(57)【要約】【課題】  本発明は、特異的に増幅させることを目的とするサンプル中の標的ＤＮＡが微量の長鎖ＤＮＡである場合や、用いるプライマーが高度の特異性を有する長鎖である場合であっても、複雑な工程を経ることなく、また、非特異的増幅産物を生じさせることなく、メタゲノム解析に耐える実用的な感度で、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によって標的ＤＮＡを増幅させることを目的とする。【解決手段】  本発明は、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含むサンプル、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマー、および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程を含むことを特徴とする、サンプルに含まれる標的ＤＮＡの特異的増幅方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含むサンプル、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマー、および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程を含むことを特徴とする、サンプルに含まれる標的ＤＮＡの特異的増幅方法。
【請求項２】
合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成して二本鎖ＤＮＡを合成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖ＤＮＡを合成する工程の前に、ＤＮＡ結合酵素を用いて標的ＤＮＡを含む環状ＤＮＡを合成する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーが非ＤＮＡ核酸プライマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非ＤＮＡ核酸プライマーがＲＮＡプライマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項７】
非ＤＮＡ核酸プライマーを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって合成された核酸を検出することを含む、標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項９】
標識ヌクレオチドアナログを用いて請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を行うことを特徴とする、標識ＤＮＡの製造方法。
【請求項１０】
標識ヌクレオチドアナログ、ＤＮＡ結合酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルに含まれる標的ＤＮＡの特異的増幅方法、標的ＤＮＡの特異的増幅方法のためのキット、および標的ＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川や土壌などの環境中には培養条件が不明な微生物が多数存在する。このような微生物は、解析対象とするＤＮＡを十分に取得することができないため、遺伝子解析が十分に進んでいない。このような微生物の遺伝子を解析することによって、全く新規な有用遺伝子が見出されることが期待されている。
【０００３】
人為的培養ができない微生物の遺伝子解析の手法として、メタゲノム解析が知られている。メタゲノム解析は、環境中の微生物の集合体（微生物叢）から抽出した各種微生物ゲノムＤＮＡの混合物を解析対象として用いる。メタゲノムに含まれる同一種由来のＤＮＡのポピュレーションは極めて低いため、実際の解析では、抽出したＤＮＡ混合物をもとにランダムプライマーを用いて元の組成を維持しつつ増幅させた増幅産物を用いることがある。データベース上のデータに基づくバイオインフォマティクス解析等がこれらのゲノムＤＮＡについて行われるため、得られる遺伝子情報はしばしば有用遺伝子の一部分となる。このような部分的な遺伝子配列情報から全体の遺伝子情報を得るためには、その部分配列を含むゲノムＤＮＡを広範囲にわたって取得する必要がある。そのため、一部の配列情報をもとにして、その周辺領域を含む広範囲のゲノムＤＮＡを特異的に増幅させる技術が求められている。
【０００４】
一部の既知配列からその周辺配列を特異的に増幅させる方法として、逆ＰＣＲ法が知られている（非特許文献１など）。逆ＰＣＲ法は、ＤＮＡサンプルを特定の制限酵素で断片化してＤＮＡ連結酵素によって自己環状化させた環状ＤＮＡをテンプレートとして用いて、環状ＤＮＡの一領域から外に向かって設計したプライマーによってＰＣＲ反応を行うことにより、環状化ＤＮＡ全体を増幅させる技術である。
【０００５】
しかしながら、逆ＰＣＲ法にはいくつかの問題がある。まず、逆ＰＣＲ法では、通常のＤＮＡ合成酵素が用いられるが、通常のＤＮＡ合成酵素は、増幅できる鎖長がおおよそ１０Ｋ残基以内であり、それより長い場合には増幅効率が著しく低いことが知られており、逆ＰＣＲ法によって広範囲のゲノム領域を取得することは困難である。そこで、増幅に適した長さのテンプレートＤＮＡを得るために、様々な制限酵素を用いたＤＮＡ断片化の条件検討が必要になる。また、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅は、鋳型となるＤＮＡ配列、特にＧＣ残基の存在割合（ＧＣ％）に非常に大きな影響を受けるため、特定のＤＮＡ配列は増幅させることができない。さらに、エクステンションと呼ばれるＤＮＡ合成時間長は、テンプレートの環状ＤＮＡ長に合わせて設定する必要があるため、長さが不明のＤＮＡを増幅させる場合には、多数の合成時間長を検討しなければならない。このようなことから、通常のＤＮＡ合成酵素によるＰＣＲ法を用いずにゲノムＤＮＡを広範囲にわたって特異的に増幅させる技術が求められている。
【０００６】
ＤＮＡを増幅させる酵素として、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が知られている。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素である。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、室温などの等温条件下で増幅反応を行う。環状ＤＮＡをテンプレートとして鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いてＤＮＡ合成を行うと、合成酵素が複製起点に達しても鎖を剥がしながら合成を進めるため、結果的に、テンプレートＤＮＡがタンデムに並んだ直鎖状のＤＮＡが合成される。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、ＰＣＲ法に用いられる通常のＤＮＡ合成酵素と異なり、変異の導入効率が低く、長鎖ＤＮＡの合成に適していることが知られている。
【０００７】
