(57)【要約】【課題】難治性神経変性疾患の検査診断並びに治療に利用することができるバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを提供する。【解決手段】本発明で特定したｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定することにより、難治性神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症を検出することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の遺伝子産物を同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、神経変性疾患の検出方法。
【請求項２】
表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡからなる群から選んだｍｉＲＮＡ、又は表５〜表８に記載の標的遺伝子からなる群から選んだ標的遺伝子の遺伝子産物である、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表６に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、多系統萎縮症の検出方法。
【請求項４】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表３〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表７〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
【請求項５】
神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、前記治療効果の判定方法。
【請求項６】
表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。
【請求項７】
表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
【請求項８】
多系統萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症の治療用である、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
表１〜４に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
表１〜４に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患の存在を検出するための検査診断および同疾患の治療標的として有用なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその標的遺伝子とそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査方法を用いた診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。その結果、難治性で、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。神経変性疾患は患者本人だけでなく、介護者にも多大な負担が及び、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。超高齢化社会が進む我が国では、神経変性疾患対策が国家的な重要課題となってきている。すなわち、（１）高齢化社会における医療福祉行政の基幹的課題であること、（２）認知症による膨大な経済的損失（年間５兆円相当）を軽減すること、（３）医療イノベーションで日本発の革新的治療法の開発を推進し、日本の医薬品輸入赤字（２兆円超）を解消すること、（４）国の5ヵ年計画（2012）で対策が必要な重点疾患（がん、難病・希少疾病、肝炎、感染症、糖尿病、脳心血管疾患、精神神経疾患、小児疾患）に指定されていること、などである。このように、新たなバイオマーカーの開発、検査診断薬の開発、治療薬・治療法の開発が緊急の課題となっている。
【０００３】
検査診断法については、疾患関連バイオマーカーが特定され、血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のＱＯＬの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。治療法に関しては、病態改善薬のみならず、進行抑制薬も十分に医療上の意義が高く、そのためのバイオマーカーの神経機能への関与の解析も重要である。
【０００４】
神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：ＡＬＳ）と多系統萎縮症（Multiple System Atrophy：ＭＳＡ）は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、有用なバイオマーカーの開発は緊急の課題となっている。
【０００５】
近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡ（small non-coding RNA）であり、ヒトには約１０００種類以上存在することが示唆されている。ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ III酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（RNA-induced silencing complex：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【０００６】
ｍｉＲＮＡはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なる事から、発がん過程へのｍｉＲＮＡ発現異常の関与が強く示唆されている。すなわち、腫瘍抑制的ｍｉＲＮＡの発現低下あるいは発がん促進的ｍｉＲＮＡの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡの産業上の利用に関しても、もっぱらがんの領域での利用が主体であるが、ようやく各種疾患に対する創薬への利用が報告され始めてきた（非特許文献２）。神経疾患関係においては、損傷後の神経の再生にｍｉＲＮＡを利用する方法（特許文献１）や多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法（特許文献２）が報告されている。
【０００７】
しかしながら、ｍｉＲＮＡは各種疾患に広く関与している可能性が高いにもかかわらず、具体的にＡＬＳとＭＳＡへのｍｉＲＮＡの応用技術に関する情報は乏しく、ＡＬＳの進行抑制にｍｉＲＮＡ−２０６が関与することを示唆した文献（非文献情報３）、ＡＬＳ患者の白血球中のｍｉＲＮＡの変化の報告（非文献情報４）や脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy：ＳＭＡ）への関与を示唆する文献（非文献情報５）など、少数の報告があるにすぎない。進行性で内因的な因子の関与が大きいと考えられるＡＬＳとＭＳＡでは、ｍｉＲＮＡを利用した検査診断あるいは創薬に有用な疾患バイオマーカーの開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表2011-515407号公報
【特許文献２】特表2012-530054号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】microRNAの制御異常と癌、実験医学  vol.27, No.8, 2009.
【非特許文献２】臨床・創薬利用が見えてきたmicroRNA、遺伝子医学MOOK23  2012.
【非特許文献３】Williams AH et al., Science. 2009;326(5959):1549-54.
