(57)【要約】      （修正有）【課題】ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のリーディングフレームの修復を目的として、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンをスキップし、そこから産生されるｍＲＮＡから上記エクソンを排除するためのオリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。【解決手段】遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは少なくとも２つの部分を含み、２つの部分は、ｍＲＮＡ前駆体の第１のエクソン、及び第２のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、第１、第２の部分が含まれ、更に、２つの部分は、各々連結成分によって隔てられているオリゴヌクレオチド。更に、ｍＲＮＡ二次構造を改変してスプライシング過程に干渉する方法、並びに上記オリゴヌクレオチド及び上記方法を用いた疾病（筋ジストロフィー）の治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物であって、該化合物は少なくとも２つの部分を含み、該少なくとも２つの部分には、該少なくとも２個のエクソンの内の第１のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第１の部分、および該ｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第２の部分が含まれ、該ｍＲＮＡ前駆体内の該第１エクソンと該第２のエクソンとは少なくとも１個のエクソンによって隔てられていることを特徴とする化合物。
【請求項２】
１６〜８０ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該エクソンに相補的なヌクレオチド伸長鎖を含む少なくとも２つの部分は、それぞれ連結成分によって隔てられていることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
該連結成分が４〜４０ヌクレオチドを包含することを特徴とする、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
該連結成分が少なくとも４個のウラシルヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの化合物であって、構造的にロックされた核酸およびモルフォリノ−ホスホロジアミデートからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む化合物。
【請求項７】
該遺伝子がジストロフィン遺伝子であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
該ジストロフィン遺伝子の該第１のエクソンおよび該第２のエクソンが、エクソン２、８、９、１７、１９、２９、４０〜４６、４８〜５３、５５および５９からなる群より選ばれるエクソンであることを特徴とする、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
該ジストロフィン遺伝子の該第１のエクソンと該第２のエクソンとの組合せが、エクソン４５とエクソン５１との組合せ、エクソン４４とエクソン５２との組合せ、エクソン１７とエクソン４８との組合せ、エクソン４５とエクソン５５との組合せ、エクソン４２とエクソン５５との組合せ、エクソン４９とエクソン５９との組合せ、およびエクソン４５とエクソン４９との組合せから選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の２個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導するための医薬の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかの化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の３個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導するための医薬の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかの化合物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンと、該少なくとも２個のエクソンの間に位置する配列である介在配列のスキッピングを誘導するための医薬の製造方法。
【請求項１３】
該介在配列が、少なくとも１個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかの化合物の、スプライシング機構によるｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識効率を改変する方法に用いる医薬の製造への使用であって、該ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該化合物は該エクソンの内の少なくとも２個にハイブリダイズし得るものであり、該改変方法は以下の工程を包含することを特徴とする使用。
該スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、該化合物を提供し、そして
該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。
【請求項１５】
該遺伝子が、少なくとも３個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
スプライシング機構によるｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識効率を改変するための、人体には適用しない方法であって、該ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、以下の工程を包含することを特徴とする方法。
該スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、請求項１〜９のいずれかの化合物であって、該エクソンの内の少なくとも２個にハイブリダイズし得るものを提供し、そして
該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。
【請求項１７】
該遺伝子が、少なくとも３個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明はｍＲＮＡ前駆体から産生するｍＲＮＡの再構成およびその治療用途に関する。
【０００２】
生物学のセントラルドグマとは、遺伝情報は細胞のＤＮＡに存在し、この遺伝情報は転写によって発現され、そして細胞の翻訳機構に付随してコードされているタンパク質が産生されるというものである。遺伝情報の流れ方に関するこのような見解は、細胞に含まれるタンパク質に干渉するための、主としてＤＮＡに基づくアプローチの発展を促進した。この見解は徐々に変わってきており、ＤＮＡレベルでの干渉に代わるものが要求されている。
【０００３】
高等真核生物においては、細胞内ＤＮＡのタンパク質に関する遺伝情報は、イントロン配列によって互いに隔てられているエクソンによってコードされている。このようなイントロンは非常に長い場合もある。転写機構によってエクソンとイントロンの両方を含むｍＲＮＡ前駆体が産生し、スプライシング機構は、しばしばｍＲＮＡ前駆体の産生時に、早くもｍＲＮＡ前駆体に存在する複数のエクソンを１つにスプライシングし、タンパク質の実際のコード領域を産生する。
【０００４】
ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生じるための実際の工程については明らかになっていることも多いが、不明な点もまた多い。本発明では、スプライシング工程に影響を与えることで異なるｍＲＮＡの産生が可能であることを開示する。この工程は、スプライシング機構の産生するｍＲＮＡの予測通り且つ再現性のある再構成を可能とする。成熟したｍＲＮＡに通常は含まれるエクソンに対応するｍＲＮＡ前駆体内の位置にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドは、このように標的としたエクソンまたはその一部の除外を誘導することができる。
【０００５】
本発明においては、適切な相補的オリゴヌクレオチドを設計するための手段および方法を提供する。従って本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、エクソンから転写したＲＮＡについて、ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの（予測した）二次構造から決定し、そして少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造に相補的であり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造に相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造することを包含する方法を提供する。ＲＮＡ分子は、１つのＲＮＡ分子内で相補的または部分的に相補的な伸長鎖と塩基対を形成するが故に、強固な二次構造を示す。ＲＮＡ内の構造は、ＲＮＡの機能において役割を担うものであると長く考えられていた。理論に拘束されることなく考えれば、ＲＮＡ中のエクソンの二次構造はスプライシング工程の構築において役割を担うと考えられる。その構造から、エクソンはｍＲＮＡに包含されなければならない部分であると認識されている。本明細書では、このようなシグナリング機能を「エクソン包含シグナル（exon inclusion signal）」と称する。本発明の相補的なオリゴヌクレオチドは、エクソンの構造に干渉することで、エクソンのエクソン包含シグナルに干渉することができる。多くの相補的なオリゴヌクレオチドはこのような能力を確実に有し、その中には他のものより効率的なものもあることが明らかになった。本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、本来のエクソンＲＮＡに存在するオープン構造とクローズド構造に対する上記のような重なる部分を有するものは、産生可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択したものである。このようなオリゴヌクレオチドとして選択されるものには、エクソン包含シグナルに効率的に干渉することのできるオリゴヌクレオチドが含まれる。理論に拘束されることなく考えれば、オープン構造との重なりがオリゴヌクレオチドの侵入効率を向上させる（即ち、オリゴヌクレオチドがＲＮＡ構造に入り込むことのできる効率を上昇させる）のに対し、クローズド構造との重なりはエクソンのＲＮＡの二次構造に干渉する効率を上昇させて、エクソン包含シグナルに干渉すると考えられる。クローズド構造とオープン構造の両方について、オリゴヌクレオチド内の部分的相補性を示す領域の長さは厳密には限定されるものではないことがわかった。本発明者らは、いずれの構造についても、相補性領域の長さを変えたオリゴヌクレオチドで高い効率を確認した。本明細書で「相補性」という用語は、生理的条件下において、核酸伸長鎖が他の核酸伸長鎖にハイブリダイズ可能な性質を意味する。したがって、相補性を示す領域内のすべての塩基が、対立鎖の塩基と対を形成し得ることが絶対的に必要なわけではない。例えばオリゴヌクレオチドを設計する場合、相補鎖の塩基と対を形成しない残基などを組み込むことができる。細胞内においてヌクレオチド伸長鎖が相補的な部分にハイブリダイズすることができるかぎり、ミスマッチはある程度まで許容される。好ましい態様においては、（上記のオープン構造またはクローズド構造のいずれかに）相補的な部分は、少なくとも３個、さらに好ましくは少なくとも４個の連続したヌクレオチドを含む。相補性領域は、それらを組み合わせた時に、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンに特異的になるように設計することが好ましい。このような特異性は、転写系の他のｍＲＮＡ（前駆体）の実際の配列に依存するので、種々の長さの相補性領域が特異性を示す。１個以上の他のｍＲＮＡ前駆体がオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする危険性は、オリゴヌクレオチドが大きくなるほど減少する。相補的な領域にミスマッチを有していても、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであれば、本発明で使用可能なことは明らかである。しかしながら、少なくとも相補的な部分にはこのようなミスマッチを持たないものが好ましく、これは１個以上の相補性領域にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりもこのようなオリゴヌクレオチドの方が一般的に高い効率と高い特異性を有するためである。より高いハイブリダイゼーション強度（即ち、対立鎖との相互作用の数が増加すること）は、転写系のスプライシング機構に干渉する工程の効率を上昇させるのに都合がよいと考えられる。
【０００６】
二次構造は、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンが存在する領域に関して分析するのが最もよい。このような二次構造の解析に実際のＲＮＡを用いてもよいが、しかしながら、最近では、構造モデリングプログラムを用いてＲＮＡ分子の二次構造を（最低のエネルギーコストで）かなり正しく予測することが可能になった。適当なプログラムの例としては、RNA mfold version 3.1 というサーバー（Mathews et al., 1999, J. Mol. Biol. 288: 911-940）が挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、ヌクレオチド配列を与えられれば、適当な再現性をもってエクソンの妥当な構造を予測することができる。最もよい予測結果は、このようなモデリングプログラムにエクソンと隣接するイントロンの両方の配列を与えたときに得られる。全長ｍＲＮＡ前駆体の構造を予測することは一般的には必要ではない。
【０００７】
オリゴヌクレオチドが対応するオープン構造とクローズド構造は、互いに隣接していることが好ましい。このような構造であれば、オープン構造へのオリゴヌクレオチドのアニーリングはクローズド構造の開環を誘導し、その結果、アニーリングがクローズド構造内に進行すると考えられる。このような作用を介して、これまで閉じていた構造は異なる立体配座をとる。異なる立体配座はエクソン包含シグナルの崩壊をもたらす。しかしながら、潜在的な（隠蔽された）スプライス受容部位配列および／またはスプライス供与部位配列が標的エクソン内に存在する場合には、時には異なる（ネオ (neo)）エクソン（即ち、異なる５’末端、異なる３’末端またはその両方を有するエクソン）を定義する新たなエクソン包含シグナルが生じる。この種の活性は、標的エクソンをｍＲＮＡから除外するので、本発明の範囲に含まれる。標的エクソンの一部を含む新たなエクソンがｍＲＮＡに存在することは、標的エクソンそのものが除外されるという事実を変えるものではない。ネオエクソンの包含は、時たま生じる副効果と考えられる。変異の結果として崩壊したオープンリーディングフレーム（の一部）を修復するのにエクソンスキッピングを用いた場合には、２つの可能性がある。一方は、ネオエクソンがオープンリーディングフレームの修復に機能するのに対し、他方ではオープンリーディングフレームは修復されない。エクソンスキッピングによってリーディングフレームを修復するためのオリゴヌクレオチドの選択において、（ネオエクソンを含んでいるか含んでいない）オープンリーディングフレームを修復するエクソンスキッピングを確かにもたらすオリゴヌクレオチドのみを選択することは、このような条件下では当然のことながら明らかである。
【０００８】
ｍＲＮＡ前駆体は種々のスプライシング事象、例えば選択的スプライシング、に付される。このような事象は、細胞または人工的なスプライシング系の環境によって誘導または触媒される。したがって、同一のｍＲＮＡ前駆体から、いくつかの異なるｍＲＮＡが産生されることもある。この異なるｍＲＮＡはすべてエクソン配列を含むが、これこそがエクソンの定義である。しかしながら、ｍＲＮＡの内容の流動性故に、本発明においてはエクソンという用語の定義づけが必要となる。本発明においてエクソンとは、ｍＲＮＡ前駆体とそれから生じるｍＲＮＡの両方に存在する配列であって、ｍＲＮＡに含まれる配列は、ｍＲＮＡ前駆体においては、その片側（１番目と最後のエクソンの場合）またはその両側（１番目と最後のエクソン以外のエクソンの場合）にｍＲＮＡには存在しない配列が隣接しているものである。原則的に、ｍＲＮＡ前駆体から生じるいかなるｍＲＮＡもこの定義にかなうものである。しかしながら、本発明においては、いわゆる優勢ｍＲＮＡ（dominant mRNA’s）、即ち、所定の条件下でｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡの少なくとも５％を構成するｍＲＮＡが好ましい。特にヒト免疫不全ウイルスは、選択的スプライシングを極端に使用する。いくつかの非常に重要なタンパク質産物が、このウイルスから調製した全ｍＲＮＡの５％にも満たないｍＲＮＡから産生される。レトロウイルスのゲノムＲＮＡは、そこから誘導される全てのスプライシング産物にとってｍＲＮＡ前駆体として捉えることができる。選択的スプライシングは細胞種により異なるので、エクソンは、その転写系で用いられるスプライシング条件におけるエクソンと定義する。仮定的な例においては、筋細胞のｍＲＮＡは、神経細胞の同一のｍＲＮＡ前駆体から生じたｍＲＮＡには存在しないエクソンを含んでいることもある。同様に、癌細胞のｍＲＮＡは、正常細胞の同一のｍＲＮＡ前駆体から生じたｍＲＮＡには存在しないエクソンを含んでいることもある。
【０００９】
選択的スプライシングは、同一のｍＲＮＡ前駆体からのスプライシングによって起こる。しかしながら、選択的スプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体の変異、例えば、さらなるスプライス受容部位配列および／またはスプライス供与部位配列を生じる変異によって起こる場合もある。このような選択的スプライス部位配列を、「潜在的スプライス受容部位配列／供与部位配列」としばしば称する。このような潜在的スプライス部位配列は新たなエクソン（ネオエクソン）をもたらすことがある。本発明の方法を用いることで、産生されたｍＲＮＡにネオエクソンが包含されるのを、少なくとも部分的に妨げることができる。ネオエクソンに潜在的且つ「正常な」スプライス供与部位配列／受容部位配列が隣接している場合には、ネオエクソンは古い（パレオ (paleo)）エクソンを含む。このような場合に、潜在的なスプライス供与部位／受容部位が取って代わったもとのスプライス供与部位配列／受容部位配列が未だにｍＲＮＡ前駆体に存在すると、ネオエクソンのエクソン認識シグナルに干渉することによってパレオエクソンを含むｍＲＮＡの産生を増幅することができる。このような干渉は、パレオエクソンに対応するネオエクソンの一部と、このようなネオエクソンの追加的部分の両方に作用し得る。この種のエクソンスキッピングは、スプライス補正（splice correction）と捉えることができる。
【００１０】
エクソンスキッピング技術は多種多様な目的のために用いることができる。しかしながら、対象生物において望ましくないスプライシングを示すｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡを再構成するのに用いることが好ましい。このような再構成は、細胞によって産生されるタンパク質の量を減少させるのに用いることができる。これは、細胞が特定の望ましくないタンパク質を産生する場合に有用である。しかしながら、好ましい態様においては、細胞による機能性タンパク質の産生を促進するために再構成を用いる、即ち、再構成によって機能性タンパク質のコード領域が生じる。後者の態様は、変異によって失われたオープンリーディングフレームを修復するために好ましく用いられる。好ましい遺伝子には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子、コラーゲンＶＩα１遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１）、筋細管ミオパシー１遺伝子（ＭＴＭ１）、ジスフェリン遺伝子（ＤＹＳＦ）、ラミニン−α２遺伝子（ＬＡＭＡ２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィー遺伝子（ＥＭＤ）および／またはカルパイン３遺伝子（ＣＡＰＮ３）が含まれる。さらに、デュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子を例に挙げて本発明を詳細に説明する。この遺伝子は本発明において特に好ましい遺伝子を構成するが、本発明はこの遺伝子に限定されるものではない。
【００１１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）はいずれも、Ｘ染色体に位置し、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の変異によってもたらされる（文献１〜６）。ＤＭＤの発生率は、新生男児で１：３，５００である。患者は進行性の筋衰弱に苦しみ、１３歳未満で車椅子生活を余儀なくされ、３０歳を迎えずに亡くなることが多い（文献７）。一般的に、より軽症のＢＭＤの発生率は１：２０，０００である。ＢＭＤ患者は４０歳を過ぎても歩行可能であり、ＤＭＤ患者よりも余命が長い（文献８）。
【００１２】
ジスロトフィンはジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の必須成分であり、特に筋繊維の膜安定性の維持に関与する（文献９、１０）。ＤＭＤ遺伝子のフレームシフト変異は、筋細胞のジストロフィン欠乏をもたらす。このような現象は他のＤＧＣタンパク質の低減を伴い、ＤＭＤ患者に見られる重度な表現型をもたらす（文献１１、１２）。ＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームをそのまま維持する変異は、重症度の低いＢＭＤに関与する、短いが部分的に機能性を有するジストロフィンを生じる（文献１３、１４）。
【００１３】
広範囲にわたる努力にもかかわらず、ＤＭＤ患者のための臨床で適用可能且つ効果的な療法は未だ開発されていない（文献１５）。しかし、疾病の発症および／または症状の進行は糖質コルチコイド療法によって遅らせることができる（文献１６）。ＭｄｘモデルマウスとＤＭＤ患者から得た細胞におけるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のリーディングフレームの修復を目的とした遺伝子治療について、本発明者らを含む研究者らによって見込みある結果が近年報告されている（文献１７〜２３）。特定のエクソンを標的としたスキッピングによって、ＤＭＤ表現型を軽症のＢＭＤ表現型に変換することができる。エクソンのスキッピングは、スプライス部位のいずれかまたは両方、あるいはエクソン内部配列を標的とするアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）の結合によって誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合にのみｍＲＮＡに包含されるので、スプライス部位がＡＯＮの標的となることは明かである。これは、効力および効率が変動するものの、正しいことが明かとなっている（文献１７、１８、２０、２１）。本発明者らは、エクソン内部配列を標的とすることは、特異性を上昇させ、スプライシング機構そのものとの干渉を減少させると仮定した。エクソンの中には弱いスプライス部位を有し、スプライシング機構によって正しく認識されるためには、エクソン認識配列（ＥＲＳ）またはエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）へのＳＲタンパク質の結合が必要であると考えられるものがある（文献２４）。ＳＲタンパク質は、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに必須の、アルギニン／セリンに富んだスプライソソーム関連リンタンパク質からなる高度に保存されたファミリーである（文献５０、５１）。ＳＲタンパク質は、スプライス部位の認識とスプライソソームの集合を促進することによって、スプライシングの初期段階で活躍すると考えられる。ＳＲタンパク質は、in vivo および in vitro において選択的スプライス部位の用法を決定することができるので、調節的な役割も担う。ＳＲタンパク質は、細胞核内で転写とｍＲＮＡ前駆体のスプライシングとを空間的に配置するために、ＳＲタンパク質が濃縮されている核「スペックル」から、転写の場に送られると考えられる（文献４９、５２）。破壊的な点変異やこれら配列を遮断するＡＯＮは、エクソンスキッピングをもたらすことが明らかになった（文献１９、２２、２４〜２８）。本発明者らはすでにエクソン４６の中のＥＲＳ様配列に特異的なエクソン内部ＡＯＮを用いて、エクソン４５の欠失を有する２人のＤＭＤ患者由来の培養筋管において、スプライシングパターンを調節することができた（文献１９）。ＡＯＮ療法に続いてエクソン４６がスキップされ、その結果、少なくとも７５％の細胞でリーディングフレームが修復され、ジストロフィン合成が誘導された。本発明者らは、エクソン内部ＡＯＮを用いることで、ヒトの対照筋細胞においても、１５種のＤＭＤエクソンのエクソンスキッピングを効率的に誘導することができることを最近証明した（文献２３、未発表結果）。スキッピングは弱いスプライス部位またはＥＲＳ様配列を含むエクソンでのみ達成されるというこれまでの見解とは対照的に、本発明者らは、本発明の研究でスキップされたエクソンのほとんどが弱いスプライス部位を有しておらず、ＥＲＳ様配列も含有しないことを知見した。したがって、標的エクソンそのものに対するＡＯＮの結合がエクソンスキッピングを引き起こすのに十分であり、この時ＡＯＮは、スプライシング機構の１個以上の成分に干渉するか、ＲＮＡの二次構造を変化させることによって、スプライシング機構がもはやエクソンを認識しないようにする。好ましい態様においては、スキップされるエクソンはエクソン２，８，９，１７，１９，２９，４０〜４６，４９〜５３，５５または５９を含み、さらに好ましくは、エクソン２，８，９，１７，４０，４１，４２，４４，４６，４８，４９〜５２，５５または５９を含んでいる。他の１つの態様においては、スキップされるエクソンはエクソン２，２９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４８，４９，５０，５１，５３または５５を含んでいる。
【００１４】
本発明の要件を満たすいかなるオリゴヌクレオチドもＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングの誘導に用いることができる。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングにおいて活性を示す配列として表２に記載した配列またはその機能性同等物を含み、機能性同等物は上記の活性を有する配列と同種、好ましくは同じであるが、強度が必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション能力を有する。オリゴヌクレオチドは、表２に記載の配列であって、エクソン２，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４８，４９，５０，５１，５３または５５から誘導され、エクソンスキッピングにおいて活性を示す配列を含むことが好ましい。したがって、本発明はさらに、表２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を提供する。好ましくは、本発明は、表２に記載のエクソンスキッピングを誘導可能な、表に示したオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、表２のオリゴヌクレオチドであって、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン２，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４８，４９，５０，５１，５３または５５に相補的なものを提供する。
【００１５】
リーディングフレームの補正は、欠失に隣接する１個または２個のエクソンのスキッピング、ナンセンス変異を含むインフレームエクソンのスキッピング、または重複したエクソンのスキッピングによって達成される。これにより、種々のＢＭＤ患者に見られるタンパク質と類似のものが生じる（文献２、２９）。ライデンＤＭＤ変異データベース（Leiden DMD mutation database）（www.dmd.nl；（文献３０））の調査から、本発明者らは、ＤＭＤを引き起こす変異の７５％超を補正できる（表４参照）ことがわかる。本発明者らは、７種の変異に対するエクソンスキッピングの実際の治療効果について開示する。すべての患者筋細胞培養物に関して、本発明者らは、７５〜８０％の処置細胞でジストロフィン合成を修復することができた。
【００１６】
本発明の方法で製造した相補的オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるエクソンＲＮＡの連続した１３〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的であることが好ましい。他の１つの態様においては、本発明の方法で製造した相補的オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるエクソンＲＮＡの連続した１６〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的である。オリゴヌクレオチドは、このようなエクソンＲＮＡの連続した１３〜２５ヌクレオチドからなる部分に相補的であることが好ましく、連続した１４〜２５ヌクレオチドからなる部分に相補的であることがより好ましい。種々の核酸をオリゴヌクレオチドの製造に用いることができる。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは非常に安定なので、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含むことが好ましい。エクソンスキッピング技術の目的の一つは対象生物においてスプライシングを促すことなので、オリゴヌクレオチドＲＮＡは、ＲＮＡにさらなる特性、例えば、エンドヌクレアーゼやＲＮａｓｅ Ｈに対する耐性、さらなるハイブリダイゼーション強度、（例えば体液中での）安定性の向上、柔軟性の向上または低減、毒性の低下、細胞内輸送性の向上、組織特異性などを付与する修飾を有することが好ましい。このような修飾は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含むことが好ましい。また、このような修飾は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含むことが好ましい。１つの態様においては、本発明は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾と構造的にロックされた核酸とを有するオリゴヌクレオチドを含む、ハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。このような特定の組み合わせは、構造的にロックされた核酸のみを有する同等物と比べて高い配列特異性を示し、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾のみを含むオリゴヌクレオチドと比べて効率が向上している。
【００１７】