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、至適反応温度が低く、低反応温度では長いプライマーは増幅の鋳型として非特異的な増幅を引き起こすため、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素とともに用いることができるプライマーの長さには制限があると考えられている。また、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素には製造の過程で宿主ＤＮＡが不可避的に混入しており、これが増幅の鋳型となって特異的増幅の妨げになることが知られている。そのため、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いて各種のＤＮＡ混合物から目的ＤＮＡ配列を特異的に増幅させることは容易ではないと考えられている。
【０００８】
特許文献１は、特異的増幅のために鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いる技術として、特殊なアダプターと複数のプライマーとを用いる方法を開示する。しかしながら、長鎖ＤＮＡはアダプターとのライゲーション効率が低いため、この方法は、長鎖ゲノムＤＮＡを増幅する目的には適さない。また、この方法は、増幅目的ＤＮＡに対する脱リン酸化処理や制限酵素処理などの煩雑な工程を行う必要があり、その際に目的ＤＮＡを失う可能性があるため、微量のＤＮＡをテンプレートとするメタゲノム解析の用途には適さない。なお、この方法では、１つのＤＮＡ合成反応で二本鎖ＤＮＡが合成されており、一本鎖ＤＮＡを合成する工程は行われていない。
【０００９】
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の他の用途として、標的領域の存否を検出する反応への用途が知られている（特許文献２、非特許文献２〜３参照）。これらの方法では、特定のＤＮＡが特異的に増幅されている。しかしながら、これらの方法は、極めて短鎖の非天然のプローブを特異的に増幅させており、サンプルに含まれる天然の微生物ゲノムＤＮＡ配列などの長鎖ＤＮＡを増幅させるものではない。また、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、至適反応温度が低いことを生かして、短鎖のランダムプライマーと組み合わせて用いて、各種ＤＮＡ混合物をまんべんなく増幅させる目的にも用いられてきた（特許文献３〜６、および非特許文献４〜６参照）。これらの方法は、合成反応において複数のプライマーを用いるなど、特異性の低い増幅を行うことを目的としており、特定のプライマーによって合成されたＤＮＡが再びプライマーとアニーリングして二本鎖ＤＮＡが合成されるため、その合成反応は、一本鎖ＤＮＡを合成する工程を行っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−５８号公報
【特許文献２】特開２０１２−８０８７１号公報
【特許文献３】特開２０１０−９４０９１号公報
【特許文献４】特開２００９−３５号公報
【特許文献５】特表２００６−５１２０９４号公報
【特許文献６】特開２０１０−５１１８２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｃｈｍａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０（３），６２１−６２３，（１９８８）．
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４  Ｄｅｃ；１（３）：２２７−３２．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｎｏｖ  １８．
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｎｏｖ  １５；２６（２２）：５０７３−８．
【非特許文献４】Ｄｅａｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（８），５２６１−５２６６，（２００２）．
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｏｆ  ｅｎｔｉｒｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０（４），９７８-９８７，（２００８）．
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００９  Ｊｕｌ；４７（１）：６０９−１５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、特異的に増幅させることを目的とするサンプル中の標的ＤＮＡが微量の長鎖ＤＮＡである場合や、用いるプライマーが高度の特異性を有する長鎖である場合であっても、複雑な工程を経ることなく、また、非特異的増幅産物を生じさせることなく、メタゲノム解析に耐える実用的な感度で、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によって標的ＤＮＡを増幅させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の目的について鋭意探求していたところ、一般的に行われているように鎖置換型ＤＡＮ合成酵素と複数のプライマーとを用いて一度に二本鎖ＤＮＡを合成させるのではなく、あえて、一本鎖ＤＮＡ合成を行い、その後、合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成するという二段階の増幅工程を試みた。すると、全く意外なことに、二段階の増幅工程を経ずに一度に二本鎖ＤＮＡを合成させていた場合に比して飛躍的に高い特異性で目的とする二本鎖ＤＮＡを増幅させることができ、長鎖ＤＮＡを標的ＤＮＡとする場合や、長鎖プライマーを用いる場合であっても、メタゲノム解析に耐える実用的な感度で、サンプルに含まれる標的ＤＮＡを特異的に増幅させることができることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含むサンプル、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマー、および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程を含むことを特徴とする、サンプルに含まれる標的ＤＮＡの特異的増幅方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成して二本鎖ＤＮＡを合成する工程を含む、前記の方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、一本鎖ＤＮＡを合成する工程の前に、ＤＮＡ結合酵素を用いて標的ＤＮＡを含む環状ＤＮＡを合成する工程を含む、前記の方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーが非ＤＮＡ核酸プライマーである、前記の方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、非ＤＮＡ核酸プライマーがＲＮＡプライマーである、前記の方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、前記の方法を行うためのキットを提供する。
【００２０】
