(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養培地および細胞を含んでなる細胞培養の連続的灌流培養による、高い生存細胞密度と高い細胞生存率で細胞凝集が少なく、可視凝集体のない細胞の培養方法の提供。【解決手段】細胞培養培地は細胞培養に添加され、細胞培養は中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として細胞培養よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、前記フィルタモジュール内の流れは交互接線流である、灌流培養方法の、細胞培養物中の細胞の凝集度合いを減少させるための使用であって、好ましくは、培養培地は、特定の灌流量で添加され、かつ／又はバイオマスが少なくとも１回培養から除去される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物の連続的灌流培養による細胞の培養のための方法であって、
前記細胞培養培地が前記細胞培養物に添加され、
前記細胞培養物が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として前記細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、かつ前記フィルタモジュール内の流れが交互接線流である方法。
【請求項２】
前記細胞培養培地が、式１：
灌流量＝ＳＰＲ＊総細胞培養容積＊生存細胞密度（１）
（式中、前記灌流量はリットル／日で表され、ＳＰＲは比灌流量、すなわち前記細胞培養培地が、生存細胞／時間単位当たりで添加される培地の容積で表される前記細胞培養物に供給される速度であり、前記生存細胞密度は生存細胞／容積単位の数である）に従って計算される灌流量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＰＲが、０．０１〜０．３ｎＬ／細胞／日である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バイオマスが少なくとも１回、前記細胞培養物から除去され、かつ追加の細胞培養培地が前記細胞培養物に添加される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマスの除去が、前記細胞が定常状態に達する直前または直後に開始される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
バイオマスの容積が、細胞培養／日の全容積の２〜４０％で除去される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記交互接線流が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって前記細胞培養物を循環させる１つのポンプを使用し、かつ、前記細胞培養より低い細胞密度を前記フィルタ分離前に有する液体を除去する別のポンプを使用することにより達成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、少なくとも８０×１０６細胞／ｍｌの生存細胞密度および少なくとも９０％の細胞生存率に培養される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも５個の細胞の凝集体が、細胞の総量の最大でも５％を構成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が動物細胞、好ましくは、哺乳類細胞、または酵母細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類細胞がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が生物学的物質を産生する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的物質が、モノクローナル抗体、成長因子またはペプチドホルモン、酵素、遺伝子治療において使用されるウイルスベクターなどポリヌクレオチド、もしくはワクチンなど治療的または診断的タンパク質、好ましくは、モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的物質がさらに下流処理で精製される、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の灌流培養に関する。
【０００２】
本発明は、細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物の灌流培養による細胞の培養のための方法を開示するが、ここで細胞培養培地は細胞培養物に添加され、ここで細胞培養物は中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、ここでフィルタモジュール内の流れは交互接線流である。
【０００３】
