(57)【要約】      （修正有）【課題】比較的簡易な操作でシガトキシン2型群タンパク質を大量に精製する手段の提供。【解決手段】ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を精製するシガトキシン2型群タンパク質精製方法を提供する。ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、その担体にシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順と、その担体に結合したシガトキシン2型群タンパク質を高濃度二価金属塩溶液で溶出させる手順とを行うことにより、比較的簡易な操作で、大量のシガトキシン2型群タンパク質を分離・濃縮・回収することができる。これにより、ワクチン製造に必要な量のStx2eを精製することも可能となり、豚の浮腫病のワクチンの工業的生産も可能となる。【選択図】図１
2014240357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を精製するシガトキシン2型群タンパク質精製方法。
【請求項２】
前記担体に前記シガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順を含む請求項１記載のシガトキシン2型群タンパク質精製方法。
【請求項３】
前記担体に結合又は吸着した前記シガトキシン2型群タンパク質を、高濃度二価金属塩溶液で溶出させる手順を含む、請求項２記載のシガトキシン2型群タンパク質精製方法。
【請求項４】
前記二価金属塩が塩化マグネシウムである請求項３記載のシガトキシン2型群タンパク質精製方法。
【請求項５】
前記シガトキシン2型群タンパク質がシガトキシン2eである請求項１〜４のいずれか一項記載のシガトキシン2型群タンパク質精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を精製するシガトキシン2型群タンパク質精製方法などに関連する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（学名「Escherichia  coli」、以下同じ）は、グラム陰性の通性嫌気性桿菌であり、主に哺乳類・鳥類の消化管内に生息する。大腸菌は、細胞壁由来のO抗原、鞭毛由来のH抗原など、抗原特異性に基づき、多くの血清型に細分類されている。現在、170種類以上のO群血清型が知られている。ほとんどの大腸菌は無害であるが、いくつかの大腸菌は、疾患の原因となっている。
【０００３】
腸管出血性大腸菌（EHEC；Enterohemorrhagic  Escherichia  coli）は、ベロトキシンを産生する大腸菌であり、ヒトの出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群（HUS）などの原因菌である。ヒトでは、患者・保菌者から検出される腸管出血性大腸菌のO群血清型は、主に、O157、O111、026などである。
【０００４】
ベロトキシン（VT；Verotoxin）は、腸管出血性大腸菌などが産生し、菌体外へ分泌する毒素タンパク質（外毒素）である。ベロトキシンは、腸管上皮細胞に作用して出血性下痢を引き起こすだけでなく、その一部が全身に移行する。ベロトキシンの体内における細胞表面受容体は、糖脂質の一つであるグロボトリアオシルセラミド（Gb3）などである。なお、ベロトキシンは、志賀赤痢菌の産生するシガトキシン（Stx；Shigatoxin）との相同性が高いことが分かり、シガトキシンと呼ぶことが国際的に提唱された。
【０００５】
シガトキシンは、毒素としての活性を有するAサブユニット（Activeサブユニット）1つと、細胞に対する結合活性を有するBサブユニット（Bindingサブユニット）5つから構成される。シガトキシンはシガトキシン１型とシガトキシン2型に大別される。シガトキシン2型に分類されるシガトキシン（以下、「シガトキシン2型群タンパク質」とする。）として、シガトキシン2（Stx2）の他、シガトキシン2c（Stx2c）、シガトキシン2d（Stx2d）、シガトキシン2e（Stx2e）、シガトキシン2f（Stx2f）などのバリアントが知られている。
【０００６】
豚の浮腫病（ED；Edema  disease）は、腸管出血性大腸菌による豚の感染症で、離乳後2〜4週の仔豚に好発し、眼瞼浮腫・運動失調・痙攣・麻痺・突然死などの症状を呈する。発生は散発的であるが、発生した場合の致死率が高い。該疾患の主な原因因子はシガトキシン2型のバリアントの一つであるシガトキシン2e（Stx2e）である。Stx2eを産生する腸管出血性大腸菌が主に小腸に定着・増殖し、産生されたStx2eが腸管から吸収されて全身に移行し、循環障害などを引き起こす。なお、起因菌のO群血清型は、主に、O138、O139、O141などである。
【０００７】
豚の浮腫病の原因毒素であるStx2eとStx2の間のアミノ酸相同性は、Aサブユニットで94％、Bサブユニットで84％である。また、細胞表面受容体としての機能を有する糖脂質の中で、Stx2eは、グロボトリアオシルセラミド（Gb3）よりはむしろ、グロボテトラオシルセラミド（Gb4）に対し、高い親和性を示すことが知られている。
【０００８】
現在のところ、豚の浮腫病のワクチンなどの実用化には至っていないが、Stx2eを不活化又は弱毒化したトキソイドワクチンの有効性は既に確認されている（非特許文献１〜４参照）。また、Stx2eの精製方法についてもいくつか報告されている（非特許文献５、６参照）。なお、これらの報告によれば、非特許文献５におけるStx2e回収量は6L培養で1.5mg、非特許文献６におけるStx2e回収量は培養液1L当たり0.16mgである。その他、本発明に関連する事項として、非特許文献７には、免疫グロブリンの精製方法として、Thiophilic  interaction  chromatographyの手法が記載されている。また、非特許文献８はThermo  Scientific社製のD-ガラクトースゲル「Immobilized  D-Galactose  Gel」の取扱説明書、非特許文献９はThermo  Scientific社製「Pierce  Thiophilic  Adsorbent」の取扱説明書、非特許文献１０はClontech社製「Thiophilic  Resin」の取扱説明書である。
【非特許文献１】Protection  of  Piglets  against  Edema  Disease  by  Maternal  Immunization  with  Stx2e  Toxoid.  Infect.  Immun.  (2012)  80(1)  469-473.
【非特許文献２】Genetically  modified  Shiga  toxin  2e  (Stx2e)  producing  Escherichia  coli  is  a  vaccine  candidate  for  porcine  edema  disease.  Microb  Pathog.  (2001)  31(1)  1-8.
【非特許文献３】An  enzymatic  mutant  of  Shiga-like  toxin  II  variant  is  a  vaccine  candidate  for  edema  disease  of  swine.  Infect  Immun  (1992)  60(2)  485-490.
