(57)【要約】【課題】リグノセルロース系バイオマス原料を酵素糖化して単糖類等を製造する方法において、酵素コストの低減と生産性（反応器単位容積当たりの糖生産速度）の向上を同時に実現可能な糖の製造方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース系バイオマス原料を酵素で糖化して糖を製造する方法であって、以下の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含み、工程（Ｂ）を複数回繰り返すことを特徴とする糖の製造方法。（Ａ）リグノセルロース系バイオマス原料、酵素および水を含む反応混合物を調製し、糖化反応を開始する工程（Ｂ）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともリグノセルロース系バイオマス原料および水を追加して糖化反応を再開する工程（Ｃ）糖化反応を進行させて反応混合物から糖化液を回収し、糖化反応を終了する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマス原料を酵素で糖化して糖を製造する方法であって、以下の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含み、工程（Ｂ）を複数回繰り返すことを特徴とする糖の製造方法。
（Ａ）リグノセルロース系バイオマス原料、酵素および水を含む反応混合物を調製し、糖化反応を開始する工程
（Ｂ）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともリグノセルロース系バイオマス原料および水を追加して糖化反応を再開する工程
（Ｃ）糖化反応を進行させて反応混合物から糖化液を回収し、糖化反応を終了する工程
【請求項２】
工程（Ｂ）において、下記式（１）で算出されるリグノセルロース系バイオマス原料の区間原料分解率が２０〜６０質量％の時点で、反応混合物から糖化液の一部を回収することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
式（１）：
区間原料分解率（質量％）＝区間糖生成量（ｇ）／１．１／区間開始時点の原料量（ｇ）
（ただし区間は、前工程における反応開始または反応再開を開始時点とし、次に行う糖化液回収を終了時点とする一反応区間を意味する。）
【請求項３】
複数回繰り返す工程（Ｂ）の少なくとも１回を、以下の工程（Ｂ’）に置換することを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
（Ｂ’）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくとも酵素および水、または少なくとも水を追加して糖化反応を再開する工程
【請求項４】
工程（Ｂ）において、前工程における反応開始または反応再開から６〜３０時間後に反応混合物から糖化液の一部を回収することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
酵素活性を高めるための前処理を行い、かつ、含水状態であるリグノセルロース系バイオマス原料を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
工程（Ｃ）に続いて、以下の工程（Ｄ）を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（Ｄ）糖化液回収後の残渣に含まれる酵素および糖を回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスからの糖の製造方法に関するものであり、より詳細には、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化して糖を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロース系バイオマスを糖化し、発酵原料となる単糖類を得る技術は、食料と競合しない非可食性のバイオマスの資源・エネルギー利用という観点から、極めて重要な技術である。リグノセルロース系バイオマスを糖化する方法は、硫酸等の酸を用いて加水分解する酸糖化法と、酵素を用いて加水分解する酵素糖化法に大別される。酸糖化法は反応速度が高いという利点があるが、耐酸性の反応器を必要とし、使用後の酸を中和・回収する工程が必要となる点で課題を有する。一方、酵素糖化法は、比較的マイルドな反応条件で分解反応が進行するので、酸糖化法と比較してユーティリティコストが低い、あるいは反応時における安全性が高いという利点を有する。しかしながら、酵素は高価であり、酵素コストが実用上の大きな課題となっている。
【０００３】
酵素コストを低減する方策として、種々の酵素リサイクルが試みられている。その一つに、糖化酵素が未分解の糖質およびリグニンに吸着することを利用して、糖化反応残渣に吸着した糖化酵素をリサイクル利用する方法がある。例えば、特許文献１には、不溶性セルロースを酵素を用いて糖化するに当たり、分解糖化処理完了後の反応混合物から糖含有液を分離、除去したのち、残存する不溶部分に原料を加え、新たに酵素を補給することなく分解糖化を行わせることが記載されている。特許文献２には、前処理が施されたリグノセルロース原料にセルロース加水分解酵素を添加して酵素糖化を行い、加水分解されず、かつ添加した酵素が付着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用することが記載されている。特許文献３には、リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液中の糖化酵素をリグノセルロース原料に吸着させて回収し、回収された前記糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化することが記載されている。このように、糖化反応残渣に吸着した糖化酵素をリサイクル利用する方法が種々提案されているが、さらなる酵素コスト低減のために、より効率よく吸着酵素をリサイクル利用する方法の開発が望まれている。
【０００４】
また、酵素糖化は反応時間が長い（反応速度が遅い）ので、生産性（反応器単位容積当たりの糖生産速度）が低いという実用上の課題がある。酵素糖化により高い分解率（糖収率）を得るためには、通常２〜５日程度の糖化時間を要する。そのため、高い糖収量を確保するためには巨大な反応器が必要となり、設備費が莫大となる。そこで、生産性を向上させることができれば、設備のコンパクト化が可能となり、設備費を低減することができる。使用する酵素量を増加すれば生産性が向上することは言うまでもないが、酵素コスト低減の課題解決に反するので採用できない。それゆえ、酵素コストを低減させつつ、生産性を向上させる技術の開発が強く望まれている。
【０００５】
また、酵素糖化特有の課題として、生成物阻害があげられる。これは、グルコース等の生成糖により酵素が阻害を受けるというもので、糖化反応が進行し糖濃度が高くなるほど阻害が大きくなり、反応速度が低下する。糖の生産性を向上させるには、この生成物阻害を低減させることも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−２１３３９６号公報
