(57)【要約】【課題】予後不良である肺線維症の病態進行度をより的確に推測し、治療方針を決定することができる新たなマーカーを提供する。【解決手段】肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ−Ｃ）の前駆蛋白（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の発現レベルを定性的あるいは定量的に観察することで、予後不良である肺線維症の病態の進行度をより的確に推測し、治療方針を決定することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ-Ｃ）の前駆蛋白質（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の発現を指標とする間質性肺炎の病態の評価方法。
【請求項２】
間質性肺炎の病態が肺線維症である請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現を免疫染色により観察する請求項１または２記載の評価方法。
【請求項４】
免疫染色されたｐｒｏＳＰ−Ｃの染色強度と肺胞上皮細胞全体に占める割合を数値化する請求項１〜３のいずれかの項記載の評価方法。
【請求項５】
ｐｒｏＳＰ−Ｃに係る数値と数値化された病理組織学的所見を比較する請求項４項記載の評価方法。
【請求項６】
数値化された病理組織学的所見が、弾性繊維、蜂巣構造、線維化、マクロファージおよび炎症かから選ばれる一つ以上の所見である請求項５記載の評価方法。
【請求項７】
間質性肺炎の病態の評価するための指標としての肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ−Ｃ）の前駆蛋白（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の使用。
【請求項８】
間質性肺炎の病態が肺線維症である請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質性肺炎の病態を評価するための方法および間質性肺炎の病態を評価するための肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ-Ｃ）の前駆蛋白質（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺サーファクタントは、肺胞II型上皮細胞で産生され肺胞へ分泌されるリン脂質・蛋白質複合体であり、その機能の一つは、肺胞表面張力を低下させることで肺胞虚脱の防止である。
肺サーファクタントには、4種の特異蛋白質が含まれており、サーファクタント蛋白Ａ〜Ｄ（ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｄ）と命名された。このうち、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは疎水性が強く、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは親水性である（非特許文献１）。
【０００３】
一方、間質性肺炎は、肺の間質に炎症が起きる病気の総称であり、進行して炎症組織が線維化したものが肺線維症と呼ばれている。
肺の線維化の血清マーカーとして、肺胞ＩＩ型細胞の膜構成蛋白の糖蛋白抗原（Ｋｒｅｂｓ  ｖｏｎ  ｄｅｎ  Ｌｕｎｇｅｎ−６：以下、ＫＬ−６）、サーファクタント蛋白Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタント蛋白Ｄ（ＳＰ−Ｄ）が知られている（非特許文献２）。
また、ＫＬ−６、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ以外に、血清中の抗ａｎｎｅｘｉｎ抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ抗体などの自己抗体を特発性肺線維症のマーカーとして利用する試みがなされている（特許文献１）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】分子呼吸器病，１６（１），１５１−１５６，２０１２．
【非特許文献２】検査と技術，３８（１０），９２６−９３０，２０１０．
【特許文献１】ＷＯ２００６／０９８１４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＫＬ−６、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは、特発性肺線維症や非特異性間質性肺炎などの特発性間質性肺炎でも高率に陽性となり、病態のモニタリング、治療反応性の評価に有用とされているが、これらは血清学的なマーカーであり、患者の病理組織標本を用いて病理組織学的に、病態の進行度や、予後を予測するに至るマーカーは未だ報告されていない。
予後不良である肺線維症の病態進行度をより的確に推測し、治療方針を決定することができる新たなマーカーが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ−Ｃ）は、家族性間質性親子症例で、ＳＰ−Ｃ遺伝子の欠損変異が同定されたことなどから注目された。
ＳＰ−Ｃは、ＳＰ−Ｃ遺伝子が翻訳され小胞体でｐｒｏＳＰ−Ｃが生成し、細胞内切断修飾によりＳＰ−Ｃとなる（非特許文献１）
肺線維症に対する新規マーカー探索の中で、病理組織標本の薄切片を用い、ｐｒｏＳＰ−Ｃに対する免疫染色の組織学的所見と病理組織学検討から、ｐｒｏＳＰ−Ｃが肺線維症の病態進行度のマーカーでとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明は、肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ-Ｃ）の前駆蛋白質（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の発現を指標とする間質性肺炎の病態の評価方法および間質性肺炎の病態の評価するための指標としての肺サーファクタント蛋白Ｃ（ＳＰ−Ｃ）の前駆蛋白（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）の使用である。
