(57)【要約】【課題】溶液中で細胞を保存する際に細胞の生存率低下を抑制することができる細胞保存剤及び細部保存液を提供することを目的とする。【解決手段】人工タンパク質（Ａ）からなる細胞保存剤であって、（Ａ）が、ペンタペプチド配列（ＧＶＧＶＰ配列（１）等）、ヘキサペプチド配列（ＧＶＧＶＡＰ配列（６）等）、ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ配列（１２）、ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ配列（１３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連結したポリペプチド（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である細胞保存剤。ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工タンパク質（Ａ）からなる細胞保存剤であって、
（Ａ）が、下記ペンタペプチド配列、下記ヘキサペプチド配列、ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ配列（１２）、ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ配列（１３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１４）からなる群より選ばれる１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連結したポリペプチド（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、
（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である細胞保存剤。
ペンタペプチド配列：ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＶＧＶＰＧ配列（２）、ＧＶＰＧＶ配列（３）、ＶＰＧＶＧ配列（４）及びＰＧＶＧＶ配列（５）。
ヘキサペプチド配列：ＧＶＧＶＡＰ配列（６）、ＶＧＶＡＰＧ配列（７）、ＧＶＡＰＧＶ配列（８）、ＶＡＰＧＶＧ配列（９）、ＡＰＧＶＧＶ配列（１０）及びＰＧＶＧＶＡ配列（１１）。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【請求項２】
人工タンパク質（Ａ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）をさらに有する請求項１に記載の細胞保存剤。
【請求項３】
人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）とポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率｛配列（１５）：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：２〜１：２０である請求項２に記載の細胞保存剤。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の１０〜８０％がリシン及び／又はアルギニンで置換されているアミノ酸配列。
【請求項４】
人工タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞保存剤。
【請求項５】
人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）であるポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシンで置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞保存剤。
【請求項６】
人工タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（１６）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１７）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞保存剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞保存剤及び水を含む細胞保存用溶液であって、細胞保存用溶液中の細胞保存剤の濃度が細胞保存用溶液の体積を基準として、５〜１０００μg／ｍｌである細胞保存用溶液。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞保存用溶液で細胞（Ｂ）を保存する方法である細胞（Ｂ）の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞保存剤及び細胞保存用溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の保存には、従来、凍結保存方法及び溶液中で保存する方法が用いられている。
凍結保存法としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と血清とを含む培地に細胞を入れて凍結保存する方法（非特許文献１）が一般的に用いられている。しかしながら、凍結状態（低温）を維持したまま輸送するのは温度管理が難しい問題がある。また、輸送時に低温を維持できずに融解してしまった場合、ＤＭＳＯの細胞毒性により細胞の生存率が低下してしまう問題がある。
【０００３】
溶液中で保存する方法としては、血清を含む培地中に細胞を懸濁する方法が用いられている。溶液中で保存する場合は、凍結保存方法のように低温を維持する必要はないものの、細胞が容器に接着したり、細胞の分化の状態が変化する問題がある。特に、接着性細胞は、基材や細胞同士で接着していないと、アポトーシスの誘導が起こるため、溶液中で保存すると細胞の生存率が低くなる問題がある。また、浮遊性細胞においても、溶液中では、ストレスによりアポトーシスの誘導が起こり、細胞の生存率が低くなる問題がある。したがって、細胞を溶液中で保存する際に、細胞の生存率低下を抑制する細胞保存剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】村上浩紀、菅原卓也、細胞工学概論、コロナ社、１９９４年１２月、ｐ９９−１０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、溶液中で細胞を保存する際に、細胞の生存率低下を抑制することができる細胞保存剤及びこの細胞保存剤を含む細部保存液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞保存剤は、人工タンパク質（Ａ）からなる細胞保存剤であって、（Ａ）が、下記ペンタペプチド配列、下記ヘキサペプチド配列、ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ配列（１２）、ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ配列（１３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１４）からなる群より選ばれる１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連結したポリペプチド（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である細胞保存剤である。
ペンタペプチド配列：ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＶＧＶＰＧ配列（２）、ＧＶＰＧＶ配列（３）、ＶＰＧＶＧ配列（４）及びＰＧＶＧＶ配列（５）。
