(57)【要約】【課題】ショートタンデムリピート遺伝子座のマルチプレックス増幅のための方法およびキットの提供。【解決手段】１回のマルチプレックス反応でゲノムＤＮＡの少なくとも１１個の特定のＳＴＲ遺伝子座を同時に増幅するのに使用する方法および材料を開示し、そうした反応の産物の分析に使用する方法および材料も開示する。本発明には１回のマルチプレックス反応で、１０個のＡｍｐＦｌＳＴＲ？ＳＧＭｐｌｕｓ？ＳＴＲ遺伝子座と、アメロゲニン遺伝子座と、５個の新しいＳＴＲ遺伝子座とを含む１６個の特定の遺伝子座を同時に増幅する材料および方法が含まれ、そうした遺伝子座を分析する方法および材料も含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年１０月３０日に出願された米国特許出願第６０／９８３，７３７号（これは、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
序論
本教示は全般的には、ゲノム系における遺伝子マーカーの検出を対象とする。種々の実施形態では、各遺伝子座の対立遺伝子を決定するため１回のマルチプレックス反応で複数の異なる多型遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ）を同時に増幅する。分析される多型遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ）はショートタンデムリピート（ＳＴＲ：ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）遺伝子座であってもよく、ショートタンデムリピートは約２００塩基対またはそれ未満のアンプリコンを与えるミニＳＴＲを含む場合がある。
【０００３】
当業者であれば、以下に記載する図が例示のみを目的としたものであることを理解するであろう。各図は、いかなる意味でも本教示の範囲を限定することを意図するものでない。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）マルチプレックス（ｍｕｌｔｐｌｅｘ）増幅反応で分析される少なくとも１個のＤＮＡサンプルの一組の遺伝子座を共増幅する工程であって、該反応の産物は該組内の該共増幅した（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄｄ）遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物であり、該遺伝子座の組は１０個のＳＴＲ遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ８Ｓ１１７９、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＶＷＡ；およびＳＴＲ遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２２Ｓ１０４５およびＤ２Ｓ４４１からなる群から選択される１つまたは複数を含む、工程；
（ｂ）該混合物中の該増幅された対立遺伝子を評価して該少なくとも１個のＤＮＡサンプル内の該遺伝子座の組で分析された各該遺伝子座に存在する該対立遺伝子を決定する工程を含む、方法。
（項目２）
工程（ａ）の上記遺伝子座の組は上記少なくとも１個のＤＮＡサンプルの供給源（単数または複数）の性別を特定するのに使用され得る遺伝子座をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ＤＮＡサンプル（単数または複数）の上記供給源はヒトであり、該ヒトの性別の特定に使用する上記遺伝子座はアメロゲニン遺伝子座である、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記評価する工程の前に上記増幅された対立遺伝子を分離する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記増幅された対立遺伝子はキャピラリーゲル電気泳動により分離される、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記共増幅する工程は上記遺伝子座の組内の該遺伝子座それぞれに対して１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含み、該対のプライマーはそれぞれ上記マルチプレックス反応における該遺伝子座の組の遺伝子座に隣接する、項目１に記載の方法。
（項目７）
オリゴヌクレオチドプライマーの各対の少なくとも１個のプライマーは標識プライマーである、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記標識プライマーの標識は蛍光標識である、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記共増幅する工程は少なくとも５個の蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含み、該少なくとも５個の標識プライマーは、該標識プライマーにそれぞれ共有結合した少なくとも５種類の異なる蛍光標識を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記共増幅する工程は少なくとも６個の蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含み、該少なくとも６個の標識プライマーは、該標識プライマーにそれぞれ共有結合した少なくとも６種類の異なる蛍光標識を有する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
上記少なくとも６種類の異なる蛍光標識が、５２０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第１の蛍光標識、５５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第２の蛍光標識、５７５ｎｍでその最大の蛍光を放つ第３の蛍光標識、５９０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第４の蛍光標識、６５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第５の蛍光標識および６２０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第６の蛍光標識を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
選択された上記遺伝子座の組の各遺伝子座はポリメラーゼ連鎖反応を使用して共増幅される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
分析される上記少なくとも１個のＤＮＡサンプルはヒト組織から調製される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ヒト組織は血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、骨、口腔サンプル、胎盤細胞を含む羊水および胎児細胞を含む羊水からなる群の１つまたは複数から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
分析される少なくとも１個のＤＮＡサンプルの一組の遺伝子座を共増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、キットであって、該遺伝子座の組は共増幅され得；該プライマーは１つまたは複数の容器内にあり；該遺伝子座の組はアメロゲニン遺伝子座と、１０個のＳＴＲ遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ８Ｓ１１７９、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＶＷＡと、ＳＴＲ遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２２Ｓ１０４５およびＤ２Ｓ４４１からなる群の１つまたは複数とを含む、キット。
（項目１６）
上記キット内の上記オリゴヌクレオチドプライマーはすべて１つの容器内にある、項目１５に記載のキット。
（項目１７）
少なくとも１回のマルチプレックス増幅反応のための試薬をさらに含む、項目１５に記載のキット。
（項目１８）
少なくとも１つのサイズ標準の入った容器をさらに含む、項目１５に記載のキット。
（項目１９）
上記サイズ標準はＤＮＡマーカーである、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
上記サイズ標準は遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーである、項目１８に記載のキット。
（項目２１）
上記遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーのおのおのの格（ｒｕｎｇ）、および上記遺伝子座の組の各遺伝子座に対する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーは、それらに共有結合した蛍光標識を有し、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２個は、該プライマーに共有結合した、上記容器内の他のプライマーと異なる蛍光標識を有する、項目２０に記載のキット。
（項目２２）
上記標識プライマーの少なくとも５個が、該標識プライマーにそれぞれ共有結合した少なくとも５種類の異なる蛍光標識を有する、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
上記少なくとも５種類の異なる蛍光標識が、５２０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第１の蛍光標識、５５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第２の蛍光標識、５７５ｎｍでその最大の蛍光を放つ第３の蛍光標識、５９０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第４の蛍光標識および６５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第５の蛍光標識を含む、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
