(57)【要約】【課題】実際の産業（医療現場）利用に適したアシネトバクター属菌の菌種同定法および流行クローン同定法および／又は菌株式別法を提供すること、およびそれに用いるプライマーセットを提供すること。【解決手段】アシネトバクター属菌の染色体上の、（１）Acinetobacter pittii特異的オープンリーディングフレーム（ORF）、（２）Acinetobacter nosocomialis特異的ORF、（３）Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF、（４）genomic isletを構成するORFおよび（５）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより流行クローン同定を行うステップを含む、アシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシネトバクター属菌の染色体上の、
（１）Acinetobacter pittii特異的オープンリーディングフレーム（ORF）
（２）Acinetobacter nosocomialis特異的ORF
（３）Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF
（４）genomic isletを構成するORF、および
（５）genomic islandを構成するORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、アシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項２】
前記（１）のＯＲＦにおける遺伝子が配列表の配列番号１の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が配列表の配列番号２の遺伝子であり、前記（３）のＯＲＦにおける遺伝子が配列表の配列番号３の遺伝子であり、前記（４）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、AB57_0815、AB57_3308、ACICU_02966、ACICU_03137、AB57_2484、ACICU_02042、ACICU_01870、AB57_0388、AB57_0454、AB57_0526、AB57_1914、AB57_1987、AB57_2085、AB57_2850、AB57_2930、AB57_3624、ACICU_00180、ACICU_00563、ACICU_02520、ACICU_02597、ACICU_02468、ACICU_02886、ACICU_03379、ACICU_03418およびACICU_03581からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子である請求項１に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項３】
前記（５）のＯＲＦにおけるgenomic islandがABTJ_03567からABTJ_03571、ABTJ_01331からABTJ_01338、ABTJ_02589からABTJ_02595、ACICU_00873からACICU_00880、AB57_0290、ABZJ_00241 からABZJ_00248、ABTJ_02688 からBTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0959からAB57_0970、ABTJ_00965 からABTJ_00971、ACICU_02206からACICU_02209、blaTEMからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子である請求項１に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項４】
前記（４）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、AB57_0815、AB57_3308、ACICU_02966、ACICU_03137、AB57_2484、ACICU_02042、ACICU_01870、AB57_0388、AB57_0454、AB57_0526、AB57_1914、AB57_1987、AB57_2085、AB57_2850、AB57_2930、AB57_3624、ACICU_00180、ACICU_00563、ACICU_02520、ACICU_02597、ACICU_02468、ACICU_02886、ACICU_03379、ACICU_03418、ACICU_03581およびA1S_3257からなる群より選ばれる少なくとも４種の遺伝子である請求項１に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項５】
前記（５）のＯＲＦにおけるgenomic islandがABTJ_03571、ABTJ_01334、ABTJ_02589、ACICU_00874、AB57_0290、ABZJ_00242、ABTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0967、ABTJ_00969、ACICU_02209、blaTEMからなる群より選ばれる少なくとも４種の遺伝子である、請求項１に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項６】
前記（４）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、AB57_0815、AB57_3308、ACICU_02966、ACICU_03137、AB57_2484、ACICU_02042およびACICU_01870からなる７種の遺伝子であり、前記（５）のＯＲＦにおけるgenomic islandがABTJ_03571、ABTJ_01334、ABTJ_02589、ACICU_00874、AB57_0290、ABZJ_00242、ABTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0967、ABTJ_00969、ACICU_02209、blaTEMからなる１２種の遺伝子である、請求項１に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定および菌株識別法。
【請求項７】
配列表の配列番号４と５からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、PCR（polymerase chain reaction）法により前記（１）のORFの検出を行い、配列番号６と７からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行い、配列番号８と９からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、PCR法により前記（３）のORFの検出を行い、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３と１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された７組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる７組のプライマーを用いて、PCR法により前記（４）のORFの検出を行い、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８、配列番号７９と８０、配列番号８１と８２、配列番号８３と８４、配列番号８５と８６、配列番号８７と８８、配列番号８９と９０、配列番号９１と９２に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーを用いて、PCR法により前記（５）のORFの検出を行う、請求項２から６の何れか１項に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項８】
上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項７に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項９】
前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項７又は８に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項１０】
前記（４）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化する、請求項１〜９の何れか１項に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項１１】
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化する、請求項１０に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号４と５からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号６と７からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号８と９からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３と１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された７組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる７組のプライマーと、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８、配列番号７９と８０、配列番号８１と８２、配列番号８３と８４、配列番号８５と８６、配列番号８７と８８、配列番号８９と９０、配列番号９１と９２に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーとを含む、アシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のためのプライマーセット。
【請求項１３】
