(57)【要約】【課題】本発明の目的は、検出すべき細胞を比較的高濃度に有する細胞試料を扱うこともできる、細胞試料の細胞を定量化する方法及び装置を明らかにすることにある。【解決手段】超常磁性の標識粒子を有するマイクロ流体チャンバであって、標識粒子がチャンバの一内表面に正確に集められているマイクロ流体チャンバを準備する段階と、チャンバ内に細胞懸濁液を充填する段階とを含む、細胞懸濁液の細胞を標識する方法が明らかにされる。【選択図】図2
2014006255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性の標識粒子(11)を有するマイクロ流体チャンバ(10)であって、標識粒子(11)が実質的にチャンバ(10)の実質的に一内表面に集められているマイクロ流体チャンバ(10)を準備する段階(100、110、120)と、
チャンバ(10)内に細胞懸濁液を充填する段階(130)とを有する、細胞懸濁液の細胞(15)を標識する方法。
【請求項２】
空洞が立方体状であり、厚さが10μmから1000μmの間であるチャンバ(10)が用いられ、厚さが、標識粒子(11)が集められている内表面に対して垂直な広がりを意味する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
マイクロ流体チャンバ(10)を準備する段階は、下記の段階、
標識粒子(11)を有する懸濁液をマイクロ流体チャンバ(10)に充填する段階と、
磁石(12)によって標識粒子(11)をチャンバ(10)の内表面上に集める段階とを含む請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
共有の吸引段階を用いて、標識粒子(11)を有する懸濁液がチャンバ(10)から除去され、チャンバ(10)に細胞懸濁液が充填される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
チャンバ(10)内に層状の流れが実質的に存在するように細胞懸濁液がチャンバ(10)を通って流される請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞懸濁液がチャンバ(10)内に充填された後に、及び静止時間の終了後に、細胞懸濁液が測定装置(14)へ流される請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
静止時間として1秒未満が用いられる請求項6に記載の方法。
【請求項８】
標識した細胞(16)が測定装置(14)で計数される請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞懸濁液の細胞(15)を標識する装置(1)であって、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法を行うように設計され、
マイクロ流体チャンバ(10)と、
チャンバ(10)に液体を充填する手段とを有する装置(1)。
【請求項１０】
チャンバ(10)の領域内に配置された永久磁石(12)を有する請求項9に記載の装置(1)。
【請求項１１】
チャンバ(10)の内表面の領域内においてチャンバ(10)の外側に配置された、鉄芯を備えたコイル(41)を有する請求項10に記載の装置(1)。
【請求項１２】
鉄芯が、チャンバ(10)の内表面に向けられた外表面上に凹部(52、54)を有する請求項10に記載の装置(1)。
【請求項１３】
内表面が切り欠き(61)を有している請求項9に記載の装置(1)。
【請求項１４】
標識した細胞(16)を計数する測定装置(14)であって、永久磁石(12)及びチャンバ(10)と共有の支持体上に配置された測定装置(14)を有する請求項9から13のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を標識するために設けられた超常磁性の標識粒子、特に特定の抗体を備えた超常磁性の標識粒子を用いて細胞懸濁液の細胞を標識する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な標識方法を用いて細胞試料中の細胞物質を標識することにより、複雑な細胞試料から細胞物質を選択して定量化することが可能になる。単離細胞の計数に基づいて細胞物質を定量化することが可能な方法は周知である。様々な連続的フローサイトメトリー法(continuous-flow cytometric method)により、蛍光に基づく選択的標識又は磁気による選択的標識を用いて細胞の定量化が可能になる。しかしながら、この方法は不都合なことに、測定すべき試料の労働集約的な精密検査を必要とする。試料の精密検査は、例えば遠心分離、ろ過、沈殿及びその他多くの作業等の作業段階を必要することがある。しばしば、このような作業方法は検体の部分的な損失と関係がある。