核酸模倣技術の出現とともに、核酸と同種、好ましくは同じであるが、強度が必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション特性を有する分子を製造することが可能となった。当然のことながら、このような同等物も本発明の一部である。このような模倣同等物の例としては、ペプチド核酸、構造的にロックされた核酸および／またはモルフォリノ−ホスホロジアミデートが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドの同等物として適切なものは以下の文献に挙げられているが、これらに限定されるものではない： Wahlestedt, C. et al., Potent and non-toxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci USA 97, 5633-8. (2000)； Elayadi, A.N. & Corey, D.R. Application of PNA and LNA oligomers to chemotherapy. Curr Opin Investig Drugs 2, 558-61. (2001)； Larsen, H.J., Bentin, T. & Nielsen, P.E. Antisense properties of peptide nucleic acid. Biochim Biophys Acta 1489, 159-66. (1999)； Braasch, D.A. & Corey, D.R. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry 41, 4503-10. (2002)； および Summerton, J. & Weller, D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7, 187-95 (1997)。１個以上の同等物どうしのハイブリッド、および／または同等物と核酸とのハイブリッドも、当然のことながら本発明の一部である。好ましい態様においては、同等物は構造的にロックされた核酸を含み、これは構造的にロックされた核酸が高い標的親和性と低い毒性を示し、故にエクソンスキッピングの効率が高いからである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常はエクソンのスプライス供与部位またはスプライス受容部位との重なりを有する必要はない。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、当然のことながら、ｍＲＮＡの構造に干渉するための他の方法と組み合わせることができる。例えば、ある方法で使用するオリドヌクレオチドに、ｍＲＮＡ前駆体の他のエクソンの少なくとも１個に相補的な、他のオリゴヌクレオチドを少なくとも１個含ませることができる。この方法は、ｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡに、ｍＲＮＡ前駆体の２個以上のエクソンが包含されるのを妨げるために用いることができる。好ましい態様においては、少なくとも１個の他のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法により製造したオリゴヌクレオチドまたはその同等物である。本発明のこのような態様を、「ダブルエクソンスキッピング」または「マルチエクソンスキッピング」と称する。多くの場合、ダブルエクソンスキッピングは、ｍＲＮＡ前駆体から２個の標的とした（相補的）エクソンのみを除外する。しかしながら、他の場合には、複数の標的エクソンの間に他のエクソン（即ち、介在エクソン）が存在しても、ｍＲＮＡ前駆体の２個の標的エクソンとこれらエクソンの間の全領域が産生されたＲＮＡに存在しないことがわかった。このようなマルチスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子から得たオリゴヌクレオチドの組み合わせ、具体的にはエクソン４５に対するオリゴヌクレオチドとエクソン５１に対するオリゴヌクレオチドとを、ＤＭＤ遺伝子を転写する細胞に加えた際に顕著であった。このような設定の結果、産生されたｍＲＮＡはエクソン４５〜５１を含んでいなかった。この結果から明らかなように、上述のオリゴヌクレオチドの存在下におけるｍＲＮＡ前駆体の構造は、スプライシング機構がエクソン４４とエクソン５２を互いに繋ぐように促進されたものであった。
【００１９】
本発明においては、２個の相補的なオリゴヌクレオチドの間に結合を設けることで、介在エクソンのスキッピングも特異的に促進することが可能であることがわかった。したがって、本発明は、遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物を提供し、該化合物は少なくとも２つの部分を含み、該少なくとも２つの部分には、該少なくとも２個のエクソンの内の第１のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第１の部分、および該ｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第２の部分が含まれる。該化合物中の少なくとも２つの部分は、１つの分子を形成するように結合されている。結合はいかなる手段によるものでもよいが、ヌクレオチド結合によって形成されたものが好ましい。後者の場合、一方の相補的エクソンまたは他方の相補的エクソンとの重なりをもたないヌクレオチドの数は０であってもよいが、４〜４０ヌクレオチドであることが好ましい。このような連結成分は、オリゴヌクレオチドを連結することができればいかなる種類の成分であってもよい。近年、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を模倣する種々の化合物が入手可能である。このような同等物が同種であるが、強度が必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション特性を有する場合、本発明で用いる化合物として適当である。適当な同等物はすでに本明細書に記載した。化合物中の１個、好ましくは複数のオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを製造するための本発明の方法によって製造する。前述の通り、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的エクソンとのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドのみからなる必要はない。さらなる材料および／またはヌクレオチドが加えられていてもよい。
【００２０】
前述の通り、ｍＲＮＡの再構成を行うことが好ましい遺伝子はＤＭＤ遺伝子である。ＤＭＤ遺伝子は大きな遺伝子であり、多くの異なるエクソンを有する。この遺伝子がＸ染色体に位置することを考慮すると、この病気に罹患するのは男児がほとんどであるが、二親の両方から遺伝子の悪いコピーを受け継いだり、筋細胞における特に偏ったＸ染色体の不活性化による、機能性対立遺伝子の特に偏った不活性化を患ったりすることによって、女児もこの病気に罹患する。タンパク質は、少なくとも２．６Ｍｂにわたる複数のエクソンによってコードされている（文献７９）。欠陥はＤＭＤ遺伝子のいかなる部分でも生じ得る。１個以上の特定のエクソンのスキッピングは、ほとんどの場合、正常のものよりも短いが、少なくとも部分的に機能性を有するジストロフィンタンパク質をコードする再構成ｍＲＮＡをもたらす。エクソンスキッピング技術に基づく医薬の開発における実用上の問題は、細胞中の機能性ジストロフィンタンパク質を欠乏させ得る変異が複数存在することである。既に多数の異なる変異が１個のエクソンのスキッピングによって補正可能であるという事実にもかかわらず、このように複数の変異が存在するということは、異なる変異に対して異なるエクソンをスキップする必要があるので、多数の異なる薬剤の製造が必要となる。本発明の化合物、即ち２個以上のエクソンのスキッピングを誘導可能な化合物の利点は、１個を超えるエクソンを１つの薬剤でスキップできるということである。このような特性は、種々のデュシェンヌ型またはベッカー型の変異を治療するために製造しなければならない薬剤の数が限られるという点で実用上、非常に有用であるばかりではなく、今や当業者には、特に機能性の高い再構成ジストロフィンタンパク質を選択し、この好ましいジスロトフィンタンパク質を産生することのできる化合物を製造するという選択肢も与えられている。このような好ましい最終産物を「軽症表現型ジストロフィン（mild phenotype dystrophins）」と称する。正常なジストロフィンタンパク質の構造を模式的に示すと、構造的機能を有する２つの端点（ビーズ部）が長いが少なくとも部分的に可とう性を有するロッド部で互いにつながれたものである。このロッド部は、多くのベッカー患者で短くなっている。特に好ましい態様においては、本発明は表４に記載した変異を有するＤＭＤ患者の治療方法であって、表４の第１列に示したエクソンのエクソンスキッピングを誘導するのに有効なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を、患者に提供することを包含する方法を提供する。好ましい態様においては、該オリゴヌクレオチドは、表２に記載したエクソンスキッピングの誘導に有効なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含むものである。
【００２１】
上記の所見から、当業界は、ロッド部の長さではなく、ロッド部の存在とその構成（タンパク質の特定のヒンジ領域の構成）がジスロトフィンタンパク質の機能そのものに重要であるという結論に達した。ロッド部のサイズは得られる（ベッカー型）タンパク質の発揮する機能の量に影響を与えるものの、顕著な例外が多く存在する。これらの例外については以下に詳述する。特に良性の変異体の中には、非常に短いロッド部を有するものがある。本発明者らは、多くのさらに異なるタイプのベッカー型患者が患者の集団で検出されるはずだということに注目した。しかしながら、この仮定によるとベッカー型表現型を示すはずの幾種類かの短いジストロフィンタンパク質がヒトの集団で検出されることはなかった。このような「理論上の」ベッカー型タンパク質の一部については、検出されなかったことは偶然に過ぎない。しかしながら、本発明においては、このような「潜在的な」ベッカー型患者の少なくとも一部は、この種の変異を有する患者自らが医者にかかる必要が無いほど良性の表現型を示すか、またはベッカー型疾患に罹患していると診断されないことを見出した。本発明の化合物を用いると、多くの異なるデュシェンヌ型のみならず、ベッカー型の患者に関してでさえＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体を再構成し、再構成ｍＲＮＡの翻訳後に軽症表現型ジストロフィンが産生されるようにすることができる。したがって、本発明は特に好ましい化合物、即ち、エクソン１７に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む第１の部分、およびエクソン４８に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む第２の部分を少なくとも含む化合物を提供する。この結果として得られる再構成ｍＲＮＡは、エクソン１７〜４８のすべてを欠く、短くなったインフレームジストロフィンタンパク質をコードしている。この短いジストロフィンタンパク質は、上記の軽症表現型ジストロフィンを模倣している。この化合物（「１７〜４８化合物」と称する）は、最近のデータベースによると、現在特徴付けられているＤＭＤ変異を有する患者の２０％をも処置することができると考えられる。他の１つの好ましい化合物は４５〜５５化合物である。この化合物は、上記と同様の計算によると、これまでに特徴付けられたＤＭＤ変異を有する患者の３８％を処置することができる。さらに他の１つの好ましい態様においては、化合物には４２〜５５化合物と４９〜５９化合物が含まれ、それぞれ、現在特徴付けられているＤＭＤ患者の６５％と１８％を処置することができる。さらに他の１つの好ましい態様においては、化合物には４２〜５５化合物が含まれる。これと同様に、４５〜４９化合物と４５〜５１化合物も好ましく、実施例に記載されている形態のものがさらに好ましく、それぞれ、これまでに特徴付けられているＤＭＤ患者の４％および８％を処置することができる。好ましい態様においては、化合物は、表２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む。好ましくは、化合物は、少なくとも２個の表２のオリゴヌクレオチドまたは１個以上のその同等物を含む。好ましい態様において化合物は、エクソン４２に対する表２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその同等物の少なくとも１個と、エクソン５５に対��る表２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を少なくとも１個とを含む。好ましい態様において化合物は、エクソン４５に対する表２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその同等物の少なくとも１個と、エクソン５１に対する表２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその同等物の少なくとも１個とを含む。
【００２２】
本発明の一部は、遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の１個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物に関し、該化合物は少なくとも２つの部分を含み、該少なくとも２つの部分には、クローズド構造にその少なくとも一部が相補的なオリゴヌクレオチドを含む第１の部分、およびオープン構造にその少なくとも一部が相補的なオリゴヌクレオチドを含む第２の部分が含まれる。当然のことながら、オープン構造とクローズド構造はエクソンから転写したＲＮＡの二次構造から決定する。単一エクソンに相補的な２つの区別可能な部分を有する化合物は、オリゴヌクレオチドの製造方法に関して上述したオリゴヌクレオチド、その同等物またはそれらの組み合わせを含むことが好ましい。
【００２３】
本発明はさらに、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体のエクソンにハイブリダイズし得る本発明の第１のオリゴヌクレオチドまたはその同等物、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の他の１つのエクソンにハイブリダイズし得る本発明の少なくとも第２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む組成物を提供する。好ましい態様においては、第１のオリゴヌクレオチドまたはその同等物と、少なくとも第２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、同じｍＲＮＡ前駆体の異なるエクソンにハイブリダイズし得るものである。この組成物は、対応するエクソンのエクソンスキッピングを誘導するのに用いることができる。組成物がヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５とエクソン５１、またはエクソン４２とエクソン５５に対するオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む場合、得られるｍＲＮＡからは標的エクソンのみが除外されるという規則に反して、標的エクソンとそれらの間の介在領域の全てが得られるｍＲＮＡから除外されていることが観察された。本発明においては、ＤＭＤ遺伝子を衰弱化する種々の異なる変異を補正するためにこのような特性を用いる。したがって、本発明の１つの態様においては、ヒトＤＭＤ遺伝子に変異を有し、該変異の結果、ＤＭＤ遺伝子の機能性ジストロフィンタンパク質への翻訳が適当に行われていない患者の治療方法であって、患者に上記の組成物を提供することを包含する方法を提供する。このようにして補正され得る変異の典型例は、標的エクソンの内部かそれに隣接して存在するか、介在領域に存在する変異である。しかしながら、上記のエクソンと介在領域からかなり離れた外側に存在するフレームシフト変異を補正することも可能である。
【００２４】
スプライシング系を含有する転写系を in vitro で作製することができる。適当な転写系やスプライシング系が当業界では入手可能である。しかしながら、ｍＲＮＡの再構成を必要とするのは、当然ながら、主として生細胞の操作の場面である。好ましい細胞は、ｍＲＮＡの再構成により所望の効果が達成される細胞である。再構成するｍＲＮＡの好ましい例は上述した。筋細胞中で活性を有する遺伝子を本発明で用いることが好ましい。筋細胞（即ち、筋管）は、すべてではないが多くの筋細胞特異的遺伝子が長いｍＲＮＡ前駆体を経て転写される多核細胞である。長いｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡの再構成が特に効率的に行われるので、このような長いｍＲＮＡ前駆体は本発明で用いるのに好ましい。必ずしもそうではないが、全長ｍＲＮＡ前駆体の製造に比較的長い時間が必要であるということは、再構成工程の進行に費やすことのできる時間が多くなるので、本発明の方法や手段を用いた再構成の促進になると考えられる。本発明の方法で好ましく再構成することのできるｍＲＮＡに対応する遺伝子としては、次の好ましい遺伝子群が挙げられる：ベスレム（Bethlem）型ミオパシーをもたらすＣＯＬ６Ａ１、筋細管ミオパシーをもたらすＭＴＭ１、三好型ミオパシーとＬＧＭＤをもたらすＤＹＳＦ（ジスフェリン）、メロシン欠乏型筋ジストロフィーをもたらすＬＡＭＡ２（ラミニン−α２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィーをもたらすＥＭＤ（エメリン）、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーをもたらすＤＭＤ、ならびにＬＧＭＤ２ＡをもたらすＣＡＰＮ３（カルパイン）。いかなる細胞も用いることができるが、上記の通り、好ましい細胞はＤＭＤ患者由来の細胞である。細胞は in vitro、即ち、対象生物の体外で操作することができる。しかしながら、in vivo で再構成を行う能力を細胞に賦与することが理想的である。本発明のオリゴヌクレオチド、同等物または化合物を細胞に与えるための適当な手段が当業界に存在する。このような技術におけるこれまでの発展を考えると、さらなる改良が期待される。このような将来的な改良も、本発明の方法を用いたｍＲＮＡの再構成によって得られる上記の効果を達成するために、当然のことながら、本発明に組み込まれる。現在、本発明のオリゴヌクレオチド、同等物または化合物を細胞に in vivo で送達するための適当な手段としては、核酸のトランスフェクションに適したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）や合成両親媒性化合物（ＳＡＩＮＴ−１８）が挙げられる。両親媒性化合物は、in vivo での送達に用いた場合にも、向上した送達性と低減した毒性を示す。好ましい化合物としては、次の文献に記載の化合物が挙げられる：Smisterova, J., Wagenaar, A., Stuart, M.C.A., Polushkin, E., ten Brinke, G., Hulst, R., Engberts, J.B.F.N., Hoekstra, D., Molecular shape of the Cationic Lipid Controls the Structure of the Cationic Lipid/ Dioleylphosphatidylethanolamine-DNA Complexes and the Efficiency of Gene Delivery, J. Biol. Chem. 2001, 276, 47615。好ましく用いられる合成両親媒性化合物は、合成品が容易に入手可能な、「長いテール」を有するピリジニウム頭部基をベースとした材料である。多数の合成された両親媒性化合物からなる群の中には、優れたトランスフェクション能と共に、全体的な細胞��存率から見て低下した毒性を示すものがある。構造的修飾が容易であることは、さらなる修飾および（in vivo）核酸輸送特性と毒性の解析を可能とする。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物は、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識を少なくとも部分的に改変するのに用いることができる。このような態様においては、スプライシング機構がエクソンの境界を結合してｍＲＮＡを調製するのを少なくとも部分的に妨げる。本発明のオリゴヌクレオチド、同等物または化合物は、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソン認識を少なくとも部分的に改変することができる。したがって、この用途も本発明は提供する。ｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキッピングを少なくとも部分的に刺激することの用途として、標的エクソンがｍＲＮＡに包含されるのを妨げることも提供される。前述の通り、標的エクソンは得られるｍＲＮＡに包含されない。しかしながら、エクソンの一部（ネオエクソン）が産生されるｍＲＮＡに保持されることもある。これは、標的エクソンが潜在的なスプライス受容部位配列および／または供与部位配列を含む場合に時折起こる。このような態様においては、スプライシング機構がこれまでスプライス受容部位配列／供与部位配列ではなかった（または利用されていなかった）ものを使用するように再度誘導し、新たなエクソン（ネオエクソン）を産生する。ネオエクソンはパレオエクソンと同じ末端を１つ有する場合があるが、必ずしもそうではない。したがって、１つの態様においては、スプライシング機構によるスプライス供与部位またはスプライス受容部位の利用効率を改変するのに本発明のオリゴヌクレオチド、同等物または化合物を用いる。
【００２６】
上記説明を鑑みると、本発明はさらに、本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、医薬の製造方法を提供する。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を包含する医薬用製剤を提供する。本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を、伝達性遺伝疾患の治療用医薬の製造に用いることができる。同様に、スプライシング機構によるｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識効率を改変する方法が提供され、ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該改変方法は以下の工程を包含する：スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を提供し、但し、該オリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物は、該少なくとも２個のエクソンの内の少なくとも１個にハイブリダイズし得るものであり、そして該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。上記遺伝子は、少なくとも３個のエクソンを含むことが好ましい。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドを含む転写産物をコードしている発現ベクターの形態で細胞に提供することができる。発現ベクターは、遺伝子送達ベヒクルを介して細胞に導入することが好ましい。好ましい送達ベヒクルはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり、さらに好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。したがって本発明は、このような発現ベクターおよび送達ベヒクルも提供する。適当な転写産物を設計することは当業者の技術の範囲内である。本発明で用いるのに好ましい転写産物は、Pol III によって誘導された転写産物であり、好ましくはＵ１転写産物またはＵ７転写産物との融合転写産物である。このような融合物は文献５３と５４の記載に基づいて産生することができる。
【００２８】
実施例
【実施例１】
【００２９】
結果
この研究には、異なる変異（表１）に冒された６人のＤＭＤ患者が含まれる。患者ＤＬ５１２．２はエクソン４５〜５０の欠失を有し、エクソン５１のスキッピングはフレームを補正すると考えられた。患者ＤＬ３６３．２はエクソン４５〜５４の欠失を有し、この患者のリーディングフレームはエクソン４４をスキップすることで補正されると考えられた。エクソン４８〜５０の欠失に冒された患者５０６８５．１においては、リーディングフレームの補正にエクソン５１のスキッピングが必要である。患者ＤＬ５８９．２はエクソン５１〜５５の欠失を有し、エクソン５０をスキップすることでリーディングフレームは補正されると考えられた。患者５３９１４．１はエクソン５２単一の欠失を有する。注目すべきことに、この患者の場合、エクソン５１とエクソン５３のいずれのスキッピングもフレームを補正すると考えられた。最後に、患者５０４２３．１は、エクソン４９内の１個の塩基対、具体的にはｃＤＮＡレベルで７３８９番の塩基対の欠失を有し、その結果、エクソン４９にフレームシフトと未成熟なストップコドンが存在する。エクソン４９はインフレームエクソンなので、このエクソンのスキッピングはこの患者のリーディングフレームを補正すると考えられた。
【００３０】
本発明者らは、上記の標的エクソン４４、４９、５０、５１および５３のスキッピングを１μＭの濃度で誘導可能なＡＯＮをすでに同定している（文献２３）。しかしながら、続いて行った用量−応答実験では、大部分のＡＯＮに関して、５００ｎＭや２００ｎＭ、さらには１００ｎＭといったより低濃度で実質的なスキッピング効率が得られた（データは示さない）。これはトランスフェクションに必要なＰＥＩの用量を低下させるというさらなる有利な効果をもたらし、その結果、本発明者らの過去のトランスフェクション実験で見られた細胞毒性レベルを著しく低下させた。上記の６人のＤＭＤ患者由来の培養筋管に適切なＡＯＮをトランスフェクトした。平均７０〜９０％の細胞が、蛍光標識ＡＯＮの核への特異的な取り込みを示した。ＲＮＡはトランスフェクションの２４時間後に単離し、ＲＴ−ＰＣＲで分析した（図１）。すべての患者について、新規な短い転写産物の配列を解析することで確認されたように、標的エクソンのスキッピングが高い効率をもって、エクソンの境界で正確に行われた（図１）。患者５０６８５．１では、さらなる転写フラグメントが検出された（図１のＣ）。配列の解析によって、このフラグメントがエクソン５１内の潜在的スプライス部位の活性化により産生されたものであることがわかった。このフラグメントは、既に同じＡＯＮで処理したヒト対照細胞にも見られたものである（文献２３）。驚くべきことに、低レベルの自発的エクソンスキッピングが以下の患者に由来する非処理細胞で観察された：  ＤＬ３６３．２（エクソン４４をスキップする）、ＤＬ５８９．２（エクソン５０をスキップする）および５３９１４．１（エクソン５３をスキップする）。ＤＭＤ遺伝子転写産物のいくつかの大きな領域についてＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、ＡＯＮ処理により誘導されるさらなる予想外の異常なスプライシングパターンは発見されなかった。
【００３１】
得られたインフレーム転写産物はジストロフィン合成を修復すると考えられる。実際のところ、トランスフェクトした培養筋管を免疫組織化学的に分析したところ、各患者の筋管の大部分でジストロフィンが検出された（図２）。治療効果は、十分に分化した筋管を同定するための抗ミオシン抗体と抗ジストロフィン抗体を用いた二重染色により測定した。ミオシン陽性筋管の平均で７５〜８０％がジストロフィンの発現を示した。本発明者らは、トランスフェクションの２日後に、患者ＤＬ３６３．２、患者ＤＬ５８９．２および患者５３９１４．１ではっきりとした膜結合ジストロフィンを観察した（図２のＢ、Ｄ、Ｅ）。各患者について、ジストロフィンの存在をウェスタンブロット分析により確認した（図３）。患者５０６８５．１と患者ＤＬ３６３．２について経時実験を行ったところ、ジストロフィンが早くもトランスフェクション後１６時間で検出され（図３のＤ）、タンパク質の量はトランスフェクションの７日後まで増加する（図３のＢ）ことがわかった。患者ＤＬ５１５．２、患者ＤＬ３６３．２と患者ＤＬ５８９．２より得たジストロフィンタンパク質はヒト対照のものよりも著しく短く、これは欠失の大きさによるものである。
【００３２】
１人の患者（ＤＬ３６３．２）については、ジスロトフィン合成の誘導がＤＧＣの修復をもたらすかどうかについても調べた（図４）。ＡＯＮ処理の前には、低下した量の、主として細胞質に存在するα−、β−およびγ−サルコグリカンならびにβ−ジストログリカンのシグナルを（それぞれ３０％、３０％、４０％および８０％の培養筋管で）確認した（図４のＡ）。続くＡＯＮトランスフェクションにより、主として膜結合型のα−、β−およびγ−サルコグリカンならびにβ−ジストログリカンの増量が、それぞれ７０％、９０％、９０％および８０％の処理培養筋管で検出された（図４のＢ）。
【００３３】
考察
ＤＭＤ患者のためのリーディングフレーム補正戦略の目的は、アンチセンス誘導性の標的エクソンスキッピングである。このようなスキッピングによって、重症のＤＭＤ表現型を大部分が軽症であるＢＭＤ表現型に変換することができると考えられる。６人の患者、即ち、５種の欠失とエクソン４９内の点変異をそれぞれ有する患者について、上記戦略の幅広い適用性を調べた（表１）。ＡＯＮ処理に続いて、各患者について、ＲＮＡレベルで標的エクソンが正確にスキップされていること、および７５〜８０％の処理筋管にジストロフィンタンパク質が存在することを示した。特にこの研究では、いくつかの異なる欠失によって崩れたリーディングフレームを補正するための単一ＡＯＮ処理（即ち、エクソン５１の誘導性スキッピング）の適用について、初めて報告する。
【００３４】
興味深いことに、ＤＭＤ患者細胞で観察されたエクソンスキッピングのレベルは、ヒト対照細胞でこれまでに観察されたレベルよりも著しく高い（文献２３）。概して、新規なスキップ転写産物が主要産物である。これは、ナンセンス仲介減衰（nonsense-mediated decay）（ＮＭＤ）というプロセスの作用によって説明することができる（文献２５、３２）。対照細胞では、アウトオブフレームエクソンのスキッピングは、ＮＭＤの影響を受けやすいアウトオブフレーム転写産物をもたらす。一方、患者細胞では、標的エクソンのスキッピングは、ＮＭＤに耐性であり、従って本来存在するアウトオブフレーム転写産物よりも安定なインフレーム転写産物をもたらす。
【００３５】
３人の患者（ＤＬ３６３．２、ＤＬ５８９．２および５３９１４．１）については、エクソン４４、５０および５３の低レベルの自発的スキッピングを非処理細胞で検出した。この現象は、いわゆる復帰筋繊維（revertant muscle fibers）について過去にも報告されている（文献３３〜３５）。このようなジストロフィン陽性繊維はＤＭＤ筋肉に少量（２〜１０％）存在しており、リーディングフレームを修復する二次体性変異および／または選択的スプライシングの結果であると考えられる。復帰筋繊維の存在は、疾患の重症度と相関することが示唆されている（文献３６、３７）。
【００３６】
ジストロフィン合成の修復を早くもトランスフェクションの１６時間後に検出することができた。トランスフェクションの２日後にはジストロフィンが膜で検出され、この新規なＢＭＤ様タンパク質が部分的に機能性を有すると考えられることが示された。さらに、ジストロフィン合成の修復がジストロフィン−糖タンパク質複合体の形成を再度確立させると見られることを示す。
【００３７】
患者ＤＬ３６３．２および患者ＤＬ５８９．２では、それぞれ標的エクソンのスキッピングによる欠失がエクソン４４〜５４およびエクソン５０〜５５に広がっていた。これまでにこのような欠失は、ＤＭＤ患者やＢＭＤ患者で報告されていない。つまり、これらの欠失がいずれも存在しないか、ＢＭＤであると診断されない非常に軽症の表現型を生じることを意味する。ＢＭＤ変異の多様性および観察したＢＭＤ発病率が著しく低いことを考慮すると、後者の説明が前者よりも妥当であると考えられる。患者ＤＬ５１５．１、患者５０６８５．１および患者５０４２３．１のアウトオブフレーム欠失は、エクソン４５〜５１、エクソン４８〜５１またはエクソン４９の欠失を有するＢＭＤ患者に見られるインフレーム欠失に変換された（文献３０、３８〜４０）。注目すべきことには、エクソン４８〜５１の欠失は無症候性のヒトでも報告されている（文献４０）。しかしながら、一方では、このような欠失を有するＤＭＤ患者も存在する（文献３８、４１〜４３）。このような理論上のインフレーム欠失の大部分がＤＮＡレベルでのみ検出されたものなので、これらＤＭＤ患者におけるジストロフィン欠乏は、アウトオブフレーム転写産物をもたらすＲＮＡレベルのさらなる異常なスプライシングパターンによって発生したものと仮定した。
【００３８】
ライデンＤＭＤ変異データベースに報告されている変異の７５％超を補正することが可能である（文献３０）。本発明者らの結果は、アンチセンス誘導性のリーディングフレーム補正が、種々の欠失や点変異を有する多くのＤＭＤ患者のための見込みある治療アプローチになることを示している。臨床試験の確立のために、in vivo のマウス筋組織における送達法の研究と最適化を現在行っている。
【００３９】
材料と方法
ＡＯＮとプライマー 
使用したＡＯＮ（表１）はすでに公知のものである（文献２３）。ＡＯＮは、５’フルオレセイン基（６−ＦＡＭ）、全長ホスホロチオエート主鎖および２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子（ベルギー国、Eurogentec社製）を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のＡＯＮを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー（配列は要求に応じて公表する）は、Eurogentec社（ベルギー国）またはIsogen Bioscience BV（オランダ国）によって合成された。
【００４０】
