(57)【要約】      （修正有）【課題】癌に対して免疫反応を惹起することの可能なポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコード化する核酸ＤＮＡ、腫瘍細胞を認識および破壊することの可能なＴリンパ球を発生するための方法、ならびに癌の処置、予防または診断用の医薬組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＴ細胞応答を誘導可能である当該ポリペプチド。ＴＥＲＴγおよびσスプライシング変異体に基づいたペプチドおよび前記ペプチドをコード化する核酸であり、これらを医療、診断に使用する。【選択図】図１
2014138587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療における使用のためのポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、
ａ）SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１中で与えられる配列を含み、
ｂ）SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１からの８個の連続したアミノ酸を含み、但し前記８個の連続したアミノ酸の少なくとも１個が SEQ ID NO１、３、５または１１からであり、または、
ｃ）前記ｂ）に記載の８個の連続したアミノ酸に関連した１個、２個または３個だけのアミノ酸の変更（例えば置換）を持つ８個の連続したアミノ酸を含み、但し前記８個の連続したアミノ酸の少なくとも１個が SEQ ID NO１、３、５または１１からであり、
ここで該ポリペプチドがＴ細胞応答を誘導可能である当該ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、
ａ）デフォルトのパラメータを有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO１の配列を含む分子と少なくとも５５％の配列同一性を持ち、
ｂ）デフォルトのパラメータを有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO２の配列を含む分子と少なくとも５５％の配列同一性を持ち、
ｃ）１０００の期待値（Expect value）および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO３の配列を含む分子と少なくとも４０％の配列同一性を持ち、
ｄ）１０００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO４の配列を含む分子と少なくとも４０％の配列同一性を持ち、
ｅ）１０００００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO５の配列を含む分子と少なくとも７０％の配列同一性を持ち、
ｆ）１０００００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO６の配列を含む分子と少なくとも５０％の配列同一性を持ち、または、
ｇ）１０００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合に、SEQ ID NO１１の配列を含む分子と少なくとも４０％の配列同一性を持つ
当該ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１中で与えられるような配列を含むか、またはSEQ ID NO１、３、５、６または１１中に示されるような配列の断片である当該ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記Ｔ細胞応答が、ＭＨＣまたはＨＬＡ結合溝へ適合する断片を提供するための該ポリペプチドの細胞内開裂後に生じる当該ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない当該ポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、８〜１０個のアミノ酸長である当該ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスII結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない当該ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、１２〜２５個のアミノ酸長である当該ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記Ｔ細胞応答が、Ｔヘルパーおよび／またはＴ細胞傷害性細胞の数および／または活性を上昇させる当該ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、骨髄幹細胞、結腸の陰窩中の上皮細胞またはリンパ球の内の１つ以上に対する患者における実質的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激しない当該ポリペプチド。
【請求項１１】
医療における使用のための核酸分子であって、ここで該核酸分子が、
ａ）請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する鎖を持ち、
ｂ）前記ａ）に記載の鎖と相補的である鎖を持ち、または、
ｃ）前記ａ）もしくは前記ｂ）に記載の分子とハイブリダイズする鎖を持つ（例えばストリンジェント条件下で）
核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医療における使用のための核酸分子を含むベクターまたは細胞。
【請求項１３】
医療における使用のための結合剤であって、該結合剤が、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドと結合する当該結合剤。
【請求項１４】
請求項１４に記載の医療における使用のための結合剤であって、該結合剤が、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドに対して特異的である結合剤。
【請求項１５】
抗体またはこの断片である、請求項１４に記載の医療における使用のための結合剤。
【請求項１６】
医療における使用のためのＴリンパ球であって、該Ｔリンパ球が、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドを発現している細胞を殺傷することが可能な、またはこのような細胞の殺傷において補助することが可能なＴリンパ球。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医療における使用のためのＴリンパ球であって、該Ｔリンパ球が、Ｔ細胞傷害性細胞またはＴヘルパー細胞であるＴリンパ球。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の医療における使用のための複数のＴリンパ球を含むクローン細胞株。
【請求項１９】
請求項１７に記載のＴヘルパー細胞または請求項１８に記載のこのような細胞のクローン細胞株、および請求項１７に記載のＴ細胞傷害性細胞または請求項１８に記載のこのような細胞のクローン細胞株を含む、医療における使用のためのＴリンパ球の混合物。
【請求項２０】
癌を処置するための医薬の調製または癌を診断するための診断薬の調製における、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のベクターもしくは細胞、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合剤、請求項１６もしくは１７に記載のＴリンパ球、請求項１８に記載の細胞株、または請求項１９に記載のＴリンパ球の混合物の使用。
【請求項２１】
前記癌が哺乳類の癌である請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌がヒトの癌である請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸−直腸癌、肺癌、悪性黒色種、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頚部癌または胆管癌である請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬がワクチンである請求項２０〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬がアンチセンス分子であるか、または in vivo においてアンチセンス分子を生じることが可能である請求項２０〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
前記診断薬がキット中で提供される請求項２０〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
前記キットが、探知可能なシグナル（例えば蛍光ラベル、放射性ラベル）または探知可能な変化（例えば酵素触媒される変化）を生じるための手段を含む請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記キットが、癌を診断することにおける使用のための使用説明書を包含する請求項２６または請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のベクターもしくは細胞、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合剤、請求項１６もしくは１７に記載のＴリンパ球、請求項１８に記載の細胞株、または請求項１９に記載のＴリンパ球の混合物を含む医薬組成物。
【請求項３０】
癌遺伝子により生成されたポリペプチドに対して、または突然変異腫瘍抑制タンパク質に対して向けられたＴ細胞応答を誘導することが可能なポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコード化している核酸、あるいはこのようなポリペプチドに結合する結合剤、あるいはこのようなポリペプチドを発現している細胞を殺傷することの可能な、またはこのような細胞を殺傷することを補助することの可能なＴ細胞を更に含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記前記癌遺伝子または突然変異腫瘍抑制タンパク質が、ｐ２１−ｒａｓ、Ｒｂ、ｐ５３、ａｂｌ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ｒｅｔまたはｔｒｋである請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
抗癌治療における同時の、別々のまたは連続の使用のための、請求項２９に記載の成分および請求項３０または請求項３１に記載の成分を含む組み合わされた調製物。
【請求項３３】
請求項２９〜３１のいずれかに記載の医薬組成物、または請求項３２に記載の組み合わされた調製物であって、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、添加物、安定化剤および／または補助剤を更に含み、前記組成物または組み合わされた調製物が、サイトカインまたは成長因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＧＭ−ＣＳＦ）ならびにフレームシフト突然変異（例えばＢＡＸまたはｈＴＧＦβ−ＲII遺伝子におけるフレームシフト突然変異）から生じる他のポリペプチドの１つ以上を任意に更に包含する医薬組成物、または組み合わされた調製物。
【請求項３４】
ワクチンである請求項２９〜３１または３３のいずれかに記載の医薬組成物、あるいは請求項３２または３３に記載の組み合わされた調製物。
【請求項３５】
アンチセンス分子を含むか、または生成可能である、請求項２９〜３１もしくは３３のいずれかに記載の医薬組成物、または請求項３２もしくは３３に記載の組み合わされた調製物。
