(57)【要約】【課題】高精細で高信頼性の超解像画像を観察可能な超解像顕微鏡を提供する。【解決手段】少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料Ｓを観察する超解像顕微鏡であって、活性化光及び不活性化光を試料Ｓに照射する第１光学系と、ポンプ光及びイレース光を空間的に一部重ね合わせて試料Ｓに集光する第２光学系と、イレース光及びポンプ光により試料Ｓを走査させる走査部３６と、試料Ｓからの発光を検出する検出部５５と、活性化光、不活性化光、ポンプ光及びイレース光の試料Ｓに対する照射、及び走査部３６による走査を制御して、検出部５５からの検出信号に基づいて試料Ｓの発光画像を生成する演算制御部５６と、を有し、演算制御部５６は、活性化光及び不活性化光を順次に照射させた後、イレース光及びポンプ光を走査させた際に、各走査点において検出部５５から得られる検出信号に基づいて試料Ｓの発光画像を生成する。【選択図】図１
2014006450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる活性化光及び前記物質を不活性化させる不活性化光を前記試料に照射する第１光学系と、
前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光及び前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光を、空間的に一部重ね合わせて前記試料に集光する第２光学系と、
前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記活性化光、前記不活性化光、前記ポンプ光及び前記イレース光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記活性化光及び前記不活性化光を順次に照射させた後、前記イレース光及び前記ポンプ光を走査させた際に、各走査点において前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
前記第２光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する、請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で集光させる照射光学系と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記走査部による前記試料の各走査点において、前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光を順次に照射させた際に前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項４】
前記照射光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する、請求項３に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
前記走査部は、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
前記演算制御部で生成される発光画像を表示する表示部をさらに有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
前記演算制御部は、前記検出部から得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
前記演算制御部は、さらに前記イレース光の尖頭値強度又は照射時間を調整する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項９】
前記走査部は、前記試料に照射する光を走査するガルバノミラーを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１０】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる活性化光を前記試料に照射する活性化ステップと、
前記活性化光が照射された領域に、活性化状態の前記物質が分子レベルで空間分離するように、前記物質を不活性化させる不活性化光を照射する不活性化ステップと、
前記不活性化光が照射された領域に、前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光と、前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光とを空間的に一部重ね合わせて集光して、当該領域内を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。
【請求項１１】
前記活性化ステップ、前記不活性化ステップ、前記走査ステップ及び前記検出ステップを順次繰り返し行い、
前記演算制御ステップは、順次の前記検出ステップによる検出信号を合成して前記試料の発光画像を生成する、
ことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡観察法。
【請求項１２】