【特許文献２】特開２０１０−９８９５１号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１−０６５４４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス原料を酵素糖化して単糖類等を製造する方法において、酵素コストの低減と生産性（反応器単位容積当たりの糖生産速度）の向上を同時に実現可能な糖の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］リグノセルロース系バイオマス原料を酵素で糖化して糖を製造する方法であって、以下の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含み、工程（Ｂ）を複数回繰り返すことを特徴とする糖の製造方法。
（Ａ）リグノセルロース系バイオマス原料、酵素および水を含む反応混合物を調製し、糖化反応を開始する工程
（Ｂ）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともリグノセルロース系バイオマス原料および水を追加して糖化反応を再開する工程
（Ｃ）糖化反応を進行させて反応混合物から糖化液を回収し、糖化反応を終了する工程
［２］工程（Ｂ）において、下記式（１）で算出されるリグノセルロース系バイオマス原料の区間原料分解率が２０〜６０質量％の時点で、反応混合物から糖化液の一部を回収することを特徴とする前記［１］に記載の製造方法。
式（１）：
区間原料分解率（質量％）＝区間糖生成量（ｇ）／１．１／区間開始時点の原料量（ｇ）
（ただし区間は、前工程における反応開始または反応再開を開始時点とし、次に行う糖化液回収を終了時点とする一反応区間を意味する。）
［３］複数回繰り返す工程（Ｂ）の少なくとも１回を、以下の工程（Ｂ’）に置換することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の製造方法。
（Ｂ’）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくとも酵素および水、または少なくとも水を追加して糖化反応を再開する工程
［４］工程（Ｂ）において、前工程における反応開始または反応再開から６〜３０時間後に反応混合物から糖化液の一部を回収することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］酵素活性を高めるための前処理を行い、かつ、含水状態であるリグノセルロース系バイオマス原料を用いることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかのいずれかに記載の製造方法。
［６］工程（Ｃ）に続いて、以下の工程（Ｄ）を行うことを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
（Ｄ）糖化液回収後の残渣に含まれる酵素および糖を回収する工程
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマス原料を酵素糖化して単糖類等を製造する方法において、酵素コストを低減でき、同時に生産性を向上させることができる。生産性の向上は、設備のコンパクト化および施設コストの低減に寄与するので、本発明により、従来の酵素糖化法と比較して、大幅なコストの低下を図ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス原料を酵素で糖化して糖を製造する方法、すなわちリグノセルロース系バイオマス原料の酵素糖化による糖の製造方法を提供する。
本発明の製造方法は、以下の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含み、工程（Ｂ）を複数回繰り返すことを特徴としている。
（Ａ）リグノセルロース系バイオマス原料、酵素および水を含む反応混合物を調製し、糖化反応を開始する工程
（Ｂ）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともリグノセルロース系バイオマス原料および水を追加して糖化反応を再開する工程
（Ｃ）糖化反応を進行させて反応混合物から糖化液を回収し、糖化反応を終了する工程
本発明の製造方法は、上記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は特に限定されない。
【００１１】
工程（Ａ）はリグノセルロース系バイオマス原料、酵素および水を含む反応混合物を調製し、糖化反応を開始する工程である。
本発明の製造方法に用いるリグノセルロース系バイオマス原料は、リグノセルロース系バイオマスを含むものであれば特に限定されない。リグノセルロース系バイオマス（以下単に「バイオマス」と記す）は、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されており、木本植物、草本植物、それらの加工品、それらの廃棄物等が該当する。具体的には、例えば、木材、間伐材、製材残材、建築廃材、樹皮、果房、果実殻、茎葉、わら、バガス、古紙等が挙げられる。好ましくは、アブラヤシ、ナツメヤシ、サゴヤシ、ココヤシ等のヤシ類（幹、茎葉、空果房、果実繊維）、サトウキビ（バガス、葉）、トウモロコシ（穂軸、茎葉）、ユーカリ、ポプラ、スギ等の木材（樹皮、木部）、稲わら、麦わら、スウィッチグラス、ネピアグラス、エリアンサスまたはススキである。より好ましくはヤシ類の空果房、サトウキビバガス、トウモロコシ穂軸、稲わら、麦わら、ユーカリまたはスギであり、さらに好ましくはアブラヤシの空果房である。
【００１２】
バイオマス原料の大きさ、形状等は特に限定されないが、裁断、粉砕等により粉体状、チップ状、細片状にしたものや、解繊により繊維状にしたものが好ましい。バイオマス原料の大きさは、最長辺の長さとして、好ましくは平均約０．１ｃｍ〜３０ｃｍであり、さらに好ましくは約１ｃｍ〜１０ｃｍである。大きさをこの範囲とすることで、高い酵素糖化性、固液分離性、移送性等を得ることができる。またバイオマス原料としては、含水状態のものを用いることが好ましい。通常、含水状態の原料を（半）連続的に糖化する場合には、含まれる水による糖液の希釈や重量増が問題になるが、本発明では特に問題にならない。したがって、含水状態のバイオマス原料を用いることは、本発明の好適な実施形態である。バイオマス原料の含水率としては、約３０％〜９０％であることが好ましく、約４０〜８０％がより好ましい。
【００１３】
バイオマス原料は、酵素糖化効率を高めるための前処理を行ったものを用いることが好ましい。前処理の方法は特に限定されず、例えば、アルカリ処理、酸処理、水熱処理、爆砕処理、有機溶媒処理、イオン性液体処理、マイクロ波処理、白色腐朽菌などのリグニン分解菌による処理、粉砕処理などの公知の前処理方法を適宜選択して用いることができる。前処理を行うことにより、セルロースおよびヘミセルロースへの酵素の接触が容易となり、酵素反応の効率が向上し、生産性が向上する。好ましくは水存在下でのアルカリ処理、酸処理および水熱処理であり、さらに好ましくはアルカリ処理である。本発明はアルカリ前処理との組み合わせで特に大きな効果が得られる。これは、アルカリ前処理によってリグニンが効率的に除去されるため、酵素の非特異的吸着や未分解残渣量が低減するためである。水存在下での前処理により、含水状態の前処理バイオマス原料が得られるが、この含水状態の前処理バイオマスを次の糖化工程に供することがより好ましい。これにより高い生産性と酵素糖化性を得ることができる。この場合の前処理バイオマス原料の含水率としては、約３０％〜９０％であることが好ましく、約４０〜８０％がより好ましい。この含水率範囲の前処理バイオマス原料を用いることで、酵素の浸透性が向上し高い反応速度を得ることができる。また脱水（乾燥）工程を行わずそのまま糖化工程に供することもできるため、低エネルギーかつシンプルなプロセスとすることが可能である。
