(57)【要約】【課題】抗体媒介性ニューロパシーを処置するための方法および組成物の提供。【解決手段】抗体媒介性ニューロパシーを治療するための、補体を阻害できる療法、例えば抗Ｃ５抗体の使用を開示する。抗体媒介性ニューロパシーの症候を改善し、かつ回復時間を短縮する別の治療が大いに必要とされている。抗体媒介性ニューロパシーを患う患者を治療する方法および組成物を示す。特定の実施形態では、哺乳動物の抗体媒介性ニューロパシーを治療する方法は、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。【選択図】図１
2014240438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年９月５日に出願された、米国仮出願第６０／８４２，２９６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本出願は、補体を活性化して神経損傷を誘導する抗体媒介性ニューロパシーを治療するための方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、本出願は、抗体媒介性ニューロパシーを治療する治療薬としての、補体カスケード阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ニューロパシーは、末梢神経系の疾患を記述するのに用いられる総称である。末梢ニューロパシーの原因としては、約２００の異なった原因が知られている。ほとんどのニューロパシーは、３つの主要クラスの神経線維のすべてに、様々な程度で影響するが、一部の疾患は１つまたは２つのみに関与し、それゆえ、純粋にまたは主として運動、感覚、または自律性ニューロパシーであると言われる。
【０００４】
ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）は、通常、インフルエンザ様の疾患、またはカンピロバクター小腸炎を含めた他の感染の２から３週間後に発症する、末梢神経系に関与する急性疾患である。それは主として運動ニューロパシーであり、これは、その症候が概ね運動神経の関与に関することを意味する。この疾患が本来、運動性の性質であるのにもかかわらず、最も早い症候は、下肢の麻痺および刺痛感、ならびにそのすぐ後に続く、下肢遠位筋の脱力でありうる。脱力が呼吸筋に及ぶと、危険が生じる。ＧＢＳは、一部の症例では、広範な特定の糖脂質構造に対する抗ガングリオシド自己抗体（ＡＧＡ）を伴う症例の一部と関連しており、さらに、ミエリンタンパク質およびグリコサミノグリカンを含めた他の神経成分に対する抗体を伴う症例とも関連しており、また、他のＧＢＳの症例では、抗体が存在していると推定されているが、まだ正式に同定されていない。
【０００５】
ミラーフィッシャー症候群（ＭＦＳ）はギラン−バレー症候群の亜型であり、症例の５〜１０％の割合を占める。一調査では、年間発生率が人口１０万人当たり０．０９件と推算されている。ＭＦＳは、眼筋麻痺、運動失調、および反射消失の急性のエピソードを特徴とする。抗ＧＱ１ｂガングリオシド抗体が、ＭＦＳの血清学的ホールマークである。上記抗体は、一部の場合には、カンピロバクターリポ多糖との分子類似性を介して産生されうる。現在では、ＭＦＳを有する患者の９０％を十分に超える患者が、上記疾患の急性期の間に抗ＧＱ１ｂ  ＩｇＧ抗体を有することが広く受け入れられている。正常群および他の疾患の対照群における抗ＧＱ１ｂ  ＩｇＧ抗体の完全な不在も等しく重要であり、これはこの疾患の関連に関する高レベルの特異性を示している。抗体価は、臨床症状の発症時でピークに達し、臨床的な回復の経過に従って急速に衰退する。抗ＧＱ１ｂ  ＩｇＧ抗体価は、眼筋麻痺を伴うギラン−バレー症候群を有する一部の患者の急性期血清中でも上昇している。抗ＧＱ１ｂ  ＩｇＧ抗体マーカーは、しばしばＭＦＳの不完全型と考えられる、外眼筋麻痺または小脳性様の運動失調の存在を共通に有する密接に関連した一群の症候群も同定する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＧＡ媒介性の症例を含めたＧＢＳの現行の治療は、静脈免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）、血漿交換、またはこれら両方の組合せである。ＧＢＳのような一部のニューロパシーは、通常、自己限定的な疾患あるが、しばしば徹底的な治療介入が必要である。一部の個体は、残遺障害を有するままにされている。他のニューロパシーは慢性であり、痛みなどの症候のみが治療されている。抗体媒介性ニューロパシーの症候を改善し、かつ回復時間を短縮する別の治療が大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
抗体媒介性ニューロパシーを患う患者を治療する方法および組成物を示す。特定の実施形態では、哺乳動物の抗体媒介性ニューロパシーを治療する方法は、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。
【０００８】
多数のニューロパシーで、神経の特定成分に対する抗体が同定されている。これらの疾患の一部は、ギラン−バレー症候群のミラーフィッシャー亜型などのように、抗ガングリオシドおよび抗糖脂質自己抗体によって媒介されている。ＧＭ１、ＧＭ１（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ１ｂ、ＧａｌＮＡｃ−ＧＭ１ｂ、ＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ−ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、９−Ｏ−アセチルＧＤ１ｂ、ＧＤ３、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｂａ、ＬＭ１、ガラクトセレブロシド、およびＳＧＰＧを含めた広範な糖脂質に対する抗体が炎症性ニューロパシーに関する論文で、症例報告として、そして、より大きなシリーズで報告されている。一実施形態では、哺乳動物のＡＧＡ媒介性ニューロパシーを治療する方法は、抗Ｃ５抗体などの、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。
【０００９】
タンパク質および糖タンパク質を含めた他の神経成分に対する抗体がニューロパシーの原因となることも報告されている。例えば、ミエリン関連糖タンパク質に対するモノクローナルＩｇＭは、抗ＭＡＧ  ＩｇＭ異常タンパク血性ニューロパシーを引き起こす（ＷｉｌｌｉｓｏｎおよびＹｕｋｉ、Ｂｒａｉｎ、２００２年、１２５巻、２５９１〜２６２５頁）。ニューロパシーの症例の一部では、抗体関連の症例で見られるものと類似した病理学的パターンおよび治療反応により、抗体が存在していると推定されているが、推定された抗体の特異性はまだ正式に同定されていない。特定の実施形態では、上記抗体媒介性ニューロパシーが、以下のもの、すなわち、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、急性眼麻痺、失調性ギラン−バレー症候群、咽頭−頚部−上腕型脱力、抗糖脂質抗体を伴う慢性ニューロパシー症候群、抗ＭＡＧ  ＩｇＭ異常タンパク血性ニューロパシー、抗ジシアロシル抗体を伴う慢性感覚失調性ニューロパシー、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ異常タンパク血性ニューロパシー、抗ＧＭ１抗体および抗ＧＭ２抗体を伴う運動ニューロパシー、慢性炎症性脱髄性ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、多病巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）、ならびに多病巣性後天性脱髄性感覚および運動ニューロパシー（ＭＡＤＳＡＭ）のうちの１つまたは複数でありうる。
【００１０】
一部のニューロパシー、例えば遺伝性アミロイドニューロパシーでは、補体の活性化が抗体非依存性でありうる。この疾患では、検出可能な抗体の非存在下において、早期の古典経路活性化マーカーであるＣ１ｑおよびＣ４がアミロイド沈着物中で検出されている（参照により本明細書に組み込まれている、Ｈａｆｅｒ−Ｍａｃｋｏら、Ｊ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒ  Ｎｅｒｖ  Ｓｙｓｔ．、２０００年９月、５巻３号、１３１〜９頁）。これは、古典経路の抗体非依存的な活性化が起こりうること、および補体カスケード阻害剤が、抗体非依存性、補体媒介性のニューロパシーに有効でありうることを示唆している。一実施形態では、哺乳動物の抗体非依存性補体媒介性ニューロパシーを治療する方法は、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本出願の抗体が、古典経路、第２経路、またはレクチン補体経路の活性化を阻害する。特定の実施形態では、前記抗体が補体成分Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９を含む群の任意のメンバーに対する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体がＣ５に対する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体がＣ５切断の阻害剤である。
【００１１】
特定の実施形態では、本出願の補体カスケード阻害剤が、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、抗体、核酸、ＲＮＡｉコンストラクト、核酸類似体、および小分子から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、本出願の抗体が、抗体全体または抗体断片である。特定の実施形態では、前記抗体全体または抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくは抗体断片、ダイアボディ、キメラ化もしくはキメラ抗体もしくは抗体断片、ヒト化抗体もしくは抗体断片、脱免疫化ヒト抗体（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）もしくは抗体断片、完全ヒト抗体もしくは抗体断片、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または、Ｆ（ａｂ’）２からなる群から選択される。
【００１３】
特定の実施形態では、本出願の抗体が、古典経路、第２経路、またはレクチン補体経路の活性化を阻害する。特定の実施形態では、前記抗体が補体成分Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９を含む群の任意のメンバーに対する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体がＣ５に対する抗体である。特定の実施形態では、前記抗体がＣ５切断の阻害剤である。
【００１４】
特定の実施形態では、本出願の抗体がエクリズマブである。特定の実施形態では、前記抗体がパキセリズマブである。特定の実施形態では、エクリズマブを用いた前記治療が長期にわたるものである。特定の実施形態では、パキセリズマブを用いた前記治療が急性のエピソードを治療するステップを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本出願の哺乳動物が、前記抗体を静脈内投与することによって治療する。特定の実施形態では、前記抗体を前記哺乳動物に全身投与する。特定の実施形態では、前記薬剤を前記哺乳動物に局所投与する。
【００１６】
特定の実施形態では、本出願の治療の結果、本出願の哺乳動物の神経損傷が低減する。
【００１７】
特定の実施形態では、抗体依存ニューロパシーによる過度の神経損傷の結果として生じる望ましくない生理的条件を阻害するか、上記生理的条件の量および／または程度を低減するように、本出願の哺乳動物を治療する。特定の実施形態では、前記望ましくない生理的条件が、眼筋麻痺、運動失調、反射消失、筋協調異常、眼筋の麻痺、筋肉の疼痛（ａｃｈｉｎｇ  ｐａｉｎ）、腱反射消失、下肢の麻痺および刺痛感、下肢遠位筋の脱力、垂れ足、下肢全体に及んだ脱力、上肢に及んだ脱力、呼吸筋の脱力、および死亡からなる群から選択される。
【００１８】
特定の実施形態では、本出願の方法の結果、シナプス前運動軸索での細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成が低減する。
【００１９】
特定の実施形態では、本出願の方法の結果、微小終板電位の正常な頻度が回復する。
【００２０】
特定の実施形態では、本出願の方法の結果、神経筋接合部でのシナプス伝達が回復する。
【００２１】
特定の実施形態では、本出願の方法の結果、神経筋接合部における終末部の完全性の喪失が減少する。
【００２２】