意外にも、本発明による動物細胞、具体的には哺乳類細胞、または酵母細胞の灌流培養によって、きわめて高い生存細胞密度を得ることができるが、細胞培養物はさらにきわめて高い細胞生存率を提示することが見出されている。さらに、本発明の灌流方法が培養物における少ない細胞凝集、および可視凝集体なしに単一細胞の懸濁物である培養物さえもたらすことが見出された。これは、灌流細胞培養など低い剪断条件の使用が、一般的には細胞の解離をもたらすことがないので、驚くべき所見である。灌流細胞培養時の細胞凝集は、例えば、細胞凝集体内の細胞の代謝プロフィールにおける不均一性により、方法の制御がより困難であるため不利である。これは特に、細胞が５個の細胞もしくはそれ以上の凝集体を形成する場合、かつその凝集体が全体で細胞の総量の５％もしくはそれ以上を構成する場合に厄介である。
【０００４】
灌流方法が米国特許第６，５４４，４２４号明細書に記載されている。この文書は、この方法が動物細胞の灌流培養に使用できることに言及してはいるが、本発明において見出されたきわめて高い細胞密度を開示も示唆もしていない。さらに、米国特許第６，５４４，４２４Ｂ１号明細書は、灌流方法が中空繊維の膜表面上の障害物の付着および増殖を減少させうることを開示しているが、細胞培養物そのものにおける細胞が凝集しないことを開示も示唆もしていない。
【０００５】
ボアジュ（Ｖｏｉｓｉｅｒ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２（２００３年）、７５１〜７６５頁）は、懸濁哺乳類細胞の高密度灌流培養物におけるさまざまな細胞保持法を検討している。検討された細胞保持系のうち、本発明のきわめて高い細胞生存率と相まってきわめて高い生存細胞密度を提供できるものはない。
【０００６】
細胞の灌流培養は、当技術分野におけるその従来の意味を有し、すなわち、培養時に細胞が分離デバイスによって保持されることを意味するが、ここで分離前よりも低い細胞密度を有する液体の流出があり、かつ細胞培養培地の流入がある。本発明の方法においては、分離デバイスは中空繊維を含むフィルタモジュールである。
【０００７】
灌流培養としては、連続流および半連続流、例えば、段階的流またはねじれ流が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００８】
「中空繊維」という語では管膜が意味される。管の内径は、好ましくは、０．３〜６．０ｍｍ、より好ましくは、０．５〜３．０ｍｍ、最も好ましくは、０．５〜２．０ｍｍである。好ましくは、膜のメッシュサイズは、メッシュの孔のサイズが細胞の直径に近く、細胞の高い保持力を確保すると同時に、細胞残屑がフィルタを通過しうるように選択される。好ましくは、メッシュサイズは３〜３０μｍである。
【０００９】
中空繊維を含むフィルタモジュールは、例えば、ジェネラル・エレクトリック（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）（旧アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））から市販されている。
【００１０】
「フィルタモジュール内の交互接線流」により、中空繊維の膜表面と（すなわち、その接線と）同じ方向での１つの流れがあり、中空繊維をその流れが往復し、かつ前記フィルタ表面に対して実質的に垂直の方向で別の流れがあることが意味される。接線流は、当業者に周知の手法に従って達成されうる。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書においては、交互接線流が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって細胞培養物を循環させる１つのポンプを使用し、かつ細胞培養物より低い細胞密度をフィルタ分離前に有する液体を除去する別のポンプを使用することにより達成されることが記載されている。
【００１１】
本発明の方法においては、細胞の培養に適したすべてのタイプの細胞培養培地が原則として使用されうる。細胞培養培地および細胞培養条件を選択するガイドラインは当該技術分野で周知であり、例えば、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ（基本技術マニュアル）、第４版（２０００年）、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）の８章および９章、およびドイル（Ｄｏｙｌｅ），Ａ．、グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ），Ｊ．Ｂ．、ニューエル（Ｎｅｗｅｌｌ），Ｄ．Ｇ．、Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  １９９３年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）において示されている。
【００１２】
