(57)【要約】【課題】  本発明は、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）及びその遺伝子を提供する。【解決手段】  本発明は、メタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）遺伝子をクローニングし、形質転換株を用いて新規なエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）を提供した。本発明のEndo-Omは、公知のEndo-Mと比較して13倍もの高い比活性および55倍もの高いVmaxを有し、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析及び糖鎖修飾にとって有用である。さらに、Endo-Om遺伝子配列をもとにCandida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株、Pichia anomala ATCC36904株、及びZygosaccharomyces rouxii ATCC2623株から、Endo-Omと同様の複合型糖鎖切断活性及び複合型糖鎖転移活性を有するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Cp）、（Endo-Pa）、及び（Endo-Zr）を提供した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とする、糖タンパク質からのアスパラギン結合型糖鎖切断用試薬；
(1)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【請求項２】
糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法であって、下記の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を標的糖タンパク質に作用させる工程を含むことを特徴とする、方法；
(1)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【請求項３】
下記の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とする、アスパラギン結合型糖鎖転移用試薬；
(1)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【請求項４】
アスパラギン結合型糖鎖を任意のアクセプター分子に対して転移する方法であって、
下記の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を標的アクセプター分子に作用させる工程を含むことを特徴とする、方法；
(1)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合型糖鎖の加水分解酵素及びその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は酵母などの微生物からヒトまで真核生物に見られるほか、近年ではいくつかの細菌でも報告されている。その糖鎖の機能はタンパク質の安定性やプロテアーゼ耐性などに関わるだけでなく、高次構造形成のための折りたたみにも必要である。またタンパク質間の相互作用を制御したり、細胞表面のレクチンと結合しシグナル伝達などを起こすことも知られている。これらの糖タンパク質の解析のために、糖鎖を切り離して糖鎖構造を決定することが必要である。アスパラギン残基に結合したN-型糖鎖を切り離す酵素としてはペプチド：N-グリカナーゼやエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼが知られている。後者のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼはN-型糖鎖の還元末端に存在するキトビオースの間を切断する酵素であり、これまでにArthrobacter由来のEndo-A（非特許文献１、特許文献４）、Streptococcus pneumoniae由来のEndo-D（非特許文献２）、Flavobacterium由来のEndo-F（非特許文献３）、Streptomyces plicatus由来のEndo-H（非特許文献４）、Mycosphaerella由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（特許文献３）、イネ由来のEndo-Os（非特許文献５）、Mucor hiemalis由来のEndo-M（特許文献１，２，５，非特許文献６，７）などが知られている。これらの多くはキトビオースの間を切断する分解活性のほか、糖鎖を転移するトランスグリコシダーゼ活性が存在する。すなわち、これらは糖タンパク質のN-結合型糖鎖に作用して糖鎖を切り出し、 該糖鎖をアクセプターである糖質や複合糖質に転移する反応を効率よく触媒する。したがって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖構造の解析のみならず、複合糖質糖鎖の修飾、ネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製、糖タンパク質の糖鎖部分の均一化等に有用な酵素群である。
しかしながら、主要な生理活性を示す糖タンパク質が有するアスパラギン結合型糖鎖は、その構造から高マンノース型(マンナン型糖鎖)、混成型及び複合型に分類されるが、複合型糖鎖を切断する活性を有すると報告されているのは、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのうちで、Endo-M、Endo-F2、Endo-F3、Endo-S、Endo-CEである。
Endo-Mはその諸性質が詳しく調べられており、その基質特異性は高マンノース型のMan8GlcNAc2に対する活性を100％とした際に、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対して4.4％である（非特許文献６）。また３分岐、アシアロ４分岐のN-型糖鎖を切断できるという記載（非特許文献７）がある一方、PA糖鎖を利用した酵素活性測定においては、アシアロ３分岐、アシアロ４分岐に対する活性は検出されていない（非特許文献６）。またコアフコースが付加した２分岐PA化糖鎖も切断できない。
Endo-F2はElizabethkingia miricola由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖の加水分解活性はない（非特許文献８）。Endo-F3もElizabethkingia miricola由来の酵素であり、２分岐または３分岐複合型糖鎖を加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない（非特許文献８）。Endo-SはStreptococcus pyogenes由来の酵素であり、２分岐複合型糖鎖のみを加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない（非特許文献９）。Endo-CE はCaenorhabditis elegans由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐の複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖を切断でいるかどうかは不明である（非特許文献１０）。
複合型糖鎖の修飾に関しても、従来の知見からみて、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのトランスグリコシダーゼ活性の基質特異性は分解活性と同一であるから、複合型糖鎖をアクセプターに転移することができるのもこれらの酵素のみしかない。
糖タンパク質の糖鎖構造の解析の際にはもちろんのこと、複合糖質糖鎖を含む様々な糖鎖を有する糖タンパク質を合成するためには、Endo-Mとは基質特異性が異なるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの提供が切望されており、またさらに複合型糖鎖に対する比活性が高い酵素の提供も望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許公開平１１−３３２５６８号公報
【特許文献２】特許公開平７−５９５８７号公報
【特許文献３】特許公開平９−１９１８７５号公報
【特許文献４】特許公開平９−１７３０８３号公報
【特許文献５】ＷＯ２００８／１１１５２６号パンフレット
【特許文献６】ＷＯ２００９／０５７８１３号パンフレット
【特許文献７】特許第４４６４２６９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Takegawa K et al.,(1989)Appl Environ Microbiol.55：p3107-3112
【非特許文献２】Koide N and Muramatsu T,(1974) J Biol Chem.249：p4897-4904
【非特許文献３】Elder JH and Alexander S,(1982) PNAS U S A.79：4540-4544
【非特許文献４】Robbins PW et al.,(1984) J Biol Chem.259：p7577-7583
【非特許文献５】Kimura Y,(2007)In Comprehensive Glycoscience 3:p61-78
【非特許文献６】Fujita et al.,(2004)Arch Biochem Biophy.432：p41-49
【非特許文献７】Kadowaki S et al.,(1990)Agric Biol Chem.54：p97-106
【非特許文献８】Tarentino AL et al.,(1993)J Biol Chem.268：p9702-9708
【非特許文献９】Goodfellow JJ et al.,(2012)J Am Chem Sci.134：p8030-8033
【非特許文献１０】Kato T et al.,(2002)Glycobiology 12：p581-587