上記標識プライマーの少なくとも６個が、該標識プライマーにそれぞれ共有結合した少なくとも６種類の異なる蛍光標識を有する、項目２１に記載のキット。
（項目２５）
上記少なくとも６種類の異なる蛍光標識が、５２０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第１の蛍光標識、５５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第２の蛍光標識、５７５ｎｍでその最大の蛍光を放つ第３の蛍光標識、５９０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第４の蛍光標識、６５０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第５の蛍光標識および６２０ｎｍでその最大の蛍光を放つ第６の蛍光標識を含む、項目２４に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】実施例に記載されているような１５個のＳＴＲ遺伝子座（１０個のＳＧＭｐｌｕｓ（登録商標）遺伝子座と５個の新しい遺伝子座）およびアメロゲニン性決定遺伝子座（Ａｍｅｌ：Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ）のマルチプレックス増幅により生成されるアンプリコンの相対的なサイズ範囲（塩基対単位）を示す図である。
【図２】ＳＧＭｐｌｕｓ（登録商標）ＳＴＲ遺伝子座ＶＷＡ（ｖＷＡ）、Ｄ１６Ｓ５３９（Ｄ１６）、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ８Ｓ１１７９（Ｄ８）、Ｄ２１Ｓ１１（Ｄ２１）、Ｄ１８Ｓ５１（Ｄ１８）、Ｄ１９Ｓ４３３（Ｄ１９）、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ３Ｓ１３５８（Ｄ３）、性決定遺伝子座アメロゲニン（Ａｍｅｌ）および（丸で囲んだ）５個の新しいＳＴＲ遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８（Ｄ１０）、Ｄ２２Ｓ１０４５（Ｄ２２）、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ１Ｓ１６５６（Ｄ１）およびＤ１２Ｓ３９１（Ｄ１２）を同時増幅して得られる産物の５色蛍光検出のアウトプットの図である。遺伝子座は実施例に記載されているようにヒトゲノムＤＮＡサンプルから増幅し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌジェネティックアナライザーにより検出した。４つのパネルは上から下へ６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）およびＰＥＴ（登録商標）色素標識のピークに対応する（第５の色素ＬＩＺ（商標）はサイズ標準の標識に使用したため示していない）。各パネルのｘ軸は増幅産物のサイズを塩基対単位で表す。
【図３】実施例で使用した５種の蛍光色素（６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）およびＬＩＺ（商標））、および６種の色素のマルチプレックス反応で使用できる第６の追加色素（ＳＩＤ：ｓｉｘｔｈ  ｄｙｅ）の発光スペクトル（ｎｍ単位の波長）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本明細書に使用する単語の大部分は、その単語について当業者が考えるような意味を持つ。本明細書に具体的に定義される単語は、全体として本教示の文脈から読み取れ、通常当業者が理解するような意味を持つ。当該技術分野で理解されている語句の定義と本明細書に具体的に教示する定義とに矛盾が生じた場合、本明細書を優先するものとする。本明細書に使用する見出しは便宜上使用されているに過ぎず、いかなる意味でも限定するものと解釈してはならない。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡおよび染色体ＤＮＡなど当該技術分野において理解されている様々な形態のデオキシリボ核酸をいう。「核酸」とは、任意の形態のＤＮＡまたはＲＮＡ（リボ核酸）をいう。本明細書で使用する場合、「単離された核酸分子」という用語は、本来の環境から取り除かれた核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をいう。単離された核酸分子のいくつかの例としてベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ分子、異種の宿主細胞内で維持された組換えＤＮＡ分子、ある程度または十分に精製された核酸分子および合成ＤＮＡ分子がある。「単離された」核酸については、その核酸が由来する生体のゲノムＤＮＡの核酸に本来隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まなくてもよい。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は組換え技法により作製した場合、他の細胞成分または培養基を実質的に含まなくてもよいし、あるいは化学的に合成した場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【０００７】
「ショートタンデムリピート」または「ＳＴＲ」遺伝子座とは、短い反復配列エレメントを含むゲノムＤＮＡの領域をいう。反復される配列エレメントは、以下に限定されるものではないが、一般に３〜７塩基対長である。各配列エレメントはＳＴＲ内で少なくとも１回反復され、本明細書ではそれを「反復単位」という。ＳＴＲという用語は、複数の反復単位が縦列にまたは塩基を介して反復したゲノムＤＮＡの領域も包含する。ただし、少なくとも配列の１つは縦列に少なくとも２回反復するものとする。
【０００８】
「多型ショートタンデムリピート遺伝子座」はＳＴＲ遺伝子座をいい、ゲノムＤＮＡの個々の領域における反復配列エレメントの数（および配列全体の長さ）は対立遺伝子間および個体間で異なる。
【０００９】
本明細書で使用する場合、「対立遺伝子ラダー」とは、遺伝子座から増幅された対立遺伝子からなる標準サイズマーカーをいう。「対立遺伝子」とは、あるＤＮＡの断片に認められる遺伝的変異、すなわち、同一遺伝子座を占めるＤＮＡ配列において２つ以上の相互に異なる型の１つをいう。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「生化学命名法」とは、ヌクレオチドの塩基をアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）と命名する標準的な生化学命名法をいう。そのヌクレオチドは、たとえば、デオキシグアノシン−５’−トリホスファート（ｄＧＴＰ）である。
【００１１】
「ＤＮＡ多型」とは、同じ交配集団内のＤＮＡ配列に２つ以上の異なるヌクレオチド配列が共存している状態をいう。
【００１２】
「遺伝子座」または「遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ）」とは、染色体上の特定の物理的位置をいう。遺伝子座の対立遺伝子は相同染色体上の同一位置にある。
【００１３】
「遺伝子座特異的プライマー」とは、増幅法に使用する条件下で少なくとも遺伝子座の１つの対立遺伝子に対応して規定した遺伝子座の一部またはその相補鎖と特異的にハイブリダイズし、他のＤＮＡ配列とはうまくハイブリダイズしないプライマーをいう。
【００１４】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」とは、変性、プライマーとのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼ酵素による伸長という反復サイクルにより標的ＤＮＡ配列のコピー数を約１０６倍またはそれ以上増幅する手法をいう。核酸を増幅するＰＣＲプロセスは、プロセスの説明のため参照によってその全体を本明細書に援用する米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。どのＰＣＲも反応条件として、反応の化学的成分およびその濃度、反応サイクルに使用する温度、反応のサイクル数ならびに反応サイクルの各段階の時間が挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「増幅する」とは、特定のヌクレオチド配列の量を酵素により増加させるプロセスをいう。こうしたの増幅は、以下に限定されるものではないが、ＰＣＲにより行うのが一般的である。本明細書で使用する場合、「変性」とは、２本の相補的なヌクレオチド鎖がアニールされた状態から分離することをいう。変性の誘導は、たとえば、緩衝液のイオン強度、温度または塩基対の相互作用を破壊する化学品など多くの要素により行うことができる。本明細書で使用する場合、「アニーリング」とは、実質的にワトソン−クリック塩基対により決定される相補性に基づき各鎖が互いに結合するヌクレオチド鎖間の特異的相互作用をいう。アニーリングが起こる際の相補性は１００％である必要はない。本明細書で使用する場合、「伸長」とは、プライマーオリゴヌクレオチドおよび標的核酸がアニールされた後に、ポリメラーゼ酵素が標的核酸を複製の鋳型としてプライマーを伸長させて適切なサイズのフラグメントにする増幅サイクルをいう。
【００１６】
「プライマー」とは遺伝子座のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントをいい、プライマーの３’終端はＤＮＡポリメラーゼ酵素による重合および伸長部位として機能することができる。「プライマー対」とは、増幅対象のＤＮＡ配列の一方の末端で一本鎖とハイブリダイズするプライマー１と、増幅対象のＤＮＡ配列の相補鎖の他方の末端とハイブリダイズするプライマー２とを含む２つのプライマーをいう。「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域をいう。
【００１７】