【００１４】
アルカリ前処理方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、以下に示すアルカリ前処理方法が好ましく用いられる。
まずアルカリ水溶液を調製する。アルカリ水溶液に用いるアルカリ化合物としては、ナトリウム、カルシウム、カリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の水酸化物、酸化物、硫化物、炭酸塩または炭酸水素塩を好適に使用することができる。また、アンモニアを使用することもできる。好ましくは水酸化ナトリウム、硫化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウムまたは炭酸カリウムであり、より好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化カリウムである。アルカリ化合物は１種を用いてもよく、複数種の混合物を用いてもよい。これらのアルカリ化合物を水に溶解し、アルカリ水溶液を調製する。アルカリ水溶液のアルカリ化合物濃度は、約０．１〜２０％が好ましく、約０．５〜１０％がより好ましく、約１〜５％がさらに好ましい。アルカリ水溶液のｐＨは、ｐＨ約１１〜１５が好ましく、ｐＨ約１２〜１４．５がより好ましく、ｐＨ約１２．５〜１４がさらに好ましい。
【００１５】
続いて、アルカリ水溶液をバイオマス原料と接触させ、アルカリをバイオマスに含浸させる。アルカリ水溶液の使用量は、バイオマス原料重量（水分を含まない固形分重量）に対して、約１〜３０倍量が好ましく、約１〜２０倍量がより好ましく、約１〜１０倍量がさらに好ましい。含浸工程は常圧で行ってもよく、減圧条件または加圧条件で行ってもよい。含浸時間は、好ましくは約０．１〜１０時間、より好ましくは約０．１〜３時間、さらに好ましくは約０．１〜１時間である。アルカリ含浸の後、固液分離等の方法で余剰の（含浸されない）アルカリ水溶液を除去することが好ましい。これによりアルカリの作用効率を高め、アルカリ使用量の低減や糖収率の向上を図ることができる。固液分離には、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、デカンター等を使用することができる。
【００１６】
続いて、アルカリ含浸バイオマスに対して熱処理を行う。熱処理の温度は、約８０〜２５０℃が好ましく、約１００〜２００℃がより好ましく、約１４０〜２００℃がさらに好ましく、約１６０〜２００℃が特に好ましい。熱処理時の圧力は、ゲージ圧で約０〜５ＭＰaが好ましく、約０．１〜３ＭＰaがより好ましく、約０．３〜２ＭＰａがさらに好ましい。熱処理は酸素存在下で行ってもよい。酸素存在下で行うことで、リグニン分解を促進して糖収率を向上させることができる。
熱処理後のバイオマスはそのまま反応混合物の調製に供してもよいが、洗浄によりアルカリ前処理で生成した分解物やアルカリを除去してから反応混合物の調製に供することが好ましい。洗浄溶媒としては、水が好ましい。アルコール、ケトン等の有機溶媒、あるいはｐＨ調整のための酸類を添加した水を洗浄溶媒として使用してもよい。洗浄溶媒の使用量は、アルカリ含浸バイオマスの重量に対して、０．１〜１００倍量であることが好ましく、０．５〜１０倍量であることがより好ましく、１〜５倍量であることがさらに好ましい。洗浄溶媒を熱処理後のバイオマスに添加して洗浄した後、再度固液分離を行って、バイオマス原料（前処理バイオマス原料）と洗浄液（前処理液）とに分離する。洗浄操作は１回でもよく、複数回行ってもよい。
【００１７】
本発明の製造方法に用いる酵素は、セルロースを単糖（グルコース）に加水分解できる酵素、またはヘミセルロースを単糖（キシロース、マンノース、アラビノース等）に加水分解できる酵素を含むものであればよい。このような酵素は、一般にセルラーゼ、ヘミセルラーゼと称され、複数の酵素で構成される。本発明に用いる酵素は、セルラーゼまたはヘミセルラーゼを含むものであればよいが、糖化効率を向上させるために、両者の混合物を用いることが好ましい。セルラーゼとしては、セロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを含むものであることが好ましい。ヘミセルラーゼとしては、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼを含むものであることが好ましい。他のヘミセルラーゼとしては、アセチルキシランエステラーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、キシログルカナーゼ、ペクトリアーゼ、ペクチナーゼなどが挙げられる。また、植物細胞壁分解に関わる他の酵素、例えば、フェルラ酸エステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、プロテアーゼなどを含んでいてもよい。これらの酵素を含有しているか否かは、各酵素の基質を用いて酵素活性を調べることにより、確認することができる。
【００１８】
酵素の由来は特に限定されないが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物などに由来する酵素が挙げられ、好ましくはトリコデルマ属、アクレモニウム属、アスペルギルス属由来の酵素であり、さらに好ましくはトリコデルマ属由来の酵素である。
【００１９】
これらの酵素は市販されており、本発明の製造方法に好適に用いることができる。市販の酵素製剤（商品名）としては、ノボザイムズ社製のセリックシリーズ（シーテック、エイチテック等）、ノボザイム１８８、セルクラスト、パルプザイム、ジェネンコア社製のアクセルラーゼシリーズ（ＴＲＩＯ、ＤＵＥＴ等）、マルチフェクトシリーズ、明治製菓社製のメイセラーゼ、ヤクルト社製のオノズカ、アマノエンザイム社製のセルラーゼ（Ａ、Ｔ）などが挙げられる。好ましくはセリックシリーズおよびアクセルラーゼシリーズである。これらの酵素製剤はセロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼを含んでおり、原料バイオマスの組成や含有酵素活性を考慮して、単独、あるいは複数を組み合わせて用いることができる。セルラーゼ活性の高い酵素製剤とヘミセルラーゼ活性の高い酵素製剤を組み合わせて用いることが好ましく、例えば、セリックシーテックシリーズ（セルラーゼが主成分）とセリックエイチテックシリーズ（ヘミセルラーゼが主成分）を組み合わせて混合して用いることが好ましい。
【００２０】
反応混合物の調製方法は特に限定されず、例えば、反応器内にバイオマス原料、酵素および水を添加し、混合して反応混合物を調製することができる。また、反応器外で調製した反応混合物を反応器内に移してもよい。
バイオマス原料の使用量は特に限定されないが、反応開始時には、下記式で算出される原料充填率が約６０〜１００％になる量を用いることが好ましい。
原料充填率（体積％）＝原料見掛体積（ｍｌ）／反応器容積（ｍｌ）