ヘキサペプチド配列：ＧＶＧＶＡＰ配列（６）、ＶＧＶＡＰＧ配列（７）、ＧＶＡＰＧＶ配列（８）、ＶＡＰＧＶＧ配列（９）、ＡＰＧＶＧＶ配列（１０）及びＰＧＶＧＶＡ配列（１１）。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞保存剤は、細胞を保存する溶液中に含ませることで、溶液中の細胞の生存率の低下を抑制することができるという効果を奏する。
また、本発明の細胞保存用溶液を用いて細胞を保存すると、細胞の生存率が低下しにくいという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００９】
本発明の細胞保存剤は、人工タンパク質（Ａ）からなる細胞保存剤であって、（Ａ）が、下記ペンタペプチド配列、下記ヘキサペプチド配列、ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ配列（１２）、ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ配列（１３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１４）からなる群より選ばれる１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連結したポリペプチド（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である細胞保存剤である。
ペンタペプチド配列：ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＶＧＶＰＧ配列（２）、ＧＶＰＧＶ配列（３）、ＶＰＧＶＧ配列（４）及びＰＧＶＧＶ配列（５）。
ヘキサペプチド配列：ＧＶＧＶＡＰ配列（６）、ＶＧＶＡＰＧ配列（７）、ＧＶＡＰＧＶ配列（８）、ＶＡＰＧＶＧ配列（９）、ＡＰＧＶＧＶ配列（１０）及びＰＧＶＧＶＡ配列（１１）。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖。
【００１０】
本発明においてポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＧＶＧＶＰ）b配列、（ＶＧＶＰＧ）c配列、（ＧＶＰＧＶ）d配列、（ＶＰＧＶＧ）e配列、（ＰＧＶＧＶ）f配列、（ＧＶＧＶＡＰ）g配列、（ＶＧＶＡＰＧ）h配列、（ＧＶＡＰＧＶ）i配列、（ＶＡＰＧＶＧ）j配列、（ＡＰＧＶＧＶ）k配列、（ＰＧＶＧＶＡ）l配列、（ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ）m配列、（ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ）n配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）o配列で表されるポリペプチド鎖等が挙げられる。（なお、ｂ〜ｏはそれぞれアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。）
人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖を１種有してもよく、２種以上有してもよい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ｂ〜ｏが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｏが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
【００１１】
ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（１）が好ましい。つまり、ポリペプチド鎖（Ｙ）として（ＧＶＧＶＰ）b配列が好ましい。
【００１２】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｏが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、連続する個数は２〜２０個（上記ｂ〜ｏが２〜２０）が好ましく、さらに好ましくは８〜１６個（上記ｂ〜ｏが８〜１６）である。
【００１３】
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換され、置換したリシン及びアルギニンの合計個数が１〜１００個であるポリペプチド鎖である。具体例としては、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部が、下記アミノ酸配列（Ｘ’）に置換され、（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がＫ及び／又はＲで置換されたものとなったポリペプチド鎖が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の１０〜８０％がＫ及び／又はＲで置換されたアミノ酸配列。
【００１４】
アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数（Ｋ及び／又はＲで置換された数）は、水への溶解性の観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）において、溶解性及びアポトーシス抑制の観点から、アミノ酸配列（Ｘ）中の全アミノ酸の１０〜６０％が置換されたアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは２０〜６０％が置換されたアミノ酸配列である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、水への溶解性及びアポトーシス抑制の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（１８）、ＫＧＶＰＧ配列（１９）、ＧＫＰＧＶ配列（２０）、ＫＰＧＶＧ配列（２１）及びＰＧＫＧＶ配列（２２）、ＧＶＧＫＰ配列（２３）、ＶＧＫＰＧ配列（２４）、ＧＶＰＧＫ配列（２５）、ＶＰＧＫＧ配列（２６）、ＰＧＶＧＫ配列（２７）、ＧＫＧＫＰ配列（２８）、ＫＧＫＰＧ配列（２９）、ＧＫＰＧＫ配列（３０）、ＫＰＧＫＧ配列（３１）及びＰＧＫＧＶＫ配列（３２）からなる群より選ばれる１種以上の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（１８）、ＫＧＶＰＧ配列（１９）、ＧＫＰＧＶ配列（２０）、ＫＰＧＶＧ配列（２１）及びＰＧＫＧＶ配列（２２）からなる群より選ばれる１種以上である。
【００１５】
人工タンパク質（Ａ）はアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有するので、細胞と適度に相互作用し、アポトーシス抑制作用を発揮する。また、（Ａ）が細胞と適度に相互作用し、アポトーシス抑制作用を発揮するので、後述する本発明の細胞保存剤及び水を含む細胞保存用溶液を用いた場合、細胞保存剤が細胞の周辺に存在し、細胞が保存容器へ接着するのを抑制し、細胞を長期間保存することが可能である。
【００１６】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、人工タンパク質（Ａ）の配列中のＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中のリシン及び／又はアルギニンで置換されるアミノ酸の合計個数は１〜１００個であるが、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、５〜５０個が好ましく、さらに好ましくは１３〜２６個である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中の全アミノ酸の０．１〜１０％がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であるが、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、０．５〜５％が好ましく、さらに好ましくは１〜３％である。
