(57)【要約】【課題】本願発明の目的は、新たな自己免疫疾患治療又は予防用組成物を提供することにある。本願発明の目的はまた、新たな自己免疫疾患治療又は予防用医薬組成物、サプリメント及び食品を提供することにある。【解決手段】キャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）を有効成分とする自己免疫疾患治療又は予防用組成物、殺菌処理されたキャンディダ  ケフィール菌体と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、及び殺菌処理されたキャンディダ  ケフィール菌体を含有するサプリメント又は食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）を有効成分とする、自己免疫疾患治療又は予防用組成物。
【請求項２】
キャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）が、殺菌処理された菌体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
キャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）が、加熱殺菌処理された菌体である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
医薬又はサプリメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
殺菌処理されたキャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）の菌体と、薬学的に許容される担体とを含有する、医薬組成物。
【請求項６】
殺菌処理されたキャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）の菌体を含有する、サプリメント又は食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ  ケフィールを含有する組成物に関する。本発明はまた、キャンディダ  ケフィールを含有する医薬組成物、サプリメント及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患とは、免疫系の認識システムに異常が生じ、自己の抗原を非自己の抗原であるかのように認識して攻撃することにより発症する疾患である。自己免疫疾患の多くは、原因が未解明であり、治療も困難とされている。
【０００３】
一方、ケフィアとは、コーカサス地方を起源とする、発酵した乳飲料である。ケフィアは、牛等の乳をケフィア  グレインという種菌を用いて発酵させることにより作られる。ケフィア  グレインは、複数の酵母及び乳酸菌からなる、酵母や真正細菌の結合体である。
【０００４】
ケフィアは、ラクトースの消化を助ける役割等、健康への利点があることが知られている。また、特許文献１で開示されているように、ケフィアは、掻痒の予防及び／又は治療に有用であり、特許文献２、３で開示されているように、ケフィア  グレインに含まれる酵母の一種であるキャンディダ  ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）は、血中や肝臓のコレステロールを有効に低下しうることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２７３７８３号公報
【特許文献２】特開２００１−３１５７８号公報
【特許文献３】特開平０３−３０６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明の目的は、新たな自己免疫疾患治療又は予防用組成物を提供することにある。本願発明の目的はまた、新たな自己免疫疾患治療又は予防用医薬組成物、サプリメント及び食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、キャンディダ  ケフィールが自己免疫疾患の症状を改善することを見出した。ケフィアあるいはキャンディダ  ケフィールによる、自己免疫疾患の治療又は予防については報告がない。また、他の酵母やザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）では自己免疫疾患の症状を改善しないか、むしろ悪化させることもあることを見出した。したがって、キャンディダ  ケフィールによる自己免疫疾患の症状改善作用は、ケフィアあるいはキャンディダ  ケフィールの他の作用と完全に異なる、他の酵母やザイモサンに見られないキャンディダ  ケフィールに特異的なものであり、予想外の作用である。
【０００８】
以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、キャンディダ  ケフィールを有効成分とする自己免疫疾患治療又は予防用組成物である。キャンディダ  ケフィールを有効成分として用いることにより、自己免疫疾患の症状を有意的に改善することができる。
