(57)【要約】 【課題】  従来の人体の活性酸素では、装置が高価かつ大型のものは費用的にも導入が容易ではなく、また、煩雑な前処理を必要とするものなどがある。更に、その他、発光や蛍光を利用した活性酸素計測手法においても、採血が必要であるかプローブを穿刺して生体内に入れて血液等の体液に接触させる必要があるなど観血的または侵襲的な手法である。そこで、非侵襲的、簡便、且つ安定的に生体内の活性酸素量を測定する方法を提供する。【解決手段】  既知濃度の水素ガスを含む試験ガスを吸入し、一定時間後の呼気中の水素ガス量を求め、吸気と呼気の水素ガス量の差が生体内で活性酸素によって消費されたものとして算出することを特徴とする生体内の活性酸素量の測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知濃度の水素ガスを含む試験ガスを吸入し、一定時間後の呼気中の水素ガス量を求め、吸気と呼気の水素ガス量の差が生体内で活性酸素によって消費されたものとして算出することを特徴とする生体内の活性酸素量の測定方法。
【請求項２】
被測定者の室内気呼吸時の呼気中の水素ガス濃度を１０ｐｐｍ以下にして行なうものである請求項１記載の生体内の活性酸素量の測定方法。
【請求項３】
該試験ガスの水素ガス濃度は、５０〜２００ｐｐｍである請求項１又は２記載の生体内の活性酸素量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内の活性酸素量を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体の疾病は活性酸素に由来するものが多いことは種々の検査等から示唆されており、生体内の活性酸素量の測定は医学分野をはじめ様々な分野で大きな需要がある。生体内活性酸素定量法として最も信頼性が高い手法は、ＥＳＲ（Electron Spin Resonance ）法である。その他、活性酸素と反応して光を発する化学物質を添加して発光量から活性酸素量を計測する方法（特許文献１）、蛍光を利用した方法（特許文献２、３）、活性酸素を捕捉するために錯体を用いる方法（特許文献４、５）、試薬を塗布して皮膚などの生体組織表面の局所的な活性酸素量を測定する方法（特許文献６）、針を穿刺して生体内に入れて血液等の体液に接触させて測定する方法（特許文献７）も見出されている。また、最近では水素水を飲み、呼気中の水素排気量から活性酸素種の生成量を推定する方法が考案されている（特許文献８）。また，レーザー誘起蛍光法による皮膚表面からのヒドロキシルラジカルの計測法も報告されている（特許文献９）。
【０００３】
一方、水素は生体分野では、摂取した食物が小腸を通過して大腸に到達した際に腸内細菌の醗酵作用で水素が発生することから小腸通過時間の測定や消化不良の指標として用いられている（非特許文献１）。さらに、水素が生体内の活性酸素であるヒドロキシラジカルと選択的に反応する（活性酸素を消去する）ことが明らかになり（非特許文献２）、生体における水素の効能が見直されてきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ０３／０３８４２９
【特許文献２】特開平１０−３３２６６７
【特許文献３】ＷＯ２００５／１０３２８２
【特許文献４】ＷＯ２００４／０７４８２８
【特許文献５】ＷＯ０３／０５４５３６
【特許文献６】特開２０００−３３３９０７
【特許文献７】特開２００２−０５５０７８
【特許文献８】特開２０１２−０８８２０１
【特許文献９】特願２０１２−０７１１８９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kamm MA Leonnard-Jones JE, editors: Gastrointestinal transit timepathophysiology and pharmacology. WrightsonBiormedical Publishimg Ltd,Petersfield, 1991．
【非特許文献２】Ohsawa I et al,Nature medicine 13:688-694 , 2007
【非特許文献３】Shimouchi A et al.Adv Exp Med Biol. 737: 245-50, 2012.