別の実施形態では、哺乳動物のギラン−バレー症候群を治療する方法は、抗Ｃ５抗体などの、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。別の実施形態では、哺乳動物のギラン−バレー症候群のミラーフィッシャー亜型を治療する方法は、抗Ｃ５抗体などの、治療有効量の補体カスケード阻害剤を上記哺乳動物に投与するステップを含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
抗体媒介性ニューロパシーを有する哺乳動物を治療する方法であって、治療有効量の補体カスケード阻害剤を該哺乳動物に投与するステップを含む方法。
（項目２）
前記哺乳動物が、抗ガングリオシドまたは抗糖脂質抗体（ＡＧＡ）媒介性ニューロパシーを有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抗体媒介性ニューロパシーが、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、急性眼麻痺、失調性ギラン−バレー症候群、咽頭−頚部−上腕型脱力、抗糖脂質抗体を伴う慢性ニューロパシー症候群、抗ＭＡＧ  ＩｇＭ異常タンパク血性ニューロパシー、抗ジシアロシル抗体を伴う慢性感覚失調性ニューロパシー、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ異常タンパク血性ニューロパシー、抗ＧＭ１抗体および抗ＧＭ２抗体を伴う運動ニューロパシー、慢性炎症性脱髄性ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、多病巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）、ならびに多病巣性後天性脱髄性感覚および運動ニューロパシー（ＭＡＤＳＡＭ）からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記補体カスケード阻害剤が、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物、抗体、核酸、ＲＮＡｉコンストラクト、核酸類似体、および小分子から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記補体カスケード阻害剤が抗体である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗体が、抗体全体または抗体断片である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記抗体全体または抗体断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体もしくは抗体断片、ダイアボディ、キメラ化もしくはキメラ抗体もしくは抗体断片、ヒト化抗体もしくは抗体断片、脱免疫化ヒト抗体もしくは抗体断片、完全ヒト抗体もしくは抗体断片、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または、Ｆ（ａｂ’）２からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記抗体が、古典的補体経路、第２補体経路、またはレクチン補体経路の活性化を阻害する、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体が、補体成分Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９からなる群の任意のメンバーに対する抗体である、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体がＣ５に対する抗体である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体がＣ５切断の阻害剤である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記抗体がエクリズマブである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体がパキセリズマブである、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記治療が長期にわたるものである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記治療が急性のエピソードの治療を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体を静脈内投与することによって、前記哺乳動物を治療する、項目６に記載の方法。
（項目１８）
前記抗体を前記哺乳動物に全身投与する、項目６に記載の方法。
（項目１９）
前記補体カスケード阻害剤を前記哺乳動物に局所投与する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記治療の結果、前記哺乳動物の神経損傷が低減する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記補体カスケード阻害剤が、過度の神経損傷の結果として生じる望ましくない生理的条件を阻害するか、該生理的条件の量および／または程度を低減する、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記望ましくない生理的条件が、眼筋麻痺、運動失調、反射消失、筋協調異常、眼筋の麻痺、筋肉の疼痛、腱反射消失、下肢の麻痺および刺痛感、下肢遠位筋の脱力、垂れ足、下肢全体に及んだ脱力、上肢に及んだ脱力、呼吸筋の脱力、および死亡からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記治療の結果、シナプス前神経筋接合部での細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の形成が低減する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記治療が微小終板電位の正常な頻度を回復させる、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記治療が神経筋接合部でのシナプス伝達を回復させる、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記治療が神経筋接合部での終末部の完全性の喪失を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
ギラン−バレー症候群を有する哺乳動物を治療する方法であって、治療有効量の補体カスケード阻害剤を該哺乳動物に投与するステップを含む方法。
（項目２８）
前記哺乳動物が、ギラン−バレー症候群のミラーフィッシャー亜型を有する、項目２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおける、ＮＭＪでのＭＡＣ沈着および終末運動軸索障害に対するエクリズマブの保護効果に関する免疫組織学的実証を示す図である。マウス半横隔膜標本を抗ＧＱ１ｂガングリオシドｍＡｂであるＣＧＭ３（５０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートし、その後、エクリズマブ（抗ヒトＣ５中和ｍＡｂ；１００μｇ／ｍｌ）または非特異的な同アイソタイプ対照ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）を添加した４０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）で処置し、未処理の組織と比較した。図１Ａは、ＮＨＳ／対照ｍＡｂ処置組織（ｐ＝０．１２）のものに類似した神経筋接合部（ＮＭＪ）での強いＣ３ｃ染色を示した、ＮＨＳ／エクリズマブで処置された組織を示す。図１Ｂは、エクリズマブの存在下で細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）染色が観察されなかった（ベースラインに匹敵する強度、ｐ＝０．９２）ことを示し、最終補体の完全阻害を示している。図１Ｃは、神経細線維（ＮＦ）シグナルの存在によって評価した際に、エクリズマブの存在下で、未処理対照におけるベースラインに匹敵する軸索の完全性が保存されたことを示す（ｐ＝０．８０）。図４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆは、ＮＨＳ／対照ｍＡｂ処置と比較した、ＭＡＣ沈着（図４Ｄ）、シナプス周囲シュワン細胞（ｐＳＣ）損傷（図４Ｅ）、および終末運動軸索損傷（図４Ｆ）に対するエクリズマブの保護効果を実証する、ホールマウントの筋におけるＮＭＪの例示的免疫蛍光画像である。ＮＭＪを描写するに、後シナプスニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ；紫色）染色を用いた。中間補体タンパク質Ｃ３ｃ（図４Ｄ）は、ＮＭＪに豊富に沈着したまま残っている。＊ｐ＜０．０１、未処理と異なる；＃ｐ＜０．０１、対照ｍＡｂ処置と異なる；スケールバー＝２０μｍ。
【図２】図２Ａ〜２Ｇは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおいて、ＮＭＪで誘発される電気生理学的および機能的障害からエクリズマブが保護することを示す図である。マウス半横隔膜標本を抗ＧＱ１ｂガングリオシドｍＡｂであるＣＧＭ３（５０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートし、その後、１００μｇ／ｍｌのエクリズマブ（抗ヒトＣ５中和ｍＡｂ）または非特異的な同アイソタイプ対照ｍＡｂを添加した４０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）で処置した。図２Ａは、ＭＥＰＰ頻度として測定された、ＮＭＪにおける自発性の単一素量アセチルコリン放出を示す。エクリズマブは高ＭＥＰＰ頻度の誘発を阻止した（ｐ＜０．００１、ｎ＝５筋肉）。図２Ｂは、エクリズマブ（上側の記録）または対照ｍＡｂ（下側の記録）を添加したＮＨＳとのインキュベーション中に得られた代表的な１秒間の記録を示す。図２Ｃは、ＮＨＳによって誘発された筋繊維の非同期的な単収縮がエクリズマブによって大幅に阻止されたことを示す（ｐ＜０．０１、ｎ＝５筋肉）。図２Ｄは、エクリズマブが「サイレント」なＮＭＪ（すなわち、検出可能なシナプス電気生理シグナルがない）の出現を完全に阻止したことを示す。図２Ｅ、２Ｆ、および２Ｇ用には、半横隔膜筋神経標本を２００μｇ／ｍｌのＣＧＭ３と共にプレインキュベートし、ＮＨＳに添加された、いくつかの濃度のエクリズマブ（０〜１００μｇ／ｍｌ、１濃度当たりｎ＝２〜５筋肉）の防御効果を筋肉収縮力記録実験で観測した。図２Ｅは、エクリズマブ無添加の、または６もしくは１００μｇ／ｍｌのエクリズマブを添加したＮＨＳインキュベーションの開始後０、３０、６０、および９０分に観測した収縮プロフィールの例を示す。各収縮は、４０Ｈｚ、３秒間の横隔神経の最大上電気刺激によって誘発した。図２Ｆは、様々な濃度のエクリズマブを添加したＮＨＳインキュベーション中における、収縮減失の発生を示す。図２Ｇは、エクリズマブと、ＮＨＳインキュベーションの開始後９０分以降における収縮減失に対する保護との濃度効果相関を示す。データポイント全体にわたってボルツマンＳ字曲線を適合させ、それによって７．１μｇ／ｍｌのＥＣ５０が得られた。図２Ａ、２Ｄ、２Ｆ、および２ＧのエラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのエクリズマブ容量反応曲線を示す図である。図３Ａは、エクリズマブの用量の増大の結果、ＮＭＪにおけるＭＡＣ沈着の用量依存的低減がもたらされることを示す。図３Ｂは、神経細線維シグナルを示し、ＰＢＳ処置のベースライン対照と比較して、調査したすべての用量で、エクリズマブが軸索の完全性を保存することを実証する。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＦＳモデルにおける呼吸麻痺が、横隔膜における神経筋伝達のシナプス前遮断の阻害により、エクリズマブによって阻止されることを示す図である。抗ＧＱ１ｂガングリオシドｍＡｂであるＣＧＭ３  １．５ｍｇをマウス（ｎ＝６）に腹腔内注射し、その１６時間後に、１００％正常ヒト血清（ＮＨＳ）０．５ｍｌを補体源として腹腔内注射した。２００μｇのエクリズマブまたは対照ｍＡｂ一用量をＮＨＳ注射のすぐ前に尾静脈に注射した。図４Ａは、ＮＨＳ注射の２時間後における握力分析を示す。エクリズマブは、対照ｍＡｂ群で観測された牽引力の減失を阻止した（ｐ＜０．０１）。図４Ｂは、平均の１回呼吸量を示し、図４Ｃは、ＮＨＳ注射前、ならびにＮＨＳ注射後の２番目、４番目、および６番目の１時間における、全身プレチスモグラフィーで測定された呼吸速度を示す。エクリズマブによって呼吸困難の発症が阻止された。図４Ｄは、エクリズマブ処置マウスおよび対照ｍＡｂ処置マウスで得られた、プレチスモグラフィーシグナルの１秒間の記録の例を示す。図４Ｅおよび図４Ｆは、それぞれ単一および４０Ｈｚの電気的神経刺激によって、切り出された横隔膜筋で誘発された単収縮力および強縮力を示す。エクリズマブは、対照ｍＡｂ処置マウスの筋で観察された重度な麻痺を完全に阻止した（ｐ＜０．