より好ましくは約７０〜１００％、さらに好ましくは約８０〜１００％、特に好ましくは約９０〜１００％である。ここで、原料見掛体積とは、反応混合物を静置した時に、バイオマス原料が反応器中で占める体積を意味し、空隙を考慮しない見掛けの体積のことである。高い原料充填率で糖化反応を開始することにより、原料濃度を高め、反応器を有効利用して生産性を向上させることができる。
【００２１】
酵素の使用量は、必要な反応速度と原料への酵素吸着の程度を考慮して、工程（Ａ）および工程（Ｂ）で使用する酵素量を設定することが好ましい。本発明では、原料に酵素を吸着させて継続的にリサイクル利用するが、吸着しにくいごく一部の酵素は工程（Ｂ）において酵素ロスとなる。この酵素ロスを勘案し、糖生産速度と酵素使用量が最適化されるように、全体の酵素使用量の配分を設定することが好ましい。
工程（Ａ）においては、酵素の使用量は特に限定されないが、好ましくはバイオマス原料に対して、酵素活性成分の重量として約０．０１〜１０質量％、より好ましくは約０．０５〜３質量％である。水の添加量は特に限定されないが、好ましくはバイオマス原料（乾燥重量）に対して約１〜２０倍、さらに好ましくは約２〜１０倍量である。
【００２２】
反応混合物には、酵素反応の妨げとならない限りバイオマス原料、酵素および水以外の成分を添加してもよい。例えば、テトラサイクリン、シクロヘキシミド、アジ化ナトリウムなどの薬剤を雑菌等による糖消費の抑制の目的で添加してもよい。また、ｐＨコントロールのために、酢酸、クエン酸、コハク酸、リン酸などのバッファー成分を添加してもよい。ｐＨ調整には酸、アルカリを適宜選択して用いることができる。アルカリ前処理を行ったバイオマス原料を用いる場合には、バイオマス原料がアルカリ性になっているため、酸を使用して糖化に適したｐＨに調整する。この場合、使用する酸は特に限定されないが、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、二酸化炭素などを用いることができる。好ましくは硫酸、塩酸、酢酸、二酸化炭素である。反応混合物のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに従って設定すればよいが、通常ｐＨ約３〜７、好ましくはｐＨ約４．５〜６である。
【００２３】
また、酵素のバイオマス原料への非特異的吸着を低減させ、生産性（糖生産速度）の向上を図るために、反応混合物に添加剤を添加してもよい。このような添加剤としては、親水性ポリマー、タンパク質、界面活性剤、リグニン分解物などが挙げられ、好ましくは真菌や細菌などの微生物を培養して得られるタンパク質（菌体由来、および菌体外分泌タンパク質）、非イオン性の親水性ポリマー（ＰＥＧ等）、非イオン性の界面活性剤（ＰＥＧ鎖を有するもの等）、アルカリ前処理で得られるリグニン分解物である。
【００２４】
本発明において、糖化反応の開始は、反応混合物の全量が反応器に仕込まれ、所定の温度に達した時点と定義される。反応条件は、酵素による加水分解が進行する条件であれば特に限定されない。反応温度は通常約２０〜８０℃、好ましくは約３０〜６０℃である。
【００２５】
工程（Ｂ）は、糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともバイオマス原料および水を追加して糖化反応を再開する工程であり、複数回繰り返される。工程（Ｂ）を複数回繰り返すことにより、バイオマス原料に吸着した酵素を効率よくリサイクル使用して酵素コストを低減するともに、バイオマス原料を逐次追加して高い原料濃度を維持し、反応器を効率よく使用することで生産性を向上させることが可能となる。バイオマス原料に吸着した酵素は、新たに追加された未分解のバイオマス原料へと系中で移行するため、追加酵素が無い、もしくは少量の場合でも、酵素をリサイクルしながら継続的に糖化反応を行うことが可能である。
【００２６】
工程（Ｂ）において重要なのは、糖化液の回収と、バイオマス原料等の追加の順序である。本発明においては、糖化液を一部回収した後に、バイオマス原料等の追加を行うことを特徴とし、この逆は含まない。また、本発明は糖化液の回収とバイオマス原料等の追加を段階的に行う反応方法（逐次糖化法）であり、糖化液の回収とバイオマス原料との追加を同時に行う方法（連続糖化法）は含まない。
【００２７】
本発明は、バイオマス原料への酵素の吸着現象を利用した方法であるが、吸着現象を利用した逐次的な反応方法には、以下の２つの方法が一般に知られている。
（ｉ）先にバイオマス原料等を追加した後に、糖化液を回収する方法
（ｉｉ）先に糖化液を回収した後、バイオマス原料等を追加する方法
方法（ｉ）では、酵素回収率を高められるというメリットがある一方、通常得られる含水状態の前処理原料を使用する場合には、糖化液が大きく希釈されてしまうこと、また原料追加のための反応器容積が余分に必要であるというデメリットを有していた。一方、方法（ｉｉ）では、原料に吸着しない酵素（遊離酵素）は、回収した糖化液とともに失われるため、複数回のリサイクル反応や、ヘミセルロース等を含む実際のバイオマス原料に対しては、実用的でないという課題があった。
【００２８】
本発明者らは、方法（ｉｉ）においても、特定の領域で糖化液の回収を行うことで、上記課題が解決されることを見出した。すなわち、糖化反応進行中に糖化液の一部を回収する方法である。糖化反応が進行している領域では、未分解の原料が十分に残存しているため酵素吸着率が十分に高く、糖化液を回収しても酵素ロスは僅かであり、複数回のリサイクル反応や、実際のバイオマス原料に対しても有効であることを確認している。また本発明の方法によると、含水状態の原料でも糖化液の希釈を起こさず使用可能であり、かつ、糖化液を先に回収することで追加原料の容積が確保されるため、余分な反応器容積を必要とせず、反応容器をコンパクト化して生産効率を高められることも見出した。さらには、特定の領域で糖化液の回収とバイオマス原料等の追加を逐次的に繰り返すことで、生成糖の系外への除去と蓄積（糖濃度の低下と上昇）を効率良く行うことができ、糖による酵素の生成物阻害を低減できるというメリットも得られる。一方、連続糖化法では、高い糖濃度が維持されるため、生成物阻害の影響が更に顕著になり好ましくない。
【００２９】
糖化反応進行中とは、反応混合物中の単糖の生成量が実質的に増加している状態を意味し、またバイオマス原料が十分に存在している状態を意味する。糖化反応を反応初期、中期、終期の３つに分ける場合、反応中期であることが好ましい。反応中期には、酵素が原料に十分吸着しており、糖化液の一部回収を行っても酵素ロスは僅かであり、また生成糖量および糖濃度も比較的高いため、生成物阻害の低減効果も大きい。反応終期には、原料減少により酵素が遊離し始めるため、酵素ロスが大きくなる。反応初期には、生成糖量および糖濃度が低いため、生成物阻害の低減効果が小さい。
【００３０】
反応混合物から糖化液を回収する方法は特に限定されない。例えば、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、デカンター等の固液分離法を用いることができる。固液分離により一部の糖化液と未分解のバイオマス原料を分離し、糖化液を回収する。固液分離された未分解のバイオマス原料は、反応器外へ排出してもよいが、反応器内へ留めて蓄積させることが好ましい。未分解のバイオマス原料を反応器内へ留めて蓄積させることで、原料に吸着した酵素を継続的にリサイクル使用できる。具体的には、好ましくは、ストレーナー、メッシュ等を用いたろ過であり、より好ましくは、ストレーナーやメッシュを付属した反応器を用い、未分解のバイオマス原料は反応器中に留めつつ、固液分離を行いながら糖化液を回収する方法である。糖化液は反応混合物中に含まれる液体を意味し、糖化液の一部とは、反応混合物中に含まれる液体の全部でないことを意味する。回収する糖化液の量の多少は限定されないが、反応混合物中に含まれる全液体量（質量）の約１０〜９０％が好ましく、約２０〜８０％がより好ましく、約３０〜８０％がさらに好ましい。
