(57)【要約】【課題】超好熱性二本鎖特異的核酸分解酵素（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；  ＤＳＮ）および該ＤＳＮを用いた核酸の切断方法を提供する。【解決手段】オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）由来の二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組み換えベクター並びに該ベクターを含む形質転換体および形質導入体。該形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。該二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法および該タンパク質を用いるＲＮＡ検出方法、並びに該タンパク質を含む試薬キット。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２２番目のグリシンまでを除いたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。
【請求項２】
少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲で二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
２０℃から８０℃までの温度範囲のうち、少なくとも８０℃以上で最も高い二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示す請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．１〜４．２である請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。  
【請求項７】
オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
コエノビータ  プルプレウス（Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）由来である請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）請求項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を有する請求項１０に記載の遺伝子。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１５】
昆虫細胞内で二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。
【請求項１７】
一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
二本鎖特異的な核酸の切断方法であって、４０℃以上の条件下で反応させる請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
６０℃以上の条件下で反応させる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
【請求項２２】
特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超好熱性二本鎖特異的核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：以下、ＤＳＮとも記載する）活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規なＤＳＮ活性を有するタンパク質、および該タンパク質の製造方法に関する。また該タンパク質を用いる核酸の切断方法および該タンパク質を用いるＲＮＡ検出方法、並びに該タンパク質を含む試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでいくつかの甲殻類、特にエビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）の消化腺または肝膵臓中に、ＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）活性を示すヌクレアーゼが見出されている。その中のいくつかは、二本鎖核酸に高度に特異的なＤＮａｓｅ活性を示すことから、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＤＳＮ）と呼ばれている。
【０００３】
１．Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ  ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
エビおよびカニなどのＤｅｃａｐｏｄａ（十脚目）由来のヌクレアーゼは、最初にクダヒゲエビ科のＳｏｌｅｎｏｃｅｒａ  ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）から肝膵臓由来ＤＮａｓｅとして精製された（非特許文献１）。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、ウシ肝膵臓由来ＤＮａｓｅよりも大きな分子量（約４４ｋＤａ）を持っていた。ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは糖鎖を持たないことが確認され、その分子量が大きいのはポリペプチド鎖が長いためであると考えられた。
【０００４】
ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、金属イオン要求性と至適活性ｐＨはウシ膵臓由来ＤＮａｓｅとよく似ており、ＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）活性は示さなかった。またナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは、トリプシン消化に対する耐性を持つことが示された。アミノ酸組成の解析結果から、ナミクダヒゲエビＤＮａｓｅは３６のＣｙｓ残基による１８のジスルフィド結合によって高度に分子内架橋されていることが示された。
【０００５】
２．Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
クルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献２）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献３）。クルマエビヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ活性に加えて、低いレベルのＲＮａｓｅ活性を示した。アミノ酸配列の相同性から、クルマエビヌクレアーゼは、ウシＤＮＡ分解酵素Ｉ様タンパク質（ｂｏｖｉｎｅ  ＤＮａｓｅ−Ｉ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）よりむしろ霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼに代表されるＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼ（ＤＲＮＳＮ）のファミリーに属することが示された。
【０００６】
クルマエビヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０２アミノ酸残基あり、３８１残基の成熟酵素と２１残基の推定シグナルペプチドから成る。クルマエビヌクレアーゼは、１１のＣｙｓ残基を持っており、それらのうちの１０のＣｙｓ残基が５つの分子内ジスルフィド結合を形成し、残る１つのＣｙｓ残基は、分子量５００〜７００Ｄａと推定されるチオール化合物に結合していた。Ｗａｎｇらは大腸菌中でクローンしたヌクレアーゼ遺伝子を発現させたが、発現したタンパク質はヌクレアーゼ活性を示さなかった（非特許文献３）。
【０００７】
３．Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
タラバガニ科Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ  ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）の肝膵臓からも同様な分子量のヌクレアーゼが精製され（非特許文献４）、またそのｃＤＮＡ配列が明らかにされた（非特許文献５）。タラバガニヌクレアーゼのアミノ酸配列は、４０７アミノ酸残基あり、３８０残基の成熟酵素と２７残基の推定シグナルペプチドから成り、クルマエビヌクレアーゼの配列と６４％の同一性を有していた。
【０００８】
タラバガニヌクレアーゼ配列もまたＤＲＮＳＮに共通するＮＵＣドメインを有していたが、精製酵素のキャラクタリゼーションの結果、驚くべきことに、タラバガニヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡ基質に強い切断選択性を示し、一本鎖ＤＮＡにはほとんど活性を示さなかった。またタラバガニヌクレアーゼはＲＮＡ基質に対してほとんど切断活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖においては、その中のＤＮＡ分子のみを効率良く切断した。またミスマッチを含む短い二本鎖ＤＮＡに対してほとんど切断活性を示さなかった。ここにタラバガニヌクレアーゼの特徴的な基質特異性が明らかにされ、この酵素は“ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ”（ＤＳＮ）と呼ばれた（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００９】
Ｓｈａｇｉｎらは、タラバガニＤＳＮのｃＤＮＡをクローンし、推定シグナルペプチドを除いた成熟タラバガニＤＳＮを、Ｎ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として大腸菌中で発現させたが、組換えタンパク質は酵素活性を有していなかった（非特許文献５）。Ａｎｉｓｉｍｏｖａらは、大腸菌内で組換えＤＳＮ分子が凝集した封入体から、変性、リフォールディングおよび活性化を含む一連の手順を通じて、可溶性で酵素活性を有する組換えタラバガニＤＳＮを精製することに成功している（非特許文献７）。
【００１０】
また、本発明者らは以前に、タラバガニＤＳＮ遺伝子を単離し、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて、シグナルペプチド配列を有する該ＤＳＮ遺伝子から、組換えタラバガニＤＳＮの発現を行った。この結果、リフォールディングの必要のない可溶性の組換えタラバガニＤＳＮを発現および精製することに成功し、得られた組換えＤＳＮは天然由来のＤＳＮと同様の二本鎖特異的ヌクレアーゼ活性を示した（非特許文献８）。
【００１１】
４．Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ＤＳＮ
タラバエビ科のＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）の消化腺から精製されたヌクレアーゼもまた二本鎖ＤＮＡ基質に対する切断選択性を有し、一本鎖ＤＮＡはほとんど分解しないことが示された（特許文献１）。このホッコクアカエビＤＳＮは、耐熱性を有するタラバガニＤＳＮとは対照的に、至適活性温度が２５℃であり、７０℃、３０分間または９４℃、２分間の加熱で失活する易熱性の酵素である。
【００１２】
前記易熱性を利用したホッコクアカエビＤＳＮの用途として、ＰＣＲ産物のキャリーオーバーコンタミネーションの除去方法が開示されている（特許文献１）。ＮｉｌｓｅｎらによってホッコクアカエビＤＳＮをコードするｃＤＮＡが単離され、それによってアミノ酸配列も明らかにされている（非特許文献９）。
【００１３】
５．Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
本発明者らは以前に、クモガニ科のＣｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）遺伝子を単離しバキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて、組換えズワイガニＤＳＮの発現を行った。ズワイガニＤＳＮは、クルマエビＤＮａｓｅに対して塩基配列レベルで６４％、アミノ酸配列レベルで５９％の同一性を示し、タラバガニＤＳＮに対しては、塩基配列レベルで６６％、アミノ酸配列レベルで６１％の同一性を示した。しかしながら、精製した組換えズワイガニＤＳＮはクルマエビＤＮａｓｅよりむしろ、タラバガニＤＳＮと同様の二本鎖特異的ＤＮＡ切断活性を示し、至適活性温度６０℃を示す耐熱性を備えていた（特許文献３〜５、非特許文献１０、非特許文献１１）。
【００１４】
６．その他のＤＳＮホモログ
タラバガニＤＳＮのアミノ酸配列と相同性のあるＤＳＮホモログが、いくつかのＤｅｃａｐｏｄａで見つかっている。Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇらはクルマエビ科Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ（ブラックタイガーエビ）肝膵臓からＤＳＮホモログをコードするｃＤＮＡを単離した。その予測アミノ酸配列は、クルマエビヌクレアーゼの配列と８９％の同一性を有していた（非特許文献１２）。
【００１５】
その他のＤＳＮホモログ配列として、クルマエビ科Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ（パシフィックホワイトシュリンプまたはバナメイエビ）由来ＤＮａｓｅＩのｍＲＮＡ［ＧｅｎＢａｎｋ  ＦＪ５４８９２５］、スナガニ科Ａｍｐｈｉｕｃａ  ｃｒａｓｓｉｐｅｓ（別名Ｕｃａ  ｃｒａｓｓｉｐｅｓ、ベニシオマネキ）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ８６２５４０］およびＰａｌａｅｍｏｎｉｄａｅ  ｓｐ．（テナガエビ科の一種）由来のｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ８６２５３８］がＧｅｎＢａｎｋ配列データベース中に見出される。タラバガニＤＳＮとその他のＤＳＮホモログを、進化系統樹的な解析から新規なヌクレアーゼのファミリーとして分類する提案もなされた（非特許文献１３）。
【００１６】
しかしながら、これらのＤＳＮホモログ配列は、いずれもタンパク質の単離および酵素活性についての報告はなく、実際にヌクレアーゼ活性を有するタンパク質として翻訳されているのか否か、また翻訳産物がタラバガニＤＳＮのような二本鎖特異的な核酸切断活性を有するかどうか、さらには耐熱性を有するかどうかということは、現在のところ不明である。
【００１７】
さらにワタリガニ科Ｐｏｒｔｕｎｕｓ  ｐｅｌａｇｉｃｕｓ（タイワンガザミ）由来のＤＳＮのｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ  ＪＦ２７６４２６］がデータベース上で開示されており、その配列はタラバガニやズワイガニのＤＳＮと一定の相同性を持っている。しかしながらタイワンガザミＤＳＮのｍＲＮＡと言われるこの配列の翻訳産物の酵素が、実際に二本鎖特異的な基質切断活性を示すという証拠は現在のところ開示されていない。
【００１８】
総括すると、Ｄｅｃａｐｏｄａ由来のＤＳＮ、ＤＳＮ様ヌクレアーゼおよびＤＳＮホモログの中で、実際に二本鎖特異的ヌクレアーゼ活性が示されているのは、タラバガニＤＳＮ、ズワイガニＤＳＮ、およびホッコクアカエビＤＳＮの３種類である。タラバガニＤＳＮとズワイガニＤＳＮは至適活性温度が６０℃前後で耐熱性があるのに対して、ホッコクアカエビＤＳＮは至適温度が２５℃の易熱性酵素である。
【００１９】
タラバガニＤＳＮは、核酸分子の切断に特徴的な選択性を持つことと、耐熱性があり高温で活性を有するという特徴から、分子生物学分野における様々な応用が示されている。例えば、ＳＮＰ解析（非特許文献５、特許文献２）、ｃＤＮＡライブラリのノーマライゼーション（非特許文献１４）、サブトラクション法（非特許文献１５）およびテロメアの一本鎖オーバーハング長の解析（非特許文献１６）などが開示されている。このような背景のもと、ＤＳＮの二本鎖選択性をより広い範囲で利用可能とするため、より耐熱性の高いＤＳＮが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第９９／０７８８７号
【特許文献２】国際公開第０３／０４８３７８号
【特許文献３】特開２０１０−０８１９３４号公報
【特許文献４】欧州特許第２１６１３３１号明細書
【特許文献５】米国特許第２０１０００９２９７６号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕ，Ｍ．Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１０３６，９５−１００（１９９０）