少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で順次に照射する照射ステップと、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。
【請求項１３】
前記走査ステップは、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。
【請求項１４】
前記演算制御ステップは、前記検出ステップから得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。
【請求項１５】
前記試料は、凍結試料である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。
【請求項１６】
前記試料に照射される前記イレース光は、ラゲールガウシアンビームである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の顕微鏡観察法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛍光顕微鏡分野では、画像処理による超解像技術の開発が盛んに行われている。この超解像技術は、図７に示すような蛍光輝点の像、すなわち顕微鏡の光学系によるＰＳＦ（Point spread function；点像分布関数）を、光学理論で仮定される関数形として、理論的に又は標準試料を用いて予め測定する。そして、実際の観察試料から取得された画像を、測定されたＰＳＦに基づいてデコンボリューション処理して、最大強度の点を決定するものである。
【０００３】
この画像処理による超解像技術によると、蛍光輝点が重ならないスパースな蛍光画像の場合は、各輝点の像において決定した最大強度の点を計算機上で重ね合わせることにより、回折限界より精細な画像を再生することが可能となる。また、蛍光輝点が重なるようなスパースでない蛍光画像の場合は、例えば特許文献１に開示のように、蛍光物質の活性化と不活性化とを繰り返しながら、不活性化状態での蛍光画像を順次取得し、その順次の蛍光画像を同様にデコンボリューション処理して合成することにより、回折限界より精細な画像を再生することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５４２８２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の画像処理による超解像技術は、光学理論で仮定される関数形としてＰＳＦを測定している。そのため、実際の観察試料に対して異なる結果を与えることになる。また、光学理論で仮定されるＰＳＦの関数形がガウス型で、先頭形状が急峻でないため、最大点の位置の決定が不正確となって、再生画像の信頼性が低下することが懸念される。
【０００６】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、高精細で高信頼性の超解像画像を観察可能な超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成する第１の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる活性化光及び前記物質を不活性化させる不活性化光を前記試料に照射する第１光学系と、
前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光及び前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光を、空間的に一部重ね合わせて前記試料に集光する第２光学系と、
前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記活性化光、前記不活性化光、前記ポンプ光及び前記イレース光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記活性化光及び前記不活性化光を順次に照射させた後、前記イレース光及び前記ポンプ光を走査させた際に、各走査点において前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする。
【０００８】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る超解像顕微鏡において、前記第２光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する。
【０００９】
さらに、上記目的を達成する第３の観点に係る超解像顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で集光させる照射光学系と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査部と、
前記試料からの発光を検出する検出部と、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光の前記試料に対する照射、及び前記走査部による走査を制御して、前記検出部からの検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御部と、を有し、
