(57)【要約】      （修正有）【課題】一定の品質の（１→３）−β−Ｄ−グルカン及びエンドトキシン測定試薬を安定的・安価・大量に製造しうる、カブトガニ由来のプロクロッティングエンザイムをコードする核酸、これを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたプロクロッティングエンザイムの生産方法、並びに当該エンザイムを用いた（１→３）−β−Ｄ−グルカンとエンドトキシンの測定手段の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え体によって生産された、カブトガニ由来のプロクロッティングエンザイムを用いたエンドトキシンの検出方法であって、エンドトキシン検出系において硫酸マグネシウムを添加しない、該検出方法。【選択図】図５
2014207912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを検出するための被験試料に、下記（１）、（２）及び（３）を共存させたエンドトキシン検出系において、下記組換えプロクロッティングエンザイム（１）からクロッティングエンザイムへの変換、により誘導される酵素活性を、合成発色基質である「Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ」の発色をシグナルとして定量的又は定性的に検知し、これを被験試料中のエンドトキシンの存在量又は存在の指標として、当該試料中のエンドトキシンの検出を行うことを特徴とする、エンドトキシンの検出方法であって、エンドトキシン検出系において、硫酸マグネシウムを添加しない（塩化マグネシウムを添加する態様を除く）ことを特徴とする、エンドトキシンの検出方法。
（１）組換えプロクロッティングエンザイム：
当該プロクロッティングエンザイムは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡが保持されたバキュロウイルスを保持する昆虫由来の細胞を生育させ、その生育物からプロクロッティングエンザイムを採取するステップを少なくとも含む、プロクロッティングエンザイムの生産方法により製造される組換えタンパク質である。
（２）組換えＣ因子
（３）組換えＢ因子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カブトガニ由来のプロクロッティングエンザイムをコードする核酸、これを保持するウイルス、これを保持する細胞及びこれを用いたプロクロッティングエンザイムの生産方法、さらにはこれにより得られたプロクロッティングエンザイムを用いるＥｔやＢＧの検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（カブトガニ血球抽出液、以下、単に「ライセート」という。）を使用して、ＥｔやＢＧを測定する方法が知られている。この方法は、ＥｔやＢＧによってライセートが凝固することに基づいている。この凝固反応は、いくつかの凝固因子が段階的に活性化されることによって引き起こされる（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
例えば、ＢＧがライセートに接触すると、ライセート中に存在するＧ因子が活性化されて活性型Ｇ因子が生成する。この活性型Ｇ因子により、ライセート中に存在するＰｒｏ−ＣＥを活性化してＣＥが生成する。このＣＥは、ライセート中に存在するコアキュローゲン分子中の特定の箇所を限定水解し、これによりコアギュリンゲルが生成してライセートが凝固する。ＣＥは、合成基質（例えば、ｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニン−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ））にも作用して、そのアミド結合を水解してｐＮＡを遊離する。したがって、生成した発色物質（ｐＮＡ）の吸光度を測定することにより、ＢＧを定量することができる（特許文献１）。
【０００４】
Ｐｒｏ−ＣＥは既にクローニングされているが（非特許文献２）、この核酸を用いて活性を保持するタンパク質（Ｐｒｏ−ＣＥ）を発現することは困難であった。
【０００５】
すなわち、Ｐｒｏ−ＣＥはすでにクローニングされているが、本文献で開示された技術及び成果物は、目的とするタンパク質をコードするｃＤＮＡの標的クローンを得るための標準的な手法のみである。つまり、抗ＣＥ抗体を用いて、λgt11 ｃＤＮＡライブラリー（１５０万個のクローン）から２３個のクローンを選別、ｐＵＣ１１８／１１９ベクターにサブクローニングした後、塩基配列が決定されるに止まっている。実際の問題として当該作業だけでも膨大な労力が必要であり、セリンプロテアーゼ前躯体であるｐｒｏＣＥの酵素活性［ＣＥのプロテアーゼ（アミダーゼ）活性］の発現、及び、活性型Ｂ因子によるＰｒｏＣＥの活性化あるいは、活性型Ｃ因子及びＢ因子の共存下で酵素活性の定量的な再現試験（再構成）を行うには至っていない。特定のタンパク質の塩基配列を決定する作業と、当該タンパク質を組み換え体として得て、これを用いる特定のアッセイ系を構築することは全く別次元の高度な技術的創作性が求められる事項である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０８−１２２３３４号公報
【特許文献２】特開２００６−２７１３８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Protein Chem., 5, p255-268 (1986)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 265(36). P22426-22433 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、一定の品質を有するＥｔやＢＧの検出試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうる、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸、これを保持するウイルス、これを保持する細胞、これを用いたＰｒｏ−ＣＥの生産方法、この生産方法により得られたＰｒｏ−ＣＥを用いたＥｔやＢＧの検出方法や検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｐｒｏ−ＣＥをコードするＤＮＡを保持するウイルスが保持された細胞を用いることにより、Ｐｒｏ−ＣＥの活性を有するタンパク質を製造することができることを見出し、これにより一定の品質を有するＥｔ及びＢＧの検出試薬を安定的に、安価に、かつ大量に製造しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
上記の背景技術の欄を含め、本出願書類の全てにおいて使用する略号は以下の通りである。
Ｐｒｏ−ＣＥ：プロクロッティングエンザイム（pro-clotting enzyme）
ＣＥ：クロッティングエンザイム（clotting enzyme）
ＡｃＮＰＶ：Autographa californicaの核多角体病ウイルス
ＢＧ：（１→３）−β−Ｄ−グルカン
Ｅｔ：エンドトキシン（「リポポリサッカライド」ともいう。）
ＨＥＰＥＳ：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＭＯＩ：多重感染度（multiplicity of infection）
ＮＰＶ：核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus）
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水（phosphate buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ｐＮＡ：パラニトロアニリン
ＰＶＤＦ：ポリビニリデン・ジフルオリド(polyvinylidene difluoride)
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＬＡＬ：limulus amebocyte lysate
【００１１】
すなわち本発明は、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸（以下、「本発明核酸」という。）を提供する。
【００１２】
ここにいうカブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びタキプレウス・ロツンディカウダ（カルシノスコルピウス・ロツンディカウダともいう。）の４種のいずれかから選択される。
【００１３】
またここにいう「カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸」は下記（Ａ）〜（Ｃ）から選ばれる核酸である事がより好ましい。
【００１４】
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡを転写することにより得られるＲＮＡ。
【００１５】
またここにいう「カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸」は、下記（ａ）〜（ｃ）から選ばれる核酸であることが好ましい。
【００１６】
（ａ）配列番号３における塩基配列１〜１１４３で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３における塩基配列１〜１１４３で示される塩基配列を含む塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有することを特徴とするＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを転写することにより得られるＲＮＡ。
【００１７】
また本発明は、本発明核酸が保持されたウイルス（以下、「本発明ウイルス」という。）を提供する。
【００１８】
ここにいう「ウイルス」はバキュロウイルスであることが好ましい。バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。
【００１９】
また本発明は、本発明ウイルスを保持する細胞（以下、「本発明細胞」という。）を提供する。
【００２０】
ここにいう「細胞」は特に限定はされず、上記の本発明ウイルスとの相性等を考慮して、自由に選択することができる。すなわち、大腸菌由来、バクテリア由来、酵母由来、昆虫由来である細胞等が例示される。上述のように、好適な本発明ウイルスがバキュロウイルスであり、当該ウイルスを選択する場合には、昆虫由来の細胞を選択することが好適である。
【００２１】
また本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを採取するステップを少なくとも含む、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの生産方法（以下、「本発明生産方法」という。）を提供する。
【００２２】
また本発明は、本発明生産方法により製造されるＰｒｏ−ＣＥ（以下、「本発明酵素」という。）を提供する。
【００２３】
また本発明は、Ｅｔを検出するための被験試料において、本発明酵素及び「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を共存させ、本発明酵素からＣＥへの変換に伴う酵素活性を指標として、当該試料中のＥｔの検出を行うことを特徴とする、Ｅｔの検出方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。