【００１７】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である人工タンパク質である。（Ａ）が、（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、（Ｙ）の個数はその合計である。（Ｙ’）も同様である。
【００１８】
人工タンパク質（Ａ）は、（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を合計１〜１００個有するものであるが、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、５０〜１００個が好ましく、特に好ましくは７５〜１００個である。
【００１９】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であるが、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、０．５〜１．２が好ましく、さらに好ましくは０．５〜０．８であり、次にさらに好ましくは０．５５〜０．７５であり、特に好ましくは０．６〜０．７２である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ.ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学  上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６−３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭT）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭT：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１７）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
【００２０】
本発明においては、人工タンパク質（Ａ）が上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有していることで、アポトーシス抑制効果が高く、細胞保存性の優れた細胞保存剤となる。また、上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、且つ（Ａ）の疎水性度が上記範囲内であることにより、人工タンパク質（Ａ）を水に溶解し、細胞保存用溶液を作成することができる。
（Ａ）は配列（Ｘ）を有する場合、細胞との相互作用が適度であり、アポトーシス抑制作用を有するが水への溶解性が低い場合がある。その場合、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸をＫ及びＲで１０〜８０％の割合で置換することにより、水溶性が増加する。また、（Ａ）の分子の疎水性度が０．２〜１．２の範囲にある事により、水溶液への溶解性と細胞との相互作用のバランスがよくなる。
【００２１】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（１５）を有することが好ましい。（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１５）を有している場合、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、配列（１５）が連続する数は、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０個であり、次にさらに好ましくは４０〜８０個であり、特に好ましくは４０〜６０個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１つ以上有すればよいが、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは４０〜６０個である。
【００２２】
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（３３）、ＧＡＡＧＹ配列（３４）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
【００２３】
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。（Ｔ）は、（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは５〜４０個、特に好ましくは１０〜３５個である。（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（３５）等が挙げられる。
【００２４】
人工タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２５】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、（Ａ）の分子量を基準として、４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。
【００２６】
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
津製作所社製ペプチドシーケンサー（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００  （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸の数
β：各アミノ酸の分子量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数
【００２７】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、細胞との相互作用及びアポトーシス抑制の観点から、（Ａ）の分子量を基準として４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。
【００２８】
人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、人工タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、人工タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を測定する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）の分子量｝×１００
【００２９】
タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）の個数とポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）の個数：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数）は、細胞との相互作用及び水への溶解性の観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。
【００３０】
（Ａ）がポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、疎水性度が０．２〜１．２であれば細胞との相互作用が適度であるが、（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１５）を有していると、細胞との相互作用がさらに適度となる。特に、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）とアミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）との比が１：２〜１：２０であることで、細胞との相互作用がさらに適度となる。