【非特許文献２】Ｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１２０９，２０９−２１４．（１９９４）
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４６  Ｐｔ  ３，７９９−８０４（２０００）
【非特許文献４】Мензорова，Н．И．ら，Биохимия．５８，６８１−６９１（１９９３）（Ｍｅｎｚｏｒｏｖａ，Ｎ．Ｉ．ら，Ｂｉｏｋｈｉｍｉａ，５８，６８１−６９１（１９９３））
【非特許文献５】Ｓｈａｇｉｎ，Ｄ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１２，１９３５−１９４２（２００２）
【非特許文献６】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９，１４（２００８）
【非特許文献７】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），７１，５１３−５１９（２００６）
【非特許文献８】平川雄三、大磯勲：タラバガニ由来ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅの昆虫細胞−バキュロウイルス系による発現、第１１回マリンバイオテクノロジー学会大会、Ｐ４−１（２００８年５月２４〜２５日）
【非特許文献９】Ｎｉｌｓｅｎ，Ｉ．Ｗ．ら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５，ｅ１０２９５（２０１０）
【非特許文献１０】平川雄三，大磯勲：ズワイガニ（Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ  ｏｐｉｌｉｏ）由来耐熱性ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅのクローニング、発現、およびキャラクタリゼーション，ＭＢＳＪ２００９（第３２回日本分子生物学会年），２Ｐ−０８３７，（２００９年１２月９〜１２日）
【非特許文献１１】平川雄三，大磯勲：タラバガニおよびズワイガニ由来ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅの特性比較，第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会，Ｐ−２３（２０１０年５月２９〜３０日）
【非特許文献１２】Ｍｏｌｔｈａｔｈｏｎｇ  Ｓ．ら，Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２，６１７−６２７（２００７）
【非特許文献１３】Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｇｅｎｅ，４１８，４１−８（２００８）
【非特許文献１４】Ｚｈｕｌｉｄｏｖ，Ｐ．Ａ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３２，ｅ３７（２００４）
【非特許文献１５】Ｐｅｎｇ，Ｒ．Ｈ．ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３７２，１４８−１５５（２００８）
【非特許文献１６】Ｚｈａｏ，Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３６，ｅ１４（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、従来のＤＳＮよりも耐熱性の高い、新規なＤＳＮ遺伝子および酵素を提供することを主たる課題とする。また組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造することができる新規な超好熱性ＤＳＮ、およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属するＣｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓中にＤＳＮ様ポリペプチド配列をコードしているｍＲＮＡが発現していることを見出し、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ肝膵臓由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中の、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを単離し、該遺伝子が実際にＤＳＮ活性を示すことのできるタンパク質をコードしていることを明らかにした。さらに当該タンパク質が既知のＤＳＮを大きく上回る耐熱性を示すことを見出し、また当該タンパク質を組換えタンパク質発現技術を用いて容易に製造する方法を見出して、上記課題を解決しうる発明を完成させるに至った。
【００２４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１のタンパク質；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２２番目のグリシンまでを除いたアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質。
２．少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲で二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する、前項１に記載のタンパク質。
３．２０℃から８０℃までの温度範囲のうち、少なくとも８０℃以上で最も高い二本鎖特異的核酸分解酵素活性を示すことのできる耐熱性を有する前項２に記載のタンパク質。
４．８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示す前項３に記載のタンパク質。
５．無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上である前項１〜４のいずれか１に記載のタンパク質。
６．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が４２，０００〜４６，０００で、かつ等電点が４．１〜４．２である前項１〜５のいずれか１に記載のタンパク質。
７．オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来である、前項１〜６のいずれか１に記載のタンパク質。
８．コエノビータ  プルプレウス（Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）由来である前項１〜７のいずれか１に記載のタンパク質。
９．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
１０．以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子；
（ａ）前項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）前項１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
１１．ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を有する前項１０に記載の遺伝子。
１２．前項１０または１１に記載の遺伝子を含む組換え体ベクター。
１３．前項１２に記載の組換え体ベクターを含む形質転換体または形質導入体。
１４．前項１３に記載の形質転換体または形質導入体を培地で培養し、培養物から二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質の製造方法。
１５．昆虫細胞内で二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする前項１４に記載の方法。
１６．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質を用いる核酸の切断方法。
１７．一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する前項１６に記載の方法。
１８．ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する前項１６に記載の方法。
１９．二本鎖特異的な核酸の切断方法であって、４０℃以上の条件下で反応させる前項１６〜１８のいずれか１に記載の方法。
２０．６０℃以上の条件下で反応させる前項１９に記載の方法。
２１．以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）前項１〜５のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質で、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
２２．特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出するＲＮＡ検出方法であって、前記工程（ｉ）において検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる、前項２１に記載の方法。
２３．前項１〜８のいずれか１に記載のタンパク質または前項１４若しくは１５に記載の方法によって製造された二本鎖特異的核酸分解活性を有するタンパク質のうち少なくとも１つを含む試薬キット。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＤＳＮ活性を有し、従来のＤＳＮおよびＤＳＮホモログよりも高い超好熱性を有する新規なタンパク質（以下、本発明のＤＳＮ、ヤドカリＤＳＮとも記載する）、当該超好熱性タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、当該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、および該タンパク質の製造方法が提供される。また本発明により、該タンパク質を用いる核酸の切断方法および該タンパク質を用いるＲＮＡ検出方法、並びに該タンパク質を含む試薬キットが提供される。本発明のＤＳＮは、核酸分子の分析、検出、分解、合成および改変などを含む様々な検査技術、診断技術並びに遺伝子工学技術に利用することが可能である。
【００２６】
本発明のＤＳＮは、少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲でその活性を示すことができ、前記温度範囲内では８０℃で最も高い活性を示すことのできる超好熱性を有する。このような高い耐熱性を持つ酵素は，熱水噴出口などの極限環境に住む好熱性細菌由来のものは知られているが、高等生物由来のヌクレアーゼとしては他に類を見ない、極めて珍しい酵素である。本発明の酵素によれば、従来、使用温度に制限のあったＤＳＮの各種用途について、幅広い温度の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヤドカリＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示した図である。
【図２】ヤドカリＤＳＮと、クルマエビＤＮａｓｅ、ズワイガニＤＳＮおよび、タラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントの図である。
【図３】ヤドカリＤＳＮの精製過程の各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。
【図４】ヤドカリＤＳＮの二本鎖特異的核酸切断活性を示す図である。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの至適活性温度を示す図である。
【図６】様々な温度条件下におけるヤドカリＤＳＮの２本鎖特異性を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、ヤドカリＤＳＮの熱処理後の残存活性を示した図である。
【図８】ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨを示す図である。
【図９】ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性を示す図である。
【図１０】ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性を示す図である。
【図１１】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を示す図である。
【図１２】ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解を表す模式図である。
【図１３】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの一本鎖ＤＮＡ分解能を示す図である。
【図１４】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出を示す図である。
【図１５】ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出の模式図である。
【図１６】ヤドカリＤＳＮの１塩基のミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡに対する分解能を示す図である。
【図１７】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す図である。
【図１８】（ａ）および（ｂ）は、ヤドカリＤＳＮの熱による構造変化をＣＤによって測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてＤＳＮ（二本鎖特異的核酸分解酵素）とは、ＤＳＮ活性（二本鎖特異的核酸分解酵素活性）を示す能力を有する酵素のことをいい、該ＤＳＮ活性とは、二本鎖核酸中に存在するデオキシリボ核酸を優先的に切断または分解する活性のことをいう。
【００２９】
前記二本鎖核酸には、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖および部分的な一本鎖構造と部分的な二本鎖構造を有する核酸分子の中の二本鎖部分が含まれる。該部分的な一本鎖構造としては、例えば、塩基のミスマッチ、バルジ構造、ループ構造、フラップ構造および偽Ｙ構造（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などが挙げられる。
【００３０】
ＤＳＮ活性の１つの例は、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解する活性である。また別のＤＳＮ活性の１つの例は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解する活性である。
【００３１】
また別のＤＳＮ活性の１つの例は、完全な塩基対を形成している二本鎖核酸およびミスマッチを含む二本鎖核酸が存在する系で、完全な塩基対を形成している二本鎖核酸部分を優先的に分解する活性である。
【００３２】
ＤＳＮ活性は、例えばＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）で測定可能である。また、ＤＳＮ活性は、例えば、核酸を基質として精製酵素を３７℃で３０分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、基質のバンドの有無および濃淡を比較することによっても検出可能である。
【００３３】
本発明のＤＳＮは、少なくとも２０℃から８０℃までの温度範囲でＤＳＮ活性を示すことが好ましく、より好ましくは前記温度範囲内では少なくとも８０℃以上で、さらに好ましくは８０℃で最も高い活性を示すことのできる超好熱性を有する。また、本発明のＤＳＮは、８０℃での活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示すことが好ましい。
【００３４】
例えば、本願実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、約２０℃から約８０℃の範囲で６０Ｕ／ｍｌ〜３２００００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ分解活性を示すことが好ましい。
【００３５】