【００２４】
本発明方法１において、「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」は、「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」、及び、「カブトガニ由来のＣ因子及び／又は組換えＣ因子」であることが好ましい。
【００２５】
さらに、当該「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」、好ましくは、カブトガニ由来のＢ因子及び／又は組換えＢ因子である。
【００２６】
上記Ｃ因子とＢ因子は、共に組換え型であることが好適であり、本発明方法１の最も好適な態様の一つとして、Ｅｔを検出するための被験試料において、本発明酵素と共に、Ｃ因子とＢ因子を共存させ、かつ、当該Ｃ因子とＢ因子の全てが組換え型である態様を例示することができる。Ｃ因子とＢ因子として、カブトガニ由来の天然型を用いて本発明方法１を行うことは、検出感度等の方法の有効性という観点からすると、十分に好適であるが、その一方で、天然のＣ因子とＢ因子の原料となるカブトガニの体液を採取するには、カブトガニを捕獲して、その永続的な生育に支障が出ない限度で体液を採取する必要がある。この捕獲と体液の採取の際にカブトガニに対して、ある程度のストレスを与えてしまうことは避けられず、環境破壊などに伴う個体数の減少を指摘する声もある。このように、本発明方法１を行うためのカスケード反応タンパク質の全てを組換え型とすることは、特に、貴重な生物資源を保護する観点から意義深く、生物保護、動物代替への貢献は計り知れない。
【００２７】
Ｅｔの検出系の構成要素として用いられるＣ因子又はＢ因子を組換え型因子とする場合、これらの因子をコードする遺伝子を組み込むベクターと、これを形質導入する宿主の選択は、特に限定されずに行うことも可能であるが、前述の組換え型のＰｒｏ−ＣＥと同様に、ベクターとして、ウイルス、好適には、バキュロウイルスが挙げられ、バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい。そして、宿主としては、大腸菌由来、バクテリア由来、酵母由来、昆虫由来である細胞等が例示されるが、好適な本発明ウイルスがバキュロウイルスであり、当該ウイルスを選択する場合には、昆虫由来の細胞を選択することが好適である。
【００２８】
また、「本発明酵素からＣＥへの変換に伴う酵素活性を指標とする」とは、本発明酵素であるＰｒｏ−ＣＥからＣＥへの変換により誘導される酵素活性を、定量的又は定性的に検知し、これを被験試料中のＥｔの存在量又は存在の指標とすることを意味するものである。「Ｐｒｏ−ＣＥからＣＥへの変換に伴う酵素活性を示す現象」としては、ＣＥの存在による、コアギュリンゲルの生成に伴うライセートの凝固（ゲル化や濁度の変化等により検出可能である）や、合成発色基質のアミド結合の水解により分離した発色色素の発色、等が挙げられる。とくに、合成発色基質を用いることにより、高感度で再現性の良い測定系を構築することができ、さらに、カブトガニ由来のライセートを用いる必要もなく、貴重な生物資源を保護する観点からもきわめて有益である。
【００２９】
合成発色基質としては、例えば、Ｘ−Ａ−Ｙ（式中、Ｘは保護基、Ｙは発色色素、Ａはトリペプチドである）で示されるものを挙げることができる。ＣＥの存在によりＡ−Ｙ結合が切断されて、発色色素Ｙが発色し、Ｅｔの存在の定量的又は定性的な指標となる。ここで、保護基Ｘは、ペプチドの公知の保護基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基等を挙げることが可能であり、発色色素Ｙとしては、例えば、ｐＮＡ、ＭＣＡ（7-メトキシクマリン-4-酢酸）、ＤＮＰ（2,4-ジニトロアニリン）、Dansyl 色素等が挙げられる。トリペプチドとしては、例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ：一文字表記）、及びＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ：一文字表記）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ：一文字表記）等を例示することができる。
【００３０】
本発明方法１を定量的に行う場合には、予めＥｔの標準品を用いた、Ｅｔ量と指標強度（発色色素Ｙによる発色の強度や、ライセートの凝固による濁度等）との関連を示す相関データ（典型的には検量線）の作成を行い、これを基準として被験試料内におけるＥｔを、検出された指標強度を基礎として検量的に確定することができる。
【００３１】
上記被験試料は特に限定されず、注射用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器（医療用具）医薬部外品、化粧品などのほか、食品、飲料水、空気、河川、土壌などの環境試料、ネイティブな蛋白質や遺伝子組換えタンパク、核酸、酵素、糖質、電解質に加え、血液、体液、組織などの生体成分等を挙げることができる。
【００３２】
また本発明は、本発明酵素及び「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を少なくとも構成として含むことを特徴とする、本発明方法１を行うためのＥｔの検出キット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
【００３３】
また本発明キット１は、「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が、「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」、及び、「カブトガニ由来のＣ因子及び／又は組換えＣ因子」であることが好ましい。
【００３４】
さらに、当該「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」は、好ましくは、カブトガニ由来のＢ因子及び／又は組換えＢ因子である。
【００３５】
また本発明キット１において、上記Ｃ因子とＢ因子は、共に組換え型であることが好適であり、本発明キット１の最も好適な態様の一つとして、その構成として含まれるＣ因子とＢ因子の全てが組換え型である態様を例示することができる。すなわち、本発明キット１に含まれるカスケード反応タンパク質として、本発明酵素、組換えＣ因子及び組換えＢ因子のみであることがより好ましい。
【００３６】
本発明キット１には、本発明方法１を行うために用いる試薬等、例えば、上記の合成発色基質（Ｘ−Ａ−Ｙ）、緩衝液、希釈液、塩類、カブトガニのライセート等を、本発明キット１により行われる本発明方法１の態様に応じて選択して、キットの構成に含めることができる。
【００３７】
また本発明は、ＢＧを検出するための被験試料において、本発明酵素及び「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を共存させ、本発明酵素からＣＥへの変換に伴う酵素活性を指標として、当該試料中のＢＧの検出を行うことを特徴とする、ＢＧの検出方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
【００３８】
本発明方法２において、「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が、カブトガニ由来のＧ因子及び／又は組換えＧ因子であることが好ましい。
【００３９】
上記Ｇ因子は、組換え型であることが好適であり、本発明方法２の最も好適な態様の一つとして、ＢＧを検出するための被験試料において、本発明酵素と共に、Ｇ因子を共存させ、かつ、当該Ｇ因子の全てが組換え型である態様を例示することができる。
【００４０】
なお、本発明方法２において用いるＧ因子が組換え型であることが好適な理由は、本発明方法１において、Ｃ因子とＢ因子が組換え型であることが好適である理由と同様である。また、組換え型Ｇ因子を得る際のベクターとしてウイルス、好適には、バキュロウイルスが挙げられ、バキュロウイルスのなかでも、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶであることがより好ましい点は上述したＣ因子とＢ因子と同様である。さらに、宿主としては、大腸菌由来、バクテリア由来、酵母由来、昆虫由来である細胞等が例示されるが、好適な本発明ウイルスがバキュロウイルスであり、当該ウイルスを選択する場合には、昆虫由来の細胞を選択することが好適である点もまた同様の理由によるものである。
【００４１】
また、「本発明酵素からＣＥへの変換に伴う酵素活性を指標とする」とは、本発明酵素であるＰｒｏ−ＣＥからＣＥへの変換を示す現象を、定量的又は定性的に検出し、これを被験試料中のＢＧの存在量又は存在の指標とすることを意味するものであることは、本発明方法１と同様であり、「Ｐｒｏ−ＣＥからＣＥへの変換を示す現象」の内容についても本発明方法１について開示したものと同様である。本発明方法２においても、合成発色基質Ｘ−Ａ−Ｙを好適に用いることができる。
【００４２】
本発明方法２を定量的に行う場合には、予めＢＧの標準品を用いた、ＢＧ量と指標強度（発色色素Ｙによる発色の強度や、ライセートの凝固による濁度等）との関連を示す相関データ（典型的には検量線）の作成を行い、これを基準として被験試料内におけるＢＧを、検出された指標強度を基礎として検量的に確定することができる。
【００４３】
上記被験試料は特に限定されず、注射用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器（医療用具）、医薬部外品、化粧品などのほか、食品、飲料水、空気、河川、土壌などの環境試料、ネイティブな蛋白質や遺伝子組換えタンパク、核酸、酵素、糖質、電解質に加え、血液、体液、組織などの生体成分等を挙げることができる。
【００４４】
また本発明は、本発明酵素及び「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を少なくとも構成として含むことを特徴とする、本発明方法２を行うためのＢＧの検出キット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
【００４５】
本発明キット２は、「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が、カブトガニ由来のＧ因子及び／又は組換えＧ因子であることが好ましい。
【００４６】
また本発明キット２は、上記Ｇ因子は組換え型であることが好適であり、本発明キット２の最も好適な態様の一つとして、その構成として含まれるＧ因子の全て(α、βサブユニット)が組換え型である態様を例示することができる。すなわち、本発明キット２に含まれるカスケード反応タンパク質として、本発明酵素、組換えＧ因子のみであることがより好ましい。
【００４７】
本発明キット２には、本発明方法２を行うために用いる試薬等、例えば、上記の合成発色基質（Ｘ−Ａ−Ｙ）、緩衝液、希釈液、塩類、カブトガニのライセート等を、本発明キット２により行われる本発明方法２の態様に応じて選択して、キットの構成に含めることができる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明核酸は、これを用いることによって、一定の品質を有するＰｒｏ−ＣＥの安定的、効率的、大量かつ安価な生産に有用な本発明ウイルスが提供されることから極めて有用である。また本発明ウイルスは、これを用いることによって、一定の品質を有するＰｒｏ−ＣＥの安定的、効率的、大量かつ安価な生産に有用な本発明細胞が提供されることから極めて有用である。また本発明細胞は、これを用いることにより、Ｐｒｏ−ＣＥの活性を保持した一定の品質のタンパク質を安定的、効率的、大量かつ安価に生産することができ、またこれによって本発明方法及び本発明キットが提供されることから極めて有用である。さらに、本発明方法及び本発明キットでは、貴重な生物資源であるカブトガニからライセートを調製せずに、ＥｔやＢＧの検出、測定を行うことも可能であり、生物保護、動物代替、費用、精度、再現性等の点で、極めて有用な手法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Ｐｒｏ−ＣＥ組換えウイルスの目的配列Ｎ末端、Ｃ末端領域のシークエンス解析結果を示す図である。