【００３１】
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、水への溶解性の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは６０〜８０ｋＤａである。この範囲であると、（Ａ）が分解されるまでの時間が適度である。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【００３２】
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）の人工タンパク質
（１−１）ＧＶＧＶＰ配列（１）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１７）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（１６）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（２１）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１３）である。
具体的には、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（１６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１７）（Ｙ’１１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（３６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（３７）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６１８）；ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（３６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（３９）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７１８）等である。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（３６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）11配列（３８）（Ｙ’１２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１２）（Ｓ１−２）｝16で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（４０）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ、疎水性度０．６９３）等である。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（３６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）11配列（３８）（Ｙ’１２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（１５）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（１６）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（４１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ、疎水性度０．６０７）等である。
【００３３】
本発明の細胞保存剤を用いて保存できる細胞（Ｂ）としては、特に限定はなく、接着性細胞（Ｂ１）及び浮遊性細胞（Ｂ２）が含まれる。
接着性細胞（Ｂ１）は、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、中皮細胞、内皮細胞及びがん細胞等であり、具体的には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳ細胞、線維芽細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、骨前駆細胞、表皮細胞、腺房細胞、腺細胞、腹膜由来細胞、血管内皮細胞及び肝がん細胞、腸がん細胞、肺がん細胞等が挙げられる。
浮遊性細胞（Ｂ２）は、血球系細胞であり、具体的には、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等が挙げられる。
本発明の細胞保存剤を用いて保存する細胞（Ｂ）としては、細胞保存性の観点から、接着性細胞が好ましく、さらに好ましくは幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、中皮細胞、内皮細胞及びがん細胞である。
【００３４】
本発明の細胞保存剤の使用方法としては、細胞の輸送時の保存剤や、一時的に細胞の使用を中断するときの保存剤として使用できる。
本発明の細胞保存剤は、後述する細胞保存用溶液に細胞を懸濁して細胞を保存しても良く、細胞懸濁液中に添加してもいい。細胞を懸濁させた溶液中に添加する場合、細胞懸濁液中の細胞保存剤の濃度は、細胞保存性の観点から、細胞懸濁液の体積を基準として、５〜１０００μg／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍｌであり、次にさらに好ましくは５００〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００３５】
本発明の細胞保存用溶液は、上記細胞保存剤及び水を含む細胞保存用溶液であって、細胞保存用溶液中の細胞保存剤の濃度が細胞保存用溶液の体積を基準として、５〜１０００μg／ｍｌである細胞保存用溶液であり、細胞保存性の観点から、１０〜１０００μｇ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは５００〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００３６】
細胞保存用溶液中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【００３７】
細胞保存用溶液中には、上記細胞保存剤及び水以外に培地成分（血清、成長因子、糖、ビタミン、アミノ酸、ピルビン酸、フェノール指示薬等）、無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
【００３８】
血清としては、ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等などが挙げられ、
細胞保存用溶液中の血清の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜２０％が好ましい。
【００３９】
成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）が挙げられる。
細胞保存用溶液中の成長因子の含有量（重量ｐｐｍ）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜１０００が好ましく、さらに好ましくは０〜１００であり、次にさらに好ましくは０〜５０である。
【００４０】
