(57)【要約】【課題】  熱安定性に優れた微小カプセルを含むエマルションを利用した核酸増幅方法、および核酸増幅反応用キットを提供することを課題とする。【解決手段】  ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物を界面活性剤として用いてエマルションを作製することにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、該核酸とハイブリダイズするプライマー、および核酸増幅反応用試薬を含む水性組成物を調製する工程と、
前記水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、前記水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する工程と、
前記微小カプセル内で核酸増幅反応を行う工程と
を含み、
前記シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅方法。
【請求項２】
分岐状オルガノポリシロキサンが、ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコンであり、架橋型オルガノポリシロキサンが、(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーから選択される少なくとも１種である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
油が、ｎ−ヘキサデカン、ミネラルオイル、炭素数10〜20のオレフィン系炭化水素およびシリコーンオイルから選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
油中水型エマルション調製用試薬として、シリコーン系界面活性剤および油を含み、
前記シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅反応用試薬キット。
【請求項５】
分岐状オルガノポリシロキサンが、ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコンであり、架橋型オルガノポリシロキサンが、(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーから選択される少なくとも１種である請求項４に記載の試薬キット。
【請求項６】
油が、ｎ−ヘキサデカン、ミネラルオイル、炭素数10〜20のオレフィン系炭化水素およびシリコーンオイルから選択される少なくとも１種である請求項４または５に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エマルションを利用した核酸増幅方法、および核酸増幅反応用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞には、その癌に特異的な遺伝子変異が存在することが知られている。この癌特異的な遺伝子変異を高感度で検出することができれば、血液検査や細胞診のような低襲侵の検査による癌の早期発見や治療・再発のモニタリングへの応用が可能となる。しかし、遺伝子変異の検出に現在利用されているシーケンス法やPCR法では、感度が、数個から100個の細胞群の中から１個の癌細胞を検出できる程度(感度１〜20％)でしかない。これに対して、血液検査や細胞診に求められる感度は、１万個の細胞群の中から１個の癌細胞を検出できるレベル(感度0.01％)である。それゆえ、癌特異的な遺伝子変異の検出に基づいた血液検査や細胞診は未だ実用化されていない。
【０００３】
他方で、近年、エマルションを利用した核酸増幅方法が開発されている。この方法では、油中水型エマルションの分散相(水相)を、核酸増幅反応における独立した微小反応場として利用することにより、効率的な核酸増幅が行われる(例えば、特許文献１〜３参照)。また、この方法は、分散相の各コンパートメントに増幅対象の核酸を１分子含むよう条件を設定することで、１分子遺伝子増幅に応用することも可能である。この１分子遺伝子増幅は、所定の核酸の検出を高感度に行うことが可能な技術として注目されている。
【０００４】
上記の核酸増幅方法では、油中水型エマルションを作製するために界面活性剤が用いられている。そのような界面活性剤としては、Tween(商標)80やSpan(商標)80などの非イオン界面活性剤が用いられているが、最近では直鎖状シリコーン系界面活性剤のセチルジメチコンコポリオールがよく用いられている(特許文献１〜３参照)。このような界面活性剤の膜で水相を包み込むことにより、核酸増幅反応において独立した反応場となる微小カプセルが形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／０２６７１号
【特許文献２】国際公開第２００３／０４４１８７号