【請求項３６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１２に記載のベクターまたは細胞、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合剤、請求項１６または１７に記載のＴリンパ球、請求項１８に記載の細胞株、または請求項１９に記載のＴリンパ球の混合物を含む診断用組成物。
【請求項３７】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項３８】
任意に単離された形態の請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、図４中に示される配列からなるポリペプチドではないポリペプチド。
【請求項３９】
任意に単離された形態の請求項１１に記載の核酸であって、ここで該核酸が、請求項３８から除外されたポリペプチドをコード化している核酸ではなく、図４または図５において示されるような核酸でもない核酸。
【請求項４０】
任意に単離された形態の請求項１２に記載のベクターまたは細胞。
【請求項４１】
任意に単離された形態の請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合剤。
【請求項４２】
任意に単離された形態の請求項１６または１７に記載のＴリンパ球。
【請求項４３】
任意に単離された形態の請求項１８に記載のクローン細胞株。
【請求項４４】
請求項１９に記載のＴリンパ球の混合物。
【請求項４５】
請求項３８に記載のポリペプチドの配列、または請求項３９に記載の核酸の配列を含む、機械で読み取り可能なデータ担体（例えばディスク）。
【請求項４６】
配列の同一性の研究、配列の相同性の研究、またはハイブリダイゼーションの研究を実行するための、請求項３８に記載のポリペプチドの配列または請求項３９に記載の核酸分子の配列を使用することを含む方法。
【請求項４７】
構造および／または機能を予測するための（例えば抗癌活性を予測するための）、請求項３８に記載のポリペプチドの配列または請求項３９に記載の核酸分子の配列を使用することを含む方法。
【請求項４８】
薬物の開発またはスクリーニング方法における、請求項４６または請求項４７に記載の方法の使用。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法により同定または選ばれた薬物。
【請求項５０】
請求項３８に記載のポリペプチドまたは請求項３９に記載の核酸分子の配列を表示または貯えておき、あるいは請求項４６または４７に記載の方法を実行するために設置されるコンピュータまたはデータベース。
【請求項５１】
添付の図および実施例への言及を伴った、明細書中に実質的に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対して免疫反応を惹起することの可能なポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコード化する核酸ＤＮＡ、腫瘍細胞を認識および破壊することの可能なＴリンパ球を発生するための方法、ならびに癌の処置、予防または診断用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、幾つかの突然変異の現象を伴う多段階の過程を通じて進展する。これらの突然変異は、２つの範疇、即ち癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に属する遺伝子の変えられた発現／機能をもたらす。癌遺伝子は、癌原遺伝子から点突然変異または転座を通じて自然に生じ、これによって、該突然変異を宿している細胞の形質転換状態をもたらす。癌遺伝子はタンパク質をコードし、タンパク質を通じて機能する。癌原遺伝子は、癌遺伝子になる潜在能力を持つ、該細胞の正常な遺伝子である。大多数の場合では、癌原遺伝子は、シグナル伝達経路の成分であることが示されている。癌遺伝子は、優性に作用する。一方で腫瘍抑制遺伝子は、機能的なタンパク質をコード化する両方の対立遺伝子が非機能的な遺伝子産物を生成するように変えられてしまう場合、劣性に、即ち機能の消失を通じて作用し、発癌に寄与する。
【０００３】
ヒトの癌免疫学の分野では、この２０年間に、真性癌特異的抗原を特徴付ける徹底的な努力が見られた。特にヒトの腫瘍抗原に対する抗体の分析に努力が捧げられた。先行技術は、このような抗体が、例えば抗癌剤と関連して、診断および治療目的に使用され得ることを示唆している。しかしながら抗体は、腫瘍細胞の表面に曝された腫瘍抗原に結合することだけが可能である。この理由により、体の免疫系に基づいた癌の処置を生成する努力は、期待されるより成功してはいない。
【０００４】
免疫系の基礎的な特色は、それが非自己の分子から自己の分子を区別できること、およびそれが自己の分子に対しては正常では反応しないことである。他の個体から移植された組織または器官の拒絶は、該移植細胞の表面上の外来抗原に対する免疫応答であることが示されている。該免疫応答は、抗体により仲介される液性応答と細胞応答とを含む。抗体はＢリンパ球により生成および分泌され、元来の立体構造をした遊離の抗原を典型的に認識する。それらはそれ故に、該抗原表面上に曝された殆ど全ての部位を潜在的には認識することができる。抗体とは対照的に、免疫応答の細胞の戦闘力を仲介するＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の関係においてのみ、および適切な抗原プロセシングの後にのみ抗原を認識する。この抗原プロセシングは、タンパク質のタンパク質分解的な断片化から通常なり、該ＭＨＣ分子の溝へ適合するポリペプチドをもたらす。これは、Ｔ細胞が細胞内のタンパク質断片／抗原由来のポリペプチドをも認識することを可能にする。
【０００５】
Ｔ細胞は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣ分子の関係において、腫瘍細胞中のあらゆる場所に由来した異常なポリペプチドをも認識し得る。このＴ細胞は次いで、この異常ポリペプチドを宿している腫瘍細胞を除去するように活性化され得る。マウスの腫瘍を含む実験モデルにおいて、正常なポリペプチドとは１つのアミノ酸において異なるポリペプチドからなる細胞内の「自己」タンパク質中の点突然変異は、腫瘍拒絶抗原を引き起こすかもしれないことが示されている。腫瘍細胞の表面上のＭＨＣ分子の関係においてこれらのポリペプチドを認識するＴ細胞は、該腫瘍細胞を殺傷することが可能で、このように腫瘍を宿主から拒絶することが可能である（Boon et al., 1989, Cell 58: 293-303）。
【０００６】
ヒトにおけるＭＨＣ分子は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子として正常には言及される。ＨＬＡ分子の２つの主要なクラス、即ちクラスＩおよびクラスIIがある。ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ Ａ、ＢおよびＣ副遺伝子座によりコード化され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を主に活性化する。他方でＨＬＡクラスII分子は、ＣＤ４＋（細胞傷害性またはヘルパー）Ｔ細胞を主に活性化し、ＨＬＡ ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ副遺伝子座によりコード化される。幾つかの場合には、異なるＨＬＡクラスＩ分子の数は、２回同じＨＬＡ対立遺伝子が発生することによって減るが、全ての個体は６つの異なるＨＬＡクラスＩ分子（通常は３つの亜群Ａ、ＢおよびＣのそれぞれから２つの対立遺伝子）を正常には持つ。一般的な総説としては、Roitt, I. M. et al. (1998) 免疫学、第５版、Mosby, London を参照のこと。
【０００７】
ＨＬＡ遺伝子産物は、非常に多型である。異なる個体は、他の個体において見出されるものとは異なる区別可能なＨＬＡ分子を発現する。これは、移植においてＨＬＡが適合した臓器提供者を見出すことの難しさを説明している。免疫生物学におけるＨＬＡ分子の遺伝子の多様性の意義は、免疫応答遺伝子としてのそれらの役割にある。それらのポリペプチドとの結合能力を通じて、ある種のＨＬＡ分子の有無は、特異的なポリペプチド抗原決定基に対する個体の応答能力を司る。結果として、ＨＬＡ分子は、疾病に対する耐性または感受性に影響を及ぼす。
【０００８】
Ｔ細胞は、種々の機序により癌の進展および成長を阻害し得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８＋およびＨＬＡクラスII拘束ＣＤ４＋の両方）は、適切な腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞を直接殺傷することがある。正常には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に必要とされるが、もしポリペプチド抗原が適切なＡＰＣにより提示されるならば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は直接に活性化でき、これはより速く、より強くてより有効な応答をもたらす。
【０００９】
国際出願 PCT/NO92/00032（WO92/14756 として公開）では、その癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子タンパク質に比較して突然変異または転座の点を持つ癌遺伝子タンパク質産物の合成ペプチドおよび断片が記載されている。これらのペプチドは、癌細胞または他の抗原提示細胞により提示されるようなプロセシングされた癌遺伝子タンパク質断片または腫瘍抑制遺伝子断片の断片に対応し、該断片を完全に網羅するか該断片そのものであり、また各個体において少なくとも１つの対立遺伝子によるＨＬＡ−ポリペプチド複合体として提示される。該ポリペプチドは、プロセシングによって細胞より生成されてＨＬＡ分子中に提示された実際の癌遺伝子タンパク質断片に対する特異的なＴ細胞応答を誘導することが示された。特に WO92/14756 において、ポリペプチドが、特定のアミノ酸の位置、すなわち１２、１３および６１位に点突然変異を持つｐ２１−ｒａｓタンパク質に由来したことが記載されている。これらのポリペプチドは、in vitro において癌細胞の成長を調節することにおいて有効であることが示されている。更に該ポリペプチドは、ワクチン接種または癌治療スキームにおけるこのようなポリペプチドの投与を通じて、突然変異したｐ２１−ｒａｓ癌遺伝子タンパク質を宿している癌細胞に対してＣＤ４＋Ｔ細胞免疫を惹起することが示された。引き続いてこれらのポリペプチドは、前記投与を通じて、突然変異したｐ２１−ｒａｓ癌遺伝子タンパク質を宿している癌細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞免疫も惹起することが示された（Gjertsen, M. K. et al., 1997, Int. J Cancer 72: 784-790）。
【００１０】
国際出願 PCT/NO99/00143（WO99/58552 として公開）は、癌細胞中の遺伝子において起こるフレームシフト突然変異から生じる突然変異タンパク質産物の合成ペプチドおよび断片を記載している。これらのペプチドは、癌細胞または他の抗原提示細胞により提示されるようなプロセシングされたフレームシフト突然変異タンパク質断片の断片に対応し、該断片を完全に網羅するか該断片そのものであり、各個体において少なくとも１つの対立遺伝子によるＨＬＡ−ポリペプチド複合体として提示される。特に、ＢＡＸおよびｈＴＧＦβ−ＲII遺伝子におけるフレームシフト突然変異からもたらされるポリペプチドが開示されている。これらのポリペプチドは、特異的な様式でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することにおいて有効であることが示された。
【００１１】
しかしながら、前記ポリペプチドは、癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子における点突然変異、フレームシフト突然変異または転座を伴った癌遺伝子を含む幾つかの数の癌においてのみ有用であろう。包括的な範囲の癌に対して有効であろう抗癌治療またはワクチンに対する強い必要性がある。
【００１２】
