(57)【要約】【課題】  本願発明は、遺伝子工学的手法を用いた高コストのリコンビナントG-CSFに代わって、体内におけるG-CSFの産生を誘導・促進させる天然素材を用いることによって、ヒトもしくはヒト以外の動物の免疫機能を調節する産物・方法を提供することにある。【解決手段】  米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）を主成分として含有することで顆粒球コロニー刺激因子の産出を誘導・促進させることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸を主成分として含有することで顆粒球コロニー刺激因子の産出を誘導・促進させることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物。
【請求項２】
米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸を主成分として含有する天然素材由来の産物をヒト末梢血単核球に添加することで顆粒球コロニー刺激因子の産出を誘導・促進させることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、体内における顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）の産生を誘導・促進させ、ヒトおよび動物の免疫機能を調節・増強することで各種疾患の予防および治療に寄与する医薬品・医薬部外品・飲食品・嗜好品・飼料および化粧品に応用される産物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫機能に作用して異物（外来抗原）に対する防御力を高める生体応答修飾物質および生体応答調節剤療法（biological response modifiers: BRMs）が、癌・アレルギー・感染症の予防や治療に応用されるようになってきた。中でも、サイトカインを用いたBRMsは、遺伝子工学的手法によりリコンビナントサイトカインが製造されると共に、各種疾病の予防・治療を目指した応用が世界の病院や研究機関で精力的に行われている。その一方で、生産コストが高い遺伝子工学的手法に頼らない天然素材やその抽出物を利用し、体内においてある種のサイトカインを誘導・促進し、宿主の免疫系を調節・増強することで癌・感染症・アレルギー等を改善するための新規の素材探索も精力的に行われるようになってきた。
【０００３】
サイトカインの中で顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）は、顆粒球、特に好中球の産出促進およびその機能を高める作用がある。G-CSF は主にマクロファージが分泌するタンパク質で、顆粒球前駆細胞の受容体に結合し、顆粒球の分裂（増殖）と分化（成熟）を誘導する。G-CSFは分子量が約19-Kda（キロダルトン）で、174個のアミノ酸からなる糖蛋白質である。骨髄中の前駆細胞から好中球への増殖・分化を誘導・促進する生理活性物質として同定された。よって現在、遺伝子工学的手法を用いたヒトリコンビナントG-CSF製剤は、好中球減少症の治療に用いられている。
【０００４】
造血器腫瘍の治療においては、化学療法などの副作用を抑えるための補助療法として、造血因子（サイトカイン）が製剤として用いられる。現在までに、造血器腫瘍の増殖・分化を調節する多くの造血因子が同定されている。そのうち、わが国で使用可能なものは、G-CSF、 M-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）、EPO（エリスロポエチン）、 インターロイキン２、インターフェロンα・β・γである。これらの造血因子の開発とその臨床応用は、血液疾患の治療法を大きく変えたと言っても過言ではない。特に、G-CSFの導入によって、化学療法後の骨髄抑制に伴う白血球減少（好中球減少）が改善され、感染症の合併をうまくコントロールできるようになった。さらに、大量の抗癌剤を用いる治療法も可能となった。好中球減少期間の短縮や感染症の減少効果のみならず、抗癌剤の投与量の増加や投与間隔の短縮などにも効果が認められている。また、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、先天性好中球減少症など、汎血球減少を主体とした疾患の治療にも広く応用できるようになった。今後、G-CSFの臨床応用は、造血器腫瘍の治療形態の変化と治療成績の向上をもたらすものと期待されている。
【０００５】
さらに詳しく説明すれば、G-CSFは抗癌剤治療において副作用として生じる好中球減少症に対して、好中球を増加させると共に、その機能を亢進させる作用を有する。よって、好中球減少症の改善として、癌の化学療法に応用されている。特に、癌の化学療法では、顆粒球、特に好中球が減少すると、免疫機能が低下し、感染症を合併する危険性が生じる。こうした癌の化学療法によって生じる副作用（主に好中球減少症）に対する改善薬として、G-CSF「グラン」（一般名フィルグラスチム）が開発され、臨床応用されている。
【０００６】
