(57)【要約】【課題】  タパシン（Ｔｐｎ）は、ＭＨＣクラスＩ担持複合体のメンバーであり、ＴＡＰペプチドトランスポーターとＭＨＣクラスＩ分子を架橋させるために働く。転移性ヒト癌は、低レベルの抗原プロセシング成分（ＡＰＣ）タパシン及びＴＡＰを発現し、数個の機能性表面ＭＨＣクラスＩ分子を提示する。結果として、癌は、エフェクター細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識不能であることが多い。【解決手段】  Ｔｐｎ単独で腫瘍に対する哺乳動物の生存及び免疫を高めることはできるが、ただし追加的に、ＴｐｎとＴＡＰを免疫療法ワクチンプロトコルの成分として一緒に使用して、腫瘍を根絶することができる。【選択図】  図５
2014196338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するための、ヒト細胞に投与される医薬組成物であって、唯一の免疫応答増強剤として、前記抗原を有する前記細胞中のタパシンのレベルを増加させるためにタパシンをコードする核酸を含んでいる有効量のベクターを含み、前記抗原が、インフルエンザ抗原、天然痘抗原、及び結核抗原からなる群から選択される、上記医薬組成物。
【請求項２】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ベクターが、プラスミドベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記投与をｅｘ  ｖｉｖｏで行う、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記投与をｉｎ  ｖｉｖｏで行う、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するための、ヒト細胞に投与される医薬組成物であって、唯一の免疫応答増強剤として組み合わせて、有効量の（ａ）前記抗原を有する前記細胞中のタパシンのレベルを増加させるためにタパシンをコードする核酸を含んでいるベクター、及び（ｂ）前記細胞中のＴＡＰ−１のレベルを増加させるためにＴＡＰ−１をコードする核酸を含んでいるベクターを含み、前記抗原が、インフルエンザ抗原、天然痘抗原、及び結核抗原からなる群から選択される、上記医薬組成物。
【請求項８】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ベクターが、プラスミドベクターである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記投与をｅｘ  ｖｉｖｏで行う、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記投与をｉｎ  ｖｉｖｏで行う、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する腫瘍抗原の交差提示による抗腫瘍免疫応答の開始と、腫瘍特異的細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）による腫瘍細胞の認識及び死滅の両方にとって重要である。２つのこれらのプロセスにおける重要な成分は、４８ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質であるシャペロンタンパク質タパシン（Ｔｐｎ）であり、その機能は、小胞体（ＥＲ）のクラスＩ分子に抗原ペプチドを担持させるのに寄与することである。Ｔｐｎがこの機能を仲介する機構には、ペプチドを担持するまでのＥＲの空のＭＨＣクラスＩ分子の保持、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）タンパク質の安定化、ＭＨＣクラスＩ抗原とＴＡＰの架橋形成、及びＭＨＣクラスＩ抗原と高親和性ペプチドの結合の支援がある。Ｔｐｎの存在下では、表面ＭＨＣクラスＩ分子はより安定しており、したがってＣＴＬ又はその前駆体に対して抗原を提示する際により効率的である。Ｔｐｎ発現の欠損は、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２を含めたＭＨＣクラスＩ担持複合体の不安定化、及び細胞表面でのＭＨＣ分子の発現の低減をもたらす。
【０００２】
Ｔｐｎは、乳癌、メラノーマ、結腸直腸癌、及び小細胞と非小細胞肺癌の両方などの多くのヒトの癌、並びにマウス線維肉腫及びマウスメラノーマなどのマウスの癌において下方制御されることが知られている。特に、ヒト結腸直腸癌では、Ｔｐｎは、ＴＡＰ１、潜在性膜タンパク質２（ＬＭＰ２）及び潜在性膜タンパク質７（ＬＭＰ７）よりも頻繁に欠失し、それにより、Ｔｐｎの欠失がこれらの腫瘍において免疫監視に打ち勝つ上での重要な事象であり得ることが示唆される。さらに、ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路中のＴｐｎを含めた成分の下方制御又は欠損は、腫瘍の免疫原性の低下をもたらし、様々なヒトの癌における疾患の進行及び疾患の転帰と関係付けられる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける自然発生肺癌由来のマウス肺癌細胞系ＣＭＴ．６４は、ＭＨＣクラスＩ重鎖、β２−マイクログロブリン、ＬＭＰ２及びＬＭＰ７、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２、並びにＴｐｎを含めた抗原提示経路の多くの成分の下方制御によって特徴付けられる。いくつもの試験において、複製ワクシニアウイルス又は非複製アデノウイルスを使用してＣＭＴ．