具体的には、間質性肺炎の患者から得られる病理組織標本において、ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現を定性的あるいは定量的に観察することで、予後不良である肺線維症の病態進行度をより的確に推測し、治療方針を決定することができる。
【０００８】
本発明に用いる病理組織標本は、手術やバイオプシーなどで得られた病理組織をパラフィン、セロイジン、カーボワックス、ゼラチン、ＯＣＴコンパウンドなど包埋剤で包埋した組織標本ブロックから薄切やコア抜きして得られる組織片であれば、特に限定されないが、パラフィン包埋組織ブロックから薄切される組織片が好ましい。
また、パラフィン包埋組織ブロックからコア抜きした柱状組織片をアレイ状に配置した組織アレイやパラフィン包埋組織ブロックから薄切した組織片をロール状に成形しアレイ状に配置したスパイラル組織アレイを用いてもよい。
【０００９】
ｐｒｏＳＰ−Ｃを検出するための手法は、特に限定されないが、免疫染色法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法のいずれでもよいが、免疫染色法が好ましい。
免疫染色は、酵素抗体法、蛍光抗体法のいずれでもよいが、酵素抗体法が好ましい。
免疫染色に使用する一次抗体は、ｐｒｏＳＰ−Ｃに対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、ポリクローナル抗体が好ましい。
【００１０】
ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現を定性的あるいは定量的に評価するためには、例えば、ｐｒｏＳＰ−Ｃの免疫染色の強度を数値化することが好ましい。さらに、数値化した免疫染色の強度と肺胞上皮細胞全体に占める割合を掛け合わせｐｒｏＳＰ−Ｃの所見の数値とすることが好ましい。
【００１１】
ｐｒｏＳＰ−Ｃを、間質性肺炎の病態の評価に使用するには、ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現に係る数値を、病理学組織学的所見、例えば、弾性繊維、蜂巣状構造、線維化、II型肺胞上皮細胞、マクロファージ、炎症などから選ばれる一つ以上の病理学組織学的所見を数値化したものと比較することにより行えばよい。
【発明の効果】
【００１２】
ｐｒｏＳＰ−Ｃの値は、線維化の強い病変部位では低値となり、細胞湿潤の強い病変部位では高値となる。ｐｒｏＳＰ−Ｃは肺の線維化の程度と強く相関することから、ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現レベルを観察することは、病態の進行度を評価するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＥ染色したスパイラル組織アレイである。
【図２】免疫染色したスパイラル組織アレイの拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
＜試料＞
米国、メーヨー・クリニックとの共同研究において、移植肺46症例のパラフィン包埋組織ブロックから得られた薄切された組織片を用い、特許４６２５９０９の記載に準じてスパイラル組織アレイを作製した。
【００１５】
＜免疫染色＞
スパイラル組織アレイの未染標本に対し、一次抗体としてｐｒｏＳＰ−Ｃのポリクローナル抗体（ミリポア社製）を８００倍に希釈して室温で３０分間反応させた後、デキストランポリマーとペルオキシダーゼを用いる増感法試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  ＨＲＰ：ダコ社製）を使用して室温で３０分間二次抗体反応を行った。
【００１６】
＜免疫染色の数値化＞
（１）ｐｒｏＳＰ−Ｃの染色強度を０〜３の４段階に分類
（２）肺上皮細胞全体に対する割合を１０％ごとに評価
（３）染色強度のスコアとその割合をそれぞれ掛け合わせたものを総和し、１００で割ってｐｒｏＳＰ−Ｃの染色所見を数値化した。
【００１７】
・図２の数値化
（０×３０％＋１×２０％＋２×４０％＋３×１０％）÷１００＝１．３
【００１８】
＜組織所見の数値化と統計解析＞
ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した病理組織標本を用いて、病理組織学的所見（弾性繊維、炎症、マクロファージ、扁平上皮化生、血管壁の厚さ、フィブリン沈着、リンパ球の集族、巨細胞、毛細血管性血管腫、蜂巣状構造、  線維化、ＩＩ型肺胞上皮細胞、平滑筋の増生、線維芽細胞、活動性、正常肺領域）に関してスコアリングし、その程度によってネガティブとポジティブの２群に分け、ｐｒｏＳＰ−Ｃの数値との関係について統計解析を行った。統計解析は、ウィルコクソン(Wilcoxon)の順位和検定およびフィッシャー(fisher)の正確確率検定を用いて、ｐ＜０.０５を有意差「有」とみなした。
その結果、弾性繊維（ｐ＝０.００２５）、蜂巣状構造（ｐ＝＜０.０００１）、線維化（ｐ＝０.００１５）、ＩＩ型肺胞上皮細胞（ｐ＝０.００２５）が強い症例でｐｒｏＳＰ−Ｃの値は低くなり、一方、マクロファージ（ｐ＝０.０００６）と炎症（ｐ＝０.０１４３）が強い症例では、ｐｒｏＳＰ−Ｃの値は高くなっていた。
【００１９】
以下に、蜂巣状構造、線維化、ＩＩ型肺胞上皮細胞、マクロファージおよび炎症の病理組織学的所見スコアとｐｒｏＳＰ−Ｃスコアを表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００２１】
ｐｒｏＳＰ−Ｃの値は、線維化の強い病変部位では低値となり、細胞浸潤の強い病変部位では高値となる。ｐｒｏＳＰ−Ｃは肺実質の線維化と強く相関することから、ｐｒｏＳＰ−Ｃの発現レベルを定性的あるいは定量的に観察することで、予後不良である肺線維症の病態進行度をより的確に推測し、治療方針を決定することができる。
【図１】
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【図２】
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