(57)【要約】【課題】発現誘導／非誘導時の全遺伝子発現への影響が少なく、なおかつ非誘導時の導入遺伝子の発現をほぼ完全に抑制可能な発現制御系を構築できるプロモーターを提供すること。【解決手段】グルコースとソルビトールでは、ソルビトールの取込みやヒドロキシル基の酸化に関する系以外では、遺伝子発現の変動や、代謝系の変化が少ないものと考えられる。そこで、麹菌において、グルコースでは発現が見られず、ソルビトールに応答して誘導される遺伝子を検索したところ、遺伝子の変動は全体的に少なかったが、その中でも50倍以上の変動がある２遺伝子を特定することに成功した。本発明のソルビトール誘導性プロモーターは、これら２遺伝子のプロモーター領域に基づく。【選択図】図１
2014093954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)〜(d)のいずれかのDNAからなるソルビトール誘導性プロモーター。
(a)  配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
(b)  配列番号１に示される塩基配列中の連続する740塩基以上の部分領域からなり、かつ、第669番〜第1408番塩基の領域を含むDNA。
(c)  配列番号３に示される塩基配列からなるDNA。
(d)  (a)〜(c)のいずれかのDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ソルビトール存在下で遺伝子発現を誘導するプロモーター活性を有するDNA。
【請求項２】
前記(d)のDNAが、前記(a)〜(c)のいずれかのDNAと95％以上の同一性を有する塩基配列からなる請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
前記(d)のDNAが、前記(a)〜(c)のいずれかのDNAにおいて１個若しくは数個の塩基が置換、欠失又は挿入された塩基配列からなる請求項１記載のプロモーター。
【請求項４】
前記(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる請求項１記載のプロモーター。
【請求項５】
炭素源としてグルコースのみが存在する条件下では遺伝子発現を実質的に誘導しないことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項７】
前記プロモーターに機能的に連結された、所望のRNAをコードするDNAをさらに含む請求項６記載の組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターで形質転換された糸状菌。
【請求項９】
麹菌である請求項８記載の糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌遺伝子に由来するソルビトール誘導性プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
麹菌では、麹菌自身あるいは外来の遺伝子を任意に発現誘導するために、amyBプロモーター（非特許文献１）やthiAプロモーター（非特許文献２）などの誘導型のプロモーターが利用されてきた。しかし、発現誘導時の発現が大き過ぎたり、非誘導時にも低量ながら発現したり、制御する遺伝子との構造的な関連により完全に発現抑制できない等の問題があった。また、発現誘導条件と非誘導条件では細胞内の代謝が大きく変わることが予想されるなど、発現制御条件による影響が大きいという欠点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Tada S, et al., Mol. Gen. Genet., 229, 301-306 (1991)
【非特許文献２】Shoji JY, et al., FEMS Microbiol. Lett., 244, 41-46 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、発現誘導/非誘導時の全遺伝子発現への影響が少なく、なおかつ非誘導時の導入遺伝子の発現をほぼ完全に抑制可能な発現制御系を構築できるプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ソルビトールは、グルコースのアルデヒド基がヒドロキシ基に置換された糖アルコールで、グルコースと同じ解糖系に入り代謝されるものと考えられる。その為、グルコースとソルビトールでは、ソルビトールの取込みやヒドロキシル基の酸化に関する系以外では、遺伝子発現の変動や、代謝系の変化が少ないものと考えられる。そこで、本願発明者らは、DNAマイクロアレイ解析を行ない、グルコースでは発現が見られず、ソルビトールに応答して誘導される遺伝子を検索したところ、遺伝子の変動は全体的に少なかったが、その中でも50倍以上の変動がある２遺伝子を特定することに成功した。そして、該２遺伝子のプロモーター領域を鋭意検討して特定することにより、本願発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記(a)〜(d)のいずれかのDNAからなるソルビトール誘導性プロモーターを提供する。