【非特許文献４】野瀬和利他。安定同位体と生体ガス2(1)：35-39，2010．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した従来の測定方法で、ＥＳＲはスペクトルから活性酸素種の同定ができ、強度から濃度の測定ができる半面、装置が高価かつ大型であるために導入が容易ではない。かつ、寿命の短い活性酸素を固定するためにスピントラップ剤による煩雑な前処理を必要とするなどの欠点がある。
その他、発光や蛍光を利用した活性酸素計測手法においても、試薬の反応の場が液体を原則としているために、採血が必要であるかプローブを穿刺して生体内に入れて血液等の体液に接触させる必要があるなど観血的または侵襲的な手法である。
【０００７】
皮膚などの生体組織に塗布する方法では非侵襲的ではあるが局所的な情報であり、生体内全体の活性酸素を測定する方法ではない。また、上記課題を解決するために、水素水を飲んで呼気から排気される方法も考案されているが、計測に６０分以上の時間がかかること、水分負荷が３００〜５００ｍＬ程度で大きいこと、さらに安定した水素濃度での投与ができないことが難点であった。
【０００８】
そこで、非侵襲的、簡便、且つ安定的に生体内の活性酸素量を測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上の現状に鑑み本発明者等は鋭意研究の結果、本発明測定方法を完成したものであり、その特徴とするところは、既知濃度の水素ガスを含む試験ガスを吸入し、一定時間後の呼気中の水素ガス量を求め、吸気と呼気の水素ガス量の差が生体内で活性酸素によって消費されたものとして算出する点にある。
【００１０】
本発明の原理は、生体内で水素が活性酸素を消去する作用を利用して、低濃度水素ガスを吸入した後の呼気水素排気量を計測することにより、投与量と排気量の差から生体内活性酸素産生量を推定するものである。本発明は、呼気水素排気量を算出するために、間欠的あるいは連続的に呼気水素濃度を測定する。
即ち、一定時間の吸気と呼気とに含まれる水素ガスの量の差が、１モルとすると、その１モルはすべて活性酸素によって消費され、それも１モル対１モルで消費されるとして、その一定時間の体内活性酸素発生量は１モルであると判断するのである。
【００１１】
試験ガスとは、既知濃度の水素ガスを含むガスであり、水素ガス以外は通常の空気とほぼ同様である。水素ガス濃度は、５０〜２００ｐｐｍが、生体内呼気水素濃度を十分上昇させ、かつガス分析や費用、危険性等の問題から最も効果的である。しかし、２００ｐｐｍ〜２％でも発明としては問題はなかった。
【００１２】
この水素ガス以外の成分としては、酸素２０．９％（安全性が確保できる範囲ならばよい）で、窒素バランスとしたものがよい。勿論、通常の空気に上記の割合で水素ガスを混合してもよい。
【００１３】
この試験ガスは、吸入時に高濃度水素ガスと人工空気又は天然空気と混合して所定の濃度にしてもよいが、予め所定の濃度に調整したガスを用いてもよい。
【００１４】
本発明では、試験ガスを吸入し始めてから、一定時間経過後の呼気中の水素ガス量を求めるのである。一定時間とは、通常は１分〜５分程度である。水素ガス量の求めかたは、水素ガス濃度と、呼気量を測定して求めるものである。
【００１５】
呼気水素ガス濃度の計測方法は、呼気が連続的に流れる流路（呼吸回路）を設けて、その流路内又は流路出口に水素ガスセンサーを設ければよい。また、バッチ式としては、間欠的に呼気をバッグ等に採取し、そのバッグ内水素ガス濃度を別途測定装置で測定してもよい。
【００１６】
呼気水素ガス濃度の計測方法は、呼気が連続的に流れる流路（呼吸回路）を設けて、その流路内又は流路出口に水素ガスセンサーを設ければよい。また、バッチ式としては、間欠的に呼気をバッグ等に採取し、そのバッグ内水素ガス濃度を別途測定装置で測定してもよい。バッグの大きさは所定時間内の呼気を採取できる容量であればよく、１００ｍＬ〜１０Ｌの範囲が好適であり、測定精度や保管のし易さから、呼吸回路の出口で採取する場合で５Ｌ，呼吸回路を使用しない場合で３００ｍＬ程度の容量がより望ましい。
【００１７】
呼吸回路の素材としてはテフロン（登録商標）などの合成樹脂や金属などのような水素の透過性の低い素材を用いるのがよい。また、呼吸相による水素濃度の変動を平均化するため蛇腹管を用いるのが望ましい。呼気を採取する際に使用するバッグの材質は、ポリエチレン、ポリフッ化ビニル、アルミニウムなどが考えられるが、水素が透過しにくい材質、例えばアルミニウム製のバッグやダグラスバッグを用いることが望ましい。
【００１８】
間欠的に呼気採取を行う場合の時間的間隔は、例えば３０秒から１０分間隔であってもよく、水素ガス摂取量が安定するまでの時間は長ければ長いほどいいが、生体内活性酸素量を推定する際の結果の精度ならびに生体への負担を考慮すると水素ガス吸入開始から１０〜２０分程度以内での計測が望ましい。