【００３１】
糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくともバイオマス原料および水を追加する。反応容器内にバイオマス原料および水を添加して混合すればよいが、反応器外でバイオマス原料および水を混合した後に反応器内に移してもよい。工程（Ａ）における反応混合物の調製と同様に、バイオマス原料および水以外の成分を添加してもよい。酵素は追加してもしなくてもよいが、酵素を追加することが好ましい。バイオマス原料の追加量は特に限定されないが、追加後のバイオマス原料の原料充填率（工程（Ａ）の説明を参照）が約６０〜１００％になるように、バイオマス原料を追加することが好ましい。より好ましくは約７０〜１００％、さらに好ましくは約８０〜１００％、特に好ましくは約９０〜１００％である。
【００３２】
水の追加量については、バイオマス原料およびそれ以外の成分の追加量に応じて、工程（Ａ）における反応混合物の総質量と同等となるように追加するか、あるいは、反応器の空隙部を充填するのに必要な量を追加することが好ましい。
酵素を追加する場合は、工程（Ａ）で述べたように、原料への酵素吸着の程度（酵素ロス）を勘案し、糖生産速度と酵素使用量が最適化されるように、全体の酵素使用量の配分を設定することが好ましい。具体的には、追加酵素量が工程（Ａ）における酵素使用量の約５０質量％以下であることが好ましく、約３０質量％以下であることがより好ましく、約２０質量％以下であることがさらに好ましい。
追加する酵素は、工程（Ａ）の反応混合物調製時に用いたものと同じ酵素でもよく、異なる酵素でもよい。異なる酵素を用いる場合には、追加する酵素は反応混合物調製時に用いる酵素よりヘミセルラーゼ活性が高いことが好ましい。例えば、反応混合物調製時にセリックシーテック（商品名）シリーズを用いた場合、追加時にはよりヘミセルラーゼ活性が高い酵素として、セリックエイチテック（商品名）シリーズまたは両者の混合物を用いることが好ましい。
本発明において、糖化反応の再開は、追加する成分のすべてが反応器に仕込まれ、所定の温度に達した時点と定義される。
【００３３】
工程（Ｂ）の繰り返し回数は、２回以上であれば特に限定されないが、２回〜１０回が好ましく、２回〜５回がより好ましい。工程（Ｂ）の繰り返し回数は、未分解原料（残渣）の蓄積量を勘案しながら適宜設定することができる。
また、複数回繰り返す工程（Ｂ）の中に、原料バイオマスを追加しない工程を設けてもよい。すなわち、複数回繰り返す工程（Ｂ）の少なくとも１回を、以下の工程（Ｂ’）に置き換えてもよい。
（Ｂ’）糖化反応進行中に反応混合物から糖化液の一部を回収した後、反応混合物に少なくとも酵素および水、または少なくとも水を追加して糖化反応を再開する工程
（Ｂ’）における酵素および水の追加量は、工程（Ｂ）で述べたものと同様である。酵素および水、または水以外の成分を添加してもよい。工程（Ｂ’）ではバイオマス原料は追加しなくてもよいが、バイオマス原料を一緒に追加してもよい。この場合のバイオマス原料の追加量は、工程（Ｂ）で述べたものと同様の原料充填率としてもよいが、より低い原料充填率としてもよい。
複数回繰り返す工程（Ｂ）の少なくとも１回を工程（Ｂ’）と置き換えればよく、２回以上を置き換えてもよい。複数回繰り返す工程（Ｂ）のどの回を工程（Ｂ’）と置き換えてもよいが、工程（Ｂ）の最終回（工程（Ｃ）の前の回）を工程（Ｂ’）と置き換えることが好ましい。
【００３４】
工程（Ｂ）において、糖化液の一部回収は、前工程において開始または再開した糖化反応が進行中のいずれかの時期であれば特に限定されないが、下記式で算出されるバイオマス原料の区間原料分解率が約２０〜６０質量％の時点で行うことが好ましい。
区間原料分解率（質量％）＝区間糖生成量（ｇ）／１．１／区間開始時点の原料量（ｇ）
（ただし区間は、前工程における反応開始または反応再開を開始時点とし、次に行う糖化液回収を終了時点とする一反応区間を意味する。）
上記式において、区間糖生成量を１．１で割るのは加水分解で増加する水の重量を考慮するためである。区間糖生成量は、反応混合物から糖化液をサンプリングし、公知の糖定量法（例えば、ＨＰＬＣ等）を用いて糖の生成量を測定することにより求めることができる。なおここで、糖生成量、および原料量は、絶乾基準の重量である。
より好ましくは区間原料分解率が約２０〜５５質量％の時点、さらに好ましくは区間原料分解率が約２０〜５０質量％の時点で糖化液の回収を行う。また、１回目の糖化液回収時の区間原料分解率より、２回目以後の糖化液回収時の区間原料分解率が低いことが好ましい。したがって、１回目の糖化液回収は、区間原料分解率が約３０〜６０質量％の時点で行うことが好ましく、２回目以後の糖化液回収は、区間原料分解率が約２０〜５０質量％の時点で行うことが好ましい。工程（Ｂ’）における糖化液の一部回収時期についても、上記と同様である。
【００３５】
また、工程（Ｂ）において、糖化液の一部回収は、前工程における反応開始または反応再開から約６〜３０時間後に行うことが好ましい。より好ましくは約６〜２４時間後、さらに好ましくは約６〜２０時間後に糖化液の回収を行う。工程（Ｂ’）についても同様である。
【００３６】
また、工程（Ａ）および工程（Ｂ）において、バイオマス原料の原料充填率が約６０〜１００％の状態で反応を開始または再開し、反応を進行させて原料充填率を減少させ、次の工程（Ｂ）において、該原料充填率が約４０〜８０％になった時点で、反応混合物から糖化液の一部を回収することが好ましい。好ましい開始時または再開時の原料充填率については、上述のとおりである。糖化液回収時の原料充填率は、より好ましくは約４０〜７５％であり、さらに好ましくは約４０〜７０％である。また、該原料充填率の減少量（反応の開始または再開から次の工程の糖化液回収までの原料充填率の減少量）としては、２０〜６０％であることが好ましく、２５〜６０％であることがより好ましく、２５〜５５％であることがさらに好ましい。工程（Ｂ’）の場合も、工程（Ｂ）と同様である。
【００３７】
工程（Ｃ）は、糖化反応を進行させて反応混合物から糖化液を回収し、糖化反応を終了する工程である。工程（Ｂ）または（Ｂ’）から工程（Ｃ）への移行は、糖化反応速度と、未分解原料（残渣）の蓄積量を勘案して行うことが好ましい。すなわち、反応が進行してバイオマス原料濃度が低下し、かつ、工程（Ｂ）または（Ｂ’）の繰り返しにより未分解残渣が蓄積してくると、糖化反応速度が低下し、糖の生産性が低下する。また、未分解残渣が蓄積すると、物理的に原料追加が不可能になるため、この時点で工程（Ｃ）を行うことが好ましい。この観点からすると、残渣量が少ないバイオマス原料を用いることが好ましく、そのような原料を用いることで、工程（Ｂ）の繰り返し反応を長期間行うことができる。具体的には、アルカリ前処理を行ったバイオマス原料を用いることが好ましく、さらには上述のアルカリ前処理方法（アルカリ液を含浸後、固液分離にて余剰のアルカリ液を除去して加熱処理を行う）を行った原料を用いることが好ましい。この前処理方法によると、リグニンが極めて効率的に除去されるため、残渣量も少なく本発明に好適に用いることができる。
