(57)【要約】【課題】  小流量の計測が可能かつ簡便・安価な流量計を備えた液体クロマトグラフ装置、および前記液体クロマトグラフ装置において前記流量計で計測した流量に基づき、分析カラムに導入する溶離液の流量を補正する方法を提供すること。【解決手段】  溶離液を送液する送液手段と、試料導入手段と、分析カラムと、検出手段と、溶離液が流れる前記検出手段の下流側の流路に一定量の空気を導入可能な空気導入手段と前記空気導入手段で導入された空気の通過を検出可能な第１および第２のセンサ（ただし、第２のセンサは第１のセンサの下流側に設けている）と前記第１および第２のセンサからの検出信号に基づく空気の通過時間に基づき、流路内を通過する溶離液の流量を計算する算出手段とを設けた前記溶離液の流量を計測する流量計と、を備えた液体クロマトグラフ装置、および前記装置で計測した流量に基づき、分析カラムに導入する溶離液の流量を補正する方法により、前記課題を解決する。【選択図】  図１
2014102164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶離液を送液する送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入した試料中の各成分を分離する分析カラムと、前記分析カラムより分離した各成分を検出する検出手段と、前記溶離液の流量を計測する流量計とを備えた、液体クロマトグラフ装置であって、
前記流量計が、
溶離液が流れる前記検出手段の下流側の流路に一定量の空気を導入可能な空気導入手段と、
前記空気導入手段で導入された空気の通過を検出可能な第１および第２のセンサ（ただし、第２のセンサは第１のセンサの下流側に設けている）と、
前記第１および第２のセンサからの検出信号に基づく空気の通過時間に基づき、流路内を通過する溶離液の流量を計算する算出手段と、
を設けた流量計である、前記装置。
【請求項２】
空気導入手段が、入口側と出口側に逆止弁を有し、かつ入口側が大気開放状態のダイアフラムポンプである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
空気導入手段が、柔軟性や弾力性を有するチューブと、前記チューブを挟み込む、直列に配置された２つのピンチバルブとを有した手段である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
液体と空気との光の透過率の差を検知可能な第１および第２のセンサにより、溶離液と空気導入手段により導入した空気との界面を検知した時間をそれぞれ記憶し、
第１のセンサによる界面を検知した時間と第２のセンサによる界面を検知した時間との差を算出し、
前記差と第１のセンサから第２のセンサまでの流路の配管容量から流量を算出する、
請求項１から３のいずれかに記載の装置に備えた流量計による流量の算出方法。
【請求項５】
請求項４で算出した流量Ｆと、送液手段の駆動量Ｄとの関係を１次式（下記式（１））で近似させて係数（傾き）ａを算出し、
【数１】
2014102164.tif 000019
目的流量Ｆｔを得るのに必要な送液手段の駆動量Ｄｔを下記式（２）により算出し、
【数２】
2014102164.tif 000020
得られた駆動量Ｄｔで駆動することで、目的流量に近づける操作を１回以上行なう、
流量の補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小流量の計測が可能かつ簡便・安価な流量計を備えた液体クロマトグラフ装置、および前記装置における流量補正方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィでは、試料中に含まれる成分の同定を溶出時間を基に行ない、当該溶出時間におけるピーク高さやピーク面積から試料中に含まれる成分の定量を行なう。そのため、分析カラムに導入する溶離液の流量には高い精度が要求される。分析カラムに充填するゲルの粒子径が数μｍで、試料測定時の分析カラムの圧力が数ＭＰａから数十ＭＰａとなる、高圧の液体クロマトグラフ装置では、プランジャと逆止弁から構成されるプランジャ式ポンプが通常使用され、当該ポンプは前記溶離液を精度を高く送液可能である。
【０００３】
しかしながらプランジャ式ポンプは高価なため、分析カラムに充填するゲルの粒子径が数十μｍで試料測定時のカラム圧力が０．１ＭＰａ程度の低圧の液体クロマトグラフ装置の場合は、プランジャ式ポンプの代わりに、回転体により軟質チューブを扱くことで送液を行なうチューブポンプ（図１４ａ）やギアポンプ（図１４ｂ）やダイアフラムポンプ（図１４ｃおよび図１４ｄ）といった、耐圧性は低いものの安価である簡易ポンプを用いることが多い。ただしこれら簡易ポンプは、短期的な流量安定性は得られるものの、流量安定性を長期間確保することが難しいという問題がある。例えばチューブポンプの場合、扱われる軟質チューブの劣化により、徐々に流量が低下する傾向がある。そのためこれら簡易ポンプを、液体クロマトグラフ装置に備える溶離液送液ポンプとして用いるためには、何らかの方法で実流量を計測し、当該計測結果に基づき送液量が常に一定になるよう調整しながら送液する必要がある。例えば、簡易ポンプを用いて実際に溶離液の送液を行ない、分析カラムから溶出した溶離液をメスシリンダ等で受け、溶出した溶離液が一定の容量になるまでの時間を計測することで実流量を算出し、当該実流量に基づき、送液量が常に一定になるよう調整する。
【０００４】
