(57)【要約】【課題】実検体に近いＢＮＰ測定用標準物質を提供すること。【解決手段】ＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰをＢＮＰ測定用の標準物質に用いる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰを含むことを特徴とする、ＢＮＰ測定用標準物質。
【請求項２】
前記ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰを２：８〜６：４の割合で含む、請求項１に記載のＢＮＰ測定用標準物質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＢＮＰ測定用標準物質を使用することを特徴とする、検体中のＢＮＰを定量的に測定する方法。
【請求項４】
検体中のＢＮＰ実測値を前記ＢＮＰ測定用標準物質で作成した標準曲線の近似式の傾きで除することにより検体中のＢＮＰを定量的に測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載のＢＮＰ測定用標準物質を使用することを特徴とする、ＢＮＰ測定試薬の製造方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載のＢＮＰ測定用標準物質を含むことを特徴とする、ＢＮＰ測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＮＰ測定用標準物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、特に血液検査の分野において、心臓の異常を判断するための指標としてＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）を測定することが広く知られており、例えば、心筋梗塞や心不全などの心疾患の診断、予後判定に用いられている。ＢＮＰは、利尿作用、血管拡張作用、レニン・アルドステロン分泌抑制、交感神経抑制、心肥大抑制などの作用があり、心室より分泌され心筋を保護するように働くホルモンであり、心臓に負担がかかった際、主に心室部分から血液中に分泌される。特に、心不全や狭心症などの心臓病の自覚症状が表れる前の早期段階でも心臓の状態をかなり鋭敏に示すと言われ、診断、それらの病態把握や治療効果判定などの指標を得るために重要である。
【０００３】
また、ＢＮＰは、ｐｒｏＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体）から生成する。循環血液量の増加や心室壁へのストレスなど、心負荷の増大によりｐｒｏＢＮＰが産生され、これが蛋白分解酵素により、ヒト心臓中で生理活性を持つＢＮＰと生理活動性を有しないＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント）に分解されて、血中に放出されることが知られている。健常人のＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ血中濃度は極めて低く、心不全の重症度に応じてそれぞれの血中濃度が上昇する。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの血中半減期は約１２０分と長く存在し、ＢＮＰの６倍以上多く存在するとも言われている。
【０００４】
このように、特に心臓病に羅患している場合には、ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが血液中に混在しており、それらの存在量を正確に検出することが望まれている。
【０００５】
現に、市販の６種類のＢＮＰ測定イムノアッセイ試薬で実施した全国コントロールサーベイ結果では、同一試料を測定したにも関わらず、例えば、試料１で最小濃度３３．０５ｐｇ／ｍＬから最大濃度８２．１５ｐｇ／ｍＬまで、試料２では最小濃度２１６．７５ｐｇ／ｍＬから最大濃度４８４．４５ｐｇ／ｍＬまでと非常に測定値の幅が大きく、最小最大で２倍以上の値の差が生まれる場合もあることが確認された（非特許文献３）。
また、各試薬で使用されている抗体のエピトープの違いも確認されている。例えば、ＡｘＳＹＭやＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（Ａｂｂｏｔｔ社）、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ（Ｂａｙｅｒ社）等はリング構造に特異的な抗体とＣ末端ペプチドに特異的な抗体２種類使用している一方で、Ｔｒｉａｇｅ（Ｂｉｏｓｉｔｅ社）やＡｃｃｅｓｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）はＮ末端ペプチドに特異的な抗体を使用している（非特許文献４）。このような試薬で使用されている抗体エピトープの差も試薬間差を生む原因の一つと考えられる。