一般に、哺乳類細胞の細胞培養培地は、塩、アミノ酸、ビタミン、脂質、界面活性剤、緩衝剤、成長因子、ホルモン、サイトカイン、微量元素、および糖質を含んでなる。塩の例としては、マグネシウム塩、例えば、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，ＭｇＳＯ４、およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏイオン塩、例えば、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、カリウム塩、例えば、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＣｌ、ナトリウム塩、例えば、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、およびカルシウム塩、例えば、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが挙げられる。アミノ酸の例は、すべて２０個の既知のタンパク質新生アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グルタミン、トレオニン、セリン、メチオニンである。ビタミンの例としては、アスコルビン酸塩、ビオチン、コリン・Ｃｌ、ミオ−イノシトール、Ｄ−パントテン酸塩、リボフラビンが挙げられる。脂質の例としては、脂肪酸、例えば、リノール酸およびオレイン酸、大豆ペプトンおよびエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８が挙げられる。緩衝剤の例はヘペス（ＨＥＰＥＳ）である。成長因子／ホルモン／サイトカインとしては、ＩＧＦ、ヒドロコルチゾン、および（組換え）インスリンが挙げられる。微量元素は当業者に周知であり、例としてはＺｎ、Ｍｇ、およびＳｅが挙げられる。糖質の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、およびピルビン酸塩が挙げられる。
【００１３】
細胞培養培地のｐＨ、温度、溶解酸素濃度、および浸透圧は原則として重要ではなく、選択される細胞のタイプによって決まる。好ましくは、ｐＨ、温度、溶解酸素濃度、および浸透圧は、細胞の成長および生産性に最適であるように選択される。当業者には灌流培養のための最適なｐＨ、温度、溶解酸素濃度、および浸透圧を見出す方法が周知である。通常、最適なｐＨは６．６〜７．６であり、最適な温度は３０〜３９℃であり、最適な浸透圧は２６０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００１４】
本発明の方法に有利にかけられる細胞は、この方法、すなわち、きわめて高い生存細胞密度およびきわめて高い細胞生存率への培養から恩恵を受けるすべての細胞タイプでありうる。
【００１５】
本発明の方法によれば、きわめて高い生存細胞密度が、少なくとも８０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは、少なくとも１００×１０６細胞／ｍＬ、より好ましくは、少なくとも１１０×１０６細胞／ｍＬ、より好ましくは、少なくとも１２０×１０６細胞／ｍＬ、より好ましくは、少なくとも１３０×１０６細胞／ｍＬ、最も好ましくは、少なくとも１４０×１０６細胞／ｍＬである。一般的には、細胞密度における適切な上限が約５００×１０６細胞／ｍＬでありうる。
【００１６】
意外にも、本発明のきわめて高い細胞密度は、きわめて高い細胞生存率によって達成される。きわめて高い細胞生存率が、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、最も好ましくは、少なくとも９９％である。
【００１７】
非常に高い生存細胞密度および非常に高い細胞生存率は、一定期間の灌流培養後、一般に細胞が定常状態に達した場合、哺乳類細胞では一般的に灌流培養の開始後１２〜２５日で達すことが理解されるべきである。
【００１８】
本発明の方法は、動物細胞または酵母細胞の培養、特に哺乳類細胞の培養に適している。
【００１９】
本発明の方法はさらに、培養時、特に灌流培養時に凝集体（いわゆる凝集細胞）を容易に又は本質的に形成する細胞の培養に特に適している。意外にも、本発明の方法は、フィルタ膜上の凝集体除去を減少させるだけではなく、灌流培養方法時の細胞の凝集、凝集体を形成する固有の傾向を有する細胞の凝集も減少させる。本発明による凝集細胞の培養は、結果として、少なくとも５個の細胞の凝集体が最大でも細胞の総量の５％、好ましくは、最大でも４％、より好ましくは、最大でも３％、さらにより好ましくは、最大でも細胞の総量の２％を構成する、培養物をもたらす。特に好ましくは、本発明による凝集細胞の培養物は、結果として、真の単一細胞懸濁物である培養物をもたらす。
【００２０】
凝集細胞は、少なくとも５個の細胞の凝集体を形成する細胞であり、その凝集体は全体で細胞の総量の少なくとも５％を構成する。好ましくは、凝集体は、少なくとも６個、より好ましくは、少なくとも７個、さらにより好ましくは、少なくとも８個、さらにより好ましくは、少なくとも９個、さらにより好ましくは、少なくとも１０個の細胞からなる。好ましくは、凝集体は、全体で細胞の総量の少なくとも７％、より好ましくは、少なくとも１０％、最も好ましくは、少なくとも１５％を構成する。
【００２１】
哺乳類細胞の例としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（ベイビーハムスター腎）細胞、骨髄腫細胞、ヒト細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞、ヒトリンパ球様細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、マウス細胞、例えば、ＮＳＯ細胞が挙げられる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、クリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属からの酵母細胞が挙げられる。