他の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の組み合わせの協調した作用は、細胞の形質転換および悪性の表現型の進展をもたらす。このような細胞は、しかしながら、老化への傾向があり、限られた寿命を持つ。最も多くの癌において、腫瘍細胞の不死化は、テロメラーゼと呼ばれる酵素複合体を作動させることを要求する。体細胞においては、テロメラーゼホロ酵素の触媒的サブユニットｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）は、正常では発現していない。腫瘍ウィルスによりコード化されるタンパク質の作用または沈黙化された（メチル化された）プロモーター部位の脱メチル化のような追加的な現象が、機能的なテロメラーゼ複合体の成分をコード化している遺伝子の腫瘍細胞における発現をもたらし得る。
【００１３】
最も多くの型の癌細胞におけるテロメラーゼの存在により、該酵素は、一般的な癌ワクチンの候補として開示されている（WO00/02581 として公開された国際特許出願第 PCT/NO99/00220 号）。WO00/02581 は、癌を患っている（または癌を患っているらしい）哺乳類において、テロメラーゼ発現細胞に対するＴ細胞応答を発生することにより、癌を妨げまたは処置するための方法を記載している。WO00/02581 においては、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋両方のＴ細胞が、このようなテロメラーゼタンパク質由来の配列を持つポリペプチドの投与により刺激され得ることが論証されている。
【００１４】
テロメラーゼプレｍＲＮＡの選択的スプライシング変異体が、文献において報告されている（Kilian, A. et al., 1997, Hum. Mol. Genet. 6: 2011-2019）。Kilian ら（１９９７年、同上）は、幾つかのスプライシング変異体がｈＴＥＲＴの不可欠なＲＴ（逆転写酵素）ドメインと共に位置されるのは注目に値することであると指し示した。しかしながら、ｈＴＥＲＴのスプライシング変異体の意義の充分な理解は得られておらず、更なる機能的な特徴付けが要求されると彼らは述べた。
【００１５】
ｈＴＥＲＴ遺伝子の完全なゲノム配列の分析は、異なるｍＲＮＡのスプライシング変異体が、ｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡ中の他のスプライシング部位の使用から生じることを証明した（Wick, M. et al., 1999, Gene 232: 97-106）。全長のｈＴＥＲＴのｍＲＮＡと比較して、少なくとも５つの追加的なスプライシング変異体が探知された。これらの変異体のスキーム的な図面は図１中に与えられ、図２はコード化されたタンパク質の配列を示す。α-del（またはＤＥＬ１）およびβ-del（またはＤＥＬ２）と名付けられた２つのスプライシング変異体は、特異的なコード配列の欠損を表す。該α-del 変異体は、エクソン６の最初の３６個のヌクレオチドを欠損し、ひとつづきの１２個の内部アミノ酸を欠くタンパク質をコード化している。該β-del 変異体では、エクソン７および８全体を表す１８２個のヌクレオチドがなくなっており、オープン・リーディング・フレーム中のシフト、および全長のｈＴＥＲＴタンパク質中には存在しない４４個のアミノ酸長のカルボキシル末端を有する、短縮タンパク質をもたらす。残りのスプライシング変異体は、イントロン領域の内部に位置される他のスプライシング部位の使用により得られ、オープン・リーディング・フレーム内でのイントロン配列の挿入および翻訳の早まった終結をもたらす。σ−挿入（またはＩＮＳ１）変異体は、イントロン４の最初の３８個のヌクレオチドの挿入により得られる。σ−挿入は停止コドンを含有しないが、代わりにオープン・リーディング・フレームは、他のリーディング・フレームを使用した正常な配列中に２２個のヌクレオチドを延伸する。γ−挿入（またはＩＮＳ３）変異体は、イントロン１４からの最後の１５９個のヌクレオチドの挿入により引き起こされる。Ｉｎｓ−４は、エクソン１５およびエクソン１６の大部分を同時に欠損している一方で、イントロン１４からの最初の６００個のヌクレオチドを含有する。これらのスプライシング変異体の翻訳から得られた短縮タンパク質が、図２に示される。
【００１６】
最近の幾つかの研究は、テロメラーゼ活性の調節を説いており、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの転写とテロメラーゼ活性との間のある種の相関が、幾つかの細胞株および組織に関して報告されている（Nakamura, T. M. et al., 1997, Science 277: 955-959; Meyerson, M. et al., 1997, Int. J. Cancer 85: 330-335; Nakayama, J. et al., 1998, Nature Genet. 18: 65-68; Liu, K. et al., 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 5147-5152）。他の研究は、テロメラーゼ活性がタンパク質キナーゼＣαによるｈＴＥＲＴタンパク質のリン酸化を通じてアップレギュレーションされ、逆に、タンパク質キナーゼＣ阻害剤およびホスファターゼ２Ａの存在によりダウンレギュレーションされることを示している（Li, H. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16729-16732; Li, H. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 33436-33442; Bodnar, A. G. et al., 1996, Exp. Cell Res. 228: 58-64; Ku, W. C. et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 730-736）。ｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、テロメラーゼ活性を調節するための追加的な機序を表し、胎児の腎臓の発達の間および成人の卵巣および子宮組織におけるダウンレギュレーションを仲介することが示されている（Ulaner, G. A. et al., 1998, Cancer Res. 58: 4168-4172; Ulaner, G. A. et al., 2000, Int. J. Cancer 85: 330-335）。前記研究の焦点はαおよびβスプライシング変異体にあり、おそらくそれらが重要な逆転写酵素のモチーフをコード化すると信じられている配列を欠損しているからである（Lingner, J. et al., 1997, Science 276: 561-567）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＴＥＲＴγおよびσスプライシング変異体に基づいたペプチドおよび前記ペプチドをコード化する核酸、ならびに医療（medicine）におけるこれらのペプチドおよび核酸の新規使用を提供する。
【００１８】
従って本発明によれば、医療における使用のためのポリペプチドが提供され、ここで該ポリペプチドは、
ａ）SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１中で与えられる配列を含み、
ｂ）SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１からの８個の連続したアミノ酸を含み、但し前記８個の連続したアミノ酸の少なくとも１個が SEQ ID NO１、３、５または１１からであり、または、
ｃ）前のｂ）において記載の８個の連続したアミノ酸に関連した１個、２個または３個だけのアミノ酸の変更（例えば置換）を持つ８個の連続したアミノ酸を含み、但し存在する８個の連続したアミノ酸の少なくとも１個がSEQ ID NO１、３、５または１１からであり、
ここで該ポリペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導可能である。
【００１９】
明細書中で使用される文言「含む（comprise）」は「からなる（consist）」を包含する。本発明のポリペプチド（または核酸）は、もし特定されなければ、１個以上のアミノ酸（または核酸）残基に隣接されていてもよい。例えば、該ポリペプチドは、融合タンパク質の精製を可能にするために、Ｎ−またはＣ−末端で１個以上の隣接ドメインを持つ融合タンパク質の一部であってもよい。
【００２０】
ポリペプチド中のアミノ酸変更または修飾（例えば置換）は特に、Ｔ細胞への提示のためにＨＬＡまたはＭＨＣ分子へ適合するアンカー残基に対してなされてもよい。ＨＬＡまたはＭＨＣ分子に対する該ポリペプチドの増強された結合および免疫原性は、このように達成されてもよい（Bristol, J. A. et al., 1998, J. Immunol. 160(5): 2433-2441; Clay, T. M. et al., 1999, J. Immunol. 162(3): 1749-1755 参照）。
【００２１】
前記ポリペプチドは任意に、
ａ）デフォルトのパラメータを有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO１の配列を含む分子と少なくとも５５％の配列同一性を持ち、
ｂ）デフォルトのパラメータを有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO２の配列を含む分子と少なくとも５５％の配列同一性を持ち、
ｃ）１０００の期待値（Expect value）および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO３の配列を含む分子と少なくとも４０％の配列同一性を持ち、
ｄ）１０００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO４の配列を含む分子と少なくとも４０％の配列同一性を持ち、
ｅ）１０００００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO５の配列を含む分子と少なくとも７０％の配列同一性を持ち、
ｆ）１０００００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO６の配列を含む分子と少なくとも５０％の配列同一性を持ち、または、
ｇ）１０００の期待値および他のパラメータをデフォルトとして有する NCBI BLASTP 2.1.2 版探索により決定される場合、SEQ ID NO１１の配列を含む分子と少なくとも４０％、好ましくは６０％の配列同一性を持っていてもよい。
【００２２】
NCBI BLASTP プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ に見出され、デフォルトのパラメータは、Advanced Search を使用して変換できる。表示されるべき照合を小さなクェリー（query）配列を用いて探索する場合、デフォルトの「期待」値よりも高いことが要求されることがある。明細書中で使用される文言「配列同一性」は、対応する関連した位置において正確に一致する最適に直線状に並べられた配列中のアミノ酸残基のことをいう。例えば NCBI BLASTP プログラムは、クェリーと対象（「ヒットした」）配列との間の同一性の百分率の値を提供する。
【００２３】
前記ポリペプチドは、SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１において与えられるような配列を含んでもよく、SEQ ID NO１、３、５、６または１１において示されるような配列の断片であってもよい。
【００２４】