【００１９】
バッグ等を用いて採取した呼気の水素ガス濃度は、例えば半導体ガスセンサーや質量分析装置により測定する。低濃度水素ガスを投与した結果得られる呼気を対象とする場合は０．１ｐｐｍレベルの分解能を有する検出器（例えば，ガスクロマトグラフ半導体検知装置、質量分析装置）を使用することが望ましい。
【００２０】
吸入気量や呼気量の測定には、熱線型や超音波型などの流量計を用いればよいが、限定するものでなくどのような方法、どのような装置でもよい。
【００２１】
水素ガスを吸入した場合、皮膚表面から放出される水素ガスは無視できるほどきわめて微量である（非特許性文献４）。従って、水素ガス摂取量は、吸入水素量と呼気として排気した呼気水素排気量の差であるから下記式１のように求められる。
ＶＨ2＝ＶＩ×ＦＩＨ2−ＶＥ×（ＦＥＨ2−baseline ＦＥＨ2）  ・・・式１
ＶＨ2：水素摂取量
ＶＩ：分時吸気量（吸入量）
ＦＩＨ2：吸気水素ガス濃度
ＶＥ：分時呼気量
ＦＥＨ2：呼気水素ガス濃度
baselineＦＥＨ2：室内気呼吸中における呼気水素ガス濃度
【００２２】
また、水素ガス吸入前から室内気吸入を行ったときの呼気水素濃度を計測しておくのが好ましい。なぜならば、腸内嫌気性発酵が亢進し、かつ室内気呼吸中の呼気中水素濃度が１０ｐｐｍ以上の場合、安定した結果が得られるかどうかが問題であるためである。
呼気水素ガスは摂取した食品の未消化物の腸内醗酵により水素濃度が大きく上昇または下降する場合があるため、できるだけ消化のよい食品摂取か、あるいは前夜の夕食以降の食事摂取をひかえた状態で行うと安定した水素摂取量が計測できる。室内空気吸入時の呼気中水素濃度が１０ｐｐｍ以下であればほぼ安定した結果が得られる。
【００２３】
ここで、ベースライン（室内気吸入を行ったときの呼気水素濃度）は、短時間であれば（１０分、２０分又は１時間以内等）、計測中も持続的に一定濃度で呼気中に出てくるものとみなすことができるため、試験ガスを吸入した後の呼気水素濃度からベースラインを差し引いたものが上記のＦＥＨ2（呼気水素ガス濃度）となる。
【００２４】
更に、吸入気量は計器では測定せず、呼気量から簡易法として計算で求めることも可能である。
その計算法を述べる。不活性ガスは呼吸を介するマスバランスはゼロであり、また、酸素や二酸化炭素と比較すると他の低濃度微量ガス物質についても無視できるため、次の式２が成り立つ。
ＶＩ×（１−ＦＩＯ2−ＦＩＣＯ2）＝ＶＥ×（１−ＦＥＯ2−ＦＥＣＯ2）  ・・・式２
ＶＩ：分時吸気量
ＦＩＯ2：吸入気酸素濃度
ＦＩＣＯ2：吸入気二酸化炭素濃度
ＶＥ：分時呼気量
ＦＥＯ2：呼気酸素濃度
ＦＥＣＯ2：呼気二酸化炭素濃度
【００２５】
よって、分時吸気量は、次の式３
【数１】
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となり、計算で求められる。
【００２６】
ここで１例を示すと、既知水素ガス濃度ＦＩＨ2（例えば、５０〜２００ｐｐｍ）、吸入酸素濃度２０．９％、吸入二酸化炭素濃度０．３％（これらの数値は実験によって異なる）を採用し、呼気量、呼気水素濃度、呼気酸素濃度、呼気二酸化炭素濃度を計測することにより、上記の式３から容易に分時水素摂取量Ｖを求めることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明では、高額かつ大型の装置を必要とせず、非侵襲的に簡便かつ安定的に生体内活性酸素量を推定することが可能になる。２０分以内の呼気測定により生体全体の活性酸素量が推定可能であり非常に迅速である。また、低濃度水素ガスによる治療と兼ねた水素摂取量の連続モニターとしても使用可能である。
また、従来技術では、安全かつ簡便な活性酸素（特にヒドロキシラジカル）の全身での生成量の推定（測定）は困難であったため、計測条件が腸内発酵を抑制した条件付きとなるものの、革新的な活性酸素測定法となる。更に、手術中、術後管理や救急救命、心筋梗塞や脳梗塞などの虚血性再還流障害などの酸化ストレス疾患での応用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明方法を実施するための装置の１例を示す正面図である。
【図２】試験ガス（水素ガス含有ガス）を吸入したときと、室内気吸入時の呼気中の水素濃度を示すグラフである。
【図３】ベースラインの呼気中水素濃度 baselineＦＩＨ2と、分時水素摂取量ＶＨ2の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の測定精度を確かめるため、次のような実験を行った。