６４及び他の腫瘍細胞中のＴＡＰ−１発現を回復させると、腫瘍抗原特異的免疫応答が増大し、動物の生存期間が延長することが実証されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、非複製アデノウイルスから発現される、単独の、又はヒトＴＡＰ１（ｈＴＡＰ１）と組み合わせたヒトＴｐｎ（ｈＴｐｎ）が抗原提示を回復し、腫瘍抗原特異的免疫応答を増大させ、腫瘍を有する哺乳動物の生存期間を延長することができるかどうかを決定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、機能性表面ＭＨＣクラスＩ抗原複合体の発現を回復させ、腫瘍細胞の免疫原性を増加させ、これらの転移性腫瘍を有する動物の長期の生存を促進するための、Ｔｐｎ欠損癌細胞におけるＴｐｎの発現を対象とする。Ｔｐｎ欠損マウス肝臓癌細胞系Ｈ６癌細胞系及びヒトＨｅｐＧ２細胞系においてＴｐｎを発現させると、表面ＭＨＣクラスＩの発現が増大することが示されており、それにより、この手法が多くの癌を治療する際に有効であり得ることが示唆される。ここに表す結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｄｈＴｐｎ感染によってＭＨＣクラスＩの表面発現及び免疫原性を増強させると、ＣＭＴ．６４腫瘍の増殖が有意に遅延し、動物の生存が高まることが示される。腫瘍の部位への局所的なＡｄｈＴｐｎ注射により、ＣＭＴ．６４細胞に感染し、内因性抗原提示経路の活性が増大し、それにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）によって支援される腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増大によって後に認識することができるＭＨＣクラスＩ拘束性腫瘍抗原の表面発現をもたらすと考えられる。
【０００５】
表面ＭＨＣクラスＩの発現の回復及び腫瘍細胞の免疫原性の増大は、ＭＨＣクラスＩ重鎖、β２−マイクログロブリン、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、及びＬＭＰ７の下方制御を含む、ＣＭＴ．６４細胞における多数のＡＰＣの欠損にもかかわらず起こる。ＥＲへのペプチドの残りの輸送は、低レベルのＴＡＰ発現（ウエスタンブロットによって検出不能）により、Ｔｐｎ仲介型シャペロン活性の存在下で、十分なＭＨＣクラスＩペプチド複合体に特異的エフェクターＴ細胞による死滅に対する感受性の有意な増大がもたらされることが原因である可能性がある。ＴＡＰを含めた抗原提示経路の他の成分の安定状態レベルは、Ｔｐｎによって安定化されることが示されている。したがって、ＣＭＴ．６４細胞中でのＴｐｎの発現は、これらの細胞中に存在する低レベルのＴＡＰを安定化させることが可能であり、したがって、Ｈ−２Ｋｂ及びＨ−２Ｄｂの表面発現並びにＣＭＴ．６４細胞の免疫原性をこのようにして有意に増大させることが可能である。（これら２つの成分を欠く）癌の治療におけるＡｄｈＴＡＰ１とＡｄｈＴｐｎの組合せは、腫瘍を有する動物中で十分な防御及び生存をもたらす。
【０００６】
これらの発見の新規性に加えて、これはマウス中でのＴｐｎの発現の増大が外から得られた抗原（ＯＶＡ）に対する抗原特異的免疫応答を増大させる最初の兆候であると考えられる。循環ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するウイルス感染細胞又は腫瘍細胞による直接的抗原提示に必要不可欠であるペプチド担持複合体の成分は、腫瘍抗原特異的免疫応答の開始中の前駆体ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する専門的抗原提示細胞による間接的提示にも必要とされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣの交差提示活性を増大させる追加的なＴｐｎ発現はＴｐｎとベクターの影響の組合せである可能性があり、抗原提示経路と先天性機構の間の相互作用を示唆する。ＯＶＡと組み合わせてＡｄｈＴｐｎを感染させたマウス由来のＤＣのＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞を活性化する能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られた影響の生理的に適切なｉｎ  ｖｉｖｏでの相関関係を実証する。ＡｄｈＴｐｎ感染によるｉｎ  ｖｉｖｏでのクロスプライミング活性の増大は、テトラマー染色により測定した、末梢血と脾臓の両方におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増大によってさらに実証された。
【０００７】
増大するクロスプライミングの機構は、ＡｄｈＴｐｎで治療したマウスの腫瘍塊内のＣＤ４＋ＴＩＬの有意な増大と相関関係がある可能性があり、これはアデノウイルスベクター自体の免疫原性と関係がある可能性がある。多数のＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のＣＤ４＋Ｔ細胞依存経路を好み、それによってＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４０リガンドを介してＤＣを刺激することができ、及び／又はＤＣにクロスプライミングを可能にすることができる代替シグナルを示し、又はインターロイキン−２などのサイトカインによってＣＤ８＋Ｔ細胞を直接刺激することができる。
【０００８】
