(57)【要約】【課題】従来のイムノクロマト法よりも高感度にてインフルエンザウイルスを検出しかつ検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを知ることができる技術を開発する。【解決手段】ノイラミニダーゼ活性阻害剤をＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼと組み合わせて生体外にて用いることによって、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する技術を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程；
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに
第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程
を包含する、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、被験体サンプルとインキュベートする工程；
インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程；ならびに
第二の発光量を、前記第一の発光量および前記コントロール発光量と比較する工程
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗インフルエンザ抗体を、被験体サンプルと接触させる工程；
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、それぞれインキュベートする工程；
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに
第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程
を包含する、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、前記被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、インキュベートする工程；
インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程；ならびに
第二の発光量を、前記第一の発光量および前記コントロール発光量と比較する工程
を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤が、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ前記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものである、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７】
前記ルシフェラーゼが、下記〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕または〔ＩＩＩ〕のアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
〔Ｉ〕配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列において下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも１つの置換が生じたアミノ酸配列：
（ａ）４２３位のイソロイシンの、ロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンへの置換；
（ｂ）４３６位のアスパラギン酸の、グリシン、アラニンもしくはセリンへの置換；または
（ｃ）５３０位のロイシンの、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンへの置換、
〔ＩＩ〕配列番号３に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３に示されるアミノ酸配列において下記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の少なくとも１つの置換が生じたアミノ酸配列；
（ｄ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；
（ｅ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または
（ｆ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換、
〔ＩＩＩ〕配列番号５に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号５に示されるアミノ酸配列において下記（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の少なくとも１つの置換が生じたアミノ酸配列；
（ｇ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；
（ｈ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または
（ｉ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換。
【請求項８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬と、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とを備えている、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するためのキット。
【請求項９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬をさらに備えている、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
抗インフルエンザ抗体をさらに備えている、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための組成物。
【請求項１２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬、ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程；
インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量、インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに
第一の発光量、第二の発光量及びコントロール発光量をそれぞれ比較する工程
を包含する、インフルエンザウイルスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスを診断および治療する技術に関するものであり、より詳細には、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはコア蛋白質（核蛋白（ＮＰ蛋白）および膜蛋白（Ｍ１蛋白））の抗原性に基づき分類され、現在では、インフルエンザＡ、ＢおよびＣの３つの型があることが明らかになっている。
【０００３】