前記演算制御部は、前記走査部による前記試料の各走査点において、前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光を順次に照射させた際に前記検出部から得られる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する、ことを特徴とする。
【００１０】
第４の観点に係る発明は、第３の観点に係る超解像顕微鏡において、前記照射光学系は、前記イレース光をビーム面内において空間的に位相変調又は偏光制御するビーム整形素子を有する。
【００１１】
第５の観点に係る発明は、第１〜４のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記走査部は、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる。
【００１２】
第６の観点に係る発明は、第１〜５のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部で生成される発光画像を表示する表示部をさらに有する。
【００１３】
第７の観点に係る発明は、第１〜６のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部は、前記検出部から得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する。
【００１４】
第８の観点に係る発明は、第１〜７のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記演算制御部は、さらに前記イレース光の尖頭値強度又は照射時間を調整する。
【００１５】
第９の観点に係る発明は、第１〜８のいずれかの観点に係る超解像顕微鏡において、前記走査部は、前記試料に照射する光を走査するガルバノミラーを有する。
【００１６】
さらに、上記目的を達成する第１０の観点に係る顕微鏡観察法の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる活性化光を前記試料に照射する活性化ステップと、
前記活性化光が照射された領域に、活性化状態の前記物質が分子レベルで空間分離するように、前記物質を不活性化させる不活性化光を照射する不活性化ステップと、
前記不活性化光が照射された領域に、前記物質を活性化状態から発光量子状態に励起して発光させるポンプ光と、前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制するイレース光とを空間的に一部重ね合わせて集光して、当該領域内を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする。
【００１７】
第１１の観点に係る発明は、第１０の観点に係る顕微鏡観察法において、前記活性化ステップ、前記不活性化ステップ、前記走査ステップ及び前記検出ステップを順次繰り返し行い、
前記演算制御ステップは、順次の前記検出ステップによる検出信号を合成して前記試料の発光画像を生成する。
【００１８】
さらに、上記目的を達成する第１２の観点に係る顕微鏡観察法の発明は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ物質を含む試料を顕微鏡により観察するにあたり、
前記物質を活性化させる復帰光、活性化状態の前記物質を発光抑制量子状態に遷移させて発光を抑制させるイレース光、及び、活性化状態の前記物質を発光量子状態に励起して発光させるポンプ光を前記試料に同軸上で順次に照射する照射ステップと、
前記復帰光、前記イレース光及び前記ポンプ光と前記試料とを相対的に変位させて前記試料を走査する走査ステップと、
前記走査ステップによる前記試料からの発光を検出する検出ステップと、
前記走査ステップによる前記試料上の各走査位置及び当該走査位置における前記検出ステップによる検出信号に基づいて前記試料の発光画像を生成する演算制御ステップと、
を有することを特徴とする顕微鏡観察法。
【００１９】
第１３の観点に係る発明は、第１０〜１２いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記走査ステップは、前記試料上の順次の走査点を、前記試料に照射される前記ポンプ光の回折限界よりも小さい距離で変位させる。
【００２０】
第１４の観点に係る発明は、第１０〜１３いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記演算制御ステップは、前記検出ステップから得られる検出信号の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、前記強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して前記発光画像を生成する。
【００２１】
第１５の観点に係る発明は、第１０〜１４いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記試料は、凍結試料である。
【００２２】
第１６の観点に係る発明は、第１０〜１５いずれかの観点に係る顕微鏡観察法において、前記試料に照射される前記イレース光は、ラゲールガウシアンビームである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、高精細で高信頼性の超解像画像を観察可能な超解像顕微鏡及び顕微鏡観察法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。