【特許文献３】国際公開第２００７／１４９４３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、エマルションを利用した核酸増幅方法では、高温処理を伴う反応の間に微小カプセルが破壊されたり、微小カプセル間で融合したりするという問題があった。このように微小カプセルが熱に対して不安定であると、増幅産物を利用した所定の核酸の検出感度に多大な影響を及ぼし得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者は、熱安定性に優れた微小カプセルを含むエマルションを利用した核酸増幅方法、および核酸増幅反応用キットを提供することを課題とした。そして、本発明者は、エマルションにおいて熱安定性に優れた微小カプセルを形成させることが可能な界面活性剤について鋭意検討した結果、所定のシリコーン系界面活性剤を用いることにより、熱安定性に優れた微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製できることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
核酸、該核酸とハイブリダイズするプライマー、および核酸増幅反応用試薬を含む水性組成物を調製する工程と、
上記の水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、該水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する工程と、
上記の微小カプセル内で核酸増幅反応を行う工程と
を含み、
上記のシリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である
核酸増幅方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、油中水型エマルション調製用試薬として、シリコーン系界面活性剤および油を含み、該シリコーン系界面活性剤が、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物である核酸増幅反応用試薬キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、エマルション中の微小カプセルは、核酸増幅反応における高温処理にも十分に耐えるので、微小カプセルの破壊および微小カプセル間の融合が防止される。したがって、本発明は、所定の核酸を増幅し、高感度で検出したい場合に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の核酸増幅方法で用いられる架橋型シリコーン系界面活性剤および従来法で用いられる界面活性剤のそれぞれを用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムである。
【図２】本発明の核酸増幅方法で用いられる分岐状シリコーン系界面活性剤および従来法で用いられる界面活性剤のそれぞれを用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムである。
【図３】本発明の核酸増幅方法を行った後の微小カプセルの写真である。
【図４】本発明で用いられる十字型分岐部を有するマイクロ流路を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の核酸増幅方法（以下、単に「方法」ともいう）では、まず、核酸、該核酸とハイブリダイズするプライマー、および核酸増幅反応用試薬を含む水性組成物を調製する。
【００１３】
本発明の実施形態において、核酸は、増幅の対象となる鋳型核酸であれば特に限定されず、DNAおよびRNAのいずれであってもよい。また、核酸の由来は特に限定されず、天然由来の核酸であってもよいし、合成核酸であってもよい。例えば、本発明の方法では、ゲノムDNA、mRNA、cDNA、cRNAなども鋳型核酸として用いることができる。核酸の形態は特に限定されず、直鎖状または環状の核酸であってもよいし、また、１本鎖または２本鎖の核酸であってもよい。
【００１４】
本発明の実施形態において、核酸は、単一の塩基配列を有する１種類の核酸であってもよいし、種々の塩基配列をそれぞれ有する複数種類の核酸(例えば、cDNAライブラリーなど)であってもよい。
【００１５】
本発明の実施形態において、水性組成物中の核酸の濃度は特に限定されず、核酸増幅反応の条件などに応じて適宜設定できる。１分子の核酸の増幅を行う場合、核酸濃度は、後述するエマルション中の微小カプセル内に１分子の核酸が含まれるような濃度(例えば、１zM〜１pM程度)とすることが望ましい。
【００１６】
本発明の実施形態において、核酸とハイブリダイズするプライマー(以下、単に「プライマー」という)は、核酸の一部の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、核酸増幅反応に用いることができるオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーと鋳型核酸との間に少なくとも90％以上、好ましくは少なくとも95％以上の配列同一性があるときに、該プライマーが鋳型核酸に特異的にハイブリダイズできる条件である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの所定の塩基配列の熱的融点(thermal melting point：Tm)よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、(規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で)鋳型核酸の塩基配列に相補的なプライマーの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。