【０００９】
上記キャンディダ  ケフィールは、殺菌処理された菌体であることが好ましい。殺菌処理された菌体を用いることにより、より保存性がよい治療又は予防用組成物を得ることができる。
【００１０】
また、簡便性及び低コスト性の観点から、キャンディダ  ケフィールは、加熱殺菌処理された菌体であることがより好ましい。
【００１１】
上記組成物は、医薬又はサプリメントであることが好ましい。上記組成物を医薬又はサプリメントとして用いることにより、天然物由来の自己免疫疾患治療又は予防用の医薬及びサプリメントを提供することができる。
【００１２】
本願発明はまた、キャンディダ  ケフィールの菌体、特に殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、キャンディダ  ケフィールの菌体、特に殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体を含有するサプリメント又は食品を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、キャンディダ  ケフィールを有効成分とする自己免疫疾患治療又は予防用組成物が提供される。また、本発明によれば、殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、並びに殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体を含有するサプリメント及び食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（実験的自己免疫性脳脊髄炎、以下、ＥＡＥともいう。）インビボ疾患モデルにおける、サッカロマイセス  セレビシエ菌体の投与の結果を示す図である。アステリスクは、有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図２】ＥＡＥインビボ疾患モデルにおける、アスペルギルス  オリーゼ菌体の投与の結果を示す図である。
【図３】ＥＡＥインビボ疾患モデルにおける、キャンディダ  ケフィール菌体の投与の結果を示す図である。アステリスクは、有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図４】慢性マウスＤｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ  （以下、ＤＳＳともいう。）大腸炎モデルにおける、体重に対する各種菌体の作用を示す図である。
【図５】慢性マウスＤＳＳ大腸炎モデルにおける、腸管長に対する各種菌体の作用を示す図である。アステリスクは、有意差を示す（＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である）。
【図６】慢性マウスＤＳＳ大腸炎モデルにおける、腸管相対湿重量に対する各種菌体の作用を示す図である。アステリスクは、有意差を示す（＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
本明細書において、キャンディダ  ケフィールは、ケフィア  グレインに含まれるキャンディダ属の菌である。キャンディダ  ケフィールの入手方法は特に限定されず、例えばケフィアから単離することができる。かかる単離方法は、当業者にとって周知である。
【００１８】
キャンディダ  ケフィールはまた、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター生物資源課（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＩＴＥ、以下ＮＢＲＣともいう。）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣともいう。）等から、単離された菌として入手することができ、入手した菌を培養し、培養系から菌を回収して用いることもできる。
【００１９】
ＮＢＲＣから入手する場合、キャンディダ  ケフィールは、例えば受託番号が１０２８７の菌株、受託番号が０００８の菌株、受託番号が０４３２の菌株、受託番号が０５８６の菌株、受託番号が０６１６の菌株、受託番号が０７０６の菌株、受託番号が０８８２の菌株、受託番号が０８８３の菌株、受託番号が０９４２の菌株、受託番号が０９６０の菌株、受託番号が１０６５の菌株等として入手することができる。
【００２０】
