示されるように、被験物質としてＥＧを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００６２】
（４０％（ｗ／ｖ）  イミダゾリジニルウレア／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ２０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に４０％（ｗ／ｖ）  イミダゾリジニルウレア／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に４０％（ｗ／ｖ）  イミダゾリジニルウレア／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ２１：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に４０％（ｗ／ｖ）  イミダゾリジニルウレア／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００６３】
図９はこのケージ２０、２１についての結果を示すグラフであり、図９（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図９（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図９に示されるように、被験物質としてイミダゾリジニルウレアを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００６４】
（２．５％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ２２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２．５％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２．５％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ２３：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２．５％（ｗ／ｖ）  塩化ベンザルコニウム／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００６５】
図１０はこのケージ２２、２３についての結果を示すグラフであり、図１０（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１０（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１０に示されるように、被験物質として塩化ベンザルコニウムを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。ここで、塩化ベンザルコニウムは、従来、皮膚刺激性は有するものの、ＬＬＮＡ：ＤＡなどを用いた皮膚感作性に関する検出結果は偽陽性であり、皮膚感作性は有さないと一般的に考えられていた。これは、塩化ベンザルコニウムの強い皮膚刺激性のため、塩化ベンザルコニウムについて皮膚感作性を検出しようとする場合には、低い濃度で行なっていたことに起因すると考えられる。本発明の皮膚感作性物質の検出方法は、従来法と比較すると、左右の耳介を用いることで皮膚の刺激を感じる濃度でも検出が可能であり、高い感度で皮膚感作性物質を検出できることが分かった。
【００６６】
（１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ／ＤＭＦ溶液を用いた場合）
・ケージ２４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ／ＤＭＦ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ／ＤＭＦ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ２５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ／ＤＭＦ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００６７】
図１１はこのケージ２４、２５についての結果を示すグラフであり、図１１（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１１（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１１に示されるように、被験物質としてＳＤＳを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。ＳＤＳの場合も、上述した塩化ベンザルコニウムと同様、皮膚刺激性は有するものの皮膚感作性は有さないと考えられていたが、本発明の皮膚感作性物質の検出方法により初めて、その皮膚感作性を検出することができた。
【００６８】
（メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ２６：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ２７：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  メ
チルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）、
・ケージ２８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に５０％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に５０％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ２９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に５０％（ｗ／ｖ）  メチルサリチレート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００６９】
図１２はこのケージ２６〜２９についての結果を示すグラフであり、図１２（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１２（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１２に示す結果から、皮膚感作性を有さないことが知られているメチルサリチレートについて、皮膚感作性は検出されなかった。
【００７０】
＜実験例４＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに５匹個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。実験例１と同様に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液（被験物質塗布液）を調製し、以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００７１】
・ケージ３０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、７日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、９日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ３１：７日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＨＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、９日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００７２】
図１３はこのケージ３０、３１についての結果を示すグラフであり、図１３（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１３（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。
【００７３】
＜実験例５＞
ＣＢＡ／Ｊの系統の未経産で非妊娠の若齢（８〜１２週齢）の雌マウスを各ケージごとに５匹個体識別ができるように飼育し、試験開始時および終了時に体重を測定した。以下の被験物質塗布液をそれぞれ調製した。
【００７４】
・２．５％（ｗ／ｖ）  パラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）／ＡＯＯ溶液、
・１００％（ｗ／ｖ）  ヘキサン、
・５０％（ｗ／ｖ）  サリチル酸／ＡＯＯ溶液、
・５０％（ｗ／ｖ）  イソプロパノール／ＡＯＯ溶液、
・２５％（ｗ／ｖ）  ２−メルカプトベンズチアゾール／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、
・１００％（ｗ／ｖ）  メチルメタクリレート、
・２５％（ｗ／ｖ）  シトラール／ＡＯＯ溶液、
・２５％（ｗ／ｖ）  クロロベンゼン／ＡＯＯ溶液、
・２５％（ｗ／ｖ）  乳酸／ＤＭＳＯ溶液、
・１０％（ｗ／ｖ）  塩化ニッケル／ＤＭＳＯ溶液、
・５０％（ｗ／ｖ）  オイゲノール／ＡＯＯ溶液、
・１０％（ｗ／ｖ）  塩化コバルト／ＤＭＳＯ溶液、
・１０％（ｗ／ｖ）  フェニルベンゾエート／ＡＯＯ溶液、
・０．０５％（ｗ／ｖ）  ５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾール−３−オン（ＣＭＩ）／ＡＯＯ溶液、
・２５％（ｗ／ｖ）  シンナミルアルコール（ＣＡ）／ＡＯＯ溶液。
【００７５】