(a)  配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
(b)  配列番号１に示される塩基配列中の連続する740塩基以上の部分領域からなり、かつ、第669番〜第1408番塩基の領域を含むDNA。
(c)  配列番号３に示される塩基配列からなるDNA。
(d)  (a)〜(c)のいずれかのDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ソルビトール存在下で遺伝子発現を誘導するプロモーター活性を有するDNA。
【０００７】
また、本発明は、上記本発明のプロモーターを含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の組換えベクターで形質転換された糸状菌を提供する。さらに、本発明は、所望のRNAの発現誘導が望まれる場合には、ソルビトール存在下で上記本発明の糸状菌を培養し、所望のRNAの発現抑制が望まれる場合には、ソルビトール非存在下で上記本発明の糸状菌を培養することを含む、所望のRNAの発現を制御する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ソルビトールで遺伝子発現を誘導する新規なプロモーターが提供された。ソルビトールと、ソルビトールに非常に類似した構造を有するグルコースとの使い分けで発現誘導のオン・オフを達成できるプロモーターは、宿主細胞ないしは宿主個体の全体の遺伝子発現に対する影響や代謝系への影響が少ないと考えられる。その上、本発明のプロモーターは、非誘導時の発現がほぼ完全に抑制されるという利点も有している。従って、本発明のプロモーターは、基礎研究においても実用化の場面でも非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各種炭素源の存在下で麹菌アスペルギルス・オリゼRIB40株を培養し、SorA遺伝子及びSorB遺伝子の発現量を調べた結果を示すグラフである。SMC: 液体培養、MPC: メンブレンプレート培養。
【図２Ａ】実施例で用いた麹菌形質転換用プラスミドの作製工程の概略図である。
【図２Ｂ】実施例で用いた麹菌形質転換用プラスミドの作製工程の概略図である（図２Ａの続き）。
【図３Ａ】SorA-Lプロモーターの制御下でGFPタンパク質を発現する形質転換体作出のためのプラスミドpUSC-SorA-L-T-EGFPの構築図である。
【図３Ｂ】SorA-Sプロモーターの制御下でGFPタンパク質を発現する形質転換体作出のためのプラスミドpUSC-SorA-S-T-EGFPの構築図である。
【図３Ｃ】SorBプロモーターの制御下でGFPタンパク質を発現する形質転換体作出のためのプラスミドpUSC-SorB-T-EGFPの構築図である。
【図４Ａ】ネガティブコントロールの形質転換体sC-EGFP株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図４Ｂ】ネガティブコントロールの形質転換体USA株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図４Ｃ】ポジティブコントロールの形質転換体A.oryzae TF2株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図４Ｄ】SorBプロモーターを用いた形質転換体pUSA-SorB-T-EGFP株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図４Ｅ】SorA-Lプロモーターを用いた形質転換体pUSA-SorA-L-T-EGFP株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図４Ｆ】SorA-Sプロモーターを用いた形質転換体pUSA-SorA-S-T-EGFP株にてGFPタンパク質の蛍光を観察した結果である。
【図５】実施例で作製した各形質転換体において、タンパク質レベルでGFPの発現誘導の有無を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のソルビトール誘導性プロモーターは、下記いずれかのDNAからなる。