【図２】Ｐｒｏ−ＣＥ発現物のウエスタンブロッティングを示す図である。
【図３】ＢＧ濃度１ng/mLにおける上清画分の反応性を示す図である。
【図４】ＢＧ濃度１０ng/mLにおける上清画分の反応性を示す図である。
【図５】ＤＳ−３ＧII画分使用におけるＢＧの反応性を示す図である。
【図６】Ｅｔ濃度１０ng/mLにおける上清画分の反応性を示す図である。
【図７】Ｅｔ濃度１００ng/mLにおける上清画分の反応性を示す図である。
【図８】組換えＧ因子（５倍希釈）用いたときのＢＧの反応性を示す図である。
【図９】Ｅｔ反応において用いるべき組換えＢ因子の検討の結果を示す図である。
【図１０】Ｅｔ反応において、用いた各サンプルにおける当該反応の結果を示す図である。
【図１１】高濃度のＥｔ存在下における各因子の、Ｂｏｃ−ＬＧＲ−ｐＮＡ基質に対する水解特性について調べた結果を示す図である。
【図１２】硫酸マグネシウム濃度の完全再構築系のＥｔ反応に対する影響を０〜１００mMの間で検討した結果を示す図である。
【図１３】硫酸マグネシウム濃度の完全再構築系のＥｔ反応に対する影響を０〜１０mMの間で検討した結果を示す図である。
【図１４】塩化カルシウム濃度の完全再構築系のＥｔ反応に対する影響を０〜５mMの間で検討した結果を示す図である。
【図１５】塩化ナトリウム濃度の完全再構築系のＥｔ反応に対する影響を０〜２．５Ｍの間で検討した結果を示す図である。
【図１６】Ｂｏｃ−ＬＧＲ−ｐＮＡとＢｏｃ−ＶＰＲ−ｐＮＡを基質として用いた場合の、完全再構成系のＥｔ反応の差異を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明を実施するための最良の形態により本発明を説明する。
【００５１】
＜１＞本発明核酸
本発明核酸は、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸である。本発明核酸における「カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸」は、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥがコードされている核酸である限りにおいて特に限定されない。例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸が例示される（配列番号２は、当該塩基配列に基づくアミノ酸配列のみの表示）が、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有する塩基配列からなる核酸も本発明核酸に包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００５２】
ここで用いる「核酸」は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、当業者がその用途に合わせて選択することができる。例えば、より安定性を重視する場合にはＤＮＡを選択することができる。
【００５３】
このような核酸としては、以下のカブトガニに由来するＰｒｏ−ＣＥがコードされている核酸が例示される；
タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びタキプレウス・ロツンディカウダ。
【００５４】
これらのなかでも、タキプレウス・トリデンタツスやリムルス・ポリフェムスに由来するＰｒｏ−ＣＥがコードされている核酸が好ましく、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＰｒｏ−ＣＥがコードされている核酸がより好ましい。
【００５５】
また本発明核酸は、化学的に合成することもでき、遺伝子工学的に製造することもできる。遺伝子工学的に製造するには、例えばリムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、並びにタキプレウス・ロツンディカウダ等のカブトガニの血球（アメボサイト）から常法に従って調製したｃＤＮＡライブラリーを、例えば配列番号５又は６に記載の人工的に調製した塩基配列のプライマーを使用して、ＰＣＲ法により目的のＤＮＡを増幅させて調製することができる。ＰＣＲ産物はゲル電気泳動などの分子量による分離手段を用いることにより容易に単離することができる。
【００５６】
またここにいう「カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸」は下記（Ａ）〜（Ｃ）の核酸であることがより好ましい。
【００５７】
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ、
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡを転写することにより得られるＲＮＡ。
【００５８】
ここにいう「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ」は、タキプレウス・トリデンタツスに由来するＰｒｏ−ＣＥをコードするＤＮＡである。
【００５９】
また天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異によりアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるほか、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってアミノ酸のリン酸化、糖鎖付加、脂質付加、プロリンの水酸化などの翻訳後修飾が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等なものといえる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。このような「変異を有するタンパク質」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により作成することができる。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等の機能を有するタンパク質である。上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００６０】
なお本出願書類において「数個のアミノ酸」とは、当該タンパク質の活性が失われない範囲で変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基を含むタンパク質の場合には２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８の数を示す。
【００６１】
（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有するものである。Ｐｒｏ−ＣＥの活性は該Ｐｒｏ−ＣＥ、合成基質（例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニン−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ））、Ｅｔ、Ｃ因子及びＢ因子を共存させることによりその反応性を調べることにより確認できる。具体的には該Ｐｒｏ−ＣＥに活性があれば、該Ｐｒｏ−ＣＥ、合成基質、Ｅｔ、Ｃ因子を共存させることによりｐＮＡが遊離してくるので、このｐＮＡの生成量を吸光度測定を行うことにより検知することができる。具体的な方法は実施例２を参照されたい。
【００６２】
ここで用いる「共存」とは、共存するものが相互に接触する状態にある限りにおいて特に限定されない。具体的には、これらの該Ｐｒｏ−ＣＥ、合成基質、Ｅｔ、Ｃ因子及びＢ因子と接触させる、又は該Ｐｒｏ−ＣＥ、合成基質、ＢＧ及びＧ因子とが相互に接触する状態であることをいう。
【００６３】
またここで用いる「反応」は、該Ｐｒｏ−ＣＥを合成基質と共存させ、該Ｐｒｏ−ＣＥがＣＥに変換されることにより、合成基質に作用して、そのアミド結合を水解してｐＮＡを遊離する反応のことをいう。
【００６４】
また、前記（Ａ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、配列番号３における塩基番号１〜１１４３で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが例示される。またGenBank accession No. Ｄ１６１６５７として登録されているＤＮＡも使用することができる。
【００６５】
また、前記（Ｂ）の「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、例えば前記（Ａ）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００６６】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Denhardt's solution、１００μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００６７】
また、本発明核酸としては、マーカーペプチド等をコードするＤＮＡがさらに連結されているものが好ましい。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。また本発明核酸には上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡを転写することにより得られるＲＮＡも含まれる。
【００６８】
本発明核酸は、例えば後述する「本発明ウイルス」の製造に使用することができ、ひいては本発明細胞等の生産に利用することができる。
【００６９】
＜２＞本発明ウイルス
本発明ウイルスは、本発明核酸が保持された、ウイルスである。
【００７０】
本発明核酸についての説明は、前記の通りである。
【００７１】
本発明ウイルスにおいて「核酸が保持された」とは、その核酸が保持されている限りにおいて、他の塩基や核酸が更に保持されていることを妨げるものではない。したがって、例えばその核酸のみならず、更にマーカーペプチド等をコードする核酸等が保持されていてもよい。
【００７２】
例えば、「上記本発明核酸における（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ」と「マーカーペプチド等をコードするＤＮＡ」とが連結されたＤＮＡが保持されたベクターも、本発明ウイルスに包含される。保持される核酸をこのようにデザインすると、マーカーペプチド等との融合タンパク質として発現させることができ、その発現されたタンパク質の精製、検出、分析等を容易にすることができるというメリットがある。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、ＦＬＡＧとの融合タンパク質については抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００７３】