【００３８】
工程（Ｃ）において、糖化反応終了時点での原料充填率は、約２０〜８０％が好ましく、約２５〜７５％がより好ましく、約３０〜７０％がさらに好ましい。糖化液の回収の方法としては、上述の公知の固液分離法を好適に用いることができる。本工程においては、十分に固液分離して、糖化液を回収することが好ましい。
本発明において、糖化反応の終了は、工程（Ｃ）において糖化液の回収を終了した時点と定義される。
【００３９】
本発明の製造方法により製造される糖としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖が挙げられ、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、セロビオース、キシロビオース、セロオリゴ糖、キシロオリゴ糖等が挙げられる。二糖およびオリゴ糖は、酵素等を用いて単糖化してから使用してもよい。
得られた単糖類の用途は特に限定されないが、発酵原料、化学品原料、飼料、肥料等に好適に用いることができる。発酵原料として用いる場合には、エタノール、１−ブタノール、イソブタノール、２−プロパノール、乳酸、コハク酸、酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、クエン酸、アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、各種アミノ酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール等の化学品の発酵生産に好適に用いることができる。
【００４０】
本発明の製造方法において、上記工程（Ｃ）に続いて、糖化液回収後の残渣に含まれる酵素および糖を回収する工程（Ｄ）を行うことが好ましい。具体的には、例えば、残渣を水または他の溶液（例えば、バッファー、アルカリ水溶液等）で洗浄することにより、残渣に含まれる糖化液中の糖および遊離酵素を回収することができる。洗浄後の洗浄液を回収し、それまでに得られた糖化液と合わせるか、もしくは、洗浄液を別の逐次反応の仕込み（工程（Ａ））に利用することで、生成した糖類を無駄なく回収・利用することができる。また別の工程（Ａ）に利用する場合には、酵素リサイクルを同時に行えるため、酵素コストをさらに低減することが可能である。
【００４１】
さらに、残渣に吸着した酵素を回収する場合には、例えば、公知の酵素回収方法（例えば、特開２０１２−２２３１１３参照）を用いて酵素を回収することができる。回収した酵素をリサイクル利用することにより、酵素コストの低減を図ることができる。残渣から回収した吸着酵素は、別の工程（Ａ）での仕込みに再利用することが好ましい。
工程（Ｄ）において、残渣からの遊離酵素および糖の回収、もしくは吸着酵素の回収を行う場合、使用するバイオマス原料はアルカリ前処理を行った原料であることが好ましく、さらには上述のアルカリ前処理（アルカリ液を含浸後、固液分離にて余剰のアルカリ液を除去して加熱処理を行う方法）を行った原料であることが好ましい。この前処理方法によると、リグニンが極めて効率的に除去されるため、残渣からの酵素回収も容易であり、本発明に好適に用いることができる。
【００４２】
また、工程（Ｂ）および工程（Ｂ’）にて回収した糖化液には、微量ながら糖化酵素が含まれる。本発明では、酵素をバイオマス原料に高吸着させてリサイクルするため、基本的には糖化液中に流出する酵素は僅かである。糖化液中の酵素を膜分離（限外ろ過）等の方法で分離回収してもよいが、コスト高となるため、膜分離は行わないほうが好ましい。本発明は膜分離回収を必要としないことも特徴である。
ただし、工程（Ｃ）で回収される糖化液は、比較的高い酵素量を含んでいる場合がある。これは、工程（Ｃ）では反応進行度が高いため、残存バイオマス原料が少なく、遊離酵素が増えるためである。したがって、工程（Ｃ）で回収される糖化液中の酵素をリサイクルすることは、好ましい実施形態である。
【００４３】
本発明の製造方法に用いる糖化反応器は特に限定されず、例えば、攪拌装置を備えた反応器、外部循環型の反応器、ドラム回転式の反応器等を用いることができる。好ましくはストレーナー、メッシュ等の固液分離機能を有する外部循環型の反応器を使用することである。この場合、バイオマス原料は基本的に反応器内に留め、糖化液を固液分離しながら外部循環させて糖化反応を進行させる。
【００４４】
本発明の製造方法は、固液分離機能を有する反応器を使用し、工程（Ａ）の糖化反応開始から工程（Ｃ）の糖化反応終了まで、反応器内からバイオマス原料または残渣を反応器外に取り出すことなく同一反応器内で糖化反応を行うことが好ましい。固液分離機能を有する反応器を使用することで、工程（Ｂ）または（Ｃ）における糖化液の回収が、反応器を利用して極めて容易に行うことができるため、プロセスのシンプル化および生産性向上に寄与する。さらに固体移送および固液分離の負荷低減（工程時間、設備費）にも寄与する。
【００４５】
工程（Ｂ）または（Ｃ）において糖化反応を進行させる際には、反応器を利用して固液分離をしながら、糖化液を外部循環させることで効率的に反応を進行させることができる。この反応方法は液のみの移送で済むため、固体スラリーを移送、あるいは攪拌する方法に比べて、より低エネルギーで行うことができ、さらにバイオマス原料濃度も高めることができるため、生産性向上にも寄与する。また残渣の微粉化を抑制することができるため、固液分離性が高いという利点もある。
工程（Ａ）または（Ｂ）におけるバイオマス原料等の添加の際には、反応器の上部から行うことが好ましい。糖化液の回収は、反応器の上部、中部、底部のいずれから行ってもよい。
【００４６】
このように、固液分離機能を有する反応器を使用することで、工程（Ａ）の糖化反応開始から工程（Ｃ）の糖化反応終了まで、反応器内からバイオマス原料または反応残渣を反応器外に取出すことなく同一反応器内で糖化反応を行うことが可能であり、そのような反応方法が本発明の好ましい実施形態である。また工程（Ｄ）における反応残渣からの酵素および糖の回収も同一の反応器を使用して行うことが可能であり、そのような方法が好ましい。工程（Ｂ’ ）は工程（Ｂ）と同様である。
また、反応装置は、残渣を反応器外へ排出する機構を有していることが好ましい。具体的には、スクリュー、圧送、スラリーポンプ等による排出機構があげられる。具体的な反応装置としては、パルプ製造で使用されるバッチ式もしくは連続式の蒸解釜等が一例としてあげられる（単行本、紙パルプ製造技術シリーズ第１巻クラフトパルプ、７８ページの図参照。紙パルプ技術協会、１９９６年発行）。
【００４７】
本発明の製造方法を用いてバイオマス原料から糖を製造する場合、下記式で算出される糖化反応開始から終了までの糖生成速度（糖生産性の指標であり、反応器単位体積当たりの糖生産速度を示す。）は、１．０以上であることが好ましく、１．５以上であることがより好ましく、２．０以上であることがさらに好ましい。
糖生成速度（ｇ／Ｌ・ｈｒ）＝積算糖生成量（ｇ）／反応器容積（Ｌ）／反応時間（ｈｒ）
【００４８】
本発明の製造方法を用いてバイオマス原料から糖を製造する場合、下記式で算出される糖化反応開始から終了までの酵素原単位（酵素コストの指標であり、単位重量の糖を生成するのに必要な酵素量を示す。）は、０．１５以下であることが好ましく、０．１０以下であることがより好ましい。ただし、下記式における積算酵素量は、酵素活性成分の乾燥重量基準である。
