(57)【要約】【課題】ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの一部の配列を用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及び、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供すること。【解決手段】配列番号１、２及び３に記載の塩基配列、前記配列番号１、２及び３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するＤＮＡとする。【選択図】図１
2014207918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に記載の塩基配列、前記配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するＤＮＡ。
【請求項２】
前記配列番号３に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部である請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡを用いてｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３遺伝子は、人の多がん組織及びがん細胞において、最も高頻度で変異・欠失が観察されている遺伝子である（例えば下記非特許文献１参照）。変異ｐ５３遺伝子を有するリー・フラウメニ症候群患者やｐ５３ノックアウトマウスにおいてがんが多発することから、ｐ５３遺伝子の異常はがんの発生・進展に密接に関連していると考えられている（例えば下記非特許文献２、３参照）。
【０００３】
ｐ５３は、転写活性調節ドメインを含むＮ末端領域と、ＤＮＡ結合に関与するＤＮＡ結合領域と、四量体形成ドメインを含むＣ末端領域からなり、がん細胞で観察される変異は、ＤＮＡ結合領域に集中している。
【０００４】
野生型ｐ５３は転写調節因子として機能し、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシスに関わる多くの遺伝子の発現に関与していることが知られている。例えば野生型ｐ５３蛋白質は、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであるｐ２１遺伝子（別名：ＷＡＦ１、ＣＩＰ１、ＳＤＩ１）の転写を活性化して細胞周期停止を誘導する。また野生型ｐ５３は、Ｂａｘ遺伝子、Ｎｏｘａ遺伝子、Ｐｕｍａ遺伝子等の転写を活性化してアポトーシスを誘導することが知られている（例えば下記非特許文献４乃至６参照）。
【０００５】
これらのことから、ｐ５３の転写調節因子としての活性を測定することによって、発がんやアポトーシスの進行程度を推測することが可能であり、また、ｐ５３の転写誘導活性を調節することによって発がんやアポトーシスを抑制することが可能である。
【０００６】
Ｃ／ＥＢＰは塩基性アミノ酸の領域とロイシンジッパーをもったｂＺＩＰタンパク質であり、異なった遺伝子にコードされたＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰγ、ＣＲＰ１、ＣＨＯＰからなるＣ／ＥＢＰファミリーを構成している（例えば下記非特許文献７参照）。Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδは急性期反応に重要な転写因子である。Ｃ／ＥＢＰαはｐ２１を介して細胞周期を止め、細胞増殖抑制作用を示し（例えば下記非特許文献８参照）、がん抑制遺伝子の一つである（例えば下記非特許文献９参照）。
【０００７】
ところでｄｅｃｏｒｉｎは低分子ロイシンリッチ・プロテオグリカンと呼ばれる分子ファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ−ＩＲ等の増殖因子受容体に結合して強い細胞増殖やアポトーシスに影響を及ぼす（例えば下記非特許文献１０参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，５４，４８５５−４８７８
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，７６，１−１４
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６，２１５−２２１
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，１９９５，８０，２９３−２９９
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８，１０５３−１０５８
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，２００１，７，６８３−６９４
【非特許文献７】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９８，７９，３６９−３９１
【非特許文献８】Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９６，１０，８０４−８１５
【非特許文献９】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００５，２０２，８５−９６
【非特許文献１０】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８，２８３，２１３０５−２１３０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記従来の技術には、Ｃ／ＥＢＰファミリー、及びｐ５３の標的遺伝子のプロモーターを用いた遺伝子発現制御に関する記載もあるが、これらの生物学的重要性を考慮すれば１つでも多くの標的遺伝子の同定が求められている。
【００１０】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターにＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３が作用する領域を同定し、それらの転写因子に依存して任意の遺伝子を発現させる方法、及び、それらの転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための一手段に係るＤＮＡは、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を制御する機能を有するものである。
【００１２】
また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを他の任意の遺伝子の上流につないで、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδ依存的に他の遺伝子を発現させる。
【００１３】
また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを用いて、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する。
【００１４】
また、上記課題を解決するための他の一手段に係るＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するものである。
【００１５】
また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを用いて、ｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
以上、本発明により、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３に依存して任意の遺伝子を発現させる方法、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する方法、及び、ｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】種々の転写因子によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化である。 Ｄｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃ（０．１μｇ）をＳＶ４０プロモーターにより恒常的にウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミドｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ（０．０１μｇ）、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４、またはｐ５３の発現ベクター、またはインサート遺伝子を含まない空の対照ベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ）（０．３μｇ）とともにマウス線維芽細胞ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ試薬（インビトロジェン社）を用いて導入した。２日間培養した後、ルシフェラーゼ活性をデュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社）を用いて測定し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するホタル・ルシフェラーゼ活性の比を算出した。その結果、対照ベクターに比べＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２〜４６倍に上昇していた。ＨＮＦ４はほとんど影響がなかった。