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような従来におけるこれらのアスパラギン結合型糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法、またトランスグリコシダーゼ活性を用いた複合型糖鎖の転移の問題点を解決するためになされたものである。すなわち、これまでに報告されているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼとは異なる新規の酵素を取得し、基質特異性や比活性などの点でEndo-Mとは異なるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、メタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株の特性を研究する中で、その培養上清中に高いエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）活性が存在することを見いだした。そこで、当該酵母からEndo-Om遺伝子を単離し、塩基配列及び対応するアミノ酸配列を決定した（配列番号１、２）。本発明のEndo-Omは、従来知られているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのどの配列とも相同性（同一性）は低く、公知のMucor属由来Endo-Mとはアミノ酸レベルで33.9％、Endo-F2とは8.8％、Endo-F3とは9.0％、Endo-Sとは14.7％、Endo-CEとは18.9％の同一性であり、データベース上で最も近い配列を有するCandida属由来の機能不明タンパク質（hypothetical protein）ともアミノ酸レベルで53.9％程度の同一性しかない新規酵素である。Endo-Om遺伝子を用いて当該遺伝子を単離したO.minuta株を形質転換し、Endo-Om遺伝子の過剰発現株を作製することによってエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性が増加した。この過剰発現株からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを単離し、諸性質を決定することに成功し、本発明を完成させた。
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）は、次の酵素学的及び理化学的性質を有する；
(1)作用；アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。 
(2)基質特異性； 
1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
2）高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約15％。
(3)至適pH；約5.5
(4)至適温度；45〜50℃
(5)遺伝子；2,319bp（Endo-Mとアミノ酸配列で33.9％の相同性）
(6)分子量；87,398 Da（アミノ酸配列より）
(7)1mM 複合型２分岐糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を基質とした際の比活性；0.80μmol/min/mg  （Endo-Mの比活性（0.06μmol/min/mg）の約13倍）
(8) 複合型２分岐糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）に対するKm; 5539μM, Vmax; 3.88μmol/min/mg 
（Endo-MのKm（176μM）の31倍、Endo-MのVmax（0.070μmol/min/mg）の55倍）
(9)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型（NGA2-Asn-Fmoc）を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
本発明のEndo-Omは、高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約15％で、公知のEndo-Mとは基質特異性が異なっており、またEndo-Mの13倍という高い比活性およびEndo-Mの55倍という高いVmaxを有している。また、本発明により開発された過剰発現系を用いることで大量生産が可能であるから、高品質の酵素を安価に生産できる。
【０００７】
さらに、本発明のEndo-Omのアミノ酸配列をもとに近縁の酵母類のNCBIアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、部分的に相同性の高い遺伝子が数種類検出された。これら酵母類由来遺伝子をクローニングして配列決定し、その発現産物を精製して得た酵素液の酵素活性を詳細に検討した結果、これら遺伝子発現酵素液のうち、Candida属の Candida parapolymorpha DL-1株由来酵素、Pichia属のPichia anomala由来酵素、及びZygosaccharomyces属のZygosaccharomyces rouxii由来酵素が、いずれもEndo-Om と同様の高いエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）活性を有する新規酵素であることを見出した。それぞれの酵素を「Endo-Cp」、「Endo-Pa」、及び「Endo-Zr」と命名した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質；
(1)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕  前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕  下記の(1)〜(6)のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(1)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3)配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号２と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(4)配列番号７及び８に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号６と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(5)配列番号１１及び１２に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１０と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(6)配列番号１５及び１６に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１４と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔４〕  前記〔２〕又は〔３〕に記載のポリヌクレオチドを含有する、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を発現するためのベクター。
〔５〕  前記〔４〕に記載のベクターが導入されている、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質発現用形質転換細胞。
〔６〕  前記形質転換細胞がOgataea minuta、Candida parapolymorpha、Pichia anomala、及びZygosaccharomyces rouxiiのいずれかの酵母から選択された酵母細胞を宿主とする形質転換細胞である、前記〔５〕に記載の形質転換細胞。
〔７〕  前記〔５〕又は〔６〕に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔８〕  前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法。
〔９〕  前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、アスパラギン結合型糖鎖を任意のアクセプター分子に対して転移する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明におけるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼEndo-Omは、公知のEndo-Mとは、アミノ酸配列レベルでの同一性は33.9％と低く、高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約15％である点で基質特異性も異なる上に、Endo-Mの13倍という高い比活性およびEndo-Mの55倍という高いVmaxを有している点で、明らかに新規酵素であるが、Endo-Mの特性である、複合型糖鎖を加水分解でき、かつ複合型糖鎖に対するトランスグリコシダーゼ活性も有する、という優れた機能はそのまま保持し、その非活性および最大反応速度が顕著に高いという特性も兼ね備えていることから、特に、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析及び糖鎖修飾などの有用性に大きな期待が持てる。さらに、本発明により開発された過剰発現系を用いることで、この高品質のEndo-Om酵素を大量生産により安価に供給できる。
本発明の他のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであるEndo-Cp、Endo-Pa及びEndo-Zrも同様の複合型糖鎖切断活性及び複合型糖鎖転移活性を有しており、Endo-Omと同様の用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はEndo-Om遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。
【図２】図２はEndo-Omと酵母に近い生物種由来のENGaseとの系統樹である。図中、括弧内の数値はアミノ酸配列の長さとEndo-Omとの相同性を示す。Accession No., Ashbya gossypii, NP_986144; Mucor hiemalis (Endo-M), BAB43869; Candida parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1), EFW94296; Pichia anomala, CAC69142; Zygosaccharomyces rouxii, XP_002495262.