ＨＬＡクラスII分子により提示されるポリペプチドは、変化する長さ（１２〜２５個のアミノ酸）のものであるが、ＨＬＡクラスＩ分子により提示されるポリペプチドは、クラスＩ ＨＬＡの結合溝へ適合するためには、正常には９個のアミノ酸残基長でなくてはならない。クラスＩ拘束ＨＬＡ溝中で提示する前に、もしＡＰＣまたは癌細胞のような標的細胞により内部的にプロセシングされることが可能でないならば、より長いペプチドは結合しないであろう。９個のアミノ酸のこの要求からの逸脱は、限られた数しか報告されておらず、それらの場合においては、提示されたポリペプチドの長さは８個または１０個のアミノ酸残基長である。ＭＨＣ分子へ結合するポリペプチドに関する総説に関しては、Rammensee, H.-G. et al. (1995) Immunogenetics 41: 178-228 および Barinaga (1992), Science 257: 880-881 を参照のこと。Male, D. K. et al.（1996, Advanced Immunology, Mosby, London）は、免疫学の分野に関する背景情報を提供している。
【００２５】
前記ポリペプチドにより発生されるＴ細胞応答は、ＭＨＣまたはＨＬＡ結合溝へ適合する断片を提供するポリペプチドの細胞内開裂後に発生されてもよい。あるいは、前記ポリペプチドは、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としないことがある。この場合、該ポリペプチドは８〜１０個のアミノ酸長であってもよい。ＭＨＣまたはＨＬＡクラスII結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない前記ポリペプチドも提供される。この場合、該ポリペプチドは１２〜２５個のアミノ酸長であってもよい。
【００２６】
本発明によるＴ細胞応答は、ヘルパーＴおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞の数および／または活性を上昇させ得る。
【００２７】
骨髄幹細胞、結腸の陰窩中の上皮細胞またはリンパ球の内の１つ以上に対する患者における実質的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激しないポリペプチドも提供される。
【００２８】
本発明により、医療における使用のための核酸分子が更に提供され、ここで該核酸分子は、
ａ）前記のように、前記ポリペプチドをコード化する鎖を持ち、
ｂ）前のａ）中に記載の鎖と相補的である鎖を持ち、または、
ｃ）前のａ）またはｂ）中に記載の分子とハイブリダイズする鎖を持つ（例えばストリンジェント条件下で）。
【００２９】
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, J. et al.（1989, Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）のｐｐ１．１０１−１．１１０および１１．４５−１１．６１に詳しく論じられている。使用できるハイブリダイゼーション条件の１つの例は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予備洗浄溶液を使用すること、および５×ＳＳＣを使用して５５℃にて終夜ハイブリダイゼーションを試みることを含む。本発明の範囲内においてハイブリダイゼーション核酸配列には、プローブ、プライマーまたはＤＮＡ断片を包含する。文言プライマーには、適切な条件（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のようなポリメリゼーション試薬の存在下において）下で、適切な緩衝液中および適温にて、鋳型に従ったＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドを包含する。
【００３０】
医療における使用のための、本発明による核酸分子を含むベクターまたは細胞も提供される。
【００３１】
医療における使用のための結合剤も更に提供され、ここで該結合剤は、前記の前記ポリペプチドと結合する。前記結合剤は、前記のポリペプチドに特異的であってもよい。前記結合剤は、抗体またはその断片であってもよい。前記結合剤は、レクチンであってもよい。
【００３２】
その様々な文法の形態での文言抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり抗体結合部位またはパラトープを含有する分子のことをいうために明細書中で使用される。このような分子はまた、免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」としても言及される。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、ならびにパラトープを含有する免疫グロブリン分子のそれらの部分であり、この部分には当業界でＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')2およびＦ(v)として知られるそれらの部分が包含される。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。文言抗体は、一本鎖抗体、キメラ、ヒト化または霊長類化された（ＣＤＲ−移植）抗体など、ならびにキメラまたはＣＤＲ−移植単鎖抗体を包含するように意図され、これには２つの異なる種からの部分が含まれる。抗体の調製には、Harlow, E. および Lane, D.（1988, 抗体：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）、および Harlow, E. および Lane, D.（1999, 抗体の使用：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）を参照のこと。ワクチン用のレシチンを含む免疫学的補助剤は、抗体産生を刺激するために使用されてもよい（例えば US4,803,070 参照）。
【００３３】
本発明により、医療における使用のためのＴリンパ球が更に提供され、ここで該Ｔリンパ球は、本発明による前記ポリペプチドを発現している細胞を殺傷することができ、またはこのような細胞の殺傷において補助することができる。前記Ｔリンパ球は、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞であってもよい。
【００３４】
医療における使用のために、前記の複数のＴリンパ球を含むクローン細胞株も提供される。ヘルパーＴ細胞またはこのような細胞のクローン細胞株、および細胞傷害性Ｔ細胞またはこのような細胞のクローン細胞株を含む、医療における使用のためのＴリンパ球の混合物も提供される。
【００３５】
哺乳類において腫瘍細胞を認識して破壊することができるＴリンパ球を発生する方法も提供され、これは哺乳類からＴリンパ球の試料を取ること、ならびにこのＴリンパ球を、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質特異的Ｔリンパ球および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質特異的Ｔリンパ球を発生するのに充分な量の少なくとも１つの前記ポリペプチドの存在下で培養することを含む。
【００３６】
本発明による抗体を発生するのに有用であり得るＢリンパ球も提供される。本発明による抗体を発生することが可能なハイブリドーマも包含される（例えば Koehler et al., 1975, Nature 256: 495-497; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA 80: 2026-2030; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, pp. 77-96 参照）。
【００３７】
癌の処置用の医薬（medicament）の調製または癌を診断するための診断薬の調製における、前記ポリペプチド、前記核酸、前記ベクターまたは細胞、前記結合剤、前記Ｔリンパ球、前記細胞株、または前記Ｔリンパ球の混合物の使用も、本発明により更に提供される。該癌は哺乳類の癌であってもよい。特に、該癌はヒトの癌であってもよい。例えば該癌は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸−直腸癌、肺癌、悪性黒色種、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頚部癌または胆管癌であってもよい。
前記医薬はワクチンであってもよい。
【００３８】
明細書で記載されるポリペプチドは、ＣＤ４＋かＣＤ８＋かのＴ細胞免疫を間違いなく惹起することの可能なワクチンにおける使用に特に適している。該ポリペプチドは合成的に生成されてもよいので、該ポリペプチドを包含する医薬は、有害な効果を生成するかも知れない形質転換癌遺伝子または他の部位または物質を包含しない。該ポリペプチドは、他の望まれない応答の副作用なしに、特定の型のＴ細胞応答を標的とするかもしれない。
【００３９】
前記医薬はアンチセンス分子であってもよく、または in vivo においてアンチセンス分子を発生することが可能である。
【００４０】
前記診断薬は、キット中で提供されてもよい。該キットは、探知可能なシグナル（例えば蛍光ラベル、放射性ラベル）または探知可能な変化（例えば酵素触媒される変化）を発生するための手段を含んでもよい。該キットは、癌を診断することにおける使用のための使用説明書を包含してもよい。
【００４１】
前記ポリペプチド、前記核酸、前記ベクターまたは細胞、前記結合剤、前記Ｔリンパ球、前記細胞株、または前記Ｔリンパ球の混合物を含む医薬組成物も更に提供される。
【００４２】
前記医薬組成物は、癌遺伝子により生成されたポリペプチドに対して、または突然変異腫瘍抑制タンパク質に対して向けられたＴ細胞応答を誘導することが可能なポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコード化している核酸、あるいはこのようなポリペプチドに結合する結合剤、あるいはこのようなポリペプチドを発現している細胞を殺傷することが可能な、またはこのような細胞を殺傷することを補助することの可能なＴ細胞を含んでもよい。このような癌遺伝子または突然変異腫瘍抑制タンパク質の例は、ｐ２１−ｒａｓ、Ｒｂ、ｐ５３、ａｂｌ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ｒｅｔまたはｔｒｋを包含する。該癌遺伝子標的は、国際出願第 PCT/NO92/00032 号（公開番号第 WO92/14756 号）において記載されているｐ２１−ｒａｓポリペプチドであってもよい。
【００４３】
抗癌治療における同時の、別々のまたは連続の使用のための前記医薬組成物からの成分を含む組み合わされた調製物も提供される。
【００４４】
医薬的に許容可能な担体、希釈剤、添加物、安定化剤および／または補助剤を更に含む、前記医薬組成物または組み合わされた調製物も提供され、前記組成物または組み合わされた調製物は、サイトカインまたは成長因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＧＭ−ＣＳＦ）ならびにフレームシフト突然変異（例えばＢＡＸまたはｈＴＧＦβ−ＲII遺伝子におけるフレームシフト突然変異）から生じる他のポリペプチドの１つ以上を任意に更に包含する。
【００４５】
ＢＡＸおよびｈＴＧＦβ−ＲII遺伝子におけるフレームシフト突然変異から得られるポリペプチドによる特異的な様式でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への刺激の効果は、WO99/58552（前を参照）において開示された。
【００４６】
前記医薬組成物または組み合わされた調製物は、ワクチンであってもよい。
前記医薬組成物または組み合わされた調製物は、アンチセンス分子を含むかまたは生成可能であってもよい。
前記医薬組成物の調製のための方法も提供され、これは医薬的に許容可能な担体、希釈剤、添加物、安定化剤および／または補助剤に、前記成分を組み合わせる工程を含む。
【００４７】
本発明による医薬組成物は、以下の混合物のいずれを含んでもよい。
ａ）異なる配列を持つ他のポリペプチドと共に、前記の少なくとも１つのポリペプチドの混合物、
ｂ）ポリペプチドが異なるＭＨＣまたはＨＬＡ対立遺伝子に適合するのに適切であるように重なる配列を持つ他のポリペプチドと共に、前記の少なくとも１つのポリペプチドの混合物、
ｃ）混合物ａ）およびｂ）両方の混合物、
ｄ）混合物または幾つかの混合物ａ）、
ｅ）幾つかの混合物ｂ）の混合物、または、
ｆ）幾つかの混合物ａ）および幾つかの混合物ｂ）の混合物。
【００４８】