本発明ウイルスの製造方法も特に限定されない。本発明ウイルスを製造する方法の一例は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。
【００７４】
まず、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードする核酸を用意する。当該核酸として、前記（Ａ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。また、前記（Ｂ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号４に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。このＤＮＡは、それぞれ所定のタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。これらのＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するものが存在するが、いずれの塩基配列を有するＤＮＡをも用いることができる。
【００７５】
このような核酸をウイルスに導入することにより、本発明ウイルスを製造することができる。
【００７６】
このような核酸が導入されるウイルスは、遺伝子のトランスフェクションに用いることができるウイルスである限りにおいて特に限定されない。なかでもバキュロウイルスが好ましい。その中でも、ＮＰＶが好ましい。ＮＰＶは、ＮＰＶとして分類されるウイルスである限りにおいて特に限定されず、例えばＡｃＮＰＶや、カイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV、BmNPV）等を用いることができる。なかでも、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
【００７７】
ウイルスへの核酸の導入は、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターの種類も特に限定されず、例えばpPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等が例示されるが、なかでもpPSC8が好ましい。これらのトランスファーベクターは、市販のものを用いることもできる。
【００７８】
トランスファーベクターを用いた相同的組換えの方法も特に限定されない。その具体的な一例は、実施例を参照されたい。
【００７９】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたウイルスが製造されたか否かは、例えば、製造されたウイルスの塩基配列を解析して、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥをコードするＤＮＡが保持されているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質が、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥのアミノ酸配列を有しているか否か、製造されたウイルスから発現されたタンパク質がＰｒｏ−ＣＥの活性を有しているか否か、等を調べることによって確認することができる。
【００８０】
本発明ウイルスは、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明方法等に利用することができる。
【００８１】
＜３＞本発明細胞
本発明細胞は、本発明ウイルスを保持する細胞である。
【００８２】
「本発明ウイルス」についての説明は、前記の通りである。
【００８３】
ここで用いる「細胞」は、本発明ウイルスが感染しうる細胞であって、かつ、本発明ウイルスが保持しているカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥが発現することができるものであれば良い。その一例として昆虫に由来する細胞を挙げることができる。また昆虫に由来する細胞として、Ｓｆ９細胞を例示することができる。
【００８４】
本発明ウイルスを細胞に保持させる方法も特に限定されないが、例えばウイルスとしてＮＰＶを採用した場合には、単に本発明ウイルスと細胞とを接触させるだけで、本発明ウイルスを当該細胞に感染させることができ、本発明ウイルスを当該細胞に保持させることができる。その具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
【００８５】
本発明細胞は、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを生産する能力を有することから、これらの性質を指標にして、本発明細胞を選択することができる。
【００８６】
本発明細胞は、例えば後述する本発明生産方法等に利用することができる。
【００８７】
＜４＞本発明生産方法
本発明生産方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを採取する工程を少なくとも含む、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの生産方法である。
【００８８】
「本発明細胞」については、前記の通りである。
【００８９】
本出願書類において「生育」とは、形質転換体である細胞の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）、培養された細胞自体、細胞を組み込んだ動物・昆虫等からの分泌物・排出物等を包含する概念である。
【００９０】
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。
【００９１】
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するＰｒｏ−ＣＥの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。
【００９２】
生育物からカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを採取する方法は、生育物の種類に応じて、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。
【００９３】
例えば、Ｐｒｏ−ＣＥが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。またＰｒｏ−ＣＥが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によってこれらのＰｒｏ−ＣＥを抽出することができ、その抽出物をそのままＰｒｏ−ＣＥとして用いてもよい。
【００９４】
本発明生産方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からカブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたＰｒｏ−ＣＥをさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、Ｐｒｏ−ＣＥの使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００９５】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００９６】
生産されたタンパク質が、Ｐｒｏ−ＣＥから構成されているか否か、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥの活性を保持しているか否か等は、採取されたタンパク質のアミノ酸配列、分子量、電気泳動結果、Ｐｒｏ−ＣＥに特異的に反応する抗体を用いたウエスタンブロッティング等を分析することによって確認することができる。
【００９７】
本発明方法によれば、Ｐｒｏ−ＣＥの活性を保持しているタンパク質を極めて効率的に生産することができる。
【００９８】
＜５＞本発明酵素
本発明酵素は、本発明生産方法により製造されるＰｒｏ−ＣＥである。
【００９９】
「本発明生産方法」については、前記の通りである。
【０１００】
本発明酵素は、後述する本発明方法１等に用いることができる。
【０１０１】
＜６＞本発明方法１
本発明方法１は、Ｅｔを検出するための被験試料において、本発明酵素及び「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を共存させ、本発明酵素からＣＥへの変換に伴う酵素活性を指標として、当該試料中のＥｔの検出を行うことを特徴とする、Ｅｔの鋭敏な検出方法である。
【０１０２】
「本発明酵素」については、前記の通りである。
【０１０３】
ここで用いる「共存」とは、共存するものが相互に接触する状態にある限りにおいて特に限定されない。
【０１０４】
例えば、これら本発明酵素、Ｅｔを検出するための被験試料及び「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が相互に接触する状態にある限りにおいて特に限定されず、溶液中で共存させてもよく、Ｐｒｏ−ＣＥ若しくは、Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体を適当な固相に固着させ、これに前記「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」あるいはＰｒｏ−ＣＥを接触させてもよい。
【０１０５】
また本発明方法１において、「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」は、「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」、及び、「カブトガニ由来のＣ因子及び／又は組換えＣ因子」であることが好ましい。
【０１０６】
さらに、当該「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」は、好ましくは、カブトガニ由来のＢ因子及び／又は組換えＢ因子である。
【０１０７】
本発明方法１で用いられる「Ｃ因子」及び「Ｂ因子」はその機能を保持している限りにおいて特に限定されない。例えば、４種のカブトガニ、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・ギガス及びタキプレウス・ロツンディカウダのいずれかに由来するライセートをクロマトグラフィー等で精製することにより得た天然のＣ因子画分、Ｂ因子画分を用いることもでき、組換えＣ因子、Ｂ因子を用いることもできる。天然のＣ因子、Ｂ因子はデキストラン硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体又は特異的な吸着担体等を用いてライセートを処理し、Ｃ因子、Ｂ因子の画分を得ることができる。また、組換え体に関しては、例えばタキプレウス・トリデンタツス及びタキプレウス・ロツンディカウダ由来の天然Ｃ因子に対するアミノ酸配列が公知であるので、これらの配列に基づいて適宜調製することができる。その方法は特に限定されるものではないが、例えば次の方法で得ることができる。Ｃ末端にＨｉｓ−Ｔａｇを付加したＣ因子の目的塩基配列を合成し、トランスファーベクター（例えばｐＰＳＣ８、タカラバイオ社製）に導入し、得られた発現ベクター（Ｆａｃｔｏｒ Ｃ/ｐＰＳＣ８）ＤＮＡとバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡをＳｆ９細胞にコトランスフェクションし、培養上清から得られたウイルス液を純化、増幅することによって調製できる。また、Ｂ因子についても同様の方法で取得できる。Ｃ因子及びＢ因子共に、そのアミノ酸配列とこれをコードする遺伝子は既に知られており（Ｃ因子については市販されており、後述する実施例に当該市販品が開示されている。Ｂ因子について配列番号１５は遺伝子の塩基配列を示し、配列番号１６にアミノ酸配列を示した。）、これらの因子の組み換え体は当該配列情報に基づいて、上記の本発明酵素と実質的に同様の工程にて製造することができる。なお、遺伝暗号の縮重による、公知のＣ因子の塩基配列と配列番号１５とは異なった塩基配列を有する塩基配列であって、それに基づき製造されるタンパク質がＣ因子又はＢ因子本来の作用を有する範囲で、本発明において用いることが可能なＣ因子とＢ因子であり得ることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【０１０８】