０１）。図４Ｇは、これらのマウスで、エクリズマブが「サイレント」なＮＭＪ（すなわち、検出可能なシナプス電気生理シグナルがない）の出現をほぼ完全に阻止したことを示す（ｐ＜０．００１）。図４Ｈは、エクリズマブ処置マウス（上側の記録）または対照ｍＡｂ処置マウス（下側の記録）の筋のＮＭＪで得られた１秒間の代表的記録を３０重ねたものを示す。これらの図の棒グラフにおけるエラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＦＳマウスの横隔膜組織におけるＮＭＪの形態分析を示す図である。抗ＧＱ１ｂガングリオシドｍＡｂであるＣＧＭ３  １．５ｍｇでマウスに受動免疫処置を施し、その１６時間後に、１００％正常ヒト血清０．５ｍｌ（腹腔内）と、エクリズマブまたは対照ｍＡｂ（静脈内；２００μｇ）とを同時注射した。図５Ａおよび５Ｂは、エクリズマブ処置マウスおよび対照ｍＡｂ処置マウスの両方の神経筋接合部（ＮＭＪ）でＣ３ｃおよび細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）沈着が低減することを示す（ｐ＜０．０１）。図５Ｃは、神経細線維（ＮＦ）シグナルが、エクリズマブ処置マウスの筋のＮＭＪで、対照と比較して有意に大きいことを示す（ｐ＜０．０１）。図５Ｄおよび５Ｅは、ホールマウントの筋におけるＮＭＪの例示的免疫蛍光画像に示す。ＮＭＪを描写するに、後シナプスニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ；紫色）染色を用いた。図５Ｄは、Ｃ３ｃおよびＭＡＣの沈着をさらに示す。図５Ｅは、ＮＦ完全性およびＭＡＣ沈着をさらに示す。図５Ｆは、緊密に充填されたシナプス小胞と、平行なクリステを有する高電子密度のミトコンドリアとを有する、エクリズマブで保護された神経終末の電子顕微鏡写真である。対照ｍＡｂ処置マウスのＮＭＪでは、神経終末は、まばらなシナプス小胞と膨張したミトコンドリアとを有し、電子透過性である。＃ｐ＜０．０１、対照ｍＡｂ処置と異なる。図５Ｄおよび５Ｅのスケールバー＝２０μｍ；図５Ｆのスケールバー＝１μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
概要
本明細書では、補体阻害剤を用いた抗体媒介性ニューロパシー患者の治療が神経損傷を減弱させるであろうと提唱されている。例えば、上記抗体媒介性ニューロパシーは、ＡＧＡ媒介性ニューロパシーでありうる。補体カスケードの構成要素の阻害剤には、例えば、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９などの成分に対する抗体が含まれる。特定の実施形態では、本出願は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの、Ｃ５の切断を阻害することが知られている抗Ｃ５抗体であるエクリズマブ（抗体全体）の使用を企図している。そのような阻害剤を用いた患者の治療は、それによって補体媒介性の神経損傷を低減する。エクリズマブは臨床試験で使用されており、副作用が最小限であり、十分に許容されることが見出されている。参照によりその内容が本明細書に明確に組み込まれている米国特許第６３５５２４５号およびＨｉｌｌｍｅｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３５０巻、５５２〜５５９頁（２００４年）を参照のこと。
【００２５】
補体系
補体系は、細胞性およびウイルス性の病原体の侵入に対して防御するために、身体の他の免疫系と協働して作用する。少なくとも２５種の補体タンパク質が存在し、それらは、血漿タンパク質および膜補因子の複雑な収集物として見出されている。血漿タンパク質（それらはリンパ液、骨髄液、滑液、および脳脊髄液などの他のほとんどの体液中でも見出されている）は、脊椎動物の血清中のグロブリンの約１０％を占める。補体成分は、一連の、複雑ではあるが正確な酵素的切断事象および膜結合事象における相互作用によって、それらの免疫防衛的な機能を達成する。その結果である補体カスケードは、オプソニン機能、免疫調節機能、および分解機能を有する産物の産生をもたらす。
【００２６】
補体カスケードは、古典的経路または第２経路を介して進行する。これらの経路は多くの構成成分を共有し、それらは、それらの早期のステップで相違しているが、両方とも、標的細胞およびウイルスの破壊の原因となる同じ最終補体成分に収束し、それらを共有している。
【００２７】
古典的補体経路は、通常、標的細胞表面の抗原部位の抗体認識、およびそれへの結合によって開始される。この表面結合抗体は、その後、補体の最初の成分であるＣ１と反応する。そのように結合したＣ１は、１セットの自己触媒反応を行い、それは、とりわけ、補体成分Ｃ２およびＣ４に作用するＣ１のタンパク質分解活性の誘導をもたらす。
【００２８】
この活性化されたＣ１は、Ｃ２およびＣ４を、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ、およびＣ４ｂに切断する。Ｃ２ｂの機能に関しては、乏しい理解しか得られていない。Ｃ２ａおよびＣ４ｂは結合して、Ｃ４ｂ，２ａ複合体を形成し、それは、古典経路のＣ３コンバターゼとして知られている活性プロテアーゼである。Ｃ４ｂ，２ａは、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断する作用を有する。Ｃ３ａおよびＣ４ａは両方とも、肥満細胞の顆粒消失を誘導して、その結果ヒスタミンおよび他の炎症媒介因子の放出をもたらしうる比較的弱いアナフィラトキシンである。
【００２９】
Ｃ３ｂは複数の機能を有する。オプソニンとして、それは細菌、ウイルス、他の細胞、および粒子に結合し、それらに、循環系から除去するための目印を付ける。Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂ，Ｃ２ａと複合体を形成して、Ｃ４ｂ，２ａ，３ｂ、すなわち古典経路のＣ５コンバターゼを産生することもできる。Ｃ４ｂ，２ａ，３ｂは、Ｃ５をＣ５ａ（別のアナフィラトキシン）およびＣ５ｂに切断する。別のＣ５コンバターゼは、Ｃ３ｂ，Ｂｂ，Ｃ３ｂであり、同じ機能を行う。Ｃ５ｂは、Ｃ６と結合してＣ５ｂ，６を産生し、この複合体がＣ７と結合して、三重複合体であるＣ５ｂ，６，７を形成する。Ｃ５ｂ，６，７複合体は、細胞膜表面でＣ８と結合する。Ｃ９の結合で、完全な細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）が形成され（Ｃ５ｂ〜９）、それが外来細胞、微生物、およびウイルスの溶解を媒介する。
【００３０】
古典的補体経路に関するさらなる考察、および補体活性化の第２経路に関する詳細な記述は、例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、５７巻、３２１〜４７頁を含めた多数の出版物で見出すことができる。
【００３１】
補体カスケードの阻害剤
特定の実施形態では、補体阻害剤は、小分子（分子量が最大６０００Ｄａまで）、核酸もしくは核酸類似体、ペプチド模倣物、または核酸でも、タンパク質でもない高分子でありうる。これらの薬剤には、有機小分子、ＲＮＡアプタマー、Ｌ−ＲＮＡアプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、アンチセンス化合物、２本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ロックト核酸阻害剤（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、およびペプチド核酸阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
特定の実施形態では、補体阻害剤は、タンパク質またはタンパク質断片でありうる。ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ４６、ならびにＣ８およびＣ９の他の阻害剤を含めた、補体カスケードを阻害するタンパク質が知られている（米国特許第６１００４４３号参照）。補体受容体として知られているタンパク質、および補体に結合するタンパク質も知られている（国際公開第９２／１０２０５号および米国特許第６０５７１３１号参照）。可溶性型の補体受容体、例えば可溶性ＣＲ１の使用は、好中球の酸化バースト、補体媒介性神経損傷、ならびにＣ３ａおよびＣ５ａの産生などの、補体活性化の帰結を阻害することができる。上記のものは、補体およびその活性化を阻害する既知な方法のすべてではないが一部として当業者に認識されている。
【００３３】
特定の実施形態では、補体阻害剤は、ＭＡＣの形成を遮断できる抗体など、補体を阻害できる抗体でありうる。例えば、抗体補体阻害剤には、抗Ｃ５抗体が含まれうる。そのような抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ｂの形成および／または生理学的機能を阻害するように、Ｃ５および／またはＣ５ｂに直接相互作用するものでありうる。
【００３４】
適した抗Ｃ５抗体は、当業者に知られている。活性化された補体の個々の構成成分に対する抗体、例えばＣ７およびＣ９などに対する抗体を作製することができる（例えば、米国特許第６５３４０５８号、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８７号、および米国特許第５６６０８２５号を参照）。米国特許第６３５５２４５号は、Ｃ５に結合して、Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害し、それによって、Ｃ５ａのみでなく、下流の補体成分の形成も低減する抗体を教示する。
【００３５】
体液中におけるＣ５ａおよびＣ５ｂの濃度および／または生理学的活性は、当技術分野でよく知られている方法で測定することができる。Ｃ５ａに関しては、そのような方法に、走化性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡが含まれる（例えば、ＷａｒｄおよびＺｖａｉｆｌｅｒ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、１９７１年３月、５０巻３号、６０６〜１６頁；Ｗｕｒｚｎｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、８巻、３２８〜３４０頁、１９９１年）。Ｃ５ｂに関しては、本明細書に論じる溶血アッセイまたは可溶性Ｃ５ｂ〜９のアッセイを用いることができる。当技術分野で知られている他のアッセイも用いることができる。１）本出願の実施に有用な化合物を同定するため、および２）そのような化合物の適切な用量レベルを決定するために、これら、または他の適したタイプのアッセイを用いて、抗Ｃ５抗体などの、補体を阻害できる現在既知であるか、後で同定される候補抗体をスクリーニングすることができる。
【００３６】
Ｃ５ｂに影響を与える抗Ｃ５抗体など、補体を阻害できる抗体は、患者の少なくとも１種の血液由来の体液に存在しているＣ５ｂレベルに、上記体液中の補体を活性化させた後に実質的な低減（すなわち、抗Ｃ５抗体の非存在下のものと比較して、少なくとも約２５％の低減）を与える濃度で用いることが好ましい。そのような濃度は、上記体液中に存在している補体の細胞溶解能力（例えば溶血活性）または上記体液中に存在している可溶性Ｃ５ｂ〜９のレベルを測定することによって好都合に決定できる。したがって、Ｃ５ｂに影響を与える抗体の具体的な濃度の１つは、患者の血液由来の体液の少なくとも１つに存在する補体の細胞溶解能力に実質的な低減（すなわち、少なくとも約２５％の低減）をもたらすものである。患者の体液中に存在する補体の細胞溶解能力の低減は、例えば、ＫａｂａｔおよびＭａｙｅｒ（編集）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、１３５〜２４０頁、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，  ＩＬ、ＣＣ  Ｔｈｏｍａｓ（１９６１年）、１３５〜１３９頁に記載の溶血アッセイなどの従来の溶血アッセイ、または下記に記載のニワトリ赤血球溶血法などの、上記アッセイの従来の変法など、当技術分野でよく知られている方法で測定することができる。
【００３７】
抗Ｃ５抗体などの、補体を阻害できる特異抗体は、比較的特異的であり、早期の補体成分の機能を遮断しない。詳細には、そのような特異的薬剤は、補体成分Ｃ３ｂに関連したオプソニン化機能を実質的に損なわないであろう。オプソニン化機能は、外来の粒子および物質を身体から除去する手段を提供する。
【００３８】
Ｃ３ｂは、Ｃ３の切断によって生成され、それは、古典経路および／または第２経路のＣ３コンバターゼによって行われ、その結果、Ｃ３ａおよびＣ３ｂの両方の産生がもたらされる。したがって、Ｃ３ｂに関連したオプソニン化機能を損なわないためには、抗Ｃ５抗体などの、Ｃ３の下流の補体を阻害できる特異的抗体は、患者の体液（例えば血清）中の補体成分Ｃ３の、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへの切断を実質的に妨げないものである。Ｃ３の切断のそのような妨害は、Ｃ３コンバターゼの作用によって等モル比で産生されるＣ３ａおよび／またはＣ３ｂの体液レベルを測定することによって検出できる。補体を阻害できる抗体によって切断が妨害される場合、Ｃ３ａおよびＣ３ｂレベルが低減するであろう（抗Ｃ５抗体などの、補体を阻害できる抗体を含有しない適合試料と比較して）ので、そのような測定は有益である。