Ａ型インフルエンザウイルスは、さらに、ウイルス粒子の２種類の表面糖蛋白であるヘマグルチニン（Hemagglutinin（ＨＡ）、以下、適宜ＨＡと略記する。）とノイラミニダーゼ（Neuraminidase（ＮＡ）、以下、適宜ＮＡと略記する。）との抗原性に基づいて、ＨＡでＨ１〜Ｈ１６、ＮＡでＮ１〜Ｎ９の亜型に分類される。ＨＡは、ヒト等の細胞に吸着および侵入する際に、細胞表面に存在するシアル酸と結合して、インフルエンザウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときの重要な役割を果たしている。一方、ＮＡは、ウイルス粒子が感染後期に細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを有し、感染性を獲得するのに役立っている。
【０００４】
インフルエンザの確定診断のための技術には、ウイルス分離法、ＲＴ−ＰＣＲ法等が用いられている。しかし、これらの方法は操作が煩雑でありかつ測定に時間を要するので迅速な診断に適していない。迅速かつ簡便な検査法として、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマト法が近年用いられるようになっている。この技術は、検出対象に特異的に結合する固相（例えばメンブレン）と、検出対象（ウイルス粒子）と、検出対象に特異的に結合する標識物（標識化した抗体）との複合体を固相上に形成する方法である。検出対象と特異的に結合する抗体に、標識物として、酵素（例えばアルカリフォスファターゼ）、金属コロイド（例えば金コロイド）、着色ラテックス粒子等が結合されている。特許文献１には、イムノクロマト法に基づく技術が開示されており、この技術を用いたキットも市販されている。しかし、従来のイムノクロマト法の診断キットは、特異度が高いものの（９８．２％）感度が低い（６２．３％）（非特許文献１参照）。
【０００５】
ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの増殖過程において、感染細胞からのインフルエンザウイルスの放出に必要である。従って、ノイラミニダーゼを阻害することにより、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。インフルエンザウイルスの新しい治療法としてノイラミニダーゼ活性阻害剤が注目されており、これまでにいくつかの化合物が開発されている。これまでに開発された薬剤としては、ザナミビル（商品名リレンザ）、オセルタミビル（商品名タミフル）、ペラミビル（商品名ラピアクタ）、ラニナミビル（登録商標イナビル）などがある。ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、呼吸器部位における粘液中のウイルス感染を阻害し、早期治療に有効と考えられている。また、インフルエンザを検出するための、Ｎ−アセチルノイラミン酸誘導体を発光試薬として用いる検出法が知られている（特許文献２〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１０５５３７（２０１１年９月１日国際公開）
【特許文献２】特表平５−５０５０９９号（平成５年８月５日公表）
【特許文献３】米国特許公開ＵＳ２００８／０２８６７５８号（２００８年１１月２０日公開）
【特許文献４】米国特許公開ＵＳ２０１１／０１８９６５５号（２０１１年８月４日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ann. Intern. Med. 156, 500−511, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、インフルエンザの発症後の早期（４８時間以内）に投与されることが必要であるため、感染したインフルエンザウイルスにノイラミニダーゼ活性阻害剤が有効であるかを迅速に判断することが求められる。しかし、従来のイムノクロマト法の診断キットを用いた場合、感度の低さに起因して発症初期での感染患者を見逃す可能性がある。また、従来のイムノクロマト法は、検出されたインフルエンザウイルスがＡ型であるかＢ型であるかを判定することができるが、ノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを判定することができない。
【０００９】
また、特許文献２〜４の技術は、ノイラミニダーゼ活性を検出するための技術に過ぎず、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する技術が何ら検討されていないだけでなく、検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを知るための技術について何ら検討されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、具体的には、従来のイムノクロマト法よりも高感度にてインフルエンザウイルスを検出しかつ検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを簡便に知ることができる技術を提供することにある。
【００１１】
すなわち、本発明は、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定する方法を提供し、本方法は、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程；インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに、第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程を包含するか、あるいは、抗インフルエンザ抗体を、被験体サンプルと接触させる工程；Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、それぞれインキュベートする工程；インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに、第一の発光量をコントロール発光量と比較する工程を包含することを特徴としている。なお、本方法は、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するデータを取得する方法でもあり得る。
【００１２】
また、本発明は、さらにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、被験体サンプルとインキュベートする工程；インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程；ならびに第二の発光量を、上記第一の発光量および上記コントロール発光量と比較する工程を包含するか、あるいは、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を、上記被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分と、インキュベートする工程；インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量を測定する工程；ならびに第二の発光量を、上記第一の発光量および上記コントロール発光量と比較する工程を包含する方法であってもよい。
【００１３】