「遺伝子マーカー」は一般に、個体をＤＮＡの変異に基づき識別するＤＮＡタイピングなどの分析対象となる特徴を持つゲノムＤＮＡの対立遺伝子である。大部分のＤＮＡタイピング法は、ある集団において少なくとも２つの異なる型、すなわち対立遺伝子に現れることが分かっている、ＤＮＡマーカーの１つまたは複数の領域の長さおよび／または配列の違いを検出および分析することを目的にしている。こうした変異は「多型」と呼ばれ、そうした変異が起こるＤＮＡの任意の領域は「多型遺伝子座」と呼ばれる。ＤＮＡタイピングが可能な方法の１つでは、ＰＣＲ増幅技術（ＫＢ  Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）と長さの違いによる多型分析とを組み合わせている。従来はＰＣＲを用いても、比較的小さいＤＮＡ断片しか確実に増幅することができなかった。すなわち、３，０００塩基長未満のＤＮＡ断片の増幅に限られていた（Ｍ．Ｐｏｎｃｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ｍｉｃｏｌ（１９９２），ＮＡＲ２０（３）：６２３；Ｒ．Ｄｅｃｏｒｔｅら（１９９０），ＤＮＡ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．９（６）：４６１  ４６９）。長さの違いによる多型のいくつかの例として、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、ミニサテライトおよびタンデム反復の可変数（ＶＮＴＲ：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ
ｒｅｐｅａｔ）がある。ミニサテライトまたはＶＮＴＲを含むＤＮＡ断片は一般に、ＰＣＲにより確実に増幅するには長すぎる。これに対し、約３〜７ヌクレオチドの反復単位を含むＳＴＲは十分に短いため、ＰＣＲ用途の遺伝子マーカーとして有用である。これは、長さが変異する他のＤＮＡの領域の場合よりも小さい産物が生成されるように増幅プロトコルを設計できるためである。
【００１８】
１回の増幅反応および分離プロセスで複数の遺伝子座を同時に増幅および検出すると望ましい場合が多い。分析のためいくつかの遺伝子座を同時に標的にするこうした系は「マルチプレックス」システムと呼ばれる。これまで複数のＳＴＲ遺伝子座を含むいくつかのこうしたシステムが記載されている。たとえば、ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＳＧＭＰＬＵＳ（商標）ＰＣＲ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ  ＵＳＥＲ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．ｉ−ｘ  ａｎｄ  １−１  ｔｏ  １−１６（２００１）；ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ（登録商標）ＰＣＲ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ  ＵＳＥＲ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．ｉ−ｘ  ａｎｄ  １−１  ｔｏ  １−１０（２００１）；ＪＷ  Ｓｃｈｕｍｍら，米国特許第７，００８，７７１号を参照されたい。
【００１９】
一部の国の政府ではＤＮＡタイピング情報のデータベースを維持している。こうしたデータベースの最大のものがＮａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（ＮＤＮＡＤ）であり、ＤＮＡプロフィルは約２．７百万人にのぼる。Ｈ．Ｗａｌｌａｃｅ（２００６），ＥＭＢＯ  ＲＥＰＯＲＴＳ  ７：Ｓ２６−Ｓ３０（Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ，２００６から引用）。１９９９以来、ＮＤＮＡＤのＤＮＡプロフィルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが開発したＳＧＭｐｌｕｓ（登録商標）システムに基づいている。Ｉｄ．ＤＮＡプロファイリングシステムではＤＮＡサンプルを分解したときの個体の特定方法で問題が何度も起きている。欧州および米国の実験室では、分解されたＤＮＡサンプルを分析する際の遺伝子マーカーとして従来のＳＴＲ（サイズが約１００〜約４５０塩基対の範囲にあるアンプリコン）とミニＳＴＲ（２００塩基対またはそれ以下のアンプリコン）とを比較検討するいくつかの試験が行われてきた。たとえば、ＬＡ  Ｄｉｘｏｎら（２００６），ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．ＩＮＴ．１６４（１）：３３−４４を参照されたい。その結果からは、ミニＳＴＲ遺伝子座から得られるアンプリコンのようにアンプリコンのサイズが小さくなると、分解されたＤＮＡサンプルの分析から満足できる結果を得られる可能性が高まることが示される。Ｉｄ．；ＭＤ  Ｃｏｂｌｅ  ａｎｄ  ＪＭ  Ｂｕｔｌｅｒ（２００５），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ
ＳＣＩ．５０（１）：４３−５３。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ（ＥＮＦＳＩ）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＥＤＮＡＰ）グループは、小さいアンプリコンの検出が可能になるようにＤＮＡタイピング用のマルチプレックスＰＣＲシステムを再設計し、欧州内のプロファイリングシステムの標準化にはミニＳＴＲを考慮に入れる旨、合意した。Ｐ．Ｇｉｌｌら（２００６），ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．ＩＮＴ．１５６（２−３）：２４２−２４４。本教示は、長さの違いによる複数の多型を１回の反応で同時に分析することに関する。本教示の種々の実施形態は、ミニＳＴＲ遺伝子座をマルチプレックス増幅システムに導入する。こうしたシステムは、ＤＮＡタイピングでの使用など種々の用途に適している。
【００２０】
本教示の方法は、共増幅された複数の遺伝子座から対立遺伝子（アンプリコン）を増幅するための遺伝子座、プライマーおよび増幅プロトコルの適切な組を選択することを意図している。アンプリコンはサイズが重複しないように設計し、および／または様々な遺伝子座のサイズが重複する対立遺伝子を識別できるように標識することができる。さらに、こうした方法は、１回の増幅プロトコルで使用できる複数のＳＴＲ遺伝子座を選択することも意図している。本明細書に記載の遺伝子座の指定の組み合わせは本出願に独特のものである。本教示の種々の実施形態では、最大のアンプリコンサイズが約２００塩基対未満の少なくとも８個のミニＳＴＲ遺伝子座を含む１５個のＳＴＲ遺伝子座の共増幅を教示する。
【００２１】
本明細書に開示する組み合わせ以外の有効な組み合わせを実現するには、たとえば、遺伝子座の組み合わせを試行錯誤して、プライマー対配列を選択し、プライマー濃度の調整を行い分析される全遺伝子座を増幅できる平衡状態を確認すればよい。こうした教示の方法および材料が開示されれば、本方法に使われる遺伝子座、プライマー対および増幅技法ならびに本教示のキットを選択する種々の方法が当業者に示唆されるであろう。こうした方法はすべて添付の特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。
【００２２】
本教示の方法を実施するには、どれも１回のマルチプレックス増幅反応で共増幅できるＤ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ８Ｓ１１７９、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＶＷＡと、Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２２Ｓ１０４５およびＤ２Ｓ４４１の少なくとも１個とを含む、少なくとも１１個のＳＴＲ遺伝子座の組を選択することから始めればよい。マルチプレックス増幅反応には上述の１５個の遺伝子座以外にまたは加えて他の遺伝子座を含めてもよい。本教示のマルチプレックス増幅反応の遺伝子座および遺伝子座を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを選択できる方法については、本明細書に記載し、下記の実施例で説明する。
【００２３】
本教示に従って使用する遺伝子座の組を選択するには様々な技法があり、どのような技法を用いてもよい。本分析法に使用するのに有用な遺伝子座の組を実現する一手法については、以下の実施例に記載する。少なくとも１１個のＳＴＲ遺伝子座を含むマルチプレックスを実現すれば、その１１個の遺伝子座より多い遺伝子座を含み、ＳＴＲ遺伝子座以外の遺伝子座、たとえば、性決定遺伝子座を含むマルチプレックスを構築するコアとして使用することができる。したがって、最初の１１個のＳＴＲ遺伝子座を含み、１１個の遺伝子座よりも多い新しい組み合わせを構築してもよい。
【００２４】
本教示の方法により分析される遺伝子座の選択にどのような方法を用いたとしても、種々の実施形態では、マルチプレックス分析のため選択された遺伝子座は以下の特徴の１つまたは複数を共有している：（１）対立遺伝子のＤＮＡ評価を行える十分な増幅産物が生成されること；（２）妥当な標的遺伝子座の伸長過程での追加塩基の取り込みが原因で、または非特異的アンプリコンの生成が原因でマルチプレックス増幅工程においてアーチファクトがほとんどなく、発生してもごくわずかであること；および（３）ポリメラーゼによる増幅反応の途中終了が原因のアーチファクトがほとんどなく、発生してもごくわずかであること。たとえば、ＪＷ  Ｓｃｈｕｍｍら（１９９３），ＦＯＵＲＴＨ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＮ  ＨＵＭＡＮ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ｐｐ．１７７−１８７，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．を参照されたい。
【００２５】
