(57)【要約】【課題】対象物の質量に応じた周波数の変化に基づいて、試料液中の対象物を感知するにあたり、簡易な手法で周波数変化を増幅させること。【解決手段】水晶片３１の表面に励振電極３２Ａ，３２Ｂを形成すると共に、裏面側に励振電極３３Ａ、３３Ｂを形成し、励振電極３２Ａ上に吸着層５１を固定化する。試料液を吸着層５１に供給すると、感知対象物Ｘが含まれているときには、前記対象物Ｘが前記吸着層５１に捕捉される。次いで、第１の液体を供給すると、第１の液体に含まれる第１の増感物質７１が前記対象物Ｘに結合する。続いて、第２の液体を供給すると、第２の液体に含まれる第２の増感物質８１が第１の増感物質７１と反応して不溶性物質８２を生成し、当該不溶性物質８２は電極３２Ａ上に沈降する。第１の増感物質７１と不溶性物質８２の質量に相当する分の質量増加が得られるため、これに対応して周波数変化が増幅される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を捕捉するための吸着層を備えた電極を圧電片に設けた圧電振動子を用い、当該圧電振動子を液体に接触させた状態で発振回路により発振させ、前記電極に付着した対象物の質量に応じた周波数の変化に基づいて、試料液中の対象物を感知する方法において、
前記試料液を吸着層に供給する工程と、
次に、前記対象物に結合する第１の増感物質を含む第１の液体を前記吸着層に供給する工程と、
次いで、前記第１の液体を前記吸着層から排出する工程と、
続いて、前記第１の増感物質と反応して不溶性物質を生成する第２の増感物質を含む第２の液体を前記吸着層に供給する工程と、
前記吸着層に液体を供給した後第２の液体を供給する前に、圧電振動子を発振させて発振回路の発振周波数に対応する第１の周波数信号を取得する工程と、
前記吸着層に第２の液体を供給してから、圧電振動子を発振させて発振回路の発振周波数に対応する第２の周波数信号を取得する工程と、を含むことを特徴とする感知方法。
【請求項２】
前記試料液、第１の液体及び第２の液体は、前記吸着層の表面を通流するように供給することを特徴とする請求項１記載の感知方法。
【請求項３】
前記第１の増感物質は、前記対象物と結合する吸着成分と、この吸着成分と結合し、前記第２の増感物質と反応して不溶性物質を生成する反応成分とを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の感知方法。
【請求項４】
前記第１の増感物質の吸着成分は前記対象物の抗体であり、前記第１の増感物質の反応成分はアルカリフォスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項３記載の感知方法。
【請求項５】
前記第２の増感物質は、前記第１の増感物質の反応成分がアルカリフォスファターゼであるときには、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾリウムクロライドとの混合物、及びナフトールＡＳ−ＢＩリン酸の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項４記載の感知方法。
【請求項６】
前記第２の増感物質は、西洋ワサビペルオキシダーゼであるときには、ジアミノベンジジン、3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン及び3-アミノ-9-エチルカルバゾールの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項４記載の感知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電片に設けられた電極上の吸着層に対象物を吸着させ、圧電片の固有振動数の変化に基づいて対象物を感知する感知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中や気体中の微量物質を感知する装置として、水晶振動子によるＱＣＭ（Quarts Crystal Microbalance）を用いた感知装置が知られている。この種の感知装置では、水晶発振回路を構成する水晶振動子に物質を例えば抗原抗体反応により吸着させ、このときの質量変化に応じた水晶振動子の固有振動数の変化を利用して、微量物質の定性分析や定量分析を行っている。このため、サンプルの質量が大きいほど振動数の変化量が大きく、精度の高い分析を行うことができる。  
しかしながら近年では、ピコオーダーやナノオーダー等の微量物質の計測が要請されており、一般的な抗原抗体反応を利用した感知装置では、振動数の変化量が微小であって高精度な分析に対応できないケースも出てきている。
【０００３】