癌の化学療法によって好中球数および機能が低下した患者にG-CSFを投与すると、好中球の増加と共に、各種感染に対する抵抗力が強くなる。G-CSFが臨床の現場で最も多く使用されているのは、癌の化学療法に伴う副作用の1つである好中球減少症の改善である。特に、白血病・悪性リンパ腫などの造血器腫瘍は、抗癌剤の強化療法が原則である。その結果、好中球減少症が高い頻度で起こることになる。そこで、抗癌剤治療後、好中球が減少する前に、予防的にG-CSFを使用することで、抗癌剤の化学療法を効果的に実施することが可能となる。また、G-CSFは臓器移植後、好中球の増殖過程において補助的な作用もある。さらに、エイズ・骨髄異形成症候群・再生不良性貧血による好中球減少症、先天性・特発性好中球減少症の治療にも応用されている。最近ではG-CSFを用いて骨髄から造血幹細胞を末梢血中に誘導する方法が確立され、既に有効性と安全性が確認されていることから、末梢血幹細胞移植においてもG-CSFの臨床応用が大いに期待されている。
【０００７】
近年、G-CSFが造血幹細胞や血球系に限らず心筋・肝臓・消化管粘膜の構成細胞に分化を誘導することが明らかになってきた。このことは、G-CSFが組織再生にも深く関与していることを示すものである。今後、G-CSFによる組織の修復促進作用が心血管疾患、特に虚血性疾患治療への応用に試みられると期待されている。
【０００８】
一方、G-CSFの免疫抑制作用に関しても明らかになってきた。臨床例において、G-CSF処置後の末梢血中では１型免疫反応を誘導する樹状細胞（DC-1）は変化しないが、２型免疫反応を促進する樹状細胞（DC-2）が有意に増加することが認められている。これは、移植後の急性・慢性拒絶反応である移植片対宿主病（graft versus host disease :GVHD）の発症を抑制する知見である。G-CSF処置により単球の増加ならびに抗炎症性サイトカインであるインターロイキン-10の産生亢進が起こり、その結果、Tリンパ球の活性化が抑制されると言う作用メカニズムである。
【０００９】
これらの所見はG-CSFの投与が１型免疫反応を2型免疫反応へと誘導し、1型免疫反応過剰を病態とするGVHDの発生を予防することを意味している。このように、G-CSFは、生体免疫系の調整として重要な役割を演じている。これらの所見は、関節リウマチ・全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患（膠原病）の発症予防、さらに治療にも十分応用可能であることを示すものである。
【００１０】
ところで、本願出願人は、長年の研究に基づいて、一般の食品素材を利用して製造される生体免疫系の増強、及び抗腫瘍、抗ウィルス感染効果を有する素材である米胚芽発酵液及び米胚芽発酵粉末並びにその製造方法を提供している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１１−２１７７３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本願発明は、遺伝子工学的手法を用いた高コストのリコンビナントG-CSFに代わって、体内におけるG-CSFの産生を誘導・促進させる天然素材を用いることによって、ヒトもしくはヒト以外の動物の免疫機能を調節する産物・方法を提供しようとするものである。また、本願発明は天然素材を由来とするものであることから、安全でかつ継続的に摂取可能であるため、日常的に各種疾患の予防、さらには治療に寄与する顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）産生促進物質・方法である。現在までに、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の産生を誘導・促進する天然素材と方法は存在しないため、今後各産業界での応用が大いに期待される次世代の機能的産物・方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明の第１の発明は、米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）を主成分として含有することで顆粒球コロニー刺激因子の産出を誘導・促進させることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物である。
第２の発明は、米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）を主成分として含有する天然素材由来の産物をヒト末梢血単核球に添加することで顆粒球コロニー刺激因子の産出を誘導・促進させることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進方法である。
【００１４】
ここで、「ガンマ−アミノ酪酸」（GABA）には、免疫担当細胞表面分子（CD93）の発現と機能を増強する作用がある。詳しくは、前者の発現増強には、単球・顆粒球・血管内皮細胞のCD93分子の発現増強と、造血幹細胞（さい帯血細胞・骨髄細胞）のCD93分子の発現増強がある。後者の機能増強には、免疫応答の調節とアポトーシス（プログラム死）細胞の除去、さらには再生医療（さい帯血移植・骨髄移植）分野での応用がある。また、「ガンマ−アミノ酪酸」（GABA）には、サイトカイン（インターロイキン-8:IL-8）の産生増強機能がある。詳しくは、GABAによって産生増強されたIL-8は、免疫応答・血管新生・神経細胞保護に関与すると共に、好中球・単球の遊走作用、さらには感染症の防御作用に関与する。        
【００１５】
また、イノシトール６リン酸（フィチン酸及びイノシトール：IP6）には、癌（腫瘍）細胞の正常化（大腸癌および肝細胞癌に特異的な腫瘍マーカーであるCEAおよびPIVKA-IIの産生を抑制）や癌（腫瘍）細胞の増殖抑制（癌（腫瘍）腫瘍のプログラム細胞死としてのアポトーシスの誘導）の作用がある。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明によれば、以下の効果を有する。