【図３】図３はEndo-Om過剰発現O.minuta株におけるタンパク質の発現と酵素活性の測定結果を示す。Ａ．ウエスタンブロッティングによるEndo-Om過剰発現の確認Ｂ．HPLCによる酵素反応検出結果Ｃ．Endo-Om過剰発現株の比活性
【図４】図４は組換え型Endo-Omの精製サンプルのSDS-PAGE結果である。
【図５】図５はEndo-Omと市販のEndo-MのKmとVmaxの測定結果を示す。
【図６】図６はEndo-Omの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。Ａ．至適pHＢ．至適温度
【図７】図７はEndo-Omのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。Ａ．Endo-Omの糖転移反応図Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン
【図８】図８はEndo-Cp遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。
【図９】図９はEndo-Cp部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。Ａ．SDS-PAGEＢ．ウエスタンブロッティングＣ．HPLCによる酵素活性の検出
【図１０】図１０はEndo-Cpの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。Ａ．至適pHＢ．至適温度
【図１１】図１１はEndo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。Ａ．Endo-Omの糖転移反応図Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン
【図１２】図１２はEndo-Pa遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。
【図１３】図１３はEndo-Pa部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。Ａ．SDS-PAGEＢ．ウエスタンブロッティングＣ．HPLCによる酵素活性の検出
【図１４】図１４はEndo-Paの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。Ａ．至適pHＢ．至適温度
【図１５】図１５はEndo-Paのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。Ａ．Endo-Paの糖転移反応図Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン
【図１６】図１６はEndo-Zr遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。
【図１７】図１７はEndo-Zr部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。Ａ．SDS-PAGEＢ．ウエスタンブロッティングＣ．HPLCによる酵素活性の検出
【図１８】図１８はEndo-Zrの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。Ａ．至適pHＢ．至適温度
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼについて
１−１．「Endo-Om」について
（１）酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；  アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
2）高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約15％。
(3)至適pH；  約5.5
(4)至適温度；  45〜50℃
(5)遺伝子；  2,319bp（Endo-Mとアミノ酸配列で33.9％の相同性）
(6)分子量；  87,398 Da（アミノ酸配列より）
(7)1mM 複合型２分岐糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を基質とした際の比活性；0.80μmol/min/mg（Endo-Mの比活性（0.06μmol/min/mg）の約13倍）
(8) 複合型２分岐糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）に対するKm; 5539μM, Vmax; 3.88μmol/min/mg 
（Endo-MのKm（176μM）の31倍、Endo-MのVmax（0.070μmol/min/mg）の55倍）
(9)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型（NGA2-Asn-Fmoc）を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
【００１２】
（２）アミノ酸配列及び塩基配列
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）は、以下の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特に、Ogataea属酵母由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）
(3)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。）
(4)配列番号２に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号２に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
ここで、ストリンジェントな条件とは、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作で、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件である。例えば、6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNA中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件が挙げられる。よりストリンジェンシーを高めたい場合は、さらに2×SSC、0.5％SDS、25％ホルムアミド、5×デンハルツ及び100μg/mlサケ精子DNA中で、55℃で4時間〜一晩保温を行う条件を適用することができる。一般には、全塩基配列中の15％未満、好ましくは10％未満のミスマッチを許容する条件であるということができる。
さらに、本発明のEndo-Om活性を有するタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Ogataea属酵母由来遺伝子であることが好ましい。
または、配列番号２に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
また、本発明のEndo-Om遺伝子は、上記(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Ogataea属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号２に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号２と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。）
ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）は、公知のMucor属由来Endo-Mとは、アミノ酸配列レベルで33.9％の同一性しかなく、データベース内での最も近い位置のCandida属由来の機能不明タンパク質ともアミノ酸レベルで53.9％程度の同一性しかない、特異的な配列を有しているから、配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Om活性を有している蓋然性が高く、配列番号２に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Om遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００１３】
（３）各種糖鎖に対する加水分解活性
本発明のEndo-Om精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖（TaKaRa-Bio社）に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文（非特許文献６）の測定値と共に下記（表１）に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
【表１】
2014138616.tif 000002
上記（表１）の結果から見て、Endo-OmはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B、M9A構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
【００１４】
（４）トランスグリコシダーゼ活性
Endo-OmはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
Endo-Omのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液を30℃で3時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された（図７）。
【００１５】
１−２．「Endo-Cp」について
（１）酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；  アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
2）高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約172％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約7.0％。
(3)至適pH；  約5.5
(4)至適温度；  60℃
(5)遺伝子；  2,238bp（Endo-Mとアミノ酸配列で38.2％の相同性）
(6)分子量；  86,500 Da（アミノ酸配列より）
(7)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型（NGA2-Asn-Fmoc）を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
【００１６】
（２）アミノ酸配列及び塩基配列
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Cp）は、以下の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、より好ましくはCandida属酵母由来、最も好ましくはCandida parapolymorpha由来のタンパク質である。
(1)配列番号５に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）
(3)配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。）
(4)配列番号６に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。（なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。）
さらに、本発明のEndo-Cp活性を有するタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Candida属酵母由来遺伝子、とりわけCandida parapolymorpha由来であることが好ましい。
または、配列番号６に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
また、本発明のEndo-Cp遺伝子は、上記(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Candida属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号６に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号７及び８に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号６と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。）
ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Cp）は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで53.9％の同一性があり、同時に見出されたPichia anomala由来の「Endo-Pa」酵素、及びZygosaccharomyces rouxii由来「Endo-Zr」酵素とは、それぞれ42.8％及び31.9％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで38.2％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Cp」は特異的な配列を有しているから、配列番号５に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Cp活性を有している蓋然性が高く、配列番号６に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Cp遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００１７】
（３）各種糖鎖に対する加水分解活性
本発明のEndo-Cp部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖（TaKaRa-Bio社）に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文（非特許文献６）の測定値と共に下記（表２）に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
【表２】
2014138616.tif 000003
上記（表２）の結果から見て、Endo-CpはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
【００１８】
（４）トランスグリコシダーゼ活性
Endo-CpはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
Endo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液を30℃で3時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された（図１１）。
【００１９】
１−３．「Endo-Pa」について
（１）酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；  アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
2）高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約140％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約54.4％。