酵素原単位（ｇ／ｇ）＝積算酵素量（ｇ）／積算糖生成量（ｇ）
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
〔実験材料〕
（１）バイオマス原料
バイオマス原料として、パーム油の搾油工程で排出されるパーム空果房（産地インドネシア、以下「ＥＦＢ」と記す）を使用した。ＥＦＢには以下の処理を行って原料として用いた。すなわち、ＥＦＢをシュレッダーで処理して繊維状ＥＦＢとした後、風乾した（含水率９％）。さらに繊維状ＥＦＢを連続式カッターミルで粗粉砕し、３ｍｍスクリーンを通過したものを取得し、続いて０．２５ｍｍ以下の微粉を篩で除去したものを取得した（粗粉砕ＥＦＢ）。
（２）糖化酵素
ノボザイム社製の糖化酵素セリックシーテック２（商品名、以下「酵素Ａ」と記す）およびセリックエイチテック２（商品名、以下「酵素Ｂ」と記す）を使用した。酵素Ａはセルラーゼが主成分の糖化酵素液であり、ヘミセルラーゼも含有する。酵素Ｂはヘミセルラーゼが主成分の糖化酵素液であり、セルラーゼも含有する。
【００５１】
〔分析方法〕
糖化液中の生成糖量の定量分析は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用して行った。カラムはＳｈｏｄｅｘ（登録商標）Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０１（商品名、配位子交換クロマトグラフィ用カラム、粒径６μｍ、使用最大圧力５．０ＭＰａ、常用流量０．５〜１．０ｍｌ／分、昭和電工社製）を用い、示差屈折計（ＲＩ）にて検出を行った。移動相として純水を用い、カラム温度６０℃にて分析を行った。
生成糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、キシロビオースが検出され、これらを合計した値を糖生成量とした。
【００５２】
〔評価指標〕
（１）原料充填率
原料充填率（体積％）＝原料見掛体積（ｍｌ）／反応器容積（ｍｌ）
バイオマス原料固体が反応器容積に占める見掛けの体積割合を示す。
（２）区間原料分解率
区間原料分解率（質量％）＝区間糖生成量（ｇ）／１．１／区間開始時点の原料量（ｇ）
本発明の製造方法において、各反応区間におけるバイオマス原料の分解率を示す。１．１で割るのは加水分解で増加する水の重量を考慮するためである。
（３）積算糖収率
積算糖収率（質量％）＝積算糖生成量（ｇ）／積算原料量（ｇ）
本発明の製造方法において、糖化反応開始からある区間までの糖生成量を積算して重量収率で表したものである（対積算原料量）。積算糖生成量は各区間の糖生成量の和であり、積算原料量は各区間で加えられたバイオマス原料（前処理品）の和である。
（４）積算糖生成速度
積算糖生成速度（ｇ／Ｌ・ｈｒ）＝積算糖生成量（ｇ）／反応器容積（Ｌ）／反応時間（ｈｒ）
本発明の製造方法において、糖化反応開始からある区間までを積算した糖生産性を表す指標であり、反応器単位体積当たりの糖生産速度である。高いほど糖生産性が高いことを示す。積算糖生成量は各区間の糖生成量の和である。
（５）積算酵素原単位
積算酵素原単位（ｇ／ｇ）＝積算酵素量（ｇ）／積算糖生成量（ｇ）
本発明の製造方法において、糖化反応開始からある区間までを積算した酵素使用効率を表す指標である。単位重量の糖を生成するのに必要な酵素量を示し、低いほど酵素の使用効率が高い（酵素コストが低い）ことを示す。
【００５３】
＜実施例１＞
（１）アルカリ前処理
１Ｌビーカー中に粗粉砕ＥＦＢを８０．０ｇ（絶乾重量）取り、アルカリ液として３質量％の水酸化ナトリウム水溶液を８００ｇ加えた。ビーカーを室温にて減圧下に３分間置いて解圧する操作を３回繰り返し、アルカリ液をＥＦＢ内部に浸透させた。続いてろ過を行い、アルカリ液を含浸した固体ＥＦＢ（アルカリ含浸ＥＦＢ）２６０．９ｇと余剰のアルカリ液とに固液分離した。
アルカリ含浸ＥＦＢを５００ｍｌのジャケット加熱式高圧反応器に充填し、密閉した後、内温１００〜１１５℃（ジャケットのオイル温度１２０℃）にて１時間加熱処理を行った。加熱後のＥＦＢを取出し、８００ｍｌのイオン交換水を加えて攪拌混合（１０分間）し、可溶化成分を溶出させ、さらにろ過により固体ＥＦＢと洗浄水とに固液分離する水洗操作を行った。この水洗操作を合計３回繰り返した。ただし３回目では、攪拌混合の際に１０％酢酸水溶液を用いて系のｐＨを５．０に調整する操作を行った。最終３回目の固液分離後に、含水状態の固体ＥＦＢを２０２．９ｇ取得した（前処理品Ａ）。一部を乾燥して調べたところ、前処理品Ａの固形分濃度は２６．１％（含水率は７３．９％）であった。前処理品Ａは冷蔵庫内で保存し、反応の際は一部を取り出して使用した。
【００５４】
（２）反応混合物の調製および逐次糖化
〔反応器〕
糖化に用いる反応器（固液分離機能を有する）を以下のように作製した。プラスチック製シリンジ（テルモ社製、容量１０ｍｌ、底部ルアーコック型、容量目盛有り）のプランジャーを取り外した筒部を用い、筒の底部に固液分離用の円形金網（１７ｍｍφ、１００メッシュ）を固定し、出口（ルアーコック側）をストッパーで封じた。
【００５５】
〔反応混合物の調製〕
ＥＦＢ前処理品Ａ５．０７ｇ（絶乾重量１．３２ｇ）、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２．５ｍｌ、０．１％シクロヘキシミド０．５ｍｌ、１％テトラサイクリン塩酸塩０．０５ｍｌ、酵素Ａ１２５ｍｇ、最後に水を添加し総重量を１０．０ｇに調整した。なお酵素液は高粘度のため水で５倍希釈してから所定量加えた。
【００５６】
〔逐次糖化・区間１（反応開始〜反応２４時間→糖化液回収１）〕
上記反応混合物を仕込んだ反応器をシリコンゴム栓で密閉し、さらにテフロン（登録商標）テープでシールをした。４５℃に保温したインキュベーター（タイテック社、バイオシェーカーＢＲ−４０ＬＦ型）中、チューブローテーター（井内製作所、ＴＲ−３５０型）に反応器をセットし、２０ｒｐｍで回転させながら糖化反応を開始した。なお反応開始時点での原料ＥＦＢの見掛け体積をシリンジ目盛りより読取ったところ９．０ｍｌであり、充填率は９０％であった。
【００５７】
４５℃で２４時間反応した時点で冷却して反応を一時停止し、ルアーコック側出口より糖化液を回収した。回収した糖化液量は６．５ｇであり、反応器中の反応混合物量は３．５ｇであった。なお糖化液回収の際は、上部より固形分を圧搾し、底部金網で固液分離しながら出口より糖化液を回収した。糖化液回収後のＥＦＢ見掛体積は４．５ｍｌであり、充填率は４５％に低下した。
【００５８】
回収した糖化液をＨＰＬＣにて分析したところ、グルコース、キシロース、アラビノースおよびキシロビオースが検出された。それらを合計した糖濃度は７．３％であり、糖生成量（区間糖生成量）は０．７３ｇであった。なお糖生成量は回収した糖化液中の糖量に、残渣中に含まれる糖量（＝ウェットの残渣重量と糖化液の糖濃度から算出）を合計した値であり、糖化反応によって生成した糖の総量を示している。また糖生成量より、未分解の残存原料量は０．６６ｇと見積もられた（残存原料量＝仕込みの原料量−糖生成量／１．１、１．１で割るのは加水分解で増加する水の重量を考慮するため）。したがって、区間１における区間原料分解率は５０％（対仕込み、絶乾基準）となった。
【００５９】
〔逐次糖化・区間２（原料等追加１→反応２４〜４８時間→糖化液回収２）〕