【０００６】
これらのＢＮＰ測定イムノアッセイ試薬において、標準物質はＢＮＰのみを用いていることが多いが、上記のような現状であることを鑑みると、標準物質としてＢＮＰのみを用いることは不十分であり、試薬間差を生む一因と考えられる。
このことからも分かるように、ＢＮＰ測定イムノアッセイ試薬において、ＢＮＰ測定用の標準物質や管理検体の必要性が明らかになってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Clin Chem. 2007;53:866-73
【非特許文献２】Clin Chem Acta. 2003;334:233-9
【非特許文献３】第３０回イムノアッセイ検査  全国コントロールサーベイ（２００８年）成績報告書
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５４：９：１５１１−１５１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者らは、上記のような実情を鑑みると、正確に血中のＢＮＰ量を測定するためには、ＢＮＰ測定用の標準物質や試薬製造の管理検体として、単にＢＮＰのみで構成するのではなく、より実検体に近づけるための工夫が必要になると考えた。よって、本発明は、実検体に近いＢＮＰ測定用標準物質を提供することを目的とする。
【０００９】
BNPは検体の保存安定性が悪く劣化が激しいことより、検体から抽出して作製するような管理検体の入手が困難で、容易に人工的に調製できる実検体様の管理検体が必要と思われる。そこで、本発明はまた、実検体様の管理検体を調製する方法およびその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰの両方を標準物質に用いると実検体に近いＢＮＰ測定が可能になること、およびＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの両方を用いると管理検体として優れることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、以下のとおりである。
（１）ＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰを含むことを特徴とする、ＢＮＰ測定用標準物質。
（２）前記ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰを２：８〜６：４の割合で含む、（１）に記載のＢＮＰ測定用標準物質。
（３）（１）または（２）に記載のＢＮＰ測定用標準物質を使用することを特徴とする、検体中のＢＮＰを定量的に測定する方法。
（４）検体中のＢＮＰ実測値を、ＢＮＰ測定用標準物質で作成した標準曲線の近似式の傾きで除することにより検体中のＢＮＰを定量的に測定する、（３）に記載の方法。
（５）（１）または（２）に記載のＢＮＰ測定用標準物質を使用することを特徴とする、ＢＮＰ測定試薬の製造方法。
（６）（１）または（２）に記載のＢＮＰ測定用標準物質を含むことを特徴とする、ＢＮＰ測定キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、心臓病患者の臨床挙動に合致したＢＮＰ測定用の標準物質やＢＮＰ試薬製造の管理検体を提供することができ、心臓病の診断の感度および特異性を高めたり、試薬製造を容易にしたりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各イムノアッセイキット（ＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰおよびＴＯＳＯＨ  ＢＮＰ）におけるＬｅｖｅｌ１サンプルと実検体の測定結果の相関図。
【図２】各イムノアッセイキット（ＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰおよびＴＯＳＯＨ  ＢＮＰ）におけるＬｅｖｅｌ２サンプルと実検体の測定結果の相関図。
【図３】各サンプルプロットについて、実検体相関の一次回帰線からの乖離度の割合を示す図。
【図４】ｐｒｏＢＮＰ:ＢＮＰを各割合で用いて調製した標準物質をＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰで測定した時の検量線を示す図。