Ｔｐｎ及びＴＡＰ１をコードするＡＰＣ遺伝子を含有するアデノウイルスベクターは、将来の癌免疫療法において重要な役割を果たす可能性がある。ＴＡＰと一緒のＴｐｎの回復は他の既存の手法に優るいくつかの利点を有し、腫瘍の抗原組成又は宿主のＭＨＣハプロタイプと無関係に腫瘍に対する免疫応答を増大させる一般法をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＡｄｈＴｐｎ感染後のＣＭＴ．６４細胞中でのタパシンの発現は用量依存的であり、増大した表面ＭＨＣクラスＩのレベル及びウイルスエピトープの提示をもたらすことを示す一連のグラフ及びブロットの図である。図１Ａは、ＣＭＴ．６４細胞にＡｄｈＴｐｎを１、５、２５、５０、及び１００ＰＦＵ／ＡｄｈＴｐｎ細胞のＭＯＩで、又はΨ５を１００ＰＦＵ／細胞で感染させ、４８時間後に採取したことを示すブロット及びグラフである。ウエスタンブロッティングは、抗ｈＴｐｎ、ｍＴＡＰ１、及びｍＴＡＰ１ポリクローナル抗体及びβ−アクチンｍＡｂを用いて実施した。β−アクチンはタンパク質担持の対照として使用した。濃度測定をｈＴｐｎバンドに実施して、それぞれの用量でのＡｄｈＴｐｎ感染によって生成したタンパク質の量を定量化した。図１Ｂは、ＡｄｈＴｐｎ感染がＣＭＴ．６４細胞中でのＨ−２ＫｂとＨ−２Ｄｂ両方の表面発現を増大させることを示すグラフである。Ψ５−アデノウイルスベクター対照、ＩＦＮ−γ−陽性対照。図１Ｃは、ＡｄｈＴｐｎによるＣＭＴ．６４細胞の感染がＶＳＶ−ＮＰエピトープのＭＨＣクラスＩ抗原提示を回復させ、ＶＳＶ−ＮＰ特異的エフェクター細胞による溶解に対する感受性を増大させることを示す。標的：ＶＳＶ−ＮＰ（５２〜５９）ミニ遺伝子をトランスフェクトしたＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ−ＣＭＴ．６４、Ψ５（アデノウイルスベクター対照）を感染させたＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ、又はＡｄｈＴｐｎを感染させたＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ。エフェクター：ＶＳＶ感染マウス由来の脾細胞。
【図２】ＡｄｈＴｐｎはオボアルブミン抗原の樹状細胞とのクロスプライミングを増大させることを示す一連のグラフ及び顕微鏡写真である。図２Ａは、ＡｄｈＴｐｎがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＯＶＡ抗原のＤＣとの交差提示を増大させることを示す。脾細胞ＤＣはＡｄｈＴｐｎ又はΨ５で２時間感染させ、次にＯＶＡと共に１６時間インキュベートし、次いで２５．Ｄ１．１６を用いて染色し、ＦＡＣＳ分析によって測定した。図２Ｂ及び２Ｃは、ＡｄｈＴｐｎ感染が可溶性ＯＶＡを用いた免疫処置後にＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングを促進することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＡｄｈＴｐｎ、Ψ５又はＰＢＳを腹膜内注射し、１６時間後、マウスにＯＶＡを皮下注射し、７日目に同じウイルス及びＯＶＡで追加抗原刺激した。８日後、脾細胞ＤＣは異なる割合でＢ３ＺＴ細胞と共に培養した。同時培養の２４時間後、β−ガラクトシダーゼ生成により評価したＢ３Ｚの活性化を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより測定した。図２Ｄは、脾臓及び血液ＡＰＣのＭＨＣクラスＩ分子上のオボアルブミン由来の免疫優勢ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー染色によって定量化したことを示す。
【図３】ＡｄｈＴｐｎ及びＡｄｈＴＡＰ１は、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長することを示すグラフである。図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＭＴ．６４細胞（４×１０５個の細胞／マウス）を腹膜内注射し、１日目、３日目、５日目、及び８日目に１．２５、２．５、５．０、１０×１０７ＰＦＵでＡｄｈＴＡＰ１、５００μｌのＰＢＳ中に１×１０８ＰＦＵでΨ５、又はＰＢＳのいずれかで治療し、かつ生存期間は９０日間続いたことを示す。保護効果を示す最低用量（２．５×１０７ＰＦＵ）をＡｄｈＴｐｎとの相補性試験用に選択した。図３Ｂは、ＡｄｈＴｐｎ、ＡｄｈＴＡＰ１、ＡｄｈＴＡＰ１及びＡｄｈＴｐｎ、Ψ５（５．０×１０７ＰＦＵ／５００μｌのＰＢＳ）又はＰＢＳを用いた治療を前述のように実施し、生存期間は９０日間続いたことを示す（ｎ＝群当たり１０匹のマウス）。全群が同じ数のＡｄ粒子を得ることを確実にするために、ＡｄｈＴＡＰ１単独又はＡｄｈＴｐｎ単独で治療したマウスに、等量のΨ５ベクターを補充して５×１０７ＰＦＵの合計Ａｄ用量を維持した。同じ用量で、ＡｄｈＴＡＰ１及びＡｄｈＴｐｎはいずれも、ＡｄｈＴｐｎ単独ではなく、ＡｄｈＴＡＰ１単独並びにΨ５及びＰＢＳ対照を統計上上回った最大防御をもたらした（ＡｄｈＴＡＰ１＋ＡｄｈＴｐｎ対ＡｄｈＴＡＰ１単独に関してｐ＝０．００６１）。ＡｄｈＴＡＰ１＋ＡｄｈＴｐｎ（２．５×１０７ＰＦＵのそれぞれのウイルス）で治療したマウスの生存は、最高用量（１×１０８ＰＦＵ）のＡｄｈＴＡＰ１単独で治療したマウスのそれと同等であった。
【図４】腫瘍浸潤リンパ球及びＤＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡｄｈＴｐｎを用いて治療したＣＭＴ．６４腫瘍中で増大したことを示す顕微鏡写真である。ＡｄｈＴｐｎ（Ａ、Ｄ、Ｇ）又はΨ５（Ａｄベクター対照）、又はＰＢＳを用いて治療したＣＭＴ．６４腫瘍中のＣＤ４＋（図４Ａ）、ＣＤ８＋（図４Ｂ）又はＣＤ１１ｃ＋（図４Ｃ）細胞に関するＩＨＣ染色。ＣＭＴ．６４細胞をマウスに導入してから１９日後に腫瘍を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＣＭＴ．６４細胞（４×１０５個の細胞／マウス）を腹膜内注射し、１日目、３日目、５日目及び８日目に２．５×１０７ＰＦＵ／マウスのＡｄｈＴｐｎ又はΨ５又はＰＢＳ単独のいずれかで治療した。陽性染色は、細胞表面膜の強烈な茶色の標識によって示される（倍率２００倍）。
【図５】ＦＡＣＳ分析（治療及びＰＢＳ対照中のＣＤ８に関して＊＊ｐ＝０．０１１。分散の均一性を満たすための平方根変換後の治療及びＰＢＳ対照中のＣＤ４に関して＊ｐ＝０．０４２）によって、腫瘍浸潤リンパ球がｉｎ  ｖｉｖｏでＡｄｈＴｐｎを用いて治療したＣＭＴ．６４腫瘍中で増大したことを示すグラフである。腫瘍浸潤ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球は腫瘍中の全細胞の割合として表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ここで本発明を以下の詳細な実施例中でさらに記載し、実施例は例示としてのみ表し、本発明の範囲若しくは精神又は任意のその実施形態を他に制限すると解釈すべきではない。
