(57)【要約】【課題】耐光性・発光性に優れ、かつ、生体に悪影響を与えることがない安全性に優れた活性酸素検出用プローブを提供すること。【解決手段】活性酸素検出用プローブは、単層又は多層のグラフェンナノシートからなり、シートの端部にアームチェア型端面部を含むシート部と、前記アームチェア型端面部と１辺のみを共有して結合している末端６員環と、前記シート部及び／又は前記末端６員環を構成する炭素原子に結合しているアミノ基とを備えたグラフェン構造体からなる。活性酸素検出用プローブは、生体内における次亜塩素酸イオンの検出に用いることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単層又は多層のグラフェンナノシートからなり、シートの端部にアームチェア型端面部を含むシート部と、
前記アームチェア型端面部と１辺のみを共有して結合している末端６員環と、
前記シート部及び／又は前記末端６員環を構成する炭素原子に結合しているアミノ基と
を備えたグラフェン構造体からなる活性酸素検出用プローブ。
【請求項２】
次亜塩素酸イオンの検出に用いられる請求項１に記載の活性酸素検出用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素検出用プローブに関し、さらに詳しくは、生体内における活性酸素種の特異的測定に有用な活性酸素検出用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種による細胞やその集合体である組織、あるいは各種生理活性分子などに対する障害は、様々な生体反応や疾病に関与していると考えられている。例えば、次亜塩素酸イオンは、生体内で作用する活性酸素種の１つであり、生体内で好中球が貪食される際に生成し、生体防御機構としての重要な役割を果たしていることが分かっている。このような活性酸素種の生体内での動態を解明するときには、生きたままの状態で細胞や組織中の局所的に生成した次亜塩素酸イオン、あるいはパーオキシナイトライトやヒドロキシラジカルなどの活性酸素種を高感度に検出することが必要である。
【０００３】
従来、活性酸素種を測定する手法として蛍光イメージング法が提案され、生体内でパーオキシナイトライト及びヒドロキシラジカルなどの活性酸素種を測定可能な蛍光プローブの開発が行われている。例えば、活性酸素種を測定する蛍光プローブとしては、フルオレセインやローダミンのジヒドロ体であるジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）やジヒドロローダミン（ＤＨＲ）などが知られている。これらの化合物は、活性酸素によって酸化されるとフルオレセインやローダミンに変換されることで蛍光を発し、活性酸素種の発生を可視化して検出するものである。
【０００４】
さらに、近年、特定の活性酸素種に特異的に反応する蛍光プローブが報告されている。例えば、トリフェニルホスフィンのベンゼン環の１つを蛍光色素で置換した蛍光プローブが、過酸化物（・ＯＨ）を特異的に検出できることが報告されている（特許文献１参照）。また、ローダミン類似化合物を用いることで、次亜塩素酸イオン（ＣｌＯ-）を選択的に検出できることが報告されている（特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの蛍光プローブは有機蛍光色素を使用したものであり、有機蛍光色素は光照射時の劣化が激しく寿命が短い。そのため、生体内で生成した活性酸素種の経時変化を測定するのは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３２１２６２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００７／１０００６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、耐光性・発光性に優れ、かつ、生体に悪影響を与えることがない安全性に優れた活性酸素検出用プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明に係る蛍光プローブは、