【００１７】
プライマーは、増幅対象の核酸の塩基配列に基づいて適宜設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが好ましい。プライマーの長さは、通常５〜50ヌクレオチド、好ましくは10〜40ヌクレオチドである。なお、プライマーは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
【００１８】
本発明の実施形態において、プライマーは、公知の標識物質で標識されていてもよい。プライマーの標識は、放射活性同位体または非放射活性物質を用いて行うことができる。放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3Hおよび125Iが挙げられる。非放射活性物質としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および、化学発光性、生物発光性、蛍光またはリン光性の試薬のような発光性試薬が挙げられる。
【００１９】
本発明の実施形態において、核酸増幅反応用試薬は特に限定されず、採用する核酸増幅反応に応じて適切な試薬を用いればよい。例えば、核酸増幅反応としてPCR法を採用する場合は、試薬としてdNTPおよびDNAポリメラーゼが挙げられ、RT-PCR法を採用する場合は、試薬としてdNTPおよび逆転写酵素が挙げられる。また、核酸増幅反応を良好に進行させるために、緩衝剤および無機塩をさらに添加して、水性組成物のpHおよびイオン強度を調整することが好ましい。緩衝剤としては、例えばTris-HClなどが挙げられる。また、無機塩としては、NaCl、KClなどが挙げられる。なお、当該技術においては、種々の核酸増幅反応に応じた試薬および試薬キットが公知であり、一般に入手可能である。
【００２０】
本発明の実施形態においては、増幅反応後の核酸を検出する場合、検出方法に応じた試薬をさらに用いてもよい。そのような検出用試薬としては、例えば、蛍光を発するインターカレーター(例えばSYBR(登録商標)Greenなど)、5'末端および3'末端をそれぞれ蛍光物質およびクエンチャー物質で修飾したプローブ(例えばTaqMan(登録商標)プローブなど)が挙げられる。
【００２１】
次いで、本発明の方法では、上記の水性組成物と、シリコーン系界面活性剤および油を含む油性組成物とを混合することにより、該水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションを調製する。
【００２２】
本発明の方法では、シリコーン系界面活性剤として、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物を用いる。ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状オルガノポリシロキサンは、直鎖状のドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を分岐鎖として有するシリコーンである。そのようなシリコーンとしては、INCI名(International Nomenclature of Cosmetic Ingredient labeling name)で表してラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコンが特に好ましい。また、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する架橋型オルガノポリシロキサンは、直鎖状のドデシル鎖を分岐鎖として有するシリコーン鎖がポリオキシエチレン鎖を介して架橋されたシリコーンである。そのようなシリコーンとしては、INCI名で表して(PEG-15／ラウリルジメチコン)クロスポリマー、(PEG-10／ラウリルジメチコン)クロスポリマーおよび(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーが挙げられ、特に(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマーが好ましい。なお、これらのシリコーン系界面活性剤は信越化学工業株式会社から入手可能である。
【００２３】
本発明の実施形態において、油としては、上記のシリコーン系界面活性剤を溶解するが、水には不溶であり、熱に安定な性質を有する油が好ましい。そのような油としては、例えばｎ−ヘキサデカン、ミネラルオイル、炭素数10〜20のオレフィン系炭化水素およびシリコーンオイルなどが挙げられる。
【００２４】
油性組成物中のシリコーン系界面活性剤の濃度は、水性組成物を内包する微小カプセルを含むエマルションが得られる濃度であれば特に限定されないが、通常１〜３０％(v/v)であり、好ましくは５〜１５％(v/v)である。上記の２種類のシリコーン系界面活性剤の混合物を用いる場合は、それぞれの界面活性剤濃度の値の和が上記の範囲にあればよい。
【００２５】