【０００３】
ここで、細胞試料に含まれる少数の細胞を標識して最終的に計数するサイトメトリーにおいて、周知の方法には基本的な問題がある。そのため、周知の方法は、標識した少数の細胞から十分な信号を発生させるために行なわれる。標識すべき細胞を多数含む細胞試料、例えば104個/μlの濃度で含む細胞試料をかろうじてしか扱うことができないということが、連続的フローサイトメトリーに関する周知の方法の欠点である。これは特に、高濃度の受容体(多数の細胞)に起因して、十分に良好な磁気標識のために多数の標識粒子が必要となるからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、冒頭に述べた問題を極小化し、特にそれによって検出すべき細胞を比較的高濃度で有する細胞試料を扱うこともできる、細胞試料中の細胞を定量化する方法及び装置を明らかにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、請求項1の特徴を有する方法によって達成される。別の解決策は請求項9に係る装置である。従属請求項は本発明の好適な実施形態に関する。
【０００６】
細胞懸濁液の細胞を標識する本発明の方法では、最初の段階として、細胞への結合用に特定の抗体を特に有する超常磁性の標識粒子を備えたマイクロ流体チャンバが準備される。超常磁性の標識粒子はチャンバの実質的に一内表面上に集められている。次の段階として、細胞懸濁液がチャンバ内に充填される。
【０００７】
好都合なことに、このことは、懸濁液において明確に規定可能な細胞の画分の標識を達成する。また、標識粒子が集められている内表面の領域内を流れる細胞懸濁液中のこの細胞のみが標識される。この内表面の領域内を流れない細胞は標識粒子と全く接触せず、そのため標識も行なわれない。
【０００８】
換言すれば、従って、前記方法により規定された細胞の画分が標識されることになるが、実質的にこの規定された画分のみが標識されることにもなる。
【０００９】
この場合において重要なことは、マイクロ流体チャンバ内では、その寸法に起因して実質的に層状の流れが主流であるということである。この場合、流れる細胞懸濁液の様々な層は互いにほとんど混合せず、それ故に実質上、標識粒子が占める内表面のごく近傍に入るこの細胞のみが標識される。これは実質上、標識粒子に衝突した小さな板状体のみがそれらと結合することができるという拡散に依存した方法である。この時点から、細胞は転動し、この過程でさらにより多くの標識粒子を取り始める。
【００１０】
そのため、内表面に対して垂直であるチャンバの厚さ、及び標識を施す細胞懸濁液の層の厚さによって、標識した細胞の画分を容易に規定することができる。
【００１１】
そのため、本明細書に記載された発明により、マイクロ流体システムにおいて、少量の複雑な試料内での超常磁性のナノ粒子又はマイクロ粒子による細胞物質の制御した、部分的で損失のない標識が可能になる。この場合には好都合なことに、希釈処置の必要はない。既に大量に含まれる細胞物質を予め濃縮して他の細胞型から分離する必要はない。示されたシステムは好都合なことに、体液又は身体の分泌物等の複雑な試料中の細胞の精製及び標識の作業段階を単純化する。
【００１２】
ここで、実質的に立方体状である空洞を有するチャンバが用いられることが有効である。単純な形状のため、それによって、標識した細胞の画分を特に容易に規定することが可能である。
【００１３】
さらに、チャンバの厚さが10μmから1000μmの間であることが有効であり、厚さは、標識粒子が集められている内表面に対して垂直な広がりを意味する。この厚さの範囲において、層状の流れが最も良く達成されているのと同時に、標識された細胞の画分は百分率又は千分率の範囲内である。チャンバの厚さによってこの画分を確立することにより、細胞懸濁液を希釈する必要性を避けることも可能である。
【００１４】
マイクロ流体チャンバを準備するために、好ましくは下記の段階、
標識粒子を有する懸濁液をマイクロ流体チャンバに充填する段階と、
磁石によって標識粒子をチャンバの内表面上に集める段階とが行なわれる。
【００１５】
この目的のために、好ましくは永久磁石が用いられる。しかしながら代わりに電磁石を用いることも可能である。
【００１６】
細胞懸濁液のチャンバ内への充填は、標識粒子を含む懸濁液の残余をチャンバから同時に除去する一つの吸引段階で適切に行なわれる。次いで、静止時間の間に細胞懸濁液がチャンバ中に静止して留まるように、チャンバ内への充填を中断することができる。例えば、静止時間として、1秒以下の時間を選択することができる。静止時間では重力の作用により内表面の領域内において標識した細胞の画分が増加するが、例えば静止時間によりチャンバ内での細胞の拡散も可能になり、その結果、標識領域内において内表面に実質的には近接していなかった細胞を標識することができる。また、中断することなくチャンバを通って細胞懸濁液を流すことができる。