また、本発明は、非ＤＮＡ核酸プライマーを含む、前記のキットを提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、前記の方法によって合成された核酸を検出することを含む、標的ＤＮＡの検出方法を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、標識ヌクレオチドアナログを用いて前記の方法を行うことを特徴とする、標識ＤＮＡの製造方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、標識ヌクレオチドアナログ、ＤＮＡ結合酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、前記の製造方法を行うためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の増幅方法によれば、特異的に増幅させることを目的とするサンプル中の標的ＤＮＡが微量の長鎖ＤＮＡである場合や、用いるプライマーが高度の特異性を有する長鎖である場合であっても、複雑な工程を経ることなく、また、非特異的な増幅産物を生じさせることなく、メタゲノム解析に耐える実用的な感度で、サンプル中に存在する標的ＤＮＡを増幅させることができる。本発明の増幅方法によれば、極めて効率的にメタゲノム解析を行うことができ、人為的に培養することができない環境中の微量微生物から全く新規な有用遺伝子の情報を取得するメタゲノム解析が極めて容易になる。
【００２５】
また、本発明の増幅方法においては、ＰＣＲ法において問題となる増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションを考慮する必要が殆どないため、初期導入コストとランニングコストを低く抑えることが可能である。
【００２６】
本発明の増幅方法によれば、簡便な操作と設備で目的のＤＮＡをその全配列が既知であるか否かにかかわらず増幅することができ、また、当該ＤＮＡを有する微生物などを検出するために有用なＤＮＡマーカーを容易に作製することができ、医学、薬学、農学、食品学などの研究や、感染症の臨床検査の医療分野や、食品産業における簡便な生菌検査や食中毒における迅速検査など、簡便さ、省力化、迅速さが求められる様々な基礎および応用分野においてとくに有用である。
【００２７】
メタゲノム解析においては、個体数が非優占であっても細菌種が非常に多数いるため、次世代シークエンサーを用いて配列未知の標的遺伝子の配列決定を行おうとしても、それらのゲノムも同時に解読してしまい、同一ゲノム由来のリードを取得する確率が低く、そのためアセンブルされず長いコンティグを取得することができなかった。本発明の増幅方法によれば、配列未知の標的遺伝子を特異的に濃縮することができるため、冗長度が上昇することでコンティグ長が増加し、遺伝子の全配列を取得することが可能になる。特に、本発明の増幅方法によれば、創薬シーズとして注目されているものの現在取得方法が確立されていなかったメタゲノム中の二次代謝産物の遺伝子クラスターを取得することができる。
【００２８】
メタゲノム解析において、従来法は、セルソーターや、希釈法、マイクロフルイディクスなどで分取された微生物１細胞をもとにして、ランダムヘキサマーを用いたＭＤＡ法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で全ゲノム増幅をしたものを、全ゲノム解読に使用している。このランダムな配列のプライマーを用いたＭＤＡ法では、ｐｈｉ２９ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに混入している大腸菌ゲノムも増幅されるという問題があった。本発明の増幅方法において、大腸菌にコードされていない配列のプライマーを設計して使用することによって、この問題を回避することができる。そして、メタゲノム解析において得られた部分配列情報を用いて、効率的に、微生物の１細胞由来のゲノムをほぼ完全に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の増幅方法によって特異的に増幅させた一本鎖ＤＮＡを、用いたプライマーごとに異なるレーンでゲル電気泳動して確認する写真である。
【図２】図２は、本発明の増幅方法によって特異的に増幅させた一本鎖ＤＮＡの相補鎖をＰｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（図２Ａ）またはＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（図２Ｂ）によって合成して得た二本鎖ＤＮＡを、用いたプライマーごとに異なるレーンでゲル電気泳動して確認する写真である。矢印が２．７ｋｂの増幅産物を示す。
【図３】図３は、ｐＵＣ１９および大腸菌の混合物をテンプレートとして行った第１の増幅反応においてｐＵＣ１９のみが特異的に増幅されたことを確認するゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、シュードモナスと大腸菌との混合菌液をテンプレートとして行った第１の増幅反応において、シュードモナス属のゲノムＤＮＡのみが特異的に増幅されたことを確認するゲル電気泳動の写真である。
【図５】図５は、テンプレートとして用いた混合菌液の希釈倍率が異なる場合についての図４と同様の写真である。
【図６】図６は、第１の増幅反応に用いたプライマーが異なる場合についての図４と同様の写真である。
【図７】図７は、テンプレートとして用いた菌液の希釈倍率が異なり、かつ用いたプライマーが異なる場合についての図４と同様の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の増幅方法は、一本鎖ＤＮＡを合成する工程を含む。
【００３１】
本発明の一本鎖ＤＮＡを合成する工程においては、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含むサンプルが用いられる。サンプルは、特異的に増幅させることを目的とするＤＮＡを含む任意の試料である。サンプルの由来としては、ウイルス、原核生物、真核生物などが挙げられる。また、サンプルの由来としては、ヒトなどの動物、植物、昆虫、菌類、原生生物、細菌、カビ、酵母などが挙げられる。サンプルは、個体そのものに由来するものであっても、その一部に由来するものであってもよく、糞便、尿、および汗などの排泄物、血液、精液、唾液、胃液、および胆汁などの体液等、ならびに外科的に生体から取り出した組織、および体毛などの生体から脱落した組織に由来するものであってもよい。また、サンプルの由来としては、食品等の加工物が挙げられる。サンプルは、ＤＮＡなどの核酸以外の生体成分であるタンパク質などを除去する工程や、ＤＮＡなどの核酸を濃縮する工程などによって精製されたものであってもよい。サンプルに含まれるＤＮＡは、単一の配列からなるものであってもよいし、異なる配列からなるＤＮＡ断片の混合物であってもよい。サンプルは、単独または複数の微生物由来の全体または一部のゲノムＤＮＡを含むメタゲノム解析用ＤＮＡ試料であってもよい。メタゲノム解析用ＤＮＡ試料の由来としては、たとえば、ヒトの腸内細菌叢、海中の微生物群、海底の鯨骨細菌群、農場土壌の細菌群、鉱山廃水中のバイオフィルム、メタン酸化古細菌群などが挙げられる。ＤＮＡ試料の由来する微生物は、培養条件が既知であってもよいし、培養条件が未知である難培養菌であってもよい。
【００３２】