流体の流量を計測する流量計として、容積式、コリオリ式、熱式、渦式、超音波式、といった、さまざまな原理を利用した流量計がこれまで実用化されている。しかしほとんどの流量計は毎分数Ｌ以上の流量を計測する流量計であり、内部容量も大きいことから、毎分数百μＬから数ｍＬの流量計測が必要な、液体クロマトグラフ装置に備える流量計としては不向きであった。前述した流量計の中でも熱式流量計は、内部容量が少なく、液体クロマトグラフィに備える流量計としての使用が可能であるが、高価であることが難点であった。
【０００５】
前述した流量計以外の流量計としては、液流中に電磁弁、圧力計、レギュレータ等から構成される気体導入機構により気体を導入し、液流中の気泡の移動速度から流量を算出する産業用の液体流量計（特許文献１）がある。しかしながら特許文献１で開示の流量計も、高い流量域を想定しており、かつ気体導入機構も複雑で高価なことから、液体クロマトグラフ装置に備える流量計への適用は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２９２０６７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、毎分数百μＬから数ｍＬといった小流量の計測が可能かつ簡便・安価な流量計を備えた液体クロマトグラフ装置、および前記液体クロマトグラフ装置において前記流量計で計測した流量に基づき、分析カラムに導入する溶離液の流量を補正する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
溶離液を送液する送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入した試料中の各成分を分離する分析カラムと、前記分析カラムより分離した各成分を検出する検出手段と、前記溶離液の流量を計測する流量計とを備えた、液体クロマトグラフ装置であって、
前記流量計が、
溶離液が流れる前記検出手段の下流側の流路に一定量の空気を導入可能な空気導入手段と、
前記空気導入手段で導入された空気の通過を検出可能な第１および第２のセンサ（ただし、第２のセンサは第１のセンサの下流側に設けている）と、
前記第１および第２のセンサからの検出信号に基づく空気の通過時間に基づき、流路内を通過する溶離液の流量を計算する算出手段と、
を設けた流量計である、前記装置である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、空気導入手段が、入口側と出口側に逆止弁を有し、かつ入口側が大気開放状態のダイアフラムポンプである、前記第一の態様に記載の装置である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、空気導入手段が、柔軟性や弾力性を有するチューブと、前記チューブを挟み込む、直列に配置された２つのピンチバルブとを有した手段である、前記第一の態様に記載の装置である。
【００１２】
さらに本発明の第四の態様は、
液体と空気との光の透過率の差を検知可能な第１および第２のセンサにより、溶離液と空気導入手段により導入した空気との界面を検知した時間をそれぞれ記憶し、
第１のセンサによる界面を検知した時間と第２のセンサによる界面を検知した時間との差を算出し、
前記差と第１のセンサから第２のセンサまでの流路の配管容量から流量を算出する、
前記第一から第三の態様のいずれかに記載の装置に備えた流量計による流量の算出方法である。
【００１３】
さらに本発明の第五の態様は、
前記第四の態様で算出した流量Ｆと、送液手段の駆動量Ｄとの関係を１次式（下記式（１））で近似させて係数（傾き）ａを算出し、
【００１４】
【数１】
2014102164.tif 000003
目的流量Ｆｔを得るのに必要な送液手段の駆動量Ｄｔを下記式（２）により算出し、
【００１５】
【数２】
2014102164.tif 000004
得られた駆動量Ｄｔで駆動することで、目的流量に近づける操作を１回以上行なう、
流量の補正方法である。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、溶離液を送液する送液手段と、試料導入手段と、分析カラムと、検出手段とを備えた液体クロマトグラフ装置において、溶離液が流れる前記検出手段の下流側の流路に一定量の空気を導入可能な空気導入手段と、前記空気導入手段で導入された空気の通過を検出可能な第１および第２のセンサ（ただし、第２のセンサは第１のセンサの下流側に設けている）と、前記第１および第２のセンサからの検出信号に基づく空気の通過時間に基づき、流路内を通過する溶離液の流量を計算する算出手段と、を設けた流量計を備えることで、定期的に流量を計測し、かつその値が目的流量となるように送液手段による液体の送液量を制御することを特徴としている。
【００１８】
送液手段としては、通常用いられるプランジャ式ポンプの他に、回転体（２１３）で軟質チューブ（２１１）を扱いて液を送るチューブポンプ（図１４ａ）や、複数のギア（２２１）の動力により液を送るギアポンプ（図１４ｂ）や、モータを動力としてダイアフラム（２３３）を伸縮させることで液を送る一般的なダイアフラムポンプ（図１４ｃ）や、電磁力を動力としダイアフラム（２４３）を伸縮させることで液を送る電磁式ダイアフラムポンプ（図１４ｄ）等の簡易ポンプも使用できる。
【００１９】
本発明のクロマトグラフ装置の一例を示した流路図を図１に示す。なお、図１では送液ポンプ（１５）としてチューブポンプを使用している。図１に示す装置に備える、流量計（１００）の一例を図２に示す。図２に示す流量計（１００）は、図１に示す本発明のクロマトグラフ装置において検出器（３５）の下流側に備えられている。検出器（３５）下流側から流れた溶離液は、流量計（１００）に設けた分岐ブロック（１３０）に到達する。分岐ブロック（１３０）には、一定量の空気を前記溶離液が流れる流路へ導入可能な空気導入部（１１０）が接続されている。図２に示す流量計（１００）に設けた空気導入部（１１０）は、シリコーンチューブなどの軟質チューブ（１１３）と、２つのピンチバルブ（１１１、１１２）と、抵抗管（１５０）を有しており、２つのピンチバルブ（１１１、１１２）は軟質チューブ（１１３）に対し直列に設けている。