上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項１２に記載のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のためのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシネトバクター属の菌種同定法、クローン同定法および／又は菌株識別法ならびにこれに用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アシネトバクター属菌は、近年、病院で院内感染の原因として問題となっている病原細菌である。特に、Acinetobacter baumanniiでは、カルバペネム、アミノ配糖体、ニューキノロンに広範な耐性を獲得した多剤耐性株の増加と蔓延が問題となっており、重要な感染制御の対象菌種となっている。
欧州や米国の医療機関では、多剤耐性を獲得したAcinetobacter baumannii、なかでもinternational clone I（またはEuropean clone I）やinternational clone II（またはEuropean clone II）と呼ばれるクローンが増加し大きな問題となっている。しかし、厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業の集計によれば、国内の主要な病院で分離される多剤耐性アシネトバクターの割合は、2012年時点で１％以下であり、我が国では、この状態を今後も維持する必要がある。
【０００３】
以上のことから、多剤耐性を獲得したAcinetobacter baumanniiの国内の医療機関での増加や蔓延を防止するため、本耐性菌を早期に検出することが重要となっている。しかし、医療機関の一般医的な細菌検査室や検査センターなどでは、Acinetobacter 属菌の中からAcinetobacter baumanniiおよびその流行株を正確に同定、識別することが困難である。
【０００４】
また、院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これを菌株識別あるいは遺伝子型別分類という。
菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法（以下、PFGEという。）が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから菌株識別の定法とされる。
【０００５】
しかし、PFGEは結果が出るまでに早くても菌株分離同定後３日程度と時間がかかり、検査結果が出たときにはすでに感染拡大が終了していることが多い。また複雑なバンドパターンを比較することにより判定する必要があることに加え、アシネトバクター属菌のPFGEパターンは変化しやすく同一集団感染由来株であっても時間経過に伴いバンドパターンが変化していることも多く、主観的な要素が入りがちである。そのため同時に泳動した菌株でさえも遺伝子型が同一か否かを判断するには熟練者が必要となる。したがって、異なる時刻または別の実験室で得られたPFGE解析の結果を比較することで、複数の分離株の遺伝子型が同等か否かを判定することは非常に困難であった。
さらに、PFGEは作業が煩雑で作業者の熟練を要するうえ、パルスフィールドゲル電気泳動装置などの特殊な高額の装置を必要とし、試薬などのコストも高い。したがって、より簡便かつ迅速に、幅広くアシネトバクター属菌を遺伝子型別分類することができる方法の開発が依然として強く望まれている。
【０００６】
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献２には、緑膿菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１２０５２８号公報
【特許文献２】特開２０１３−１４６２４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アシネトバクター属菌は、細菌検査室等で一般的に実施されている生化学性状等による同定が困難で、自動同定機や同定キットによってアシネトバクター属菌とされた分離株は通常Acinetobacter calcoaceticus - baumannii complexのどれかの菌種であるが、時にそのほかのAcinetobacter属菌が含まれることもある。アシネトバクター属菌に対する感染制御を適切に実施するためには、本菌が喀痰や尿から分離された場合は、それが医療環境で問題となりやすいAcinetobacter baumanniiか、それとも臨床的にあまり問題とならないその近縁の類縁菌種か否かを識別しなければならない。また、遺伝子の解析等によりAcinetobacter baumanniiと同定された場合も、染色体上の複数の遺伝子の解析などにより、医療環境で伝播拡散しやすい国際流行株か否かの判別をする必要がある。そのためには、複数の遺伝子を検出し、それらの塩基配列を解析することが必要であるが、それを一般的な検査室における日常業務として実施することは、手技や経費の面で困難である。そこで、これまでの解析手法によらず、分離されたアシネトバクター属菌がAcinetobacter baumanniiか否かや、さらにAcinetobacter baumanniiの中の特定の国際流行株であるか否かの識別、さらに院内感染事例を引き起すことの多いAcinetobacter baumanniiの感染源調査において利用することができる簡便かつ安価な検査方法を構築することが必要となっている。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速なアシネトバクター属菌の菌種の識別、流行クローンの識別および菌株識別のための手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適したアシネトバクター属菌の菌種同定、流行クローン同定および／又は菌株識別のための方法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに上記菌種の同定、流行クローンの同定および／又は菌株識別のための方法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、データベース上に蓄積されつつあるアシネトバクター属菌、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter baumanniiの国際流行株の遺伝情報を比較し、Acinetobacter baumanniiやAcinetobacter baumanniiの国際流行株に特異的な遺伝子を複数個検出、選択し、それらの遺伝子をPCRで増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定することなく、通常の電気泳動により遺伝子産物の泳動パターンを比較することによりアシネトバクター属菌の中から、Acinetobacter baumannii特にAcinetobacter baumanniiの国際流行株を識別する簡便かつ迅速な方法の構築、及び院内感染発生時の感染源調査に利用可能なAcinetobacter baumanniiの株レベルでの識別に成功した。具体的には、本発明者は、（１）Acinetobacter pittii特異的ORF、（２）Acinetobacter nosocomialis特異的ORF、（３）Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF、（４）染色体上の、genomic isletを構成するORFならびに（５）染色体上の、genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効にアシネトバクター属菌の菌種同定及び遺伝子型別分類を行うことができることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明によれば、アシネトバクター属菌のゲノム上の、（１）Acinetobacter pittii特異的オープンリーディングフレーム（ORF）、（２）Acinetobacter nosocomialis特異的ORF、（３）Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF、（４）genomic isletを構成するORF、および（５）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、アシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法が提供される。
【００１２】
本発明のアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法においては、前記（１）のＯＲＦにおける遺伝子が配列番号１の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が配列番号２の遺伝子であり、前記（３）のＯＲＦにおける遺伝子が配列番号３の遺伝子であり、前記（４）のgenomic isletを構成するＯＲＦがAB57_0815、AB57_3308、ACICU_02966、ACICU_03137、AB57_2484、ACICU_02042、ACICU_01870、AB57_0388、AB57_0454、AB57_0526、AB57_1914、AB57_1987、AB57_2085、AB57_2850、AB57_2930、AB57_3624、ACICU_00180、ACICU_00563、ACICU_02520、ACICU_02597、ACICU_02468、ACICU_02886、ACICU_03379、ACICU_03418、ACICU_03581およびA1S_3257からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも４種、特に好ましくはAB57_0815、AB57_3308、ACICU_02966、ACICU_03137、AB57_2484、ACICU_02042およびACICU_01870の７種）の遺伝子であることが好ましく、前記（５）のＯＲＦにおけるgenomic islandがABTJ_03567からABTJ_03571、ABTJ_01331からABTJ_01338、ABTJ_02589からABTJ_02595、ACICU_00873からACICU_00880、AB57_0290、ABZJ_00241 からABZJ_00248、ABTJ_02688 からBTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0959からAB57_0970、ABTJ_00965 からABTJ_00971、ACICU_02206からACICU_02209、blaTEMからなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも8種、特に好ましくはABTJ_03571、ABTJ_01334、ABTJ_02589、ACICU_00874、AB57_0290、ABZJ_00242、ABTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0967、ABTJ_00969、ACICU_02209、blaTEMの12種）の遺伝子であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法は配列表の配列番号４と５からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、ＰＣＲ法により前記（１）のＯＲＦの検出を行い、配列番号６と７からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、ＰＣＲ法により前記（２）のＯＲＦの検出を行い、配列番号８と９からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）を用いて、ＰＣＲ法により前記（３）のＯＲＦの検出を行い、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３と１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された７組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる７組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（４）のＯＲＦの検出を行い、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８、配列番号７９と８０、配列番号８１と８２、配列番号８３と８４、配列番号８５と８６、配列番号８７と８８、配列番号８９と９０、配列番号９１と９２に示された12組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により前記（５）のＯＲＦの検出を行うことによって実施することができる。
【００１４】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【００１５】
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。
【００１６】
前記（４）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が数値化され見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
【００１７】
さらに本発明によれば、配列表の配列番号４と５からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号６と７からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号８と９からなる１組のプライマー（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）と、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３と１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された７組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる７組のプライマー、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８、配列番号７９と８０、配列番号８１と８２、配列番号８３と８４、配列番号８５と８６、配列番号８７と８８、配列番号８９と９０、配列番号９１と９２に示された１２組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１２組のプライマーを含む、アシネトバクター属菌の遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。
【００１８】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、アシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定、及び／又は菌株識別を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、アシネトバクター属菌の伝播しやすいクローンを、院内感染が発生する前に速やかに検出し、また、国際流行株等の特定の菌株の医療機関内での伝播、拡散を追跡することを可能とし、その結果、院内感染の広がりの防止を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例１の電気泳動写真を示す。図１において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【図２】図２は、実施例２の電気泳動写真を示す。図２において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【図３】図３は、実施例３の電気泳動写真を示す。図３において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【図４】図４は、実施例４の電気泳動写真を示す。図４において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は分離株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係るアシネトバクター属菌の菌種同定、クローン同定法および／又は菌株識別のための方法は、アシネトバクター属菌の染色体上の、（１）Acinetobacter pittii特異的オープンリーディングフレーム（ORF）、（２）Acinetobacter nosocomialis特異的ORF、（３）Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF、（４）genomic isletを構成するORF、および（５）genomic islandを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら５種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
【００２２】
［（１）〜（３）菌種特異的ORF］
Acinetobacter calcoaceticus - baumannii complexを構成する菌種として、A. baumannii、A. pittii、A. nosocomialisおよびA. calcoaceticusなどがあるとされ、さらに種名記載はないが上記4種とは異なる遺伝子型の種としてAcinetobacter species close to nosocomialisがデータベース上に登録されている。これらのうちA. calcoaceticusを除く4種は臨床検体からしばしば検出される。
臨床分離される4菌種のうち、OXA-51型β−ラクタマーゼの遺伝子の検出により種が同定可能なA. baumanniiをのぞき、同定にはrpoB遺伝子などの塩基配列解読が必要となる。Acinetobacter属菌は、日常的な細菌学的検査では同定や菌株識別が困難であるため、通常は分離株の菌種同定などは行われず、感染対策の遅れや混乱を招く恐れがあった。
そこで、ゲノム情報を比較し、各菌種内で保存されておりかつ異なる菌種からは見つからない菌種特異的ORFを選び出し、正確に同定が完了している臨床分離株を用いてORFの保有についての実証解析を行った。データベース上では菌種特異的とみられたORFにおいても臨床分離株の調査では保有状態にばらつきが見られため、試行錯誤の上で菌種特異的ORFを選び決定した。
【００２３】
（Acinetobacter baumannii特異的ORF）
Acinetobacter baumanniiはOXA-51型β−ラクタマーゼの遺伝子およびそのバリアントを検出することで、同定可能とされている。Acinetobacter baumanniiの同定法は既知である。OXA-51型β−ラクタマーゼ遺伝子は配列表の配列番号２９（フォワード）および３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより容易に検出可能である。
【００２４】
（Acinetobacter pittii特異的ORF）
公開データベース上で利用可能なAcinetobacter pittiiのゲノム情報としてはSH024（Accession Number NZ_ADCH00000000、ADCH01000001-ADCH01000089）、DSM 21653（Accession Number AIEK00000000、AIEK01000001-AIEK01000458）、DSM 9306（Accession Number AIEF00000000、AIEF01000001-AIEF01000321）、D499（Accession Number AGFH00000000、AGFH01000001-AGFH01000030）などがある。Acinetobacter pittiiのゲノム情報を他のアシネトバクター属菌と比較し、A. pittiiのみで特異的に見いだされたORFを選び出した。選び出したORFを増幅可能なPCRプライマーを設計し、既に正確に同定が完了している臨床分離株を用いてA. pittiiに特異的なORFを選び出した（配列番号１）。A. pittii特異的なORFは配列表の配列番号４（フォワード）および５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより容易に検出可能である。なお、Acinetobacter calcoaceticusにもホモロジー約80%の近縁なORFが見つかるが、配列番号４（フォワード）および５（リバース）のプライマーはAcinetobacter calcoaceticusの近縁なORFとは反応せず、それらを検出しない。
【００２５】