糖としては、従来知られている糖が含まれ、具体的には、単糖（グルコース等）、オリゴ糖（ショ糖、ラクトース及びマンノース等）、多糖（ヒアルロン酸等）及びこれらが化学修飾されたもの等が挙げられる。
細胞保存用溶液中の糖の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜１％が好ましい。
【００４１】
ビタミンとしては、従来知られているビタミンが含まれ、具体的には、ミオイノシトール、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン及び塩酸チアミン等が挙げられる。
細胞保存用溶液中のビタミンの含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細細胞保存用溶液の重量を基準として０〜０．０１％が好ましい。
【００４２】
アミノ酸としては、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
細胞保存用溶液中のアミノ酸の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜０．２％が好ましい。
【００４３】
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
細胞保存用溶液中の塩の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜１．３が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．３であり、次にさらに好ましくは０．７〜１．１であり、特に好ましくは０．８５〜０．９５である。
【００４４】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
細胞保存用溶液中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
細胞保存用溶液中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の重量を基準として０〜０．３０が好ましく、さらに好ましくは０．１０〜０．３０であり、次にさらに好ましくは０．１２〜０．２８であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６である。
【００４５】
細胞保存用溶液のｐＨは、細胞保存性の観点から、６〜８が好ましく、さらに好ましくは６．８〜７．２である。
【００４６】
また、水及びその他の成分（培地成分等）を含む下記培地を用いて細胞保存用溶液を作成してもよい。培地を用いて細胞保存用溶液を作成した場合の、細胞保存用溶液中の各成分の好ましい含有量、好ましいｐＨは、上述と同じである。
培地としては、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
【００４７】
本発明の細胞保存用溶液の製造方法としては、特に限定ないが、一例を下記に示す。
（１）水を含む２０〜４０℃の溶液を作成する。
（２）（１）の溶液に、所定量の細胞保存剤を添加し、均一になるまで室温（例えば２５℃）で振とう混和する。
【００４８】
また、本発明の細胞保存用溶液の使用方法としては、特に限定ないが、一例を下記に示す。
（Ｉ）細胞保存用溶液を２０〜４０℃に温調する。
（ＩＩ）（Ｉ）の細胞保存用溶液中に細胞を添加し、ピペット等を用いて懸濁させる。
（ＩＩＩ）細胞を懸濁させた（ＩＩ）の溶液を、２０〜４０℃に温調する。
上記（ＩＩ）において、細胞数は、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液の体積を基準として、１０3〜１０7個／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０5〜１０6個／ｍｌである。
【００４９】
本発明の細胞（Ｂ）の保存方法は、細胞保存用溶液を用いて、細胞（Ｂ）を保存する方法である。本発明の保存方法において、細胞保存性の観点から、細胞保存用溶液中の細胞保存剤の下記細胞接着率が０〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは０〜１０％である。
細胞接着率：１ｃｍ2当たり２．５μｇの人工タンパク質（Ａ）を有する基材を作成し、基材に細胞（Ｂ）を播種したとき、基材に接着する接着性細胞の割合。
細胞接着率は、具体的には、下記細胞接着率の測定法によって測定される。
【００５０】
＜細胞接着率の測定法＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作成
細胞保存剤１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：ＰＢＳ）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の細胞保存剤の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製する。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、基材の表面に細胞保存剤を有する細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）を作成する。
（２）コーティング量の測定
次に、細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）の表面の細胞保存剤によるコーティング量を測定する。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得る。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置する。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ+とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得る。
（３）細胞の接着及び細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴でプレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、細胞（Ｂ）を１０4ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去する。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置する。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、それぞれ８穴分の平均データとする。
細胞保存剤の代わりにフィブロネクチンを用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行う。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量（Ｘ0）を測定する。（Ｘ0）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ0）を下記式に当てはめ、プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）の細胞接着率を算出する。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ0）×１００
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が２．５のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００５２】
＜実施例１＞
（１）人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製した。分子質量が約８０ｋＤａの配列（３７）の細胞保存剤（Ｉ）である人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６１８）を得た。