(a)  配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
(b)  配列番号１に示される塩基配列中の連続する740塩基以上の部分領域からなり、かつ、第669番〜第1408番塩基の領域を含むDNA。
(c)  配列番号３に示される塩基配列からなるDNA。
(d)  (a)〜(c)のいずれかのDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ソルビトール存在下で遺伝子発現を誘導するプロモーター活性を有するDNA。
【００１１】
上記したDNAの配列は、後述する通り、麹菌遺伝子のプロモーター配列に由来する。従って、本発明のプロモーターは、麹菌を含む各種糸状菌において好ましく使用することができる。
【００１２】
本発明において、ソルビトール誘導性プロモーターとは、ソルビトール存在下で遺伝子発現を誘導する活性を有するプロモーターである。より具体的には、所望の遺伝子をプロモーターと機能的に連結させた形態で宿主細胞内に導入し、該細胞をソルビトール存在下で培養した場合に、該細胞内で所望の遺伝子のmRNAを転写させる活性を有するプロモーターである。「機能的に連結」とは、該プロモーターの支配を受けるようにその下流に遺伝子配列を連結することをいう。
【００１３】
本発明のソルビトール誘導性プロモーターは、ソルビトールに対する特異性が高く、ソルビトールと非常に近い構造を有するグルコースを用いた場合であっても、遺伝子発現を実質的に誘導しない。「実質的に誘導しない」とはすなわち、炭素源としてグルコースのみが存在する条件下では、該プロモーターの下流に連結された遺伝子が検出可能なレベルで発現しない（すなわち、発現量がバックグラウンド以下である）か、又は検出可能なレベルで発現したとしても、その発現の程度がごく微弱であって、当業者であれば遺伝子発現が誘導されていないと判断する程度にしか発現しないことを意味する。本明細書では、この本発明のプロモーターの活性を「ソルビトール特異的」と表現することがある。好ましくは、本発明のソルビトール誘導性プロモーターは、ソルビトールが存在せず、炭素源としてグルコースのみが存在する条件下では、遺伝子発現を検出可能なレベルで誘導しないプロモーターである。
【００１４】
任意の塩基配列からなるDNAが上記に定義した通りのプロモーター活性を有しているかどうかは、ルシフェラーゼ遺伝子等を利用した周知のレポーターアッセイにより容易に確認することができる。レポーターアッセイのためのキットや試薬類は市販されており、当業者であれば容易に実施できる。また、下記実施例に記載するように、任意のDNAの下流にGFP等の蛍光タンパク質を連結させ、実際に宿主細胞（本発明では麹菌等の糸状菌の細胞）に導入して形質転換体を作出し、ソルビトール特異的にGFPの発現が誘導されるかどうかを蛍光顕微鏡下で確認してもよい。このような手法自体は周知の常法である。
【００１５】
なお、麹菌の培養に一般的に使用される炭素源としては、グルコース、マルトース、デキストリン、デンプン（全てグルコースが構成糖）、ショ糖（グルコースとフルクトースで構成される二糖類）が挙げられる。また、一般的ではないが使用されることがある炭素源として、グリセロール、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キチン、セルロースなどが挙げられる。本発明のプロモーターは、これらの炭素源によっては発現誘導活性を示さないものと考えられる。
【００１６】
上記(a)にいう配列番号１の塩基配列は、本願発明者らが、グルコースでは発現誘導されず、ソルビトールにより特異的に発現誘導される遺伝子として見出し、SorAと命名した遺伝子のプロモーターの配列であり、SorA遺伝子の翻訳開始点より上流1408塩基の領域の配列に相当する。この遺伝子は、米国National Center for Biotechnology InformationのデータベースにAO090020000639のGene IDで登録されている。
【００１７】
上記(b)のDNAは、(a)の一部からなるDNAである。配列番号１に示す塩基配列中の第669番〜第1408番塩基の領域を含んでいる限り、(b)のDNAの鎖長は特に限定されない。配列番号１の第669番〜第1408番塩基の領域とは、SorA遺伝子の翻訳開始点より上流740塩基の領域である。この740塩基の領域の塩基配列を配列表に配列番号２として示す。この740塩基の領域のみでもソルビトール特異的なプロモーター活性を発揮できることは、下記実施例において具体的に示されている通りである。従って、この領域を含む限り、配列番号１に示す塩基配列の部分領域からなるDNAも、ソルビトール誘導性プロモーターとして利用可能である。