ＡＴＣＣから入手する場合、キャンディダ  ケフィールは、例えば受託番号が８６１９の菌株、受託番号が３８２９６の菌株、受託番号が８６６０の菌株、受託番号が２００３３８の菌株、受託番号が２０４０９３の菌株、受託番号が４６７６４の菌株、受託番号が９７６７の菌株、受託番号が８６２２の菌株、受託番号が８６５９の菌株、受託番号が８５５３の菌株、受託番号が４９２２の菌株、受託番号が６６０２８Ｄ−５の菌株、受託番号が４１３５の菌株、受託番号が７４８の菌株、受託番号が６６０２８Ｄの菌株、受託番号が３４１３７の菌株、受託番号が８６１０の菌株、受託番号が８６５４の菌株、受託番号が８６１８の菌株、受託番号が８６４１の菌株、受託番号が８６４８の菌株、受託番号が８６１７の菌株、受託番号が１４２４５の菌株、受託番号が２８８３８の菌株、受託番号が２８９０８の菌株、受託番号が４２２６５の菌株、受託番号が６６０２８の菌株、受託番号が８５５５の菌株、受託番号が９０９０２の菌株、受託番号が１４２４４の菌株、受託番号が１３１９３の菌株、受託番号が８６５５の菌株、受託番号が８６２４の菌株、受託番号が８６４５の菌株、受託番号が８５７２の菌株、受託番号が８５９６の菌株、受託番号が８６２８の菌株、受託番号が２５４０の菌株、受託番号が２５１２の菌株、受託番号が７０１４の菌株、受託番号が４４６９１の菌株、受託番号が２００５５３の菌株等として入手することができる。
【００２１】
自己免疫疾患の治療又は予防の効果の点から、ＮＢＲＣから入手可能な受託番号が１０２８７の菌株及び受託番号が０４３２の菌株を用いることが好ましい。
【００２２】
本明細書において、菌体との用語は、菌由来のものであればよく、例えば菌の抽出物、菌の粗画分等を含むことができる。抽出、精製方法は公知の方法を使用することができる。
【００２３】
本明細書において、薬学的に許容される担体との用語は、特に限定されず、例えば溶剤、コーティング剤、等張剤、吸収促進剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、着香剤、滑沢剤、結合剤、安定剤、保存剤等が挙げられる。これらの薬学的に許容される担体は、単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
かかる溶剤は特に限定されず、例えば水、植物油、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００２５】
コーティング剤として使用される担体としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、アミノアルキルメタクリレートコポリマー等が挙げられる。
【００２６】
等張剤は特に限定されず、例えば糖類、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、グリセリン、ソルビトールであってもよい。
【００２７】
吸収促進剤の例としては例えば第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２８】
賦形剤は、有機系賦形剤又は無機系賦形剤であり得る。有機系賦形剤は、例えば乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのようなデンプン誘導体、結晶セルロースのようなセルロース誘導体、アラビアゴム、デキストラン、プルラン等であってもよい。無機賦形剤は、例えば軽質無機ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムのようなケイ酸塩誘導体、リン酸水素カルシウムのようなリン酸塩、炭酸カルシウムのような炭酸塩、硫酸カルシウムのような硫酸塩等であってもよい。
【００２９】
ｐＨ調整剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、乳酸、クエン酸、酒石酸等周知なものを用いることができる。
【００３０】
抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、α−トコフェロール、トコトリエノール、ポリフェノール（フラボノイド、レスベラトロール等）、カロテノイド、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等が挙げられる。
【００３１】
崩壊剤は、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類等であってもよい。
【００３２】
着色剤は特に限定されず、例えば三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カラメル等を挙げることができる。
【００３３】
矯味矯臭剤は、例えば、通常使用される甘味料、高甘度甘味料、酸味料等であってもよい。
【００３４】
着香剤としては、例えばオレンジエキス、オレンジ油、オレンジエッセンス、スペアミント油、ハッカ油、バニラフレーバー、レモン油、ｌ−メントール、ピーチフレーバー、グレープフルーツフレーバー、ストロベリーエッセンス等を挙げることができる。
【００３５】
滑沢剤は、例えばステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩、タルク、コロイドシリカ、ビーガムのようなワックス類、アジピン酸、硫酸ナトリウムのような硫酸塩、グリコール、フマル酸、安息香酸ナトリウム、ＤＬ−ロイシン、脂肪酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩、無水ケイ酸、ケイ酸水和物のようなケイ酸類、デンプン誘導体等を挙げることができる。
