(57)【要約】【課題】難水溶性の蛍光色素に対して高い水溶性を付与する。【解決手段】20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下といった難水溶性の蛍光色素に対して、ヌクレオチドを結合させることで水溶性を付与し、結合するヌクレオチド分子の数に応じて水溶性を調節する。【選択図】図１
2014093950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した２mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素。
【請求項２】
前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。
【請求項３】
前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項２記載の水溶性蛍光色素。
【化１】
2014093950.tif 000022
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
【請求項４】
上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。
【請求項５】
上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項１記載の水溶性蛍光色素。
【請求項６】
20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させる、水溶性蛍光色素の製造方法。
【請求項７】
前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【請求項８】
前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項７記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【化１】
2014093950.tif 000023
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
【請求項９】
上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【請求項１０】
上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項６記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【請求項１１】
20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した６mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素標識プライマー。
【請求項１２】
前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする請求項１１記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
【請求項１３】
前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする請求項１２記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
【化１】
2014093950.tif 000024
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
【請求項１４】
上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする請求項１１記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
【請求項１５】
請求項１１〜１４いずれかに記載の水溶性蛍光色素標識プライマーを用いて被検体の核酸を増幅する工程と、
上記工程で得られた増幅産物を上記プライマーに含まれる蛍光色素からの蛍光を測定することで、上記水溶性蛍光色素標識プライマーに含まれるヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する核酸を検出する工程とを含む、生体関連物質の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質の標識に使用することができる蛍光色素、当該蛍光色素の製造方法、当該蛍光色素を利用した標識プライマー及び当該標識プライマーを利用した生体関連物質の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素は、タンパク質、核酸といった生体関連物質の標識化合物として利用されている。すなわち、生体関連物質に含まれる反応性のアミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基或いはスルフヒドリル基等の官能基と蛍光色素とを結合させることで、当該生体関連物質を蛍光色素で標識することができる。生体関連物質の標識として使用できる蛍光色素としては、種々の化合物が知られている。例えば、特許文献１には、近赤外線ないし遠赤外線の励起光により蛍光を発するインドシアニングリーン誘導体が開示されている。
【０００３】
また、特許文献２には、蛍光色素にて標識したオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用して核酸増幅反応を実施し、核酸が固定された所謂マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を利用して増幅産物を検出するシステムが開示されている。特許文献２に開示されたシステムに限らず、蛍光色素を標識として使用することで核酸等の生体関連物質を検出することができる。
【０００４】
このとき、標識として使用される蛍光色素には、高い水溶性が求められる。特許文献１には、水溶性に優れたインドシアニングリーン誘導体を提供するとの記述があるものの、十分とは言えなかった。すなわち、特許文献１に開示されたインドシアニングリーン誘導体や、従来公知の蛍光色素については水溶性が十分でないため、生体関連物質を検出するための標識として使用するのが困難であるといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許4098839号公報