再構築系を作動させる条件としては、昆虫細胞を経る（反応の場として提供される）必要はなく、細胞フリーの系で、少なくともカスケード反応のトリガリング、セリンプロテアーゼ前駆体の逐次活性化及びＣＥの反応を円滑に進めるため、好ましくは一定の加温がなされることと、アルカリ土類金属（カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ベリリウム、マグネシウム等）、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）に代表される金属イオンが共存することなどが挙げられる。
【０１０９】
本発明方法１においては、カスケード反応タンパク質として、本発明酵素、組換えＣ因子及び組換えＢ因子のみを共存させることがより好ましい。
【０１１０】
本明細書で用いる「カスケード反応」とは、次の反応の「１．」及び／又は「２．」のことをいう；
１．ライセートにＥｔが加わると、ライセート中に存在するＣ因子（Ｅｔ感受性因子、分子量１２３，０００）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はＰｒｏ−ＣＥ（分子量５４，０００）を活性化してＣＥに変換し、ＣＥはコアギュロゲン（凝固タンパク、分子量１９，７２３）のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を、すなわち…Ａｒｇ１８−Ｔｈｒ１９…の間及び…Ａｒｇ４６−Ｇｌｙ４７…の間を限定水解してＨ−Ｔｈｒ１９…Ａｒｇ４６−ＯＨで表されるペプチドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応、
２．ライセートにＢＧが加わると、ライセート中に存在するＧ因子（ＢＧ感受性因子）が活性化され、活性型Ｇ因子がＰｒｏ−ＣＥを活性化しＣＥに変換し、コアギュロゲンのジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を限定水解し、コアギュリンゲルが生成される、という一連の反応。
【０１１１】
また「カスケード反応タンパク質」とは「カスケード反応」を構成するタンパク質のことをいう。セリンプロテアーゼ前駆体（Ｃ因子、Ｂ因子、Ｇ因子及びＰｒｏ−ＣＥ）のことをいい、具体的には上記カスケード反応の「１．」ではＣ因子、Ｂ因子及びＰｒｏ−ＣＥのことをいい、「２．」ではＧ因子及びＰｒｏ−ＣＥのことをいう。
【０１１２】
また後述する実施例からもわかるように、本発明方法１に用いられる遺伝子工学的に得られた各凝固因子はそれぞれ由来が異なっていてもよい。例えば本発明酵素、タキプレウス・ロツンディガウダ由来のＣ因子及びリムルス・ポリフェムス由来のＢ因子を共存させるステップを含むことによりＥｔを検出することもできる。
【０１１３】
本発明方法１は、後述する本発明キット１を用いることにより、簡便に行うことができる。
【０１１４】
＜７＞本発明キット１
また本発明キット１は、本発明酵素及び「Ｅｔと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を少なくとも構成として含むことを特徴とする、本発明方法１を行うためのＥｔの検出キットである。
【０１１５】
「本発明酵素」については、前記した通りである。
【０１１６】
さらに、当該「活性型Ｃ因子と接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」は、好ましくは、カブトガニ由来のＢ因子及び／又は組換えＢ因子である。
【０１１７】
また本発明キット１は、カスケード反応タンパク質として本発明酵素、組換えＣ因子及び組換えＢ因子のみで構成されていることが好ましい。
【０１１８】
また、本発明キット１は、本発明方法１に基づいて当業者が適宜利用することができる。
【０１１９】
本発明キット１で用いられる、「Ｃ因子」、「Ｂ因子」及び「カスケード反応」等の用語の意味等は本発明方法１で用いられるものと同じある。また、前記したように、本発明方法１を行うために用いる試薬等、例えば、上記の合成発色基質（Ｘ−Ａ−Ｙ）、緩衝液、希釈液、塩類、カブトガニのライセート等を、本発明キット１により行われる本発明方法１の態様に応じて選択して、キットの構成に含めることができる。
【０１２０】
＜８＞本発明方法２
また本発明方法２は、ＢＧを検出するための被験試料において、本発明酵素、及び「ＢＧと接触することによりプロクロッティングエンザイムをクロッティングエンザイムに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を共存させ、本発明酵素からクロッティングエンザイムへの変換に伴う酵素活性を指標として、当該試料中のＢＧの検出を行うことを特徴とする、ＢＧの検出方法である。
【０１２１】
「本発明酵素」については、前記の通りである。
【０１２２】
本発明方法２は、「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が、カブトガニ由来のＧ因子及び／又は組換えＧ因子であることが好ましい。
【０１２３】
本発明方法２で用いることができる「Ｇ因子」とはその機能を保持している限りにおいて特に限定されない。例えば、４種のカブトガニのいずれかに由来するライセートをクロマトグラフィー等で精製することにより得た天然のＧ因子画分を用いることもでき、組換えＧ因子を用いることもできる。また組換え体のＧ因子に関しては、Ｇ因子がαサブユニットとβサブユニットから構成されているタンパク質であり、そのそれぞれに関して下記の手順で生産できる。
【０１２４】
まず、カブトガニ由来のＧ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡを用意する。当該ＤＮＡとしては例えばGenBank accession No.１６６２２として登録されているＤＮＡが例示される（配列番号１７：アミノ酸配列は、配列番号１８）。このＤＮＡをBamHI/Hind IIIで処理し、目的の遺伝子配列が含まれるＤＮＡ断片を回収する。このサンプルを平滑末端化処理後、Nru Iで処理したpPSC8（トランスファーベクター）と混合しライゲーション反応を行う。その後ライゲーション産物でE.coli JM109を形質転換し、形質転換体を得る。目的サイズの断片が確認されたプラスミドを精製する。選択された発現ベクター（Ｇ因子−α／ｐＰＳＣ８）ＤＮＡとバキュウロウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡをSf9細胞にコトランスフェクトする。その後、この培養液の上清より得られたウイルス液を純化し増幅する。このウイルス液をexpres SF+細胞に感染させ、培養液を遠心分離することにより上清画分と沈殿画分が得られる。これらの画分よりＧ因子のαサブユニットを得ることができる。また、βサブユニットに関しては、αサブユニットを得る方法における、用いるＤＮＡをカブトガニ由来のＧ因子のβユニットをコードするＤＮＡに置き換えることにより得ることができる。また、βユニットをコードするＤＮＡとしては、例えばGenBank accession No.１６６２３（配列番号１９）として登録されている塩基配列やそのアミノ酸配列（配列番号２０）も使用することができる。なお、遺伝暗号の縮重による、配列番号１６と１７とは異なった塩基配列を有する塩基配列であって、それに基づき製造されるタンパク質がＧ因子本来の作用を有する範囲で、本発明において用いることが可能なＧ因子であり得ることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【０１２５】
再構築系を作動させる条件としては、昆虫細胞を経る（ある種の細胞が反応の場として提供される）必要はなく、細胞フリーの系で、少なくともカスケード反応のトリガリング、セリンプロテアーゼ前駆体の逐次活性化及びＣＥの反応を円滑に進めるため、好ましくは、一定の加温がなされること、アルカリ土類、アルカリ金属などの金属イオンが共存すること等が挙げられる。
【０１２６】
また本発明方法２は、カスケード反応タンパク質として本発明酵素及び組換えＧ因子のみを共存させることがより好ましい。また本発明方法１と同様に、本発明酵素と組換えＧ因子の由来が同一ものを用いてもよく、異なる由来の酵素を組み合わせてもよい。
【０１２７】
本発明方法２で用いられる「共存」、「カスケード反応」、「カスケード反応タンパク質」等の用語の意味は本発明方法１で用いられるものと同じである。
【０１２８】
本発明方法２は、後述の本発明キット２に利用することができる。
【０１２９】
＜９＞本発明キット２
また本発明キット２は、本発明酵素及び「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」を少なくとも構成として含むことを特徴とする、本発明方法２を行うためのＢＧの検出キットである。
【０１３０】
「本発明酵素」については、前記の通りである。
【０１３１】
本発明キット２では、「ＢＧと接触することによりＰｒｏ−ＣＥをＣＥに変換させる活性を発現するセリンプロテアーゼ前駆体」が、カブトガニ由来のＧ因子及び／又は組換えＧ因子であることが好ましい。
【０１３２】
当該Ｇ因子は組換え型であることがさらに好適であり、本発明キット２の最も好適な態様の一つとして、その構成として含まれるＧ因子の全てが組換え型である態様を例示することができる。すなわち、本発明キット２に含まれるカスケード反応タンパク質として、本発明酵素、組換えＧ因子のみであることがより好ましい。
【０１３３】
また、本発明キット２は、本発明方法２に基づいて当業者が適宜使用することができる。
【０１３４】
本発明キット２で用いられる「Ｇ因子」は本発明方法２と同じ意味で用いられる。また「カスケード反応」、「カスケード反応タンパク質」は本発明方法１で用いられるものと同じ意味で用いる。また、前記したように、本発明方法２を行うために用いる試薬等、例えば、上記の合成発色基質（Ｘ−Ａ−Ｙ）、緩衝液、希釈液、塩類、カブトガニのライセート等を、本発明キット２により行われる本発明方法２の態様に応じて選択して、キットの構成に含めることができる。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【０１３６】
［実施例１］昆虫細胞を用いたＰｒｏ−ＣＥの発現