本発明において、上記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤は、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明において、上記第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤は、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルおよびラニナミビルからなる群より選択され、且つ上記第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものであることが好ましい。
【００１５】
本発明において、上記ルシフェラーゼは、下記〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕または〔ＩＩＩ〕のアミノ酸配列からなることが好ましい。
〔Ｉ〕配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列において下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列：
（ａ）４２３位のイソロイシンの、ロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンへの置換；
（ｂ）４３６位のアスパラギン酸の、グリシン、アラニンもしくはセリンへの置換；または
（ｃ）５３０位のロイシンの、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンへの置換；
〔ＩＩ〕配列番号３に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３に示されるアミノ酸配列において下記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列：
（ｄ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；
（ｅ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または
（ｆ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換；
〔ＩＩＩ〕配列番号５に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号５に示されるアミノ酸配列において下記（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列：
（ｇ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；
（ｈ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または
（ｉ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換。
【００１６】
本発明において、上記被験体サンプルは被験体の鼻咽頭に由来するサンプルであることが好ましく、鼻咽頭または咽頭のスワブ、鼻腔または気管支の洗浄液、あるいは鼻腔の吸引液であってもよい。
【００１７】
本発明は、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の生体外での使用方法を提供し、本方法は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤がＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼと組み合わせて用いられることを特徴としており、抗インフルエンザ抗体がさらに組み合わせられてもよい。
【００１８】
本発明はさらに、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための組成物を提供し、本組成物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいることを特徴としている。
【００１９】
本発明はまた、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するためのキットを提供し、本キットは、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を備えていることを特徴としており、抗インフルエンザ抗体をさらに備えていてもよい。好ましくは、本キットは、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬と、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とを備えている。本キットはさらにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬を備えていてもよい。
【００２０】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬、ならびにＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬を、被験体サンプルとそれぞれインキュベートする工程；インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量、インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程；ならびに第一の発光量、第二の発光量及びコントロール発光量をそれぞれ比較する工程を包含する、インフルエンザウイルスの検出方法であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を用いれば、イムノクロマト法よりも高感度にてインフルエンザウイルスを検出しかつ検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを簡便かつ迅速に知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】イムノクロマト法に基づく従来の検査キットを用いて、インフルエンザウイルスの検出感度を検討した結果を示す図である。
【図２】本発明を用いて、インフルエンザウイルスの検出感度を検討した結果を示す図である。
【図３】異なるノイラミニダーゼに対するオセルタミビルの影響を検討した結果を示す図である。
【図４】検出されたインフルエンザウイルスがオセルタミビルに感受性であるか否かを知ることができるかどうかを検討した結果を示す図である。
【図５】異なるノイラミニダーゼに対するザナミビルの影響を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２４】
〔ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定〕