【００１８】
上記(c)にいう配列番号３の塩基配列は、本願発明者らが、グルコースでは発現誘導されず、ソルビトールにより特異的に発現誘導される遺伝子として見出し、SorBと命名した遺伝子のプロモーター配列であり、SorB遺伝子の翻訳開始点より上流574塩基の領域の配列に相当する。この遺伝子は、米国National Center for Biotechnology InformationのデータベースにAO090020000635のGene IDで登録されている。
【００１９】
上記(d)のDNAは、(a)〜(c)のいずれかのDNAにおいて、少数の塩基が置換、欠失又は挿入された塩基配列からなり、かつ、ソルビトール存在下で遺伝子発現を誘導するプロモーター活性を有するDNAである。(a)〜(c)のいずれかと配列の同一性が高いDNAは、もとのDNAと同様に、上記定義の通りのソルビトール誘導性プロモーターとしての活性を発揮し得る。(d)のDNAと(a)〜(c)のいずれかのDNAとの同一性は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。(d)のDNAのさらなる好ましい例として、(a)〜(c)のいずれかのDNAにおいて１個若しくは数個の塩基が置換、欠失又は挿入された塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
【００２０】
ここで、塩基配列の「同一性」とは、比較すべき２つの塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した塩基数を、全塩基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。
【００２１】
ただし、比較すべき配列が他の任意の配列と連結された状態にある場合には（例えば、発現ベクターに組み込まれた状態、発現させたい所望の遺伝子と連結させた状態など）、プロモーターに相当する領域のみを取り出して配列を対比し、同一性を算出する。
【００２２】
プロモーターは、発現させたいRNAをコードするDNAと連結して用いられるものであり、また多くの場合発現ベクターに組み込まれた状態で市販されるため、通常、他の配列が付加された形態にある。本発明のプロモーターの一端又は両端に任意の配列が付加されたDNAは、本発明のプロモーターを利用したものといえるため、本発明の範囲に包含される。任意の他の配列としては、特に限定されないが、例えば、ベクター由来の配列、制限酵素認識配列、スペーサー配列、マーカー遺伝子配列のほか、本発明のプロモーターの制御下で発現させたい所望のRNAをコードする塩基配列等が挙げられる。
【００２３】
(a)〜(c)のDNAは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により容易に調製することができる。例えば、麹菌細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅して得ることができる。PCRに用いるプライマーは、配列番号１〜３に示した塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
【００２４】
(d)のDNAは、市販の核酸合成機を用いるほか、SorAプロモーター領域又はSorBプロモーター領域に一塩基多型等の天然の変異を有する麹菌細胞から抽出したゲノムDNAをPCRの鋳型として用いることで得ることができる。あるいは、(a)〜(c)のDNAに常法により適宜変異を導入することで合成することもできる。
【００２５】
本発明のプロモーターは、マルチクローニングサイト等を適宜具備するベクターに組み込まれた組換えベクターの形態で提供できる。ベクターはプラスミドでもウイルスでもよい。各種のプラスミドベクター及びウイルスベクターが公知であり、使用対象となる宿主細胞の種類及び使用目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