サンプルは、標的ＤＮＡを含む。標的ＤＮＡは、特異的に増幅させることを目的とするＤＮＡである。標的ＤＮＡは、サンプルに他のＤＮＡが含まれる場合、それらと比較して高い効率で増幅させることを目的とするＤＮＡである。本発明の増幅方法によれば、標的ＤＮＡの配列の全部が既知でなくても、増幅させることができる。したがって、標的ＤＮＡは、配列の全部が既知であることもあるが、配列の一部のみが既知であることもある。また、標的ＤＮＡは、既知配列と相同性を有する領域を一部にのみ有することもある。標的ＤＮＡは、長鎖ゲノムＤＮＡであってもよく、その鎖長は、たとえば、１ｋｂｐ〜全ゲノムスケール（数Ｍｂｐ（たとえば、２〜９Ｍｂｐ））である。標的ＤＮＡは、培養条件が未知の微生物のゲノムＤＮＡの部分配列であってもよい。標的ＤＮＡの含有量は、サンプル全体に対して、たとえば、数分子（たとえば、２〜９分子）／μＬ〜６ｆＭ、または１００分子／μＬ〜６ｆＭなどである。後記の実施例に示すように、本発明の増幅方法においては、標的ＤＮＡの分子数が１０分子である場合であっても、ゲル電気泳動で視覚可能な程度に標的ＤＮＡを特異的に増幅させることができた。したがって、サンプル中の標的ＤＮＡの分子数は、数分子（たとえば、２〜９分子）以上、または１０分子以上であってもよい。
【００３３】
サンプルは、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含む。サンプルは、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡの全体として含んでもよく、標的ＤＮＡを環状ＤＮＡの一部分に含んでもよい。
【００３４】
標的ＤＮＡを環状ＤＮＡとして含むサンプルは、標的ＤＮＡを含有する直鎖状ＤＮＡを含むサンプルをもとにした環状化反応により調製してもよい。環状化反応は、ＤＮＡ結合酵素などの酵素によって行ってもよい。ＤＮＡ結合酵素としては、たとえば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）等の耐熱性ＤＮＡ連結酵素や、Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（各社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（各社）などが挙げられる。環状化反応を行う直鎖ＤＮＡは、制限酵素などのＤＮＡ切断酵素などによって断片化したものであってもよい。断片化によって、標的ＤＮＡが１つのＤＮＡ断片の全部になるようにしてもよいし、標的ＤＮＡが１つのＤＮＡ断片の一部分として含まれるようにしてもよい。直鎖ＤＮＡは、環状化反応に先立ち、アダプターなどの付加的なＤＮＡと接続してもよい。環状化反応は、サンプルに含まれるＤＮＡの全量を環状化させるものであってもよいし、部分的に環状化させるものであってもよい。環状化反応の後、ＤＮＡ分解酵素によって、非環状化ＤＮＡの分解除去を行ってもよい。しかしながら、直鎖ＤＮＡが残存する場合でも、直鎖ＤＮＡをテンプレートとする増幅反応は行われないと考えられるから、非環状化ＤＮＡの分解除去は行わなくてもよい。非環状化ＤＮＡの分解除去を行わない場合には、より簡便に本発明の方法を行うことができる。ＤＮＡ分解酵素としては、たとえば、ＲｅｃＢＣＤエクソヌクレアーゼ（各社）、エクソヌクレアーゼＩ（各社）、Ｔ５エクソヌクレアーゼ（各社）、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅ（登録商標、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）エクソヌクレアーゼＶＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）、ＲｅｃＪエクソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）などの、直鎖状ＤＮＡをモノヌクレオチドまで分解可能なエクソヌクレアーゼが挙げられる。
【００３５】
環状ＤＮＡは、標的ＤＮＡの内部以外の部分に、制限酵素切断部位を１または複数有していてもよい。その場合、後述のとおり、二本鎖のＤＮＡ増幅産物を得たのち、当該制限酵素による切断を行うことによって、多コピー数のＤＮＡ断片からなる特異的ＤＮＡ増幅産物を得ることができる。環状ＤＮＡは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。環状ＤＮＡの鎖長は、たとえば、１ｋｂｐ〜全ゲノムスケール（数Ｍｂｐ（たとえば、２〜９Ｍｂｐ））である。
【００３６】
本発明の一本鎖ＤＮＡを合成する工程においては、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーが用いられる。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーの配列は、標的ＤＮＡにおける既知の配列情報や、標的ＤＮＡに関する物理的性質の実験結果などをもとにして、公知の方法および技術常識に従って、適宜決定することができる。また、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーの配列は、サンプル中のＤＮＡに関する情報に基づかずに、増幅を目的とする配列を任意に選択することによって設計してもよい。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーの鎖長は、たとえば、８〜１００塩基、より好ましくは８〜２０塩基である。標的ＤＮＡに対する特異性は、プライマーが長いほど上昇し、短いほど減少する傾向にある。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーは、プライマー自身がテンプレートとならず、特異的増幅効率が高まる点で、非ＤＮＡ核酸プライマーであることが好ましい。非ＤＮＡ核酸としては、ＲＮＡのほか、ＧＮＡ、ＬＮＡ／ＢＮＡ、ＴＮＡなどの核酸アナログが挙げられる。非ＤＮＡ核酸プライマーとしては、プライマーになりうるだけでなく、鋳型となることができ、２本鎖化することができるプライマーが好ましい。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーは、ＤＮＡの特異的な増幅を効率的に行うことができる点で、Ｔｍ値が４０〜５６℃であることが好ましい。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーは、特異的増幅効率の高さの点で、エクソヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。ここで、エクソヌクレアーゼとしては、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が有するエクソヌクレアーゼが挙げられる。標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーとして、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素のエクソヌクレアーゼに対して耐性を有するプライマーを用いる場合には、より特異性の高いＤＮＡ増幅をより効率的に行うことができる。
【００３７】