【００２２】
好ましくは、哺乳類細胞、より好ましくは、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞が使用される。好ましくは、その培養（凝集細胞）時の凝集反応について周知の細胞も使用される。最も好ましくは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞が使用される。
【００２３】
細胞凝集は、例えば、顕微鏡下に判定されうる。
【００２４】
細胞培養培地の培養物への添加速度（流入量または灌流量）は、細胞の生存率および密度に影響を及ぼす。
【００２５】
本発明の１つの実施形態においては、細胞培養培地は、以下の式１
灌流量＝ＳＰＲ＊総細胞培養容積＊生存細胞密度  （１）
（式中、前記灌流量はリットル／日で表され、ＳＰＲは比灌流量、すなわち細胞培養培地が、生存細胞／時間単位当たりで添加される培地の容積で表される細胞培養物に供給される速度であり、生存細胞密度は生存細胞／容積単位の数である）に従って計算される灌流量で添加される。生存細胞の数は、当業者によって、例えば、トリパンブルー排除法によって判定されうる。
【００２６】
比灌流量は、好ましくは、０．０１〜０．３ｎＬ／細胞／日、より好ましくは、０．０１〜０．２ｎＬ／細胞／日で選択される。
【００２７】
灌流量を調節する際の追加のパラメータ、例えば、培養物に供給されるグルコースの量および／または酸素濃度を考慮することは有利でありうる。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）では、グルコース灌流量は、好ましくは、培地灌流量の一環として、３〜２０ｍｍｏｌｅｓ／Ｌ、より好ましくは、５〜１５ｍｍｏｌｅｓ／Ｌで選択される。
【００２８】
当業者は流出量を測定する方法を理解している。液体の流出量は灌流量によって測定され、一般に等しい値で選択される。
【００２９】
本発明の１つの実施例においては、流出液体は実質的に生存細胞を欠いている。
【００３０】
本発明の別の実施形態においては、バイオマス（すなわち、細胞培養物における細胞）が細胞培養物から少なくとも１回除去され、追加の細胞培養培地が細胞培養物に添加され、バイオマス除去を相殺する。バイオマス除去は高い細胞密度をもたらしうる。バイオマスは連続的または段階的に除去されうる。
【００３１】
段階的やり方においては、バイオマスは所定の時間に連続的に除去される。段階的やり方が使用される場合は、バイオマス除去は、好ましくは、細胞が定常状態に達する直前または直後に開始される。
【００３２】
段階的やり方が使用される場合は、好ましくは、作業量／日の２〜４０％、より好ましくは、作業量／日の５〜３０％、さらに好ましくは、作業量／日の１０〜２５％のバイオマスの量が、バイオマス除去ステップ毎に除去される。
【００３３】
「作業量」により、細胞培養の総量が意味される。
【００３４】
「バイオマス除去ステップ」により、バイオマス除去の開始から停止までの時間が意味される。連続的やり方が使用される場合は、バイオマスは、細胞培養の終了まで連続的に除去される。好ましくは、バイオマスの連続的除去は、細胞が定常状態に達する直前または直後に開始される。好ましくは、バイオマスの量は、作業量／日の２〜４０％、より好ましくは、作業量／日の３〜３０％、さらに好ましくは、作業量／日の４〜１５％で除去される。
【００３５】
追加の細胞培養培地の添加は、バイオマス除去を相殺するために行われる。追加の細胞培養培地が細胞培養物に添加される供給は、灌流供給に合流されうるが、分離供給でも添加されうる。当業者は、どのくらいの追加の細胞培養培地がバイオマス除去を相殺するために必要であるかを承知している。一般に、追加の細胞培養培地の細胞培養物への追加の速度は、バイオマス除去速度と同じとなる。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態においては、生物学的物質が細胞によって産生される。細胞の灌流培養において適切に産生されうる生物学的物資は原則として、動物、特に哺乳類、および酵母細胞によって産生されうるすべての生物学的物質、例えば、モノクローナル抗体、成長因子またはペプチドホルモン、酵素などの治療的および診断的タンパク質、遺伝子治療において使用されるウイルスベクターなどのポリヌクレオチド、ワクチン等である。
【００３７】
本発明の灌流培養方法において、流出液体は、分離前の液体よりも低い細胞密度を有するが、同じ濃度の生物学的物質を有する。
【００３８】