本発明のプロモーターを含む組換えベクターは、さらに、該プロモーターに機能的に連結された、所望のRNAをコードするDNAを含み得る。そのようなDNAの典型例としては、タンパク質をコードする遺伝子DNAを挙げることができるが、このような遺伝子に限定されず、アンチセンスRNA、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、又はmiRNAをコードするDNAなどの、タンパク質をコードしないDNAであってもよい。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のプロモーターと、該プロモーターに機能的に連結された、所望のRNAをコードするDNAとを含む組換えベクターで形質転換された糸状菌を提供する。糸状菌は、好ましくは麹菌である。麹菌等の糸状菌の形質転換体の作出方法はこの分野で公知であり、一般に、菌糸を酵素処理してプロトプラストを調製し、ポリエチレングリコール存在下で外来DNAを含むベクター等のDNA構築物をプロトプラストと接触させて細胞内にDNA構築物を取り込ませ、糸状菌染色体にDNAを組み込ませることにより行なわれる。こうした手法に用いるための糸状菌用のベクターも各種のものが知られており、例えばpUSA（O.Yamada et.al. J.Biosci.Bioeng. 95(1), 82-88, 2003）、pUNG（Appl.Microbiol.Biotechnol., 44, 425-431 (1995)）、pMARG（Appl.Microbiol.Biotechnol., 40, 327-332 (1993)）、pUSC（Agric.Biol.Chem. 51, 2549-2555 (1987)）等が挙げられる。これらの公知のベクターのプロモーターを本発明のプロモーターに置き換えて使用することで、本発明のプロモーターの制御下で外来遺伝子を導入した形質転換体を作出することができる。
【００２８】
所望のRNAをコードするDNAを、本発明のプロモーターに機能的に連結するようにしてベクターに組み込み、これを麹菌等の糸状菌の細胞に導入して形質転換体を作出すれば、培地に添加する炭素源の種類によってRNAの発現のオン・オフを制御できる発現制御系を構築することができる。RNA発現をオンにしたい場合には、炭素源としてソルビトールを含有する培地を用いて、ソルビトール存在下で形質転換体を培養すればよく、RNA発現をオフにしたい場合には、ソルビトールを含有しない培地を用いて、ソルビトール非存在下で形質転換体を培養すればよい。オフにしたい場合は、グルコースの他、ガラクトース、デキストリン、マルトース、デンプンなどの、本発明のプロモーターが実質的に発現誘導活性を示さない上記した炭素源を使用することもできる。本発明のプロモーターは、オフ時（非誘導時）に遺伝子発現をほぼ完全に抑制できるという点でも非常に優れている。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
１．DNAマイクロアレイによる発現解析
Asperigillus oryzae RIB40株、分生子1x106/mLとなるように、Modified Minimal Medium (MMM)培地(1% Glucose, 3g/L Glutamic acid, minimal medium, pH6.5)に植菌し、30℃、100 rpmで24時間培養した。次いで、菌体を新たなMMM培地又はSMM培地（1% Sorbitol, 3g/L Glutamic acid, minimal medium, pH6.5）に移して、30℃、100 rpmで1時間培養した。培養後、菌体を回収し、市販の試薬（Isogen等）を用いてRNAを抽出し、公知の麹菌DNAchip（NCBI Gene Expression Omnibus: Platform GPL16184）を用いてDNAマイクロアレイ解析を行なった。この実験は２回反復して行なった。
【００３１】
DNAマイクロアレイ解析の結果から、MMM培地をコントロールとして、SMM培地において危険率1％以下で有意に50倍以上高発現しており、MMM培地では発現が見られない遺伝子を選抜したところ、２遺伝子のみが見出された。これらの遺伝子は、米国National Center for Biotechnology InformationのデータベースにAO090020000639及びAO090020000635のGene IDで登録されており、本願発明者らはAO090020000639遺伝子をSorA、AO090020000635遺伝子をSorBと命名した。
【００３２】
２．ソルビトール誘導性遺伝子の発現解析
上記で見出されたSorA及びSorBの２遺伝子について、ソルビトール誘導性プロモーターとしての利用を検討するため、数種類の炭素源を使用して各種条件下で発現解析を行なった。菌株はAsperigillus oryzae RIB40株を使用し、炭素源としてはソルビトール、グルコース、ガラクトース及びデキストリンをそれぞれ培地中終濃度1%で用いた。液体培養及びプレート培養のほか、米麹を用いた固体培養も検討した。培養条件の詳細を以下に記載する。