（Acinetobacter nosocomialis特異的ORF）
公開データベース上で利用可能なAcinetobacter nosocomialisのゲノム情報としてはNCTC 8102（Accession Number AIEJ00000000、AIEJ01000001-AIEJ01000277）、RUH2624（Accession Number NZ_ACQF00000000、ACQF01000001-ACQF01000116）などがある。Acinetobacter nosocomialisのゲノム情報を他のアシネトバクター属菌と比較し、A. nosocomialisだけに見いだされるORFを選び出した。選び出したORFに対するプライマーを設計し、同定済み臨床分離株を用いてA. nosocomialisに特異的なORFを選び出した（配列番号２）。A. nosocomialis特異的なORFは配列表の配列番号６（フォワード）および７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより容易に検出可能である。
【００２６】
（Acinetobacter species close to nosocomialis特異的ORF）
Acinetobacter species close to nosocomialisは菌種名が決まっていないものの、比較的頻繁に患者より分離されるアシネトバクター属菌である。公開データベース上で利用可能なAcinetobacter species close to nosocomialisのゲノム情報としてはGG2（Accession Number ALOW00000000、ALOW01000001-ALOW01000040）がある。Acinetobacter species close to nosocomialisのゲノム情報を他のアシネトバクター属菌と比較し、Acinetobacter species close to nosocomialisのみに見いだされたORFを選び出した。選び出したORFを検出可能なプライマーを設計し、既に正確に同定されている臨床分離株を用いてAcinetobacter species close to nosocomialis特異的なORFを選び出した（配列番号３）。Acinetobacter species close to nosocomialis特異的なORFは配列表の配列番号８（フォワード）および９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより容易に検出可能である。
【００２７】
［（４）genomic isletを構成するＯＲＦ］
（アシネトバクター属菌の遺伝的特徴）
アシネトバクター属菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、multilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。アシネトバクター属菌のMLST解析にはフランス、パスツール研究所が開発した方法と、Bartualらが開発した方法(Journal of Clinical Microbiology 2005, 43:4382-4390)があるが、ここではパスツール研究所が開発した方法に従って解析した。
【００２８】
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子(cpn60, fusA, gltA, pyrG, recA, rplB, rpoB)の塩基配列を決定し、sequence type (ST)を決定する。また近縁なSTの集団を集めたclonal complex (ＣＣ)とすることで、遺伝的バックグラウンドが同一の株、すなわちクローンをまとめることが可能であり、疫学調査には欠かせない。なお、ＣＣを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌および緑膿菌では示されていたが、アシネトバクター属菌でも同様の手法が有効であるか否かはこれまでは不明であった。
【００２９】
アシネトバクター属菌にはさまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、それのみでは、最低限のＯＲＦを検出することによりアシネトバクター属菌を同定し、また流行クローンを同定できる菌種同定およびクローン同定法を開発するには十分でない。
【００３０】
そこで本発明者は、臨床分離されたアシネトバクター属菌を収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で臨床分離されるアシネトバクター属菌にはAcinetobacter baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. species close to nosocomialisが混在し、A. baumanniiは多様なＣＣに分類される株が存在することが判明し、流行クローン同定のためにはＣＣを識別できる程度の菌株識別能を実現する必要がある。
【００３１】
（genomic isletを構成するＯＲＦ）
前記のCC型を区別するためには、アシネトバクター属菌においてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
【００３２】
【表１】
2014207895.tif 000002
【００３３】
表１からわかるように、Acinetobacter baumanniiのST型の異なる株ではgenomic islet (AB57_2484〜A1S_3257)の保有パターンが異なっている。なお、D499株、NCTC8102株、GG2株のゲノムデータはドラフトシークエンスデータのため、ORF番号等の遺伝子情報は付加されておらず、該当ORFが見いだされるcontig番号が記入してある。
【００３４】
表１のゲノムデータのアクセッション番号は
AB0057 (Accession Number CP001182)
ACICU (Accession Number CP000863)
ATCC17978 (Accession Number CP000521)
SDF（Accession Number CU468230)
D499（Accession Number AGFH00000000、AGFH01000001-AGFH01000030）
NCTC 8102（Accession Number AIEJ00000000、AIEJ01000001-AIEJ01000277）
GG2（Accession Number ALOW00000000、ALOW01000001-ALOW01000040）
である。
【００３５】
臨床分離株におけるgenomic islet保有状況を調査した結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2014207895.tif 000003
【００３７】
これらのgenomic isletのうちアシネトバクター属菌のAB0057株の遺伝子AB57_0815およびAB57_3308、ならびにACICU株の遺伝子ACICU_02966およびACICU_03137を検出することで流行クローン（菌株番号１−３および４−５）のＣＣ型を区別可能であった。加えてAB57_2484、ACICU_02042およびACICU_01870を検出することでＣＣ型との相関性の向上と流行クローン識別の確実性が向上した。菌種同定およびクローン同定ならびに特定の流行クローンによらない集団感染の解析においては、genomic islet検出によるタイピングにおいても十分な菌株識別能が得られる。
【００３８】
なお、たとえば前記AB57_0815は、GenBankにおいて公開されているAB0057株の815番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はAB0057株のみにしか存在しないわけではなく、例えばSDF株におけるA1S_0767など、それから派生した菌株や、それとは異なる系統のアシネトバクター属菌においても存在する可能性がある。
【００３９】
なお、遺伝子AB57_2484は、配列表の配列番号１０（フォワード）および１１（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02042は、配列表の配列番号１２（フォワード）および１３（フォワード）ならびに１４（リバース）および１５（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02966は、配列表の配列番号１６（フォワード）および１７（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_01870は、配列表の配列番号１８（フォワード）および１９（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_3308は、配列表の配列番号２０（フォワード）ならびに２１（リバース）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_03137は、配列表の配列番号２３（フォワード）および２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_0815は、配列表の配列番号２５（フォワード）および２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
【００４０】