該混合物中のポリペプチドはお互いに共有結合して、より大きなポリペプチドまたは環状ポリペプチドさえ形成してもよい。ポリペプチド自体は、直鎖または環状形態であってもよい。
【００４９】
前記ポリペプチド、前記核酸、前記ベクターまたは細胞、前記結合剤、前記Ｔリンパ球、前記細胞株、または前記Ｔリンパ球の混合物を含む診断用組成物も、本発明により提供される。
前記診断用キットも、本発明により提供される。
【００５０】
患者または同じものを必要とする動物に、治療的に有効な量の前記医薬組成物を投与することを含む、ヒトまたは動物の体の癌の処置または予防の方法も、本発明により提供される。本発明は、癌で苦しんでいる患者または動物の処置または予防の方法を包含し、該方法は、前記癌に対してのＴ細胞応答を惹起するのに充分な量の前記医薬組成物を、前記患者または動物に投与することを含む。処置の該方法は、in vivo または ex vivo において、前記医薬組成物での刺激も包含してもよい。Ex vivo 治療は、患者または動物から樹状細胞または他の適切な抗原提示細胞を単離すること、前記細胞を前記の少なくとも１つのポリペプチドまたは核酸で装填すること、およびこれらの装填された細胞を前記患者または動物中へ注入して戻すことを包含してもよい。前記該ポリペプチドまたは核酸は、癌に対しての抵抗力を得るために、患者のワクチン接種の方法中で使用されてもよい。癌遺伝子は、時々ウィルスに関連している。本発明は、ある種のウィルス性疾患の処置にも適切である。
【００５１】
本発明によるポリペプチドは、ワクチン接種されるべき平均的なヒトの患者または個体に対して、１μｇ〜１ｇの範囲の量で投与されてもよい。各投与につき１μｇ〜１ｍｇの範囲の小さい投薬量を使用することが好ましい。
【００５２】
正確な投薬量、つまり医薬的に許容可能な投薬量、および本発明の医薬組成物および医薬の投与レジメは、例えば投薬量−応答アッセイを例えば使用して、当業者により容易に決定されてよい。
【００５３】
該投与は、所望のＴ細胞免疫を確立および／または維持するのに適切なように、１回または数回行ってもよい。本発明によるポリペプチドは、サイトカインおよび／または成長因子、つまりインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または免疫応答を強くするための、当業界において既知の同様のもののような化合物と共に、同時か別々に投与されてもよい。該ポリペプチドは、単独または他の物質と組み合わせて、ワクチンまたは治療用組成物中で使用され得る。例えば、該ポリペプチド（単数または複数）は、高親和性細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することで知られるリポペプチド接合体の形態で供されてもよい（Deres, K. et al., 1989, Nature 342: 561-564）。
【００５４】
本発明によるポリペプチドは、ＤＮＡワクチンの形態で個体または動物に投与されてもよい。単数または複数の該ペプチドをコード化しているＤＮＡは、クローニングされたプラスミドＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドの形態であってもよい。該ＤＮＡは、ＩＬ−２のようなサイトカイン、および／または他の同時刺激分子と共に送達されてもよい。該サイトカインおよび／または他の同時刺激分子は、それ自体がプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡの形態で送達されてもよい。
【００５５】
ＤＮＡワクチンに対する応答は、免疫刺激性ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）の存在により上昇することが示されている。これらは、式（５’−プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン−３’）による、メチル化ＣｐＧを含有する６量体のモチーフの形態を取り得る。本発明によるＤＮＡワクチンはこれ故に、これらのまたは他のＩＳＳを、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質をコード化しているＤＮＡの中に、サイトカインまたは他の同時刺激分子をコード化しているＤＮＡの中に、または両方の中に取り込んでもよい。ＤＮＡワクチン接種の利点の総説は、Tighe et al.（1998, Immunology Today, 19(2): 89-97）により提供される。
【００５６】
場合によって単離形態で、前記ポリペプチドも本発明により提供され、ここで該ポリペプチドは、図４中に示される配列からなるポリペプチドではない。
【００５７】
図４に示されるポリペプチド配列は、SEQ ID NO１の４４個のアミノ酸を包含する、約１１００個のアミノ酸残基のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体のＣ末端の４６個のアミノ酸残基についての Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃにおける開示を表している。Kilian et al.（１９９７年、同上）において提供される配列は、ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質の「他のＣ−末端」を示している（Kilian et al.（１９９７年、同上）は、対応するＤＮＡ配列が GenBank Accession number AF015950 により提供されることを指し示している）。Kilian et al.（１９９７年、同上）は、ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質のＣ末端における SEQ ID NO１、２または５によるポリペプチドを別々の実体としては開示しておらず、彼らは SEQ ID NO１、２または５によるポリペプチドの薬用の使用を開示または示唆していない。
【００５８】
明細書中に記載されるポリペプチドは、従来の方法により、例えば当業界で既知の様々なポリペプチド合成法により生成されてもよい。あるいはそれらは、例えば臭化シアンを使用する開裂および引き続いての精製により生成されるｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質の断片および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質であってもよい。酵素的な開裂が使用されてもよい。該ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質およびｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質またはペプチドは、組み換え発現タンパク質またはポリペプチドの形態であってもよい。
【００５９】
明細書中に記載されているような核酸も、場合によっては単離された形態で提供され、ここで該核酸は、前で除外されたポリペプチドをコード化している核酸ではなく、図４または図５において示されるような核酸でもない。
【００６０】
約３１００塩基対のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体の３’−末端にある核酸配列は、その一部が SEQ ID NO１を包含する対応するタンパク質のＣ−末端をコード化しており、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図４において提供される。Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂ中で開示されているようなｈＴＥＲＴスプライシング変異体ＩＮＳ１（σ−挿入スプライシング変異体と等価）およびＩＮＳ３（γ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン−イントロン境界にある該核酸配列が、図５中に示される。図５中に示される Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂ中で開示されているような該核酸は、SEQ ID NO１〜６および１１中に存在するアミノ酸残基をコード化するヌクレオチドを包含する。Wick et al.（１９９９年、同上）は、明確な実体として示される該核酸の存在およびそれらの医学的な使用に関して特定の言及をしていない。Wick et al.（１９９９年、同上）は、GenBank Accession numbers AF128893 および AF128894 中のそれらのｈＴＥＲＴ遺伝子の、完全なヌクレオチド配列に関する言及を提供している。
【００６１】
本発明のポリペプチドをコード化する核酸は、オリゴヌクレオチド合成により作られてもよい。これは、当業界で利用可能な様々な方法のいずれによってなされてもよい。テロメラーゼタンパク質をコード化する核酸は、従来のライブラリー・スクリーニングを使用してゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングされてもよい。そのプローブは、既知のｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入遺伝子のいずれの配列の一部分に対応してもよい。あるいは該核酸は、ポリメラーゼ直鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより得られることができる。該核酸は、好ましくはＤＮＡであり、ベクター中に適切にクローニングされてもよい。サブクローンが、適切な制限酵素を使用することにより発生されてもよい。クローニングまたはサブクローニングされたＤＮＡは、適切な宿主（例えばバクテリアの宿主）中で繁殖されてもよい。あるいは該宿主は、酵母またはバキュロウィルスのような真核細胞生物であることが可能である。ｈＴＥＲＴγ−挿入およびｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質またはポリペプチドは、適切な宿主における発現により生成されてもよい。この場合該ＤＮＡは、発現ベクター中へクローニングされる。様々な商業的な発現キットが入手可能である。Sambrook, J. et al.（1989, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）において記載されている方法が、これらの目的に使用されてもよい。
【００６２】
明細書中に記載されるようなベクターまたは細胞も、任意に単離された形態で提供される。
明細書中に記載されるような結合剤が、任意に単離された形態で更に提供される。
明細書中に記載されるようなＴリンパ球が、任意に単離された形態でなお更に提供される。
明細書中に記載されるようなクローン細胞株も、任意に単離された形態で提供される。
明細書中に記載されるようなＴリンパ球の混合物が、更に提供される。
【００６３】
明細書中に記載されるようなポリペプチドの、または核酸の配列を含む、機械で読み取り可能なデータ担体（例えばディスク）も提供される。
【００６４】
配列の同一性の研究、配列の相同性の研究、またはハイブリダイゼーションの研究を実行するために、明細書中に記載されるようなポリペプチドまたは核酸分子の配列を使用することを含む方法が、なお更に提供される。前記方法は、構造および／または機能を予測するために（例えば抗癌活性を予測するために）前記配列を使用することを包含してもよい。薬物の開発またはスクリーニングの手順においても、この方法の使用が提供される。
【００６５】
明細書中に記載されるようなポリペプチドまたは核酸分子の配列を表示または貯えておき、あるいは前記方法を実行するために設置されるコンピュータまたはデータベースも提供される。
【００６６】
添付の図および実施例への言及と共に、明細書中において前に実質的に記載の発明も提供される。
語句「アミノ酸残基」および「アミノ酸」は、WIPO Standard ST.25 において定義されて明細書中で援用されるような修飾または異常アミノ酸を包含するように、幅広く定義される。
明細書中で使用される文言、処置または治療は、適用可能な場合、予防的な処置または治療を包含する。
明細書中で論じられる文献のそれぞれの内容は、その中で引用される文献を含んで、それらの全体を明細書中に援用される。
【００６７】
本発明は、例だけのつもりであるが、本発明による様々なポリペプチドおよびそれらの使用を示す幾つかの添付の図に関する言及と共に、以下の記載から更に明白になるであろう。