以下のように、各ケージごとに、操作を行った。なお、１回の塗布量は２５μｌとした。被験物質塗布液の塗布には、ピペットマンを用いた。
【００７６】
（２．５％（ｗ／ｖ）  ＰＰＤ／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ３２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２．５％（ｗ／ｖ）  ＰＰＤ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２．５％（ｗ／ｖ）  ＰＰＤ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ３３：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２．５％（ｗ／ｖ）  ＰＰＤ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００７７】
図１４はこのケージ３２、３３についての結果を示すグラフであり、図１４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１４に示されるように、被験物質としてＰＰＤを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００７８】
（１００％（ｗ／ｖ）  ヘキサンを用いた場合）
・ケージ３４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１００％（ｗ／ｖ）  ヘキサンを塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１００％（ｗ／ｖ）  ヘキサンを塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ３５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１００％（ｗ／ｖ）  ヘキサンを塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００７９】
図１５はこのケージ３４、３５についての結果を示すグラフであり、図１５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１５に示されるように、被験物質としてヘキサンを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００８０】
（５０％（ｗ／ｖ）  サリチル酸／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ３６：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に５０％（ｗ／ｖ）  サリチル酸／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に５０％（ｗ／ｖ）  サリチル酸／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ３７：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に５０％（ｗ／ｖ）  サ
リチル酸／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００８１】
図１６はこのケージ３６、３７についての結果を示すグラフであり、図１６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１６に示されるように、被験物質としてヘキサンを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００８２】
（５０％（ｗ／ｖ）  イソプロパノール／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ３８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に５０％（ｗ／ｖ）  イソプロパノール／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に５０％（ｗ／ｖ）  イソプロパノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ３９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に５０％（ｗ／ｖ）  イソプロパノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００８３】
図１７はこのケージ３８、３９についての結果を示すグラフであり、図１７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１７に示されるように、被験物質としてイソプロパノールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００８４】
（２５％（ｗ／ｖ）  ２−メルカプトベンズチアゾール／ＤＭＳＯ溶液を用いた場合）
・ケージ４０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ２−メルカプトベンズチアゾール／ＤＭＳＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ２−メルカプトベンズチアゾール／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ４１：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ２−メルカプトベンズチアゾール／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００８５】
図１８はこのケージ４０、４１についての結果を示すグラフであり、図１８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１８に示されるように、被験物質として２−メルカプトベンズチアゾールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００８６】
（１００％（ｗ／ｖ）  メチルメタクリレートを用いた場合）
・ケージ４２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１００％（ｗ／ｖ）  メチルメタクリレートを塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１００％（ｗ／ｖ）  メチルメタクリレートを塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ４３：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１００％（ｗ／ｖ）  メチルメタクリレートを塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００８７】
図１９はこのケージ４２、４３についての結果を示すグラフであり、図１９（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図１９（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図１９に示されるように、被験物質としてメチルメタクリレートを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００８８】
（２５％（ｗ／ｖ）  シトラール／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ４４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  シトラール／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  シトラール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ４５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  シトラール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００８９】
図２０はこのケージ４４、４５についての結果を示すグラフであり、図２０（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２０（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２０に示されるように、被験物質としてシトラールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００９０】
（２５％（ｗ／ｖ）  クロロベンゼン／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ４６：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  クロロベンゼン／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  クロロベンゼン／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ４７：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  クロロベンゼン／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００９１】