本明細書で使用する個々のＳＴＲ遺伝子座に対する用語は、そうした遺伝子座に付与された当該技術分野において公知の名称をいう。遺伝子座については、たとえば、すべて参照によってその全体を本明細書に援用する以下の一覧における種々の参考文献および種々の受託番号で同定されている。以下の参考文献一覧は、遺伝子座情報の例示のみを意図している。こうした遺伝子座を含み、標的増幅の対象となるＤＮＡ領域に関する情報は一般に入手可能であり、以下のまたは他の参考文献および／または受託番号を参照すれば容易に確認できる。必要に応じて、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が提供する、出願時点で最新の受託番号を示してある。たとえば、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８の場合、Ｈ．Ｌｉら（１９９３），ＨＵＭ．ＭＯＬ．ＧＥＮＥＴ．２：１３２７；Ｄ１２Ｓ３９１の場合、ＭＶ  Ｌａｒｅｕら（１９９６），ＧＥＮＥ  １８２：１５１−１５３；Ｄ１８Ｓ５１の場合、ＲＥ  Ｓｔａｕｂら（１９９３），ＧＥＮＯＭＩＣＳ  １５：４８−５６；Ｄ２１Ｓ１１の場合、Ｖ．Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌｉｔｔ（１９９２），Ｈｕｍ．ＭＯＬ．ＧＥＮＥＴ．１：６７；ＦＧＡ（ＦＩＢＲＡ）の場合、ＫＡ  Ｍｉｌｌｓら（１９９２），ＨＵＭ．ＭＯＬ．ＧＥＮＥＴ．１：７７９；ＴＨ０１の場合、Ａ．Ｅｄｗａｒｄｓ（１９９１），ＡＭ．Ｊ．ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．４９：７４６−７５６およびＭＨ  Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９９１），ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１９：３７５３；ＶＷＡ（ｖＷＦ）の場合、ＣＰ  Ｋｉｍｐｔｏｎら（１９９２），ＨＵＭ．ＭＯＬ．ＧＥＮＥＴ．１：２８７；Ｄ１０Ｓ１２４８の場合、ＭＤ  Ｃｏｂｌｅ  ａｎｄ  ＪＭ  Ｂｕｔｌｅｒ（２００５），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．５０（１）：４３−５３；Ｄ１６Ｓ５３９の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０７９２５；Ｄ２Ｓ１３３８の場合，Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０８２０２  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎらｉｎ  ＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＩＮ  ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ７：ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  １７ＴＨ  ＩＮＴ’Ｌ  ＩＳＦＨ  ＣＯＮＧＲＥＳＳ，ＯＳＬＯ，２−６  ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ  １９９７，Ｂ．Ｏｌａｉｓｅｎら，ｅｄｓ．，ｐｐ．１９２−１９４（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｄ８Ｓ１１７９の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０８７１０，ａｎｄ  ＮＪ  Ｏｌｄｒｏｙｄら（１９９５），ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ  １６：３３４−３３７；Ｄ２２Ｓ１０４５の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０８０８５；Ｄ１９Ｓ４３３の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａ���ｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０８０３６，ａｎｄ  ＭＶ  Ｌａｒｅｕら（１９９７），ｉｎ  ＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＩＮ  ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ７：ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  １７ＴＨ  ＩＮＴ’Ｌ  ＩＳＦＨ  ＣＯＮＧＲＥＳＳ，ＯＳＬＯ，２−６  ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ  １９９７，Ｂ．Ｏｌａｉｓｅｎら，ｅｄｓ．，ｐｐ．１９２−２００，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｄ２Ｓ４４１の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０８１８４；Ｄ１Ｓ１６５６の場合、Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら（１９９５），未発表のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，受託番号Ｇ０７８２０を参照されたい。
【００２６】
参照によって本明細書に援用するＭＤ  Ｃｏｂｌｅ（２００５），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．５０（１）：４３−５３で明らかにされているように、ミニＳＴＲ（約２００塩基対未満の遺伝子座）の増幅であれば、高度に分解されたＤＮＡのプロファイリング分析が可能になる。図１は、上述の１５個の遺伝子座全部とサイズ測定用アメロゲニン遺伝子座遺伝子座のサイズ範囲を示す。図１で確認できるように、前述の一覧で特定される遺伝子座のうち８個は、Ｄ１０Ｓ１２４８、ＶＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ３Ｓ１３５８およびＤ１Ｓ１６５６などのミニＳＴＲ遺伝子座である。
【００２７】
本教示による共増幅および分析用に選択される遺伝子座の組は、少なくとも１１個のＳＴＲ遺伝子座以外に少なくとも１個の遺伝子座を含んでもよい。この追加遺伝子座は、ＳＴＲもしくは他の配列多型、または、たとえばある個体のＤＮＡを集団内の他の個体のＤＮＡと分類する何らかの特徴が同定される任意の他の特性を含んでもよい。さらに、追加遺伝子座は、分析されるＤＮＡサンプルの供給源の性別を特定する遺伝子座であってもよい。ＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡである場合、アメロゲニン遺伝子座などの性別を識別するための遺伝子座を本方法による共増幅および分析用として選択すればよい。アメロゲニン遺伝子座はＧｅｎＢａｎｋによりＨＵＭＡＭＥＬＹ（男性のＤＮＡに存在するようなＹ染色体上の遺伝子座の同定に使用）またはＨＵＭＡＭＥＬＸ（男性または女性のＤＮＡに存在するようなＸ染色体上の遺伝子座の同定に使用）として同定されている。
【００２８】
１回のマルチプレックス反応による共増幅に適した遺伝子座の組を特定すれば、その組内の各遺伝子座の共増幅に好適なプライマーを決定することができる。反応混合物にオリゴヌクレオチドプライマーを加えて増幅ＤＮＡフラグメントの５’および３’末端の境界を画定させてもよい。一方のオリゴヌクレオチドプライマーは変性された鋳型ＤＮＡのセンス（＋）鎖とアニールし、もう一方のオリゴヌクレオチドプライマーは変性された鋳型ＤＮＡのアンチセンス（−）鎖とアニールする。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは約１２〜２５ヌクレオチド長であってもよいが、サイズは、たとえば、増幅対象の鋳型配列の塩基組成、増幅反応条件などのパラメータによって大きく異なってもよい。本教示の実施にとってプライマーの個々の長さは本質的なものではない。オリゴヌクレオチドプライマーは目的の遺伝子座に隣接する特定のＤＮＡ部分にアニールするように設計し、プライマーと相補的な部位の間にあるＤＮＡ部分を特異的に増幅するようにすればよい。
【００２９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシチジンのほか、ウラシル、ヌクレオシドアナログ（たとえば、以下に限定されるものではないが、イノシン、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、非ヌクレオチドリンカー、ペプチド核酸（ＰＮＡ：：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）およびホスポルアミジット）、および放射性核種（たとえば、３２Ｐおよび３５Ｓ）、蛍光分子、副溝結合剤（ＭＧＢ：ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）などの化学部分を含む、またはそれとコンジュゲートしたヌクレオシドまたは当該技術分野において公知の任意の他のヌクレオシドコンジュゲートを含んでもよい。
【００３０】
一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは化学的に合成することができる。プライマーの設計および選択はＰＣＲの最適化における通常の手順である。当業者であれば、本明細書に記載の参考文献から目的の標的遺伝子座を増幅するための特異的なプライマーを容易に設計したり、プライマーの組を得たりすることができる。こうしたプライマーはすべて本教示の範囲内である。
【００３１】
マルチプレックス反応に使用するプライマー配列の選択には注意が必要である。プライマーの選択が不適切な場合、増幅が見られない、予定の標的遺伝子座以外の１つまたは複数の部位で増幅が見られる、プライマー二量体が形成される、異なる遺伝子座に対するプライマー間で望ましくない相互作用が起こる、ある遺伝子座の対立遺伝子のアンプリコンが別の遺伝子座の対立遺伝子と重複（たとえば、サイズ）する、あるいは１回のマルチプレックスシステムに適合せずに、異なる遺伝子座ごとに個々に適した増幅条件またはプロトコルが必要になるなど望ましくない影響が出る場合がある。プライマーについては、本教示のマルチプレックスシステムを用いて、たとえば、当業者よく知られているマルチプレックス最適化の反復プロセスを利用すれば開発および選択を行うことができる。その反復プロセスではプライマー配列を選択し、選択した遺伝子座の共増幅のためプライマーを混合し、遺伝子座を共増幅してから増幅産物を分離および検出して増幅におけるプライマーの有効性を決定する。
【００３２】