本発明の一本鎖ＤＮＡを合成する工程においては、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が用いられる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離することができるＤＮＡ合成酵素であり、市販品として容易に入手することができる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としては、たとえば、ｐｈｉ２９  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（各社）、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５’−３’，３’−５’ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓ）（各社）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＵＳＢ社）、Ｂｓｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ社）などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）（各社）、Ｂｓｍ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が挙げられる。このうち、増幅後の配列の正確性の点で、ｐｈｉ２９  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが好ましい。また、本発明の一本鎖ＤＮＡを合成する工程において用いられる鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、エクソヌクレアーゼ活性を有するものであってもよい。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としては、正確性の点で、ｐｈｉ２９  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのような高いエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が望ましい。
【００３８】
本発明の増幅方法においては、これらのサンプル、プライマー、および合成酵素を用いて、一本鎖ＤＮＡを合成する工程が行われる。一本鎖ＤＮＡを合成する反応は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ伸長反応によって行われる。一本鎖ＤＮＡを合成する反応において、反応液中に含まれる含有量は、標的ＤＮＡについては、たとえば、数分子（たとえば、２〜９分子）／μＬ〜６ｆＭ、または１００分子／μＬ〜６ｆＭなどであり、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーについては、たとえば、２．５μＭ〜１０μＭであり、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素については、たとえば、０．１〜１０００ｕｎｉｔｓ／μＬ、より好ましくは５〜１００ｕｎｉｔｓ／μＬである。一本鎖ＤＮＡを合成する反応に用いる反応液は、Ｍｇ２＋などの金属イオン、緩衝剤などを含む鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液や、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオチドなどの他の成分を含んでよい。後記の実施例に示すように、本発明の増幅方法においては、標的ＤＮＡの分子数が１０分子である場合であっても、ゲル電気泳動で視覚可能な程度に標的ＤＮＡを特異的に増幅させることができた。したがって、反応液に含まれる標的ＤＮＡの分子の数は、たとえば、数分子（たとえば、２〜９分子）以上、または１０分子以上である。
【００３９】
一本鎖ＤＮＡを合成する反応におけるＤＮＡ伸長反応の反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定すればよい。反応温度は、たとえば、室温程度の等温であり、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは２８〜３２℃である。一本鎖ＤＮＡを合成する反応におけるＤＮＡ伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、一定の低温において実施すればよい。一本鎖ＤＮＡを合成する反応におけるＤＮＡ伸長の反応時間は、たとえば、１０時間〜４０時間である。ＤＮＡ伸長反応ののち、熱変成によってＤＮＡ伸長反応を停止してもよい。
【００４０】
一本鎖ＤＮＡを合成する反応に先立ち、標的ＤＮＡと、標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーとをアニーリングさせるプライマーアニーリング反応を行ってもよい。また、プライマーアニーリング反応に先立ち、３０秒〜２分間、９０〜１００℃で加熱することによって標的ＤＮＡを熱変性させてもよい。プライマーアニーリング反応は、たとえば、熱変性工程の後、２０〜６０分間かけて９０〜９８℃から２０〜３０℃まで徐々に温度を下げるなどの漸進的アニーリング工程によって行われる。
【００４１】
一本鎖ＤＮＡを合成する工程は、合成されたＤＮＡが一本鎖ＤＮＡであることを確認する工程を含んでもよく、たとえば、一本鎖ＤＮＡの確認は、制限酵素消化による切断の可否を調べることによって行うことができる。
【００４２】
以上の一本鎖ＤＮＡを合成する工程を行うことによって、サンプルに含まれる標的ＤＮＡを特異的に増幅させることができ、標的ＤＮＡのタンデムリピートであるＤＮＡ増幅産物が得られる。得られた標的ＤＮＡの特異的増幅産物は、合成された一本鎖ＤＮＡのままでもよいが、合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成して二本鎖ＤＮＡを合成する工程によって、二本鎖ＤＮＡとしてもよい。
【００４３】
合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成して二本鎖ＤＮＡを合成する工程は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡの伸長反応によって行ってもよい。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、前述のものを用いることができる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応において、用いるプライマーは、既知配列から設計することができる配列特異的なプライマーであってもよいし、ランダムヘキサマーなどのランダムプライマーであってもよいが、残存するコンタミＤＮＡを増幅させるおそれが少ない点で、配列特異的なプライマーを用いることが好ましい。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素による反応は、前述の一本鎖ＤＮＡを合成する反応と同様の反応条件において行うことができる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によって二本鎖ＤＮＡを合成する工程において用いる配列特異的なプライマーの鎖長は、たとえば、２０〜１００塩基、とくに、２０〜３０塩基である。
【００４４】