【図５】ｐｒｏＢＮＰ:ＢＮＰを各割合で用いて調製した標準物質で求めた実検体中のＢＮＰ測定値をそれぞれプロットし、各イムノアッセイキット（ＰＡＴＨＦＡＳＴおよびＴＯＳＯＨ  ＢＮＰ）間の相関を検討した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質は、実検体を反映したＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの混合物である。
【００１５】
「ＢＮＰ」とは、３２アミノ酸残基からなり、分子量約３．５ＫＤのペプチドホルモンである。ペプチド配列はSPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH（配列番号１）で、Cys10とCys26の間にジスルフィド結合が存在する。合成ＢＮＰは、公知の方法に従って容易に合成することができる。なお、ＢＮＰは組換え体でもよい。
【００１６】
「ｐｒｏＢＮＰ」とは、１０８アミノ酸残基からなり、分子量約１２ＫＤのペプチド配列はHPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV WKSREVATEG IRGHRKMVLY
TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL GCKVLRRH（配列番号２）である。ｐｒｏＢＮＰは、公知の方法に従って容易に調製することができ、例えば、大腸菌で組換え型ｐｒｏＢＮＰを発現することができる。また、「ｐｒｏＢＮＰ」はグリコシル化ｐｒｏＢＮＰでもよい。例えば、分子量約３５ＫＤのグリコシル化ｐｒｏＢＮＰは、公知の方法に従い、ＨＥＫ２９３細胞で発現させて得ることができる。なお、ｐｒｏＢＮＰは合成されたものでもよい。
【００１７】
ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの混合比（モル比）は、当業者であれば、実検体と比較して適宜設定できるが、２：８〜６：４、好ましくは４：６〜６：４、更に好ましくは５：５である。
【００１８】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質が、実検体を反映していることは、当業者であれば容易に試験を行い評価することができるが、例えば、後述する実施例のように、実検体の挙動と比較して確認することができる。
【００１９】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質は、上記のようにして調製されるＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰの混合物をそのまま、または適当な希釈液で希釈するか、あるいは濃縮することにより濃度を適宜調節して用いることができる。さらに、上記のようにして調製されるＢＮＰ及びｐｒｏＢＮＰの混合物を凍結乾燥に付したものに使用時に緩衝液を添加して用いることもできる。
【００２０】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質は、健常人血漿・血清、または緩衝液、タンパク質安定化剤（例えばウシ血清アルブミン（BSA）など）、ｐＨ調整剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、抗生物質など）などを含み得る。
ＢＮＰ測定用標準物質のベースとしては、健常人の血漿や血清を用いることが好ましい。これらはＢＮＰを含まないものが好ましく、例えば、通常心臓疾患を有しない健常人は、実質的にＢＮＰを含まないので好ましい。
【００２１】
緩衝液としては、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９に緩衝作用を有するものが好ましく、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン− 塩酸、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどの各種緩衝液が挙げられる。
【００２２】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質は、ＢＮＰ測定において、測定用標準物質または精度管理用試剤のいずれとしても用いることができる。
【００２３】
ＢＮＰ測定法は、当該分野で通常用いられている方法であれば特に限定されず、免疫学的測定方法としては、ＣＬＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫凝集法やイムノクロマト法などが挙げられる。
【００２４】