プライマー選択の一例を挙げると、上記の遺伝子座のいずれかの増幅に有用である、本明細書に引用する参考文献で特定された、または他の参考文献に記載の個々のプライマーおよびプライマー対を選択して本教示に従ってＳＴＲ遺伝子座の増幅および分析を行えばよい。もう１つの例として、増幅システムおよび／またはマルチプレックスシステム開発向けの入手可能で当該技術分野において公知の様々なソフトウェアプログラムのいずれかを使用してプライマーを選択してもよい。たとえば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。ソフトウェアプログラムの使用例としては、目的の遺伝子座の領域の配列情報をソフトウェアにインポートすればよい。その後ソフトウェアは種々のアルゴリズムを用いて使用者の仕様に最も適合するプライマーを選択する。
【００３３】
最初に、このプライマー選択プロセスでは増幅の際に上述の望ましくない影響のいずれかが現れたり、または一部のプライマーとそのそれぞれの標的間の結合強度が他のプライマーよりも強くなることで、たとえば、一部の遺伝子座のアニーリングおよび増幅が優先されるため、一部の遺伝子座の産物の収量が他の遺伝子座よりも多くなり、増幅産物のバランスが崩れたりする場合がある。あるいは、プライマーが標的遺伝子座の対立遺伝子そのものでない増幅産物、すなわち、非特異的増幅産物を生成することもある。こうしたプライマー設計のまずさが原因の無関係な産物は、たとえば、プライマーとサンプルＤＮＡの非標的領域との、あるいはさらには他のプライマーとのアニーリングに続いて起こる、アニーリング後の増幅に起因する場合がある。
【００３４】
プライマー選択の過程でマルチプレックスシステムにバランスの崩れた増幅産物または非特異的増幅産物が認められる場合、マルチプレックスのセット全体からプライマーを個別に取り出し、同一遺伝子座または他の遺伝子座のプライマーと一緒に増幅に使用すれば、どのプライマーが増幅バランスの崩れまたはアーチファクトに関係するかを特定することができる。アーチファクトまたはバランスの崩れの１つまたは複数を引き起こす２個のプライマーを特定したら、この１個または２個の寄与因子を改変し、一対のみで、あるいはマルチプレックスシステム（またはマルチプレックスシステムのサブセット）で再試験すればよい。このプロセスは、産物の評価の結果、マルチプレックスシステムで増幅された対立遺伝子の増幅アーチファクトが認められないか許容可能なレベルになるまで繰り返してもよい。
【００３５】
プライマー濃度の最適化については最終的なプライマー配列の決定前に行っても、決定後に行ってもよいが、多くの場合、プライマーの選択後に行うと考えられる。一般に、任意の特定の遺伝子座のプライマー濃度が上昇すると、その遺伝子座を対象として生成された産物の量が増加する。しかしながら、プライマー濃度の最適化も、たとえば、ある遺伝子座の産物の収量が増えると、もう一方の遺伝子座またはそれ以外の遺伝子座の収量が減る場合があるため、やはり反復プロセスである。さらに、プライマーは互いに相互作用することもあり、これが様々な遺伝子座の増幅産物の収量に直接影響する場合もある。つまり、特定のプライマーの組の濃度が直線的に増加しても、対応する遺伝子座の増幅産物の収量が直線的に増加するとは限らない。遺伝子座特異的プライマーのさらに詳しい説明には、その教示内容全体を参照によって本明細書に援用するＭＪ  Ｓｉｍｏｎｓ、米国特許第５，１９２，６５９号を参照されたい。
【００３６】
マルチプレックス反応における増幅産物の遺伝子座間のバランスはさらに、たとえば、鋳型（サンプルＤＮＡ）の投入量、使用する増幅サイクルの数、熱サイクルプロトコルのアニーリング温度、およびサイクルプロセス終了時における追加伸長工程の有無など増幅プロトコルの多くのパラメータにより左右される場合がある。理論的には全対立遺伝子および遺伝子座にわたり増幅産物の収量バランスが完全にとれていることが望ましいものの、実際には実現されないのが一般的である。
【００３７】
さらに、マルチプレックスシステムを構成する遺伝子座を決定し、そのシステムの反応条件を策定するプロセスも反復プロセスである場合がある。すなわち、最初に少数の遺伝子座を対象としたマルチプレックスシステムを開発し、このシステムに増幅アーチファクトおよび産物バランスの崩れが認められないか、ほとんどが認められないようにしてもよい。次いでこのシステムのプライマーを、もう１個の遺伝子座または分析される所望の他のいくつかの遺伝子座のプライマーと組み合わせればよい。この拡大させたプライマーの組み合わせからは、増幅アーチファクトまたは産物の収量バランスの崩れが認められることもあれば、そうでない場合もある。その結果、いくつかの遺伝子座をシステムから除去することもあり、および／または新しい遺伝子座を導入して評価することもある。
【００３８】
上述の反復選択プロセスの１つまたは複数については、ＳＴＲ遺伝子座ＶＷＡ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ３Ｓ１３５８ならびにＤ１０Ｓ１２４８、Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ１Ｓ１６５６およびＤ１２Ｓ３９１の１つまたは複数を含む、上記のような共増幅用に選択された少なくとも１１個の遺伝子座の共増幅に使用できるプライマーの完全な組が特定されるまで繰り返せばよい。特定の遺伝子座の組を増幅するのに多種多様なプライマーの組が開発され得ることが理解されよう。本教示に使用するプライマーの合成は、当業者に公知の、および／または市販されている任意の標準的なオリゴヌクレオチド合成手順を用いて行うことができる。本教示の種々の実施形態では、下記の全１５個のＳＴＲ遺伝子座ＶＷＡ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、ＴＨ０１、ＦＧＡ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ１Ｓ１６５６およびＤ１２Ｓ３９１を１つのマルチプレックス増幅システムで共増幅することができる。本教示の他の実施形態では、こうした全１５個のＳＴＲ遺伝子座を１つのマルチプレックス増幅システムで共増幅するだけでなく、ＤＮＡサンプル供給源の性決定のアメロゲニン遺伝子座を含めて共増幅することができる。
【００３９】
本教示の方法に使用するゲノムＤＮＡのサンプルは、その後のＤＮＡ増幅に適合する任意のサンプル調製手順を用いて調製できる。こうした手順は当業者に多く知られている。いくつかの例として、フェノール抽出によるＤＮＡ精製（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．９．１４−９．１９）および塩析による部分精製（Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８），ＮｕＣＬ．ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１６：１２１５）またはキレックス（ＰＳ  Ｗａｌｓｈら（１９９１），ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  １０：５０６−５１３；ＣＴ  Ｃｏｍｅｙら（１９９４），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．３９：１２５４）および未処理血液を用いた未精製材料の放出（Ｊ．Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ（１９９４），ＰＣＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ３：２３９−２４３；ＲＢＥ  ＭｃＣａｂｅ（１９９１），ＰＣＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  １：９９−１０６；ＢＹ  Ｎｏｒｄｖａｇ（１９９２），ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  １２：４  ｐｐ．４９０−４９２）が挙げられる。
【００４０】
本教示の方法を用いて分析される少なくとも１個のＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡである場合、ＤＮＡは、たとえば、１つまたは複数の血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、骨、口腔サンプル、胎盤細胞または胎児細胞を含む羊水、絨毛膜絨毛および／またはこうした組織もしくは他の組織のいずれかの混合物などの組織サンプルから調製してもよい。
【００４１】
任意に、当業者に公知の任意のＤＮＡ定量の標準的な方法を用いてＤＮＡ濃度を本教示の方法に使用前に測定してもよい。こうした定量方法には、たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），ｓｕｐｒａ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ．５に記載されているような分光光度測定；またはＣＦ  Ｂｒｕｎｋら（１９７９），ＡＮＡＬ．ＢｌＯＣＨＥＭ．９２：４９７−５００に記載されているような測定手法を用いた蛍光測定法がある。ＤＮＡ濃度は、ＪＳ  Ｗａｙｅら（１９９１），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．３６：１１９８−１２０３（１９９１）に記載されているようなヒト特異的プローブとＤＮＡ標準物質とのハイブリダイゼーション量を比較して測定してもよい。増幅反応に使用する鋳型ＤＮＡが多すぎると、本当の対立遺伝子でないと見られる増幅アーチファクトが生じる場合がある。
【００４２】
ゲノムＤＮＡのサンプルを調製したら、本教示のマルチプレックス増幅工程で標的遺伝子座を共増幅することができる。増幅方法は様々あるが、遺伝子座の増幅には、たとえば、ＰＣＲ（ＲＫ  Ｓａｉｋｉら（１９８５），ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３０：１３５０−１３５４）、転写による増幅（ＤＹ  Ｋｗｏｈ  ａｎｄ  ＴＪ  Ｋｗｏｈ（１９９０），ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９０）および鎖置換増幅（ＳＤＡ：ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＧＴ  Ｗａｌｋｅｒら（１９９２），ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６）など、どのような増幅方法を用いてもよい。本教示のいくつかの実施形態では、マルチプレックスにおける各遺伝子座に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡサンプルを増幅するＰＣＲによりマルチプレックス増幅を行ってもよい。