【００１１】
材料及び方法
細胞、ウイルス、及びマウス
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＣＲＥ８細胞（Ｓ．Ｈａｒｄｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ；７１：１８４２〜１８４９（１９９７））、ＣＭＴ．６４細胞（Ｙ．Ｌｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；６５：７９２６〜７９３３（２００５）；ＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ（Ｈ−２Ｋｂ上で提示されるアミノ酸５２〜５９由来の免疫優勢エピトープを含有するＶＳＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）ミニ遺伝子をトランスフェクトしたＣＭＴ．６４）及びＴ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１９９１、ｈＴｐｎ陽性細胞系）を、１０％のＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。ＣＲＥ８細胞は、ＨＥＫ２９３細胞に安定的に組み込まれたＮ末端核局在シグナルを有するＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を誘導する、β−アクチン系発現カセットを有する（Ｓ．Ｈａｒｄｙら、上記）。Ψ５ウイルスは、パッケージング部位に隣接するｌｏｘＰ部位を含有するＥ１及びＥ３欠失型のＡｄ５である（Ｓ．Ｈａｒｄｙら、上記）。Ψ５及び組換えアデノウイルスを増殖させ、ＨＥＫ２９３細胞において力価測定した。主要マウス脾細胞及び．２２０細胞（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ、Ｕ．Ｓ．Ａ．によって提供されたＴｐｎ欠損ヒトミエローマ細胞）は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳからなる完全培養培地中で培養した。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）メスマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手し、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓで、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ブリティッシュコロンビア大学において収容した。
【００１２】
非複製アデノウイルス／ヒトタパシン（ＡｄｈＴｐｎ）の構築
ヒト脾臓由来のＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（商標）全ＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）から入手した。製造者の説明書に従いオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ用のＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（登録商標）第一鎖合成キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＴｐｎのｃＤＮＡは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、ヒトＴｐｎ転写産物変異体１（ＮＭ＿００３１９０）の配列に基づいて設計したプライマーを使用して増幅した。使用したプライマー配列は以下の通りであった：順方向プライマー５’−ＧＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１）及び逆方向プライマー５’−ＧＧＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＧＧＧＴＡ−３’（配列番号２）。挿入体をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、両鎖を塩基配列決定して突然変異が存在しないことを確実にした。ｈＴｐｎはＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩを用いてＴＯＰＯ／ｈＴｐｎから消化し、次いでＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩ消化型シャトルベクター、パドロックスプラスミドにクローニングした（Ｓ．Ｈａｒｄｙら、上記）。生成したベクター、Ｐａｄ／ｈＴｐｎを単離し、塩基配列決定して配列忠実度を確実にした。ＡｄｈＴｐｎは以前に記載されたように作製した（Ｓ．Ｈａｒｄｙら、上記）。簡単に言うと、ＳｆｉＩで線状化したｐａｄ／ｈＴｐｎを、リポフェクタミンプラス（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してΨ５ＤＮＡと共にＣＲＥ８細胞にコトランスフェクトしてＡｄｈＴｐｎを作製した。ＡｄｈＴｐｎ組換えウイルスクローンを免疫蛍光アッセイによって同定し、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラークは３回精製した。組換えウイルスはＨＥＫ２９３細胞において大規模ストックで増幅し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法によって精製し、ＨＥＫ２９３細胞において力価測定した。