(57)【要約】【課題】クサウラベニタケの近縁種を同定するキノコの同定方法等を提供する。【解決手段】キノコの同定方法は、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｃII、又は、ＨａｅIIIにより、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する同定工程と、を含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素により、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、
前記切断工程により切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する同定工程と、
を含むキノコの同定方法。
【請求項２】
前記制限酵素は、ＭｓｌI、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｃII、又は、ＨａｅIIIである、
ことを特徴とする請求項１に記載のキノコの同定方法。
【請求項３】
前記切断工程では、前記ＭｓｌIが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から５００〜６３０番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＭｓｌIが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ及びこの近縁種を同定する、
ことを特徴とする請求項２に記載のキノコの同定方法。
【請求項４】
前記切断工程では、前記ＤｄｅＩが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４０〜８５０番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＤｄｅＩが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ及びこれらの近縁種を同定する、
ことを特徴とする請求項２又は３に記載のキノコの同定方法。
【請求項５】
前記切断工程では、前記ＨｉｎｃII及び前記ＨａｅIIIが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から９０〜７００番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＨｉｎｃII及び前記ＨａｅIIIが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、イッポンシメジ及びこれらの近縁種を同定する、
ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載のキノコの同定方法。
【請求項６】
前記クサウラベニタケ及びこの近縁種は、イッポンシメジ（Entoloma）属のキノコである、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のキノコの同定方法。
【請求項７】
前記同定工程では、前記切断工程により切断されたＤＮＡを電気泳動する、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のキノコの同定方法。
【請求項８】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する増幅工程をさらに含み、
前記切断工程では、前記増幅工程により増幅されたＰＣＲ産物を切断する、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のキノコの同定方法。
【請求項９】
前記増幅工程では、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅する、
ことを特徴とする請求項８に記載のキノコの同定方法。
【請求項１０】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブを用いて前記クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する同定工程と、
を含むキノコの同定方法。
【請求項１１】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｃII、又は、ＨａｅIIIを備えるクサウラベニタケ及びこの近縁種同定用の同定キット。
【請求項１２】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備える、
ことを特徴とする請求項１１に記載の同定キット。
【請求項１３】
前記プライマーは、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅するためのプライマーである、
ことを特徴とする請求項１２に記載の同定キット。
【請求項１４】
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、
前記プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブと、
を備えるクサウラベニタケ及びこの近縁種同定用の同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコの同定方法、及び、同定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食用のキノコと形態が似ているため、自生している毒キノコを誤食する事例が報告されている。毒キノコによる中毒は自然の毒による中毒の７０％を占め、死亡例の６０％を占めている。厚生労働省の統計によると２００２年から２００６年までの５年間において約２５０件の毒キノコによる中毒が発生し、のべ患者数は８００名を越え、数名の死者も出ている。これらの毒キノコによる中毒事例のうち、食用キノコのウラベニホテイシメジ（Entoloma sarcopum）と形態が似ている毒キノコである、クサウラベニタケ（Entoloma rhodopolium）、イッポンシメジ（Entoloma sinuatum）を誤食した事例が多数ある。
【０００３】
食用キノコであるか、毒キノコであるかを判定（同定）するには、かなりの熟練を要し、大学などの研究機関や博物館などに所属する高度な専門家に頼らざるを得ない。そのため、医療機関、又は、科学捜査研究所や保健所などの行政機関の一般的な職員が、キノコの同定をするのはきわめて困難である。
【０００４】
毒キノコの中毒が疑われる患者が発生した場合、迅速に適切な治療をする必要があるが、そのためには原因となる毒キノコを正確に同定することが重要である。特許文献１には、毒キノコであるクサウラベニタケのリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を含むＤＮＡに特異的に反応するプライマーを用いて、クサウラベニタケを同定する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１９４０１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示される同定方法では、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の公的なデータベースに公開されているクサウラベニタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーを用いている。しかしながら、クサウラベニタケにはＤＮＡ塩基配列が異なる変種（近縁種）が多く存在するため、このプライマーを用いても、クサウラベニタケの近縁種を同定することはできず、また、食用のウラベニホテイシメジを同定することもできない。このため、ＤＮＡが公的に公開されているクサウラベニタケだけではなく、ウラベニホテイシメジを含むクサウラベニタケの近縁種を同定するための新たな方法が求められている。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、クサウラベニタケの近縁種を同定できるキノコの同定方法、及び、同定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るキノコの同定方法は、