【００３９】
実際、Ｃ３ａは流動相に残留するが、Ｃ３ｂは迅速に除去されるので、そのような切断の定量測定は、通常、体液Ｃ３ｂレベルの測定ではなく、体液Ｃ３ａレベルの測定によって行う場合に、より正確である。体液中のＣ３ａレベルは、当技術分野でよく知られている方法によって、例えば市販のＣ３ａ  ＥＩＡキット、例えばＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ（Ｃａｌｉｆ．）所在のＱｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社販売のものを製造業者の指示に従って使用することなどによって測定できる。抗Ｃ５抗体などの、補体を阻害できるとりわけ特異的な抗体は、そのようなアッセイで試験された際に、補体活性化の後に、体液Ｃ３ａレベルの低減を本質的に生まないものである。
【００４０】
本開示の特定の抗体は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂを形成するための、Ｃ５の切断を阻止し、それによって、Ｃ５ａに関連したアナフィラトキシン活性の産生を阻止し、かつＣ５ｂに関連した細胞膜傷害複合体の構築を阻止するであろう。上記に論じた通り、特定の実施形態では、これらの抗Ｃ５抗体がＣ３ｂの作用に関連したオプソニン化機能を損なわないであろう。
【００４１】
補体活性を阻害する好ましい方法は、補体Ｃ５に結合し、かつその切断を阻害するモノクローナル抗体を用いることである。これは、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの両方の形成を低減し、一方で、同時に、レシピエントに有益であるＣ３ａおよびＣ３ｂの形成を可能にする。ヒト補体に特異的なそのような抗体は公知である（米国特許第６３５５２４５号）。米国特許第６３５５２４５号に開示されたこれらの抗体には、好ましい抗体全体（現在、エクリズマブと命名されている）が含まれる。マウスＣ５に対する類似の抗体は、ＢＢ５．１と呼ばれる（Ｆｒｅｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ．、１巻、１４１〜１４９頁（１９８７年））。補体活性を阻害する抗体は、モノクローナル抗体である必要はない。それらは、例えば、ポリクローナル抗体でありうる。加えて、それらは抗体断片でもよい。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、およびＦｖが含まれるが、これらに限定されない。さらに、抗体はヒト化（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５頁（１９８６年））、キメラ化、または脱免疫化できることが、当業者にはよく知られている。本開示で使用する抗体は、これらのうちのいずれでもよい。ヒト化抗体を用いることが好ましい。
【００４２】
特定の実施形態では、本開示の治療薬は抗体または抗体断片を含む。抗体およびそれらの断片は、本明細書に記載の方法など、いかなる従来の方法で作製してもよい。抗体は、複数の形態、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどで見出される。加えて、抗体は多数の方法で構築することができる。それらは、一本鎖抗体（ＳＭＩＰ（商標）（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が含まれる）、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片などとして作製できる。抗体は、ヒト化抗体、キメラ化抗体、脱免疫化抗体、または完全ヒト抗体でありうる。多数の出版物が、多くのタイプの抗体、およびそのような抗体を構築する方法を記載している。例えば、米国特許第６３５５２４５号、第６１８０３７０号、第５６９３７６２号、第６４０７２１３号、第６５４８６４０号、第５５６５３３２号、第５２２５５３９号、第６１０３８８９号、および第５２６０２０３号を参照のこと。
【００４３】
本発明は、抗Ｃ５抗体の断片を提供し、それは、完全な抗体の一部、好ましくは完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含みうる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻、１０５７〜１０６２頁（１９９５年））；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００４４】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一な抗原結合断片と、その名が容易に結晶化するその能力を反映している、残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。抗体のペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原の架橋結合が可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【００４５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片を指す。この領域は、緊密に非共有会合している１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それは、各可変ドメインの３つＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面にある抗原結合部位を定める立体配置にある。集合的に、これら６つのＣＤＲが抗原結合の特異性を抗体に与える。しかし、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和性である可能性が高いが、抗原を認識して、結合する能力を有する。
【００４６】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有している。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含めた、重鎖ＣＨ１ドメインカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂ断片と相違している。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書における、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それぞれの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００４７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、その際、これらのドメインは単一ペプチド鎖で存在している。Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。ｓｃＦｖの概説には、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編集（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年）、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２６９〜３１５頁を参照。
【００４８】
ＳＭＩＰは、標的結合領域およびエフェクタードメイン（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含むように構築された一本鎖ペプチドの１クラスである。例えば、米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号を参照。上記標的結合領域は、抗体、例えば本出願の抗Ｃ５抗体の可変領域またはＣＤＲに由来するものでありうる。別法では、上記標的結合領域が、Ｃ５に結合するタンパク質に由来する。
【００４９】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、それらの断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に含む。同一鎖上の２つのドメイン間における対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、上記ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を形成することが強いられる。ダイアボディに関しては、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に、より完全に記載されている。
【００５０】
分子（または病原体）への、Ｆｃ領域を有する抗体の結合は、上記分子（または病原体）のプロセッシングおよび除去の助けとなることがよく知られている。抗体のＦｃ部分は、免疫エフェクター細胞によって発現される専門化した受容体によって認識される。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体のＦｃ部分は、マクロファージおよび好中球などの食細胞の表面に存在するＦｃ受容体によって認識され、それらの食細胞は、それによって、これらのアイソタイプの抗体でコーティングされている分子または病原体に結合して、貪食することができる（Ｃ．  Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５版、１４７頁、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年））。
【００５１】
この開示は、モノクローナル抗Ｃ５抗体も提供する。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、微量に存在しうる潜在的な天然存在の変異を除いて、この集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得ることができる。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して産生されたものである。さらに、通常、様々な決定基（エピトープ）に対して産生された様々な抗体を含有する従来（ポリクローナル）の抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して産生されたものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、しばしば他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養物で合成される点で有利である。モノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞などの形質移入細胞でも産生できる。「モノクローナル」という修飾語は、それらの抗体が、抗体の実質的に均質な集団から得られるという性質を示し、それらの抗体の産生がなんらかの特定の方法によるものである必要はない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号および第６３３１４１５号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、６２４〜６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻、５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載の技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００５２】
特定の結合特性を有するマウス抗ヒトＣ５モノクローナル抗体の調製に関する記載は、米国特許出願公開第２００５０２２６８７０号に提示されている。Ｗｕｒｚｎｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、８巻、３２８〜３４０頁（１９９１年）は、Ｎ１９−８およびＮ２０−９と呼ばれる他のマウス抗ヒトＣ５モノクローナル抗体の調製について記載している。
【００５３】
明確に企図されている他の抗体は、「オリゴクローナル」抗体である。本明細書で使用される場合、「オリゴクローナル」抗体という用語は、異なったモノクローナル抗体の所定の混合物を指す。例えば、国際公開第９５／２０４０１号、米国特許第５７８９２０８号、および第６３３５１６３号を参照。一実施形態では、１つまたは複数のエピトープに対する抗体の所定の混合物からなるオリゴクローナル抗体を単一細胞内で産生する。他の実施形態では、オリゴクローナル抗体が、共通の軽鎖と対形成して、複数の特異性を有する抗体を産生できる複数の重鎖を含む（例えば、国際公開第０４／００９６１８号を参照）。オリゴクローナル抗体は、単一標的分子（例えばＣ５）上の複数のエピトープを標的とすることが望ましい場合に特に有用である。本明細書に開示のアッセイおよびエピトープに照らして、当業者は、意図されている目的および所望の必要性に適切である抗体または抗体の混合物を産生または選択することができる。