【００３３】
液体培養：
最小培地（3g/L Glutamic acid, minimal medium, pH6.5）又は0.8M NaClを添加した最小培地を使用。分生子1x106/mLとなるように培地に植菌し、30℃、100 rpmで24時間培養した。
【００３４】
メンブレンプレート培養：
最小培地（3g/L Glutamic acid, minimal medium, pH6.5）に2％となるよう寒天を添加した最小培地を使用。直径9センチのプレートに本培地を20ml加え、寒天が凝固後に、さらに滅菌したセルロースメンブラン（アドバンテック社製No.C080A090C）を乗せて、その上に分生子1x106をとなるように培地に植菌し、30℃で24時間培養した。その後メンブランごと菌体を回収した。
【００３５】
固体培養（米麹）：70％精米歩合の日本晴を用いて、定法により製麹を行い、盛、仲仕事、仕舞仕事、最高温度、出麹の操作毎にサンプリングを行った。
【００３６】
培養後、菌体を回収し、市販の試薬（Isogen等）を用いてRNAを抽出した。得られたRNAサンプルを用いてSorA遺伝子及びSorB遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は公知の麹菌DNAchip（NCBI Gene Expression Omnibus: Platform GPL16184）を用いてDNAマイクロアレイ解析によりを行なった。この実験は２回以上反復して行なった。
【００３７】
結果を図１に示す。SorA遺伝子、SorB遺伝子いずれも、ソルビトール存在下でのみ高い発現が認められ、グルコース、ガラクトース、デキストリンでは発現がほとんど確認されなかった。また、米麹を用いた固体培養の結果から、通常の製麹工程ではこれら2遺伝子は発現しないことが確認された。
【００３８】
３．形質転換用プラスミドの作成（図２Ａ−Ｂに作成の流れを示す）
麹菌ゲノムDNAを鋳型とし、プロモーター領域となるSorAの翻訳開始点より上流1408bp（SorA-L領域、配列番号１）及び上流740bp（SorA-S領域、配列番号２）、並びにSorBの翻訳開始点より上流574bp（SorB領域、配列番号３）の領域をPCRにより増幅した。プライマーの配列は表1に示す。
【００３９】
【表１】
2014093954.tif 000003
【００４０】
この時用いたプライマーは、5’側に制限酵素KpnIの切断部位を付加しており、増幅断片をKpnIで処理してプロモーター領域の断片を獲得した。次に、プラスミドpUSAをKpnIで処理し、α−アミラーゼ遺伝子ターミネーター(TamyB)の上流にプロモーター断片を挿入した。このプラスミドのシーケンスを確認した後、Promoter-TamyB領域を、5’及び3’末端側にプラスミドpUSCと相同な配列を付加したプライマーによって増幅した（プライマーは表２に記載）。
【００４１】
【表２】
2014093954.tif 000004
【００４２】
一方、pUSCを制限酵素SmaI処理によってsCマーカーの下流でシングルカットし、上記で得たpUSCと相同な配列を持った各Promoter-TamyB断片とIn-Fusion Cloning法（clontech社のIn Fusion Advantage Cloning Kitを使用）で連結させた。
【００４３】
連結後の各反応溶液10μLをマイクロチューブ内で混合し、DNA Thermal Cyclerにセットし、37℃で15分反応後、50℃で15分反応を行なった（pUSC-Pro-TamyB）。得られた各プラスミドpUSC-Promoter-TamyBでNEB 5-αコンピテント細胞を形質転換し、大腸菌細胞内で増幅させた。コロニーPCRにより各Promoter-TamyBが正しく連結しているかを確認した。コロニーPCRには、フォワードプライマーとしてFusion-USC-26L-F（SorA-L-TamyBの確認）、Fusion-USC-26S-F（SorA-S-TamyBの確認）及びFusion-USC-23-F（SorB-TamyBの確認）を、リバースプライマーとしてM13R（GTCATAGCTGTTTCCTG、配列番号13）を用いた。
【００４４】