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素により、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、
前記切断工程により切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する同定工程と、
を含む。
【０００９】
前記制限酵素は、ＭｓｌI、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｃII、又は、ＨａｅIIIでもよい。
【００１０】
前記切断工程では、前記ＭｓｌIが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から５００〜６３０番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＭｓｌIが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ及びこの近縁種を同定してもよい。
【００１１】
前記切断工程では、前記ＤｄｅＩが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４０〜８５０番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＤｄｅＩが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ及びこれらの近縁種を同定してもよい。
【００１２】
前記切断工程では、前記ＨｉｎｃII及び前記ＨａｅIIIが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から９０〜７００番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＨｉｎｃII及び前記ＨａｅIIIが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、イッポンシメジ及びこれらの近縁種を同定してもよい。
【００１３】
前記クサウラベニタケ及びこの近縁種は、イッポンシメジ（Entoloma）属のキノコでもよい。
【００１４】
前記同定工程では、前記切断工程により切断されたＤＮＡを電気泳動してもよい。
【００１５】
また、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する増幅工程をさらに含み、
前記切断工程では、前記増幅工程により増幅されたＰＣＲ産物を切断してもよい。
【００１６】
この場合、前記増幅工程では、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅してもよい。
【００１７】
本発明の第２の観点に係るキノコの同定方法は、
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブを用いて前記クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する同定工程と、
を含む。
【００１８】
本発明の第３の観点に係るクサウラベニタケ及びこの近縁種同定用の同定キットは、
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｃII、又は、ＨａｅIIIを備える。
【００１９】
この場合、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備える、
こととしてもよい。
【００２０】
前記プライマーは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅するためのプライマーである、
こととしてもよい。
【００２１】
本発明の第４の観点に係るクサウラベニタケ及びこの近縁種同定用の同定キットは、
クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、
前記プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブと、
を備える。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、クサウラベニタケの近縁種を同定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ゲノムＤＮＡ上でリボソームＲＮＡをコードする領域を示す図である。
【図２Ａ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｂ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｃ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｄ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｅ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｆ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｇ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｈ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｉ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｊ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図２Ｋ】塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。
【図３】分子系統樹解析の結果を示す図である。
【図４】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において制限酵素ＭｓｌIでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図５】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において制限酵素ＤｄｅIでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図６】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において制限酵素ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図７】制限酵素ＭｓｌIが切断した塩基の位置を示す図である。
【図８】制限酵素ＤｄｅIが切断した塩基の位置を示す図である。
【図９】制限酵素ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIが切断した塩基の位置を示す図である。
【図１０】ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図である。
【図１１】ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において制限酵素ＭｓｌIでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図１２】クサウラベニタケ混入サンプルにｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用した結果を示す図である。