（１）米胚芽発酵液から抽出されたガンマ−アミノ酪酸とイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）の相互作用によって、生体免疫力の向上・増強を及ぼす。
（２）その結果、免疫担当細胞の形態変化誘導（ヒト末梢血単核球に形態変化を与え細胞間凝集を誘導）、サイトカインの産出増強（IL-1β・ IL-6・ IL-8・ TNF-αの産生を増強）、特殊サイトカインの産出増強（G-CSF・GM-CSFの産生を増強）などの効果を発揮する。
（３）特に、特殊サイトカイン（顆粒球コロニー刺激因子：G-CSF）の産出増強の意義として、次のことがいえる。癌の化学療法（抗癌剤）の副作用による免疫力の低下は、顆粒球（主に好中球）の激減と機能不全を起こす。現在、これを補うための造血因子療法として、遺伝子組み換え型のリコンビナントG-CSF（グラン：一般名フィルグラスチム）が臨床応用されている。G-CSFは、非常に高価なものであるが、本願発明のG-CSFは安価であると共に、比較的容易に好中球の激減と機能不全を改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本願発明に係る米胚芽発酵液の製造方法（一例）を示す説明図。
【図２】実施例１の実験結果を示す写真（写真１及び２）。
【図３】実施例２の実験結果を示す表（表１及び２）。
【図４】実施例３の実験結果を示す表（表３）。
【図５】実施例４の実験結果を示す表（表４）。
【図６】実施例５の実験結果を示す表（表５）。
【図７】実施例６の実験結果を示す表（表６）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本願発明に係る米胚芽発酵液の製造方法（一例）を示す説明図である。
図１に示すように、玄米（Ｆ０１）を精米処理（Ｆ０２）することによって得られた米糠（Ｆ０３：糯米、粳米のどちらでも良い）を選別（Ｆ０４）し、これにグルタミン酸又はグルタミン酸塩と、アルコールを加え、液状に分散したものに、乳酸菌をスターターとして加え（Ｆ０５）、適度な酸素を与えられるように攪拌を行い、２５℃〜４５℃にて１２〜２４０時間程度反応および発酵を同時進行で進め（Ｆ０６）、グルタミン酸をＧＡＢＡに転換させながら、胚芽や糠の由来成分（有用成分）を溶出させる。この時、乳酸菌の活性化のために糖やビタミン，ミネラル等を加えてやると良い。
【００１９】
反応終了後、活性炭を混合し、脱臭・脱色処理を行った後、２００メッシュ〜４００メッシュのスクリーンで０．５〜２．０ｋｇ／ｍｉｎの処理速度で固形物を除去する搾汁処理（Ｆ０７）を行う。これに再度活性炭を加えて、脱色・除臭処理を施し、７０〜９５℃に品温を維持しながら孔径０．１〜１．０μのセラミック膜にて流量２０〜６０Ｌ／ｍｉｎの処理速度で濾過処理（Ｆ０８）をし、濾液すなわち原液（Ｆ０９）を得て、終点（米胚芽発酵液）とする。なお、これを濃縮、粉末化して任意の濃度に調整してもよい。
【００２０】
そして、このするような製造方法で製造された米胚芽発酵液から本願発明（顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物）の主成分であるガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）を得る（抽出する）ことができる。
【００２１】
次に、本願発明の顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進作用・効果に関する実施例を示す。
【実施例１】
【００２２】
（本願発明に関する米胚芽発酵液（以下、本件米胚芽発酵液）の健常成人末梢血単核球の形態に与える影響）
健常成人末梢血単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴プレートに播いた。次に、各希釈倍数の本件米胚芽発酵液を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、その形態変化を位相差顕微鏡で検討したところ、本件米胚芽発酵液添加群は、無添加群に比べて著明な細胞間凝集が認められた（図２）。
【実施例２】
【００２３】
（本件米胚芽発酵液による健常成人末梢血単核球からの顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）の産生促進）
健常成人（5名）の末梢血単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴マイクロプレートに播いた。次に、各希釈倍数の本件米胚芽発酵液を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、培養上清中のgranulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）の濃度を酵素抗体法（enzyme immunoassay: EIA法）で調べた。その結果、図３の表１に示すように、本件米胚芽発酵液添加群は、無添加群に比べて大量のG-CSF産生促進作用が認められた。また、この産生は、本件米胚芽発酵液の濃度（希釈倍数）依存的な産生能を示した（図３の表２）。
【実施例３】
【００２４】