特許文献１には、ＱＣＭセンサーを用いた定量において、ラテックス粒子又は金コロイド粒子よりなる質量増感微粒子を用いて質量増感し、さらに架橋性化合物を作用させて架橋反応による増感を図る技術が記載されている。この手法では、電極と、基質Ｂと基質Ｃとを固定化した質量増感微粒子ａとの間に測定対象物質を挟み込み、次いで基質Ｃを有する質量増感微粒子ｂと、基質Ｃに反応する基質Ｄを有する架橋性化合物Ｅを添加することが行われている。このため、薬剤の種類が多くなる上、予め増感微粒子ａ，ｂに夫々基質を固定化する作業が必要であることから、周波数変化の増幅作業を簡便に行うことは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２７５８６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、対象物の質量に応じた周波数の変化に基づいて、試料液中の対象物を感知するにあたり、簡易な手法で周波数変化を増幅させることができる感知方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対象物を捕捉するための吸着層を備えた電極を圧電片に設けた圧電振動子を用い、当該圧電振動子を液体に接触させた状態で発振回路により発振させ、前記電極に付着した対象物の質量に応じた周波数の変化に基づいて、試料液中の対象物を感知する方法において、
前記試料液を吸着層に供給する工程と、
次に、前記対象物に結合する第１の増感物質を含む第１の液体を前記吸着層に供給する工程と、
次いで、前記第１の液体を前記吸着層から排出する工程と、
続いて、前記第１の増感物質と反応して不溶性物質を生成する第２の増感物質を含む第２の液体を前記吸着層に供給する工程と、
前記吸着層に液体を供給した後第２の液体を供給する前に、圧電振動子を発振させて発振回路の発振周波数に対応する第１の周波数信号を取得する工程と、
前記吸着層に第２の液体を供給してから、圧電振動子を発振させて発振回路の発振周波数に対応する第２の周波数信号を取得する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
試料液中に対象物が含まれるときには、圧電振動子の電極に形成された吸着層に対して試料液を供給すると、前記対象物が前記吸着層に捕捉される。次いで、第１の液体を前記吸着層に供給すると、第１の液体に含まれる第１の増感物質が前記対象物に結合する。続いて、第２の液体を前記吸着層に供給すると、第２の液体に含まれる第２の増感物質が第１の増感物質と反応して不溶性物質を生成し、当該不溶性物質が電極上に沈降する。このように、第１の液体と第２の液体の供給という簡易な手法で、第１の増感物質と不溶性物質の質量に相当する分の質量増加が得られ、これに対応して周波数変化を増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の感知方法を実施する感知装置の一例を示す縦断面図である。
【図２】センサユニットの一例を示す分解斜視図である。
【図３】センサユニットに用いられる水晶振動子の一例を示す平面図である。
【図４】感知装置における回路構成を示す概略図である。
【図５】感知装置を用いて行われる本発明の感知方法を示す工程図である。
【図６】感知方法を示す工程図である。
【図７】感知方法を示す工程図である。
【図８】感知方法を示すフローチャートである。
【図９】本発明の感知方法を実施する感知装置の他の例を示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の感知方法を実施する感知装置の一例について、図１〜図４を参照して説明する。この感知装置では、感知センサである水晶センサを備えており、この水晶センサはセンサユニット１に収納されている。例えばセンサユニット１は、図１及び図２に示すように、支持体１１、封止部材１２、配線基板２、圧電振動子である水晶振動子３、流路形成部材１３及び上部カバー１４を下側からこの順番で積層して構成されている。
【００１０】
水晶センサ４は配線基板２上に水晶振動子３を設けてなり、この水晶振動子３は、図２及び図３に示すように、例えばＡＴカットの圧電片である円板状の水晶片３１の表面側及び裏面側に、夫々例えば金（Ａｕ）などからなる励振電極を設けて構成されている。この例では、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、水晶片３１の裏面側に第１の励振電極３３Ａ及び第２の励振電極３３Ｂを互いに離間して配置すると共に、表面側に前記励振電極３３Ａ、３３Ｂに対する第１の励振電極３２Ａ及び第２の励振電極３２Ｂを備えた共通の励振電極（共通電極）３２を配置している。従って、図４に示すように、第１の励振電極３３Ａ及び第１の励振電極３２Ａにより第１の振動領域３Ａが形成され、第２の励振電極３３Ｂ及び第１の励振電極３２Ｂにより第２の振動領域３Ｂが形成されている。
【００１１】