本発明のＤＳＮは、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物由来であることが好ましく、より好ましくは、Ｂｉｒｇｕｓ（ビルグス）属とＣｏｅｎｏｂｉｔａ（コエノビータ）属由来のＤＳＮである。オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）に属する生物としては例えば、Ｂｉｒｇｕｓ  ｌａｔｒｏ、Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｂｒｅｖｉｍａｎｕｓ、Ｃ．ｃａｒｎｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃａｖｉｐｅｓ、Ｃ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ、Ｃ．ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ、Ｃ．ｌｏｎｇｉｔａｒｓｉｓ、Ｃ．ｏｌｉｖｉｅｒｉ、Ｃ．ｐｅｒｌａｔｕｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｒｕｇｏｓｕｓ、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ、Ｃ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｒｕｇｏｓｕｓ、Ｃ．ｓｃａｅｖｏｌａ、Ｃ．ｓｐｉｎｏｓｕｓ、Ｃ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｏｍｐｔａおよびＣ．ｌａｅｖｉｕｓｃｕｌａなどが挙げられる。
【００３６】
これらの中でも、好ましくはＢｉｒｇｕｓ  ｌａｔｒｏ（ヤシガニ）、Ｃ．ｂｒｅｖｉｍａｎｕｓ（オオナキオカヤドカリ）、Ｃ．ｃａｖｉｐｅｓ（オカヤドカリ）、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ムラサキオカヤドカリ）、Ｃ．ｒｕｇｏｓｕｓ（ナキオカヤドカリ）またはＣ．ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ（コムラサキオカヤドカリ）であり、より好ましくはＣ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓである。
【００３７】
本発明のＤＳＮは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列領域（Ｎ末端から第２２番目のグリシンまで）を除いた配列、あるいは前記アミノ酸配列のいずれかから１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００３８】
ここで、１若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠損、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をいう。
【００３９】
本発明のＤＳＮのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、４２，０００〜４６，０００であることが好ましい。また、本発明のＤＳＮの等電点は４．１〜４．２であることが好ましい。
【００４０】
さらにまた、本発明のＤＳＮは、二価の金属イオン、例えば、Ｍｇ２＋イオン存在下において好適なＤＳＮ活性を示すことが好ましい。例えば、後述する実施例で示されるウシ胸腺由来のＤＮＡを用いた活性測定方法により精製酵素の活性を測定した場合に、Ｍｇ２＋イオンを使用した場合は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で活性を示すことが好ましく、さらには１０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲で３０％〜１００％の相対活性を示すことがより好ましい。
【００４１】
また本発明のＤＳＮと二価の金属イオンの共存は、本発明のＤＳＮの耐熱性にも寄与している。その影響は金属イオンの種類と濃度にもよるが、後述する実施例８および実施例１６に示した条件の場合では、Ｍｇ２＋イオン非存在下の本発明のＤＳＮの耐熱性は、Ｍｇ２＋イオン共存下の場合と比較して約７〜１０℃ほど低下した。
【００４２】
本発明のＤＳＮは、無機塩存在下における７０℃３０分間加熱処理後の残存活性が６０％以上であることが好ましく、７５℃１０分間加熱処理後の残存活性が３０％以上であることがより好ましく、８０℃５分間加熱処理後の残存活性が１０％以上であることがさらに好ましい。
【００４３】
本発明のＤＳＮの好ましい形態の１つは、オカヤドカリ科（Ｃｏｅｎｏｂｉｔｉｄａｅ）の生物の肝膵臓から精製された酵素であり、例えばＣｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓から精製された酵素である。
【００４４】
Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの肝膵臓中に超好熱性ＤＳＮを発現しているという本発明の開示に基づき、当業者はオカヤドカリ科の生物の肝膵臓から、一般的な生化学的方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、濃縮および透析等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、本発明のＤＳＮを単離精製することができる。
【００４５】
また、当業者は開示された類似の肝膵臓由来酵素の精製方法、例えば、ナミクダヒゲエビ肝膵臓からのＤＮａｓｅの精製方法（非特許文献１）、タラバガニ肝膵臓からのＤＳＮの精製方法（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、およびホッコクアカエビ肝膵臓からのＤＳＮの精製方法（非特許文献９）、並びにこれらに準ずる方法およびこれらを改変した方法によって精製することもできる。
【００４６】
本発明のＤＳＮは、前記のごとく天然の生体由来材料から、単離および精製してもよいが、本発明のＤＳＮをコードする遺伝子を用いて、組換えタンパク質として調製してもよい。
【００４７】
本発明のＤＳＮをコードする遺伝子は、配列表の配列番号１または配列番号３に示される塩基配列に基づき、当業者に公知のクローニング手法等によって調製される。例えば、該遺伝子は、Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ肝膵臓由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡとして調製することができる。また、例えば、該遺伝子は開示された配列に基づき後述する実施例３に記載の方法によって調製される。
【００４８】
また、前記のＤＳＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明のＤＳＮをコードする遺伝子に含まれる。また、該ＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤＳＮ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。
【００４９】
また、配列番号２に記載のＤＳＮまたは該ＤＳＮからシグナル配列領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端から第２２番目のグリシンまで）を除いたＤＳＮをコードする塩基配列を有するＤＮＡにおいて、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列であって、かつＤＳＮ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡも、本発明の遺伝子に含まれる。
【００５０】
ここで、１若しくは複数個の塩基が付加、欠損若しくは置換された塩基配列とは、基準とする配列と比較して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の塩基配列同一性を有する塩基配列をいう。
【００５１】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
【００５２】
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００５３】
また、生物由来材料からＤＳＮ遺伝子を調製する方法の他に、確定したＤＳＮの塩基配列情報を基に、有機合成法および酵素合成法並びにそれらを適宜組み合わせた方法により、直接的に所望するＤＳＮ遺伝子を合成することもできる。
【００５４】
本発明の組換え体ＤＮＡは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡ等が挙げられる。
【００５５】
プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０およびｐＴＰ５等）および酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４およびＹＣｐ５０等）などが挙げられる。
【００５６】
ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。さらに、例えば、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター並びにバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００５７】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製された本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーおよびリボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００５８】
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。本発明の遺伝子には、後で本発明のＤＳＮの精製および検出を容易にするために、または発現したＤＳＮが細胞内で不溶化してしまうのを防ぐために、ＧＳＴタグまたはヒスチジンタグなどのタグ配列等をコードする配列を付加してもよい（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０，５２３−５３３，２００３）。
【００５９】
本発明の形質転換体および形質導入体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで用いる宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
【００６０】
例えば、エッシェリヒア属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等）、シュードモナス属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ等）、バチルス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）およびリゾビウム属（例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ等）などに属する細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の酵母、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞等の動物細胞並びにヨトウガ細胞（例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１等）およびカイコ細胞（例えば、ＢｍＮ４等）などの昆虫細胞が挙げられる。
【００６１】
本発明の形質転換体および形質導入体が得られたならば、その培養物から本発明のＤＳＮを採取するには、当業者が通常行う酵素採取手段を用いることができる。本発明のＤＳＮが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより当該酵素を抽出できる。
【００６２】
例えば、常法により菌体または細胞を超音波破砕処理および磨砕処理などする方法、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて該酵素を抽出する方法、並びにトルエン等の存在下で振盪または放置して自己消化を行なわせ該酵素を菌体または細胞外に排出させるなどの方法で菌体内または細胞内から該酵素を抽出することができる。
【００６３】
前記のごとくして得られた本発明のＤＳＮを含む調製物から、さらに本発明のＤＳＮを精製し、精製酵素標品を得る場合には、当業者がタンパク質の単離精製に用いる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー等を単独または適宜組み合わせて用いることにより、前記酵素溶液から本発明のＤＳＮを単離精製することができる。
【００６４】
本発明のＤＳＮに、ＧＳＴタグまたはヒスチジンタグなどのタグ配列等を付加して発現させた場合、このような付加配列は、当該酵素の精製途中または精製後に、当業者が通常行う適当な酵素処理等によって取り除いてもよいし、付加配列によって本発明のＤＳＮの活性が損なわれない場合はそのままでもよい。
【００６５】
ナミクダヒゲエビ肝膵臓由来ＤＮａｓｅおよびウシ膵臓由来ＤＮａｓｅはトリプシン消化に対する耐性を示し（非特許文献１）、タラバガニ肝膵臓由来ＤＳＮはプロテイナーゼＫ消化に対する耐性を示すことが知られていた（非特許文献６）。
【００６６】
一方、本発明者らは、本発明のオカヤドカリ科由来ＤＳＮが、プロテイナーゼＫ消化に対して耐性を示すことを見出した。本開示により、当業者は、プロテイナーゼＫによって目的外のタンパク質の大部分を消化せしめ、所望する本発明のＤＳＮは分解されないような条件で処理することによって、本発明の酵素の精製を簡便に行うことが可能である。そのような精製手順を含む本発明のＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。
【００６７】
本発明のＤＳＮは、開示したアミノ酸配列から理解できるように、高度にシステイン残基を有しており、このことから分子内に複数のジスルフィド架橋が形成されることが推察される。一般的に、高度な分子内ジスルフィドネットワークを有するタンパク質は、大腸菌などの原核生物を宿主として成功裏に組換えタンパク質を得るのが困難な場合がしばしばあることは、当業者の知るところである。大腸菌内で発現させた目的タンパク質が、不溶化した封入体として得られる場合には、封入体の可溶化およびリフォールディング等の手順を経て、可溶性で酵素活性のある目的タンパク質を再生することができる［例えば、Ａｎｉｓｉｍｏｖａ，Ｖ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），７１，５１３−５１９（２００６）（非特許文献７）］。
【００６８】
本発明のＤＳＮを組換えタンパク質として調製する方法の好ましい実施形態の１つの例は、真核生物細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、好ましい１つの例は昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させる方法であり、例えば、組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で目的タンパク質を発現させるバキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系（例えば、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．らの文献、“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５年およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．らの文献、“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９４年）を用いる方法が挙げられる。バキュロウイルス−昆虫細胞組換えタンパク質発現系を用いる本発明のＤＳＮの製造方法の好ましい実施形態の１つの例を、本明細書の実施例においてより詳しく具体的に説明する。
【００６９】
本発明のＤＳＮを用いることで、当該酵素を用いた核酸の切断方法が提供される。当該方法によれば、二本鎖特異的に核酸を切断することができる。より詳しくは、当該方法によれば、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡが共存する系で、一本鎖ＤＮＡよりも二本鎖ＤＮＡを優先的に分解することができる。また、当該方法によれば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖中のＤＮＡ鎖を優先的に分解することができる。本発明のＤＳＮを用いて二本鎖特異的に核酸を切断する場合、好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の範囲の条件下で反応を行うことが好ましい。
【００７０】