ＡｄｈＴｐｎの同一性は、Ｔｐｎ及びＴｐｎ遺伝子の片側に隣接するアデノウイルスＤＮＡに特異的なプライマーを使用して、精製したウイルスＤＮＡのＰＣＲ及びＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。プライマー配列は以下の通りであった：Ｔｐｎの増幅用に順方向プライマー５’−ＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３）及び逆方向プライマー５’−ＡＡＴＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４）、アデノウイルス隣接配列の増幅用に順方向プライマー５’−ＧＴＧＴＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＧＣＧＴＡＡ−３’（配列番号５）及び逆方向プライマー５’−ＣＣＡＴＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＣ−３’（配列番号６）。
【００１３】
ＣＭＴ．６４細胞のＡｄｈＴｐｎ感染後のＴＡＰ及びＴｐｎの発現
高用量のＡｄｈＴｐｎに応じたＴｐｎ及びＴＡＰの発現を調べるために、ＣＭＴ．６４細胞にＡｄｈＴｐｎを１、５、２５、５０及び１００ＰＦＵ／細胞で、又はΨ５（陰性対照）を１００ＰＦＵ／細胞で感染させた。Ｔ１細胞及び．２２０細胞をそれぞれｈＴｐｎ陽性及び陰性対照として使用した。ＩＦＮ−γで処理したＣＭＴ．６４細胞は、マウスＴＡＰ１（ｍＴＡＰ１）、マウスＴＡＰ２（ｍＴＡＰ２）及びマウスＴｐｎ（ｍＴｐｎ）発現の陽性対照であった。感染２日後、細胞を溶解しＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｈｙｂｏｎｄ  ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、イングランド）に電気的に転写した。ブロットはウサギ抗ｈＴｐｎ抗体（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、ＢＣ、カナダ）、ウサギ抗ｍＴｐｎ抗体（Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏからの贈答品）、ウサギ抗ｍＴＡＰ１及びウサギ抗ｍＴＡＰ２（ｍＴＡＰ−１（ＲＧＧＣＹＲＡＭＶＥＡＬＡＡＰＡＤ−Ｃ）（配列番号７）又はｍＴＡＰ−２（ＤＧＱＤＶＹＡＨＬＶＱＱＲＬＥＡ）（配列番号８）、ＫＬＨと結合したマウスＴＡＰ２）配列（Ｑ．Ｊ．Ｚｈａｎｇ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００７））のＣ末端における最後の１６アミノ酸に相当するペプチドから作製した合成ペプチドでウサギを免疫処置することにより本発明者らの研究室によって作製）、及びヒトβ−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、カナダ）で処理した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）は、二次抗体として使用した。バンドは十分な化学発光及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への露光によって目に見える状態にした。直線的濃度測定は、ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣソフトウェア、バージョン６．０．０（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を使用して実施した。
【００１４】
ＭＨＣクラスＩの表面発現に対するＡｄｈＴｐｎの影響
ＣＭＴ．６４細胞にＡｄｈＴｐｎ又はΨ５を５０ＰＦＵ／細胞で感染させた。感染２日後、４℃で３０分間、細胞を抗ＭＨＣクラスＩｍＡｂ、ｙ３（Ｈ−２Ｋｂ特異的）及び２８．１４．８Ｓ（Ｈ−２Ｄｂ特異的）と共にインキュベートした。結合した抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）によって検出した。ＦＡＣＳ分析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で実施した。
【００１５】
ＣＴＬアッセイ
細胞障害性は標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した。簡単に述べると、アミノ酸５２〜５９からなる免疫優勢ウイルスペプチドを含有する水泡性口内炎ウイルス核タンパク質（ＶＳＶ−ＮＰ）を発現する安定的にトランスフェクトしたＣＭＴ．６４細胞（ＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ）に、ＡｄｈＴｐｎ又はΨ５を５０ＰＦＵ／細胞で１日間感染させた。これらの細胞はＮａ２５１ＣｒＯ４（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、ＶＳＶ特異的エフェクター細胞の標的として使用した。ＶＳＶ特異的ＣＴＬエフェクターは、マウスへの５×１０７ＰＦＵのＶＳＶの腹膜内注射によって生成した。脾細胞は感染５日後に回収し、１μＭのＶＳＶ−ＮＰ（５２〜５９）ペプチドを含むＲＰＭＩ−１６４０完全培地中で５日間培養した。
【００１６】
ＤＣによるオボアルブミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ交差提示