遺伝子AB57_0388は、配列表の配列番号３１（フォワード）および３２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_3624は、配列表の配列番号３３（フォワード）および３４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_00563は、配列表の配列番号３５（フォワード）および３６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_0526は、配列表の配列番号３７（フォワード）および３８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02468は、配列表の配列番号３９（フォワード）および４０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_0454は、配列表の配列番号４１（フォワード）および４２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_1914は、配列表の配列番号４３（フォワード）および４４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_1987は、配列表の配列番号４５（フォワード）および４６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_2085は、配列表の配列番号４７（フォワード）および４８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_2850は、配列表の配列番号４９（フォワード）および５０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_2930は、配列表の配列番号５１（フォワード）および５２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_00180は、配列表の配列番号５３（フォワード）および５４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02520は、配列表の配列番号５５（フォワード）および５６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02597は、配列表の配列番号５７（フォワード）および５８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02886は、配列表の配列番号５９（フォワード）および６０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_03379は、配列表の配列番号６１（フォワード）および６２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_03418は、配列表の配列番号６３（フォワード）および６４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_3581は、配列表の配列番号６５（フォワード）および６６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子A1S_3257は、配列表の配列番号６７（フォワード）および６８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にＣＣ型の区別ができる。
【００４１】
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
【００４２】
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic isletのＯＲＦ（４）を検出することを主に説明してきたが、genomic isletのＯＲＦ（４）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
【００４３】
［（５）genomic islandを構成するORF］
Acinetobacter baumanniiの中には、伝播しやすい国際流行クローン（international clone I、international clone II）が存在し、院内感染の原因となりやすいことが知られている。国際流行クローンによる院内感染の調査には、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
【００４４】
近年ゲノムの解読が進み、Acinetobacter baumanniiには５〜１００個の外来遺伝子からなる遺伝子クラスターが見いだされる。このクラスターをgenomic islandという。genomic islandには溶原ファージや病原アイランド、耐性アイランドに加え機能が不明なものが含まれる。個々のgenomic islandはおよそ５ｋｂｐ程度、またはそれ以上の大きさで、５〜１００個のORFから構成されている。genomic islandにはモザイク状にORFが組み合わされ、genomic island内のORFの構成に多様性が見られる場合と、株が異なってもORF構成がほとんど同じで多様性が見られない場合がある。
【００４５】
しかし、Acinetobacter baumanniiにはさまざまな株が存在する。実際の野生株における遺伝子型の調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献あるいはゲノム塩基配列データベースとして個々の断片的な情報として利用できるが、それのみでは最低限のＯＲＦを検出することによるAcinetobacter baumanniiの菌株同定法を開発するには十分でない。
【００４６】
そこで本発明者はGenBankのAcinetobacter baumanniiについての公開遺伝子情報を利用し、多くのgenomic islandのORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つAcinetobacter baumanniiについて、それらの保有するgenomic island遺伝子のORFの構成について検討した。
【００４７】
ゲノムデータベース登録株における全ゲノムデータの精査、および臨床分離株によるORF保有確認実験を繰り返した結果、genomic island遺伝子のORFをいくつか組み合わせて検出することが、Acinetobacter baumanniiの菌株識別にきわめて有効であることが明らかとなった。
【００４８】
その結果ABTJ_03571、ABTJ_01334、ABTJ_02589、ACICU_00874、AB57_0290、ABZJ_00242、ABTJ_02691、ACICU_00228、AB57_0967、ABTJ_00969、ACICU_02209、blaTEMを検出の対象とすると、Acinetobacter baumanniiの菌株を高精度で分類することができることを本発明者は見出した。上記のORFを検出することによって特に国際流行クローンであるinternational clone IIと呼ばれるクローンにおいて高い菌株識別能力が得られる。これらのgenomic islandを構成するORFをすべて検出することで最大の菌株識別能力を実現する。
【００４９】
なお、たとえば前記ABTJ_03571は、GenBankにおいて公開されているMDR-TJ株の3571番目の遺伝子、ACICU_00874はACICU株の874番目の遺伝子、AB57_0290はAB0057株の290番目の遺伝子、ABZJ_00242はMDR-ZJ06株の242番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はそれぞれMDR-TJ株、AB0057株、MDR-ZJ06株、ACICU株のみにしか存在しないわけではなく、例えばABTJ_03571はAB_TG27331株においても見いだされるなど、菌株によって保有している場合と、保有していない場合がある。
【００５０】
表３に全ゲノムデータ株におけるＯＲＦ保有状態を示す。表３からわかるように、菌株ごとに異なるＯＲＦ構成パターンが得られる。
【表３】
2014207895.tif 000004
【００５１】
なお、genomic islandを構成するＯＲＦの中には、表３に挙げたORFに限定されず、表３のORFが含まれるgenomic islandを構成するＯＲＦでは、ほぼ同様の保有パターンとなる傾向にあるものがある。表４は全ゲノムシークエンス解析株における、genomic island構成ＯＲＦの保有状況を、blast検索によって示した表である。なお、表４の、例えばgenomic island ABTJ_03567から03571は、このgenomic islandがABTJ_03567、ABTJ_03568、ABTJ_03569、ABTJ_03570およびABTJ_03571から構成されることを示している。この傾向はST2の株（菌株名ACICUからAB_515-8）のみならず、ST1の株（菌株名AB0057およびAYE）でも同様であった。表３のORFは、そのサイズやプライマーの作りやすさ、増幅のしやすさについて、臨床分離株を用いて検討し、決定した。
【００５２】
【表４】
2014207895.tif 000005
【００５３】
表３および表４のゲノムデータのアクセッション番号は
ACICU (Accession Number CP000863)
MDR-TJ (Accession Number CP003500)
MDR-ZJ06 (Accession Number CP001937)
AB_TG27331 (Accession Number NZ_AMIP01000000, AMIP01000001-AMIP01000148)
AB_TG27327 (Accession Number NZ_AMIO01000000, AMIO01000001-AMIO01000104)
AB_2008-23-07-01-7 (Accession Number NZ_AMHR01000000, AMHR01000001-AMHR01000242)
ABNIH1 (Accession Number NZ_AFSZ01000000, AFSZ01000001-AFSZ01000103)
Naval-78 (Accession Number NZ_AMFZ01000000, AMFZ01000001-AMFZ01000112)
UMB001 (Accession Number NZ_AEPK01000000, AEPK01000001-AEPK01000118)
53264 (Accession Number NZ_ALPW01000000, ALPW01000001-ALPW01000130)
AB_TG2026 (Accession Number AMIH01000000, AMIH01000001-AMIH01000691)
MRY10-0558 (Accession Number BASB01000000, BASB01000001-BASB01000077)
MRY12-0277 (Accession Number BASC01000000, BASC01000001-BASC01000106)
MRY09-0642 (Accession Number BASA01000000, BASA01000001-BASA01000148)
AB_1595-8 (Accession Number NZ_AMHE01000000, AMHE01000001-AMHE01000205)