筋原細胞の培養とＡＯＮによるトランスフェクション 
患者ＤＬ５１５．２（エクソン４５〜５０を欠失）、患者ＤＬ３６３．２（エクソン４５〜５４を欠失）、患者５０６８５．１（エクソン４８〜５０を欠失）、患者ＤＬ５８９．２（エクソン５１〜５５を欠失）および患者５３９１４．１（エクソン５２を欠失）について、筋生検材料から原始ヒト筋芽細胞を単離し、公知の方法（文献４４）で培養した。コラーゲン（Vitrogen 100；Cohesion社製）をあらかじめコートしたフラスコとプレートに培養物を植えつけた。血清欠乏条件で７〜１４日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。次いで、低血清培地中で筋管をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたトランスフェクションに３時間付した。トランスフェクションは製造者の説明書（ExGen500（MBI Fermentas社製）に添付のもの）に従って行い、トランスフェクトするＡＯＮ １μｇあたり３．５μｌのＰＥＩを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析には、濃度が５００ｎＭのＡＯＮを用いた。この濃度だと、細胞死が穏やかなレベルであるにもかかわらず、スキッピングレベルが最大となった。免疫組織化学的分析とウェスタンブロット分析にはより多くの生存筋管が必要なので、使用するＡＯＮ濃度を２００ｎＭにした。
【００４１】
エクソン４９に点変異を有する患者５０４２３．１については、繊維芽細胞のみが提供されていた。ＭｙｏＤ遺伝子を含有するアデノウイルスベクター（Ad50MyoD）による感染（ＭＯＩ５０〜１００）に続いて、公知のプロトコール（文献４５〜４７）に従って繊維芽細胞の筋発生を強制的に行った。トランスフェクションの２時間後に培地を低血清培地に交換し、そして筋管が形成されるまで細胞を８〜１０日間インキュベートした。トランスフェクション条件は上記のものと同じであった。
【００４２】
ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ分析 
トランスフェクションの２４時間後に総ＲＮＡを培養筋管から単離した（RNA-Bee RNA isolation solvent；オランダ国、Campro Scientific社製）。３００ｎｇの総ＲＮＡをC. therm ポリメラーゼ（オランダ国、Roche Diagnostics社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析に付し、２０μｌの反応系、６０℃で３０分、種々のＤＭＤ遺伝子特異的リバースプライマー（表１）をプライマーとして会合させた。初期ＰＣＲとしては、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（６０秒）からなるサイクルを２０サイクル行った。次いで、得られた反応液１μｌをネステッドＰＣＲに付し、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（６０秒）からなるサイクルを３２サイクル行って再増幅した。ＰＣＲ産物は１．５％または２％のアガロースゲル上で分析した。注目すべきことに、既知量の標準転写フラグメントと短い転写フラグメントとの混合物の規定の系列についてＰＣＲ分析を行ったところ、短いフラグメントの増幅に対する顕著な選択性を示す証拠は得られなかった（データは示さない）。
【００４３】
配列の解析 
ＲＴ−ＰＣＲ産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトＤＮＡシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンター（Leiden Genome Technology Center）（ＬＧＴＣ）が BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（PE Applied Biosystems社製）を用いて実施し、ABI 3700 Sequencer（PE Applied Biosystems社製）で解析した。
【００４４】
タンパク質の単離とウェスタンブロット分析 
タンパク質抽出物は、筋管の生存率に応じて、トランスフェクションの２〜４日後の処理培養筋管（２５ｃｍ2のフラスコ）から、１５０μｌの処理用緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１５％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール、２％のグリセロールおよび０．００１％のブロモフェノールブルー）を用いて単離した。経時実験では、トランスフェクション後４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間にタンパク質抽出物を単離する（患者５０６８５．１の場合）か、トランスフェクション後２日、４日および７日に単離した（患者ＤＬ３６３．２の場合）。
【００４５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロッティングは、Anderson et al の報告（文献４８）にわずかな修正を加えた方法で行った。簡単に記すと、サンプル（７５μｌ）を、４〜７％のポリアクリルアミドグラジエントゲルに４℃で一晩流した。得られたゲルをニトロセルロースに対して４℃で５〜６時間ブロットした。５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．５％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ８））でニトロセルロース上のブロットを１時間ブロッキングし、１：５０に希釈した（ジストロフィンを認識する）ＮＣＬ−ＤＹＳ２と共に一晩インキュベートした。１：１０，０００に希釈したＨＲＰ−結合抗マウス抗体（Santa Cruz社製）を二次抗体として用いた。免疫反応バンドは、Lumi-Lightplus Western Blotting Substrate で視覚化し、Lumi-Imager（オランダ国、Roche Diagnostics社製）でスキャンした。
【００４６】
免疫組織化学的分析 
処理した培養筋管を、筋管の生存率に応じてトランスフェクションの１〜４日後に−２０℃のメタノールで固定した。種々の抗体と反応させる前に、５％のウマ血清（Gibco BRL社製）と０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Sigma社製）とを含有するＰＢＳ（Gibco BRL社製）であるブロッキング溶液中で１時間インキュベートした。使用したすべての抗体をこのブロッキング溶液で希釈した。以下の抗体を処理した筋管にアプライした。１：１００に希釈したデスミンポリクローナル抗体（ICN Biomedicals社製）；１:１００に希釈したミオシンモノクローナル抗体（ＭＦ２０；アイオワ大学、発生研究ハイブリドーマバンク（Developmental Studies Hybridoma Bank）より入手）；１：１００に希釈したミオシンポリクローナル抗体Ｌ５３（オランダ国、ＡＭＣ、M. van den Hoff 博士より寄贈）；ジストロフィンを検出するための、１：１０に希釈したＭＡＮＤＹＳ１（英国、ノースイーストウェールズインスティチュート（North East Wales Institute）、G. Morris 博士より寄贈）と１:１０に希釈したＮＣＬ−ＤＹＳ２（Novacastra Laboratories Ltd社製；およびα−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカンとβ−ジストログリカンをそれぞれ検出するための、１：７５に希釈したＮＣＬ−ａ−ＳＡＲＣ（Novacastra Laboratories Ltd社製）、１：５０に希釈したＮＣＬ−ｂ−ＳＡＲＣ（Novacastra Laboratories Ltd社製）、１：５０に希釈したＮＣＬ−ｇ−ＳＡＲＣ（Novacastra Laboratories Ltd社製）、と１：５０に希釈したＮＣＬ−ｂ−ＤＧ（Novacastra Laboratories Ltd社製）。抗体と共に１時間インキュベートした後、筋管を含むスライドをすすぎ、二次抗体として１：１０００に希釈した Alexa Fluor 594 標識ヤギ抗ウサギ抗体または１：２５０に希釈した Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗マウス抗体（共にMolecular Probes Inc社製）と共に１時間インキュベートした。このスライドは落射蛍光光学部品を備えた Leica 社製の共焦点顕微鏡で観察した。デジタル画像はＣＣＤカメラ（Photometrics社製）で撮影した。
【実施例２】
【００４７】
材料と方法
ＡＯＮとプライマー 
ＡＯＮの系列（各エクソンにつき２種、表２参照）は、比較的プリン含量の高いエクソン内部標的配列に結合し、好ましくは、RNA mfold version 3.1 サーバーで推定した（３７℃における）ｍＲＮＡ前駆体二次構造のオープン構造にも結合するように設計した（文献［２２］）。ＡＯＮの長さは１５〜２４ｂｐであり、Ｇ／Ｃ含量は２６〜６７％であった。これらＡＯＮは以下の化学修飾を有するように合成した：５’−フルオロセイン基（６−ＦＡＭ）、全長ホスホロチオエート主鎖および２'−Ｏ−メチル修飾リボース分子（ベルギー国、Eurogentec社製）。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析に用いたプライマー（表３）は、Eurogentec社（ベルギー国）またはIsogen Bioscience BV（オランダ国）により合成された。
【００４８】
In vitro 実験 
原始ヒト筋芽細胞は、非罹患個体（ＫＭ１０８）の筋生検材料から酵素的解離により単離した。簡単に記すと、組織を５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＶＩＩＩ（Sigma社製）、５ｍｇ／ｍｌのウシアルブミン画分Ｖ（Sigma社製）および１％のトリプシン（Gibco BRL社製）を含有するＰＢＳ（Gibco BRL社製）中でホモジナイズした。３７℃で１５分間の一連の培養工程を数回行った後、２０％のウシ胎児血清（Gibco BRL社製）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Gibco BRL社製）とを添加した増殖培地（GlutaMax-1添加 Nut.Mix F-10 (HAM)、Gibco BRL社製）に解離細胞を含む懸濁液を等量加え、そこでプールした。遠心分離を行った後、精製ウシ表皮コラーゲン（Vitrogen 100；Cohesion社製）であらかじめコートしたフラスコを用い、細胞を増殖培地に植え付けてさらに培養した。免疫組織化学的アッセイでデスミン陽性細胞の百分率として求めた培養物中の筋原細胞含量は、培養を繰り返すことにより５８％まで上昇した（文献［２３］）。筋管は、低血清培地（２％のGlutaMax-1、１％のグルコース、２％のウシ胎児血清および１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したＤＭＥＭ（Gibco BRL社製））で７〜１４日間インキュベートしてコンフルエントに達した培養筋原細胞から得た。培養筋管のトランスフェクションには、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ExGen 500）を製造者（MBI Fermentas社）の説明書に従って用いた。ＡＯＮに３．５等量のＰＥＩを結合したもの１ｍＭを、低血清培地中で培養筋管に３時間トランスフェクトした。
【００４９】
ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ分析  トランスフェクションの２４時間後に、RNAzol B（オランダ国、Campro Scientific社製）を製造者の説明書に従って用い、総ＲＮＡを培養筋管から単離した。１μｇのＲＮＡを C. therm ポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析に付し、２０μｌの反応系、６０℃で３０分、種々のＤＭＤ遺伝子特異的リバース（ＲＴ）プライマー（表３）をプライマーとして会合させた。初期ＰＣＲにはアウタープライマーのセット（表３参照）を用い、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（９０秒）からなるサイクルを２０サイクル行った。次いで、得られた反応液１μｌを適当なプライマーの組み合わせ（表３）を用いてネステッドＰＣＲに付し、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（６０秒）からなるサイクルを３２サイクル行って再増幅した。ＰＣＲ産物は１．５％または２％のアガロースゲル上で分析した。
【００５０】
配列の解析  ＲＴ−ＰＣＲ産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトＤＮＡシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンター（ＬＧＴＣ）が BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（PE Applied Biosystems社製）を用いて実施し、ABI 3700 Sequencer（PE Applied Biosystems社製）で解析した。
【００５１】
結果
In vitro エクソンスキッピング 
カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたヒト対照培養筋管へのトランスフェクションに続く、ＡＯＮによるエクソンスキッピングの誘導について、実験的に分析した。蛍光標識ＡＯＮの核への取り込み量から求めた平均トランスフェクション効率は、６０〜８０％であった。トランスフェクションの２４時間後に、標的エクソンを包囲する種々のプライマーの組み合わせ（表３）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって、転写産物を分析した。試験した３０個のＡＯＮのうちの合計２１個（７０％）について、標的エクソンの特異的スキッピングに対応する大きさの、短い転写フラグメントが再現性をもって産生された（図５および表２）。実際に、短い転写産物の配列の解析によって確認されたように（データは示さない）、標的とした１５個のエクソンのうち１３個（即ち、７個のインフレームエクソンのうちの５個と８個のアウトオブフレームエクソンのうちの８個）で特異的なスキッピングを誘導することができた。エクソン４７とエクソン４８のスキッピングは検出されなかった（図５のｅ、ｇ）。
【００５２】
この実験で調べた特定の転写領域では、トランスフェクトしていない対照筋管において、エクソン２とエクソン２９の近傍で選択的スプライシングパターンが観察された（図５のｂ、ｃ）。このような選択的スプライシング産物のシークエンシングを行ったところ、これらはエクソン２〜７（インフレーム）、エクソン３〜７（アウトオブフレーム）、エクソン２８〜２９（インフレーム）およびエクソン２７〜２９（インフレーム）のスキッピングによるものであることがわかった。これらの天然（genuinely）のエクソンスキッピングは、これまでにヒト骨格筋でも検出されている（文献［２４］、［２５］）。驚くべきことに、選択的スプライシングのレベルは、トランスフェクトした培養筋管におけるＡＯＮ処理により著しく増加した。注目すべきことに、ｈ２ＡＯＮ１が正常転写産物だけでなく、エクソン１と２がエクソン８にスプライシングしている選択的転写産物のいずれかにおいても、エクソン２のスキッピングを誘導することも確認した（図５のｂ）。
【００５３】
大部分のＡＯＮが、隣接するエクソンの本来のスプライス部位を用いて標的エクソンの正確なスキッピングを誘導した。しかしながらｈ５１ＡＯＮ２に対する応答では、エクソン５１内のインフレーム潜在的スプライス部位が用いられた（図５のｈ）。このような選択的スプライス産物のレベルは、一連のトランスフェクション実験で変動した。最後に、トランスフェクション実験のいくつかでは、隣接するエクソンの共スキッピング（co-skipping）によるさらなる異常なスプライシングフラグメントが検出された。しかしながら、このような共スキッピングの発生は一貫しておらず、しかも非常に低いレベルであった。
【００５４】
実施例２の参考文献（以下の文献番号は、実施例２に記載した番号にのみ対応する）
[1] Hoffman EP, Brown Jr RH, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 1987;51:919-928.
[2] Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S, Moser H, Kunkel LM. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics 1988;2:90-95.
[3] Koenig M, Beggs AH, Moyer M, et al. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 1989;45:498-506.
[4] Zubrzycka-Gaarn EE, Bulman DE, Karpati G, et al. The Duchenne muscular dystrophy gene product is localized in sarcolemma of human skeletal muscle. Nature 1988;333:466-469.
[5] Yoshida M, Ozawa E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem (Tokyo) 1990;108:748-752.
[6] Ervasti JM, Campbell KP. Membrane organization of the dystrophin glycoprotein complex. Cell 1991;66:1121-1131.
[7] Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell 1988;53:219-226.
[8] van Deutekom JC, Floyd SS, Booth DK, et al. Implications of maturation for viral gene delivery to skeletal muscle. Neuromuscul Disord 1998;8:135-148.
[9] Mayeda A, Hayase Y, Inoue H, Ohtsuka E, Ohshima Y. Surveying cis-acting sequences of pre-mRNA by adding antisense 20-O-methyl oligoribonucleotides to a splicing reaction. J Biochem (Tokyo) 1990;108:399-405.
[10] Galderisi U, Cascino A, Giordano A. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents. J Cell Physiol 1999;181:251-257.
[11] Baker BF, Monia BP. Novel mechanisms for antisense-mediated regulation of gene expression. Biochim Biophys Acta 1999;1489:3-18.
[12] Kole R, Sazani P. Antisense effects in the cell nucleus: modification of splicing. Curr Opin Mol Ther 2001;3:229-234.
[13] Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, Barnard PJ. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science 1989;244:1578-1580.
[14] Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, Eperon IC, Dickson G. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 1998;7:1083-1090.
[15] Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, et al. Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:42-47.
[16] Wilton SD, Lloyd F, Carville K, et al. Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using anti-sense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 1999;9:330-338.
[17] Takeshima Y, Wada H, Yagi M, et al. Oligonucleotides against a splicing enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient. Brain Dev 2001;23:788-790.
[18] Pramono ZA, Takeshima Y, Alimsardjono H, Ishii A, Takeda S, Matsuo M. Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence. Biochem Biophys Res Commun 1996;226:445-449.
[19] Watakabe A, Tanaka K, Shimura Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes Dev 1993;7:407-418. 
[20] Tanaka K, Watakabe A, Shimura Y. Polypurine sequences within a downstream exon function as a splicing enhancer. Mol Cell Biol 1994;14:1347-1354.
[21] van Deutekom JC, Bremmer-Bout M, Janson AA, et al. Antisenseinduced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient
derived muscle cells. Hum Mol Genet 2001;10:1547-1554. 
[22] Mathews DH, Sabina J, Zuker M, Turner DH. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J Mol Biol 1999;288:911-940. 
[23] Richler C, Yaffe D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol 1970;23:1-22.
[24] Surono A, Takeshima Y, Wibawa T, Pramono ZA, Matsuo M. Six novel transcripts that remove a huge intron ranging from 250 to 800 kb are produced by alternative splicing of the 50 region of the dystrophin gene in human skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun 1997;239:895-899.
[25] Shiga N, Takeshima Y, Sakamoto H, et al. Disruption of the splicing enhancer sequence within exon 27 of the dystrophin gene by a nonsense mutation induces partial skipping of the exon and is responsible for Becker muscular dystrophy. J Clin Invest 1997;100:2204-2210.
[26] Wells DJ, Wells KE, Asante EA, et al. Expression of human full length and minidystrophin in transgenic mdx mice: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet 1995;4:1245-1250.
[27] Sironi M, Pozzoli U, Cagliani R, Comi GP, Bardoni A, Bresolin N. Analysis of splicing parameters in the dystrophin gene: relevance for physiological and pathogenetic splicing mechanisms. Hum Genet 2001;109:73-84. 
A. Aartsma-Rus et al. / Neuromuscular Disorders 12 (2002) S71-S77.
【実施例３】
【００５５】
結果
２人のＤＭＤ患者におけるダブルエクソンスキッピング 
この研究には、リーディングフレームの補正に２個のエクソンのスキッピングを必要とする、ＤＭＤ遺伝子の異なるフレーム崩壊変異（表５）に冒された２人のＤＭＤ患者が含まれる。患者ＤＬ９０．３はエクソン４３にナンセンス変異を有する。この単一エクソンがアウトオブフレームであることを考慮すると、エクソン４３のスキッピングはナンセンス変異を取り除くが、リーディングフレームを修復しないと考えられた。エクソン４４との組み合わせはインフレームなので、この患者では、これら両方のエクソンを標的としたダブルエクソンスキッピングを目的とした。患者ＤＬ４７０．２は、エクソン４６〜５０の欠失に冒されている。フレームの修復にはこの欠失に隣接する両方のエクソンのダブルエクソンスキッピングが必要であると考えられた。両方の患者のそれぞれから得た培養筋管に、エクソン４３特異的ＡＯＮとエクソン４４特異的ＡＯＮとの混合物（ＤＬ９０．３の場合）またはエクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮとの混合物（ＤＬ４７０．２の場合）をトランスフェクトした。個々のＡＯＮ（表５）は、既に単一エクソンスキッピングで高い効果を示している。蛍光標識ＡＯＮの核への特異的な取り込みのあった細胞数から明かなように、トランスフェクション効率は概ね８０％を超えた。トランスフェクションの２４〜４８時間後のＲＴ−ＰＣＲ分析は、実際に両方のサンプルで特異的なダブルエクソンスキッピングが行われたことを示した（図６および図７）。この結果は配列の解析により確認した（データは示さない）。さらに、短い転写フラグメントが以下の単一エクソンスキッピングにより得られた：患者ＤＬ９０．３におけるエクソン４４のスキッピング（図６）、および患者ＤＬ４７０．２におけるエクソン５１のスキッピング（図７）。
【００５６】
マルチエクソンスキッピング 
（ＤＬ４７０．２で誘導されたように）エクソン４４が直接エクソン５２にスプライシングされることにより、インフレーム転写産物が産生された。これらエクソンの間に介在するエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピング（即ち、マルチエクソンスキッピング）を誘導することにより、いくつかの既知の小さいＤＭＤ変異をカバーしてそれらを修復するＢＭＤ様欠失（４５〜５１）が誘導されると仮定した。これは一種類のフレーム補正の恩恵に与るＤＭＤ患者群をさらに拡大すると考えられた。マルチエクソンスキッピングの可能性は、エクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮとの混合物で処理したヒト対照筋管で最初に示された（図７；ＫＭ１０９）。その後、上記ＡＯＮ混合物をエクソン４８〜５０の欠失を有する第３のＤＭＤ患者（５０６８５．１）から得た筋管に投与した。エクソン４５とエクソン５１と共に、それらの間の（残っている）エクソンを含む伸長鎖のＡＯＮ誘導性スキッピングにより、エクソン４４がエクソン５２にスプライシングしてなる、予想された小さいインフレーム転写産物が得られた（図７）。
【００５７】
Ｕで連結したＡＯＮの組み合わせを用いた、ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング 
１個のｍＲＮＡ前駆体分子から１個よりも多くのエクソンをスキップするには、使用するＡＯＮがすべて同じ核内に存在し、同一の分子を標的とする必要がある。このような機会を増やすために、エクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮ（ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２）とを１０個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型ＡＯＮの可能性について調べた（表５）。この「Ｕ−リンカーＡＯＮ」をヒト対照およびＤＭＤ患者であるＤＬ４７０．２と５０６８５．１のそれぞれから得た筋管へトランスフェクトし、次いでＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、エクソン５２にエクソン４４がスプライシングされた予想通りのインフレーム転写産物を産生するというＡＯＮの効力が明らかになった（図７）。配列の解析により確認したところ、このマルチエクソンスキッピングはエクソンの境界で特異的且つ正確に生じた（データは示さない）。患者ＤＬ４７０．２とは対照的に、ヒト対照および患者５０６８５．１では、Ｕ−リンカーＡＯＮはＡＯＮの混合物よりもわずかに効率的だった。
【００５８】
材料と方法
ＡＯＮとプライマー 
エクソン４３、４４と５１のそれぞれを標的とするＡＯＮは公知のものである（Aartsma-Rus, 2002）。エクソン４５を標的とするＡＯＮは新たに設計した（配列は要求に応じて公表する）。すべてのＡＯＮは、５’フルオレセイン基（６−ＦＡＭ）、全長ホスホロチオエート主鎖および２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子（ベルギー国、Eurogentec社製）を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のＡＯＮを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー（表５、配列は要求に応じて公表する）は、Eurogentec社（ベルギー国）によって合成された。
【００５９】
ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ分析 
トランスフェクションの２４〜４８時間後に総ＲＮＡを培養筋管から単離した（RNA-Bee RNA isolation solvent；オランダ国、Campro Scientific社製）。３００ｎｇの総ＲＮＡをC. therm ポリメラーゼ（オランダ国、Roche Diagnostics社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析に付し、２０μｌの反応系、６０℃で３０分、種々のＤＭＤ遺伝子特異的リバースプライマー（表５）をプライマーとして会合させた。初期ＰＣＲとしては、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（６０秒）からなるサイクルを２０サイクル行った。次いで、得られた反応液１μｌをネステッドＰＣＲに付し、９４℃（４０秒）、６０℃（４０秒）そして７２℃（６０秒）からなるサイクルを３２サイクル行って再増幅した。ＰＣＲ産物は１．５％または２％のアガロースゲル上で分析した。転写産物の定量のためには、ネステッドＰＣＲを２４サイクル行った。ＰＣＲ産物は、DNA 7500 LabChipR Kit と Agilent 2100 bioanalyzer（オランダ国、Agilent Technologies社製）を用いて分析した。
【００６０】
配列の解析 
ＲＴ−ＰＣＲ産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトＤＮＡシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンター（ＬＧＴＣ）が BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（PE Applied Biosystems社製）を用いて実施し、ABI 3700 Sequencer（PE Applied Biosystems社製）で解析した。