【特許文献２】特開2009-229398号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、難水溶性の蛍光色素に対して高い水溶性を付与した水溶性蛍光色素、難水溶性の蛍光色素に優れた水溶性を付与する水溶性蛍光色素の製造方法、難水溶性の蛍光色素に対して高い水溶性を付与した水溶性蛍光色素標識プライマー及び当該水溶性蛍光色素標識プライマーを用いた生体関連物質の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下といった難水溶性の蛍光色素に対して、ヌクレオチドを結合させることで水溶性が付与され、また、結合するヌクレオチド分子の数に応じて水溶性がより高くなるといった知見を見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
【０００８】
（１）20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した２mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素。
（２）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。
（３）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（２）記載の水溶性蛍光色素。
【化１】
2014093950.tif 000003
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（４）上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。
（５）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（１）記載の水溶性蛍光色素。
【０００９】
（６）20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させる、水溶性蛍光色素の製造方法。
（７）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
（８）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（７）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【化１】
2014093950.tif 000004
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（９）上記ヌクレオチドは５mer以上であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
（１０）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（６）記載の水溶性蛍光色素の製造方法。
【００１０】
（１１）20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素と、当該蛍光色素に結合した６mer以上のヌクレオチドとを含む水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１２）前記蛍光色素はインドシアニン化合物であることを特徴とする（１１）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１３）前記インドシアニン化合物は下記（１）の構造式で表されることを特徴とする（１２）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
【化１】
2014093950.tif 000005
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）
（１４）上記ヌクレオチドは１０mer以上であることを特徴とする（１１）記載の水溶性蛍光色素標識プライマー。
（１５）上記（１１）〜（１４）いずれかに記載の水溶性蛍光色素標識プライマーを用いて被検体の核酸を増幅する工程と、上記工程で得られた増幅産物を上記プライマーに含まれる蛍光色素からの蛍光を測定することで、上記水溶性蛍光色素標識プライマーに含まれるヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する核酸を検出する工程とを含む、生体関連物質の検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下の蛍光色素に対して水溶性を付与することができる。すなわち、本発明によれば、本来20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下といった難水溶性であって水系溶媒に使用できない蛍光色素であっても水系溶媒にて使用できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】反応液中のオリゴヌクレオチド又は化合物１で標識されたオリゴヌクレオチドが水層、クロロホルム層にどちらに移行したかについて、移行率を計算した結果を示す特性図である。
【図２】化合物１を結合したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したPCRによる増幅産物を検出した結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る水溶性蛍光色素は、20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下といった難水溶性の蛍光色素に対して、２mer以上のヌクレオチドを結合させることで難水溶性を改善した（すなわち、水溶性を付与した）ものである。ここで、蛍光色素にヌクレオチドを結合させるとは、蛍光色素に対してヌクレオチドを直接結合させる形態、リンカー分子を介して間接的に結合させる形態の両者を含む意味である。
【００１４】
ここで、難水溶性の蛍光色素とは、言い換えると20±5℃における溶解度（g/100g-H2O）が１０以下であり、所定の波長の励起光が照射されると蛍光を生ずる化合物を意味する。具体的に、難水溶性の蛍光色素としては、インドシアニングリーン誘導体を含むインドシアニン化合物、フルオレセイン化合物、ローダミン化合物、クマリン化合物、ピレン化合物などを挙げることができる。
【００１５】
インドシアニングリーン誘導体としては、特許4098839号公報に開示されたものを挙げることができる。より詳細には、難水溶性の蛍光色素として、下記構造式（１）に示されるインドシアニン化合物を挙げることができる。
【化１】
2014093950.tif 000006
（ここでX-はハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン又はチオシアン酸イオンを表す）なお、構造式（１）においてXは、母核内の窒素原子上の陽電荷を打ち消して化合物を全体として中性に維持するアニオンである。
【００１６】
また、難水溶性の蛍光色素に結合させるヌクレオチドとは、五単糖の1位にプリン塩基又はピリミジン塩基がグリコシド結合してなるヌクレオシドに１〜３のリン酸基が結合した化合物である。プリン塩基としてはアデニン及びグアニンを挙げることができる。ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシル及びチミンを挙げることができる。また、五単糖としては、リボース及びデオキシリボースを挙げることができる。