【００４３】
標準的なＰＣＲの化学成分には一般に、溶媒、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（「ｄＮＴＰ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）、オリゴヌクレオチドプライマー、二価の金属イオンおよび標的（単数または複数）を含むと見られるＰＣＲ増幅用のＤＮＡサンプルが含まれる。ＰＣＲ用の溶媒としては一般に水にすればよく、典型的には緩衝剤およびＫＣｌなどの非緩衝塩を含む。緩衝剤は、以下に限定されるものではないが、トリス−ＨＣｌなど当該技術分野において公知の任意の緩衝液としもよく、ＰＣＲの結果を最適化するため通常の実験により変更しても構わない。当業者であれば最適な緩衝液条件を容易に決定することができる。ＰＣＲ緩衝液は、増幅に使用する個々の酵素に応じて最適化してもよい。
【００４４】
ポリメラーゼを効果的に機能させるには二価の金属イオンが有利な場合が多い。たとえば、マグネシウムイオンは、ある種のＤＮＡポリメラーゼを効果的に機能させるイオンである。典型的にはＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４を反応緩衝液に加えて至適マグネシウムイオン濃度を得ればよい。最適なＰＣＲ増幅に必要なマグネシウムイオン濃度は、使用する個々のプライマーおよび鋳型の組によって異なる場合がある。したがって、最適な増幅を得るために加えるマグネシウム塩の量は経験的に決定される場合が多く、当該技術分野において日常的に行われている。一般に、最適なＰＣＲのためのマグネシウムイオン濃度は約１〜約１０ｍＭの範囲にすればよい。ＰＣＲにおけるマグネシウムイオン濃度の典型的な範囲は約２．５ｍＭを中間点として前後に幅がある約１．０〜約４．０ｍＭとしてもよい。あるいは、二価イオンのマンガンを用いて、たとえば、マンガンジオキシド（ＭｎＯ２）の形で、標準的な実験手順により当業者が容易に決定できる、最適ポリメラーゼ活性の観点から望ましい濃度に調整してもよい。
【００４５】
ｄＮＴＰは核酸分子の増幅に使用される構成要素であり、標準的なＰＣＲでは概して、たとえば、デオキシアデノシン三リン酸（「ｄＡＴＰ：ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）、デオキシグアノシン三リン酸（「ｄＧＴＰ：ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）、デオキシシチジン三リン酸（「ｄＣＴＰ：ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）およびデオキシチミジン三リン酸（「ｄＴＴＰ：ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）をそれぞれ約４０〜２００μＭの濃度で供給すればよい。さらに、デオキシウリジン三リン酸（「ｄＵＴＰ：ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ」）、ｄＮＴＰアナログ（たとえば、イノシン）およびｄＮＴＰコンジュゲートなど他のｄＮＴＰを用いてもよく、本明細書で使用する場合、そうしたｄＮＴＰも「ｄＮＴＰ」という用語に包含される。本教示の方法には各ｄＮＴＰを約４０〜２００μＭの濃度で使用すると適している場合もあれば、各ｄＮＴＰの濃度が約２００μＭを超えると都合がよい場合もある。このため、本教示の方法のいくつかの実施形態では、各ｄＮＴＰの濃度は一般に少なくとも約５００μＭであり、最大約２ｍＭとしてもよい。いくつかのさらなる実施形態では、各ｄＮＴＰの濃度は約０．５ｍＭ〜約１ｍＭの範囲であってもよい。任意のマルチプレックス増幅に使用する個々のｄＮＴＰ濃度はマルチプレックス条件によって異なる場合があり、標準的な実験手順により当業者が経験的に決定すればよい。
【００４６】
ＰＣＲにおいてヌクレオチド三リン酸を増幅産物に重合する酵素は、どのようなＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、たとえば、当該技術分野において公知の任意の耐熱性ポリメラーゼとしてもよい。本教示に使用できるポリメラーゼのいくつかの例として、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．など生体由来のＤＮＡポリメラーゼがある。こうした酵素は、たとえば、起源細菌から単離する、組換えＤＮＡ技術により作製する、または商業的供給源から購入するといったいくつかの可能な方法のいずれかにより取得することができる。こうした市販されているＤＮＡポリメラーゼの例として、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；およびｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＸＬ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．社製）が挙げられる。好適なポリメラーゼの他の例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｎｅ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの大きなフラグメント、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ、Ｄｅｅｐ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびにＰｆｕ、ならびに前述のミュータント、変異体および誘導体がある。
【００４７】
本教示の範囲内で他の既知のＰＣＲ要素を用いてもよい。そうした要素のいくつかの例として、ソルビトール、界面活性剤（たとえば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ−２０）および、たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）およびテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）およびウラシルＮ−グリコシラーゼなどヌクレオチド対のミスマッチを防ぐ薬、またはＰＣＲ手順の開始前のＰＣＲのインキュベーションまたは調製の過程でＰＣＲのアンプリコンの混入および／または不要な産物の生成を防ぐ作用がある他の薬が挙げられる。
【００４８】
個々の反応を最適化するため、通常の実験に従ってＰＣＲサイクルの温度、サイクル数およびその時間を変更してもよい。当業者であれば下記がＰＣＲの種々のパラメーターを決定する際の手引きとなり、さらに、１つまたは複数の条件を変更しても本教示の範囲内であることを認識するであろう。温度およびサイクルの時間は、変性、アニーリングおよび伸長というＰＣＲの３つの段階に応じて決定される。１回の変性、アニーリングおよび伸長を「サイクル」という。変性は一般にＤＮＡ鎖が分離するには十分だが、ポリメラーゼ活性を破壊するほど高くない温度で行えばよい。反応には一般に、高温で変性しないが、ある程度の活性を保持する熱耐性ポリメラーゼを使用することができる。ただし、ＰＣＲの各変性工程後に補充を行うのであれば非耐熱性ポリメラーゼを用いてもよい。典型的には、変性は約９０℃以上約１００℃未満で行うことができる。いくつかの実施形態では、変性を行うのは約９４〜９５℃の温度でもよい。ＤＮＡの変性は一般に少なくとも約１〜約３０秒間行うことができる。いくつかの実施形態では、変性を行うのは約１〜約１５秒間であってもよい。他の実施形態では、変性を行うのは最大約１分間またはそれ以上であってもよい。ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）などいくつかのポリメラーゼでは、ＤＮＡの変性に加えて変性温度でのインキュベーションが酵素を活性化する働きもする。このため、こうしたポリメラーゼを使用する際はＰＣＲの最初の変性工程をその後の変性工程よりも長くすると都合がよい場合がある。
【００４９】
アニーリング段階では、オリゴヌクレオチドプライマーの相補的な領域が標的ＤＮＡにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマー−鋳型二本鎖に結合すると、プライマーはＤＮＡポリメラーゼにより実質的に伸長される。従来のＰＣＲでは、アニーリング温度は典型的には安定性が最も低いプライマー−鋳型二本鎖の融点（Ｔｍ）またはそれ未満とすればよく、Ｔｍについては当業者によく知られているいくつかの理論的方法のいずれかにより推定することができる。たとえば、Ｔｍは下記式により求めることができる：
Ｔｍ＝（４℃×ＧおよびＣ塩基の数）＋（２℃×ＡおよびＴ塩基の数）。
【００５０】
標準的なＰＣＲの場合、アニーリング温度は概して、安定性が最も低いプライマー−鋳型二本鎖の推定Ｔｍよりも約５〜１０℃低くすればよい。アニーリング時間は約３０秒から約２分とすればよい。典型的にはアニーリング段階の後に伸長段階が続く。伸長は、ポリメラーゼ酵素が完全にプライマー伸長を行い増幅産物が適当なサイズになる十分な時間をかけて行うことができる。
【００５１】
ＰＣＲのサイクル数（１サイクルは変性、アニーリングおよび伸長を含む）により増幅の程度およびその後の増幅産物の量が決定される。ＰＣＲの結果、ＤＮＡ分子は指数関数的に増幅される。したがって、理論的には前のサイクルに存在した産物数は、ＰＣＲ試薬が枯渇し、これ以上の増幅産物が生成されないプラトーになるまでＰＣＲの各サイクル後に２倍になる。典型的には、このプラトーになるまで約２０〜３０サイクルのＰＣＲを行うことができる。サイクル数を特に限定するものではないが、より典型的には約２５〜３０サイクルを行ってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲの最終サイクルの最後の段階後、ある温度で反応物をインキュベートすると都合がよい場合がある。いくつかの実施形態では、長時間の伸長段階を選択してもよい。他の実施形態では、低温（たとえば、約４℃）でのインキュベーションを選択してもよい。
【００５３】