【００３６】
結合剤は、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、アルファー化デンプン等を挙げることができる。
【００３７】
安定剤は、例えばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコールのようなアルコール類、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾールのようなクレゾール類、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸であることができる。
【００３８】
保存剤は例えば、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム等が挙げられる。
【００３９】
本明細書において、サプリメントとの用語は、健康の保持増進に役立つものを意味する。かかるサプリメントは、例えば保健機能食品、健康補助食品、健康食品、機能性食品、美容食品、栄養補助食品、栄養調整食品、特定保健用食品、栄養機能食品として知られるものである。
【００４０】
かかるサプリメントは、果汁、乳製品、小麦粉等食材を含んでもよく、また、サプリメントを製造する際に必要な成分を適宜の添加剤等として更に含んでもよい。かかる添加剤は例えば上記薬学的に許容される担体と同様なものであってもよい。サプリメントがこれらの食材及び／又は添加剤を含有する場合、その含有量は当業者が適宜決めることができる。
【００４１】
サプリメントの形態は特に限定されず、例えば粉末状、ゼリー状、液状、固形等の形態のサプリメントであることが好ましい。
【００４２】
固形サプリメントは特に限定されず、例えば錠剤、カプセル、軟カプセル、トローチ、ビスケット、シリアルバー、キャンディー（グミを含む）等が挙げられる。
【００４３】
液状のサプリメントは特に限定されず、例えば栄養ドリンク等が挙げられる。
【００４４】
本明細書における自己免疫疾患という用語は、免疫系の認識システムに異常が生じ、自己の抗原を非自己の抗原であるかのように認識して攻撃することにより発症する疾患を意味する。かかる自己免疫疾患は、例えば炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、全身性エリトマトーデス、ネフローゼ症候群、糸球体硬化症、多発性硬化症等が挙げられ、中でも炎症性腸疾患及び多発性硬化症であることが好ましい。
【００４５】
本発明の第一の実施形態は、キャンディダ  ケフィールを有効成分とする自己免疫疾患治療又は予防用組成物である。かかる組成物の投与又は摂取により、自己免疫疾患の症状を低減することができ、また、健常人又は疾患リスクのある人が自己免疫疾患を罹患する確率を下げることができる。
【００４６】
組成物中のキャンディダ  ケフィールの含有量は特に限定されず、組成物の形態、用途等に応じて当業者が適宜に決めることができる。
【００４７】
本実施形態の組成物に含まれるキャンディダ  ケフィールの形態は特に限定されず、生菌であってもよく、凍結乾燥された菌体、殺菌処理された菌体であってもよい。これらの形態の菌は単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。保存性の観点から、キャンディダ  ケフィールは、殺菌処理された菌体であることが好ましい。
【００４８】
かかる殺菌処理の方法は特に限定されず、例えば加熱殺菌方法、高圧殺菌方法、紫外線、ガンマ線及び電子線等の電磁波を用いた殺菌方法等が挙げられる。中でも簡便性の観点から、加熱殺菌方法が好ましい。
【００４９】
加熱殺菌方法の例として、例えば１００℃以下で３０分以上加熱する低温殺菌方法、１００℃の湿熱で加熱する高温殺菌、１２０℃の湿熱で加熱する超高温殺菌、高温高圧滅菌方法が挙げられる。中でも、簡便性及びコストの観点から、高温高圧滅菌方法が好ましい。
【００５０】
高温高圧滅菌は、例えばオートクレーブ等を用いて行うことができる。高温高熱滅菌方法を用いる場合の温度及び圧力は、組成物の成分、使用目的等によって当業者が適宜決めることができる。好ましくは、高温高圧滅菌は、温度が１１５℃〜１３５℃、圧力が２Ｐａ〜３Ｐａの条件で行われる。また、加熱時間も特に限定されないが、滅菌を充分に行なうため、１５分以上加熱することが好ましい。
【００５１】
殺菌処理を行う時期も特に限定されず、キャンディダ  ケフィールを殺菌処理してから他の成分と混合して組成物を調製してもよく、組成物を調製する過程で殺菌処理してもよく、組成物を調製してから殺菌処理してもよい。
【００５２】
本実施形態における組成物は、医薬組成物又はサプリメントであることができる。かかる医薬組成物又はサプリメントを摂取することにより、天然由来の成分を用いて自己免疫疾患を治療又は予防することができる。
【００５３】