本発明の実施形態において、水性組成物と油性組成物との混合比は、体積比で表して通常１：0.1〜100であり、このましくは１：１〜10である。なお、上記の水性組成物と油性組成物との混合方法は、該水性組成物を内包する微小カプセルを含むエマルションが得られる方法であれば特に限定されない。例えば、水性組成物と油性組成物とを１つの容器に入れ、これに物理的処理を施して混合する方法が挙げられる。そのような物理的処理としては、攪拌処理(ボルテックスミキサー、マグネティックスターラーなどを用いる)、ホモジナイズ処理、超音波処理などが挙げられる。あるいは、Ｔ字型、Ｙ字型、十字型などの分岐部を有するマイクロ流路を用いて、水性組成物と油性組成物とを混合してもよい。マイクロ流路を用いる混合方法では、水性組成物と油性組成物とを互いに異なる流路から流して分岐部で両者を合流させることにより、分散相(水性組成物)が連続相(油性組成物)で剪断されて、油中水型エマルションが調製される。図４に、本発明の実施形態で用いられる十字型分岐部を有するマイクロ流路を示す。図４のマイクロ流路では、油性組成物を左右の流路から流し、水性組成物を上の流路から流すことにより、水性組成物が油性組成物で剪断されることで、油中水型エマルションを調製することができる。
【００２６】
なお、水性組成物と油性組成物との混合物は、その全体がエマルションとなっていてもよいし、微小カプセルを含むエマルションの層と、残存した油性組成物の層との二層に分離していてもよい。また、微小カプセルは、エマルション中に均一に分散していてもよいし、沈殿していてもよい。
【００２７】
上記の混合により、水性組成物を内包する微小カプセルを含む油中水型エマルションが得られる。得られた微小カプセルは、水性組成物の微小粒子が上記のシリコーン界面活性剤の膜で覆われた構造をしている。微小カプセルは該シリコーン界面活性剤の膜によって熱に安定となるので、核酸増幅反応中に微小カプセル間で融合することが防止される。したがって、エマルション中の微小カプセルのそれぞれは、核酸増幅反応において、独立した微小反応場を提供する。なお、該微小カプセルのサイズは特に限定されず、核酸増幅の目的に応じて適宜設定できるが、直径で通常１〜500μmであり、好ましくは10〜200μmである。
【００２８】
本発明の実施形態においては、当該技術において公知の方法により、上記の微小カプセルを硬化する工程を任意に行ってもよい。しかし、本発明の方法で得られる微小カプセルは、通常の核酸増幅反応の加熱条件に十分耐えるので、微小カプセルを硬化する工程は通常は必要ではない。
【００２９】
そして、本発明の方法では、上記で得られたエマルションに含まれる微小カプセル内で核酸増幅反応を行う。本発明の実施形態において、核酸増幅反応自体は、上記の微小カプセル内を反応場とすること以外は、当該技術において公知の核酸増幅方法と特に異なるところはない。したがって、採用する核酸増幅反応の種類に応じて、必要な器具や装置を用いて反応を行えばよい。
【００３０】
本発明の実施形態において、核酸増幅反応のサンプルとして、上記で得られたエマルションの一部または全部を用いることができる。また、微小カプセルがエマルション中で沈殿している場合は、微小カプセルが堆積している層を回収し、これをサンプルとして用いてもよい。
【００３１】
本発明の実施形態において、核酸増幅反応の種類は特に限定されず、目的に応じて公知の核酸増幅法から適宜選択することができる。そのような核酸増幅法としては、例えばPCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、リアルタイムRT-PCR法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、3SR(Self-sustained Sequence Reaction)法、SDA(Standard Displacement Amplification)法、TMA(Transcription Mediated Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法などが挙げられる。なお、反応条件は、核酸増幅法の種類、プライマーの塩基配列などによって異なるが、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第２版) Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989))などに記載の方法を参照して適宜設定することができる。
【００３２】
本発明の方法は、任意に、増幅産物を検出する工程をさらに含んでいてもよい。検出方法は特に限定されず、核酸増幅の目的に応じて公知の方法から適宜選択することができる。本発明の方法では、蛍光標識プローブを利用した核酸増幅反応後の微小カプセルを観察および／または撮影することにより、蛍光を発する微小カプセルを、所望の核酸増幅がなされた微小カプセルとして計数する方法が好適に用いられる。
【００３３】
上記のとおり、本発明の方法において得られる微小カプセルは、優れた熱安定性により、核酸増幅反応後もその形状を維持するので、本発明の方法は、例えばKRAS遺伝子の変異の検出のような非常に高い検出感度(感度0.01％程度)が要求される検査や実験に好適に用いることができる。
【００３４】