【実施例４】
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む転写産物をコードする発現ベクター 
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体およびＡＯＮは共に代謝回転率が決まっているので、本発明のＤＭＤフレーム補正治療は、ＡＯＮの反復投与を必要とする。しかも、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の転写およびスプライシングが起こる核内で、比較的高濃度のアンチセンスＲＮＡが必要とされる。そこで本発明者らは、特定のＡＯＮ配列が修飾遺伝子に組み込まれたベクター系を構築した。この実施例では、このような態様をＵ７核内低分子ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）に関連して説明する。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、ヒストンｍＲＮＡ前駆体の３’末端のプロセシングに関与するＵ７リボ核タンパク質粒子（Ｕ７ｓｎＲＮＰ）のＲＮＡ成分である。その機能に固有の現象として、Ｕ７ｓｎＲＮＡは細胞質から効率的に輸送されて核に戻り、核では非常に安定なＵ７ｓｎＲＮＰ複合体に組み込まれる。β−サラセミアに対するＡＯＮに基づく遺伝子治療の研究において、類似のアプローチの適用に成功した（文献５３、５４）。これらの研究では、修飾Ｕ７ｓｎＲＮＡ遺伝子を含む種々のプラスミドを遺伝子工学的に作製しており、修飾Ｕ７ｓｎＲＮＡ遺伝子は、ヒストンｍＲＮＡ前駆体に対するＵ７ｓｎＲＮＡ遺伝子内の天然のアンチセンス配列を、β−グロブリン遺伝子内のβ−サラセミア関連異常スプライシング部位を標的としたアンチセンス配列で置換したものである。このプラスミドのトランスフェクションの後には、正しいスプライシングおよび全長β−グロブリンタンパク質の発現を修復することができ、その効率は、種々の変異β−グロブリン遺伝子を発現する培養細胞で６５％にまで達することができた。
【００６２】
種々のＵ７ｓｎＲＮＡ遺伝子構築物を文献５３の記載に従って遺伝子工学的に作製したが、但し、β−グロブリン配列を、種々のＡＯＮから誘導したアンチセンス配列で正確に置換するという変更を加えた。この実施例では、マウスのエクソン４６のスキッピングを誘導する際に有効だったｍ４６ＡＯＮ４、６、９または１１を、β−グロブリン配列を置換するアンチセンス配列として用いた。センス構築物も負の対照として含めた（ｍ４６ＳＯＮ６）。シークエンシングで構築物を確認した後に、プラスミドを培養Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞にトランスフェクトすることにより in vitro で試験した。Ｕ７ｓｎＲＮＡ−ｍ４６ＡＯＮ６構築物が最も効率的だった。
【００６３】
ＡＯＮ−Ｕ７ｓｎＲＮＡ遺伝子構築物の送達性を向上するために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のベクターにクローニングした。ＡＡＶは、非病原性で、ヘルパー依存性の生活環を示す一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。他のウイルス（アデノウイルス、レトロウイルスおよび単純ヘルペスウイルス）とは対照的に、ｒＡＡＶベクターは成熟骨格筋の形質導入に非常に効率的である。古典的なＤＭＤ「遺伝子添加」研究にｒＡＡＶ用いることは、そのパッケージングの限度に限りがある（＜５ｋｂ）が故に妨げられていたが、ここではずっと小さなＵ７ｓｎＲＮＡアンチセンス構築物（＜６００ｂｐ）の成熟マウス骨格筋への効率的な送達にｒＡＡＶを用いる。
【００６４】
マウスＣ２Ｃ１２筋管へのトランスフェクションに続くエクソン４６のスキッピングの誘導は、Ｕ７−ｍ４６ＡＯＮ６構築物が最も効率的であり、これをＮｏｔＩ断片としてｒＡＡＶベクター（Stratagene社製）にクローニングした。このベクターは、ＡＡＶ−由来ＩＴＲ配列間にクローニングされた緑色蛍光タンパク質の遺伝子（ＧＦＰ−ｃＤＮＡ）を含有する。感染後、ＧＦＰタンパク質は、筋肉における形質導入効率の決定を可能とする。Ｕ７−ＡＯＮ構築物を単独、またはＧＦＰ遺伝子に隣接してかその遠位に含む種々のベクターを遺伝子工学的に作製した。ベクターの挿入物は、配列の解析により確認した。ｒＡＡＶウイルスを産生するために、２９３細胞にＵ７−ＡＯＮ−ｒＡＡＶプラスミドと共に、パッケージング／ヘルパープラスミドとなるｐＤＰ−５をコトランスフェクトした。このパッケージング／ヘルパープラスミドは、ＡＡＶベクターの増幅とパッケージングに必要な全てのＡＡＶ配列とアデノウイルス配列を含む改良ヘルパープラスミドである。J. Kleinschmidt 博士（ドイツ国、ハイデルベルグ、ｄｋｆｚ）より寄贈されたｐＤＰ−５プラスミドは、感染性ｒＡＡＶ １ｍｌあたり１０12個のウイルス粒子に達する高い力価での産生を容易にし、野生型のＡＡＶまたはアデノウイルスによる汚染はない。精製および濃縮に続いて、二種の構築物、即ち、ｒＡＡＶ−Ｕ７ｍ４６ＡＯＮ６とｒＡＡＶ−ＧＦＰ−Ｕ７ｍ４６ＡＯＮ６について、Ｃ２Ｃ１２マウス筋管に二種のＭＯＩ（感染多重度）で感染させることにより試験した。感染の７日後にＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を（「材料と方法」の欄の記載に従って）行った。ｒＡＡＶ−ｍ４６ＡＯＮ６構築物は最も効率的であり、エクソン４６のスキッピングを２０％に達するレベルで誘導した（図１７参照）。
【実施例５】
【００６５】
表題：
ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング 
ＡＯＮの組み合わせを用いてエクソン４３とエクソン４４のダブルエクソンスキッピングを誘導し、エクソン４３のナンセンス変異に冒された一人の患者から得た筋管でジストロフィン合成を修復した。エクソン４６〜５０の欠失を有する別の一人の患者では、治療効果のある、エクソン４５とエクソン５１のダブルエクソンスキッピングが達成された。注目すべきことに、対照筋管では、ＡＯＮの後者の組み合わせにより、エクソン４５〜５１の全伸長鎖のスキッピングが生じた。このようなインフレームマルチエクソンスキッピングは、種々のＤＭＤ発症性変異を有する一連の患者の治療に役立つと考えられた。実際に、エクソン４８〜５０の欠失を有する患者から得た筋管でその可能性を証明する。マルチエクソンスキッピングの適用は、より大きなＤＭＤ患者群のためのより不変的な方法を提供する。
【００６６】
ＡＯＮは近年、ヒト疾患の研究や治療において魅力的な手段となった。最初のうちＡＯＮは、発生過程を明らかにしたり、悪性または異常な遺伝子の発現を抑制したりするための、遺伝子の配列特異的阻害に用いられていた（Dennis et al. 1998; Stevenson et al. 1999; Nasevicius and Ekker 2000; Corey and Abrams 2001; Dove 2002）。これらの研究では、ＡＯＮはｄｓＲＮＡのＲＮＡａｓｅ Ｈによる分解を仲介したり、転写や翻訳の開始を妨げたりした。しかしながら、ＡＯＮはｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節することも可能である（Sierakowska et al. 1996）。疾病発症性点変異の少なくとも１５％がＲＮＡスプライシングの欠陥をもたらすと推定されていることから（Krawczak et al. 1992; Cartegni et al. 2002; Buratti et al. 2003）、後者の適用法は、将来的な遺伝子治療と密接に関連すると考えられる。例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ耐性ＡＯＮは、潜在的スプライス部位のブロッキングによる擬似エクソン（pseudo-exons）のスキッピングをβ−グロブリン遺伝子（Sierakowska et al. 1996）と嚢包性線維症膜貫通調節遺伝子（Friedman et al. 1999）で誘導することに成功した。また、通常はスキップされる変異ＢＲＣＡ１エクソンおよび変異ＳＭＮ２エクソンの包含を誘導するために、スプライシングエンハンサー因子を人為的に導入するための１０個のアルギニン−セリンジペプチドリピート配列で連結したＡＯＮを in vitro で用いた（Cartegni and Krainer 2003）。悪性のイソフォームを非悪性のイソフォームに変換するために、癌関連遺伝子に対してＡＯＮを用いた場合に、ＡＯＮは選択的スプライシング比率の改変にも有効であることが示された（Mercatante et al. 2001, 2002）。最後になるが、軽んじるべきではない用途としては、変異転写産物のリーディングフレームを補正するために特異的なエクソンスキッピングを誘導し、部分的に機能性を有するタンパク質を翻訳できるようにするという、最近開発された見込みあるＡＯＮの用途が挙げられる。ジストロフィンをコードしているＤＭＤ遺伝子は、この最後の用途に適している。このタンパク質は、アクチンフィラメントに結合するＮ−末端ドメイン、中央のロッドドメイン、およびジストロフィン−糖タンパク質複合体に結合するＣ−末端システインリッチドメインからなる（Hoffman et al. 1987; Koenig et al. 1988; Yoshida and Ozawa 1990）。リーディングフレームを中断させるＤＭＤ遺伝子の変異は、ジストロフィン機能の完全な喪失をもたらし、重症のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ（ＭＩＭ３１０２００））を発症させる（Hoffman et al. 1988; Koenig et al. 1989; Ervasti et al. 1990）。一方、軽症のベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ（ＭＩＭ３００３７６））は、上記と同じ遺伝子内のフレームシフトを伴わない変異の結果であり、この変異は、内部領域を欠失しているが、Ｎ−末端とＣ−末端を保持する部分的に機能性を有するジストロフィンをもたらす（Koenig et al. 1989; Di Blasi et al. 1996）。ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者の３分の２超が、１個以上のエクソンの欠失を有する（den Dunnen et al. 1989）。驚くべきことに、非常に軽症のＢＭＤを発症しているが、中央のロッドドメインの６７％までを欠く患者が報告されている（England et al. 1990; Winnard et al. 1993; Mirabella et al. 1998）。このような報告は、大きな欠失であっても転写産物がインフレームである限り、部分的に機能性を有するジストロフィンの産生が可能であることを示唆する。スプライシングを改変するためのＡＯＮは、オープンリーディングフレームを修復し、重症のＤＭＤ表現型を軽症のＢＭＤ表現型に変換する。いくつかの研究によって、治療を目的としたＡＯＮ誘導性の単一エクソンスキッピングが、ｍｄｘマウスモデルから得た細胞（Dunckley et al. 1998; Wilton et al. 1999; Mann et al. 2001, 2002; Lu et al. 2003）および種々のＤＭＤ患者から得た細胞（Takeshima et al. 2001; van Deutekom et al. 2001; Aartsma-Rus et al. 2002, 2003; De Angelis et al. 2002）について報告されている。現在までに、本発明者らは２０種のエクソン（エクソン２、８、１７、１９、２９、４０〜４６、４８〜５３、５５および５９）のスキッピングの誘導に用いることのできる一連のＡＯＮを同定した（Aartsma-Rus et al. 2002）。すべてのＤＭＤ患者のうち、７５％超がこれらのエクソンのスキッピングの恩恵に与ると考えられた。これまでに、異なるＤＭＤを患う患者８人から得た細胞で単一エクソンスキッピングの適用に成功している（van Deutekom et al. 2001; Aartsma-Rus et al. 2003）。これらの研究では、アウトオブフレーム欠失に隣接するエクソンまたはナンセンス変異を含むインフレームエクソンのスキッピングはリーディングフレームを修復し、処置細胞の約７５〜８０％でＢＭＤ様ジストロフィンの合成を誘導した。このような新規なジストロフィンは早くもトランスフェクションの１６時間後に検出することができ、ジストロフィンはそれから４日間のうちに顕著なレベルまで増加し、少なくとも７日間は維持された（Aartsma-Rus et al. 2003）。本発明では、ダブルエクソンスキッピングおよびマルチエクソンスキッピングを実施することにより（図８）、この手法の治療への適用性を著しく拡大する。アウトオブフレームエクソンにナンセンス変異を有する一人の患者と、１個のエクソンのみのスキッピングでは回避できない欠失を有する別の一人の患者においては、２個のエクソンの同時スキッピング（ダブルエクソンスキッピング）に続いてリーディングフレームが修復された。さらに、連続したエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピング（マルチエクソンスキッピング）によって、既知のＤＭＤ変異のうちの１４％までを修復する可能性のあるＢＭＤ様欠失が生じた。
【００６７】
材料と方法
ＡＯＮとプライマー 
エクソン４４を標的とするエクソン内部ＡＯＮ（ｈ４４ＡＯＮ１）およびエクソン５１を標的とするエクソン内部ＡＯＮ（ｈ５１ＡＯＮ２）は公知のものである（Aartsma-Rus et al. 2002）。エクソン４３標的ＡＯＮおよびエクソン４５標的ＡＯＮはこの研究のために特別に設計した（ｈ４３ＡＯＮ５：CUGUAGCUUCACCCUUUCC；ｈ４５ＡＯＮ５：GCCCAAUGCCAUCCUGG）。ＡＯＮのＢＬＡＳＴ分析では、ヒトゲノム内の他の配列との完全なホモロジーは発見されなかった（最大ホモロジー：９４％、最小Ｅ値：０．３）。すべてのＡＯＮは、５’フルオレセイン基（６−ＦＡＭ）、全長ホスホロチオエート主鎖および２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子（Eurogentec社製）を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のＡＯＮを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー（図８）は、Eurogentec社によって合成された（配列は要求に応じて公表する）。
【００６８】
筋原細胞の培養とＡＯＮによるトランスフェクション 
ヒト対照と２人のＤＭＤ患者（ＤＬ４７０．２（エクソン４６〜５０の欠失）および５０６８５．１（エクソン４８〜５０の欠失））について、筋生検材料から原始筋芽細胞を単離し、公知の方法（Aartsma-Rus et al. 2002）で培養した。血清欠乏条件で７〜１４日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。筋管に各ＡＯＮ２００ｎＭを含む混合物をトランスフェクトした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬とし、製造者の説明書（ExGen500（Fermentas社製）に添付のもの）に従って使用した。各ＡＯＮにつき別々のＡＯＮ−ＰＥＩ希釈物を調製し、トランスフェクトするＡＯＮ １μｇあたり３．５μｌのＰＥＩを用いた。エクソン４３に点変異を有する患者ＤＬ９０．３については、繊維芽細胞のみが提供されていた。ＭｙｏＤ遺伝子を含有するアデノウイルスベクター（Ad50MyoD）による感染（感染多重度（ＭＯＩ）は５０〜１００）に続いて、公知のプロトコール（Murry et al. 1996; Roest et al. 1996; Aartsma-Rus et al. 2002; Havenga et al. 2002）に従って繊維芽細胞の筋発生を強制的に行った。トランスフェクション条件は上記のものと同じであった。
【００６９】
ＲＮＡの単離とスキップ産物のＲＴ−ＰＣＲ分析 
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列の解析を公知の方法（Aartsma-Rus et al.2002）に従って行った。プライマーの位置については、図８を参照されたい。スキップ産物の定量ためには、ネステッドＰＣＲを２４サイクル行った。ＰＣＲ産物は、DNA 1000 LabChip Kit と 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）を用いて分析した。全長ＤＭＤ遺伝子のスプライシングを分析するために、１μｇのＲＮＡ、ランダムヘキサマープライマーおよび SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてＲＴ反応を行った。ＰＣＲ分析は、公知の短縮タンパク質アッセイ（protein-truncation test、ＰＴＴ）用プライマー（Roest et al.1993）を用いて行った。ＰＣＲプライマーのいくつかは患者ＤＬ４７０．２では欠失しているエクソンに位置しているので、エクソン４１、４２、４５、５３と５４のそれぞれに対するさらなるプライマーを特別に設計した（配列は要求に応じて公表する）。
【００７０】
ジストロフィンタンパク質の分析 
免疫組織化学的分析およびウェスタンブロット分析は公知の方法（Aartsma-Rus et al.2002）に従って行った。ミオシンポリクローナル抗体Ｌ５３（オランダ国、アムステルダムメディカルセンター（Amsterdam Medical Center）、M. van den Hoff 博士より寄贈）はミオシンを検出するために用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（英国、ノースイーストウェールズインスティチュート、G. Morris 博士より寄贈）、ＮＣＬ−ＤＹＳ２（Novacastra Laboratories社製）およびＮＣＬ−ＤＹＳ１（Novacastra Laboratories社製）はジストロフィンを検出するために用いた。ウェスタンブロット分析では、ジストロフィンレベルを LumiAnalyst 3.0（Roche社製）を用いて定量した。
【００７１】
結果
２人のＤＭＤ患者におけるダブルエクソンスキッピング 
単一エクソンのみのスキッピングは、すべての変異のリーディングフレームの修復に十分ではない。かなりの数の変異においては、２個のエクソンを同時にスキップする必要がある（図８のＡ）。例えば、患者ＤＬ９０．３はエクソン４３にナンセンス変異を有する。この単一エクソンがアウトオブフレームであることを考慮すると、エクソン４３のスキッピングはナンセンス変異を取り除くが、リーディングフレームを修復しない。エクソン４３とエクソン４４との組み合わせはインフレームなので、これら両方のエクソンの同時スキッピングを目的とした。患者ＤＬ４７０．２は、エクソン４６〜５０の欠失に冒されている。フレームの修復にはこの欠失に隣接する２個のエクソンの共スキッピングが必要である（図８のＡ）。両方の患者のそれぞれから得た培養筋管に、エクソン４３特異的ＡＯＮとエクソン４４特異的ＡＯＮとの混合物（ＤＬ９０．３の場合）またはエクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮとの混合物（ＤＬ４７０．２の場合）をトランスフェクトした。蛍光標識ＡＯＮの核への特異的な取り込みのあった細胞数から明かなように、トランスフェクション効率は概ね８０％を超えた。トランスフェクションの２４時間後または４８時間後のＲＴ−ＰＣＲ分析は、実際に両方の患者で特異的なダブルエクソンスキッピングが行われたことを示し（患者ＤＬ９０．３および患者ＤＬ４７０．２について、それぞれ総転写フラグメントの３０％および７５％）、この結果は配列の解析により確認した（図９のＡおよび図１０のＡ）。予想した通り、ダブルエクソンスキッピングに加えて、単一エクソンスキッピングを患者ＤＬ９０．３（エクソン４４、総転写産物の２７％）と患者ＤＬ４７０．２（エクソン５１、総転写産物の１２％）で検出した。ＤＭＤ転写産物よりも大きな領域やその他の領域がＡＯＮ処理の影響を受けていないことを確認するために、全長ＤＭＤ遺伝子について、一連のエクソンの組み合わせを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。処理筋管と非処理筋管の両方で、ＤＭＤ遺伝子にさらなる異常なスプライシングパターンは検出されなかった（図１１）。ジストロフィンの内部領域に対する抗体（ＭＡＮＤＹＳ１）およびＣ末端部分に対する抗体（Ｄｙｓ２）の２種を用いた免疫組織化学的分析は、ダブルエクソンスキッピングにより得られたインフレーム転写産物がＢＭＤ様ジストロフィンを産生したことを示した。ミオシン陽性筋管の平均で７０％が、ＡＯＮトランスフェクションに応答してジストロフィン発現を示した（図９のＢおよび図１０のＢ）。ウェスタンブロット分析により、（トランスフェクションの４日後の）患者ＤＬ９０．３および（トランスフェクションの２日後の）患者ＤＬ４７０．２においてジストロフィンの存在を確認したところ、その量は対照筋管と比べてそれぞれ３．３％および１．８％であった（図９のＣおよび図１０のＣ）。
【００７２】
マルチエクソンスキッピング 
（患者ＤＬ４７０．２で誘導されたように）エクソン４４が直接エクソン５２にスプライシングされることにより、インフレーム転写産物が産生された。これらエクソンの間に介在するエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピング（即ち、マルチエクソンスキッピング）を誘導することにより、種々のより小さな内部ＤＭＤ変異にまたがるＢＭＤ様欠失（エクソン４５〜５１）が産生されると考えた（図８のＢ）。マルチエクソンスキッピングは、エクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮとをそれぞれ２００ｎＭ含む混合物で処理したヒト対照筋管（個体：ＫＭ１０９）で初めに試験した（図１２のＡ）。標的としたエクソン４５〜５１のスキッピングによって生じると考えられる産物に対応する大きさの、新規な短い転写産物が観察された。実際に、配列の解析により、エクソン４４が直接エクソン５２にスプライシングされたことが明らかになった（データは示さない）。その後、上記ＡＯＮ混合物をエクソン４８〜５０の欠失を有するＤＭＤ患者（５０６８５．１）から得た筋管に投与した（図８のＢ）。エクソン４５〜５１のすべてのエクソンのＡＯＮ誘導性スキッピングにより、目的としたインフレーム転写産物が得られた（図１２のＡ）。
【００７３】
Ｕで連結したＡＯＮの組み合わせを用いた、ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング 
１個のｍＲＮＡ前駆体分子から１個よりも多くのエクソンをスキップするには、使用するＡＯＮがすべて同じ核内に存在し、同一の分子を標的とする必要がある。このような確率を特異的に増やすために、エクソン４５ＡＯＮとエクソン５１ＡＯＮ（ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２）とを１０個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型ＡＯＮを設計した（図１２のＢ）。この「Ｕ連結ＡＯＮ」をヒト対照（個体：ＫＭ１０９）および２人のＤＭＤ患者（ＤＬ４７０．２と５０６８５．１）のそれぞれから得た筋管へトランスフェクトし、次いでＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、エクソン５２にエクソン４４がスプライシングされたインフレーム転写産物を産生するというＡＯＮの効力が明らかになった（図１２のＡ）。配列の解析により確認したところ、このマルチエクソンスキッピングはエクソンの境界で特異的且つ正確に生じた（データは示さない）。患者５０６８５．１とヒト対照の筋管では、Ｕ連結ＡＯＮはＡＯＮの混合物よりも効率的であることが定量により明かとなったが、患者ＤＬ４７０．２の筋管では異なっていた（図１２のＣ）。
【００７４】
考察  
実際に誘導した単一エクソンの誘導性スキッピングは、ＤＭＤ患者から得た培養筋細胞において、リーディングフレームを補正してＢＭＤ様ジストロフィンの合成を誘導する治療可能性を示した（Takeshima et al. 2001; van Deutekom et al. 2001; De Angelis et al. 2002; Aartsma-Rus et al. 2003）。この実施例では、治療を目的とする標的アンチセンス誘導性マルチエクソンスキッピングの可能性を示す。複数のエクソンの自発的スキッピングは、低レベルであるが天然でしばしば生じる。このようなスキッピングはＤＭＤ患者と非罹患個体の両方で検出されている（Sironi et al. 2002）。さらに、この現象はｍｄｘマウスモデルとＤＭＤ患者におけるジストロフィン陽性「復帰」繊維の発生の根底にあるメカニズムであると示唆されている（Sherratt et al. 1993; Thanh et al. 1995; Lu et al. 2000）。マルチエクソンスキッピングは、ｍｄｘマウスの筋細胞における変異エクソン２３の標的スキッピングを目的としたＤＭＤ遺伝子治療研究でも観察された（Dunckley et al. 1998; Wilton et al. 1999; Bertoni et al. 2003）。このエクソンの３’−スプライス部位に対するＡＯＮとＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの両方が、エクソン２３に隣接しているエクソンもスキップした、短いインフレーム転写産物またはアウトオブフレーム転写産物を産生した。この実施例では、マルチエクソンスキッピングの誘導に特に焦点を当てた。ＡＯＮの組み合わせを用いることにより、エクソン４３〜４４やエクソン４５〜５１におけるダブルエクソンスキッピングを患者から得た培養筋管で誘導した。個々の筋管の免疫組織化学的分析は、このスキッピングにより７０％に達する筋管でジストロフィンの合成を可能にしたことを示す。この百分率は、単一エクソンスキッピングの研究でこれまでに得られた値（７５〜８０％）（Aartsma-Rus et al. 2003）よりも著しく低いものではなかった。この結果は、２種のＡＯＮを同時にトランスフェクトすることとその場合のスキッピング能は、単一ＡＯＮに比べて著しく効率が悪いわけではないことを示唆する。しかしながら、多くの残存するジストロフィン陰性筋管では、単一エクソンスキッピングのみが生じた。患者から得た総筋管の培養物から調製したタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、ジストロフィン濃度が比較的低い（３％未満）ことを示した。免疫組織化学的分析で高いレベル（７０％）が観察されたことを考慮すると、矛盾があるようだ。しかしながらこの矛盾は、免疫組織化学的分析では１つのミオシン陽性筋管に焦点を当てているのに対し、ウェスタンブロット分析のサンプルには非常に多くのジストロフィン陰性細胞も含まれるという事実によって説明することができる。さらに、対照タンパク質サンプルを得た培養細胞は、２倍も高い筋原性（即ち、培養患者細胞では４０％であるのに対し、対照サンプルでは９０％）を示したので、より多くのジストロフィン産生細胞が含まれていた。最後に、ウェスタンブロット分析の対照タンパク質サンプルは、分化の全期間（２週間）にわたりジストロフィンを発現していた筋管から得たものであるのに対し、患者から得た筋管では、ジストロフィン合成は分析時にのみ（最大でも４日間だけ）誘導した。筋管はトランスフェクションから数日間のみ生存可能であることから、こ��より長い発現期間を達成することはできない。エクソン４５特異的ＡＯＮとエクソン５１特異的ＡＯＮを種々の割合で用いて評価したところ、最も高いダブルエクソンスキッピング率が１：１の割合のときに得られた（データは示さない）。両方のＡＯＮが同じ効率で核に進入した。ダブルエクソンスキッピングに加えて単一エクソンスキッピングが、特にエクソン４４（患者ＤＬ９０．３の場合）とエクソン５１（患者ＤＬ４７０．２の場合）について観察された。これは、ｍＲＮＡ前駆体の局部二次構造はこれらのエクソンを標的としているＡＯＮの影響をより強く受け、その結果、エクソン４３とエクソン４５のそれぞれにＡＯＮが接近しづらくなっているためと考えられる。２つのＡＯＮが共に同じ核に取り込まれるだけでなく、同じＲＮＡ分子にハイブリダイズする確率を向上するために、１０個のウラシルヌクレオチドで連結した２つのＡＯＮからなるＡＯＮを設計した。２種のＡＯＮの混合物と比べると、Ｕで連結したＡＯＮは、実際にヒト対照とエクソン４８〜５０の欠失を有する患者のそれぞれの筋管において、高いレベルのマルチエクソンスキッピングを誘導した。対照的に、未だその理由は不明であるが、エクソン４６〜５０の欠失を有する患者の筋管では、ダブルエクソンスキッピングの誘導効率が低かった。追跡実験によって、Ｕ−リンカーの長さの影響について評価したところ、顕著な差は見られなかった（データは示さない）。マルチエクソンスキッピングのメカニズムについては、２つの説が考えられる。第一は、ｍＲＮＡ前駆体の二次構造における、ＡＯＮ誘導性の全体的な改変によってエクソン４５とエクソン５１の間に存在するエクソンとイントロンの両方からなる全領域がスプライシングにより除かれるという説である。第二は、エクソン４５〜５１の個々のエクソンのスプライシングが、エクソン４４がエクソン４５にスプライシングされるよりも早く生じるとする説である（イントロン４４の長さが２７０ｋｂであることを考慮すると、ありえないわけではない）。この場合、エクソン４５とエクソン５１のそれぞれにハイブリダイズしたＡＯＮが存在するので、スプライシング機構はエクソン４５〜５１を１個の大きなエクソンとみなしてそれを削除する。後者の説は、上流のイントロンよりも前に下流のイントロンがスプライシングを受けるＤＭＤ遺伝子内領域でのみマルチエクソンスキッピングが有効であることを示唆する。本発明者らは、現在、ＤＭＤ遺伝子の他の領域で（Ｕで連結した）ＡＯＮの種々の組み合わせを用いて、この説の立証に取り組んでいる。単一エクソンスキッピングのみを考慮すると、アンチセンスに基づくリーディングフレーム補正治療は、理論的にはＤＭＤ患者の７５％超に利益をもたらすと考えられた。マルチエクソンスキッピングは、この百分率をＤＭＤ変異の大部分にまで著しく拡大すると考えられるが、Ｎ−末端の機能的に重要なドメインやシステインリッチＣ−末端ドメインに影響を与える変異あるいはプロモーター領域、第一エクソンまたは転移に関与する変異を除くものとする。しかしながら、後者の変異は、本発明者らのデータベースに報告されているＤＭＤを有する全患者の８％未満にしか見られない（den Dunnen 1996）。マルチエ��ソンスキッピングは、このアプローチの恩恵に与る患者の数を増加させるばかりでなく、もっと重要なことには、このアプローチの変異特異性を低減させる。この研究で示したエクソン４５〜５１のマルチエクソンスキッピングは、ＤＭＤ変異データベースに報告されている全欠失変異の１４％および小さな変異の全量のうちの６％について、フレームを修復すると考えられた（den Dunnen 1996）。さらに、軽症ＢＭＤ表現型と関連することが知られる比較的大きなインフレーム欠失を生じるといった治療可能性を提供する（England et al. 1990; Winnard et al. 1993; Mirabella et al. 1998）。この手法の最終的な治療への適用は、in vivo での効率に大きく依存する。Luおよびその共同研究者ら（2003）は、最近、プルロニック共重合体Ｆ１２７を送達試薬として用いた、ｍｄｘ筋肉におけるＡＯＮ誘導性エクソン２３スキッピングについて報告した。正常に近いレベルのほぼ全長といえるジストロフィンが多くの筋繊維で観察され、筋肉の機能を向上させた。このような効果は２〜４週間で最適となったが、ＡＯＮ注射の３ヶ月後でもジストロフィンは検出可能であった（Lu et al. 2003）。本発明者らの経験では、筋細胞におけるＡＯＮの in vitro の効果と in vivo の効果は非常によく相関するので、この結果は、現在行っているマウスのマルチエクソンスキッピングに関する研究が有望であることの根拠となる。
【００７５】
本実施例に記載したデータに関するＵＲＬを次に示す：オンライン ヒト・メンデル遺伝（Online Mendelian Inheritance in Man）（ＯＭＩＭ）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/（ＤＭＤおよびＢＭＤに関するデータ）。
【００７６】
実施例５の参考文献
Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson A, den Dunnen J, van Ommen G, van Deutekom J (2002) Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne Muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 12:S71. 