上記の医薬組成物の形態は特に限定されず、内服薬、注射薬、点滴薬等の形態の医薬組成物であることが好ましい。かかる医薬組成物の効果的な投与量及び投与スケジュールは、投与方法、病状、患者の体重及び年齢等によって当業者が適宜に決定することができるが、成人（６０ｋｇ）に対する経口投与では０．１〜１００ｇ／日であることが好ましい。
【００５４】
上記医薬組成物の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００５５】
サプリメントの調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、サプリメントの効果的な摂取量は、当業者が適宜に決定することができるが、成人（６０ｋｇ）に対する経口投与では０．１〜１００ｇ／日であることが好ましい。
【００５６】
本発明の第二の実施形態は、殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物である。本実施形態によれば、安全性に優れる天然由来の成分を含有する医薬組成物が提供される。また、本実施形態におけるキャンディダ  ケフィールは、殺菌処理されており、保存性が一層優れるようになる。
【００５７】
本実施形態において、医薬組成物中のキャンディダ  ケフィールの含有量は特に限定されず、治療・予防対象となる病気等により当業者が適宜決めることができる。
【００５８】
上記医薬組成物の形態は特に限定されず、内服薬、注射薬、点滴薬等の形態の医薬組成物であることが好ましい。かかる医薬組成物の効果的な投与量及び投与スケジュールは、投与方法、病状、患者の体重、年齢等によって当業者が適宜に決定することができる。
【００５９】
本実施形態における医薬組成物の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００６０】
本発明の第三の実施形態は、殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体を含有するサプリメント又は食品である。
【００６１】
キャンディダ  ケフィールは、ケフィアに含まれる酵母の一種であるが、ケフィアは、生きている状態の乳酸菌及び酵母を腸内に届けることにより腸機能の改善作用を有する。一方、本実施形態におけるサプリメント又は食品に含まれるキャンディダ  ケフィールは、殺菌処理された菌体である。本実施形態によれば、自己免疫疾患の症状を改善でき、安全性及び保存性に優れる天然由来の成分を含有するサプリメント又は食品が提供される。
【００６２】
本実施形態のサプリメント又は食品中の殺菌処理されたキャンディダ  ケフィールの菌体の含有量は特に限定されず、当業者が用途に応じて適宜に決定することができる。
【００６３】
本実施形態におけるサプリメントの調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、かかるサプリメントの効果的な摂取量は、目的に応じて当業者が適宜に決定することができるが、成人（６０ｋｇ）に対する経口投与では０．１〜１００ｇ／日であることが好ましい。
【００６４】
かかる食品は、果汁、乳製品、小麦粉等他の食材を含んでもよく、また、食品衛生法で許可される添加剤等を適宜に含んでもよい。かかる添加剤は例えば上記薬学的に許容される担体と同様なものであってもよく、その添加量は当業者が適宜決めることができる。
【００６５】
本実施形態における食品の形態は特に限定されず、固形食品であってもよく、飲料であってもよい。
【００６６】
固形食品は特に限定されず、例えばビスケット、クッキー、チップス、キャンディ、ショートブレッド、ウェハース、せんべい、ふりかけ等が挙げられる。
【００６７】
飲料は特に限定されず、例えばジュース、液状ヨーグルト、お茶、コーヒー、牛乳、アルコール飲料、清涼飲料、発酵乳、豆乳飲料等が挙げられる。
【００６８】
本実施形態における食品はまた、調味料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、豆腐、豆乳ヨーグルト、豆乳プリン等であってもよい。
【００６９】
本実施形態における食品の製造方法は特に限定されず、当業者が適宜に決めることができる。
【００７０】
第二及び第三の実施形態におけるキャンディダ  ケフィールの殺菌処理の方法は、第一の実施形態で説明したとおりである。
【実施例】
【００７１】
（実施例１  多発性硬化症モデルマウスに対するキャンディダ  ケフィールの投与効果）
自己免疫疾患の１つである多発性硬化症に対するキャンディダ  ケフィールの投与効果を確認するために、多発性硬化症モデルマウスであるＥＡＥモデルマウスでインビボ実験を行った。
【００７２】
［菌体の調製］
キャンディダ  ケフィールは、ＮＢＲＣ（受託番号：１０２８７）からＬ−乾燥標品として入手した。菌を指定された条件で培養して集菌した後、凍結乾燥した。乾燥した菌は、１００ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で懸濁し、菌液を得た。菌液は温度１２０℃、圧力２Ｐａにて２０分間オートクレーブで加熱殺菌処理した。殺菌処理された菌体は、各５ｍＬで投与用のサンプルとしてストックし、使用する直前まで−８０℃で保存した。