【図１３】マルチプレックスリアルタイム−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定する同定方法、及び、同定キットを提供する。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を制限酵素で切断した際の長さの違いによってＤＮＡの塩基配列の変異（構造多型）を見出す方法である。制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の長さ（大きさ）が対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、塩基配列の変異位置を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。そして、バンドの移動度の差に基づいて、キノコが同定される。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いることにより、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、短時間で、キノコを同定することができる。
【００２５】
本明細書において「近縁種」とは、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジに形態が類似しているイッポンシメジ（Entoloma）属のキノコであり、ＮＣＢＩのデータベースに公開されていない塩基配列からなるイッポンシメジ属キノコを含む。クサウラベニタケはイッポンシメジ科イッポンシメジ属のキノコであり、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジもイッポンシメジ属のキノコであるため、これらのキノコに形態が類似しているキノコ、及び、ゲノムの塩基配列の相同性が高いキノコは、近縁種に含まれる。
【００２６】
（１．キノコの同定方法）
本実施の形態に係るキノコの同定方法では、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種からＤＮＡ（塩基）を抽出する。ＤＮＡを抽出するキノコは、日本の野山に自生しているキノコに限定されず、世界各地に自生しているキノコも含まれる。また、同定するキノコは、生のキノコに限定されず、冷凍キノコ、乾燥キノコ、及び、裁断されたキノコ、加熱調理されたキノコなど任意である。キノコからＤＮＡを抽出する方法は、通常公知の方法が使用できる。具体的には、同定するキノコを洗浄後に、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に供するため、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、タカラバイオ社製など）により、このキノコ由来の試料からＤＮＡを抽出する。
【００２７】
図１は、ゲノムＤＮＡ上でリボソームＲＮＡをコードする領域を示す図である。同図に示す遺伝子ｒＤＮＡ（核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子）のＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer）１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域は約１０００塩基対（１ｋｂｐ）からなる。クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定するために、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する。抽出したＤＮＡを増幅する方法は、通常公知の方法が使用できる。具体的には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いることができるが、リアルタイム−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、及び、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法などの通常公知の方法を用いることもできる。
【００２８】
ＰＣＲ法に用いるプライマーには、遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域を増幅し得るものがすべて含まれる。プライマーの塩基長としては１０塩基以上が好ましく、１５塩基以上がさらに好ましい。また、各プライマーは、単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。ＰＣＲにおけるプライマーの例として、配列表の配列番号１、２に示すプライマーが挙げられるが、これらのプライマーに限定されず、遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部を増幅できるプライマーであれば任意である。またプライマーの配列は変異箇所を含んでいれば制限なく設計することができる。
【００２９】
ＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物の長さは選択したプライマーによって規定され、その長さは特に定めないが、好ましくは１０塩基対から１０００塩基対、電気泳動および観察のしやすさから特に１００塩基対から４００塩基対が好ましい。
【００３０】
例えば、下記実施例３に示すように、プライマーは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対程度の領域を増幅するものであってもよい。この場合のＰＣＲにおけるプライマーの例としては、配列表の配列番号３、４に示すプライマーが挙げられる。ＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物は、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から５００〜６３０番目の塩基を含めばよく、ＰＣＲ産物の長さは、１３１〜３００塩基対、１５０〜２５０塩基対、１６０〜２２０塩基対であってもよい。
【００３１】
次に、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素により、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する。例えば、ＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物に制限酵素を添加してダイジェストしてもよい。より詳細には、制限酵素は、図１に示すＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識し、認識した変異の部位を切断する。添加する制限酵素は、具体的には、ＭｓｌI、ＤｄｅI、ＨｉｎｃII、ＨａｅIIIが挙げられる。
【００３２】
ＭｓｌIは、食用のウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種の遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識し、切断する。具体的には、ＭｓｌIは、この塩基配列の５'側から５００〜６３０番目の塩基の範囲内にある変異（５０５塩基、５６４塩基、６２３塩基）を認識して切断する。その結果、ＭｓｌIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、５００塩基対及び３００塩基対付近に２本のバンドが得られる。しかし、ＭｓｌIは、毒性のあるクサウラベニタケ、毒性のあるイッポンシメジ、及び、これらの近縁種の塩基配列は認識しない。このため、ＭｓｌIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３３】