本発明は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の新たな用途を提供する。具体的には、本発明は、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の生体外での使用を提供し、本発明は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤がＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼと組み合わせて用いられることを特徴としている。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ノイラミニダーゼ活性阻害剤」は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの活性を阻害すれば特に限定されず、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼのみに特異的であることを必要としない。好ましくは、ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの活性を特異的に阻害する化合物であり、例えば、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビルまたはラニナミビルである。このようなノイラミニダーゼ活性阻害剤は、インフルエンザウイルスの治療剤として開発されたものであるが、生体外での判定、具体的にはノイラミニダーゼ活性阻害剤が有効であるか否かの判定に用いられておらず、もちろんそのような用途は想定されていない。特に、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼと組み合わせて生体外での判定に用いられることは、これまで全く記載も示唆もされていない。
【００２６】
〔ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定方法〕
本発明は、インフルエンザに罹患していることが疑われる被験体に対してノイラミニダーゼ活性阻害剤が有効であるか否かを判定する方法であり得る。本発明の方法は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定を補助する方法でもあり得、具体的には、インフルエンザに罹患していることが疑われる被験体に対してノイラミニダーゼ活性阻害剤が有効であるか否かを判定するためのデータを取得する方法でもあり得る。
【００２７】
本発明は、被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬とインキュベートする工程を包含する。上記インキュベートする工程は、被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とインキュベートする工程と並行して行われる。
【００２８】
ヒト被験体を対象とする場合、本発明は、インフルエンザに罹患していることが疑われるヒト被験体から取得されたサンプル（被験体サンプル）が好適に用いられる。治療的診断の観点で用いられる場合、被験体サンプルは被験体の鼻咽頭に由来するサンプルであることが好ましく、例えば、鼻咽頭または咽頭のスワブ、鼻腔または気管支の洗浄液、鼻腔の吸引液（例えば鼻汁）であり得、他の呼吸組織もしくは浸出液、またはリンパ節を含む生検試料でもあり得る。あるいは、予後的診断の観点で用いられる場合は、動物（生体または死体）由来の種々の組織材料であってもよい。被験体サンプルは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの活性を妨げない限り、組織材料の組織または細胞の構造を物理的に破壊して調製されてもよく、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含む溶液または懸濁液として調製されてもよい。
【００２９】
発光試薬またはコントロール試薬と被験体サンプルとのインキュベートは、室温にて短時間行われればよく、例えば、１０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃、より好ましくは２０〜３０℃にて、１〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、より好ましくは１０〜１５分間行われ得る。
【００３０】
本発明において、被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬またはコントロール試薬とインキュベートした後に、発光試薬またはコントロール試薬からの発光量が測定される。すなわち、本発明は、インキュベートした後の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程を包含する。
【００３１】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンを構成するルシフェリンはホタルルシフェリンが好ましく、一実施形態において、以下の構造を有する化合物ＡがＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンとして用いられる。
【００３２】
【化１】
2014155485.tif 000002
【００３３】
インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、上記化合物Ａを加水分解して下記化合物Ｂ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）および化合物Ｃ（ホタルルシフェリン）を生成し、このホタルルシフェリンは、Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下にてルシフェラーゼに触媒されて酸化される際に発光する。
【００３４】
【化２】
2014155485.tif 000003
【００３５】
【化３】
2014155485.tif 000004
【００３６】
本実施形態において、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とインキュベートする被験体サンプルにインフルエンザウイルスが含まれていると、インキュベート後のコントロール試薬が発光し、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬とインキュベートする被験体サンプルに、ノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるインフルエンザウイルスが含まれていると、インキュベート後の発光試薬は発光しない。さらに、インフルエンザウイルスが含まれていない被験体サンプルを発光試薬またはコントロール試薬とインキュベートしたとしても、インキュベート後の発光試薬もコントロール試薬も発光しない。
【００３７】
発光試薬またはコントロール試薬からの発光量の測定は、ルシフェラーゼの発光を測定するために用いられる従来公知の測定手法が用いられればよく、特に限定されない。なお、被験体サンプルとのインキュベートの前に発光試薬またはコントロール試薬の発光量が測定されてもよく、その場合、インキュベート前後の発光量が比較されることが好ましい。
【００３８】
また、Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒトだけでなく、鳥、ブタ、馬、ミンク、クジラ等の動物にも感染するので、非ヒト被験体を対象とする場合、本発明は、被験体からサンプルを取得する工程を包含してもよい。
【００３９】
Ａ型／Ｂ型インフルエンザウイルスを迅速に検査するためにイムノクロマト法を利用した簡易検査試薬が広く用いられている。上記簡易検査試薬は、被験体の鼻腔または咽頭をぬぐった固相（例えば、綿棒）を抽出液内へ入れ、抽出されたウイルス由来のタンパク質を抗原とした免疫反応によって生成した免疫複合体を可視的に発光させることによって、ウイルスを検出する。あるいは、上記簡易検査試薬は、上記免疫反応をテストストリップ上にて行う態様でもあり得、この場合、テストストリップが、被験体の鼻腔または咽頭をぬぐうための固相であり得る。ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、インフルエンザの発症後の早期に投与されることが必要であるため、インフルエンザの感染初期にノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定することが好ましい。本発明は、このようなイムノクロマト法と組み合わせて実行されてもよい。