【００２０】
通常の状態ではピンチバルブＡ（１１１）とピンチバルブＢ（１１２）をともに開放状態にする。これにより、検出器（３５）下流側から流れる溶離液は抵抗の少ない気泡検出流路（１２７）側に全て流れる（Ｓｔｅｐ  １、図６ａ）。流量計測を行なう場合は、まず軟質チューブ（１１３）上流側に設けたピンチバルブＡ（１１１）を閉じる。これにより軟質チューブ（１１３）内に空気が密封される（Ｓｔｅｐ  ２、図６ｂ）。次に軟質チューブ（１１３）下流側に設けたピンチバルブＢ（１１２）を閉じる。これにより軟質チューブ（１１３）内の体積が減少し、その結果、空気が気泡として分岐ブロック（１３０）に押し出される（Ｓｔｅｐ  ３、図７ｃ）。分岐ブロック（１３０）に押し込まれた気泡（１４１）は気泡検出流路（１２７）に流れ込み、気泡検出流路（１２７）の上流側に設けたセンサＡ（１２１）が前記気泡を検出する（Ｓｔｅｐ  ４、図７ｄ）。その後、気泡検出流路（１２７）の下流側に設けたセンサＢ（１２２）がセンサＡ（１２１）と同様に気泡を検出する（Ｓｔｅｐ  ５、図８ｅ）。そして、センサＡ（１２１）が気泡を検出した時間（溶離液と空気（気泡）との界面を検知した時間）と、センサＢ（１２２）が気泡を検出した時間との差から流量を算出（計測）する。
【００２１】
なお図２に示す流量計（１００）では軟質チューブ（１１３）の空気流入口側に抵抗管（１５０）を設けているが、これは２つのピンチバルブ（１１１、１１２）を開放状態にした際、検出器（３５）から流入する液体が軟質チューブ（１１３）側に流れ込まないように圧力を掛けるためである。なお、抵抗管（１５０）を設ける代わりに、検出器（３５）から軟質チューブ（１１３）側への流入を阻止可能な逆止弁（１１４）を空気導入部（１１０）と分岐ブロック（１３０）との間に設けた態様としてもよい（図３）。さらにピンチバルブＡ（１１１）の代わりに検出器（３５）から軟質チューブ（１１３）側への流入を阻止可能な逆止弁（１１５）を設けた態様としてもよい（図４）。
【００２２】
図１に示す装置に備える、流量計（１００）の別の例を図５に示す。図５に示す流量計は、空気導入手段として電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）を採用している。電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）はプランジャ（１１７）を電磁石（１１９）による電磁力で
駆動させ、柔軟性のあるダイアフラム（１１８）を変形させることで流体を移動させるポンプである。なおダイアフラム（１１８）の入口側（空気流入口）と出口側（空気吐出口）には、それぞれ１方向にしか空気を流さない逆止弁（１１４、１１５）を設けており、電磁石（１１９）のＯＮ／ＯＦＦにより、空気を一定量吸引／吐出させることができる。
【００２３】
電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）の出口側（空気吐出口）を分岐ブロック側（１３０）に、入口側（空気吸引口）を大気開放になるように、それぞれ接続する。通常の状態では電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）は吸引状態（ダイアフラムが膨らんだ状態）にする（Ｓｔｅｐ  １、図９ａ）。これにより、検出器（３５）から分岐ブロック（１３０）に流入する溶離液は、抵抗の少ない気泡検出流路（１２７）側に全て流れる。流量計測を行なう場合は、電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）を吐出状態（ダイアフラムが縮んだ状態）にする。これによりダイアフラム内の空気が分岐ブロック（１３０）へ押し出され、気泡導入流路（１２７）に流れこむ（Ｓｔｅｐ  ２、図９ｂ）。流れ込んだ気泡（１４１）は気泡検出流路（１２７）の上流側に設けたセンサＡ（１２１）で検出する（Ｓｔｅｐ  ３、図１０ｃ）。その後、気泡検出流路（１２７）の下流側に設けたセンサＢ（１２２）がセンサＡ（１２１）と同様に気泡を検出する（Ｓｔｅｐ  ４、図１０ｄ）。そして、センサＡ（１２１）が気泡を検出した時間と、センサＢ（１２２）が気泡を検出した時間との差から流量を算出（計測）する。
【００２４】
二つのセンサ（１２１、１２２）を設けた気泡検出流路（１２７）の詳細を図１１および１２に示す。図１１は気泡導入量が少ない場合を、図１２は気泡導入量が多い場合を、それぞれ示している。気泡検出流路（１２７）は全てまたは一部が光を透過する材料でできており、気泡を検出するためのセンサ（１２１、１２２）は、光源（１２３、１２４）と受光部（１２５、１２６）とが互いに対面となるように設けており、各センサ（１２１、１２２）は、気泡検出流路（１２７）の流体（溶離液または気泡）が流れる方向に対し直列に設けている。
【００２５】
溶離液が流れる際の光量（光の透過率）と気泡が流れる際の光量（光の透過率）との違いから、溶離液と気泡との差異を検出することができる。一つの気泡が液流に沿って移動する場合、まず上流側に設けたセンサＡ（１２１）が先に気泡を検出後、時間をおいてセンサＢ（１２２）が気泡を検出する。センサＡ（１２１）からセンサＢ（１２２）間の気泡検出流路（１２７）の容量が一定かつ既知の場合、気泡が検知される時間差から流量を算出することできる。