ＤｄｅIは、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種の遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識し、切断する。具体的には、ＤｄｅIは、毒性のあるイッポンシメジ、及び、この近縁種の塩基配列の５'側から４０〜８５０番目の塩基の範囲内にある変異（４３塩基、７０９塩基、８４８塩基）を認識して切断する。その結果、ＤｄｅIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、６７０塩基対付近に明瞭な１本のバンドが得られる。また、ＤｄｅIは、クサウラベニタケ、及び、この近縁種の塩基配列の５'側から１００〜８５０番目の塩基の範囲内にある変異を認識して切断する。その結果、ＤｄｅIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、５００塩基対付近に明瞭な１本のバンドが得られる。しかし、ＤｄｅIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種の塩基配列の５'側から４０〜８５０番目の塩基の範囲内にある変異（４８塩基、３５６塩基、６１８塩基、８４５塩基）を認識して切断する。その結果、ＤｄｅIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、２４０塩基対から３００塩基対付近に３本のバンドが得られる。このため、ＤｄｅIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種、さらに、イッポンシメジ、及び、この近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３４】
ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種の遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識し、切断する。具体的には、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、毒性のあるクサウラベニタケ、及び、イッポンシメジの塩基配列の５'側から９０〜７００番目の塩基の範囲内にある変異（９６塩基、６９２塩基）を認識して切断する。その結果、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、６００塩基対及び３００塩基対付近に明瞭な２本のバンドが得られる。また、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、クサウラベニタケの近縁種の塩基配列の５'側から９０〜７００番目の塩基の範囲内にある変異（９６塩基、２３１塩基、７００塩基）を認識し、切断する。その結果、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、４７０塩基対及び３００塩基対付近に明瞭な２本のバンドが得られる。しかし、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、ウラベニホテイシメジの塩基配列の５'側から６６０番目付近〜６７０番目の塩基の範囲内にある変異（６６４塩基）を認識して切断する。その結果、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動では、６７０塩基対及び３００塩基対付近に明瞭な２本のバンドが得られる。すなわち、それぞれ異なった位置にバンドが見られる。このため、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、クサウラベニタケ、及び、この近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３５】
制限酵素は、ＭｓｌI、ＤｄｅI、ＨｉｎｃII、ＨａｅIIIに限定されず、遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の変異を認識し、ＤＮＡを切断できる制限酵素であれば任意である。また、制限酵素FastDigest（登録商標）（Thermo Scientific製）を用いることにより、５〜１５分程度の短時間でダイジェストすることができる。
【００３６】
次に、切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記クサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する。例えば、制限酵素により切断したＤＮＡ断片を電気泳動法により解析する。電気泳動法は、通常公知の方法が使用できる。電気泳動後のバンドの移動度の差から、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定する。また、同定したキノコの食毒判定を行う。
【００３７】
制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅI、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIでＰＣＲ産物をダイジェストすると、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域に存在する塩基配列の変異が認識され、認識された部位で切断される。ＭｓｌIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種の塩基配列の変異のみを認識して切断する。このため、ＭｓｌIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動のバンド位置は、約１ｋｂｐのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域のバンドが検出される位置と異なる位置で検出される。すなわち、毒性のあるキノコ、及び、この近縁種由来のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域はいずれもこの制限酵素で切断されない。この結果、ウラベニホテイシメジ、及び、クサウラベニタケとイッポンシメジとこれらの近縁種とを同定することができ、さらに、食用のキノコを判定することができる。
【００３８】
ＤｄｅIは、イッポンシメジ、及び、この近縁種のＰＣＲ産物の電気泳動において、６７０塩基対付近にバンドを与える。また、ＤｄｅIは、クサウラベニタケ、及び、この近縁種のＰＣＲ産物の電気泳動において、５００塩基対付近にバンドを与える。しかし、ＤｄｅIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種のＰＣＲ産物の電気泳動において、２４０〜３００塩基対付近に３本バンドを与える。このため、ＭｓｌIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動のバンド位置から、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、及び、これら近縁種を同定でき、さらに、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種を同定できる。そして、クサウラベニタケ、イッポンシメジは毒性のあるキノコであり、ウラベニホテイシメジは食用のキノコであるため、キノコの食毒判定も行うことができる。
【００３９】
ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、ウラベニホテイシメジ、及び、この近縁種のＰＣＲ産物の電気泳動において、６７０塩基対及び３００塩基対付近に明瞭な２本のバンドを与える。このため、ＨｉｎｃIIとＨａｅIIIでダイジェストしたＰＣＲ産物の電気泳動のバンド位置から、食用のウラベニホテイシメジ、毒性のあるクサウラベニタケ、及び、これらの近縁種を同定することができる。