【非特許文献４】De Felice B et al., Gene. 2012;508(1):35-40.
【非特許文献５】Haramati S et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jul 20;107(29):13111-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のとおり、難治性のＡＬＳやＭＳＡに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。疾患に関与すると言われているｍｉＲＮＡの神経変性疾患におけるバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡを見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態モニタリング法、さらには治療薬への応用が可能となる。
本発明の目的は、神経変性疾患の検査と治療に対するｍｉＲＮＡの利用であり、特にＡＬＳとＭＳＡのバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を臨床検査や病態モニタリング、さらには治療法へ応用することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の発明に関する：
［１］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、神経変性疾患の検出方法。
［２］表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡからなる群から選んだｍｉＲＮＡ、又は表５〜表８に記載の標的遺伝子からなる群から選んだ標的遺伝子の遺伝子産物である、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー。
［３］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表６に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、多系統萎縮症の検出方法。
［４］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表３〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表７〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
［５］神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表５〜表８に記載の標的遺伝子の少なくとも１つである、前記治療効果の判定方法。
［６］表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。
［７］表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
［８］多系統萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症の治療用である、［６］又は［７］の医薬組成物。
［９］表１〜４に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
［１０］表１〜４に記載したｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法によれば、簡便な遺伝子検査方法、又はタンパク質分析方法により、神経変性疾患、特に多系統萎縮症（ＭＳＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を検出することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡ、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に特に記載すること以外は、本発明の検出方法・治療効果判定方法・治療方法・医薬組成物・治療薬のスクリーニング方法において、適宜、相互に参照することができる。
本発明の検出方法では、神経変性疾患、特には多系統萎縮症（ＭＳＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を検出するバイオマーカーとして、表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡ、あるいは、表５〜表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物（ポリペプチド又はメッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと称する）、好ましくはポリペプチド）を使用することができる。
該ｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の遺伝子産物は、単独で使用することもできるし、複数を使用することもできる。精度を高めるため複数を組み合わせて使用する方が好ましい。具体的には、ｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を１〜２０、好ましくは２〜１０を組み合わせて利用することが望ましい。
また、公知のｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を組み合わせて利用することもできる。
【００１４】
後述の実施例において具体的実験データを示すとおり、ＭＳＡ患者は健常者と比較して、表１のｍｉＲＮＡが脳疾患部位にて増大、かつ表２のｍｉＲＮＡが減少しており、他方、ＡＬＳ患者では表３のｍｉＲＮＡが脳疾患部位において健常者に比べて増大、かつ表４のｍｉＲＮＡが減少している。従って、被験者、特に、神経変性疾患が疑われる患者又は神経変性疾患患者から採取した臓器組織、細胞、血液、脳脊髄液、唾液、涙液等の試料中のこれらのｍｉＲＮＡ（以下、それぞれ、ＭＳＡ又はＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡと称する）の少なくとも１つを、それ自体公知の方法に従って測定することにより、ＭＳＡ又はＡＬＳであるか否かを判定することができる。特に、脳疾患部位（ＭＳＡ患者であれば小脳病巣部位等、ＡＬＳ患者であれば脳運動野病巣部位等）やその周辺部位（脳脊髄液等）を試料とすることが好ましい。
また、減少したｍｉＲＮＡの全部または一部を医薬組成物として投与し、ｍｉＲＮＡを補充すること、あるいは増大したｍｉＲＮＡを減少させる作用の有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与し、過剰なｍｉＲＮＡの作用を抑制することは、いずれもＭＳＡ又はＡＬＳの治療に有用な薬剤を提供する。
【００１５】
存在率が増大しているｍｉＲＮＡの場合は、より好ましい標的遺伝子では、その変化率（signal ratio）が高い傾向にある。よって、変化率（Ｌｏｇ２表記）が＋０．１以上、好ましくは＋０．５以上のｍｉＲＮＡを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。他方、存在率が減少しているｍｉＲＮＡの場合は、より好ましい標的遺伝子では、その変化率（signal ratio）が低い傾向にある。よって、変化率（Ｌｏｇ２表記）が−０．５未満、好ましくは−１．０未満のｍｉＲＮＡを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。ただし、変化率は測定条件によって変動する場合があるので、変化率の基準値によらず、変動幅の大きい順からバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを選定することもできる。表１〜表４のｍｉＲＮＡの配列は公知のデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ：http://www.mirbase.org/）から入手することができる。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【表２】