【００２６】
気泡検出流路（１２７）の内径をＤ、センサＡ（１２１）からセンサＢ（１２２）までの距離をＬ、センサＡでの検出時間をＴ１、センサＢ（１２２）での検出時間をＴ２とすると、実流量（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）は下記式（３）により導かれる。
【００２７】
【数３】
2014102164.tif 000005
例えば、Ｄが１．０ｍｍ、Ｌが５０ｍｍ、Ｔ１が１分、Ｔ２が１．５分の場合、流量は毎時７８．５μＬと算出される。
【００２８】
前記式（３）により得られた実流量をもとに送液手段の制御を行なうことで常に一定の流量で液体クロマトグラフによる分析が可能となり、測定精度の向上につながる。
【００２９】
気泡導入量が少ない場合（図１１）は、溶離液から気泡に切り替わる際の信号差と気泡から液体に切り替わる際の信号差とはほぼ同じとなり、どちらを基準にしても気泡の検出や流量計算を行なうことができる。
【００３０】
一方気泡導入量が多い場合（図１２）は、気泡導入により気泡検出流路（１２７）側に流れる流体（溶離液＋気泡）量が一時的に増加し、また大量の気泡が圧縮されるのに時間を要する。このため、溶離液の流量が安定するまで時間を要する。このような場合、溶離液から気泡に切り替わる際の信号差と気泡から溶離液に切り替わる際の信号差とに差異が生じやすくなることから、気体から溶離液に切り替わる信号を基準に気泡の検出や流量計算を行なった方がよい。
【００３１】
液体クロマトグラフからの溶出液、空気導入部（１１０）および気泡検出流路（１２７）を接続する分岐ブロック（１３０）は、これら３つの流路が合流できる構造であれば特に限定はなく、その一例を図１３に示す。単純なＴ型構造のブロック（図１３ａ）を用いるのが一般的であるが、空気導入部（１１０）から導入された空気（気泡）がスムーズに移動できるように高低差を付けたブロック（図１３ｂ）であってもよい。また分岐ブロック（１３０）と気泡検出流路（１２７）とが一体化したブロック型構造（図１３ｃ）であってもよい。
【００３２】
次に、前述した方法で得られた実流量を基にした、流量補正方法について詳細に説明する。
【００３３】
本発明のクロマトグラフ装置に備える流量計で算出した流量をＦとし、その際の送液ポンプの駆動量をＤとすると、ＦとＤには比例関係がある。例えばチューブポンプ（図１４ａ）を使用した場合、駆動量Ｄはロータの回転数に相当し、ダイアフラムポンプ（図１４ｃ）の場合はダイアフラムを往復動作させるカムの回転数またはプランジャのストローク長に相当し、電磁式ダイアフラムポンプ（図１４ｄ）の場合は、ダイアフラムを往復動作させる周波数またはプランジャのストローク長に相当することになる。つまり送液ポンプの駆動量Ｄを上げると流量は増加し、下げると流量が減少する。この関係はおよそ正の比例関係にあり、多項式で近似が可能である。１次式で近似させた場合の流量補正方法を示した図を図１５（実流量が目的流量より少ない場合）および図１６（実流量が目的流量より多い場合）に示す。流量計で検出／算出された流量をＦ、その際のポンプ（１５）の駆動量をＤとした場合、下記式（１）に示す１次式で近似を行なう（ａは係数）。
【００３４】
【数４】
2014102164.tif 000006
目的流量をＦｔとした場合、それを得るのに必要なポンプの駆動量Ｄｔは下記式（２）で算出される。ここで得られた駆動量Ｄｔでポンプを駆動させることにより、目的の流量が得られることになる。
【００３５】
【数５】
2014102164.tif 000007
しかしながら一般的な簡易ポンプは、負荷圧により実流量が低下する傾向にあり、式（１）に示す１次式では広範囲にわたり近似ができないことが多い。一般的には、設定値を上げるほど実流量は理論値より低下する傾向にあり、式（４）に示すような指数関数に近い挙動を示すことが多い。
【００３６】
【数６】
2014102164.tif 000008
このため、目的流量と実流量が近い場合は、前述した単純な１次近似により補正可能であるが、目的流量と実流量の差が大きい場合は補正流量に誤差が生じてしまうことになる。このような場合、補正を複数回行なうことで、真の値に近づけることができる。
【００３７】
図１８に基づき詳細に説明する。まず１回目の補正を行ない、得られた駆動量（Ｄ２）で送液を行なう。駆動量と実流量が１次式で正確に近似できる場合は、この駆動量（Ｄ２）で目的流量Ｆｔとなるが、近似式が直線でないことから、両者に大きな差異が残る。そこで、この状態から再度実流量を計測し、２回目の補正を実施する。これにより得られた駆動量で得られる流量と目的流量との差異は小さくなる。なお、２回の補正では不十分な場合、同様な操作を繰り返すことで、実流量を目的流量により近づけることが可能となる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明は、溶離液を送液する送液手段と試料導入手段と分析カラムと検出手段と流量計とを備えた液体クロマトグラフ装置であって、前記流量計が、溶離液が流れる前記検出手段の下流側の流路に一定量の空気を導入可能な空気導入手段と前記空気導入手段で導入された空気の通過を検出可能な第１および第２のセンサ（ただし、第２のセンサは第１のセンサの下流側に設けている）と前記第１および第２のセンサからの検出信号に基づく空気の通過時間に基づき流路内を通過する溶離液の流量を計算する算出手段とを設けていることを特徴としている。
【００３９】