好ましくは、本発明による方法は、医療用途を有する生物学的物質である生物医薬品の製造に使用される。生物医薬品の例は以下の通りである（括弧内の対応する生物医薬品の商標の例を含む）。すなわち、テネクテプレース（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）（ＴＮ  Ｋａｓｅ（商標））、（組換え）抗血友病因子（ＲｅＦａｃｔｏ（商標））、リンパ芽球様インターフェロンα−ｎ１（ＷｅｌＩｆｅｒｏｎ（商標））、（組換え）凝固因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標））、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、トラスツマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標））、ダクリツマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（Ｚｅｎａｐａｚ（商標））、（組換え）凝固因子ＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ（商標））、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）アルファ（Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標））、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、インターフェロンアルファ−２ｂ（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標））、組換えインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標））、インターフェロンベータ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、第８因子（ＫｏＧＥＮａｔｅ（登録商標））、グルコセレブロシダーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））、インターフェロンベータ１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、ＴＮＦアルファ受容体（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、卵胞刺激ホルモン（Ｇｏｎａｌ−Ｆ（登録商標））、Ｍａｂアブシクスマブ（ａｂｃｉｘｍａｂ）（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｍａｂリチキシマブ（ｒｉｔｉｘｉｍａｂ）（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、組織プラスミノゲン活性化因子（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）、Ａｃｔｉｌｙａｓｅ（登録商標））、ヒト成長ホルモン（Ｐｒｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標））、ＧｅｎｏＴｒｏｐｉｎ（商標））。可能な医療用途を有するポリヌクレオチドの例は、遺伝子治療的プラスミドＤＮＡである。一部の遺伝子治療的ＤＮＡは現在、その医療用途のための臨床試験においてテストされている。ワクチンの例は、生、口腔、四価ロタウイルスワクチン（ＲｏｔａＳｈｉｅｌｄ（商標））、狂犬病ワクチン（ＲａｎＡｖｅｒｔ（商標））、Ｂ型肝炎ワクチン（ＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ  ＨＢ（登録商標）、エンゲリックス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）（登録商標））、および不活性化Ａ型肝炎ワクチン（ＶＡＱＴＡ（商標））である。
【００３９】
流出における生物学的物資はさらに、いわゆる下流処理で精製されうる。下流処理は通常、さまざまな組合せおよび順序でいくつかの精製ステップを含む。下流処理における精製ステップの例は分離ステップ（例えば、親和性クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって）、生物学的物質の濃縮のためのステップ（例えば、限外ろ過またはダイアフィルトレーションによって）、緩衝剤を交換するステップおよび／またはウイルスを除去または不活性化するステップ（例えば、ウイルスろ過、ｐＨシフト、または溶媒界面活性剤処理によって）である。
【００４０】
本発明をこれから以下の実施例によって説明するが、しかし、それに限定されることはない。
【００４１】
［実施例１：生物製剤の製造のためのヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の方法最適化］
＜序論＞
多くの発現プラットフォームが現在、生物製剤の製造のために存在する。新しい製品の大部分は、哺乳類系を選択する必要があり、それは、これらの細胞が含有し、その他の細胞は欠いているグリコシル化機構によるところが大きい。しかし今日まで、これらの細胞の細胞量および結果として得られるこれらの細胞の生産性は、そのような製品を製造する機構を細胞が有した場合に対応する微生物系の１０〜１００倍低い要因である。
【００４２】