また、合成された一本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成して二本鎖ＤＮＡを合成する工程は、鎖置換型でない通常のＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応によって行ってもよい。鎖置換型でない通常のＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡの伸長反応は、たとえば、サーマルサイクラーを用い、高分子ＤＮＡの立体構造をほぐす変性を行うための変性温度、プライマーを鋳型ＤＮＡに結合（アニール）させる対合を行うための対合温度、酵素活性による相補鎖の伸長を行うための伸長温度という３種類の温度に変化させる温度変化を１回〜数回与えて行われる。温度変化の回数は、プライマーダイマー形成などの好ましくない反応が起こりにくい点で、２回以下〜９回以下であることが好ましい。好ましくは、変性温度および伸長温度は、使用酵素の至適温度であり、対合温度は、プライマーのＴｍ値の±５℃の範囲である。通常のＤＮＡ合成酵素による二本鎖ＤＮＡ合成工程において用いるプライマーの鎖長は、たとえば、２０〜１００塩基である。
【００４５】
本発明の増幅方法は、特異的に増幅させた増幅産物を、配列依存的に切断する工程を含んでもよい。たとえば、二本鎖ＤＮＡである特異的増幅産物は、制限酵素によって切断してもよい。配列依存的に切断することによって、タンデムリピートであるＤＮＡ増幅産物を、繰り返し単位ごとに切断することができる。配列依存的に切断する部位が、標的ＤＮＡの外側にある場合、切断によって、配列を同じくする多数のＤＮＡ断片としてＤＮＡ増幅産物を製造することができ、これにより、標的ＤＮＡのコピー数を増大させることができる。そのようなコピー数を増大させた標的ＤＮＡは、ゲル電気泳動などによる増幅産物の同定、分離、および精製が容易であり、その後の解析などの操作を容易に行うことができる。
【００４６】
本発明の増幅方法は、前述のようなＤＮＡ結合酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、および鎖置換型ＤＮＡ合成反応用緩衝液を含むキットによって行ってもよい。キットは、前述のような標的ＤＮＡに対する特異的なプライマーを含んでもよい。また、キットは、ｄＮＴＰ混合物など、ＤＮＡ伸長反応などに用いられる他の成分を含んでよく、鋳型となる環状ＤＮＡや標識ヌクレオチドアナログや検出用蛍光色素を含んでもよい。
【００４７】
本発明の増幅方法は、標的ＤＮＡの全配列が既知でなくても、標的ＤＮＡの全配列を増幅することができる。したがって、本発明の増幅方法は、既知配列の周辺領域を含む長鎖ＤＮＡを取得するための方法、およびゲノムＤＮＡ上の既知配列の周辺領域の配列を決定するための方法として有用である。本発明の増幅方法は、標的ＤＮＡとしての有用遺伝子をクローニングするための方法として有用であり、特に、培養方法が未知であって自然界に微量にしか存在しない微生物における有用遺伝子をクローニングするための方法として有用である。また、本発明の増幅方法は、長鎖ＤＮＡの特異的増幅に適しており、たとえば、１ｋｂｐ〜全ゲノムスケール（数Ｍｂｐ（たとえば、２〜９Ｍｂｐ））の長鎖ゲノムＤＮＡの特異的増幅方法として有用である。ＰＣＲプライマーは、２箇所の既知配列が存在しないと適切なプライマーを設計することができず、しかも、その既知配列は増幅可能な１０ｋｂ以下の距離に位置していなければならないのに対して、本発明の増幅方法は、１箇所のみの既知配列をもとにして広範囲な領域を合成することができる。したがって、本発明の増幅方法は、標的ＤＮＡにおける既知配列が１箇所である場合の増幅方法として、または配列特異的なプライマーとして１種類のプライマーのみを用いる場合の増幅方法として、有用である。さらに、本発明の増幅方法は、サンプル中の標的ＤＮＡの存在を検出するための方法としても有用である。サンプル中の標的ＤＮＡの存在の検出は、本発明の増幅方法によって合成された核酸を、配列依存的な検出方法によって検出することによって行うことができる。さらに、標識ヌクレオチドアナログを用いて本発明の増幅方法を行うことによって、標識ＤＮＡを製造することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１  環状ＤＮＡモデルを用いた特異的プライマーによる増幅：
環状ＤＮＡモデルに使用したｐＵＣ１９はマルチクローニングサイト脇に特異的なＭ１３ファージの配列を有する。この領域に特異的な配列をもつ９〜１１ｍｅｒのＲＮＡプライマー（表１）をデザインし、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ推奨の方法（メーカー名：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で第１の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応を行った。まず、２μＬのｂｕｆｆｅｒ（メーカー名：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、１ｆｇのｐＵＣ１９および２００ｐｍｏｌのプライマーを全量１０μＬになるように加え、９５℃１分間の熱変性後、３０分かけて２５℃まで徐々に温度を下げることによってプライマーアニーリング反応を行った。次に、プライマーアニーリング反応後の反応液に、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ推奨のＲＣＡ反応溶液（メーカー名：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を、全量２０μＬになるように加え、３０℃で１６時間の等温増幅反応を行った。最後に６５℃まで温度を上げ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを失活させて反応を終了し、第１増幅反応の反応液を得た。第１のＤＮＡ伸長反応による増幅産物が１本鎖ＤＮＡであることは、ＥｃｏＲＩ消化で切断されないことによって確かめた（図１）。図１において、各レーン１〜６は、それぞれ、第１の増幅反応に配列番号１〜６のプライマーを用いた場合の結果を示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
次に、ｐＵＣ１９上のマルチクローニングサイト近傍のＭ１３領域の異なる配列でデザインされたＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（表２）を使用して、次の２通りの方法で増幅を行い、二本鎖化のための２次増幅を行った。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
１）第２の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応：
増幅が終了した第１増幅反応の反応液５μＬに対し、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ推奨の方法で調製した２００ｐｍｏｌのＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含むＲＣＡ反応液（メーカー名：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を２０μＬ加え、第１増幅反応と同様に等温増幅反応を行った。
【００５４】