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【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
前記ＭＳＡで増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表５に、ＭＳＡで減少したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表６に示した（以下、これらをＭＳＡ検出用遺伝子産物と称する場合がある）。これらの標的遺伝子でコードされる遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ、好ましくはポリペプチド）は、それ自体、ＭＳＡのバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、ＭＳＡ治療薬、または発症予防薬のターゲットとしても使用することができる。
【００２１】
【表５】
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【００２２】
【表６】
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【００２３】
前記ＡＬＳで増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表７に、ＡＬＳで減少したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表８に示す（以下、これらをＡＬＳ検出用遺伝子産物と称する場合がある）。これらの標的遺伝子でコードされる遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ、好ましくはポリペプチド）は、それ自体、ＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、ＡＬＳ治療薬または発症予防薬のターゲットとしても使用することができる。
【００２４】
【表７】
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【００２５】
【表８】
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【００２６】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子のｍＲＮＡを使用する場合、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法により、測定することができる。
また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするポリペプチドを使用する場合、それ自体公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法や質量分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。
【００２７】
本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳疾患部位、脳脊髄液、血液試料（例えば、末梢血、血漿、血清）、唾液、涙液、尿、リンパ液、その他の体液、好ましくは、脳疾患部位やその周辺部位（脳脊髄液等）を用いることができる。さらには生検で採取された臓器組織、病理組織、細胞、又はそれらからの抽出成分も利用できる。
【００２８】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡ、あるいは、表５〜表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ、好ましくはポリペプチド）は、神経変性疾患、特にはＭＳＡ又はＡＬＳの患者に対して行う各種治療の効果を判定するために使用することもできる。
本発明の治療効果判定方法は、神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含む。
【００２９】
本発明の治療効果判定方法において、ＭＳＡ患者に対する治療効果を判定する場合には、表１又は表２に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡ、あるいは、表５又は表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ）を使用することができる。
表１に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡ（ＭＳＡ患者において存在率が増加しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
また、表２に記載のＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡ（ＭＳＡ患者において存在率が減少しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００３０】
表５に記載のＭＳＡ検出用遺伝子産物（ＭＳＡ患者において遺伝子発現が抑制されていると推定されるｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子産物）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、その発現量が健常者よりも低い数値を示すと推定される。当該発現量が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
表６に記載のＭＳＡ検出用遺伝子産物（ＭＳＡ患者において遺伝子発現が増強されていると推定されるｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子産物）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＭＳＡ患者では、その発現量が健常者よりも高い数値を示すと推定される。当該発現量が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
【００３１】
本発明の治療効果判定方法において、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には、表３又は表４に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡ、あるいは、表７又は表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ）を使用することができる。
表３に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＬＳ患者において存在率が増加しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
また、表４に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡ（ＡＬＳ患者において存在率が減少しているｍｉＲＮＡ）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、そのｍｉＲＮＡ値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００３２】
表７に記載のＡＬＳ検出用遺伝子産物（ＡＬＳ患者において遺伝子発現が抑制されていると推定されるｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子産物）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、その発現量が健常者よりも低い数値を示すと推定される。当該発現量が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