【００１７】
両方の場合において、細胞懸濁液を測定装置、例えば標識した細胞の計数用の測定装置へ流すことができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、チャンバの外側ではあるがチャンバの内表面の領域内において、鉄芯を備えたコイルが配置されている。鉄芯は、標識粒子を内表面に引き付ける磁場を形成するのに役立つ。好都合なことに、これにより内表面上で標識粒子がより均一に広がることになる。これは鉄芯により磁場の不均一性が低下するからである。このようにして、チャンバの一端に向かって標識粒子が蓄積されることが抑えられる。この場合、チャンバの内表面に向けられた鉄芯の外表面が少なくとも内表面の寸法を有していることが適切である。理想的には、鉄芯はマイクロ流体チャンバよりも若干大きい。コイルは磁石の磁場に比べて大きな磁場、特に十分大きな磁場を適切に形成する。
【００１９】
本発明の発展形において、鉄芯は、チャンバの内表面に向けられた外表面上に凹部を有している。好ましくは、凹部は規則的なパターンで配置されている。凹部は、例えば平行線であることが可能であり、又は例えば正方形の線のパターンに従うことができる。それにより、標識粒子の付着の形状を規定することができる。
【００２０】
また、鉄芯を使用するために、内表面自体に凹部を設けることも可能である。それにより、チャンバの一端に向かって標識粒子が蓄積されることが同じく抑えられる。これは、標識粒子が凹部内に集まり、磁場の影響下では凹部と凹部との間をほとんど移動できないからである。
【００２１】
本発明の別の適切な実施形態及び利点は、図を参照した本発明の代表的な実施形態についての下記記載の主題であり、同一の参照符号は、同様に作動する構成要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】マイクロ流体システムを用いた細胞の測定用の装置を示す図である。
【図２】細胞の測定のためのマイクロ流体チャンバを示す図である。
【図３】部分的に標識した細胞を備えたマイクロ流体チャンバの抜粋を示す図である。
【図４】追加の鉄芯を備えた装置の実施形態を示す図である。
【図５】凹部を有する鉄芯を備えた装置の実施形態を示す図である。
【図６】マイクロ流体チャンバの壁内に凹部を備えた装置の実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下において、代表的実施形態は、図1に記載の細胞測定の装置1に関する。この装置1では、非常に高濃度の細胞を含む細胞懸濁液の細胞15、16が標識され、その後、計数装置14に送られて定量化される。この場合、装置1は共有の支持体上に配置された永久磁石12を有している。共有の支持体の表面上において、永久磁石はマイクロ流体システムを構成している。この場合、マイクロ流体システムは、マイクロ流体の流路13内に液体を送る試料供給口18を備えている。
【００２４】
試料供給口18は液体をマイクロ流体チャンバ10内に流し、マイクロ流体チャンバ10内で細胞が標識される。この場合、チャンバ10は永久磁石上に実装されている。出口側において、マイクロ流体システムは計数装置14に更に繋がっており、標識した細胞を計数装置14内で計数することができる。
【００２５】
本例において、計数装置14は磁界、例えばGMR、AMR又はTMRの検出に基づいている。この場合、計数装置14を通過する液体中の標識した細胞が過剰に高濃度であるとセンサが飽和状態になり、その結果、測定結果が改ざんされる。そのため、ここで用いた、細胞の濃度が例えば105個/μlである細胞懸濁液のために特別な標識方法が用いられており、この方法での処理が図2を参照して以下により詳細に記載されている。
【００２６】
図2は、細胞標識用のマイクロ流体チャンバ10での処理を示しており、マイクロ流体チャンバは第1の段階100で準備される。好都合なことに、射出成形技術によってマイクロ流体チャンバ10を製造することができる。本例において、マイクロ流体チャンバ10の厚さDはD=100μmであるべきである。しかしながら、例えばD=10μm、D=50μm又はD=980μm等の他の寸法も可能である。マイクロ流体チャンバ10は、その両端面21上に、図2に図示されていない入口開口部及び出口開口部を有している。本例において、チャンバの全容積は1μlであり、前述した厚さ100μmの場合にはチャンバの長さは10mm、高さは1mmである。
【００２７】
第2の段階110において、超常磁性の標識粒子11を含む懸濁液がマイクロ流体チャンバ10内に導入される。この場合、標識粒子11は通常、懸濁液中に明確な境界線をまだ示しておらず、まず均一に分散している。さらに本例において、標識粒子11は特定の抗体を有している。代替実施形態において、抗体を有していない標識粒子11を用いることもできる。