本発明の液体クロマトグラフ装置は、前記流量計にて、液体と空気との光の透過率の差を検知可能な第１および第２のセンサで溶離液と空気導入手段により導入した空気との界面を検知し、当該検知時間をそれぞれ記憶し、第１のセンサによる界面検知時間と第２のセンサによる界面検知時間との差を算出し、前記差と第１のセンサから第２のセンサまでの流路の配管容量から実流量Ｆを算出した上で、送液手段の駆動量Ｄとの関係を１次式（下記式（１））で近似させて係数（傾き）ａを算出し、
【００４０】
【数７】
2014102164.tif 000009
目的流量Ｆｔを得るのに必要な送液手段の駆動量Ｄｔを下記式（２）により算出し、
【００４１】
【数８】
2014102164.tif 000010
得られた駆動量Ｄｔで駆動する流量補正操作を１回以上行なうことで、簡便・安価な流量計を用いても、溶離液を精度高く送液をすることができ、液体クロマトグラフ装置における分析を高い精度で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の液体クロマトグラフ装置の一例を示した図である。
【図２】本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計の第一の例を示した図である。
【図３】本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計の第二の例を示した図である。
【図４】本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計の第三の例を示した図である。
【図５】本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計の第四の例を示した図である。
【図６】図２に示す流量計による流量計測操作を示した図である。
【図７】図２に示す流量計による流量計測操作を示した図である。
【図８】図２に示す流量計による流量計測操作を示した図である。
【図９】図５に示す流量計による流量計測操作を示した図である。
【図１０】図５に示す流量計による流量計測操作を示した図である。
【図１１】図２に示す流量計に設けた検出部による気泡の検出を示した図である。
【図１２】図５に示す流量計に設けた検出部による気泡の検出を示した図である。
【図１３】本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計のうち、空気導入部から導入される空気と溶離液との合流部の一例を示した図である。
【図１４】本発明の液体クロマトグラフ装置で使用可能な、簡易ポンプの一例を示した図である。
【図１５】本発明の液体クロマトグラフに備えた流量計で計測した結果、目的流量より少ない場合において、実流量を補正する方法を示した図である。
【図１６】本発明の液体クロマトグラフに備えた流量計で計測した結果、目的流量より多い場合において、実流量を補正する方法を示した図である。
【図１７】本発明の液体クロマトグラフに備えた流量計で計測した結果、目的流量からの乖離が大きい場合において、実流量を補正する方法を示した図である。
【図１８】実施例１で使用した本発明のクロマトグラフ装置を示した図である。
【図１９】図１８に示す装置に備えた流量計の詳細図である。
【図２０】図１９に示す流量計で計測した流量値と、天秤を用いて計測した実流量値とを比較した図である。
【図２１】図１８に示す装置に備えた送液ポンプのプランジャ往復運動周期を変化させたときの、溶出時間（ピーク）の変化を示した図（クロマトグラム）である。
【図２２】図１８に示す装置に備えた送液ポンプのプランジャ往復運動周期を変化させたときの、図１９に示す流量計に設けた検出部におけるセンサ出力の変化を示した図である。
【図２３】実施例２で使用した本発明のクロマトグラフ装置を示した図である。
【図２４】図２３に示す装置に備えた流量計の詳細図である。
【図２５】図２４に示す流量計で計測した流量値を基に、溶離液の流量を補正したことによる効果を示した図である。
【図２６】図２４に示す流量計で計測した流量値を基に、溶離液の流量を補正した場合と補正しない場合とで、流量および溶出時間の再現性を比較した図である。
【図２７】図２４に示す流量計で流量値を計測した結果、目的流量の乖離が大きい場合における、溶離液を流量補正したことによる効果を示した図である。
【図２８】図２４に示す流量計で流量値を計測した結果、目的流量の乖離が大きい場合における、溶離液の流量補正を複数回行なうことによる効果を示した図である。
【図２９】図２３に示す装置に備えた送液ポンプの流量特性を示した図である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００４４】
実施例１
図１８に示す本発明のクロマトグラフ装置を用いて、当該装置に備える流量計の有用性を評価した。溶離液（１０）、送液ポンプ（１５）、試料導入バルブ（２０）、抵抗管（５５）、紫外可視検出器（３５）の順に直列に備え、検出器（３５）の下流側に流量計（１００）を備えている。溶離液（１０）は純水を用い、試料導入バルブ（２０）で導入する試料として４％アセトン溶液を用いた。送液ポンプ（１５）としてＫＮＦ社製電磁式ダイアフラムポンプを使用し、プランジャのストローク長を最大に設定し、プランジャの往復動作の周期を調整することで流量を調整した。抵抗管（５５）は本発明の流量計の効果を明確にするため分析カラムの代わりに備えたものであり、長さ２ｍ、内径０．４ｍｍの管である。なお実流量の計測が可能なように、流量計（１００）から排出された液を電子天秤（４０）に置いた廃液容器（４５）に全量回収できる構成としている。電子天秤による実流量の算出は、２．５分間での重量変化の移動平均により算出した（表１）。