【００４０】
すなわち、本発明は、抗インフルエンザ抗体を、被験体サンプルと接触させる工程を包含してもよい。本発明に利用可能な抗インフルエンザ抗体は、Ａ型またはＢ型のインフルエンザ粒子またはノイラミニダーゼと免疫複合体を形成し得るものであれば特に限定されない。抗インフルエンザ抗体と被験体サンプルとの接触は、液体形態にて両者を混合することによって両者を接触させても、抗インフルエンザ抗体を固定化したテストストリップに液体形態の被験体サンプルを吸収〜展開させることによって両者を接触させてもよい。
【００４１】
本発明において、形成した免疫複合体を、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬とインキュベートする工程を包含する。液体形態にて抗インフルエンザ抗体と被験体サンプルとを接触させた場合、従来公知の手法を用いて上記抗体を回収することによって、上記抗体を含有する画分として上記免疫複合体を得ることができる。テストストリップ上にて抗インフルエンザ抗体と被験体サンプルとを接触させた場合、上記抗体を固定化した領域を切り出すことによって、上記抗体を含有する画分として上記免疫複合体を得ることができる。すなわち、上記インキュベートする工程は、被験体サンプルと接触させた抗インフルエンザ抗体を含有する画分を、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬とインキュベートする工程である。上記インキュベートする工程は、形成した免疫複合体を、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とインキュベートする工程と並行して行われる。
【００４２】
上記画分と発光試薬またはコントロール試薬とのインキュベートもまた、室温にて短時間行われればよく、例えば、１０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃、より好ましくは２０〜３０℃にて、１〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、より好ましくは１０〜１５分間行われ得る。
【００４３】
本発明において、上記画分を、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬またはコントロール試薬とインキュベートした後に、発光試薬またはコントロール試薬からの発光量が測定される。すなわち、本発明は、インキュベートした後の発光試薬からの第一の発光量およびインキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量を測定する工程を包含する。
【００４４】
発光試薬からの発光量の測定は、ルシフェラーゼの発光を測定するために用いられる従来公知の測定手法が用いられればよく、特に限定されない。なお、上記画分とのインキュベートの前に発光試薬の発光量が測定されてもよく、その場合、インキュベート前後の発光量が比較されることが好ましい。
【００４５】
Ａ型またはＢ型のインフルエンザがノイラミニダーゼを有している。すなわち、本発明を用いれば、検出されるインフルエンザウイルスがＡ型またはＢ型のインフルエンザであることを判定する方法を提供することにより、被験体がインフルエンザに罹患しているかどうかを判定することができるようになる。後述する実施例に示すように、本発明は、イムノクロマト法よりも高感度にてインフルエンザウイルスを検出することができる。そして、イムノクロマト法の簡易検査試薬に本発明を組み合わせて用いれば、検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを簡便かつ迅速に知ることができる。
【００４６】
本明細書中にて使用される場合、「ルシフェラーゼ」はホタルルシフェラーゼが意図され、より詳細には、北米ホタルルシフェラーゼ、ヘイケホタルルシフェラーゼおよびゲンジホタルルシフェラーゼからなる群より選択されるホタルルシフェラーゼが意図される。ルシフェラーゼは野生型であっても変異型であってもよい。変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、野生型北米ホタルルシフェラーゼの、（ａ）４２３位のイソロイシンの、ロイシン、メチオニンもしくはフェニルアラニンへの置換；（ｂ）４３６位のアスパラギン酸の、グリシン、アラニンもしくはセリンへの置換；または（ｃ）５３０位のロイシンの、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンへの置換の少なくとも１つの置換が生じた変異アミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。さらなる変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、野生型ヘイケホタルルシフェラーゼの、（ｄ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；（ｅ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または（ｆ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換の少なくとも１つの置換が生じた変異アミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。なおさらなる変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、野生型ゲンジホタルルシフェラーゼの、（ｇ）４２５位のイソロイシンの、ロイシンへの置換；（ｈ）４３８位のアスパラギン酸の、グリシンへの置換；または（ｉ）５３２位のイソロイシンの、アルギニンへの置換の少なくとも１つの置換が生じた変異アミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。これらの変異型ルシフェラーゼは、野生型と比較して発光強度が増大している。野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ配列番号１および２に示され、野生型ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ配列番号３および４に示され、野生型ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ配列番号５および６に示される。なお、本発明に利用可能な変異型ルシフェラーゼは、上述したものに限定されず、特開２００７−９７５７７号（２００７（平成１９）年４月１９日公開）に、熱安定性が向上したもの、基質親和性が向上したもの、発光波長が変化したもの、発光の持続性が向上したもの、界面活性剤耐性を有するものとして挙げられているタンパク質であってもよい。
【００４７】