【００４０】
酵素の反応時間・温度に制限はないが、一般的には３７℃で３時間から一晩反応させる。反応バッファーも制限はないが、市販品の酵素に添付されるものを用いるのが通常である。電気泳動の方法も特に決まったものはなく、スラブゲル型、サブマリン型、キャピラリーなど核酸が電気的に分離できるものであればいずれの方法を用いてもよい。ゲルの材料についてもアガロースやアクリルアミドなどが一般的であるが、特に制限はない。ＤＮＡ断片の検出は電気的、紫外線吸収、染色など種々の方法を用いることができる。また、電気泳動は、通常のアガロースのほか、マイクロチップ電気泳動装置を用いることもできる。例えば、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies製）を用いることにより、アガロースを用いた場合より短時間で、高分解能でＰＣＲ産物を電気泳動することができる。また、反応条件（温度、時間等）は、ＤＮＡ含有量、並びに、制限酵素の種類及び量によって変化するものであり、上述した値に限定されるものではない。
【００４１】
以上説明したように、本発明のキノコの同定方法により、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定することができ、さらに、キノコの食毒判定を行うこともできる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いることにより、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、短時間で、キノコを同定することができる。
【００４２】
なお、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で用いるプライマーは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅するものであってもよい。当該領域には、ＭｓｌIが認識する部位が含まれる。このため、ＭｓｌIでダイジェストすることで、約１ｋｂｐのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域が残されていないサンプル、例えば、加熱調理又は消化によって分解された毒性のクサウラベニタケ及び食用のウラベニホテイシメジのｒＤＮＡを含むサンプルに対してもＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用して、食毒判定ができる。
【００４３】
（２．リアルタイム−ＰＣＲ法を用いたキノコの同定方法）
本実施の形態におけるキノコの同定方法は、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ及びこれらの近縁種に、特異的なプローブを用いる。
【００４４】
ＰＣＲ増幅では、上述のように、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅する。ここでのプライマーとしては、配列表の配列番号５、６及び７に示すプライマーが挙げられるが、これらのプライマーに限定されず、遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅できるプライマーであれば任意である。
【００４５】
次に、増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブを用いてクサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する。リアルタイム−ＰＣＲ法を用いる場合、特定の塩基配列に特異的なプローブを用いてＰＣＲ増幅を行うことでクサウラベニタケ及びこの近縁種を同定する。プローブとは、核酸の相補性に基づいたハイブリダイゼーション等を利用して核酸又はその塩基配列中の特定の部位について解析するための核酸の断片をいう。プローブは、例えば、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の連続する少なくとも１０塩基対以上、好ましくは１０〜１００塩基対、より好ましくは、１０〜５０塩基対のＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
特定の塩基配列に特異的であるということは、プローブが、特定の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするが、当該塩基配列を有していないＤＮＡにはハイブリダイズしないことをいう。ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内のクサウラベニタケ、イッポンシメジ及びウラベニホテイシメジ各々に特有の塩基配列を標的としてプライマーを設計することで、当該プライマーは標的とする塩基配列を有するＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。クサウラベニタケに特異的なプローブ、イッポンシメジに特異的なプローブ、ウラベニホテイシメジに特異的なプローブの塩基配列及び未同定近縁種であるEctomycorrhizalに特異的なプローブは、それぞれ配列表の配列番号８、９、１０及び１１に示される。蛍光物質又は放射性物質等によって標識されたプローブを用いることで、ＰＣＲ産物を定量できる。
【００４７】
リアルタイム−ＰＣＲにおけるハイブリダイゼーションの条件は、標的の塩基配列を区別するのに十分な条件であればよい。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、ある一定温度条件で標的の塩基配列のＤＮＡとはハイブリダイズするが、標的の塩基配列ではないＤＮＡとはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。例えば、プライマーのアニーリング温度より１０度高い温度、である。他の一般的なハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）等に基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
【００４８】
リアルタイム−ＰＣＲ法を適用する場合、例えば、Roch LightCycler（登録商標）等を用いて、例えば蛍光強度を測定することで、ＰＣＲのサイクル数に応じて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ及びウラベニホテイシメジそれぞれで異なるパターンが得られる。こうすることで、試料内のキノコを同定でき、食毒も判定できる。
【００４９】
以上説明したように、本同定方法によれば、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、迅速に、キノコを同定することができる。また、同定したキノコからキノコの食毒を判定することもできる。
【００５０】
（３．同定キット）
本実施の形態に係る同定キットは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定するキット、及び、キノコを同定後に、同定したキノコの食毒を判定するキットである。同定キットは、キノコの核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列の変異を認識する制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅI、ＨｉｎｃII、及び／又は、ＨａｅIIIを備える。同定キットの形態として、例えば、上述したプライマー、及び、プライマーを用いて遺伝子多型の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。また、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキット化することもできる。
【００５１】