AB_515-8 (Accession Number NZ_AMHU01000000, AMHU01000001-AMHU01000222)である。
AB0057 (Accession Number CP001182)
AYE (Accession Number CU459141)
である。
【００５４】
臨床分離株におけるgenomic island保有状況を調査した結果を表５に示す。臨床分離株においても菌株に特異的なORF保有パターンとなった。
【００５５】
【表５】
2014207895.tif 000006
【００５６】
なお、遺伝子ABTJ_03571は、配列表の配列番号６９（フォワード）および７０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ABTJ_01334は、配列表の配列番号７１（フォワード）および７２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ABTJ_02589は、配列表の配列番号７３（フォワード）および７４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_00874は、配列表の配列番号７５（フォワード）ならびに７６（リバース）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_0290は、配列表の配列番号７７（フォワード）および７８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ABZJ_00242は、配列表の配列番号７９（フォワード）および８０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ABTJ_02691は、配列表の配列番号８１（フォワード）および８２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_00228は、配列表の配列番号８３（フォワード）および８４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子AB57_0967は、配列表の配列番号８５（フォワード）および８６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ABTJ_00969は、配列表の配列番号８７（フォワード）および８８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子ACICU_02209は、配列表の配列番号８９（フォワード）および９０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子blaTEMは、配列表の配列番号９１（フォワード）および９２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
【００５７】
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
【００５８】
以上では、ＰＣＲ法によりgenomic islandを構成するＯＲＦ（５）を検出することを主に説明してきたが、genomic islandを構成するＯＲＦ（５）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
【００５９】
［ORF検出手段］
上述した、アシネトバクター属菌の染色体上の、各菌種特異的ORF（１）（２）（３）、genomic isletを構成するORF（４）およびgenomic islandを構成するORF（５）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００６０】
＜ＰＣＲ＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、アシネトバクター属菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
【００６１】
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、たとえば、アシネトバクター属菌マーカーとしてatpAを検出するプライマー（配列表の配列番号２７と２８）およびAcinetobacter baumanniiを検出するプライマー（配列表の配列番号２９と３０または９３と９４）を加えた、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応後の液を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認する。
【００６２】
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してＯＲＦを検出する。micro arrayによる検出では、各ＯＲＦとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のＯＲＦが検出可能となる。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
【００６３】
（プライマーの設計）
上記genomic isletを構成するORF（４）およびgenomic islandを構成するORF（５）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどのアシネトバクター属菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
【００６４】
上記菌種同定のためのORF（１）（２）（３）、genomic isletを構成するORF（４）およびgenomic islandを構成するORF（５）に加え、アシネトバクター属菌の共通マーカーとしてのatpAを検出するプライマーおよびAcinetobacter baumanniiを検出するプライマーのそれぞれに対応するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。
【００６５】
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜700bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するＯＲＦにおいては、ＰＣＲ増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することが重要である。
【００６６】
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマーおよびプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアあるいはウエブを通じて自由に入手し利用可能なソフトウェアにより行うことができる。
【００６７】
具体的には、上記（１）〜（５）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）Acinetobacter pittiiを検出するためのプライマーとして１組のプライマー、
（２）Acinetobacter nosocomialisを検出するためのプライマーとして１組のプライマー、
（３）Acinetobacter species close to nosocomialisを検出するためのプライマーとして１組のプライマー、
（４）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして７組のプライマー、
（５）genomic islandを構成するORFためのプライマーとして１２組のプライマー、
の合計２２組のプライマー（配列表の配列番号４〜２６、６９〜９２）を本発明者は設計した。
【００６８】
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表６にprimer mixtureとして示すように、１０組のプライマーセットにアシネトバクター属菌の共通マーカーとしてのatpAを検出するプライマー（配列表の配列番号２７と２８）およびAcinetobacter baumanniiの識別用マーカーとしてのOXA-51型β−ラクタマーゼの遺伝子を検出するプライマー（配列表の配列番号２９と３０）を加えた１２組のプライマーを組み合わせて混合した反応系、および下記表７にprimer mixtureとして示すように、１２組のプライマーセットにAcinetobacter baumanniiのマーカーとしてOXA-51型β−ラクタマーゼを検出するプライマー（配列表の配列番号９３と９４）を加えた１３組のプライマーを組み合わせて混合した反応系にてＰＣＲを実施することが望ましい。なお、アシネトバクター属の菌種同定およびクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
【００６９】
なお、配列番号２７および２８で示された増幅ＯＲＦのatpAとは、F0F1 ATP synthase subunit alphaをコードする遺伝子であり、アシネトバクター属菌に普遍的に見出されるので、アシネトバクター属菌を識別する共通マーカーとして用いることができる。
【００７０】
【表６】
2014207895.tif 000007
【００７１】
【表７】
2014207895.tif 000008
【００７２】
以上に示した具体的なプライマーは、標的ＯＲＦを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、ＰＣＲによって標的ＯＲＦを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。
【００７３】
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ＯＲＦと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。
【００７４】
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（アシネトバクター属菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
【００７５】
［ORF検出菌種同定およびクローン同定、並びに菌株識別法の実施方法］
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（５）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明のアシネトバクター属菌の菌種同定およびクローン同定法の手順を説明する。