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Baas F, Van Ommen GJ, et al. (2003) Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet 12:907-914.
Bertoni C, Lau C, Rando TA (2003) Restoration of dystrophin expression in mdx muscle cells by chimeraplast-mediated exon skipping. Hum Mol Genet 12:1087-1099.
Buratti E, Baralle FE, Pagani F (2003) Can a "patch" in a skipped exon make the pre-mRNA splicing machine run better? Trends Mol Med 9:229-232.
Cartegni L, Chew SL, Krainer AR (2002) Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 3:285-298.
Cartegni L, Krainer AR (2003) Correction of disease-associated exon skipping by synthetic exon-specific activators. Nat Struct Biol 10:120-125.
Corey DR, Abrams JM (2001) Morpholino antisense oligonucleotides: tools for investigating vertebrate development. Genome Biol 2: reviews1015.1-reviews1015.3.
De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, Toso S, Galluzzi G, Ricci E, Cossu G, Bozzini I (2002) Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:9456-9461.
den Dunnen J (1996) ライデン筋ジストロフィーページ（The Leiden Muscular Dystrophy pages）. http://www.dmd.nl （２００３年１２月１０日付でアクセス）
den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker E, Blonden LA,Ginjaar HB, Wapenaar MC, van Paassen HM, van Broeckhoven C, Pearson PL, van Ommen GJ (1989) Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet 45:835-847.
Dennis JU, Dean NM, Bennett CF, Griffith JW, Lang CM, Welch DR (1998) Human melanoma metastasis is inhibited following ex vivo treatment with an antisense oligonucleotide to protein kinase C-alpha. Cancer Lett 128:65-70.
Di Blasi C, Morandi L, Barresi R, Blasevich F, Cornelio F, Mora M (1996) Dystrophin-associated protein abnormalities in dystrophin-deficient muscle fibers from symptomatic and asymptomatic Duchenne/Becker muscular dystrophy carriers. Acta Neuropathol (Berl) 92:369-377.
Dove A (2002) Anti-sense and sensibility. Nat Biotechnol 20:121-124.
Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, Eperon IC, Dickson G (1998) Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 7:1083-1090.
England SB, Nicholson LV, Johnson MA, Forrest SM, Love DR, Zubrzycka-Gaarn EE, Bulman DE, Harris JB, Davies KE (1990) Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature 343:180-182.
Ervasti JM, Ohlendieck K, Kahl SD, Gaver MG, Campbell KP(1990) Deficiency of a glycoprotein component of the dystrophin complex in dystrophic muscle. Nature 345:315-319.
Friedman KJ, Kole J, Cohn JA, Knowles MR, Silverman LM, Kole R (1999) Correction of aberrant splicing of the cysticfibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene by antisense oligonucleotides. J Biol Chem 274:36193-36199.
Havenga MJ, Lemckert AA, Ophorst OJ, van Meijer M, Germeraad WT, Grimbergen J, van Den Doel MA, Vogels R, van Deutekom JCT, Janson AAM, de Bruijn JD, Uytdehaag F, Quax PH, Logtenberg T, Mehtali M, Bout A (2002) Exploiting the natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J Virol 76:4612-4620.
Hoffman EP, Brown RH, Jr., Kunkel LM (1987) Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophyn locus. Cell 51:919-928.
Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD, Harris JB, et al. (1988) Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N Engl J Med318:1363-1368.
Koenig M, Beggs AH, Moyer M, Scherpf S, Heindrich K, Bettecken T, Meng G, et al. (1989) The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 45:498-506.
Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM (1988) The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell 53:219-226.
Krawczak M, Reiss J, Cooper DN (1992) The mutational spectrum of single base-pair substitutions in mRNA splice junctions of human genes: causes and consequences. Hum Genet90:41-54.
Lu QL, Mann CJ, Lou F, Bou-Gharios G, Morris GE, Xue SA, Fletcher S, Partridge TA, Wilton SD (2003) Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 9:1009-1014.
Lu QL, Morris GE, Wilton SD, Ly T, Artem'yeva OV, Strong P, Partridge TA (2000) Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J Cell Biol 148:985-996.
Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, Ly T, Lloyd F, Fletcher S, Morgan JE, Partridge TA, Wilton SD (2001) Antisense-inducedexon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc Natl Acad Sci USA 98:42-47.
Mann CJ, Honeyman K, McClorey G, Fletcher S, Wilton SD(2002) Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy. J Gene Med 4:644-654.
Mercatante DR, Mohler JL, Kole R (2002) Cellular response to an antisense-mediated shift of Bcl-x pre-mRNA splicing and anti neoplastic agents. J Biol Chem 277:49374-49382.
Mercatante DR, Sazani P, Kole R (2001) Modification of alternative splicing by antisense oligonucleotides as a potential chemotherapy for cancer and other diseases. Curr. Cancer Drug Targets 1:211-230.
Mirabella M, Galluzzi G, Manfredi G, Bertini E, Ricci E, DeLeo R, Tonali P, Servidei S (1998) Giant dystrophin deletion associated with congenital cataract and mild muscular dystrophy. Neurology 51:592-595.
Murry CE, Kay MA, Bartosek T, Hauschka SD, Schwartz SM (1996) Muscle differentiation during repair of myocardial necrosis in rats via gene transfer with MyoD. J Clin Invest 98:2209-2217.
Nasevicius A, Ekker SC (2000) Effective targeted gene "knockdown" in zebrafish. Nat Genet 26:216-220.
Roest PA, Roberts RG, van der Tuijn AC, Heikoop JC, van Ommen GJ, den Dunnen JT (1993) Protein truncation test(PTT) to rapidly screen the DMD gene for translation terminating mutations. Neuromuscul Disord 3:391-394.
Roest PA, van der Tuijn AC, Ginjaar HB, Hoeben RC, Hoger-Vorst FB, Bakker E, den Dunnen JT, van Ommen GJ (1996) Application of in vitro Myo-differentiation of non-muscle cells to enhance gene expression and facilitate analysis of muscle proteins. Neuromuscul Disord 6:195-202.
Sherratt TG, Vulliamy T, Dubowitz V, Sewry CA, Strong PN (1993) Exon skipping and translation in patients with frameshift deletions in the dystrophin gene. Am J Hum Genet 53:1007-1015.
Sierakowska H, Sambade MJ, Agrawal S, Kole R (1996) Repair of thalassemic human beta-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 93:12840-12844.
Sironi M, Cagliani R, Pozzoli U, Bardoni A, Comi GP, GiordaR, Bresolin N (2002) The dystrophin gene is alternatively spliced throughout its coding sequence. FEBS Lett 517:163-166.
Stevenson JP, Yao KS, Gallagher M, Friedland D, Mitchell EP, Cassella A, Monia B, Kwoh TJ, Yu R, Holmlund J, DorrFA, O'Dwyer PJ (1999) Phase I clinical/pharmacokinetic and pharmacodynamic trial of the c-raf-1 antisense oligonucleotide ISIS 5132 (CGP 69846A). J Clin Oncol 17:2227-2236.
Takeshima Y, Wada H, Yagi M, Ishikawa Y, Minami R, Nakamura H, Matsuo M (2001) Oligonucleotides against a splicing enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient. Brain Dev 23:788-790.
Thanh LT, Nguyen Thi M, Hori S, Sewry CA, Dubowitz V, Morris GE (1995) Characterization of genetic deletions inBecker muscular dystrophy using monoclonal antibodies against a deletion-prone region of dystrophin. Am J Med Genet 58:177-186.
van Deutekom JC, Bremmer-Bout M, Janson AA, Ginjaar IB, Baas F, den Dunnen JT, van Ommen GJ (2001) Antisense induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 10:1547-1554.
Wilton SD, Lloyd F, Carville K, Fletcher S, Honeyman K, Agrawal S, Kole R (1999) Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 9:330-338.
Winnard AV, Klein CJ, Coovert DD, Prior T, Papp A, Snyder P, Bulman DE, et al. (1993) Characterization of translational frame exception patients in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Hum Mol Genet 2:737-744.
Yoshida M, Ozawa E (1990) Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem (Tokyo) 108:748-752.
【実施例６】
【００７７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のための小分子薬物として、特定のエクソンスキッピングを誘導し、ＤＭＤ転写産物の崩壊したリーディングフレームを修復することが報告されている。これにより、機能の大部分を有するＢＭＤ様ジストロフィンの合成と、重症ＤＭＤ表現型の軽症ＢＭＤ表現型への潜在的な変換が可能となる。これまで、本発明者らは２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（２ＯＭｅＰＳ）ＡＯＮを用いてきた。この研究では、モルフォリノ−ホスホロジアミデート、構造的にロックされた核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる主鎖を含む種々のＡＯＮ類似体のスキッピング効率について調べた。ＰＮＡとモルフォリノ化合物とは対照的に、ＬＮＡはスプライス調節物質としては未だ試験されていない。最も効果的なＡＯＮであるエクソン４６に対する２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮと比べて、ＬＮＡはより高いスキッピングレベルの誘導をヒト対照から得た筋管（８５％対２０％）とエクソン４５欠失ＤＭＤ患者から得た筋管（９８％対７５％）で示した。モルフォリノ誘導性スキッピングのレベルはたった５〜６％であり、ＰＮＡは効果がないと考えられた。さらに、３つ以下のミスマッチを有するＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮとの比較分析によって、ＬＮＡはより高いスキッピング効率を誘導するものの、配列特異性は低いことが明らかになった。このようなＬＮＡの限界は、ヒトゲノムの他の場所における副作用の危険性を増大する。従ってオリゴ化学（oligo-chemistry）のさらなる発展を待っている現状では、標的ＤＭＤエクソンスキッピングのための最も好ましい化合物は２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮであると考える。
【００７８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）がｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節することは、いくつかの研究によって報告されている（文献１）。例えば、ＡＯＮは、潜在的スプライス部位のブロッキングにより正常なスプライシングに修復し（文献２、３）、悪性のイソフォームを非悪性のイソフォームに変換する選択的スプライシングの発生率を改変し（文献４）、そして通常はスキップされる変異エクソンの包含を誘導する（文献５）。これらの研究では、ＡＯＮ処理は野生型ｍＲＮＡの再構築を目的とした。一方、近年のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子治療研究においては、ＡＯＮをジストロフィンｍＲＮＡの崩壊したリーディングフレームの修復に用いている。ＤＭＤ患者は重症の筋変性に苦しむが、これはジストロフィンタンパク質の合成を未成熟の状態で中断させる、ＤＭＤ遺伝子内のフレーム崩壊性変異によるものである（文献６〜９）。対照的に、リーディングフレームに影響しないＤＭＤ遺伝子内変異は、内部領域を欠失しているが、部分的に機能性を有するジストロフィンを産生し、重症度の低いベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）をもたらす（文献１０、１１）。ＤＭＤリーディングフレームのＡＯＮ誘導性修復は、特定のエクソンのスキッピングの誘導に基づいている。この手法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者とｍｄｘマウスモデルのそれぞれから得た培養筋細胞に対する適用に成功している（文献１２〜１９）。９０％に達する高いエクソンスキッピングレベルが達成され、顕著なレベルのＢＭＤ様ジストロフィンの合成が処置細胞の７５％超で可能となった（文献１７）。合成されたジストロフィンは筋鞘の近傍に位置し、そして機能修復の確固たる指標であるジストロフィン糖タンパク質複合体を修復した。
【００７９】
これらの研究で用いたＡＯＮは、ＲＮａｓｅ Ｈ独立性にするための２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子と、全長ホスホロチオエート主鎖を含んでいた（２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ）（表６）。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮは、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性や、ホスホジエステルＡＯＮと比べて増加した取り込み量といった利点を有するものの、ホスホロチオエート主鎖が多少の細胞毒性を有することや、免疫原性応答を誘発する可能性があるという問題点も有する（文献２０、２１）。
【００８０】
オリゴ化学の近年の発展は、ヌクレオチドの糖や主鎖への種々の修飾によって、種々の生物物理学的、生化学的そして生物学的な特性を有するＡＯＮを提供した。修飾ＡＯＮ類似体には、モルフォリノ−ホスホロジアミデート（モルフォリノ化合物）、構造的にロックされた核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＳ）が含まれる（文献２１で検討している）。モルフォリノ化合物では、ＤＮＡの糖リン酸主鎖がモルフォリノ−ホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドで置換されている（表６）（文献２２、２３）。モルフォリノ化合物は非毒性であり、ヌクレアーゼ耐性であり（文献２３）、そしてＲＮＡへの親和性が増加していることから、ＲＮＡの二次構造を崩壊することが示唆されている（文献１、２２）。一方、モルフォリノ化合物は電荷を帯びていないので、トランスフェクトするのが難しい。それにもかかわらず、スクレープローディング法（scrape loading technique）やエトキシル化ポリエチレンイミン（ＥＰＥＩ）を用いた手法で妥当〜良好なトランスフェクション効率が達成されている。モルフォリノ化合物はとりわけ、遺伝子のノックダウンによるゼブラフィッシュの発生過程の研究（文献２６）や、in vitro と in vivo でのβ−グロブリン遺伝子のスプライシングの調節（文献２５、２７）に使用されている。最近では、ｍｄｘマウスモデルで変異エクソン２３のスキッピングを誘導するためにモルフォリノ化合物を用いている（文献２８）。モルフォリノ化合物は、カチオン性リポプレックスを形成するために、センスオリゴ鎖（連結鎖（leash））と組み合わせて細胞にトランスフェクトした。このようなモルフォリノ処理は、in vitro と in vivo の両方でｍｄｘ筋細胞におけるジストロフィン合成を修復した。
【００８１】
ＬＮＡは、リボースの２’−酸素を４’−炭素につなぐメチレンブリッジを有するＤＮＡ類似体である（表６）。このブリッジは３’内部構造の固定をもたらすので、リボース構造の可とう性を低減する（文献１）。ＬＮＡはヌクレアーゼ耐性であり、非毒性であり、そしてこれまでにいかなるＤＮＡ類似体について報告されているよりも高い親和性を、相補的なＤＮＡとＲＮＡに対して示す（文献２９、３０）。このような高い親和性故に、次のような利点と問題点が発生する。ＬＮＡは非常に効率的にその標的にハイブリダイズするが、１５塩基対を超えるＬＮＡは熱安定性の自己構造化（self-structuring）を示す。さらに全長ＬＮＡは、ＰＮＡ ＡＯＮおよび２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮよりも低い配列特異性でハイブリダイズすると考えられる（文献２９、３１）。ＬＮＡは負の電荷を帯びているので、細胞への送達にはカチオン性脂質ポリマーを用いる。ＬＮＡは癌関連遺伝子の発現に対する強力な阻害剤であることが報告されている（文献３１）が、スプライシング調節物質としてはこれまで研究されていない。
【００８２】
ＰＮＡでは、ＤＮＡの糖リン酸主鎖がアキラルなポリアミド主鎖で置換されている（表６）（文献３２）。ＰＮＡは２ＯＭｅＰＳ主鎖に比べてＤＮＡとＲＮＡに対する親和性が非常に増加しているので、より配列特異的であり、プロテアーゼ耐性およびヌクレアーゼ耐性であり、高濃度でも非毒性であることが示唆されている（文献１、３３）。ＰＮＡが非イオン性であることの欠点は水溶性が不十分なことであり、この性質によりＰＮＡのトランスフェクションが煩雑になる（文献２７、３４）。Sazaniおよびその共同研究者らは近年、４個のリシン残基をＰＮＡのＣ末端にカップリングすることでこの問題を回避した（文献２７、３５）。リシンのカチオン性は水溶性を非常に向上させたので、トランスフェクション試薬を使用することなく、ＰＮＡが細胞と核へ進入するのを可能とした。ＰＮＡは、in vitro でのマウスインターロイキン５レセプターのα鎖のスプライシング、および in vitro と in vivo でのβ−グロブリ遺伝子のスプライシングの調節に有効であった（文献２７、３５、３６）。
【００８３】
今後の臨床研究のために好ましいＡＯＮ類似体は、低い細胞毒性レベルで最も高いレベルのエクソンスキッピングを誘導するものである。この実施例では、対照生物と患者のそれぞれから得た筋管の両方においてＤＭＤエクソン４６に特異的な、公知の２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ（文献１６、３７）と、その類似体であるモルフォリノ類似体、ＬＮＡ類似体とＰＮＡ類似体の効力、効率および適用性を比較した。
【００８４】
結果
ヒト対照筋管におけるＡＯＮ類似体の比較分析 
種々のＡＯＮ類似体（表６）の標的ｍＲＮＡ前駆体への結合親和性を測定するために、ゲル移動度シフトアッセイを行った。ＤＮＡ ＡＯＮ、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮ、ＬＮＡ ＡＯＮおよびＰＮＡ ＡＯＮを32Ｐ標識エクソン４６ＲＮＡフラグメントにハイブリダイズさせた（図１３のａ）。ＤＮＡ ＡＯＮ、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮおよびＬＮＡ ＡＯＮはそれぞれはっきりとした移動度シフトを誘導し、これら類似体が標的ＲＮＡに結合できることを示した。モルフォリノＡＯＮおよびＰＮＡ ＡＯＮについては、シフトは検出されなかった。この結果は、これら類似体は標的ＲＮＡに対する親和性が低いことを示唆した。しかしながら、これまでに行った実験において、顕著な移動度シフトを誘導しないにもかかわらず、実際にエクソンスキッピングを誘導するものがＡＯＮの中には存在することを観察している（未発表結果）。このような理由から、モルフォリノＡＯＮとＰＮＡ ＡＯＮも、さらなる分析の対象とすることに決定した。
【００８５】
いずれも５’−フルオロセイン基を有する種々のＡＯＮ類似体のトランスフェクション条件は、ヒト対照筋管で最適化した（図１３のｂ）。核蛍光シグナルの存在に基づいてトランスフェクション効率を測定したところ、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮおよびＬＮＡ ＡＯＮは概ね８０％を超えた。ＰＮＡのトランスフェクション効率は一般的にこれよりも低かった（〜６０−７０％）。注目すべきことに、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、ＬＮＡ ＡＯＮおよびＰＮＡ ＡＯＮについては蛍光発光の大部分が核内で見られたのに対し、モルフォリノ化合物の蛍光発光は明かに細胞質にも存在していた。
【００８６】
これまでの実験によると、最も効率的な（ＲＴ−ＰＣＲによって検出した）スキッピングレベルは、５００ｎＭの２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮを用いた際に得られた（文献１７）。以下の実験では、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの他に、ＬＮＡ ＡＯＮと、驚くべきことにモルフォリノＡＯＮがエクソン４６のスキッピングの誘導に有効であることを示す（図１３のｃ）。モルフォリノＡＯＮとＬＮＡ ＡＯＮの濃度系列実験は、それぞれ用量が１μＭと５００ｎＭのときに最も高いスキッピング効率が達成されることを示した。両方の類似体において、より高い濃度がさらに高いレベルのエクソン４６スキッピングをもたらすことはなく（データは示さない）、その代わりにモルフォリノＡＯＮでは、重度の細胞毒性作用が誘導された。５００ｎＭのＬＮＡをトランスフェクトした培養筋管においては、トランスフェクションの６日後でも最小レベルの細胞毒性しか存在しなかったのに対し、２００ｎＭの２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの場合には、同じ時点で重度の細胞死が観察された（データは示さない）。ＬＮＡのトランスフェクションにはより多くの単位のＰＥＩを用いたので、上記の差はＰＥＩ誘導性細胞毒性によるものとは考えられない。高用量の２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮとＬＮＡ ＡＯＮのそれぞれに応じて生じる、エクソン４５とエクソン４６の両方のスキッピングも低レベルであるが時折観察した（図１３のｃ）。ＰＮＡは、２０μＭでもエクソン４６のスキッピングを一貫して誘導しなかった（データは示さない）。種々のＡＯＮ類似体によるエクソン４６のスキッピング効率は、ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの定量により求めた（図１３のｄ）。２ＯＭｅＰＳ（２０％）と比べると、ＬＮＡ ＡＯＮはより効率的（８５％）であったのに対し、モルフォリノＡＯＮのスキッピングレベルは６％以下だった。
【００８７】
患者から得た筋管におけるＡＯＮ類似体の比較分析 
これまでに、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮは対照サンプルと比べて高いレベルのエクソンスキッピングを患者から得た筋管で誘導することを観察した（文献１６、１７）。以下の実験では、この効果をエクソン４５の欠失に冒されたＤＭＤ患者（ＤＬ２７９．１）から得た筋管で確認した。この患者では、エクソン４６のスキッピングによりインフレーム転写産物が産生される。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮについては、患者ＤＬ２７９．１で観察したエクソン４６のスキッピングは７５％であったのに対し、対照筋管では２０％だった（図１３のｃ、ｄ）。ＬＮＡ ＡＯＮとモルフォリノＡＯＮもエクソンスキッピングを誘導可能であったが（それぞれ９８％および５％）、ＰＮＡは誘導できなかった（図１３のｃ、ｄ）。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮと同様に、ＬＮＡは、対照筋管と比べて高いスキッピングレベルをＤＬ２７９．１で示した（９８％対８５％）。しかしながら、この効果は、モルフォリノＡＯＮやＰＮＡ ＡＯＮでは著しいものではなかった。
【００８８】
用量効果と配列特異性に関する、ＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの比較 
ＬＮＡが最も高いスキッピングレベルを誘導したことから、最小有効用量を測定するために濃度系列実験を行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析（図１４のａ）および定量分析（図１４のｂ）の結果は、ヒト対照筋管では、用量が５００ｎＭ未満になると効率が９７％から３０％に著しく下落し、１００ｎＭで検出されるエクソン４６のスキッピングは非常に低いレベル（＜１％）であることを示した。しかしながら、患者から得た筋管では、低用量によるエクソンスキッピングのレベルはより緩やかに下降し、用量が３００ｎＭの時に検出されるエクソン４６のスキッピングのレベルは８６％であり、１００ｎＭでも顕著なレベル（１０％）であった（図１４のａ、ｂ）。
【００８９】
次いで、（対照筋管よりも高いスキッピングレベルを示すという理由から）患者筋管で、ＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの配列特異性を分析した。５’末端、３’末端または中央部分に１つまたは２つのミスマッチを有する５種のＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ１〜ＬＮＡｍｍ５、図１５のａ）およびエクソン４６の３’方向にシフトした１つのＬＮＡ（ＬＮＡ９、図１５のａ）について検討した。ゲル移動度シフトアッセイは、すべてのＬＮＡが標的ｍＲＮＡ前駆体に結合し得ることを明らかにした（データは示さない）。その後、５００ｎＭのＬＮＡを患者筋管にトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ分析（図１５のｂ）および定量（図１５のｃ）の結果は、３’末端に１つまたは２つのミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ１およびＬＮＡｍｍ４）は、本来の１００％相補的なＬＮＡ８に匹敵する高いレベル（７１〜９４％対１００％）でエクソン４６のスキッピングが誘導可能なことを示し、これはＬＮＡの配列特異性が低いことを示唆した。中央に１つのミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ２）は低レベル（８％）のエクソンスキッピングを誘導したのに対し、中央に２つのミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ５）と５’末端にミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ３）は検出可能なスキッピングを誘導しなかった。ＬＮＡ９はエクソン４６に完全に相同であるにもかかわらず、エクソン４６のスキッピングを誘導しなかった。３’ミスマッチ含有ＬＮＡの低濃度における効果についても調べたところ、ＬＮＡ８と同等の低用量でエクソンスキッピングが観察された（データは示さない）。
【００９０】
本来の配列を有する２ＯＭｅＰＳオリゴ鎖と比べて最大で３つのミスマッチを有する５種の２ＯＭｅＰＳオリゴ鎖類似体について、同様に患者筋管で試験した（２ＯＭｅＰＳｍｍ１〜２ＯＭｅＰＳｍｍ５、図１５のｄ）。ＬＮＡとは対照的に、３'末端に１つまたは２つのミスマッチを有する２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ１〜２ＯＭｅＰＳｍｍ２）は、本来のオリゴ鎖に比べて低いレベルのエクソン４６スキッピングを誘導した（７％〜１７％対４８％）（図１５のｅ、ｆ）。３’末端に３つのミスマッチを有するオリゴ鎖（２ＯＭｅＰＳｍｍ３）や５’末端に１つのミスマッチを有するオリゴ鎖（２ＯＭｅＰＳｍｍ４）は、かろうじて検出可能なレベル（１〜２％）のエクソンスキッピングを誘導し、３つのミスマッチがオリゴ鎖全体に分散した２ＯＭｅＰＳ（２ＯＭｅＰＳｍｍ５）はエクソンスキッピングを誘導することはできなかった。ミスマッチを有する２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮおよびＬＮＡについてトランスフェクション実験およびＲＴ−ＰＣＲ分析を数回繰り返したところ、得られる効率には再現性があった。本発明者らの結果は、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮはＬＮＡよりも配列特異性が高いことを示す。
【００９１】
考察
アンチセンス誘導性エクソンスキッピングに関するこれまでの研究には、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮを用いた（文献１６、１７、３７）。この実験では、さらなるＡＯＮ類似体について、対照培養筋管とＤＭＤ患者から得た培養筋管のそれぞれにおいてＤＭＤのエクソン４６のスキッピングを誘導する効力、効率そして適用可能性を試験した。臨床試験を将来行うにあたって最も適したＡＯＮ類似体は、高いレベルのエクソンスキッピングを誘導するのはもちろん、非毒性で、送達が容易であり、好ましくは比較的安価なものである。この実験で試験した、ＡＯＮに代わる４種の類似体のうち、ＬＮＡのみが２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮよりも高いレベルのエクソンスキッピングを誘導した。モルフォリノ化合物は患者筋管と対照筋管の両方で、２ＯＭｅＰＳよりも効率が低いながらもスキッピングを示したのに対し、ＰＮＡは全く効果がなかった。ＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの両方のエクソンスキッピングレベルが、対照細胞よりも患者から得た細胞で高かった。本発明者らは、これまでにこのような効果を他のＤＭＤ患者から得た細胞で観察しており（文献１７）、これは、ナンセンス仲介ＲＮＡ減衰（ＮＭＤ）によるものであると仮定する。対照筋管においてＮＭＤはアウトオブフレームスキップ産物を選択的に標的とし、スキップ産物の相対量に負の影響を与える。患者から得た細胞では、本来のアウトオブフレームｍＲＮＡはＮＭＤに付されるのに対し、インフレームスキッピング産物はＮＭＤに付されない。他の説明としては、患者では、局所的なスプライシングをすでに混乱させている欠失が存在するために、ＡＯＮ仲介エクソンスキッピングが実際に増幅されているというものがある。モルフォリノ誘導性エクソンスキッピングのレベルは、患者サンプルと対照サンプルで同等であった（６％対５％）。