【００１７】
また、２mer以上のヌクレオチドとは、複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合して五単糖とリン酸が一つおきにつながった構造を意味する。難水溶性の蛍光色素に結合させるヌクレオチドとしては、上述のように五単糖がリボースであるリボヌクレオチドでも良いし、五単糖がデオキシリボースであるデオキシリボヌクレオチドであっても良い。
【００１８】
さらに、難水溶性蛍光色素に結合する2mer以上のヌクレオチドの配列としては、特に限定されず、適宜、設計することができる。例えば、所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように、2mer以上のヌクレオチドの配列を設計することができる。また、2mer以上のヌクレオチドの配列としては、ランダム配列であってもよい。すなわち、2mer以上のヌクレオチドが如何なる配列であっても、上述した難水溶性の蛍光色素に対して水溶性を付与することができる。
【００１９】
なお、難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数は、２mer以上であれば特に限定されるものではない。すなわち、２mer以上のヌクレオチドを結合させることによって上述した難水溶性の蛍光色素は、水溶性が付与されることなる。特に、難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数は、５mer以上とすることが好ましく、１０mer以上とすることがより好ましい。難水溶性の蛍光色素に対して結合させるヌクレオチドの数を上記範囲とすることによって、上述した難水溶性の蛍光色素に対してより優れた水溶性を付与することができる。
【００２０】
一方、上述した難水溶性の蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させるには、予め、２mer以上のヌクレオチドに対して例えば、反応性のアミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基、スルフヒドリル基等を導入しておき、これら官能基に対して蛍光色素を結合させる方法を使用することができる。その他にも、難水溶性の蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させるには、ビオチン−アビジン又はストレプトアビジンなどの相互作用を介した結合方法や酵素反応による結合方法といった方法を適用することもできる。
【００２１】
特に、上述した構造式（１）に示した化合物を使用する場合、ジメチルスルホキシド (DMSO)等の適切な溶媒に当該化合物を溶解して蛍光色素溶液を準備し、反応性のアミノ基を導入した２mer以上のヌクレオチドを含む溶液と当該蛍光色素溶液を混合することで、蛍光色素と２mer以上のヌクレオチドとを結合させることができる。
【００２２】
以上のように、難水溶性の蛍光色素に対して２mer以上のヌクレオチドを結合させることによって、全体として水溶性を有する蛍光色素となる。すなわち、本発明によれば、難水溶性の蛍光色素に対して水溶性を付与できるため、蛍光色素としての利用用途が大幅に拡大することとなる。本発明に係る水溶性蛍光色素における２mer以上のヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応に利用することができる。したがって、本発明に係る水溶性蛍光色素は、PCR（Polymerase Chain Reaction）やLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）等の核酸増幅反応のプライマーや、サザンハイブリダイゼーションのプローブ等に利用することができる。
【００２３】
なお、本発明に係る水溶性蛍光色素は、所定の波長の励起光を照射することで所定の波長の蛍光を発するため、当該波長の蛍光に基づいて検出することができる。具体的に、特許4098839号公報に開示されたインドシアニングリーン誘導体、特に構造式（１）に示す化合物は、励起波長500〜800nmであり、蛍光波長550〜850nmの蛍光特性を備えている。よって、高出力の半導体レーザーやHe・Neレーザーを励起光源として用い、550〜850nmを検出できる蛍光検出器を用いて高感度に検出することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕
本実施例では、構造式（１）に示す蛍光色素（なおX-はCl-、以下、化合物１）に対して異なる数のヌクレオチドを結合することによる水溶性の変化を検証した。
【００２６】
＜方法＞
先ず、化合物１（同仁化学研究所社製）にジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を加え、1 mg/mLになるように溶解した。また、表１に示したヌクレオチド（BIOLOG社製）又は各オリゴヌクレオチド（ライフテクノロジーズジャパン社製）に滅菌水を加え、1 mmol/Lになるように溶解した。
【００２７】
【表１】
2014093950.tif 000007
【００２８】
次に、1.5 mLチューブに表２に示す組成で反応液を作製した。また、実験対照として、オリゴヌクレオチドの代わりに滅菌水を加えた。
【表２】
2014093950.tif 000008
【００２９】
上述のように作製した反応液を４℃、遮光下にて16時間以上静置した。その後、少量のサンプルを抜き取った後、減圧下で反応溶液を乾燥させた。そして、乾固物にクロロホルム（キシダ化学社製）を加え、撹拌混合した。その後、さらに滅菌水を加え、撹拌混合した。チューブを遠心して水層（上層）及びクロロホルム層（下層）に分離した。上記工程で抜き取った少量のサンプル、水層及びクロロホルム層について、260 nm及び640 nmの吸光度をそれぞれ測定した。なお、260 nmの吸光度に基づいて核酸濃度が測定でき、640 nmの吸光度に基づいて化合物１の濃度を測定できる。
【００３０】
＜結果＞
反応液から抜き取った少量のサンプルに含まれる化合物１と各オリゴヌクレオチドのモル濃度を測定した結果を表３に示した。
【表３】
2014093950.tif 000009
【００３１】
水層とクロロホルム層に含まれる化合物１と各オリゴヌクレオチドのモル濃度を測定した結果をそれぞれ表４及び５に示した、
【表４】
2014093950.tif 000010
【表５】
2014093950.tif 000011
【００３２】
表１〜３に示した測定結果に基づいて、反応液中のオリゴヌクレオチド又は化合物１で標識されたオリゴヌクレオチドが水層、クロロホルム層にどちらに移行したかについて、移行率を計算した結果を表６に示した。また、表６に示した数値をグラフ化したものが図１である。