本発明の範囲には、核酸増幅反応用試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)も含まれる。本発明の試薬キットは、油中水型エマルション調製用試薬として、ドデシル鎖およびポリオキシエチレン鎖を有する分岐状または架橋型オルガノポリシロキサンあるいはこれらの混合物であるシリコーン系界面活性剤、および油を含む。なお、シリコーン系界面活性剤および油の具体的な種類、エマルションの調製方法、利用可能な核酸増幅反応の種類などについては、これまでに述べたことと同様である。また、本発明の試薬キットは、上記の核酸増幅反応用試薬、緩衝剤、無機塩、検出用試薬などをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の実施形態において、シリコーン系界面活性剤および油は、それぞれ別個の試薬として含まれていてもよいし、両者を混合した油性組成物として含まれていてもよい。なお、シリコーン系界面活性剤および油を混合する場合の比率は、これまでに述べたとおりである。
【００３６】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３７】
試験例１  微小カプセルの熱安定性の検討(１)
（１）実験準備
本試験例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KSG-320Z(INCI名：(PEG-15／ラウリルポリジメチルシロキシエチルジメチコン)クロスポリマー；信越化学工業株式会社)を用いた。対照として、直鎖型シリコーン系界面活性剤のAbil(登録商標)WE09(INCI名：セチルジメチコンコポリオール；Evonik社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水相として蒸留水を用いた。
【００３８】
本試験例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、ボルテックスミキサーを用いた。加熱機器としてドライブロックバスTHB-1(アズワン株式会社)を使用した。なお、各サンプルの加熱処理は1.5 mLエッペンチューブ内で行っている。微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、顕微鏡として蛍光顕微鏡IX71(オリンパス株式会社)を使用した。微小カプセルの直径は、IX71で撮影した写真に基づいてImage-Pro 6.0J(Media Cybernetics社)により解析した。
【００３９】
（２）実験手順
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカンを2.7 mLずつ、２本の15 mLチューブに分注した。そして、それぞれのチューブに界面活性剤WE09およびKSG-320Zを300μLずつ加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%)。得られた油性組成物を１mLずつ２本のエッペンチューブに分注した。続いて、水相の準備を次のように行った。蒸留水１mLをエッペンチューブに取った。蒸留水を100μLずつ、先に分注した油性組成物１mLが入ったエッペンチューブに添加した(水と油性組成物との体積比は１：10)。そして、油性組成物と水とが入ったエッペンチューブをボルテックスミックスで攪拌(max、１秒×３回)して、エマルションを得た。これを室温にて15分以上静置して、微小カプセルがチューブの底に沈降していることを確認した。
【００４０】
（ii）微小カプセルの直径の測定
まず、加熱前の微小カプセルの直径を次のようにして計測した。チューブの底に溜まった微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。続いて、エマルションの加熱処理を次のようにして行なった。エッペンチューブに残った微小カプセルをそのままの状態でドライブロックバスにて95℃で２時間加熱した。加熱後、微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。加熱の前後で計測した直径のデータについて、Excel(登録商標)(Microsoft社)を用いてヒストグラム解析を行った。微小カプセルの熱耐性を、熱処理後の直径の変化に基づいて評価した。
【００４１】
（３）実験結果
図１に、各界面活性剤を用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムを示した。図１より、架橋型シリコーン系界面活性剤KSG-320Zを用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピーク形状にほとんど変化が見られなかった。これに対して、WE09を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピークのばらつきが確認できた。すなわち、WE09を用いて作製した微小カプセルは、加熱により直径が大きく推移していた。
したがって、微小カプセルの耐熱性という点においては、KSG-320Zの方がより優れていると判断される。
【００４２】
試験例２  微小カプセルの熱安定性の検討(２)
（１）実験準備
本試験例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KF-6038(INCI名：ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン；信越化学工業株式会社)を用いた。対照として、Abil(登録商標)WE09(Evonik社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水相として蒸留水を用いた。