同一被験者で２ヶ月の期間内で日を変えて実験を行った。被験者は身長１８０ｃｍ、体重９２ｋｇ、体表面積２．１２ｍ2 であった。予め標準ガス（水素ガス１．３％、酸素ガス２０．９％、窒素ガスバランス）と人工空気を混合し、吸入気水素ガス濃度を１６４±１４ｐｐｍに調整した。被験者は空腹の状態（呼気水素濃度は１０ｐｐｍ以下）で安静座位とし、ノーズクリップを装着し、一方向弁付きマウスピース（被験者は通常の呼吸をするだけで、一方からのみ気体を吸引し、排出は他方に行われるもの）をくわえた状態で、まず、室内空気呼吸を６分間行い、次いで所定の水素濃度ガスを供給する呼吸回路を介して安静呼吸した。この間の換気諸量ならびに吸入気呼気ガス濃度を測定した。上記の式３及び式１から計算による水素摂取量を求めた。なお、計算の際、上述のベースラインから更に室内気水素濃度（０．６ｐｐｍ）を減じたものをベースラインとして式３に代入して求めた。
【００３０】
呼気流量ならびに酸素、二酸化炭素濃度は、ミナトＡＥ３３０を用い、水素濃度はガスクロマトグラフ半導体検知法（ＴＲＩｌｙｅｒ、株式会社タイヨウ製）を用いて計測した。その結果を表１に示す。
水素摂取量は、体表面積換算で、０．７１±０．４７（ＳＤ）μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ2 又は体重換算で１６．３±１０．８（ＳＤ）ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｋｇ（Ｎ＝７）となり、同一被験者での水素水飲水の結果（平均０．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ2 体表面積または１７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｋｇ体重、特許文献８の１例目）とほぼ一致した結果を得ることができた。日本成人の標準体重６０ｋｇに換算すると約１μｍｏｌ／ｍｉｎのオーダーで水素が活性酸素により摂取されていることが推定できた。水素ガスは生体内では弱いながらも活性酸素種のうち特にヒドロキシルラジカルを選択的に消去するという学説（非特許文献２）に基づくと、これは少なくとも水素ガス摂取量は生体内で生成されるヒドロキシルラジカル生成速度に反映しているものと考えられる。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
次に本発明を実施するための装置の１例について説明する。
図１は、本発明方法を実施するための装置である。水素ガスボンベ１（濃度が既知、例えば人工空気で２％に希釈した水素ガス）と、人工空気ボンベ２を混合器３に接続し、流量計を調節して所定の濃度（例えば、１５０ｐｐｍ）に混合する。混合器３の出側にはリザーバーバッグ４（クッションタンクのようなもの）が設けられている。リザーバーバッグ４から、一方向弁付きのマウスピース５に接続され、吸気はこのリザーバーバッグ４からのみになるように接続される。
マウスピース５からの出側は、ガスセンサー６（水素濃度計）及び流量計７が設けられている。この図では、吸気側に流量計がないが、設けてもよい。そして最後尾にガス採取バッグ８を設けている。
これで、２つのガスボンベを開放し、被験者が通常の呼吸をすれば、測定が可能である。
【００３３】
試験ガスとしては、予め５０〜１５０ｐｐｍ等の低濃度に調整したものを使用してもよい。この場合は混合器を省略することができる。また、リザーバーを使わないで、検査に必要な量だけの低濃度水素ガスを例えば大容量ダグラスバッグなどに貯蔵しておき、そこから低濃度水素ガスを吸入することにしてもよい。呼気中の酸素、二酸化炭素、水素ガス濃度はオフラインでバッグ内にためたガスを各センサーでオフライン計測する。
【００３４】
しかし、吸気ライン及び呼気ラインに、濃度計、及び流量計を設けて、すべてをオンライン、連続方式で行うことも可能である。濃度計や流量計をコンピューターと接続し、経時的に計測値を記憶しておけばよい。
【００３５】
図２は、試験ガス（水素ガス含有ガス）を吸入したときと、室内気吸入時の呼気中の水素濃度を調べたものである。２分間隔で測定したが、応答が速く呼気に水素濃度が反映していることがわかる。
【００３６】
上記したとおり、通常の呼気（水素ガスを含有する試験ガスでなく、室内気を吸引しているときの呼気）に水素ガスが一定以上含まれている場合について種々検討を試みた。図３は、ベースラインの値と呼気中の水素濃度との関係を示すグラフである。通常の呼気での水素ガス濃度が、上記したベースラインが１０ｐｐｍを超えると、不安定になり、わずかではあるが測定に影響があると思われる。よって、前記したとおり、ベースラインを１０ｐｐｍにすることが望まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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