配列番号３で示されるｃＤＮＡ（配列番号３の１〜１１２５で示される塩基配列のＣ末端にＨｉｓ−Ｔａｇ配列を付加したもの）（九州大学大学院医学研究院分子細胞生化学分野（現在、東北大学大学院生命科学研究科）の牟田達史博士より恵与された。このｃＤＮＡは、前記の非特許文献２に記載の方法で調製したものである。）を、トランスファーベクター（ｐＰＳＣ８）に導入し、所定の塩基配列を有するクローンを選択した。選択された発現ベクター（ＰＣ／ｐＰＳＣ８）ＤＮＡとバキュウロウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡをＳｆ９細胞にコトランスフェクションした。この培養液上清から得られたウイルス液を純化し、増幅した。バキュウロウイルスに感染した細胞からウイルスＤＮＡを抽出しシークエンス解析した。得られたウイルス液を昆虫細胞ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）に感染させ、ウエスタンブロッティングによって発現物の解析を行った。以下、これらのステップの詳細を説明する。
【０１３７】
１．発現ベクターの構築
０．２mLのサンプルチューブにＰＣ／ｐＵＣ１１８（２０ng/μg)1μL、２．５mM ｄＮＴＰ  １２μL、ＫＯＤ buffer #１５μL、２５mM 塩化マグネシウム溶液 ２μL、ＰＣ−Ｆ、ＰＣ−Ｒ（４pmol/μL)をそれぞれ ２．５μL、KOD DNA polymerase （東洋紡社製）1 μL及び滅菌した純水を２４μLを加え攪拌し、ＰＣＲを行った。目的の遺伝子が含まれる事を確認した後、ＴＥバッファーで全量を16 μLとした。得られたＰＣＲ産物に１００mM  ＡＴＰ １μL、10×Buffer 1 μL及びＴ４Polynucleotide Kinase （タカラバイオ株式会社製）を加え３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＣＲ産物を精製後、Sma Iで処理したｐＰＳＣ１２と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物で E.coli JM109を形質転換し、形質転換体（PC/pPSC12）を得た。ＰＣ／ｐＰＳＣ１２をXba I/Bgl IIで消化し、目的遺伝子が含まれる断片を回収した。得られた断片を同酵素で処理したpPSC8と混合し、ライゲーション反応を行った。ライゲーション産物で E.coli  JM109を形質転換し、形質転換体を得た。目的サイズの断片が確認されたプラスミドを精製し、シークエンスを確認した。シークエンスの解析には、以下のプライマー、及びABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3(Applied Biosystems社)を使用し、解析には自動シークエンサーABI Prism 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)を使用した。プライマー配列を配列表の配列番号５〜１０に示す。
配列番号５：ＰＣ−Ｆ
配列番号６：ＰＣ−Ｒ
配列番号７：ＰＳＣ２
配列番号８：ＰＳＣ４
配列番号９：ＰＣ  ４５３／４７２−Ｆ
配列番号１０：ＰＣ  ６８３／６６４−Ｒ
【０１３８】
目的遺伝子の挿入が確認されたクローンを、５０μg/mLのアンピシリンを含む１００mLのLB培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。増殖した菌体を回収し、Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製）のマニュアルに従ってプラスミドを精製した。
【０１３９】
２．コトランスフェクション
２５  ｃｍ２フラスコに播いた１．０×１０６個のＳｆ９細胞に、Ｐｒｏ−ＣＥをコードするｃＤＮＡを保持する発現ベクター２．３μg、Linear AcNPV DNA ８５ng及びLIPOFECTIN Reagent（（インビトロジェン）Invitrogen社製） ５μLを含む無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地（（インビトロジェン）Invitrogen社製）２００μLを加えた。２８℃で６時間静置後、培養液量が5 mLとなるように無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地を加えた。さらに２８℃で５日間培養後、培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
【０１４０】
３．組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。
【０１４１】
２．０×１０６個のＳｆ９細胞を直径６０ｍｍのシャーレに播き、２８℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ｍＬずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに震盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、０．５％  SeaKemGTG agarose（ＢＭＡ社製）  を含有する無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地  ４mLを流し込んで、２８℃で８日間静置培養した。培地ごとに、多角体（Polyhedra）が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１mLの無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地に懸濁させ、ウイルス原液とした。
【０１４２】
４．組換えウイルスの増殖
次いで、組換えウイルスの増殖（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【０１４３】
２５ｃｍ２フラスコに播いた２．０×１０６個のＳｆ９細胞に上記ウイルス原液を０．５mLずつ添加して、２８℃で１時間静置培養した。培養液量が５mLとなるように無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地を加え、３日間静置培養し、第１代ウイルス液とした。
【０１４４】
７５  ｃｍ２フラスコに播いた６．０×１０６個のＳｆ９細胞に、第１代ウイルス液を全量加え、２８℃で１時間静置培養した。その後、無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地を１０mL加えてさらに３日間培養した。培養後、培養上清を回収し、３，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液とした。
【０１４５】
５．組換えウイルス液の作製
対数増殖期にある培養昆虫細胞ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋を、１．５×１０６個／mLとなるように無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地で希釈し、１２５  ｍＬ三角フラスコに５０mL用意した。これに上記第２代ウイルス液を０．５mL加え、１３０ｒｐｍ、２８℃で３日間震盪培養した。培養後、培養液を１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第３代ウイルス液とした。
【０１４６】
６．遺伝子挿入確認
その後、細胞へのＤＮＡの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。
【０１４７】
上記のように回収した第３代ウイルス液を１．５mL  マイクロチューブに０．７mL入れ、等量の２０％ポリエチレングリコール、１Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、よく混合し、１時間静置した。その後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清と沈殿に分画した。この沈殿を回収し、QIAamp DNA Miki Kit（QIAGEN社製）のマニュアルに従いBuffer ALT １８０μLに溶解し、ウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下のようにＰＣＲを行った。
配列番号１１：ＰＳＣ  Ｎ３Ｆ
配列番号１２：ＰＳＣ  Ｎ３Ｒ
【０１４８】
０．２mLのサンプルチューブに上記のウイルスＤＮＡ 1μL、10×PCR buffer for KOD -Plus- ５μL、２mM ｄＮＴＰｓ ５μL、２５mM 硫酸化マグネシウム溶液 ２μL、ＰＳＣ  Ｎ３Ｆ及びＰＳＣ  Ｎ３Ｒプライマー（４pmol/mL）にそれぞれ３．７５μL、KOD -Plus- DNA Polymerase（東洋紡社製） １μL及び滅菌した純水１９．５μLを添加してよく攪拌した。これを用いて、「９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で４分間」のサイクルを３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。
【０１４９】
１０μLのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス解析は、前記「１.」と同様の試薬、機器を使用し、プライマーは以下のものを用いた。プライマーの配列を配列表の配列番号１３及び１４に示す。
配列番号１３：PSCNF2
配列番号１４：PSC3
【０１５０】
７．タイター測定
２．０×１０６個のＳｆ９細胞を直径６０mmのシャーレに播き、２８℃で１時間静置して細胞を底面に定着させた後、培養液を除去した。第３代ウイルス液を無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地で１０５、１０６、１０７及び１０８倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１mLずつシャーレに添加し、室温で１時間穏やかに震盪した。その後、シャーレの上清（ウイルス液）を取り除き、０．５％ SeaKemGTG agarose （BMA社製）を含有する無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地４ｍLを流し込んで、２８℃で７日間静置培養した。培地ごとに、観察されたプラークの個数を数え、タイターを求めた。
【０１５１】
８．発現試験
昆虫細胞 ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋を、１．５×１０６個/mLとなるように無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地で希釈し、２５０mL三角フラスコ９本に１００mLずつ用意した。これらに、第３代ウイルス液を各々ＭＯＩ＝０．２、１、５となるように加え（各３本ずつ）１３０ｒｐｍ、２８℃でそれぞれ４８、７２、９６時間震盪培養した。培養後、培養液を３，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、沈殿と上清に分画した。
【０１５２】
９．発現物の確認
前記「８．」で回収したサンプルについて、定法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。セミドライブロッティング法によりブロッティング膜にタンパク質を転写し以下の条件でウエスタンブロティングを行った。なお、ウイルス中に組み込まれた「Ｐｒｏ−ＣＥをコードするＤＮＡ」はＨｉｓ−Ｔａｇが結合した形で発現されるようにデザインされている。
サンプルの処理：上清については、Laemmli Sample Buffer（BIO-RAD社製）を加え、９９℃で３分間熱処理した。沈殿については、２００μL相当の沈殿に４００μLのＰＢＳを加え懸濁後、Laemmli Sample Bufferを加え、９９℃で３分間熱処理した。