【００４３】
本試験例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、十字型マイクロ流路(流路の幅および高さ 100μm；フロイドウェア社製)、油相および水相を流路へアプライするためのディスポシリンジ(テルモ株式会社)、シリンジ内の液を流路側へ送るためのシリンジポンプSPE-1(アズワン株式会社)およびNE-1010X(株式会社ニューロサイエンス)、微小カプセルを作製している様子をモニタリングするための金属顕微鏡BM-3400TTR(株式会社WRAYMER)を使用した。加熱機器としてドライブロックバスTHB-1(アズワン株式会社)を使用した。また、微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、観察にはBM-3400TTRを使用した。微小カプセルの直径は、撮影した写真に基づいて、BM-3400TTRに付属している計測モードで計測した。
【００４４】
（２）実験手順
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物(油相)の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカンを2.7 mLずつ、２本の15 mLチューブに分注した。そして、それぞれのチューブに界面活性剤WE09およびKF-6038を300μLずつ加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%となった)。得られた油性組成物を３mLプラスティック製シリンジに充填した。続いて、水相の準備を次のように行った。蒸留水１mLをエッペンチューブに取り、１mLディスポシリンジに充填した。そして、十字型マイクロ流路を用いて、微小カプセルを含むエマルションを作製した。十字型マイクロ流路を金属顕微鏡に固定し、油相が入ったシリンジと水相が入ったシリンジとをそれぞれ十字型マイクロ流路にセットした。油相から送液を開始し、流路内に油相が浸入したことを確認した後、水相を送液した。流路出口から油相および微小カプセルが流れていることを、顕微鏡のモニターおよび目視により確認した後、1.5 mLエッペンチューブに微小カプセルを回収した。
【００４５】
（ii）微小カプセルの直径の測定
まず、加熱前の微小カプセルの直径を次のようにして計測した。回収した微小カプセルの一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、金属顕微鏡BM-3400TTR (倍率×40)にて観察および撮影した。Image-Pro 6.0Jを用いて、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。続いて、エマルションの加熱処理を次のようにして行なった。エッペンチューブに残った微小カプセルをそのままの状態でドライブロックバスにて95℃で２時間加熱した。加熱後、微小カプセルを含む層の一部(20μL)を取り、沈渣用プレートに全量アプライした。これを、蛍光顕微鏡IX71(倍率×40)にて観察および撮影した。BM-3400TTRに付属している計測モードで、撮影した写真から微小カプセルの直径を計測した。加熱の前後で計測した直径のデータについて、Excel(登録商標)(Microsoft社)を用いてヒストグラム解析を行った。微小カプセルの熱耐性を、熱処理後の直径の変化に基づいて評価した。
【００４６】
（３）実験結果
図２に、各界面活性剤を用いて作製した微小カプセルの加熱前後での直径変化を示したヒストグラムを示した。図２より、分岐状シリコーン系界面活性剤KF-6038を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピーク形状は大きくずれていなかった。これに対して、WE09を用いて作製した微小カプセルでは、加熱前後でピークのばらつきが確認できた。これは、加熱により微小カプセルの形状が維持できず、微小カプセル間で融合もしくは微小カプセルが分裂しているためと推測される。
したがって、微小カプセルの耐熱性という点においては、KF-6038の方がより優れていると判断される。
【００４７】
実施例１  微小カプセルを含むエマルションを利用したリアルタイムRT-PCR
（１）実験準備
本実施例で使用した試薬は次のとおりである。シリコーン系界面活性剤として、KF-6038(INCI名：ラウリルPEG-9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン；信越化学工業株式会社)を用いた。界面活性剤を溶解させる油としてｎ−ヘキサデカン(和光純薬工業株式会社)を用いた。水性組成物として、Bcr-AblのRT-PCR反応液を使用した。核酸増幅反応用試薬として、QuantiFast Probe RT-PCR Kit(QIAGEN社)を用いた。鋳型核酸として、ヒト白血病細胞株K562のtotal RNA (Bcr-Abl遺伝子 5copy／反応液(20μL)を含む)を用いた。プライマーとして、ENF501 (CCGCTGACCATCAAYAAGGA：配列番号１、10μM)およびENR561 (CACTCAGACCCTGAGGCTCAA：配列番号２、10μM)の組み合わせを用いた。また、TaqMan(登録商標)プローブとして、BcrAbl-DQ-Dye-1 (FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-DQ：配列番号３、10μM)を用いた。なお、FAMは蛍光色素、DQはダーククエンチャーである。