【図２】図１の位相板の３つの例を示す図である。
【図３】図１の超解像顕微鏡による顕微鏡観察法を説明するための図である。
【図４】図１の超解像顕微鏡のＰＳＦを従来の顕微鏡のＰＳＦと比較して示す図である。
【図５】第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。
【図６】図５の超解像顕微鏡による顕微鏡観察法を説明するための図である。
【図７】従来の顕微鏡のＰＳＦを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００２６】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。本実施の形態では、例えば遺伝子導入により蛍光タンパク質のドロンパ（Doronpa）が発現した試料Ｓを超解像で観察する。なお、試料Ｓは、分子等が移動しないように凍結されていてもよい。
【００２７】
ドロンパは、蛍光発光可能な状態（活性化状態）で、波長が約５０３ｎｍの光が照射されると緑色の蛍光を発する。しかし、波長４８８ｎｍの光が照射されると、照射総量に応じて、試料Ｓ中のドロンパが不活性化される確率が高くなり、極限の場合、活性化状態で残存するドロンパが１分子レベルで空間分離される。また、ドロンパは、波長４０５ｎｍの光が照射されると、活性化状態に復帰する。
【００２８】
図１に示す超解像顕微鏡は、上記のドロンパの性質を利用して試料Ｓを超解像観察するもので、第１の光源１１〜第４の光源１４を備える。第１の光源１１は、試料Ｓの活性化光を得るための第１の光を射出し、第２の光源１２は、試料Ｓの不活性化光を得るための第２の光を射出する。第３の光源１３は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を励起するポンプ光を得るための第３の光を射出し、第４の光源１４は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を抑制するイレース光を得るための第４の光を射出する。
【００２９】
第１の光源１１〜第４の光源１４から射出される第１の光〜第４の光の光路は、ビームコンバイナ２１で同軸に合わされた後、ダイクロイックミラー２２により、第１の光及び第２の光の光路と、第３の光及び第４の光の光路とに分岐される。
【００３０】
ダイクロイックミラー２２で分岐される第１の光及び第２の光は、反射ミラー２３を経てＡＯＴＦ（Acoust-Optic Tunable Filters：音響光学波長可変フィルタ）２４に入射される。これにより、それぞれ活性化光及び不活性化光が得られる。活性化光及び不活性化光は、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７及び二次元ガルバノミラー２８を経て、ダイクロイックミラー２９に入射される。
【００３１】
また、ダイクロイックミラー２２で分岐される第３の光及び第４の光は、ＡＯＴＦ３１に入射される。これにより、それぞれポンプ光及びイレース光が得られる。ポンプ光及びイレース光は、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、ビーム整形素子を構成する位相板３４、ダイクロイックミラー３５及び走査部を構成する二次元ガルバノミラー３６を経て、ダイクロイックミラー２９に入射される。
【００３２】
位相板３４は、例えば、図２（ａ）〜（ｃ）に示す構成のものが使用可能である。図２（ａ）に示す位相板３４は、イレース光の位相を光軸周りに２πで周回させるように構成されたものである。
【００３３】
図２（ｂ）に示す位相板３４は、同心円状に分割された輪帯状の中央部領域３４ａと周辺部領域３４ｂとを有し、中央部領域３４ａに光学多層膜がコートされた輪帯位相板である。光学多層膜は、例えばＴｉＯ２とＳｉＯ２とを交互に４層程度積層して構成される。中央部領域３４ａは、光学多層膜の屈折率の波長分散性により、イレース光及びポンプ光の波長に対して異なる実効屈折率を有し、中央部領域３４ａを通過したイレース光のみを位相反転し、ポンプ光については反射、又は位相を反転させることなく透過させるように設計されている。なお、周辺部領域３４ｂは、ポンプ光及びイレース光を位相変調することなく透過させるように構成される。
【００３４】
図２（ｃ）に示す位相板３４は、図２（ｂ）と同様に同心円状に分割された輪帯状の中央部領域３４ａと周辺部領域３４ｂとを有する輪帯位相板である。中央部領域３４ａ及び周辺部領域３４ｂは、それぞれイレース光の位相を光軸の周りで２π変化させるが、位相シフトの回転方向が光軸に関して互いに反対方向となるように構成される。
【００３５】
図１において、ダイクロイックミラー２９は、活性化光及び不活性化光の射出光路と、ポンプ光及びイレース光の射出光路とを一致させる。ダイクロイックミラー２９から射出される光は、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により、試料ステージ４５に載置された試料Ｓに照射される。
【００３６】