また、上記ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定方法は、複数（少なくとも２種類以上）のノイラミニダーゼ活性阻害剤を用いて行われてもよい。本明細書において、ノイラミニダーゼ活性阻害剤およびそれを含んでいる発光試薬を２種類以上使用してもよいことを意図して、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤、第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤、第一の発光試薬、第二の発光試薬と記載する場合もある。つまり、例えば、本発明において、(i)被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第一の発光試薬とインキュベートする工程と、(ii)被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる第二の発光試薬とインキュベートする工程と、(iii)被験体サンプルを、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とインキュベートする工程とが、並行して行われてもよい。そして、本発明は、インキュベートした後の第一の発光試薬からの第一の発光量、インキュベートした後の第二の発光試薬からの第二の発光量、および、インキュベートした後のコントロール試薬からのコントロール発光量、を測定する工程を包含してもよい。さらに、本発明は、第一の発光量、第二の発光量およびコントロール発光量を比較する工程を包含してもよい。
【００４８】
ここで、第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤は、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤とは異なるものであることが好ましい。例えば、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤がオセルタミビルである場合、第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤はオセルタミビル以外のノイラミニダーゼ活性阻害剤（例えば、ザナミビル、ペラミビルまたはラニナミビル）であることが好ましい。
【００４９】
これにより、被験体サンプルにおいて、いずれかのノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して耐性を有しているインフルエンザウイルスが含まれていることを正確に判定することができる。具体的には、コントロール試薬で発光し、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を添加した第一の発光試薬で発光し、第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を添加した第二の発光試薬で発光しない場合は、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して耐性を有するインフルエンザ（第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤に対しては感受性）であると判定できる。また、コントロール試薬で発光し、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤を添加した第一の発光試薬で発光せず、第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤を添加した第二の発光試薬でも発光しない場合は、第一のノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して感受性のインフルエンザ（第二のノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して感受性でもある）であると判定できる。
【００５０】
なお、上記ノイラミニダーゼ活性阻害剤は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの活性を特異的に阻害する化合物（例えば、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビルまたはラニナミビル）であることが好ましい。この場合、阻害剤の特異性によって、細菌と、阻害剤に耐性を有するインフルエンザとを確実に区別することができる。
【００５１】
例えば、オセルタミビル耐性ウイルスの被験体サンプルの場合では、コントロール試薬を用いた場合に発光し、オセルタミビルを含んでいる発光試薬を用いた場合でも発光する。そのため、イムノクロマト法等によってインフルエンザであると特定できていればオセルタミビル耐性インフルエンザであると判定できるが、インフルエンザであると特定できていない場合、オセルタミビル耐性インフルエンザなのかインフルエンザ由来ではないノイラミニダーゼを持つ微生物なのか区別することができない場合がある。近年、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスが報告され、日本においても２００８／０９年のシーズンに、オセルタミビル耐性ウイルスが流行して問題となった。今後、オセルタミビル耐性ウイルスが流行する可能性は高く、その場合、確実にオセルタミビル耐性ウイルスであることを特定できれば、非常に意義のあることである。
【００５２】
そこで、本発明者らは特定のノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して耐性を有しているウイルスかどうかを判定する方法として以下のことを考えた。例えば、オセルタミビル耐性ウイルスは世界各地で報告されているが、ザナミビル耐性ウイルスの報告は極めて限られている（Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ５２，  ４３２−４３７，  ２０１１）。そのため、オセルタミビルとザナミビルとの両方に耐性をもつインフルエンザウイルスが出現する可能性は極めて低いと考えられる。そこで、本発明者らは、例えば、オセルタミビルとザナミビルとの２種類を用いて試験を行えばオセルタミビル耐性ウイルスであるかどうか判定することができると考えた。具体的には、コントロール試薬で発光し、オセルタミビルを添加した発光試薬で発光し、ザナミビルを添加した発光試薬で発光しない場合は、オセルタミビル耐性のインフルエンザ（ザナミビル感受性）であると判定できる。また、コントロール試薬で発光し、オセルタミビルを添加した発光試薬で発光せず、ザナミビルを添加した発光試薬でも発光しない場合は、オセルタミビル感受性のインフルエンザ（ザナミビル感受性でもある）であると判定できる。なお、コントロール試薬、オセルタミビルを添加した発光試薬、ザナミビルを添加した発光試薬のいずれにおいても発光する場合は、ノイラミニダーゼを有する細菌であると判定できる。
【００５３】
なお、もちろん、上述の抗インフルエンザ抗体を、被験体サンプルと接触させる工程を包含する場合においても同様に、ノイラミニダーゼ活性阻害剤を２種類以上使用してもよい。
【００５４】
〔ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定用の組成物〕
本発明はさらに、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための組成物を提供し、本組成物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいることを特徴としている。本発明の組成物は、ノイラミニダーゼ活性阻害剤が有効であるか否かを判定する方法に用いられることが好ましく、本発明の組成物を構成するＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤は、上述した特徴を有していればよい。