灌流培養構成が、生物製剤の製造を良好にさせる多くの特徴を有するヒト細胞系であるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系のために開発された。灌流構成は培養ブロスのさまざまな成分の分離を含み、細胞が保持され、集菌が捕捉され、培地清浄化が起こる。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系のスピンフィルタ、音響デバイス、および交互接線流（ＡＴＦ）ユニットを評価した。
【００４３】
＜材料と手法＞
＜細胞系および維持＞：ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系をヒトＩｇＧを産生する本試験において使用した。６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））を補充した血清を含有しない市販の培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＶＰＲＯ培地、ＪＲＨバイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））中に細胞を維持した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系は、ホスホグリセレートキナーゼプロモータを使用することによりアデノウイルスタイプ５（ａｄ５）Ｅ１遺伝子で不死化したヒト胚細胞系である。
【００４４】
＜バイオリアクター構成＞：１Ｌおよび４Ｌ作業量リアクター（アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）、オランダ、およびＢ．ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、ドイツ）を本試験中に使用した。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ＤＣＵ３コントローラー（Ｂ．ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、ドイツ）を使用し、規定設定点で方法を操作した。温度を３６．５℃（範囲３５．５〜３７．５℃）で維持した。ヘッドスペースを通じた吸気組成物の自動調整および微孔性スパージャーによる一時的散布で５０％（範囲４０〜６０％）の空気飽和で溶解酸素濃度を制御した。ｐＨ設定点は７．１（範囲６．７〜７．５）であり、ヘッドスペースを介しＣＯ２の流れによって制御した。細胞を発酵槽において接種生存細胞密度範囲０．２〜０．５＊１０６細胞／ｍＬで接種した。灌流は１〜３＊１０６細胞／ｍＬの範囲の生存細胞密度で開始した。
【００４５】
＜細胞保持＞：３種類のデバイスを使用してリアクター内で細胞を保持した。最初に１０μｍの細孔径を有するスピンフィルタ（ＧＫＤ、デューレン（Ｄｕｅｒｅｎ）、ドイツ）を使用した。次に、Ｂｉｏｓｅｐ  ＡＤ１０１５細胞保持システムおよびコントローラー（アプリセンス（ＡｐｐｌｉＳｅｎｓ）、オランダ）を使用した。最後に、関連中空繊維膜モジュールを有するＡＴＦ−４制御ユニットおよびハウジング（リファイン・テクノロジー（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国（ＵＳＡ））を評価した。使用された中空繊維フィルタはモデルＣＦＰ−２−Ｅ−８ＳＩＰ（０．２ミクロン、面積：４６００ｃｍ２、マゼラン・インスツルメンツ（Ｍａｇｅｌｌａｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から得られたアマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国（ＵＳＡ））であった。一定の培養量を維持するためにレベルセンサ制御ループが実施中であった。
【００４６】
＜分析的手法＞：バイオリアクターからの細胞計数をトリパンブルー排除法を使用して行った。生存細胞の数は以下の通り測定された。すなわち、トリパンブルーで染色した細胞の量をフックス・ローゼンタール（Ｆｕｃｈｓ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）血球計算器に移した。血球計算器のチャンバを顕微鏡下に配置し、適切な数のボックスを計算した。生存細胞密度を以下の式：
生存細胞密度（×１０５細胞／ｍｌ）＝（Ａ＋Ｂ）×Ｅ／３２０  （２）
（式中、
Ａ＝四角Ａにおける非染色細胞の数
Ｂ＝四角Ｂにおける非染色細胞の数
Ｅ＝希釈係数）を使用して計算した。
【００４７】
ＵＶ２８０ｎｍの吸収検出でＨＰＬＣを使用して分析的プロテインＡカラムによって抗体濃度を測定し、実際の濃度をＩｇＧ１標準品の較正曲線に基づき測定した。
【００４８】
＜結果＞
＜灌流培養＞
上記の材料および手法で得られた結果は図１〜図６に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】スピンフィルタ分離デバイスを使用したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを産生するＩｇＧ１の２種類の連続的灌流の生存細胞密度（×１０６細胞／ｍｌ）対培養時間（日）。１Ｌアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）発酵槽の攪拌速度設定は１００〜１５０ｒｍｐであった。灌流ランは１Ｌ作業量で行った。両方の灌流ランの比灌流量（ＳＰＲ）は０．１〜０．３ｎＬ／細胞／日であった。両方の場合に灌流ランはスピンフィルタの目詰まりにより終了しなければならなかった。