脾臓を前に記載したようにＣ５７ＢＬ／６マウスから得て（及び５％のＦＣＳ、１ｍｇのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌａｖａｌ、Ｑｃ、カナダ）を含有する１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地の注入によって破壊して）、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＤＣ多量細胞集団をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）勾配で細胞懸濁液の遠心分離によって得た。次いでＤＣは抗ＣＤ１１ｃＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いた陽性選択によって精製し、生成した集団は＞９８％ＣＤ１１ｃ＋であった。次いで脾細胞ＤＣに２時間２０ＰＦＵ／細胞でＡｄｈＴｐｎ又はΨ５のいずれかを感染させ、次にオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）と共に、３７℃において１６時間５ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。ＤＣを洗浄し、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な２５．Ｄ１．１６ｍＡｂ（Ａ．Ｐｏｒｇａｄｏｒ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６（１９９７）、次にフィコエリスリン（ＰＥ）結合ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．）を用いた染色前に、Ｆｃ受容体は２．４Ｇ２ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ遮断薬（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ  ＯＮ、カナダ）で遮断した。フローサイトメトリーを使用して、ＤＣの表面上のＨ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体を定量化した。
【００１７】
オボアルブミンのｉｎ  ｖｉｖｏ交差提示及び特異的免疫応答の生成
０日目に、マウスに１×１０８ＰＦＵのＡｄｈＴｐｎ、Ψ５、又はＰＢＳを腹膜内注射した。１６時間後に可溶性ＯＶＡ（１００μｌ中に３０ｍｇ）を皮下注射し、７日目にこの動物を同じ用量のウイルス及びＯＶＡで追加抗原刺激した。ＤＣのクロスプライミング活性を試験するために、脾細胞ＤＣを２４時間後にマウス脾臓から単離し、０．００５％のグルタルアルデヒド中に固定し、異なる割合のＢ３Ｚ（Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の認識によって活性化され得るＩＬ−２分泌型、ＬａｃＺ誘導性Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｎ．Ｓｈａｓｔｒｉ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５０：２７２４〜２７３６（１９９３））、Ｄｒ．Ｎｉｌａｂｈ  Ｓｈａｓｔｒｉ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡからの贈答品）の存在下で、９６ウエルプレート中で３７℃において培養した。２４時間の同時培養後、活性化はβ−ガラクトシダーゼ生成の評価、次にクロロフェノールレッド−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の添加によって測定した。プレートは５９５ｎｍにおいて２４時間後にＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、６３０ｎｍのバックグラウンド吸光度を差し引いた。５日目に最後の免疫処置後、静脈血を回収し、リンパ球多量集団をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配での血液の遠心分離によって得た。脾臓も採取し、前に記載したように消化し、脾細胞多量集団を同じ形式で生成した。リンパ球及び脾細胞は、ｉＴＡｇ（商標）Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、カナダ）及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（Ｌｙ−２）（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）抗体で二重染色して、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な全体及びＣＤ８＋脾細胞を決定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）を使用してデータを回収し、それらはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【００１８】
ＡｄｈＴｐｎ及びＡｄｈＴＡＰ１を用いたＣＭＴ．６４腫瘍を有するマウスの治療
ウイルス用量の力価測定用に、４×１０５個のＣＭＴ．６４細胞、５００μｌＰＢＳ中の腹膜内注射によって、群当たり３又は４匹のマウスの６群において腫瘍を確立した。ＣＭＴ．６４細胞の導入後１日目、３日目、５日目及び８日目に、マウスに１．２５、２．５、５．０、１０×１０７ＰＦＵでＡｄｈＴＡＰ１、５００μｌのＰＢＳ中に１×１０８ＰＦＵでΨ５、又はＰＢＳのいずれかをさらに腹膜内注射し、生存を９０日間追跡した。ＣＭＴ．６４腫瘍を有するマウスにおけるＡｄｈＴｐｎ又はＡｄｈＴｐｎ及びＡｄｈＴＡＰ１治療用に、ＣＭＴ．６４細胞（４×１０５個の細胞、５００μｌのＰＢＳ中）の腹膜内注射によって、群当たり１４〜１８匹のマウスの５群において腫瘍を確立した。ＣＭＴ．６４細胞の導入後第１日目、３日目、５日目及び８日目に、マウスにＡｄｈＴｐｎ、ＡｄｈＴＡＰ１、ＡｄｈＴＡＰ１及びＡｄｈＴｐｎ、Ψ５、（５．０×１０７ＰＦＵ／５００μｌのＰＢＳ）又はＰＢＳをさらに腹膜内注射し、生存を９０日間追跡した。全注射群が同じ数のＡｄ粒子を得ることを確実にするために、わずか１つの型の組換え体で治療したマウスに、十分なΨ５ベクターを補充して５×１０７ＰＦＵの合計Ａｄ用量を維持した。実験中、ＡｄｈＴｐｎ、Ψ５又はＰＢＳ群の４〜８匹のマウスを選択した時間に各群から屠殺して、腫瘍増殖パターンを観察し、腫瘍浸潤ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球並びにＣＤ１１ｃ＋ＤＣの数を測定した。