【００４５】
【表１】
2014102164.tif 000011
図１８に示す液体クロマトグラフ装置に備えた流量計（１００）の詳細を図１９に示す。電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）（高砂電気（株）製  定量ポンプ  ＰＫＰ−５００Ｐ）を空気導入手段として用い、気泡検出流路（１２７）として内径０．８ｍｍ、外径１／１６インチの光透過性チューブ（ＰＴＦＥ製）を用い、二つのフォトセンサ（１２１（センサＡ）、１２２（センサＢ））を１０ｃｍ離して設けた。検出器（３５）下流側から排出された溶離液は導管を通り、３方分岐ブロック（１３０）のポートＡに導入される。なお３方分岐ブロック（１３０）のポートＢには電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）の吐出口（出口側）が、ポートＣに気泡検出流路（１２７）が、それぞれ接続される。通常の状態では、電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）を吸引状態（ダイアフラムが膨らんだ状態）とし、検出器（３５）下流側から排出された溶離液は、３方分岐ブロック（１３０）のポートＡからポートＣを通り、全量、気泡検出流路（１２７）に流れ、廃液容器（４５）へ排出される。このとき電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）は吸引口と吐出口に逆止弁を有しているため、検出器（３５）から排出された液がダイアフラムポンプ側に流れることはない。流量を計測する場合は、電磁式ダイアフラムポンプ（１１６）を吐出状態（ダイアフラムが縮んだ状態）とする。これにより、ダイアフラム内の空気が排出され、３方分岐ブロック（１３０）で検出器（３５）から排出された液と合流した後、気泡検出流路（１２７）に流れる。ここで導入された空気と溶離液との差を気泡検出流路（１２７）に設けた二つのフォトセンサ（１２１、１２２）で検知し、時間差で除することで流量を算出する。
【００４６】
送液ポンプ（１５）の往復動作の周期を変化させ、一定時間経過後、流量計（１００）で流量を計測（算出）した。また試料導入バルブ（２０）から導入した試料のピークでの溶出時間も測定した。なおこの間、確認のため、電子天秤（４０）を用いた実流量計測も同時に実施している。
【００４７】
図１９に示す流量計（１００）に設けたフォトセンサ（１２１、１２２）の応答時間、当該時間から算出した流量、および電子天秤（４０）を用いて算出した流量を表２に、図１９に示す流量計（１００）を用いて算出した流量または電子天秤（４０）を用いて算出した実流量とピークでの溶出時間との関係、および図１９に示す流量計（１００）を用いて算出（計測）した流量と電子天秤（４０）を用いて算出（計測）した流量との関係を図２０に、送液ポンプのプランジャ往復運動周期を変化させたときの試料のクロマトグラムを図２１に、図１９に示す流量計（１００）に設けたフォトセンサ（１２１、１２２）の出力と図２２に、それぞれ示す。
【００４８】
【表２】
2014102164.tif 000012
図２２より、送液ポンプ（１５）のプランジャ往復動作の周期（往復周期）が短くなるにつれ、センサＡ（１２１）とセンサＢ（１２２）との応答時間の差が短くなる、つまり流量が高くなっていることが分かる。例えば４．０秒サイクルで送液した場合、センサＡ（１２１）とセンサＢ（１２２）との応答時間の差は０．２４６分であり、検出管の容量（５０．２４μＬ）を当該応答時間で除すると、流量は毎分２０２．７１μＬと算出できる。同じ条件で、電子天秤（４０）を用いて算出した流量は毎分２４２．８０μＬであった。また２．０秒サイクルで送液した場合、センサＡ（１２１）とセンサＢ（１２２）との応答時間の差は０．１４３分であり、検出管の容量（５０．２４μＬ）を当該応答時間で除すると、流量は毎分３４８．８５μＬと算出できる。同じ条件で、電子天秤（４０）を用いて算出した流量は毎分３８０．４４μＬであった。
【００４９】
電子天秤（４０）を用いて算出した流量の逆数と溶出時間との間には良好な相関関係が見られる（Ｒ２＝０．９９５４）（図２０ａ）。一方、図２１に示す流量計（１００）で算出した流量の逆数と溶出時間との間にも、電子天秤（４０）を用いた場合より精度が若干劣るものの、良好な相関関係が見られる（Ｒ２＝０．９７５２）（図２０ｂ）。また電子天秤（４０）を用いて算出した流量値と、図１９に示す流量計（１００）で算出した実流量値との間にも良好な相関関係が見られる（Ｒ２＝０．９７２）。以上より、図１９に示す流量計で算出される流量値は電子天秤を用いて算出した流量と比例関係があり、図１９に示す流量計で算出した流量値を基に流量補正が可能であることを示している。
【００５０】
実施例２
本発明の液体クロマトグラフに備える流量計により算出した流量を基にして、流量をある一定の値に補正する効果について検証した。
【００５１】