２）ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長：
増幅が終了した第１増幅反応の反応液１０μＬからエタノール沈殿によって反応液を除去し、ＤＮＡ回収した。その沈殿を１０μＬのミリＱで溶解し、これをＤＮＡテンプレートとして、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、製品プロトコルに従って、１００ｐｍｏｌのＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含むＰＣＲ反応液１００μＬを調製した。９４℃を３分、５５℃を５分、続いて７２℃を２時間で相補鎖伸長反応を行った。
【００５５】
上の１）２）で得られた反応液２μＬをＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡをゲル電気泳動によって観察した。ゲル電気泳動の結果を図２に示す。図２の（Ａ）は、第２の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応を行った上記の１）の結果である。図２の（Ｂ）は、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長を行った上記の２）の結果である。各レーン１〜６は、それぞれ、第１の増幅反応に配列番号１〜６のプライマーを用いた場合の結果を示す。図２に示すように、上記１）、および上記２）のいずれの場合においても、全てのプライマーを用いた場合において、ｐＵＣ１９の長さと一致する２．７ｋｂの断片が観察された。このことから、本発明の増幅方法によって、標的ＤＮＡであるｐＵＣ１９が特異的に増幅できることがわかった。また、二本鎖化のための二次増幅は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いても、ＤＮＡポリメラーゼを用いても、効率的に行うことができることがわかった。このように、上記の実施例の条件においては、増幅目的の標的ＤＮＡが微量な長鎖ＤＮＡであり、用いるプライマーが長鎖であり、反応液中には鎖置換型ＤＮＡ合成酵素に含まれる大腸菌ゲノムＤＮＡが混入していたにもかかわらず、非特異的な増幅産物を生じさせることなく、メタゲノム解析に耐えるほどの実用的な感度で、特異的に標的ＤＮＡを増幅させることができた。
【００５６】
実施例２  ｐＵＣ１９および大腸菌の混合テンプレートを使用する増幅反応：
１０１１細胞／μＬ以下の濃度の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）の菌液を１０７倍に希釈した菌液（１０３〜１０４細胞）に、１ｐｇ（約３．４ｘ１０５分子）のｐＵＣ１９を混合したものを鋳型（混合テンプレート）に使用したこと、およびｐＵＣ１９のｂｌａ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）の配列を基にして設計した以下の表３に示すＲＮＡプライマーを使用したことのほかは、実施例１と同様の方法によって第１の増幅反応を行った。なお、対照として、鋳型を用いない増幅反応も行った。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
第１の増幅産物の２本鎖化は行わず、第１の増幅反応によって得た増幅産物をテンプレートとして、以下の表４に示すｂｌａ遺伝子特異的プライマーセットを用いて、または表５に示すＥ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いて、通常のＰＣＲ増幅反応を行い、鋳型（混合テンプレート）に含まれるｐＵＣ１９が第１の増幅反応によって特異的に増幅されたかどうかを確認した。なお、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットは、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１９９６，ｐ．１２４２−１２４７を参考にして設計した。ｂｌａ遺伝子特異的プライマーセットを用いる場合、テンプレートにｂｌａ遺伝子が含まれていれば、３８７ｂｐの増幅産物が得られることが予想される。Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いる場合、テンプレートにＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡが含まれていれば、５８５ｂｐの増幅産物が得られることが予想される。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
2014103948.tif 000006
【００６１】
確認のためのＰＣＲ増幅反応の増幅産物のゲル電気泳動の結果を図３に示す。図３の左側のゲルの写真は、ｂｌａ遺伝子特異的プライマーセットを用いた場合の結果を示す。図３の右側のゲルの写真は、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いた場合の結果を示す。それぞれのゲルの写真において、１〜４のレーンは、順に、配列番号８〜１１のＲＮＡプライマーを用いて、かつ鋳型を用いて行った第１の増幅反応によって得られた増幅産物の結果を示し、５〜８のレーンは、順に、配列番号８〜１１のＲＮＡプライマーを用いて、鋳型を用いずに行った第１の増幅反応によって得られた増幅産物の結果を示す。
【００６２】
図３の左側の写真のレーン１〜４において、約４００ｂｐの増幅産物が観察されたことから、第１の増幅反応によってｐＵＣ１９が増幅できたことが確認された。これに対して、図３の右側の写真のレーン１〜４においては、約６００ｂｐの増幅産物が確認されなかったことから、第１の増幅産物によって大腸菌のゲノムＤＮＡが特異的に増幅されなかったことが確認された。このことから、本発明の増幅方法によれば、特異的な増幅を目的とするＤＮＡ以外のＤＮＡが鋳型に混入している場合においても、目的とするＤＮＡを特異的に増幅させることができることが明らかになった。なお、右側の写真の第３および第４レーンに見られる増幅産物は、確認のためのＰＣＲ増幅反応における非特異的な増幅産物であると推察される。
【００６３】
実施例３  シュードモナスと大腸菌の混合テンプレートを使用する増幅反応：
以下の点を除き、実施例１と同様にして第１の増幅反応を行った。鋳型としては、１０１１細胞／μＬ以下の濃度の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）の菌液を１０７、１０８、１０９、または１０１０倍に希釈した希釈大腸菌菌液（数〜１０４細胞）と、１０１１細胞／μＬ以下の濃度のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ１７４００株の菌液を１０７、１０８、１０９、または１０１０倍に希釈した希釈シュードモナス菌液（数〜１０４細胞）と、同希釈倍率の希釈大腸菌菌液および希釈シュードモナス菌液を１：１で混合したものとを使用した。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ１７４００株は非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）遺伝子を保持しているため、第１の増幅反応におけるＲＮＡプライマーとしては、ＮＲＰＳの配列をもとに設計した以下の表６に示すプライマーを用いた。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