前記裏面側の第１の励振電極３３Ａ及び第２の励振電極３３Ｂは、夫々引出電極３３１，３３２を介して、図２に示すように、水晶センサ４をセンサユニット１に装着した時に、配線基板２上に引き回された導電路２２、２４に夫々電気的に接続されている。また、前記表面側の第１の励振電極３２Ａ及び第２の励振電極３２Ｂを備えた共通電極３２は、裏面側へ回り込むように形成された引出電極３２１を介して、水晶センサ４をセンサユニット１に装着した時に、配線基板２上に形成された導電路２３に電気的に接続されている。配線基板２の端部領域には、各導電路２２〜２４と夫々接続される接続端子２５〜２７が形成されている。そして、これら導電路２２、２４は、図４に示すように、第１の発振回路４Ａ及び第２の発振回路４Ｂに夫々接続され、共通電極４２は発振回路４Ａ、４Ｂのアース側に接続される。尚、図３（ａ）は水晶振動子３の表面側、同図（ｂ）は裏面側を夫々示している。
【００１２】
前記第１の励振電極３２Ａの表面には、図４に示すように、感知対象物を捕捉して吸着するための第１の吸着層５１が形成されている。感知対象物ＸがＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）である抗原である場合を例にして説明すると、第１の吸着層５１は、例えば感知対象物Ｘである抗原と反応することにより、当該感知対象物Ｘを捕捉する例えば抗ＣＲＰ抗体等の抗体Ａにより構成される。一方、第２の励振電極３２Ｂの表面には第２の吸着層５２が形成され、この吸着層５２は、例えば抗ウサギＩｇＧ抗体等の感知対象物Ｘと反応しない抗体Ｂにより構成される。ここで、反応とは、抗原抗体反応のように、対象物（抗原）と吸着膜（抗体）との結合により、対象物の分に相当する質量付加が行われることをいう。この例では、第１の吸着層５１に感知対象物Ｘが結合するため、第１の振動領域３Ａを構成する電極３２Ａ，３３Ａが反応電極対となり、第２の振動領域３Ｂを構成する電極３２Ｂ，３３Ｂがリファレンス電極対となる。ここで、リファレンス電極対に第２の吸着層５２を設けるのは、測定環境を反応電極対に近づけると共に、感知対象物に硫黄（Ｓ）が含まれている場合には、例えば金よりなる電極と硫黄との反応を防ぐためである。
【００１３】
水晶振動子３は、図１及び図２に示すように、配線基板２に形成された貫通孔２１を塞ぐように装着されており、水晶センサ４は、この図２に示すように、弾性体からなる流路形成部材１３と、リング状の弾性体からなる封止部材１２とにより夫々表面側及び裏面側が押し付けられた状態でセンサユニット１に取り付けられる。図１及び図２中１５は液体供給管、１６は液体排出管であり、液体供給管１５を介して供給された液体が流路形成部材１３と水晶振動子３との間の流路である液体供給領域１７を通流して液体排出管１６から排出されるように構成されている。
【００１４】
また、液体供給管１５には、図１に示すように、例えば夫々バルブＶ１〜Ｖ４を備えた供給路６１ａ，６２ａ，６３ａ，６４ａを介して、試料液の供給源６１、第１の液体の供給源６２、第２の液体の供給源６３、緩衝液の供給源６４に夫々接続されている。前記第１の液体とは第１の増感物質７１を含む液体であり、前記第１の増感物質７１とは感知対象物Ｘと結合し、かつ後述する第２の増感物質８１と反応して不溶性物質８２を生成するものをいう。この例では、第１の増感物質７１は、前記感知対象物と結合する吸着成分７２と、この吸着成分７２と結合すると共に前記第２の増感物質８１と反応して不溶性物質８２を生成する反応成分７３とを含むものである。具体的には、例えば前記第１の増感物質７１の吸着成分７２は感知対象物Ｘの増感用抗体Ｃよりなる。この増感用抗体Ｃは例えば感知対象物Ｘが抗体Ａと反応（結合）する部位とは異なる部位にて反応するもの、例えば感知対象物ＸがＣＲＰである場合には、抗体Ａとは異なる抗ＣＲＰ抗体等が用いられる。但し、反応が確認されているものであれば増感用抗体Ｃとして抗体Ａと同じものを用いるようにしてもよい。
【００１５】
また、前記第１の増感物質７１の反応成分７３としては、例えばアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）が用いられる。このＡＬＰとは、分子量が８００００〜１０００００程度の、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する酵素である。例えばこのＡＬＰと増感用抗体Ｃとを、予めアミンカップリングすることにより反応させて、増感用抗体ＣにＡＬＰが付加した第１の増感物質７１を生成しておく。そして、この第１の増感物質７１をゲル濾過や透析により精製することにより第１の液体を得る。
【００１６】
前記第２の液体は、前記第１の増感物質７１の反応成分７３と反応して不溶性物質８２を生成する第２の増感物質８１を含むものである。前記反応成分７３がＡＬＰである場合には、第２の増感物質８１としては、例えばＡＬＰの基質であるＢＣＩＰ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸）とＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）の混合物が用いられ、第２の液体はＢＣＩＰとＮＢＴとを混合した溶液よりなる。また、緩衝液とは、試料液、第１の液体及び第２の液体と反応しない液体例えばリン酸バッファーよりなる。