本実施例では図２３に示すクロマトグラフ装置を用いて評価した。溶離液（１０）、送液ポンプ（１５）、試料導入バルブ（２０）、分析カラム（３０）、紫外可視検出器（３５）の順に直列に備え、検出器（３５）の下流側に本発明の流量計（１００）を備えている。溶離液（１０）は１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム＋１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｄ−ソルビトールを用い、試料導入バルブ（２０）で導入する試料として全血を用いた。送液ポンプ（１５）としてＫＮＦ社製電磁式ダイアフラムポンプを使用し、プランジャのストローク長を最大に設定し、プランジャ往復動作の周期を調整することで流量を調整した。分析カラム（３０）はＴＳＫｇｅｌ  Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ（内径６ｍｍ×長さ１０ｍｍ）（東ソー製）を用い、カラムオーブン（６５）により４５℃で温調して使用した。なおこの間、確認のため、流量計（１００）から排出された液を電子天秤（４０）に置いた廃液容器（４５）に全量回収できる構成としている。電子天秤による流量の算出は、実施例１と同様な方法で算出した。
【００５２】
図２３に示す分析装置に備えた流量計（１００）の詳細を図２４に示す。図２４に示す流量計は、二つのフォトセンサ（１２１（センサＡ）、１２２（センサＢ））間の距離が５０ｃｍ離れている他は、図１９に示す流量計と同じである。
【００５３】
実流量を故意に変化させた状態から、目的流量まで補正可能か、以下に示す方法で検証した。なお溶出挙動も確認するため、流量補正前の時点と流量補正後の時点でそれぞれ試料を注入し、ピークでの溶出時間の確認も行なった。
［１］送液ポンプ（１５）のプランジャ往復動作の周期を１．１から１．４秒の範囲で故意に変化させる。
［２］図２４に示す流量計（１００）で流量を算出する。
［３］補正後に毎分５００μＬとなる、プランジャ往復動作の周期を算出する。
［４］［３］で算出された周期で送液ポンプ（１５）で動作させ、かつ図２４に示す流量計（１００）で流量を算出する。
【００５４】
送液ポンプ（１５）の流量Ｆと駆動量Ｄには、下記式（１）に示す比例関係がある（ａは係数）。なお今回送液ポンプ（１５）として使用した、電磁式ダイアフラムポンプの場合、駆動量Ｄはプランジャ往復動作の周期（Ｃ）の逆数に相当する（下記式（５））。
【００５５】
【数９】
2014102164.tif 000013
また目的の流量をＦｔとした場合、Ｆｔを得るのに必要なポンプ駆動量（Ｄｔ）は下記式（６）のように表される。
【００５６】
【数１０】
2014102164.tif 000014
上記式（６）で得られたポンプの駆動量（Ｄｔ）で駆動することにより、目的の流量に補正された流量が得られる。
【００５７】
図２４に示す流量計（１００）に設けたフォトセンサ（１２１、１２２）の応答時間、当該時間から算出した流量を表３に示す。なお表３において、左側は流量補正前での値であり、右側は毎分５００μＬになるように流量補正した後での値である。
【００５８】
【表３】
2014102164.tif 000015
図２３は流量補正前後における流量変化（図２５ａ）およびピーク溶出挙動（クロマトグラム変化）（補正前：図２５ｂ、補正後：図２５ｃ）を示した図である。表３および図２３からわかるように、たとえ補正前の流量がばらついていても、図２４に示す流量計（１００）による流量の算出および算出された流量値に基づく流量補正により、ほぼ目的流量（毎分５００μＬ）に補正することができ、試料のクロマトグラムの挙動（溶出挙動）も一定になることがわかる。なお溶出時間の再現性は、流量補正前は０．６３％だったものが、流量補正後では０．１１％と大きく改善されている（図２６）。
【００５９】
実施例３
図２３に備えた送液ポンプのプランジャ駆動周期の逆数（１／Ｃｙｃｌｅ）と実流量との関係（図２９）からもわかるように、ポンプの駆動周期の逆数（１／Ｃｙｃｌｅ）が０から１．０までの範囲ではほぼ原点を通る１次式で精度良く近似できる（Ｒ２：０．９７８８）。しかしながら、０から２．０までの広い範囲を対象とした場合は１次式では大きな誤差が生じてしまう（Ｒ２：０．４３１１）。つまり、特に高い流量域において、補正前の流量と目的流量とが乖離する場合、原点を通る１次式近似に基づく補正では補正が難しいことがわかる。そこで本実施例では、補正前の流量と目的流量とが乖離している場合における、流量計による補正の効果を検証した。クロマトグラフ装置（図２３）および流量計（図２４）は実施例２と同様である。
【００６０】
送液ポンプ（１５）のプランジャ往復動作の周期を０．５から１．０秒と、実施例２よりも乖離量を大きくして送液を行なった後、実施例２の［２］から［４］に記載の方法で、流量補正および流量算出を行なった。なお溶出挙動を確認するため、流量補正前の時点と流量補正後の時点でそれぞれ試料を導入し、ピークでの溶出時間の確認を行なった。
【００６１】
図２４に示す流量計（１００）に設けたフォトセンサ（１２１、１２２）の応答時間、当該時間から算出した流量を表４に示す。なお表４において、左側は流量補正前での値であり、右側は毎分５００μＬになるように流量補正した後での値である。
【００６２】
【表４】
2014102164.tif 000016
図２７は流量補正前後における流量変化（図２７ａ）およびピーク溶出挙動（クロマトグラム変化）（補正前：図２７ｂ、補正後：図２７ｃ）を示した図である。表４および図２７からわかるように、たとえ補正前の流量がばらついていても、図２４に示す流量計（１００）による流量の算出および算出された流量値に基づく流量補正により、流量が目的値（毎分５００μＬ）に近づき、試料のクロマトグラムの挙動（溶出挙動）も一定に近づくことがわかる。しかしながら、実施例２の場合と比較し、補正の効果は小さい。これは実施例２の場合と比較し、補正前の流量と目的流量の乖離が大きいためである。
【００６３】
補正前の流量と目的流量の乖離が大きい場合は、本発明の流量計による流量算出／流量補正の操作を複数回繰り返すことで、目的流量により近づけることができる。以下に、具体例を示す。
【００６４】