ＣＬＥＩＡ法の例としては、第一の抗ＢＮＰ抗体を磁性粒子に固定化し、これを被検試料として検体若しくは、本発明のいくつかの濃度に調製したＢＮＰ測定用標準物質とを接触させ、続いて、第二の抗ＢＮＰ抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した検出用抗体と接触させて免疫複合体を形成させ、これを磁力体により分離し、発光基質を反応させると、前記第一の抗ＢＮＰ抗体と結合した測定試料中のＢＮＰと結合した前記検出用抗体の前記標識からの信号を検出することができる。次に、本発明のいくつかの濃度に調製されたＢＮＰ測定用標準物質から検出された検出値をもとに標準曲線を作成し、前記標準曲線を用いて、検体から検出された検出値から、検体に含まれるＢＮＰの濃度を得ることができる。
【００２５】
免疫凝集法の例としては、抗ＢＮＰ抗体をラテックス粒子に固定化し、これと被検試料として検体若しくは、本発明のいくつかの濃度に調製したＢＮＰ測定用標準物質とを接触させると、検体中のＢＮＰと凝集反応をおこし、その凝集度合いを検出することができる。次に、本発明のいくつかの濃度に調製されたＢＮＰ測定用標準物質から検出された検出値をもとに標準曲線を作成し、前記標準曲線を用いて、検体から検出された検出値から、検体に含まれるＢＮＰの濃度を得ることができる。
前記ＢＮＰ測定用標準物質による標準曲線の作成と利用は、検体の測定と同時に行っても良いし、別に行って参照しても良い。
公知の方法に従い前記ＢＮＰ測定用標準物質による標準曲線を作成し、ＢＮＰ測定試薬で得られた実測値を該標準曲線を元に補正し、検体中のＢＮＰ濃度を決定する。
例えば、前記ＢＮＰ測定用標準物質を、ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰをモル濃度比で１：１になるように混合して作成したものを、ＢＮＰモル濃度で０〜１２９ｐｍｏｌ／Ｌの間で段階的に調製し、測定に使用する（あるいは基準となる）ＢＮＰ測定試薬で各々の実測値を求め、ＢＮＰ理論値とＢＮＰ実測値を比較し、１次回帰線の近似式及び近似式の傾きを求める。次いで、検体をＢＮＰ測定試薬で測定し、ＢＮＰ実測値をもとめ、前記で決定した近似式の傾きで除することによって、検体中のＢＮＰ濃度を決定する。
利用する近似式と利用方法は、公知の方法から適宜選択することができる。
【００２６】
このように、本発明によるＢＮＰ測定用標準物質を用いて、本発明の検体中のＢＮＰを定量的に測定する方法を実施することができる。本発明のＢＮＰを定量的に測定する方法に用いる被検試料は、本発明による濃度既知のＢＮＰ測定用標準物質や、ＢＮＰを含む可能性のある試料であれば特に限定されるものではないが、例えば、検体として、生体試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましくは血漿又は血清である。
【００２７】
本発明のＣＬＥＩＡ法やＥＬＩＳＡ法等による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。
【００２８】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、
発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００２９】
本発明の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。こうして、モノクローナル抗体と不溶性担体との複合体（抗体／担体複合体）を形成し、これを本発明の免疫学的分析方法に用いることができる。
【００３０】
また、ＢＮＰ測定用標準物質をＢＮＰ測定試薬の精度管理用試剤として使用することができる。精度管理用試剤とは、ＢＮＰ測定試薬の性能が期待通りに製造できているかを確認するものであり、管理検体として、常に一定の性質をもつことが求められている。精度管理用試剤は、上記測定用標準物質と同様に調製・使用することができる。精度管理の方法としては、例えば、あらかじめ基準となるＢＮＰ測定試薬で管理値として値付けを行った精度管理用試剤を、新たに製造したＢＮＰ測定試薬で測定し、前記管理値と比較することである。
【００３１】
本発明のＢＮＰ測定用標準物質は、ＢＮＰ測定を簡便に精度よく実施するため、ＢＮＰ測定試薬を含むＢＮＰ測定キットに含めることができる。ＢＮＰ測定用標準物質は、至適濃度に既に調製されたものでも良いし、使用時に適宜調製しても良い。また、ＢＮＰ測定試薬としては、公知のものが使用できる。調製方法や使用方法は、添付の説明書に記載してある内容を参考にして行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