【００４８】
本実施例で使用した機器は次のとおりである。エマルションの調製には、十字型マイクロ流路(流路の幅および高さ 100μm；フロイドウェア社製)、油相および水相を流路へアプライするためのディスポシリンジ(テルモ株式会社)、シリンジ内の液を流路側へ送るためのシリンジポンプSPE-1(アズワン株式会社)およびNE-1010X(株式会社ニューロサイエンス)、微小カプセルを作製している様子をモニタリングするための金属顕微鏡BM-3400TTR(株式会社WRAYMER)を使用した。核酸増幅反応には、リアルタイムRT-PCRシステムABI7500(Applied Biosystems社)および96ウェルプレートを使用した。また、微小カプセルの顕微鏡観察用の機器類として、観察用チャンバーにマツナミ沈渣用プレート MUR-300 (３窓タイプ、間隙70μm；松浪ガラス工業株式会社)を用い、観察には蛍光顕微鏡BZ-9000(株式会社キーエンス)を使用した。なお、蛍光としてFAMを検出した。微小カプセルの解析には、BZ-9000に付属の画像解析ソフトウェアBZ-1を使用した。
【００４９】
（２）実験手順
本実施例では、同一サンプルを用いてN=3で行なった。
（i）微小カプセルを含むエマルションの調製
まず、油性組成物(油相)の調製を次のように行なった。ｎ−ヘキサデカン2.7 mLを15 mLチューブに分注した。そして、チューブに界面活性剤KF-6038を300μL加えて、よく混合した(界面活性剤の終濃度は５%となった)。得られた油性組成物を３mLプラスティック製シリンジに充填した。続いて、水性組成物(水相)の調製を次のように行った。1.5 mLエッペンチューブに、K562細胞のtotal RNA (Bcr-Abl遺伝子 5copy／反応液(20μL)を含む)を５μL、10μM ENF501プライマーおよびENR561プライマーを６μLずつ、10μM TaqManプローブを６μL、およびQuantiFast Probe RT-PCR Kitのマスターミックスを50μL加え、dH2Oで全量を100μLにした。得られた水相を１mLディスポシリンジに充填した。
【００５０】
十字型マイクロ流路を用いて、微小カプセルを含むエマルションを次のようにして作製した。十字型マイクロ流路を顕微鏡に固定し、油相が入ったシリンジと水相が入ったシリンジとをそれぞれ十字型マイクロ流路にセットした。油相から送液を開始し、流路内に油相が浸入したことを確認した後、水相を送液した。流路出口から油相および微小カプセルが流れていることを、顕微鏡のモニターおよび目視により確認した後、1.5 mLエッペンチューブに微小カプセルを回収した。
【００５１】
（ii）核酸増幅反応
回収した微小カプセルの一部(25μL)を取り、96ウェルプレートに分注した。これをABI7500にセットし、次の反応条件でリアルタイムRT-PCR反応を行なった。
＜反応条件＞
50℃で10分間を１サイクル、
94℃で５分間を１サイクル、および
(94℃で10秒間、60℃で10秒間および72℃で30秒間)を38サイクル。
【００５２】
核酸増幅後の反応液中の微小カプセルについて、次のようにして蛍光分析を行った。反応終了後の微小カプセルをクリーンベンチ内で新しいエッペンチューブへ移した。そして、微小カプセルを25μLずつ、２枚のグラスチャンバーにアプライして蛍光顕微鏡(倍率×100)にて微小カプセルの蛍光を観察および撮影した。撮影条件は、対物レンズ10倍、露光時間3.0秒、モノクロ12 bitであった。この条件で、チャンバーのほぼ全域をカバーする範囲(縦16枚×横20枚＝計320枚)を自動撮影した。撮影終了後、320枚の写真を１枚にジョイントし、ダイナミックセルカウント機能により、全ての微小カプセルの蛍光輝度を測定してヒストグラム解析した。
【００５３】
（３）実験結果
図３に、320枚の写真を１枚にジョイントした写真およびその拡大図を示す。図３のうち、３Ａはチャンバー全体像であり、３Ｂは拡大図である。なお、図中の矢印は、蛍光を発していた微小カプセルを示す。撮影した写真より、作製した微小カプセルの直径を全て計測し、各種の情報を下表にまとめた。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
蛍光を発していた微小カプセルの数について、予想される数と実測数とを比較すると、概ね予想通りの数値を返した。この結果では、5copy／μg total RNAを検出できることを示している。従来のRT-PCR法の感度が100 copy／μg total RNAを検出できる程度であるのに対して、本発明の方法では理論的に1copy／μg total RNAを検出することができることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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