(3)至適pH；  約5.0〜5.5
(4)至適温度；  40℃
(5)遺伝子；  1,971bp（Endo-Mとアミノ酸配列で33.0％の相同性）
(6)分子量；  76,050 Da（アミノ酸配列より）
(7)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型（NGA2-Asn-Fmoc）を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
【００２０】
（２）アミノ酸配列及び塩基配列
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Pa）は、以下の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特にPichia属酵母由来、とりわけPichia anomala由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号９に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号９に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）
(3)配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。）
(4)配列番号１０に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号１０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。（なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。）
さらに、本発明のEndo-Pa活性を有するタンパク質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Pichia属酵母由来遺伝子、とりわけPichia anomala由来遺伝子であることが好ましい。
または、配列番号１０に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
また、本発明のEndo-Pa遺伝子は、上記(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Pichia属酵母由来、とりわけPichia anomala由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号１０に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号１０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号１１及び１２に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１０と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。）
ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Pa）は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで42.5％の同一性があり、同時に見出されたCandida parapolymorpha DL-1由来の「Endo-Cp」酵素、及びZygosaccharomyces rouxii由来「Endo-Zr」酵素とは、それぞれ42.8％及び30.2％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで33.0％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Pa」は特異的な配列を有しているから、配列番号９に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Pa活性を有している蓋然性が高く、配列番号１０に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Pa遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００２１】
（３）各種糖鎖に対する加水分解活性
本発明のEndo-Pa部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖（TaKaRa-Bio社）に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文（非特許文献６）の測定値と共に下記（表３）に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
【表３】
2014138616.tif 000004
上記（表３）の結果から見て、Endo-PaはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、ほとんどの糖鎖でEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
【００２２】
（４）トランスグリコシダーゼ活性
Endo-PaはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
Endo-Paのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液を30℃で16時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された（図１５）。
【００２３】
１−４．「Endo-Zr」について
（１）酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；  アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
2）高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約127％、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary PA-sugar）に対する活性が約23.6％。
(3)至適pH；  約4.5〜5.0
(4)至適温度；  40℃
(5)遺伝子；  1920bp（Endo-Mとアミノ酸配列で29.4％の相同性）
(6)分子量；  73,105 Da（アミノ酸配列より）
(7)トランスグリコシダーゼ活性；検出されなかった。 
【００２４】
（２）アミノ酸配列及び塩基配列
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Zr）は、以下の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特に、Zygosaccharomyces属酵母由来、とりわけZygosaccharomyces rouxii由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、（なお、数個とは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を表す。）
(3)配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。）
(4)配列番号１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。（なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。）
さらに、本発明のEndo-Zr活性を有するタンパク質は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Zygosaccharomyces属酵母由来遺伝子であることが好ましい。
または、配列番号１４に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
また、本発明のEndo-Zr遺伝子は、上記(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)〜(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Zygosaccharomyces属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号１５及び１６に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１４と７0％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。）
ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Zr）は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで30.6％の同一性があり、同時に見出されたCandida parapolymorpha DL-1由来の「Endo-Cp」酵素、及びPichia anomala由来の「Endo-Pa」酵素とは、それぞれ31.9％及び30.2％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで29.4％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Zr」は特異的な配列を有しているから、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Zr活性を有している蓋然性が高く、配列番号１４に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Zr遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００２５】
（３）各種糖鎖に対する加水分解活性
本発明のEndo-Zr部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖（TaKaRa-Bio社）に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文（非特許文献６）の測定値と共に下記（表４）に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
【表４】
2014138616.tif 000005
上記（表４）の結果から見て、Endo-ZrはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖、bisecting GlcNAcを有する混成型糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特に２分岐の複合型糖鎖やM3B、M5A、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
【００２６】
２．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの取得方法及び製造方法
２−１．Endo-Omの取得方法及び製造方法
（１）本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）産生菌株
本発明のEndo-Om産生微生物は、本発明者らの先の出願明細書特許文献６に記載されたメタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株であり、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母株である。培養方法などの詳細は、特許文献６に記載されるとおりであり、通常の酵母用の培地にメタノールを加えて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Om遺伝子をクローニングし、もとの酵母株を宿主として形質転換を行い、下記（３）に述べるように、Endo-Om遺伝子過剰発現系を作製した。
【００２７】
（２）他の微生物からのEndo-Om及びその遺伝子の採取方法
Ogataea minuta IFO10746株を用いた宿主・ベクター系については、特許4464269号（特許文献７）に記載されている。このゲノム配列情報に対し、Endo-Mと相同性の高い遺伝子を検索したところ、部分的に相同性の高い遺伝子を見いだした。そこでO.minutaのゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー１（配列番号３）とプライマー２（配列番号４）を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー１：5’-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3’  (配列番号３)
プライマー２：5’-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3’  (配列番号４)
得られたPCR断片をTOPO Blunt cloning kit（Invitrogen社）によりサブクローニングし、塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-O遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１に示した。Endo-OmのORFは2319塩基からなり、772アミノ酸からなる分子量87,398のタンパク質をコードしていた。
当該方法を本発明のEndo-Om 遺伝子を採取したOgataea minutaの近縁微生物、例えば他のメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Om活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
すなわち、このようにして得られたEndo-Om遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Om活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Om遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Om遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Om活性を有するタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００２８】
（３）過剰発現系の構築とEndo-Omの大量生産方法
メタノール資化性酵母O.minutaでのEndo-Om過剰発現株の作製は以下のように行った。
まずPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列（2349 bp）を増幅し、精製後、発現用プラスミド pOMEA1にIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pOMEA1-Endo-Omを構築する。
構築したpOMEA1-Endo-Omを、O.minuta TK10-1-2株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Endo-Om過剰発現O.minuta株（Endo-Om/TK10-1-2株）を得る。
Endo-Om/TK10-1-2株に対してEndo-Omの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Om粗酵素液とする。
Endo-Om粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