【表６】
2014093950.tif 000012
【００３３】
＜考察＞
表１〜５に示したように化合物１自体の水溶性は著しく低く、化合物１は、難水溶性の蛍光色素であることが理解できる。表６及び図１に示したように、難水溶性の蛍光色素である化合物１に対して２mer以上のヌクレオチドを結合させることで、その鎖長依存的にクロロホルム層から水層に移行するオリゴヌクレオチドが増加した。すなわち、難水溶性の蛍光色素に対して２mer以上のヌクレオチドを結合することで水溶性の蛍光色素として利用できることが示唆された。また、結合するヌクレオチドを1〜4merと段階的に増加した場合には、クロロホルム層でも10%以上核酸が検出されたことから難水溶性である化合物１の物性を段階的に水溶性へ変換したと考えられる。
【００３４】
以上の結果から、化合物が難水溶性であっても、化合物に核酸を結合させることにより、水溶性の性質を付加することが可能となることが明らかとなった。
【００３５】
〔実施例２〕
本実施例では、PCRに使用するプライマーに対して化合物１を結合し、このプライマーを用いてPCRを行う際に、最適なプライマーの鎖長を検討した。
【００３６】
＜方法＞
先ず、実施例１と同様に、化合物１（同仁化学研究所社製）にジメチルスルホキシド（キシダ化学社製）を加え、1 mg/mLになるように溶解した。また、表７に記載したオリゴヌクレオチド（ライフテクノロジーズジャパン社製）に滅菌水を加え、1 mmol/Lになるように溶解した。
【表７】
2014093950.tif 000013
【００３７】
次に、1.5 mLチューブに表８に示す組成で反応液を作製した。
【表８】
2014093950.tif 000014
【００３８】
上述のように作製した反応液を４℃、遮光下にて16時間以上静置した。その後、MicroSpin G-25 Columns（GEヘルスケア社製）を用いて精製した。そして、精製物の260 nmの吸光度を測定した後、滅菌水で核酸濃度が10μmol/Lとなるように調製した。
【００３９】
以上で作製した、化合物１を結合したオリゴヌクレオチドを一方のフォワードプライマーとし5’-TGTGGCGCGGTATTATCC（配列番号１１）をリバースプライマーとしたPCRを行うため、表９に示す組成の反応液を調製した。
【表９】
2014093950.tif 000015
【００４０】
また、PCRにおけるサーマルサイクルは表１０に示すように設定した。
【表１０】
2014093950.tif 000016
【００４１】
PCRの終了後、PCR産物を含む反応液及び100 bp ladder（タカラバイオ社製）を３％アガロースゲル電気泳動にて泳動後、SYBR Green（LONZA社製）を用いて核酸を染色した。染色後、トランスイルミネーターで染色されたDNAを検出した。
【００４２】
＜結果＞
染色されたDNAを検出した結果を図２に示した。図２に示すように、化合物１を結合した10mer以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合には、PCRによって増幅産物が得られることが確認できた。実施例１に示したように、10mer以上のオリゴヌクレオチドについても蛍光を観測できていることから、化合物１を結合した10mer以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合、化合物１に基づいて増幅産物を検出できることが示唆された。
【００４３】
〔実施例３〕
本実施例では、PCRに使用するプライマーに対して化合物１を結合した蛍光色素標識プラマーを用いてPCRを行って得られた増幅産物を、当該増幅産物に相補的な配列を有するプローブを用いて検出する系において蛍光色素を利用できることを検討した。
【００４４】
＜方法＞
ＵＧＴ１Ａ１＊２８遺伝子多型の遺伝子型を判別するための一対の核酸プローブをそれぞれ２点ずつ有するＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップに搭載した核酸プローブの一覧を表１１に示した。
【表１１】
2014093950.tif 000017
【００４５】
実施例２と同様にして、5’末端をアミノ化したオリゴヌクレオチド（配列5’-amino-ATGGCGCCTTTGCTCCT（配列番号１４））に化合物１を結合させたリバースプライマーとし、5’- TAGTCGTCCTTCTTCCTCTCTGGT（配列番号１５）をフォワードプライマーとしたPCRを行うため、表２に示す組成の反応液を調製した。
【表１２】
2014093950.tif 000018
【００４６】
また、PCRにおけるサーマルサイクルは表１３に示すように設定した。
【表１３】
2014093950.tif 000019
【００４７】
以上のようにして得られた増幅断片をＤＮＡチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、54℃に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液（組成：1×クエン酸ナトリウム緩衝液（SSC）/0.1％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）溶液）を1.5μLとPCR産物を3μL入れ、混合した。混合液のうち3μLをＤＮＡチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱毎、チャンバー内に載置した。その後、54℃で1時間静置した。
【００４８】
その後、直ちに48℃に加温した1×SSC/0.1％SDS溶液に５分間静置、次に室温の1×SSC/0.1％SDS溶液に5分間静置した後、室温の1×SSC溶液に3分間静置して洗浄した。
【００４９】
さらに表１４に示す順に洗浄し、洗浄後のＤＮＡチップを室温の1×SSC液に測定するまで静置した。
【表１４】
2014093950.tif 000020
【００５０】
ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）を使用した。このとき、スポット径は16ピクセル（約200μm）に設定し、露光時間を20秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。本実施例のうち、蛍光標識プライマーを用いてPCRを行った検体の蛍光強度を表１５に示した。
【表１５】
2014093950.tif 000021
【００５１】
＜考察＞
表１５に示すように、蛍光標識プライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅産物をDNAチップを用いて検出する際に、蛍光色素標識プライマーに基づいて検出できることが明らかになった。
【図１】
2014093950.tif 000025
【図２】
2014093950.tif 000026
【配列表】
2014093950000001.app