（２）細胞保存用溶液の作製
血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に細胞保存剤（Ｉ）を５００μｇ／ｍｌとなるように溶解し、細胞保存用溶液を得た。ここに、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）１０5Ｃｅｌｌｓを懸濁し、細胞懸濁液（ＣＰ１）（１０5Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を得た。
【００５３】
＜実施例２＞
（１）人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）の作製
実施例１と同様にして、分子質量が約８２ｋＤａの配列（３９）の細胞保存剤（ＩＩ）である人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７１８）を得た。
（２）細胞保存溶液の作製
細胞保存剤（ＩＩ）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行い、細胞保存用溶液を作成し、細胞懸濁液（ＣＰ２）を得た。
【００５４】
＜実施例３＞
（１）                                                                                人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ）の作製
実施例１と同様にして、分子質量が約７１ｋＤａの配列（４０）の細胞保存剤（ＩＩＩ）である人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ、疎水性度０．６９３）を得た。
（２）細胞保存溶液の作製
細胞保存剤（ＩＩＩ）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行い、細胞保存用溶液を作成し、細胞懸濁液（ＣＰ３）を得た。
【００５５】
＜実施例４＞
（１）人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ）の作製
実施例１と同様にして、分子質量が約６５ｋＤａの配列（４１）の細胞保存剤（ＩＶ）である人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ、疎水性度０．６０７）を得た。
（２）細胞保存溶液の作製
細胞保存剤（ＩＶ）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行い、細胞保存用溶液を作成し、細胞懸濁液（ＣＰ４）を得た。
【００５６】
＜比較例１＞
（１）細胞保存容器の作製
細胞保存剤（Ｉ）を用いなかったこと以外、実施例１と同様にして行い、細胞懸濁液（ＣＰ５）を得た。
【００５７】
＜Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の細胞接着率の測定＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作製
細胞保存剤（Ｉ）〜（ＩＶ）それぞれ１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：ＰＢＳ）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の細胞保存剤の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製した。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、基材の表面に細胞保存剤を有する細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）を得た。
（２）コーティング量の測定
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量を得た。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
（３）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴で細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本製薬株式会社製）を１０4ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値から細胞接着率を算出した。細胞接着率は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
＜評価：細胞生存率の測定＞
細胞生存率の測定はＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて行った。
１２時間室温保存した細胞懸濁液（ＣＰ１〜４）を遠心（１０００ｒｐｍ、５分）し、細胞ペレットを得た。さらに、細胞ペレットに冷やしたＰＢＳ（４℃）を加え、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）することで、細胞ペレットを洗浄した。洗浄は２回行った。洗浄した細胞ペレットにＫｉｔに含まれるＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ加え、細胞を懸濁させて細胞再懸濁液を作成した。ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（５μｌ）とＰｏｐｉｄｉｕｍｅ  ｉｏｄｉｄｅ（５μｌ）を細胞再懸濁液へ加え、軽く振とう混和した。その後、１５分間、室温、暗所で静置し、４００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。
解析はＦＡＣＳ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて行い、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＰＩどちらにも染色されなかったものを生存細胞、Ａｎｎｅｘｉｎのみで染色された細胞をアポトーシス細胞、ＰＩのみで染色された細胞をネクローシス細胞、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＰＩどちらにも染色されているものを死細胞として評価を行った。これらの結果を表２に記す（これらの結果は３サンプル分の平均データである）。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
表２の結果から、本願発明の細胞保存剤を含む細胞保存用溶液を用いた実施例１〜４は、細胞保存剤を含まない溶液を用いた比較例１と比較して、１２時間室温保存後の細胞懸濁液中の生存細胞が８０〜９２％と多く、死細胞も３〜８％と非常に少なかった。したがって、本発明の細胞保存剤を用いれば、細胞の生存率の低下を抑制できることが分かる。
また、実施例１〜４においては、アポトーシス細胞が５〜１２％と比較例よりも低く、アポトーシス抑制効果もあることが分かる。
また、ネクローシス細胞が０％であることから、病理的な原因ではなく、生理的な原因で細胞が死んだことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の細胞保存剤は、細胞を溶液中で保存する際の細胞保存剤として使用でき、例えば、細胞の輸送時の保存剤や一時的に細胞の使用を中断するときの保存剤として使用できる。また、本発明の細胞保存用溶液は、細胞を輸送する際の溶液として使用できる。
【配列表】
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