表８に記載のＡＬＳ検出用遺伝子産物（ＡＬＳ患者において遺伝子発現が増強されていると推定されるｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子産物）をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者では、その発現量が健常者よりも高い数値を示すと推定される。当該発現量が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。
【００３３】
本発明の治療方法では、神経変性疾患、特にはＭＳＡ又はＡＬＳで存在率が減少している表２又は表４に記載のｍｉＲＮＡの全長又は一部を用いて、あるいは、当該疾患で存在率が増加している表１又は表３に記載のｍｉＲＮＡに対する抑制性オリゴヌクレオチドを用いて、神経変性疾患を治療することができる。また、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子の遺伝子発現が抑制されている神経変性疾患患者では、その遺伝子産物を補充することにより、逆に、遺伝子発現が増強されている神経変性疾患患者では、その遺伝子産物の発現又は活性を抑制することにより、神経変性疾患を治療することができる。なお、本明細書において、用語「治療」には、疾患発症後の患者を処置する狭義の「治療」と、疾患発症前の患者を処置する「予防」が含まれる。
【００３４】
表２又は表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが減少している神経変性疾患患者（特には、表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが減少しているＭＳＡ患者、又は表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが減少しているＡＬＳ患者）では、その減少しているｍｉＲＮＡを患者に補充することにより、神経変性疾患を治療することができる。ｍｉＲＮＡを患者に投与する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、ｍｉＲＮＡ又はその誘導体を、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、ＲＮＡの糖部分のＯ（酸素）をＳ（硫黄）  で置き換えた４’−チオＲＮＡ化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充することができる。同時に、ｍｉＲＮＡは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。
【００３５】
一方、表１又は表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが増加している神経変性疾患患者（特には、表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが増加しているＭＳＡ患者、又は表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つが増加しているＡＬＳ患者）では、その増加しているｍｉＲＮＡを患者体内において抑制することにより、神経変性疾患を治療することができる。生体内のｍｉＲＮＡを抑制する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、例えば、対象ｍｉＲＮＡの全長または一部とハイブリダイズ可能な相補的配列を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を投与することによって行うことができる。この場合のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、ＲＮＡの糖部分のＯ（酸素）をＳ（硫黄）で置き換えた４’−チオＲＮＡ化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充することができる。同時に、ｍｉＲＮＡは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、神経変性疾患、特にＭＳＡ又はＡＬＳの治療に用いることができ、有効成分として、表２若しくは表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長又は一部）、あるいは、表１若しくは表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含むことができ、所望により、製薬学的に許容される担体を更に含むことができる。
表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長又は一部）、若しくはその誘導体、又は表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含む、本発明の医薬組成物は、ＭＳＡ患者の治療に用いることができる。
表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長又は一部）、若しくはその誘導体、又は表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含む、本発明の医薬組成物は、ＡＬＳ患者の治療に用いることができる。
【００３７】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡ、あるいは、その標的遺伝子でコードされる遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ、好ましくはポリペプチド）は、神経変性疾患、特にはＭＳＡ又はＡＬＳの治療薬をスクリーニングするために使用することができる。
本発明において、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物を標的とする候補物質（例えば化合物）をスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、直接標的に結合する候補物質を分光学的な変化で調べる方法や培養細胞に候補物質を暴露させて培養細胞中の標的（ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物）の発現を調べる方法などが適用され、さらにｉｎ  ｖｉｖｏでは、モデル動物にて神経変性症状または神経変性病理像の改善を指標とした方法などが適用される。
【００３８】
例えば、本発明のスクリーニング方法の内、表５〜表８に記載の標的遺伝子でコードされるポリペプチドを利用する態様では、前記の各種ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて実施することができる。本態様では、例えば、当該ポリペプチド又はそれを発現する細胞、組織、若しくは動物個体（特には非ヒト動物）と、候補物質とを接触させる工程、および前記候補物質とポリペプチドとの結合、前記ポリペプチドの発現量変化若しくは活性変化、又は動物固体における症状変化を分析する工程を含む方法により、実施することができる。
【００３９】