【００５４】
ヒト化抗体および／またはキメラ抗体を含めた特定の実施形態では、ＣＤＲの１つまたは複数が抗ヒトＣ５抗体に由来する。特定の一実施形態では、ＣＤＲのすべてが抗ヒトＣ５抗体に由来する。別の特定の実施形態では、複数の抗ヒトＣ５抗体に由来するＣＤＲを１つのキメラ抗体内に混成および適合させる。例えば、キメラ抗体は、第２の抗ヒトＣ５抗体の軽鎖からのＣＤＲ２およびＣＤＲ３に結合した、第１の抗ヒトＣ５抗体の軽鎖からのＣＤＲ１を含むものでありえ、かつその重鎖のＣＤＲが第３の抗ヒトＣ５抗体に由来するものでありうる。さらに、フレームワーク領域は、複数の同一な抗ヒトＣ５抗体の１つに由来するものでも、ヒト抗体などの１つまたは複数の異なった抗体に由来するものでも、ヒト化抗体に由来するものでもよい。ヒト抗体またはヒト化抗体は、ヒト患者への投与に特有である。
【００５５】
特定の実施形態では、一本鎖抗体、およびキメラ、ヒト化、または霊長類化（ＣＤＲ移植）抗体、ならびに異なった種に由来する部分を含むキメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体も、抗体の抗原結合性断片として本開示に包含される。これらの抗体の様々な部分は、従来の技法によって化学的に連結することができ、または遺伝子工学技法を用いて連続したタンパク質として調製することができる。例えば、連続したタンパク質を産生するために、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させることができる。例えば、米国特許第４８１６５６７号および第６３３１４１５号、米国特許第４８１６３９７号、欧州特許第０１２０６９４号、国際公開第８６／０１５３３号、欧州特許第０１９４２７６号、米国特許第５２２５５３９号、ならびに欧州特許第０２３９４００を参照。霊長類化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１４５５〜１４６０頁（１９９２年）も参照のこと。一本鎖抗体に関しては、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４９４６７７８号；およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁（１９８８年）を参照のこと。
【００５６】
加えて、キメラ、ヒト化、霊長類化、または一本鎖抗体の断片を含めた、抗体の機能性断片を産生することもできる。対象とする抗体の機能性断片は、それらが由来する完全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。好ましい機能性断片は、対応する完全長抗体の抗原結合機能（例えば、Ｃ５に結合する抗Ｃ５抗体の能力など）を保持する。
【００５７】
動物の免疫処置（この場合Ｃ５および／またはＣ５ｂを用いた免疫処置など）、抗体産生細胞の単離、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するための不死細胞（例えば骨髄腫細胞）とのそのような細胞の融合、分泌されたモノクローナル抗体の所望の抗原（この場合、免疫原または免疫原を含有する分子）との反応性に関するハイブリドーマ上清のスクリーニング、ハイブリドーマ上清中または腹水液中のそのような抗体の大量調製、ならびにそのようなモノクローナル抗体の精製および貯蔵の一般的方法は、多数の出版物で見出すことができる。これらには、Ｃｏｌｉｇａｎら編集、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ所在、１９９２年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ所在、１９８８年；ＬｉｄｄｅｌｌおよびＣｒｙｅｒ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、英国Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ州Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ所在、１９９１年；Ｍｏｎｔｚら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２７巻、３３７〜３５１頁（１９９０年）；Ｗｕｒｚｎｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、８巻、３２８〜３４０頁（１９９１年）；ならびにＭｏｌｌｎｅｓら、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻、３０７〜３１２頁（１９８８年）が含まれる。
【００５８】
医薬製剤および使用
小分子、タンパク質、および核酸の投与の方法は、当業者にはよく知られている。抗体の投与の方法は、当業者にはよく知られている。所望の阻害を実現するために、様々な単位剤形で抗体を投与することができる。用量は特定の抗体に従って異なるであろう。例えば、異なった抗体は、異なった質量および／または親和性を有し、それゆえ異なった用量レベルを必要としうる。Ｆａｂ断片として調製される抗体も、それらは完全な免疫グロブリンより質量がかなり小さく、それゆえ、患者血液中で同じモルレベルに達するのに必要な用量が、より少ないので、対応する完全な免疫グロブリンとは、必要とする用量が異なるであろう。用量は、投与の方法、治療される患者の特定の症候、患者の総合的健康、状態、サイズ、および年齢、ならびに処方する医師の判断にも応じて異なるであろう。ヒト対象用の上記抗体の用量レベルは、１治療１患者当たり概ね１ｋｇにつき約１ｍｇから、１ｋｇにつき約１００ｍｇまでの間であり、１治療１患者当たり１ｋｇにつき約５ｍｇから、１ｋｇにつき約５０ｍｇまでの間が好ましい。血漿中濃度では、上記抗体の濃度が約２５μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍｌまでの範囲にあることが好ましい。しかし、極めて重症な場合には、より多い量が必要でありえ、より軽症な場合には、よりわずかな量が十分でありうる。
【００５９】
抗Ｃ５抗体の投与は、通常、血管内経路、例えば、注射による静脈注入で行われるであろう。望ましい場合には、投与の他の経路も使用されうるが、静脈内経路が最も好ましいであろう。注射に適した製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（Ｐａ．）所在、第１７版（１９８５年）に見出される。そのような製剤は、無菌かつ非発熱性でなければならず、通常、食塩水、緩衝（例えばリン酸緩衝）食塩水、ハンクス液、リンゲル液、ブドウ糖／食塩水、およびグルコース溶液などの薬学的有効な担体を含有するであろう。上記製剤は、必要に応じて、等張化剤、湿潤剤、殺菌薬、保存剤、および安定化剤などの薬学的に許容できる補助剤を含有しうる。
【００６０】
抗Ｃ５抗体などの補体を阻害できる抗体の投与は、通常、非経口経路によって、典型的には、関節内もしくは血管内注射（例えば静脈注入）、または筋肉内注射など、注射を介して行われるであろう。投与の他の経路（例えば経口（ｐ．ｏ．））も、それが望ましく、かつ投与される、補体を阻害できる特定の抗体に実用的である場合には使用できる。抗Ｃ５抗体などの補体を阻害できる抗体は、様々な単位剤形で投与でき、それらの用量も、投与される、補体を阻害できる特定の抗体のサイズ、効力、およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に応じて異なるであろう。抗Ｃ５抗体などの補体を阻害できる抗体の用量は、投与の方法、治療される患者の特定の症候、患者の総合的健康、状態、サイズ、および年齢、ならびに処方する医師の判断にも応じて異なるであろう。
【００６１】
特定の実施形態では、典型的な治療処置に、通常、臨床エンドポイントのモニタリングと同時に投与されるであろう一連の用量が含まれ、上記用量のレベルが、望ましい臨床成果を実現するのに必要とされるレベルに調整されている。特定の実施形態では、少なくとも１週間にわたって、治療を複数用量施す。特定の実施形態では、少なくとも１カ月にわたって、治療を複数用量施す。特定の実施形態では、少なくとも１年間にわたって、治療を複数用量施す。特定の実施形態では、患者の残りの生涯にわたって、治療を複数用量施す。
【００６２】
投与の頻度も、様々なパラメータに従って調整できる。これらには、臨床反応、開示の治療の血漿内半減期、および血液、血漿、血清、または滑液などの体液中の抗体レベルが含まれる。投与の頻度の調整を導くために、体液中における、本開示の治療薬のレベルを治療経過中にモニターしてもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、投与の頻度を、患者の体液の１つまたは複数に存在する補体の細胞溶解能力を測定するアッセイに従って調整できる。細胞溶解能力は、本明細書に記載したタイプの溶血アッセイにおける溶血のパーセントとして測定できる。本出願の実施に使用される、補体を阻害できる抗体で治療した後の体液中に存在する補体の細胞溶解能力が１０％、２５％、または５０％低減しているとは、治療後の溶血のパーセントが、それぞれ、治療の前の溶血のパーセントの９０、７５、または５０パーセントであることを意味する。
【００６４】
抗Ｃ５抗体などの、補体を阻害できる抗体の全身投与による抗体媒介性ニューロパシーの治療（局所投与とは反対に）には、多量の初期用量の投与、すなわち、患者血清の溶血活性の実質的な低減、より好ましくは少なくとも約５０％の低減をもたらすのに十分な単一初期用量が特有である。そのような多量の初期用量の後に、血清の溶血力価の実質的な低減を維持するのに必要とされる漸減的な用量の定期的の反復投与を行うことが好ましい。別の実施形態では、初期用量が局所経路および全身経路の両方で投与され、その後、上述の通り、漸減的な用量の反復全身投与が行われる。ヒトへの抗Ｃ５抗体の投与に関しては、例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３５０巻、５５２〜５５９頁（２００４年）を参照のこと。Ｈｉｌｌｍｅｎらにおいて投与された抗体のレベルは、抗体の半減期に基づいていており、ニューロパシーの治療などの他の適用のための、抗Ｃ５抗体の投与にも妥当である。
【００６５】
抗体ベースの治療薬にとりわけ有用な製剤は、米国特許出願公開第２００３０２０２９７２号、第２００４００９１４９０号、および第２００５０１５８３１６号にも記載されている。特定の実施形態では、本出願の液体製剤は、界面活性物質および／または無機塩を実質的に含有しない。別の特定の実施形態では、上記液体製剤が約５．０〜約７．０までの範囲のｐＨを有する。さらに別の特定の実施形態では、上記液体製剤が約１ｍＭから約１００ｍＭまでの範囲の濃度のヒスチジンを含む。上記液体製剤が、糖、アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、およびメチオニン）、およびポリオールなどの１つまたは複数の賦形剤をさらに含むことも企図されている。液体製剤の調製および分析に関するさらなる記載および方法は、例えば、国際公開第０３／１０６６４４号、国際公開第０４／０６６９５７号、および国際公開第０４／０９１６５８号に見出すことができる。
【００６６】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、  調味料および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も、本出願の医薬組成物中に存在しうる。
【００６７】
特定の実施形態では、対象とする抗体の製剤は、エンドトキシンおよび／または関連の発熱性物質を実質的に含有しない無発熱物質製剤である。エンドトキシンには、微生物の内部に包含され、かつ上記微生物が破砕されるか、または死亡した際に放出される毒素が含まれる。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性熱安定物質（糖タンパク質）も含まれる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与された際に、発熱、低血圧、およびショックを引き起こしうる。潜在的有害効果のため、静脈内投与される医薬品溶液からは、低量のエンドトキシンさえ除去するのが有利である。米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、１時間の静脈内薬物投与１回における上限を、１キログラム体重当たり、１用量当たり５エンドトキシン単位（ＥＵ）に設定した（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ、２６巻１号、２２３頁（２０００年））。モノクローナル抗体を用いた場合にありうるように、１キログラム体重当たり数百または数千ミリグラムの量で治療用タンパク質を投与する場合、痕跡量のエンドトキシンさえ除去するのが有利である。