【００９２】
ゲル移動度シフトアッセイでは、モルフォリノＡＯＮとＰＮＡ ＡＯＮについてシフトは見られず、標的ｍＲＮＡ前駆体に対するこのような明かに低い親和性にもかかわらず、モルフォリノ化合物はエクソン４６のスキッピングを低レベルで誘導することができた。これは、標的ＲＮＡフラグメントへの正しいハイブリダイゼーションを妨げ得るセンスＤＮＡオリゴ鎖（ＥＰＥＩカップリングトランスフェクションのための連結鎖）にモルフォリノ化合物がハイブリダイズしていたという事実によって説明できる。細胞にトランスフェクトした後にモルフォリノ化合物は連結鎖からはずれるので、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることが可能となる。Schmajukおよびその共同研究者らは、モルフォリノ化合物は２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮよりもβ−グロブリン遺伝子の野生型スプライシングの修復に効果的であることを見出した（文献２５）。しかしながら、モルフォリノ化合物のトランスフェクション後には細胞質と核の両方に蛍光発光が見られることから、エクソンスキッピングが低レベルであることは、モルフォリノ化合物の効率が低いというよりはむしろ核への取り込みが不十分なためと考えられる。したがって、モルフォリノ化合物そのものとＥＰＥＩトランスフェクションに必要な連結鎖のさらなる最適化によって、エクソン４６のスキッピングのレベルが向上すると考えられる。実際に、Gebskiおよびその共同研究者らは、ｍｄｘマウスにおけるエクソン２３のスキッピングのレベルは、異なる連結鎖を用いると変化することを近年報告した（文献２８）。
【００９３】
ＰＮＡ類似体とＬＮＡ類似体の配列は完全に同じであるものの、ＬＮＡは高レベルのエクソン４６スキッピングを誘導するのに対し、ＰＮＡは検出可能なスキッピングを誘導しない。ＰＮＡオリゴ鎖は、モルフォリノ類似体や２ＯＭｅＰＳ類似体よりも高いレベルの正しくスプライシングされたβ−グロブリンｍＲＮＡを誘導することが報告されている（文献２７、３５）。この知見は、実際のところＰＮＡはスプライシングを調節することができることを示し、この実験でエクソン４６のスキッピングが見られないのは特定の標的ＲＮＡ配列に本発明者らのＰＮＡが結合できないか、ＰＮＡ−ＲＮＡ複合体の安定性が不十分なためであることを示唆した。さらなる実験によって、エクソン４６標的配列に対する高い結合親和性を有するＰＮＡを同定することができるであろう。
【００９４】
ＬＮＡは比較的新しいＡＯＮ類似体であり、これまで標的遺伝子の発現の阻害にのみ用いられていた（文献２９、３１）。この実験では、ＬＮＡがｍＲＮＡ前駆体の強力な調節物質でもあることを示す。一連の実験では、ＬＮＡは対照転写産物の８５％で、そしてエクソン４５の欠失を有するＤＭＤ患者から得た転写産物の９８％で、エクソン４６のスキッピングを誘導した。これに比べて今まで使用していた２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮが対照細胞で誘導したエクソン４６のスキッピングは２０％であり、エクソン４５欠失転写産物におけるスキッピングは７５％だった。注目すべきことに、ＬＮＡは２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮよりも細胞毒性が低いようである。
【００９５】
これらの結果に基づくと、ＬＮＡは、原則としてアンチセンス誘導性エクソンスキッピング研究のための有望な代替物であると考えられる。しかしながら残念なことに、短い配列（１４量体）であるためにヒトゲノム内のいくつかの他の配列に完全に相同である。これらの大部分は遺伝子内またはその近傍の非コード領域に位置する。ＬＮＡを長くすると特異性が向上する（文献２９）。ミスマッチを有するＬＮＡを用いた本発明者らの実験の結果は、ＡＯＮの３’部分に１つまたは２つのミスマッチを有するＬＮＡが特異的ＬＮＡと同じくらい強力であることを示す。これは、たった１２個の塩基対による結合がエクソン４６のスキッピングの誘導に十分であることを示唆するが、ＬＮＡの融解温度が非常に高い（本発明者らの１４量体ＬＮＡの予想融解温度は１３１℃である；表６）ことを考慮すると、これは驚くべきことではない。しかしながら、この結果は、本発明者らのエクソン４６特異的ＬＮＡは、このような１２塩基対を含有するヒトゲノム内の他の配列にも望ましくない結合を示すことを意味する。例えば、７量体でも予想される融解温度は６０℃を超えるので、ＬＮＡは短い配列にも結合し得る。最近、本発明者らはヒトＬＮＡをマウス筋肉に注射した。マウス配列と比べて１つのミスマッチを有するこのヒトＬＮＡは、マウスエクソン４６のスキッピングを低濃度でも誘導することができた。ＲＮＡに対する親和性を低下するために、キメラ状のＬＮＡ／２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴ鎖を製造した（文献３８）。このようなキメラは全長ＬＮＡよりも融解温度は低いが、ＲＮＡに対する親和性は２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮよりも高い。実際に、キメラＬＮＡは、ＨＩＶ−１トランス活性化応答エレメント（HIV-1 transactivating responsive element）の転写を in vitro で阻害することが報告されている（文献３８）。
【００９６】
ミスマッチを有する２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮを用いた本発明者らの結果は、この類似体がＬＮＡよりも配列特異性が高いことを示す。３’末端に存在する１つのミスマッチによってエクソン４６のスキッピングレベルはほぼ３分の１に減少し、３つの３'ミスマッチを有する２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮではエクソンスキッピングは起こらなかった。短い１４量体であるＬＮＡにおける１つのミスマッチの効果のほうが、それよりも長い２０量体である２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮにおける効果よりも大きいと考えがちである。しかしながら、３’末端のミスマッチについては、この逆こそが真実であった。さらに、ＬＮＡ類似体および２ＯＭｅＰＳ類似体の両方において、３’末端のミスマッチは、ＡＯＮの５’末端や中央のミスマッチよりも高いレベルのエクソン４６スキッピングを誘導した。これは、蛍光標識の存在のためか否か、５’末端のミスマッチは標的ＲＮＡに対する親和性を大きく減少させることを示唆する。
【００９７】
材料と方法
ＡＯＮとプライマー 
この実験のＡＯＮ類似体の特徴は表６に概説した。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ（配列は図１５のｄに示した；ベルギー国、Eurogentec社製）は全長ホスホロチオエート主鎖および２’−Ｏ−メチル修飾リボース分子を有する公知のＡＯＮ（文献１６、３７）である。モルフォリノ化合物（米国、Gene-Tools社製）はモルフォリノ−ホスホロアミデート主鎖を有し、ＥＰＥＩトランスフェクションのためのセンスＤＮＡオリゴ鎖に連結している。ＬＮＡ（配列は図１５のａに示した；仏国、Proligo社製）は、その全長主鎖がロックされた核酸からなるものである。ＰＮＡ（ベルギー国、Eurogentec社製）はペプチド核酸主鎖、および水溶性の向上と細胞へのトランスフェクションの促進のための４個のリシン残基をＣ末端に有する。すべてのＡＯＮは５’フルオレセイン基（６−ＦＡＭ）を含有する。
【００９８】
ゲル移動度シフトアッセイ 
ヒトジストロフィンエクソン４６ＲＮＡは、公知の方法（文献１６）に従って in vitro で転写した。個々のＡＯＮ（０．５ｐｍｏｌ）の結合親和性は、ハイブリダイゼーション緩衝液（１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｎＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ2）中、３７℃で一晩インキュベートし、次いで８％ＰＡＧＥおよび PhosphoImager（Molecular Dynamics社製）で分析することにより求めた。
【００９９】
筋原細胞の培養とトランスフェクション 
非罹患対照およびＤＭＤ患者（ＤＬ２７９．１；エクソン４５の欠失を有する患者）について、筋生検材料から原始ヒト筋芽細胞を単離し、公知の方法（文献３７）で培養した。血清欠乏条件で７〜１４日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮとＬＮＡ ＡＯＮのトランスフェクションには、製造者の説明書（ExGen500（MBI Fermentas社製）に添付のもの）に従ってＰＥＩを用いた。具体的には、トランスフェクトするＡＯＮ １μｇあたり３．５μｌのＰＥＩ（即ち、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮには１２．９μｌ（７０μＭ）、ＬＮＡオリゴ鎖には９．２μｌ（５０μＭ））を用いた。モルフォリノＡＯＮのトランスフェクションには、製造者の説明書に従ってＥＰＥＩを用いた。具体的には、各２００ｎｍｏｌのモルフォリノ化合物に１μｌの２００μＭ ＥＰＥＩ（米国、Gene-Tools社製）用いた。ＰＮＡは、いかなるトランスフェクション試薬も用いずに１ｍｌの培地にアプライした。トランスフェクションの３時間後に２ｍｌの培地を添加した。
【０１００】
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲと配列の解析 
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ分析と直接シークエンシングは公知の方法（文献１７）で行った。初期ＰＣＲにはエクソン４３に対するプライマー（CCTGTGGAAAGGGTGAAGC）とエクソン４８に対するプライマー（CTGAACGTCAAATGGTCCTTC）が含まれ、ネステッドＰＣＲにはエクソン４４に対するプライマー（CGATTTGACAGATCTGTTGAG）とエクソン４７に対するプライマー（GAGCACTTACAAGCACGGG）が含まれていた。すべてのプライマーが Eurogentec社（ベルギー国）によって合成された。定量のために、スキップ産物は DNA 1000 LabChipR Kit を用い、Agilent 2100 bioanalyzer（米国、Agilent Technologies社製）で分析した。
【０１０１】
実施例６の参考文献
1  Braasch DA, Corey DR. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry 2002; 41: 4503-4510.
2  Suwanmanee T et al. Repair of a Splicing Defect in Erythroid Cells from Patients with beta-Thalassemia/HbE Disorder. Mol Ther 2002; 6: 718-726.
3  Friedman KJ et al. Correction of aberrant splicing of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene by antisense oligonucleotides. J Biol Chem 1999; 274: 36193-36199. 
4  Mercatante DR, Sazani P, Kole R. Modification of alternative splicing by antisense oligonucleotides as a potential chemotherapy for cancer and other diseases. Curr Cancer Drug Targets 2001; 1: 211-230.
5  Cartegni L, Krainer AR. Correction of disease-associated exon skipping by synthetic exon-specific activators. Nat Struct Biol 2003; 10: 120-125.
6  Hoffman EP, Brown RH, Jr., Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 1987; 51: 919-928.
7  Hoffman EP et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N Engl J Med 1988; 318: 1363-1368.
8  Koenig M et al. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 1989; 45: 498-506.
9  Ervasti JM et al. Deficiency of a glycoprotein component of the dystrophin complex in dystrophic muscle. Nature 1990; 345: 315-319.
10  Di Blasi C et al. Dystrophin-associated protein abnormalities in dystrophin-deficient muscle fibers from symptomatic and asymptomatic Duchenne/Becker muscular dystrophy carriers. Acta Neuropathol (Berl) 1996; 92: 369-377.
11  Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell 1988; 53: 219-226.
12  Dunckley MG et al. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 1998; 7: 1083-1090.
13  Wilton SD et al. Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 1999; 9: 330-338.
14  De Angelis FG et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 9456-9461.
15  Takeshima Y et al. Oligonucleotides against a splicing enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient. Brain Dev 2001; 23: 788-790.
16  van Deutekom JC et al. Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 2001; 10: 1547-1554.
17  Aartsma-Rus A et al. Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet 2003; 12: 907-914.
18  Aartsma-Rus A et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004; 74: 83-92. Epub 2003 Dec 2016.
19  Lu QL et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 2003; 6: 6.
20  Agrawal S. Importance of nucleotide sequence and chemical modifications of antisense oligonucleotides. Biochim Biophys Acta 1999; 1489: 53-68.
21  Manoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2002; 12: 103-128.
22  Ekker SC, Larson JD. Morphant technology in model developmental systems. Genesis 2001; 30: 89-93.
23  Summerton J. Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H independent structural type. Biochim Biophys Acta 1999; 1489: 141-158.
24  Morcos PA. Achieving efficient delivery of morpholino oligos in cultured cells. Genesis 2001; 30: 94-102.
25  Schmajuk G, Sierakowska H, Kole R. Antisense oligonucleotides with different backbones. Modification of splicing pathways and efficacy of uptake. J Biol Chem 1999; 274: 21783-21789.
26  Nasevicius A, Ekker SC. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet 2000; 26: 216-220.
27  Sazani P et al. Systemically delivered antisense oligomers upregulate gene expression in mouse tissues. Nat Biotechnol 2002; 20: 1228-1233.
28  Gebski BL et al. Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin exon 23 skipping in mdx mouse muscle. Hum Mol Genet 2003; 12: 1801-1811.
29  Braasch DA, Liu Y, Corey DR. Antisense inhibition of gene expression in cells by oligonucleotides incorporating locked nucleic acids: effect of mRNA target sequence and chimera design. Nucleic Acids Res 2002; 30: 5160-5167.
30  Leumann CJ. DNA analogues: from supramolecular principles to biological properties. Bioorg Med Chem 2002; 10: 841-854.
31  Fluiter K et al. In vivo tumor growth inhibition and biodistribution studies of locked nucleic acid (LNA) antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res 2003; 31: 953-962.
32  Larsen HJ, Bentin T, Nielsen PE. Antisense properties of peptide nucleic acid. Biochim Biophys Acta 1999; 1489: 159-166.
33  Mologni L et al. Additive antisense effects of different PNAs on the in vitro translation of the PML/RARalpha gene. Nucleic Acids Res 1998; 26: 1934-1938.
34  Ray A, Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. Faseb J 2000; 14: 1041-1060.
35  Sazani P et al. Nuclear antisense effects of neutral, anionic and cationic oligonucleotide analogs. Nucleic Acids Res 2001; 29: 3965-3974.
36  Karras JG et al. Deletion of individual exons and induction of soluble murine interleukin-5 receptor-alpha chain expression through antisense oligonucleotide-mediated redirection of pre-mRNA splicing. Mol Pharmacol 2000; 58: 380-387.
37  Aartsma-Rus A et al. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 2002; 12: S71.
38  Arzumanov A et al. Inhibition of HIV-1 Tat-dependent trans activation by steric block chimeric 2'-O-methyl/LNA oligoribonucleotides. Biochemistry 2001; 40: 14645-14654.
【実施例７】
【０１０２】
マルチエクソンスキッピング 
フレーム修復性マルチエクソンスキッピングの他の例としては、ＤＭＤ変異の最大２０％を治療可能なエクソン１７と４８の間の伸長鎖（エクソン１７〜４８の欠失は、軽症ＢＭＤ様表現型と関連することが知られる非常に大きな変異である）、エクソン１９〜５１（３５％に適用可能）、エクソン４８〜５９（１８％に適用可能）およびエクソン４２〜５５（６５％に適用可能）が挙げられる。特に最後の組み合わせは、本願で他の１つの例（図８）として挙げたように、大きな患者群への適用が考えられる。エクソン４２〜５５のマルチエクソンスキッピングの可能性を、ｈ４２ＡＯＮ１とｈ５５ＡＯＮ１との混合物（表２参照）、またはこれらＡＯＮを１０個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型ＡＯＮで処理したヒト対照筋管で証明した。この混合物または「Ｕ連結ＡＯＮ」の筋管へのトランスフェクションに続いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、エクソン４２がエクソン５５にスプライシングされた予想通りのインフレーム転写産物の誘導において、いずれも類似した効率を示すことが明らかになった（図１６）。配列の解析により、この特定のマルチエクソンスキッピングがエクソンの境界で特異的に且つ正確に生じたことが確認された（データは示さない）。
【０１０３】
これらの実験は、上述したエクソン４５〜５１のマルチエクソンスキッピング（実施例５の「材料と方法」の欄を参照）と同様に行った。
【０１０４】
参考文献
1. Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr., Kunkel, L. M. (1987) Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell, 51, 919-928.
2. Hoffman, E. P., Fischbeck, K. H., Brown, R. H., Johnson, M., Medori, R., Loike, J. D., Harris, J. B., Waterston, R., Brooke, M., Specht, L., et al. (1988) Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med., 318, 1363-1368.
3. Den Dunnen, J. T., Grootscholten, P. M., Bakker, E., Blonden, L. A., Ginjaar, H. B., Wapenaar, M. C., van Paassen, H. M., van Broeckhoven, C., Pearson, P. L., van Ommen, G. J. (1989) Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am. J. Hum. Genet., 45, 835-847.
4. Koenig, M., Beggs, A. H., Moyer, M., Scherpf, S., Heindrich, K., Bettecken, T., Meng, G., Muller, C. R., Lindlof, M., Kaariainen, H., et al. (1989) The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am. J. Hum. Genet., 45, 498-506.
5. Tuffery-Giraud, S., Chambert, S., Demaille, J., Claustres, M. (1999) Point mutations in the dystrophin gene: evidence for frequent use of cryptic splice sites as a result of splicing defects. Hum. Mutat., 14, 359-368.
6. Prior, T. W., Bartolo, C., Pearl, D. K., Papp, A. C., Snyder, P. J., Sedra, M. S., Burghes, A. H., Mendell, J. R. (1995) Spectrum of small mutations in the dystrophin coding region. Am. J. Hum. Genet., 57, 22-33.
7. Moser, H. (1984) Duchenne muscular dystrophy: pathogenetic aspects and genetic prevention. Hum. Genet., 66, 17-40.
8. Emery, A. E. (2002) The muscular dystrophies. Lancet, 359, 687-695.
9. Yoshida, M., Ozawa, E. (1990) Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J. Biochem. (Tokyo), 108, 748-752.
10. Ervasti, J. M., Campbell, K. P. (1991) Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex. Cell, 66, 1121-1131.
11. Di Blasi, C., Morandi, L., Barresi, R., Blasevich, F., Cornelio, F., Mora, M. (1996) Dystrophin-associated protein abnormalities in dystrophin-deficient muscle fibers from symptomatic and asymptomatic Duchenne/Becker muscular dystrophy carriers. Acta Neuropathol. (Berl), 92, 369-377.
12. Ervasti, J. M., Ohlendieck, K., Kahl, S. D., Gaver, M. G., Campbell, K. P. (1990) Deficiency of a glycoprotein component of the dystrophin complex in dystrophic muscle. Nature, 345, 315-319.
13. Matsumura, K., Burghes, A. H., Mora, M., Tome, F. M., Morandi, L., Cornello, F., Leturcq, F., Jeanpierre, M., Kaplan, J. C., Reinert, P., et al. (1994) Immunohistochemical analysis of dystrophin-associated proteins in Becker/Duchenne muscular dystrophy with huge in-frame deletions in the NH2-terminal and rod domains of dystrophin. J. Clin. Invest., 93, 99-105.
14. Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. (1988) An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 2, 90-95.
15. Clemens, P. R., Duncan, F. J. (2001) Progress in gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. Curr. Neurol. Neurosci. Rep., 1, 89-96.
16. Khan, M. A. (1993) Corticosteroid therapy in Duchenne muscular dystrophy. J. Neurol. Sci., 120, 8-14.
17. De Angelis, F. G., Sthandier, O., Berarducci, B., Toso, S., Galluzzi, G., Ricci, E., Cossu, G., Bozzoni, I. (2002) Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9456-9461.
18. Mann, C. J., Honeyman, K., Cheng, A. J., Ly, T., Lloyd, F., Fletcher, S., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Wilton, S. D. (2001) Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 42-47.
19. van Deutekom, J. C., Bremmer-Bout, M., Janson, A. A., Ginjaar, I. B., Baas, F., den Dunnen, J. T., van Ommen, G. J. (2001) Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum. Mol. Genet., 10, 1547-1554.
20. Wilton, S. D., Lloyd, F., Carville, K., Fletcher, S., Honeyman, K., Agrawal, S., Kole, R. (1999) Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul. Disord., 9, 330-338.
21. Dunckley, M. G., Manoharan, M., Villiet, P., Eperon, I. C., Dickson, G. (1998) Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum. Mol. Genet., 7, 1083-1090.
22. Takeshima, Y., Wada, H., Yagi, M., Ishikawa, Y., Minami, R., Nakamura, H., Matsuo, M. (2001) Oligonucleotides against a splicing enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient. Brain Dev., 23, 788-790.
23. Aartsma-Rus, A., Bremmer-Bout, M., Janson, A., den Dunnen, J., van Ommen, G., van Deutekom, J. (2002) Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul. Disord., 12, S71.
24. Shiga, N., Takeshima, Y., Sakamoto, H., Inoue, K., Yokota, Y., Yokoyama, M., Matsuo, M. (1997) Disruption of the splicing enhancer sequence within exon 27 of the dystrophin gene by a nonsense mutation induces partial skipping of the exon and is responsible for Becker muscular dystrophy. J. Clin. Invest., 100, 2204-2210.
25. Cartegni, L., Chew, S. L., Krainer, A. R. (2002) Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat. Rev. Genet., 3, 285-298.
26. Schaal, T. D., Maniatis, T. (1999) Multiple distinct splicing enhancers in the protein-coding sequences of a constitutively spliced pre-mRNA. Mol. Cell. Biol., 19, 261-273.
27. Takeshima, Y., Nishio, H., Sakamoto, H., Nakamura, H., Matsuo, M. (1995) Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin Kobe. J. Clin. Invest., 95, 515-520.
28. Pramono, Z. A., Takeshima, Y., Alimsardjono, H., Ishii, A., Takeda, S., Matsuo, M. (1996) Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun., 226, 445-449.
29. Koenig, M., Monaco, A. P., Kunkel, L. M. (1988) The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell, 53, 219-226.
30. Den Dunnen, J. (1996) ライデン筋ジストロフィーページ（The Leiden Muscular Dystrophy pages）; http://www.dmd.nl.
31. Mann, C. J., Honeyman, K., McClorey, G., Fletcher, S., Wilton, S. D. (2002) Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy. J. Gene Med., 4, 644-654.
32. Kerr, T. P., Sewry, C. A., Robb, S. A., Roberts, R. G. (2001) Long mutant dystrophins and variable phenotypes: evasion of nonsense-mediated decay? Hum. Genet., 109, 402-407.
33. Klein, C. J., Coovert, D. D., Bulman, D. E., Ray, P. N., Mendell, J. R., Burghes, A. H. (1992) Somatic reversion/suppression in Duchenne muscular dystrophy (DMD): evidence supporting a frame-restoring mechanism in rare dystrophin-positive fibers. Am. J. Hum. Genet., 50, 950-959.