したがって、図１において、ＡＯＴＦ２４、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７、二次元ガルバノミラー２８、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２、反射ミラー４３及び顕微鏡対物レンズ４４は、第１光学系を構成する。また、ＡＯＴＦ３１、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、位相板３４、ダイクロイックミラー３５、二次元ガルバノミラー３６、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２、反射ミラー４３及び顕微鏡対物レンズ４４は、第２光学系を構成する。
【００３７】
一方、試料Ｓから発生する蛍光は、顕微鏡対物レンズ４４により集光され、ポンプ光及びイレース光の光路を逆に辿ってダイクロイックミラー３５により、ポンプ光及びイレース光の光路から分岐される。そして、ダイクロイックミラー３５から射出される蛍光は、レンズ５１、共焦点ピンホール５２、回折格子５３及びピンホール５４を経て、検出部を構成する光電子増倍管（ＰＭＴ）５５で検出される。光電子増倍管５５の検出信号は、演算制御部５６に入力される。
【００３８】
演算制御部５６は、試料Ｓに対する活性化光、不活性化光、ポンプ光及びイレース光の照射、及び、二次元ガルバノミラー２８，３６の動作を制御するとともに、光電子増倍管５５からの検出信号に基づいて試料Ｓの蛍光画像を生成して表示部５７に表示する。
【００３９】
次に、本実施の形態に係る超解像顕微鏡による顕微鏡観察法について、図３（ａ）〜（ｃ）に示す模式図を参照しながら説明する。
【００４０】
本実施の形態に係る顕微鏡観察法は、試料Ｓの観察領域に対して、デフォーカス状態での活性化光の照射と、デフォーカス状態での不活性化光の照射と、フォーカス状態での超解像用のポンプ光及びイレース光による走査及び蛍光検出とを、順次繰り返し行うことにより、試料Ｓを超解像で観察する。そのため、先ず、演算制御部５６は、第１の光源１１から第１の光を射出させて、第１の光を、ビームコンバイナ２１、ダイクロイックミラー２２及び反射ミラー２３を経てＡＯＴＦ２４に入射させる。そして、ＡＯＴＦ２４から波長４０５ｎｍの活性化光を射出させる。
【００４１】
ＡＯＴＦ２４から射出される活性化光は、ブロードバンドファイバ２５、レンズ２６、デフォーカスレンズ２７、二次元ガルバノミラー２８、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓに照射させる。これにより、試料Ｓの観察領域を、図３（ａ）に示すようにデフォーカス状態で照明して、当該観察領域に位置するドロンパを確実に蛍光発光可能な活性化状態に初期化する。なお、この場合の活性化光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。また、活性化光による試料Ｓの観察領域は、二次元ガルバノミラー２８により決定される。
【００４２】
次に、演算制御部５６は、第２の光源１２から第２の光を射出させて、第２の光を第１の光と同一光路に入射させる。そして、ＡＯＴＦ２４から波長４８８ｎｍの不活性化光を射出させて、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓにデフォーカス状態で不活性化光を照射させる。これにより、図３（ａ）において活性化光が照射された観察領域を、図３（ｂ）に示すように不活性化光により照明して、当該観察領域に蛍光発光可能なドロンパが１分子レベルで空間分離して残存するように不活性化させる。つまり、観察領域内の活性化状態のドロンパを間引きしてスパースな状態とする。なお、この場合の不活性化光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。
【００４３】
次に、演算制御部５６は、第３の光源１３及び第４の光源１４からそれぞれ第３の光及び第４の光を射出させて、第３の光及び第４の光をビームコンバイナ２１及びダイクロイックミラー２２を経てＡＯＴＦ３１に入射させる。そして、ＡＯＴＦ３１から波長５０３ｎｍのポンプ光及び波長６５３ｎｍのイレース光をそれぞれ射出させる。
【００４４】
ＡＯＴＦ３１から射出されるポンプ光及びイレース光は、ブロードバンドファイバ３２、レンズ３３、位相板３４、ダイクロイックミラー３５、二次元ガルバノミラー３６、ダイクロイックミラー２９、瞳投影レンズ４１、４２及び反射ミラー４３を経て、顕微鏡対物レンズ４４により試料Ｓに照射させる。これにより、図３（ｃ）に示すように、フォーカス状態（回折限界）のポンプ光及びイレース光によって、観察領域を二次元に走査する。なお、ポンプ光及びイレース光の尖頭値強度又は照射時間は、演算制御部５６により適宜設定する。また、二次元ガルバノミラー３６による走査は、少なくとも通常の蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を与える必要があるため、試料Ｓ上の順次の走査点が、試料Ｓに照射されるポンプ光の回折限界よりも小さい距離とする。
【００４５】