＜実施例１＞  ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰの添加比の検討
（人工管理検体の調製）
人工管理検体として、グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ及びＢＮＰ含有物を以下のように調製した。グリコシル化ｐｒｏＢＮＰ（Ｈｙｔｅｓｔ社、フィンランド）は、１．２５ｍｇ／ｍＬになるように５０mＭ酢酸ナトリウム水溶液で溶解した。合成ＢＮＰ−３２（ペプチド研究所、日本）は５μｇ／ｍＬになるように調製液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＢＳＡ、０．０３％  ＰｒｏＣｌｉｎを含む）で溶解した。溶解後、これら２つの溶液を、健常人由来のＥＤＴＡ血漿に添加した。添加は以下のようにモル比を段階的に変化させて実施した。グリコシル化ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰのモル比を１０：０、８：２、６：４、４：６、２：８、０：１０の６段階とした。
【００３４】
（使用したイムノアッセイキット）
今回測定に用いた２つのイムノアッセイキットの測定原理は、共に１ステップサンドイッチアッセイである。検体中のＢＮＰと、抗ＢＮＰ抗体を固定化した磁性粒子及びアルカリホスファターゼ標識抗ＢＮＰ抗体を結合させ、過剰のアルカリホスファターゼ標識抗ＢＮＰ抗体を除去した後、抗原抗体反応により形成された免疫複合体のアルカリホスファターゼ酵素活性を測定する。１法は化学発光免疫測定試薬ＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰ（三菱化学メディエンス）であり、発光基質を用いたＣＬＥＩＡ法により、２法目は酵素免疫測定試薬ＴＯＳＯＨ  ＢＮＰ（東ソー）であり、蛍光物資の生成速度を測定するＥＩＡ法により、それぞれ検体中のＢＮＰ濃度を求めた。
【００３５】
（実検体）
心臓疾患のある患者から採取した４９名の血漿検体を実検体として使用した。
【００３６】
（ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰの添加比の検討）
表１のようにｐｒｏＢＮＰとＢＮＰの添加比率（モル濃度比率）を変化させて調製したサンプルをイムノアッセイキットで測定し、また同時に実検体も測定した。結果を図１〜図３に示す。図中の四角記号あるいは三角記号はベース血漿の種類を示し、ベース血漿Ａは四角記号、ベース血漿Ｂは三角記号である。また、実検体を白抜きの丸記号（○）で示す。また、ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰ添加量の異なる２系列を、添加量Ｌｅｖｅｌ１は塗りつぶし記号、添加量Ｌｅｖｅｌ２は白抜き記号で表す。サンプルは、ベース血漿Ａ・添加量Ｌｅｖｅｌ１（■）、ベース血漿Ａ・添加量Ｌｅｖｅｌ２（□）、ベース血漿Ｂ・添加量Ｌｅｖｅｌ１（▲）、ベース血漿Ｂ・添加量Ｌｅｖｅｌ２（△）と示される。
【００３７】
なお、購入した各抗原の表示濃度からの理論的な値として、表２、３に示すモル濃度でｐｒｏＢＮＰとＢＮＰをベース血漿に添加した。例えば、ＢＮＰは、４５０ｐｇ／ｍＬ＝１２９ｍｏｌ／Ｌ、ｐｒｏＢＮＰは、４．５ｎｇ／ｍＬ＝１２９ｍｏｌ／Ｌとなる。
【００３８】
図１，図２は各イムノアッセイキットにおけるサンプルと実検体の測定結果を、相関図としてプロットしたものである。ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰ添加比によって、相関関係に違いがあることがわかった。更に、それぞれのサンプルプロットについて、実検体相関の一次回帰線からの乖離度の割合を図３に示す。乖離度の求め方として、例えば、あるプロットが（ｘ、ｙ）＝（ａ、ｂ）であり、一次回帰線がｙ＝ｃｘ＋ｄであった場合、そのプロットの乖離度は（ｂ÷ａ−ｃ）×１００％となる。図３より、ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル比が、６：４〜４：６の人工管理検体が近似直線からの乖離度が±20%に収まり、実検体と同様の挙動を示すことが確認された。
【００３９】
【表１】
2014032062.tif 000003
【００４０】
【表２】
2014032062.tif 000004
【００４１】
【表３】
2014032062.tif 000005
【００４２】
＜実施例２＞ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰを組み合わせた標準物質の検討