【００６８】
対象とする抗体の製剤には、経口、食餌、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、眼科（例えば局所的または眼内）、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、または経口吸入、鼻腔内ドロップ）、直腸、および／または腟内投与に適したものが含まれる。投与の他の適した方法には、再充填可能または生分解性装置、および調節放出重合体装置も含まれうる。ステントは、とりわけ、本出願の薬剤と混合された調節放出重合体でコーティングされたものでありうる。本開示の医薬組成物は、他の薬剤と共に組合せ療法の一部として投与することができる（同一製剤中または別々の製剤中のいずれかで）。
【００６９】
治療上有効であろう製剤量は、標準的な臨床技法によって決定できる。加えて、最適用量範囲を特定するのを補助するために、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行うこともできる。上記製剤で用いられるべき正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重度にも依存するであろう。そして、これは医師の判断と、各患者の病状とに従って決定するべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの検査系から得られた用量反応曲線から推定することができる。投与される組成物の用量は、過度の実験をしないでも、標準的な用量反応性試験と併せて、当業者が決定できる。それらの決定を行う際に考慮するべき重要な状況には、治療するべき１つまたは複数の状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症候の重度が含まれる。例えば、投与される製剤の用量をミリリットル（ｍＬ）で計算するために、実際の患者体重を用いることができる。「理想的」体重への下方修正があってはいけない。そのような状況で、以下の数式、すなわち、用量（ｍＬ）＝［患者体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）／薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）］によって、適切な用量を計算できる。
【００７０】
望ましい治療成果を実現するために、抗Ｃ５抗体を様々な単位剤形で投与することができる。用量は特定の抗体に従って異なるであろう。例えば、異なった抗体は、異なった質量および／または親和性を有し、それゆえ異なった用量レベルを必要としうる。Ｆａｂ’断片または一本鎖抗体として調製される抗体も、それらは天然の免疫グロブリンより質量がかなり小さく、それゆえ、患者血液中で同じモルレベルに達するのに必要な用量が、より少ないので、対応する天然の免疫グロブリンとは、必要とする用量が異なるであろう。
【００７１】
本開示の他の治療薬も、様々な単位剤形で投与することができ、それらの用量も、投与される特定の治療薬のサイズ、効力、およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に応じて異なるであろう。
【００７２】
本開示の治療薬の用量は、投与の方法、治療される患者の特定の症候、患者の総合的健康、状態、サイズ、および年齢、ならびに処方する医師の判断にも応じて異なるであろう。
【００７３】
本出願の製剤は、包装材料、ならびに上記補体を阻害できる抗体と、投与の方法に適した薬学的に許容できる担体とを含む薬剤を含む製造物品として配付することができる。上記包装材料には、上記製剤が抗体媒介性ニューロパシーの治療に使用するためのものであることを示す標識が含まれうる。抗Ｃ５抗体は安全であり、かつヒトの下流補体成分の蓄積を低減するのに有効であることが既に示されており、抗体、とりわけ抗Ｃ５抗体が好ましいが、他の補体阻害剤の使用も、本開示に企図されている。本開示の医薬製剤および使用は、いかなる既知な補体阻害剤または当技術分野で知られている抗体媒介性ニューロパシー治療（上記）とも併用できる。
【００７４】
治療の方法
本出願の方法は、抗体媒介性ニューロパシー関連した症候を治療するのに使用できる。例えば、本出願の方法は、ＡＧＡ媒介性ニューロパシーの症候を治療するのに使用できる。本出願の方法は、ギラン−バレー症候群に関連した症候を治療するのに使用できる。抗体媒介性ニューロパシーの治療は、標準的な手段によって施すことができる。本出願の治療は、本出願の他の治療または抗体媒介性ニューロパシーの既知な治療と併用できる。本出願の治療は、抗体媒介性ニューロパシーの症候を治療する他の治療と同時投与できる。本開示の治療薬の投与は、通常、非経口経路によって、典型的には、関節内もしくは血管内注射（例えば静脈注入）、または筋肉内注射など、注射を介して行われるであろう。投与の他の経路（例えば経口（ｐ．ｏ．））も、それが望ましく、かつ投与される、補体を阻害できる特定の抗体に実用的である場合には使用できる。
【００７５】
参照による組込み
本明細書で言及されたすべての出版物および特許を、個々の出版物または特許のそれぞれが、参照により組み込まれると明確かつ個別的に示されているのと同じように、参照により全体として本明細書に組み込む。矛盾がある場合には、本明細書中のいかなる定義も含めた本出願が統制するであろう。
【００７６】
上記の方法を、下記の実施例を参照して説明する。実施例は、例として示されており、いかなる意味でも本開示を限定するものではない。当技術分野でよく知られている標準技法、または下記に具体的に記載する技法が使用される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
エクリズマブはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおける補体媒介性の構造的および機能的障害を予防する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおいて、エクリズマブの陰性対照として働く無関係な同アイソタイプのｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で、横隔膜神経筋標本をＣＧＭ３抗ＧＱ１ｂ  ｍＡｂおよび正常ヒト血清（ＮＨＳ）で処置すると、ＮＭＪで補体活性化が誘導される。これは、Ｃ３ｃおよびＭＡＣの沈着（図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆ）によって、そして、それぞれエチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）染色および神経細線維（ＮＦ）染色の減失によって示される損傷したシナプス周囲シュワン細胞（ｐＳＣ）および運動神経終末（図１Ｃ、１Ｅ、および１Ｆ）によって、形態学的に証明された。これらの特徴は以前に報告されたものと同じであった（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年）；Ｈａｌｓｔｅａｄら、Ｂｒａｉｎ、１２７巻、２１０９〜２１２３頁（２００４年）；Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））。補体源として１００μｇ／ｍｌのエクリズマブをＮＨＳに添加したところ、ＭＡＣ沈着（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆ；ｐ＜０．００１）および終末軸索でのＮＦ減失（図１Ｃおよび１Ｆ；ｐ＜０．００１）が完全に阻止されたが、より早期の補体成分であるＣ３ｃの沈着は影響を受けなかった（図１Ａおよび１Ｄ；ｐ＝０．２）。さらに、１つまたは複数のＥｔｈＤ−１陽性核を有していたのは、対照ｍＡｂで処置された組織で調査された１５２９のＮＭＪの３３％と比較して、調査された１４３９のＮＭＪの２％のみであったので、ｐＳＣの損傷が消失した（図１Ｅ；ｐ＜０．００１）。
【００７８】
これらの免疫組織学的観察は、電気生理学的および機能的観察と並行して行った。以前に観察された通り、ＣＧＭ３と共にプレインキュベートされたＮＭＪでは、対照ｍＡｂの存在下におけるＮＨＳ（４０％）によって、微小終板電位（ＭＥＰＰ、シナプス前運動神経終末からの単一アセチルコリン素量の自発性放出から生じるシナプス後事象）の頻度の大きな増大が誘導された（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年））。この影響は、１００μｇ／ｍｌのエクリズマブによってほぼ完全に阻止された。ＭＥＰＰ頻度は、５０μｇ／ｍｌ  ＣＧＭ３インキュベーションの前後には、約０．７ｓ−１であり、１００μｇ／ｍｌの対照ｍＡｂが添加されたＮＨＳの存在下では３４．０±４．６ｓ−１に上昇した。対照的に、１００μｇ／ｍｌのエクリズマブが添加されたＮＨＳの存在下では、ＭＥＰＰ頻度が３．１±１．３ｓ−１でしかなかった（図２Ａおよび２Ｂ；ｎ＝５筋肉；ｐ＜０．００１）。
【００７９】
エクリズマブは、筋繊維静止膜電位またはＭＥＰＰの振幅、上昇時間、および減衰時間を変化させなかった（データは示されていない）。以前に記載されている通り（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年）；Ｐｌｏｍｐら、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．、４５巻、１８９〜１９９頁（１９９９年））、ＮＨＳインキュベーション中には、個々の筋繊維の非同期的な単収縮が起こる（視覚スコアの中央値は４；ｎ＝５筋肉）。エクリズマブは、そのような高度な単収縮を阻止し、若干１のスコアの中央値が観測された（図２Ｃ；ｎ＝５筋肉、ｐ＜０．０１、マン−ホイットニー検定）。これは、ＣＧＭ３インキュベーションの前後の観察時間に観測された低い基底レベルと等しい。
【００８０】
抗ＣＧＭ３／補体媒介性のシナプス前損傷の最終帰結は、アセチルコリンを放出できないことによるＮＭＪでのシナプス伝達の阻害である（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年））。エクリズマブは、この影響を完全に阻止した。「サイレント」なＮＭＪ（すなわち、ＭＥＰＰおよび神経刺激誘発性の筋活動電位の不在）には遭遇しなかった。一方、対照ｍＡｂ条件では、試料抽出されたＮＭＪの総数の１９±２．６％がサイレントになったと観察された（図２Ｄ；ｎ＝５筋肉）。さらに、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおける、筋肉麻痺へのエクリズマブの防御効果を定量化した。エクリズマブは、２００μｇ／ｍｌ  ＣＧＭ３および３３％ＮＨＳ処置の後に、半横隔膜標本の神経刺激誘発性収縮力の減失を濃度依存的な様式で阻害した（図２Ｅおよび２Ｆ）。エクリズマブを含まない対照実験では、ＮＨＳが収縮力のほぼ完全な減失を９０分以内に誘導した。上記ＮＨＳに３μｇ／ｍｌまたは６μｇ／ｍｌのエクリズマブを添加したところ、収縮力減失の速度がかなり減速した（５０％減失は、対照条件での２７分と比較して、それぞれ３９分および６０分に観測された；図２Ｆ）。９および１２μｇ／ｍｌという、より高いエクリズマブ濃度はほぼ完全に保護的であり（９０分後に初期収縮の＞９０％が残っていた）、一方、２５、５０、および１００μｇ／ｍｌは、ＣＧＭ３／ＮＨＳ誘発性のいかなる収縮減失も完全に阻止した。得られた濃度効果データポイント全体にわたって適合されたボルツマンＳ字曲線は、これらの条件下で、７．１μｇ／ｍｌというエクリズマブのＥＣ５０を産した（図２Ｇ）。
【００８１】
これらの免疫組織学的分析および機能的分析は、エクリズマブが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデルにおける補体媒介性の病態生理学的影響を効率的に阻止することを示している。
【００８２】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるエクリズマブの容量反応曲線
次に、ギラン−バレー症候群のこのマウスモデル系における、エクリズマブのｉｎ  ｖｉｖｏでの有益性を検査した。抗ガングリオシド抗体またはＰＢＳ（陰性対照として）でマウスに受動免疫処置を施し、その後、ＮＨＳ（腹腔内）と、０、５０、１００、２００、４００μｇ／マウスのエクリズマブを含むＰＢＳ（静脈内）とを同時注射した。抗ガングリオシド抗体を投与されたすべてのマウスのＮＭＪで補体Ｃ３が豊富に沈着した。エクリズマブの用量の増大は、ＮＭＪにおけるＭＡＣ沈着の用量依存的低減をもたらす（図３Ａ）。神経細線維シグナルの検査は、ＰＢＳで処置されたベースライン対照と比較して、調査されたすべての用量でエクリズマブが軸索の完全性を保存したことを実証している（各用量当たりｎ＝３）（図３Ｂ）。
【００８３】
（実施例３）
エクリズマブはｉｎ  ｖｉｖｏのＭＦＳモデルでニューロパシーおよび呼吸麻痺から保護する
エクリズマブのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を判定するために、本発明者らは、補体源としてＣＧＭ３抗ＧＱ１ｂ抗体およびＮＨＳの腹腔内注射を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＦＳマウスモデルを産生した。ＣＧＭ３注射の１６時間後に、２００μｇのエクリズマブまたは対照ｍＡｂの一用量を、尾静脈を介して全身投与し、その後、０．５ｍｌのＮＨＳを腹腔内注射した。腹腔限局中にＮＨＳ中のＣ５がエクリズマブによって即時に阻害されるのを回避するために、エクリズマブおよびＮＨＳの注射経路が異なっているプロトコールを適用した。ＣＧＭ３、ＮＨＳ、および対照ｍＡｂ（ｎ＝１０）で処置されたマウスは、ＮＨＳ注射の後２時間以内に、全体的に弱った外観、一部の場合には背中が低い姿勢、側腹部の陥入、および呼吸困難（あえぎ呼吸）を発症した。静脈内エクリズマブ注射は、これらの症候の発症を完全に阻止した（ｎ＝１１）。本発明者らは、対照ｍＡｂまたはエクリズマブ、およびＮＨＳの注射前および２時間後における、ＣＧＭ３で前処置されたマウスの握力測定で、脱力を定量化した（図４Ａ）。対照群マウス（ｎ＝５）は、対照ｍＡｂおよびＮＨＳの注射の直前に５６．０±５．７ｇを牽引し、一方、エクリズマブ群のマウス（ｎ＝５）は、この段階で、５４．３±８．４ｇ（ｐ＝０．８７）を牽引した。対照ｍＡｂ／ＮＨＳ注射の２時間後牽引力は、２２％低下していた（４３．７±４．５ｇ；ｐ＜０．００５）。エクリズマブは、そのような影響を寛解させた（８％の低減；ｐ＝０．０７）。呼吸器障害は、ｍＡｂ／ＮＨＳ注射の後、６時間にわたって連続的に、全身プレチスモグラフィーで評価した（図４Ｂおよび４Ｃ；１群当たり、ｎ＝５のマウス）。ＣＧＭ３注射前の１回呼吸量は、両群で同様であった（対照ｍＡｂ群およびエクリズマブ群でそれぞれ０．２１±０．０１および０．２２±０．０３ｍｌ）。対照ｍＡｂ群では、ＮＨＳ注射の４および６時間後に約５０％の低減（ｐ＜０．００１）が観測された。そのような低減は、エクリズマブによって大きく阻止された（これらの時点で１７％のみの低減、図４Ｂ）。同様に、対照ｍＡｂ群では、ＮＨＳ注射の４および６時間後に呼吸速度が約３０％（ｐ＜０．０１）抑制された。エクリズマブ群では、この低減は７％のみであった（図４Ｃ）。ｍＡｂ／ＮＨＳの２時間後に測定した場合、ＣＧＭ３注射前の速度と比較して、両治療群とも、約４０％という等しい、呼吸速度の初期低下を示した。これは、明らかに腹腔内注射措置によるものであった。得られた呼吸シグナルの記録例を図４Ｄに示す。
【００８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＧＭ３／ＮＨＳ処置されたマウスから、ＮＨＳ注射の４時間後に、半横隔膜の横隔神経標本を切り出し、ＮＭＪでの電気生理学的測定、筋肉収縮実験、および詳細な免疫組織学的分析を行った。目視検査は、エクリズマブ処置マウスから得られた筋の完全な収縮と比較して、対照ｍＡｂ処置マウスからの筋では、その非常に小さな部分のみが、横隔神経の最大を超える電気的刺激で収縮したことを示した。受動免疫処置から採取された組織でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ収縮実験で、この影響を定量化した（図４Ｅおよび４Ｆ）。対照ｍＡｂ群（ｎ＝４）では、短収縮性および強縮性（４０Ｈｚ）張力がそれぞれ０．０７±０．０６および０．９２±０．６１ｇであったが、エクリズマブ群（ｎ＝４）では、これらが、それぞれ１．３６±０．２９および９．２６±０．６５ｇであり、ＮＨＳ処置されていない同齢マウスから筋の値に等しかった（データは示されていない）。電気生理学的分析を用いて、本発明者らは、ＮＭＪ機能障害によって麻痺症が引き起こされたかどうか試験した。対照ｍＡｂ群から切り出した筋で、試料抽出されたＮＭＪの６６±７％が「サイレンス」になっていた。すなわち、検出可能なＭＥＰＰも、神経刺激に際した筋活動電位もなかった。エクリズマブ群では、３±２％のみが「サイレンス」になっていた（図４Ｇおよび４Ｈ；ｐ＜０．００１）。免疫組織学的分析は、２つの治療群のＮＭＪで、ＣＧＭ３が等しく沈着したことを示した（データは示されていない）。Ｃ３ｃ沈着物は、エクリズマブ群では強度がいくらか弱かったが、両群のＮＭＪで同定された（図５Ａおよび５Ｄ；ｐ＜０．００１）。ＭＡＣは、対照ｍＡｂ処置マウスからの筋のＮＭＪでは明確に沈着したが、エクリズマブ処置群では実質的に存在しなかった（図５Ｂ、５Ｄ、および５Ｅ）。エクリズマブは、ＮＦシグナルの強度および終板領域に重なるパターン、すなわち終末軸索分岐が明確に完全な状態で残っていることによって証明される通り、対照ｍＡｂ処置マウスのＮＭＪにおける終末部の完全性の喪失を阻止した（図５Ｃおよび５Ｅ）。加えて、電子顕微鏡的検査は、特徴的な終末部の腫脹、シナプス小胞喪失、および膨張したミトコンドリアを示した対照ｍＡｂ処置マウスのものと比較して、良好に保存されたシナプス前超微細構造の存在を、エクリズマブ処置マウスのＮＭＪで示した（図５Ｆ）（Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））。これらの電気生理学的、機能的、および免疫組織学的データは、本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＦＳモデルで、補体媒介性終末運動ニューロパシーが発症していること、および観察された呼吸障害に隔膜麻痺が寄与していることを示している。最も重要なことは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのエクリズマブ処置がこれらの神経病理学的な欠損をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に阻止したことである。
【００８５】
（実施例４）
方法
マウス
雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（３〜６週齢、１０〜２５ｇ）は、Ｈａｒｌａｎ社（英国またはオランダ所在）から入手した。一部の筋収縮実験（下記参照）では、雄雌のＧＭ２／ＧＤ２−シンターゼヌル変異体マウス（Ｂｕｌｌｅｎｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２巻、６８７６〜６８８４頁（２００２年））を１２〜２２週齢で用いた（１９〜３７ｇ）。すべての動物実験は、英国内務省ガイドライン（ＵＫ  ＰＰＬ６０／３０９６）、オランダの法律、ならびにグラスゴー大学およびライデン大学のガイドラインに従って行った。
【００８６】
モノクローナル抗体および正常ヒト血清
ＩｇＭ抗ＧＱ１ｂガングリオシドｍＡｂであるＣＧＭ３は、ＧＴ１ａを有するカンピロバクター−ジェジュニのリポオリゴ糖を接種されたマウスから得られた（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年））。ＣＧＭ３は、すべてが末端ジシアリルガラクトース構造を共有するガングリオシドであるＧＱ１ｂ、ＧＤ３、およびＧＴ１ａと反応する。以前の研究は、ＣＧＭ３がヒトＭＦＳ血清と同様なガングリオシド特異性を有し、それらと同一な補体依存的病原性効果を誘導したことを示している（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年））。ＣＧＭ３濃度は、定量的ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国Ｔｅｘａｓ所在）を用いて測定した。正常ヒト血清（ＮＨＳ）は、新たに凍結され、補体活性を保存するために複数のアリコートに−７０℃で保存された単一のドナーストックから採取した。実験に使用する前に、ＣＧＭ３およびＮＨＳを、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で予めガス処理したリンゲル液（１１６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２３ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）に対して４℃で２４時間透析した。ヒト化抗ヒトＣ５  ｍＡｂであるエクリズマブおよび非特異的な同アイソタイプ対照ｍＡｂであるＡＬＸＮ３３００は、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国Ｃｈｅｓｈｉｒｅ所在）から入手し、４℃で保存した。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＦＳモデル
ＣＧＭ３およびＮＨＳを用いたＭＦＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、以前に記載されている（Ｇｏｏｄｙｅａｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４巻、６９７〜７０８頁（１９９９年）；Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））。簡潔には、横隔神経が付いているマウス半横隔膜（または例示的ＮＭＪ免疫組織学の一部の場合には三角胸骨筋（ｔｒｉａｎｇｕｌａｒｉｓ  ｓｔｅｒｎｉ  ｍｕｓｃｌｅ））を、室温（２０〜２２℃）のリンゲル培地中で切り出し、マウントした。なんらかのインキュベーション、および後続のベースライン免疫組織学的分析のための、ドライアイス上での迅速凍結の前に、未処理の小さな対照切片を各筋標本から切り出した。筋をＣＧＭ３（５０μｇ／ｍｌ）と共に３２℃で２〜２．５時間、その後４℃で３０分間インキュベートし、その後室温で１０分間平衡化させ、リンゲル培地中ですすぎ、それに続いて、３３または４０％のＮＨＳを含有するリンゲル培地に室温で１時間暴露した。エクリズマブ（１００μｇ／ｍｌ）または対照ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）が筋標本のインキュベーションの１０分前にＮＨＳに混ぜられた。このモデルにおけるＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気生理学測定（下記参照）、ＮＭＪにおける制御されていない伝達物質放出のホールマークである筋繊維単収縮のスコア測定（Ｊａｃｏｂｓら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２５巻、５４９〜５５８頁（２００２年）；Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））を、ＣＧＭ３インキュベーションの前後、および１時間のＮＨＳインキュベーションの間に行った。ＮＨＳとのインキュベーションの前および後の両方に、筋ストリップをドライアイス上で凍結させ、−２０℃で保存した。ＩｇＭ、Ｃ３ｃ、ＭＡＣ、およびＮＦのレベル、ならびにｐＳＣ生存率に関して、ＮＭＪおよび終末運動軸索を評価した（下記参照）。
【００８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＦＳモデル
Ｂａｌｂ／ｃマウス（３〜４週齢、１０〜１５ｇ）に、１．５ｍｇのＣＧＭ３を腹腔内注射し、その後、１６時間後に０．５ｍｌの１００％  ＮＨＳを腹腔内注射した。さらに４〜６時間マウスを観察し、全身プレチスモグラフィー（下記参照）以前に記載されている通りの握力試験（Ｋａｊａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２５巻、２００９〜２０２０頁（２００７年））で分析した。その後、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺し、半横隔膜筋組織を切り出し、電気生理学的実験および筋収縮実験（下記参照）で分析するか、免疫組織学的分析用にさらに処理した（下記参照）。腹腔内ＮＨＳ注射のすぐ前に、２００μｇのエクリズマブまたは対照ｍＡｂを尾静脈に注射することによって、ｉｎ
ｖｉｖｏ症候へのエクリズマブの影響、およびそれに続いて分析した電気生理学的、機能的、組織学的な障害をこのモデルで試験した。初期の用量域決定実験（データは示されていない）は、＞５０μｇ／マウスの用量のエクリズマブがニューロパシーから保護したことを示した。
【００８９】
プレチスモグラフィー
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における呼吸パラメータの変化を実証するために、非侵襲性の全身プレチスモグラフィー（ＥＭＭＳ社、英国Ｈａｎｔｓ所在）を採用した。実験開始の前にベースラインデータを収集した。マウスにＣＧＭ３を注射し、その後、１６時間後に、エクリズマブまたは対照ｍＡｂを含有するＮＨＳを注射し（上記のプロトコール）、６時間連続的にモニターした。呼吸頻度および１回呼吸量に関する液流由来パラメータを、承認された２５回の呼吸から収集し、１時間にわたって平均した。
【００９０】
ＮＭＪのｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気生理学分析および筋収縮性の目視スコア測定