【非特許文献４】Vaccination  with  genetically  modified  Shiga-like  toxin  IIe  prevents  edema  disease  in  swine.  Infect  Immun.  (1996)  64(1)  55-60.
【非特許文献５】Purification  and  characterization  of  an  Escherichia  coli  Shiga-like  toxin  II  variant.  Infect  Immun.  (1990)  58(5)  1232-1239.
【非特許文献６】One  step  high  yield  affinity  purification  of  shiga-like  toxin  II  variants  and  quantitation  using  enzyme  linked  immunosorbent  assays.  Microb  Pathog.  (1993)  14(1)  57-66.
【非特許文献７】Thiophilic  adsorption  -  a  new  method  for  protein  fractionation.  FEBS Lett.  (1985)  185(2)  306-310.
【非特許文献８】Thermo  Scientific「Immbobilized  D-Galactose  Gel」instructions
【非特許文献９】Thermo  Scientific「Pierce  Thiophilic  Adsorbent」instructions
【非特許文献１０】Clontech「Thiophilic  Resin」user  manual
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述の通り、シガトキシン2e（Stx2e）を不活化又は弱毒化したトキソイドワクチンの有効性は既に確認されている。しかし、ワクチン製造のためには、Stx2eを大量精製する必要があるのに対し、現在のところ、Stx2eの精製操作が煩雑で、回収率も低いという課題があり、豚の浮腫病のワクチンの実用化には至っていない。その他、シガトキシン2型群タンパク質を簡易に大量調製できる手段が開発されれば、シガトキシン2型群タンパク質に対するワクチン、毒素の検出・解析などに用いる抗体の作製などにも有用である。
【００１０】
そこで、本発明は、比較的簡易な操作でシガトキシン2型群タンパク質を大量に精製する手段を提供すること、豚の浮腫病のワクチンの工業的生産を実現することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、担体の表面上又は担体内に存在するジビニルスルホン基に、シガトキシン2e（Stx2e）が特異的に結合又は吸着すること、及び、その担体に結合又は吸着したStx2eを高濃度二価金属塩溶液で溶出させることができることを新規に見出した。また、Stx2eのBサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギンがジビニルスルホン基との結合に重要な役割を果たしており、その他のシガトキシン2型群タンパク質についても、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸をアスパラギンに置換することにより、同様に結合又は吸着させることが可能であることを新規に見出した。
【００１２】
そこで、本発明では、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を精製するシガトキシン2型群タンパク質精製方法を提供する。
【００１３】
例えば、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質をその担体に結合又は吸着させる手順と、その担体に結合又は吸着したそのシガトキシン2型群タンパク質を高濃度二価金属塩溶液で溶出させる手順とを行うことにより、比較的簡易な操作で、大量のシガトキシン2型群タンパク質を分離・濃縮・回収することができる。
【００１４】
従って、例えば、野生型でBサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるStx2eの場合、ワクチン製造に必要な量のStx2eを精製することが可能となり、豚の浮腫病のワクチンの工業的生産が可能となる。例えば、本発明方法により野生型のStx2eを大量調製し、それを不活化処理することで、不活化トキソイドワクチンを生産してもよいし、本発明により弱毒変異型Stx2eを大量調製し、弱毒化トキソイドワクチンなどとして生産してもよい。
【００１５】
また、野生型でBサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンでないその他のシガトキシン2型群タンパク質についても、例えば、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸をアスパラギンに置換することにより、同様に大量調製することが可能になる。このことは、例えば、シガトキシン2型群タンパク質に対するワクチン、毒素の検出・解析などに用いる抗体の作製などに有効な手段となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、比較的簡易な操作でシガトキシン2型群タンパク質を大量に精製することができる。また、豚の浮腫病のトキソイドワクチンの工業的生産に必要な量のStx2eを調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜本発明に係るシガトキシン2型群タンパク質精製方法について＞
本発明は、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を精製するシガトキシン2型群タンパク質精製方法をすべて包含する。
【００１８】
以下、図１を用いて、本発明の手順の例を説明する。なお、本発明に係るシガトキシン2型群タンパク質精製方法は、少なくとも、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて、前記担体にシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順が少なくとも含まれていればよく、例えば、一部の手順が省略されていること、他の手順を含むこと、一部の手順を行う順序が異なること、一部の又は全手順が繰り返し行われることなどによって、狭く限定されない。
【００１９】
図１は、本発明に係るシガトキシン2型群タンパク質精製方法のフローの例を示す図である。図１のフローは、前処理として試料を調製する手順（符号S0）と、担体を平衡化する手順（符号S1）と、担体に試料を供給し、担体にシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順（符号S2）と、担体に結合又は吸着したシガトキシン2型群タンパク質を溶出させ、シガトキシン2型群タンパク質を回収する手順（符号S3）とにより構成されている。
【００２０】
前処理として試料を調製する手順（符号S0）では、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質の産生と、精製に供するために必要な調製を行う。
【００２１】
例えば、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質を産生する大腸菌株を用いる場合、その菌株を培養し、遠心分離などにより菌体を除去し、その培養上清を回収し、その培養上清を試料として用いることができる。
【００２２】
例えば、遺伝子工学的方法により、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質の強制発現大腸菌を作製した場合、その菌を培養して菌体を回収し、ポリミキシンBなどの薬剤処理、超音波処理などによりその菌体を破砕し、遠心分離などにより菌体抽出液を回収し、その菌体抽出液を試料として用いることができる。