34. Sherratt, T. G., Vulliamy, T., Dubowitz, V., Sewry, C. A., Strong, P. N. (1993) Exon skipping and translation in patients with frameshift deletions in the dystrophin gene. Am. J. Hum. Genet., 53, 1007-1015.
35. Lu, Q. L., Morris, G. E., Wilton, S. D., Ly, T., Artem'yeva, O. V., Strong, P., Partridge, T. A. (2000) Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J. Cell Biol., 148, 985-996.
36. Nicholson, L. V., Johnson, M. A., Bushby, K. M., Gardner-Medwin, D. (1993) Functional significance of dystrophin positive fibres in Duchenne muscular dystrophy. Arch. Dis. Child, 68, 632-636.
37. Vainzof, M., Passos-Bueno, M. R., Takata, R. I., Pavanello Rde, C., Zatz, M. (1993) Intrafamilial variability in dystrophin abundance correlated with difference in the severity of the phenotype. J. Neurol. Sci., 119, 38-42.
38. Singh, V., Sinha, S., Mishra, S., Chaturvedi, L. S., Pradhan, S., Mittal, R. D., Mittal, B. (1997) Proportion and pattern of dystrophin gene deletions in north Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy patients. Hum. Genet., 99, 206-208.
39. Melacini, P., Fanin, M., Danieli, G. A., Fasoli, G., Villanova, C., Angelini, C., Vitiello, L., Miorelli, M., Buja, G. F., Mostacciuolo, M. L., et al. (1993) Cardiac involvement in Becker muscular dystrophy. J. Am. Coll. Cardiol., 22, 1927-1934.
40. Melis, M. A., Cau, M., Muntoni, F., Mateddu, A., Galanello, R., Boccone, L., Deidda, F., Loi, D., Cao, A. (1998) Elevation of serum creatine kinase as the only manifestation of an intragenic deletion of the dystrophin gene in three unrelated families. Europ. J. Paediatr. Neurol., 2, 255-261.
41. Onengut, S., Kavaslar, G. N., Battaloglu, E., Serdaroglu, P., Deymeer, F., Ozdemir, C., Calafell, F., Tolun, A. (2000) Deletion pattern in the dystrophin gene in Turks and a comparison with Europeans and Indians. Ann. Hum. Genet., 64, 33-40.
42. Rosenberg, C., Navajas, L., Vagenas, D. F., Bakker, E., Vainzof, M., Passos-Bueno, M. R., Takata, R. I., Van Ommen, G. J., Zatz, M., Den Dunnen, J. T. (1998) Clinical diagnosis of heterozygous dystrophin gene deletions by fluorescence in situ hybridization. Neuromuscul. Disord., 8, 447-452.
43. Sertic, J., Barisic, N., Sostarko, M., Brzovic, Z., Stavljenic-Rukavina, A. (1997) Deletion screening of the Duchenne/Becker muscular dystrophy gene in Croatian population. Coll. Antropol., 21, 151-156.
44. Rando, T. A., Blau, H. M. (1994) Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol., 125, 1275-1287.
45. Murry, C. E., Kay, M. A., Bartosek, T., Hauschka, S. D., Schwartz, S. M. (1996) Muscle differentiation during repair of myocardial necrosis in rats via gene transfer with MyoD. J. Clin. Invest., 98, 2209-2217.
46. Roest, P. A., van der Tuijn, A. C., Ginjaar, H. B., Hoeben, R. C., Hoger-Vorst, F. B., Bakker, E., den Dunnen, J. T., van Ommen, G. J. (1996) Application of in vitro Myo-differentiation of non-muscle cells to enhance gene expression and facilitate analysis of muscle proteins. Neuromuscul. Disord., 6, 195-202.
47. Havenga, M. J., Lemckert, A. A., Ophorst, O. J., van Meijer, M., Germeraad, W. T., Grimbergen, J., van Den Doel, M. A., Vogels, R., van Deutekom, J., Janson, A. A., et al. (2002) Exploiting the natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J. Virol., 76, 4612-4620.
48. Anderson, L. V., Davison, K. (1999) Multiplex Western blotting system for the analysis of muscular dystrophy proteins. Am. J. Pathol., 154, 1017-1022.
49. Neugebauer, KM, et al., J Cell Biol 129:899-908 (1995).
50. Tacke R and Manley JL, Proc Soc Exp Biol Med 220:59-63 (1999).
51. Graveley BR et al., Curr Biol 9:R6-7 (1999).
52. Misteli T et al., Nature 387:523-527 (1997).
53. Gorman L, Suter D, Emerick V, et al. Stable alteration of pre mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 4929 4934.
54. Suter D, Tomasini R, Reber U, et al. Double target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta thalassemic mutations. Hum Mol Genet 1999;8:2415 2423.
【０１０５】
【表１】
2014138589.tif 000002
【０１０６】
【表２】
2014138589.tif 000003
【０１０７】
【表３】
2014138589.tif 000004
【０１０８】
【表４】
2014138589.tif 000005
【０１０９】
【表５】
2014138589.tif 000006
【０１１０】
【表６】
2014138589.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＡＯＮ処理したＤＭＤ患者由来培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの、スキッピングの標的としたエクソンを含む領域に焦点を当てたＲＴ−ＰＣＲ分析と配列の解析。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）と比べると、短い新規な転写産物が観察された。配列の解析によって標的エクソンの正確なスキッピングを確認した。患者５０６８５．１（Ｃ）で検出された選択的スプライス産物をシークエンシングしたところ、エクソン５１内の潜在的スプライス部位の活性化により誘導されたものであることがわかった。患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）、患者ＤＬ５８９．２（Ｄ）と患者５３９１４．１（Ｅ）の非トランスフェクト培養筋管で検出された短いフラグメントをシークエンシングしたところ、それぞれエクソン４４、エクソン５０とエクソン５３の自発的なスキッピングの結果であることがわかった。いくつかの分析では、野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントが観察されたことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【図２】異なるＤＭＤ患者６人のＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（データは示さない）。トランスフェクションの１〜４日後にジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１（中央のパネル）およびＤｙｓ２（右側のパネル）を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）またはＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞ではジストロフィンシグナルを検出できなかったのに対し、エクソンスキッピングの誘導によって、各患者ではっきりとした、主として細胞質性のジストロフィンシグナルを検出することができた。患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）、患者ＤＬ５８９．２（Ｄ）と患者５３９１４．１（Ｅ）では、ジストロフィン膜シグナルを観察することができた。膜シグナルは、全長ジストロフィンを認識するＤｙｓ２に対してより頻繁に観察されることに注目した。ＭＡＮＤＹＳ１はジストロフィンの内部部分を認識し、合成の第一段階のジストロフィンも検出することから、細胞質性のシグナルを生じる傾向が高い。倍率：６３倍。
【図３】ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体ＤＹ４を用いた。ヒト対照の培養筋管（ＨＣ）から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用いた（ＣおよびＦ）。露出過度になるのを避けるために、このサンプルは１対１０に希釈した。タンパク質サンプルの泳動量が等しいことを示すために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）では、ジストロフィンは検出されないか、自発的エクソンスキッピングの結果として非常に低い（ＢおよびＣ）レベルで検出された。はっきりとしたジストロフィンシグナルが各患者のＡＯＮ処理培養筋管で観察された。患者５０６８５．１と患者ＤＬ３６３．２については経時実験を行った。５０６８５．１では、トランスフェクション後１６時間でジストロフィンが検出され、トランスフェクションの２４時間後と４８時間後にはタンパク質量が増加していることがわかった（Ｄ）。患者ＤＬ３６３．２については、ジストロフィン量の増加がトランスフェクションの７日後まで検出できた（Ｂ）。患者ＤＬ５１５．２（Ａ）、患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）とＤＬ５８９．２（Ｅ）については、検出したジストロフィンは対照のジストロフィンより著しく短かった。これは、これら患者の欠失の大きさによるものである。
【図４】患者ＤＬ３６３．２由来の処理培養筋管から得た４種のＤＧＣタンパク質の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（図示しない）。α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカンとβ−ジストログリカンをそれぞれ検出するために、モノクローナル抗体であるＮＣＬ−ａ−ＳＡＲＣ、ＮＣＬ−ｂ−ＳＡＲＣ、ＮＣＬ−ｇ−ＳＡＲＣとＮＣＬ−ｂ−ＤＧを用いた。非処理細胞においてこれらタンパク質の検出割合は低下しており（〜４０％）、主として細胞質に局在した（Ａ）。しかしながらＡＯＮ処理の後には、筋管の７０％でα−サルコグリカンが検出され、９０％でβ−サルコグリカンが検出され、９０％でγ−サルコグリカンが検出され、そして８０％でβ−ジストログリカンが検出され、これらタンパク質の大部分が膜結合型だった（Ｂ）。倍率：６３倍。
【図５】スキッピングの標的としたエクソンを含む領域におけるヒトジストロフィンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）と比べると、短い新規な転写フラグメントが種々のＡＯＮのトランスフェクションに続いて観察された。標的エクソンのスキッピングは配列の解析（データは示さない）で確認し、それを各図面の隣のラベルで示した。エクソン２（ｂ）、エクソン２９（ｃ）とエクソン５１（ｈ）の近傍の領域に検出された選択的スプライス産物をシークエンシングしたところ、これらは隣接するエクソンの共スキッピングまたは潜在的スプライス部位の使用によって誘導された産物であることがわかった。特異的な（ＲＴ−）ＰＣＲ産物は得られなかった。いくつかの分析では、野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントの存在が検出された。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。
【図６】アウトオブフレームエクソン４３にナンセンス変異を有するＤＭＤ患者ＤＬ９０．３におけるダブルエクソンスキッピング。この患者のＡＯＮ処理筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、非トランスフェクト筋管（ＮＴ）には存在しない短い新規な転写産物が検出された。配列の解析により、標的としたエクソン４３とエクソン４４の正確なスキッピングが確認された。このダブルスキッピングに加えて、エクソン４４の単一エクソンスキッピングも検出した。野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントは、ヘテロ二本鎖の形成によるものであることに注目されたい。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【図７】ヒト対照筋管（ＫＭ１０９）、エクソン４６〜５０の欠失を有するＤＭＤ患者ＤＬ４７０．２とエクソン４８〜５０の欠失を有するＤＭＤ患者５０６８５．１におけるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング。（Ａ）ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２との混合物（混合物）またはＵで連結したＡＯＮの組み合わせ（Ｕ：ｈ４５ＡＯＮ５が１０個のウラシルヌクレオチドを介してｈ５１ＡＯＮ２に連結したもの）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ−リンカーＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５２にスプライシングしたエクソン４４を含み、且つ非処理筋管（ＮＴ）には存在しない短い転写フラグメントが検出された。この新規なインフレーム転写産物は、（標的としたエクソン４５と５１が欠失に直接隣接する）患者ＤＬ４７０．２においてはダブルエクソンスキッピングにより生じたが、ヒト対照と患者５０６８５．１の両方では、マルチエクソンスキッピングにより生じた。処理培養患者筋管では、エクソン４５の単一エクソンスキッピングとエクソン５１の単一エクソンスキッピングのそれぞれによる、さらなる短いフラグメントが観察された。いくつかのレーンには、野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。（Ｂ）すべてのフラグメントを、DNA 7500 labchipR と Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて定量した。ダブルエクソン４５〜５１スキッピングまたはマルチエクソン４５〜５１スキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する上記フラグメントの比から求めた。ＡＯＮの混合物と比べて、Ｕ結合型ＡＯＮの効率はＤＬ４７０．２では低いがＫＭ１０９と５０６８５．１では高いようだ。
【図８】３人の患者とヒト対照で生じるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピングの概略図。ＡＯＮは青色の線で示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマーは矢印で示す。（Ａ）患者ＤＬ９０．３はエクソン４３にナンセンス変異（アスタリスクで示した）を有する。その結果であるアウトオブフレーム転写産物は赤色で示す。エクソン４３またはエクソン４４の単一エクソンスキッピングとは対照的に、この両方のエクソンのダブルエクソンスキッピングはリーディングフレームを修復する（インフレーム転写産物は緑色で示した）。この患者から得た筋管をエクソン４３とエクソン４４のそれぞれに特異的なＡＯＮによるターゲティングに付すと、予想通りのダブルエクソンスキッピングに加えて、エクソン４３の単一エクソンスキッピングとエクソン４４の単一エクソンスキッピング（赤色の破線で示した）が生じると予想される。患者ＤＬ４７０．２はエクソン４６〜５０の欠失を有し、この欠失によりフレームシフトおよびエクソン５１内のストップコドンが生じる。エクソン４５またはエクソン５１の単一エクソンスキッピングはフレームを修復することができないのに対し、エクソン４５とエクソン５１の両方のダブルエクソンスキッピングはフレームを修復する。（Ｂ）エクソン４５〜５１のマルチエクソンスキッピングは対照転写産物（個体：ＫＭ１０９）のリーディングフレームを保存する。患者５０６８５．１はエクソン４８〜５０の欠失を有し、これはエクソン５１内にストップコドンをもたらす。エクソン４５、４６、４７と５１のマルチエクソンスキッピングはこの患者のリーディングフレームを修復する。エクソン４５〜５１のスキッピングに加えて、エクソン４５の単一エクソンスキッピングとエクソン５１の単一エクソンスキッピングも予想される。
【図９】アウトオブフレームエクソン４３にナンセンス変異を有する患者ＤＬ９０．３におけるダブルエクソンスキッピング。（Ａ）ＡＯＮ処理培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、非トランスフェクト（ＮＴ）培養筋管には存在しない短い新規な転写産物が明らかとなった。配列の解析により、エクソン４３とエクソン４４の両方のエクソンの正確なスキッピングを確認した。このダブルスキッピングに加えてエクソン４４の単一スキッピングも検出したが、エクソン４３の単一エクソンスキッピングは検出されなかった。野生型産物よりわずかに短い、さらなる弱いフラグメントが存在したことに注目されたい。これらはヘテロ二本鎖の形成によって誘導されたものである。１００ｂｐ：サイズマーカー、ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。（Ｂ）ＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（下側のパネル）。トランスフェクションの２日後にはジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１およびＤｙｓ２を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）かＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞ではジストロフィンシグナルは検出できなかったのに対し、処理細胞でははっきりとしたジストロフィンシグナルを両方のジストロフィン抗体によって検出することができた。倍率：６３倍。（Ｃ）ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体Ｄｙｓ１を用いた。ＭｙｏＤをトランスフェクトしたヒト対照（ＨＣ）の繊維芽細胞から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用いた。露出過度になるのを避けるために、このサンプルは１：５に希釈した。タンパク質サンプルの泳動量が等しいことを確認するために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。ＮＴ培養筋管ではジストロフィンは検出されなかった。ＡＯＮ処理培養筋管では、はっきりとしたジストロフィンシグナルが２日後に観察され、これは４日後には増加した。
【図１０】エクソン４６〜５０の欠失を有する患者ＤＬ４７０．２におけるダブルエクソンスキッピング。（Ａ）ＡＯＮ処理培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＮＴ培養筋管には存在しない短い新規な転写産物が明らかとなった。配列の解析により、エクソン４５とエクソン５１の両方のエクソンの正確なスキッピングを確認した。このダブルスキッピングに加えてエクソン５１の単一スキッピングも検出したが、エクソン４５の単一スキッピングは検出されなかった。ヘテロ二本鎖の形成によって、野生型産物よりわずかに短い、さらなる弱いフラグメントが観察された。１００ｂｐ＝サイズマーカー、ＲＴ−ＰＣＲ＝負の対照。（Ｂ）ＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（下側のパネル）。トランスフェクションの２日後にはジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１およびＤｙｓ２を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）かＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞とは対照的に、処理細胞でははっきりとしたジストロフィンシグナルを両方の抗体によって検出することができた。倍率：６３倍。（Ｃ）ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体Ｄｙｓ１を用いた。ヒト対照筋管から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用い、露出過度になるのを避けるために１：１０に希釈した。すべてのサンプルの泳動量が等しいことを確認するために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。ＮＴ培養筋管ではジストロフィンは検出されなかったのに対し、ＡＯＮ処理培養筋管では、はっきりとしたジストロフィンシグナルが１日後に観察され、これは２日後には増加した。患者ＤＬ４７０．２のジストロフィンは対照のジストロフィンより短いことに注目されたい。ジストロフィンの長さは欠失の大きさと相関する。
【図１１】二人の患者の非処理の（−）筋管と処理した（＋）筋管から単離したＲＮＡに対応する全長ＤＭＤ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析。エクソン３４〜４５（患者ＤＬ９０．３）とエクソン４２〜５３（患者ＤＬ９０．３と患者ＤＬ４７０．２）のそれぞれを含むフラグメントには、予想した通りの特異的エクソンスキッピングパターンが存在する。エクソン４６〜５０の欠失故に、患者ＤＬ４７０．２の野生型フラグメントは患者ＤＬ９０．３のものより短いことに注目されたい。ＤＭＤ遺伝子の他の部分で予想に反した異常なスプライシングが検出されないことから、ＡＯＮの配列特異性を確認した。「Ｍ」は１００ｂｐのサイズマーカーである。
【図１２】ヒト対照（個体：ＫＭ１０９）、患者ＤＬ４７０．２（エクソン４６〜５０を欠失）と患者５０６８５．１（エクソン４８〜５０を欠失）のそれぞれから得た筋管におけるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング。（Ａ）ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２との混合物（混合物）またはＵで連結したこれらＡＯＮの組み合わせ（Ｕ）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ連結ＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５２に正確にスプライシングしたエクソン４４を含む短い転写フラグメントが検出された（配列の解析により確認；データは示さない）。このフラグメントはＮＴ筋管には存在しなかった。この新規なインフレーム転写産物は、（標的としたエクソン４５と５１が欠失に隣接する）患者ＤＬ４７０．２においてはダブルエクソンスキッピングにより生じたが、ヒト対照と患者５０６８５．１の両方では、マルチエクソンスキッピングにより生じた。また、（エクソン４５またはエクソン５１の）単一エクソンスキッピングや（エクソン４６〜５１の）部分マルチエクソンスキッピングによって生じたさらなる短いフラグメントも観察された。いくつかのレーンには、野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐ＝サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ＝負の対照。（Ｂ）Ｕ連結ＡＯＮの該略図。エクソン５１特異的ＡＯＮ（ｈ５１ＡＯＮ２）が１０個のウラシルヌクレオチドを介してエクソン４５特異的ＡＯＮ（ｈ４５ＡＯＮ５）に連結している。（Ｃ）すべてのフラグメントを、DNA 1000 LabChip と Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて定量した。エクソン４５〜５１のダブルエクソンスキッピングやマルチエクソンスキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する上記フラグメントの比から求めた。個々のＡＯＮの混合物と比べて、Ｕ連結ＡＯＮの効率は、患者ＤＬ４７０．２とは対照的にＫＭ１０９と患者５０６８５．１では高かった。
【図１３】エクソン４６に対するＤＮＡ ＡＯＮ、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮ、ＬＮＡ ＡＯＮおよびＰＮＡ ＡＯＮの比較分析。（ａ）種々の類似体にハイブリダイズさせた放射線標識エクソン４６ＲＮＡフラグメントを用いたゲル移動度シフトアッセイ。ＤＮＡやＬＮＡの主鎖を有するＡＯＮについてははっきりとした移動度シフトが観察され、それらほど顕著ではないが２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮにも移動度シフトが観察された。モルフォリノＡＯＮ、ＰＮＡ ＡＯＮまたはランダムＡＯＮではシフトは観察されなかった。（ｂ）対照筋管への種々のＡＯＮ類似体のトランスフェクション。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮおよびＬＮＡ ＡＯＮでは８０％超の効率が達成されたのに対し、ＰＮＡでは効率は６０〜７０％だった。他のＡＯＮ類似体とは対照的に、モルフォリノ化合物は細胞質にも豊富に存在した。（ｃ）種々のＡＯＮ類似体のトランスフェクションの後に実施した、非罹患対照とＤＭＤ患者（ＤＬ２７９．１）から得た筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＰＮＡを除いては、試験した各類似体について患者筋管および対照筋管の両方でエクソン４６のスキッピングが検出された。エクソン４６の正確なスキッピングは配列の解析により確認した（データは示さない）。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量。エクソン４６のスキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する短いフラグメントの比から求め、各縦棒の上部に記載した。ＬＮＡは、非罹患対照の筋管（８５％）と患者から得た筋管（９８％）の両方で最も高いレベルのエクソンスキッピングを誘導した。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮは、対照と比べて患者の筋管で著しく効率が高かった（２０％対７５％）。モルフォリノ化合物は、対照筋管と患者筋管の両方で適度な効率（５〜６％）しか発揮しなかった。
【図１４】培養した対照筋管と患者（ＤＬ２７９．１）筋管におけるＬＮＡ８の濃度系列実験。（ａ）ジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。患者（ＤＬ２７９．１）については、顕著なレベルのエクソン４６のスキッピングが試験した各用量で観察されたのに対し、ヒト対照においては、２００ｎＭと１００ｎＭでは低レベルのスキッピングしか検出されなかった。対照筋管では、エクソン４５とエクソン４６の両方のスキッピングが高用量（４００ｎＭと５００ｎＭ）でときどき観察された。ＤＬ２７９．１のフラグメントのいくつかについては、野生型フラグメントよりわずかに大きい産物を観察することができる。これは一次ＰＣＲ産物と二次ＰＣＲ産物のへテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの定量によると、エクソンスキッピングのレベルはヒト対照では５００ｎＭ未満で著しく低下する（５００ｎＭでは９７％だったのが、４００ｎＭでは３０％になり、１００ｎＭでは１％未満まで低下する）が、患者では３００ｎＭでも高いまま（８６％）であり、濃度１００ｎＭでもなお有意な値（１０％）であることが明らかになった。
【図１５】ミスマッチを有するＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの、患者から得た筋管における分析。（ａ）エクソン４６内の標的配列（上部に３’→５’方向に示した）に対する種々のＬＮＡ配列のアライメント。標的配列とのミスマッチに下線を付した。本来のＬＮＡ（ＬＮＡ８）と比べてＬＮＡ９は標的配列の３’側にずれており、標的配列と完全に相同である。ＬＮＡ処理した患者（ＤＬ２７９．１）筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ分析と（ｃ）定量。３’末端にミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ１およびＬＮＡｍｍ４）は、本来のＬＮＡによる誘導に匹敵するレベルのエクソン４６のスキッピングを誘導した（７１〜９４％対１００％）。５’末端または中央部分におけるミスマッチ（ＬＮＡｍｍ２、ＬＮＡｍｍ３およびＬＮＡｍｍ５）は、スキッピング能を大きく低下させた（＜８％）。野生型のバンドよりわずかに大きなフラグメントが観察された。これは一次ＰＣＲ産物と二次ＰＣＲ産物との間のヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｄ）エクソン４６内の標的配列（上部に３’→５’方向に示した）に対する種々の２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの配列のアライメント。標的配列とのミスマッチに下線を付した。２ＯＭｅＰＳ処理した患者（ＤＬ２７９．１）筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの（ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ分析と（ｆ）定量。３’側の１つのミスマッチの存在（２ＯＭｅＰＳｍｍ１）によって、早くもエクソンスキッピングレベルが２．５分の１未満に低下し、２つまたは３つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ２と２ＯＭｅＰＳｍｍ３）ではさらに低下していた。オリゴ鎖の５’部分に１つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ４）や３’部分、中央および５’部分にそれぞれ１つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ５）は実際にスキッピングを誘導しなかった。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。