【００１７】
第１の増感物質７１の反応成分７３であるＡＬＰに、第２の増感物質８１であるＢＣＩＰ／ＮＢＴを作用させると、ＡＬＰがＢＣＩＰを酸化する過程で、ＮＢＴが酸化されて、不溶性物質８２であるＮＢＴホルマザンが生成する。この不溶性物質８２とは、水晶振動子３に供給される液体である試料液、第１の液体、第２の液体及び緩衝液に溶解しない性質の物質をいう。  
このような試料液、第１の液体、第２の液体及び緩衝液は、例えばシリンジポンプ等に貯留されており、夫々所定の流量で供給路６１ａ〜６４ａ及び液体供給管１５を介してセンサユニット１の液体供給領域１７に供給される。また、液体排出管１６の下流側には排液部６５が設けられている。
【００１８】
水晶センサ４の説明に戻ると、図４に示すように、前記第１の振動領域３Ａを発振させるための第１の発振回路４Ａ、第２の振動領域３Ｂを発振させるための第２の発振回路４Ｂの発振出力（周波数信号）は、スイッチ部４１により交互に周波数測定部４２に取り込まれるように構成されている。この周波数測定部４２は、例えば周波数カウンターや、例えば特開２００６−２５８７８７号等に記載されているように回転ベクトルの速度を求める手法などによって、周波数を検出するように構成されている。この周波数測定部４２にて得られた各振動領域３Ａ、３Ｂの各々の発振周波数は、データ処理部４３に送られ、例えば演算部である差分取得プログラム４４によって比較され（差分を取られ）、例えば表示部４５に表示される。尚、図４中４６はＣＰＵ、４０はバスである
次に、上述の感知装置を用いて行われる本発明の感知方法において、図５〜図８を参照して、感知対象物Ｘの有無を検出する場合を例にして説明する。先ず、水晶振動子３において、図５及び図６（ａ）に示すように、第１の励振電極３２Ａの表面に抗体Ａを固定化して第１の吸着層５１を形成すると共に、第２の励振電極３２Ｂの表面に抗体Ｂを固定化して第２の吸着層５２を形成する。次いで、この水晶振動子３をセンサユニット１内に収納して図２に示すように気密に一体化すると共に、配線基板２に形成された接続端子２５〜２７を介して振動領域３Ａ、３Ｂと発振回路４Ａ、４Ｂとを夫々電気的に接続する。
【００１９】
続いて、バルブＶ４を開いて緩衝液を供給路６４ａ及び液体供給管１５を介してセンサユニット１内に所定の流量で供給する（ステップＳ１）。これにより、緩衝液はセンサユニット１の液体供給領域１７を通流していき、当該液体供給領域１７の内部は気相から液相に変化する。そして、各発振回路４Ａ、４Ｂにより例えば９ＭＨｚの周波数で水晶振動子３（振動領域３Ａ、３Ｂ）を発振させ、周波数測定部４２においてこれら振動領域３Ａ、３Ｂの各々の発振周波数の測定を開始して、夫々の発振回路４Ａ，４Ｂの発振周波数を取得する（ステップＳ２）。このとき取得した振動領域３Ａの発振周波数が第１の周波数信号に相当する。なお、発振周波数の測定は、緩衝液をセンサユニット１内に供給する前に開始するようにしてもよい。
【００２０】
緩衝液を液体供給領域１７に満たすように供給した後、バルブＶ４を閉じて緩衝液の供給を停止し、バルブＶ１を開いて試料液を供給路６１ａ及び液体供給管１５を介してセンサユニット１内に所定の流量で供給する（ステップＳ３）。これにより試料液は、センサユニット１の液体供給領域１７を通流していき、当該試料液中に感知対象物Ｘが含まれる場合には、図５及び図６（ｂ）に示すように、感知対象物Ｘが抗原抗体反応により第１の吸着層５１に速やかに吸着（結合）する。一方、感知対象物Ｘは抗体Ｂとは反応しないため、第２の吸着層５２には吸着しない。
【００２１】
こうして、第１の吸着層５１と感知対象物Ｘとの反応が十分に進行する時間、センサユニット１に試料液を供給した後、バルブＶ１を閉じて試料液の供給を停止し、バルブＶ２を開いて第１の液体の供給を開始する（ステップＳ４）。これにより第１の液体は、センサユニット１の液供給領域１７を通流していく。そして、図５及び図７（ａ）に示すように、第１の液体中に含まれる第１の増感物質７１の吸着成分７２（増感用抗体Ｃ）は、第１の吸着層５１に捕捉された感知対象物Ｘに抗原抗体反応により結合する。一方、第２の吸着層５２には感知対象物Ｘが吸着されていないため、第２の吸着層５２には吸着せずに通流していく。感知対象物Ｘと第１の増感物質７１の吸着成分との反応が十分に進行する時間、センサユニット１に第１の液体を供給した後、バルブＶ２を閉じて第１の液体の供給を停止し、バルブＶ４を開いて緩衝液の供給を開始する（ステップＳ５）。これにより緩衝液が前記液供給領域１７を通流していくため、当該液供給領域１７つまり励振電極３２Ａ，３２Ｂ上の第１の液体が排出される。
【００２２】