【００２３】
大腸菌の培養方法は、公知の方法を採用でき、特に限定されない。例えば、培養液として、LB培地、2×YT培地、YM液体培地、Lennox培地、Davis培地、BHI培地、Syncase培地、TG培地、SOC培地、YPD液体培地、YPAD培地、NZY培地、MMI培地、CAYE培地、M9カザミノ酸培地などを用いることができ、サプリメント試薬などを適宜添加して用いてもよい。培養温度を、通常の至適温度、例えば、10〜40℃に設定してもよい。
【００２４】
公知の方法、例えば、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質のコード遺伝子を発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、シガトキシン2型群タンパク質の強制発現大腸菌を作製できる。シガトキシン2型群タンパク質を発現させるプロモータには、通常用いられるもの、例えば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、λファージのPRプロモータ、PLプロモータ、T5プロモータなど、強力なプロモータを採用できる。ベクターには、通常用いられるもの、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、pACYC184、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE30、pKK233-2、pBluescript、pBluescript  IIなどを採用できる。また、シガトキシン2型群タンパク質のコード遺伝子の下流に、通常用いられるターミネータ、例えば、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータなどが連結されていてもよい。その他、エンハンサ、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などが連結されていてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２５】
本発明において、「Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質」は、野生型でBサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるStx2e、及び、遺伝子工学的方法により、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸をアスパラギンに置換したシガトキシン2型群タンパク質の両者を包含する。Stx2e以外のシガトキシン2型群タンパク質として、例えば、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸をアスパラギンに置換したStx2、同Stx2c、同Stx2d、同Stx2fなどが挙げられる。
【００２６】
また、本発明に係るシガトキシン2型群タンパク質は、少なくともBサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるものであればよく、例えば、免疫原性を保持しつつ毒性を低減するために、シガトキシン2型群タンパク質のアミノ酸配列中、Bサブユニットの17位のアミノ酸以外の一部のアミノ酸が置換・欠損・付加などされたものなどについても、本発明に広く包含される。例えば、弱毒変異型のStx2eとして、(1)Aサブユニットのアミノ酸配列中の167位のグルタミン酸をグルタミンなどに変異したもの、(2)Aサブユニットのアミノ酸配列中の167位のグルタミン酸をグルタミンなどに変異し、同170位のアルギニンをロイシンなどに変異したもの、(3)Aサブユニットのアミノ酸配列中の167位のグルタミン酸をグルタミンなどに変異し、同77位のチロシンをセリンなどに変異したもの、などを適用してもよい。Bサブユニットの17位のアミノ酸以外のアミノ酸配列に変異を加えたシガトキシン2型群タンパク質を、強制発現大腸菌を用いて産生する場合、例えば、公知方法で、発現ベクター中に組み込まれた、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアミノ酸がアスパラギンであるシガトキシン2型群タンパク質の遺伝子に変異を加えた後、その発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、それらの変異型シガトキシン2型群タンパク質を大腸菌で強制発現することができる。
【００２７】
シガトキシン2型群タンパク質を産生する大腸菌株の培養上清、又は、シガトキシン2型群タンパク質の強制発現大腸菌の菌体抽出液を回収した後、それらの試料について、適宜、シガトキシン2型群タンパク質の精製に供するために必要な調製を行ってもよい。
【００２８】
例えば、試料をシガトキシン2型群タンパク質の精製に供する前に粗精製を行ってもよい。粗精製を行う方法として、公知の方法、例えば、遠心分離などによる夾雑物の除去、膜ろ過による濃縮・フィルタリング、硫酸アンモニウムなどによる塩析などが挙げられる。
【００２９】
例えば、精製に供する前に、バッファー交換やバッファーなどによる希釈を行ってもよい。バッファー交換は、分子篩クロマトグラフィーなど、公知の方法で行うことができる。バッファー交換又は希釈に用いるバッファーは、公知のものを用いることができる。また、シガトキシン2型群タンパク質の精製の際に用いる結合バッファーを用いてもよい。
【００３０】
本発明では、ジビニルスルホン基を有する担体とシガトキシン2型群タンパク質とを結合又は吸着させるための結合バッファーに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）など、通常の緩衝液を用いることができる。本発明に係るStx2e精製方法では、結合バッファー中への、最終濃度0.1〜1.0MのNa2SO4、K2SO4、NaClなどの塩の添加を必要としない。但し、発明者らの経験上の知見では、結合バッファー中に、最終濃度0.1〜1.0MのNaClを添加することにより、担体への不純物の非特異的結合を抑制できる。
【００３１】
本発明で用いる担体は、担体の表面上又は担体内にジビニルスルホン基が存在するものであればよい。ジビニルスルホンは、ジビニルスルホン基の二つの官能基にそれぞれ別個の化合物を結合することにより二つの化合物を架橋することができるため、架橋剤として用いられている。例えば、ジビニルスルホン基の二つの官能基のうちの一方に担体の基材を、他方に化合物を、それぞれ結合することにより、ジビニルスルホン基を介して、担体の表面上又は担体内に化合物を固定化することができる。この方法を用いて、例えば、β-メルカプトエタノール、α-ガラクトースなどがジビニルスルホン基を介して固定化された担体が既に開発されており、これらの担体の表面上又は担体内にはジビニルスルホン基が存在する。本発明は、それらの担体を広く採用できる。
【００３２】
担体の基材は、ジビニルスルホン基の一方の官能基と結合できるものであればよく、特に限定されない。基材として、例えば、アガロース樹脂、ポリアクリルアミド樹脂などを採用できる。また、担体は、例えば、ビーズ状に形成されたものなどを広く採用できる。例えば、ビーズ状の担体の場合、バッファーなどによる担体の懸濁と、遠心分離などによる担体又は上清の回収を繰り返すことにより、本発明に係る精製を行うことができる。また、担体をカラムなどに充填して、本発明に係る精製を行ってもよい。
【００３３】
担体を平衡化する手順（符号S1）では、平衡化に用いるバッファーを担体に供給し、担体の平衡化を行う。例えば、上記の結合バッファーを平衡化に用いてもよい。供給量は特に限定されないが、充分量を供給することが好ましく、また、複数回バッファーを供給してもよい。
【００３４】