【００２８】
第3の段階120において、次に、磁力の作用により(本例では永久磁石12により)標識粒子11がマイクロ流体チャンバ10の底部に引き付けられる。
【００２９】
以下に、第4の段階130において、永久磁石12で保持された標識粒子11を除いた懸濁液がマイクロ流体チャンバ10から除去される。この場合、実際の検体溶液が到達する前に、最初に充填された標識粒子11の溶媒が空気で置換される。その結果、標識粒子11が乾燥される。この段階の持続時間は、(入口からチャンバまでの)システム全体の容積の影響を受ける可能性がある。同じ段階において、最初は未標識の細胞15を有する細胞懸濁液がマイクロ流体チャンバ10内に導入される。本例において、このことは、マイクロ流体チャンバ10から細胞測定装置14を経由して通っているマイクロ流体の流路13の一端17での吸引により行なわれる。
【００３０】
細胞懸濁液がマイクロ流体チャンバ10中に位置している場合には、非常に短い時間、例えば0.5秒の間、そこに静止することが可能である。この時間において、細胞懸濁液の未標識の細胞15は、マイクロ流体チャンバ10内で実質的に静止して留まっており、層の形成又は沈殿はほとんど起きていない。しかしながら、超常磁性の標識粒子11の近傍に入るこの未標識の細胞15が標識粒子11と結合し、その結果、標識した細胞16となる。このようにして、標識した細胞16がマイクロ流体チャンバ10の底部に近接する特定の領域内のみに形成される。
【００３１】
図3は、マイクロ流体チャンバ10への細胞懸濁液の充填中に起きていることを模式的に示している。標識粒子11を備えた内表面の近くに位置している一部の細胞は、チャンバの内表面上を転動し、この過程において、しばしば多数の標識粒子11を得る。そのため、内表面から幾何学的に離れている一部の細胞15が実質的に未標識のまま残るのと同時に、標識した細胞16が相当な量の標識粒子11により形成される。
【００３２】
本例において、チャンバ10の底部から5μmの領域内において下方に位置する全ての未標識の細胞15は潜在的に標識される。この領域内に位置する事実上全ての細胞15もまた、チャンバ10を通る流路上で実際には標識されることになるとみなすことができることから、単純計算で細胞15の5%が標識した細胞16になる。この場合、精度を高めるために、細胞の直径を考慮に入れることもできる。
【００３３】
細胞16の比較的小さい画分のみではあるが特定の画分が標識されることから、計数装置14は支障なく細胞を計数することができ、実際の細胞濃度を推定することができる。
【００３４】
この場合、マイクロ流体システムは好都合なことに、標識粒子11を含むチャンバ10を容易に交換することができるように設計可能である。そのため、標識粒子11又はチャンバの形状を選択することにより、標識を存在する細胞懸濁液の種類に適合させることができる。
【００３５】
永久磁石12上へのマイクロ流体チャンバ10の配置には、下記の問題の可能性がある。標識粒子11は磁場に従うことから、標識粒子11はチャンバ10の一端、事実上永久磁石12の中心44に向かって蓄積される。このことを避けるために、様々な可能性がある。
【００３６】
代表的実施形態2
図4に示すように、鉄芯を有するコイル41が、マイクロ流体チャンバ10の一側面上に永久磁石12から離れて配置されている。コイルはそれ自体が、磁力線43で示される磁場を生成する。この磁場がマイクロ流体チャンバ10の長さにわたって均一であり永久磁石12の磁場よりも著しく強い場合には、本例においてマイクロ流体チャンバ10が永久磁石12の中心44から著しく離れて配置されている場合であっても、標識粒子11はマイクロ流体チャンバ10の対応する壁に均一に引き付けられる。コイルに必要なエネルギーは、コイルの磁石からの距離によって決まる。これは、距離と共に磁力が弱まるからである。磁石への距離を適合させることにより、エネルギーを節約することができ、例えば電池から少ないエネルギーをコイルに供給することもできる。
【００３７】
代表的実施形態3
図5は、鉄芯に関する複数の実施形態を示す。最初の実施形態51において、鉄芯は凹部52を有しており、各凹部52の間に残るランドは、マイクロ流体チャンバ10内での流れの方向に対して横方向の線を形成する。標識粒子11は残存するランドに付着しており、そのためマイクロ流体チャンバ10の表面上に線を形成する。
【００３８】
鉄芯に関する第2の実施形態53において、鉄芯はより小さい凹部54を有しており、この実施形態53において、残存するランドは正方形の線のパターンを形成する。そのため、標識粒子11は、マイクロ流体チャンバ10の表面上において正方形のパターンで付着する。