これらプラスミドをさらに制限酵素SmaIで処理し、各プロモーターとTamyBの間で切断した。次に、pUSC-Promoter-TamyBのSmaI処理を行なった切断部分と相同な配列を付加したプライマー（Fus-promoter-TamyB-F: CCGAGCTCGGTACCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT、配列番号14；Fus-promoter-TamyB-R: CTACTACAGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG、配列番号15）を用いて、pEGFP（クローンテック社）から緑色蛍光タンパク質をコードするEGFP遺伝子領域を増幅し、この増幅断片とリニア化した各pUSC-Pro-TamyBをIn-Fusion Cloning法で連結した。得られたプラスミドを用いてNEB 5-αコンピテント細胞(BioLads)を形質転換し、コロニーPCRにより正しく各Promoter-EGFP-TamyBが連結されているプラスミドを選抜した。この時のコロニーPCRには、フォワードプライマーとして26L-1363LP: CTCGGTACCTTCCAGGTCTCCCCGACCACCAAGTTCCACGTCC（配列番号16、pUSC-SorA-L-T-EGFPの確認）、26S-697LP: ATTGGTACCATTCTTCAAAACGGCATACCACCGCTGGACCTCTG（配列番号17、pUSC-SorA-S-T-EGFPの確認）及び23-611LP: ACGGGTACCCGTATAATAGAATGGAATGACTTGACATCATGATT（配列番号18、pUSC-SorB-T-EGFPの確認）を、リバースプライマーとしてM13Rを用いた。以上の操作により、各プロモーターの制御下でGFPタンパク質を発現する３種類の形質転換用プラスミド（図３Ａ−Ｃ）を作製した。
【００４５】
４．麹菌の形質転換
アスペルギルス・オリゼNSR-ΔLD2株を宿主麹菌として利用した。この株の分生子懸濁液を、アデニンを0.05%添加した酵素生産培地(1L中にグルコース 20g, トリプトン 1g(ディフコ), 酵母エキス 5g(ディフコ), NaNO3 1g, K2HPO4 0.5g, MgSO4・7H2O 0.5g, FeSO4・7H2O 0.01g, pH6.0)に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。ミラクロスを用いて菌体を集菌後、菌体を滅菌0.8 M NaCl/10mM Phosphate buffer (pH6.0)で3回洗浄した。その後、マイレックスHV(ミリポア)でフィルター滅菌した20mlプロトプラスト化溶液が入った50ml容滅菌ファルコンチューブに菌体を移して懸濁し、30℃、80rpm、3時間振盪してプロトプラスト化反応を行った。この時用いたプロトプラスト化溶液の組成を下記表３に示す。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
滅菌した3G1ガラスフィルターにて反応液をろ過し、濾液中のプロトプラストを5分間遠心分離することで沈殿を得た。上清みを捨て、さらに30mlの滅菌0.8M NaClにてプロトプラストを洗浄し、3,000rpm、4℃で5分間遠心分離することで沈殿を得た。このプロトプラストを滅菌0.8M NaCl 10mlとSolution I (0.8 M NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl、pH 8.0) 20mlに懸濁し、懸濁液中のプロトプラスト数をトーマの血球計数機で計測した。計測後、3,000rpm、4℃で5分間遠心分離することで沈殿を得た。このプロトプラストを2.4×108 plotoplast/mlとなるようにSolution Iを加えて懸濁した。プロトプラスト懸濁液50μLを滅菌した2ml容のマイクロチューブに移し、それぞれにSolutionII (40% (w/v) PEG4000, 50 mM CaCl2, 10 mMTris-HCl、pH8.0)12.5μLと前述した形質転換用DNA溶液各5μl(DNA量として2μg以上)を加えてチップの先で優しく混合した後、氷上で30min放置した。この溶液に、Solution II 500μlを加えて優しく混合し、室温で15min放置した。この溶液にSolution I 1mlを加えて転倒混和した。この溶液を0.05％のアデニンと0.8MのNaClを添加した選択寒天培地(Glucose 20g, NH4Cl 2g, (NH4)2SO4 1g, KCl 0.5g , KH2PO4 1g, MgSO4・7H2O 0.5g, FeSO4・7H2O 0.02g, pH5.5)に250μlをスポット植菌し、そこに0.8MのNaClを添加した選択軟寒天培地約10mlを重層した。その後、コロニーを形成するまで30℃で培養した。
【００４８】