こうして、液供給領域１７内を緩衝液で置換した後、バルブＶ４を閉じて緩衝液の供給を停止し、バルブＶ３を開いて第２の液体の供給を開始する（ステップＳ６）。これにより第２の液体は前記液供給領域１７を通流していき、第２の増感物質８１であるＢＣＩＰ／ＮＢＴは、既述のように第１の増感物質７１の反応成分７３であるＡＬＰと速やかに反応して前記不溶性物質８２を生成する。この不溶性物質８２は、図５及び図７（ｂ）に示すように、感知対象物Ｘに結合したＡＬＰの周囲のみならず、増感用抗体Ｃや感知対象物Ｘの周囲に付着すると共に、第１の励振電極３２Ａ上に沈降していく。一方、第２の励振電極５２上にはＡＬＰが存在しないため、第２の液体を供給しても、ＢＣＩＰ／ＮＢＴとの反応が発生せず、不溶性物質８２は生成しない。図７（ｂ）では、第１の励振電極３２Ａ側で生成した不溶性物質８２が、第２の液体の通流により液供給領域１７内に形成された液流れに沿って、第２の励振電極３２Ｂ側に移動していく様子を示している。  
ここで、第１の液体の通流と第２の液体の通流との間に緩衝液を通流させるのは、第１の液体中のＡＬＰと第２の液体中のＢＣＩＰ／ＮＢＴとの反応は速やかに進行するため、第１の液体と第２の液体とが通流する供給路や液体供給管１５内でのこれらの反応を抑えるためである。
【００２３】
こうして、試料液中に感知対象物Ｘが含まれている場合には、第１の励振電極３２Ａ側において、感知対象物Ｘが抗原抗体反応によって第１の吸着層５１へ捕捉される。そして、この第１の吸着層５１に捕捉された感知対象物Ｘに対して第１の増感物質７１の吸着成分７２が抗原抗体反応により結合する。さらに、第１の吸着層５１上の感知対象物Ｘに結合した第１の増感物質７１の反応成分７３と第２の増感物質８１との反応によって不溶性物質８２の生成が起こり、当該不溶性物質８２が第１の励振電極３２Ａに沈降する。
【００２４】
前記第１の増感物質７１は反応成分７３としてＡＬＰを用いているが、このＡＬＰは分子量が８００００〜１０００００と大きいので、第１の増感物質７１を感知対象物Ｘに結合させただけでも、質量の付加効果が得られる。さらに、第１の増感物質７１中のＡＬＰと第２の増感物質８１であるＢＣＩＰ／ＮＢＴとの反応は速やかに進行し、大量の不溶性物質８２を生成する。この不溶性物質８２は、既述のようにＡＬＰや感知対象物Ｘ、増感用抗体Ｃや第１の吸着層５１に分子間力により付着した状態である。このため、第１の励振電極３２Ａ（第１の吸着層５１）の表面では、第２の液体の液流れが形成されていても、不溶性物質８２が第１の励振電極３２Ａ表面に留まるため、第１の励振電極３２Ａでは非常に大きな質量が付加されることになる。
【００２５】
従って、第１の振動領域３Ａでは、捕捉された感知対象物Ｘの質量のみならず、前記感知対象物Ｘに結合した第１の増感物質７１の質量と、第２の励振電極３２Ａ側に付着した不溶性物質８２の質量に相当する分の質量付加効果が起こり、発振周波数が低下する。こうして、第２の液体を供給してから、これら振動領域３Ａ、３Ｂの各々の発振回路４ａ，４Ｂの発振周波数を取得する（ステップＳ７）。このとき取得した振動領域３Ａの発振周波数が第２の周波数信号に相当する。そして、第２の液体を供給する前に取得した第１の周波数信号との差分を取り、この差分に基づいて感知対象物Ｘの有無を判定する（ステップＳ８）。この第２の周波数信号を取得するタイミングは、例えば１の励振電極３Ａ（第１の吸着層５１）へ第２の液体の供給を開始してから、第１の増感物質７１の反応成分７３と第２の増感物質８１との反応が十分に進行する時間経過後である。具体的には、例えば第２の液体をセンサユニット１に供給してから１２００秒後のタイミングである。
【００２６】
上述の例では、第１の周波数信号を取得するタイミングで各振動領域３Ａ、３Ｂの発振周波数を取得して両者の差分を取る（第２の液体供給前の差分データ）と共に、第２の周波数信号を取得するタイミングで各振動領域３Ａ、３Ｂの発振周波数を取得して両者の差分を取る（第２の液体供給後の差分データ）。こうして、第２の液体供給後の差分データから第１の液体供給前の差分データを差し引くことにより、感知対象物Ｘの質量に対応する周波数データを算出し、このデータに基づいて、感知対象物Ｘの有無が判定される。この判定は、例えばデータ処理部４３において、予め設定された閾値と比較して、前記周波数データが閾値以上であれば感知対象物Ｘが「有る」とし、閾値未満であれば感知対象物Ｘが「無い」とすることにより行なわれる。この判定結果や周波数データは例えば表示部４５に表示される。この例では、第２の振動領域３Ｂの発振周波数は温度変化や水溶液そのものの粘度、あるいは対象物以外の物質の付着などの外乱によるものであることから、第１の振動領域３Ａの発振周波数から第２の振動領域３Ｂの発振周波数を差し引くと、外乱による周波数の変動分を補償した、対象物の吸着に起因する周波数の差分が得られる。このため、感知対象物Ｘの有無について精度の高い計測を行うことができる。
【００２７】
上述の実施の形態によれば、既述のように、試料液中に感知対象物Ｘが存在する場合には、捕捉された感知対象物Ｘの質量のみならず、前記感知対象物Ｘに結合した第１の増感物質７１の質量と、第２の励振電極３２Ａ側に沈降した不溶性物質８２の質量に相当する質量付加効果が起こる。このため、感知対象物Ｘが微量であっても、第１の増感物質７１と不溶性物質８２の質量に相当する分、周波数変化が増幅される。これにより、感知対象物Ｘを感度良く感知することができる。  