【図２】ｐ５３によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 レポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−１２３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−１０３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−７３６：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−５９９：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−４１４：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃ、又はＤｅｃｏ（−２０４：＋４２）−Ｌｕｃ（０．１μｇ）をコントロールプラスミドｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ（０．０１μｇ）、及びｐ５３発現ベクター（０．３μｇ）とともにｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞に共導入し、ルシフェラーゼ活性の変動を調べた。その結果、−２５２〜−２０５の領域を持つレポーターに対して最も顕著なホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。
【図３】ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｐ５３によりｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 図２と同様にレポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃ、またはＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）ｍ−Ｌｕｃに対するｐ５３の用量依存的活性化を調べた。Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）ｍ−Ｌｕｃはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５２〜−２０５の領域に見られるｐ５３の結合コンセンサス配列（５’−ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ−３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）のＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドである。この活性化はｐ５３の用量に依存しており、ｐ５３結合コンセンサス配列に依存していた。
【図４】Ｕ−８７グリオーマ細胞におけるｐ５３によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 図３と同様にレポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃ、またはＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対するｐ５３用量依存的活性化をヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７を用いて調べた。Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対して最も高い活性化を示した。
【図５】クロマチン免疫沈降法によるｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合解析を示す図である。図中の矢印はＰＣＲ産物の位置を示す。 ＣｈＩＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）を用いてクロマチン免疫沈降解析を行なった。アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１、及びＢｐ５３−１２；サンタクルーズ社）を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（−４１３〜−２３２）に設計したプライマー（ＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ｐ５３抗体を用いた時にのみ予想された１８２塩基対のＤＮＡのバンドが検出された。このことはｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーターに直接結合することを示唆している。矢印は予想されるＰＣＲ産物の位置を示す。
【図６】ＥＭＳＡによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターとｐ５３の結合を示す図である。 ＥＭＳＡ法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎで標識し、アドリアマイシン処理Ｕ−８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体を反応させ、ＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した。移動度の低いバンドはＤＮＡ−タンパク質複合体を示す。レーン１：標識プローブのみ、核抽出液なしレーン２：標識プローブ＋核抽出液レーン３：標識プローブ＋核抽出液＋抗ｐ５３抗体（Ｎ−１９）レーン４：標識プローブ＋核抽出液＋抗ｐ５３抗体（Ｍ−１９）レーン５：標識プローブ＋核抽出液＋抗ＮＦ-κＢ抗体レーン６：標識プローブ＋核抽出液＋非標識プローブ（×８０）これらの結果はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。
【図７】Ｃ／ＥＢＰαによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰαによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は−２０４〜＋４２の領域に対して最も著しく、次いで−４１４〜−２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、−２８７〜−２０５の領域では低下した。このことからＣ／ＥＢＰαはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２、及び−４１４〜−２８８の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【図８】Ｃ／ＥＢＰβによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰβによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は−２０４〜＋４２、及び−４１４〜−２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、−２８７〜−２０５の領域では低かった。このことからＣ／ＥＢＰβはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２、及び−４１４〜−２８８の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【図９】Ｃ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 Ｃ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は−２０４〜＋４２の領域に対して最も高く、その他のレポーターでは３分の１以下であった。このことからＣ／ＥＢＰδはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２の領域に主に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【図１０】ＨＮＦ４によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 ＨＮＦ４について図２と同様にｄｅｃｏｒｉｎプロモーターへの影響を調べた。Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した。