【００７３】
サッカロマイセス  セレビシエは、ＮＢＲＣ（受託番号：２０４４）からＬ−乾燥標品として入手して指定された条件で培養した。集菌した後、キャンディダ  ケフィール菌体と同様に殺菌処理された菌体のサンプルストックを調製し、使用する直前まで−８０℃で保存した。
【００７４】
アスペルギルス  オリーゼは、ＮＢＲＣ（受託番号：３０１１３）からＬ−乾燥標品として入手し、米で培養した。アスペルギルス  オリーゼの胞子は、米での培養後、乾燥させてメッシュで篩分けをすることで得た。胞子を集めた後、キャンディダ  ケフィール菌体と同様に殺菌処理された菌体のサンプルストックを調製し、使用する直前まで−８０℃で保存した。
【００７５】
アスペルギルス  オリーゼ菌糸体は、ＮＢＲＣ（受託番号：３０１１３）からＬ−乾燥標品として入手し、指定された液体培地で培養した。集菌後凍結乾燥した。乾燥した菌は、１００ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で懸濁後、超音波処理を行い、菌液を得た。菌液は温度１２０℃、圧力２Ｐａにて２０分間オートクレーブで加熱殺菌処理した。殺菌処理された菌体は、使用する直前まで−８０℃で保存した。
【００７６】
［菌体の投与］
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、日本チャールス・リバー社から入手）を菌体投与群（各ｎ＝５）と、対象群（ｎ＝４）とに分けた。各々の菌体のサンプルストックを最終濃度０．８ｍｇ／ｍＬになるように再蒸留水で懸濁し、給水ボトルに入れた。各菌体投与群のマウスには、各菌体を含む水を、多発性硬化症を惹起する２週間前から実験終了まで自由引水させた。対象群には、脱イオン水を自由引水させた。
【００７７】
［多発性硬化症の惹起］
１００ｍｇＭＯＧ（ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の第３５〜５５アミノ酸からなるペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＰＶＶＨＬＹＲＮＧＫ、配列番号１）と、２００ｍｇ殺菌、乾燥されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ無毒株を含む完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手）とでエマルジョンを作成した。菌体を投与開始してから２週間後、マウスに上記エマルジョンを皮下注射して免疫し、この時点を０日目とした。
【００７８】
さらに、０日目及び２０日目に、２００ｍｇＰｅｒｔｕｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ（Ｌｉｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を腹腔内注射した。
【００７９】
［多発性硬化症の症状の評価］
菌体投与群及び対照群の症状を表１の基準で連日評価し、臨床スコアを統計解析して平均値を算出した。また、ｐ値は、各マウスのそれぞれの日における臨床スコアを用いて、対照群に対してＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔを用いて算出した。結果を図１〜図３に示している。なお、アスペルギルス  オリーゼ菌糸体投与群において、多発性硬化症を惹起してから１０日目に１匹の死亡が確認された。また、アスペルギルス  オリーゼ胞子投与群及びサッカロマイセス  セレビシエ菌体投与群において、多発性硬化症を惹起してから２０日目にそれぞれ１匹の死亡が確認された。
【００８０】
【表１】
2014172823.tif 000002
【００８１】
図１で示されているように、サッカロマイセス  セレビシエ菌体の投与は、有意に多発性硬化症の症状を悪化させている。また、図２で示されているように、アスペルギルス  オリーゼの胞子及び菌糸体の投与は、多発性硬化症の症状に有意な変化をもたらさなかった。一方、図３で示されているように、キャンディダ  ケフィール菌体の投与は、多発性硬化症の症状に有意な改善をもたらした。なお、ＮＢＲＣから入手した受託番号０４３２についても多発性硬化症の症状の有意な改善を確認している。
【００８２】
（実施例２  炎症性腸疾患モデルマウスに対するキャンディダ  ケフィールの投与効果）
自己免疫疾患の１つである炎症性腸疾患に対するキャンディダ  ケフィールの投与効果を確認するために、炎症性腸疾患のモデルマウスである慢性マウスＤＳＳ大腸炎モデルを用いてインビボ実験を行った。
【００８３】
［菌体の調製］
ＮＢＲＣから、キャンディダ  ケフィール（受託番号：１０２８７）、キャンディダ  ヴァリダ（受託番号：１０３１８、）、キャンディダ  ベルサチリス（受託番号：１００５６）及びサッカロマイセス  セレビシエ（受託番号：２０４４）を入手し、指定された方法で培養して集菌し、凍結乾燥した。