また、第１の吸着層５１に第１の増感物質７１を含む第１の液体を供給し、当該第１の液体を排出してから第２の増感物質８１を含む第２の液体を供給すればよいので、簡易な手法で周波数変化を増幅することができる。さらに、薬剤は第１の増感物質７１を構成する吸着成分７２と反応成分７３、及び第２の増感物質８２のみであるので使用する薬剤が少なくて済み、予め調製する薬剤は第１の増感物質７１のみであるため、調製作業も容易である。
【００２８】
さらにまた、第１の増感物質７１の吸着成分７２を感知対象物Ｘ（抗原）の抗体とし、反応成分７３を酵素であるＡＬＰ、第２の増感物質８１をＡＬＰの基質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴとしている。このため、感知対象物Ｘへの第１の増感物質７１の結合、及び第１の増感物質７１と第２の増感物質８１の反応とが速やかに起こる。これにより、試料液、第１の液体及び第２の液体を第１の吸着層５１の表面を通流するように供給しても、既述の反応が十分に進行する。従って、試料液、第１の液体及び第２の液体を所定の流量で所定時間通流させることにより、確実に周波数の増幅作用を確保することができるので、当該増幅作用を得るにあたってスループットの低下を抑えられる。
【００２９】
また、上述の例では、液体をセンサユニット１に通流しながら供給しているので、第１の液体と第２の液体との間に緩衝液を第１の吸着層５１の表面を通流するように供給することにより、第１の吸着層５１の表面から第１の液体の排出を行うことができ、当該排出作業を容易に行うことができる。
【００３０】
また、不溶性物質８２は例えば分子量が約５００と小さいので、第２の液体を第１の吸着層５１の表面に通流させることにより、第１の励振電極３２Ａに沈降しない分の不溶性物質８２は液流れに沿って液体供給領域１７から排出されていく。従って、不溶性物質８２がセンサーユニット１の流路内を塞いで第２の液体の通流を妨げ、励振電極３２Ｂ（第２の吸着層５２）側に不溶性物質８２が沈降してしまうといった事態の発生が抑えられ、安定した計測を行うことができる。
【００３１】
続いて、第１の増感物質７１と第２の増感物質８１の他の例について、表１を参照して説明する。表１に示すように、第１の増感物質７１の反応成分７３がＡＬＰである場合には、第２の増感物質８１はナフトールＡＳ−ＢＩリン酸（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）を用いることができる。この場合、ＡＬＰとＦａｓｔ  Ｒｅｄとの反応によりアゾ色素よりなる不溶性物質８２が生成する。
【００３２】
また、第１の増感物質７１の反応成分７３を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とし、第２の増感物質８２をジアミノベンジジン（ＤＡＢ：Diamino benzidine）、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine）、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（ＡＥＣ：3-amino-9-ethylcarbazole)のいずれかとしてもよい。ＨＲＰは、分子量が４０，０００程度であって、ペルオキシド構造を酸化的に切断してヒドロキシル基に分解する酵素であり、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＡＥＣは夫々ＨＲＰの基質である。
【００３３】
この場合、第１の増感物質７１は、増感用抗体ＣとＨＲＰとをアミンカップリングすることにより結合させて構成され、この第１の増感物質７１をゲル濾過や透析により精製することにより第１の液体が得られる。また、第２の液体は、第２の増感物質８２であるＤＡＢ、ＴＭＢ、ＡＥＣを単体で使用する。そして、第２の増感物質８１がＤＡＢである場合には、ＨＲＰとＤＡＢとの反応により不溶性物質８２である酸化ＤＡＢが生成する。また、第２の増感物質８１がＴＭＢである場合には、ＨＲＰとＴＭＢとの反応により不溶性物質８２である酸化ＴＭＢが生成する。さらに、第２の増感物質８１がＡＥＣである場合には、ＨＲＰとＡＥＣとの反応により不溶性物質８２である酸化ＡＥＣが生成する。
【００３４】
【表１】
2014006208.tif 000003
【００３５】
以上において、ＡＬＰやＨＲＰと増感用抗体Ｃとは予め結合させておくことが好ましいが、吸着成分７２を感知対象物Ｘに抗原抗体反応により結合させた後、反応成分７３を供給するようにしてもよい。このように、第１の増感物質７１を構成する吸着成分７２を吸着層５１に供給してから、反応成分７３を吸着層５１に供給する場合も、第１の増感物質７１を含む第１の液体を前記吸着層５１に供給する工程の実施に含まれる。