【００７６】
（菌種の同定）
血液、痰、膿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液などの患者由来の検体あるいは患者に使用したカテーテルやガーゼ等の医療器具などの材料から、血液寒天培地（一般細菌分離用）、マッコンキー培地などのアシネトバクター属菌を分離可能な培地を用いてアシネトバクター属菌様の菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および生化学性状の確認により、アシネトバクター属菌と同定する。
【００７７】
アシネトバクター属菌であると同定された菌株を、アシネトバクター属菌を増殖可能な液体培地（Luria-Bertani broth、Brain Heart Infusion培地、トリプトソイブイヨン等）、あるいは寒天培地（Luria-Bertani寒天培地、Brain Heart Infusion寒天培地、トリプトソイ寒天培地、普通寒天培地等）を用いて37℃で一晩培養する。
【００７８】
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料（テンプレート）とする。
【００７９】
（PCR反応）
マルチプレックスPCRで上記表６および７に記載の、菌種同定のためのORF  3個、genomic isletを構成するORF  ７個、genomic islandを構成するORF  12個に加え、アシネトバクター属菌共通マーカーとしてのatpA、Acinetobacter baumannii識別マーカーとしてOXA-51型β−ラクタマーゼの検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１２組および１３組の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、菌種同定およびクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
【００８０】
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
【００８１】
（結果判定）
最大１２本または１３本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
【００８２】
このコードは（１）〜（５）の各ＯＲＦおよびOXA-51型β−ラクタマーゼごとに作成してもよいし、または、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（５）のＯＲＦおよびOXA-51型β−ラクタマーゼの一部をまとめて作成するなどしてもよい。本発明の菌種同定およびクローン同定法が実際の医療の現場で使用される場合には、（１）〜（５）のＯＲＦおよびOXA-51型β−ラクタマーゼすべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのＯＲＦの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。
【００８３】
ここで上述のとおり、（１）から（３）のORFおよびOXA-51型β−ラクタマーゼは菌種同定に関連し、また遺伝子型の分類上、アシネトバクター属菌は、clonal complex (ＣＣ)型にまとめると理解がしやすく流行クローンを同定する上でも有用である。（４）のＯＲＦの保有パターンはＣＣ型との相関が高く、ＣＣを推定するのに役立つ。（５）のORFの保有パターンを比較することで菌株識別が可能となる。
【００８４】
したがって、（４）のＯＲＦ検出結果を一つのコードとして作成することが好ましく、（５）のＯＲＦ検出結果は一つまたは二つのコードとして作成することが好ましいが視認性の良さを考慮すると二つのコードとして作成することがより好ましい。
【００８５】
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表８に示す。表８の例は図1の分離株番号１のものである。
【００８６】
【表８】
2014207895.tif 000009
【００８７】
まず、適切なプライマーを使用したＰＣＲおよび電気泳動により、試験対象のアシネトバクター属菌における各ＯＲＦの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る（コード  １２２−５３−９）。
【００８８】
表８に示された例において、コード１は（４）のORFの検出結果をまとめたものであるので、複数のアシネトバクター属菌株について遺伝子型コードを作成した場合に、アシネトバクター属菌のCCに相当する数値となる。この数値から世界流行クローンであるかどうかを判断することができる。コード２とコード3の組み合わせは菌株に固有のコードであり、計算上4096種類の遺伝子型に分けることが可能である。コード２とコード3は特にInternational clone IIにおける菌株識別能が高くなるようORFが選択されているが、その他のクローンにおいても菌株識別は可能である。
【００８９】
具体的には、たとえば、アシネトバクター属菌臨床分離株22株における７個のORF（AB57_2484〜AB57_0815）の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表９のとおりである。
【００９０】
【表９】
2014207895.tif 000010
【００９１】
表９において、一番上の行は、菌種名、上から2番目の行は菌株の番号、上から3番目の行はMLST解析によるSequence type (ST)型である。
OXA-51型β−ラクタマーゼおよび配列表１〜３のORF検出結果から菌種が同定できる。
さらに、このように判定結果をコード化するとコード１＝122が世界で最も流行しているクローンであるinternational clone IIでコード69がもう一つの世界流行クローンであるinternational clone Iであることがわかる。さらに得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
【００９２】
さらにコード１＝122のAcinetobacter baumannii臨床分離株、23株について（５）genomic islandを構成するORFの検出を行うと表１０のとおりである。
【００９３】
【表１０】
2014207895.tif 000011
【００９４】
表１０において、一番上の行は菌株番号である。菌株番号１、２および３は表９の菌株番号１、２および３と同一である。表１０の菌株のコード１はすべて122となる。
23株は20種類の遺伝子型に細分された。23株のうち菌株番号２、３８および３９は同一の集団感染事例から採取された菌だが、同一遺伝子型に属することがわかる。
【００９５】
さらに、本発明で検出の対象としているＯＲＦの大部分は、アシネトバクター属菌の病原性等に関連しないＯＲＦである。病原性に関連するなど、特定の機能を有する遺伝子は、そのアシネトバクター属菌が宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げることがある。つまりこのような遺伝子は、アシネトバクター属菌の多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なＯＲＦを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
ある病院で臨床分離されたアシネトバクター属菌（19株）およびATCC標準株(3株)の合計22株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
【００９７】
＜ORF検出による菌種およびクローン同定＞
（アシネトバクター属菌の培養）
アシネトバクター属菌であると同定された２２の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【００９８】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【００９９】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【０１００】
プライマーは１２組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１２個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１１のとおりである。
【０１０１】
【表１１】
2014207895.tif 000012
【０１０２】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出したDNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【０１０３】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【０１０４】
（結果判定）
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表８と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表９に示す。
【０１０５】
表９において、前述のようにOXA-51型β−ラクタマーゼおよび配列表１〜３のORF検出結果から菌種が同定でき、コードからＣＣが判明するが、たとえば菌株１〜３はAcinetobacter baumanniiと同定され、コードが１２２であることから世界流行クローンのinternational clone IIであることがわかる。
各菌種特異的ＯＲＦの検出から、菌種同定が可能である。菌株２２はAcinetobacter属菌であるが、種特異的ORFおよびgenomic isletが検出されず、Acinetobacter calcoaceticus - baumannii complexに含まれる菌種ではないことがわかる。
【０１０６】
実施例２
＜ORF検出による菌株同定＞
（アシネトバクター属菌の培養）
ORF検出による菌種およびクローン同定によってinternational clone IIと同定された２３の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【０１０７】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【０１０８】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【０１０９】