マルチプレックス反応で得られた増幅産物混合物中の、増幅された対立遺伝子産物を評価するには、たとえば、蛍光標識産物の検出、放射性同位元素標識産物の検出、増幅産物の銀染色、または二本鎖増幅産物を可視化するエチジウムプロミド（ＥｔＢｒ：ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）およびシアニン系色素ＳＹＢＲグリーンのようなＤＮＡインターカレーター色素の使用など種々の方法を用いることができる。本教示に用いるプライマーに結合させるのに好適な蛍光標識は多く市販されており、当該技術分野において公知である。蛍光分析の場合、各遺伝子座の増幅に少なくとも１個の蛍光標識プライマーを用いてもよい。蛍光検出は、たとえば、放射性材料を使用する必要がないことから、放射性材料の使用に伴う規制上および安全上の問題が回避されるため、放射能を用いて標識および産物の検出を行う方法よりも望ましい場合がある。さらに、標識プライマーによる蛍光検出は銀染色およびＤＮＡインターカレーターなど他の非放射性検出法よりも選択されることがある。蛍光検出法では一般に、銀染色およびＤＮＡインターカレーターよりもわずかな増幅アーチファクトが明らかにされるためである。これは１つには、蛍光検出では標識を含む増幅されたＤＮＡ鎖しか検出されないのに対して、銀染色およびインターカレーター検出法を用いいると、あらゆる増幅産物のどちらの鎖も染色および検出されるため多くの非特異的な増幅アーチファクト可視化されることによる。加えて、ＥｔＢｒおよびＳＹＢＲの使用には健康リスクが伴う可能性もある。ＥｔＢｒは変異誘発物質として知られており、ＳＹＢＲは変異誘発物質としてはＥｔＢｒほどではないが、一般に皮膚を速やかに通過するＤＭＳＯに懸濁される。
【００５４】
マルチプレックス反応にプライマーの蛍光標識を使用する場合、一般に少なくとも３種類の標識を用いて異なるプライマーを標識すればよい。サイズマーカーを用いてマルチプレックス反応の産物を評価する場合、サイズマーカーの調製に使用するプライマーは、反応の際に目的の遺伝子座を増幅するプライマーと異なる標識で標識することができる。自動蛍光画像処理分析の登場によって、マルチプレックス増幅産物の検出および分析を迅速に行うことができる。
【００５５】
本教示のいくつかの実施形態では、フルオロフォアを用いて、たとえば、マルチプレックス増幅の少なくとも１個のプライマーに共有結合させて蛍光標識プライマーを作製することでプライマーを標識してもよい。いくつかの実施形態では、１つのマルチプレックスにおいて異なる標的遺伝子座に対するプライマーを別々のフルオロフォアで標識してもよい。各フルオロフォアはフルオロフォアの発光波長に応じて産物に異なる色を与える。同じマルチプレックス反応にこうした様々な標識プライマーを用いてもよく、その後その各増幅産物をまとめて分析することができる。ある遺伝子座を増幅するプライマー対のフォワードプライマーを標識してもリバースプライマーを標識してもよいが、フォワードプライマーを標識する場合が多いかもしれない。
【００５６】
当該技術分野において周知であり、本教示に使用するのに好適と思われるフルオロフォアの一部の例は以下の通りである。このリストは例示を目的とするものであり、決して網羅的なものではない。考えられるいくつかのフルオロフォアとして：吸収極大が４９２ｎｍにあり、発光極大が５２０ｎｍにあるフルオレセイン（ＦＬ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）；吸収極大が５５５ｎｍにあり、発光極大が５８０ｎｍにあるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））；吸収極大が４９５ｎｍにあり、発光極大が５２５ｎｍにある５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ（商標））；吸収極大が５２５ｎｍにあり、発光極大が５５５ｎｍにある２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ（商標）））；吸収極大が５８５ｎｍにあり、発光極大が６０５ｎｍにある６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ（商標））；吸収極大が５５２ｎｍにあり、発光極大が５７０ｎｍにあるＣＹ３（商標）；吸収極大が６４３ｎｍにあり、発光極大が６６７ｎｍにあるＣＹ５（商標）；吸収極大が５２１ｎｍにあり、発光極大が５３６ｎｍにあるテトラクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ（商標））；および吸収極大が５３５ｎｍにあり、発光極大が５５６ｎｍにあるヘキサクロロ−フルオレセイン（ＨＥＸ（商標））；吸収極大が５４６ｎｍにあり、発光極大が５７５ｎｍにあるＮＥＤ（商標）；発光極大が約５２０にある６−ＦＡＭ（商標）；発光極大が約５５０にあるＶＩＣ（登録商標）；発光極大が約５９０にあるＰＥＴ（登録商標）；および発光極大が約６５０にあるＬＩＺ（商標）がある。ＳＲ  Ｃｏｔｉｃｏｎｅら，米国特許第６，７８０，５８８号；ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＩＤＥＮＴＩＦＩＬＥＲ（商標）ＰＣＲ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ  ＵＳＥＲ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ，ｐｐ．１−３，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（２００１）を参照されたい。上記の発光および／または吸収波長は標準的なものであり、一般的なガイダンスに対してのみ使用できるものである。実際のピーク波長は様々な用途および異なる条件下で変わる場合があることに留意されたい。
【００５７】
本教示の種々の実施形態は、少なくとも４種類の色素を含む１回のマルチプレックスシステムを含んでもよい。こうした少なくとも４種の色素は、上述の任意の４色素を含んでも、当該技術分野において公知の任意の他の４色素を含んでも、または６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）およびＰＥＴ（登録商標）を含んでもよい。本教示の他の実施形態は、少なくとも５種類の色素を含む１回のマルチプレックスシステムを含んでもよい。こうした少なくとも５種の色素は、上述の任意の５色素を含んでも、当該技術分野において公知の任意の他の５色素を含んでも、または６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）およびＬＩＺ（商標）を含んでもよい。実施例に記載されているような５種の色素６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）およびＬＩＺ（商標）による１６遺伝子座のマルチプレックス増幅から得られるＤＮＡプロファイルの例として図２を参照されたい（ＬＩＺ（商標）はサイズ標準の標識に使用したため、ＬＩＺ（商標）の増幅ピークは示していない）。本教示の他の実施形態は、少なくとも６種類の色素を含む１回のマルチプレックスシステムを含んでもよい。こうした少なくとも６種の色素は、上述の任意の６色素を含んでも、当該技術分野において公知の任意の他の６色素を含んでも、または６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、ＬＩＺ（商標）および発光極大が約６２０ｎｍにある第６の色素（ｄｙｅ）（ＳＩＤ）を含んでもよい。図３を参照されたい。
【００５８】
ＰＣＲ産物はふるい媒体で分析しても、非ふるい媒体で分析してもよい。本教示のいくつかの実施形態では、たとえば、Ｈ．Ｗｅｎｚら（１９９８），ＧＥＮＯＭＥ  ＲＥＳ．８：６９−８０（Ｅ．Ｂｕｅｌら（１９９８），Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩ．４３：（１），ｐｐ．１６４−１７０）も参照されたい）に記載されているようなキャピラリー電気泳動またはＭ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９９），ＳＣＡＮＤ．Ｊ．ＣＬＩＮ．ＬＡＢ．ＩＮＶＥＳＴ．５９（３）：１６７−１７７に記載されているようなスラブゲル電気泳動または変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１３．４５−１３．５７を参照されたい）のような電気泳動によりＰＣＲ産物を分析することができる。電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分離は主にフラグメントサイズが異なっていることに基づく。また、増幅産物は、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）のようなクロマトグラフィーにより分析してもよい。
【００５９】
増幅した対立遺伝子を分離したら、その対立遺伝子および、たとえば、ゲルまたはキャピラリー内の他の任意のＤＮＡ（たとえば、ＤＮＡサイズマーカーまたは対立遺伝子ラダー）を可視化し、分析すればよい。ＤＮＡの可視化は、たとえば、銀染色または本明細書に記載するような放射性同位元素および蛍光色素または化学発光物質などのレポーターの使用および酵素と検出可能な基質との組み合わせといった当該技術分野において公知の多くの技法のいずれかにより行うことができる。マルチプレックスの遺伝子座の検出方法は蛍光による場合が多い。たとえば、ＪＷ  Ｓｃｈｕｍｍらｉｎ  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ
ＦＲＯＭ  ＴＨＥ  ＥＩＧＨＴＨ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ
ＯＮ  ＨＵＭＡＮ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ｐｕｂ．１９９８  ｂｙ  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．７８−８４；Ｅ．Ｂｕｅｌら（１９９８），ｓｕｐｒａを参照されたい。マルチプレックス反応の各遺伝子座の検出に蛍光標識プライマーを用いる場合、増幅後に蛍光検出器により標識産物の検出を行えばよい。上掲の蛍光色素の説明を参照されたい。
【００６０】