本発明のＤＳＮを用いる核酸の切断方法における、反応液組成および反応条件は、当業者が目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本明細書の実施例に記載の反応液組成および反応条件並びにそれらを改変したものが使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
上述のごとく、本発明のＤＳＮは好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の範囲で好ましく使用することができるが、使用できる反応温度はこの範囲に限られるものではない。後述する実施例１５はミスマッチ塩基を識別する目的で、３０℃で反応を行った例である。当業者は目的に応じて様々な温度条件下で使用することができる。例えば、本発明のＤＳＮを、一定温度条件下、ある範囲の温度変化が伴う条件下、および所定のまたはプログラムされた温度サイクリング条件下などで使用して、本発明の核酸の切断方法を実施することができる。
【００７２】
本発明のＤＳＮを用いることで、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むＲＮＡ検出方法が提供される；
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程、
（ｉｉ）本発明のＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
工程（ｉ）において、検出対象とするＲＮＡおよび該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させることにより、特定のヌクレオチド配列を有するＲＮＡを検出することができる。
【００７３】
以下、各工程について説明する。
（ｉ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる工程
この工程は、ＲＮＡと該ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとのハイブリッド鎖を形成させる工程である。ここで「ハイブリッド」とは、ＲＮＡとＤＮＡとの相補的結合の結果物をいう。
【００７４】
ＲＮＡとしては、全体が天然型のＲＮＡである場合のほか、ＲＮＡをその一部に含む核酸および非天然型のヌクレオチドを含むＲＮＡなどが挙げられる。また、本発明の方法によればＲＮＡの断片も検出可能である。
【００７５】
ＲＮＡは溶液中に存在していてもよく、固体状態であってもよい。また、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイと呼ばれる固相担体上に相補的結合により固定されている状態でもよい。溶液の場合には、溶媒としては水または緩衝液が好ましく、水の他に水と混和しうる溶媒を適宜混合して用いるのが好ましい。
【００７６】
水と混和して用いる溶媒の例としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびスルホランなどが挙げられる。固体状態の場合には、検出対象となるＲＮＡは他の物質と混合状態であってもよく、複数種のＲＮＡの混合物であってもよい。
【００７７】
固相担体上にＲＮＡが固定されている場合、該固相担体としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリメチルメタクリレート等のポリマー並びにシリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維およびメンブレンフィルター等の多孔質物質が拳げられる。
【００７８】
また、固相担体はビーズ状になったものおよびアクリルアミドゲルのようにゲル状のものであってもよい。また、ＲＮＡが単に固相担体上に物理的に密着されていてもよく、固相担体上から一部固相担体内に浸透した形態であってもよい。また、ＲＮＡが完全に固相担体に浸透した形態であってもよく、共有結合で化学的に固相担体に結合されていてもよい。
【００７９】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡとしては、例えば、化学的に合成したＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などによって酵素学的に合成したＤＮＡ並びに生物由来試料から抽出またはクローン化したＤＮＡが挙げられる。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させるＤＮＡは、特定のＲＮＡのヌクレオチド配列を検出する場合、該ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブＤＮＡであることが好ましい。
【００８０】
また、該プローブＤＮＡは標識物質を結合するものであることが好ましい。標識物質としては、例えば、クエンチャー（例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＴＡＭＲＡ（登録商標）およびＭＧＢなど）およびレポーター色素（例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＥＴおよびＨＥＸなど）等の蛍光色素、ビオチン並びに放射性同位体元素が挙げられる。
【００８１】
また他の標識としては、例えば、直接は検出できないが標識物質と特異的に結合する物質（例えばアビジンなど）との反応によって間接的に検出可能となるような物質、例えば、ハプテンおよび抗体などが挙げられる。当該ＤＮＡは、１５〜３００ヌクレオチド、好ましくは１５〜６０ヌクレオチドを含有することが好ましい。
【００８２】
（ｉｉ）本発明のＤＳＮで、工程（ｉ）で形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程
この工程は、本発明のＤＳＮを用いて二本鎖特異的に核酸を切断することにより、工程（ｉ）で形成された一本のＲＮＡ鎖および一本のＤＮＡ鎖からなるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡを分解する工程である。工程（ｉｉ）は、好ましくは４０℃以上、より好ましくは６０℃以上、また、好ましくは８０℃以下の条件下で反応を行うことが好ましい。
【００８３】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程。
この工程は、工程（ｉｉ）におけるＤＮＡの分解を検出することにより、ＲＮＡの存在を検出する工程である。ＤＮＡの分解は、例えば、次の方法により検出することができる。工程（ｉ）においてＤＮＡの５’末端をレポーターの蛍光色素、３’末端をクエンチャーの蛍光色素で標識したプローブＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成させる。
【００８４】
その後、本発明のＤＳＮでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中にＤＮＡを分解することにより、プローブＤＮＡに結合しているリポーターの蛍光色素とクエンチャーの蛍光色素が離れ離れになり、リポーターの蛍光色素が検出されるようになる。すなわち、検体中にＲＮＡが存在すれば、リポーターの蛍光色素が検出される。
【００８５】
また、例えば、平板ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動およびマススペクトル分析などの当業者に公知の様々な核酸の分析手法によっても検出が可能である。例えば、本発明のＤＳＮ酵素を添加する場合と添加しない場合との電気泳動パターンを比較することによりＤＮＡの分解を検出することも可能である。
【００８６】
本発明のＤＳＮを含んでなる試薬キットも本発明の範囲に包含される。本試薬キットは、標識物質、緩衝液および塩など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。当該試薬キットは、本発明の二本鎖特異的な核酸の切断方法およびＲＮＡの検出方法に使用可能である。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００８８】
［実施例１］
ヤドカリ肝膵臓由来ｃＤＮＡの調製
本発明者らは、ヤドカリの肝膵臓中にＤＳＮが発現していることを見出し、その遺伝子を単離および同定する目的で、まず以下の方法で肝膵臓由来１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを調製した。
【００８９】
（１）ヤドカリからの肝膵臓の採取
Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの生体を購入し、解剖して肝膵臓を採取した。採取した肝膵臓、約１００ｍｇを直ちに１．２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に浸漬し、４℃で１６時間保存した。浸漬した肝膵臓をピンセットで取り出し、新しいエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９０】
（２）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
−８０℃で保存したヤドカリの肝膵臓から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。３０ｍｇの肝膵臓から、６０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。
【００９１】
（３）１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの作製
以下に示す逆転写反応により、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。反応は３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を使用して行った。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、１μｌのプライマーＡＰ（配列番号４）（１０μＭ）および、１０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、７０℃で１０分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。
配列番号４：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’
【００９２】
熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で２分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  Ｒｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。
【００９３】
反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。反応液を氷上で冷却して、ＲＮａｓｅＨ  ２．０Ｕを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。この溶液を１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ溶液とした。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。
【００９４】
［実施例２］
ヤドカリＤＳＮ遺伝子の塩基配列の決定
実施例１の方法で調製したヤドカリ肝膵臓由来１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として用い、まずＤＳＮ遺伝子の内部配列を取得した後、得られた内部配列を元に３’領域配列を決定し、次に５’領域配列を決定し、最終的にヤドカリＤＳＮ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列決定に至った（配列番号３）。
【００９５】
図１はヤドカリＤＳＮ遺伝子の部分配列および全長配列のクローニングの概要を示す図であり、用いたプライマーの位置の模式図とそれぞれのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を示す（レーンＭ；ＤＮＡサイズマーカー、レーン６；プライマーＭ＾ＧＳＰ６−２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＩ；プライマーＭｉ１およびＭｉ２によるＰＣＲ増幅産物、レーン３’；プライマーＭｉ１およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーン５’；プライマーＹ５Ｒ２およびＡＵＡＰによるＰＣＲ増幅産物、レーンＦ；プライマーＹＷＰＦ１およびＹＷＰＲ１のＰＣＲ増幅産物）。
【００９６】
（１）ヤドカリ遺伝子の内部配列の取得
種々の甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間でよく保存されている領域を参考にして、プライマーＭＧＳＰ６（配列番号５）、ＭＧＳＰ６−２（配列番号６）、Ｍｉ１（配列番号７）、Ｍｉ２（配列番号８）を作製した。
配列番号５：５’−ｇｃｃａａｃａｔｔｇｃｃｇｃｃａａｇｇａ−３’
配列番号６：５’−ｇｃｃａａｇｇａｃａｔｃｇａｇａｃｃｔｃ−３’
配列番号７：５’−ｔｔｃａａｇａｃｃｔｃｃａｃｃｇｇｇｔｔｃｔｔｃａ−３’
配列番号８：５’−ｔｇｃｃａｔｔａｔｔｇａａｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｔｇ−３’
【００９７】
以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を増幅した。１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。
【００９８】
反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６（配列番号５）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
配列番号９：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃ−３’
【００９９】
サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ａ〉を得た。
【０１００】
次に、増幅産物〈Ａ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＭＧＳＰ６−２（配列番号６）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
【０１０１】
９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｂ〉を得た。増幅産物〈Ｂ〉を、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの確認をした結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示すように、特異的な増幅産物は観察されなかった［図１（ａ）レーン６］。
【０１０２】
そこで、増幅産物〈Ｂ〉を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。増幅産物〈Ｂ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈した。この希釈液  ２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍｉ１（配列番号７）およびＭｉ２（配列番号８）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）に示すように、約２５０  ｂｐの位置にバンドが観察された［図１（ｂ）レーンＩ］。
【０１０３】
このバンドを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を決定した。
【０１０４】
（２）ヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域配列の取得
取得したヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列を解析したところ、Ｍｉ１（配列番号７）周辺領域とヤドカリＤＳＮ遺伝子間で高い相同性が確認されたので、Ｍｉ１（配列番号７）を用いてヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域配列の取得を行った。以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の３’領域配列を増幅した。
【０１０５】