【実施例】
【００６８】
図１において、ｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡ中に存在するイントロンの位置は、文字「ｉ」とそれに続く適切な数字により指し示される。挿入および欠損変異体は４角ボックスとして示され、中にシェード付きのものは、全長のｈＴＥＲＴタンパク質中には存在しないタンパク質配列をコード化する配列を表す。異なるスプライシング変異体を分析するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの位置および方向は、矢印により指し示される。
【００６９】
図２において、アミノ酸の付番は、配列の上に示される。アミノ酸は、当業界で既知の、それらの標準的な１文字略号により表される。
【００７０】
図３において、SEQ ID NO１は、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質の短縮された尾を反映し、SEQ ID NO２は、天然由来のｈＴＥＲＴγ−挿入発現産物（下線部）中のこれらの位置において正常には見出される９個のアミノ酸を伴ったアミノ末端での延長を伴った同じポリペプチドを反映する。SEQ ID NO３は、ｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質の短縮された尾を反映する。SEQ ID NO４は、天然のｈＴＥＲＴσ−挿入発現産物（下線部）中のこれらの位置において正常には見出される９個のアミノ酸を伴ったアミノ末端での延長を伴った SEQ ID NO３を反映する。
【００７１】
図４において、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃ中に提供されているような挿入スプライシング変異体３（ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン／イントロン接合部が示される。以下の情報が、Kilian et al.（１９９７年、同上）により提供される：核酸配列は、太字で与えられた推定のスプライシングされていないイントロンと共にタンパク質翻訳配列上に示され、推定のエクソン／イントロン接合部が｜でマークされ、核酸配列の付番は以下に対応する：ヌクレオチド１は、GenBank Accession number AF015950 中の配列のヌクレオチド１３９に対応し、推定のｃ−Ａｂｌ／ＳＨ３結合部位に対応するアミノ酸は、下線を施されている。Kilian et al.（１９９７年、同上）により示されるアミノ酸配列は、約１１００個のアミノ酸残基のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質のＣ−末端を表す。
【００７２】
図５において、Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂにおいて開示されているような、ｈＴＥＲＴスプライシング変異体ＩＮＳ１（σ−挿入スプライシング変異体と等価）およびＩＮＳ３（γ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン−イントロン境界のヌクレオチドが表される。イントロンおよびエクソンの配列が、それぞれ小文字および大文字で示されている。Wick et al.（１９９９年、同上）は、それらのｈＴＥＲＴ遺伝子のヌクレオチド配列が、GenBank Accession number AF128893 および AF128894 として寄託されていることを指し示している。
【００７３】
ｈＴＥＲＴγ−挿入およびσ−挿入スプライシング変異体は、癌細胞株および腫瘍においては発現されるが、正常細胞においては探知不可能または非常に低いレベルで存在することが立証された。本願はそれ故に、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）タンパク質の機能的変異体に基づいたワクチンと比較して特異性が改善された一般的な癌ワクチンの候補を開示する。γおよびσ挿入両方は、停止コドンの早い形成およびカルボキシル末端において短縮されたタンパク質の発現をもたらす。短縮ｈＴＥＲＴのγ−およびσ−挿入タンパク質は、それら自身テロメラーゼ活性を持たない。γ−挿入の場合、該タンパク質の短縮された尾は、４４個のアミノ酸の配列（SEQ ID NO１）である。σ−挿入は、その中で短縮された尾が２０個のアミノ酸の配列（SEQ ID NO３）であるタンパク質をもたらす。それらは、癌細胞株において優性に発現されるが、正常細胞においては探知不可能、または非常に低いレベルで存在し、これ故に特異的な免疫治療のための標的となる。本発明によれば、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはσ−挿入スプライシング変異体により発現されるタンパク質のカルボキシル末端（短縮された尾）に対応するポリペプチドは、ヒトにおける癌細胞に対しての免疫系（Ｔ−細胞）の細胞の戦闘力の引き金を引く機能を有する抗癌剤またはワクチンとして有用である。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO５による配列を含む。本発明の他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO６による配列を含む。なお他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO１１による配列を含む。
【００７４】
（実験の部）
明細書中で概説される実験は、正常細胞と比較して、様々な癌細胞株におけるｈＴＥＲＴスプライシング変異体の特徴付けを記載する。本発明によるポリペプチドの合成、および癌治療における使用のためのポリペプチドの効果を試すための実験が詳述される。SEQ ID NO１１によるアミノ酸配列を持つペプチドによるヒトＴ細胞の誘導および増殖を示す実験が記載される。
【００７５】
（ｈＴＥＲＴのγ−挿入およびσ−挿入スプライシング変異体のＲＴ−ＰＣＲ分析）
（ＲＮＡ分析）
完全に溶解された細胞からのポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡが、磁気的オリゴ（ｄＴ）ビーズを使用して、粗溶解物から直接単離された（Dynal, A. S.; Jakobsen, K. S. et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669）。細胞質ゾルのｍＲＮＡ分画が、１分間０℃にて１％ＩＧＥＰＡＬ（シグマ）中で細胞をインキュベートし、その後、核を除くために遠心分離（１００００ｇ、１分、４℃）されることにより調製された。ポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡがその後、前記オリゴ（ｄＴ）ビーズを使用して上清から単離された。
【００７６】
（ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ）
第１の鎖のｃＤＮＡの合成が、Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ÷逆転写酵素（プロメガ社）を使用して標準的な手順により実施され、ＰＣＲ反応は、HotStar Taq ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）を使用することにより実行され、ＰＣＴ−２００サーマル・サイクラー（MJ Research）上で３５サイクル回された。ＰＢＭおよびＣＤ３４＋細胞からの探知可能な産物を得るために、反応物の１０％が２回目のＰＣＲ反応における鋳型として使用され、更なる１５サイクルにより増幅された。
【００７７】
γ−挿入スプライシング変異体、すなわち＋鎖プライマー変異体の分析のために、＋鎖プライマーｈＴＥＲＴ−ｐ３１９５（5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT-SEQ ID NO７）および−鎖プライマーｈＴＥＲＴ−ｍ３６５２（5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA-SEQ ID NO８）が使用された。これらのプライマーは、全長のｈＴＥＲＴのｃＤＮＡおよびγ−挿入変異体に適用されると、それぞれ４６５個および６２４個のヌクレオチドの断片を生成する。σ−挿入変異体の分析は、プライマーｈＴＥＲＴ−Ｐ６（5-GCC AAG TTC CTG CAC TGG CTG A-SEQ ID NO９）およびｈＴＥＲＴ−ｍ２０４４（5-GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG-SEQ ID NO１０）を使用することにより実行された。全長のｈＴＥＲＴのｃＤＮＡおよびσ−挿入変異体と共にこれらのプライマーを使用することから得られる増幅産物は、それぞれ３６９個および４０７個のヌクレオチドを含む。これらのＰＣＲ産物が真性のスプライシング変異体を表すことを証明するために、断片がゲルから単離され、ＡＢＩプリズム３１０自動化シーケンサー（ＰＥ社）を使用する直接の配列決定により分析された。
【００７８】
（結果）
テロメラーゼ活性は、転写後のレベルでの複雑な調節に付され、テロメラーゼタンパク質の有無を探知するのに使用される方法は、該タンパク質それ自身、あるいはｍＲＮＡ変異体の直接の測定を含むべきである。更に、細胞中に見出される異なるｈＴＥＲＴスプライシング変異体の多さは、同じ細胞の細胞質ゾル分画中に見出されるレベルとは必ずしも相関されている必要はない（図６参照）。このような逸脱は、ｍＲＮＡ変異体が核から細胞質ゾルの区画へ運ばれる効率における違いにより、および／または該細胞質ゾル中での特異的なスプライシング変異体の格差安定性により説明されることがある。このような機序が遺伝子制御の概念の一部であることが、当業界ではよく知られている。それにもかかわらず、前に引用されたものを包含するｈＴＥＲＴ調節を説明するために遂行される研究は、それらの分析のために完全に溶解された細胞から単離された全てのＲＮＡまたはｍＲＮＡを使用してきた。この種のＲＮＡ単離を実行するために要求されるキットおよび試薬が、商業的な市場において広く入手可能である。遺伝子発現の正しい状況を得るために、ｍＲＮＡの多さに関する研究は、細胞質ゾル区画に特異的なｍＲＮＡの分析を包含するべきである。
【００７９】
図６は、ｈＴＥＲＴのγ−（Ａ）およびσ−挿入変異体（Ｂ）を含む領域のＲＴ−ＰＣＲ分析からの結果を示す。ＨＬ６０、Ｋ５６２および Jurkat が、分析された癌細胞株を表している。ＨＬ６０は前骨髄細胞白血病細胞株（Sokoloski, J. A. et al., 1993, Blood 82: 625-632）であり、Ｋ５６２は赤血球の白血病細胞株である（Lozzio, C. B. et al., 1975, Blood 45: 321-324）、一方 Jurkat は急性Ｔ−リンパ球白血病細胞に由来する（Gillis, S. et al., 1980, J. Exp. Med. 152: 1709-1719）。ＨＬ６０、Ｋ５６２および Jurkat 癌細胞株は、商業的に入手可能である（例えばＡＴＣＣ、オスロから）。ＰＢＭ１、ＰＢＭ２、ＰＢＭ３およびＰＢＭ４は、４人の異なる健康な提供者から単離された末梢血単核（ＰＢＭ）細胞集団を表す。ＣＤ３４は、健康な提供者から単離されたＣＤ３４−陽性幹細胞を表し、ＣＣ１／ＣＣ２は、Norwegian Radium Hospital（オスロ）の２人の癌患者から得られた結腸癌生検を表し、ＣＣ２ａおよびＣＣ２ｂとは同じ腫瘍から解剖された２つの組織の試料である。細胞の完全な溶解により単離されたｍＲＮＡ、および細胞質ゾル分画から単離されたｍＲＮＡを用いて実行されるＲＴ−ＰＣＲ反応は、それぞれ文字「Ｔ」および「Ｃ」でマークされる。「Ｍ」は、分子量マーカーを有するレーンを指し示している。γ−およびσ−挿入スプライシング変異体およびそれぞれの全長のｈＴＥＲＴ産物（＋）を表すＰＣＲ断片の位置は、パネルの右側に指し示される。