単層又は多層のグラフェンナノシートからなり、シートの端部にアームチェア型端面部を含むシート部と、
前記アームチェア型端面部と１辺のみを共有して結合している末端６員環と、
前記シート部及び／又は前記末端６員環を構成する炭素原子に結合しているアミノ基と
を備えたグラフェン構造体からなることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００９】
次亜塩素酸イオンは生体内で作用する活性酸素種の１つであり、生体内で好中球が貪食される際に生成する。アミノ基終端のグラフェン構造体は、例えば生体内に投与された場合、白血球などの好中球に蓄積される。蓄積されたグラフェン構造体の末端に修飾されたアミノ基は、好中球が貪食される際に生成する次亜塩素酸イオンによりニトロ基に変換される。ニトロ基に変換したグラフェン構造体は、電子構造の変化から発光色が緑色から青色に変換する。その結果、好中球の貪食過程で生成する次亜塩素酸イオンを発光色の変化により検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１（ａ）は、アームチェア型端面構造の模式図である。図１（ｂ）は、ジグザグ型端面構造の模式図である。
【図２】アミノ基終端のグラフェン構造体の次亜塩素酸イオンによる構造変化の模式図である。
【図３】グラフェン構造体の質量スペクトルである。
【図４】グラフェン構造体分散液（図４（ａ））と、次亜塩素酸ナトリウムを添加したグラフェン構造体分散液（図４（ｂ））の蛍光スペクトルを示す図である。挿入した写真は、発光色の様子を示している。
【図５】次亜塩素酸ナトリウムを添加した後の次亜塩素酸イオンによるグラフェン構造体分散液の蛍光強度の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施の形態について詳細に説明する。
［１．  活性酸素検出用プローブ］
本発明に係る活性酸素検出用プローブは、
単層又は多層のグラフェンナノシートからなり、シートの端部にアームチェア型端面部を含むシート部と、
前記アームチェア型端面部と１辺のみを共有して結合している末端６員環と、
前記シート部及び／又は前記末端６員環を構成する炭素原子に結合しているアミノ基と
を備えたグラフェン構造体からなる。
【００１２】
［１．１．  グラフェン構造体］
本発明において、「グラフェン構造体」とは、シート部と、末端６員環と、アミノ基とを備えているものをいう。
【００１３】
［１．１．１．  グラフェン構造体の構成］
［Ａ．  シート部］
本発明において「シート部」とは、単層又は多層のグラフェンナノシートからなり、シートの端部にアームチェア型端面部（図１（ａ）参照）を含むものをいう。シート部の端部は、アームチェア型端面部のみからなるものが望ましいが、一部にジグザグ型端面部（図１（ｂ）参照）を含んでいても良い。
また、本発明において「シート部」というときは、グラフェンナノシートを構成する６員環の内、１辺を介してアームチェア型端面部に結合している末端６員環（図１（ａ）中、点線で表示）は含まれない。
シート部は、単層のグラフェンナノシートからなるものでも良く、あるいは、多層のグラフェンナノシートからなるものでも良い。
【００１４】
本発明において「グラフェンナノシート」とは、炭素の環構造及びｓｐ2結合性の芳香環で構成された２次元のシート状構造を有するものをいう。グラフェンナノシートは、不可避的不純物としての窒素を０．５ｗｔ％未満含有しているもの（狭義の「グラフェンナノシート」）でも良く、あるいは、窒素を０．５ｗｔ％以上含有しているもの（窒素含有グラフェンナノシート）でも良い。
発光（ＰＬ）特性を示すためには、グラフェンナノシートは、ｓｐ3型の混成軌道をもつ炭素からなる絶縁性のマトリックス（ｓｐ3マトリックス）中に、ｓｐ2型の混成軌道をもつ炭素からなる微細なクラスター（ｓｐ2クラスター）が埋め込まれた構造を備えている必要があると考えられている。すなわち、ＰＬ特性を示すグラフェンナノシートにおいて、ｓｐ2クラスターは、発光中心として機能すると考えられている。