【００３９】
代表的実施形態4
図6は、マイクロ流体チャンバ10の代替実施形態を示す。この場合、コイル41は用いられていない。ここではその代わりとして、マイクロ流体チャンバ10の表面が構造化されている。粒子は永久磁石12の中心44に向かって引き付けられるが、表面の構造化のためにチャンバの表面に沿って移動することができない。そのため、粒子は規定された位置で保持される。例えば、マイクロ流体チャンバ10の標識粒子11が付着した内表面は、切り欠き61を有している。切り欠き61は、マイクロ流体チャンバ10の長さにわたって均一に配置されている。
【符号の説明】
【００４０】
1  装置
10  マイクロ流体チャンバ
11  超常磁性の標識粒子
12  永久磁石
14  計数装置
15  未標識の細胞
16  標識した細胞
41  コイル
52  凹部
54  凹部
61  切り欠き
100  第1の段階
110  第2の段階
120  第3の段階
130  第4の段階
【図１】
2014006255.tif 000003
【図２】
2014006255.tif 000004
【図３】
2014006255.tif 000005
【図４】
2014006255.tif 000006
【図５】
2014006255.tif 000007
【図６】
2014006255.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月3日(2013.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性の標識粒子(11)を有するマイクロ流体チャンバ(10)であって、標識粒子(11)がチャンバ(10)の一内表面に集められているマイクロ流体チャンバ(10)を準備する段階(100、110、120)と、
チャンバ(10)内に細胞懸濁液を充填する段階(130)とを有する、細胞懸濁液の細胞(15)を標識する方法。
【請求項２】
空洞が立方体状であり、厚さが10μmから1000μmの間であるチャンバ(10)が用いられ、厚さが、標識粒子(11)が集められている内表面に対して垂直な広がりを意味する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
マイクロ流体チャンバ(10)を準備する段階は、下記の段階、
標識粒子(11)を有する懸濁液をマイクロ流体チャンバ(10)に充填する段階と、
磁石(12)によって標識粒子(11)をチャンバ(10)の内表面上に集める段階とを含む請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
共有の吸引段階を用いて、標識粒子(11)を有する懸濁液がチャンバ(10)から除去され、チャンバ(10)に細胞懸濁液が充填される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
チャンバ(10)内に層状の流れが存在するように細胞懸濁液がチャンバ(10)を通って流される請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞懸濁液がチャンバ(10)内に充填された後に、及び静止時間の終了後に、細胞懸濁液が測定装置(14)へ流される請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
静止時間として1秒未満が用いられる請求項6に記載の方法。
【請求項８】
標識した細胞(16)が測定装置(14)で計数される請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞懸濁液の細胞(15)を標識する装置(1)であって、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法を行うように設計され、
マイクロ流体チャンバ(10)と、
チャンバ(10)に液体を充填する手段とを有する装置(1)。
【請求項１０】
チャンバ(10)の領域内に配置された永久磁石(12)を有する請求項9に記載の装置(1)。
【請求項１１】
チャンバ(10)の内表面の領域内においてチャンバ(10)の外側に配置された、鉄芯を備えたコイル(41)を有する請求項10に記載の装置(1)。
【請求項１２】
鉄芯が、チャンバ(10)の内表面に向けられた外表面上に凹部(52、54)を有する請求項10に記載の装置(1)。
【請求項１３】
内表面が切り欠き(61)を有している請求項9に記載の装置(1)。
【請求項１４】
標識した細胞(16)を計数する測定装置(14)であって、永久磁石(12)及びチャンバ(10)と共有の支持体上に配置された測定装置(14)を有する請求項9から13のいずれか一項に記載の装置。
【外国語明細書】
2014006255000001.pdf