上記のようなEndo-Om過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Om遺伝子を採取したと同じメチル資化性酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
これら形質転換Ogataea minuta Endo-Om過剰発現株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で、又はメタノール誘導を用いた培養法などを適用することにより、大量生産が可能となる。
【００２９】
２−２．Endo-Cpの取得方法及び製造方法
（１）本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Cp）産生菌株
本発明のEndo-Cp産生微生物は、メタノール資化性酵母Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株であり、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地にメタノールを加えて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Cp遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記（３）に述べるように、Endo-Cp遺伝子過剰発現系を作製した。
【００３０】
（２）他の微生物からのEndo-Cp及びその遺伝子の採取方法
Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー３（配列番号７）とプライマー４（配列番号８）を用いてPCR法によりEndo-Cp遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー３：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3’  （配列番号７）
プライマー４：  5’-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3’  （配列番号８）
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Cpを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Cp遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Cp遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図８に示した。Endo-CpのORFは2238塩基からなり、745アミノ酸からなる分子量86,500のタンパク質をコードしていた。
当該方法を本発明のEndo-Cp遺伝子を採取したCandida parapolymorpha DL-1の近縁微生物、例えば他のメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Cp活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
すなわち、このようにして得られたEndo-Cp遺伝子は、配列番号６に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Cp活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Cp遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Cp遺伝子は、配列番号６に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Cp活性を有するタンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００３１】
（３）過剰発現系の構築とEndo-Cpの大量生産方法
大腸菌でのEndo-Cp過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記（２）で述べたpCold I-Endo-Cpをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換し、Endo-Cp発現大腸菌株を得る。
Endo-Cp発現大腸菌株に対してEndo-Cpの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Cp粗酵素液とする。
Endo-Cp粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
上記のようなEndo-Cp過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Cp遺伝子を採取したと同じCandida属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
これらEndo-Cp過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
【００３２】
２−３．Endo-Paの取得方法及び製造方法
（１）本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Pa）産生菌株
本発明のEndo-Pa産生微生物は、Pichia anomala ATCC36904株という酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地を用いて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Pa遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記（３）に述べるように、Endo-Pa遺伝子過剰発現系を作製した。
【００３３】
（２）他の微生物からのEndo-Pa及びその遺伝子の採取方法
Pichia anomala ATCC36904株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー５（配列番号１１）とプライマー６（配列番号１２）を用いてPCR法によりEndo-Pa遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー５：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3’  （配列番号１１）
プライマー６：  5’-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3’  （配列番号１２）
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Paを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Pa遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Pa遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１２に示した。Endo-PaのORFは1971塩基からなり、656アミノ酸からなる分子量76,050のタンパク質をコードしていた。
当該方法を本発明のEndo-Pa遺伝子を採取したPichia anomalaの近縁微生物、例えばメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Pa活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
すなわち、このようにして得られたEndo-Pa遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Pa活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Pa遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Pa遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Pa活性を有するタンパク質は、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００３４】
（３）過剰発現系の構築とEndo-Paの大量生産方法
大腸菌でのEndo-Pa過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記（２）で述べたpCold I-Endo-Paをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換し、Endo-Pa発現大腸菌株を得る。
Endo-Pa発現大腸菌株に対してEndo-Paの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Pa粗酵素液とする。
Endo-Pa粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
上記のようなEndo-Pa過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Pa遺伝子を採取したと同じPichia属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
これらEndo-Pa過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
【００３５】
２−４．Endo-Zrの取得方法及び製造方法
（１）本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Zr）産生菌株
本発明のEndo-Zr産生微生物は、Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株という酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地を用いて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Zr遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記（３）に述べるように、Endo-Zr遺伝子過剰発現系を作製した。
【００３６】
（２）他の微生物からのEndo-Zr及びその遺伝子の採取方法
Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー７（配列番号１５）とプライマー８（配列番号１６）を用いてPCR法によりEndo-Zr遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー７：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3’  (配列番号１５)
プライマー８：  5’-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3’  (配列番号１６)
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Zrを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Zr遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Zr遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１６に示した。Endo-ZrのORFは1920塩基からなり、639アミノ酸からなる分子量73,105のタンパク質をコードしていた。
当該方法を本発明のEndo-Zr遺伝子を採取したZygosaccharomyces rouxiiの近縁微生物、例えばメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Zr活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
すなわち、このようにして得られたEndo-Zr遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Zr活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Zr遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Zr遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Zr活性を有するタンパク質は、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００３７】
（３）過剰発現系の構築とEndo-Zrの大量生産方法
大腸菌でのEndo-Zr過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記（２）で述べたpCold I-Endo-Zrをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換し、Endo-Zr発現大腸菌株を得る。
Endo-Zr発現大腸菌株に対してEndo-Zrの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Zr粗酵素液とする。
Endo-Zr粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
上記のようなEndo-Zr過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Zr遺伝子を採取したと同じZygosaccharomyces属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
これらEndo-Zr過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
【００３８】
３．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの用途
本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）は、高い比活性で複合型糖鎖を切断する活性と共に、グルコースやN-アセチルグルコサミンなどの単糖又はその誘導体、あるいはそれらを有する糖ペプチドや糖タンパク質などの任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖や化学合成した糖鎖を転移する活性を有している。
したがって、本発明のEndo-Omを用いることで、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析が行える。また、天然には糖鎖が付加しないタンパク質に糖鎖を付加する、あるいは従来付加しない位置にN-型糖鎖を導入するといったネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製や、不均一な糖鎖を一旦切断し、トランスグリコシダーゼ反応を用いて糖タンパク質のN-型糖鎖部分を均一化する、また糖鎖分析装置に対する標準糖タンパク質の作製等、様々な糖鎖修飾に用いることもできる。
本発明の他のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであるEndo-Cp、Endo-Pa及びEndo-Zrも同様の複合型糖鎖切断活性及び任意のアクセプター分子に対する複合型糖鎖転移活性を有することから、同様の用途が期待される。
【００３９】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。また、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）O.minuta由来ENGase (Endo-Om)の発見