【００５５】
本明細書中にて使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図されるものである。
【００５６】
〔ノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性の判定用のキット〕
本発明はまた、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するためのキットを提供し、本キットは、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいる発光試薬と、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含んでいるコントロール試薬とを備えていることを特徴としており、抗インフルエンザ抗体をさらに備えていてもよい。ここで、「キット」とは、組成物中に含有されるべき各種成分が容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）に含まれておりかつ容器の全てが全体として１つに梱包されている形態が意図されるものである。また、本キットは、２種類以上の発光試薬を備えていてもよい。つまり、本キットは例えば、発光試薬として第一の発光試薬と第二の発光試薬とを備えていてもよく、第一の発光試薬と第二の発光試薬とは互いに異なる種類のノイラミニダーゼ活性阻害剤を含んでいてもよい。
【００５７】
本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に成分が内包されている状態が意図される。また、キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、容器中に内包された溶液形態の組成物を梱包していてもよく、異なる２つ以上の成分を同一の容器に混合して備えてもよい。キットは、上記成分を使用する手順（すなわち、検出されるインフルエンザウイルスに対するノイラミニダーゼ活性阻害剤の有効性を判定するための手順）を記載した指示書を備えていることが好ましい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。キットは、上述した組成物を構成するために用いられてもよく、上述した組成物に含まれる物質を別々に備えていても、上述した組成物とさらなる成分とを別々に備えていてもよい。
【００５８】
なお、本キットは、発光試薬および／またはコントロール試薬を調製するためのＮ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびノイラミニダーゼ活性阻害剤を別々の容器にて備えていてもよい。
【００５９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
以下の実施例では、インフルエンザウイルスの検出感度について、本発明の方法と従来のイムノクロマト法との比較を行った。具体的には、実施例１にて、市販のイムノクロマト法に基づく従来の検査キットを用いて、インフルエンザウイルスの検出感度を検討し、実施例２にて、発光試薬を用いる発光検出法を用いてインフルエンザウイルスの検出感度を検討した。また、実施例３にて、異なるノイラミニダーゼに対するオセルタミビルの影響を検討し、実施例４では、従来のイムノクロマト法によって検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを知ることができるかどうかを検討した。具体的には、イムノクロマト法によってインフルエンザウイルスを検出し、検出部を切り出した後、オセルタミビル添加または非添加の発光試薬中にて切り出した検出部をインキュベートすることによってオセルタミビルの効果を検証した。また、実施例５にて、異なるノイラミニダーゼに対するザナミビルの影響を検討した。
【００６２】
〔実施例１〕イムノクロマト法によるインフルエンザウイルスの検出感度について
イムノクロマト法によるインフルエンザウイルス検査キットとして、ラピッドテスタカラーＦＬＵスティック（積水メディカル社製）を使用した。インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。３００μＬの希釈用溶液に、１０μＬの水、または６．１×１０４〜６．１×１０６ｖｐ（ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）／１０μＬのインフルエンザウイルス検体液を添加した後に、テストスティックを検体希釈液に浸漬した。浸漬から１０分後に、検体希釈液からテストスティックを取り出して、テストスティックの判定域をスキャナーＥＳ−２２００（ＥＰＳＯＮ社製）にて取り込んで画像化した。結果を図１に示す。今回使用したインフルエンザウイルスはＡ型なので、テストスティックの判定域において青いライン（図中、下の矢印）が検出された。図中、上の矢印はコントロールを示す。
【００６３】
テストスティックの浸漬から１０分後に、ウイルス数が６．１×１０６以上の場合は、青い明瞭なラインが判定域にて検出された。ウイルス数が６．１×１０５の場合は弱いが青いラインが検出され、ウイルス数が６．１×１０４の場合は青いラインが全く検出されなかった。以上の結果から、従来のイムノクロマト法に基づく方法では、６．１×１０５のインフルエンザウイルスの検出が可能であることがわかった。
【００６４】
〔実施例２〕発光試薬によるインフルエンザウイルスの検出感度について
インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。発光試薬として、発光試薬Ａ（５０ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ８．０）、５μｇ／ｍＬホタルルシフェラーゼ（供給源：プロメガ社製またはバイオエネックス社製）、１０μｇ／ｍＬ  Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン（特許文献３に記載の手法に従って合成）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  補酵素Ａ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％トレハロース、４％マンニトール、１％スクロース、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用した。４０μＬの発光試薬Ａに、１０μＬの水、または６．１×１０２〜６．１×１０７ｖｐ／１０μＬのインフルエンザウイルス検体液を添加した後に、ルミテスターＣ１１０（キッコーマン社製）を用いて混合液中の発光量を測定した。結果を図２に示す。
【００６５】
６．１×１０４のインフルエンザウイルスの添加から１０分後の発光量が７０３であり、添加前のバックグラウンドの発光量２７４と区別することができた。このことから、６．１×１０４のインフルエンザウイルスの検出が可能であることがわかった。また、この結果は、実施例１で示したイムノクロマト法と比較して１０倍程度高感度であることを示す。さらに、６．１×１０３のインフルエンザウイルスの添加から６０分後の発光量が５９６であり、添加前のバックグラウンドの発光量２６８と区別することができた。このことから、インフルエンザウイルス検出感度は６．１×１０３であることがわかった。
【００６６】
〔実施例３〕ノイラミニダーゼ活性阻害剤によるインフルエンザウイルス特異的な発光抑制効果について
インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。発光試薬として、発光試薬Ｂ（５０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．０）、５μｇ／ｍＬホタルルシフェラーゼ、１０μｇ／ｍＬ  Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  補酵素Ａ、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、４％マンニトール、１％スクロース、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用した。４０μＬの発光試薬Ｂに、０〜１０ｍＭ／５μＬ（最終濃度０〜１０００μＭ）のオセルタミビルリン酸塩（通称タミフル、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の添加後に、０．１Ｕ／５μＬのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｏｓ社製）または、６．１×１０５ｖｐ／５μＬのインフルエンザウイルス検体液を添加した後に、ルミテスターＣ１１０（キッコーマン社製）を用いて混合液中の発光量を測定した。結果を図３に示す。
【００６７】
Ｃ．Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼを用いた場合、１０００μＭのオセルタミビルを添加しても混合液中の発光量の低下は見られなかった（図３（ａ））。しかし、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを用いた場合、オセルタミビルの濃度に応じて混合液中の発光量の低下がみられ、１０００μＭのオセルタミビル存在下では発光が完全に抑制された（図３（ｂ））。このことより、オセルタミビルはＣ．Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼを阻害せず、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼを特異的に阻害することがわかった。
【００６８】
〔実施例４〕イムノクロマト法で検出されたインフルエンザウイルスに対するオセルタミビル感受性試験
イムノクロマト法によるインフルエンザウイルス検査キットとして、ラピッドテスタカラーＦＬＵスティック（積水メディカル社製）を使用した。インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。３００μＬの希釈用溶液に、３．０５×１０８ｖｐ／５μＬのインフルエンザウイルスを添加した後に、テストスティックを検体希釈液に浸漬した。浸漬から１０分後に、検体希釈液からテストスティックを取り出して、テストスティックの判定域を切り出し、水で洗浄した。次に、４０．５μＬの発光試薬Ｂに対して、４．５μＬの水、または１０ｍＭ／４．５μＬ（最終濃度１ｍＭ）のオセルタミビルリン酸塩（商品名タミフル、ＬＫＴ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加した後に、混合液中で洗浄後の判定域をインキュベートして、ルミテスターＣ１１０（キッコーマン社製）にて混合液中の発光量を測定した（図３および４参照）。
【００６９】
オセルタミビル非存在下では発光が確認されたが、オセルタミビル存在下では発光がほぼ完全に抑制された（図４参照）。この結果は、使用したインフルエンザウイルスがオセルタミビル感受性株であることと相関している。すなわち、検出されたインフルエンザウイルスのオセルタミビルに対する感受性を知ることができることがわかった。また、この方法はオセルタミビルだけでなく他のノイラミニダーゼ活性阻害剤（例えばリレンザ）においても同様に試験することができ、検出されたインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活性阻害剤に対する感受性を知ることができ、検出されたインフルエンザウイルスに適した治療薬を選択することができると考えられる。
【００７０】
〔実施例５〕ノイラミニダーゼ活性阻害剤によるインフルエンザウイルス特異的な発光抑制効果について−２
インフルエンザウイルスとして、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）  ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。発光試薬として、発光試薬Ｂ（５０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．０）、５μｇ／ｍＬホタルルシフェラーゼ、１０μｇ／ｍＬ  Ｎ−アセチルノイラミン酸−ルシフェリン、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１２ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  補酵素Ａ、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、４％マンニトール、１％スクロース、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用した。４０μＬの発光試薬Ｂに、０〜１０ｍＭ／５μＬ（最終濃度０〜１０００μＭ）のザナミビル（通称リレンザ、東京化成工業株式会社製）の添加後に、０．２Ｕ／５μＬのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｏｓ社製）または、１．２２×１０６ｖｐ／５μＬのインフルエンザウイルス検体液を添加した後に、ルミテスターＣ１１０（キッコーマン社製）を用いて混合液中の発光量を測定した。結果を図５に示す。
【００７１】
Ｃ．Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼを用いた場合、１０００μＭのザナミビルを添加しても混合液中の発光量の低下はほとんど見られなかった（図５（ａ））。しかし、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを用いた場合、ザナミビルの濃度に応じて混合液中の発光量の低下がみられ、１０μＭのザナミビル存在下では発光が完全に抑制された（図５（ｂ））。このことより、ザナミビルはＣ．Ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼを阻害せず、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼを特異的に阻害することがわかった。
【００７２】
なお、実施例３および５の結果からわかるように、本発明においては、様々な種類のノイラミニダーゼ活性阻害剤を用いることができる。よって、上述のように、複数の種類のノイラミニダーゼ活性阻害剤を用いて試験を行えば、いずれかのノイラミニダーゼ活性阻害剤に対して耐性を有するインフルエンザウイルスであっても特定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によって、高感度にてインフルエンザウイルスを高感度にて検出しかつ検出されたインフルエンザウイルスがノイラミニダーゼ活性阻害剤に感受性であるか否かを簡便かつ迅速に知ることができるので、医薬分野における開発に寄与することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【配列表】
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