続いて原料等の追加操作を行った。ＥＦＢ前処理品Ａ２．５４ｇ（絶乾重量０．６６ｇ）、酵素Ａ１６ｍｇ、０．２Ｍ酢酸緩衝液１．５ｍｌを追加し、最後に水で総重量を１０．０ｇに再調整して反応器を密閉した。合計のＥＦＢ原料量（残存原料量＋追加原料量）は１．３２ｇ、原料見掛体積は９．０ｍｌとなり、原料充填率は９０％に上昇した。
【００６０】
４５℃での糖化反応を再開し、更に２４時間（合計４８時間）反応した時点で区間１と同様に糖化液を回収し、糖化液を６．１ｇ取得した。原料見掛体積は４．９ｍｌであり、原料充填率は４９％であった。回収した糖化液の糖濃度は６．８％であり、区間２における正味の糖生成量（区間糖生成量）は０．４３ｇであった（区間１からの持込み糖量を差し引いた値）。未分解の残存原料量は０．９３ｇと見積もられ、区間２における区間原料分解率は３０％となった（区間２開始時点の原料量に対する分解率）。
【００６１】
〔逐次糖化・区間３（原料等追加２→反応４８〜７２時間→糖化液回収３）〕
続いて原料等の追加操作を区間２と全く同じ方法で行った。合計のＥＦＢ原料量は１．５９ｇ、原料見掛体積は９．４ｍｌとなり、原料充填率は９４％であった。
４５℃での糖化反応を再開し、更に２４時間（合計７２時間）反応した時点で糖化液を回収し、糖化液を５．６ｇ取得した。原料見掛体積は５．４ｍｌであり、原料充填率は５４％であった。回収した糖化液の糖濃度は６．９％であり、区間糖生成量は０．４１ｇであった。未分解の残存原料量は１．２１ｇと見積もられ、区間３における区間原料分解率は２４％となった（区間３開始時点の原料量に対する分解率）。
【００６２】
〔逐次糖化・区間４（酵素等追加３→反応７２〜１２０時間→反応終了）〕
続いて酵素等の追加操作を行った。すなわち、区間２と同様の操作において原料ＥＦＢを追加せず、酵素Ａ１６ｍｇ、緩衝液および水を追加して総重量を１０．０ｇに再調整した。
４５℃での糖化反応を再開し、更に４８時間（合計１２０時間）反応した時点で糖化液を回収し、反応を終了した。原料見掛体積は３．５ｍｌであり、原料充填率は３５％であった。回収した糖化液の糖濃度は６．５％であり、区間４における区間糖生成量は０．３５ｇであった。未分解の残存原料量は０．８９ｇと見積もられ、区間４における区間原料分解率は２６％となった（区間４開始時点の原料量に対する分解率）。
【００６３】
（３）結果まとめ
実験条件と結果をまとめて表１に示す。本実施例は、４区間で構成される逐次糖化反応であり、原料充填率は約３０〜１００％、区間原料分解率は約２０〜５０％の範囲で実施された。また積算糖収率、積算糖生成速度、及び積算酵素原単位を算出して表１に合わせて示した。最終的に反応全体では、積算糖収率が７３ｗｔ％、糖生成速度が１．６ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位が０．０９０ｇ／ｇ（酵素液基準）であった。なお、表１の下部の注釈は、表２〜７についても同様である。
【００６４】
【表１】
2014103949.tif 000002
【００６５】
＜実施例２＞
表２に示した実験条件で実施例１と同様に逐次的な糖化反応を実施した。ただしここでは追加する酵素サンプルとして、酵素Ａと酵素Ｂ（ヘミセルラーゼが主成分）の１：１混合液を使用した。結果を合わせて表２に示す。本実施例では、原料充填率は約３０〜１００％、区間原料分解率は約２０〜５０％の範囲で実施された。最終的に反応全体では、積算糖収率が７８ｗｔ％、糖生成速度は１．７ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．０８５ｇ／ｇであった。
【００６６】
【表２】
2014103949.tif 000003
【００６７】
＜実施例３＞
表３に示した実験条件で実施例１と同様に逐次的な糖化反応を実施した。ただしここでは追加する酵素量を増やし、反応終了時間を変更して実験を行った。結果を合わせて表３に示す。本実施例では、原料充填率は約３０〜１００％、区間原料分解率は約２０〜５０％の範囲で実施された。最終的に反応全体では、積算糖収率が７６ｗｔ％、糖生成速度は２．１ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．１３ｇ／ｇであった。
【００６８】
【表３】
2014103949.tif 000004
【００６９】
＜実施例４＞
表４に示した実験条件で実施例１と同様に逐次的な糖化反応を実施した。ただしここでは仕込時の酵素量を増やし、糖化液回収／原料等追加のタイミングを変更して実験を行った。結果を合わせて表４に示す。本実施例では、原料充填率は約３０〜９０％、区間原料分解率は約１０〜６０％の範囲で実施された。最終的に反応全体では、積算糖収率が７６ｗｔ％、糖生成速度は２．１ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．１３ｇ／ｇであった。
【００７０】
【表４】
2014103949.tif 000005
【００７１】
＜実施例５＞
実施例１と全く同様にＥＦＢのアルカリ前処理工程を行った。ただしここではアルカリ含浸ＥＦＢの加熱条件を変更し、内温１７５〜１８５℃で１５分、加熱処理を行った。実施例１と同様に水洗、ｐＨ調整操作を行い、最終的に含水状態の前処理ＥＦＢ（前処理品Ｂ）を２０７．４ｇ取得した。一部を乾燥して調べたところ、前処理品Ｂの固形分濃度は２３．４％（含水率は７６．６％）であった。
【００７２】
続いて表５に示した実験条件で実施例１と同様に逐次的な糖化反応を実施した。ただしここでは原料ＥＦＢサンプルとして、上記前処理品Ｂを使用し（未処理のＥＦＢ基準で実施例１と同量使用。すなわち実施例１の０．９２倍量）、追加する酵素に酵素Ａと酵素Ｂの１：１混合液を用い、かつ糖化液回収／原料等追加のタイミングを変更して実験を行った。結果を合わせて表５に示す。本実施例では、原料充填率は約３０〜８０％、区間原料分解率は約３０〜６０％の範囲で実施された。最終的に反応全体では、積算糖収率が８５ｗｔ％、糖生成速度は２．６ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．０８３ｇ／ｇであった。
【００７３】
【表５】
2014103949.tif 000006
【００７４】
＜実施例６＞
表６に示した実験条件で実施例５（前処理品Ｂ使用）と同様に逐次的な糖化反応を実施した。ただし、ここでは原料等追加の際には酵素を全く追加せず、かつ、糖化液回収／原料等追加のタイミングを変更して実験を行った。結果を合わせて表６に示す。本実施例では、原料充填率は約３０〜８０％、区間原料分解率は約３０〜６０％の範囲で実施された。最終的に反応全体では、積算糖収率が８２ｗｔ％、糖生成速度は２．５ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．０８９ｇ／ｇであった。
【００７５】
【表６】
2014103949.tif 000007
【００７６】
＜比較例１＞
一般的なバッチ反応で糖化反応を実施した。すなわち実施例１と全く同様に仕込を行って反応開始し、途中、糖化液回収／原料等追加操作を行わずに、７２時間、糖化反応を継続した。ただし途中３回のサンプリングを行い、反応進行度を確認した。実験条件と結果を合わせて表７に示す。最終的に反応７２時間で糖収率が７４ｗｔ％、糖生成速度は１．４ｇ／Ｌ・ｈｒ、酵素原単位は０．１３ｇ／ｇであった。
【００７７】
【表７】
2014103949.tif 000008
【００７８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。