形質転換後、再生した菌体のうちシングルコロニーを形成した菌体の菌糸を火炎滅菌したピンセットで採取し、選択培地に植え継いだ。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。その後、コロニーの端から菌糸を火炎滅菌したピンセットで選択培地に植え継いだ。この植え継ぎ操作を少なくとも3回以上行うことで核の純化を行った。
【００４９】
５．形質転換体の確認
相同的に形質転換が行われたか確認をするため、それぞれ2カ所のプライマーを用いてPCRを行った。確認したのはプロモーターの上流からEGFPの下流までと、sCマーカーの下流から各遺伝子の下流までの2カ所である。各断片の増幅にはクルードサンプルをテンプレートとして用いることができるKOD FX Neo(TOYOBO)を用いた。テンプレートは、滅菌した96穴マイクロプレートに50μlづつ分注した BufferA (1M KCl、10mM EDTA、100mM Tris-HCl、pH8.5)に各形質転換体の菌糸と胞子をそれぞれ懸濁し、5分間ボルテックスした後に、95℃で10分間煮沸後、さらに5分間ボルテックスし、3000rpm、4℃で15分間遠心分離して得られた上清1μlを用いた。PCRの結果2カ所での増幅が確認されたものを形質転換成功株とした。この確認PCRに用いたプライマーの配列を表４に示す。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
６．EGFP蛍光による定性評価
蛍光観察を行うために、グルコースまたはソルビトールを単一炭素源とする液体培地を作製した。MMM培地に5%のアデニンを添加した培地をMMM+ade培地、SMM培地に5%のアデニンを添加した培地をSMM+ade培地とする。グルコース/ソルビトール、1M MgSO4・7H2O及びTrace elements以外の成分を蒸留水に溶解させてpH 6.5に調製しメスアップ後、500ml容バッフル付き三角フラスコに100mlづつ分注しシリコ栓をしてオートクレーブした。その後、クリーンベンチ内でフィルター滅菌した30 mMグルコースまたはソルビトール溶液 2ml、1M MgSO4・7H2O 210μL及びTrace elements 100μLを無菌的に添加した。
【００５２】
そこに、1×108cells/mlに調製した分生子懸濁液を100μL植菌し、30℃で24時間振盪培養した。先切れチップを用いて培養液を1mlサンプリングし、その中から菌体採取し蛍光顕微鏡を用いて観察した。ポジティブコントロールには、α-アミラーゼ遺伝子プロモーターの制御下でGFPを導入したA.oryzae TF2株を、ネガティブコントロールには、マーカーであるsCのみを導入したUSA株及びsCに加えてプロモーターと連結させずにGFPを導入したsC-EGFP株を用いた。この結果を図４Ａ〜図４Ｆに示す。pUSA-ProT-EGFP株をSMM+ade培地で培養した時のみ蛍光が観察され、このプロモーターがソルビトールで誘導されグルコースで抑制されることが示唆された。
【００５３】
また、MMM+ade培地で24時間培養した後、MMM+ade培地またはSMM+ade培地で1時間誘導を行った場合でも、SMM+ade培地のみに蛍光が観察された。逆に、SMM+ade培地で24時間培養し、MMM+ade培地に移行させた場合、徐々に蛍光の減少が見られた。
【００５４】
７．Western boltによるGFPタンパクの定量試験
500ml容バッフル付き三角フラスコに上記で示した100mlのSMM+ade培地又はMMM+ade培地を加え、これに1×108 cells/mlの分生子懸濁液を100μL植菌して30℃で48時間振盪培養した。この培養液をミラクロスをセットした漏斗でろ過し、4℃の滅菌水を用いて洗浄後、脱水し集菌した。この菌体0.1gをβ-メルカプトエタノールを含むSDSサンプルバッファーで処理し、タンパク質を抽出した後、Anti-GFP rabbit polyclonal serum (invitrogen)とProto Blot II AP System with stabilized substrate (Promega)を用いてGFPタンパク質を検出した。その結果、図５に示す通り、SMM+ade培地でのみGFPタンパク質が検出された。各プロモーターはグルコース存在下では抑制され、ソルビトール存在下では誘導されることがタンパクレベルで示された。
【００５５】
また、MMM+ade培地で24時間培養した後、MMM+ade培地またはSMM+ade培地で1時間誘導を行った場合でも同様の結果が得られた。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【配列表】
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