サンプルアプライ量：20 μL/レーンとした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度：１０〜２０％ゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル通電１５０Ｖ、ＣＶとした。
ブロッティング膜：ＰＶＤＦを用いた。
ブロッティング通電：１５Ｖ、ＣＶ、３０分間とした。
一次抗体：Penta・His Antibody （QIAGEN社製）を用いた。
二次抗体：Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP Conjugate(BIO-RAD社製)を用いた。
検出：Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate （Milipore社製）を用いた。
【０１５３】
１０．結果
組換えウイルスの目的配列のシークエンス解析結果を図１に示す。上段が解析結果を、下段にＰｒｏ−ＣＥの配列を示した。これからわかるように組換えウイルス中にＰｒｏ−ＣＥのＮ末端、Ｃ末端の配列が一致した。このことから、組換えウイルス中にＰｒｏ−ＣＥをコードするＤＮＡの塩基配列の存在が確認された。
【０１５４】
また、タイター測定の結果は、0.7×108 pfu/mLであった。
【０１５５】
前記「９．」の結果、目的の位置（約40kDa付近）に、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体と反応するバンドが確認された（図２）。図２のＭは分子量マーカー、４８，７２，９６はそれぞれ４８時間感染区、７２時間感染区、９６時間感染区を示し、Ｓはウイルス非感染区、Ａは野生型ウイルス感染区をそれぞれ示す。このことから、Ｐｒｏ−ＣＥが発現されたことが確認された。
【０１５６】
［実施例２］組換えＰｒｏ−ＣＥの活性確認
昆虫細胞  ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋を、１．５×１０６個/mLとなるように無血清Ｓｆ−９００ＩＩ培地で希釈し、２５０mL三角フラスコ９本に100mLずつ用意した。これらに、第３代ウイルス液を各々MOI=0.2、1、5となるように加え（各３本ずつ）１３０rpm、２８℃でそれぞれ４８、７２、９６時間震盪培養した。培養後、培養液を３，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、沈殿と上清に分画した。上清は凍結させて保存した。
【０１５７】
サンプル１：ＭＯＩ＝０．２、４８時間
サンプル２：ＭＯＩ＝０．２、７２時間
サンプル３：ＭＯＩ＝０．２、９６時間
サンプル４：ＭＯＩ＝１、４８時間
サンプル５：ＭＯＩ＝１、７２時間
サンプル６：ＭＯＩ＝１、９６時間
サンプル７：ＭＯＩ＝５、４８時間
サンプル８：ＭＯＩ＝５、７２時間
サンプル９：ＭＯＩ＝５、９６時間
サンプル１０：ウイルス非感染細胞
サンプル１１：野生型ウイルス感染細胞
【０１５８】
（試薬）
ＤＳ−３ＧII画分：カブトガニ血球抽出液由来Ｇ因子[デキストラン硫酸Sepharose CL-6B(以下DS-Sepharose)による分画精製品]
ＤＳ−１０ＡII画分：カブトガニ血球抽出液由来Ｐｒｏ−ＣＥ（DS-Sepharose精製品）
ＢＧ：ＣＳＢＧ（1495ng/vial）を蒸留水1.495 mLで溶解後、１０倍段階希釈した。
【０１５９】
１.上清画分とＧ因子を用いたＢＧ濃度１〜１００ng/mLにおける反応性
まず上記９サンプルの上清について、発現されたタンパク質がＰｒｏ−ＣＥの活性を保持しているか否かを調べた。
【０１６０】
培養後の上清画分を、１５０mM  ＮａＣｌ含有５０mL Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でそれぞれ１０倍希釈した。この希釈物（それぞれ２５μL）にＤＳ−３ＧII画分（２５μL）、デキストラン（終濃度２．４％）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（終濃度８０mM）、ＭｇＳＯ４（終濃度６４mM）、ＣａＣｌ２（終濃度０．４mM）、Ｎａ２ＳＯ４（終濃度８mM）、注射用蒸留水（１５μL）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA基質（前記の特許文献１参照）（終濃度０．２４mM）及びＢＧ溶液（０、１、１０、１００ng/mL）を２５μL添加し、総容量を１２５μLとして、Wellreader SK603内に移し、３７℃で２時間反応させた後、測定波長４０５nm（対照波長４９２nm）における吸光度を自動測定した。また陽性コントロールとして、ＤＳ−１０ＡII画分を用いた。実験は二重測定で行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を図３、４及び表１に示す。
【０１６１】
【表１】
2014207912.tif 000003
【０１６２】
表１に示されるように、サンプル１〜９のウイルス感染細胞の培養上清中には当該酵素がほぼ同一量存在しており、全ての画分においてＰｒｏ−ＣＥの発現が確認された。特にサンプル２は強い活性を示していた。
【０１６３】
また、表２及び図５は上記サンプル２の組換えＰｒｏ−ＣＥとＤＳ−１０ＡII画分の活性を比較したものである。
【０１６４】
【表２】
2014207912.tif 000004
【０１６５】
これらの結果より、当該組換えＰｒｏ−ＣＥはカブトガニ血球抽出液由来Ｐｒｏ−ＣＥとほぼ同等の活性を有することを確認した。
【０１６６】
２．上清画分とＢ及びＣ因子を用いたＥｔ濃度１〜１００ng/mLにおける反応性
上記「１．」で得られた希釈物に当該組換えＰｒｏ−ＣＥ及びＰｒｏ−ＣＥの溶出画分であるＤＳ１０−ＡII画分（陽性コントロール）と、さらにＢ及びＣ因子の代わりにＢ及びＣ因子の溶出画分であるＤＳ−１２ＢＣI画分（25 μL）とＥｔを添加した。加えたＥｔ濃度はそれぞれ０、１、１０、１００ng/mLとした。その他の反応混合物に関しては同様の濃度、量を加え、総容量を１２５μLとしてWellreader SK603内に移し、３７℃で３０分間反応させた後、測定波長４０５nm（対照波長４９２nm）における吸光度を自動測定した。実験は二重測定で行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を図６、７及び表３に示す。
【０１６７】
【表３】
2014207912.tif 000005
【０１６８】
表３に示されるように、全てのサンプルのウイルス感染細胞の培養上清中に当該Ｐｒｏ−ＣＥが存在していることが確認できた。特にサンプル２は強い活性を示していた。
【０１６９】
［実施例３］組換えＰｒｏ−ＣＥ及び組換えＧ因子による完全再構成系の活性発現の確認
（試薬）
（１）組換えＧ因子（αサブユニット：βサブユニット＝２：１の培養上清）
（２）組換えＰｒｏ−ＣＥ（実施例２のサンプル２の培養上清）
（３）ＢＧ：ＣＳＢＧ（1495 ng/vial）を蒸留水1.495mLで溶解後、１０倍段階希釈した。
【０１７０】
特開２００６−２７１３８４号公報（特許文献２）にて開示された方法に準じて製造された（１）、及び、（２）の培養上清を、１５０mM  ＮａＣｌ含有５０mL Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でそれぞれ５倍希釈した。なお、ここでは、Ｇ因子のαサブユニットをコードするＤＮＡとして、配列番号２１に示す配列のものを用いた。希釈した組換えＧ因子（２５μL）に組換えＰｒｏ−ＣＥ（２５μL）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（終濃度８０mM）、ＭｇＳＯ４（終濃度６４mM）、ＣａＣｌ２（終濃度０．４mM）、Ｎａ２ＳＯ４（終濃度８mM）、注射用蒸留水（１５μL）、デキストラン（終濃度２．４％）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA基質（終濃度０．２４mM）及びＢＧ溶液（０、１、１０ng/mL）を２５μL添加し、総容量を１２５μLとして、Wellreader SK603内に移し、常法通り反応させた後、測定波長４０５nm（対照波長４９２nm）における吸光度を自動測定した。実験は二重測定で行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を表４及び図８に示す。
【０１７１】
【表４】
2014207912.tif 000006
【０１７２】
これらの結果から、組換えＧ因子と組換えＰｒｏ−ＣＥを組み合わせることによっても、ライセート中の各因子(天然のＬＡＬ因子)と同様にＢＧによる反応が濃度依存的に進行し、天然のＬＡＬ因子と同様に活性発現されていることが確認された。
【０１７３】
［実施例４］組換えＰｒｏ−ＣＥ、組換えＢ因子及び組換えＣ因子を用いた完全再構成系によるＥｔ反応の確認
Ｂ因子のＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇ配列を付加したＢ因子の発現目的塩基配列を合成し、トランスファーベクター（ｐＰＳＣ８）に導入した。得られた発現ベクター（ＦａｃｔｏｒＢ／ｐＰＳＣ８）ＤＮＡとバキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡをＳｆ９細胞にコトランスフェクションし、この培養液上清から得られたウィルス液を純化、増幅した。ウィルス液からウィルスＤＮＡを抽出し、塩基配列の解析を行い、組込み遺伝子のＮ末端及びＣ末端、それぞれの配列を確認した。得られた組換えウィルスを１００mL培養液相当のｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞へＭＯＩ=０．０２、０．１及び０．５で感染させ、４８、７２及び９６時間後に培養上清及び沈殿を回収した。回収した発現物は、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより発現の確認を行った。さらに、本因子と組換えＣ因子（PyroGene、ケンブレックス社製）ならびに組換えＰｒｏＣＥの共存下で、Ｅｔ（０、０．０１，０．１，１，１０，１００μg/ml）を添加、３７℃、１時間反応させ、ｐｒｏ−ＣＥの合成基質（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）水解能により、ＰｒｏＣＥの活性化（ＣＥの生成）を確認した。
【０１７４】
実施例１と同様の実験を行い組換えＢ因子の活性を確認後、Ｅｔ反応性について検討したところ、ＭＯＩ＝０．１、９６時間の条件のものが最もＥｔ反応性が高かったことから、Ｃ系のカスケードの再構築にはこの条件のものを用いた（表５、図９）。
【０１７５】
【表５】
2014207912.tif 000007
【０１７６】
また、異なるカブトガニ由来の各因子を組み合わせた場合にもカスケード反応が進むかどうかを確認するため、組換えＣ因子には、市販のPyroGene（ケンブレックス社製）の構成品である組換えＣ因子（タキプレウス・ロツンディガウダ由来）を用いた。
【０１７７】
（試薬）
（１）組換えＢ因子（ＭＯＩ＝０．１、９６時間の培養上清）
（２）組換えＰｒｏ−ＣＥ（実施例２のサンプル２の培養上清）
（３）組替えＣ因子（商品名 PyroGene、原液で使用）
（４）Ｅｔ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４由来（シグマ社製）を蒸留水にて１mg/mLに調製後、１０倍段階希釈した。
【０１７８】
また、実験結果がカスケードを再構成した結果得られたものであることを確認するために、以下のような組み合わせのサンプルを作成し検証した。