特記する以外は、実施例１と同様に行った。
実施例１と同様にして、ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率を（３）６：４、（４）４：６、（６）０：１０（なお、これら（３）、（４）、（６）は図４、図５および表４では丸数字で示されている）に調製した標準物質を利用し、2種類のイムノアッセイ法にて検量線を作成した。図４に、ｐｒｏＢＮＰ:ＢＮＰを上記で調製した標準物質をＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰで測定した時の検量線を示す。横軸は、購入した表示濃度からの理論的な値としてのＢＮＰ添加濃度、縦軸は、発光カウントである。
【００４３】
次に、これを元に、ＢＮＰ理論値とＢＮＰ実測値の関係を検討した。
表４は上記（３）、（４）、（６）について、購入した表示濃度からの理論的な値としてのＢＮＰ添加濃度（ＢＮＰ理論値）をｘ、２種類のイムノアッセイ法での各実測ＢＮＰ濃度（ＢＮＰ実測値）をｙとしてプロットし、各々一次回帰線の近似式及び近似式の傾きを求めた結果である。イムノアッセイの1法目は化学発光免疫測定試薬ＰＡＴＨＦＡＳＴ
ＢＮＰ（三菱化学メディエンス）であり、２法目は酵素免疫測定試薬ＴＯＳＯＨ  ＢＮＰ（東ソー）である。
【００４４】
次に、上記２種類のイムノアッセイ法で実検体中のＢＮＰ濃度を測定し、該イムノアッセイ法間で誤差が少ない標準物質を検討した。まず、前記で求めた対応するイムノアッセイ法の近似式の傾きで、各実検体中のＢＮＰ濃度を補正する（実測値÷傾き）ことにより、実検体中のＢＮＰ測定値を求めた。各標準物質で求めた実検体中のＢＮＰ測定値をそれぞれプロットし、該イムノアッセイ法間の相関を検討した。その結果を、図５に示す。ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率が６：４の場合は、ｙ＝１．０２２３ｘ＋１．６４７４、モル濃度比率が４：６の場合は、ｙ＝０．９９７８ｘ＋２．６５９２となり、２種類のイムノアッセイ法はｙ≒ｘで、非常に相関が高かった。一方、ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率０：１０ （すなわちＢＮＰのみからなる標準物質）では、ｙ＝０．８１２３ｘ＋５．０１５６となり、２種類のイムノアッセイ法はｙ≒０．８ｘで、両法での乖離が確認された。
以上より、ＢＮＰのみでなく、ｐｒｏＢＮＰを添加することにより、複数の試薬で同等に使用可能な標準物質を作製できることが示された。
【００４５】
【表４】
2014032062.tif 000006
【００４６】
＜実施例３＞ｐｒｏＢＮＰとＢＮＰを組み合わせた標準物質の利用の検証
特記する以外は、実施例２と同様に行った。
検体中のＢＮＰ濃度を測定可能であるか検証するため、ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率を（３）６：４、（４）４：６、（６）０：１０に調製した標準物質を利用し、２種類のイムノアッセイ法で同様なＢＮＰ濃度が得られるか検討した。
例えば、（４）の標準物質を使用して、ＰＡＴＨＦＡＳＴ  ＢＮＰを用いて測定する場合、ＢＮＰ実測値を表４で求めた対応する近似式の傾き３．８１で除することにより、検体中のＢＮＰ濃度を求め、一方、ＴＯＳＯＨ  ＢＮＰを用いて測定する場合、ＢＮＰ実測値を表４で求めた対応する近似式の傾き２．３４で除することにより、検体中のＢＮＰ濃度を求め、それらの値を比較した。
その結果を、図５に示す。ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率が６：４の場合は、ｙ＝１．０２２３ｘ＋１．６４７４、モル濃度比率が４：６の場合は、ｙ＝０．９９７８ｘ＋２．６５９２となり、２種類のイムノアッセイ法はｙ≒ｘで、非常に相関が高かった。一方、ｐｒｏＢＮＰ：ＢＮＰのモル濃度比率０：１０（すなわちＢＮＰのみからなる標準物質）では、ｙ＝０．８１２３ｘ＋５．０１５６となり、２種類のイムノアッセイ法はｙ≒０．８ｘで、両法での乖離が確認された。
以上より、ＢＮＰのみでなく、ｐｒｏＢＮＰを添加することにより、複数の試薬で同等に使用可能な標準物質を作製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によりＢＮＰ標準化に即した物質を提供することができ、ＢＮＰ測定の臨床検査の精度管理や測定間格差の是正に貢献することができる。
【図１】
2014032062.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2014032062000001.app