【００８４】
所定量の菌を秤量し、１００ｍｇ／ｍＬとなるようにＭｉｌｉＱ水に懸濁し、菌液を得た。菌液は、温度１２１℃、気圧２Ｐａにて１５分間オートクレーブで加熱殺菌処理した。
【００８５】
［ＤＳＳ水溶液の調製］
ＤＳＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）は、マウスに投与する当日に、最終濃度３．１重量／体積％となるようにろ過水に溶解した。
【００８６】
［ＦＫ５０６投与液の調製］
ＦＫ５０６免疫抑制剤は、炎症性腸疾患に効果があると知られており、本実施例ではポジティブコントロールとして用いた。
【００８７】
ＦＫ５０６投与液は、所定のＦＫ５０６（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を秤量し、２ｍｇ／ｍＬとなるように０．５％メチルセルロース水溶液（Ｗａｋｏ社製）に懸濁することで調製した。
【００８８】
［菌体の投与］
９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、日本チャールスリバー株式会社から入手）を各菌体投与群（各ｎ＝１０）並びにＦＫ５０６投与群、対象群（各ｎ＝１０）及び正常群（ｎ＝５）に分けた。各々の菌体は最終濃度０．８ｍｇ／ｍＬになるようにろ過水で懸濁され、給水ボトルに入れた。各菌体投与群のマウスには、各菌体を含む水を、炎症性腸疾患を誘発する２週間前から１４日間自由飲水させて投与した。ＦＫ５０６投与群、対象群及び正常群は、炎症性腸疾患を誘発する２週間前から１４日間水道水を自由飲水させた。ＦＫ５０６投与群には、ＤＳＳ飲水の開始３日目から解剖日の前日（１６日間）まで体重１ｋｇ当たり１０ｍｇのＦＫ５０６投与液を、ディスポーザブル経口ゾンデを用いて経口投与した。
【００８９】
［炎症性腸疾患の誘発］
各菌体投与群、ＦＫ５０６投与群及び対照群を、３．１％ＤＳＳ水溶液を５日間自由飲水させた後、水道水を自由飲水させた。水道水飲水を１４日間継続することにより、炎症性腸疾患を誘発した。各菌体投与群には、ＤＳＳ飲水を開始してから菌体の投与を行わなかった。一方、正常群にはＤＳＳ水溶液を飲水させず、実験終了時まで水道水を自由飲水させた。また、実験終了時まで、マウスの一般状態観察を毎日行い、体重を測定し、初期体重に対する割合の平均値を算出した。結果（体重曲線）を図４で示している。水道水飲水開始から１４日後に、主要評価項目として腸管相対湿重量を、副次評価項目として腸管長及び体重曲線を用いて、各投与群、対照群及び正常群の評価を行った。
【００９０】
キャンディダ  ケフィール菌体投与群の体重減少は、対照群に比べて有意に抑制された。一方、他のキャンディダ属菌体投与群には、このような効果が見られなかった。
【００９１】
［腸管長の測定］
水道水飲水開始から１４日後に、マウスをエーテル軽麻酔下で開腹し、腹部の大静脈を切断することにより放血死させた。大腸全体を直ちに摘出し、デジタルノギス（ミツトヨ社製）で大腸全長を測定して統計解析し、平均値及び標準誤差値を算出した。また、ｐ値は、対照群に対してＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔを用いて算出した。結果を表２及び図５で示している。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
キャンディダ  ケフィール菌体の投与群には、有意な腸管長の短縮抑制作用が認められた。一方、他のキャンディダ属及びサッカロマイセス  セレビシエ菌体投与群にはこのような作用を確認することができなかった。
【００９４】
［腸管相対湿重量の算出方法］
大腸全体を摘出して大腸全長を測定した後、大腸に付着した結合組織を除去し、結腸を切開して生理食塩水で洗浄した。水分を軽く拭き取った後、腸管湿重量を電子天秤（メトラー社製）で測定した。また、腸管相対湿重量、すなわち腸管１ｃｍあたりの重量を、腸管長に対する腸管湿重量の割合として算出し、統計解析して平均値及び標準誤差値を算出した。また、ｐ値は、対照群に対してＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔを用いて算出した。結果を表３及び図６で示している。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
キャンディダ  ケフィール菌体投与群は、腸管相対湿重量の有意な低下を示した。一方、このような作用は他のキャンディダ属及びサッカロマイセス  セレビシエ菌体投与群では認められなかった。
【００９７】
以上より、キャンディダ  ケフィールは、自己免疫疾患の症状を改善する効果を有することが認められた。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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