【図１１】ＣＯＵＰ−ＴＦＩによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。 ＣＯＵＰ−ＴＦＩによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ＣＯＵＰ−ＴＦＩはＤｅｃｏ（−２８７：−２０５）−ＬｕｃとＤｅｃｏ（−２０４：＋４２）−Ｌｕｃに対して最も高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃでは活性化が減弱したが完全には消失しなかった。従って、それらの作用領域は確定しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を活性化型Ｈａ−ｒａｓ遺伝子により形質転換したｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞はがん細胞の様相を呈するが、そこにＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４及びＣ／ＥＢＰα遺伝子を導入し発現させたところ、細胞の形態が正常型に復帰することを発見した。そして、これらの遺伝子導入細胞と親株のｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞について遺伝子発現の差をマイクロアレイ法により網羅的に解析したところ、いずれもｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現が上昇していた。すなわち、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４、及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の作用により、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現が誘導されるのではないかと考えられた。
【００１９】
一方、ｐ５３は代表的ながん抑制遺伝子であり、その遺伝子をｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入したところ、上記と同様の形態的正常復帰が観察された。またマウスｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子を導入しても同様の形態的正常復帰が観察された。これらのことから、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４、及びＣ／ＥＢＰαとｐ５３、及びｄｅｃｏｒｉｎの間に何らかの関係があると推定された。
【００２０】
そこで次に、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現調節機構について解析した。解析は、後述の実施例から明らかとなるが、ヒト培養食道がん細胞株Ｔ．ＴｎのゲノムＤＮＡを鋳型として、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（−１３３８〜−２０５）をＰＣＲ法により増幅して単離し、ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＧＬ３（プロメガ社）に組み込み、レポータープラスミドｄｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃを作製した。そしてこのレポータープラスミドをＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰα、及びｐ５３の発現ベクターとともにマウス線維芽細胞ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３に導入し、２日後にルシフェラーゼ活性を測定した。Ｃ／ＥＢＰαと同じ遺伝子ファミリーであるＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２〜４６倍に上昇していた（図１参照）。なおＨＮＦ４はほとんど影響がなかった。
【００２１】
次にこのルシフェラーゼ・レポータープラスミドに組み込まれたｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（−１３３８〜−２０５）を段階的に５’側から削除して７種類のレポータープラスミド（Ｄｅｃｏ（−１２３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−１０３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−７３６：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−５９９：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−４１４：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃ）を作製した。またＤｅｃｏ（−２０４：＋４２）−Ｌｕｃも別途作製した。ｐ５３によるこれらのプラスミド由来のルシフェラーゼ活性の変動を調べたところ、−２５２〜−２０５の領域で最も顕著なルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図２参照）。この活性上昇はｐ５３の用量に依存しており（図３参照）、ヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７でも同様の結果が得られた（図４参照）。
【００２２】
このｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（−２５２〜−２０５）にはｐ５３の結合コンセンサス配列（５’−ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ−３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）が含まれていた。そこでこの配列のうち最も重要であると推定されているＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）ｍ−Ｌｕｃを作製して調べたところ、ｐ５３による活性化は５分の１程度に減少した（後述の図２、及び３参照）。これらのことからｐ５３はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５２〜−２０５の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【００２３】
次に、クロマチン免疫沈降法により、アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域に設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅したところ、予想されたＤＮＡのバンドが検出された（図５参照）。このことはｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域に直接結合することを示唆している。
【００２４】
次にＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎで標識し、Ｕ−８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体とＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３−（４−ｍｅｔｈｏｓｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）Ｔｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］Ｄｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した結果、ＤＮＡ−タンパク質複合体が移動度の低下したバンドとして検出された（図６）。このバンドは核抽出液の非存在下では観察されなかった。また、過剰量の非標識プローブを加えると消失した。また、抗ｐ５３抗体（Ｎ−１９、またはＭ−１９）を加えるとコントロールの抗ＮＦ−κＢ抗体を加えたサンプルに比べ、バンドが薄くなった。このことはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。
【００２５】
一方、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδによるルシフェラーゼ活性の上昇は−２０４〜＋４２の領域を含むレポータープラスミドで最も高かった（後述の図７、８、９参照）。このことからこれらのＣ／ＥＢＰファミリーはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２の領域に主に作用すると考えられた。また、Ｃ／ＥＢＰα、及びＣ／ＥＢＰβでは−４１４〜−２０５の領域で高く、−２８７〜−２０５の領域では減少した（後述の図７、８、９参照）。このことからＣ／ＥＢＰαとＣ／ＥＢＰβはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−４１４〜−２８８の領域にも作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【００２６】
ＨＮＦ４はｐ５３と同様にＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した（図１０参照）。また、ＣＯＵＰ−ＴＦＩはＤｅｃｏ（−２０４〜＋４２）−Ｌｕｃ、及びＤｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃで高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃでは活性が低下した（図１１参照）。しかしながら、これらはＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対しても発現誘導活性を示したことからそれらの作用領域は明確でなかった。
【００２７】