【図２】細胞保持系として音響デバイスを備えた連続的灌流システムにおいてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を産生するＩｇＧ１の成長。１Ｌアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）発酵槽の攪拌速度設定は１００〜１５０ｒｍｐであった。ラン／停止サイクルに使用された設定は前方３００秒および後方４．５秒であった。ラン時にこれは３００秒／３秒サイクル（１５日目）に適合させた。灌流ランの比灌流量（ＳＰＲ）は、０．１〜０．３ｎＬ／細胞／日であった。
【図３】細胞保持システムとしてＡＴＦ−４ユニットを備えた連続的灌流システムにおけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を産生するＩｇＧ１の成長。実験は４Ｌアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）発酵槽で行われた。攪拌速度の設定は１２５ｒｐｍであった。ＡＴＦ−４では０．５〜３作業量／日で操作された。ＳＰＲは０．０３〜０．０８ｎＬ／細胞／日で設定された。差込図は培養の高い細胞密度を示し、凝集細胞を完全に欠いている。
【図４】スピンフィルタ分離デバイスを使用したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを産生するＩｇＧ１の２種類の連続的灌流発酵のＩｇＧ１対培養時間（日）の生産性。
【図５】細胞保持システムとしての音響デバイスを備えた連続的灌流システムにおけるＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞を産生するＩｇＧ１の生産性。
【図６】細胞保持システムとしてのＡＴＦユニットを備えた連続的灌流システムにおけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を産生するＩｇＧ１の生産性。
【図７】灌流方法を使用して培養されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の細胞培養時間（日）対流（Ｌ／日）および比環流量（ｎｌ／細胞／日でのＳＰＲ）。
【図８】実施例２に記載された手順を使用した生存細胞密度および細胞生存率。
【００５０】
＜概要＞
異なるタイプの灌流で得られたデータの要旨については表１を参照。
【００５１】
【表１】
2014128272.tif 000002
【００５２】
ＡＴＦユニットを使用した連続的灌流実験は、非常に高い細胞密度および生成物濃度（１００×１０６細胞／ｍＬおよび０．９ｇ／Ｌ／日）を達成する大きな可能性を示すが、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の凝集は観察されなかったと結論づけることができる。
【００５３】
［実施例２：灌流によるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の培養］
＜機器＞：Ｂ．ブラウン（Ｂｒａｕｎ）発酵槽制御ユニット（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、ドイツ）、７Ｌブラウン（Ｂｒａｕｎ）管、および付随ｐＨ、溶解酸素（ＤＯ）、およびレベルセンサプローブ（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、ドイツ）を備えたヘッドプレート、ＡＴＦ−４制御ユニット、および付随中空繊維膜モジュール（リファイン・テクノロジー（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国（ＵＳＡ））。
【００５４】
＜フィルタ＞
フィルタモデル：ＣＦＰ−２−Ｅ−８ＳＩＰ
タイプ：０．２ミクロン
面積：４６００ｃｍ２
アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
【００５５】
＜作業量＞
設定点：４．１Ｌ
範囲：３．８−４．７Ｌ
【００５６】
【表２】
2014128272.tif 000003
【００５７】
＜流出率＞
バイオマス除去はこの方法には適用されなかった。
【００５８】
＜材料＞：ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＶＰＲＯ培地（ＪＲＨバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国（ＵＳＡ））、１２％Ｎａ２ＣＯ３中６ｍＭ（最終濃度）Ｌ−グルタミン（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））を使用してｐＨを制御する。
【００５９】
＜細胞系および培養条件＞