担体に試料を供給し、担体にシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順（符号S2）では、平衡化された担体に上記の試料を供給し、担体とシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させ、シガトキシン2型群タンパク質を捕捉する。試料を担体に供給した後、結合バッファーを供給し、非結合物などを除去してもよい。
【００３５】
担体に結合又は吸着したシガトキシン2型群タンパク質を溶出させ、溶出させたシガトキシン2型群タンパク質を回収する手順（符号S3）では、担体に溶出バッファーを供給し、シガトキシン2型群タンパク質を担体から溶出させ、シガトキシン2型群タンパク質溶液を回収する。
【００３６】
溶出バッファーには、例えば、高濃度二価金属塩溶液を用いる。溶出バッファーは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）など、通常の緩衝液に、二価金属塩を高濃度溶解した溶液であればよい。二価金属塩は塩化マグネシウムであることが好適である。例えば、2.0〜5.0M、より好適には3.0〜5.0M、最も好適には4.0〜5.0Mの塩化マグネシウムを含有するバッファーを用いることができる。高濃度の二価金属塩を溶出バッファーに含有することにより、担体に結合又は吸着したシガトキシン2型群タンパク質を溶出させることができる。
【００３７】
以上の手順により、例えば、シガトキシン2型群タンパク質の強制発現大腸菌でシガトキシン2型群タンパク質を産生した場合、1L培養当たり、10〜50mgのシガトキシン2型群タンパク質を回収することが可能である。
【００３８】
回収したシガトキシン2型群タンパク質に関し、例えば、透析、バッファー交換などにより塩を除去してもよい。また、目的・用途などに応じ、適宜、化合物の添加、各種処理などを行ってもよい。
【００３９】
＜本発明に係るトキソイドワクチン製剤について＞
本発明により、ワクチン製造に必要な量のStx2eを精製することが可能となり、豚の浮腫病のワクチンの工業的生産が可能となる。従って、本発明は、本発明に係るStx2e精製方法によって精製されたStx2eを少なくとも含有する、豚の浮腫病に対するトキソイドワクチン製剤をすべて包含する。
【００４０】
本発明は、野生型Stx2eを100〜20,000mg/L含有する不活化トキソイドワクチン製剤を広く包含する。本発明により、ワクチン製造に必要な量の野生型のStx2eを精製することが可能になる。従って、野生型のStx2eを不活化することにより、Stx2eの免疫原性を保持しつつ毒性を低減できるため、トキソイドワクチンとして、適用可能になる。
【００４１】
また、本発明は、弱毒変異型Stx2eを100〜20,000mg/L含有する弱毒化トキソイドワクチン製剤を広く包含する。本発明により、ワクチン製造に必要な量の弱毒変異型のStx2eを精製することが可能になる。従って、弱毒変異型のStx2e又はそれを不活化したものを調製することにより、Stx2eの免疫原性を保持しつつ毒性を低減できるため、トキソイドワクチンとして、適用可能になる。
【００４２】
不活化トキソイドワクチン製剤を作製する場合、公知の方法、例えば、Stx2e含有液に対し、物理的処理(紫外線照射、X線照射、熱処理、超音波処理など)、化学的処理(ホルマリン・クロロホルムなどによる有機溶媒処理、酢酸などの弱酸による酸処理、アルコール・塩素・水銀などによる処理)などにより、不活化を行うことができる。
【００４３】
例えば、Stx2e含有液にホルマリンを0.001〜2.0％、より好適には0.01〜1.0％の容量濃度で添加し、4〜37℃で、1〜10日間感作することにより、ホルマリンによる不活化を行うことができる。例えば、緩衝液などで透析してホルマリンなどの不活化剤を除去したり、中和剤を添加して中和したりしてもよい。また、膜ろ過などによりトキソイドを濃縮・回収してもよい。
【００４４】
このワクチン製剤には、公知のアジュバントを添加してもよい。公知のアジュバントとして、例えば、動物油(スクアレンなど)又はそれらの硬化油、植物油(パーム油、ヒマシ油など)又はそれらの硬化油、無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステルなどを含む油性アジュバント、PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミニウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質などの水溶性アジュバント、水酸化アルミニウム(ミョウバン)、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分、その他、ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキンなどが挙げられる。また、これらを混合したものでもよい。
【００４５】
このワクチン製剤には、目的・用途などに応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加してもよい。
【００４６】
緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などを用いることができる。
【００４７】
等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどを用いることができる。
【００４８】
無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。
【００４９】
防腐を目的とした薬剤の好適な例として、例えば、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、その他、各種防腐剤、抗生物質、合成抗菌剤などを用いることができる。
【００５０】
抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。
【００５１】
その他、このワクチン製剤には、補助成分、例えば、保存・効能の助剤となる光吸収色素(リボフラビン、アデニン、アデノシンなど)、安定化のためのキレート剤・還元剤(ビタミンC、クエン酸など)、炭水化物(ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストランなど)、カゼイン消化物、各種ビタミンなどを含有させてもよい。
【００５２】
ワクチン製剤の剤型などについては、公知のものを採用でき、特に限定されない。例えば、液体製剤として用いてもよいし、経口投与用に、凍結乾燥などの処置の後、餌などに混入させてもよい。
【００５３】
その他、このワクチン製剤は、他の疾患に対する一又は複数のワクチンとの混合ワクチン製剤であってもよい。
【００５４】
このワクチン製剤は、豚の浮腫病の予防に適用可能である。
【００５５】
この豚の浮腫病に対するワクチン製剤は、液剤を皮下・皮内・筋肉注射などにより投与してもよいし、餌などに混入させて経口投与してもよい。例えば、皮下・皮内・筋肉注射などでは、一回当たり、10〜500μg、経口投与では、一回当たり、50〜2,000μg投与する。投与回数は、特に限定されないが、1回又は1週間〜3カ月間隔で数回が好適である。また、1年に1回以上の投与が好適である。
【実施例１】
【００５６】
実施例１では、Stx2e発現大腸菌を作製・培養し、その菌体抽出液を調製した。
【００５７】
Stx2e遺伝子全長を増幅するプライマーを設計した。Stx2e遺伝子の5’側プライマーのAサブユニット遺伝子の上流には、毒素原性大腸菌が産生する易熱性毒素(LT)のBサブユニットの翻訳に関わるリボソーム結合配列（SD配列）を付加した。
【００５８】
設計プライマーを用いて、豚浮腫病由来株である腸管出血性大腸菌220811A78株（血清型：O139）から抽出した遺伝子を鋳型として、PCRにより、Stx2eのコードDNAを増幅した。プラスミドベクター「pBluescript  II  SK(＋)」（アジレントテクノロジーズ社製）のlacZα遺伝子内に、PCR増幅産物をlacZαと異なる読み枠で挿入した。この作製プラスミドを「pBSK-Stx2e」とした。