【００８０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、γ−およびσ−挿入スプライシング変異体の双方が全ての癌細胞株において、および分析された腫瘍試料の１つ（ＣＣ２ｂ）において、容易に探知可能であり、σ−挿入変異体が細胞質ゾル分画中で最も多いものとして出現したことを示した。対照的に我々は、これらの試料を用いて実行された広範囲のＰＣＲ増幅にもかかわらず、ＰＢＭ細胞から単離された細胞質ゾルのｍＲＮＡ集団において、これらの変異体を探知することができなかった。ＰＢＭおよびＣＤ３４−陽性細胞におけるσ−挿入プライマーを用いて生成される弱い３９５−塩基対断片の同一性は、今のところ知られていない。
【００８１】
（癌に関連する適用のためのペプチド合成および分析）
（ポリペプチド合成）
ポリペプチドは、連続フロー固相ペプチド合成を使用することにより合成された。適切な側鎖の保護を有するＮ−ａ−Ｆｍｏｃ−アミノ酸が使用された。該Ｆｍｏｃ−アミノ酸は、カップリングのためにペンタフルオロフェニルエステルとして、あるいはカップリング前にＴＢＴＵまたはジイソプロピルカルボジイミドによる活性化を使用することにより活性化された。ＤＭＦ中の２０％のピペリジンが、各カップリングの後のＦｍｏｃの選択的な除去のために使用された。樹脂からの開裂および側鎖保護の最終的な除去は、適切なスキャベンジャーを含有する９５％ＴＦＡにより実行された。ポリペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製および分析された。該ポリペプチドの同一性は、電子−噴射質量分光を使用することにより確かめられた。
【００８２】
（ポリペプチド試験および癌治療）
本発明による癌ワクチンおよびＴ細胞免疫に基づいた特異的な癌治療のための方法が有効であるために、２つの条件が適えられなければならない。即ち、
（ａ）ポリペプチドが少なくとも８個のアミノ酸長であり、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質の断片であり、また、
（ｂ）該ポリペプチドが、その全長か抗原提示細胞によるプロセシングの後で、Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
【００８３】
これらの条件が特定のポリペプチドに対して適えられるかどうか決定するために、以下の実験の方法が使用されてもよい。第１に、特定の該ポリペプチドが in vitro においてＴ細胞免疫応答を引き起こすかどうか決定されるべきである。合成ポリペプチドが、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質を宿す癌細胞において、あるいは天然のｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質をプロセシングした抗原提示細胞において、生じるポリペプチド断片に対応するポリペプチド断片に対応するか、あるいはプロセシング後に得ることが可能か立証されることも必要であろう。ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種により in vivo において誘導されるＴ細胞の特異性も、決定されるかも知れない。
【００８４】
（In vitro におけるＴ細胞応答分析）
ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入を発現している腫瘍細胞株が、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種後に、ガン患者からの末梢血から得られたＴ細胞クローンにより殺傷され得るかどうか決定することが必要である。Ｔ細胞クローンは、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種後に、ガン患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中に存在するＴ−細胞芽細胞のクローニングの後に得られる。ポリペプチドのワクチン接種のプロトコルは、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の普通に使用される補助剤と共に皮膚内で、ポリペプチドの in vivo における幾つかの注射を包含する。Ｔ細胞のクローニングは、応答するＴ細胞芽細胞を寺崎プレート（Terasaki plates）上に、穴につき５個の芽細胞にて蒔くことにより実行される。各穴は、フィーダー細胞として２×１０４個の放射線照射（３０Ｇｙ）自家のＰＢＭＣを含有する。該細胞は２０ｍｌの全体積中で、２５ｍＭでのｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドならびに５Ｕ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（Amersham, Aylesbury, UK）を用いて増殖される。９日後、Ｔ細胞クローンは、１ｍｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ、Wellcome, Dartford, UK）、５Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２、およびフィーダー細胞として放射線照射（３０Ｇｙ）同種のＰＢＭＣ（穴につき２×１０５個）と共に、平底９６−穴プレート上に移動された。成長しているクローンは、ＰＨＡ／ｒＩＬ−２およびフィーダー細胞として１×１０６個の同種の放射線照射ＰＢＭＣと共に、更に２４−穴プレートにおいて増やされ、４〜７日後に、ポリペプチドの特異性を求めてスクリーニングされた。
【００８５】
Ｔ細胞クローンは、更なる特徴付けのために選ばれた。該Ｔ細胞クローンの細胞表面表現型は、該Ｔ細胞クローンがＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるかどうか確かめるために決定される。Ｔ細胞クローンは、腫瘍細胞の溶解が起きるかどうか決定するために、異なる（エフェクター：標的）比率で、自家の腫瘍細胞標的と共にインキュベートされる。溶解は、該Ｔ細胞が、例えばｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質である抗原由来の腫瘍に対して向けられた反応性を持つことを指し示す。
【００８６】
（ポリペプチドと in vivo ｈＴＥＲＴ挿入断片との間の相関）
認識される抗原がｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質と相互作用することを証明するために、およびＴ細胞クローンに対し推定のｈＴＥＲＴγ−挿入またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドを提示するＨＬＡクラスＩまたはクラスII分子を同定するために、患者のそれらと共通の１つ以上のＨＬＡクラスＩまたはII分子を担持する、異なるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入発現腫瘍細胞株が、細胞傷害性アッセイにおいて標的細胞として使用される。標的細胞は、終夜５１Ｃｒまたは３Ｈ−チミジン（９．２５×１０４Ｂｑ／ｍＬ）でラベルされ、１回洗浄され、９６穴プレートにおいて、穴につき５０００個の細胞にて蒔かれる。Ｔ細胞は異なる（エフェクター：標的）比率で加えられ、該プレートは３７℃にて４時間インキュベートされ、その後液体シンチレーション・カウンター（Packard Topcount）中でカウントする前に採取される。例えば、膀胱ガン細胞株Ｔ２４（１２Ｖａｌ＋、ＨＬＡ−Ａ１＋、Ｂ３５＋）、黒色腫細胞株ＦＭＥＸ（１２Ｖａｌ＋、ＨＬＡ−Ａ２＋、Ｂ３５＋）および結腸ガン細胞株ＳＷ４８０（１２Ｖａｌ＋、ＨＬＡ−Ａ２＋、Ｂ８＋）、または他のいかなるテロメラーゼ陽性腫瘍細胞株も、標的細胞として使用されてもよい。ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質を発現しない適切な細胞株がコントロールとして使用されてもよく、溶解されるべきではない。特定の細胞株の溶解は、試験されるＴ細胞クローンが、その細胞株により発現されるＨＬＡクラスＩまたはクラスIIサブタイプの関係において、内側からプロセシングされるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入抗原決定基（エピトープ）を認識することを指し示す。
【００８７】
（Ｔ細胞クローンの特徴付け）
Ｔ細胞クローンのＨＬＡクラスＩまたはクラスII拘束は、遮断実験により決定されてもよい。ＨＬＡクラスＩ抗原に対してのモノクローナル抗体、例えば全てに反応性のＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体Ｗ６／３２、またはＨＬＡクラスII抗原に対しての、例えばＨＬＡクラスIIＤＲ、ＤＱおよびＤＰ抗原に対して向けられたモノクローナル（Ｂ８／１１、ＳＰＶ−Ｌ３およびＢ７／２１）が使用されてもよい。自家の腫瘍細胞株に対してのＴ細胞クローン活性は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にてＨＬＡクラスＩおよびII分子に対して向けられたモノクローナル抗体を使用して評価される。アッセイが、９６穴プレートにおいて３通りに、前記のように組み立てられ、標的細胞が、Ｔ細胞の添加の前に３７℃にて３０分間前インキュベーション処理される。
【００８８】
Ｔ細胞クローンの細かな特異性は、ポリペプチド刺激（パルス）実験を使用して決定されてもよい。Ｔ細胞クローンにより実際に認識されるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドを同定するために、９量体のポリペプチドのパネルが試験される。５１Ｃｒまたは３Ｈ−チミジンラベルされ、穏やかな酸で溶出された自家の線維芽細胞が、９６穴プレートにおいて穴につき２５００個の細胞にて蒔かれ、Ｔ細胞の添加前に３７℃にて５％ＣＯ２のインキュベーター中で、ｂ２−ミクログロブリン（２．５μｇ／ｍＬ）と共に、１μＭの濃度のポリペプチドで刺激される。アッセイが、９６穴プレートにおいて３通りに組み立てられ、５：１の（エフェクター：標的）比率で４時間インキュベートされる。コントロールは、単独で、ポリペプチドの非存在下でＡＰＣと共に、または無関連な黒色種関連ポリペプチドＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａポリペプチドと共に培養されたＴ細胞クローンを包含することが可能である。
【００８９】
Ｔ細胞クローンの細かな特異性を決定する他のプロトコルも使用されてもよい。この他のプロトコルでは、ＴＡＰ不全Ｔ２細胞株が抗原提示細胞として使用される。この細胞株は小さな量のＨＬＡ−Ａ２抗原しか発現しないが、該細胞表面での上昇したレベルのＨＬＡクラスＩ抗原が、ｂ２−ミクログロブリンの添加により誘導され得る。３Ｈ−ラベルされた標的細胞が、３７℃にて１時間ｂ２−ミクログロブリン（２．５μｇ／ｍＬ）と共に、異なる試験ポリペプチドおよび１μＭの濃度でのコントロールのポリペプチドと共にインキュベートされる。ポリペプチドで刺激された後、該標的細胞はよく洗浄され、数えられ、Ｔ細胞の添加前に９６穴プレートにおいて穴につき２５００個の細胞にて蒔かれる。該プレートは、採取前に５％ＣＯ２中３７℃にて４時間インキュベートされる。コントロールは、単独で、またはポリペプチドの非存在下で標的細胞と共に培養されたＴ細胞クローンを包含する。アッセイが、２０：１の（エフェクター：標的）比率で、９６穴プレートにおいて３通りに組み立てられた。
【００９０】
前に同定された特定のポリペプチドに対するＴ細胞クローンの感受性も、投薬量−応答実験を使用して決定されてもよい。ポリペプチド感受性にされた線維芽細胞が、標的細胞として使用され得る。該標的細胞は、ペプチドがＴ細胞の添加前に異なる濃度にて加えられることを除き、細かな特異性の決定のために前記の特定のペプチドで刺激される。コントロールは、標的細胞単独、および無関連な黒色種関連ペプチドＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１と共に刺激された標的細胞を包含する。
【００９１】
（ｈＴＥＲＴσ−挿入ペプチドに対するヒトＴ細胞応答の誘導および増殖）