【０１７９】
サンプルＡ：組換えＰｒｏ−ＣＥ、組換えＢ因子及び組換えＣ因子
サンプルＢ：組換えＰｒｏ−ＣＥ、組換えＢ因子及び蒸留水
サンプルＣ：組換えＰｒｏ−ＣＥ、組換えＣ因子及び蒸留水
サンプルＤ：組換えＢ因子、組換えＣ因子及び蒸留水
サンプルＥ：組換えＰｒｏ−ＣＥ及び蒸留水
サンプルＦ：組換えＢ因子及び蒸留水
サンプルＧ：組換えＣ因子及び蒸留水
【０１８０】
また、それぞれのサンプルには、上記（１）及び（２）の培養上清を、１５０mM ＮａＣｌを含有する氷冷した５０mL Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でそれぞれ５倍希釈ものを用い、全液量が６０μLとなるように調製した。
【０１８１】
それぞれのサンプルに、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（終濃度８０mM）、ＭｇＳＯ４（終濃度６４mM）、ＣａＣｌ２（終濃度０．４mM）、Ｎａ２ＳＯ４（終濃度８mM）、デキストラン（終濃度２．４％）、注射用蒸留水（１５μL）、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA基質（終濃度０．２４mM）及びＥｔ溶液（０、１００ng/mL）を２５μL添加し、総容量を１２５μLとして、Wellreader SK603内に移し、３７℃で１０時間反応させた後、測定波長４０５nm（対照波長４９２nm）における吸光度を測定した。実験は二重測定で行い、吸光度の平均値を算出した。その結果を表６及び図１０に示す。
【０１８２】
【表６】
2014207912.tif 000008
【０１８３】
また、高濃度のＥｔ存在下における各因子（サンプルＡ、Ｂ及びＥ〜Ｇ）のBoc-Leu-Gly-Arg-pNA基質に対する水解特性について調べた。組換えＰｒｏ−ＣＥ及び組換えＢ因子それぞれ単独又は共存させたサンプルにおいては高濃度のＥｔによる活性化が見られなかった。一方組換えＣ因子単独のもの、並びに組換えＣ因子、組換えＢ因子及び組換えＰｒｏ−ＣＥによる完全再構成系において顕著な水解活性が認められた。ただし、組換えＰｒｏ−ＣＥ、組換えＢ因子及び組換えＣ因子による完全再構成系における水解活性は、組換えＣ因子単独での水解活性と比較して著しい活性化（およそ３桁の違い）が誘導された（図１１）。
【０１８４】
これらの結果より、組換えＣ因子、組換えＢ因子及び組換えＰｒｏ−ＣＥを組み合わせることにより、天然の各因子(天然のＬＡＬ因子)と同様にＥｔの濃度依存的にカスケード反応が進むことが判明した。また、このカスケードを再構築する際にカブトガニの種が異なる凝固因子を用いても、天然のＬＡＬ因子と同様に活性発現されていることが確認された。
【０１８５】
［実施例５］完全再構成系のＥｔ反応の活性に対する金属塩の影響についての検討
実施例４に示した完全再構築系（サンプルＡ）のＥｔ反応において、金属塩の添加量を変化させた場合のＥｔ反応の活性の変化について検討した。
【０１８６】
（Ａ）硫酸マグネシウムの影響（塩化カルシウムと塩化ナトリウムは未添加）
（ａ）０〜１００mMの濃度範囲における検討
実施例４の完全再構築系のＥｔ反応において、当該実施例では６４mMである硫酸マグネシウムの濃度を、０〜１００mMの間で変化させて、反応活性の変化を観察した（反応時）。その結果を、図１２に示す。なお、本反応で、Ｅｔ溶液は、０ng/mL（対照）と１００ng/mLの２種類の系にて行った。
【０１８７】
【表７】
2014207912.tif 000009
図１２に示す結果により、本発明方法１の完全再構築系では、本測定系に添加した硫酸マグネシウムの濃度上昇に伴い、活性値が有意に減少した。
【０１８８】
（ｂ）０〜１０mMの濃度範囲における検討
上記本実施例の（ａ）の反応系において（Ｅｔ濃度は、０ng/mL（対照）と２０ng/mL）、硫酸マグネシウムの濃度を、反応時に０〜１０mMになるように変化させて、再構成後の活性変化を観察した。その結果を、表８と図１３に示す。
【０１８９】
【表８】
2014207912.tif 000010
表８と図１３に示す結果により、本発明方法１の完全再構築系では、硫酸マグネシウムの濃度が１０mM以下であっても濃度依存的に、Ｅｔ反応の抑制を認めた。
【０１９０】
これらの結果より、本測定系によるＥｔ反応においては、硫酸マグネシウムを添加しなくても各因子の再構成後の活性は良好に検出、維持されることが判明した。
【０１９１】
（Ｂ）塩化カルシウムの影響（硫酸マグネシウムと塩化ナトリウムは未添加）
実施例４の完全再構築系のＥｔ反応において（Ｅｔは、無添加（対照）と２０ng/mL）、塩化カルシウム濃度を、反応時に０〜５mMになるように添加し、再構成後の活性変化を観察した。その結果を、表９と図１４に示す。
【０１９２】
【表９】
2014207912.tif 000011
表９と図１４の結果により、完全再構成系のＥｔ反応においては、塩化カルシウムを添加しなくても、マグネシウムと同様に各因子の活性は良好に検出、維持されることが確認された。
【０１９３】
（Ｃ）塩化ナトリウムの影響（硫酸マグネシウムと塩化カルシウムは未添加）
本試験系において、反応緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ＝８．０）中のＣｌ-が、反応時に８０mM存在することになるが、本試験系においては、Ｎａ＋は共存せず、塩化ナトリウム濃度としては算入付加されない。
【０１９４】
実施例４の完全再構築系のＥｔ反応において（Ｅｔは、無添加（対照）と２０ng/mL）、当該実施例では、１５０mM添加されていた塩化カルシウム濃度を、０、０．０７８、０．１５６、０．３１３、０．６２５，１．２５、２．５（Ｍ）と、０〜２．５Ｍの間で変化させて、反応値の変化を観察した（反応時）。その結果を、表１０と図１５に示す。
【０１９５】
【表１０】
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表１０と図１５の結果により、塩化ナトリウムの反応時の濃度が、０〜５０mMの間では、再構成後の活性にほとんど影響を認めないが、それ以上の濃度では、有意の反応抑制がみられた（２００mMでおよそ３０％の低下）。
【０１９６】
［実施例６］完全再構成系におけるＥｔ反応の基質特異性に関する検討
組換えＣ因子を構成品とするＥｔ測定試薬（PyroGene：Cambrex社）に含まれる蛍光合成基質、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡと類似の発色合成基質、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Boc-VPR-pNA）（酢酸塩）（以下、基質１ともいう）を用いて、実施例４の完全再構成系におけるＥｔ反応を、通常のＬＡＬ反応では最適のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ(Boc-LGR-pNA)（以下、基質２ともいう）と比較した。
【０１９７】
Ｅｔ反応時の基質濃度は、基質１、基質２、共に０．３mMに設定して行った。
【０１９８】
その結果を、表１１と図１６に示す。
【０１９９】
【表１１】
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表１１と図１６に示された結果より、完全再構成系による本系のＥｔ活性は、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（基質２）の方が、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（基質１）に比べ、反応値が２００倍ほど高いことが判明した。
【０２００】
なお、別試験として、組換え型Ｃ因子のみの系（基質濃度は、基質１、基質２、共に０．３ｍＭに設定して行った）のＥｔ反応の検討を行ったところ、基質２を用いた場合の反応値に比べ、基質１を用いた場合の方が、反応値が１．６倍ほど高かった。
【０２０１】
このことから、組換え型Ｃ因子単独の場合に比べ、完全再構成系によるエンドトキシン活性の方が著しく高い反応値を示すことが明らかとなった。また、（１→３）−β−Ｄ−グルカンにおいても同様の傾向を示す。すなわち、本発明により、微量でも高感度かつ再現性の良いエンドトキシン及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出・定量を行うことが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
本発明により、カブトガニ由来のＰｒｏ−ＣＥを大量に遺伝子発現させ、微生物由来の菌体成分を効率的かつ再現性よく検出、測定するためのin vitro のツールや方法が提供される。さらに、本発明により得られるＰｒｏ−ＣＥは、他のＬＡＬ反応に関与する組換え因子とともに反応系を構成する主要な因子として提供される。本法は、Ｅｔ及びＢＧの検出、定量による医薬品、医療用具等の安全性評価、敗血症、真菌感染症等の血清診断、環境・食品衛生分野における微生物汚染の検出ツールとして、又は、研究用試薬等として、恒久的かつ幅広い利用が期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【０２０３】
配列番号１：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムをコードするｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号３：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムおよびＨｉｓ−Ｔａｇからなるポリペプチドをコードする組換えＤＮＡの塩基配列
配列番号４：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムおよびＨｉｓ−Ｔａｇからなるポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号５〜１４：プライマー
配列番号１５：タキプレウス・トリデンタツスのＢ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１６：タキプレウス・トリデンタツスのＢ因子のアミノ酸配列
配列番号１７：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のαサブユニットをコードするｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１８：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１９：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のβサブユニットをコードするｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２０：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号２１：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のαサブユニットおよびＨｉｓ−Ｔａｇを含むポリペプチドをコードする組換えＤＮＡの塩基配列
配列番号２２：タキプレウス・トリデンタツスのＧ因子のαサブユニットおよびＨｉｓ−Ｔａｇを含むポリペプチドのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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