図２１はこのケージ４６、４７についての結果を示すグラフであり、図２１（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２１（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２１に示されるように、被験物質としてクロロベンゼンを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００９２】
（２５％（ｗ／ｖ）  乳酸／ＤＭＳＯ溶液を用いた場合）
・ケージ４８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  乳酸／ＤＭＳＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  乳酸／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ４９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  乳
酸／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００９３】
図２２はこのケージ４８、４９についての結果を示すグラフであり、図２２（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２２（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２２に示されるように、被験物質として乳酸を用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００９４】
（１０％（ｗ／ｖ）  塩化ニッケル／ＤＭＳＯ溶液を用いた場合）
・ケージ５０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化ニッケル／ＤＭＳＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化ニッケル／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ５１：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化ニッケル／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００９５】
図２３はこのケージ５０、５１についての結果を示すグラフであり、図２３（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２３（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２３に示されるように、被験物質として塩化ニッケルを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００９６】
（５０％（ｗ／ｖ）  オイゲノール／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ５２：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に５０％（ｗ／ｖ）  オイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に５０％（ｗ／ｖ）  オイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ５３：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に５０％（ｗ／ｖ）  オイゲノール／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００９７】
図２４はこのケージ５２、５３についての結果を示すグラフであり、図２４（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２４（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２４に示されるように、被験物質としてオイゲノールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【００９８】
（１０％（ｗ／ｖ）  塩化コバルト／ＤＭＳＯ溶液を用いた場合）
・ケージ５４：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化コバルト／ＤＭＳＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化コバルト／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ５５：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１０％（ｗ／ｖ）  塩化コバルト／ＤＭＳＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【００９９】
図２５はこのケージ５４、５５についての結果を示すグラフであり、図２５（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２５（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２５に示されるように、被験物質として塩化コバルトを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【０１００】
（１０％（ｗ／ｖ）  フェニルベンゾエート／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ５６：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に１０％（ｗ／ｖ）  フェニルベンゾエート／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に１０％（ｗ／ｖ）  フェニルベンゾエート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ５７：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に１０％（ｗ／ｖ）  フェニルベンゾエート／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【０１０１】
図２６はこのケージ５６、５７についての結果を示すグラフであり、図２６（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２６（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２６に示されるように、被験物質としてフェニルベンゾエートを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【０１０２】
（０．０５％（ｗ／ｖ）  ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ５８：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に０．０５％（ｗ／ｖ）  ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に０．０５％（ｗ／ｖ）  ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ５９：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に０．０５％（ｗ／ｖ）
ＣＭＩ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【０１０３】
図２７はこのケージ５８、５９についての結果を示すグラフであり、図２７（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２７（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２７に示されるように、被験物質としてＣＭＩを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【０１０４】
（２５％（ｗ／ｖ）  ＣＡ／ＡＯＯ溶液を用いた場合）
・ケージ６０：１、２、３日目、同じ時刻（およそ１３時）にマウスの右耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布し、１０日目の同じ時刻に右耳および左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ４Ｌ１）、
・ケージ６１：１０日目のみ（およそ１３時）にマウスの左耳に２５％（ｗ／ｖ）  ＣＡ／ＡＯＯ溶液を塗布した後、１２日目の同じ時刻に左右両方の耳介リンパ節を摘出し、実験例２のケージ７と同様に、重量およびＡＴＰ量を測定（Ｒ０Ｌ１）。
【０１０５】
図２８はこのケージ６０、６１についての結果を示すグラフであり、図２８（ａ）では、縦軸は耳介リンパ節の重量（ｍｇ）、横軸は各ケージの番号を示し、図２８（ｂ）では、縦軸はＡＴＰ量（ＲＬＵ）、横軸は各ケージの番号を示している。図２８に示されるように、被験物質としてシンナミルアルコールを用いた場合でも、右の耳介リンパ節で十分な感作の成立を確認しつつ、左の耳介リンパ節で惹起反応を確認できるという結果が得られた。
【０１０６】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図１】
2014102247.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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