ＤＮＡサンプル中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子のサイズは、電気泳動の際に既知サイズのＤＮＡマーカーなどのサイズ標準と比較して決定することができる。２つ以上の多型ＳＴＲ遺伝子座を含むマルチプレックス増幅を評価するためのマーカーは、遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーを含んでも、評価対象の各遺伝子座の対立遺伝子ラダーの組み合わせを含んでもよい。たとえば、Ｃ．Ｐｕｅｒｓら（１９９３），ＡＭ．Ｊ．ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．５３：９５３−９５８；Ｃ．Ｐｕｅｒｓら（１９９４），ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ２３：２６０−２６４を参照されたい。さらに、ＳＴＲ遺伝子座の検出に使用するのに好適ないくつかの対立遺伝子ラダーおよびそこに開示されたラダーのいくつかの構築方法を記載した米国特許第５，５９９，６６６号；同第５，６７４，６８６号；および同第５，７８３，４０６号も参照されたい。個々の遺伝子座に対する対立遺伝子ラダーを構築したら、増幅産物と同時にそのラダーを電気泳動する。各対立遺伝子ラダーはその遺伝子座から対立遺伝子と共に移動する。
【００６１】
また、本教示のマルチプレックス反応産物は、レーン内標準物質、すなわち、たとえば、増幅産物と同じキャピラリー内で電気泳動されるように形成された特殊なサイズマーカーを用いて評価してもよい。レーン内標準物質は、既知の長さのいくつものフラグメントを含んでもよい。さらに、レーン内標準物質は、増幅反応における他の色素と識別可能な蛍光色素で標識してもよい。このレーン標準物質はゲル電気泳動の様々なレーンまたはキャピラリー電気泳動の様々なキャピラリー内の移動を比較するため、増幅されるサンプルまたはサイズ標準／対立遺伝子ラダーと混合し、どちらと電気泳動してもよい。レーン内標準物質の移動の差異は、分離媒体の性能の差異を示す働きをし得る。この差および対立遺伝子ラダーとの相関関係を定量化すれば、様々なレーンまたはキャピラリーにおいて電気泳動された増幅産物の検量線を作成し、未知のサンプルにおける対立遺伝子のサイズ測定を正規化することができる。
【００６２】
蛍光色素を用いて増幅産物を標識する場合、電気泳動して分離した産物は、たとえば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０または３１３０ｘｌジェネティックアナライザーまたはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）；またはＨｉｔａｃｈｉ  ＦＭＢＩＯ（商標）ＩＩ蛍光スキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｌｔｄ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）などの蛍光検出装置を用いて分析することができる。本教示の種々の実施形態では、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１３０ｘｌジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような電気泳動機器をキャピラリーゲル電気泳動プロトコルと併用してＰＣＲ産物を分析し、電気泳動した増幅産物の対立遺伝子の分析については、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ＩＤソフトウェアｖ３．２により行うことができる。他の実施形態では、たとえば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７自動蛍光ＤＮＡシーケンサー用に調製された約４．５％、２９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド、８Ｍ尿素ゲルで電気泳動して増幅産物を分離してもよい。
【００６３】
本教示はさらに、上述のプロセスに役立つキットを対象とする。いくつかの実施形態では、基本的なキットは、１つまたは複数の遺伝子座特異的プライマーの入った容器を含む。さらに、キットは任意に使用説明書を含んでもよい。キットはさらに、他の任意のキット要素、たとえば、特定の各遺伝子座に対する１つまたは複数の対立遺伝子ラダー、増幅を行うのに十分な量の酵素、増幅を促進する増幅緩衝液、酵素活性を促進する二価カチオン溶液、増幅において鎖を伸長させるためのｄＮＴＰ、増幅した材料を電気泳動用に調製するための添加液、鋳型コントロールとしてのゲノムＤＮＡ、物質が分離媒体中を予想通り移動するかを確認するためのサイズマーカー、および使用者に説明して誤使用を減らすためのプロトコルおよびマニュアルを含んでもよい。また、キット内の種々の試薬の量は、プロセスの最適感度などいくつかの要因によって異なって構わない。手動用の検査キットまたは自動検出器または分析器用の検査キットを提供することは本教示の範囲内である。
【００６４】
個人識別検査またはＤＮＡタイピングは、骨、毛髪、血液、組織および同種のものなど核酸を含む任意の検体で行うことができる。ＤＮＡについては検体と、本明細書に記載するような増幅産物の組を生成するマルチプレックスにおいてＤＮＡの所望のＳＴＲ遺伝子座の組を増幅するのに使用した一連のプライマーとから抽出すればよい。法医学的検査の場合、個々の検体の増幅パターンまたはＤＮＡプロファイルは、推定される犠牲者から採取した既知のサンプル（一致すると推定される対象）と比較しても、または同じＳＴＲ遺伝子座の組が増幅される、推定される犠牲者の家族（たとえば、母親および／または父親）由来の増幅した遺伝子座のパターンと比較してもよい。ＳＴＲ遺伝子座の増幅パターンを用いれば、ｖｉｃｔｉｍの同一性を確定または除外することができる。親子鑑定の場合、被検検体は一般に子供のものであってもよく、擬父のＳＴＲ遺伝子座パターンと比較し、および／または小児の母親のＳＴＲ遺伝子座パターンと一致させてもよい。ＳＴＲ遺伝子座の増幅パターンを用いれば、父親の同一性を確定または除外することができる。さらに、たとえば、ウシ、イヌ、ウマおよび他の動物の育種における親子鑑定にも、特定の遺伝子座の増幅および比較を用いることができる。ＣＲ  Ｐｒｉｍｍｅｒら（１９９５），ＭＯＬ．ＥＣＯＬ．４：４９３−４９８。
【００６５】
こうしたＳＴＲマーカーは、たとえば、骨髄移植におけるドナーの生着度合いなど臨床現場で使用してもよい。病院では、こうしたマーカーが検体のマッチングおよび追跡確認の際にも有用である場合がある。さらに、こうしたマーカーは、ヒトの人種および民族による相違に関する集団生物学の研究（ＤＢ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９９５），ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６７２３−６７２７）、進化および系統ならびに動物および植物分類群における変異（ＭＷ  Ｂｒｕｆｏｒｄら（１９９３），ＣＵＲＲ．ＢｌＯＬ．３：９３９−９４３）など他の科学分野にも応用されている。
【００６６】
本明細書に記載した参考文献、特許、特許出願、科学文献および他の刊行物のほか、ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列の受託番号はすべて参照によってその全体を本明細書に援用する。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例によって本教示の態様の理解を深めることができる。ただし、実施例はいかなる意味においても本教示の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００６８】
ある種の実施形態では、ＰＣＲ混合物中で分析されるＤＮＡサンプルとＳＴＲ特異的およびアメロゲニン特異的プライマーの組とを組み合わせて遺伝子座Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ８Ｓ１１７９、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＶＷＡ、アメロゲニンおよび５個の新しいＳＴＲ遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２２Ｓ１０４５およびＤ２Ｓ４４１を増幅した。こうした遺伝子座に対するプライマーの組は、本明細書に記載の上掲の方法に従って設計した。Ｄ１０Ｓ１２４８、ＶＷＡ、Ｄ１６Ｓ５３９およびＤ２Ｓ１３３８を増幅する各プライマーの組の１つのプライマーを６−ＦＡＭ（商標）蛍光標識で標識した。アメロゲニン、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ２１Ｓ１１およびＤ１８Ｓ５１を増幅する各プライマーの組の１つのプライマーをＶＩＣ（登録商標）蛍光標識で標識した。Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ１９Ｓ４３３、ＴＨ０１およびＦＧＡを増幅する各プライマーの組の１つのプライマーをＮＥＤ（商標）蛍光標識で標識した。Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１Ｓ１６５６およびＤ１２Ｓ３９１を増幅する各プライマーの組の１つのプライマーをＰＥＴ（登録商標）蛍光標識で標識した。第５の蛍光標識ＬＩＺ（商標）を用いてサイズ標準を標識した。
【００６９】
次いでこの反応混合物をポリメラーゼ連鎖反応に付した。ＳＴＲ遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座から増幅産物が生成され、標識プライマーが増幅産物に取り込まれた。このため増幅産物は６−ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）またはＰＥＴ（登録商標）蛍光標識で標識された。増幅後にこの反応混合物の全部または一部を１つのキャピラリー流路でキャピラリー電気泳動にかけた。さらに、ＬＩＺ（商標）標識サイズ標準も電気泳動した。１回のアウトプットで蛍光標識からの発光を検出し、表示させた。５種の色素による１６遺伝子座の増幅のＤＮＡプロファイルについては図２を参照されたい（ＬＩＺ（商標）標識サイズ標準は示していない）。ＳＴＲ遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座が流路を移動する速度はそのサイズよって決まる。ＳＴＲおよびアメロゲニン増幅産物のサイズおよびその標識の色により各遺伝子座の対立遺伝子が同定された。
【００７０】
当業者であれば分かるように、本教示の精神を逸脱しない範囲でその教示内容の種々の実施形態に対して多くの変形および修正が可能である。そうした変更はすべて本教示の範囲に包含される。
【図１】
2014155504.tif 000002
【図２】
2014155504.tif 000003
【図３】
2014155504.tif 000004
【外国語明細書】
2014155504000001.pdf