実施例２（１）の増幅産物〈Ｂ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈した溶液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｍｉ１（配列番号７）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
【０１０６】
サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。
【０１０７】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約７００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｃ）レーン３’］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。
【０１０８】
得られた産物をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ〈Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ〉（タカラバイオ社製）を用いて、当該キットに添付のｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子３’領域の塩基配列を決定した。
【０１０９】
（３）ヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域配列の取得
以下に示す５’ＲＡＣＥ法により、ヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を解読した。反応は５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の試薬を用いて行った。取得したヤドカリＤＳＮ遺伝子の内部配列をもとに、Ｙ５ＲＴ（配列番号１０）、Ｙ５Ｒ１（配列番号１１）、Ｙ５Ｒ２（配列番号１２）を作製した。
配列番号１０：５’−ｇｃｇｔｔｇａｔｇａａｇｔａｇｔａｇｇｔｇｇｃｇｔ−３’
配列番号１１：５’−ｔｇｃｔｃｇｇｃｃａｃｔｇｔｃａｃｇａａｇｔｃｔ−３’
配列番号１２：５’−ｔｇｇｔｇｇｔｃｇｇｇｇｔｃａａｔｇａｔｇｇｔ−３’
【０１１０】
以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、２．５μｌのプライマーＹ５ＲＴ（配列番号１０）（１μＭ）および、１２．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、７０℃で１０分間インキュベート後、氷上で急冷した。
【０１１１】
熱処理後の混合液（１５．５μｌ）に、反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を２μｌ添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．４ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が２．５ｍＭ、そしてＤＴＴが１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、４２℃で１分間インキュベートした。逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  Ｒｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを２００Ｕ添加して、反応液（全量２５μｌ）を調製した。
【０１１２】
反応液を４２℃で５０分間インキュベート後、７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この反応液に、ＲＮａｓｅ  ｍｉｘ  １μｌを添加し３７℃で３０分間インキュベート後、該キットに添付のＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該キットに付属の仕様書に従った。
【０１１３】
次に、ＴｄＴ−ｔａｉｌｉｎｇ反応を行った。Ｏｌｉｇｏ−ｄＣ付加酵素として、該キットに付属のＴｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を使用した。Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ精製ｃＤＮＡ  １０μｌ、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ｔａｉｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ、ｄＣＴＰは終濃度が０．２ｍＭになるように添加して、混合液（全量２４μｌ）を調製した。
【０１１４】
この混合液を９４℃で３分間インキュベートし、氷上で急冷した。ＴｄＴを１μｌ添加して反応液（全量２５μｌ）を調製し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、６５℃で１０分間インキュベートして、ＴｄＴを不活性化した。この溶液をｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ溶液とした。
【０１１５】
以下のＰＣＲによって、ヤドカリＤＳＮ遺伝子の５’領域の配列を増幅した。ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ  ５μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｙ５Ｒ１（配列番号１１）およびＡＡＰ（配列番号１３）をそれぞれ終濃度０．４μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。配列番号１３において、「ｉ」は、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）であることを示す。
配列番号１３：５’−ｇｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔａｇｔａｃｇｇｇｉｉｇｇｇｉｉｇｇｇｉｉｇ−３’
【０１１６】
サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の温度サイクルを３５回繰り返し、増幅産物〈Ｄ〉を得た。
【０１１７】
次に、増幅産物〈Ｄ〉を滅菌超純水で１００倍に希釈し、この希釈液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。希釈液２μｌを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）２．５Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、Ｙ５Ｒ２（配列番号１２）およびＡＵＡＰ（配列番号９）をそれぞれ終濃度０．２μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
【０１１８】
９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で６０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約８００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｄ）レーン５’］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水１０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。
【０１１９】
得られた産物をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ〈Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ〉（タカラバイオ社製）を用いて、該キットに添付のｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。本操作の手順は、当該キットに付属の仕様書に従った。得られた組換え体ＤＮＡ中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。
【０１２０】
以上のようにしてヤドカリＤＳＮ遺伝子５’領域の塩基配列を決定した。このようにして最終的にヤドカリＤＳＮ遺伝子の全長ｍＲＮＡの塩基配列（配列番号３）が得られた。該配列は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号１のＤＳＮ遺伝子を有していた。
【０１２１】
［実施例３］
ヤドカリＤＳＮ全長遺伝子のクローニング
実施例２によってヤドカリＤＳＮのｍＲＮＡの塩基配列からｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３）を決定した我々は、この配列に基づきプライマーＹＷＰＦ１（配列番号１４）およびＹＷＰＲ１（配列番号１５）を設計し、これによってヤドカリＤＳＮ全長遺伝子（配列番号１）をクローンした。全長遺伝子の電気泳動像を図１（ｅ）に示す。
配列番号１４：５’−ｃｔｇｃｔｇｔｇａｇｇｔｇｇａａｇａａａｇｇｔｇｔ−３’
配列番号１５：５’−ｔｇｔｇｃａｔｔａｇｔｃｇｇｔｃａｇｇａｇａｔｃａ−３’
【０１２２】
逆転写およびＰＣＲ反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いて行った。まず以下に示す逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。ヤドカリ肝膵臓から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ（０．５μｌ）を鋳型として使用した。０．５μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ、５μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（配列番号１６）（１０μＭ）および、６．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを混合し、６５℃で５分間熱処理を行い、その後氷上で急冷した。熱処理後の混合液（１２μｌ）に、反応緩衝液として、５倍濃度の緩衝液（５×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ  ）を４μｌ添加した。ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓを２μｌ、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社製）を１μｌ、それぞれ添加して反応液（全量２０μｌ）を調製した。
配列番号１６：５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’
【０１２３】
反応液を４２℃で２０分間インキュベート後、９９℃で５分間インキュベートし、逆転写反応を終了させた。この溶液を逆転写ｃＤＮＡ溶液とした。この逆転写ｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として、反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。
【０１２４】
反応緩衝液として、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーＹＷＰＦ１（配列番号１４）およびＹＷＰＲ１（配列番号１５）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。
【０１２５】
９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９８℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、約１３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物［図１（ｅ）レーンＦ］を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルから回収後、精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。得られた増幅産物を常法に従って、ｐＵＣ１１８ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ中（以下ｐＵＣ１１８  ＹＤＳＮと呼ぶ）の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読した。以上のようにしてヤドカリＤＳＮ全長遺伝子をクローンし、その全配列を確認した。
【０１２６】
単離されたヤドカリＤＳＮ  ｃＤＮＡのコード領域は、１２１２塩基からなる配列であり（配列番号１）、４０３アミノ酸の配列からなるポリペプチドをコードしていた（配列番号２）。ヤドカリＤＳＮは、ズワイガニＤＳＮ（非特許文献１０）に対して塩基配列レベルで６６％、アミノ酸配列レベルで６０％の同一性を示し、タラバガニＤＳＮ（非特許文献８）に対しては、塩基配列レベルで７５％、アミノ酸配列レベルで７３％の同一性を示した。
【０１２７】
ヤドカリＤＳＮとズワイガニＤＳＮ、クルマエビＤＮａｓｅおよびタラバガニＤＳＮのアミノ酸配列の比較を示すマルチプルアライメントを図２に示す。図２中、ＫｕｒｕｍａはクルマエビＤＮａｓｅ、ＴａｒａｂａはタラバガニＤＳＮ、ＺｕｗａｉはズワイガニＤＳＮ、ＹａｄｏｋａｒｉはヤドカリＤＳＮのアミノ酸配列を示す。４つの配列の間で一致するアミノ酸を四角で囲んで示した。シグナルペプチド切断部位を縦二重線（‖）で示す。
【０１２８】
シグナルペプチド切断部位は、ヤドカリＤＳＮおよびタラバガニＤＳＮについてはＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  ソフトウェア（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０，７８３−９５，２００４年）による予測切断部位であり、ズワイガニＤＳＮについては組換えタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析の結果（非特許文献１０）、クルマエビＤＮａｓｅについてはＷａｎｇらの実験によって明らかにされた切断部位（非特許文献３）である。
【０１２９】
ＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼファミリーのＮＵＣ保存ドメインの活性部位に相当する位置のアミノ酸残基を斜線で示した。配列中のＣｙｓ残基を灰色で示した。ヤドカリＤＳＮはＮ末端から２２アミノ酸の推定シグナル配列を有しており、全長ポリペプチドの計算分子量は４４．３ｋＤａ、予測等電点は４．２、予測成熟ポリペプチドの計算分子量は４１．８ｋＤａ、予測等電点は４．１であった。ヤドカリＤＳＮには、タラバガニＤＳＮとの間で保存された位置にある１０のＣｙｓ残基を有していた。
【０１３０】
［実施例４］
組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製
実施例３によって単離されたヤドカリＤＳＮ  ｃＤＮＡを用い、バキュロウイルス−昆虫細胞系による組換えＤＳＮ酵素の発現と精製を行った。
【０１３１】
（１）組換えバキュロウイルスの作製
以下に示すＰＣＲにより、ヤドカリＤＳＮ  ｃＤＮＡを増幅させた。ヤドカリＤＳＮ  ｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するために、プライマーＹＥＰＦ（配列番号１７）およびＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）を作製した。ヤドカリＤＳＮをＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として発現させるために、ＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）の５’末端側に、６×ヒスチジンをコードする塩基配列を付加した。
配列番号１７：５’−ａａｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｇｃｇａｃｇｔｃｇａｇｔａａｔ−３’
配列番号１８：５’−ｃｃｇａａｔｔｃｔｃａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｇａｇａｔｃａａｃｇｔ−３’
【０１３２】