ここで、イレース光は、光軸上の強度が最小となる中空状のビームとして試料Ｓに照射される。したがって、イレース光の中空領域にドロンパが存在すると、ドロンパはポンプ光により活性化状態から発光量子状態に励起されて蛍光を発する。また、イレース光の照射領域に活性化状態のドロンパが存在すると、当該ドロンパは発光抑制量子状態に遷移されて発光が抑制される。そして、試料Ｓから発した蛍光は、上述したように光電子増倍管５５で検出されて演算制御部５６に入力される。これにより、試料Ｓを染色するドロンパを、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える１分子レベルの超解像で検出することが可能となる。なお、二重共鳴吸収過程を用いた超解像原理については、例えば、特開２００１−１００１０２号公報等に開示されて周知であるので、ここでは詳細な説明は省略する。演算制御部５６は、光電子増倍管５５からの入力信号を試料Ｓのポンプ光の照射位置に対応する出力として記憶する。
【００４６】
以後、演算制御部５６は、図３（ａ）〜図３（ｃ）の一連のプロセルを所定回数繰り返す。そして、所定回数の一連のプロセルが終了すると、演算制御部５６は、所定回数の蛍光出力を合成して観察領域の蛍光強度分布を得、該蛍光強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、蛍光強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して蛍光画像（発光画像）を生成し、該蛍光画像を表示部５７に表示させる。
【００４７】
以上のように、本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、試料Ｓの観察領域に対して、デフォーカス状態での活性化光の照射と、デフォーカス状態での不活性化光の照射と、フォーカス状態での超解像用のポンプ光及びイレース光による走査及び蛍光検出とを、順次繰り返し行う。ここで、イレース光は、位相板３４により光軸上の強度が最小となるラゲールガウシアンビームとして試料Ｓに照射されるので、この場合のＰＳＦは、例えば図４に実線で示すように幅の狭い急峻なローレンス関数となる。なお、図４には、比較のために図７に示したＰＳＦを破線で示している。したがって、光軸上すなわち観測点における分子の位置同定精度が極めて高くなるので、高精細で高信頼性の超解像画像を観察することが可能となる。
【００４８】
特に、図３（ｂ）又は図３（ｃ）に示した位相板３４を用いた場合、イレース光については、光の干渉により、焦点近傍で光が当たらない微小な立体空間（ダークホール）を生成することができる。また、ポンプ光については、光の位相面が変化しないためにダークホールの中心に集光させることができる。したがって、ダークホールの生成により、光軸方向にも超解像機能を発現でき、これにより３次元的な画像観察も可能となる。
【００４９】
（第２実施の形態）
図５は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の構成を示す図である。本実施の形態では、例えばジアリールエテンにルシファーイエローを化学修飾したフォトクロミック分子によって染色された試料Ｓを超解像で観察する。試料Ｓは、第１実施の形態の場合と同様に、凍結されていてもよい。
【００５０】
フォトクロミック分子は、蛍光発光部をルシファーイエローが担い、ジアリールエテンがルシファーイエローの蛍光応答を支配する。より具体的には、ジアリールエテンの６員環の化学結合基を開閉することで、ルシファーイエローの発光を制御する。そして、波長５３０ｎｍ前後の光（復帰光）が照射されると、６員環の化学結合基が開き、ルシファーイエローが蛍光発光可能な状態（活性化状態）に変化する。このとき、波長４５０ｎｍ前後の光（ポンプ光）が照射されると、波長５２０ｎｍの強い蛍光を発する。しかし、紫外領域の光（イレース光）が照射されると、６員環の化学結合基が閉じて、ルシファーイエローが無蛍光状態（不活性化状態）になる。この変化は、蛍光共鳴エネルギー移動に基づくものである。
【００５１】
図５に示す超解像顕微鏡は、上記のフォトクロミック分子の性質を利用して試料Ｓを超解像観察するもので、第１の光源１０１〜第３の光源１０３を備える。第１の光源１０１は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を抑制するイレース光を得るための第１の光を射出する。第２の光源１０２は、試料Ｓを超解像で観察する際に、蛍光発光を励起するポンプ光を得るための第２の光を射出する。第３の光源１０３は、試料Ｓの復帰光を得るための第３の光を射出する。
【００５２】
例えば、第１の光源１０１は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザからなり、その３倍波（３５５ｎｍ）がイレース光として使用される。第２の光源１０２は、波長４４５ｎｍの半導体レーザからなり、その基本波がポンプ光として使用される。第３の光源１０３は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザからなり、その２倍波（５３２ｎｍ）が復帰光として使用される。これらのレーザは、小型でありながら１００ｍＷ以上の出力があるので、分子の蛍光制御及び読出しには十分である。
【００５３】
本実施の形態に係る超解像顕微鏡では、復帰光、イレース光、ポンプ光を試料Ｓに時系列で照射する。そのため、第１の光源１０１〜第３の光源１０３の射出光路には、それぞれＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator：音響光学素子）１１１〜１１３が配置されて、射出光がナノ秒単位のレベルでパルス化される。