【００５９】
pBSK-Stx2eで大腸菌MV1184株（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、その形質転換体を、アンピシリン含有LB培地3mL中で、37℃、一晩培養した後、アンピシリン及びリンコマイシン塩酸塩を含むCAYE培地1Lにこの培養液を接種し、30℃、48時間振盪培養を行った。なお、CAYE培地の組成は以下の通りである。2％カザミノ酸、0.6％酵母エキス、0.25％塩化ナトリウム、0.871％リン酸水素二カリウム、0.1％Trace  salt溶液（5％MgSO4、0.5％MnCl2、0.5％FeCl3）、0.25％グルコース。
【００６０】
遠心分離により、その1L培養液から菌体を回収した。リン酸緩衝生理食塩液（pH7.4、以下「PBS」とする。）に最終濃度0.5MのNaClを添加したバッファー（以下「PB-0.5MNaCl」とする。）でその菌体を懸濁し、浮遊液を調製した。この浮遊液中の菌体を超音波破砕し、遠心分離によりその上清を回収した後、0.8/0.2μmのシリンジフィルターでろ過し、Stx2eを含有する菌体抽出液100mLを得た。
【実施例２】
【００６１】
実施例２では、実施例１で得た菌体抽出液から、D-ガラクトースゲルを用いてStx2eの精製を試みた。
【００６２】
担体として、D-ガラクトースゲル（商品名「Immobilized  D-Galactose  Gel」、Thermo  Scientific社製）を準備した。この製品は、ビーズ状のアガロースゲルにジビニルスルホン基を介してD-ガラクトースが固定化されたもので、レクチン、コレラ毒素など、ガラクトースに結合活性を有する物質を精製するための担体として市販されている（非特許文献８参照）。
【００６３】
この充填カラムをPB-0.5MNaClで平衡化した後、実施例１で得た菌体抽出液100mLを添加し、PB-0.5MNaClで充分洗浄して不純物を洗い流した。次に、4.5MのMgCl2を含むPBSを溶出液として、担体に結合したStx2eを2mL/fractionで回収した。
【００６４】
回収した各フラクション溶液のうち5μLを0.25mLのQuick  Start  Bradford  Dye  Reagent（Bio-Rad社製）と5分間反応させた後、OD595nm値を測定し、対照の溶出液よりも吸光度の高いフラクションを集めた。
【００６５】
集めたフラクション溶液について、MgCl2を除去する目的でPBSに透析した後、遠心分離操作を行い、わずかに生じた不溶物を除去した。そして、最終的に得られたタンパク質について、「DC  Protein  Assay  Reagent」（Bio-Rad社）を用いて、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果、1L培養当たりのStx2e収量は41.2mgであった。
【００６６】
透析を行った後の試料について、SDS-PAGEを行った。
【００６７】
結果を図２に示す。図２は、D-ガラクトースゲルを用いて回収したStx2e精製物のSDS-PAGE電気泳動写真である。図２中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1はD-ガラクトースゲルを用いて回収したStx2e精製物を供した場合の結果を、それぞれ表わす。
【００６８】
図２に示す通り、Stx2eのAサブユニット及びBサブユニットの位置に明瞭なバンドが検出され、また、他のバンドは検出されなかった。この結果より、担体としてThermo  Scientific社製のD-ガラクトースゲルを用いた場合、Stx2eを大量かつ高純度に精製できることが分かった。
【実施例３】
【００６９】
実施例３では、他社製のガラクトース固定化樹脂を用いてStx2eの結合を検討した。
【００７０】
担体として、実施例２で用いたThermo  Scientific社製のD-ガラクトースゲル（陽性対照）、EY-Laboratories社製のα-ガラクトース固定化樹脂、及び、同β-ガラクトース固定化樹脂を用いた。それぞれ、実施例１で得た菌体抽出液50μLと担体25μLとを混合した後、PB-0.5MNaClで担体を洗浄し、SDS-PAGEサンプルバッファーを25μL添加して5分間加熱処理し、10μLをSDS-PAGEに供した。また、同じ試料について、一次抗体に抗Stx2eウサギ血清を用いてウエスタンブロットを行った。
【００７１】
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは実施例１の菌体抽出液と各ガラクトース担体とを混合した場合における担体吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真、図３Ｂは同ウエスタンブロット写真である。両図中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1はD-ガラクトースゲルを用いた場合の結果（陽性対照）を、レーン2はα-ガラクトース固定化樹脂を用いた場合の結果を、レーン3はβ-ガラクトース固定化樹脂を用いた場合の結果を、それぞれ表わす。図３Ａ中のレーン4は担体と混合する前の試料（実施例１で得た菌体抽出液）を供した場合の結果（Input）を、図３Ｂ中のレーン4は精製Stx2eを供した場合の結果を、それぞれ表わす。
【００７２】
図３Ａ及び図３Ｂに示す通り、回収したフラクション溶液について、SDS-PAGEを行った結果、α-ガラクトース固定化樹脂を用いた場合、Stx2eのAサブユニット及びBサブユニットの位置にCBB-R250レベルで薄いバンドが検出され、ウエスタンブロットレベルでは明瞭なバンドが認められた。一方、β-ガラクトース固定化樹脂を用いた場合、Stx2eのバンドはウエスタンブロットレベルでも検出されなかった。
【００７３】
実施例２及び本実施例の結果は、Stx2eがα-ガラクトースに少量は結合又は吸着することを示すとともに、実施例２のD-ガラクトースゲルでは、Stx2eの大部分がα-ガラクトース以外の部位、即ち、ジビニルスルホン基の部位に結合又は吸着したことを示唆する。
【実施例４】
【００７４】
実施例４では、ジビニルスルホン基を有する他の担体を用いて、Stx2eの精製を試みた。
【００７５】
担体として、「Pierce  Thiophilic  Adsorbent」（Thermo  Scientific社製）を準備した。この製品は、TAR（Thiophilic  Adsorbent  Resin）担体の製品であり、ビーズ状のアガロース樹脂にジビニルスルホン基を介してβ-メルカプトエタノールが固定化されている。主に免疫グロブリンを精製するための担体として市販されている（非特許文献９、１０参照）。
【００７６】
TAR充填カラムをそれぞれPB-0.5MNaClで平衡化した後、実施例１で得た菌体抽出液100mLをそれぞれ添加し、PB-0.5MNaClで充分洗浄して不純物を洗い流した。次に、4.5MのMgCl2を含むPBSを溶出液として、TARに結合したStx2eをそれぞれ2mL/fractionで回収した。
【００７７】
回収した各フラクション溶液のうち5μLを0.25mLのQuick  Start  Bradford  Dye  Reagent（Bio-Rad社製）と5分間反応させた後にOD595nm値を測定し、対照の溶出液よりも吸光度の高いフラクションを集めた。
【００７８】
集めたフラクション溶液について、MgCl2を除去する目的でPBSに透析した後、遠心分離操作を行い、わずかに生じた不溶物を除去した。そして、最終的に得られたタンパク質について、実施例２と同様の手順で定量した。その結果、1L培養当たりの収量は44.9mgであった。
【００７９】
透析を行った後の試料について、SDS-PAGEを行った。
【００８０】