第１の増幅反応によって得られた増幅産物について、実施例２と同様の方法によって、増幅産物の確認のためのＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ増幅反応には、以下の表７に示すシュードモナス属特異的プライマーセット、および表８に示すＥ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いた。なお、シュードモナス属特異的プライマーセットの設計にあたっては、Ｐｒｏｓ  Ｏｎｅ，２００８，ｅ３５７８を参照した。Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットの設計にあたっては、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１９９６，ｐ．１２４２−１２４７を参照した。シュードモナス属特異的プライマーセットを用いる場合、テンプレートにシュードモナス属由来のＤＮＡが含まれていれば、６１７ｂｐの増幅産物が得られることが予想される。Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いる場合、テンプレートにＥ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡが含まれていれば、５８５ｂｐの増幅産物が得られることが予想される。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
配列番号１６のＮＲＰＳ９Ｒプライマーと各種の鋳型を用いて行った第１の増幅反応についての実験結果を図４に示す。図４における各レーンは、鋳型として、以下の表９に示す菌液を用いた実験についての結果である。ただし、レーンＥは、ＲＣＡ増幅を行わず、大腸菌のポジティブコントロールとして示した。図４において、ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｓ−ｓｐは、シュードモナス属特異的プライマーセットを、ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｃｏ−ｓｐは、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを、確認のためのＰＣＲ増幅反応に用いたことを示す。
【００６９】
【表９】
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【００７０】
また、用いた鋳型の希釈度が異なる以外は図４と同様の方法によって得た結果を、図５に示す。第１の増幅反応のためのＲＮＡプライマーとしては、ＮＲＰＳ９Ｒプライマーを用いた。レーンの１〜４は、希釈大腸菌菌液（Ｅ．ｃｏｌｉのみ）、希釈シュードモナス菌液（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓのみ）、およびこれらの混合菌液（ｍｉｘ１：１）を調製した際の希釈倍率が異なる。レーン１〜４についての希釈倍率を以下の表１０に示す。
【００７１】
【表１０】
2014103948.tif 000011
【００７２】
図４および図５に示すように、シュードモナス属特異的プライマーセットを用いた場合には、鋳型が混合菌液である場合であっても、約６００ｐｂの増幅産物が得られた。これに対して、Ｅ．ｃｏｌｉ特異的プライマーセットを用いた場合には、約６００ｂｐの増幅産物は観察されなかった。このことから、本発明の増幅方法によって、鋳型が混合菌液である場合であっても、目的としないＥ．ｃｏｌｉのゲノムを非特異的に増幅させることなく、目的とするシュードモナス属のゲノムＤＮＡを特異的に増幅することができたことが分かる。特に、図５に示すように、１０１０倍の希釈を行った場合（数コピーの鋳型）にも、シュードモナス属のゲノムＤＮＡ由来の増幅産物が観察されたことから、本発明の増幅方法は、高い検出感度を有することが分かる。
【００７３】
第１の増幅反応に用いたプライマーが異なる場合を比較した結果を図６に示す。実験の手法は、図４および図５の場合と同様である。レーン１〜４は、用いたプライマーがそれぞれ異なる。用いたプライマーを以下の表１１に示す。
【００７４】
【表１１】
2014103948.tif 000012
【００７５】
図６に示すように、いずれのプライマーを用いた場合にも、約６００ｂｐの増幅産物が確認された。プライマーが短くても、効率よく増幅産物が得られる場合があることがわかる。
【００７６】
第１の増幅反応に用いたプライマーが異なり、かつ、第１の増幅反応に用いた鋳型の希釈度が異なる場合についての同様の実験の結果を図７に示す。鋳型には、希釈大腸菌菌液と希釈シュードモナス菌液との混合菌液を用いた。各レーンについての希釈の倍率を以下の表１２に示す。
【００７７】
【表１２】
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【００７８】
図７に示すように、鋳型が混合菌液である場合において、いずれのプライマーを用いた場合にも、シュードモナス属のゲノムＤＮＡを特異的に増幅させることができた。特に、ＮＲＰＳ９Ｒについてのレーン１〜４、ＮＲＰＳ１２Ｆについてのレーン１〜４、ＮＲＰＳ１７Ｒについてのレーン４、およびＮＲＰＳ１８Ｆについてのレーン１〜３においては、強い増幅が観察された。プライマーとしてＮＲＰＳ１２Ｆを用いた場合には、鋳型の分子数が１０８であっても増幅度が低かったのに対して、プライマーとしてＮＲＰＳ１８Ｆを用いた場合には、１０１０倍に希釈した鋳型を用いた場合であっても増幅が観察された。このことから、第１の増幅反応における特異的増幅の効率は、第１の増幅反応に用いるプライマーの長さよりも、そのプライマーのＴｍ値に関係があると考えることができる。増幅効率の高かったＮＲＰＳ９ＲのＴｍ値は、増幅効率の低かったＮＲＰＳ１２ＦのＴｍ値より高い。このことから、Ｔｍ値が高い方が増幅の特異性は向上すると考えられる。一方、ＮＲＰＳ１７ＲのＴｍ値は高いが、増幅効率は高くない。このことから、Ｔｍ値は高すぎても、高い増幅効率は得られないと考えられる。したがって、ＮＲＰＳ９ＲのＴｍ値とＮＲＰＳ１８ＦのＴｍ値の間のＴｍ値、つまり４０〜５６℃のＴｍ値を持つプライマーであれば、プライマーの長さに関わらず、特異的な増幅を効率的に行うことができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の増幅方法は、メタゲノム解析の実用に適した増幅感度を有するので、メタゲノム解析用のメタゲノムＤＮＡの製造方法や、メタゲノム解析用のメタゲノムＤＮＡから特定の微生物由来ゲノムＤＮＡの全部または一部を増幅または濃縮する方法として、有用である。しかしながら、本発明の増幅方法を用いる技術分野は、メタゲノム解析の分野に限定されることなく、本発明の増幅方法は、たとえば、医学、薬学、農学、食品学などの研究や、感染症の臨床検査の医療分野や、食品産業における簡便な生菌検査や食中毒における迅速検査など、簡便さ、省力化、迅速さが求められる様々な基礎および応用分野において用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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