【００１５】
本発明において「窒素含有グラフェンナノシート」とは、グラフェンナノシートに意図的に窒素が導入されたものであって、窒素含有量が０．５ｗｔ％以上であるものをいう。
本発明において、「窒素が導入されている」とは、
（１）グラフェンナノシートを構成する炭素の一部が窒素で置換されていること、
（２）グラフェンナノシートのエッジ（末端６員環と共有している辺上の原子を含む）及び／又は基底面に窒素含有官能基が結合していること、又は、
（３）グラフェンナノシートの表面又はシート間に窒素含有化合物が吸着していること、
をいう。
グラフェンナノシートに導入された窒素は、置換、結合又は吸着のいずれか１種の形態で存在していても良く、あるいは、２種以上の形態で存在していても良い。
窒素含有官能基及び窒素含有化合物については、後述する。
【００１６】
［Ｂ．  末端６員環］
本発明において「末端６員環」とは、シート部のアームチェア型端面部と１辺のみを共有して結合している炭素６員環をいう。
図１（ａ）に、アームチェア型端面部に結合している末端６員環を示す。図１（ａ）中、シート部は実線で表され、末端６員環は破線で表されている。高い発光特性を得るためには、１個のシート部に含まれる末端６員環の数は、多いほど良い。
【００１７】
［Ｃ．  アミノ基］
上述したように、グラフェン構造体は、さらにアミノ基（−ＮＨ2）を含んでいる。アミノ基は、グラフェン構造体を構成する炭素原子（すなわち、シート部及び／又は末端６員環を構成する炭素原子）に結合する形態で含まれている。
すなわち、本発明に係るグラフェン構造体は、
（ａ）末端６員環を構成する炭素原子の内、アームチェア型端面部と結合していない炭素原子、及び、
（ｂ）シート部を構成する炭素原子（末端６員環と共有している辺上の炭素原子を含む）
から選ばれるいずれか１以上の炭素原子に結合しているアミノ基（−ＮＨ2）を備えている。
【００１８】
末端６員環又はシート部は、１つのアミノ基が結合しているものでも良く、あるいは、２つ以上が結合しているものでも良い。また、末端６員環にアミノ基が結合している場合、末端６員環の一部にアミノ基が結合していても良く、あるいは、すべての末端６員環にアミノ基が結合していても良い。
【００１９】
本発明において「窒素含有官能基」とは、窒素を構成元素として含む官能基をいう。窒素含有官能基としては、例えば、アミノ基、イミノ基、Ｎ−オキシド基、Ｎ−ヒドロキシ基、ヒドラジン基、ニトロ基、アゾ基、ジアゾ基、アジド基などがある。
グラフェン構造体は、アミノ基以外の窒素含有官能基を含むこともできる。しかしながら、活性酸素種を高感度で検出するためには、アミノ基以外の窒素含有官能基は、少ないほど良い。
【００２０】
［１．１．２．  窒素含有量］
グラフェン構造体に含まれる窒素含有量は、発光効率及び発光波長に影響を与える。一般に、窒素含有量が多くなるほど、発光波長の変化量が大きくなる。このような効果を得るためには、窒素含有量は、０．５ｗｔ％以上が好ましい。窒素含有量は、さらに好ましくは１ｗｔ％以上、さらに好ましくは２ｗｔ％以上、さらに好ましくは５ｗｔ％以上である。
一方、窒素含有量が多くなりすぎると、電子状態が大幅に変化し、ＰＬ特性が得られない。従って、窒素含有量は、５０ｗｔ％以下が好ましい。窒素含有量は、さらに好ましくは４０ｗｔ％以下、さらに好ましくは３０ｗｔ％以下、さらに好ましくは２０ｗｔ％以下、さらに好ましくは１０ｗｔ％以下である。
【００２１】
［１．１．３．  平均質量］
グラフェン構造体の平均質量は、発光効率及び発光波長に影響を与える。
ここで、「平均質量」とは、質量スペクトルを測定することにより得られる単位電荷当たりのグラフェン構造体の質量の平均値をいう。平均質量とグラフェン構造体のサイズには相関があり、平均質量が小さくなるほど、グラフェン構造体のサイズが小さくなることを表す。