【００５４】
第１の光源１０１及び第２の光源１０２から、それぞれＡＯＭ１１１及び１１２を経て射出されるイレース光及びポンプ光の光路は、ビームコンバイナ１２１により同軸に合わされる。ビームコンバイナ１２１から射出される光は、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４及びビーム整形素子を構成する位相板１２５を経てビームコンバイナ１２６に入射される。位相板１２５は、例えば図２（ａ）〜（ｃ）に示した構成のものが使用可能である。
【００５５】
また、第３の光源１０３からＡＯＭ１１３を経て射出される復帰光は、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８及び反射ミラー１２９を経てビームコンバイナ１２６に入射される。ビームコンバイナ１２６は、イレース光、ポンプ光及び復帰光の光路を一致させる。ビームコンバイナ１２６から射出される光は、ハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、走査部を構成する３次元試料ステージ１３２に載置された試料Ｓに照射される。
【００５６】
したがって、図５において、ＡＯＭ１１１、ＡＯＭ１１２、ビームコンバイナ１２１、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４、位相板１２５、ビームコンバイナ１２６、ＯＭ１１３、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８、反射ミラー１２９、ハーフミラー１３０、顕微鏡対物レンズ１３１は、照射光学系を構成する。
【００５７】
一方、試料Ｓから発生する蛍光は、顕微鏡対物レンズ１３１により集光され、照明光の光路を逆に辿ってハーフミラー１３０により照明光の光路から分岐される。そして、ハーフミラー１３０から射出される蛍光は、ブロックフィルタ１３３、コレクターレンズ１３４及び共焦点ピンホール１３５を経て、検出部を構成する光電子増倍管１３６で検出される。光電子増倍管１３６の検出信号は、演算制御部１３７に入力される。
【００５８】
演算制御部１３７は、試料Ｓに対する復帰光、ポンプ光及びイレース光の照射、及び、３次元試料ステージ１３２の動作を制御するとともに、光電子増倍管１３６からの検出信号に基づいて試料Ｓの蛍光画像を生成して表示部１３８に表示する。
【００５９】
図５において、特に、イレース光及びポンプ光に関しては、色収差の無い顕微鏡対物レンズ１３１で試料Ｓに集光させれば、完全にイレース光の中心にポンプ光が集光する。なぜなら、これら２色の光りは、完全点光源と見なせる同一のシングルモードファイバから放出されるからである。
【００６０】
一方、復帰光の光軸は、イレース光及びポンプ光の光軸と一致しており、試料Ｓにおける照明領域は、イレース光及びポンプ光の集光スポットサイズより広い。なぜなら、試料Ｓの照射領域に存在する全分子を、活性化状態に確実に初期化する必要があるからである。本実施の形態に係る超解像顕微鏡では、絞り１２７により、復帰光のビーム径をイレース光及びポンプ光のビーム径より細くしているとともに、復帰光の光路にデフォーカスレンズ１２８を挿入して、復帰光の集光スポットサイズを調整している。なお、復帰光の集光スポットサイズは、絞り１２７及びデフォーカスレンズ１２８の双方を用いて調整する場合に限らず、いずれか一方のみで調整するようにしてもよい。
【００６１】
次に、本実施の形態に係る超解像顕微鏡による顕微鏡観察法について、図６（ａ）〜図６（ｅ）に示す模式図を参照しながら説明する。なお、図６（ａ）〜図６（ｅ）において、試料Ｓ内に白抜きで示す分子は、不活性化状態にある分子を示し、斜線を施して示す分子は、活性化状態にある分子を示す。
【００６２】
まず、演算制御部１３７は、３次元移動ステージ１３２を駆動して、試料Ｓを観測点の初期ポイントにセットする。次に、ＡＯＭ１１３を駆動して、パルス化された復帰光を、絞り１２７、デフォーカスレンズ１２８、反射ミラー１２９、ビームコンバイナ１２６及びハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、図６（ａ）に示すように試料Ｓに照射させる。その際、図６（ｂ）に示すように、照射ポイントの蛍光分子が確実に活性化状態に初期化されるように、演算制御部１３７により復帰光のパルス幅又は尖頭値強度を調整する。
【００６３】
次に、演算制御部１３７は、ＡＯＭ１１１を駆動して、パルス化されたイレース光を、ビームコンバイナ１２１、コレクターレンズ１２２、シングルモードファイバ１２３、コリメータレンズ１２４、位相板１２５、ビームコンバイナ１２６及びハーフミラー１３０を経て顕微鏡対物レンズ１３１により試料Ｓに照射する。これにより、図６（ｃ）に示すように、ビーム中央で強度の極小値をもつ中空状のイレース光を試料Ｓに集光させる。その際、図６（ｄ）に示すように、光軸中央部のみ１分子レベルで活性化状態の蛍光分子が残存し、光軸以外の領域に存在する活性化状態の蛍光分子が不活性化状態に転換されるように、演算制御部１３７によりイレース光のパルス幅又は尖頭値強度を調整する。
【００６４】