【００３６】
また、本発明の感知方法を実施する感知装置は、図９に示すように構成してもよい。この例は、反応電極対９１を備えた水晶振動子９Ａと、リファレンス電極９２を備えた水晶振動子９Ｂを用意し、一方のセンサユニット１Ａには反応電極対９１Ａを備えた水晶振動子９Ａ、他のセンサユニット１Ｂにはリファレンス電極対９１Ｂを備えた水晶振動子９Ｂを設けたものである。前記反応電極対９１には第１の吸着層５１が形成され、リファレンス電極対９２には第２の吸着層５２が形成されている。夫々のセンサユニット１Ａ，１Ｂには、供給路６１ａ〜６４ａを介して試料液、第１の液体、第２の液体及び緩衝液が夫々供給されるように構成されている。例えば試料液、第１の液体、第２の液体及び緩衝液は、センサユニット１Ａ及びセンサユニット１Ｂに同じタイミングで供給される。そして、水晶振動子９Ａを発振させるための第１の発振回路４Ａ、水晶振動子９Ｂを発振させるための第２の発振回路４Ｂの夫々の発振出力（周波数信号）は、スイッチ部４１により交互に周波数測定部４２に取り込まれ、既述の手法で、周波数の差分データが取得されるように構成されている。  
この例においては、反応電極対９１とリファレンス電極対９２とが夫々別個のセンサユニット１Ａ，１Ｂに設けられているので、反応電極対９１側で生成した不溶性物質８２がリファレンス電極側９２に移動していくおそれがない。このため、より精度の高い計測を行うことができる。
【００３７】
以上において、後述の実施例より明らかなように、第２の液体供給後における第１の振動領域３Ａの発振周波数の変化分は非常に大きい。従って感知対象物Ｘの有無を判定する定性分析を行う場合には、前記吸着層５１に液体を供給した後第２の液体を供給する前に取得した発振周波数（第１の周波数信号）と、第２の液体を吸着層５１に供給してから取得した発振周波数（第２の周波数信号）との差に基づいて判定するようにしてもよい。従って、吸着層５１に緩衝液を供給した後、第２の液体供給前においては、どのタイミングの振動領域３Ａの発振周波数であっても、第２の液体供給後の振動領域３Ａの発振周波数との差分を取ることにより、感知対象物Ｘの有無を判定することができる。また、試料液供給前に緩衝液を供給する必要は必ずしもなく、試料液をセンサユニット１に供給することにより、液供給領域１７を気相から液相に置換するようにしてもよい。
【００３８】
以上において、本発明の感知方法は、試料中の感知対象物の定量分析にも適用できる。図１に示すセンサユニット１を例にして説明すると、例えばセンサユニット１に緩衝液を供給し、試料液を供給する前に、水晶振動子３を発振させて発振周波数（第１の周波数信号）を取得しておく。そして、センサユニット１に第２の液体を供給してから、水晶振動子３を発振させて発振周波数（第２の周波数信号）を取得する。こうして、例えば第２の液体を供給してからの各振動領域３Ａ、３Ｂの発振周波数の差分を取ると共に、この差分から、緩衝液供給後試料液供給前に取得した各振動領域３Ａ、３Ｂの発振周波数との差分を差し引くことにより、感知対象物Ｘの質量に対応する周波数データを算出する。そして、予め取得しておいた周波数と質量との相関関係を示す検量線に基づいて、感知対象物Ｘの質量を求める。
【００３９】
また、本発明では、例えば前記吸着層に液体を供給した後第２の液体を供給する前に取得した第１の周波数信号と、前記吸着層に第２の液体を供給してから取得した第２の周波数信号とを表示部４５に表示し、これらの周波数信号の差に基づいて、オペレータが感知対象物Ｘの有無の判定や、感知対象物Ｘの定量を行うようにしてもよい。前記第１の周波数信号及び第２の周波数信号は、発振周波数の測定開始から所定時間毎又は予め設定されたタイミングで取得したデータを表示部４５に表示してもよいし、発振周波数の測定開始から取得したデータを連続的にプロットしてグラフ化したものを表示してもよい。
【００４０】
さらに、上述の例では、緩衝液、試料液、第１の液体及び第２の液体を吸着層５１の表面を通流するように供給したが、このときの通流速度や供給時間は液体の種類毎に変えるようにしてもよい。例えば試料液、第１の液体及び第２の液体では、夫々の反応を十分に進行させるために、夫々の液体の通流速度や供給時間の最適化を図るようにしてもよい。さらに、例えば液体排出管１６に開閉バルブを設け、試料液、第１の液体及び第２の液体を供給するときに、所定時間開閉バルブを閉じて、第１の液体等を吸着層の表面近傍に滞留させ、夫々の反応を十分に進行させてから、液体の通流を再開するようにしてもよい。
【００４１】
さらにまた、本発明では、第１の液体を吸着層に供給した後、第２の液体を供給する前に、第１の液体を吸着層から排出する工程を実施する必要がある。吸着層５１の表面に第１の液体が存在するときに第２の液体を供給すると、吸着層５１に感知対象物Ｘが捕捉されていない場合であっても、第１の液体に含まれる第１の増感物質７１と第２の液体に含まれる第２の増感物質８１との反応が起こり、不溶性物質８２が生成して吸着層５１上に沈降する。既述のように、前記不溶性物質は吸着層５１（励振電極３２Ａ）に分子間力によって付着しているため、不溶性物質８２が生成してから第２の液体を吸着層５１から排出しても、不溶性物質８２の一部は残存してしまい、精度の高い計測を行うことができなくなるおそれがあるからである。