【００１９】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＤＣ
ＴＩＬ及び腫瘍浸潤ＤＣを、ＦＡＣＳと免疫組織化学染色（ＩＨＣ）の両方を使用して分析した。腫瘍を単細胞に分け、ラット抗マウスＣＤ８（Ｌｙ−２）ｍＡｂ及びＲ−ＰＥ結合ラット抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ｍＡｂと共にインキュベートし、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬの数をＦＡＣＳによって定量化した。凍結腫瘍のアセトン固定凍結切片（８μｍ）は、ラット抗マウスＣＤ４ｍＡｂ（ＲＭ４−５）、ラット抗マウスＣＤ８ｍＡｂ（５３−６．７）、又はハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）を用いて腫瘍浸潤細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣ）に関して染色した。ラットＩｇＧ２ａは抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体のアイソトープ対照として使用し、一方ハムスターＩｇＧはＣＤ１１ｃ＋細胞を検出する抗体の対照であった。ビオチニル化ポリクローナル抗ラットＩｇＧ及びビオチニル化抗ハムスターＩｇＧ二次抗体及びストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＤＡＢ検出システムを用いて、抗体結合を検出した（全ての試薬はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した）。
【００２０】
統計分析
交差提示アッセイ用に、カイ二乗検定（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、ＦｌｏｗＪｏ  ３．７．１．）を使用して、ＯＶＡとのインキュベーション後のＡｄｈＴｐｎ又はΨ５（対照ベクター）に感染したＤＣ上で発現された全Ｈ−２Ｋｂ又はＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７−２６７複合体の差に関するＦＡＣＳヒストグラムを分析した。ｐ＜０．０１（９９％信頼度）であった場合、結果は有意であったと考え、Ｔ（Ｘ）＞１０はカットオフ値として経験的に決定した。４回の反復実験の１つの代表的なヒストグラムを示している。生存データは「生存分布の比較」法を使用して分析した。ｐ＜０．０５であった場合、データは統計上異なると考えた。
【００２１】
結果
ＡｄｈＴｐｎはＣＭＴ．６４細胞中のＭＨＣクラスＩの表面発現及び免疫原性を増大させる。
ＡｄｈＴｐｎを感染させたＣＭＴ．６４細胞は用量依存式にｈＴｐｎを発現した（図１Ａ）。しかしながら、ウエスタンブロットによって、ＡｄｈＴｐｎ感染ＣＭＴ．６４細胞中で内因性ｍＴｐｎ、ｍＴＡＰ１及びｍＴＡＰ２タンパク質発現の増大は検出しなかった。それにもかかわらず、フローサイトメトリー分析は、Ｈ−２Ｋｂ及びＨ−２Ｄｂの細胞表面発現はＡｄｈＴｐｎを感染させたＣＭＴ．６４細胞中で増大したが（図１Ｂ）、一方Ψ５を感染させた細胞はこのような増大を示さなかったことを示した。ＩＦＮ−γで治療したＣＭＴ．６４細胞は陽性対照として使用し、Ｈ−２Ｋｂ及びＨ−２Ｄｂの表面発現のより大きな増大（図１Ｂ）、及びウエスタンブロット分析において内因性ｍＴｐｎ、ｍＴＡＰ１及びｍＴＡＰ２タンパク質レベルの増大を示した（図１Ａ）。ＡｄｈＴｐｎは、ＣＴＬに対して免疫優勢ＶＳＶ−ＮＰ５２−５９ペプチドを提示する、ＶＳＶ核タンパク質ミニ遺伝子（ＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ）を安定的にトランスフェクトしたＣＭＴ．６４の能力も向上させた。ＡｄｈＴｐｎを感染させたＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ細胞はＶＳＶ特異的エフェクターＴリンパ球の細胞溶解活性に対して敏感であり、一方ＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ細胞単独又はΨ５を感染させたＣＭＴ／ＶＳＶ−ＮＰ細胞は、おそらく後者の細胞の細胞表面上でのＨ−２Ｋｂ／ＶＳＶペプチドの欠如のために、殺傷に対する耐性があった（図１Ｃ）。これらの結果は、ＡｄｈＴｐｎ感染後のｈＴｐｎの発現及び活性は特異的エピトープ（ＶＳＶ−ＮＰ５２−５９）の十分なＭＨＣクラスＩの拘束性抗原提示を回復して、特異的ＣＴＬ活性に対してこれらの細胞を敏感にすることができることを示す。
【００２２】
ＡｄｈＴｐｎは樹状細胞の交差提示及びクロスプライミングを増大させる
モデル抗原ＯＶＡを使用して、Ｈ−２Ｋｂの状況で免疫優勢ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを交差提示するＡｄｈＴｐｎを感染させたＤＣの能力を評価した。フローサイトメトリーは細胞表面Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の数の半定量的読み出し値をもたらし、交差提示効率の評価を可能にする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄｈＴｐｎを感染させた脾細胞ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、Ψ５を感染させたＤＣと比較して、Ｈ−２ＫｂでのＳＩＩＮＦＥＫＬの有意に増大した交差提示を示した（ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。