【図１６】ヒト対照筋管（ＫＭ１０９）におけるエクソン４２〜５５のマルチエクソンスキッピング。ｈ４２ＡＯＮ１とｈ５５ＡＯＮ１との混合物（レーン４：混合物）、またはこれらをＵで連結したＡＯＮの組み合わせ（レーン３、Ｕ：ｈ４２ＡＯＮ１が１０個のウラシルヌクレオチドを介してｈ５５ＡＯＮ１に連結したもの）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ−リンカーＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５５にスプライシングしたエクソン４２を含み、且つ非処置筋管（レーン２、「ＮＴ」）には存在しない短い転写フラグメントが検出された。この新規なインフレーム転写産物はエクソン４２と５５の間の伸長鎖のマルチエクソンスキッピングによって生じた。さらなる短いフラグメントが、さらなる選択的スプライシングパターンにより観察された。また、いくつかのレーンには野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。レーン（１）＝１００ｂｐ：サイズマーカー、レーン５＝−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
配列番号１    人工的な配列の説明： ｈ４３ＡＯＮ５
配列番号２    人工的な配列の説明： ｈ４５ＡＯＮ５
配列番号３    人工的な配列の説明： エクソン４３に対するプライマー
配列番号４    人工的な配列の説明： エクソン４８に対するプライマー
配列番号５    人工的な配列の説明： エクソン４４に対するプライマー
配列番号６    人工的な配列の説明： エクソン４７に対するプライマー
配列番号７    人工的な配列の説明： ｈ２ＡＯＮ１
配列番号８    人工的な配列の説明： ｈ２ＡＯＮ２
配列番号９    人工的な配列の説明： ｈ１７ＡＯＮ１
配列番号１０  人工的な配列の説明： ｈ１７ＡＯＮ２
配列番号１１  人工的な配列の説明： ｈ２９ＡＯＮ１
配列番号１２  人工的な配列の説明： ｈ２９ＡＯＮ２
配列番号１３  人工的な配列の説明： ｈ４０ＡＯＮ１
配列番号１４  人工的な配列の説明： ｈ４０ＡＯＮ２
配列番号１５  人工的な配列の説明： ｈ４１ＡＯＮ１
配列番号１６  人工的な配列の説明： ｈ４１ＡＯＮ２
配列番号１７  人工的な配列の説明： ｈ４２ＡＯＮ１
配列番号１８  人工的な配列の説明： ｈ４２ＡＯＮ２
配列番号１９  人工的な配列の説明： ｈ４３ＡＯＮ１
配列番号２０  人工的な配列の説明： ｈ４３ＡＯＮ２
配列番号２１  人工的な配列の説明： ｈ４４ＡＯＮ１
配列番号２２  人工的な配列の説明： ｈ４４ＡＯＮ２
配列番号２３  人工的な配列の説明： ｈ４５ＡＯＮ１
配列番号２４  人工的な配列の説明： ｈ４６ＡＯＮ４ｂ
配列番号２５  人工的な配列の説明： ｈ４６ＡＯＮ８ｂ
配列番号２６  人工的な配列の説明： ｈ４６ＡＯＮ２６
配列番号２７  人工的な配列の説明： ｈ４７ＡＯＮ１
配列番号２８  人工的な配列の説明： ｈ４７ＡＯＮ２
配列番号２９  人工的な配列の説明： ｈ４８ＡＯＮ１
配列番号３０  人工的な配列の説明： ｈ４８ＡＯＮ２
配列番号３１  人工的な配列の説明： ｈ４８ＡＯＮ６
配列番号３２  人工的な配列の説明： ｈ４８ＡＯＮ７
配列番号３３  人工的な配列の説明： ｈ４９ＡＯＮ１
配列番号３４  人工的な配列の説明： ｈ４９ＡＯＮ２
配列番号３５  人工的な配列の説明： ｈ５０ＡＯＮ１
配列番号３６  人工的な配列の説明： ｈ５０ＡＯＮ２
配列番号３７  人工的な配列の説明： ｈ５１ＡＯＮ１
配列番号３８  人工的な配列の説明： ｈ５１ＡＯＮ２
配列番号３９  人工的な配列の説明： ｈ５３ＡＯＮ１
配列番号４０  人工的な配列の説明： ｈ５３ＡＯＮ２
配列番号４１  人工的な配列の説明： ｈ５５ＡＯＮ１
配列番号４２  人工的な配列の説明： ｈ５５ＡＯＮ６
配列番号４３  人工的な配列の説明： ｈ５９ＡＯＮ２
配列番号４４  人工的な配列の説明： モルフォリノ−ホスホロジアミデートＤＮＡ
配列番号４５  人工的な配列の説明： ＰＮＡまたはＬＮＡ８
配列番号４６  人工的な配列の説明： 置換したエクソン４３
配列番号４７  人工的な配列の説明： エクソン４２／エクソン４５連結部
配列番号４８  人工的な配列の説明： エクソン４５／エクソン５１連結部
配列番号４９  人工的な配列の説明： エクソン４４／エクソン５２連結部
配列番号５０  人工的な配列の説明： Ｕ連結オリゴ鎖
配列番号５１  人工的な配列の説明： エクソン４６内の標的配列
配列番号５２  人工的な配列の説明： ＬＮＡｍｍ１
配列番号５３  人工的な配列の説明： ＬＮＡｍｍ２
配列番号５４  人工的な配列の説明： ＬＮＡｍｍ３
配列番号５５  人工的な配列の説明： ＬＮＡｍｍ４
配列番号５６  人工的な配列の説明： ＬＮＡｍｍ５
配列番号５７  人工的な配列の説明： ＬＮＡ９
配列番号５８  人工的な配列の説明： エクソン４６内の標的配列
配列番号５９  人工的な配列の説明： ２ＯＭｅＰＳｍｍ１
配列番号６０  人工的な配列の説明： ２ＯＭｅＰＳｍｍ２
配列番号６１  人工的な配列の説明： ２ＯＭｅＰＳｍｍ３
配列番号６２  人工的な配列の説明： ２ＯＭｅＰＳｍｍ４
配列番号６３  人工的な配列の説明： ２ＯＭｅＰＳｍｍ５
【図１−１】
2014138589.tif 000008
【図１−２】
2014138589.tif 000009
【図２】
2014138589.tif 000010
【図３】
2014138589.tif 000011
【図４】
2014138589.tif 000012
【図５−１】
2014138589.tif 000013
【図５−２】
2014138589.tif 000014
【図６】
2014138589.tif 000015
【図７】
2014138589.tif 000016
【図８】
2014138589.tif 000017
【図９】
2014138589.tif 000018
【図１０】
2014138589.tif 000019
【図１１】
2014138589.tif 000020
【図１２】
2014138589.tif 000021
【図１３】
2014138589.tif 000022
【図１４】
2014138589.tif 000023
【図１５】
2014138589.tif 000024
【図１６】
2014138589.tif 000025
【図１７】
2014138589.tif 000026
【配列表】
2014138589000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月4日(2014.3.4)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
【図１】ＡＯＮ処理したＤＭＤ患者由来培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの、スキッピングの標的としたエクソンを含む領域に焦点を当てたＲＴ−ＰＣＲ分析と配列の解析。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）と比べると、短い新規な転写産物が観察された。配列の解析によって標的エクソンの正確なスキッピングを確認した。患者５０６８５．１（Ｃ）で検出された選択的スプライス産物をシークエンシングしたところ、エクソン５１内の潜在的スプライス部位の活性化により誘導されたものであることがわかった。患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）、患者ＤＬ５８９．２（Ｄ）と患者５３９１４．１（Ｅ）の非トランスフェクト培養筋管で検出された短いフラグメントをシークエンシングしたところ、それぞれエクソン４４、エクソン５０とエクソン５３の自発的なスキッピングの結果であることがわかった。いくつかの分析では、野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントが観察されたことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【図２】異なるＤＭＤ患者６人のＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（データは示さない）。トランスフェクションの１〜４日後にジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１（中央のパネル）およびＤｙｓ２（右側のパネル）を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）またはＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞ではジストロフィンシグナルを検出できなかったのに対し、エクソンスキッピングの誘導によって、各患者ではっきりとした、主として細胞質性のジストロフィンシグナルを検出することができた。患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）、患者ＤＬ５８９．２（Ｄ）と患者５３９１４．１（Ｅ）では、ジストロフィン膜シグナルを観察することができた。膜シグナルは、全長ジストロフィンを認識するＤｙｓ２に対してより頻繁に観察されることに注目した。ＭＡＮＤＹＳ１はジストロフィンの内部部分を認識し、合成の第一段階のジストロフィンも検出することから、細胞質性のシグナルを生じる傾向が高い。倍率：６３倍。
【図３】ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体ＤＹ４を用いた。ヒト対照の培養筋管（ＨＣ）から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用いた（ＣおよびＦ）。露出過度になるのを避けるために、このサンプルは１対１０に希釈した。タンパク質サンプルの泳動量が等しいことを示すために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）では、ジストロフィンは検出されないか、自発的エクソンスキッピングの結果として非常に低い（ＢおよびＣ）レベルで検出された。はっきりとしたジストロフィンシグナルが各患者のＡＯＮ処理培養筋管で観察された。患者５０６８５．１と患者ＤＬ３６３．２については経時実験を行った。５０６８５．１では、トランスフェクション後１６時間でジストロフィンが検出され、トランスフェクションの２４時間後と４８時間後にはタンパク質量が増加していることがわかった（Ｄ）。患者ＤＬ３６３．２については、ジストロフィン量の増加がトランスフェクションの７日後まで検出できた（Ｂ）。患者ＤＬ５１５．２（Ａ）、患者ＤＬ３６３．２（Ｂ）とＤＬ５８９．２（Ｅ）については、検出したジストロフィンは対照のジストロフィンより著しく短かった。これは、これら患者の欠失の大きさによるものである。
【図４】患者ＤＬ３６３．２由来の処理培養筋管から得た４種のＤＧＣタンパク質の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（図示しない）。α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカンとβ−ジストログリカンをそれぞれ検出するために、モノクローナル抗体であるＮＣＬ−ａ−ＳＡＲＣ、ＮＣＬ−ｂ−ＳＡＲＣ、ＮＣＬ−ｇ−ＳＡＲＣとＮＣＬ−ｂ−ＤＧを用いた。非処理細胞においてこれらタンパク質の検出割合は低下しており（〜４０％）、主として細胞質に局在した（Ａ）。しかしながらＡＯＮ処理の後には、筋管の７０％でα−サルコグリカンが検出され、９０％でβ−サルコグリカンが検出され、９０％でγ−サルコグリカンが検出され、そして８０％でβ−ジストログリカンが検出され、これらタンパク質の大部分が膜結合型だった（Ｂ）。倍率：６３倍。
【図５】スキッピングの標的としたエクソンを含む領域におけるヒトジストロフィンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。非トランスフェクト培養筋管（ＮＴ）と比べると、短い新規な転写フラグメントが種々のＡＯＮのトランスフェクションに続いて観察された。標的エクソンのスキッピングは配列の解析（データは示さない）で確認し、それを各図面の隣のラベルで示した。エクソン２（ｂ）、エクソン２９（ｃ）とエクソン５１（ｈ）の近傍の領域に検出された選択的スプライス産物をシークエンシングしたところ、これらは隣接するエクソンの共スキッピングまたは潜在的スプライス部位の使用によって誘導された産物であることがわかった。特異的な（ＲＴ−）ＰＣＲ産物は得られなかった。いくつかの分析では、野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントの存在が検出された。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。
【図６】アウトオブフレームエクソン４３にナンセンス変異を有するＤＭＤ患者ＤＬ９０．３におけるダブルエクソンスキッピング。この患者のＡＯＮ処理筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、非トランスフェクト筋管（ＮＴ）には存在しない短い新規な転写産物が検出された。配列の解析により、標的としたエクソン４３とエクソン４４の正確なスキッピングが確認された。このダブルスキッピングに加えて、エクソン４４の単一エクソンスキッピングも検出した。野生型産物よりもわずかに短いさらなるフラグメントは、ヘテロ二本鎖の形成によるものであることに注目されたい。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【図７】ヒト対照筋管（ＫＭ１０９）、エクソン４６〜５０の欠失を有するＤＭＤ患者ＤＬ４７０．２とエクソン４８〜５０の欠失を有するＤＭＤ患者５０６８５．１におけるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング。（Ａ）ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２との混合物（混合物）またはＵで連結したＡＯＮの組み合わせ（Ｕ：ｈ４５ＡＯＮ５が１０個のウラシルヌクレオチドを介してｈ５１ＡＯＮ２に連結したもの）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ−リンカーＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５２にスプライシングしたエクソン４４を含み、且つ非処理筋管（ＮＴ）には存在しない短い転写フラグメントが検出された。この新規なインフレーム転写産物は、（標的としたエクソン４５と５１が欠失に直接隣接する）患者ＤＬ４７０．２においてはダブルエクソンスキッピングにより生じたが、ヒト対照と患者５０６８５．１の両方では、マルチエクソンスキッピングにより生じた。処理培養患者筋管では、エクソン４５の単一エクソンスキッピングとエクソン５１の単一エクソンスキッピングのそれぞれによる、さらなる短いフラグメントが観察された。いくつかのレーンには、野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐ：サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。（Ｂ）すべてのフラグメントを、DNA 7500 labchipR と Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて定量した。ダブルエクソン４５〜５１スキッピングまたはマルチエクソン４５〜５１スキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する上記フラグメントの比から求めた。ＡＯＮの混合物と比べて、Ｕ結合型ＡＯＮの効率はＤＬ４７０．２では低いがＫＭ１０９と５０６８５．１では高いようだ。
【図８】３人の患者とヒト対照で生じるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピングの概略図。ＡＯＮは青色の線で示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマーは矢印で示す。（Ａ）患者ＤＬ９０．３はエクソン４３にナンセンス変異（アスタリスクで示した）を有する。その結果であるアウトオブフレーム転写産物は赤色で示す。エクソン４３またはエクソン４４の単一エクソンスキッピングとは対照的に、この両方のエクソンのダブルエクソンスキッピングはリーディングフレームを修復する（インフレーム転写産物は緑色で示した）。この患者から得た筋管をエクソン４３とエクソン４４のそれぞれに特異的なＡＯＮによるターゲティングに付すと、予想通りのダブルエクソンスキッピングに加えて、エクソン４３の単一エクソンスキッピングとエクソン４４の単一エクソンスキッピング（赤色の破線で示した）が生じると予想される。患者ＤＬ４７０．２はエクソン４６〜５０の欠失を有し、この欠失によりフレームシフトおよびエクソン５１内のストップコドンが生じる。エクソン４５またはエクソン５１の単一エクソンスキッピングはフレームを修復することができないのに対し、エクソン４５とエクソン５１の両方のダブルエクソンスキッピングはフレームを修復する。（Ｂ）エクソン４５〜５１のマルチエクソンスキッピングは対照転写産物（個体：ＫＭ１０９）のリーディングフレームを保存する。患者５０６８５．１はエクソン４８〜５０の欠失を有し、これはエクソン５１内にストップコドンをもたらす。エクソン４５、４６、４７と５１のマルチエクソンスキッピングはこの患者のリーディングフレームを修復する。エクソン４５〜５１のスキッピングに加えて、エクソン４５の単一エクソンスキッピングとエクソン５１の単一エクソンスキッピングも予想される。
【図９】アウトオブフレームエクソン４３にナンセンス変異を有する患者ＤＬ９０．３におけるダブルエクソンスキッピング。（Ａ）ＡＯＮ処理培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、非トランスフェクト（ＮＴ）培養筋管には存在しない短い新規な転写産物が明らかとなった。配列の解析により、エクソン４３とエクソン４４の両方のエクソンの正確なスキッピングを確認した。このダブルスキッピングに加えてエクソン４４の単一スキッピングも検出したが、エクソン４３の単一エクソンスキッピングは検出されなかった。野生型産物よりわずかに短い、さらなる弱いフラグメントが存在したことに注目されたい。これらはヘテロ二本鎖の形成によって誘導されたものである。１００ｂｐ：サイズマーカー、ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。（Ｂ）ＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（下側のパネル）。トランスフェクションの２日後にはジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１およびＤｙｓ２を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）かＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞ではジストロフィンシグナルは検出できなかったのに対し、処理細胞でははっきりとしたジストロフィンシグナルを両方のジストロフィン抗体によって検出することができた。倍率：６３倍。（Ｃ）ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体Ｄｙｓ１を用いた。ＭｙｏＤをトランスフェクトしたヒト対照（ＨＣ）の繊維芽細胞から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用いた。露出過度になるのを避けるために、このサンプルは１：５に希釈した。タンパク質サンプルの泳動量が等しいことを確認するために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。ＮＴ培養筋管ではジストロフィンは検出されなかった。ＡＯＮ処理培養筋管では、はっきりとしたジストロフィンシグナルが２日後に観察され、これは４日後には増加した。
【図１０】エクソン４６〜５０の欠失を有する患者ＤＬ４７０．２におけるダブルエクソンスキッピング。（Ａ）ＡＯＮ処理培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＮＴ培養筋管には存在しない短い新規な転写産物が明らかとなった。配列の解析により、エクソン４５とエクソン５１の両方のエクソンの正確なスキッピングを確認した。このダブルスキッピングに加えてエクソン５１の単一スキッピングも検出したが、エクソン４５の単一スキッピングは検出されなかった。ヘテロ二本鎖の形成によって、野生型産物よりわずかに短い、さらなる弱いフラグメントが観察された。１００ｂｐ＝サイズマーカー、ＲＴ−ＰＣＲ＝負の対照。（Ｂ）ＡＯＮ処理培養筋管の免疫組織化学的分析。十分に分化した筋管を同定するために、細胞中のミオシンを染色した（下側のパネル）。トランスフェクションの２日後にはジストロフィンを検出するために、モノクローナル抗体であるＭＡＮＤＹＳ１およびＤｙｓ２を用いた。ＭＡＮＤＹＳ１（左側のパネル）かＤｙｓ２（図示しない）で染色した非処理細胞とは対照的に、処理細胞でははっきりとしたジストロフィンシグナルを両方の抗体によって検出することができた。倍率：６３倍。（Ｃ）ＡＯＮ処理培養筋管のウェスタンブロット分析。ジストロフィンの検出にはモノクローナル抗体Ｄｙｓ１を用いた。ヒト対照筋管から単離したタンパク質抽出物を正の対照として用い、露出過度になるのを避けるために１：１０に希釈した。すべてのサンプルの泳動量が等しいことを確認するために、ミオシンに対する抗体でブロットをさらに染色した。ＮＴ培養筋管ではジストロフィンは検出されなかったのに対し、ＡＯＮ処理培養筋管では、はっきりとしたジストロフィンシグナルが１日後に観察され、これは２日後には増加した。患者ＤＬ４７０．２のジストロフィンは対照のジストロフィンより短いことに注目されたい。ジストロフィンの長さは欠失の大きさと相関する。
【図１１】二人の患者の非処理の（−）筋管と処理した（＋）筋管から単離したＲＮＡに対応する全長ＤＭＤ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析。エクソン３４〜４５（患者ＤＬ９０．３）とエクソン４２〜５３（患者ＤＬ９０．３と患者ＤＬ４７０．２）のそれぞれを含むフラグメントには、予想した通りの特異的エクソンスキッピングパターンが存在する。エクソン４６〜５０の欠失故に、患者ＤＬ４７０．２の野生型フラグメントは患者ＤＬ９０．３のものより短いことに注目されたい。ＤＭＤ遺伝子の他の部分で予想に反した異常なスプライシングが検出されないことから、ＡＯＮの配列特異性を確認した。「Ｍ」は１００ｂｐのサイズマーカーである。
【図１２】ヒト対照（個体：ＫＭ１０９）、患者ＤＬ４７０．２（エクソン４６〜５０を欠失）と患者５０６８５．１（エクソン４８〜５０を欠失）のそれぞれから得た筋管におけるダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング。（Ａ）ｈ４５ＡＯＮ５とｈ５１ＡＯＮ２との混合物（混合物）またはＵで連結したこれらＡＯＮの組み合わせ（Ｕ）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ連結ＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５２に正確にスプライシングしたエクソン４４を含む短い転写フラグメントが検出された（配列の解析により確認；データは示さない）。このフラグメントはＮＴ筋管には存在しなかった。この新規なインフレーム転写産物は、（標的としたエクソン４５と５１が欠失に隣接する）患者ＤＬ４７０．２においてはダブルエクソンスキッピングにより生じたが、ヒト対照と患者５０６８５．１の両方では、マルチエクソンスキッピングにより生じた。また、（エクソン４５またはエクソン５１の）単一エクソンスキッピングや（エクソン４６〜５１の）部分マルチエクソンスキッピングによって生じたさらなる短いフラグメントも観察された。いくつかのレーンには、野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐ＝サイズマーカー、−ＲＴ−ＰＣＲ＝負の対照。（Ｂ）Ｕ連結ＡＯＮの該略図。エクソン５１特異的ＡＯＮ（ｈ５１ＡＯＮ２）が１０個のウラシルヌクレオチドを介してエクソン４５特異的ＡＯＮ（ｈ４５ＡＯＮ５）に連結している。（Ｃ）すべてのフラグメントを、DNA 1000 LabChip と Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて定量した。エクソン４５〜５１のダブルエクソンスキッピングやマルチエクソンスキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する上記フラグメントの比から求めた。個々のＡＯＮの混合物と比べて、Ｕ連結ＡＯＮの効率は、患者ＤＬ４７０．２とは対照的にＫＭ１０９と患者５０６８５．１では高かった。
【図１３】エクソン４６に対するＤＮＡ ＡＯＮ、２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮ、ＬＮＡ ＡＯＮおよびＰＮＡ ＡＯＮの比較分析。（ａ）種々の類似体にハイブリダイズさせた放射線標識エクソン４６ＲＮＡフラグメントを用いたゲル移動度シフトアッセイ。ＤＮＡやＬＮＡの主鎖を有するＡＯＮについてははっきりとした移動度シフトが観察され、それらほど顕著ではないが２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮにも移動度シフトが観察された。モルフォリノＡＯＮ、ＰＮＡ ＡＯＮまたはランダムＡＯＮではシフトは観察されなかった。（ｂ）対照筋管への種々のＡＯＮ類似体のトランスフェクション。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮ、モルフォリノＡＯＮおよびＬＮＡ ＡＯＮでは８０％超の効率が達成されたのに対し、ＰＮＡでは効率は６０〜７０％だった。他のＡＯＮ類似体とは対照的に、モルフォリノ化合物は細胞質にも豊富に存在した。（ｃ）種々のＡＯＮ類似体のトランスフェクションの後に実施した、非罹患対照とＤＭＤ患者（ＤＬ２７９．１）から得た筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＰＮＡを除いては、試験した各類似体について患者筋管および対照筋管の両方でエクソン４６のスキッピングが検出された。エクソン４６の正確なスキッピングは配列の解析により確認した（データは示さない）。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量。エクソン４６のスキッピングの百分率は、転写フラグメントの総量に対する短いフラグメントの比から求め、各縦棒の上部に記載した。ＬＮＡは、非罹患対照の筋管（８５％）と患者から得た筋管（９８％）の両方で最も高いレベルのエクソンスキッピングを誘導した。２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮは、対照と比べて患者の筋管で著しく効率が高かった（２０％対７５％）。モルフォリノ化合物は、対照筋管と患者筋管の両方で適度な効率（５〜６％）しか発揮しなかった。
【図１４】培養した対照筋管と患者（ＤＬ２７９．１）筋管におけるＬＮＡ８の濃度系列実験。（ａ）ジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。患者（ＤＬ２７９．１）については、顕著なレベルのエクソン４６のスキッピングが試験した各用量で観察されたのに対し、ヒト対照においては、２００ｎＭと１００ｎＭでは低レベルのスキッピングしか検出されなかった。対照筋管では、エクソン４５とエクソン４６の両方のスキッピングが高用量（４００ｎＭと５００ｎＭ）でときどき観察された。ＤＬ２７９．１のフラグメントのいくつかについては、野生型フラグメントよりわずかに大きい産物を観察することができる。これは一次ＰＣＲ産物と二次ＰＣＲ産物のへテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの定量によると、エクソンスキッピングのレベルはヒト対照では５００ｎＭ未満で著しく低下する（５００ｎＭでは９７％だったのが、４００ｎＭでは３０％になり、１００ｎＭでは１％未満まで低下する）が、患者では３００ｎＭでも高いまま（８６％）であり、濃度１００ｎＭでもなお有意な値（１０％）であることが明らかになった。
【図１５】ミスマッチを有するＬＮＡ ＡＯＮと２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの、患者から得た筋管における分析。（ａ）エクソン４６内の標的配列（上部に３’→５’方向に示した）に対する種々のＬＮＡ配列のアライメント。標的配列とのミスマッチに下線を付した。本来のＬＮＡ（ＬＮＡ８）と比べてＬＮＡ９は標的配列の３’側にずれており、標的配列と完全に相同である。ＬＮＡ処理した患者（ＤＬ２７９．１）筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ分析と（ｃ）定量。３’末端にミスマッチを有するＬＮＡ（ＬＮＡｍｍ１およびＬＮＡｍｍ４）は、本来のＬＮＡによる誘導に匹敵するレベルのエクソン４６のスキッピングを誘導した（７１〜９４％対１００％）。５’末端または中央部分におけるミスマッチ（ＬＮＡｍｍ２、ＬＮＡｍｍ３およびＬＮＡｍｍ５）は、スキッピング能を大きく低下させた（＜８％）。野生型のバンドよりわずかに大きなフラグメントが観察された。これは一次ＰＣＲ産物と二次ＰＣＲ産物との間のヘテロ二本鎖の形成によるものである。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。（ｄ）エクソン４６内の標的配列（上部に３’→５’方向に示した）に対する種々の２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮの配列のアライメント。標的配列とのミスマッチに下線を付した。２ＯＭｅＰＳ処理した患者（ＤＬ２７９．１）筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントの（ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ分析と（ｆ）定量。３’側の１つのミスマッチの存在（２ＯＭｅＰＳｍｍ１）によって、早くもエクソンスキッピングレベルが２．５分の１未満に低下し、２つまたは３つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ２と２ＯＭｅＰＳｍｍ３）ではさらに低下していた。オリゴ鎖の５’部分に１つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ４）や３’部分、中央および５’部分にそれぞれ１つのミスマッチを有するＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳｍｍ５）は実際にスキッピングを誘導しなかった。１００ｂｐはＤＮＡサイズマーカーである。
【図１６】ヒト対照筋管（ＫＭ１０９）におけるエクソン４２〜５５のマルチエクソンスキッピング。ｈ４２ＡＯＮ１とｈ５５ＡＯＮ１との混合物（レーン４：混合物）、またはこれらをＵで連結したＡＯＮの組み合わせ（レーン３、Ｕ：ｈ４２ＡＯＮ１が１０個のウラシルヌクレオチドを介してｈ５５ＡＯＮ１に連結したもの）のいずれかで処理した培養筋管のジストロフィンｍＲＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＡＯＮの混合物またはＵ−リンカーＡＯＮのいずれかで処理したサンプルのすべてにおいて、エクソン５５にスプライシングしたエクソン４２を含み、且つ非処置筋管（レーン２、「ＮＴ」）には存在しない短い転写フラグメントが検出された。この新規なインフレーム転写産物はエクソン４２と５５の間の伸長鎖のマルチエクソンスキッピングによって生じた。さらなる短いフラグメントが、さらなる選択的スプライシングパターンにより観察された。また、いくつかのレーンには野生型産物よりわずかに短い他のフラグメントが存在したことに注目されたい。これはヘテロ二本鎖の形成によるものだった。レーン（１）＝１００ｂｐ：サイズマーカー、レーン５＝−ＲＴ−ＰＣＲ：負の対照。
【図１７】Ｃ２Ｃ１２マウス筋管を、ｒＡＡＶ−Ｕ７ｍ４６ＡＯＮ６ベクターで、二種のＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。ＲＮＡを単離して、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ｒＡＡＶ−ｍ４６ＡＯＮ６構築物は効率的であり、エクソン４６のスキッピングを２０％に達するレベルで誘導した。