一般に、グラフェン構造体のサイズが小さくなるほど、量子サイズ効果により、発光波長は短くなる。可視光領域で発光させるためには、グラフェン構造体の平均質量は、５００ｍ／ｚ以上が好ましい。平均質量は、さらに好ましくは、１０００ｍ／ｚ以上である。
一方、グラフェン構造体のサイズが大きくなりすぎると、可視光領域で発光しなかったり、あるいは、発光中心からの蛍光がシートに再吸収される、いわゆる「消光」が起こるため、発光効率が低下する。従って、グラフェン構造体の平均質量は、５００００ｍ／ｚ以下が好ましい。
【００２２】
［１．１．４．  平均厚さ］
グラフェン構造体の厚さ（すなわち、シート部の積層数）は、発光効率及び発光波長に影響を与える。
シート部が単層であっても、蛍光体として機能する。単層のグラフェンナノシートの厚さは、約０．３ｎｍである。すなわち、グラフェン構造体の平均厚さは、０．３ｎｍ以上であれば良い。
【００２３】
グラフェン構造体の厚さが厚くなるほど、発光波長が長くなる。これは、ｓｐ2クラスターのシート積層方向のサイズが大きくなることにより、π−π*エネルギーギャップが小さくなるためと考えられる。
しかしながら、グラフェン構造体の厚さが厚くなりすぎると、電子構造がバルクに近づくため、効率的な発光が得られない。従って、グラフェン構造体の平均厚さは、５０ｎｍ以下が好ましい。平均厚さは、さらに好ましくは、２０ｎｍ以下、さらに好ましくは、１０ｎｍ以下である。
【００２４】
ここで、「グラフェン構造体の平均厚さ」とは、無作為に選んだｎ個（ｎ≧５）のグラフェン構造体の厚さの平均値をいう。
厚さの測定方法としては、
（１）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いてシートの厚さを直接測定する方法、
（２）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真や電子線回折像から求められるシート１層分の厚みを考慮して厚さを求める方法、
などがある。いずれの方法を用いても、ほぼ同等の結果が得られる。
【００２５】
［１．１．５．  発光効率］
本発明に係るグラフェン構造体は、１％以上の発光効率を示す。平均厚さ（シート部の層数）、平均サイズ、窒素含有量などを最適化すると、発光効率は、さらに増大する。具体的には、これらを最適化することによって、グラフェン構造体の発光効率は、７％以上、１０％以上、１５％以上、あるいは、２０％以上となる。
ここで、「発光効率」とは、吸収された光子数に対する蛍光として発光される光子数の割合をいう。
【００２６】
［１．２．  活性酸素検出用プローブの用途］
本発明に係る活性酸素検出用プローブは、アミノ基が結合しているグラフェン構造体からなるので、生体内における活性酸素種（特に、次亜塩素酸イオン）の特異的測定に有用である。
【００２７】
［２．  活性酸素検出用プローブの製造方法］
本発明に係る活性酸素検出用プローブは、
窒素含有化合物を溶解させた水溶液に酸化グラファイト又はグラフェン酸化物を分散させ（分散工程）、
前記水溶液を６０℃以上で加熱する（加熱工程）
ことにより製造することができる。
【００２８】
［２．１．  分散工程］
［Ａ．  窒素含有化合物］
「窒素含有化合物」とは、窒素を構成元素として含む化合物であって、水に溶解又は分散可能なものをいう。
窒素含有化合物としては、例えば、
（１）尿素、アンモニア、チオ尿素、ヒドラジン、硝酸エステル、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、ピリジンＮ−オキシド、Ｎ−ヒドロキシルアルキレンイミン、アジ化ナトリウム、ナトリウムアミド、カルボン酸アジド、
（２）メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミンなどのアルキルアミンやそのハロゲン酸塩、
（３）エチレンジアミン、プロパンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ポリエチレングリコールビスアミンなどのジアミン類、