（本件米胚芽発酵液による臍帯血由来単核球からの顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）産生促進）
臍帯血（5名）由来単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴マイクロプレートに播いた。次に、各希釈倍数の本件米胚芽発酵液を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、培養上清中のgranulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）の濃度を酵素抗体法（enzyme immunoassay: EIA法）で調べた。その結果、図４の表３に示すように、本件米胚芽発酵液添加群は、無添加群に比べて大量のG-CSF産生促進作用が認められた。
【実施例４】
【００２５】
（本件米胚芽発酵液に対する抗体よる健常成人末梢血単核球からの顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）産生促進作用の抑制）
健常成人末梢血単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴マイクロプレートに播いた。次に、本件米胚芽発酵液（最終希釈100倍）と各種濃度の本件米胚芽発酵液に対する抗体を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、培養上清中のgranulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）の濃度を酵素抗体法（enzyme immunoassay: EIA法）で調べた。その結果、図５の表４に示すように、本件米胚芽発酵液に対する抗体は、本件米胚芽発酵液添加によって産生されるG-CSF産生促進を部分的に抑制した。
【実施例５】
【００２６】
（本件米胚芽発酵液に対する抗体による臍帯血単核球からの顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）産生促進作用の抑制）
臍帯血単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴マイクロプレートに播いた。次に、本件米胚芽発酵液（最終希釈100倍）と各種濃度の本件米胚芽発酵液に対する抗体を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、培養上清中のgranulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）の濃度を酵素抗体法（enzyme immunoassay: EIA法）で調べた。その結果、図６の表５に示すように、本件米胚芽発酵液に対する抗体は、本件米胚芽発酵液添加によって産生されるG-CSF産生促進を部分的に抑制した。
【実施例６】
【００２７】
（本件米胚芽発酵液による自己免疫疾患患者（関節リウマチ）由来末梢血単核球からの顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF）の産生促進）
関節リウマチ患者（4名）末梢血単核球を10%牛胎児血清(fetal calf serum: FCS）加RPMI-1640培地に浮遊し、細胞数が2x105個/穴になるように96穴マイクロプレートに播いた。次に、本件米胚芽発酵液（100倍希釈）を添加し、37℃で1日間培養した。培養後、培養上清中のgranulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）の濃度を酵素抗体法（enzyme immunoassay: EIA法）で調べた。その結果、図７の表６に示すように、本件米胚芽発酵液添加群は、無添加群に比べて大量のG-CSF産生促進作用が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上、本願発明の上記実施例から、ヒト末梢血単核球（健常成人・臍帯血・関節リウマチ患者）に天然素材由来の本件米発酵液を添加すると、特に好中球の数および機能を活性化するG-CSFの著明な産生誘導・促進作用が認められた。このことは、本件米発酵液に含まれるガンマ−アミノ酪酸およびイノシトール６リン酸（またはイノシトール６リン酸並びにその他のイノシトール）を主成分とする顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物が好中球の活性化を基盤とする各種疾病に対する新しい免疫療法、さらには抗癌剤治療における補助療法として大変有益であることを示している。
【００２９】
本願発明の顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物・方法は、本願出願人が長年の研究から独自の製法よって開発したものである。さらに、好中球の強力な活性作用を有する唯一の天然産物であり、次世代の最も有益なサプリメントである。
【００３０】
本願発明の顆粒球コロニー刺激因子産出誘導・促進産物・方法によるG-CSFの産生誘導および促進作用は、各種疾病、特に、癌の化学療法における好中球減少における補助療法として、さらには再生医療分野への応用において大いに期待される技術である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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