実施例３で作製したｐＵＣ１１８  ＹＤＳＮ  ８ｎｇを鋳型として反応液（全量５０μｌ）に添加した。ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）１．０Ｕを反応液に添加した。反応緩衝液として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ製品に添付の１０倍濃度の緩衝液（１０×ＫＯＤ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）を５μｌ添加した。プライマーとして、ＹＥＰＦ（配列番号１７）およびＹＥＰＲ−Ｈｉｓ（配列番号１８）をそれぞれ終濃度０．３μＭになるように反応液に添加した。ｄＮＴＰは終濃度が各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４は終濃度が１．５ｍＭとなるようにそれぞれ反応液に添加した。
【０１３３】
サーマルサイクラーは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用した。９４℃で２分間の熱処理を１回、続いて９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の温度サイクルを３５回繰り返した。
【０１３４】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約１３００ｂｐの位置にバンドが確認された。このＰＣＲ増幅産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水５０μｌで溶出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。精製した増幅産物を、ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社製）を用いて消化後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌超純水２０μｌで溶出した。制限酵素で消化した増幅産物を常法に従って、ｐＶＬ１３９３ベクターへ挿入した。得られた組換え体ＤＮＡ（以下ｐＶＬ１３９３  ＹＤＳＮ−Ｈｉｓと呼ぶ）中の塩基配列をＤＮＡシーケンサーによって解読し、配列番号１と一致することを確認した。
【０１３５】
作製したｐＶＬ１３９３  ＹＤＳＮ−Ｈｉｓ  １．２μｇ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｏｒｂｉｇｅｎ社製）０．１μｇおよびＧｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，  ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を混合して溶液Ａ（全量１００μｌ）を調製した。また、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，  ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ９２μｌとセルフェクチンＩＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）８μｌを混合して溶液Ｂを調製した。溶液Ａと溶液Ｂを混合して溶液Ｃを調製し、室温で３０分間静置した。
【０１３６】
φ６０ｍｍ  ｄｉｓｈに０．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量４ｍｌ）で準備したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶液Ｃを添加し、２８℃で５時間インキュベートした。培地のみを除去し、新しいＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ２ｍｌを添加して、２８℃で５日間インキュベートした。
【０１３７】
ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を１ｓｔ  組換えウイルス液とした。次に、組換えウイルスの感染力価を増加させるために、以下の操作を行った。１ｓｔ組換えウイルス液５００μｌを、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１５ｍｌ）で組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で５日間インキュベートした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を２ｎｄ組換えウイルス液とした。
【０１３８】
次に、作製した２ｎｄ組換えウイルス液  １ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量５０ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、２８℃で振とうしながら、４日間インキュベーションした。ウイルス感染培養液を２，５００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を３ｒｄ組換えウイルス液とした。
【０１３９】
（２）組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製
以下の手順に従い組換えヤドカリＤＳＮの発現および精製を行った。作製した３ｒｄ組換えウイルス  ２ｍｌを、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１００ｍｌ）でベントキャップ付き三角フラスコ（コーニング社製）に準備したＳｆ９細胞に添加し、１８℃で振とうしながら、７日間インキュベーションした。同様の条件で、さらに１本の該フラスコ（計２００ｍｌ）で感染を行った。ウイルス感染培養液（全量２００ｍｌ）を７，０００×ｇで５分間遠心分離した。
【０１４０】
沈殿した細胞を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）２０ｍｌに懸濁し、氷上で１時間静置した。この懸濁液を、超音波破砕処理した後、１０，０００ｇ×２０分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清中に含まれる昆虫細胞およびバキュロウイルス由来のタンパク質を分解した。
【０１４１】
この処理液を１０，０００ｇ×２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清から、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ヤドカリＤＳＮを精製した。クロマトグラフィーシステムはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅ１０Ｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。カラムの平衡化およびサンプル添加後のカラムの洗浄には緩衝液Ａを使用した。カラムに吸着したヤドカリＤＳＮの溶出は、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）を用いたリニアグラジエントによって行った。
【０１４２】
精製各段階の画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図３に示す。図３中、各レーンは次のサンプルを示す：レーンＭ；分子量マーカー、レーン１；組換えウイルス感染昆虫細胞培養上清、レーン２；細胞破砕上清、レーン３；細胞破砕沈殿、レーン４；プロテイナーゼＫ処理上清、レーン５；プロテイナーゼＫ処理沈殿、レーン６；ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム非吸着画分、レーン７；カラム洗浄画分、レーン８；溶出画分。この結果、ヤドカリＤＳＮの予測分子量に一致する単一のタンパク質バンドが観察されることを確認した（図３  レーン８）。ヤドカリＤＳＮと考えられるバンドを矢印で示す。
【０１４３】
溶出画分をＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、等量のグリセロール（和光純薬工業社製）を添加し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール溶液として保存した。以上のような精製操作により、２００ｍｌの組換えウイルス感染培養液から、約１７０μｇの高純度酵素が得られた。
【０１４４】
［実施例５］
ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
（１）ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ分解活性
実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素のＤＮＡ分解活性を測定した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ、Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１４５】
調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、４０℃で平衡化した。精製酵素１０μｌを添加し、すばやく攪拌した後に、波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素活性を１Ｕとした。この結果、精製酵素の活性は２６３１Ｕ／ｍｌであることが示された。
【０１４６】
（２）ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的核酸切断活性
ヤドカリＤＳＮの２本鎖特異的切断活性を評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１４７】
基質溶液９μｌに、実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素原液、または、該酵素溶液をＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール）で２．５、５、１０、２０、４０、８０倍希釈したサンプルを、それぞれ１μｌを添加して反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。
【０１４８】
調製した反応液を６０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図４に示す。
【０１４９】
図４中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、各レーンの数値は酵素の希釈倍率を示す。レーンＤＢは陰性コントロールのＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示す。また図４中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３  ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。
【０１５０】
図４に示すように、酵素を添加したすべての反応液で、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、１本鎖ＤＮＡ基質であるＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、酵素の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した場合（図４  レーンＤＢ）では、両方の基質が分解されなかった。
【０１５１】
このことから、ヤドカリＤＳＮは１本鎖ＤＮＡにはほとんど作用せず、２本鎖ＤＮＡのみを特異的に分解することが示された。また、２本鎖ＤＮＡの分解の度合いは、酵素希釈倍率に依存していた。このことは、反応系への酵素の添加量をコントロールすることで、２本鎖ＤＮＡの分解度合いをコントロールすることができることを示している。
【０１５２】
［実施例６］
ヤドカリＤＳＮの至適活性温度
ヤドカリＤＳＮの様々な温度におけるＤＮＡ分解活性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１５３】
調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、２０℃〜８０℃の範囲の各活性測定温度で平衡化した。活性測定には、溶液の蒸発を防ぐために蓋付きの石英セルを使用した。波長２６０ｎｍの吸光度の値が安定した後、実施例４で取得したヤドカリＤＳＮ精製酵素を１０μｌ添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に３分間測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
【０１５４】
測定結果を図５に示す。図５は、各温度において（ａ）測定された活性（Ｕ／ｍｌ）および（ｂ）相対活性（％）のグラフを示す。この結果から、ヤドカリＤＳＮの至適活性温度は約８０℃以上であることが示された。８０℃を越える温度では、基質であるウシ胸腺由来のＤＮＡの融解が始まるため正確に酵素活性を測定できなかった。８０℃（３２２０３３Ｕ／ｍｌ）でのヤドカリＤＳＮの活性を最大活性とした場合、７５℃から８０℃までの範囲で最大活性の７０％以上の活性を示すことが分かった。
【０１５５】
一方、ヤドカリＤＳＮは、２０℃（６８Ｕ／ｍｌ）から４０℃（２６３１Ｕ／ｍｌ）までの範囲では、最大活性の１％以下の活性しか示さなかった。ヤドカリＤＳＮは室温付近の温度では、最小限の活性しか示さないが、少なくとも８０℃以上で最も高い活性を示す超好熱性酵素であった。
【０１５６】
［実施例７］
様々な温度条件下におけるヤドカリＤＳＮの２本鎖特異性
ヤドカリＤＳＮの２本鎖選択性に対する反応温度の影響を評価した。１本鎖ＤＮＡ基質としてＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を、２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＭ１３  ｍｐ１８  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。基質溶液９μｌにＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで２５倍希釈したヤドカリＤＳＮ精製酵素  １μｌ（０．１Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。
【０１５７】
調製した反応液を３０、４０、５０、６０、７０℃の各温度で、３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。
【０１５８】
得られた電気泳動像を図６に示す。図６中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーンＹはヤドカリＤＳＮ添加サンプルを、レーンＢは酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示し、その上に反応温度を示した。
【０１５９】
また図６中、白抜き矢印はλＤＮＡ、黒矢印はＭ１３  ＤＮＡの、それぞれ無傷の分子量の位置を示す。この結果、試験したいずれの温度においても、１本鎖ＤＮＡのバンドの消失は認められなかった。一方、２本鎖ＤＮＡのバンドは、反応温度４０、５０、６０、７０℃において、ほぼ完全に消失した。３０℃の場合は、ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ分解活性が低く、３分の反応時間では完全に分解されなかったと考えられる。
【０１６０】
図６に示す結果から、ヤドカリＤＳＮは３０℃から７０℃の広い温度範囲において、１本鎖ＤＮＡを分解する活性が極めて低いか、分解活性を持たないこと、および該酵素が２本鎖ＤＮＡに対して非常に高い選択性を有することがわかった。さらに、ヤドカリＤＳＮが４０℃以上の温度で、より高い２本鎖核酸選択性を有し、また７０℃でさらに高い２本鎖核酸選択性を有することがわかった。
【０１６１】
［実施例８］
ヤドカリＤＳＮの耐熱性
ヤドカリＤＳＮは、マグネシウム存在下では高い耐熱性を示すが、マグネシウムが存在しない条件下では、その耐熱性が減弱するという性質を持つ。この性質を評価するために以下の実験を実施した。
【０１６２】
（１）熱処理後の残存活性
ヤドカリＤＳＮのマグネシウム存在下での熱安定性を以下の方法で評価した。はじめに、ヤドカリＤＳＮを含まない反応基質溶液を調製した。反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、ウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）が終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１６３】