プライマーは１３組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１３個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１２のとおりである。
【表１２】
2014207895.tif 000013
【０１１０】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【０１１１】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【０１１２】
（結果判定）
１反応につき最大１３本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表８と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図２および表１０に示す。
【０１１３】
表１０において、一番上の行は菌株番号である。菌株番号１、２および３は表９の菌株番号１、２および３と同一である。表９の菌株のコード１はすべて122である。
23株は20種類の遺伝子型に細分された。23株のうち菌株番号２、３８および３９は同一の集団感染事例から採取された菌だが、同一遺伝子型であることがわかる。
【０１１４】
実施例２
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離されたアシネトバクター属菌（19株）およびATCC標準株(3株)の合計22株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った
【０１１５】
＜ORF検出による遺伝子型別分類＞
（アシネトバクター属菌の培養）
アシネトバクター属菌であると同定された２２の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【０１１６】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【０１１７】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【０１１８】
プライマーは１２組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１２個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１３のとおりである。
【０１１９】
【表１３】
2014207895.tif 000014
【０１２０】
なお、配列番号９５は配列番号４に対して2塩基を付加したものであり、配列番号９６は配列番号５に対して2塩基を置換したものであり、配列番号９７は配列番号６に対して1塩基を欠失させ、1塩基を付加したものであり、配列番号９８は配列番号７に対して２塩基を置換したものであり、配列番号９９は配列番号８に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１００は配列番号９に対して2塩基を置換したものであり、配列番号１０１は配列番号１０に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１０２は配列番号１１に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１０３は配列番号１２に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１０４は配列番号１３に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１０５は配列番号１４に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１０６は配列番号１５に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１０７は配列番号１６に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１０８は配列番号１７に対して２塩基を欠損させたものであり、配列番号１０９は配列番号１８に対して２塩基を欠損させたものであり、配列番号１１０は配列番号１９に対して２塩基を挿入したものであり、配列番号１１１は配列番号２０に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１１２は配列番号２１に対して１塩基を置換したものであり、配列番号１１３は配列番号２２に対して１塩基を置換したものであり、配列番号１１４は配列番号２３に対して１塩基を欠損させ、1塩基を付加したものであり、配列番号１１５は配列番号２４に対して２塩基を挿入したものであり、配列番号１１６は配列番号２５に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１１７は配列番号２６に対して2塩基を付加したものである。
【０１２１】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【０１２２】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【０１２３】
（結果判定）
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表８と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図３に示す。菌株番号２１におけるACICU_02042の増幅がやや悪くなったが、図1および表９と同様の結果が得られた。
【０１２４】
＜ORF検出による菌株同定＞
（アシネトバクター属菌の培養）
アシネトバクター属菌であると同定された２２の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【０１２５】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【０１２６】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【０１２７】
プライマーは１２組を組み合わせ１本の反応チューブを使用し、１２個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ、及びその最終濃度は下記表１４のとおりである。
【０１２８】
【表１４】
2014207895.tif 000015
【０１２９】
なお、配列番号１１８は配列番号６９に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１１９は配列番号７０に対して2塩基を置換したものであり、配列番号１２０は配列番号７１に対して１塩基を欠失させ、１塩基を付加したものであり、配列番号１２１は配列番号７２に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１２２は配列番号７３に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１２３は配列番号７４に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１２４は配列番号７５に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１２５は配列番号７６に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１２６は配列番号７７に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１２７は配列番号７８に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１２８は配列番号７９に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１２９は配列番号８０に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１３０は配列番号８１に対して２塩基を挿入したものであり、配列番号１３１は配列番号８２に対して２塩基を欠損させたものであり、配列番号１３２は配列番号８３に対して２塩基を欠損させたものであり、配列番号１３３は配列番号８４に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１３４は配列番号８５に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１３５は配列番号８６に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１３６は配列番号８７に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１３７は配列番号８８に対して２塩基を付加したものであり、配列番号１３８は配列番号８９に対して２塩基を置換したものであり、配列番号１３９は配列番号９０に対して２塩基を挿入したものであり、配列番号１４０は配列番号９１に対して2塩基を付加したものであり、配列番号１４１は配列番号９２に対して2塩基を欠失させたものである。
【０１３０】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）に熱抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、52℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【０１３１】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【０１３２】
（結果判定）
１反応につき最大１２本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表８と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図４に示す。非特異な増幅が見られたが、特異的な反応は図２および表１０と同様の結果が得られ、プライマーの機能は保たれていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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