次に、演算制御部１３７は、ＡＯＭ１１２を駆動して、パルス化されたポンプ光を、イレース光と同じ光路を経て顕微鏡対物レンズ１３１により、図６（ｅ）に示すように試料Ｓに照射させる。そして、照明領域から放出される蛍光を、顕微鏡対物レンズ１３１、ハーフミラー１３０、ブロックフィルタ１３３、コレクターレンズ１３４及び共焦点ピンホール１３５を経て光電子増倍管１３６で検出する。その際、光電子増倍管１３６が飽和しないように、ポンプ光のパルス幅又は尖頭値強度、及び、光電子増倍管１３６の印加電圧を調整する。光電子増倍管１３６の出力信号は、演算制御部１３７において光軸の位置座標に対応して記憶される。
【００６５】
以後、演算制御部１３７は、３次元移動ステージ１３２を駆動して、試料Ｓに対する光軸位置を移動させながら、図６（ａ）〜図６（ｅ）の一連のプロセスを繰り返す。なお、この際の光軸位置の移動量は、少なくとも通常の蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を与える必要があるため、ポンプ光の回折限界よりも小さく調整する。そして、試料Ｓの観察領域の走査が終了すると、演算制御部１３７は、観察領域のすべての位置の蛍光出力の強度分布をローレンツ関数でデコンボリューション処理して、蛍光強度分布の極大値の空間位置と強度とを演算して蛍光画像（発光画像）を生成し、該蛍光画像を表示部１３８に表示させる。
【００６６】
本実施の形態に係る超解像顕微鏡によると、中空状のイレース光の照射により、光軸位置に存在する蛍光分子を活性化状態に保ち、それ以外の領域に存在する蛍光分子を不活性化状態に転換できるので、高い精度で光軸上すなわち観測点における蛍光分子の存在の有無を検出することができる。特に、イレース光にラゲールガウシアンビームを用いることで、活性化状態にある蛍光分子の存在確率が、光軸から離れるに従いローレンツ関数に従って急激に減少する。しかも、その半値幅は、イレース光の強度と照射時間とで決まる総ドーズ量の増加に従って細くなる。言い換えると、多数の活性化状態の蛍光分子が存在するとき、イレース光の照射総量を調整することで、極限の場合、光軸以外に存在する蛍光分子を不活性化状態にすることができる。これにより、活性化状態の蛍光分子の確率分布を、光軸を中心とするデルタ関数とすることができ、蛍光分子の位置同定精度を極めて高くできるので、高精細で高信頼性の超解像画像を観察することが可能となる。また、３次元移動ステージ１３２を光軸方向に移動させることにより、３次元的な画像観察も可能となる。
【００６７】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、蛍光分子（染色物質）はドロンパに限らず、kaede(カエデ)等も適用可能であり、使用される染色物質に応じて、活性化光、不活性化光、ポンプ光、イレース光の波長を設定すればよい。また、第１実施の形態において、試料Ｓの観察領域は、二次元ガルバノミラー２８によることなく、試料ステージ４５により行うようにしてもよい。また、ポンプ光及びイレース光による二次元走査は、二次元ガルバノミラー３６によることなく、二次元方向に移動可能な試料ステージにより行うようにしてもよいし、試料ステージと一次元ガルバノミラーとを互いに直交する方向に移動させて行うようにしてもよい。
【００６８】
また、第２実施の形態においても、染色物質は、フォトクロミック分子に限らず、他の物質の場合にも適用可能であり、使用される染色物質に応じて、ポンプ光、イレース光、復帰光の波長を設定すればよい。また、第２実施の形態においては、二次元ガルバノミラーを用いて試料Ｓを走査するように構成してもよいし、試料ステージと一次元ガルバノミラーとを互いに直交する方向に移動させて試料Ｓを走査するように構成してもよい。
【００６９】
さらに、第１実施の形態及び第２実施の形態においては、ビーム整形素子として位相板を用いてイレース光をビーム面内において空間的に位相変調することにより、集光点において中空状に整形したが、位相板に代えてイレース光をビーム面内において空間的に偏光制御して、集光点において中空状に整形する偏光制御素子を用いてもよい。
【符号の説明】
【００７０】
Ｓ  試料
１１，１２，１３，１４  光源
２１  ビームコンバイナ
２４，３１  ＡＯＴＦ（音響光学波長可変フィルタ）
２５，３２  ブロードバンドファイバ
２７  デフォーカスレンズ
２８，３６  二次元ガルバノミラー
３４  位相板
４４  顕微鏡対物レンズ
４５  試料ステージ
５２  共焦点ピンホール
５３  回折格子
５４  ピンホール
５５  光電子増倍管
５６  演算制御部
５７  表示部
１０１，１０２，１０３  光源
１１１，１１２，１１３  ＡＯＭ（音響光学素子）
１２１，１２６  ビームコンバイナ
１２３  シングルモードファイバ
１２５  位相板
１２７  絞り
１２８  デフォーカスレンズ
１３１  顕微鏡対物レンズ
１３２  ３次元試料ステージ
１３５  共焦点ピンホール
１３６  光電子増倍管
１３７  演算制御部
１３８  表示部
【図１】
2014006450.tif 000003
【図２】
2014006450.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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