調製した反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、４０℃で平衡化した。次に実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素に１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加して、終濃度が１４ｍＭとなるよう調製し、基質ＤＮＡが存在しない条件下で、５０℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃の各温度で、５、１０、１５、２０、３０分間インキュベーションした後、その１０μｌを取り、前記の反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌し、活性測定を行った。
【０１６４】
活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
【０１６５】
熱処理前の活性に対する、熱処理後の相対活性（％）の変化を図７（ａ）に示す。図７（ａ）に示すように、５０℃、６０℃、および６５℃の各温度で処理した酵素は、３０分経過後でも、熱処理前と同等の活性を保持していた。７０℃で処理した酵素は、３０分経過後でも、熱処理前の６０％以上の活性を保持していた。７５℃で処理した酵素は、１０分経過後に熱処理前の約３０％の活性となった。８０℃で処理した酵素は、５分経過後に約１０％まで減少した。
【０１６６】
この結果は、ヤドカリＤＳＮが、マグネシウム存在下で少なくとも７０℃までの温度では、３０分間の加熱に耐えて約６０％の活性を保持できる耐熱性を有することを示す。また、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下では、７５℃および８０℃でもＤＮＡ分解活性を保持していることが示された。この結果は、実施例６のヤドカリＤＳＮが８０℃以上の温度でも数分間であれば、酵素活性を保持し、最大活性を発揮できるという結果と一致し、ヤドカリＤＳＮがこれまでに報告されたＤＳＮと比較して、高い耐熱性を有することを示している。
【０１６７】
マグネシウムが存在しない条件で、同様の実験を行った場合の結果を図７（ｂ）に示す。図７（ｂ）に示すように、６０℃で処理した酵素は３０分経過後でも熱処理前の約８０％の活性を保持していたが、６５℃で処理した酵素は、３０分経過後では約２０％の活性しか残存しなかった。さらに７０℃以上の温度での処理では、５分経過後には、約１０％の活性しか残存しなかった。
【０１６８】
マグネシウム存在条件下では、７０℃での熱処理では、５分経過後では約９０％、３０分経過後でも６０％以上の高い残存活性を保持していたことから、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で耐熱性が顕著に向上する酵素であることが示された。
【０１６９】
（２）７０℃での熱処理後の残存活性
ヤドカリＤＳＮに７０℃で熱処理を加えた場合の熱安定性を以下の方法で評価した。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡを、終濃度がそれぞれ２１μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０％グリセロール）と１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２により、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むヤドカリＤＳＮ精製酵素（０．０５Ｕ／μｌ）を調製した。
【０１７０】
陰性コントロールとして、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒと滅菌ミリＱ水により、ＭｇＣｌ２を含まないヤドカリＤＳＮ精製酵素（０．０５Ｕ／μｌ）も調製した。各酵素液１０μｌを、７０℃で１５分間熱処理した後、氷上で保存した。基質溶液９μｌに７０℃で１５分間熱処理した各酵素  １μｌ（０．０５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。陽性コントロールとして熱処理していない酵素  １μｌ（０．０５Ｕ）を添加して、反応液を調製した。
【０１７１】
調製した反応液を７０℃で３分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、基質バンドの有無および濃淡を比較した。その電気泳動像を図７（ｃ）に示す。
【０１７２】
図７（ｃ）中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーン１、２は、マグネシウムを含む酵素液を７０℃で熱処理した後にＤＮＡ分解反応に供した結果を、レーン３は、マグネシウムを含む酵素液を熱処理せずにＤＮＡ分解反応に供した結果を示す。レーン４、５は、マグネシウムを含まない酵素液を７０℃で熱処理した後にＤＮＡ分解反応に供した結果を、レーン６は、マグネシウムを含まない酵素液を熱処理せずにＤＮＡ分解反応に供した結果を示す。レーンＤＢは酵素液の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルを示す。また図７（ｃ）中、白抜き矢印はλＤＮＡの無傷の分子量の位置を示す。
【０１７３】
図７（ｃ）に示すように、レーン１、２のマグネシウム存在下で、７０℃で熱処理したヤドカリ精製酵素は、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡを、ほぼ完全に分解した。λＤＮＡの分解度合いはレーン３、６の熱処理していないヤドカリ精製酵素と同等レベルと考えられるので、ヤドカリ精製酵素はマグネシウム存在下では、７０℃での熱処理でほとんど失活しないと考えられる。
【０１７４】
一方、レーン４、５のマグネシウム非存在下で、熱処理したヤドカリ精製酵素は、λＤＮＡをわずかに分解したが大部分が残存していた。この結果は前述の実験（１）で得られた、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で、７０℃で１５分間の熱処理で約８０％の活性を保持し、マグネシウム非存在下では、７０℃の熱処理でほぼ失活するという結果と合致する。
【０１７５】
［実施例９］
ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨ
ヤドカリＤＳＮの至適ｐＨを以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。
【０１７６】
各ｐＨの反応基質溶液は、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５の場合は、５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅを、ｐＨ６、ｐＨ６．５の場合は、５０ｍＭ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨを、ｐＨ７、ｐＨ７．５の場合は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを、ｐＨ８、ｐＨ８．５、ｐＨ９の場合は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを、ｐＨ９．５、ｐＨ１０の場合は、５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨを用いて調製し、これらの各溶液にＭｇＣｌ２を１４ｍＭおよびウシ胸腺由来のＤＮＡ  が終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１７７】
調製した各ｐＨの反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、５０℃で平衡化した。実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
【０１７８】
最大の活性が得られたｐＨの反応液の活性を１００％とした場合の相対活性を図８に示す。図８に示すように、ヤドカリＤＳＮがｐＨ６で最大の活性があることを示している。
【０１７９】
［実施例１０］
ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性
ヤドカリＤＳＮのマグネシウムイオン要求性を以下の方法で評価した。基質としてウシ胸腺由来のＤＮＡ（和光純薬社製）を用いた。活性測定はＫｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３，３４９−３６２，１９５０）に従い行った。
【０１８０】
反応基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に、ＭｇＣｌ２をそれぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ添加し、この溶液にウシ胸腺由来のＤＮＡが終濃度４０μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１８１】
調製した各反応基質溶液（９９０μｌ）を石英セルに添加し、７０℃で平衡化した。実施例４で得られたヤドカリＤＳＮ精製酵素１０μｌを反応基質溶液に添加し、すばやく攪拌した。波長２６０ｎｍの吸光度を５秒毎に測定した。１Ｕの活性は、１分間に波長２６０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量とした。
【０１８２】
最大の活性が得られた基質溶液の活性を１００％とした場合の相対活性を図９に示す。図９に示すように、ヤドカリＤＳＮは、ＭｇＣｌ２を５０ｍＭ含む反応液で最大の活性を示し、１０ｍＭから１００ｍＭの広い範囲のマグネシウムイオン濃度で最大活性の３０％以上の高い活性を示した。
【０１８３】
［実施例１１］
ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性
ヤドカリＤＳＮのＲＮＡ分解活性を評価した。ＲＮＡ基質として昆虫細胞由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた。５×１０６個のＳｆ９細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。精製操作の手順は、該精製キットに付属の仕様書に従った。
【０１８４】
５×１０６個のＳｆ９細胞から、５．４μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡが得られた。２本鎖ＤＮＡ基質としてλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を、ＲＮＡ基質として上記で調製した昆虫細胞由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、λＤＮＡとＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、終濃度がそれぞれ５．２５μｇ／ｍｌと１８μｇ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１８５】
基質溶液  ９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素  １μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロール、ＤＮａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ社製）を１μｌ（５Ｕ）添加したサンプルを陽性コントロール、および、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１の混合液であるＲＮａｓｅ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ添加したサンプルを陽性コントロールとして調製した。
【０１８６】
調製した各反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反応液１０μｌについて１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した後、ＵＶ照射下で、各基質バンドの有無および濃淡を比較した。
【０１８７】
その電気泳動像を図１０に示す。図１０中、レーンＭはλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡサイズマーカー（東洋紡社製）、レーン１はＲＮａｓｅ  ｍｉｘ、レーン２はヤドカリＤＳＮ精製酵素、レーン３はＤＮａｓｅ  Ｉ、レーン４はＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した反応液である。
【０１８８】
図１０に示すように、ヤドカリＤＳＮ精製酵素を添加した反応液（図１０  レーン２）では、２本鎖ＤＮＡ基質であるλＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。一方、該精製酵素の代わりにＲＮａｓｅ  ｍｉｘを添加した場合（図１０  レーン１）では、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（黒矢印）のみが分解され、２本鎖ＤＮＡ基質であるλ  ＤＮＡ（白抜き矢印）は分解されなかった。
【０１８９】
ヤドカリＤＳＮ精製酵素の代わりにＤＮａｓｅ  Ｉを添加した場合（図１０  レーン３）は２本鎖ＤＮＡ基質であるλ  ＤＮＡ（白抜き矢印）のみが分解され、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（黒矢印）は分解されなかった。また、酵素の代わりにＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した場合（図１０  レーン４）では、両方の基質が分解されなかった。これらのことから、ヤドカリＤＳＮは、ＲＮＡを分解せず、２本鎖ＤＮＡを特異的に分解することが示された。
【０１９０】
［実施例１２］
ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性
ヤドカリＤＳＮのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖の分解活性を評価した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、ＲＮＡ鎖としてＰｏｌｙ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ社製）を、ＤＮＡ鎖として５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号１９）を用いた。
配列番号１９：５’−ＦＡＭ−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−Ｑ−３’
【０１９１】
基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、Ｐｏｌｙ  ＡとＤＮＡプローブを、終濃度がそれぞれ１２．５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。別に、ＤＮＡプローブを単独で添加した基質溶液も調製した。
【０１９２】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を調製するために、基質溶液を室温で３０分間放置し、ハイブリダイゼーションを行った。次に、該基質溶液  １９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素  １μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。
【０１９３】
別に、酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロールとして調製した。調製した反応液を３７℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。
【０１９４】
測定結果を図１１（ａ）に、反応開始２０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きを図１１（ｂ）に示す。図１１（ａ）および（ｂ）に示すように、Ｐｏｌｙ  Ａ、ＤＮＡプローブおよびヤドカリＤＳＮ（ＹＤＳＮ）を添加したサンプルは、反応開始直後から急激に相対蛍光強度（ＲＦＵ）値が増加した。一方、ＹＤＳＮを添加していないサンプル、および、ＹＤＳＮとＤＮＡプローブのみを添加したサンプルのＲＦＵ値の増加量は、Ｐｏｌｙ  Ａ、ＤＮＡプローブおよびＹＤＳＮを添加したサンプルと比較して、顕著に少なかった。
【０１９５】
この結果から、Ｐｏｌｙ  ＡとＤＮＡプローブがＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成できる条件下で、ヤドカリＤＳＮが、該ハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を分解して蛍光の増加をもたらしたことがわかった。本反応の模式図を図１２に示す。