同定キットは、通常公知の方法で使用する。具体的には、同定するキノコを洗浄後に、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に供するため、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、タカラバイオ社製など）により、このキノコ由来の試料からＤＮＡを抽出する。抽出した変異を含むＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、同定キットが備える制限酵素で処理することによって、塩基配列の変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出する。そして、バンドの移動度の差に基づいて、キノコを同定する。
【００５２】
以上説明したように、本実施の形態に係る同定キットを用いて塩基配列の変異を検出することにより、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、短時間で、キノコを同定することができる。また、同定したキノコからキノコの食毒を判定することもできる。
【００５３】
なお、本同定キットは、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備えてもよい。この場合、プライマーは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５'側から４７０〜６８５番目の塩基を含む少なくとも２１６塩基対の領域を増幅するためのプライマーであってもよい。
【００５４】
（４．リアルタイム−ＰＣＲ用の同定キット）
本実施の形態に係る同定キットは、リアルタイム−ＰＣＲ法を用いて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定するキット、及び、キノコを同定後に、同定したキノコの食毒を判定するキットである。同定キットは、クサウラベニタケ及びこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長又は一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、当該プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に特異的なプローブと、を備える。同定キットは、緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類を備えていてもよい。
【００５５】
本同定キットを用いることで、上記リアルタイム−ＰＣＲ法を用いたキノコの同定方法を簡便に行うことができる。
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：キノコの分類）
キノコの形態に基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ、イッポンシメジの何れかに該当すると判別できた自生していたキノコを、日本国内から３８サンプル採取した。この採取した３８サンプルのキノコの核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列を、ダイレクトシークエンスすることにより、塩基配列に基づく系統樹解析を行った。そして、この系統樹解析から３８サンプルのキノコを分類した。
【００５８】
まず、各サンプルを滅菌蒸留水でよく洗浄し、湿重量で100gから500gの試料を採取し、マイクロ乳棒（エッペンドルフ製）でホモジナイズした後に、AP1 buffer、RNase Aを加えて１０分間、６５℃でインキュベートした。次に、AP2 bufferを添加して、よく混合後氷上に１０分間置く。14000 rpmで10分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を、QIAshredder mini spin columnに負荷し、14000 rpmで遠心分離し、得られた溶出液の１．５倍量のAP3/E bufferを添加し、DNeasy Minispin columnに負荷した。AW bufferで洗浄した後、AE bufferでＤＮＡを溶出した。そして、分離した各サンプルのＤＮＡをダイレクトシークエンスした。
【００５９】
図２Ａ〜図２Ｋは、３８サンプルの塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。同図に示す、サンプル名のE. rhodopoliumはクサウラベニタケの塩基配列、E. sinuatumはイッポンシメジの塩基配列、E. sarcopumはウラベニホテイシメジの塩基配列を示したものであり、これらの塩基配列は、ＮＣＢＩのデータベースに公開された塩基配列と同じ塩基配列である。サンプル名のKUBは、国内各地から採取したサンプルから得られた新規の塩基配列である。また、同図に示すE. rhodopolium〜KUB134の塩基配列は、配列表の配列番号１２〜４９に示す塩基配列に該当する。
【００６０】
図２Ａ〜図２Ｋに示す塩基配列、及び、配列番号１２〜４９の塩基配列に基づいて、３８サンプルの系統樹解析を行った。図３は、３８サンプルの分子系統樹解析の結果を示す図である。同図に示すように、３８サンプルは、４つのグループに分類することができた。E. rhodopolium、KUB1、KUB124、KUB132、KUB3-seq2、KUB123、KUB130、KUB3-seq1、KUB2を含むグループをグループ１とし、KUB101-seq2、KUB127-seq1、KUB126、KUB127-seq2、KUB128-ITS、KUB102、KUB101-seq1、KUB9、KUB10、KUB7、KUB6、KUB5を含むグループをグループ２とし、KUB105、KUB109、KUB104、KUB111、KUB107、KUB114、KUB110、KUB113、KUB108、KUB106、E. sinuatumを含むグループをグループ３とし、E. sarcopum、KUB136-seq2、KUB133-seq2、KUB133-seq1、KUB136-seq1、KUB134を含むグループをグループ４とした。グループ１は、ＮＣＢＩのデータベースに公開されたE. rhodopolium（クサウラベニタケ）の塩基配列を含んでいるため、クサウラベニタケ及びこの近縁種からなる毒性を有するグループと判定できた。また、グループ２は、ＮＣＢＩのデータベースに公開された塩基配列と一致する塩基配列を含まないグループであるが、解析した塩基配列からクサウラベニタケの近縁種からなる毒性を有するグループと判定できた。また、グループ３は、ＮＣＢＩのデータベースに公開されたE. sinuatum（イッポンシメジ）の塩基配列を含むため、イッポンシメジ及びこの近縁種からなる毒性を有するグループと判定できた。また、グループ４は、ＮＣＢＩのデータベースに公開されたE. sarcopum（ウラベニホテイシメジ）の塩基配列を含むため、ウラベニホテイシメジ及びこの近縁種からなる食用可能なグループと判定できた。
【００６１】
以上の結果から、キノコの遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列を、ダイレクトシークエンスすることにより、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を分類できることが明らかとなった。また、それぞれの近縁種間の塩基配列の違いに基づいて、キノコの食毒判定を行うことができることが明らかとなった。さらに、ＮＣＢＩで公開されていないクサウラベニタケ及びこの近縁種の塩基配列情報を得ることができた。
【００６２】
（実施例２：キノコの同定）
次に、日本国内で採取した３８サンプルのキノコの核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて解析することにより、キノコの同定を行った。
【００６３】