全体の表面Ｈ−２Ｋｂレベルも、Ψ５感染ＤＣと比較してＡｄｈＴｐｎ感染ＤＣにおいてわずかに増大した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこの影響を調べるために、本発明者らはΨ５、ＰＢＳ、又はＡｄｈＴｐｎを腹膜内投与しＯＶＡを皮下注射して、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成におけるＡｄｈＴｐｎの影響を試験した。ＡｄｈＴｐｎを感染させＯＶＡで免疫処置したマウスからｅｘ  ｖｉｖｏで得た脾臓由来のＤＣは、ベクターのみを感染させたマウス由来のＤＣより高い、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｂ３Ｚを活性化する能力を有していた（図２Ｂ）。ＯＶＡで免疫処置したＡｄｈＴｐｎ感染マウスは、ベクター対照（Ψ５）又はＰＢＳ対照と比較して、全体的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増大数によって検出したより高い全身免疫応答（データ示さず）、及び脾臓において（テトラマー染色で測定した）Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な多数のＣＤ８＋Ｔ細胞によって示される有意に増大したＯＶＡ特異的応答を示した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの増大は、Ψ５及びＰＢＳ対照と比較して、ＡｄｈＴｐｎ感染マウス由来の末梢血においてより一層顕著であった（図２Ｃ及び図２Ｄ）。これは、Ψ５のみではなくＡｄｈＴｐｎによる脾細胞ＤＣの感染は、全身応答と抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方の増大の原因であり、それはしたがってｉｎ  ｖｉｖｏでの外来性抗原の増大した交差提示がおそらく原因であることを示す。
【００２３】
ＡｄｈＴｐｎ治療はＡｄｈＴＡＰＡ治療よりＣＭＴ．６４腫瘍を有するマウスの生存期間を増大させ、かつＡｄｈＴｐｎとＡｄｈＴＡＰ１の両方を組み合わせることによって最大防御が得られる
以前、本発明者らは、ヒトＴＡＰ１（ＡｄｈＴＡＰ１）を発現する組換えアデノウイルスを用いたＣＭＴ．６４腫瘍を有するマウスの治療は、Ψ５又はＰＢＳのみで治療したマウスと比較して、増大した生存期間をもたらしたことを実証した（Ｙ．Ｌｏｕら、上記）。ＡｄｈＴｐｎは、ＡｄｈＴＡＰ１治療と同様の形式で、ＭＨＣ−Ｉ抗原表面発現を増大させＣＴＬ殺傷に対する感度を回復させるので、本発明者らは、ＡｄｈＴＡＰ１と組み合わせたＡｄｈＴｐｎが、ＣＭＴ．６４腫瘍形成の阻害を増強することができるかどうか調べた。高いアデノウイルス負荷と関係がある細胞障害性を回避するために、防御効果を有することが実証された、力価測定により決定した２．５×１０７ＰＦＵのＡｄｈＴＡＰ１の準最適用量（図３Ａ）を等量のＡｄｈＴｐｎと組み合わせて使用した。ウイルス負荷のバランスをとるために、ＡｄｈＴＡＰ１とＡｄｈＴｐｎ単独の治療を等しい数のΨ５ウイルスと混合した。ＡｄｈＴｐｎとＡｄｈＴＡＰ１を用いた二重治療は、いずれかのウイルスよりさらに長いマウスの生存期間をもたらし、Ψ５のみを用いた治療は、ＡｄｈＴｐｎを用いた３０％及び低用量のＡｄｈＴＡＰ１を用いた１０％と比較して、目に見える腫瘍がない５０％の長期生存率（１００日を超える）をもたらした（図３Ｂ）。この二重治療は、同じウイルス用量でΨ５又はＡｄｈＴＡＰ１治療単独より統計上有効であったが（ｐ＜０．０１）、同じ用量でＡｄｈＴｐｎ治療単独と統計上異ならなかった。それぞれのウイルスの２．５×１０７ＰＦＵ（５×１０７ＰＦＵ全ウイルス）でのＡｄｈＴｐｎ及びＡｄｈＴＡＰ１はさらに高用量（１×１０８ＰＦＵ）のＡｄｈＴＡＰ１単独と同等であり、二重治療は所与の用量でより有効であることが実証される（図３Ｂ）。
【００２４】
ＡｄｈＴｐｎ治療はＣＭＴ．６４腫瘍におけるＴＩＬ及び腫瘍浸潤ＤＣを増大させる
ＡｄｈＴｐｎ治療群、並びにΨ５及びＰＢＳ対照群からの４〜８匹のマウスを、最後の治療注射後２０日の腫瘍増殖のパターンに関して調べた。ＡｄｈＴｐｎで治療したマウスの腹膜腔は腫瘍を含んでいなかった、又は直径１又は２ミリメートルのわずか数個の小さな腫瘍を有していた。肝臓と腸の両方が目視検査によって正常に見えた。これはＰＢＳ又はΨ５で治療したマウスと非常に対照的であった。これらのマウスは、大量の血液状腹水（２〜５ｍｌ）及び腹膜腔全体に分布する多くの腫瘍を有していた。腫瘍は肝臓と腸の両方で増殖するのを観察し、大きな線維接着部分と結合した。マウスから採取した腫瘍は、ＦＡＣＳ及びＩＨＣ染色によってＴＩＬ及びＤＣ浸潤に関して調べた。ＩＨＣ染色は、ＡｄｈＴｐｎで治療したマウスは、Ψ５又はＰＢＳで治療したマウスから採取した腫瘍における腫瘍塊中に、有意に多数のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣを有していたことを示した（図４）。ＦＡＣＳ分析も、ＡｄｈＴｐｎで治療したマウスは、Ψ５及びＰＢＳで治療したマウスから採取した腫瘍中より、有意に多数のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＴＩＬを有していたことを確認した（それぞれｐ＝０．０１１及びｐ＝０．０４２）（図５）。これらの結果は、ＡｄｈＴＡＰ１でＣＭＴ．６４腫瘍を有するマウスを治療した本発明者らの以前の発見と一致し（１０）、ＡｄｈＴｐｎ治療は腫瘍抗原特異的免疫応答を増大させることによって、類似した形式で働き得ることを示唆する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月25日(2014.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するための、ヒト細胞に投与される医薬組成物であって、唯一の免疫応答増強剤として、前記抗原を有する前記細胞中のタパシンのレベルを増加させるためにタパシンをコードする核酸を含んでいる有効量のベクターを含み、前記抗原が、インフルエンザ抗原、天然痘抗原、及び結核抗原からなる群から選択される、上記医薬組成物。