それぞれ横隔神経が付いた左右の半横隔膜を切り出し、室温の１．５ｍｌリンゲル培地中で、シリコーンゴムを敷いたディッシュ内に、ピン留めした。微小終板電位（ＭＥＰＰ、シナプス前運動神経終末からの単一アセチルコリン素量の自発性放出から生じるシナプス後事象）の細胞内記録を、ＮＭＪで、２０〜２２℃で行った。シグナルの増幅およびフィルタリング（１０ｋＨｚ低域通過）用のＧｅｎｅＣｌａｍｐ  ５００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ（ＣＡ）所在）に接続された、３Ｍ  ＫＣｌ充填の１０〜２０ＭΩのガラス微小電極と共に、筋繊維をＮＭＪの近くに固定した。シグナルは、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインタフェース、Ｃｌａｍｐｅｘ  ９．２、およびＣｌａｍｐｆｉｔ  ９．２プログラム（すべてＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、Ｍｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ６．０（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ社、米国Ｆｏｒｔ  Ｌｅｅ所在）、ならびにＭａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ社、米国Ｎａｔｉｃｋ（ＭＡ）所在）内にプログラムされたルーチンを用いて、デジタル化、保存、および分析（オフライン）した。
【００９１】
ＣＧＭ３／補体媒介性シナプス前損傷から生じる高いＭＥＰＰ頻度によって誘導される自発性の非同期的繊維単収縮の出現（Ｐｌｏｍｐら、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒａｌ．、４５巻、１８９〜１９９頁（１９９９年））を、目視により５分毎にスコア測定した（Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））。上記組織は、無活性の場合０点、＜１０の繊維の単収縮の場合１点、上記組織全体にわたる少量の単収縮の場合２点、中程度の量の場合３点、そして、多量の場合４点を獲得した。各測定時間中の平均スコアを計算した。ＣＧＭ３／補体媒介性シナプス前損傷の最終帰結は、ＮＭＪにおけるシナプス伝達のサイレンシングである。「サイレント」なＮＭＪ（すなわち、検出可能なＭＥＰＰおよび横隔膜神経刺激誘発性の筋活動電位の出現がない）の数は、各実験条件下における筋で試料抽出されたＮＭＪの総数（８〜４１）に対するパーセントで表した。
【００９２】
筋収縮実験
半横隔膜標本の神経刺激誘発性収縮力のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＧＭ３／ＮＨＳ誘発性減失に対するエクリズマブの保護能力を試験した。以前の研究が、ＣＧＭ３／ＮＨＳ誘発性の収縮減失に対する、この株の筋の感受性が他のものよりいくらか高いことを示したので（Ｂｕｌｌｅｎｓら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２巻、６８７６〜６８８４頁（２００２年））、本発明者らは、ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼヌル変異体マウスからの横隔膜を用いた。２００μｇ／ｍｌのＣＧＭ３と共に３２℃で３時間プレインキュベートされた左右の横隔神経／半横隔膜標本を、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を連続的に供給されている、室温（２０〜２２℃）のリンゲル培地２．２５ｍｌを含有する、シリコーンゴムを敷いたディッシュ内にマウントした。以前に記載されている通り（Ｋａｊａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２５巻、２００９〜２０２０頁（２００７年））、この筋の胸郭側を多数の小さなピンでディッシュの底部に完全に固定し、腱中心を、増幅器およびデジタル化装置に接続された力変換器に金属フックおよび糸を介して接続した。１００秒間の最大上刺激（通常約１０Ｖ）を４０Ｈｚで３秒間、５分毎に、Ｍａｓｔｅｒ−８プログラム可能刺装置（ＡＭＰＩ社、イスラエル国Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ所在）から送達した。最大刺激の強縮性収縮力（通常約１０ｇ）を得るように、基礎張力をバーニヤ制御で調整した。誘発された収縮の安定性を３０〜５０分間、モニターした。続いて、添加の約１０分前にエクリズマブ（３、６、９、１２、２５、５０、または１００μｇ／ｍｌ）を添加し、混合しておいたＮＨＳ（３３％）で培地を置換し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を連続的に穏やかに供給しながら、その影響を１００〜２００分間、モニターした。エクリズマブを添加しない対照実験では、１００μｇ／ｍｌの対照ｍＡｂをＮＨＳに添加した。収縮の振幅は、各神経刺激過程の開始２秒後に、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  ９．０プログラム（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、米国Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ所在）で、オフラインでカーソル測定した。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＦＳプロトコールを施されたマウスから切り出された左半横隔膜筋にｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経刺激を与えた際の、強縮性および単収縮性収縮力も測定した。
【００９４】
免疫組織学的分析
未固定の半横隔膜切片をＬｉｐｓｈａｗ社製Ｍ−１封入剤（米国Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ（ＰＡ）所在）中でマウントし、縦方向のクリオスタット切片（８〜２０μｍ）を３−アミノプロピルトリエトキシシランコーティングされたスライド上に切り出し、空気乾燥させ、その後−２０℃で保存した。ＮＭＪを局在化するために、ＴＲＩＴＣおよびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）標識されたα−ブンガロトキシン（α−ＢＴｘ、１．３μｇ／ｍｌに１／７５０希釈；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国Ｏｒｅｇｏｎ州Ｅｕｇｅｎｅ所在）を用いた。ＦＩＴＣ標識のウサギ抗Ｃ３ｃ（１／３００；Ｄａｋｏ社、英国Ｅｌｙ所在）と共に４℃で１時間インキュベートすることによって、中間補体成分であるＣ３ｃを検出した。ＭＡＣは、マウス抗ヒトＣ５ｂ−９（１／５０；Ｄａｋｏ社）と、その後にＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／３００）とを、共に４℃で１時間用いて検出した。
【００９５】
ＮＦ染色には、未固定組織の切片をＴＲＩＴＣ結合のα−ＢＴｘと共に４℃で１時間プレインキュベートし、すすぎ、−２０℃のエタノール中に２０分間浸漬し、その後、ウサギポリクローナル血清１２１１（１／７５０；リン酸化ＮＦと反応性；Ａｆｆｉｎｉｔｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．社、英国Ｅｘｅｔｅｒ所在）と共に室温で終夜インキュベートし、それに続いて、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／３００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）と共に４℃で３時間インキュベートした。すべての検出抗体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。
【００９６】
ｐＳＣ生存率は、膜透過処理された細胞の核酸を赤色蛍光で標識する膜不透過色素であるＥｔｈＤ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国Ｏｒｅｇｏｎ州Ｅｕｇｅｎｅｓ所在）を用いて評価した。簡潔には、２μＭのＥｔｈＤ−１を含有するリンゲル液に神経筋標本を暴露した。上記組織を暗中、室温で１時間インキュベートし、リンゲル液中ですすぎ、免疫組織学用に凍結させた。ＢＯＤＩＰＹ結合α−ＢＴｘ（１．３μｇ／ｍｌ）で染色することによって、１５μｍのクリオスタット切片中でＮＭＪを同定し、ＮＭＪにおける、ＥｔｈＤ−１陽性核を有するＮＭＪのパーセントを計算した。
【００９７】
例示用に、ホールマウントの三角胸骨筋を、ＣＧＭ３（５０μｇ／ｍｌ）および蛍光色素結合α−ＢＴｘ（ＴＲＩＴＣ／ＦＩＴＣ／ＣＹ５）（２μｇ／ｍｌ；１：５００）と共にインキュベートし、その後、ＮＨＳ＋エクリズマブまたは対照ｍＡｂと共にインキュベートした。標本を蛍光結合α−ＢＴｘおよび以下のもの、すなわちマウス抗Ｃ５ｂ−９（１：４０；Ｄａｋｏ社）、抗Ｃ３ｃ−ＦＩＴＣ（１：２００；Ｄａｋｏ社）、またはＥｔｈＤ−１（２μＭ）の様々な組合せと共に、リンゲル培地中、室温で１時間インキュベートし、リンゲル培地中ですすぎ、その後、４％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で２０分間固定した。未反応のアルデヒド基は、０．１Ｍグリシンと共に１０分間インキュベートすることによって消光した。その後、上記抗体をＰＢＳ中に再添加し、室温で終夜振盪させた。細胞内抗原の染色には、筋を４％ホルムアルデヒド中で２０分間、その後０．１Ｍグリシン中で１０分間固定し、その後、ＰＢＳ中に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する透過処理溶液中、ＲＴで３０分間インキュベートし、透過処理溶液中に希釈されたウサギ抗Ｓ１００（１：１５０；Ｄａｋｏ社）またはウサギ抗ＮＦ（１：１５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、英国Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ所在）のいずれかを添加して室温で終夜インキュベートした。組織をＰＢＳですすぎ、必要な場合、１：３００に希釈された以下の蛍光結合抗体、すなわち抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣまたは抗マウスＩｇＧ−ＴＲＩＴＣと共にインキュベートし、暗中、ＲＴで７時間振盪させた。組織をＰＢＳですすぎ、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（商標）封入剤（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、英国Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ所在）中にマウントした。
【００９８】
画像の取得、定量化、および統計的分析
デジタル画像は、Ｚｅｉｓｓ社製Ｐａｓｃａｌ共焦点レーザー顕微鏡と、ＡｐｏＴｏｍｅ搭載のＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１との両方を用いて捕捉した。画像分析測定は、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国Ｍａｒｙｌａｎｄ州Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ所在）画像分析ソフトウェアを用いて行った。ＩｇＭの定量分析には、Ｃ３ｃ、ＭＡＣ、およびＮＦの各マーカーの３通りの染色を少なくとも３つの個々の半横隔膜から得られた組織で行い、以前の記載にしたがって定量化した（Ｏ’Ｈａｎｌｏｎら、Ｂｒａｉｎ、１２４巻、８９３〜９０６頁（２００１年））。すべての検査は、観察者盲検であった。ノンパラメトリックデータの免疫組織学的分析には、１％有意水準を採用したマン−ホイットニー検定を用いて統計的比較を行った。ＮＭＪにおけるＥｔｈＤ−１陽性ｐＳＣの比較には、カイ二乗検定を１％有意水準で用いた。
【００９９】
参考文献
【０１００】
【化１】
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【０１０１】
【化２】
2014240438.tif 000004
【０１０２】
【化３】
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【０１０３】
【化４】
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【図１】
2014240438.tif 000007
【図２】
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【図３】
2014240438.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
2014240438000001.pdf