結果を図４に示す。図４は、TARを用いて回収したStx2e精製物のSDS-PAGE電気泳動写真である。図４中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1はTARを用いて回収したStx2e精製物を泳動した結果を、それぞれ表わす。
【００８１】
図４に示す通り、担体にTARを用いた場合も、実施例２と同様、Stx2eのAサブユニット及びBサブユニットの位置に明瞭なバンドが検出された。
【００８２】
実施例２及び本実施例の結果は、担体の表面上又は担体内に存在するジビニルスルホン基に、Stx2eが大量かつ特異的に結合又は吸着すること、及び、その担体に結合又は吸着したStx2eを高濃度二価金属塩溶液で溶出させることができること、即ち、ジビニルスルホン基を有する担体を用いることにより、Stx2eを大量かつ特異的に精製できることを示す。
【００８３】
なお、D-ガラクトースゲルを用いた場合（実施例２、図２参照）と比較して、図４において非特異のバンドが複数認められた理由は、D-ガラクトースゲルを用いた場合、実施例３で示した通り、Stx2eがジビニルスルホン基の他にα-ガラクトースにも少量結合又は吸着し、特異性が向上したこと、及び、TARを用いた場合、菌体由来タンパク質の一部がβ-メルカプトエタノールに非特異的に結合又は吸着したことによると推測する。
【００８４】
その他、用いた各充填カラムの取扱説明書（非特許文献９、１０）では、0.5M程度のNa2SO4又はK2SO4を含むリン酸緩衝液条件下で目的蛋白を結合させ、溶出時にNa2SO4又はK2SO4の濃度を下げて結合蛋白を回収するとされている。それに対し、本実施例では、MgCl2を含まない緩衝液でStx2eを結合させ、4.5MのMgCl2を含むPBSで溶出し、Stx2eを回収している。即ち、本実施例では、結合時にMgCl2を添加せず、溶出時にMgCl2の濃度を上げ、Stx2e精製を行っている。このことは、Stx2e精製の原理が、これらの充填カラムで想定するタンパク質精製の原理とは全く異なるものであることを示す。
【００８５】
また、本実施例では、結合バッファーとして0.5MNaClを添加したものを用いている。しかし、本発明者らの検討では、結合バッファーにNaClを添加しない場合でも、上記と添加した場合と同様に、Stx2eを大量かつ特異的に精製できた。このことは、NaClの添加が、担体へのStx2eの結合又は吸着には関与しないことを示す。
【００８６】
付記的事項として、充填カラムの取扱説明書（非特許文献９）には、このカラムが高濃度のNaClの存在により結合を起こさないことが記載されている。本実施例において0.5MNaClを添加した理由は、本発明者らの経験に基づき、担体への不純物の非特異的結合を抑制するためである。
【実施例５】
【００８７】
実施例５では、弱毒変異型のStx2e発現大腸菌を作製・培養し、その菌体抽出液から弱毒変異型のStx2eの精製を試みた。
【００８８】
実施例１で作製したpBSK-Stx2eを鋳型にし、「Quikchange  II  Site-directed  mutagenesis  kit」(アジレントテクノロジーズ社)を用いて、Aサブユニットのアミノ酸配列中の167位のグルタミン酸をグルタミンに置換し、同170位のアルギニンをロイシンに置換した変異体（以下「E167Q＋R170L」とする。）を発現するプラスミドを作製した。
【００８９】
実施例１と同様の方法で、各プラスミドで大腸菌MV1184株（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、大腸菌を培養し、その1L培養液から菌体を回収して、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eを含有する菌体抽出液を得た。
【００９０】
実施例２と同様の手順で、D-ガラクトースゲル充填カラムを用いて、この菌体抽出液からE167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eを回収した。MgCl2を除去する目的でPBSに透析し、遠心分離操作を行い、わずかに生じた不溶物を除去した。そして、最終的に得られたタンパク質について、実施例２などと同様の手順で定量した。その結果、1L培養当たりの収量は30.6mgであった。
【実施例６】
【００９１】
実施例６では、実施例２で精製したStx2e、及び、実施例５で精製したE167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eのVero細胞に対する毒性を調べた。
【００９２】
Vero細胞に各Stx2eを各濃度添加し、50％細胞傷害濃度(50％  Cytotoxic  dose；CD50)を調べた。その結果、野生型のStx2eでは1.7pg/mLであったのに対し、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでは6.9μg/mLであった。
【実施例７】
【００９３】
実施例７では、マウスへの致死活性を調べた。
【００９４】
野生型のStx2e、及び、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eを、それぞれ、マウスへ腹腔内接種し、50％致死量（50％  Lethal  dose；LD50）を調べた。
【００９５】
その結果、野生型のStx2eではLD50が50ngであったのに対し、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでは100μgを接種した場合にも死亡例が見られなかった。
【実施例８】
【００９６】
実施例８では、実施例５で精製したE167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eに、ワクチンとしての効果があるかどうか、検証した。
【００９７】
マウス（ICR系、実験開始時6週齢、雌）10匹に、それぞれ、実施例５で精製したE167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eを、3週間間隔で2回、背部皮下に接種し、免疫した。また、対照として、同様のマウス5匹に、それぞれ、アジュバント（0.05％水酸化アルミニウム）のみを、同様に3週間間隔で2回、背部皮下に接種した。
【００９８】
2回目の接種の2週間後に各マウスから採血し、抗体価を測定した。図５は、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでマウスに免疫した際の抗体価を示すグラフである。図５中、「Adjuvant  x2」は対照としてアジュバントを2回接種した場合の結果であることを、「mStx2e  1μgx2」は精製したE167Q＋R170L弱毒変異型Stx2e  1μgを2回接種した場合の結果であることを、それぞれ表し、縦軸（Stx2e  specific  IgG  titer）は抗体価を表す。図５に示す通り、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2e  1μgを2回接種した場合、高い抗体価を示した。
【００９９】
そこで、2回目の接種の3週間後、各免疫マウスを5匹ずつ2群に分け、各群のマウスに、攻撃毒素として、実施例２と同様の方法で精製したStx2eを、それぞれ、1μg、10μgずつ腹腔内投与し、経過を観察した。また、対照群のマウスには、同様に、それぞれ、Stx2eを1μg腹腔内投与し、経過を観察した。なお、攻撃毒素Stx2e  1μgは、LD50値の約20倍量に相当する。
【０１００】
図６は、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでマウスに免疫した後、攻撃毒素Stx2eを投与した場合の生存率を示すグラフである。図６中、横軸は攻撃毒素を投与してからの日数（単位：Day）を、縦軸は生存率（Percent  survival、単位：％）を、それぞれ表し、丸印の折れ線は免疫マウスに攻撃毒素Stx2eを1μg投与した場合の経過日数時における生存率を、三角印の折れ線は同10μg投与した場合の経過日数時における生存率を、×印の折れ線は対照群マウスに攻撃毒素Stx2eを1μg投与した場合の経過日数時における生存率を、それぞれ表す。