【０１９６】
また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖を形成することのできない条件下、すなわち反応中にＲＮＡが存在しない場合は、ＤＮＡプローブは１本鎖の状態にあり、ヤドカリＤＳＮによってほんど分解されないことも示された。従って、ヤドカリＤＳＮが１本鎖ＤＮＡに対しては、ほとんど分解活性を示さず、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を特異的に分解することが示された。
【０１９７】
［実施例１３］
ヤドカリＤＳＮの１本鎖ＤＮＡ分解活性
ヤドカリＤＳＮの１本鎖ＤＮＡの分解活性を評価した。１本鎖ＤＮＡとして５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  （Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号１９）を用いた。基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。
【０１９８】
次に、該基質溶液  １９μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素  １μｌ（２．６Ｕ）を添加して、反応液を調製した。別に、酵素の代わりに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ添加したサンプルを陰性コントロール、ＤＮａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ社製）を１μｌ（５Ｕ）添加したサンプルを陽性コントロールとして調製した。
【０１９９】
調製した反応液を３７℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。
【０２００】
測定結果を図１３（ａ）に、反応開始５０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きを図１３（ｂ）に示す。図１３（ａ）および（ｂ）に示すように、ＤＮＡプローブおよびヤドカリＤＳＮ（ＹＤＳＮ）を添加したサンプルの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値は全く増加しなかった。陽性コントロールとしてＤＮａｓｅ  Ｉを添加したサンプルは、反応開始直後から急激にＲＦＵ値が増加した。一方、陰性コントロールとしてＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルは、ＹＤＳＮ添加サンプルと同様にＲＦＵ値は全く増加しなかった。
【０２０１】
この結果から、核酸選択性を持たないＤＮａｓｅ  Ｉは１本鎖ＤＮＡを分解するのに対して、２本鎖ＤＮＡを特異的に分解する酵素であるヤドカリＤＳＮは、１本鎖ＤＮＡを全く分解しないことが示された。
【０２０２】
［実施例１４］
ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出
ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出方法を評価した。実施例１２では、ヤドカリＤＳＮは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を特異的に分解することが示された。また、実施例１３では、ヤドカリＤＳＮが１本鎖のＤＮＡを全く分解しないことが示された。これらのことから、図１２に示した反応が、Ｐｏｌｙ  Ａ以外の任意のヌクレオチド配列をもつＲＮＡについても、進行すると推測される。
【０２０３】
検出対象のＲＮＡとしてＴａｒｇｅｔ４１８−４４４（配列番号２０）を、検出用のＤＮＡプローブとして５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２１）を用いた。なお、配列表の配列番号２０で示される塩基配列において、「ｔ」は「ｕ（ウラシル）」を示す。
配列番号２０：５’−ｇｇｇａｇｇａａｇｇｇａｇｕａａａｇｕｕａａｕａｃｃｕ−３’
配列番号２１：５’−ＦＡＭ−ｇｇｔａｔｔａａｃｔｔｔａｃｔｃｃｃｔｔｃｃ−Ｑ−３’
【０２０４】
基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％ポリエチレングリコール６０００（和光純薬工業社製）に、ＤＮＡプローブを、終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。該基質溶液１８μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素  １μｌ（２．６Ｕ）、および、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を終濃度がそれぞれ、５、４、３、２、１ｐｍｏｌ／ｍｌになるように添加して、反応液を調製した。Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４の代わりに滅菌超純水を添加したサンプルを陰性コントロールとした。
【０２０５】
調製した反応液を５４℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。
【０２０６】
測定結果を図１４（ａ）に示し、各Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４濃度の反応開始３０分間までの相対蛍光強度（ＲＦＵ）値の増加の傾きをプロットした結果を図１４（ｂ）に示す。図１４（ａ）に示すように、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を添加した反応液は、相対蛍光強度（ＲＦＵ）値が時間の経過とともに徐々に増加した。Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４の代わりに滅菌超純水を添加した反応液のＲＦＵ値の増加量は、Ｔａｒｇｅｔ４１８−４４４を添加した反応液と比較して顕著に少なかった。また、図１４（ｂ）に示すように、ＲＦＵ値の増加の傾きとＴａｒｇｅｔ４１８−４４４濃度は、正比例しており、高い相関関係があることがわかった。
【０２０７】
この結果から、ヤドカリＤＳＮと検出対象ＲＮＡに相補的なプローブＤＮＡを用いれば、ヌクレオチド配列特異的にＲＮＡを検出できることがわかった。本反応の模式図を図１５に示す。また、本実施例では、Ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ量とＲＦＵ増加量間に、高い相関があることから、該検出方法は配列特異性だけでなく、定量性もあることを示している。
【０２０８】
［実施例１５］
ヤドカリＤＳＮのミスマッチ塩基の認識
ヤドカリＤＳＮのミスマッチ塩基の認識能を評価した。完全マッチ２本鎖ＤＮＡ溶液を調製するために、完全マッチＤＮＡ（配列番号２２）および、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  （Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２３）を用いた。
配列番号２２：５’−ａｇａａｔｔａｃｃｃ−３’
配列番号２３：５’−ＦＡＭ−ａｇｔｇａｇｇｇｔａａｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ−Ｑ−３’
【０２０９】
完全マッチＤＮＡ基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、これらのＤＮＡを終濃度がそれぞれ５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。次に、ミスマッチ２本鎖ＤＮＡ溶液を調製するために、ミスマッチＤＮＡ（配列番号２４）および、５’末端をＦＡＭ、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  （Ｑ）で修飾したオリゴＤＮＡ（配列番号２３）を用いた。
配列番号２４：５’−ａｇａａｇｔａｃｃｃ−３’
【０２１０】
ミスマッチＤＮＡ基質溶液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に、これらのＤＮＡを終濃度がそれぞれ５ｎｍｏｌ／ｍｌと０．５ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加して調製した。別に、ＤＮＡプローブを単独で添加した基質溶液も調製した。調製した各基質溶液を８５℃で３分間熱処理後、室温で３０分間放置した。各基質溶液１８μｌにヤドカリＤＳＮ精製酵素  ２μｌ（５．２Ｕ）を添加して、反応液を調製した。
【０２１１】
調製した反応液を３０℃でインキュベートし、３０秒おきに蛍光値を測定し、５０分間まで測定を行った。蛍光値の測定は、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。各反応液の反応開始２０分後の相対蛍光強度（ＲＦＵ）値を図１６に示す。図１６に示すように、完全マッチＤＮＡ反応液のＲＦＵ値は、ミスマッチＤＮＡ反応液、およびＤＮＡプローブのみの反応液よりも顕著に高い値であった。
【０２１２】
この結果から、ヤドカリＤＳＮは配列が完全に相補的な２本鎖ＤＮＡは分解するが、１塩基のミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡは分解しにくいことが示された。よって、ヤドカリＤＳＮは１塩基のミスマッチを認識してＤＮＡを切断する酵素であると考えられる。
【０２１３】
ヤドカリＤＳＮが１塩基の違いを認識可能であることにより、実施例１４で示した、ヤドカリＤＳＮを用いた配列特異的なＲＮＡの検出方法の精度はより高くなると考えられる。また、ヤドカリＤＳＮの耐熱性を利用して、反応温度を任意の塩基配列の核酸のハイブリダイゼーションに適した温度に設定することで、さらに検出精度を上げることができると思われる。
【０２１４】
［実施例１６］
円二色性（ＣＤ）測定による解析
円二色性（ＣＤ）測定によって、ヤドカリＤＳＮの高次構造の変化からその耐熱性を分析した。測定には円二色性測定装置Ｊ−７１５（日本分光製）を使用した。バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，５０ｖ／ｖ％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中に０．１ｍｇ／ｍＬのヤドカリＤＳＮを含む溶液を測定試料とし、波長２００ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＣＤスペクトルを一定温度で測定した。その結果を図１７（ａ）に示す。
【０２１５】
また、バッファー中に０．１ｍｇ／ｍＬのヤドカリＤＳＮに加え、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液を測定試料とし、同様に測定を行った結果を図１７（ｂ）に示す。図１７（ａ）および（ｂ）中、Ｎは温度２５℃で測定したスペクトル、Ｄは同試料を温度９５℃に上昇させた後に測定したスペクトル、Ｒは同試料を再び温度２５℃に冷却した後に測定したスペクトルである。
【０２１６】
図１７（ａ）および（ｂ）に示すように、ヤドカリＤＳＮは２５℃ではαヘリックス含量の高い高次構造を持っていることが分かった（スペクトルＮ）。試料中のマグネシウムの存在の有無によってスペクトルに若干の差異が見られるが、いずれの場合も温度に対するピークシフトについてはおおむね類似の傾向を示した。変性状態（９５℃）のスペクトル（スペクトルＤ）は、典型的なランダムコイルのスペクトルを示さず、むしろβシート構造が支配的であることを示唆した。また、この変性は不可逆で、再び酵素を２５℃に冷却しても、βシート支配的なスペクトルを示した（スペクトルＲ）。
【０２１７】
次に、測定波長を２２２ｎｍに固定し、温度を２５℃から９５℃まで上昇させた場合のＣＤ値の変化を測定した結果を図１８（ａ）に示す。測定は、バッファー中にヤドカリＤＳＮのみを含む試料（Ｎ）、ヤドカリＤＳＮと１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む試料（Ｍ）、ヤドカリＤＳＮと２本鎖ＤＮＡを含む試料（ｄｓ）について行った。
【０２１８】
図１８（ａ）に示すように、マグネシウムを含まない試料（Ｎ）とマグネシウムを含む試料（Ｍ）を比較すると、マグネシウム不在下の酵素は約６５℃から変性が始まり，約７８〜８０℃付近で変性を終えた。その変性中点は約７１℃であった。
【０２１９】
一方、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２存在下の酵素は、約７１℃から変性が始まり，約８５℃で変性を終えた。その変性中点は約７８℃であった。すなわち、１４ｍＭマグネシウムの存在によって酵素の熱安定性は約７℃ほど向上していることが観測された。
【０２２０】
このことから、ヤドカリＤＳＮはマグネシウム存在下で熱に対する構造安定性が顕著に向上する酵素であることが示された。本実施例では、酵素の高次構造の変化から、マグネシウムが酵素の熱安定性を向上させることを示したが、この結果は、実施例８で酵素活性の変化に基づいてマグネシウムの効果を調べた結果（図７）とほぼ合致する。
【０２２１】
２本鎖ＤＮＡ共存下のヤドカリＤＳＮのＣＤ測定には、牛胸腺由来ＤＮＡ（和光純薬製）を使用し、試料中のＤＮＡ濃度は０．７５ｍｇ／ｍＬとした。この試料中にマグネシウムは含まない。また、ベースラインを取るためバッファー中に同じ濃度のＤＮＡのみを含む試料についても同様にＣＤ測定を行った。そして、２本鎖ＤＮＡとヤドカリＤＳＮを含む試料のＣＤ測定値から、２本鎖ＤＮＡのみを含む試料のＣＤ測定値を差し引いた差ＣＤを図１８（ｂ）に示す（ｄｓ）。
【０２２２】
図１８（ｂ）に示すように、、酵素のみの熱変性曲線（Ｎ）と、２本鎖ＤＮＡ共存下の酵素の熱変性曲線（ｄｓ）とを比較すると、酵素のみの場合に約７１℃であった変性中点が、２本鎖ＤＮＡ共存下では約７８℃へと移動していることが観測される。このことから２本鎖ＤＮＡの存在によってもヤドカリＤＳＮの熱安定性が向上していることが示唆された。
【配列表フリ−テキスト】
【０２２３】
配列番号１：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  遺伝子の塩基配列
配列番号２：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  のアミノ酸配列
配列番号３：Ｃｏｅｎｏｂｉｔａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ  ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号４：３’−ＲＡＣＥ法に用いたアダプタープライマーの塩基配列（ＡＰ）
配列番号５：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（ＭＧＳＰ６）
配列番号６：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（ＭＧＳＰ６−２）
配列番号７：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（Ｍｉ１）
配列番号８：甲殻類由来のヌクレアーゼ遺伝子間で保存された領域を基にしたプライマーの塩基配列（Ｍｉ２）
配列番号９：ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドユニバーサルアンプリフィケーションプライマーの塩基配列
（ＡＵＡＰ）
配列番号１０：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５ＲＴ）
配列番号１１：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５Ｒ１）
配列番号１２：ヤドカリＤＳＮ遺伝子内部配列を基にしたプライマーの塩基配列（Ｙ５Ｒ２）
配列番号１３：５’−ＲＡＣＥ法に用いたアブリッジドアンカープライマーの塩基配列（ＡＡＰ）
配列番号１４：配列番号３を基にしたプライマーの塩基配列（ＹＷＰＦ１）
配列番号１５：配列番号３を基にしたプライマーの塩基配列（ＹＷＰＲ１）
配列番号１６：Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー
配列番号１７：配列番号３のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列（ＹＥＰＦ）
配列番号１８：配列番号３のｃＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターｐＶＬ１３９３に挿入するためのプライマーの塩基配列（ＹＥＰＲ−Ｈｉｓ）
【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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