すなわち、本発明の第一の形態に係るＤＮＡは、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を制御する機能を有する。なお配列番号１に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−４１４〜−２８８の領域を示すものであり、配列番号２に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２の領域を、配列番号３は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５２〜−２０５の領域をそれぞれ示している。
【００２８】
なおこの形態において、配列番号１及び２に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部であることが好ましい。
【００２９】
また本発明の第二の形態に係る遺伝子を発現させる方法は、上記第一の形態に係るＤＮＡを、他の遺伝子の上流につないで、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδ依存的に他の任意の遺伝子を発現させる。
【００３０】
また本発明の第三の形態に係るＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する方法は、上記第一の形態に係るＤＮＡを用いて行なう。
【００３１】
また、本発明の第四の形態に係るＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有する。
【００３２】
なおこの形態において、配列番号３に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部であることが好ましい。
【００３３】
また本発明の第五の形態に係るｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法は、上記第四の形態に係るＤＮＡを用いて行なう。
【００３４】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー、プラーク由来のＤＮＡ又はこのＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在か６５℃で葉イブリダイゼーションを行なった後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるものを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００３５】
また、本発明において用いられるレポータープラスミドはルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドに限られず、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、オワンクラゲ蛍光発色体（ＧＦＰ）を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明の一形態に係る遺伝子を発現させる方法において、接続させる遺伝子は、限定されるわけではないが、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス阻害遺伝子、殺細胞遺伝子、及び、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の標的で発現異常を引き起こした遺伝子などが考えられる。薬剤耐性遺伝子の例としては、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｔｒｐＢ、ｈｉｓＤ、ＯＤＣなどがある。ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与える遺伝子であり、ｇｐｔはミコフェノール酸への耐性を与える遺伝子であり、ｎｅｏはアミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与える遺伝子であり、ｈｙｇｒｏはハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子である。またｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを許容する遺伝子であり、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを許容する遺伝子であり、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子）は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を与える遺伝子である。アポトーシス阻害遺伝子の例としてはＩＡＰを挙げることができる。ＩＡＰ遺伝子の上流に配列番号２の遺伝子を組み込んで細胞に予め導入しておけば、薬物処理によりｐ５３を活性化させた場合にアポトーシスは起こさず、細胞周期の停止を優先的に起こすことができる。逆に、がん細胞などを死滅させたい場合には殺細胞遺伝子を接続させることによって目的を達成できる。Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ｐ５３の標的で発現異常を引き起こした遺伝子の発現を正常に戻すためには、本実施形態に係るプロモーターＤＮＡを有する標的遺伝子をアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのベクターに挿入し、又は、リポソームなどに封入して体細胞に導入することにより、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ｐ５３の正常な転写制御下に標的遺伝子を発現させることができる。
【００３７】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に記載のＤＮＡを過剰に細胞内に導入し、そこにＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ又はｐ５３を結合させてそれらの機能を制御する際、このプロモーターＤＮＡの少なくとも一部を含むＤＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ又はｐ５３との結合を拮抗阻害しうる。拮抗阻害に用いるＤＮＡは、通常少なくとも６塩基の鎖長を有する。
【００３８】
またｄｅｃｏｒｉｎｅプロモーターＤＮＡは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列を採用することができる。当業者であれば、種々の文政生物学的手法、例えば制限酵素法、ＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、部位特異誘発法による変異導入、合成変異ＤＮＡの導入などの方法で、天然型プロモーターＤＮＡの塩基配列の一部を他の塩基に置換したり、あるいは、一部塩基を欠失、または、付加させることにより、天然型と同等のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有し、液が置換、欠失、及び／又は付加した塩基配列を有するＤＮＡも使うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の具体的な実施の例について詳細に説明する。
【００４０】
（実施例１）
まず、ヒト培養食道癌細胞Ｔ．ＴｎからゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＡＣ００７１１５．１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １２ ｃｌｏｎｅの１２０３０ｂａｓｅ〜１３１６３ｂａｓｅ［ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（−３８〜−２０５）；全長１１３４塩基対］、及び１３１６４塩基対〜１３４０９塩基対［ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（−２０４〜＋４２）；全長２４６塩基対］の領域をＰＣＲ法により増幅した。その際、ＸｈｏＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩサイトをそれぞれ末端に導入し、ＴＡクローニングにてサブクローニングを行い、ホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）のＸｈｏｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ間に組み込み、レポータープラスミドＤｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃを作製した。
【００４１】