モデルＩｇＧを発現するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系を本試験で検討した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系は、網膜由来初代ヒト細胞から産生された。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系は、完全なヒトモノクローナル抗体（グリカンを含む）（参考文献１、参考文献２）を産生することが可能である。
【００６０】
エアレニマー（Ｅｒｌｅｎｙｍｅｒ）フラスコを１１０ｒｐｍおよび３６．５℃下に攪拌して細胞を培養した。これらのフラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２／空気の混合物を使用して制御した。
【００６１】
参考文献１：ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｄ．Ｈ．、バン・ベルケル（ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ），Ｐ．Ｈ．Ｃ．、ログテンベルク（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ），Ｔ．、およびバウト（Ｂｏｕｔ），Ａ．２００２年「ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  ２２、５０−５４頁。
【００６２】
参考文献２：ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｄ．ら、２００３年、「Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＰＥＲ．Ｃ６」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９、１６３−１６８頁。
【００６３】
＜発酵槽の操作＞
溶解酸素圧、ｐＨ、温度、および攪拌速度が下記の通り制御された発酵槽で細胞を培養した。
【００６４】
【表３】
2014128272.tif 000004
【００６５】
＜方法の説明＞：
接種生存細胞密度範囲０．２−０．５×１０６細胞／ｍｌおよび設定点０．３×１０６細胞／ｍｌの発酵槽で細胞を接種する。灌流は、２×１０６細胞／ｍｌを上回る生存細胞密度または培養の５日時点のいずれかが最初に達成されると開始される。
【００６６】
灌流量は、培養の細胞密度に依存し、使用される灌流量は以下の表に記載されている。流量および希釈率は、発酵槽内の細胞密度の増大に応じて調節される。
【００６７】
【表４】
2014128272.tif 000005
【００６８】
本実施例からの実際のデータおよび結果（とりわけ本実施例において使用された流量および比灌流量）は、以下の表２および図７および図８に示されている。
【００６９】
【表５】
2014128272.tif 000006
【図１】
2014128272.tif 000007
【図２】
2014128272.tif 000008
【図３】
2014128272.tif 000009
【図４】
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【図５】
2014128272.tif 000011
【図６】
2014128272.tif 000012
【図７】
2014128272.tif 000013
【図８】
2014128272.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月27日(2014.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物が中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、前記フィルタモジュール内の流れが交互接線流である、灌流培養方法の、細胞培養物中の細胞の凝集度合いを減少させるための使用であって、
前記細胞が培養時に凝集体を容易に又は本質的に形成する形成する傾向を有し、
当該灌流培養方法が、少なくとも９０％の細胞生存率で、少なくとも８０×１０６細胞／ｍｌの生存細胞密度に達するまで続けられ、
当該灌流培養方法によって、少なくとも５個の細胞の凝集体が最大でも前記細胞培養物中の細胞の総量の５％を構成する前記細胞培養物がもたらされる、
使用。
【請求項２】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞、ヒト細胞又はマウス細胞である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
バイオマスが少なくとも１回、前記細胞培養物から除去され、かつ追加の細胞培養培地が前記細胞培養物に添加される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記細胞培養培地が、式１：
灌流量＝ＳＰＲ＊総細胞培養容積＊生存細胞密度（１）
（式中、前記灌流量はリットル／日で表され、ＳＰＲは比灌流量、すなわち前記細胞培養培地が、生存細胞／時間単位当たりで添加される培地の容積で表される前記細胞培養物に供給される速度であり、前記生存細胞密度は生存細胞／容積単位の数である）に従って計算される灌流量で添加される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【外国語明細書】
2014128272000001.pdf