表５は、補正前の流量が毎分７３９μＬであり、目的流量が毎分５００μＬであるとき（補正前の流量が過大のとき）の、流量補正の例を示している。１回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が０．７４秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分６９８μＬとなる。２回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が１．０３秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分５７５μＬとなる。３回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が１．１８秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分５１６μＬとなる。４回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が１．２１７秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分４９９μＬとなる。このように流量算出／流量補正の操作を複数回繰り返すことで、目的流量（毎分５００μＬ）に近づけることができる。
【００６５】
【表５】
2014102164.tif 000017
表６は、補正前の流量が毎分３２９μＬであり、目的流量が毎分５００μＬであるとき（補正前の流量が過小のとき）の、流量補正の例を示している。１回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が１．３０秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分４７７μＬとなる。２回目の補正ではプランジャ往復動作の周期が１．２４秒と算出され、流量計で算出される流量は毎分４９９μＬとなる。このように、補正前の流量が過大のとき（表５）と同様、流量算出／流量補正の操作を複数回繰り返すことで、目的流量（毎分５００μＬ）に近づけることができる。
【００６６】
【表６】
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図２８に、表５および表６に示す流量補正を行なった際の溶出時間変動（クロマトグラム変化）（表５に示す流量補正：図２８ａ、表６に示す流量補正：図２８ｂ）および流量変化（表５に示す流量補正：図２８ｃ、表６に示す流量補正：図２８ｄ）を示す。
【００６７】
以上をまとめると、本発明の液体クロマトグラフ装置に備える流量計を用いて流量補正を行なうことで、実流速を常に一定に保つことができ、精度の高い分析が可能となる。
【符号の説明】
【００６８】
１０：溶離液
１５：送液ポンプ
２０：試料注入バルブ
２５：試料ループ
３０：分析カラム
３５：検出器
４０：電子天秤
４５：廃液容器
５０：流量算出手段（確認用）
５５・１５０：抵抗管
６０：流量算出手段およびポンプ制御手段
６５：カラムオーブン
１００：流量計
１１０：空気導入部
１１１・１１２：ピンチバルブ
１１３・２１１：軟質チューブ
１１４・１１５・２３４・２３５・２４５・２４６：逆止弁
１１６：電磁式ダイアフラムポンプ
１１７・２３２・２４２：プランジャ
１１８・２３３・２４３：ダイアフラム
１１９・２４４：電磁石
１２０：検出部
１２１・１２２：センサ
１２３・１２４：光源部
１２５・１２６：受光部
１２７：気泡検出流路
１３０：分岐ブロック
１４０・１４１：空気（気泡）
２１２：チューブ押さえ
２１３：回転体
２２１：ギア
２２２：チャンバ
２３１：カム
２４１：ばね
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014102164.tif 000025
【図６】
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【図７】
2014102164.tif 000027
【図８】
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【図９】
2014102164.tif 000029
【図１０】
2014102164.tif 000030
【図１１】
2014102164.tif 000031
【図１２】
2014102164.tif 000032
【図１３】
2014102164.tif 000033
【図１４】
2014102164.tif 000034
【図１５】
2014102164.tif 000035
【図１６】
2014102164.tif 000036
【図１７】
2014102164.tif 000037
【図１８】
2014102164.tif 000038
【図１９】
2014102164.tif 000039
【図２０】
2014102164.tif 000040
【図２１】
2014102164.tif 000041
【図２２】
2014102164.tif 000042
【図２３】
2014102164.tif 000043
【図２４】
2014102164.tif 000044
【図２５】
2014102164.tif 000045
【図２６】
2014102164.tif 000046
【図２７】
2014102164.tif 000047
【図２８】
2014102164.tif 000048
【図２９】
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