本発明者らの先の出願明細書（特許文献６）に記載の通り、O.minutaによるヒト糖転移酵素の分泌生産を行なった。分泌されたMGAT5を部分精製し、複合型２分岐糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を受容体基質、UDP-GlcNAcを供与体基質として反応を行なった。生成産物の解析を行なったところ、糖転移反応による産物以外に、副産物として別のピークが確認された。受容体基質のNGA2-Asn-Fmocをエキソ型のグリコシダーゼで順次消化して標準サンプルを作製し、このピークについて解析を行なったところ、受容体基質の還元末端側に存在するGlcNAcβ1-4GlcNAcの間が切断されていることが示唆された。複合型２分岐糖鎖を効率よく切断する活性はEndo-Mが知られていることから、O.minutaにも同様の活性があると考えられたため、遺伝子のクローニングを検討した。
【００４１】
（実施例２）O.minuta由来ENGase (Endo-Om)遺伝子のクローニング
Ogataea minuta IFO10746株を用いた宿主・ベクター系については、特許4464269号（特許文献７）に記載されている。このゲノム配列情報に対し、Endo-Mと相同性の高い遺伝子を検索したところ、部分的に相同性の高い遺伝子を見いだした。そこでO.minutaのゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー１（配列番号３）とプライマー２（配列番号４）を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー１：  5’-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3’  (配列番号３)
プライマー２：  5’-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3’  (配列番号４)
得られたPCR断片をTOPO Blunt cloning kit（Invitrogen社）によりサブクローニングし、塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-O遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１に示した。Endo-OmのORFは2319塩基からなり、772アミノ酸からなる分子量87,398のタンパク質をコードしていた。推定等電点は5.59であった。得られたアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、Endo-OmはN末端側約80〜410アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。BLAST検索によりヒットした上位の配列のうち、酵母に近い種について系統樹を作製した結果を図２に示した。Endo-M以外の配列については、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。Endo-Omはメタノール資化性酵母Candida parapolymorpha DL-1(Hansenula polymorpha DL-1)由来の推定のENGase(下記実施例６、Endo-Cp)との相同性が最も高く、53.9％であった。Mucor hiemalis由来のEndo-Mとの相同性は33.9％であり、N末端側の保存配列以外には全く相同性がなかった。一方、同じメタノール資化性酵母であるPichia pastorisやCandida boidiniiでは該当する遺伝子は検出されなかった。さらにSaccharomyces cerevisiaeでも該当する遺伝子は検出されなかった。
【００４２】
（実施例３）Endo-Om過剰発現O.minuta株の作製
メタノール資化性酵母O.minutaでのEndo-Om過剰発現株の作製は以下のように行った。
まず実施例２の通り、上記プライマー１（配列番号３）とプライマー２（配列番号４）を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
増幅した2349 bpのPCR産物を精製した後、BamHIで切断した発現用プラスミド pOMEA1にIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pOMEA1-Endo-Omを構築した。
構築したpOMEA1-Endo-OmをNotIで切断後、O.minuta TK10-1-2株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法を用いて形質転換した。形質転換後の菌液をSD-Ade寒天培地（2％ D-グルコース、0.67％ Yeast Nitrogen Base w/o amino acids(Difco社)、0.5％ Casamino acid、0.1mg/ml Uracil、1.5％ Agar）に塗布し、30℃で2日間培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にて染色体上への組み込みを確認し、Endo-Om過剰発現O.minuta株（Endo-Om/TK10-1-2株）とした。
【００４３】
（実施例４）Endo-Om過剰発現O.minuta株におけるEndo-Omの発現と酵素活性の確認
Endo-Om/TK10-1-2株を3mlのYPD培地（2％ Peptone、1％ Yeast Extract、2％ グルコース）にまき、30℃で2日間培養を行った。遠心分離により培地上清を除いた後、菌体に3mlのBMMY培地（2％ Peptone、1％ Yeast Extract、1.34％ Yeast Nitrogen Base w/o amino acids、2％ Casamino acid、1％ MeOH、0.2mg/ml Adenine1/2硫酸塩、0.1mg/ml Uracil、100mM リン酸カリウムバッファー（pH6.0））を加えて再懸濁し、20℃でさらに2日間培養することでEndo-Omの発現誘導を行った。回収した菌体に抽出バッファー（50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール）とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Om粗酵素液とした。
ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Om粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗FLAG抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム（GE Healthcare社）および化学発光検出器（GE Healthcare社）を用いて行った。
ウェスタンブロッティングの結果を図３のＡに示した。Endo-Om過剰発現株ではEndo-Omの分子量である87kDaに相当する位置にFLAG-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された。
酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した２分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）、およびEndo-Om粗酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を50℃で１時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E（4.6 x 250 mm、Shodex社）を使用し、溶媒はアセトニトリル（溶媒A）と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器（励起波長265nm、蛍光波長315nm）にて検出を行った。Endo-Omの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
HPLCによる酵素反応の検出結果を図３のＢに示した。まず基質の２分岐複合糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を単独でHPLCに供したところ、11.7minの位置にピークが検出された。続いて形質転換前のO.minuta株とEndo-Om過剰発現株の粗酵素液でそれぞれ50μg protein/reactionの割合で反応を行い、活性を比較した。Endo-Om過剰発現株では形質転換前の株に比べて基質のピークが大幅に減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク（6.8 min）が増大していた。この結果からEndo-OmがO.minutaの持つ２分岐複合型糖鎖を加水分解する酵素の正体であることが確認された。
続いてEndo-Om過剰発現株の比活性を比較した結果を図３のＣに示した。形質転換前のTK10-1-2株では、10μM NGA2-Asn-Fmocを基質とした際に比活性が15.0[μUnit/mg protein]であったのに対し、Endo-Om過剰発現株では295〜339[μUnit/mg protein]（形質転換前の20〜24倍）に増大していた。
【００４４】
（実施例５）Endo-Omの諸性質の検討
（５−１）Endo-Om精製酵素液の調製と比活性およびKm、Vmaxの算出
Endo-Omの諸性質の検討は精製酵素液を用いて行った。実施例４に記載した方法により100ml分の菌液から調製したEndo-Om粗酵素液を透析により平衡化バッファー（20mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール）に置換した。透析後のEndo-Om粗酵素液をHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Omを含む画分をAmicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Om精製酵素液とした。実施例４に記した方法により基質濃度を1mMとしたときのEndo-Om精製酵素液の活性を測定し、比活性を算出した。また、種々の濃度のNGA2-Asn-Fmocを基質として活性測定を行い、KmとVmaxを算出した。比較のために同様の方法により市販のEndo-Mの比活性およびKm、Vmaxを算出した。なおEndo-Mの至適pHは6.0(非特許文献６)であるため、Endo-Mの活性測定の際は酢酸ナトリウムバッファーのpHを6.0とした。
Endo-Omの精製結果を図４に示した。Endo-OmはSDS-PAGE上で単一にまで精製された。精製したEndo-Omの比活性は1mMのNGA2-Asn-Fmocを基質としたときに0.80μmol/min/mgであった。同測定条件における市販のEndo-Mの比活性は0.06μmol/min/mgであり、Endo-Mに比べてEndo-Omは約13倍の比活性を有していることが明らかとなった。また、種々の濃度のNGA2-Asn-Fmocを基質として活性測定を行い、KmとVmaxを算出した結果、Endo-OmのKmは5539μM、Vmaxは3.88μmol/min/mgであり、市販のEndo-MのKm（176μM）の31倍、市販のEndo-MのVmax（0.070μmol/min/mg）の55倍であることが明らかとなった(図５)。
【００４５】
（５−２）Endo-Omの至適反応条件の検討
Endo-Omの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を50℃で１時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー（pH3.5-5.5）、酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5-6.0）、リン酸ナトリウムバッファー（pH6.0-7.5）、MOPS-NaOHバッファー（pH6.5-8.0）、Tris-HClバッファー（pH8.0-9.0）を使用した。実施例４に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例４に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
Endo-Omの至適反応条件の測定結果を図６に示した。Endo-Omの至適反応pHは5.5付近、至適反応温度は50℃付近であった。
【００４６】
（５−３）各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖（TaKaRa-Bio社）、およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3〜12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII（2.0 x 150mm、ナカライテスク社）を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー（pH4.0：溶媒A）および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール（溶媒B）を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器（励起波長 320nm、蛍光波長400nm）にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1 Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Omの加水分解活性の測定結果を表１に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ（非特許文献６）を引用した。Endo-OmはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B、M9A構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
【００４７】
（５−４）トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Omにも同様の糖転移活性（トランスグリコシダーゼ活性）があるか否かを調べた。
Endo-Omのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例４に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。さらに、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS (AXIMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
Endo-Omの糖転移活性の検出結果を図７に示した。まず、反応系にアクセプターを加えていない条件では糖転移反応が起こらないため、ドナーのNGA2-Asn-Fmoc（10.8min）と加水分解物であるGlcNAc-Asn-Fmoc（6.6min）のピークのみが検出された。続いてアクセプターを加えた条件では、加水分解物のピークの他に糖転移反応物と思われる新たなピーク（4.15min）が検出された。このピークを分取してMS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された（m/z=1389[M+Na-O2]+, m/z=1405[M+Na-O]+, m/z=1421[M+Na]+, m/z=1437[M+K]+）。以上の結果から、Endo-Omは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示された。
【００４８】
（実施例６）Candida parapolymorphaDL-1由来ENGase (Endo-Cp)遺伝子のクローニング
Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された（図２）。この中でCandida parapolymorpha DL-1(Hansenula polymorpha DL-1)由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと53.9％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Cp遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー３（配列番号７）とプライマー４（配列番号８）を用いてPCR法によりEndo-Cp遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー３：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3’  （配列番号７）
プライマー４：  5’-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3’  （配列番号８）
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Cpを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Cp遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Cp遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図８に示した。Endo-CpのORFは2238塩基からなり、745アミノ酸からなる分子量86,500のタンパク質をコードしていた。推定等電点は5.61であった。Endo-CpはN末端側約75〜410アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
【００４９】
（実施例７）Endo-Cp発現大腸菌株の作製
実施例６のpCold I-Endo-Cpをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（2.5％ LB Broth,Miller (Difco社)、1.5％ Agar）に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Cp遺伝子の増幅を確認し、Endo-Cp発現大腸菌株とした。
【００５０】
（実施例８）Endo-Cpの発現誘導と部分精製酵素液の調製
Endo-Cp発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約３時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー（50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール）とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Cp粗酵素液とした。Endo-Cp粗酵素液は透析により平衡化バッファー（20mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール）に置換した。透析後のEndo-Cp粗酵素液をHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Cpを含む画分をAmicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Cp部分精製酵素液とした。
ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Cp部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム（GE Healthcare社）および化学発光検出器（GE Healthcare社）を用いて行った。
酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した2分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）、およびEndo-Cpを含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E（4.6 x 250 mm、Shodex社）を使用し、溶媒はアセトニトリル（溶媒A）と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器（励起波長265nm、蛍光波長315nm）にて検出を行った。Endo-Cpの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
Endo-Cp部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図9に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングではEndo-Cpの分子量である86.5kDaに相当する位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された(図９A,B)。2分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Cp部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク（10.8min）が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した（図９C）。この結果からEndo-Cpが既知のEndo-Mと同様に2分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Cp部分精製酵素液の比活性は120μUnit/mgであった。
【００５１】
（実施例９）Endo-Cpの諸性質の検討
（９−１）Endo-Cpの至適反応条件の検討
Endo-Cpの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー（pH3.5-5.5）、酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5-6.0）、リン酸ナトリウムバッファー（pH6.0-7.5）、MOPS-NaOHバッファー（pH6.5-8.0）、Tris-HClバッファー（pH8.0-9.0）を使用した。実施例８に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例８に記載した活性測定法の反応温度を10℃から70℃まで変えることにより行った。
Endo-Cpの至適反応条件の測定結果を図10に示した。Endo-Cpの至適反応pHは5.5付近、至適反応温度は60℃付近であった。
【００５２】
（９−２）各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖（TaKaRa-Bio社）、およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3〜12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII（2.0 x 150mm、ナカライテスク社）を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー（pH4.0：溶媒A）および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール（溶媒B）を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器（励起波長 320nm、蛍光波長400nm）にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1 Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Cpの加水分解活性の測定結果を表2に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ（非特許文献６）を引用した。Endo-CpはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
【００５３】
（９−３）トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Cpにも同様の糖転移活性（トランスグリコシダーゼ活性）があるか否かを調べた。
Endo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例８に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。また、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS (AXIMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
Endo-Cpの糖転移活性の検出結果を図11に示した。比較のためにEndo-Omの結果を合わせて表示した。反応系にアクセプターを加えた条件でEndo-Cpを反応させたところ、Endo-Omと同様に加水分解物のピークの他に糖転移反応物のピーク（4.15min）が検出された。このピークを分取し、MS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された（m/z=1389[M+Na-O2]+, m/z=1405[M+Na-O]+, m/z=1421[M+Na]+, m/z=1437[M+K]+）。以上の結果から、Endo-Cpは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示唆された。
【００５４】
（実施例１０）Pichia anomala由来ENGase (Endo-Pa)遺伝子のクローニング
Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された（図２）。この中でPichia anomala由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと42.5％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Pa遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
Pichia anomala ATCC36904株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー５（配列番号１１）とプライマー６（配列番号１２）を用いてPCR法によりEndo-Pa遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー５：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3’  (配列番号１１)
プライマー６：  5’-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3’  (配列番号１２)
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Paを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Pa遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Pa遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図12に示した。Endo-PaのORFは1971塩基からなり、656アミノ酸からなる分子量76,050のタンパク質をコードしていた。推定等電点は6.06であった。Endo-PaはN末端側約65〜400アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
【００５５】
（実施例１１）Endo-Pa発現大腸菌株の作製
実施例１０のpCold I-Endo-Paをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（2.5％ LB Broth,Miller (Difco社)、1.5％ Agar）に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Pa遺伝子の増幅を確認し、Endo-Pa発現大腸菌株とした。
【００５６】
（実施例１２）Endo-Paの発現誘導と部分精製酵素液の調製
Endo-Pa発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約３時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー（50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール）とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Pa粗酵素液とした。Endo-Pa粗酵素液は透析により平衡化バッファー（20mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール）に置換した。透析後のEndo-Pa粗酵素液をHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Paを含む画分をAmicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Pa部分精製酵素液とした。
ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Pa部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム（GE Healthcare社）および化学発光検出器（GE Healthcare社）を用いて行った。
酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した2分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）、およびEndo-Paを含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E（4.6 x 250 mm、Shodex社）を使用し、溶媒はアセトニトリル（溶媒A）と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器（励起波長265nm、蛍光波長315nm）にて検出を行った。Endo-Paの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
Endo-Pa部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図13に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングでは配列から予測される分子量である76kDaよりもやや下の位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された（図１３Ａ，Ｂ）。２分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Pa部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク（10.8min）が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した（図１３Ｃ）。この結果からEndo-Paが既知のEndo-Mと同様に2分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Pa部分精製酵素液の比活性は353μUnit/mgであった。
【００５７】
（実施例１３）Endo-Paの諸性質の検討
（１３−１）Endo-Paの至適反応条件の検討