この実験では、４人の健康なヒト（提供者「１４３２８」「１４３１３」「２３２４４」および「２３２５５」）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が単離され、ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来の SEQ ID NO１１のペプチドで刺激された樹状細胞を用いて７日間予め用意された後、ペプチドで刺激された自家のＰＢＭＣを用いての７日の再刺激からなる２サイクルが行われた。該樹状細胞は、末梢血からの単球由来であった。結果として得られたひとまとまりの培養物からのＴ細胞は、３日後の採取前に、ペプチドで刺激された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて、または用いずに３通りに試験された。該培養物の増殖能力を測定するために、採取前に３Ｈ−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／穴）が、終夜該培養物に加えられた。非刺激ＡＰＣを用いて、またはＡＰＣを用いずに、培養物がコントロールとして働いた。該培養物の増殖能力を示す結果が、図７において示される。使用された該プロトコルの更なる詳細が、以下に詳しく述べられる。
【００９２】
Ｔ細胞クローンは、ワクチン接種されていない提供者１４３１３および２３２５５からもたらされたひとまとまりの培養物から得られた。該クローンは、前のセクション「In vitro におけるＴ細胞応答分析」において記載のＰＲＭＣ中に存在するＴ細胞芽細胞から得られた。ペプチドで刺激された、および非ペプチドで刺激された抗原提示細胞を用いた該Ｔ細胞クローンの増殖の結果は、図８（提供者１４３１３）および図９（提供者２３２５５）において示される。
【００９３】
図７、８および９中の結果は、３通りの測定の分当たりの平均カウント（ｃｐｍ）として与えられる。該データは、ヒトからの血がｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来のペプチド由来のペプチド（SEQ ID NO１１）について特異的な循環Ｔ細胞を含有し、更に、このようなＴ細胞が関連のペプチドでの刺激を伴って in vitro において拡張されることが可能であることを論証している。
【００９４】
従って、図７、８および９の実験は、該ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドがヒトにおいて免疫原性であることを示す。In vitro（または in vivo）における刺激はこれ故に、癌患者における腫瘍の成長により過剰発現された場合、同じ抗原を認識する潜在能力を伴ってｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質特異的Ｔ細胞応答を引き起こし得る。この特別な実験は、一般原則として SEQ ID NO１１のペプチドは、ヒトにおいて癌ワクチンとして開発され得ることを論証している。
【００９５】
（ＭＨＣクラスII拘束Ｔ細胞応答の誘導のためのプロトコル）
（０日目）
ＰＢＭＣは、５０ｍｌの血（バッフィーコートから）から分離された。該細胞は数えられ、ＲＰＭＩ−１６４０／１５％の完全なプール血清中に再懸濁された。
ひとまとまりの培養物は、１〜１．５ｍｌ中２×１０６個の細胞／ｍｌにてＰＢＭＣの２４穴プレートの１〜２個の穴を用いて組み立てられた。ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来の、２５μＭの SEQ ID NO１１のペプチドが加えられた。
【００９６】
（９〜１０日目）
ひとまとまりの培養物は採取され、放射線照射ＰＢＭＣおよびペプチドで刺激された。もし高い率の細胞死があったならば、培養物は Lymphoprep で分けられ、さもなければそれらは数えられて、ＲＰＭＩ／１５％プール血清中に再懸濁された（ひとまとまりの培養物の Lymphoprep 遠心分離は、１；８ｍｌの細胞懸濁物を加え、および２；２ｍｌの Lymphoprep を敷くことにより、１５ｍｌのファルコン・チューブ中で行われる。３０分間に１５００ｒｐｍでの回転、および食塩水での２回の洗浄）。自家のＰＢＭＣの１つのバイアルが解凍され、洗浄され、数えられて、ＲＰＭＩ／１５％ＦＣＳ中に再懸濁された。該ＰＢＭＣは放射線照射された（２５ＧＹ、５分５８秒）。細胞は２４穴プレートから外に出された。ひとまとまりの培養物からの０．５〜２．０×１０６個のＴ細胞が、１×１０６個の放射線照射フィーダー細胞（ＰＢＭＣ）および２５μＭの SEQ ID NO１１のペプチドで刺激された。最終体積は１ｍｌであった。
【００９７】
（１２日目）
ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）が加えられた。もし必要ならば培地も、体積の半分を置き換えることにより加えられた。もし必要ならば、培養物は分けられた。
（１７日目）
ひとまとまりの培養物中のＴ細胞は、１０日目のように、自家の放射線照射ＰＢＭＣおよび SEQ ID NO１１のペプチドで再刺激された。
（１９日目）
ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）が、１７日目の再刺激されたひとまとまりの培養物に加えられた。
【００９８】
ペプチド特異性に関してＴ細胞を試験するための増殖アッセイが、９６穴プレートにおいて、各条件を３通りに組み立てられた。
【００９９】
【表１】
2014138587.tif 000003
【０１００】
増殖アッセイの２〜３日目に、３Ｈ−チミジン（２０μｌ）が加えられ、採取前に終夜３７℃にてインキュベートされた。
（前の実施例において使用されたような）プロトコルの変異体において、ＰＢＭＣは０日目に、SEQ ID NO１１で刺激された樹状細胞を用いて予め用意された。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、癌細胞株中に見出される全長のｈＴＥＲＴのｍＲＮＡおよびスプライシング変異体のスキームの図面である。
【図２】図２は、ｈＴＥＲＴタンパク質の一部分とスプライシング変異体の翻訳から得られるタンパク質との間のタンパク質を直線に並べたものを示す。
【図３】図３は、ｈＴＥＲＴγ−挿入およびσ−挿入のスプライシング変異体タンパク質のカルボキシル末端を示す。
【図４】図４は、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃにおいて開示されているようなｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体に関連する先行技術の配列を示す。
【図５】図５は、Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂにおいて開示されているようなｈＴＥＲＴγ−挿入またはσ−挿入スプライシング変異体に関連する先行技術の配列を示す。
【図６】図６は、ｈＴＥＲＴのγ−挿入（Ａ）およびσ−挿入（Ｂ）スプライシング変異体を含む領域のＲＴ−ＰＣＲ分析からの結果を示す。
【図７】図７は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより、ヒトの血液試料中に誘導される増殖するＴ細胞応答を示す。
【図８】図８は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより誘導されるＴ細胞クローンの増殖を示す。
【図９】図９は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより誘導される他のＴ細胞クローンの増殖を示す。
【図１】
2014138587.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014138587.tif 000011
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月12日(2014.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）に由来するポリペプチドであって、該ポリペプチドはｈＴＥＲＴスプライシング変異体の一つであるσ−挿入変異体に由来するペプチドを含み、該ポリペプチドはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない、１２〜２５個のアミノ酸長である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｔ細胞応答はＴヘルパーおよび／またはＴ細胞傷害性細胞の数および／または活性を上昇させることである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号３、４、５、６及び１１からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドを含む、Ｔ細胞応答を誘導するための医薬組成物であって、該ポリペプチドがｈＴＥＲＴスプライシング変異体の一つであるσ−挿入変異体に由来するペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号３、４、５、６及び１１からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記Ｔ細胞応答はＴヘルパーおよび／またはＴ細胞傷害性細胞の数および／または活性を上昇させることである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない、１２〜２５個のアミノ酸長である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
核酸分子を含むＴ細胞応答を誘導するための医薬組成物であって、該核酸分子が、
ａ）ポリペプチドをコード化する鎖を有し、該ポリペプチドがｈＴＥＲＴスプライシング変異体の一つであるσ−挿入変異体に由来するペプチドを含む、
ｂ）該ａ）に記載の鎖と相補的である鎖を有し、または、
ｃ）該ａ）もしくは該ｂ）に記載の分子と、ストリンジェント条件下で、ハイブリダイズする鎖を有する、医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない、１２〜２５個のアミノ酸長である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
核酸分子を含むベクターまたは細胞を含む、Ｔ細胞応答を誘導するための医薬組成物であって、該核酸分子が、
ａ）ポリペプチドをコード化する鎖を有し、該ポリペプチドがｈＴＥＲＴスプライシング変異体の一つであるσ−挿入変異体に由来するペプチドを含む、
ｂ）該ａ）に記載の鎖と相補的である鎖を有し、または、
ｃ）該ａ）もしくは該ｂ）に記載の分子と、ストリンジェント条件下で、ハイブリダイズする鎖を有する、医薬組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない、１２〜２５個のアミノ酸長である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌を処置するための医薬の調製または癌を診断するための診断薬の調製におけるポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドはｈＴＥＲＴスプライシング変異体の一つであるσ−挿入変異体に由来するペプチドを含む、使用。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ結合溝へ適合するための細胞内開裂を必要としない、１２〜２５個のアミノ酸長である、請求項１３の使用。
【請求項１５】
前記癌が哺乳類の癌である請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記癌がヒトの癌である請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸−直腸癌、肺癌、悪性黒色種、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頚部癌または胆管癌である請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬がワクチンである請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記診断薬がキット中で提供される請求項１３に記載の使用。