また、本発明のスクリーニング方法の内、表１〜表４に記載のｍｉＲＮＡ、又は表５〜表８に記載の標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を指標とする態様では、例えば、候補物質を培養細胞、組織、又は動物個体（特には、非ヒト動物）に投与する工程、前記個体から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを測定する工程を含む方法により、実施することができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法で評価する候補物質は、特に限定されるものではないが、各種化合物に加え、各種抽出物、例えば、微生物の培養上清、各種生物若しくはその組織由来の天然成分若しくは抽出物を挙げることができる。また、使用する細胞は、組織から分離された培養細胞、樹立された培養細胞株、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが、非ヒト動物においては、特定遺伝子のノックアウトあるいはノックインの処理を施したモデルマウス、モデルラットなどを挙げることができる。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法において、表２又は表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を増加させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。特に、表２に記載のｍｉＲＮＡ量を増加させることができる物質はＡＬＳ治療薬の候補として、また、表４に記載のｍｉＲＮＡ量を増加させることができる物質はＭＳＡ治療薬の候補として、選択することができる。
【００４２】
一方、表１又は表３に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。特に、表１に記載のｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質はＡＬＳ治療薬の候補として、また、表３に記載のｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質はＭＳＡ治療薬の候補として、選択することができる。
【００４３】
また、表６又は表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の少なくとも１つを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。特に、表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質はＡＬＳ治療薬の候補として、また、表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質はＭＳＡ治療薬の候補として、選択することができる。
【００４４】
一方、表５又は表７に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の少なくとも１つを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。特に、表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質はＡＬＳ治療薬の候補として、また、表８に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質はＭＳＡ治療薬の候補として、選択することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
《実施例１：脳病変組織中のｍｉＲＮＡの分析》
確定診断された多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者の小脳病巣部位、確定診断された筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者の脳運動野病巣部位、及び健常対照群として健常者脳の正常部位を、剖検後に採取し、１０％ホルマリンにて固定し、パラフィンにて包埋し、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）標本とした。ＦＦＰＥ標本（５ｘ５ｍｍ、５μｍ、２〜４枚）を材料とし、ＭＳＡ患者５例、ＭＳＡ健常対照３例、ＡＬＳ患者３例、ＡＬＳ健常対照３例の標本から、それぞれＲＮＡ抽出後、マイクロアレイによるｍｉＲＮＡ分析を行った。
【００４７】
マイクロアレイは３Ｄ−ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡ抽出液並びにハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１，８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）で行い、対象群に対する患者群のシグナル強度の変化を求めた。
ｍｉＲＮＡ増減の変化率を求め、健常対照に対して増大した上位２０位のｍｉＲＮＡ「増大したｍｉＲＮＡ（upregulated miRNA）」、及び減少した上位３０位のｍｉＲＮＡを「減少したｍｉＲＮＡ（downregulated miRNA）」と規定した。
【００４８】
その結果として、表１〜表４に示す結果が得られた。表１はＭＳＡ患者の小脳ＦＦＰＥ標本中で増大したｍｉＲＮＡ群であり、表２はＭＳＡ患者の小脳ＦＦＰＥ標本中で減少したｍｉＲＮＡ群である。表３はＡＬＳ患者の脳運動野ＦＦＰＥ中で増大したｍｉＲＮＡ群であり、表４はＡＬＳ患者の脳運動野ＦＦＰＥ中で減少したｍｉＲＮＡ群である。
これらのｍｉＲＮＡ群は、それぞれの疾患の検査診断バイオマーカーあるいは治療のためのｍｉＲＮＡ情報として利用することができる。
【００４９】
《実施例２：ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を特定する方法》
実施例１で検出されたｍｉＲＮＡ群が生体内で制御する標的遺伝子群を特定するために、２段の解析法を用いた。
まず、検出されたｍｉＲＮＡリスト（前記表１〜表４）から標的遺伝子を推定するために、miRanda-mirSVRをベースにした解析ツールmicroRNA.org-Targets and Expression（http://www.microrna.org/microrna/home.do）にて、ｍｉＲＮＡ配列情報とのマッチングによる標的遺伝子候補をリストアップし（〜５０種程度）、このうち、神経系に関連があると思われる１０〜３０種の因子を抽出した。
ＭＳＡで増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表５に、ＭＳＡで減少したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表６に、ＡＬＳで増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表７に、ＡＬＳで減少したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表８に示す。
【００５０】
なお、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、先述したとおり、データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１，８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載した市販の３Ｄ−ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を使用したため、データベースmiRBase Release17.0に基づいた名称（ID）を使用している。本明細書に記載したｍｉＲＮＡの名称と、データベースmiRBase（http://www.mirbase.org/）におけるAccession No.を表９〜表１２に示す。
【００５１】
【表９】
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【００５２】
【表１０】
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【００５３】
【表１１】
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【００５４】
【表１２】
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【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、神経変性疾患の検査診断並びに治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。