Endo-Paの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー（pH3.5-5.5）、酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5-6.0）、リン酸ナトリウムバッファー（pH6.0-7.5）、MOPS-NaOHバッファー（pH6.5-8.0）、Tris-HClバッファー（pH8.0-9.0）を使用した。実施例12に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例１２に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
Endo-Paの至適反応条件の測定結果を図１４に示した。Endo-Paの至適反応pHは5.0-5.5付近、至適反応温度は40℃付近であった。
【００５８】
（１３−２）各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖（TaKaRa-Bio社）、およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3〜12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII（2.0 x 150mm、ナカライテスク社）を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー（pH4.0：溶媒A）および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール（溶媒B）を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器（励起波長 320nm、蛍光波長400nm）にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1 Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Paの加水分解活性の測定結果を表3に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ（非特許文献６）を引用した。Endo-PaはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、ほとんどの糖鎖でEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
【００５９】
（１３−３）トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Paにも同様の糖転移活性（トランスグリコシダーゼ活性）があるか否かを調べた。
Endo-Paのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で16時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例１２に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。また、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS (AXIMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
Endo-Cpの糖転移活性の検出結果を図１５に示した。比較のためにEndo-Omの結果を合わせて表示した。反応系にアクセプターを加えた条件でEndo-Paを反応させたところ、Endo-Omと同様に加水分解物のピークの他に糖転移反応物のピーク（4.15min）が新たに検出された。このピークを分取し、MS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された（m/z=1389[M+Na-O2]+, m/z=1405[M+Na-O]+, m/z=1421[M+Na]+, m/z=1437[M+K]+）。以上の結果から、Endo-Paは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示唆された。
【００６０】
（実施例１４）Zygosaccharomyces rouxii由来ENGase (Endo-Zr)遺伝子のクローニング
Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された（図２）。この中でZygosaccharomyces rouxii由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと30.6％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Zr遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー７（配列番号１５）とプライマー８（配列番号１６）を用いてPCR法によりEndo-Zr遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー７：  5’-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3’  (配列番号１５)
プライマー８：  5’-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3’  (配列番号１６)
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Zrを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Zr遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
クローニングの結果得られたEndo-Zr遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１６に示した。Endo-ZrのORFは1920塩基からなり、639アミノ酸からなる分子量73,105のタンパク質をコードしていた。推定等電点は6.69であった。Endo-ZrはN末端側約70〜400アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
【００６１】
（実施例１５）Endo-Zr発現大腸菌株の作製
実施例１４のpCold I-Endo-Zrをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル（NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs社）に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地（2.5％ LB Broth,Miller (Difco社)、1.5％ Agar）に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Zr遺伝子の増幅を確認し、Endo-Zr発現大腸菌株とした。
【００６２】
（実施例１６）Endo-Zrの発現誘導と部分精製酵素液の調製
Endo-Zr発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約3時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー（50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール）とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Zr粗酵素液とした。Endo-Zr粗酵素液は透析により平衡化バッファー（20mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール）に置換した。透析後のEndo-Zr粗酵素液をHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Zrを含む画分をAmicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Zr部分精製酵素液とした。
ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Zr部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム（GE Healthcare社）および化学発光検出器（GE Healthcare社）を用いて行った。
酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した2分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）、およびEndo-Zrを含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3〜12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E（4.6 x 250 mm、Shodex社）を使用し、溶媒はアセトニトリル（溶媒A）と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器（励起波長265nm、蛍光波長315nm）にて検出を行った。Endo-Zrの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
Endo-Zr部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図１７に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングではEndo-Zrの分子量である73kDaに相当する位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された（図１７Ａ，Ｂ）。2分岐複合型糖鎖（NGA2-Asn-Fmoc）を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Zr部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク（10.8min）が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した（図１７Ｃ）。この結果からEndo-Zrが既知のEndo-Mと同様に2分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Zr部分精製酵素液の比活性は3.3μUnit/mgであった。
【００６３】
（実施例１７）Endo-Zrの諸性質の検討
（１７−１）Endo-Zrの至適反応条件の検討
Endo-Zrの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー（pH3.5-5.5）、酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5-6.0）、リン酸ナトリウムバッファー（pH6.0-7.5）、MOPS-NaOHバッファー（pH6.5-8.0）、Tris-HClバッファー（pH8.0-9.0）を使用した。実施例１６に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例１６に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
Endo-Zrの至適反応条件の測定結果を図１８に示した。Endo-Zrの至適反応pHは4.5-5.0付近、至適反応温度は40℃付近であった。
【００６４】
（１７−２）各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖（TaKaRa-Bio社）、およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で3〜12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII（2.0 x 150mm、ナカライテスク社）を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー（pH4.0：溶媒A）および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール（溶媒B）を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器（励起波長 320nm、蛍光波長400nm）にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1 Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Zrの加水分解活性の測定結果を表４に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ（非特許文献６）を引用した。Endo-ZrはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖、bisecting GlcNAcを有する混成型糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特に２分岐の複合型糖鎖やM3B、M5A、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
【００６５】
（１７−３）トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Zrにも同様の糖転移活性（トランスグリコシダーゼ活性）があるか否かを調べた。
Endo-Zrのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子（p-ニトロフェニルグルコース）およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液（total volume：10μl）を30℃で16時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例１６に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。
HPLCによる解析の結果、Endo-Zrのサンプルでは糖転移反応物のピークは検出されず、トランスグリコシダーゼ活性は確認できなかった（Data not shown）。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：Endo-Om AA
配列番号２：Endo-Om (2319 bp)
配列番号３：プライマー１（Endo-Om primer  F）
配列番号４：プライマー２（Endo-Om primer  R）
配列番号５：Endo-Cp AA（Candida parapolymorpha）
配列番号６：Endo-Cp（Candida parapolymorpha）(2238 bp)
配列番号７：プライマー３（Endo-Cp primer  F）
配列番号８：プライマー４（Endo-Cp primer  R）
配列番号９：Endo-Pa AA（Pichia anomala）
配列番号１０：Endo-Pa（Pichia anomala）(1971 bp)
配列番号１１：プライマー５（Endo-Pa primer  F）
配列番号１２：プライマー６（Endo-Om primer  R）
配列番号１３：Endo-Zr AA（Zygosaccharomyces rouxii）
配列番号１４：Endo-Zr（Zygosaccharomyces rouxii）(1920 bp)
配列番号１５：プライマー７（Endo-Zr primer  F）
配列番号１６：プライマー８（Endo-Zr primer  R）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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