そして、このレポータープラスミドをＳＶ４０、ＣＭＶプロモーターにより恒常的にウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミド−ｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ、又はｐＧＬ４．７５［ｈＲｌｕｃ／ＣＭＶ］ｖｅｃｔｏｒ、及びＣＯＵＰ−ＴＦＩ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、又はｐ５３の発現ベクター、又はインサート遺伝子を含まない空の対照ベクターとともにマウス線維芽細胞ｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ試薬（インビトロジェン社）を用いて導入した。そして２日間培養した後、ルシフェラーゼ活性をデュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社）を用いて測定し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するホタル・ルシフェラーゼ活性の比を算出した。この結果、対照ベクターに比べＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ−ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２〜４６倍に上昇していた（図１）。なおＨＮＦ４に関しては殆ど影響がなかった。
【００４２】
（実施例２）
ルシフェラーゼ・レポータープラスミドＤｅｃｏ（−１３３８：−２０５）−Ｌｕｃに組み込まれたｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（−１３３８〜−２０５）を段階的に５’側から削除して７種類のレポータープラスミド（Ｄｅｃｏ（−１２３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−１０３７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−７３６：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−５９９：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−４１４：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃ）をｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＴ法により、ＫＯＤ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いて作製した。そして、これらのプラスミドまたはＤｅｃｏ（−２０４：＋４２）−Ｌｕｃとコントロールプラスミド−ｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ、及びｐ５３発現ベクターをｒａｓ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性の変動を調べたところ、−２５２〜−２０５の領域で最も顕著なホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図２）。なおこの活性上昇は、ｐ５３の用量に依存しており、（図３）、ヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７でも同様の結果が得られた（図４）。
【００４３】
（実施例３）
ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５２〜−２０５の領域にはｐ５３の結合コンセンサス配列（５’−ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ−３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）が含まれていた。そこで、この配列のうち最も重要であると推定されるＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドＤｅｃｏ（−２５２：−２０５）ｍ−ＬｕｃをＫＯＤ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて作製して調べたところ、ｐ５３による活性化は１７０倍から３０倍程度に減少した（図３）。このことからｐ５３はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターのＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧを含む−２５２〜−２０５の領域に作用して顆粒の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
【００４４】
（実施例４）
ＣｈＩＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）を用いて、クロマチン免疫沈降解析を行なった。アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ−８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１、及びＢｐ５３−１２；サンタクルーズ社）を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（−４１３〜−２３２）に設計したプライマー（ＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧ、及び、ＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧ）を用いてＰＣＴ法により増幅したところ、予想された１８２塩基対のＤＮＡのバンドが検出された（図５）。このことは、ｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーターに直接結合することを示唆している。
【００４５】
（実施例５）
ＥＭＳＡ法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎで標識し、Ｕ−８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体とＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した。ＤＮＡ−タンパク質複合体を示す移動度の低いバンドが検出された（図６、レーン２）。このバンドは核抽出液の非存在下では観察されなかった（レーン１）。また、過剰量の非標識プローブを加えると消失した（レーン６）。また、抗ｐ５３抗体（Ｎ−１９、またはＭ−１９）を加える（レーン３、４）とコントロールの抗ＮＦ−κＢ抗体を加えたサンプル（レーン５）に比べ、バンドが薄くなった。このことはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２５６〜−２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。
【００４６】
（実施例６）
一方、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を同様に実施例２に示すレポータープラスミドを用いて調べたところ、ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は−２０４〜＋４２、及び−４１４〜−２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、−２８７〜−２０５の領域では減少した（図７、８、９）。このことからＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの−２０４〜＋４２、及び−４１４〜−２８８の領域に作用して顆粒の遺伝子の発現を誘導すると考えた。
【００４７】
ＨＮＦ４について同様に、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターへの影響を調べた結果、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した（図１０）。また、ＣＯＵＰ−ＴＦＩはＤｅｃｏ（−２８７：−２０５）−Ｌｕｃで最も高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（−２５２：−２０５）−Ｌｕｃでは活性化が減弱したが完全には消失しなかった（図１１）。したがって、それらの作用領域については確定しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、ＤＮＡ、このＤＮＡを利用したＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３の機能解析、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３に依存的な遺伝子発現、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３の機能抑制が可能となり、細胞増殖、分化、細胞死の関与する種々の疾患の解明と予防に大きな進展が期待でき、産業上の利用可性がある。
【図１】
2014207918.tif 000003
【図２】
2014207918.tif 000004
【図３】
2014207918.tif 000005
【図４】
2014207918.tif 000006
【図５】
2014207918.tif 000007
【図６】
2014207918.tif 000008
【図７】
2014207918.tif 000009
【図８】
2014207918.tif 000010
【図９】
2014207918.tif 000011
【図１０】
2014207918.tif 000012
【図１１】
2014207918.tif 000013
【配列表】
2014207918000001.app