【０１０１】
図６に示す通り、免疫マウスに攻撃毒素Stx2eを1μg又は10μg投与した場合、1週間後も全マウスが生存したのに対し、対照群マウスでは、攻撃毒素投与の5日後には全マウスが死亡した。また、免疫マウスでは、攻撃毒素を投与した後、いずれの個体においても、特段の症状は観察されなかった。
【０１０２】
この結果は、例えば、弱毒変異を加えたStx2eを、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて精製することにより、ワクチン製造に充分な量のワクチン用抗原タンパク質を簡易かつ有効に精製できることを示す。
【実施例９】
【０１０３】
実施例９では、Stx2eにおけるジビニルスルホン基への結合領域の絞り込みを試みた。
【０１０４】
上述の通り、シガトキシン2型群タンパク質にはStx2とその数種のバリアントが存在し、いずれも、1つのAサブユニットと5つのBサブユニットで構成されている。そのうち、Stx2とStx2eは、アミノ酸配列において、Aサブユニットで94％、Bサブユニットで84％の相同性を有する。一方、本発明者らの独自の実験により、ジビニルスルホン基を有する担体は、Stx2eとは結合するが、Stx2とは結合しないことが分かった。そこで、AサブユニットとBサブユニットの組み合わせを置換したStx2とStx2eのキメラ毒素を発現させ、Stx2eにおけるジビニルスルホン基への結合領域の絞り込みを試みた。
【０１０５】
図７は、Stx2とStx2eとのキメラ毒素を発現させるために用いた遺伝子配列について、各サブユニットのコード配列の位置及び組み合わせを示した模式図である。図７中、「Stx2e」は野生型のStx2eの遺伝子配列を示し、順に、Stx2eのAサブユニットとStx2eのBサブユニットの各遺伝子が塩基配列上にコードされていることを示す。図７中、「Stx2A2eB」はStx2とStx2eのキメラ毒素の遺伝子配列を示し、順に、Stx2のAサブユニットとStx2eのBサブユニットの各遺伝子が塩基配列上にコードされていることを示す。図７中、「Stx2」は野生型のStx2の遺伝子配列を示し、順に、Stx2のAサブユニットとStx2のBサブユニットの各遺伝子が塩基配列上にコードされていることを示す。図７中、「Stx2eA2B」はStx2とStx2eの別の組み合わせのキメラ毒素の遺伝子配列を示し、順に、Stx2eのAサブユニットとStx2のBサブユニットの各遺伝子が塩基配列上にコードされていることを示す。
【０１０６】
実施例１と同様の方法で、図７に示す4種類の遺伝子配列をプラスミドベクターに挿入して、大腸菌を形質転換し、菌体抽出液を得た。実施例３と同様の手順で、各菌体抽出液とTAR担体とを混合し、洗浄・加熱などの処理を行った後、SDS-PAGEに供した。また、各菌体抽出液について、一次抗体に実施例３と同様の抗Stx2eウサギ血清、又は、抗Stx2ウサギ血清を用いてウエスタンブロットを行った。
【０１０７】
結果を図８に示す。図８は、Stx2とStx2eのキメラ毒素を大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真である。図８中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1は、野生型のStx2e（図７中の「Stx2e」と示された遺伝子配列の組み合わせ）を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン2は、図７中の「Stx2A2eB」と示された遺伝子配列の組み合わせの変異タンパク質を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン3は、野生型のStx2（図７中の「Stx2」と示された遺伝子配列の組み合わせ）を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン4は、図７中の「Stx2eA2B」と示された遺伝子配列の組み合わせの変異タンパク質を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、それぞれ表す。なお、図８中、電気泳動写真の下側の写真は、各レーンに各菌体抽出液を供した場合のウエスタンブロット写真のうち、Bサブユニットの位置を抜き出したものであり、各菌体抽出液中に各タンパク質が発現していたことを示す。レーン1及びレーン2では一次抗体に実施例３と同様の抗Stx2eウサギ血清を、レーン3及びレーン4では一次抗体に抗Stx2ウサギ血清を、それぞれ用いた。
【０１０８】
図８に示す通り、各毒素についてSDS-PAGEを行った結果、レーン１及びレーン2では、それぞれ、Aサブユニット及びBサブユニットの位置に明瞭なバンドが検出されたのに対し、レーン3及びレーン4では、バンドが検出されなかった。
【０１０９】
図７に示す通り、レーン1及びレーン2の発現タンパク質は、BサブユニットがStx2eのBサブユニットで共通しており、レーン3及びレーン4の発現タンパク質は、BサブユニットがStx2のBサブユニットで共通している。従って、この結果は、Stx2eにおけるジビニルスルホン基への結合領域が、Stx2eのBサブユニット内に存在することを示す。
【実施例１０】
【０１１０】
実施例１０では、実施例９の結果に基づき、Stx2eにおけるジビニルスルホン基への結合領域の特定を試みた。
【０１１１】
図９は、本実施例において採用したStx2eとStx2の各Bサブユニットのアミノ酸配列を示す。図９中、「Stx2eB」は本実施例において採用したStx2eのBサブユニットのアミノ酸配列を、「Stx2B」は同Stx2のBサブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ表す。図９において、Stx2eとStx2のアミノ酸配列は、Bサブユニット中、17位、24位、26位、31位、66位、69位、70位などで相違する（69位及び70位はStx2のみ）。なお、配列表中、配列番号１は本実施例において採用したStx2eのBサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号２は同Stx2のBサブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ表わす。
【０１１２】
そこで、実施例１で作製したStx2eを発現するプラスミドについて、上記の各位置のアミノ酸がStx2の同じ位置のアミノ酸に置換されたものを発現するように塩基配列に変異を加え、実施例１と同様の方法で、そのプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、菌体抽出液を得た。実施例３などと同様の手順で、各菌体抽出液とTAR担体とを混合し、洗浄・加熱などの処理を行った後、SDS-PAGEに供した。また、各菌体抽出液について、一次抗体に実施例３などと同様の抗Stx2eウサギ血清を用いてウエスタンブロットを行った。
【０１１３】
同様に、実施例９で作製したStx2を発現するプラスミドについて、上記の各位置のアミノ酸がStx2eの同じ位置のアミノ酸に置換されたものを発現するように塩基配列に変異を加え、実施例１と同様の方法で、そのプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、菌体抽出液を得た。実施例３などと同様の手順で、各菌体抽出液とTAR担体とを混合し、洗浄・加熱などの処理を行った後、SDS-PAGEに供した。また、各菌体抽出液について、一次抗体に実施例９と同様の抗Stx2ウサギ血清を用いてウエスタンブロットを行った。
【０１１４】
結果を図１０及び図１１に示す。
【０１１５】