【００４２】
但し、緩衝液、試料液、第１の液体及び第２の液体は、必ずしも吸着層５１の表面を通流するように供給する必要はない。第１の液体を吸着層５１に供給した後、第２の液体を供給する前に、第１の液体を吸着層５１から排出する工程を実施するようにすれば、感知対象物が含まれないときの第１の増感物質７１と第２の増感物質８２との反応が抑えられるからである、ここで、第１の液体を吸着層５１から排出する工程の実施は、オペレータが吸着層５１から第１の液体を除去する作業を行うようにしてもよいし、既述の例のように第１の液体を緩衝液で置換することにより行ってもよい。また、第１の液体をポンプ等により吸引して除去するようにしてもよく、上述のセンサユニット１にて第１の液体を液供給領域１７から吸引除去する場合には、第１の液体の供給後に緩衝液を供給する必要はない。さらに、バルブＶ１〜Ｖ４の切り替えは手動にて行ってもよいし、自動的に操作を行うようにしてもよい。
【００４３】
さらに、本発明では、第１の増感物質７１の反応成分７３として、ＡＬＰとＨＲＰとを組み合わせて用いてもよい。また、第１の増感物質７１の反応成分７３がＡＬＰの場合に、第２の増感物質８１として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴとＦａｓｔ  Ｒｅｄとを組み合わせて用いてもよいし、第１の増感物質７１の反応成分７３がＨＲＰの場合に、第２の増感物質８１として、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＡＥＣのいずれか又は全てを組み合わせて用いてもよい。また、本発明では、ＡＴカット以外の水晶振動子を用いるようにしてもよい。
【実施例】
【００４４】
図１に示す感知装置を用い、感知対象物ＸとしてＣＲＰ（抗原）を含む試料液をセンサユニット１に通流させて、発振周波数の変化を測定した。このとき、第１の励振電極３２Ａの表面に抗ＣＲＰ抗体よりなる抗体Ａを第１の吸着層５１として形成すると共に、第２の励振電極３２Ｂの表面に抗ウサギＩｇＧ抗体よりなる抗体Ｂを第２の吸着層５２として形成し、第１の増感物質７１としては、吸着成分７２が抗体Ａとは異なる抗ＣＲＰ抗体よりなる増感用抗体Ｃ、反応成分７３がＡＬＰであるものを用いた。そして、センサユニット１に緩衝液と、試料液と、第１の液体と、緩衝液と、第２の液体とをこの順番で夫々５μｌ／ｍｉｎの流量で６００秒間供給し、試料液を供給しているときと、第１の液体を供給しているときと、第２の液体を供給しているときの発振周波数を夫々取得した。発振周波数の取得のタイミングは、各液体のセンサユニット１への供給開始から１２００秒後である。
センサユニット１内に試料液を供給してから、夫々のタイミングで取得した発振周波数を表２に示す。この発振周波数は、夫々のタイミングで取得した発振周波数と緩衝液を供給しているときに取得した発振周波数との差分を示したものである。
【００４５】
【表２】
2014006208.tif 000004
【００４６】
この結果、第２の液体を供給後の発振周波数のデータは、反応電極対とリファレンス電極対との間で大きく異なり、第１の増感物質７１と第２の増感物質８１との反応によって不溶性物質８２を生成させることにより、大きな質量付加効果を得ることができ、周波数変化を大きく増幅できることが確認された。なお、第２の液体供給後においてはリファレンス電極対においても、周波数変化が大きくなっている。これは液体供給領域１７における第２の液体の流れに沿って、第１の励振電極３２Ａ側にて生成した不溶性物質８２が第２の励振電極３２Ｂに流れていき、当該励振電極３２Ｂに沈降したことにより起こったものと推察される。
【符号の説明】
【００４７】
１          センサユニット
３          水晶振動子
３Ａ，３Ｂ  振動領域
４          水晶センサ
４Ａ，４Ｂ  発振回路
５１        第１の吸着層
７１        第１の増感物質
７２        吸着成分
７３        反応成分
８１        第２の増感物質
８２        不溶性物質
４２        周波数測定部
【図１】
2014006208.tif 000005
【図２】
2014006208.tif 000006
【図３】
2014006208.tif 000007
【図４】
2014006208.tif 000008
【図５】
2014006208.tif 000009
【図６】
2014006208.tif 000010
【図７】
2014006208.tif 000011
【図８】
2014006208.tif 000012
【図９】
2014006208.tif 000013