まず、採取したキノコを、湿重量の場合には100mg以上、凍結乾燥の場合には20mg以上マイクロチューブに取った。マイクロチューブに取った各サンプルに、サンプル懸濁バッファーPrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(applied biosystems製) 400μlを添加し、底部を高速旋回して内容液を撹拌（ボルテックス）した。これらを、１００℃で１０分間処理し、13,000g x 2分間遠心して上清をとり、ＰＣＲのテンプレートとした。そして、ＰＣＲチューブに、50μl反応系において、2x Ampdirect Plus 25μl、BIOTAQ HS DNA Polymerase(5U/μl) 0.25μ、10μM 5'-Primer 2.5μl、10μM 3'-Primer 2.5μl、サンプル(テンプレート) 1μl、Distilled water 18.75μlを添加して、調製した。調製したＰＣＲチューブにおいて、配列表の配列番号１、２に示すプライマー（FASMAC製）、ＰＣＲ装置（BIO-RAD製iCycler 170-8720JA、96ウェルx 0.2mlリアクションモジュール）、ＰＣＲ試薬Ampdirect Plus（島津製作所製）、ＰＣＲ用酵素BIOTAQ HS DNA Polｙmerase、ＰＣＲ用バッファー2x Ampdirect Plusを用いて、９５℃で３分間を１サイクル、次に９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして４５サイクル、その後４℃で保持するＰＣＲ増幅を行った。
【００６４】
次に、ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を精製しないまま、制限酵素（NEW ENGLAND BioLabs製）で処理をした。未精製ＰＣＲ産物１μgにつき制限酵素１０ユニット以上使用した。制限酵素として、（１）ＭｓｌI（ダイジェスト条件：３７℃、４時間）、（２）ＤｄｅI（ダイジェスト条件：３７℃、３時間）、（３）制限酵素ＨｉｎｃII−ＨａｅIII（ダイジェスト条件：３７℃、３時間）の３つを用いて、系統樹解析によりグループ１〜４に分類したグループごとに各々ダイジェストした。なお、ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIは、同一チューブに同時に２種の制限酵素を添加し、ダイジェストを行った。制限酵素は、FastDigest（登録商標）（Thermo Scientific製）を用いることにより、５〜１５分程度のより短時間でダイジェストできる。
【００６５】
次に、各制限酵素でダイジェストしたＰＣＲ産物を電気泳動した。低電気浸透高ゲル強度の微粉末アガロース（nacalai tesque製）に、バッファーnacarai tesque Tris-Acetate-EDTA Buffer(10x)、Nuclease and Protease tested [TAE Buffer]（nacalai tesque製）を添加することにより作成した２％アガロースゲルに、6x Loading Buffer Orange G (ニッポン・ジーン製）を添加し、泳動装置（ADVANCE製Mupid 2-plus）を用いてゲルを電気泳動した。そして、ゲルの泳動後、エチジウムブロマイドにて３０分間染色した後、アガロースゲル撮影装置Diana-III Advanced Imaging System（raytest製）でゲルを撮影した。その撮影した泳動パターンに基づいてキノコの同定を行った。
【００６６】
図４〜図６は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において、制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅI、及び、ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIでダイジェストしたＤＮＡの電気泳動の結果を示す図である。図４に示すように、ＭｓｌIでダイジェストすることによりグループ４を検出（分類）することができた。また、図５に示すように、ＤｄｅIでダイジェストすることによりグループ１及びグループ２と、グループ３と、グループ４との３つのグループを検出（分類）することができた。また、図６に示すように、ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIでダイジェストすることによりグループ２と、グループ１及びグループ３と、グループ４との３つのグループを検出（分類）することができた。これらの結果から、３種類の制限酵素処理のいずれでも食毒判別が可能である。また、３種類の制限酵素処理のすべての結果から、４つのグループを分類することができた。
【００６７】
図７〜９は、グループ１〜４の遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における、制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅI、及び、ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIで切断した塩基の位置を示した図である。図７に示すように、ＭｓｌIは、グループ４の５０５番目、５６４番目、６２３番目の塩基を切断していた。グループ４は、食用であるウラベニホテイシメジ及びこの近縁種からなるグループである。このため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いてＭｓｌIでダイジェストした塩基配列を解析することにより、食用であるウラベニホテイシメジ及びこの近縁種を同定できることが明らかとなった。また、図８に示すように、ＤｄｅIは、グループ３の７０９番目、８４８番目、グループ４の３５６番目、６１８番目、８４５番目の塩基を切断しているが、グループ１、２においては７０９番目、３５６番目、６１８番目付近の塩基を切断していなかった。ＤｄｅIに切断される塩基の位置が各グループで異なるため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いてＤｄｅIでダイジェストした塩基配列を解析することにより、毒性のあるイッポンシメジ及びこの近縁種、及び、食用であるウラベニホテイシメジ及びこの近縁種を同定できることが明らかとなった。また、図９に示すように、ＨｉｎｃII及びＨａｅIIIは、グループ２の２３１番目の塩基を切断していた。このため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いてＨｉｎｃII−ＨａｅIIIでダイジェストした塩基配列を解析することにより、毒性のあるクサウラベニタケ近縁種を同定できることが明らかとなった。
【００６８】
以上の結果から、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて、制限酵素ＭｓｌI、ＤｄｅI、及び、ＨｉｎｃII−ＨａｅIIIでダイジェストした塩基配列を解析することにより、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を分類でき、さらに、キノコの食毒判定を行うことができることが明らかとなった。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて解析することにより、煩雑で時間のかかるシークエンス解析を行うことなく、簡便な操作で、短時間で、キノコの同定、及び、キノコの食毒判定を行うことができた。
【００６９】
（実施例３：ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に基づくキノコの同定及び食毒判定）
キノコの加熱調理後又は消化後には、キノコのＤＮＡは、短い断片に分解されてしまう。実用面を考慮して短い断片からも毒性のキノコを判定するために、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域に含まれる特定の短い領域を解析対象として、キノコの食毒判定を検討した。