などがある。
【００２９】
本発明においては、シート部及び／又は末端６員環にアミノ基を導入する必要がある。そのためには、窒素含有化合物として、アミノ基を生成可能なものを用いる必要がある。
アミノ基を生成可能な窒素含有化合物としては、例えば、尿素、アンモニア、ヒドラジン、メチルアミン、ジメチルアミンなどがある。
出発原料には、いずれか１種の窒素含有化合物を用いても良く、あるいは、２種以上を組み合わせて用いても良い。
【００３０】
窒素含有化合物は、水に溶解又は分散させた水溶液の状態で使用される。水溶液に含まれる窒素含有化合物の濃度は、特に限定されるものではなく、出発原料の種類や要求される特性などに応じて最適な濃度を選択すれば良い。窒素含有化合物の濃度は、通常、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌである。
【００３１】
［Ｂ．  酸化グラファイト及びグラフェン酸化物］
「酸化グラファイト」とは、グラファイトを構成するグラフェン層のエッジ及び／又は基底面上に酸素含有官能基（例えば、−ＣＯＯＨ基、−ＯＨ基、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−基など）が結合しているものをいう。酸化グラファイトは、例えば、強酸（濃硫酸）中で酸化剤（過マンガン酸カリウム、硝酸カリウムなど）を用いてグラファイトを酸化させることにより得られる。原料として使用するグラファイトは、ラマンスペクトルにおいてＤ／Ｇ面積比が０．１０以上であるものが好ましい。
「グラフェン酸化物」とは、酸化グラファイトの層間を剥離させることにより得られるシート状物質をいう。グラフェン酸化物は、例えば、酸化グラファイトを水溶液中に分散させ、超音波を照射することにより得られる。
本発明において、出発原料には、層間剥離を行う前の酸化グラファイト又は層間剥離させたグラフェン酸化物のいずれか一方を用いても良く、あるいは、双方を用いても良い。
【００３２】
酸化グラファイト及び／又はグラフェン酸化物は、窒素含有化合物を含む水溶液に添加される。水溶液に含まれる酸化グラファイト及び／又はグラフェン酸化物の量は、特に限定されるものではなく、出発原料の種類や要求される特性などに応じて最適な量を選択すれば良い。酸化グラファイト及び／又はグラフェン酸化物の量は、通常、０．１〜５０ｇ／Ｌである。
【００３３】
［２．２．  加熱工程］
窒素含有化合物を分散させた水溶液に酸化グラファイト及び／又はグラフェン酸化物を分散させた後、水溶液を加熱する。加熱は、反応速度を速くするために行う。加熱温度が水溶液の沸点を超える場合、加熱は、密閉容器内で行う。
加熱温度が低すぎると、現実的な時間内に反応が十分進行しない。従って、加熱温度は、６０℃以上である必要がある。加熱温度は、さらに好ましくは、７０℃以上、さらに好ましくは、８０℃以上である。
一方、加熱温度が高くなりすぎると、置換や結合した窒素が脱離するおそれがある。また、高価な耐圧容器が必要となり、製造コストが増大する。従って、加熱温度は、２００℃以下が好ましい。加熱温度は、さらに好ましくは、１８０℃以下、さらに好ましくは、１６０℃以下である。
【００３４】
加熱時間は、加熱温度に応じて、最適な時間を選択する。一般に、加熱温度が高くなるほど、短時間で反応を進行させることができる。加熱時間は、通常、１〜２０時間である。
加熱条件を最適化すると、グラフェン構造体の窒素含有量、平均厚さ、及び、平均サイズを制御できる。一般に、加熱温度が高くなるほど、及び／又は、加熱時間が長くなるほど、窒素含有量が減少し、平均厚さが薄くなり、あるいは、平均サイズが小さくなる。
得られたグラフェン構造体は、そのまま活性酸素種の検出に供しても良く、あるいは、必要に応じて、洗浄、ろ過及び／又は透析を行っても良い。
【００３５】
［３．  活性酸素検出用プローブの作用］