図１０は、所定位置のアミノ酸を置換した変異Stx2eを大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真である。図１０中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1は、野生型のStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン2は、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギンをアスパラギン酸に変異させたStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン3は、同24位のセリンをアスパラギン酸に変異させたStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン4は、同26位のアルギニンをリシンに変異させたStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン5は、同31位のアスパラギンをセリンに変異させたStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン6は、同66位のリシンをグルタミンに変異させたStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン7は、Bサブユニットのアミノ酸配列中の末端に69位のアスパラギンと70位のアスパラギン酸を付加したStx2eを発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、それぞれ表わす。
【０１１６】
図１１は、所定位置のアミノ酸を置換した変異Stx2を大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真である。図１１中、レーンMは分子量マーカーを、レーン1は、野生型のStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン2は、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させたStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン3は、同24位のアスパラギン酸をセリンに変異させたStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン4は、同26位のリシンをアルギニンに変異させたStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン5は、同31位のセリンをアスパラギンに変異させたStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン6は、同66位のグルタミンをリシンに変異させたStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、レーン7は、Bサブユニットのアミノ酸配列中の末端の69位のアスパラギンと70位のアスパラギン酸を削除したStx2を発現させた場合のTAR吸着物を泳動した結果を、それぞれ表わす。
【０１１７】
なお、図１０及び図１１中、電気泳動写真の下側の写真は、各レーンに各菌体抽出液を供した場合のウエスタンブロット写真のうち、Bサブユニットの位置を抜き出したものであり、各菌体抽出液中に各タンパク質が発現していたことを示す。
【０１１８】
図１０に示す通り、各変異Stx2eについてSDS-PAGEを行った結果、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギンをアスパラギン酸に変異させたStx2eを発現させた場合（レーン2）、それぞれ、Aサブユニット及びBサブユニットの位置のバンドが他のレーンと比較して不明瞭になった。また、図１１に示す通り、各変異Stx2についてSDS-PAGEを行った結果、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させたStx2を発現させた場合（レーン2）、他のレーンよりも明瞭なバンドが検出された。
【０１１９】
これらの結果は、Stx2eのジビニルスルホン基への結合に、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位のアスパラギンが重要な役割を果たしていることを示す。
【０１２０】
また、本結果は、Stx2を含むStx2e以外のシガトキシン2型群タンパク質についても、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位をアスパラギンに変異させることにより、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて大量精製することが可能であること、即ち、例えば、Bサブユニットのアミノ酸配列中の17位をアスパラギンに変異したシガトキシン2型群タンパク質を人為的に大量発現させた後、ジビニルスルホン基を有する担体を用いて大量精製することにより、そのシガトキシン2型群タンパク質を簡易かつ大量に調製することが可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明に係るシガトキシン2型群タンパク質精製方法のフローの例を示す図。
【図２】実施例２において、D-ガラクトースゲルを用いて回収したStx2e精製物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【図３Ａ】実施例３において、実施例１の菌体抽出液と各ガラクトース担体とを混合した場合における樹脂吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【図３Ｂ】実施例３において、実施例１の菌体抽出液と各ガラクトース担体とを混合した場合における樹脂吸着物のウエスタンブロット写真。
【図４】実施例４において、TARを用いて回収したStx2e精製物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【図５】実施例８において、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでマウスに免疫した際の抗体価を示すグラフ。
【図６】実施例８において、E167Q＋R170L弱毒変異型Stx2eでマウスに免疫した後、攻撃毒素Stx2eを投与した場合の生存率を示すグラフ。
【図７】実施例９において、Stx2とStx2eとのキメラ毒素を発現させるために用いた遺伝子配列について、各サブユニットのコード配列の位置及び組み合わせを示した模式図。
【図８】実施例９において、Stx2とStx2eのキメラ毒素を大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【図９】実施例１０において、該実施例において採用したStx2eとStx2の各Bサブユニットのアミノ酸配列を示す図。
【図１０】実施例１０において、所定位置のアミノ酸を置換した変異Stx2eを大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【図１１】実施例１０において、所定位置のアミノ酸を置換した変異Stx2を大腸菌の形質転換により発現させた際におけるそのTAR吸着物のSDS-PAGE電気泳動写真。
【符号の説明】
【０１２２】
S0  前処理として試料を調製する手順
S1  担体を平衡化する手順
S2  担体に試料を供給し、担体にシガトキシン2型群タンパク質を結合又は吸着させる手順
S3  担体に結合又は吸着したシガトキシン2型群タンパク質を溶出させ、回収する手順
【図１】
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【図９】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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