【００７０】
上記実施例２に示すように、ＭｓｌIは、食用であるウラベニホテイシメジ及びこの近縁種からなるグループ４において、５０５番目、５６４番目、６２３番目の塩基を切断していた。当該５０５番目、５６４番目及び６２３番目の塩基を含む領域を解析対象とすることで加熱調理後又は消化後のキノコに対しても食毒判定を行うことが可能である。以下詳細を説明する。
【００７１】
まず、採取したキノコを十分に水洗いし、湿重量で100mg以上をサンプルとして量り取った。サンプルを沸騰水中で６０分間又は３０分間ボイルした。次に、サンプルを薬局方崩壊試験第一液に浸漬した状態で、３７℃で９０分間振盪し、擬似的な消化処理を行った。消化処理後のサンプルに、サンプル懸濁バッファーPrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(applied biosystems製) 400μlを添加し、ホモジナイザーを用いて１００℃で１０分間懸濁した。得られたサンプルのホモジネートを13,000g x 2で２分間遠心分離した。遠心分離により得られた上清をＰＣＲテンプレートとした。
【００７２】
上記実施例２と同様に、ＰＣＲテンプレートに対してＰＣＲ増幅（以下、単に「ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ」ともいう）を行った。用いたプライマーの塩基配列は、配列表の配列番号３、４に示す。ＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、次に９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクルとして４０サイクル、続いて７２℃で７分間を１サイクルであって、その後４℃で保持した。なお、加熱及び人工胃液消化の影響を確認するために、上記実施例２と同じプライマーを用いたＰＣＲ増幅（以下、単に「ＩＴＳ−ＰＣＲ」ともいう）も当該ＰＣＲ条件で行った。
【００７３】
次に、ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を、上記実施例２と同様に制限酵素で処理した。本実施例では、制限酵素はＭｓｌIのみを用いた。制限酵素は、FastDigest（登録商標）（Thermo Scientific製）を用いて、ＭｓｌIによるダイジェスト条件は、３７℃で３０分間とした。電気泳動は、低分子量分類用のゲルを併用して上記実施例２と同様に行った。
【００７４】
図１０は、ＩＴＳ−ＰＣＲ及びｓｈｏｒｔ−ＰＣＲそれぞれで得られた各ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。レーン１、２はクサウラベニタケ、レーン３、４はクサウラベニタケ未同定近縁種、レーン５〜７は、イッポンシメジのサンプルを示す。ＩＴＳ−ＰＣＲでは、約１ｋｂｐのＰＣＲ産物が擬似的な調理加工及び人工胃液消化処理の影響で、１００ｂｐ以下に断片化され、すべてのサンプルで検出できなかった。一方、ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲでは、擬似的な調理加工及び人工胃液消化処理の後でも約２００ｂｐの明瞭なバンドが得られ、ＰＣＲ増幅が可能であることがわかった。
【００７５】
図１１は、ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＭｓｌIで処理して得られたＤＮＡの電気泳動の結果を示す図である。レーン１〜３はウラベニホテイシメジ、レーン４はクサウラベニタケ、レーン５は、イッポンシメジのサンプルを示す。食用のウラベニホテイシメジでは、制限酵素処理により切断された約６０〜１６０ｂｐの複数のバンドパターンが得られた。一方、毒性のクサウラベニタケ及びイッポンシメジでは、切断されずに約２００ｂｐのバンドが残った。この結果から、ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲを行うことで調理加工及び人工胃液消化処理をされたサンプルが対象であっても、迅速な食毒判定を行うことができた。
【００７６】
（実施例４：クサウラベニタケ混入サンプルの判定）
サンプル中に複数の食用のキノコが混在する場合であっても、上記実施例３の方法を用いて毒性のキノコの有無を判定できることを確認した。
【００７７】
サンプルは表１に示す配合で調製した。なお、市販栽培種ミックスは、５９１ｍｇのぶなしめじ、５１７ｍｇのマッシュルーム（白）、５２６ｍｇのマッシュルーム（茶）、９８５ｍｇのなめこ、５０７ｍｇのえのき、６６１ｍｇのエリンギ、５１６ｍｇのまいたけ及び３７７ｍｇのしいたけを、バイオマッシャーII（ニッピ製）を用いて、ホモジナイズしたものである。
【００７８】
【表１】
2014155486.tif 000003
【００７９】
各サンプルに上記実施例３と同じｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用した結果を図１２に示す。クサウラベニタケを含むサンプル２、４、５、７では、制限酵素処理後も約２００ｂｐのバンドが得られた。一方、クサウラベニタケを含まないサンプル１、３、６では、制限酵素処理後に約２００ｂｐのバンドが検出されなかった。このため、ｓｈｏｒｔ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によって、種々のキノコが混在するサンプルについても迅速に毒性のクサウラベニタケの有無を確実に判定することができた。また、本方法は、クサウラベニタケが微量（２０ｍｇ）の場合であっても（サンプル７）、その有無を判定することが可能であった。
【００８０】
（実施例５：リアルタイム−ＰＣＲ法に基づくキノコの同定）
リアルタイム−ＰＣＲ法を用いてクサウラベニタケ、イッポンシメジ及びウラベニホテイシメジを同定できるか検討した。ＰＣＲチューブに、25μl反応系において、2x FastStart Universal Probe Master 12.5μl、50μM Forward-primer 0.25μl、50μM Reverse-primer 0.25μl、10μM クサウラベニタケ特異的プローブ 0.5μl、10μM イッポンシメジ特異的プローブ 0.5μl、10μM ウラベニホテイシメジ特異的プローブ 0.5μl、10ng/μl サンプル(テンプレート) 0.5μl、Distilled water 9.5μlを添加して、調製した。リアルタイム−ＰＣＲ装置は、Roch LightCycler（登録商標）96を用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を１サイクルとして４０サイクルとした。
【００８１】
Forward-primerの塩基配列は、配列表の配列番号５に示す。Reverse-primerの塩基配列は、配列表の配列番号６、７に示す。また、クサウラベニタケ特異的プローブ、イッポンシメジ特異的プローブ及びウラベニホテイシメジ特異的プローブの塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号８、９及び１０に示す。クサウラベニタケ特異的プローブはＦＡＭ、イッポンシメジ特異的プローブはＣｙ３及びウラベニホテイシメジ特異的プローブはＣｙ５で蛍光標識したものを用いた。
【００８２】
図１３は、リアルタイム−ＰＣＲ法の結果を示す。サイクルに応じて、蛍光標識ごとに異なる蛍光強度の曲線が得られ、クサウラベニタケ、イッポンシメジ及びウラベニホテイシメジそれぞれを交差反応することなく検出できた。
【００８３】
したがって、リアルタイム−ＰＣＲ法を用いることで、クサウラベニタケ及びこの近縁種を高感度で、迅速に同定できた。このため、毒性キノコの誤食防止の観点から本方法は、食用キノコの同定に至るまでの精査体制の構築に寄与する。
【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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