図２に、アミノ基終端のグラフェン構造体の次亜塩素酸イオンによる構造変化の模式図を示す。アミノ基終端のグラフェン構造体は、例えば生体内に投与された場合、白血球などの好中球に蓄積される。蓄積されたグラフェン構造体の末端に修飾されたアミノ基は、好中球が貪食される際に生成する次亜塩素酸イオンによりニトロ基に変換される。ニトロ基に変換したグラフェン構造体は、電子構造の変化から発光色が緑色から青色に変換する。その結果、好中球の貪食過程で生成する次亜塩素酸イオンを発光色の変化により検出することができる。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
［１．  活性酸素検出用プローブの作製］
０．１ｇの酸化グラファイトを０．２ｍｏｌ／Ｌの尿素溶液：５ｍＬに分散させた。得られた混合溶液を密閉容器中、９０℃×１０時間で加熱した。加熱後、過剰なアンモニアを除去し、遠心分離によりグラフェン構造体を濃縮分離した。濃縮分離後、リン酸緩衝液を加え、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。
【００３７】
［２．  試験方法］
［２．１．  質量分析、窒素含有量］
グラフェン構造体について、飛行時間型質量分析計を用いた質量分析、及び、Ｘ線光電子分光計を用いた窒素含有量の測定を行った。
【００３８】
［２．２．  蛍光測定、発光効率］
分光蛍光光度計（ＦＰ−６５００、日本分光（株）製）を用いて、グラフェン構造体分散液の蛍光スペクトル及び蛍光強度の経時変化を測定した。
また、絶対蛍光量子収率測定装置（Ｃ９９２０−０２、浜松ホトニクス（株）製）を用いて、発光効率を測定した。
［２．３．  次亜塩素酸イオンに対するグラフェン構造体の反応性の評価］
次亜塩素酸イオンは、水溶液に次亜塩素酸ナトリウムを添加することで生成することができる。５ｍＬのグラフェン構造体分散液に１ｍＭの次亜塩素酸ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ添加した後の、蛍光波長４５０ｎｍ（励起波長３５０ｎｍ）での蛍光強度の経時変化を測定することで次亜塩素酸イオンとグラフェン構造体の反応性を評価した。
【００３９】
［３．  結果］
［３．１．  質量分析、窒素含有量］
図３に、実施例１で得られたグラフェン構造体の質量スペクトルを示す。図３より、平均質量１４８３ｍ／ｚのグラフェン構造体が生成していることがわかる。スペクトルは質量数７４の繰り返しの規則的なパターンであり、グラフェン構造体のアームチェア型端面部に辺を共有して炭素６員環が結合していることを示している。また、グラフェン構造体の窒素含有量は、約１４ｗｔ％であった。
【００４０】
［３．２．  蛍光測定、発光効率］
図４に、グラフェン構造体分散液（図４（ａ））と、次亜塩素酸ナトリウムを添加したグラフェン構造体分散液（図４（ｂ））の蛍光スペクトルを示す。挿入した写真は、発光色の様子を示している。
次亜塩素酸ナトリウムを添加していないグラフェン構造体分散液は、５２０ｎｍに蛍光スペクトルの最大波長を有している（発光効率：約２０％）。一方、次亜塩素酸イオンとの反応により、発光波長は４５０ｎｍに変換した。
【００４１】
［３．３．  反応性の評価］
図５に、次亜塩素酸ナトリウムを添加した後の次亜塩素酸イオンによるグラフェン構造体分散液の蛍光強度（波長：４５０ｎｍ）の経時変化を示す。次亜塩素酸ナトリウムを添加していないグラフェン構造体分散液（ブランク）の蛍光強度に変化は見られない。一方、次亜塩素酸ナトリウムの添加によってグラフェン構造体分散液の蛍光強度が時間と共に増加した。これらの結果は、本発明に係るグラフェン構造体が活性酸素種を測定するプローブとして機能していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る活性酸素検出用プローブは、生体内における次亜塩素酸イオンの検出に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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